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[ APPLICATION NOTE ]

ウォーターズのソリューションACQUITY UPLC® H-Class Bio システム

ACQUITY QDa 検出器

ACQUITY UPLC Tunable UV （TUV）検出器

Waters® CSH カラム

MassLynx 4.1 ソフトウェア

キーワード合成ペプチド、不純物プロファイリング、 バッチ解析、質量検出、 ACQUITY QDa、ProMass

アプリケーションのメリット■■ 合成ペプチドの質量確認および不純物プロファイリングのための MassLynx® と ProMass による自動ワークフロー

■■ ACQUITY® QDa® 検出器による合成ペプチドの品質管理のための費用対効果に優れたソリューション

■■ オンライン UV-MS 検出によるペプチド不純物の定量と確認

はじめにペプチドは広範に及ぶ活性を有し、毒性が低いため、ペプチドベースの医薬品の市場は拡大を続けています 1。ペプチド医薬品の大部分の製造に用いられる固相合成法では、脱保護が不十分なペプチドや副反応生成物などのプロセス関連不純物が度々生じます 2,3。また、酸化や脱アミドなど、製造製品に関連する不純物も生じるため、医薬品の不純物プロファイルの複雑さが増します 2,3。医薬品の有効性と安全性を確保するために、医薬品規制調和国際会議（ICH）のガイドラインでは新規医薬品の毒性と投与量に基づいた不純物の同定が求められています 4。不純物レベルの判断には、一般的に LC-UV による光学検出の閾値が使用されます。しかし、光学検出は既知または特性が明らかなサンプル以外には使用できず、通常は分取と濃縮を行い、さらに MS ベースの分析法で同定する必要があります。ペプチドベースの医薬品が成長を続けるなかで、製品の品質を保ちながら、時機を逸することなく医薬品を上市できる効率的なワークフローが求められています。質量分析法 (MS) などの直交的な検出法を併用すると、合成ペプチド製造時の不純物プロファイリングにおける課題に対処することができます。

ACQUITY QDa 検出器を導入すると、LC-UV ベースのワークフローに MS 検出を組み込むことができ、効率的で費用対効果に優れたソリューションとなります 5。また、以前に示したとおり、MassLynx と ProMass ソフトウェア（Novatia 社）の併用により、ACQUITY QDa 検出器で得られる MS データの自動解析が可能になるため、合成ペプチドのスクリーニングをハイスループットで行うことができます 6。

本アプリケーションノートでは費用対効果に優れた LC-UV-MS ベースのワークフローを示します。このワークフローでは MassLynx と ProMass を併用して質量確認を行い、ACQUITY QDa 検出器をインラインの直交的な検出器として使用して合成ペプチドの不純物モニタリングを行います。このワークフローを説明するために、臨床的に意義のある合成ペプチドのEledoisinの解析を行いました。

ACQUITY QDa 検出器と ProMass ソフトウェアの使用による LC-UV-MS ベースの合成ペプチド同定および不純物プロファイリングXimo Zhang, Brooke Koshel, Jing Fang, William Alley, Robert Birdsall, and Yinq Qing YuWaters Corporation, Milford, MA, USA

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2ACQUITY QDa 検出器による LC-UV/MS ベースの合成ペプチド同定および不純物プロファイリング

実験

試薬合成ペプチドのEledoisin（pGlu-Pro-Ser-Lys-Asp-Ala-Phe-Ile-Gly-Leu-Met-NH2）は New England Peptide 社より購入しました。HPLC グレードの水、アセトニトリル、ギ酸は Fisher Scientific 社より購入し、そのまま使用しました。ペプチドのストック液は水に2 mg/mL の濃度で溶解したのち、必要な濃度に希釈しました。分析の最適化は、注入量を 5 µL に保ったまま、ペプチドの質量負荷を 0.05 µg から 5.00 µg まで変化させて行いました。サンプル負荷 2 µg が最適な質量負荷と判明したため、別途記載している場合を除き、すべての分析でサンプル負荷 2 µg としました。

LC 条件LC システム： ACQUITY UPLC H-Class Bio

検出器： ACQUITY UPLC TUV 検出器、 5 mm フローセル、λ = 215 nm

ACQUITY QDa 検出器 （パフォーマンスモデル）

LC カラム： ACQUITY UPLC CSH C18、 1.7 µm、130 Å、2.1 mm × 100 mm （製品番号 186006937）

カラム温度： 60°C

サンプルバイアル： 12 mm × 32 mm ガラスバイアル、 トータルリカバリー （製品番号 600000750cv）

注入量： 5 µL

移動相 A： 0.1% ギ酸含有 水溶液

移動相 B： 0.1% ギ酸含有アセトニトリル

グラジエントテーブル：

時間 流速 （分） （分） %A %B Initial 0.200 82.0 18.0 2.00 0.200 82.0 18.0 2.01 0.200 82.0 18.0 22.01 0.200 72.0 28.0 22.02 0.200 20.0 80.0 24.02 0.200 20.0 80.0 24.03 0.200 82.0 18.0 30.00 0.200 82.0 18.0

ACQUITY QDa 検出器の設定質量範囲： 350～ 1,250 m/z

イオン化モード： ESI+

取得モード： コンティナム

サンプリングレート： 2 ポイント/秒

コーン電圧： 10 V

プローブ温度： 500°C

キャピラリー電圧： 1.5 kV

データ管理MassLynx v 4.1

ProMass for MassLynx

[ APPLICATION NOTE ]

3ACQUITY QDa 検出器による LC-UV/MS ベースの合成ペプチド同定および不純物プロファイリング

結果および考察

メソッドの最適化LC-UV ベースの手法による合成ペプチドの不純物プロファイリングでは、ピーク分離能と検出器感度の最適化が必要です。この実験では、図 1 に示すように、20 分のグラジエントで主要ピークと 11 の不純物ピークを分離できることがわかりました。ICH ガイドラインでは 1 日摂取量に基づいた不純物の同定が推奨されています。この実験では、メソッドの広範な適用性を判断するためのカットオフ値を S/N 比 10 以上、相対存在比 0.2% としました。図 1 の 11 のピーク中 8 つは、MassLynx による自動ピーク積分でこの基準を満たすピークと判明したもので、青字の番号で示されています。光学検出の S/N 比のカットオフ値を上回っていたピークはすべてマススペクトルでも認められました（図 1B）。

分

%

3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00

3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00

0.0

2.5e-2

5.0e-2

7.5e-2

1.0e-1

2: Diode ArrayRange: 1.453e-1

Areax6 9.26

22142

8.602808.39

437.69127.02

803.03241

9.11232

10.801469.98

11710.26

19

1: Scan ES+TIC

2.03e9x6 9.27

8.62

3.01

9.1410.8210.00

0.0

TUV

Rel

ativ

e In

tens

ity

1 2 3 4

5 6

Eledoisin

8

7

1A.

1B.

9 10 11

ACQUITY QDa TIC

AU

図 1. 直交的な質量検出による合成ペプチドEledoisin分離の最適化。1A）215 nm での UV 検出。MassLynx 積分ツールで 11 の不純物ピークが同定され、保持時間とピーク面積が示されています。ピーク面積が 0.2% を上回っているピークは青字、上回っていないピークは赤字の番号で示されています。1B）ACQUITY QDa 検出器による MS 検出。

図 2. 質量負荷の最適化。質量負荷を 2A）0.1 µg、2B）2 µg、2C）5 µg として、18% B から 28% B までの 20 分間のグラジエントで合成ペプチド分離を比較。検出されたピーク面積全体に対する標的ペプチドのピーク面積比（%）として純度が計算され、示されました。質量負荷 5 µg では分離能のロスが認められたため、最適な質量負荷は 2 µg であると判断しました。

添加試験を行う代わりに、質量負荷による純度（%）を用いて、分析の適用範囲を求めました。濃度を段階的に高めた 10 種類のサンプル（0.01 mg/mL から 1.0 mg/mL まで）を調製し、最適なグラジエントで評価しました。光学検出で得られた結果の総ピーク面積に基づく純度評価で、質量負荷 0.5 µg を上回る場合に 92.74 % ± 0.45% で安定であることがわかりました。分析の正確さを評価するために、3 回の繰り返し測定を行い、純度の %RSD を求めました。その結果、すべての質量負荷で %RSD は 5% を下回りました。これらのデータを総合的に判断し、Eledoisinとその不純物の S/N 比を 10 以上に保ち、最適なクロマトグラフィー性能を得られる質量負荷を 2 µg と判断しました（図 2）。

分

AU

0.0

1.0e-1

2.0e-1

AU

0.0

5.0e-2

1.0e-1

AU

0.0

5.0e-3

1.0e-2

2: Diode ArrayRange: 1.098e-2

Area9.43597

10.7853

2: Diode ArrayRange: 1.453e-1

Area9.26

22142

8.602808.39

437.69127.02

803.03241

9.11232

10.801469.98

11710.26

19

2: Diode ArrayRange: 2.854e-1

Area9.13

71034

8.621184

8.43957.72

1073.04179

2.6027

7.05156

6.66126

5.96105

5.16636

3.195

6.228

9.06326

10.85547

9.72435

10.01550 10.60

50 11.2388

5 µg 純度 92.93%

0.1 µg純度 97.58%

2 µg 純度 93.43%

2A.

2B.

2C. ピーク未分離

3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00

3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00

3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00

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4ACQUITY QDa 検出器による LC-UV/MS ベースの合成ペプチド同定および不純物プロファイリング

スペクトルデコンボリューションのパラメーターメソッドを最適化すると、質量検出のメリットを活用することができるようになります。ACQUITY QDa 検出器の使用により、不純物と標的ペプチドの質量差をソフトウェアで求めて、不純物を同定できます。MassLynx と ProMass を併用すると、合成ペプチドの自動データ取得と解析が可能です。図 3A は MassLynx のサンプルリストの例で、データ取り込み用の装置メソッド、標的質量の計算で必要となる情報、ProMass での合成ペプチドのデータデコンボリューション用パラメーターファイルが表示されています。ペプチドの不純物プロファイリングでは、図 3A の拡大図に示されているように、標的ペプチドの情報を Sequence 列と Target Info 列に入力する必要があります。この例では、「Ladder = internal」という情報を指定して、どちらの末端を有するフラグメントもすべて検出されるようにしました。標的合成ペプチドのEledoisinの C 末端には OH ではなく一級アミノ基（NH2）があるため、質量を正確に決定するには末端をこのように指定する必要があります。MS スペクトル解析用パラメーターは、ProMassBridge Parameter File 列と Znova Parameter File 列で指定するファイルを使って定義します。ProMassBridge Parameter File は ProMass と MassLynx とのやり取りを可能にするファイルで、解析対象とする保持時間ウィンドウ、スムージング、ベースライン減算などのユーザー定義パラメーターが含まれています。ProMass ソフトウェアで使用する Znova™ Parameter File には、スペクトルデコンボリューション用パラメーターと、レポートを簡素化するための閾値が記録されています。

Znova 解析ファイルは、図 3B に示されているように、標的の同定と不純物プロファイリングに使用するカスタマイズ可能なデータベースを指定します。標的質量の計算用の「構成要素」として、天然に存在するアミノ酸とともに、修飾および誘導体化されているアミノ酸を指定することができます。Eledoisinの例では、合成ペプチド末端のアミノ酸誘導体を示すために Pyroglutamic Acid（ピログルタミン酸）（/Pyr/=111.1）を指定しました。同様に、既知不純物については、標的ピークとの質量差の計算値を手動で指定できます。図 3B の青色の四角形で囲まれている部分に示されているように、酸化した標的ペプチドからのロイシンの欠損（Loss of Leu from OxiMet = -97.2）、想定されるペプチドフラグメント（Impurity A = -313.9）、C 末端の置換（OH terminal group instead of NH2 = 1）は、この実験の前の高分解能質量分析ですでに判明していました。デコンボリューションレポートでは、一致している質量差と、それに対応する不純物が示されます。

3A.

3B. Sequence

/Pyr /PSKDAFIGLM

Target Info

Sequence = peptide, Ladder = internal, termini = H, NH2

修飾および誘導体化されているアミノ酸

既知不純物

図 3. データデコンボリューションのパラメーター。3A）MassLynx のサンプルリストの例。拡大図はペプチドの標的質量計算の形式を示しています。3B）Znova Processing File のカスタマイズ可能なデータベース。天然に存在するアミノ酸と特定の不純物はデータベースにすでに登録されていましたが、青色の四角形で囲まれている項目は標的の同定と不純物プロファイリングのために手動で追加しました。

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5ACQUITY QDa 検出器による LC-UV/MS ベースの合成ペプチド同定および不純物プロファイリング

不純物プロファイリングの結果上記のメソッドを使用してEledoisinを分析し、標的質量の確認と不純物スクリーニングを行いました。レポートで示されたサンプルの純度は 88.87% で、この数値はマススペクトル中の標的質量（付加イオンを含む）の存在比（%）に基づいて推定し、クロマトグラムのピーク面積比（%）で標準化したものです。純度（%）は、質量誤差や存在比（%）などの標的ペプチドに関する情報とともに、Target Mass Summary 表に示されています（図 4）。Sequence Ladder Summary 表には同定されたペプチドフラグメント配列が示されています。Chromatogram Summary 表には、クロマトグラム上の閾値（0.2%）を上回った検出ピークがすべて示されています。この表の Spectral Quality は、存在比と検出された電荷状態の数に基づいて判定されており、カットオフ値（スコアが 4 以上）を下回ったピーク番号 4 および 5 以外の不純物については「ok」と示されました。この例で、保持時間 8.40 分（ピーク番号 4）がスコア不足（low score）となった原因はスペクトルのノイズが高かったこと、保持時間 8.62 分（ピーク番号 5）がスコア不足となった原因はスペクトルで認められた電荷状態が 1 つのみであったためにベースピークの電荷が誤同定されたことにあります。Spectrum Quality の閾値はユーザーが設定することができ、デコンボリューションの入力および出力スペクトル両方の品質を指定して、不純物同定結果の信頼性を高められます。

8

1 2 3 4 5 6

Eledoisin 7

9 10 11

ハイパーリンクピーク番号

ProMass results:

図 4. ペプチドの不純物プロファイリングの各サマリー。標的質量と純度（%）が Target MassSummary 表に示されています。UV 検出で 0.2% を上回ったピークの番号は、Chromatogram Summary 表に青字で示されています。表の項目が色文字で示されている場合はすべてハイパーリンクになっており、クリックするとデコンボリューションの詳細情報が表示されます。

ProMass ソフトウェアには、Chromatogram Summary 表のハイパーリンクをクリックして、分析結果それぞれの詳細情報を表示する機能があります。保持時間 9.99 分のピークの表示例を図 5 に示します。上側の枠内には、ピークのリストとそのスコアおよび推定結果が示されています。下側の枠内には、9.99 分に検出されたすべてのピークのデコンボリューション後のマススペクトルが示されています。このリストでは、質量 1101.0 Da のピークは標的ペプチドからセリン（S）が欠損したものである可能性が示されています。保持時間、ピーク面積比（%）とその %RSD、質量、不純物と標的ペプチドの質量差、検出された不純物の推定結果など、ProMass で得られたデータ解析結果を表 1 に示します。3 回の繰り返し測定で対象としたすべての不純物について同定結果の再現性は良好だったため、LC-MS ベースのワークフローによる合成ペプチドの不純物プロファイリングの信頼性が高いと言えます。

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6ACQUITY QDa 検出器による LC-UV/MS ベースの合成ペプチド同定および不純物プロファイリング

デコンボリューション後のマススペクトル

ハイパーリンクに関連付けられているデータ:

デコンボリューションピークレポート

図 5. デコンボリューション後のマススペクトルやピークに関するレポートなど、ハイパーリンクに関連付けられている不純物プロファイリング結果の詳細は、図 4 の各サマリーのハイパーリンクをクリックすると表示されます。

保持時間 （分）

MS ピーク面積比 （%） % RSD

質量 （Da）

質量差 （Da）

スコア 同定結果

3.02 0.68 3.53 1204.9 16.7 4.86 酸化

7.02 0.12 5.09 874.8 -313.4 5.01 不純物 A7.70 0.18 9.35 1091.2 -97 4.09 P または L の欠損8.40 0.19 12.01 1003.6 -184.6 3.77 pE-KDAFIGLM-NH2

8.62 2.38 2.73637.4 -550.8 3.04 未同定

1188.9 0.7 5.11 pE-PSKDAFIGLM-OH1245.0 56.8 5.34 G の付加

8.95 0.73 1.57 1131.1 -57.1 4.95 G の欠損9.12 0.77 2.95 1116.9 -71.3 5.12 A の欠損9.28 92.80 0.08 1188.2 0 6.66 pE-PSKDAFIGLM-NH2

9.76 0.32 8.17 1259.5 71.3 4.59 A の付加9.99 0.80 4.56 1099.5 -88.7 4.62 S の欠損10.26 0.14 13.32 1188.4 0.3 4.34 pE-PSKDAFIGLM-NH2

10.82 0.89 2.90 1189.1 0.9 4.82 pE-PSKDAFIGLM-OH

表 1. 不純物のサマリー。ピーク面積比（%）、3 回の繰り返し測定に基づくピーク面積比の %RSD、質量、不純物と標的ペプチドの質量差、スコア、推定結果を提示。

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©2017 Waters Corporation.Produced in Japan.2017 年 12 月 720005921JA　PDF

結論合成ペプチドの質量確認および不純物プロファイリングの自動ワークフローを、

ACQUITY QDa 検出器、MassLynx、ProMass の併用により開発しました。Eledoisinの質量負荷 2 µg で、光学検出の閾値 0.2% を上回る不純物の検出と同定に成功しました。標的ペプチドと不純物の両方の保持時間、質量、推定結果は、ProMass のデコンボリューションに関するサマリーに示されています。デコンボリューションの信頼性は各ピークのスコアとして示されています。光学検出ワークフローに ACQUITY QDa 検出器を追加することで、不純物解析の時間が大幅に短縮されます。また、MassLynx と ProMass を併用することで自動ワークフローによるハイスループットスクリーニングが実現し、開発や品質管理における合成ペプチドの不純物プロファイリングの生産性が向上します。

参考文献

1. Vlieghe, M., Lisowski, V., Martinez, J., Khrestchartisky, M. Synthetic therapeutic peptides: science and market.Drug Discovery Today.2010, 15:40–56.

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3. Zeng, K., Geerlof-Vidavisky, I., Gucinski, A., Jiang, X., Boyne, M. T. Liquid chromatography-high resolution mass spectrometry for peptide drug quality control.The AAPS Journal.2015, 17:643–651.

4. Guidance for industry Q3B (R2) impurities in new drug products.2006, Revision 2.

5. Birdsall, R., E., McCarthy, S., M. Increasing specificity and sensitivity in routine peptide analyses using mass detection with the ACQUITY QDa Detector.Waters Application Note.2015 (P/N 720005377EN).

6. Birdsall, R., E., Yu, Y., Q. High-throughput screening of oligonucleotides for identity and purity assessment using the ACQUITY QDa Detector and ProMass for MassLynx.Waters Application Note.2016 (P/N 720005681EN).