Análisis Citométrico de la Función Plaquetaria: Técnicas de Análisis

Análisis Citométrico de la Función

Plaquetaria: Técnicas de Análisis

ESTUDIO CLINICO DE LA HEMOSTASIA: INTEGRACION DE FUNCION PLAQUETARIA Y COAGULACION

• El estado actual del conocimiento de la hemostasia, su regulación y su patología exige incluir el análisis de la función plaquetaria en el estudio de los fenómenos prohemorrágicos y protrombóticos.

• El desarrollo actual de la citometría de flujo la convierte en una tecnología de elección para ese fin.

• La disponiblidad de técnicas citométricas en sangre entera potencia el valor diagnóstico y pronóstico de la citometría de flujo en el estudio clínico de la hemostasia.

LA PREGUNTA CLAVE:¿HAY VIDA MAS ALLA DE ESTE HISTOGRAMA?

LA RESPUESTA:HAY VIDA (SIN NUCLEO) MAS ALLA DE ESTE HISTOGRAMA!!!

LAS DIEZ MEJORES “EXCUSAS” PARA NO ESTUDIAR LA FUNCION PLAQUETARIA POR CITOMETRIA DE FLUJO

• Los citómetros de flujo son para analizar leucocitos.

• Las plaquetas son demasiado pequeñas para ser detectadas.

• Las plaquetas sólo se pueden estudiar en forma de PRP.

• Las plaquetas se activan con mucha facilidad.

• No hay marcadores fenotípicos de plaquetas.

• Hay demasiados marcadores fenotípicos de plaquetas.

• Pero si en la Hemostasia lo importante es la coagulación...

• Pero si ya se usa un contador de plaquetas...

• Pero si ya se usa el agregómetro...

• Pero si ya las estudian en el Centro de Transfusiones...

ESTUDIO COMPLETO DE LA HEMOSTASIA: VENTAJAS DE LA CITOMETRIA EN SANGRE ENTERA

• Permite estudiar la función plaquetaria en condiciones cuasi-fisiológicas

• La manipulación mínima previene la activación artefactual de plaquetas

• Evita la pérdida potencial de subpoblaciones plaquetarias

• Requiere pequeños volúmenes de muestra (pocos microlitros de sangre)

• Permite el análisis simultáneo de plaquetas y otras células sanguíneas

ESTUDIO COMPLETO DE LA HEMOSTASIA: VENTAJAS DE LA CITOMETRIA EN SANGRE ENTERA

PE

L

+ADP

+ADPBASAL

BASAL

WB PRP GFP WP Positive control

0

20

40

60

80

100

*

*

*

% P

late

lets

CD

62P*

ESTUDIO COMPLETO DE LA HEMOSTASIA: CITOMETRIA FUNCIONAL VERSUS AGREGOMETRIA

ADP

SS Log

FS

Log

CITOMETRIA DE FLUJO EN EL ANALISIS DE PLAQUETAS

Hasta ahora, el análisis citométrico de

plaquetas más habitual es el de anticuerpos

antiplaquetarios:• Autoanticuerpos

• Aloanticuerpos:

• Inmunofenotipo de HPA-1a

• Detección de anticuerpos maternos y fetales anti-

HPA-1a

• Analisis de IgG asociadas a plaquetas en

trombopenias

• Analisis de IgG asociadas a plaquetas en

aloinmunización

• Cross-match de plaquetas

• La función plaquetaria también se puede analizar

ampliamente en sangre entera por citometría de flujo• Activación plaquetaria in vivo• Reactividad plaquetaria in vitro• Interacciones plaqueta-plaqueta• Interacciones plaquetas-leucocito• Interacciones plaquetas-eritrocito• Liberación de micropartículas procoagulantes• Alteraciones en el recuento de plaquetas• Alteraciones en la morfología de la plaqueta• Maduración normal y patológica de la plaqueta• Monitorización del tratamiento antiagregante

CITOMETRIA DE FLUJO EN EL ANALISIS DE PLAQUETAS

ANALISIS CITOMETRICO DE LA FUNCION PLAQUETARIA

ANALISIS DE LA ACTIVACION PLAQUETARIA

• La preparación y el procesamiento de la muestra deben

ser cuidadosos para mantener las funciones intrínsecas

• Las condiciones del análisis citométrico se deben

adaptar para acotar la población de plaquetas


RBC

Plaquetas

• La extracción debe realizarse en reposo y con el

mínimo traumatismo

• Se recomienda desechar los primeros mL de muestra

• La sangre entera se debe anticoagular con citrato

• Las muestras se diluyen (1:100) para minimizar la

formación de agregados plaquetarios

• Se utiliza un anticuerpo monoclonal contra una proteína

constitutiva de la superficie de la plaqueta para identificar

y seleccionar la población plaquetaria


• Preparar todos los reactivos necesarios anticipadamente• Dispensar la sangre sobre anticoagulante• Diluir la sangre (antes de 30 min) con el tampón adecuado• Opciones de ensayo:

Þ Fijar MarcarÞ Activar Fijar MarcarÞ Activar Marcar FijarÞ Marcar Activar FijarÞ Marcar y activar simultáneamente Fijar

• Diluir en tampón adecuado o fijador• Analizar p0or citometría de flujo


Muestras fijadas

• Ventajas:• Fácil de realizar antes de 30

minutos de la toma de muestra• Mejor estimación estática del

estado de activación plaquetario

• Desventajas:• Impide estudiar las respuestas de

activación plaquetaria• Algunos epitopos se pueden

alterar por el fijador

Muestras frescas

• Ventajas:• Posibilidad de medir la

activación plaquetaria in vivo y la reactividad plaquetaria a varios agonistas

• Desventajas:• La preparación es crítica debido

a la activación espontánea de las plaquetas con el tiempo


• En ausencia de agonistas exógenos se determina el estado de activación in vivo de las plaquetas circulantes

• La adición de un agonista permite analizar la reactividad in vitro de las plaquetas circulantes.

+ADPBASAL


• Los agonistas más utilizados para la estimulación

de plaquetas son:

• Agonistas fuertes: Trombina y TRAP

• Agonistas débiles: ADP, Colágeno, Tromboxano A2

• Ionóforos de Calcio: Ionomicina, A23187

• Esteres de forbol: PMA


BASAL COLLAGEN

ADP THROMBIN


[ Ca2+

[

= 100 nMPlaqueta en

reposo

Plaqueta

activada

STD

gránulos densos

mitocondrias

gránulos a

Ca2+ en sangre = 10.000 en citosol

Ca2+

Ca2+

Canales específicos

GPIIb/IIIa

Ca2+

STD

GD

• La respuesta plaquetaria se puede estimar con:

•Anticuerpos monoclonales contra marcadores de

activación

•Fluorocromos específicos de funciones bioquímicas

•Parámetros morfológicos asociados a cambios

funcionales

CD62P

Con

taje


PARAMETROS CITOMETRICOS DE ACTIVACION PLAQUETARIA

Parámetro

Ca libre citosólico 2+

Actina G

Cambio detectado

Aumento reversible

Polimerización a Actina F

Marcador Citométrico

FLUO-3 AM

Falacidina

Faloidina

Cambios en FS

Cambios en SS

Emisión de Fluorescencia

Aumento reversible

----

Aumento reversible

Tamaño

Granularidad

Aumento o Disminución

Desgranulación


Mepacrina

Parámetro Cambio detectadoMarcador

CitométricoEmisión de

Fluorescencia

Gránulos densos(Número)

Complejosgp IIb/IIIa(Número)

Complejosgp b/V/IX(Número)

Liberación delcontenido

Disminución ensuperficie

Aumento ensuperficie

Anticuerposespecíficos


Disminución

Disminución

Aumento




Fluorescencia

Complejosgp IIb/IIIa




Conformaciónalterada

Conformaciónalterada

Unión deligandos

Expresión deLIBS y RIBS



contra ligandos

Anticuerposespecíficossimultáneos


contra neoepítopos

Aumento

Aumento

Aumento

Modificación dela resonancia de

fluorescenciaFRET




Fluorescencia

Fosfolípidosaniónicos

Aumento Aumento

Aumento

Aumento Aumento

Aumento

Factores de lacoagulación

CD62P(P-Selectina)

CD63(gp53)

Aumento




contra V y VIIIa

Annexina V

Aumento


CD107a(LAMP-1)

CD 107b(LAMP-2)

Gp40

CD40L



Fluorescencia

Aumento

Aumento

Aumento

Aumento

Aumento

Aumento

Aumento

Aumento






Detección de plaquetas activadas in vivo:• Objetivos:• Detección de plaquetas activadas circulantes• Medición del riesgo protrombótico o prohemorrágico

• Aspectos metodológicos:• El análisis se efectúa en sangre completa periférica• Identificación de plaquetas: CD41, CD49 o CD61 con PE• Cuantificación de P-selectina: CD62P-FITC• Cuantificación del receptor activo de fibrinógeno: PAC-1 FITC

ANALISIS CITOMETRICO DE LA ACTIVACION PLAQUETARIA

Detección de plaquetas activadas ex vivo:• Objetivos:• Determinación de la respuesta a agonistas exógenos• Estimación del riesgo protrombótico o prohemorrágico• Monitorización de tratamientos antiplaquetarios• Caracterización del perfil de activación plaquetaria

• Aspectos metodológicos:• El análisis se efectúa en sangre periférica• Activación con agonistas plaquetarios: ADP, trombina, etc.• Identificación de plaquetas: CD41, CD49 o CD61 con PE• Cuantificación de P-selectina: CD62P-FITC• Cuantificación del receptor activo de fibrinógeno: PAC-1 FITC


TUBO MUESTRA Agonista CD41-PE+CD62P-FITC

Solución Stop(Tyrode a

+4°C)0 40µL None 10µL + 5µL 2 mL

1 36µL 4µL of 50µMADP

10µL + 5µL 2 mL

2 36µL 4 µL of100µMTRAP-6

10µL + 5µL 2 mL

TIEMPO 10 min37°C

5 min37°C

Análisis en+/- 15 minutos

Análisis de laActivación

ex vivo

Análisis de la activación

in vitro

Procedimiento típico de un ensayo de activación plaquetaria

Anticuerpos CD41/GPIIb

Clone Bindingconditions

Epitope resistantto fixation

Special effect Forms andPart. No

P2 Only whenCD41 isnaturally

complexed toCD61 (GPIIIa)

Yes

Blocks thebinding offibrinogen toplatelets;inhibitsaggregation

IM0145

IM0718 Biot

IM0649 FITC

IM1416 PE

SZ22 CD41 evendissociatedfrom CD61

ND

None

IM0539

IM0720 Biot

IM1756 FITC


Clone Bindingconditions

Epitope resistantto fixation

Special effect Forms andPart. No

SPAN12 Only on intactThrombin

receptor, i.e.before theactiation ofthrombin

No

Inhibitsthrombin-activation

IM2086

IM2583 PE

WEDE15 Both on intactand thrombin-

cleavedreceptor No

None

IM2085

IM2584 PE

Anticuerpos contra el receptor de trombina


0.00 0.25 0.50 0.75 1.000

50

1006D1 (GP1b)AK1 (GP1b/IX)FMC25 (GPIX)S12 (P-selectin)PAC110E5 (GPIIb-IIIa)OKM5 (CD36)

5.0

[Thrombin] U /ml

Perc

ent o

f Max

imal

Fluo

resc

ence



Expresión de P-selectina (CD62P):

CD62P-FITC

+ ADPBASAL

+ADP

BASAL

FS

log

CD62P-FITC

Con

taje


Inducción de la activación:• Objetivos:·Medición del riesgo protrombótico o prohemorrágico·Monitorización de tratamientos antiplaquetarios·Caracterización del perfil de activación plaquetaria

• Aspectos metodológicos:·El análisis se efectúa en sangre periférica·Activación con agonistas específicos·Identificación con CD41, CD49 o CD61 con PE·Medida cinética de la liberación de calcio con Fluo-3 o Fluo-4


Inducción de la activación:

+ADP


Inducción de la activación:


Medida de la expresión de superficie procoagulante:

• Objetivos:• Cuantificación de la expresión de fosfatidilserina en la

superficie de la plaqueta activada

• Evaluación de la contribución plaquetaria a la coagulación

Aspectos metodológicos:

• El análisis se efectúa en sangre periférica

• Identificación con CD41 o CD61 con PE o PC5

• Medida de fosfatidilserina con Anexina V-FITC


Medida de la expresión de superficie procoagulante:


Análisis cuantitativo de micropartículas plaquetarias:• Objetivos:• Detección y cuantificación de fragmentos circulantes de

membrana plaquetaria que expresan fosfatidilserina

• Diferenciar micropartículas activadas y no activadas

• Evaluación de la contribución plaquetaria a la coagulación

Aspectos metodológicos:

• El análisis se efectúa en sangre periférica

• Identificación con CD41 o CD61 con PE o PC5

• Medida de fosfatidilserina con Annexina V-FITC

• Método normalizado en Biocytex

BASAL


A23187 67mM


A23187 67mM


BASAL


Análisis cuantitativo de micropartículas plaquetarias:

Number of Pathological Samples : n = 22

Test A Test B

CD61/CD41 Annexin V/CD41

Mean 7745 1362

SD 3474 570

Range 1839 - 13620 400 - 2280

Results expressed in number of events / µl whole blood

Micropartículas activadas

Micropartículas plaquetarias

A B C

D E

F

G

RBC

Plaquetas

ADP

Basal

ADPADP

A23187A23187 Basal

ADPBasal

EJEMPLO DE ANALISIS CITOMETRICO INTEGRADO DE LA FUNCION PLAQUETARIA

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Análisis Citométrico de la Función Plaquetaria: Técnicas de Análisis