AF060 – Biotecnologia Vegetal aula... · •Rótulo das culturas - Diferentes concentrações ORGANIZAÇÃO DO LABORATÓRIO. Cultura de Tecidos Vegetais PREPARO DE MEIO DE CULTURA

AF060 – Biotecnologia Vegetal

Professores responsáveis:

Prof. Dr. Luiz Antônio Biasi

Prof. Dr. João Carlos Bespalhok Filho

Profa Dra Renata Faier Calegario

Mestranda: Laudiane Zanella

Tópicos

•Cultura de Tecidos Vegetais:

- Organização do laboratório

- Meios de Cultura (componentes e preparo)

- Assepsia

- Organogênese

- Embriogênese

Cultura de Tecidos Vegetais

FINALIDADE:

Pesquisa X Comercial- Qualidade - Custo

- Logística

ORGANIZAÇÃO DO LABORATÓRIO


VANTAGENS E DESVANTAGENS:


Alto custo;

Mão de obra especializada;

Contaminação;

Oxidação;

Declínio do vigor;

Grande nº de mudas;

Controle das condições de trabalho;

Livres de doenças;

Crescimento rápido;

Multiplicar plantas que não produzem ou produzem poucas sementes.


BÁSICOS:

• Eletricidade:

- Gerador

- Estabilizador

• Água:

- Destilada

- Deionizada

- Água MiliQ

• Acesso

- Limitado para transgênico/CTNBio

- CQB/ CIBio


www.ebiotecnologia.org


BÁSICOS:

• Contaminações:

- Evitar

• Manter a assepsia:

- Lavar as mãos

- Toca de cabelo/ Luvas/ Pés limpos



ESTRUTURA

• Depende da técnica a ser utilizada:

- Micropropagação

- Transformação genética

- Cultura de anteras

- Cultura de meristemas

- Protoplastos



DIVISÕES

• Preparo de meio de cultura

• Lavagem e esterilização

• Sala asséptica

• Sala de crescimento

• Aclimatação

• Outros



PREPARO DE MEIO DE CULTURA

• Geladeira

- Soluções estoque

• Freezer

- Reguladores de crescimento

- Antibióticos

• Balança de precisão

• pHmetro

• Agitador


• Deionizador • Forno de microondas • Pipetas automáticas



Organização/Cuidados

• Cálculo das concentrações

• Cuidado com rótulo

- Prejuízo

• Nome do Produto

- Concentração

- Data

- Quem fez

• Rótulo das culturas

- Diferentes concentrações




Equipamentos

Autoclave:


www.solucoesindustriais.com.br es.tuttnauer.com


LAVAGEM E ESTERILIZAÇÃO

• Pias fundas

• Locais para armazenar vidros sujos

• Lavagem

- Detergente

- Hipoclorito (NaClO)

• Estufa para secagem

• Descarte de material

- Produtos químicos

- Material transgênico



LAVAGEM E ESTERILIZAÇÃO


www.mpcaldeiraria.com


SALA ASSÉPTICA

• Capela de fluxo laminar



SALA ASSÉPTICA

• Cabine de fluxo laminar – Luz UV


www.posgrad.epm.br


SALA ASSÉPTICA

• Lupa

• Bicos de busen/Lamparina/Esterilizador


wikiciencias.casadasciencias.orgwww.casaarco.com.br www.lojalab.com.br


SALA DE CRESCIMENTO

• Sala

- Luminosidade - 16 h• Timer

• Lâmpadas

• Prateleiras

- Temperatura• Ar condicionado

- 23 ºC ± 2ºC



SALA DE CRESCIMENTO



SALA DE CRESCIMENTO

• B.O.D

- Temperaturas diferentes

- Luminosidade- (≠ Foto período/ escuro)

• Fitotron®

- Umidade controlada

• Agitadores

- Células em suspensão

• Biorreator

- Multiplicação em larga escala


www.splabor.com.br

www.embrapa.br


SALA DE EQUIPAMENTOS



ACLIMATAÇÃO

• Casa de Vegetação

- Climatizada

- Nebulização



FOTOGRAFIA



CUIDADOS

• Corte com vidros quebrados ou bisturi;

• Queimaduras com material da autoclave;

• Incêndio com álcool (lamparina ou assepsia);



CUIDADOS

• Fonte de informações

• Máximo de informações

• Deve ficar no laboratório



ORGANIZAÇÃO DO TRABALHO

• Espaço multi usuário

• Necessidade de programação para:- Preparo de meio

- Autoclavagem

- Câmera de fluxo laminar

- Sala de cultivo

- Lavagem e descarte de materiais



Meios de Cultura


• Componentes

– Água

– Macronutrientes

– Micronutrientes

– Vitaminas

– Carboidratos

– Reguladores do crescimento

– Ágar e outros geleificantes

– pH

Meios de Cultura


Água

Meios de Cultura - Componentes


• Macronutrientes

– Nitrogênio (N)

– Fósforo (P)

– Potássio (K)

– Cálcio (Ca)

– Magnésio (Mg)

– Enxofre (S)



• Micronutrientes

– Ferro (Fe)

– Manganês (Mn)

– Zinco (Zn)

– Boro (Bo)

– Cobre (Cu)

– Molibdênio (Mo)

– Outros• Cobalto e Iodo



• Vitaminas e Inositol

– Tiamina

– Ácido Nicotínico

– Piridoxina

– Mio Inositol



• Carboidratos

– Sacarose



• Reguladores do crescimento

– Auxinas• AIA, AIB, 2,4-D, ANA, 2iP

– Citocininas• CIN, BAP, TDZ

– Giberilinas• GA3

– Ácido Abscísico• ABA



• Ágar e outros geleificantes

– Ágar

6 a 10 g/L

– Gelrite/phytagel

1 a 2 g/L



• pH

– Deve ficar na faixa de 5 a 5,8

– Ajustar pH adicionando solução de NaOH (base) ou HCl(ácido)

– pH influencia

• Disponibilidade de nutrientes• Consistência do gel



• Preparo

– Soluções estoque: preparo e armazenamento

– Distribuição nos frascos

– Autoclavagem do meio



• Meio MS

– Murashige e Skoog (1962)

– Mais utilizado na cultura de tecidos

– Rico em Nitrogênio



• Meio MS - Tabela de composição do meio


Assepsia


• Eliminação de microrganismos patogênicos na forma vegetativa,presentes em superfícies inertes, mediante aplicação de agentesquímicos e físicos.

Assepsia


• Lavagem com água esterilizada;

• Hipoclorito de Sódio (NaClO);

• Etanol;

• Cloreto de Mercúrio (HgCl2);

• Detergentes (Twin 20);

• As concentrações variam de acordo com o tempo que o material será exposto ao produto

Concentração Tempo e vice-versa.

Assepsia


1. Retirar as folhas da coroa até expor as gemas;

2. Lavar em água corrente (esponja e detergente levemente);

3. Excisar as gemas da coroa formando uma base triangular na gema;

4. Álcool 70% por 30 segundos;

5. Hipoclorito comercial a 25% por 15 minutos;

6. Lavar 3 vezes em água deionizada e autoclavada;

7. Introduzir em meio de cultura

Assepsia do Abacaxi

www.cefetbambui.edu.br


Organogênese


Organogênese

www.abctp.org.br agro.unc.edu.ar

• Regeneração em cultura de tecidos a partir da formação de um órgão

– Gema/ Broto

– Raíz

• Monopolar


• Direta

– Sem formação de calo

• Indireta

– Com formação de calo

Organogênese

jbioleng.biomedcentral.com


• Principais fatores que afetam a organogênese

– Espécie/genótipo

– Explante

• Juvenil x Maduro

– Meio de cultura

– Fitoregulador

• Tipo e concentração

- Gemas: citocininas (BAP ou cinetina)

Organogênese


• Aplicações

- Micropropagação

- Organogênese direta

- Transformação genética

• Desvantagem: origem multicelular

Organogênese


Embriogênese


•Organogênese

- Formação de um órgão

•Embriogênese

- Formação de um embrião

Embriogênese


• Processo de formação de um embrião a partir de um tecidosomático.

• Embrião somático é bipolar

– Ápice caulinar

– Radicular

Embriogênese


• Embriogênese direta

- Sem formação de calo

• Embriogênese indireta

- Com formação de calo

Embriogênese

nptel.ac.in

www.scielo.cl


• Estágios de desenvolvimento

– globular, cordiforme, torpedo e cotiledonar

Embriogênese


• Indução (indireta)

– Auxinas (2,4-D) – desdiferenciação – formação do calo embriogênico

• Formação do embrião

– Retirada/Diminuição da concentração de auxinas

Embriogênese


• Fatores que afetam

– Espécie/genótipo

– Explante

– Meio de cultura Alta concentração de sais, principalmente Nitrogênio

– Luz Indução geralmente é feita no escuro

Embriogênese


• Aplicações

– Sementes sintéticas

– Transformação genética

– Origem unicelular (evitar formação de quimeras)

Embriogênese

www.seedbiology.de

[email protected]

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