ANÁLISIS DE RIESGO DE COTAMINACIÓN POR PATÓGENOS EN EL PROCESO PRIMARIO DE LECHE CRUDA.UCE-FCQ

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MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

Análisis de Riesgo de Patógenos

UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS

ESCUELA DE BIOQUÍMICA

CARRERA QUIMICA DE ALIMENTOS

ASIGNATURA: MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS

TRABAJO DE PATOGENOS

TITULO: AANNÁÁLLIISSIISS DDEE RRIIEESSGGOO DDEE CCOONNTTAAMMIINNAACCIIÓÓNN PPOORR PPAATTÓÓGGEENNOOSS EENN LLAA PPRROODDUUCCCCIIÓÓNN PPRRIIMMAARRIIAA DDEE LLEECCHHEE CCRRUUDDAA DDEE

LLAA HHAACCIIEENNDDAA ““SSAANNTTAA RRIITTAA””

INTEGRANTES:

CAHUASQUÍ JIMENA

GARCÍA ALEXANDRA SALAZAR GABRIELA

VITERI DAVID

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INDICE

INDICE ____________________________________________________________________ 1

1. TITULO __________________________________________________________________ 3

2. ANTECEDENTES _________________________________________________________ 3

3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ________________________________________ 4

4. JUSTIFICACIÓN __________________________________________________________ 4

5. OBJETIVOS ______________________________________________________________ 5

5.1 Objetivo general: _____________________________________________________________ 5

5.2 Objetivos específicos: _________________________________________________________ 5

6. MARCO TEÓRICO ________________________________________________________ 6

LECHE CRUDA ________________________________________________________________ 6

Generalidades. __________________________________________________________________ 6

Calidad de la leche:: ______________________________________________________________ 6

CONTAMINACIÓN ENDÓGENA DE LA LECHE ____________________________________ 6 Contaminación Exógena De La Leche _______________________________________________________ 6 Fuentes de Contaminación de exógena de La Leche ___________________________________________ 6

MICROORGANISMOS DE IMPORTANCIA EN LECHE CRUDA ______________________ 7 Bacterias Gram. positivas: ________________________________________________________________ 7 Bacterias Gram. Negativas ________________________________________________________________ 8

7. MARCO METODOLÓGICO ________________________________________________ 9

7.1 DIAGRAMAS DE FLUJO REAL Y TEORICO DEL PROCESO DEPRODUCIÓN PRIMARIA DE LA LECHE CRUDA DE BOVINO ____________________________________ 9

7.2 Análisis de Riesgo del proceso real de producción primaria de la leche cruda __________ 11

8. MUESTREO _____________________________________________________________ 12

8.1 Tipo De Muestreo ___________________________________________________________ 12

8.2 Procedimiento ______________________________________________________________ 12

8.3 Toma De Muestras Para El Análisis Microbiológico _______________________________ 12

8.4 MÉTODOS ESPECÍFICO DE ANÁLISIS ____________________________________ 13

8.4.1 MÈTODOS GENERALES ____________________________________________________ 13

8.4.2 MÉTODOS ESPECÍFICOS __________________________________________________ 13 8.4.2.1 Análisis Microbiológico cualitativo y Análisis Microbiológico cuantitativo ___________________ 13

9. FACTIBILIDAD __________________________________________________________ 14

10. CRONOGRAMA ________________________________________________________ 14

11. BIBLIOGRAFÍA _________________________________________________________ 15

12. ANEXOS _______________________________________________________________ 16

Norma Argentina Requisitos microbiológicos de la leche cruda ________________________ 16

Lista de patógenos que se encuentra en la leche cruda ________________________________ 16

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1. TITULO

AANNÁÁLLIISSIISS DDEE RRIIEESSGGOO DDEE CCOONNTTAAMMIINNAACCIIÓÓNN PPOORR PPAATTÓÓGGEENNOOSS EENN LLAA PPRROODDUUCCCCIIÓÓNN

PPRRIIMMAARRIIAA DDEE LLEECCHHEE CCRRUUDDAA DDEE LLAA HHAACCIIEENNDDAA ““SSAANNTTAA RRIITTAA””

2. ANTECEDENTES

La leche proveniente de la Hacienda “Santa Rita” localizada en la provincia de Imbabura, en la

ciudad de San Pablo del Lago (aprox. 63.061 habitantes en el cantón Otavalo).

Se producen en promedio 800-1000 Litros de leche diarios, la producción se entrega a los

distribuidores informales, para la elaboración de quesos frescos dentro de la misma zona.

No existe un historial veterinario ni de manejo zootécnico, las pruebas de mastitis son

realizadas esporádicamente.

El establecimiento ganadero no garantiza su funcionalidad, y no brinda facilidades para buenas

prácticas, mantenimiento y limpieza adecuada.

La infraestructura de los corrales es inconveniente para el ganado lechero, el piso es de tierra,

hay cúmulo de desechos orgánicos, no existen zonas limpias destinadas para cada actividad.

Los equipos no se limpian ni desinfectan correctamente para evitar la proliferación de

microorganismos.

Mala calidad de piensos y tolvas, por la falta de un proveedor de referencia que certifique la

inocuidad de los forrajes, piensos y agua.

El agua que se utiliza para todos los procesos es potable, no cuenta con instalaciones adecuados

para la disposición final de aguas negras y efluentes industriales.

La hacienda cuenta con 6 personas que se encargan de los diferentes procesos, y no tienen

conocimientos básicos teóricos de proceso.

El personal no es sometido a exámenes clínicos (pro-cultivos) para reportar portadores sanos,

capaces de provocar contaminaciones de los alimentos que se manipulan;

El personal no cumplen con buenas prácticas de manufactura para higiene personal y uniformes

(no utilizan mascarillas ni guantes).

En las etapas de ordeño, existe una inadecuada manipulación de los instrumentos y utensilios

(recipientes, pezoneras, etc.,) generando una contaminación exógena.

El sistema de succión de la leche se lo hace a través de pezoneras y mangueras que luego son

colocadas en el piso.

El trasvase hacia y desde las cubas no se realiza bajo estrictas condiciones higiénicas.

El transporte de la leche cruda se realiza en vehículos que no son destinados exclusivamente a

este fin.

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3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

La Hacienda “Santa Rita”, se dedica a la producción y distribución de leche de una forma informal, su

producción y comercialización es realizada sin un adecuado registro sanitario ni documentos de

compra/venta, el expendio de la misma se la hace de una forma clandestina.

No hay capacitación para el trabajador, la infraestructura no está adecuada a estándares

internacionales, y el proceso de transporte no es el adecuado, por lo que es necesario realizar un análisis

de riesgos microbiológicos para este tipo de productos ya que estos van ligados directamente con la

salud de la población que los consume.

4. JUSTIFICACIÓN

Existe aprox. 63.061 habitantes en el cantón Otavalo, entre la cual encontramos a varios grupos

vulnerables como niños, ancianos y mujeres embarazadas. Estos grupos son reconocidos como entes

altamente susceptibles a la transmisión de enfermedades a través de alimentos (Leche cruda), por lo

tanto mediante este proyecto se pretende concienciar a los trabajadores del peligro que está

sometido la población día a día

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5. OBJETIVOS

5.1 Objetivo general:

Identificar y Realizar un análisis de riesgo de los puntos de contaminación por patógenos en la

producción primaria de la leche.

5.2 Objetivos específicos:

Realizar una lista de los principales patógenos que pueden existir en la leche cruda Bovina.

Determinar los Factores de crecimiento de patógenos y posibilidad de proliferación, supervivencia

de las fases del proceso de producción y expendió de la leche cruda.

Levantamiento del proceso real y teórico con los posibles microorganismos presentes en las

diferentes fases en exclusivo orden de severidad luego de constatar el proceso.

Ejecutar el análisis de riesgo de contaminación por patógenos del proceso teórico y real.

Establecer si la contaminación es de origen exógeno o endógeno proveniente del análisis de Riesgo

durante el proceso producción y expendió de la leche cruda bovino de la hacienda “Santa Rita”.

Comparar el proceso teórico de producción primaria de la leche cruda bovina del proceso real para

establecer los puntos riesgo y/o sitios de muestreo.

Aplicar técnicas y estrategias de muestreo y asegurar resultados precisos en el análisis

microbiológico.

Aislamiento, identificación y recuento de patógenos en el laboratorio.

Recopilación y discusión de los resultados obtenidos en el laboratorio.

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6. MARCO TEÓRICO

LECHE CRUDA

Generalidades. La leche es el producto de la secreción normal de la glándula mamaria de las hembras de los

mamíferos sanos, obtenida por varios ordeños diarios, higiénicos, completos e interrumpidos. Es un

líquido de color blanco y opaco, de sabor dulce, su pH es próximo a la neutralidad de (6.4- 6.6) y un

aw de 0.99, son los que hacen que la leche sea un medio ideal para el crecimiento y multiplicación de

microorganismos, especialmente de las bacterias. Estas bacterias pueden provenir de la micro flora

normal y habitual de la vaca, del ambiente de la vaquería, las máquinas y equipo de ordeño y hasta de

los mismos empleados.

Calidad de la leche::

CONTAMINACIÓN ENDÓGENA DE LA LECHE

Algunos componentes de la leche se forman en la glándula mamaria como la caseína y otros ya

existentes en la sangre, que pasan directamente a constituir parte de este producto. Este proceso

facilita la contaminación endógena de la leche durante su formación y almacenamiento en la glándula

mamaria por los agentes físicos, químicos o biológicos que se encuentran en la sangre de los animales

productores. La protección de la salud de los animales por los servicios médicos veterinarios y las

aplicaciones correctas de las normas zootécnicas contribuyen a evitar importantes agentes biológicos

que pueden afectar la salud del hombre. Entre estas se encuentra la brucelosis y la tuberculosis, que

deja de constituir un problema sanitario, a través de la leche, por la erradicación de estas enfermedades

en los animales.

Contaminación Exógena De La Leche

La posibilidad de crecimiento o incremento de los contaminantes en la leche durante la producción

primaria está en relación directa con la temperatura a que se mantenga después de su obtención.

Las principales fuentes de contaminación son las heces, el suelo, las camas, el pienso, el aire, agua, los

equipos de ordeño y de almacenamiento, los manipuladores y los vectores. (Fuentes de contaminación

Exógena)

Fuentes de Contaminación de exógena de La Leche

Aire: el aire representa uno de los medios más hostiles para la supervivencia de los microorganismos

debido a la constante exposición al oxigeno, cambios de temperatura y humedad relativa, radiación

solar, etc. Es por ello que solo aquellos microorganismos resistentes podrán ser capaces de permanecer

en el aire y llegar a contaminar los alimentos. Los microorganismos Gram negativos mueren

CALIDAD DE LA LECHE EN EL ESTABLO

FACTORES QUE DETERMINAN LA CALIDAD DE

LA LECHE

FACTORES QUE AFECTAN LA CALIDAD DE LA

LECHE

Salud animal Ordeño

Alojamiento de las vacas Nutrición Especie y Raza

Practicas de ordeño Agua

Manejo de la leche Alimentación

Mastitis y Período de lactancia

Temperatura

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rápidamente mientras que los Gram positivos y aquellos esporulados pueden persistir por largo tiempo.

En el aire se pueden encontrar Micrococcus, Streptomyces y esporas de mohos como Penicillium y

Aspergillus. Las levaduras raramente se encuentran en suspensiones aéreas.

Agua: el agua utilizada para la limpieza de los equipos y utensilios de ordeño, la higiene del animal y del

personal, debe ser lo más limpia posible. El agua puede ser una fuente importante de microorganismos

psicrófilos (Pseudomonas) y por contaminación de esta, de bacterias coliformes.

Suelo: el suelo es la principal fuente de microorganismos termodúricos y termófilos. La leche nunca

entra en contacto con el suelo pero si los animales, utensilios y personal, de manera que es a través de

ellos que los microorganismos telúricos (Clostridium) pueden alcanzar a contaminar la leche.

El ordeñador: el ordeñador puede llegar a jugar un papel importante en la contaminación de la leche,

sobre todo cuando el ordeño es manual. En nuestro medio es frecuente observar como el personal

encargado del ordeño no se lava las manos y peor aún se las humedece en la misma leche para lograr

lubricación que facilite el ordeño. Se ha señalado al ordeñador como responsable de la contaminación

de la leche con microorganismos patógenos (S. Aureus, Leptospiras, E. coli, M. tubercolosis,

Streptococcus, etc.). Las heridas infectadas en manos y brazos pueden ser fuentes de algunos de estos

microorganismos.

Estiércol: el estiércol es la fuente principal de microorganismos coliformes. Estos pueden alcanzar la

leche a través del animal o del ordeñador así como también por medio de los utensilios mal

higienizados.

Utensilios y Transporte: el contacto de la leche con el material de ordeño y su permanencia en los

tanques y transporte puede multiplicar por un factor de 2 a 50 la flora microbiana presente. De allí que

la higiene adecuada de estos, por medio de agentes desinfectantes, afecta significativamente la calidad

sanitaria de la leche. La flora microbiana proveniente de esta fuente puede ser diversa, pero la más

frecuente es flora termorresistente, razón más que suficiente para exigir al máximo la higiene.

MICROORGANISMOS DE IMPORTANCIA EN LECHE CRUDA

A continuación presentamos una descripción de los principales microorganismos que pueden

encontrarse en leche cruda. Patógenos de particular interés son

Bacterias Gram. Positivas:

Listeria monocytogenes es un patógeno considerado por la FDA como uno de cero tolerancia en los

alimentos, ya que puede causar desde meningitis hasta abortos en mujeres embarazadas. L. monocytogenes

es un peligro para el ganado lechero ya que puede ocasionar mastitis.

Estafilococos: Son anaerobios facultativos, fuertemente fermentadores. Son de gran importancia desde

el punto de vista sanitario. Causan mastitis y pueden provocar enfermedades o intoxicaciones en los

humanos. Staphilococus Aureus produce una exotoxina que causa fuertes trastornos intestinales en los

humanos, la cual es termorresistente, por lo cual no es destruida con la pasteurización. El

Staphilococcus epidermidis se ve implicado en algunos casos de mastitis, por lo cual puede llegar a

contaminar la leche.

Bacterias esporuladas: los Bacillus son bacterias aeróbicas con actividad enzimática variada producen

acidificación, coagulación y proteolisis. Los Clostridium son anaerobios estrictos, producen gas.

Algunos producen toxinas patógenas (Clostridium botulinum). Ambos géneros son de poca

importancia en leche cruda, su crecimiento es inhibido por las bacterias lácticas. Cobran importancia

en productos lácteos como en leches pasteurizadas, quesos fundidos, leches concentradas, quesos de

pasta cocida. Resisten la pasteurización por su capacidad de producir esporas, las cuales solo se

destruyen a temperaturas por encima de 100 ºC.

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Otras bacterias Gram +que pueden encontrarse en la leche son Corynebacterium , bacterias

propionicas, Brevibacterium estos últimos se encuentran en las cortezas de algunos quesos madurados

almacenados en condiciones húmedas.

Bacterias Gram. Negativas

Enterobacterias: los miembros de la familia Enterobacteriacea e son huéspedes normales del intestino

de los mamíferos, por lo tanto su presencia en el agua y la leche se relaciona con contaminación de

origen fecal. Las enterobacterias son menos abundantes en la leche que otras bacterias gran negativas,

sin embargo, tienen una gran importancia desde dos puntos de vista, higiénico. Enterobacterias más

comunes de la leche cruda: Escherichia coli, Enterobacter aerógenes, Klebsiella, Citrobacter,

Salmonella, Shigella, Proteus, Serratia. Los últimos dos géneros se consiguen poco frecuentes, son

microorganismos inocuos pero por su poder proteolítico pueden provocar alteraciones en la leche.

Salmonella spp. Es una bacteria que puede causar una deshidratación crónica y muerte en los niños

mientras que en el ganado puede causar abortos. Una vez la vaca es infectada con Salmonella su

erradicación es difícil ya que hay cepas resistentes a antibióticos. Además, puede transmitirse por

contacto directo del animal.

Bacteria Dosis infectiva [células]

Factores de crecimiento Metabolismo Modo de

patogenicidad

pH aw T ºC

E. Coli 10 ----- ----- 7-48 Anaerobio Facultativo

Infectante Endógeno y exógeno

Listeria. M 100 4.3-9.1 ----- 1.1-45 Anaerobio Facultativo

Infectante exógeno

S. Aureus 106 cél /g 4.5 -7-9.4 >0.86 10-35-47 Anaerobio

Facultativo Intoxicante exógeno

Salmonella 15 – 20 4.5-9 0.93 5-45

Anaerobio Facultativo

Infectante endógeno y exógeno

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7. MARCO METODOLÓGICO

7.1 DIAGRAMAS DE FLUJO REAL Y TEORICO DEL PROCESO DEPRODUCIÓN PRIMARIA DE LA LECHE CRUDA DE BOVINO

DIAGRAMA DE FLUJO REAL DEL ORDEÑO MECÁNICO

Animal: Cualquier lesión en el animal puede causar una elevada contaminación, la ubre esta en contacto con el suelo, heno, etc., animales enfermos (mastitis)

desinfeccion de las Ubres:no saben la concentracion de Yodo para desinfectar y no hay control de esta.

El empleo de sistemas de ordeño mecánico la contaminación en este caso estará mayormente en los tanques de almacenamiento y en el sistema de ordeño en si mismo.

Utensilios y transportes: higiene por medio de detergente y agua fría.

Después de cada transporte,no se limpia y desinfecta adecuadamente los recipientes que se utilizo para el transporte de la leche al establecimiento de transformación. Ni tampoco el transporte

La leche recogida no se filtrar y no enfria lo más rápido posible

Ingreso sala

de ordeño

Preparacion

de las ubres

Ordeño mecánico

Filtración y

recolección

Transporte

inadecuado

Animal : S. Aureus F,

Agua: Pseudomona Єsuelo : termodúricos y termófilos Єestiercol ; coliformes - E. coli Єaire: micrococus, mohos y levaduras Є

ordeñador-personal: E. coli, S. Aureus ambiente: Bacillus, Listeria Monocytogenes Campylobacter

origen mamario: Streptococcus F, S. Aureus (toxina Termoresistente)F

ordeñador: S. Aureus, E. Coli Єutensilios y transporte : Flora termoresistente ЄAire: esporulados, microccus, mohos ambiente : L. monocytogenesЄ

personal : S. Aureus, shiguella F Є

Limpieza Bidón: E colimedio Ambiente: L. Monocytogenes salmonellasuelo: Yersenia Є

Tleche= 35ºCpH= 6.3-6.8

Tamb= 20-27ºCt= 8 min

T leche = 33ºCT amb= 14-27t= 20 min

falta de cierre hermético del bidón: S. Aureuspiso del vehículo: E coli, B. Psicrófilas : L. Monocytogenes.

PC

Enfriamient

PseudomonasS. AureusE.coli , salmonella L. monicytogenesYersenia Bacillus Cereus Є

Tleche= 8 ºCt= 5 min

T= 20-30ºCHR= 82-87%

T= 20-30ºCHR= 82%

ProliferacionMuerteSobreviven ContaminacionExógena ЄContaminacion Endógena F

PC

10



DIAGRAMA DE FLUJO TEÓRICO DEL ORDEÑO MECÁNICO

ordeño y utensillosfalta de limpieza accidental: bacterias de crecimiento rápido ( termosensible, facilmente eliminables)falta de limpieza total :máquinas o utensilios mal lavados y mal secados : microflora psicrófila y enterobacteriaslisteria monocytognes, S. Aureus, E.coli, salmonella

Debe mantenerse refrigeradat<7ºCsolo creseran PsicrofilasL. monocytogenes Bacillus

desinfeccion de equipos con agentes desinfectantes (solución clorada con 100-300 ppm/cloro disponible o solución yodada con 25-75 ppm/yodo disponible)

Ordeño

mecánico

Una vez ordeñada la vaca, es importante refrigerar la leche pordebajo de los 4° C, para evitar que los microorganismos quepudiera contener empiecen a degradarla y descomponerla. Para ello, se utilizan tanques enfriadores que cuentan con un agitador, el cual evita que se separe la grasa de la leche o capuchones aislantes cuando se deposita en tinas

Enfriamient

Durante el transporte deberá mantenerse la cadena de frío, y a la llegada al establecimiento de destino, , la temperatura de la leche no deberá superar los 10°C

Recolección

y Filtración

Transporte

Adecuado

La leche recogida debe filtrarsela recolección debe hacerseen un ambiente limpio .Es importante una buena higiene de las canteras o recipientes por medio de agentes desinfectantes.(Cloro 25 ppm, 23-37 ºC)

La flora microbiana de esta fuente puede ser diversa, pero la mas frecuente es la flora termoresistente, razón mas que suficiente para exigir al máximo la higiene.microflora Psícrofila , enterobacterias

E.coli, Salmonella , S. Aureussolo creseran Psicrofilas

Bacillus psicrófilos , Listeria monocytogenes Є

inactiva o controlaproliferacionmuertesobreviven contaminacionExógena Єcontaminacion

T=35ºCpH= 6.3-6.8

T= 3-4ºCpH= 6.3-6.6t= < 3h

T=4ºCpH= 6.6-6.6

interior de la ubre stafilococcus exterior de la ubre salmonella Bacillusclostridios; C. butyricummanipuladores: E. coli, Campylobacter. S. Aureus

Ingreso sala

de ordeño

Ganado y alimento para el mismo ( pasto y alimento balanceado).Agua limpia para beber

Preparación

de ubres

La afmosfera de los establos esta siempre cargada de microorganismos precedentes de excrementos, paja y alimentos , los cuales son transportados por el aire. El heno y la paja contaminan la leche con microorganismos esporulados: bacillus y clostridios.los excrementoos son fuente principal de enterobacterias (E.Coli)

*Lavar los pezones con agua caliente que contenga desinfecctante (solución clorada con 100-300 ppm/cloro disponible o solución yodada con 25-75 ppm/yodo disponible) y secarlos individualmente con toallas de papel

T= 20-30ºC

T= 20-30ºC

T=20-30º C

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7.2 Análisis de Riesgo del proceso real de producción primaria de la leche cruda

ETAPA FUENTES DE CONTAMINACIÓN BACTERIAS CONDICIONES

PREPARACIÓN

DE LA VACA

PARA EL

ORDEÑO

Alimentación

de la vaca

EX

ÓG

EN

A Є

La atmósfera de los establos esta

siempre cargada de M.O

precedentes de excrementos, paja y

alimentos, los cuales son

transportados por el aire. Las primeras fuentes de peligros microbiológicos en los piensos son los pastizales contaminados, los forrajes y las harinas proteicas animales y vegetales suministradas directamente a los animales.

El heno y la paja

contaminan la

leche con M.O

Micrococcus y

clostridios.

Aire: Micrococcus,

mohos y levaduras

Salmonella

Brucella(piensos)

T= 14-27º C

Lavado de las

ubres :

Inadecuada higiene del personal:

Agua no contaminada:

E. coli, S. Aureus

Pseudomona Є

ORDEÑO

MECÁNICO

Colocación

de las

pezoneras

EN

DÓ

GE

NA

F

Los microorg. Alcanzan la ubre,

pueden llegar a contaminar la leche

antes o después del ordeño. Estos

pueden alcanzar la leche por vía

mamaria

Mastis: S. Aureus

Via sanguínea :

salmonella,

brucella,

mycobacterium

Tamb=27ºC

HR= 82%

EX

OG

EN

A Є

Pezonera mal lavadas, desinfectadas

y secadas

micrococos y

Enterecocos

microflora

psicrófila y

enterobacterias Utensilios

PC

RECOLECCIÓN

PC

Colocación

de recipientes

EX

OG

EN

A

Є

Recolección en recipientes que nos

son de acero inoxidable

Recipientes mal lavados y

desinfectados

Mesófilos: E. Coli,

L. Monocytogenes

salmonella, S.

Aureus

Tleche= 35ºC

pH= 6.3-6.8

t= 5-10 min

ENFRIAMIENTO Estanques de

agua fría

EX

OG

EN

A Є

Temperatura inadecuada de

enfriamiento; tiempo

Insuficiente de enfriamiento

No existe control de temperatura

B. psicrofilas:

Pseudomonas


L. Monocytogenes

salmonella, S.

Aureus

T= 6-8 ºC

ALMACENAJE

Y

TRANSPORTE

Transporte

inadecuado

PC

EX

OG

EN

A Є

Tiempos largos de espera

Interrupción en la cadena de frío

No existe control de temperatura


L. Monocytogenes

S. Aureus B. Cerus

B. psicrofilas:

Pseudomonas

Tamb: 14- 26ºC

Tleche : 8-16ºC

pH= 6.3-6.8

Supervivencia

Proliferación contaminación endógena F Contaminación exógena Є

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8. MUESTREO

8.1 Tipo De Muestreo

Mediante las comparaciones entre el proceso experimental y el proceso teórico se decidió realizar un muestreo en tres puntos donde hay mayor riesgo de contaminación ya sea propia de la leche o contaminación exógena. Se realizara en los siguientes puntos: Ordeño (Al momento de salir la leche por el conducto de la máquina de ordeño) Equipos y utensilios Transporte

Se determinó realizar el muestreo no probabilístico, selección intencional

8.2 Procedimiento

Ubicación del estudio. El estudio se realizará en la Hacienda “Santa Rita ” ubicado la provincia de

Imbabura, en la ciudad de San Pablo del Lago en el cantón Otavalo, donde se tomaran muestras para

análisis microbiológicos de los diferentes puntos de riesgo proveniente de esta Hacienda.

8.3 Toma De Muestras Para El Análisis Microbiológico

Cuando las muestras de leche o derivados lácteos se destinan a análisis de tipo microbiológicos, es

necesario tomar una serie de precauciones que además de garantizar la obtención de muestras

verdaderamente representativas, eviten la contaminación por fuentes externas y la proliferación de la

carga bacteriana ya presente en los productos.

Entre esas precauciones destacan las siguientes:

a) Todos los equipos empleados en la toma de muestras deben encontrarse estériles y desinfectados

antes de cada recolección. Por ejemplo, para tomar varias muestras de leche cruda puede emplearse un

probador adecuado que se va esterilizando en un baño de agua hirviente (1 minuto) o una solución que

contenga 250 a 500 ppm de cloro residual (“esterilización química”) cuyo exceso se elimina por

enjuague en agua estéril a fin de evitar que el desinfectante contamine el producto, donde actuaría como

inhibidor microbiano.

b) Tomar precauciones para evitar la contaminación externa, incluso de las manos de la persona que

hace la operación.

c) Recolectar porciones representativas (no menos de 150 g) directamente de tanques, recipientes de

transporte o pesada, pero no de envases al por menor, los cuales deben tomarse completos en numero

proporcional al lote.

Plan de muestreo Límite por gr/ml

Parámetro Categoría Clases n c m M

Rcto. Aerobios Mesóf. 3 3 5 1 5x10^5 10^6

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8.4 MÉTODOS ESPECÍFICO DE ANÁLISIS

8.4.1 MÈTODOS GENERALES

En este caso se utilizó las técnicas certificadas por los organismos de la AOAC y normas ISO, las cuales ofrecen resultados confiables en el aislamiento e identificación de las bacterias en estudio.

8.4.2 MÉTODOS ESPECÍFICOS

8.4.2.1 Análisis Microbiológico cualitativo y Análisis Microbiológico cuantitativo

Bacteria Código de la técnica

Justificación

Staphylococcus Aureus ISO Determinación selectiva y cuantitativa de

Staphylococcus Aureus

Escherichia Coli Método oficial de la AOAC 998.08

Método para determinar E.

coli en los alimentos por el método petrifilm

Determinación cuantitativa y cualitativa

Escherichia Coli por medios selectivos

Salmonella AOAC Método altamente selectivo para aislar e

identificar presencia o ausencia de Salmonella.

Listeria Monocytogenes USDA-FSIS ISO 11290

La composición de los medios es selectiva

para aislar Listeria

Medio de Cultivo M.O Justificación Colonias

Agar Baird-Parker Estafilococo Aureus

Contiene Cloruro de litio y Telurito para la inhibición de la flora

acompañante en tanto que el Piruvato y la Glicocola

actúan favorecienndo selectivamente el crecimiento

Negras, lustrosas convexas. Dentro del

halo claro presencia de anillos opacos

no visibles antes de las 48 horas de incubación.

BHI Estafilococo Aureus

Es especialmente adecuado para el cultivo es Estafilococos, su

composición es D(+)Glucosa, Cloruro Sódico, Hidrogeno Fosfato disódico

TSB Listeria Monocytogenes

Adecuado para cultivos exigentes, exentos de sustancias

inhibidoras e indicadoras.

Agar PALCAM (Agar Selectivo para

Listeria)

Listeria Monocytogenes

Medio altamente selectivo y diferencial. La selectividad del medio se debe a las sustancias inhibidoras del crecimiento,

tales como Polimixina B-sulfato, Acriflavian, cloruro delitio y

Ceftacidina.

Crecen formando colonia de color verde grisáceo con un halo

marrón-negro.

Salmonella Enriquecimiento Este medio tiene una mayor selectividad que otros medios, considerándose mayor

rendimiento en Salmonella

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9. FACTIBILIDAD

10. CRONOGRAMA

MÉTODO OFICIAL MEDIOS Y REACTIVOS DISPONIBILIDAD

ISO AGAR BAIR PARKER

AGAR BHI si

Método oficial de la AOAC 998.08 Método

para determinar E. coli en los alimentos por

el método petrifilm

AGUA DE PEPTONA

PETRIFILM si

AOAC

Caldo lactosado

Tetrationato de miuller

Rappaport Vassidialis

Bismuto sulfito

XLD agar

Hektoen Entérico

SI

AOAC TSB

OXFORD

SI

MUESTRA MICROORANISMOS MEDIO FASE TÉCNICA (Días)

Ordeño mecánico

E. COLI

Agua de peptona

Enriquecimiento

AOAC

LUNE

Ordeñadores Petrifilm Aislamiento MARTES

transporte Identificación MIERCOLES

JUEVES

Ordeño

S. AUREUS

Agua de Peptona

Preenriquecimiento

ISO

LUNES

Ordeñadores Agua de Peptona

Enriquecimiento MARTES

Transporte

Baird Parker

Aislamiento MIERCOLES

BHI Identificación JUEVES

Coagulasa

Catalasa

Ordeño mecánico

L. MONOCYTOGENES

TSB Preenriquecimiento

ISO

LUNES

Equipos y utensilios

EB/ Enriquecimiento MARTES

PALCAM Aislamiento MIERCOLES

OXFORD Identificación JUEVES

Ordeño

salmonella

Caldo

lactosado Preenrequcimiento

AOAC

Lunes

Tetrationato

de miuller

Enrequecimiento Martes

Ordeñadores

Rappaport

Vassidialis

Enriquecimiento Selectivo

Miércoles

Selectivo y diferencial

Jueves

Equipos XLD agar Identificación Lunes

Hektoen Entérico

Aislamiento selectivo

Martes

Enriquecimiento

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11. BIBLIOGRAFÍA

MICROBIOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS, Fundamentos ecológicos para garantizar y

comprobar la inocuidad y la calidad de los alimentos, D.A.A. MOSSEL, editorial ACRIBIA, S.A,

ZARAGOZA(España), primera edición.

PROGRAMA DE SALUD PUBLICA VETERINARIA, “Guía para el establecimiento de

sistemas de vigilancia epidemiológica de enfermedades transmitidas por alimentos (VETA) y la

investigación de brotes de toxi-infecciones alimentarias”, INPPAZ,Pág. 16, 20,26, 27.

ROBINSON. R.K, “Microbiologia Lactologíca“Vol 2, Pág 151-217

FOSTER, NELSON, “Microbiologia de la leche“ Pág 120 -151

SPEER EDGAR, LACTOLOGIA INDUSTRIAL editorial ACRIBIA, S.A, Pág 25-74

Dr. SANCHEZ, Carlos, “Tratado de Microbiología”, 22ava edición, México DF, Ed

Interamericana, 1991, Pág Capitulo 13,14,15,17,18,19,21.

E:\Microbiologia\clostridium perfringes.htm

E:\Microbiologia\e.coli.htm

E:\Microbiologia\campylobacter spp.htm

E:\Microbiologia\clostridium botulini.htm

E:\Microbiologia\Enfermedades Transmitidas por Alimentos (ETA).htm

E:\Microbiologia\ETA.htm

E:\Microbiologia\Listeria.htm

E:\Microbiologia\salmonella spp.htm

E:\Microbiologia\stafylococus aureus.htm

http://www.tecnologiadelqueso.com/noticias/20010.php

http://www.unavarra.es/genmic/curso%20microbiologia%20general/notas_de_microbiologia_d

e_los_al.htm

http://cvu.rediris.es/pub/bscw.cgi/d311175-1/*/Normicro/ISO

MICROORGANISMS IN FOODS 2 Sampling fo microbiologica analysis:Principles and specific

applications, ICMSF Blackwell Scientific Publications

(*) INEC (http://www.inec.gov.ec/)

http://cvu.rediris.es/pub/bscw.cgi/d311175-1/*/Normicro/ISO

16



12. ANEXOS

Norma Argentina Requisitos microbiológicos de la leche cruda

Microorganismos Criterios de Aceptación

Categoría ICMSF (1)

Coliformes, NMP/g (a 30°C)

n=5; c=2; m=100; M=5000

5

Coliformes, NMP/g (a 45°C)

n=5; c=2; m=10; M=500

5

Estafilococos coagulasa (+), UFC /g

n=5; c=2; m=10; M=1000

5

Salmonella spp, UFC/25 g n=5; c=0; m=0 10

Listeria monocytogenes, UFC /25g

n=5; c=0; m=0 10

Lista de patógenos que se encuentra en la leche cruda

BBaacctteerriiaass AAlliimmeennttooss iimmpplliiccaaddooss

FFaaccttoorreess ddee ccrreecciimmiieennttoo CCaarraacctteerrííssttiiccaa EEnn ddoonnddee ssee eennccuueennttrraann

EEsscchheerriicchhiiaa CCoollii

AAlliimmeennttooss ccrruuddooss,, lleecchhee ssiinn pprroocceessaarr yy ddeerriivvaaddooss,, hhuueevvooss

ppoollllooss ffrruuttaass

AAnnaaeerroobbiioo ffaaccuullttaattiivvoo TT== 77ººCC--5500ººCC tt ooppttiimmaa== 3377ººCC ppHH== 66..99--77..44 AAWW== 00..9955--11

AAnnaaeerroobbiioo ffaaccuullttaattiivvoo bbaacctteerriiaa eennddóóggeennaa yy eexxóóggeennaa

HHeecceess ddee aanniimmaalleess,, hhoommbbrree

SSttaapphhyyllooccooccccuuss AAuurreeuuss

CCrreeccee eenn ccoommiiddaass,, lláácctteeooss

PPrroodduucceenn eenntteerroo ttooxxiinnaass..

HHaabbiittuuaall eenn lleecchhee nnoo ppaasstteerriizzaaddaa

AAnnaaeerroobbiioo ffaaccuullttaattiivvoo TT== 1100--3355--4477 ººCC TT ooppttiimmaa == 4400ººCC PP.. ttooxxiinnaa TT== 2255--3377--4400ººCC ppHH== 44,,55--77--99,,44 PP ttooxxiinnaa ppHH== 55,,55--77--99 AAww== >>00,,8866 –– 00,,9900 ttooxxiinnaa AAeerroobbiioossiiss RReessiisstteenntteess aall 1100 %%

TTooxxiinnaass tteerrmmoo--rreessiisstteennttee 3300mmiinn-------- 110000ººCC MMeeddiiddaass ddee ccoonnttrrooll ddee llaa tteemmppeerraattuurraa DDee ccoonnsseerrvvaacciióónn ppoosstt ttrraattaammiieennttoo ,, hhiiggiieennee eenn mmaanniippuullaacciióónn

CCoommeennssaall :: ddee ppiieell yy mmuuccoossaa FFoossaass nnaassaalleess ,, hheerriiddaass PPoorrttaaddoorr.. MMaanniippuullaaddoorr ccoonnttaammiinnaacciióónn ccrruuzzaaddaa

SSaallmmoonneellllaa

FFuueenntteess ffeeccaalleess ::

ccoonnttaammiinnaacciióónn lleecchhee yy pprroodduuccttooss lláácctteeooss

AAlliimmeennttooss ffeerrmmeennttaaddooss

AAeerroobbiioo ffaaccuullttaattiivvoo MMeessóóffiilloo TT== 4455ººCC TToolleerraannttee aall ffrriioo ((44--55ººCC)) nnoo ccrreecceenn ccoonnggeellaacciióónn AAww== 00..9933 EEhh== aaeerroobbiiooss ffaaccuullttaattiivvooss PPooccoo rreessiisstteennttee aa aaggeenntteess ccuurraaddoo ((55..88%%))

DDeessttrruuiiddooss ttrraattaammiieennttoo ttéérrmmiiccoo 2277 mmiinn ---------- 6600ººCC NNoo rreessiisstteenntteess aall ccaalloorr

HHoommbbrree,, aanniimmaalleess,, CCoonnttaammiinnaacciióónn eexxóóggeennaa yy eennddóóggeennaa

LLiisstteerriiaa MMoonnooccyyttooggeenneess

PPrroodduuccttooss ffrreessccooss,, lleecchhee yy ssuuss ddeerriivvaaddooss

AAnnaaeerroobbiioo ffaaccuullttaattiivvoo TT ooppttiimmaa == 3300--3377ºº CC tt mmiinn== 44ººCC ppHH== 66 rreessiissttee bbaajjoo ppHH AAcciiddoo ttoolleerraannttee ttoolleerraa %% ssaalliinnaass CCrriioo ttoolleerraannttee

SSeennssiibbllee aa ccaalloorr AAvveess,, hhoommbbrree,,

ssuueelloo

17



Método de ensayo cualitativo para determinar E.Coli por el método Petrifilm de contaje en placa

Incubar por 24 1 h a 35ºC

18



Método de ensayo cualitativo para determinar Salmonella

Transferir 0,1 mL de la mezcla

Caldo de lactosa o TSB

25 g muestra

-255 mL de caldo para muestra no pulverizada -225 mL de caldo para muestra pulverizada (15mL agitar y agregar

en porciones: 10, 10, 190 agitar

para no formar grumos

- Agitar la mezcla y taparla

- Dejar al ambiente por 605 min - Determinar el pH y ajustarlo a

6,80,2 - Incubar con la tapa sobrepuesta

por 242 h a 35ºC

PRE-ENRIQUECIMIENTO

ENRIQUECIMIENTO Transferir 1 mL de la mezcla

Incubar por 242 h

a 42ºC0,2ºC 10mL de RV

10mL de TT

Agar previamente preparado y repartido en cada caja 20 mL

Incubar: - Alimentos con alta carga

microbiana 242 h a 42ºC0,2ºC - Alimentos con baja carga

microbiana 242 h a 35ºC2ºC

- Sembrar de cada tubo a una de las cajas que contiene diferente agar usando la técnica de estriado.

Incubar todas las cajas por 242 h a

35ºC

- Tomar colonias de las cajas de 24 h y sembrar para pruebas. - Reincubar las cajas de 24 h por 24 h más a 35ºC Cajas con presencia de colonias de Salmonella

RESULTADO POSITIVO

Pruebas de identificación y serotipificación

- Sembrar por picada y arrastre

- Incubar por 242 h a 35ºC

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Método de ensayo cuantitativo para determinar Staphylococcus Aureus

Técnica de Aislamiento y

numeración en superficie de agar

para S. Aureus

De cada plato de dilución transferir 1mL

de suspensión de prueba de 3 cajas con

agar Baird-Parker; repartir ese volumen

entre 3 cajas (Ej. 0.4, 0.4, 0.3 mL)

Esparcir el inóculo sobre el agar

con una asa de digralsky, evitando

los filos del plato.

Mantener los platos en posición vertical

(=10 min) hasta que el inóculo sea

absorbido por el agar. Si el inóculo no se

absorbe con facilidad se pone en el

incubador por 1 hora en posición vertical

Invertir las cajas e incubar de

45-48 horas a 35-37ºC

Seleccionar las cajas que tienen de 20-200

colonias, y las cajas de las diluciones bajas

que tienen (>200 colonias) que tengan

colonias típicas de S.Aureus

Si algunos tipos de colonias son observados

con apariencia de S.Aureus (cajas con >200 y

<20 colonias), contar el número de colonias

de cada tipo y registrar las cuentas

separadamente

Seleccione una colonia de cada tipo y

hacer la prueba de producción de

coagulasa

Sumar las colonias de S.Aureus de las 3

cajas y multiplicar por el factor de

dilución

Reportar este número como número de

S.Aureus / g de alimento analizado

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ANÁLISIS DE RIESGO DE COTAMINACIÓN POR PATÓGENOS EN EL PROCESO PRIMARIO DE LECHE CRUDA.UCE-FCQ