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AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS DEGRADADORES DE 2,4,6-TRINITROTOLUENO (TNT) A PARTIR DE AMBIENTES CONTAMINADOS CON EXPLOSIVOS. SONIA MARCELA VILLEGAS PLAZAS PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL BOGOTÁ D.C. JUNIO 19 DE 2009

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AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS DEGRADADORES DE

2,4,6-TRINITROTOLUENO (TNT) A PARTIR DE AMBIENTES

CONTAMINADOS CON EXPLOSIVOS.

SONIA MARCELA VILLEGAS PLAZAS

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

BOGOTÁ D.C. JUNIO 19 DE 2009

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AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS DEGRADADORES DE

2,4,6-TRINITROTOLUENO (TNT) A PARTIR DE AMBIENTES

CONTAMINADOS CON EXPLOSIVOS.

SONIA MARCELA VILLEGAS PLAZAS

TRABAJO DE GRADO PRESENTADO COMO REQUISITO PARCIAL

PARA OPTAR AL TÍTULO DE MICROBIÓLOGO INDUSTRIAL

DIRECTOR: FABIO ROLDÁN, Ph.D.

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

BOGOTÁ D.C. JUNIO 19 DE 2009

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NOTA DE ADVERTENCIA

“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus

alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada

contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan

ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el

anhelo de buscar la verdad y la justicia”.

Artículo 23 de la Resolución No. 13 de julio de 1946

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AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS DEGRADADORES DE

2,4,6-TRINITROTOLUENO (TNT) A PARTIR DE AMBIENTES

CONTAMINADOS CON EXPLOSIVOS.

SONIA MARCELA VILLEGAS PLAZAS

APROBADO __________________________ Fabio Roldán, Ph.D. Microbiólogo Director

__________________________Ziv Arbeli, Ph.D. Microbiólogo Codirector

__________________________ Aura Marina Pedroza, Ph.D. Bacterióloga Jurado

__________________________Gloria Acosta, M.Sc Microbióloga Jurado

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

BOGOTÁ D.C. JUNIO DE 2009

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AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS DEGRADADORES DE

2,4,6-TRINITROTOLUENO (TNT) A PARTIR DE AMBIENTES

CONTAMINADOS CON EXPLOSIVOS.

SONIA MARCELA VILLEGAS PLAZAS

_________________________

Ingrid Schuler García, Ph.D

Decana Académica

Facultad de Ciencias

_________________________

Janeth Arias Palacios, M.Sc

Directora

Carreras Microbiología

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS

MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL BOGOTÁ D.C.

JUNIO 19 DE 2009

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AGRADECIMIENTOS

A Fabio Roldán, Erika García, Ziv Arbeli y Joaquín Benavidez por permitirme

participar en un proyecto de aspiraciones grandes, imponentes e importantes. A

Fabio por ser el ejemplo de una carrera exitosa y a Erika por enseñarme a dar

pasos grandes. A Carlos por ser un compañero incondicional dentro y fuera del

laboratorio, porque gracias a su humor, serenidad y responsabilidad, este proceso

estuvo cobijado por una gran amistad. A todas las manos amigas que en momentos

de desesperación nos brindaron su ayuda, Johan, Juan Pablo, Angela y Angélica,

espero que sigan haciendo parte de este proyecto y que sus logros se queden en

casa.

A INDUMIL por creer en el proyecto y motivar la respuesta de sus participantes

dándonos un ejemplo de palabra y eficiencia. A la Unidad de Saneamiento y

Biotecnología Ambiental (USBA) por el espacio de trabajo y la formación académica.

A Fabio Roldán y Erika García por la dirección de este proyecto, los aportes

académicos, la confianza, la comprensión y el apoyo en momentos difíciles.

A mi familia por la confianza y la motivación para hacer las cosas cada día mejor y a

mis amigos por ser cómplices y víctimas de este proceso.

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TABLA DE CONTENIDO

AGRADECIMIENTOS …………………………………………………………………… VI

TABLA DE CONTENIDO ………………………………………………………………. VII

ÍNDICE DE FIGURAS …………………………………………………………………… IX

ÍNDICE DE TABLAS …………………………………………………………………….. X

RESUMEN ………………………………………………………………………………... XI

1. INTRODUCCIÓN ………………………………………………………………….…… 1

2. MARCO TEÓRICO ……………………..……………………………………………… 2

2.1 DEGRADACIÓN MICROBIOLÓGICA DE TNT …………………………………… 5

2.2 RUTAS METABÓLICAS …………………………………………………….……….. 7

2.2.1 VÍA I ………………………………………………………………………………….. 8

2.2.2 VÍA II …………………………………………………………………………………. 9

2.2.3 VÍA III ……………………………………………………………………...………... 11

2.3 MICROORGANISMOS DEGRADADORES DE TNT ………………………….... 13

2.3.1 AISLAMIENTO ……………………………………………………………………. 13

2.3.1.2 MEDIOS DE CULTIVO ……………………………………………………….… 14

2.3.2 EVALUACIÓN DEL POTENCIAL DEGRADADOR ……………………….…... 15

3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN …………………….….... 16

4. OBJETIVOS ……………………………………………………………………….…... 17

5. MATERIALES Y MÉTODOS ………………………………………………………… 18

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5.1 ANÁLISIS FÍSICO-QUÍMICO ……………………………………………………… 18

5.2 AISLAMIENTO ………………....………………………………………………...…. 19

5.2.1 ETAPA I: PREENRIQUECIMIENTO ……………………………….…………… 20

5.2.2 ETAPA II: AISLAMIENTO EN MEDIO DE CULTIVO SÓLIDO …………...….. 21

5.2.3 ETAPA III: SEGUNDO CULTIVO Y SELECCIÓN MACROSCÓPICA DE

COLONIAS………………………………………………………………………….……. 21

5.2.4 ETAPA IV: MÉTODOS ANALÍTICOS: HPLC ……………………………...…… 22

6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ……………………….……………………………... 23

6.1 ETAPA I: PRE-ENRIQUECIMIENTO ……………………………………………... 24

6.2 ETAPA II: AISLAMIENTO EN MEDIO DE CULTIVO SÓLIDO ………….……... 27

6.3 ETAPA III: SUBCULTIVO Y SELECCIÓN DE COLONIAS ……………….……. 33

6.4 ETAPA IV: MÉTODOS ANALÍTICOS: HPLC …………………………..………… 35

7. CONCLUSIONES …………………………………………………………………….. 43

8. RECOMENDACIONES ……………………………………………………………..... 44

9. REFERENCIAS ……………………………………………………………………….. 45

10. ANEXOS …………….……………………………………………………………….. 48

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ÍNDICE DE FIGURAS

1. Estructura química del TNT …………..……………………………………… 3

2. Reducción de TNT mediante enzimas Nitroreductasas ………………..… 10

3. Formación del complejo Meisenheimer ……………………………………. 12

4. Transformación del complejo Meisenheimer …………………………….… 12

5. Diversidad de colonias obtenidas en T2 de la muestra No. 6 …………… 32

6. Subcultivo en medio líquido correspondiente a T2 ……………………….. 33

7. Coloraciones de Gram de las colonias T1, T100, T54 y T 137 ………….. 34

8. Cromatograma Estándar 100ppm TNT …………………………………….. 36

9. Cromatograma Control No 1 ……………………………………………….... 38

10. Cromatograma Control No 2 ….……………………………………………. 39

11. Cromatograma Cepa T1 ………………………………………………….... 41

12. Cromatograma Cepa T100 ………………………………………………… 42

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ÍNDICE DE TABLAS

1. Propiedades físico químicas del TNT ……………………………………..… 3

2. Estudios que reportan microorganismos como potenciales degradadores

de TNT …………………………………………………………………………..…. 6

3. Medios de cultivo más reportados para el aislamiento de microorganismos

degradadores de TNT …………………………………………………………… 14

4. Puntos de Muestreo seleccionados ……………………………………..…. 18

5. Tratamientos utilizados en el aislamiento de microorganismos

degradadores de TNT ………………………………………………………..…. 19

6. Caracterización físico química de las muestras ………………………….. 23

7. Morfología microscópica de los microorganismos desarrollados en los pre-

enriquecimientos ……………………………………………………………….... 26

8. Número de colonias seleccionadas a partir de cada muestra …………… 30

9. Cromatografía curva de calibración de TNT ……………………………… 37

10. Cromatografía Control No 1 ……………………………………………..… 38

11. Cromatografía Control No 2 …………………………………………….…. 39

12. Cromatografía Cepa T1 …………………………………………………….. 41

13. Cromatografía Cepa T100 ……….………………………………………… 42

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RESUMEN

El 2,4,6-Trinitrotolueno (TNT) es un compuesto nitroaromático con propiedades explosivas y gran estabilidad química. Su producción incrementó desde la primera guerra mundial y actualmente supera los dos millones de toneladas anuales. De la mano con su uso ha incrementado la contaminación generada por este compuesto, el cual tiene efectos mutagénicos y carcinogénicos. Estas características han generado la necesidad de buscar estrategias para eliminarlo del ambiente; la biorremediación se ha perfilado como una de las más efectivas debido a que además de ser ambientalmente amigable, logra la mineralización completa del contaminante. Para llevar a cabo este método es necesario conocer microorganismos con capacidad metabólica para degradarlo. Los sitios que presentan contaminación histórica con explosivos, son una excelente fuente de aislamiento de microorganismos con potencial degradador, ya que están adaptados a su presencia y han adquirido la capacidad de incorporarlo a su metabolismo y transformarlo. El aislamiento se realizó a partir de zonas aledañas a una de las plantas de producción y ensamblaje de explosivos más importante de Colombia, donde se presumía había contaminación histórica de TNT. Se utilizaron tres medios de cultivo, diferenciados básicamente por la presencia o ausencia de fuentes adicionales de carbono (glucosa, citrato, glicerol y acetato) y nitrógeno (NH4). El aislamiento se realizó en tres fases diferentes, en las que se incrementó la concentración del explosivo en el medio de cultivo desde 50ppm hasta 100ppm. Se seleccionaron de todos los medios, las colonias que presentaron diferencias morfológicas, y aquellas que en la última etapa se desarrollaron en el medio de cultivo que no contenía ninguna fuente adicional de carbono y nitrógeno. La degradación del explosivo por parte de los microorganismos aislados se evaluó mediante la técnica de HPLC, la cual permitió comprobar el potencial degradador de 31 cepas aparentemente diferentes.

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ABSTRACT

2,4,6–Trinitrotoluene (TNT) is a nitroaromatic compound that has stand out due to its explosive properties and its great chemical stability. Its production has been increased since the World War II and now days it is over 2 million tons per year. As well as the use of this product has been increase, the contamination that it generates, which has mutagenic and carcinogenic effects has also raised. These features have generated the need of strategies that allow the elimination of this compound from the environment. The bioremediation seems to be one of the most effective alternatives since it is environmentally friendly and also it gets the whole mineralization of the contaminant. In order to accomplish this method it is required to know microorganisms metabolically capable to degrade this compound. Places that present historic contamination with explosives or with some compounds of similar chemical nature are an excellent isolation source of microorganisms with degradation potential for these compounds. It occurs not only because the microorganisms have adapted to the compound presence but also because they have acquired the capability of incorporate it to its metabolism, transforming it in simpler and less toxic compounds. The isolation was made from zones near by the colombian more important explosive production and assembly plant. Those places where presume to be contaminated with nitroaromatics like TNT. Three different culture media were used, basically differenced by the presence or absence of additional carbon sources (glucose, citrate, glycerol and acetate) and nitrogen (NH4). The isolation was made in three different phases in which the explosive concentration was increased from 50ppm to 100 ppm. The colonies that were selected from all the different media were those that presented morphological differences, and those which in the last stage developed in the culture medium that has not additional sources of carbon and nitrogen. The explosive degradation by the microorganism was evaluated with the HPLC technique.

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1. INTRODUCCIÓN

El TNT es uno de los explosivos más importantes dentro de la industria

militar debido a que detona con gran potencia y por su estabilidad es fácil de

manipular. En Colombia, se viene utilizando en diversas actividades como la

minería, las excavaciones y las demoliciones, y esto ha provocado el

incremento de su producción.

Este compuesto es uno de los nitroaromáticos más conocidos y hace parte

de un grupo de xenobióticos recalcitrantes que generan efectos nocivos

sobre el medio ambiente. Dichas estructuras aromáticas nitrogenadas, se

caracterizan por ser compuestos persistentes y altamente tóxicos, son

químicos mutagénicos y carcinógenicos, que están clasificados por la

USEPA (del inglés United States Environmental Protection Agency) como

uno de los contaminantes de mayor prioridad, debido a su toxicidad con el

ambiente y el peligro que representan para la salud humana.

Estas características, han generado la necesidad de encontrar métodos

efectivos y ambientalmente amigables que permitan tratar diversos

ambientes contaminados con TNT. Aunque la incineración es el método más

utilizado a nivel mundial para tratar este tipo de contaminantes, en las últimas

décadas la biorremediación se ha convertido en una de las mejores

alternativas para la eliminación de contaminantes xenobióticos, debido a que

representa ventajas en cuanto a costos, seguridad, mineralización completa

y efectividad, frente a los otros métodos.

La biorremediación es definida como la degradación biológica de

compuestos orgánicos mediante el metabolismo de diversos organismos. Su

mecanismo de acción ha convertido al conocimiento de microorganismos con

potencial degradador de compuestos recalcitrantes como el TNT, en el

principal objetivo para su implementación en ambientes contaminados con

compuestos de esta naturaleza.

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Experiencias en biorremediación basadas en la degradación de compuestos

persistentes como explosivos, fenoles e hidrocarburos, reportan que los

microorganismos nativos presentes en estos ambientes contaminados son

los degradadores más efectivos, pues están adaptados a las condiciones del

ambiente y la presencia del contaminante. Esto lleva a pensar que los sitios

con presencia histórica de contaminación por TNT son unas de las mejores

fuentes para buscar degradadores nativos con capacidad para utilizar este

compuesto en su crecimiento como fuente de carbono y/o nitrógeno

2. MARCO TEÓRICO

A partir de 1830, con el desarrollo de la química orgánica, se empezaron a

sintetizar gran diversidad de compuestos, dentro de los que destacaron

gracias a su propiedad explosiva, los productos resultantes del proceso de

nitrificación (Lewis et al., 2003). La Primera Guerra Mundial, trajo consigo

un gran avance en la producción de estos compuestos, que logró consolidar

la industria militar como una de las industrias más importantes durante el

siglo XX. El 2,4,6-trinitrotolueno, más conocido como dinamita o TNT, ha sido

uno de los productos dominantes dentro de esta industria, siendo también

uno de los más utilizados en el desarrollo de bombas, granadas, propulsores

y dispositivos detonantes empleados en demoliciones (Nyanhongo et al.,

2008), gracias a que por su estabilidad es fácilmente manipulable.

El TNT es el producto de la nitración del tolueno (Figura 1), que se genera

mediante una reacción llamada sustitución electrofílica, la cual requiere la

presencia de una mezcla de ácidos nítricos y sulfúricos altamente

concentrados (McMurry, 2004). Este compuesto posee una gran estabilidad

química, y esto permite que en la producción de dispositivos detonantes

pueda utilizarse de forma pura, sin la presencia de ninguno de sus isómeros

(Unión Española de Explosivos, 1994). Sin embargo, en algunas ocasiones,

se generan mezclas con otro tipo de nitrocompuestos de igual naturaleza

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como el pentaeritritol, con el objetivo de aumentar el potencial detonante de

los productos (Ballesteros 2006).

Figura 1: Estructura química del 2,4,6-Trinitrotolueno.

Tomada de: Lewis et al., 2003

Tabla No 1: Propiedades físico químicas del TNT

Propiedad Magnitud Punto de solidificación 80,6ºC Punto de Degradación 300ºC Temperatura de Explosión 400ºC Solubilidad Agua 20oC 120mg/L Coeficiente Henry 0,0018 Presión de Vapor 20oC 150Pa Densidad 1,65g/cm3 Velocidad de Detonación 6900m/s Peso Molecular 227,1 gmol

Tomada de: Unión Española de Explosivos, 1994 Byung-Hoon et al., 2008

Además de ser un compuesto químicamente estable, el TNT se caracteriza

por ser insoluble en agua, neutro y no corrosivo (Unión Española de

Explosivos, 1994). Forma cristales color amarillo pálido y bajo la luz solar se

torna color rojizo. Su temperatura de fusión está cercana a los 80,6ºC y la de

explosión supera los 400 ºC (Tabla 1), por lo cual debe utilizarse un

detonador para ocasionarla. Parte de la estabilidad de este compuesto se

debe a la insensibilidad que posee hacia los golpes, la fricción y la agitación

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(Unión Española de Explosivos, 1994). Es importante tener en cuenta que

para mantener estables sus características a temperatura ambiente y

trabajarla sin peligro de explosión, la muestra debe estar disuelta en

compuestos como etanol y acetona (Ballesteros, 2006).

EL TNT es uno de los explosivos más utilizados, su producción supera los

dos millones de toneladas anuales (Byung-Hoon In et al., 2008), y esta es

una de las razones por las cuales se ha convertido en un contaminante de

gran prioridad dentro de la lista especial que maneja la EPA acerca de los

químicos contaminantes tóxicos más peligrosos. Adicionalmente, el TNT

hace parte de un grupo de xenobióticos recalcitrantes nocivos para el

ambiente (Bradley et al., 1994); razón que cual ha motivado diversas

investigaciones dirigidas hacia la búsqueda de tratamientos que permitan

recuperar las zonas afectadas con estos compuestos, las cuales

generalmente están ubicadas alrededor de las plantas de producción, y

ensamble de armamento (misiles) o de lugares de alta actividad militar. Estas

zonas se han caracterizado por presentar concentraciones superiores a los

200g TNT/Kg de Suelo (Zoe & Neil, 2006).

Muchos de los compuestos nitroaromáticos, como los explosivos,

fertilizantes, insecticidas y solventes, han sido clasificados como compuestos

citotóxicos y carcinogénicos (Park et al., 2003). Por parte del TNT, se ha

reportado que tiene la capacidad de causar anomalías en los eritrocitos,

destrucción del hígado y diferentes tipos de cáncer (Zoe & Neil, 2006), y es

esta otra de las razones por las cuales se clasifica como un contaminante

prioritario.

Debido a que su estructura química no es similar a la de algún compuesto

generado de forma natural, el TNT, y en general todos los nitroaromáticos, se

han convertido en compuestos altamente persistentes, pues su constitución

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química artificial, limita el proceso de degradación por microorganismos

nativos presentes en los suelos contaminados (Zoe & Neil, 2006). Estas

características y su persistencia en el ambiente afecta la integridad del

ecosistema provocando efectos mutagénicos en los humanos, peces, algas y

microorganismos (Park et al., 2003).

Actualmente, se conocen diferentes tratamientos, físicos, químicos y

biológicos para tratar ambientes contaminados con explosivos, entre los que

destacan la incineración de suelos, el compostaje y la biorremediación. Sin

embargo, algunos estudios demuestran que la degradación biológica de

compuestos nitroaromáticos representa ventajas frente a las otras

soluciones, debido a que es un tratamiento ambientalmente amigable,

económico, seguro para el personal que lo efectúa y efectivo debido a que no

traslada el contaminante de un ambiente a otro, sino que realmente lo

trasforma en metabolitos simples e inocuos (Zoe & Neil, 2006).

Es así, como conocer el metabolismo de los microorganismos capaces de

degradar los explosivos en compuestos más simples y menos tóxicos para el

entorno, ha tomado gran importancia, abriendo las puertas al desarrollo de

métodos de remediación biológica.

2.1 Degradación Microbiológica de TNT El hallazgo de microorganismos presentes en áreas contaminadas con

compuestos nitroaromáticos como TNT, solventes y fertilizantes, evidencia la

existencia de especies capaces de tolerar estos compuestos y utilizarlos en

su metabolismo, bien sea como fuente de carbono o nitrógeno. Esta

capacidad y la gran diversidad metabólica de los microorganismos se ha

convertido en un potencial biotecnológico para la biorremediación de

compuestos xenobióticos como los nitroaromáticos.

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Numerosos estudios han reportado el aislamiento de microorganismos con

potencial degradador de TNT (Tabla 2), capaces incluso de mineralizar este

compuesto, a partir de ambientes contaminados con explosivos.

Tabla No 2: Estudios que reportan algunos microorganismos

como potenciales degradadores de TNT.

FUENTE AÑO INVESTIGACIÓN

Boopathy R., et al. 1993Desulfovibrio sp: Transformación de TNT en compuestos como 2,4-diamino-6-nitrotolueno.

Vanderberg L., et al. 1995

Mycobacterium vaccae: Degradación de TNT produciendo un compuesto marrón identificado como 4-amino-2,6-dinitroácido benzóico.

Pasti-Grigsby M., et al. 1996Actinomyces sp: Degradación aeróbica y anaeróbica de TNT con producción de intermediarios hidroxilaminotoluenos.

Tope A., et al. 1999Estudio sobre la transformación de TNT en aminonitrotoluenos por parte de una cepa de Arthrobacter sp.

Pavlostathis S., et al. 2002 Anabaena sp: Transformación de TNT en productos solubles y metabolitos polares.

Kim H., et al. 2002Evaluación de la capacidad de Klebsiella sp. Para degradar TNT en compuestos menos tóxicos como amino-nitrotolueno.

Park C., et al. 2002Estimación de la cinética de degradación de TNT por parte de una cepa de Pseudomonas putida.

Yin H., et al. 2004

Evaluación de la capacidad metabólica de Escherichia coli para convertir TNT en compuestos como Hidroxilamino-dinitrotolueno.

Kutty R., et al. 2005 Clostridium acetobutylicum: Degradación de TNT mediante enzimas nitroreductasas.

Claus H., et al. 2007 Raoutella terrígena degradación de TNT en metabolitos más sencillos

Claus H., et al 2007Aislamiento en suelos contaminados con TNT de una cepa de Raoultella terrígena capaz de degradar este compuesto.

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2.2 Rutas Metabólicas de Degradación de TNT:

Se conocen principalmente tres vías metabólicas por las cuales algunos

microorganismos degradan el TNT, convirtiéndolo en compuestos

intermediarios menos tóxicos. La primera (Vía I), se da en condiciones de

anaerobiosis y consiste en una transformación secuencial de los grupos nitro

unidos al anillo aromático hacia la correspondiente amina (Yin et al., 2004).

Esta vía de transformación, es generalmente realizada por microorganismos

anaeróbicos, donde Clostridium sp es uno de los más reportados, junto con

algunas bacterias sulfatoreductoras como Desulfovibrio sp (Zoe & Neil,

2006).

Así mismo, se han descrito otras dos vías alternativas, que ocurren en

presencia de oxígeno, aún cuando una de ellas no lo utiliza como aceptor

final de electrones. Precisamente, la segunda vía (Vía II), es aquella en la

que el TNT actúa como un aceptor de electrones, debido a la gran facilidad

que existe para reducir los nitro-grupos formados por los enlaces nitrógeno-

oxígeno altamente electrofílicos (Yin et al., 2004), con este metabolismo se

han reportado bacterias como Enterobacter cloacae, Escherichia coli y

Pseudomonas putida (Zoe & Neil, 2006).

La tercera vía (Vía III) es una de las rutas metabólicas más complejas, que

se caracteriza por la formación de un complejo llamado Meisenheimer, que

se genera cuando el microorganismo es capaz de atacar directamente los

enlaces que conforman el anillo aromático. Esta es una de las vías más difícil

y menos común dentro de los microorganismos reportados (Zoe & Neil,

2006).

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2.2.1 Vía I

La descripción de esta ruta metabólica es dada con claridad en el estudio

realizado por Preuss y col. (1992), donde utilizaron bacterias

sulfatoreductoras crecidas en un medio con sulfato y piruvato como fuente de

energía y TNT como única fuente de nitrógeno.

Esta degradación consiste, básicamente, en una reducción secuencial de los

grupos nitro del TNT hasta sus respectivas aminas (Yin et al., 2004). Algunos

autores reportan que la reducción del primer nitro-sustituto del TNT, puede

darse bajo condiciones tanto de aerobiosis como anaerobiosis (Zoe & Neil,

2006). Cuando se lleva a cabo este paso se obtiene uno de los primeros

subproductos, denominado: 4-amino-2,6-dinitrotolueno (4-ADNT), y su

isómero: 2-amino-4,6-dinitrotolueno (2-ADNT) (Preuss et al., 1992). Una de

las características de esta secuencia de reacciones, es que el segundo grupo

nitrogenado no se reduce hasta que finaliza la reacción anterior, por lo cual el

segundo paso está definido por la transformación de 4-ADNT y 2-ADNT a

2,4-diamino-6-nitrotolueno (DANT) (Preuss et al., 1992).

La siguiente etapa es la reducción total del TNT, produciendo finalmente

triaminotolueno (TAT). Esta reacción requiere un donador de electrones

como el piruvato o el monóxido de carbono y un conjunto de enzimas

encargadas de catalizar la reacción, llamadas hidrogenasa, Piruvato:

ferredoxin oxidoreductasa y monóxido de carbono dihidrogenasa (Preuss et

al., 1992).

Por lo general, este paso ocurre de manera directa sin la generación de

ningún intermediario, sin embargo se han reportado casos en los que bajo la

acción de la enzima monóxido de carbono dihidrogenasa se genera un

compuesto intermediario conocido como 2,4-diamino-6-hidroxilaminotolueno

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(DAHAT) (Preuss et al., 1992). Los resultados obtenidos en este experimento

sugirieron que bajo estas condiciones, el monóxido de carbono juega un

papel bifuncional dentro de la reacción, donde además de ser el donador de

electrones puede ser inhibidor de la reducción de DAHAT a TAT (Preuss et

al., 1992).

2.2.2 Vía II

Esta es una de las rutas metabólicas que aunque no es estrictamente

aeróbica, por lo general ocurre en presencia de oxígeno (Kim et al., 2002). El

proceso, consiste en una reacción reductiva (Figura 2), a partir de la cual,

uno o máximo dos de los grupos nitro que componen el TNT son convertidos

en radicales nitroso e hidroxilamina, por acción de enzimas nitroreductasas

(Kim et al., 2002).

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10  

Figura 2: Reducción de TNT mediante enzimas Nitroreductasas

(Tomada de: Zoe & Neil, 2006)

Amino‐Dinitrotolueno 

Hidroxilamino‐Dinitrotolueno 

Nitroso‐Dinitrotolueno 

TNT 

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11  

2.2.3 Vía III

Esta ruta metabólica corresponde a la degradación aeróbica del TNT. La

formación del complejo Meisenheimer y la dependencia de oxígeno, son sus

principales características (Zoe & Neil, 2006). Actualmente no se reportan

muchos microorganismos capaces de llevar a cabo este mecanismo, sin

embargo se conoce con certeza que Pseudomonas fluorescens,

Enterobacter cloacae y Rhodococcus erythropolis son capaces de degradar

compuestos nitroaromáticos mediante esta vía (Núñes et al., 2001).

Este tipo de metabolismo, al ser uno de los más complejos, es también el

menos conocido, aunque no se han determinado con seguridad todos los

metabolitos producidos, se cree que la etapa final de esta ruta es la

mineralización total del TNT (Vorbeck et al., 1994; Núñes et al., 2001; Zoe &

Neil, 2006).

La formación del complejo Meisenheimer (Figura 3), implica la pérdida de las

propiedades aromáticas del benceno. Aunque este compuesto es uno de los

mejores donadores de electrones, cuando se encuentra nitrogenado (como lo

es el TNT), pierde propiedades oxidativas, debido a la presencia de los

grupos nitro unidos a sus carbonos 2,4 y 6 (Zoe & Neil, 2006). En

consecuencia, el potencial redox del TNT disminuye, llevándose a cabo un

ataque reductivo que trae consigo la formación NO2 y el complejo

anteriormente mencionado (Figura 4) (Núñes et al., 2001; Zoe & Neil, 2006).

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12  

Figura 3: Formación del Complejo Meisenheimer

(Tomada de: Vorbeck et al., 1994)

Figura 4: Transformación del complejo Meisenheimer (Tomada de: Zoe & Neil, 2006)

Complejo Dihiíbrido‐Meisenheimer

Complejo Híbrido‐Meisenheimer

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13  

Aunque los últimos productos de esta ruta metabólica no se han podido

identificar, se ha confirmado que la transformación del complejo dihíbrido-

Meisenheimer ocurre mediante varias reacciones de reducción que genera la

producción de diversos metabolitos y NO2 (Zoe & Neil, 2006).

2.3 Microorganismos Degradadores de TNT 2.3.1 Aislamiento Numerosos estudios reportan que los microorganismos nativos de ambientes

contaminados con explosivos, son los microorganismos que presentan mejor

potencial degradador de compuestos nitrogenados como el TNT.

Debido a la complejidad química que caracteriza a todos los compuestos

xenobióticos, la búsqueda de estos microorganismos implica la localización

de áreas de contaminación histórica, que son aquellos lugares en los que el

compuesto ha permanecido presente durante largos periodos de tiempo; con

el objetivo de encontrar microorganismos que han conseguido adaptarse a

su presencia, desarrollando potencial degradador, que les permite

aprovecharlo en su metabolismo como única fuente de carbono o nitrógeno

(Zaripov et al., 2004; Oh et al., 1998).

Varias investigaciones reportan que el TNT es tomado por los

microorganismos como fuente única de nitrógeno (Zaripov et al., 2004; Oh et

al., 1998). Por ese motivo, necesitan la presencia adicional de compuestos

que puedan consumir como fuente de carbono, bien sea materia orgánica

presente naturalmente en el suelo o carbohidratos simples de fácil

degradación como glucosa, succinato y acetato (Gonnison et al., 1993)

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14  

2.3.1.2 Medios de Cultivo El aislamiento de microorganismos con este potencial degradador, requiere

de un medio de cultivo que le brinde las condiciones nutricionales para

efectuar este metabolismo. En la Tabla No 3, se muestra el contenido de

cinco medios de cultivo diferentes, utilizados en estudios realizados con

microorganismos degradadores de compuestos nitroaromáticos. En términos

generales, además del explosivo, los microorganismos deben contar con una

fuente de carbono, una solución mínima de sales, fósforo, vitaminas y

elementos traza.

Tabla No 3: Medios de cultivo más reportados para el aislamiento de microorganismos degradadores de TNT.

FUENTE AÑO MEDIO DE CULTIVO

Spanggord R., et al. 1991

FC: - FN: 100ppm DNT Medio Base: K2HPO4, 0.7g/L; KH2PO4,0.3 g/L;(NH4)2S04, 0.5 g/L; NaCl, 0.5 g/L; MgSO4 - 7H20, 0.05 g/L; CaCl2.2H20, 0.1 g/L; FeSO4 7H20, 0.003 g/L. Elementos Traza: H3BO3, 0.1g/L; CaSO4 5H20, 0.05 g/L; ZnSO4. 7H20, 0.05 g/L; Na2MoO2 6H20, 0.05 g/L.

Boopathy R., et al. 1993

FC: Lactato o Piruvato 30mM FN: TNT 100ppm Medio Base: KH2PO4, 2.94 mM; K2HPO4, 1.15 mM; NH4Cl, 9.35 mM; NaCl, 10.27 mM; MgCl2, 0.5 mM; CaCl2, 0.34 mM; Na2SO4, 20.0 mM; Na2S, 0.5 mM; Resarsurina 0,003 mM.

Kim H., et al. 2002

FC: 2,5g/L Glucosa FN: 300ppm TNT; 1g/L Sulfato de Amonio Medio Base: 0,1g/L MgSO4; 3,5g/L K2HPO4; 1,5g/L KH2PO4; 1g/L Extracto Levadura

Zaripov S., et al. 2003

FC: Glucosa 5g/L FN: TNT 12-200 g/L Medio Base: 0,25g/L MgSO4; 4,5 g/L Na2HPO4; 3 g/L KH2PO4; 1 g/L (NH4)SO4; 0,05 g/L Extracto de Levadura

Claus H., et al. 2007 Agar Nutritivo Standard Con adición de 10mg/L TNT

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15  

Como se muestra en la tabla anterior (Tabla No 3), la concentración de TNT

óptima para estimular la degradación del compuesto por parte de los

microorganismos, varía en las investigaciones en un rango muy amplio, pues

abarca concentraciones que van desde 50ppm, hasta 200g/L (200.000ppm).

Sin embargo algunos estudios reportan que concentraciones por encima de

los 100ppm ejercen un efecto inhibidor sobre el crecimiento de los

microorganismos con potencial degradador (Gonnison et al., 1993).

2.3.2 Evaluación del Potencial Degradador La evaluación del potencial degradador de los microorganismos crecidos en

un medio, se da generalmente mediante el control de consumo del sustrato,

en este caso TNT. Los métodos más utilizados para esto son la

cromatografía de gases y la cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC)

(Núñes et al., 2001), el objetivo es determinar la disminución de la

concentración inicial de TNT presente en el medio en un determinado

intervalo de tiempo.

En el análisis por HPLC, un gran número de estudios reportan el etanol

(Lachance et al., 2004; Collie et al., 1995; Park et al., 2003) como la fase

líquida más utilizada, sin embargo también se usan compuestos como

metanol y acetona. Aunque esta técnica es la más reportada para el estudio

de la degradación de compuestos nitroaromáticos, Bruns-Nagel y col (1996)

reportan que la cromatografía de gases fue el método más rápido y eficiente

para la detección de compuestos como TNT, 4-ADNT y 2-ADNT en muestras

provenientes de suelos contaminados.

Por otra parte, existen técnicas más específicas, en cuanto a que son útiles

para detectar uno de los posibles productos de la degradación. La detección

de nitratos, mediante la técnica colorimétrica de Nessler, es una alternativa

viable cuando se evalúa la degradación de TNT por parte de un

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microorganismo que lleva a cabo el metabolismo aeróbico en el que se

produce el complejo de Meisenheimer (Vorbeck et al., 1994).

3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN

El uso de TNT ha incrementado con el desarrollo de la industria militar que

inició su progreso en la Primera Guerra Mundial. En Colombia, este

compuesto se utiliza en diversas actividades que incluyen la excavación, la

minería y la milicia. De la mano de su utilización, ha incrementado la

contaminación producida por la acumulación de este compuesto en diversos

ambientes. La toxicidad de su composición química y las propiedades

mutagénicas y carcinogénicas que le son atribuidas, ha incentivado la

búsqueda de soluciones efectivas y económicas, capaces de disminuir la

concentración de este compuesto sin trasladarlo de un ambiente a otro.

Actualmente, la biorremediación se perfila como una de las mejores

alternativas para remediar regiones contaminadas con compuestos

explosivos como TNT, debido a que es una solución ambientalmente

amigable que requiere una baja inversión económica. Sin embargo, en

Colombia no se reporta ninguna investigación orientada a la biorremediación

de explosivos y esto ha impedido el aprovechamiento de sus ventajas en

nuestro país.

La biorremediación, es una herramienta biológica que busca la degradación

de compuestos químicos persistentes, por medio de organismos vivos que

son capaces de metabolizarlos. Esta alternativa exige el conocimiento previo

de microorganismos (en este caso) con una capacidad metabólica para

degradar compuestos de naturaleza química similar al contaminante. Esta

necesidad y el hecho de que no existen estudios similares en Colombia, ha

motivado esta investigación, cuyo objetivo principal fue aislar

microorganismos nativos de suelos contaminados con explosivos, capaces

de degradar TNT.

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17  

4. OBJETIVOS

4.1 OBJETIVO GENERAL:

Aislar microorganismos degradadores de TNT, a partir de ambientes

contaminados con explosivos.

4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

• Identificar sitios contaminados en los que posiblemente se encuentren

microorganismos con potencial degradador de TNT.

• Evaluar si el TNT es utilizado por los microorganismos degradadores

como fuente de carbono y/o nitrógeno, utilizando otras fuentes

adicionales fácilmente asimilables.

• Realizar una caracterización macro y microscópica de los

microorganismos degradadores de TNT aislados.

• Comprobar la degradación de TNT por parte de los microorganismos

aislados mediante la técnica de HPLC.

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18  

5. MATERIALES Y MÉTODOS

Las muestras de suelo, agua y lodos contaminados con residuos explosivos,

entre los que se encontraban grandes cantidades de TNT, fueron recogidas

en sitios aledaños a una de las principales plantas colombianas fabricadoras

de productos explosivos comerciales. Alrededor de sus instalaciones, se

definieron doce puntos de muestreo, que fueron elegidos por su proximidad

con las áreas de manipulación del compuesto de interés y las áreas de

desechos y manejo de residuos resultantes de los procesos de producción

físicos y químicos (Tabla 4). Las muestras se almacenaron en bolsas

estériles que se mantuvieron en refrigeración hasta su análisis en el

laboratorio de USBA (Unidad de Saneamiento y Biotecnología Ambiental).

Tabla No 4: Puntos de muestreo seleccionados

No Área Muestreada 1 Exterior 2 Canal Exterior 3 Trampa Taller Multiplicador 4 Canal de la Trampa 5 Caneca 6 Tanque de Transporte 7 Ex Caja de Captación 8 Concentración Tensoactivos 9 Campo de Prueba

10 Lodos de Planta Tratamiento de Aguas Residuales (PTAR)

11 Fitorremediación 12 Caño PTAR

5.1 Análisis Físico-Químico

Inicialmente, se realizó una caracterización preliminar de las muestras

determinando pH y salinidad, estas propiedades se calcularon siguiendo los

POE’s del laboratorio de USBA de la Universidad Javeriana. Estas

propiedades se eligieron por la facilidad y economía con la que pueden ser

calculadas y por ser las más importantes a la hora de guiarnos en la

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19  

preparación del medio de cultivo. A la muestra número 6, correspondiente a

los trozos de producto comercial tomados del tanque transportador de la

planta no se le midieron estas variables, debido a que por su composición se

recomendó evitar al máximo su manipulación.

Incluir cálculos sobre la concentración inicial de explosivo y la presencia de

fuentes de carbono y nitrógeno, habría permitido realizar una caracterización

completa de las muestras, arrojando datos importantes para definir cuál de

los sitios funcionaría mejor como fuente de aislamiento de microorganismos

degradadores, sin embargo estos ensayos no se incluyeron en este proyecto

por limitantes de tiempo y presupuesto.

5.2 Aislamiento

La preparación de los medios de cultivo que se utilizaron fueron tomadas de

estudios que reportaron aislamientos exitosos de microorganismos

degradadores de TNT (Zaripov et al., 2004; Kim et al., 2002). Para realizar el

aislamiento a partir de las muestras tomadas, se evaluó el crecimiento de

microorganismos en tres tratamientos diferentes. La diferencia entre estos

tratamientos, fue básicamente la presencia de carbono y nitrógeno, con el fin

de determinar si el TNT era metabolizado por los degradadores como una

fuente de carbono o nitrógeno. El medio de cultivo base para los tres,

contenía una solución mínima de sales, buffer fosfato, trazas, vitaminas y

TNT.

Tabla No 5: Tratamientos Utilizados en el aislamiento de microorganismos degradadores de TNT

Tratamiento Características Fuente Carbono Fuente Nitrógeno

T1 - - T2 + - T3 - +

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20  

Como fuente de carbono se utilizó una mezcla de glucosa, glicerol, citrato y

acetato a una concentración final de 25 ppm, y como fuente de nitrógeno 10

ppm de nitrato de amonio (NH4NO3). El explosivo se adicionó a los tres

tratamientos en solución con acetona a una concentración final de 50 ppm,

concentración que fue seleccionada por ser la más reportada en diversas

investigaciones, como una concentración óptima para evaluar la

biodegradación de este compuesto.

El proceso que se llevó a cabo para el aislamiento de microorganismos

degradadores, se dividió en tres etapas, cada una con una duración

aproximada de diez días.

5.2.1 Etapa I: Preenriquecimiento:

Se montaron en total 36 preenriquecimientos, tres tratamientos por cada una

de las 12 muestras, utilizando frascos de vidrio estériles (100 mL).

El montaje se realizó colocando inicialmente 1 g o mL de muestra y 125 µL

de solución de explosivo en acetona, solvente que se dejó evaporar en la

cabina de flujo laminar durante dos horas, con el objetivo de volatilizar la

acetona y disminuir los residuos que pudieran interferir en los ensayos y

evitar que fuera utilizado como una fuente de carbono adicional para los

microorganismos, o ejerciera un efecto tóxico sobre los mismos.

Posteriormente, se agregaron 4 g o mL de muestra y 45 mL del medio de

cultivo correspondiente a cada tratamiento.

Los preenriquecimientos se mantuvieron a temperatura ambiente (21,0 ± 0,9 oC) y agitación constante de 115 rpm durante 10 días. Los frascos utilizados

para mantener estos microcosmos no se sellaron completamente, para

garantizar la presencia de oxígeno en el ambiente.

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21  

5.2.2 Etapa II: Aislamiento en Medio de Cultivo Sólido

A partir de los preenriquecimientos, se realizaron diluciones seriadas (10-2, a

10-5) en solución salina al 0,85% p/v, utilizando la metodología estandarizada

por Latorre (2007) en el laboratorio de USBA. Todos los preenriquecimientos,

fueron sembrados en superficie por duplicado en tres medios de cultivo

sólidos, correspondientes a T1, T2 y T3 (Tabla 5).

Adicionalmente se realizó un ensayo en una de las réplicas del Tratamiento1

(T1) que consistía en adicionar el explosivo en la superficie del medio ya

solidificado, mientras que en los otros tratamientos se manejó disolviendo la

solución de explosivo y acetona en el medio líquido estéril justo antes de

servir las cajas.

Todos los cultivos fueron incubados a temperatura ambiente (21,0 ± 0,9 oC)

en condiciones aeróbicas, durante aproximadamente dos semanas.

5.2.3 Etapa III: Segundo cultivo y selección macroscópica de colonias.

La etapa III inició con la selección de todas las colonias que crecieron en los

tratamientos y presentaron diferencias macroscópicas, esperando tomar el

mayor número de posibles degradadores. El segundo cultivo se realizó en

medio sólido de cada uno de los tratamientos con concentración doble de

TNT (100ppm) para generar mayor presión selectiva sobre los

microorganismos. Para llevar a cabo el aislamiento de estas colonias se

utilizaron cajas de petri marcadas con una cuadrícula de 22 espacios (uno

para cada colonia).

Cada colonia seleccionada se repicó con un palillo de madera estéril en los

tres tratamientos, el cual se introdujo finalmente en un tubo para centrífuga

(50 mL) con 10 mL de T2 (100 ppm de TNT), medio de cultivo elegido para el

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22  

análisis mediante HPLC, debido a que es reportado como el medio más

favorable para la degradación del compuesto evaluado.

Estos cultivos fueron incubados a temperatura ambiente (21,0 ± 0,9 oC)

durante 10 días. Finalizado este periodo, se evaluaron las características

macroscópicas y microscópicas de todas las colonias. Se definió como

primer criterio de selección el crecimiento positivo en T1, debido a que por

sus condiciones nutricionales este medio podría ser el más selectivo.

Posteriormente se evaluaron las colonias crecidas en T2 y se seleccionaron

aquellas que presentaran morfologías macro y microscópicas diferentes.

5.2.4 Etapa IV: Métodos Analíticos: HPLC

El TNT residual de los tubos sembrados en la etapa anterior, fue evaluado

mediante cromatografía liquida de alta eficiencia (HPLC), basándose

principalmente en el método 8330 descrito por la EPA (EPA, 1994). Para su

desarrollo se tomaron 1.2 ml de cada cultivo y se centrifugaron a 1200 rpm

durante 10 min; el sobrenadante obtenido se pasó a través de un filtro de

membrana 0.2 µm (Advantec) de nitrato de celulosa. Posteriormente se

inyectaron 100 µL de cada muestra al equipo de HPLC marca Shimatzu

prominence, que consta de un detector de diodos y una columna Restek C-

18. Se utilizó una solución Metanol:Agua (50:50 v/v) como fase móvil con un

flujo de 1 ml/minuto y una temperatura de 35ºC. La longitud de onda

empleada para la detección de los picos de TNT fue 254 nm.

Una solución estándar de TNT fue utilizada para validar el tiempo de

retención de este compuesto y se procesó bajo las mismas condiciones.

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Para poder cuantificar la concentración de TNT presente en los cultivos, se

elaboró una curva patrón, utilizando soluciones estándar preparadas con

concentraciones conocidas de TNT (12,5 ppm, 25 ppm, 50 ppm, 100 ppm).

Se definieron dos controles diferentes. El control No 1 correspondió al medio

de cultivo del Tratamiento 2 sin ser inoculado, el cual permitió cuantificar la

concentración inicial de TNT presente en el medio. El segundo control fue

tomado del medio de cultivo T2 contenido por un palillo de madera estéril,

igual a los que se utilizaron para inocular las cepas. Esto con el objetivo de

visualizar su efecto en el medio.

6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Se realizó una caracterización preliminar físico-química de las muestras y se

obtuvieron los siguientes valores de pH y conductividad.

Tabla 6: Caracterización físico-química de las muestras

Muestra No pH Conductividad (deciSiemens/metro) Dilución

1 7,11 0,34 1:1 2 7,34 0,22 1:1 3 6,58 0,17 - 4 7,14 1,15 - 5 2,11 1,47 - 7 7,54 0,44 - 8 7,20 14,96 - 9 7,88 0,63 - 10 8,73 1,57 1:1 11 7,42 0,47 1:1 12 8,95 0,44 1:1

La conductividad de los ambientes muestreados se determinó con el objetivo

de tener un indicio a cerca de las propiedades salinas de los mismos, para

así orientar la preparación de los medios de cultivo. En general, los valores

de todas las muestras estuvieron entre 0 y 2 dS/m, valores entre los que se

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consideran ambientes normales de baja salinidad. Sin embargo, la muestra

No. 8, procedente del tanque de concentración de tensoactivos, obtuvo una

conductividad superior de 14,96 dS/m indicando características de fuerte

salinidad (Tabla No. 6). Este fenómeno, puede deberse a la presencia de

compuestos como carbonatos, cloruros y sulfatos, que junto con los

tensoactivos, pueden ser compuestos residuos de la producción de los

explosivos comerciales.

Como se puede visualizar en la Tabla No 6, la mayoría de las muestras

presentaron un pH cercano a la neutralidad, sin embargo algunas de ellas

arrojaron valores extremos de acidez y alcalinidad. Aunque es difícil pensar

que a partir de muestras con un pH de 2,11 se logren obtener

microorganismos nativos que puedan desarrollarse en un medio de cultivo

con pH neutro, no se considera una variable que pueda influir en el

aislamiento de microorganismos degradadores de TNT, ya que como lo

reportan Zaripov (2004) y Kim (2002) en sus estudios, la degradación

biológica de compuestos nitroaromáticos ha sido posible en amplios rangos

de pH.

6.1 Etapa I: Pre-enriquecimiento

Todos los pre-enriquecimientos presentaron turbidez lo cual podía ser

considerado como indicador de crecimiento. Se comprobó la presencia de

microorganismos mediante coloración de Gram y se observaron

principalmente tres morfotipos: cocos Gram positivos, bacilos Gram positivos

(GP) y bacilos Gram negativos (GN), siendo las dos últimas las morfologías

más predominantes. Un estudio realizado por Fuller y col (1996) demostró

que las bacterias Gram positivas son muchos más sensibles al TNT que las

bacterias Gram negativas, las cuales tienden a tolerar concentraciones más

altas de este compuesto y presentar velocidades de degradación mucho más

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25  

eficientes. Sin embargo, en la evaluación microscópica que se hizo de los

pre-enriquecimientos, fue más común la presencia de bacterias GP que GN

(Tabla 7), lo que puede deberse a la ventaja que representa para estas

bacterias (GP) la esporulación.

A pesar de que los pre-enriquecimientos preparados presentaban una

concentración considerable de TNT (50 ppm), la presión selectiva que este

ejerció sobre los microorganismos no fue tan alta, debido a la posibilidad de

que las muestras (suelos, lagos y aguas) contuvieran algunas trazas de

carbono y nitrógeno fácilmente asimilables. Aunque habría sido bastante útil

determinar la presencia de estas trazas y la concentración inicial de TNT en

cada una de las muestras para conocer con certeza las condiciones

nutricionales bajo las cuales se desarrollaban los microorganismos nativos,

esta determinación no se realizó por limitantes de tiempo y presupuesto.

En algunas muestras se observó la presencia de bacilos Gram negativos

curvos y en forma de “S”, muy similares a las bacterias características del

ciclo del azufre (Tabla 7). En un estudio realizado por Kulkarni y Chaudhari

(2007) se presentó una revisión general de los microorganismos capaces de

degradar compuestos nitroaromáticos, donde encontraron que Desulfovibrio

sp y en general bacterias sulfato reductoras, presentan la capacidad de

degradar TNT. La morfología característica de estas bacterias se encontró en

los Tratamientos 1 y 2 (Tabla 7), los cuales tienen en común la ausencia de

una fuente adicional de nitrógeno. El estudio mencionado, reporta que estas

bacterias utilizan el TNT como única fuente de nitrógeno, convirtiéndolo en

triaminotolueno (TAT) y algunos otros compuestos no identificados.

Es importante tener en cuenta que al abrir los frascos de los pre-

enriquecimientos, el sonido y los olores percibidos evidenciaron la

acumulación de gases, los cuales sugieren un metabolismo activo por

microorganismos dentro de los mismos.

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Aunque inicialmente las condiciones de los microcosmos fueron aeróbicas,

es probable que al finalizar el periodo de incubación, la disponibilidad de

oxígeno haya disminuido y las condiciones finales fueran favorables para el

crecimiento de microorganismos anaerobios. La degradación de TNT se

puede llevar a cabo en cualquiera de estas condiciones, de hecho

microorganismos estrictamente anaeróbicos como Clostridium sp.y

Acetobacterium sp han sido reportados como potenciales degradadores de

compuestos nitroaromáticos como TNT (Neal & Arnett, 2004; Kutty &

Bennett, 2005).

Tabla 7: Morfología microscópica de los microorganismos desarrollados en los pre-enriquecimientos.

Mtra. Tto Bacilos Gram

Positivos

Bacilos Gram

Negativos

Cocos Gram

PositivosOtra

Morfología

1

T1 x - x -

T2 x - x BGN en forma de S

T3 x - - -

2 T1 x - x - T2 x - x BGN curvo T3 x x - -

3 T1 x x x - T2 x - x - T3 x - x -

4

T1 x - x BGN en forma de S

T2 x - x BGN en forma de S

T3 x - x -

5 T1 x x - - T2 x - - - T3 - - x -

6 T1 x - x - T2 x - x - T3 x - x -

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Mtra. Tto. Bacilos Gram

Positivos

Bacilos Gram

Negativos

Cocos Gram

PositivosOtra

Morfología

7

T1 x - x -

T2 x x x BGN en forma de S

T3 x - - -

8 T1 x - - - T2 x - - BGN curvo T3 x - - -

9 T1 x x - - T2 x - - - T3 x - - -

10 T1 - - - - T2 x - - - T3 - - - -

11 T1 x x - - T2 x x - - T3 - x - -

12 T1 x - - BGN en

forma de S T2 x x x - T3 x - - -

6.2 Etapa II: Aislamiento en medio de cultivo sólido

El crecimiento de colonias en los medios de cultivo correspondientes a los

tres tratamientos fue muy diverso, sin embargo no se observó ninguna

característica particular de las colonias conocidas de los microorganismos

degradadores de TNT que son descritas en estudios anteriores.

Nyanhongo y col (2008) por ejemplo, realizaron un estudio en el que lograron

identificar el potencial degradador de microorganismos como Pseudomonas

putida y Bacillus SF en medio de cultivo sólido, gracias a las características

macroscópicas y el viraje del color del medio provocado por las colonias.

Según los resultados de esta investigación, cuando los microorganismos

degradan los cristales de TNT, forman colonias color rojo oscuro y viran el

color del medio a rojo o amarillo, dependiendo del metabolito que produzcan.

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28  

Con el objetivo de evidenciar un efecto parecido, se realizaron dos ensayos

sobre la forma de adicionar el explosivo al medio de cultivo, en superficie y

en solución. Aunque se encontraron diferencias importantes en el

crecimiento de microorganismos adicionando la solución de TNT en la

superficie del medio, es necesario estandarizar la concentración de TNT bajo

la cual se logra opacidad en el medio de cultivo, de tal forma que se puedan

observar los halos de degradación, o se logre visualizar el cambio de color

provocado por la producción de metabolitos como 2-aminodinitrotolueno y

sus isómeros.

En este ensayo, en el que el TNT fue adicionado en la superficie del medio

una vez solidificado, el número de colonias obtenidas fue mucho más

pequeño y la diversidad morfológica que se apreció en estas cajas fue

menor, probablemente debido a que la concentración final de TNT que se

consiguió sobre la superficie del medio fue mayor que la que resultó con la

disolución del explosivo en el medio líquido, ensayos en los que el número

de colonias fue mucho mayor y con una distribución en el medio mucho más

homogénea.

La adición del explosivo en la superficie, formó una mancha blanca opaca

sobre el medio, que se difuminó al adicionar el inóculo. Sin embargo, en una

de las cajas fue posible observar el crecimiento de dos colonias circulares,

pequeñas, blancas, convexas y de borde regular sobre la mancha de TNT.

Alrededor de las colonias se identificó la formación de una zona de

aclaramiento, que sin ser totalmente translúcida, fue posible diferenciarla en

la superficie del medio. Aunque no se puede afirmar que dicha zona

corresponde a un halo de degradación, es importante tener en cuenta, que

estas dos colonias además de presentar la morfología más abundante

encontrada en los diferentes ensayos, fueron seleccionadas para pasarlas al

subcultivo de la Etapa III. De igual forma presentaron un crecimiento

abundante en el Tratamiento 2, que según la teoría se ha reportado como el

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29  

medio de cultivo óptimo para el crecimiento de los microorganismos con

potencial degradador de TNT.

Diversos estudios (Gonnison et al., 1993; Zaripov et al., 2003; Stenuit et al.,

2006; Kulkarni M. & Chaudhari A., 2007), han demostrado que dichos

microorganismos utilizan el explosivo como única fuente de nitrógeno, por lo

cual recomiendan agregar al medio de cultivo una fuente adicional de

carbono fácilmente asimilable como la glucosa o el acetato (Gonnison et al.,

1993), para generar un balance de nutrientes favorable para la degradación.

En este estudio, el tratamiento con estas características (T2) no solo

presentó el mayor número de colonias, sino que fue donde mayor diversidad

morfológica se observó.

Como parte de los resultados, se esperaba que el crecimiento en los otros

tratamientos, en los que no se adicionaba ninguna fuente de carbono, fuera

bajo; sin embargo en T3, por ejemplo, la mayoría de las muestras

presentaron crecimiento masivo de una colonia puntiforme, trasparente y

regular. Mientras que en T1, a pesar de ser el tratamiento con menor

recuperación de biomasa, fue bastante diverso.

Es posible suponer que todos los microorganismos capaces de desarrollarse

bajo las condiciones nutricionales de estos medios, son potenciales

degradadores de TNT, sin embargo es importante tener en cuenta, que al ser

muestras procedentes de suelos y lodos, las suspensiones inoculadas,

podrían contener algunas trazas importantes de carbono orgánico y

nitrógeno fácilmente asimilable, suficientes para permitir su desarrollo; razón

por la cual se realizaron pases sucesivos de las colonias en medios de

cultivo con mayor concentración de explosivo (100ppm), esperando ejercer

una presión selectiva sobre los microorganismos no degradadores de TNT.

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30  

Tabla 8: Número de colonias seleccionadas a partir de cada muestra.

Muestra Origen No Colonias

1 Exterior 22 2 Canal Exterior 22 3 Trampa Taller Multiplicador 20 4 Canal de la Trampa 18 5 Caneca 16 6 Tanque de Transporte 14 7 Ex Caja de Captación 14 8 Concentración Tensoactivos 8 9 Campo de Prueba 15

10 Lodos de PTAR 6 11 Fitorremediación 4 12 Caño PTAR 5

El crecimiento de microorganismos fue muy diferente en todas las muestras.

Aunque en términos generales, fue positivo para todas, se obtuvo un mayor

número de colonias potencialmente degradadoras, a partir de los cultivos

procedentes de las muestras 1, 2 y 3 (Tabla 8). Estas muestras se

caracterizaron por estar constituidas de lodo y agua procedentes del pantano

que rodeaba la planta de cristalización del explosivo (Muestra No 1) y los

canales de desagüe ubicados alrededor de ella (Muestras No 2 y 3). La

carga microbiana puede deberse a la alta disponibilidad de nutrientes de

estos ambientes y la lejanía de los mismos con fuentes de contaminación por

sustancias químicas que puedan ejercer algún efecto tóxico.

La muestra No 10 y la Muestra No 12, presentaron el pH más alto de todas

las muestras obtenidas, 8,73 y 8,95, respectivamente (Tabla 6). La primera

corresponde a los lodos de la Planta de Tratamiento de Aguas Residuales

(PTAR) caracterizados por contener altas concentraciones de aluminio, y la

segunda al caño ubicado alrededor de ésta. Probablemente el pH alto,

influyó en que a partir de estas muestras la recuperación de colonias no haya

sido muy abundante, pues como se muestra en la Tabla 8 fueron las

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31  

muestras a partir de las cuales se seleccionaron menos colonias

aparentemente degradadoras de TNT. El impacto químico característico de

estas zonas es la causa de la carga microbiana reducida presente en estos

ambientes.

Contrario a esto, la Muestra No 5, que también se caracterizó por tener un

pH extremo, pero en este caso ácido con un valor de 2,11, presentó en

comparación con las muestras 10 y 12, un crecimiento abundante. Mientras

en T2 se obtuvo gran diversidad morfológica (Figura 5), en T1 y T3, las

colonias, aunque abundantes fueron todas muy similares: trasparentes,

pequeñas, convexas y circulares. Debido a que el pH del medio utilizado se

encontraba cercano a la neutralidad, no se esperaba crecimiento microbiano

a partir de estas muestras, pues se dio un cambio drástico en las condiciones

ambientales, y se esperaría que esto generara estrés en los

microorganismos inhibiendo su crecimiento. Estos resultados abren dos

nuevos interrogantes, el primero dirigido a la razón por la cual a partir de una

muestra con un pH extremadamente ácido como lo es 2,11, lograron aislarse

un gran número de microorganismos en un medio con condiciones

nutricionales especiales y un pH cercano a la neutralidad. Y el segundo,

dirigido hacia la evaluación de la eficiencia de microorganismos acidófilos

para degradar compuestos nitroaromáticos como los explosivos.

Es probable que la diferencia existente entre la recuperación de la biomasa

que se logró en las muestras con pH básico y ácido, no se deba

necesariamente a la influencia del pH sobre la capacidad degradadora de los

microorganismos, sino que es importante tener en cuenta que las muestras

de pH básico fueron tomadas de zonas que con el objetivo de eliminar

residuos del contaminante, habían sido sometidas a diversos tratamientos

por los cuales podrían estar presentes algunas sustancias químicamente

tóxicas, afectando directamente la carga microbiana de estos ambientes.

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6

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T

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6.3 Etapa I

En total se

presentaro

subcultivaro

T2 con con

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sembraron

que el del

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se acumu

Aminodinitr

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al., 2002)

(Kulkarni et

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esulfovibrio

y algunos

t al., 2007).

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33 

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et al., 2004

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T3.

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on

ón

de

os

es

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de

4).

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35  

Finalmente tras diez días de incubación de los subcultivos, fueron

seleccionadas 31 colonias, a las cuales les fue evaluada la capacidad

degradadora de TNT, mediante la técnica de HPLC.

6.4 Etapa IV: Métodos Analíticos: HPLC

Para evaluar la degradación de TNT por parte de las cepas seleccionadas,

se realizó una curva patrón preliminar con una solución estándar de TNT de

concentración conocida, que permitiera trazar un punto de comparación para

determinar si la concentración del explosivo en los diferentes cultivos había

disminuido o no (Cromatograma, Figura 8). Como se muestra en la Tabla No

9, no fue posible realizar una relación del área bajo la curva, con la

concentración de explosivo, debido a que la curva, además de contener muy

pocos puntos, no fue del todo precisa. La zona sombreada en las tablas que

acompañan todos los cromatogramas, representa los datos correspondientes

a TNT. Como es posible verlo en la Tabla No 9, el tiempo de retención para

el TNT fue de 5,9 minutos con un área correspondiente a 100ppm de

aproximadamente 14678057,9 mm2.

Adicional a esto, se analizaron dos controles diferentes que permitieron

evaluar la presencia de TNT en el medio de cultivo T2 sin ser inoculado. El

primer control, correspondió únicamente al medio de cultivo y arrojó un

tiempo de retención para el TNT de 6,2 minutos (Cromatograma, Figura 9;

Tabla No 10). El segundo control se analizó diez días después de introducir

en el medio un palillo con los cuales se estaba inoculando cada muestra.

Como se puede observar en el Cromatograma correspondiente a la figura 10

(Tabla no 11), es probable que el control se haya contaminado y la

concentración de TNT haya disminuido, pues el área bajo la curva

correspondiente al tiempo 6,2, que es proporcional a la concentración del

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36  

explosivo, es diez veces más pequeña que la de los estándares, lo que

sugiere que la concentración de TNT presente fue mucho menor a 100ppm.

Figura 8: Cromatograma Estándar 100ppm TNT

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 min

-50

0

50

100

150

200

250

300

350

400

mAU210nm,4nm (1.00)

/0.0

40/0

.049 /1

.619

/1.6

61

RT2

.365

/0.9

95

RT3

.320

/1.9

25

/76.

301

/17.

410

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37  

Tabla 9: Cromatografía Curva de Calibración de TNT

ABS 254 nm

T. RETENCIÓN ÁREA ALTURA 12,5 ppm

1,307 33432,4 2159,3 1,631 133276,8 12081,8 1,755 225116,9 15220,5 2,358 438400,4 16521,1 3,371 65185,9 1824,7 5,954 1728559,7 21870,3 9,197 100731,7 1307

25 ppm 1,331 21065,7 1319,1 1,765 265919,5 16862,5 2,348 947950,5 32981,3 5,949 3421050,0 45787,6

50 ppm 0,162 14685,5 2534 0,523 1029,3 170 0,797 1809,8 141,7 2,138 2037,3 145,5 2,549 4070,1 270,6 3,406 64397,5 1899,4

100 ppm 1,463 21826,7 1962,3 1,765 62188,5 4901,7 2,318 4221569,5 207254 4,183 2284,6 133,3 5,914 14678057,9 308678,2

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38  

Figura 9: Cromatograma Control No 1

Tabla 10: Cromatografía Control No 1

ABS 254 nm

T. RETENCIÓN ÁREA ALTURA 1,694 2839784,9 115919,4 2,426 3458913,2 318677,4 3,408 5395,8 403 4,075 20630,8 1239,7 4,382 34827,2 1504,8 6,227 7966096,8 207288,9

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 min

-50

-25

0

25

50

75

100

125

150

175

200

225

250

275

300

325

mAU210nm,4nm (1.00)

/0.1

08

/24.

798

/17.

033

RT2

.365

/0.4

57

RT3

.320

/0.4

48

/0.2

20/0

.315

/55.

858

/0.7

63

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39  

Figura 10: Cromatograma Control No 2

Tabla 11: Cromatografía Control No 2

ABS 254 nm

T. RETENCIÓN ÁREA ALTURA 1,818 11441883,7 1004096,7 2,417 6378743,2 363018,5 6,159 140842,1 4185,1 7,322 366834,7 9964,6 7,986 225687,2 5188,2

El resultado para todas las cepas analizadas fue muy similar a los

cromatogramas que se muestran a continuación, correspondientes a las

cepas T1 y T100. Las curvas de mayor altura que aparecen en el extremo

izquierdo de las gráficas (Figuras 11 y 12), antes del tiempo de retención del

explosivo, corresponde quizás a la presencia de azúcares simples como

glucosa, acetato, glicerol y citrato, los cuales fueron la fuente de carbono

1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 min

-50

0

50

100

150

200

250

300

350

mAU210nm,4nm (1.00)

/96.

315

RT2

.365

/1.9

68

/0.0

68

/0.1

79

/0.9

78

/0.4

93

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40  

adicionada al medio y se caracterizan por tener tiempos de retención

pequeños.

Para los dos casos, la curva que corresponde al TNT (probablemente situada

entre los tiempo 6-6,1) es mucho más pequeña que la del control No 1, el

cual puede considerarse la concentración inicial de TNT en el medio, antes

de ser inoculado.

Las curvas que aparecen en el extremo derecho de los cromatogramas,

mostrando tiempos de retención más altos, indican la presencia de

compuestos menos polares que el TNT, pues la fase móvil utilizada fue

metanol y éste al ser un compuesto polar, hace que los compuestos no

polares, con los cuales no tiene afinidad, se demoren más en atravesarla y

muestren un tiempo de retención más alto.

Diversos estudios en los que han caracterizado el metabolismo de los

microorganismos degradadores de TNT, se ha encontrado la producción de

metabolitos menos polares como el 4-Amino-2,6-Dinitrotolueno, su isómero

2-Amino-4,6-Dinitrotolueno (Stenuit et al., 2006) y el Triainotolueno (TAT), el

cual es producido junto con otros subproductos desconocidos, pero se

resumen como la ruta más eficiente en la degradación del TNT (Kulkarni et

al., 2007).

El área bajo la curva correspondiente a la concentración de TNT presente en

el medio disminuyó en todas las cepas analizadas. Aunque aparentemente,

todas tienen un potencial degradador de TNT, para poder concluir esto con

certeza es necesario hacer un seguimiento en intervalos de tiempo más

cortos, para evaluar la reducción del compuesto en el medio.

En vista que el control No 2 no pudo ser utilizado como un blanco de

comparación por la presencia de contaminantes, podría evaluarse otro

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41  

material diferente a la madera para inocular los medios de cultivo y así

eliminar una posible fuente de contaminación.

Figura 11: Cromatograma Cepa T1

Tabla 12: Cromatografía Cepa T1

ABS 254 nm

T. RETENCIÓN ÁREA ALTURA 1,789 11971153,5 932139,5 2,427 5137177,1 318568 3,706 71319,2 4202,9 4,619 27899,9 1403,1 5,323 4478,1 205 6,133 2960,3 130,4 7,313 150230,8 4256,9 8,054 187625,3 3853,2

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 min

0

50

100

150

200

250

300

350

400mAU

210nm,4nm (1.00)

/97.

069

RT2

.365

/1.8

79

/0.0

89

/0.0

21

/0.0

35

/0.4

43

/0.4

52

/0.0

10

/0.0

03

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42  

Figura 12: Cromatograma Cepa T100

Tabla 13: Cromatografía Cepa No 100

ABS 254 nm

T. RETENCIÓN ÁREA ALTURA 1,746 3479490 316794,9 2,003 357736 46789 2,418 3380758 194810,4 4,088 16003,7 1061,7 4,593 13040,4 686,2 6,077 167444,4 4817,9

7,28 196788 5403,3

1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 min-50

0

50

100

150

200

250

300

350

mAU210nm,4nm (1.00)

/0.0

52

/45.

513

/5.4

41R

T2.0

66/1

0.83

4R

T2.3

65/8

.546

RT2

.365

/25.

756

/0.0

99

/0.0

39

/0.6

33

/1.5

38

/0.5

71/0

.979

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7. CONCLUSIONES

‐ Los sitios ubicados alrededor de la planta de cristalización de TNT, a

partir de los cuales se tomaron sedimentos, fueron los ambientes a

partir de los cuales se logró aislar un mayor número de

microorganismos (colonias) potencialmente degradadores de TNT.

‐ La mayor variabilidad de morfotipos se obtuvo a partir del tratamiento

2, indicando la importancia de adicionar al medio una fuente de

carbono, para favorecer la degradación.

‐ La mayoría de las cepas que presentaron potencial degradador de

TNT son bacilos Gram negativos.

‐ La degradación de TNT por parte de los microorganismos aislados se

comprobó mediante la técnica de HPLC, la cual permitió comprobar la

disminución de la concentración de TNT presente en el medio y la

aparición de otros metabolitos, posiblemente subproductos de la

degradación del explosivo.

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8. RECOMENDACIONES

‐ Es necesario estandarizar la forma de adicionar el explosivo al medio

de cultivo, de tal forma que resulte más fácil visualizar la degradación

del compuesto y así realizar el seguimiento del metabolismo.

‐ Debido a que el control No 2 (Medio de cultivo + Palillo estéril)

presentó contaminación, es importante probar materiales diferentes

para realizar esta siembra, con el objetivo de eliminar una posible

fuente de contaminación.

‐ Es necesario conseguir estándares de HPLC para diferentes

subproductos del metabolismo de TNT como aminodinitrotolueno y

triaminotolueno. Y evaluar cuál sería la mejor técnica para identificar

estas sustancias.

‐ El aislamiento de microorganismos degradadores de TNT requiere la

elaboración de pases sucesivos en medios de cultivo con explosivo,

para eliminar trazas de compuestos orgánicos de fácil asimilación

provenientes de la muestra, y ejercer una presión selectiva importante

sobre los microorganismos no degradadores.

‐ La concentración de explosivo adicionada al medio de cultivo debe ser

superior a 50 ppm, ya que bajo esta concentración no hay una presión

selectiva importante sobre los microorganismos nativos.

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ANEXOS

ANEXO 1: Características macro y microscópicas de las colonias seleccionadas para el análisis mediante HPLC

# Origen Caract. Macroscópicas Caract. Microscópicas

T4 Muestra 1 Regular, mucosa, convexa color crema BGN

T9 Muestra 1 Irregular, cóncava, seca, color amarillo claro BGN

T17 Muestra 1 Circular, cóncava, bordes regulares y claros, color

amarillo BGN

T12 Muestra 1 Irregular, cóncava, cremosa, color amarillo pálido con el

centro más oscuro BGN largos

T21 Muestra 1 Irregular, cremosa, cóncava, color amarillo oscuro BGN y levaduras

T24 Muestra 2 Regular, ovalada, plana, cremosa, amarillo pálido. BGP

T27 Muestra 2 Regular, cóncava, cremosa y blanca BGP

T39 Muestra 2 Irregular, cremosa, bordes dentados, cóncava, blanca. BGP

T40 Muestra 2 Regular, convexa, cremosa, amarillo pálido con centro

oscuro. BGP

T42 Muestra 2 Irregular, plana, blanca con bordes oscuros. BGN

T43 Muestra 2 Regular, convexa, mucosa,

amarilla pálida y centro oscuro.

BGN

T50 Muestra 3 Irregular, convexa, cremosa y amarilla BGN cortos

T52 Muestra 3 Regular, cóncava, cremosa color beige. BGN delgados

T58 Muestra 3 Irregular, plana, cremosa de centro más oscuro. BGP

T62 Muestra 3 Irregular, convexa, cremosa, blanca con bordes oscuros. BGN delgados y levaduras.

T63 Muestra 3 Regular, convexa, cremosa, opaca y de centro oscuro. BGN cortos

T64 Muestra 3 Regular, cóncava, cremosa, amarillo pálido. BGN cortos y levaduras

T65 Muestra 4 Regular, cóncava, cremosa, beige de centro oscuro. BGN cortos.

T68 Muestra 4 Irregular, cremosa, plana y blanca BGN cortos.

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# Origen Caract. Macroscópicas Caract. Microscópicas

T69 Muestra 4 Circular, bordes irregulares, cremosa, convexa, blanca. BGN cortos.

T73 Muestra 4 Circular, regular, cóncava, cremosa, beige. BGN cortos y levaduras.

T74 Muestra 4 Irregular, convexa, cremosa, blanca con centro oscuro. BGP y BGN cortos

T87 Muestra 5 Irregular, seca, plana, opaca, transparente. BGN cortos

T89 Muestra 5 Circular, convexa, cremosa, brillante, color crema. BGN

T96 Muestra 5 Regular, cóncava, cremosa, blanca. BGN

T98 Muestra 5 Circular, convexa, cremosa, amarillo pálido con centro

oscuro. BGN y BGP

T99 Muestra 6 Regular, plana, cremosa, opaca, blanca CGP y BGN

T100 Muestra 6 Irregular, convexa, brillante, cremosa, blanca BGN

T105 Muestra 6 Circular, regular, convexa, cremosa y brillante BGP

T107 Muestra 6 Circular, cóncava, cremosa, blanca BGP

T111 Muestra 6 Regular, convexa, cremosa, brillante, blanca, traslúcida. BGP