Agilent Seahorse XF Live-Cell Metabolism Solutions for

STEM CELL RESEARCH

08.2017

製造元：XF シリーズ 日本総代理店：

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【References】❶doi: 10.1016/j.cmet.2011.06.011. [PubMed] 21803296　❷doi: 10.1016/j.stem.2012.10.002. [PubMed] 23122287　❸doi: 10.1089/scd.2016.0162. [PubMed] 27784195　❹doi: 10.1038/ncb3264. [PubMed] 26571212　❺doi: 10.1371/journal.pone.0077077. [PubMed] 24204740　❻doi: 10.1155/2017/5080128. [PubMed] 28265337　❼doi: 10.7554/eLife.13374. [PubMed] 27282387

細胞外フラックスアナライザー

幹細胞研究アプリケーション特集

細胞にとって何が重要かを計測する20,000の遺伝子、200,000のタンパク質、幾千もの経路に関し、細胞で一度にすべてを計測することはできません。しかしお客様は、それら“代謝”を駆動するエネルギーが何によって提供されるのかを計測することができます。Agilent Seahorse XFテクノロジーは細胞の生体エネルギープロファイルの変化をリアルタイムに検出し、細胞シグナリング、増殖、活性化、毒性、生合成を駆動するために必須な機能を知る手段を提供します。お客様の細胞が何たるかを超え、細胞が何を行っているかをより明確に描写しましょう。

Agilent Seahorse Wave ソフトウェアSeahorseの専用ソフトウェアであるWaveにより、生のカイネティックデータをパワフルな結果へと変換することが可能です。Waveにプレインストールされた各Seahorse XFアッセイキットに対するテンプレートとプロトコルに

より、アッセイデザインに要する時間を削減することができます。Waveはさらに、Seahorse XFのデータ解析と解釈を容易にするいくつかの解析ビューとエクスポート・オプションも提供しています。

※ご注意：本パンフレットに掲載の製品は、ライフサイエンス研究用です。人・動物の臨床用途に使用することはできません。

成果論文Seahorse XFを利用した幹細胞研究に関する研究成果論文はこちらからご覧いただけます。www.agilent.com/cs/pubimages/misc/StemCells_2017_April_BiblioPage.pdf

XF論文データベースwww.agilent.com/publications-database/

細胞運命の遷移をモニターする

分化とリプログラミングの結果を改善

細胞の年齢と起源、ドナーの多様性に加え、プロトコルの差異、増殖速度と培地の選択は、一貫性のないリプログラミングおよび／または分化効率に影響を与えます。細胞運命の変化が起こる前後に特徴づけられる代謝エネルギーの利用プロファイルは、代謝表現型を同定し、研究者が実施可能なリプログラミングと分化能を明らかにすることで、細胞機能の予測と確認を可能にします。

成人の線維芽細胞 幹細胞 造血細胞 脂肪細胞

肝細胞

心筋細胞

神経細胞

分化(iPS/ES Cells)

リプログラミング(iPS Cells)

細胞の代謝表現型解析は、未分化型と分化型との間の遷移を準備するための細胞のエネルギー要求性と経路選択性を計測します。代謝のスイッチングは、細胞が休止型から多能性状態へ、および／または多能性状態から分化型へと遷移する際に飛躍的に起こります。

Seahorse XF テクノロジー:

• 生細胞 • リアルタイム • ラベルフリー • ダイナミックなインジェクションポート• 酸素消費速度と解糖速度を同時に計測

Somatic oxidative bioenergetics transitions into pluripotency-dependent glycolysis to facilitate nuclear reprogramming. Folmes, C. D., et al. Cell Metab. 2011. 14: 264-71.❶

1

細胞代謝の表現型解析のパワー

多能性と分化の間の遷移を同定

Seahorse XF テクノロジー:• 異なる代謝の特性を計測する

• 各ステージにおける細胞表現型を特徴づける

• ルーチンかつ信頼性の高い幹細胞の表現型解析

• 新しいスタンダードとベンチマークの発見を容易にする

Seahorse XFテクノロジーは、細胞運命の遷移を予測し、モニターし、追跡することのできる、信頼性の高い計測が可能です。これらの代謝の計測が非効率性を最小化するための指標として使用可能であり、分化とリプログラミング・アプローチを改善することをご実感ください。ルーチンのアッセイは、細胞表現型と細胞遷移の同定を容易にします。さらに、Seahorse XFによる代謝の表現型解析は、お客様のアプローチをカスタマイズするためのツールと知識を提供し、新しいアッセイの開発を通して幹細胞研究の従来の境界を取り払います。

Seahorse XF テクノロジーは、酸化的代謝と解糖の速度を、ラベルフリー、リアルタイムに生細胞において同時に計測します。

“iPSCsとそれらの分化型の細胞は代謝的に異なっており、これらの代謝の指標は幹細胞のアイデンティティにとって重要である。” -Dr. James Ryall, University of Melbourne, Australia

心筋細胞

幹細胞

解糖

分化

リプログラミング

酸化的代謝 解糖

iPS 細胞

神経細胞 脂肪細胞 線維芽細胞

Metabolic plasticity in stem cell homeostasis and differentiation. Folmes, C. D., et al. Cell Stem Cell. 2012. 11: 596-606.❷

2▶最終ページ【References】に❶～❼の詳細がございます。

酸化的代謝型 グルコース

解糖乳酸

ピルビン酸

体性細胞

酸化的代謝

核リプログラミング

人工多能性幹細胞

解糖代謝型 グルコース

解糖

酢酸

乳酸

ピルビン酸

酸化的代謝

リプログラミング／多能性

3

分化

Reprogramming

4

リプログラミング効率の予測

Naïve 幹細胞とPrimed 幹細胞の区別による分化能の決定

予備呼吸能によりリプログラミング効率を予測

• ミトコンドリア呼吸能を最小化している体細　胞は、リプログラミングのための理想的な　候補です。• 予備呼吸能の効率がいつ最大化されたかが　分かります。• 細胞培養条件を最適化するために、このベ　ンチマークアッセイを用います。

細胞の品質管理• 多能性幹細胞の代謝の特性を評価すること　により、いつiPS細胞を保存すべきか、または　いつ分化を開始すべきかが明らかになります。• エネルギー経路の優勢は、細胞の分化に　関する準備状態を決定します。• 代謝スイッチのタイミングと効率を算出する　ことは、遺伝子ターゲティング効率の改善に　必須です。

Spare Respiratory Capacity

*****

*

OC

R (p

mol

/min

/mg/

mL)

Rep

rogr

amm

ing

ef�c

ienc

y (%

)

NHDF-1

NHDF-2

NHDF-3

0

-0,2

0,2

0,4

0,6

0,8

******

*

NHDF-1

NHDF-2

NHDF-3

0

0,1

0,05

0,15

0,2

0,25

H1 4iLIFH1

Elf1

**

***

NS

Naive Primed

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

Rel

ativ

e O

CR

chan

ges

afte

r FC

CP

Elf1

H1 4iL

IF H1 H7Time (min)

235

210

186

161

137

112

87

63

38

14

–110 19 38 57 76 94 113 132

Nor

mal

ized

OC

R (p

mol

/min

) Oligo FCCP Anti/Rot

より大きな予備呼吸能を持つ細胞は、iPS細胞を低い効率で産生します。

代謝特性の遷移が細胞運命の変化を促進します。

Mitochondrial Spare Respiratory Capacity Is Negatively Correlated With Nuclear Reprogramming Efficiency. Zhou, Y., et al. Stem Cells Dev. 2016. 26(3): 166-176.❸

The metabolome regulates the epigenetic landscape during naive-to-primed human embryonic stem cell transition. Sperber, H., et al. Nat Cell Biol. 2015. 17: 1523-35.❹

分化進行の根底にある代謝のスイッチング・イベントをモニターする

細胞運命の遷移• 予備呼吸能が細胞の分化に関する傾向を　示します。• 増殖と自己再生能を決定するために　解糖速度を計測します。• 代謝スイッチに基づき　コミットメントステージを決定します。

酸素消費速度の増加は、系統のコミットメント、分化、成熟のためのエネルギー要求の高さを反映している。

分化の確認

機能的なパフォーマンス • 代謝スイッチイベントを計測し、　初期の系統コミットメントを決定します。• 系統特異化の間、機能的能力を　実際の機能に適応させます。• 親細胞の表現型の代謝プロファイルと　比較することにより、疾病モデルの有効性を　確認します。

分化している肝細胞が酸化的な表現型へとスイッチする。

***

Reserve respiratory capacity

0

50

100

150

200

Day 2-

Stem Cell

Day 10

-Hep

Spec

Day 5-

Endo

Diff

Day 15

-Earl

y Hep

Mat

Day 20

-Late

Hep M

at

Mitochondrial Respiration Regulates Adipogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. Zhang, Y., et al. PLoS ONE. 2013. 8: e77077.❺

Bioenergetic Changes during Differentiation of HumanEmbryonic Stem Cells along the Hepatic Lineage. Hopkinson, B. M., et al. Oxid Med Cell Longev. 2017. 2017: 5080128.❻

Oxy

gen

cons

ump

tion

rate

(% b

asal

res

pira

tion)

疾患モデリング

5

Seahorse XFテクノロジーの仕組み

6

正常モデル 遺伝子欠損

遺伝子編集 リプログラミング自然発生的な染色体異常

遺伝子欠損を伴う多能性幹細胞

ES 細胞 体細胞

代謝の評価

がん研究

肝細胞研究

心血管研究 造血研究

神経生物学研究

肥満・糖尿病・代謝性疾患研究

Rotenone +Antimycin A

pmols/min/10µg

FCCP

NeuronNPC

機能的パフォーマンスとモデル関連性の計測

疾患モデルの最適化• 体細胞、由来細胞、多能性の中間体、　分化細胞を比較します。• 機能的結果を改善するために代謝を　調節します。• 細胞の特性評価のためにアッセイを　標準化します。

Metabolic reprogramming during neuronal differentiation from aerobicglycolysis to neuronal oxidative phosphorylation. Zheng, X., et al. Elife. 2016. 5:e13374 (data figure).❼

Seahorse XF アナライザー

Seahorse XF アッセイとキット

Seahorse XF アナライザーは、細胞の2つの主要なエネルギー代謝経路であるミトコンドリア呼吸と解糖を同時に計測します。計測には、ラベルフリーの生細胞を用い、マイクロプレート中に固体センサー付きのカートリッジを浸して行います。初代培養細胞や浮遊細胞だけでなく、膵島細胞、スフェロイド、単離ミトコンドリアを含む多くの細胞系での研究成果があります。

アッセイ 目的 価値

XF ミトストレステスト ミトコンドリア機能と予備呼吸能低い予備呼吸能は多能性を、高い酸化的リン酸化は分化を示す

XF Glycolytic Rate アッセイ 解糖の利用とエネルギー要求の補填能力 高い解糖能は多能性と増殖を示す

XF Mito Fuel Flex テスト3つの主要な基質酸化経路：グルコース、グルタミン、脂肪酸（経路依存性） グルタミンの除去は分化を促進する

XF Cell Energy Phenotypeテスト解糖と酸化的リン酸化を同時計測（経路の嗜好）

エネルギーマップは分化した細胞と幹細胞の集団を容易に区別する。スイッチは分化の成功に必須である。

全てを可能にする特許取得済の設計

Seahorse XFアナライザーは、特許取得済の一過性の微小環境を用い、これにより高感度、正確かつ、ラベルフリーの、生きた細胞におけるリアルタイムな代謝計測を可能にしています。

統合されたインジェクションポート。最大４種の化合物を連続的に注入することができ、ウェルごとに多様な条件を作りだすことができます。

センサープローブが穏やかに降下し、一過性の微小環境を形成します。これにより、細胞外培養液中の酸素とプロトン濃度を迅速・リアルタイムに計測することができます。

Seahorse XF 細胞培養用マイクロプレートは、組織培養処理とプレートリーダーに適応します。

不活性の光学的マイクロセンサーにより、酸素消費と細胞外酸性化の速度を同時に計測します。色素添加は必要ありません。

マイクロプレートウェルは従来のレスピロメーターと比較して10～20倍も少ない細胞数しか必要としません。