ANALISIS DE COCAINA ANALISIS DE COCAINA Y Y

SUS METABOLITOSSUS METABOLITOS

INDICEINDICE

1. INTRODUCCIÓN 1.1-Características y sus efectos en el cuerpo humano. 1.2-Caracterización del analito. 1.3-Metabolismo de la cocaína.

2. ANALISIS DE COCAINA 2.1-Características generales de las técnicas de extracción. 2.2-Otras técnicas. 2.3-Aplicación de las técnicas en función de la matriz 2.4-Tabla resumen.

3. BIBLIOGRAFÍA

1. INTRODUCCIÓN1. INTRODUCCIÓN

Características y sus efectos en cuerpo humanoCaracterísticas y sus efectos en cuerpo humano

La coca es una especie de singular importancia cuyas plantas fueroncultivadas por los indios de América del Sur; masticaban sus hojas como estimulante para resistir diferentes inclemencias e incluso en ceremonias religiosas. Actualmente se cultiva en varias partes del continente americano, en la isla de Java y en la India, principalmentepara la producción de cocaína.

Básicamente hay dos formas químicas: -las sales: la forma más común del polvo de cocaína, se disuelve en agua; forma intravenosa o intranasal. -los cristales de cocaína (como base libre): no ha sido neutralizado por ácido para producir la sal correspondiente; se puede fumar, ya que no se descompone como sí lo hace el clorhidrato.

La cocaína es un estimulante adictivo que funciona en el sistema nervioso central, principalmente al sistema dopaminérgico mediante la modulación de la dopamina, un neurotransmisor que se encuentra en ciertas zonas y neuronas del cerebro.

EFECTOS

USO MEDICINAL: Las hojas de la coca se han usado durante milesde años como hierba medicinal y para la elaboración de infusiones debido a su carácter anestésico local, por lo que se usa en ciertostipos de cirugías de los ojos, oídos y garganta.

-elevación de la autoestima y la confianza en uno mismo, -una gran locuacidad, excitación (pudiendo llegarse a la extrema irritabilidad). -dura relativamente poco tiempo (unos 30-60 minutos) -ansiedad por recibir otra dosis

Caracterización del analitoCaracterización del analito

COCAINA:

(1R,2R,3S,5S)-3-(benzoiloxi)-8-metil-8-azabiciclo[3.2.1] octano-2-carboxilato de metilo. C17H21O4N Es un alcaloide perteneciente al grupo de los alcaloides tropánicos; es una base nitrogenada capaz de formar sales en acidos organicos e inorganicos.

Propiedades físicas: -son prismas monoclínicos, incoloros, con un punto de fusión de 98ºC. -es muy soluble en cloroformo (CHCl3), soluble en etanol, eter dietílico, CS2, benceno, muy poco soluble en agua fria. -la soluciones de cocaína son levógiras y tiene una [a]D 20= -15,83º en cloroformo. -sublima con descomposición a temperaturas que estén por encima de su punto de fusión. -sabor amargo e insensibiliza transitoriamente los nervios linguales.

Núcleo fundamental: tropano

Función de puente

Del tropano deriva la ecgoninaque presenta un radical hidroxilo (OH) en el carbono 3 y un grupo carboxílico (COOH) en posición 2; siendo por tanto el 3-hidroxi-2-carboxi-tropano.

303272198

182

82

122

10594

N-desalquilacion

Hidrólisis de ester

N-desalquilacionHidrólisis de ester

Hidrólisis de ester

N-desalquilacion

Trans-esterificacion

Metabolismo de la cocaína:Metabolismo de la cocaína:

-Reacciones metabólicas de fase I:

-Reacciones metabólicas de fase II: formación de glucoconjugados.

La biotransformación de la cocaína se realiza en el hígado y en el plasma sanguíneo a través de las colinesterasas que dan lugar a productos hidrosolubles.

2. ANALISIS DE COCAÍNA2. ANALISIS DE COCAÍNA

CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LAS TÉCNICAS DE EXTRACCIÓN.

Extracción líquido – líquido (LLE)

No tóxicos, transparentes, no emulsiones, más densos que el

agua

Extracción en fase sólida (SPE).

1. Acondicionamiento del cartucho

2. Paso lento de la muestra

3. Fase lavado

4. Desorción con disolvente apropiado.

ParámetroParámetro LLELLE SPESPE

EspecificidadEspecificidad Baja Alta

Tiempo de Tiempo de análisisanálisis

Largo Corto

Concentración Concentración El analito se diluye

Se obtiene extracto concentrado

RecuperaciónRecuperación Baja Alta

SalubridadSalubridad Solventes tóxicos

Menos cantidades

CostosCostos Consumo de solventes y t

Consumo de solventes y t

Comparación entre técnicas:

Microextracción en fase sólida (SPME): “Extracción Extracción de los analitos de la matriz de la muestra mediante una de los analitos de la matriz de la muestra mediante una fibra de sílice fundida que está recubierta de un fibra de sílice fundida que está recubierta de un sorbente, seguida de una desorción de los mismos, sorbente, seguida de una desorción de los mismos, térmica o mediante el empleo de un solvente orgánicotérmica o mediante el empleo de un solvente orgánico”.

• “Ausencia” disolventes y bajo coste.

• Elevada sensibilidad y puede automatizarse

• Pequeños volúmenes muestra

• Fácil transporte y versatilidad matrices (aliento, sol. Liq.)

• Problemas de reproducibilidad, gran número de variables implicadas (limitación análisis cuantitativo) Patrón interno

• A veces LD altos (SPME-LC)

Modo SPME Propiedades del analito

Matrices

 

Inmersión Directa  Espacio de cabeza Membrana protectora 

 

De media a baja volatilidad  De alta a mediana volatilidad Baja volatilidad

 

Muestras gaseosas, liquidas. Liquidas, sólidas Muestras complejas

“Practical Tips on Preparing Plasma Samples for Drugs analysis Using SPME”. (www.lcgeurope.com)

““Practical Tips on Preparing Plasma Samples for Drugs analysis Using SPME”. Practical Tips on Preparing Plasma Samples for Drugs analysis Using SPME”. (www.lcgeurope.com)(www.lcgeurope.com)

Extracción HS en Nurka390 termostatizador

Termómetro a 60ºC.1 hora con cronom. Time:

01:00:00

Inyección directa

10’

45º

C

10ºC/min

180ºC

5ºC/min.

290ºC

25ºC

300 ºC

-Molecularly Imprinted Solid Phase Extraction (MISPE)

-Microextracción Líquido-Liquido (LLME)

-Extracción Sólido-Líquido:

-Asistido por ultrasonidos-Asistido microondas-Agitación directa

-Análisis in-vivo con sondas de microdiálisis

Otras técnicas empleadas en la extracción de Otras técnicas empleadas en la extracción de cocaínacocaína

MISPE

-soporta condiciones de alta temperatura, presión, pH extremos y disolventes orgánicos

-bajo coste y alta capacidad

-reproducibilidad en la fabricación

-reconocimiento a medida

Empleado para BE en muestrasacuosas a niveles clínicos μg/mL

Relleno de columnas de HPLC

LLME

LLME en dos o tres fases

-Tres fases:

ASample ↔ AAqueous acceptor ↔ AOrganic acceptor

-Dos fases

La fase aceptora es igual que la orgánica

Cocaína en saliva y orina

Cloroformo como fase orgánica y aceptora (dos fases)

TIPOS DE MUESTRA(Uñas, billetes, polvos “ilícitos”, hojas de coca, tejidos post-mortem, saliva, pelo, orina, sangre)

UñasSe busca COC, NCOC y BE

ProcedimientoExtracción S-L con 3ml MeOH 16h 40ºCSPE

Activación: 2ml MeOH y 2ml tampón fosfato pH=6Lavado: 6ml H2O, 3ml HCl 0,1 M y 9ml MeOHElución: 2ml methylene chloride–2-propanol–amoniumhydroxide (80:20:2, v/v/v).

Evaporación derivatización 25μl Etilacetato

2μl GC/MS

Billetes($,$can,Fr suizos, €, GBP)

Procedimiento

-Agitación en Vórtex 5 min 15 ml MeOH-Evaporación-O,5 ml MeOH GC/MS

SALIVA

Correlación con plasmaCocaína está presente en saliva de consumidoresBúsqueda de EME, BE, COC (69, 54 y 31 ppb, resp.

17h después de dosis)

Recolección de muestra:-sin estímulo-con estímulo: caramelos cítricos, chicle, etc

Procedimiento:1ml saliva pH=9-Extracción L-L con 3ml de organoclorados-Evaporación-GC/MS

SPME: Selección de la fibra Polydimethylsiloxane (PDMS) Analito en líquido Inmersión directa Analito en matriz sólida Espacio de cabeza (HS) Factores que pueden optimizar el proceso:

Fuerza iónica Adición de sales (NaCl) pH matriz Drogas ácidas y/o neutras drogas neutras en

fibra Tiempo de extracción Tiempo requerido para establecer

equilibrio (15-30 min) Aditivos orgánicos (MeOH) Pueden eliminar proteínas de la

matriz. Temperatura Establecer un equilibrio de temperatura Derivatización Agitación Influencia de las proteínas en la fibra

SANGRE

SPMECentrifugación10 min a 4000rpm

Adición de patrón interno deuterado disuelto en ACN

Centrifugación 5 min a 12000 rpm

400 µL plasma+

200 µL Borax buffer (pH = 9)

Mejorar la SPME: Adición 50 mg NaCl y agitar

SPME directa (25 min): PDMS (100 µm polydimethylsiloxane)

GC-MS (5min)

PELO-Cocaína como compuesto mayoritario y, BEG y EME en bajas concentraciones (deg.)-1er analisis: 1981, mediante RIAGC/MS.-Se puede detectar meses después de su administración.

LAVADO 5-10mg + 1mL MeOH 15min, 37ºC + 3x(fosfato pH6 30min, 37ºC ).

DIGESTION Alcalina: 1h en 1N NaOH a 100ºC. Eliminación de proteínas. Degradación de cocaína.

Acida: 50mg pulv. + 0.1M HCl 45ºC, noche +100μL 1M NaOH +2mL pH 7.4.

(sin pulv) 1mL 0.1M HCl durante 18h a 37ºC .

Enzimática: 10mg + 2.6mL buffer + 0.4mL 0.4M dithiothreitol durante2h a 40ºC. +50μL de proteinase K, a 40ºC por la noche.

buffer:1 mL 1 M Tris HCI buffer, 20 mL 10% SDS + 79 mL agua destilada.

EXTRACCIÓN Liquido-líquido:

SPE: C18, 6mL MeOH 3mL H2O 10min secado 3x 500μL 3mL H2O 3mL acético 15min 4500rpm

acetona:diclorometano 3mL H2O 3:1

también: Bond Elut fase reversa + intercambio iónico.GC/MS (derivatización) y LC/MS.

ORINA-Compuestos mayoritarios: BEG y EME, y en baja concentración COC libre.-En control de dopaje solo se monitoriza BEG y EME.

EXTRACCIÓN líquido-líquido: 100μL pH 11 + 5mL TBME, agitar, centrifugar y separar fases.

SPE: C18, centrifugar. 500μL MeOH 1mL H2O 200μL AcN:MeOH (70:30) 500μL H2O

Bond Elut, 1mL+ 2mL buffer pH9, vortex 10s.

3mL MeOH 3mLH2O 2mL CH2Cl:isoprop (8:2) 3mL H2O 2% ammonio

SECAR FASES EN CASO DE DERIVATIZAR.

DERIVATIZACIÓN residuo+50μL MSTFA:dith:NH4I a 65ºC 30min. residuo+10μL CD3I a 100ºC 5min.

HPLC/MS

GC/MS

HIDROLISIS 2mL + 100μL pH7 + 25 μL β-glucoronidasa a 55ºC durante 1h.

Tipo de Tipo de muestramuestra TratamientoTratamiento DetecciónDetección

Uñas SLE, SPE GC-MS

Billetes SLE GC-MS

T.Post-mortem SPE GC-MS

Hojas de coca SPME, MW GC-MS

Saliva LLE, MLLE GC-MS

Sangre SPME, SPE GC-MS

Pelo SPE GC-MS, LC-MS

OrinaLLE, MLLE, SPE,

MISPEGC-MS, LC-MS

3. BIBLIOGRAFÍA3. BIBLIOGRAFÍA

“Analysis of Hair for Cocaine”, Gary L. Henderson, Martha R. Harkey, and Reese T. Jones.“Hair Testing for Drugs of Abuse: International Research on Standards and Technology”, 1995, p. 91-120. NIH Publication No. 95-3727.“Rapid assay of cocaine, opiates and metabolites by gas chromatography-mass spectrometry”. E.J.Cone, W.D.Darwin. J.Chr. Biomed Appli. 580 (1991) 43-61.“Determination of cocaine and benzoylecgonine by derivatization with Iodomethane-D3 or PFPA/HFIP in human blood and urine using GC/MS (EI or PCI mode)” R.E.Aderjan, G.Schmitt, M.Wu, Ch.Meyer. J. Anal. Toxic, vol.17 (1993). “A method for the simultaneous determination of cocaine, benzoylecgonine and ecgonine methyl ester in blood and urine using GC/EIMS with derivatization to produce high mass molecular ions”. D.S.Isenschmid, B. S. Levine, Y.H.Caplan. J. Anal. Toxic, vol.12 (1988). “Practical Tips on Preparing Plasma Samples for Drugs analysis Using SPME”. (www.lcgeurope.com) “Determination of cocaine and cocaethylene in plasma by solid-phase microextraction and gas chromatography-mass spectrometry”. I. Álvarez et al. / J.Chromatogr.B 845 (2007) 90-94“Validated, non-destructive and environmentally friendly determination of cocaine in euro bank notes”, Francesc A. et al, /Journal of Chromatography A, 1065 (2005) 321–325“Bioanalysis of drugs by liquid-phase microextraction coupled to separation techniques”, Stig Pedersen-Bjergaard∗, Knut Einar Rasmussen, /Journal of Chromatography B, 817 (2005) 3–12“Simple microbore high-performance liquid chromatographic method for the determination of dopamine and cocaine from a single in vivo brain microdialysis sample”,Loren H, /Journal of Chromatography B, 709 (1998) 35–45“Molecularly imprinted solid-phase extraction of cocaine metabolites from aqueous samples”, A. Zurutuza, /Analytica Chimica Acta 542 (2005) 14–19“Review: Pharmacokinetics of illicit drugs in oral fluid”, Olaf H. Drummer, /Forensic Science International 150 (2005) 133–142“Validation of a method to detect cocaine and its metabolites in nails by gas chromatography–mass Spectrometry”, Simone Valente-Campos, /Forensic Science International 159 (2006) 218–222