Análise do perfil de expressão gênica da resposta imuno ...bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes/premio2012/doutorado/Luana... · inflamatória na infecção por Mycobacterium bovis

INSTITUTO OSWALDO CRUZ Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular

Luana Tatiana Albuquerque Guerreiro

Análise do perfil de expressão gênica da resposta imuno-inflamatória na infecção por Mycobacterium bovis BCG

e Mycobacterium leprae

Rio de Janeiro Maio 2012

II



Análise do perfil de expressão gênica da resposta imuno-inflamatória na infecção por Mycobacterium bovis BCG

e Mycobacterium leprae

Tese apresentada ao Instituto Oswaldo Cruz como parte

dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Biologia Celular e Molecular.

Orientador: Dr. Milton Ozório Moraes

Rio de Janeiro Maio 2012

III



Análise do perfil de expressão gênica da resposta imuno-inflamatória na infecção por Mycobacterium bovis BCG e Mycobacterium leprae

ORIENTADOR: Dr. Dr. Milton Ozório Moraes Aprovada em: ___03__/__05___/__2012___ EXAMINADORES: Prof. Dra. Cristina Maria Vidal Pessolani - Presidente Prof. Dr. Patrícia Torres Bozza Prof. Dr. Jose Roberto Lapa e Silva SUPLENTES: Prof. Dra. Leila de Mendonça Lima Prof. Dra. Danuza de Almeida Esquenazi

Rio de Janeiro, 03 de Maio de 2012

IV

Aos meus pais, alicerces da minha vida, por todo apoio e dedicação.

V

AGRADECIMENTOS Em primeiro lugar a Deus por sua presença constante em minha vida e pelas oportunidades que tive até hoje. Ao Dr. Milton Moraes, além de um querido orientador, se tornou um amigo, me incentivando sempre, mas também puxando a minha orelha em todos os momentos necessários. A meus pais, Itamar e Regina, por todo embasamento que me deram para chegar aonde cheguei e por estarem sempre ao meu lado. Ao meu marido Leonardo, pelo seu amor e por ter sempre se mostrado orgulhoso pelo meu trabalho, mesmo sem saber ao certo o que faço até hoje. A meu irmão Cláudio e minha cunhada Carolina que ficaram sempre na torcida, e estão esperando ansiosos eu defender a tese para voltarmos a fazer os nossos passeios dos finais de semana. Aos meus colegas de laboratório, Anna “Xuxu” Beatriz e Alexandre Almeida (além de tudo, pela ajuda nos experimentos de microarranjo), Carlos Diego, Carolinne Marques e Suelen (grandes parceiras de congressos), Caroline Xavier e Lucia Elena (que estão dividindo comigo esse momento de aflição pré-defesa), Cintia, Ohanna, Paula, Sandro, Tiana e Valcemir, pela ajuda e companheirismo, além de tornarem o nosso laboratório um ótimo ambiente de trabalho. Ao Thiago em especial, meu ex-aluno de iniciação, hoje aluno de mestrado, cuja ajuda foi essencial para o bom andamento da tese, e pela cumplicidade no sucesso e derrota dos experimentos que dividimos até hoje. Aos que seguiram outro rumo, mas tive o prazer de conviver no laboratório, Alejandra, Alexandre Freire, Alice, Cláudia, Cynthia, Diogo, Flávia, Guilherme, Karina, Matilde, Patrícia e Viviane. Saudades de vocês! Ao Dr. Marcelo Ribeiro-Alves, por estar sempre disposto ajudar e tirar dúvidas, e principalmente pelas análises dos dados da minha tese. À Dra. Cristina Pessolani e aos colegas da “sala 27”, que sempre me receberam muito bem e me ajudaram no que eu precisei para realização dos meus experimentos. Em particular

VI

agradeço a Dra. Luciana Rodrigues pela ajuda nos trabalhos com fagocitose e ao André pela ajuda com os experimentos de ELISA. À Dra. Euzenir Sarno e ao pessoal da “sala 6/21”, por todos os empréstimos de pipetas, reagentes etc....que precisei fazer durante a minha tese. À Dra. Leila Mendonça pela criteriosa revisão da tese, além das sugestões que ajudaram a aperfeiçoar o texto para o melhor entendimento e finalização da mesma. A todos do Pavilhão de Hanseníase, que embora não nomeados, me proporcionaram um agradável convívio. A minha amiga Priscila, ex-colega de faculdade e de mestrado, que mesmo de longe, sempre esteve na torcida pelo sucesso da minha tese. Às agências de fomento CNPq, IOC, FAPERJ pelo suporte financeiro que possibilitaram o andamento e finalização da tese.

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“Evolução é ter sempre em mente que não nos pertencemos, mas sim à humanidade. E é em

nome dela que nos aperfeiçoamos.”

Itamar Guerreiro

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INSTITUTO OSWALDO CRUZ

Análise do perfil de expressão gênica da resposta imuno-inflamatória na infecção por Mycobacterium bovis BCG e Mycobacterium leprae

RESUMO

Luana Tatiana Albuquerque Guerreiro A cepa vacinal Mycobacterium bovis BCG confere proteção parcial ao desenvolvimento da tuberculose e hanseníase, doenças infecciosas causadas pelas micobactérias intracelulares Mycobacterium tuberculosis e Mycobacterium leprae, respectivamente. Esse efeito protetor pode variar entre 0 e 80% em diferentes populações, sendo as diferenças genômicas entre cepas de BCG e a variabilidade genética do hospedeiro dois dos principais fatores que levam a diferenças na eficácia protetora da vacina. No Brasil, a cepa utilizada na vacinação é a BCG Moreau, considerada uma das mais antigas em relação às outras cepas, e uma das mais imunogênicas. Entretanto, a cepa brasileira é pouco utilizada em outros países e, portanto, ainda é difícil atribuir uma maior importância às diferenças da genética desta cepa na eficácia vacinal. Neste contexto, diferenças no perfil de expressão gênica de células THP-1 induzidas pelas cepas de BCG (Danish, Moreau e Pasteur), em comparação com M. leprae, avaliadas por qRT-PCR e microarranjos poderiam revelar novas vias que indiquem proteção às infecções micobacterianas. Para tal, células THP-1 foram infectadas com micobactérias por até 48h, com diferentes concentrações de bacilo (MOI 2:1 e 10:1), sendo avaliados o índice de fagocitose, expressão de mRNA e secreção de citocinas. Foi determinado o tempo de 24h de infecção como o mais adequado, com taxas de fagocitose em torno de 80%, e observado que a infecção pelas cepas de BCG parece não acarretar diferenças no perfil de expressão gênica de células THP-1. Entretanto, a infecção por M. leprae leva a repressão de vários genes, incluindo CCL2, CCL3, CCL4, IL-1 e SOD2. Estes genes também foram pouco induzidos em amostras de validação de biopsias de nervo de pacientes com a forma neural pura da hanseníase quando comparados à pacientes não hansenianos. Experimentos de microarranjo de DNA demonstraram que a expressão de outros genes também foi reprimida pela infecção com M. leprae, quando comparada ao BCG Moreau, como: LGALS1, GPI e RNEP. Com a ausência de diferenças no perfil de secreção de citocinas em THP-1 infectadas pelas diferentes cepas de BCG, utilizou-se PBMC para avaliar a influência da variabilidade do hospedeiro. Com isso, foi identificado um aumento na secreção de TNF apenas na infecção com BCG Moreau, indicando uma resposta diferencial do hospedeiro à cepa brasileira. Ainda, a influência de polimorfismos em TNF, IL-10 e TLR1 na produção de TNF, IL-10 e no log(TNF/IL-10) foi investigada e observada a influência do SNP TLR1 743G com uma diminuição significativa no log(TNF/IL-10) apenas na infecção por BCG Moreau, sugerindo um padrão de ativação da resposta imune dependente do genótipo do hospedeiro. A diminuição da expressão de vários genes relacionados à resposta imune após infecção por M. leprae sugere um possível efeito supressor desta micobactéria em macrófagos in vitro que pode estar associado a regulação negativa da resposta imune e, consequentemente, ao sucesso da infecção. Já que a interação patógeno-hospedeiro é complexa e a emergência da resposta imune protetora é dependente de genótipos de ambos, essas características devem ser levadas em consideração no desenvolvimento de melhores vacinas.

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INSTITUTO OSWALDO CRUZ

Gene expression profile analysis of immune-inflammatory response during Mycobacterium bovis BCG and Mycobacterium leprae infection

ABSTRACT


The bacterial vaccine strain Mycobacterium bovis BCG confers partial protection to the development of tuberculosis (TB) and leprosy, which are infectious diseases, caused by intracellular micobactéria, Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium leprae, respectively. This protective effect ranged from 0 to 80% in different populations conducted in several countries, in which the genomic differences between BCG strains and host genetic variability are two of main factors leading to variability in vaccine protective efficacy. In Brazil, the strain used is BCG Moreau that is considered an old strain when compared to other strains and it is also considered one of the most immunogenic strains currently in use. The Brazilian strain, however, is rarely used in other countries and therefore, it is still difficult to assign a greater importance to the genetics of this strain in vaccine efficacy. In this context, differences in the gene expression profile of THP-1 cells induced by BCG strains (Danish, Moreau e Pasteur) in comparison to M. leprae could unravel novel pathways suggesting protection. To do so, THP-1 cells were infected with mycobacteria for up to 48 hours, using different bacilli concentration (MOI 2:1 and 10:1) and evaluated phagocytosis rate, mRNA expression and cytokine secretion. It was determined that twenty-four hours of infection was considered suitable, with phagocytosis rates of approximately 80%, and observed that infection by BCG strains did not seem to lead to differences in THP-1 immune response profile. However, M. leprae infection leads to repression of several genes, including CCL2, CCL3, CCL4, IL-1 and SOD2. The same genes were also less induced in a validation sample using nerve biopsies of pure neural leprosy patients when compared to non-leprosy cases. DNA microarray experiments were conducted and others genes such as LGALS1, GPI and RNEP were also found to be repressed by M. leprae infection. Due to the lack of differences in cytokine secretion profile in THP-1 infected with BCG strains, PBMC was used to assess the influence of host variability. It was identified an increase in TNF secretion induced solely by the infection with BCG Moreau was identified, indicating a differential response of the host to the Brazilian strain. Furthermore, the influence of TNF, IL-10 and TLR1 gene polymorphisms in production of TNF, IL-10 and log(TNF/IL-10) was investigated. SNP TLR1 743G was associated with a significant decrease in log(TNF/IL-10) in BCG Moreau infection only, suggesting an activation pattern of the immune response that is also dependent on the genotype of the host. The repression of several genes expression related to immune response following infection with M. leprae suggest a possible suppressive effect of these mycobacteria in macrophages in vitro, that may be associated with negative regulation of the immune response and therefore, with the success of the infection. Since, the host-pathogen interaction is complex and the emergence of protective immune response is dependent on the genotypes of both, these features should be taken into consideration for the development of better vaccines.

X

Lista de abreviaturas, siglas e símbolos

°C Graus Celsius 3’UTR Região 3´ não traduzida de um gene 5’UTR Região 5’ não traduzida de um gene. ADC albumina bovina, dextrose, catalase Ag 85B Antígeno 85B AIDS Síndrome da imunodeficiência adquirida ANOVA Análise de variância aRNA Ácido ribonucleico amplificado ASA Ambulatório Souza Araújo ATCC American type culture collection ATP Adenosina trifosfato aRNA Ácido ribonucleico amplificado BAAR Bacilo álcool-ácido resistente. Bad Bcl-2 antagonist of cell death Bak Bcl-2 homologous antagonist/killer Bax Bcl-2-associated X protein BCG Bacilo de Calmette e Guérin BCL2 B-cell CLL/lymphoma 2 BB Borderline-bordeline BL Borderline-lepromatosa BLAST Basic local alignment search tool BSA Bovine serum albumin BT Borderline-tuberculóide C Complemento C21orf126 Chromosome 21 open reading frame 126 CACNA2D3 Calcium channel, voltage-dependent, alpha 2/delta subunit 3 CAMP Catelicidina cDNA Ácido nucleico complementar CEP Comitê de ética em pesquisa CCL Chemokine ligands CD Cluster of differentiation CFP-10 Culture filtrate protein 10 CO2 Deoxido de carbono Cp Ponto característico (crossing point) Cq Ciclo de quantificação CYP Citocromo P450

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DATASUS Departamento de Informatica do SUS dATP Desoxi-adenosina trifosfatado DAVID Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery DC-SiGN Receptor de células dendríticas dCTP Desoxi-citosina trifosfatado DEPC Dietilpirocarbonato DEFB4A Defensina beta 4A dGTP Desoxi-guanina trifosfatado DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DNA Ácido Desoxirribonucléico dNTP Desoxirribonucleotídeos trifosfatados D.O. Densidade óptica DOL Degree of labelling DTT Ditiotreitol DU Duplicação EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético EHW Equilibrio de Hardy & Weinberg ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assays ENH Eritema nodoso hansênico ESAT-6 Early secretory antigenic 6-kDa et al E outros EUA Estados Unidos da América FC Fold change g força-G G Green GAD2 Glutamate decarboxylase 2 GAPDH Desidrogenase glyceraldeído 3-fosfato G-CSF Fator estimulador de colônia de granulócitos GM-CSF Fator estimulador de colônia de granulócitos e macrófagos GPI Glucose-6-phosphate isomerase h Horas HCl Ácido clorídrico HIV Vírus da imunodeficiência humana HPRT1 Hipoxantina fosforibosiltransferase 1 IDO Indoleamine 2,3-dioxygenase IFN-g Interferon-gama IgM Imunoglobulina M IL Interleucina

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IMF Intensidade média de fluorescência IS6110 IS-like element IL-1b Interleucina 1 beta KCl Cloreto de potássio LDLR Receptor de proteína de baixa intensidade LGALS1 Lectin, galactoside-binding, soluble-1 LL Lepromatosa LPL Lipoprotein lipase LRRK2 Leucine-rich repeat kinase 2 LTA Linfotoxina alfa LTA4H Leucotrieno A4 hidrolase LTB4 Leucotrieno B4 LXA4 Lipoxina A4 M Molar M. Mycobacterium M. tb. Mycobacterium tuberculosis MB Mega pares de base MB Multibacilar MDR Multi-droga resistente MDM Macrófagos derivados de monócitos de sangue periférico MESP2 Mesoderm posterior protein 2 mg Micrograma MG Miligrama MIF Macrophage migration inhibitory factor Mirna microRNA mL Mililitro µM Micromolar mM Milimolar MOI Multiplicidade de infecção MOPS Ácido 3-(N-morfolino) propanesulfonico MRC Receptor de manose mRNA Acido ribonucléico mensageiro Mt_ATP6 Mitochondrially encoded ATPsintetase subunit 6 Mt_COX2 Mitochondrially cytochrome c oxidase subunit 2 Mt_CYTb Mitochondrially encoded cytochrome b Mt_ND1 Mitochondrially encoded NADH dehydrogenase subunit 1 Mt_ND2 Mitochondrially encoded NADH dehydrogenase subunit 2 Mt_ND3 Mitochondrially encoded NADH dehydrogenase subunit 3

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Mt_ND4L Mitochondrially encoded NADH dehydrogenase subunit 4L Mt_ND5 Mitochondrially encoded NADH dehydrogenase subunit 5 mRNA Ácido ribonucléico mensageiro NaCl Cloreto de sódio NAD Dinucleótido de nicotinamida e adenina NCBI National Center for Biotechnology Information NF-kB Fator nuclear kappa B ng Nanograma NK Natural killer NL Paciente não hanseniano nM Nanomolar nm Nanômetros NOD Nucleotide-binding oligomerization domain NOX3 NADPH oxidase 3 O-2 Superóxido OASL Oligoadenylate synthetase-like OligoDT Oligonucleotídeo iniciador de timidinas OMS Organização Mundial da Saúde ORF Janela aberta de leitura (open reading frame) oxLDL Proteína de baixa densidade oxidada PACRG Parkin co-regulated gene PAMP Pathogen-Associated Molecular Pattern PAS p-aminossalicílico ácido PARK Gene que codifica a proteína parkina. PB Paucibacilar PBMC Peripheral Blood Mononuclear Cells PBS Tampão Salina Fosfato PCR Reação em cadeia da polimerase pg Picograma PGL-1 glicolipídeo fenólico I PGN Peptideoglicano PH Potencial hidrogeniônico PINK1 PTEN induced putative kinase 1 PMA Acetato de forbol-miristila PNL Forma neural pura PPARg Peroxisome proliferator-activated receptor gamma PPD Derivado de proteína purificada PQT Poliquimioterapia

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PRR Pattern recognition receptor qRT-PCR RT-PCR em tempo real R Red RD Região de diferença RLEP M. leprae-specific repetitive element RPL13a Proteína Ribossomal 60S L13a RPS13 Proteína Ribossomal 40S S13 RNA Ácido ribonucléico RNPEP Arginyl aminopeptidase (aminopeptidase B) ROS Espécies reativas de oxigênio RPM Rotações por minuto RPMI Royal Park Memorial Institute RR Reação reversa rRNA Ácido ribonucleíco ribossomal RT Transcrição reversa SECII Secretogranina 2 SET1DB Histona-lisina metiltransferase SDS Dodecil sulfato de sódio SFB Soro fetal bovino SNP Polimorfismo de base única (Single Nucleotide Polymorphism) SOD Superoxide dismutase 2 sRNA Small RNA SSC Solução salina de citrato TB Tuberculose TE Tampão Tris EDTA TCEAL5 Transcription elongation factor A protein-like 5 TGFb Fator de Crescimento Tumoral Beta Th Linfócitos T auxiliares (T helper) TLR Receptores do tipo Toll (Toll-like receptors) TME101 Transmembrane protein 101 TNF Fator de necrose tumoral TNFSF15 Tumor necrosis factor (ligand) superfamily member 15 TNFR Receptor de fator de necrose tumoral Treg Células T reguladoras tRNA RNA transportador TT Tuberculóide U Unidade UK Reino Unido

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URE-B1 E3-Ubiquitina ligase UCSC University of California Santa Cruz V Volts VDR Receptor de vitamina D VNTR Variable-number tandem repeats v/v Volume por volume WHO World Health Organization ZDHHC22 Zinc finger, DHHC-type containing 22 ZNF79 Proteína de dedo de zinco 79 ZNRF1 ZNRF1 zinc and ring finger 1

XVI

Lista de Figuras Figura 1.1. Cepas vacinais de BCG utilizadas em todo o mundo entre 2003 e 2007....................................3 Figura 1.2. Mapa apresentando a política de vacinação adotada em diferentes países.................................7 Figura 1.3. Genealogia das cepas de BCG...................................................................................................11 Figura 1.4. Genes e vias mais importantes identificados em estudos genéticos de associação à hanseníase.................................................................................................................................................19 Figura 1.5. Taxas de prevalência de hanseníase no mundo.........................................................................21 Figura 1.6. Taxas de incidência de hanseníase no mundo...........................................................................23 Figura 1.7. Formas clínicas da hanseníase...................................................................................................25 Figura 1.8. Taxas de incidência de tuberculose no mundo..........................................................................33 Figura 4.1. Desenho experimental do estudo...............................................................................................45 Figura 4.2. Desenho experimental de microarranjos de DNA.....................................................................58 Figura 5.1. Avaliação da taxa de fagocitose de BCG Moreau marcado com PKH2 por células THP-1 em 1, 4, 24 ou 48 horas....................................................................................................................68 Figura 5.2. Citometria de fluxo para avaliar a taxa de fagocitose das cepas de BCG Danish, Moreau e Pasteur, e M. leprae marcados com PKH2 pelas células THP-1 após 24 horas..........................68 Figura 5.3. Valores normalizados de expressão gênica por multiplex PCR em tempo real, de células THP-1 controle e infectadas com as cepas de BCG Danish, Moreau e Pasteur, em MOI 2...........73 Figura 5.4. Níveis de CCL2, IL-1, TNF e IL-8 (pg/ml) em sobrenadante de células THP-1 controle e infectadas com as cepas de BCG Danish, Moreau e Pasteur......................................................74 Figura 5.5. Valores normalizados de expressão gênica de células THP-1 controle e infectadas com BCG Moreau e M. leprae em MOI 2:1................................................................................................75 Figura 5.6. Níveis de CCL2, IL-1 , TNF e IL-8 (pg/ml) em sobrenadante de células THP-1 controle e infectadas com BCG Moreau e M. leprae (MOI 2:1).................................................................78 Figura 5.7. Valores normalizados de expressão gênica de células THP-1 controle e infectadas com as cepas de BCG Danish, Moreau e Pasteur, em MOI 10:1................................................................79 Figura 5.8. Níveis de CCL2, TNF e IL-8 (pg/ml) em sobrenadante de células THP-1 controle e infectadas com as cepas de BCG Danish, Moreau e Pasteur (MOI 10:1)...................................................82 Figura 5.9. Valores normalizados de expressão gênica de células THP-1 controle e infectadas com BCG Moreau e M. leprae, em MOI 10:1.............................................................................................83 Figura 5.10. Níveis de CCL2, IL-8 e TNF (pg/ml) em sobrenadante de células THP-1 controle e infectadas com as cepas de BCG Moreau e M. leprae (MOI 10:1)..........................................................85 Figura 5.11. Níveis de IL-8, TNF e IL-10 (pg/ml) em sobrenadante de células PBMC infectadas com BCG Danish, Moreau e Pasteur, em MOI 10:1...................................................................................87 Figura 5.12. Avaliação do logaritmo da razão TNF/IL-10 em PBMC controle e infectadas com as cepas de BCG Danish, Moreau e Pasteur................................................................................................88

XVII

Figura 5.13. Investigação da influência do polimorfismo genético TNF -308 G>A nos níveis de secreção de (A) TNF, (B) IL-10 e (C) log(TNF/IL10)...........................................................................89 Figura 5.14. Investigação da influência do polimorfismo genético IL10 -819 C>T nos níveis de secreção de (A) IL-10, (B) TNF e (C) log(TNF/IL-10)..........................................................................90 Figura 5.15. Investigação da influência do polimorfismo genético TLR1 743 A>G nos níveis de secreção de (A) IL-10, (B) TNF e (C) log(TNF/IL-10)..........................................................................91 Figura 5.16. Valores normalizados de expressão gênica de biopsias de nervo de pacientes hansenianos (L) e não hansenianos (NL).....................................................................................................95

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Lista de Tabelas Tabela 1.1. Comparação das características do genoma das cepas de BCG Pasteur, Japan, Moreau, Danish, Russia e Tice......................................................................................................................9 Tabela 1.2. Comparação das características do genoma de M. bovis, M. tuberculosis e M. leprae......................................................................................................................................................18 Tabela 4.1. Condições das reações de PCR em tempo real para amplificação de regiões polimórficas dos genes IL-10 -819 C>T, TNF -308 G>A e TLR1 743 A>G.............................................63 Tabela 4.2. Sequências dos oligonucleotídeos-iniciadores e sondas empregadas para tipificação dos SNPs nos genes IL-10 -819 C>T, TNF -308 G>A e TLR1 743 A>G pela técnica de PCR tempo real....................................................................................................................................................64 Tabela 5.1. Genes diferencialmente expressos (p-valor 0,005) entre células THP-1

em três condições.......................................................................................................................................92

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Sumário Resumo..........................................................................................................................................................VIII Abstract............................................................................................................................................................IX Lista de abreviaturas, siglas e símbolos............................................................................................................X Lista de figuras..............................................................................................................................................XVI Lista de tabelas...........................................................................................................................................XVIII Sumário.........................................................................................................................................................XIX 1. INTRODUÇÃO.............................................................................................................................................1 1.1. Mycobacterium bovis BCG.............................................................................................................2 1.1.1. Histórico....................................................................................................................................2 1.1.2. Eficácia da vacina BCG......................................................................................................................4 1.1.3. Genoma do BCG.................................................................................................................................7 1.1.4. Diferenças entre as cepas de BCG......................................................................................................9 1.1.5. Relação BCG-hospedeiro..................................................................................................................11 1.1.6. Novas estratégias vacinais para a proteção contra TB e hanseníase.................................................13 1.2. Micobactérias patogênicas: agentes etiológicos da hanseníase e tuberculose..........................................14 1.2.1. Mycobacterium leprae.......................................................................................................................15 1.2.2. Mycobacterium tuberculosis.............................................................................................................17 1.2.3. Interação das micobactérias patogênicas com o hospedeiro.............................................................18 1.3. Principais micobacterioses em humanos...................................................................................................20 1.3.1. Hanseníase........................................................................................................................................20 1.3.2. Resposta imune em hanseníase.........................................................................................................27 1.3.3. Genes e imunidade em hanseníase....................................................................................................31 1.4. Tuberculose...............................................................................................................................................33 1.5. Expressão gênica global em infecções micobacterianas...........................................................................36 1.6. Células THP-1...........................................................................................................................................38 2. JUSTIFICATIVA.........................................................................................................................................40 3. OBJETIVOS.................................................................................................................................................42 3.1. Objetivo geral............................................................................................................................................43 3.2. Objetivos específicos.................................................................................................................................43 4. MATERIAIS E MÉTODOS........................................................................................................................44 4.1. Desenho de estudo.....................................................................................................................................45 4.2. Cultivo de micobactérias...........................................................................................................................46 4.2.1. BCG........................................................................................................................................................46 4.2.2. Mycobacterium leprae............................................................................................................................46 4.2.3. Pureza e viabilidade das culturas de micobactérias................................................................................47

XX

4.3. Cultivo de células e infecção.................................................................................................................48 4.3.1. Células THP-1.......................................................................................................................................48 4.3.2. Células Mononucleares de Sangue Periférico (PBMC) humanas.........................................................48 4.4. Biopsias de nervos humanos....................................................................................................................49 4.5. Extração de Ácidos Nucléicos..................................................................................................................50 4.5.1. Extração de RNA de células THP-1...................................................................................................50 4.5.2. Extração de DNA das amostras de sangue total.................................................................................51 4.5.3. Extração de RNA e DNA de biopsias de nervos humanos................................................................52 4.6. Ensaios de associação de micobactérias com células THP-1...................................................................52 4.6.1. Marcação das micobactérias..................................................................................................................52 4.6.2. Avaliação da associação de micobactérias com células THP-1............................................................53 4.7. PCR em tempo real..................................................................................................................................53 4.7.1. Síntese de cDNA................................................................................................................................53 4.7.2. Reação de RT-PCR em Tempo Real (qRT-PCR)..............................................................................54 4.7.3. Análise dos dados de qRT-PCR.........................................................................................................55 4.8. Multiplex PCR em Tempo Real...............................................................................................................56 4.8.1. Reação de PCR multiplex em Tempo Real........................................................................................56 4.8.2. Análise dos dados de PCR multiplex em tempo real.........................................................................57 4.9. Microarranjos de DNA............................................................................................................................57 4.9.1. Desenho experimental........................................................................................................................57 4.9.2. Amplificação do RNA........................................................................................................................59 4.9.3. Marcação fluorescente da segunda fita de cDNA...............................................................................59 4.9.4. Hibridação e lavagem das lâminas de microarranjo...........................................................................60 4.9.5. Aquisição e análise das imagens do microarranjo..............................................................................60 4.9.6. Análise de dados.................................................................................................................................61 4.10. Genotipagem de polimorfismos de base única por PCR em tempo real................................................62 4.10.1. Genotipagem de SNPs dos genes IL-10, TNF e TLR1...................................................................62 4.11. Dosagem de citocinas.............................................................................................................................64 4.11.1. Desenho experimental......................................................................................................................64 4.11.2. Dosagem das citocinas TNF, IL-8, IL-1, IL-10 e CCL2................................................................65 5. RESULTADOS...........................................................................................................................................66 5.1. Células THP-1 fagocitam BCG e M. leprae eficientemente....................................................................67 5.2. Diferenças na expressão gênica e secreção de citocinas de células THP-1.............................................69 5.2.1. Diferenças na expressão gênica e secreção de citocinas de células THP-1 infectadas pelas cepas de BCG Danish, Moreau e Pasteur, em MOI 2:1...................................................70 5.2.2 Diferenças na expressão gênica e secreção de citocinas de células THP-1 infectadas por BCG Moreau e M. leprae em MOI 2:1................................................................................74 5.2.3 Diferenças na expressão gênica e secreção de citocinas de células THP-1

XXI

infectadas pelas cepas de BCG Danish, Moreau e Pasteur, em MOI 10:1..................................................78 5.2.4 Diferenças na expressão gênica e secreção de citocinas de células THP-1 infectadas por BCG Moreau e M. leprae em MOI 10:1...............................................................................82 5.3. Influência da variabilidade do hospedeiro na secreção de citocinas.........................................................86 5.4. O logaritmo da razão TNF/IL-10 (log(TNF/IL-10)) foi ligeiramente aumentado em PBMC infectado com BCG Moreau...............................................................................87 5.5. Influência dos SNPs TNF -308 G>A, IL-10 -819 C>T e TLR1 743 A>G na secreção de TNF e IL-10, e no log(TNF/IL-10).................................................................................88 5.6. Estudos de expressão diferencial de genes por microarranjo de DNA em células THP-1 infectadas por M. leprae e BCG..............................................................................................................92 5.7. Diferenças no perfil de expressão gênica de amostras de biopsias de nervo humano..............................94 6. DISCUSSÃO...............................................................................................................................................98 6.1. Análise do perfil de expressão gênica e secreção de citocinas de células THP-1 e PBMC frente à infecção com BCG e M. leprae........................................................................................................102 6.2. Análise do perfil de expressão gênica em biopsia de nervos de pacientes hansenianos e não hansenianos.........................................................................................................................................115 6.3. Considerações finais..............................................................................................................................118 7. CONCLUSÕES........................................................................................................................................121 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.....................................................................................................124 9. ANEXOS..................................................................................................................................................155 Anexo I. Oligonucleotídeos utilizados nos ensaios de qRT-PCR (1)e PCR multiplex em tempo real (2)...............................................................................................................................................156 Anexo II. Valores normalizados de expressão gênica por RT-PCR em tempo real, de células THP-1 controle e infectadas com as cepas de BCG Danish, Moreau e Pasteur em MOI 2:1.................................................................................................................................162 Anexo III. Valores normalizados de expressão gênica por RT-PCR em tempo real, de células THP-1 controle e infectadas com BCG Moreau e M. leprae em MOI 2:1.................................164 Anexo IV. Valores normalizados de expressão gênica por RT-PCR em tempo real, de células THP-1 controle e infectadas com as cepas de BCG Danish, Moreau e Pasteur em MOI 10:1................................................................................................................................165 Anexo V. Valores normalizados de expressão gênica por RT-PCR em tempo real, de células THP-1 controle e infectadas com BCG Moreau e M. leprae em MOI 10:1..............................168

1

1. INTRODUÇÃO

2

1.1. Mycobacterium bovis BCG 1.1.1. Histórico

Em 1908, no Instituto Pasteur de Lille, na França, Albert Calmette e Camille Guérin

deram início ao trabalho de atenuação de uma cepa virulenta de Mycobacterium bovis, obtida

de uma vaca com mastite tuberculosa (revisado por Liu et al., 2009). Após 13 anos de estudos

onde realizaram 231 passagens sucessivas em meio contendo batata, glicerina e bile bovina,

esses pesquisadores observaram uma mudança morfológica na cultura. A partir daí,

começaram a testar a virulência dessa cepa em diversos modelos animais. Em 1921, a cepa

atenuada de M. bovis foi administrada oralmente a uma criança em Paris, cuja mãe tinha

morrido de tuberculose (TB) e observou-se que a criança não desenvolveu a doença. A partir

disso, a vacina foi administrada oralmente em mais de 300 crianças em um período de um ano

(revisado por Brewer & Colditz 1995). Durante este período vários testes demonstraram que

essa cepa havia perdido a virulência, mas ainda mantinha suas propriedades imunogênicas.

Esta cepa passou a ser chamada de Bacilo de Calmette e Guérin (BCG)§ e utilizada na

prevenção contra o desenvolvimento da TB, sendo posteriormente utilizada também contra o

desenvolvimento da hanseníase (Prevention Trial Group 1996; Fine et al., 1999; Scollard et al,

2006; revisado por Zodpey et al., 2007; Merle et al., 2010).

Desde 1924, a vacina BCG passou a ser distribuída pelo Instituto Pasteur e

subcultivada em diferentes países (Behr, 2002). No decorrer de algumas décadas, cada

laboratório para onde a vacina foi ditribuída, desenvolveu sua própria cepa de BCG, sendo

posteriormente denominada pela cidade, país ou laboratório aonde foi propagada.

Aproximadamente 14 cepas de BCG subcultivadas foram utilizadas como vacina em

diferentes partes do mundo. Porém, mais recentemente foi observada que existem cerca de

sete cepas sendo utilizadas mundialmente como vacina (Ritz & Curtis, 2009) (figura 1.1).

Apesar dos esforços para padronização do crescimento e produção das vacinas, diferentes

§ O BCG é uma bactéria aeróbica de crescimento lento, ligeiramente curva, sem mobilidade e não esporulada.

Possui uma parede celular rica em lipídeos, composta principalmente de peptideoglicano (PGN), arabinogalactano e ácido

micolico (ácido graxo saturado de elevado peso molecular) (Begum et al., 2002). O PGN do BCG é estruturalmente único e

com isso é facilmente distinguível do PGN das bactérias gram-negativas (Seya et al., 2002). As bactérias coram-se de

vermelho pelo método Ziehl-Nielsen, sendo considerados bacilos álcool-ácido resistentes (BAAR).

3

condições de passagens foram utilizadas pelos diferentes laboratórios contribuindo para as

mudanças genéticas observadas nas cepas de BCG.

Figura 1.1 – Cepas vacinais de BCG utilizadas em todo o mundo entre 2003 e 2007. Na legenda, as cepas de BCG foram separadas em caixas de acordo com suas similaridades genéticas. Adaptado de Ritz & Curtis, 2009.

Em 1930, ocorreu o acidente de Lubeck, onde 250 crianças receberam a vacinação por

BCG, e após 4 a 6 semanas, 72 crianças morreram, 135 crianças desenvolveram TB, mas se

recuperaram, e o restante não manifestou a doença, pelo menos durante o tempo de

acompanhamento médico que foi de 12 anos (revisado por Brewer & Colditz 1995). Isto

levou uma ampla reação contra a vacinação por BCG. Mais tarde descobriram que a vacina

tinha sido contaminada com uma cepa virulenta de Mycobacterium tuberculosis (M. tb.),

agente etiológico da tuberculose, porém a ampla vacinação de crianças só foi restabelecida em

1932, depois de novas técnicas levarem a uma produção mais segura. Este acidente mostrou a

grande variação da resposta imune nos indivíduos expostos a bactéria, e começou-se a

suspeitar que diferenças genéticas também do hospedeiro poderiam ser fundamentais na

determinação de quais crianças resistiram à doença, as que foram suscetíveis e as que

mantiveram um equilíbrio com o patógeno (revisado por Mitsos et al., 2003).

4

No Brasil, a vacina chegou em 1925 trazida pelo médico Uruguaio Julio Elvio Moreau

e entregue ao pesquisador Arlindo de Assis, que passou a cultivá-la no Instituto Vital Brasil,

onde a cepa passou a adquirir características próprias (Benévolo-de-Andrade et al., 2005).

Essa cepa foi denominada BCG Moreau e posteriormente passou a ser cultivada pela

Fundação Ataulpho de Paiva, que hoje em dia é responsável por 5% da produção de BCG do

mundo todo. Após o acidente de Lubeck, a vacinação por via oral foi substituída por uma

vacinação intradérmica em praticamente todos os países. Porém, no Brasil a vacina continuou

sendo administrada por via oral até 1973, e desde então foi substituída exclusivamente pela

vacinação intradérmica (Monteiro-Maia et al., 2006). Desde 1976, a BCG Moreau passou a

fazer parte do calendário de vacinação obrigatória no Brasil.

1.1.2. Eficácia da vacina BCG A vacina BCG confere proteção contra TB e hanseníase, sendo indicada

principalmente para prevenir as formas graves de TB (miliar e meníngea) em crianças

menores de cinco anos de idade, mais frequentemente nos menores de um ano de idade

(Colditz et al, 1995). Essa proteção oferecida pelo BCG é parcial e varia amplamente em

diferentes países e populações. O efeito protetor para TB pulmonar varia de 0% a 80% em

ensaios clínicos realizados em diversos países, enquanto que para a hanseníase o efeito

protetor varia de 20 a 80% (Prevention Trial Group, 1996; Fine et al., 1999; Zodpey et al.,

2005; Scollard et al, 2006; Merle et al., 2010). Com isso, grandes esforços têm sido realizados

na tentativa de buscar um novo candidato à vacina contra TB e hanseníase que tenha uma

melhor eficácia.

A variabilidade na proteção da vacina de BCG é atribuída à: (i) diferenças genotípicas

e fenotípicas das cepas vacinais BCG, que teriam ocorrido em função das mutações

acumuladas ao longo do tempo; (ii) exposição prévia à micobactérias ambientais, que podem

modular a resposta imune do hospedeiro, interferindo na proteção conferida pela vacina; (iii)

via de infecção, onde diferenças na infecção (infecção primária ou re-infecção) poderiam

interferir no efeito protetor; (iv) outros fatores relacionados a condições de utilização da

vacina, como sua viabilidade, dose utilizada e via de administração, e ainda, (v) a fatores

relacionados ao hospedeiro, como o estado nutricional, co-infecções e aspectos genéticos

(Starke & Conelly, 1998; Fine & Vynnycky, 1998; Fine et al., 1999; Behr 2002; Brandt et al.,

2002; Barreto et al., 2006; Fernando & Britton, 2006). Outra fonte observada que estaria

5

contribuindo para variabilidade na eficácia das diferentes cepas vacinais, seria o meio de

crescimento utilizado para a preparação das vacinas, que poderia influenciar nas propriedades

das cepas de BCG (Petricevich et al., 2001; Venkataswamy et al., 2012).

Horwitz e colaboradores (2009) utilizaram um modelo animal para investigar se as

diferentes cepas de BCG possuem eficácia protetora distinta na proteção contra TB pulmonar.

Neste estudo, porquinhos-da-índia foram vacinados com seis cepas de BCG diferentes,

posteriormente desafiados com aerossol contendo M. tb., e então, investigados quanto ao

desenvolvimento de TB pulmonar. Das cepas utilizadas, incluiu-se uma cepa considerada

antiga (cujo critério para classificação será detalhado posteriormente), BCG Japan, e cinco

cepas consideradas recentes, Connaught, Danish, Glaxo, Pasteur e Tice. Estes autores

observaram que com exceção de BCG Glaxo, que se mostrou relativamente menos eficaz,

todas as outras cepas apresentaram uma eficácia protetora comparável, não existindo

diferença entre a cepa antiga e as cepas recentes. Já foi sugerido por Broch e colaboradores

(2007) que as cepas antigas conferem uma melhor proteção contra TB quando comparadas às

cepas recentes; entretanto no estudo de Horwitz e colaboradores, só foi incluída uma cepa das

consideradas antigas (BCG Japan), e, embora não tenha se mostrado mais eficaz do que as

cepas mais recentes utilizadas no estudo (Horwitz et al., 2009), não deve ser descartada a

possibilidade de que outras cepas consideradas antigas, como BCG Russia e BCG Moreau

possam apresentar uma maior eficácia na proteção contra TB.

Recentemente, a cepa BCG Moreau foi comparada com a cepa BCG Danish, onde foi

avaliada não só sua eficácia protetora, como também a influência da via de administração da

vacina (Clark et al., 2010). Neste trabalho, foi observado que a vacina BCG Moreau

administrada oralmente proporcionou uma proteção equivalente a BCG Danish injetável

contra TB pulmonar em modelo animal. A cepa de BCG Moreau quando era administrada por

forma oral apresentava um bom índice de segurança e até menos efeitos colaterais em

comparação com outras cepas de BCG. Deste modo, Clark e colaboradores sugerem que a

volta da administração da vacina por via oral poderia ser uma boa opção, pois teria as

vantagens de não precisar utilizar nenhum objeto perfurocortante, diminuindo possível

contaminação por infecções transmitidas pelo sangue. Além disso, não teria necessidade de

profissionais treinados para realizar a vacinação e seria uma estratégia considerada ideal para

as populações que vivem em países com uma infra-estrutura sanitária deficiente.

Devido a variabilidade na eficácia protetora da vacina de BCG, vários países têm

adotado diferentes programas de vacinação. Alguns países adotam ou já adotaram o programa

universal de vacinação, outros recomendam a vacinação só para grupos de alto risco, como é

6

o caso de contato de pacientes com hanseníase, incluindo Canadá e Estados Unidos. E há

ainda os que não possuem nenhum programa de vacinação (Zwerling et al, 2011) (figura 1.2).

A política de vacinação varia em relação ao número de doses utilizadas, a idade recomendada

para a primeira vacinação e ainda a via de administração da vacina. Devido a essas diferenças

de política de vacinação entre os vários países, foi criado um banco de dados com

informações sobre a vacina BCG em mais de 180 países (http://www.bcgatlas.org/).

A maioria dos países adota a vacinação com BCG em dose única ao nascer,

principalmente os países com alta incidência de TB (como é o caso do Brasil) de acordo com

recomendação da Organização Mundial de Saúde (OMS) (1995). Outros países adotam mais

de uma dose, como é o caso da Rússia, pois acreditam que a proteção conferida pelo BCG vai

diminuindo ao longo do tempo. Há países que revacinam crianças em idade escolar que não

apresentam a cicatriz vacinal, como é o caso de Japão ou Tailândia, ou revacinam

independente da presença da cicatriz ou do resultado do teste cutâneo com PPD (derivado de

proteína purificada de M. tb.), como a Turquia. Há ainda os que revacinam os indivíduos que

apresentam resultado negativo com PPD negativo, como a Bulgária e Polônia (Pereira et al.,

2007). O Brasil é um dos países que até pouco tempo adotava a revacinação, porém estudos

realizados com crianças em idade escolar mostraram ausência de proteção da segunda dose de

BCG contra TB pulmonar (Barreto et al., 2002; Rodrigues et al., 2005) e hanseníase (Cunha

et al., 2008), e como consequência, foi recomendado que a prática de revacinação fosse

suspensa.

Por outro lado, foi estabelecida pelo Ministério da Saúde, a vacinação de todos os

contatos intradomiciliares de pacientes com hanseníase e que estejam sem presença de sinais e

sintomas da doença no momento da avaliação, independentemente de serem contatos de casos

PB ou MB (Brasil, 2009). Foi demonstrado que a administração da vacina BCG subsequente

ao diagnóstico de um caso de hanseníase multibacilar foi eficaz na redução do risco de doença

entre os familiares e outros contatos próximos a esses pacientes com hanseníase (Duppre et al.,

2008).

7

Figura 1.2 – Mapa apresentando a política de vacinação adotada em diferentes países. A, representa países que atualmente possuem o programa universal de vacinação, por exemplo, recomendam a vacinação com BCG para todos ao nascimento. B, representa países que costumavam recomendar a vacinação com BCG para todos, mas atualmente não. C, representa países onde nunca foi recomendado a vacinação para todos, ou é dado apenas para grupos de alto risco, como os contatos de pacientes. Adaptado de Zwerling et al., 2011.

1.1.3. Genoma do BCG O genoma de M. bovis BCG Pasteur 1173P2 possui aproximadamente 4,4 Mb

contendo 3.954 genes e 34 pseudogenes (Brosch et al., 2007). Possui 99,95 % de identidade

com o genoma do M. tb. e, quando comparado a este genoma que também possui

aproximadamente 4,4 Mb, pode-se observar aproximadamente 2.400 polimorfismos de base

única (SNPs). As duplicações em tandem, DU1 e DU2, são os polimorfismos genômicos mais

proeminentes encontrados no genoma de BCG Pasteur. As duas cópias de DU1 são idênticas,

sendo esta duplicação observada apenas na cepa de BCG Pasteur. Enquanto DU2 possue uma

diferença não-sinônima em uma base dentro do gene BCG3258, e ocorre em uma das quatro

diferentes formas (DU2-I à DU2-IV) em todas as cepas de BCG (Brosch et al., 2007). Além

do sequenciamento do BCG Pasteur, também foi sequenciado o genoma do BCG Japan 1172,

a fim de comparar o genoma de uma cepa antiga com uma cepa recente (Seki et al., 2009).

Assim como o genoma do BCG Pasteur, o genoma do BCG Japan (Tokyo), possui

8

aproximadamente 4,4 Mb, e contém 4.033 genes, incluindo 3.950 gene que codificam para

proteínas, 3 genes codificam para rRNA, 45 genes para tRNA e 30 pseudodegenes. Na

comparação com o genoma de BCG Pasteur, foi identificado um total de 18 regiões de

diferença (RDs), apresentando diferenças de mais de 20 pb, incluindo RD14, RD2 e nRD18,

já previamente relatadas; incluindo, também, sete RDs encontradas no locus VNTR (do inglês,

variable-number tandem repeats). Além disso, também foram identificados

inserções/deleções de menos de 20 pb e 68 SNPs entre as cepas.

Outras três cepas de BCG, Danish 1331, Russia e Tice, também tiveram seu genoma

sequenciado (Pan et al., 2011), e mesmo ainda sendo um rascunho, foi observado que

possuem um tamanho similar de aproximadamente 4,27 Mb, contendo 4.030 genes, incluindo

três genes que codificam para rRNA (5S, 16S e 23S) e 45 genes que codificam para tRNA.

Comparando com seu progenitor, M. bovis, foram identificados mais de 350 SNPs, onde

aproximadamente 170 SNPs foram específicos destas cepas de BCG. E cada cepa de BCG

possui 12 SNPs específicos, que não eram compartilhados com as outras cepas. As

duplicações em tandem foram confirmadas neste trabalho, onde foi observada a presença da

DU2-I na BCG Russia, DU2-III na BCG Danish e DU2-IV na BCG Tice.

Recentemente a cepa brasileira teve seu genoma seqüenciado (Gomes et al., 2011) e

possui aproximadamente 4,4 Mb, assim como o genoma das outras cepas sequenciadas

(Pasteur e Japan). Esse genoma contém 3.945 genes, incluindo 3 genes que codificam rRNA e

45 genes que codificam para tRNA, e possui um alto conteúdo G+C (65,64%) assim como o

genoma de M. tb., com o qual compartilha mais de 99% de identidade. Neste trabalho, foi

confirmada a presença da DU2-I, assim como a deleção RD16 específica da cepa Moreau.

Um resumo comparando as principais características do genoma destas cepas de BCG

encontra-se na tabela 1.1.

Ao comparar o genoma de BCG com M. tb. e M. leprae, além das regiões de diferença

(algumas já previamente mencionadas), foram descritas outras diferenças, como

inserções/deleções. Uma das diferenças observadas é o número de membros da família PE

que varia muito entre as micobactérias. BCG e M. tb. possuem aproximadamente 80-140

genes, enquanto M. leprae possui menos de 10 genes, que por sua vez, parecem ser

pseudogenes (Cosma et al., 2003).

9

Tabela 1.1. – Comparação das características do genoma das cepas de BCG Pasteur, Japan,

Moreau, Danish, Russia e Tice.

Cepas de BCG Pasteur Japan Moreau Danish/Russia/Tice

Tamanho (Kb) 4. 374 4.371 4.340 4.270

Genes que codificam:

Proteínas 3.954 3.950 3.945 4.030

rRNA 3 3 3 3

tRNA 47 45 45 45

Pseudogenes 34 30 ND ND

Conteúdo G+C (%) 65 65.64 65.64 65

SNPs* 736* / 2.400† 68 ND 350*

* em relação a M. bovis, † em relação a M. tb., em relação a BCG Pasteur. ND=Não determinado.

1.1.4. Diferenças entre as cepas de BCG A cepa original BCG apresenta uma série de deleções que restringem a virulência e a

taxa de proliferação do microorganismo, como é o caso da RD1, que difere o BCG do M.

bovis, M. tb. e M. leprae, e supostamente foi perdida durante o processo de atenuação entre

1908-1921 (Behr et al., 1999). Essa região possui genes que codificam as proteínas CFP-10

(do inglês, culture filtrate protein 10) e ESAT-6 (do ingês, early secretory antigenic 6-kDa), e

sabe-se que essas proteínas possuem um papel importante na virulência das micobactérias

(Liu et al., 2009). Outra região que não foi observada em nenhuma cepa de BCG, foi a RD3.

Já a RD2, que contém o gene mpt64, foi deletada apenas nas cepas derivadas após 1926,

indicando que não foi uma deleção ocorrida na cepa BCG original (Mahairas et al., 1996).

BCG Moreau é uma das cepas que mantém essa região. Também foi observado que a região

nRD18 está ausente nas cepas obtidas após 1933 (Mostowy et al., 2003; Lui et al., 2009).

Além disso, as cepas de BCG apresentam outras diferenças entre si (figura 1.3), como

algumas deleções e inserções que estão presentes em um número restrito de cepas, por

exemplo, BCG Japan, Russia e Moreau possuem um elemento dentro da região promotora do

gene phoP, o que deve eliminar a auto-repressão de phoP, enquanto BCG Pasteur não possui

10

esta inserção, resultando em um baixa expressão do gene, podendo ter implicações em sua

virulência (Brosch et al., 2007). Outras regiões faltam em apenas uma das cepas, como é o

caso da Rv3698 (RD Russia) que está ausente na cepa BCG Russia, RD14 na cepa BCG

Pasteur, RD8 na cepa BCG Montreal (BCG Frappier) (Behr et al., 1999; Mostowy et al.,

2003), RD Denmark/Glaxo que está ausente na cepa BCG Danish e também na cepa derivada

dela, BCG Glaxo (BCG Copenhagen 1077) (Mostowy et al., 2003), e ainda BCG Moreau que

possui uma deleção específica chamada RD16 (Behr et al., 1999; Behr et al., 2002 Benévolo-

de-Andrade et al., 2005; Cogrove et al., 2006).

As cepas de BCG foram classificadas em 2 grandes grupos: Grupo I, que consiste nas

cepas de BCG que possuem a região RD2, que contém o gene que expressa a proteína MPT64.

Estas cepas são consideradas como cepas antigas, mais próximas da cepa original e, incluem

BCG Japan, Russia e Moreau, distribuídas antes de 1925 (Behr et al., 1999; Behr et al., 2002;

Brosch et al., 2007). Estas três cepas possuem 2 cópias de uma sequência de inserção

(IS6110), sendo que as cepas consideradas antigas obtidas entre 1925 e 1927 (BCG Sweden e

Birkhaug) já perderam um elemento IS6110. O Grupo II consiste nas cepas que não possuem

a RD2, e são as consideradas recentes. Essas diferenças genômicas contribuem para as

propriedades variáveis das diferentes cepas de BCG (Behr et al., 2002; Brosch et al., 2007).

As diferenças genéticas entre as cepas de BCG são fatores importantes que contribuem

para a grande variabilidade observada na imunidade protetora adquirida após a vacinação.

Apesar das modificações genéticas que diferem a cepa BCG Moreau de várias outras cepas,

como por exemplo, a BCG Danish e Pasteur, não foi observada redução da capacidade

protetora descrita originalmente, onde a cepa brasileira é considerada uma das mais

imunogênicas dentre as várias cepas utilizadas na vacinação (Brewer & Colditz, 1995). Além

disso, Bêrredo-Pinho e colaboradores (2011), ao comparar o perfil proteômico de BCG

Moreau e Pasteur, mostraram a expressão aumentada de proteínas imunogênicas em BCG

Moreau, muitas das quais têm sido implicadas na resposta imune protetora.

11

Figura 1.3 – Genealogia das cepas de BCG. No esquema são mostradas algumas diferenças genéticas entre as cepas, como as deleções ocorridas ao longo do tempo (quadrados azuis), desde a atenuação da cepa de BCG original. Os quadrados rosa escuro em destaque representam as cepas utilizadas em nosso estudo. Esquema adaptado de Hayashi et al., 2009.

1.1.5. Relação BCG-hospedeiro O padrão de especificidade entre a micobactéria e o hospedeiro já foi investigado tanto

em populações humanas, quanto em modelo animal. Wu e colaboradores (2007), utilizando

células de recém-nascidos vacinados com diferentes cepas de BCG (Japan, Moreau ou

Danish), desafiadas com proteínas de M. tb., identificaram diferenças na resposta imune.

Neste trabalho, observou-se que a vacinação com BCG Moreau ou Danish induziu

preferencialmente a expressão de citocinas envolvidas na imunidade adaptativa, como

interleucina (IL)-12 e interferon (IFN)-γ, enquanto a vacinação com BCG Japan induziu

preferencialmente citocinas associadas com resposta pró-inflamatória, como IL-1β e IL-6.

Este estudo, somado a outros, confirmam que a resposta do hospedeiro desencadeada por

diferentes cepas de BCG tem mostrado não ser homogênea.

12

O perfil de citocinas induzido após a vacinação por BCG também foi observado por

Lalor e colaboradores (2010), que identificaram citocinas pró-inflamatórias, como IFN-γ,

fator de necrose tumoral (TNF), IL-2, IL-1β, IL-6 e IL-17, além da indução de citocinas T

helper (Th)2, como IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13, bem como das quimiocinas, IL-8, proteína

induzível por interferon (IP)-10 e proteína inflamatória de macrófago (MIP)-1α, e dos fatores

de crescimento, G-CSF (fator estimulador de colônia de granulócitos) e GM-CSF (fator

estimulador de colônia de granulócitos e macrófagos). Posteriormente, foi investigado pelo

mesmo grupo (Lalor et al., 2011), diferenças no perfil de citocinas de crianças pertencentes a

duas populações diferentes, Malawi e Reino Unido, após vacinação com BCG Danish 1331.

Das 42 citocinas analisadas, foram identificadas 27 citocinas e quimiocinas diferencialmente

expressas nessas duas populações. Das sete induzidas em indivíduos do Reino Unido, todas

estavam relacionadas com uma resposta Th1, incluindo IL-2, IL-6, IL-12p40, LT- e IFN-

γ, e quimiocinas, como CCL3, as quais já são conhecidas estarem involvidas na imunidade

contra TB. Enquanto das 20 citocinas/quimiocinas induzidas em indivíduos de Malawi,

estavam incluídas citocinas pró-inflamatórias, como IL-1α, citocinas Th2, como IL-4, IL-5 e

IL-13, bem como a citocina regulatória IL-10, sugerindo uma maior imunoregulação nessa

população. Além disso, foi observada a indução de IL-17, quimiocinas e fatores de

crescimento, sugerindo um maior desenvolvimento e diferenciação de novos tipos celulares.

Porém, apesar desse aumento dos fatores de crescimento, foi observada uma resposta Th1

diminuída na população de Malawi, com um perfil imune preferencialmente Th2, sendo

assim, os autores sugerem que essa estratégia de vacinação em crianças de Malawi pode não

ser a ideal. Com isso, foram observadas diferenças no perfil e dimensão da resposta imune em

diferentes populações após a vacinação, confirmando que a vacinação por BCG não protege

de forma igual nos diferentes conjuntos populacionais.

Por um lado, uma mesma cepa de BCG dada a indivíduos com diferentes background

genéticos pode variar muito em relação a sua imunogenicidade (Black et al., 2002; Lalor et al.,

2009), onde já foi observado que apesar de BCG induzir uma robusta resposta Th1, em

muitos indivíduos esta resposta por si só, não é suficiente para ocasionar resistência do

hospedeiro contra infecção por M. tb. e M. leprae. Somado ao fato de que em uma mesma

população, cepas de BCG podem levar a diferentes reações adversas (Liu et al., 2009),

poderia refletir interações específicas cepa de BCG-hospedeiro. Recentemente, foi mostrado

que cepa BCG Danish 1331 ativa a resposta imune celular dependente também do genótipo

do hospedeiro (Randhawa et al., 2011). Neste trabalho, foi demonstrado que SNPs em TLR1

13

e TLR6 estão associados com a resposta imune induzida por BCG, 10 semanas após a

vacinação de recém-nascidos, sugerindo que fatores genéticos do hospedeiro estão associados

com a resposta à vacina de BCG.

Recentemente, Di Pietrantonio e colaboradores (2011) investigaram os efeitos do

background genético tanto do hospedeiro quanto da micobactéria, empregando duas

linhagens de camundongo, conhecidas por possuírem distintas respostas à infecção por

micobactérias; com isso, foram observadas diferenças na expressão de citocinas e quimiocinas

após infecção por cada uma das três cepas de BCG empregada (BCG Russia, Japan e Pasteur).

Além disso, foram mostradas diferenças na capacidade de crescimento das cepas de BCG no

pulmão do hospedeiro dependente da linhagem de camundongo utilizada. Os resultados

observados demonstraram que a variabilidade genética tanto do hospedeiro quanto da bactéria

contribue fortemente em diferentes aspectos da suscetibilidade do hospedeiro à infecções

micobacterianas, mostrando a importância de considerar esses efeitos em conjunto (Di

Pietrantonio et al., 2010; Di Pietrantonio et al., 2011). Com isso, acredita-se que o principal

efeito sobre a resposta do hospedeiro seria devido ao tipo de micobactéria utilizada, enquanto

que o background genético do hospedeiro seria o modulador dessa resposta.

1.1.6. Novas estratégias vacinais para a proteção contra TB e hanseníase Levando-se em consideração que BCG é a única vacina disponível contra TB,

conferindo proteção em recém-nascidos e crianças contra o desenvolvimento das formas mais

graves de tuberculose disseminada, seria recomendada a continuidade da vacinação em países

endêmicos para a doença. No entanto, a eficácia variável da vacina BCG e o aumento dos

casos de TB multi-droga resistentes em todo o mundo sugerem a necessidade de uma vacina

melhor contra a TB. Algumas abordagens experimentais já prevêem o desenvolvimento de

uma vacina BCG melhorada, incluindo a utilização de micobactérias atenuadas, vacinas de

subunidades e vacinas de DNA (Andersen & Doherty, 2005).

Alguns trabalhos já estudaram o impacto da utilização de BCGs recombinantes, em

sua maioria, em sistema murino (Horwitz et al., 2000; Goonetilleke et al., 2003; Pym et al.,

2003; Chatterjee et al., 2011; Lin et al., 2011). Recentemente, Chatterjee e colaboradores

(2011) mostraram que BCG (Danish) recombinante contendo a região RD1, que contém um

gene codificante para a proteína ESAT-6 (um dos antígenos mais importantes expressos por

M. tb., ausentes em BCG), induziu uma maior eficácia protetora da vacina em modelo murino

14

quando comparado com a cepa BCG Danish não recombinante. Este grupo observou que

enquanto a cepa selvagem induziu apenas uma resposta Th1, a cepa recombinante induziu

uma resposta Th1 e Th17. Foi observado ainda que estas células Th17 desempenham um

papel importante no estabelecimento de resposta imune protetora contra a TB (Khader et al.,

2007; Wozniak et al., 2010; Chatterjee et al., 2011).

Os adjuvantes também têm sido utilizados para estimularar a resposta imune, sendo

parte da sua função, a estimulação e liberação de mediadores, como as citocinas (Lindblad et

al.,1997). No caso das vacinas de subunidade, que se mostram pouco imunogênicas ao serem

utilizadas sozinhas, é essencial administrá-las junto com um adjuvante (Ottenhoff et al., 2010).

A inclusão de adjuvantes pode melhorar a proteção induzida pela vacina por fornecer uma

resposta imune forte e de longo prazo. Neste caso, um dos principais problemas no

desenvolvimento de vacinas antimicobacterianas é a falta de adjuvantes que efetivamente

estimulem a imunidade mediada por células, na mesma medida que torne a vacina segura o

suficiente para ser utilizada no homem.

1.2. Micobactérias patogênicas: agentes etiológicos da hanseníase e tuberculose

Micobactérias que causam doenças são conhecidas há muito tempo e os relatos sobre a

hanseníase podem ser encontradas desde tempos bíblicos. Também já foram identificadas

múmias egípcias de mais de 5.000 anos, apresentando anormalidades e deformidades

caracterísda TB em sua forma óssea (Ducati et al., 2006).

O M. tb. e M. leprae se adaptaram por nichos específicos preferenciais no hospedeiro

humano, sendo o M. leprae altamente adaptado a um ambiente intracelular, o que levou a uma

evolução redutiva do genoma e a impossibilidade de crescimento in vitro (como será melhor

detalhado a seguir). O M. tb. é capaz de crescer em meios de cultura convencionais in vitro e

se adapta a diferentes tecidos, tendo um padrão de crescimento mais rápido que o M. leprae,

bem como maior diversidade genética com inúmeras cepas circulantes no mundo.

15

1.2.1. Mycobacterium leprae

O agente etiológico da hanseníase, o M. leprae**, também conhecido como bacilo de

Hansen, foi identificado pelo médico norueguês Gerhard Henrik Armauer Hansen em 1873

como o agente causador da doença (Foss, 1999; Gomes, 2000). É um parasito intracelular

obrigatório com alta afinidade pelas células de Schwann nos nervos periféricos e macrófagos

da pele, o que explica as lesões observadas nos pacientes (Kaplan & Cohn, 1986). Essa

predileção pode causar danos neurais e deformações, como perda de sensibilidade, atrofias e

paralisias musculares, que se não tratadas adequadamente, podem evoluir para incapacidades

físicas permanentes (Brasil, 2001).

Até hoje, o M. leprae tem resistido a todas as tentativas de cultivo em meios de cultura

in vitro, o que tem dificultado o estudo de sua biologia e dos mecanismos de patogênese

causado por este microrganismo. A obtenção de massa bacilar é possível a partir da infecção

de animais, como o tatu de nove bandas (Dasypus novemcinctus), que é um hospedeiro

natural, ou em camundongos normais da linhagem C57/Black6, camundongos atímicos (nude)

ou nocautes de genes como TNF, linfotoxina-α (LTA) ou receptor de TNF (TNFR) (Hagge et

al., 2009, Cardoso et al., 2011b). O crescimento do M. leprae no coxim plantar de

camundongos atímicos, por exemplo, fornece quantidades suficientes de bacilos viáveis para

fins experimentais. Esses camundongos são extremamente suscetíveis à infecção pelo M.

leprae por apresentar um alto grau de imunodeficiência. Cerca de 2 x 107 bacilos inoculados

no coxim plantar de camundongos nude permitem a obtenção de aproximadamente 1010

bacilos num período de 6 meses (Truman & Krahenbuhl, 2001).

O genoma completo do M. leprae, publicado em 2001, apresenta características

interessantes (Cole et al., 2001), onde apenas metade do seu genoma contém genes que

codificam proteínas e o restante consiste em pseudogenes e regiões não codificantes. Estudos

comparativos mostraram existir um caso de redução evolutiva no genoma dessa bactéria.

Utilizando M. tb. e M. bovis BCG, como critério de comparação, observa-se que ambas as **O M. leprae é uma bactéria de crescimento lento, que se apresenta sob a forma de bacilo reto ou levemente encurvado, imóvel, que pode ser encontrado formando aglomerados, dispostos paralelamente em feixes, também chamados de globias. Coram-se de vermelho pelo método Ziehl-Nielsen, sendo considerados bacilos álcool-ácido resistentes (BAAR), método comumente utilizado para diagnóstico em laboratório (Britton & Lockwood, 2004; Scollard et al., 2006; Hussain, 2007). O patógeno possui um envelope celular complexo, contendo uma estrutura única, rica em lipídeos. Esse envelope compreende uma membrana celular, uma parede celular formada principalmente por peptideoglicanos e ácidos micólicos, e uma cápsula rica em glicolipídeos, com destaque para o mais abundante, o glicolipídeo fenólico I (PGL-I), presente exclusivamente no M. leprae (Daffé & Draper, 1998). Muitas moléculas do envelope celular são essenciais para a patogênese do M. leprae, tais como as adesinas que mediam a interação do bacilo tanto com células de Schwann, quanto com células epiteliais e endoteliais do hospedeiro (Pessolani et al., 2003).

16

micobactérias apresentam um genoma de aproximadamente 4,4 Mb, contendo em média

3.973 genes e uma quantidade de pseudogenes que varia de 6 para M. tb. e 34 para BCG,

enquanto o M. leprae possui apenas 1.614 genes e um surpreendente número de 1.133

pseudogenes (Scollard et al., 2006). O número de pseudogenes e sua proporção no genoma do

M. leprae é consideravelmente maior do que em outras micobactérias (Akama et al., 2010).

Recentemente, foi analisado o perfil de expressão global de genes, pseudogenes e

regiões não codificantes em M. leprae, e foi observado, por exemplo, que os pseudogenes

podem ser abundantemente transcritos. Muitas vezes, se observa níveis de transcrição em

taxas similares aos genes (Akama et al., 2009), porém ainda não se sabe o porquê da

transcrição destas sequências, que a princípio se pensava serem não-funcionais. De fato,

análises proteômicas (Wiker et al., 2011) e análises in silico (Williams et al., 2009) sugerem

que esses RNAs de pseudogenes não são traduzidos. Eventos como rearranjos e deleções no

genoma, perda de fatores sigma e a presença de seqüências Shine-Dalgarno alteradas ou

degeneradas seriam responsáveis pelo acúmulo de pseudogenes que se mantêm transcritos

(Williams et al., 2009). Mesmo assim, é curioso observar que esta micobactéria mantém um

gasto energético relevante para gerar produtos que não são funcionais (assumindo a visão

clássica um gene- uma proteína). Entretanto, é interessante a hipótese de que os pseudogenes

transcritos possam participar em vias de regulação gênica do hospedeiro em mecanismos de

controle do tipo microRNA (miRNA) já descritos em E. coli como sRNA (do inglês, small

RNA), o que poderia explicar a capacidade de sobrevivência do M. leprae mediante o número

tão limitado de seqüências codificantes (Akama et al., 2009).

Ainda é importante ressaltar que a “degeneração” do genoma do M. leprae resultou na

eliminação de diversas vias fundamentais, o que implica em respostas limitadas perante o

estresse do ambiente. O acúmulo de pseudogenes, com a consequente perda de função gênica,

deve ser uma das causas do crescimento lento do bacilo e seu inviável cultivo in vitro,

podendo ter resultado em uma evolução adaptativa que possivelmente avançou de um modo

de vida livre a um nicho extremamente especializado dos macrófagos e das células de

Schwann dos nervos periféricos (Monot et al., 2009). Este grupo ao comparar o genoma de

quatro cepas de M. leprae observou a baixa diversidade genômica da micobactéria, o que se

mostrou de acordo com a hipótese de que a hanseníase surgiu da infecção por um único clone,

e que este então, passou por um processo evolutivo. Esta cepa progenitora teria se originado

no leste da África e se espalhado pela Ásia e Europa, e posteriormente para as Américas

(Monot et al., 2005; Monot et al., 2009), reforçando a teoria de que a doença teria surgido no

continente africano.

17

Recentemente, foi demonstrado por comparações genômicas que o M. leprae isolado

de pacientes hansenianos naturais do Sul dos Estados Unidos e o que ocorrem naturalmente

em tatus desta região possuem sequências genômicas idênticas, sendo considerada uma única

cepa responsável pelas infecções nos dois hospedeiros. Os resultados deste trabalho implicam

fortemente os tatus como fonte de infecção, sugerindo que a hanseníase seria uma zoonose

nesta região (Truman et al., 2011).

1.2.2. Mycobacterium tuberculosis

O agente etiológico da tuberculose, o M. tb.†, também conhecido como bacilo de Koch,

foi identificado por Robert Koch em 1882, como causador da doença (Hussain, 2007). É um

patógeno de crescimento preferencialmente intracelular, e embora possa afetar outras células,

possui um tropismo por macrófagos alveolares.

O M. tb. é uma bactéria que faz parte do complexo Mycobacterium tuberculosis que

inclui outras quatro espécies que também podem causar tuberculose, que são M. bovis, M.

africanum, M. microti e M. canetti (Tsukamura et al., 1985; van Soolingen et al., 1997).

Apesar de estreitamente relacionadas, estas micobactérias diferem em relação à morfologia,

bioquímica, variedade de hospedeiros e patogenicidade (Brosch et al., 2002)

O genoma do M. tb., como mencionado anteriormente possui 4,4 Mb, contendo 3.993

genes, onde inclui-se cerca de 2.441 genes com funções atribuídas, 912 genes com funções

hipotéticas conservadas, 606 genes com funções desconhecidas e 6 pseudogenes. Além disso,

possui um alto conteúdo G+C (65%) (Cole et al., 1998) (tabela 1.2). O genoma de M. tb.

difere radicalmente de outras bactérias, já que uma parcela muito grande de sua capacidade de

codificação é dedicada à produção de enzimas envolvidas na lipogênese e lipólise; codifica

também duas novas famílias de proteínas ricas em glicina com uma estrutura repetitiva que

pode representar uma fonte de variação antigênica.

† O M. tb. é uma bactéria que apresenta crescimento lento e a faixa ideal de temperatura para seu crescimento é de 37° C. Estes bacilos costumam se agrupar em forma de ramos alongados e tortuosos, conhecidos como cordas. Seu tempo de geração é longo, podendo variar de 14 a 20 horas dependendo do meio de cultura utilizado para seu crescimento (Hussain, 2007). O M. tb. possui uma complexa parede celular que é um dos principais determinantes de virulência da bactéria. Essa parede celular possui um alto teor lipídico (mais de 60%), contendo peptidoglicano, arabinogalactana, que faz a ligação do peptideoglicano aos lipídeos frouxamente ligados (tais como, fator corda e cera) e ácidos micólicos; e proteínas (extrato que é utilizado para fabricação da tuberculina) (Hussain, 2007). A bactéria não é classificada nem como gram-positiva, nem como gram-negativa, pois sua parede celular não apresenta características químicas de nehum dos dois. Porém, se o bacilo for submetido a coloração de Gram, poderá ser fracamente corado como gram-positivo (referido como bacilo fantasma). Assim como outras micobactérias, são consideradas bacilos álcool-ácido resistentes (BAAR).

18

Vários genótipos para M. tb. já foram descritos, como por exemplo, RD Rio (Lazzarini

et al., 2007) e Beijing (Gynn et al., 2002). A compreensão das variações genéticas entre os

diferentes genótipos de M. tb. poderia ajudar a esclarecer sua contribuição para as diferenças

fenotípicas, e entender o impacto da variabilidade destas cepas de M. tb. na progressão da

doença seria importante para a implementação de medidas de controle da tuberculose

(Hanekom et al., 2011). Um número crescente de evidências sugere que diferentes cepas de

M. tb. apresentam diferenças substanciais em seu potencial patogênico (Gagneux & Small,

2007; Nicol & Wilkinson, 2008) Observações recentes de associações preferenciais de

linhagens de M. tb. com grupos étnicos podem refletir uma co-adaptação da micobactéria e

seu hospedeiro humano (Gagneux et al., 2006).

Tabela 1.2 - Comparação das características dos genomas de M. bovis, M. tb e M. leprae. Características M. bovis M. tb. M. leprae

Tamanho (Mb) 4.345 4.411 3.268

Genes que codificam:

Proteínas 3.951 3.959 1.614

rRNA 3 3

tRNA 45 45 47*

Pseudogenes 27 6 1.113

Conteúdo G+C (%) 65.6 65.6 57.8 * Compreende tanto os genes que codificam para rRNA quanto para tRNA

1.2.3. Interação das micobactérias patogênicas com o hospedeiro A interação do M. leprae e M. tb. com o hospedeiro determina o desenvolvimento ou

não da doença, bem como de suas complicações. A maioria dos indivíduos infectados não

desenvolve hanseníase ou TB, sugerindo a existência de variações genéticas, biológicas e

ambientais que influenciam na resistência dos indivíduos às estas doenças.

Existem similaridades entre a hanseníase e a tuberculose relacionadas à interação

patógeno-hospedeiro e a ativação da resposta imune celular, onde M. leprae e M. tb. induzem

uma resposta imune celular específica no hospedeiro para controlar a infecção.

Resumidamente, após contato com o hospedeiro, através das vias aéreas superiores, o bacilo

19

pode penetrar no corpo e se espalhar, instalando-se preferencialmente em macrófagos de pele

e em células de Schwann nos nervos periféricos, no caso do M. leprae, e em macrófagos

alveolares no caso do M. tb. Após ser reconhecido pelo macrófago, o bacilo será fagocitado e

em seguida serão ativadas vias que tentarão impedir o sucesso da infecção, tais como a

produção de óxido nítrico, de radicais superóxido, e de peptídeos antimicrobianos como

catelicidina e β-defensinas (Liu et al., 2006). Essa interação micobactéria:hospedeiro pode

ocorrer através da interação com os receptores de fagocitose como C3 (complemento 3) ou

MRC1 (receptor de manose) ou DC-SIGN (receptor de células dendríticas, do inglês,

dendritic cell-specific intercellular adhesion ) e ativação se dá por receptores que reconhecem

padrões ou PRR (do inglês, pattern recognition receptors) como os receptores do tipo Toll

(TLR do inglês, Toll-like receptor) e NOD2 (do inglês, Nucleotide- binding oligomerization).

No final, o isolamento das bactérias em granulomas no pulmão, no caso de M. tb., ou na pele

ou nervo, no caso do M. leprae, é a forma de impedir a progressão da doença (Cardoso et al.,

2011a). Os genes e as vias mais importantes identificados em estudos de associação à

hanseníase estão resumidos na figura 1.4.

Figura 1.4 - Genes e vias mais importantes identificados em estudos genéticos de associação à hanseníase; mostrando desde o primeiro nível de interação da bactéria com a célula do hospedeiro através de PRRs, até a produção de proteínas envolvidas diretamente na atividade microbicida. As setas azuis pontilhadas correspondem às vias de ativação, enquanto as setas sólidas identificam interações ou translocações de cada proteína. Adaptado de Cardoso et al., 2011a.

20

1.3. Principais micobacterioses em humanos

As duas micobacterioses mais importantes como problemas de saúde pública são a

tuberculose e hanseníase. Outra micobacteriose de interesse é a úlcera de Buruli, caracterizada

por ulcerações típicas na pele devido ao desenvolvimento de necrose da derme. Esta doença é

a terceira mais comum causada por micobactérias em humanos, e possui o Mycobacterium

ulcerans como agente etiológico, porém é de pouco interesse clínico e epidemiológico nas

Américas. Já foi observado que a vacinação com BCG também fornece uma significante

proteção contra a úlcera de Buruli em crianças e adultos (Portaels et al., 2002; Portaels et al.,

2004).

Nas últimas décadas, tem sido observado o aumento de micobacterioses causadas por

micobactérias oportunistas. Destas, destaca-se o Mycobacterium abscessus, a mais perigosa

micobactéria, responsável por um amplo espectro de infecções em humanos, como doenças

pulmonares (em condições de predisposição, como fibrose cística), cutâneas e ósseas

(associadas aos cuidados de saúde, como feridas após mamoplastia), e doença disseminada

(casos de cirurgia ocular) (revisado por Medjahed et al., 2009).

Além disso, existem as micobacterioses em animais, sendo a tuberculose bovina a

mais importante. É uma doença infecto-contagiosa, crônica, que apresenta como agente

etiológico o M. bovis. A TB bovina pode causar grandes prejuízos, pois é capaz de levar a

uma redução do tempo de vida produtiva do rebanho, crescimento mais lento ou mesmo perda de

peso e diminuição na produção de leite, sendo importante causa de perdas econômicas (OIE,

2009). Um dos pontos mais críticos desta doença com relação à saúde pública é a transmissão

da TB bovina ao homem por meio do leite de vacas infectadas. Porém, após a implantação da

pasteurização, esta forma de transmissão foi minimizada. Entretanto, esta doença vem se

destacando entre indivíduos que trabalham diretamente com animais contaminados, como

veterinários, tratadores, laboratoristas, entre outros (Michel et al., 2010). E apesar da eficácia

protetora variável, também foi mostrado que a vacinação com BCG leva a uma proteção

contra infecções por M. bovis (OIE, 2009).

1.3.1. Hanseníase

A hanseníase é uma doença infecto-contagiosa de evolução crônica, sistêmica,

considerada uma das mais antigas doenças que afligem o homem. A doença é amplamente

21

conhecida pelo nome de lepra, porém no Brasil, a substituição do termo lepra por hanseníase

foi em homenagem ao médico que identificou a bactéria M. leprae, como já mencionado,

Gerhard Henrik Armauer Hansen. Esta mudança foi realizada justamente para minimizar o

forte estigma social que se faz presente até hoje.

A hanseníase ainda é considerada um problema de saúde pública em alguns países,

dentre os quais se destacam a Índia e o Brasil. Este último apresenta um dos maiores números

absolutos de casos e prevalência acima da meta estabelecida pela OMS (figura 1.5).

Figura 1.5 - Taxas de prevalência de hanseníase no mundo. Os dados são reportados pela OMS e correspondem ao início de 2011. As taxas referem-se a cada 100.000 habitantes da população (WHO, 2011).

De acordo com relatórios enviados de 130 países e territórios à OMS, a detecção de

novos casos registradas em 2010 foi de 228.474, e a prevalência global registrada no começo

de 2010 foi de 192.246 casos (WHO, 2011). Na América Latina, o Brasil se destaca,

apresentando aproximadamente 80% dos casos do continente, com 34.894 novos casos

registrados em 2010, dos quais 7,1% são detectados em menores de 15 anos, indicando a

22

existência de transmissão ativa do bacilo. Embora, a Índia seja responsável pelo maior

número de novos casos de hanseníase no mundo segundo a OMS (134.184 novos casos em

2008), foi observado um declínio nesses números ao longo dos últimos anos, que contribuiu

para a redução na prevalência mundial. Porém, acredita-se que a redução na prevalência

venha sendo influenciada muito mais pela diminuição no tempo de tratamento e pela remoção

dos registros de pacientes curados, do que pela redução nos níveis de transmissão do M.

leprae. Entretanto, em muitos países a redução na prevalência não foi acompanhada pela

redução no número de novos casos o que ocorre, por exemplo, no Brasil (figura 1.6). O

diagnóstico tardio e o longo período de incubação da doença são fatores que contribuem para

a transmissão ativa da hanseníase, dificultando a redução significativa no número de novos

casos.

A hanseníase possui uma distribuição desigual no Brasil, que acompanha a

desigualdade sócio-econômica regional. Em 2009, a região Nordeste foi responsável por

40,8% do número de novos casos no país, seguida da região Norte que possuiu 21,1%

(DATASUS, 2010). Nesse mesmo ano, a região Sudeste possuía 17% do número de novos

casos da doença, enquanto que o Sul, região onde os índices de prevalência já são menores do

que 10 a cada 100.000 habitantes, contribuiu com apenas 4,1% (DATASUS, 2010). Os dados

no país em relação à doença demonstram a necessidade de reforçar a vigilância

epidemiológica nas áreas mais endêmicas, dando continuidade ao cumprimento de atividades

que controlem a transmissão da hanseníase.

23

Figura 1.6 - Taxas de incidência de hanseníase no mundo. Os dados são reportados pela OMS e correspondem ao início de 2011. As taxas referem-se a cada 100.000 habitantes da população (WHO, 2011). As vias aéreas superiores constituem a principal porta de entrada e via de eliminação

do bacilo, constituindo a forma mais provável de transmissão da hanseníase entre seres

humanos. Desta forma, a proximidade com pacientes é um importante determinante da

transmissão da doença (Noordeen, 1994). Os indivíduos com maior probabilidade de contrair

a doença são aqueles que residem na mesma casa, que vivem no peridomicílio ou que tenham

contato íntimo e frequente com o paciente. Um estudo realizado em uma população endêmica

na Indonésia demonstrou que o risco estimado para a hanseníase foi cerca de nove vezes

maior em famílias de pacientes e quatro vezes maior em pessoas com relações diretas com

pacientes em comparação às famílias que não tinham qualquer contato com os doentes (Van

Beers et al., 1999). Outro estudo realizado recentemente por Sales e colaboradores (2011),

confirmou que o principal fator de risco entre os contatos de casos de hanseníase foi a

proximidade com os doentes, onde os contatos intradomiciliares apresentam um risco

praticamente duas vezes maior de adoecer quando comparados àqueles extradomiciliares,

apesar da força desta associação ser diferente para casos incidentes (entendidos como os que

adoecem no acompanhamento após o início do tratamento do caso índice) e co-prevalentes

24

(caso secundário diagnosticado no momento do exame de todos os familiares reportados pelo

paciente índice). Entretanto, além da proximidade, a carga bacilar também mostrou

associação importante na determinação da doença entre os contatos e doentes hansenianos,

onde contatos de casos multibacilares tem uma chance quatro vezes maior de desenvolverem

hanseníase do que contatos de casos paucibacilares. Quando a taxa de adoecimento foi

avaliada, segundo status vacinal, observou-se que o risco de adoecer foi três vezes maior no

grupo sem cicatriz vacinal (não vacinado), do que no grupo com cicatriz vacinal (vacinado).

Apesar de ter sido demonstrado que indivíduos que vivem nas mesmas habitações que

pacientes de hanseníase possuem um risco aumentado de desenvolver a doença, a maioria dos

contatos não a manifesta e a prevalência entre os contatos é baixa. Entretanto, o risco de

adoecimento é também aumentado pelo parentesco, onde a relação de consangüinidade de

primeiro grau é um fator muito importante, indicando um papel fundamental de fatores

genéticos no estabelecimento da infecção por M. leprae, que por sua vez é modulada por

fatores ambientais (Almeida et al., 2004; Moet et al., 2006; Lázaro et al., 2010). Sendo assim,

a hanseníase apresenta um caráter multifatorial, onde o elevado risco de desenvolver

hanseníase possui uma contribuição tanto genética quanto de fatores ambientais (Moraes et

al., 2006), e embora a infecção pelo M. leprae seja a necessária, ela não é suficiente para o

estabelecimento da doença.

A infecção causada pelo M. leprae apresenta um longo período de latência, onde o

tempo médio de incubação nos pacientes pode variar de quatro até trinta anos (Noordeen,

1994). Acredita-se que este longo período de incubação contribua para a transmissão da

hanseníase, pois o indivíduo já poderia estar transmitindo a doença antes mesmo de apresentar

manifestações clínicas. Após o contato do M. leprae com o hospedeiro, o bacilo pode penetrar

no corpo através das vias aéreas superiores, e posteriormente, espalhar-se preferencialmente

em áreas de baixas temperaturas como as extremidades do corpo, como os pés, mãos e face.

As principais manifestações clínicas da hanseníase dependem da resposta imune do

hospedeiro, que influencia não só na suscetibilidade, mas também no curso da infecção

(Ridley & Jopling, 1966). Elas incluem lesões de pele, mucosas e nervos. Desta forma, os

pacientes são classificados em cinco formas clínicas baseadas na carga bacilar e resposta

imune (figura 1.7). A forma mais grave, ou lepromatosa (LL) é caracterizada por uma alta

carga bacilar, numerosas lesões na pele e baixa atividade de resposta imune celular. Já a

forma mais branda, ou tuberculóide (TT), apresenta uma resposta imune celular parcialmente

eficiente que controla a proliferação e a dispersão do bacilo, poucas lesões na pele e baixo

número de bactérias. Existem ainda três formas intermediárias chamadas de borderline

25

tuberculóide (BT), borderline borderline (BB) e borderline lepromatosa (BL), em ordem

crescente de severidade (Ridley & Jopling, 1966). Além desta classificação espectral, a OMS propõe uma subdivisão simplificada dos

pacientes para fins de tratamento. Neste caso, os pacientes são classificados em multibacilares,

caracterizados pela presença de carga bacilar positiva na biopsia, seis ou mais lesões cutâneas

e esfregaço positivo para a presença da bactéria, e incluem as formas LL, BB e BL. Enquanto

os paucibacilares são caracterizados pelo aparecimento de raros bacilos, apresentando cinco

ou menos lesões cutâneas e esfregaço negativo, e incluem as formas TT e BT. Ao longo do

curso natural da doença, os pacientes podem desenvolver reações, que representam episódios

inflamatórios que se intercalam no curso crônico da hanseníase. As reações são divididas em

reação reversa (RR) ou reação do tipo I, que ocorre nas formas BL, BB e BT,

preferencialmente; e eritema nodoso hansênico (ENH) ou reação do tipo II que ocorre mais

freqüentemente, nas formas BL e LL. Ambas as reações são caracterizadas por uma

reativação do processo inflamatório que pode culminar em lesões na pele e neurite aguda no

caso da reação do tipo I e até mesmo complicações sistêmicas no caso da reação do tipo II

(Scollard et al., 2006; Nery et al., 1998).

Figura 1.7 - Formas clínicas da hanseníase. Esquema demonstra o perfil espectral da doença. Representação baseada na classificação de Ridley e Jopling: TT (tuberculóide), BT (borderline tuberculóide), BB (borderline), BL (borderline lepromatosa), LL (lepromatosa). Estão incluídos aspectos da resposta imune do paciente e os episódios reacionais RR (reação reversa) e ENH (eritema nodoso hansênico). Adaptado de Ridley & Joplin, 1966.

26

A hanseníase é a neuropatia não traumática mais importante em saúde pública onde a

lesão neural leva a morbidade cerca de 30% dos pacientes. Existe ainda, a forma neural pura

(PNL) que é uma das formas clínicas da doença causada por M. leprae. A PNL apresenta uma

neuropatia periférica isolada, sem evidências de lesões na pele, caracterizada por disfunção

motora, sensorial ou por ambas. A incidência de pacientes hansenianos com PNL varia de

acordo com a população, onde, por exemplo, na Índia varia de 5,5 a 17,7% de todos os casos

de hanseníase. No Brasil, a proporção de PNL ainda não foi determinada (Jardim et al., 2003).

A PNL é uma das formas mais mutiladoras da hanseníase, já que não há lesões visíveis

na pele que possam indicar um diagnóstico de hanseníase. Além disso, os bacilos podem não

ser demonstrado em esfregaços de pele para confirmar a doença, com isso, os danos

nos nervos prosseguem até se tornarem irreversíveis (Suneetha et al., 2005). O diagnóstico de

PNL exige a realização de biopsias de nervo periférico devido à ausência de lesões cutâneas

(Jardim et al., 2003; Jardim et al., 2005).

Os danos nos nervos periféricos estão presentes em todas as formas de manifestação

da doença. Nas formas iniciais, os nervos sensoriais e motores da pele são afetados, levando a

perda da sensibilidade a estímulos externos, enquanto os danos em nervos cutâneos mais

profundos podem levar a perda da função muscular e a paralisia. A perda das pontas dos

dedos, uma característica da desfiguração dos pacientes com hanseníase, ocorre devido à

osteoporose resultante da inflamação, traumas e à infecções bacterianas secundárias (Wilder-

Smith & Brakel, 2008).

O sistema de classificação clínica e patológica permanece o diagnóstico padrão da

hanseníase, com importantes implicações para o tratamento e prognóstico (Hussain, 2007). O

diagnóstico é comumente baseado em sintomas e sinais clínicos. Os sinais são lesões

cutâneas, nervos espessados e sensibilidade alterada em 70% dos casos. A lesão de pele pode

ser única ou múltipla e geralmente fica menos pigmentada que a pele normal ao redor.

Geralmente, um nervo espessado é muitas vezes acompanhado por outros sinais como

resultado de danos ao nervo. Porém, na ausência de sinais, espessamento dos nervos por si só,

sem perda sensorial e/ou fraqueza muscular muitas vezes não é uma sinal confiável da

hanseníase. Em alguns casos, a confirmação do diagnóstico requer o uso de exames

laboratoriais complementares, como a baciloscopia e a histopatologia. É observada

microscopicamente a presença do M. leprae em amostras obtidas diretamente da pele ou de

lesões, bem como a integridade dos nervos cutâneos.

Ainda não está disponível nenhum teste sorológico que pudesse ser implementado

rotineiramente no diagnóstico da hanseníase. Imunoensaios tem sido desenvolvidos para

27

detectar anticorpos contra o antígeno PGL-1 do M. leprae (Moura et al., 2008), no qual os

níveis de produção do IgM anti PGL-1 indicam exposição ao M. leprae e mostram correlação

positiva com a baciloscopia. Entretanto, esses ensaios ainda não possuem satisfatório grau de

sensibilidade e especificidade para a aplicação de diagnóstico.

Já o diagnóstico laboratorial teve grandes avanços nos últimos anos e foram

desenvolvidos métodos para a extração, amplificação e identificação de DNA do M. leprae

em amostras clínicas utilizando a técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) e outras

técnicas moleculares. Muitos genes foram utilizados no desenvolvimento do ensaio de PCR

para a detecção do bacilo em amostras clínicas, tais como o elemento repetitivo RLEP, fbpB

(Ag 85B), SodA e o rrs (16S rRNA), têm sido utilizados e comparados (Martinez et al., 2006;

Martinez et al., 2009; Martinez et al., 2011), onde RLEP mostrou ser o mais sensível. Esses

ensaios têm sido muito úteis em casos de difícil diagnóstico da doença, devido a sua alta

especificidade e sensibilidade, possibilitando a sua utilização em quase todos os tipos de

amostras clínicas, incluindo linfa, sangue, secreção nasal e biopsias de tecido. Embora a

técnica ainda seja cara e não esteja disponível como um teste de rotina, a PCR pode fornecer

um complemento excelente para diagnóstico clínico e histopatológico da hanseníase

(Martinez et al., 2011).

Desde 1981, a OMS introduziu a poliquimioterapia (PQT) para tratamento da doença

(Scollard et al., 2006). A PQT é uma associação dos antibióticos rifampicina, dapsona e

clofazimina, que dificulta o desenvolvimento de resistência medicamentosa. Essa combinação

elimina os bacilos, impedindo o paciente de transmitir a doença logo no início do tratamento,

e garante a cura da doença caso o esquema terapêutico seja administrado de forma correta.

(Brasil, 2009). Para o tratamento da reação reversa, o único tratamento realmente eficaz é

realizado através da introdução de corticóides, que têm como principal objetivo reduzir a

reação inflamatória. No tratamento do ENH, a droga de escolha é a talidomida, que apresenta

grande efeito imunomodulatório (Sheskin, 1965).

1.3.2. Resposta imune em hanseníase Uma resposta imune inata efetiva em combinação com a moderada virulência do M.

leprae pode ser a base da resistência do indivíduo ao desenvolvimento da doença clínica

(Scollard et al., 2006). Essa resposta imune inata constitui o primeiro nível de interação do M.

leprae com o hospedeiro e pode ser suficiente para reconhecer e restringir a infecção,

28

podendo ser relevante no estágio inicial onde se define o estabelecimento ou não da doença.

Além disso, é importante ressaltar que a interação do patógeno com o hospedeiro é complexa

e multifatorial.

Células fagocitárias, como as células dendríticas e os macrófagos, são as primeiras

células do hospedeiro a responder a infecção por micobactérias. As células dendríticas são

potentes indutores de uma resposta imunológica celular contra micobactérias e são ativadas

durante o primeiro contato com patógeno, passando a ser eficientes em fagocitar, processar e

apresentar antígenos aos linfócitos T e B distantes do sítio da infecção. Além disso, a célula

dendrítica ativada participa na modulação do curso da resposta imune adaptativa, produzindo

moléculas co-estimulatórias e citocinas como IL-12, TNF, IL-10 e IL-6 (Demangel & Britton,

2000). A produção de IL-12 potencializa o desenvolvimento de células Th1, que por sua vez

produzem IFN-γ e TNF. Já a geração de IL-1, IL-6 e TNF contribui para o desenvolvimento

do processo inflamatório, através do recrutamento de leucócitos levando à formação de

granuloma e impede a disseminação das micobactérias.

Os macrófagos participam da interação inicial com o M. leprae, e possuem uma ação

diretamente efetora na restrição do crescimento e proliferação da micobactéria. Foi observado

que após essa interação, os macrófagos passam a apresentar fenótipos distintos relacionados à

resposta imunológica do hospedeiro. Eles diferem em relação a expressão de receptores,

função efetora e produção de citocinas e quimiocinas (Montovani et al., 2002). Macrófagos

no polo tuberculóide da hanseníase são bem diferenciados e raramente contêm bactérias,

enquanto no pólo lepromatoso, esses macrófagos são caracterizados por bacilos intracelulares

abundantes e formação de células espumosas (Cruz et al., 2008). Enquanto no polo

tuberculóide as citocinas expressas são IFN- TNF e IL-15, no pólo lepromatoso as citocinas

majoritariamente expressas são IL-4 e IL-10. Destas citocinas, IL-15 e IL-10 são produzidas

pela ativação do sistema imune inato e são conhecidas por regular a função dos macrófagos

diferenciando-os em macrófagos do tipo 1 ou tipo 2. Estas citocinas seriam capazes de

desencadear distintos programas funcionais em macrófagos, com relevância para a defesa do

hospedeiro na infecção humana (Montoya et al., 2009). Os dois tipos de macrófagos diferem

quanto ao seu papel principal, podendo ser microbicida (tipo 1) ou fagocítico (tipo 2). A

atividade antimicrobiana dos macrófagos induzida por IL-15 seria compatível com as lesões

de pacientes do polo tuberculóide, enquanto IL-10 desencaderia a atividade fagocítica

observada em pacientes com lesões do pólo lepromatoso. Foi observada ainda a conversão

desta atividade fagocítica para a antimicrobiana em pacientes que tiveram reação reversa,

sugerindo um padrão de reativação de uma respota imune celular (Montoya et al., 2009).

29

De fato, a progressão à doença induz modificações celulares onde o M. leprae nos

macrófagos e células de Schwann (e também M. tb. nos macrófagos) após serem fagocitados

levam ao acúmulo de grandes quantidades de lipídios, e foram descritos como células

espumosas (Virchow, 1863). Estas células foram observadas na forma lepromatosa da

hanseníase (e também nas formas pulmonares da TB), porém não na forma tuberculóide (Kim

et al., 2010). Os mecanismos que regulam esse acúmulo de lipídios ainda não estão claros, e

pensava-se que esses lipídios, incluindo fosfolipídeos e ácido graxos, eram derivados de M.

leprae (Sakurai & Skinsnes, 1970). Porém, mais recentemente, foi realizada uma análise mais

detalhada do metabolismo lipídico em lesões LL, indicando o acúmulo de lipídios derivados

do hospedeiro nas células, tais como fosfolipídios oxidados e éster de colesterol (Cruz et al.,

2008; Mattos et al., 2010). Cruz e colaboradores ainda mostrou que esses lipídios,

denominados corpúsculos lipídicos, são capazes de diminuir a regulação da resposta imune

inata, sugerindo que essa acumulação em células infectadas pode favorecer o crescimento

bacteriano e persistência no hospedeiro. Além do efeito inbitório sobre a imunidade inata,

esse acúmulo de lipídios interfere nas funções das células dendríticas e na atividade

antimicrobiana mediada pelos TLRs (Montoya et al., 2009).

Ensaios in vitro utilizando cultura de macrófagos mostraram que micobactérias

patogênicas podem utilizar uma variedade de receptores para sua internalização.

Possivelmente esses diferentes receptores são expressos em várias fases da infecção, de modo

que a capacidade de usar vários receptores do hospedeiro representaria uma série de

adaptações para completar um ciclo de infecção de sucesso (Ernst, 1998). O M. leprae é

reconhecido pelas células do hospedeiro através dos PRRs, receptores que reconhecem os

padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs, do inglês Pathogen-Associated

Molecular Patterns), que variam dependendo da natureza do PAMP e da sua localização na

célula. Os macrófagos possuem uma linha completa de TLR, que são uma família altamente

conservada de proteínas responsáveis pelo reconhecimento de várias vias de padrões PAMPs.

No caso da hanseníase, demonstrou-se que os receptores TLR1 e TLR2 reconhecem

lipopeptídeos da parede bacteriana do M. leprae (Walker & Lockwood, 2006). Esses TLR1 e

TLR2 foram mais expressos em amostras de lesões de pacientes do pólo tuberculóide do que

em lesões de pacientes do pólo lepromatoso, sugerindo que a ativação dos TLR no sítio da

doença contribui para conter a infecção (Krutzik et al., 2003). Depois de ativados pelos seus

ligantes, os TLRs iniciam uma cascata de sinalização que levam à ativação de fatores de

transcrição, tais como o fator nuclear kappa B (NF-kB), levando a indução da resposta

inflamatória e modulação da imunidade inata (Liu et al., 2006).

30

Outra classe de PRRs são os receptores do tipo NOD que são receptores citosólicos,

que reconhecem patógenos intracelulares. Dentre eles, os recpetores NOD1 e NOD2 quando

estimulados, resultam na ativação de NF-kB e proteínas quinases ativadas por mitógenos

(MAPks, do inglês mitogen-activated protein kinases (Hayden et al., 2004), os quais dirigem

a transcrição de numerosos genes envolvidos na resposta imune inata e adaptativa. Apesar do

M. leprae se replicar preferencialmente em vesículas, acredita-se que a bactéria seja

reconhecida pelos receptores NOD através de componentes do bacilo, que podem ser

secretados para o citoplasma (Berrington et al., 2010).

O controle efetivo da infecção pelo M. leprae se dá através do desenvolvimento

preferencial de uma resposta imune do tipo celular, que é altamente complexa e envolve a

geração de vários subconjuntos de linfócitos T com várias funções e liberação de citocinas.

(Hussain, 2007). Estas citocinas, tais como IL-12 e IL-23 ativam uma cascata de sinalização

celular que culmina na liberação de IFN- e, conseqüente, ativação dos mecanismos

oxidativos do macrófago, essenciais para a destruição do bacilo. Dessa forma, o eixo IL-

12/IL-23/IFN-γ é uma das vias principais de ativação celular no combate ao patógeno

intracelular (revisado por Goulart et al., 2002).

O perfil da resposta imune adaptativa potencializa os efeitos da imunidade inata e

esses eventos juntos, atuam de maneira altamente dinâmica para controlar a infecção. A

importância da imunidade adaptativa na resposta imune ao M. leprae acontece principalmente

pelo direcionamento do curso da infecção, assim como das diversas formas clínicas da

hanseníase (revisado por Goulart et al., 2002).

O tipo de resposta desencadeada pelos linfócitos Th, através da produção de citocinas

específicas, pode explicar os diferentes perfis de resposta imune entre pacientes tuberculóides

e lepromatosos (Yamamura et al., 1991). De uma forma geral, os pacientes paucibacilares

com a forma tuberculóide da hanseníase são relativamente resistentes ao patógeno, possuem

uma infecção localizada com granulomas bem formados e as lesões caracterizadas por um

perfil de células Th1 com expressão de citocinas, como IFN-, TNF e IL-2, características de

uma resposta imune celular intensa. IFN- ativa macrófagos infectados, enquanto a IL-2 pode

induzir a expansão de células T ativadas e aumentar a produção de IFN- (Sieling & Modlin,

1994). Em contraste, no pólo oposto, pacientes com a forma lepromatosa são relativamente

suscetíveis ao patógeno, possuem uma infecção sistemicamente disseminada, pois possuem

granulomas mal formados ricos em macrófagos espumosos contendo abundantes bacilos. As

lesões são caracterizadas por um perfil de células Th2, com liberação das citocinas IL-4, IL-5

e IL-10, indicando uma resposta imune celular ineficaz, com falha na ativação de macrófagos,

31

característica das respostas humoral com alta produção de anticorpos, que por sua vez não são

protetores, estando assim, associada com a progressão da doença. (Krutzik et al., 2005).

Em resumo, sugere-se que os pacientes do pólo tuberculóide tenham um padrão de

resposta imune protetora mediada pelas células T parcialmente eficientes, com produção de

citocinas que contribuem na maturação e ativação dos macrófagos, culminando no controle da

multiplicação dos bacilos e a sua subsequente eliminação. Por outro lado, os pacientes do pólo

lepromatoso, parecem possuir um perfil de citocinas que induz a redução da resposta

inflamatória, com inibição de macrófagos e perfil característico da resposta humoral, que

somados a outros fatores, seriam insuficientes para conter o M. leprae. No entanto, muitos

pacientes podem exibir um perfil de resposta mista, produzindo citocinas do perfil Th1 e Th2.

Isso mostra que o predomínio de uma resposta não implica na anulação da outra, e pode

sugerir ainda que em alguns pacientes, a resposta imune ao M. leprae possa não satisfazer

completamente o modelo Th1/Th2. Sendo assim, vale destacar que novos subgrupos de

células T auxiliares já foram descritos, como as células T reguladoras (Treg) e as células T

produtoras de IL-17 (Th17), indicando que a resposta celular não é tão dicotômica como se

pensava (Hall, 2011).

A resposta imune de contatos de pacientes com hanseníase também vem sendo

investigada. No trabalho de Lima e colaboradores (2000) foi comparada a resposta imune à

infecção com M. leprae entre contatos de casos novos de pacientes com hanseníase

multibacilar e os contatos previamente expostos (considerados resistentes) após vacinação

com BCG, e observado uma baixa frequência de indivíduos produtores de INF-γ entre os

contatos de casos novos, bem como uma razão de TNF/IL-10 aumentada, sugerindo que essa

razão aumentada teria um papel na restrição da invasão e replicação micobacteriana no início

da infecção. Por outro lado, foi observado nos contatos previamente expostos, um aumento na

produção de INF-γ, condizente com sua função na resposta protetora, uma produção de IL-5 e

uma razão TNF/IL-10 diminuída.

1.3.3. Genes e imunidade em hanseníase

As características clínicas da hanseníase sugerem fortemente a participação de

diversos genes na regulação da resposta imune, na proteção e na suscetibilidade à doença.

Dentre os genes que participam, os que codificam citocinas são críticos no controle da

natureza, celular ou humoral, gravidade e duração da resposta contra o agente infeccioso.

32

Desta forma, variações pontuais, também conhecidas como polimorfismos de base única

(SNP), nas regiões promotoras ou outras regiões codificantes e não codificantes de citocinas

poderiam influenciar os níveis de expressão gênica ou a atividade de uma enzima, o que

poderia explicar os diferentes padrões de resposta observados entre pacientes tuberculóides e

lepromatosos (Moraes et al., 2004; Santos et al., 2002). Na hanseníase, o TNF apresenta um

papel relevante tanto na resistência quanto na inflamação. Portanto, freqüências de SNPs no

promotor do gene do TNF foram investigadas na população do Rio de janeiro. Esses estudos

sugeriram que o SNP -308A tem uma freqüência aumentada em controles quando comparados

à pacientes, indicando uma associação deste alelo com resistência à hanseníase. Assim, a

produção aumentada de TNF restringiria a proliferação do M. leprae (Santos et al., 2000;

Moraes et al., 2001; Santos et al., 2002).

IL-10 é outra citocina que mostrou estar associada à hanseníase, onde foram

observados níveis aumentados nas formas multibacilares da doença (Yamamura et al., 1991;

Misra et al., 1995; Moubasher et al., 1998). O alelo T do polimorfismo -C819T em IL-10 foi

associado à suscetibilidade à hanseníase na população brasileira em dois estudos diferentes,

sendo confirmado na população indiana (Santos et al., 2002; Malhotra et al., 2005; Pereira et

al., 2009). No estudo de Pereira e colaboradores foram observados níveis menores de IL-10

nos carreadores do alelo -819T comparado com os não carreadores, indicando que este SNP

regula a secreção de IL-10 in vitro e sugerindo que baixos níveis desta citocina durante o

início da hanseníase, podem conduzir a uma resposta do paciente não protetora, levando a

disseminação da doença.

Recentemente foi observado que SNPs no gene LTA4H (leucotrieno A4 hidrolase)

estão associados com proteção tanto da forma multibacilar da hanseníase, quanto da

tuberculose (Tobin et al., 2010). Esse controle genético regula uma produção diferencial do

eicosanóide pró-inflamatório LTB4 (leucotrieno B4) e anti-inflamatório lipoxina A4 (LXA4),

que funcionam de maneira antagônica na regulação dos níveis de TNF (Tobin et al., 2012).

Foi mostrado que genótipos associados a uma baixa produção de LTB4 e altos níveis de

LXA4 levam a baixos níveis de TNF, podendo resultar em tuberculose clínica ou na forma

multibacilar da hanseníase (Tobin et al., 2012). Por outro lado, o excesso de TNF, causado

por genótipos associados a alta produção de LTA4H (e consequentemente excesso de LTB4),

podem levar a uma resposta imune exacerbada e o adoecimento do indivíduo. Assim,

variações genéticas em genes que regulam a resposta imune inata podem afetar a resposta

adaptativa e consequentemente a proteção à M. leprae/M. tb.

33

1.4. Tuberculose A TB é uma doença infecciosa predominantemente urbana, associada a moradias

superlotadas e pouco ventiladas, e está intimamente ligada a pobreza e má distribuição de

renda. Com o surgimento da epidemia da síndrome da imuno deficiência adquirida (AIDS, do

inglês, acquired immune deficiency syndrome), o problema da tuberculose se agravou ainda

mais. O termo tuberculose diz respeito à "tubérculos", que foram as primeiras características

clínicas associadas à doença no século XVII (Hussain, 2007).

A TB continua sendo um sério problema de saúde pública no Brasil. Em 2010, foi

estimado 85 mil novos casos, com uma prevalência de 92 mil e mortalidade em torno de 5 mil

casos. No país, a tuberculose é a terceira causa de óbitos por doenças infecciosas e a primeira

entre pacientes com AIDS (WHO, 2011). No mundo, houve uma estimativa de 8,8 milhões de

casos incidentes. A figura 1.8 apresenta o número estimado de casos novos de TB a cada

100.000 habitantes no mundo. A maior parte destes casos ocorreu na Ásia (59%) e África

(26%), onde a Índia foi responsável por cerca de 30% destes pacientes de tuberculose (WHO,

2011).

Figura 1.8 - Taxas de incidência de tuberculose no mundo. Os dados são reportados pela OMS e correspondem a 2010. As taxas referem-se a cada 100.000 habitantes (adaptado de WHO, 2011).

34

A progressão da TB vai depender de alguns fatores como: as cepas de M. tb.,

exposição prévia, vacinação, a dose infecciosa e o estado imune do hospedeiro. Existem

várias formas da doença, sendo as formas pulmonares as mais freqüentes em adultos. Existem

também, as extra-pulmonares que incluem as formas mais graves de tuberculose, meníngea e

miliar (ou disseminada), e são mais frequentes em crianças, devido a propagação da

micobactéria através do sangue, após uma infecção pulmonar primária. Em adultos, a infecção

está freqüentemente limitada aos pulmões, e reflete a reativação da tuberculose latente,

proveniente de uma infecção primária silenciosa (Alcais et al., 2005). Nos últimos anos, foi

observado o surgimento de cepas multidroga resistente do M. tb. (MDR-TB), devido

predominantemente ao abandono do tratamento. Essa resistência ocorre com maior freqüência

aos quimioterápicos mais comumente empregados no tratamento da TB, a isoniazida e

rifampicina, e estão associados a uma alta taxa de mortalidade, sendo um grande problema em

várias regiões do mundo (Delogu & Fadda, 2009). Com o aumento da infecção pelo vírus da

imunodeficiência humana (HIV) e o risco elevado de indivíduos infectados de desenvolver

TB, a prevalência de MDR-TB deve certamente aumentar em vários países do mundo.

A transmissão da tuberculose se dá através de aerosóis produzidos por indivíduos

contaminados. Os bacilos contidos em gotículas são expulsos por atos respiratórios, fala, tosse

e espirros. Raramente, o M. tb. é transmitido por ingestão ou infecção da pele (Hussain, 2007).

A probabilidade de transmissão de uma pessoa para outra depende do número de bacilos

expelidos por um transportador, a eficácia da ventilação, a duração da exposição e a

virulência da cepa micobacteriana.

Após a inalação do aerosol contendo os bacilos, as bactérias podem atingir os alvéolos

pulmonares e se espalhar para os nódulos linfáticos e então, através da corrente sanguínea,

alcançar tecidos mais distantes onde a doença pode se desenvolver. Porém, na maioria dos

casos, a resposta imune do hospedeiro é capaz de conter a multiplicação do bacilo, impedindo

sua disseminação. Uma vez que os bacilos são fagocitados pelos macrófagos alveolares, se

não forem detidos, haverá uma intensa multiplicação dos bacilos, onde acontecerá o

rompimento dos macrófagos e disseminação da bactéria. Então, a exposição do homem ao M.

tb. pode levar a alguns resultados potenciais, que incluem uma eliminação precoce da

infecção (provavelmente por mecanismos da imunidade inata), desenvolvimento da doença

logo após a infecção (tuberculose primária ou pós-primária), ou o desenvolvimento de uma

infecção subclínica ou assintomática (tuberculose latente) com potencial de transição para a

doença ativa ao longo da vida do indivíduo infectado (Hussain, 2007).

35

O M. tb. apresenta mecanismos de escape do sistema imune pela inibição da maturação

do fagossoma, que permite sua sobrevivência e multiplicação dentro de macrófagos. Após

serem fagocitados, os bacilos podem inibir a fusão fagossomo-lisossomo. A bactéria pode

permanecer ou escapar do fagossomo, porém em ambos os casos ela encontra um ambiente

protegido para o crescimento no macrófago (revisado por Houben et al., 2006; revisado por

Hussain, 2007). A formação do granuloma através da agregação de macrófagos ativados e

linfócitos impedem a disseminação da bactéria, que no interior do granuloma pode ficar em

estado de dormência, catacterizando uma infecção latente (revisado por Houben et al., 2006).

Mesmo com sua atividade metabólica deprimida, o bacilo pode proliferar dentro do

granuloma, podendo reativar a infecção posteriormente.

O controle da infecção por M. tb. depende do reconhecimento do patógeno e ativação de

ambas as respostas imune inata e adaptativa (Quesniaux et al., 2004). A detecção de M. tb.

por macrófagos e células dendríticas via PRRs, como a família de TLRs, desencadeia cascatas

de sinalização, que iniciam secreção de citocinas, sugerindo um papel na proteção contra M.

tb.. Por exemplo, foi observado que a ativação do heterodímero TLR2/1 reduziu a viabilidade

de M. tb. intracelular em monócitos humanos e macrófagos, porém não em células dendríticas

derivadas de monócitos (Liu et al., 2006). A regulação de genes induzidos por TLR2/1

influenciando na viabilidade de M. tb. e M. leprae, foi mostrada recentemente por Liu e

colaboradores (2012), como sendo realizada por microRNAs (miRNAs). Neste trabalho, os

autores identificaram um miRNA, hsa-mir-21, que se mostrou mais expresso tanto em lesões

de pacientes com a forma lepromatosa, quanto em monócitos in vitro infectados com M.

lepare. Esse hsa-mir-21 diretamente diminuiu a expressão CYP27B1 (citocromo P450, família

27, subfamília B, polipeptídeo 1) e IL1B que são induzidos por TLR2/1, e indiretamente

induziu IL-10, levando a inibição da expressão de genes que codificam dois peptídeos

antimicrobianos dependentes de vitamina-D, CAMP (catelicidina) e DEFB4A (defensina beta

4A). Além disso, foi observado que o bloqueio deste miRNA levou a restauração da atividade

antimicrobiana mediada por TLR2/1.

A infecção de macrófagos por M. tb. induz tanto citocinas pró-inflamatórias, tais como

TNF, IL-2 e IL-6, bem como citocinas imunoreguladoras, como IL-10 (Giacomini et al.,

2001). Já foi demonstrado que a liberação de TNF nestes macrófagos infectados pode ter um

efeito no aumento da atividade antimicobacteriana, ativando macrófagos e induzindo

formação de granuloma, enquanto TNF em excesso na célula hospedeira resulta em necrose e

disseminação de micobactérias (Mootoo et al., 2009). Enquanto IL-10 está associada com

doença progressiva (Jamil, et al., 2007), a ausência dele resulta em falta de imuninade contra

36

a micobactéria.

O diagnóstico da tuberculose é baseado principalmente nas características clínicas,

histopatologia e isolamento da bactéria a partir de tecido. A radiografia de tórax mostra a

cavitação, a calcificação no caso de doença curada, e nódulos nos lobos superiores, porém não

confirma o diagnóstico. Já granulomas com caseificação obtido de biopsias podem indicar o

diagnóstico, mas se não houver caseificação, podem ter outros possíveis diagnósticos. Os

esfregaços de escarro e culturas também são úteis no diagnóstico da tuberculose pulmonar.

Porém o diagnóstico definitivo requer crescimento da bactéria e confirmação do M. tb. com

testes bioquímicos ou sondas de DNA, o que pode levar várias semanas (Hussain, 2007).

O tratamento da tuberculose é prolongado e a associação de drogas é necessária

devido ao freqüente aparecimento de sub-populações resistentes. As drogas mais comumente

utilizadas são a isoniazida, rifampicina, pirazinamida, estreptomicina e etambutol,

consideradas drogas de primeira linha, geralmente utilizadas em casos novos. Já a etionamida,

cicloserina, ácido p-aminossalicílico (PAS), tiacetozona, canamicina, capreomicina,

amicacina e fluoroquinolonas são consideradas drogas de segunda linha e utilizadas no

retratamento ou como alternativa para o tratamento de TB, quando os bacilos são resistentes

às drogas de primeira linha (WHO, 2010). O aparecimento da resistência do M. tb. às drogas

acontece quando o paciente é submetido a um esquema terapêutico inadequado ou quando

ocorre o abandono do tratamento.

1.5. Expressão gênica global em infecções micobacterianas

Estudos de expressão gênica global apresentam-se como ferramentas valiosas na

compreensão da interação micobactéria-hospedeiro. Entretanto, existem poucos estudos de

expressão gênica utilizando modelos animais vacinados ou infectados com BCG. Um destes

estudos, utilizando a tecnologia de microarranjo identificou diferenças na expressão gênica

em camundongos vacinados com BCG (Danish 1331) e infectados com M. tb. (Mollenkopf et

al., 2006), onde foram observados genes induzidos por M. tb, incluindo INF-γ e CCL8.

Também utilizando a tecnologia de microarranjo, Tree e colaboradores (2006) conseguiram

examinar a expressão de múltiplas citocinas, quimiocinas e genes relacionados à resposta

imune no modelo de porquinho da índia, definindo um perfil imunológico da vacinação de

BCG neste modelo de cobaia. Neste mesmo contexto, há poucos relatos do perfil de expressão

gênica global induzido por micobactérias em células humanas, onde em um dos estudos, por

37

exemplo, foi analisado através da utilização da tecnologia de microarranjo, diferenças na

expressão gênica de células THP-1 infectadas com M. tb. em diferentes tempos de infecção

(Ragno et al., 2001). Recentemente, foram analisadas diferenças no perfil de expressão gênica

entre pacientes com TB, indivíduos infectados sem manifestações clínicas (TB latente) e

indivíduos saudáveis, onde não foram observadas importantes diferenças entre os grupos de

indivíduos saudáveis e os com TB latente, entretanto foram observados genes

diferencialmente expressos entre os pacientes com TB e o grupo com TB latente, mostrando

um enriquecimento de genes envolvidos na regulação da resposta imune, transdução de sinais

e ativação de leucócitos (Maertzdorf et al., 2011).

O microarranjo é uma poderosa ferramenta que permite obter informações sobre a

expressão de muitos genes avaliados simultaneamente em diferentes condições biológicas,

podendo ser utilizado para estudar a resposta do hospedeiro à diversos microorganismos

patogênicos. Apesar das novas tecnologias desenvolvidas, como os sequenciadores de nova

geração, o microarranjo é uma ferramenta empregada até hoje e é umas das tecnologias

empregadas neste estudo, onde utilizamos arranjos de genes envolvidos direta e indiretamente

na resposta imune ao BCG e M. leprae viável.

Também foi observada a existência de poucos estudos de comparação do perfil de

expressão gênica global induzido pelas diferentes cepas vacinais de BCG. Um dos trabalhos

foi o de Di Pietrantonio e colaboradores (2011), mencionado anteriormente, onde foi realizada

uma investigação simultânea dos efeitos do background genético do hospedeiro e da

micobactéria na magnitude e variância de fenótipos da resposta do hospedeiro. Ao empregar

duas linhagens diferentes de camundongo, com três cepas diferentes de BCG e uma cepa de

M. tb., os autores confirmaram que camundongos distintos geneticamente diferem

significantemente na sua suscetibilidade a infecções micobacterianas. No trabalho de Irwin e

colaboradores (2008), ao utilizar populações geneticamente homogêneas de linhagens puras

de camundongos, foram observadas diferenças na resposta imune às cepas de BCG

(Connaught, Pasteur e Sweden). Neste trabalho, ainda que não tenha sido investigado o perfil

de expressão gênica, os autores mostraram que apesar das cepas de BCG induzirem uma

resposta imune qualita- e quantitativamente diferente, elas induziram uma redução semelhante

da carga bacilar após desafio com uma cepa virulenta de M. tb. Embora os dados obtidos com

sistema murino contribuam no entendimento da influência genética do hospedeiro, bem como

das interações hospedeiro-patógeno, resultados observados utilizando modelos animais nem

sempre traduzem o ocorrido em sistema humano, principalmente devido a diferenças na

suscetibilidade à TB (e hanseníase) e os padrões de doença. Com isso, se faz necessária a

38

confirmação dos resultados em hospedeiro humano.

1.6. Células THP-1

Monócitos e linhagens de células monocíticas geralmente apresentam número

reduzido de receptores e são menos eficientes em fagocitar patógenos (Schwende, 1996).

Entretanto, macrófagos diferenciados apresentam um grande número de receptores e tem

capacidade fagocítica aumentada. Estudos de interações entre micobactérias e macrófagos

humanos têm empregado muitos sistemas, como células primárias e diferenciadas in vitro,

para mimetizar a situação in vivo. A linhagem celular de leucemia monocítica aguda humana,

THP-1, obtida através da purificação de monócitos do sangue periférico de uma criança com

leucemia monocítica aguda, desenvolve função de macrófagos mediante a adição de

estimuladores. Um dos estimuladores é o acetato de forbol-miristila (PMA) que ativa proteína

quinase C e induz um grande grau de diferenciação em células THP-1. As células após serem

diferenciadas passam a ter uma diminuição na síntese de DNA, a aderir em plásticos e

assemelham-se a macrófagos primários em sua morfologia e, além disso, passam a expressar

marcadores de superfície associados a diferenciação dos macrófagos (Schwende, 1996).

Essa linhagem é um sistema bem estabelecido para o estudo do crescimento e

persistência de micobactérias (Paul et al., 1996; Oliveira et al., 2001; Theus et al, 2004). Por

exemplo, esse sistema foi utilizado para examinar a taxa de crescimento de cepas de M. tb. de

isolados clínicos, para determinar se esta se correlacionava com a virulência previamente

definida em modelos animais (Paul et al., 1996). Neste estudo, as cepas H37Rv e sua variante

avirulenta H37Ra de M. tb. apresentaram taxas de crescimento similares em THP-1, o que não

era observado em macrófagos de camundongos in vitro, onde o crescimento da cepa H37Rv

foi mais rápido, indicando que a virulência da micobactéria em sistema murino não

necessariamente traduz o ocorrido em sistema humano. Recentemente (Singhal et al., 2012),

as células THP-1 foram utilizadas para analisar e comparar perfil de expressão proteica após

infecção por isolados clínicos de M. tb., onde foi observado que a maioria das proteínas

comumente expressas tanto após infecção por M. tb. sensível quanto por M. tb.-MDR,

pertenciam a categoria de metabolismo celular e respiração, representando alguns

mecanismos em comum adotados por estas micobactérias (sensível e resistente) para sua

sobrevivência.

Esse sistema foi também empregado na comparação da apoptose induzida pela

39

infecção por M. leprae e BCG, onde observou-se que havia uma inibição da apoptose em

células THP-1 infectadas pelo M. leprae e aumento desta quando infectadas pelo BCG

(Montreal) (Hasan et al., 2006a). Recentemente, células THP-1 foram utilizadas para avaliar a

influência de espécies reativas de oxigênio (ROS) na secreção de CCL2 após infecção por

BCG (Méndez-Samperio et al.., 2010), e foi demonstrado que esse ROS tem um papel

essencial na regulação da secreção desta quimiocina por estas células infectadas com BCG.

CCL2 tem um papel importante na infecção micobacteriana por induzir recrutamento e

ativação de leucócitos. A utilização deste modelo pode ajudar a esclarecer eventos

moleculares envolvidos no início de interações entre macrófagos e micobactérias.

40

2. JUSTIFICATIVA

41

Ainda hoje a incidência de hanseníase e tuberculose permanece alta e, por esta razão,

ambas as doenças são consideradas problemas de saúde pública no Brasil. A única vacina

empregada na prevenção destas doenças ainda possui um efeito protetor muito variável na

população, sendo pouco eficiente especialmente na população adulta, independente da cepa

vacinal ou do país onde se emprega a vacina. Algumas hipóteses sugerem que a resposta

imune induzida durante a vacinação não é duradoura e, portanto, se perde na idade adulta.

Mesmo assim, a BCG é uma vacina segura e protege crianças contra tuberculose meníngea,

embora com taxas variáveis de proteção nos diversos países onde é utilizada. De fato, o

entendimento aprofundado que indique o porquê de tantas diferenças na eficácia da BCG nos

países em que é utilizada, pode fornecer pistas sobre a melhor abordagem para melhorar a

vacina ou os esquemas de vacinação (via de administração, número de doses, uso de

adjuvantes, etc). As diferenças genéticas entre as cepas BCG são consideradas como fatores

importantes na variabilidade observada na imunidade protetora adquirida após a vacinação.

Identificar mecanismos de ativação da resposta imune do hospedeiro por diferentes

cepas de BCG é importante para entender o processo de interação micobactéria-hospedeiro.

Entretanto, até o momento, foi observado apenas um estudo de análise de padrões de

expressão gênica em humanos utilizando a cepa BCG Moreau (Schreiber et al., 2010),

importante pela sua imunogenicidade. Além disso, também só foi observado um estudo

comparando o perfil de expressão gênica de BCG Moreau com outras cepas de BCG (Wu et

al., 2007), realizado em condições diferentes do presente estudo. Realizamos ainda a inédita

comparação entre BCG Moreau e M. leprae viável. Essas comparações realizadas com uma

lógica de testar concentrações diferentes de bactéria por célula (2:1 e 10:1), bem como

identificar um perfil de expressão gênica específico, podem ajudar a entender as vias

principais de ativação, que pode culminar no desenvolvimento de melhores vacinas. Nesse

trabalho, pretende-se determinar o perfil de expressão gênica relacionada à resposta imune

empregando o sistema de células humanas diferenciadas in vitro e diferentes cepas de

micobactérias.

Os genes utilizados para análise da expressão gênica pelos métodos de RT-PCR em

tempo real (qRT-PCR) e PCR multiplex em tempo real (Biomark, Fluidigm) foram incluídos

no presente estudo após terem sido observados em estudos da literatura, bem como em outros

trabalhos desenvolvidos em nosso laboratório, e que foram surgindo ao longo do nosso estudo.

Porém, por limitação de tempo e principalmente de material, a expressão de alguns genes só

foi analisada em algumas condições, como observado na tabela que se encontra no anexo I.

42

3. OBJETIVOS

43

3.1. Objetivo geral Analisar a resposta imuno-inflamatória através do perfil de expressão gênica frente à infecção

pelas cepas vacinais de BCG Danish, Moreau e Pasteur, e compará-la a resposta imuno-

inflamatória à infecção por M. leprae.

3.2. Objetivos específicos:

3.2.1. Estabelecer padrões de expressão gênica e secreção de citocinas em células THP-1

diferenciadas, infectadas com as cepas de BCG Danish, Moreau e Pasteur, e M. leprae

vivo por 24 horas, em diferentes MOI (multiplicidade de infecção);

3.2.2. Avaliar os níveis de secreção de citocinas, incluindo TNF, IL-10, CCL2 e IL-8 a

partir das dosagens em sobrenadantes de cultura de células mononucleares de sangue

periférico (PBMC) in vitro nas infecções pelas cepas de BCG Danish, Moreau e Pasteur;

3.2.3. Avaliar a influência de polimorfismos genéticos na secreção de citocinas, TNF e IL-

10 em culturas de PBMC infectadas com as cepas de BCG Danish, Moreau e Pasteur;

3.2.4. Comparar a expressão gênica de células THP-1 infectadas com M. leprae e BCG

Moreau, através de microarranjo de DNA, para identificar genes diferencialmente

expressos entre esses dois modelos de infecção;

3.2.5. Estabelecer padrões de expressão gênica em biópsias de nervo de pacientes

hansenianos, na tentativa de correlacionar com os resultados obtidos de células após

infecção por M. leprae;

44

4. MATERIAIS E MÉTODOS

45

4.1. Desenho de estudo O desenho do estudo adotado na presente tese encontra-se resumido na figura 4.1.

Figura 4.1 – Desenho experimental do estudo. A partir de uma hipótese a priori, genes identificados em trabalhos anteriores foram incluídos no presente estudo e analisadas a expressão gênica e secreção de proteínas de células THP-1 infectadas com cepas de BCG (Danish, Moreau e Pasteur) e M. leprae em diferentes concentrações de bactérias, MOI 2:1 e 10:1. Também foram dosados níveis de proteínas em sobrenadantes de PBMCs infectadas com as cepas de BCG para investigação de diferenças não observadas em THP-1. Paralelamente, a partir de um estudo sem hipótese a priori, foi analisado o perfil de expressão gênica por microarranjo de células THP-1 infectadas com BCG Moreau e M. leprae em MOI 10:1. Genes identificados como diferencialmente expressos nos ensaios de microarranjos não foram validados no presente estudo, entretanto os genes identificados serão incluídos em ensaios de PCR em tempo real para confirmação. Além disso, foram utilizadas biopsias de nervos de pacientes hansenianos e não hansenianos para confirmação in vivo da expressão gênica diferencial observada em experimentos com THP-1.

46

4.2. Cultivo de micobactérias

4.2.1. BCG

As cepas vacinais BCG Danish, doada pela Dra. Leila Mendonça Lima (Laboratório

de Genômica Funcional e Bioinformática, Instituto Oswaldo Cruz, Fiocruz), BCG Moreau,

doado por Carolina Zavareze (Fundação Ataulfo de Paiva, RJ) e BCG Pasteur 1173P2 (OMS)

foram cultivadas em meio de cultura Middlebrook 7H9 (DIFCO Laboratories, EUA) contendo

0,02% glicerol, 0,05% Tween-80 (DIFCO laboratories, EUA) e enriquecido com 10%

Middlebrook ADC (albumina bovina, dextrose, catalase) por cerca de duas semanas, em

constante agitação, em uma temperatura de 37º C. Após esse período, a densidade óptica

(D.O.) foi medida e ao atingir uma D.O. de aproximadamente 1, as bactérias foram utilizadas

para contagem.

Antes das infecções, uma alíquota de cada cultura em suspensão foi centrifugada a 500

rpm por 2 min para evitar grumos de micobactérias. Os sobrenadantes foram utilizados para a

quantificação das bactérias na câmara de contagem de bactéria Petroff-Hausser. Depois de

contadas, as suspensões foram centrifugadas a 14.000 rpm por 10 minutos, o sobrenadante

descartado, e o sedimento ressuspenso em RPMI 1640. Este sedimento foi posteriormente

utilizado nos ensaios de infecção. As suspensões contendo bacilos que não foram utilizadas

imediatamente foram aliquotadas em 20% de glicerol (LGC Biotecnologia, Brasil) estéril e

estocadas a -70º C até o momento da utilização em ensaios de infecção posteriores ou para um

novo cultivo.

4.2.2. Mycobacterium leprae

Foi utilizado M. leprae Thai-53 vivo, tanto cedido pela Dra. Patrícia Sammarco Rosa

(Instituto Lauro de Souza Lima, Bauru, SP) quanto pelo Dr James Krahenbuhl (Department of

Health and Human Services, Baton Rouge, Louisiana, EUA). Em ambas as fontes de M.

leprae, a micobactéria foi proveniente de modelo de infecção de coxim plantar de

camundongos atímicos nude (nu/nu) infectados. Após ser colhida das patas dos camundongos,

a suspensão de bacilos foi tratada com hidróxido de sódio 0,1 M, e, posteriormente

ressuspensa em meio de cultura 7H12 Middlebrook (DIFCO Laboratories, EUA)

47

suplementado com 50 µg/mL de ampicilina (Sigma-Aldrich, EUA) e 50 µg/mL de

anfotericina B (Sigma-Aldrich, EUA). Os bacilos foram incubados por três horas em estufa a

33° C. As bactérias foram centrifugadas a 10.000 x g por 5 minutos e ressuspendidas em meio

de cultura D-10 contendo DMEM (Gibco, Life Technologies EUA), 10% soro fetal bovino

(SFB) inativado (HyClone Laboratories, Canadá) e 50 µg/mL de gentamicina (Sigma-Aldrich,

Brasil). Posteriormente os bacilos foram quantificados por contagem direta em microscópio

óptico através de lâmina corada pelo método de Kinyoun (Barlelt, 2000), descrito no item

4.2.3. Todas as infecções realizadas com M. leprae vivo, foram incubadas em estufa a 33ºC e

5% CO2.

4.2.3. Pureza e viabilidade das culturas de micobactérias

A pureza das culturas de micobactérias foi determinada através da técnica de Kinyoun.

Para isso, foram utilizados 10 L da cultura para fazer um esfregaço em lâmina de vidro.

Depois de seco, o esfregaço foi fixado na lâmina por calor. Posterior à fixação, a lâmina foi

coberta com fucsina fenicada, deixando agir por cerca de 5 minutos. A lâmina foi lavada

delicadamente em água corrente para a retirada da fucsina e, em seguida, foi lavada com a

solução de álcool-ácido para a descoloração. Novamente, a lâmina foi lavada em água

corrente para a retirada do álcool-ácido. Posteriormente, a lâmina foi coberta com solução de

azul de metileno durante 30 segundos. Mais uma vez, a lâmina foi lavada em água corrente e,

depois de seca, foi observada ao microscópio óptico com lente de imersão (Nikon Eclipse

E400) em um aumento de 100 x. A cultura foi determinada livre de contaminação, quando

foram observados apenas bacilos corados com fucsina (em rosa).

A viabilidade das culturas de micobactérias foi observada por coloração fluorescente

através do ensaio BacLight® Live/Dead (Invitrogen, Life Technologies, EUA). Para isso, as

micobactérias foram centrifugadas a 14.000 rpm por 10 minutos, o sedimento ressuspendido

em 300 L PBS 1x, e então adicionado 6 M de SYTO 9 (componente A) e 30 M de iodeto

de propídio (componente B) por 15 minutos à temperatura ambiente. Após a coloração, foi

realizado um esfregaço em lâmina de vidro. Através da microscopia de fluorescência,

bactérias vivas e mortas foram quantificadas por contagem dos bacilos verdes e vermelhos,

respectivamente. Essa discriminação ocorre pela capacidade dos corantes usados de

penetrarem nas bactérias em questão. O corante SYTO 9 marca todas as bactérias,

independente de sua viabilidade. Entretanto, o iodeto de propídio penetra somente nas

48

bactérias com danos na membrana, reduzindo assim a fluorescência do corante SYTO 9.

Assim, bactérias viáveis, com a membrana intacta, irão fluorescer em verde, enquanto

bactérias com danos na membrana irão fluorescer em vermelho. A taxa de viabilidade

considerada para a utilização das micobactérias nos ensaios de infecção foi de >80%.

4.3. Cultivo de células e infecção

4.3.1. Células THP-1

Células THP-1 adquiridas do American Type Culture Collection (ATCC, Rockville,

EUA) foram cultivadas em meio RPMI-1640 completo (LGC Biotecnologia, Brasil) contendo

2 mM L-Glutamina, 100 U/mL de penicilina e 100 g/mL estreptomicina, e suplementado

com 10% de SFB (HyClone Laboratories, Canadá). As células foram mantidas em frascos de

cultura na estufa a 37ºC com 5% CO2. A quantificação de células viáveis foi realizada através

do método de exclusão por meio de coloração pelo azul Tripan (Sigma-Aldrich, EUA). Após

duas semanas de expansão, as células foram contadas através da câmara de Neubauer e

diferenciadas em macrófagos, mediante estímulo com 80 nM (50ng/mL) de acetato de forbol-

miristila (PMA, Sigma-Aldrich EUA). Após 24 horas de diferenciação, o meio foi trocado

para retirada do PMA e adicionado meio RPMI fresco sem adição de antibiótico. Os

macrófagos derivados de THP-1 foram então, infectados com as cepas vacinais de BCG em

diferentes multiplicidade de infecção (MOI) 2:1 e 10:1, ou com M. leprae em MOI 2:1 e 10:1,

por 24 horas.

4.3.2. Células Mononucleares de Sangue Periférico (PBMC) humanas Apenas para os estudos funcionais, foram coletadas amostras de sangue periférico de

22 voluntários sadios com média de idade de 33 anos. Neste grupo estavam incluídos 17

indivíduos do sexo masculino, e 5 indivíduos do sexo feminino.

As amostras de sangue periférico foram coletadas em tubos com heparina e diluído

numa proporção 1:1 em meio RPMI-1640 completo (LGC Biotecnologia, Brasil) contendo

2mM L-Glutamina, 100 U/mL de penicilina e 100 g/mL estreptomicina. O sangue diluído

foi cuidadosamente depositado sobre um gradiente de Ficoll-Hypaque (Sigma-Aldrich, EUA)

49

na proporção 1:2 e centrifugado a 1.200 x g por 20 minutos, sem freio, à temperatura

ambiente. Ao final da centrifugação, o anel contendo PBMC, que se encontra na interface

Ficoll-Hypaque/plasma foi coletado. As células obtidas foram lavadas com meio RPMI na

proporção 1:1 e centrifugadas a 670 x g por 10 minutos a 4º C. O sobrenadante foi descartado

e o sedimento foi ressuspenso com RPMI, na mesma proporção, ocorrendo então, uma nova

centrifugação a 670 x g por 10 minutos a 4º C. Esse processo foi repetido e o sedimento foi

ressuspenso em 5 mL de meio RPMI contendo 10% de SFB. A quantificação de células

viáveis foi realizada através do método de exclusão, por meio de coloração pelo azul de

Tripan (Sigma-Aldrich, EUA), em câmara de Neubauer, observada em microscópio óptico,

com aumento de 40x. Em seguida, 3 x 106 células foram cultivadas em placas de cultura de 24

poços de fundo chato (BD Biosciences FALCON™) com meio RPMI completo acrescido de

10% de soro AB RH+ humano inativado (Sigma-Aldrich), e foram infectadas com cada uma

das cepas de BCG em MOI 10:1. Estas células foram mantidas na estufa a 37º C com 5% CO2

por 24 e 72 horas.

A retirada do sangue periférico dos indivíduos aconteceu depois da obtenção do termo

de consentimento livre e esclarecido por escrito, como aprovado pelo Comitê de Ética em

Pesquisa em seres humanos da Fiocruz (Protocolo CEP 206/03). O processamento do sangue

dos indivíduos incluídos neste estudo foi realizado em câmara de fluxo laminar respeitando as

normas de precauções para manipulação de material biológico.

4.4. Biópsias de nervos humanos

A coleta de rotina de biopsias de nervo foi realizada no Ambulatório Souza Araújo

(ASA, Instituto Oswaldo Cruz, Fiocruz, RJ) em pacientes de difícil diagnóstico, como é o

caso da forma neural pura da hanseníase, onde a patologia é restrita ao nervo e o paciente não

apresenta lesões de pele (Jardim et al., 2003). Foram coletadas 96 biopsias de nervos de

pacientes atendidos no ASA com intuito de se fazer diagnóstico. Todos os indivíduos

apresentavam neuropatia periférica com exame de eletroneuromiografia alterado (Jardim et

al., 2003) e tinham suspeita de hanseníase. O protocolo de extração de RNA e DNA destas

biópsias foi estabelecido para realização de estudos de expressão gênica a partir de nervos

colhidos para o diagnóstico molecular e histopatológico (Martinez et al., 2009). Também, foi

coletado sangue total destes mesmos pacientes a partir do qual, foi extraído DNA para

genotipagem de polimorfismos em alguns genes previamente associados à hanseníase.

50

Os ensaios que se valeram da utilização de amostras humanas foram realizados depois

da obtenção do termo de consentimento livre e esclarecido por escrito, de acordo com as

normas do Comitê de Ética em Pesquisa da Fiocruz (protocolo CEP/Fiocruz 151/01).

4.5. Extração de Ácidos Nucléicos

4.5.1. Extração de RNA de células THP-1

As células THP-1 tiveram seu RNA extraído pelo método descrito pelo fabricante do

reagente Trizol (Invitrogen, Life Technologies, EUA). Após 24 horas de infecção, o

sobrenadante das células foi retirado e armazenado -20° C. Nas células aderentes foi

adicionado 1 mL de Trizol para rompimento das células e estas foram destacadas utilizando a

ajuda de um raspador plástico estéril (“rodinho”) e transferidas para tubos eppendorf de 1,5

mL. Em seguida, adicionou-se 200 L de clorofórmio (Merck, Alemanha) a cada tubo

seguido de homogeneização por inversão. Os homogeneizados foram centrifugados a 14.000

x g por 15 minutos a 4° C. A fase aquosa superior contendo o RNA foi transferida para novos

tubos eppendorf de 1,5 mL, foi adicionado 500 L isopropanol (Sigma-Aldrich, EUA),

misturado por inversão e incubado a -70° C, por uma noite ou mais. Após a incubação, os

tubos foram centrifugados a 14.000 x g por 20 minutos a 4° C. O sobrenadante foi descartado

e os sedimentos lavados com 500 L de etanol (Merk, Alemanha) 70% por centrifugação a

10.000 x g por 10 minutos a 4° C. O sobrenadante foi aspirado e os sedimentos foram

ressupensos em 30 L de água tratada com dietilpirocarbonato 0,01% (v/v) (DEPC,

Invitrogen, Life Technologies, EUA).

Posteriormente, foi realizada uma quantificação do RNA através da leitura em

espectrofotômetro NanoDrop ND-1000 (Thermo Scientific, Waltham, EUA), onde 1 µl da

amostra foi lido contra um “branco” contendo água DEPC. Para avaliar a pureza das

amostras, utilizou-se a razão da absorbância em dois comprimentos de onda, onde a razão

A260/280 indica o grau de contaminação por proteínas e a razão A260/230 indica a contaminação

por compostos orgânicos. Amostras com razões de A260/280 e A260/230 inferiores à 1,8 foram

consideradas inadequadas e foram repurificadas até atingirem a razão de A260/280 e A260/230

iguais ou superiores à 1,8. A análise da integridade do RNA foi observada através da

eletroforese em gel de agarose (Invitrogen, Life Technologies, EUA) a 1,2% em tampão

MOPS 1X (Sigma-Aldrich, EUA), no qual 200 ng de RNA foi previamente desnaturado com

51

35% formamida, MOPS 1X e corado com 0,125% azul de bromofenol e 1 L de SYBR Green

II 100X (Applied Biosystems, Life Technologies, EUA). O RNA foi incubado em banho seco

a 65° C por 10 minutos e, em seguida, aplicado ao gel. O gel foi submetido a uma corrente

elétrica de 100 V por 40 minutos. Após a corrida eletroforética, o gel foi analisado por um

sistema de fotodocumentação (l-Pix Touch, Loccus Biotecnologia, Brasil).

4.5.2. Extração de DNA das amostras de sangue total O DNA foi extraído a partir de amostras de sangue total dos indivíduos saudáveis

utilizando o método salting out (Miller et al., 1988), com algumas modificações.

Primeiramente, foram adicionados 10 mL de tampão TE (Tris-HCl 10 mM; EDTA 1 mM) a

um tubo cônico Falcon de 15 mL contendo 2 mL de sangue total. O conteúdo do tubo foi

misturado por inversão e centrifugado a 1.200 x g durante 20 minutos. Após o sobrenadante

ter sido descartado, tampão TE foi adicionado ao precipitado até completar o volume de 10

mL. Posteriormente, o material foi homogeneizado no vórtex até que o precipitado estivesse

completamente dissolvido e, em seguida, o tubo foi centrifugado a 1.200 x g durante 20

minutos. O sobrenadante foi descartado e o precipitado foi novamente ressuspenso em 10 mL

de tampão TE, homogeneizado e centrifugado. Depois de descartar o sobrenadante, foi

adicionado ao precipitado 600 µL de tampão de lise (Tris-HCl 10 mM pH 8.0, NaCl 400 mM

e EDTA 2 mM), 80 µL de uma solução de SDS a 10% e 9 µL de solução de proteinase K a 25

mg/mL. O material foi homogeneizado no vórtex por 2 segundos e incubado a 37º C durante a

noite. Posteriormente, foram acrescentados 200 µL de uma solução de acetato de sódio

saturado a 6,83 M e o material foi centrifugado a 1.200 x g por 20 minutos. O sobrenadante

foi coletado e transferido para um novo tubo de 15 mL, ao qual foi adicionado etanol absoluto

(2 vezes o volume recuperado). A solução foi então misturada por inversão até que o DNA

precipitasse. O precipitado de DNA foi coletado e transferido para um microtubo eppendorf

de 1,5 mL, adicionando-se 200 µL de etanol 70%. Em seguida, o material foi centrifugado a

12.000 rpm por 5 minutos e o sobrenadante foi descartado. O microtubo foi cuidadosamente

mantido invertido por 30 minutos para que o etanol evaporasse completamente. Finalmente,

foram adicionados 100-200 µL de tampão TE (Tris-HCl 5 mM pH8.0, EDTA 0,1 mM) ao

sedimento de DNA, e o material foi incubado a 56º C até que o sedimento estivesse dissolvido.

Posteriormente, o DNA foi quantificado através da leitura em espectrofotômetro NanoDrop

ND-1000 (Thermo Scientific, Waltham, EUA), observando-se os mesmo parâmetros descritos

52

no item 4.4.1, e em seguida estocado a -20ºC.

4.5.3. Extração de RNA e DNA de biopsias de nervos humanos

A extração de RNA de biópsias de nervo foi realizada pelo método descrito pelo

fabricante do reagente Trizol (Invitrogen, Life Technologies, EUA). Para isso, as biopsias,

pesando em torno de 10 mg, foram maceradas utilizando pistilo e almofariz de inox mantidos

congelados em gelo seco. O macerado foi colocado em microtubos eppendorf de 1,5 mL e

adicionado 1 mL de Trizol. Em seguida, foi adicionado 200 L de clorofórmio:álcool

isoamílico (Sigma-Aldrich, EUA) 24:1 a cada tubo seguido de homogeneização por inversão.

Os passos seguintes de extração de RNA foram realizados como descrito no item 4.4.1. As

fases intermediária e inferior orgânica foram armazenadas a -20° C para posterior extração de

DNA. Posteriormente, foi realizada a extração de DNA presente na interfase e na fase

orgânica inferior. Para isso, foi adicionado aos tubos contendo as fases de interesse, 100 L

de tampão TE (Tris-HCl 5 mM pH8.0, EDTA 0,1 mM) e 150 L de clorofórmio:alcool

isoamílico (24:1). A mistura foi homogeneizada no instrumento FastPrep 120 (MP

Biomedicals, Solon, OH, EUA) na velocidade de 6,5 metros/segundo (m/s) por 45 segundos.

Logo após, os tubos foram incubados em gelo por 5 minutos e então centrifugados a 12.000 x

g por 10 minutos à temperatura ambiente. A fase aquosa superior foi transferida para um novo

tubo eppendorf de 1,5 mL, onde foram adicionados 2 vezes o volume de isopropanol e 2 L

de GlycoBlue (Invitrogen, Life Technologies, EUA) e, então foi homogeneizada por inversão.

A mistura foi incubada por no mínimo 4 horas a -20° C seguido de centrifugação a 12.000 x g

por 30 minutos à temperatura ambiente. O sobrenadante foi descartado e o sedimento lavado

com 500 L de etanol 70% por centrifugação a 12.000 x g por 15 minutos a 4° C. O

sobrenadante foi descartado e o sedimento foi seco à temperatura ambiente por

aproximadamente 15 minutos. O DNA foi ressuspenso em 20-30 L de água tratada com

DEPC.

4.6. Ensaios de associação de micobactérias com células THP-1 4.6.1. Marcação das micobactérias As cepas de BCG e M. leprae foram marcados com o PKH2 Green Fluorescent Cell

53

Linker Kit (Sigma-Aldrich, EUA), de acordo com instruções do fabricante. Para isso,

aproximadamente 107 bacilos foram centrifugados a 14.000 rpm por 10 minutos à temperatura

ambiente. O sobrenadante foi descartado e o sedimento foi ressuspenso em 1 mL do diluente

A. Posteriormente, foi adicionado 1 mL do corante PKH2 diluído no diluente A e

homogeneizado. A mistura foi incubada por 5 minutos à temperatura ambiente, protegido da

luz. Em seguida, foi adicionado igual volume de SFB e incubados por 1 minuto, para a

neutralização. A suspensão de bacilos foi, então, diluída em igual volume de meio RPMI-

1640 completo e centrifugada por 10 minutos a 14.000 rpm. Após a centrifugação, o

sobrenadante foi descartado e as bactérias foram lavadas por três vezes com meio RPMI-1640

para a retirada do excesso de fluorocromo. Ao final, as bactérias foram ressuspendidas no

volume inicial de meio de cultura e a eficiência da marcação monitorada em microscópio de

fluorescência com lente de imersão (Nikon Eclipse E400) em aumento de 1000X.

4.6.2. Avaliação da associação de micobactérias com células THP-1 Para avaliar a eficiência da infecção das culturas, células THP-1 foram infectadas com

as diferentes cepas de BCG (Danish, Moreau e Pasteur) e M. leprae por períodos de até 48 h.

Para isso, 3 x 105 células diferenciadas foram infectadas com micobactérias marcadas, em

MOI 10:1, e incubadas a 37º C, por até 48 horas. Posteriormente, as células foram lavadas

com PBS e depois destacadas com ajuda de um raspador plástico estéril (“rodinho”) e

mantidas em PBS com 2% SFB. Aproximadamente 10.000 células foram adquiridas em

citometria de fluxo Accuri C6 (Accuri Cytometers, Inc.) e a fluorescência detectada pelo

canal FL1-A. As amostras foram adquiridas com e sem corante vital Azul de Tripan (0,4%)

com o objetivo de distinguir células contendo bactérias aderidas e/ou internalizadas. Neste

ensaio, denominado ensaio de “quenching”, o corante é adicionado para “apagar” a

fluorescência das bactérias extracelulares (Lamprou et al., 2007). O percentual de células

associadas à bactérias (adesão + internalização), bem como o percentual de células contendo

apenas bactérias internalizadas (fagocitose) foi determinado a partir de culturas não infectadas.

A análise quantitativa dos dados foi realizada utilizando programa cflow Plus.

4.7. PCR em tempo real

4.7.1. Síntese de cDNA

54

O cDNA foi transcrito reversamente a partir do RNA total utilizando superscript III

seguindo instruções do fabricante (Invitrogen, Life Technologies, EUA). Inicialmente, 1 µg

RNA em solução aquosa, foi misturado a 0,5 µg de iniciador oligo(dT) e 0,125 mM de dNTP,

e incubado no banho seco (modelo DB- Heat & Cool, Loccus Biotechnologia, Brasil) por 5

minutos a 65° C. Posteriormente, a essa mistura foi adicionado o tampão da enzima em

concentração final 1x, DTT a 10 mM, 40U de Inibidor de RNAse e 200U da enzima

Superscript III, em um volume final de 20 µL. Em seguida, esta reação foi incubada em banho

seco por 60 minutos a 50° C para realização da transcrição, seguidos de 15 minutos a 70° C

para a inativação da enzima. Ao final da reação, adicionamos 180 µL de água milli-q. O

cDNA foi armazenado a -20° C.

4.7.2. Reação de RT-PCR em Tempo Real (qRT-PCR)

A reação de PCR em tempo real foi realizada utilizando o sistema SYBR Green I

(Applied Biosystems, Life Technologies, EUA) seguindo instruções do fabricante. Para isso,

foi utilizado 5 µM de cada cDNA e, a estes, adicionados Sybr Green PCR Master Mix 1X

(Applied Biosystems, Life Technologies, EUA) e 0,25 µM de cada oligonucleotídeo, em um

volume final de 20 µL. Para cada amostra foi amplificado o cDNA dos genes de interesse

além dos genes constitutivos RPL13, RPS13 e HPRT1. As reações foram incubadas no

sistema de PCR em tempo real ABI 7000 (Applied Biosystems, Life Technologies, EUA),

seguindo as condições da reação: 95° C por 10 minutos, seguido de 40 ciclos de 95° C por 15

segundos e 60° C por 1 minuto. Ao final da reação de amplificação, as amostras foram

submetidas a uma nova incubação para geração da curva de dissociação, onde se determina o

ponto correspondente à temperatura de dissociação dos oligonucleotídeos de suas sequências

alvo.

Todos os oligonucleotídeos utilizados na reação de qRT-PCR (tabela em anexo I)

foram desenhados a partir de sequências de referência de cada gene obtidas no UCSC

Genome Bioinformatics (http://genome.ucsc.edu/), utilizando o software Primer3 v.0.4.0

(http://frodo.wi.mit.edu/primer3), para tal, alguns fatores foram controlados: (i) tamanho do

iniciador; (ii) tamanho do produto; (iii) temperatura de anelamento dos iniciadores; (iv)

conteúdo GC do iniciador; (v) chance de pareamento entre o par de iniciadores e dentro do

mesmo iniciador; e (vi) força de anelamento na extremidade 3’ do iniciador. Após serem

desenhadas, as sequências foram validadas pela ferramenta Primer-BLAST

55

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast) utilizando o banco de genes humanos do

NCBI (National Center for Biotechnology Information).

4.7.3. Análise dos dados de qRT-PCR Primeiramente, foi realizada no próprio equipamento, uma análise da curva de

dissociação (curva de “melting”), para confirmar a amplificação específica através da

temperatura de dissociação do produto de amplificação, que produz um único pico. Caso

tenha sido observada a presença de produtos inespecíficos na reação ou formação de dímeros

de oligonucleotídeos, era realizada uma de eletroforese em gel de agarose para confirmação

dos produtos indesejáveis, e caso fosse confirmado, essa quantificação era descartada e

repetida.

A partir dos dados de acúmulo de fluorescência das triplicatas da reação de qRT-PCR

de cada amostra (Rn), utilizou-se o ajuste de função logística, ou curva sigmóide, de quatro

parâmetros para representar cada curva de amplificação, usando a biblioteca de funções qpcR

(Ritz & Spiess, 2008), para a linguagem estatística R (R Development Core Team, 2009)

versão 2.922. O ciclo de quantificação, ou Cq, foi determinado como o ciclo relativo ao ponto

de máxima da segunda derivada da curva sigmóide ajustada (ponto característico, ou crossing

point [Cp]). O uso desse ponto de máxima característico é conveniente uma vez que ele se

encontra numa região de eficiência constante na fase exponencial da curva de amplificação,

além de ser invariante do poço e placa aonde ocorre a reação de qRT-PCR (Rebrikov et al.,

2006). A eficiência de cada reação de amplificação foi calculada como a razão entre a

fluorescência do ciclo de quantificação e a florescência do ciclo anterior a esse. A eficiência

estimada de cada gene foi obtida pela eficiência média das eficiências calculadas para cada

reação de amplificação daquele gene. Os genes empregados na normalização entre as

diferentes amostras amplificadas foram selecionados pelos métodos geNorm (Vandesompele

et al., 2003) e NormFinder (Andersen et al., 2004). O algoritmo do geNorm parte do

pressuposto de que os genes com expressão mais estável em relação aos outros genes

analisados são os mais adequados para normalização interna. Enquanto, o algoritmo

NormFinder parte do pressuposto de que a expressão média entre todos genes testados possua

uma pequena variação entre grupos, próxima de zero.

Para a comparac o de dias dos valores de o normalizados entre os grupos

foi utilizado one-way ANOVA o trica via permutaço irrestrita (n=1000), seguido

da comparac o de dias par-a-par por teste t o trico via permutac o (n=1000) com

56

correc o de Bonferoni (Basso et al., 2009). Os dados são apresentados pela média ± erro

padrão da média. Níveis de significância bi-caudais menores ou iguais a 0,01, 0,05 e 0,1

foram considerados como altamente significantes, significantes e sugestivos, respectivamente.

4.8. Multiplex PCR em Tempo Real

Outra metodologia utilizada em nosso estudo para a análise da expressão gênica foi a

tecnologia de qRT-PCR multiplex em sistema microfluídica da Fluidigm, no qual foi utilizado

um painel de 48 genes (tabela no anexo I) para uma análise simultânea de 96 amostras.

Em um primeiro experimento foram utilizadas células THP-1 infectadas com as cepas

de BCG Danish, Moreau e Pasteur em MOI 2:1 e 10:1; e infectadas com M. leprae em MOI

2:1 e 10:1. Em um segundo experimento, foi utilizado o cDNA de biopsias de nervos

humanos.

4.8.1. Reação de PCR multiplex em Tempo Real

Inicialmente, 100 ng de cDNA foi pré-amplificado em um termociclador convencional

(Gene Amp PCR System 9700, Applied Biosystems, Life Technologies, EUA) com uma

mistura de 48 oligonucleotídeos (tabela no anexo I) para cada uma das 96 amostras

simultaneamente. Para isso, foi utilizado 2,5 µL do TaqMan preAmp Master mix (Applied

Biosystems, Life Technologies, EUA) na presença de 200 nM de cada oligonucleotídeo e 1,25

µL de cada cDNA em 5 µL finais, nas seguintes condições da reação: 95° C por 10 minutos,

seguido de 14 ciclos de 95° C por 15 segundos e 60° C por 4 minutos. Posteriormente, o

cDNA pré-amplificado é carregado no controlador de fluídos e depois amplificado no sistema

Biomark (Fluidigm, EUA), que com um sistema de microfluidica, define 9216 pontos com

poços de 8nl possibilitando a amplificação simultânea de 96 amostras por 96

oligonucleotídeos, ou como foi utilizado em nosso estudo, 48 oligonucleotídeos em duplicata.

Para a amplificação em tempo real no sistema Biomark (Fluidigm, EUA), 2 µL de

cada cDNA pré-amplificado foi misturado a 2,5 µL de 2x Taqman Gene Expression Master

mix (Applied Biosystems, Life Technologies, EUA) e 0,25 µL de 20x EvaGreen DNA

binding dye (Applied Biosystems, Life Technologies, EUA) em 5 µL finais. Paralelamente,

20 µM de cada um dos 48 oligonucleotídeos foi misturado a 2,5 µL de 2x Assay Loading

Reagent (Applied Biosystems, Life Technologies, EUA) em 5 µL finais. Então, ambos cDNA

57

pré-amplificado e as sondas, foram adicionados no chip (96.96 Dynamic Array IFC, Fluidigm,

EUA), em seus respectivos poços, e esse chip foi colocado no IFC Controller MX (Fluidigm,

EUA) para que fosse carregado. Em seguida, o chip carregado foi adicionado ao

termociclador Biomark (Fluidigm, EUA) para a amplificação simultânea das 96 amostras

onde cada oligonucleotídeo foi analisado em cada uma das amostras.

4.8.2. Análise dos dados de PCR multiplex em tempo real

A partir dos dados de acúmulo de fluorescência das duplicatas da reação de PCR

multiplex em tempo real de cada amostra (Rn), utilizou-se o ajuste de função logística, ou

curva sigmóide, de quatro parâmetros para representar cada curva de amplificação, utilizando

a biblioteca de funções qpcR, para a linguagem estatística R (R Development Core Team,

2009) versão 2.922. O ciclo de quantificação, ou Cq, foi determinado pelo ciclo

correspondente ao ponto de máxima da primeira derivada da curva sigmóide ajustada (Cp). A

eficiência de cada reação de amplificação foi calculada como a razão entre a fluorescência do

ciclo de quantificação e a florescência do ciclo anterior a esse. A eficiência estimada de cada

gene foi obtida pela eficiência média das eficiências calculadas para cada reação de

amplificação daquele gene. Os genes empregados na normalização entre as diferentes

amostras amplificadas foram selecionados pelos métodos geNorm e NormFinder.

Para a comparaço de dias dos valores de o normalizados entre os grupos

foi utilizado one-way ANOVA o trica via permutac o irrestrita (n=1000), seguido

da comparac o de dias par-a-par por teste t o trico via permutac o (n=1000) com

correc o de Bonferoni (Basso et al., 2009). Os dados são apresentados pela média ± erro

padrão da média. Níveis de significância bi-caudais menores ou iguais a 0,01, 0,05 e 0,1

foram considerados como altamente significantes, significantes e sugestivos, respectivamente.

4.9. Microarranjos de DNA 4.9.1. Desenho experimental Para avaliar o efeito da cepa de BCG Moreau e M. leprae na expressão gênica global

58

de células THP-1 e observar possíveis diferenças na resposta destas células, foi utilizada a

técnica de microarranjo de DNA. Para isso, foram utilizadas três condições experimentais:

células THP-1 não infectada, células THP-1 infectadas com BCG Moreau e células THP-1

infectadas com M. leprae, por 24 horas. As comparações foram realizadas entre: as células

infectadas com BCG Moreau e infectadas com M. leprae; e células não infectadas e infectadas

com M. leprae (figura 4.2). As hibridações foram realizadas em triplicata biológica, com troca

dos fluoróforos entre as amostras, resultando em um total de 12 lâminas.

As lâminas utilizadas nesse estudo foram adquiridas da Stanford Genomics Facility e

continham 44.544 sondas de oligonucleotídeos de 70 bases. Desses, 30.718 sondas

reconheciam transcritos de genes, 8.441 reconheciam exons de alguns genes com splicing

alternativo conhecido, 196 reconheciam RNA não codificante e 372 sondas reconheciam

transcritos de genes que sofrem rearranjo somático. Além dessas sondas, também estava

incluída na lâmina um conjunto grande de controles de hibridação incluindo 398 controles

negativos, 864 positivos e 1384 controles que reconhecem sequências não-humanas de

amostras controle acrescentadas ao RNA antes da marcação. Também foi adquirido da

Stanford o pool de RNAs controle spike-in contendo 51 RNAs não-humanos que são

reconhecidos pelas sondas controle. O desenho experimental das hibridizações foi do tipo

competitivo, no qual duas amostras foram hibridadas por lâmina, sendo cada amostra marcada

com fluoróforos distintos (Alexa 555, cor verde, ou Alexa 647, cor vermelha). Duas lâminas

foram hibridadas para cada conjunto de amostras, e em cada uma dessas hibridações foi

efetuada a troca dos fluoróforos entre as amostras (do inglês, dye swap).

Figura 4.2 - Desenho experimental de microarranjos de DNA. Foi analisada a diferença na expressão gênica de células THP-1 após 24 horas de infecção por BCG Moreau ou M. leprae. Desenho com replicação em dye swap. As setas correspondem a hibridações entre as duas amostras. Por convenção, representamos a amostra corada em verde na ponta e a amostra

Células THP-1 não infectadas (controle)

Células THP-1 infectadas com M.lep

Células THP-1 infectadas com BCG Moreau

59

corada em vermelho na cauda da seta.

4.9.2. Amplificação do RNA

O RNA extraído das células THP-1 foi amplificado utilizando o kit Message AmpTM

II aRNA (Ambion, Life Tecnologies), seguindo as recomendações do fabricante. Para isso, 2

µg de RNA total foram submetidos a uma transcrição reversa para a síntese de uma primeira

fita de cDNA numa reação contendo T7 oligo (dT), 1 X First Strand Buffer, 4 µL dNTP, 1 µL

de inhibidor de RNases e 1 µL de enzima ArrayScript, em 20 µL finais. A reação foi incubada

por 2 horas a 42º C. Posteriormente, foi realizada a síntese da segunda fita de cDNA através

de uma reação contendo, além do conteúdo da primeira reação, 1 X Second Strand Buffer, 4

µL dNTP, 2 µL de DNA polimerase e 1 µL de RNase H, em 100 µL finais. Essa reação foi

incubada por 2 horas a 16º C. O cDNA de dupla fita foi purificado através de colunas do

próprio kit e em seguida submetida a uma transcrição in vitro para síntese de aRNA numa

reação contendo tampão da transcrição, dNTP e enzima que foi incubado por 14 horas a 37º

C. O aRNA foi purificado através de colunas do kit e quantificado no espectrofotômetro

NanoDrop ND-1000.

4.9.3. Marcação fluorescente da segunda fita de cDNA

As amostras de aRNA foram submetidas a marcação direta para a incorporação de

nucleotídeos acoplados aos fluoróforos Alexa 555 ou 647 através de uma adaptação do

Bioprime DNA labeling kit (Invitrogen, Life Technologies, EUA). Para isso, 2 µg de aRNA

foram submetidos a uma reação de transcrição reversa contendo 2 µL de random primer, 2 µL

dNTP, 1 µL RNA controle (spike-in), 1 X First Strand Buffer, 1 µL DTT, 1 µL inibidor de

RNase e 2 µL enzima Superscript III, no volume de 20 µL. Essa reação foi incubada a 50º C

por 2 horas em termociclador. Posteriormente, o RNA foi digerido adicionando-se ao tubo 1

X Tampão RNase One, 2 µL de enzima RNase One e 68 µL de água livre de nucleases (água

DEPC). Esta reação foi incubada por 10 minutos a 37º C. O restante do cDNA foi purificado

por centrifugação a 13.000 x g por 10 minutos em colunas Microcon 30 (Millipore). Em

seguida o cDNA foi marcado numa reação contendo 20 µL da solução de random primer, 1

µL do fragmento Klenow da DNA polimerase, 120 µM de dATP, dTTP e dGTP, 60 µM de

60

dCTP não marcado, e 40 µM de dCTP-Alexa 555 ou 647, em um volume final de 50 µL.

Após incubar a 37º C por 3 horas, o cDNA marcado foi purificado por 4 centrifugações a

13.000 x g em colunas Microcon 30, com 400 µL de água DEPC cada vez. Ao final da

purificação, as amostras foram quantificadas no espectrofotômetro NanoDrop ND-1000 para

cálculo do grau de incorporação dos fluoróforos (DoL, do inglês, Degree of Labelling). O

DoL é expresso em porcentagem e representa o número de bases marcadas incorporadas a

cada 100 bases. Valores de DoL entre 1,0 e 3% indica boa incorporação e foram utilizados

como controle de qualidade das marcações.

4.9.4. Hibridação e lavagem das lâminas de microarranjo

Antes da hibridação, as lâminas de microarranjo foram lavadas para retirada de sujeira

e bloqueadas para evitar sinal inespecífico seguindo as recomendações do fabricante. Para

isso, as lâminas foram lavadas nas seguintes condições: 5 minutos em Triton X-100 0,1%

(v/v); 2 minutos em 1 mM HCl por 2 vezes; 10 minutos em 100 mM KCl; 1 minuto em água

Milli-Q; 15 minutos a 50º C em 50 mM etanolamina, 0,1% SDS e 0,1 M Tris-HCl, pH 9.0; 1

minuto em água Milli-Q. As amostras marcadas e purificadas foram hibridadas com as

lâminas de microarranjo em solução contendo 5 X SSC (NaCl/citrato de sódio) e 0,1% SDS

(dodecil sulfato de sódio). A hibridação foi realizada em câmaras mantidas em banho-maria a

60º C sob agitação por 18 horas. Após a hibridação, as lâminas foram lavadas em vidro

béquer sob agitação contendo 500 mL das seguintes soluções: 2 X SSC, 0,2% SDS por 10

minutos; 0,5 X SSC, 0,02% SDS por 10 minutos; 0,1 X SSC por 5 minutos; 0,1 X SSC por 5

minutos. As lâminas foram secas por centrifugação em suporte apropriado por 10 minutos a

500 x g.

4.9.5. Aquisição e análise das imagens do microarranjo

As lâminas foram analisadas em um leitor óptico (Vers Array Chip ReaderTM,

BioRad), que quantifica a emissão de fótons após a excitação dos fluoróforos por um laser,

em leituras independentes ao comprimento de onda de 532 nm (para quantificação do Alexa

555, denominado canal “verde”) ou de 635 nm (para quantificação do Alexa 647, denominado

canal “vermelho”). Nesse estudo, cada lâmina foi analisada com 9 µm de resolução dos pixels

61

e intensidade do laser de 100%, porém variando a voltagem do tubo fotomultiplicador de

forma a balancear a razão da emissão entre os canais.

A análise das imagens foi realizada através do programa GenePix Pro v.6.0 (Axon), e

incluiu três etapas: (i) gradeamento, que é o alinhamento de uma grade sobre os pontos de

impressão das sondas para marcar as coordenadas de cada ponto; (ii) segmentação, na qual

uma máscara circular é posicionada sobre o ponto, e os pixels que localizam-se sob a máscara

são classificados como sinal, enquanto que os pixels fora da máscara são classificados como

ruído; e (iii) quantificação, na qual são calculadas estatísticas correspondentes às áreas de

sinal e ruído segmentadas (média, mediana, desvio-padrão, distância interquatílica). O método

de segmentação utilizado por este programa é o de círculos adaptativos, que permitem

variações no diâmetro de cada ponto (Yang et al., 2001).

4.9.6. Análise de dados

Todas as análises foram realizadas utilizando o pacote Limma (Smyth, 2004)

desenvolvido para a linguagem de programação R (R Development Core Team, 2010),

utilizando as medianas do sinal e do ruído em cada canal como dados brutos de entrada, uma

vez que médias são mais influenciadas por valores extremos. A correção pelo ruído é utilizada

para remover os possíveis efeitos de hibridação não-específica da heterogeneidade espacial no

microarranjo. Entretanto, a correção de ruído padrão, estimada pela subtração sinal - ruído

para cada ponto em cada canal introduz uma grande variabilidade nos pontos de baixa

intensidade e gera problemas como valores negativos de intensidade. O método de correção

pelo ruído empregou o modelo de misturas normo-exponencial (Bolstad, 2004), que é mais

adequado por evitar valores negativos. Os pontos foram filtrados por três critérios: razão sinal

ruído (SNR, do inglês, signal to noise ratio) > 3, flag do software Genepix -49, Hthreshold

< 0,2. O software Genepix identifica pontos não detectados durante o gradeamento com flag

no valor de -50. O Hthreshold é um critério que elimina pontos com grande diferença entre a

média e a mediana da intensidade dos pixels (normalizados pela média de intensidade do

canal), que podem representar pontos com artefatos.

Em seguida, foram feitos gráficos MA (MA plots) para visualização do perfil das

intensidades dos pontos de cada lâmina. Esses gráficos foram propostos por Dudoit e

colaboradores (2002) e tem se tornando o método padrão para visualização de dados de

microarranjos por hibridação competitiva pelo fato dos mesmos revelarem mais

62

características e artefatos dos dados que os RG plots utilizados anteriormente. O gráfico MA é

feito plotando no eixo x o valor da intensidade média de todos os pixels em escala log2 [índice

A; A = 1/2 (log2R + log2G); onde R e G são os valores de intensidade do ponto nos canais

vermelho e verde, respectivamente (do inglês, Red e Green)] e no eixo y a razão da expressão

entre os canais, que é estimada pela diferença na quantidade de pixels em escala log2 [índice

M; M = log2R - log2G = log2 (R/G)]. Após análise visual dos gráficos MA, optou-se pela

normalização lowess global (Yang et al., 2002) e pelo escalonamento pelos quantis da

distribuição dos valores médios de intensidade A, método conhecido por A-quantile (Irizarry

et al., 2003). Aos dados normalizados e escalonados, assim como para o experimento anterior

de microarranjo, optou-se pelo ajuste de um modelo linear com um fator principal (infecção) e

apenas dois níveis, infectado ou não-infectado. Esse modelo de one-way ANOVA pode ser

representado por: Yij = µi +Iij+ εij, onde, Yij é a expressão log-transformada do gene i, i

={1,...,n}, dada a presença ou ausência de infecção Ij, j={1,2}. A média global é representada

por µ, enquanto ε corresponde ao componente aleatório do modelo. Em seguida, dois testes de

hipótese foram utilizados na comparação de médias do contraste de interesse: (i) frequentista

moderado e; (ii) Bayesiano. Os mesmos critérios de seleção de genes diferencialmente

expressos (GDEs) foram considerados, ou seja: (i) p-valor ajustado < 0,05, para controle do

erro family-wise do tipo I ou false discovery rate (Benjamini e Hochberg, 1995); (ii) valor

absoluto de log fold change 1 (fold change 0,5 ou fold change 2); e (iii) odds

Probability 0,95. Foi realizada uma anotação funcional dos genes através do software

Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery (DAVID;

http://david.abcc.ncifcrf.gov).

4.10. Genotipagem de polimorfismos de base única por PCR em tempo real

4.10.1. Genotipagem de SNPs dos genes IL-10, TNF e TLR1 Para identificar se polimorfismos em genes de citocinas envolvidas na resposta imune,

que exercem alguma influência na suscetibilidade ou resistência à hanseníase, influenciam a

secreção de citocinas por PBMC infectadas com diferentes cepas de BCG, fizemos a

genotipagem dos SNPs IL10 -819 C>T (rs1800871), TNF -308 G>A (rs1800629) e TLR1 743

A>G (N248S) (rs5433095), através da técnica de discriminação alélica utilizando PCR em

tempo real. Nesta técnica, são utilizadas sondas fluorescentes específicas para cada alelo, e a

63

inferência dos genótipos são baseadas na intensidade de fluorescência.

Tabela 4.1 - Condições das reações de PCR em tempo real para amplificação de regiões polimórficas dos genes IL-10 -819 C>T, TNF -308 G>A, TLR1 743 A>G e TNFSF15 A>G.

SNPs IL-10 -819C>T TNF -308G>A TLR1 743A>G

Ciclagens (1 ciclo) (1 ciclo) (1 ciclo)

Para desnaturação

94°C-3min

Para desnaturação

94°C-5min

Para desnaturação

95°C-10min

(35 ciclos) (35 ciclos) (40 ciclos)

94°C-40seg 94°C-1min 95°C-15seg

56°C-45 seg 57°C-1min 60°C-1 min

72°C-40seg 72°C-1min 60°C-30seg

(1 ciclo) (1 ciclo) -

Para extensão final

72°C-10min

Para extensão final

72°C-5min - As reações de PCR foram realizadas utilizando o sistema TaqMan Assay (Applied

Biosystems, Life Technologies, EUA), de acordo com recomendações do fabricante,

utilizando o aparelho StepOne Real Time PCR Systems (Applied Biosystems, Life

Technologies, EUA). Este sistema é baseado no uso de duas sondas, cada uma carregando um

fluoróforos, VIC e FAM, específicas para cada alelo estudado. Para isso, foram utilizados 20-

50µg/mL de DNA, misturados a TaqMan Universal Master Mix (40X) e a sonda. As

condições das reações de PCR em tempo real foram diferentes para cada sonda, e estão

descritas na tabela 4.1. Os oligonucleotídeos e as sondas utilizadas nos ensaios também se

encontram na tabela 4.2. A determinação dos genótipos foi realizada através do programa

Step One 2.1 software (Applied Biosystems, Life Technologies, EUA), obtendo-se uma razão

entre a fluorescência dos dois fluoróforos (R).

64

Tabela 4.2 - Seqüências dos oligonucleotídeos-iniciadores e sondas empregadas para tipificação dos SNPs nos genes IL-10 -819 C>T e TNF -308 G>A pela técnica de PCR tempo real.

Gene SNP

Seqüências 5’3’ dos

oligonucleotídeos iniciadores

Seqüências 5’3’ dos

oligonucleotídeos sondas

IL-10 -819 C>T

F 5’-GGCACTGGTGTACCCTTGTA 3’

R 5’-CATGACCCCTACCGTCTCTATTTT 3’

VIC: 5’CACAGAGATGTTACATCAC 3’

FAM: 5’CACAGAGATATTACATCAC3’

TNF -308 G>A

F 5’-CCAAAAGAAATGGAGGCAATAGGTT 3’

R 5’-GGACCCTGGAGGAGGCTGAAC 3’

VIC: 5’CCCGTCCCCATGCC 3’

FAM: 5’CCCGTCCTCATGCC3’

TLR1 743 A>G C__44103606_10 (Código do Ensaio Applied)

VIC: 5’ TAAGGTAAGACTTGATAACTTTG

FAM: 5’ TAAGGTAAGATTTGATAACTTTG F (forward) = oligonucleotídeo senso; R (reverse) = oligonucleotídeo antisenso. Obs: em negrito e vermelho são demonstrados os SNPs identificados pelos oligonucleotídeos-sondas

4.11. Dosagem de citocinas

4.11.1. Desenho experimental Foi utilizado sobrenadante de células THP-1 infectadas com as cepas de BCG Danish,

Moreau e Pasteur, e M. leprae em MOI 2:1 e 10:1 por 24 horas, para a dosagem de TNF, IL-

1, IL-8, IL-10 e CCL2. Ainda, foi utilizado o sobrenadante de PBMC infectadas com as

cepas de BCG Danish, Moreau e Pasteur após 24 horas, para a dosagem de TNF e IL8; e após

72 horas, para a dosagem de IL-10.

4.11.2. Dosagem das citocinas TNF, IL-8, IL-1, IL-10 e CCL2 As citocinas TNF, IL-1, IL-8, IL-10 e CCL2 foram quantificadas separadamente por

Ensaio Imunoenzimático (ELISA, do inglês Enzyme-linked immunosorbent assay) utilizando

kit DuoSet (R&D Systems, EUA) específico para cada citocina, de acordo com as

recomendações fornecidas pelo fabricante. Inicialmente, placas de 96 poços de fundo chato

65

(NUNC) foram sensibilizadas com 50 L do anticorpo de captura específico para cada

citocina, diluído em PBS, por 16 horas a temperatura ambiente. Posteriormente, os poços

foram lavados 3 vezes com tampão de lavagem (0,05% Tween 20 em PBS) e bloqueados com

reagente diluente (1% de BSA diluído em PBS) por 1 hora a temperatura ambiente. Os poços

foram novamente lavados 3 vezes. Em seguida, as placas foram incubadas à temperatura

ambiente, durante 12 horas, com 50 L das amostras a serem testadas em duplicata e com 50

L da citocina padrão (anticorpo recombinante), utilizada para a geração da curva padrão. Os

poços foram lavados novamente por 3 vezes, e logo após, foi adicionado 50 L do anticorpo

de detecção específico para cada citocina, conjugado a biotina e diluído em reagente diluente.

Então, a placa foi incubada por mais 2 horas a temperatura ambiente. Após a lavagem dos

poços, foi adicionado 50 L de estreptavidina conjugada a peroxidase, diluída em reagente

diluente na proporção de 1:200 por 20 minutos à temperatura ambiente. Após mais 3

lavagens, a atividade da peroxidase foi revelada com peróxido de hidrogênio e

tetrametilbenzidina (TMB; LGC Biotecnologia, Brasil) em um volume final de 100 L. A

reação colorimétrica foi interrompida com 50 L de ácido sulfúrico a 2,5 N e a leitura da

densidade óptica foi determinada em espectrofotômetro usando o programa SOFTmax®PRO

4.0 (Life Sciences Edition, Molecular Devices Corporation, EUA) a uma absorbância de 450

nm. Após a leitura, os resultados foram analisados com base na confecção da curva padrão.

As concentrações de cada anticorpo, os pontos da proteína padrão e os componentes do

reagente diluente variavam de acordo com a citocina quantificada. As dosagens foram feitas

em duplicatas. Os resultados foram expressos em pg/mL.

A comparação das médias dos valores normalizados de expressão da proteína entre os

grupos foi realizada por uma ANOVA one-way não paramétrico com 1000 permutações

irrestritas, seguido de comparações de pares com o ajustamento de Bonferroni (Bickel et al.,

2009). Os resultados foram representados em gráficos mostrando os níveis de expressão

média ± erro padrão da média de cada grupo em relação ao grupo controle. Níveis bicaudais

de significância menor ou igual a 0,01, 0,05 e 0,1 foram considerados como altamente

significativo, significativo e sugestivo, respectivamente.

66

5. RESULTADOS

67

5.1. Células THP-1 fagocitam BCG e M. leprae eficientemente Para avaliar a taxa de fagocitose das micobactérias, primeiramente foi realizada uma

curva temporal, onde células THP-1 foram infectadas com BCG Moreau (MOI 10:1) por 1, 4,

24 e 48 horas. Os resultados foram observados de duas formas diferentes: a partir da

associação, que significa que as bactérias estão aderidas a membrana da célula, e fagocitadas

que significa que estão no citoplasma celular. Na figura 5.1 observa-se que há aumento da

fagocitose de BCG dependente do tempo de infecção. Após 1 hora de infecção, 54% das

bactérias apresentaram-se associadas às células, sendo observado 44% de células contendo

BCG fagocitado (figura 5.1A e B); e após 4 horas, a taxa de associação aumentou para

aproximadamente 81%, sendo 67,5% de células com BCG fagocitado. Em 24 e 48 horas de

infecção, a taxa de associação e de fagocitose, se manteve praticamente a mesma entre os dois

tempos, em torno de 90% e 80% respectivamente, entretanto, a quantidade de BCG por célula

foi maior em 48 do que em 24 horas de infecção, medidos pela intensidade média de

fluorescência (figura 5.1C).

A)

68

B) C)

Figura 5.1 - Avaliação da taxa de fagocitose de BCG Moreau (MOI 10:1) previamente corado com PKH2 por células THP-1 em 1, 4, 24 ou 48 horas (n=1). Através da citometria de fluxo foi medido em (A) o percentual de associação das células, em (B) a diferença entre fagocitose e adesão, que foi determinada pela adição de azul de Tripan no ensaio de “quenching”, e em (C), a quantidade de BCG por células foi avaliada através da intensidade média de fluorescência (IMF).

Com isso, adotou-se o tempo de 24 horas de infecção. A partir daí, foi avaliada a

capacidade das células THP-1 de fagocitarem as diferentes cepas de BCG Danish, Moreau,

Pasteur, e M. leprae viável (MOI 10:1). Na figura 5.2, foi mostrado que acima de 80% das

células fagocitaram tanto BCG, independentemente da cepa, quanto M. leprae, sendo

considerada uma boa taxa de infecção pelas micobactérias, sendo utilizada para experimentos

posteriores de análise de expressão gênica e secreção de citocinas.

69

Controle

BCG Danish

BCG Morea

u

BCG Pasteu

r

M. le

prae0

25

50

75

100

% fa

goci

tose

Figura 5.2 – Citometria de fluxo para avaliar a taxa de fagocitose de BCG Danish, Moreau e Pasteur, e M. leprae (MOI 10:1) marcados com PKH2 pelas células THP-1 após 24 horas. Células não infectadas foram utilizadas como controle. As barras representam média ± desvio padrão das amostras biológicas (n=3) pertencentes a cada grupo.

5.2. Diferenças na expressão gênica e secreção de citocinas de células THP-1

A estratégia inicial do presente estudo foi desenvolvida para avaliar a expressão

gênica diferencial em células THP-1. Assim, experimentos com uma baixa concentração de

bactérias (MOI 2:1) foram realizados, para posteriormente comparar os padrões de expressão

gênica utilizando uma concentração mais alta (MOI 10:1), e observar se haveria maiores

diferenças decorrente de diferentes concentrações bacterianas.

Nesta etapa, foram utilizadas duas técnicas para análise da expressão gênica de células

THP-1 baseadas na amplificação por qRT-PCR (em tempo real), como já mencionada na

justificativa. A diferença entre os métodos é que a primeira técnica realiza o qRT-PCR para

cada gene separadamente em um termociclador (SDS7000 ou Step One, Applied Biosystems,

Life Technologies) com detecção de amplificação em tempo real, enquanto a outra técnica

realiza a amplificação simultânea em sistema multiplex (Biomark, Fluidigm). A metodologia

para qRT-PCR multiplex foi implementada recentemente em nosso laboratório, e foi utilizada

em nosso estudo de expressão gênica utilizando um painel de 48 genes para uma análise

simultânea de 96 amostras. Foram utilizados genes identificados como relacionados à resposta

às doenças micobacterianas, bem como identificados em trabalhos do nosso grupo (Ferreira,

70

2011), e a tabela com os genes utilizados no presente estudo encontra-se em anexo (anexo I),

onde a grande parte dos genes empregados na qRT-PCR estava presente no sistema multiplex

da fluidigm, e a maioria dos resultados obtidos foi semelhante. Com isso, optou-se por

apresentar aqui, apenas os resultados do fluidigm para evitar a redundância.

Antes das análises, foi realizada a seleção dos normalizadores, com base nos dois

métodos utilizados para esta seleção, geNorm e NormFinder. Com isso, foram escolhidos

como genes normalizadores, os três genes constitutivos incluídos no estudo, HPRT1, RPS13 e

RPL13, e esses normalizadores foram utilizados para todas as análises de expressão gênica de

células THP-1.

5.2.1. Diferenças na expressão gênica e secreção de citocinas de células THP-1 infectadas pelas cepas de BCG, Danish, Moreau e Pasteur, em MOI 2:1

Depois de normalizados, os dados foram analisados. Com isso, observamos na figura

5.3, que não houve diferenças significativas na expressão gênica das células THP-1 tanto

controle, quanto infectadas pelas diferentes cepas de BCG, quando utilizada uma baixa

multiplicidade de infecção.

71

72

73

Figura 5.3 – Valores normalizados de expressão gênica por multiplex PCR em tempo real, de células THP-1 controle e infectadas com as cepas de BCG Danish, Moreau e Pasteur, em MOI 2:1 por 24 horas. As barras representam média ± erro padrão das amostras biológicas (n=10) pertencentes a cada grupo.

Mesmo observando que não houve diferenças na expressão de todos os 48 genes

estudados, algumas citocinas foram dosadas no sobrenadante das culturas das células THP-1.

As citocinas/quimiocinas CCL2, IL-1β, IL-8, TNF e IL-10 foram escolhidas como candidatas

(devido a importância descrita em diferentes modelos de infecção micobacteriana)

(Yamamura et al., 1991; Suzuki et al., 1993; Ragno et al., 2001; Kirkaldy et al., 2003;

Murray et al., 2007), para medir seus níveis de produção em sobrenadantes, na tentativa de

correlacionar esses resultados com os níveis de expressão gênica. Após 24 horas de infecção com as cepas de BCG Danish, Moreau e Pasteur, com MOI

2:1, os níveis de CCL2, IL-1, IL-8, TNF e IL-10 foram dosados nos sobrenadantes das

células THP-1. Foi realizado um ensaio para cada citocina e os resultados foram apresentados

como média ± erro padrão das amostras biológicas pertencente a cada grupo.

Não foram observadas diferenças significativas na secreção de CCL2, IL-1, IL-8 e

TNF pelas células THP-1 tanto controle quanto infectadas com qualquer uma das cepas de

BCG (figura 5.4), podendo ser correlacionados com os resultados de expressão gênica destas

citocinas. Já os níveis de IL-10, não foram detectáveis nestas células.

74

Figura 5.4 – Níveis de CCL2, IL-1, TNF e IL-8 (pg/ml) em sobrenadante de células THP-1 controle e infectadas com BCG Danish, Moreau e Pasteur (MOI 2:1) por 24 horas. As barras representam média ± erro padrão das amostras biológicas (n=5) pertencente a cada grupo. Os níveis de IL-10 não foram detectáveis.

5.2.2 Diferenças na expressão gênica e secreção de citocinas de células THP-1 infectadas por BCG Moreau e M. leprae em MOI 2:1

Por não terem sido observadas diferenças significativas na expressão gênica de células

THP-1 infectadas com diferentes cepas de BCG, foram realizadas infecções, agora utilizando

apenas o BCG Moreau, que é a cepa utilizada na vacinação no Brasil, e M. leprae em um

MOI 2:1.

Depois de normalizados, os dados foram analisados e foi observado que alguns dos

genes foram diferencialmente expressos (figura 5.5). As quimiocinas CCL2, CCL3, CCL4,

CCL7 e IL-8 foram reguladas negativamente em células THP-1 infectadas com M. leprae em

relação as célula infectadas com BCG Moreau e controle. Também foi observado uma

diminuição da expressão das citocinas IL-1β e IL-6, bem como de SOD2 e TNFSF15 em

células infectadas com M. leprae.

75

76

77

Figura 5.5 – Valores normalizados de expressão gênica de células THP-1 controle e infectadas com BCG Moreau e M. leprae em MOI 2:1 por 24 horas. As barras representam média ± erro padrão das amostras biológicas (n=6) pertencente a cada grupo. Níveis de significância bi-caudais inferiores ou iguais a 0,01 (**), 0,05 (*) e 0,1 (x) foram considerados como altamente significante, significante e sugestivo, respectivamente.

Após 24 horas de infecção com BCG Moreau e M. leprae em MOI 2:1, foram dosados

os níveis de CCL2, IL-1, IL-8, TNF e IL-10 em sobrenadantes das células THP-1. Foi

realizado um ensaio para cada citocina e os resultados foram apresentados como média ± erro

padrão das amostras biológicas pertencente a cada grupo

Não foram observadas diferenças significantes na secreção de CCL2, IL-1, IL-8 e

78

TNF pelas células THP-1 (figura 5.6). Embora não tenha sido significante, foi observada uma

redução na produção de CCL2 nas células infectadas com M. leprae, podendo ser

correlacionado com o resultado observado na expressão gênica para esta citocina, enquanto a

secreção das outras citocinas não foi correlacionada com os resultados da expressão destes

genes. Os níveis de IL-10 não foram detectáveis nestas células.

Figura 5.6 – Níveis de CCL2, IL-1, TNF e IL-8 (pg/ml) em sobrenadante de células THP-1 controle e infectadas com BCG Moreau e M. leprae (MOI 2:1) por 24 horas. As barras representam média ± erro padrão das amostras biológicas (n=4) pertencente a cada grupo. Os níveis de IL-10 não foram detectáveis.

5.2.3 Diferenças na expressão gênica e secreção de citocinas de células THP-1 infectadas pelas cepas de BCG Danish, Moreau e Pasteur, em MOI 10:1

Já que não foram observadas diferenças significantes na expressão gênica de células

THP-1 infectadas com qualquer uma das cepas utilizando uma MOI baixa (2:1), a

multiplicidade de infecção foi aumentada para 10:1.

Após a normalização, os dados foram analisados. Mesmo utilizando uma MOI maior

(10:1), não foram observadas diferenças significantes na expressão dos genes estudados nas

células THP-1, tanto controle quanto infectadas pelas diferentes cepas de BCG (figura 5.7).

79

80

81

Figuras 5.7 – Valores normalizados de expressão gênica de células THP-1 controle e infectadas com as cepas de BCG Danish, Moreau e Pasteur, em MOI 10:1 por 24 horas. As barras representam média ± erro padrão das amostras biológicas (n=5) pertencente a cada grupo

Foram dosados os níveis de CCL2, IL-8, TNF e IL-10 em sobrenadantes de células

THP-1 após 24 horas de infecção com BCG Danish, Moreau e Pasteur, em MOI 10:1. Foi


padrão das amostras biológicas pertencente a cada grupo.

Foi observado um aumento significativo na secreção de TNF nas células THP-1

82

infectadas com BCG Moreau em relação ao controle, porém não foi observada nenhuma

diferença na secreção destas citocinas entre as células infectadas (figura 5.8). Já os níveis de

IL-10, mesmo utilizando uma MOI mais alta, continuaram não sendo detectáveis nestas

células.

Figura 5.8 – Níveis de CCL2, IL-8 e TNF (pg/ml) em sobrenadante de células THP-1 controle e infectadas com as cepas de BCG Danish, Moreau e Pasteur (MOI 10:1) por 24 horas. As barras representam média ± erro padrão das amostras biológicas (n=6) pertencente a cada grupo. Os níveis de IL-10 não foram detectáveis. Níveis de significância bi-caudais inferiores ou iguais a 0,01 (**), 0,05 (*) e 0,1 (x) foram considerados como altamente significante, significante e sugestivo, respectivamente.

5.2.4 Diferenças na expressão gênica e secreção de citocinas de células THP-1 infectadas por BCG Moreau e M. leprae em MOI 10:1

Mesmo utilizando uma MOI maior (10:1), não foram observadas diferenças

significantes na expressão de células THP-1 infectadas com as diferentes cepas de BCG. Com

isso, foram realizadas infecções das células utilizando apenas a BCG Moreau e M. leprae em

uma MOI 10:1.

Depois de normalizados, os dados foram analisados e foi observado que não houve

diferenças significantes na expressão gênica das células THP-1, tanto controle quanto

infectadas pelo BCG Moreau e M. leprae, utilizando uma MOI 10:1 (figura 5.9). Acredita-se

que a grande variabilidade observada na expressão gênica ao utilizar uma MOI 10:1, tenha

83

sido devido ao baixo número de replicatas biológicas.

84

85

Figura 5.9 – Valores normalizados de expressão gênica de células THP-1 controle e infectadas com a cepa de BCG Moreau e M. leprae, em MOI 10:1 por 24 horas. As barras representam média ± erro padrão das amostras biológicas (n=3) pertencente a cada grupo

Após 24 horas de infecção com BCG Moreau e M. leprae com MOI 10:1, foram

dosados os níveis de CCL2, IL-8, TNF e IL-10 em sobrenadantes das células THP-1. Foi


padrão das amostras biológicas pertencente a cada grupo.

Não foram observadas diferenças nos níveis de IL-8 em sobrenadantes de células

THP-1 infectadas com BCG e M. leprae (figura 5.10), já os níveis de CCL2 parecem ter tido

86

uma diminuição nas células infectadas com M. leprae, o que não foi correlacionado com os

resultados de expressão de CCL2 em MOI 10:1, porém correlacionou com os resultados

obtidos em MOI 2:1. Entretanto, foi observado um aumento significativo na secreção de TNF

em células infectadas com BCG Moreau em relação às células controle ou infectadas com M.

leprae, o qual não foi correlacionado com os resultados de expressão gênica. Já os níveis de

IL-10, mesmo utilizando um MOI mais alto, continuaram não sendo detectáveis nestas células.

Figura 5.10 - Níveis de CCL2, IL-8 e TNF (pg/ml) em sobrenadante de células THP-1 controle e infectadas com BCG Moreau e M. leprae em MOI 10:1 por 24 horas. As barras representam média ± erro padrão das amostras biológicas (n=3) pertencente a cada grupo. Os níveis de IL-10 não foram detectáveis neste experimento. Níveis de significância bi-caudais inferiores ou iguais a 0,01 (**), 0,05 (*) e 0,1 (x) foram considerados como altamente significante, significante e sugestivo, respectivamente. 5.3. Influência da variabilidade do hospedeiro na secreção de citocinas

Como não foram observadas grandes diferenças na secreção das citocinas estudadas

pelas células THP-1 infectadas com as diferentes cepas de BCG, foram dosados níveis de

citocinas em sobrenadante de PBMC de indivíduos saudáveis para investigar se a

variabilidade do hospedeiro poderia influenciar na secreção destas citocinas. Foram dosados

níveis de IL-8 e TNF após 24 horas, e IL-10 após 72 horas de infecção pelas diferentes cepas

de BCG (MOI 10:1) em PBMC. Foi realizado um ensaio para cada citocina e os resultados

foram apresentados como média ± erro padrão das amostras biológicas pertencente a cada

grupo (figura 5.11). Apesar do aumento da secreção das citocinas nas células infectadas, não

87

foram observadas diferenças significativas na secreção de IL-8 e IL-10 entre PBMC

infectadas com as diferentes cepas de BCG. No entanto, foi observado um aumento

significativo nos níveis de TNF em PBMC infectada com BCG Moreau em comparação com

as células infectadas com BCG Danish e BCG Pasteur, sugerindo uma interação especie-

especifica, que leva a uma resposta diferencial do hospedeiro frente a cepa de BCG Moreau.

Figura 5.11 – Níveis de IL-8, TNF e IL-10 (pg/ml) em sobrenadante de células PBMC infectadas com as cepas de BCG Danish, Moreau e Pasteur, em MOI 10:1 por 24 (para IL-8 e TNF) e 72 (para IL-10) horas. Com BCG Danish foi utilizado um n=18, 15 e 16; com BCG Moreau, um n=19, 16 e 16; com BCG Pasteur, um n=16, 15 e 15; para IL-8, TNF e IL-10, respectivamente. O box - e strip-plot representa a distância interquartílica e mediana das amostras biológicas pertencente a cada grupo. A expressão de TNF foi significativamente aumentada (p<0,01) em PBMC infectada com BCG Moreau. 5.4. O logaritmo da razão TNF/IL-10 (log(TNF/IL-10)) foi ligeiramente aumentado em

PBMC infectada com BCG Moreau

Já foi mostrado que uma razão TNF/IL-10 alta está relacionado com a proteção à

hanseníase (Lima et al., 2000). Com isso, foi avaliado o logarítmo da razão TNF/IL-10 em

PBMC infectadas com as diferentes cepas de BCG. Apesar de não ter sido significante, foi

observado um aumento do log(TNF/IL-10) em células infectadas com BCG Moreau em

relação às células infectadas com BCG Danish ou BCG Pasteur, que por sua vez,

88

apresentaram uma diminuição significativa em relação às células controle (figura 5.12).

Controle Danish Moreau Pasteur-1.0

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5*

*

log

(TNF

/IL-1

0)

Figura 5.12 – Avaliação do logaritmo da razão TNF/IL-10 em PBMC controle e infectadas com as cepas de BCG Danish, Moreau e Pasteur em MOI 10:1 por 24 (para TNF) e 72 (para IL-10) horas. O strip-plot representa a mediana das amostras biológicas pertencente a cada grupo. Níveis de significância bi-caudais inferiores ou iguais a 0,01 (**), 0,05 (*) e 0,1 (x) foram considerados como altamente significante, significante e sugestivo, respectivamente. 5.5. Influência dos SNPs TNF -308 G>A, IL-10 -819 C>T e TLR1 743 A>G na secreção de TNF e IL-10, e no log(TNF/IL-10)

DNA dos indivíduos doadores do sangue utilizado nos ensaios de secreção de

citocinas foi utilizado para genotipagem. Assim, 22 indivíduos saudáveis foram genotipados

para os polimorfismos TNF -308 G>A (rs1800629), IL-10 -819 C>T (rs1800871) e TLR1 743

A>G (rs4833095). Primeiramente foi investigada a influência do SNP rs1800629 na secreção

de TNF e IL-10 em sobrenadante de PBMC dos indivíduos saudáveis infectados com as

diferentes cepas de BCG, bem como no log(TNF/IL-10). Para isso, os indivíduos foram

agrupados pela presença ou ausência do alelo A. Apesar de ter sido observado um aumento

significante nos níveis de TNF em PBMC infectada com BCG Moreau (figura 5.12), não foi

observada nenhuma diferença significante na secreção de TNF em relação ao genótipo

estudado (figura 5.13A). Ou seja, o SNP rs1800629 não influenciou na secreção desta citocina,

assim como, também não influenciou na secreção de IL-10 (figura 5.13B). O log(TNF/IL-10)

89

também não foi afetado por esse polimorfismo (figura 5.13C).

A)

Figura 5.13 – Investigação da influência do polimorfismo genético TNF -308 G>A nos níveis de secreção de (A) TNF, (B) IL-10 e (C) log(TNF/IL-10). Os indivíduos foram estratificados pelo genótipo do SNP rs1800629 como sendo homozigotos GG ou carreadores do alelo A (GA/AA). O strip-plot representa a mediana das amostras biológicas pertencente a cada grupo.

B)

Controle

GG

Controle

GA/AA

Danish

GG

Danish

GA/AA

Moreau G

G

Moreau G

A/AA

Pasteu

r GG

Pasteu

r GA/AA

0

2500

5000

7500

10000

12500

TNF

(pg/

mL)

Controle

GG

Controle

GA/AA

Danish

GG

Danish

GA/AA

Moreau G

G

Moreau G

A/AA

Pasteu

r GG

Pasteu

r GA/AA

-5

0

5

10

log(

TNF/

IL-1

0)

Controle

GG

Controle

GA/AA

Danish

GG

Danish

GA/AA

Moreau G

G

Moreau G

A/AA

Pasteu

r GG

Pasteu

r GA/AA

0

10000

20000

IL-1

0 (p

g/m

L)

C)

90

Parelelamente, foi investigada a influência do SNP rs1800871 na secreção de TNF e

IL-10 em sobrenadante de PBMC dos indivíduos saudáveis infectados com as diferentes

cepas de BCG, bem como no log(TNF/IL-10). Para isso, os indivíduos foram agrupados pela

presença ou ausência do alelo T. Apesar de não ter sido observada diferença significante na

secreção de IL-10 entre as células infectadas com as cepas de BCG (figura 5.12), notou-se um

agrupamento de baixos, intermediários e altos produtores de IL-10. Entretanto ao investigar a

influência do polimorfismo genético rs1800871 na secreção de IL-10 em PBMC, não foi

observada nenhuma diferença significante na secreção desta citocina, independente da cepa

utilizada e do genótipo estudado (figura 5.14A). Esse polimorfismo também não influenciou

na secreção de TNF (figura 5.14B), bem como não afetou o log(TNF/IL-10) (figura 5.14C).

Controle

CC

Controle

CT/TT

Danish

CC

Danish

CT/TT

Moreau CC

Moreau CT/TT

Pasteu

r CC

Pasteu

r CT/TT

0

2500

5000

7500

10000

12500

TNF

(pg/

mL)

Controle

CC

Controle

CT/TT

Danish

CC

Danish

CT/TT

Moreau CC

Moreau CT/TT

Pasteu

r CC

Pasteu

r CT/TT

0

10000

20000

IL-1

0 (p

g/m

L)

A)

B)

91

Figura 5.14 – Investigação da influência do polimorfismo genético IL10 -819 C>T nos níveis de secreção de (A) IL-10, (B) TNF e (C) log(TNF/IL-10). Os indivíduos foram estratificados pelo genótipo do SNP rs1800871 como sendo homozigotos CC ou carreadores do alelo T (CT/TT). O strip-plot representa a mediana das amostras biológicas pertencente a cada grupo.

Posteriormente, foi investigada a influência do SNP rs4833095 presente no gene de

TLR1 na secreção de TNF e IL-10 em sobrenadante de PBMC infectados com as diferentes

cepas de BCG, bem como no log(TNF/IL-10). Para isso, os indivíduos foram agrupados pela

presença ou ausência do alelo G, e não foi observada nenhuma diferença significante na

secreção de TNF e IL-10 em PBMC, independente da cepa utilizada e do genótipo estudado

(figura 5.15A e B). Entretanto, esse polimorfismo afetou o log(TNF/IL-10) (figura 5.15C),

sendo que os indivíduos carreadores do alelo G tiveram uma diminuição significante no

log(TNF/IL-10) quando as células foram infectadas com BCG Moreau, sugerindo um padrão

de ativação da resposta imune dependente do genótipo do hospedeiro.

Contro

le AA

Controle

GA/GG

Danish

AA

Danish

GA/G

G

Moreau AA

Moreau G

A/GG

Pasteu

r AA

Pasteu

r GA/AA

0

2500

5000

7500

10000

12500

TNF

(pg/

mL)

Controle

CC

Controle

CT/TT

Danish

CC

Danish

CT/TT

Moreau CC

Moreau CT/TT

Pasteu

r CC

Pasteu

r CT/TT

-5

0

5

10

log(

TNF/

IL-1

0)

C)

A)

92

Figura 5.15 – Investigação da influência do polimorfismo genético TLR1 743 A>G nos níveis de secreção de (A) IL-10, (B) TNF e (C) log(TNF/IL-10). Os indivíduos foram estratificados pelo genótipo do SNP rs433095 como sendo homozigotos AA ou carreadores do alelo G (AG/GG). Níveis de significância bi-caudais inferiores ou iguais a 0,01 (**), 0,05 (*) e 0,1 (x) foram considerados como altamente significante, significante e sugestivo, respectivamente. O strip-plot representa a mediana das amostras biológicas pertencente a cada grupo.

5.6. Estudos de expressão diferencial de genes por microarranjo de DNA em células THP-1 infectadas por M. leprae e BCG

Nesta etapa, foram utilizadas amostras de células THP-1 controle, de células

infectadas com BCG Moreau e de células infectadas com M. leprae, em um total de três

Controle

AA

Controle

GA/GG

Danish

AA

Danish

GA/G

G

Moreau AA

Moreau G

A/GG

Pasteu

r AA

Pasteu

r GA/AA

0

10000

20000

IL-1

0 (p

g/m

L)

Controle

AA

Controle

GA/GG

Danish

AA

Danish

GA/G

G

Moreau AA

Moreau G

A/GG

Pasteu

r AA

Pasteu

r GA/AA

-5

0

5

10

*

log(

TNF/

IL-1

0)

B)

C)

93

replicatas biológicas. Após as hibridações e estabelecimento de critérios de qualidade, os

dados filtrados e normalizados foram utilizados na inferência estatística, utilizando como

critério de seleção p-valor (não ajustado) 0,005, onde foi encontrado um número restrito de

genes (n=12) como diferencialmente expressos (tabela 5.1).

Tabela 5.1: Genes diferencialmente expressos (p-valor 0,005) entre células THP-1 em três condições. Primeira condição: células infectadas com BCG Moreau x células controle; segunda condição: células infectadas com M. leprae x células controle; e terceira condição: células infectadas com M. leprae x células infectadas com BCG Moreau; por 24 horas.

Condição de infecção Símbolo do gene Descrição do gene logFC p-valor

Primeira condição TMEM101 Transmembrane protein 101 -1,871 0,00165

C21orf126 Chromosome 21 open reading frame 126 1,697 0,00482

Segunda condição TMEM101 Transmembrane protein 101 -1,201 0,00334

Terceira condição LGALS1 Lectin, galactoside-binding, soluble-1 -1,591 0,00041

CACNA2D3 Calcium channel, voltage-dependent, alpha 2/delta subunit 3 -1,380 0,00245

GPI Glucose-6-phosphate isomerase -1,373 0,00331

RNPEP Arginyl aminopeptidase (aminopeptidase B) -1,370 0,00162

suid=1417524 Sem anotação até o momento -1,224 0,00431

TCEAL5 Transcription elongation factor A protein-like 5 -1,202 0,00361

ZDHHC22 Zinc finger, DHHC-type containing 22 -1,107 0,00287

Random_709 Random|corinne|150275298|662356677|709 -1,035 0,00168

SFT2D2 SFT2 domain containing 2 -0,939 0,00450

MESP2 Mesoderm posterior protein 2 -0,907 0,00314 logFC: log fold change

Nesta lista de genes, foi observado que a expressão de uma proteína transmembranar,

TMEM101, se encontrava reprimida nas células infectadas com as micobactérias (tanto por M.

leprae quanto BCG Moreau) em relação às células THP-1 controle (tabela 5). Este gene está

relacionado com a regulação positiva da cascata I-kappaB quinase/NF-kappaB. Em células

infectadas com BCG Moreau foi observado que a expressão do gene C21orf126, localizado

no braço longo do cromossomo 21, estava induzida em relação às células controle.

Na comparação entre as cepas infectadas com as micobactérias, encontrou-se 9 genes

diferencialmente expressos (tabela 5). Dessa lista, destacou-se a LGALS1, reprimida em

94

células infectadas com M. leprae, e está associada na modulação de interações célula-célula e

célula-matriz (Paclik et al., 2011). Outro gene reprimido foi o GPI, pertencente à família GPI,

(Malaisse et al., 1990). Também foi observado repressão na expressão de RNPEP, uma

exopeptidase que selectivamente remove resíduos de arginina e/ou lisina a partir do N-

terminal de vários substratos de peptídeos (Foulon et al., 1999).

5.7. Diferenças no perfil de expressão gênica de amostras de biopsias de nervo humano

Após a identificação de genes regulados em estudos de infecção de células THP-1 por

M. leprae, decidiu-se investigar, in vivo, a expressão gênica em amostras de biópsias de

nervos de pacientes com suspeita de hanseníase. Portanto, nesta amostra de validação temos

35 pacientes que tiveram a confirmação diagnóstica de hanseníase (que envolve resultados de

PCR para DNA de M. leprae, análise sorológica, histopatologia e clínica) e 50 pacientes que

apresentam outra neuropatia periférica, com exclusão de hanseníase (além destes, onze

pacientes ainda não tinham sido diagnosticados e não foram incluídos na análise). Assim,

foram denominados hansenianos e não hansenianos, respectivamente. Com isso, poderíamos

validar os genes observados como diferencialmente expressos no modelo de infecção in vitro.

Portanto como explicado acima, nesta etapa, foram utilizadas amostras de cDNA

provenientes de biópsias de nervo de pacientes hansenianos (L) e não hansenianos (NL). Os

normalizadores utilizados neste ensaio foram GAPDH, RPS13 e RPL13. Depois de

normalizados, os dados foram analisados.

Foram observados vários genes significativamente regulados (figura 5.16). Os genes

BAD, CCL2, CCL3, CCL4, IL-1β, IL-10, IL-12, SOD2, e os mitocondriais mt_ATP6,

mt_COX, mt_CYB, mt_ND1, mt_ND3 e mt_ND5 foram regulados negativamente em

amostras de biópsias de pacientes hansenianos. Enquanto, E3-Ub-ligase e LDLR foram

regulados positivamente nestas amostras.

Além disso, apesar de não ter sido significante, foi observada uma leve diminuição na

expressão da maioria dos outros genes nas amostras de biopsias de pacientes hansenianos

(figura 5.16). São estes: CCL5, CCL7, LPLR, LRRK2, MIF, NOD2, OASL, PINK1 PPDRJ,

SET1DB, TNF, ZNF79 e ZNRF1.

95

96

97

Figura 5.16 - Valores normalizados da expressão gênica de biopsias de nervo de pacientes

hansenianos (L) (n=35) e não hansenianos (NL) (n=50). As barras representam média ± erro

padrão das amostras biológicas pertencente a cada grupo. Níveis de significância bi-caudais

inferiores ou iguais a 0,01 (**), 0,05 (*) e 0,1 (x) foram considerados como altamente

significante, significante e sugestivo, respectivamente.

98

6. DISCUSSÃO

99

Neste trabalho, primeiramente optou-se por utilizar o sistema de células THP-1, pois já

foi demonstrado que estas células são um sistema bem estabelecido para o estudo do

crescimento e persistência de micobactérias (Paul et al., 1996; Oliveira et al., 2001; Theus et

al., 2004), e tem se mostrado um bom modelo para macrófagos derivados de monócitos

diferenciados in vitro. Como o objetivo principal deste estudo era observar possíveis

diferenças na resposta imune após infecção por diferentes cepas de BCG e M. leprae, se fazia

interessante a utilização de THP-1, devido a sua vantagem de ter sido obtida de um único

doador, não apresentando variabilidade do indivíduo na função do macrófago (Schwende et

al., 1996). Entretanto, há a necessidade de uma ativação prévia para que os monócitos se

diferenciem em células tipo macrófago, principalmente quando se avalia a produção de

citocinas como TNF, que foi um dos genes candidatos importantes de nosso estudo. Células

THP-1 indiferenciadas não produzem quantidades detectáveis de TNF, mesmo quando

estimuladas, por exemplo, com LPS (Schwende et al., 1996; Takashiba et al., 1999) ou com

M. leprae (Oliveira et al., 2001). Por outro lado, as células THP-1 diferenciadas por PMA

secretam TNF. O PMA é um dos ativadores químicos mais comumente utilizados para induzir

esse estado de diferenciação, porém o PMA não é produzido endogenamente pelo hospedeiro,

e é considerado tóxico para humanos in vivo (revisado por Estrella et al., 2011). Com isso,

alguns trabalhos utilizaram outros agentes para ativação de THP-1 como, por exemplo, ácido

retinóico e a vitamina D3, que já se mostrou estar associada à resposta imune contra uma

infecção por M. tb. (revisado por Estrella et al., 2011). Em estudos em nosso laboratório, foi

observado que células THP-1 diferenciadas com PMA mantiveram sua viabilidade em torno

de 80% e, por isso, mantivemos como modelo para essa parte do estudo (Toledo-Pinto,

comunicação pessoal).

Entretanto, vale a pena ressaltar que esta linhagem de células THP-1 pode não induzir

o mesmo padrão de expressão gênica que é observado em macrófagos in vivo, como no caso

de macrófagos alveolares, ou macrófagos derivados de monócitos de sangue periférico (MDM)

(Monahan et al., 2001), e que diferentes linhagens celulares utilizadas para avaliar a interação

macrófagos-micobactérias também podem influenciar a produção de proteínas, um dos

motivos pelos quais também foi incluído, em um segundo momento, neste trabalho as células

mononucleares de sangue periférico.

Já é conhecido que com a diferenciação de células THP-1, elas passam a expressar

marcadores de superfície associados à diferenciação dos macrófagos, como CD14, e têm sua

capacidade fagocítica aumentada (Schwende et al., 1996). Em experimentos realizados em

nosso laboratório, foi observado um aumento significativo de CD14 em células THP-1

100

diferenciadas quando infectadas com BCG, o que está de acordo com Sendide e colaboradores

(2005), que mostrou que CD14 desempenha um papel importante na fagocitose de BCG por

estas células. Em ensaios de fagocitose realizados no presente estudo, foi observado que

acima de 80% das células THP-1 diferenciadas fagocitaram micobactérias e que o pico de

fagocitose foi em torno de 24 h, não havendo diferenças entre a taxa de fagocitose das três

cepas de BCG utilizadas no estudo, nem de M. leprae. Entretanto, foi observado que em 48 h,

houve uma maior quantidade de BCG por células do que em 24 h, porém esse tempo não foi

utilizado em experimentos posteriores. Deste modo, foram realizados os ensaios de expressão

gênica e dosagem de citocinas utilizando as cepas de BCG e M. leprae escolhendo-se o tempo

de 24 h para as análises, e acredita-se que as diferenças observadas a partir daí, não devem ser

devido a diferenças na fagocitose dessas micobactérias pelas células THP-1. Porém, alguns

trabalhos utilizaram tempos diferentes em estudos da expressão gênica em THP-1, como por

exemplo, Ragno e colaboradores que identificaram mudanças na expressão gênica em tempos

mais precoces de infecção (6 e 12 h) por M. tb. Enquanto, Hasan e colaboradores (2006a)

observaram diferenças na expressão gênica entre células THP-1 tanto em 18 quanto em 48

horas de infecção por M. leprae ou BCG.

As cepas de BCG possuem diferenças genéticas que contribuem para as propriedades

variáveis observadas no que diz respeito a eficácia protetora entre as cepas de BCG quando

utilizadas na vacinação em países distintos. Acredita-se que um dos principais fatores que

contribuem para essa grande variabilidade é a imunidade protetora distinta adquirida após a

vacinação. Entretanto, mais recentemente tem sido sugerido que fatores genéticos do

hospedeiro estão associados com a resposta imune à vacinação por BCG, onde Di

Pietrantonio e colaboradores (2011) empregando duas linhagens distintas de camundongo,

com três cepas diferentes de BCG (Russia, Japan e Pasteur), mostraram que cada cepa

apresentou habilidades específicas para o crescimento nos pulmões do hospedeiro, e que essas

diferenças dependiam também da linhagem de camundongo utilizada. Ainda as diferenças na

expressão de citocinas e quimiocinas observada após infecção por cada cepa de BCG foi mais

proeminente em uma das linhagens de camundongo, sugerindo dependência do background

genético do hospedeiro. Além disso, também já foi mostrado que diferentes cepas de BCG

induzem diferentes níveis de proteção contra TB e hanseníase, além de variar nos efeitos

adversos observados nos indivíduos (Liu et al., 2009).

A cepa de BCG Moreau é considerada uma das mais imunogênicas atualmente em uso.

Entretanto, o Brasil é um dos únicos países do mundo que utilizam esta cepa na vacinação, e

consequentemente, ainda são observados poucos estudos a respeito desta cepa, principalmente

101

se comparado com trabalhos que utilizam a cepa de BCG Pasteur. Só recentemente a cepa de

BCG Moreau teve seu genoma seqüenciado (Gomes et al., 2011). Além do mais, estudos de

análises do perfil de expressão gênica em células hospedeiras utilizando BCG Moreau são

escassos, e ainda, uma comparação do perfil de expressão com M. leprae viável é inédita na

literatura científica mundial.

BCG Moreau difere das cepas Danish e Pasteur, pois é a única das cepas estudadas

aqui que possui a região RD2 (Mahairas et al., 1996) observada também em outras

micobactérias, como M. bovis e M. tb. Essa região é conhecida por conter o gene mpt64 que

codifica uma proteína altamente imunogênica, MPT64. Sua função ainda não é bem

conhecida, porém já se sabe que ela tem um papel na estimulação do sistema imune (revisado

por Kozak & Behr, 2011). Kozak & Behr demonstraram que a perda da RD2 contribuiu para

uma vacina menos imunogênica, porém isso não se refletiu de uma maneira evidente na

eficácia protetora da vacina contra TB em murino. Essa proteína foi recentemente utilizada na

construção de uma cepa de BCG Pasteur recombinante (Sali et al., 2010), onde a expressão da

proteína quimera PE-MPT64 na superfície do BCG, aumentou sua imunogenicidade. Além

disso, este BCG recombinante induziu uma proteção melhor contra TB em relação a cepa

BCG Pasteur e até mesmo em relação a outras cepas de BCG recombinante expressando este

mesmo antígeno, porém localizado em diferentes compartimentos celulares. Com isso

acredita-se que, pelo menos em parte, o aumento da imunogenicidade descrita nas cepas

antigas de BCG, deve-se a presença dessa proteína, que poderia ser utilizada como adjuvante

com outras cepas de BCG utilizadas na vacinação em outros países.

Além disso, cada uma destas cepas não apresenta outras regiões de diferenças

específicas. A cepa de BCG Danish possui uma deleção chamada RD Denmark/Glaxo

(Mostowy et al., 2003), uma região de 726 pb que afeta a Rv1809, que corresponde a uma

proteína da família PPE e a Rv1810, que corresponde a uma proteína hipotética conservada. A

cepa de BCG Pasteur não possui a chamada RD14 (Behr et al., 1999), uma região de 9073 pb

que afeta a Rv1766 à Rv1773c (Mostowy et al., 2003), sendo a Rv1768 correspondente a uma

proteína da família PE-PGRS, a Rv1771 corresponde a uma gulono-lactona desidrogenase

recentemente descrita e, os outros genes que correspondem a ORFs ainda não caracterizadas

(Alexander & Behr, 2007). A Rv1773 truncada explica a regulação positiva da transcrição do

operon Rv1774-Rv1775, observada apenas no BCG Pasteur. E a cepa de BCG Moreau não

possui a RD16 (Behr et al., 1999; Behr et al., 2002), uma região de 7068 pb que afeta a

Rv3400 à Rv3405c (Mostowy et al., 2003), onde essa Rv3405c corresponderia a uma possível

proteína de regulação transcricional. Uma hipótese interessante seria sugerir que esse fator

102

transcricional poderia ter um papel na regulação da expressão de alguns genes que passariam

a ser mais expressos nessa cepa em comparação com BCG Danish e BCG Pasteur, por

exemplo. E isso poderia também ajudar a explicar a maior imunogenicidade da cepa de BCG

Moreau. Mesmo assim, estudos de transcriptomica ou proteômica comparativa das cepas de

BCG (verificando RNAm e proteínas da micobactéria) em células infectadas no mesmo

modelo seriam necessários para confirmar essa hipótese.

De qualquer forma, no presente estudo, os resultados observados utilizando as três

cepas de BCG (Danish, Moreau e Pasteur) conhecidamente diferentes entre si, sugerem uma

interação hospedeiro-patógeno, que estaria sendo modulada pelo genótipo do hospedeiro, e

que seria dependente também da cepa de BCG (BCG Moreau). E ainda, a infecção por M.

leprae parece ter um efeito supressor em macrófagos in vitro maior que a infecção por BCG,

o que se acredita estar associado à regulação negativa da resposta imune do hospedeiro.

Ambos os resultados serão explorados adiante.

6.1. Análise do perfil de expressão gênica e secreção de citocinas de células THP-1 e PBMC frente à infecção com BCG e M. leprae

Foram investigadas possíveis diferenças na expressão e/ou secreção de

citocinas/quimiocinas em células infectadas com diferentes cepas de BCG e M. leprae. Para

isso, foi utilizada a linhagem celular THP-1, que representa um único hospedeiro, bem como a

influência de vários hospedeiros (PBMC de indivíduos saudáveis) na secreção destas

citocinas/quimiocinas.

Para a análise do perfil de expressão gênica, além da técnica de microarranjo de DNA,

foram utilizadas duas outras metodologias. Uma delas foi o qRT-PCR, que é a metodologia

mais utilizada para a quantificação da expressão gênica e é um dos métodos utilizados para

validação de experimentos de microarranjo. A outra metodologia foi o multiplex PCR em

tempo real através do sistema Biomark de microfluídica (Fluidigm), que foi colocada em

prática no nosso laboratório recentemente, e possibilitou a amplificação simultânea de 96

amostras utilizando 48 oligonucleotídeos, empregando uma quantidade muito menor de cada

amostra, de reagentes e de tempo, quando comparada a RT-PCR em tempo real. Porém, um

dos problemas do multiplex PCR em tempo real é o grande número de pares de

oligonucleotídeos específicos que são adicionados na mesma reação, possibilitando o

surgimento de produtos inespecíficos, podendo comprometer o rendimento da amplificação

103

(Dahl et al., 2007; Fredriksson et al., 2007). Entretanto, com uma única reação pode-se

analisar simultaneamente várias amostras com vários genes, diminuindo o viés experimental

relativo a eficiências distintas em múltiplas reações de PCR. Essa metodologia foi pela

primeira vez empregada em estudos de expressão gênica de células humanas infectadas com

micobactérias e, com isso, foram observadas algumas diferenças que serão discutidas adiante.

No presente estudo, decidiu-se começar a analisar diferenças na expressão gênica

utilizando cepas de BCG em uma baixa multiplicidade de infeção (MOI 2:1) que deveria se

assemelhar mais com o que acontece durante infecções in vivo. Existem vários outros

trabalhos que também optaram por utilizar uma baixa MOI. Por exemplo, Almeida e

colaboradores (2009) observaram a indução da expressão de PPAR-γ (do inglês, peroxisome

proliferator-activated receptor γ) em macrófagos infectados com BCG em MOI 1:1. Também

utilizando MOI 1:1, Vergara e colaboradores (2009) observaram a viabilidade de macrófagos

infectados por BCG frente a componentes de uma nova droga em desenvolvimento contra M.

tb. E ainda, com um MOI de 3:1, Méndez-Samperio e colaboradores (2010) observaram

aumento na expressão de CCL2 em células THP-1 diferenciadas e infectadas com BCG.

Entretanto, nenhum destes trabalhos exemplificados observou diferenças na expressão gênica

frente à infecção por diferentes cepas de BCG.

Com isso, no presente estudo, ao utilizar uma MOI baixa não observamos diferenças

na expressão gênica entre as células THP-1 infectadas com as cepas de BCG Danish, Moreau

e Pasteur. Como não houve diferenças ao utilizar as três cepas de BCG, apenas a cepa BCG

Moreau foi selecionada para comparar com a expressão gênica de células THP-1 infectadas

com M. leprae. Deste modo, foi observado que a expressão das quimiocinas, CCL2, CCL3,

CCL4, CCL7 e IL-8 foi regulada negativamente nas células infectadas com M. leprae em

relação às célula infectadas com BCG Moreau, o que foi correlacionado com o resultado de

secreção de CCL2 em sobrenadante de células THP-1, que apesar de não significante,

encontraca-se diminuida na infecção com M. leprae. Já foi demonstrado que CCL2, CCL3,

CCL4, CCL7 possuem habilidade de atrair e ativar principalmente monócitos, células T e

outros tipos celulares, como células NK (do inglês, natural killer) e células dendríticas,

enquanto IL-8 pode atrair e ativar principalmente neutrófilos, mas também algumas células T

e células NK (Méndez-Samperio et al., 2003; Luo et al., 2007). Com isso, sugere-se um papel

das quimiocinas na modulação da resposta imune protetora contra infecção por micobactérias,

indicando sua grande importância.

No presente estudo foi identificada uma produção aumentada de IL-8 em PBMC

infectada com BCG (independente da cepa), em acordo com trabalhos de Méndez-Samperio e

104

colaboradores (2001 e 2002). A secreção de IL-8 contribui para o início da resposta do

hospedeiro contra infecções de micobactérias, participando do aumento da inflamação local e

recrutamento de monócitos, linfócitos e neutrófilos. Embora tenha sido observado um

aumento na expressão de IL-8 em biopsia de pele de pacientes hansenianos (Kirkaldy et al.,

2003; Hussan et al., 2004), em nosso estudo não foram observadas diferenças na expressão

desta quimiocina em biopsia de nervo de pacientes com hanseníase, entretanto, foi observada

a diminuição na expressão gênica de IL-8 por M. leprae em células THP-1. Acredita-se que

baixos níveis desta quimiocina em uma situação de infecção in vivo estariam contribuindo

para a diminuição da migração celular durante a infecção pela micobactéria e,

consequentemente, com a diminuição da inflamação, sugerindo um sucesso infectivo nos

eventos mais precoces da interação de M. leprae:célula hospedeira. Mesmo assim, os dados

de expressão gênica não foram corroborados pelos níveis de secreção desta citocina, onde não

foi observada nenhuma diferença na secreção de IL-8 em células infectadas com BCG e M.

leprae, o que pode estar relacionado com a cinética de tempo escolhido para a análise de

expresão de mRNA e secreção de proteína.

Alguns trabalhos já mostraram o aumento da secreção das quimiocinas CCL2 (Luo et

al., 2007), CCL3, CCL4 e CCL5 (Méndez-Samperio et al., 2003) após infecção de PBMC por

BCG. Enquanto, Méndez-Samperio e colaboradores (2010) observaram aumento na

expressão/secreção de CCL2 por células THP-1. Com isso, sugere-se que a habilidade do

BCG em aumentar a produção de quimiocinas em células humanas estaria relacionada a um

aumento da resposta imune contra infecções micobacterianas. Entretanto, em nosso estudo

utilizando células THP-1, não foi observado o aumento da expressão destas quimiocinas, o

que poderia estar relacionado ao tipo celular utilizado e/ou diferenças no tempo de infecção.

Também foi observado um aumento na produção de quimiocinas após infecção de

células tanto por M. tb. (Lin et al., 1998; Kasahara et al., 1998; Ragno et al., 2001), quanto

por M. leprae (Sinsimer et al., 2010) e também em pacientes com hanseníase (Kirkaldy et al.,

2003; Hasan et al., 2006b). Entretanto, ao mesmo tempo em que Hasan e colaboradores

observaram um aumento na produção de CCL2 em soro de pacientes hansenianos, estes

autores observaram uma diminuição dos níveis de CCL2 em monócitos destes mesmos

pacientes em cultura in vitro infectados ou não por M. leprae; com isso, acredita-se que outros

tipos celulares além de monócitos, estariam contribuindo para a elevada produção desta

quimiocina in vivo. Estes dados estariam de acordo com a diminuição da expressão/secreção

de CCL2 que foi apresentada para as infecções por M. leprae em nosso estudo, e que foi

confirmada em biopsias de pacientes hansenianos. A baixa expressão/produção das

105

quimiocinas em células infectadas por M. leprae, poderia ser um indicativo de que células

THP-1 infectadas com esta micobactéria seriam capazes de evitar a ativação da resposta

quimiotática do hospedeiro, e assim, escapar de uma destruição pelo sistema imune do

hospedeiro, contribuindo para o estabelecimento da infecção intracelular e, como

consequência, a disseminação da doença. Infelizmente, não foi possível realizar infecção de

PBMC com M. leprae para uma comprovação definitiva da produção de CCL2 e IL-8, pois o

desenho experimental proposto se utiliza de M. leprae vivo, e, como não há uma farta

disponibilidade da micobactéria e os experimentos com PBMC são individualizados há

dificuldade de realizar ensaios de rotina com células isoladas a partir de sangue fresco.

Já foi mostrado que M. leprae é um pobre ativador de macrófagos e células dendríticas

in vitro, principalmente comparado com M. tb. e BCG (Suzuki et al., 1993; Murray et al.,

2007; Sinsimer et al., 2010), onde foi observado que BCG e M. tb. são melhores indutores de

IL-1 e TNF, e IL-6 (no caso de BCG) nestas células do que M. leprae, o que está de acordo

com nossos resultados de expressão de IL-1 e IL-6 que mostraram diminuição em células

THP-1 diferenciadas infectadas com M. leprae. IL-1 e IL-6 são citocinas pró-inflamatórias

que participam no controle de infecção aguda por micobactérias, e a diminuição destas

citocinas por M. leprae pode sugerir que a micobactéria esteja contribuindo para o

favorecimento da sua infecção, por evitar a reação do hospedeiro.

Estudos têm mostrado que PGL-1, antígeno principal e específico de M. leprae,

purificado da parede celular da micobactéria, possui um efeito modulador na indução de

citocinas por células humanas. Foi observado que PGL-1 purificado adicionado sozinho a

cultura de monócitos levou a uma pobre indução da produção de TNF (Silva et al., 1993;

Charlab et al., 2001; Dhungel et al., 2008; Manca et al., 2012), IL-6 (Silva et al., 1993), IL-

10 (Manca et al., 2012) e IL-1β (Silva et al., 1993; Manca et al., 2012), porém a produção de

TNF foi aumentada quando as células foram infectadas simultaneamente com PGL-1 e M.

leprae obtido a partir de tatu (acreditando-se que o PGL-1 tenha sido parcialmente perdido

durante o processo de purificação da micobactéria) (Charlab et al., 2001; Dhungel et al.,

2008). Entretanto esse aumento na produção de TNF ainda foi significativamente menor

comparado com a infecção por M. leprae obtido a partir de pata de camundongo, envolvendo

um processo de purificação menos rigoroso, acreditando-se possuir um PGL-1 mais intacto

(Dhungel et al., 2008). Além disso, foi observado que BCG Pasteur recombinante capaz de

sintetizar PGL-1 levou a uma diminuição da secreção de TNF em macrófagos comparado com

BCG Pasteur, apesar do BCG recombinante ter sido fagocitado mais eficientemente (Tabouret

et al., 2010). Ainda, Manca e colaboradores (2012) também utilizando este mesmo BCG

106

recombinante tiveram resultados opostos em monócitos mostrando um aumento na secreção

de TNF, e a possível explicação para essa diferença nos resultados seria atribuída a diferenças

na maturação e diferenciação destas células em cultura (monócitos ou macrófagos). Sendo

assim, acredita-se que PGL-1 possui um papel chave na regulação de citocinas/quimiocinas

em células humanas interferindo na reposta imune à infecção por M. leprae. É possível que o

PGL-1 no M. leprae vivo utilizado em nosso modelo de estudo, mesmo assumindo que uma

parte do PGL-1 tenha se perdido durante a purificação, esteja participando nesse efeito na

diminuição da expressão destas citocinas e quimiocinas contribuindo para evasão da resposta

imune do hospedeiro. Esta controvérsia é interessante, mas no nosso modelo parece que o M.

leprae se assemelha ao BCG recombinante do estudo de Tauboret (2010), pois induz uma

diminuição da expressão de genes associados à ativação da resposta imune protetora.

Além disso, também foi observada uma diminuição na expressão de SOD2 e

TNFSF15 em células THP-1 infectadas com M. leprae. SOD2 (do inglês, superoxide

dismutase 2) é uma enzima metabólica mitocondrial membro da família SOD, que está

envolvida na defesa contra superóxido (O2-) tóxico e outras espécies reativas de oxigênio

(ROS) (Rakkola et al., 2007). Macrófagos ativados produzem O2- tóxico e ROS durante a

fagocitose para destruir patógenos invasores, porém, estes produtos em níveis elevados podem

causar prejuízos ao DNA, proteínas e lipídeos, onde SOD2 atuaria como uma enzima

antioxidante. Rakkola e colaboradores observaram uma expressão elevada desta enzima em

macrófagos após estimulação com ligantes de TLR, sugerindo que SOD2 estaria envolvida na

proteção do macrófago contra estresse oxidativo durante a fagocitose de patógenos. Já foi

observado que a expressão de SOD2 foi estimulada por M. tb. em macrófagos (Thuong et al.,

2008) e por componentes da parede celular de BCG em células dendríticas (Ishii et al., 2005).

Além disso, foi observada a associação deste gene com suscetibilidade à hanseníase (Mira et

al., 2004). No nosso estudo, a diminuição da expressão desse gene observada em células

THP-1 infectadas com M. leprae, e validada in vivo em biópsia de nervo de pacientes

hansenianos confirma a participação do gene na resistência/suscetibilidade ao M. leprae.

Entretanto, a correlação genótipo-fenótipo é difícil de ser realizada com os dados nesse

momento. Estudos com a genotipagem dos pacientes para os SNPs associados à

suscetibilidade à hanseníase deverão ainda ser realizados para verificar os níveis de expressão

de mRNA no nervo. Ainda, devido aos resultados de expressão dos genes mitocondriais,

estudos funcionais para dosagem de produtos de metabolismo oxidativo em células do sangue

periférico de indivíduos genotipados também é uma estratégia interessante.

O gene SOD2 se encontra no cromossomo 6q25, próximo ao gene PARK2, que

107

compartilha um promotor com outro gene, o PARCRG (do inglês, parkin co-regulated gene)

(West et al., 2003), e ambos estão envolvidos no sistema de ubiquitinação. O gene PARK2

codifica uma proteína chamada parkina, uma E3-ubiquitina ligase multifuncional, que além de

participar da via de degradação de proteínas, interage com proteínas do sistema imune como,

TLRs e, ainda interfere na produção de ROS (revisado por Schurr et al., 2006). Também foi

demonstrada uma função anti-apoptótica da parkina, que estaria associada ao controle do

estresse oxidativo causado por ROS, levando à hipótese de que a infecção por M. leprae altere

de alguma maneira a expressão da parkina, o que poderia impedir a apoptose da célula e,

portanto, favorecer a perpetuação do M. leprae no organismo do hospedeiro. Foi observado

que SNPs nos genes PARK2 e PARCRG também estão associados à hanseníase. Dos SNPs

identificados nestes genes, o haplótipo formado apenas pelos polimorfismos das regiões -2599

e rs1040079 (localizados no promotor de PARK2 e PARCRG) mostrou-se bastante

informativo, de modo que a presença do alelo T na região -2599 e do alelo C no SNP

rs1040079 confere uma maior suscetibilidade à doença (Mira et al., 2004). Esses SNPs foram

associados à suscetibilidade à hanseníase em duas populações distintas, vietnamita e brasileira.

O aumento da expressão de outro gene, E3-ubiquitina ligase, foi observado em biópsias de

pacientes hansenianos no presente estudo, e apesar da grande quantidade de enzimas E3-

ubiquitina ligase identificadas, poderia reforçar a associação da parkina à hanseníase.

Outros genes associados à PARK2 como LRRK2 (leucine-rich repeat kinase 2) e

PINK1 (PTEN induced putative kinase 1), também foram incluídos no presente estudo.

LRRK2 é uma proteína citoplasmática que interage diretamente com a parkina e acredita-se

que estaria regulando a atividade ligase de PARK2 (Smith et al., 2005). Já foi identificada

uma associação de LRRK2 com a hanseníase em outros estudos (Zhang et al., 2009; Sun et

al., 2011), onde foi observada que o SNP rs1491938 neste gene mostrou uma forte associação

com a forma multibacilar, mas não com a paucibacilar da doença (Zhang et al., 2009),

entretanto não foi observada nenhuma associação da expressão diferencial de LRRK2 com a

hanseníase no presente estudo. PINK1 é uma proteína mitocondrial com suposta atividade

quinase, e teria um papel na proteção de células contra condições de estresse celular, e

consequentemente contra disfunções mitocondriais e apoptose. A maioria das mutações

identificadas em PINK1 está dentro do domínio quinase, podendo levar a perda da suposta

atividade quinase da proteína, o que afetaria a função das mitocôndrias (Valente et al., 2004).

Além disso, parkina-PINK1 regula o tráfico de mitocôndrias para a região perinuclear para

serem degradadas, indicando a participação destas proteínas na regulação da autofagia de

mitocôndrias danificadas (mitofagia) (Vives-Bauza et al., 2010). Deste modo, semelhanças

108

entre mecanismos de sinalização da autofagia de mitocôndrias e de bactérias intracelulares

(Deretic et al., 2009) reforçam a hipótese de que a parkina, assim como proteínas associadas a

ela, também estariam atuando na autofagia do M. leprae, e mutações nestas proteínas

poderiam proporcionar um ambiente que permita o crescimento da micobactéria. No entanto,

assim como LRRK2, PINK1 não se mostrou diferencialmente expresso em células infectadas

por M. leprae ou em biópsias de nervo de pacientes com hanseníase em nosso estudo.

TNFSF15 (do inglês, tumor necrosis factor (ligand) superfamily member 15), outro

gene também observado ter sua expressão diminuída em células THP-1 infectadas com M.

leprae, é uma molécula da superfamília do TNF que é expressa em células endoteliais,

macrófagos, células dendríticas, e células T e B (Croft, 2009). Tem sido relatado que o

TNFSF15 tem um papel importante na modulação da resposta imune adaptativa. Este gene,

também conhecido como TL1A, se liga a um receptor pertecente a família de TNF (DR3, do

inglês, death receptor3) e essa interação TNFSF15-DR3 pode resultar em aumento da

proliferação de células T e produção de citocinas (Meylan et al., 2008). A expressão

aumentada de TNFSF15 em lesões de pacientes hansenianos (Sun et al., 2011), e variantes

genéticos nesse gene identificados através de um estudo de associação do genoma completo

(GWAS, do inglês genome-wide association study) (Zhang et al., 2009), mostraram uma

significativa associação à suscetibilidade à hanseníase. Entretanto, esta associação de

TNFSF15 não foi replicada em estudos realizados por Wong e colaboradores (2009), e uma

possibilidade, seria que o efeito de variantes neste gene poderia ser população-específica,

sendo associado à suscetibilidade à hanseníase em chineses, no caso do estudo de Zhang e

colaboradores. Porém, não estaria associado à suscetibilidade à doença em indianos, no caso

do estudo de Wong e colaboradores, e nem em brasileiros (dados não mostrados), indicando a

heterogeneidade da população. Os dados de expressão em nervos de pacientes não

confirmaram os ensaios de infecção de M. leprae in vitro utilizando a linhagem THP-1. A

discrepância dos resultados (que também aparecem nos estudos genéticos da literatura) nos

impede de indicar mais claramente como o TNFSF15 participaria na suscetibilidade à

hanseníase.

TNF é uma citocina pró-inflamatória, produzida principalmente por macrófagos,

linfócitos T e células NK. Esta citocina possui um papel fundamental na defesa do hospedeiro

contra infecções micobacterianas, onde está intimamente envolvida na formação do

granuloma e restrição de micobactérias (Garcia et al., 1997; Kindler et al., 1998). Foi

observado que a administração de drogas anti-TNF para doenças autoimunes, como por

exemplo, a doença de Crohn, levou a ativação de uma infecção latente por M. tb. ou M. leprae,

109

e os pacientes desenvolveram tuberculose pulmonar ou hanseníase (revisado por Moraes et al.,

2006), demonstrando um papel essencial no controle da latência da infecção por

micobactérias, impedindo a progressão da doença. No presente estudo, não foram observadas

diferenças na expressão gênica entre células THP-1 infectadas com as cepas de BCG, nem em

relação ao controle em ambas as MOIs. Entretanto, foi observado um aumento na secreção de

TNF em células infectadas com as cepas de BCG em relação ao controle, apesar de não ter

sido observada diferenças entre as cepas de BCG utilizadas, porém apenas utilizando uma

carga bacteriana maior (10:1). Quando foram comparadas apenas células infectadas com a

cepa de BCG Moreau e M. leprae, foi observado um aumento na secreção de TNF após

infecção por BCG em relação às células infectadas com M. leprae, de acordo com os

trabalhos discutidos acima, onde foi demonstrado que BCG é um melhor indutor de TNF

(além de IL-1 e IL-6) do que M. leprae (Suzuki et al., 1993; Murray et al., 2007; Sinsimer et

al., 2010). Entretanto, apesar desse aumento na secreção de TNF no sobrenadante de células

THP-1, não foi observado o aumento da expressão do mRNA de TNF, sugerindo claramente

uma regulação pós-transcricional deste gene, que pode ter sido alvo da atuação de um miRNA.

Devido a ausência de diferenças na secreção das citocinas entre as células THP-1 após

infecção com as diferentes cepas de BCG, foi investigado, através da utilização de PBMC, se

a variabilidade do hospedeiro poderia influenciar na secreção destas citocinas. Com isso, foi

observado um aumento significante nos níveis de TNF, entretanto, apenas nas células

infectadas com a cepa de BCG Moreau, indicando que a variabilidade do hospedeiro poderia

influenciar na secreção desta citocina; além disso, o resultado sugere uma interação

hospedeiro-cepa específica. Esse resultado levou o nosso grupo a investigar a associação de

SNPs na produção desta citocina.

O gene TNF é um dos alvos mais comuns de estudos de associação em hanseníase,

principalmente o SNP -308G>A. A freqüência deste SNPs no promotor de TNF já foi bem

investigada, e foi mostrado que o SNP -308A tem uma frequência aumentada em controles

quando comparados a pacientes, sugerindo uma associação deste alelo com proteção à

hanseníase (Santos et al.,2000; Moraes et al., 2001; Santos et al.,2002; Cardoso et al., 2011b).

Assim, a produção aumentada de TNF restringiria a proliferação do M. leprae. No presente

estudo, foi avaliada a influência deste SNP, rs1800629, na secreção de TNF em sobrenadante

de PBMCs infectadas com as diferentes cepas de BCG, e não foi observada diferença na

secreção desta citocina nestas células, independente do genótipo e da cepa estudada, nem

mesmo diferenças no log(TNF/IL-10). Além disso, também não foi observada influência do

SNP IL-10 -C819T na produção desta citocina.

110

IL-10 é uma citocina produzida principalmente por macrófagos e monócitos, mas

também podem ser induzidas em células T, B e eosinófilos. É uma citocina pleiotrópica, que

desenvolve atividade anti-inflamatória e imunossupressora sobre a resposta imune Th1 pela

supressão de citocinas pró-inflamatórias, como IFN-, TNF, IL-12 e GM-CSF, e é co-

estimuladora de citocinas em macrófagos, contribuindo para a persistência do patógeno (Volk

et al., 2001; Grutz, 2005). Já foi observado que a síntese de IL-10 está aumentada em

infecções micobacterianas (Misra et al., 1995; Santos et al., 2002; Jang et al., 2006). Esta

citocina mostrou estar associada à hanseníase, onde foram observados níveis aumentados de

IL-10 nas formas multibacilares da doença (Yamamura et al., 1991; Misra et al., 1995;

Moubasher et al., 1998). O alelo T do polimorfismo -C819T em IL-10 foi associado à

suscetibilidade à hanseníase na população brasileira em dois estudos diferentes (Santos et al.,

2002; Pereira et al., 2009), além de ter sido confirmado na população indiana (Malhotra et al.,

2005). No estudo de Pereira e colaboradores foram observados níveis menores de IL-10 nos

carreadores do alelo -819T comparado com os não carreadores, indicando que este SNP

regula a secreção de IL-10 in vitro. Estes resultados somados a resultados anteriores sugerem

uma participação definitiva do alelo IL-10 -819T na suscetibilidade a hanseníase.

Em nossos estudos, não foram observadas diferenças na expressão de IL-10 em células

THP-1, independente da micobactéria e da MOI utilizada. Além disso, não foram obtidos

níveis detectáveis de IL-10 em sobrenadantes destas células, o que poderia estar relacionado

ao tempo de infecção escolhido. Entretanto, curiosamente foi observada secreção de TNF por

THP-1 após 24 horas de infecção por BCG Pasteur (Sendide et al., 2005), porém foi utilizada

diferentes MOIs (25:1 e 50:1) e concentração de PMA (20 ng/ml). Embora estudos anteriores

do nosso laboratório sugiram que para PBMC o pico de secreção de IL-10 seja entre 18-20h

(Sampaio et al., 1998), para as células THP-1 utilizadas em nosso estudo, o tempo de 24 h

poderia não ser o tempo ideal, já que foi observado secreção de IL-10 por células THP-1 após

72 h de infecção por M. tb. (Lasunskaia et al., 2010; Kanji et al., 2011). Deste modo, optou-se

por utilizar o tempo de 72 h de infecção em PBMC. Com isso, observamos secreção de IL-10,

e apesar de ter sido notado um aumento desta citocina em células infectadas com as cepas de

BCG em relação às células controle, não foi observada nenhuma diferença significante entre

as células infectadas com as diferentes cepas. Entretanto, foi notado um agrupamento, de

baixos, intermediários e altos produtores de IL-10; levando-se em consideração que SNPs no

promotor de IL-10 estão associados à hanseníase, resolveu-se investigar a influência do

polimorfismo genético -819 na produção de IL-10, e sobre o log(TNF/IL-10). Apesar de ter

sido observado que a produção de IL-10 foi influenciada pelos genótipos em infecção de

111

PBMCs com M. leprae (Pereira et al., 2009), aqui, a produção de IL-10 e o log(TNF/IL-10)

não foram influenciados pelos genótipos em cada estímulo de BCG utilizado. Além disso,

também não foi observada influência do SNP TNF -308G>A na produção desta citocina.

Ainda no estudo de análise de associação realizado por Wong e colaboradores, foram

identificados variantes genéticos em regiões de TLR1 que estariam associados com a

suscetibilidade à hanseníase, onde o efeito do tamanho desta associação observada sugere que

TLR1 é um dos principais genes associados à suscetibilidade à hanseníase (Wong et al., 2009).

Um dos SNPs de TLR1 é o N248S localizado no domínio extracelular, necessário para o

reconhecimento de lipopeptídeos bacterianos (Omueti et al., 2007), e foi observado que o

genótipo homozigoto SS está relacionado com o aumento da suscetibilidade à hanseníase na

população de Bangladesh (Schuring et al., 2009). A associação do polimorfismo N248S à

hanseníase foi confirmada por Salles-Marques e colaboradores (dados ainda não publicados),

onde os autores demonstraram que o alelo 248S está associado à suscetibilidade à doença na

população brasileira. Então, resolveu-se estudar a influência desse polimorfismo na produção

de citocinas por células humanas e se haveria alguma diferença em relação à cepa de BCG

utilizada. Com isso, foi investigada a influência do SNP rs4833095 na secreção de TNF e IL-

10 em sobrenadante de PBMCs infectadas com as diferentes cepas de BCG, e não foi

observada diferença na secreção destas citocinas nestas células, independente do genótipo e

da cepa estudada. Entretanto, a análise do log(TNF/IL-10), demonstra que indivíduos

carreadores do alelo S tiveram uma diminuição significante no log(TNF/IL-10) quando as

células foram infectadas com a cepa de BCG Moreau, sugerindo um padrão de ativação da

resposta imune dependente não só do genótipo do hospedeiro, mas também da cepa utilizada.

Essa diminuição do log(TNF/IL-10) em carreadores de S foi confirmada por Salles-Marques e

colaboradores (dados ainda não publicados) quando as células foram estimulados por um

antígeno de M. leprae. Como já foi observado que níveis aumentados da razão TNF/IL-10

estão associados à proteção à hanseníase (Lima et al., 2000), uma baixa razão TNF/IL-10

observada nos carreadores do alelo S, sugere uma influência deste SNP na ativação da

resposta imune contra M. leprae, e poderia indicar uma diminuição da ação protetora da cepa

BCG Moreau contra infecção por M. leprae.

Outra metodologia empregada neste estudo para análise da expressão de genes

envolvidos direta e indiretamente na resposta imune de células THP-1 foi o microarranjo de

DNA. A tecnologia do microarranjo é uma poderosa ferramenta pela qual é possível obter

informações sobre a expressão de milhares genes simultaneamente avaliados em diferentes

condições biológicas. Deste modo, através do microarranjo é possível medir a quantidade de

112

mRNA (ligado em cada sítio do arranjo) de milhares de genes paralelamente num mesmo

experimento, e é extremamente útil quando se necessita analisar um grande número de genes

rapidamente. Essa metodologia já vem sendo utilizada há bastante tempo para investigar

diferenças na expressão após infecção por micobactérias, onde no estudo de Ragno e

colaboradores (2001) foram investigadas diferenças na expressão gênica de células THP-1

infectadas com M. tb. em diferentes tempos de infecção. Apesar das novas tecnologias

desenvolvidas, como os sequenciadores de nova geração, o microarranjo é uma ferramenta

empregada até hoje. Recentemente foi utilizada para investigar mudanças transcricionais de M.

tb. em resposta a exposição a uma nova droga, a linezolida (Liang et al., 2012), bem como

utilizada para identificação de M. tb. e M. bovis em gado (Jia et al., 2012).

Através do PCR em tempo real, não foram observadas diferenças na expressão gênica

de células infectadas com as diferentes cepas de BCG. Sendo assim, foi utilizada nesta etapa

para as análises por microarranjo, apenas a cepa de BCG Moreau em comparação com M.

leprae. Devido a algumas limitações de tempo e custo da técnica, em nosso trabalho,

inicialmente foram utilizadas para comparação, apenas células infectadas com micobactérias

em MOI 10:1; entretanto comparações utilizando MOI 2:1 serão realizadas futuramente.

Obviamente, estamos na fase de confirmação da expressão gênica por qRT-PCR tanto em

THP-1 utilizando um número maior de replicatas, bem como nas amostras de biópsias de

nervo. Entretanto, os resultados encontrados são muito interessantes adicionando novos genes

de vias importantes que podem desempenhar um papel fundamental na

resistência/suscetibilidade à hanseníase.

Foram encontrados 12 genes como diferencialmente expressos incluindo as três

condições experimentais. Na primeira condição, onde foram comparadas indiretamente as

células infectadas com BCG Moreau e as células controle, foram observados dois genes como

diferencialmente expressos. O gene C21orf126 localizado no braço longo do cromossomo 21,

que codifica uma proteína ainda não caracterizada, se mostrou induzido em células infectadas

com BCG Moreau em relação às células controle. Enquanto, o gene TMEM101 se encontrava

reprimido nas células infectadas com BCG. Esse gene está localizado no cromossomo 17 e

codifica a proteína transmembranar 101. Tem sido proposto que essa proteína participa da

regulação positiva da cascata I-kappaB quinase/NF-kappaB (informação retirada do NCBI,

AceView: Gene:TEMEM101). Esse TMEM101 também se encontrava reprimido nas células

infectadas com M. leprae em relação às células controle, que foi a segunda condição avaliada,

o que corrobora os resultados.

Também foram observados genes diferencialmente expressos após vacinação de

113

indivíduos com BCG Moreau (Schreiber et al., 2010). Neste trabalho, os autores utilizaram

microarranjo para analisar perfil de expressão gênica de indivíduos saudáveis vacinados

oralmente com BCG Moreau em 3 dias diferentes. Com isso, observaram 6 genes reprimidos

quatro dias após a primeira vacinação e 9 genes reprimidos sete dias após a primeira

vacinação. Nenhum destes genes diferencialmente expressos foi observado em nosso estudo.

A terceira condição analisada foi a comparação entre células infectadas com BCG e M.

leprae, onde foram observados 9 genes diferencialmente expressos. Destes, destaca-se o gene

LGALS1 (do inglês, lectin, galactoside-binding, soluble, 1), reprimido em células infectadas

com M. leprae. Esse gene codifica a galectina-1 (Gal-1), uma subdivisão das galectinas, que

pertencem à família das lectinas, proteínas de ligação de beta-galactósideos implicadas na

modulação de interações célula-célula e célula-matriz, e podem regular proliferação e

diferenciação celular, secreção de citocinas, migração e apoptose (Paclik et al., 2011). Gal-1 é

expressa por muitos tipos celulares, incluindo células do sistema imune, como monócitos e

macrófagos (Stewart et al., 2008), e se mostrou ser quimoatraente de monócitos in vitro

(porém não de macrófagos), assim como CCL2 (Malik et al., 2009). Gal-1 também apareceu

diferencialmente expressa nos experimentos de microarranjo realizados por Galindo e

colaboradores (2009). Nesse estudo, utilizando modelo animal, foi observado que este gene se

encontrava reprimido após infecção por M. bovis. Esse resultado, somado ao nosso, sugere

que a expressão diminuida de Gal-1 em resposta a infecção por micobactérias mais virulentas,

como M. bovis e M. leprae, seria um mecanismo do hospedeiro para evitar a inibição da

replicação destas micobactérias nos macrófagos infectados.

Um dos achados mais interessantes do estudo de microarranjos foi a repressão do gene

RNPEP [do inglês, arginyl aminopeptidase (aminopeptidase B)] parálogo ao LTA4H. RNPEP

codifica aminopeptidase B, uma exopeptidase que selectivamente remove resíduos de arginina

e/ou lisina a partir do N-terminal de vários substratos de peptídeos (Foulon et al., 1999),

podendo hidrolisar leucotrieno A4 (LTA4) em leucotrieno B4 (LTB4), um mediador lipídico

de inflamação. A produção diferencial de LTB4 está associada com infeções micobacterianas,

onde já foi demonstrada a indução de LTB4 em soro de camundongos após infecção por M. tb.

(Bafica et al., 2005). Então, assim como a deficiência de LTA4H causada por um

polimorfismo no locus deste gene, a diminuição de RNPEP levaria a uma baixa produção de

LTB4, que por sua vez, leva a uma baixa produção de TNF, o que pode causar uma

deficiência da proteção à infecções micobacterianas, resultando em tuberculose clínica ou na

forma multibacilar da hanseníase (Tobin et al., 2010). Porém, também foi mostrado que

excesso de LTB4, resultando em uma resposta pró-inflamatória exarcebada, pode levar ao

114

adoecimento do indivíduo, como consequência do aumento da imunopatologia. Com isso,

Tobin e colaboradores (2012) sugerem que uma terapia sob medida para genótipos específicos

de LTA4H que levam a esses estados inflamatórios divergentes (devido a uma resposta imune

inadequada ou exacerbada do hospedeiro) poderia melhorar os resultados dos pacientes ao

tratamento de doenças micobacterianas.

Nesse mesmo contexto, pensar em uma terapia preventiva específica para contatos de

pacientes hansenianos que possuem um genótipo de TLR1 que indique um fenótipo TNF/IL-

10 baixo, através da utilização de medicamentos que influencie no reestabelecimento da

resposta moderada TNF/IL-10 é uma estratégia interessante. Ainda, a vacinação com uma

cepa de BCG adjuvantada específica para o genótipo do hospedeiro, seria importante contra

infecção por M. leprae, e consequente redução no número de novos casos de hanseníase, o

que sugere claramente o início da era da vacinação personalizada.

Outro gene reprimido foi o GPI (do inglês, Glucose-6-phosphate isomerase),

pertencente à família GPI, cujos membros codificam proteínas multifuncionais fosfoglicose

isomerase (PGI) envolvidas nas vias de glicólise e glicogênese (Malaisse et al., 1990; Jeffery

et al., 2000; Tsutsumi et al., 2009). A PGI tem sido bem estudada no câncer, onde o aumento

desta proteína está associada à progressão da doença (Funakasa et al., 2009; Tsutsumi et al.,

2009). Porém, não foram encontrados relatos na literatura sobre o papel desta proteína em

doenças micobacterianas, assim como da proteína MESP2 (do inglês, mesoderm posterior 2),

codificada pelo gene MESP2, também reprimido pela infecção com M. leprae. MESP2 é um

fator de transcrição tipo bHLH (do inglês, basic helix-loop-helix) (Haraguchi et al., 2001). A

família HLH é um grupo de fatores de transcrição eucariótico que estão envolvidos na

regulação de diversos processos biológicos, dentre eles, a diferenciação e proliferação celular

(Toledo-Ortiz, et al., 2003).

Os experimentos envolvendo microarranjos não têm como objetivo confirmar uma

hipótese a priori. Seu principal objetivo seria funcionar como uma ferramenta geradora de

hipóteses, onde os dados obtidos muitas vezes servem como base para estudos mais precisos

de expressão gênica realizados através de PCR quantitativo e de outros métodos. Neste caso,

após uma análise estatística dos dados de microarranjo, os genes candidatos observados

precisariam passar por comprovação. Infelizmente no presente trabalho, não foi possível

realizar a confirmação dos resultados de microarranjo, e devido à falta de validação, é

possível que os resultados obtidos sejam falso positivos. Entretanto, já foram desenhados

oligonucleotídeos para os principais genes observados no microarranjo e a confirmação dos

resultados através de RT-PCR em tempo real será realizada futuramente. Devido a algumas

115

limitações técnicas em nosso trabalho, as análises de expressão gênica por qRT-PCR foram

realizadas antes das análises de expressão gênica por microarranjo, e com isso, nenhum dos

genes identificados como diferencialmente expressos por qRT-PCR foram confirmados por

experimentos de microarranjo. E apesar desta tecnologia não ter como finalidade a validação

de resultados, acredita-se que essa falta de confirmação, seja em parte, devido ao enorme

volume de dados gerados a partir de uma lâmina de microarranjos, e com isso seria

importante direcionar as análises para os objetivos específicos do experimento, além de levar

em conta a variabilidade técnica e tamanho amostral.

Com base em nossos resultados, onde foi observada a diminuição de várias

citocinas/quimiocinas relacionadas à resposta imune contra infecção por M. leprae, sugere-se

que M. leprae parece ter um efeito mais supressor do que indutor de resposta imune em

macrófagos in vitro. Esse efeito supressor pode ser, em parte, atribuído ao antígeno PGL-1, já

que, como mencionado anteriormente, foi observado um aumento da fagocitose de BCG

Pasteur recombinante produtor de PGL-1 em macrófagos humanos ao mesmo tempo em que

foi associado a uma diminuição na resposta inflamatória, quando comparado com BCG

Pasteur selvagem (Tabouret et al., 2010).

Outra hipótese para a diminuição da expressão de alguns dos genes estudados induzida

por M. leprae, seria a influência de miRNAs. Já foi mostrado que a infecção por M. leprae

regula o perfil de miRNA interferindo com a resposta antimicrobiana do hospedeiro,

contribuindo para o aumento da viabilidade da micobactéria. Foi observado que o miRNA

hsa-mir-21 estava mais expresso em lesões de pacientes LL, confirmado em monócitos in

vitro infectados com M. leprae ou apenas estimulados com PGL-1 (Liu et al., 2012). Esse

hsa-mir-21 diminui a expressão de CYP27B1 e IL-1β, levando a inibição da expressão de

genes da via microbicida dependente de vitamina D, onde ele atuou diretamente. É possível

que este miRNA esteja contribuindo para a diminuição de IL-1β, assim como outros miRNAs

poderiam estar influenciando na repressão de outros genes observados no presente estudo.

6.2. Análise do perfil de expressão gênica em biopsias de nervos de pacientes hansenianos e não hansenianos

Em um estudo tipo caso/controle foi investigada a expressão gênica entre pacientes

hansenianos (L) e não hansenianos (NL). Com isso, foi observado através de um PCR

multiplex em tempo real, que 16 genes se encontravam diferencialmente expressos entre as

116

duas condições (L e NL).

Assim como foi observado na análise do perfil de expressão gênica em células THP-1

infectadas com M. leprae, houve uma diminuição da expressão das quimiocinas, CCL2,

CCL3 e CCL4, e também de IL-1β e SOD2 em amostras de pacientes hansenianos. Outras

citocinas também se mostraram menos expressas nestes pacientes, como é o caso de IL-10 e

IL-12.

Já foi mostrado que a forma tuberculóide da hanseníase possui um perfil de células

preferencialmente Th1, com produção de citocinas como TNF, IFN-γ, IL-1 e IL-12, onde se

observam macrófagos com atividade antimicrobiana dependente de vitamina D, que é

induzida por IL-15. Enquanto a forma lepromatosa apresenta um perfil preferencialmente Th2,

com produção de IL-4, IL-5 e IL-10 (Yamamura et al., 1991), onde IL-10 desencadearia a

atividade fagocítica dos macrófagos (Montoya et al., 2009). Esta citocina, como mencionado

anteriormente, possui atividade imunoreguladora, e IL-12 é uma das citocinas que sofrem

supressão por ação da IL-10. IL-12 potencializa o desenvolvimento de células T, que passam

a produzir citocinas inflamatórias, IFN-γ, TNF e IL-2 que por sua vez vão mediar a resposta

imune (Demangel & Britton, 2000). Então, uma produção de IL-12 diminuída estaria

associada à suscetibilidade a infecção por micobactérias. Esta citocina é produzida por

monócitos/macrófagos e células dendríticas após contato com a micobactéria, e o equilíbrio

entre a produção de IL-12 e IL-10 é de fundamental importância, onde IL-12 promove o

aumento da resposta Th1, enquanto IL-10 diminui essa resposta (Libraty et al. 1997). Assim,

é esperada uma diminuição da produção de IL-12 em lesões de pacientes hansenianos, em

razão de um aumento da expressão de IL-10. IL-10 promoveria um aumento da fagocitose de

micobactérias e de lipoproteína de baixa densidade oxidada (oxLDL), onde estes lipídeos

podem inibir a resposta imune inata contra as micobactérias através da diminuição da

atividade antimicrobiana induzida por TLR e do desvio do equilíbrio das citocinas para

induzir uma produção maior de IL-10 e menor de IL-12 (Cruz et al., 2008). Entretanto, apesar

de ter sido observado o aumento do receptor de LDL (que será discutido mais adiante), o que

deve levar ao aumento nos níveis de LDL, contribuindo para a repressão de IL-12 observada

no presente estudo, curiosamente, também foi observada a diminuição de IL-10 em pacientes

hansenianos. Uma possível explicação para essa ausência de relação observada entre a

expressão das citocinas seria a falta de uma estratificação dos pacientes hansenianos de

acordo com as formas clínicas da doença, para uma investigação do perfil de citocinas

específicas de acordo com cada programa de diferenciação macrofágica, predominantes em

117

cada pólo da doença.

Outro gene que se mostrou reprimido em pacientes hansenianos foi o Bad (do inglês,

BCL-2 antagonist of cell death), que é um gene pró-apoptótico, membro da família Bcl-2 (do

inglês, B-cell CLL/lymphoma 2), que codificam proteínas que podem promover ou inibir a

apoptose. Bad regula positivamente a apoptose, pois forma heterodímeros com proteínas anti-

apoptóticas conseguindo reverter a sua atividade repressora de morte celular. As

micobactérias interferem com a apoptose da célula hospedeira através da modificação da

expressão de membros da família Bcl-2, onde já foi observado que M. tb. reprime a apoptose

pela regulação positiva de genes anti-apoptóticos, como Bcl-2 e Mcl-1, e repressão dos genes

pró-apoptóticos, Bad e Bax (do inglês, BCL2-associated X protein) em células epiteliais;

entretanto em linhagens de macrófagos alveolares (U937), foi observado o contrário

(Danelishvili et al., 2003). Esse aumento da expressão de genes pró-apoptóticos, como Bax e

Bak (do inglês, Bcl-2 homologous antagonist/killer) também foi observado ao utilizar PBMC

de pacientes hansenianos infectados por M. leprae morto (Hernadez et al., 2003), porém

acredita-se que macrófagos de pacientes hansenianos estejam mais propensos a morte por

apoptose do que macrófagos de indivíduos saudáveis. No entanto, o gene Bad também se

mostrou reprimido após infecção de células THP-1 por M. leprae nos estudo de Hasan e

colaboradores (2006a). Nesse trabalho, os autores observaram que M. leprae morto inibe a

apoptose pela repressão da expressão de genes pró-apoptóticos Bad e Bak e indução do gene

anti-apoptótico Mcl-1 (do inglês, myeloid cell leukemia sequence 1), enquanto na infecção por

BCG foi observado o oposto, o que implica o papel da apoptose na defesa da células

hospedeiras contra a infecção micobacteriana. Trabalhos recentes mostraram que M. leprae

viável não induz apoptose em macrófagos murinos, apesar de M. leprae morto induzir, (Lahiri

et al., 2010) e em linhagem de células de Schwann, em condições de privação de soro

(Rodrigues et al., 2010). Apesar de ainda ser controverso se M. leprae induz ou não apoptose,

o que pode ser causado pelas diferentes fontes, pureza e viabilidade da micobactéria, estes

resultados somados as nossas observações, (que incluem a repressão de Bad e indução de

URE-B1) ajudam a confirmar a diminuição da apoptose da célula hospedeira pela infecção por

M. leprae, o que seria uma estratégia adequada deste patógeno intracelular que só se

multiplica a cada 14 dias.

Um conjunto de genes que também se mostraram regulados negativamente em

pacientes hansenianos, foram os mitocondriais, mt_ATP6 (do inglês, mitochondrially encoded

ATPsintetase subunit 6), mt_COX-2 (do inglês, mitochondrially cytochrome c oxidase subunit

2), mt_CYB (do inglês, mitochondrially encoded cytochrome b), mt_ND1 (do inglês,

118

mitochondrially encoded NADH dehydrogenase subunit 1), mt_ND3 (do inglês,

mitochondrially encoded NADH dehydrogenase subunit 3) e mt_ND5 (do inglês,

mitochondrially encoded NADH dehydrogenase subunit 5); cada um codifica uma subunidade

de um dos complexos protéicos que participam da fosforilação oxidativa, cujo objetivo final é

a geração de trifosfato de adenosina (ATP). Estes complexos protéicos estão localizados na

membrana interna da mitocôndria e são subdivididos em complexo I (NADH-ubiquinona

oxidoredutase ou desidrogenase), complexo II (succinato-ubiquinona oxidoredutase),

complexo III (ubiquinolol-citocromo c oxidoredutase), complexo IV (citocromo c oxidase) e

complexo V (ATP sintase). Os genes mitocondriais foram investigados no presente estudo,

após terem sido identificados em estudos recentes de nosso laboratório (Ferreira, 2011), como

reprimidos em células de Schwann após infecção por M. leprae, sugerindo uma repressão de

etapas do metabolismo energético mitocondrial. As alterações mitocondriais observadas

estariam de acordo no que se refere a processos de apoptose e autofagia que muitas vezes são

iniciados pela mitocôndria. Essas organelas desempenham uma função central como sensor de

estresse dentro da célula, e a repressão de genes mitocondriais, poderia ser uma confirmação

da diminuição da apoptose ocasionada pela infecção por M. leprae.

Ainda nesta análise de expressão gênica, foi identificado um aumento na expressão do

gene E3-Ubiquitina ligase (URE-B1) em pacientes hansenianos. Existe um grande número de

enzimas E3-Ubiquitina ligase, e várias delas já foram identificadas como reguladoras da

resposta imune. Uma das mais conhecidas é a parkina (Schurr et al., 2006), já mencionada

anteriormente, descrita como associada à hanseníase.

Outro gene que também teve sua expressão aumentada foi o LDLR (receptor de

proteína de baixa intensidade). Foi mostrado que as micobactérias além se ligarem a uma

variedade de receptores em macrófagos, como TLR, complemento, manose, também são

capazes de interagir com colesterol da membrana plasmática (Gatfield & Pieters, 2000). A

parede celular micobacterina, já conhecida por ser rica em glicolipídeos, parece conter

componentes que se ligam diretamente ao colesterol, indicando a presença de um sítio de

ligação a colesterol de alta afinidade (Gatfield & Pieters, 2000); com isso, o teor de colesterol

das membranas das células do hospedeiro parece ser fundamental para a entrada das

micobactérias. Sendo assim, sugere-se que o colesterol funcione como um sítio para ligação

direta das micobactérias, estabilizando sua ligação com a membrana das células do hospedeiro.

Sendo assim, é proposto que LDLR esteja aumentado nas infecções micobacterianas, para

aumentar os níveis de LDL, como mecanismo do patógeno de facilitar sua entrada nas células

do hospedeiro.

119

6.3. Considerações finais Uma limitação das análises realizadas no presente estudo foi o tamanho amostral,

principalmente no que diz a respeito às infecções com M. leprae vivo, que como mencionado

anteriormente, não havia uma farta disponibilidade da micobactéria. A ausência de uma

cinética a fim de ser definido qual o melhor tempo para dosagem de citocinas no sobrenadante

das células pode ter contribuído para a divergência de resultados entre expressão gênica e a

secreção de citocinas.

Curiosamente, os efeitos observados na regulação da expressão gênica em células

THP-1 parecem pronunciados apenas em MOI 2:1. Uma hipótese para não terem sido

observadas diferenças em MOI 10:1, seria o baixo número de replicatas em nosso estudo.

Entretanto, quando dosamos os níveis de citocinas em sobrenadantes de THP-1, observamos

que em baixa MOI (e nos tempos escolhidos) não houve nenhuma diferença nos níveis de

citocinas. Porém, em MOI 10:1 foi observado aumento nos níveis de TNF para as cepas de

BCG, um dos motivos para ter sido escolhido este MOI para dosagem das citocinas em

sobrenadantes de PBMC infectadas pelas cepas de BCG.

Mesmo assim, reunimos aqui uma série de resultados muito relevantes e, em conjunto

com dados recentes na literatura (Di Pietrantonio et al., 2011; Randawa et al., 2011), têm

mostrado que cepas de BCG específicas têm papel protetor dependente também do genótipo

do hospedeiro. Nossos estudos com diferentes cepas vacinais de BCG utilizadas para

prevenção de doenças micobacterianas, sugerem que a interação do patógeno com o

hospedeiro indica padrões de resposta imune específicas para a cepa de BCG Moreau que não

se repetem nas cepas de BCG Pasteur ou Danish. Entretanto, o efeito é observado apenas

quando as diferentes cepas são utilizadas para estímulo em células de sangue periférico de

diferentes indivíduos com genótipos distintos. Além disso, vale a pena ressaltar que são

indivíduos que já foram expostos à micobactérias ambientais e provavelmente todos já foram

vacinados com BCG Moreau (uma ou até duas vezes), o que poderia contribuir para as

diferenças observadas entre os indivíduos, e para o efeito específico observado com BCG

Moreau. Quando as diferentes cepas são utilizadas para infectar uma linhagem celular, que

apresenta apenas um único genótipo, essas diferenças não são observadas.

Acredita-se então, que esses fatores poderiam refletir interações específicas cepa de

BCG-hospedeiro. Com isso, acredita-se que uma vacina de BCG específica para o genótipo

do hospedeiro seria mais eficaz na prevenção contra TB e hanseníase. Entretanto, até agora

120

não há relatos que descrevam a relação genótipo-fenótipo, ou seja, como que indivíduos que

carregam determinadas combinações genotípicas respondem frente à infecção.

121

7. CONCLUSÕES

122

1 – Não houve diferenças na expressão gênica e na secreção de citocinas/quimiocinas de

células THP-1 infectadas pelas cepas de BCG Danish, Moreau e Pasteur independente da

multiplicidade de infecção utilizada (2:1 e 10:1), podendo ser correlacionados estes resultados;

2 – A infecção de células THP-1 por M. leprae levou a uma diminuição da expressão de genes

associados a infecções micobacterianas, porém apenas quando a MOI 2:1 foi utilizada. Os

genes reprimidos foram SOD2 e TNFSF15, e os genes codificantes para as quimiocinas IL-8,

CCL2, CCL3, CCL4 e CCL7, e para as citocinas IL-1β e IL-6;

3 – Não houve diferenças nos níveis de secreção de citocinas e quimiocinas entre as células

THP-1 infectadas por BCG Moreau e M. leprae em MOI 2:1 no tempo estudado. Por outro

lado houve um aumento na expressão de TNF em células THP-1 infectadas por BCG Moreau

em MOI 10:1. Ambos os resultados não puderam ser correlacionados com os dados de

expressão gênica;

4 – A variabilidade do hospedeiro influenciou na secreção de TNF, porém apenas na infecção

com a cepa de BCG Moreau, sugerindo uma interação espécie-específica, levando a uma

resposta diferencial do hospedeiro frente à cepa brasileira;

5 – Não houve influência dos SNPs TNF -308 G>A, IL-10 -819 C>T e TLR1 743 A>G na

secreção de TNF e IL-10. Entretanto, diferente dos outros SNPs, o TLR1 743 A>G afetou o

logaritmo da razão (TNF/IL-10), em células infectadas com BCG Moreau, sugerindo um

padrão de ativação da resposta imune dependente do genótipo do hospedeiro;

6 – A análise de expressão de genes por microarranjo revelou genes diferencialmente

expressos em células THP-1 infectadas por M. leprae, incluindo genes envolvidos em

modulação de interações célula-célula e célula-matriz, em vias de glicólise e glicogênese, e

também envolvidos na biosíntese de leucotrienos;

7 – Em uma amostragem de validação foi confirmado em amostras de biópsias de pacientes

hansenianos a repressão de CCL2, CCL3, CCL4, IL-1β e SOD2 quando comparados a

pacientes não hansenianos indicando uma assinatura molecular específica. Além disso,

123

também foram reprimidos os genes mitocondriais e induzidos os genes E3-Ub-ligase e LDLR;

8 – Sugere-se que o desenvolvimento de uma vacina de BCG específica para o genótipo do

hospedeiro seria mais eficaz na prevenção contra TB e hanseníase, indicando a importância de

uma vacinação personalizada.

124

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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155

9. ANEXOS

156

157

Anexo I - Oligonucleotídeos utilizados nos ensaios de qRT-PCR (1) e PCR multiplex em tempo real (2), com suas respectivas sequências. Também foram incluídos os trabalhos nos quais estes genes foram identificados, bem como a importância pela qual foram adicionados no presente estudo. Essa tabela mostra todas as condições de infecção em que as células THP-1 foram submetidas, e quais genes foram utilizados para quais condições específicas. Os genes em negrito são os constitutivos utilizados para a normalização dos ensaios.

Gene

THP-1 +

cepas de

BCG 2:1

THP-1 + BCG

Moreau

e M. lep 2:1

THP-1 +

cepas de

BCG 10:1

THP-1 + BCG

Moreau

e M. lep 10:1 Fita Seqüência (5' - 3')

qPCR (1) ou PCR

multiplex (2)

Importância em

nosso trabalho Referências

GAPDH x x x x Senso AGTGATGGCATGGACTGTGGTCAT 1 e 2 Gene constitutivo -

Antisenso CAACAGCCTCAAGATCATCAGCAA

HPRT1 x x x x Senso GTGGAAGATATAATTGACACTGGC 1 e 2 Gene constitutivo -

Antisenso AACACTTCGTGGGGTCCTTT

RPL13a x x x x Senso GACAAGAAAAAGCGGATGGT 1 e 2 Gene constitutivo -

Antisenso GTACTTCCAGCCAACCTCGT

RPS13a x x x x Senso CGAAAGCATCTTGAGAGGAACA 1 e 2 Gene constitutivo -

Antisenso TCGAGCCAAACGGTGAATC

TGFb1 x x x x Senso AAGGACCTCGGCTGGAAGT 1 Gene associado à Yamamura et al., 1991

Antisenso GACCTTGCTGTACTGCGTGT hanseníase

VDR x Senso TTGAGCCCCTCATCAAGTTC 1 Gene associado à Liu et al., 2007

Antisenso GACGATCTGGGGAGACGAT TB

Catelicidina x Senso ACACAGCAGTCACCAGAGGA 1 Gene associado à Liu et al., 2007

(CAMP) Antisenso GGGCAAATCTCTTGTTATCCTT TB

CCL2 x x x x Senso CCTGCTGTTATAACTTCACCAAT 1 e 2 Gene associado à Kirkaldy et al., 2003

Antisenso TTGAAGATCACAGCTTCTTTGG hanseníase

158

Gene

THP-1 +

cepas de

BCG 2:1

THP-1 + BCG

Moreau

e M. lep 2:1

THP-1 +

cepas de

BCG 10:1

THP-1 + BCG

Moreau e M.

lep 10:1 Fita Seqüência (5' - 3')

qPCR (1) ou PCR

multiplex (2)

Importância em


CCL3 x x x x Senso TGCTGCTTCAGCTACACCTC 1 e 2 Gene associado à Hasan et al., 2004

Antisenso GCTTCGCTTGGTTAGGAAGA hanseníase

CCL4 x x x x Senso CGCCTGCTGCTTTTCTTACA 1 e 2 Gene associado à Lin et al., 1998

Antisenso TGCTTCTTTTGGTTTGGAAT TB

CCL5 x x x x Senso CCTGCTGCTTTGCCTACATT 2 Gene associado à Kirkaldy et al., 2003

Antisenso GGGTGACAAAGACGACTGCT hanseníase

CCL7 x x x x Senso CTTCAACTACCTGCTGCTACAGA 2 Gene associado à Ragno et al., 2001

Antisenso CAGTTTGGTCTTGAAGATTACAGC TB

TNF x x x x Senso GAGGGTTTGCTACAACATGG 1 e 2 Gene associado à Yamamura et al., 1991

Antisenso CCCCAGGGACCTCTCTCTA hanseníase

IL-6 x x x x Senso GCATCTAGATTCTTTGCCTTTTT 1 e 2 Gene associado à Yamamura et al., 1991

Antisenso GAAAATCATCACTGGTCTTTTGG hanseníase

Il-10 x x x x Senso ATCGATGACAGCGCCGTAG 1 e 2 Gene associado à Yamamura et al., 1991

Antisenso GATGCCCCAAGCTGAGAAC hanseníase

IL-12 x x x x Senso TTTCTTTTCTCTCTTGCTCTTGC 1 e 2 Gene associado à Libraty et al., 2012

Antisenso GTGGAGGTCAGCTGGGAGTA hanseníase

IL-1 x x x x Senso CAAAATACCTGTGGCCTTGG 1 e 2 Gene associado à Yamamura et al., 1991

Antisenso TTTTTGGGATCTACACTCTCCAG hanseníase

IL-8 x x x x Senso CTGCGCCAACACAGAAATTA 1 e 2 Gene associado à Kirkaldy et al., 2003

Antisenso TGAATTCTCAGCCCTCTTCAA hanseníase

159

Gene

THP-1 +

cepas de

BCG 2:1

THP-1 + BCG

Moreau

e M. lep 2:1

THP-1 +

cepas de

BCG 10:1

THP-1 + BCG

Moreau e M.


qPCR (1) ou PCR

multiplex (2)

Importância em


NOX3 x x x x Senso CTGGGACGAAAATACTGACG 1 e 2 Gene associado à Sly et al., 2001

Antisenso AATACTGCTGCTGGGGTGAT TB

SOD2 x x x x Senso GGAACGGGGACACTTACAAA 1 e 2 Gene associado à Mira et al., 2004

Antisenso TAAGCGTGCTCCCACACAT hanseníase

NOD2 x x x x Senso CACTGATGCTGGCAAAGAAC 1 e 2 Gene associado à Zhang et al., 2009

Antisenso GGTAGGTGATGCAGTTATTGGA hanseníase

OASL x x x x Senso AAATTTCTGCCCATCCTTCAG 1 e 2 Gene associado à Ferreira, 2011

Antisenso TGGCTTTCACATACTGCTGGTA hanseníase

SET1DB x x x x Senso AGCTCAAGTTCCGGAAGAAA 1 e 2 Gene possivelmente Ferreira, 2011

Antisenso GCGATCACCTGACGGATATT associado à hanseníase

mtND1 x x x x Senso TCCGCTACGACCAACTCATA 1 e 2 Gene associado à Ferreira, 2011

Antisenso GGGGAATGCTGGAGATTGTA hanseníase

mtND2 x x x x Senso ACTAGCCCCCATCTCAATCA 2 Gene associado à Ferreira, 2011

Antisenso ATTTTGCGTAGCTGGGTTTG hanseníase

mtND3 x x x x Senso GCGTCCCTTTCTCCATAAAA 2 Gene associado à Ferreira, 2011

Antisenso GGCTCATGGTAGGGGTAAAA hanseníase

mtND4L x x x x Senso TCACACCTCATATCCTCCCTACTAT 2 Gene associado à Ferreira, 2011

Antisenso GGAGTGGGTGTTGAGGGTTAT hanseníase

mtND5 x x x x Senso AGGCGCTATCACCACTCTGT 2 Gene associado à Ferreira, 2011

Antisenso TTGGTTGATGCCGATTGTAA hanseníase

160

Gene

THP-1 +

cepas de

BCG 2:1

THP-1 + BCG

Moreau

e M. lep 2:1

THP-1 +

cepas de

BCG 10:1

THP-1 + BCG

Moreau e M.


qPCR (1) ou PCR

multiplex (2)

Importância em


mtCOX2 x x x x Senso GGCCTGACTGGCATTGTATT 1 e 2 Gene associado à Ferreira, 2011

Antisenso TCAGTGAATGAAGCCTCCTATG hanseníase

mtCYTb x x x x Senso AGACGCCCTCGGCTTACTT 1 e 2 Gene associado à Ferreira, 2011

Antisenso ATGTGGGGAGGGGTGTTTA hanseníase

mtATP6 x x x x Senso GCCACCTACTCATGCACCTAAT 1 e 2 Gene associado à Ferreira, 2011

Antisenso TTAAGGCGACAGCGATTTCTA hanseníase

SECII x Senso GGAGAACGGGGAGGAATATG 1 Gene possivelmente Ferreira, 2011

Antisenso AGATGAGGAAAATTAAAGGGATAAGA associado à hanseníase

LTA x x x x Senso CTGGGGTCTCCAATGAGGT 2 Gene associado à Yamamura et al., 1991

Antisenso GTTGGCCTCACACCTTCAG hanseníase

Ninjurina1 x x x x Senso CTTGACAAGGAAGATGAGCAG 2 Gene associado à Cardoso et al., 2007

Antisenso AAGGCCGTCGTGGAACAG hanseníase

BCL2 x x x x Senso CCCCTGGTGGACAACATC 2 Gene associado à Hasan et al., 2006a

Antisenso CAGCCAGGAGAAATCAAACAG hanseníase

IDO1 x x x x Senso GGGAAGACCCAAAGGAGTTT 2 Gene associado à de Souza Sales et al., 2011

Antisenso GGAGGAACTGAGCAGCATGT hanseníase

IDO2 x x x x Senso TGCTTCATGCCTTTGATGAG 2 Gene associado à de Souza Sales et al., 2011

Antisenso GGAAGGTGCTGAGTGGATGT hanseníase

LRRK2 x x x x Senso TGATGACAGCACAGCTAGGAA 2 Gene associado à Zhang et al., 2009

Antisenso CCAAACGGTCAAGCAAGATT hanseníase

161

Gene

THP-1 +

cepas de

BCG 2:1

THP-1 + BCG

Moreau

e M. lep 2:1

THP-1 +

cepas de

BCG 10:1

THP-1 + BCG

Moreau e M.


qPCR (1) ou PCR

multiplex (2)

Importância em


PINK1 x x x x Senso GCCTCCAGACGTGAGACAG 2 Gene associado à parkina Poole et al., 2008

Antisenso CACCCCAGAGGCTTAGATGA

(possível associação à

hanseníase)

ZNRF1 x x x x Senso TGCTTGCTGACTCCTCTCAA 2 É uma E3-Uligase Araki & Milbrandt, 2003

Antisenso GGAGGAAGGGAGAACCATGA


hanseníase)

TNFSF15 x x x x Senso CAGGAGTTTGCACCTTCACA 2 Gene associado à Zhang et al., 2009

Antisenso TGCTGTGTGGGAGTTTGTCT hanseníase

RIPK2 x x x x Senso GGGATAGCACCATTTCTGGA 2 Gene associado à Zhang et al., 2009

Antisenso ATACCAGGCTGCAGACGTTC hanseníase

ZNF79 x x x x Senso TCCAGGAGCCTTGTCCTACT 2 Gene possivelmente Ferreira, 2011

Antisenso CTCTGGTGGTGATCCAGATATAA associado à hanseníase

C6orf136 x x x x Senso CTTGCTCTTTTTGCGGTTCT 2 Gene possivelmente Ferreira, 2011

Antisenso TAGACGATGGCGACAAATGA associado à hanseníase

E3-Uligase x x x x Senso CCATCTTCACTGAGCAGGAGTTA 2 Gene associado à parkina Ferreira, 2011

Antisenso GAACCACTGCATCTGAATAGAGTTG


hanseníase)

BAK x x x x Senso ACGACATCAACCGACGCTAT 2 Gene associado à Hasan et al., 2006a

Antisenso CACTCTCAAACAGGCTGGTG hanseníase

162

Gene

THP-1 +

cepas de

BCG 2:1

THP-1 + BCG

Moreau

e M. lep 2:1

THP-1 +

cepas de

BCG 10:1

THP-1 + BCG

Moreau e M.


qPCR (1) ou PCR

multiplex (2)

Importância em


BAD x x x x Senso GAGGACGACGAAGGGATG 2 Gene associado à Hasan et al., 2006a

Antisenso TCCCTTCTTAAAGGAGTCCACA hanseníase

MIF x x x x Senso CGCAGAACCGCTCCTACA 2 Gene associado à Yamada et al., 2002

Antisenso GAGTTGTTCCAGCCCACATT TB

GAD2 x x x x Senso CGGCAACTCACCAAGACATT 2 Gene possivelmente Ferreira, 2011

Antisenso AAGTTTCTCAGTAGGGGGCTTAG associado à hanseníase

LTA4H x x x x Senso AATTGAATGAGTTTTTAGCACAGA 2 Gene associado à Tobin et al., 2004

Antisenso GCAGCCATCTGAATCGTATTT hanseníase

PPARg x x x x Senso AGTCCTCACAGCTGTTTGCAAGC 2 Gene asscociado à Almeida et al., 2009

Antisenso GAGCGGGTGAAGACTCATGTCTGT infecção micobacteriana

LPL x x x x Senso AAAGGCACCTGCGGTATTT 2 Gene associado à Singh et al., 2010

Antisenso TCACATGCCGTTCTTTGTTC TB

LDLR x x x x Senso ACCAGGACGGCTACAGCTAC 2 Gene possivelmente Gatfield & Pieters, 2000

Antisenso GAGGTCTCAGGAAGGGTTCTG associado à hanseníase

163

Anexo II. Valores normalizados de expressão gênica avaliada por RT-PCR em tempo real, de células THP-1 controle e infectadas com as cepas de BCG Danish, Moreau e Pasteur em MOI 2:1 por 24 horas. Foram 8 replicatas biológicas utilizadas com 13 oligonucleotídeos: CCL2, CCL3, CCL4, IL-1, IL-10, IL-12, IL-6, IL-8, TGF-β, TNF, OASL, IL-12, VDR e Catelicidina. Os genes constitutivos utilizados foram HPRT1, RPL13 e RPS13. Como foi observado na figura abaixo, não houve diferença significante na expressão gênica das células THP-1 tanto controle, quanto infectadas pelas diferentes cepas de BCG, a não ser na expressão de OASL e TNF por células infectadas com BCG Danish em relação à célula controle. Níveis de significância bi-caudais inferiores ou iguais a 0,01 (**), 0,05 (*) e 0,1 (x) foram considerados como altamente significante, significante e sugestivo, respectivamente.

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Anexo III. Valores normalizados de expressão gênica por RT-PCR em tempo real, de células THP-1 controle e infectadas com BCG Moreau e M. leprae em MOI 2:1 por 24 horas. Foram 4 replicatas biológicas utilizadas com 18 oligonucleotídeos: CCL2, CCL3, CCL4, IL-1, IL-10, IL-6, IL-8, TGF-β, TNF, SOD2, OASL, NOX3, SECII, NOD2 e alguns genes mitocondriais que foram observados em arranjos realizados em nosso laboratório, mt_ATP6, mt_COX, mt_CYB e mt_ND1. Como genes constitutivos, foram utilizados HPRT1, RPL13 e RPS13. Como foi observado na figura abaixo, houve um aumento na expressão de IL-1, SOD2 e TGF-β em células THP-1 infectadas com M. leprae, enquanto para os outros genes, não houve diferença significante na expressão pelas células THP-1 tanto controle, quanto infectadas pelo BCG Moreau e M. leprae. Níveis de significância bi-caudais inferiores ou iguais a 0,01 (**), 0,05 (*) e 0,1 (x) foram considerados como altamente significante, significante e sugestivo, respectivamente.

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Anexo IV. Valores normalizados de expressão gênica por RT-PCR em tempo real, de células THP-1 controle e infectadas com as cepas de BCG Danish, Moreau e Pasteur em MOI 10:1 por 24 horas. Foram 6 replicatas biológicas utilizadas com 13 oligonucleotídeos: CCL2, CCL3, CCL4, IL-1, IL-10, IL-6, IL-8, TGF-β, TNF, OASL, SET1DB e SOD2. Os genes constitutivos utilizados como normalizadores foram HPRT1, RPL13 e RPS13. Como foram observados na figura abaixo, alguns dos genes são significativamente regulados positivamente quando comparado aos controles, embora não tenha sido observado um padrão claro em relação à cepa de BCG utilizada na infecção, porém não foram observadas diferenças quando foram comparadas as linhagens entre si. Níveis de significância bi-caudais inferiores ou iguais a 0,01 (**), 0,05 (*) e 0,1 (x) foram considerados como altamente significante, significante e sugestivo, respectivamente.

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Anexo V. Valores normalizados de expressão gênica por RT-PCR em tempo real, de células THP-1 controle e infectadas com BCG Moreau e M. leprae em MOI 10:1 por 24 horas. Foram 4 replicatas biológicas utilizadas com 16 oligonucleotídeos: CCL2, CCL3, CCL4, IL-1, IL-10, IL-6, IL-8, TGF-β, TNF, SOD2, OASL, NOX3, SET1DB e os genes mitocondriais, mt_ATP6, mt_COX, mt_CYB e mt_ND1. Os genes constitutivos utilizados foram HPRT1, RPL13 e RPS13. Como foi observado na figura abaixo, houve um aumento significante na expressão de CCL2, IL-6, IL-10, SOD2 nas células THP-1 infectadas com BCG Moreau e um aumento na expressão de TNF nas células infectadas com M. leprae.

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Análise do perfil de expressão gênica da resposta imuno ...bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes/premio2012/doutorado/Luana... · inflamatória na infecção por Mycobacterium bovis