48
1 1 ~ 2. AMINOKISELINE I PROTEINI ~ πρωτεος gr.- prvi, najvažniji, koji zauzima prvo mesto peptidi – polimeri aminokiselina, koje su međusobno povezane peptidnim (amidnim) vezama redosled aminokiselina nosi u sebi genetsku informaciju koja se odražava kroz njihove specifične funkcije N H 2 NH NH NH O R O O R R NH NH NH OH O O R O O R R R Naziv “protein” potiče od grčke reči proteios (prvi, najvažniji), što ukazuje na njihov fundamentalni značaj za strukturu i funkciju živih bića. Po strukturi, proteini su peptidi, tj. polimeri α- aminokiselina međusobno povezanih amidnim, tzv. peptidnim vezama. Redosled povezivanja AK (sekvenca) genetski je uslovljen i karakterističan za dati protein, i manifestuje se kroz specifičnu f-ju tog proteina.

Amnino kiseline i peptidi

  • Upload
    djordje

  • View
    475

  • Download
    4

Embed Size (px)

DESCRIPTION

Amino kiseline i peptidi, struktura, funkcija, nomenklatura, podela, stereohemija aminokiselina

Citation preview

Page 1: Amnino kiseline i peptidi

1

1

~ 2. AMINOKISELINE I PROTEINI ~

• πρωτεῖος gr.- prvi, najvažniji, koji zauzima prvo mesto• peptidi – polimeri aminokiselina, koje su međusobno povezane peptidnim

(amidnim) vezama

• redosled aminokiselina nosi u sebi genetsku informaciju koja se odražava kroz njihove specifične funkcije

NH2NH

NHNH

O

R O

O RR

NHNH

NHOH

O

O

R O

OR

RR

Naziv “protein” potiče od grčke reči proteios (prvi, najvažniji), što ukazuje na njihov fundamentalni značaj za strukturu i funkciju živih bića. Po strukturi, proteini su peptidi, tj. polimeri α-aminokiselina međusobno povezanih amidnim, tzv. peptidnim vezama. Redosled povezivanja AK (sekvenca) genetski je uslovljen i karakterističan za dati protein, i manifestuje se kroz specifičnu f-ju tog proteina.

Page 2: Amnino kiseline i peptidi

2

2

2.1. AMINOKISELINE

• proteine izgrađuju α-aminokiseline• opšta struktura:

Karboksilna grupa

α-ugljenik

Bočni niz

α-amino-grupa NH3+

CH C

O

O-

R

NH2

CH C

OH

O

R

amonio-grupa

karboksilato-grupa

Svi organizmi koriste identičnu paletu od 20–22 osnovne (standardne, uobičajene) AK za izgradnju proteina. Uprkos ograničenom broju AK, postoji ogroman broj polipeptida i proteina sa širokim spektrom funkcija, koji nastaju njihovim različitim kombinovanjem.

Standardne aminokiseline predstavljaju derivate karboksilnih kiselina sa NH2vezanom za α-C (pozicija 2 po IUPAC-u). Za α-C su dodatno vezani atom vodonika i bočni niz R koji je karakterističan za svaku AK, i koji joj određuje fizička i hemijska svojstva i biološku funkciju.

U ćeliji, pri fiziološkim uslovima, i -NH2 i –COOH su jonizovane. Naime, sredina u ćeliji je približno neutralna; pošto je pKa (-NH3

+) grupe oko 9, ona će se nalaziti u protonovanoj formi (kao aminijum-jon), a pošto je pKa (-COOH) oko 3, ona će biti deprotonovana (kao karboksilatni jon).

Page 3: Amnino kiseline i peptidi

3

3

2.1.1. Stereohemija aminokiselina

• α-ugljenikov atom je asimetričan (4 različite grupe): H-, R-, NH2-, -COOH

• aminokiseline se javljaju kao enantiomeri – molekuli koji se odnose kao predmet i njegov lik u ogledalu

• označavanje konfiguracije na α-ugljeniku – analogno D-/L-gliceraldehidu COOH

C

CH3

HNH2S

L-Alanin(S)-Alanin

COOH

C

CH3

H NH2R

D-Alanin(R)-Alanin

CHO

CH2OH

H OH

CHO

CH2OH

OH H

L-GliceraldehidD-Gliceraldehid

S• sistematsko označavanje stereoizomera: Cahn-Ingold-Prelog-ovo pravilo

Kod svih AK sem glicina na α-C nalaze se 4 različite grupe, odn. α-C je asimetrični (hiralni) centar. Samim tim, tih 19 AK mogu se javiti u dve enantiomerne forme. Po konvenciji, enantiomeri AK označavaju se kao D i L, po analogiji sa D- i L-gliceraldehidom. AK predstavljamo Fišerovom projekcijom, tako da je α-COOH gore a bočni niz dole, pri čemu su oba orijentisana od posmatrača (ispod ravni papira), dok su H i NH2 iznad ravni. Enantiomer kod koga je je NH2 grupa sa leve strane označava se sa L, i obrnuto.

Alternativno, konfiguracija hiralnog centra može se označiti sistematski, korišćenjem CIP pravila. Ovaj sistem se ređe koristi jer, dok sve hiralne proteinogene AK imaju identičnu L/D konfiguraciju (L), nemaju sve identičnu R/S konfiguraciju (cistein je R).

Page 4: Amnino kiseline i peptidi

4

4

• Gly jedini nema hiralni centar

COOH

NH2

CH3

C2H5

H

H

COOH

NH2

CH3

C2H5

H

H

COOH

NH2

CH3

C2H5

H

H

COOH

NH2

CH3

C2H5

H

H

L-Izoleucin D-IzoleucinL-Aloizoleucin D-Aloizoleucin

COOH

NH2

OH

CH3

H

H

COOH

NH2

OH

CH3

H

H

COOH

NH2

OH

CH3

H

H

COOH

NH2

OH

CH3

H

H

L-Alotreonin D-AlotreoninL-Treonin D-Treonin

• neke od AK (Ile, Thr) imaju dodatne hiralne centre → 2n stereoizomera

NH2–CH2–COOH

enantiomeridiastereoizomeri

diastereoizomeri

Kao što je pomenuto, glicin nema nijedan hiralni centar jer na α-C ima dva identična supstituenta (H). S druge strane, dve AK – izoleucin i treonin – poseduju dodatni hiralni centar na β-C-atomu, te se javljaju u vidu 4 stereoizomera (2 enantiomerna para).

Page 5: Amnino kiseline i peptidi

5

5

Hiralnost života• klasična hemijska sinteza:

ahiralni prekursor → racemska smešabiosinteza:

ahiralni prekursor → čist stereoizomer

COOH

C

R

HNH2

L-aminokiseline• hiralni biomolekuli dominantno se javljaju u jednoj konfiguraciji (homohiralnost)

• drugi enantiomer je često neaktivan ili toksičan

• proteinogene AK uvek imaju L-konfiguraciju

(D-izomeri neuobičajeni; nađeni u bakterijskom ćelijskom zidu, nekim antibioticima...)

• monosaharidi predominantno imaju D-konfiguraciju

CHO

CHOH

CHOH

CHOH

C

CH 2OH

H OH

D-heksoze

L-Asp–L-Phe–MeL-Asp–D-Phe–Me

Aspartamsladakgorak

N

NH

O

O

O

OTalidomidR - antiemetikS - teratogen

Kao što je već pomenuto, prvi molekuli AK nastali su abiotički, iz neorganskih prekursora. Prilikom klasične hemijske sinteze u ahiralnim uslovima, iz ahiralnih prekursora uvek će nastati racemska smeša (2 enantiomera u odnosu 1:1). Međutim, uočeno je da se u biološkim sistemima uvek jedan enantiomer javlja u velikom višku. Tako, sve proteinogene AK imaju L-konfiguraciju, dok većina monosaharida ima D-konfiguraciju. Ovo ne znači da se u prirodi drugi izomer uopšte ne javlja – D-aminokiseline su pronađene u ćelijskom zidu bakterija, u nekim antibioticima itd.

Uzrok homohiralnosti biomolekula još uvek je nepoznat. Jedna od mogućnosti je da su AK nastale u svemiru, na kometama, i polarizovano zračenje Sunca selektivno je uništavalo D-enantiomer. Pošto su samo L-izomeri AK bili prisutni u dovoljnim količinama, živi svet se razvio tako da samo njega iskorišćava. Formirani enzimi su, zahvaljujući svojoj hiralnosti, nastavili da proizvode samo jedan stereoizomer.

Budući da su enzimi, receptori i drugi sistemi u organizmu hiralni, oni tipično prihvataju samo jedan stereoizomer biomolekula, dok su ostali neaktivni, pokazuju drugačiju aktivnost, ili su čak toksični. Jedan primer je aspartam, veštački zaslađivač koji je zapravo metil-estar dipeptida; dok je izomer sa L-Phe sladak, izomer sa D-Phe ima gorak ukus. Drastičniji primer je talidomid, sedativ koji se koristio 1950-ih i 1960-ih, a koji se javlja u 2 enantiomerne forme. R-izomer pokazuje željeno dejstvo, zbog čega se talidomid prepisivao trudnicama protiv jutarnje mučnine. Međutim, uvek prisutni S-izomer pokazuje teratogeno dejstvo (izaziva poremećaje u razvoju ploda); kao posledica, preko 10 000 dece rođeno je sa deformitetima kao što je fokomelija.

Page 6: Amnino kiseline i peptidi

6

6

2.1.2. Proteinogene aminokiseline• 22 proteinogene aminokiseline (20 genetski kodiranih)

COOH

NH2

GlicinGly (G)

COOH

NH2

AlaninAla (A)

COOH

NH2

COOH

NH2

COOH

NH2

ValinVal (V)

LeucinLeu (L)

IzoleucinIle (I)

COOH

NH2

OH

SerinSer (S)

TreoninThr (T)

COOH

NH2

OH

COOH

NH2

FenilalaninPhe (F)

TirozinTyr (Y)

COOH

NH2OH

COOHNH NH

NH2

NH2

ArgininArg (R)

COOH

O

NH2

NH2

AsparaginAsn (N)

Asparaginska k.Asp (D)

COOH

O NH2

OH

CisteinCys (C)

COOH

NH2

SH

Glutaminska k.Glu (E)

GlutaminGln (Q)

COOHO

NH2

NH2

COOHO

NH2

OHCOOH

NH2

NH

N

HistidinHis (H)

MetioninMet (M)

COOH

NH2

SCOOHN

H

ProlinPro (P)

TriptofanTrp (W)

COOH

NH2NH

LizinLys (K)

COOH

NH2

NH2

SelenocisteinSec (U)

COOH

NH2

SeH

PirolizinPyl (O)

NH2

NHN

O

COOH

Na slajdu je prikazano 20 uobičajenih proteinogenih AK, koje su direktno kodirane u DNK. Dodatno, date su i dve manje uobičajene proteinogene AK – selenocistein i pirolizin – koje su na neuobičajen način kodirane u DNK i RNK. Kao što se vidi, AK su strukturno veoma raznovrsne – neki od bočnih nizova su hidrofobni, neki hidrofilni ili čak naelektrisani.

AK je najlakše pamtiti prema svojstvima bočnog niza (2.1.2.2.).

Page 7: Amnino kiseline i peptidi

7

7

“asparDic acid”D Asp Asparaginska k.

Y Tyr Tirozin (tYrosine)najjednostavnija na TT Thr Treonin

W Trp Triptofan V

U S O P F M K L I H Q E G C N

R A

uobičajena na S

sledeća uobičajena na Pfonetski

posle L ide K...najjednostavnija na L

posle D (za Asp) ide Enajjednostavnija na G

najjednostavnija na A

Val Valin

Sec SelenocisteinSer SerinPyl PirOlizinPro ProlinPhe FenilalaninMet MetioninLys LizinLeu LeucinIle IzoleucinHis HistidinGln GlutaminGlu Glutaminska k.Gly GlicinCys CisteinAsn AsparagiN

Arg ARgininAla Alanin

XJZB

Xaabilo koja aminokiselinaXleLeucin / izoleucinGlxGlutamin / glutaminska k.Asx Asparagin / asparaginska k.

Za svaku AK date su standardne troslovne i jednoslovne skraćenice, koje se koriste prilikom pisanja peptidnih sekvenci (IUPAC pravilo 3AA-21).

Page 8: Amnino kiseline i peptidi

8

8

2.1.2.1. Esencijalne i neesencijalne AK

Neesencijalne• nisu neophodne u ishrani• mogu nastati transaminacijom iz α-ketokiselina...

Esencijalne• neophodne u ishrani• čovek ne poseduje enzimske sisteme potrebne za sintezu

Gly, AlaAsp, AsnGlu, GlnProSerCys*Tyr*

* nastaju iz esencijalnih aminokiselina Met odn. Phe

Leu, Ile, Val HisLysMetPhe, TrpThr

Sve proteinogene AK neophodne su za izgradnju proteina i normalno funkcionisanje organizma. Mnoge od njih ljudski organizam u stanju je da sintetiše iz drugih jedinjenja (kao što su α-ketokiseline), te ih nije neophodno uzimati hranom. S druge strane, za sintezu nekih AK – esencijalnih AK – čovek ne poseduje odgovarajuće enzime, te ih je neophodno uneti ishranom. U slučaju deficita esencijalnih AK, dolazi do poremećaja - nervoze, zamora, ošamućenosti, imunodeficijencije... Treba napomenuti da podela AK na esencijalne i neesencijalne nije stroga – pojedinci koji ne sintetišu određenu AK u dovoljnim količinama mogu zahtevati dodatni unos, neke od AK mogu se sintetisati, ali samo iz esencijalnih AK.

Proteini u kojima su prisutne esencijalne AK u optimalnom odnosu nazivaju se kompletnim. Ovde spada većina proteina životinjskog porekla (iz mesa, ribe, mleka, jaja), dok biljni proteini uglavnom imaju ograničen sadržaj neke od esencijalnih AK (npr. Met, Trp, Lys). Međutim, uravnoteženom ishranom lako se postiže unos dovoljnih količina svih esencijalnih AK, čak i kod vegetarijanaca.

Page 9: Amnino kiseline i peptidi

9

9

• struktura bočnog niza određuje svojstva svake AK• polarnost/hidrofobnost• sposobnost građenja H-veza• jonizabilnost (naelektrisanje) • fleksibilnost, voluminoznost

• ima esencijalnu ulogu u određivanju strukture i f-ja proteina

• prema strukturi bočnog niza:

2.1.2.2. Podela aminokiselina

Asp, Asn, Glu, GlnKisele AK i amidi

Lys, Arg, HisBazne AK

Cys, MetAK sa sumporom

Ser, ThrHidroksi-AK

Phe, Tyr, TrpAromatične AK

ProCiklične AK

Gly, Ala, Val, Leu, IleAlifatične AK

Specifična svojstva svake AK određena su prirodom njenog bočnog niza, naročito njenom polarnošću i hidropatijom (hidrofoban/hidrofilan), jonizabilnošću (mogućnošću formiranja +/-šarže), sposobnošću građenja H-veza, kao i stereohemijskim faktorima (voluminoznost, fleksibilnost).

Prema strukturi bočnog niza (R), odn. funkcionalnim grupama, AK se dele na one sa alifatičnim bočnim nizom (Gly, Ala, Val, Leu, Ile), alicikličnim (Pro), aromatičnim (Phe, Tyr, Trp), alkoholnom hidroksilnom grupom (Ser, Thr), sumpornim grupama (Cys, Met), baznim grupama (Lys, Arg, His), aminodikarboksilne kiseline (Asp, Glu) i njihove amide (Asn, Gln).

Page 10: Amnino kiseline i peptidi

10

10

Asp, GluPolarne negativno naelektrisane AK

Lys, Arg, HisPolarne pozitivno naelektrisane AK

Ser, Thr, Cys, Asn, GlnPolarne nenaelektrisane AK

Phe, Tyr, TrpAromatične AK

Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, MetNepolarne alifatične AK

• prema svojstvima (polarnosti i naelektrisanju) bočnog niza:

hidrofobne hidrofilne

Phe Met Ile Leu Val Cys Trp Ala Thr Gly Ser Pro Tyr His Gln Asn Glu Lys Asp ArgIle Phe Val Leu Met Trp Ala Gly Cys Tyr Pro Thr Ser His Glu Asn Gln Asp Lys Arg

Alternativno, prema svojstvima (polarnost, naelektrisanje) R, AK se dele na one sa nepolarnim bočnim nizom – alifatičnim (Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met) i aromatičnim (Phe, Tyr, Trp), sa polarnim nenaelektrisanim bočnim nizom (Ser, Thr, Cys, Asn i Gln) i polarnim naelektrisanim bočnim nizom – pozitivnim (Lys, Arg, His) i negativnim (Asp, Glu). Generalno, polarnije AK teže da se koncentrišu na površini proteina (u kontaktu sa vodom), a hidrofobnije – u unutrašnjosti.

Tačno definisanje hidropatije (hidrofilnosti/hidrofobnosti) AK je teško, i postoje različite skale (na slajdu prikazane dve). Kao što se vidi, redosled pojedinih AK varira između različitih skala. Za sada još uvek nije moguće sa sigurnošću predvideti da li će se dati AK ostatak u proteinu nalaziti na vodi izloženoj površini ili u hidrofobnoj unutrašnjosti.

Page 11: Amnino kiseline i peptidi

11

11

• AK sa nepolarnim bočnim nizom

COOH

NH2

GlicinGly (G)

COOH

NH2

AlaninAla (A)

COOH

NH2

ValinVal (V)

COOH

NH2

LeucinLeu (L)

COOH

NH2

IzoleucinIle (I)

COOHNH

ProlinPro (P)

• ciklične AK

• alifatični nizovi su nepolarni i hidrofobni• hidrofobnost raste sa porastom broja C atoma u bočnom nizu• teže da se koncentrišu u unutrašnjosti proteina (Gly i Ala mogu i spolja)• izgradnja hidrofobnih džepova• Gly - fleksibilan

• jedina ciklična AK (sa sekundarnom amino-grupom – iminokiselina / pirolidinkarboksilna kiselina)• hidrofoban, ali se može naći i spolja• rigidna konformacija, narušava strukturu α-heliksa i β-nizova, često – na mestima petlji i zavoja

U AK sa nepolarnim alifatičnim bočnim nizom spadaju glicin i 4 AK kod kojih je R alkil-grupa (metil- kod Ala, izopropil- kod Val, izobutil- kod Leu i s-butil kod Ile). Alifatični bočni nizovi nepolarni su i hidrofobni; hidrofobnost raste sa porastom broja C-atoma u lancu. Ala, Val, Leu i Ile imaju značajnu ulogu u formiranju i održavanju 3D strukture proteina, zahvaljujući težnji da se bočni nizovi u vodenoj sredini grupišu unutar proteinske globule, daleko od vode. Dodatno, zajedno sa aromatičnim aminokiselinama, učestvuju u izgradnji hidrofobnih džepova u aktivnom centru nekih enzima, koji imaju funkciju vezivanja nepolarnih supstrata ili obezbeđuju “anhidrovanu” sredinu neophodnu za neke reakcije. Gly, zahvaljujući najmanjim dimenzijama molekula, lako rotira i uvodi fleksibilnost u polipeptidni lanac.

Prolin se razlikuje od ostalih 20 AK po tome što mu je bočni niz (C3) vezan za α-NH2, formirajući cikličnu strukturu sa sekundarnom amino-grupom (pirolidinski prsten). Za razliku od ostalih AK, kod kojih je moguća rotacija oko Cα-N veza, ciklična struktura prolina je rigidna, i ograničava strukturu (konformaciju) polipeptidnog lanca. Može dovesti do naglih promena smera lanca – petlji i zavoja. Pro je hidrofobna AK, mada manje nego Val, Leu i Ile, te se može naći i na površini proteina.

Page 12: Amnino kiseline i peptidi

12

12

• aromatične AKCOOH

NH2

FenilalaninPhe (F)

TirozinTyr (Y)

COOH

NH2OH

TriptofanTrp (W)

COOH

NH2NH

• AK sa sumporom

CisteinCys (C)

COOH

NH2

SH

MetioninMet (M)

COOH

NH2

S

• Phe: fenil-grupa, Tyr: p-hidroksifenil-, Trp: 1H-indol-3-il-• hidrofobnost raste u nizu Tyr < Phe < Trp (neke skale: Tyr < Trp < Phe)• Tyr – slabo kisela fenolna OH, pKa = 10,10

• Cys jonizabilan (pKa = 8,14) i relativno polaran ali retko na površini, Met hidrofoban• Cys se može reverzibilno oksidovati do cistina (nastali disulfidni mostovi imaju strukturnu ulogu)• Cys može imati funkcionalnu ulogu

COOH

N H 2

S H

COOH

N H 2

S H

COOH

N H 2

S

COOH

N H 2

S

-2H+ - 2e

2H+ + 2e

Aromatične AK u bočnom nizu sadrže aromatične prstenove – fenil- (Phe), p-hidroksifenil- (Tyr) odn. indolil- (Trp). Aromatični prstenovi su po prirodi hidrofobni; prisustvo polarnih grupa (OH kod Tyr, N kod Trp) povećava mogućnost interakcije sa polarnim rastvaračem i hidrofilnost. Tirozin poseduje flabo kiselu fenolnu OH grupu, koja pri normalnim fiziološkim uslovima ostaje nedisosovana (pKa=10). OH grupa kod nekih proteina podleže fosforilaciji (vezivanju ostatka fosforne kiseline).

Dve AK – Cys i Met – u svom bočnom nizu poseduju atom S. U slučaju Met, S je u vidu tioetarske grupe, što ga čini hidrofobnom AK. Tiolna (sulfanil-, sulfhidrilna, merkapto-) grupa cisteina je relativno polarna, i može graditi slabe vodonične veze, a predstavlja i slabu kiselinu (pKa=8, u proteinima 5-10) koja može disosovati gradeći tiolatni jon. Uprkos polarnosti, Cys se retko nalazi na površini proteina. Naime, SH grupe lako se oksiduju pri fiziološkim uslovima, uz povezivanje dva Cys disulfidnim mostom (-SS-) i građenje cistina. Disulfidni mostovi (disulfidne veze) omogućavaju unakrsno povezivanje različitih polipeptidnih lanaca ili različitih delova istog lanca, čime se stabilizuje 3D struktura (naročito bitno kod ekstracelularnih proteina koji moraju da funkcionišu u agresivnoj sredini, npr. u digestivnom sistemu). Pored toga, kod intracelulanih proteina Cys može imati i funkcionalnu ulogu, odn. nalaziti se u aktivnom centru enzima (zahvaljujući nukleofilnosti -S– jona), a bitan je deo i mnogih peptida i proteina koji učestvuju u redoks reakcijama ili koriste metalne kofaktore (glutation, Fe-S klasteri...). Toksičnost teških metala velikim delom je posledica njihove težnje da se vezuju za -S– cisteina, čime narušavaju funkciju enzima.

Page 13: Amnino kiseline i peptidi

13

13

• hidroksi-AK

• u bočnom nizu: alkoholna OH• polarne, grade vodonične veze• mogu biti fosforilovane ili glikozilovane → regulacija, markiranje...

COOH

NH2

OH

SerinSer (S)

TreoninThr (T)

COOH

NH2

OH

• bazne AK

COOHNH NH

NH2

NH2

ArgininArg (R)

COOH

NH2

NH

N

HistidinHis (H)

LizinLys (K)

COOH

NH2

NH2

• sadrže u bočnom nizu N sa slobodnim el. parom, koji može vezati H+

• pKa bočnog niza: Arg (guanidino-grupa) 12,10, Lys (ε-NH2) 10,67, His (imidazol) 6,04• pri fiziološkim uslovima pozitivno naelektrisane• imidazol – lako prima/otpušta H+; ligand kod metaloproteina

Dve AK – Ser i Thr – u svom bočnom nizu sadrže alkoholnu OH grupu koja je polarna i sposobna za građenje vodoničnih veza, te su ove AK hidrofilne. Hidroksilna grupe Ser i Thr manje su kisele od fenolne OH grupe Tyr, i ne disosuju pri fiziološkim uslovima. Uprkos tome, zahvaljujući nukleofilnosti, one mogu učestvovati u različitim reakcijama te se mogu naći u aktivnom centru enzima (npr. serinske proteaze i esteraze). OH grupa Ser i Thr se u ćeliji često modifikuje (fosforiluje, glikoziluje), što ima ulogu u regulaciji aktivnosti enzima (aktivacija/inhibicija), markiranju proteina itd.

Arg, Lys i His poseduju hidrofilne bočne nizove koji sadrže N sa slobodnim elektronskim parom, tj. bazni N. Pri fiziološkim uslovima, ovi bočni nizovi vezuju H+. U slučaju His, bočni niz sadrži imidazolov prsten, čiji je pKa blizak neutralnom pH; zahvaljujući tome, on lako prima i otpušta H+, te kod nekih enzima (uklj. serinske proteaze i esteraze) može učestvovati u kiselo-baznoj katalizi. Dodatno, on može kompleksirati različite metalne jone, te se javlja kao ligand kod metaloproteina (pored ostalog, i u Hb i Mb). Lys u položaju ε sadrži dodatnu NH2 grupu, i pri fiziološkim uslovima pozitivno je naelektrisan. Arginin je najbaznija od 20 AK, jer sadrži guanidino-grupu (guanidin je jaka organska baza), i pri fiziološkim uslovima potpuno je protonovan (tj. nosi pozitivnu šaržu).

Page 14: Amnino kiseline i peptidi

14

14

• kisele AK i njihovi amidi

• dikarboksilne kiseline, pri fiziološkom pH otpuštaju H+ → negativno naelektrisanje• pKa bočnog niza 3,71 za Asp, 4,15 za Glu

COOH

O

NH2

NH2

AsparaginAsn (N)

Asparaginska k.Asp (D)

COOH

O NH2

OH

GlutaminGln (Q)

COOHO

NH2

NH2

Glutaminska kiselinaGlu (E)

COOHO

NH2

OH

Na kraju, dve AK – Asp i Glu – u bočnom nizu sadrže dodatne karboksilne grupe sa pKa≈4, koje su pri fiziološkim uslovima deprotonovane (tj. prisutan je aspartat/glutamat) i negativno naelektrisane. Karboksilatne grupe mogu se nalaziti u aktivnom centru nekih enzima (npr. serinske proteaze i esteraze), ili služiti za vezivanje metalnih jona. U organizmu su pored slobodnih kiselina prisutni i njihovi amidi – Asn i Gln, koji su nenaelektrisani ali i dalje veoma polarni i sposobni za građenje vodoničnih veza, te se često nalaze na površini proteina.

Page 15: Amnino kiseline i peptidi

15

15

• neke od AK nakon biosinteze proteina mogu podleći modifikacijama (hidroksilacija, fosforilovanje, karboksilacija, acilovanje, alkilovanje...)

2.1.2.3. Posttranslaciona modifikacija AK

COOHNH

OH

4-HidroksiprolinHyp

• komponente kolagena• uloga u stabilizaciji heliksa• hidroksilacijom u prisustvu vitamina C

5-HidroksilizinHyl

COOH

NH2

NH2

OH

Cistin

COOH

NH2

SSHOOC

NH2

• nastaje oksidacijom cisteina• povezuje 2 lanca / 2 dela istog lanca, i stabilizuje 3D strukturu proteina

COOH

NH2

OP

O

O-

O-

O-Fosfoserin O-Fosfotirozin

COOH

NH2OP

O

O-

O-

γ-Karboksiglutaminska k.

COOHO

NH2

OH

O OH

• fosforilacija često ima ulogu u aktivaciji / deaktivaciji enzima

• u proteinima vezanim za koagulaciju krvi

Uz osnovnih 20/22 AK koje su kodirane u DNK, u strukturu proteina ulaze i brojne AK nastale modifikacijom nakon translacije (sinteze polipeptidnog niza). Ove reakcije uključuju hidroksilaciju, fosforilovanje, karboksilaciju, acilovanje (formil-, acetil-, ostaci masnih kiselina), alkilovanje (metil-, prenil-), građenje amida na C terminusu, glikozilaciju itd. Na slajdu su dati neki od primera modifikovanih AK.

Hyp i Hyl nastaju hidroksilacijom Pro i Lys u prisustvu askorbinske kiseline (vitamina C). Nalaze se u proteinu kolagenu, i imaju značajnu ulogu u stabilizaciji strukture. U nedostatku vitamina C formira se manje stabilan kolagen, i dolazi do slabljenja vezivnog tkiva, odn. skorbuta. Cistin, koji nastaje oksidativnim povezivanjem 2 Cys, već je pomenut. Ima funkciju u stabilizaciji 3D strukture proteina. O-fosfoserin i O-fosfotirozin nastaju fosforilacijom Ser i Tyr uz utrošak ATP, i imaju ulogu u regulaciji enzimske aktivnosti (neki enzimi se fosforilacijom aktiviraju/deaktiviraju). γ-karboksiglutamat nalazi se u nekoliko faktora koagulacije krvi. Vitamin K je neophodan za sintezu ove AK; u slučaju deficita, može doći do hemoragije.

Page 16: Amnino kiseline i peptidi

16

16

2.1.3. Neproteinogene AK

H2N CNH2

NCH3

CH2 COO-

kreatin H3N CH2 CH2 SO3-

+

taurin

+

β-cijanoalanin

CH2 C≡NCOO-CHH3N

H3N CH COO-

CH2 O CO

CH N N-+

azaserin

O NC O

H3N

H

+

cikloserin

NO2

CH2OHC HC OHH

NHC

O

CHCl2

hloramfenikolL-

lekovi

H3N CH COO-CH2 CH2 SH

homocistein

NH3

CH2

CH2

CH2

CHH3N COO-+

+

ornitin

NH CO

NH2

CH2

CH2

CH2

CHH3N COO-+

citrulin

intermedijeri

CH2-OOC CH2

CH2

NH3+

γ-aminobuterna kiselinaGABA N

NCH2

CH2H3NH+

histamin

HO

HO

CH2

CH2H3N+

Dopamin

O

I

I

HO

I

I

CH2

CHH3N COO-+

tiroksin

neurotransmiteri i hormoni

Uz navedene AK koje izgrađuju proteine, postoji i niz biološki značajnih neproteinogenih AK i njihovih derivata. GABA i dopamin nastaju dekarboksilacijom Glu i Tyr, i imaju ulogu neurotransmitera u mozgu sisara. Histamin, nastao dekarboksilacijom histidina, jedan je od značajnih medijatora inflamacije (→ antihistaminici), i reguliše kontrakciju krvnih sudova i lučenje želudačne kiseline. Tiroksin, nastao jodovanjem (zato je organizmu neophodan jod) i dimerizacijom Tyr u štitnoj žlezdi, i adrenalin/epinefrin, nastao iz tirozina u nadbubrežnoj žlezdi, hormoni su koji regulišu metabolizam.

Kreatin, u vidu kreatin-fosfata, pomaže u skladištenju i transferu energije, naročito u mišićima. Ponekad se koristi kao dijetetski suplement pri bodibildingu, jer (po nekim autorima) poboljšava performanse anaerobnog treninga i stimuliše razvoj mišića. Taurin, amino-sulfonska kiselina koja nastaje iz cisteina, ulazi u sastav žučnih soli, emulgatora u digestivnom traktu. Dodaje se i u energetske napitke, jer poboljšava performanse mišića, mada novija istraživanja ukazuju da količina prisutna u napicima nije dovoljna za ispoljavanje bilo kakvog pozitivnog efekta. Citrulin i ornitin učestvuju u ciklusu uree, kojim organizam koristi za izbacivanje suvišnog azota.

Neki AK derivati našli su primenu u medicini. Hloramfenikol je u drugoj polovini XX veka korišćen kao antibiotik širokog spektra, mada je zbog neželjenih efekata danas uglavnom napušten. Cikloserin se koristi u tretmanu tuberkuloze, a azaserin je potencijalni antikancer lek.

Page 17: Amnino kiseline i peptidi

17

17

2.1.4. Kiselobazna svojstva aminokiselina

• sve AK sadrže dve grupe koje mogu jonizovati: α-COOH i α-NH2

• za slabu kiselinu, konstanta disocijacije (kiselinska konstanta) iznosi:

odn, u formi Henderson-Hasselbach-ove jednačine:

• pri pH = pKa, [HA] = [A-]• pri pH < pKa, preovlađuje protonovani oblik• pri pH > pKa, preovlađuje deprotonovani oblik

R-COOH R-COO– + H+→←

R-NH3+ R-NH2 + H+→←

pKa ≈ 3,5–4,0 (u AK: 1,7-2,4)

pKa ≈ 9,0–10,8

+ -

+ -

-+

-+

-

[H ][A ][HA]

[H ][A ][HA]

[A ][H ]+[HA]

[A ][H ] = - +[HA]

[A ]+[HA]

a

a

a

a

a

K

log K log

log K log log

log log K log

pH pK log

=

=

=

=

+ -[H ][A ][HA]aK =

-[A ]+[HA]apH pK log=

Na fizička i hemijska svojstva i biološku aktivnost AK i proteina u celini značajno utiče naelektrisanje svih jonizabilnih funkcionalnih grupa. Sve AK sadrže 2 grupe koje mogu jonizovati: α-COOH i α-NH2. Za svaku slabu kiselinu, moguće je definisati kiselinsku konstantu odn. pKa vrednost (negativni logaritam Ka). Iz Henderson-Hazelbahove jednačine vidimo da je pri pH=pKa koncentracija protonovanog i deprotonovanog oblika kiseline jednaka. Kada je pH<pKa (tj. u kiselijoj sredini), dominira protonovani oblik, a pri pH>pKa, deprotonovani.

Page 18: Amnino kiseline i peptidi

18

18

R-COOH R-COO– + H+→←

R-NH3+ R-NH2 + H+→←

pKa ≈ 3,5-4,0

pKa ≈ 9,0-10,8

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

RCOO–RCOOH

RNH3+ RNH2

• ni pri jednoj pH vrednosti ne postoji nejonski oblik AK

• oblik koji ima ukupno naelektrisanje 0 je cviterjon (zwitterion)

• pH pri kome je ukupno naelektrisanje 0 je izoelektrična tačka, pH(I)

COOH

NH3+

R COO-

NH3+

R COO-

NH2

R

Da vidimo kako se ponašaju α-COOH i α-NH2 grupe AK koja nema jonizabilne bočne grupe. pKa(α-COOH) je oko 2; pri pH<2, ona je protonovana i nenaelektrisana (-COOH), iznad pH 2 je deprotonovana (-COO─). pKa(α-NH3

+) grupe je oko 9, te je ona pri pH<9 protonovana i pozitivna (-NH3

+), iznad pH 9 je nenaelektrisana (-NH2). Kao što se može videti, u celom pH opsegu bar jedna grupa je jonizovana, tj. ni pri jednoj pH vrednosti ne postoji nejonski oblik AK. Oblik koji ima ukupno naelektrisanje 0 (mada unutar molekula i dalje postoje šarže) je cviterjon (zwitterion), a pH pri kome je ukupno naelektrisanje 0 naziva se izoelektrična tačka, i označava sa pI, IET ili (po IUPAC-u) pH(I).

Page 19: Amnino kiseline i peptidi

19

19

Određivanje pH(I)A) računski: iz pKa grupa koje dobijaju naelektrisanje pri sniženju i povišenju pH u odn. na pH(I) (tj. u odnosu na oblik sa ukupnim naelektrisanjem 0)

COOH

NH3+

COO-

NH3+

COO-

NH2

+a a 3pK (α - COOH) + pK (α - NH ) 2,33+ 9,71pH(I) = = = 6,02

2 2

z = 0 z = -1z = +1

Poznavanje izoelektrične tačke aminokiselina, peptida i proteina veoma je važno za prečišćavanje i izolaciju proteina postupcima kao što je taloženje i elektroforeza, zbog čega je neophodno znati odrediti ovu vrednost. pH(I) se najčešće određuje računski ili eksperimentalno (volumetrijski, pH-metrijski).

Kod računskog određivanja, uzima se srednja vrednost pKa grupa koje prve jonizuju pri povišenju i sniženju pH u odnosu na pH(I), odn. u odnosu na oblik sa ukupnim naelektrisanjem 0. U slučaju AK koje nemaju jonizabilne grupe u bočnom nizu, situacija je jednostavna – koriste se pKa vrednosti za α-COOH i α-NH3

+.

Page 20: Amnino kiseline i peptidi

20

20

pH(I)

pKa(α-COOH)

pKa(α-NH3+)

COOH

NH3+

COO-

NH3+

COO-

NH2

0,5 eq

B) iz titracione krive:

1 eq

1,5 eq

2 eq

Alternativno, pH(I) se može odrediti eksperimentalno, titracijom rastvorom baze. Ukoliko krećemo od potpuno protonovanog oblika (pri niskom pH), vidimo da pH pri dodatku NaOH postepeno raste. Dolazi do postepene deprotonacije kiselije grupe (α-COOH). Kada je utrošeno 0,5 ekvivalenata NaOH, koncentracija protonovanog i deprotonovanog oblika je jednaka, a pH odgovara pKa(α-COOH). Kada je utrošen 1 eq NaOH, COOH grupa je potpuno deprotonovana, i dalji dodatak NaOH titruje NH3

+ grupu. Opet, pri 1,5 eq možemo očitati pKa(α-NH3+), a pri 2 eq i NH3

+ je potpuno deprotonovana.

Sa krive vidimo da oblik sa z=0 imamo pri 1 eq; pH vrednost koja odgovara ovoj tački je pH(I).

Page 21: Amnino kiseline i peptidi

21

21

• polifunkcionalne AK (sa baznim/kiselim bočnim nizom)

LizinpKa(ε-NH3

+)=10,80

COOH

NH3+

NH3+

NH3+

- H+

TirozinpKa(PhOH)=10,07

COOH

NH2OH

O-

- H+

Asparaginska k.pKa(β-COOH)=3,83

COOH

O NH2

OH

- H+

O

O-

CisteinpKa(RSH)=8,33

COOH

NH2

SH

- H+

S-

Glutaminska k.pKa(γ-COOH)=4,25

COOHO

NH2

OH

- H+

O

O-

ArgininpKa(GndH+)=13,20

COOHNH2

+NH

NH2

NH3+

NH NH

NH2

- H+

NH2 NH

NH2+

HistidinpKa(ImH+)=6,04

COOH

NH2

NH

NH

+

- H+

NH

N

NH+

NH

Prikazana situacija odnosi se na AK koje imaju samo α-COOH i α-NH2 grupu. Međutim, postoje i AK koje poseduju dodatne jonizabilne grupe – arginin, histidin i leucin sadrže bazne grupe koje se mogu protonovati i nositi pozitivnu šaržu, a cistein, tirozin, glutaminska kiselina i asparaginska kiselina sadrže kisele grupe koje podležu deprotonaciji.

Page 22: Amnino kiseline i peptidi

22

22

• AK sa kiselim bočnim nizom: Asp

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

α-COO-α-COOH

RNH3+ RNH2

COOH

NH3+

HOOC

pKa(α-COOH) = 1,95pKa(β-COOH) = 3,71pKa(α-NH3

+) = 9,66

β-COO-β-COOH

COO-

NH3+

HOOC

COO-

NH3+

O-OC

COO-

NH2

O-OC

z = +1 z = 0 z = -1 z = -2

a apK (α - COOH) + pK (β - COOH) 1,95 + 3,71pH(I) = = = 2,832 2

• pH(I) << 7 ⇒ pri fiziološkim uslovima Asp je negativno naelektrisana

U ovom slučaju, za računanje izoelektrične tačke koriste se pKa vrednost grupe koja se prva protonuje kada se pH spusti ispod pH(I), i grupe koja se prva deprotonuje pri pH>pH(I). Kao što se vidi, kod AK sa dodatnim kiselim grupama, pH(I) je pomerena ka kiseloj sredini. Pri fiziološkim uslovima, ovakve AK biće negativno naelektrisane.

Page 23: Amnino kiseline i peptidi

23

23

COOHNH3

+

HOOC

COO-

NH3+

HOOC

COO-

NH3+

O-OC

COO-

NH2

O-OC

z = +1 z = 0 z = -1 z = -2

Titraciona kriva analogna je krivoj za AK bez jonizabilnih bočnih nizova; razlika je u pojavi dodatnih prevoja.

Page 24: Amnino kiseline i peptidi

24

24

• AK sa baznim bočnim nizom: His

COOH

NH3+

NHNH+

pKa(α-COOH) = 1,70pKa(α-NH3

+) = 9,09pKa(ImH+) = 6,04

COO-

NH3+

NHNH+

COO-

NH3+

NHN

COO-

NH2

NHN

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

α-COO-α-COOH

RImH+ RIm

z = +2 z = +1 z = 0 z = -1

+ +a a 3pK (ImH ) + pK (α - NH ) 6,04 + 9,09pH(I) = = = 7,56

2 2

• pH(I) blizu 7 ⇒ pri fiziološkim uslovima His je pribl. neutralan, i lako razmenjuje H+

RNH3+ RNH2

Page 25: Amnino kiseline i peptidi

25

25

COOHNH3

+

NHNH+

COO-

NH3+

NHNH+

COO-

NH3+

NHN

COO-

NH2

NHN

z = +2 z = +1 z = 0 z = -1

pH(I)

pKa (ImH+)

pKa (α-NH3+)

pKa (α-COOH)

Page 26: Amnino kiseline i peptidi

26

26

• AK sa baznim bočnim nizom: Lys

COOH

NH3+

NH3+

pKa(α-COOH) = 2,15pKa(α-NH3

+) = 9,16pKa(ε-NH3

+) = 10,67

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

α-COO-α-COOH

z = +2 z = +1 z = 0 z = -1

+ +a 3 a 3pK (α - NH ) + pK (ε - NH ) 9,16 +10,67pH(I) = = = 9,92

2 2

• pH(I) > 7 ⇒ pri fiziološkim uslovima Lys je pozitivno naelektrisan

RNH3+ RNH2

COO-

NH3+

NH3+

COO-

NH2

NH3+

COO-

NH2

NH2

RNH3+ RNH2

Page 27: Amnino kiseline i peptidi

27

27

2.1.5. UV spektri aminokiselina

• sve AK bezbojne (ne apsorbuju u VIS području)• u UV području apsorbuju AK sa aromatičnim prstenom (Phe, Tyr, Trp)• apsorpciju pokazuje i cistin (omogućava detekciju disulfidnih mostova)

λmax (Phe) = 257, 206, 188 nm

λmax (Tyr) = 274, 222, 193 nm

λmax (Trp) = 280, 219 nm

λmax (Cys-Cys) = 250 nm

λmax (His) = 211 nm

Phe

Tyr

Trp

protein

Zbog odsustva proširene delokalizacije, nijedna AK ne apsorbuje svetlost u vidljivom području, odn. sve AK su bezbojne. Većina i u UV području pokazuje apsorpciju samo pri niskim λ. Izuzetak su aromatične AK, koje zahvaljujući prisustvu delokalizovanih π-elektrona apsorbuju svetlost u UV području (Tyr i Trp imaju maksimum na 280 nm, dok Phe pokazuje slabu apsorpciju na 260 nm). Zbog toga, većina proteina apsorbuje na 280 nm, što se može iskoristiti za grubo određivanje njihove koncentracije. Dodatno, apsorpciju pokazuje i cistin, što se može iskoristiti za detekciju disulfidnih mostova.

Page 28: Amnino kiseline i peptidi

28

28

2.1.6. Metaboličke reakcije aminokiselina• transaminacija

R1 COOH

NH2

R1 COOH

O

R2 COOH

NH2

R2 COOH

O

aminokiselina1

ketokiselina2

ketokiselina1

aminokiselina2

• dekarboksilacija

R COOH

NH2

aminokiselina

R

NH2

amin

CO2

biogeni amini His → histamin (medijator inflamacije)Ser → etanolamin (komponenta lipida)Glu → GABA (neurotransmiter)5-OH-Trp → serotonin (neurotransmiter)L-DOPA → dopamin (neurotransmiter)Phe → fenetilamin (neurotransmiter)Lys → kadaverinOrn → putrescin...

• deaminacija

R COOH

NH2

-2H

aminokiselina

R COOH

NH

iminokiselina

NH3

OH2

R COOH

O

ketokiselina

Jedna od najvažnijih metaboličkih reakcija aminokiselina je transaminacija, odn. transfer amino-grupe sa jednog molekula na drugi. Pritom, α-aminokiselina reaguje sa α-keto-kiselinom (2-okso-kiselinom), i nastaje novi par aminokiselina-ketokiselina. Reakcije ovog tipa značajne su za biosintezu i degradaciju aminokiselina, i metabolizam azota uopšte. Konverzija aminokiselina u ketokiseline (koje su u metabolizmu značajni međuproizvodi) može se postići i oksidativnom deaminacijom – oksidacijom do iminokiselina, koje zatim podležu hidrolizi.

Mnoge α-aminokiseline podležu gubitku karboksilne grupe – dekarboksilaciji – pri čemu nastaju tzv. biogeni amini, koji često imaju značajnu ulogu u organizmu. Tako γ-aminobuterna kiselina (iz glutaminske kiseline), serotonin (iz 5-hidroksitriptofana), dopamin (iz L-3,4-dihidroksifenilalanina) i još neki amini deluju kao neurotransmiteri (učestvuju u prenošenju nervnog impulda), histamin (koji nastaje iz histidina) učestvuje u razvoju inflamatornih procesa (upala, alergija)... Kadaverin i putrescin i (koji nastaju iz lizina i neproteinogene aminokiseline ornitina) odgovorni su za karakteristični miris truleži.

*Napomena: pošto biohemijski procesi tipično predstavljaju čitav niz ili mrežu reakcija, uobičajeni način pisanja reakcija (A + B → C + D) je nepraktičan, i retko se koristi. Umesto toga, mnogo je češće u upotrebi sistem zakrivljenih strelica, kojima se prikazuju vrste koje ulaze u reakciju ili iz nje izlaze. Tipično se glavni učesnici (prekursor i produkt) povezuju pravom strelicom, a pomoćna jedinjenja krivim. Još neke konvencije pri pisanju biohemijskih reakcija:

•reakcije se često ostavljaju neizjednačenim po pitanju naelektrisanja; naelektrisanja se generalno ignorišu (npr. piše se ATP, veoma retko ATP4–)•mnoge čestice pišu se u najjednostavnijoj formi, umesto u realno prisutnoj: H+ umesto H3O+, ATP umesto Mg2+·ATP4– itd.•zbog glomaznih struktura i sistematskih imena jedinjenja, uobičajeno je korišćenje trivijalnih imena i skraćenica, npr. Glc → Glc6P → Fru6P → Fru1,6BP → G3P + DHAP.

Page 29: Amnino kiseline i peptidi

29

29

2.1.7. Hemijske reakcije aminokiselina2.1.7.1. Reakcije karboksilne grupe

R COOH

NH2

aminokiselina NH3

OH2R CONH2

NH2

amid

R COOH

NH2

aminokiselina

OH2R CONH-R1

NH2

amidNH2R1

R COOH

NH2

aminokiselina

OH2R COOR1

NH2

estarOHR1

R1 COOH

NH2

aminokiselina1

R2 COOH

NH2+ R1 CO

NH2

R2 COOH

NH

aminokiselina2 amid (peptid)

Hemijske reakcije aminokiselina obuhvataju reakcije karboksilne grupe, amino-grupe i bočnih nizova.

Kao i sve karboksilne kiseline, i aminokiseline mogu da grade derivate sa amonijakom i aminima (amide) i alkoholima (estre). Biološki najznačajnija je reakcija građenja amida između –COOH grupe jedne aminokiseline i –NH2 grupe druge. Nastala amidna veza, tzv. peptidna veza, omogućava formiranje makromolekula – proteina.

Page 30: Amnino kiseline i peptidi

30

30

2.1.7.2. Reakcije amino grupe

R COOH

NH2

aminokiselina

OH2 R COOH

N

R1Šifova baza

(imin)R1

O

aldehid

R COOH

NH2

aminokiselina

OH2 R COOH

NH

R1

ON-acil-aminokiselina

R1

O

Clacil-hlorid

• ninhidrinska reakcijaO

O

N C-

O

O

O

O

N

O

O-

ljubičasti proizvod

R COOH

NH2O

O

OH

OH

ninhidrin

RCHOCO2

O

O

OH

H

hidrindantin

NH3

O

O

OH

OH

Amino-grupa može da reaguje sa karbonilnom grupom, dajući jedinjenja tipa imina. Ova reakcija značajna je kod procesa koji uključuju PALP (koenzim izveden iz vitamina B6) i kod kovalentnog umrežavanja kolagena. S druge strane, toksični efekti aldehida i alkohola (koji se u organizmu prevode u aldehide) može se pripisati njihovoj reakciji sa amino-grupama biomolekula.

Ninhidrinska reakcija često se koristi za dokazivanje aminokiselina, peptida i proteina. Ninhidrin je oksidans, i dovodi do oksidativne deaminacije α-NH2, pri čemu sam prelazi u hidrindantin. Hidrindantin reaguje sa još jednim molekulom ninhidrina i nastalim NH3 gradeći intenzivno plavoljubičast proizvod. Sem za detekciju, reakcija se koristi i za kvantifikaciju proteina, merenjem apsorbancije na 570 nm i očitavanjem sa kalibracione krive. Ninhidrin se inače koristi i u forenzici, za detekciju otisaka prsta.

Page 31: Amnino kiseline i peptidi

31

31

2.1.7.3. Specifične reakcije

• Cys – građenje disulfidnih mostova

COO-

NH3+

SH

S

O-OC

N+

S

O-

O

COO-

N+O

-

OS

-

COO-

N+O

-

O

S

O-OC

N+

S

O-

O

COO-

NH3+

• 5,5’-ditiobis(2-nitrobenzoeva kiselina), DTNB, Elmanov reagens

COO-

NH3+

SHO

-OC

NH3+

SCOO

-

NH3+

S2- 2H

2H

• Lys – građenje iminaCOO

-

NH3+

NH3+

COO-

NH3+

NROR

Pored reakcija na α-COOH i α-NH2, postoji i niz reakcija specifičnih za određene bočne nizove. Niz ovih reakcija biće obrađen na vežbama; ovde će samo biti prikazano nekoliko primera. Već je pomenuta oksidacija cisteina u cistin; reakcija je reverzibilna, i redukcija se prilikom određivanja strukture proteina koristi za razdvajanje lanaca i odmotavanje proteina. Reakcija sa Elmanovim reagensom - 5,5’-ditiobis(2-nitrobenzoevom kiselinom), pri kojoj nastaje žuto obojeni NTB2– proizvod, koristi se za spektrofotometrijsku kvantifikaciju tiolnih grupa.

Page 32: Amnino kiseline i peptidi

32

32

2.1.8. Tehnike razdvajanja aminokiselina• jonoizmenjivačka hromatografija

katjonski izmenjivači

anjonski izmenjivači

S

O

O

O-

CH2N

COO-

COO-

O

COO-

jako kiselapolistirenska smola

slabo kisela karboksimetil-celuloza (CMC)

slabo kisela/helirajućapolistirenska smola

N+

CH3

CH3

CH3

jako baznapolistirenska smola

O NH+

slabo baznadiaminoetilceluloza

SO3- SO3

-

H+ H+SO3

- SO3-

Lys2+ Glu+SO3

- SO3-

Lys2+

Glu+

Na+

Na+

SO3- SO3

-

Lys2+

Na+Na+

Na+Na+

Na+

Da bi se ispitala svojstva nekog određenog proteina, peptida ili aminokiseline, neophodno je prethodno ga razdvojiti od svih ostalih komponenti biološkog materijala (hiljade drugih biomolekula). Prečišćavanje se može zasnivati na raznim fizičkim ili hemijskim svojstvima, uključujući veličinu molekula, naelektrisanje, rastvorljivost, selektivno vezivanje (afinitet)... Uobičajena metoda razdvajanja AK je jonoizmenjivačka hromatografija. Postoji niz različitih stacionarnih faza, koje karakteriše prisustvo kiselih ili baznih grupa koje se pri uslovima analize jonizuju, i sposobne su za vezivanje suprotno naelektrisanih jona aminokiselina.

U slučaju da se koristi katjonski izmenjivač (sa negativno naelektrisanim grupama), koristi se mobilna faza dovoljno niskog pH da AK budu u protonovanoj, pozitivno naelektrisanoj formi. AK nanesene na kolonu će se zbog toga vezivati za stacionarnu fazu (jonoizmenjivač). AK se zatim eluiraju postepenom (gradijentnom) promenom koncentracije soli (npr. NaCl) u mobilnoj fazi ili promenom pH. U slučaju eluiranja rastvorom soli (Na+ istiskuje R-NH3

+), prvo se odvajaju AK koje nose najmanje pozitivno naelektrisanje i najslabije su vezane – prvo će eluirati kisele AK, pa neutralne, pa bazne. U slučaju gradijenta pH (od niskih ka visokim vrednostima), situacija je slična – prvo eluiraju AK koje i u jako kiseloj sredini imaju malo pozitivno naelektrisanje, dok bazne AK eluiraju tek pri visokim vrednostima pH, potrebnim za njihovo deprotonovanje.

Page 33: Amnino kiseline i peptidi

33

33pH

AspThr

Ser Glu

Pro

Gly Ala

U praksi, za analizu AK koriste se aminokiselinski analizatori, koji predstavljaju specijalno adaptirane HPLC sisteme. Uzorci se automatski nanose na visokoefikasnu katjon-izmenjivačku kolonu u protonovanoj formi (nisko pH). Komponente se eluiraju korišćenjem pufera kao mobilne faze, pri čemu se korišćenjem binarne pumpe obezbeđuje kontrolisana gradijentna promena (porast) pH. Pošto su AK bezbojne, u cilju detekcije efluentu sa kolone kontinualno se dodaje ninhidrin, koji sa njima daje intenzivnu plavoljubičastu boju koja se detektuje spektrofotometrijski. Rezultat analize je hromatogram, u kome je retenciono vreme (vreme eluiranja) karakteristično za svaku AK (i povezano sa njenim naelektrisanjem), a površina pika srazmerna njenoj koncentraciji.

AK se alternativno mogu određivati i klasičnom reverzno-faznom HPLC tehnikom, ali ih je u tom slučaju neophodno derivatizovati odn. hemijskim putem prevesti u formu koja se ne jonizuje (jonska jedinjenja tipično se ne zadržavaju na RP stacionarnoj fazi) i koja se može detektovati UV/VIS tehnikom. Primer reagensa za derivatizaciju AK je o-ftalaldehid.

Page 34: Amnino kiseline i peptidi

34

34

2.2. PEPTIDI

• peptidi : oligo- i polimeri AK međusobno vezanih peptidnim vezama• α-COOH jedne AK povezuje se sa α-NH2 druge

CH C OHNH2

R1

O

CH C OHNH

R2

O

H

CH C OHNH

R2

O

CH CNH2

R1

O

H2O

ΔG0` ≈ 21 kJ/mol

peptidna veza

peptidna (amidna) grupa

Najvažnija biološka funkcija AK je da predstavljaju gradivne jedinice peptida i proteina. Peptidi su oligomeri i polimeri AK, međusobno povezanih amidnim, tzv. peptidnim vezama. Prilikom formiranja peptidne veze, dolazi do kondenzacije α-COOH grupe jedne AK i α-NH2 grupe sledeće, uz gubitak molekula vode. Reakcija je, u principu, termodinamički nepovoljna i ne odigrava se spontano. Za razliku od COOH i NH2 grupa slobodnih AK, peptidna grupa je pri fiziološkim uslovima nenaelektrisana.

Page 35: Amnino kiseline i peptidi

35

35

NH2N

R1 H

HR2O

H

N

O R3H

H

N

O HR4

H

N

O R5H

H O

N

HR6

H O

OH

• pp lanac: pp kičma + varijabilni bočni niz

• konvencija pisanja: od N-terminusa ka C-terminusu

O

NHNH

O

NH2

SH

O

OH

NH2-Cys-Phe-Ala-COOHCys-Phe-AlaCFAcisteinil-fenilalanil-alanin

• nastavak -in (-an kod Trp) → -il• kod Cys: cisteinil• kiseline: α-/β-asparagil, α-/γ-glutamil• amidi: asparaginil, glutaminil

peptidi:• oligopeptidi (2-10 AK)• polipeptidi (10-50/100)• proteini (50/100-)

Povezivanjem većeg broja AK ostataka nastaje polipeptidni niz, koga čine polipeptidna kičma (sačinjena od N-atoma, α-C i karbonilnog C) za koju su vezani bočni nizovi (R). Po konvenciji, oligo- i polipeptidni nizovi uvek se pišu od N-terminusa (slobodne NH2 grupe) ka C-terminusu (slobodnoj COOH). Peptidi se imenuju navođenjem naziva svih AK ostataka koji ih izgrađuju. Imena AK ostataka dobijaju se zamenom nastavka –in/an nastavkom –il (glicin→glicil, lizin→lizil). U slučaju cisteina, IUPAC nalaže upotrebu naziva cisteinil, da bi se izbeglo mešanje sa ostatkom cisteinske kiseline (→cisteil). Kod dvobaznih AK i njihovih amida potrebno je obratitipažnju: ostatak Asp je asparagil (ili aspartil), a ostatak Asn – asparaginil. Kod dvobaznih kiselina je, u slučaju neklasičnog povezivanja, neophodno naglasiti i koja COOH učestvuje u građenju peptidne veze. Na primer, tripeptid glutation je γ-glutamil-cisteinil-glicin, jer se peptidna veza uspostavlja između γ-COOH grupe Glu i α-NH2 grupe Cys. Prilikom pisanja peptida i proteina, uobičajeno je korišćenje troslovnih ili jednoslovnih skraćenica.

Prema dužini lanca, peptidi se dele na oligopeptide, sa 2 do 10-20 AK ostataka (dalje se razlikuju di-, tri-, tetrapeptidi itd.), polipeptide (10-50 do 50-100 AK ostataka), i proteine (preko 50-100 AK ostataka). Ne postoji prirodna, strogo definisana granica između polipeptida i proteina. Razlika je prvenstveno u 3D strukturi – peptidi kraćeg lanca najčešće nemaju stabilnu 3D strukturu, dok se proteini uvijaju u tzv. nativnu konformaciju.

Proteini mogu da sadrže veoma veliki broj AK ostataka; najveći poznati protein, titin iz mišića, čini čak 27-33 000 AK. Čak i relativno mali proteini imaju veliku molekulsku masu (uz prosečnu Mr(AK) od 110 Da, Mr proteina od 100 aminokiselina iznosi 11 000 Da). Zbog toga se Mrproteina tipično izražava u kilodaltonima (kDa).

Page 36: Amnino kiseline i peptidi

36

36

2.2.1. Struktura i stereohemija peptidne grupe

• C-N veza: parcijalni karakter dvostruke veze• otežana rotacija → cis- i trans- konformacija• sp2 → koplanarni atomi: Cα, C=O, N-H, Cα• smanjena baznost

N

O

H

N+

O-

H

N

O

Hδ+

δ–

Rendgenostrukturna analiza pokazala je da je C–N veza peptidne grupe kraća nego što bi se očekivalo za normalnu jednostruku C–N vezu, ali duža od C=N. Sledi da peptidna veza ima parcijalni karakter dvostruke veze, i može se predstaviti kao rezonantni hibrid dve strukture date na slajdu. Ovo ima više značajnih posledica, od kojih su najznačajnije vezane za stereohemiju peptidne grupe. Delokalizacija elektrona i parcijalni karakter dvostruke veze onemogućavaju slobodnu rotaciju oko C–N veze, dok sp2 hibridizacija C i N atoma ima za posledicu koplanarnost atoma peptidne veze (α-C, C=O, N-H i sledeći α-C leže u istoj ravni). Broj mogućih konformacija peptidne grupe je zbog sprečene rotacije sveden na dve – cis i trans. U cis-konformaciji, dva α-C (iz susednih AK ostataka) su sa iste strane peptidne veze, te se javljaju sterne smetnje između bočnih nizova vezanih za te C-atome. Zbog toga je trans-konformacija povoljnija, i skoro sve peptidne veze u proteinima imaju trans-konformaciju (kod prolina je, zbog specifičnosti bočnog niza, česta i cis). Planarnost peptidne grupe značajno ograničava broj mogućih konformacija celog polipeptidnog niza (v. 2.3.5.3.).

Page 37: Amnino kiseline i peptidi

37

37

2.2.2. Fiziološki aktivni peptidi

• Sintetišu se:

1. translacijom mRNK na ribozomima (→ samo proteinogene AK + modifikovane)

2. proteolitičkim cepanjem dužih pp lanaca (→ samo proteinogene AK + modifikovane)

3. na specifičnim enzimima - sintetazama neribozomalnih peptida

(→ i neuobičajene AK, D-AK, neuobičajeno povezivanje...)

2.2.2.1. Peptidni hormoni• = peptidi koji se luče u krvotok i imaju regulatornu f-ju

• {sinteza na ribozomu}→ pre-prohormon —{ER}→ prohormon —{pakovanje u vezikule}→ —{hidroliza}→ hormon —{lučenje}→

• sadrže od 3 AK ostatka (tiroliberin) do 84 (parathormon)

└─SS─┘CYPQNCPRG

FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT

GIVEQCCTSICSLYQLENYCN

|S2|

\S2\

└-S2-┘

S

Ala Trp γ,δ-(OH)2 Leu

Hyp Cys Thr Ala

U daljem tekstu, biće obrađeno nekoliko primera fiziološki aktivnih peptida. Ovi peptidi mogu u ćeliji nastati na nekoliko načina:1) Translacijom mRNK na ribozomima, identično biosintezi proteina. Ovakvi peptidi sadrže samo proteinogene aminokiseline (20 uobičajenih L-AK) i AK nastale njihovom posttranslacionom modifikacijom. Ovde spadaju peptidni hormoni i signalni molekuli, kao i neki antibiotici.2) Cepanjem dužih polipeptidnih lanaca odgovarajućim proteolitičkim enzimima. Budući da polipeptidi-prekursori takođe nastaju translacijom, i ova grupa sadrži samo proteinogene i modifikovane AK. Ovde spadaju otpadni proizvodi aktiviranja proenzima (zimogena), sazrevanja kolagena, prelaska fibrinogena u fibrin...3) Na specifičnim enzimima – sintetazama neribozomalnih peptida. Zahvaljujući tome, oni nisu ograničeni genetski kodiranim AK, nego mogu da sadrže i neuobičajene AK i D-AK, a između njih može postojati i neuobičajeno povezivanje (ciklične strukture, razgranate strukture, peptidna veza koja nije uspostavljena između αCOOH i αNH2). U ovu grupu spadaju glutation (→), kao i razni peptidi jednoćelijskih organizama, biljaka i gljiva (uklj. antibiotike i toksine).

Prva grupa bioaktivnih peptida o kojoj će biti reči su peptidni hormoni. Hormoni uopšte predstavljaju jedinjenja koja luče žlezde u jednom delu organizma, a koja izazivaju odgovor u udaljenim delovima. Peptidni hormoni sintetišu se translacijom (odn. kodirani su u DNK). U prvoj fazi, sintetiše se pre-prohormon, koji se u endoplazmatskom retikulumu modifikuje (uklanja se N-terminalna sekvenca, ponekad dolazi i do glikozilacije) dajući prohormon, koji se pakuje u vezikule. Prohormon se po potrebi (kao odgovor na spoljašnji signal) izlučuje iz ćelije egzocitozom. Prethodno dolazi do finalnog uklanjanja nepotrebnih delova sekvence (koji su imali funkciju stabilizacije pri umotavanju) endopeptidazama. Peptidni hormoni značajno se razlikuju po dužini niza – dok najkraći (tiroliberin) imaju samo 3 AK ostatka, paratiroidni hormon (parathormon) sadrži 84 AK ostatka i ima Mr od skoro 10 kDa.

Page 38: Amnino kiseline i peptidi

38

38

Insulin• prvi otkriveni peptidni hormon• ekstrahovan i primenjen 1921-22. (Banting, Macleod) → Nobelova nagrada• prvi kristalisani peptid 1926. (Abel)• prvi sekvencionisan peptid 1955. (Sanger et al.) → Nobelova nagrada• prvi hemijski sintetisan peptid 1964. (Du et al., Katsoyoanis et al.)• tercijarna struktura 1969. (Hodgkin) → Nobelova nagrada

• nastaje u β-ćelijama Langerhansovih ostrvaca

• aktivacija: pre-proinsulin (114 AK) → otkidanje terminalnog peptida →proinsulin (84 AK) → insulin (51 AK)

NH2–

SH–COOH

SHSH SH

pre-proinsulin(114 AK)

proinsulin(84 AK)

NH2–

–COOHSS

SS

insulin(51 AK, 5808 Da)

NH2–

–COOHSS

SS

NH2–

–COOH

Prvi otkriveni peptidni hormon bio je insulin. Zbog njegovog značaja za medicinu, intenzivno je istraživan, što je rezultovalo i nizom Nobelovih nagrada.

Insulin sintetišu β-ćelije Langerhansovih ostrvaca pankreasa u vidu pre-proinsulina, polipeptida od 114 AK ostataka. U endoplazmatskom retikulumu dolazi do otkidanja N-terminalne sekvence, umotavanja i oksidacije Cys uz formiranje disulfidnih mostova, pri čemu se stvara proinsulin (84 AK). Isecanjem centralnog dela lanca nastaje zreli insulin, koji sadrži 51 AK i ima Mr od 5808 Da.

Page 39: Amnino kiseline i peptidi

39

39

• 2 lanca: A (21 AK) i B (30 AK)

• 2 interlančana disulfidna mosta (A7-B7, A20-B19), 1 intralančani (A6-A11)

• signalizira dostupnost Glc →

• stimuliše ulazak glukoze iz krvi u ćelije (ugl. mišićne i masnog tkiva), sintezu glikogena, masnih kiselina i TAG,

• inhibira glukoneogenezu, proteolizu, lipolizu

B

A

Glc

mk

CO2glikogen

TAGmk

insulin

glukagonGlc

glikogen

pyr

*

Molekul zrelog insulina sastoji se od dva polipeptidna lanca, A (21 AK) i B (30 AK). Lanci su povezani preko dva interlančana disulfidna mosta. Dodatno, u molekulu postoji jedan intralančani disulfidni most, koji povezuje delove lanca A.

U organizmu, insulin signalizira dostupnost glukoze (npr. nakon unetog obroka). On stimuliše ulazak glukoze iz krvi u ćelije, ugl. mišćnog tkiva (gde dalje stimuliše njeno deponovanje u vidu glikogena) i masnog tkiva (gde stimuliše sintezu i deponovanje masnih kiselina i triacilglicerola). Dodatno, on inhibira procese mobilizacije energetskih zaliha – glukoneogenezu, proteolizu i lipolizu.

U slučaju poremećaja u sintezi insulina, dolazi do poremećaja u metabolizmu glukoze i uopšte energetskom metabolizmu – dijabetesa.

Page 40: Amnino kiseline i peptidi

40

40

• jedan lanac (29 AK, 3485 Da), bez disulfidnih mostova

• nastaje u α Langerhansovim ćelijama pankreasaiz proglukagona (9 kDa)

• antagonist insulinu – signalizira hipoglikemiju →stimuliše konverziju glikogena iz jetre u glukozu (glikogenolizu), lipolizu, glukoneogenezu

Glukagon

*

Glc

mk

CO2glikogen

TAGmk

insulin

glukagonGlc

glikogen

pyr

Drugi peptidni hormon koji učestvuje u regulaciji nivoa glukoze u krvi i energetskog metabolizma je glukagon. Ovaj hormon sintetišu α-ćelije Langerhansovih ostrvaca pankreasa, takođe u vidu prohormona – proglukagona. Za razliku od insulina, u pitanju je jednolančani polipeptid bez disulfidnih mostova.

Antagonist je insulinu, i signalizira hipoglikemiju, odn. smanjen nivo glukoze u krvi. Stimuliše mobilizaciju energetskih rezervi – glikogenolizu i lipolizu – kao i sintezu glukoze iz nešećernih prekursora (glukoneogenezu).

Page 41: Amnino kiseline i peptidi

41

41

Hormoni zadnjeg režnja hipofize

• hipofiza – endokrina žlezda u osnovi mozga, ispod hipotalamusa

• prednji režanj: hormoni koji stimulišu lučenje drugih hormona

• zadnji režanj: oksitocin, vazopresin

Oksitocin• nonapeptid• 1007 Da• Cys povezani S-S mostom• uloga u reprodukciji – stimuliše:

• vezivanje za partnera...• seksualno uzbuđenje• kontrakcije pri porođaju • laktaciju • majčinski nagon

• antagonist: progesteron

CYIQNCPLG-NH2└─SS─┘

U grupu peptidnih hormona spadaju i hormoni koje luči hipofiza. Hipofiza je endokrina žlezda koja se nalazi u osnovi mozga, ispod hipotalamusa (koji je kontroliše), i zadužena je za lučenje niza hormona koji regulišu homeostazu. Sastoji se od prednjeg režnja (adenohipofize), koja luči hormone koji stimulišu lučenje drugih hormona, i zadnjeg režnja (neurohipofize) koja luči oksitocin i vazopresin (o kojima će dalje biti reči).

Oksitocin je po strukturi nonapeptid mase oko 1 kDa, sa jednim intralančanim disulfidnim mostom. Ima niz funkcija, od kojih su najvažnije vezane za reprodukciju. Odgovoran je za uspostavljanje čvrste veze između partnera (zbog čega se naziva “hormonom ljubavi”), seksualno uzbuđenje, majčinski nagon, kontrakcije pri porođaju (zbog čega se koristi za stimulaciju trudova) i laktaciju. Povezuje se i sa uspostavljanjem društvenih veza, razvijanjem poverenja, empatijom i darežljivošću, a nesposobnost lučenja ovog hormona sa sociopatijom, psihopatijom, narcisizmom...

Page 42: Amnino kiseline i peptidi

42

42

Vazopresin, antidiuretski hormon (ADH)• nonapeptid

• Cys povezani S-S mostom

• reguliše resorpciju vode iz bubrežnih tubula → retencija vode → hipertenzija

• vazokonstriktor → hipertenzija → primena kod hipovolemijskog šoka

• povezan sa procesom pamćenja?

• održava vezu između partnera, stimuliše agresivnost mužjaka prema drugim mužjacima

• strukturno sličan oksitocinu:

└─SS─┘CYFQNCPRG

C–Y–I–Q–N–C–P–L–G–NH2└──S──S──┘

C–Y–F–Q–N–C–P–R–G–NH2└──S──S──┘

Drugi hormon zadnjeg režnja hipofize je vazopresin ili antidiuretski hormon. To je takođe nonapeptid sa intralančanim disulfidnim mostom, koji se od oksitocina razlikuje samo u dva AK ostatka. Ovaj hormon prvenstveno reguliše retenciju vode u organizmu, putem regulacije resopcije vode u bubrezima. Pošto deluje i kao vazokonstriktor, u visokim koncentracijama povećava krvni pritisak. Dok ovaj efekat kod zdravih osoba nije izražen, u medicini se koristi kod hipovolemijskog šoka (npr. usled gastrointestinalnog krvarenja, porođaja...). Pored ovoga, vazopresin ima dejstvo i na centralni nervni sistem. Implicirana je uloga u procesu pamćenja (kontroverzno), a utiče i na društveno ponašanje – povezuje se sa održavanjem veze između partnera i agresivnošću mužjaka prema drugim mužjacima.

Page 43: Amnino kiseline i peptidi

43

43

• mali peptidni molekuli koji deluju kao neurotransmiteri • poznato oko 100

• enkefalini: met-enkefalin (YGGPM), leu-enkefalin (YGGPL)• endorfini (endogeni morfini)

2.2.2.2. Neuropeptidi

2.2.2.3. Peptidni antibiotici

1) peptidi: bacitracin, tirocidin, gramicidin...

Tirocidin AD-Phe–Pro–Phe–D-Phe–Asn–Gln–Tyr–Val–Orn–Leu

Gramicidin S1D-Phe–Pro–Val–Orn–Leu–D-Phe–Pro–Val–Orn–Leu

Neuropeptidi su mali peptidni molekuli koji deluju kao neurotransmiteri, odn. omogućavaju komunikaciju između neurona (prenos signala sa presinaptičkog na postsinaptički neuron). Za razliku od peptidnih hormona, dejstvo je lokalizovano samo na okolne ćelije (postsinaptičke neurone). Za razliku od niskomolekulskih neurotransmitera (acetilholin, noradrenalin...), dejstvo je duže i raznovrsnije. Poznato je oko 100 različitih neuropeptida kod sisara.

Prvi primer, enkefalin, predstavlja pentapeptid koji se javlja u dve forme, kao met-enkefalin (sekvence YGGPM) i leu-enkefalin (YGGPL). Ima ulogu u regulaciji nocicepcije (percepcije bola) – ima opioidno delovanje (smanjuje bol, popravlja raspoloženje).

Endorfine (endogeni morfini) proizvode hipofiza i hipotalamus. Luče se prilikom stresa – fizičke aktivnosti, uzbuđenja, bola, ljubavi... Kao i enkefalini, izazivaju analgeziju i dobro raspoloženje.

Peptidni antibiotici su peptidi prirodnog porekla koji imaju funkciju zaštite organizma od mikroorganizama (bakterija, gljivica), a koji se često koriste u humanoj medicini. U pitanju su neribozomalni peptidi, koji nastaju na specijalizovanoj neribozomalnoj peptid sintetazi (NRPS) kao templatu. Zbog toga, u njihovim strukturama uobičajene su nestandardne aminokiseline, D-aminokiseline, i nestandardni načini povezivanja (naročito – formiranje cikličnih struktura).

Prvu grupu čine antibiotici čisto peptidne strukture, linearne ili ciklične. Primeri su bacitracin (izolovan iz Bacillus subtilis), tirocidin (Bacillus brevis) i gramicidin (iz Bacillus brevis). Deluju tako što narušavaju lipidni dvosloj ćelijske membrane i/ili ćelijski zid bakterija.

Tirocidin A je ciklični dekapeptid. Predstavlja prvi komercijalno dostupan antibiotik. Zbog toksičnosti (utiče na crvena krvna zrnca i reproduktivni sistem), te je nepogodan za unutrašnju upotrebu. Gramicidini su linearni pentadekapeptidi (A, B, C) ili ciklični dekapeptidi (gramicidin S). Ugrađuju se u ćelijsku membranu bakterija gradeći kanal kroz koga mogu da prođu joni. Zbog toksičnosti (izazivaju hemolizu) koriste se samo eksterno.

Page 44: Amnino kiseline i peptidi

44

44

2) glikopeptidni antibiotici: vankomicin, teikoplanin, bleomicin

3) β-laktamski antibiotici: penicilini (iz Penicillium sp. i Aspergillus sp.) icefalosporini

• sadrže β-laktamski prsten

Penicilini: benzilpenicilini, fenoksimetilpenicilini, ampicilin

Cefalosporini: cefalosporin C, cefaleksin, cefritaksin

tiazolidinskiprsten

β-laktamski prsten

S

N

NHR

O

OCOOH

β-laktamski prstendihidrotiazinski prsten

N

NHR

O

O

S

R1

COOH

Glikopeptidni antibiotici su ciklični peptidi za koje su vezani ugljenohidratni molekuli. Inhibiraju izgradnju ćelijskog zida bakterija, čineći ih neotpornim na uslove okoline. Zbog toksičnost, koriste se samo u posebnim situacijama – kod kritično bolesnih pacijenata, pacijenata preosetljivih na β-laktamske antibiotike, i u slučaju penicilin-rezistentnih infekcija. Predstavnici su vankomicin (1449 Da, iz Streptomyces orientalis, inhibira izgradnju ćelijskog zida Gram-pozitivnih bakterija, nefrotoksičan), teikoplanin i bleomicin.

β-laktamske antibiotike karakteriše prisustvo β-laktamskog (četvoročlanog) prstena. U najpoznatije predstavnike spadaju penicilini i cefalosporini.

Page 45: Amnino kiseline i peptidi

45

45

• rezistencija: β-laktamaza koja razara antibiotike

• klavulanska kiselina – inhibitor β-laktamaze

• imipenem – β-laktamski antibiotik veoma širokog dejstva

O

NO

COOH

HOH

O

NO

COOH

HOH

S

NH

NH

klavulanskakiselina

imipenem

Gram-pozitivna

Gram-negativna

• inhibiraju izgradnju ćelijskog zida

Deluju tako što inhibiraju izgradnju (tačnije, umrežavanje) peptidoglikanskog sloja ćelijskog zida bakterija (Gram-pozitivnih, a noviji deluju i na Gram-negativne). Kao posledica toga, bakterija postaje manje otporna na uslove spoljašnje sredine; dodatno, normalna deoba je sprečena a pri pokušaju deobe bakterija potpuno gubi ćelijski zid.

Neke bakterije razvile su rezistenciju putem sinteze enzima β-laktamaze, koji raskida β-laktamski prsten antibiotika i time ih inaktivira. U ovakvim slučajevima, uz antibiotik se daju inhibitori β-laktamaze, kao što je klavulanska kiselina.

Jedan od pripadnika grupe β-laktamskih antibiotika je i imipenem. Imipenem predstavlja antibiotik veoma širokog dejstva, efikasan i protiv Gram-pozitivnih i protiv Gram-negativnih bakterija. Samo mali broj bakterija pokazuje rezistenciju prema ovom jedinjenju.

Page 46: Amnino kiseline i peptidi

46

46

4) makrolidni antibiotici: • makrociklični (≥7 atoma) laktoni

• inhibiraju sintezu proteina kod bakterija vezivanjem za ribozome ili DNK

• Aktinomicin D – iz Streptomyces, sadrži fenoksazon-dikarboksilnu kiselinu amidno vezanu za pentapeptid, deluje i kao citostatik (inhibira transkripciju)

N

O O

NH2

ThrOOThr

D Val

Pro

O

Sar

Me Val Me Val

O

SarPro

D Val

Page 47: Amnino kiseline i peptidi

47

47

• životinjski otrovi (pčela, škorpija, paukova, zmija) su tipično peptidi

• peptidi otrova kobre (LD50 = 750 μg/kg) – kardiotoksini (oštećuju srčani mišić), neurotoksini (izazivaju paralizu), hemotoksini

2.2.2.4. Peptidni toksini

• bakterijski toksini: botulinum toksin (Botox) iz Clostridium botulinum -neurotoksin, LD50 ≈ 1 ng/kg

α-amanitin (Amanita phalloides)hepato- i nefrotoksičan

γ,δ-(OH)2 Ile 6-OH-Trp Gly

Asn

Hyp

Cys

S=O

Gly

Ile

faloidin (Amanita phalloides)

S

Ala Trp γ,δ-(OH)2 Leu

Hyp Cys Thr Ala

• amanita toksini (iz Amanita pečurki) – amatoksini i falotoksini

Page 48: Amnino kiseline i peptidi

48

48

2.2.2.5. Glutation

• tripeptid: γ-glutamil-cisteinil-glicin

O

NH

SH

NH COOHHOOC

O

NH2

peptidna veza između α-NH2 Cys i –COOH iz bočnog niza Glu!

• redukovani oblik – GSH,

• oksidovani oblik – GSSG

• glavni antioksidans u ćelijama, štiti ih od toksičnih oblika kiseonika

• visoka C u eritrocitima – redukuje metHb u Hb

• GSH + GSH reduktaza učestvuju u formiranju disulfidnih veza kod peptida i proteina

• GSH – nosač u transportu AK (donor γ-glutamil grupe)

• učestvuje u brojnim detoksifikacijama, metaboličkim putevima...

Redoks ciklus GSH

2 GSH GSSG

H2O2 2 H2O

NADPH + H+NADP+

GSH reduktaza

GSH peroksidaza