Eletroforese capilarEletroforese capilar

Analítica V: Analítica V: Aula 11

Prof. Rafael SousaDepartamento de Química Departamento de Química -- ICEICErafael.arromba@ufjf.edu.brrafael.arromba@ufjf.edu.br

Notas de aula: www.ufjf.br/baccanNotas de aula: www.ufjf.br/baccan

EEletroforeseletroforese CCapilarapilar (EC)(EC)

TÉCNICA ELETROANALÍTICATÉCNICA ELETROANALÍTICA

HISTÓRICOHISTÓRICOCriada por Criada por ArneArne TiseliusTiselius para estudar proteínaspara estudar proteínasem soro na década de 30 (prêmio Nobel em 1948)em soro na década de 30 (prêmio Nobel em 1948)em soro na década de 30 (prêmio Nobel em 1948)em soro na década de 30 (prêmio Nobel em 1948)

APLICAÇÕESAPLICAÇÕESCompostos orgânicos e inorgânicosCompostos orgânicos e inorgânicosMacromoléculas (DNA e RNA)Macromoléculas (DNA e RNA)

Introduzida como técnica instrumental (1981): ECIntroduzida como técnica instrumental (1981): ECJorgensonJorgenson e e LukacsLukacs

EC EC -- Técnica instrumentalTécnica instrumental

CapilarCapilar preenchido com uma solução tampãopreenchido com uma solução tampãoimerso em recipientes contendo o mesmo tampão (potencial)

Amostra é depositada na extremidade do capilar oposta ao detectorVoltagens de 5 – 60 kV

Correntes de 10 – 100 mA (FEO)

Detector espectrofotométrico de UV-Vis

Principio da separação em eletroforesePrincipio da separação em eletroforese

Diferença nas velocidades de migração de compostos diferentes quando aplicadouma ddp entre as extremidades do capilar

ν = µe E µe ���� mobilidade eletroforética

E ���� força do campo elétrico (POTENCIAL/DISTÂNCIA)

�Altos potenciais ���� velocidade de migração elevada ���� separação rápida�Altos potenciais ���� velocidade de migração elevada ���� separação rápida

EFICIÊNCIA DA SEPARAÇÃO: NÚMERO DE PRATOS TEÓRICOS (N)

µe VN = D ���� coeficiente de difusão (cm2 s-1)

2D

N é geralmente superior àqueles conseguidos em CLAE !

Fluxo Fluxo eletroosmóticoeletroosmótico (FEO)(FEO)

Dependente do pH (Dependente do pH (geralmente acima de 3geralmente acima de 3): ionização dos grupos ): ionização dos grupos silanóissilanóis

�Velocidade de fluxo uniforme esem pressão (em contrário à CLAE)

�Atua como uma “bomba”

� Não favorece o alargamento de pico

InstrumentaçãoInstrumentação

(4 (4 –– 5 5 µLµL))

Eletrodos de Eletrodos de PtPt

Introdução da amostraIntrodução da amostra

Volumes de 10 a 100 nL são introduzidos no capilar

Não

func

iona

qu

ando

se

ench

e o

capi

lar c

om g

el

capilar

Det

ecto

r

pressãopressão vácuovácuocapilar

Detector

Favorece a injeção de uma quantidademaior dos íons de maior mobilidade

Não

func

iona

qu

ando

se

ench

e o

capi

lar c

om g

el

eletrocinéticoeletrocinéticosifonamentosifonamento

capilarcapilar

Reservatório de eletrólito Reservatório de eletrólito

DetectorDetector

amostraamostraamostraamostra

amostraamostra amostraamostra

Reservatório de eletrólito Reservatório de eletrólito

CapilaresCapilares

Comprimento Comprimento de 25 de 25 –– 100 cm 100 cm

Diâmetro interno Diâmetro interno de 10 de 10 –– 100 100 µmµm

�� VidroVidro�� TeflonTeflon (não usado com as voltagens mais elevadas)(não usado com as voltagens mais elevadas)�� TeflonTeflon (não usado com as voltagens mais elevadas)(não usado com as voltagens mais elevadas)

�� Sílica fundidaSílica fundida

A superfície interna A superfície interna pode ser quimicamente modificadapode ser quimicamente modificada

O capilar é refrigerado O capilar é refrigerado externamente por ar ou líquido externamente por ar ou líquido ((repetibilidaderepetibilidade))

DetectorDetector

�������� Responde à passagem das espécies “Responde à passagem das espécies “onon--columncolumn””(Cada espécie apresenta um tempo de passagem diferente)

�������� VÁRIOS TIPOS VÁRIOS TIPOS de detectores de detectores PODEM SER USADOSPODEM SER USADOS

Mais comum: Espectrofotométrico no Mais comum: Espectrofotométrico no UVUV--VisVis�� caráter “universal”caráter “universal”�� caráter “universal”caráter “universal”

Outros exemplos:Outros exemplos:- Fluorescência induzida por laser

- Amperométricos, condutométricos(precisam ser devidamente isolados, eletricamente, do capilar)

Acoplamento com outras técnicasAcoplamento com outras técnicas- Espectrometria de massas (informações estruturais)

Sinal analíticoSinal analíticoEletroferogramaEletroferograma:: resposta em função do temporesposta em função do tempo

�� Diferença na mobilidade dos solutosDiferença na mobilidade dos solutos

-- CátionsCátions migram mais rápidomigram mais rápido

-- Compostos neutros (em uma única “zona”) seguem o FEO Compostos neutros (em uma única “zona”) seguem o FEO (cetonas)

-- ÂnionsÂnions migram mais lentamente (vão no sentido contrário ao FEO)migram mais lentamente (vão no sentido contrário ao FEO)

Fatores que afetam o sinalFatores que afetam o sinal

�� Aquecimento Aquecimento JouleJoule

A passagem da corrente promove um aquecimento do capilar A passagem da corrente promove um aquecimento do capilar �� CAUSA alargamento dos picosCAUSA alargamento dos picos

PARA EVITAR: PARA EVITAR: - Usar voltagem e tampão em conc. adequadas

�� ComprimentoComprimento de “injeção”de “injeção”�� ComprimentoComprimento de “injeção”de “injeção”Comprimentos na ordem de mm podem ser grandes, pois aComprimentos na ordem de mm podem ser grandes, pois ajanela de detecção é da ordem de 0,1 mmjanela de detecção é da ordem de 0,1 mm�� CAUSA alargamento dos picosCAUSA alargamento dos picos

PARA EVITAR:PARA EVITAR:- Usar um solvente com força iônica menor que a do tampão

Análise Análise qualiquali e e quantitativaquantitativa

�������� Necessidade de calibraçãoNecessidade de calibração

Compara-se a respostade PADRÕES e AMOSTRAS nas mesmas condições

� Respostas (nos tempos de migração correspondentes):

- Áreas dos picos (de espectros UV-Vis, p. ex)

- Construção de curvas de calibração

Análise quali e quantitativaAnálise quali e quantitativa

Exemplo de resultadoExemplo de resultado

Modos de separação por eletroforeseModos de separação por eletroforese

- Eletroforese capilar em solução livre (ECSL)

- Eletroforese capilar em gel (ECG)

- Isotacoforese capilar (IC)

- Eletrocromatografia capilar micelar (ECCM)

- Eletroforese capilar com focalização isoelétrica (ECFI)

Modos de separação por eletroforeseModos de separação por eletroforese

•• Eletroforese capilar em solução livre (ECSL)Eletroforese capilar em solução livre (ECSL)

�� Baseada nas diferenças das velocidades de migração deBaseada nas diferenças das velocidades de migração deespécies iônicas espécies iônicas em um dado tampãoem um dado tampão

�� Não serve para espécies neutrasNão serve para espécies neutras(a menos que sejam derivatizadas)

• Eletroforese capilar em gel (ECG)Eletroforese capilar em gel (ECG)

�� O capilar é O capilar é preenchido por um gel preenchido por um gel com tamanho de porocom tamanho de poroapropriadoapropriado

�� Macromoléculas como DNA podem ser separadas em funçãoMacromoléculas como DNA podem ser separadas em funçãodo tamanho do tamanho (menores ficam menos retidas, ao contrário da CE)(menores ficam menos retidas, ao contrário da CE)

�� Como o FEO é suprimido não ocorre separação das espéciesComo o FEO é suprimido não ocorre separação das espéciesneutrasneutras

Moléculade DNA

Eletroforese capilar em gel (Eletroforese capilar em gel (ECG))

Modos de separação por eletroforeseModos de separação por eletroforese

•• IsotacoforeseIsotacoforese capilar (IC)capilar (IC)

�� Em Em um dos um dos tampões: íons com alta mobilidade (dianteiros)tampões: íons com alta mobilidade (dianteiros)- localizado próximo ao detector

�� No outro: íons com baixa mobilidade (No outro: íons com baixa mobilidade (terminadoresterminadores))

- componentes da amostra se separam em zonascomponentes da amostra se separam em zonas(de acordo com a sua mobilidade)

- todas essas zonas se movem com a mesma velocidade- Na quantificação se mede os comprimentos das zonas- Na quantificação se mede os comprimentos das zonas

•• Eletroforese capilar com focalização isoelétrica Eletroforese capilar com focalização isoelétrica ((ECFI))

�� Substâncias Substâncias anfóterasanfóteras ((proteínasproteínas) ficam focalizadas em uma) ficam focalizadas em umadada região do capilar devido a um gradiente de pHdada região do capilar devido a um gradiente de pH

�� UtilizaUtiliza--se uma mistura de se uma mistura de anfólitosanfólitos ** para dissolver a amostrapara dissolver a amostra

�� O O cátodocátodo é mantido em pH alto e o é mantido em pH alto e o ânodoânodo em pH baixoem pH baixo

* * ácsács. poliméricos sintéticos. poliméricos sintéticos

Eletroforese capilar com focalização isoelétrica (Eletroforese capilar com focalização isoelétrica (ECFI))

“A”, “B” e “C”“A”, “B” e “C” ficamficam“focalizadas” na região de“focalizadas” na região de

pH que corresponde aopH que corresponde aoseu ponto isoelétricoseu ponto isoelétrico

•• EletrocromatografiaEletrocromatografia capilar capilar micelarmicelar ((ECCM) ) –– técnica híbridatécnica híbrida

�� UtilizaUtiliza--se eletrólitos contendo conc. elevadas de surfactantesse eletrólitos contendo conc. elevadas de surfactantesa ponto de formarem micelas (carga neg.)a ponto de formarem micelas (carga neg.)

�� Espécies positivasEspécies positivas movemmovem--se mais lentamentese mais lentamente�� EEspécies neutras spécies neutras sofrem partição entre as micelas e a fasesofrem partição entre as micelas e a fase

aquosa do tampão (migração intermediária)aquosa do tampão (migração intermediária)�� Espécies negativas Espécies negativas são repelidas pelas micelas e migram maissão repelidas pelas micelas e migram mais

rapidamenterapidamente

�������� VANTAGEM SOBRE CLL:VANTAGEM SOBRE CLL:Maior eficiência de separaçãoMaior eficiência de separação

Vantagens e desvantagensVantagens e desvantagens

VANTAGENS:VANTAGENS:

�� Elevada Elevada frequenciafrequencia analítica (rapidez)analítica (rapidez)�� VersatilidadeVersatilidade�� Baixo custoBaixo custo

-- Baixo consumo de amostras, reagentes e solventesBaixo consumo de amostras, reagentes e solventes�� Desempenho analítico satisfatórioDesempenho analítico satisfatório�� Desempenho analítico satisfatórioDesempenho analítico satisfatório

-- Excelentes separações e resoluçõesExcelentes separações e resoluções�� Possibilidade detecção Possibilidade detecção onon lineline

DESVANTAGENS:DESVANTAGENS:

�� Não se aplica Não se aplica a todos os tipos de compostos, como:a todos os tipos de compostos, como:-- Voláteis, apolares e/ou de baixa massa molar Voláteis, apolares e/ou de baixa massa molar (adequados para CG)(adequados para CG)

-- Polímeros iônicos de massa molar altaPolímeros iônicos de massa molar alta

Referências

SkoogSkoog,, DD.. AA..,, Holler,Holler, FF.. JJ.;.; NiemanNieman,, TT.. AA..PrinciplesPrinciples ofof InstrumentalInstrumental AnalysisAnalysis

55thth eded..,, SaundersSaunders CollegeCollege Publishing,Publishing, 19981998

Harris,Harris, DD.. CC..AnáliseAnálise QuímicaQuímica QuantitativaQuantitativa

77aa eded..,, LTCLTC –– LivrosLivros TécnicosTécnicos ee CientíficosCientíficos Editora,Editora, 20082008

Grossman, P. D.; Colburn. J. C. CapillaryCapillary Electrophoresis. Theory and PracticeElectrophoresis. Theory and Practice

Academic Press Inc., 1992

Queiroz, SCN; Jardim, ICSF; “Eletroforese Capilar”, Chemkeys, 2001

Tavares, MFM; “Eletroforese Capilar: Conceitos Básicos”, Quim. Nova, 19 (1996) 173

Questões

1- Defina eletroforese capilar e explique o que é o fluxoeletroosmótico.

2- Em relação ao sinal analítico, qual é o perfil esperadopara um eletroferograma? Justifique.para um eletroferograma? Justifique.

3- Cite duas fontes de alargamento de banda naeletroforese capilar e comente como este problema podeser minimizado.