4. Analyse yon biologischem Material 151

mi2t gegen einen Blindansatz mit normalem Blur die Extinktion bei 535 m#. Die Werte entnimmt man einer Eichkurve, die bis 175 #g/ml eine Gerade bildet. Bei h6heren Konzentrationen muB man mit Athanol verdfinnen. Langerer Kontakt mit der alkalischen Phase bringt die Farbe zum Sehwinden, wahrend sie in der getrenn- ten Pyridinsehieht mindestens 3 Std bestandig ist.

Analyst 84, 67--68 (1959). Univ. Armidale (Australien). E. Mi~LL~R, Wfirzburg

Nachweis und Bestimmung yon unverandertem Meprobamat im Urin lassen sich naeh M. SmMmg, S. I cm~uR~ und H. ~oR~ ~ papierehromatographisch unter Benutzung yon Ehrlich-l~eagens durchffihren. Nach ora!er Einnahme yon 1,6 g Meprob~ma~ wurden die Ausscheidungen im Verlau~ yon 72 Std bestimmt. Ehr- liehs l~eagens wird 4urch L6sen yon 2~ p-Dimethylaminobenzaldehyd in konz. Salzsaure hergestellt. Als Laufmittel dienen 1. Butanol-Essigsaure-HeO (4:1:5); 2. Toluol-Butanol-Formamid (3:1: gesiittigt) und 3. Cyelohexan-Essigsaure- CHCI~-H~O (10 : 3:4: 0,1). Mit diesen L6sungsmitteln wurden im Durehsehnitt 950/0 des zugesetzten Meprobamats im Urin gefunden.

J. pharmac. See. Japan 78, 1374--1377 (1958) [Japanisch]. (bTaeh engl. Zus.fass. ref.) Daiiehi Seiyaku Co. Ltd., (Japan). B. l~.oss~N~

Aminosiiuren. J. SCttORMULL]~R, H.-~). B~HTZ und G. ADLER 1 beriehten fiber Erfahrungen mit der Trennung und Bestimmung yon Aminos(~uren an Dowex50 nach S. MOORE und W. H. STEIN 2. Dureh Wahl eines Citratpuffers veto p~ 3,10 (~nstatt 3,42) konnte die Trennung Glykokoll yon Alanin verbessert werden. Die Bereehnung yon Glutamins~ure und Prolin ist ~uch bei ~berlappung der Gipfel nach den angegebenen einfachen Formeln mSglieh. Ninhydrinl6sung ist unter Ne im Eissehrank etwa 4 Tage ohne nennenswerte Veriinderung haltbar. Die Be- stimmung des Methionins ist naeh dem Verfahren 3 nicht mSglieh, auch Zusatz yon Antioxydantien zur Verhfitung einer Oxydation war nicht erfolgreieh. Zusatz yon Benzylalkohol zum Phosphatpuffer p~ 6,9 nach 2 ist entbehrlich, Tryptophan und Histidin sind in jedem Falle gut trennbar. Bei der Trennung der basisehen Aminosi~uren wurden folgende Abweiehungen ffir die Maxima (in Millilitern Eluat) gegenfiber den Angaben in der Originalvorsehrift (in Klammern) ge~unden: Histidin 76 (65), Lysin 126 (96), ~VH 3 150 (127), Arginin 240 (185).

1 Z. Lebensmittel-Unters. u. -Forsch. 109, 129--134 (1959). Teehn. Univ. Berlin. -- 2 j . biol. Chemistry 192, 663 (1951); vgl. diese Z. 136, 371 (1952). -- 3 SCHOR~t~LLER, J. , u. H.-D. B~LITZ: Z. Lebensmittel-Unters. u. -Forseh. 108, 414 (1958). - - S C } ~ O R ~ E U L L E I r J. , 11. G. ADLER: Z. Lebensmittel-Unters. u. -Forseh. 109, 13 (t959). B. S~TSO~TI

K. HA~TIG ~ beriehtet fiber Erfahrungen mit einer automatisch arbeitenden Aminos~iurebestimmungsmethode in Anlehnung an D. ill. SPACY~A~T, W. I-I. STriCT und S. MOOgE 2. Bei Ausseh~ltung aller subjektiven FehlermSgliehkeiten werden die einzelnen Aminos~uren nach vorausgegangener Trennung in einer Ionen- austausehers~ule im Durehlauf eolorimetrisch kontinuierlieh erial~t und registriert. Dazu wird dem Durehlauf kontinuierlich Ninhydriareagens zugeffigt. Die F~rbung der einzelnen Komponenten wird innerhalb yon 20 rain w~hrend des Durchlaufens eines langen Teflonschlauches, der sich eingerollt in einem siedenden Wasserbad befindet, entwickelt und in der angeschlossenen Mefikfivette eines Photometers gemessen und kontinuierlich registriert. Jede Aminos~ure erscheint dann als eine GauB-Kurve, deren Fl~cheninhalt der Aminosi~uremenge bis zu 3 #Mol streng- proportional gefunden wurde. Als Beispiele werden die nichtbasischen Amino- s~uren eines Kollagenhydrolysates sowie basische Aminos~uren getrennt und

152 Berieht: Spezielle ana]ytische Methoden

bestimmt. Die Ergebnisse einer 6faehen Bestimmung des gleichen Kollagenhydro- lysates erreiehen mit mittleren Fehlern yon =]= 0,96 bis ~= 5,24 fast die Genauigkeit anorganiseh-chemischer Analysen. -- Apparatur. Als Austauseher wird Natrium- Dowex50-X8 (400--800 mesh, dureh Sieb 0,05 mm getrieben) verwendet. Elutions- mittel und Ninhydrinreagens werden gleiehm~l~ig mittels Dosierpumpen zugefiihrt. Der Zutritt der ~inhydrinlSsung erfolgt unterhalb der S~ule dutch ein T-Capillar- stiiek. Daran sehlieBt sich ein 20 m langer Teflonsch]aueh mit 0,8--1,0 mm lichter Weite in siedendem Wasserbad aus Dreihalskolben und I-Ieizpilz. Ein Extinktions- sehreiber mit Fflterweehseleinriehtung miBt gleichzeitig die Extinktion bei 436 m/~ (Prolin- und I-Iydroxyprolinf~rbung) und 578 m# (iibrige Aminos~uren) und sehreibt einmal je Minute bei einem Papiervorsehub von 1 ram/rain. -- Arbeits- weise. 0,2--1 ml Aminos~urelSsung, entsprechend 1--2 mg Protein, veto p ~ 2,5 werden auf die S~ule gegeben und 3mal mit je 0,3 ml Citratpuffer veto PH 2,2 gewasehen. Dann eluier~ man mit 0,2 m Citratpuffer veto p~ 3,1 bei 0,5 ml/min und 50 • 0,5 ~ C. Naeh 2 Std wird die NinhydrinlSsung mit 0,25 ml/min zuge~iihrt. Naeh 210 ml Durch]auf wird d~s p~ des Elutionsmittels ]angsam auf 5,1 gebraeht. 7,5 Std nach dem Pufferwechsel haben alle nichtbasisehen Aminosguren die S~ule durchlaufen. Trennung und Bestimmung der Aminos~uren dauert damit 16 Std, der reine Arbeitsaufwand jedoch nur einen Bruehteil davon. Regeneriert wird mit 100 ml 0,2 n Natronlauge und 100 ml 0,2 m Citratpuffer veto p~ 3,1. Im Gegen. satz zu 2 wird die Natriumionenkonzentration aller PufferlSsungen konstant ge- halten, um ein Schrump~en der S~ulenffilhng zu vermeiden. Alle ElutionsflfissJg- keiten werden vorher ausgekoeht und nnter ParaffinS1 vo]lkommen luftfrei gehalten, um ein Gasen in der S~ule zu verhindern. - - Basisehe Aminos~uren l<Snnen an Amberlite IRC 50 ( ~ 0,12 ram) in einer S~ule 0,6 �9 50 em mit 0,2 m Citratpuffer bei p~ 7,0 nnd 40 ~ C mit 0,5 ml/min getrennt werden.

1 Clin. chim. Acta (Amsterdam) 4, 51--57 (1959). Max-Planek-Inst. f. EiweiB- u. Lederforsch., Miinehen. -- Federation Prec. 15, 358 (1956). Naeh VerSffent- liehung yon 1 neuerdings ausffihrlieh bei MooRE, S., D. H. SPACX~AN u. W. H. STEr~: Analyt. Chemistry 80, 1185 (1958); vgl. diese Z. 167, 225 (1959); und SPAC~A~, D. H., W. H. STEIN U. S. IV[eeRIe: Analyt. Chemistry 30, 1190 (1958); vgl. diese Z. 167, 224 (1959). B. SA~so~I

Uber die quantitative Bestimmung yon Aminosiiuren aus h ochspannungselektro- 2horetisch getrennten Gemischen dutch automatische Extin~tionsschreibung be- riehten K. RSw]~, E. F ~ R B ~ und H. F i s c ~ L Speziell wird die Zus~mmen- setzung des Thymus-Histons untersueht. Es ist mit dieser ~e thode mSglieh, mehrere Proteinhydrolysate in kurzer Zeit nebeneinander auf Unterschiede in ihrer Aminos~urezusammensetzung zu untersuchen. Die Trennung der S~uren in einem Pherographen , ,Frankfurt" der Fa. Hormuth und Vetter, Heidelberg auf Sehl. & Sch.-Papier 2043a mgl 35X40 em dauert bei pH2 (Puffer: Ameisensaure/ Eisessig/Wasser, 1 : 3:16) bei 60 V/era 60 rain, bei p~ 6 (Pyridin/Eisessig/Wasser, 10:1:89) bei 40 V/cm 90--100 rain. Die Streifen werden dann 20 rain bei 37~ getroeknet, dureh Ninhydrinreagens (1 g Ninhydrin, 10 ml Eisessig und l0 ml Wasser zn 200 ml mit Aceton aufgeffillt) gezogen, 20 rain bei 37 ~ C gehMten und dann genau 10 rain bei 75~ in einem mit feuchtem Ffltrierpapier ausgelegten Troekenschrank (Wasserdampf-S~ttigung) gehangt. D~naeh bespriiht man sio beidseitig mit Kupfer-Reagens (1,0 ml ges~tt. KupfernitratlSsung, 0,05 ml 20~ Salpeters~ure, 100 ml Aceton) und wertet die F~rbung nach 30--90 rain in einem Extinktionssehreiber (hier Spinco Analytrol yon Beckman, Wolframlampe Cam ]3 3, 1 mm Spaltbreite, Blaufilter 300--531) aus. Prolin wird mit Isatin naehgewiesen, indem man die ]ufttroekenen Streifen in das Isatin-Reagens (250 mg Isatin, 200 mg Zinkaeetat in 1,0 ml Pyridin, 100 ml Aeeton, vor jedem Versuch frisch bereitet)

4. Analyse yon biologisehem MateriM 153

bringt und sin 15 rain im feuehten Trockenschrank bei 75 ~ C bel~13t. Die Extinktion l~gt schon nuch 1 Std nach, sie sollte deshalb sofort gemessen werden. Ns.eh dieser Methode kSnnen Lysin, Arginin, Histidin, Glykokoll, Alanin, Prolin, Glutamin- s~ure, Asparaginsgure, Phenylalanin and Tyrosin quantitativ bestimmt werden. Die nicht getrennten Aminos~uren werden angen~ihert als Summe erfaBt. Die Analyse yon KMbsthymus-Histon bringt ann~ihernd dieselben Werte, die yon 2r IVi. DALY und A . E . MII~SKY ~ bei der s~iulenchromatographischen Trennung gefunden wurden.

i Hop!0e_Seyler, s Z. physiol. Chem. 313, 174--183 (1958). Med. Univ. Klinik, Frankfurt a .M. -- ~ J. gen. Physiol. 88, 405 (1955). UI~SVLA BAUMAI~

Uber die chromatographische Trennung von neutralen Aminos~iuren an Cellulose- siiulen berichten A. IAC~A~ und J. C. Pm~t~o-~E 1. Als Eluierungsmittel dienen J, thanol-Wassergemisehe weehselnder Zusammensetzung. Die Auftrennung nines Gemisehes yon je O,7 #MolenD,L-Leuein, D,L- Valin, D,L-Phenylalanin, D,L-Methio- nin, L- Prolin, D,L-Alanin, D,L. Threonin, D,L-Serin und Glycin gelingt m~LBig, wenn man auf einer 100• cm grogen Kolonne bei einer Durehlaufgeschwindigkeit yon 2,5 ml/Std mit 75~ ~_thanol eluiert. Die Auftrennung wird wesentlich besser, wenn man die Elution mit 95~ Athanol beginnt, dem automatiseh 400/0iger Alkoho] zugesetzt wird. Zm" Analyse werden mit Hilfe nines automatisehen Fraktionssammlers Fraktionen yon je 0,75 ml aufgefangen, welche naeh tier Nin- hydrinmethode yon W. TIROL:5 und 1%. K. CaN~A~ ~ sowie durch eindimensionMe Papierchromatographie untersucht werden.

J . Chromatogr. (Amsterdam) 2, 213--215 (1959). Nut. Technol. Inst., Rio de Janeiro (Brasilien). -- ~ J. biol. Chemistry 200, 802 (1953); vgl. diese Z. 146, 306 (1955). H. GAI~SCHAG]~

Eine Methode zur spektrophotometrisehen Bestimmung yon PyridoxM-5- phosphat geben V. BONAVlTA und V. SCARDI 1 an. Es wird das Absorptions- maximum bei 385 m/~ ausgewertet, das die Verbindung yon Pyridoxal-5-phosphat (Py5P) mit einem ~berschuB yon KMiumcyanid bei pI~ 7,4--8 eingeht, wahrschein- lieh das entspreehende Cyanhydrin. Die Methode ist einfach, sehnell und spezifisch; PyridoxMhydroehlorid, Pyridoxindihydi'oehlorid, Pyridoxaminphosphat, Pyrid- oxalhydroehlorid~thylaeetM und Pyridoxaminhydrochlorid st6ren nieht. Die Anwendbarkeit der Methode auf biologisches Material wird gepriift. - - Ausfiihrung. Die Probe sell nicht mehr als 25 #g Py5P/ml enthalten und p~t 7,4 aufweisen. Davon nimmt man 2 Proben zu je 3 ml, A und B. A versetzt man mit 0,i ml 0,03 m KaIium- cyanidlSsung in 0,2 m NatriumphosphatpufferlSsung yon pI~ 7,4, B m i t 0,1 ml der PufferlSsung al!ein. Nach Erw~rmen auf 50 ~ C Itir 45 rain miBt man die Extinkt ion bei 385 m#. Die Differenz der Extinktionen yon B und A vergleicht man mit einer Standardkurve yon bekannten Py5P-Mengen: (0,0001 m Py5P in 0,2 m Natrium- phosphatpufferl6sung yon pl< 7,4; vor Gebraueh aus einer 0,001 m Stamm]Ssung hergestellt, die ihrerseits gefroren aufbewahrt wird).

1 Anal. ehim. Aeta (Amsterdam) 20, 47--50 (1959). Univ. Neapel (Italien). E. MULLEIr Wtirzburg

~;ber nine spezifische Methode zur Bestimmung yon Kreatin und yon Kreatinin mit der Reaktion yon SAKAGVOnI naeh vorheriger Oxydation dureh NeBler-l%eagens beriehtet J. C~IAZ~AI~ ~. Es handelt sieh um nine Modifikation bekannter Methoden, deren letzte yon J. F. vAI~ PILSI:~, 1%. P. MAI~TIN, E. KITe und J. HEss 2 an- gegeben ist, unter Bertieksiehtigung der Erfahrungen yon G. CEmOTTI end L. SPA~ ~- I)t~IO a. Naeh eingehenden Untersuehungen ergibt sieh folgendes Ve~fahren. Man stellt 4 Ansi~tze her, I, I I , I I I und IV. I enthMt entweder 2 m] 1 : 400 verd. Harn