Upload
mariah
View
48
Download
0
Embed Size (px)
DESCRIPTION
ANALIZA METABOLITÓW ROŚLIN TRANSGENICZNYCH Z PODWYŻSZONĄ ZAWARTOŚCIĄ FLAWONOIDÓW. BamHI. HindIII. SacI. EcoRI. Promotor GT. NOS. Petunia hybrida DFRa cDNA. pBinAR. Rośliny pGT/DFR. Promotor genu transferazy glukozowej (GT), gdyż: jest regulowany czynnikami środowiskwymi - PowerPoint PPT Presentation
Citation preview
ANALIZA METABOLITÓW ANALIZA METABOLITÓW ROŚLIN TRANSGENICZNYCH Z ROŚLIN TRANSGENICZNYCH Z
PODWYŻSZONĄ PODWYŻSZONĄ ZAWARTOŚCIĄ ZAWARTOŚCIĄ
FLAWONOIDÓWFLAWONOIDÓW
Petunia hybrida DFRa Petunia hybrida DFRa cDNAcDNA
NOSNOSPromotor Promotor GTGT
HindIII BamHI
SacI EcoRI
pBinAR
Promotor genu Promotor genu transferazy transferazy glukozowej (GT), glukozowej (GT), gdyż:gdyż:
jest regulowany jest regulowany czynnikami czynnikami środowiskwymiśrodowiskwymi
jest tkankowo-jest tkankowo-specyficznyspecyficzny
Gen reduktazy Gen reduktazy dihydroflawonlu (DFR), dihydroflawonlu (DFR), gdyż:gdyż:
DFR jest kluczowym DFR jest kluczowym enzymem na szlaku enzymem na szlaku biosyntezy antocyjanówbiosyntezy antocyjanów
Rośliny pGT/DFRRośliny pGT/DFR
Celowość tworzenia roślin Celowość tworzenia roślin pGT/DFRpGT/DFR
Ekspresja genu DFR pod kontrolą promotora Ekspresja genu DFR pod kontrolą promotora genu transferazy glukozowej pozwala na genu transferazy glukozowej pozwala na zwiększanie puli flawonoidów w roślinie:zwiększanie puli flawonoidów w roślinie:
w określonych tkankach w określonych tkankach
w określonych warunkach ( czynniki w określonych warunkach ( czynniki stresowe)stresowe)
1 AATTTAATTG ATAATACTTA CCTATTAAAT AAATTTCTTA AGATAAATAT AAATACAGAA
61 AATTGATTTG AATAATGCTA TTCAAGTCAT AGTGGCAAGA TTGAAGTAAA AAAAAAAAAG
121 AAATTGCATT TTATTTTATT TAGTTTTCAA ATTTAGTTCA TTATTTAGCT CAAAATATAT
181 CCAAATTAAG TTAAAATTTA CAATGTCAAT AACTAAAATA TAAAGTTTAT TTTTTTTAAA
241 AAAAAGAGAA CATTATATAT ATATTGATCC ATAGCATTTA ATGCCATAAA ATTTCCGTTA
301 ATAAAAGAAA GAGAACAACA TTCCATGTGG TGGTCAATAC ATATTCGGTA TATCATGTGA
361 CAATTATTAA TGACGAATTT AAAATTTAAA TTTTATAAAT TTAAAACTAA CTTATTATAT
421 TTTTAAAGTT ACAAATCCAT AATTACTAGT ATATTTATTA CAATTTGAAT AATATTTTAT
481 ATATAAATTA ATTTTTTACG TTAAAAATAT TATATTCAAA AGAACTCGAT ACTATGACGT
541 TAGATCAGCC CGTGATAGAT GCATCAAAAT CCATGCCCAA CTTCAATCTC TACATTGTAT
601 CTGGCTATCC TAGATTAGGC AGTAGCTTGC CAGAAGTTTT TATTTTTATA ATAATTGAAT
661 TAAAAAATAA TAATAACAGA AACATATTCC AGACAACTCA TGTCATGCAT GACAAATTCT
721 GAAATTGGGC TTACTGGCTA CTGCTGAAAG GTATGGCTCA CTAACCAAAA TAAAATACTA
781 GTGCCCACAA CGAGTGATGG AGTGGTAAGA TTACTCTGTC TTTAGTAAAG ATCTGGAATT
841 TCAATTTTAA ATATGAAGAA AATTTGGTTA GGAGTATCAC TCCCAAATGA GCTTTGCATT
901 GCACGATTCG AATTTAGGCG AAGGTCCAGC GGTGAGAAAC TACCAAACAC AATCCATACA
961 ATAGTAGAAT TTATTTATTT TCTTGCATCA ATTTGTTTTT CTTTTTTTAG ACCGTTTGAT
1021 AAAAATGTCT TTTTTCCTTT TTGATAATTA TTTAATTTTT GATTTTTTAC ATGATATATT
1081 TAAAATTAGA GAATTAAAGA ACGTTTTAGT ACATATATTT AATTTAAGAT TTTAAAACTT
1141 AAAAGTCTTA TTTTCTTTTG TAAATTACGT ATCAAATTAA AATTAGTTAA ATAAATAAAA
1201 ACAAAATATT TGTTTTGCAA GTAAGATAAA TAGTCACTCT CTTCTGTCCA TCTGGTGTTT
1261 TTTCTATAGA ATTAAATAAA TTAAAAGAAA GAAACAAAAA CGAAGTACCG GCAAAATTTG
1321 TCTTCTCATC AATTTCGTCA CCTCAAACGT CATATGACAT GCATGTGTTT AAATTTGGTC
1381 CTCAAACATG TTACTCAAAC GTAGAAATGG ACATGATGGG ATAGATATTG AAATTTTTAC
1441 TAACGTAACG TGCTCACCCC TACAAACTCC TTATATATAT CCCTCTAACT ATCATCATAT
1501 ATACCACACA ATAATTAAGA GTCTTACAAG TCAAAGATTT CTCTCACACA ATACTAAAGT
1561 CTACTTTCAT TCATTTGACC TCGAACTTTG AACTTAGGTT CTATTTTAAG TTTGTGAGTG
1621 TAAAAATGATG
SEKWENCJE INDUKOWANE PROMIENIOWANIEM UV
sekwencja homologiczna z fragmentem promotora genu liazy fenyloalanyloamoniowej z pietruszki CCCCTACAAACCCTTCCCCTACAAACCCTTSEKWENCJE INDUKOWANE
KWASEM ABSCYSYNOWYM (ABA)
E – boxy
sekwencja genu β – konglicyniny
motyw ABRE
SEKWENCJE REGULOWANE ŚWIATŁEM
I – boxy
sekwencja CCCCTACAAACCCTTCCCCTACAAACCCTT
sekwencja GAAAGAAGAAAGAA
motywy GATAGATA, , GT1GT1, , G - boxyG - boxy
PROMIENIOWANIE UVPROMIENIOWANIE UV
5,5 X
0
100
200
300
400
500
600
700
15min 30min
acti
vit
y (
%)
próba kontrolna
próba naświetlana UV-C
NISKA TEMPERATURANISKA TEMPERATURA
0
100
200
300
400
500
600
700
0h 6h 12h 24h 48h
ac
tiv
ity
(%
)
pGT/GUS, 22C
pGT/GUS, 4C
6 X6 X
KWAS KWAS ABSCYSYNOWYABSCYSYNOWY
0
200
400
600
800
1000
1200
0h 12h 24h 48h
acti
vity
(%
)
8 X8 X
pGT/ GUS
pCaMV35S/ GUS
0
100
200
300
400
500
600
700
0h 8h 12h
%ac
tivi
ty
ŚWIATŁOŚWIATŁO
pGT/ GUS
pCaMV35S/ GUS
5 X5 X
BULWA LIŚĆ KORZEŃ
- miękisz gąbczasty
- miękisz palisadowy
- cortex
- cortex
- komórki przy wiązkach przewodzących
DFR / dihydroflavonol 4-reductase -DFR / dihydroflavonol 4-reductase - katalizuje reakcję redukcji dihydroflawonolu do katalizuje reakcję redukcji dihydroflawonolu do leukoantocyjanidynyleukoantocyjanidyny
EcoRI Ncol EcoRV KpnI BamHI HindIII
promotor terminator
CaMV35S Petunia hybrida DFR cDNA OCS
Konstrukt DFR EcoRI Ncol EcoRV KpnI BamHI HindIII
promotor terminator
CaMV35S Petunia hybrida DFR cDNA OCS
Konstrukt DFRanty
Desi DFR DFRa
2 0 0 2 r .
2 0 0 1 r .
2 0 0 3 r .
0
1 1 0
2 2 0
3 3 0
D D F R 2 D F R 5 D F R
1 1
D F R a
1
D F R a
2
D F R a
3
mg/1
00gD
W
0
1 5
3 0
4 5
D D F R 2 D F R 5 D F R
1 1
D F R a
1
D F R a
2
D F R a
3
mg/1
00gD
W
0
7 0
1 4 0
2 1 0
D D F R 2 D F R 5 D F R
1 1
D F R a
1
D F R a
2
D F R a
3
mg/1
00gD
W
0
3 0
6 0
9 0
D D F R 2 D F R 5 D F R
1 1
D F R a
1
D F R a
2
D F R a
3mg
/100
gDW
0
5 0
1 0 0
1 5 0
2 0 0
D D F R 2 D F R 5 D F R
1 1
D F R a
1
D F R a
2
D F R a
3
mg/1
00gD
W
0
1 0
2 0
D D F R 2 D F R 5 D F R
1 1
D F R a
1
D F R a
2
D F R a
3
mg/1
00gD
W
p e t u n i d y n a 3 - r u t 5 - g l c a c y l o w a n a k w a s e m p - k u m a r o w y m
p e l a r g o n i d y n a 3 - r u t 5 - g l c a c y l o w a n a k w a s e m p - k u m a r o w y m
Zawartość Zawartość antocyjanówantocyjanów
2001r.
0
0,1
0,2
0,3
0,4
Desi DFR 2 DFR 5 DFR11
DFRa1
DFRa2
DFRa3
ug D
W
Potencjał antyoksydacyjny Potencjał antyoksydacyjny (IC50)(IC50)
Zawartość kwasów Zawartość kwasów fenolowychfenolowych
k w a s i z o c h l o r o g e n o w y
0
5 0
1 0 0
1 5 0
D D F R2
D F R5
D F R1 1
D F R a1
D F R a2
D F R a3
mg/10
0gDW
k w a s c h l o r o g e n o w y
0
5 0
1 0 0
1 5 0
D D F R2
D F R5
D F R1 1
D F R a1
D F R a2
D F R a3
mg/10
0gDW
k w a s k a w o w y
0
6 0
1 2 0
1 8 0
D D F R2
D F R5
D F R1 1
D F R a1
D F R a2
D F R a3
mg/10
0gDW
2 0 0 2 r .
k w a s c h l o r o g e n o w y
0
1 0 0
2 0 0
3 0 0
D D F R2
D F R5
D F R1 1
D F R a1
D F R a2
D F R a3
mg/10
0gDW
k w a s k a w o w y
0
6 0
1 2 0
1 8 0
D D F R2
D F R5
D F R1 1
D F R a1
D F R a2
D F R a3
mg/10
0gDW
k w a s i z o c h l o r o g e n o w y
0
1 0 0
2 0 0
D D F R2
D F R5
D F R1 1
D F R a1
D F R a2
D F R a3
mg/10
0gDW
2 0 0 1 r .
Petunia hybrida DFRa Petunia hybrida DFRa cDNAcDNA
NOSNOSPromotor Promotor GTGT
HindIII BamHI
SacI EcoRI
pBinAR
Promotor genu Promotor genu transferazy transferazy glukozowej (GT), glukozowej (GT), gdyż:gdyż:
jest regulowany jest regulowany czynnikami czynnikami środowiskwymiśrodowiskwymi
jest tkankowo-jest tkankowo-specyficznyspecyficzny
Gen reduktazy Gen reduktazy dihydroflawonlu (DFR), dihydroflawonlu (DFR), gdyż:gdyż:
DFR jest kluczowym DFR jest kluczowym enzymem na szlaku enzymem na szlaku biosyntezy antocyjanówbiosyntezy antocyjanów
Rośliny pGT/DFRRośliny pGT/DFR
Analiza roślin pGT/DFRAnaliza roślin pGT/DFR
Selekcja roślin pGT/DFRSelekcja roślin pGT/DFR
Preselekcja metodą PCRPreselekcja metodą PCR
A) PRIMERY NA KANAMYCYNĘA) PRIMERY NA KANAMYCYNĘ
0,5 kb0,5 kb
SEKWENCJA PRIMERÓW:GMO6/1 5’ – CCGACCTGTCCGGTGCCCC-3’
GMO6/2 5’ - CCGCCACACCCAGCCGGCC-3’
H20 Desi BinAR 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10H20 Desi BinAR 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
B) PRIMERY NAMNAŻAJĄCE GEN DFRB) PRIMERY NAMNAŻAJĄCE GEN DFR
SEKWENCJA PRIMERÓW:DFRAR 5'- GGT GCA TTC TCT TTG CCA CTT GC-
3’DFRAF 5‘ - GAC AGT TTG CGT CAC TGG AGC
TG-3’
1,5 kb1,5 kb
H20 Desi DFR 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10H20 Desi DFR 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Analiza Analiza fenotypowafenotypowa
pGT/DFRpGT/DFR DesireeDesiree
Kwitnienie roślin: 6. 07. 2004Kwitnienie roślin: 6. 07. 2004
Wstępna analiza Wstępna analiza metabolitów metodą GCMSmetabolitów metodą GCMS
FENYLOALANINA
0
50
100
150
200
control ABA UV COLD NaCl
%
TYROZYNA
0
50
100
150
200
250
control ABA UV COLD NaCl
%
TRYPTOFAN
0
20
40
60
80
100
120
140
160
control ABA UV COLD NaCl%
prefenian
indol
antranilan
Trp
choryzmian
Tyr
Phe
quinian
heptuzolonian-7P
szikimian
2 PEPD-erytrozo-4P +
cykl pentozowy glikoliza
flawonoidy
POZIOM AMNOKWASÓWPOZIOM AMNOKWASÓW
MANNITOL
0
50
100
150
control ABA UV COLD NaCl
%
SORBITOL
0
50
100
150
200
control ABA UV COLD NaCl
%
PRO
0
20
40
60
80
100
120
140
160
control ABA UV COLD NaCl
%
Glc-6P Fru6P
sorbitolpyruvate
mannitol-1P
2-oxoglutaratesuccinate
fumarate
malate
oxaloacetate citrate
cis-aconitate
isocitrate
Arg Pro metabolism
Tyr metabolism
myo-Inositol-1P
ononitol
mannitol
pinitol
sorbitol-6P
myo-Inositol
phospholipids, phosphoinositides, phytate
raffinose, gums, gluconeogenesis
Protektanty w warunkach Protektanty w warunkach stresustresu
warunki kontrolne
chłód
ABA
UV
CO BĘDZIEMY ROBIĆ:CO BĘDZIEMY ROBIĆ:
• pomiar poziomu antocyjanów w roślinach pomiar poziomu antocyjanów w roślinach pGT/DFR poddanych działaniu czynników pGT/DFR poddanych działaniu czynników stresowych (ABA, UV, CHŁÓD)stresowych (ABA, UV, CHŁÓD)
•oznaczenie potencjału antyoksydacyjnego oznaczenie potencjału antyoksydacyjnego (IC 50) w stresowanych roślinach pGT/DFR(IC 50) w stresowanych roślinach pGT/DFR
prefenian
indol
antranilan
Trp
choryzmian
Tyr
t-cynamonian
p-kumarynian
Phe
quinian
salicylansalicylan-Glc
benzoinian
kawoinian ferulan synapinian
naringenina
suberynyligniny
eriodiktiol
chlorogenian
CHS
CHI
PAL
3-OH-flawanon(dihydroflawonol)
flawan-3,4-diol(leukoantocyjanidyna)
antocyjan
DFR
heptuzolonian-7P
szikimian
katechol
2 PEPD-erytrozo-4P +
p-kumarylo-CoAacetylo-CoA
biosynteza kwasów tłuszczowych
3 malonylo-CoA +
trihydroksychalkon tetrahydroksychalkon
likwirtigenina
2’-hydroksyizoflawanon
izoflawonoid
izoflawon
flawan-4-ol 3-deoksyantocyjanidyny
flawon
aurony
flawonol glukozyd flawonolu
flawan-3-ol
3-OH-antocyjanidyna proantocyjanidyna skondensowane taniny
cykl pentozowy glikoliza
F3HF3’HF3’5’H
ANS
GTOMTRT
DAHP
CM
PDT
CHR
IFSIFS
rezweratrol (stilbeny)
SS
4CL
prefenian
indol
antranilan
Trp
choryzmian
Tyr
t-cynamonian
p-kumarynian
Phe
quinian
salicylansalicylan-Glc
benzoinian
kawoinian ferulan synapinian
naringenina
suberynyligniny
eriodiktiol
chlorogenian
CHS
CHI
PAL
3-OH-flawanon(dihydroflawonol)
flawan-3,4-diol(leukoantocyjanidyna)
antocyjan
DFR
heptuzolonian-7P
szikimian
katechol
2 PEPD-erytrozo-4P +
p-kumarylo-CoAacetylo-CoA
biosynteza kwasów tłuszczowych
3 malonylo-CoA +
trihydroksychalkon tetrahydroksychalkon
likwirtigenina
2’-hydroksyizoflawanon
izoflawonoid
izoflawon
flawan-4-ol 3-deoksyantocyjanidyny
flawon
aurony
flawonol glukozyd flawonolu
flawan-3-ol
3-OH-antocyjanidyna proantocyjanidyna skondensowane taniny
cykl pentozowy glikoliza
F3HF3’HF3’5’H
ANS
GTOMTRT
DAHP
CM
PDT
CHR
IFSIFS
rezweratrol (stilbeny)
SS
4CL
Potencjał antyoksydacyjny (IC50)
0
0,1
0,2
0,3
0,4
Desi DFR2
DFR5
DFR11
DFRa1
DFRa2
DFRa3
Desi DFR2
DFR5
DFR11
DFRa1
DFRa2
DFRa3
ug F
W
Potencjał antyoksydacyjny (IC 50)
Wpływ promieniowania UV na Wpływ promieniowania UV na właściwości antyoksydacyjne roślin z właściwości antyoksydacyjne roślin z
nadekspresją DFRnadekspresją DFR
rośliny CaMV35S/DFR /kontrola
rośliny CaMV35S/DFR/naświetlane UV
Funkcje flawonoidówFunkcje flawonoidów
odporność na patogeny
ochrona przed UV
ODPOWIEDŹ NA STRESY ABIOTYCZNE I BIOTYCZNE