Aktivitas Bakteriosin Bakteri Asam Laktat yang Diisolasi dari Air Penggumpal

Tahu Alami

(Bacteriocin of Lactic Acid Bacteria that were Isolated from Tofu Coagulant)

Oleh

Dona Bella

NIM: 412013014

SKRIPSI

Diajukan untuk memenuhi sebagian dari persyaratan untuk memperoleh gelar

Sarjana Sains (Biologi) dari Program Studi Biologi, Fakultas Biologi

Fakultas Biologi

Universitas Kristen Satya Wacana

Salatiga

2016

Pendahuluan

Tahu merupakan salah satu produk olahan kedelai yang sering digunakan

masyarakat sebagai lauk sehari-hari. Tahu merupakan makanan yang diolah dari

sari kedelai yang digumpalkan. Proses penggumpalan tahu merupakan proses

penting dalam pembuatan tahu. Proses diawali dengan pembuatan sari kedelai

dan proses penggumpalan sari kedelai. Untuk penggumpalan sari kedelai,

biasanya para produsen menggunakan asam asetat, batu tahu dan air

penggumpal tahu alami (Bella dkk, 2016).

Cara yang paling alami dan memberikan rasa tahu lebih enak yang dapat

digunakan sebagai koagulan tahu yaitu dengan menggunakan bakteri asam laktat

(BAL) yang diisolasi dari air penggumpal tahu (Bella dkk., 2016). BAL adalah

mikroba yang memproduksi asam laktat sebagai produk akhir. BAL memiliki ciri

gram positif, tidak membentuk spora, bersifat anaerob fakultatif dan biasanya

berbentuk basil atau batang. BAL memiliki banyak manfaat dan keunggulan bagi

kesehatan manusia terutama baik untuk saluran pencernaan. Hal itu dikarenakan

BAL dapat merangsang sekresi cairan lambung, serta sebagai sumber energi

dalam proses respirasi (Ramadzanti, 2006).

Kelebihan penggunaan bakteri asam laktat dalam industri pangan adalah

karena tingkat efisiensinya yang tinggi dalam beradaptasi terhadap lingkungan

serta memungkinkan dimanfaatkan oleh masyarakat karena harga yang relatif

murah (Misgiyarta, 2003). Salah satu peran bakteri asam laktat dalam proses

penggumpalan tahu adalah sebagai pengawet alami. BAL dapat berfungsi sebagai

pengawet karena memproduksi asam organik, dapat menurunkan pH

lingkungannya dan dapat mengekskresikan beberapa senyawa penghambat

mikroorganisme patogen seperti bakteriosin. Bakteriosin merupakan substansi

protein yang disintesis oleh ribosom yang memiliki aktivitas antimikrobia.

Bakteriosin dari BAL ini dapat memberikan pengawetan sekaligus nutrisi bagi

makanan (Kusmarwati dkk, 2014).

Pseudomonas aeruginosa merupakan bakteri gram negatif, berbentuk

batang berukuran 0,6 x 2 µm dan merupakan patogen utama bagi manusia.

Bakteri ini bersifat aerob, katalase positif, oksidase positif, tidak mampu

berfermentasi tetapi dapat mengoksidasi glukosa/karbohidrat lain, tidak

berspora, tidak mempunyai selubung dan mempunyai flagel. Suhu optimum untuk

pertumbuhan P. aeruginosa adalah 42oC (Mayasari, 2005). Bacillus subtilis

merupakan bakteri gram positif, berbentuk batang, bersifat anaerobik fakultatif,

mesofilik dan memiliki endospora. B. subtilis juga dapat menjadi agen pengendali

hayati dan PGR (Plant Growth Promoting Rhizobacteria). Bacillus merupakan flora

normal yang tidak berbahaya bagi manusia (Kosim & Putra, 2010)

Penelitian mengenai aktivitas bakteriosin yang diisolasi dari air

penggumpal tahu belum pernah dilakukan, sehingga dilakukan penelitian ini

dengan tujuan untuk mengetahui aktivitas bakteriosin dari bakteri asam laktat

pada air penggumpal tahu sebagai penghambat pertumbuhan bakteri Bacillus

subtilis dan Pseudomonas aeruginosa. Bacillus subtilis dan Pseudomonas

aeruginosa digunakan sebagai bakteri indikator karena kedua bakteri ini umum

ditemukan sebagai penyebab pembusukkan (Kosim & Putra, 2010).

Metode Penelitian

Pengambilan Sampel

Sampel berupa air penggumpal tahu,diambil dari produsen tahu di

Kalitaman, kota Salatiga, Jawa Tengah. Pengambilan sampel dilakukan pagi hari.

Air penggumpal tahu dibawa menggunakan jerigen, dan langsung dibawa ke

laboratorium untuk diisolasi bakteri asam laktatnya

Isolasi Bakteri Asam Laktat

Sebanyak 1 ml sampel air penggumpal tahu diencerkan hingga

pengenceran 10-4. Dari tiap-tiap pengenceran tersebut diambil 0,2 ml untuk

ditabur pada media MRS agar dan diinkubasi selama 3 hari dalam inkubator 37oC.

Pemurnian Isolat Bakteri

Koloni bakteri yang tumbuh terpisah, langsung diuji kemurniannya

dengan pengecatan sederhana dan diamati di bawah mikroskop. Isolat yang telah

murni, kemudian dipelihara pada medium agar miring MRS. Jika dalam

pengamatan masih belum murni, maka perlu dimurnikan lebih lanjut dengan cara

menggores pada medium lempeng agar MRS (Nuryadi dkk, 2013).

Karakterisasi Bakteri Asam Laktat

Uji morfologi koloni dan sel

Morfologi koloni dilakukan dengan pengamatan koloni tiap bakteri yang

telah tumbuh pada medium MRS agar. Pengamatan dilakukan terhadap bentuk,

elevasi, tepian dan warna koloni. Untuk morfologi sel dilakukan pengecatan sel

menggunakan cat gram. Sedikit bakteri dari kultur yang telah murni, diletakan

pada setetes akuades steril pada object glass, lalu di fiksasi dengan melalukan

pada api bunsen hingga kering. Pengecatan diawali dengan meneteskan pewarna

kristal violet (gram A) sampai menutupi hasil fiksasi bakteri pada object glass

selama 2 menit dan dicuci dengan akuades. Kemudian preparat ditetesi iodine

(gram B) selama 1 menit dan dicuci dengan akuades. Selanjutnya preparat dicuci

ulang dengan etanol 95% (gram C) dan dibilas dengan akuades. Langkah terakhir

dengan memberikan pewarna safranin (gram D) selama 30 detik dan dicuci

dengan akuades. Preparat tersebut diamati dibawah mikroskop (Sari dkk., 2012).

KOH string test

Satu ose kultur murni bakteri dari media miring usia 48 jam dicampur

dengan setetes KOH 3% pada object glass dan diaduk menggunakan ose,

kemudian ose diangkat secara cepat. Uji positif ditandai dengan terbentuknya

lendir seperti benang jika ose diangkat sedikit dari koloni (Arthi dkk., 2003),

Uji Biokimiawi (uji katalase)

Uji katalase dilakukan dengan menggunakan larutan H2O2 yang diteteskan

pada object glass. Koloni BAL yang telah murni diambil sedikit dengan ose

kemudian diletakkan pada object glass yang berisi larutan H2O2. Uji positif

ditandai dengan terbentuknya gelembung gas (Hadioetomo, 1990).

Uji Pembentukan Dekstran

Uji diilakukan dengan menumbuhkan isolat bakteri pada media SYP

(sucrose yeast extract peptone). Bakteri diinokulasikan pada media padat SYP

kemudian diinkubasi selama 48 jam. Amati pembentukan dekstran (Nuryadi dkk,

2013).

Tipe Fermentasi

Pengujian dilakukan dengan menginokulasi isolat bakteri dalam MRS cair

yang terdapat tabung durham kemudian diinkubasi selama 2x24 jam pada suhu

37oC. Amati pembentukan gelembung pada tabung durham (Romadhon &

Margino, 2012).

Uji Aktivitas Bakteriosin dari BAL terhadap Bakteri Indikator

Uji aktivitas bakteriosin dilakukan menggunakan metode cakram kertas

atau paperdisc dengan dua perlakuan bakteri indikator. Masing-masing perlakuan

diulang sebanyak 5 kali dan satu kontrol. Bakteri indikator yang digunakan

(Bacillus subtilis dan Pseudomonas aeruginosa) merupakan koleksi Laboratorium

Mikrobiologi, Fakultas Biologi, Universitas Kristen Satya Wacana, Salatiga.

Sebanyak satu ose biakan bakteri indikator murni disuspensikan dalam 10 ml

garam fisiologis, kemudian sebanyak 1 ml suspensi biakan diinokulasikan pada 10

ml media NA yang masih cair pada tabung reaksi. Media tersebut dicampur

dengan baik dan dituangke dalam cawan petri steril, kemudian dibiarkan hingga

memadat.

Isolat bakteri asam laktat yang telah didapat ditumbuhkan dalam media

MRS cair hingga berumur 2x24 jam. Pengkulturan dilakukan untuk masing-masing

isolat murni atau campuran. Setelah inkubasi 2x24 jam, sebanyak 20 µl masing-

masing kultur murni atau campuran diteteskan pada cakram kosong dan

diletakkan diatas media NA yang telah mengandung bakteri indikator. Sebagai

kontrol digunakan akuades steril sebagai pengganti kultur BAL. Cawan uji tersebut

kemudian diinkubasi selama 48 jam. Aktivitas bakteriosin diukur berdasarkan zona

hambat yang terbentuk disekitar cakram (Kelana dkk., 2010).

Analisis Data

Aktivitas bakteriosin diukur dari diameter zona bening yang terbentuk

disekitar paperdisc. Data dianalisis statistik nonparametrik dengan uji Kruskal-

Wallis H dan uji posterior Mann Whitney pada SPSS16.

Hasil dan Pembahasan

Karakterisasi Isolat Bakteri

Dari proses isolasi bakteri asam laktat asal sampel air penggumpal tahu

yang diambil dari produsen tahu di daerah Kalitaman, kota Salatiga, didapatkan 4

isolat yang berbeda yang tumbuh pada media MRS agar.Karakter morfologi koloni

dan sel ke empat isolat bakteri tersebut dapat dilihat pada tabel 1. Sedangkan

untuk hasil karakter fisiologis ke empat isolat yang didapat, dapat dilihat pada

tabel 2.

Tabel 1. Karakteristik Morfologi Koloni dan Sel

Bentuk Tepian Elevasi Warna Sel

Koloni A Bundar Licin Tombol Putih

kekuningan

Kokus

Koloni B Tak

Beraturan

Berombak Tombol Putih

kekuningan

Kokus

Koloni C Bundar Cembung Tombol Putih tulang Kokus

Koloni D Berkerut Berombak Cembung Putih susu Batang

Tabel 2. Karakter Fisiologi Isolat Bakteri

A B C D

KOH - - - -

Katalase + + - -

Pembentukan

Dekstran

- - + -

Tipe Fermentasi + - + -

Berdasarkan karakter fisiologi pada tabel 2, dapat diketahui bahwa isolat

A dan B tidak sepenuhnya mempunyai ciri bakteri asam laktat sedangkan isolat C

dan D merupakan bakteri asam laktat. Ciri bakteri asam laktat adalah bersifat

gram positif, katalase negatif, serta tidak membentuk spora (Romadhon &

Margino, 2012). Semua isolat tidak membentuk benang pada KOH string test yang

berarti semua isolat bersifat gram positif. Pada pengujian katalase, isolat A dan B

menghasilkan gelembung pada saat ditetesi H2O2. Salah satu ciri bakteri asam

laktat adalah tidak mampu memecah H2O2 atau bersifat katalase negatif seperti

isolat C dan D yang menunjukan reaksi katalase negatif (Romadhon & Margino,

2012).

Isolat C dapat menghasilkan dekstran, hal ini menunjukkan bahwa isolat C

merupakan bakteri asam laktat dari genus Leuconostoc yang dapat memproduksi

enzim dekstransukrase sehingga mampu mengubah sukrosa menjadi dekstran

(Landon dkk, 1993). Bakteri asam laktat memiliki dua tipe fermentasi yaitu

homofermentatif dan heterofermentatif. Isolat A dan C memiliki tipe fermentasi

heterofermentatif dimana hasil fermentasi berupa asam laktat serta asam organik

lainnya seperti asam asetat dan etanol serta menghasilkan karbondioksida. Isolat

B dan D memiliki tipe fermentasi homofermentatif dimana isolat tersebut hanya

menghasilkan asam laktat sebagai produk akhir (Rachmawati dkk., 2006).

Aktivitas Bakteriosin Bakteri Asam Laktat pada Bakteri Indikator

Uji aktivitas bakteriosin oleh bakteri asam laktat dilakukan hanya dengan

isolat C dan D. Isolat A dan B tidak digunakan dalam uji aktivitas bakteriosin

karena memiliki sifat katalase positif sehingga tidak memenuhi kriteria bakteri

asam laktat. Adanya aktivitas bakteriosin (terbentuknya zona bening disekitar

paperdisc) pada isolat C dan D dapat dilihat pada gambar 1 dan 2.

Gambar 1. Zona Hambat BAL dengan Bakteri Indikator P. aeruginosa

Gambar 2. Zona Hambat BAL dengan Bakteri Indikator B.subtilis

C

C D

D

CD Kontrol

Kontrol CD

Semua isolat menunjukkan adanya zona hambat di sekitar paperdisc.

Dengan begitu isolat C dan D mampu menghambat pertumbuhan bakteri

indikator sehingga dapat dijadikan pengawet alami makanan. Diameter zona

hambat yang dihasilkan oleh tiap isolat dapat dilihat pada grafik 1. Hasil tersebut

sudah termasuk diameter dari paperdisc sebesar 6 mm. Menurut Rai (2009),

aktivitas bakteriosin ditandai dengan adanya zona hambat yang jernih, luas dan

bulat. Jika tidak maka aktivitas tersebut diperkirakan merupakan aktivitas dari

asam, hidrogen peroksida atau diasetil. Beberapa penelitian mengenai aktivitas

bakteriosin dari bakteri asam laktat telah dilaporkan. Isolat BAL genus

Leuconostoc yang diisolasi dari asinan sawi mampu menghambat pertumbuhan

bakteri gram negatif E.coli dengan diameter zona hambat sebesar 4,67 mm

(Rachmawati dkk, 2006). Sedangkan isolat bakteri asam laktat genus Leuconostoc

yang diisolasi dari pekasam ale-ale mampu menghambat pertumbuhan

Pseudomonas aeruginosa dengan zona hambat sebesar 5,82 mm (Sari dkk, 2012).

Aktivitas penghambat oleh isolat C yang tergolong sangat kecil diperkirakan

merupakan aktivitas dari diasetil. Diasetil merupakan hasil produksi metabolisme

sitrat oleh beberapa genus BAL. Diasetil bereaksi dengan arginine-binding protein

pada bakteri gram negatif dan mempengaruhi penggunaan arginin (Rachmawati

dkk, 2006).

. Aktivitas bakteriosin isolat C, D dan gabungan isolat C dan D tidak

memiliki perbedaan yang signifikan dalam menghambat pertumbuhan Bacillus

subtilis. Semua isolat memiliki aktivitas bakteriosin yang sama, terlihat pada

kemampuan menghambat bakteri gram positif Bacillus subtilis. Menurut Daeschel

(1993), bakteri asam laktat memproduksi bakteriosin hanya sedikit dibanding

asam organik. Meskipun begitu, adanya aktivitas bakteriosin yang dihasilkan

semua isolat pada bakteri indikator Bacillus subtilis sesuai dengan penelitian

Ogunbanwo dkk (2003) yang menyatakan bahwa bakteriosin yang dihasilkan BAL

mampu menghambat pertumbuhan bakteri patogen seperti B. cereus, B. subtilis,

E. coli dan V.cholera. Bakteriosin yang dihasilkan oleh BAL dapat membentuk

lubang pada membran sel bakteri sehingga rusak dan mengalami kebocoran.

Dengan begitu, akan terjadi ketidakstabilan membran sel sehingga pertumbuhan

terhambat dan mati (Rachmawati dkk, 2006).

Grafik 1. Diameter Zona Hambat Isolat terhadap Bakteri Indikator

Bakteriosin yang dihasilkan oleh isolat mampu menghambat

pertumbuhan paling baik terdapat pada penghambatan bakteri gram negatif

Pseudomonas aeruginosa dibanding bakteri gram positif Bacillus subtilis. Bakteri

gram positif memiliki dinding sel yang lebih tebal berkisar 15-23 nm dibandingkan

dengan bakteri gram positif yang hanya 10-15 nm. Oleh sebab itu bakteri gram

positif lebih resisten terhadap lisis. Selain itu, bakteri gram negatif juga tidak

tahan asam sedangkan bakteri gram positif ada yang tahan asam. Bakteri gram

negative juga tidak mengandung asam teikoik namun mengandung polisakarida

yang lebih rentan terhadap kerusakan kimia dan mekanik. Hal ini dapat menjadi

penyebab penghambatan yang lebih bagus terhadap bakteri gram positif (Jawetz

dkk, 2001).

Kesimpulan

Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan, dapat disimpulkan bahwa

adanya aktivitas bakteriosin dari isolat C dan D yang dapat digunakan sebagai

pengawet alami pangan. Isolat C memiliki aktivitas bakteriosin yang rendah dalam

menghambat bakteri indikator gram negatif Pseudomonas aeruginosa dibanding

dengan isolat D memiliki aktivitas bakteriosin yang lebih besar. Sedangkan dalam

0123456789

C D CD K

Dia

met

er Z

on

a H

am

ba

t

(mm

)

Isolat Bakteri Asam Laktat

P. aeruginosa

B. subtilis

menghambat bakteri indikator gram positif Bacillus subtilis, tiap isolat memiliki

kemampuan yang sama.

Saran

Terlihat adanya aktivitas bakteriosin atau penghambat oleh bakteri asam

laktat terhadap bakteri lain. Oleh karena itu diperlukan penelitian lebih lanjut

untuk menentukan kadar bakteri asam laktat yang tepat agar dapat digunakan

sebagai pengawet alami dalam waktu tertentu.

Ucapan terima kasih

Terima kasih kepada Laboratorium Mikrobiologi Universitas Kristen Satya

Wacana yang telah berkenan memfasilitasi seluruh kegiatan penelitian serta

kepada pembimbing Dr. V. Irene Meitiniarti, M.P. yang telah membimbing serta

mendukung kegiatan penelitian hingga selesai.

Daftar Pustaka

Arthi, K., Appalaraju, B., Parvathi, S. 2003. “Vancomycin Sensitivity and KOH String Test as an Alternative of gram staining of Bacteria” Indian Journal of Medical Microbiology. Vol. 21 (2): 121-123.

Bella, D., Khaq, KN., Meitiniarti, VI. 2016. “Isolasi Bakteri Asam Laktat Penghasil Asam Terbaik pada ‘kecutan’ sebagai Penggumpal Protein Tahu Alami.” Prosiding Seminar Nasional Mikrobiologi II. Kerjasama Fakuktas Biologi, UKSW dengan PERMI cabang Solo.Salatiga.

Daeschel, MA. 1993. “Application and interactions of bacteriocins from lactic acid bacteria in foods and beverages”. In Bacteriocins of Lactic Acid Bacteria. Academic Press Inc. New York 63-91.

Hadioetomo, RS. 1990. Mikrobiologi dasar dalampraktek teknik dan prosedur Dasar laboratorium. Jakarta: PT Gramedia.

Jawetz, Melnick, and Adelberg,s. 2001 ; Mikrobiologi Kedokteran ; Edisi I ; Salemba Medika, Jakarta ; 196 -198.

Kelana, TB., Suryanto, D., Wahyuni, S. 2010. “Uji Antimikroba Fraksi Ekstrak Metanol, Etil Asetat dan α-Heksana Daun Tabar-Tabar (Costus speciosus) dan Toksisitasnya terhadap Larva Udang” Jurnal Biota Vol 15. No. 1: 118-125.

Kurmarwati, A., Arief, FR., Haryati, S. 2014. “Eksplorasi Bakteriosin dari Bakteri Asam Laktat Asal Rusip Bangka dan Kalimantan” JPB Perikanan Vol 9 No. 1: 29-40.

Kusmiyati., Agustini, NWR. 2006.” Uji Aktivitas Senyawa Antibakteri dari Mikroalga Porphyridium cruentum” Jurnal Biodiversitas Vol. 8 No. 1: 48-53. Kosim, M & Putra, S. R. 2010. “Pengaruh Suhu pada Protease dari Bacillus subtilis. Skripsi. Jurusan Kimia FMIPA ITS Surabaya. Landon, RS., Hudson, FW., Kramerand, C. 1993. “A Model Dextransucrase

synthesis by Leuconostoc mesenteroides” Trans Ichem E72 Part C. 209-215.

Mayasari, Evita. 2005. Pseudomonas aeruginosa; Karakteristik, Infeksi dan Penanganannya. USU repository 2006.

Misgitarta & Widowati, S. 2003. “Efektifitas Bakteri Asam Laktat (BAL) dalam Pembuatan Produk Fermentasi Berbasis Protein/Susu Nabati.” Prosiding Seminar Hasil Penelitian Rintisan dan Bioteknologi Tanaman.

Ogunbanwo, S.T., Sanni, A.L., and Onilude, A.A. 2003. “Characterization of Bacteriocin Produced by Lactobacillus plantarum F1 and Lactobacillus brevis OGI” Department of Botany and microbiology University of Ibadan, Nigeria African Journal of Available online at http:// www.academicjournals. org/AJBnI, Academic Journals, ISSN 1684-5315

Rachmawati, A., Suranto., Setyaningsih, R. 2006.” Uji Antibakteri Bakteri Asam

Laktat asal Asinan Sawi terhadap Bakteri Patogen” Jurnal Bioteknologi Vol. 2 (2):43-48.

Rai, A K., Bhaskar, N., Amami, P M., Indirani, K., Suresh, P V., Mahendrakar, M S. 2009. “Characterization and application of native lactid acid bacterium isolated from tannery fleshing for fermentative bioconversion of tannery fleshing” Aplication Microbiology Biotechnology Vol. 83. 757-766.

Ramadzanti, A. 2006. “Aktivitas Protease dan Kandungan Asam Laktat pada Yoghurt yang dimodifikasi Bifidobacterium bifidum” Skripsi. Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor.

Romadhon, S., Margino, S. 2012. “Isolasi dan Karakteristik Bakteri Asam Laktat dari Usus Udang Penghasil Bakteriosin sebagai Agen Antibakteria pada Produk-produk Hasil Perikanan” Jurnal Saintek Perikanan Vol. 8 No. 1.

Sari, RA., Nofiani, R., Ardiningsih, P. 2012. “Karakterisasi Bakteri Asam Laktat Genus Leuconostoc dari Pekasam Ale-ale Hasil Formulasi Skala Laboratorium” JKK Vol. 1 (1):14-20.