ORIGINALES

Aceite de oliva e inhibición de la oxidación de las lipoproteínas de baja densidad. Importancia de los compuestos fenólicos

Montserrat Fitóa, María Isabel Covasa,b, Rosa M. Lamuela-Raventósc, Joan Vilaa, Carmen de la Torrec y Jaume Marrugata

aUnidad de Lípidos y Epidemiología Cardiovascular. Institut Municipal d’Investigació Mèdica (IMIM). Barcelona. bLaboratorio de Referencia de Catalunya. L’Hospitalet de Llobregat. Barcelona.cDepartamento de Bromatología y Nutrición. Facultat de Farmacia. Universitat de Barcelona.

1

Correspondencia: Dra. M.I. Covas.Unitat de Lípids i Epidemiologia Cardiovascular.Institut Municipal d’Investigació Mèdica (IMIM). Doctor Aiguader, 80. 08003 Barcelona.Correo electrónico: mcovas@imim.es

Recibido el 24-1-2000; aceptado para su publicación el 4-4-2000

FUNDAMENTO: Investigar el efecto protector de aceites de oliva con diferente composición fenóli-ca sobre la predisposición de las lipoproteínas de baja densidad a la oxidación.MÉTODOS: Los aceites refinado (contenido fenólico: 0 mg/l equivalentes de ácido cafeico), común(0,1 y 0,3 mg/l equivalentes de ácido cafeico) y virgen diluido con refinado (0,1 y 0,3 mg/lequivalentes de ácido cafeico) se añadieron a lipoproteínas de baja densidad aisladas. Se mo-nitorizó la formación de dienos conjugados tras oxidación de la lipoproteína de baja densidadmediada por cobre.RESULTADOS: La fase de latencia de la formación de dienos conjugados se incrementó con elcontenido de compuestos fenólicos en el aceite de oliva (p < 0,0001, ANOVA). Los análisis deregresión múltiple demostraron que los fenoles fueron los principales responsables del incre-mento en la fase de latencia (p < 0,0001), tras ajuste por los otros antioxidantes presentes enlos aceites de oliva común y virgen. El aumento en la fase de latencia asociado con un incre-mento de 0,1 mg/l de ácido cafeico en la concentración fenólica fue de 72 min (IC del 95%:64-80 min) para el aceite de oliva común y de 111 min (IC del 95%: 100-123 min) para elvirgen. Se obtuvo una asociación significativa de las concentraciones de α-tocoferol (p =0,003) con el aumento de la fase de latencia en el experimento con aceite de oliva común, al-canzando una significación marginal en el virgen (p = 0,084).CONCLUSIONES: Los aceites con contenido fenólico demostraron mayor poder antioxidante frentea la oxidación de las lipoproteínas de baja densidad. La naturaleza del contenido fenólico influ-ye en la capacidad antioxidante del aceite de oliva.

Palabras clave: Aceite de oliva; Compuestos fenólicos; Lipoproteínas de baja densidad; Oxidación;Dieta mediterránea.

Olive oil and inhibition of low density lipoprotein oxidation. Role of phenolic compounds

BACKGROUND: To investigate the protective effect of several olive oils with different phenoliccomposition on low density lipoprotein susceptibility to oxidation.PATIENTS AND METHODS: Refined olive oil (phenolic content: 0 mg/l caffeic acid equivalents[CAE]), common olive oil (0.1 and 0.3 mg/l CAE), and virgin olive oil diluted with refined oliveoil (0.1 y 0.3 mg/l CAE), were added to isolated low density lipoprotein. Conjugated dienes for-mation was monitored after copper-mediated low density lipoprotein oxidation.RESULTS: An increase in the lag time of conjugated dienes formation after copper-mediated lowdensity lipoprotein oxidation was observed linked to olive oil phenolic content (p < 0.0001,ANOVA). Multiple regresion analysis showed that phenolics were the most significant antioxi-dants with 0.1 mg/l-increase in phenolic concentration, adjusted for α-tocopherol and β-carote-ne, was 72 minutes (95% confidence interval [CI] 64 to 80 min) for common olive oil, and111 min (CI 95%: 100-123 min) for virgin olive oil. In common olive oil α-tocopherol levelswere significatively associated with the increase in the lag time (p = 0.003), reaching in virginolive oil a borderline signification (p = 0.084).CONCLUSIONS: Olive oil containing phenolics showed more antioxidant effect on low density lipo-protein oxidation than refined olive in relation to its phenolic content. The nature of the pheno-lic content influences the antioxidant capacity of an olive oil.

Med Clin (Barc) 2000; 115: 166-169

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La enfermedad coronaria es en la actuali-dad el problema de salud más importan-te en la población adulta de los paísesdesarrollados. Existe, sin embargo, unaamplia variabilidad en la incidencia y ta-sas de mortalidad de esta enfermedad,siendo el área mediterránea la que pre-senta las tasas más bajas del mundo1. Lamenor incidencia de enfermedad corona-ria en los países mediterráneos se ha atri-buido en parte a la dieta, rica en frutafresca, vegetales, legumbres, cereales yvino, y cuyo principal aporte de grasasestá constituido por el aceite de oliva2.Estos alimentos contienen cantidadesdestacables de antioxidantes naturalesque pueden prevenir la oxidación de laslipoproteínas de baja densidad (LDL). Laeficacia de la dieta de tipo mediterráneoen la prevención secundaria de la enfer-medad coronaria ha sido demostrada3.Uno de los factores clave en el desarrollode la aterosclerosis es la oxidación de lasLDL4. Estudios nutricionales con dietas ri-cas en ácido oleico, efectuados en mode-los animales y en humanos, han demos-trado su capacidad para reducir lasusceptibilidad de las LDL a la oxidación,además de mejorar el perfil lipídico deriesgo cardiovascular5. En diversos estu-dios6,7, aunque no en todos8, las LDL ri-cas en ácido oleico presentaron una me-nor susceptibilidad a las modificacionesoxidativas que las enriquecidas con ácidolinoleico. Además, la fracción no grasadel aceite de oliva virgen (aceite obtenidode manera directa del fruto del olivo pormedios puramente físicos, como la pre-sión y la centrifugación) es rica en com-puestos fenólicos, cuyas propiedades an-tioxidantes protegen al aceite de oliva dela autooxidación9. En los sistemas biológi-cos, los extractos fenólicos del aceite deoliva virgen10 y algunos componentes fe-nólicos aislados de los mismos, como elhidroxitirosol y la oleuropeína11, handemostrado poseer propiedades antioxi-dantes in vitro. Otros fenoles de origenvegetal, como los flavonoides12 y las cate-

M. FITÓ ET AL.– ACEITE DE OLIVA E INHIBICIÓN DE LA OXIDACIÓN DE LAS LIPOPROTEÍNAS DE BAJA DENSIDAD. IMPORTANCIA DE LOS COMPUESTOS FENÓLICOS

quinas13, han demostrado ser biodisponi-bles y poseer propiedades antioxidantesen estudios efectuados in vitro e in vivo.Además de compuestos fenólicos, elaceite de oliva virgen contiene otros an-tioxidantes, como el α-tocoferol y, en másreducidas cantidades, β-caroteno. Los fe-noles se pierden en el proceso de refina-do del aceite de oliva. En nuestro mediose consumen tres tipos de aceite de oli-va: el de orujo de oliva refinado (de ca-racterísticas similares al aceite de olivarefinado) que no posee compuestos fenó-licos, el aceite de oliva común (mezcla deaceite refinado y virgen) y el aceite de oli-va virgen que se consume directamentesin refinar, a diferencia de aceites deotros orígenes. La naturaleza y cantidaddel contenido fenólico de un aceite deoliva varía según las condiciones del cli-ma, tiempo de recogida, tipo de almace-namiento y tecnología utilizada en su pro-cesamiento14.Dada la relevancia del aceite de oliva en laalimentación mediterránea, consideramosimportante estudiar la influencia de lacomposición de los aceites de oliva sobrela oxidación de las LDL, como la primerafase de una serie de estudios que permi-tan efectuar en el futuro recomendacionesnutricionales precisas a la población. Eneste estudio examinamos el papel protec-tor de los aceites de oliva con distintacomposición fenólica frente al aceite refi-nado, que carece de compuestos fenóli-cos, sobre la oxidación de las LDL.

MétodosSe analizaron las características de los aceites de oli-va utilizados en el estudio. La composición de ácidosgrasos se determinó por cromatografía de gases, y elcontenido de α-tocoferol y β-caroteno mediante cro-matografía líquida de alta resolución (HPLC)15-17. Elcontenido total de compuestos fenólicos de los acei-tes de oliva se determinó por el método Folin-Ciocal-teau18. La evaluación de los componentes fenólicosde los aceites de oliva común y virgen se efectuó me-diante HPLC19.

Obtención de las muestras y separación de las LDL

Los especímenes de sangre de 10 voluntarios sanosse obtuvieron por extracción venosa en decúbito su-pino y recolección en tubos con 1 g/l de EDTA (Veno-ject, Leuven, Bélgica) tras 12 h de ayuno. El plasmase separó por centrifugación a 1.000 × g durante 15 min. Se descartaron las muestras hemolizadas, ic-téricas o lipémicas. Tras efectuar un pool de plasmase llevó a cabo la separación de las LDL por ultracen-trifugación secuencial20. Se dializó la LDL nativa me-diante cromatografía de exclusión en columnas Se-phadex G-25 (Pharmacia, Uppsala, Suecia) contampón salino fosfato (PBS) 0,01 mmol/l, pH 7,4 y a4 °C. El contenido proteico se determinó mediante elmétodo del rojo de pirogalol (Sigma Chemical Co., StLouis, EE.UU.).

Adición de los aceites de oliva

El aceite de oliva es, por su propia naturaleza, unasolución de los componentes cuya capacidad antioxi-dante se quiere evaluar. Por ello, en 5 experimentos,efectuados por sextuplicado, se añadieron a 1 ml deLDL dializada: 40 mg de aceite de oliva refinado, 10 y

DAD1 A, Sig = 280,4 Ref = 550,100

70

60

50

40

30

20

10

0

mAU

0 5 10 15 20 25 min

1 2

3

4

5 67

8

9

1011

12

13

a

Fig. 1. Cromatogramas con los perfiles de compuestos fenólicos presentes en los aceites de oliva virgen (a) ycomún (b). Numeración de los picos: (1) hidroxitirosol; (2) ácido protocatéquico; (3) tirosol; (4) ácido vainílico;(8) ácido m-cumárico; (9) oleuropeína; (10) oleuropeína aglicona; (5-7) y (10-13) fenoles no identificados.

DAD1 A, Sig = 280,4 Ref = 550,100

70

60

50

40

30

20

10

0

mAU

0 5 10 15 20 25 min

2

3

5 8 12

b

36 mg de aceite de oliva común y 11 y 40 mg deaceite de oliva virgen diluido al 1/10 con aceite de oli-va refinado. Con ello se obtuvieron unas concentra-ciones de compuestos fenólicos de 0 mg/kg equiva-lentes de ácido cafeico (CAE) (refinado), y de 01, a0,3 mg/kg de CAE (para los aceites de origen comúny virgen). Dichas concentraciones de fenoles fueronelegidas según los requerimientos para prolongar lafase de latencia de los dienos conjugados en un 50%(CI50) y en un 100% (CI100) obtenidas en un estudioprevio10. Tras agitación rotatoria durante 15 min atemperatura ambiente (en ausencia de luz), centrifu-gación en frío durante 5 min a 1.000 × g y rotura me-cánica de la emulsión en el sobrenadante (procesoefectuado por duplicado), la oxidación de la LDL serealizó como se describe a continuación.

Oxidación de la LDL mediada por cobre

La LDL dializada (0,05 g de proteína/l) se incubó consulfato de cobre (Sigma Chemical Co., St Louis,EE.UU.) (5 µmol) en PBS con un volumen total finalde 1 ml. La cinética de formación de los dienos con-jugados (formación de dobles enlaces alternos copla-nares) en los ácidos grasos poliinsaturados (AGP) delas lipoproteínas se monitorizó a una absorbancia de234 nm21, durante 5 h a intervalos de 2 min, a 30 °C,mediante un espectrofotómetro (Hewlett Packard,Palo Alto, EE.UU.) equipado con un cambiador auto-

mático de cubetas de 7 posiciones. El parámetro ele-gido para evaluar la predisposición a la oxidación dela LDL fue la fase de latencia en la formación de losdienos conjugados. Dicha fase de latencia correspon-de al tiempo transcurrido desde el inicio del estrésoxidativo in vitro hasta el comienzo de la fase de pro-pagación (velocidad máxima de formación) de dienosconjugados, tiempo durante el cual se agotan los an-tioxidantes de la LDL, por lo que esta fase está direc-tamente relacionada con la protección de la LDLfrente a la oxidación.

Análisis estadístico

Se realizó un análisis de la variancia (ANOVA) con untest de Dunnett para la comparación simultánea ymúltiple entre los distintos grupos de aceites. Lasasociaciones simples se evaluaron mediante el coefi-ciente de correlación de Spearman. Se realizaronanálisis de regresión lineal múltiple para investigar elretraso en la fase de latencia de la formación de die-nos conjugados asociado a un incremento de la con-centración de fenoles de los aceites de oliva, comúny virgen diluido, de 0,1 mg/l de CAE. El criterio de ex-clusión de variables del modelo fue de p < 0,1 en elestudio de asociaciones simples. Se consideró esta-dísticamente significativa una p = 0,05. Los cál-culos se efectuaron mediante el paquete estadísticoSPSS/PC (SPSS Inc., Chicago, EE.UU.).

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MEDICINA CLÍNICA. VOL. 115. NÚM. 5. 2000

Fig. 2. Efecto de la adición de aceites de oliva sobre la fase de latencia de la oxidación de las lipoproteínas debaja densidad (LDL) mediada por cobre. Se oxidó la LDL (0,05 g/l) con cobre 5 µmol y aceite de oliva con lascantidades indicadas de compuestos fenólicos (CAE, equivalentes de ácido cafeico). a) aceite de oliva refinado:b y d); aceite de oliva común; c y e); aceite de oliva virgen diluido. Los valores representan la media y desvia-ción estándar de seis experimentos. *p < 0,05 respecto al control. **p < 0,005 respecto al aceite de oliva refi-nado. ***p < 0,05 respecto al aceite de oliva virgen diluido a la misma concentración de compuestos fenólicos.

400

350

300

250

200

150

100

50

0% in

crem

ento

en

fase

de

late

ncia

0 0,1 0,1 0,3 0,3Aceites de oliva (mg/l CAE, contenido fenólico)

***, **, *

***, **, *

**, *

**, *

a b

c

d

eFrente a controlFrente a aceite refinado

Resultados

Estudio analítico de los aceites de oliva

El porcentaje de ácidos grasos monoinsa-turados (AGM), poliinsaturados (AGP) ysaturados (AGS) fue del 73, el 10 y el17%, respectivamente, en el aceite deoliva virgen, del 72, el 12 y el 16% en elaceite de oliva común, y del 74, el 11 y el 15% en el aceite refinado. Las concen-traciones de α-tocoferol y de β-carotenoen cada aceite de oliva fueron de 214 y5,04 mg/kg en el virgen, de 194 y 0,75mg/kg en el común y de 174 y < 0,01mg/kg en el refinado. La concentraciónde compuestos fenólicos fue de 139,12,4 y 0 mg/kg CAE para los aceites deoliva virgen, común y refinado, respecti-vamente. En la figura 1 se observa el per-fil cromatográfico de los componentes fe-nólicos de los aceites de oliva virgen ycomún en el que se observan las diferen-cias entre ambos. Los fenoles hidroxitiro-sol, ácido vainílico, oleuropeína y los pi-cos 11 y 13 (fenoles no identificados)presentes en el aceite de oliva virgen nose encontraban en cantidades detecta-bles en el aceite de oliva común.

Efecto de la adición de los aceites de oliva sobre la oxidación de las LDL

Todos los aceites de oliva incrementaronla fase de latencia de formación de losdienos conjugados en las LDL, en com-paración con las LDL control, aunque enel aceite refinado no se alcanzó la signifi-cación estadística (fig. 2). El incrementode la fase de latencia estuvo en relacióndirecta con la concentración de com-puestos fenólicos en el aceite de oliva (p < 0,0001, ANOVA). Se obtuvieron di-ferencias significativas entre el aceite deoliva común y el virgen a la misma con-centración de compuestos fenólicos (p <

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0,05). Cuando se efectuaron las asocia-ciones simples se obtuvo una correlaciónpositiva significativa entre la fase de la-tencia de formación de los dienos conju-gados y la concentración de fenoles (p <0,001), α-tocoferol (p < 0,05) y β-carote-no (p < 0,01) añadidos a las LDL aisla-das. No se obtuvo asociación entre lafase de latencia y la concentración deAGM, AGP o AGS añadidos a la LDL ais-lada. Los resultados de los análisis de re-gresión lineal múltiple (tabla 1) pusieronde manifiesto una asociación significativaentre el contenido de compuestos fenóli-cos y el incremento en la fase de latenciade los dienos conjugados (p < 0,0001).El aumento de la fase de latencia asocia-do con el incremento de 0,1 mg/l en laconcentración de compuestos fenólicos,ajustado por α-tocoferol y β-caroteno, fuede 72 min (intervalo de confianza [IC] del95%: 64-80 min) para el aceite de olivacomún y de 111 min (IC del 95%: 100-123 min) para el virgen diluido. En el ex-perimento con aceite de oliva común elcontenido de α-tocoferol estuvo tambiénasociado significativamente con el retra-so de la fase de latencia (p = 0,003). El aumento en la fase de latencia asociadoal incremento de 0,1 mg/l en la concen-tración de α-tocoferol fue de 1,5 min (ICdel 95%: 1,01-2 min).

Discusión

Existen cada vez más evidencias de quela dieta mediterránea clásica tiene unefecto protector sobre enfermedades yprocesos asociados con la lesión oxidati-va, como la enfermedad coronaria y lasneoplasias, y también con el envejeci-miento2,3,22,23. El aceite de oliva es uno delos principales alimentos de la dieta me-diterránea cuyo consumo se ha relacio-nado con un perfil de menor riesgo depadecer enfermedades coronarias24 ycon un menor riesgo de cáncer de pul-món23. Respecto a los componentes delaceite de oliva, los AGM provenientes dela dieta han demostrado reducir el gradode factores de riesgo de padecer enfer-medad coronaria25. Por otra parte, en al-gunos estudios prospectivos de larga du-ración la ingesta elevada de vitamina E serelacionó con un bajo riesgo de enferme-dad coronaria26. El consumo de com-puestos fenólicos, como los flavonoides,se ha observado asociado a una reduc-ción de la mortalidad cardiovascular endiversos estudios epidemiológicos pros-pectivos27. El efecto biológico del aceitede oliva, con sus compuestos antioxidan-tes, merece ser analizado detalladamen-te, ya que es un buen candidato paraexplicar una parte sustancial de los bene-ficios de la dieta mediterránea. Nuestrosexperimentos fueron diseñados para exa-minar la influencia del perfil de compues-tos fenólicos de un aceite de oliva sobrela protección de la oxidación de las LDL.Aunque todos los aceites de oliva retarda-ron la oxidación de la LDL, se observó unincremento de la actividad antioxidantecuanto mayor era la concentración fenóli-ca en el aceite de oliva. El aceite de olivarefinado, sin compuestos fenólicos detec-tables, retrasó la fase de latencia de la for-mación de dienos conjugados en un 52%.Esta protección frente a la oxidación de lasLDL es atribuible a los compuestos no fe-nólicos con capacidad antioxidante pre-sentes en el aceite de oliva. Al añadir acei-te refinado a la LDL aislada se alcanzó unaconcentración final de α-tocoferol de 4,38mg/l. Frankel et al28 observaron un retrasoen la fase de latencia del 42% en la oxida-ción de LDL inducida por cobre trabajandoa una concentración de α-tocoferol similar

TABLA 1

Análisis de regresión lineal múltiple del incremento en la fase de latencia de la oxidación de la LDL y componentes antioxidantes de los aceites de oliva común y virgen

Aceite de oliva común Aceite de oliva virgen Antioxidante

B (EE)* p R2 B (EE)* p R2

Fenoles 72,1 (8,3) < 0,0001 0,894 111,2 (11,5) < 0,0001 0,947α-tocoferol 1,5 (0,5) 0,003 5,0 (2,7) 0,084β-caroteno – – – –

*B: coeficiente de regresión: EE: error estándar; R2: coeficiente de determinación.

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a la utilizada en nuestro experimento. Elhecho de que el retraso en la fase de laten-cia tras la adición de aceite refinado fueramenor que el obtenido con los otros acei-tes de oliva indica que los fenoles del acei-te de oliva pueden tener una mayor pro-piedad antioxidante que el α-tocoferolfrente a la oxidación de la LDL in vitro.Esto concordaría con los resultados obte-nidos por otros autores15,28, en los cualescompuestos fenólicos como resveratrol,epicatequina o quercetina han demostra-do poseer una mayor actividad antioxidan-te frente a la oxidación de la LDL in vitroque el α-tocoferol.Las concentraciones de compuestos fe-nólicos, α-tocoferol y β-caroteno, presen-taron una asociación positiva con la fasede latencia de formación de los dienosconjugados. Por ello, y con el fin de obte-ner una estimación del efecto sobre laoxidación de las LDL atribuible a cadacomponente, se realizaron análisis de re-gresión múltiple con dichas variables. Loscompuestas fenólicos de los aceites deoliva común y virgen fueron los principa-les responsables del incremento en lafase de latencia. Observamos una contri-bución menor, aunque significativa, delα-tocoferol al incremento de la fase de la-tencia en el experimento con aceite deoliva común. No se observaron asociacio-nes con las concentraciones de β-carote-no. Cabe mencionar que la concentra-ción de β-caroteno presente en lassoluciones de incubación fue menor quela utilizada habitualmente para inhibir laformación de dienos conjugados29. Estosresultados indican que, aunque todos los componentes antioxidantes del aceitede oliva pueden estar involucrados en laprotección que ejerce el aceite sobre la oxidación de las LDL, los compuestosfenólicos poseen la mayor capacidadantioxidante. Los resultados de este estu-dio apoyan la idea de que el consumo deaceite de oliva, especialmente el virgencon alto contenido fenólico y por ello conmayor probabilidad de absorción de di-chos compuestos fenólicos, puede tenerun efecto protector frente al desarrollo delos procesos ateroscleróticos.El aumento de la fase de latencia de for-mación de los dienos conjugados asocia-do con un incremento de 0,1 mg/l en laconcentración de fenoles fue de 72 minpara el aceite de oliva común y de 111min para el aceite de oliva virgen. La dis-tinta actividad antioxidante de ambosaceites a idénticas concentraciones fenó-licas, y tras el ajuste por los otros antioxi-dantes añadidos, podría atribuirse a unadiferencia en la naturaleza de los com-puestos fenólicos. El examen de los perfi-les cromatográficos de ambos aceitespuso de manifiesto diferencias entre am-bos (fig. 1). El aceite de oliva común noposeía cantidades detectables de hidroxi-

tirosol y oeluropeína, los cuales han de-mostrado ser de los compuestos fenóli-cos del aceite de oliva con mayor capaci-dad antioxidante in vitro30. El origen delos aceites de oliva común y virgen conlos que se ha realizado este estudio eradistinto, y el aceite de oliva virgen utiliza-do para la preparación del aceite comúnno era el mismo que el empleado ennuestro experimento. Se requieren poste-riores estudios para identificar los com-puestos fenólicos del aceite de oliva, subiodisponibilidad y sus efectos antioxidan-tes en el contexto del aceite de oliva invivo, con el fin de determinar cuál es elmejor perfil antioxidante de un aceite deoliva y poder establecer recomendacionesdietéticas en torno a su consumo. De con-firmarse la biodisponibilidad de los com-puestos fenólicos del aceite de oliva, nues-tros hallazgos sustentarían uno de losmecanismos a través de los cuales la dietamediterránea proporciona sus beneficios.En conclusión, todos los aceites de olivaprotegieron a las LDL frente a la oxida-ción, aunque los aceites con contenidofenólico demostraron mayor poder anti-oxidante in vitro. Se observó una relacióndirecta entre la concentración de fenolesen el aceite de oliva y la capacidad anti-oxidante del mismo. La naturaleza delcontenido fenólico influye en la capacidadantioxidante in vitro de un aceite de oliva.

AgradecimientoEste trabajo ha sido financiado mediante lasbecas: CICYT (ALI97-1607-C02-01), FIS(98/9562 FPI) y por la Federació de Cooperati-ves Agràries de Catalunya, y parcialmente fi-nanciado por la beca CIRIT (1999SGR-00243).

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