ALT SOLUNUM YOLUNDA ALT SOLUNUM YOLUNDA HASTALIK YAPAN VİRÜSLERHASTALIK YAPAN VİRÜSLER

Araş.Gör.Dr.Oya AKKAYA Araş.Gör.Dr.Oya AKKAYA Prof.Dr.Bülent BAYSALProf.Dr.Bülent BAYSAL

RSVRSV

• Paramyxoviridea ailesinden tek zincirli ve zarflı bir virüstür.• Hemaglütinin ve nöraminidaz aktivitesi yoktur• Dünyada infant ve küçük çocuklarda bronşiolit ve pnömoninin

en yaygın sebebidir.• Prematüre infantlar, küçük bebekler, immunkompromize

kişiler ve yaşlılar ciddi RSV infeksiyonu için yüksek risk grubunu oluştururlar

• İmmünitesi baskılanmış ve özellikle kemik iliği transplantasyonu yapılan hastalarda ağır pnömoniler yapar

• İnfeksiyon kontamine eller ve eşyalarla ya da direkt olarak damlacık infeksiyonu yoluyla bulaşır

İNFLUENZA VİRÜSLERİİNFLUENZA VİRÜSLERİ

• Orthomyxoviridae ailesinin üyesidir• Zarflı, tek zincirli, parçalı genomlu RNA virüsleridir• Matriks proteini ve nükleokapsid proteini gibi 2 ayrı yapısal

proteindeki antijenik farklılıklara göre influenzavirüs A-B-C diye 3 farklı gruba ayrılır

• Hemaglütinin ve nöraminidaz aktiviteleri vardır• Hemaglütinin hücreye yapışmada önemlidir

• Virüsü nötralize edici antikorlar bu antijene karşı gelişir• Nöraminidaz ise virüsün infekte hücreden salınımında

önemlidir ve infeksiyonu ilerletir

.

• Antijenik drift, HA’inin distal membran kısmında bulunan, A’ dan E’ ye kadar olan antijenik bölgelerindeki aminoasitlerde bir seri nokta mutasyonun birikmesiyle meydana gelir.– Bu değişiklikler, önceki infeksiyonlarla oluşturulan

antikorların bağlanmasını engeller ve virus konağı infekte eder. Antijenik drift, İnfluenza virusların NA’larında da meydana gelir ve aminoasit sekanslarında farklılığa yol açar.

• Antijenik drift varyantları, pandemi aralarında meydana gelen dönemsel epidemilerden sorumludur. Bu şekilde iki-beş yıllık aralıklarla ortaya çıkan ve baskın hale geçen İnfluenza A ve B virus antijenik varyantları, insanlarda grip salgınlarına neden olur

• Antijenik şift, sadece İnfluenza A viruslarında meydana gelir ve daha büyük antijenik değişikliklere neden olur

• Antijenik şift, önceden dolaşımda bulunan izolatlardan immünolojik olarak farklı olan ve yeni bir HA’e ya da HA ile NA’a sahip yeni bir alttip İnfluenza virusunun, insan populasyonunda görülmesidir

• Antijenik şiftler, düzensiz olarak ve önceden saptanamayan

aralıklarla meydana gelen pandemilerden sorumludur

• Pandemi birkaç kıtada görülür ve yaş gruplarının çoğunu etkiler.

• Uzmanlar geçen yüzyılda, en azından üç gerçek grip pandemisi olduğu konusunda hem fikirdirler;– 1918 İspanya gribi (A/H1N1)– 1957 Asya gribi (A/H2N2) – 1968 Hong Kong gribi (A/H3N2)

PARAİNFLUENZA VİRÜSLER PARAİNFLUENZA VİRÜSLER

• Paramyxoviridae ailesinin üyesidirler• Tümü tek iplikli, negatif polariteli, segmentsiz RNA

virüsleridir. 6 yapısal proteini vardır: – Yüzey glikoproteinleri olan hemaglütinin nöraminidaz – füzyon (F)proteini, – fosfoprotein(P), – nükleokapsid proteini(N),– L proteini, – membran proteini(M)

• Parainfluenza 1-2-3 genellikle üst solunum yolunda kalırlar ve soğuk algınlığı benzeri semptomlara neden olurlar

• Vakaların %25’i alt solunum yoluna yayılır ve laringotrakeobronşit ve pnömoni şeklinde devam edebilir

• Primer infeksiyon 5 yaşın altında, reinfeksiyon ise yaşam boyu oluşabilir

• Bebeklerde infeksiyon daha ciddidir

HUMAN METAPNOMOVİRÜS(hMPVHUMAN METAPNOMOVİRÜS(hMPV)

• Paramyxoviridae ailesinin üyesidirler• Zarflı, tek iplikli ve segmentsiz RNA virüsüdür• Hücre kültüründe üreme güçlükleri sebebiyle son dönemlere

kadar bilinmeyen bir virüstür• hMPV salgınları, kışın geç dönemi ve ilkbaharın erken dönemi

boyunca görülür• 5 yaş altındaki çocukların hemen hepsi bu virüs infeksiyonunu

geçirmiştir• Hafif soğuk algınlığından ciddi pnömoni ve bronşiyolite kadar

uzanan klinik tablolara sebep olur• Seronegatif çocuklar, yaşlı ve immun sistemi baskılanmış

bireyler bu hastalık için risk altındadır

KORONAVİRÜSLERKORONAVİRÜSLER

• Coronaviridae ailesinin bir üyesidirler

• En uzun RNA genomuna sahip zarflı virüslerdir

• Soğuk algınlığının rinovirüsten sonra en sık 2. etkenidir.

• İnsanlarda enfeksiyon oluşturan beş koronavirüs türü vardır:– OC43, 229E, SARS-Coronavirüs, NL63 ve HKU1

• 2002’de Güney Çin’de ortaya çıkan ağır akut solunum yetmezliği sendromunun (SARS) sorumlusu olan virüstür

• Çocuk ve erişkinlerde gastroenterit yaptığı da gösterilmiştir

• İnfeksiyon üst solunum yollarında sınırlı kalır çünkü viral üreme için optimum ısı 33-35 derecedir

ADENOVİRÜSLERADENOVİRÜSLER

• Adenoviridae ailesinin bir üyesidirler.• Zarfsız, ikosahedral , DNA virüsleridir• Kapsid yapısal olarak hekzon, penton ve fiberlerden oluşur. • Penton bazlı kapsomerlerden, uçlarında topuz şeklinde

oluşumlar bulunan fiber adı verilen ipliksi yapılar çıkar• Fiber virüsün konak hücreye tutunmasından ve

hemaglütinasyondan sorumludur• Hekzonlar, pentonlar ve fiberler virüsün sınıflandırılmasında

ve hastalığın tanısında önemli olan majör adenovirüs antijenlerini oluştururlar.

• Günümüzde adenovirüslerin en az 47 farklı serotipi bilinmektedir

• Adenovirüsler genom homolojisi temel alınarak altı gruba(A-B-C-D-E-F) ayrılmıştır. Belirli serotipler özel doku tropizmi gösterir ve spesifik hastalık tabloları oluşturur– Grup A en yüksek onkojenite gösteren adenovirüstür– Pediyatrik solunum yolu hastalıklarının %5-10’u tip 1,2,5 ve 6

tarafından oluşturulur

• En sık sebep olduğu hastalıklar; solunum yolu infeksiyonları, konjonktivit, meningoensefalit, hemorajik sistit ve gastroenteritlerdir

• Adenovirüslerin yaptığı konjonktivit, foliküler konjonktivittir

• Bu tür konjonktivitler sporadik olarak veya salgınlar şeklinde görülebilir

• Epidemik keratokonjonktivit yapabilir

• Adenovirüsler akut gastroenteritlerin en önemli nedenidirler. Bu klinik tablodan serotip 40 ve 42 enterik adenovirüsler sorumludurlar

RİNOVİRÜSLERRİNOVİRÜSLER

• Picornaviridae ailesinde yer alan zarfsız ve tek zincirli bir virüstür

• Yaklaşık 100 serotipi vardır• Replikasyonu burunda olduğundan ve burunla ilgili

semptomlar yaptığından rinovirüs adını almıştır• ICAM-1 olarak bilinen hücrelerarası adezyon molekülü

reseptörlerine bağlanır• Nezle (soğuk algınlığı) etkenidir

• Eylül ayında pik yapar, baharın sonunda 2. pikini yapar

• Tüm nezle olgularının % 50’sinden sorumludur

• Yaşlılarda, kronik hastalığı oanlarda, yenidoğanlarda, immunsupressiflerde alt solunum yolu hastalıkları da yapabilir

• Solunum salgılarının eller vasıtasıyla bulaşı en çok gözlenen bulaş yoludur

• Ciddi astım alevlenmeleriyle ilgilidir

BULAŞ VE KLİNİK TABLO

• Solunum yolu virüslerinin hemen hepsinde infeksiyonun kaynağı insandır

• Geniş partiküllü aerosolleri içeren kontamine sekresyonlar veya kontamine yüzeylerle direk veya yakın temasla ortaya çıkar

• Hemen hepsi soğuk algınlığı, trakeit, krup, bronşit, bronşiolit, ve pnömoni yapabilir

VİRAL PNÖMONİLERVİRAL PNÖMONİLER

• Viral pnömoniler bütün yıl boyunca görülebilmelerine karşın özellikle kış aylarında daha sıktır.

• Tüm yaş gruplarını etkileyebilir, ancak çocuklarda erişkinlerden daha sık görülür.

• Kapalı ortamda yaşayan topluluklarda (kışla, okul, vb.) daha sık ortaya çıkar.

• Özellikle çocuklarda ve yaşlı kişilerde, bağışıklığı baskılanmış hastalarda şiddetli hastalık ve ölüme neden olabilir, altta yatan kronik akciğer hastalığı bulunan kişilerde solunum yetmezliğine yol açabilir.– Bu durum viral infeksiyonun solunum sisteminin savunma

mekanizmalarını etkileyerek bakteriyel infeksiyon için uygun zemin yaratmasına bağlıdır. Böylece viral -bakteriyel etkenlerin birlikte görüldüğü infeksiyonlar sıktır.

• Viral etkenlere bağlı pnömoniler, – yenidoğan ve çocuklarda, – bağışıklığı baskılanmış hastalarda sık görülürken erişkinlerde daha

nadirdir

• Altta yatan kronik kardiyak veya pulmoner hastalığı olanlarda daha sıktır

• Çocuk hastalarda Respiratuar sinsityal virüs (RSV), Rinovirüs, Parainfluenza virüs, influenza virüs A ve B ve Adenovirüs etkendir.

Erişkin hastalarda ; • adenovirüs, • parainfluenza virüs, • RSV ve • herpes virüsler etkendir

Bağışıklığı baskılanmış hastalarda ise ;• RSV• CMV(sitomegalovirüs)• VZV(varisella-zoster virüs)• HSV(herpes simpleks virüs)• kızamık virüsü ve • adenovirüs etkendir.

Multiplex PCR kiti olan Seeplex RV12’de bulunan virüsler

Human metapneumovirüs Human adenovirüs Human coronavirüs 229E/NL63 Human coronavirüs OC43/HKU1 Human parainfluenza virüs 1-2-3 Human rhinovirüs A/B Human Respiratory syncytial virüs A-B Influenza A-B virüs

PCRPCR• İlk kez 1983-1985'de Dr.Kary B.Mullis

tarafından bilim dünyasına sunulduğundan itibaren hem araştırmada hem de klinik laboratuvarlarda tanıda yeni bir çığır açmıştır.

• Bu buluşundan dolayı K.Mullis, 1993 yılı Nobel Kimya Ödülüne hak kazanmıştır

• ABD'de Cetus Corporation'da çalışan; Henry A. Erlich, Dr.Kary B.Mullis ve Randall K. Saiki tarafından geliştirilmiştir– samanlıkta iğne aramak yerine samanlığı iğnelerin samanlıkta iğne aramak yerine samanlığı iğnelerin

çoğunlukta olduğu bir hale getirmektirçoğunlukta olduğu bir hale getirmektir”

• DNA içerisinde yer alan, dizisi bilinen iki segment arasındaki özgün bir bölgeyi in vitro koşullarda amplifiye etmek için uygulanan tepkimelere verilen ortak bir isimdir

• Metod basitçe tüpte nükleik asitlerin uygun koşullarda çoğaltılmasıdır

• Bir çeşit "in vitro klonlama"dır

• Her adımı farklı ısılarda gerçekleşen üç basamaktan oluşur:– Denatürasyon (90-95 C)– Primer bağlanması (50-70 C)– DNA sentezi(70-75 C)

• Bu 3 adım bir PCR siklusunu oluşturur ve bu siklusların belirli sayıda tekrarlanması esasına

dayanır.

• Her ürün bir sonraki aşamada oluşacak bağlanma ve uzamalarda kalıp olarak kullanılır

• Tüm işlemler thermal cycler denilen cihazda gerçekleşir

• İdeali 20 siklus sonunda 106 katlık amplifikasyona ulaşma – ve 30 siklus sonunda 109 katlık amplifikasyon oluşmasıdır

Her Bir Isı Döngüsünde Oluşan Kopya Sayısı

0Döngü

Sayı1

3

8

2

4

1

2

4

16

5

32

6

64

• P: Ürün (Product)• n: Siklus sayısı• T: Başlangıçtaki DNA sayısı(Template)

• P = (2)n T• PCR ürünü başlangıçtaki DNA sayısına bağlıdır

• Yöntemin temeli, çoğaltılmak istenen bölgenin iki ucuna özgü, bu bölgedeki baz dizilerine tamlayıcı bir çift sentetik oligonükleotid primer (18-20 baz uzunluğunda) kullanılarak; bu iki primer ile sınırlandırılan genin enzimatik olarak sentezlenmesine dayanır

Teknolojisi için: • DNA örneği, genelde genomik DNA

• Çoğaltılacak olan bölgeyi sağdan ve soldan çevreleyen bir çift sentetik primer

• dNTP 'ler (A,T,C,G)

• Isıya dayanıklı DNA-Polimeraz enzimi,

• Uygun pH ve iyon koşullarını (Mg+2) sağlayan tampon karışımı gereklidir.

PCR KULLANIM ALANLARI

1. Kalıtsal hastalıklarda taşıyıcının ve hastanın tanısı1. Kalıtsal hastalıklarda taşıyıcının ve hastanın tanısı 2. Prenatal tanıda2. Prenatal tanıda 3. Klinik örneklerde patojen organizmaların saptanması3. Klinik örneklerde patojen organizmaların saptanması 4. Adli tıpta4. Adli tıpta 5. Onkogenesisin araştırılmasında5. Onkogenesisin araştırılmasında 6. Probe'ların olusturulmasında/klonlamada/gen expresyon araştırmalarında6. Probe'ların olusturulmasında/klonlamada/gen expresyon araştırmalarında 7. DNA dizi analizinde, büyük miktarda DNA örneklerinin oluşturulmasında7. DNA dizi analizinde, büyük miktarda DNA örneklerinin oluşturulmasında 8. Bilinmeyen dizilerin tayininde8. Bilinmeyen dizilerin tayininde 9. Geçmis DNA'nın incelenmesi ve evrimin aydınlanmasında9. Geçmis DNA'nın incelenmesi ve evrimin aydınlanmasında10. Invitro fertilizasyon yapılan tek hücrede, implantasyon öncesi genetik 10. Invitro fertilizasyon yapılan tek hücrede, implantasyon öncesi genetik

testlerin yapılması ve sonra implantasyon gerçeklestirilmesi ile bebeğin testlerin yapılması ve sonra implantasyon gerçeklestirilmesi ile bebeğin normal doğmasının sağlanmasınormal doğmasının sağlanması

PCR ÇEŞİTLERİPCR ÇEŞİTLERİ

• Real-time PCR• Touchdown PCR• Hot Start PCR• Multiplex PCR• Nested PCR• Kısmi Nested PCR• Revers Transkriptaz PCR

REAL-TİME PCRREAL-TİME PCR• Hedefin amplifikasyonu ve tesbiti aynı tüpte eş zamanlı olarak

oluşmaktadır• Bu sistem floresans oluşumunu monitörize eden, belli optikleri

olan özel thermal cycler cihazı gerektirmektedir• Bilgisayarlar herbir reaksiyon ve siklusta oluşan

amplifikasyonu gözlemleyen bir yazılım ile desteklenmektedir• Real-time PCR bizi klasik PCR sonrası yapılması zorunlu jel

elektroforez gibi diğer değerlendirme çalışmalarından da kurtarır

• Real-time PCR sisteminin temelini floresan taşıyıcı moleküllerinin ışınımlarının tespiti ve miktarının belirlenmesi oluşturur.– Sinyal artışı PCR ürün artışıyla direkt orantılıdır

ÇOKLU (MULTİPLEKS) PCRÇOKLU (MULTİPLEKS) PCR

• Bir PCR ile birden fazla hedef dizinin aynı reaksiyonda birlikte çoğaltılması çoklu (multipleks) PCR olarak adlandırılır

• Burada 2 veya daha fazla primer çifti farklı hedefleri amplifiye etmek için aynı reaksiyon karışımında bulunur

• Bu reaksiyonda seçilen primerlerin aynı yapışma ısısına sahip olması ve dikkatli bir biçimde seçilmesi gerekmektedir

• Multipleks PCR yöntemi, tek primer setli PCR yöntemine göre daha karmaşıktır ve duyarlılığı daha azdır– Özellikle santral sinir sistemi ve solunum sistemi patojenlerini tespit

etmek için birçok multipleks PCR yöntemi geliştirilmiştir

Multiplex PCR gen delesyonlarının haritalanması, küçük

delesyonların, çerçeve kayması ve nokta mutasyonlarının

analizinde kullanılan bir yöntem olduğundan kistik fibrozis

gibi genetik hastalıkların tanısında kullanılmaktadır.

TEZİN AMACITEZİN AMACI

• Hastanelerde yatan hastalarda en sık ateş sebebi pnömonidir. Amerika’da ve Avrupa ülkelerinde yapılan çalışmalarda bu pnömoniler arasında viral pnömoni oranlarının hiç de az olmadığı görülmüştür.

• Bizim bu çalışmadaki amacımız, hastanemize viral pnömoni ön tanısıyla yatırılan hastalardan alınan nasofarengial örneklerdeki virüsleri PCR yöntemiyle göstermek ve oranları ortaya koymaktır.

• Hastanemizde böyle bir oranı ortaya koyacak bir çalışma yapılmamıştır. Bu çalışmayı yaparak hem viral pnömoni tanısı konmuş olacak hem de viral pnömoni oranları ortaya çıkmış olacaktır.

• böylece pnömonilerin tedavi planlaması da farklı olacaktır.

 

SAĞLIK BAKANLIĞI 2003 VERİLERİNE GÖRE;

• 0 -1 yaş grubu bebek ölümlerinin %48.4’ünden• 1-4 y grubundaki ölümlerin ise %42.1’inden pnömoniler sorumludur• Yaşamın ilk yılında oluşan pnömonilerin %90’ı viral iken, okul

çağında bu oran %50’ye düşer.

Bu veriler ülkemizde özellikle <5y çocuklarda pnömonilerin yüksek Bu veriler ülkemizde özellikle <5y çocuklarda pnömonilerin yüksek mortalite ve morbiditeye yol açan önemli bir sağlık sorunu olduğunu mortalite ve morbiditeye yol açan önemli bir sağlık sorunu olduğunu göstermektedir.göstermektedir.

WHO’NÜN 1999 YILI VERİLERİNE GÖRE;WHO’NÜN 1999 YILI VERİLERİNE GÖRE;

• Dünyada her yıl <5y 10.5 milyon çocuk önlenebilir ve tedavi edilebilir hastalıklar nedeniyle ölmektedir

• Ölümlerin %28’inden solunum yolu enfeksiyonları sorumludur

• Yaşamın ilk yılında alt solunum yolu enfeksiyonu insidansı %30-35 ‘tir ve bunun yaklaşık %10’unu pnömoniler oluştururken

• İkinci ve üçüncü yıllarda %4-5• >10y ise insidans %1 ‘e düşmektedir

ÇALIŞMA DÜZENİ

• Çalışma Ekim 2010 ile Mart 2011 tarihleri arasında yapılmıştır• Çalışma,Göğüs Hastalıkları ve Pediatri klinikleriyle birlikte

yürütülmüştür• Ateş,öksürük, kas ağrısı, burun akıntısı, nefes darlığı gibi

şikayetleri olan ayaktan veya pnömoni ön tanısıyla yatırılan 0-70 yaşındaki tüm hastalar çalışmaya dahil edilmiştir

• Bu bulguları olan 200 hastadan nasofarengiyal sürüntü örneği alınarak liquid Amies transport besiyerine konarak laboratuvarımıza gönderilmiştir

• Örnekler çalışma zamanına kadar -20ºC de saklanmıştır– Çalışmanın tamamı S.Ü. Meram Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji A.D’nda

gerçekleştirilmiştir

SONUÇLAR

• 200 viral pnömoni ön tanılı hasta çalışmaya alındı• 200 hastanın 150 tanesi yetişkin, 50 tanesi çocuktu• 170 nasofaringiyal örnekte multipleks PCR yöntemiyle virüs

arandı– 30 örnek henüz çalışılmadı

• 68 örnekte virüs bulundu• 102 örnekte virüs bulunamadı

• 35 hasta RSV• 13 hasta influenza A• 3 hasta influenza B• 5 hasta parainfluenza virüs• 2 hasta coronavirüs• 7 hasta rinovirüs• 3 hasta adenovirüs olarak rapor edildi

• 170 hastanın 68 tanesinde virüs bulundu• Yani %40 oranında viral pnömoni tanısı kondu• Viral pnömoni tanısı konan 68 hastanın ise– %51’i RSV– %19’u influenza A– %4.4’ü influenza B– % 10’u rinovirüs– % 7.3’ü parainfluenza virüs– %4.4’ü adenovirüs– %3’ü coronavirüs bulundu.

KAYNAKLARKAYNAKLAR

• 1. Klinik Mikrobiyoloji (Patrick Murray, Ellen Jo Baron, James Jorgensen, Michael Pfaller)

• 2. Asya Mikrobiyoloji• 3. Moleküler Mikrobiyoloji (Rıza Durmaz)