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UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI SIENA FACOLTÀ DI MEDICINA E CHIRURGIA
Scuola di Specializzazione in Genetica Medica
Analisi di array-CGH in pazienti con ritardo mentale e anomalie congenite:
vantaggi clinici e implicazioni diagnostiche
Relatore: Prof.ssa Alessandra Renieri
Tesi di Specializzazione della: Dott.ssa Maria Antonietta Mencarelli
Anno Accademico 2007-2008
“We believe that array-CGH is a major advance
in pediatric and prenatal diagnosis”
Arthur L. Beaudet
ASHG 2008
Nell’arco dei quattro anni della Scuola di Specializzazione ho effettuato
personalmente oltre 550 consulenze genetiche. Di queste circa 180 sono state
relative all’inquadramento diagnostico di pazienti con ritardo psicomotorio/ritardo
mentale e anomalie congenite. Oltre 70 hanno riguardato la sindrome di Rett ed il suo
ampio spettro fenotipico dalla forma classica alla variante con convulsioni ad esordio
precoce alla variante Zappella. Mi sono occupata di circa 40 famiglie con
retinoblastoma, seguendole nella conferma della diagnosi e nella definizione del rischio
di ricorrenza. Ho inoltre avuto la possibilità di eseguire consulenze per una serie
ampissima di patologie diverse, spaziando dall’ambito pediatrico alle malattie
dell’adulto, dall’oncologia alla neurologia, a dimostrazione dell’ampio campo di
applicazione e della trasversalità di questa disciplina. A seconda dei diversi casi ho
effettuato inoltre consulenze preconcezionali, prenatali e presintomatiche.
Presso il nostro centro il ritardo mentale rappresenta senza dubbio uno dei
motivi più frequenti di richiesta della consulenza genetica. Purtroppo, al momento
attuale, solo in alcuni rari casi una diagnosi specifica può essere seguita da un
trattamento terapeutico. Tuttavia, la diagnosi genetica può chiarire la prognosi,
indirizzare gli accertamenti clinico-strumentali e la sorveglianza. Inoltre ha un
notevole impatto sulla famiglia permettendo la definizione del rischio di ricorrenza.
Indubbiamente l’introduzione dell’array-CGH ha rappresentato una sorta di rivoluzione
che ha consentito di implementare notevolmente la possibilità di diagnosi. Per questi
motivi e per le numerose famiglie viste in questi anni in consulenza genetica, ho deciso
di incentrare la mia tesi di specializzazione sull’applicazione della tecnica di array-
CGH nella diagnosi del ritardo mentale.
I
INDICE
1. Introduzione 1
1.1 Ritardo Mentale 2
1.2 Anomalie Congenite 5
1.3 Array-CGH 7
2. Materiali e metodi 12
3. Risultati 13
3.1 Nuove sindromi da microdelezione 14
3.1.1 Delezione 2q24q31 15 2q24-q31 deletion: report of a case and review of the literature Pescucci C, Caselli R, Grosso S, Mencarelli MA, Mari F, Farnetani MA,
Piccini B, Artuso R, Bruttini M, Priolo M, Zuffardi O, Gimelli S,
Balestri P, Renieri A Eur J Med Genet. 2007 Jan-Feb;50(1):21-32.
3.1.2 Delezione 2q31.2q32.3 28 Clinical and molecular characterization of a patient with a
2q31.2-32.3 deletion identified by array-CGH Mencarelli MA, Caselli R, Pescucci C, Hayek G, Zappella M,
Renieri A, Mari F. Am J Med Genet A. 2007 Apr 15;143(8):858-65.
3.1.3 Delezione 6q24.3q25.1 37 A 2.6 Mb deletion of 6q24.3-25.1 in a patient with growth failure,
cardiac septal defect, thin upperlip and asymmetric dysmorphic ears Caselli R, Mencarelli MA, Papa FT, Uliana V, Schiavone S, Strambi M,
Pescucci C, Ariani F, Rossi V, Longo I, Meloni I, Renieri A, Mari F. Eur J Med Genet. 2007 Jul-Aug;50(4):315-21.
3.1.4 Delezione 7q36.1q36.2 45 Delineation of the phenotype associated with 7q36.1q36.2
deletion: long QT syndrome, renal hypoplasia and mental retardation R Caselli, MA Mencarelli, FT Papa, F Ariani, I Longo, I Meloni, G Vonella,
M Acampa, A Auteri, S Vicari, A Orsi, G Hayek, A Renieri and F Mari.
Am J Med Genet A. 2008 May 1;146A(9):1195-9.
3.1.5 Delezione 14q12 51 A 3 Mb deletion in 14q12 causes severe mental retardation,
mild facial dysmorphisms and Rett-like features Papa FT, Mencarelli MA, Caselli R, Katzaki E, Sampieri K, Meloni I,
Ariani F, Longo I, Maggio A, Balestri P, Grosso S, Farnetani MA, Berardi R,
Mari F, Renieri A. Am J Med Genet A. 2008 Aug 1;146A(15):1994-8.
II
3.2 Sindromi note in pazienti con fenotipo atipico 57
3.2.1 Sindrome di Wolf-Hirschhorn 58
3.2.2 Sindrome di Angelman 60
3.2.3 Sindrome da delezione 22q11.2 62
3.3 Sindromi note difficilmente riconoscibili su base clinica 64
3.3.1 Sindrome di Potocki-Lupski 65
3.3.2 Sindrome da duplicazione 15q 66
3.4 Riarrangiamenti privati ereditati da un genitore sano 69 Private inherited microdeletion/microduplications: Implications
in clinical practice. Mencarelli MA, Katzaki E, Papa FT, Sampieri K, Caselli R, Uliana V, Pollazzon M,
Canitano R, Mostardini R, Grosso S, Longo I, Ariani F, Meloni I, Hayek J,
Balestri P, Mari F, Renieri A. Eur J Med Genet. 2008 Sep-Oct;51(5):409-16.
4. Discussione 80
5. Bibliografia 86
1
1. INTRODUZIONE
La recente introduzione nella diagnostica clinica della tecnica di array-CGH ha
letteralmente rivoluzionato le strategie di approccio diagnostico ai pazienti con
ritardo mentale e anomalie congenite e fenotipo non inquadrabile nell’ambito di
patologie sindromiche note.
L’analisi condotta su pazienti con ritardo mentale e un fenotipo clinico non
suggestivo di uno specifico quadro sindromico, valutati in consulenza genetica presso
la Genetica Medica dell’Università di Siena, ha permesso di identificare nel 12.5% dei
casi un riarrangiamento cromosomico patogenetico. In particolare sono state
caratterizzate 11 nuove delezioni, 1 riarrangiamento complesso e 15 sindromi note in
pazienti con fenotipo atipico. Inoltre in 32 casi l’analisi ha permesso di identificare
copy number variations (CNVs) di dubbio significato patogenetico in quanto ereditate
da un genitore sano.
In dettaglio, nel sottogruppo di pazienti personalmente valutati in consulenza
genetica, l’analisi di array-CGH ha permesso l’identificazione di 5 nuove sindromi da
microdelezione, 2 sindromi note difficilmente riconoscibili su base clinica (due
pazienti con duplicazione reciproca AS/PWS ed una con sindrome di Potocki-Lupski) e
3 sindromi note in pazienti con fenotipo atipico, che includono una sindrome da
delezione 22q11.2, una sindrome di Angelman e una delle più piccole delezioni terminali
4p.
Sebbene tali risultati non possano che rimarcare l’importanza dell’applicazione
della tecnica di array-CGH nell’approccio diagnostico ai pazienti con ritardo mentale,
non è possibile non prendere in esame le difficoltà che si impongono al clinico ed al
laboratorista di fronte al reperimento di riarrangiamenti di dubbio significato.
2
1.1 RITARDO MENTALE
Nei Paesi sviluppati il ritardo psicomotorio (RPM) e il ritardo mentale (RM)
rappresentano la causa più frequente di handicap in età pediatrica e costituiscono una
delle principali ragioni di accesso alla consulenza genetica. La prevalenza nella
popolazione generale è stimata intorno al 2-3% con una variabilità, a seconda delle
diverse casistiche, tra l’1 e il 10% ed una maggiore incidenza nel sesso maschile (sex
ratio maschi:femmine 1.5) [Riva et al., 2007].
L’etiologia del RM è largamente eterogenea, e sebbene i difetti genetici siano
responsabili della maggioranza dei casi, nel 30-40% dei pazienti con RM che giungono
all’osservazione clinica non è possibile determinare un chiaro meccanismo
etiopatogenetico (Fig. 1).
Figura 1. Cause di Ritardo Mentale (modificata da [Stevenson et al., 2003]).
3
Si è soliti effettuare una distinzione tra i termini RPM e RM, riservando il
primo a bambini di età inferiore ai 5 anni e indicando invece con il secondo soggetti di
età maggiore in cui il quoziente intellettivo (QI) sia valutabile con test standardizzati
[Moeschler et al., 2006]. I bambini con ritardo psicomotorio presentano un ritardo
nell’acquisizione delle tappe evolutive in relazione a quanto atteso per l’età. Questo
implica un ritardo nell’apprendimento ed un deficit adattativo, spesso significativi e
predittivi di deficit cognitivo e intellettivo che potrà successivamente rendersi
evidente. Tuttavia un ritardo nell’apprendimento, specialmente se lieve, può avere
carattere transitorio e non indicativo di altre disabilità intellettive [Moeschler et al.,
2006].
Il ritardo mentale può essere indicato come l’esito di una o più condizioni di
alterazione dello sviluppo cognitivo e adattivo che coinvolgono la persona nella sua
globalità e determinano condizioni eterogenee. L’ICD 10, ovvero la decima revisione
della classificazione internazionale delle sindromi e dei disturbi psichici e
comportamentali, definisce il Ritardo Mentale come “una condizione di interrotto o
incompleto sviluppo psichico, caratterizzata soprattutto da compromissione delle
abilità che si manifestano durante il periodo evolutivo e che contribuiscono al livello
globale di intelligenza, cioè quelle cognitive, linguistiche, motorie e sociali. Il ritardo
può presentarsi con o senza altre patologie psichiche o somatiche. Comunque, gli
individui mentalmente ritardati possono presentare tutta la gamma delle sindromi
psichiche, e la prevalenza di tali sindromi è almeno tre o quattro volte maggiore in
questo gruppo che nella popolazione generale. Inoltre, gli individui mentalmente
ritardati sono maggiormente a rischio per lo sfruttamento e la violenza fisica e
sessuale. L'adattamento sociale è sempre compromesso, ma tale compromissione può
non essere evidente in soggetti con lieve ritardo mentale che vivono in ambienti sociali
protetti dove è disponibile un adeguato sostegno”. Secondo il Diagnostic and
Statistical Manual of Mental Disorder, quarta edizione, revisionata, (DSM-IV-TR)
(American Psychiatric Association, 2000) il Ritardo Mentale è definito come una
4
condizione estremamente eterogenea caratterizzata da un funzionamento intellettivo
generale significativamente al di sotto della media (Criterio A), accompagnato da
severe limitazioni nel funzionamento adattivo (Criterio B) con esordio prima dei 18
anni (Criterio C).
Il RM viene quindi classificato in quattro categorie di gravità tenendo conto del
QI calcolato sulla base di test standardizzati (O.M.S. 1980):
1. Ritardo Mentale Lieve: Quoziente Intellettivo 50 – 70, età mentale 8 - 12 anni
2. Ritardo Mentale Medio: Quoziente Intellettivo 35 – 50, età mentale 3 - 7 anni
3. Ritardo Mentale Grave: Quoziente Intellettivo 20– 35, età mentale 0 - 2 anni
4. Ritardo Mentale Gravissimo/Profondo: Quoziente Intellettivo inferiore ai 20.
5
1.2 ANOMALIE CONGENITE
La valutazione “dismorfologica” rappresenta un elemento essenziale
nell’inquadramento sindromico dei pazienti con RM. L’approccio più appropriato al
paziente con RM deve infatti essere inclusivo di un accurato esame clinico, focalizzato
sulla ricerca di eventuali anomalie congenite. Da un punto di vista terminologico si è
soliti effettuare una distinzione tra anomalie e varianti minori [Aase, 1990]. Le prime
si distinguono a loro volta in malformazioni, deformazioni, distruzioni e displasie sulla
base del meccanismo etiopatogenetico ipotizzato, mentre le seconde vengono
suddivise in anomalie minori e varianti comuni in considerazione delle loro implicazioni
cliniche e della loro prevalenza [Spranger et al., 1982; Merks et al., 2003]. La
malformazione è quindi definita come un’anomalia dell’embriogenesi da alterata
morfogenesi che può essere isolata o multipla ed ha una prevalenza inferiore al 4%.
L’anomalia minore rappresenta un difetto dello sviluppo da alterata fenogenesi
(sviluppo fetale) ed ha una frequenza inferiore o uguale al 4%. Le varianti comuni sono
variazioni morfologiche anatomiche comuni che hanno una frequenza nella popolazione
generale superiore al 4% [Merks et al., 2003].
Una stretta correlazione tra occorrenza di disabilità intellettiva e riscontro di
anomalie minori è stata dimostrata già da uno studio condotto nel 1964 da Smith e
Bostian [Smith et al., 1964]. Indagando il numero e il tipo di anomalie in 50 bambini
con RPM/RM e in 100 soggetti di controllo senza RM, gli autori rilevarono che nel 42%
dei bambini con RPM/RM erano presenti tre o più anomalie associate e di cui circa
l’80% era rappresentato da anomalie minori, che non venivano invece riscontrate nei
controlli [Smith et al., 1964]. Gli autori concludevano pertanto che “the etiology of
the intellectual disability was the abnormal development of the central nervous
system heralded by the presence of the minor anomalies on the surface examination”
[Smith et al., 1964].
6
Come dimostrato da uno studio retrospettivo basato sull’analisi della valutazione
diagnostica di 411 bambini con RPM/RM i segni fisici e la gestalt dei paziente
rappresentano l’elemento principe nel determinare la fattività o meno della diagnosi. Il
raggiungimento della diagnosi è infatti significativamente più probabile nei pazienti
con caratteristiche faciali e fisiche peculiari, mentre la presenza di malformazioni
maggiori, sebbene il loro numero sia ridotto, non influisce significativamente
sull’efficacia diagnostica [Hunter, 2000].
Un risultato analogo è emerso da uno studio prospettico effettuato su 281
pazienti con RPM/RM in cui il raggiungimento di una diagnosi eziologica è stato
possibile in 150 casi (54%) [van Karnebeek et al., 2005]. In particolare, in un terzo dei
casi la diagnosi è stata effettuata sulla sola base della storia clinica e dell’esame
obiettivo; in un terzo l’ipotesi diagnostica, formulata tenendo conto degli elementi
emersi dalla storia clinica e l’esame obiettivo, ha successivamente necessitato
dell’avallo di indagini strumentali aggiuntive; mentre nel restante terzo, la diagnosi si è
basata esclusivamente sulle indagini di laboratorio. Tale analisi ha dimostrato che
l’esame dismorfologico è indicativo della diagnosi nel 79% dei casi, ma essenziale
addirittura nel 62%. Inoltre tenendo conto esclusivamente della storia clinica la
diagnosi può essere stabilita in 1 paziente su 20, mentre sulla sola base dell’esame
fisico in 1 su 30, combinando i due aspetti è possibile formulare una diagnosi in 1 su 3
pazienti. Va inoltre tenuto in considerazione che l’esame clinico rappresenta un
elemento fondamentale nell’indirizzare le aggiuntive indagini strumentali e di
laboratorio da effettuare, essenziali nel conseguimento della diagnosi [van Karnebeek
et al., 2005].
7
1.3 ARRAY COMPARATIVE GENOMIC HYBRIDIZATION
La tecnica Comparative Genomic Hybridization (ibridazione genomica
comparativa) (CGH) è stata introdotta nel 1992 da Kallioniemi [Kallioniemi et al.,
1992].
Il principio della tecnica si basa su una ibridazione in situ modificata che
sfrutta la competizione tra due campioni di DNA genomico (test e controllo), ibridati
contemporaneamente in quantità equimolari su un vetrino su cui sono fissati cromosomi
normali in metafase (CGH convenzionale) o sull’array su cui si trovano immobilizzate le
sequenze omologhe di DNA (array-CGH). La tecnica di CGH convenzionale è una
tecnica di rilevazione che consente di analizzare l’intero genoma del soggetto che si
vuole esaminare, grazie ad un unico esperimento in grado di identificare anomalie del
corredo genetico, quali riarrangiamenti sbilanciati, ovvero delezioni e duplicazioni
cromosomiche.
La tecnica di array-CGH, è stata sviluppata sostituendo i cromosomi delle
metafasi di riferimento con una matrice su cui sono disposti (spottati) cloni BAC
(cromosomi artificiali batterici), PAC (cromosomi artificiali di fago P1) o sequenze di
oligonucleotidi, corrispondenti a loci specifici di ogni singolo cromosoma, fino a
comprendere l’intero genoma umano. L’utilizzo di tali cloni, infatti, permette
l’immediata correlazione tra l’eventuale alterazione sospettata in un paziente e una
precisa posizione del riarrangiamento nel genoma, grazie alla scomparsa di un segnale
corrispondente al clone contenente la sequenza deleta, o viceversa, all’aumento di
segnale dovuto ad una duplicazione della sequenza. La risoluzione genomica dell’array-
CGH dipende dalla lunghezza dei cloni utilizzati e dalla distanza tra un clone e l’altro.
Pertanto, l’utilizzo di tali cloni permette di superare il limite principale della CGH
convenzionale, che è la bassa risoluzione.
Gli array ad oligonucleotidi sono stati introdotti per rilevare i polimorfismi di singoli
nucleotidi (SNP) [Bignell et al., 2004]. Questo tipo di array contiene sonde da 21–25
8
oligonucleotidi, sintetizzate usando un metodo fotolitografico. Ogni SNP è
rappresentato sull’array da più sonde differenti, che si legano ad entrambi i filamenti
di DNA [Bignell et al., 2004; Slater et al., 2005]. Nel 2004, Bignell et al.,
ottimizzarono un metodo per utilizzare gli SNP-array nell’analisi delle variazioni del
numero di copie, usando una diversa strategia nella preparazione del campione da
analizzare [Bignell et al., 2004]. La piattaforma di SNP-array permette
l’identificazione di delezioni/duplicazioni, ma mostra una maggiore variazione nella
capacità di rilevamento e un più basso segnale rispetto agli array a BAC [Bignell et al.,
2004; Zhao et al., 2004; Lockwood et al., 2006]. Il vantaggio di questo approccio è la
possibilità di correlare il numero di copie e lo stato allelico a livello dei loci selezionati.
Successivamente, sono stati sviluppati array ad oligonucleotidi, contenenti sonde più
lunghe (60-70 nucleotidi). L’utilizzo di tali sonde aumenta la specificità di ibridazione
e può rilevare, in modo riproducibile, alterazioni cromosomiche comprendenti delezioni
in singola copia e in omozigosi, con una risoluzione estremamente alta [Carvalho et al.,
2004; Brennan et al., 2004; Barrett et al., 2004; van den Ijssel et al., 2005].
Attualmente sono disponibili in commercio array ad oligonucleotidi che coprono l’intero
genoma, con una risoluzione di circa 6,5 kb.
Le differenze tecniche tra le diverse piattaforme utilizzate nell’array-CGH
possono essere sostanzialmente riassunte in due caratteristiche: la grandezza delle
sequenze genomiche disposte sull’array e la copertura del genoma. La flessibilità nella
creazione di microarray specifici per ampi tratti del genoma, per i cromosomi, o per
determinati loci, e la possibilità di coprire il genoma umano con una risoluzione
estremamente alta, rendono l’array-CGH ideale per le applicazioni in genetica clinica
come l’identificazione dei geni malattia, la correlazione genotipo-fenotipo e l’analisi di
anomalie cromosomiche sconosciute.
Negli ultimi anni i microarray per CGH vengono preferiti sempre più a quelli
cromosomici, per identificare particolari squilibri, in differenti tipi di tumore
[Albertson et al., 2003; Floridia et al., 2005]. Attualmente, i metodi array-CGH
9
vengono sempre più impiegati per l’analisi di pazienti con fenotipi complessi. Una delle
prime applicazioni dell’array-CGH è stato lo screening dei riarrangiamenti
subtelomerici, a causa di numerosi studi che riportavano squilibri subtelomerici in
pazienti con ritardo dello sviluppo [Veltman et al., 2002; Flint et al., 2003; Knight et
al., 2004; Kok et al., 2005]. Di grande importanza è l’indagine sull’intero genoma per
individuare la presenza di delezioni submicroscopiche o duplicazioni in pazienti con
ritardo mentale e caratteristiche faciali peculiari. In uno studio, comprendente 90
pazienti, sono state identificate aberrazioni submicroscopiche in circa il 21% dei casi
[Sanlaville et al., 2005]. La capacità risolutiva degli array-CGH può essere di
particolare importanza nell’identificazione di specifici loci causa di malattia e in
sindromi malformative sporadiche, per le quali altri metodi di mappaggio non sono
applicabili. Nel 2004, Vissers et al., usando questo approccio, scoprirono che la
sindrome CHARGE è dovuta ad aploinsufficienza del gene CHD7, dimostrando
l’efficacia dell’array-CGH nel localizzare i geni causa di malattia [Vissers et al., 2003;
Vissers et al., 2004; Vissers et al., 2005]. Gli array tiling path sono molto utili nel
mappare e nel rilevare l’estensione di aberrazioni in specifici segmenti, permettendo
accurati studi nella correlazione genotipo-fenotipo [Sahoo et al., 2005; Glass et al.,
2006]. Nel 2003, Yu et al., utilizzarono questo tipo di array per meglio definire
pazienti con la sindrome da delezione 1p36 [Yu et al., 2003]. Tale array, contenente 10
Mb della regione terminale 1p, permise di classificare correttamente i pazienti sulla
base delle loro alterazioni cromosomiche [Yu et al., 2003]. Infine, l’array-CGH ha
consentito di conoscere la variazione normale del genoma umano: esso, infatti, ha
rivelato un inaspettato livello di variazione, dovuto a differenze nel numero di copie
tra gli individui. Le potenziali difficoltà nel differenziare le variazioni nel numero di
copie ereditate, che causano fenotipi anormali dalle varianti rare, non correlate ad
alterazioni cliniche, possono rappresentare un limite nell’uso della CGH basata sui
microarray per guidare la consulenza genetica.
10
I principi di base dell’array-CGH assomigliano a quelli dell’ibridazione genomica
comparativa tradizionale. I campioni di DNA test e di controllo sono differentemente
marcati, con fluorocromi rossi (Cy5) e verdi (Cy3), successivamente coprecipitati in
presenza di Cot-1 DNA per bloccare le sequenze ripetitive e co-ibridizzati sull’array
(Fig. 2a).
Si tratta di una competizione comparativa in cui si legherà in proporzione più
DNA da testare in ogni locus se maggiore sarà il numero di copie presenti in quel locus
rispetto al numero di copie presenti nel DNA genomico di controllo. Viceversa se ne
legherà meno se minore sarà il numero di copie presenti in quel locus rispetto al
numero di copie presenti nel DNA genomico di controllo.
La fluorescenza è rilevata mediante uno scanner a laser (Fig. 2b), grazie al
quale si acquisisce un’immagine per entrambi i fluorocromi. In seguito, le immagini sono
quantificate con metodo digitale mediante software specifici, che quantificano
l’intensità di fluorescenza emessa per ogni sonda (Fig. 2c), calcolando quanto il
rapporto tra i segnali emessi dal campione e dal DNA di riferimento devia dai valori
attesi. Dato che le misurazioni possono essere riferite direttamente alle posizioni sul
genoma, è possibile definire, con precisione, i punti di rottura (breakpoints) dei
riarrangiamenti eventualmente presenti. La risoluzione dell’esperimento dipende dalla
risoluzione dell’array.
La sovrapposizione dei due segnali corrispondenti ai due fluorocromi, nel caso di
un soggetto normale produce un valore di intensità di fluorescenza uguale a 1, poiché il
rapporto tra i 2 fluorocromi 2/2 è pari a 1. La rappresentazione grafica fornita dal
software trasforma questo valore in logaritmo. Quindi i cloni in cui è avvenuta una
normale ibridazione tra DNA di controllo e DNA test si trovano lungo la linea grafica
dello 0. L’elaborazione finale del programma produce uno schema in cui è possibile
vedere la distribuzione dei segnali di fluorescenza dei cloni nell’intorno del valore
“zero” ad indicare una uguale dosaggio della regione del DNA test e del DNA di
controllo. Cloni che si discostano da questa linea di “zero” verso +0.58, dove il
11
rapporto tra i 2 fluorocromi è di 3/2, sono indicativi di una regione duplicata e cloni
che si discostano verso –0.80, dove il rapporto tra i 2 fluorocromi è 1/2, sono
indicativi di una delezione. Si considerano possibili delezioni o duplicazioni quando si
discostano dal valore di “zero” almeno 3 sonde (Fig. 2d).
Figura 2. Rappresentazione schematica di un esperimento array-CGH. (a) I DNA test e di controllo sono differentemente marcati, coprecipitati e ibridizzati su un array. Dopo le procedure di lavaggio, i vetrini sono analizzati attraverso uno scanner (b) e viene determinata l’intensità di fluorescenza di ogni sonda (c). Dopo la trasformazione dell’immagine e la normalizzazione dei dati, i rapporti in log2 delle sonde sono tracciati come funzione della posizione cromosomica. Le sonde con un valore uguale a zero rappresentano un uguale rapporto dell’intensità della fluorescenza tra il test e il controllo. Ogni punto rappresenta una singola sonda individuata sull’array. (d) Ideogramma visualizzato dal software. La regione cromosomica appare duplicata poiché il rapporto di fluorescenza delle sonde presenti è di 3/2.
PPAAZZIIEENNTTEE CCOONNTTRROOLLLLOO
MMIIXX
IIBBRRIIDDAAZZIIOONNEE
SSCCAANNSSIIOONNEE
DDEELLEEZZIIOONNEE DDUUPPLLIICCAAZZIIOONNEE
((bb)) SSCCAANNNNEERR AA LLAASSEERR
((cc)) AARRRRAAYY
((aa)) ((dd)) IIDDEEOOGGRRAAMMMMAA
12
2. MATERIALI E METODI
Dall’Ottobre 2006, periodo in cui è stato introdotto in diagnostica l’array-CGH
presso la Genetica Medica di Siena, sono stati analizzati 215 pazienti con RM. Tutti
erano stati precedentemente valutati in consulenza genetica e sulla base
dell’anamnesi, della valutazione dismorfologica e di indagini strumentali e molecolari
mirate non era stato possibile inquadrare il fenotipo clinico nell’ambito di una specifica
sindrome.
L’analisi di array-CGH è stata condotta con 44K o 105K oligo array-CGH.
In tutti i casi il riarrangiamento identificato è stato confermato da un secondo
esperimento indipendente, condotto con tecnica di Real-time quantitative PCR, MLPA
(Multiplex Ligation Probe Amplification) o array-CGH a seconda dell’aberrazione
identificata e della disponibilità o meno di sonde specifiche per la regione coinvolta.
In ogni caso è stata ricercata l’eventuale presenza del riarrangiamento nei
genitori al fine di definirne l’origine. L’analisi è stata condotta con tecnica di Real-
time quantitative PCR, MLPA o array-CGH.
13
3. RISULTATI
L’analisi di array-CGH, effettuata presso la Genetica Medica nel periodo tra
l’Ottobre 2006 e l’Ottobre 2008, ha consentito di identificare la presenza di un
riarrangiamento privato in 71 su 215 pazienti (33%). In 27 casi (38%) si è trattato di
un riarrangiamento de novo, in particolare sono state caratterizzate 11 nuove
delezioni, 1 riarrangiamento complesso e 15 sindromi note in pazienti con fenotipo
atipico. Inoltre in 32 casi (45%) l’analisi ha permesso di identificare CNVs di dubbio
significato patogenetico in quanto ereditate da un genitore sano. Sui restanti 12
pazienti sono attualmente in corso indagini aggiuntive volte a definire l’origine del
riarrangiamento identificato.
In particolare tra i pazienti da me personalmente valutati in consulenza
genetica l’indagine ha permesso l’identificazione di 5 nuove sindromi da
microdelezione, 2 sindromi note difficilmente riconoscibili su base clinica (due
pazienti con duplicazione reciproca AS/PWS ed una con sindrome di Potocki-Lupski) e
3 sindromi note in pazienti con fenotipo atipico, che includono una sindrome da
delezione 22q11.2 e una delle più piccole delezioni terminali 4p ad oggi descritte.
14
3.1 NUOVE SINDROMI DA MICRODELEZIONE
L’analisi di array-CGH nella coorte di pazienti da me valutati in consulenza
genetica ha permesso l’identificazione di 5 nuove sindromi da microdelezione, in
particolare sono state identificati due riarrangiamenti coinvolgenti il cromosoma 2, un
riarrangiamento sul cromosoma 6, uno sul 7 e uno sul cromosoma 14 (Fig. 3). In tutti i
casi è stato dimostrato che la delezione è insorta de novo nel probando. Ovviamente la
sola insorgenza de novo non è sufficiente a dimostrare la patogenicità del
riarrangiamento. In alcuni casi in letteratura erano già riportati di pazienti con un
riarrangiamento coinvolgente la stessa regione cromosomica, pertanto la presenza di
un fenotipo parzialmente sovrapponibile è stata di supporto nel chiarire il ruolo
patogenetico dell’aberrazione cromosomica. In altri casi l’analisi dettagliata del
contenuto genico della regione ha permesso di correlare, almeno in parte, il dato
fenotipico al difetto molecolare riscontrato.
Figura 3. Cariogramma indicante i riarrangiamenti de novo identificati
15
2q24-q31 deletion:
report of a case and review of the literature
Pescucci C, Caselli R, Grosso S, Mencarelli MA, Mari F, Farnetani MA, Piccini B,
Artuso R, Bruttini M, Priolo M, Zuffardi O, Gimelli S, Balestri P, Renieri A.
Eur J Med Genet 2007 Jan-Feb;50(1):21-32
16
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21
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Clinical and molecular characterization of a patient with a
2q31.2-32.3 deletion identified by array-CGH
Mencarelli MA, Caselli R, Pescucci C, Hayek G, Zappella M, Renieri A, Mari F.
Am J Med Genet A. 2007 Apr 15;143(8):858-65
29
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36
37
A 2.6 Mb deletion of 6q24.3-25.1
in a patient with growth failure, cardiac septal defect,
thin upperlip and asymmetric dysmorphic ears
Caselli R, Mencarelli MA, Papa FT, Uliana V, Schiavone S, Strambi M, Pescucci C,
Ariani F, Rossi V, Longo I, Meloni I, Renieri A, Mari F.
Eur J Med Genet. 2007 Jul-Aug;50(4):315-21
38
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41
42
43
44
45
Delineation of the phenotype associated with
7q36.1q36.2 deletion:
long QT syndrome, renal hypoplasia and mental retardation
R Caselli, MA Mencarelli, FT Papa, F Ariani, I Longo, I Meloni, G Vonella, M Acampa,
A Auteri, S Vicari, A Orsi, G Hayek, A Renieri and F Mari.
Am J Med Genet A; 2008 May 1;146A(9):1195-9
46
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51
A 3 Mb deletion in 14q12 causes severe mental retardation,
mild facial dysmorphisms and Rett-like features
Papa FT, Mencarelli MA, Caselli R, Katzaki E, Sampieri K, Meloni I, Ariani F, Longo I,
Maggio A, Balestri P, Grosso S, Farnetani MA, Berardi R, Mari F, Renieri A.
Am J Med Genet A. 2008 Aug 1;146A(15):1994-8
52
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57
3.2 SINDROMI NOTE IN PAZIENTI CON FENOTIPO ATIPICO
L’analisi di array-CGH ha permesso di identificare riarrangiamenti cromosomici
noti in pazienti che presentavano un fenotipo clinico atipico e quindi difficilmente
inquadrabile da un punto di vista sindromico unicamente sulla base dell’anamnesi e
dell’esame obiettivo. In particolare, tra i pazienti da me valutati in consulenza
genetica sono state riscontrate una microdelezione del cromosoma 4p, sindrome di
Wolf-Hirschhorn, una delezione della regione 15q11.2q13.1, sindrome di Angelman, e
una delezione 22q11.2 (Fig. 4).
Figura 4. Cariogramma indicante i riarrangiamenti causativi di sindromi note identificati in pazienti con fenotipo atipico.
58
3.2.1 SINDROME DI WOLF-HIRSCHHORN
Caratteristiche Cliniche:
Femmina, 11 anni e 7 mesi
Difficoltà di alimentazione
Deficit di crescita staturo-ponderale nel primo anno di vita
RM lieve
ADHD
Convulsioni febbrili
Fronte alta con attaccatura arretrata dei capelli, sopracciglia sparse nel terzo
laterale, ipoplasia medio faciale, orecchio sinistro a coppa, naso piriforme, dita delle
mani affusolate, accenno alla sindattilia tra 2°-3° dito dei piedi bilateralmente
Normali parametri auxologici
Fossette simmetriche paravertebrali in regione presacrale
Cariotipo Molecolare: del(4)(p16.3p16.3){2.0 Mb}
Segni “atpici”: Fenotipo faciale scarsamente evocativo, normale accrescimento
staturo-ponderale, ritardo mentale lieve con presenza di linguaggio verbale
59
Figura 5. Confronto tra le caratteristiche faciali della nostra paziente (#387), foto in alto, e quelle di pazienti descritti in letteratura con delezione di estensione inferiore a 3.5 Mb [Zollino et al., 2008].
Figura 6. Correlazione genotipo-fenotipo nella sindrome di Wolf-Hirschhorn. In azzurro è indicata l’estensione della delezione identificata nella nostra paziente [Zollino et al., 2008].
60
3.2.2 SINDROME DI ANGELMAN
Caratteristiche Cliniche:
Maschio, 5 anni e 3 mesi
Ipotonia generalizzata
Ipospadia di I grado
Ritardo dello sviluppo psicomotorio con assenza di linguaggio
Iperattività
Crisi convulsive
Reflusso gastroesofageo
Dolicocolon con stipsi importante
Circonferenza cranica sul 10° centile
Cariotipo Molecolare: del(15)(q11.2q13.1){5.7 Mb}
Segni “atipici”: presenza di dolicocolon e di ipospadia; bocca piccola, assenza della
gestalt tipica
61
Figura 7. A sinistra foto del paziente (#174) all’età di 4 anni e 2 mesi. A destra pazienti con diagnosi molecolare di sindrome di Angelman (www.geneclinics.org).
62
3.2.3 SINDROME DA DELEZIONE 22q11.2
Caratteristiche Cliniche:
Femmina, 16 anni e 8 mesi
Scarso attaccamento al seno e pianto flebile nel periodo postnatale
Episodi infettivi ricorrenti
Ritardo mentale medio
Esiti di maculopatia in occhio sinistro
Età ossea ritardata rispetto all’età anagrafica (12.8 vs 15.2 anni)
Macrocefalia
Obesità truncale (BMI 25.1)
Rime palpebrali rivolte in alto e in fuori, orecchio con elice ripiegato, palato ogivale,
diastasi degli incisivi mediali superiori
Mani piccole con dita affusolate
Asimmetria del torace con emitorace destro maggiore del sinistro
Cariotipo Molecolare: del(22)(q11.21q11.21){2.7 Mb}
Analisi molecolare del gene COH1: variante rara c.2472C>T; p.S824S nell’esone 17;
polimorfismo IVS20+14A>T nell’esone 20; polimorfismo IVS36-4insT nell’esone 37.
Tali alterazioni non sono state riscontrate nel DNA della madre. Il padre non si è reso
disponibile al prelievo
Segni “atipici”: assenza delle caratteristiche faciali peculiari, gestalt Cohen-like,
presenza di maculopatia, assenza di insufficienza velo-faringea, assenza di difetti
cardiaci
63
Figura 8. Confronto tra il fenotipo fisico e faciale della paziente (#107), in alto, e il fenotipo classico dei pazienti con delezione 22q11.2, riquadro in basso.
Figura 9. Confronto tra la delezione caratterizzata nella nostra paziente e quella di 3Mb comunemente riscontrata nel 90% dei pazienti con sindrome di DiGeorge/Velocardiofaciale: le due regioni risultano essere perfettamente sovrapponibili. In alto sono indicati i geni inclusi nella regione [Kobrynski et al., 2007].
64
3.3 SINDROMI NOTE DIFFICILMENTE RICONOSCIBILI SUL PIANO CLINICO
L’analisi di array-CGH effettuata su un numero sempre maggiore di pazienti con
ritardo mentale e anomalie congenite ha permesso la caratterizzazione di una
quantità crescente di delezioni/duplicazioni ricorrenti. Ai punti di rottura di tali
riarrangiamenti è frequente il riscontro di low copy repeats (LCRs) che rappresentano
un elemento predisponente agli eventi di ricombinazione omologa non allelica (NAHR).
Le sindromi emergenti presentano nella maggior parte dei casi caratteristiche
faciali e fisiche difficili da caratterizzare data la mancata specificità o per
un’estrema variabilità clinica che rende complesso il riconoscimento della sindrome e
la sua caratterizzazione.
Nella nostra esperienza grazie all’array-CGH sono state identificate una
duplicazione 17p11.2, sindrome di Potocki-Lupski, reciproca della delezione
caratteristica della sindrome di Smith-Magenis e due duplicazioni della regione
15q11.2q13.1, reciproca della regione della sindrome di Angelman/Prader-Willi.
65
3.3.1 SINDROME DI POTOCKI-LUPSKI
Caratteristiche Cliniche:
Femmina, 7 anni e 6 mesi
Severa ipotonia post-natale
Scarso accrescimento staturo-ponderale
Ritardo dello sviluppo psicomotorio
Disturbi del comportamento
Microcefalia postnatale, bassa statura, narici anteverse, columella prominente, labbro
superiore sottile, atteggiamento della mandibola in protrusione, lieve asimmetria della
muscolatura facciale
Mani piccole normoconformate, clinodattilia del 5° dito del piede destro e del 3°, 4° e
5° dito del piede sinistro
Cariotipo: 47,XXX
Cariotipo Molecolare: 47(XXX) de novo dup(17)(p11.2p11.2){3.6 Mb}
Figura 10. Sulla sinistra foto della nostra paziente rispettivamente all’età di 6 mesi (foto in alto) e a 7 anni e 2 mesi (in basso). Sulla destra foto di pazienti con duplicazione 17p11.2 (modificata da [Potocki et al., 2007]. Si noti l’importante ipotono riscontrato nella bambina in età infantile.
66
3.3.2 SINDROME DA DUPLICAZIONE 15q
Paziente A
Caratteristiche cliniche:
Femmina, 15 anni e 3 mesi
Ritardo mentale lieve (QI 71)
Comportamento autistico
Disturbi del comportamento con autoaggressività
Impaccio motorio
Epilessia farmacoresistente
Facies allungata, filtro ben disegnato, naso bulboso con ponte nasale alto e largo,
labbro superiore ad M, mani piccole con dita lunghe e affusolate
Cariotipo molecolare: dup(15)(q11.2q13.1){6.4 Mb}
Figura 11. Foto della paziente (#1002) rispettivamente all’età di 8 mesi, 13 e 15 anni.
67
Paziente B
Caratteristiche cliniche:
Maschio, 5 anni e 10 mesi
Ritardo psicomotorio con prevalente compromissione del linguaggio
Autismo
Epilessia
Rime palpebrali rivolte in basso
Epicanto
Orecchie prominenti
Cariotipo molecolare: dup(15)(q11.2q13.1){7.9 Mb} ereditata dalla madre
Figura 12. A sinistra fenotipo faciale del paziente (#812). Si apprezzano l’aspetto triangolare del volto, l’andamento orizzontale delle sopracciglia, l’epicanto bilaterale, il naso bulboso con ponte nasale alto e largo, l’andamento ad M del labbro superiore. A destra il paziente insieme alla madre, 31 anni con analoga duplicazione.
68
Figura 13. Confronto tra le caratteristiche faciali dei due pazienti con duplicazione 15q11.2 e pazienti precedentemente riportati in letteratura con duplicazione sovrapponibile (paziente C da Possum; paziente D, 26 anni, da [Hogart et al, 2008]).
B
D C
A
69
3.4 RIARRANGIAMENTI PRIVATI EREDITATI DA UN GENITORE SANO
L’analisi di array-CGH ha inoltre portato all’identificazione di delezioni e
duplicazioni del genoma di incerto significato clinico. Alcune di queste sono
apparentemente CNVs non patogenetiche, ma altre potrebbero assumere una rilevanza
clinica che al momento attuale resta difficile da valutare. Secondo dati recenti è
stimato che oltre il 12% del genoma umano normale è interessato da alterazioni del
numero di copie [Redon et al., 2006]. Tali CNVs restano difficilmente interpretabili
sia da un punto di vista diagnostico che di ricerca.
Dall’analisi della nostra casistica è emerso che in circa il 72% dei pazienti si
riscontrano CNVs, solitamente in numero maggiore di uno per ciascun caso esaminato,
con un numero medio di 5. Tali aberrazioni hanno un’estensione variabile tra 62 Kb e 1
Mb e sono riportate nei database come polimorfismi non patogenetici
(http://projects.tcag.ca/bioxrt/).
L’analisi ha inoltre permesso di identificare in un 12% di pazienti
riarrangiamenti privati ereditati da un genitore sano. Tali sbilanciamenti, con
un’estensione variabile tra 0.1 e 3.8 Mb, sono rappresentati nel 30% dei casi da
delezioni e nel restante 70% da duplicazioni. Le regioni sono riportate, nella maggior
parte dei casi, nei database come polimorfiche in percentuale variabile tra il 10 ed il
100%. Alcune di queste coprono regioni prive di geni, ma nella maggior parte sono
inclusi geni noti associati a malattia, in media 5, con una variabilità compresa tra 1 e
21. In particolare in 10 diversi riarrangiamenti sono stati individuati 12 geni malattia:
KAL1 nella duplicazione Xp22.31, STS in un’altra duplicazione Xp22.31, TCF2 nella
duplicazione 17q12, STRC nella delezione 15q15, CHRNA7 nella duplicazione 15q13.3,
SEMA7A nella duplicazione 15q24.1, UNG nella duplicazione 12q24.12, EDARADD nella
duplicazione 1q43, IGF1R e MEF2A nella duplicazione 15q26.3, HLCS e CLDN14 in
21q22.12 and OTOA nella delezione 16p12.
70
Tali riarrangiamenti, sulla base delle conoscenze attuali sono stati refertati
come presumibilmente non patogenetici, anche se ulteriori studi saranno necessari per
definirne un possibile ruolo nelle malattie multifattoriali o come fattori modificatori
del fenotipo in patologie monogeniche.
Figura 14. Cariogramma indicante la distribuzione dei riarrangiamenti ereditati riscontrati
71
Private inherited microdeletion/microduplications:
Implications in clinical practice.
Mencarelli MA, Katzaki E, Papa FT, Sampieri K, Caselli R, Uliana V,
Pollazzon M, Canitano R, Mostardini R, Grosso S, Longo I, Ariani F,
Meloni I, Hayek J, Balestri P, Mari F, Renieri A.
Eur J Med Genet. 2008 Sep-Oct;51(5):409-16
72
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4. DISCUSSIONE
L’introduzione nella pratica clinica dell’array-CGH ha letteralmente
rivoluzionato la citogenetica classica e quindi i test genetici disponibili per i pazienti
con RPM/RM, caratteristiche cranio-faciali peculiari ed anomalie congenite. Fino a non
molti anni fa il cariotipo ad alta risoluzione e gli studi di ibridizzazione fluorescente in
situ (FISH) con sonde specifiche per le regioni subtelomeriche erano considerati il
gold standard per l’identificazione di anomalie cromosomiche [Slavotinek, 2008]. Lo
sviluppo dell’array-CGH ha modificato profondamente le strategie di approccio
diagnostico grazie ad una sensibilità decisamente superiore rispetto a quella del
cariotipo ad alta risoluzione, alla possibilità di indagare contemporaneamente loci
multipli rispetto alla FISH con una complessiva riduzione dei costi, ad una maggiore
possibilità di identificare delezioni cromosomiche di piccole dimensioni e ad una
superiore capacità di identificare duplicazioni [Slavotinek, 2008]. Un cariotipo ad alta
risoluzione con bandeggio G è in grado di identificare anomalie in circa il 3-5% dei
pazienti con MR e la successiva analisi di FISH per la ricerca di riarrangiamenti delle
regioni subtelomeriche consente di individuare l’alterazione patogenetica in un
ulteriore 3-6% [Slavotinek, 2008]. È stato recentemente dimostrato che l’analisi di
array-CGH in pazienti con RM e anomalie congenite con cariotipo normale permette il
conseguimento della diagnosi nel 4-17% dei casi [Slavotinek, 2008].
Nella nostra esperienza la percentuale di diagnosi effettuate è risultata essere
del 12.5%. I casi diagnosticati e la loro successiva pubblicazione hanno contribuito alla
definizione di nuove sindromi da microdelezione e microduplicazione cromosomica e
alla caratterizzazione del fenotipo clinico associato.
La definizione del meccanismo molecolare alla base del RM ha permesso di
stabilire correttamente il rischio di ricorrenza sia in gli altri eventuali figli della
coppia che nei figli dei fratelli dei probandi, consentendo inoltre di proporre per le
gravidanze successive la possibilità di una diagnosi prenatale. L’analisi dei geni inclusi
81
negli sbilanciamenti cromosomici ha indirizzato l’esecuzione di ulteriori indagini
cliniche e strumentali mirate. In particolar modo, nella paziente con delezione
7q36.1q36.2, data la presenza nella delezione del gene KCNH2, la cui aploinsufficienza
è responsabile della sindrome del QT lungo, lo studio mirato della conduzione cardiaca
ha permesso di identificare un prolungamento del tratto QT e quindi di diagnosticare
una condizione potenzialmente letale, consentendo di attuare le misure profilattiche
volte a prevenire gli episodi di sincope e la morte improvvisa [Caselli et al., 2008].
L’analisi dei geni contenuti nelle regioni riarrangiate ha inoltre permesso
l’identificazione del terzo gene della sindrome di Rett [Ariani et al., 2008]. La
bambina con delezione 14q12 presenta infatti un quadro clinico che richiama per alcuni
aspetti la sindrome di Rett: all’anamnesi la madre riferisce un normale periodo pre- e
post-natale a cui intorno ai 6 mesi ha fatto seguito una fase di arresto e regressione;
la bambina presenta inoltre microcefalia postnatale, stereotipie motorie delle mani
lungo la linea mediana e un coinvolgimento del sistema nervoso autonomo analogo a
quello riscontrato nella bambine con sindrome di Rett. La regione deleta, che si
estende per 3 Mb, è particolarmente povera di geni includendone soltanto 5. Solo due
di questi, FOXG1B e PRKD1, sono inclusi in una delezione recentemente identificata da
Bisgaard et al. in una bambina con caratteristiche cliniche analoghe [Bisgaard et al.,
2006]. FOXG1 è apparso subito un candidato molto interessante per il fenotipo
neurologico in quanto codifica per un fattore trascrizionale espresso quasi
esclusivamente nel cervello [Papa et al., 2008]. È stata quindi effettuata l’analisi
mutazionale di tale gene in 53 pazienti con sindrome di Rett, negative per mutazioni in
MECP2 o CDKL5. Tale indagine ha permesso di identificare due mutazioni troncanti
del gene FOXG1 insorte de novo in due bambine con variante congenita della sindrome
di Rett [Ariani et al., 2008].
L’analisi di array-CGH nella nostra casistica di pazienti ha portato
all’identificazione di 3 riarrangiamenti causativi di sindromi note: un caso di sindrome
da delezione 22q11, una sindrome di Angelman e una sindrome di Wolf-Hirschhorn.
82
La delezione 4p16.3 rappresenta una delle delezioni più piccole ad oggi
caratterizzate nella sindrome di Wolf-Hirschhorn. A posteriori il fenotipo faciale
della paziente è effettivamente riconducibile alla sindrome, tuttavia la prima ipotesi
diagnostica è stata fuorviata dal grado lieve del ritardo mentale: la ragazza presenta
infatti un linguaggio verbale semplice, scrive in stampatello e sa leggere sillabando.
Nel caso del paziente con sindrome di Angelman l’analisi a posteriori del
fenotipo ha permesso in effetti di individuare la presenza delle caratteristiche
fisiche e comportamentali tipiche della sindrome. Alla prima valutazione tali elementi
erano rimasti misconosciuti, dato il quadro gravemente compromesso del piccolo
paziente, che era alimentato con sondino naso-gastrico per gli importanti episodi di
vomito e presentava uno squilibrio idro-elettrolitico conseguente alla severa
alterazione dell’alvo da dolicolon.
Nel caso della paziente con sindrome da delezione 22q11 in prima analisi, sulla
base delle caratteristiche fisiche, era stata ipotizzata una sindrome di Cohen. La
ragazza presentava infatti una gestalt faciale suggestiva, obesità truncale, mani con
dita affusolate, esiti di maculopatia. L’analisi del gene COH1 ha evidenziato la
presenza di una variante rara nell’esone 17 e di due polimorfismi, rispettivamente uno
nell’esone 20 ed uno nell’esone 37. Data l’impossibilità di analizzare il DNA di entrambi
i genitori e dal momento che non è stato stabilito se le alterazioni si trovino in cis
sullo stesso allele o in trans su due alleli diversi, non è escludibile al momento attuale
un loro possibile ruolo come modificatori del fenotipo. Inoltre nella coorte di oltre 80
pazienti in cui ad oggi è stata effettuata l’analisi del gene COH1 solo in un caso è stato
riscontrato il polimorfismo sull’esone 20, mentre le altre due alterazioni non sono mai
state riscontrate.
Frequentemente le caratteristiche fenotipiche delle sindromi emergenti sono
difficili da caratterizzare e da riconoscere su base clinica per una serie di ragioni: il
fenotipo può essere difficile da delineare per una mancata specificità o per
un’estrema variabilità clinica che rende complesso il riconoscimento della sindrome e
83
la sua caratterizzazione. In questo contesto sono da collocare i risultati relativi alla
diagnosi di sindromi note difficilmente riconoscibili sul piano clinico, quali la sindrome
di Potocki-Lupski (reciproca delle sindrome di Smith-Magenis) e la sindrome da
duplicazione 15q (reciproca della sindrome di Prader-Willi/Angelman – PWS/AS). In
quest’ultima in particolare, il fenotipo comportamentale e neurologico è noto in
letteratura ed è caratterizzato da ritardo mentale medio-lieve con prevalente
compromissione del linguaggio, epilessia e comportamento autistico, mentre non sono
mai state messe in evidenza caratteristiche faciali ricorrenti. Entrambi i nostri
pazienti presentano un fenotipo faciale simile con lievi tratti dismorfici: facies
triangolare, sopracciglia con andamento orizzontale, filtro ben disegnato, labbro
superiore ad M, naso bulboso con ponte nasale alto e largo. Materiale iconografico dei
pazienti precedentemente descritti in letteratura è disponibile soltanto per alcuni dei
pazienti pubblicati e per un solo paziente dal database Possum. Tale comparazione ha
permesso di evidenziare che alcune caratteristiche, quali l’aspetto del naso con ponte
largo e la forma del labbro superiore, ricorrono tra i vari pazienti. Queste
considerazioni non possono non far riflettere sul fatto che l’array-CGH ha facilitato
una sorta di approccio “dismorfologico al contrario” in contrasto con il classico
approccio fenotipico. A seguito dell’identificazione dell’anomalia genetica comune si
procede alla caratterizzazione del corrispondente fenotipo clinico e qualora questo sia
sufficientemente distintivo, si ricerca il difetto cromosomico in altri pazienti valutati
in precedenza [Slavotinek, 2008].
L’analisi di array-CGH ha inoltre portato all’identificazione di delezioni e
duplicazioni del genoma di incerto significato clinico in quanto ereditate da un
genitore sano e coinvolgenti regioni parzialmente polimorfiche. Seppure al momento
attuale tali riarrangiamenti siano stati refertati come di probabile significato non
patogenetico, un loro possibile ruolo nella determinazione del fenotipo clinico non è
escludibile. Infatti sebbene il riscontro di un’alterazione di dubbio significato sia nel
probando che nel genitore sano faccia propendere per la non patogenicità dello stesso,
84
concetti come la penetranza incompleta e l’espressività variabile sono principi
imprescindibili della genetica. È inoltre da tenere in considerazione la possibilità che
tali regioni siano essere soggette ad imprinting, come è noto per la regione 15q11q13.
Per di più delezioni/duplicazioni ricorrenti, anche ereditate, possono essere causative
di malattia come dimostrato per la regione 22q11.2. Soprattutto per quanto riguarda
le delezioni, resta infine da considerare la possibilità di una concomitante alterazione
sull’altro allele. Dal versante opposto l’insorgenza de novo di un’aberrazione non è
sufficiente a dimostrarne il ruolo patogenetico, in quanto non è possibile escludere né
l’ipotesi di una variante benigna ad insorgenza de novo né quella di una attribuzione di
paternità non corretta.
In conclusione, è da evidenziare come l’analisi di array-CGH in pazienti con
difficoltà di apprendimento o ritardo mentale abbia arricchito in modo considerevole
le nostre conoscenze sulle sindromi da microdelezione e microduplicazione e la nostra
comprensione dell’architettura cromosomica predisponente. Una serie di nuove
sindromi sono state caratterizzate e senza dubbio altre emergeranno in un futuro
molto prossimo, sottolineando la necessità di applicare una tecnologia whole-genome.
Tale approccio presenta infatti l’enorme vantaggio dell’elevata sensibilità e della
possibilità di individuare riarrangiamenti non ricorrenti a fronte delle difficoltà
interpretative che possono presentarsi per variazioni del numero di copie di
significato incerto. I risultati ottenuti e la percentuale di riarrangiamenti
caratterizzati sostengono inoltre la necessità di una rivoluzione nell’approccio
diagnostico al paziente con ritardo mentale e/o anomalie congenite e fenotipo non
caratterizzabile su base clinica. L’analisi di array-CGH ad oggi rappresenta un’indagine
imprescindibile nella caratterizzazione di questi pazienti in quanto combina i vantaggi
del cariotipo e quelli della FISH per i riarrangiamenti subtelomerici raddoppiandone la
capacità diagnostica. L’array-CGH consente infatti di effettuare l’analisi dell’intero
genoma in un unico esperimento con una risoluzione elevata, non richiede una cultura
cellulare, presenta un numero ridotto di falsi positivi e pressoché nullo di falsi
85
negativi, ha un’alta specificità a cui si va ad aggiungere un’elevata sensibilità ed è
rapido in quanto parte delle procedure sono semiautomatizzate [Oostlander et al.,
2004]. Per queste ragioni è auspicabile che l’array-CGH vada a rappresentare
l’indagine molecolare di elezione in quei pazienti con MCA/MR in cui un’accurata
valutazione clinica abbia escluso un possibile inquadramento sindromico specifico.
86
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