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UNIDAD DIDACTICA 2. ANALISIS DE PELIGROS Y PUNTOS DE CONTROL CRITICO.
LECCION 4. TECNICAS DE MUESTREO EN EL ANALISIS
MICROBIOLOGICO DE ALIMENTOS
1 .INTRODUCCION
Además de los muestreos realizados por los fabricantes en base a características físicas y/o químicas de los productos, cada vez más se están utilizando criterios microbiológicos en los planes de muestreo, ya que aseguran la salubridad y calidad de los alimentos y, por tanto, en la aceptación por el consumidor. El binomio microorganismos – salubridad y calidad se refiere a la presencia o ausencia de microorganismos patógenos o sus toxinas y la facilidad para su control o destrucción. La aplicación de criterios microbiológicos debería distinguir entre un producto aceptable o inaceptable o entre prácticas de fabricación y manipulación aceptables o inaceptables Un criterio microbiológico para un alimento consiste en:
• Establecer el alimento al que se aplicará el criterio • Establecer los contaminantes (microorganismo o sus toxinas) • El método analítico que va a utilizarse para su detección y/o recuento • La muestra procedente de lote fabricado • Los límites microbiológicos apropiados para el producto.
Los términos para describir los criterios microbiológicos son:
• Norma microbiológica: criterio definido por Ley y por tanto obligatorio. • Especificación microbiológica: criterio obligatorio aplicado a un alimento o ingrediente
para que sea aceptado por el fabricante • Recomendación microbiológica: utilizado por el fabricante para controlar el proceso. No
son obligatorias. Para el cumplimiento de los objetivos de los criterios microbiológicos debe tenerse en cuenta:
• Evidencia de riesgo • La microbiología de la materia prima • El efecto del tratamiento • La probabilidad y consecuencias de la contaminación microbiana y/o el crecimiento de los
microorganismos durante posteriores manipulaciones y almacenamiento • El tipo de riesgo para el consumidor • La relación coste / beneficio asociada con la aplicación del criterio.
Para ello, es necesario:
• Conocer los agentes etiológicos específicos • Los métodos analíticos • Disponer de procedimientos de muestreo para establecer límites de tolerancia.
Los agentes etiológicos como Salmonellas, Staphilococu aureus y C. perfringes causan entre el 70 – 80% de las enfermedades alimentarias de los países occidentales mientras que en Japón el 40 – 50% de los brotes fueron debidos a Vibrio parahaemolyticus por el consumo de pescado crudo Metodología: se basan en métodos de detección y recuento publicados por IDF, ISO, AOAC, APHA y ICMSF, los tres primeros intentar armonizar sus métodos. Programas de muestreo: son procedimientos para la recogida de muestras, el análisis adecuado de unidades de muestra y la toma de decisiones en función de un criterio establecido, tal como la presencia o ausencia de un determinado contaminante o número de bacterias totales que no debe exceder en una muestra.
2. DEFINICION DE CONCEPTOS
Probabilidad
La probabilidad de obtener un resultado positivo es el número de veces que el resultado es positivo dividido entre el número de veces que se analiza el alimento. Varía entre 0 y 1
Población y muestra
En relación con el resultado de un análisis, se considera población a todos los resultados de las pruebas realizadas sobre todas las unidades del lote del alimento y muestra a los resultados obtenidos exclusivamente con las unidades de muestra analizadas. No confundir entre la muestra estadística y la muestra del analista.
Elección de las unidades de muestra
Las características de las muestras son: Aleatorias: todas las unidades que forman parte del lote tengan la misma probabilidad de formar parte de la muestra. Homogeneidad: que pertenezcan a un mismo grupo, turno, máquina etc.
Programa de muestreo
Tras el análisis de las unidades de muestra, los resultados obtenidos deben confrontarse con determinados criterios para decidir si el lote debe aceptarse o rechazarse. La elección del procedimiento de muestreo y del criterio de decisión se denomina programa de muestreo. Tomadas 10 unidades de muestra de un lote y tras el análisis microbiológico se decide que si existe el microorganismo en 2 o menos unidades (resultando el análisis positivo) el lote se acepta; si se encuentra el microorganismo en 3 o más unidades muestrales el lote se rechaza. Este programa de muestreo viene definido por n=10 (tamaño muestral) y c=2 (número máximo de unidades defectuosas).
La curva característica
Una vez definido el programa de muestreo, el fabricante estará interesado en conocer que proporción de los lotes que produce serán aceptados o rechazados. Para ello, se establece la curva característica en la cual el eje de abcisa constituye el porcentaje de defectuoso con el que fabrica la empresa y en el eje de ordenadas la probabilidad de aceptación del lote.
CURVA CARACTERISTICA DE OPERACION PARA n=10 Y c =2
00.10.20.30.40.50.60.70.80.9
1
Porcentaje de defectuoso
Prob
abili
dad
de a
cept
ació
n
1 0.93 0.68 0.38 0.17 0.05 0.01
0 10 20 30 40 50 60
La probabilidad de aceptación de un lote con el programa de muestreo n=10 y c=2 y un porcentaje de defectuoso del 20% es del 68%, es decir, en 68 ocasiones de cada 100 el lote se aceptará y el 32 ocasiones el lote se rechazará
Probabilidad de los riesgos del productos y del consumidor
La decisión de aceptar o rechazar lotes se toma en base a los resultados derivados del análisis de un determinado número de muestras. Así en ciertas ocasiones se rechazarán lotes que deberían ser aceptados denominándose riesgo del productor y en otras ocasiones se aceptará un lote cuya carga microbiana excede a lo especificado en el programa de muestreo denominándose riesgo del consumidor.
3. PROGRAMAS DE MUESTREO EN ANALISIS MICROBIOLOGICOS
3.1. Programas de dos clases
El atributo a considerar es la presencia o ausencia de un microorganismo y en el caso de presencia del mismo la tasa microbiana por encima o debajo de una concentración. Un programa de atributos de 2 clases viene definido por:
• n = número de unidades de muestras a analizar • c = número máximo permisible de unidades defectuosas para aceptar el lote • m: recuento superior a una concentración dada que determina una unidad defectuosa.
La severidad del programa de muestreo depende del n si c está definido, siendo más severo si se analizan 100 unidades de muestra con c = 2 que si n = 10.
3.2. Programa de atributos de 3 clases
En este caso, la calidad del producto puede dividirse en tres atributos dependiendo de la concentración de microorganismos en las unidades de muestra. Se define este programa por:
• n = número de unidades de muestras a analizar • c = número máximo permisible de unidades defectuosas para aceptar el lote • m: valor de recuento de microorganismos que separa la calidad buena de una calidad
provisionalmente aceptable
• M = valor de recuentos de microorganismos por el cual se rechaza el lote.
Para describir la calidad de un lote sus recuentos estarán comprendidos entre:
0 y m m y M mayor que M aunque sólo hay que definir 2 de ellas ya que la suma de las tres es igual a la unidad.
Estas dos clases podrían definirse como el porcentaje de rechazables, es decir valor superior a M (Pd) y el porcentaje de provisionalmente aceptables es decir entre m y M (Pm). Por lo tanto, el porcentaje de aceptables, igual o menor a m, es 100% menos la suma de los otros dos porcentajes. Las probabilidades asociadas a diversos programas de tres clases para varias calidades del lote . La aceptación o rechazo de un lote depende no sólo de la proporción del material rechazable (Pd) sini también de la proporción del provisionalmente aceptable (Pm), o lo que es lo mismo de la distribución de frecuencias de los microorganismos en el lote. Ejemplo: si se analiza un lote con un: 20 % de provisionalmente aceptables 10 % de rechazables n = 10 c = 2
la probabilidad de aceptación del lote será de un 21%
otro lote con: 40 % de provisionalmente aceptables
0 % de rechazables n = 10 c = 2
la probabilidad de aceptación del lote será de un 17%
3.3. Elección de un programa de muestreo
La severidad de un programa de muestreo depende de:
• El riesgo para el consumidor • Presencia de microorganismos patógenos, toxinas, metabolitos • Presencia de microorganismos que alteran el alimento.
TABLA 1. PROGRAMA DE 2-CLASES (c=0). PROBABILIDADES DE ACEPTACION (Pa) DE LOTES QUE CONTIENEN LAS PROPORCIONES INDICADAS DE UNIDADES DE MUESTRA ACEPTABLES Y RECHAZABLES
COMPOSICION DEL LOTE
NUMERO DE UNIDADES DE MUESTRA ANALIZADAS PROCEDENTES DE LA POBLACION (n)
Aceptables Rechazables 3 5 10 15 20 30 60 100 98 95 90 80 70 60 50 40 30 20 10
2 5
10 20 30 40 50 60 70 80 90
0,94 0,86 0,73 0,51 0,34 0,22 0,13 0,06 0,03 0,01
<
0,90 0,77 0,59 0,33 0,17 0,08 0,03 0,01
< < <
0,82 0,60 0,35 0,11 0,03 0,01
<
0,74 0,46 0,21 0,04
<
0,67 0,36 0,12 0,01
<
0,55 0,21 0,04
<
0,30 0,05
<
0,13 0,01
<
< : Pa menos de 0,05
TABLA 2 PROGRAMA DE 2-CLASES PARA DETERMINADOS VALORES DE c. PROBABILIDADES DE ACEPTACION (Pa) DE LOTES QUE CONTIENEN LAS PROPORCIONES INDICADAS DE UNIDADES DE MUESTRA ACEPTABLES Y RECHAZABLES
Composición del lote Aceptables
(100-p) Rechazables (p) C=3 C=2 C=1 C=3 C=2 C=1 C=4 C=2 C=1 C=9 C=4 c=1
98 95 90 80 70 60 50 40 30 20 10 5
2 5
10 20 30 40 50 60 70 80 90 95
1,00 1,00 1,00 0,99 0,97 0,91 0,81 0,66 0,47 0,26 0,08 0,02
1,00 1,00 0,99 0,94 0,84 0,68 0,50 0,32 0,16 0,06 0,01 <
1,00 0,98 0,92 0,74 0,53 0,34 0,19 0,09 0,03 0,01 <
1,00 1,00 0,99 0,88 0,65 0,38 0,17 0,05 0,01 <
1,00 0,99 0,93 0,68 0,38 0,17 0,05 0,01 <
0,98 0,91 0,74 0,38 0,15 0,05 0,01 <
1,00 1,00 0,99 0,84 0,52 0,22 0,06 0,01 <
1,00 0,96 0,82 0,40 0,13 0,03 <
0,96 0,83 0,55 0,17 0,04 0,01 <
1,00 1,00 1,00 1,00 0,95 0,76 0,41 0,13 0,02
1,00 1,00 0,96 0,63 0,24 0,05 0,01
0,94 0,74 0,39 0,07 0,01 < <
TABLA 3. PROGRAMA DE 3-CLASES: PROBABILIDADES DE ACEPTACION (Pa) DE LOTES QUE CONTIENEN LAS PROPORCIONES INDICADAS PARA VARIOS NUMEROS DE UNIDADES DE MUESTRA ANALIZADAS Y PARA DIVERSOS VALORES c (Pd= % RECHAZABLES; Pm = ACEPTABLES PROVISIONALMENTE) Pm Pd 10 20 30 40 50 60 70 80 90 N=5, c=3 50 40 30 20 10 5 0
0,03 0,08 0,17 0,33 0,59 0,77 1,00
0,03 0,07 0,16 0,32 0,58 0,77 0,99
0,02 0,06 0,15 0,31 0,56 0,75 0,97
0,01 0,04 0,12 0,27 0,52 0,69 0,91
<
0,02 0,07 0,20 0,43 0,60 0,81
< 0,03 0,12 0,32 0,47 0,66
< 0,04 0,18 0,31 0,47
< 0,06 0,14 0,26
< 0,02 0,08
N=5, c=2 50 40 30 20 10 5 0
0,03 0,08 0,16 0,32 0,58 0,77 0,99
0,02 0,06 0,14 0,29 0,55 0,72 0,94
0,01 0,04 0,11 0,24 0,47 0,63 0,84
<
0,02 0,06 0,16 0,36 0,50 0,68
< 0,02 0,09 0,23 0,35 0,50
< 0,03 0,12 0,20 0,32
0,01 0,05 0,09 0,16
< 0,01 0,02 0,06
< <
0,01
Pm Pd 10 20 30 40 50 60 70 80 90 N=5, c=2 50 40 30 20 10 5 0
0,02 0,06 0,14 0,29 0,53 0,70 0,92
0,01 0,04 0,09 0,21 0,41 0,55 0,74
<
0,01 0,05 0,13 0,27 0,38 0,53
< 0,02 0,06 0,16 0,23 0,34
< 0,02 0,07 0,12 0,19
0,01 0,03 0,05 0,09
< 0,01 0,01 0,03
< <
0,01
N=10, c=3 40 30 20 10 5 0
0,01 0,03 0,10 0,34 0,59 0,99
<
0,02 0,08 0,29 0,51 0,88
0,01 0,05 0,20 0,34 0,65
< 0,02 0,10 0,20 0,38
< 0,03 0,08 0,17
0,01 0,02 0,05
< <
0,01
N=10, c=2 30 20 10 5 0
0,02 0,09 0,32 0,55 0,93
0,01 0,06 0,21 0,39 0,68
<
0,02 0,10 0,20 0,38
0,01 0,04 0,08 0,17
< 0,01 0,02 0,05
< <
0,01
N=10, c=1 30 20 10 5 0
0,02 0,07 0,24 0,43 0,74
<
0,03 0,11 0,21 0,38
0,01 0,04 0,08 0,15
< 0,01 0,02 0,05
< <
0,01
TABLA 4. PROBABILIDADES DE ACEPTACION (Pa) PARA LOS PROGRAMAS DE ATRIBUTOS DE 2 Y 3-CLASES CUANDO EL LOTE CONTIENE 5%, 20% Ó 50% DE UNIDADES DE MUESTRA
5% >m 20%>>m 50%>m PROGRAMA DE MUESTREO 3-CLASES 3-CLASES 3-CLSES N c 2-
CLASES 0%>M 5%>M 2-
CLASES 0%>M 10%>M 20%>M 2-
CLASES 0%>M 25%>M 50%>M
5 5 5 5
0 1 2 3
0,77 0,98 1,00 1,00
0,77 0,98 1,00 1,00
0,77 0,77 0,77 0,77
0,33 0,74 0,94 0,99
0,33 0,74 0,94 0,99
0,33 0,53 0,58 0,59
0,33 0,33 0,33 0,33
0,03 0,19 0,50 0,81
0,03 0,19 0,50 0,81
0,03 0,11 0,19 0,23
0,03 0,03 0,03 0,03
10 10 10 10
0 1 2 3
0,60 0,91 0,99 1,00
0,60 0,91 0,99 1,00
0,60 0,60 0,60 0,60
0,11 0,38 0,68 0,88
0,11 0,38 0,68 0,88
0,11 0,24 0,32 0,34
0,11 0,11 0,11 0,11
< 0,01 0,05 0,17
< 0,01 0,05 0,17
< 0,01 0,02 0,03
15 0 0,46 0,46 0,46 0,04 0,04 0,04 0,04 20 0 0,36 0,36 0,36 0,01 0,01 0,01 0,01 60 0 0,05 0,05 0,05
El riesgo de una enfermedad alimentaria es tanto más elevado conforme el patógeno va multiplicándose en el alimento y, por tanto, su número aumenta. Pero además la manipulación del alimento durante la distribución , el almacenamiento y la preparación puede provocar la disminución, mantenimiento o aumento del número de microorganismos presentes. De esta forma, la elección de un programa de muestreo debe tener en cuenta:
• El tipo de riesgo que conllevan las especies microbianas que se están analizando • Condiciones previsibles de manipulación y consumo a las que el lote se someterá tras el
muestreo. La tabla 5. recoge 15 tipos de programas de muestreo en relación con los factores anteriormente mencionados. TABLA 5. SEVERIDAD DEL PROGRAMA (CATEGORIA) EN RELACION CON EL RIESGO SANITARIO Y CON LAS CONDICIONES DE USO. CONDICIONES NORMALES ESPERADAS DE
MANIPULACION Y CONSUMO DEL ALIMENTO TRAS EL MUESTREO
Tipo de riesgo Reducen el riesgo
Riesgo sin cambios
Aumentan el riesgo
Sin riesgo directo para la salud Utilidad (contaminación general, reducción de vida útil y alteración Riesgo para la salud Bajo, indirecto (indicadores) Moderado, directo, diseminación limitada Moderado, directo, diseminación potencialmente extensa Grave, directo
Categoría 1
Categoría 4
Categoría 7
Categoría 10
Categoría 13
Categoría 2
Categoría 5
Categoría 8
Categoría 11
Categoría 14
Categoría 3
Categoría 6
Categoría 9
Categoría 12
Categoría 15 Entre los factores que influyen en el riesgo hay que tener en cuenta:
• Consideraciones epidemiológicas • Consideraciones ecológicas • Consideraciones clínicas • Consideraciones laboratoriales
El agua y el marisco son frecuentes vehículos de fiebres tifoideas, cólera y hepatitis. Si bien la carne de aves y abasto se relacionan con brotes de salmonelosis, el jamón cocido y los bollos rellenos con las intoxicaciones estafilocócicas. La carne de ave cocinada, la cual ha sufrido un abuso de tiempo y temperatura es vehículo del C. perfringes. Es conocido que el botulismo se produce en alimentos procesados por el calor en el hogar. La leche cruda es frecuentemente vehículo de Campilobacterias, Brucellas y Salmonellas y en el arroz cocido se relaciona con la gastroenteriris causada por el Bacillo cereus. Las enfermedades alimentarias se originan, principalmente, por el consumo de alimentos de origen animal, aunque también el hombre es un reservorio de algunos patógenos. En la presentación de dichas enfermedades hay que considerar:
• Costumbres locales y prácticas higiénicas • Suministro de agua • Control de procesado de alimentos • Detección – retirada – decomiso de alimentos contaminados • Control de parásitos • Uso de refrigeración en la distribución y en los hogares.
La mortalidad de algunas enfermedades depende de la susceptibilidad de ciertos segmentos de la población (niños, malnutridos, ancianos). La mortalidad varía según el tipo de microorganismo patógeno causante de la enfermedad. Así en el botulismo la mortalidad se cifra en un 50%, puede elevarse hasta un 70% en el caso del cólera. Es importante el aislamiento e identificación del agente patógeno en el laboratorio, ya que muchos síntomas son comunes a diferentes microorganismos En la tabla 6 se presentan los principales microorganismos patógenos, causantes de enfermedades alimentarias Las pruebas de detección de patógenos en los alimentos se deben realizar en circunstancias especiales:
• En un muestreo rutinario, si el historial de los análisis de una determinada muestra confirma que cuando el patógeno está presente desarrolla la enfermedad.
• En un muestreo específico: • Si la epidemiología de un brote de origen alimentario hace sospechar que un
determinado lote de alimentos ha sido la causa de la enfermedad. • Cualquier circunstancia que haga sospechar la presencia de un patógeno.
3.4. Influencia de las condiciones de manipulación y uso en el riesgo.
Hemos relacionado el riesgo con la tasa de microorganismos en el alimento. Ahora bien, El riesgo puede:
aumentar: en el caso de la leche en polvo puede haber multiplicación microbiana durante su reconstitución no cambiar: congelación en el caso de helados disminuir: cocinado de los alimentos
Durante la manipulación tras el análisis, hay que tener en cuenta:
• Naturaleza del alimento como medio de multiplicación microbiana La incorporación de sal al 10% permite el crecimiento estafilocócico, pero no de Salmonella. Así si estos alimentos no se refrigeran puede clasificarse en la categoría 9 de los Estafilococos y en la 11 de las Salmonellas.
• La carne fresca con mayor desarrollo microbiano se clasificaría en las categorías 3, 6, 9, 12 ó 15 mientras que la carne deshidratada en categorías 2, 5, 8, 11 ó 14.
• Competencia microbiana: los estafilococos no crecen en la carne fresca alimentos con organismos alterantes, pero si se desarrolla tras el cocinado.
• Temperatura si se mantiene el jamón cocido a una temperatura inferior de 6º C, puede
considerarse en la categoría 8 en lugar de la 9; sin embargo, el pescado ahumado C. botulinum a temperaturas de 3º C durante suficiente tiempo de almacenamiento puede producir toxinas.
• Hábitos de consumo: en Japón que se consume pescado crudo es un medio idóneo para el
desarrollo de V. Haemolyticus, con lo que se consideraría en la categoría 9.
TABLA 6 PRINCIPALES PATOGENOS CAUSANTES DE ENFERMEDADES ALIMENTARIAS Microorganismo (enfermedad) Frecuencia aparición de la
enfermedad Ejemplo de vehículos Otros factores relevantes
I RIESGOS GRAVES Brucella melitensis B. abortus, B. Suis (Brucelosis)
Relativamente rara, pero en ocasiones endémica
Leche cruda y queso sobre todo de cabra
Frecuentemente convalecencia prolongada
Clostridium botulinum tipos A, B, E y F (Botulismo)
Rara Alimentos enlatados elaborados defectuosamente. Productos cárnicos curados en el hogar, pescados crudos y ahumado
Alta mortalidad; el reconocimiento rápido y tratamientos específicos pueden ser esenciales para la supervivencia del enfermo, se requieren precauciones de los fabricantes
Clostridium perfringes Tipo C(Enteritis necroticans)
Rara Carne de cerdo cocinada Alta mortalidad en personas deficiente en proteínas
Virus de la hepatitis A (Hepatitis A)
Frecuente Marisco crudo, ensaladas piezas cárnicas frías, hortalizas crudas, agua
Muy grave en pacientes con trastornos hepáticos; convalecencia prolongada
Salmonella typhi; S. paratyphi A, B (schttmulleri) y C (especialmente Fiebre tíficas y paratíficas)
Endémica en muchas partes del mundo; ocasionalmente epidémica
Agua, leche y productos lácteos crudos, productos cárnicos, hortalizas y marisco
Requiere cuidados médicos prolongados; puede transmitirse por portadores (S. typhi)
Shigiella dysenteriae I (sigelosis, disentería bacilar)
Esporádica o epidémica Hortalizas crudas y ensaladas Alta mortalidad; a menudo se diagnostica erróneamente; dosis infectiva baja
Vibrio cholerae O1, (cólera) Esporádica, endémica y ocasionalmente epidémica
Pescado, marisco y agua
Microorganismo (enfermedad) Frecuencia aparición de la
enfermedad Ejemplo de vehículos Otros factores relevantes
II RIESGOS MODERADOS: DISEMINACION POTENCIALMENTE EXTENSA� Estreptococosβ-hemolíticos (garganta séptica y dolorosa, escarlatina)
Enfermedad alimentaria Leche y productos lácteos crudos, contienen huevo
Mayor incidencia en malnutridos y en personas recuperándose de cirugía intestinal; alta mortalidad en personas no tratadas y deshidratadas. Secuelas: faringitis aguda, nefritis, artritis y complicaciones cardiovasculares. Diseminación secundaria por contactos
Escherichia coli patógeno (diarrea por E. coli)
En aumento en muchas áreas; causa frecuente de la diarrea de viajeros
Alimentos en contacto con personas infectadas, carne cruda o poco hecha, leche y productos lácteos crudos, ensaladas, agua.
Grave en individuos jóvenes; síndrome parecido a la sigelosis
Salmonella typhimurium y otros serovares de Salmonella (Salmonelosis)
Muy frecuente Carne de aves huevos, otras carnes otros muchos alimentos
Graves en niños y ancianos; contaminación cruzada entre carne de entre carnes de aves y otras carnes; algunas cepas de S. typhimurium y de otros , serotipos son muy virulentas
Shigella flexneri. S. boydii, S. sonnei (véase Sección I) (Sigelosis, disentería bacilar)
Esporádica a veces endémica Alimentos que puedan ser contaminados por personas infectadas o por agua residuales como hortalizas crudas, ensaladas
Grave para niños y ancianos; infecciones secundarias por contacto; a veces dosis infectivas bajas
Microorganismo (enfermedad) Frecuencia aparición de la
enfermedad Ejemplo de vehículos Otros factores relevantes
III RIESGOS MODERADOS: DISEMINACIÓN LIMITADA Bacillus cereus (gastroenteritis por B. cereus)
Frecuente Arroz cocido o frito, productos cereales reconstituidos, pudines y natillas
Campylobacter fetus subsp. jejuni (Campilobacteriosis)
Frecuente Leche cruda, agua, carne de aves y otros tipos de carne
Clostridium perfringens tipo A (Enteritis por C. perfringens)
Frecuente Carnes cocinadas no curadas, carne de aves y salsas
Staphylococcus aureus (Enterotoxicosis estafilocócica o intoxicación estafilocócica)
Frecuente Jamón, embutidos fermentados, otros productos cárnicos incluyendo carnes de aves, pasteles de crema, leche cruda, cruda, platos preparados con queso y huevos. Productos de pastelería fabricados con caseinato
Vibrio cholerae no Ol (Cólera no Ol)
En aumento Mariscos, crustáceos
Vibrio parahaemolyticus (Gastroenteritis por V parahaemolyticus)
Frecuente en Asia en aumento en todo el mundo
Pescados crudos de agua salada, crustáceos
Yersinia enterocolitica y Y paratuberculosis (Yersiniosis)
En aumento Leche cruda, leche pasterizada recontaminada agua, «tofu»
Los síntomas pueden parecerse a los de la apendicitis
3.5. Elección de la categoría
Los alimentos con un tratamiento térmico son más seguros; aunque hay riesgo de recontaminación tras el tratamiento, de condiciones idóneas de multiplicación, no se cocinan antes de su consumo. En la elección de la categoría hay que tener en cuenta 2 aspectos: 1. Si consideramos la vida útil del alimento, el recuento de aerobios en placa (RAP) es un indicador
valioso en alimentos no pasterizados, mientras que en alimentos pasterizados, el RAP es un reflejo del tratamiento, ya que un alimento muy alterado tras la pasterización puede dar un RAP aceptable, en este caso, es recomendable un recuento microscópico directo (RMD), ya que esta prueba indicará la tasa bacteriana que el alimento tenía antes del tratamiento. Para las pruebas RMD y RAP la elección de la categoría sería 1, 2 ó 3, dependiendo del uso posterior del alimento.
2. Microorganismos indicadores (coliformes):
Un alimento crudo que sufra tratamiento térmico la categoría 4 es la apropiada. Un alimento pasterizado con coliformes (recontaminación del alimento por malas condiciones higiénicas, se demora en su reconstitución se elige la categoría 6. En el caso de alimentos crudos sin cocinarse con estafilococos coagulasa +, se recomienda la categoría 7. Alimentos ya cocinados que son recontaminados con estafilocos por manipuladores se escogerá la categoría 9. Tanto el B. Cereus como Cl perfringes presentan riesgos moderados ya que producen esporas en alimentos con calentamiento moderado. Se clasifican en la categoría 8 si su consumo es inmediato tras la descongelación o en la categoría 9 si se demora el consumo. Las Salmonellas en alimentos proteicos como el huevo se destruyen tras la pasterización; aunque puede haber recontaminación y la congelación o deshidratación posterior no destruyen estas bacterias. Si el alimento deshidratado se consume como tal sin reconstitución se elige la categoría 11 Si la reconstitución se retrasa y no hay tratamiento térmico posterior se considera en la categoría 12. Si se cocina tras su reconstitución se mantendrá en la categoría 10. La tabla 7 amplia el número de ejemplos anteriormente mencionados.
3.6 Elección del programa de 2 ó 3 clases
La elección del programa de 2 o 3 clases estriba en si se puede permitir la presencia de una muestra positiva en cualquiera de las unidades de fabricación.
Si la respuesta es NO se elegirá un programa de 2 clases con c= 0 Si la respuesta es SI se podrá elegir un programa de 2 ó 3 clases.
Se recomienda un programa de 3-clases:
Elíjase a partir de la tabla 2 los valores de n para proporcionar la probabilidad deseada
Elíjase a partir de la tabla 3 los valores de n y c para proporcionar la probabilidad deseada
Si no es posible c = 0
Si es posible c > 0
¿Puede aceptarse la presencia de este microorganismo en el alimento?
Las pruebas de +/- requieren un Programa de 2-clases
En las pruebas de recuento es preferible un programa de 3-clases
Elíjase a partir de la tabla 3 los valores den y c para proporcionar la probabilidad deseada
¿se va a estimar el microorganismos problema por: pruebas de presencia o ausencia (+/-)
o por pruebas de recuento?
TABLA 7.RELACIONES ENTRE CATEGORIAS, TIPO DE AIMENTO, PRUEBAS MICROBIOLOGICAS Y CONDICIONES DE TRATAMIENTO DEL ALIMENTO Tipo de prueba Influencia de las
condiciones Categoría Alimento Pruebas
bacteriológicas Tratamiento, usos o manipulación previstas
1 Pescado, fresco o congelado RAP Cocinado antes de consumo 1 Crustáceos crudos congelados RAP Cocinado antes de consumo 1 Canales antes de refrigeración RAP Cocinado antes de consumo 1 Canales refrigeradas RAP Cocinado antes de consumo 1 Despojos comestibles refrigerados RAP Cocinado antes de consumo 1 Canales congeladas RAP Cocinado antes de consumo 1 Carne deshuesada congelada RAP Cocinado antes de consumo 1 Carne picada congelada RAP Cocinado antes de consumo 1 Despojos comestibles congelados RAP Cocinado antes de consumo
Reducción del riesgo
1 Carne de pollo, fresca o congelada RAP Cocinado antes de consumo 2 Leche en polvo RAP Tras rehidratación se consume o
refrigera inmediatamente 2 Ovoproductos líquidos
pasterizados congelados o deshidratados
RAP Se emplean inmediatamente después de reconstitución en productos formulados que posteriormente no se tratan térmicamente
2 Pescados empanados, precocinados congelados
RAP Se consumen rápidamente tras su descongelación
Riesgo no se modifica
2 Crustáceos precocinados congelados
RAP Se consumen rápidamente tras su descongelación
Sin riesgo directo para la salud, contaminación general, alteración y vida útil
Aumento del riesgo 3 Carne de cangrejo precocinada refrigerada o congelada
RAP Recocinada antes de su consumo; es posible que se someta a un control de temperatura escaso y puede almacenarse períodos prolongados tras la apertura del envase o su descongelación
3 Moluscos bivalvos frescos o
congelados RAP Se consumen crudos o tras un cocinado muy
ligero; puede que se sometan a un control de temperatura escaso y pueden almacenarse períodos prolongados tras la apertura del envase o su descongelación
4 Pescado fresco o congelado E. coli Cocinado antes de consumo 4 Crustáceos crudos congelados E. coli Cocinado antes de consumo
Reducción del riesgo
4 Productos deshidratados que requieren un calentamiento o hervirse antes de su consumo
RAP, coliformes Cocinado antes de consumo
Riesgo para la salud bajo indirecto (microorganismos indicadores
5 Leche en polvo Coliformes Se consume rápidamente tras su reconstitución
5 Ovoproductos líquidos pasterizados, congelados o deshidratados
Coliformes Se emplean inmediatamente sin ningún tratamiento posterior
5 Pescados precocinados empanados, congelados
E. coli No siempre se recalientan bien antes de su consumo pero suelen consumirse inmediatamente tras el recalentamiento
5 Crustáceos precocinados congelados
E. coli Consumo inmediato tras descongelación
5 Verduras o frutas (pH 4,5) congelada
E. coli Consumo inmediato tras descongelación
5 Productos vegetales deshidratados
E. coli Consumo inmediato tras descongelación
Riesgo no se modifica
5 Cereales (incluyendo harinas) Mohos Se cocinan, pero las micotoxinas no tienen por qué destruirse con el calentamiento
5 Harina, concentrados y productos de la soja
Mohos Sufren un procesado posterior, pero las micotoxinas no tienen por qué destruirse por el calentamiento
5 Galletas «estables» rellenas o con
cobertura Coliformes Se consumen en estado seco
5 Agua mineral natural no carbonatada (eauxplates) y otras aguas embotelladas no carbonatadas
Coliformes Por regla general se consume pronto tras la apertura del envase (el número de microorganismos disminuye con nel tiempo de embotellado, pero algunos pueden sobrevivir)
6 Crustáceos precocinados congelados
E. coli 0 no se cocinan o muy ligeramente; a veces se almacenan con escaso control de la temperatura y pueden almacenarse períodos prolongados tras la descongelación
6 Carne de cangrejo precocinada refrigerada o congelada
E. coli 0 no se cocinan o muy ligeramente; a veces se almacenan con escaso control de la temperatura y pueden almacenarse períodos prolongados tras la descongelación
6 Moluscos bivalvos frescos o congelados
E. coli 0 no se cocinan o muy ligeramente; a veces se almacenan con escaso control de la temperatura y pueden almacenarse períodos prolongados tras la descongelación
Aumento del riesgo
6 Productos formulados deshidratados o de disolución instantánea reconstitución
RAP, coliformes
Posible almacenamiento tras la reconstitución con almacenan con escaso control de la temperatura y pueden almacenarse períodos prolongados tras la descongelación que precisan periodos de tiempo prolongados
Riesgo para la salud moderado, del riesgo directo, diseminación
Reducción del riesgo
7 (Según el criterio de la ICMSF no hay ejemplos)
Patógenos vegetativos que no producen toxinas termoestables
Cocinado antes de consumo
8 Sangre, plasma o gelatina
deshidratada Staph. Aureus Cl. perfringens
Usados como ingredientes en productos que no reciben un tratamiento térmico adecuado (enterotoxinas y esporas sobreviven al calentamiento)
8 Carne de pollo precocinada, que será recalentada, congelada
Staph. Aureus Recalentada antes de su consumo, pero la enterotoxina no se destruye
8 Carne de pollo precocinada lista para consumo (por ej., rollitos de pavo) congelada
Staph. Aureus Se consume rápidamente tras la descongelación o se mantiene en refrigeración
8 Crustáceos precocinados Staph. Aureus Se consumen rápidamente tras la descongelación congelados
8 Quesos «duros» y «semiduros» Staph. Aureus Normalmente no se tratan térmicamente; puede que no se mantengan en refrigeración (no debería haber crecimiento tras el procesado)
Productos de panadería con rellenos de baja acidez o elevada a (por ej., pastel de carne empanadas, pizzas) congelados
Staph. Aureus No siempre se recalientan de forma apropiada antes de su consumo, pero se consumen rápidamente tras el recalentamiento
8 Aperitivos que contienen harina de maíz o de arroz como principal ingrediente
B. Cereus Se recalientan, pero las esporas y la toxina emética no se inactivan; se consumen rápidamente tras el recalentamiento
Pasta congelada o desecada Staph. Aureus Normalmente se trata térmicamente, pero la enterotoxina puede permanecer activa
limitada Riesgo no se modifica
Agua mineral natural no carbonatada (eaux plates)
Pseudomonas aeruginosa
Normalmente se consume rápidamente tras la apertura del envase; no sufre posteriores tratamientos
9 Carne de pollo precocinada, lista
para consumo (por ej., rollitos de pavo) congelada
Staph. Aureus No se recalienta siempre; con escaso control de temperatura tras descongelación y puede almacenarse períodos de tiempo prolongados
9 Carne de pollo curada y/o ahumada
Staph. Aureus Puede que se almacene con escaso control de temperatura y durante períodos de tiempo prolongados
9 Productos deshidratados o de disolución instantánea que requieren reconstitución
Staph. Aureus Puede que se almacene con escaso control de temperatura y durante períodos de tiempo prolongados
9 Productos de panadería (listos para consumo) con ingredientes de baja acidez o elevada aw
Staph. Aureus Puede que se almacene con escaso control de temperatura y durante períodos de tiempo prolongados
Aumento del riesgo
9 Carne de cangrejo precocinada, refrigerada
Staph. Aureus Puede que no se cocine antes de su consumo y que se almacene con escaso control de temperatura y/o congelada durante períodos de tiempo prolongados
10 Leche en polvo Salmonella Se usa como ingrediente de un producto que se trata térmicamente
10 Ovoproductos líquidos pasterizados, congelados o deshidratados
Salmonella Se usa como ingrediente de un producto que se trata térmicamente
10 Productos deshidratados que requieren ebu11ición antes de su consumo
Salmonella Se calientan antes de su consumo
10 Carne de pollo precocinada, que se recalienta antes de su consumo, congelada
Salmonella Se recalienta antes de su consumo
Riesgo para la salud moderado, directo; diseminación posiblemente extensa
Reducción del riesgo
Harina, concentrados y productos de la soja
Salmonella Se usa como ingrediente de un producto que se trata térmicamente
Productos de panadería
(preparados para cocinarse) con ingredientes de baja acidez o elevada a (por ej., pastel de carne, empanadas, pizzas), congelados
Salmonella Se calientan antes de su consumo
10 Derivados de cereales congelados o deshidratados
Salmonella Se calientan antes de su consumo
11 Carne de pollo precocinada, lista para consumo (por ej., rollitos de pavo) congelada
Salmonella Se consume rápidamente tras la descongelación
11 Carne de pollo curada y/o ahumada, refrigerada o congelada
Salmonella Se consume rápidamente tras la apertura del envase o tras la descongelación
11 Productos deshidratados a base de carne de pollo
Salmonella No siempre se recalientan bien antes de su consumo; pueden emplearse como ingredientes de ensaladas tras su rehidratación; se consumen rápidamente tras rehidratación�
Leche en polvo Salmonella Se consume rápidamente tras la reconstitución
Ovoproductos pasterizados líquidos, congelados o deshidratados
Salmonella Se consumen rápidamente tras la reconstitución o descongelación
11 Cacao Salmonella Se usa como ingrediente de productos estables
Chocolate y otros productos de confitería
Salmonella Productos estables, consumidos sin posteriores tratamientos
Riesgo no se modifica
Alimentos de humedad intermedia para animales de compañía.
Salmonella Productos estables consumidos sin posteriores tratamientos
Alimentos deshidratados y que
no precisan reconstitución para animales de compañía
Salmonella Productos estables consumidos sin posteriores tratamientos
Sangre, plasma o gelatina deshidratada
Salmonella Se usa en productos estables
Coco (desecado) Salmonella Se consume en estado seco; crecimiento no previsto
Mantequilla de cacahuete Salmonella Producto estable consumido sin posterior tratamiento
12 Paté Salmonella Puede que se almacene con escaso control de la temperatura durante períodos de tiempo prolongados
12 Roast beef congelado Salmonella Puede que, tras la descongelación, se almacene con escaso control de la temperatura durante períodos de tiempo prolongados
12 Alimentos deshidratados que precisan de rehidratación para animales de compañía
Salmonella Puede que. tras la rehidratación, se almacene con escaso control de la temperatura durante períodos de tiempo prolongados
12 Leche en polvo Salmonella Puede que, tras la reconstitución, se almacene con escaso control de la temperatura durante períodos de tiempo prolongados
12 Ovoproductos pasterizados líquidos, congelados o deshidratados
Salmonella Puede que, tras la descongelación o reconstitución, se almacene con escaso control de la temperatura
Aumento del riesgo
12 Coco (desecado) Salmonella Probablemente usado en un producto de humedad elevada; puede almacenarse con escaso control de temperatura y durante períodos de tiempo prolongados
12 Levaduras Salmonella Puede que se usen como ingredientes de
un producto de humedad elevada; pueden almacenarse con escaso control de temperatura y durante períodos de tiempo prolongados tras la formulación, descongelación o rehidratación.
12 Mantequilla de cacahuete Salmonella Puede que se use como ingrediente de un producto de humedad elevada; puede almacenarse con escaso control de temperatura y durante períodos de tiempo prolongados tras la formulación, descongelación o rehidratación
12 Productos formulados deshidratados o de disolución instantánea que requieren reconstitución
Salmonella Pueden almacenarse con escaso control de la temperatura y durante períodos de tiempo prolongados tras la reconstitución
12 Productos de panadería (listos para consumo) con rellenos o cubiertas de baja acidez o elevada a, congelados
Salmonella Pueden almacenarse, tras la descongelación, con escaso control de la temperatura y durante períodos de tiempo prolongados
Riesgo para la salud grave y directo
Reducción del riesgo
13 (Según el criterio de la ICMSF no hay ejemplos)
Brucella, C. botulinum, C. perfringens, tipo C Salm. typhi, Shig. dysenteriae. V cholerae. Virus de la hepatitis A
Cocinado antes de su consumo
Riesgo no se
modifica 14 (Según el criterio de la ICMSF
no hay ejemplos) Brucella, C. botulinum, C. perfringens, tipo C Salm. typhi, Shig. dysenteriae. V cholerae. Virus de la hepatitis A
Productos estables consumidos en el mismo estado que quedan tras su procesado o inmediatamente tras la descongelación o reconstitución
15 (Según el criterio de la ICMSF no hay ejemplos)
Brucella, C. botulinum, C. perfringens, tipo C Salm. typhi, Shig. dysenteriae. V cholerae. Virus de la hepatitis A
Sujetos a control de temperatura escaso y almacenados, durante períodos de tiempo prolongados tras su preparación, descongelación o reconstitución
• Si un alimento se fabrica bajo buenas prácticas, pueden existir unidades con valores analíticos superiores al habitual sin haber problemas (provisionalmente aceptables)
• Existe un límite de riesgo (M) • Permite controlar la tendencia de los análisis. Si hay un aumento de muestras entre los
valores m y M indica una falta de control.
3.7. Determinación de m y M
El valor de m es la cantidad aceptable y esperable que un microorganismo puede alcanzar en un alimento. Si el microorganismo es un patógeno se recomienda que m = 0 ó nivel de detectibilidad de la prueba analítica. M es el nivel de contaminación de riesgo inaceptable, M se establece mediante diferentes estrategias:
• Indice de utilidad del producto: relación entre tasa bacteriana y alteración evidente (color, olor)
• Indice higiénico general • Peligro para la salud
M se establece por el riesgo y m está definido por las BPF El conocimiento del lote es fundamental para la elección de un programa de muestreo, ya que aquellos productos con un extenso historial de buena calidad:
Reduce los costes de almacenamiento Disminuye el número de unidades de muestra a analizar (n = 5) con o que el coste analítico es menor.
La severidad de un programa se mide por la probabilidad de aceptación de los lotes en los que una determinada % de unidades de muestra es rechazable. Así, un programa de 3 clases con: n = 5 c = 3
5% de unidades rechazables 30% de unidades aceptables provisionalmente
La probabilidad de aceptación es del 75%
Un programa de 2 clases con: n = 60 c = 0
5% de unidades rechazables
Un programa de 2 clases con: n = 60 c = 0
0,5% de unidades rechazables
La probabilidad de aceptación es del 95% Puede suponerse que en el primer caso, una probabilidad de un 75% no proporciona protección alguna; sin embargo, la pérdida de 1 lote de cada 4 es tan importante que obligará al productor a reducir el contenido bacteriano de su producto a un nivel inferior. La elección de n y c en un programa de muestreo varía en función de la rigurosidad Es más riguroso cuando n es alto y c es bajo y es menos riguroso cuando n es bajo y c es alto Con un 5% de rechazables, n = 5 y c = 1 la probabilidad de aceptación es de 77,5 %. Con el mismo porcentaje de rechazables si n = 3 y c = 3 la probabilidad de aceptación es 100%. La tabla 8. refleja los programas de muestreo recomendables en función del riesgo TABLA 8 PROGRAMAS DE MUESTREO RECOMENDADOS PARA DIFERENTES GRADOS DE RIESGO PARA LA SALUD CONDICIONES NORMALES ESPERADAS DE MANIPULACION Y
CONSUMO DEL ALIMENTO TRAS EL MUESTREO Tipo de riesgo Reducen el riesgo Riesgo sin cambios Aumentan el riesgo Sin riesgo directo para la salud Utilidad (vida útil y alteración) Riesgo para la salud Bajo, indirecto (indicadores) Moderado, directo, diseminación limitada Moderado, directo, diseminación
Aumento de la vida útilCategoría 1
3-clases n=5, c=3
Disminución del riesgo Categoría 4
3-clases n=5, c=3
Categoría 7 3-clases n=5, c=2
Categoría 10
2-clases n=5, c=0
Sin modificación Categoría 2
3-clases n= 5, c=2
Sin modificación Categoría 5
3-clases n= 5, c=2
Categoría 8 3-clases n= 5, c=1
Categoría 11
2-clases n= 10, c=0
Disminución de vida útil
Categoría 3 3-clases n=5, c=1
Aumento del riesgo
Categoría 6 3-clases n= 5, c=1
Categoría 9
3-clases n= 10, c=1
Categoría 12
potencialmente extensa Grave, directo
Categoría 13 2-clases n=15, c=0
Categoría 14 2-clases n= 30, c=0
2-clases n= 20, c=0
Categoría 15 2-clases n= 60, c=0
Aunque el valor de n dependerá siempre de la capacidad analítica del laboratorio, aunque debe constituir un compromiso entre la protección total del consumidor y la capacidad del laboratorio. Cuando se requieren inspecciones más rigurosas; se aumenta n, m y M y disminuye el valor de c. Si c = 0, la severidad se incrementa aumentando las unidades de muestra a analizar. Las inspecciones más rigurosas pueden realizarse para
Establecer cargas económicas a suministradores con un historial de producción y manipulación de lotes con una calidad microbiológica deficiente Reemplazar programas de muestreos rutinarios cuando se presume que el grado de importancia o sus condiciones sobrepasan lo especificado en la tabla anterior.
PROGRAMAS DE MUESTREO Y LIMITES MICROBIOLOGICOS RECOMENDADOS PARA CARNE CRUDA
Límite por cm² o g
Producto Análisis Categoría Programa de clase
N c m M
Canal antes de refrigerarse Canales refrigeradas Despojos refrigerados Canales refrigeradas Carne deshuesada congelada (vaca, ternera, cerdo, ovino) Carne picada congelada Despojos congelados
RAP RAP RAP RAP RAP
RAP RAP
1 1 1 1 1
1 1
3 3 3 3 3
3 3
5 5 5 5 5
5 5
3 3 3 3 3
3 3
105
106
106
5x105
5x105
106
5x105
106
107
107
107
107
107
107
PROGRAMAS DE MUESTREO Y LIMITES MICROBIOLOGICOS RECOMENDADOS PARA PRODUCTOS CARNICOS PROCESADOS
Límite por cm² o g
Producto Análisis Categoría Programa de clase
N c m M
Sangre deshidratada, plasma y gelatina Roast beef Paté
Staph. Aureus C. perfringes Salmonella Salmonella Salmonella
8 8
11 12 12
3 3 2 2 2
5 5
10 20 20
1 1 0 0 0
102
102
0
0
0
104
104
PROGRAMAS DE MUESTREO PARA CARNES CURADAS EN SEMICONSERVA
Análisis Programa
de clase N C m M Aceptación
Paso1: Inspección visual para detectar envases abombados o defectuosos Paso 2: Medida de temperatura entre envases Paso 3: determinar aerobios en placa con muestras del centro y periferia del envase
2
2
3
10
10
5
0
0
2
103
0
0
104
Rechazo si se detectan 1 o más envases con defectos. Si no se encuentran defectuosos, se procederá con el paso 2 Aceptar si la temperatura es menor de 10ºC. Si es mayor procédase con el paso 3
PROGRAMAS DE MUESTREO Y LIMITES MICROBIOLOGICOS RECOMENDADOS PARA CARNE CRUDA
Límite por cm² o g
Producto Análisis Categoría Programa de clase
N c m M
Carne de ave precocinada, congelada, que se recalienta antes de su consumo (platos preparados) Carne de ave cocinada, congelada, lista para su consumo (rollitos de pavo) Carne de ave curada y/o ahumada Productos avícolas deshidratados Carne de pollo cruda (fresca o congelada), durante su procesado
Staph. Aureus Salmonella
Staph. Aureus
Salmonella
Staph. Aureus Salmonella
Salmonella
RAP
8 10
8 9
11
9 11
11
1
3 2
3 3 2
3 2
2
3
5 5
5 10 10
10 10
10
5
1 0
1 1 0
1 0
0
3
103
0
103
103
0
103
0
0
5x105
104
104
104
104
107
PROGRAMAS DE MUESTREO Y LIMITES MICROBIOLOGICOS RECOMENDADOS PARA LECHE EN POLVO Y QUESO
Límite por cm² o g
Producto Análisis Categoría Programa de clase
N c m M
Leche en polvo Queso de tipo duro y semiblando
RAP Coliformes Salmonella
Rutina normal
Salmonella Población alto
riesgo Staph. Aureus
2 5
10 11 12 10 11 12 8
3 3 2 2 2 2 2 2 2
5 5 5
10 20 15 30 60 5
2 1 0 0 0 0 0 0 0
3x104
10 0 0 0 0 0 0
104
3x105
102
PROGRAMAS DE MUESTREO Y LIMITES MICROBIOLOGICOS RECOMENDADOS PARA HUEVO LIQUIDO PASTERIZADO,
CONGELADO Y OVOPRODUCTOS DESHIDRATADOS Análisis Categoría Programa de clase N c m M
RAP Coliformes Salmonella
Rutina normal
Salmonella Población alto riesgo
2 5
10 11 12 10 11 12
3 3 2 2 2 2 2 2
5 5 5
10 20 15 30 60
2 2 0 0 0 0 0 0
5x104
101
0 0 0 0 0 0
106
103
3. BIBLIOGRAFIA. - BERNEL, M. (2002). “Criterios microbiológicos: fundamentos para su aplicación en el sistema de APPCC”. Revista A.I.C.E. Enero-Marzo. - E.E.C. (2001). “On strategy for setting microbiological criteria for foodstuffs in Community legislation”. SAINCO 1252/2001. Rev.8.
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Roma.