AKTIVITAS EKSTRAK LEMON (Citrus limon) TERHADAPKUANTITAS CD68, TNFα DAN IL-1 PADA MENCIT BETINA

(Mus musculus) MODEL KANKER PAYUDARA

SKRIPSI

olehCHALISSA NURUZZULFA

135090107111003

JURUSAN BIOLOGIFAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS BRAWIJAYAMALANG

2017

AKTIVITAS EKSTRAK LEMON (Citrus limon) TERHADAPKUANTITAS CD68, TNFα DAN IL-1 PADA MENCIT BETINA

(Mus musculus) MODEL KANKER PAYUDARA

SKRIPSI

Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelarSarjana Sains dalam Bidang Biologi

olehCHALISSA NURUZZULFA

135090107111003

JURUSAN BIOLOGIFAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS BRAWIJAYAMALANG

2017

HALAMAN PENGESAHAN SKRIPSI

AKTIVITAS EKSTRAK LEMON (Citrus limon) TERHADAPKUANTITAS CD68, TNFα DAN IL-1 PADA MENCIT BETINA

(Mus musculus) MODEL KANKER PAYUDARA

CHALISSA NURUZZULFA135090107111003

Telah dipertahankan di depan Majelis Pengujipada tanggal 17 Juli 2017

dan dinyatakan memenuhi syarat untuk memperoleh gelarSarjana Sains dalam Bidang Biologi

MenyetujuiPembimbing

Prof. Muhaimin Rifa’i, PhD.Med.Sc.NIP. 196806261997021001

MengetahuiKetua Program Studi S1 Biologi

Fakultas MIPA Universitas Brawijaya

Rodiyati Azrianingsih, S.Si., M.Sc., Ph.DNIP. 197001281994122001

iii

HALAMAN PERNYATAAN

Saya yang bertanda tangan di bawah ini:Nama : Chalissa NuruzzulfaNIM : 135090107111003Jurusan : BiologiPenulis Skripsi berjudul : Aktivitas Ekstrak Lemon (Citrus limon)

terhadap Kuantitas CD68, TNFα dan Il-1 PadaMencit Betina (Mus musculus) Model KankerPayudara

Dengan ini menyatakan bahwa:1. Skripsi ini adalah benar-benar karya sendiri dan bukan hasil

plagiat dari karya orang lain. Karya-karya yang tercantum dalamDaftar Pustaka Skripsi ini semata-mata digunakan sebagai acuanatau referensi.

2. Apabila kemudian hari diketahui bahwa isi Skripsi sayamerupakan hasil plagiat, maka saya bersedia menanggung segalaresiko.

Demikian pernyataan ini dibuat dengan segala kesadaran.

Malang, 31 Juli 2017Yang menyatakan,

Chalissa Nuruzzulfa135090107111003

iv

PEDOMAN PENGGUNAAN SKRIPSI

Skripsi ini tidak dipublikasikan namun terbuka untuk umum denganketentuan bahwa hak cipta ada pada penulis. Daftar Pustakadiperkenankan untuk dicatat, tetapi pengutipan hanya dapat dilakukanseizin penulis dan harus disertai kebiasaan ilmiah untuk menyebutkannya.

v

Aktivitas Ekstrak Lemon (Citrus limon) terhadap Kuantitas CD68,TNFα dan IL-1 pada Mencit Betina (Mus musculus) Model Kanker

Payudara

Chalissa Nuruzzulfa, Muhaimin Rifa’iJurusan Biologi, FMIPA, Universitas Brawijaya, Malang

2017

ABSTRAK

Kanker payudara merupakan sel yang tumbuh abnormal dan merusakjaringan normal payudara. Kanker payudara berasosiasi dengan growthfactor kinase dan mengaktivasi faktor transkripsi NF-κB, yangbertanggung jawab terhadap beberapa pathway dalam mensekresikansitokin proinflamasi TNFα dan IL-1. Peningkatan tumor menyebabkanjumlah TAM (tumor-associated macrophages) semakin banyak dan halini berasosiasi dengan prognosis buruk kanker payudara. Marker yangdigunakan pada TAM ialah CD68. Penelitian ini bertujuan untukmengetahui pengaruh ekstrak buah Citrus limon terhadap kuantitasmakrofag dan sitokin proinflamasi (TNFα dan IL-1), penelitian inidilakukan dengan enam perlakuan yaitu normal (N), kontrol negatifdengan induksi DMBA (D) dosis 0,015 mg/kg BB mencit, pemberianekstrak lemon dengan dosis 50 mg/kg BB (DL50) dan 200 mg/g BB.Induksi kanker payudara menggunakan DMBA (7,12Dimethylbenz[a]antracene) dilakukan selama enam minggu. Sample yangberasal dari spleen diwarnai dengan antibodi intraseluler danekstraseluler, serta dianalisis dengan flow cytometry. Analisis datamenggunakan analis statistik ANOVA dan dilanjutkan dengan uji Tukeypada signifikansi 5 % dengan program SPSS 16.0 for windows. Hasilmenunjukkan bahwa ekstrak lemon DL200 mampu menurunkan molekulmakrofag (TAM) dan sitokin proinflamasi (TNFα dan IL-1) melaluiaktivitas NF-κB secara signifikan. Ekstrak lemon memiliki kandunganflavonoid, terutama hesperidin yang mampu menginhibisi aktivitas NF-κB.

Kata Kunci : DMBA, kanker payudara, lemon, makrofag, sitokinproinflamasi

vi

Aktivitas Ekstrak Lemon (Citrus limon) terhadap Kuantitas CD68,TNFα dan IL-1 pada Mencit Betina (Mus musculus) Model Kanker

Payudara

Chalissa Nuruzzulfa, Muhaimin Rifa’iJurusan Biologi, FMIPA, Universitas Brawijaya, Malang

2017

ABSTRACT

Breast cancer is a abnormal cell and damaged normal system of thebreast. Breast cancer associated with growth factor which can activateNF-κB, is a transcription factor that activate signalling pathway ofproinflamatory cytokine TNFα and IL-1. Increased tumor causes thenumber of TAM (tumor-associated macrophages) increase and associatedwith poor prognosis. The marker used on TAM is CD68. The aim of thisresearch is to know the effect of lemon extract on the quantity ofmacrophages and proinflammatory cytokines (TNFα and IL-1). Thisresearch was conducted with six normal treatment (N), negative controlwith DMBA induction (D) with doses 0,015 mg/kg of weight, lemonextract at 50 mg/kg of weight (DL50) and 200 mg/kg of weight. Theinduction of breast cancer using DMBA (7.12 Dimethylbenz [a]antracene) was performed for six weeks. The Samples from spleen withintracellular and extracellular antibodies and analyzed by flow cytometry.Data analysis used ANOVA analyzed by SPSS 16.0 for windowsprogram. The results showed the extract of DL200 able to decrease themacrophage (TAM) molecule and proinflammatory cytokines (TNFα andIL-1) through NF-κB activity significantly. Lemon extract has a flavonoidcontent, especially hesperidin which able to inhibit NF-κB activity.

Key words: Breast cancer, DMBA, lemon, macrophage, proinflammatorycytokines

vii

KATA PENGANTAR

Puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT yang telahmemberikan rahmat dan Karunia-Nya penulis dapat menyelesaikanpenyusunan skripsi. Shalawat serta salam semoga tetap tercurahkankepada Nabi Muhammad SAW dan kepada umatnya hingga akhir zaman.Penulisan skripsi yang berjudul “Aktivitas Ekstrak Lemon (Citrus limon)terhadap Kuantitas CD68, TNFα dan Il-1 Pada Mencit Betina (Musmusculus) Model Kanker Payudara” diajukan untuk memenuhi salahsyarat untuk memenuhi salah satu syarat dalam memperoleh gelar SarjanaSains di Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Malang, UniversitasBrawijaya.

Penyususnan skripsi ini tidak terlepas dari bantuan, bimbingan dandukungan dari berbagai pihak. Oleh karena itu, dengan segala kerendahanhati penulis menyampaikan ucapan terimakasih kepada :1. Prof. Muhaimin Rifa’i S.Si., Ph.D., Med.Sc selaku Dosen

Pembimbing Skripsi, atas bimbingan, dedikasi serta motivasi kepadapenulis.

2. Drs. Aris Soewondo dan Dr. Sri Widyarti, M.Si selaku DosenPenguji I dan II.

3. Bapak Ir. Iskandar dan Ibu Evie Sulistyowati, M. Chalif Nurfaizi,Chafisa Nurfaidza, serta keluarga besar penulis, atas doa, dukungan,dan semangat kepada penulis sehingga skripsi ini dapat terselesaikan.

4. Teman-teman terbaik selama kuliah Dea Esaayu M., Ramdhani F. I.N., Anggita R. I., Restu U. S., Nihayatul L., Melati F., LaksmanaCipardhya K. P. S.T, Adelian V. Amd, serta seluruh temanseperjuangan Biologi angkatan 2013, atas kerjasama dan dukunganselama perkuliahan

5. Tim Lemon M. Sultonun A., Vetti A., dan Astrid K., serta kakak-kakak dan rekan satu laboratorium Fisiologi Hewan, atas kerjasamadan batuan selama penelitian.Semoga Allah SWT memberikan balasan kepada semuanya. Penulis

menyadari bahwa penulisan skripsi ini masih jauh dari kata sempurna.Oleh karena itu, Penulis sangat menghargai adanya saran dan kritik yangmembangun demi penyempurnaan skripsi ini.

Malang, 31 Juli 2017

Penulis

viii

DAFTAR ISI

HalamanABSTRAK ......................................................................................... vABSTRACT ....................................................................................... viKATA PENGANTAR ....................................................................... viiDAFTAR ISI ...................................................................................... viiiDAFTAR TABEL ............................................................................. xDAFTAR GAMBAR ......................................................................... xiiDAFTAR LAMPIRAN ..................................................................... xiiiDAFTAR LAMBANG DAN SINGKATAN ................................... xiv

BAB I PENDAHULUAN .................................................................. 11.1 Latar Belakang .................................................................. 11.2 Rumusan Masalah ............................................................. 21.3 Tujuan Penelitian .............................................................. 21.4 Manfaat Penelitian ............................................................ 2

BAB II TINJAUAN PUSTAKA ....................................................... 32.1 Kanker Payudara terhadap Imunitas ................................ 32.2 Pengaruh Zat Karsinogenik terhadap Mencit ................... 42.3 Lemon (Citrus limon) ....................................................... 62.4 Makrofag........................................................................... 92.5 Sitokin .............................................................................. 102.6 Histopatologi Kanker Payudara Akibat DMBA ............... 122.7 Flow Cytometry................................................................. 14

BAB III METODE PENELITIAN .................................................. 173.1 Waktu dan Tempat ............................................................ 173.2 Deskripsi Hewan coba ..................................................... 173.3 Deskripsi Perlakuan dan Rancangan Penelitian ............... 173.4 Injeksi DMBA dan Lemon ............................................... 183.5 Penetuan Histopatologi Payudara .................................... 183.6 Isolasi Sel Limfosit .......................................................... 193.7 Immunostainning antibodi Ekstraseluler dan Intraseluler.. 193.8 Analisa Statistik ............................................................... 203.9 Kerangka Operasional ...................................................... 21

ix

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ........................................... 224.1 Histopatologi Payudara.......................................................... 224.2 Analisis Rata-Rata Jumlah Relatif Sel CD68 ........................ 234.3 Analisis Rata-Rata Jumlah Relatif Sel CD68+TNFα+ ........... 264.4 Analisis Rata-Rata Jumlah Relatif Sel CD68+IL-1+ .............. 284.5 Hubungan antara ROS dan senyawa Ekstrak Lemon ............ 30

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ............................................ 335.1 Kesimpulan ............................................................................ 335.2 Saran ...................................................................................... 33

DAFTAR PUSTAKA ......................................................................... 34

LAMPIRAN........................................................................................ 39

x

DAFTAR TABEL

Nomor Halaman1 Komposisi flavonoid C. Limon (1 mg/100 mL) ..................... 8

2 Kelompok perlakuan penelitian ...................................... ....... 18

LT3.1Konversi dosis hewan ke manusia berdasaran luaspermukaan............................................................................... 39

LT4.1 Hasil uji normalitas jumlah relatif sel CD68 pada masing-masing perlakuan...................................... .............................. 41

LT4.2Hasil uji normalitas jumlah relatif sel CD68 pada masing-masing perlakuan...................................... .............................. 41

LT4.3 Hasil uji ANOVA jumlah relatif sel CD68 pada masing-masing perlakuan...................................... .............................. 41

LT4.4Hasil uji Tukey HSD pada jumlah relatif sel CD68 padamasing-masing perlakuan...................................... ................. 41

LT5.1Hasil uji normalitas jumlah relatif sel CD68+TNFα+padamasing-masing perlakuan...................................... ................. 42

LT5.2Hasil uji homogenitas jumlah relatif sel CD68+TNFα+pada masing-masing perlakuan............................................... 42

LT5.3 Hasil uji ANOVA jumlah relatif sel CD68+TNFα+ padamasing-masing perlakuan...................................... ................. 42

LT5.4Hasil uji TUKEY HSD pada Jumlah Relatif SelCD68+TNFα+ pada masing-masingperlakuan................................................................................. 42

LT6.1Hasil uji normalitas jumlah relatif sel CD68+IL-1+ padamasing-masing perlakuan...................................... ................. 43

LT6.2 Hasil uji homogenitas jumlah relatif sel CD68+IL-1+ padamasing-masing perlakuan...................................... ................. 43

xi

LT6.3 Hasil uji ANOVA jumlah relatif sel CD68+ IL-1+ padamasing-masing perlakuan...................................... ................. 43

LT6.4 Hasil uji TUKEY HSD pada Jumlah relatif sel CD68+IL-1+ pada masing-masing perlakuan...................................... ... 43

xii

DAFTAR GAMBAR

Nomor Halaman1 Subset Sel T pada Kanker Payudara ...................................... 3

2 Metabolisme DMBA Memicu Formasi DNA Adducts ......... 5

3 Skematik Inflamasi dan Peran Inflamasi dalam

Tumorigenesis ....................................................................... 6

4 Citrus limon ........................................................................... 7

5 Peran Sitokin dalam Beberapa Tahapan Kanker Payudara ... 12

6 Karakterisasi Histopatologi Kanker Payudara Induksi

DMBA ................................................................................... 14

7 Prinsip Flowsitometri ............................................................. 15

8 Kerangka Operasional Penelitian ......................................... 21

9 Histopatologi Karsinoma Payudara ....................................... 22

10 Hasil analisis flow cytometry CD68........................................ 24

11 Rata-rata jumlah relatif sel CD68+IL-1+ ................................. 24

12 Hasil analisis flow cytometry CD68+TNFα+ ........................... 27

13 Rata-rata jumlah relatif sel CD68+TNFα+............................... 28

14 Hasil analisis flow cytometry CD68+IL-1+.............................. 29

15 Rata-rata jumlah relatif sel CD68+IL-1+ ................................. 30

LG16 Rata-rata jumlah relatif sel CD68+IL-1+ ................................. 30

xiii

DAFTAR LAMPIRAN

NomorHalaman

1 Konversi dosis DMBA dari tikus ke mencit........................... 39

2 Perhitungan dosis DMBA....................................................... 39

3 Perhitungan dosis ektrak lemon ............................................. 40

4 Penentuan volume larutan ekstrak lemon ............................... 40

5 Hasil analisis ragam ANOVA dan uji lanjutan Tukey HSDterhadap jumlah relatif sel CD68 dengan menggunakansoftware SPSS versi 16 for windows...................................... 41

6 Hasil analisis ragam ANOVA dan uji lanjutan Tukey HSDterhadap jumlah relatif Sel CD68+TNFα+ denganmenggunakan software SPSS versi 16 for windows .............. 42

7 Hasil analisis ragam ANOVA dan uji lanjutan Tukey HSDterhadap Jumlah Relatif Sel CD68+IL-1+ denganmenggunakan software SPSS versi 16 for windows .............. 43

8 Data akumulasi berat badan mencit selama 8 minggu............ 44

9 Keterangan laik etik penelitian..... .......................................... 45

xiv

DAFTAR LAMBANG DAN SINGKATAN

Simbol/Singkatan KeteranganAhR Aryl hydrocarbon ReceptorANOVA Analysis of VarianceCD Cluster of DifferentiationCdks Cyclin Dependent KinaseCOX CyclooxygenaseCTLs Cytotoxic T cellDCIS Ductal Carcinoma in situDMBA 7,12 Dimethylbenz[a]anthraceneDNA Deoxyribonucleic AcidER Estrogen ReceptorsFITC Fluorescein IsothiocyanateFOXP3 Forkhead Box P3HE Hematoxylin/eosinHER2 human epidermal growth factor 2HPLC High-performance liquid

chromatographyIDC Ductal CarcinomaIFN InterferonIL InterleukinILC Invasive Lobular CarcinomaINOS Nitric oxide synthase IIRF Interferon Regulatory FactorLAMP Lysosomal Associated MembraneProteinLCIS Lobular Carcinoma in situLPS LipopolisakaridaMAPK Mitogen-activated protein kinasemIRNA Micro Ribonucleic AcidMMP Matrix MetalloproteinaseMyc Myelocytomatosis oncogeneNF-κB Nuclear Factor Kappa-Light-Chain-

Enhancer of Activated B CellsOxLDL Oxidized Low-density LipoproteinPAH Polycyclic Aromatic HydrocarbonsPBS Phosphate-buffered SalinePDGF Platelet-derived growth factorPPARγ Peroxisome proliferator-activated

xv

receptor gammaRb Retinoblastoma ProteinRNA Ribonucleic acidROS Reactive Oxygen SpeciesTACE TNFα Converting EnzymeTAM Tumor-Associated MacrophagesTGFβ Transforming growth factor betaTNFα Tumor necrosis factor alphaVEGF Vascular Endhothelial Growth Factor

Simbol/Singkatan Keteranganα alphaγ gammaβ beta

1

BAB IPENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Kanker payudara adalah keganasan sel pada payudara. Insidenkanker payudara yang paling sering terjadi pada pada wanita, baik dinegara maju maupun berkembang (Romadhon, 2013). Pada tahun 2014,WHO mendata kejadian kanker payudara di Indonesia mencapai 50.000,dengan angka kematian sebanyak 20.000 jiwa (WHO, 2014).

Paparan DMBA memicu aktivitasi metabolit untuk memproduksisenyawa karsinogen berupa dihydrodiol epoksida, yang memicukerusakan DNA, pembentukan ROS dan bertindak sebagai perantaraproses inflamasi kronik (Manoharan dkk., 2009). Proses tersebutmemicu pembentukan dan akumulasi sitokin, kemokin, radikal bebasdan growth factor. Hal ini menginduksi pembentukan tumor termasukkerusakan DNA, modifikasi protein dan perbahan profil ekspresi gen,serta ekspresi mIRNA spesifik (Hussain & Harris, 2007).

Perkembangan tahap kanker payudara dipengaruhi oleh sitokin.Perbedaan sitokin berperan dalam pembentukan, perkembangan danmetastasis kanker payudara. Paparan sitokin yang terlalu tinggi terhadapsel normal dapat memicu adanya fenotip neoplastik. Aktivitas sitokinproinflamasi seperti IL-6, IL-1 dan TNFα menyebabkan aktivasi NF-κBdan peningkatan dalam cyclin D1 pada sel payudara normal, sehinggamenghasilkan jaringan neoplastik (Velaquez dkk., 2015). Prognosiskanker payudara yang buruk berkoralasi dengan CD68, yang merupakanmarker yang digunakan pada TAM (tumor-associated macrophages).TAM meningkatkan perkembangan tumor dengan invasi tumor, migrasidan angiogenesis (Medrek dkk., 2012).

Indonesia memiliki keanekaragaman tumbuhan yang memilikipotensi sebagai tanaman herbal. Salah satu tanaman herbal yang dapatdimanfaatkan sebagai obat alternatif di masa mendatang ialah lemon(Citrus limon). Buah lemon mengandung komponen kimiawi sepertisenyawa fenolik (terutama flavonoid), dan nutrisi (vitamin, minyakesensial, dan karetenoid). Buah lemon kaya akan kandungan flavonoidyang dapat berperan dalam mencegah penyakit seperti obesitas,diabetes, penyakit cardiovaskular dan berbagai tipe kanker (González-Molina dkk., 2010).

Pengembangan strategi baru dalam mengobati kanker dipandangsangat perlu untuk dilakukan. Banyak mekanisme senyawa antikanker

2

yang dapat menekan proliferasi sel-sel ganas dengan menginduksiapoptosis, sehingga pendekatan mekanistik berguna untukkemoprevensi kanker dan kemoterapi. Namun, terdapat beberapa efeksamping yang tidak menguntungkan dan adanya resistensi terhadap agenantikanker yang digunakan. Oleh karena itu, mulai dikembangkankhasiat dari bahan-bahan alami, salah satunya menggunakan ekstrakbuah lemon. Buah Citrus memiliki efek antiproliferatif pada berbagaitipe kanker (Alshatwi dkk., 2011).

Flavonoid secara efektif menghambat mekanisme NF-κB danmenghalangi stimulator inflamatori primer (LPS) dan sekunder (TNFαand IL-1) melalui inhibisi aktivitas IκB kinase (Lin dkk., 2008).Berdasarkan latar belakang tersebut penelitian ini penting untukdilakukan, karena lemon mengandung senyawa yang berperan dalammeningkatkan sistem imun. Penelitian terdahulu melihat efekasi lemonterhadap kanker payudara secara in vitro. Namun belum ada penelitiansecara in vivo

1.2 Rumusan Masalah

Penelitian ini dilakukan karena adanya masalah, yaitu bagaimanaaktivitas ekstrak lemon (Citrus limon) terhadap kuantitas CD68 dansitokin proinflamasi (TNFα dan IL-1) mencit betina (Mus musculus)model kanker payudara injeksi DMBA (7,12Dimethylbenz[a]antracene)?

1.3 Tujuan Penelitian

Tujuan dilakukan penelitian ini untuk mengetahui pengaruhekstrak lemon terhadap kuantitas CD68 dan sitokin proinflamasi (TNFαdan IL-1) mencit betina model kanker payudara injeksi DMBA

1.4 Manfaat Penelitian

Manfaat penelitian ini adalah memberikan bukti ilmiahmengenai keefektifan penggunaan ekstrak buah lemon sebagai agenumtuk meningkatkan imunitas terhadap kanker payudara, sehinggadapat dijadikan sebagai alternatif obat di masa mendatang. Selain itupenelitian ini dapat merangsang peneliti lain dalam mengembangkanpotensi buah lemon dalam meningkatkan sistem imunitas terhadapkanker payudara.

3

BAB IITINJAUAN PUSTAKA

2.1 Kanker Payudara terhadap Imunitas

Sistem imun innate dilibatkan pada respon awal terhadap suatupenyakit. Sel tersebut akan melawan patogen dalam berbagai cara, danmembatasi infeksi melalui beberapa proses, seperti fagositosis. Sistemimun adaptif dibangun oleh sel T dan sel B, yang mengekspresikanreseptor antigen spesifik yang telah dibentuk melalui rekombinasi DNAsomatik terspesialisasi untuk suatu individu antigen (Varn dkk., 2016).

(Varn dkk., 2016)

Gambar 1. Subset sel T pada kanker payudara

Subset sel T pada kanker payudara yang ditunjukkan pada Gambar1 dibagi menjadi tiga kategori, yaitu CTLs, sel T helper CD4+, danimmunosuppresive CD4+, FOXP3+CD25+ sel Treg. Sel T sitotoksikCD8+ terlibat dalam proses lisis sel tumor secara langsung. Tingginyasel T CD8+ berkorelasi dengan prognosis yang baik. sel T helper CD4+

4

mengalami diferensiasi menjadi sel Th1 yang dapat meningkatkanaktivitas sel T sitotoksik CD8+ dan mengaktivasi presentasi antigen padasel dendritik, sehingga meningkatkan imunitas anti tumor. Namun, selTh2 melakukan hal yang berlawanan dengan menekan fungsi seldendritik supaya memicu perkembangan tumor, dan dapat menginhibisiaktivitas sel T CD8+. Aktivitas sel Th2 dapat dicegah melalui inhibisi IL-13. Pada akhirnya CD4+, FOXP3+CD25+ menekan fungsi sel Tsitotoksik sel CD8+, dan membantu menghindari kekebalan terhadaptumor, selain itu dapat menekan fungsi sel Th. Sel Treg pada jaringan insitu dan invasive karsinoma duktal lebih tinggi daripada jaringannormal. Peningkatan sel Treg berkaitan dengan faktor prognosis negatif,yang meliputi ER negatif, tingginya stadium tumor, dan adanyametastasis (Varn dkk., 2016).

2.2 Pengaruh Zat Karsinogenik terhadap Mencit

Peningkatan usia, faktor reproduksi, densitas mammorgrafik, faktorgenetik, dan riwayat keluarga menjadi faktor resiko kanker payudara.Banyak faktor yang terlibat dalam resiko penyakit kanker payudara,yaitu paparan bahan kimia (karsinogenik), bahan penambah padamakanan (penyedap, perasa dan pewarna), western diet dan infeksi daribakteri dan virus (Thompson ., 2014).

Polycyclic Aromatic Hydrocarbons (PAH) merupakan salah satukelompok utama pada karsinogen. Zat karsinogen terlibat dalamtumorigenesis dalam payudara. DMBA(7,12dimethylbenz[a]anthracene) merupakan prototipe PAH yangdigunakan untuk menjadikan objek penelitian tumor. Tumor payudaradapat disimulasikan pada hewan rodentia dengan paparan DMBAsehingga memicu regulasi Aryl hydrocarbon Receptor (AhR) yangmerupakan reseptor sitosolik seluler untuk DMBA (Currier dkk., 2005).

5

(Morrissaeau & Hammock, 2008)

Gambar 2. Metabolisme DMBA memicu formasi DNA adducts

Aktivasi ligan menyebabkan AhR berpindah ke dalam nukleus danberasosiasi dengan kofaktor ARNT, sehingga inti AhR mengalamipemindahan protein. Kompleks AhR/ARNT yang teraktivasi berikatanterhadap DNA spesifik pada upstream gen responsif AhR danmenginduksi transkripsi gen. Tahap awal tumorigenesis diikuti denganadanya reaksi DMBA dengan sitokrom enzim P-450, yang melakukanmetabolisme DMBA menjadi mutagenik (dihydrodiol epoxide) sehinggasegera membentuk DNA adduct karena adanya ikatan kovalen denganDNA sel yang aktif. Adisi diasosiasikan dengan mutasi DNA dantransformasi malignan merupakan proses yang terlibat dalam PAHsebagai mediator karsinogenesis (Currier dkk., 2005).

Perubahan epigenetik dalam ekspresi onkogen dan sinyaltransduksi berperan penting dalam proses tumorogenesis. TranskripRNA untuk Cyclin D1 dan c-myc merupakan onkogen penting dalamkanker payudara. Perlakuan DMBA pada regulator upstream c-myc dancyclin D1 melibatkan jalur sinyal transduksi NF-κB dan Wnt. Cyclin D1mendorong pertumbuhan sel dengan mengaktifkan cyclin dependentkinase (Cdks) 4 dan 6, yang memfosforilasi retinoblastoma protein (Rb)(Currier dkk., 2005).

6

(Anggarwal dkk., 2006)

Gambar 3. Skematik Inflamasi dan peran inflamasi dalam tumorigenesis

Zat mutagenik DMBA menyebabkan stress jaringan sehinggamemicu sitokin proinflamasi, kemokin, molekul adhesi dan enziminflamasi untuk membentuk inflamasi kronik. Inflamasi kronikbertindak dalam berbagai penyakit, salah satunya kanker. Inflamasikronik berkaitan dengan berbagai tahap yang terlibat dalamtumorigenesis, yang meliputi transformasi seluler, proliferasi, invasi,angiogenesis dan metastasis (Anggarwal dkk., 2006).

2.3 Lemon (Citrus limon)

Citrus limon (Gambar 4) tergolong dalam Famili Rutaceae danberasal dari asia. Lemon dapat tumbuh di seluruh dunia pada ikilimtropis, semi-tropis, dan wilayah dengan suhu hangat. Klasifikasi lemonialah sebagai berikut (Courteau, 2013):

Kingdom : PlantaeDivisi : MagnoliophytaKelas : MagnoliopsidaOrdo : SapindalesFamili : RutaceaeGenus : CitrusSpesies : Citrus limon

7

Buah Citrus memiliki kandungan vitamin C yang tinggi. Citrusberperan sebagai neutraceuticals karena mengandung senyawa bioaktifberupa flavonoid, limonoid, komarin, asam fenolik dan vitamin. Hal inimenyebabkan komponen citrus sangat diapresiasi dalam menjagakesehatan tubuh manusia dan aplikasi industri, terutama dalam industrifarmasi, makanan dan kosmetik (Ledesma-Escobar dkk., 2016).

(Floratoskana, 2017)

Gambar 4. Citrus limon

Limonoids dapat mengobati berbagai tipe kanker pada manusiaseperti kanker usus, pankreas, payudara, lueukimia, hati danneurablastoma. Selain itu, limnoids berguna untuk mencegah penyakitserangan jantung dan inflamasi. adanya furan dan struktur lengkapcincin A berkontribusi dalam pencegahan kanker dan aktivitas antiimflamasi. Metabolit sekunder dapat mengobati berbagai tipe kankerpada manusia seperti kanker usus, pankreas, payudara, lueukimia, hatidan neurablastoma. Selain itu, limnoids berguna untuk mencegahpenyakit serangan jantung dan inflamasi. adanya furan dan strukturlengkap cincin A berkontribusi dalam pencegahan kanker dan aktivitasantiimflamasi (Kim dkk., 2013).

Menurut González-Molina dkk. (2010) buah lemon memilikikomponen bahan kimia alami yang dapat mendorong daya tahan tubuh.Buah lemon banyak mengandung flavonoid yang berfungsi dalamkeseimbangan diet, mencegah penyakit, seperti obesitas, diabetes,penyakit kardiovaskular dan beberapa tipe kanker. Flavonoid

8

merupakan kelompok metabolit sekunder. Flavonoid tersusun atas duacincin aromatik (A dan B), yang dihubungkan melalui cincin pyroneatau hydropyrone (C), flavon atau flavanon. Kandungan flavonoid padaCitrus ada dalam bentuk glikosida atau aglycone. Flavonoid dalam juicemengandung derivat glicosil (flavonoid glikosida, FGs). Bentukglikosida dari derivat di-glikosida dan L-rhamnosyl D-glucosyl,diklasifikasikan menjadi dua tipe, yaitu neohesperidoside danrutinoside, dihubungkan melalui ikatan α-1,2 atau α-1,6 interglikosidik.Flavonoid yang telah diidentifikasi dalam Citrus sp. terbagi menjadi tigakelompok, yaitu flavanon, flavon, dan flavonol. Flavonon merupakanasam lemah. Senyawa flavonon mengandung hesperidin dan eriocitrin.Senyawa ini terdistribusi di seluruh bagian lemon. Flavon dalam Citrusmengandung chrysoeriol 6,8-di-glucoside, apingenin 7(malonylapiosyl)-glucoside dan diosmetin 8-C-d-glucoside. Flovonolpada sari lemon mengandung rutin dan myrelcetin, quercetin dankaempferol. Hal ini didukung oleh penelitian yang dilakukan olehGattuso dkk. (2007) bahwa terdapat jumlah senyawa flavonon yangcukup signifikan, yaitu hesperidin (20,5 mg/100 ml) dan eriocitrin (16,7mg/100 ml). Beragam senyawa flavonoid yang terkandung di dalam C.Limon ialtercantum pada Tabel 1.

Tabel 1. Komposisi flavonoid C. Limon (mg/100 mL)

(Gattuso dkk., 2007)

Kandungan flavonoid pada Citrus sangat amat dan obat non toksik.Flavonoid berperan dalam modulator tirosin kinase hal ini berimplikasidalam pengobatan kanker. Eriocitin dari buah Citrus menginduksiapoptosis (melalui caspase-3) dalam sel HL-60. Selain itu, hesperidinmenunjukkan aktivitas antiproliferasi. Penelitian lain menunjukkanbahwan hesperedin dan diosmin efektif sebagai agen chemopreventive

9

pada karsinogen kandung kemih. Lemon berpotensi dalam aktivitasantiproliferasi HepG2 pada pertumbuhan sel kanker hati. Eriocitrindapat berperan sebagai senyawa inhibitor melawan 5- dan 12-lipogenase yang terlibat dalam biosintesis berbagai bioregulator yangerat kaitannya dengan patogenesis beberapa penyakit, misalnya kanker.D-limone menunjukkan peran chemopreventive dalam uji preklinikmodel karsinoma hepatoseluler. Peran D-limone melawan sel kankerdengan menginduksi sitokrom sitokrom isoenzim P450. D-limone jugamerupakan kandidat dalam chemoprevention kanker kulit, meskipunmenyebabkan dermatitis, terutama ketika teroksidasi. Selain itu, D-limone menunjukkan efek antiangiogenik, proapoptosis, mencegahpertumbuhan tumor dan metastasis pada kanker lambung (González-Molina dkk., 2010).

2.4 Makrofag

Makrofag merupakan derivat dari prekursor bone marrow yangberkembang menjadi monosit, yang selanjutnya akan berkembangmenjadi makrofag. Fungsi utama makrofag ialam untuk mencernaantigen dari luar yang masuk ke dalam tubuh, termasuk mikroba danantigen lain. Makrofag tidak hanya esensial terhadap sistem imunitas,tetapi untuk perkembangan dan keseimbangan jaringan (Duque &Descoteaux, 2014).

Makrofag yang berada di lingkungan tumor berkorelasi denganTAM, yang diketahui bertanggung jawab terhadap pengeluaranbeberapa faktor pertumbuhan, sitokin, kemokin, dan mediatorinflamatori. VEGF, PDGF, dan IL-10 merupakan beberapa faktor yangterlibat dalam pertumbuhan tumor, progresi tumor, dan metastasis.TAM merupakan molekul yang berasal dari monosit. Aktivasi TAMberasal dari respon terhadap sitokin prroinflamasi (TNFα, IFNγ, dan IL-12) dan antiinflamasi (IL-4 dan IL-10), serta LPS (Lipopolisakarida).Makrofag dibagi menjadi dua bentuk terpolarisasi, yaitu M1 dan M2.Makrofag M1 berperan sebagai aktivitas antitumor, sedangkan M2berperan dalam sekresi sitokin antiinflamasi, meningkatkan invasi tumordan metastsis. Makrofag M1 diaktivasi oleh IFNγ, LPS dan TNFα.Fenotip makrofag M1 mensekresikan IL-1, TNFα dan IL-12. Sedangkanmakrofag M2 mensekresikan IL-10 dan menghambat APC, sertaproliferasi sel T. Makrofag M2 dalam berbagai pertumbuhan sel tumordan meningkatkan daya tahan tumor, serta berperan secara vital dalamproses angiogenesis melalui VEGF (mediator angiogenesis) CD68

10

merupakan marker pan-makrofag yang digunakan sebagai marker untukTAM. CD68 mengenali bentuk makrofag M1 sebagai tumoricidal danM2 sebagai antiinflamasi. Molekul TAM merupakan bentuk polarisasimakrofag tipe M2 (He dkk., 2014; Almatroodi dkk., 2016).

CD68 merupakan protein transmembran terglikosilasi, terdiri darisejumlah besar N-glikosilat prolin pada domain ekstraseluler (271-a.a),domain transmembran (TM, 25-a.a), dan domain intraseluler pendek (2-a.a). Transmembran tipe I diklasifikasikan sebagai LysosomalAssociated Membrane Protein (LAMP), karena meskipun dapat jugadideteksi pada membran plasma sel, lebih tinggi diekspresikan dalamlisosom. Gen yang mengkode CD68 terdiri dari 6 ekson dengan sebuahpromotor yang berkontribusi untuk spesifitas makrofag dengan tempatpengikatan untuk Interferon Regulatory Factor (IRF), Elf-1, Fli-1 danPU (McCoy, 2012).

CD68 berperan dalam berbagai proses seluler yaitu, sebagaifagositosis, metabolisme lisosomal, interaksi patogen dengan sel danlemahnya ikatan densitas lipoprotein. CD68 dapat ditemukan padapermukaan sel dan mampu atau secara cepat internalisasi untukdilibatkan sebagai reseptor scavenger pada oxLDL (McCoy, 2012).

Menurut Li dkk. (2015) tingginya jumlah CD68 berkorelasi denganbesarnya ukuran tumor, tinggi stadium T (Tumor diameter), N (Noduslymph), dan M (Metastasis) serta positif HER-2. Selain itu, adanyaindikasi upregulation RAS dan makrofag CD68+ berkorelasi denganangiogenesis. Angiogenesis merupakan pembentukan pembuluh darahbaru dari endotelium pada pembuluh darah yang sudah ada. Hal inimenyebabkan perkembangan metastasis, melalui sel malignan ke dalamsirkulasi.

2.5 Sitokin

Pada tumor terdapat sel tumor, imun, stromal, dan inflamasi, yangmengandung sitokin, growth factor, dan molekul adhesi. Sel-sel tersebutmemicu pertumbuhan tumor dan metastasis. Interaksi antar sel tersebutberperan penting dalam inflamasi dan proses pro angiogenesis, sertamemicu proliferasi sel tumor (Lewis dkk., 2006).

Sitokin meregulasi pertumbuhan, signalling, dan diferensiasi selstromal dan tumor. Sitokin yang diproduksi oleh sel kanker berfungsiuntuk menciptakan kondisi pertumbuhan optimal bagi tumormicroenvironment, sedangkan sitokin yang dihasilkan oleh sel stromalakan mempengaruhi sel ganas. Sitokin yang diinduksi oleh hipoksia,

11

menandakan adanya pertumbuhan sel kanker, meliputi Vascularendhothelial Growth Factor (VEGF), TNF, IL-1 dan IL-6 (Velaquezdkk., 2015).

TNF (merujuk pada TNFα) merupakan suatu protein yang terdiri157 asam amino dan disintesis sebagai suatu protein yang terikat padamembra (pro TNF), yang dapat dilepas oleh TNFα Converting Enzyme(TACE). TNFα berperan penting dalam aktivitas seluler, sepertiproliferasi, survival, diferensiasi dan kematian sel. TNFα berfungsidalam molekul proinflamasi dan disekresi oleh sel inflamatori, yangterlibat dalam inflamasi, berasosiasi dengan karsinogenesis (Wang &Lin, 2008). Hal ini didukung oleh Velaquez dkk. (2015), ekspresi kronikTNFα pada kanker payudara akan memicu pertumbuhan tumor, namunhasil ini akan berbeda jika dilakukan secara in vitro dengan cell line.TNFα akan menginduksi apoptosis, menghambat prolifersi,meningkatkan migrasi, invasi serta resistensi terhadap chemotherapeuticdalam sel MCF-7.

TNFα memiliki peran therapeutic. Namun, ketika didisregulasi dandisekresi di dalam sirkulasi, TNFα berperan dalam mediasi berbagaipenyakit, termasuk kanker. TNFα menjadi mediator utama prosesinflamasi dan menginduksi mediator inflamatori lain dan protease yangmengatur respon inflamasi. TNFα diproduksi oleh tumor dan berperansebagai promotor tumor endogen. TNFα mampu menginduksi faktorangiogenesis dalam sel glioma malignan, sehingga meningkatkanangiogenesis dan progresi tumor. Terdapat marker up regulasi (RNAdan protein) TNFα, IL-8 dan VEGF dalam sel glioma seelah pemberianstimulus dengan TNFα. TNFα dapat meningkatkan invasivenessbeberapa karsinoma atau menstimulasi epitel dalam menyembuhkanluka secara in vivo. TNFα dapat menjadi mediasi makrofag dalammenginduksi angiogenesis. Aktivitas angiogenik diproduksi olehperitonial murin makrofag yang teraktivasi sepenuhnya dinetralisasioleh antibodi poloklonal terhadap TNFα (Anggarwal dkk., 2006).

12

(Velaquez dkk., 2015)Gambar 5. Peran sitokin dalam beberapa tahapan kanker payudara

Sitokin lain yang berperan dalam pementukan kanker ialah IL-1,yang merupakan sitokin pleiotropik yang dapat menentukan keadaanfisiologis dan patologis. Famili IL-1 terdiri dari tiga protein, duadiantaranya merupakan agonis, IL-1α dan IL-1β, serta yang ketigamerupakan antagonis, reseptor IL-1 (IL-1ra). IL-1α dan IL-1β berbedadalam aktivitas dan sekresi. IL-1α terletak dalam sitosol atau membransel, sedangkan IL-1β disekresi secara ekstraselelur. Terdapat dua macamtipe reseptor IL-1 yaitu, IL-1 receptor type I (IL-1RI) dan IL-1 receptortype II (IL-1RII). IL-1RI terekspresi pada seluruh tipe sel dan berikatandengan IL-1α, serta bertanggung jawab terhadap sinyal transduksi IL-1.IL-1RII berperan antagonis dan biasanya ditemukan dengan limfosit B,netrofil dan monosit, serta berikatan dengan IL-1β.

2.6 Histopatologi Kanker Payudara Akibat DMBA

Kelenjar mamae membentuk struktur percabangan yang menjadilobus dan terdiri dari dua komponen utama, yaitu Terminal Duct–Lobular Unit (TDLU) dan Large Duct System. TDLU dibentuk olehlobus dan duktus terminal. Bagian tersebut dihubungkan oleh saluransubsegmental, yang kemudian akan menuju aluran segmental dan kesaluran pengumpul (Laktiferus dan galaktoforus), serta akan bermuarapada nipple (Rosai & Ackerman, 2011). Payudara tersusun atas

13

epitelium dan stroma yang terspesialisasi yang dapat menimbulkan lesijinak dan ganas pada organ (Kumar & Abbas, 2015).

Kanker payudara adalah keganasan sel pada payudara. Karsinomapayudara dibagi menjadi dua yaitu karsinoma in situ dan karsinomainvasif. Letaknya dapat dibedakan menjadi dua yaitu, lobular danduktal. Kanker payudara tipe invasif dibagi menjadi dua yaitu, InvasiveDuctal Carcinoma (IDC) dan Invasive Lobular Carcinoma (ILC). Tipenoninvasive dibagi menjadi dua, yaitu Ductal Carcinoma in situ (DCIS)dan Lobular Carcinoma in situ (LCIS). Tipe DCIS akan muncul disekitar saluran payudara dan tidak masuk ke dalam jaringan payudara,sedangkan tipe IDC muncul dalam saluran susu payudara. Sel kankermerusak seluruh jalan melalui dinding saluran menuju jaringan lemakpayudara dan diikuti oleh metastasis pada tubuh bagian lain. Tipe IDCdibagi menjadi beberapa subtipe yaitu karsinoma adenosistik,adenosquamos, medular, musinosum, papilaris, mikropapilaris, tubular,dan metaplastik. Sel karsinoma tipe LCIS tetap pada lobulus, sedangkanpada tipe ILC terjadi pada kelenjar susu dan sel kanker melakukanmetastasis (Barh dkk., 2014).

Variasi morfologi DCIS terdiri dari papillary, comedocarcinoma,solid, micropapillary, dan cystic hypersecretory. DCIS tipecomedocarcinoma dikarakterisasi dengan adanya sel pleomorfik (besar)yang berasosiasi dengan nekrosis. Ukuran comedocarcinoma relatifbesar dan menjadi jelas. Secara mikroskopik, duktus menunjukanpertumbuhan pada pleomorfik sel tumor (besar) dan disertai denganaktivitas mitosis, serta tidak adanya jaringan ikat. Pada tipe ini terdapatjaringan yang mengalami nekrosis dan menjadi tanda penting dalamdiagnosa (Rosai & Ackerman, 2011).

Secara mikroskopik, sel tumor pada IDC dapat tumbuh menyebar,well-defined nests, memanjang, atau sel individu. Sel tumor bervariasipada ukuran dan bentuk, serta lebih pleomorfik dari pada bentuk ILC.Nuclei dan Nucleoli lebih menonjol dan lebih banyak mitosis. Areanekrosis terjadi sekitar 60 % kasus (Rosai & Ackerman, 2011).

Secara mikroskopik, sel tumor pada LCIS memiliki karakteristiklobulus besar dan terisi seragam, bulat, sel berukuran kecil hingga besardengan bentuk bulat dan inti normochromatic. Pada suatu kasus LCIS,jarang atau tidak ada pleomorfism, aktivitas mittosis dan nekrosis (Rosai& Ackerman, 2011).

Penelitian yang dilakukan oleh Samy dkk. (2006) menunjukkanbahwa tikus yang diinduksi DMBA mengalami lesi yang berkembangpada kelenjar mamae yang berimplikasi pada karsinoma. Secara

14

histopatologi mengungkapkan bahwa karsinoma menunjukkan bentuknuklear. Sedangakan, penelitian yang dilakuakan oleh Minari dkk.(2016), adanya DMBA menginduksi atropi kelenjar seromukosa disekitar fibrosa stromal dan hiperplasia kelenjar serosa dan mucin. Selainitu, terdapat karsinoma yang muncul dari duktal kelenjar mamae.Penelitian lain yang dilakukan oleh Nicolas dkk. (2005) menunjukkanbahwa hitologi tumor payudara induksi DMBA ialah karsinomasquamos atau adenosquamos.

(a) (b)(Siddiqui dkk., 2013)

Gambar 6. Karakterisasi histopatologi kanker payudara induksi DMBA.Keterangan : (a) Karsinoma Adenosquamos & (b)Karsinoma duktal

Preparat melintang Gambar 6.a menunjukkan terdapat pelebaranjaringan (ectactic) duktal oleh epitelium squamos berlapis. Selain ituterdapat jaringan padat dengan berbagai ukuran yang seringkali disertaikeratinisasi dan inflamasi stromal. Jaringan preparat Gambar 6bmenunjukkan jaringan padat dan nuclear pleomorfism moderate, sertainflamasi stromal ringan (Shiddiqui dkk., 2013).

2.7 Flow Cytometry

Flowsitometri merupakan suatu alat yang digunakan untukmenganalisis berbagai parameter sel individu dari heterogen populasi.Flowsitometri digunakan dalam berbagai aplikasi seperti immuno-phenotyping, analisis DNA, proliferasi dan fluoresent protein (Picot

15

dkk.,2012). Flowsitometri mengukur beberapa karakteristik suatupartikel individu yang bergerak pada suatu aliran fluida. Flowsitometrimemberikan analisis yang cepat terhadap beberapa karakteristik seltunggal. Informasi yang diperoleh bersifat kualitatif dan kuantitatif(Brown & Witter, 2000).

Ribuan sel per sekon satu demi satu melalui satu atau lebih sorotanlaser pada flow cytometry, yang akan diukur penyebaran cahaya padabeberapa sudut dan emisi fluorensen. Terdapat tiga bagian dalam flowcytometry (Gambar 7), yaitu (Picot dkk., 2012) :1. Sistem fluiditas menginduksi fokus hydodinamik2. Sumber eksitasi dan sistem emisi optikal dari filter panjanggelombang

untuk mendeteksi adanya bagian optikal3. Sistem elektronik digital yang dianalisis dengan softwere komputer

(Picot dkk., 2012)Gambar 7. Prinsip flowsitometri

Flow cytometry mengukur secara optikal dan karakteristik fluoresenssel tunggal. Ciri fisik, seperti ukuran dan kompleksitas internal dapatmenjelaskan populasi sel. Pewarnaan fluoresens berikatan dengankomponen seluler yang berbeda seperti DNA atau RNA. Selain itu,

16

antibodi terkonjugasi ke pewarnaan fluoresens yang berikatan proteinspesifik pada membran sel atau di dalam sel. Ketika sel yang telahdilabel dilewati oleh sumber cahaya, molekul fluoresens menjadi energiyang lebih tinggi. Setelah kembali pada keadaan diam, flurokrommemancarkan energi cahaya pada panjang gelombang tinggi.Penggunaan beberapa flurokrom, masing-masing dengan eksitasipanjang gelombang yang mirip dan perbedaan emisi panjanggelombang, sehingga memungkinkan beberapa sifat sel dapat diukursecara terus menerus. Pewarnaan yang biasanya digunakan ialahpropium iodida, fikoeritrin, dan fluorescein (Brown & witter, 2000).

17

BAB IIIMETODE PENELITIAN

3.1 Waktu dan Tempat

Penelitian ini dilakukan pada bulan Oktober 2016 sampai denganMei 2017 bertempat di Laboratorium Fisiologi, Struktur danPerkembangan Hewan, Fakultas Matematika dan Ilmu PengetahuanAlam, Jurusan Biologi, Universitas Brawijaya, Malang.

3.2 Deskripsi Hewan coba

Hewan coba yang digunakan ialah mencit (Mus musculus) BALB/cyang berumur tujuh hingga delapan minggu. Hewan coba yangdigunakan berjenis kelamin betina. Mencit yang digunakan memilikiberat badan standar yaitu >20g. Mencit pada penelitian ini dalamkondisi memiliki kanker payudara dengan injeksi zat karsinogenikmenggunakan DMBA (7,12 dimethylbenz[a]anthracene). Mencitdirawat dengan dijaga kebersihannya, sehingga tidak ada patogen asingyang masuk ke dalam tubuh mencit. Mencit ditimbang setiap akanmemulai perlakuan, sehingga bisa dijadikan acuan untuk menentukanvolume larutan yang masuk ke dalam tubuh mencit.

3.3 Deskripsi Perlakuan dan Rancangan Penelitian

Rancangan penelitian ini menggunakan desain Rancangan AcakLengkap (RAL). Penelitian menggunakan 16 ekor mencit. Penentuandesain RAL berdasarkan mencit yang digunakan berumur tujuh hinggadelapan minggu yang diberi empat perlakuan dengan empat kaliulangan. Masing-masing perlakuan tidak dipengaruhi oleh faktor lain(makanan, suhu dan sebagainya) sehingga tidak perlu dikelompokkan.Berikut ini merupakan kelompok perlakuan (Tabel 2).

18

Tabel 2. Kelompok perlakuan penelitianKelompok perlakuan Keterangan

Normal (N) Kontrol tanpa perlakuanKontrol Negatif (D) Perlakuan DMBA, tanpa

perlakuan ekstrak lemonEkstrak lemon dosis 50 mg/ml

(DL50)Perlakuan DMBA, menggunakan

ekstrak lemon dosis 50 mg/mlEkstrak lemon dosis 200 mg/ml

(DL200)Perlakuan DMBA, menggunakanekstrak lemon dosis 200 mg/ml

3.4 Injeksi DMBA dan Lemon

Induksi DMBA dilakukan selama enam minggu dengan injeksisubkutan. Injeksi dilakukan satu minggu sekali. Injeksi DMBAdilakukan pada daerah sekitar payudara. Pelarut untuk DMBA ialahminyak jagung (Currier dkk., 2005). Dosis induksi DMBA secarasubkutan ialah 7,5 mg/kg BB tikus dan apabila dikonversi untuk dosismencit ialah 0,015 mg/g BB dengan dilarutkan dalam 0,1 mL. Volumelarutan DMBA yang diinjeksikan mengacu pada berat badan mecit.Berat badan setiap perlakuan kemudian dijadikan rerata, lalu beratbadan individu mencit yang akan diinjeksikan dibagi berat rerata sesuaidengan kelompok perlakuan dan dikalikan 100 µl (Tieppo dkk., 2007).

Bagian lemon yang digunakan pada penelitian ini adalah bagianbuah (lengkap). Kemudian lemon dihancurkan dengan menggunakanblender dan disaring dengan menggunakan kertas saring. Filtrat di freezedry sehingga didapatkan ekstrak lemon berbentuk pasta. Ekstrak lemondisimpan dalam kondisi dingin dengan suhu 4 oC.

Ekstrak kandungan lemon yang diberikan pada mencit setiap harisebesar 50 dan 200 mg/kg BB selama 14 hari. Injeksi lemon dilakukansecara oral dengan menggunakan pelarut yang digunakan ialah aquades.Perhitungan volume lemon yang diinjeksikan pada mencit dihitung beratbadan mencit. Berat badan setiap perlakuan kemudian dijadikan rerata,lalu berat badan individu mencit yang akan diinjeksikan dibagi beratrerata sesuai dengan kelompok perlakuan dan dikalikan 500 µl (Patildkk., 2009).

3.5 Penetuan Histopatologi Payudara

Jaringan payudara mencit yang telah diinduksi DMBA selama 6minggu akan dibuat preparat histopatologis. Jaringan yang akan dibuat

19

preparat berasal dari jaringan di sekitar payudara dan berada padalapisan kedua setelah lapisan kulit.

Jaringan payudara yang telah diambil dilakukan fiksasi dalamformalin 40 % dan ditanam (embedding) di dalam parafin, dipotongdengan menggunakan mikrotom sekitar 4-5 µm dan diwarnai denganhematoxylin/eosin (HE). Potongan diamati di bawah mikroskop denganperbesaran 40 dan 100 kali.

3.6 Isolasi Sel Limfosit

Semua kelompok perlakuan mencit dilakukan dislokasi bagianleher. Mencit difiksasi dengan menggunakan jarum. Abdomen mencitdibersihkan dengan menggunakan alkohol 70 %. Mencit dibedah daribagian dorsal kiri hingga ventral. Spleen diambil dan dicuci dua kalidengan menggunakan PBS supaya tidak ada lemak yang menempelpada spleen. Organ diletakkan pada cawan yang berisi 1 mL PBS dandigerus dengan menggunakan spuit ujung tumpul searah dengan jarumjam. Spleen yang telah digerus dimasukkan ke dalam propilen 15 ml.Kemudian disentrifugasi pada kecepatan 2500 rpm dengan suhu 10 oCselama 5 menit. Pelet ditambahkan 1 ml PBS dan dihomogenisasidengan cara pipetting.

3.7 Immunostainning antibodi Ekstraseluler dan Intraseluler

Pewarnaan Antibodi dilakukan secara ektraseluler dan intraseluler.Pewarnaan antibodi ekstraseluler dilakukan dengan pelet yangditambahkan 1 ml PBS kemudian diambil 60 µL dan ditambahkandengan PBS 300 µL. Kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 2500rpm, 10 oC selama 5 menit. Supernatan dibuang dan pelet ditambahkan50 µL antibodi, serta diresuspensi dan diinkubasi selama 20 menit.Antibodi monoklonal yang digunakan ialah Fluorescein isothiocyanate(FITC) anti mouse CD68, Pychoerythrin (PE) rat anti mouse TNFα, danPE/Cy5 rat anti mouse IL-1. Selanjutnya sampel yang telah diinkubasiantibodi sekunder dipindahkan ke dalam kuvet dan ditambahkan 400 µLuntuk dilakukan flow cytometry. Pewarnaan antibodi intraselulerdilakukan dengan microtube yang berisi pelet dan PBS 100 µLditambahkan dengan cytofix (fiksatif) 50 µL, serta diinkubasi selama20 menit. Kemudian suspensi sel ditambahkan washperm 500 µL dandiresuspensi agar sisa cytofix dapat hilang. Setelah itu, suspensidisentrifugasi dengan kecepatan 2500 rpm, suhu 10 oC selama 5 menit.

20

microtube ditambahkan antibodi 50 µL CD68. Empat microtubetersebut diinkubasi selama 20 menit. Pelet dipisahkan dari supernatan,kemudian pelet ditambahkan antibodi intraseluler sebanyak 50 µL. Peletyang telah ditambahkan antibodi intraseluler, diikubasi selama 20 menitdidalam ice box. Masing-masing suspensi sel (yang telah diberipewarnaan antibodi intraseluler) dipindahkan ke dalam kuvet danditambahkan 400 µL PBS. Suspensi sel yang terdapat dalam kuvetdibaca dengan flow cytometry (Khasanaah & Rifa’i, 2012).

3.8 Analisa Statistik

Analisis flow cytometry dilakukan dengan menggunakan softwareBD CELLQUEST ProTM, sehingga diperoleh jumlah relatif sel CD68;CD68+TNFα+; dan CD68+IL1+. Analisis statistik dengan menggunakanprosedur ANOVA. Jenis ANOVA yang digunakan ialah One WayANOVA dengan nilai signifikansi sebesar 5 % dan menggunakan ujiTukey HSD untuk mengetahui uji beda nyata. Analisis statistik denganmenggunakan program SPSS versi 16 for Windows.

21

3.9 Kerangka Operasional

Gambar 8. Kerangka operasional penelitian

22

BAB IVHASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Histopatologi Payudara

Berdasarkan hasil histopatologi preparat jaringan payudaradidapatkan bahwa mencit yang diberi perlakuan DMBA selama 6minggu mengalami karsinoma invasive. Hal tersebut dibuktikan olehpreparat Gambar 9.

(a) (b)

(c) (d)

Gambar 9. Histopatologi karsinoma payudara. Keterangan : (a) dan (b)Perbesaran100x & (c) dan (d) perbesaran 400x.

Gambar 9 menunjukkan bahwa adanya perubahan bentuk duktus.Sel-sel epitel mulai merambat keluar dari duktus. Menurut Rosai &

23

Ackerman (2011), in situ duktus karsinoma dikarakterisasi denganadanya sel pleomorfik (besar) yang berasosiasi dengan nekrosis. Secaramikroskopik, duktus menunjukan pertumbuhan pada pleomorfik seltumor (besar) dan diserta dengan aktivitas mitosis, serta tidak adanyajaringan ikat. Terdapat jaringan yang mengalami nekrosis dan menjaditanda penting dalam diagnosis. Sel tumor pada invasif duktus karsinomadapat tumbuh menyebar, well-defined nests, memanjang, atau selindividu. Sel tumor bervariasi pada ukuran dan bentuk, serta lebihpleomorfik dari pada bentuk invasif lobular karsinoma. Karakterisasikarsinoma in situ ditandai dengan proliferasi sel epitel yang berada disekitar membran basal, adanya peningkatan jumlah fibroblas danpeningkatan angiogenesis. Tingginya fibroblas dan menekannya selmyoepitel menyebabkan progresi kanrsinoma in situ menjadi invasive.

4.2 Analisis Rata-Rata Jumlah Relatif Sel CD68

Sel CD68 merupakan molekul protein spesifik pada makrofag.Berdasarkan hasil analisis flow cytometry pada spleen, diketahui bahwajumlah relatif sel CD68 (Gambar 10 dan 11) pada perlakuan kontrolnegatif (D) memiliki jumlah relatif yang paling tinggi jikadibandingakan dengan kelompok perlakuan lainnya yaitu sebesar 7,51%. Nilai terrsebut tidak memiliki beda nyata dengan perlakuan D yaitusebesar 6,32 % (memiliki notasi yang sama yaitu c pada Gambar 11).Kelompok perlakuan normal (N) memiliki jumlah relatif rata-rata selCD68 yang paling rendah dan berbeda secara nyata dengan perlakuanlainnya yaitu sebesar 1,75 % (ditunjukkan dengan notasi a pada gambar11). Kelompok perlakuan mencit kanker dan diberi perlakuan lemondosis 200 mg/kg BB menunjukkan perbedaan secara nyata denganperlakuan normal dan DMBA yaitu sebesar 3,72 % (ditunjukkan dengannotasi b pada gambar 11).

Berdasarkan Gambar 11 menunjukkan bahwa kelompok perlakuanDL200 produksi sel makrofag pada organ spleen menurun secarasignifikan. Meskipun jumlah relatif sel makrofag tidak berbeda secaranyata dengan perlakuan normal, kelompok perlakuan DL200 mampumenurunkan jumlah sel CD68 hingga berbeda dari perlakuan DMBAdan mencit kanker yang diberi dosis 50 mg/kg BB. Menurut Li dkk.(2015) adanya peningkatan sel CD68 berkorelasi dengan terjadinyaangiogenesis. Penurunan jumlah CD68 pada kelompok perlakuanDL200 menunjukkan bahwa ekstrak lemon dengan dosis 200 mg/kg BBmampu menurunkan proses angiogenesis pada sel kanker. Peningkatan

24

dosis perlu dilakukan untuk mengetahui dosis yang lebih tinggi dalamproses penurunan CD68 hingga mendekati perlakuan normal.

Gambar 10. Hasil analisis Flow cytometry sel makrofag CD68

Gambar 11. Rata-rata jumlah relatif sel CD68. Keterangan : N: Normal,D: DMBA, DL50: Dosis ekstrak lemon 50 mg/kg BB,DL200: Dosis ekstrak lemon 200 mg/kg BB). Huruf yangberbeda menunjukkan beda nyata berdasarkan Uji Tukey

HSD

25

CD68 merupakan marker pan-makrofag yang digunakan sebagaimarker untuk TAM. CD68 mengenali bentuk makrofag M1 sebagaitumoricidal dan M2 sebagai antiinflamasi. Molekul TAM merupakanbentuk polarisasi makrofag tipe M2. Kedua populasi makrofag tersebutmemiliki profil sitokin yang berbeda, M1 memproduksi kelebihan stressoksidatif dan mensekresi sitokin proinflamasi TNFα, IL-1 dan IL-6,sedangkan M2 mensekresikan sitokin antiinflamasi IL-4, IL-10, dan IL-13 (He, 2014; Mittal dkk., 2014).

Aktivasi makrofag M1 berkorelasi dengan respon inflamasi TNFα.Aktivasi TNFα bergantung pada interaksi TNF dan TNFR yang memicudownstream signalling MAPK dan IKK, yang kemudian mengaktivasiNF-κB. H2O2 merupakan bentuk ROS yang dapat mengakumulasi NF-κB ketika distimulasi oleh TNFα. H2O2 akan mengoksidasi sisteinkatalitik fosfatase MAPK dan memicu aktivasi MAPK cascade yangmeliputi JNK dan P38 MAPK. Kelebihan H2O2 meningkatkan aktivasiIKK dan fosfolirisasi tirosin IκBα, sehingga memicu jalur sinyal NF-κB.ROS lain seperti O2

- mampu mempengaruhi diferensiasi makrofagmenjadi M2 (Tan dkk., 2016).

Polarisasi makrofag berasosiasi dengan pertumbuhan tumor. TAMmenyerupai makrofag M2, dibuktikan dengan berkurangnya sitokinproinflamasi IL-12, TNFα dan IL-1B, serta tinggainya sitokinantiinflamasi IL-10 dan TGFβ. Makrofag M2 mendukung adanyaangiogenesis. Sel tumor menarik monosit dari sirkulasi ke jaringantumor, dengan mensekresikan CCL-2 dan CSF1. Monosit tersebutberdiferensiasi menjadi TAM yang akan mengakumulasi vascularisasiyang buruk, area hypoxic, dan meningkatkan progresi tumor secaralangsung dengan mendukung proliferasi sel tumor. Secara tidaklangsung perkembangan tumor didukung oleh produksi proteasesepperti MMP-9 untuk menurunkan matriks ekstraseluler danmengeluarkan growth factor (VEGF A, FGF2, dan PDGF) untukproliferasi sel endotel dan formasi mikrovessel, Selain itu, TAMberfungsi dalam perekrutan sel leukosit dari sirkulasi darah untukembentuk jalur metastase (Jetlen dkk., 2013).

Aktivasi NF-κB dikarakterisasi oleh adanya subunit IKK. KompleksIKK terdiri dari dua subunit kinase, IKKα (IKK1) dan IKKβ (IKK2),dan IKKγ. IKKβ menekan fenotip proinflamasi M1 dan meningkatkanmakrofag tipe M2. Defisisensi IKKβ akan menunjukkan peningkatanekspresi MHC II, iNOS, dan IL-12, sehingga mengaktivasi makrofagtipe M1. Aktivasi NF-κB dikarakterisasi oleh adanya subunit IKK(Lawrence, 2009).

26

Menurut Blaylock (2015) NF-κB akan mengaktivasi perubahanmakrofag fenotip M1 menjadi fenotip M2 (protumor). TAMmeningkatkan angiogenesis dan meningkatkan immune escape, yangselanjutnya akan terjadi metastasis. Adanya fenotip makrofag M2 padatumor stroma akan meningkatkan ukuran tumor, invasi, faktorprognostik buruk pada penderita kanker payudara. Beberapa flavonoiddapat menghambat aktivasi NF-κB, seperti hesperidin, apigenin, danluteolin. Inhibisi NF-κB akan menstimulasi aktivitas antitumor olehmakrofag tipe M1 dan menigkatkan perubahan makrofag tipe M2(protumor) menjadi tipe M1.

Pengujian kandungan ekstrak lemon perlu dilakukan lebih lanjut,seperti menggunakan uji High Performance Liquid Chromathography(HPLC), karena ekstrak lemon hanya dilarutkan dengan menggunakanair. HPLC merupakan suatu metode untuk memisahkan,mengidentifikasi dan menentukan kuantitas masing-masing komponendalam suatu bahan. Sample yang dianalisis dengan HPLC harusberbentuk zat cair. (Rubiyanto, 2017)

4.3 Analisis Rata-Rata Jumlah Relatif Sel CD68+TNFα+

TNFα secara umum diproduksi oleh makrofag, tetapi juga olehberbagai jaringan lain seperti sel limfoid, sel mast, sel endotelial,jaringan fibroblas dan neuronal (Wajant dkk., 2013). Ketika makrofagterpapar respon inflamasi, maka akan mensekresi sitokin proinflmanasiseperti TNFα, IL-1, IL-6 IL8, dan IL-12 (Duque & Descoteaux, 2014).Hasil analisis flow cytometry dan analisis statistik jumlah relatif selmakrofag yang mengekspresikan TNFα dari organ spleen ditunjukkanoleh gambar 12 dan 13. Berdasarkan Gambar 13 menunjukkan bahwakelompok perlakuan mencit kanker memiliki jumlah makrofag yangmempresentasikan TNFα paling tinggi yaitu sebesar 24, 98 % namuntidak berbeda nyata pada kelompok perlakuan mencit kanker yangdiberi ekstrak lemon dosis 50 mg/kg BB yaitu sebesar 22, 49 % (ditunjukkan dengan notasi c). Rata-rata jumlah relatif sel makrofag yangmempresentasikan TNFα yang dimiliki oleh kelompok perlakuannormal (N) lebih rendah dibanding dengan seluruh perlakuan yaitusebesar 7.67 % dan berbeda secara nyata dengan perlakuan lainnya(ditunjukkan oleh notasi a). Terjadi penurunan jumlah sel relatifmakrofag yang mengekspresikan TNFα pada perlakuan DL200 sebesar18,57 %. Jumlah relatif sel pada kelompok perlakuan DL50 tidakmenunjukkan beda nyata terhadap perlakuan DL200 dan D. Hal ini

27

menunjukkan bahwa perlakuan DL200 mampu mengurangi produksisitokin proinflamasi.

Respon inflamasi bermanfaat ketika diproduksi dalam jumlah yangtepat tetapi bersifat toksik ketika kelebihan produksi IL-1 dan TNF.Sitokin proinflamasi yang berlebihan memicu karakteristik responinflamasi shock sepsis dan berbagai kegagalan organ (Duque &Descoteaux, 2014).

Gambar 12. Hasil analisis Flow cytometry sel makrofag CD68+TNFα+

28

Gambar 13. Rata-rata jumlah relatif sel CD68+TNFα+. Keterangan : N:Normal, D: DMBA, DL50: Dosis ekstrak lemon 50 mg/kgBB, L200: Dosis ekstrak lemon 200 mg/kg BB. Hurufyangberbeda menunjukkan beda nyata berdasarkan Uji Tukey

HSD

Sitokin proinflamasi TNFα terekspresi tinggi dalam karsinomapayudara. TNFα pada kanker payudara mendukung pertumbuhan tumor.Beberapa sel yang mengekspresikan TNFα dalam karsinoma payudaraberkorelasi dengan peningkatan grade tumor dan keterlibatan nodusdalam metastasis (Kamel dkk., 2012).

NF-κB berperan dalam regulator ekspresi gen proinflamasi. Sintesisbeberapa sitokin TNF-α, IL-1β, IL-6, dan IL-8 dimediasi oleh NF-κB.protein IKK yang berperan pada aktivasi NF-κB, meningkatkan TNF-αdan IL-1 (Tak & Firestein, 2001). Hesperidin dapat berperan sebagaiantiinflamasi dan memiliki target terhadap komponen inflamasi, sepertiIL-6, TNF-α IL-1 dan yang berperan dalam progresi tumor (Devi dkk.,2015).

4.4 Analisis Rata-rata Jumlah Relatif Sel CD68+IL-1+

IL-1 terdiri dari beberapa protein, salah satunya ialah IL-1β. IL-1yang disekresi oleh makrofag merupakan komponen stromal dalamkanker payudara (Hou dkk., 2011; Tan dkk., 2016). Hasil analisis flowcytometry dan analisis statistik jumlah relatif sel makrofag yangmengekspresikan IL-1 dari organ spleen ditunjukkan pada Gambar 14

29

dan 15. Berdasarkan Gambar 15 menunjukkan bahwa kelompokperlakuan mencit kanker memiliki jumlah makrofag yangmempresentasikan TNFα paling tinggi yaitu sebesar 33,13 % danberbeda secara nyata dengan perlakuan lainnya (ditunjukkan dengannotasi b). Rata-rata jumlah relatif sel makrofag yang mempresentasikanIL-1 yang dimiliki oleh kelompok perlakuan normal (N) lebih rendahdibanding dengan perlakuan lainnya yaitu sebesar 14,87 % namun tidakberbeda secara nyata dengan kelompok perlakuan mencit kanker yangdiberi dosis lemon 50 mg/ Kg BB sebesar 21,54 % dan 200 mg/kg BBsebesar 20, 98 % (ditunjukkan oleh notasi a). Hasil tersebutmenunjukkan bahwa pada perlakuan ekstrak lemon hampir mendekatinormal. Ekstrak lemon dengan dosis 50 dan 200 mg/kg BB mampumengurangi kelebihan sitokin proinflamasi molekul IL-1.

Gambar 14. Hasil analisis Flow cytometry sel makrofag CD68+IL-1+

30

Gambar 15. Rata-rata jumlah relatif sel CD68+IL-1+. Keterangan : N:Normal, D: DMBA, DL50: Dosis ekstrak lemon 50mg/kg BB, DL200: Dosis ekstrak lemon 200 mg/kg BB.Huruf yang berbeda menunjukkan beda nyataberdasarkan Uji Tukey HSD

IL-1 dapat melakukan up regulasi di beberapa tumor danberimplikasi pada pertumbuhan tumor melalui gen metastasis danangiogenesis dan growth factor. Tingginya konsentrasi IL-1 berkorelasidengan semakin virulent fenotip tumor. IL-1 menginduksi ekspresi genmetastasis seperti Matrix Metalloproteinase (MMP) dan menstimulasiprotein terdekat untuk memproduksi protein angiogenik dan growthfactor seperti VEGF, IL-8, IL-6, TNFα, dan TGFβ (Lewis dkk., 2006).Hesperidin dapat berperan sebagai antiinflamasi dan memiliki targetterhadap komponen inflamasi, seperti IL-6, TNF-α IL-1 dan yangberperan dalam progresi tumor (Devi dkk., 2015).

4.5 Hubungan Antara ROS, Sitokin Proinflamasi dan SenyawaEkstrak LemonROS merupakan kelompok molekul yang terdiri dari superoksida

(O2-), radikal hidroksil, COX-2, iNOS dan hidrogen peroksida (H2O2).Molekul tersebut disintesis dalam sel melalui metabolisme oksigen.Tingkat seluler ROS dimodulasi oleh keseimbangan antar proses seluleryang memproduksi dan menghilangkannya. ROS dihilangkan oleh

31

beberapa enzim antioksidan seperti SOD, Katalase, thiredoxin,glutathione peroksidase dan peroxdoxin. ROS yang terlibat dalam stresoksidatif dikarakterisasi dengan meningkatnya tingkat ROS yangmemicu kerusakan protein, lipid dan DNA. Peningkatan ROS selulerterjadi karena adanya disfungsi mitokondria sehingga meningkatnyakonsentrasi ROS, oksidasi protein, lipid, dan DNA, keseimbangan redoxdan stres oksidatif. Jalur sinyal MAPK dan NF-κB meningkat dalam selinflamasi dan berperan dalam peningkatan ekspresi iNOS, COX-2,TNFα, dan IL-6 (Morgan dkk., 2008; Hoesel & Schmid, 2014; Perezdkk., 2015).

Inflamasi berperan dalam inisiasi tumor dengan memicu produksiROS, kerusakan DNA, dan meningkatkan laju mutasi. Inflamasimemicu sekresi growth factor, seperti EGF dan FGF. Apabila sudahmemasuki inflamasi kronik maka akan memicu angiogenesis, hal inidikarenakan adanya tumor yang mensekresikan sitokin proinflamasi,seperti IL-6, IL-1a, IL-1b, dan TNFα. Sitokin proinflamasi tersebutdapat memicu upregulasi COX-2 yang kemudian meningkatkan ekspresiVEGF dalam sel tumor, menyebabkan angiogenesis. Cyclooxygenase-2(COX-2) diregulasi oleh growth factor dan berbagai sitokin, yangkemudian bertanggung jawab selama inflamasi dan mendukung faktortranskripsi NFκB (Sobolewski dkk., 2010; Velaquez dkk., 2015).

Aktivasi NF-κB menghasilkan upregulasi anti apoptosis yangkemudian mendukung ketahanan hidup sel tumor dengan stressfisiologis dan memicu respon inflamasi. NF-κB menginduksi sitokinyang meregulasi respon imun (seperti TNFα, IL-1, IL-6 dan IL-8), danmemicu pengarahan leukosit ke tempat inflamasi. Respon imun innateneutrofil melepaskan ROS untuk membunuh patogen dapatmenyebabkan kerusakan DNA dan menimbulkan efek samping berupamutasi genetik, sehingga memicu inisiasi tumor. Selain itu, sinyal NF-κB ditunjukkan untuk berkontribusi pada perkembangan kanker denganmengendalikan epitel hingga transisi mesenkim dan metastasis. NF-κBberkontribusi pada perkembangan tumor dengan mengendalikanvaskularisasi tumor melalui upregulasi VEGF dan reseptornya (Hoesel& Schmid, 2013).

Proliferasi sel dan apoptosis diregulasi oleh NF-κB dan P53 tumorsupresor. NF-κB merupakan jalur sinyal yang berperan penting dalamapoptosis, proliferasi, diferensiasi dan perkembangan. Aktivasi NF-κBberkaitan dengan tumorigenesis. Sel kanker menghindari apoptosisdengan menstimulasi jalur NF-κB yang mendukung terhadap resistensiapoptosis. Salah satu senyawa kandungan ekstrak lemon, hisperidin

32

menginduksi growth arrest dan apoptosis dengan berikatan denganPPARγ, p53, dan NF-κB. PPARγ memicu inhibisi fosforilasi IκB danmengaktivasi NF-κB. Inhibisi NF-κB dapat mendukung apoptosis.Hisperidin mampu meningkatkan senyawa antioksidan SOD, katalase,vitamin E dan vitamin C (Devi dkk., 2015).

33

BAB VKESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa ekstrak lemon denganmenggunakan pelarut aquades yang diberikan pada mencit betinaBALB/c selama 14 hari mampu menurunkan produksi sel makrofagCD68+, CD68+TNFα+, CD68+IL1+. Hasil statistika menunjukkan bahwapemberian ekstrak lemon dosis 50 mg/kg BB terhadap jumlah relatif selmakrofag dan TNFα tidak berpengaruh nyata, sedangkan berbeda nyatapada pemberian ekstrak lemon dosis 200 mg/kg BB. Pemberian ektraklemon dosis 50 dan 200 mg/kg BB terhadap jumlah relatif sel IL-1berpengaruh secara nyata.

5.2 Saran

Penelitian lebih lanjut perlu dilakukan supaya mengetahuimekanisme ekstrak lemon terhadap sel kanker lebih lanjut denganmenambahkan parameter seperti NF-κB. Penelitian ini juga perlumenambahkan analisis High Performance Liquid Chromathography(HPLC) untuk mengetahui kandungan senyawa yang terkandung dalambuah lemon. Variasi dosis yang berbeda dari ekstrak lemon perluditambahkan agar dapat mengoptimalkan hasil penelitian lebih lanjut.

34

DAFTAR PUSTAKA

Almatroodi, S. A., McDonald, C. F., Darby, I. A. & Pounioti, D.S.2016. Characterization of M1/M2 Tumour-AssociatedMacrophages (TAMs) and Th1/Th2 Cytokine Profiles inPatients with NSCLC. Cancer Microenvironment 9(1): 1–11

Alshatwi, A. A., Shafi, G., Hasan, T. N., Hazzeni, A. A. A., Alsaif,M.A., Alfawaz, M. A., Lei, K. Y., & Munshi, A. 2011.Apoptosis-mediated inhibition of human breast cancer cellproliferation by lemon citrus extract asian pacific. JournalCancer Preview. 12:1555-1559.

Anggarwal, B. B., Shishodia, S., Sandur, S. K., Pandey, M. K. & Sethi,G. 2006. Inflammation and cancer: How hot is the link?.Biochemical Pharmacology 72:1605–1621.

Barh, D., Carpi, A., Verma, M., & Gunduz, M. 2014. Cancerbiomarkers: minimal and noninvasive early diagnosis andprognosis. CRC press. New York.

Blaylock, R. L. 2015. Cancer microenvironment, inflammation andcancer stem cells: A hypothesis for a paradigm change and newtargets in cancer control. Surgical Neurology International92:1-14.

Brown, M. & Witter, C. 2000. Flow cytometry: Principles and clinicalapplications in hematology. Clinical Chemistry 46(8):1221–1229.

Courteau, J. 2013. Citrus limon (L.) Burm. f. (pro. sp.).http://eol.org/pages/582200/overview. Diakses 7 Januari 2017.

Currier, N., Farago, M., Solomon, S. E., Ying, H., Xiao, Z. J., Demicco,E. G., Dominguez, I., Sherr, D. H., Chang, D. L. F., Sonenshein,G. E., Seldin, D. C. & Cardiff, R. 2005. Oncogenic signalingpathways activated in dmba-induced mouse mammary tumors.Journal of Toxicologic Pathology 33:726-737.

Devi, K. P., Rajavel, T., Nabavi, S. F., Setzer, W. N., Ahmadi, A.,Mansouri, K., & Nabavi, S. M. 2015. Hesperidin: A promisinganti cancer agent from nature. Industrial Crops and Products76:582-589.

Duque, G. A., & Descoteaux, A. 2014. Macrophage cytokines:Involvement in immunity and infectious disease. Frontiers inimuununology 5(491):1-9

35

Floratoskana. 2017. Citrus limon 'Lunario' - Lemon, Four-Seasons.https://flora-toskana.com/en/citrus-plants/188-citrus-limon-lunario-vier-jahreszeiten-zitrone.html. Diakses 7 Januari 2017.

Gattuso, G., Barreca, D., Gargiulli, C., Leuzzi, U. & Caristi, C. 2007.Flavonoid composition of citrus juices. Molecules 12:1641–1673.

González-Molina, E., Domínguez-Perles, R., Moreno, D.A., & García-Viguera, C. 2010. Natural bioactive compounds of Citrus limonfor food and health. Journal of Pharmaceutical and BiomedicalAnalysis. 51:327–345.

He, K., Zhang, L., Huang, C., Ma, S., Wang, Y., Wang, W., Zhao,Z.,Liu, B., Zhao, Y., Zhang,W., & Sun, Z. 2014. CD163+ tumor-associated macrophages correlated with poor prognosis andcancer stem cells in oral squamous cell carcinoma. BioMedResearch International. 2014:1-9.

Hoesel, B., & Schmid, J. A. 2014. The complexity of NF-κB signalingin inflammation and cancer. Biomed central 2013: 12: 86

Hou, Z., Falcone, D. J., Subbaramaiah, K., & Dannenberg, A. J. 2011.Macrophages induce COX-2 expression in breast cancer cells:role of IL-1β autoamplification. Carcinogenesis 32(5): 695–702

Hussain, P. S & Harris, C. C. 2007. Inflammation and cancer: Anancient link with novel potentials. International Union AgainstCancer 121: 2373–2380.

Jayakumar, J.K., Nirmala, P., Praveen K. B.A., & Kumar, A.P. 2014.Evaluation of protective effect of myricetin, a bioflavonoid indimethyl benzanthracene-induced breast cancer in femaleWistar rats. South Asian J Cancer. 3(2):107-111

Jetlen, N., Verbuggen, S., Gijbels, M. J., Post, M. J., Winther, M. P. J.,& Donners, M. M. P. C. 2013. Anti Inflamatory M2, but not proinflamatory M1 macrophage promote angiogenesis in vivo.Angiogenesis. 2013:1-10

Kamel, M., Shouman, S., El-Merzebany, M., Kilic, G., Veenstra, T.,Patel, D. 2012. Effect of TNFα on estrogen metabolic pathwaysin breast cancer cells Journal of Cancer. 3:310-321.

Khasanah, Q. & Rifa'i, M. 2014. Activity of dexamethasone therapy onpro-inflammatory cytokines profile of Balb/c mice with biliaryatresia. Jurnal Biotropika 2(2): 92 -97.

Kim, J., Jayaprakasha, G. K., & Patil, B. S. 2013. Limonoids and theiranti-proliferative and antiaromatase properties in human breastcancer cells. Journal of Food & Function 4:258-265.

36

Kumar, V. & Abbas, A. K. 2015. Robbins & cotran pathologic basisof disease 9th edition. Elsevier Canada.

Lawrence, T. 2009. The Nuclear Factor NF-κB pathway ininflammation. Cold Spring Harbor Perspective in Biology1(6):1-10.

Ledesma-Escobar, C.A., Priego-Capote, F., & De Castro, M. D. L.2016. Effect of sample pretreatment on the extraction of lemon(Citrus limon) components. Talanta 91: 153-173.

Lewis, A.M., Varghese, S., Xu, H., & Alexander, H. R. 2006.Interleukin-1 and cancer progression: The emerging role ofinterleukin-1 receptor antagonist as a novel therapeutic agent incancer treatment. Journal of translational medicine 4(48): 1-12.

Li, W., Liang, R, Zhou, C., Wu, Meng-Yao, L.L., Yuan, Gao-Feng, W.,Ming-Yun, X., Shou, L., Gong, F., Chen, K., Duan, W. & Tao,M. 2015. The association between expressions of RAS andCD68 in the angiogenesis of breast cancers. Journal of cancercell 15(17): 3-10.

Lin, Y., Shi, R., Wang, X., & Shen, H. 2008. Luteolin, a flavonoid withpotentials for cancer prevention and therapy. Current CancerDrug Targets 8(7): 634–646.

Macdonald, F., Ford, C. H. J. & Casson, A. G. 2005. Molecular biologyof cancer. BIOS Scientific Publishers. Canada.

Manoharan, S., Balakrishnan, S., Menon V. P., Alias, L.M., & Reena,A. R. 2009. Chemopreventive efficacy of curcumin and piperineduring 7,12-dimethylbenz [a]anthracene-induced hamsterbuccal pouch carcinogenesis. Singapore Medical Journal 50(2): 139-146.

McCoy, E., Welch, D., Feng, X. 2012. Potential Role of CD68 in BreastCancer Bone Metastasis. American National Standards Institute98(8): 1-19

Medrek, C., Ponten, F., Jirstrom, K., & Leandersson, K. 2012. Thepresence of tumor associated macrophages in tumor stroma as aprognostic marker for breast cancer patients. BioMed CentralCancer 12 (306): 2-9.

Minari, J. B., Ogar, G. O., & Bello, A. J. 2016. Antiproliferativepotential of aqueous leaf extract of mucuna pruriens on dmba-induced breast cancer in female albino rats. The EgyptianJournal of Medical Human Genetics 17(4): 331-343.

37

Mittal, M., Siddiqui, M. R., Tran, K., Reddy, S.p. & Malik, A. B. 2014.Reactive Oxygen Species in inflammation and tissue injury.Antioxidant Redox Signal. 20(7): 1126–1167

Morgan, M. J., Kim, Y., & Liu, Z. 2008. TNFα and reactive oxygenspecies in necrotic cell death. Cell Research 18:343-349

Morrissaeau, C. & Hammock, B. D. 2008. Gerry Brooks and epoxidehydrolases: Four decades to a pharmaceutical. PestManagement Science 64: 594–609.

Nicolas, C., Sandra, E.S,. Elizabeth, G.D., Donny, L.F.C., Marganit, F.,Haoqiang, Y. 2005. Oncogenic signaling pathways activated indmba-induced mouse mammary tumors. Toxicol Pathology2(33): 726.

Patil, J.R., Jayaprakasha, G.C., Murthy, C. K. N., Tichy, S.E., Chetti,M., B., & Patil, B.S. 2009. Apoptosis-mediated proliferationinhibition of human colon cancer cells by volatile principles ofCitrus aurantifolia. Food Chemistry 114: 1351–1358.

Perez, L., Mourroux, R. & Guittaut, M. 2015. Interplay between ROSand autophagy in cancer cells, from tumor initiation to cancertherapy. Redox Biology 4(2015): 184–192

Picot, J., Guerin, C., L., Kim, C. L., Boulanger, C. M. 2012. Flowcytometry: Retrospective, fundamentals and recentinstrumentation. Journal of Cytotechnology 64: 109–130.

Romadhon, Y.A. 2013. Gangguan Siklus Sel & Mutasi Gen padaKanker Payudara. Opini 40:786-789.

Rosai, J. & Ackerman. 2011. Surgical pathology 10th edition. Elsevier.Canada.

Rubiyanto, D. 2017. Metode kromatografi: prinsip dasar, praktikumdan pendekatan pembelajaran kromatografi. Deepublish.Yogyakarta

Samy, R. P., Gopalakrishnakone, P., & Ignacimuthu, S. 2006. Anti-tumor promoting potential of luteolin against 7,12-dimethylbenz(a)anthracene-induced mammary tumors in rats.Chemico-Biological Interaction 164: 1-14.

Siddiqui, R. A., Harvey, K. A., Walker, C., Altenburg, J., Xu, Z., Tery,C., Camarillo, I., Jones-Jall, Y., & Mariash, C. 2013.Characterization of synergistic anti-cancer effects ofdocosahexaenoic acid and curcumin on dmba-inducedmammary tumorigenesis in mice. BMC Cancer 418(13):1-16.

Sobolewski, C., Cerella, C., Dicato, M., Ghibelli, L., & Diederich, M.2010. The Role of Cyclooxygenase-2 in Cell Proliferation and

38

Cell Death in Human Malignancies. International Journal ofCell Biology. 2010:1-21

Tak, P. P. & Firestein, G. S. 2001. NF-κB: A key role in inflammatorydiseases. Journal of Clinical Investigation 107(1): 1–11.

Tan, H., Wang, N., Li, S., Hong, M., Wang, X., & Feng, Y. 2016. TheReactive Oxygen Species in macrophage polarization:Reflecting its dual role in progression and treatment of humandiseases. Oxidative Medicine and Cellular Longevity 2016: 1-16

Thompson, A. M. 2014. Molecular pathways: Preclinical models andclinical trials with metformin in breast cancer. Clinical CancerResearch 20(10): 2508-2515

Tieppo, J., Vercelino, R., Dias, A.S., Vas, Silva M. F., Silveira, T. R.,Marroni, C.A., Marroni, N.P., Henriques, J.A., Picada, J.N. & .2007. Evaluation of the protective effects of quercetin in thehepatopulmonary syndrome. Food Chemical Toxicology 45(7):1140-1146.

Varn, F. S., Mullins, D. W., Pulido, H. A., Fiering, S., & Cheng, C.2016. Adaptive immunity programmes in breast cancer. Journalof Immunology 150: 25–34.

Velaquez, M. E., Saloma, P. O., Arreola, M. I. P., Castro, K. E. N.,Castro, J. I. & Montor, J. M. 2015. The role of cytokine inbreast cancer cevelopment and progression. Journal ofInterferon & Cytokine Research 35(1):1-10.

Wajant, H., Pfizenmaier, K., & Scheurich, P. 2003. Tumor necrosissignalling. Cell death and differentiation 10:45-65

Wang, X. & Lin, Y. 2008. Tumor necrosis factor and cancer, buddies orfoe. National Institutes of Health 29(11): 1275-1288.

WHO. 2014. Cancer country profile in Indonesia.http://www.who.int/cancer/country-profiles/idn_en.pdf?ua=1 .Diakses 7 Januari 2017.

BAGIAN DEPAN.pdfBAB I.pdfBAB II.pdfBAB III.pdfBAB IV.pdfBAB V.pdfDAFTAR PUSTAKA (1).pdf