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Análisis
Instrumental
Prof. Dr. Eliel R. Romero García
® ®
VIII- Métodos de
aislamiento y
purificación
Antecedentes
•A mediados del siglo XX la mayoría de las separaciones analíticas
se llevaban a cabo por los métodos clásicos (v.g. precipitación,
destilación y extracción), pero ahora muchas de ellas se realizan por
cromatografía y electroforesis.
•La cromatografía es un método aplicado en múltiples ramas de la
ciencia (v.g. Química analítica, Bioquímica, Ciencias de los
materiales, Química Ambiental).
•A principio del siglo XX, Mikhail Tswett separó los pigmentos
vegetales(clorofilas y xantofilas) haciendo pasar disoluciones de
estos compuestos a través de una columna de vidrio rellena con
CaCO3 finamente empacado. Las especies separadas aparecían
como bandas coloreadas en la columna por lo que le designó a su
método Cromatografía, del griego chroma «color» y graphein
«escribir».
•Múltiples premios Nóbel han sido otorgados a investigadores que
hicieron uso de técnicas cromatográficas en sus hallazgos entre
1937 y 1972.
Generalidades
• La cromatografía agrupa un conjunto de métodos y técnicas científicas
que permiten separar compuestos estrechamente relacionados en
mezclas complejas.
• En toda separación cromatográfica, la muestra se desplaza con una
fase móvil (sea gas, líquido o fluído supercrítico), y dicha fase móvil se
hace pasar a través de una fase estacionaria con la que es inmiscible, y
que se fija a una columna o una superficie sólida.
•Los componentes de la muestra se deberán distribuir de modo distinto
entre ambas fases, pues aquellos componentes que son retenidos
fuertemente por la fase estacionaria se moverán lentamente con el flujo
de la fase móvil; de otra forma, los componentes que se unan débilmente
a la fase estacionaria fluirán con rapidez con la fase móvil.
•En consecuencia de la misma movilidad, los componentes de la muestra
se separan en bandas o zonas discretas que pueden analizarse (de
manera cualitativa y/o cuantitativa).
Clasificación de los métodos cromatográficos
Los métodos cromatográficos se pueden clasificar de dos maneras:
1. Por el tipo de contacto:
• Cromatografía de columna: un tubo estrecho contiene la
fase estacionaria a través de la cual se hace pasar la fase
móvil a presión
• Cromatografía en un plano: la fase estacionaria se fija
sobre una placa plana o a los intersticios de un papel, en
donde la fase móvil se desplaza a través de la fase
estacionaria por capilaridad o gravedad
2. Por el tipo de fase móvil y estacionaria y los equilibrios de
transferencia de los solutos en las fases:
• Cromatografía de líquidos
• Cromatografía de gases
• Cromatografía de fluídos supercríticos
Antecedentes….
Uno de los ejemplos más básicos y de importante aplicación en
los inicios de la separación y purificación de sustancias es la
cromatografía en papel
Cromatografía en papel
Flujo de
la fase
móvil
Aplicaciones de la cromatografía de líquidos
Exclusión por tamaño
Penetrabilidad sobre gel Filtración sobre gel
Adsorción Intercambio
iónico
Reparto
Reparto en
fase reversa
Reparto en
fase normal
102
103
104
105
106
Pes
o m
ole
cula
r
Polaridad creciente
Insoluble en agua Soluble en agua
No polar Iónico
No iónico polar
• Gran parte de la Bioquímica moderna se basa en el uso
de métodos de cromatografía en columna y la
electroforésis para separar las biomoléculas, en particular:
1. La cromatografía de intercambio iónico
2. La cromatografía de afinidad
3. Cromatografía líquida-sólido (o de adsorción)
4. Cromatografía de exclusión molecular
Tipos de cromatografía de Líquidos
1. Cromatografía en fase Normal (NPC):
•Permite separar moléculas en base a su polaridad,
•Utiliza una fase estacionaria polar y una fase móvil apolar, y se utiliza cuando el compuesto
de interés es muy polar.
•El analito polar se asocia y es retenido por la fase estacionaria y la fuerza de absorción
incrementa a medida que aumenta la polaridad del compuesto y la interacción entre el
compuesto polar y la fase estacionaria polar (en comparación a la fase móvil) aumenta el
tiempo de retención.
•La fuerza de interacción no sólo depende de los grupos funcionales del compuesto de
interés, sino también por efectos estericos, útil para separar y diferenciar los isómeros
estructurales.
•El uso de disolventes más polares en la fase móvil disminuye el tiempo de retención de los
compuestos mientras que los disolventes más hidrofóbicos tienden a aumentar el tiempo de
retención.
•La NP-HPLC ya no es comumente utilizada con la aparición de la RP-HPLC por la falta de
reproductibilidad de los tiempos de retención puesto que los disolventes próticos alteran el
estado de hidratación de la silica o alúmina de la fase estacionaria.
Tipos de cromatografía de Líquidos
2. Cromatografía en fase reversa (RPC):
• Permite separar moléculas en base a su polaridad,
• Consiste en una fase estacionaria apolar y una fase móvil de polaridad moderada.
• El principio de la cromatografía en fase reversa es semejante al de la
cromatografía en capa fina (Thin Layer Chromatography “TLC”).
• La fase estacionaria es de partículas de sílica químicamente modificadas con
hidrocarburos saturados, insaturados o aromáticos de diferentes tipos. Esto
convierte a la fase estacionaria en una matríz apolar.
• Para este tipo de cromatografías se emplean mezclas de solventes polares, tales
como agua, acetonitrilo, acetato de etilo, acetona y alcoles alifáticos.
• También se conoce como cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) cuando
se emplean substituyentes y matrices compatibles con fluidos biológicos, p.ej. En
la purificación de proteínas y carbohidratos.
•En este la RPC las moléculas se retienen en la columna en virtud de las
interacciones hidrofóbicas que establecen con la sílica modificada, aunque dichas
interacciones son en general bastante débiles, son generalmente muy numerosas y
para “eluír” las moléculas es casi siempre necesario disminuir la polaridad del
disolvente; para ello se puede substituir el agua de la fase móvil con un solvente
orgánico cuya concentración se va aumentando gradualmente.
•La versatilidad y eficiencia de este tipo de cromatografía se ha visto incrementada
con el uso de sistemas de alto desempeño (HPLC, del inglés "High Performance
Liquid Chromatography") que utilizan alta presión para mejorar la resolución y
reducir los tiempos de separación.
•Los sistemas de alto desempeño pueden también emplearse en otros tipos de
cromatografías, de manera que para referirse a la cromatografía en fase reversa en
sistemas de alto desempeño se emplea la abreviatura HPLC-RPC.
•Por ejemplo en la separación e identificación de Péptidos y aminoácidos.
•En la separación de aminoácidos y péptidos mediante fase reversa la resina
más comúnmente empleada posee una cadena lineal de 18 carbonos y se
denomina como C18.
|SiO2|-(CH2)17-CH3
•Se requiere de sistemas C18-HPLC.
•La muestra se aplica a la columna en solución acuosa acidificada con ácido
trifluoroacético, un ácido orgánico volátil y que se requiere muy puro. Para
mejorar la solubilidad de los péptidos formados por aminoácidos muy apolares
se añade al solvente un 10 a 20% de acetonitrilo (CH3CN).
•A fin de eluír de la columna los aminoácidos más apolares es necesario
aumentar la concentración de acetonitrilo en el sistema. Esto se hace en forma
gradual durante la elución, lo cual permite una gran resolución en la
separación de las moléculas.
•El sistema C18-HPLC completo requiere, una bomba peristáltica
que inyecta la fase móvil a la columna a alta presión para que el
flujo de líquido sea adecuado, un generador de gradientes para
variar la proporción de solvente en la fase móvil y el inyector
permite la aplicación de la muestra.
•A la salida de la columna se coloca un detector (generalmente de
absorción ultravioleta o de fluorescencia) y si se desea recuperar
las moléculas que eluyen de la columna, se requiere un colector.
•En el análisis y la cuantificación de aminoácidos, la recuperación
de la muestra es innecesaria; pero cuando se separan péptidos
producto de la fragmentación de una proteína para propósitos de
secuenciación, el colector es indispensable.
Cromatograma típico
Los picos se relacionan según su "tiempo de retención" con estándares, que permiten
identificar los aminoácidos presentes en la mezcla. La cantidad relativa de cada uno de
ellos se determina calculando el área la curva del pico correspondiente.
1. Cromatografía de adsorción (líquido-sólido):
La fase estacionaria es un sólido sobre el que las moléculas se adhieren por un
efecto de adsorción físico-químico.
El parámetro implicado es el coeficiente de adsorción
El mecanismo de separación esta basada en la competencia de los
componentes de la muestra por los sitios activos en un absorbente como el
silicagel.
2. Cromatografía iónica:
La fase estacionaria presenta en su superficie sitios
iónicos y la fase móvil es una disolución tampón acuosa
La fase estacionaria permite el intercambio de estos
contraiones móviles con iones de la misma carga de la
muestra.
La separación depende de los coeficientes de distribución
iónica
Materiales de relleno de las columnas de intercambio
aniónico y catiónico (fase estacionaria)
Cromatografía de
intercambio iónico
3. Cromatografía de exclusión:
La fase estacionaria es un material poroso, cuyo
tamaño de poro se eligen en relación con el tamaño de
las especies por separar.
Se realiza un tamiz molecular de permeabilidad
selectiva
También designada como filtración en gel o
permeabilidad en gel, según la naturaleza acuosa u
orgánica de la fase móvil
El coeficiente de distribución se designa como
coeficiente de difusión
The largest molecules will elute first with a volume
equal to the void volume and the smallest molecule will
elute last with a volume equal to volume 1 and volume 2
Large molecules
cannot penetrate the
pore of the matrix
and the accessible
volume for large
molecules is equal to
volume 1
Medium-sized molecules
can partially penetrate
the pore and the
apparent column
volume will be equal to
volume 1 plus part of
volume 2
Small molecules can
completely penetrate the
pore and the accessible
volume will be equal to
volume 1 plus volume 2.
Selectividad: Distribución por el tamaño de poro
Cromatografía de exclusión
molecular
•Cromatografía líquido-líquido (o de reparto):
La fase estacionaria es un líquido inmovilizado sobre un
material inerte y poroso que solo desempeña un papel de
apoyo
El proceso transcurre por impregnación
4. Cromatografía de afinidad (de fase enlazada):
La fase estacionaria se fija covalentemente a un polímero.
La fase móvil transporta los analitos que se unen por
enlaces coordinados a la fase estacionaria para ser luego
removidas las moléculas afines por el paso de moléculas de
mucho mayor afinidad y son arrastradas por la elución.
El método se basa en un coeficiente de reparto “K” de la
disolución entre las dos fases.
Cromatografía de afinidad
Aplicaciones de la cromatografía de líquidos
1. Purify protein in one day ??
Among about of dozen kinds of chromatography the most universal
and useful are:
Cromatography type Purification fold
Ion-exchange chromatography 2 - 10
Gel-filtration 2 - 3
Hydrophobic chromatography 2 - 10
Affinity and pseudo affinity chromatography up to hundreds
Muestra
MW<2000
MW>2000
Hidrosolubles
Iónico
No iónico
IC
HPLC
pares iónicos
HPLC
fase normal
HPLC
fase inversa
Organosolubles
Polar
No polar
HPLC
fase normal
HPLC
fase normal
HPLC
fase inversa
HPLC
fase inversa
Hidrosolubles
Organosolubles
SEC
Filtración en gel
IC
HPLC
fase inversa
SEC
Permeabilidad en gel
Guía para la selección de diferentes técnicas cromatográficas
que utilizan una fase móvil líquida
Sample Type LC Mode
Positional isomers LSC or LLC
Moderate Polarity Molecules LSC or LLC
Compounds with Similar Functionality LS or LLC
Ionizable Species IEC
Compounds with Differing Solubility LLC
Mixture of Varying Sized Molecules GCC
II. Cromatografía de gases (GC)
•La fase móvil es un gas inerte (H, He, N2)
•Se dividen según el fenómeno aplicado en:
•Cromatografía gas-liquido:
La fase móvil es un gas y la estacionaria es un líquido
impregnado a un soporte inerte que puede ser simplemente la
pared de la columna
El coeficiente de reparto K es el implicado
•Cromatografía gas-sólido:
La fase estacionaria es un sólido poroso (grafito, gel de sílice
o aluminio) y la móvil es un gas
Efectiva para mezcla de gases y compuestos volátiles
El parámetro implicado es el coeficiente de adsorción
Cromatógrafo de gases
• Columna tubular abierta de pared recubierta (WCOT):
la pared interior de la columna está recubierta de una fase
estacionaria líquida.
• Columnas tubulares abiertas recubiertas de soporte
(SCOT): la fase estacionaria líquida recubre un soporte
sólido unido a la pared interior de la columna.
• Columna tubular abierta de capa porosa (PLOT): la
pared interior está recubierta de una fase estacionaria
sólida.
• Al disminuir el grosor de la fase estacionaria
1. disminuye la altura de plato
2. disminuye el tiempo de retención
3. disminuye la cantidad de analito que se puede analizar
Columnas para CG
Cromatografía de gases: las columnas de separación
• El teflón es un polímero prácticamente inerte usado para la CG:
-CF2-CF2-CF2-CF2-CF2-
Cromatografía de gases: las columnas de separación
• CG o CL con fase estacionaria quiral (ópticamente activa) es útil para separar enantiómeros,
v.g. los L y D aminoácidos
• Las ciclodextrinas son muy útiles para estas separaciones ya que poseen una cavidad quiral
hidrófoba de 0.78 nm y otra apertura opuesta más pequeña, cuyos extremos hidroxilos se
pueden bloquear con cadenas de pentilo o trifluoroacetilo (-C(=O)-CF3) para disminuir la
polaridad de las caras. Cada enantiómero posee distinta afinidad por la cavidad interior de la
ciclodextrina, por lo que dos enantiómeros se separan a medida que pasan por la columna
• Medicamentos hidrófobos que son insolubles en agua forman complejos estables dentro de las
ciclodextrinas cuyo interior es hidrófilo, por lo que se plantea su uso en formulaciones de
medicamentos
Aplicaciones de la CG para los distintos
tipos de columnas
SOLVENTES
Solventes Polares
Water > Methanol > Acetonitrile > Ethanol > Oxydipropionitrile
Solvents No polares
N-Decane > N-Hexane > N-Pentane > Cyclohexane
III. Cromatografía de fluidos supercríticos (SFC)
•La fase móvil es un fluido en estado supercrítico, v.g. CO2 a
50 °C y 150 bar (15 MPa); los SFC comparten características
de líquidos y de gases
•La fase estacionaria puede ser un sólido o líquido
•Reúne las ventajas de la LC y la GC
Los Cromatogramas
Separación de una mezcla A y B por cromatografía de elución en columna y la
señal de salida del detector en las distintas fases de la elución
Distancia
recorrida
• El detector responde a la concentración de los analitos y se coloca al final de la columna,
registra la señal en función del tiempo (o del volumen de la fase móvil añadido), se obtienen
una serie de picos, generando un gráfico denominado CROMATOGRAMA.
• Los cromatogramas son útiles para el análisis cualitativo y cuantitativo, puesto que la
posición de los picos en el eje del tiempo puede servir para identificar los componentes de la
muestra
•Las áreas bajo los picos proporcionan la medida cuantitativa de la cantidad de cada
componente.
Esta especie es retenida
más fuertemente, por lo
que se retrasa durante la
migración
CROMATOGRAMAS
metros
• En ocasiones, la identificación de los compuestos moleculares por
cromatogramas es aleatoria, por lo que se recomienda asociar dos
técnicas complementarias, v.g. un cromatógrafo acoplado a
espectrómetro de masas o IR.
• Estos métodos de segundo orden permiten colectar la información de
forma independiente y determinar con certeza la composición de las
mezclas complejas o la concentración de ciertos compuestos (v.g. de
cantidades del orden de nanogramos)
Aumento de
la separación
de las bandas
Disminución de
las velocidades
y la dispersión
de las bandas
Bandas
dispersadas
y solapadas
• El movimiento de avance por la columna aumenta la distancia entre las dos
bandas y al mismo tiempo ocurre un ensanchamiento de ambas zonas
• Conforme pasa el tiempo de recorrido se ensancha la banda de resolución de
cada componente, por lo que disminuye la eficacia de la columna
Efecto de la velocidad de migración
• La eficacia de una columna para separar dos solutos depende, en parte, de las
velocidades relativas con las que eluyen las dos especies y son determinadas por
las constantes de equilibrio durante la distribución
• El equilibrio de distribución implica la transferencia de analito entre las fases
móvil y estacionaria
Amóvil Aestacionaria
• La constante de equilibrio K para este proceso se denomina constante de
distribución (razón de distribución o coeficiente de distribución):
• Esta ecuación se limita a la proporción directa entre las concentraciones de
soluto en la fase móvil y la estacionaria en la cromatografía lineal en donde los
cromatogramas muestran picos gaussianos simétricos y de tiempos de
retención idependientes de la concentración de analitos
Velocidad de migración
M
S
C
CK
Factor de retención
•Cuando el factor de retención de un soluto es <<< 1 la elución
es tan rápida que es muy difícil determinar con exactitud los
tiempos de retención
• Cuando el factor de retención es del orden de 20 a 30 o mayor
los tiempos de retención son excesivamente largos
• Idealmente, se busca que las condiciones de las separaciones
de mezclas de solutos arrojen factores de retención del rango de
entre 2 y 10
Tiempo de retención
• Es el tiempo que transcurre después de la inyección de la muestra hasta que el
pico de concentración del analito alcanza al detector y se simboliza como tR
• Se le designa tiempo muerto tM al tiempo que le toma a la muestra no retenida
alcanzar al detector. La velocidad de la muestra no retenida coincide con la
velocidad promedio del movimiento de las moléculas de la fase móvil por tanto
también se considera como el tiempo que le toma a una molécula de la fase móvil
pasar a través de la columna
Línea base
(ausencia de
analito)
En ocasiones hay picos
pequeños que corresponden a
muestras que no se retienen
Estos picos
sirven de
referencia y en
ocasiones se
adicionan
• Cuando se disponen de sustancias mixtas, previo a
un análisis, el tiempo de retención permite identificar
las muestras comparando los tiempos de migración de
cada componente
Tiempo de retención
Factor de retención de Kovats
El índice de retención de Kovàts para un
analito se define por:
• t’R(A)Tiempo de retención ajustado del
analito A
• t’R(N)Tiempo de retención ajustado de n-
alcano con N carbonos
• t’R(n)Tiempo de retención ajustado de n-
alcano con n carbonos (n = N + 1 carbonos)
)('log)('log
)('log)('log100100
ARtnRt
NRtARtNI
Interpolación
logarítmica de los t’R
tM
t’R(A)
t’R(N)
t’R(n)
t
Ejemplo:
Si los tiempos de retención de son tR(CH4) = 0,5 min,
tR (octano) = 14,3 min, tR (compuesto ?) = 15,7 min y
tR (nonano) = 18,5 min, hallar el índice de retención
del compuesto desconocido.
SOLUCIÓN
15.8572.15log0,18log
8,13log2,15log100)8(100
I
Factor de selectividad “a”
• Se define como el cociente del coeficiente de distribución de la
especie más fuertemente retenida (KB) entre el coeficiente de
distribución de la menos retenida (KA):
• Según esta definición a debe ser siempre mayor que 1; pero
también se puede determinar en función de a sus factores de
retención de los analitos o desde el cromatograma:
A
B
K
Ka
A
B
k
k
'
'a
MAR
MBR
tt
tt
)(
)(aó
0
tM tRA tRB
A
B
t’RB
t’RA
MAR
MBR
tt
tt
)(
)(a
t’R = tiempo de retención reducido
Factor de selectividad “a”
Comparación de curvas gaussianas en picos de un cromatograma
• Los cromatogramas reales distan mucho de presentar un pico gaussiano, puesto
que se produce una irregularidad en la concentración en la zona de depósito de la
sustancia que se encuentra en la cabeza de la columna, la velocidad de la fase
móvil es nula en las paredes de la columna y máxima en el centro de esta.
• La simetría del pico se traduce a dos parámetros: el factor de simetría (Fa) y
factor de cola (Fc), medidos al 10% de la altura
a
baF
a
bF ca
2
Picos de elución gaussianos
10%
100%
b a
Deformaciones en los picos de elución
• Algunos picos no son ideales y presentan deformaciones hacia
la cola o hacia el frente.
• En el primer caso la cola del pico que aparece a la derecha del
cromatograma se alarga mientras el frente se acorta
bruscamente
• En la deformación hacia el frente ocurre lo contrario, pues se
muestran picos con asimetría frontal
Deformaciones en los picos de elución
• Las causas de esta asimetría pueden ser:
1. Un coeficiente de distribución no lineal
2. La asimetría frontal suele presentarse cuando se ha
introducido exceso de muestra
• Estas distorsiones no son deseables puesto a que
conducen a peores separaciones y a tiempos de
elución no reproducibles
El ensanchamiento de la banda
• Durante la migración de una molécula, esta presenta miles de
transferencias entre la fase estacionaria y la fase móvil, y el
tiempo que pase entre cada interacción es muy irregular y es
dependiente de la energía térmica que gane en el proceso
generando tiempos de residencia entre cada fase transitorios y a
veces largos, por tanto su migración en la columna es muy
irregular
El ensanchamiento de la banda
• Algunas partículas se incluyen en la fase móvil
desplazándose con rapidez y otras se incorporan
accidentalmente en la fase estacionaria retrasándose su
migración.
• En consecuencia ocurre una dispersión simétrica de las
velocidades alrededor del valor medio (comportamiento de la
molécula promedio)
El ensanchamiento de la banda
• La anchura la banda aumenta conforme se mueve a través de
la columna ya que dispone de más tiempo para que la
dispersión tenga lugar
• Por tanto, la anchura de la zona es directamente proporcional
a la permanencia en la columna e inversamente proporcional a
la velocidad de flujo de la fase móvil
Procesos cinéticos que contribuyen al
ensanchamiento del pico
Eficacia de la columna
• Martin y Synge aplicaron la comparativa de la columna
cromatográfica con una torre de destilación, con la analogía de que
se constituyen las columnas de múltiples capas estrechas,
discretamente contíguas, denominados platos teóricos de Craig:
Donde:
H= altura del plato teórico
N= el número de platos
L= longitud del relleno de la columna
H
LN
Perfil del analito en el extremo final del relleno
Definición de la altura del plato (H)
• Se supone que en cada plato se establece el equilibrio de la especie entre la
fase móvil y estacionaria. El movimiento del analito a través de la columna
se trataba como una transferencia por etapas de la fase móvil equilibrada de
un plato al siguiente en una constante dinámica de adsorción-desorción. Pero
falla por no abordar el ensanchamiento de las bandas.
Detector
Concentración en
la columna
L
Eluyente
Señal
0
Distancia
migrada (m)
Altura equivalente al plato teórico (HETP)
Es la longitud necesaria de la columna por la lograr el equilibrio de
distribución (es una medida de la eficiencia de la columna).
Platos teóricos (N)
• A medida que un soluto migra en la columna , ocupa una zona
al ensancharse, esta dispersión lineal sL, representada por la
varianza s2L aumenta con la distancia recorrida L:
• A partir de un pico de elución de un compuesto, del cual se
pueda medir la s2 temporal, se podrá calcular para el compuesto
la eficacia teórica N y deducir el valor de H sabiendo que
H=L/N:
LHL 2s
Eficacia de la columna
2
2
2
2
ssR
L
tLN s
t 0
señ
al
Variables que influyen en la eficacia de la
columna
FACTORES GENERALES QUE FAVORECEN LA
RESOLUCIÓN
1. Incrementar L
2. Disminuir el diámetro de la columna (dp)
3. Disminuir la velocidad de flujo
4. Uniformidad del relleno de la columna
5. Empacado uniforme de la columna
6. Disminuir el tamaño de la muestra
7. Seleccionar una fase estacionaria,
8. una fase móvil, y
9. una presión apropiados
10. Para la LC usar un adecuado y mejor gradiente de elución
Factor de resolución entre dos picos R
•Se utiliza para determinar la eficiencia de la separación de dos
picos, entre mayor sea R mejor será la separación
•Se calcula a partir del cromatograma y con las ecuaciones:
22
1
1
4
1
177.1
2
21
12
2
2
kk
kkNR
k
kNR
ttR
ttR
B
BA
RR
BA
RR
AB
AB
a
a
Efecto de la longitud de la columna en la resolución
El problema general de la elución en cromatografía
The compounds listed in Table 2 were separated on an nonpolar, 95% methyl,
5% phenylpolysiloxane column, 30 m long, 0.25 mm ID, and 0.25 micrometer
film thickness.
About 1 microliter of the hydrocarbon sample were injected. Approximately 5
nanograms (ng) of each component was injected per 1 microliter. A flame
ionization detector (FID) was used.
Optimización del análisis cromatográfico
•La cromatografía es preferentemente usada en análisis
cuantitativo, y para esto se miden las áreas de los picos con
precisión y para esto se deben separar muy bien los picos
•La resolución R y el tiempo de elución son las dos variables
dependientes más importantes que se deben considerar
•La idea es separar lo mejor posible los compuestos en el menor
tiempo posible
•Se debe considerar un tiempo de estabilización antes de re-usar
las columnas
•La longitud de la columna define en muchas ocasiones la
resolución de las separaciones
•Si solo interesan un tipo de componentes de la mezcla se pueden
usar detectores específicos
Optimización del análisis cromatográfico
•La cromatografía siempre se delimita a un triángulo cuyos
vértices corresponden a la resolución, velocidad y capacidad, los
tres son parámetros que se oponen.
•Una cromatografía optimizada utiliza al máximo el parámetro
más eficaz, la selectividad, localizada cerca del vértice de la
resolución.
Resolución
Capacidad Velocidad 1
2
3
La parte sombreada indica el
terreno correspondiente a la
analítica, que saca provecho
de los parámetros K, N, k, L,
a y R
Evaluación:
1. Investigar los diferentes tipos de detectores utilizados en
los cromatógrafos de gases, líquidos y fluídos
supercríticos, así como el fundamento técnico
2. Investigar, analizar y sintetizar al menos un artículo
científico donde se aplique al menos uno de los métodos
de cromatografía de gases (gas-liq., gas-sol), de líquidos
(liq-liq, liq-sol) y de fluídos supercríticos
