Analisa Hemoglobin pada Thalasemia

Oleh :Galih Cakhya Imawandr. H. Heru Wahyono Sp.A

Thalasemia

Penyakit anemia hemolitik kongenital herediter yang diturunkan secara autosomal resesif atau ko-dominan, yang disebabkan oleh kekurangan sintesis satu atau lebih atau tidak adanya rantai polipeptida yang menyusun molekul globin dalam hemoglobin.

Pengertian thalasemia secara medis adalah penyakit kelainan darah yang ditandai dengan kondisi sel darah merah mudah rusak atau umurnya lebih pendek dari sel darah normal (normalnya 120 hari). Hal ini diakibatkan karena ketidakseimbangan pembuatan dan produksi salah satu dari ke 4 rantai asam amino yang berfungsi membentuk hemoglobin (HB).

KlasifikasiSecara Molekuler• Thalasemia α gangguan pembentukan rantai α• Thalasemia β gangguan pembentukan rantai β

Secara klinis thalassaemia dibagi menjadi:1. Thalassaemia minor/Thalassaemia Trait/Pembawa sifat

Thalassaemia: Tdk bergejala, tdk membutuhkan tranfusi darah, hidup seperti orang normal.

2. Thalassaemia Intermedia:Gejala ringan, membutuhkan tranfusi darah tetapi tidak rutin.

3. Thalassaemia Mayor: Membutuhkan tranfusi darah secara rutin, seumur hidup.

Diagnosis Thalasemia

• Pemeriksaan pada penderita yang secara klinik diduga menderita talasemi meliputi pemeriksaan hematologi lengkap (complete hematology examination) dan pemeriksaan analisis hemoglobin yang bisa diperiksa dengan metode elektroforesis hemoglobin atau high performance liquid chromatography (HPLC).

Analisa hemoglobin mempunyai peranan penting dalam diagnosis hemoglobinopati karena diagnosis hemoglobinopati ditegakkan berdasarkan gambaran hematologi dan analisa hemoglobin, baik thalassemia maupun Hb varian.

• Hemoglobin tersusun dari empat molekul protein (globulin chain) yang terhubung satu sama lain. Hemoglobin normal orang dewasa (HbA) terdiri dari 2 alpha-globulin chains dan 2 beta-globulin chains,

• sedangkan pada bayi yang masih dalam kandungan atau yang sudah lahir terdiri dari beberapa rantai beta dan molekul hemoglobinnya terbentuk dari 2 rantai alfa dan 2 rantai gama yang dinamakan sebagai HbF.

Normal Human HaemoglobinsHaemoglobin Structural formula

Adult Hb-A 2 2 98%

Hb-A2 2 2 1.5-3.2%

Fetal Hb-F 2 2 0.5-1%

Hb-Bart’s 4

Embryonic Hb-Gower 1 2 2

Hb-Gower 2 2 2

Hb-Portland 2 2

Hb anak dan dawasa normal : 98% HbA (2 2), < 2% HbA2 (2 2 ) , dan <3% HbF (2 2 )Neonatus : HbF 95%, seiring perkembangan HbF menurun, umur 1 tahun telah mencapai keadaan normal

*Galanello dkk (1979) menganjurkan nilai MCV < 79 fL dan MCH < 27 pg sebagai nilai ambang (cut-off) untuk uji saring awal thalassemia β *Sementara penelitian Rogers dkk (1995) menyebutkan nilai cut off untuk skrining antenatal thalassemia β pada wanita hamil adalah MCH < 27 pg dan MCV < 85 fl, dimana nilai MCH lebih superior daripada MCV.

Nilai MCV dan MCH pada uji saring awal thalassemia β

Analisis Hemoglobin• Sebagian besar laboratorium menggunakan

teknik elektroforesis pada pH alkali untuk analisis hemoglobin secara kuantitatif– Untuk menganalisa hemoglobin secara kuantitatif

biasanya digunakan ionexchange chromatogphy untuk HbA2 dan denaturasi alkali untuk HbF

• Teknik yang paling mutakhir untuk analisa hemoglobin saat ini adalah High Performance Liquid Chomatography (HPLC)

ELECTROPHORESIS

Hemoglobin elektroforesis berdasarkan prinsip bahwa bila protein diletakan pada membran yang terpapar medan bermuatan, akan terpisah satu dengan yang lain dan dapat diperlihatkan dengan memberikan zat warna pada protein atau hem.

Elektroforesis

• Hb elektroforesis memperlihatkan setelah usia 12-16 bulan selalu terdiagnisis ketika lebel Hb A2 , Hb F, atau keduanya meningkat. thalassemia mayor saat skrening sering memperlihatkan Hb A negative.

Hb elekrteoporesis memperlihatkan hanya Hb F dan Hb A2 pada anak anak dengan βH-thalassemia homozigot. Mereka dengan gen β+ -thalassemia memiliki beberapa Hb A tetapi mengalami peningkatan pada Hb F dan Hb A2. Diagnosis homozygot β -thalassemia sebaiknya juga diperkuat dengan temuan β-thalassemia minor pada kedua orang tua penderita.

Penetapan Fraksi Hemoglobin A2 Secara Kuantitatif

• Bila pada penetapan fraksi HbA2 dengan cara ini dijumpai kadar yang sangat tinggi, melebihi 8% perlu dicurigai adanya fraksi hemoglobin lain dan dilakukan pemeriksaan elektroforesis hemoglobin.

• Selain itu pada penetapan kadar HbA2 sebaiknya penderita tidak ditrnasfusi terlebih dahulu karena akan mempengaruhi hasil pemeriksaan. Pemeriksaan kadar HbA2 sebaiknya dilakukan 8 minggu pasca transfusi darah.

• Meningkatnya kadar HbA2 pada seorang yang secara klinis normal merupakan kriteria diagnostik thalassemia _ heterozigot. Selain itu kadar HbA2 dapat pula meningkat pada hipertiroid dan anemia megaloblastik, peningkatan yang terjadi berkisar antara 3,6-7,8% dengan rata-rata 5,2%.

Penetapan Fraksi Hemoglobin F Secara Kuantitatif

• Pada orang dewasa normal kadar HbF kurang dari 1% dan akan• meningkat ringan 1 – 5% pada 50% karier _ Thalassemia, • 5 – 20% mengambarkan d_ thalassemia trait dan • hereditary persistence of fetal Hb (HPFH), 20 – 45% merupakan gambaran

HPFH panseluler tipe Africa. Pada beberapa kasus homozigot, HbF dapat mencapai >90% dari total Hb.

High Performance Liquid Chomatography (HPLC)

• HPLC berupaya untuk memisahkan molekul berdasarkan perbedaan afinitasnya terhadap zat padat tertentu.

• Prinsip kerjanya adalah pemisahan berbagai jenis hemoglobin oleh adanya perbedaan muatan antar molekul hemoglobin tersebut

• Pada cara ini fase cair dipompakan melalui kolom fase padat. Hemolisat yang mengandung berbagai jenis Hb yang berbeda akan diadsorbsi pada fase padat yang bermuatan positif.

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC)

Fasa stationer Fasa Gerak

Padat Cair

• HPLC telah dirancang sedemikian rupa sehingga jenis-jenis Hb yang paling sering sudah dapat diidentifikasi, seperti HbA2/HbE, HbF, HbS dan HbD dan juga mampu mendeteksi Hb varian tersering didunia yaitu HbS dan HbE.

Diagram alir HPLC Solvent

reservoir

Pump to produce high

pressure

Sample injection

HPLC tube

detector

Signal to processor

waste

Processing unit and display

Kesimpulan

• Thalasemia α• Thalasemia β

1. Thalassaemia minor/Thalassaemia Trait/Pembawa sifat Thalassaemia

2. Thalassaemia Intermedia3. Thalassaemia Mayor

Hidrops Fetal

Thalasemia β

Anak dengan β-thalassemia minor pada screening memperlihatkan hasil normal tapi suspect pertumbuhan dari penurunan MCV dengan atau tanpa anemia ringan. Apusan darah tepi memperlihatkan hipokromik, target sel dan terkadang basofil stipling. Hb elektroforesis memperlihatkan setelah usia 12-16 bulan selalu terdiagnisis ketika lebel Hb A2 , Hb F, atau keduanya meningkat. β -thalassemia mayor saat skrening sering memperlihatkan HbA negative.

THANKS….