Alteraciones moleculares de la señalización estrogénica en ... · A los Doctores José Bañuls, Antonio Picó y Ruth Sánchez Ortiga. Desde vuestra confianza en mi trabajo y el

ALTERACIONES MOLECULARES DE LA SEÑALIZACIÓN ESTROGÉNICA EN EL CÁNCER DE MAMA CON

RECEPTORES HORMONALES POSITIVOS

Laura Sánchez Tejada

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ALTERACIONES MOLECULARES

DE LA SEÑALIZACIÓN ESTROGÉNICA

EN EL CÁNCER DE MAMA

CON RECEPTORES HORMONALES POSITIVOS


Tesis Doctoral

Alicante, diciembre 2015

Departamento de Biotecnología

Facultad de Ciencias

Alteraciones moleculares de la señalización estrogénica

en el Cáncer de Mama con receptores hormonales positivos


Tesis presentada para aspirar al grado de

DOCTOR O DOCTORA POR LA UNIVERSIDAD DE ALICANTE

Doctorado en Biotecnología y Biomedicina

Dirigida por

Dr. F. Ignacio Aranda López

Dr. Francisco Ignacio Aranda López, Jefe del Servicio de Anatomía

Patológica del Hospital General Universitario de Alicante,

CERTIFICA:

Que el trabajo titulado “Alteraciones moleculares de la señalización

estrogénica en el Cáncer de Mama con receptores hormonales

positivos” ha sido realizado por Dña. Laura Sánchez Tejada bajo mi

dirección en el Laboratorio de Genómica y Proteómica de la Unidad de

Investigación del Hospital General Universitario de Alicante, para

optar al grado de Doctora por la Universidad de Alicante.

Alicante a 10 de diciembre de 2015.

Fdo. Dr. F. Ignacio Aranda López

Dr. Joaquín De Juan Herrero, Catedrático de Biología Celular,

Especialista en Patología, Departamento de Biotecnología, Universidad

de Alicante,

CERTIFICA:



positivos” ha sido realizado por Dña. Laura Sánchez Tejada bajo mi

tutela académica en el Laboratorio de Genómica y Proteómica de la

Unidad de Investigación del Hospital General Universitario de

Alicante, para optar al grado de Doctora por la Universidad de

Alicante.

Alicante a 10 de diciembre de 2015.

Fdo. Dr. Joaquín De Juan Herrero

Dr. José Miguel Sempere Ortells, Director del Departamento de

Biotecnología, Universidad de Alicante,

CERTIFICA:



positivos” ha sido realizado por Dña. Laura Sánchez Tejada bajo la

inmediata dirección y supervisión del Dr. F. Ignacio Aranda López y

bajo tutela académica del Dr. Joaquín De Juan Herrero, y da su

conformidad para que sea presentada ante la comisión de doctorado.

Y para que conste a los efectos oportunos, firma el presente certificado,

a 10 de diciembre de 2015.

Fdo. Dr. José Miguel Sempere Ortells

Director del Departamento de Biotecnología.

Universidad de Alicante.

El presente trabajo de Tesis Doctoral ha sido realizado en el

Laboratorio de Genética de la Unidad de Investigación del Hospital

General Universitario de Alicante y financiado con los proyectos:

- Alteración de la vía PI3K-PTEN-AKT en el cáncer de mama con

receptores hormonales positivos: significado pronóstico y terapéutico.

FCVI-HGUA (PI-C/03); 2008-2009. IP: Dr. Ignacio Aranda López.

- Expresión de c-Src en carcinoma infiltrante de mama positivo para

receptores de estradiol. Significado pronóstico y terapéutico. FCVI-

HGUA (PC/04); 2009-2010. IP: Dr. Ignacio Aranda López.

- Caracterización de carcinomas infiltrantes de mama positivos para

receptores de estradiol en función de los patrones de expresión de

microRNAs asociados a la regulación del receptor de estrógenos.

Consejería de Educación (GV/2011/010); 2011-2012. IP: Dr. Francisco

Gutiérrez Aviñó.

“La paciencia es la fortaleza del débil

y la impaciencia, la debilidad del fuerte”

Kant

“Sobrestimamos el evento y subestimamos el proceso,

cada sueño realizado ocurrió gracias a la dedicación de un proceso”

John C. Maxwell

“Cuanto más dura es la batalla, más dulce es la victoria”

Bob Marley

AGRADECIMIENTOS

Son muchas las personas con las que me he cruzado en todo este camino de

aprendizaje y de crecimiento personal. Cuando llegué al HGUA no sabía bien quién era,

no era consciente de mis virtudes y ni mucho menos de mis defectos.

Durante estos años he intentado aprender de cada uno de vosotros y quedarme con

lo mejor. También he intentado dar lo mejor de mi misma y disfrutar de esta profesión

que, aunque a veces sea relegada a planos menos importantes, tanta falta hace a la

humanidad.

A Susana y a Gloria quiero agradecerles la oportunidad de empezar. La puerta de

entrada que muchos no encuentran nunca yo la encontré antes incluso de tener el título

provisional de la Licenciatura, y eso es de agradecer. También la exigencia de ambas,

porque me obligó a endurecerme y a entender que nada se consigue sin esfuerzo.

A Emi, no sé cuantas veces he ido a verte con la cara triste y he salido con una

sonrisa en la cara. Se te echa muchísimo de menos en la 6ª planta. No cambies nunca.

Ojalá hubiesen más personas como tú en este mundo.

A Nacho, mi director de tesis, al que considero mi mentor. La ciencia y la

medicina no podrían evolucionar sin gente como tú, que las vives con pasión y sacas

tiempo de donde no lo hay para poder continuar aportando tu granito de arena al

conocimiento de la patología humana. Siempre me apoyaste y me dejaste total libertad

para expresarme en mi trabajo. Nunca recibí de tu parte un no por respuesta. Siempre

motivador, siempre conciliador. Te doy las gracias por todo y te animo a que continúes

siendo ese ejemplo para los que vengan después de mí.

A los Doctores José Bañuls, Antonio Picó y Ruth Sánchez Ortiga. Desde vuestra

confianza en mi trabajo y el respeto que habéis mostrado a mi especialidad me habéis

empujado y animado a terminar esta “dichosa” tesis y a seguir creciendo personal y

profesionalmente. Todo en mí hacia vosotros es agradecimiento.

A mi compañera Lucía. Ha sido difícil para ambas pero siempre pensé que eras

una persona incansable, capaz de alcanzar todas tus metas con perseverancia y siendo la

mejor compañera que se puede tener. Con tus rarezas, nunca olvidaré las risas y los años

que compartimos. Quién me iba a decir que aquel día nos lo jugábamos casi todo... ya

me entiendes.

Al resto de compañeros de la Unidad de Investigación que pasaron durante esos

años por el grupo de mama, ya fuese para quedarse unos añitos o de paso: Adriana,

Mayte, Fran y Dani, Estela, Montse, Cristina, Laura, Ari, Eloy, Elena. Y aunque a todos

les debo algunas risas, sobre todo a Ari y a Fran, al que jamás olvidaré y al que siempre

estaré agradecida es a ti, Fer. Me has escuchado una y mil veces, hemos compartido

horas de laboratorio, de ordenador y de desayuno-comida-merienda que siempre

atesoraré en mis recuerdos.

A las chicas de Colon: de nuevo Lucía y Carla, Miriam, María, Eva, Cecilia y

Araceli. No creo que Rodrigo hubiese soñado jamás con conseguir reunir a personas tan

trabajadoras como vosotras. Sois geniales y siempre encuentro apoyo en vosotras.

Aguantáis mis malos momentos y compartimos los buenos. Ojala la vida os devuelva lo

que merecéis, que es mucho.

Al resto de compañeros de trabajo: Sandra, que siempre está disponible para

ayudar, Ana, Pura, Bea y las chicas del CIBER: empezando por Rocío y Paula, con las

que he compartido todo mi recorrido en el HGUA y terminando por Irma, Mónica, Bea,

Alba e Isabel.

Al Dr. Lluís Catasús por facilitarme las muestras control que hicieron posible que

realizase el análisis de las mutaciones hotspot del PI3KCA.

Al Servicio de Anatomía Patológica al completo, puesto que sin su trabajo habría

sido imposible realizar este estudio. Gracias por facilitarme todos los datos clínicos y

patológicos que he necesitado para elaborar mi tesis doctoral y gracias por la revisión de

los casos y la selección de las zonas de los bloques idóneas para la extracción de los

cilindros que he necesitado para realizar los análisis. En especial al Dr. Javier Seguí y a

Tania Muci.

A mis tíos Herta y Miguel, que siempre habéis estado ahí para mí, que nunca me

habéis negado nada, que me queréis más de lo que me merezco. Que nunca dudasteis

que lo conseguiría. Gracias, gracias y gracias.

A mis padres y hermanos. Os quiero con toda mi alma y soy quien soy gracias a

vosotros. No puedo entender mi mundo sin nuestras alegrías y tristezas. Mamá: nunca

dudes que te estoy agradecida por ser la madre que eres y más todavía por ser la mejor

yaya que podía soñar para mis hijos. Tu exigencia y tu empuje han hecho de mi quien

soy, ojalá mis hijos lleguen a enorgullecerse de mí la mitad que yo lo estoy de ti. Lucía:

qué sería mi vida sin ti. Gracias por tantos favores, por tantas tardes-noches, por estar

ahí y no saber decir que no, por todo. Papá, en especial esta tesis doctoral es para ti. Por

tantas horas en las que cuidaste de mi hija para que pudiese escribirla, por tantos

ánimos, por toda tu paciencia y tu impaciencia y porque te quiero y estoy orgullosa del

padre que me tocó.

A Lolo, a Sara y a Samuel: mis estrellas polares. Gracias por aceptar mi trabajo,

por vuestro apoyo incondicional, por creer en mí. Os debo pedir perdón por tantas horas

robadas. Sois mi razón para vivir, para intentar ser mejor cada día. Sólo espero que

lleguéis a estar orgullosos de mí, aunque sea la mitad de lo que yo lo estoy de vosotros.

ÍNDICE

ÍÍÍNNNDDDIIICCCEEE

RESUMEN............................................................................................................23

.

INTRODUCCIÓN

1. Epidemiología del cáncer de mama...................................................................25

2. Clasificación del cáncer de mama......................................................................27

2.1 Características del subtipo de cáncer de mama luminal.................................. 30

3. La señalización estrogénica................................................................................33

4. Vías de señalización y factores implicados en la regulación del ESR1.............40

4.1. La vía de señalización PI3K............................................................................40

4.2 El receptor tirosina-quinasa IGF1R.................................................................44

4.3 El receptor tirosina-quinasa EGFR..................................................................46

4.4 La tirosina-quinasa citosólica c-Src.................................................................47

4.5 El coactivador MED1.......................................................................................49

5. Los microARNs y su implicación en la señalización estrogénica.....................52

5.1.- Biogénesis y función de los microARNs.......................................................52

ÍNDICE

5.2.- Los microARNs en el cáncer mama y su relación con el ESR1....................55

5.3.- El pri-miR-17~92...........................................................................................57

5.4.- El miR-Let-7a................................................................................................60

5.5.- El miR-206.....................................................................................................61

5.6.- El miR-222.....................................................................................................62

5.7.- El miR-21.......................................................................................................63

6. Justificación.......................................................................................................65

HIPÓTESIS Y OBJETIVOS..............................................................................67

MATERIALES Y MÉTODOS

1. Diseño y muestreo..............................................................................................69

1.1 Criterios de inclusión........................................................................................70

1.2 Criterios de exclusión.......................................................................................70

1.3 Muestra.............................................................................................................70

2. Variables a estudio.............................................................................................71

2.1 Variable de identificación................................................................................71

2.2 Variables clínicas.............................................................................................71

2.3 Variables patológicas.......................................................................................71

2.4 Variables inmunohistoquímicas (IHQ)............................................................73

2.5 Variables moleculares......................................................................................74

2.5.1 Extracción de ADN..................................................................................74

2.5.2 Análisis de mutaciones “hotspot” en PI3KCA.........................................76

2.5.3 Extracción de ARN...................................................................................81

2.5.4 Retrotranscripción (RTPCR)...................................…….…..........…......82

2.5.5 Análisis de los niveles de expresión de ARNm por qPCR.......................83

ÍNDICE

2.5.6 Extracción de microARNs........................................................................92

2.5.7 Retrotranscripción de los microARNs (RTPCR)....……...............…......93

2.5.5 Análisis de los niveles de expresión de microARNs por qPCR...............94

3. Análisis estadístico.............................................................................................97

3.1 Etapa I: Estudios descriptivos..........................................................................97

3.2 Etapa II: Estudios de asociación entre variables.............................................98

3.3 Etapa III: Estudios de supervivencia...............................................................99

Apéndice: Protocolos...........................................................................................100

RESULTADOS

1. Análisis descriptivo de las variables clínico-patológicas.................................115

2. Análisis descriptivo de las variables moleculares............................................117

2.1 Mutaciones en el gen PI3KCA.......................................................................117

2.2 Expresión de ARNm de los genes IGF1R, EGFR, c-Src, ESR1 y MED1.....118

2.3 Expresión de los miRNAs Let-7a, miR-21, miR-206 y miR-222..................120

2.4 Expresión del pri-miR-17~92.........................................................................122

3.- Asociaciones entre las variables moleculares y las clínico-patológicas.........124

3.1 Asociaciones entre las mutaciones en el gen PI3KCA y las variables clínico-

patológicas............................................................................................................124

3.2 Asociaciones entre los niveles de expresión génicos y las variables clínico-

patológicas............................................................................................................125

ÍNDICE

3.3 Asociaciones entre los niveles de expresión de los miRNAs y las variables

clínico-patológicas...............................................................................................133

3.4 Asociaciones entre los niveles de expresión del pri-miR-17~92 y las variables

clínico-patológicas...............................................................................................137

4. Asociaciones entre las variables moleculares..................................................139

4.1 Asociaciones entre la existencia de mutaciones en el gen PI3KCA y los

niveles de expresión de los genes IGF1R, EGFR, c-Src, ESR1 y MED1............139


miRNAs Let-7-a, miR-21, miR-206 y miR-222..................................................140


niveles de expresión del pri-miR-17-92...............................................................142

4.4 Correlaciones entre las variables moleculares (niveles de expresión de los

genes IGF1R, EGFR, c-Src, ESR1 y MED1, del pri-miR-17~92 y de los miRNAs

Let-7a, miR-21, miR-206 y miR-222...................................................................143

5. Análisis de supervivencia.................................................................................144

5.1 Supervivencia Libre de Enfermedad (SLE).......................................144

5.1.1 Asociaciones con la recidiva tumoral..............................................144

5.1.2 SLE en función del tiempo de seguimiento.....................................146

5.2 Supervivencia Global (SG)............................................................................151

ÍNDICE

DISCUSIÓN........................................................................................................157

LIMITACIONES...............................................................................................177

CONCLUSIONES..............................................................................................179

REFERENCIAS.................................................................................................183

.

ÍNDICE

ÍÍÍnnndddiiiccceee dddeee tttaaabbblllaaasss

Tabla 1: Alteraciones directas e indirectas de la vía PI3K-PTEN-Akt descritas en el

cáncer de mama por subtipo molecular.

Tabla 2: Cebadores y sondas correspondientes a la discriminación alélica de cada uno

de los hotspots.

Tabla 3: Información sobre los ensayos prediseñados de Applied Biosystems para la

cuantificación de la expresión génica de los genes estudiados.

Tabla 4: Información sobre los ensayos prediseñados de Applied Biosystems para la

cuantificación de los microARNs estudiados.

Tabla 5: Características clínico-patológicas de los tumores analizados.

Tabla 6: Expresión inmunohistoquímica de los marcadores Ki67, p53, RE, RPG y

BCL2.

Tabla 7: Distribución de los patrones de expresión génicos.

Tabla 8: Clasificación de los niveles de expresión génica en función de sus valores

respecto de los valores normales.

Tabla 9: Distribución de los patrones de expresión de los miRNAs en función de la

existencia de mutaciones en el gen PI3KCA.

Tabla 10: Clasificación de los niveles de expresión de los miRNAs en función de sus

valores respecto de los valores normales.

Tabla 11: Clasificación de los niveles de expresión génica en función de sus valores

respecto de los valores normales.

Tabla 12: Valores de Rho de Spearman y su significancia estadística entre las variables

inmunohistoquímicas, para los distintos subtipos tumorales en función de la


Tabla 13: Correlaciones entre el IGF1R y las variables inmunohistoquímicas en función

del subtipo luminal y de la existencia de mutaciones en el gen PI3KCA.

Tabla 14: Correlaciones entre el EGFR y las variables inmunohistoquímicas en función


Tabla 15: Asociación entre los niveles de expresión de c-Src y la metástasis en ganglios

en función del subtipo luminal.

ÍNDICE

Tabla 16: Correlaciones entre el c-Src y las variables inmunohistoquímicas en función


Tabla 17: Correlaciones entre el ESR1 y las variables inmunohistoquímicas en función


Tabla 18: Correlaciones entre el MED1 y las variables inmunohistoquímicas en función


Tabla 19: Correlaciones entre el miR-Let-7a y las variables inmunohistoquímicas en

función del subtipo luminal y de la existencia de mutaciones en el gen PI3KCA.

Tabla 20: Correlaciones entre el miR-21 y las variables inmunohistoquímicas en






Tabla 23: Correlaciones entre el pri-miR-17~92 y las variables inmunohistoquímicas en


Tabla 24: Expresión del ESR1 a nivel mensajero y proteína, en función del subtipo

tumoral y del dominio mutado de PI3K (Prueba U de Mann-Whitney).

Tabla 25: Expresión del miR-Let-7a en función del subtipo tumoral y del dominio

mutado de PI3K (Prueba U de Mann-Whitney).

Tabla 26: muestra los valores de Rho de Spearman y su significancia estadística entre

las variables moleculares, para los distintos subtipos tumorales en función de la


Tabla 27: Distribución de los datos de reaparición de la enfermedad en función del

subtipo y en la serie completa (N (%)).

Tabla 28: Variables con influencia en la SLE de la serie completa con dos seguimientos

distintos (60 y 185 meses). Se muestra el número de casos para cada categoría con

su media de supervivencia y el intervalo de confianza del 95% (Curvas de Kaplan-

Meier), así como el valor p del test de comparación entre las curvas Log Rank.

Tabla 29: Variables con influencia en la SLE de los Luminales A con dos seguimientos




Tabla 30: Variables con influencia en la SLE de los luminales B con dos seguimientos


ÍNDICE



Tabla 31: Variables con influencia en la SG de la serie completa.

Tabla 32: Variables con influencia en la SG de los Luminales A.

Tabla 33: Variables con influencia en la SG de los luminales B.

ÍNDICE

ÍÍÍnnndddiiiccceee dddeee fffiiiggguuurrraaasss

Figura 1: Epidemiología mundial del cáncer de mama.

Figura 2: Mortalidad de mujeres por cáncer de mama entre los años 1981 y 2012 en

España.

Figura 3: Actividad del ESR1 por la vía clásica.

Figura 4: Estructura del ESR1.

Figura 5: Vías moleculares asociadas a la señalización alternativa del ESR1.

Figura 6: Cascada de señalización principal de la vía PI3K.

Figura 7: Biogénesis de los microARNs.

Figura 8: Publicaciones registradas en PubMed sobre la participación de los microRNAs

en el cáncer de mama.

Figura 9: (a) Representación esquemática del cluster miR-17~92 y sus clusters

parálogos: miR-106b~25 y miR-106a~363. (b) Los microARNs maduros

originados se engloban en 4 familias: miR-17, miR-18, miR-19 y miR-92.

Figura 10: Representación esquemática del bucle de regulación c-Myc-E2F-pri-miR-

17~92 y de las funciones de los microARNs maduros del cluster.

Figura 11: Representación de las 3 etapas de la técnica de genotipado o discriminación

alélica por sondas de hidrólisis.

Figura 12: Representación de los resultados de un estudio de genotipado con sondas de

hidrólisis TaqMan.

Figura 13: Representación de la reacción de PCR cuantitativa a tiempo real con sondas

de hidrólisis Taqman®.

Figura 14: Ejemplo de representación gráfica de los niveles de cuantificación relativa de

la expresión génica (RQ del inglés Relative Quantification) generada mediante el

método ddCt.

Figura 15: Bioanálisis de microARNs con el Bioanalizador 2100 de Agilent.

Figura 16: Amplificación y detección de los microARNs maduros.

Figura 17: Distribución de la presencia de mutaciones en el gen PI3KCA en función del

subtipo tumoral.

Figura 18: Distribución de los niveles de expresión génicos en función del subtipo

tumoral.

ÍNDICE

Figura19: Distribución de los niveles de expresión del miR-Let-7a en función del

subtipo tumoral y de la existencia de mutaciones en el gen PI3KCA.

Figura 20: Distribución de los niveles de expresión del miR-206 en función del subtipo

tumoral en los casos silvestres para el gen PI3KCA.

Figura 21: Distribución de los niveles de expresión del Pri-miR-17~92 en función del

subtipo tumoral.

Figura 22: Comparativa de las distribuciones de los niveles de expresión de EGFR en

función de sobreexpresión de p53≥15% de sus células (Prueba U de Mann-

Whitney) en los luminales B.

Figura 23: Comparativa de la distribución de los niveles de expresión de c-Src en

función de la expresión inmunohistoquímica de receptores de progesterona de los

tumores (Prueba U de Mann-Whitney) en los luminales A.

Figura 24: Comparativa de la distribución de los niveles de expresión génica de ESR1

en función de la edad de los pacientes (Prueba U de Mann-Whitney) en los

luminales A.

Figura 25: Comparativa de la distribución de los niveles de expresión génica de ESR1

en función de la presencia de necrosis en el tumor (Prueba U de Mann-Whitney) en

los luminales B.

Figura 26: Comparativa de la distribución de los niveles de expresión génica de MED1

en función de la bilateralidad del cáncer de mama (Prueba U de Mann-Whitney) en

los luminales B.

Figura 27: Comparativa de la distribución de los niveles de expresión del miR-222 en

función del grado de diferenciación de Nottingham alcanzado por el tumor (Prueba

de Kruskal-Wallis).

Figura 28: Comparativa de la distribución de los niveles de expresión del pri-miR-

17~92 en función del desarrollo de metástasis ganglionar (Prueba U de Mann-


Figura 29: Comparativa de la distribución de los niveles de expresión de IGF1R en

función de la presencia de la mutación G1624A en el exón 9 del gen PI3KCA

(Prueba U de Mann-Whitney).

Figura 30: Comparativa de las distribuciones de los niveles de expresión del miR-Let-7a

en función de la presencia de la mutación G1624A en el exón 9 del gen PI3KCA y

del subtipo luminal (Prueba U de Mann-Whitney).

Figura 31: Comparativa de la distribución de los niveles de expresión del miR-222 en

función de la presencia de la mutación G1633A en el exón 9 del gen PI3KCA para

los luminales A (Prueba U de Mann-Whitney).

ÍNDICE

Figura 32: Curvas de Kaplan-Meier para la SLE en función del fenotipo.

Figura 33: Asociación del % de células inmunopositivas para BCL2 con el desarrollo de

metástasis en los luminales B (Prueba de Kruskal-Wallis).

Figura 34: Curvas de Kaplan-Meier para la SG en función del fenotipo.

23

RRREEESSSUUUMMMEEENNN

El carcinoma infiltrante de mama constituye una entidad biológicamente

heterogénea cuya subclasificación se ha establecido en base al estudio

inmunohistoquímico y molecular. Sin embargo, los criterios de subclasificación todavía

no están definidos para el subgrupo luminal, caracterizado por expresar receptores de

estrógenos (RE) y progesterona (RP). Los luminales representan el fenotipo

predominante (aproximadamente el 65% de los carcinomas infiltrantes de mama) y

presentan niveles de respuesta variable a hormonoterapia (tamoxifeno) y características

patológicas heterogéneas. La mayor actividad proliferativa, el nivel de positividad para

receptores hormonales, la expresión de p53 o la positividad para Her-2 se han señalado

como posibles factores relacionados con la respuesta a hormonoterapia y el pronóstico

de estos tumores, si bien, no han permitido establecer estrategias claras de tratamiento

entre los distintos subgrupos luminales. La determinación de factores moleculares que

permitan identificar a las pacientes con mayor riesgo dentro del grupo luminal es de

gran importancia ya que evitaría sobretratar a pacientes con tumores de buen pronóstico

y pobre respuesta a quimioterapia, susceptibles de recibir únicamente tratamiento

24

hormonal. Además, un mejor conocimiento de las vías implicadas en este grupo de

cáncer de mama abriría la posibilidad de describir nuevas dianas terapéuticas.

En la presente tesis doctoral se han estudiado 220 tumores de mama luminales en

los que se ha evaluado la presencia de mutaciones “hotspot” en PI3KCA por genotipado

con sondas de hidrólisis, y la expresión génica del ESR1, de los receptores tirosina-

quinasa IGF1R y EGFR, de la quinasa citosólica c-Src y del mediador MED1 y de

algunos de los microARNs relacionados con la señalización estrogénicas y más

señalados por su participación en las neoplasias humanas (pri-miR-17~92, miR-21,

miR-206, miR-222 y miR-Let-7a) por PCR cuantitativa a tiempo real. Se han estudiado

las alteraciones de estas variables moleculares, su convivencia y su relación con las

variables clínico-patológicas clásicas. Así mismo, se ha investigado el valor pronóstico

de estos factores moleculares frente a la supervivencia libre de enfermedad y a la

supervivencia global.

Aunque la única variable capaz de discriminar entre los subtipos luminales fue el

microARN Let-7a, se han observado distintas relaciones entre las variables

moleculares estudiadas en función del subtipo y sobre todo ha destacado la influencia

de la mutación de PI3K en estas relaciones. Nuestros resultados apuntan a que la

oncogénesis de los luminales A está dirigida por la señalización estrogénica, mientras

que otras vías con mayor potencial oncogénico intervienen en los luminales B, siendo

responsables de su peor pronóstico. El EGFR, el miR-222 y el miR-21 podrían ser útiles

marcadores pronóstico de estos tumores, si bien son necesarios más estudios sobre

series más amplias de Luminales B para establecer los parámetros útiles para el

seguimiento de estos pacientes.

INTRODUCCIÓN

25

IIINNNTTTRRROOODDDUUUCCCCCCIIIÓÓÓNNN

1. Epidemiología del cáncer de mama

La Organización Mundial de la Salud y su Agencia Internacional de Investigación

en Cáncer desarrollaron en 2008 el proyecto GLOBOCAN para proporcionar

estimaciones actuales de la incidencia, mortalidad y prevalencia, ajustados por años de

vida (DALY), de los principales tipos de cáncer a nivel mundial, regional y nacional,

para 184 países del mundo. Los últimos datos recogidos son del 2012. El proyecto cifra

en 14,1 millones de nuevos casos al año con 8,2 millones de muertes/año por causa

directa del cáncer y destaca que en 2012, 32,6 millones de personas en el mundo

luchaban contra esta enfermedad. La mayor incidencia la ostenta el cáncer de pulmón

(13%) seguido del cáncer de mama (11,9%), aunque esta situación cambia al

estandarizar los datos por edad, dando como resultado una tasa del 43,3% de cáncer de

mama que supera al resto de patologías oncológicas. El estudio prevé que el 42,1% de

INTRODUCCIÓN

26

los tumores desarrollados por mujeres de la Unión Europea en 5 años serán tumores

mamarios, con una mortalidad asociada del 16,3% (1-2).

Figura 1: Epidemiología del cáncer de mama en el sur de Europa. ASR: ratio

estandarizado con respecto a la edad, de nuevos casos o muertes por 100.000 personas

por año (de Age-Standardised Rate). Una tasa estandarizada por edad es la tasa que la

población tendría si tuviera una estructura de edad estándar. La normalización es

necesaria cuando se comparan varias poblaciones que difieren con respecto a la edad,

porque la edad tiene una gran influencia en el riesgo de cáncer. Tomada de: Ferlay J,

Soerjomataram I, Ervik M, Dikshit R, Eser S, Mathers C, Rebelo M, Parkin DM,

Forman D, Bray, F. GLOBOCAN 2012 v1.0, Cancer Incidence and Mortality

Worldwide: IARC CancerBase No. 11 [Internet]. Lyon, France: International Agency

for Research on Cancer; 2013. Disponible en: http://globocan.iarc.fr el día 1/12/2015

(1-2).

En España, desde 1990 se ha implantado en todas nuestras Comunidades

Autónomas un programa de detección precoz del cáncer de mama coordinado y guiado,

INTRODUCCIÓN

27

que ha permitido conocer la epidemiología de la enfermedad en nuestra sociedad. Según

las últimas estimaciones, se diagnostican anualmente alrededor de 16000 casos nuevos

y, a pesar de los avances alcanzados en su diagnóstico y tratamiento, supone la primera

causa de mortalidad por cáncer en mujeres (3).

Figura 2: Mortalidad de mujeres por cáncer de mama entre los años 1981 y 2012

en España. Obtenido de la aplicación Ariadna de los Servidores interactivos de

información epidemiológica (Epibase) del Instituto de Salud Carlos III.

2. Clasificación del cáncer de mama

El carcinoma infiltrante de mama constituye una entidad biológicamente

heterogénea (4-5) que ha sido subclasificada tradicionalmente en función de las

características morfopatológicas de sus células y atendiendo a la expresión

inmunohistoquímica de citoqueratinas específicas de células luminales (CK8/18 y 19) o

bien de células basales (CK5/6). En 1987 se demostró la amplificación del gen Erb-B2

INTRODUCCIÓN

28

(Human Epidermal Growth Factor Receptor 2 o HER2) en el 30% de los tumores

mamarios y su implicación en el pronóstico de las pacientes (6). La clasificación

patológica introdujo entonces la expresión de receptores estrogénicos (RE), de

receptores de progesterona (RP) y de HER2 en los análisis de rutina y se consiguieron

mejoras respecto al tratamiento de estas pacientes. En el año 2000, el grupo de Charles

Perou analizó 42 muestras de mama (36 carcinomas ductales invasivos, 2 carcinomas

lobulillares, 1 carcinoma ductal in situ, 1 fibroadenoma y 3 muestras de mama normal)

con matrices o arrays de expresión, y en base al estudio de los distintos patrones de

expresión que observaron y sus características histopatológicas, propusieron análisis

concretos para poder discriminar el comportamiento de las distintas entidades que

conforman el cáncer de mama (7). Un año después ampliaron el estudio y realizaron los

análisis de supervivencia que dieron fe de las diferencias intrínsecas a los distintos

subtipos (8): un 55-65% corresponderían al tipo luminal, con expresión de receptores de

estradiol y/o progesterona (receptores hormonales positivos), susceptible de tratamiento

hormonal con o sin quimioterapia asociada. Proponían subdividir este grupo en otros

dos, luminal A y luminal B, con diferente pronóstico, y la posibilidad de ampliar a tres

sumando el luminal C (un subgrupo peor definido pero también con peor pronóstico por

reunir características de los tumores con receptores hormonales negativos). Un 15-20 %

de los casos se incluirían en el grupo Her-2 (con sobreexpresión y/o amplificación de

Her-2) (9-10), tratados con quimioterapia y Herceptin® y que cursarían con un

pronóstico intermedio. Un tercer grupo sería definido como triple negativo o basal

(TN/B) (RE/RP/Her-2 negativos), con peor pronóstico pero con mejor respuesta al

tratamiento quimioterápico (11-13). El último subtipo se bautizó como normal-like y

estaba definido por un patrón de expresión similar a la mama sana aunque

posteriormente se definieron como tumores de baja densidad celular ricos en estroma;

INTRODUCCIÓN

29

sin embargo otros autores han sugerido una posible contaminación de células de la

mama normal por lo que actualmente no se contempla en la clasificación (14). La

descripción de los subtipos moleculares fue rápidamente aplicada en la práctica clínica

gracias a la reproducción de la clasificación aplicando herramientas

inmunohistoquímicas (5, 8, 15-16). Sin embargo, la concordancia entre la clasificación

molecular y la basada en inmunohistoquímica no es absoluta, y los criterios de

subclasificación no están bien definidos (4-5, 11-12, 17-19), lo que ha determinado

problemas de reproducibilidad de resultados.

Si bien es cierto que la clasificación se ajusta a diferencias biológicas pero

también pronósticas de los tumores (8), existen tumores dentro de cada subtipo que

escapan a las características clínicas y pronósticas de su grupo, por lo que los

investigadores no han cesado en su intento de matizar la clasificación y mejorar la

caracterización del cáncer de mama. El equipo de Reis-Filho comparó en 2011 los

resultados obtenidos por distintas plataformas de análisis molecular con matrices de

expresión sobre la clasificación de 779 casos. No encontraron grandes diferencias en la

clasificación de los subtipos Her2 y TN; sin embargo, el grupo luminal concentró las

mayores diferencias en cuanto a la subclasificación de los tumores, lo que pone de

manifiesto la necesidad de profundizar en el conocimiento sobre las diferentes entidades

biológicas que agrupa (20). Este mismo equipo de investigadores ha comprobado

recientemente, mediante métodos de secuenciación masiva en paralelo, la notable

heterogeneidad de la enfermedad, destacando que los cánceres de mama RE-negativos y

los RE-positivos son enfermedades completamente diferentes a nivel molecular (21).

A lo largo de la última década se ha definido el fenotipo Claudin-Low, bautizado

así por su baja expresión de proteínas Claudina. Este subgrupo se caracteriza por una

expresión baja de los receptores hormonales y de HER-2, asemejándose al fenotipo

INTRODUCCIÓN

30

TN/B aunque sin sobreexpresar genes de proliferación, y cursa con un pronóstico

intermedio entre los subtipos HER-2 y TN/B. Particularmente, presentan características

de células progenitoras y una expresión alta de marcadores de transición epitelio-

mesenquimal y de angiogénesis (16).

2.1 Características del subtipo de cáncer de mama luminal

El grupo de pacientes con tumores positivos para receptores hormonales presenta

gran relevancia clínica ya que constituye el grupo más importante numéricamente (en

torno al 65%). Derivado de sus características morfopatológicas y su origen celular, se

ha bautizado como fenotipo luminal. Sin embargo, estos tumores presentan

características morfológicas y biológicas heterogéneas (22).

El grupo de Perou subclasificó estos tumores en luminales A y B, diferenciando a

los tipo B por expresar niveles más altos de genes relacionados con la proliferación

como Ki67 (7-8). Aunque el marcador de proliferación Ki67 se incluye en la evaluación

del grado histológico y es, en gran medida, responsable de su valor pronóstico, la

evaluación de la expresión de Ki67 por inmunohistoquímica ha dado resultados

contradictorios y la comparación entre distintos estudios es complicada por la

variabilidad metodológica y por los puntos de corte aplicados para definir el subtipo

luminal B (23-25). En los últimos años se ha intentado hacer frente a estas limitaciones

y consensuar su utilización en el diagnóstico clínico de estos tumores (18, 26). En 2011,

en la reunión de expertos celebrada durante la XII Conferencia Internacional de Cáncer

de Mama de St Gallen (St Gallen International Expert Consensus on the Primary

Theraphy of Early Breast Cancer) se consideró que a pesar de la utilidad de las matrices

de expresión para la clasificación de esta neoplasia, actualmente no era posible hacer

INTRODUCCIÓN

31

frente al coste de la técnica para el diagnóstico clínico rutinario y propusieron como

método de clasificación el publicado por Cheang y su equipo en 2009 (18, 27),

basándose en la concordancia con la clasificación obtenida por el panel de 50 genes

(PAM50) propuesto por Parker y su grupo (28). Los luminales A quedarían, por tanto,

definidos por ser positivos para la expresión de RE y RP, negativos para HER2 y tener

un índice de Ki67 <14%, y los luminales B se diferenciarían por tener un índice de Ki67

≥14%. Sin embargo, el Grupo Internacional de Trabajo sobre Ki67 en Cáncer de Mama

(International Ki67 in Breast Cancer Working Group) definió en el 2010 la

metodología admitida para el análisis del marcador, pero destacó que, dadas las

limitaciones típicas de la técnica inmunohistoquímica (incluyendo la reproducibilidad

de la técnica, la interpretación subjetiva y la existencia de en torno a un 25% de falsos

negativos y positivos), la aplicación directa de los puntos de corte específicos para la

toma de decisiones debe ser considerada poco fiable a menos que los análisis se lleven a

cabo en un laboratorio altamente experimentado con sus propios datos de referencia

(26). Estas limitaciones fueron recientemente subrayadas de nuevo en la “14th St.

Gallen International Breast Cancer Conference” (29).

Hay que añadir que no sólo el nivel de proliferación aporta un valor pronóstico en

este tipo de tumores, sino que el p53 también ha demostrado contribuir a conocer el

pronóstico de estos (30). Los luminales A también tienen un bajo porcentaje de células

con sobreexpresión de p53 (8, 31), a diferencia de los luminales B, por lo que

Kobayashi, entre otros autores, propuso en 2013 incorporar esta alteración al panel

inmunohistoquímico de la subclasificación de los luminales (32-33). Este autor fija los

límites en un 10%, tanto para el p53 como para el índice Ki67, y propone que los

tumores que alcancen este nivel de positividad para alguna de las dos variables o para

ambas, se clasifiquen como luminales B.

INTRODUCCIÓN

32

Por otro lado, se ha propuesto en distintas ocasiones la ampliación del subgrupo

con el subtipo C, caracterizado por sobreexpresar también el receptor HER-2 (8).

Cheang extrae estos casos del subgrupo luminal y propone un nuevo grupo denominado

subtipo luminal-HER2-positivo (27). De cualquier forma, en la práctica clínica estos

tumores se consideran dentro del subtipo HER-2 por sus connotaciones pronósticas y de

tratamiento.

En cualquier caso, no se conocen los cambios biológicos asociados a las

características que presentan los tumores luminales de mal pronóstico ni pueden

explicarse sus respuestas terapéuticas en muchos casos, por lo que en los últimos años la

comunidad científica ha intentado responder a la necesidad de estudiar profundamente

los patrones biológicos que dirigen la oncogénesis y el desarrollo de estos tumores (34-

35). Los esfuerzos han sido dirigidos también a completar las estrategias de

diferenciación entre los subtipos luminales y predicción de su respuesta al tratamiento

(36).

El tratamiento de estos pacientes puede limitarse a hormonoterapia, sin embargo

en un 30-40% de los casos se produce progresión de la enfermedad con pobre respuesta

al tratamiento hormonal y necesidad de quimioterapia adyuvante con tasas de respuesta

clínica del 30-50% (13, 22). Deben existir mecanismos moleculares por los que algunos

tumores luminales escapan a la terapia hormonal o generan resistencia. Su

descubrimiento puede permitir identificar a las pacientes con mayor riesgo, susceptibles

de recibir terapias más específicas o al menos más agresivas, y al mismo tiempo evitar

el sobretratar a pacientes con tumores de buen pronóstico.

INTRODUCCIÓN

33

3. La señalización estrogénica

Además de su función principal en la reproducción, los estrógenos están presentes

en la regulación de los sistemas cardiovascular, esquelético, inmunitario y nervioso y

juegan un papel fundamental en enfermedades como la osteoporosis. En el epitelio

mamario tienen una función importante en el crecimiento, la diferenciación y la

proliferación, así como en la oncogénesis de sus neoplasias y la metástasis (37). Todas

estas funciones se efectúan, tanto a través de la acción de los estrógenos endógenos (E1

(estrona), E2 (17β-estradiol) y E3 (estriol)), como de diversas formas sintéticas. La

inhibición de su actividad ha sido la base del tratamiento de esta enfermedad durante

mucho tiempo. Su función está mediada por los receptores REα y REβ, predominando

el primero en el útero y la glándula mamaria, mientras que el segundo tiene un papel

importante en los sistemas nervioso central, cardiovascular y respiratorio así como en el

tracto urogenital y los huesos. Aunque la mayoría de los tumores de mama coexpresan

ambos receptores, el estradiol (E2) ejerce sus efectos proliferativos principalmente a

través del receptor nuclear REα o ESR1 (38-39).

La molécula del ESR1 se compone de tres dominios funcionales: el dominio N-

terminal AF1, responsable de la función transcripcional, el dominio de unión al ADN, y

el dominio de unión al ligando AF2 (40) (Figura 4). Las acciones del ESR1 pueden

dirigirse por dos vías distintas: la vía clásica o genómica, que se basa en su interacción

con el ADN, y la vía no genómica, basada en su interacción con otras proteínas y

factores de transcripción (41).

El E2, al ser una hormona esteroidea, puede atravesar la membrana plasmática de

la célula, con lo que los receptores no necesitan estar anclados a membrana para ser

ligados. La unión del ligando al ESR1 desencadena la activación de la vía clásica

(Figura 3). La máxima actividad transcripcional requiere la acción sinérgica del dominio

INTRODUCCIÓN

34

AF1 independiente del ligando y del dominio AF2 ligando-dependiente. Esta función

también depende de una serie de cofactores reguladores:

- los complejos de remodelación de la cromatina,

- los coactivadores: como miembros de la familia p160/SRC (del inglés Steroid

Receptor Coactivator) destacando el SRC1/NcoA1 (del inglés Nuclear Receptor

coActivator 1), el NcoA2, el NcoA3 (también conocido como AIB1), el CBP (del inglés

cAMP response element-binding (CREB) Binding Protein) y

- los correpresores (como NCoR (del inglés Nuclear Receptor co-Represor) y

MTA1 (del inglés Metastasis Associated-1) del ESR1.

Los coactivadores generalmente no se unen al ADN pero son reclutados a los

promotores de los genes diana a través de interacciones proteína-proteína con el ESR1.

Es el equilibrio relativo entre los receptores, los coactivadores y las proteínas

correpresoras el que determinará la capacidad de actuación del ESR1 por la vía clásica.

Los genes dependientes de estrógenos poseen en sus promotores sitios de unión

específicos conocidos como Elementos de Respuesta a Estrógenos o EREs (5’-

AGGTCAnnnTGACCT-3’) que son reconocidos por el ESR1 para promover su

transcripción (41). La identificación de los genes de respuesta a estrógenos se considera

un paso esencial para la comprensión de las funciones biológicas de la hormona y de los

mecanismos moleculares a través de los que ESR1 controla la expresión génica (42).

INTRODUCCIÓN

35

Figura 3: Actividad del ESR1 por la vía clásica. El ESR1 se encuentra en el

citoplasma en ausencia de estrógeno, ligado a la proteína de choque térmico 90 (HSP90)

(43). La unión del E2 desencadena la disociación de HSP90, su homodimerización y su

traslocación al núcleo. Una vez allí ejerce su función como receptor nuclear tipo I

uniéndose a los EREs (HRE en la figura, del inglés Hormone Response Element), y

recluta a otras proteínas coactivadoras como NCOA3 y a mediadores para activar la

transcripción del gen en cuestión. Imagen tomada de Interactions between the estrogen

receptor, its cofactors and microRNAs in breast cancer. McCafferty et al;Breast Cancer

Res Treat (2009) 116:425–432 (44).

La señalización no genómica a través de ESR1 la conduce el receptor localizado

en la membrana plasmática y en el citoplasma. Es una señalización de respuesta rápida

que utiliza las cascadas de señalización disponibles en la célula para obtener un efecto

inmediato. Así, activa la vía PI3K/Akt (fosfoinositol-3-quinasa/ serina-treonina quinasa

Akt) con efectos antiapoptóticos, promueve la activación de la vía de crecimiento de las

MAPK (del inglés Mitogen-Activated Protein Kinase) mediante su interacción con

receptores tirosina-quinasas (RTKs) y regula otras vías de señalización o potencia estas

mismas a través de su interacción con otras proteínas quinasa citosólicas como c-Src,

INTRODUCCIÓN

36

PKA y PKC (45). Recientemente se ha demostrado la capacidad del ESR1 de activar la

transcripción de genes que no poseen EREs en su promotor, ampliando así su radio de

acción por mecanismos indirectos de los que hablaremos más adelante (46).

El ESR1 debe ser capaz, por tanto, de integrar múltiples señales procedentes tanto

de sus ligandos como de las principales vías de señalización intracelulares para poder

llevar a cabo sus funciones en el núcleo y el citoplasma. Por tanto, otro de los

mecanismos más estudiados es la sobreactivación del ESR1 a través de su fosforilación

por diversas quinasas implicadas en las vías de crecimiento (como algunas de las

MAPK, el AKT y el c-Src), intensificando la activación de la acción genómica y no

genómica de ESR1, tanto en presencia como en ausencia de ligando (Figura 5). Aunque

se han descrito numerosos sitios susceptibles de fosforilación, las serinas S118 y S167,

localizadas en la región AF1, parecen ser los nucleótidos con mayor influencia en la

actividad del receptor (Figura 4) (41, 47-49).

Figura 4: Estructura del ESR1. Se muestran los tres dominios que componen la

molécula, en los que se han marcado los sitios de fosforilación, así como las quinasas

propuestas como responsables.

La alteración del equilibrio de la señalización estrogénica en el cáncer de mama se

desarrolla a través de la afectación del ESR1 por múltiples mecanismos. A nivel génico,

INTRODUCCIÓN

37

se han descrito numerosos polimorfismos que podrían alterar su función y/o su

regulación (50). Otro mecanismo de alteración del ESR1 podría ser la sobreexpresión

génica derivada de la amplificación del gen ESR1, si bien esta posibilidad está muy

discutida (51-57). Las diferencias metodológicas y los criterios que definen la

amplificación génica podrían estar detrás de estas diferencias, por lo que son necesarios

más estudios sobre este capítulo de la regulación del ESR1. No obstante, la

sobreexpresión es la alteración descrita con mayor frecuencia, por lo que toma

protagonismo la vía de la regulación transcripcional del ESR1. Existen dos sitios

predominantes para la estimulación de la transcripción de ESR1: uno es el sitio P1

(aguas abajo del promotor), localizado en el nucleótido +1 relativo al sitio de inicio de

la transcripción, y el otro es el sitio P0 (aguas arriba del promotor), localizado a -3090

pb del sitio de inicio de la transcripción. Así, Hayashi y los suyos mostraron la

importancia del sitio P0 para los mecanismos de sobreexpresión en la regulación

específica de tumores (58), mientras que deGraffenried y su grupo demostraron que los

factores de transcripción Sp-1 y el USF-1 (del inglés Specific Protein 1 y Upstream

Stimulatory Factor 1 respectivamente) actúan sobre el sitio P1 para ejercer su actividad

promotora de la transcripción de ESR1 (59-60). Sin embargo los detalles del mecanismo

de sobreexpresión de ESR1 aún necesitan ser esclarecidos (42).

La regulación del ESR1 a nivel de proteína se ha estudiado desde el punto de vista

de su degradación, puesto que las funciones del receptor dependen del mantenimiento

de su concentración proteica. Si bien es cierto que el tratamiento de células de cáncer de

mama luminal con E2 resulta en la disminución de los niveles de proteína ESR1,

también se ha detectado una estimulación prolongada de la transcripción de genes de

respuesta a estrógenos en respuesta al bloqueo de la degradación inducida por ligando.

Los detalles de este mecanismo necesitan todavía ser aclarados (42).

INTRODUCCIÓN

38

En la última década, se ha observado un nuevo mecanismo de regulación del

ESR1 tanto a nivel de ARN mensajero como de proteínas. Se trata de la regulación por

microARNs. Estas moléculas de ARN de pequeño tamaño son parte esencial de

numerosos bucles regulatorios que tienen como protagonista al ESR1. Se trata del

mecanismo alternativo propuesto por el que el ESR1 es capaz de activar la transcripción

de genes que inicialmente no son de respuesta a estrógenos. Del mismo modo, esta

regulación también hace posible que genes de respuesta a estrógenos no varíen su

concentración proteínica a pesar de la activación de la señalización estrogénica (46).

Hoy en día son frecuentes los estudios que corroboran esta co-regulación entre los

microARNs y el ESR1 (41, 44, 46, 61-66). Abordaremos sus implicaciones en el

apartado correspondiente.

Figura 5: Vías moleculares asociadas a la señalización alternativa del ESR1.

Imagen modificada a partir de la Figura 1 de: Estrogen Regulation of MicroRNA

Expression. Klinge et al. Current Genomics (2009),10:169-183 (41). Modelo celular

INTRODUCCIÓN

39

que muestra la vía de señalización de ESR1 derivada de su estimulación en la

membrana plasmática y en el citoplasma por otras cascadas de señalización celulares.

Su interacción en la membrana plasmática con proteínas G, caveolina (Cav-1) y c-Src

estimula la vía de crecimiento MAPK y su interacción con PI3K estimula la vía

antiapoptótica PI3K/Akt. Estas vías se sobreestimulan indirectamente por su acción

sobre los RTK a través de c-Src y de su proteína colaboradora MNAR (del inglés

Modulator of Nongenomic Activity of ESR1). Los microARNs participan en esta

regulación bidireccionalmente. La fosforilación de ESR1 por quinasas como Akt y las

MAPK favorece su activación independiente de ligando y su entrada al núcleo, donde

actúa como receptor nuclear para promover la transcripción de los genes de respuesta a

estrógenos.

Hoy en día la terapia endocrina sobre los tumores luminales se basa en intentar

regular la señalización estrogénica por diversos métodos (67):

a) Castración ovárica: actuando directamente sobre la principal fuente fisiológica

productora de estrógenos. El método puede ser mediante ooforectomía quirúrgica,

radioterapia ovárica (ooforectomía actínica), o el uso de fármacos como

- análogos de LHRH (hormona liberadora de gonadotropina) o

- inhibidores de la aromatasa: dirigidos a la anulación de la síntesis estrogénica

mediante la inhibición del complejo enzimático del grupo p-450 que cataliza el paso de

andrógenos a estrógenos de origen extraovárico. Dentro del grupo de inhibidores de la

aromatasa encontramos los de estructura esteroidea que generan una unión irreversible

en el sustrato de ligazón (formestano y exemestano) y los de estructura no esteroidea

cuya unión es competitiva (aminoglutetimida, anastrozol, letrozol).

b) Moduladores selectivos de los receptores de estrógenos o SERMs (del inglés

Selective Estrogen Receptor Modulators): es el caso del tamoxifeno, que fue el primer

antiestrógeno con actividad antagonista en la mama y agonista parcial en hueso, hígado

y útero. Sin embargo se han observado casos de cáncer de mama en los que actúa como

agonista. El tamoxifeno posee una afinidad por el ESR1 muy baja, por lo que necesita

ser metabolizado por el hígado inicialmente para poder realizar su función. Sus

INTRODUCCIÓN

40

metabolitos compiten con el E2 por unirse al dominio AF2 del ESR1, bloqueando la

estimulación por su ligando natural y previniendo los cambios conformacionales que

posibilitan la función del ESR1 por la vía clásica.

c) Bloqueadores selectivos del receptor estrogénico (fulvestrant): es un

antiestrógeno puro y bloqueador selectivo del ESR1. Aún no está aprobado para

utilizarse como terapia adyuvante del cáncer de mama.

A pesar de ello en torno a un 30-40% de los casos cursa con pobre respuesta al

tratamiento hormonal, por lo que queda de manifiesto que en estos tumores la

activación de la señalización estrogénica se realiza a través de la regulación del ESR1

por otras vías de señalización celular que pueden, a su vez, estar alteradas (Figura 5).

4. Vías de señalización y factores implicados en la regulación del ESR1

4.1. La vía de señalización PI3K

Los fosfatidilinositoles destacaron ya en 1953 por su implicación en la

transducción de señales intracelulares. Las funciones de estos fosfolípidos en la célula

son muchas y dependen de la fosforilación de la molécula inicial de fosfatidilinositol

(PI), desencadenada por factores de crecimiento que activan a los receptores tirosina

quinasa (RTKs) y a los receptores de proteína G. Una primera fosforilación da lugar al

PI 4-fosfato o PIP, que es de nuevo fosforilado a PI 4, 5-bisfosfato o PIP2. Los

productos de su degradación, inositol 1, 4, 5-trisfosfato (IP3) y diacilglicerol, son los

responsables de la transducción de señales que desencadena la proliferación celular. El

IP3 es capaz de unirse a receptores del retículo endoplasmático activando la liberación

de Ca2+, y el diacilglicerol es el responsable de la activación de la serina/treonina

quinasa C (PKC), que, en presencia de altos niveles citosólicos de Ca2+, activa la vía

INTRODUCCIÓN

41

MAPK y, por otro lado, es capaz de activar al NF-κβ que migra hasta el núcleo y activa

la transcripción génica.

Sin embargo, una parte del PIP2 generado no es degradado, sino que la enzima

fosfatidilinositol 3’-quinasa (PI3K) es capaz de volver a fosforilarlo dando lugar al PI-

3,4,5-trifosfato o PIP3. Esta molécula actúa como ligando para reclutar la

serina/treonina quinasa Akt (c-Akt, también llamada proteína quinasa B o РKВ) a la

membrana plasmática. Al mismo tiempo, activa a las quinasas fosfoinosítido

dependientes 1 y 2 (PKD1/2) que fosforilan a Akt para activarlo. Esto deriva en la

fosforilación de las proteínas BAD у caspasa 9, inhibiendo su actividad apoptótica у

promoviendo, por tanto, la supervivencia celular. Akt también actúa activando al

complejo mTOR, a GSK-3 y a otras proteínas quinasa, así como a factores de

transcripción como NF-κβ, que amplifican su efecto antiapoptótico y afectan a otros

aspectos de la célula como la proliferación у la angiogénesis (Figura 6).

Figura 6: Cascada de señalización principal de la vía PI3K.

INTRODUCCIÓN

42

El mantenimiento del equilibrio de activación de esta vía recae, en gran medida,

sobre el gen supresor tumoral PTEN (del inglés Phosfatasa and Tensin Homolog). La

proteína codificada por este gen es una fosfatidilinositol-3,4,5-trifosfato 3-fosfatasa que

revierte la formación de PIP3 a PIP2, evitando la activación de la vía Akt y, por tanto,

sus efectos antiapoptóticos (68).

La enzima PI3K es una quinasa lipídica heterodimérica que contiene una

subunidad p110 catalítica y una subunidad p85 reguladora. Existen tres isoformas

homólogas p110α, p110β y p110δ codificadas por los genes PIK3CA, PIK3CB y

PIK3CD respectivamente, aunque en el tejido mamario sólo se expresan la isoforma

p110α y la p110β.

Si bien en las células normales la vía del PI3K-PTEN-Akt está bajo un estricto

control homeostático a través de distintos bucles regulatorios, en el cáncer de mama es

la vía más frecuentemente alterada (Tabla 1). Este desequilibrio de la vía suele

acontecer paralelamente por varias alteraciones a distintos niveles, aportando a la célula

ventajas oncogénicas por diferentes mecanismos. Así mismo, se han asociado las

mutaciones en PIK3CA con alteraciones de los RTKs, mientras que las alteraciones de

la isoforma p110β, que se activa principalmente en respuesta a los receptores acoplados

a proteína G, parece mediar en la tumorigénesis de células con alteraciones en PTEN

(69-70).

INTRODUCCIÓN

43

Gen

(Proteína) Alteración

Efecto en la

señalización

Frecuencia

Luminal

(RE+) HER2+

Basal

(TN)

ErbB2

(HER2)

Amplificación

génica /

sobreexpresión

Hiperactivación

de las vías

PI3K y MEK

10% 100% 0%

EGFR Amplificación 0, 8% de todos los casos

IGF1R Hiperactivación /

amplificación

génica

41-48% 18-64% 42%

FGFR1 Amplificación /

mutación activadora

8, 6-11,

6% 5, 4% 5, 6%

c-Src Sobreexpresión 50-57%

PIK3CA

(p110α/PI3K) Mutación activadora Hiperactivación

PI3K 28-47% 23-33% 8-25%

PIK3CB

(p110β/PI3K) Amplificación Desconocido 5% de todos los casos

PIK3R1

(p85α/PI3K)

Mutación

inactivadora

Hiperactivación

PI3K 2% de todos los casos

PTEN Mutación (pérdida

función) / represión

Hiperactivación

PI3K 29% 22% 67%

AKT1 Mutación activadora Hiperactivación

AKT

2, 6-3,

8% 0% 0%

AKT2 Amplificación Hiperactivación

AKT 2, 8% de todos los casos

PDK1 Amplificación o

sobreexpresión

Hiperactivación

PDK1/AKT 22% 22% 38%

Tabla 1: Alteraciones directas e indirectas de la vía PI3K-PTEN-Akt descritas en

el cáncer de mama por subtipo molecular. Modificada a partir de la Tabla 1 de:

Mutations in the phosphatidylinositol 3-kinase pathway: role in tumor progression and

therapeutic implications in breast cancer. Miller et al. Breast Cancer Research 2011,

13:224 (71).

Las mutaciones en el gen PIK3CA destacan por su frecuencia en el cáncer de

mama. Más del 80% de éstas afectan a los residuos E542K y E545K del exón 9, en el

dominio helical, y al residuo H1047R del exón 20, en el dominio quinasa (72-73). A

través de estudios in vitro y en ratones se ha observado que cualquiera de las tres

mutaciones confiere, aunque a través de distintos mecanismos, un incremento de la

INTRODUCCIÓN

44

actividad catalítica de la enzima (74-76). Sin embargo, la investigación en muestras

humanas ha asociado la existencia de mutaciones en PI3K con factores pronósticos

favorables y bajos niveles de activación de la vía (77-78), así como no se han

encontrado asociaciones con la respuesta a tamoxifeno (79). La heterogeneidad de las

series estudiadas y las diferentes metodologías empleadas pueden estar velando su

verdadero valor como factor pronóstico.

En el subtipo luminal, destaca la frecuencia con la que se describen alteraciones

en esta vía, quedando claro que la alteración de su actividad juega un papel central en la

oncogénesis de estos tumores. Cabe destacar la interacción de la vía con el ESR1 directa

e indirectamente (45, 70, 80-81). Como hemos visto en el apartado del ESR1, Akt es el

responsable de la fosforilación de la serina S167 del dominio AF1 de ESR1,

promoviendo su activación independiente de ligando (47), lo que podría explicar la

relevancia de esta vía en los luminales. Sin embargo, no se han estudiado en

profundidad las diferencias entre ambos subtipos de luminales y los pocos estudios

realizados apuntan a un mayor peso de la vía en el subgrupo B (80-81).

4.2. El receptor tirosina-quinasa IGF1R

El eje de señalización del factor de crecimiento IGF (del inglés Insulin-like

growth factor), juega un papel crítico en el crecimiento fisiológico y además es un

mediador bien caracterizado del fenotipo maligno (82-85). Existen 3 receptores tirosina

quinasa transmembrana responsables de la actividad de la vía: los receptores similares al

receptor insulínico tipo 1 o IGF1R (del inglés Insulin-like growth factor receptor), el

tipo 2 o IGF2R y el propio receptor de insulina (IR). Sin embargo, la función del IGF2R

no se relaciona con los otros dos y no se le conoce función de transducción de señales.

INTRODUCCIÓN

45

El IGFI es el ligando principal para el IGF1R, para el IR y para su heterodímero o HR

(del inglés Hybrid-Receptor) (82-83, 86-91). Al ligar a IGFI, el IGF1R se autofosforila

provocando una cambio conformacional que activa el dominio quinasa formando sitios

de unión para sus proteínas efectoras, entre las que destacan los substratos adaptadores

del IR (IRS-1 a IRS-4), la proteína del colágeno homóloga al Src (Shc, del inglés Src

Homologous Collagen) y la proteína 14-3-3 (86, 89). La actividad quinasa de IGF1R

intracelular está regulada por c-Src, integrinas, fosfatasas, como la proteína tirosina

fosfatasa 1B (PTP-1B), y la proteína RACK1 (del inglés Receptor for Activated C

Kinase 1), una proteína G responsable de regular la activación de la vía PI3K desde el

IGF1R. Por tanto, a través de múltiples efectores, el IGF1R es capaz de participar en

numerosas vías de señalización (87, 92).

Se ha demostrado que es necesaria la presencia del IGF1R funcional para que sea

posible la transformación a fenotipos malignos, el crecimiento celular y la supervivencia

tanto en estudios in vitro como in vivo (90, 93), por lo que se ha establecido como una

molécula importante en las etapas tempranas de la oncogénesis. Así mismo, sigue

participando en el progreso tumoral favoreciendo la supervivencia celular.

El IGF1R se encuentra sobreexpresado frecuentemente en las neoplasias humanas,

incluyendo el melanoma, el carcinoma de colon, páncreas, próstata, riñón y en los

tumores de mama (88). Esta alteración se ha vinculado a un mal pronóstico en algunos

tipos tumorales (94) y se ha demostrado que, en el modelo de cáncer en ratón RIP1-

TAG2, acelera el desarrollo de los tumores y los hace más invasivos, incrementando el

número de metástasis (95). También se ha asociado a la promoción de una combinación

de crecimiento celular y evasión de la apoptosis tal, que posibilita el crecimiento

independiente de anclaje y la supervivencia de las células (adaptaciones celulares

necesarias en el proceso de la metástasis) (85, 96-97).

INTRODUCCIÓN

46

En el cáncer de mama se ha descrito su sobreexpresión en aproximadamente un

60% de los casos (98-102). Se han propuesto otro tipo de alteraciones menos frecuentes,

como la existencia de polimorfismos (103) y la variación de otros componentes de la

vía IGF (104). Se han demostrado diferencias en función del subtipo tumoral (101), la

aparición de recidivas y el pronóstico (105) y otras características clínico-patológicas

(106). Paralelamente, se ha establecido una relación con el ESR1 y su señalización que

amplía su participación en la oncogénesis de los tumores luminales (98, 107-109), e

incluso se ha señalado su implicación en la respuesta a terapia (110) y a la adquisición

de resistencias (111-114).

4.3. El receptor tirosina quinasa EGFR

El receptor del factor de crecimiento epidérmico o EGFR (del inglés Epidermal

Growth Factor Receptor) es un miembro de la familia de receptores ErbB, que incluye

además al ErbB2 (HER2/neu, sobreexpresado en un 30% de los tumores de mama), el

ErbB3 y el ErbB4. Se trata de receptores tirosina-quinasa transmembrana que son

expresados en la superficie de las células epiteliales para recibir señales de su entorno

en forma de factores de crecimiento y transducir la señal al interior de la célula. En

respuesta, el EGFR regula procesos importantes como la supervivencia celular, la

progresión del ciclo celular y la angiogénesis. Del mismo modo, también tiene un papel

fundamental en la oncogénesis, la progresión del cáncer y la adquisición de capacidades

invasivas.

El EGFR está alterado a distintos niveles en varias neoplasias. A nivel de

secuencia génica, se han caracterizado mutaciones en tumores de pulmón (115). El

polimorfismo 142285GA, que conduce a la sustitución de arginina por lisina en el

codón 521, afectando al subdominio extracelular IV (rs11543848, también conocido

INTRODUCCIÓN

47

como HER-1 R497K) ha sido descrito en distintos tipos de tumores malignos (116). Así

mismo, también se ha descrito la amplificación de EGFR y se ha propuesto como un

factor predictivo de la respuesta a la terapia (117). No obstante, la sobreexpresión del

EGFR es la alteración más habitual en los distintos tumores sólidos estudiados.

En el cáncer de mama la sobreexpresión de EGFR se ha vinculado a los subtipos

moleculares altamente agresivos como algunos HER2, TN/B y los tumores portadores

de la mutación en BRCA1 (118). Sin embargo, se ha demostrado que su carácter

oncogénico se obtiene de su coexistencia con otros oncogenes como el c-Src (119-121),

el IGF1R (108, 122-124) y el ESR1 (108, 125-127). Además, la expresión de EGFR

aumenta en los tumores resistentes a tamoxifeno (108, 112, 124, 126-127) y se ha

vinculado con la resistencia a terapias como el trastuzumab (113).

Dadas las diferentes respuestas a terapia de los luminales B, el EGFR podría estar

ejerciendo un papel distinto en la biología de estos tumores, ya fuese por sí solo o en

comunión con otras alteraciones que podrían explicar su comportamiento.

4.4. La tirosina-quinasa citosólica c-Src

La proteína pp60c-Src o c-Src es una tirosina quinasa citoplasmática de 60 kDa

codificada por el gen SRC, homólogo celular del oncogen viral v-Src. Esta enzima

participa en una gran variedad de cascadas de transducción de señales que influyen en la

proliferación, diferenciación, motilidad y supervivencia celular (37). Está

sobreexpresado en numerosas neoplasias humanas y se ha probado su interacción con la

vía PI3K-PTEN-AKT (128). Su activación proviene de los receptores de factores de

crecimiento como EGFR, HER-2, PDGFR (receptor de factor de crecimiento

plaquetario), FGFR (receptor del factor de crecimiento fibroblástico) y VEGFR

INTRODUCCIÓN

48

(receptor del factor de crecimiento vascular) (120, 128-129) o incluso directamente del

ESR1 (130). Ya en 1999, Castoria y colaboradores apuntaron a su función reguladora

no transcripcional en respuesta a estrógenos (131) y recientemente se ha vinculado con

el desarrollo de resistencia a trastuzumab (132). El c-Src también media la actividad

promovida por MUC1, una glicoproteína integral de membrana que está sobreexpresada

en el 90% de los tumores de mama, y que tiene como resultado la hiperactivación de las

vías PI3K y RAS-ERK (133). Los últimos hallazgos apuntan a que c-Src amplía su

efecto proliferativo fosforilando a p27 y, por tanto, reprimiendo su acción reguladora

sobre la ciclina E-Cdk2, lo que se traduce en la entrada de la célula en fase S (130).

Aunque algunos estudios en modelos celulares han demostrado una relación inversa

entre la expresión de c-Src y el ESR1 y que los inhibidores de c-Src parecen aumentar la

expresión de éste (134), también estudios in vitro han demostrado un aumento de

actividad de c-Src en líneas celulares de cáncer de mama luminales durante la

adquisición de resistencia a tamoxifeno (135) y su capacidad, en respuesta a señales del

EGFR, para potenciar la transcripción del ESR1 y del RP a través de la fosforilación de

la proteína WBP2 (ww-binding protein 2) (125). Por otra parte, se han desarrollado

herramientas terapéuticas que inhiben la actividad quinasa de c-Src con efectos en la

motilidad celular, en la dimerización Her2-EGFR y en la inhibición del desarrollo de

metástasis destructivas óseas (129, 136), demostrándose su ineludible función en la

adquisición de la capacidad invasiva junto con el EGFR (121). Estudios recientes han

demostrado aumento de expresión de c-Src en el 50-57% de los tumores luminales. Sin

embargo, esta sobreexpresión parece aportar a los tumores mayor sensibilidad al

tamoxifeno, presentando tasas menores de recaída y mayor supervivencia global (137).

A pesar de ser uno de los primeros proto-oncogenes descritos, sus mecanismos de

acción y las implicaciones clínicas de su expresión en el carcinoma de mama, y más

INTRODUCCIÓN

49

concretamente en el subtipo luminal, no están bien establecidos. Tampoco se conoce si

está implicado en las diferencias entre los luminales A y los luminales B.

4.5. El coactivador MED1

Otro de los posibles puntos de control sobre ESR1 es, precisamente, sobre su

actividad como factor de transcripción nuclear. Es en este aspecto donde destaca el

papel del Mediador o Med1. Este coactivador de la superfamilia de receptores nucleares

PPAR (de Peroxisome Proliferator-Activated Receptors) fue descrito en 1995 por Lee,

al intentar elucidar los mecanismos por los que los receptores hormonales de tiroides

activaban la transcripción génica (138). Se trata de una proteína de 205 KDa capaz de

ejercer como puente de unión entre los receptores nucleares y el ADN en respuesta a

factores de transcripción dependientes de ligando, y de facilitar el reclutamiento de las

proteínas accesorias necesarias para formar el complejo transcripcional (139-142).

A pesar del gran número de coactivadores de la transcripción descritos, MED1 ha

destacado por su papel en la regulación de p53 (143-144). En la célula fisiológica

MED1 es capaz de interactuar con el gen supresor de tumores a través de su dominio C-

terminal para actuar como cofactor de la activación de la transcripción sobre el

promotor de genes como BAX, o de la represión sobre los promotores de genes como

p21/Waf1 o IGFBP3. Sin embargo, al mismo tiempo regula la entrada en apoptosis

dependiente de p53, al promover la expresión de MDM2 y, como consecuencia, la

degradación de p53 en los proteosomas (145) y al actuar directamente sobre el promotor

de p53 para inhibir su transcripción (146). En las células tumorales, en cambio, las

mutaciones en p53 alteran esta interacción, de modo que MED1 deja de promover la

transcripción de MDM2 y de inhibir al promotor de p53. Como consecuencia se

INTRODUCCIÓN

50

produce una sobreexpresión del gen, que unida a la disminución de su proteolisis

dependiente de MDM2, resulta en altos niveles de la proteína p53 mutada (144, 146).

La regulación que realiza el MED1 sobre los promotores de MDM2 y p53 es

independiente de ambas moléculas y no está demostrado quién la dirige. En 2002, Misra

demostró que MED1 tenía sitios de fosforilación para las quinasas A y C (PKA y PKC)

y para las MAPK y propuso esta vía como la responsable de la regulación de su

actividad (147); unos años después, Pandey apuntó que ERK (la quinasa regulada por

señales extracelulares de la vía MAPK) fosforilaba a MED1 en los residuos T1032 y

T1457, sobre todo durante la fase G2-M del ciclo celular, promoviendo su entrada al

nucleolo y, por tanto, su actividad (148).

Dadas las diferencias en los niveles inmunohistoquímicos de p53 entre los

luminales A y los B, puede que MED1 esté jugando distintos roles en su biología.

Recientes estudios proponen a MED1 como el responsable de los altos niveles de

AURKA en las células tumorales. Esta serina/treonina quinasa, sobreexpresada en

varios tipos de cáncer, regula la función del centrosoma durante la fase M (149); se ha

propuesto como un marcador de proliferación mucho más sólido que el Ki67 y como un

posible marcador para la subclasificación de los luminales B (150), mostrándose como

un buen marcador pronóstico en los tumores de mama sin ganglios afectos (N0) (151).

En 1998, Yuan y su grupo demostraron que MED1 también mediaba la actividad

de otros receptores nucleares como el receptor de la vitamina D y el ESR1 de forma

dependiente de ligando (142). Sin embargo, meses más tarde Zhu y su equipo

demostraron, in vitro, que, aunque la asociación MED1-ESR1 se intensificaba en

presencia de E2, también existía en ausencia de éste e incluso en presencia del

antiestrógeno tamoxifeno (152). Detectaron, además, la sobreexpresión del mediador en

INTRODUCCIÓN

51

aproximadamente un 50% de los tumores primarios y las líneas celulares de cáncer de

mama estudiadas, y su amplificación génica en aproximadamente el 24% de los tumores

primarios y el 30% de las líneas celulares (152). Desde entonces, otros autores han

demostrado que el ESR1 depende del MED1 para ejercer su actividad transcripcional in

vitro (153-154) y Jiang y su equipo desarrollaron un modelo de ratón para demostrar in

vivo el papel ineludible que juega MED1 en la función del ESR1 como factor de

transcripción durante el desarrollo mamario y la diferenciación de las células luminales

(155). Estos hallazgos apuntan hacia la existencia de diversas rutas de sobreexpresión

del MED1 en el cáncer de mama y a su relevancia en la oncogénesis de los tumores

luminales. En los últimos años se ha retomado la importancia del MED1 en el cáncer de

mama y se ha propuesto como un peldaño fundamental en la progresión del tumor hacia

la resistencia a tamoxifeno. En 2012, Cui ha aportado estudios in vitro que demuestran

que en respuesta a tamoxifeno puede promoverse la activación de MED1 por

fosforilación, ya sea a través de HER2 o por la vía EGFR-ESR1. Este hecho origina su

entrada al núcleo y la activación de la transcripción de genes dependientes de

estrógenos, explicando el crecimiento tumoral en pacientes tratados con este fármaco

(156). Aunque queda claro que MED1 interviene en la regulación de la transcripción

dependiente de estrógenos y puede tener un papel importante en la biología de los

tumores de mama luminales, no hay estudios que aclaren su comportamiento y/o sus

alteraciones en series de muestras humanas.

INTRODUCCIÓN

52

5. Los microARNs y su implicación en la señalización estrogénica

5.1. Biogénesis y función de los microARNs

En 1993, Lee y sus colaboradores describieron la existencia de unas moléculas de

ARN de pequeño tamaño que interferían en la regulación génica post-transcripcional de

la biología del gusano Caenorhabditis elegans (157). Los microARNs (o miRNAs, del

inglés micro-ribonucleic acid) son un componente fundamental de los mecanismos de

regulación génica. Se trata de un gran grupo de ARNs de pequeño tamaño (21-22

nucleótidos) que no codifican proteínas (158-159).

La mayoría de los microARNs (alrededor de un 37%) son transcritos por la ARN

polimerasa II en forma de una molécula conocida como microARN primario o pri-

microARN. Esta molécula consta de entre unos cientos y miles de nucleótidos unidos a

una molécula de CAP (7-metil-guanosina) en 5’ y poliadenilado en 3’, de forma similar

a los ARN mensajeros (160-162). El pri-microARN, permanece en el núcleo para ser

procesado en transcritos más cortos de aproximadamente 70 nucleótidos, conocidos

como microARNs precursores o pre-microARNs, por un complejo proteínico específico

que lidera la enzima ARNasa III Drosha. Todos los microARNs maduros originados a

partir del mismo pri-micro-ARN policistrónico se consideran componentes de un

cluster (163). Los clusters de microARNs están muy conservados entre las distintas

especies, sugiriendo una presión evolutiva para mantener su organización, quizás por las

importantes funciones reguladoras que ejercen.

Otros microARNs, conocidos como miRtrones, se encuentran codificados en el

interior de intrones génicos, se transcriben con el gen que les acoge y se liberan en el

núcleo en forma de pre-microARNs durante el proceso de splicing de su mensajero

INTRODUCCIÓN

53

(164). Por último, un pequeño porcentaje de estas moléculas están codificadas entre

secuencias repetitivas en el ADN y son transcritos independientemente a pre-

microARNs por la enzima ARN polimerasa III (165).

El transportador específico Exportin-5 es el encargado de trasladar los pre-micro-

ARNs al citoplasma (166). Una vez allí son recibidos por la enzima ARNasa Dizer, que

vuelve a procesarlos dando como resultado pequeñas cadenas de doble hebra de 20-22

nucleótidos de ARN (167). Éstas se incorporan entonces al complejo-RISC, formado

por varias enzimas (168), donde una de las dos hebras suele ser degradada y la otra, que

es el miRNA maduro, ayudado por la enzima catalítica del complejo-RISC AGO2, ya

puede ejercer su función reguladora sobre la traducción de sus genes diana (167, 169-

171) (Figura 7).

La función reguladora de los microARNs puede estar dirigida hacia la inhibición

de la traducción del mensajero mediante la unión a su región 3’UTR, o bien a marcar la

molécula para que sea degradada (159, 172-173). De cualquiera de las formas, el

resultado es una disminución de la cantidad de proteína del gen diana en cuestión. La

interacción con el gen diana se basa en la complementariedad incompleta de la

secuencia de los nucleótidos 2 a 7 del miRNA con la región 3’UTR del mensajero (159,

172-173). Esta secuencia se conoce con el nombre de “secuencia semilla” (o SS, del

inglés Seed Sequence). La SS no es específica de cada microARN, sino que se repite en

todos los miRNAs de una misma familia que cooperan en la regulación de sus genes

diana (174). Por tanto, cada gen diana es objeto de regulación de múltiples miRNAs y

cada miRNA posee múltiples genes diana, lo que incrementa exponencialmente la

capacidad reguladora de estas moléculas.

INTRODUCCIÓN

54

Actualmente hay descritos 1881 precursores y 2661 microARNs maduros en el

ser humano (datos extraídos el 31 de octubre de 2015 del registro MiRBase (175-179)).

Figura 7: Biogénesis de los microARNs. Imagen modificada a partir de la figura 1

de Sotiropoulou et al. Emerging roles of microARNs as molecular switches in the

integrated circuit of the cancer cell. RNA (2009), 15:1443-1461(180).

Los miRNAs actúan como reguladores de la expresión génica durante el

desarrollo y la diferenciación. Además, participan coordinados con los factores

transcripcionales c-Myc, E2F y p53, y regulan a elementos tan importantes como las

ciclinas en el control del ciclo celular. En general, a través de la regulación de sus

dianas génicas, controlan las rutas de señalización celular (181-183).

La alteración de sus patrones de expresión se ha vinculado a procesos como la

inflamación, la respuesta al estrés celular, la apoptosis y la invasión, lo que les ha dado

un papel fundamental en la oncogénesis y la progresión del cáncer (159, 180-182, 184-

187).

INTRODUCCIÓN

55

5.2. Los microARNs en el cáncer de mama y su relación con el ESR1

En el cáncer de mama se han documentado alteraciones en los patrones de

expresión de numerosos miRNAs que deben estar participando en la oncogénesis de

estos tumores (188-189).

Las alteraciones descritas se han vinculado a aspectos tan variados como la

susceptibilidad al cáncer de mama (190), el fenotipo tumoral (61, 63, 191), los estadíos

tumorales (185, 192-193), la agresividad tumoral, la metástasis ganglionar (194-195) y

la recidiva local o a distancia (196). En los últimos años se ha incrementado

notablemente la publicación de hallazgos que ponen de manifiesto la participación de

estas moléculas en el cáncer de mama (Figura 8).

Figura 8: Publicaciones registradas en PubMed sobre la participación de los

microRNAs en el cáncer de mama. Datos tomados de

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/resultsbyyear el 31 de octubre de 2015.

INTRODUCCIÓN

56

En los últimos años se discute su validez como marcadores de metástasis (197).

Así mismo, se han señalado como posibles marcadores para la selección de terapias

individualizadas (198), al verse implicados en los mecanismos de respuesta a fármacos,

como es el caso del miR-21 y el alcaloide matrina (199), del miR- let-7a y el

antidiabético metformina (200) o del miR-let-7f y el inhibidor de aromatasa letrozol

(201). Paralelamente también participan en la adquisición de resistencia a fármacos

(202) como paclitaxel (203-204), tamoxifeno (205-209), taxol (210) o fulvestrant (211).

Incluso se han relacionado con la respuesta a radioterapia (212).

Recientemente, se han demostrado cambios en sus concentraciones circulantes,

proponiéndose su utilización como marcadores tumorales (213-214), incluso

específicamente en tumores luminales tempranos (215-216).

Tal como introdujimos en el apartado correspondiente, el ESR1 se ha visto

inmerso en la regulación de varios microARNs, de forma que es capaz de favorecer

directamente la transcripción de algunos y reprimir la expresión de otros a través de la

regulación de sus proteínas reguladoras. Paralelamente, también él mismo se ve

sometido a la regulación de estas moléculas, estableciéndose una red de señalización

pro- y antiestrogénica que puede derivar en su estimulación o su represión en función de

las señales que reciba la célula y de las vías de señalización activas (41, 44, 46, 64, 217-

220). Incluso se ha señalado su participación en la regulación de las proteínas

implicadas en la biogénesis y en la función de los miRNAs (221).

En nuestro estudio hemos seleccionado un conjunto de 4 miRNAs y 1 pri-

microARN cuya alteración ha sido previamente descrita en el cáncer de mama, por su

relación con el ESR1 y su participación en las vías de señalización exploradas.

INTRODUCCIÓN

57

5.3. El pri-miR-17~92

El pri-miRNA-17~92 codifica uno de los clusters policistrónicos de miRNAs

mejor caracterizado. Está codificado en el cromosoma 13 y los miRNAs maduros que

comprende son el miR-17, el miR-18a, el miR-19a, el miR-20a, el miR-19b-1 y el miR-

92a. A pesar de estar altamente conservado en todos los vertebrados, durante su

evolución temprana se originaron dos anomalías cromosómicas que afectaron a este

cluster: una duplicación de la región implicada, que dio lugar al cluster parálogo miR-

106b~25 (localizado en el humano en el cromosoma 7, dentro del intrón 13º del gen

MCM7), y otra duplicación/deleción que dio lugar al cluster parálogo miR-106a~363

(localizado en el humano en el cromosoma X) (Figura 9).

Figura 9: (a) Representación esquemática del cluster miR-17~92 y sus clusters

parálogos: miR-106b~25 y miR-106a~363. (b) Los microARNs maduros originados se

engloban en 4 familias: miR-17, miR-18, miR-19 y miR-92. Imagen tomada de: The

microRNA-17-92 family of microRNA clusters in development and disease. Concepcion

et al. Cancer J. 2012;18(3):262-267 (222).

INTRODUCCIÓN

58

La regulación de la transcripción del pri-miR-17~92 es estrógeno-dependiente,

coordinada por el ESR1 (64, 217), a través de la actividad de c-Myc sobre el locus

c13orf25 en el cromosoma 13q31. 3, si bien se ha señalado que los factores de

transcripción de la familia E2F también pueden unirse a su promotor (183) de forma

dependiente de p53 (223). Sin embargo, se ha descubierto que miR-17 y miR-20 son

capaces de reprimir la traducción de E2F1, por lo que se propone como un bucle

regulador en la señalización de la vía c-Myc-E2F (223-225).

Aunque los genes diana del cluster no están bien definidos, tratándose en la

mayoría de los casos de estudios in silico, se ha demostrado el papel regulador de sus

funciones en múltiples aspectos de la biología celular, no obstante existe una gran

controversia sobre si su actividad se ajusta a un perfil pro-oncogénico o supresor de

tumores (225-227).

No son pocos los estudios que apuntan al posible carácter supresor tumoral de

algunos de sus microARNs maduros, como el miR-18a, que reprime la traducción de K-

ras (228) y de ESR1 (218), o el miR-17 y el miR-20, que reprimen la traducción de la

ciclina D1 (229), de E2F1 (183) y de AIB1 (230). Sin embargo, se ha demostrado que

también son capaces de promover la oncogénesis en muchos de sus aspectos más

importantes (Figura 10) (231-233), incluyendo la apoptosis (el miR-19 reprime la

expresión de PTEN), la proliferación (miR-17 y miR-20a actúan sobre los inhibidores

del ciclo p21 y p57) y la angiogénesis (controlando la expresión de factores

antiangiogénicos como el TSP-1 y el CTGF, ejercida por el miR-18a y el miR-19

respectivamente) (222, 227, 231, 234-239).

El papel de este grupo de miRNAs en cáncer de mama es igualmente

controvertido y sus niveles de expresión se han visto tanto disminuidos como

INTRODUCCIÓN

59

aumentados en esta neoplasia. Kim y su grupo, han demostrado recientemente que el

pri-mir-17~92 puede jugar un papel oncogénico en el cáncer de mama a través de la

represión del represor transcripcional ZBTB4, cuya expresión se ha correlacionado con

la supervivencia libre de enfermedad (240). Yu destacó en líneas celulares de esta

neoplasia la regulación ejercida por el miR-17 y el miR-20 sobre la ciclina D1 (229) y

también se demostró que el miR-17 conseguía la disminución del crecimiento

dependiente de estrógenos a través de la represión de AIB1, un oncogen frecuentemente

sobreexpresado en cáncer de mama que actúa como coactivador del ESR1 en su

actividad como factor de transcripción (44, 230). Sin embargo, la gran mayoría de los

estudios realizados se han centrado en líneas celulares, habiéndose realizado muy pocos

estudios en muestras humanas, y no se conoce su comportamiento en función del

subtipo tumoral.

Figura 10: Representación esquemática del bucle de regulación c-Myc-E2F-pri-

miR-17~92 y de las funciones de los microARNs maduros del cluster. Imagen

modificada a partir la Figura 2 de: The microRNA-17-92 family of microRNA clusters in

development and disease. Concepcion et al. Cancer J. 2012;18 (3):262-267 (222).

INTRODUCCIÓN

60

5.4. El miR-Let-7a

El micro-ARN-Let-7a también participa en la regulación de la expresión de c-Myc

y por tanto, indirectamente, en la del pri-miR-17~92 (241). Los microARNs de esta

familia se caracterizaron inicialmente como genes supresores de tumor en cáncer de

pulmón, por regular la expresión del proto-oncogen RAS (242). Recientemente se han

demostrado sus múltiples funciones anti-oncogénicas en líneas celulares, reprimiendo

tanto la supervivencia celular, como la invasión y la adhesión celular (243). También se

ha caracterizado su función reguladora sobre la expresión de la interleucina 6 (IL6), por

lo que al inhibirse el miR-Let-7, su expresión aumenta y con ella la expresión del NFκβ

y la activación, a través de STAT3, de la inflamación asociada al tumor (244-245). En

líneas celulares de mama se ha observado la implicación del miR-Let-7a en la

incapacitación de las células para la migración y la invasión a través de la represión del

receptor de quimiocinas C-C tipo 7 (CCR7), que actúa en la adquisición de las

capacidades quimiotácticas de las células metastásicas y está sobreexpresado en tumores

de mama (246), y sobre BACH1, que induce la expresión de metaloproteinasa 1

(MMP1), osteopontina (OPN) y el receptor C-X-C de quimiocinas tipo 4 (CXCR4),

todos ellos involucrados en la metástasis ósea. En los últimos año se ha descrito incluso

la importancia de esta familia en el mantenimiento de las células progenitoras de cáncer

de mama, en las que los miR-Let-7 se mostraron reprimidos y esto propiciaba la

sobreexpresión de Ras, y consecuentemente la activación de p-Ras y p-ERK (247).

La represión que parece sufrir esta familia de miRNAs parece estar regulada

desde múltiples vías y por distintos mecanismos. Recientemente, se ha descrito en

líneas celulares de mama la existencia del polimorfismo rs7963551, localizado en la

secuencia de unión del miR-Let-7, que lo incapacita para su función represiva sobre

genes como RAD52, proteína reparadora de la doble hélice que tiene un papel

INTRODUCCIÓN

61

fundamental en la recombinación génica y se ha visto involucrada en la adquisición de

resistencia a radioterapia (190). También en tumores mamarios, se ha descrito

recientemente la disminución del número de copias del microARN-Let-7a-2 (248). En

el año 2007 se demostró la regulación de esta familia de microARNs por c-Src en

respuesta a estrógenos, a través de la proteína Lin28 (203, 244-245, 249), y es

precisamente la inhibición de esta vía el mecanismo propuesto por el que las células

responden al inhibidor de la proteína quinasa Raf (RKIP) (250). Asimismo, se proponen

mecanismos de regulación epigenéticos, como el miR-107 (251) o incluso la metilación

de su promotor (252-253), observada en el 45% de los casos esporádicos de cáncer de

mama, mientras que parece sobreexpresarse en el 64% de los casos de cáncer de mama

familiar (254). Además, se ha explicado la respuesta de líneas celulares de cáncer de

mama a metformina por su capacidad de sobreexpresar el miR-Let-7a (200). De

cualquier modo, su importancia en el cáncer de mama parece clara (255) y es destacable

su posible función en los tumores luminales, pues se ha señalado su implicación en la

respuesta a tamoxifeno por mediar la represión de la señalización del ESR1 (66, 209).

5.5. El miR-206

Otro de los microARNs caracterizados por jugar un papel anti-oncogénico es el

miR-206, destacado en distintas neoplasias por su papel proapoptótico y antimetastásico

y su posible aplicación terapéutica (256-258). La relación del miR-206 con el ESR1 es

compleja y bidireccional. El miR-206 reprime la expresión del ESR1 uniéndose a dos

sitios específicos de la región 3’UTR de su ARN mensajero (hERα1 y hERα2) (63, 259-

260), así como de sus coactivadores SRC-1, SRC-3 y GATA-3 (260) e inhibe la

proliferación dependiente de la señalización estrogénica en líneas celulares (261). Al

mismo tiempo, el ESR1 inhibe la transcripción del miR-206 (259-260). Se le ha

INTRODUCCIÓN

62

identificado como responsable del cambio de fenotipo luminal A a TN/B de la línea

celular de mama MCF-7 en respuesta a la señalización del EGFR (262), y a través de la

represión de los mensajeros de los coactivadores de la señalización estrogénica SRC1,

SRC3 y GATA3, así como del oncogen Ciclina D1 (263) y el marcador asociado a

estimulación con estrógenos PFKFB3 (264). Sin embargo, todos los que han estudiado

la interrelación entre ESR1 y el miR-206 en muestras de tumores de mama humanos se

han centrado en las diferencias del fenotipo ER (+) respecto al fenotipo ER (-). Las

implicaciones que pudiese tener esta co-regulación dentro del subtipo luminal podrían

ayudar a entender los distintos comportamientos de estos tumores.

5.6. El miR-222

El miR-222, sin embargo, ha destacado por sus funciones pro-oncogénicas. Así,

es capaz promover la progresión del ciclo celular reprimiendo la expresión de su

inhibidor p27 (206, 265-268). El miR-222 también participa como factor anti-

apoptótico al ser responsable de promover la degradación del ARNm de PTEN,

disminuyendo la concentración de la molécula y, por consiguiente, su traducción a

proteína, promoviendo así la sobreactivación de la vía PI3K (212, 269-272).

Igualmente, inhibe la traducción del inhibidor de metaloproteinasas 3 (TIMP3 del inglés

Tissue Inhibitor Metalloproteinasa 3) (269, 273-274) y de RECK (275), inhibidor de la

secreción de las MMP-9 y 2 y de su función, facilitando la adquisición de fenotipos

invasivos y habiéndose relacionado directamente con la respuesta a tamoxifeno (276).

La regulación de este microARN oncogénico se ha asignado a oncogenes como KRAS

(277) o MET (269) y a la vía ERK (278). Además se ha señalado como uno de los

responsables del fenotipo agresivo de los tumores de mama TN/B (279-280), y de la

adquisición de resistencias frente a fulvestrant (211) y tamoxifeno (206, 208, 281). Se

INTRODUCCIÓN

63

ha descrito la sobreexpresión del miR-222 en carcinomas ductales invasivos y en líneas

celulares resistentes a tamoxifeno (208, 282-283). Se ha demostrado que es capaz de

inhibir la traducción del ESR1 (62, 208) y modular a su represor N-COR (44), y que, al

mismo tiempo, el ESR1 reprime su expresión (62). La alteración de este bucle auto-

regulado por otros factores podría estar involucrada en las diferencias entre los

luminales A y los luminales B.

5.7. El miR-21

Otro de los microARNs más estudiados es el miR-21 (284). Se ha focalizado su

importancia en su capacidad represiva sobre PTEN (285-286), pero posee otros genes

diana como el ligando de los receptores NOTCH, JAG1 (287), la tropomiosina 1

(TPM1), el supresor de metástasis Maspin, el pro-apoptótico PDCD4 (288), el gen

supresor tumoral RHOB (289) y, compartiendo diana con el miR-222, el TIMP3(290).

Li y su grupo han demostrado en la línea celular de cáncer de mama MCF-7, que la

función anticancerígena del alcaloide matrine se consigue a través de la represión del

miR-21, que tiene como consecuencia el aumento de las proteínas p21, p27 y PTEN,

recuperando el control del ciclo celular y de la apoptosis (199). Han y sus

colaboradores, también apuntan a la acción represiva del miR-21 sobre PTEN como la

responsable de la transición epitelio-mesenquimal y de la desdiferenciación a células

progenitoras cancerígenas (CSC o cancer stem cell) de las líneas celulares de cáncer de

mama MDA-MB-231 (291) y MCF-7 (292-293). Sin embargo, el papel de este

microARN es controvertido debido a que también es capaz de inhibir la traducción de

oncogenes como el E2F2 y el c-Myc (amplificado en aproximadamente un 40% de los

tumores de mama y responsable de la regulación de la expresión de microRNAs como

el cluster miR-17~92) (46, 294).

INTRODUCCIÓN

64

La participación de este microARN en el cáncer de mama se ha documentado con

numerosos estudios sobre líneas celulares, vinculándose a la pérdida de expresión de

PTEN, así como en tumores de mama, en los que se ha asociado a metástasis linfática,

baja supervivencia y estadio tumoral avanzado e incluso a valores de Ki67>10% (195,

295). Sus niveles se han mostrado tanto sobreexpresados (46, 191) como inhibidos

(296). Se ha señalado su participación en la adquisición de resistencia a la doxorubicina

(297) y a trastuzumab (298) a través de su regulación sobre PTEN, y se ha propuesto el

uso de inhibidores específicos en terapia combinada con taxol como una alternativa

terapéutica que incrementa el éxito del quimioterápico (210). Sin embargo, se ha

observado su sobreexpresión en respuesta al arresto del ciclo celular promovido por el

fitoquímico 3, 3’-diindolylmetano (DIM) (299) y al tratamiento con el ácido holo-trans-

retinoico (300). Así mismo, se está valorando la utilidad diagnóstica de la cuantificación

de sus niveles circulantes (213-216, 301). Algunos autores han descrito su represión

derivada del tratamiento con E2 (64, 296), mientras que no se ha conseguido con el

tratamiento con tamoxifeno, lo que indica que la transcripción del miR-21 está regulada

por el ESR1 (46, 64, 287, 296). Sin embargo, Bhat-Nakshatri y su grupo demostraron

que el ESR1 podía sobreexpresar o reprimir el miR-21 en función del estado de

activación de Akt (46). Este miRNA está reprimido en líneas celulares de tumor de

mama resistentes a tamoxifeno (44, 206), mientras que aumenta en pacientes tratados

con este inhibidor del ESR1 y está sobreexpresado en la línea celular de mama tumoral

MCF-7 (64). También se ha demostrado una mayor expresión del miR-21, entre otros

miRNAs, en casos con tumores bilaterales (302) e incluso se ha descrito su

participación en la resistencia a la radioterapia (303). Sin embargo, no se ha estudiado

su comportamiento específicamente en el subtipo luminal.

INTRODUCCIÓN

65

6. Justificación

Los carcinomas infiltrantes de mama con receptores hormonales positivos

constituyen un grupo heterogéneo, con pronóstico en general más favorable y respuesta

variable a tratamiento hormonal (fenotipos luminal A y B). Sin embargo, existe un

subgrupo que presenta peor pronóstico y peor control de la enfermedad con tratamiento

hormonal, por lo que se hace necesaria la quimioterapia adyuvante.

Con este estudio pretendemos evaluar en el subtipo luminal la implicación de

alteraciones moleculares descritas frecuentemente en el cáncer de mama y su

interacción con la señalización estrogénica. Así pues, hemos analizado en una serie de

tumores luminales las alteraciones moleculares destacadas en los RTK, la vía PI3K, la

quinasa c-Src y el mediador de la transcripción MED1, así como los patrones de

expresión de microARNs seleccionados por su relación con el ESR1 y su implicación

en la regulación de las vías moleculares exploradas.

Pretendemos aportar nuevos datos sobre la implicación de estos marcadores

moleculares en las diferencias entre los luminales A y los luminales B, así como su

aplicación como factores pronósticos para estos tipos de tumores mamarios.

INTRODUCCIÓN

66

HIPÓTESIS Y OBJETIVOS

67

HHHIIIPPPÓÓÓTTTEEESSSIIISSS

Los factores moleculares efectores de las vías celulares reguladas por la acción

estrogénica, participan en mayor o menor grado en la oncogénesis de los tumores

luminales de mama. Además, estos factores se alterarásn en función de las

características del tumo, afectando a sus características patológicas y a su

comportamiento clínico. Como los microARNs muestran distintos comportamientos en

función del tipo celular y su contexto, su coexistencia con otras alteraciones analizadas

también podría condicionar sus patrones de regulación y por tanto sus funciones en la

célula tumoral.

Esta información, en combinación con otros criterios como la proliferación

celular y el estado de p53 contribuirá a identificar grupos con mayor riesgo a recidivar o

supervivencia libre de enfermedad menor, en los que sería necesaria la aplicación de

alternativas terapéuticas más agresivas y seguimientos clínicos más estrictos.

68

OOOBBBJJJEEETTTIIIVVVOOOSSS

Objetivos Principales

1.- Analizar la participación de un panel de genes y microARNs asociados a la

señalización estrogénica en los carcinomas infiltrantes de mama con fenotipo

luminal.

2.- Comparar el panel en función de que el fenotipo sea luminal A o B.

3.- Investigar el valor pronóstico de estos factores moleculares frente a la

supervivencia libre de enfermedad y su validez en función del tiempo de

seguimiento

Objetivos Secundarios

a) Determinar la frecuencia de las mutaciones “hotspot” en el gen PI3KCA en

nuestra serie.

b) Describir las alteraciones en los niveles de expresión de los receptores tirosina-

quinasa IGF1R y EGFR, de la quinasa citosólica c-Src y del mediador MED1, en

relación con las características clínico-patológicas de nuestra serie y en función

del subtipo luminal.

c) Describir las alteraciones en el patrón de expresión de los miRNAs relacionados

con el receptor de estrógenos ESR1, en relación con las características clínico-

patológicas de nuestra serie y en función del subtipo luminal.

d) Estudiar las asociaciones entre las alteraciones descritas en los objetivos

secundarios a-c, en relación con las características clínico-patológicas de nuestra

serie y en función del subtipo luminal.

e) Evaluar el significado pronóstico de estas alteraciones y su valor en la

identificación de grupos de riesgo en función del tiempo de seguimiento.

MATERIAL Y MÉTODOS

69

MMMAAATTTEEERRRIIIAAALLL YYY MMMÉÉÉTTTOOODDDOOOSSS

1. Diseño y muestreo

El presente proyecto se realizó en plena colaboración con el Servicio de Anatomía

Patológica (SAP) del Hospital General Universitario de Alicante (HGUA). Dadas las

características del estudio, fue diseñado como un estudio transversal retrospectivo. Los

casos fueron seleccionados de la base de datos de cáncer de mama del SAP sobre

pacientes intervenidos en el HGUA entre el año 2000 y 2006. Así mismo se

seleccionaron 10 pacientes de cirugía de reducción mamaria sin patología previa para la

obtención de tejido normal que pudiese ser utilizado para la obtención de los valores de

referencia de las variables moleculares.

A pesar de que todos los diagnósticos eran anteriores a la publicación de la Ley

14/2007, de 3 de julio, de Investigación biomédica, el Biobanco del HGUA solicitó al

Comité de Ética (CEIC) de nuestra institución la exención de consentimiento informado

para este grupo de pacientes, que fue concedido con fecha 9 de junio de 2010.

Todos aquellos datos que podían comprometer la confidencialidad de las

pacientes incluidas en el estudio fueron eliminados por el patólogo responsable tras

obtener el listado de pacientes. Además, la utilización de dichas muestras para el

MATERIAL Y MÉTODOS

70

presente estudio no modificó de ninguna manera la actitud terapéutica hacia las

pacientes.

Las muestras tumorales y sanas fueron obtenidas de bloques de tejido fijado en

formalina al 10% e incluido en parafina (FFPE) según la metodología de rutina en el

SAP.

1.1 Criterios de inclusión

- carcinomas infiltrantes de mama

- expresión inmunohistoquímica positiva para receptores de estrógenos y

progesterona

- expresión inmunohistoquímica negativa para Her-2 o no confirmada por los

estudios de hibridación in situ de fluorescencia (FISH) o cromogénica (CISH).

1.2 Criterios de exclusión

- pacientes de sexo masculino

- pacientes con subtipos histológicos especiales (poco frecuentes, como los de

células en anillo de sello, los adenoides quísticos, cribiformes...)

- pacientes que hayan recibido tratamiento neoadyuvante

- tejido insuficiente que impida obtener cilindros para la obtención del material

genético

- muestras que no cumpliesen los mínimos de cantidad y calidad del material

genético extraído.

1.3 Muestra

Se seleccionaron 240 casos que cumplían los criterios de inclusión y exclusión.

De ellos se perdieron 20 casos por problemas de cantidad o de calidad del ADN y/o del

ARN, alcanzando una muestra final de 220 casos.

MATERIAL Y MÉTODOS

71

2. Variables a estudio

2.1 Variable de identificación

Las muestras fueron anonimizadas asignándoles el código generado

automáticamente por el programa Access (Microsoft Office 97-03) al incluirlas en el

cuaderno de recogida de datos del proyecto.

2.2 Variables clínicas

Fueron obtenidas de la base de datos del SAP y de la historia clínica de los

pacientes.

- Edad al diagnóstico (años): categorizada en <50 vs ≥50 años.

- Periodo Libre de Enfermedad (PLE): meses a partir de la cirugía curativa hasta

la detección del primer episodio de recidiva o, en su defecto, hasta el éxitus de la

paciente. Se evaluó en dos variables separadas:

* PLEc: meses a partir de la cirugía curativa hasta la detección del primer

episodio de recidiva o, en su defecto, hasta el éxitus de la paciente, teniendo en cuenta

un periodo máximo 60 meses (5 años).

* PLEl: meses a partir de la cirugía curativa hasta la detección del primer

episodio de recidiva o, en su defecto, hasta el éxitus de la paciente, teniendo en cuenta

el tiempo de seguimiento completo.

- Supervivencia global (SG): meses a partir de la cirugía curativa hasta el éxitus

de la paciente.

2.3 Variables patológicas

Todas fueron obtenidas de la base de datos del SAP.

MATERIAL Y MÉTODOS

72

- Tamaño máximo del componente infiltrante en mm (TT): categorizada en ≤20 vs

>20 mm.

- Tipo histológico (OMS 2003): Carcinoma Ductal Infiltrante (CDI NOS),

Carcinoma Lobulillar Infiltrante (CLI).

- Fenotipo: Luminal A (LA) o Luminal B (LB). En el presente estudio hemos

tomado como referencia los marcadores Ki67 y p53, pero tomando como puntos de

corte aquellos que en la práctica clínica de nuestro hospital han demostrado aproximar

más la clasificación luminal a las curvas de supervivencia establecidas (8). De esta

forma, se clasifican como tumores luminales B aquellos con una expresión

inmunohistoquímica nuclear de Ki67≥15% y/o una expresión inmunohistoquímica

nuclear de p53 ≥15% (304).

- Grado de diferenciación nuclear (Nottingham/Tenovus Primary Breast Cancer

Study). La modificación Nottingham del índice de Scarff-Bloom-Richardson incluye 3

categorías:

Tumores bien diferenciados (grado I).

Tumores moderadamente diferenciados (grado II).

Tumores pobremente diferenciados (grado III).

- Necrosis tumoral (si, no).

- Invasión linfovascular (presencia de células tumorales en espacios

endotelizados) (si, no).

- Infiltración de piel (si, no).

- Estado ganglionar (EG):

MATERIAL Y MÉTODOS

73

Ganglios analizados

Ganglios afectos: se categorizó en los grados N.

Metástasis en ganglios (si, no).

2.4 Variables inmunohistoquímicas (IHQ)

La valoración inmunohistoquímica se realizó en microscopio óptico de

multiobservación. Se cuantificaron al menos 1000 células por dos observadores de

forma independiente y el resultado se expresó en porcentaje de células tumorales

positivas. Se cuantificó la cifra media de los dos observadores. En caso de discrepancia

mayor al 10% se reevaluó.

- Porcentaje de células tumorales positivas para receptores de estradiol (RE).

- Porcentaje de células tumorales positivas para receptores de progesterona (RP).

- Actividad proliferativa y ciclo celular: Evaluación IHQ de la proliferación

celular (Ki67, clon MIB1, Dako); se consideró actividad proliferativa alta cuando el

porcentaje de células positivas para Ki67 fue ≥15%.

- Expresión IHQ de p53 (clon D07, Dako): evaluación IHQ de la positividad

nuclear. Se consideró afectación de la función de p53 alta cuando el porcentaje de

células positivas para p53 fue ≥15%.

MATERIAL Y MÉTODOS

74

2.5 Variables moleculares

Las variables moleculares analizadas fueron:

Presencia de mutaciones en el gen PI3KCA.

Patrones de expresión génica de los genes MED1, IGF1R, EGFR, ESR1 y c-Src.

Patrón de expresión del microARN primario pri-miR-17~92.

Patrones de expresión de los microARNs miR-let-7-a, miR-21, miR-206, miR-

222.

2.5.1 Extracción de ADN

Se seleccionaron 2 cilindros de bloques de tejido parafinado de distintas zonas del

tumor, con una celularidad tumoral superior al 30%. Los cilindros fueron

microdisecados manualmente y posteriormente deparafinados con xilol y rehidratados

(Protocolo 1). El tejido recuperado se sometió primero a una homogeneización

mecánica en frío (nitrógeno líquido) con pistilos y posteriormente a una

homogeneización enzimática con proteinasa K en un tampón de lisis celular (Qiagen)

(Protocolo 2).

Tras someter el homogeneizado a 90ºC durante 1 hora para revertir los

entrecruzamientos provocados por la fijación en formalina, que podrían disminuir la

eficiencia de la extracción, se procedió a la extracción de ADN en un kit basado en

columnas con membranas de sílice (QiaAmp de Qiagen). Este método se basa en la

adsorción y desorción de los ácidos nucleicos en presencia de sales caotrópicas. Bajo

condiciones nativas, el ADN está recubierto de una capa hidratante de moléculas de

agua que mantienen su solubilidad en soluciones acuosas. Con la adición de iones

caotrópicos, se destruye esta ordenada estructura de moléculas de agua de la capa

MATERIAL Y MÉTODOS

75

hidratante, creándose un entorno hidrofóbico alrededor del ADN. Bajo estas

condiciones hidrofóbicas, el ADN se une a la membrana de sílice de la columna,

mientras que el ARN, las proteínas, los metabolitos y otros contaminantes eluyen de la

columna al centrifugar (Protocolo 3).

Una vez extraído el ADN fue cuantificado y evaluado en el Nanodrop 1000

(Thermo Scientific). Este espectrofotómetro es capaz de cuantificar ácidos nucleicos y

proteínas con 1µL de muestra. Ésta se pipetea en el extremo de un cable de fibra óptica

(pedestal inferior). Un segundo cable de fibra óptica (pedestal superior) se pone

entonces en contacto con la muestra de líquido haciendo que el líquido, por la tensión

superficial, forme una columna que comunica ambos extremos de fibra óptica. La

columna se modifica para que mida 1 mm y 0,2 mm de alto, longitudes a las que se

realizan medidas de la absorbancia de la muestra. Una lámpara de flash de xenón

pulsado proporciona la fuente de luz y el espectrómetro utiliza una matriz lineal CCD

para analizar la luz después de pasar a través de la muestra. Se tomó la concentración en

ng/µL basada en la absorbancia a 260nm. El software utiliza la Ley de Beer para

calcularla. Además se utilizaron los ratios 260/280 y 260/230 para valorar la

contaminación por proteínas (280 nm) y otros contaminantes como las sales de guanidio

presentes en los reactivos de lavado (230 nm). Los ratios aceptados siempre fueron

iguales o superiores a 1,8.

Las muestras de ADN fueron modificadas para que su concentración rondase los

80-120 ng/µL. Aquellas con una concentración mayor fueron diluidas. Aquellas con una

concentración mayor de 50 ng/µL pero menor de 80 ng/µL fueron concentradas en el

SpeedVak (60ºC durante 1 hora) y resuspendidas en un volumen de agua calculado en

función de su cantidad total de ng de ADN. Para algunos de los casos con muestras de

ADN con una concentración menor de 50 ng/µL fue posible la obtención de más

MATERIAL Y MÉTODOS

76

material para una nueva extracción. Para aquellos en los que no fue posible obtener más

material se realizó una amplificación global del ADN genómico utilizando el kit

específico para muestras parafinadas RepliG FFPE (Qiagen). Este método está basado

en la tecnología Whole Genome Amplification, una amplificación de larga duración que

utiliza una polimerasa que actúa a 37ºC y es capaz de polimerizar fragmentos de más de

2 Kb. Para poder utilizar ADN procedente de muestras FFPE es necesario el ligamiento

previo de los fragmentos de ADN (Protocolo 4). Una vez amplificado el ADN fue

reevaluado en el Nanodrop 1000. Los casos en los que la calidad o la cantidad del ADN

no fueron suficientes fueron excluidos del estudio.

2.5.2 Análisis de mutaciones “hotspot” en PI3KCA

Se realizó el análisis de 3 mutaciones hotspot, seleccionadas de la literatura por su

alta frecuencia en cáncer de mama y sus connotaciones biológicas, correspondientes a

los dominios accesorio (helical) y catalítico (quinasa), localizadas:

en el exón 9:

- Mutación G1624A (E542K)

- Mutación G1633A (E545K)

en el exón 20 la mutación A3140G (H1047R).

La tecnología seleccionada para el análisis fue la amplificación por PCR a tiempo

real (qPCR). Este tipo de PCR consiste en incluir un fluoróforo para poder seguir la

evolución de la amplificación en el transcurso de los ciclos de reacción. Una de las

estrategias posibles consiste en la adición a la mezcla de reacción de un oligonucleótido

de unos 8 pb conocido como sonda, que es complementario a la zona central del

amplicón. La sonda tiene unido en su extremo 5’ un fluoróforo y en su extremo 3’ un

quencher (molécula capaz de absorber la energía del fluoróforo en su estado excitado,

MATERIAL Y MÉTODOS

77

devolviéndolo a su estado fundamental, y liberar la energía en forma de calor) del tipo

no fluorescente (Non Fluorescent Quencher o NFQ) y unido al NFQ una molécula

MGB®, compuesto que se intercala en el surco pequeño de la doble hebra que forma el

ADN y la sonda durante la etapa de hibridación de la PCR aumentando la temperatura

de fusión y la eficiencia de la reacción. De esta forma, mientras la sonda está intacta e

hibridada al ADN no puede existir emisión de fluorescencia. Durante la etapa de

elongación de la hebra copia, la polimerasa, al alcanzar la doble hebra generada a partir

de la hibridación de la sonda, corta ésta nucleótido a nucleótido con su actividad 5’-

exonucleasa para poder continuar con la polimerización. En este momento el fluoróforo

es liberado y se aparta del quencher por difusión en la mezcla de reacción, de forma que

comienza a emitir fluorescencia, que es captada por el sistema y plasmada en el

software en forma de gráfica (∆FR versus ciclo de amplificación).

La metodología utilizada para el análisis molecular fue el genotipado o

discriminación alélica mediante sondas de hidrólisis Taqman® MGB. Esta tecnología

consiste en la realización de la qPCR de la región que contiene la mutación en presencia

de 2 sondas, una complementaria para cada alelo, marcadas con fluoróforos distintos. El

fluoróforo con que marcamos la sonda complementaria al alelo mutante fue FAM™,

seleccionado por su alta intensidad de fluorescencia, y el fluoróforo con que marcamos

la sonda complementaria al alelo silvestre fue VIC® (Figura 11). Los cebadores y

sondas diseñados para cada hotspot se recogen en la Tabla 2. Las qPCR fueron

realizadas para cada muestra problema por duplicado en un Real Time PCR System

7500 Fast (Applied Biosystems) según el Protocolo 5. En todas las placas se incluyeron

diversos controles:

- un control negativo para descartar posibles contaminaciones de las mezclas de

reacción,

MATERIAL Y MÉTODOS

78

- un control positivo homozigoto silvestre, para lo que se utilizó ADN genómico

humano comercial (Roche),

- un control positivo heterozigoto para cada hotspot, para lo que se utilizaron

muestras previamente secuenciadas que fueron cedidas por el Dr. Lluís Catasus

(Hospital de la Santa Creu i Sant Pau, Barcelona).

Figura 11: Representación de las 3 etapas de la técnica de genotipado o

discriminación alélica por sondas de hidrólisis. Imagen tomada de Applied Biosystems.

En la etapa 1 el ADN molde se desnaturaliza para que, en la etapa 2, los cebadores y la

sonda complementaria hibriden con sus respectivas secuencias. Durante la etapa 3 se

produce la polimerización de la hebra copia del ADN y por consiguiente la

fragmentación de la sonda hibridada y la emisión de la fluorescencia correspondiente.

MATERIAL Y MÉTODOS

79

Hotspot Cebadores

G1624A F:5’-TGACAAAGAACAGCTCAAAGCAA-3’

R:5’-CCTGTGACTCCATAGAAAATCTTTCTC-3’

G1633A F: 5’-CAAAGAACAGCTCAAAGCAATTTC-3’

R: 5’-TTAGCACTTACCTGTGACTCCATAGAA-3’

A3140G F: 5’-GCAAGAGGCTTTGGAGTATTTCA-3’

R: 5’-GAAGATCCAATCCATTTTTGTTGTC-3’

Hotspot Sonda Alelo Silvestre (VIC®) Sonda Alelo Mutante (FAM™)

G1624A 5’-TCCTCTCTCTGAAATC-3’ 5’-CCTCTCTCTAAAATC-3’

G1633A 5’-AAATCACTGAGCAGGAGA-3’ 5’-AAATCACTAAGCAGGAGAA-3’

A3140G 5’-ATGATGCACATCATGGT-3’ 5’-TGATGCACGTCATGGT-3’

Tabla 2: Cebadores y sondas correspondientes a la discriminación alélica de cada

uno de los hotspots. El diseño se llevó a cabo utilizando el programa Primer Express

(Applied Biosystems). Se seleccionaron los mejores cebadores en función de su

localización respecto del hotspot, de su secuencia y contenido en GC, su temperatura de

fusión y con nula o baja tendencia a la formación de dímeros de cebadores y estructuras

secundarias, para asegurar la mejor eficiencia de la reacción. En cada caso, una vez

seleccionados los cebadores y establecido el amplicón, se seleccionó la sonda de forma

que el hotspot estuviese contenido en su tramo medio y que no tuviese secuencias

proclives a hibridar con alguno de los cebadores o consigo misma. Se testearon todos

los oligonucleótidos en el programa en red Basic Local Alignment Search Tool (BLAST,

del Nacional Center Biotechnology Information) para descartar posibles

amplificaciones inespecíficas. Del mismo modo, se descartó la amplificación de las

regiones altamente homólogas al exón 9 contenidas en los pseudogenes descritos del

gen PI3KCA (gi 28913054 y gi 5931525).

MATERIAL Y MÉTODOS

80

La interpretación de los resultados se realizó con el Software SDS (Applied

Biosystems). La técnica de genotipado se basa en el estudio de las fluorescencias

generadas a tiempo final de la qPCR, es decir, en la etapa plateau. En este punto se

analiza la generación de fluorescencia por uno de los dos o por ambos fluoróforos.

Normalmente se utilizan gráficos de que enfrentan la fluorescencia generada por

cada uno de los fluoróforos en cada eje, representándose cada muestra en función de los

valores para cada uno de ellos (Figura 12).

Figura 12: Representación de los resultados de un estudio de genotipado con

sondas de hidrólisis Taqman®. Se distinguen cuatro cuadrantes en el gráfico:

- cuadrante negativo (X): es el cuadrante donde se sitúan los controles negativos,

puesto que no poseen ninguna de sus secuencias.

- cuadrante homozigoto silvestre (AA): en este cuadrante toda la fluorescencia es

generada por Vic y por tanto en estas muestras sólo existe la secuencia silvestre. En este

cuadrante deben situarse los controles de ADN genómico humano normal (Roche).

- cuadrante homozigoto mutante (GG): en este cuadrante toda la fluorescencia es

generada por Fam® y por tanto en estas muestras sólo existe la secuencia mutante.

MATERIAL Y MÉTODOS

81

- cuadrante heterozigoto (AG): en este cuadrante se detectan fluorescencias de

ambas moléculas. A medida en que aumenta el número de células del tumor que porte la

mutación en heterozigosis, la representación de la muestra está más centrada en el

gráfico, puesto que un heterocigoto 100% tiene la misma intensidad de fluorescencia

para cada una de las moléculas. En este cuadrante deben situarse los controles positivos

de heterozigosis.

2.5.3 Extracción de ARN

Se extrajeron 2 cilindros de zonas con una celularidad tumoral superior al 30%,

seleccionadas de distintas zonas del tumor incluido en bloques de tejido parafinado en el

caso de las muestras problema y 2 cilindros de bloques de tejido parafinado en el caso

de las muestras sanas de referencia. Los cilindros fueron microdisecados manualmente y

posteriormente desparafinados con xilol y rehidratados (Protocolo 1). El tejido

recuperado se sometió primero a una homogeneización mecánica en frío (nitrógeno

líquido) con pistilos y posteriormente a una homogeneización enzimática con proteinasa

K en un tampón de lisis celular (Qiagen) (Protocolo 2).

Tras someter el homogeneizado a 80ºC durante 15 minutos exactos para revertir al

menos en parte los entrecruzamientos provocados por la fijación en formalina, que

podrían disminuir la eficiencia de la extracción, se procedió a la extracción de ARN en

un kit basado en columnas con membranas de sílice que utiliza una tecnología similar al

utilizado para la extracción de ADN (RNeasy Formalin Parafin de Qiagen) (Protocolo

6).

Una vez extraído el ARN fue cuantificado y evaluado en el Nanodrop 1000. Los

ratios aceptados siempre fueron iguales o superiores a 1,8. Los casos en los que la

calidad o la cantidad del ARN no fueron suficientes fueron excluidos del estudio.

MATERIAL Y MÉTODOS

82

2.5.4 Retrotranscripción (RTPCR)

Inmediatamente después de su análisis, las muestras de ARN fueron modificadas

para que su concentración rondase los 100 ng/μL. Aquellas con una concentración

mayor fueron diluidas. Aquellas con una concentración menor fueron concentradas en el

SpeedVak (60ºC durante 1 hora) y resuspendidas en un volumen de agua calculado en

función de su cantidad total de ng de ARN.

La RTPCR es una PCR en la que participa una enzima polimerasa derivada de

retrovirus y capaz de generar hebras copia de ADN tomando como molde cadenas de

ARN. Dada la alta inestabilidad del ARN, la disponibilidad de este ADN

complementario (ADNc) supuso un salto cualitativo en las posibilidades de análisis de

los perfiles de expresión génica, puesto que esta molécula sí puede ser sometida a ciclos

de amplificación y otras técnicas que no habrían podido desarrollarse sobre la molécula

de ARN original.

Se retrotranscribió 1 μg de ARN de cada muestra con el kit Quantitect Reverse

Transcription Kit (Qiagen), que incluye un tratamiento capaz de eliminar el ADN

genómico que pueda quedar en la muestra. Para ello se siguieron las instrucciones del

fabricante (Protocolo 7).

Una vez retrotranscrito, el ADNc fue diluido 1:5 para evitar que los componentes

de la reacción de RTPCR mermasen la eficiencia de la reacción de qPCR.

MATERIAL Y MÉTODOS

83

2.5.5 Análisis de los niveles de expresión de ARNm por qPCR

La tecnología seleccionada para el análisis fue, de nuevo, la qPCR aunque en esta

ocasión la cuantificación debe realizarse durante la fase exponencial de la reacción,

puesto que proporciona los datos más precisos para la cuantificación. Para poder

realizar las mediciones en la fase exponencial, se calculan dos valores:

• Umbral: El nivel de intensidad de fluorescencia mínima generada por la reacción

al que se considera fruto de la amplificación específica y no ruido de fondo o

amplificaciones inespecíficas derivadas del exceso inicial de reactivos presentes en la

mezcla de reacción. Debe definirse por encima del ruido de fondo y siempre al principio

de la fase exponencial.

• Ct (Cycle threshold): Es el ciclo de la reacción de qPCR en el que la muestra

alcanza el umbral. Su valor es inversamente proporcional a la cantidad de copias del

ARNm diana iniciales, puesto que cuantas más copias iniciales haya en la muestra

menos ciclos de amplificación se necesitan para alcanzar la intensidad de fluorescencia

umbral y viceversa.

La tecnología fluorescente utilizada también fueron las sondas de hidrólisis

Taqman® MGB (Figura 13). A diferencia de la técnica diseñada para el genotipado, en

esta ocasión sólo existe en la reacción una sonda marcada con el fluoróforo FAM™ en

5’ y con un complejo NFQ-MGB en 3’. Al conjunto de los cebadores específicos para la

amplificación del ARNm en cuestión y la sonda complementaria al centro de este

amplicón, se le conoce como ensayo. Los ensayos fueron seleccionados del panel de

ensayos disponibles en Applied Biosystems en función de los siguientes criterios:

MATERIAL Y MÉTODOS

84

- Que el ensayo amplifique el mayor número de secuencias posibles (RefSeq) del

ARNm en cuestión.

- Un tamaño de amplicón de entre 60 y 90 pb: el límite inferior es prudente a la

hora de asegurar la especificidad de la amplificación y la disponibilidad de suficiente

secuencia para la selección de una sonda que cumpla todas las características buscadas.

El límite superior es debido a la procedencia de nuestras muestras de material FFPE.

Dada la gran degradación a la que ha sido expuesto el ARN de nuestras muestras la

selección de amplicones más largos disminuiría el número de moléculas íntegras para

amplificar.

- Que en el diseño del ensayo la sonda incluya en su secuencia parte de 2 exones.

Esto asegura que no sea posible la detección de la amplificación de ADN genómico.

Los ensayos seleccionados y sus características se recogen en la Tabla 3.

MATERIAL Y MÉTODOS

85

Figura 13: Representación de la reacción de PCR cuantitativa a tiempo real con

sondas de hidrólisis Taqman®. Imagen tomada de “Introduction to Quantitative PCR.

Methods and Applications Guide” Agilent Technologies, 2010. En la fase de

hibridación los cebadores y la sonda hibridan con sus secuencias complementarias.

Durante la fase de polimerización la polimerasa se encuentra con la sonda y escinde

nucleótido a nucleótido para poder continuar con su labor. Como resultado el fluoróforo

se separa del quencher y comienza la emisión de fluorescencia.

MATERIAL Y MÉTODOS

86

GEN ENSAYO SECUENCIA AMPLICÓN

EGFR Hs01076091_m1 NM_005228.3

CCAGTGTGCTGCAGGCTGCACAGGCCCC

CGGGAGAGCGACTGCCTGGTCTGCCGCAAA

TTCCGAGACGAAGCCACGTGCAAGGACA

MED1 Hs01062349_m1 NM_004774.3

TGGTCAGCTGTTTGGAGACATTGCAG

AAGGCTCTCAAAGTAACATCTTTACCA

GCAATGACTGATCGT

FOXA1 Hs00270129_m1 AK313785.1

ACCAGCGACTGGAACAGCTACTACGCA

GACACGCAGGAGGCCTACTCCTCCGTCC

CGGTCAGCAACATGAACTC

IGF1R Hs00951562_m1 NM_000875.3

TGCATGGTAGCCGAAGATTTCACAGTC

AAAATCGGAGATTTTGGTATGACGCGA

GATATCTATGAGACAGACTATTACCGG

c-Src Hs01062585_m1 NM_004383.2

GACGAGGAGGTGTACTTTGAGAACCTC

ATGCAGCTGGTGGAGCACTACACCTCA

GACGCAGATGGACTCTGTACGCGC

Tabla 3: Información sobre los ensayos prediseñados de Applied Biosystems para

la cuantificación de la expresión génica de los genes estudiados. Se indican: el nombre

del ensayo, la secuencia tomada como referencia para la obtención de la información

referida al amplicón y la secuencia del amplicón. El amplicón comprende la secuencia

incluida entre los dos cebadores y la suya propia en la hebra molde (5’3’).

MATERIAL Y MÉTODOS

87

GEN ENSAYO SECUENCIA AMPLICÓN

ESR1 Hs01046818_m1 NM_000125.3

CCCAGCTCCTCCTCATCCTC

TCCCACATCAGGCACATGAGTAACAAA

GGCATGGAGCATCTGTACAG

PUM1 Hs00982765_m1 NM_014676.2

TTTGGACAAGGTCTGGCAGCAGGCA

TGCCAGGTTATCCGGTGTTGGCTCC

TGCTGCTTACTATGACCA

GUSB Hs99999908_m1 NM_000181.3

TCATTTGGAATTTTGCCGATTTCATGAC

TGAACAGTCACCGACGAGAGTGCTGGG

GAATAAAAAGGGGATCTTCACTCGGC

Tabla 3 (Continuación): Información sobre los ensayos prediseñados de Applied

Biosystems para la cuantificación de la expresión génica de los genes estudiados. Se

indican: el nombre del ensayo, la secuencia tomada como referencia para la obtención

de la información referida al amplicón y la secuencia del amplicón. El amplicón

comprende la secuencia incluida entre los dos cebadores y la suya propia en la hebra

molde (5’3’).

Las qPCR fueron realizadas por duplicado según el Protocolo 8 en un Real Time

PCR System 7500 Fast (Applied Biosystems). Se seleccionaron los genes endógenos

GUSB y PUM1 a partir de la literatura, por su expresión altamente estable en el tejido

mamario tanto en condiciones fisiológicas como patológicas. El análisis de estos genes

sirve para poder normalizar la expresión de los genes diana, de forma que el resultado se

independiza de variables como la cantidad de ARN total puesto en la reacción, que

podrían llevar a error a la hora de comparar entre distintas muestras.

MATERIAL Y MÉTODOS

88

A pesar de que los ensayos Taqman® de Applied Biosystems están probados y

garantizan una eficiencia del 100%±10%, dada la procedencia de nuestras muestras de

ARN y la gran exposición a la degradación que han sufrido durante el tratamiento

FFPE, se realizó la puesta a punto de los ensayos escogidos (Protocolo 8A). A partir de

mezclar 500 ng de ADNc de 10 muestras de tejido FFPE extraído y retrotranscrito

siguiendo los mismos protocolos se creó una muestra estándar de concentración

conocida que representaba todas las condiciones presentes en nuestras muestras

problema. Se realizaron 6 diluciones seriadas de esta muestra estándar que fueron

analizadas con cada uno de los ensayos. Con los resultados obtenidos se realizaron las

curvas patrón necesarias para el cálculo de la eficiencia de amplificación de los ensayos

seleccionados siguiendo las instrucciones del manual Amplification Efficiency of

Taqman® Gene Expression Assays de Applied Biosystems. La eficiencia de los ensayos

de los genes endógenos y los genes diana fueron similares (con una diferencia inferior al

10%): los valores de R2 para todas las curvas de calibración generadas fueron

superiores a 0,99 y todas las eficiencias de ensayos Taqman® fueron superiores al 90%.

Se cumplieron, por tanto, todas las condiciones exigibles para poder realizar el análisis

según el Método ddCt (User Bulletin #2, Applied Biosystems; (305)). Este método

consiste en una cuantificación relativa de los genes diana (306). El Ct de cada muestra

para el gen diana se normaliza con el Ct de la misma para el gen endógeno, dando como

resultado el valor dCt. En un segundo análisis se enfrentan los dCt de las muestras

problema con el dCt de la muestra de referencia o calibrador, dando como resultado el

valor ddCt. Para obtener el valor de cuantificación relativa (RQ) se debe aplicar este

valor a la fórmula RQ=2^-ddCt, lo que nos da los valores de cambio relativo, medidos

en unidades de fold change (FC).

MATERIAL Y MÉTODOS

89

Se realizaron controles RT-minus para cada ensayo tomando como muestra ADN

humano total comercial (Roche®) para garantizar que no se detectaba la amplificación

de ADN genómico. Se analizó un control negativo de cada serie de retrotranscripciones

realizadas para descartar contaminaciones en este paso. Así mismo se incluyeron otros

controles en cada placa de qPCR:

- controles negativos para cada ensayo para descartar la contaminación de las

mezclas de reacción de qPCR,

- un control positivo tomando como muestra ARN total humano de mama

comercial (Human Breast Total RNA, Ambion®) para descartar que la eficiencia de la

qPCR variase entre placas.

Las muestras sanas fueron evaluadas por separado siguiendo estrictamente los

mismos protocolos que las muestras problema. Una vez comprobado que las diferencias

estadísticas entre ellas no eran significativas, se unieron formando un pool que fue

analizado del mismo modo para obtener los valores de referencia para cada gen,

constituyendo el calibrador en nuestro método ddCt.

Se realizó el análisis de la fluorescencia final generada para cada muestra

mediante el software SDS y en caso de que la desviación estándar obtenida entre los

duplicados fuese mayor de 0,35 se reanalizó la muestra. Se evaluaron los controles de

forma que:

- para los controles negativos sólo se aceptaron resultados de “no amplificación”

(Undeterminate),

MATERIAL Y MÉTODOS

90

- se analizaron los distintos análisis en cada placa del control positivo,

descartándose desviaciones estándar superiores a 1 Ct entre las distintas mediciones de

cada ensayo.

Una vez hechos los experimentos para todas las muestras y el calibrador, y

evaluados todos los controles, se realizó un estudio que incluía todos los experimentos

en el que se establecieron las líneas basales y las fluorescencias umbrales para cada gen.

Los resultados se corrigieron en función de las eficiencias calculadas previamente para

cada ensayo. Se definieron como controles endógenos los genes PUM1 y GUSB y como

muestra de referencia el calibrador. El software corrige las fluorescencias generadas en

función de la eficiencia dada para cada ensayo y aporta un dato de Ct para cada pocillo.

Realiza los cálculos referidos al método ddCt con el Ct medio de los duplicados y

aporta los datos de RQ y un intervalo de confianza del 95% (RQmin-RQmax). Los

datos de RQ se representan en un gráfico de barras tomando la expresión del calibrador

como valor 1 (Figura 14).

Los niveles de RQ expresados en valores de FC, representan el cambio de

expresión sufrido en una muestra patológica frente a los niveles considerados como

fisiológicos (RQ=1FC). De esta forma, se considera que valores de RQ ≤0,5 FC indican

una represión de la transcripción del gen en cuestión, mientras que valores de RQ ≥2FC

indican una sobreexpresión génica. Sin embargo, hay que tener en cuenta que no

siempre estas alteraciones en los niveles de expresión génica, es decir, de transcripción

a ARNm, se ven trasladados al nivel de proteína, ya sea por factores reguladores

postranscripcionales como la acción de los microARNs, por la estabilidad de las

moléculas de ARN, intrínseca a su propia naturaleza y a su secuencia, o por factores

reguladores de la traducción y modificaciones postraduccionales que determinan en

gran medida los valores finales de proteína funcional. En base a estas consideraciones,

MATERIAL Y MÉTODOS

91

las variables moleculares de expresión génica fueron categorizadas como expresión

reprimida (RQ≤0,5FC), similar a la fisiológica (0,5FC<RQ<1,5FC) o sobreexpresión

(RQ≥1,5FC). Estos son los rangos que actualmente se consideran en la práctica de la

genética clínica. Sin embargo, para facilitar el análisis estadístico, en algunos análisis

estas 3 categorías se agruparon en 2, de forma que hablamos de sobreexpresión frente a

normal o reprimido o bien de represión frente a normal o sobreexpresado en función de

las características del gen en cuestión.

Figura 14: Ejemplo de representación gráfica de los niveles de cuantificación

relativa de la expresión génica (RQ del inglés Relative Quantification) generada

mediante el método ddCt. El calibrador de mama normal (CMN) establece el nivel de

expresión normal correspondiéndose con un RQ=1. En comparación con él, se

relativizan las expresiones génicas del resto de muestras (NTC= “not template control”

o control negativo).

MATERIAL Y MÉTODOS

92

2.5.6 Extracción de microARNs

Se extrajeron 2 cilindros de zonas con una celularidad tumoral superior al 30%,

seleccionadas de distintas zonas del tumor incluido en bloques de tejido parafinado en el

caso de las muestras problema y 2 cilindros de bloques de tejido parafinado en el caso

de las muestras sanas de referencia. Los cilindros fueron microdisecados manualmente y

posteriormente procesados con un kit basado en columnas con membranas de sílice que

utiliza una tecnología similar al utilizado para la extracción de ADN y ARN pero está

diseñado especialmente para la extracción de ARN total, es decir, incluidos los pre, pri

y microARNs. Este protocolo incluye una metodología de desparafinación y

homogeneización del tejido alternativa (Protocolo 9).

Una vez extraído, el ARN total fue sometido a bioanálisis con chips Small RNA

Assay en el Bioanalizador 2100 (Agilent Technologies) (Figura 15). Este instrumento

utiliza la tecnología de microfluidos para analizar la calidad y la cantidad de la muestra

de ARN total. El conjunto de moléculas de la muestra se marca con fluoróforos

inespecíficos y se somete a un campo eléctrico en el interior de un sistema de

microcanales rellenos de un polímero específico para su separación. Como resultado las

moléculas que conforman la muestra se separan y se genera un electroforegrama en el

que las moléculas están ordenadas según su tamaño. El sistema analiza en paralelo una

muestra patrón que permite identificar los tamaños de las moléculas de la muestra.

Además, en cada carga se introduce un marcador ligado a un fluoróforo distintivo que

consiste en dos moléculas de tamaños extremos y concentración conocida, permitiendo

calcular la concentración de cada uno de los picos de fluorescencia generados por cada

grupo de moléculas en la muestra (Protocolo 10).

MATERIAL Y MÉTODOS

93

Figura 15: Bioanálisis de microARNs con el Bioanalizador 2100 de Agilent.

Imagen del chip específico para el análisis de microRNAs y electroforegrama de

ejemplo donde se enmarca la zona del electroforegrama correspondiente a los

microARNs.

Los casos en los que la calidad o la cantidad del ARN no fueron suficientes fueron

excluidos del estudio.

2.5.7 Retrotranscripción (RTPCR)

Inmediatamente después de su análisis, las muestras de ARN total fueron

modificadas para que su concentración rondase los 100 ng/μL. Aquellas con una

concentración mayor fueron diluidas. Aquellas con una concentración menor fueron

concentradas en el SpeedVak (60ºC durante 1 hora) y resuspendidas en un volumen de

agua calculado en función de su cantidad total de ng de ARN.

MATERIAL Y MÉTODOS

94

Para el análisis del pri-miR-17~92, se retrotranscribió 1 μg de ARN de cada

muestra con el kit Quantitect Reverse Transcription Kit (Qiagen) (Protocolo 7). Una

vez retrotranscrito, el ADNc fue diluido 1:5 para evitar que los componentes de la

reacción de RTPCR mermasen la eficiencia de la reacción de qPCR. El protocolo de

análisis qPCR utilizado fue el mismo que para los ARNm (Protocolo 8).

Para el análisis de los microARNs la RTPCR se realiza con un pool formado por

cebadores específicos para cada uno de los microARNs a concentraciones iguales y el

kit Taqman® MicroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems)

(Protocolo 11). Estos cebadores vienen diseñados por Applied Biosystems en relación

con el ensayo que se utiliza para la cuantificación.

2.5.8 Análisis de los niveles de expresión de microARNs por qPCR

La metodología empleada para la cuantificación de los niveles de expresión de los

microARNs fue la misma que se utilizó para los ARNm.

Los ensayos Taqman® para microARNs detectan una nueva diana específica de la

secuencia formada por un bucle derivado del cebador de retrotranscripción (Stem-loop)

para poder amplificar los microARNs maduros a pesar de su corta longitud. El cebador

se extiende en el extremo 3' de la secuencia complementaria al microARN diana para

poder ofrecer una secuencia sobre la que diseñar un ensayo Taqman® tradicional.

Además, esto confiere una ventaja clave de estos ensayos: la detección altamente

específica de los microARNs maduros biológicamente activos (Figura 16). La longitud

del Pri-miR-17~92, sin embargo, permite la retrotranscripción ordinaria con cebadores

al azar y el diseño directo de un ensayo Taqman® tradicional. Los ensayos fueron

seleccionados del panel de ensayos disponibles en Applied Biosystems siguiendo sus

recomendaciones (Tabla 4).

MATERIAL Y MÉTODOS

95

Figura 16: Amplificación y detección de los microARNs maduros. Imagen

tomada de “Product Bulletin: Taqman® MicroRNA Assays” Life Technologies, 2011.

Muestra la estrategia desarrollada para poder amplificar y detectar secuencias de tan

pequeño tamaño como los microARNs maduros. El cebador de RTPCR es

complementario a la secuencia del microARN en su extremo 5’ mientras que en su

extremo 3’ su secuencia se alarga formando un bucle conocido como stem-loop. Tras la

RTPCR específica la secuencia stem-loop es utilizada para poder diseñar el cebador

mientras que la sonda sigue hibridando con la secuencia específica del microARN.

MATERIAL Y MÉTODOS

96

miR Ensayo miRBase Amplicón con Stem-Loop

hsa

-let

-7a

000377 MIMAT0000062

GGGUGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU

UGGGGCUCUGCCCUGCUAUGGGAUA

ACUAUACAAUCUACUGUCUUUCCU

hsa

-miR

-20

6

000510 MIMAT0000462

UGCUUCCCGAGGCCACAUGCUUCUUUAUAU

CCCCAUAUGGAUUACUUUGCUAUGGAAUG

UAAGGAAGUGUGUGGUUUCGGCAAGUG

hsa

-miR

-21

000397 MIMAT0000076

UGUCGGGUAGCUUAUCAGACUGA

UGUUGACUGUUGAAUCUCAUGGC

AACACCAGUCGAUGGGCUGUCUGACA

hsa

-miR

-222

0002097 MIMAT0004569

GCUGCUGGAAGGUGUAGGUACCCUCAA

UGGCUCAGUAGCCAGUGUAGAUCCUGUC

UUUCGUAAUCAGCAGCUACAUCUGGCUA

CUGGGUCUCUGAUGGCAUCUUCUAGCU

RN

U43

001095 NR_002439 GAACTTATTGACGGGCGGACAGAAAC

TGTGTGCTGATTGTCACGTTCTGATT

U5

4

001210 AB061842 TGGCGATGAGGAGGTACCTATTGTGTTGAGTA

ACGGTGATAATTTTATACGCTATTCTGAGCC

Tabla 4: Información sobre los ensayos prediseñados de Applied Biosystems

para la cuantificación de los microARNs estudiados. Se indican: el nombre del ensayo

escogido, la secuencia tomada como referencia para el diseño del ensayo (176-178) y

el amplicón con el stem-loop utilizado para su detección.

MATERIAL Y MÉTODOS

97

miR Ensayo miRBase Amplicón con Stem-Loop

Pri-miR-17~92

Hs0

32

95

90

1_

pri

MI0000071

GUCAGAAUAAUGUCAAAGUGCUUACAGUG

CAGGUAGUGAUAUGUGCAUCUACUGCAGU

GAAGGCACUUGUAGCAUUAUGGUGAC

Tabla 4 (continuación): Información sobre los ensayos prediseñados de Applied

Biosystems para la cuantificación de los microARNs estudiados. Se indican: el nombre

del ensayo escogido, la secuencia tomada como referencia para el diseño del ensayo

(176-178) y el amplicón con el stem-loop utilizado para su detección.

Se realizaron los mismos estudios y se incluyeron los mismos tipos de controles

que en el caso de los ARNm. Así mismo, el análisis de los resultados fue similar,

basado en el método ddCt.

3. Análisis estadístico

El análisis estadístico se realizó con el programa SPSS 15 y la significación

estadística se estableció cuando p<0,05. Los análisis estadísticos se repitieron en

función del fenotipo y de la detección de mutaciones en el gen PI3K.

3.1 Etapa I: Estudios descriptivos

3.1.1 Variables clínico-patológicas

Se realizó una descripción fenotípica de la población en función de las variables

clínico-patológicas. Para describir las variables cualitativas se utilizaron las frecuencias

relativas en porcentajes. Para las cuantitativas se realizó el Test de Kolmogorov–

Smirnov para conocer su distribución. La edad y el tamaño tumoral, así como las

variables inmunohistoquímicas resultaron ser no paramétricas por lo que para

MATERIAL Y MÉTODOS

98

describirlas se utilizaron las medianas y los percentiles 25 y 75. Una vez categorizadas

en función del criterio establecido para cada una de ellas, se utilizaron sus frecuencias

relativas en porcentajes.

3.1.2 Variables moleculares

Para describir la existencia de mutaciones en el gen PI3K se utilizó la frecuencia

relativa en porcentajes.

Se realizó el Test de Kolmogorov–Smirnov para conocer la distribución de las

variables moleculares cuantitativas. Todas resultaron ser no paramétricas, por lo que se

describieron con la mediana y los percentiles 25 y 75. Una vez categorizadas en

expresión reprimida, normal o sobreexpresada se utilizaron las frecuencias relativas en

porcentajes.

3.2 Etapa II: Estudio de asociación entre variables:

- Se analizó la existencia de asociaciones entre las variables patológicas y las

variables moleculares con los test U. de Mann-Whitney y Kruskal-Wallis en función de

las categorías de la variable patológica.

- Para los estudios de asociación entre las variables moleculares entre ellas

mismas y frente a las variables clínico-patológicas cuantitativas, se utilizó la

Correlación de Spearman.

- Se estratificaron las variables cuantitativas en variables cualitativas tal y como se

ha descrito anteriormente. Las asociaciones de las variables moleculares categorizadas

entre ellas mismas y con el resto de variables clínico-patológicas se analizaron mediante

tablas de contingencia. Se leyó la prueba de Chi cuadrado de Pearson o el Test Exacto

de Fisher (en caso de que el número total de casos fuese menor de 20 o la frecuencia

MATERIAL Y MÉTODOS

99

mínima esperada menor de 5). También se obtuvo, siempre que el número de categorías

lo permitió, la odds ratio y su intervalo de confianza del 95%.

3.3 Etapa III: Estudios de supervivencia

- Se estudió la reaparición de la enfermedad (recidiva y/o metástasis) y su

asociación a las variables clínico-patológicas y moleculares, en la serie completa y en

función del subtipo, con tablas de contingencia o los test de Mann-Whitney y Kruskal-

Wallis siguiendo los criterios de las Etapas I y II.

- Para determinar el valor pronóstico de cada una de las variables con respecto a la

SLE y la SG se realizó un estudio univariado aplicándose el método de Kaplan-Meier,

siendo las diferencias entre las curvas evaluadas con el test log-rank. Se obtuvo el riesgo

o Hazard Ratio con la Regresión de Cox.

- Con los resultados significativos que cumplieron los criterios de factor de

confusión se realizó el análisis multivariante con el modelo de regresión de Cox.

- Para evaluar la influencia del tiempo de seguimiento sobre los resultados, se

repitieron los análisis de SLE con tiempo de seguimiento máximo de 60 meses y con un

tiempo de seguimiento máximo de 185 meses. El corte de 60 meses de tiempo de

seguimiento ha sido seleccionado por ser el corte destacado en los paneles moleculares

con valor pronóstico en la “14th St. Gallen International Breast Cancer Conference”

(29).

APÉNDICE: Protocolos

100

Protocolo 1:

Recuperación de tejido parafinado

1. Volcar los cilindros en la tapa del Éppendorf y cortar muy fino con bisturí.

Devolver al mismo Éppendorf.

2. Desparafinación:

1. Añadir 900 μL de xilol (extracción de la parafina).Vórtex.

2. Centrifugar: 5min; Vmáx; Tª amb

3. Desechar el sobrenadante por pipeteo.

4. Añadir 900 μL de xilol (extracción de la parafina).Vórtex.

5. Centrifugar: 5min; Vmáx; Tª amb


7. Añadir 900 μL etanol absoluto (extracción del xilol residual).Vórtex.

8. Centrifugar: Vmáx; 5min; Tª amb


10. Añadir 900 μL de etanol absoluto (extracción del xilol residual).Vórtex.

11. Centrifugar: Vmáx; 5min; Tª amb


13. Incubar con el tubo abierto a 37ºC; 10-15min hasta secar.

Protocolo 2:

Disgregación y homogenización del tejido tumoral

1. Resuspender el pellet en 180 μL de Buffer ATL del kit de Qiagen.

2. Añadir 20-30 μL de PROTEINASA K (10 mg/ml) en función de la cantidad y el

grado de disgregación del tejido. Vórtex y pulso. Comprobar que los volúmenes

de todos los tubos son iguales.

3. Incubar a 56ºC durante toda la noche en agitación a 900 rpm.

4. Si es necesario por la mañana añadir otros 10-20 μL de Proteinasa K e incubar

hasta que NO se observen restos de tejido).

Protocolo 3:

Extracción de ADN con kit de Qiagen.

1. RECUPERACIÓN: Incubar durante 1h a 90ºC.

2. PREPARACIÓN: Añadir 200 μL de Buffer AL. Vórtex. Incubar 70ºC; 10 min.

3. Añadir 200 μL de Etanol Absoluto. Vórtex. Importante: Siempre hay que

mantener los volúmenes de AL y etanol iguales, si no es así, no se precipitará

bien el ADN y se perderá.

4. UNIÓN A MEMBRANA: Transferir la muestra a la columna (previamente

numerada). En el tubo poner nombre de la muestra y TP (Tubo de

Precipitación).Centrifugar: 8000 rpm; 1 min.

5. LAVADOS: Transferir la columna a un tubo nuevo marcado. Guardar el tubo de

precipitación en nevera hasta comprobar que la extracción ha sido satisfactoria.

Añadir 500 μL de Buffer AW1. Centrifugar: 8000 rpm; 1 min.

6. Desechar el eluido y secar un poco el tubo porque lo reutilizamos. Añadir 500

μL de Buffer AW2. Centrifugar: 14000 rpm; 3 min.


101

7. ELUCIÓN: Desechar el eluido y cambiar a un tubo lo-bind de 1.5mL (rotulado).

Añadir 200 μL de Agua GBM. Incubar Tª ambiente 10 min. Centrifugar: 9000

rpm; 3 min; ¡Con tapa hacia centro del rotor! Desechar columna y almacenar

los Éppendorf rotulados a –20ºC.

Nota: Antes de usar por primera vez los Buffers AW1 y AW2 se tienen que añadir 30

mL de EtOH 100% y homogeneizar porque vienen concentrados. Marcar fecha de

reconstitución.

Una vez extraído, el ADN debe cuantificarse en el Nanodrop 1000 (Thermo Scientific).

Se recogerán los datos de concentración (ng/µL) y los ratios 280/260 y 230/260. Una

vez comprobada la extracción de ADN se tirarán los tubos de lisis y los de

precipitación. Las cubetas se lavarán en lejía y en agua destilada, se dejarán secar y se

guardarán.

Los ADN cuantificados deben homogeneizarse en concentración a un rango de 60-120

ng/µL para asegurar que las eficiencias en el análisis posterior sean similares entre las

distintas muestras. Para ello se establecen 3 vías posibles:

- cuando la concentración es mayor de 120 ng/µL se diluirá a una concentración de 100

ng/µL.

- cuando la concentración es menor de 60 ng/µL se evaporará hasta conseguir una

concentración de 100 ng/µL.

- cuando la concentración esté entre 10 y 60 ng/µL se preamplificará con el kit RepliG

FFPE de Qiagen (Protocolo 4).

Protocolo 4:

Preamplificación del genoma completo con kit RepliG FFPE de Qiagen.

Son necesarios mínimo10 ng de ADN genómico aunque si la calidad del ADN es buena

puede hacerse a partir de 1 ng.

Antes de empezar:

- Descongelar los reactivos a Tª ambiente excepto la polimerasa (a 0ºC).

- Hacer cálculos para:

o Buffer N1 (cantidades para 15 o 7 reacciones)

Stop Solution 8μL

H2O 72μL

o Buffer D1 (cantidades para 15 o 7 reacciones)

Buffer DLB 5μL

H2O 35μL

o Mix (en función de la cantidad de ADN molde)

o Mix de ligación

- Numerar Éppendorf de 0.2 mL.

- Reconstituir buffer DLB añadiéndole 500 μL de H2O de GBM.

- Vórtex y pulso a todos los reactivos.

- Poner el termomixer a 30ºC.

- Preparar los Buffers D1 y N1.


102

- Preparar el mix de ligación con: tampón de ligación, ligasa y enzima FFPE en

ratio 1/1/8 y por este orden, calculando para el número de muestras.

NOTA cada 10 μL de ADN necesitarán otros 10 μL de mix de ligación.

- LIGACIÓN: incubar a 24ºC durante 30 minutos. Parar la reacción

incubando a 95ºC durante 5 minutos y enfriar en hielo.

En función de la cantidad de ADN de la que vas a partir las cantidades serán las de la

columna de la izquierda o la de la derecha:

1. Añadir 2.5μL del ADN molde muy

bien homogeneizado por vórtex.

1. Añadir 5μL del ADN molde muy

bien homogeneizado por vórtex.

2. Añadir 2.5μL del buffer D1.

Vórtex y pulso.

2. Añadir 2.5μL del buffer D1.

Vórtex y pulso.

3. Incubar 3 minutos a Tª ambiente 3. Incubar 3 minutos a Tª ambiente

4. Añadir 5μL del buffer N1. Vórtex

y pulso.

5. Preparar el MIX:

N= reacciones + 0.5

Buffer Repli-g Midi Reaction 29μL

H2O 10μL

Polimerasa 1μL

6. Añadir 40 μL Mix

7. Incubar a 30ºC de 8 a 16 h

4. Añadir 10μL del buffer N1. Vórtex

y pulso.

5. Preparar el MIX:

N= reacciones + 0.5

Buffer Repli-g Midi Reaction 29μL

Polimerasa 1μL

6. Añadir 30 μL Mix

7. Incubar a 30ºC de 8 a 16 h

8. Sacar las muestras y subir la Tª 65ºC. Cuando la alcance incubar durante 3

minutos. Almacenar a -20ºC

NOTAS:

Es muy importante apuntar las fechas de reconstitución y preparación de buffers porque:

D1 y N1 pueden usarse hasta 3 meses tras su preparación.

Buffer DLB puede usarse hasta 6 meses tras reconstituirlo.

Una vez preamplificado el ADN deberá ser de nuevo analizado en el Nanodrop y su

concentración será ajustada a un rango de 60-120 ng/µL.

Protocolo 5

Genotipado por PCR cuantitativa con sondas de hidrólisis

- Las sondas de hidrólisis se ajustarán a 100 µM y los cebadores se ajustarán a 10

nmoles.

- Se prepara un master-mix en función del número de muestras (n), teniendo en cuenta

que la n estará compuesta por:

- las muestras problema,

- 1 control negativo (sólo mix),

- 1 control heterocigoto positivo (de una mezcla de muestras que ya se sabe que

están mutadas),


103

- 1 control homozigoto silvestre (ADN total humano de Roche);

Se tendrá en cuenta que siempre se realizará por duplicado (N= nx2).

TaqMan® Genotyping Master Mix (Applied Biosystemns) 10 µL

Primer Forward (10mM) 1.8 µL

Primer Reverse (10mM) 1.8 µL

Sonda silvestre (VIC) (100 µM) 0.5 µL

Sonda mutada (FAM) (100 µM) 0.5 µL

H2O - GBM 1.4 µL

- Una vez preparado se mezcla el master-mix por inversión y se le da un pulso de

centrífuga.

- Se reparten 16 µL de master-mix por cada pocillo de 0,1 mL de la placa de 96.

- Se añade el ADN correspondiente a cada pocillo:

ADN ajustado 60-120 ng/µL 4 µL

____________

Volumen total de reacción = 20 µL

Aunque el genotipado con sondas de hidrólisis TaqMan necesita únicamente 10 ng de

ADN para asegurar eficiencias máximas, como se trata de muestras FFPE, tenemos que

tener en cuenta que gran parte del ADN no será productivo porque estará dañado. Así

que tras realizar la puesta a punto correspondiente se observó que una concentración

mínima de 60 y máxima de 120 ng/µL garantizaba una eficiencia de la reacción máxima

con este tipo de muestras, puesto que aportaba suficiente ADN molde productivo. Para

la puesta a punto se siguieron las indicaciones de ADN “Genotyping from Human FFPE

Samples, Reliable and Reproducible” de Applied Bosystems.

- Se tapa la placa con una cubierta óptica y se le da un pulso de centrífuga. Se introduce

en el 7500fast Real Time PCR System de AB.

- Se programa el análisis (7500 Software v 2.0.5): se selecciona 7500Fast, Genotyping,

Taqman, Standard. Se registra la placa tal cual se ha preparado, asignando a cada

pocillo el número de muestra problema o si es control negativo, control heterocigoto o

control homozigoto silvestre. En el run-method, se comprueba que el volumen final es

20 µL y se programa:

Pre-PCR read 1 minuto 60ºC

Desnaturalización 10 minutos 95ºC

Amplificación 45 ciclos x 15´´ a 92º

90´´ a 60º

Post-PCR read 1 minuto 60ºC

En los experimentos de genotipado, que son a punto final, la diferencia en la

fluorescencia generada por el fluoróforo se calcula entre la lectura pre-PCR y la lectura

post-PCR. Así pues, ΔRn se calcula como:

ΔRn = Rn (lectura post-PCR) - Rn (lectura pre-PCR),

Dónde Rn = fluorescencia generada por cada fluoróforo normalizado con ROX.


104

Protocolo 6

Extracción de ARN desde cilindros FFPE con kit de Qiagen

Preparación:

Preparar todos los reactivos, gradillas, tubos… que se van a usar.

Preparar los bastones de digestión mecánica si no lo están:

Limpiarlos con etOH70%.

Incubar con ARNasa-Away durante al menos 30 minutos.

Enjuagar con H2O-GBM y EtOH100%-ARN. Dejar secar.

Limpiar todo el material y las superficies que vayan a estar en contacto con las muestras

con etanol 70%. Ponerlo en tratamiento con ARNasa Away durante al menos 30

minutos.

Comprobar que el reactivo RPE está reconstituido. Si no lo está, añadir 44 mL de Etanol

absoluto por cada 11 mL de RPE.

Poner el termomixer a 55ºC y el termobloque a 80ºC.

1.- Desparafinación:

14. Añadir 1mL de xilol-ARN (extracción de la parafina). Rascar la gradilla

con precaución de que el tubo no se abra.

15. Centrifugar: 2min; Vmáx; Tª amb. Desechar el sobrenadante por pipeteo.

16. Añadir 1mL de xilol-ARN (extracción de la parafina). Rascar la gradilla


17. Centrifugar: 5min; Vmáx; Tª amb. Desechar el sobrenadante por pipeteo.

18. Añadir 1mL etOH100%-ARN (extracción del xilol residual). Rascar la

gradilla con precaución de que el tubo no se abra.

19. Centrifugar: Vmáx; 5min; Tª amb. Desechar el sobrenadante por pipeteo.

20. Añadir 1mL etOH100%-ARN (extracción del xilol residual). Rascar la

gradilla con precaución de que el tubo no se abra.

21. Centrifugar: Vmáx; 5min; Tª amb. Desechar el sobrenadante por pipeteo.

22. Dar un pulso y repasar con pipeta el sobrenadante que pueda quedar.

23. Dejar secar con el tubo abierto dentro de la campana.

2.- Homogeneización del tejido:

24. Traspasar los cilindros de tejido a epp libres de ARNasas previamente

identificados.

25. (Uno a uno) sumergir en el N2 sujetándolo por la tapa abierta hasta que

deje de hervir.

26. Machacar el tejido congelado con uno de los bastones hasta disgregar lo

máximo el tejido. Si es necesario, volver a congelar cuantas veces se

necesite conforme se vaya descongelando por el rozamiento.

27. Repetir el proceso con cada caso.

28. Resuspender el pellet disgregado en 150μL de Buffer PKB.

29. Añadir 30μL de PROTEINASA K (10 mg/ml) homogeneizada por

inversión y mezclar por pipeteo.

30. Dar un pulso e incubar a 55ºC en agitación a 900 rpm en el termomixer.

El tiempo de incubación variará en función de la cantidad y el grado de

disgregación del tejido entre 30 minutos y toda la noche. Si es necesario

se puede añadir otros 20-30μL de Proteinasa K. En cualquier caso

siempre se tendrá que incubar hasta que NO se observen restos de tejido.


105

31. Incubar durante 15 minutos exactos a 80ºC sin cambio gradual de Tª

(para revertir los entrecruzamientos provocados por la fijación con

formalina).

3.- Extracción y Purificación:

Preparar e identificar las columnas y los tubos del kit necesarios.

Dar un pulso. Añadir 320μL de Buffer RBC y mezclar muy bien por

pipeteo. Transferir todo a la columna azul.

Centrifugar durante 30 segundos a más de 10000 rpm.

Descartar el filtro.

Añadir 720μL de etOH100%-ARN y mezclar muy bien por pipeteo.

Transferir inmediatamente 700μL de la muestra a la columna rosa. Si se ha

formado algún tipo de precipitado también debe transferirse.

Cerrar rápidamente la columna y centrifugar durante 15 segundos a más de

10000 rpm. Desechar el eluido y limpiar lo que sea posible el tubo.

Transferir el resto de la muestra y repetir la operación.

1º Lavado: añadir 500μL de Buffer RPE. Cerrar rápidamente y centrifugar a

más de 10000 rpm durante 15 segundos. Desechar el eluido y limpiar el

tubo lo que sea posible.

2º Lavado: añadir 500μL de Buffer RPE. Cerrar rápidamente y centrifugar a

más de 10000 rpm durante 2 minutos. Desechar el eluido y limpiar el tubo

lo que sea posible.

Desechar el tubo y pasar la columna a uno nuevo. Con la columna abierta,

centrifugar durante 5 minutos a velocidad máxima. Colocar las tapas en

sentido contrario a la del giro del rotor para evitar que se rompan.

o ¡¡Es muy importante que durante los lavados el filtro de la

columna no toque jamás el eluido!!

4.- Elución:

Identificar los Éppendorf de elución del kit y pipetear en el fondo 2,5μL de

Inhibidor de ARNasas 20U/μL.

Traspasar las columnas y añadir en el centro de la membrana 24,5μL de agua de

GBM. Incubar durante 15 minutos a TA.

Centrifugar a velocidad máxima durante 1 minuto.

El volumen muerto de la columna es de 2μL, por lo que eluirán

22,5, que añadidos al Inhibidor harán un volumen total de 25μL.

Cuantificamos el ARN en el Nanodrop 1000 (Thermo Scientific). Se recogerán

los datos de concentración (ng/µL) y los ratios 280/260 y 230/260.

Si no se va a realizar inmediatamente la retrotranscripción se almacenarán las

muestras a –80ºC.


106

Protocolo 7

Retrotranscripción de ARN con Quantitect Reverse transcription Kit de Qiagen

Este protocolo incluye un paso de eliminación del ADN genómico. Todo el proceso se

realizará en hielo.

- se calcula la cantidad necesaria de cada muestra para obtener 1 µg de ARN y se pasa a

tubos Éppendorf de 0,2 µL rotulados previamente. Se completa el volumen de ARN con

H2O-GBM hasta 12 µL en función de cada caso. Añadimos 2 µL de gDNA wipeout

Buffer 7x a cada tubo. Incubamos a 42ºC durante 2 minutos exactos y pasamos a hielo

inmediatamente para cortar la reacción.

- En función del número de muestras, que se calculará teniendo en cuenta el número de

muestras problema, las mamas normales que formarán el calibrador, más un control

negativo y un control de ARN de mama comercial, se prepara el master-mix:

Buffer de retrotranscripción 5x 4 µL

RT primer mix (con oligonucleótidos cebadores) 1 µL

Transcriptasa 1 µL

- Se mezcla el master-mix por inversión y se le da un pulso de centrífuga. Se reparten 6

µL de master-mix por tubo de retrotranscripción (lo que suponen 20 µL totales).

- Termociclado: Retrotranscripción 15 minutos 42ºC

Parado de la reacción 3 minutos 95ºC

Para disminuir la concentración de los reactivos excedentes de la reacción de

retrotranscripción y que éstos no interfieran en la reacción de qPCR, se diluyen los

ADNcopia (ADNc) 1:5 (80 µL de H2O-GBM), con lo que obtenemos de cada muestra

retrotranscrita 100 µL finales con una concentración de ADNc de 10 ng/µL. Los ADNc

se almacenan a -20ºC hasta su cuantificación.

Protocolo 8

Cuantificación de la expresión génica por qPCR a tiempo real con sondas Taqman

Protocolo 8A.-Puesta a punto de un estudio de expresión

Selección de los ensayos para los genes de interés:

TaqMan® Gene Expression Assays https://products.appliedbiosystems.com/ab/en/US/adirect/ab?cmd=catNavigate2&catID=601267

AB diseña distintos ensayos a lo largo de todo el gen y el investigador decide cual es el

que le interesa teniendo en cuenta que queremos amplificar ADNc y no ADNg. Por

tanto, hay que seleccionar el ensayo en función de:

- Los exones que codifique.

- Procurar que codifique parte de 1 exón y parte del contiguo para evitar que hibride el

ADNg.


107

- Estudiar los posibles genes homólogos y/o pseudogenes para evitar la amplificación de

sus secuencias que puedan falsear los resultados dando falsos positivos.

- El tamaño del amplicón: debe estar entre 60–100 pb, preferentemente entre 60-80 pb si

trabajamos con tejido FFPE, pues su ARNm estará mucho más dañado.

Estudiar la bibliografía relacionada para escoger al menos 2 endógenos o

realizar una placa de endógenos de AB para seleccionar los más estables en nuestras

muestras. Buscar los ensayos para éstos:

TaqMan® Endogenous Controls https://products.appliedbiosystems.com/ab/en/US/adirect/ab?cmd=catNavigate2&catID=602765

Para comprobar que los endógenos son estables en las muestras haremos un estudio de

estabilidad:

- cuantificaremos unas 5 muestras en el Bioanalizador.

- haremos diluciones para llevar todas las muestras a la misma concentración.

- Q-PCR Los Ct deben ser los mismos para todas las muestras.

Para escoger el endógeno al que finalmente referiremos los resultados debemos

controlar:

- que la correlación entre todos los endógenos sea buena (Rango de Correlación de

Spearman: r ≈1 con p<0.5)

- que es estable en nuestras muestras

- que la diferencia de Cts entre el endógeno y el gen diana no sea muy grande para

asegurar que la eficiencia de la reacción es similar entre ellos.

- que cumpla los criterios de eficiencia de la QPCR (Bulletin 2, AB: Apéndice 1).

Controles:

Controles comerciales: es aconsejable poner como mínimo 2. Pueden ser del mismo

tejido en estudio (1 patológico y otro normal) o bien de otros tejidos. Nos sirven para

valorar la eficacia de la RT-PCR y de la Q-PCR. Su dCt no debe variar más de dCt ±

0.2 desv. Deben incluirse en todas las RT-PCR en una concentración de máximo 10

ng/µL, así como en todas las placas, para valorar las diferencias de eficacia de un

análisis a otro. Si no cumplen los criterios no se podrán validar los resultados de las

muestras vinculadas a esa RT/QPCR.

Control negativo de la RT-PCR (RTC-): para valorar contaminaciones durante la RT-

PCR. Debe hacerse con cada nueva RT-PCR y analizarse al menos una vez en QPCR

(mix + C-). Si da positivo no pueden validarse los resultados de ninguna muestra de esa

tanda de RT-PCR.

Control negativo de la qPCR o “No Template Control” (NTC): para valorar

contaminaciones en el mix de Q-PCR. Debe estar en todas las placas. Sólo contendrá

mix de qPCR y agua.

RT minus: para asegurar que las sondas no hibridan con DNA genómico. Consiste en

analizar en las primeras placas muestras de RNA sin pasar por la retrotranscripción. El

resultado debe ser negativo preferiblemente, si no es así indica que el/ ensayo está


108

detectando ADNg. Se acepta hasta un 5% de ADNg detectado porque se entiende que

no afecta al resultado final de expresión.

Elección del calibrador:

El calibrador es el valor de referencia a la hora de valorar los resultados. Puede ser un

RNA comercial o bien RNA extraído a partir de muestras propias, debe escogerse en

función del interés.

En caso de muestras propias el calibrador puede ser:

- un pool de muestras sanas que servirán de referencia a todas las muestras

tumorales.

- De cada paciente se toma la muestra tumoral (problema) y muestra sana

(calibrador individual) que puede ser tejido adyacente al tumor o no.

En caso de elegir el pool de muestras sanas debemos primero analizar las muestras por

separado para asegurarnos que no son demasiado discordantes. Una vez hecho esto las

mezclaremos a partes iguales y analizaremos el pool para comprobar que los resultados

prácticos no varían demasiado con respecto a la media aritmética de los dCt

individuales.

Valoración de la reproducibilidad de la Q-PCR:

Diluimos los controles con un Fd = 1/100 y los analizamos en tres placas distintas. Las

desviaciones de las tres medidas de cada control y de cada control diluido 1/100 no

deben ser >0,33.

Estudio de eficacia de la qPCR y cumplimiento de los criterios de uso del

método ddCt:

Para asegurar la eficiencia de nuestros ensayos hacemos una placa con diluciones de un

control comercial, la concentración de la disolución madre debe ser de ≈10 ng/µL. Lo

ideal es hacer unas 8 diluciones con Fd ¼ y otras 2 con Fd 1/100.

(Utilizar el archivo Excel Puesta a Punto Estudio de Expresión que está en la carpeta

“Protocolos” del directorio de la Unidad de Investigación)

1º) Rellenamos la tabla de Excel para eficiencia y hacemos la recta.

Se debe cumplir que la pendiente del endógeno y del target IGF1R sean aproximadas,

con una desviación típica <0.1. Esto indica que las eficiencias para E y T son similares

y por lo tanto puede llevarse a cabo el estudio de la eficiencia relativa.

2º) Rellenamos la tabla de Excel para eficiencia relativa y hacemos la recta.

Se debe cumplir que la pendiente de la Eficiencia Relativa debe ser menor de 0,1,

validando el experimento para poder utilizar el método del ΔΔCt.


109

Protocolo 8B.- Protocolo de qPCR

Antes de comenzar el estudio deben hacerse los cálculos de material necesario.

Para igualar al máximo posible las condiciones de estudio entre las distintas muestras,

todos los reactivos de la qPCR se homogeneizarán entre los del mismo tipo pero distinto

kit y se alicuotarán. Esto evitará variaciones en la qPCR por cambios en los kits.

Además se hará un mix general por cada ensayo para todo el estudio a ser posible. Los

mix se prepararán en la campana con la luz apagada. Deberán almacenarse en oscuridad

y a 4ºC correctamente identificados y con la fecha de preparación. Todos los reactivos

deben atemperarse previamente, homogeneizarse y dar un spin a los ensayos. La

proporción por muestra es, para un volumen final de 12 µL, en principio:

TaqMan Gene Expression Master Mix 2X 6,25 µL

TaqMan Assay 20X 0,625 µL

H2O-GBM 3,125 µL

Añadiremos de 2 µL del ADNc obtenido de la RT-PCR (20 ng totales).

Cada placa tendrá que llevar:

- Controles + comerciales,

- Calibrador (pool),

- Controles - : NTC y cuando corresponda, el RTC-,

- Muestras problema.

Se analizarán en la misma placa tanto los endógenos como los genes diana. Todos ellos

se harán por duplicado.

Protocolo 9

Extracción de ARN total con el RecoverAll™ Total Nucleic Acid Isolation Kit de

Ambion

Preparación:

Preparar los bastones de digestión mecánica si no lo están:

Limpiarlos con etOH70%.

Incubar con ARNasaAway durante al menos 30 minutos.

Enjuagar con H2O-GBM y EtOH100%-ARN. Dejar secar.

Preparar y limpiar todos los reactivos, gradillas, tubos… que se van a usar: limpiar todo

el material y las superficies que vayan a estar en contacto con las muestras con etanol

70%. Ponerlo en tratamiento con ARNasa Away durante al menos 30 minutos.

Comprobar que los reactivos de lavado están reconstituidos.

Preparar mezcla de Isolation Additive y EtOH100%RNA: 240 μL de Isolation Additive

y 550 μL de EtOH100%RNA por cada muestra.

Preparar mezcla de tratamiento DNasa: 6 μL de DNase Buffer 10X, 4 μL de DNase y 50

μL de H2O-GBM por muestra.

Poner el termomixer a 50ºC y el termobloque a 80ºC.


110

1. Volcar los cilindros en la tapa del Éppendorf y cortar muy fino con

bisturí. Devolver al mismo Éppendorf. Traspasar los cilindros de tejido a

epp libres de ARNasas previamente identificados. Uno a uno sumergir en

el N2 sujetándolo por la tapa abierta hasta que deje de hervir. Machacar

el tejido congelado con uno de los bastones hasta disgregar lo máximo el

tejido. Si es necesario, volver a congelar cuantas veces se necesite

conforme se vaya descongelando por el rozamiento. Repetir el proceso

con cada caso.

2. Desparafinación:

Añadir 1mL de xilol-ARN (extracción de la parafina). Incubar a 50ºC durante 3

min.

Centrifugar: 2 min; Vmáx; Tª amb. Desechar el sobrenadante por pipeteo.

Añadir 1mL de xilol-ARN (extracción de la parafina). Incubar a 50ºC durante 3

min.

Centrifugar: 2min; Vmáx; Tª amb. Desechar el sobrenadante por pipeteo.

Añadir 1mL etOH100%-ARN (extracción del xilol residual). Rascar la gradilla


Centrifugar: Vmáx; 5min; Tª amb. Desechar el sobrenadante por pipeteo.

Añadir 1mL etOH100%-ARN (extracción del xilol residual). Rascar la gradilla


Centrifugar: Vmáx; 5min; Tª amb. Desechar el sobrenadante por pipeteo.

Secar en Speed-Vac (limpio y tratado) con tubo abierto a 40ºC durante 40

minutos.

3. Homogenización del tejido:

Añadir 200 μL de buffer de digestión y 4 μL de Proteasa del kit homogeneizada

por inversión.

Hacemos pasar el tejido en homogenización por aguja de insulina las veces

necesarias hasta que no se detecten grumos de tejido.

Dar un pulso e incubar a 50ºC durante 15 minutos. El tiempo de incubación

variará en función de la cantidad y el grado de disgregación del tejido. Podemos

añadir otros 4 μL de Proteasa del kit homogeneizada por inversión, volver a

pasar por aguja de insulina e incubar otros 15 minutos aquellas muestras que no

alcancen la homogeneización requerida. NO deben observarse restos de tejido al

finalizar esta etapa.

Incubar a 80ºC durante otros 15 minutos máximo nos ayudará a revertir

los entrecruzamientos provocados por la fijación con formalina.

4. Extracción y Purificación:

Preparar e identificar las columnas y los tubos del kit necesarios.

Dar un pulso a las muestras homogenizadas. Añadir 480μL de la mezcla de

Isolation Additive+EtOH100% y mezclar muy bien con vórtex.

Añadir 1100μL de EtOH100%-ARN y mezclar muy bien con vórtex.

Transferir inmediatamente 700μL de la muestra a la columna. Si se ha formado

algún tipo de precipitado también debe transferirse.

Cerrar rápidamente la columna y centrifugar durante 30 segundos a 10000 rpm.

Desechar el eluido y limpiar lo que sea posible el tubo.


111

Transferir el resto de la muestra y repetir la operación.

1º Lavado: añadir 700μL de Buffer de lavado BW1. Cerrar rápidamente y

centrifugar 30 segundos a 10000 rpm. Desechar el eluido y limpiar el tubo lo que

sea posible.



sea posible.

Desechar el tubo y pasar la columna a uno nuevo. Añadir DNasa mix e incubar

durante 30 minutos.



sea posible.



sea posible.



sea posible.

Con la columna abierta, centrifugar durante 2 minutos a velocidad máxima.

Colocar las tapas en sentido contrario a la del giro del rotor para evitar que se

rompan.

o ¡¡Es muy importante que durante los lavados el filtro de la columna no

toque jamás el eluido!!

5. Elución:

Identificar los Éppendorf de elución del kit y pipetear en el fondo 3 μL de

Inhibidor de ARNasas 20U/μL.

Traspasar las columnas y añadir en el centro de la membrana 30 μL de Elution

solution. Incubar 1 minuto a Tª amb.


Añadir en el centro de la membrana otros 30 μL de Elution solution. Incubar 1

minuto a Tª amb.


El volumen muerto de la columna es de 2μL, por lo que eluirán 28 μL

cada vez, que añadidos al Inhibidor harán un volumen total de 59 μL.

Cuantificamos el ARN en el Nanodrop 1000 (Thermo Scientific). Se recogerán

los datos de concentración (ng/µL) y los ratios 280/260 y 230/260.

Si no se va a realizar inmediatamente el bioanálisis y la retrotranscripción se

almacenarán las muestras a –80ºC.


112

Protocolo 10

Bioanálisis de microARNs

Consideraciones previas:

- Todos los reactivos deben conservarse a 4º, sino se degradan.

- Proteger los reactivos que lleven dye de la luz.

- Sacar los reactivos de la nevera 30´antes.

- Proteger mixes con dye de la luz.

- Insertar pipeta al fondo del pocillo.

- Usar nueva jeringa y limpiador de electrodos en cada kit. Cambiar el sello de la base

específico para miRNAs.

- Colocar la base en C y el émbolo de la jeringa en la posición más baja.

- Poner chips a analizar siempre dentro de los 5 min posteriores a su preparación.

- No tocar el Bioanalizador mientras está analizando.

Preparar el Gel-Dye Mix.

1- Permitir que el gel dye y el matrix gel se equilibren a Tª ambiente.

2- Pasar el matrix gel por el filtro: centrifugar a 12000 rpm durante 15 minutos.

3- Vórtex de 10’’ a gel dye y pulso de centrífuga.

4- En un Éppendorf de 0,5 mL, mezclar 2 μL de gel dye por cada 40 μL de matrix

gel.

5- Mezclar por inversión y chasquear hasta que esté totalmente homogéneo.

6- Centrifugar 10´ a 12000 rpm y al sacarlo protegerlo de la luz.

Preparar CHIP

1- El gel ya preparado se saca 30’ antes de su uso.

2- Añadimos 9 μL de gel en G grande.

3- Presionar jeringuilla hasta que haga clic.

4- Esperar 1’ exacto.

5- Llevar jeringa hasta 1 ml.

6- Abrir CHIP y poner 9 μL en pocillo de ambas G pequeñas.

7- Pipetear 9 µl de Small RNA Condition (blanco) en el pocillo CS.

8- Pipetear 5 µl de marcador (verde) en 11 muestras y ladder. No dejar ningún

pocillo vacio.

9- Pipetear 1 µl de Small RNA ladder (amarillo) en escalera.

10- Pipetear 1 µl de cada muestra de RNA total o agua.

11- Vórtex 1’ exacto (2400 rpm).

12- Poner CHIP en Bioanalizador, seleccionar el kit Small RNA y Start Run.


113

Protocolo 11

Retrotrancripción de los microARNs

Todo el proceso se realizará en hielo. Atemperar los reactivos y las muestras en hielo.

- Se prepara el pool de cebadores RT de cada miRNA. Este primer específico viene

junto con el ensayo TaqMan de cada miRNA. Para preparar 1 mL de pool a 1x de cada

primer, añadimos 10 µL de cada primer homogeneizado y el resto de buffer TE hasta

los 1000 µL.

- se calcula la cantidad necesaria de cada muestra para obtener 1 µg de ARN total y se

pasa a tubos Éppendorf de 0,2 µL rotulados previamente. Se completa el volumen de

ARN con H2O-GBM hasta 3 µL en función de cada caso.

- En función del número de muestras, que se calculará teniendo en cuenta el número de

muestras problema, las mamas normales que formarán el calibrador, más un control

negativo y un control de ARN TOTAL de mama comercial, se prepara el master-mix:

RT Primer pool 6 µL

Buffer de retrotranscripción 1,5 µL

dNTPs 0,3 µL

H2O-GBM 1,2 µL

Transcriptasa 3 µL

- Se mezcla el master-mix por inversión y se le da un pulso de centrífuga. Se reparten 12

µL de master-mix por tubo de retrotranscripción (lo que suponen 15 µL totales).

- Termociclado: Activación de la RTasa 30 minutos 16ºC

Retrotranscripción 30 minutos 42ºC

Parado de la reacción 5 minutos 85ºC hielo

Para disminuir la concentración de los reactivos excedentes de la reacción de

retrotranscripción y que éstos no interfieran en la reacción de qPCR, se diluyen los

ADNcopia (ADNc) 1:5 (60 µL de H2O-GBM), con lo que obtenemos de cada muestra

retrotranscrita 75 µL finales con una concentración de ADNc de 13,3 ng/µL que

podremos traducir a miRNAs en función del resultado del bioanálisis. Los ADNc se

almacenan a -20ºC hasta su cuantificación.

114

RESULTADOS

115

RRREEESSSUUULLLTTTAAADDDOOOSSS

La serie estudiada incluye 220 tumores de mama no consecutivos, que cumplían

los criterios de inclusión y exclusión y cuyos datos de seguimiento clínico fueron

recogidos hasta el 5 de noviembre de 2015.

1. Análisis descriptivo de las variables clínico-patológicas

La mediana de la edad de las pacientes en el momento del diagnóstico fue de 60

(49-73) años, predominando las de ≥50 años (75%; 165/220). En el 96,8% (209/216) de

los casos el crecimiento tumoral fue unilateral.

El tamaño tumoral máximo se determinó en la pieza quirúrgica y mostró unas

cifras de 18(14-25) mm, siendo un 58% ≤20 mm (127/220). El grado de diferenciación

tumoral más frecuente fue el grado II (46%; 100/220). En el 40,4% (86/213) se observó

invasión vascular, siendo focal en el 63% de los casos (54/86). Sin embargo, sólo se

detectaron focos de necrosis en el 15,6% de los tumores (33/211).

RESULTADOS

116

Se estudiaron una media de 15,54±6,25 ganglios por paciente. Sólo se encontró

positividad en el 37,4% (76/203) de los casos, 75% de los cuales tuvo un máximo de 3

ganglios afectados (57/76).

Pacientes (n) Porcentaje (%)

Edad

<50 años

≥50 años

165

55

75

25

Bilateralidad

Unilateral

Bilateral

209

7

96,8

3,2

Tamaño

≤20 mm

>20 mm

127

93

58

42

Grado Diferenciación

I

II

III

43

100

77

19,5

45,5

35

Invasión vascular

Ausente

Presente

127

86

59,6

40,4

Necrosis

Ausente

Presente

178

33

84,4

15,6

Metástasis ganglionar

Negativo

Positivo

127

76

62,6

37,4

Status ganglionar (N)

N0

N1 (1-3)

N2 (3-10)

N3 (>10)

127

57

16

3

62,6

28,1

7,9

1,5

Fenotipo

Luminal A

Luminal B

139

81

63,2

36,8

Tabla 5: Características clínico-patológicas de los tumores analizados.

RESULTADOS

117

Se realizó la clasificación tumoral en función del estudio inmunohistoquímico de

la expresión del RE, RPG, Ki67 y p53. El fenotipo luminal subtipo A, caracterizado por

una expresión de Ki67 y p53 <15%, quedó representado por un 63,2% de los casos

(139/220), mientras que el 36,8% (81/220) representaba al fenotipo luminal subtipo B,

caracterizado por una expresión de Ki67 y/o p53 ≥15%. La expresión

inmunohistoquímica de las proteínas Ki67, RE, RPG, p53 y BCL2 se muestra en la

Tabla 6.

Todos Luminales A luminales B

Variable N Me(p25-p75) N Me(p25-p75) N Me(p25-p75)

Ki67 220 10(6-20) 139 8(5-10) 81 22(20-27)

P53 219 1(0-3) 138 1(0-2) 81 2(0-9)

RE 220 80(40-90) 139 80(50-90) 81 80(40-90)

RPG 220 70(16-90) 139 70(15-90) 81 70(20-90)

BCL2 219 80(30-99) 139 80(40-100) 80 70(20-99)

Tabla 6: Expresión inmunohistoquímica de los marcadores Ki67, p53, RE, RPG

y BCL2.

2. Análisis descriptivo de las variables moleculares

2.1 Mutaciones en el gen PI3KCA

Se detectaron mutaciones en el gen PI3KCA en el 30,6% (57/186) de las

pacientes, localizándose en el 52,6% (30/57) de los casos en el dominio quinasa (exón

20, cambio de residuo H1047R, mutación A3114G). En el 45,6% (26/57) de los casos

mutados se afectó el dominio helical (exón 9), siendo más frecuentes las mutaciones en

el residuo E545 (mutación G1633A), el 28,1% (16/57), que en el residuo E542

RESULTADOS

118

(mutación G1624A), presente tan sólo en el 19,3% (11/57). Sólo se detectó una paciente

doble mutante (1,8%), que tenía las mutaciones A3140G y la G1624A, afectándose

tanto el dominio quinasa como el helical.

Figura 17: Distribuciones de la presencia de mutaciones en el gen PI3KCA en

función del subtipo tumoral. Las etiquetas numéricas indican frecuencia relativa en %.

Las diferencias entre los dos subtipos no fueron significativas.

2.2 Expresión de ARNm de los genes IGF1R, EGFR, c-Src, ESR1 y

MED1

Los niveles de expresión relativos fueron analizados con el método ddCt y por

tanto se muestran en valores de Fold Change (FC). Las distribuciones de las variables

de expresión génica se muestran en la Tabla 7. No se han extraído del análisis los casos

mutados en PI3K porque las variaciones fueron despreciables.

Variable N Me(p25-p75)

IGF1R 132 4,68(2,61-8,46)

EGFR 120 0,10(0,05-0,22)

c-Src 132 1,23(0,78-1,83)

ESR1 120 1,63(0,61-2,59)

MED1 132 0,50(0,29-0,84)

Tabla 7.- Distribuciones de los patrones de expresión génicos (FC).

RESULTADOS

119

Figura 18: Distribuciones de los niveles de expresión génicos en función del

subtipo tumoral (FC). Las diferencias entre los dos subtipos no fueron significativas

para ninguno de los genes.

LUMINAL BLUMINAL A

IGF

1R (F

C)

20

15

10

5

0

LUMINAL BLUMINAL A

EG

FR (F

C)

2,0

1,5

1,0

0,5

0,0

LUMINAL BLUMINAL A

cSR

C (

FC

)

9

6

3

0

LUMINAL BLUMINAL A

ESR

1 (F

C)

12

9

6

3

0

LUMINAL BLUMINAL A

ME

D1

(FC

)

4

3

2

1

0

4,49(2,79-8,63) 4,50(2,36-6,59) 0,09(0,05-0,21) 0,11(0,05-0,26)

1,31(0,83-1,82) 1,26(0,76-2,06)

1,67(0,59-2,74) 1,60(0,66-2,48) 0,44(0,27-0,73) 0,46(0,28-0,87)

RESULTADOS

120

Para facilitar el análisis estadístico, los niveles de expresión génica se

categorizaron en reprimido, normal y sobreexpresado (Tabla 8).

TODOS Luminales A luminales B

Variable N % N % N %

IGF1R 132 80 52

SE

N

REP

91

38

3

68,9

28,8

2,3

58

21

1

72,5

26,3

1,3

33

17

2

63,5

32,7

3,8

EGFR 120 75 45

SE

N

REP

2

8

110

1,7

6,7

91,7

1

4

70

1,3

5,3

93,3

1

4

40

2,2

8,9

88,9

c-Src 132 80 52

SE

N

REP

27

90

15

20,5

68,2

11,4

15

57

8

18,8

71,3

10,0

12

33

7

23,1

63,5

13,5

ESR1 120 75 45

SE

N

REP

47

49

24

39,2

40,8

20,0

30

29

16

40,0

38,7

21,3

17

20

8

37,8

44,4

17,8

MED1 132 80 52

SE

N

REP

7

59

66

5,3

44,7

50,0

5

35

40

6,3

43,8

50,0

2

24

26

3,8

46,2

50,0

Tabla 8: Clasificación de los niveles de expresión génica en función de sus

valores respecto de los valores normales. Las diferencias entre los subtipos luminales no

fueron significativas. SE: sobreexpresado, N: normal, REP: reprimido.

2.3 Expresión de los miRNAs Let-7-a, miR-21, miR-206 y miR-222

Los niveles de expresión relativos de los miRNAs fueron analizados también con

el método ddCt y por tanto se muestran en valores de FC. Las distribuciones de las

variables de miRNAs se muestran en la Tabla 9. Se han diferenciado los casos no

mutados de los casos mutados porque se han encontrado diferencias que lo justifican,

aunque ninguna de ellas alcanza la significancia estadística. El único miRNA capaz de

RESULTADOS

121

discriminar entre los subtipos luminales fue el miR-Let-7a (Figura 19), aunque el miR-

206 también mostró una tendencia en los casos silvestres (Figura 20).

Casos No Mutados Casos Mutados

Variable N Me(p25-p75) N Me(p25-p75)

Let-7a 25 0,39(0,28-0,55) 18 0,30(0,22-0,94)

miR-21 25 0,55(0,26-0,81) 18 0,83(0,26-1,08)

miR-206 25 1,41(0,70-5,12) 18 2,92(0,87-4,84)

miR-222 25 0,41(0,25-0,68) 18 0,52(0,25-0,97)

Tabla 9: Distribuciones de los patrones de expresión de los miRNAs en función

de la existencia de mutaciones en el gen PI3KCA (FC).

Figura19: Distribuciones de los niveles de expresión del miR-Let-7a en función

del subtipo tumoral y de la existencia de mutaciones en el gen PI3KCA (FC). En ambos

casos la variación entre los subtipos fue significativa.

Figura 20: Distribuciones de los niveles de expresión del miR-206 en función del

subtipo tumoral en los casos silvestres para el gen PI3KCA. La variación entre los

subtipos mostró una tendencia a la significancia estadística.

RESULTADOS

122

Los criterios de categorización de los miRNAs fueron los mismos que en el caso

de los niveles de la expresión génica (Tabla 10).

Todos Luminales A luminales B

Variable N % N % N %

Let-7-a 58 25 33

SE

N

REP

2

22

34

3,4

37,9

58,6

0

10

15

0,0

40,0

60,0

2

12

19

6,1

36,4

57,6

miR-21 58 25 33

SE

N

REP

5

27

26

8,6

46,6

44,8

1

14

10

4,0

56,0

40,0

4

13

16

12,1

39,4

48,5

miR-206 58 25 33

SE

N

REP

27

25

6

46,6

43,1

10,3

10

12

3

40,0

48,0

12,0

17

13

3

51,5

39,4

9,1

miR-222 58 25 33

SE

N

REP

6

17

35

10,3

29,3

60,3

1

8

16

4,0

32,0

64,0

5

9

19

15,2

27,3

57,6

Tabla 10: Clasificación de los niveles de expresión de los miRNAs en función de

sus valores respecto de los valores normales. Las diferencias entre los subtipos

luminales no fueron significativas. Se han considerado tanto los casos mutados como

los silvestres para el gen PI3KCA. SE: sobreexpresado, N: normal, REP: reprimido.

2.4 Expresión del Pri-miR-17~92.

El pri-miR-17~92 fue analizado en 50 casos, expresándose según la distribución

0,75 (0,31-4,65) en todos los casos (Figura 21). No se distinguió en función de la

existencia de mutaciones porque no se encontraron diferencias significativas y el

tamaño de la muestra se veía muy resentido.

RESULTADOS

123

Figura 21: Distribuciones de los niveles de expresión del Pri-miR-17~92 en

función del subtipo tumoral. La diferencia entre los dos subtipos no fue significativa.

Los niveles de expresión del pri-miR-17~92 relativos fueron igualmente

analizados con el método ddCt y por tanto la expresión en valores de FC y su

tratamiento fueron los mismos que los utilizados en los casos anteriores (Tabla 11).

Todos

Luminales A luminales B

N % N % N %

50 23 27

SE

N

REP

17

13

20

34,0

26,0

40,0

7

7

9

30,4

30,4

39,1

10

6

11

37,1

22,2

40,7

Tabla 11: Clasificación de los niveles de expresión génica en función de sus

valores respecto de los valores normales. Las diferencias entre los subtipos luminales no

fueron significativas. SE: sobreexpresado, N: normal, REP: reprimido.

LUMINAL BLUMINAL A

Pri

-miR

-17~

92 (F

C)

15

10

5

0

0,89(0,31-3,19) 0,67(0,32-6,59)

RESULTADOS

124

3. Asociación entre las variables moleculares y las clínico-patológicas

3.1 Asociación entre la mutación en el gen PI3KCA y las variables

clínico-patológicas

En la serie completa no se encontraron asociaciones significativas entre la

existencia de mutaciones en el gen PI3KCA y las variables clínico-patológicas. No

obstante, las correlaciones entre las variables inmunohistoquímicas variaron en función

de la presencia de mutaciones y del fenotipo tumoral (Tabla 12).

CORRELACIONES ENTRE LOS CASOS MUTADOS

RE RPG BCL-2 Ki67 p53

RE

1,000

0,382*

0,376

0,041

0,442 0,337*

0,281

0,064

-0,134

LA

LB

RE

RPG LA

LB

0,178

0,158 1,000

0,263

0,414

0,175

-0,291

0,187

-0,462

LA

LB

RPG

BCL-2 LA

LB 0,355***

0,573***

0,348***

0,118 1,000

0,075

-0,232

-0,211

-0,313

LA

LB

BCL-2

Ki67 LA

LB

0,069

0,059

-0,058

0,192

-0,044

0,079 1,000

0,119

-0,150

LA

LB

Ki67

p53 LA

LB

0,123

-0,028

0,180

-0,193 0,219*

-0,100

-0,069

-0,237 1,000

p53

RE RPG BCL-2 Ki67 p53

CORRELACIONES ENTRE LOS CASOS SILVESTRES

Tabla 12: Valores de Rho de Spearman y su significancia estadística entre las variables

inmunohistoquímicas, para los distintos subtipos tumorales en función de la existencia de

mutaciones en el gen PI3KCA. *** La correlación es significativa al nivel 0,001 (bilateral).

** La correlación es significativa al nivel 0,01 (bilateral).

* La correlación es significativa al nivel 0,05 (bilateral).

RESULTADOS

125

Dado que no se encontraron diferencias entre la existencia de mutaciones en el

gen PI3KCA y las variables clínico-patológicas, se tuvieron en cuenta todos los casos

para el análisis del resto de variables moleculares frente a las variables clínico-

patológicas para asegurar el tamaño muestral, a excepción del estudio de correlaciones

frente a las variables inmunohistoquímicas por su carácter cuantitativo.

3.2 Asociación entre los niveles de expresión génicos y las variables

clínico-patológicas

El gen IGF1R reveló un comportamiento distinto en función del subtipo. En el

caso de los luminales A, se observó una tendencia a la asociación negativa entre la

sobreexpresión de IGF1R y la metástasis en ganglios: se sobreexpresó en el 82,2% de

las pacientes sin metástasis ganglionar frente al 64,3% de las pacientes con metástasis

en ganglios, actuando como un factor protector (OR= 0,389(0,131-1,154), p= 0,084).

No se encontró esta asociación en los luminales B, aunque si se asoció a diámetros

<20mm: sobreexpresaron el IGF1R el 47,8% de los tumores con diámetros ≥20mm

frente al 75,9% de los tumores con diámetros <20 mm (OR: 0,292 (0,090-0,949), p=

0,037). Además, los luminales B con un grado de diferenciación de Nottingham bajo

tendían a sobreexpresar IGF1R (p= 0,067).

Las correlaciones entre el IGF1R y las variables inmunohistoquímicas en los

distintos grupos de tumores se muestran en la Tabla 13.

RESULTADOS

126


Silvestres Mutados Silvestres Mutados

RE -0,072 0,110 0,127 0,276

RPG -0,007 0,077 0,544* -0,006

BCL-2 0,105 -0,135 -0,127 -0,517

Ki67 0,232 -0,197 0,093 0,488

p53 -0,180 0,173 -0,473* -0,012

Tabla 13: Correlaciones entre el IGF1R y las variables inmunohistoquímicas en

función del subtipo luminal y de la existencia de mutaciones en el gen PI3KCA. Se

indican los valores Rho. En negrita marcadas las correlaciones con una p<0,1 y

señalados con * las p significativas. *** La correlación es significativa al nivel 0,001 (bilateral)



En los luminales A, la presencia de expresión del gen EGFR mostró una fuerte

tendencia a la asociación con un grado de diferenciación de Nottingham III,

expresándose en el 20% de estos tumores mientras que sólo se expresó en el 3,3% de los

tumores con grados I y II (OR= 7,25 (1,09-48,19), p= 0,059). Además, la

sobreexpresión de EGFR se asoció a un incremento del riesgo 34 (9-133) veces superior

de sufrir afectación de más de 3 ganglios que los tumores con valores normales o

reprimidos (p= 0,043). Asimismo, los tumores de pacientes jóvenes (<50 años)

mostraron una expresión mayor de EGFR (0,23 (0,10-0,34) vs 0,08 (0,04-0,16),

p=0,003). En los luminales B, los tumores con sobreexpresión inmunohistoquímica de

p53 en al menos el 15% de sus células mostraron una expresión mucho mayor (Figura

22). Además, la expresión de EGFR≥ p75 mostró una tendencia a la asociación con la

RESULTADOS

127

invasión linfovascular en estos tumores, que alcanzó un OR= 2,571 (1,441-4,589)

(p=0,090).

Figura 22: Comparativa de las distribuciones de los niveles de expresión de

EGFR en función de sobreexpresión de p53≥15% de sus células (Prueba U de Mann-


Las correlaciones entre el EGFR y las variables inmunohistoquímicas en los

distintos grupos de tumores se muestran en la Tabla 14:



RE -0,224 -0,340 -0,231 0,037

RPG 0,108 0,093 -0,357 -0,585

BCL-2 0,134 0,232 -0,183 0,130

Ki67 -0,001 -0,281 -0,297 -0,031

p53 0,041 0,232 0,577** 0,381

Tabla 14: Correlaciones entre el EGFR y las variables inmunohistoquímicas en






<15%>=15%

EG

FR1

(FC

)

1,0

0,8

0,6

0,4

0,2

0,0

p=0,055

RESULTADOS

128

La sobreexpresión del gen c-Src en los luminales A se comportó como un factor

protector frente a la metástasis ganglionar: sólo un 3,6% de los tumores con metástasis

ganglionar lo sobreexpresaron frente al 24,4% de los tumores sin metástasis (OR= 0,114

(0,014-0,943) (p= 0,023) (Tabla 14). Sin embargo, los tumores con niveles de expresión

inmunohistoquímica de progesterona <10% mostraron niveles de expresión de c-Src

mayores (Figura 23).

Figura 23: Comparativa de las distribuciones de los niveles de expresión de c-Src

en función de la expresión inmunohistoquímica de receptores de progesterona de los

tumores (Prueba U de Mann-Whitney) en los luminales A.

Por el contrario, en los luminales B, la sobreexpresión del gen c-Src se comportó

como un factor de riesgo de desarrollar metástasis ganglionar con un OR= 4,650 (1,125-

19,212) (p= 0,052) (Tabla 15). Al mismo tiempo, la represión del gen c-Src mostró una

tendencia a la asociación con la necrosis tumoral, que a pesar de no alcanzar la

significancia estadística (p= 0,060), suponía un riesgo 5,190 (0,980-27,450) veces

superior. Además, los tumores con una expresión inmunohistoquímica baja del RE

mostraron una sobreexpresión del gen c-Src (OR= 5,00 (2,87-8,70); p= 0,050).

1,16 (0,82-1,66)

1,66 (1,22-3,07)

p=0,052

≥10% <10%

RESULTADOS

129

Met

ást

asi

s en

Gan

gli

os

Luminales A

N SE (%) NoRep (%) p

Sí 28 3,6 96,4

0,023

No 45 24,4 75,6

luminales B

N SE (%) NoRep (%) p

Sí 14 42,9 57,1

0,052

No 36 13,9 86,1

Tabla 15: Asociación entre los niveles de expresión de c-Src y la metástasis en

ganglios en función del subtipo luminal. SE: sobreexpresado, NoRep: normal o

reprimido.

Las correlaciones entre el c-Src y las variables inmunohistoquímicas en los




RE -0,183 -0,118 -0,464* 0,092

RPG -0,020 -0,219 -0,006 0,080

BCL-2 -0,080 -0,018 -0,385 -0,511

Ki67 0,243 -0,112 0,110 0,152

p53 -0,164 -0,179 0,114 -0,123

Tabla 16: Correlaciones entre el c-Src y las variables inmunohistoquímicas en






RESULTADOS

130

Respecto a los niveles de expresión génica del ESR1, en los luminales A el 90%

de los casos con sobreexpresión de ESR1 fueron pacientes de ≥ 50 años (OR= 4,50

(1,17-17,26); p= 0,020) siendo en general mayor el nivel de expresión en este grupo

(Figura 24).

Figura 24: Comparativa de las distribuciones de los niveles de expresión génica

de ESR1 en función de la edad de las pacientes en los luminales A (Prueba U de Mann-

Whitney).

Sin embargo, en los luminales B, la asociación entre la expresión génica del ESR1

y la edad de las pacientes no alcanzó la significancia estadística, aunque sí se mantuvo

una diferencia suficiente para mostrar una tendencia clara hacia la sobreexpresión en las

pacientes de ≥ 50 años (1,81 (0,96-2,58) vs 0,76 (0,33-2,03); p= 0,066). Por otro lado, la

presencia de expresión del gen se asoció a tumores con un diámetro máximo >20 mm

(OR: 8,24 (0,92-73,79); p= 0,051) y se evidenció asociado a la presencia de necrosis

tumoral (Figura 25).

RESULTADOS

131


de ESR1 en función de la presencia de necrosis en el tumor en los luminales B (Prueba

U de Mann-Whitney).

Las correlaciones entre el ESR1 y las variables inmunohistoquímicas en los




RE 0,007 0,508* 0,215 0,337

RPG 0,079 0,313 0,008 0,203

BCL-2 -0,138 0,114 0,091 0,080

Ki67 0,019 -0,019 0,347 -0,067

p53 -0,135 -0,122 -0,029 -0,468

Tabla 17: Correlaciones entre el ESR1 y las variables inmunohistoquímicas en


indican los valores Rho. En negrita marcadas las correlaciones con una p<0,1y




RESULTADOS

132

Los niveles de expresión del gen MED1 no revelaron asociaciones significativas

con las variables clínico-patológicas en el caso de los luminales A. En los luminales B,

sin embargo, el 88,5% de las pacientes con ≥ 50 años tenían reprimida la expresión del

gen (OR= 5,62 (1,34-2,56); p= 0,012). Contrariamente, las pacientes con tumores

bilaterales mostraron niveles de expresión mucho mayores (Figura 26). Las

correlaciones entre el MED1 y las variables inmunohistoquímicas en los distintos

grupos de tumores se muestran en la Tabla 18.


de MED1 en función de la bilateralidad del cáncer de mama en los luminales B (Prueba

U de Mann-Whitney).

RESULTADOS

133



RE -0,099 -0,109 0,120 -0,141

RPG -0,054 -0,166 0,530* 0,031

BCL-2 -0,023 -0,155 -0,027 0,160

Ki67 0,013 0,207 0,210 0,037

p53 -0,191 0,079 0,100 -0,345

Tabla 18: Correlaciones entre el MED1 y las variables inmunohistoquímicas en






3.3 Asociación entre los niveles de expresión de los miRNAs y las

variables clínico-patológicas (VCP)

En los luminales A, no se observaron asociaciones entre la expresión del miR-Let-

7a y las VCP. En los luminales B se observó una asociación con la represión del miR-

Let-7a y el grado de diferenciación de Nottingham alcanzado por los tumores (Prueba

de Kruskal-Wallis, p= 0,043) que se consolidó al observar que el 73,7% de los tumores

con un grado de diferenciación alto (grado III) tenían reprimido el miR-Let-7a (OR=

5,040 (1,129-22,496); p= 0,029). Las correlaciones entre el miR-Let-7a y las variables

inmunohistoquímicas en los distintos grupos de tumores se muestran en la Tabla 19.

RESULTADOS

134



RE -0,195 -0,154 -0,182 0,170

RPG 0,074 0,346 0,041 0,630

BCL-2 0,280 -0,133 0,362 0,786*

Ki67 -0,562* -0,402 -0,228 -0,030

p53 -0,193 -0,185 -0,223 -0,726*

Tabla 19: Correlaciones entre el miR-Let-7a y las variables inmunohistoquímicas

en función del subtipo luminal y de la existencia de mutaciones en el gen PI3KCA. Se





Respecto al miR-21, sólo se observó que en el grupo de luminales B, los tumores

con un grado de diferenciación alto (grado III) tenían asociados niveles de expresión

menores al 3º cuartil (RQ= 0,22 FC), lo que supuso una asociación muy cercana a la

significación estadística (p= 0,057) que conllevaba un incremento del riesgo de 5,333

(1,058-26,898). Las correlaciones entre el miR-21 y las variables inmunohistoquímicas

en los distintos grupos de tumores se muestran en la Tabla 20.

RESULTADOS

135



RE -0,017 -0,432 -0,391 0,356

RPG 0,031 0,068 0,156 0,525

BCL-2 -0,023 0,064 0,047 0,638

Ki67 -0,428 -0,295 0,060 0,143

p53 -0,101 0,362 0,047 -0,765*







No se encontraron asociaciones significativas entre los niveles de expresión del

miR-206 y las variables clínico-patológicas en ninguno de los dos subtipos luminales.

Las correlaciones frente a las variables inmunohistoquímicas en los distintos grupos de

tumores se muestran en la Tabla 21.



RE -0,066 -0,698* -0,009 0,576

RPG -0,142 -0,370 0,165 0,220

BCL-2 -0,007 0,051 0,317 0,800**

Ki67 -0,204 -0,153 0,317 0,454

p53 -0,332 -0,255 0,131 -0,403







RESULTADOS

136

En cuanto al miR-222, en los luminales B, se observó una tendencia a la

asociación inversa con el grado de diferenciación de Nottingham alcanzado por los

tumores (Prueba de Kruskal-Wallis, p= 0,086) (Figura 27) que se consolidó al observar

que el 27,3% de los tumores con niveles de expresión superiores al 3º cuartil (RQ= 0,84

FC) tenían un grado de diferenciación bajo (grado I) mientras que el 100% de los

tumores que no alcanzaron este nivel de expresión desarrollaban grados más avanzados

(II o III) (OR= 3,750 (2,072-6,788); p= 0,030). Las correlaciones entre el miR-222 y las

variables inmunohistoquímicas en los distintos grupos de tumores se muestran en la

Tabla 22.

Figura 27: Comparativa de la Distribuciones de los niveles de expresión del miR-

222 en función del grado de diferenciación de Nottingham alcanzado por el tumor

(Prueba de Kruskal-Wallis).

RESULTADOS

137



RE -0,339 -0,590 0,140 0,492

RPG -0,126 0,270 0,037 0,458

BCL-2 0,453 0,300 0,096 0,860**

Ki67 0,300 -0,804** 0,161 0,277

p53 0,101 0,026 -0,290 -0,698*







3.4 Asociación entre los niveles de expresión del pri-miR-17~92 y las

variables clínico-patológicas

El pri-miR-17~92 mostró, en los luminales A, una tendencia a la asociación con el

tamaño tumoral, de forma que la sobreexpresión del pri-miR-17~92 se comportaba

como un factor protector frente a diámetros ≥ 20 mm (OR= 0,100 (0,010-1,045); p=

0,069). En los luminales B, por el contrario, niveles de expresión mayores del pri-miR-

17~92 se asociaron a la metástasis ganglionar (Figura 28). Las correlaciones entre el

pri-miR-17~92 y las variables inmunohistoquímicas en los distintos grupos de tumores

se muestran en la Tabla 23.

RESULTADOS

138

Figura 28: Comparativa de la Distribuciones de los niveles de expresión del pri-

miR-17~92 en función del desarrollo de metástasis ganglionar (Prueba U de Mann-




RE 0,254 -0,102 -0,090 -0,185

RPG 0,161 0,177 -0,036 -0,500

BCL-2 0,120 0,430 0,382 -0,430

Ki67 0,404 -0,017 -0,214 -0,036

p53 0,084 0,113 0,236 0,891**

Tabla 23: Correlaciones entre el pri-miR-17~92 y las variables

inmunohistoquímicas en función del subtipo luminal y de la existencia de mutaciones

en el gen PI3KCA. Se indican los valores Rho. En negrita marcadas las correlaciones

con una p<0,1 y señalados con * las p significativas. *** La correlación es significativa al nivel 0,001 (bilateral)



RESULTADOS

139

4. Asociaciones entre las variables moleculares


niveles de expresión de los genes IGF1R, EGFR, c-Src, ESR1 y MED1

Los mutantes del gen PI3KCA, de ambos subtipos, expresaron el EGFR en un

14,3% de los casos, mientras que el 97,1% de los tumores silvestres reprimieron este

gen (OR= 5,58 (0,96-32,46); p= 0,053). Por el contrario, los niveles de IGF1R tendieron

a ser más bajos que en los tumores silvestres. Concretamente, la presencia de mutación

en el hotspot A3140G (exón 20) se asoció a la represión de IGF1R en un 13,3% de los

mutantes frente a su expresión en el 98,8% de los silvestres (OR= 12,77 (1,08-151,06);

p= 0,059). En los luminales A, las mutaciones en el exón 9 se comportaron como factor

de protección frente a la sobreexpresión de IGF1R puesto que sólo el 40% de los que

tenían afectado el dominio helical sobreexpresaron el gen, frente al 77,6% de los casos

silvestres (OR= 0,19 (0,05-0,79); p= 0,023). En particular, los niveles de expresión de

IGF1R se redujeron a la mitad en los mutantes G1624A (Figura 29).

Figura 29: Comparativa de las distribuciones de los niveles de expresión de

IGF1R en función de la presencia de la mutación G1624A en el exón 9 del gen PI3KCA

(Prueba U de Mann-Whitney).

RESULTADOS

140

En el caso de la expresión génica del ESR1, encontramos diferencias en función

del dominio afectado por la mutación y del subtipo luminal, aunque no se trasladaron a

la expresión proteica (% de células positivas por inmunohistoquímica) (Tabla 24).

Dominio Helical

p (

fen

oti

po

s)

Dominio Quinasa

p (

fen

oti

po

s)

p (

dom

inio

s)

ARNm

Luminales A 2,08 (0,87-5,46)

ns

0,30 (0,03-0,82)

0,032

0,010

luminales B 2,81 (0,70-5,82) 1,58 (0,96-2,17) ns

% IHQ

Luminales A 85 (50-93)

ns

60 (10-90)

ns

ns

luminales B 56 (35-83) 85 (49-93) ns

Tabla 24: Expresión del ESR1 a nivel mensajero y proteína (ER), en función del

subtipo tumoral y del dominio mutado de PI3K (Prueba U de Mann-Whitney).


miRNAs Let-7-a, miR-21, miR-206 y miR-222

Los patrones de expresión de algunos miRNAs también fueron diferentes en

función del dominio afectado por la mutación y/o del subtipo luminal.

La presencia de mutaciones en el dominio helical se relacionó con la

sobreexpresión del miR-21 puesto que esta situación se dio en el 27,3% de los casos

portadores mientras que el 96,9% de los casos silvestres mostraron una expresión

normal o reprimida del miRNA en cuestión (OR= 11,31 (1,06-127,24); p= 0,045).

El miR-Let-7a mostró patrones muy diferenciados (Tabla 25) destacando las

diferencias para los portadores de mutaciones en el residuo E542 (Figura 30).

RESULTADOS

141

Concretamente, en los luminales B, los casos con mutaciones en el dominio helical

presentaron expresión del miR-Let-7a en el 75% de los casos, mientras que se encontró

reprimido en todos los casos mutados en el dominio quinasa (OR: 0,167 (0,028-0,997);

p= 0,048) y en el 87,5% de los casos silvestres (OR: 21,00 (1,40-314,04); p= 0,032).

Dominio Helical

E542

Dominio Helical

E545

Dominio Quinasa

H3140

Luminales A 0,30 (0,29-0,30) 0,62 (0,34-1,31) 1,29 (1,22- 1,36)

luminales B 0,93 (0,53-1,33) 0,37 (0,11-0,62) 0,17 (0,14-0,23)

p 0,076 ns 0,053

Tabla 25: Expresión del miR-Let-7a en función del subtipo tumoral y del dominio

mutado de PI3K (Prueba U de Mann-Whitney).

Figura 30: Comparativa de las distribuciones de los niveles de expresión del miR-

Let-7a en función de la presencia de la mutación G1624A en el exón 9 del gen PI3KCA

y del subtipo luminal (Prueba U de Mann-Whitney).

RESULTADOS

142

En lo que respecta a la mutación G1633A, se encontró una asociación

significativa con la expresión del miR-222 en los luminales A (Figura 31).

Figura 31: Comparativa de las distribuciones de los niveles de expresión del miR-

222 en función de la presencia de la mutación G1633A en el exón 9 del gen PI3KCA

para los luminales A (Prueba U de Mann-Whitney).

4.3 Asociación entre la existencia de mutaciones en el gen PI3KCA y los

niveles de expresión del pri-miR-17~92

Los mutantes del gen PI3KCA expresaron el pri-miR-17~92 en un 87,5% de los

casos mientras que el 47,4% de los silvestres reprimieron su expresión (OR= 6,30 (1,11-

35,67); p= 0,027). La expresión del pri-microARN destacó principalmente en los

mutantes del dominio quinasa, puesto que se expresó en el 100% de los casos mientras

que el 40,7% de los casos no portadores lo reprimieron (OR= 1,69 (1,23-2,31); p=

0,037).

RESULTADOS

143

4.4 Correlaciones entre las variables moleculares (niveles de expresión de los

genes IGF1R, EGFR, c-Src, ESR1 y MED1, del pri-miR-17~92 y de los

miRNAs Let-7-a, miR-21, miR-206 y miR-222)

Para poder valorar la existencia de correlaciones entre los distintos genes, pri-

miRNA y miRNAs estudiados se realizó el Test de Correlación de Spearman (Tabla 26).

CORRELACIONES ENTRE LOS CASOS MUTADOS

IGF1R EGFR1 c-Src ESR1 MED1 Pri-miR Let7-a miR-21 miR-206 miR-222

IGF1R LA

LB 1,000

-0,204

0,250

-0,040

0,794**

-0,085

-0,067

0,179

0,370

-0,107

0,286

0,393

-0,075

0,500

-0,150

-0,357

-0,200 0,679

-0,233

LA

LB

IGF1R

EGFR1 LA

LB 0,048

-0,314 1,000

-0,009

0,146

-0,110

-0,012

0,157

0,500

0,417

0,536

0,503

0,063

0,095

-0,176 0,952***

-0,042

0,048

-0,159

LA

LB

EGFR1

c-Src LA

LB 0,538***

0,112

0,028

0,074 1,000

0,124

0,042 0,506*

0,152 -0,643

0,071 -0,536

0,017

0,036

0,100

-0,536

-0,433

-0,217

0,000

LA

LB

c-Src

ESR1 LA

LB 0,119

0,077

-0,217

-0,255

-0,176

-0,078 1,000

-0,256

0,139 -0,667*

0,714

-0,240

0,176

0,095

0,433 -0,810*

-0,183

0,238

0,100

LA

LB

ESR1

MED1 LA

LB 0,371**

0,197

-0,033

0,242

0,368**

0,233

0,325*

-0,003 1,000

-0,222

-0,357

-0,556

0,452

-0,148

0,117

0,500

-0,150

-0,357

-0,200

LA

LB

MED1

Pri-miR-

17~92 LA

LB 0,597*

-0,607 0,670*

-0,306

0,150

-0,714

0,060

-0,500

-0,032

-0,357 1,000

0,036

-0,714

0,310

-0,750*

0,381

-0,107

0,214

-0,571

LA

LB

Pri-miR-

17~92

Let7-a LA

LB -0,014

0,286

0,159

0,365

0,008

0,511

-0,286

-0,188

0,118

0,310

-0,035

-0,306 1,000

0,353

0,820**

0,385

0,636

0,487

0,854**

LA

LB

Let7-a

miR-21 LA

LB -0,033

0,345

-0,077

0,471

0,292

0,588

-0,317

0,030

-0,289

0,491

-0,354

-0,393

0,381

0,838*** 1,000

0,276

0,483 0,693*

0,817**

LA

LB

miR-21

miR-206 LA

LB 0,079

0,080

0,233

-0,214

0,396

-0,103

-0,196

-0,127

0,016

0,115

0,109

0,571

0,491

0,260 0,642*

0,364 1,000

0,151

0,883**

LA

LB

miR-206

miR-222 LA

LB 0,567*

0,389

0,207

0,193

0,402

0,091

-0,015

0,012

0,195

-0,035

0,434

-0,414

0,263

0,642*

0,183

0,661*

0,559*

0,606* 1,000

LA

LB

miR-222

IGF1R EGFR1 c-Src ESR1 MED1 Pri-miR Let7-a miR-21 miR-206 miR-222

CORRELACIONES ENTRE LOS CASOS SILVESTRES

Tabla 26: muestra los valores de Rho de Spearman y su significancia estadística entre

las variables moleculares, para los distintos subtipos tumorales en función de la existencia de

mutaciones en el gen PI3KCA. *** La correlación es significativa al nivel 0,001 (bilateral)


RESULTADOS

144


5. Análisis de Supervivencia

5.1 Supervivencia Libre de Enfermedad

5.1.1 Asociaciones con la recidiva tumoral

El tiempo de seguimiento medio fue de 128 (93-148) meses con un mínimo de 16

y un máximo de 185 meses. Se obtuvieron datos de seguimiento del 91,4% (201/220) de

las pacientes. En cuanto a las metástasis, el 61,5% fueron óseas, el 19,2 hepáticas y el

19,3% restante afectaron a otros órganos diversos. La forma de reaparición de la

enfermedad no se diferenció en función del fenotipo (tabla 27), aunque sí el tiempo que

tardó en reaparecer, definido como la SLE (figura 32).

Fenotipo

(N total)

Luminales A

(125)

luminales B

(76)

Todos

(201)

Recidiva local 11 (8,8%) 13 (17,1%) 24 (12%)

Metástasis 14 (11,2%) 6 (7,9%) 20 (10%)

Recidiva + metástasis 4 (3,2%) 2 (2,6%) 6 (3%)

Libre de enfermedad 96 (76,8%) 55 (72,4) 151 (75,1%)

Tabla 27: Distribuciones de los datos de reaparición de la enfermedad en función del

subtipo y en la serie completa (N (%)), p > 0,05.

Luminal A: 170 (163-177)

Luminal B: 142 (131-152)

Test Log Rank, p=0,025

Hazard ratio (HR)= 2,28 (1,09-4,78)

RESULTADOS

145

Figura 32: Curvas de Kaplan-Meier para la SLE en función del fenotipo.

Se estudió la existencia de asociaciones entre la reaparición de la enfermedad y las

características clínico-patológicas y moleculares analizadas.

En la serie completa, la afectación de más de 3 ganglios mostró una fuerte

asociación con la reaparición metastásica de la enfermedad. 6/26 (23%) pacientes con

más de 3 ganglios afectados al diagnóstico desarrollaron metástasis a distancia, lo que

ocurrió sólo en 10/162 (6,2%) pacientes con 3 o menos ganglios afectos, suponiendo un

riesgo 4,56 (1,50-13,90) veces mayor (p= 0,012).

La inmunotinción positiva ≥10% de RE demostró ser un factor protector frente a

la reaparición de la enfermedad. 7/12 (58,3%) de las pacientes con RE<10% recidivaron

mientras que sólo lo hicieron 40/183 (21,9%) de las pacientes con RE≥10% (OR: 0,2

(0,06-0,66), p= 0,009).

Del mismo modo, la inmunotinción positiva del RPG mostró una clara tendencia a

actuar como factor protector frente a la recidiva. 12/32 (37,5%) de las pacientes con

RPG <10% recidivaron mientras que sólo lo hicieron 35/163 (21,5%) de las pacientes

con RPG≥10% (OR: 0,46 (0,20-1,02), p= 0,053).

En los luminales A el riesgo de reaparición de la enfermedad aumento 3,294 veces

(0,916-11,843) cuando el tumor tenía la mutación G1633A (5/11 (45,5%) de los

mutados sufrieron recidiva frente a sólo 21/104 (20,2%) de los silvestres) (p= 0,057).

En este subtipo también fue determinante el porcentaje de células que sobreexpresaron

inmunohistoquímicamente el RE, puesto que sólo 21/111 (18,9%) de las pacientes con

RE≥10% presentó recidiva de la enfermedad frente a 5/8 (62,5%) de las pacientes con

RE<10%. Así pues, un RE≥10% se consolidó como un factor protector frente a la

reaparición de la enfermedad (OR: 0,14 (0,03-0,63), p= 0,012).

RESULTADOS

146

En los luminales B el porcentaje de células con inmunotinción positiva para BCL2

se asoció al desarrollo de metástasis (figura 33).

Figura 33: Asociación del % de células inmunopositivas para BCL2 con el

desarrollo de metástasis en los luminales B (Prueba de Kruskal-Wallis).

Además, en este fenotipo, la sobreexpresión del miR-222 por encima del 3º cuartil

supuso un incremento de 7,60 veces (1,07-54,09) el riesgo de desarrollar recidiva local

puesto que sólo 2/21 (9,5%) de las pacientes con una expresión del miR-222 < 3º cuartil

presentaron recidiva de la enfermedad frente a 4/9 (44,4%) de las pacientes con una

expresión del miR-222 ≥ 3º cuartil (p=0,049).

5.1.2 SLE en función del tiempo de seguimiento

Para evaluar la influencia del tiempo de seguimiento de las pacientes sobre las

variables que en principio están asociadas a una disminución de la SLE, se realizó el

análisis de supervivencia por duplicado: tomando como tiempo máximo de seguimiento

60 meses, que representa un tiempo de seguimiento medio de un buen número de series

publicadas, con el tiempo máximo de seguimiento real (185 meses máximo). Las

RESULTADOS

147

diferencias entre las variables que resultaron significativas a corto y largo plazo de

seguimiento se muestran en las Tabla 28, 29 y 30.

Todos

N

SLE

60 meses

p

Log Rank

N

SLE

185 meses

p

Log Rank

Fenotipo

Luminal A

Luminal B

123

74

59 (58-60)

57 (55-59)

0,007

125

75

170 (163-177)

142(131-152)

0,025

HR= 3,819 (1,327-10,993) HR= 2,278 (1,085-4,782)

Bilateralidad

Bilateral

Unilateral

7

186

48 (36-59)

59 (58-60)

0,000

7

189

72(42-102)

169(163-176)

0,000

HR= 14,251 (5,548-36,606) HR= 14,251 (5,548-36,606)

Ki67

≥15%

<15%

72

119

57(55-59)

59(58-60)

0,001

73

121

141(130-152)

173(166-179)

0,007

HR= 2,303 (0,989-5,863) HR= 2,790 (1,286-6,054)

p53

≥20%

<20%

8

182

57(52-62)

58(58-59)

0,545

8

185

125(90-161)

166(160-163)

0,030

RE

<10%

≥10%

12

179

56(47-64)

59(58-60)

0,736

12

182

130(97-162)

167(160-174)

0,016

HR= 0,293 (0,101-0,847)

RPG

<10%

≥10%

32

159

57(53-60)

59(58-60)

0,197

32

162

143(126-161)

168(162-175)

0,011

HR= 0,354 (0,154-0,817)

EGFR

Sobreexpresado

Normal o reprimido

2

104

49(33-64)

58(57-60)

0,007

2

104

58(32-84)

162(152-171)

0,008

HR= 15,217 (1,717-134,876) HR= 9,987 (1,217-81,960)

EGFR

Expresado

Reprimido

9

97

55(50-61)

58(57-60)

0,060

9

97

110(80-140)

163(153-173)

0,022

Tabla 28: Variables con influencia en la SLE de la serie completa con dos

seguimientos (60 y 185 meses). Se muestra el número de casos por categoría, media de

supervivencia e intervalo de confianza del 95% (Curvas de Kaplan-Meier), y valor p del test

de comparación entre las curvas Log Rank. Se aporta el valor de Hazard Ratio (HR) para las

variables independientes.

RESULTADOS

148

Todos

N

SLE

60 meses

p

Log Rank

N

SLE

185 meses

p

Log Rank

Pri-miR-17~92

≥p75

<p75

11

33

56(51-61)

59(58-61)

0,020

11

33

119(88-151)

158(146-170)

0,106

Let7a

Sobreexpresado

Normal o reprimido

2

49

51(37-64)

59(58-60)

0,027

2

49

75(28-121)

155(144-167)

0,030

miR-222

Sobreexpresado

Normal o reprimido

6

45

53(45-61)

59(58-60)

0,009

6

45

109(70-148)

157(147-168)

0,036

miR-206

≥p75

<p75

13

38

56(52-61)

59(58-61)

0,025

13

38

131(104-157)

160(149-171)

0,171

Tabla 28 (continuación): Variables con influencia en la SLE de la serie

completa con dos seguimientos (60 y 185 meses). Se muestra el número de casos por

categoría, media de supervivencia e intervalo de confianza del 95% (Curvas de Kaplan-

Meier), y valor p del test de comparación entre las curvas Log Rank. Se aporta el valor

de Hazard Ratio (HR) para las variables independientes.

El análisis de las variables asociadas a la SLE a corto plazo señaló como

posibles factores de confusión a la expresión de EGFR, el pri-miR-17~92 y los miRNAs

Let-7a, miR-222 y miR-206. El análisis multivariante ratificó su condición de variables

codependientes (p>0,05).

El análisis de las variables asociadas a la SLE a largo plazo señaló como

posibles factores de confusión a p53 (que el análisis multivariante identificó como

dependiente de Ki67) y a la expresión de EGFR y la sobreexpresión de los miRNAs

Let-7a y miR-222, que el análisis multivariante ratificó como variables codependientes

(p>0,05).

RESULTADOS

149

Luminales A

N

SLE

60 meses

p

Log Rank

N

SLE

185 meses

p

Log Rank

Bilateralidad

Bilateral

Unilateral

3

118

41(19-64)

59 (58-60)

0,000

3

120

73(6-140)

173(167-180)

0,000

HR= 11,001 (1,274-94,954) HR= 13,450 (2,880-62,821)

RE

<10%

≥10%

8

109

No

valorable

0,666

8

111

134(99-170)

174(168-181)

0,006

HR= 0,196 (0,054-0,713)

RPG

<10%

≥10%

19

98

56(52-61)

60(59-60)

0,017

19

100

148(127-169)

176(170-182)

0,002

HR= 0,154 (0,046-0,510) HR= 0,194 (0,062-0,609)

Mutación G1633A

Mutado

Silvestre

11

102

57(52-62)

59(57-60)

0,434

11

104

152(135-170)

172(165-180)

0,067

HR = 3,151 (0,862-11,514)

c-Src

Sobreexpresado

Normal o reprimido

13

59

58(55-61)

59(57-61)

0,514

13

59

131(111-151)

173(164-182)

0,014

MED1

Sobreexpresado

Normal o reprimido

6

67

54(43-65)

59(58-61)

0,065

5

67

156(135-176)

171(162-180)

0,149

HR= 2,991 (0,627-14,280)

MED1

Normal o Sobreexp

Reprimido

35

37

59(56-61)

59(57-61)

0,626

35

37

177 (165-188)

154(143-164)

0,067

Tabla 29: Variables con influencia en la SLE de los Luminales A con dos

seguimientos (60 y 185 meses). Se muestra el número de casos por categoría, media de

supervivencia e intervalo de confianza del 95% (Curvas de Kaplan-Meier), y valor p del

test de comparación entre las curvas Log Rank. Se aporta el valor de Hazard Ratio (HR)

para las variables independientes.

El análisis de las variables asociadas a la SLE a largo plazo señaló como

posibles factores de confusión a la expresión de MED1 y la sobreexpresión de c-Src. El

RESULTADOS

150

análisis multivariante ratificó su condición de variables codependientes (p>0,05). No se

encontraron factores de confusión en la SLE a corto plazo.

Luminales B

N

SLE

60 meses

p

Log Rank

N

SLE

185 meses

p

Log Rank

Bilateralidad

Bilateral

Unilateral

4

68

53 (44-61)

58 (56-60)

0,021

4

69

71(54-89)

149(139-159)

0,000

HR= 10,586 (3,054-36,694) HR= 10,586 (3,054-36,694)

EGFR

Expresado

Reprimido

5

34

52(43-61)

58(56-61)

0,021

5

34

87(53-120)

143(130-156)

0,114

Pri-miR-17~92

≥p75

<p75

7

17

No

Valorable

0,006

7

17

111(69-153)

144(128-160)

0,182

Let7a

Sobreexpresado

Normal o reprimido

2

27

51(37-64)

59(57-61)

0,054

2

27

75(28-121)

143(129-157)

0,094

miR-21

Expresado

Reprimido

15

14

No

Valorable

0,058

15

14

124(96-152)

154(143-165) 0,047

HR= 6,673 (0,773-57,584) HR= 6,673 (0,773-57,584)

miR-222

Sobreexpresado

Normal o reprimido

5

24

52(43-61)

60(59-60)

0,008

5

24

102(58-146)

147(135-159)

0,040

HR= 5,560 (0,894-34,572)

miR-206

≥p75

<p75

10

19

No

Valorable

0,014

10

19

122(89-155)

146(135-156)

0,105

Tabla 30: Variables con influencia en la SLE de los luminales B con dos

seguimientos distintos (60 y 185 meses). Se muestra el número de casos para cada

categoría con su media de supervivencia y el intervalo de confianza del 95% (Curvas de

Kaplan-Meier), así como el valor p del test de comparación entre las curvas Log Rank.

Se aporta el valor de Hazard Ratio (HR) para las variables independientes.

El análisis de las variables asociadas a la SLE a corto plazo señaló como

posibles factores de confusión a la expresión de EGFR, el pri-miR-17~92 y los miRNAs

Let-7a, miR-222 y miR-206. El análisis multivariante ratificó su condición de variables

codependientes (p>0,05). No se encontraron factores de confusión en la SLE a largo

plazo.

RESULTADOS

151

5.2 Supervivencia Global

Durante el seguimiento se perdieron 29 pacientes y se informaron éxitus del 25%

(47/191) de las pacientes. En nuestra serie no encontramos diferencias en la SG en

función del fenotipo (Figura 34).

Figura 34: Curvas de Kaplan-Meier para la SG en función del fenotipo.

A continuación se describen las variables que demostraron influencia sobre la SG

en la serie completa (tabla 31) y en función del subtipo (tablas 32 y 33).

Luminal A: 161 (153-169)

Luminal B: 151 (140-162)

Test Log Rank, p=0,644

HR= 0,87 (0,48-1,57)

RESULTADOS

152

TODOS N Media IC (95%) p

Log Rank

Edad

≥50 años

<50 años

140

51

151

179

143-159

172-186

0,000

HR= 6,205 (1,926-19,995)

Bilateralidad

Bilateral

Unilateral

5

182

117

161

87-146

154-167

0,066

HR= 2,853 (0,883-9,217)

Tamaño

>20 mm

≤20 mm

79

112

147

167

135-159

160-174

0,005

HR= 2,271 (1,268-4,068)

Ganglios afectos

> 3

≤ 3

15

164

132

162

104-161

156-169

0,083

HR= 2,104 (0,887-4,990)

miR-222

Sobreexpresado

Normal o reprimido

6

45

98

149

62-134

137-160

0,032

HR= 3,746 (1,021-13,750)

Tabla 31: Variables con influencia en la SG de la serie completa. Se muestra el

número de casos para cada categoría con su media de supervivencia y el intervalo de

confianza del 95% (Curvas de Kaplan-Meier), así como el valor p del test de

comparación entre las curvas Log Rank. Ninguna de las variables cumplía con los

criterios de factor de confusión, por lo que no se realizó el análisis multivariante.

RESULTADOS

153

Luminales A N Madia IC (95%) p

Log Rank

Edad

≥50 años

<50 años

90

29

153

182

144-163

175-188

0,004

HR= 10,596 (1,441-77,912)

Bilateralidad

Unilateral

Bilateral

3

114

103

163

63-144

155-171

0,040

HR= 4,038 (0,951-17,137)

Metástasis ganglionar

Positivo

Negativo

41

70

152

168

137-167

160-176

0,045

HR= 2,155 (0,997-4,661)

IGF1R

Sobreexpresado

Normal o reprimido

50

21

168

142

158-178

121-163

0,065

HR= 0,419 (0,162-1,087)

Tabla 32: Variables con influencia en la SG de los Luminales A. Se muestra el





RESULTADOS

154

luminales B N Madia IC (95%) p

Log Rank

Edad

<50 años

≥50 años

50

22

137

168

124-150

155-181

0,045

HR= 4,005 (0,920-17,441)

Tamaño

>20 mm

≤20 mm

34

38

135

148

116-154

140-156

0,015

HR=3,350 (1,193-9,407)

Mutación PI3K G1633A

Mutado

Silvestre

3

48

110

152

80-141

138-166

0,088

HR= 3,484 (0,757-16,032)

miR-222

Sobreexpresado

Normal o reprimido

5

24

89

146

50-128

135-158

0,006

HR= 6,466 (1,415-29,542)

miR-21

Normal

Reprimido

12

13

107

150

86-129

137-163

0,017

HR= 3,045 (0,612-15,161)

Tabla 33: Variables con influencia en la SG de los luminales B. Se muestra el





155

156

DISCUSIÓN

157

DDDIIISSSCCCUUUSSSIIIÓÓÓNNN

Las distintas entidades biológicas que integran el cáncer de mama y sus

implicaciones moleculares, se han convertido en el centro de la investigación sobre esta

neoplasia durante la última década (7-8, 16, 307). Sin embargo, tal y como vuelve a

remarcarse en la reciente “14th St. Gallen International Breast Cancer Conference” (29),

la aplicación de los resultados moleculares al diagnóstico clínico no se termina de

conseguir y sigue siendo una prioridad aumentar el conocimiento sobre la

heterogeneidad molecular de esta neoplasia, que permita identificar a los pacientes más

adecuados para la terapia sistémica adyuvante. Los criterios histológicos y clínicos

disponibles no logran discriminar a aquellos pacientes, que por su bajo riesgo de recaída

y su baja respuesta esperada, no deberían ser sobretratados y por tanto expuestos a

experimentar los efectos secundarios del tratamiento sin que éste vaya a derivar en

algún beneficio (308). Este problema destaca en los pacientes con tumores luminales,

puesto que existen claras evidencias de la convivencia de distintos subgrupos dentro de

esta clasificación, que radican en distintos pronósticos y distintas respuestas al

tratamiento (309-312).

La proliferación en el cáncer de mama luminal tiene su eje principal en la

hiperactivación de la señalización estrogénica, mediada principalmente por su receptor

DISCUSIÓN

158

α o ESR1. Sin embargo, su actividad no siempre discurre por la vía de señalización por

ligando sino que también es posible a través de su relación con otras proteínas (42). Tal

es el caso de los receptores tirosina-quinasa (RTKs) para el factor de crecimiento

epitelial (EGFR) y para el factor de crecimiento similar a insulina (IGF1R) y de la

quinasa citosólica c-Src, que participan en la estimulación del ESR1 a través de la

señalización de las vías de crecimiento MAPK y antiapoptótica PI3K (126). Una vez

activado, el ESR1 sólo necesita entrar en el núcleo para, con la ayuda del mediador

MED1 y sus coactivadores específicos, ejercer su función como receptor nuclear

promoviendo la transcripción de genes que favorecerán el desarrollo tumoral (153). A

este sistema de regulación de la señalización estrogénica hay que sumarle el papel de los

microARNs, moduladores selectivos de cada uno de los participantes y de las vías de

señalización principales que aportan un nuevo enfoque a la biología de estos tumores

(41, 44, 217).

En el presente estudio, se ha evaluado un panel de genes y microARNs asociados

a la señalización estrogénica en una serie de 220 tumores luminales, con la pretensión

de conocer mejor su implicación en el comportamiento de estos tumores y estudiar

cómo afectan en conjunto a su biopatología. En nuestra serie todos los tumores han

mostrado al menos una alteración en las vías de señalización y otra alteración en los

perfiles de expresión de los miRNAs. Se han detectado grandes diferencias que nos han

llevado a considerar oportuna la evaluación de nuestra serie clasificando a los tumores

en función de su fenotipo y de la presencia de mutaciones en el gen PI3KCA.

DISCUSIÓN

159

Luminales A silvestres

En los luminales A silvestres cabe destacar el papel del IGF1R. En general, la

sobreexpresión de IGF1R por sí sola parece comportarse como un factor de buen

pronóstico, en consonancia con los resultados de otros autores (102, 313), e incluso

parece asociarse independientemente a tasas mejores de supervivencia global (tabla 32:

168 (158-178) vs 142 (121-163) meses, p(Log Rank)= 0,065; HR (Cox)= 0,419 (0,162-

1,087)).

El comportamiento mostrado por el EGFR es totalmente contrario al del IGF1R.

En los luminales A, encontramos una asociación con tumores de alto grado de

diferenciación, en consonancia con los resultados obtenidos por Gallardo en su serie de

tumores HER-2 (113), a lo que hay que sumar un incremento del riesgo de metástasis

ganglionar en un grado ≥N2 y una mayor presencia en tumores de mujeres jóvenes que

afianza más todavía su potencia como marcador de mal pronóstico en estos tumores. Sin

embargo sus niveles de expresión suelen ser bajos y no se sobreexpresó en ninguno de

los tumores luminales A silvestres, primando además su represión en este subtipo

(98,5%). Por lo que entendemos que su participación en la oncogénesis de estos tumores

es mínima.

El papel del c-Src en este subgrupo es más complicado y parece modificarse en

función de otros factores. La sobreexpresión del c-Src se muestra como un factor de

protección frente a la metástasis ganglionar (tabla 15) en estos tumores, de acuerdo con

otros autores (137). Sin embargo, la sobreexpresión de c-Src disminuye la SLE a largo

plazo (tabla 29) y los tumores luminales A que expresan RPG al menos en el 10% de

sus células, que suelen tener buen pronóstico y en nuestra serie han demostrado valores

mejores de SLE a corto y largo plazo en estos tumores (tabla 29), expresan menos c-Src

DISCUSIÓN

160

que los tumores que expresan RPG en menos del 10% de sus células (figura 23). El c-

Src puede actuar sobre muchas de las vías celulares en función de la señalización que

reciba. Se ha demostrado que c-Src puede ser activado por el RE (a través de su

dominio SH2) y por RPG (a través de su dominio SH3) (314), por lo que es posible que

al aumentar la cantidad de RPG compita con el RE por la unión con el c-Src y

modifique su actitud.

El MED1, no se relaciona con ninguna de las variables clínico-patológicas en

estos tumores. Sin embargo su sobreexpresión tiende a asociarse a una SLE menor a

corto plazo y, de forma codependiente con el c-Src, también a largo plazo (tabla 29). En

este sentido, ya otros autores han demostrado que está implicado en la reaparición de la

enfermedad en los tumores dependientes de la señalización estrogénica (315) e incluso

que es necesario para la adquisición de resistencia tanto a fulvestrant (316) como a

tamoxifeno (317).

Estos tres factores (IGF1R, cSRC y MED1) aparecen correlacionados con la

expresión génica de ESR1 (tabla 26) en los luminales A silvestres, por lo que

consideramos que estarían respondiendo a la señalización estrogénica en los luminales

A. Entendemos que el ESR1, en su faceta de factor de transcripción, y ayudado en sus

funciones por el MED1 (155), estaría promoviendo la transcripción del IGF1R y el c-

Src (318), que a su vez protenciarían esta misma vía y otras (como la PI3K y la MAPK)

para evadir la apoptosis y mantener el crecimiento tumoral. Sin embargo estos

mecanismos oncogénicos sólo permitirían un crecimiento del tumor a ritmos lentos,

explicando el buen pronóstico de estos tumores y su mayor SLE (figura 32).

Por otro lado, el IGF1R también se correlaciona en este grupo de tumores con el

pri-miR-17~92 (Tabla 26), que a pesar de sus posibilidades oncogénicas parece

DISCUSIÓN

161

vinculado a su buen pronóstico, tendiendo a sobreexpresarse en los tumores <20 mm.

En línea con la explicación que dábamos antes, la actividad transcripcional del ESR1

debería ser responsable de la estimulación de la expresión del cluster a través de la

actividad de c-Myc y E2F1 (64, 217), y de hecho encontramos que aparece una

correlación positiva con el nivel de expresión inmunohistoquímica del ESR1

únicamente en este grupo (Tabla 23), y entendemos que no se alcanza la significancia

estadística por el tamaño de nuestra muestra. Sin embargo, el pri-miR-17~92 también

muestra una gran correlación con el EGFR (Tabla 26), que es la única de las

alteraciones que hemos encontrado asociada a mal pronóstico en los luminales A

silvestres. Es posible que el cluster esté jugando un doble papel en estos tumores,

regulando su desarrollo a nivel transcripcional y participando en la dirección de la

actividad de sus vías. Uno de sus principales genes diana, más concretamente del miR-

17 y del miR-20, es el ZBTB4, cuya expresión se ha correlacionado con el aumento de

la supervivencia libre de enfermedad en tumores de mama (240). Esta proteína de unión

al DNA se ha caracterizado como uno de los principales represores transcripcionales del

factor Sp1, con la consiguiente represión de los oncogenes Sp1-dependientes (240,

319), grupo que incluye tanto al ESR1 (59-60) como al EGFR y otros genes muy

involucrados en el cáncer de mama como el BCL-2, la ciclina D1 y el VEGFR (240,

319), por lo que la expresión del pri-miR-17~92 estaría desregulando al Sp1 y

promoviendo la expresión de estos genes. Por otro lado, el cluster consta de miRNAs

capaces de inhibir la traducción de ESR1 (320) como el miR-18a (218) y de miRNAs

capaces de reprimir su función como receptor nuclear a través de la represión de su

coactivador AIB1, como el miR-17 (230). Hay que tener en cuenta que los niveles de

expresión del pri-miR-17~92 no dependen tanto del nivel de transcripción como del

nivel de procesamiento postranscripcional del pri-microARN para dar lugar a sus

DISCUSIÓN

162

microRNAs maduros, efectores finales del cluster. Se ha demostrado que la regulación

postranscripcional depende de la estructura terciaria de este cluster y provoca una

expresión diferencial de los miRNAs maduros (321), y que además, la selección de

genes dianas es dosis-dependiente (322). Así pues, entendemos que los mecanismos que

están regulando la expresión de este cluster de miRNAs y los que determinan el papel

que juegan en estos tumores podrían ser definitivos en su oncogénesis, pero para

conocerlos sería necesario analizar los niveles finales de cada uno de sus miRNAs

maduros e incluso estudios funcionales en líneas celulares y en cultivos de tumores

primarios que representaran los distintos escenarios en los que participan.

El otro miRNA que aparece correlacionado con el IGF1R es el miR-222 (tabla

26). Este hallazgo es inesperado por el carácter altamente oncogénico de este miRNA y

por su correlación negativa con la expresión inmunohistoquímica del ESR1 (tabla 22),

que si bien no alcanza la significancia estadística, corrobora los resultados publicados

por otros autores (62, 208). No hemos encontrado literatura que pueda ayudarnos a

explicar la interacción entre el IGF1R y el miR-222. Es posible que el miR-222, por su

función represiva sobre el ESR1 (62, 208), sea capaz de frenar la actividad proliferativa

derivada de la señalización estrogénica en estos tumores y por eso se correlacione

también negativamente con el Ki67 (r= -0,428, tabla 22). Además, encontramos que

este miRNA se correlaciona con el miR-206 y éste a su vez con el miR-21 (tabla 26),

por lo que es posible que exista un eje de regulación común para todos ellos.

El miR-Let-7a fue el único miRNA capaz de discriminar entre los subtipos

luminal A y B. En los luminales A silvestres se correlacionó negativamente con el Ki67,

por lo que nuestros resultados demuestran el carácter antiproliferativo de este miRNA,

que, de acuerdo con otros autores podría derivarse de su acción represora sobre la vía

DISCUSIÓN

163

cMYC-ESR1 o bien sobre Ras y la vía de las MAPK, en respuesta a la señalización

estrogénica (46).

Luminales B silvestres

En los luminales B silvestres, el IGF1R vuelve a comportarse como un factor de

buen pronóstico, de forma que se correlaciona inversamente con p53 (tabla 13) y su

sobreexpresión se asocia a tumores menores de 20 mm y de bajo grado de

diferenciación de Nottingham. Sin embargo, el resto de genes estudiados parecen

asociarse al mal pronóstico de estos tumores.

Por el contrario, el EGFR parece tener más peso en la regulación de la biología de

los luminales B, en los que su expresión por encima del percentil p75 supone un riesgo

34 (2-182) veces mayor de sobreexpresar p53 (p= 0,041) (figura 22), y además se

correlacionan con un r=0,577 (tabla 14). La asociación entre el p53 alterado y la

sobreexpresión de EGFR ya fue descrita en una serie de tumores de mama TN por el

grupo de Shapira, que propuso que el mecanismo por el que se da esta asociación es que

p53 mutante se une a la proteína p63, inhibiendo su función reguladora sobre el EGFR

(323). Sin embargo, esta asociación implica un aumento del reciclaje endosomal del

EGFR a nivel de proteína y la correlación que nosotros encontramos es a nivel

transcripcional, por lo que diferentes mecanismos deben estar colaborando a distintos

niveles. No obstante, llama la atención el rango de valores de expresión relativa del

EGFR, que si bien podría estar provocado por el calibrador de nuestra serie, Gee y su

grupo ya destacaron que los niveles de expresión del EGFR eran muy bajos en

comparación con otros RTK como el HER-2 y el IGF1R, por lo que eran necesarios

“análisis inmunohistoquímicos de alta sensibilidad”, y que precisamente esto podría

DISCUSIÓN

164

estar detrás de los diferentes resultados obtenidos en series equivalentes de tumores de

mama (108). En nuestra serie la sola presencia de expresión del EGFR es suficiente para

influir en la SLE (tablas 28 y 30) y en la SG (tabla 31), por lo que es posible que, tal y

como señalaba Shapira, el aumento de actividad del EGFR no venga derivado de un

incremento de su transcripción sino de una hiperactividad del RTK provocada por una

disminución del reciclaje endosomal o por alguna alteración constitutiva del propio

receptor. En este sentido, sería interesante estudiar la existencia de SNP o mutaciones

en el EGFR en una muestra de tumores de mama de fenotipo luminal B, o incluso

estudiar los cambios conformacionales del receptor, para esclarecer los mecanismos de

su hiperactivación.

El c-Src se comporta, en estos tumores, como un factor de riesgo para la

metástasis ganglionar (tabla 15), de forma totalmente contraria al grupo de luminales A,

y se correlaciona inversamente con la expresión del BCL-2 (tabla 16: r= -0,385),

considerado tradicionalmente como un factor de buen pronóstico del cáncer de mama.

También se correlaciona negativamente con la expresión inmunohistoquímica del ESR1

(tabla 16: r= -0,464), que puede explicarse con los resultados de algunos estudios en

modelos celulares que han comprobado la capacidad de c-Src de promover la proteolisis

del ESR1 dependiente del sistema ubiquitina/proteosoma (134).

Según nuestros resultados, en los luminales B, las células tumorales habrían

desregulado nuevas vías oncogénicas, por lo que la señalización en respuesta a E2

perdería su papel central. Como consecuencia el IGF1R, aunque continuaría estando

sobreexpresado, perdería importancia en la biología del tumor y el c-Src actuaría en

respuesta a señales de otros marcadores como el EGFR. Esta hipótesis ayudaría a

explicar los resultados discordantes en líneas de cáncer de mama respecto a la relación

DISCUSIÓN

165

entre c-Src y ESR1 (125, 134) puesto que en función de la señalización que reciba, esta

quinasa favorecerá unas u otras vías celulares.

En los luminales B, el coactivador de la transcripción MED1 se sobreexpresó 3,46

FC en los tumores bilaterales (figura 26), criterio de peor pronóstico en nuestra serie, y

se reprimió en las pacientes de edad avanzada. Consideramos que actúa como un

marcador de mal pronóstico en este grupo, en el que además, pierde la correlación con

el ESR1. En línea con nuestra hipótesis, el MED1 estaría colaborando en los luminales

B con otras vías distintas de la estrogénica, posiblemente con la vía MAPK, tal y como

señalan algunos autores (147-148). Este marcador tiene especial relevancia en los

tumores con sobreexpresión de p53. El MED1 participa en la entrada en apoptosis

dependiente de p53, al promover la expresión de MDM2 y, como consecuencia, la

degradación de p53 en los proteosomas (145) y al actuar directamente sobre el promotor

de p53 para inhibir su transcripción (146). En las células tumorales con mutaciones en

p53, como el 17,3% de los luminales B de nuestra serie, los cambios derivados de la

alteración de la secuencia de p53 alteran esta interacción, de modo que MED1 deja de

promover la transcripción de MDM2 y de inhibir al promotor de p53. Como

consecuencia se produce una sobreexpresión del gen, que unida a la disminución de su

proteolisis dependiente de MDM2, resulta en altos niveles de la proteína p53 mutada

(144, 146).

Los tumores luminales B con metástasis ganglionar mostraron niveles del pri-

miR-17~92 unas 4 veces mayores (figura 28), por lo que entendemos que tiene un papel

oncogénico en este subgrupo. El carácter oncogénico del cluster 17~92 en estos tumores

podría también derivar de la pérdida de función de p53 asociado a este grupo de

tumores. Se ha demostrado en células de cáncer de mama que el p53 es capaz de regular

a este cluster y sus dos clusters parálogos a través de la represión que ejerce sobre E2F1

DISCUSIÓN

166

(223). Esto implica que ante la mutación de p53, con la consiguiente pérdida de sus

funciones reguladoras, el E2F1 aumentaría y en respuesta a su señal aumentaría también

la expresión del pri-miR-17~92, lo que podría derivar en una actividad distinta de sus

miRNAs que la que mostraba bajo señalización estrogénica, ya que como hemos

explicado antes, la selección de los genes dianas del cluster parece ser dosis-

dependiente (322).

Tumores Luminales Mutados en PI3KCA

En nuestra serie las mutaciones en el gen PI3KCA se han descrito con una

frecuencia similar a la descrita por otros autores (71), predominando la mutación del

dominio quinasa, con un 52,6 % de los casos mutados. Las alteraciones en este exón

han sido vinculadas a tumores luminales con buen pronóstico, relacionándose con una

actividad baja de mTORC1 y una buena tasa de respuesta a la monoterapia con

tamoxifeno (324). El 77,4% de los tumores portadores de esta mutación de nuestra serie

son del subtipo A. Sin embargo nosotros también encontramos una asociación de esta

mutación con la afectación de ganglios en este subtipo (p=0,022) pues los dos casos con

más de 10 ganglios afectados portan la mutación, aunque para poder dar validez a este

resultado necesitaríamos un mayor número de casos del grupo N3.

Hay que tener en cuenta además, que en todos los tumores concurren otras

alteraciones, lo que podría estar afectando al significado pronóstico de las mutaciones:

el 88,5% tienen más de una alteración extra de las vías de señalización y el 11,5%

restante tiene alterado el EGFR; además el 77,8% presentan varios de los patrones de

expresión de los miRNAs estudiados alterados. En general, los mutantes del gen

PI3KCA expresaron el EGFR con una frecuencia muy superior a los tumores silvestres,

DISCUSIÓN

167

hallazgo que ha sido descrito previamente en una serie de tumores del subtipo Her2 por

Gallardo (113). Esta asociación puede explicarse gracias a los experimentos realizados

por Gustin y su equipo, sobre la línea de células epiteliales de mama MCF-10A

sometida a mutación dirigida con vectores, para crear clones portadores de las

mutaciones E545K o H1047R (325). Ellos observan que las células mutadas no

necesitan la presencia de EGF en el medio para crecer pero que, sin embargo, incluso a

bajas concentraciones de este ligando, responden mucho antes que las células no

mutadas activando las vías mTOR y ERK, lo que interpretan como un aumento de

eficiencia de la señalización de EGFR cuando PI3KCA está mutado. En base a esto la

concurrencia de una sobreexpresión del receptor con mutaciones en el gen PI3KCA

estaría aportando a la célula tumoral grandes ventajas oncogénicas. Al revisar el

comportamiento de los tumores de nuestra serie con ambas características, hemos

encontrado que el 75% son pacientes jóvenes (Test exacto de Fisher, p= 0,040) y que

además muestran valores de c-Src menores y valores de miR-206 mayores que el resto

de los tumores (Prueba de U de Mann Whitney, p= 0,039 y p= 0,028 respectivamente;

resultados no mostrados). En cualquier caso, sería interesante realizar estudios en series

más grandes de tumores con estas características dirigidos a entender el proceso por el

que las células mutadas consiguen aumentar la expresión del receptor, para entender

mejor sus implicaciones y para poder evaluar su influencia en la respuesta a terapias

específicas, la SLE y la SG.

En contraste, el IGF1R se expresa siempre menos en los mutantes que en los

silvestres. Esto podría explicarse en sincronía con la presencia del EGFR, pues estos

tumores ya no necesitarían al IGF1R para activar la señalización intracelular.

De forma similar al EGFR, en nuestra serie los tumores mutantes expresan el pri-

miR-17~92 mucho más que los tumores silvestres, lo que les aporta nuevas

DISCUSIÓN

168

posibilidades oncogénicas, aunque también puede estar condicionando la actividad del

ESR1. Destaca sobre todo la expresión del cluster en el 100% de los portadores de

mutación en el dominio quinasa, que se reprimió en el 40,7% de los casos silvestres en

A3140G (OR: 1,69 (1,23-2,31) p=0,037). Sabemos que al menos 2 de los miRNAs del

cluster, el miR-17-5p y el miR-19, tienen entre sus secuencias diana a PTEN (236, 326-

327), lo que implicaría una posible cooperación en la hiperactivación de la vía PI3K. Es

posible que estos mutantes sufran una hiperactivación de la vía c-myc/E2F1 que

explicaría el incremento de la presencia del cluster, que como ya hemos discutido

previamente, se encuentra bajo regulación de estos oncogenes (328).

La presencia de mutaciones en nuestra serie afecta también enormemente al

comportamiento a nivel génico y de proteína del ESR1. Las variaciones en los patrones

de correlación encontrados entre las variables inmunohistoquímicas en función de la

presencia de mutaciones y del subtipo luminal (tabla 12), concretamente el cambio que

muestra el RE en los luminales A. En los tumores silvestres encontramos una

correlación con el BCL-2 propia de los tumores con buen pronóstico y una correlación

de este último con el p53, coherente en respuesta a la necesidad de la célula de mantener

el equilibrio apoptótico. Sin embargo esta correlación se pierde en los mutados y

aparecen nuevas correlaciones frente al RPG y a Ki67. Entendemos que puede ser el

resultado de un incremento de la actividad transcripcional del ESR1, que aumenta su

correlación con su nivel proteico (RE) del r=0,007 a r=0,508 en los casos mutados

(tabla 17), lo que podría estar detrás de un aumento de expresión de los genes de

respuesta a estrógenos como el PR, y en consecuencia un incremento de la actividad

proliferativa (señalizado por un aumento de correlación entre el RE y Ki67 de r= 0,069

en los luminales A silvestres a r=0,337 (p<0,01) en los luminales A mutados). Estos

resultados podrían ayudar a confirmar los hallazgos del grupo de Pavlenko, que

DISCUSIÓN

169

vinculan la disminución del BCL-2 con un incremento de la proliferación tumoral y

destacan su importancia en el grupo de luminales A (329). Si evaluamos también las

correlaciones del ESR1 a nivel de mensajero (tabla 17), encontramos que la correlación

entre la cantidad de mensajero y de proteína sólo es significativa en los luminales A

mutados, lo que implica que en los otros 3 grupos de tumores (luminales A silvestres y

luminales B silvestres y mutados) y sobre todo en el grupo de luminales A silvestres

deben existir reguladores postranscripcionales del ESR1 que están alterando sus niveles

de traducción o bien sus niveles de degradación tanto a nivel de mensajero como

proteico.

Debemos destacar también la influencia de las mutaciones en PI3KCA sobre la

correlación que encontramos entre el c-Src y el miR-Let-7a, que destaca por las grandes

diferencias entre un subtipo y otro y la presencia de mutaciones (r= 0,008 y r= 0,511

para luminales silvestres A y B respectivamente vs r= -0,536 y r= 0,017 para luminales

mutados A y B respectivamente; tabla 26). En el año 2007 se demostró la regulación de

esta familia de microARNs por c-Src en respuesta a estrógenos, a través de la proteína

Lin28. Esta proteína de unión a ARN se sobreexpresa por la acción promotora de la

transcripción de NFκβ en respuesta a la señalización de c-Src (245) y es capaz de

impedir la maduración del miR-Let-7a y otros miRNAs de la misma familia (203, 244),

al mismo tiempo que promueve la expresión de p21 y del retinoblastoma (Rb), ambos

implicados en el control del ciclo celular (249), y sorprendentemente, también es capaz

de aumentar la traducción de IGF-II (330). Esto podría ayudar a entender la asociación

del c-Src a un buen comportamiento de los luminales A, puesto que aunque el miR-Let-

7a es en principio un miRNA supresor de tumores, las funciones del p21 y del Rb son

fundamentales para el control proliferativo de la célula, y explicaría la correlación

negativa encontrada entre el miR-Let-7a y Ki67 en estos tumores. Sin embargo

DISCUSIÓN

170

volvemos a tener problemas para explicar las diferencias halladas entre los subtipos en

base a la literatura existente, aunque por nuestros resultados se puede hipotetizar que en

los luminales B, o bien el c-Src pierde el control del Lin28, o bien este último el del

miR-Let-7a. El estudio de la expresión del Lin28 en ambos subtipos podría ayudarnos a

entenderlo.

Importancia del dominio afectado por las mutaciones

Aunque la frecuencia de las mutaciones en el dominio helical cambia ligeramente

en función del subtipo luminal, las variaciones entre subtipos no son significativas. Sin

embargo, sí que existen diferencias en cuanto al perfil de expresión génica en cada caso.

Este hecho ya fue observado por el grupo de Loi, que fue capaz de identificar distintos

patrones de expresión génica en función de la existencia de mutaciones en el gen

PI3KCA (324). Nosotros proponemos que, además, estos patrones estarían

influenciados en función del subtipo tumoral y del dominio afectado, y que también

tendrían asociados perfiles concretos de expresión de miRNAs que tendrían un papel

central en su regulación.

El dominio afectado ha demostrado una implicación en la expresión de ESR1 en

nuestra serie. En los luminales A encontramos grandes diferencias (p= 0,010), que no

encontramos en los luminales B (tabla 24). Sin embargo, si valoramos la relación frente

a la cantidad de proteína ESR1 (% de células positivas por IHQª), observamos que en

los luminales B mutantes del dominio helical la relación es mucho menor. Con los

luminales A mutantes del dominio quinasa ocurre exactamente lo contrario, que una

expresión muy baja del mensajero da lugar a una cantidad de proteína mucho mayor de

la esperada. Esto podría ser un reflejo de la existencia de reguladores transcripcionales y

DISCUSIÓN

171

postranscripcionales del ESR1 que están actuando en los tumores mutados. En este

sentido, los mutantes del dominio helical con fenotipo luminal B tienden a expresar

hasta 3 veces más el miR-Let-7a que los mutantes con fenotipo luminal A (p= 0,076) y

además en los luminales B se expresa en el 75% de los mutantes del dominio helical

mientras que se reprime en todos los mutantes del dominio quinasa y en un 87,5% de

los tumores silvestres (p= 0,032). Dado que este miRNA inhibe la traducción del ESR1

uniéndose a la región 3’UTR de su mensajero (66), podría ser el responsable de la

regulación postranscripcional en el caso de los luminales B. Sin embargo, en el caso de

los luminales A, la represión de la expresión de ESR1 se da a nivel transcripcional por

lo que deben haber otros reguladores implicados, como podrían ser los miRNAs del

cluster miR-17~92, puesto que en los tumores luminales A mutados la expresión del pri-

microARN se correlaciona inversamente con el ESR1 (r= -0,667; p= 0,05; Tabla 26) y

se ha demostrado que los miRNAs del cluster miR-18a y miR-19a regulan directamente

a ESR1 (320), y el miR-17 regula su función transcripcional a través de la represión de

su coactivador AIB1 (44, 230).

Nuestros resultados también nos permiten proponer al miR-222 como regulador

de la expresión de ESR1 (62, 208). En nuestra serie este miRNA es sobreexpresado en

los luminales A con mutaciones en el residuo E545, lo que podría explicar porqué los

mutantes en el dominio helical de este fenotipo expresan la misma cantidad de proteína

ESR1 que los mutantes en el dominio quinasa con fenotipo luminal B, teniendo una

expresión relativa mayor. Además también este miRNA tiene entre sus dianas a PTEN

(212, 269-272), lo que colaboraría con la sobreactivación de la vía PI3K.

Los portadores de mutaciones en el dominio helical sobreexpresan el miR-21

(OR= 11,31 (1,06-127,24); p= 0,045). Este hallazgo tiene especial relevancia porque el

miR-21 también regula la expresión de PTEN y podría suponer una colaboración entre

DISCUSIÓN

172

este miRNA, el miR-17-5p, el miR-19 y el miR-222 para contribuir a una mayor

sobreactivación de la vía PI3K en estos tumores a través de la represión del gen

supresor tumoral. La sobreexpresión del miR-21 puede estar conectada a la

sobreexpresión de ESR1 en estos tumores (64). Sin embargo, deben existir otros

mecanismos que estimulen su expresión, puesto que el ESR1 en presencia de Akt

sobreactivado, sólo interacciona con un sitio del promotor del miR-21 (46). De hecho

nuestros resultados nos permiten proponer de nuevo la regulación del miR-Let-7a como

posible colaborador a este hecho. Uno de los genes diana de este miRNA es la IL-6, a

través de la cual regula la vía IL-6/NFκβ/STAT3 (206, 244-245). Dado que el miR-21

tiene un sitio de regulación para el STAT3 en su promotor (331-332), la represión del

miR-Let-7a en los luminales A es otra posible explicación a la sobreexpresión del miR-

21 en estos tumores.

En cuanto al valor pronóstico de las mutaciones, nuestros resultados indican que

también difieren en función del residuo y del dominio al que afecten. Así, hemos

detectado que la mutación el riesgo de recidivar para los luminales A mutantes del

dominio helical G1633A es 3,29 veces mayor (p= 0,057), tendiendo a relacionarse con

una disminución de la SLE de los luminales A a largo plazo (HR= 3,151 (0,862-

11,514); p= 0,067). Además, en los luminales B, esta misma mutación muestra una

tendencia a la asociación con la disminución en la SG (HR= 3,484 (0,757-16,032);

p=0,088). Estos resultados concuerdan con los hallazgos del grupo de Barbareschi, que

estudian una serie de 45 tumores (21 casos con mutaciones en el dominio quinasa y 24

casos en el dominio helical) y encuentran que las mutaciones en este último representan

un riesgo de recidiva y de muerte casi el doble del riesgo que representa la presencia de

metástasis en ganglios (333). Para explicar sus resultados Barbareschi se basa en el

DISCUSIÓN

173

hecho de que las mutaciones en los residuos E542 y E545 afectan a la función

reguladora de la subunidad p85 sobre la subunidad p110 de la enzima PI3K, lo que

supone que además de que la enzima está sobreactivada no pueda ser inhibida, si a esto

añadimos la represión de PTEN ejercida por el miR-21 en estos tumores podemos

concluir que la hiperactivación de la vía será mucho mayor que en el caso de los

mutantes del dominio quinasa, que mantienen su susceptibilidad a la inhibición y, en

principio, la regulación de PTEN intactas (334). Aunque los estudios in vitro e in vivo

sugieren que ambos tipos de mutaciones incrementan la actividad de la vía, estos

hallazgos podrían indicar diferentes efectos biológicos en función del dominio afectado

que podrían ser relevantes en cuanto al enfoque terapéutico. De cualquier forma, lo que

trasciende de nuestros resultados es que las mutaciones en el dominio helical tienen

muchas más consecuencias para el comportamiento de los tumores luminales A que las

mutaciones en el dominio quinasa, y que la participación de los microARNs en la

regulación de este tipo de tumores es posiblemente la causa de la controversia de estas

mutaciones entre las distintas series estudiadas. Con respecto a los luminales B, destaca

en este sentido el miR-Let-7a, que se expresa en el 75% de los mutados en el dominio

helical mientras que se reprime en todos los mutantes del dominio quinasa. Sería

interesante realizar estudios funcionales sobre tumores primarios de cáncer de mama

con ambos fenotipos con moléculas siARN o anti-miR, que demostrasen hasta qué

punto estos microARNs son responsables de la biología de estos tumores. En cualquier

caso, en vista de los resultados encontrados en nuestra serie, y en consonancia con otros

autores (71, 113, 325), las implicaciones de las mutaciones en el gen PI3KCA no

pueden evaluarse en solitario puesto que hemos demostrado que otras alteraciones

concurren con ellas y modifican sus consecuencias para el desarrollo del tumor. Parece

necesaria la repetición de estos análisis en series mayores, dado que debido a la

DISCUSIÓN

174

frecuencia de las mutaciones, no hemos podido evaluar bien su influencia en función del

subtipo y del dominio mutado en la SLE y la SG, aunque parece probable que existan

diferencias a tener en cuenta.

Influencia del tiempo de seguimiento en la elección de criterios de SLE

En la “14th St. Gallen International Breast Cancer Conference” (29), el panel de

expertos consideró pertinente diferenciar los paneles de marcadores moleculares

capaces de discriminar entre SLE a corto y largo plazo de seguimiento con un punto de

corte de 5 años. Dadas las posibilidades de nuestra serie, hemos considerado interesante

estudiar estas diferencias en nuestro estudio.

En la serie completa (tabla 28), el p53≥20%, el RE≥10% y el RPG≥10% muestran

una asociación independiente con la SLE únicamente a largo plazo. Sucede lo contrario

con el miR-206, aunque la asociación de este con la SLE a corto plazo resulta ser

dependiente de la expresión de EGFR.

En el grupo de luminales A, el RE≥10% vuelve a mostrar una asociación

independiente con la SLE únicamente a largo plazo, acompañado de otros criterios

como la presencia de la mutación G1633A, la sobreexpresión del c-Src y la presencia de

expresión de MED1 (estos últimos de forma codependiente).

En los luminales B, sin embargo, muchos de los marcadores estudiados sólo

tienen influencia en la SLE a corto plazo (expresión de EGFR, sobreexpresión ≥p75 del

miR-206 y del pri-miR-17~92 y sobreexpresión del miR-Let-7a). No obstante, en este

grupo los marcadores miR-21 y miR-222 mantuvieron su influencia sobre la SLE tanto

a corto como a largo plazo.

DISCUSIÓN

175

Estas diferencias corroboran la necesidad de discriminación temporal de los

marcadores moleculares realizada por el comité de expertos de la “14th St. Gallen

International Breast Cancer Conference”.

DISCUSIÓN

176

177

LLLIIIMMMIIITTTAAACCCIIIOOONNNEEESSS

El estudio realizado puede presentar algunas limitaciones, que quedan recogidas

en los siguientes apartados:

1. La clasificación de los tumores luminales se estableció, tal y como se

explica en la página 73, en base a los criterios aconsejados en la 13th St Gallen

International Breast Cancer Conference, ajustando los valores de Ki67 y p53 a los de

nuestro propio hospital. Sin embargo, en la 14th St Gallen International Breast Cancer

Conference de agosto de 2015, el panel de expertos volvió a considerar insuficientes

estos parámetros para poder diferenciar correctamente entre estos subtipos. Una

mayoría del panel de expertos estaba dispuesto a aceptar un valor umbral de Ki-67 en el

rango de 20 - 29% para distinguir el subtipo luminal B, aunque alrededor de una quinta

parte consideró que Ki67 no era un buen criterio y que podría ser sustituido por el uso

conjunto de múltiples marcadores moleculares. Así pues, es posible que nuestros

resultados estén sesgados por los criterios que hemos utilizado para diferenciar entre

ambos subtipos (Ki67 y/o p53≥15%).

2. Para poder establecer con rigor los mecanismos de regulación génica es

preciso contar con experimentos en cultivos celulares en los que realizar estudios de

transfección, sobreexpresión y silenciamiento de genes o incluso trasladar esta

experimentación a modelos animales. Sin embargo, el presente trabajo se ha centrado en

la cuantificación de los niveles de expresión. Aunque las relaciones entre los factores

moleculares estudiados ya han sido previamente probadas y publicadas, sería necesario

comprobar nuestros resultados a un nivel experimental y no sólo observacional.

178

4. El tamaño muestral del subtipo luminal B puede condicionar que no se

encuentren asociaciones estadísticamente significativas y sólo se observen tendencias a

la asociación entre algunas de las variables estudiadas.

5. Para poder certificar la influencia de las mutaciones en el gen PI3KCA

en el resto de variables moleculares y, en general, en el comportamiento de los tumores,

sería aconsejable la realización de experimentos con mutagénesis dirigida y la

repetición de estos estudios en series humanas más largas con cada mutación.

6. En este estudio no se ha evaluado la terapia adyuvante recibida por las

pacientes. Sería muy interesante recoger el tipo de terapia administrada, así como la

dosis y la duración total del tratamiento, con el fin de estudiar su influencia en el PLE y

la SG en combinación con los factores moleculares analizados. Del mismo modo,

podrían buscarse entre estos factores aquellos que pudiesen haber tenido un papel

decisorio en la respuesta a la terapia adyuvante recibida.

179

CCCOOONNNCCCLLLUUUSSSIIIOOONNNEEESSS

1. El único marcador molecular estudiado capaz de discriminar entre los subtipos

luminales A y luminales B en nuestra serie fue el miR-Let-7a.

2. La oncogénesis de los tumores luminales A parece estar dirigida por la vía de la

señalización estrogénica, que contribuye al mantenimiento de las células

tumorales aunque con un crecimiento lento que explica su habitual buen

pronóstico. Siempre y cuando otras vías de señalización no se hayan visto

alteradas, la hormonoterapia debe ser suficiente para tratar este tipo de tumores.

3. Los tumores luminales B, han sufrido alteraciones que relegan la vía estrogénica a

un segundo plano y progresan a través de la activación de otras vías con mayor

potencial oncogénico, lo que explica su menor supervivencia libre de enfermedad

y la necesidad de terapias más agresivas. En estos tumores, la participación de los

microARNs es mayor.

4. La influencia de las mutaciones en el gen PI3KCA sobre la biopatología del

cáncer de mama depende del dominio afectado y del fenotipo tumoral.

5. La concurrencia de varias alteraciones moleculares modifica el comportamiento

de los tumores luminales A y B, por lo que sería necesario establecer paneles

moleculares que permitiesen predecir con mayor rigor su pronóstico y la

180

individualización del tratamiento, así como marcar el seguimiento clínico

necesario para estos pacientes.

6. Los marcadores pronósticos de supervivencia libre de enfermedad parecen ser

útiles durante un tiempo de seguimiento concreto, dependiendo probablemente de

la progresión del tumor y la adquisición de nuevas alteraciones moleculares que

sustituyen a las que participaron en etapas más tempranas de la oncogénesis. Por

tanto es necesario testar su validez en distintos tiempos de seguimiento antes de

emplearlos como marcadores pronósticos aplicados a la práctica clínica.

7. El EGFR, aunque se sobreexpresa con una baja frecuencia, podría ser un potente

marcador de pronóstico para los tumores de mama luminales. Su participación en

la oncogénesis de los luminales B está en estrecha relación con la existencia de

mutaciones en el p53 que provocan su sobreexpresión. Son necesarios estudios

que clarifiquen las alteraciones responsables de la hiperactivación de este receptor

tirosina-quinasa en estos tumores.

8. Los microARNs miR-222 y miR-21 han demostrado en nuestra serie una

clara influencia sobre el pronóstico de los luminales B, asociándose a tiempos

menores tanto de supervivencia libre de enfermedad como de supervivencia

global, por lo que podemos sugerir su utilidad como marcadores pronósticos de

estos tumores.

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