Almarza Castillo Jorge Luis

Comparación de los efectos inhibitorios de la urea y cloruro de guanidina sobre la actividad de la

ribonucleasa A

Universidad de Los Andes-Facultad de Ciencias-Postgrado en Química Aplicada. 2005. p. 49

Venezuela

Disponible en:

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UNIVERSIDAD DE LOS ANDES

FACULTAD DE CIENCIAS

-·JI • '. r~ n , -- -' \ .. .)( --· J ' __ ,·

POSTGRADO INTERDISCIPLINARIO EN QUIMICA APLICADA

MENCIÓN ESTUDIO DE MATERIALES

Comparación de los Efectos lnhibitorios de la Urea y

Cloruro de Guanidina Sobre la Actividad de la

Ribonucleasa A

Lic. Jorge Luis Almarza Castillo Tutor: Francisco Brito, Ph. D.

Mérida -Venezuela Julio- 2005

D~GnTt\l~ZADO http://tesis. u la .ve

1 SERBIU'LA

1 Tullo Febree Cordero ¡ ________ -- ·-----... ·····--·

Comparación de los Efectos lnhibitorios de la Urea y

Cloruro de Guanidina Sobre la Actividad de la

Ribonucleasa A

Trabajo de grado realizado por el Lic. Jorge Luis Almarza

Castillo en el Laboratorio de Genética y Química Celular

bajo la tutoría del Profesor Francisco Brito y con la

colaboración del Profesor Luis Rincón (Grupo de Química

Teórica)

Mérida, Julio 2005

UNIVERSIDAD DE LOS ANDES FACULTAD DE CIENCIAS DEPARTAMENTO DE QUÍMICA

(]'ostgraáo Interáiscipllnario en Q]tímica )Ipticadá MENCIONES

MATERIALES/ ORGÁNICA/ POLÍMEROS

Voto Salvado y Razonado Dr. Gustavo A. Fermín M.

"3.1 Se menciona repetidamente en la monografía que es el primer, o tal vez único método basado en urea para la extracción de ARN total. La bibliografía en este sentido indica lo contrario, y yo mismo suministré artículos al respecto. Se omiten numerosas referencias y se evita así la discusión formal de este aspecto y el reconocimiento de quienes ya han brindado aportes en este campo.

"3.2 Al intentar validar el método que proponen, que sin duda debe tener algún valor para el tejido de interés, fuente del ARN analizado, se brindan muy pobres datos sobre la eficiencia del mismo y sobre la ausencia de contaminación por ADN que podría brindar resultados espurios.

"3.3 Por otro lado, parte fundamental del trabajo presentado en esta monografía (aparte de los cálculos teóricos) se refiere al efecto inhibidor de la urea sobre la actividad de la RNAsa A. Dada la importancia de las aseveraciones hechas en la monografía recomendé una discusión de antecedentes sobre el mismo efecto en otras enzimas y la enzima bajo estudio (existen referencias de las cuales también suministré algunas), que nunca fue atendida incurriéndose en lo que considero son las mismas faltas señaladas en el punto 3.1.

lel.-

Gustavo A. Fermin M. Profesor Agregado UlA

Postgrado lnterdisciplinario en Quimica Aplicada (PIQA). Facultad de Ciencias. Departamento de Quimica Universidad de Los Andes. Núcleo La Hechicera. Edificio "A". Mérida, Estado Mérida. Venezuela

Telefax: +58 274 240 e-mail: piqa@ula.ve

2/4

UNIVERSIDAD DE LOS ANDES FACULTAD DE CIENCIAS DEPARTAMENTO DE QUÍMICA

CJ>ostgraáo Interáisciplinario en Q!límica.Jlpficaáa MENCIONES

MATERIALES/ ORGÁNICA/ POLÍMEROS

Observaciones al Voto Salvado y Razonado del profesor Gustavo Fermín

3.1 En la introducción entre las páginas 6-8 se hizo una revisión exhaustiva (referencias 15-28) sobre los métodos de purificación del ARN y el impacto de diversos desnaturalizantes sobre la RNasa, así que, en ningún momento, se evitó la discusión formal de ese aspecto y mucho menos el reconocimiento a los autores con aporte en ese campo. Las referencias aportadas por el profesor Fermín fueron la 23, 25 y 26. Para cada uno de esos trabajos se hizo un análisis: la 23 utilizó el detergente Catrimox 14 para limpiar la muestra de otros componentes macromoleculares que contaminaron al ARN por el uso de LiCI, es decir el producto de la purificación antes del uso del detergente resulta contaminado. El método propuesto por el Lic. Almarza muestra un ARN libre de impurezas y realizado con menos pasos de purificación. La 25 confirmó lo que se sostuvo sobre la purificación de Auffray y Rugeon (27) que utilizaron combinaciones de 8M urea 4M LiCI y 6M urea 3M LiCI respectivamente (en el buffer de extracción), y que era una contaminación constante con proteínas, ya que concentraciones tan altas de LiCI en combinación con la urea terminaban precipitando proteínas, como lo sostiene Ahmad (16) en estudios de cálculos termodinámicos del flG de inactivación de la RNasa con LiCI como agente inactivante de proteínas, y no como agente precipitante de RNA. La referencia 26 es esencialmente el método de Auffray (27) al que se le introdujo la modificación de agregarle el detergente SOS, es decir agregándole un tercer reactivo desnaturalizante a la purificación lo que hace más compleja la explicación sobre quien es el agente que precipita a las proteínas en conjunto con el ARN. El insistir repetidamente en la monografía sobre la originalidad del método de la urea se basó en que este es el primer reporte de la utilización de la urea exclusivamente (en el buffer de extracción) y en ausencia de otro agente desnaturalizante para inhibir e inactivar la RNasa en diferentes tejidos.

3.2 En materiales y métodos, en la página 16, la segunda nota explica de manera clara y diáfana la no contaminación con ADN, además de citar a la referencia 22 que utilizó el mismo criterio para descartar contaminación con ADN. La referencia 26 sugerida por el profesor Fermín, utiliza también, un criterio idéntico al que se usó en esta monografía para descartar contaminación con ADN. Además la ausencia de ADN genómico fue descartada de igual forma por la no amplificación de bandas de ADNc, de 13-actina, proveniente de dianas de ADN (página 16 y página 31 Fig. 12) En resultados y discusión, en las páginas 27 y 28 (tabla V) se muestran los rendimientos obtenidos con la utilización de los métodos estándar y mundialmente aceptados para la purificación de ARN (18· 28), así que decir que los datos son pobres es contradecir lo que miles de autores usan como criterio cotidiano, a nivel mundial, en la purificación de ARN. Es necesario hacer notar que el método

31 Figs. 11 y 12 respectivamente) y no es exclusivo para cotiledones de cacao. . también funcionó en hojas de lechosa y células de hígado de rata (página 29 tabla VI, páginas 30 y . ~

3.3 En las páginas 4 y 5 de la introducción y la página 31 de resultados y discusión se discute~ I.J V: ampliamente sobre los efectos desnaturalizantes de la urea sobre la estructura terciaria de la~ '{í.í' proteínas y en especial sobre la RNasa (desde Anfinsen en 1957 hasta Wu y Wang en 2003, rw· referencias 12-17, 31-40, 46-51). Nuevamente, se puede decir que no se evitó la discusión formal del asunto y mucho menos que no se le dan créditos a los que contribuyeron con anterioridad al desarrollo de ese conocimiento. En lo que respecta a la referencias sugeridas por el profesor Fermín se puede decir que recomendó (1.- Properties of a partially purified RNase from cow pea cotyledons, lel.- 3/4

Postgrado lnterdisciplinario en Quimica Aplicada (PIQA). Facultad de Ciencias. Departamento de Quimica Universidad de Los Andes. Núcleo La Hechicera. Edificio "A". Mérida, Estado Mérida. Venezuela

Telefax: +58 274 240 e-mail: piqa@ula.ve

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(J>ostgraáo 1 nteráisciptinario en Q!límica )fpticaáa MENCIONES

MATERIALES/ ORGÁNICA/ POLÍMEROS

Gomes Filho et al., R. Sras. Fisiol. Veg. 6: 27-31, 1994. Y 2.- 31 P and 1H NMR studies of the effect of the counteracting osmolyte trimethylamine-N-oxide on interactions of urea with RNase A, Palmer et al., JBC 275:27708-27711, 2000). Ambas referencias no fueron tomadas en cuenta ya que una (1) encuentra inhibición de la actividad de la RNasa con urea después de tratar la enzima por media hora en 6M de urea a 30 °C. En el caso de la monografía se encuentra inhibición de la cinética de la RNasa a 0.5M de urea sin ningún pretratamiento previo con urea, es decir se analiza la urea como inhibidor y no como desnaturalizante. En la referencia 2 se estudia el efecto de la urea sobre la RNasa dentro del criterio de la desnaturalización de la proteína que tiene un efecto sobre la cinética de la enzima y no dentro de la propuesta de la monografía que tiene que ver con la inhibición de la actividad enzimática de la RNasa. El trabajo de Palmer et al. cita a Holland et al. Evolution of Lactate dehydrogenase-A homologs of barracuda fishes (Genus Sphyraena) from different thermal enviroments: Differences in kinetic properties and thermal stability are due to amino acid substitutions outside the acive site. Biochem. 36: 3207-3215, 1997 como la que da la explicación del efecto de un cambio estructural en secuencias de la proteína situadas fuera del centro activo que inciden en la cinética de la enzima. Sin embargo, el trabajo de Holland et al. se limita a dar una explicación por cambios térmicos en el medio ambiente en que se encuentra la proteína y que tendrían un efecto en la cinética de la enzima y no por el efecto inhibitorio de la urea, que es lo que propone la monografía.

Dadas las aclaratorias anteriores, el resto del jurado constituido por los profesores Francisco Brito (Tutor y presidente del Jurado) y Bernardo Fontal (Jurado principal) hemos considerado no poner objeciones ni de forma ni de fondo al contenido de la monografía, después de los señalamientos hechos por el profesor Fermín en su voto salvado y razonado.

lel.-

Profesor Francisco Brito, Ph.D (Jurado Principal)

~o~ (Jurado Principal)

Postgrado lnterdisciplinario en Química Aplicada {PIQA). Facultad de Ciencias. Departamento de Química Universidad de Los Andes. Núcleo La Hechicera. Edificio "A". Mérida, Estado Mérida. Venezuela

Telefax: +58 274 240 e-mail: piqa@ula.ve

4/4

AGRADECIMIENTOS

A la Universidad de Los Andes

Al laboratorio de Genética y Química Celular (GeQuimCel)

Al FONACIT (proyecto No. 2000001576)

Al los Profesores:

• Francisco Brito, Ph.D por todo el apoyo y su confianza brindada

• Bernardo Fontal, Ph.D por enseñarme otra perspectiva de la naturaleza

• Dr. Luis Rincón por la realización de los cálculos teóricos y por su contribución

durante la interpretación de los mismos

• Pedro Jiménez, Ph.D por su cooperación durante la escritura de este manuscrito

• Gustavo Fermín por mostrar hasta donde puede llegar un investigador cuando le

da la espalda a la objetividad, ética profesional y sobre todo a la racionalidad.

A mis amigos de la universidad: Armando Briceño, Carlos Romero (Rigo ), Juan Parada,

Carie V alecillos, David Quintero, Carmelo Rosquete y a todas aquellas personas que me

brindaron su amistad sincera ... gracias

Al personal del laboratorio de Genética y Química Celular (GeQuimCel), Lic. María

Theresa Hoyer, Sonia Morales, Oliva.

La unión de la química cuántica con la bioquímica origina las herramientas que permitirán descubrir muchos de los secretos ocultos en la naturaleza, además de entenderlos mejor ...

Resumen

Compuestos como la urea y el cloruro de guanidina son muy efectivos, a

concentraciones de 8M, para destruir las interacciones no covalentes de las proteínas

aunque sus mecanismos de acción no están claros. El amplio uso de estos

desnaturalizantes sobre las proteínas ha permitido la obtención de datos cuantitativos de

las energías libres de desnaturalización de la ARNasa con urea y guanidina,

detenninándose el valor de 4.7 kcallmol para ambos compuestos. En la actualidad no se

sabe si la urea, por su capacidad de enlazarse favorablemente con electrófilos, puede

interaccionar con aminoácidos específicos de la ribonucleasa presentes tanto en el sitio

de reconocimiento del sustrato como en el centro activo, pudiendo así generar una

posible inhibición de la enzima. En el presente trabajo se llevaron a cabo comparaciones

de los valores teóricos calculados de dureza-blandura de Pearson y las energías

HOMO/LUMO, de aa protonados (presentes en el centro catalítico y de reconocimiento)

con agentes desnaturalizantes (urea y cloruro de guanidina). Los cálculos mostraron que

la interacción HOMO/LUMO y de dureza/blandura de los aa H y K (ambos protonados)

con la urea, es más favorable que la interacción de estos aa con el cloruro de guanidina.

Estos resultados fueron concordantes con la cinética de degradación del ARN por la

RNasa A en presencia de estos compuestos, donde se pudo observar que la inhibición de

la enzima fue absoluta a 0.5 M de urea en comparación con el control (sin urea ni

guanidina). Sin embargo, la velocidad de degradación del ARN en presencia de

guanidina fue ligeramente más baja que en el control; por lo tanto, la guanidina ejerce

una inhibición párcial sobre la catálisis de la RNasa A. Este trabajo es probablemente el

primer reporte que propone una explicación desde el punto de vista catalítico y cuántico

de la acción de la urea sobre la ribonucleasa, la cual usualmente se limita, solamente, a

los efectos caotrópicos del compuesto sobre el plegamiento de la enzima. Este trabajo'

tiene aplicaciones inmediatas en las extracciones de ácido ribonucleico para estudios

gcnómicos, de expresión y regulación génica. Además, el desarrollo de métodos basados

en el uso de urea tienen un beneficio adicional, por resultar en sistemas de purificación

económicos al compararlos con el método basado en el uso de cloruro de guanidina.

Abstract

Compounds as urea and guanidine chloride are very effective for disturbing non coval'ent

interactions inside protein structure when they are used at high concentrations (8M). Their

action mechanisms remain no clearly and need to be established. Using these denaturant

agents on proteins allowed to gain quantitative data on free energy for RNase denaturation

by urea and guanidine chloride, these values were determined as the same for both

compounds ( 4. 7 Kcallmol). Currently it is not clear if urea is able to inhibit the enzyme by

interacting with specific amino acids present in either in the recognizing or in the active

si te, as a consequence of its ability of binding electrophilics. In this work, Pearson 's hard

and softness theoretical values and HOMO/LUMO energies for the protonated amino acids

(present in both the catalytic and the recognition sites) and for denaturant agents (urea and

guanidine chloride) were compared. The results obtained above support the idea that

interactions between amino acids H and K (both being protonated) with urea are more

favorable than interactions with guanidine chloride. These theoretical calculations were

coJToborated by results ofRNA degradation kinetics using RNase A with urea or guanidine

chloride, when urea at 0.5 M completely inhibited the enzyme. Besides that RNA

degradation rate was lower than controls when guanidine chloride was assayed, then

guanidine chloride seems to be a partial inhibitor of RNase A. This work propases an

explanation from the catalytic and quantic points ofview for the action ofurea on RNase A

which is different to the usual explanation based on chaotropic effect on the enzyme

folding. Results of this· work have immediate applications on ribonucleic acids purification

protocols for genoriüc, gene expression, and genetic regulation research because of the

using ofurea into them render a cleaner product ata lower price ..

Lista de abreviaturas

aa: Aminoácido

ADN: Ácido desoxiribonucleíco

AIM: Atoms In Molecules (átomos en la molécula)

ARN: Ácido ribonucleico

DEPC: Dietilpirocarbonato

dNTP: Desoxirribonucleótido trifosfato

EDTA: Ethylene-Diamine-Tetraacetic A cid (ácido etilen-diaminotetraacético)

H: Histidina

HOMO: Highest Occupied Molecular Orbital (orbital molecular más alto ocupado)

K: Lisina

LUMO: Lowest Unoccupied Molecular Orbital (orbital molecular más bajo no

ocupado)

MES: [2-(N-Morpholino )-Ethane-Sulfonic Acid] (ácido morfolino-etanosulfónico)

MOPS: [3-(N-Morpholino)-Propane-Sulfonic Acid] (ácido morfolino­

propanosulfonico)

OM: Orbital Molecular

PCR: Polymerase Chain Reaction (reacción en cadena de la polimerasa)

R: Arginina

RT: Reverse Transcription (transcripción reversa)

TCA: Tricloroacetic acid (ácido tricloroacético)

Índice de contenido

Introducción

Estructura de la ribonucleasa A .................................................................................. 1

Presencia de subsitios de la ribonucleasa A y su impmiancia en el mecanismo

catalítico ..................................................................................................................... 2

Urea y guanidina como agentes desnaturalizantes ..................................................... 4

Objetivos, justificación e hipótesis ............................................................................. 9

Materiales y métodos

Material biológico ..................................................................................................... 1 O

l. Cálculos teóricos ................................................................................................... 1 O

II. Cinética de la ribonucleasa A y ribonucleasa I ................................................... 1 O

II.A.l Cinética de la ribonucleasa A ........................................................................ 11

II.A.2 Detenninación de la absorbancia óptima de nucleótidos fosforilados ........... 12

II.B Cinética de la RNasa I .................................................................................... 13

liLA Metodología de extracción de ARN con urea ................................................. 14

III.B Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR) ................................................... 15

Resultados y discusión

l. Teoría química y bioquímica ............................................................................... 17

ll. Cinética enzimátlca (RNasa A y RNasa J) ........................................................... 22

II.A.l Cinética de la RNasa A .................................................................................. 22

II.A.2 Determinación de Absorbancia óptima de nucleótidos fosforilados .............. 25

IJ.B Cinética de la RNasa I ....................................................................................... 26

III.A Sistema de purificación de ARN en base a urea .............................................. 27

III.B RT_PCR a partir de muestras de ARN total .................................................. 30

Conclusiones ............................................................................................................. 32

Bibliografía ............................................................................................................... 33

lndice de figuras

Figura l. Modelo esquemático tridimensional del complejo RNasa y d(pA)4

mostrando las interacciones electrostáticas que enlazan al polinucleótido en

la superficie de la proteína .......................................................................................... 1

Figura 2. Diagrama esquemático del sitio activo de la RNasa y los subsitios

cercanos ...................................................................................................................... 2

Figura 3. Estructura tridimensional del complejo ribonucleasa-d(ATAAG)

donde se indican los subsidios P-1, PO, P 1, P2 ........................................................... 3

Figura 4. Mecanismo de tranfosforilación (arriba) e hidrólisis (abajo) del

ARN por la RNasa A .................................................................................................. 4

Figura 5. Velocidad de liberación de oligonucleótidos: controles (abajo) y

8M de urea (an-iba) en presencia de la RNasa ............................................................ 5

Figura 6. Representación esquemática de la interacción de orbitales fronteras

entre urea y/o guanidina protonada con H y/o L (ambas protonadas) ...................... 19

Figura 7. Cinética de inhibición de la RNasa medida como incremento de la

absorción a 290 ntn .................................................................................................. 22

Figura 8. Cinética de inhibición de la RNasa medida como incremento de la

absorción a y 280 nm ................................................................................................ 23

Figura 9. Cinética de inhibición de la RNasa medida como incremento de la

absorción a 260 nm· ................................................................................................... 24

Figura 1 O. Cinétíca de inhibición de la RNasa I seguida por incremento de la

absorción a 290 nn1 ................................................................................................... 26

Figura 11. Electroforesis en gel de agarosa del ARN total aislado por dos

n1étodos diferentes .................................................................................................... 30

Figura 12. Productos amplificados por RT-PCR del gen de ¡3-actina, a partir

de ARN total aislado por el método de urea de diferentes tejidos ............................ 31

11

Índice de tablas

Tabla I. Composición de las soluciones utilizadas para la determinación de las

absorbancias óptimas de los nucleótidos libres fosforilados en buffer MOPS

Para el cálculo del factor GQ . ................................................................................... 12

Tabla II. Energías calculadas de orbitales fronteras, cargas AIM y momentos

dipolares para la urea, guanidina protonada, histidina protonada y lisina

protonada a nivel RHF/6-31G(d) .............................................................................. 18

Tabla III. Variación del pH en función de concentraciones crecientes de urea

en buffer acetato y buffer MOPS .............................................................................. 21

Tabla IV. Valores de GQ y absorbancias de los dNTPs a longitudes de ondas

distintas en buffer MOPS en presencia y ausencia de TCA ..................................... 25

Tabla V. Rendimiento de ARN total extraído a partir de embriones de cacao

usando dos métodos de aislamiento ....................................................................... 28

Tabla VI. Rendimiento y relación de absorbancia de muestras de ARN total

purificado a partir de hojas de lechosa e hígado de rata por el método de urea ....... 29

Ill

Introducdón

El ácido ribonucleico (ARN), es un biopolímero implicado en la transferencia de

información biológica y su tiempo de vida media in vivo está a menudo determinado por

la velocidad de su degradación enzimática por parte de las ribonucleasas (1). Por esta

razón la inhibición de las ribonucleasas (RNasas) es un paso clave en la purificación del

ARN de cualquier tejido.

La RNasa que ha sido objeto de mayor estudio es la ribonucleasa A, obtenida del

páncreas bovino. Al igual que muchas ribonucleasas de mamíferos, ésta es secretada al

intestino delgado donde hidroliza ciertos enlaces de los ácidos ribonucleicos presentes

en la ingesta. La RNasa A bovina tiene un peso molecular de 13.7 kDa y su estabilidad

tridimensional es proporcionada principalmente por cuatro puentes disulfuro (2).

Estructura de la RNasa A

Por estudios de complejos cristalinos de la RNasa A con tetra-desoxi-fosfoadenosinas

como análogo del sustrato [d(pA)4] y resueltos por difracción de rayos-X (3), se

determinó la presencia de un canal o multisitio extendido de aa cargados en la superficie

de la proteína (K7, K41 , K66, R85, R39, K91, K98, R33 y K31). El canal donde están

situados estos aa ejerce una interacción electrostática con los grupos fosfatos del sustrato

(figuras 1 y 2). Además, estos investigadores sugieren, la existencia de motivos para el

reconocimiento de las ribosas y bases nitrogenadas en la proteína, jugando estos un

papel mayor en la especificidad enzimática (3).

Figura l . Modelo esquemático tridimensional del complejo RNasa y d(pA)4, mostrando las interacciones electrostáticas que enlazan al polinucleótido en la superficie de la proteína [tomado de (3)]

1

Presencia de subsitios en la ribonucleasa A y su importancia en el mecanismo

catalítico

Existe evidencia de la presencia de algunos subsitios distintos al sitio catalítico que están

involucrados en la formación del complejo enzima-sustrato (figura 2). Se ha propuesto la

existencia de de tres subsitios en la RNasa A (B 1, B2 y B3) que interaccionan

específicamente con las bases nitrogenadas del ARN (4, 5). El subsitio B 1 se enlaza

aparentemente sólo a nucleótidos de pirimidinas y se ha demostrado que tiene una

mayor afinidad (~ 30 veces mayor) para citidinas que para uridinas. Las evidencias

sugieren que la especificidad de la enzima por las pirimidinas, se debe a la exclusión de

las bases de purinas por este subsitio, mientras que los subsitios B2 y B3 se unen tanto a

pirimidinas como a purinas aunque muestran tener preferencia por las últimas (6-8).

Se ha mostrado evidencia de la presencia en la enzima de otros tres subsitios (Po, P1 y

P2) que interaccionan con los grupos fosfatos del sustrato. El subsitio P 1 está constituido

principalmente por los residuos involucrados en la función catalítica (H12, H119 y

K41 ), mientras que los residuos de aa de los subsitios Po (Lys66) y P2 (L 7 y R 1 O)

incrementan la afinidad de unión por el sustrato y participan indirectamente en la

catálisis (9).

Thr-45 Phe-120

·s, Ser-123

~ \Jl c~o B,

/-o-c~,0 ~Ó- :CNH1

p,"' N j N

lys-66 : l o, OH¡_ < ) ~.-, ''1 N N B,

1 -o-c~0 ~ Ó· NH1 p,~ \. 1'1 N0N

LYI·4l Á' 0\0~ < A .. ) Hos-1l9 1/ N N

H•s-12 ¡-o-c~0 ~,{. ~ p,-~

Lys-7 R, O OH Atg-10 \

Figura 2. Diagrama esquemático del sitio activo de la RNasa y los subsitios cercanos (5)

2

Algunos datos apoyan la existencia de un sitio de unión adicional a los comentados con

anterioridad. Con la ayuda de ensayos cinéticos y termodinámicos, se encontró que en

el extremo de la cadena polipeptídica, el residuo R85 interacciona con un grupo fosforil

del sustrato unido (9), por lo que estos autores concluyen que este residuo forma parte de

un nuevo subsitio denominado P (-1) (figura 3)

Figura 3. Estructura tridimensional del complejo ribonucleasa-d(A T AAG) donde se indican los subsidios P-1(amarillo), PO(verde), Pl(azul), P2(rojo). Modificado a partir del modelo presentado por Fisher et al. (9) 2005.

En 1994 se propuso un mecanismo catalítico de transfosforilación (paso 1) e hidrólisis

(paso 2) para la RNasa (10) en donde están involucrados los resíduos H12 y H119

(figura 4). La RNasa A se une a las bases del ARN en los tres subsitios B y cataliza la

ruptura del enlace P-05' unido específicamente sobre el extremo 3' de los nucleótidos

que están enlazados al subsitio B1 (ver figuras 2 y 4) quedando el fosfato unido al

enlace en posición 3' del nucleótido que está inmediatamente enlazado al sustrato y el

nucleótido escindido queda hidroxilado en la posición 5' terminal.

3

A: +

H-0

\NA,.

Figura 4. Mecanismo de tranfosforilación (arriba) e hidrólisis (abajo) del ARN por la RNasa A. En la figura, A conesponde a la H12 y 8 a la H119 (11).

Urea y Guanidina como agentes desnaturalizantes

Compuestos como la urea y el cloruro de guanidina son muy efectivos para destruir las

interacciones no covalentes de las proteínas aunque sus mecanismos de acción no están

claros. Las cadenas polipeptídicas en presencia de estos agentes (urea 8M y guanidina

6M) adoptan estructuras al azar como lo muestran sus propiedades físicas estudiadas por

dicroísmo circular (12).

La urea ejerce un iinpacto significativo no solo a nivel de la ribonucleasa sino también

sobre su sustrato· (13, 14). Con base en sus resultados, estos investigadores llegan a las

siguientes conclusiones:

• La urea interrumpe las estructuras secundarias y los agregados del ARN que se

forman en solución acuosa, pem1itiendo la relajación de las cadenas

polinucleotídicas incrementando su concentración disponible.

• Bajo las condiciones experimentales usadas (buffer acético/acetato pH 5 y buffer

fosfato pH 7 ambos en 8M de urea), la formación de oligonucleótidos es

incrementada cuando la RNasa actúa sobre el ácido ribonucleico en presencia de

urea (Figura 5).

4

Absorbancia ARN + UREA (buffer pH 5.0) 1.2

9 ARN +UREA (buffer pH 7.0)

.6

.3 ARN (pH 7)

LL~~~====:===r ARN (pH 5) 4

Tiempo (minutos)

Figura 5. Velocidad de liberación de oligonucleótidos: controles (abajo) y 8M de urea (an·iba) en presencia de la RNasa. Los bufferes usados fueron O.lM acetato pH 5 y 0.1 M fosfato pH 7 (13)

Estos trabajos sobre la cinética de la actividad de la RNasa (13,14), probablemente,

fueron importantes a la hora de diseñar sistemas de purificación de ARN, descartando la

posibilidad del uso de la urea como agente caotrópico y tomando más en consideración

el uso de cloruro de guanidina.

En 1986, Pace (citado en 15) propone la desnaturalización con urea y cloruro de

guanidina a altas concentraciones, como una de las primeras vías para medir la

estabilidad conformacional de las proteínas. El amplio uso de estos desnaturalizantes

sobre las proteínas, ha pennitido la obtención de datos cuantitativos de las energías

libres de desnaturalización para el caso de urea y guanidina; el valor para la RNasa en

estos casos fue determinado en 4.7 kcal/mol para ambos compuestos (16). Sin embargo,

la naturaleza exacta de la interacción molecular de estos desnaturalizantes con la

proteína no está· bien entendida. No está claro aún si ellos actúan directamente

enlazándose a la proteína o indirectamente por su efecto sobre el solvente (15).

Se han propuesto muchos modelos para tratar de explicar la interacción directa de la

urea con la proteína, pero estos no explican como las proteínas superan la barrera

energética para llevar a cabo el desplegamiento. Se considera que la urea pudiera

enlazarse a la proteína y competir con las interacciones nativas que estabilizan las

proteínas y de éste modo participar activamente en procesos de desplegamiento.

Alternativamente, se ha propuesto que la urea actúa indirectamente alterando el medio

5

ambiente del solvente, debilitando así el efecto hidrofóbico y facilitando la exposición

de los residuos del interior de la proteína (17).

Todos los métodos de purificación de ARN incluyen el uso de algún agente precipitante

o inactivador de enzimas, con el fin de desnaturalizar, por desplegamiento, la estructura

tridimensional de las proteínas presentes en los extractos celulares de los tejidos en los

cuales se quiere aislar el ARN. El énfasis de todos estos métodos siempre ha estado

centrado en la desnaturalización de la RNasa para evitar la hidrólisis del RNA y de esta

manera aumentar los rendimientos de purificación en ARN. En el pasado se utilizaba

comúnmente el fenol (18) o la mezcla fenal cloroformo (19) como agentes

desproteínizantes. En los últimos veinte años el uso de desnaturalízantes orgánicos como

son el cloruro de guanidina (20) y el tiocianato de guanidina (21,22) se han impuesto

como los desnaturalizantes usualmente utilizados en los protocolos de purificación de

ARN. También ha sido frecuente el uso de detergentes como coadyuvantes en la

inactivación de la RNasa y otras proteínas, en los búferes de extracción de ARN y entre

éstos podemos mencionar al SDS, el bromuro de cetryltrimetilamonio, catrímox -14 y el

N-lam·il sarcosinato de sodio (20, 21, 23). Una variante de estos métodos es la

utilización de un método fisico para el aislamiento del ARN: en vez de precipitaciones

con agentes químicos se usa la ultra centrifugación con cloruro de cesio. El extracto

celular es tratado con agentes desnaturalizantes de proteínas como son el tiocianato de

guanidina (21) o el detergente N-lauril sarcosinato de sodio (24) para la inactivación de

la RNasa. Luego el extracto es sometido a ultra centrifugación, en un gradiente de

cloruro de cesio, hasta que se establece un equilibrio de sedimentación por densidad

entre el ARN y una cierta concentración del CsCl (24). Este método tiene la desventaja

de tener que utilizar ultra centrifugación por tiempos largos (16-18 horas), lo que lo hace

inoperante para múltiples muestras además de ser inadecuado para grandes cantidades de

tejido (19, 25). El rendimiento de este método es reducido por el bloqueo que establecen

las proteínas y el ADN en la interfase entre el gradiente de CsCI y el buffer de

extracción-CsCl, el cual atrapa al ARN y tennina contaminando al precipitado de ARN

(25). Actualmente se están utilizando combinaciones de agentes caotrópicos como son

las mezclas de urea y cloruro de litio a altas concentraciones entre 3.0 y 8.0 M; estos

6

métodos incluyen además el uso de detergentes como el SDS, otro reactivo

desnaturalizante de las RNasas (23, 26). Los métodos, con base a mezclas, fueron

desarrollados a partir de una metodología diseñada por Auffray y Rougeon en 1980 (27)

donde utilizaron las propiedades caotrópicas de la urea y el cloruro de litio (agentes

desnaturalizantes a concentraciones de 3.0 M) para producir la desnaturalización de la

RNasa, sin embargo el ARN purificado por este método siempre muestra contaminación

con proteínas (25). Es probable que la mezcla de urea y cloruro de litio, en el buffer de

homogenización, actúe combinando las acciones del agente desnaturalizante orgánico y

la alta concentración de la sal de litio (también actuando como agente caotrópico) en la

precipitación masiva de proteínas presentes en el extracto, esta precipitación no selectiva

incluiría a la RNasa y también al RNA. Esto último de alguna manera fue confirmado

por Scott et al. (23) quienes usaron catrimox-14 para separar al RNA de otros

componentes macromoleculares; muy a pesar de usar el LiC]z separadamente de la urea.

Las sales de litio han sido estudiadas como agentes desnaturalizantes de la RNasa y el

cloruro de litio presenta un L'lG de inactivacion 2. 7 más grande que el cloruro de

guanidina y la urea para esta enzima (16). Con base a lo anterior no se puede discernir si

el efecto inactivador de la mezcla es por efecto de la urea o del cloruro de litio. Es muy

probable que una concentración de cloruro de litio de 8.0 M como la que utiliza Scott et

al. (23) precipite no solo a las proteínas sino también a otros componentes

macromoleculares, como podría deducirse de los resultados de Bugos et al. (28) quienes

infructuosamente utilizaron diversas precipitaciones con cloruro de litio para tratar

incrementar la relación A2 6o/A2so en ARN purificado de material vegetal. Bugos et al.

(28) sugieren que el ARN purificado, de algunos de los tejidos que ellos utilizaron,

podría estar contaminado con polisacáridos y polifenoles y el cloruro de litio les

coprecipitó el ARN junto con estos componentes. Cuando variaron su metodología para

eliminar, previamente, al uso del cloruro de litio, los polisacáridos y polifenoles

encontraron una mejora en la relación A26o!A28o, confirmando así que el cloruro de litio

no solo precipita al ARN de alto peso molecular, sino que también es capaz de precipitar

otros componentes del extracto (28). La relación A260/A 280 la incrementaron desde 1.7

7

hasta 1.9 utilizando LiCh después de varios pasos de separación para eliminar los

contaminantes (28).

Probablemente la urea por su capacidad donadora intrínseca pueda unirse con mayor

afinidad a los aminoácidos cargados presentes tanto en el sitio de reconocimiento como

en el sitio catalítico de la RNasa, pudiendo así disminuir la velocidad de reacción de la

enzima. Este tipo de interacción de la urea con aa específicos de la proteína puede ser

estudiada de manera detallada con la ayuda de teorías químicas, como la teoría de

orbitales moleculares fronteras y la teoría de dureza-blandura de Pearson (29-32). A

través de comparaciones de los valores de sus orbitales moleculares más altos ocupados

(HOMO) y sus orbitales moleculares más bajos desocupados (LUMO), se puede conocer

la posibilidad que tienen dos moléculas para fonnar interacciones favorables.

En la actualidad no se conocen métodos eficientes de purificación de ARN total basados

solamente en urea como agente inactivador de la RNasa, por el uso tan generalizado y de

f01ma casi universal que tienen los procedimientos con base al cloruro de guanidina. La

única mención a la urea como agente desnaturalizante en una purificación de ARN la

hicieron Auffray y Rougeon (27) en 1980 (otros autores esencialmente siguen la

metodología de Auffray y Rougeon). Sin embargo, Auffray y Rougeon (27) no

mencionan su método como exclusivo de la urea, sino que ellos utilizaron una

combinación de urea y cloruro de litio y defienden esta combinación corno la mas

eficiente para purificar ARN. Al trabajo de Auffray y Rougeon se le han hecho críticas

que indican que el método no es eficiente por presentar contaminación con proteínas

(25). La alta reactividad de ·la urea, mencionada anteri01mente, ha sido utilizada

intensamente en estudios de plegamiento/desplegamiento de proteínas pero no se ha

tomado en cuenta para estudios de inhibición enzimática de la RNasa. Wu y Wang (15)

llevaron a cabo experimentos cinéticos con la RNasa y la papaína en presencia de urea.

Ellos sugieren que el efecto de la urea en estas enzimas puede ser descrito por el modelo

de unión desnaturalizante en contraposición al modelo del efecto de la urea sobre el

solvente con el concomitante desplegamiento de la enzima.

Tomando en cuenta el potencial de la urea para interaccionar con los aminoácidos del

centro activo y de reconocimiento de la RNasa es posible usar sus propiedades

8

(comentadas anteriom1ente) para desarrollar nuevos sistemas de purificación de ácido

ribonucleico basados en la utilización de la urea. En el presente trabajo, con la ayuda de

programas computacionales de química teórica (33), y con la ayuda de estudios

cinéticos de la enzima ribonucleasa, se tratará de inferir el efecto de la urea sobre la

actividad catalítica de la RNasa A y la ribonucleasa I de Escherichia coli, con miras a

desarrollar un sistema de aislamiento de ARN total tan eficiente como el sistema basado

en cloruro de guanidina y posiblemente más económico.

Objetivos

>- Realizar estudios teóricos comparativos de la reactividad de la urea y guanidina

frente a aminoácidos involucrados en los sitios de reconocimiento y catalítico de

la enzima ribonucleasa

>- Estudiar los efectos de la urea y el cloruro de guanidina sobre la actividad de la

RNasa mediante ensayos de cinética enzimática

>- Proponer un sistema de purificación de ARN total utilizando urea.

Justificación

Los sistemas de purificación de ARN con la ayuda de cloruro de guanidina y tiocianato

de guanidina son efectivos pero costosos y de bajo rendimiento (19-21, 25, 28). Esto

hace importante tratar de conocer el mecanismo de interacción de la urea y el cloruro de

guanidina con la ribonucleasa, pues permitirá el diseño de sistemas de purificación de

ARN total con rendimiento y calidad adecuados para estudios de expresión genética, los

cuales darán beneficios sustanciales para los laboratorios que trabajan con bioquímica y

biología molecular de ARN.

Hipótesis de trabajo

Si los valores teóricos calculados, de HOMO-LUMO y dureza-blandura para la

molécula de urea y para los aa cargados del sitio de reconocimiento y catalítico de la

RNasa, pem1iten predecir interacciones termodinámicamente mas favorables que los

valores calculados para el cloruro de guanidina, entonces, la urea puede ser considerada

una molécula con mayor potencial para inhibir la ribonucleasa por la fom1ación de

aductos con aa fundamentales para la actividad catalítica de la enzima.

9

Materiales y métodos

Material biológico

I. Enzimas:

Ribonucleasa A de páncreas bovino de SIGMA_ tipo IA-S

Ribonucleasa l (RNase ONETM) de E. coli de Promega

II. Sustrato: Ácido Ribonucléico de levadura para análisis bioquímico (Merck)

III. Las extracciones de ARN total de plantas fueron hechas a partir de:

• Hojas de lechosa: un cultivar propagado in vitro aclimatado en invernadero

(cultivar I) y otro silvestre (cultivar II)

• Embriones inmaduros ( ~ 3 meses de edad) de cultivares de cacao criollo (cultivar

l) y cacao forastero (cultivar II).

• Además, se usó como fuente de tejido animal hígado de rata.

Metodología

l. Cálculos teóricos

II. Cinética de la ribonucleasa

III. Método de extracción de ARN total

l. Cálculos teóricos

Los cálculos de orbitales moleculares (OM), la optimización de geometrías a nivel

RHF/6-31 G( d) fueron hechos usando el programa Gaussian 98 (33). Las cargas atómicas

en las moléculas y los momentos dipolares fueron hechos también con el mismo

programa.

II. Cinética de la ribonucleasa A y ribonucleasa 1:

Se optimizaron las condiciones para realizar la cinética de ambas enzimas. La actividad

de la RNasa se midió con base en la liberación de oligonucleótidos solubles en función

del tiempo. Para hacer una medición mas confiable se precipitó todo el ARN de alto

peso molecular con la ayuda de 50% TCA (34) se incubó en frío y se centrifugó 3 mina

máxima velocidad en una microcentrífuga.

10

II.A.l Cinética de la RNasa A

A partir de los procedimientos propuestos por Kalnitsky (13), Kunitz (35) y Shultz (36),

se optimizaron las condiciones para obtener una metodología que permitió medir la

actividad de la enzima RNasa A en estudio:

l. En un tubo de 1.5 mL se agregaron 125 f'vL de RNasa A (16 ng//)vL en 0.1 M buffer

MOPS pH 7.5) y se incubó a 37 °C por 5 min.

2. Se añadieron 125 /)vL de 1% ARN de levadura (en 0.1 M buffer MOPS pH 7.5) para

comenzar la reacción

3. Se incubó a 37 oc a distintos tiempos: O, 1, 2, 3 y 4 minutos.

4. La reacción se detuvo con 125 fJvL de TCA al 50%

5. Se incubó por 5 minutos a O °C

6. Se centrifugó por 3 minutos a 14.500 rpm en una microcentrífuga y se midieron las

absorbancias a 260, 280 y 290 nm.

Notas:

- EL stock de la ribonucleasa se preparó a una concentración de 1 O /)vgl fJvL,

resuspendiendo los cristales (50-1 00 unidades Kunits/mg de proteína) en 0.1 M de

acetato de sodio pH 5.2. A partir de este stock se prepararon las cantidades adecuadas

en los tratamientos utilizados para medir la actividad de la enzima.

-Para determinar la actividad de la ribonucleasa se utilizaron los siguientes tratamientos:

0.5 M urea en O. 1 M buffer MOPS, pH 7.5 + 5 mM MgCh + ARNasa + ARN

0.5 M clomro de guanidina en 0.1 M buffer MOPS, pH 7.5 + 5 mM MgClz +

ARNasa+ARN

0.1 M buffer MOPS, pH 7.5 + 5 mM MgCh + ARNasa + ARN (tratamiento

control)

* Los blancos se prepararon con: 250 fJvL de 0.1 M buffer MOPS, pH 7.5 + 5 mM

MgCh + (con o sin urea y guanidina dependiendo del tratamiento que corresponda) +

125 flvL de 50% TCA + incubación por 5 min a O °C + centrifugación por 3 min a

14.500 rpm en una microcentrífuga.

11

II.A.2 Determinación de la absorbancia óptima de nucleótidos fosforilados

Para determinar la longitud de onda óptima de absorción para los nucleótidos liberados

durante la cinética de la enzima, en primer lugar se procedió a realizar un análisis con

estándares en buffer MOPS en presencia y ausencia de TCA.

Las longitudes de onda utilizadas fueron 260, 280 y 290 nm, sugeridas en la bibliografía

para la cuantificación de los nucleótidos libres (13, 35, 36). Para las condiciones

experimentales empleadas en este trabajo, fue necesario llevar a cabo ensayos

preliminares de espectrometría para detem1inar el efecto del solvente sobre la absorción

de los analitos y así garantizar una máxima sensibilidad del método que permitiera

cuantificar eficientemente los nucleótidos liberados durante la cinética.

Tabla l. Composición de las soluciones utilizadas para la determinación

de las absorbancias óptimas de los nucleótidos libres fosforilados en buffer

MOPS para el cálculo del factor GQ.

Componentes Solución inicial Solución Final

dNTPs (10 mM) 3. 75 f.LL 3. 75 f.LL

MOPS (100 mM) 496.25 f.LL 371.25 f.LL

TCA (50%) - 125 f.LL

Una vez realizadas las mediciones se procedió a calcular un factor relativo llamado GQ

(GeQuimCel), que permite predecir la absorbancia óptima de un analito en solventes

modificados para la cinética de una enzima y que además, pem1ite calcular la obtención

de diferencias significativas en las pendientes obtenidas durante una cinética, evitando la

obtención de resultados poco representativos desde el punto de vista estadístico.

12

Este factor se puede fommlar mediante la siguiente expresión:

GQ = A*t..r- At..i

At..i: Absorbancia inicial a una longitud de onda (A) en un solvente A

A *t..r: Absorbancia final a una longitud de onda (A) en un solvente A modificado

Nota: Con el factor GQ, además se pueden observar diferencias significativas entre

las pendientes resultantes cuando se realice una cinética de inhibición donde se tenga

que modificar químicamente el solvente para detener la reacción, teniendo en cuenta

que:

1) Sí el factor GQ ::;O (negativo pero cercano a cero) => m 1 ':/; m 2 (A es adecuada

para el análisis cinético)

II) Sí el factor GQ >O => m 1 = m2 (A es no adecuada para el análisis cinético)

III) Sí el factor GQ =O => m 1 ~ m2 (A es poco adecuada para el análisis cinético)

).> Donde m¡ y m2 corresponden a dos pendientes obtenidas de una cinética de

inhibición.

Mientras más negativo sea el valor de GQ, la A será más adecuada para usarse en

ensayos de tipo cinético.

II.B Cinética de la RNasa 1:

l. En un tubo de 1.5 mL, se agregaron 80 ,uL del ARN de levadura (0.7 %) y se incubó

a 37 oc por 5 nrin

2. Se agregaron 20 ,uL de RNasa I (0.025U/,uL en 20 mM buffer Tris-HCI pH 7.5) para

comenzar la reacción.

3. Se incubó a 37 oc durante O, 1, 2, 3, y 4 min.

4. Se detuvo la reacción con 100 ,uL de TCA al 50 %

5. Se incubó a Ü°C por 5 min.

6. Se centrifugó a 14.000 rpm en una microcentrífuga por 4 min.

7. Se midió a una absorbancia de 290 nm.

13

Notas:

EL stock de la ribonucleasa se preparó para cada tratamiento a una concentración de

0.025 U/p,L resuspendiendo el stock comercial (7 U/t-tL) en 200mM de buffer Tris-HCl

(pH 7.5) + 5mM EDTA + 200mM de acetato de sodio y 0.05% Triton X-100.

Para medir la actividad de la ribonucleasa se utilizaron los siguientes tratamientos:

0.5M urea en 200mM de buffer Tris-HCI (pH 7.5) + 5mM EDTA + 200mM de

acetato de sodio y 0.05% Tri ton X-1 OO.

0.5M de cloruro de guanidina en 200mM de buffer Tris-HCl (pH 7.5) + 5mM

EDTA + 200mM de acetato de sodio y 0,05% de Triton X-1 OO.

200mM de buffer Tris-HCI (pH 7.5) + 5mM EDTA + 200mM de acetato de

sodio y 0,05% de Triton X-100 (tratamiento control).

Los blancos se prepararon bajo las mismas condiciones para cada tratamiento,

pero deteniendo inmediatamente el progreso de la reacción con TCA para evitar

la degradación del sustrato.

III.A Metodología de extracción de ARN con urea

Para la purificación del ARN total de todas las muestras se procedió de la siguiente

manera:

a. Se maceró la muestra (un gramo de embriones) con nitrógeno líquido

b. Se agregaron 4 mi de buffer de extracción (8 M urea; 20 mM MES, pH 7.0; 20 mM

EDTA)

c. Se agregó ¡3-mercaptoetanol hasta una concentración final 0.35 M y se homogenizó la

mezcla.

d. Se adicionó un volumen igual de una mezcla fenol:cloroformo:isoamilalcohol en una

proporción 25:24:1 respectivamente y luego se incubó por 5 minutos con agitación

El fenol fue previamente equilibrado con 0.1 M de buffer citrato, pH 4.4.

e. Se centrifugó (60min a 6500xg) a 4 oc y se extrajo la fase acuosa, a la cual se le

agregó 1 vol de clorofom1o; se agitó vigorosamente por 2 min. y fue centrifugada bajo

las condiciones anteriores.

f. Se repitió el paso anterior y se transfirió la fase acuosa a un tubo estéril.

14

g. Se agregó 0.4 vol (con respecto a la fase acuosa recuperada) de ácido acético 1 M y

una mezcla de etanol:isopropanol (1: 1) y se incubó a -20 oc durante toda la noche.

h. Se centrifugó (30min a 6500xg) a 4 oc. Se descartó el sobrenadante y el precipitado

fue disuelto por agitación vigorosa en presencia de acetato de sodio (3.0 M, pH 5.2)

calentado en un baño termostatizado.

i. Se repitió el paso anterior tres veces y se descartó el sobrenadante y luego el

precipitado fue disuelto con 70% etanol en agua tratada con DEPC.

j. Se centrifugó a 14.500 rpm en una microcentrífuga; luego se descartó la fase acuosa y

los tubos se colocaron 5 minen la estufa a 60 °C.

k. Se resuspendió con 20 J.LL de agua tratada con DEPC.

Notas:

- Las extracciones con cloruro de guanidina se llevaron a cabo bajo las mismas

condiciones comentadas, excepto por el buffer de extracción al que en lugar de urea se

agregaba guanidina 8 M (paso b)

- Las precipitaciones de la población de ARN total se realizaron con ácido acético (en

presencia de alcohol) y no con LiClz como lo sugieren algunos autores (25, 27, 28)

debido a que esta sal precipita el ARN de alto peso molecular, dejando en solución las

poblaciones más pequeñas (37,38) y como consecuencia el rendimiento de la extracción

disminuye.

- La integridad dei ARN total aislado fue corroborada en principio por la presencia de

las dos bandas ;ibosomales (ARNr) 25S y 18S para el caso de los tejidos vegetales,

mientras que para el tejido animal las bandas correspondientes para verificar su

integridad fueron 28S y 18S.

- Las muestras de ARN total se corrieron en un gel de agarosa al 1.5% en condiciones

desnaturalizantes y teñidas con bromuro de etidio como se sugiere en Sambrook et al.

(37).

III.B Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

Para verificar la calidad del ARN de cada muestra se llevaron a cabo reacciones de RT­

PCR (Transcripción Reversa- Reacción en Cadena de la Polimerasa) con la ayuda del

15

"Reverse transcription system kitTM, de Promega Cat. No. A3500. Las secuencias de

cebadores usadas para la amplificación del ARN mensajero del gen ¡'3-actina de plantas

fueron las siguientes:

Secuencia sentido (5'- TAOCAACTOOOATOACATOG- 3')

Secuencia antisentido (5'- OATOOCTOGAAOAOAACCTC- 3')

La amplificación a partir del ARN mensajero del gen ¡'3-actina de animales fue llevada a

cabo bajo las mismas condiciones, usando el par de cebadores beta-actin Promega Cat.

No. 05740. La reacción fue analizada por la fluorescencia emitida en presencia de

bromuro de etidio (50-100 ng/mL) en un gel de agarosa al 0.8%. El peso molecular de la

banda amplificada fue estimado usando la escalera de pesos moleculares de Promega

lkb Cat. No.G5711

Notas:

- Las condiciones de PCR usadas, son las sugeridas por el kit "beta-actin" de Promega

Cat. No. 05740

- La ausencia de ADN de alto peso molecular fue asumida con base a la no presencia de

bandas fluorescentes por encima de las bandas ribosomales 25S para los tejidos

vegetales y 28S para el tejido animal como lo sugieren Murillo et al. (22). Al comparar

el tamaño de las bandas amplificadas (esperadas) por RT_PCR, las cuales fueron más

pequeñas (en ausencia de ADN) debido a que los cebadores son diseñados a partir de

secuencias que flanquean intrones en el ADN genómico, asumimos también que las

muestras no presentabán contaminación con ADN de alto peso molecular.

16

Resultados y discusión

l. Teoría química y bioquímica

Se propuso con base a la teoría de orbitales moleculares fronteras y el principio acido­

base de dureza y blandura de Pearson (29-32), una explicación cualitativa para la

reactividad de la urea como agente inactivador de la ribonucleasa. Las moléculas en

estudio son caracterizadas por sus energías de orbitales fronteras y durezas absolutas

(Tabla 2). Esta es la manera aceptada de visualizar la interacción dador-aceptar (38)

usando las propiedades de las especies aisladas (29-32).

La energía del orbital molecular más alto ocupado de la urea y guanidina protonada

(Tabla 2) es comparada con la energía del orbital molecular más bajo desocupado de la

His y Lys con ambos grupos R protonados, residuos que se cree cumplen un papel

crítico en la hidrólisis del ARN (subsitio Pl) por la RNasa (39-40). El HOMO de la urea

está principalmente localizado sobre el átomo de oxígeno, mientras que el HOMO de la

guanidina protonada está localizado sobre el enlace nitrógeno-hidrógeno y los dos

valores del HOMO de la urea corresponden a los pares solitarios del oxígeno.

Las cargas atómicas (32) sobre los átomos de la molécula y el momento dipolar para la

urea y guanidina protonada fueron analizados (Tabla 2) desde la perspectiva de la teoría

de OM fronteras (29). Tomando en cuenta que la interacción más favorable ocurre entre

el HOMO del donador y el LUMO del aceptar y que una base dura con valor más bajo

interacciona mas fúertemente con un ácido duro que contenga un valor también bajo

(29-30). Los vaiores calculados de la energía de orbitales fronteras y dureza absoluta,

indican una interacción electrostática más favorable H-urea que entre K-urea (Tabla 2,

figura 6). La urea tiene una dureza de 1.05 eV mas baja que guanidina (protonada)

indicando que la urea es un donador mas adecuado y más eficiente para la interacción

con los grupos R de la H y K (cargados) implicados en la catálisis ácido-base de la

ribonucleasa.

17

Tabla 11. Energías calculadas de orbitales fronteras, cargas AIM y momentos dipolares

para la urea, guanidina protonada, histidina protonada y lisina protonada a nivel RHF/6-

31G(d).

Valores Guanidina Histidina Lysina Urea

Teóricos (protonada) (protonada) (protonada)

e o.6166 e 2.2o17

Cargas de Bader o -0.8299

N0.6511 N -1.3815

H 0.4564 H 0.4893

Momento 3.5388 2.6706

dipolar (Deb)

El-loMo (eV) -11.50 -17.27 -13.23 -13.63

-12.64

ELuMo (e V) 0.93 -2.75 -3.18 -2.35

11 (eV) 6.21 7.26 5.02 5.64

La H protonada tiene una dureza de 0.62 e V mas baja que la K cargada, indicando que H

cargada es mejor áceptor que K (Tabla2). La unión electrostática entre urea y H es

estabilizada por' una interacción de tres centros (N:H:O) cuatro electrones (38). Esta

interacción de tres centros-cuatro electrones compensa parcialmente el déficit sobre el

átomo de nitrógeno cargado (generado por compatiir su par solitario con el protón) del

imidazol de H. Además, basado en la densidad de carga negativa sobre el átomo de

oxígeno y el momento dipolar tan elevado de la urea (Tabla 2) la interacción de esta

molécula con el nitrógeno protonado del imidazol de la H resulta en una condición

electrostática fuerte y estable.

18

Energía

Figura 6. Representación esquemática de la interacción de orbitales fronteras entre urea y/o guanidina protonada con H y/o L (ambas protonadas)

Desde el punto de vista de la química cuántica, estos resultados sugieren que la

guanidina protonada tiene una probabilidad más baja de disminuir la velocidad de

reacción de la ribonucleasa en comparación con la urea, debido a que la guanidina tiene

un valor del HOMO de -17.27 eV y un valor de dureza de 7.26 eV, lo que disminuiría su

capacidad para formar aductos (por interacciones HOMO/LUMO y de dureza/blandura)

con H y K protonadas (Tabla 2, figura 6). La guanidina protonada es un compuesto

iónico que tiene "comprometido" el HOMO para estabilizar su protón (cuyo pKa es

13.6) lo que d]sminuirá su capacidad de establecer interacciones favorables con

electrófilos, a diferencia de la urea que puede interaccionar con más facilidad frente a los

aa cargados.

En 1959 Kalnitsky et al. (Fig. 5) (13), compararon la actividad de la ribonucleasa en

presencia y ausencia de urea. Esto evidenció un posible efecto potenciador de la urea

sobre la actividad de la RNasa, corno consecuencia de un incremento en la liberación de

nucleótidos (13). Estos resultados están en desacuerdo con el modelo propuesto en el

presente trabajo, pues aquí se propone que la urea ejerce una inhibición de la actividad

19

de la enzima. Un análisis del trabajo de Kalnitsky et al. permite notar que el buffer

usado para medir la actividad de la enzima fue acetato (pH 5.0), cuyo pH no resulta ser

el óptimo reportado para la enzima (7.0- 7.5) por lo que es de esperar una baja actividad

de la enzima bajo estas condiciones eliminándose así la aparente contradicción con

nuestro trabajo.

En las condiciones descritas por estos autores, buffer acetato a pH 5.0 y en presencia de

urea 8 M, se pueden proponer como explicación alternativa varias hipótesis:

l. Incremento del pH: La urea presenta pares de electrones no enlazantes, tanto en

sus nitrógenos como en sus átomos de oxígeno, lo que le confiere un carácter

básico a la molécula (base de Lewis) y por ende su capacidad de aceptar protones

(base de Bronsted) incrementando el pH del medio al entrar en solución. Esto

conduce a la deprotonación de los grupos fosfatos del sustrato (pKa ~ 6.0), lo cual

en última instancia favorecerá una mayor interacción con el centro de

reconocimiento de la enzima en comparación con la solución buffer a pH 5.0.

II. Relajación del ARN: La presencia de la urea en el medio, bajo las condiciones

descritas, favorece la relajación de las cadenas del ARN (13,14) haciéndolo mas

susceptible al ataque por la enzima.

III. Incremento de la actividad enzimática: La urea, además de causar una variación

físico-química sustancial al alterar factores tales como la fuerza iónica del medio, el

L1pH, y la ruptura de estructuras secundarias del ARN, logrando ejercer un efecto

concentrador como consecuencia de su capacidad para solvatarse en medio acuoso. Esto

último incrementa la probabilidad de encuentro enzima-sustrato y por ende aumentaría

la actividad de la enzima (41).

Para someter a prueba estas hipótesis, se procedió a observar los efectos de

concentraciones crecientes de urea sobre la variación del pH en dos soluciones buffer

20

(tabla 3). Este experimento además pennitió la selección de un buffer conveniente para

medir la actividad de la RNasa A en estudios cinéticos.

Tabla 111. Variación del pH en función de concentraciones crecientes de urea en

buffer acetato y buffer MOPS

Buffer Acetato l 00 mM Buffer MOPS 100 mM [Urea]

(pH5.0) ( pH 6.5)

o 5.05 6.72

0.5 5.05 6.73

5.14 6.76

2 5.26 6.80

3 5.37 6.85

4 5.51 6.89

8 5.89 7.00

En la Tabla 3 se observa que la variación del pH en buffer acetato (0.1 M) siempre es

mayor que en el buffer MOPS (O.lM), lo que indica que el buffer MOPS tiene un efecto

de tamponamiento. superior, haciéndolo más adecuado para estudios cinéticos en

presencia de ureaque el buffer acetato.

Además, se puede notar en la tabla 3, un incremento de casi una unidad de pH (buffer

acetato) en presencia de 8M de urea, lo que apoyaría la primera y tercera de las

hipótesis, indicando esto que el incremento de la actividad de la RNasa observado por

Kalnitsky et al. (13) en presencia de urea es un artefacto generado por el incremento del

pH hacia un pH más apropiado para potenciar la actividad enzimática, debido a la

deprotonación de los fosfatos en el RNA y hacia una concentración de protones más

adecuada para la catálisis de la RNasa.

21

11. Cinética enzimática (RNasa A y RNasa I)

II.A.l Cinética de la RNasa A

Para corroborar la probable inhibición de la ribonucleasa por efecto de la urea debido a

la formación de aductos ácido-base con la enzima, se hicieron experimentos de cinética

de inhibición para así evaluar el efecto de la urea y cloruro de guanidina sobre la

velocidad inicial de la RNasa.

La figura 7 muestra la actividad de la enzima, medida como el incremento de absorción

a 290 nm en función del tiempo, en presencia de urea e hidrocloruro de guanidina. En el

tratamiento control (buffer MOPS sin urea, ni guanidina) la velocidad inicial (que

corresponde a la pendiente mas pronunciada), es mayor en comparación con la pendiente

que corresponde al tratamiento con cloruro de guanidina y significativamente mayor

que el tratamiento con urea. Es decir, la actividad de la enzima se ve más afectada en el

tratamiento con 0.5 M de urea indicando con ésto que la urea inhibe totalmente la

velocidad de reacción de la ribonucleasa, protegiendo así al ácido ribonucleico de la

degradación. Por otro lado la velocidad inicial de la RNasa en el tratamiento con cloruro

de guanidina está dentro del mismo orden de magnitud al compararlo con el experimento

control, lo que sugiere que la velocidad de la enzima en presencia de cloruro de

guanidina, bajo estas condiciones, no es inhibida de manera significativa (figura 7)

0.06 ·¡ y = 0,0002x + 0,0072

0 ,04

... . 0,03

y = 1E-04x + 0,002

... . . . . . .. . 0,01 - • - •

~ 6E-22x + 0.0003 0,00

o 50 10 15 20 250 300

.o. Abs (290) C

- - - Lineal (Abs 290 C)

o o

* Abs (290) u

• Abs (290) G

Tiempo (s)

--Lineal (Abs 290 G) --Lineal (Abs 290 U]

Figura 7. Cinética de inhibición de la RNasa medida como incremento de la absorción a 290 nm. La comparación cinética de la ribonucleasa en presencia de 0.5 M de urea (rojo) y 0.5 M de cloruro de guanidina (azul), muestra el efecto inhibitorio tan significativo que ejerce la urea cuando se compara con el control (líneas negras).

22

Bajo nuestras condiciones experimentales, la inhibición de la enzima por urea no es

debida a un efecto desnaturalizante de este reactivo, ya que el mismo ejerce dicho efecto

a concentraciones mayores de 2M (16, 42-50). El cambio apreciable de la velocidad

inicial de la enzima a la concentración usada de urea (0.5M) puede ser explicada por el

efecto inhibidor de este compuesto sobre la RNasa A. Además, la guanidina no ejerce

un efecto de inhibición sobre la velocidad inicial, tan significativo como el de la urea. La

velocidad de degradación del ARN en presencia de guanidina fue ligeramente más baja

que el control, disminuyendo aproximadamente a la mitad la velocidad inicial de

degradación; por lo tanto, la guanidina no ejerce una completa inhibición sobre la

catálisis de la RNasa.

En paralelo se llevaron a cabo las mediciones a 260 nm y 280 nm [las longitudes de

onda utilizadas en los métodos de Kalnitsky et al. (13) y Shultz et al. (36)] para

comparar y obtener la longitud de onda óptima para la actividad de la RNasa.

0 .20 l

0 .16

A 280 0 .12

0.08

O.O.J

0.00

o

V = O.OOO.Jx + 0 .0828 ...... .

.. • .... .. .. v = 0 .0002x + 0.0226

50 100 150 200 250

A Abs (280) C x Abs (280) U • Abs (280) G

300

Tiempo (s)

- - - · Lineal(Abs 280 C) --Lineal(Abs 280 G) --Lineal(Abs 280 U)

Figura 8. Cinética de inhibición de la RNasa medida como incremento de la absorción a 280 nm. Al comparar la cinética de la ribonucleasa en presencia de 0.5 M de urea (rojo) y 0.5 M de cloruro de guanidina (azul) con el control (punteada), medidas a una longitud de onda de 280 nm, muestra un efecto inhibitorio en la velocidad de reacción.

23

0 .800

y = 0 ,0005x + 0,4918

0 .6 00 L_--.,.----=-----.±.----· 0, 4 00 -

y = 0 ,0004x + 0 ,1922 . - - .. - - - - - - ... -. o. zoo L- .:_- .:_- ...::.- ...::.-_::-_::·;:~~-~-~-:__-:__·_- 2-x _- -- -- -----x--~~=-=

y 0 ,0003x + 0 , 16 0 2

0.000 -4----~--~---~--~---~-~

o 50 100 150

.o. Abs (260) C x Abs (2 6 0 )U

2 00 250

+ Abs (260) G

3 00

Tiempo (s)

--Lin eal (Ab s (2 60) G) - - - ·Lineal (Ab s (260 ) C) --Lineal (Abs (26 0) U)

Figura 9. Cinética de inhibición de la RNasa medida como incremento de la absorción a 260 nm. La compararación cinética de la ribonucleasa en presencia de 0.5 M de urea (rojo) y 0.5 M de cloruro de guanidina (azul) con el control (punteada), medida a una longitud de onda de 260 nm, no muestra un efecto inhibitorio significativo en la velocidad de reacción en presencia de los agentes inactivantes. El valor inicial de absorbancia para el caso del clorhidrato de guanidina sugiere que a tiempo cero el ARN ya esta siendo degradado

En las figura 8 y 9, se puede observar que las velocidades iniciales de degradación del

ARN por la RNasa A, en presencia de urea y guanidina a 280 nm y 260 nm

respectivamente, no presentaron variaciones apreciables. Para el caso de la cinética

medida a una absorbancia de 260 nm las velocidades iniciales del tratamiento control, el

de urea y el de guanidina son similares. La diferencia radica en que la absorbancia

inicial (corte con el eje Y) en el tratamiento con guanidina es dos veces mayor, por lo

que parecería que en presencia de guanidina hay una mayor degradación del ARN,

mientras que las velocidades iniciales, cuantificadas a 280 nm, en presencia de urea y

guanidina, son idénticas, pero se observa una inhibición de la actividad enzimática

(50%) en presencia de ambos agentes inactivantes. Los resultados medidos a 280 nm y

260 nm resultaron contradictorios entre sí (en un caso hay inhibición y en el otro no hay

inhibición por parte de la urea y la guanidina), lo que nos sugirió que las longitudes de

onda a 260 nm y 280 nm (en las condiciones experimentales utilizadas) no son las más

adecuadas para llevar a cabo estudios cinéticos de inhibición de la RNasa. El resultado

de la cinética cuantificada a 290 nm (Fig 7) mostró una diferencia más notoria en la

cinética de inhibición de ambos nucleófilos. Es decir, ambos agentes químicos inhiben la

enzima, pero la inhibición con urea resultó ser total a una concentración de 0.5 M. Por

otra parte, la guanidina solo inhibió el 50% de la actividad de la RNasa, a esa misma

24

concentración, por lo que el ARN resulta ser más degradado en presencia de este agente

caotrópico.

Estas evidencias experimentales se pueden interpretar de dos maneras:

1) Estas dos últimas longitudes de onda (260 y 280 nm) no son las adecuadas para

cuantificar la cantidad de nucleótidos liberados bajo las condiciones

experimentales usadas

2) Que son las adecuadas y que a una absorbancia de 290 nm, la inhibición

observada sea producto de un artefacto generado por el método a esa longitud de

onda.

II.A.2 Determinación de Absorbancia óptima de nucleótidos fosforilados

Para tratar de validar una de estas alternativas y descartar la otra, se llevó a cabo la

detem1inación de la longitud de onda óptima para la cuantificación de los nucleótidos

liberados bajo las condiciones experimentales usadas con la ayuda del factor GQ.

Para verificar los resultados obtenidos en cada uno de los gráficos (figuras 7, 8 y 9) se

prepararon dos muestras (12 repeticiones/muestra) y se les midió la absorbancia a

distintas longitudes de onda (ver metodología II.A.2)

Tabla IV. Valores de GQ y absorbancias de los dNTPs a longitudes de ondas

distintas en bu~fer MOPS en presencia y ausencia de TCA

Solución A760 A2so A29ü

Inicial 2.582 ± 0.065 1.537 ± 0.096 0.475 ± 0.031

Final 1.126 ± 0.009 1.954 ± 0.1065 1.139 ± 0.072

GQ 1,456 -0.4517 -0.664

En la tabla 4 se puede notar que los valores de GQ se hacen más pequeños a medida que

se incrementa la longitud de onda en las muestras. Los resultados de los valores

25

obtenidos del factor GQ sugieren que debemos esperar diferencias de pendientes más

significativas a una longitud de onda de 290 nm entre las cinéticas obtenidas.

Al comparar los valores de GQ con las pendiente de las gráficas obtenidas en las figuras

7, 8 y 9, se puede notar una correlación entre las diferencias de los valores de las

pendientes a una longitud de onda determinada y el valor correspondiente del factor

calculado para esa longitud de onda (según la definición establecida para dicho factor);

es decir, que para una longitud de onda determinada si el valor de GQ es negativo y

cercano a cero la diferencia de las pendientes obtenidas será mas apreciable. Esta

correlación observada entre ambas variables (m y GQ) valida los resultados cinéticos

alcanzados a 290 nm, indicando no sólo que esta longitud de onda es la mas adecuada

para medir la actividad de la enzima bajo las condiciones experimentales usadas, sino

que también nos da más confianza para apoyar el modelo de inhibición por urea sobre la

RNasa propuesto en el presente trabajo.

II.B Cinética de la RNasa 1

La ribonucleasa I fue descrita como una endorribonucleasa periplásmica de 27 kDa,

presente en E. coli (51). En esta enzima también se llevó a cabo un estudio cinético en

presencia y ausencia de urea y cloruro de guanidina obteniéndose los siguientes

resultados:

y = 0.0749x + 0 .0138

2.5 3,5 4 4,5

• 1UE • 0,5UE .A. Guanidina • Urea - Lineal (lUE) - Lineal {0.5UE)

Figura 10. Cinética de inhibición de la RNasa 1 seguida por incremento de la absorción a 290 nm. La comparación cinética de la ribonucleasa 1 en presencia de 0.5 M de urea (líneas rojas) y 0.5 M de cloruro de guanidina (líneas azules punteadas), muestra el efecto inhibitorio absoluto que ejerce la urea y el cloruro de guanidina cuando se compara con la actividad de la enzima a 0.5 y 1 unidad de enzima (línea verde y morado respectivamente).

26

En la figura 1 O, se muestra el efecto de inhibición absoluto que presentan la urea y el

cloruro de guanidina sobre la actividad de otra ribonucleasa. Aunque se conozca muy

poco de esta enzima, toda ribonucleasa debería tener en su estructura nativa, un canal de

residuos cargados de K y R ("centro o región de acoplamiento" con el sustrato) que le

pennita el reconocimiento de las cargas complementarias de los grupos fosfatos y un

centro catalítico cuyos residuos involucrados en la catálisis sean principalmente residuos

básicos cargados. Por esta razón no es de sorprender la inhibición absoluta observada

frente a urea y guanidina 0.5 M aunque se necesitaría un estudio más detallado desde el

punto de vista estructural (análisis de dicroísmo circular, RMN y difracción de rayos X)

para entender mejor el efecto inhibitorio de estos compuestos sobre la actividad de las

ribonucleasas y sobre todo de la RNasa I.

IIJ.A Sistema de purificación de ARN en base a urea

Con base en los resultados de inhibición de la RNasa, se diseñó un sistema de

purificación con urea que generó resultados significativamente más eficientes en cuanto

a cantidad de ARN total/ peso de tejido fresco de los cultivares de cacao, al compararlo

con el método basado en cloruro de guanidina.

En la tabla V se pueden observar los rendimientos obtenidos con cada uno de los

métodos, lograndose apreciar una diferencia de un orden de magnitud sobre el método

de cloruro de guanidina, en los rendimientos obtenidos con el método de la urea aplicado

a cacao. Sin embargo, no se observaron diferencias considerables en cuanto a pureza

(basándose en las·relaciones 260/280) en cada una de las muestras.

El alto rendimiento en ARN total purificado con el método de urea en comparación con

el de cloruro de guanidina es consecuencia del efecto perturbador que la urea ejerce

sobre la velocidad de degradación del ARN durante la extracción. Este efecto fue

evidenciado en los experimentos de cinética enzimática en presencia de urea. Los

resultados observados en la tabla V (en cuanto a rendimiento) podrían explicarse además

por la cualidad que presenta la urea no solo por inhibir la RNasa, sino también por su

capacidad para relajar las poblaciones de ARN total compactados (lo que puede

incrementar el rendimiento en ARN total de la muestra durante la extracción).

27

Tabla V. Rendimiento de ARN total extraído a partir de embriones de cacao usando

dos métodos de aislamiento

Método de cloruro de Tipo de Método de urea Relación

tejido guanidina (¡..tg/g peso

(¡..tg/g peso fresco) 260/280 fresco)

cultivar I 36.5 ± 4 403 ± 10 1.5 ± 0.1

(cacao)

cultivar II 48.7 ± 4 500 ± 10 1.5 ± 0.1

(cacao)

Probablemente cuando el buffer con cloruro de guanidina es mezclado con los tejidos la

RNasa, independientemente del tejido que se esté utilizando, no es totalmente inhibida

(como ocmTe en la cinética de inhibición de la RNasa A en presencia de guanidina) lo

que permite que bajo estas condiciones la enzima degrade parte del sustrato en la fase

inicial de la purificación, incrementando la cantidad de ARN hidrolizado; ésto a su vez

disminuye el rendimiento del sistema empleado. Por el contrario, la urea, al entrar en

contacto con los tejidos relajaría los agregados de las poblaciones de ARN total

[incluyendo ribozimas que tienen la capacidad de degradar ARN de bajo peso molecular

(52)] que se fom1an en solución acuosa y permitirá una menor pérdida del ARN durante

la extracción, al momento de sacrificar pequeñas cantidades de fase acuosa en la

interfase de separación. Además, la urea podría reaccionar con los aminoácidos cargados

(K66, K7, RlO y R85) en el sitio de reconocimiento de la enzima (subsitios P-1, PO y

P2) con los aa involucrados en la catálisis [subsitio Pl (H12, H119, y K41)] y con los aa

involucrados en la especificidad de la catálisis (subsitios B), además de su efecto

desnaturalizante sobre cualquier RNasa que procese a su sustrato de acuerdo a este

modelo catalítico conocido. Todos estos factores provocan la pérdida de actividad de la

enzima y como consecuencia, mayor será la cantidad de ARN total no hidrolizado

generando altos rendimientos en la purificación de ARN con urea.

28

Para corroborar la reproducibilidad de la metodología diseñada con urea y guanidina

para las extracciones del ARN total, los métodos de purificación se repitieron al menos

40 veces; además se probó el sistema de purificación con urea en otros tejidos vegetales

como lo fueron dos cultivares de lechosa y también se usó hígado de rata como fuente de

tejido animal (tabla 6) arrojando resultados satisfactorios por el alto rendimiento y

pureza del ARN aislado.

Tabla VI. Rendimiento y relación de absorbancia de muestras de ARN total purificado

a partir de hojas de lechosa e hígado de rata por el método de urea.

Rendimiento (metodo de urea) Tipo de tejido Ratio 260/280

f.Lg/g peso fresco

Lechosa I 480 ± 10 1.9 ± 0.1

Lechosa II 485 ± 10 1.9 ± 0.1

Hígado de rata 508 ± 10 1.9 ± 0.1

Se puede notar en la tabla 6 que el sistema de purificación diseñado con urea, además de

ser muy efectivo para la extracción de poblaciones de ARN total de otros tejidos, la

relación de absorbancias (A26o 1 A280) tanto para el tejido vegetal (hojas de lechosa)

como para el tejido animal (hígado de rata) es aproximadamente dos, lo que indica que

la preparación extraída esta libre de polisacáridos, proteínas y polifenoles (52) a

diferencia de las muestras de cacao que tienen una relación de absorbancias (A260 1 A280)

más baja, probablemente por que los embriones de cacao poseen mayor cantidad de

polisacáridos y polifenoles.

La integridad del ARN total aislado de todas las muestras usadas fue corroborada por la

aparición de dos bandas de ARN ribosomal (ARNr). La Figura 11 muestra las dos

bandas ribosomales a 3.7 Kb y 1.9 Kb (comparando con la escalera de peso molecular

de ARN) que corresponden a los coeficientes de sedimentación 25S y 18S

respectivamente para los tejidos vegetales (pozos 1, 2, 3, 4, 6, 7) y 4. 7 y 1.9 que

corresponde a 28S y 18S para el tejido animal (pozo 5). Las muestras extraídas con

cloruro de guanidina presentaron una fluorescencia apreciable a lo largo de la corrida,

29

probablemente, como consecuencia de compuestos que coprecipitaron con la muestra y

de ADN de alto peso molecular (en la parte superior de los canales) como se observa en

los pozos (canales 1 y 2); esta fluorescencia no se logra apreciar en las muestras

purificadas usando el método con urea, canales 3-8 .

2 3 4 5 6 7 8

Figura 11 . ElectToforesis en gel de agarosa del ARN total aislado por dos métodos diferentes. a, método con hidrocloruro de guanidina; líneas 1 y 2, 20 p.g de ARN total de embriones de cacao (cultivares I y II respectivamente). b y e, método de extracción con urea, línea 3 y 4, 10 p.g de ARN total de embriones de cacao (cultivares I y II respectivamente), línea 5, 20 p.g de ARN total de hígado de rata; líneas 6 y 7, 20 ¡J,g de ARN total de hojas de lechosa (cultivares I y Il respectivamente) ; línea 8, marcadores de peso molecular de ARN.

III.B RT_PCR a partir de muestras de ARN total extraídas

Para chequear la calidad de la población del ARN total aislado de los diferentes tejidos

purificados con el método de urea, se llevo acabo un RT-PCR usando cebadores para el

gen de la ¡3-actina. La figura 12 muestra los productos amplificados a partir de las

reacciones de RT.::PcR de las !'nuestras de ARN total de lechosa (hojas) de dos cultivares

de procedencias distintas, de dos cultivares distintos de cacao y de hígado de rata. Los

fragmentos de cDNA resultantes fueron de aproximadamente 285 pb tal y como se

esperaba según el disefío de los cebadores, mientras que las dos bandas presentes en

canales 4 y 5 (figura 12) son características cuando se amplifica el gen de ¡3-actina en

lechosa (53). Estos resultados indican que el sistema de purificación diseñado usando

urea es eficiente para purificar ARN total de alta calidad (no degradado), tanto para

tejidos vegetales como animales.

30

Figura 12. Productos amplificados por RT-PCR del gen de ¡3-actina, a partir de ARN total aislado por el método de urea de diferentes tejidos (se cargaron en cada pozo 1 O J,LL del producto amplificado). El cDNA de primera cadena fue sintetizado a partir de 1 ¡,Lg del ARN total aislado de cada muestra. Línea 1, marcadores de peso molecular de ADN ; 1 ínea 2, control negativo; línea 3, hígado de rata; líneas 4 y 5, Lechosa (cultivar 1 y Il) respectivamente; líneas 6 y 7, cacao (cultivar I y II) respectivamente; línea 8, marcadores de peso molecular de ADN

Este trabajo es probablemente el primer repo1ie que propone una explicación con base a

enzimología y química cuántica del mecanismo de acción de la urea como agente

inactivante sobre la 1ibonucleasa, la cual usualmente se limita solamente a los efectos

caotrópicos del compuesto sobre el plegamiento de la enzima (16, 31-32). La literatura

menciona numerosos repmies de la urea como agente desnatura1izante (17, 31 - 38),

pero no se h~n hecho estudios previos a este trabajo sobre la reactividad de esta

molécula a nivel de una interacción donador-aceptor con aa protonados de la enzima

implicados en el reconocii11iento del ARN, en la hidrólisis (39,40) y su impacto directo

en sistemas de plirificación dé ARN total. Este trabajo tiene aplicaciones inmediatas en

las extracciones de ácido ribonucleico para estudios genómicos, de expresión y

regulación génica. Además el método basado en urea tiene un beneficio adicional por ser

un sistema de purificación económico si se compara con el de cloruro de guanidina.

La metodología que se utilizó en este trabajo (estudios químicos-teóricos antes de

realizar experimentos de cinética enzimática y purificación del ARN) permitió hacer un

ensayo más metódico y racional de planificación, para la elaboración de estudios de

inhibición y purificación.

31

Conclusiones

l. Hasta ahora, siempre se había considerado la urea como un agente

desnaturalizante de proteínas, sin embargo los resultados de los estudios

cinéticos con la RNasa A, bajo nuestras condiciones experimentales indican

que la urea actúa también como un inhibidor absoluto de la actividad de la

enzima a concentraciones de 0.5 M.

2. Con la visión cuántica de la teoría de orbitales moleculares fronteras, el

prmc1p10 acido-base de dureza-blandura de Pearson y cálculos

computacionales realizados con la ayuda del grupo de programas Gaussian

98, se pudo comparar la reactividad de la urea y el cloruro de guanidina

frente a aa claves presentes tanto en el sitio de reconocimiento como en el

centro catalítico de la ribonucleasa. Estos resultados junto con las evidencias

de cinética de inhibición enzimática nos permitieron plantear un mecanismo

de inhibición por parte de la urea sobre la RNasa A hasta ahora desconocido.

3. Bajo las condiciones experimentales optimizadas, en este trabajo, se puede

medir eficientemente la actividad de la RNasa A bovina con la ayuda del

factor GQ. Este factor permitió observar diferencias significativas entre las

pendientes resultantes, al realizar cinéticas de inhibición en las que se tenga

que modificar químicamente el solvente para detener la reacción.

4. El cloruro de guanidina comúnmente usado durante las extracciones del ácido

ribonucleko resultó tener un efecto inhibidor significativamente más bajo que

la urea ·sobre la ribonucleasa A bovina. Sin embargo frente a la RNasa I de E.

coli presento un efecto perturbador tan potente como el de la urea.

5. Se diseñó un sistema de purificación de ARN total en base a urea y resultó ser

aproximadamente 1 O veces más eficiente (para cultivares de cacao) en cuanto

a rendimiento en comparación con su equivalente de cloruro de guanidina.

Además este sistema con urea resultó ser eficaz para extracciones del ácido

ribonucleico de otros dos tejidos vegetales y un tejido animal.

32

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