ANALISIS DE FLUJOS METABOLICOS EN BACILLUS SUBTILIS

I. INTRODUCCION.-

Bacillus subtilis es el microorganismo Gram + mas ampliamente estudiado.

Sin embargo, por mucho tiempo se postuló que era un microorganismo

estrictamente aerobio y por tanto existen relativamente pocos estudios en

condiciones anaeróbicas e inexistentes en condiciones controladas en

fermentadores. Desde el punto de vista cinético, estequiométrico y

energético no se conoce a detalle como crece y que vías de fermentación

son activas en presencia de nitrato como aceptor de electrones, así mismo

no se sabe si esporula o sí inicia este proceso en estas condiciones, Durante

el crecimiento de B. subtilis en glucosa, sin limitación de oxígeno, se produce

ácido acético como subproducto. Esto sucede como respuesta a un exceso

en el flujo de entrada de glucosa y por tanto a un incremento en el flujo

glicolítico a ácido pirúvico, el cual la célula es incapaz de utilizar en su

totalidad para biosíntesis en el ciclo de Krebs (Phalakornkule, et al., 2000;

Blencke, et al., 2003). Este fenómeno ocurre cuando existe glucosa en el

medio en concentraciones suficientes para controlar, por medio de la

proteína CcpA (proteína de control catabólica), regiones reguladoras CRE

(elementos de respuesta catabólicos) en los promotores de algunos genes

entre los cuales están ackA y pta (acetato cinasa y fosfotransacetilasa) de la

vía de producción de ácido acético e incluyendo también algunos genes de

las rutas del catabolismo de la glucosa (Prescan-Siedel et al., 1999). En

estudios empleando modelos de flujos metabólicos desarrollados para la

cepa 168 de B. subtilis, se encontró que en cultivo continuo limitado por

glucosa, el flujo de carbono (milimoles de carbono/gCélula-h) al través de la

ruta de los ácidos tricarboxilicos (TCA) y la síntesis de las enzimas que

componen el ciclo, se incrementa conforme aumenta la velocidad de

crecimiento, siendo drásticamente reprimidas solamente a velocidades de

crecimiento muy altas como las que se observan en el crecimiento por lote

(0.6 h-1) y conforme la concentración de glucosa se incrementa (Goel et al.,

1993). La proteína CcpA también esta involucrada en la fuerte represión que

ocurre en casi todos los genes necesarios para el ciclo de Krebs (Tobisch, et

al., 1999). Por medio de la velocidad de crecimiento, de balances

estequiométricos, de consumo de glucosa y la acumulación de los

metabolitos formados en condiciones anaerobias, es posible calcular las

velocidades específicas (flujo metabólico) y el porcentaje de la fuente de

carbono que es catabolizada por la glicólisis y el ciclo de las pentosas, este

procedimiento fue inicialmente propuesto por Papoutsakis y Meyer (1985).

Haciendo uso de esta metodología, Bulthuis et al. (1991) cultivando a

Bacillus licheniformis en condiciones anaeróbicas, por lotes o en continuo,

encontraron que hasta un 52 % de la glucosa es metabolizada por la vía de

pentosas.

Figure 1: Metabolic Network of B. subtilis

II. PROCEDIMIENTOS Y RESULTADOS

1.- Se introdujeron los datos obtenidos de la ruta metabolica de bacillus subtilis en el programa excell.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

r1 r2 r3 r4 r5 r6 r7 r8 r9 r10 r111 G6P -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -12 R5P 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 13 GAP 2 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 04 3PG 0 1 -1 0 0 0 0 0 0 0 05 PEP 0 0 1 -1 0 0 0 -1 0 0 06 Pyr 0 0 0 1 -1 0 0 0 0 0 07 AcCoA 0 0 0 0 1 -1 0 0 0 0 08 OAA 0 0 0 0 0 -1 1 1 0 0 09 AKG 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

10 NADH 0 1 0 0 1 0 2 0 -1 0 011 FADH 0 0 0 0 0 0 1 0 0 -1 0

12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

G6P 1 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0R5P 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0GAP 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 03PG 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0PEP -1 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0Pyr 1 0 0 0 0 0 -1 -1 0 0 0 0AcCoA

0 0 0 0 0 0 0 0 -1 -1 0 0

OAA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1AKG 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 0NADH 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0FADH 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

MATRIZ ESTEQUIOMETRIA DE LAS11 REACCIONES

MATRIZ ESTEQUIOMETRIA DE LAS12 REACCIONES (12 AL 23)

2.-Siguiendo los datos extraídos del paso anterior, se dispuso a utilizar el

programa Matlab, con el cual se añadieron los siguientes:

3.- Al correr el programa, en comando se obtuvo lo siguiente:

III. CONCLUSIONES

El calculo de flujos desconocidos se da por la siguiente formula :

En matlab se aplico:

% flux calculation

qc=-inv_S_C * S_M * qm

donde S_c : MATRIZ ESTEQUIOMETRIA DE LAS11 REACCIONES

S_M : MATRIZ ESTEQUIOMETRIA DE LAS REACCIONES(12 al 23)

Q_M : QUE CONTIENE LOS FLUJOS MEDIDOS

El cálculo de flujos metabólicos es una herramienta de la ingeniería

metabólica y una determinación fundamental en estudios cuantitativos de

fisiología celular, ya que permite organizar el conocimiento metabólico de

un microorganismo en una red de reacciones bioquímicas y provee una

medida del grado de ajuste entre varias vías metabólicas (Varma y Palsson,

1994; Stephanopoulos y col., 1998; Nielsen, 2001).

El grado de ajuste entre vías metabólicas se entiende como la producción

de intermediarios en unas y el consumo de los mismos en otras, por

ejemplo, cuando las condiciones ambientales cambian los flujos

metabólicos son redistribuidos de manera que se mantenga el balance de

óxido-reducción en la célula (Varma y Palsson, 1994; Torres y Voit, 2002).

Una poderosa herramienta para la determinación de los flujos en la red de

reacciones bioquímicas es el análisis de flujos metabólicos (AFM), en el

cual los flujos intracelulares son calculados usando un modelo

estequiométrico que describe la bioquímica del microorganismo (Jørgensen

y col., 1995; Nissen y col., 1997; Stephanopoulos y col., 1998). Sin

embargo, ya que el análisis cuantitativo del metabolismo requiere datos

experimentales, es importante que la consistencia de los datos sea

confirmada, antes de utilizarlos en la determinación de flujos metabólicos

(Stephanopoulos y col., 1998).

En algunos casos, el modelo estequiométrico y los flujos extracelulares

medidos permiten calcular, además de los flujos intracelulares, flujos

extracelulares no medidos o incluso algunos que sí fueron medidos pero

fueron intencionalmente omitidos en los cálculos. En éste último caso, el

grado de concordancia entre los flujos medidos y las predicciones del

modelo, pueden servir para validarlo.

Se utilizo el comando “length” que devuelve el número de componentes de

un vector. Para usar esta función debe definir el vector antes de llamar a la

función, que define la cantidad de elementos máximos que tiene un vector.

Lista de reacciones :

Glucose + ATP = glucose-6-P + ADP

Glucose-6-P + 2NADP = ribulose-5-P + C02 + 2NADPH

Ribulose-5-P = ribose for nucleic acid

Ribulose-5-P = 3 fructose-6-P + 5 TP 2 1

Glucose-6-P = fructose-6-P

Fructose-6-P + ATP = 2 TP + ADP

TP = triglycerides

PEP = pyruvate + ATP

Pyruvate = AA (from pyruvate pool)

Pyruvate = organics (other than acetate)

Pyruvate + NAD = ACoA + C02 + NADH

ACoA = AA (from ACoA pool)

ACoA = membrane

ACoA + ADP = acetate + ATP

ACoA + OM = isocitrate

Isocitrate + NADP = a-KetoG + C02 + NADPH

a-KetoG = AA (from a-KetoG pool)

a-KetoG + FAD + GDP + 2NAD = OAA + C02 +

FADH + GTP + 2NADH

OAA = NA (from OAA pool)

OAA = AA (from OAA pool)

Pyruvate + C02 = OAA

NADH + 1.3 ADP + iy = 1.3 ATP + NAD

FADH + ;(1.3 ADP) + 502 = ;(1.3 ATP) + FAD

Las especies consideradas son las siguientes:

Glucose

Glucose 6-P

Ribulose 5-P

NA (from ribose)

Fructose 6-P

Cell wall

AA (from Glucose pool)

TP

Triglycerides

PG

AA (from PG pool)

NA (from PG pool)

PEP

AA (from PEP)

Pyruvate

AA (from pyruvate)

Organics (other than acetate)

ACoA

AA (from ACoA pool)

Membrane

Acetate

Isocitrate

a-KetoG

AA (from a-KetoG pool)

OAA

Nucleic acid (from OAA pool)

NADPH

NADH

FADH

C02

02

IV. REFERENCIAS

- Aiba, S., Matsuoka, M. 1979. Identification of metabolic model:Citrate production from glucose by Candidu lipolytica. Biotechnol.Bioeng. 21: 1373-1386.

-  Bailey, JE 1991. Towards a science of metabolic engineering.Science 252: 1668- 1675