Affidabilita` di un’analisi.

- Specificita`:- esistenza di sostanze interferenti (dovrebbero essere assenti o in conc. nota)- controllo additivita` degli effetti interferenti

- Accuratezza: bonta` di approsimazione del valore sperimentale (media campionaria) al valore vero (media della popolazione). L’accuratezza di una procedura analitica viene stabilita attraverso:

- metodo assoluto: analisi campioni noti; analisi di standard.- metodo comparativo: confronto con altre tecniche; metodo del recupero

- Precisione: ripetibilita` del metodo analitico. La precisione deve essere fornita insieme al risultato dell’analisi ed e` valutata per mezzo di parametri statistici: deviazione standard

CV%=s/quantita` *100La precisione ottenuta dipende da quella di tutti gli strumenti impiegati per l’analisi

- Sensibilita`: rapporto tra risposta strumentale e quantita` dell’analita.concetti collegati sono:

- rapporto segnale/rumore (S/N)- minima quantita` rivelabile (LOD)- minima differenza rivelabile

)1(

)( 2

n

xxs

Standardizzazione e Calibrazione

- Metodi Assoluti.

Sono metodi basati su una reazione chimica nota che va a completezza.

Peso: gravimetria; elettrogravimetria; trmogravimetria

Volume: titrimetria; gasometria

Carica tot: coulombometria

- Metodi Comparativi

Sono quei metodi analitici che richiedono una calibrazione con standard noti

al fine di ottenere risultati accurati.

La calibrazione consiste nel determinare la relazione tra laGrandezza misurata (y) e la concentrazione dell’analita (C)

y = f(C) y = mC [+b]y = m log(C)

La calibrazione richiede la disponibilita` di standard primari.Nei metodi classici di analisi si usano standard primari e secondari.

Funzioni di calibrazione lineariy = mC + b

y=parametro misuratoC=concentrazionem=costante di proporzionalita`b=termine costante (es. valore del bianco, errore determinato)

ERRORE DETERMINATO - errore misurabile e definito di cui si puo` tenere conto durante l’analisi.

ERRORE INDETERMINATO - errore che deriva dall’incertezza delle misure. E` incongnito e non puo` essere controllato dall’analista. Produce una dispersione dei risultati di misure ripetute che puo` essere valutata solo tramite test statistici.

Poiche` i punti di una calibrazione non cadono mai precisamente su una retta, si cerca la retta migliore col metodo della regressione lineare basata sul metodo dei minimi quadrati.

Presupposti del Metodo dei minimi quadrati:- le variabili indipendente (C) e dipendente (y) sono legate da una

relazione lineare;- non vi sono errori associati ai valori noti di C degli standard.

Tutto l’errore sta nella misura di y;- non vi sono dati che cadono fuori dal pattern statistico di

distribuzione normale.

Coefficiente di correlazione

(Pearson):

Grafici di calibrazione non lineari

quando vi sono deviazioni dalla linearita` si puo` operare in modo da:

1) trasformare una o entrambele variabili (indip. e dipend.) e rendere la relazione tra le due di nuovo lineare

CkaykC

aCkykyay

aC

loglog10

loglog10

2) ricorrere alla regressione nonlineare

svantaggi legati al punto 2):

maggiore complessita` del metodo;errori maggiori legati alla procedura;necessaria buona conoscenza del metodo e dell’algoritmo applicato

Metodi di aggiunta standardNon potendo eliminare o tenere esattamente conto di tutte le interferenze dovute alla matrice,la calibrazione viene svolta in presenza della matrice stessa.

Presupposti:- relazione lineare tra parametro misurato (y) e concentrazione (C) dell’analita (y=mC)- il metodo analitico non deve avere metodo determinato. Se la relazione e` del tipo y=mC+b, m deve essere nota.-la matrice non deve contenere specie che rispondolo come l’analita (ma con m in genere differente).

AGGIUNTA DI STANDARD SINGOLA

se = misura prima dell’aggiunta = conc. incognita dell’analita

= conc. dello standard nella soluzione dopo aggiunta = misura dopo aggiuntasi ha

si ricava

se le variazioni di volume non sono significative

)(0

si CCmy

mCy

sCC

iy

0y

0

0

yy

CyC

i

s

volendo tener conto anche del volume dello standard aggiunto:

SVANTAGGI:- nessun controllo su eventuali errori commessi durante la misura o l’aggiunta- nessuna media che “abbatta” gli errori indeterminati- nessun modo di rivelare agenti interferenti o mascheranti

so

i CvV

VCmy

mCy

0

0

000

00

)(

)(

VyvVy

vVCyC

i

s

METODO DELL’AGGIUNTA MULTIPLA DI STANDARD

si eseguono n aggiunte di standard contenente l’analita.dopo ogni aggiunta si ha (transcurando le variazioni di volume):

si riarrangia in

per

si ricava

volendo tener conto della diluizione, si ha:

da cui riarrangiando

0

,0

yy

CyC

i

is

0,0 y

C

Cyy isi

isC ,

iy

C

0yCy00iy

CC is ,

000

0,0

)(

)(

VyvVy

vVCyC

i

is

0,0

00

0

0 yCV

vV

C

y

V

vVy isi

METODO DELL’AGGIUNTA MULTIPLA DI STANDARD

VANTAGGI:- l’errore indeterminato viene mediato dall’interpolazione grafica (regressione)- e` spesso possibile rivelare errori dovuti all’operatore (es. discontinuita` della retta)- e` spesso possibile identificare la presenza di interferenti e/o effetto matrice

- permette una determinazione quantitativa senza conoscere la matura della matrice

SVANTAGGI:- e` un metodo di estrapolazione e quindi meno preciso di quelli per interpolazione (regressione)- ogni determinazione richiede la ripreparazione degli standard e la costruzione della curva di calibrazione

Le aggiunte sono in genere tutte uguali e il loro numero dipende da:- estensione del campo di linearita`- precisione richiesta

La quantita` aggiunta e` solitamente dello stesso ordine di grandezza di quella del campione.

CONFRONTO TRA PROCEDURE DI CALIBRAZIONE.

curva di calibrazione(validita` limitata all’immediata determinazione)(influenza dell’effetto matrice)

Metodo dello Standard InternoMetodo delle Aggiunte Standard

Metodi dello Standard Interno

I metodi di costruzione della curva di calibrazione e di aggiunta standard presuppongono:

1)precisa conoscenza dei volumi di campione e di standard2)costanza e ripetibilita`dei fattori che influenzano la misura

Poiche` per alcune tecniche analitiche questo non e` sempre vero (vedi stabilita` nel tempo del detector), nasce la necessita` di confrontare la misura conquella fornita da uno standard interno aggiunto sia agli standard della calibrazione, siaal campione da analizzare.

Conseguenze: la variabilita` dei fattori che influenzano la misura si esplicitano sia sull’analitasia sullo standard interno e il rapporto delle loro risposte si mantiene costante (a parita` di concentrazione): maggior affidabilita` analitica e durata della curva di calibrazione.

consideriamo

come l’equazione che esprime la risposta strumentale ad una certa concentrazione di due composti chimici diversi 1 e 2. Si avra` quindi:

analita

st. interno

se e derivano dalla stessa analisi, si ha e

FATTORE DI RISPOSTA

da cui:

METODO DELLO STANDARD INTERNO SINGOLO:1)si determina il valore di R da un’analisi fatta su un campione (+standard) noto2)si aggiunge una quantita` nota di standard al campione e si determina:

2222

1111

Cmky

Cmky

kmCy

2

1

22

11

2

1

C

C

km

km

y

y

1y 2y 21 kk

cost2

1 m

mR

2

1

2

1

C

CR

y

y

R

C

y

yC 2

2

11

METODO DELLO STANDARD INTERNO MULTIPLO:si ripete la misura su soluzioni contenenti conc. variabili di analita e conc. costante di standard interno

Il METODO DELLO STANDARD INTERNO puo` essere applicato attraverso:- l’uso dei fattori di risposta:

partendo da un campione incognito, si prepara un campione in cui l’analita e` presente in quantita` incognita x e lo standard interno e` presente in quantita` nota z

1C2C

IS

A

IS

A

IS

A

C

C

m

m

y

y

IS

A

IS

A

C

CR

y

y

A

IS

IS

A

C

C

y

yR

z

x

z

x

C

CR

y

y

R

C

y

yC z

z

xx

-l’uso della retta di calibrazione:si preparano vari campioni contenenti quantita` note di analita e la stessa quantita` di

standard interno

CONFRONTO FRA METODO DELLO ST. INTERNO SINGOLO E MULTIPLO:

- tempi di analisi: il metodo dello st. singolo e` molto piu` rapido: una volta determinato R bastauna sola misura, anche per piu` analiti (di cui sia noto il rispettivo R) in simultanea

- affidabilita` dei risultati: il metodo dello st. singolo e` meno affidabile perche` basato su una singola misura che puo` contenere errori casuali gravi, non mediati

- importanza della linearita`: nel caso dello st. singolo R e` assunto rigorosamente costante, mentrecon lo st. multiplo si costruisce una curva di calibrazione che potrebbe anche non essere lineare.

Le condizioni necessarie per poter applicare questi metodi sono:

- disporre di uno st. interno molto simile all’analita (chimicamente oppure in funzione della tecnica di analisi)

- lavorare all’interno del range operativo lineare

- se si utilizza un metodo di trattamento del campione e` necessario conoscere i recuperi relativiper l’analita e lo st. interno e correggere quindi le concentrazioni per tali fattori.

SCELTA DELLO STANDARD INTERNO:

un buon St. Interno deve essere:

- omologo all’analita (proprieta` chimiche e fisiche simili)- separabile dall’analita e dagli altri componenti del campione- non presente nel campione originale- non deve dare reazioni chimiche o altre interferenze col campione- miscibile col solvente impiegato per l’analisi

maggiore accuratezza e precisione(~0.5%) rispetto ad altreprocedure di calibrazione (~1-2%)

METODO DELLA NORMALIZZAZIONE INTERNA:

Non e` previsto confronto con alcun standard.La somma delle aree dei picchi (es. analisi cromatogr.) e` posta = 100 e le aree dei singoli picchisono riportate come %

CASO 1: la risposta del rivelatore e` la stessa per tutti i campioni. In questo caso la conc. % dei componenti = AREA%

CASO 2: i componenti danno risposte diverse.Si devono determinare i fattori di correzione o fattori di risposta da un cromatogramma di composizione nota. I fattori di correzione possono anche essere non assoluti ma relativia quello di un componente, posto = 1.

Requisiti. tutti i componenti devono essere:- presenti e visibili nel cromatogramma- disponibili e reperibili per poter determinare il fattore di risposta

Affidabilita` di un’analisi.

- Specificita`:- esistenza di sostanze interferenti (dovrebbero essere assenti o in conc. nota)- controllo additivita` degli effetti interferenti

- Accuratezza: bonta` di approsimazione del valore sperimentale (media campionaria) al valore vero (media della popolazione). L’accuratezza di una procedura analitica viene stabilita attraverso:

- metodo assoluto: analisi campioni noti; analisi di standard.- metodo comparativo: confronto con altre tecniche; metodo del recupero

- Precisione: ripetibilita` del metodo analitico. La precisione deve essere fornita insieme al risultato dell’analisi ed e` valutata per mezzo di parametri statistici: deviazione standard

CV%=s/quantita` *100La precisione ottenuta dipende da quella di tutti gli strumenti impiegati per l’analisi

- Sensibilita`: rapporto tra risposta strumentale e quantita` dell’analita.concetti collegati sono:

- rapporto segnale/rumore (S/N)- minima quantita` rivelabile (LOD)- minima differenza rivelabile

)1(

)( 2

n

xxs

METODO DEL RECUPERO:

Il recupero si valuta misurando concentrazioni di analita aggiunte a campioni reali (campioni spiked).

Recupero(%) = [( C1 - C2 ) / C3 ]·100

dove:•C1: concentrazione dell'analita misurata dopo l'aggiunta •C2: concentrazione dell'analita misurata prima dell'aggiunta •C3: concentrazione aggiunta

Tanto più il recupero è prossimo al 100% tanto il risultato è buono sebbene un recupero del 100% non indichi necessariamente l'assenza di errori. Il risultato finale dell'analisi può essere espresso tenendo conto della correzione apportata in funzione del recupero. È possibile ottenere anche valori superiori al 100%.Solitamente un metodo analitico prescrive che si debba rientrare entro un ben definito intervallo di valori di recupero.

CONFRONTO FRA TECNICHE ANALITICHE.(validazione di metodi)

relazione lineare tra le misure effettuate con due tecniche indipendentiavente pendenza = 1

RAPPORTO SEGNALE/RUMORE (S/N)

RAPPORTO SEGNALE/RUMORE (S/N) e LIMITE DI RIVELABILITA` (LOD)

LOD e` definito come:

se non e` presente un bianco daanalizzare si puo` utilizzarela dev. st. della regressione

questo e` il metodo piu` preciso per determinare LODperche` utilizza insieme retta di regressione e concetti di statistica