Análise da quantidade de ferro na ferritina - aula prática de Química Bioinorgânica

ANÁLISE DA QUANTIDADE

DE FERRO NA FERRITINA

RELATÓRIO DO TRABALHO PRÁTICO A LICENCIATURA EM BIOQUÍMICA

CATARINA CRUZ VAZ E PATRÍCIA FERREIRA DE CASTRO, TURMA P4

Data de realização: 07 de Março de 2013

Data de entrega: 21 de Março de 2013

Análise da quantidade de ferro na ferritina Química Bioinorgânica

Relatório do trabalho prático A Licenciatura em Bioquímica

Licenciatura em Bioquímica Página 2 de 13

Faculdade de Ciências da Universidade do Porto

ÍNDICE

Resumo ......................................................................................................................................................... 3

Parte experimental ....................................................................................................................................... 3

Reagentes ................................................................................................... Erro! Marcador não definido.

Instrumentação .......................................................................................... Erro! Marcador não definido.

Alterações ao procedimento experimental fornecido ............................................................................. 4

Preparação da solução padrão de DHF .................................................................................................... 4

Resultados experimentais ............................................................................................................................ 5

Determinação do λmáx e do ε para o complexo [Fe(o-fenantrolina)3]2+

.................................................... 5

Determinação do λmáx e do ε para o complexo [Fe(ferrozina)3]4-

............................................................. 7

Cálculo da quantidade de ferro na ferritina ............................................................................................. 8

Solução de ferritina com o-fenantrolina .............................................................................................. 9

Solução de ferritina com ferrozina ..................................................................................................... 10

Discussão dos resultados e conclusões ...................................................................................................... 10

Bibliografia.................................................................................................................................................. 12





ANÁLISE DA QUANTIDADE DE FERRO NA FERRITINA

RESUMO

O objectivo deste trabalho prático foi quantificar o número de átomos de ferro presentes por molécula

de ferritina. A ferritina é uma proteína armazenadora de ferro na sua forma oxidada. Para quantificar-

mos a quantidade de ferro na ferritina primeiro tivemos que adicionar ácido sulfúrico que levou à des-

naturação da proteína e só assim o ferro armazenado consegue ser libertado dos canais formados pelas

subunidades da ferritina para o podermos quantificar. Usamos ainda um agente redutor- DHF- que re-

duz o Fe(III) a Fe (II) pois só nesta forma é possível dosear o ferro através da utilização de um agente

quelante. Ou seja, utilizamos dois quelantes diferentes (o-fenantrolina e ferrozina) para determinar a

quantidade de ferro armazenada na ferritina, pois os quelantes ligam-se ao ferro na sua forma reduzida

permitindo o seu doseamento. Utilizando dois quelantes diferentes vamos ainda poder comparar qual

dos dois actua como melhor agente quelante dependendo do que conseguir “captar” mais átomos de

ferro.

RESULTADOS OBTIDOS EXPERIMENTALMENTE

λmáx / nm ɛ / mol⁻1.dm

-3.cm

-1 Nº átomos Fe/ molécula ferritina

509 nm 12282 199

Tabela 1. Valores obtidos para a solução com o-fenantrolina

λmáx / nm ɛ / mol⁻1.dm

-3.cm

-1 Nº átomos Fe/ molécula ferritina

564 nm 36736 311

Tabela 2. Valores obtidos para a solução com ferrozina

PARTE EXPERIMENTAL

REAGENTE MARCA QUALIDADE PERIGOS Ferritina o-fenantrolina SIGMA-

ALDRICH® 99% Tóxico por ingestão.

Muito tóxico para os organismos aquáticos com efeitos duradouros.

Acetato de sódio

VWR Internatio-nal BVBA®/ Carlo ERBA Reagents®

100%

Ácido sulfúrico 97% Corrosivo. Provoca queimaduras na pele e lesões oculares graves.

DHF 99% Líquido e vapor facilmente inflamáveis. Pode libertar peróxidos explosivos

Solução padrão Fe(II)

Tabela 3- Dados relativos aos reagentes utilizados neste trabalho prático

Marca Modelo Erros e incertezas Espectrofotómetro UNICAM®

UV300

± 0,001

Balança Mettler® Toledo

AG204 ± 0,0001 g





Tabela 4 - Dados relativos à instrumentação laboratorial utilizada neste trabalho prático

ALTERAÇÕES AO PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL FORNECIDO

A única alteração verificada em comparação com o procedimento experimental fornecido foi a utilização

de uma solução padrão de Fe(II) de mol/L, em vez de uma solução de concentração

mol/L.

PREPARAÇÃO DA SOLUÇÃO PADRÃO DE DHF PREPARAÇÃO DA SOLUÇÃO AQUOSA DE DHF DE CONCENTRAÇÃO 5MMOL/L





RESULTADOS EXPERIMENTAIS

DETERMINAÇÃO DO λmá x E DO ε PARA O COMPLEXO [FE(o-FENANTROLINA)3]2+

De forma a traçar uma recta de calibração cuja expressão permitisse determinar o λmáx e o ε para solu-

ções do complexo [Fe(o-fenantrolina)3]2+

, foram preparadas 5 soluções a partir da solução padrão de

Fe(II), presente em diferentes concentrações, contendo DHF, NaCH3COO e o-fenantrolina, e ainda um

ensaio a branco, todas com um volume final de 25,00 mL. Os dados referentes às soluções preparadas

encontram-se sucintamente apresentados na tabela que se segue:

Solução VFe/mL [Fe2+

]/mol.dm-3

branco 0,00 0,00E+00

1 2,00 8,00E-06

2 3,00 1,20E-05

3 4,00 1,60E-05

4 5,00 2,00E-05

5 6,00 2,40E-05

Tabela 5 - Volume de solução padrão de Fe(II) e respectiva concen-

tração final em cada solução, em mol/dm3

A concentração de Fe(II) foi calculada atendendo à diluição efectuada, através da expressão:

[ ] [ ] ( )

Antes da medição da absorvância das diferentes soluções, era necessário determinar o comprimento de

onda no qual se verificava absorvância máxima, através do espectro de absorvância da solução mais

concentrada:

Gráfico 1 - Espectro de absorção obtido para a solução mais concentrada do complexo [Fe(o-fenantrolina)3]

2+ no intervalo de

comprimento de onda de 400 a 800 nm (zona UV-VIS), e respectivo λmáx.

λmáx = 509 nm Abs = 0,3254

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

400 450 500 550 600 650 700 750 800

Ab

sorv

ânic

a

λ/nm

ESPECTRO DE ABSORÇÃO DO COMPLEXO [FE(O-FENANTROLINA)3]2+ (400-800 NM)





Dado que o comprimento de onda de absorvância máxima é de 509 nm, a medição da absorvância das

soluções padrão do complexo [Fe(o-fenantrolina)3]2+

foi efectuada para esse valor de comprimento de

onda. A reacção espectrofotometricamente analisada foi a seguinte:

[ ( ) ] ( ) ( ) [ ( ) ]

( ) ( )

Gráfico 2 - Valores de absorvância, a um comprimento de onda de 509 nm, das soluções preparadas do complexo [Fe(o-

fenantrolina)3]2+, e respectiva recta de calibração e erro quadrático

Tendo ainda em consideração os erros de regressão linear da recta de calibração, esta está definida

como ( ) [ ] . Então, para as soluções do complexo [Fe(o-

fenantrolina)3]2+

, a equação da recta de calibração obtida foi:

[( ) ][ ]

A lei de Lambert-Beer descreve a relação estabelecida entre a absorvância e a concentração de uma

solução através da expressão , sendo ε a absortividade molar, a distância percorrida pelo

feixe de luz UV através da solução (corresponde à largura da cuvete, 1 cm) e c a concentração da solu-

ção.

Deste modo, o valor da absortividade molar corresponde ao declive da recta. Então:

Abs = 12282[Fe2+] + 0,0046 R² = 0,9688

0.000

0.050

0.100

0.150

0.200

0.250

0.300

0.350

0.00E+00 5.00E-06 1.00E-05 1.50E-05 2.00E-05 2.50E-05 3.00E-05

Ab

s(5

09

nm

)

[Fe2+]/mol.dm-3

ABS(509 NM) DAS SOLUÇÕES DO COMPLEXO [FE(O-FENANTROLINA)3]2+





DETERMINAÇÃO DO λmá x E DO ε PARA O COMPLEXO [Fe(FERROZINA)3]4-

A determinação dos valores de λmáx e ε para o complexo com ferrozina foi efectuada de forma seme-

lhante à adoptada para o complexo de o-fenantrolina.

Foram preparadas 5 soluções a partir da solução padrão de Fe(II) presente em diferentes concentrações,

e ainda um ensaio a branco, todas com um volume final de 1,5 mL. Os dados referentes às soluções

preparadas encontram-se sucintamente apresentados na tabela que se segue:

Solução VFe/μL [Fe2+

]/mol.dm-3

branco 0 0,00E+00

1 120 8,00E-06

2 180 1,20E-05

3 240 1,60E-05

4 300 2,00E-05

5 360 2,40E-05

Tabela 6 - Volume de solução padrão de Fe(II) e respectiva concen-

tração final em cada solução, em mol/dm3

Tal como para as soluções do complexo com o-fenantrolina, a concentração de ferro em cada solução

foi calculada através da expressão seguinte:

[ ] [ ] ( )

Inicialmente, foi determinado o comprimento de onda de absorvância máxima, a partir do espectro

obtido:

Gráfico 3 - Espectro de absorção obtido para a solução mais concentrada do complexo [Fe(ferrozina)3]

4- no intervalo de compri-

mento de onda de 400 a 800 nm (zona ultravioleta-visível do espectro electromagnético), e respectivo λmáx.

λmáx= 564 nm Abs= 0,8304

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

400 450 500 550 600 650 700 750 800

Ab

sorv

ânci

a

λ/nm

ESPECTRO DE ABSORÇÃO DO COMPLEXO [FE(FERROZINA)3]4- (400-800 NM)





Dado que o comprimento de onda de absorvância máxima é de 564 nm, a medição da absorvância das

soluções padrão do complexo [Fe(ferrozina)3]4-

foi efectuada para esse valor de comprimento de onda. A

reacção espectrofotometricamente analisada foi a seguinte:

[ ( ) ] ( ) ( ) [ ( ) ]

( ) ( )

Tendo ainda em consideração os erros de regressão linear da recta de calibração, esta está definida

como ( ) [ ] . Então, para as soluções do complexo

[Fe(ferrozina)3]4-

, a equação da recta de calibração obtida foi:

[( ) ][ ]

Deste modo, o valor da absortividade molar corresponde ao declive da recta. Então:

CÁLCULO DA QUANTIDADE DE FERRO NA FERRITINA

A quantidade de ferro na ferritina foi determinada em quatro soluções preparadas a partir de solução

stock de ferritina 0,5 mg/mL, sendo que duas delas continham o-fenantrolina e as duas restantes conti-

nham ferrozina, a concentrações idênticas duas a duas. Para cada conjunto, foi também preparado um

ensaio a branco.

Foram medidas as absorvâncias para todas as soluções, sendo os resultados desta medição sucintamen-

te apresentados na seguinte tabela:

Solução Abs (564 nm)

branco 0,000

1 0,455

2 0,472

média 0,464

Tabela 5 - Valores de absorvância obtidos para as soluções de ferritina preparadas com o-fenantrolina

Abs = 36736[Fe2+] + 0,0109 R² = 0,9943

0.000

0.100

0.200

0.300

0.400

0.500

0.600

0.700

0.800

0.900

1.000

0.00E+00 5.00E-06 1.00E-05 1.50E-05 2.00E-05 2.50E-05 3.00E-05

Ab

s(5

09

nm

)

[Fe2+]/mol.dm-3

ABS(564 NM) DAS SOLUÇÕES DO COMPLEXO [FE(FERROZINA)3]4-





Solução Abs (509 nm)

branco 0,000

1 0,106

2 0,101

média 0,104

Tabela 6 - Valores de absorvância obtidos para as soluções de ferritina preparadas com ferrozina

Como proceder ao cálculo da quantidade de ferro presente na ferritina analisada?

Admitindo que todo o Fe(III) presente no mineral core da ferritina foi reduzido e complexou com a fer-

rozina ou com a o-fenantrolina, então:

[ ] ( ) ( )

A concentração de Fe(II) que complexa pode ser determinada através da recta de calibração correspon-

dente à solução do complexo a que se refere o cálculo, anteriormente construída.

A massa do mineral core permite-nos determinar a quantidade de ferro aí presente. Logo:

( )

O mineral core tem uma massa de 97,7 gramas por cada mole de Fe (III) aí presente, pelo que este se

considera um valor de massa molar.

A massa de apoferritina pode ser determinada pela diferença entre a massa total de ferritina e a massa

do mineral core. A massa de ferritina é calculada da seguinte forma:

[ ]

Assim, o quociente entre a quantidade de Fe(III) e a quantidade de apoferritina permite-nos saber a

quantidade de ferro por molécula de ferritina:

( )

SOLUÇÃO DE FERRITINA COM o-FENANTROLINA

Pela recta de calibração [ ] , sendo a média das absorvâncias medidas

. Então, [ ] .

[ ] ( ) ( )

( )

( )

( ) ( )





( )

SOLUÇÃO DE FERRITINA COM FERROZINA

Pela recta de calibração, [ ] , sendo a média das absorvâncias medidas

. Então, [ ] .

[ ] ( ) ( )

( )

( )

( ) ( )

( )

O cálculo do número de átomos de ferro por molécula de ferritina pode também ser efectuado com base

na seguinte expressão geral:

[

]

[( [ ]) ( )]





DISCUSSÃO DOS RESULTADOS E CONCLUSÕES

A determinação do espectro de absorção na zona de comprimento de onda do UV-VIS permitiu deter-

minar o comprimento de onda máximo para os complexos de ferrozina e o-fenantrolina, aos quais foi

medida a absorvância para as soluções preparadas do complexo correspondente.

O comprimento de onda máximo obtido no espectro de absorção do complexo [Fe(o-fenantrolina)3]2+

foi de 509 nm, muito próximo do valor de [1]

510 nm fornecido. O mesmo acontece com o espectro do

complexo [Fe(ferrozina)3]4-

, para o qual obtivemos um comprimento de onda de absorção máxima de

564 nm, sendo que o valor encontrado na literatura foi de [2]

562 nm.

O valor fornecido de absortividade molar para o complexo [Fe(o-fenantrolina)3]2+

foi de [1]

11 100 mol-

1dm

3cm

-1, que se afasta um pouco do valor obtido, 12 282 mol

-1dm

3cm

-1. Já para o complexo

[Fe(ferrozina)3]4-

, o afastamento do valor obtido (36 736 mol-1

dm3cm

-1) em relação ao valor presente na

literatura ([2]

27 900 mol-1

dm3cm

-1) é ainda mais acentuado, e, de facto, o erro padrão associado a estes

valores, apresentados anteriormente, é um pouco elevado se tivermos em consideração a ordem de

grandeza dos valores de absortividade molar (correspondentes ao declive das rectas de calibração) e os

erros padrão associados a estes. Esta elevada incerteza pode dever-se a eventuais erros experimentais,

como erros do espectrofotómetro, ou erros ocorridos durante a preparação das soluções analisadas.

Ao preparar as diferentes soluções usando a o-fenantrolina e a ferrozina como agentes complexantes

ocorreu o aparecimento de diferentes cores, sendo que as soluções com o-fenantrolina tinham uma cor

alaranjada e as soluções com ferrozina apresentavam uma cor roxa. Tendo em conta o tipo de ligando

de cada complexo, seria de esperar que nenhuma das soluções apresentasse cor, pois são ambos ligan-

dos de campo forte, ou seja de spin baixo, e como o átomo de Fe2+

tem uma configuração electrónica

[Ar] d6 todos os electrões se encontram emparelhados no estado de menor energia pois Δo é maior que

a energia de emparelhamento. Sabemos que os ligandos são de campo forte pois são aceitadores π

devido à sua estrutura com ligações duplas e deslocalizações electrónicas (o facto de possuir orbitais

vazias significa que são capazes de captar electrões), então o metal Fe2+

terá uma configuração octaé-

drica estável de spin baixo, como já referido. A imagem seguidamente apresentada permite verificar

que não existem transferências electrónicas d-d permitidas por spin, pois todos os electrões se encon-

tram emparelhados no estado de menor energia.

Imagem 1. Configuração electrónica do Fe2+ no estado de spin baixo.

Observando os valores de absortividade molar obtidos para cada complexo verificam-se valores bastan-

te elevados (superiores a 1 000 mol-1

dm3cm

-1 ) o que indica que ocorreu uma transferência de carga

permitida por simetria. Observa-se, em ambos os espectros de absorção, apenas uma banda a compri-

mentos de onda mais baixo, a uma energia superior, o que indica, de facto, o que já constatamos acerca

da transferência de carga. Não aparecem mais bandas o que também nos indica que não ocorre ne-

nhuma transição d-d permitida por spin, tal como era esperado.

A cor das soluções com os complexos de o-fenantrolina e ferrozina em cima mencionados ocorrem por-

tanto devido à transferência de carga referida, visto que nenhuma transição d-d é permitida pelo que a

cor das soluções deveria ser incolor mas tal não acontece como verificamos experimentalmente.





O facto de termos obtido um número tão baixo em relação ao esperado para o número de átomos de

ferro por molécula de ferritina pode advir de alguns pressupostos que seguimos para efectuar os cálcu-

los, que foram os seguintes:

A quantidade de ácido sulfúrico utilizada foi suficiente para desnaturar completamente a prote-

ína e assim, pressupomos que todo o Fe(III) presente na ferritina foi libertado.

A quantidade de DHF (agente redutor) utilizada foi suficiente para reduzir todo o Fe(III) a Fe(II),

e assim todo o ferro pôde ser captado pelos agentes quelantes para posterior quantificação.

Além de estes pressupostos poderem não ser totalmente verdadeiros, o afastamento dos valores de

absortividade molar para ambos os complexos em relação à literatura terá sido o factor que mais influ-

enciou a ocorrência desta discrepância em relação ao número de átomos de ferro por molécula de ferri-

tina que seria de esperar. Este valor, dado que é directamente retirado da recta de calibração construída

para cada complexo por medição da absorvância das soluções padrão correspondentes, afecta também

directamente o cálculo da concentração de ferro na ferritina e, portanto, o cálculo final da quantidade

de ferro presente nesta proteína.

Para além destes factores, o coeficiente de correlação linear (R2) da recta de calibração efectuada a

partir das soluções padrão de o-fenantrolina (R² = 0,9688) afasta-se um pouco mais da unidade do que o

que seria de esperar para uma regressão linear de boa qualidade, podendo dar origem a uma propaga-

ção de erros considerável.

Os valores obtidos para o número de átomos de ferro por molécula de ferritina foram, respectivamente,

199 e 311, para as soluções em que o agente quelante foi a o-fenantrolina e a ferrozina. Cada molécula

de ferritina tem a capacidade de se ligar, através do seu mineral core, a um número máximo de [2]

4500

átomos de ferro. Então, tendo em conta os resultados obtidos, a taxa de saturação da ferritina obtida

para a solução com o-fenantrolina como agente quelante foi de 4,42%, e para a solução com ferrozina

como agente quelante foi de 6,91%, o que, em princípio, revela uma saturação muito baixa da ferritina

da solução stock.

Em conclusão, os resultados obtidos mostraram a ferrozina como um melhor agente quelante do Fe(II),

apesar da baixa taxa de saturação obtida, pois complexou com um maior número de átomos de ferro, e

assim levou a uma quantificação mais eficaz do número de átomos de ferro na ferritina do que usando o

agente quelante o-fenantrolina.

BIBLIOGRAFIA

FICHAS MSDS

Sigma-Aldrich® - ficha de dados de segurança da 1,10-fenantrolina (99+)%, de acordo com a

Regulamento (CE) No. 1907/2006.

Versão 4.0 - Data de revisão 12.03.2010; disponível no endereço:

http://sites.ffclrp.usp.br/cipa/fispq/1,10-Fenantrolina.pdf

Sigma-Aldrich® - ficha de dados de segurança do ácido sulfúrico (ref. 339741), de acordo com a

Regulamento (CE) No. 1907/2006

Versão 4.0 Data de revisão 14.03.2010; disponível no endereço:

http://sites.ffclrp.usp.br/cipa/fispq/Acido%20sulfurico.pdf

Sigma-Aldrich® - ficha de dados de segurança do 2,3-DHF 99% (ref. 200018), de acordo com a

Regulamento (CE) No. 1907/2006

http://sites.ffclrp.usp.br/cipa/fispq/1,10-Fenantrolina.pdf






Versão 5.0 Data de revisão 30.12.2011; disponível no endereço:


[1] Química Bioinorgânica - Trabalhos Práticos, Departamento de Química, Faculdade de Ciências da Uni-

versidade do Porto (2012/13); “Trabalho prático A – Análise da quantidade de ferro na ferritina”

[2] M. J. Donlin, R. F. Frey, C. Putnam, J.K. Proctor, J.K. Bashkin, J. Chem. Ed., 1998, 75, 437-441


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