Aislamiento de cepa resistente al mercurio perteneciente a la especie Morganella morganii y análisis de su viabilidad en procesos de remoción de mercurio en matrices acuáticas

Camilo Andrés Moreno Alarcón Proyecto de grado de Ingeniería Ambiental Departamento de Ingeniería Civil y Ambiental. Universidad de Los Andes. Bogotá, Colombia Fecha de entrega: 14.06.2019

RESUMEN

En el presente trabajo se investigó la resistencia al mercurio, como HgCl2, de una cepa de Morganella morganii aislada de una muestra de mariscos adquirida en la plaza de mercado de Paloquemao en Bogotá. Se logró cultivar la cepa a una concentración de 250 mg/L de HgCl2 en medio líquido sin presentar inhibiciones evidentes de crecimiento con respecto a medios cultivados sin mercurio. Cultivos con HgCl2 a concentraciones de 0, 50, 200 y 250 mg/L fueron observadas en STEM. De las imágenes se dedujo que el mecanismo de resistividad utilizado por esta bacteria es la reducción a mercurio metálico de los iones Hg2+ disociados del cloruro. Los resultados señalan que la cepa aislada tiene el potencial de ser utilizada en procesos de biorremediación de matrices acuáticas. Sin embargo, es necesario realizar estudios específicos sobre la composición de los productos de mercurio encontrados en las muestras para verificar el mecanismo de remoción del metal. De igual forma, se requiere estudiar de manera cuantitativa la capacidad de remoción de la bacteria de diversos compuestos de mercurio encontrados en fuentes de agua para determinar sus límites de aplicación a procesos de biorremediación.

ABSTRACT

The present study investigated the resistance of a strain of Morganella morganii to mercury (HgCl2): the strain was isolated from shellfish acquired in the market square of Paloquemao in Bogotá. The isolate was able to grow at concentration of 250 mg/L of HgCl2 in a liquid medium without presenting obvious inhibitions of growth respect to cultivated means without mercury. Cultures with HgCl2 at concentrations of 0, 50, 200 and 250 mg/L were observed in STEM. From the images, it was deduced that the resistivity mechanism used by this bacterium is the reduction of Hg2 + to metallic mercury. The results indicate that the isolated strain has the potential to be used in bioremediation processes of aquatic matrices. However, it is necessary to further investigate the composition of the mercury products to evaluate the removal mechanism of this metal. Similarly, it is necessary to quantify the removal of other mercury compounds found in water sources to determine the applicability to bioremediation processes.

INTRODUCCIÓN

El mercurio tiene múltiples usos a nivel comercial alrededor del mundo. Es utilizado en amalgamas, componentes de luces de fluorescencia y como pigmento [1]. En Colombia es empleado principalmente en la producción de combustibles, cemento y papel; en la industria de químicos; y en la

extracción y producción de oro, cobre y metales ferrosos [2].

De estas actividades, la extracción y purificación de oro es la que tiene mayor demanda de mercurio con diferencia [3]. Siendo este a su vez el uso que más emisiones y liberaciones de este metal genera [2]. Sin embargo, en el 2018 se suspendió legalmente su utilización para

este fin bajo lo estipulado en la Ley 1658 de 2013 [4], con miras de eliminar su uso en el resto de sectores para el 2023.

Pese a lo anterior, la contaminación de las matrices ambientales en el país seguirá existiendo, incluso con la prohibición de su uso a nivel nacional. Esto debido a que se estima que el ciclo de vida de mercurio antes de volver a la litósfera puede alcanzar la escala de los miles de años [5]. Por lo que las emisiones y liberaciones a la fecha de este metal seguirán transitando su ciclo en el medioambiente por un largo periodo de tiempo.

Dado que el mercurio y sus compuestos derivados pueden generar graves afectaciones a la salud como daños al sistema nervioso, deterioro intelectual e incluso la muerte [6]; estos han sido considerados como contaminantes peligrosos a nivel mundial. Como resultado, la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos (EPA) lo ha incluido en su lista de contaminantes prioritarios [7].

Por esto, los esfuerzos de remediación de este elemento y sus derivados se centran en las matrices de exposición más directas para los seres humanos: el aire y el agua [6].

Debido a que las emisiones de mercurio volatilizado se transportan rápidamente en el aire y cuentan con una vida media en la atmósfera de aproximadamente un año hasta que se deposita en el suelo o se solubiliza en algún cuerpo de agua [8]; los esfuerzos para controlar la presencia de este contaminante en el aire se centran casi de forma exclusiva en tratamientos directos en las fuentes de emisión [9].

No obstante, la remoción de estos compuestos de las matrices de agua representa un reto mayor debido a la diversidad de interacciones fisicoquímicas y biológicas presentes en estos medios [10].

Es por esto que existen diversas técnicas para la remediación de mercurio en el agua, siendo las más estudiadas la precipitación química; la adsorción por carbón activado u otros adsorbentes; la coagulación; la filtración; la ósmosis inversa; y la biorremediación [11].

Dependiendo de las condiciones de la fuente contaminada, cada alternativa cuenta con una serie de ventajas y desventajas. Sin embargo, la biorremediación se posiciona como una de las alternativas más flexibles dada su aplicabilidad a medios abiertos y su bajo costo [10].

Los principales mecanismos de biorremediación del mercurio y sus derivados en matrices acuáticas son la bioestimulación de microrganismos presentes en los sitios contaminados que puedan degradar o secuestrar mercurio; la bioaumentación con microorganismos introducidos a la matriz; y la redirección de la matriz contaminada hacia plantas de tratamiento.

Sin embargo, un factor fundamental para determinar la aplicabilidad de cada uno de los procesos anteriores radica en conocer el sistema de remoción que los microorganismos utilizan en el proceso de remediación. La metilación, la dimetilación, la conversión de HgS, la reducción a mercurio metálico, la adsorción a las membranas celulares y el secuestro en vacuolas internas son los principales mecanismos de resistencia conocidos de las bacterias al mercurio y sus compuestos.

Por lo anterior, los organismos más utilizados para la remediación de mercurio son los que secuestran el mercurio y sus compuestos , ya sea interna o externamente como Vibrio parahemolyticus, y aquellos que son capaces de degradarlos, como diversas especies pertenecientes a las familias Pseudomonas, Bacillus y Shipgobium [12].

El propósito del presente estudio fue analizar la resistencia al mercurio de una cepa de Morganella morganii aislada de una muestra de mariscos obtenidos en la plaza de mercado de Paloquemao en Bogotá, con el fin de determinar su viabilidad para ser utilizada en tratamientos de biorremediación en matrices acuáticas de este metal pesado.

METODOLOGÍA

Muestras

Se adquirieron un total de 5 muestras de especímenes de calamar morado (Illex argentinus) y 6 muestras de especímenes de camarón patiblanco (Litopenaeus vannamei), todas en estado de congelación, en varios comercios de venta de pescado y mariscos de la Plaza de Paloquemao en Bogotá. Estas se llevaron inmediatamente al laboratorio en empaques esterilizados y se dejaron descongelando dentro de los mismos empaques en baños de agua a temperatura ambiente.

Por otro lado, se obtuvo una muestra de agua y suelo del acuario marino del grupo de investigación BIOMAR de la Universidad de los Andes. Así como una muestra de agua y suelo de la costa de Cartagena. Ambos grupos de muestras fueron recolectados en recipientes previamente esterilizados y fueron llevados sin refrigeración en contenedores aislados térmicamente al laboratorio en periodos menores a 24 horas.

Las muestras de mariscos fueron catalogadas y procesadas por macro estructuras. Las identificaciones de las muestras se muestran a continuación:

TABLA 1. Identificativos de muestras

Identificativo Descripción

SQ-C-(1,2,3,4,5) Cuerpo superior y aletas de clamares

SQ-T-(1,2,3,4,5) Tentáculos de calamares

SQ-O-(1,2,3,4,5) Órganos internos de calamares

SH-E-(1,2,3,4,5,6) Exoesqueleto de camarones

SH-M-(1,2,3,4,5,6) Musculatura de camarones

SQ-O-(1,2,3,4,5,6) Órganos internos de camarones

A-A Agua marina de acuario BIOMAR

A-C Agua marina de la costa de Cartagena

S-C Suelo de la costa de Cartagena

Enriquecimiento y cultivo

Para realizar el aislamiento de los microorganismos se siguió el protocolo para aislamiento de Vibrio del Manual Analítico Bacteriológico de la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA) [13].

Las muestras de marisco y suelo fueron trituradas y homogeneizadas con ayuda de un mortero. Luego se transfirieron 25 g de cada muestra, incluida el agua marina, a matraces de Erlenmeyer de 500 mL que contenían 225 mL de agua peptonada alcalina (APW) con una composición de 10 g de peptona de caseína y 10 g de cloruro de sodio por cada litro de agua destilada, a un pH de 8.4 ± 0.2 anterior a la trasferencia de las muestras. Esto constituyó una dilución de 1:10 de las muestras. Los caldos de cultivo fueron incubados a 37˚C durante 24 h.

A continuación, se realizaron diluciones 1:100, 1:1000 y 1:10000 de los caldos cultivados, traspasando 1 mL del sobrenadante de cada matraz a tubos Falcon con 9 mL de APW. Estos se incubaron 24 h a 37˚C. Todas las diluciones se realizaron por duplicado para incrementar la probabilidad de encontrar los microorganismos buscados.

Cada dilución fue posteriormente sembrada en forma masiva en cajas de Petri sobre agar tiosulfato citrato bilis sacarosa (TCBS) con una composición de 5 g de extracto de levadura; 20 g de sacarosa; 5 g digerido pancreático de caseína; 10 g de cloruro de sodio; 5 g de digerido péptico de tejido animal; 1 g de citrato férrico; 10 g de citrato sódico; 0.04 g de azul de bromo timol; 10 g tiosulfato sódico; 0.04 de azul de timol; 5 g de bilis de buey; 3 g de colato de sodio; y 14 g de agar por cada litro de agua destilada. Estas siembras se incubaron por 18 h a 37˚C.

En las mismas condiciones de las siembras masivas se realizaron pases por el método de siembra de aislamiento a nuevas cajas de TCBS y agar peptonado alcalino (APA), este último con una composición idéntica al APW, pero con la adición de 15 g de agar por litro de agua destilada. Estos pases se repitieron hasta aislar todos los morfotipos presentes en las siembras iniciales.

Finalmente, se realizaron tinciones de Gram a los morfotipos aislados.

Aislamiento de cepas resistentes al mercurio

Se realizó una serie de raspados de colonias aisladas de la cepa con morfotipo verde cultivada en agar TCBS obtenida en los aislamientos de la muestra SH-O-4. Dicha cepa fue nombrada con el código SHO-1V. Con estos se inocularon dos matraces de Erlenmeyer, cada uno con 100 mL de caldo de soya tríptico (TSB) con una composición de 17 g de triptona; 3 g de digerido péptico de soja; 2.5 g de glucosa; 5 g de cloruro de sodio; y 2.5 g de fosfato dipotásico de hidrógeno por cada litro de agua destilada. Los medios inoculados se incubaron durante 24 h a 220 rpm y 30˚C en un agitador de mesa.

A partir de estos cultivos se procedió a realizar un acondicionamiento de la cepa al mercurio, traspasando 100 𝜇L de sobrenadante a tubos Falcon con 10 mL de medio LB compuesto por 10 g de cloruro de sodio; 10 g de triptona; y 5 g de extracto de levadura por cada litro de agua destilada. Se realizó una solución de stock de HgCl2 a 50 mg/L y a cada tubo de medio se le agregó el volumen determinado de la misma para obtener concentraciones de 0.5, 1, 1.5, 2 y 5 mg/L de mercurio inorgánico como HgCl2. Se optó por utilizar una solución stock y no la sal de mercurio cristalizada para asegurar una buena dilución del mercurio en el medio. Los medios con mercurio se incubaron durante 24 h a 220 rpm y 30˚C en un agitador de mesa.

Posteriormente, se inocularon tubos de 5 ml de medio LB con 100 𝜇L de la cepa crecida a 5 mg/L de mercurio. Estos tubos contaron con concentraciones de 10, 20, 50, 100, 150, 200, 250, 300 y 500 mg/L de mercurio inorgánico como HgCl2, preparándose con la misma solución de stock utilizada en los tubos a concentraciones menores.

El procedimiento de aumento en la cantidad de mercurio en el medio fue llevado de manera serial: una vez se evidenciaba crecimiento por turbiedad del medio en cada iteración de cierta concentración se

inoculaba con 100 𝜇L de este cultivo un nuevo medio con la siguiente concentración más alta. Cuando no había crecimiento se realizaba una nueva iteración de la misma concentración hasta que se evidenciara turbiedad.

Todos los medios cultivados se realizaron por duplicado con el fin de mejorar la probabilidad de acondicionamiento a mayores concentraciones de mercurio. Los cultivos fueron incubados durante 24 h a 220 rpm y 30˚C en un agitador de mesa; a excepción de las concentraciones a 10, 20 y 50 mg/L de mercurio, para las cuales se requirió un tiempo de 72 h de acondicionamiento para evidenciar crecimiento.

A cada iteración de medio con HgCL2 que presentaba crecimiento bacteriano (exceptuando los cultivos con 300 y 500 mg/L de concentración) se les realizó un pase a tubos con 5 ml de TSB. Estos se cultivaron durante 18 h a 37˚C y posteriormente se sacaron alícuotas de los mismos para realizar siembras aisladas en agar TCBS y APA con el fin de confirmar la morfología y descartar posibles contaminaciones.

Caracterización molecular

Colonias aisladas de la cepa resistente a mercurio fueron cultivadas en agar TCBS por 24 h a 37˚C. De este nuevo cultivo se tomaron con aza aproximadamente 0.25 g de las colonias más aisladas y a estas se realizó una extracción del ADN utilizando el kit de extracción DNeasy PowerSoil® de QIAGEN. El gen 16S ARNr de la extracción fue amplificado con los primers 8F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′), y 1492R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′) [14] bajo los procedimientos estándar de PCR [15].

El 16S ARNr amplificado de los aislamientos fue llevado al Centro de Secuenciación de la Universidad de Los Andes y secuenciado por el método de secuenciación de Sanger. Las secuencias obtenidas fueron analizadas con el programa 4Peaks y posteriormente comparadas con la base de datos genómica del Centro Nacional para la Información

Biotecnológica de Estados Unidos (NCBI) por medio de la herramienta BLAST® [16].

Microscopía STEM

Se llevaron 4 muestras para observación en Microscopio Electrónico de Trasmisión de Barrido (STEM) en el Centro de Microscopía de la Universidad de Los Andes. Estas constaron de los cultivos en crecimiento en medio LB con concentraciones de 0, 50, 200 y 250 mg/L de mercurio inorgánico como HgCl2.

Para observación en el STEM se realizó el protocolo de fijación y secado de estructuras recomendado por el Centro de Microscopía. Primero, se centrifugaron las células en el medio de cultivo a 2700 g por 30 min a 4°C. El pellet remanente se lavó tres veces con agua destilada para remover el medio de cultivo, resuspendiendo entre cada lavado con vortex y centrifugando posteriormente a 2700 g por 10 min a 4°C. Luego, los pellets se recubrieron con glutaraldehído al 2.5% por 24 h. Pasado este tiempo, el glutaraldehído se removió y se realizaron lavados con etanol en el siguiente orden: un lavado con etanol al 70% por 5 min; dos lavados consecutivos con etanol al 95% por 10 min cada uno; y finalmente, tres lavados con etanol al 100% durante 20 min cada uno. En estos pasos se resuspendieron los pellets en el alcohol antes de iniciar el tiempo de lavado y posterior a dicho tiempo se centrifugaron a 2700 g por 10 min a 4°C, con el objetivo de asegurar una mejor limpieza

de los pellets del glutaraldehído remanente y de cualquier compuesto que no se haya solubilizado con los lavados de agua.

Para la visualización, 5 𝜇L de pellet diluido en 1 mL de alcohol al 100% de las muestras ya procesadas se colocaron sobre monedas recubiertas con papel aluminio, limpiadas previamente con alcohol. Estos montajes fueron posteriormente ingresados a la cámara de alto vacío del STEM.

Conjunto a la observación de la topografía de las muestras, se realizaron análisis de fluorescencia de rayos X por energía dispersiva (EDXRF) para determinar la composición elemental de las mismas. Esto gracias a la capacidad de STEM de leer la energía dispersada por los átomos de la muestra al pasar por el haz concentrado de electrones.

RESULTADOS

Aislamiento de cepa resistente al mercurio

Resultado de los aislamientos de las muestras de mariscos, agua marina y suelo marino adquiridos se obtuvo un total de 8 morfologías aisladas diferentes en agar TCBS, mostradas en la TABLA 2. A cada una se le realizaron tinciones de Gram, confirmando todas ser bacilos Gram negativos.

TABLA 2. Morfotipos aislados

Muestra de origen: SQ-O-5

Muestra de origen: SQ-O-1

Muestra de origen: SH-O-2

Muestra de origen: A-C

Muestra de origen: A-C

Muestra de origen: SH-O-4

Muestra de origen: SQ-C-3

Muestra de origen: SQ-O-1

La cepa SHO-1V, aislada de la muestra SH-O-4, fue escogida para realizar el acondicionamiento en medio líquido con mercurio basándose en la asunción de que se trataba de la especie Vibrio parahemolyticus, siendo que la tolerancia al mercurio de este Vibrio ya ha sido estudiada con anterioridad [17].

Dicha suposición en la identificación de la especie se debió a que la cepa SHO-1V, cultivada sobre agar TCBS, presentaba una morfología como la descrita en la literatura[18] similar a V. parahemolyticus, de colonias verdes oscuras, y no se contempló que hubiese crecimiento de una

especie diferente a la familia Vibrionaceae en este medio selectivo.

La cepa SHO-1V aislada creció de manera abundante al ser inoculada en medio LB con concentraciones de 0.5 a 5 mg/L de HgCL2. Para el acondicionamiento a las concentraciones de 10, 20 y 50 mg/L de mercurio fue necesario realizar 3, 2 y 5 iteraciones de cultivos respectivamente, cada uno con un tiempo de incubación de 72 h. Los demás cultivos a diferentes concentraciones de mercurio (100 a 500 mg/L) crecieron en sus primeras iteraciones en tiempos de incubación de 24 h y con la

misma turbiedad aparente que sus contrapartes sin mercurio.

No se realizaron los pases a medio líquido y sólido sin mercurio de los cultivos con 300 y 500 mg/L de HgCL2 por cuestiones de organización, por lo que no se pudo excluir que el crecimiento hubiese sido debido a una posible contaminación.

Pese a lo ocurrido, estas iteraciones demuestran que existe una posibilidad de acondicionar la cepa a concentraciones más altas de mercurio soluble, debido a que no se llegó a una cantidad de mercurio disuelto en el medio que inhibiera totalmente el crecimiento de los microorganismos.

Identificación de la cepa

La secuenciación del gen 16S ARNr de la cepa SHO-1V fue analizada y procesada con ayuda del programa 4Peaks, eliminando los extremos que presentaron menos de un 48% de calidad en la secuenciación, según el programa. Resultando en longitudes finales de 685 y 755 bases para las secuencias de los primer 8F y 1492R, respectivamente.

Posteriormente, la secuencia procesada fue comparada con la base de datos del NCBI, mostrando un 99.83% de identidad con 12 cepas de Morganella morganii, un bacilo Gram negativo de la familia Enterobacteriaceae [19]. El resto de coincidencias fueron a con otras cepas de la misma especie, pero presentaron porcentajes de identidad de entre 99.72% y 99.57%.

Esta especie tiene una morfología similar a V. parahemolyticus y a demás pertenecientes a la familia Vibrionaceae de colonias verdes cuando son cultivada en agar TCBS [20], debido a que no fermenta la lactosa de dicho medio [19]. Por lo cual es fácil confundir a estos dos microorganismos basándose solo en morfología.

Observación del sistema de captura de mercurio en STEM

De la observación de las muestras de la cepa SHO-1V en STEM se obtuvieron las imágenes

de la FIGURA 1 a la FIGURA 4. En estas se muestra a la izquierda la morfología de las bacterias, viéndose claramente un morfotipo de bacilo en todas las muestras, lo que confirma lo visto anteriormente en las tinciones de Gram realizadas luego del aislamiento inicial.

Así mismo, cada imagen cuenta con su contraparte analizada por EDXRF a la izquierda, denotando los cambios de composición de las diferentes partes de las muestras. Cada tonalidad de gris representa un elemento diferente, siendo para los microorganismos en general un tono más opaco, debido a su alta concentración de carbono; mientras que el fondo de la imagen se presenta en una coloración más clara, dado al recubrimiento de aluminio de las monedas sobre las cuales fueron observadas las muestras. Las múltiples partículas en el fondo son trazas de óxidos y otros metales, inherentes a su fabricación [21].

De las FIGURA 2 a la FIGURA 4 se observan grandes acumulaciones de un compuesto ajeno a la biomasa, mostradas en color blanco, formadas en clúster esféricos; mientras agrupaciones de bacterias los rodean.

Los análisis EDXRF confirmaron por medio de los espectrogramas de composición de los puntos especificados en las imágenes, encontrados en la FIGURA 5 y la FIGURA 6, que estas acumulaciones constan principalmente de mercurio, aunque con un porcentaje relativo en peso importante de carbono encontradas en el espectrograma 11 y 13 del 30.4% y el 28.7% respectivamente, y una componente en peso del 10.2% de azufre encontrada en el espectrograma 10.

Los espectrogramas 12 y 14 muestran composiciones mayoritarias de carbono, acompañadas con oxígeno y algunas trazas de nitrógeno, sodio y fósforo; resultados esperados para describir la biomasa de los microorganismos analizados en estos puntos.

FIGURA 1. Imagen de STEM de morfología (izq.) y del contraste de composición (der.) de la cepa SHO-1V cultivada en medio sin mercurio.

FIGURA 2. Imagen de STEM de morfología (izq.) y del contraste de composición (der.) de la cepa SHO-1V cultivada en medio con 200 mg/L de HgCl2 con visibles cúmulos de mercurio.

FIGURA 3. Imagen de STEM de morfología (izq.) y del contraste de composición (der.) de varios clústeres de crecimiento de la cepa SHO-1V cultivada en medio con 200 mg/L de HgCl2.

FIGURA 4. Imagen de STEM de morfología (izq.) y del contraste de composición (der.) de un clúster de crecimiento de la cepa SHO-1V cultivada en medio con 250 mg/L de HgCl2 con un visible cúmulo de mercurio.

FIGURA 5. Espectrogramas de composición de un cúmulo de mercurio (10 y 11) y un clúster de crecimiento de la cepa SHO-1V cultivada en medio con 250 mg/L de HgCl2 (12).

FIGURA 6. Espectrogramas de composición de un cúmulo de mercurio (13) y un clúster de crecimiento de la cepa SHO-1V y un cúmulo de mercurio en medio con 200 mg/L de HgCl2 (14).

DISCUSIÓN

La resistencia a mercurio de Morganella morganii ha sido documentada en un estudio previo a este trabajo, en el cual se registró que la concentración inhibitoria mínima (MIC) de dicha cepa fue de 80 mg/L de HgCL2 [22]. Dado que la MIC representa la concentración mínima de antimicrobiano a la cual se deja de observar crecimiento [23]; el cultivo de esta especie con la concentración de 250 mg/L de esta sal1 lograda en el presente trabajo representa un descubrimiento importante en la capacidad de resistencia al mercurio de la bacteria.

Si bien la capacidad de biorremediación de M. morganii de matrices contaminadas con mercurio no ha sido documentada (según la información indagada a la fecha de realización de este trabajo), existen estudios previos que muestran el potencial de la

1 Los cultivos con 300 y 500 mg/L de HgCl2 no se tomaron en cuenta para este análisis al no haber sido posible descartar una contaminación de los mismos.

especie para reducir cromo hexavalente [24], así como la capacidad de esta para resistir altas concentraciones de plata y cobre [25] [26]. De igual forma, se ha estudiado su capacidad de biodegradación de microcistina [27] y explosivos nitrados [28].

Por otra parte, la MIC más elevada encontrada en la literatura corresponde a la Klebsiella pneumonia, la cual tiene una resistividad a 651.6 mg/L de mercurio inorgánico y la segunda y la que le sigue es de una cepa de Pseudomona sp., con una MIC reportada de 250 mg/L [17]. Esto, sumado al hecho de que en el presente estudio no se logró encontrar la MIC de la cepa SHO-1V, indica que la resistividad a mercurio inorgánico de esto cepa se ubica entre las más altas reportadas.

El hecho de encontrar cúmulos de mercurio en forma esférica alrededor de las bacterias en las imágenes de STEM sugiere que los subproductos del mecanismo principal de resistividad al mercurio de la cepa SHO-1V son expulsados de las bacterias. Dado esto, los mecanismo conocidos de resistencia microbiana al mercurio, que no involucran el secuestro del metal en el interior del microorganismo, son la metilación, la dimetilación, la conversión a HgS y la reducción del mercurio a Hg0 [29]. Siendo los subproductos de dichos procesos el metilmercurio, el dimetilmercurio, el HgS y el mercurio metálico (Hg0) respectivamente.

El metilmercurio es soluble en agua; mientras que el dimetilmercurio es soluble en etanol [30]. Debido a esto, es poco factible que las acumulaciones de mercurio vistas en las muestras correspondan a cristalizaciones o conglomeraciones de estos dos compuestos, ya que los lavados y centrifugaciones del proceso de fijación y secado de estructuras hubieran diluido las numerosas acumulaciones expuestas al medio que se ven en la FIGURA 3 [31].

Por otra parte, el HgS es insoluble tanto en agua como en etanol; pero su estructura cristalina se caracteriza por tener una geometría hexagonal [32], lo cual difiere de las observaciones de los cúmulos esféricos.

La traza de azufre observada en el espectrograma 10 (FIGURA 5) puede indicar presencia de HgS en el cúmulo de mercurio, aunque la ausencia de este elemento en las mediciones de los demás espectrogramas de estas conglomeraciones de mercurio señala que dicha traza pueda ser parte de un producto del metabolismo de las células o un remanente de algún compuesto del medio de cultivo.

Así pues, lo más probable es que el mecanismo de resistividad que utilice la cepa SHO-1V sea la reducción a mercurio metálico, lo cual explicaría las acumulaciones en forma esférica del metal, dado que a temperatura ambiente este se encuentra en forma líquida, por lo que no se cristaliza, y es insoluble en agua y etanol [30].

La anterior hipótesis se respalda con el hecho de la presencia del operón mer en el genoma de M. morganii [12], al cual se le atribuye la resistencia por el mecanismo de reducción de Hg2+ a Hg0 de diferentes especies de bacterias [33].

Este mecanismo reductor es uno de los mejores en términos de biorremediación, dado que puede transformar compuestos altamente tóxicos, como en este caso el HgCl2, en mercurio elemental, el cual es poco tóxico y puede extraerse del agua por volatilización o precipitación [10].

Sin embargo, dada la limitación del análisis EDXRF de detectar solo la composición elemental, es necesario realizar pruebas específicas para determinar cuál es el compuesto de mercurio mostrado en las imágenes de STEM.

Así mismo, si bien se sabe que el operón mer se encuentra en el genoma de M. morganii [10], es necesario determinar la capacidad de la especie para reducir compuestos orgánicos de mercurio, dado que en el ambiente se encuentra este metal disperso en estas dos clasificaciones. Esto debido a que el gen responsable de la reducción de compuestos de mercurio inorgánicos (merB) no siempre se expresa conjuntamente con su contraparte que reduce compuestos inorgánicos (merB), pese a que ambos se encuentran en el operón mer [10].

Por otra parte, es necesario realizar una cuantificación de la capacidad de remoción de mercurio por parte de la cepa SHO-1V para determinar su aplicabilidad en biorremediación de este metal pesado; así como tener en cuenta la patogenicidad de Morganella morganii [19] para determinar la viabilidad de esta cepa de ser utilizada en sistemas de tratamiento de aguas.

CONCLUSIONES

De una muestra de camarón adquirida en la plaza de mercado Paloquemao de Bogotá se logró aislar la cepa resistente a mercurio inorgánico SHO-1V perteneciente a la especie Morganella morganii, la cual se cultivó hasta una concentración máxima de

250 mg/L de HgCl2 en medio líquido. Muestras de esta cepa fueron observadas en STEM, logrando determinar que el mecanismo más probable de resistencia a mercurio que posee este microorganismo sea el de reducir el ion Hg2+ a Hg0.

Lo anterior permitió determinar que la cepa SHO-1V tiene potencial para utilizarse en biorremediación de mercurio en matrices acuáticas, dado que cuenta con una resistividad alta al mercurio, así como con indicios de un mecanismo de estabilización del mercurio a su forma metálica.

Sin embargo, un mejor análisis de los compuestos de mercurio observados en las imágenes de STEM es necesario para verificar el mecanismo de resistencia al mercurio que utiliza esta cepa.

Así mismo, se requiere un estudio para determinar de manera cuantificable la capacidad remoción de compuestos de mercurio, orgánicos e inorgánicos, por parte de este microorganismo y de esta forma determinar su viabilidad real para ser utilizada en procesos de biorremediación.

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