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Adaptación y optimización de sistema de propagación de Agave atrovirens
Introducción
Las plantaciones de agave en México han sido de gran importancia y tradición, cuya
permanencia permitió el asentamiento de diversas civilizaciones, debido al uso y a los
diversos subproductos que de esta planta pueden extraerse como: agua miel, pulque, miel,
vinagre, alcohol, etc. Se caracteriza por tener tallo corto, hojas gruesas y suculentas, florea una
vez en su vida y muere. Es planta constituye la materia prima principal para la extracción de una
bebida llamada pulque, que recientemente, ha cobrado cierto auge debido a la industrialización de
esta bebida. La tasa de multiplicación que presenta ésta planta es lenta, ya que genera entre 8 y
10 hijuelos en su vida. Así mismo, el mecanismo de propagación mediante semillas producidas por
el agave comprende un período de entre 12 y 15 años por lo que no pueden realizarse trabajos de
mejoramiento de manera factible y rápida. En contraste con lo anterior, se han reportado trabajos
de propagación de este tipo de plantas utilizando las técnicas de cultivo de tejidos vegetales en sus
diversas modalidades, p/e: Agave sisalana, A. fourcroydes, A. potatorum. Por lo que este trabajo,
se enfocó a cimentar las bases para la micropropagación de Agave atrovirens, evaluando el
comportamiento de la base de hoja del agave pulquero como explante con el objeto de obtener un
determinado tipo de respuesta: callogénesis y organogénesis, exponiendo dicho tejido a dos
reguladores de crecimiento vegetal que fueron auxinas y citocininas en medio MS. Bajo la
influencia de dichas hormonas (2,4-D y 6-BAP), a concentraciones iguales de 1.5 mg/l, se obtuvo
callogénesis en los explantes utilizados en un 87.5% y mediante un cambio en la concentración
hormonal se logró obtener organogénesis utilizando 2 mg/l de 6-BAP, al igual que con CIN a
concentraciones de 1 mg/l, en medio MS.
Historia del cultivo de tejidos vegetales.
El cultivo de tejidos vegetales engloba a un conjunto de técnicas, que básicamente
consisten en aislar un fragmento de tejido el cual se denomina explante, y que al proporcionarle de
manera artificial las condiciones físicas y químicas apropiadas puede inducirse una respuesta en el
tejido ya sea de callogénesis u organogénesis y posteriormente puede diferenciarse a plántulas,
por lo que es indispensable mantener la asepsia de los cultivos para evitar la contaminación
microbiana (Roca. et al. 1991; Vázquez et al. 1997).
La teoría propuesta por Schleiden y Schwann en 1838 establece que las células son
autosuficientes y que en principio son capaces de regenerar una planta completa, lo anterior
constituye el núcleo central de cual nace el cultivo de tejidos. Los primeros intentos fueron
realizados por Haberland en 1902; más tarde otros ensayos realizados por Harrison, Burrows y
Carrel entre 1907 y 1909 no tuvieron éxito. No fue sino hasta 1939 con Nobécourt, Gautheret y
White consiguieron el primer cultivo de tejido autentico (Pierik., 1990).
Esta técnica presenta las siguientes características: (Pierik. 1990):
� Se efectúa a micro-escala
� Las condiciones ambientales se optimizan en lo que se refiere a factores físicos,
nutricionales y hormonales.
� Los microorganismos son excluidos (hongos, bacterias, virus, así como las plagas
de las plantas superiores como insectos y nemátodos.
� El patrón normal de desarrollo de una planta no se reproduce, ya que un tejido
aislado puede dar origen a un callo, o puede desarrollarse de otra manera como
embriones somáticos, organogénesis, entre otros.
� Se pueden manipular células individuales.
Tipos de explantes utilizados en la micropropagació n.
Una planta se compone de diferentes órganos, cada uno de los cuales consta de diferentes
tejidos que a su vez están constituidos de células. La gran mayoría del cuerpo de la planta deriva
de meristemo que son activas durante el crecimiento y desarrollo de ésta (Jacobs, 1997; Kerstetter,
1997).
Existen diferentes modalidades en el cultivo “in vitro”, dentro de los cuales se encuentran:
Cultivo de plantas intactas, cultivo de embriones, cultivo in vitro de órganos aislados, cultivo de
células aisladas, cultivo de protoplastos.
Factores que afectan el cultivo de tejidos: físico s y fisicoquímicos.
La elección de un explante constituye el primer paso para el establecimiento del cultivo. Es
muy frecuente que, en condiciones idénticas de medio y ambiente, las respuestas in vitro del
cultivo de un determinado explante de una especie difieran con el cultivar empleado. La asociación
explante-medio y las condiciones físicas en que normalmente se incuban los cultivos conforman un
ambiente propicio para la proliferación de microorganismos los cuales pueden destruir tales
cultivos, competir con el explante por el medio del cultivo o modificarlo. Por otra parte, la luz, la
temperatura, la humedad y el pH son factores físicos indispensables para el buen crecimiento y
desarrollo del explante; el fotoperiódo generalmente es de de 16/8 hr de luz y oscuridad . Por otra
parte, la temperatura se mantiene en un intervalo 25 a 27 °C; se sabe que la humedad de la
cámara de crecimiento influye sobre el crecimiento y desarrollo in vitro, ya que una humedad
elevada dentro de la cámara conlleva a un incremento en la contaminación (Pierik., 1990). Así,
mismo, la influencia del pH en el medio de cultivo in vitro influye en el crecimiento y desarrollo del
explante; generalmente se reportan rangos entre 5 y 6.5, por otra parte el pH después del proceso
de esterilización puede disminuir y ocasionar las siguientes complicaciones:
� Las hormonas se hacen menos estables.
� El agente gelificante puede perder su rigidez.
� Algunas sales pueden precipitarse.
� Las vitaminas pueden hacerse menos estables.
� Puede retardarse la absorción de los iones amonio.
Dentro de los factores fisicoquímicos se encuentran los medios de cultivo compuestos de
macronutrientes y micronutrientes que presentan un papel preponderante para obtener una
adecuada respuesta en el explante (Gamborg et al., 1976; Seabrook. 1980; Villalobos et al., 1984;
Leifert et al., 1985)
Etapas de la micropropagación.
Murashige (1974; 1977a, b) destaca la importancia de resaltar las diferentes etapas
asociadas con la multiplicación de plantas mediante las técnicas de cultivo de tejidos de la
siguiente manera:
Etapa 0. Consiste en seleccionar la planta madre y el procedimiento de esterilización.
Etapa I. Establecimiento del cultivo inicial.
Etapa II. Multiplicación de brotes.
Etapa III. Corresponde al enraizamiento.
Etapa IV. Transferencia final a la etapa de medio ambiente.
RESULTADOS TERCER SEMESTRE
I. Interacción de dos fitorreguladores (auxina y ci tocinina) sobre bases de hoja de agave pulquero para generar callo. Estudio preliminar.
ESQUEMA DE TRABAJO
Metodología
Material biológico.
Para desarrollar el presente trabajo experimental se utilizó como material vegetal, plantas
de agave con edad de dos años aproximadamente, con una altura de 30 cm. provenientes de la
comunidad de Nanacamilpa (Tlaxcala); dichas plantas fueron colocadas en invernadero antes de
su utilización en los experimentos.
Variedad de Agave (Agave atrovirens) a micropropagar
Pruebas de desinfección de explantes con diferentes
concentraciones de hipoclorito de calcio y de
sodio.
Siembra del explante en medio MS en condiciones
de esterilidad
Callos viables y resiembra
en medio MS
Diferentes ensayos Auxina/Citocinina
para la obtención de callogénesis.
Con el fin de evaluar el potencial de regeneración del agave se estudió el comportamiento
de la base de hoja como explante adecuado para inducir respuestas de callogénesis y
posteriormente de organogénesis.
Medio de cultivo utilizado
El medio de cultivo utilizado fue el medio MS (Murashige y Skoog, 1962), utilizado tanto en
la inducción de callos como de órganos, debido a que ha sido utilizado ampliamente en la
micropropagación de otras especies de agave y partiendo de diferentes tipos de explantes (Power
y col. 1989; Robert y col., 1987; Binh y col., 1990; Nikam y col., 1997; Das. 1992; Santa-Cruz y col.
1999; Martínez y col., 2003).
Inducción de la callogénesis.
Los explantes fueron incubados a una temperatura de 27 ± 2 °C en condiciones de
oscuridad. Las muestras fueron revisadas diariamente para detectar presencia de contaminación.
La respuesta de callogénesis fue evaluada como “% de respuesta”, es decir, número de explantes
que generan callos dividido entre el número total de muestras multiplicadas por 100.
Las concentraciones propuestas para ensayar las inducciones de callogénesis en presencia
de dos reguladores de crecimientos se ilustran en la tabla siguiente:
Tabla 1. Concentraciones hormonales utilizadas para realizar la inducción de callos en Agave
atrovirens
TRATAMIENTOS REALIZADOS
AUXINA
(2,4-D MG/L) CITOCININA
(6-BAP MG/L) T1 0.0 0.0 T2 0.0 0.5 T3 0.0 1.0 T4 0.0 1.5 T5 0.5 0.0 T6 0.5 0.5 T7 0.5 1.0 T8 0.5 1.5 T9 1.0 0.0
T10 1.0 0.5 T11 1.0 1.0 T12 1.0 1.5 T13 1.5 0.0 T14 1.5 0.5 T15 1.5 1.0 T16 1.5 1.5
RESULTADOS 1. MATERIAL BIOLÓGICO.
Se utilizó como material biológico plantas de agave pulquero con edad de dos años
aproximadamente, con una altura de 30 cm. de la comunidad de Nanacamilpa (Tlaxcala). Fig. 1a.
Figura 1. a) Material vegetativo proveniente de inv ernadero para trabajar mediante la técnica
de cultivo de tejidos vegetales. b). Material veget ativo colocado en matraces para su esterilización.
2. OBTENCIÓN DEL EXPLANTE.
La obtención del explantes de base de hoja después del procedimiento de esterilización se
logró de manera eficiente bajo condiciones de esterilidad y sin problemas de oxidación debido a la
utilización de citrato de sodio al 0.5% previamente esterilizado. Dicho material biológico fue con el
que se disponía en mayor cantidad y fue el indicado para trabajar en todo los tratamientos
posteriores (fig. 1b).
3. MEDIO DE CULTIVO UTILIZADO.
De la revisión bibliográfica realizada, que data desde 1987 hasta el 2005 se observó que el
medio basal utilizado frecuentemente en la micropropagación de este tipo de plantas es el medio
MS, por lo que se optó por la utilización del mismo.
4. INDUCCCIÓN DE LA CALLOGÉNESIS.
De acuerdo a las concentraciones de la tabla 1, de los 16 tratamientos se obtiene lo
siguiente:
a b
A concentraciones de (mg/l) 2,4-D y 6-BAP, en el tratamiento control (0.0/0.0) no se
encontró ningún tipo de respuesta. El tejido se conservó sin dar indicios de oxidación al menos en
los primeros 7 días de siembra (fig. 3a). Sin embargo a concentraciones de 0.5/0.0; 1.0/0.0;
1.5/0.0 el tejido se necrosó y no hubo respuesta de callogénesis en ninguno de los casos.
Por otra parte, a concentraciones de auxina/citocinina 0.0/0.0, 0.0/0.5, 0.0/1.0, 0.0/1.5 mg/lt
tampoco se encontró respuesta. Los ensayos realizados con auxina/citocinina a 0.5/0.5 mg/l puede
formarse un callo blanquecino pero sin que pudiera multiplicarse en un segundo subcultivo (fig 3b).
En concentraciones de 0.5/1; 0.5/1.5 no se encontró respuesta. Por otra parte, tampoco
hubo una respuesta favorable a concentraciones ensayadas a 1/0.5, 1.5/0.5 y 1.5/1.0 mg/lt de
auxina/citocinina. En los tratamientos en donde se encontró una respuesta favorable, se observó
dos semanas después de la implantación desdiferenciación en los bordes del explante (fig 3c). En
este experimento las concentraciones en donde encontramos respuesta fue a 1/1.5
auxina/citocinina con una formación de callos en un 75% del tratamiento (fig. 3d), al igual que en
concentraciones de 1/1 donde el porcentaje fue de 80% (fig. 3e), pero se llegó a obtener hasta en
un 87.5% de callogénesis en concentraciones iguales de 2,4-D y 6-BAP siendo la relación de 1.5
mg/lt de ambas (fig. 3f).
En la callogénesis obtenida de tratamientos exitosos se observó la proliferación de una
masa celular de tejido desdiferenciado en el medio MS, colocado en la oscuridad a temperatura de
27ºC, después de 6 semanas. Cabe destacar que los callos en que se observó organogénesis
fueron de aspecto blanco opaco, semicristalino, compacto, con capacidad de proliferación en cada
subcultivo.
Figura 2. a) Tratamiento control con explantes de base de hoja de agaves sembrados en
medio MS después de dos semanas de incubación a 27º C en oscuridad y sin presencia de oxidación.
b) Inducción de callogénesis a 0.5 mg/l de auxinas y citocininas 30 días después de incubación pero
sin multiplicación en un segundo subcultivo. c) Exp lantes con dos semanas en medio MS, con
desdiferenciación apreciable en los bordes del expl ante. d) Callogénesis obtenida en medio MS un
75% a concentraciones de 1/1.5 mg/l de 2,4-D y 6-BA P. e) Callogénesis obtenida en un 80% en medio
MS a concentraciones iguales de 1mg/l de auxina y c itocinina. f) Callogénesis obtenida en 87.5% en
medio MS utilizando concentraciones de 1.5/1.5 mg/l de auxina y citocinina.
a b c
d e f
II. Estudio para evitar la oxidación en callo evalu ando diversos antioxidantes y corroboración de callogenesis.
Metodología
Evaluación de antioxidantes
Debido a que en este estudio preliminar se observó una oxidación muy marcada en los
callos, se probaron 4 antioxidantes; estos fueron el citrato de sodio en una concentración de 0.5,
2.5, 4.5 y 6.5 g/l (Farooq, et. al, 2002); el ácido ascórbico a 2, y 4g/l; el PVP a 1, 3 y 6 g/l (Qu. y
Chaudhury, 2001) (Farooq, et. al, 2002) (Bhatt, I. D., and Dhar, U., 2004) y una mezcla de
antioxidantes de la marca SIGMA. Los explantes fueron pretratados con estos antioxidantes
después de hacer el corte del tejido durante 5 minutos. Para esta prueba se usaron diversas
concentraciones de 2,4-D y de 6-BAP.
Resultados
Para evitar el encafecimiento y posterior muerte del explante-callo, se evaluaron algunos
compuestos con actividad antioxidante:
• Ácido ascórbico
En la tabla 5, se aprecia que la mejor respuesta se encuentra en el tratamiento con 4g/l; en
este ensayo se obtuvo el menor porcentaje de oxidación.
Tabla 5. Efecto antioxidante del Ácido ascórbico me dido en porcentaje de respuesta sobre
explantes de agave pulquero en los diferentes trata mientos hormonales.
2,4-D mg/l
6-BAP mg/l
TRATAMIENTO N % OXIDACIÓN % CALLO
1 1 2g/l 6 62.5 62.5 1 1.5 2g/l 8 75 46.875 1 1 4g/l 10 47.5 77.5 1 1.5 4g/l 10 52.5 62.5
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
2AA/1 2AA/1.5 4AA/1 4AA/1.5
CONC. DE ANTIOXIDANTE
PR
OM
ED
IO
% OXIDACIÓN% CALLO
.
Figura 3. Porcentaje de respuesta del ácido ascórb ico usado como antioxidante.
Citrato de sodio
Los resultados obtenidos con este antioxidante muestran claramente que los niveles mas bajos de oxidación se dan en presencia de 0.5g/l de citrato; además en esta misma se da la mejor respuesta hacia la producción de callo.
Tabla 6. Efecto del citrato de sodio en la eliminac ión de la oxidación en tejidos de agave.
2,4-D mg/l
6-BAP mg/l
TRATAMIENTO N %OXIDACIÓN % CALLO
1 1 0.5g/l 10 32.5 90 1 1.5 0.5g/l 10 55 70 1 1 2.5g/l 8 53.125 68.75 1 1.5 2.5g/l 10 72.5 35 1 1 4.5g/l 8 96.875 37.5 1 1.5 4.5g/l 9 94.4444 30.5555 1 1 6.5g/l 10 62.5 62.5 1 1.5 6.5g/l 9 50 61.1111
Figura 4. Influencia del citrato de sodio sobre la eliminación de la oxidación en los explantes
de Agave.
Polivinil pirrolidona (PVP) De acuerdo a los resultados obtenidos, podemos deducir que el mejor tratamiento se obtuvo con 3g/l de PVP con 1/1mg/l de auxina y citocinina, respectivamente; esto debido a que presenta el menor índice de contaminación en comparación a los otros ensayos.
Tabla 7. Uso del PVP como antioxidante sobre explan tes de Agave.
2,4-D mg/l
6-BAP mg/l
TRATAMIENTO N % OXIDACIÓN % CALLO
1 1 1g/l 6 83.3333 33.3333 1 1.5 1g/l 9 63.8888 41.6666 1 1 3g/l 9 52.7777 63.8888 1 1.5 3g/l 8 62.5 46.875 1 1 6g/l 5 75 50 1 1.5 6g/l 10 65 42.5
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
.5CN/1 .5CN/1.5 2.5CN/1 2.5CN 4.5CN/1 4.5CN/1.5 6.5CN/1 6.5CN/1.5
CONC. DE ANTIOXIDANTE
PO
RC
EN
TA
JE
% OXIDACIÓN % CALLO
Figura 5. Respuesta del PVP ante la oxidación de te jidos de Agave.
Mezcla de antioxidantes Aquí se utilizó unicamente una concentración y podemos observar que la mejor estuvo en el medio MS con 1/1mg /l de auxina y citocinina.
Tabla 8. Efecto de la mezcla de antioxidantes en ex plantes de Agave.
2,4-D mg/l
6-BAP mg/l
TRATAMIENTO N % OXIDACIÓN % CALLO
1 1 1x 9 64.4444 47.2222 1 1.5 1x 6 75 33.3333
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
1PVP/1 1PVP/1.5 3PVP/1 3PVP/1.5 6PVP/1 6PVP/1.5
CONC. ANTIOXIDANTE
PO
RC
EN
TA
JE
% OXIDACIÓN
% CALLO
Figura 6. Efecto de la mezcla de antioxidantes en e l soporte de la oxidación en tejidos de
Agave.
Como conclusión a los ensayos anteriores, podemos decir que las mejores
respuestas a las 4 diferentes soluciones usadas como antioxidantes, se muestran en la
tabla 9. Aquí podemos observar que el mejor antioxidante es el citrato de sodio a 0.5g/l,
debido a que en este se da el menor porcentaje de oxidación y la mayor producción de
callo.
Tabla 9. Evaluación de las 4 soluciones antioxidan tes sobre tejidos de Agave.
2,4-D/6-BAP C. DE
SODIO A. ASCORBICO
PVP M. ANTIOXIDANTES
1mg/l-1mg/l 0.5g/l 4g/l 3g/l 1x % CALLO 90 77.5 63.88 47.22 %OXIDACIÓN 32.5 47.5 52.77 69.44
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
1X/1 1X/1.5 CONC. ANTIOXIDANTE
PO
RC
EN
TA
JE
% OXIDACIÓN % CALLO
Figura 7. Grafica de el tratamiento más eficiente d e cada uno de los compuestos antioxidantes
probados en tejidos de Agave.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
PO
RC
EN
TA
JE
0.5CN/1 4AA/1 3PVP/1 1X/1
CONC. ANTIOXIDANTES
% CALLO % OXIDACIÓN
Síntesis fotográfica del estudio con Antioxidantes
A) Explantes cultivados en medio MS sin fitorregu ladores, con tratamientos diferentes de antioxidantes. En las figuras anteriores podemos o bservar que cuando los explantes se cultivan en medio MS sin fitohormonas, no hay división del teji do y además no se genera oxidación en los explantes. Con 2g/l de ácido ascórbico Con 4g/l de ácido ascórbico Con 0.5g/l de citrato de sodio Con 4. 2.5g/l de citrato de sodio. Con 4.5g/l de citrato de sodio Con 6.5g/l de citrato de sodio. Con 1g/l de PVP. Con 3g/l de PVP Con 6g/l de PVP
Con mezcla antioxidante 1X B) Callos obtenidos a partir de explantes en medio MS con 1mg/l y 1mg/l de auxina y citocinina tratados con 4 antioxidantes. Con 0.5g/l de citrato de sodio Con 2.5g/l de citrato de sodio Con 4.5g/l de citrato de sodio.
Con 4g/l de ácido ascórbico Con 3g/l de PVP Con 1g/l de PVP.
En el tratamiento con 4.5g/l de citrato de sodio (fig. 14) se observa una fuerte oxidación en comparación al tratamiento con el mismo citrato pero a 0.5g/l.
C) Callos obtenidos a partir de explantes en medio MS con 1mg/l y 1.5mg/l de auxina y citocinina. Con 2g/l de ácido ascórbico Con 6g/l de PVP Con 3g/l de PVP
Con 1g/l de PVP Callo tratado con 4.5 g/l de Citrato de sodio (relación aux/cit 1/1.5g/l)
mantenidos en medio MS después de una semana de su transplante.
Fig. 24
Callos mantenidos después de una semana de su transplante tratados con 4.5 g/l de Citrato de sodio (relación aux/cit 1/1g/l).
Callos mantenidos después de una semana de su transplante tratados con 6.5 g/l de Citrato de sodio (relación aux/cit 1/1g/l)
III. Evaluación de diversas concentraciones de nitr ógeno en el medio para optimizar el desarrollo de callo de agave pulquero
Se estudió el efecto del contenido de nitrógeno sobre la producción de callo en el medio
MS. Existen varios reportes en el que se disminuyen los niveles de oxidación cundo se disminuyen las concentraciones de nitrógeno.
Las concentraciones evaluadas para KNO3 fueron de 0.5g/l (Robert et al., 1987), 1g/l y 1.9g/l (Murashige y Skoog., 1962). Para el NH4NO3 se probaron 0.7g/l, 1.4g/l (Robert et al., 1987), 1.6g/l (Murashige y Skoog., 1962) (Murashige y Skoog., 1962) y 2.1g/l. El balance NO3:NH4 es un factor clave para controlar el crecimiento de los callos y la organogénesis; cambiando el balance en el medio de cultivo se modifica enormemente la respuesta hacia callo.
Se desarrolló un método para la producción de callo en tejidos de Agave pulquero a través de la variación del contenido de nitrógeno en forma de NH4NO3 y KNO3. y probando 2 fuentes de auxinas y citocininas. El medio de cultivo control fue el MS (Murashige y Skoog., 1962) modificando el contenido normal de nitrógeno que es de 1.9g/l de KNO3 y 1.6g/l NH4NO3 mas 1mg/l de 2,4-D y 1mg/l de 6-BAP como fuente de auxina y citocinina, respectivamente. Resultados Los resultados se midieron en porcentaje de respuesta, es decir, de 20 explantes que pusieron en cada tratamiento se mide cuantos de ellos forman callo y se reporta en porcentaje.
El mejor medio MS para la producción de callo se obtuvo en la combinación de 1.6g/l de NH4NO3 y 1.9g/l de KNO3 que es el medio de cultivo control, con un porcentaje de respuesta del 65%. El medio con 0.7g/l de NH4NO3 y 1.9g/l de KNO3 muestra también una buena capacidad hacia la promoción de callo pero en 40%. Los medios restantes no tienen una buena respuesta como se muestra en la tabla 10.
Tabla 10. Evaluación del contenido de nitrógeno en forma de NH 4NO3 y KNO 3 en el medio MS
Fuentes de N NH4NO3 g/l KNO 3 g/l n
(explantes) Porcentaje de
respuesta 0.7 1.9 20 40 1.4 0.5 20 10 1.4 1 20 25 1.4 1.9 20 25 1.6 0.5 20 5 1.6 1 20 15 1.6 1.9 20 65 2.1 0.5 20 30 2.1 1 20 20 2.1 1.9 20 20
Estos resultados muestran que el bajar la concentración de nitrógeno para que se genere callo sin oxidación no dieron los resultados esperados. La concentración usada en el medio normal MS es la que da mejores resultados ya que las concentraciones menores que se evaluaron dan una eficiencia baja por que los callos se generan muy lentamente o no hay respuesta del explante.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0.7/1.9 1.4/0.5 1.4/1 1.4/1.9 1.6/0.5 1.6/1 1.6/1.9 2.1/0.5 2.1/1 2.1/1.9
Relación NH4:NO3
Por
cent
aje
de re
spue
sta
Figura 8. Efecto del contenido de nitrógeno en med io MS sobre la producción de callo en
tejidos de agave pulquero.
IV. Evaluación de otras fitoreguladores para el des arrollar callo de agave pulquero Los fitorreguladores que generalmente se usan en cultivo de tejidos son la auxina 2,4-D y
la citocinina 6-BAP. Estos fitorreguladores son que se han evaluado a lo largo de este proyecto para la generación de callo.
Varios trabajos sobre propagación de agave citan el uso de otros fitorreguladores capaces
de generar callo como el ANA (Acido naftalen acético) y la cinetina. Para la inducción de callo, el medio MS fue suplementado con 2 diferentes clases de
auxinas y citocininas para la promoción de callo en tejidos de hoja de agave pulquero. Las auxinas evaluadas fueron el 2,4-D a 0.25mg/l (Robert et al., 1987), y 1mg/l (Nikam et al., 2003); para el ANA 0.5mg/l, 1mg/l (Nikam et al., 2003) y 1.5mg/l. las citocininas probadas fueron la Cinetina 1mg/l y 2mg/ (Nikam et al., 2003) y el 6-BAP 0.25mg/l y 1mg/l (Nikam et al., 2003) (Robert et al., 1987). Resultados
Para la producción de callo, el medio que se utilizó como control fue el medio que mejor resultados había dado para generar callo y fue el MS adicionado con 1mg/l de 2,4-D como fuente de auxina y 1mg/l de 6-BAP. Los resultados después de la primera semana con esta concentración mostraron una respuesta rápida del explante hacia la formación de callo.
En comparación con los otros fitorreguladores evaluados la respuesta se comenzó a dar
hasta la segunda semana. La adición de las siguientes combinaciones de fitorreguladores 2,4-D (0.25mg/l) y 6-BAP (1mg/l); ANA (0.5mg/l) y 6-BAP (1mg/l) causaron una baja proliferación de tejido calloso como se muestra en la tabla 11.
Tabla 11. Porcentaje de respuesta hacia la promoció n de callo usando diversos
fitorreguladores en tejidos de Agave pulquero.
2,4-D mg/l ANA mg/l CINETINA mg/l 6-BAP mg/l N Porcentaje de
respuesta 0.25 1 20 5
1 0.25 20 25 0.5 1 20 15 1 1 20 20 1.5 1 20 20 0.5 1 20 30 0.5 2 20 25 1 1 20 65
De acuerdo a los resultados obtenidos en los anteriores ensayos, se puede decir que el mejor medio para la producción de callo es el medio MS control. Estas observaciones ilustran que los reguladores del crecimiento no operan aisladamente y que sus efectos pueden ser modificados por otros factores como son la cantidad de nitrógeno adicionado al medio de cultivo.
Los subcultivos de los callos obtenidos en el medio MS control sobre medio de cultivo nuevo fueron exitosos.
