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Analisi del linkage (concatenazione). Corso di Genetica per la Facoltà di Medicina e Chirurgia dell’Università di Torino Alberto Piazza. Ibridi cellulari somatici. Analisi di ibridi cellulari somatici. - PowerPoint PPT Presentation
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Analisi del linkage (concatenazione)
Corso di Genetica per la Facoltà di Medicina e Chirurgia dell’Università di Torino
Alberto Piazza
Ibridi cellulari somatici
Analisi di ibridi cellulari somatici
La rodopsina è un gene il cui difetto può causare la Retinite Pigmentosa (RP), una malattia genetica eterogenea (30% X, 25%AD, 45%AR, causa maggiore di cecità: 1/4000). Sulla base di questa analisi, quale è il cromosoma umano su cui è localizzato il gene?
Crossing-over singoli e doppi
L’effetto della ricombinazione
Crossing-over tra cromosomi omologhi
nella meiosi
Distribuzione dei ricombinanti tra due loci per diverse distanze tra i loci
D e M molto lontani D e M molto vicini D e M abbastanza lontani
Linkage tra il gene per una forma autosomica dominante di retinite pigmentosa, RP9, e due geni marcatori
A e B sul cromosoma 7
Analisi della concatenazione (o “linkage”)Analisi della concatenazione (o “linkage”)
Concatenazione – si evidenzia quando due loci (geni) sono localizzati sullo stesso cromosoma sufficientemente vicini così che la loro frequenza di ricombinazione è minore del 50%
Frequenza di ricombinazione (%) la probabilità di ricombinazione tra due loci
Frequenza di ricombinazione 50% è come se i geni fossero localizzati su cromosomi diversi
Frequenza di ricombinazione di 1% = 1centiMorgan
centiMorgan (cM) – unità di misura genetica della frequenza di ricombinazione tra due loci, di lunghezza approssimativamente costante (la distribuzione dei crossing-over varia in misura minima a seconda del cromosoma e se si tratta di meiosi maschili o femminili), equivalente alla distanza fisica di circa 2 x 106 bp (paia di basi)
Analisi del linkageAnalisi del linkage
Richiede famiglie di grandi dimensioni in cui siano presenti più persone affette e non affette
Qual è la frequenza di ricombinazione tra l’emofilia e la cecità ai colori se i geni che controllano tali caratteri distano 10 cM sul
cromosoma X?
10%: dopo la meiosi i due caratteri si troveranno su cromosomi diversi nel 10% dei casi, mentre nel 90% dei casi si troveranno
insieme sullo stesso cromosoma
Distanza fisica = (2 x 106 bp/cM) x 10 cM = 2 x 107 bp
La distanza tra il gene che causa la malattiagene che causa la malattia e il marcatore RFLPmarcatore RFLP è 14 cM: 1 R, 6NR -> 1/7
Ricombinante
Alberi genealogici di due famiglie con neurofibromatosi 1 (NF1) malattia
autosomica dominante
Fase ignota Fase nota
Della madre affetta non si conosce se D è sullo stesso cromosoma di 1 o 2
Linkage sul cromosoma X
Il gene per l’emofilia (recessivo X-linked) ha gli alleli H, h
Il gene MARCATORE ha gli alleli A,a
Tra il gene dell’emofilia e il gene marcatore vi è una distanza genetica di 3 cM
Con quale probabilità sarà affetto ?
?
Analisi del linkage due loci sono concatenati ad una frazione di ricombinazione=Likelihood ratio = ------------------------------------------------------------------------------------------- due loci NON sono concatenati (frazione di ricombinazione=0.5)(simile ad una probabilità)
LOD score – Logaritmo10 della ODDS (= likelihood) ratio
LOD score > 3.0 evidenza di linkage: 1.000 volte più probabile che due loci siano concatenati piuttosto che non concatenati.
LOD score < - 2.0 evidenza di NON linkage con una probabilità di 100 contro 1.
Analisi del linkage tra NF1 e un gene marcatore mediante il Lod
score = percentuale di ricombinazione
Likelihood = ½ (1 - )3 + ½ 3
ODDS = Likelihood / (1/2) 3
LOD score = Log (ODDS)
Curve di lod scores
In ordinata il lod score, in ascissa la frequenza di ricombinazione (da un’analisi di linkage ipotetica)
Curva 1: evidenza di linkage (Z>3) con nessun caso ricombinante
Curva 2: evidenza di linkage (Z>3) con una frazione di ricombinanti stimata di 0.23
Curva 3: linkage escluso (Z<-2) per frazioni di ricombinazione minori di 0.12, linkage indecidibile per valori maggiori
Curva 4: linkage indecidibile per tutti i valori della frazione di ricombinazione
La funzione di mappa di Haldane
La determinazione dell’ordine dei loci nell’analisi di più di
due loci
Analisi di linkage a molti punti
Uso dei dati di linkage nella diagnosi di NF1 sul cromosoma 17
L’uso della mappa genetica del cromosoma 17 per una diagnosi della NF1. Senza conoscere la posizione del gene NF1 rispetto agli altri marcatori non
sarebbe possibile la diagnosi del feto maschio che in questo caso èaffetto
Genotipizzazione ad alta densità e linkage disequilibrium (LD) nel genoma umano
(da Current Opinion in Chemical Biology 6,1( February) 2002, 24-30)
Il linkage disequilbrium (LD, in italiano “associazione gametica preferenziale”) cambia nel tempo.
(a) La croce rossa indica la posizione nella quale nel DNA di un cromosoma è avvenuta una nuova mutazione X. Si crea perciò un altro allele (polimorfismo) strettamente associato (in completo LD) agli altri alleli marcatori 1–6 sullo stesso cromosoma.
(b,c) Col passare delle generazioni l’estensione della regione di associazione (LD) diminuisce a causa della ricombinazione. La ricombinazione rimescola gli alleli marcatori che tendono a diminuire la loro associazione con l’allele mutato X.
(d) Il LD tra la mutazione (X) e i marcatori vicini si osserva solo in una regione ristretta attorno alla mutazione.
Il LD misura l’associazione tra alleli nei cromosomi degli individui di una popolazione. Diminuisce dal momento in cui è avvenuta la
mutazione, tanto più quanto maggiore è la ricombinazione. Non sono necessari nuclei famigliariNon sono necessari nuclei famigliari
X
X
X
Mappa ad alta risoluzione di un gene-malattia
Parametri citogenetici, fisici e genetici nel Genoma Umano
Riferimento Citogenetico
Dimensioni fisiche
Distanza genetica
Numero di geni
Genoma aploide(23 cromosomi)
3x109 np 4300 cM 30.000 60.000
Un cromosoma (in media)
1,5x108 np ~ 200 cM ~ 2200
Una banda cromosomica
35x106 np ~ 5 cM ~ 50
Metodi usati nella mappatura fisica del gene
Metodo Scopo Risoluzione (in np)
Ibrido cellulare uomo-topo Assegnazione del cromosoma
50 250x106
FISH Localizzazione entro una banda cromosomica
5 20x106
Mappatura mediante enzimi di restrizione
Mappatura fine di una regione del gene
105 106
Clonaggio in cromosomi artificiali (YAC)
Clonaggio del gene (frammenti lunghi)
105 106
Clonaggio in batteri (BAC) Clonaggio del gene (frammenti medi e corti)
103 105
PCR Clonaggio del gene (frammenti corti)
102 104
Sequenziamento del DNA Identificazione del nucleotide
1