Agnès Mailloux, CNRHP, Hôpital St Antoine PERSPECTIVES DAMELIORATION POUR LA PRISE EN CHARGE DE LA FEMME RHD NEGATIVE

Agnès Mailloux, CNRHP, Hôpital St Antoine

PERSPECTIVES D’AMELIORATION POUR LA PRISE EN CHARGE DE LA

FEMME RHD NEGATIVE


INTRODUCTION INCOMPATIBILITES RHD

FOETO-MATERNELLES EN FRANCE

INCIDENCE estimée(pour 1000 naissances)

MORTALITE estimée &

MORBIDITE SEVERE

1966 5 à 6 ‰ ≥ 12% des casPrévention Rh cibléeBaisse de l’indice de

fécondité

Dépistage biologiqueMédecine néonatale

Échographie fœtaleTransfusions

fœtales IV

2006 ≈ 0,8 ‰ ≈ 4% des cas


Taux cumulés d ’immunisation anti-D en fin

de grossesses chez la femme Rh négatif

Spontané

Après Ig Rh post partum seulement

+ Ig Rh ante partum systématique

1.0%

12.0%

16.8%18.1%

1.0%

12.0%

2.5%

16.8%

5.2%

18.1%

10.2%

1.0%0.4%

12.0%

2.5%

0.5%

16.8%

5.2%

0.5%

18.1%

10.2%

3.5%

Nº1 Nº2 Nº3Nº4

Rang de grossesse

IMMUNOPROPHYLAXIE RHESUS Efficacité


IMMUNOPROPHYLAXIE RHESUS Le Principe Actif

Basée sur l’utilisation d’immunoglobulines polyclonales anti-D (IgRh) :

- Seule source : fractionnement de plasma humain, contenant un titre élevé d’anticorps dirigés contre l’antigène RhD

- Plasma humain : fourni par des donneurs RH-, hyperimmunisés par injections répétées de globules rouges RH+(rémunérés)97 % de plasmas collectés aux Etats-Unis

- Spécialité commercialisée en France :RHOPHYLACR (LFB : laboratoire Français du fractionnement et des Biotechnologies)


IMMUNOPROPHYLAXIE RHESUS Mécanismes possibles

3 MECANISMES POSSIBLES :Tous dépendent de la formation d’un Immun-complexe

IgG anti-D

Antigène RhD

I- Masquage des épitopes RhD par saturation des sites antigéniques RhD.

II- Inhibition des lymphocytes B spécifiques par interaction entre le RFcIIb lymphocytaire et le segment Fc des IgG anti-D.

III- Destruction antigénique par clairance macrophagique très rapide des globules rouges RhD+


IMMUNOPROPHYLAXIE RHESUS Inconvénients

- Médicaments dérivés du sang :

- Mesures maximales en matière de sécurité virale et autres agents infectieux (pour octroi d’AMM par Afssaps)… néanmoins toujours possibilité de transmission d’agents non répertoriés

- Règles de traçabilité

- Information systématique des patientes concernant un médicament dérivé du sang (nature des produits utilisés, risques liés à leur utilisation, mesures de sécurité prises pour la fabrication des produits)

- Liés au mode de préparation de ces Ig anti-D :

- Problème d’approvisionnement en plasmas hyperimmuns

-Problème d’ordre éthique liés à l’immunisation de sujets volontaires sains


IMMUNOPROPHYLAXIE RHESUS Perspectives

1- Ig MONOCLONALES

Actuellement l’immunoprophylaxie RH ante-natale concerne toutes les femmes RH- bien que 30 à 40 % d’entre elles portent un enfant RH-


Anticorps monoclonaux humains

• Transformation de lymphocytes humains par l’EBV

Ac 1

Ac 2EBV

clonagesélection

lymphocytes Btransformés

cellulesmononucléées

• Biologie moléculaire : Ac Mo humains recombinants• Souris humanisées : greffe des loci IgG humains

lignées B

IMMUNOPROPHYLAXIE RHESUS Production d’Ig MONOCLONALES


ADNc

Lymphocytes B (EBV)

PCRL

H

Vecteurd’expression

Transfection

CHOLignées cellulaires : BHK NS0…

anticorpsrecombinants

ARN

Clonagepromoter cassette vector

5720 bp

Amp r

néo

Kappa

intron chimérique pCIneo

promoter/enhancer

BGH polyA

polyA synthétique SV40 Enh-prom préc

Col E1 ori

SV40 ori

Ori f1

Aat IIBgl II

Pme I

Spe I

Nhe I

PRINCIPE

IMMUNOPROPHYLAXIE RHESUS Production d’Anti-D recombinants


IMMUNOPROPHYLAXIE RHESUS Sélection des Ig MONOCLONALESCANDIDAT IDEAL 1- AFFINITE +++ pour l’antigène RhD

(rendement de fixation, saturation des épitopes)

2-SPECIFICITE+++pas de réaction croisée avec une autre cible antigénique

3- SENSIBILITE+++ reconnaissance d’un maximum de variant

4- PHARMACOCINETIQUE équivalent à une IgG polyclonale

5- FORT POTENTIEL d’activation des récepteurs FcImportance de la glycosylation post-traductionnelle


IMMUNOPROPHYLAXIE RHESUS Sélection des Ig MONOCLONALESTESTS FONCTIONNELS

Pour mesurer la fixation des IgG anti-D aux différents récepteurs FcMesure ADCC (antibody/dependent/cellular/cytotoxicity), permet la mesure des interactions avec le récepteur FcRIIIa

Ag

FcRIFcRII

FcRIII

Ac

IgG

Lyse

Lymphocyte


IMMUNOPROPHYLAXIE RHESUS Test de clairance des hématies

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

-50 -40 -30 -20 -10 0 10 20 30 40 50 60 70 80

IgG polyclonalesVolontaire RhD- injection de 1,5 ml de GR RhD+ marqués au Cr51Injection de 10 g de poly D H0Injection de 100 g de poly D H50T1/2 : 18h pour 10 g T1/2: 3h pour 100 g

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

-60 -50 -40 -30 -20 -10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110

IgG monoclonalesVolontaire RhD- injection de 1,3 ml de GR RhD+ marqués au Cr51Injection de 871 g de MONO-DT1/2: 13,7 jours

100 g

10 g

Etude Yves Brossard CNRHP


AD1+AD3

Poly-D

Poly-D : n=4 AD1+AD3: n=8

Time

Test de survie des GRs

AD1+AD3mAbs

AD1+AD3 : clairance moins rapide et incomplète par rapport à celle obtenue avec les Ig polyclonales anti-D

Etude clinique : sujets Rh-, hématies Rh+ Cr51,

Ig polyclonale anti-D WinRh0,

Ac monoclonaux humains AD1+AD3 (V:V)

(1996)

IMMUNOPROPHYLAXIE RHESUS 1ers anticorps


R297 anticorps monoclonal du LFB Excellente clairance en comparaison avec un anti-D polyclonal

I.V. injection of autologous 51Cr RhD+ RBC into male volunteers:

- 51Cr RBC only, n=2 - 51Cr RBC 25% saturation with marketed Poly-D antibodies , n=7 - 51Cr RBC 25% saturation with Emabling® R297 anti-RhD mAb , n=7

51Cr RBC only #151Cr RBC only #2

Marketed poly-D #3

R297 #8

R297 #9

R297 #100

20

40

60

80

100

120

0.01 0.1 1 10 100

Time (h)

RhD

+ R

BC

(%

of

15

min

51C

r v

alu

e)

Marketed poly-D

IMMUNOPROPHYLAXIE RHESUS Clairance des GRs marqués au

51Cr


IMMUNOPROPHYLAXIE RHESUS Ig MONOCLONALES

Plusieurs anticorps monoclonaux sont en cours de développement et ont été évalués en clinique :

- Rheseclone : Russie , produit par une lignée lymphoblastoïde EBV, aucune donnée disponible

- BRAD-3 (IgG3) et BRAD-5 (IgG1) Royaume Uni par BPL (Bioproduct Labratories) seuls ou en association : capable d’induire une immunosupression chez des sujets RhD- ayant reçu des GR RhD+, mais clairance des hématies moins rapide que les Ig polyclonales

- MonoRh0 : Suisse, ZLB-CSL : testé chez volontaire Rh négatif immunosupression bien clairance d’hématies RhD+ injecté beaucoup plus faible qu’avec le RhophylacR

- R597 : France, LFB, sélection d’ un anticorps humain monoclonal recombinant sur la base de son activité fonctionnelle : Forte liaison aux récepteurs FcRIII, activation des cellules NK avec lyse des hématies RhD+, clairance d’hématies RhD+ aussi rapide que RhophylacR


IMMUNOPROPHYLAXIE RHESUS Ig MONOCLONALES

INCONVENIENTS :

-Problème des résistances éventuelles : développement d’anti-idiotype

-Pour prouver efficacité et pour envisager de remplacer les IgG polyclonales : besoin d’une évaluation à grande échelle


IMMUNOPROPHYLAXIE RHESUS Perspectives

2- GENOTYPAGE

Actuellement l’immunoprophylaxie RH ante-natale concerne toutes les femmes RH- bien que 30 à 40 % d’entre elles portent un enfant RH-


LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL LE COMPLEXE Rh

Protéine RHD :protéine transmembranaire du Globule Rouge15000 sites par GR RhD+


LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL LA PROTEINE RHD


LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL LE LOCUS RH

Isolement et séquençage du gène RHD par l’équipe française INSERM U76, Y. Colin et al. Genetic Basis of the RhD-Positive and RhD-Negative Blood Group Polymorphism as determined by Southern Analysis . Blood 1991 ; 28 : 2747-52


LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL Liquide amniotique - Plasma

I - Génotypage RHD fœtal réalisable sur l’ADN des cellules amniotiques (année 90)P.R. BENNET et al. N.eng.J.Med. 1993; 329:607-610

J.T. AUBIN et al. Br J Haematol 1997 ; 98 (2) : 356-364.

- Diagnostic invasif

II – Génotype RHD fœtal à partir du sang des femmes enceintes RhD – Suite à la découverte de la présence d’ADN fœtal dans le plasma des femmes enceintes ( 1 à 6 % d’ADN d’origine fœtale sous forme acellulaire)LO Y.M. et al. Am J Hum Genet, 1998, 62 : 768-775.

- Diagnostic non invasif

Limite du test : femme ne doit pas posséder dans leur génome des séquences non exprimées du gène RHD.


LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL ADN fœtal dans le plasma maternel

ADN fœtaldans le plasma

Quantité de Génomes

(par ml de plasma maternel)

25 (3 à 70) à 15 S.A.

290 (77 à 769) à terme

Isolement

Rapide, simple

Persistance in vivo

Demi-vie< 1 heure


LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL INTERET

I- GROSSESSES AVEC IMMUNISATION ANTI-D

Diagnostic d’Incompatibilité foeto-maternelle RhD

(environ 1000 cas / an en France avec 90% de fœtus Rh+)

II- GROSSESSES SANS IMMUNISATION ANTI-D :

Cibler l’immunoprophylaxie Rh anténatale et les RAI

itératives aux seules femmes Rh - avec fœtus Rh+ (environ 120.000 femmes / an en France avec 65% de fœtus RH+)

Validation du génotypage non invasif par une étude portant sur 851 femmes enceintes au CNRHPC. Rouillac-Le Sciellour et all Large scale Pre-Diagnosis study of Fetal RHD Genotyping by PCR on plasma DNA from RhD-negative Pregnant women. Mol Diagn 2004 ; 8; 23-31.


LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL EN PRATIQUE

- Sang maternel collecté sur EDTA ( 5 à 7 ml), 48h max entre prélèvement et réception au laboratoire

- Centrifugation puis décantation plasma- Extraction de l’ADN plasmatique- Amplification par PCR des séquences spécifiques du gène RHD :

- exon 7 ( plus spécifique mais moins sensible)

- exon 10 (plus sensible mais moins spécifique)- Les 2 amplifications distinctes permettant d’augmenter la sensibilité du test

et détecter un maximum de variant du système RH

SI FŒTUS RH- REPETER LE TEST SUR UN SECOND PRELEVEMENT• Concentration plus élevée d’ADN fœtal

2) Rattraper une erreur d’étiquetage

3) Rattraper un croisement per-analytique des échantillons


LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL EVOLUTION

Coopération RECHERCHE –INDUSTRIE (INSERM – INTS- CNRHP - J.BOY) Trousse développée en 2006-2007Kit de 1ère génération pour PCR en Temps Réel avec reporter

fluorescent.Marquage CE obtenu en JUIN 2007 Cibles: exons X et VII (amorces CNRHP)Sonde Taqman

Projet STIC 2007-2008: Génotypage RHD fœtal non invasif systématiqueParis-CNRHP / Marseille / Lille / Poissy / Nantes OBJECTIFS MEDICO-ECONOMIQUES:

-Diminution des injections inutiles d’IgRH et des RAI chez les femmes avec fœtus Rh négatif ?- Amélioration de la compliance à la prévention Rh anténatale, ciblée ou systématique chez les femmes avec fœtus Rh positif ?

- Evaluer la faisabilité et le coût d’un programme de Génotypage fœtal RH systématique dans le cadre actuel du suivi prénatal en France.


LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL REGLEMENTATION

Depuis le décret 1661 du 22 décembre 2006 le génotypage fœtal RHD peut être effectué uniquement :

Dans un laboratoire autorisé par l’Agence Régionale d’Hospitalisation, après avis de l’Agence de Biomédecine.

Par des biologistes agrées par l’Agence de Biomédecine.

Documents

Agnès Mailloux, CNRHP, Hôpital St Antoine PERSPECTIVES DAMELIORATION POUR LA PRISE EN CHARGE DE LA FEMME RHD NEGATIVE