Análisis Microbiológico de Alimentos

25/08/2015

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Anlisis microbiolgico de alimentos

Mara Marcela Martnez Miranda

M.Sc Microbiologa

Docente Dpto. Ingeniera

Universidad de Caldas

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Muestreo

Es la operacin que consiste en separar un nmero

determinado de muestras de un lote, remesa, partida, etc. con

el fin de obtener unos resultados analticos fiables.

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Objetivos del muestreo

Detectar la presencia de microorganismos patgenos.

Evaluar el cumplimiento de las normas microbiolgicas.

Conocer la vida til del producto.

Conocer el estado higinico de la industria, ambiente, equipos, manipuladores, etc.

Investigar brotes alimentarios.3

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Condiciones de la muestra

Debe ser representativa del lote.

No debe sufrir dao o transformacin durante el transporte y almacenamiento.

Debe protegerse de contaminaciones externas ocasionadas por el aire, el recipiente de muestreo, los equipos de toma de muestra o por una incorrecta manipulacin.

Debera (siempre que sea posible) enviarse al laboratorio en su recipiente original, sin abrir.

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Si el producto es voluminoso, se transfiere en condiciones aspticas, una porcin en un recipiente estril.

El recipiente no debera llenarse en ms de de su capacidad para evitar posibles vertidos y favorecer el mezclado en el laboratorio.

Utensilios para el muestreo: cucharas, sacabocados, esptulas, taladros, cuchillos, pipetas, siempre estriles y escogidos de acuerdo a la naturaleza del alimento.

Condiciones para el muestreo

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Esterilizacin de los elementos para el muestreo

En autoclave a 121C durante 15 minutos, especialmente para los materiales que no soporten el calor seco.

En estufa a 160-180C durante 2 horas. Alternativamente se pueden utilizar los siguientes mtodos, teniendo en cuenta que no eliminan todas las esporas:

Inmersin del utensilio en alcohol etlico al 95% y posterior flameado.

Inmersin en una solucin de hipoclorito de sodio de 50 ppm de cloro libre durante al menos 30 segundos.

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Pasos para el muestreo

1. Seleccin de la muestra

2. Toma de la muestra

3. Conservacin y transporte de muestra

4. Recepcin de la muestra en el LMA 7

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Definiciones importantesLote

Muestra

Unidad de muestreo

Unidad analtica

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Plan de muestreo

P.M. Atributos

Dos clases

Tres clases

P.M. Variables

Extraccin de muestra, anlisis y toma de decisiones

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Plan de muestreo de 2 clases

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Anlisis cualitativos

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Plan de muestreo de 3 clases

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Anlisis cuantitativos

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Tamao de la muestra

Ms de 10.000 unidades del lote.

MIL STD

105D

501- 10.000 unidades

1% del lote

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Representativa y aleatoria

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Resolucin Mercosur 74/93

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Tamao muestra para alimentos pre-envasados

Codex Alimentarius

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Recoleccin de muestras

Lavado de manos

Indumentaria adecuada

Alimentos envasados: empaque original, aleatoria, asptica, toma de cantidad

representativa

Productos envasados en grandes envases: abrirlos y extraer la

muestra en condiciones aspticas

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Los alimentos expuestos al aire mismo y a otros contaminantes: no

requieren precauciones estrictamente aspticas.

Alimentos preparados sin envasar de consumo inmediato: la persona que elabora los alimentos introduce la

muestra en los recipientes estriles con los utensilios que usa

normalmente para servir los alimentos.

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En caso de alimentos lquidos y semilquidos:

agitar o mezclar hasta conseguir homogenizar y despus efectuar la toma de muestra en diferentes

niveles.

Cuando la toma de muestra se realice en un conducto de salida o una

compuerta de una partida a granel, antes de obtener la muestra se deben dejar

pasar las primeras fracciones del producto para limpiar dicha salida

con el flujo.

En productos a granel: tomar la muestra de varios

puntos del contenedor para obtener una muestra

representativa.

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La muestra debe ser identificada de manera clara y

completa con la siguiente informacin mnima:

Naturaleza del alimento.

No. de lote.

Fecha de vencimiento.

Peso de la muestra.

Fecha, lugar y hora del muestreo.

Razones del muestreo.

T del producto en el momento del muestreo.

Identificacin de la muestra

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Transporte de la muestra

No debe utilizase hielo suelto para

evitar contaminaciones.

Debe asegurar que se minimice la alteracin en el nmero de microorganismos presentes.

La muestra se enva al laboratorio con prontitud, manteniendo dentro de lo posible, las condiciones de almacenamiento originales.

Debe empaquetarse de forma que se eviten roturas o derrames.

Las muestras que necesitan refrigeracin o congelacin deben transportarse en contenedores aislantes, con refrigerantes o hielo seco, a fin de mantener las temperaturas de transporte respectivas.

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Temperaturas de transporterecomendadas

Productos estables: temperatura ambiente

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10-510-410-310-210-1

10 ml

Muestras slidas

Solucin madre:

1/10 de alimento

en Diluyente

Muestras lquidas

10-510-410-310-210-1

10 ml

Solucin madre:

1/10 de alimento

en Diluyente

Preparacin de diluciones

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Mtodos de recuento y deteccin de microorganismos en la industria

alimentaria

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Mtodos microbiolgicos

1. Mtodos cualitativos

Mtodos convencionales

Mtodos rpidos

2. Mtodos cuantitativos

Mtodos rpidos

Filtracin por membrana

Numero Ms Probable (NMP)

Recuento en placaa. Por profundidad

b. Por superficie 27

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Mtodos cualitativos

Estn diseados para determinar si una muestra de alimentos contiene o no una especie microbiana especfica.

Mtodos convencionales

Mtodos rpidos

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Microorganismos a detectar

Salmonella spp.

Listeria monocytogenes

E. coli O157:H7

Vibro cholerae

Clostridium botulinum

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Mtodo convencional

1. Enriquecimiento previo NO selectivo

Reparar clulas lesionadas o estresadas y proliferen hasta una cantidad medible.

2. Enriquecimiento selectivo

Proliferacin del patgeno especfico y multiplicacin abundante.

3. Diferenciacin

Desarrollo de colonias caractersticas del patgeno en medios selectivos-diferenciales

Identificacin

Realizacin de pruebas bioqumicas y serolgicas.

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Mtodos rpidos

Detectar patgenos.

Cargas bacterianas.

Toxinas.

Verificar los controles del proceso de manufactura.

Vigilar las prcticas de limpieza y desinfeccin utilizadas en cada planta. 32

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1. Rehidratar el medio con agua estril. 2. Aadir 25 g de la muestra e incubar por

8-20 h.3. Transferir 2 mL de la muestra a un tubo

de ensayo.

4. Calentar por 10 minutos.5. Enfriar la muestra y agregar 5 gotas a la

paleta.6. Leer el resultado.

2 3

4 5 6

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Ventajas Son rpidos.

Sensibles.

Especficos.

Requieren menos trabajo.

Entrega oportuna de desviaciones de proceso.

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Mtodos cuantitativos


Numero ms probable

Recuento en placa Mar

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1. Filtrar un volumen determinado de la muestra de agua a analizar a travs de una membrana de 0,45m

2. Incubar en placas con medios de cultivo selectivos.

3. Realizar el recuento.

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Paso 1:En condiciones aspticas, se utiliza un filtro de membrana

de 0,45 m de tamao de poro que se coloca en el portafiltros de la rampa de filtracin de vaco.

Mtodo Filtracin por Membrana

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Paso 2:Se coloca el embudo del filtro previamente esterilizado.


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Paso 3:Se inicia la filtracin de los 100 mL de agua.


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Paso 4:Una vez finalizado, se recoge el filtro con unas pinzas estriles y se coloca en medios de cultivo selectivos.


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Paso 5:Se incuban a la temperatura y tiempo indicados segn el

microorganismo y se hace el recuento.


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Nmero ms probable (NMP)

Determina la presencia/ausencia de un atributo especfico del m.o. en rplicas obtenidas por diluciones consecutivas.

Una sola clula viva puede desarrollarse y producir un cultivo turbio.

Al aumentar el factor de dilucin, algunos tubos contendrn tan slo un microorganismo y otros tubos no contendrn ninguno.

Al calcular la probabilidad de que los tubos no hayan recibido ninguna clula, se puede estimar el NMP de m.o. presentes en la muestra original, a partir de una tabla estadstica.

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Realizar dilucioneshasta 10-3

10-1

10-2

10-3

1 2 3 4 5

1 2 3 4 5

1 2 3 4 5

10-1

10-2

10-3

1 ml

1 ml

1 ml

Muestra

Sembrar cada dilucin por quintuplicado

Procedimiento NMP de coliformes

Crecimiento y formacin de gas No crecimiento ni formacin de gas

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Tabla de NMP

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Recuento en placa

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Es un mtodo de recuento de clulas viables (aquella capaz de dividirse y originar descendencia).

En la mayora de los casos se hacen diluciones de la muestra antes de la siembra.

Se cuentan las clulas capaces de formar colonias cuando se inoculan en un medio de cultivo slido luego de un periodo de incubacin.

El resultado se expresa como UFC/ml.

Mtodos de siembra

Superficie Profundidad

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Se inocula 0,1 ml de la muestra sobre la placa de agar y se extiende con una asa.

Se mezcla 1 ml de la muestra con el medio de cultivo fundido y se deja solidificar.

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Gua general para el recuento de microorganismos

ISO

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Recuento en medio slido: Cuntas placas se deben sembrar?

-1 placa por dilucin para un mnimo de dos diluciones consecutivas si el laboratorio trabaja bajo un sistema de garanta de calidad (ISO 17025)

- Si se realiza una sola dilucin o el laboratorio no trabaja bajo un sistema de garanta de calidad, deben sembrarse 2 placas

10-1 10-2

10-1 10-2

Ensayo cuantitativo

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Generalidades:

Inoculacin de una placa de Petri de 90 mm por cada dilucin.

Recuento mximo de colonias totales presentes: 300 por placa.

Recuento mximo de colonias tpicas o sospechosas: 150 por placa.

Nmero de colonias sospechosas inoculadas para su identificacin de cada placa escogida: 5

Estas cifras se definen en las normas especficas

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N = C

V (n1 + 0,1n2)d

Donde:

C es la suma de las colonias contadas en todas las placasescogidas de dos diluciones sucesivas, en las que al menos unacontiene 15 colonias.

V es el volumen del inculo aplicado a cada placa, en mililitros;

n1 es el nmero de placas escogidas en la primera dilucin;

n2 es el nmero de placas escogidas en la segunda dilucin;

d es la dilucin correspondiente a la primera dilucin escogida.

Mtodo de clculo: caso general

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1 mL

Ejemplo:

Esquema de siembra para muestra lquida

Siembra directa100 10-1 10-2 10-3 10-4

232, 244 33, 28 1, 31800, 1722Incontables

Se deben escoger para el recuento las placas 300 y 10 colonias

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Aplicando la frmula:

N = C = 232+244+33+28 = 537 = 24.409

V (n1 + 0,1n2)d 1 (2+0,1x2) x 102 0,022

El conteo del producto lquido da los siguientes resultado:

En la primera dilucin escogida (10-2): 232 y 244 colonias

En la segunda dilucin escogida (10-3): 33 y 28 colonias

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Los resultados se redondean a dos cifras significativas.

Si la tercera cifra es inferior a 5, no se modifica la cifraanterior; si es 5 o ms, la cifra anterior se incrementa en unaunidad.

24.409 24.000

Se toma como resultado el nmero de microorganismos pormililitro (productos lquidos) o por gramos (productosslidos), expresados como un nmero entre 1,0 y 9,9multiplicado por la potencia de 10 adecuada o un nmeroentero con dos cifras significativas.

2,4 x 104 24.000 UFC/mL55

Mtodo de clculo: despus de la identificacin

Cuando el mtodo requiere identificacin, se identifican unnmero A de colonias sospechosas de cada placa escogida parael recuento. Tras la identificacin, se calcula el n de colonias decada placa, a, que cumple con los criterios de identificacin conla siguiente frmula:

a = b x CA

b es el n de colonias que cumplen con los criterios deidentificacin dentro de las colonias identificadas A.

C es el n total de colonias sospechosas contadas en cada placa.

El nmero de microorganismos identificados se calculareemplazando C por a en la frmula. 56

El recuento da los siguientes resultado:

- en la primera dilucin escogida (10-3): 66 colonias;

- en la segunda dilucin escogida (10-4): 4 colonias.

Realizamos la identificacin de las colonias:

- De las 66 colonias, se identificaron 8 (A) de las cuales 6 (b) cumplieron con los criterios

a = b x C 6 x 66 a = 50

A 8

- De las 4 colonias, las 4 cumplieron con los criterios, a = 4

Aplicando la frmula:

N = a = 50 + 4 = 54 = 49.0 90

V x 1,1 x d 1 x 1,1 x 10 3 0,011

El resultado se informa 4,9 x 104 49.000 UFC/ g mL

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Mtodo de clculo: recuento bajo

Si la placa contiene < 10 colonias, pero como mnimo 4, el resultado se calcula siguiendo el caso general y se expresa como:

Nmero estimado de microorganismos / g mL

Si el recuento oscila entre 1 y 3, la precisin del anlisis es demasiado baja y el resultado debe expresarse como:

Hay microorganismos presentes, pero a un nivel inferior a 4 x 1/d (dilucin) / g mL

Si la dilucin inoculada es 10-1: Hay microorganismos presentes, pero a un nivel inferior 40 UFC/g mL

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Caso en que la placa no contiene colonias

Si la placa de siembra directa para productos lquidos o la suspensin inicial para productos slidos, o la primera dilucin inoculada no contiene colonias, el resultado se expresa:

Menor de 1/d / g mL

Donde d es la dilucin de la suspensin inicial o la primera dilucin inoculada.

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100 10-1 10-2 10-3

Menos de 1 por mililitro (productos lquidos) < 1 UFC/mL

Menos de 1/d por gramo (productos slidos)

En donde d es la dilucin de la suspensin inicial.

Si la dilucin inicial es 10-1 : < 10 UFC/g

Sin Desarrollo

Sin Desarrollo

Sin Desarrollo

Sin Desarrollo

Siembra directa

Ejemplo 1 : Lquidos Slidos

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10-2 10-5

Sin Desarrollo

Sin Desarrollo

Sin Desarrollo

Sin Desarrollo

10-410-3

Menos de 1/d . En donde d es la primera dilucin inoculada.

En este ejemplo donde la primera dilucin inoculada es 10-2

El resultado es < 100 UFC/g si es un producto slido o

< 100 UFC/mL si es un producto lquido.

Ejemplo 2

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Ejemplo 3: Recuentos superior a 300 colonias

Si el recuento de las colonias en todas las placas de todas las diluciones es mayor de 300 el resultado se expresa:

Ms de microorganismos / g mL

Donde es la dilucin correspondiente a la ltima dilucin escogida

Ejemplo: Si la ltima dilucin (ms diluida) sembrada fue 10-3 el resultado se expresa como:

Ms de 300.000 microorganismos/ mL o g

d/300

d

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Nunca informar !!!

Cero (0)

Sin Desarrollo

No se observa desarrollo63

Ensayos cualitativos

Un mtodo de deteccin es el que determina la presencia o ausencia de microorganismos

en una cantidad dada de producto

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Si el microorganismo buscado ha sido detectado, se informa el resultado de la siguiente manera:

Presencia en X ml analizados (productos lquidos) o X g ( productos slidos)

Si el microorganismo buscado no ha sido detectado,se informa el resultado de la siguiente manera:

Ausencia en X ml analizados (productos lquidos) o X g (productos slidos)

Bajo ninguna circunstancia se generaliza a cantidades mayores de producto 65

Los resultados deben ser informados en forma exacta, clara, no ambigua y objetiva

Informe de resultados

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Debe incluir:- Ttulo: Informe de Ensayo.

- Nombre y Direccin del Laboratorio.

- Identificacin nica del Informe y Paginado.

- Nombre y Direccin del cliente.

- Identificacin del Mtodo utilizado.

- Descripcin, condicin e identificacin exacta de la muestra.

- Fecha de recepcin y fecha de ejecucin del ensayo.

- Referencia al plan y procedimiento de muestreo (si corresponde).

- Los resultados con sus unidades de medida.

- Nombre, funcin y firma de los responsables.

- Declaracin que los resultados slo estn relacionados con la muestra ensayada.

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Solo una cosa vuelve a un sueo imposible: el miedo a fracasar

Paulo Coelho

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Análisis Microbiológico de Alimentos