Agar Mac Conkey Penyediaan 2L

Objektif Untuk menyediakan agar mac conkey

Prinsip Menghasilkan pertumbuhan yang baik bagi bakteria gram negatif. Mempunyai Kristal violet yang merencatkan pertumbuhan bakteria gram positif.

Alat radas/bahan uji: 1. Air 2. Piring petri 3. Serbuk agar mac conkey

Prosedur: 1. 103mg serbuk agar darah dicampurkan dengan 2 L air. 2. Kacau menggunakan mesin stir 3. Autoclave pada suhu 121c selama 15 minit 4. Biarkan sebentar pada suhu bilik 5. Tuang dalam piring petri 6. Biarkan membeku pada suhu bilik

Keputusan 1

2

Penyediaan agar Mac Conkey

Objektif Untuk menyediakan agar mac conkey

Prinsip Merupakan agar pembezaan dan medium yang kurang selektif yang digunakan untuk membezakan bakteria yang memfermentasikan laktosa (LF) dan bakteria tidak menfermentasikan laktosa (NLF). Media ini diformulasikan untuk menghalang swarming pada Proteus spp.

Reagent/bahan: 1. 2. 3. 4. 5. 6. Media dihidrasi ( serbuk) MacConkey Distilled water @ diionised water Silinder penyukat Conical flask Agitator Heater

Prosedur: 1. Masukkan 50g serbuk media dihidrasi di dalam 1 liter air suling atau distilled water kedalam botol media. Campur dan sebatikan. 2. Panaskan di atas agitator sambil goncang perlahan-lahan dan didihkan selama 1 minit untuk memastikan serbuk media hancur sepenuhnya. 3. Autoclave selama 15 minit pada suhu 1210C. (Elakkan dari terlalu panas). 4. Biarkan media yang telah di autoclave pada suhu 50-550C, 5. Uji pH media menggunakan pH meter atau kertas pH ( pH akhir adalah 7.1 0.2 ) . 6. Sebatikan dan tuang/ masukkan ke dalam plat media @ petri dishes yang telah diletakkan diatas permukaan rata (spt. meja, bench). (PASTIKAN BILIK 3

ADALAH BERSIH, BEKAS STERIL DAN KAEDAH ASEPTIK DIGUNAKAN SERTA ELAKKAN DARI BERBUIH) 7. Setelah medium mengeras (membentuk gel) dan sejuk, susun dan masukkan dalam beg plastik untuk mengelakkan dari hilang lembapan. 8. Jangan tinggalkan plat media terdedah terhadap cahaya terang seperti cahaya matahari. 9. Simpan pada suhu 2-3 0C. 10. Penyediaan media bergantung kepada panduan pihak pengeluar 11.( Rujuk Manufacturer product insert)

Kawalan mutu: 1. pH media: 7.2-7.6 pada suhu bilik. 2. Fungsi media: ATCC 25922 E.coli dan ATCC 29212 E.faecalis boleh digunakan untuk menguji fungsi MacConkey tersebut. 3. (Rujuk TPM-012-01 )

Rujukan 1. Medical Laboratory Manual for Tropical Countries. Vol. 1, 2nd Edition. Microbiology. 1987. Monica Cheesbrough. 2. Product insert

Penyediaan Cled agar 4

Objektif Untuk menyediakan agar Cled Prinsip Digunapakai untuk spesimen urin bagi pencilan organsima. Media ini diformulasikan untuk menghalang swarming pada Proteus spp. Reagen/bahan: Prosedur : 1. Masukkan 36g serbuk media dihidrasi di dalam 1 liter air suling atau distilled water kedalam botol media. Campur dan sebatikan. 2. Panaskan di atas agitator sambil goncang perlahan-lahan dan didihkan selama 1 minit untuk memastikan serbuk media hancur sepenuhnya. 3. Autoclave selama 15 minit pada suhu 1210C. (Elakkan dari terlalu panas). 4. Biarkan media yang telah di autoclave pada suhu 50-550C, 5. Uji pH media menggunakan pH meter atau kertas pH ( pH akhir adalah 7.3 0.2 ). 6. Sebatikan dan tuang/ masukkan ke dalam plat media @ petri dishes yang telah diletakkan diatas permukaan rata (spt. meja, bench). (PASTIKAN BILIK ADALAH BERSIH, BEKAS STERIL DAN KAEDAH ASEPTIK DIGUNAKAN SERTA ELAKKAN DARI BERBUIH) 7. Setelah medium mengeras (membentuk gel) dan sejuk, susun dan masukkan dalam beg plastik untuk mengelakkan dari hilang lembapan. 8. Jangan tinggalkan plat media terdedah terhadap cahaya terang seperti cahaya matahari. 9. Simpan pada suhu 2-3 0C. Media dihidrasi ( serbuk) CLED Distilled water @ diionised water Silinder penyukat Conical flask Agitator Heater

5

10.

Penyediaan (Manufacturer guide) Kawalan mutu:

media

bergantung

kepada

panduan

pihak

pengeluar

1. 2.

pH media: 7.2-7.5 pada suhu bilik. Fungsi media: ATCC 25922 E.coli dan ATCC 29212 E.faecalis boleh digunakan untuk menguji fungsi agar CLED tersebut. (Rujuk TPM-012-01 ) Rujukan : 1. Medical Laboratory Manual for Tropical Countries. Vol. 1, 2nd Edition. Microbiology. 1987. Monica Cheesbrough. 2. Product insert

6

Pengendalian spesimen urin

Objektif Untuk mengesan organisma patogen yang menyebabkan jangkitan pada sistem urinari

Spesimen: 1. Midstream Urine 2. 3. Catheter urine Suprapubic needle aspiration (SPA)

Reagen : 1. Gram stain

2. Ujian biokimia (rujuk TPM-03)

Media: 1. Cystein Lactose Electrolyte Deficient (CLED)

2. MacConkeyAgar(MAC)

Peralatan/radas: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Wayar loop Penunu bunsen Inkubator Mikroskop Slaid kaca VITEX Uro Strip (irradiated absorbent strip)

Prosedur 7

Pemprosesan spesimen

A. Hari pertama 1. Rujuk Arahan Kerja Pengendalian Ujian di Makmal Mikrobiologi

(HSDG/P/PK11/AK/MB-01) untuk penerimaan spesimen. 2. Rekod keadaan fizikal spesimen samada jernih, keruh atau blood stained dalam petak Gram stain di dalam by specimen (LIS). 3. Labelkan CLED agar dengan barkod pesakit. Satu media CLED digunakan untuk 2 spesimen seperti yang ditunjukkan dalam diagram 1.0. 4. Celupkan urostrip ke tahap yang ditetapkan dan lekapkan di atas 5. media CLED untuk colony count ). 6. Lakukan streaking untuk kultur di ruang untuk inokulasi seperti yang ditunjukkan dalam diagram 1.0 dan juga lakukan inokulasi di atas media MAC. 7. Eramkan media CLED dan MAC pada suhu 35-370C selama 18-24 jam.

untuk pengiraan koloni (colonies count)

Untuk inokulasi

Diagram 1.0: Agar CLED dibahagikan kepada 2 bahagian

B. Hari kedua 1. Periksa media CLED dan MAC untuk pertumbuhan. 2. Lakukan pengiraan koloni seperti jadual dibawah:

JADUAL: Result Entry 8

Pengiraan koloni 0

Result entry (Media CLED) UNG

Deskripsi Colony count and culture. No growth was obtained. Colony count less than 10,000

organisms/ml urine 25 UR4 Culture heavily mixed growth.

Suggest to repeat

Colony count more than 100,000 organisms/ml urine. >25 UR5 Significant of bacteriauria. Culture.isolated

3. .Interpretasi kultur 9

A. Midstream urine: Pure culture : Pengiraan koloni >25 dengan pure growth. Lakukan identifikasi Jalankan ujian sensitiviti antibiotik.

Pengiraan koloni 6-25 Borderline Significant suggest to repeat Keluarkan laporan

Mixed culture Pengiraan koloni 6-25 1. 2 jenis probable patogen- Lakukan identifikasi dan sensitiviti untuk patogen bagi kes recurrent atau chronic urinary tract infection. 2. 2 jenis.probable patogen tetapi tidak diberi clinical history:Laporkan sebagai mixed growth 3 jenis mikroorganisma -Menunjukkan kontaminasi Laporkan,sebagai growth B. Sampel Catheterized urine: >25 pengiraan koloni : Pure growth: Lakukan identifikasi dan sensitiviti 2 jenis.probable patogen-Jalankan identifikasi dan sensitiviti 3 jenis-Menunjukkan kontaminasi Laporkan,sebagai Mixed growth Mixed

< 25 pengiraan koloni : Lakukan ujian identifikasi dan sensitiviti untuk pesakit: Yang sedang dalam rawatan antibiotik. Didiagnosis sebagai urethritis symptomatic males

10

C. Bladder tap /suprapubic aspirate

Identifikasi & sensitiviti dijalankan walaupun jumlah bilangan koloni adalah tidak significant.

4. Lakukan ujian biokimia/ vitex (jika berkaitan) rujuk TPM-03 danTPM-04 serta sensitiviti antibiotik (TPM-05). 5. Laporkan No growth sekiranya tiada pertumbuhan untuk urin mid-stream, catheterized atau suprapubic / bladder tap.

Hari ketiga: 1. Baca ujian pengenalpastian organisma dan ujian sensitiviti antibiotik (Rujuk TPM-03, TPM-04 dan TPM-05). 2. Jika ada keraguan dalam pengenalpastian mikroorganisma, sila rujuk pegawai sains untuk mengelakkan kelewatan melaporkan keputusan. 3. Rekodkan keputusan ujian biokimia pengenalpastian mikroorganisma dalam LIS. 4. Masukkan laporan di dalam sistem LIS (Bacteriology Department). Laporan akhir akan disahkan oleh Microbiologis/JTMP U36/MLT U32. Laporan : 1. Pegawai yang menjaga mestilah memastikan proses pengeluaran keputusan ujian dan cara melaksanakan ujian mematuhi piawaian yang ditetapkan. 2. Keputusan ujian akan disahkan oleh pegawai sains atau Juruteknologi Kanan. Mikroorganisma yang patogen

11

Organisma yang biasa menjangkiti sistem urinari E.coli Enterococcus spp.

Staphylococcus saprophyticus

Pseudomonas species

Staphylococcus epidermidis Klebsiella species Proteus species

Serratia marcescens Enterobacter spp. Bacteroides fragilis

Candida albicans and other species

Anaerobic cocci

Rujukan : 1. Medical Laboratory Manual for Tropical Countries. Vol. 1, 2nd Edition. Microbiology. 1987. Monica Cheesbrough 2. Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Test: Approved Standard. 7th Edition. Jan 2000 3. Description of Medical QAP Fungi. 1992 Pengedalian spesimen feses

Objektif Untuk mengesan organisma pathogen yang menyebabkan diarrea, disenteri dan demam enterik di dalam salur usus.

Spesimen : 1. Stool 2. Rectal swab

Reagen : 12

1. Gram stain 2. Ujian biokimia (rujuk TPM-03) Media : 1. Xylose Lysine Deoxycholate (XLD) atau 2. Salmonella shigella Agar (SS) 3. MacConkey Agar 4. Selenite F Broth 5. Campylobacter Agar (CAMP)- untuk pesakit 10, sel epitelia 10 cells).

5.

Lakukan pengkulturan: 1. 2. 3. 4. Emparkan sampel selama 20 minit pada 3000 rpm jika menerima CSF lebih daripada 1 ml . Jika sampel kurang daripada 1ml , vortex sampel tersebut. Ambil supernatant sebanyak 0.5 hingga 1.0ml dengan Pasteur pipet yang steril dan simpan. Vortex sedimen sekurang-kurangnya 30 saat lagi untuk dapatkan sebatiannya. Jangan gunakan pipet atau cotton swab untuk sebatikan sedimen tersebut kerana kemungkinan bakteria dan sel-sel 35

akan melekat pada tiub dan menyebabkan keputusan ujian menjadi negatif. 5. Dengan menggunakan sterile disposable Pasteur pipette, inokulat satu titik sedimen yang telah divortek pada BA, CHOC, SAB dan MAC. 6. 7. 8. Eramkan BA dan MAC pada 18-24 jam pada suhu at 35-370C. Eramkan CHOC di dalam 5%-CO2 incubator/Jar pada suhu 35-370C selama 24-48 jam, . Eramkan SAB pada 24-48 jam pada suhu 300C atau suhu bilik.

Lakukan ujian mikroskopik : 1. Buat calitan CSF atau sedimen yang telah diemparkan pada slaid yang bersih. Biarkan kering. 2. Buat pewarnaan dengan menggunakan teknik perwarnaan gram. (Sila rujuk dokumen : TPM-03-02) 3. Jika Cryptococcal disyaki wujud, lihat sel yis yang berkapsul dalam pewarnaan Indian Ink. (Sila rujuk dokumen: TPM-03-20) 4. Masukkan keputusan ujian ke dalam sistem. 5. Jalankan ujian Cryptococcus sekiranya terdapat capsulated yeast cell dari pencelupan Indian Ink walaupun tiada permintaan.

Hari kedua: 1. 2. Lihat pertumbuhan mikroorganisma selepas 18-24 jam pengeraman. Jika tiada pertumbuhan, eramkan semula dan perhatikan pertumbuhan selepas 48 jam. Perhatikan pada CHOC Agar untuk pertumbuhan bagi mikroorganisma fakultatif anaerob ( spt. Neisseria spp. dan Haemophilus spp). 4. Perhatikan BA untuk pertumbuhan organisma gram positif dan MAC untuk gram negative. Perhatikan pertumbuhan yis / fungus (spt: Cryptococcus neoformans, Candida spp) pada SAB. 6. 7. Rekodkan morfologi koloni yang tumbuh. Lakukan ujian biokimia, pengenalpastian organisma dan ujian sensitiviti. (Sila rujuk : TPM-03, TPM-04, TPM-05). 36

3.

5.

Hari ketiga: 1. Baca ujian pengenalpastian organisma dan ujian sensitiviti antibiotik. (Rujuk TPM-03, TPM-04 dan TPM-05). 2. Jika ada keraguan dalam pengenalpastian mikroorganisma, sila rujuk pegawai sains untuk mengelakkan kelewatan melaporkan keputusan. 3. Rekodkan keputusan ujian biokimia pengenalpastian mikroorganisma ke dalam LIS. 4. Masukkan laporan di dalam sistem LIS (Bacteriology Department). Laporan akhir akan disahkan oleh Pegawai Sains Kajikuman/ JTMP U36/ MLT U32.

Laporan: 1. Hurai dan laporkan keadaan sampel yang diterima samada clear, keruh (cloudy), xantochromic atau blood stain/ bloody. 2. Pengiraan sel (cell count) Lapor jumlah sel per liter dan laporkan samada sel mengandungi neutrophils atau lymphocytes. 3. Kultur : Kultur Positif - Laporkan keputusan ujian. Kultur Negatif - Laporkan Culture No growth Obtained. 4. Pewarnaan gram - Perhatikan bakteria dan sel pus/ leukosit. 5. Indian Ink Laporkan jika kelihatan yis berkapsul

Mikroorganisma yang Patogen

37

Gram positive Streptococcus pneumoniae

Gram negative Haemophilus influenzae Pseudomonas aeruginosa Enterobacteriaceae Proteus spp Salmonella spp. Bacteroides spp (Anaerob) Haemophilus influenzae type b Flavobacterium meningospeticum Neisseria meningitidis

Staphylococcus aureus Strept. agalactiae (group B) Listeria spp. Bacillus anthracis

Rujukan : 1) Medical Laboratory Manual for Tropical Countries. Vol. 1, 2nd Edition. Microbiology. 1987. Monica Cheesbrough 2) Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Test: Approved Standard. 7th Edition. Jan 2000

38

Pengedalian spesimen genital

Objektif Untuk mengesan organisma patogen yang menyebabkan penyakit kelamin (STD).

Spesimen : 1. Urethral swab. 2. External genitalia 3. Vagina 4. Endocervix

Reagen : 1. Pewarnaan gram 2. Ujian biokimia (rujuk TPM-03)

Media : Rutin 1. Columbia Horse with 5% Blood Agar (BA) 2. MacConkey No. 3 Agar (MAC) 3. Sabouraud Dextrose Agar (SAB) 4. Chocolate II Agar (CHOC)

Prosedur Pemprosesan spesimen Hari pertama: 1. Rujuk Arahan Kerja Pengendalian Ujian di Makmal Mikrobiologi

(HSDG/P/PK11/AK/MB-01) untuk penerimaan spesimen.

39

2. Untuk spesimen yang diterima dalam Transport Media, inokulasikan ke atas BA, MAC dan SAB. Eramkan BA, MAC selama 18-24 jam pada suhu 35370C dan SAB pada suhu 300C (suhu bilik).

3. Untuk spesimen endocervical dan urethral swab, inokulasikan ke atas CHOC dan eramkan pada suhu 18-24 jam di dalam inkubator karbon dioksida (5% CO2).

4. Calitkan spesimen di atas slaid kaca untuk pewarnaan gram. (Sila rujuk TPM03-07). Lakukan pemeriksaan mikroskopik dan laporkan:

Prosedur :

1. Anggaran bilangan bakteria yang kelihatan samada numerous, moderate,few or occasional. 2. Laporkan jenis tindakbalas pewarnaan gram: Gram positif atau Gram negatif.

3. Morfologi bakteria coccus, diplococci, rods atau coccobacilli. Termasuk selsel intracellular.

4. Jumlah bilangan leukocytes. 5. Sel yis , sel epithelial dan clue cells jika kelihatan.

Bacaan plat media

Hari kedua: Periksa semua plat media untuk pertumbuhan organisma. 2. 3. Jika tiada pertumbuhan, eramkan semula pada suhu dan tempoh yang sama (lakukan pembacaan semula selepas 48 jam). Pada plat agar BA perhatikan: Fenomena Haemolisis dan saiz koloni yang tumbuh. Koloni berwarna putih Pada plat agar CHOC perhatikan: Koloni jernih/tanpa warna dan bersaiz kecil Lakukan ujian Oxidase Lakukan ujian biokimia 40

1.

4.

5. 6.

Pada plat agar MAC perhatikan: Koloni Lactose fermenter merah Koloni Non-Lactose fermenter tanpa warna Pada plat agar SAB perhatikan: Koloni berwarna putih berdiameter 2mm. Lakukan ujian germ tube (Rujuk TPM-03-17). Jika positif laporkan Candida albicans dan negatif laporkan sebagai Jika terdapat pertumbuh fungus lain. Laporkan.

Candida sp. Lakukan ujian biokimia/ vitex (jika berkaitan, rujuk TPM-03, TPM-04) dan ujian sensitiviti antibiotik (TPM-05). Hari ketiga: Baca ujian pengenalpastian organisma dan ujian sensitiviti antibiotik. (Rujuk TPM-03, TPM-04 dan TPM-05). Masukkan laporan di dalam sistem LIS (Bacteriology Department). Laporan akhir akan disahkan oleh Pegawai Sains Kajikuman/JTMP U36/MLT U32) Lapoarn : 1. Pegawai yang menjaga mestilah memastikan proses pengeluaran keputusan ujian dan cara melaksanakan ujian mematuhi piawaian yang ditetapkan. 2. Keputusan ujian akan disahkan oleh Pegawai Sains Mikrobiologi atau Juruteknologi Kanan. 3. Laporan keputusan ujian akan dilaporkan seperti berikut: Koloni tulen atau 2 jenis koloni : Culture [Microorganism] Mixed growth 3 jenis organisma : Culture mixed growth of Isolated. [ ] type of Grams positive organism and [ ] type of Grams negative organism. Suggest repeat. pNo growth : Culture No growth Obtained. Normal flora (Non Pathogenic Organism) : Culture No

7.

Recognized Pathogen Isolated

Mikroorganisma yang Patogen: 41

Organisma patogen Candida albicans Candida sp. Streptococcus group B Trichomonas vaginalis Staphylococcus aureus (toxic-shock syndrome) Neisseria ganorrhoeae Haemophilus ducreyi

Organisma Komensal Enterobacteriaceae, /-streptococci Enterococcus sp. dipthteroids Coagulase negative

staphylococcus (varies with age) anaerobes

Rujukan : 1. Manual of Clinical Microbiology. 6th Edition ASM Press 1999. 2. Medical Laboratory Manual for Tropical Countries. Vol. 1, 2nd Edition. Microbiology. 1987. Monica Cheesbrough

42

Tiub germa

Objektif Fungus wujud dalam dua bentuk: yis dan hifa atau miselium. Pengkulturan fungus ke atas plat agar boleh menonjolkan dua bentuk ini iaitu koloni yis kelihatan bulat dan agak lekit, manakala koloni berhifa atau miselium seperti kapas atau permaidani pada permukaan media. Pada fungus berfilamen, pengamatan kultur secara in situ dapat dilakukan dengan teknik kultur slaid. Pengkulturan Candida albicans di dalam serum lembu mislnya boleh menunjukkan penghasilan tiub germa oleh yis berkenaan. Ini merupkan suatu ujian diagnostik.

Spesimen : Kultur yis

Reagen/bahan : 1. Tabung uji 2. Penganggas air (water bath) 3. Jarum inokulasi 4. Slaid mikroskop 5. Penutup slaid 6. Serum lembu (steril)

43

Prosedur Tatacara Kultur yang Merangsang Penghasilan Tiub Germa: 1. Masukkan 0.5 ml serum lembu (steril) ke dalam tabung uji. 2. Masukkan 1 koloni yis ke dalam serum dan leraikan sel-sel dari koloni dengan menggoncang-goncangkan jarum inokulasi di dalam serum. 3. Eramkan pada suhu 37C selama 3 jam di dalam penganggas air. 4. Buat pelekapan basah selepas 1 jam, 2 jam dan 3 jam, dan amati penghasilan tiub germa di bawah mikroskop.

Keputusan : Pengamatan dan Pentafsiran Tiub germa akan kelihatan sebagai filamen yang muncul daripada blastospora tanpa adanya penyempitan mahupun pembengkakan pada bahagian-bahagian tertentu di sepanjang filamen tersebut.

Dengan penyempitan

Tiada penyempitan

Kawalan kualiti: 1. Serum yang digunakan kali pertama harus diuji dengan suatu strain Candida albicans yang telah dipastikan boleh mengeluarkan tiub germa. 2. Pastikan ampaian yis yang disediakan tidak tebal kerana inokulum yang besar akan mengurangkan bilangan sel yang menunjukkan tiub germa (105 106 sel/ml adalah kepekatan optimum). 44

Rujukan : 1. Diagnostic Microbiology Bailey & Scotts 2. Medical Laboratory Manual for Tropical Countries. Vol. 1, 2nd Edition. Microbiology. 1987. Monica Cheesbrough

Ujian koagulase

Objektif Ujian untuk menentukan penghasilan enzim koagulase oleh Staphylococcus adalah suatu ujian penting dalam mikrobiologi diagnostic. Ia membezakan Staphylococcus patogenik kerana berkemampuan untuk menghasilkan enzim ini, daripada yang tidak menghasilkan atau tidak patogenik. Prinsip Terdapat dua jenis Coagulase, yang satu terikat pada dinding sel bakteria (coagulase terikat) dan tidak bebas, dan satu yang satu lagi dirembeskan oleh sel ke dalam media atau cairan (Coagulase bebas).Ujian slaid di mana penggumpalan atau pengelompokan bakteria dihasilkan dipercayai disebabkan oleh coagulase terikat yang terdapat pada dinding sel. Enzim bentuk ini bertindak secara langsung ke atas fibrinogen haiwan-haiwan tersebut dan menghasilkan fibrin yang memerangkap bakteria sehingga berlakunya penggumpalan/pengelompokan tersebut. Sebaliknya, coagulase yang dihasilkan secara bebas bertindak dengan protrombin untuk menghasilkan trombin, yang seterusnya bertindak ke atas fibrinogen untuk menghasilkan fibrin (pembekuan).

Spesimen : Kultur bakteria

Reagen/bahan: 45

1. Larutan salin 0.85% 2. Slaid mikroskop 3. Tabung uji slaid 4. Gelung dawai 5. Plasma 6. Water bath pada suhu 37C

Prosedur Ujian Coagulase slaid: 1. Letakkan setitis larutan salin steril di atas sebuah slaid mikroskop yang bersih dan kering. 2. Ambil beberapa koloni bakteria dengan gelung dawai steril. 3. Buatkan suspensi bakteria ini di dalam titisan salin. 4. Tambahkan setitis plasma kepada suspensi dan campurkan dengan gelung dawai. 5. Goncangkan slaid dan amatilah penggumpalan (clumping) bakteria yang akan kelihatan sebagai kelompak-kelompak putih dalam masa 15 saat.

Ujian Coagulase Tabung: 1. Sediakan 1:9 pencairan plasma di dalam larutan salin. 2. Sediakan suspensi Staphylococcus di dalam larutan salin (atau gunakan kultur broth). 3. Campurkan 1 isipadu suspensi bakteria dengan 5 isipadu larutan plasma. 4. Campurkan dengan memutarkan tabung uji di antara kedua-dua tapak tangan. Jangan goncang. 5. Eramkan pada suhu 37C di dalam water bath dan amati selepas 1, 3, dan 6 jam dan semalaman, jika masih negatif

Keputusan Pengamatan dan Pentafsiran Ujian Coagulase slaid: Ujian positif : Pembentukkan gumpalan bakteria 46

Ujian negatif : Tiada penggumpalan dan suspensi bakteria kelihatan homogen. Pentafsiran hasil positif : Bakteria memiliki enzim koagulase.

Ujian Coagulase Tabung: 1. Ujian positif : Pemazbentukkan pembekuan 2. Ujian negatif: Campuran tetap cair 3. Pentafsiran hasil positif : Bakteria memiliki enzim koagulase Kawalan kualiti Ujian Coagulase slaid 1. Pastikan hanya menggunakan ini kerana, kultur tulen Staphylococus bakteria yang apabila boleh

menjalankan

ujian

mana-mana

menggunakan citrate sebagi sumber tenaga boleh membebaskan kalsium yang akan mengakibatkan pembekuan plasma jika plasma tersebut diambil daripada darah yang bercampur citrate. Ujian ini digunakan semata-mata untuk membezakan antara strain yang menghasilkan koagulase daripada yang tidak. 2. Perlu diperhatikan, kadang kala plasma manusia boleh mengandungi bahan perencat yang akan memberikan hasil negatif palsu. 3. Plasma perlulah diuji terlebih dahulu dengan strain kawalan positif dan negatif sebelum digunakan. Ujian tersebut perlu dilakukan ke atas beberapa jenis bakteria kawalan yang memberikan hasil positif kuat, positif lemah dan kawalan negatif. 4. Pastikan koloni bakteria boleh diemulsifikasikan di dalam salin supaya tidak menimbulkan masalah dalam pembacaan hasil nanti. 5. Ujian positif palsu boleh berlaku jika penggumpalan yang berlaku lewat diambil kira. 6. Hasil positif yang berlaku lewat atau negatif diuji semula dengan ujian koagulase tabung kerana terdapat strain S. aureus yang menghasilkan hanya koagulase bebas yang tidak bertindak dalam ujian koagulase slaid. 47

Ujian coagulase tabung: 1. 2. Untuk memudahkan pembekuan diamati, tabung uji dicondongkan. Jika terdapat pembekuan, ia akan kekal di dasar tabung uji. Sesetengah strain staphylococcus menghasilkan enzim fibrinolisin yang akan melisis semula pembekuan plasma yang dihasilkan. Untuk mengelakkan daripada memperolehi hasil yang negatif palsu, tabung hasruslah diamati beberapakali sepanjang tempoh pengeraman. Pastikan tabung tidak digoncang semasa mengamati dan membaca hasil ujian (penghasilan pembekuan) kerana ini mengakibatkan pembekuan menjadi terlerai dan tidak dapat dikesan. 3. Spesimen yang memberi hasil negatif pada masa pengeraman 6 jam dieramkan semula semalaman kerana terdapat strain S. Aureus yang kadar penghasilan koagulasenya adalah rendah maka masa yang panjang diperlukan untuk koagulase mencapai aras yang memberi hasil yang positif (hasil positif yang lewat). Rujukan : 1. Diagnostic Microbiology Bailey & Scotts 2. Medical Laboratory Manual for Tropical Countries. Vol. 1, 2nd Edition. Microbiology. 1987. Monica Cheesbrough

48

Pewarnaan Gram Objektif/Prinsip Pewarnaan Gram adalah tatacara pewarnaan utama di bidang bakteriologi. Di samping membolehkan bakteria dilihat dengan lebih mudah, pewarnaan ini juga digunakan untuk menggolongkan bakteria. Dalam tatacara pewarnaan Gram, pewarna digunakan secara berlebihan dan kemudian agen penghapus warna atau pembeza digunakan untuk menghilangkan pewarna berkenaan. Bakteria yang mengekalkan pewarna pertama (kristal ungu) disebut sebagai positif, manakala yang kehilangan pewarna ini dan diwarnai dengan warna kedua dinyatakan sebagai Gram-negatif. Larutan iodin Lugol yang digunakan berfungsi sebagai mordan dan pelarut organic seperti alcohol dan aseton digunakan sebagai pembeza atau pengnyahwarna. Pewarna yang digunakan untuk menggantikan pewarna pertama yang dihilangkan oleh pembeza disebut pewarna balas (counter stain). Hasil tindak balas pewarnaan Gram adalah bergantung kepada komposisi dinding sel bakteria yang berkemampuan untuk mengikat pewarna pertama atau tidak. Protoplasma bakteria, dalam hal ini, sentiasa memberikan tindak balas Gramnegatif.

Spesimen : Reagen/bahan : 1. Kristal ungu 2. Iodin Lugol 3. Aseton-alkohol 4. Safranin/ karbol fuksin 5. Kertas turas Kultur bakteria

Prosedur : 49

1. Buat apusan bakteria pada slaid mikroskop, keringkan pada suhu bilik dan fiksasikan apusan tersebut. 2. Liputi apusan dengan Kristal ungu selama 1 minit. 3. Cuci dengan air, kemudian singkirkan keseluruhan air tersebut. 4. Liputi pula apusan dengan iodine Lugol selama 1 minit, kemudian buangkan. 5. Pegang slaid di dalam sinki secara condong dan titiskan dengan cepat aseton-alkohol ke atas apusan ketebalan apusan). 6. Segera cuci dengan air. 7. Kemudian liputi apusan dengan safranin atau karbol fuksin cair selama 30 saat. 8. Cuci dengan air dan keringkan dengan kertas penyerap (lipat kertas turas/ penyerap, masukkan slaid ke dalam lipatan dan tekan kertas dari luar sehingga semua air terserap daripada slaid tanpa menggosok permukaan slaid atau apusan. 9. Keringkan. sehingga tiada warna biru (Kristal ungu) terlihat keluar dari apusan (lebih kurang 3-10 saat bergantung kepada

Keputusan : 1. Sel bakteria bewarna biru : Gram positif

2. Sel bakteria bewarna merah/ merah jambu : Gram negatif.

Kawalan kualiti: 1. Diagnostic Microbiology Bailey & Scotts 2. Medical Laboratory Manual for Tropical Countries. Vol. 1, 2nd Edition. Microbiology. 1987. Monica Cheesbrou

Pewarnaan Ziehl Neelson 50

Objektif /Prinsip Pewarnaan Ziehl Neelsen merupakan pewarnaan tahan asid. Mycobacteria yang diwarnakan dengan pewarna fenilmetana (contoh: fuksin bes) dalam larutan aniline atau fenol akan mengekalkan warna tersebut meskipun telah didedahkan kepada asid yang kuat berbanding dengan bakteria jenis lain. Oleh begitu, mycobacteria dikenali sebagai bakteria tahan asid. Sifat tahan asid ini merupakan ciri berfaedah dan penting dalam membezakan mycobacteria dengan bakteria yang lain (beberapa spesies actinomycetes juga tahan asid). Pada bakteria tahan asid, pewarna fenol mempunyai kelarutan yang tinggi di dalam sel dibandingkan dengan pembeza (penghilang warna), warna berkenaan kekal di dalam sel, manakala pada bakteria tidak tahan asid pewarna tersebut akan hanya masuk ke dalam sel dan kemudian disingkirkan daripada sel oleh penghilang warna. Di samping ciri-ciri ini, kadar resapan pewarna pada sel yang tahan asid adalah rendah berbanding dengan sel tak tahan asid. Ciri-ciri ini disebabkan oleh perbezaan komposisi kimia (secara kuantitatif dan kualitatif) bakteria tahan asid dan bakteria tak tahan asid. Mycobacteria yang tahan asid mempunyai karbohidrat, alcohol dan asid lemak (seperti asid mikolik) yang tersendiri. Oleh yang demikian, dalam kaedah ini, slaid perlu dipanaskan sehingga wap keluar kerana haba digunakan untuk membolehkan pewarnaan terlaksana dalam jangka masa yang munasabah.

Spesimen : Kultur bakteria Reagen : 1. Karbol fuksin Ziehl-Neelsen 2. Acid alcohol 3. Metilena biru (Methylene blue) 4. Alkohol 5. Kertas turas 6. Pemanas 51

Prosedur : 1. Buat apusan bakteria pada slaid mikroskop, keringkan di udara dan fiksasikan apusan tersebut. 2. Banjirkan apusan dengan pewarna karbol fuksin Ziehl-Neelsen. 3. Panaskan slaid dengan alat pemanas sehingga keluar wap dari apusan selama 5-10 minit. (Pastikan pewarna tidak mendidih atau menjadi kering). 4. Biarkan sejuk dan cuci dengan air. 5. Tambahkan alkohol-asid (penghilang warna) selama 25-30 saat. 6. Cuci dengan air. 7. Liputi pula apusan dengan metilena biru selama 30 saat. 8. Cuci dan keringkan dengan kertas penyerap.

Keputusan: 1. Sel bakteria berwarna merah 2. Sel bakteria berwarna biru kehijauan : Bakteria tahan asid : bakteria tak tahan asid.

52

Mycobacterium TuberculosisRujukan: 1. Diagnostic Microbiology Bailey & Scotts 2. Medical Laboratory Manual for Tropical Countries. Vol. 1, 2nd Edition. Microbiology. 1987. Monica Cheesbrough

Ujian Oxidase 53

objektif untuk mengenapasti bakteria yang menghasilkan enzim cytochrome oxidase

Prinsip ujian Phenylenediamine akan di oksidasikan oleh bakteria yang menghasilkan enzim oxidase dan menghasilkan warna ungu.

Alatan dan radas: 1. 2. 3. 4. 5. reagen oxidase kertas turas koloni bakteria salin tube

Teknik ujian: 1. 2. 3. 4. 5. ambil reagen oxidase dengan kayu aplikator capurkan dengan ambil 0.5 ml saline dan campurkan dengan reagn oxidase ambil koloni dengan kayu aplikator dan letakkan diatas kertas lalu titiskan reagen oxidase yang telah dicairkan tadi diatas kertas turas perhatikan perubahan warna

keputusan ujian: 1. 2. positif- pembentukan warna unggu negatif- tiada kehadiran warna

54

Ujian Streptex

Objektif Membezakan diantara bakteria streptococcus A, B, C, D, F, G supaya ujian yang seterusnya dapat dilakukan Prinsip ujian Streptex merupakan ujian latex yang dugunakan untuk menegenalpasti kumpulan Lancefield streptococci..In Streptex, the antigen extract is obtained using a simple enzyme extraction procedure. Polystyrene latex yang telah disaluti dengan partikal group antibodi yang spesifik digunakan untuk mengenalpasti antigen didalam sampel. Aglutinasi akan terbentuk dengan kuat sekiranya ada kehadiran antigen homologus and sekiranya tiada antigen yang hadir latex akan berwarna lembut ataupun putih susu.

Radas/peralatan: 1. Kit reagen streprex 2. Suspensi koloni bakteria 3. Kayu aplikator Teknik ujian: 1. 0.5 McFarland saspensi koloni sampel. Suspensi dieram selama10 mins and pada suhu 37o. 2. titiskan setiap satu latex ujian (A, B, C, D, F, G) pada bulatan ujian diatas kad reaksi. 3. Titiskan saatu titis saspesi ujian tadi pada setiap kad ujian tadi. 4. Campur mengunakan kayu aplikator selama 1 minit. keputusan baca selepas 1 minit Keputusaan 1. 2. Positif kehadiran aglutinasi Negatif tiada aglutimasi 55

Penyediaan Filem darah tebal

Objektif Menyediakan filem darah tebal pada slaid

Prosedur : 1. Letakkan setitis darah ke atas slaid kaca. 2. Sediakan filem darah sederhana tebalnya serta mempunyai ukuran kira - kira sebesar syiling 5 sen 3. Keringkan filem darah tebal yang telah disediakan tadi

Keputusan

Filem darah tebal

56

Pewarnaan giemsa

Prinsip Pewarnaan mengndungi Giemsa digunakan untuk membezakan nukleus dan morfologi

sitoplasma platelets, seldarah putih, sel darah merah dan parasites. Pewarna ini azure B.. pewarna mesti dicairkan telebih dahulu menggunakn air buffered to pH 6.8

Bahan/radas: 1. Slaid Filem Darah 2. Larutan Metanol 3. Pencelup Giemsa 4. Larutan Buffer pH 7.2 5. Staining tray 6. Stopwatch 7. Pasteur pipet

Prosedur : 1. Selepas filem darah kering, fiksasikan filem darah nipis ke dalam metanol beberapa saat. 2. Sediakan Giemsa 10% : 3. ( 1 ml Larutan Giemsa + 9 ml Larutan Buffer pH 7.2) 4. Slaid tadi diletakkan ke atas staining tray dan tuangkan pencelup Giemsa tadi ke atasnya selama 20 minit. 5. Bilas secara perlahan-lahan dengan air yang mengalir 6. Kemudian,biarkan slaid kering dan di lihat di bawah mikroskop dengan kanta x100 57

Keputusan

trofozoit

merozoit

gametosit skizo n Plasmodium falciparum

Plasmodium vivax

58

Pemeriksaan filem darah tebal dan nipis untuk parasit malaria

Objektif memerhatikan kehadiran parasit selepas pewarnaan giemsa

Reagen/radas : 1. Slaid yang telah diwarnakan dengan pewarnaan giemsa

59

2. 3.

Mikroskop Minyak immersi

Prosedur : 1. Filem darah nipis

Arah pemeriksaan filem darah2. Filem darah tebal

Arah pemeriksaan filem darah

60

Pembilangan parasit malaria

Objektif Untuk menentukan paras infeksi dan mengawasi rawatan penyakit malaria Bilangan atau densiti parasit malaria dalam darah boleh ditentukan melalui 2 cara iaitu, 1. 2. Kualitatif (Sistem Plus) Kuantitatif (Pengiraan parasit per mikroliter darah)

Kuantitatif (Pengiraan parasit per mikroliter darah): 1. Cara ini adalah lebih tepat dan sesuai 2. Pemeriksaan pada filem darah tebal 3. Sekurang kurangnya 200 leukosit mesti dikira untuk mendapatkan keputusan yang tepat 4. 8000 leukosit/l darah akan digunakan sebagai piawai 5. Pengiraan leukosit dilakukan dengan menggunakan tally counter.

Formula :

61

PROSEDUR KERJA BAGI UJIAN-UJIAN YANG DILAKUKAN DI UNIT ATAU MAKMAL SEROLOGI

1. Menerima borang dan sampel dari wad, klinik dan hospital yang berdekatan. 2. Pastikan butiran pesakit betul dan mencukupi kriteria. (Data pesakit, clinical history, nama dan tandatangan doktor) 3. Sekiranya tidak memuaskan, rekod dalam buku Penolakan spesimen. Rujuk arahan kerja 4. Lakukan penyediaan reagen. 5. Lakukan penyediaan spesimen. 6. Label borang kerja berdasarkan ujian yang dipohon mengikut susunan kawalan. 7. Lakukan prosedur ujian. 8. Keputusan ujian direkod. 9. Keputusan disemak dan disahkan.

62

Ujian Anti Streptolysin O Titre (ASOT)

Objektif Untuk mengesan kehadiran anti streptolysin o antibodi dalam serum pesakit ASO antibodi yang terdapat pada pesakit apabila terdapat jangkitan bakteria . haemolytic Streptococci group A , C atau G .

Prinsip ASO latex partikel telah digabungkan dengan Sreptolysin-o dan apabila dicampurkan dengan serum yang mengandungi anti-streptolysin o, maka pembentukkan agglutinasi akan berlaku

Alat radas/bahan uji: 1. Slide black area 2. Reagen ASO Latex 3. Mikro pipet 4. Mesin rotate

Prosedur: 1. 50 mikroliter serum diletakkan di atas black slide. 2. 1titis reagen ASO Latex dititiskan pada serum. 3. campurkan dengan menggunakan mesin rotate selama 3 minit. 4. Bacaan keputusan menggunakan mata kasar.

Keputusan: 1. Positif = tiada agglutinasi 2. Negatif = agglutinasi 63

Ujian Saringan HbsAG

Objektif Untuk mengesan hepatitis B surface antigen.bagi pengesanan penyakit hepatitis B.

Prinsip Antigen akan bertindak balas dengan antibodi yang terdapat pada kolam plate mikrotiter. Penambahan antibodi berlabel enzim akan bertindak balas dengan kompleks antigen antibodi. Tindakbalas dengan substart akan memberikan perubahan warna, bacaan keputusan diperolehi.

Alat radas/bahan uji: 1. Reagen anti-Hbs 2. Substart buffer 3. Mikroplate 4. Rak sampel

Prosedur: 1. Serum pesakit dimasukkan ke dalam tiub dan diletakkan dalam rak sampel. 2. Lekattkan kod bar pad arak sampel 3. Masukkan dalam mesin cobas ELISA 411 4. Takan butang start pada skrin mesin 5. Bacaan keputusan akan dikeluarkan oleh mesin setelah ujian selesai dijalankan.

64

Keputusan

1. Positif = 10ul/L 2. Negatif = < 10ul/L

65

Mesin cobas E411

66

Ujian Saringan anti-HIV

Objektif Untuk mengesan antibodi HIV bagi pengesanan penyakit HIV

Prinsip Antibodi dalam serum pesakit akan bertindak balas dengan antigen yang terdapat pada kolam plate mikrotiter. Penambahan antibodi berlabel enzim akan bertindak balas dengan kompleks antigen antibodi. Tindakbalas dengan substart akan memberikan perubahan warna, bacaan keputusan diperolehi.

Alat radas/bahan uji: 1. Reagen HIV antigen 2. Substart 3. Mikroplate 4. Rak sampel

Prosedur: 1. Serum pesakit dimasukkan ke dalam tiub dan diletakkan dalam rak sampel. 2. Lekattkan kod bar pad arak sampel 3. Masukkan dalam mesin cobas ELISA 411 4. Takan butang start pada skrin mesin 5. Bacaan keputusan akan dikeluarkan oleh mesin setelah ujian selesai dijalankan.

Keputusan: 1. Positif = 1.0 67

2. Negatif =