ANALISIS OLIGOSAKARIDA HASIL HIDROLISIS PATI … · Perkenalan Kampus Mahasiswa Baru (MPKMB), tahun 2010 sebagai divisi acara ... baca puisi tingkat nasional dan tulisan-tulisan fiksinya

ANALISIS OLIGOSAKARIDA HASIL HIDROLISIS PATI

KENTANG HITAM (Culeus tuberosus) OLEH ENZIM

AMILASE DARI Brevibacterium sp.

TITI ROHMAYANTI

DEPARTEMEN BIOKIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2013

ABSTRAK

TITI ROHMAYANTI. Analisis Oligosakarida Hasil Hidrolisis Pati Kentang

Hitam (Culeus tuberosus) oleh Enzim Amilase dari Brevibacterium sp. Dibimbing

oleh ANNA P. ROSWIEM dan YOPI

Oligosakarida merupakan kelompok penting dari makromolekul

karbohidrat yang disusun 2 sampai 20 unit sakarida. Oligosakarida memiliki

banyak manfaat di bidang pangan dan kesehatan. Salah satu bahan utama untuk

produksi oligosakarida secara enzimatis adalah pati. Kentang hitam mengandung

karbohidrat tinggi terutama pati sekitar 83%. Untuk mendapatkan oligosakarida

dari pati kentang hitam, digunakan enzim amilase yang diproduksi oleh

Brevibacterium sp. Produksi ekstrak kasar enzim amilase dari Brevibacterium sp.

menghasilkan aktivitas enzim sebesar 3.25 U/mL. Pati kentang hitam hasil

hidrolisis memiliki nilai gula reduksi sebesar 7482.500 ppm, setelah dilakukan

freeze dry gula reduksi sebesar 9647.500 ppm, dan setelah dipekatkan dengan

vacuum evaporator kandungan gula reduksinya sebesar 14908.300 ppm. Analisis

HPLC terhadap hasil hidrolisis pati kentang hitam menunjukkan adanya senyawa

oligosakarida maltosa, maltotriosa, dan maltopentosa. Sampel yang diberi

perlakuan freeze dry dan evaporasi menghasilkan nilai gula reduksi dan

konsentrasi oligosakarida yang lebih tinggi serta kromatogram HPLC dengan

puncak yang lebih tajam sehingga sampel tersebut memiiki kualitas oligosakarida

yang lebih baik dibandingkan sampel segar tanpa perlakuan.

ABSTRACT

TITI ROHMAYANTI. Analysis of Oligosaccharide from Hydrolysis The Black

Potato Starch (Culeus tuberosus) by Amylase Enzyme from Brevibacterium sp.

Supervised by ANNA P. ROSWIEM and YOPI.

Oligosaccharide is an important group of carbohydrate macromolecul

composed of 2 to 20 saccharide units. Oligosaccharide has many benefits in the

field of food and health. Starch is one of the source origin material for

oligosaccharide production by enzimatic process. Black potatoes contain high

carbohydrates especially starch of about 83%. To obtain oligosaccharide from

black potato starch can be hidrolyzed using amylase enzymes which are produced

by Brevibacterium sp. Crude extracts amylase enzyme production from

Brevibacterium sp. producing enzyme activity of 3.25 U/mL. Black potato starch

hydrolysis results a value of reducing sugar of 7482.500 ppm, after freeze drying

a value of reducing sugar was 9647.500 ppm, and after concentrated by vacuum

evaporator the value of reducing sugar was 14908.300 ppm. The results of HPLC

analysis of black potato starch hydrolysis showed that there are oligosaccharide

compound such as maltose, maltotriose, and maltopentose. The samples were

given preferential treatment freeze dry and evaporation produce reducing sugar

value and concentration of the oligosaccharide better than the fresh samples

without treatment. The identification result of oligosaccharide obtained by HPLC

shows that freeze drying and evaporating samples has a higher concentration and

better peak and sharp.

ANALISIS OLIGOSAKARIDA HASIL HIDROLISIS PATI

KENTANG HITAM (Culeus tuberosus) OLEH ENZIM

AMILASE DARI Brevibacterium sp.

TITI ROHMAYANTI

Skripsi

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Sarjana Sains pada

Departemen Biokimia

DEPARTEMEN BIOKIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2013

Judul : Analisis Oligosakarida Hasil Hidrolisis Pati Kentang Hitam (Culeus

tuberosus) oleh Enzim Amilase dari Brevibacterium sp.

Nama : Titi Rohmayanti

NIM : G84080034

Disetujui

Komisi Pembimbing

Dr. Anna P. Roswiem, MS.

Ketua

Dr. Yopi

Anggota

Diketahui

Dr. I Made Artika M.App.Sc.

Ketua Depertemen Biokimia

Tanggal Lulus:

PRAKATA

Puji syukur penulis ucapkan kehadirat Allah SWT. yang telah

melimpahkan berkah, rahmat, dan ridho-Nya sehingga penulis dapat

menyelesaikan penelitian untuk memenuhi tugas akhir pada program mayor

Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian

Bogor. Penelitian ini berjudul Analisis Oligosakarida Hasil Hidrolisis Pati

Kentang Hitam (Culeus tuberosus) oleh Enzim Amilase dari Brevibacterium sp.

Kegiatan ini didanai oleh Projek DIPAN PN LIPI 2012 dan dilakukan di

Laboratorium Biokatalis dan Fermentasi LIPI Cibinong, Bogor dari bulan Juni

hingga November 2012.

Penulis mengucapkan terima kasih kepada semua pihak yang telah

memberikan dukungan selama proses penulisan penelitian ini. Ucapan terima

kasih penulis sampaikan terutama kepada Dr. Anna P. Roswiem, MS. selaku

pembimbing utama dan Dr. Yopi selaku pembimbing kedua yang telah

memberikan saran, kritik, dan bimbingannya. Ucapan terima kasih penulis

sampaikan kepada keluarga tercinta Ayah, Ibu, teh Yani, teh Nisa, dan Mia.

Terima kasih juga untuk segenap tim di LIPI Cibinong Mba Nanik, Mba Ade,

Mba Lia, Mas Alex, Mas Dicki, Pak Awan, Rohanah, dan Sari. Teman-teman

Biokimia angkatan 45 Ines, Osa, Nisa. Teman-teman Al Hurriyyah Tika, Leli,

Arni, Edy, Abas dan teman-teman Al Iffah Filda, Dania, Riska, dan semua yang

tidak bisa disebutkan satu persatu.

Penelitian ini tentu tidak terlepas dari kekurangan. Karena itu penulis

sangat mengharapkan adanya saran dan kritik yang bermanfaat bagi penulis di

masa yang akan datang. Semoga penelitian ini dapat memberikan manfaat.

Bogor, Februari 2013

Titi Rohmayanti

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Serang pada tanggal 6 Oktober 1990 dari Bapak

Muhammad Yamin, SE. dan Ibu Siti Rohimah, S.Pd. Penulis merupakan anak

ketiga dari empat bersaudara. Tahun 2008 penulis lulus dari SMA Negeri 1

Kramatwatu, Serang dan diterima di Institut Pertanian Bogor melalui jalur

Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI). Penulis tercatat sebagai mahasiswa

Departemen Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam pada

tahun 2008.

Selama mengikuti perkuliahan penulis aktif dalam organisasi LDK Al

Hurriyyah di bagian departemen Hubungan Luar (2009-2011) dan sebagai Badan

Pengawas Nasional LDK di Jawa Barat. Penulis juga aktif di UKM Forum for

Scientific Studies (FORCES) pada tahun 2009 dan Dewan Perwakilan Mahasiswa

(DPM) FMIPA (2010). Pada tahun 2012 penulis aktif di departemen Sumber

Daya Manusia LDK Al Hurriyyah. Beberapa kepanitian yang pernah penulis ikuti

diantaranya pada tahun 2009 sebagai Penanggung Jawab Kelompok (PJK) Masa

Perkenalan Kampus Mahasiswa Baru (MPKMB), tahun 2010 sebagai divisi acara

Seminar Pertanian Indonesia, tahun 2011 Bendahara kegiatan Puskomdays

nasional, dan divisi acara Gebyar Inspirasi Muslim Intelek serta di tahun 2012

sebagai Steereing Commetee (SC) acara Salam Islamic Student Center IPB.

Penulis juga aktif mengikut berbagai kompetisi. Pada tahun 2009, penulis

pernah mengikuti ajang Muslimah Teladan se-Nasional dan masuk ke dalam lima

besar. Tahun 2010 dan 2011 penulis pernah menjadi juara kedua lomba cipta dan

baca puisi tingkat nasional dan tulisan-tulisan fiksinya beberapa kali diterbitkan di

majalah Annida dan Kompasiana. Penulis pernah mengikuti dan lolos kompetisi

writing paper “Sustainable Future for Human Security” (SUSTAIN 2011) di

Kyoto, Jepang dan di tahun yang sama penulis juga mengikuti kompetisi writing

paper pada forum “Discussion on Sustainable Women Partnership of Women

Leaders from Asia and Africa” di Duksung Woman University, Korea. Penulis

juga pernah mendapat hibah dana bersaing dari Direktorat Jenderal Pendidikan

Tinggi dalam Program Kreativitas Mahasiswa (PKM) untuk kategori Bidang

Pengabdian Masyarakat pada tahun 2011. Penulis melakukan Praktik Lapangan di

Balai Besar Penelitian Pascapanen Jl. Tentara No 1, Cimanggu Bogor dengan

judul “Studi Analisis Mutu dalam Proses Pembuatan Manisan Kering Buah

Rambutan”.

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR GAMBAR ......................................................................................... ix

DAFTAR LAMPIRAN ...................................................................................... ix

PENDAHULUAN ............................................................................................. 1

TINJAUAN PUSTAKA

Pati Kentang Hitam ................................................................................... 1

Enzim Amilase .......................................................................................... 2

Brevibacterium sp. .................................................................................... 3

Oligosakarida ............................................................................................ 3

Analisis Oligosakarida .............................................................................. 4

BAHAN DAN METODE

Bahan dan Alat.... ...................................................................................... 5

Metode ...................................................................................................... 5

HASIL DAN PEMBAHASAN

Enzim Amilase dari Brevibacterium sp .................................................... 6

Hasil Reaksi Hidrolisis Pati Kentang Hitam dengan Enzim Amilase ...... 7

Hasil Analisis TLC, Gula Reduksi, Gula Total ....................................... 8

Hasil Analisis HPLC Sampel Pati Kentang Hitam Hasil Hidrolisis ......... 9

SIMPULAN DAN SARAN

Simpulan ................................................................................................... 12

Saran ......................................................................................................... 13

DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................ 13

LAMPIRAN ....................................................................................................... 15

DAFTAR GAMBAR Halaman

1 Pati Kentang Hitam ...................................................................................... 2

2 Ekstrak Kasar Enzim Amilase ..................................................................... 7

3 Warna dan Kekentalan Pati Kentang Hitam ................................................ 7

4 Sampel Hasil Freeze Dry dan Evaporasi ..................................................... 7

5 Kromatogram TLC Standar dan Sampel ...................................................... 8

6 Kromatogram HPLC Standar dengan Perbandingan Fase Gerak 75:25

Kecepatan Aliran 1.4 mL/min dan Fase Gerak 60:40 Kecepatan Aliran

1 mL/min ...................................................................................................... 10

7 Kromatogram HPLC Sampel Segar, Freeze Dry 2.5%, dan Evaporasi

2.5% ............................................................................................................. 11

DAFTAR TABEL

Halaman

1 Kandungan Nutrisi Kentang Hitam ............................................................... 2

2 Jenis Sakarida dan Senyawa Prebiotik Lainnya ............................................ 3

3 Waktu Retensi Kromatogram TLC Standar dan Sampel……………....... ... 8

4 Nilai Gula Reduksi, Gula Total, dan Derajat Polimerasi .............................. 9

5 Waktu Retensi HPLC dan Konsentrasi Standar ........................................... 10

6 Waktu Retensi HPLC dan Konsentrasi Sampel Segar .................................. 10

7 Waktu Retensi HPLC dan Konsentrasi Sampel Freeze Dry ......................... 12

8 Waktu Retensi HPLC dan Konsentrasi Sampel Evaporasi ........................... 12

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

1 Diagram Alir Penelitian ............................................................................... 16

2 Hidrolisis Substrat ........................................................................................ 17

3 Kurva Standar Glukosa dan Nilai Aktivitas Enzim ..................................... 18

4 Kurva Kalibrasi Standar Glukosa ................................................................ 19

5 Hasil Analisis Kandungan Gula pada Sampel Segar ................................... 20

6 Hasil Analisis Kandungan Gula pada Sampel Hasil Freeze Dry ................. 21

7 Hasil Analisis Kandungan Gula pada Sampel Hasil Evaporasi ................... 22


Kecepatan Aliran 1.4 mL/min ...................................................................... 23


Kecepatan Aliran 1 mL/min ......................................................................... 24

10 Kromatogram HPLC Sampel Segar Hasil Hidrolisis ................................... 25

11 Kromatogram HPLC Sampel Hasil Freeze Dry 2.5% ................................. 26

12 Kromatogram HPLC Sampel Hasil Freeze Dry 5% .................................... 27

13 Kromatogram HPLC Sampel Hasil Freeze Dry 10% .................................. 28

14 Kromatogram HPLC Sampel Hasil Evaporasi 2.5% ................................... 29

15 Kromatogram HPLC Sampel Hasil Evaporasi 5% ...................................... 30

16 Kromatogram HPLC Sampel Hasil Evaporasi 10% .................................... 31

1

PENDAHULUAN

Oligosakarida merupakan kelompok

penting dari makromolekul karbohidrat yang

memiliki gula rantai pendek dari polisakarida

dengan 2 sampai 20 unit sakarida. Dewasa ini

perkembangan produk oligosakarida menjadi

salah satu usaha yang memiliki nilai jual

sangat tinggi di dunia industri. Produk

oligosakarida memiliki banyak manfaat di

bidang pangan dan kesehatan tubuh seperti

meningkatkan kualitas makanan dan

modifikasi rasa makanan (Marlis 2008),

meningkatkan populasi bakteri baik di saluran

cerna atau sebagai senyawa prebiotik (Rycroft

et al. 2001), mereduksi reaksi alergi

(Nakakuki 2002), meningkatkan penyerapan

mineral dan memodulasi metabolisme lipid

(Sakuma 2002).

Banyaknya manfaat oligosakarida tersebut

menyebabkan tumbuhnya inovasi baru untuk

menghasilkan oligosakarida. Penemuan

enzim-enzim baru mikroba yang mampu

mensintesis oligosakarida dengan struktur

yang spesifik meningkatkan produksi

bermacam-macam oligosakarida seperti

galaktooligosakarida, laktosukrosa, xilo-

oligosakarida, maltooligosakarida, dan

isomaltooligosakarida (Dinoto 2010). Salah

satu bahan dasar untuk memproduksi

oligosakarida secara enzimatis adalah pati

yang terdiri dari unit α-D-glukopiranosil yang

terhubung dengan ikatan α-1.4-glikosidik

dan/atau ikatan α-1.6-glikosidik.

Kentang hitam mengandung karbohidrat

tinggi terutama pati yaitu sekitar 83% dengan

kadar amilosa 32% dan amilopektin sebesar

51% (Rahmani et al. 2011). Tingginya

kandungan pati tersebut menyebabkan kentang

hitam dapat dijadikan sebagai salah satu

sumber pangan dalam upaya pengembangan

program diversifikasi pangan. Kadar

amilopektin yang lebih tinggi dari amilosa

menyebabkan kentang hitam memiliki

karakter yang unik yaitu lebih kenyal dan

renyah dibanding kentang yang lain. Hal ini

dikarenakan struktur amilopektin yang banyak

memiliki cabang disisinya. Penelitian terkait

manfaat yang terkandung dalam kentang

hitam masih terbatas sehingga penelitian

tentang analisis oligosakarida kentang hitam

ini merupakan suatu langkah menggali potensi

sumber daya umbi lokal tersebut.

Beberapa jenis enzim amilase dilaporkan

dapat dihasilkan dari mikroorganisme dan

diproduksi secara komersial pada industri.

Beberapa mikroba yang dapat memproduksi

enzim amilase untuk menghasilkan

oligosakarida seperti maltoheksosa,

maltopentosa, maltotetrosa, dan maltotriosa

diantaranya Aerobacter, Bacillus,

Pseudomonas, dan Streptomyces (Takasaki

1982; Taniguchi 1983; Robyt 1971; Wako et

al. 1979).

Saat ini mikroba yang banyak digunakan

berasal dari tanah, mikroba yang berasal dari

laut belum banyak dimanfaatkan padahal

karakteristik mikroba laut sangat unik yaitu

tahan terhadap NaCl yang sangat tinggi. Salah

satu mikroba laut yang dapat menghasilkan

enzim amilase yaitu Brevibacterium sp.

(Rahmani et al. 2011). Berdasarkan penelitian

Rohanah (2012), kondisi optimum hidrolisis

pati kentang hitam dengan enzim amilase dari

Brevibacterium sp. memiliki waktu hidrolisis

selama 4 jam, konsentrasi substrat sebesar

2.5%, dilakukan pada suhu 30oC, serta

perbandingan enzim dan substrat 1:5 dengan

aktivitas enzim amilase yang diperoleh

sebesar 2.488 U/mL.

Analisis sakarida hasil hidrolisis secara

enzimatik dapat diidentifikasi dengan

beberapa cara salah satunya adalah metode

High Performance Liquid Cromatography

(HPLC). Metode tersebut digunakan karena

memiliki kecepatan dan sensitivitas yang lebih

baik dari kromatografi lainnya. HPLC dapat

digunakan untuk mengidentifikasi bahan-

bahan yang mengandung karbohidrat dan

senyawa organik (Zou & Chen 2008).

Penelitian ini bertujuan untuk

menganalisis oligosakarida hasil hidrolisis pati

kentang hitam oleh enzim amilase dari

Brevibacterium sp. Adapun hipotesis dari

penelitian ini adalah oligosakarida dapat

dihasilkan dari pati kentang hitam hasil

hidrolisis dengan enzim amilase dari

Brevibacterium sp. Penelitian ini diharapkan

dapat memberikan pengetahuan dan nilai guna

mengenai manfaat pati kentang hitam dan

produk turunannya berupa oligosakarida yang

bernilai ekonomis dan berfungsi sebagai

komponen pangan sehat.

TINJAUAN PUSTAKA

Pati Kentang Hitam

Kentang hitam atau kentang kleci

merupakan tanaman pangan berwarna cokelat

tua hingga hitam gelap seukuran ibu jari atau

jempol kaki orang dewasa. Umbinya memiliki

banyak manfaat dan akan berwarna

kekuningan setelah direbus. Taksonomi

tanaman kentang hitam dapat diklasifikasikan

ke dalam kerajaan Plantae, divisi

2

Magnoliophyta, kelas Magnoliopsida, ordo

Lamiales, famili Lamiaceae, genus Culeus,

dan spesies Culeus tuberosus. Kentang hitam

mempunyai kandungan karbohidrat yang

tinggi, khususnya pati yaitu sebesar 33.7 gram

(Nugraheni 2011). Kompisisi nilai gizi

kentang hitam dapat dilihat pada Tabel 1.

Tabel 1 Kandungan nutrisi kentang hitam

Kandungan Kadar (per 100 g)

Air 64 %

Energi 142 kal

Karbohidrat 33.7 g

Protein 0.9 g

Lemak 0.4 g

Kalsium 34 mg

Fosfor 75 mg

Besi 0.2 mg

Tiamin 0.02 mg

Vit. C 38 mg

Sumber: Nugraheni (2011)

Kentang hitam yang digunakan pada

penelitian ini merupakan kentang hitam

varietas 2.12 hasil kultur jaringan di

Laboratorium Biak Sel dan Kultur Jaringan,

Puslit Biologi, LIPI. Sampel kentang hitam

yang digunakan dalam kultur jaringan berasal

dari daerah Nganjuk, Jawa Timur. Kentang

hitam tersebut diekstrak hingga didapatkan

pati umbi kentang hitam dalam bentuk bubuk

(Gambar 1).

Gambar 1 Pati kentang hitam

Secara alamiah pati merupakan campuran

dari amilosa dan amilopektin. Monomer

glukosa dengan hanya terdapat ikatan α-1.4

glikosidik dinamakan amilosa. Di sisi lain,

adanya ikatan α-1.6 glikosidik menghasilkan

polimer glukosa bercabang yang dinamakan

amilopektin. Komposisi amilosa dan

amilopektin berbeda-beda pada tiap

tumbuhan. Untuk pati yang berasal dari

kentang hitam memiliki kadar amilosa 32.31%

dan kadar amilopektin 52.56% (Rahmani et al.

2011). Pati kentang hitam memiliki senyawa

turunan tripterpenic acid seperti urselic acid,

oleanolic acid, dan maslinic acid, senyawa

yang berfungsi sebagai antioksidan,

hepatoprotektif, antitumor, anti inflamasi, dan

peningkat daya tahan tubuh (Yoon & Liu

2008; Feng et al., 2008; Fai & Tao 2009).

Pati termasuk karbohidrat jenis

polisakarida yang banyak terdapat di dalam

tumbuhan. Pati atau amilum bersifat tidak

larut dalam air pada suhu kamar, berwujud

bubuk putih, tidak berasa, dan tidak berbau. Di

dalam tumbuhan, pati disimpan dalam sel

sebagai granula kecil yang dapat dilihat di

bawah mikroskop. Bentuk granula pati

berbeda-beda tergantung dari tumbuhan

sumber patinya. Pati kentang hitam memiliki

granula dengan ukuran 10 μm dan baik pada

aplikasi industri (Rahmani et al. 2011).

Komponen utama polisakarida pada pati

kentang hitam dapat dihidrolisis dengan

menggunakan enzim-enzim yang memiliki

cara kerja spesifik untuk menghasilkan

oligosakarida. Enzim spesifik untuk memecah

pati menjadi gula-gula sederhana yaitu enzim

amilase (Winarno 2008).

Enzim Amilase

Enzim adalah protein yang berfungsi

sebagai katalisator, senyawa yang

mempercepat proses reaksi tanpa habis

bereaksi dalam suatu reaksi kimia. Enzim

bekerja secara spesifik, artinya setiap enzim

hanya dapat bekerja pada satu macam

senyawa atau reaksi kimia. Hal ini karena

adanya urutan asam amino spesifik yang

membentuk enzim serta mengikat dan

mengaktifkan molekul substrat. Sebagai

contoh, enzim α-Amilase hanya dapat

digunakan pada proses perombakan pati

menjadi gula sederhana (Marks et al. 2000).

Enzim α-Amilase tipe endoenzim yang

memotong ikatan amilosa dan amilopektin

dengan cepat pada larutan pati kental yang

telah mengalami gelatinisasi. Produk akhir

yang dihasilkan dari aktivitasnya adalah

dekstrin beserta sejumlah kecil glukosa dan

maltosa. α-Amilase akan menghidrolisis

ikatan α-1.4 glikosidik pada polisakarida

dengan hasil degradasi secara acak di bagian

tengah atau bagian dalam molekul (Conkerton

et al. 1983).

Enzim amilase didapatkan dari berbagai

macam sumber seperti tanaman, hewan, dan

mikroorganisme (Akyuni 2004). Amilase

diproduksi oleh berbagai mikroorganisme

seperti bakteri, khamir, kapang, ganggang

laut, dan beberapa invertebrata seperti ulat.

Penggunaan mikroba dianggap lebih

prospektif karena mudah tumbuh, cepat

3

menghasilkan produk, kondisi lingkungan

dapat dikendalikan, menguntungkan secara

ekonomis dan memilki siklus hidup pendek

sehingga produktivitasnya dapat ditingkatkan.

Salah satu bakteri yang dapat menghasilkan

enzim amilase tipe endo yaitu Brevibacterium

sp. (Rahmani et al. 2011)

Brevibacterium sp.

Mikroba laut yang dapat menghasilkan

enzim amilase diantaranya adalah bakteri

Brevibacterium sp. Isolat tersebut diprediksi

dapat memproduksi amilase tipe endo, yaitu

enzim yang bekerja menghidrolisis substrat

secara random atau acak sehingga dapat

menghasilkan produk oligosakarida dalam

jumlah yang lebih banyak. Enzim amilase

yang dihasilkan oleh Brevibacterium sp.

memiliki suhu optimum 25-30oC dan pH

optimum 6.6 (Rahmani et al. 2011).

Genus Brevibacterium adalah campuran

heterogen organisme coryneform yang

memiliki aplikasi khusus untuk produksi

industri, asam amino untuk produksi bahan

kimia halus, dan produksi keju. Genus ini

berisi sembilan spesies dari habitat beragam

seperti tanah, unggas, ikan, kulit manusia, dan

makanan (Gruner & Alexander 1993). Bakteri

yang digunakan pada penelitian ini diisolasi

dari laut dan merupakan koleksi dari BTCC

(Biotechnology Culture Collection). Isolat ini

memiliki koloni yang berwarna putih apabila

masih muda dan akan berwarna kuning di

pinggir koloni jika sudah tua (Rahmani et al.

2011).

Brevibacterium sp. memiliki bentuk sel

batang. Diameter koloni 0.6-1.2 x 1.5-6 µm.

Bakteri ini termasuk ke dalam bakteri gram

positif, aerob, tidak mampu bergerak dan

termasuk ke dalam katalase positif. Bakteri

Brevibacterium sp. yang berasal dari laut

tahan terhadap NaCl yang sangat tinggi.

Selain itu, bakteri ini juga dapat menghasilkan

enzim amilase secara ekstraseluler. Dengan

adanya substrat berupa pati yang menjadi

nutrisi metabolismenya, bakteri ini akan

mengeluarkan zat berupa enzim amilase untuk

memotong polisakarida pada pati menjadi gula

yang lebih sederhana seperti oligosakarida

(Rahmani et al. 2011).

Oligosakarida

Oligosakarida merupakan gula rantai

pendek dari polisakarida dengan 2 hingga 20

unit sakarida. Karakteristik senyawa

oligosakarida terdiri atas susunan

monosakarida antara lain glukosa, galaktosa,

xylosa, dan fruktosa. Oligosakarida memiliki

berat molekul lebih rendah dibawah

polisakarida (Manning 2004). Sebagian besar

oligosakarida berfungsi sebagai bahan pangan

prebiotik. Jenis dan senyawa prebiotiknya

dapat dilihat pada Tabel 2.

Tabel 2 Jenis sakarida dan senyawa prebiotik

lainnya

Kelompok Senyawa Prebiotik

Polylol Xylitol

Sorbitol

Mannitol

Disakarida Laktulosa

Laktitol

Oligosakarida Rafinosa

Fruktooligosakarida

Oligofruktosa

Galaktooligosakarida

Palatinosa

Isomaltooligosakarida

Laktosukrosa

Galaktosil-sukrosa

Polisakarida Inulin

Pati resisten

Sumber: Suskovic et al. (2001)

Menurut Aiyer (2005) terdapat beberapa

oligosakarida turunan pati yang memiliki

banyak manfaat di bidang pangan, misalnya

maltosa banyak digunakan sebagai pemanis,

suplemen gula pada intravena. Sirup

maltotetrosa dijadikan sebagai pengganti

sukrosa yaitu dapat mengurangi manisnya

makanan tanpa mempengaruhi rasa dan

aroma, serta dapat menjaga kelembaban dalam

pangan. Selain itu, oligosakarida juga dapat

digunakan sebagai pangan fungsional yang

memiliki potensi besar untuk meningkatkan

kualitas bahan makanan, modifikasi rasa

makanan, dan karakter fisikokimia yang

menguntungkan bagi kesehatan konsumen.

Oligosakarida ditemukan secara alami

dalam buah-buahan, sayuran, susu, dan madu.

Oligosakarida banyak digunakan dalam

minuman, susu bubuk balita, permen, roti,

yoghurt, dan produk turunan susu (Marlis

2008). Ada juga oligosakarida campuran

(maltooligomer mix) yang diperoleh dari

pemecahan pati jagung dengan α-amilase, β-

amilase, dan pululanase. Komposisinya yaitu

terdiri atas 37.5% glukosa, 2.2% maltosa, dan

46.6% maltotriosa.

Oligosakarida dapat dimanfaatkan sebagai

bahan pangan prebiotik. Prebiotik

didefinisikan sebagai komponen pangan yang

tidak tercerna dan memberikan keuntungan

pada inang melalui modulasi mikroflora (FAO

4

2007). Prebiotik menyebabkan mikroflora

yang bermanfaat bagi kesehatan dapat tumbuh

lebih baik dibandingkan mikroflora patogen.

Mikroflora tersebut terdapat di dalam usus

besar dan bermanfaat untuk pencernaan

misalnya Bifidobacterium spp., Eubacterium

spp., dan Lactobacilus spp. Mikroflora

tersebut akan bersaing dengan mikroflora

patogen yang terbawa masuk ke saluran

pencernaan melalui makanan (Roberfroid

2007).

Analisis Oligosakarida

Metode yang dikembangkan dalam analisis

karbohidrat adalah Kromatografi. Proses

kromatografi digunakan dalam metode

pemisahan komponen gula dari komponen non

gula menjadi fraksi-fraksi terpisah yang

diakibatkan oleh perbedaan adsorpsi, difusi

dan eksklusi komponen gula dan non gula

tersebut terhadap adsorben dan eluen yang

digunakan. Jenis kromatografi yang biasa

digunakan dalam analisis gula-gula sederhana

adalah Kromatografi Lapis Tipis (Thin Layer

Cromatography, TLC) dan Kromatografi Cair

Kinerja Tinggi (High Performance Liquid

Cromatography, HPLC) (Zou & Chen 2008).

TLC merupakan bentuk kromatografi

planar yang fase diamnya berupa lapisan yang

seragam (uniform) pada permukaan bidang

datar yang didukung oleh lempeng kaca, pelat

aluminium atau pelat plastik Jel silika atau

alumina merupakan fase diam. Fase diam

untuk TLC seringkali juga mengandung

substansi yang dapat berpendar dalam sinar

ultra violet. Fase diam lainnya yang biasa

digunakan adalah alumina-aluminium oksida

Fase gerak yang biasa digunakan berupa

senyawa cair seperti akuades, n-butanol, dan

asam asetat (Weston & Brokleblank 1999).

Selain TLC, kromatografi lainnya yaitu

HPLC yang mendasarkan analisis terhadap

keragaman struktur dan isomeric multiplicity.

Mekanisme pemisahan dilakukan dengan

interaksi hidrofilik, pertukaran ligan, size

exclusion, Deteksi HPLC dilakukan dengan

Deteksi Indeks Refraktif (Refractive Index

Detection, RID) atau Pulse-Amperometric

Detection (PAD) (Soga 2002). HPLC

merupakan teknik analisis pemisahan

sekaligus penentuan kualitatif maupun

kuantitatif yang banyak digunakan pada

senyawa-senyawa yang mempunyai titik didih

tinggi yang tidak dapat dilakukan dengan

analisis secara kromatografi gas (Zou & Chen

2008).

Prinsip pemisahan HPLC sama dengan

prinsip kromatografi pada umumnya yaitu

berdasarkan pada perbedaan sifat dalam

distribusi kesetimbangan dari 2 komponen

yang berbeda fasenya (fase diam dan fase

gerak). HPLC terdiri dari fase diam dengan

permukaan aktifnya yang berupa padatan,

resin penukar ion, atau polimer berpori yang

ditempatkan pada kolom serta dialiri fase

gerak cair dengan aliran yang diatur oleh suatu

pompa. Analisis dengan HPLC dilakukan pada

temperatur rendah dengan adanya kompetisi 2

fase (gerak dan diam). Migrasi dari komponen

molekul akan sebanding dengan koefisien

distribusinya, maka komponen dengan

distribusi tinggi pada fase diam akan bergerak

lebih perlahan didalam kolom sehingga dapat

terpisah dari komponen yang distribusinya

rendah (Du & Chen 2009).

Setiap komponen campuran yang keluar

dari kolom dideteksi oleh detektor kemudian

direkam dalam bentuk kromatogram. Jumlah

puncak pada kromatogram menyatakan jumlah

komponen, sedangkan luas puncak

menyatakan konsentrasi komponen dalam

campuran. Komputer dapat digunakan untuk

mengontrol kerja sistem HPLC dan

mengumpulkan serta mengolah data hasil

pengukuran HPLC (Zou & Chen 2008).

Terdapat beberapa perlakuan yang

dilakukan pada sampel sebelum dianalisis

dengan HPLC yaitu sampel dikeringbekukan

terlebih dahulu agar air atau senyawa-senyawa

pengotor yang terkandung dalam sampel tidak

mengganggu saat proses analisis. Proses yang

dapat dilakukan diantaranya freeze dry dan

vacuum evaporator. Proses ini juga bertujuan

sebagai bentuk sediaan bahan pangan yang

mengandung senyawa oligosakarida dalam

jumlah yang banyak.

Prinsip kerja freeze dry adalah pada

kondisi tekanan penguapan yang rendah, air

dapat diuapkan dari fase es tanpa membuat es

mancair. Prinsip penyubliman menjadi dasar

freeze dry ini, air akan tersublimasi pada suhu

0 derajat atau lebih rendah dan diletakkan

pada wadah dan tekanan 4,7 mmHg atau

kurang dari itu. Selain itu, prinsip utama

metode freeze-dry adalah menghilangkan

kandungan air suatu bahan sebanyak ± 98 (Du

& Chen 2009).

Metode pengeringan vaccum evaporator

dapat menghasilkan produk kering dengan

kualitas tinggi. Pada metode ini suhu atau

panas pada makanan dan laju penguapan air

dari bahan pangan dapat diatur. Panas

merambat pada bahan pangan melalui proses

radiasi dan konduksi. Setiap alat yang bekerja

dengan prinsip vaccum evaporator

mempunyai 4 bagian alat yang penting yaitu

5

wadah vakum dengan konstruksi berat untuk

menahan tekanan air dari luar yang mungkin

melebihi tekanan di dalam, penyuplai panas,

sebuah alat untuk menghasilkan dan menjaga

kondisi vakum dan sebuah komponen untuk

mengumpulkan uap air yang diuapkan dari

bahan pangan (Du & Chen 1997).

BAHAN DAN METODE

Bahan dan Alat

Bahan-bahan yang digunakan untuk

penelitian ini antara lain pati kentang hitam

varietas 2.12, isolat Brevibacterium sp. koleksi

Laboratorium Biokatalis dan Fermentasi Puslit

Bioteknologi LIPI. Komposisi media cair pre-

kultur dan kultur terdiri atas ekstrak khamir,

bacto pepton, ASW (Artificial Sea Water),

pati komersil (Merck) 2%, dan akuades. Untuk

media padat, komposisi media cair ditambah

agar 1.5%. Reagen dinitrosalisilat (DNS) yang

terdiri atas DNS murni, NaOH padat, dan

kalium natrium tartrat (KNa-tartrat) Merck.

Alkohol 70%, es batu, asam sulfat pekat,

Na2S, fenol 5%, dan bufer fosfat 2M pH 6.6.

Eluen atau fase gerak yang digunakan untuk

TLC yaitu n-butanol, asam asetat, dan akuades

dengan perbandingan 12:6:6. Adsorben atau

fase diam yang digunakan yaitu plat silica gel

60 F254 (Merck Art 20-20 cm). Standar yang

digunakan dalam TLC yaitu glukosa, maltosa,

maltotriosa, dan maltopentosa. Fase gerak

yang digunakan yaitu acetonitril dan akuades

steril dengan perbandingan 75:25 dan 60:40.

Standar yang digunakan untuk HPLC yaitu

glukosa, maltosa, maltotriosa, dan

maltopentosa.

Adapun alat-alat yang digunakan antara

lain High Performance Liquid Cromatography

(HPLC), Laminar Air Flow, autoklaf,

inkubator goyang, evaporator, freeze dryer,

hair dryer, spektrofotometer UV-Vis,

sentrifus, hot plate, vortex, neraca analitik,

labu Erlenmeyer, falcon, gelas beker, kuvet,

tabung reaksi, gelas ukur, cawan petri, rak

tabung, sudip, tisu, bunsen, pipet mikro, pipet

tetes, pinset, tabung Eppendorf, tips,

aluminium foil, lemari pendingin, botol

semprot, kertas saring, tusuk gigi, membran

dialisis, baskom, penjepit membran, corong,

tabung sentrifugasi, botol Schott, labu ukur,

sarung tangan, dan masker.

Metode Penelitian

Metode penelitian terdiri atas empat tahap

yaitu tahap awal produksi ekstrak kasar enzim

amilase dari Brevibacterium sp., tahap kedua

proses reaksi hidrolisis pati kentang hitam

dengan enzim amilase. Selanjutnya tahap

ketiga dilakukan analisis TLC, gula reduksi,

dan gula total. Tahap keempat analisis profil

oligosakarida dengan HPLC (lampiran 1).

Produksi Ekstrak Kasar Enzim Amilase

dari Brevibacterium sp.

Sebelum penelitian, isolat Brevibacterium

sp. diremajakan kembali dengan cara

ditumbuhkan dalam media agar. Isolat

diinkubasi selama 96 jam pada suhu 30oC

dengan inkubator goyang 150 rpm (Rahmani

et al. 2011). Selanjutnya isolat yang sudah

diremajakan diinokulasi ke dalam media

prekultur dan kultur. Hasil kultur disentrifus

dengan kecepatan 12000 rpm selama 15 menit

pada suhu 4oC. Setelah itu supernatan diambil

dan dipisahkan dengan peletnya. Ekstrak kasar

enzim amilase tersebut diuji aktivitasnya

dengan cara 0.25 mL larutan pati komersil

(Merck) ditambahkan dengan 0.5 mL ekstrak

kasar enzim amilase lalu divorteks dan

kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama

30 menit. Selanjutnya ditambahkan 0.75 mL

reagen DNS dan di vortex kembali. Setelah itu

dipanaskan di suhu 100oC selama 15 menit

dan kemudian didinginkan ke dalam es serta

diukur absorbansinya pada panjang

gelombang λ =540 nm (Bernfeld 1995).

Proses Reaksi Hidrolisis Pati Kentang

Hitam dengan Enzim Amilase

Hidrolisis substrat pati kentang hitam

dengan enzim amilase pada skala 1 Liter

dilakukan pada kondisi optimum berdasarkan

Rohanah (2012). Konsentrasi pati yang

digunakan sebesar 2.5%, waktu hidrolisis

selama 4 jam, perbandingan enzim dan

substrat 1:5, dan dilakukan pada suhu 30oC.

Pati kentang hitam sebanyak 25 gram

dilarutkan ke dalam akuades 1 L dan

dipanaskan pada suhu 80oC. Selanjutnya

ditambahkan enzim amilase yang memiliki

aktivitas sebesar 3.25 U/mL sebanyak 20 mL.

Substrat dan enzim tersebut kemudian

dihidrolisis selama 4 jam pada inkubator

goyang dengan kecepatan 150 rpm dan suhu

30oC. Sampel hasil reaksi hidrolisis tersebut

diberikan perlakuan dengan cara freeze dry

dan vacuum evaporator. Sampel sebanyak 1

Liter diberi perlakuan freeze dry pada tekanan

4.7 mmHg dan suhu -50oC. Perlakuan Freeze

dry dilakukan di Laboratorium PAU IPB.

Perlakuan vacuum evaporator sampel

sebanyak 1 Liter dilakukan pada suhu chiller

10oC, suhu water bath 65

oC, dan tekanan 80

kPa. (Potter & Hotchkiss 1997).

6

Analisis Kimia Kandungan Karbohidrat

Identifikasi komponen kabohidrat

dengan TLC (Thin Layer Cromatography).

Plat silica gel 60 F254 (Merck Art 20-20 cm)

nm ukuran 10x20 cm diukur jarak 1 cm dari

bawah plat sebagai garis start dan 1 cm dari

atas sampel sebagai garis finish. Sampel

ditotolkan sebanyak 4µL pada plat TLC

menggunakan pipet mikro 10 µL. Eluen yang

digunakan adalah campuran n-butanol, asam

asetat, dan akuades dengan perbandingan

12:6:6. Standar yang digunakan yaitu glukosa,

maltosa, maltotriosa, dan maltopentosa. Eluen

dikocok dan dijenuhkan selama 60 menit.

selanjutnya, plat TLC dikeringkan

menggunakan hair dryer kemudian dilakukan

proses elusi. Setelah elusi selesai. Plat TLC

disemprot dengan larutan pewarna gula yaitu

0.5 gram α-difenilamin,25 ml aseton, 2.5 ml

asam fosfat, dan 0.5 ml anilin. Setelah kering,

plat TLC dipanaskan pada suhu 100oC selama

15 menit hingga terbentuk spot. Spot yang

terbentuk dihitung nilai Rf (Retention

factor)nya dengan rumus:

Rf =

Analisis Gula Total (modifikasi Dubois

et al. 1956). Analisis gula total diukur dengan

metode fenol-sulfat. Sebanyak 0.5 mL sampel

yang sudah diencerkan sebanyak 400 kali

ditambahkan 0.5 ml fenol 5% (b/v) dan 2.5 ml

asam sulfat pekat. Selanjutnya divorteks dan

diinkubasi pada suhu ruang selama 10 menit.

Kemudian dipanaskan dalam water bath pada

suhu 40oC selama 20 menit dan diukur

absorbansinya pada λ= 490 nm. Hasil

absorbansi kemudian dimasukkan ke dalam

persamaan kurva standar glukosa.

Analisis Gula Pereduksi (modifikasi

Miller 1959). Sebanyak 10 µL sampel

ditambahkan 490 µL akuades kemudian

divorteks, selanjutnya ditambahkan 750 µL

larutan DNS dan divorteks kembali. Setelah

itu, dipanaskan pada suhu 100oC selama 15

menit sampai berubah warna. Kemudian

didinginkan di dalam es dan selanjutnya

diukur dengan spektrofotometer pada panjang

gelombang λ=540 nm. Hasil absorbansi

kemudian dimasukkan ke dalam persamaan

kurva standar glukosa.

Derajat Polimerasi (Apriyantono et al.

1989). Derajat polimerasi dihitung

berdasarkan perbandingan antara gula total

dan gula pereduksi.

Analisis Oligosakarida dengan HPLC

Penentuan kondisi optimum pada HPLC

dilakukan pada tiga variabel yaitu

perbandingan fase gerak, kecepatan alir, dan

konsentrasi sampel. Optimasi pertama

dilakukan pada perbandingan fase gerak

asetonitril:akuades sebesar 75:25 dengan

kecepatan alir sebesar 1.4 mL/min dan

perbandingan fase gerak asetonitril:akuades

sebesar 60:40 dengan kecepatan alir sebesar 1

mL/min. Fase gerak yang digunakan di filter

dan di degass terlebih dahulu. Sampel terdiri

atas sampel segar, sampel freeze dry dengan

optimasi konsentrasi 2.5%, 5%, dan 10% serta

sampel evaporasi dengan optimasi konsentrasi

2.5%, 5%, dan 10%. Detektor yang digunakan

yaitu Refractive Index Detector (RID) dan

kolom Zorbax SIL (silika) dengan dilapisi 3-

aminopropilen. Volume injek sebesar 10µL.

Standar yang digunakan yaitu glukosa,

maltosa, maltotriosa, dan maltopentaosa.

Standar dan sampel diinjek ke dalam kolom

sebanyak 10 µL hingga diperoleh data

komatogram pada komputer.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Enzim Amilase dari Brevibacterium sp. Produksi enzim amilase diawali dengan

meremajakan isolat Brevibacterium sp. Tujuan

dari peremajaan ini agar diperoleh isolat yang

segar sehingga bakteri Brevibacterium sp.

dapat optimal menghasilkan enzim amilase.

Isolat yang sudah diremajakan dimasukkan ke

dalam media prekultur dan kultur. Tujuan

prekultur dan kultur yaitu agar isolat dapat

beradaptasi dan sebagai stimulasi atau

rangsangan untuk menghasilkan enzim

amilase secara optimal. Media kultur bakteri

berubah dari kuning bening menjadi kuning

keruh. Hal tersebut merupakan salah satu ciri

adanya pertumbuhan dan sistem metabolisme

bakteri.

Keberadaan substrat berupa pati sebagai

satu-satunya sumber karbon dalam media akan

menginduksi sintesis enzim amilase. Enzim

amilase ekstrak kasar diproduksi sebanyak 1

liter dan setelah proses sentrifugasi diperoleh

volume enzim sebanyak 810 mL. Aktivitas

enzim amilase ekstrak kasar didapatkan

7

sebesar 3.25 U/mL yang berarti enzim amilase

tersebut dapat menghasilkan 3.25 mikromol

produk per menit. Rahmani et al. (2011)

menemukan bahwa Brevibacterium sp. yang

diisolasi dari Teluk Kamal mampu

menghasilkan enzim amilase dengan aktivitas

2.85 U/mL. Semakin tinggi aktivitas enzim

amilase maka semakin optimal enzim tersebut

memecah pati menjadi gula sederhana seperti

oligosakarida.

Enzim amilase ekstrak kasar tersebut

berasal dari bakteri laut, sehingga diperlukan

dialisis untuk menghilangkan garam-garam

berlebih yang kemungkinan berasal dari media

Artificial Sea Water (ASW). Dialisis

merupakan bagian dari proses pemurnian

enzim menggunakan membran semi-

permiabel. Ekstrak kasar enzim amilase hasil

dialisis berwarna kuning jernih (Gambar 2).

Gambar 2 Ekstrak kasar enzim amilase dari

Brevibacterium sp.

Hasil Reaksi Hidrolisis Pati Kentang Hitam

dengan Enzim Amilase

Reaksi hidrolisis pati kentang hitam pada

kondisi optimum berdasarkan Rohanah

(2012). Pati kentang hitam berwarna putih

kecoklatan kemudian dilarutkan dan

dipanaskan pada suhu 80°C selama 5 menit.

Sebelum dipanaskan, larutan pati tersebut

berwarna putih sedikit kecoklatan akibat

warna pati kentang hitam itu sendiri. Setelah

mengalami pemanasan pati menjadi lebih

coklat dan terlihat bahwa pati tersebut terlarut.

Setelah reaksi berlangsung selama 4 jam,

substrat berubah warna menjadi cokelat

bening karena warna cokelat terpengaruh dari

warna enzim dan substrat terlihat lebih encer,

seperti yang terlihat pada Gambar 3.

Hasil hidrolisis masih mengandung enzim

yang aktif. Kerja enzim dihentikan dengan

memanaskan hidrolisat pada suhu tinggi

supaya protein enzim terdenaturasi. Sampel

hasil hidrolisis mengandung oligosakarida

yang memiliki rantai pendek dan terlarut,

maka dilakukan sentrifugasi.

(a) (b)

Gambar 3 Perbedaan warna dan kekentalan

substrat pati kentang hitam

sebelum ditambahkan enzim

amilase (a) dan setelah

ditambahkan enzim amilase (b).

Sampel segar hasil hidrolisis sebanyak 1

Liter dikeringbekukan (freeze dry) pada

tekanan 10 µHg dengan suhu -50°C. Bobot

sampel setelah dikeringbekukan menjadi 2.1

gram. Sampel hasil freeze dry berupa padatan

berbentuk bubuk berwarna cokelat. Setelah

itu, sampel segar hasil hidrolisis sebanyak 1

Liter juga dipekatkan menggunakan vaccum

evaporator. Pemekatan dilakukan hingga

didapatkan sampel sebanyak 40 mL dalam

bentuk cairan kental. Pada sampel hasil

evaporasi, sampel berwarna kuning kecoklatan

akibat dari warna asli pati kentang hitam.

Tujuan dilakukan pemekatan dan pengeringan

beku adalah untuk menguapkan air yang

terkandung dalam sampel sehingga

konsentrasi sampel menjadi lebih tinggi dan

hasil sampel yang berupa padatan akan

memudahkan proses analisis dan penyimpanan

dalam jumlah yang banyak. Sampel freeze dry

dan evaporasi dapat dilihat pada Gambar 4.

(a) (b)

Gambar 4 Sampel hasil freeze dry (a) dan

sampel hasil evaporasi (b)

8

Supernatan hasil sentrifugasi selanjutnya

dianalisis. Terdapat tiga sampel untuk

dianalisis yaitu sampel segar hasil hidrolisis,

sampel freeze dry, dan sampel evaporasi.

Analisis sampel terdiri atas analisis profil

dengan TLC, analisis gula reduksi, dan

analisis gula total serta identifikasi dengan

HPLC.

Hasil Analisis TLC, Gula Reduksi, dan

Gula Total

Analisis profil oligosakarida pada sampel

hasil hidrolisis secara kualitatif salah satunya

yaitu dengan menggunakan kormatografi lapis

tipis. Glukosa digunakan sebagai standar

monosakarida dan maltosa, maltotriosa dan

maltopentosa digunakan sebagai standar

oligosakarida. Kromatogram TLC dapat

dilihat pada Gambar 5.

Gambar 5 Kromatogram TLC standar (1) yang

teridiri atas glukosa, maltosa,

maltotriosa, dan maltopentosa

pada sampel evaporasi (2), sampel

freeze dry (3), dan sampel segar

(4)

Sampel hasil hidrolisis secara keseluruhan

menunjukkan bahwa telah terjadi pemecahan

pati oleh enzim. Spot kromatogram sampel

hasil freeze dry dan evaporasi memiliki

ketebalan yang lebih jelas dibandingkan spot

kromatogram pada sampel segar. Hal ini

dikarenakan kedua sampel tersebut telah

mengalami pengeringan. Sampel yang sudah

dikeringkan lebih tebal karena air yang

terkandung pada sampel tersebut telah

mengalami penguapan sehingga

konsentrasinya lebih tinggi dan menghasilkan

spot lebih jelas.

Waktu retensi pada standar glukosa,

maltosa, maltotriosa, dan maltopentosa

berturut-turut sebesar 0.50, 0.41, 0.35, dan

0.22. Nilai tersebut dipengaruhi oleh

pergerakan karbohidrat selama elusi. Bobot

molekul yang lebih besar akan mengalami

pergerakan lebih lama sehingga nilai Rf

semakin rendah. Pada sampel segar, sampel

freeze dry, dan sampel evaporasi

menghasilkan nilai Rf yang tidak jauh berbeda

dengan standar. Seperti nilai maltosa dan

maltotriosa pada ketiga sampel sebesar 0.41

dan 0.35 sama seperti nilai standar. Masing-

masing nilai Rf standar dan sampel dapat

dilihat pada Tabel 3.

Tabel 3 Rf spot standar gulkosa (Glu), maltosa

(Mal), maltotriosa (Mal3), dan

maltopentosa (Mal5) pada sampel

segar (SS), freeze dry (FD), dan

evaporasi (EV)

Pada semua sampel menghasilkan lima

spot sementara standar yang digunakan hanya

empat, hal ini diperkirakan di dalam sampel

tersebut mengandung maltotetrosa yang

memiliki nilai Rf diantara maltotriosa dan

maltopentosa. Keempat spot yang muncul

pada sampel oligosakarida segar, sampel hasil

freeze dry, dan sampel hasil evaporasi

memiliki nilai Rf yang sama atau mendekati

nilai standar sehingga di dalam sampel

tersebut menunjukkan adanya senyawa

glukosa, maltosa, maltotriosa, dan

maltopentosa. Setelah adanya profil sakarida

pada analisis TLC, selanjutnya dilakukan

analisis gula reduksi dan gula total agar dapat

diperoleh derajat polimerasi.

Pada sampel segar, hasil freeze dry, dan

evaporasi. Kandungan gula reduksi pada

sampel segar hasil hidrolisis sebesar 7485.5

ppm. Gula reduksi menunjukkan terbentuknya

gula sederhana seperti oligosakarida pada pati

kentang hitam yang terhidrolisis. Jumlah gula-

gula pereduksi dan non pereduksi pada sampel

dinyatakan dalam gula total yang terdapat

pada sampel. Kandungan gula total pada

sampel segar sebesar 95600 ppm. Derajat

polimerasi (DP) diperoleh dari perbandingan

gula total dan gula pereduksi. DP pada sampel

segar sebesar 12.776 artinya pada sampel

Spot Retention factor

Glu Mal Mal3 x Mal5

Std 0.50 0.41 0.35 - 0.22

SS 0.50 0.41 0.35 0.28 0.21

FD 0.48 0.41 0.35 0.28 0.22

EV 0.50 0.41 0.35 0.30 0.22

Maltopentosa

Maltosa

Maltotriosa

Glukosa

1 4 3 2 1

9

tersebut menghasilkan 12.776 polimer hasil

dari degradasi polisakarida menjadi

oligosakarida atau gula sederhana yang

dipotong oleh enzim amilase tipe endo secara

acak.

Kandungan gula reduksi pada sampel hasil

freeze dry mengalami kenaikan yaitu sebesar

9647.5 ppm dengan kandungan gula total

sebesar 69000 ppm. DP yang dihasilkan lebih

baik yaitu sebesar 7.152. Pada sampel yang

diberi vacuum evaporator gula reduksinya

lebih meningkat menjadi 14908.3 ppm dengan

nilai gula total sebesar 69540 ppm. DP yang

diperoleh sebesar 4.664.

Sampel hasil hidrolisis setelah di freeze dry

dan evaporasi memiliki kandungan gula

reduksi lebih tinggi dikarenakan air yang

terkandung pada sampel mengalami

penguapan dan sampel mengalami pemekatan

yang menyebabkan konsentrasinya menjadi

meningkat sehingga gula-gula sederhana lebih

banyak terbentuk. DP yang dihasilkan juga

lebih baik karena oligosakarida memiliki DP

lebih besar dari 2 dan kurang dari 10

(2<DP<10). Nilai gula reduksi, gula total, dan

derajat polimerasi pada sampel dapat dilihat

pada Tabel 4.

Tabel 4 Nilai gula reduksi (GR), gula total

(GT), dan derajat polimerasi (DP)

pada sampel segar (SS), freeze dry

(FD), dan evaporasi (EV)

Sampel GR

(ppm)

GT

(ppm)

DP

SS 7482.5 95600 12.776

FD 9647.5 69000 7.152

EV 14908.3 69540 4.664

(a)

Hasil Analisis HPLC Sampel Pati Kentang

Hitam Hasil Hidrolisis

Analisis profil oligosakarida dengan HPLC

menggunakan kecepatan aliran 1.4 mL/min

dengan perbandingan fase gerak 75:25

(kondisi 1) dan kecepatan aliran 1 mL/min

dengan perbandingan fase gerak 60:40

(kondisi 2). Pada kondisi 1 diperoleh puncak

glukosa, maltosa, dan maltotriosa dengan

jarak antar puncak yang cukup berjauhan

Waktu yang diatur selama analisis adalah 30

menit. Maltopentosa tidak muncul dan

diperkirakan muncul jika waktu analisis

diperpanjang lebih dari 30 menit. Pada kondisi

2 dan waktu yang diatur selama 10 menit

semua standar glukosa, maltosa, maltotriosa,

dan maltopentosa muncul dengan waktu

retensi yang lebih singkat. Puncak yang di

dapat tidak terlalu berjauhan dan lebih tajam

dibandingkan kondisi 1 (Gambar 6).

Jika dibandingkan dengan kondisi 1,

kondisi 2 dengan perbandingan fase gerak

60:40 memiliki waktu retensi yang lebih

singkat sehingga maltopentosa dapat muncul

di waktu retensi yang lebih cepat. Hal ini

dikarenakan dengan perbandingan 60:40

komposisi akuades lebih banyak dibandingkan

komposisi akuades pada perbandingan 75:25.

Akuades yang memiliki indeks polaritas lebih

tinggi yaitu sebesar 10.2 dibandingkan

acetonitril dengan indeks polaritas 5.8

menyebabkan waktu retensi yang muncul

dapat lebih cepat karena saat keduanya

dicampur indeks polaritas fase gerak dengan

perbandingan 60:40 akan mendekati nilai

indeks polaritas akuades yang polar

dibandingkan fase gerak dengan perbandingan

75:25.

10

(b)

Konsentrasi standar yang digunakan yaitu

glukosa sebesar 50000 ppm, maltosa 50000

ppm, maltotriosa 5000 ppm, dan

maltopentosa 5000 ppm. Pada waktu injek

standar dengan kondisi 1, glukosa muncul di

waktu retensi 5.384, maltosa 10.371,

maltotriosa 16.783, dan maltopentosa tidak

muncul. Sementara itu, pada kondisi 2 waktu

retensi standar yang muncul lebih cepat yaitu

glukosa muncul di waktu 4.742, maltosa

5.309, maltotriosa 5.997, dan maltopentosa

7.567. Waktu retensi dan konsentrasi standar

dapat dilihat pada Tabel 5.

Tabel 5 Waktu retensi (Rt) dan konsentrasi

standar glukosa (Glu), Maltosa (Mal),

Maltrotriosa (Mal3), dan Maltopentosa (Mal5)

Std Rt

kondisi 1

Rt

kondisi 2

Konsentrasi

(ppm)

Glu 5.384 4.742 50000

Mal 10.371 5.309 50000

Mal3 16.783 5.997 5000

Mal5 Tidak

muncul

7.567 5000

Berdasarkan hasil standar yang diperoleh,

maka kondisi 2 yaitu perbandingan fase gerak

asetonitril:akuades 60:40 dengan kecepatan

aliran 1 mL/ min digunakan untuk menginjek

sampel. Sampel yang dianalisis berupa sampel

segar, sampel freeze dry, dan sampel evaporasi

(Gambar 7)

Kromatogram pada sampel segar

menghasilkan tujuh puncak dengan jarak antar

puncak yang stabil dan baseline yang rata.

Dari tujuh puncak tersebut memunculkan

empat puncak yang waktu retensinya tidak

berbeda jauh dengan standar yang digunakan.

Pada sampel hasil freeze dry konsentrasi 2.5%

diperoleh tujuh puncak dengan baseline yang

rata. Dari tujuh puncak tersebut dihasilkan

empat puncak yang waktu retensinya mirip

dengan standar. Terbentuknya glukosa

menandakan amilase tidak hanya bekerja

sendiri pada substrat pati, tetapi ada juga

enzim lain yang ikut bekerja yaitu

glukosidase. Pada sampel hasil evaporasi

dengan konsentrasi 2.5% tidak mengandung

senyawa glukosa hal ini dikarenakan

konsentrasi yang terlalu kecil yang terdapat

dalam senyawa tersebut.

Sampel yang sudah diberi perlakuan freeze

dry dan evaporasi menghasilkan puncak yang

lebih tajam dibandingkan sampel segar.

Oligosakarida yang teridentifikasi juga

memiliki puncak yang lebih tinggi dan

terdapat banyak puncak yang diperkirakan

adalah oligosakarida. Berdasarkan ketiga

kromatogram sampel tersebut diperoleh waktu

retensi yang tidak jauh berbeda dengan standar

yang digunakan. Waktu retensi pada sampel

segar dapat dilihat pada Tabel 6.


sampel segar hasil hidrolisis

Standar Rt

(menit)

Konsentrasi

(ppm)

Glukosa 4.941 604.222

Maltosa 5.602 748.093

Maltotriosa 6.392 13511.7

Maltopentosa

Total

8.443 4744.93

19608.945

Waktu retensi glukosa pada sampel segar

muncul di waktu 4.941, maltosa 5.602,

maltotriosa 6.392, dan maltopentosa 8.443.

Konsentrasi maltotriosa lebih tinggi

dibandingkan yang lain yaitu sebesar 13511.7

Gambar 6 Kromatogram HPLC standar dengan perbandingan fase gerak 75:45 dan kecepatan

aliran 1.4 mL/min (a) dan fase gerak 60:40 dan kecepatan aliran 1 mL/min (b)

11

(a)

(b)

(c)

ppm. Total konsentrasi dari empat puncak

tersebut sebesar 19608.945 ppm dari

konsentrasi sampel oligosakarida segar yang

diinjek sebesar 25000 ppm. Sisa konsentrasi

yang lain diperkirakan terdapat dalam tiga

puncak oligosakarida yang belum diketahui

jenisnya hal ini dikarenakan keterbatasan

standar yang digunakan.

Analisis HPLC yang dilakukan pada

sampel freeze dry dan evaporasi yang terdiri

dari konsentrasi 2.5%, 5%, dan 10%. Waktu

retensi dan konsentrasi oligosakarida dari

sampel hasil freeze dry dapat dilihat pada

Tabel 7.

Kromatogram sampel hasil freeze dry

dilakukan dengan tiga konsentrasi yang

berbeda sebagai pembanding luas area dari

perbedaan konsentrasi yang dilakukan.

Semakin tinggi konsentrasi, luas area yang

dihasilkan semakin besar. Pada konsentrasi

2.5% waktu retensi glukosa sebesar 4.825,

maltosa 5.419, maltotriosa 6.150, dan

maltopentosa 7.969. Dari keempat puncak

tersebut, senyawa oligosakarida maltosa

memiliki konsentrasi tertinggi yaitu sebesar

2605.339 ppm. Pada konsentrasi 5% dan 10%

puncak lebih tajam dan luas.. total kosentrasi

yang diperoleh pada sampel hasil freee dry 5%

Gambar 7 Kromatogram HPLC sampel segar (a), sampel hasil freeze dry 2.5% (b), dan

sampel hasil evaporasi 2.5% (c)

12

dan 10% lebih besar yaitu berturut-turut

sebesar 8911.528 ppm dan 9268.310 ppm.

Pada sampel freeze dry 5% senyawa

olligosakarida yang memiliki konsentrasi

tertinggi yaitu maltosa sebesar 6238.086 ppm

dan pada sampel hasil freeze dry 10%

senyawa oligosakarida tertinggi yaitu maltosa

sebesar 5231.677 ppm.


sampel hasil freeze dry setelah HPLC Sampel Standar Rt Konsentrasi

(ppm)

2.5% Glukosa 4.825 226.638

Maltosa 5.419 2605.339


Total

Maltopentosa 7.969 527.390

3976.095

5% Glukosa 4.825 431.913

Maltosa 5.367 6238.086


Total


8911.528

10% Glukosa 4.817 168.618

Maltosa 5.354 5231.677


Total


9268.310

Selain sampel hasil freeze dry dilakukan

juga analisis sampel hasil evaporasi. Sampel

dilakukan pada tiga konsentrasi yang berbeda

yaitu 2.5%, 5%, dan 10%. Waktu retensi dan

konsentrasi sampel evaporasi hasil HPLC

dapat dilihat pada Tabel 8. Kromatogram

sampel oligosakarida hasil evaporasi 2.5%

diperoleh tujuh puncak. Dari ketujuh puncak

tersebut didapatkan tiga senyawa yang waktu

retensinya tidak jauh berbeda dengan standar

yaitu glukosa, maltosa, maltotriosa, dan

maltopentosa dengan waktu retensi berturut-

turut sebesar 4.853, 5.393, 6.128, 8.002.

Konsentrasi oligosakarida tertinggi terdapat

pada senyawa maltosa sebesar 3658.185 ppm.

Pada konsentrasi 5% diperoleh tujuh puncak

dengan waktu retensi yang berbeda-beda.

Konsentrasi senyawa oligosakarida tertinggi

terdapat pada maltosa yaitu sebesar 4555.895

ppm. Pada konsentrasi 10% diperoleh delapan

puncak, empat diantaranya memiliki senyawa

oligosakarida maltosa, maltotriosa, dan

maltopentosa. Senyawa oligosakarida tertinggi

yaitu maltosa sebesar 8642.980 ppm. Total

konsentrasi tertinggi pada sampel hasil

evaporasi 10% yaitu sebesar 18854.632 ppm

Tabel 8 Waktu retensi dan konsentrasi sampel

hasil evaporasi Sampel Standar Rt Konsentrasi

(ppm)

2.5% Glukosa 4.853 -

Maltosa 5.393 3658.185


Total


6631.083

5% Glukosa 4.831 73.982

Maltosa 5.447 4555.895


Total


10153.732

10% Glukosa 4.788 81.557

Maltosa 5.392 8642.980


Total


18854.632

Perbedaan waktu retensi disebabkan

adanya perbedaan berat molekul dari senyawa

yang terdapat di dalam sampel. Waktu retensi

yang mendekati antar komponen sampel

dengan standar menunjukkan komponen yang

dikandung sampel sama dengan standar.

Bobot molekul dari yang terkecil hingga yang

terbesar berturut-turut dari glukosa, maltosa,

maltotriosa, dan maltopentosa. Glukosa

(C6H12O6) memiliki bobot molekul sebesar

180.116, maltosa (C12H22O11) sebesar 342.31,

maltotriosa (C18H32O16) sebesar 504.40,

maltopentosa (C30H52O26) sebesar 828.70 (Lee

2003). Berdasarkan perbedaan tersebut waktu

retensi glukosa lebih cepat dan waktu retensi

maltopentosa lebih lama.

SIMPULAN DAN SARAN

Simpulan

Enzim yang digunakan dalam hidrolisis

enzimatis pati kentang hitam berasal dari

Brevibacterium sp. memiliki aktivitas enzim

sebesar 3.25 U/mL. Pada hasil hidrolisis

kondisi optimum diperoleh gula pereduksi

pada sampel segar sebesar 7482.500 ppm,

sampel hasil freeze dry 9647.500 ppm, dan

sampel hasil evaporasi 14908.300 ppm. Pati

kentang hitam mengandung senyawa

oligosakarida maltosa, maltotriosa, dan

maltopentosa. Pada identifikasi dengan HPLC

didapatkan sampel hasil freeze dry dan

evaporasi memliki konsentrasi yang lebih

tinggi dan puncak yang lebih baik dengan

konsentrasi maltosa lebih tinggi.

13

Saran

Analisis oligosakarida pada pati kentang

hitam dengan HPLC perlu dilakukan lebih

lanjut agar diproleh oligosakarida yang murni.

Pemurnian dengan HPLC harus dilakukan

dengan kolom yang lebih besar dan volume

injek yang lebih besar pula sehingga

oligosakarida yang murni dapat diperoleh.

Selain itu standar yang digunakan lebih

bervariasi sehingga senyawa-senyawa yang

terdapat di dalam sampel dapat teridentifikasi

lebih banyak.

DAFTAR PUSTAKA

Akyuni D. 2004. Pemanfaatan pati sagu

(Metrocylon sp.) untuk pembuatan

sirup glukosa menggunakan α-amilase

dan amiloglukosidase [Skripsi]. Bogor:

Institut Pertanian Bogor, Fakultas

Teknologi Pertanian.

Aiyer PV. 2005. Amylases and their

application. J Biotechnol 4 (13): 1525–

1529.

Apriyantono A, Fardiaz, Puspitasari NL,

Budiyanto S. 1989. Analisis Pangan.

Bogor: PAU Pangan dan Gizi

Bernfeld P. 1955. Amylase α- and β-

Methodes. J Enzymol: 149-158.

Conkerton EJ, Parrish FW, Capital DC, Ory

RL. 1983. Isolation of a stachyose-

sucrose complex from soybeans and

peanuts. J Food Science 48:1269-1271.

Dinoto A, Rahayu RD, Satyaningtijas A.

2010. Perubahan kadar kolesterol

serum pada tikus setelah

mengkonsumsi maltooligosakarida

yang disintesis secara enzimatik

menggunakan amilase Bacillus

licheniformis BL1. Berita Biologi 10: 1-

4

Dubois, Gilles KA, Hamilton JK, Rebers PA,

Smith F. 1956. Colorimetric method for

determination of sugar and related

substance. J Anal Chem 28: 350 – 356.

Du H & Chen XQ (2009). Comparative study

of the separation ofoleanolic acid and

ursolic acid in Prunella vulgaris by

High Performance Liquid

Chromatography and Cyclodextrin-

Modified Micellar Electrokinetic

Chromatography. J. Iran Chem. Soc.,

6(2):334-340.

[FAO] Food Agriculture Organization. 2007.

FAO Technical Meeting on Prebiotics.

Roma: FAO.

Fai YM, Tao CC (2009). Literature review on

Pharmacutical activitiesof oleanolic

acid. Nat. Proda Med., 2: 291-298.

Feng JH, Chen W, Zhao Y, Ju XL (2008).

Anti-tumor activity ofoleanolic, ursolic

and glycyrrhetinic acid. Open Nat.

Prod. J., 2: 48-52.

Gruner E and Alexander. 1993.

Characterization of Brevibacterium sp.

from Clinical Specimens Journal of

Clinical Microbiology: American. Vol

3(6), hal.1.

Lee JW, Kwon TO, Moon IS. 2003.

Adsorption of monosaccharides,

disaccharides, and

maltooligisaccharides on activated

carbon for separation of maltopentaose.

J Carbon 42: 371-380.

Manning T, Gibson GR. 2004. Prebiotics:

Best practice and research. J Clinical

Gastroenterol 28 (12): 287 – 298.

Marlis Agani. 2008. Isolasi Oligosakarida Ubi

Jalar (Ipomoea batatas L.) dan

Pengaruh Pengolahan terhadap Potensi

Prebiotiknya [Tesis]. Sekolah

Pascasarjana. Institut Pertanian Bogor.

Tidak dipublikasikan.

Marks, Dawn B, Allan D. Marks & Collen M.

Smith. 2000. Biokimia Kedokteran

Dasar: Sebuah Pendekatan Klinis

(Basic Medical Biochemistry: A

Clinical Approach). Joko Suyono, Vivi

Sadikin, Lydia I. Mandera (eds). ECG,

Jakarta.

Miller GL. 1959. Use of dinitrosalicylic acid

reagent for determination of reducing

sugar. J Anal Chem 31: 426-428.

Nakakuki T. 2002. Present status and future of

functional oligosaccharides

development in Japan. J Pure Appl

Chem 74 (7): 1245 – 1251.

Nugraheni M. 2011. Pengaruh Coleus

tuberosus terhadap in vitro antioksidan,

mencegah perbanyakan sel, dan

apoptosis [Disertasi]. Yogyakarta:

Universitas Gajah Mada, Fakultas

Teknologi Pertanian.

Rahmani N, Yopi, Indriani A, Awan. 2011. (a)

Karakteristik dan Pengembangan

14

Karbohidrat dari Umbi Kentang Hitam

(Coleus tuberosus Benth), Ubi Kayu

(Manihot esculenta) [Laporan Teknis].

Bogor: Lembaga Ilmu Pengetahuan

Indonesia.

Rahmani N, Yopi, Andriani A, Prima A. 2011.

(b) Production and characterization of

amylase enzyme from marine bacteria.

Proceedings of the International

Seminar on Chemistry for a better

future, 24-25 November 2011,

Jatinangor.

Robyt JF, Ackerman RJ. 1971. Isolation,

Purification, and Characterization of a

maltotetraose-producing amylase from

Pseudomonas stutzeri. Arch Biochem

Biophys. 145: 14-105

Rohanah.2012. Peranan Enzim Amilase dari

Brevibacterium sp. dalam

Menghidrolisis Pati Kentang Hitam

[Skripsi]. Bogor. Institut Pertanian

Bogor, Fakultas Teknologi Pertanian.

Ruberfroid M. 2007. Prebiotics: the concept

revisited. J Nut 137: 830-837.

Rycroft CE, MR Jones, GR Gibson, and RA

Rastall. 2001. A Comparative in Vitro

Evaluation of the Fermentation

Properties of Prebiotic

Oligossacharides. Journal of Applied

Microbiology 91, 878-887

Sakuma K. 2002. Molecular Mechanism of the

Effect of Fructooligossacharides on

Calcium Absorption, Bioscience

Microflora 21, 13-20.

Sachslehner A, Gabriele F, Nikolaus F, Georg

Gu bitz, and Dietmar H. 2000.

Hydrolysis of Isolated Coffee Mannan

and Coffee Extract by Mannanases of

Sclerotium rolfsii. Journal of

Biotechnology 80:127-134.

Soga T. 2002. Analysis of carbohidrates in

food and bevarages by HPLC and CE. J

Cromatogy Library 66:483-502.

Suskovic J et al. 2001. Role of lactic acid

bacteria and bifidobacteria in symbiotic

effect. J of Food Technology and

Biotechnology 39 (3): 227-235.

Takasaki Y. 1982.Producing of Maltohexaosa

by α-amylase from Bacillus circulans

G-6.Agric Biol Chem 46: 52-345.

Taniguchi H, Jae CM, Yoshigi N, Maruyama

Y. 1983. Purification of Bacillus

circulans F-2 Amylase and its General

Properties. Agric Biol Chem 47: 9-511

Wako K, Hashimoto S, Kubomura S, Yokota

K, Aikawa K, Kanaeda J. 1979.

Purification and some Properties of a

Maltotriose-producing Amylase. J Jpn

Soc Starch Sci. 26: 81-175.

Weston RJ, Brockleblank LK. 1999. The

oligosaccharide composition of some

New Zealand honeys. Food Chem

64:33-37

Winarno. 2010. Enzim Pangan. Bogor: M-

Brio press.

Yoon H, Liu RH (2008). Effect of 2 α-

hidroxyursolic acid on NF-Bactivation

induced by TNF-α in human breast

cancer MCF-7 cells. J.Agric. Food

Chem., 56: 8412-8417.

Zou S & Chen W (2008). Determination of

oleanolic acid and ursolicacid in

different parts of Perilla frutescens by

High Performance Liquid

Chromatography. J. Braz. Chem. Soc.,

19(7): 1429-1432.

15

LAMPIRAN

16

Lampiran 1 Diagram alir penelitian

Produksi ekstrak kasar enzim amilase

Hidrolisis pati kentang hitam sampel segar, sampel freeze dry, dan

sampel evaporasi

Analisis komposisi karbohidrat (TLC gula reduksi,

gula total, dan derajat polimerasi)

Analisis profil

oligosakarida dengan

HPLC

17

Lampiran 2 Hidrolisis substrat

Substrat 2.5% + ekstrak kasar enzim amilase

(perbandingan 1:5)

Hidrolisis enzimatis selama 4 jam, suhu 30oC

Hasil hidrolisis

Dipanaskan disuhu 100oC

Hidrolisis enzimatis selama 4 jam, suhu 30oC,

Disentrifus 12000 rpm, 15 menit, 4oC Pelet dibuang

supernatan Analisis gula total,

gulareduksi, derjat

polimerasi, TLC, dan

HPLC

Freeze drying dan evaporasi

Oligosakarida hasil pemekatan

Dianalisis gula total, gula reduksi,

derajat polimerasi, TLC, dan HPLC

18

Lampiran 3 Standar glukosa dan nilai aktivitas enzim

Aktivitas Enzim Amilase dari Brevibacterium sp. pada panjang gelombang 540

nm

No

Enzim

Absorban Sampel Absorban

Kontrol (K) Rerata-K ppm sampel

Aktivitas

enzim U/mL 1 2

1 0.394 0.427 0.276 0.134 87.750 3.250

2 0.355 0.352 0.272 0.081 61.250 2.268

3 0.334 0.333 0.214 0.119 80.250 2.972

4 0.380 0.296 0.291 0.047 44.000 1.629

Rumus aktivitas enzim

Aktivitas Enzim =

Keterangan:

C : Konsentrasi sampel (mg/mL)

Fp : Faktor Pengenceran

t : Waktu

BM : Bobot molekul

[Glukosa] (ppm) Absorban RerataAbsorban

(λ) Ulangan 1 Ulangan 2

Blanko 0 0 0

0.2 0.040 0.036 0.038

0.4 0.135 0.158 0.146

0.6 0.284 0.282 0.283

0.8 0.383 0.405 0.394

1.0 0.515 0.500 0.507

19

Lampiran 4 Kurva kalibrasi glukosa

[Glukosa]

(ppm)

Absorban Rerata

Absorban (λ) Ulangan 1 Ulangan 2

0 0 0 0

62.5 0.072 0.085 0.08

125 0.259 0.268 0.26

250 0.579 0.597 0.59

500 1.224 1.24 1.23

1000 2.101 2.114 2.11

Y = 0.002X + 0.012 R

2=0.991

20

Lampiran 5 Hasil analisis kandungan gula pada sampel segar

Analisis gula total pada kondisi optimum konsentrasi 2,5%, suhu ruang, waktu 4

jam, perbandingan enzim:substrat = 1:5

Ulangan Absorban Kontrol S-K Gula total

1 0.633 0.187 0.446 89,194

2 0.725 0.155 0.570 113,994

3 0.653 0.197 0.456 91,194

Rerata 0.670 0.179 0.490 95600

Fp = 400x

y = 0.002x + 0.012

y = absorbansi

x = konsentrasi gula pereduksi (ppm)

Analisis gula reduksi pada kondisi optimum konsentrasi 2,5%, suhu ruang, waktu

4 jam, perbandingan enzim:substrat = 1:5

Ulangan Absorban Kontrol S-K Gula reduksi

1 0.277 0.018 0.259

2 0.280 0.018 0.262

3 0.272 0.018 0.254

Rerata 0.276 0.018 0.258 7482.5

Perhitungan Gula reduksi sampel segar:

Persamaan kurva standar glukosa: y= 0.002x – 0.041

Fp = 50x

Derajat Polimerasi =

=

= 12.7764

21

Lampiran 6 Hasil analisis kandungan gula sampel freeze dry

Gula Total sampel hasil Freeze Dry


1 0.523 0.187 0.336

2 0.538 0.155 0.383

3 0.543 0.197 0.346

Rerata 0.535 0.179 0.357 69000

Fp = 400x

Y = 0.002X + 0.012

Gula reduksi hasil freeze dry


1 0.334 0.020 0.015

2 0.411 0.022 0.023

3 0.352 0.020 0.017

Rerata 0.3656 0.0207 0.345 9647.5

Fp = 50x

Y = 0.002x + 0.041

0.3449= 0.002x – 0.041

X = 192.95 ppm x 50

= 9647.5 ppm


=

= 7.1521

22

Lampiran 7 Hasil analisis kandungan gula sampel evaporasi

Gula total sampel hasil evaporasi


1 0.536 0.187 0.336

2 0.591 0.155 0.383

3 0.489 0.197 0.346

Rerata 0.5387 0.179 0.359 69540

Fp = 400x

Y = 0.002X + 0.012

Gula reduksi hasil sampel evaporasi


1 0.677 0.044 0.259

2 0.535 0.043 0.262

3 0.571 0.030 0.254

Rerata 0.5943 0.039 0.555 14908.3

Perhitungan Gula reduksi oligosakarida hasil evaporasi:

Fp = 50x

Y = 0.002x + 0.041


=

= 4.6645

23

Lampiran 8 Kromatogram Standar dengan perbandingan fase gerak 75:25

kecepatan aliran 1.4 mL/min

Standar Waktu Retensi Konsentrasi (ppm)

Glukosa 6.314 50000

Maltosa 10.371 50000

Maltotriosa 16.783 5000

Maltopentosa Tidak muncul 5000

24

Lampiran 9 Kromatogram Standar dengan perbandingan fase gerak 60:40

kecepatan aliran 1 mL/min

Standar Waktu Retensi Konsentrasi (ppm)

Glukosa 4.742 50000

Maltosa 5.309 50000

Maltotriosa 5.977 5000

Maltopentosa 7.567 5000

25

Lampiran 10 Kromatogram HPLC sampel segar hasil hidrolisis

26

Lampiran 11 Kromatogram HPLC sampel hasil freeze dry 2.5%

27

Lampiran 12 Kromatogram HPLC sampel hasil freeze dry 5%

28

Lampiran 13 Kromatogram HPLC sampel hasil freeze dry 10%

29

Lampiran 14 Kromatogram HPLC sampel hasil evaporasi 2.5%

30

Lampiran 15 Kromatogram HPLC sampel hasil evaporasi 5%

31

Lampiran 16 Kromatogram HPLC sampel hasil evaporasi 10%

Documents

ANALISIS OLIGOSAKARIDA HASIL HIDROLISIS PATI … · Perkenalan Kampus Mahasiswa Baru (MPKMB), tahun 2010 sebagai divisi acara ... baca puisi tingkat nasional dan tulisan-tulisan fiksinya