Analiza struktury i funkcji tenascyny-C

Jakub Paś

Pracownia Biochemii tRNA

Tenascyna-C

•Tenascyna-C (Tn-C) jest glikoproteiną macierzy pozakomórkowej.

•Składa się z sześciu monomerów połączonych N-końcem.

•Jej wielkość waha sie pomiedzy 180 a 250 kDA jako rezultat alternatywnego składana.

•Jest białkiem wielodomenowym a dokładna charakterystyka jego domen dotychczas pozostawała nieznana.

Odziaływanie Tenascyny z komórką

Dotychczas na podstawie eksperymentów stwierdzono oddziaływanie Tenscyny-C Z pięcioma typami receptorów.

CT przed operacja

WG

Stadium: IV

Rozmiar guza: 57x47x50 mm

MRI po operacji

D. A. Daniels, H. Chen, B. J. Hicke, K. M. Swiderek, and L. GoldA tenascin-C aptamer identified by tumor cell SELEX: Systematic evolution of ligands by exponential enrichmentPNAS, December 23, 2003; 100(26): 15416 - 15421.

• Tenescyna-C jako terget przeciwko nowotworom mózgu została wyselekcjonowanakilka lat temu*• Okazało się że jej ekspresja jest bardzo specyficzna dla nowotworów mózgu.

Tenascyna-C

• Po raz pierwszy zastosowaliśmy metody bioinformatyczne do przeprowadzenia analizy Tenascyny-C*:

• Wykryliśmy obecność białka hsp33 w N- końcowej części białka, które może sugerować interakcje typu białko – białko w odpowiedzi na stres.

• Ustaliliśmy ilość powtórzeń fibronektyny typu III w Tenscynie oraz powtórzeń EGF.

• Przeprowadziliśmy analizę ekspresji białka na podstawie publicznie dostępnych danych, która została potwierdzone eksperymentalnie.

*Pas J, Wyszko E, Rolle K, Rychlewskia L,Nowak C, Żukiel R, Barciszewski J.Analysis of structure and function of tenascin-CInternational Journal of Biochemistry and Cell Biology

Metoda analizy ekspresji• W celu scharakteryzowania poziomu ekspresji Tn-C w ludzkich tkankach

wykonana została analiza danych ekspresjii pochodzących z publicznych bazach danych. Sekwencja Tn-C została użyta do przeszukania algorytmem BLAST sekwencji z baz danych „GEO Profile” i „UniGene”

• Obie bazy uzupełniają się wzajemnie i stanowią system do automatycznego grupowania sekwencji ulęgających ekspresji w nie redundantne klastry unikalne dla konkretnego genu. Bazy te zawierają informacje o poziomie ekspresji danego genu i rodzaju użytej tkanki.

• Wybrane klastry zostały posortowane pod kontem tkanek nawet jeżeli pochodziły z osobnych eksperymentów czy bibliotek. Następnie pogrupowane manualnie pod względem tkanek (np. nazwy “embryonic stem cells” czy “embryonic cells” brane były pod uwagę razem). Z analizy zostały wykluczone słabo scharakteryzowane tkanki.

• Następnie poziom ekspresji został znormalizowany pod kontem ekspresji. Średnia ekspresja w tkankach zdrowych ustalona została jako 100%.

Analiza ekspresji TN-C

Ekspresja Tenascyny-C w różnych typach komórek ludzkich

Analiza ekspresji TN-C• W komórkach nowotworowych szczególny wzrost ekspresji

obserwowany jest w tkankach skóry, kości i płuc.

• Badania przeprowadzone w naszym laboratorium wykazały zwiększenie ekspresji także w nowotworach mózgu.

Metoda analizy ekspresji

• By sprawdzić czy tenascyna jest rzeczywiście dobrym markerem także w glioblastoma sprawdzona została eksperymentalnie obecność Tn-C na żelu poliakryloamidowym a także ekspresja mRNA z użyciem metody RT/PCR.

• Taka sama procedura została zastosowana dla tkanek pochodzących z jelita i piersi. Poziom ekspresji był podobny w tkankach nowotworowch i różnił się od poziomu ekspresji w komórkach pobranych z obrzeża guza.

Zele białkowe potwierdzajace

a.) Obecność Tenascyny w rożnych typach nowotworów na żelu poliakrylamidowym, 1,2,3 – rak jelita, piersi, guz mózgu, 4- standard (katalaza)

b) Analiza RT/PCR: 1,2,3 1,2,3 – rak jelita, piersi, guz mózgu, 4, 5, 6 GAPDH (Glyseraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), M: Marker.

c ) Porównanie ekspresji Tenascyny w komórkach pobranych z cześci centralnej (1,2) i dystalnej (3,4) glioblastoma, C -standard (katalaza)

a)

b)

c)

Analiza sekwencyjna Tn-C

• Z dotychczasowych badań wynika, iż wielkość Tenascyny-c zmienia się w procesie alternatywnego wycinania intronów kodujących powtórzenia domen fibronektyny.

• Ilość tych powtórzeń jest do końca jasna. Nieznana była też budowa i funkcja pozostałych domen tego białka.

• Nieznany jest wpływ alternatywnego składania na proces nowotworzenia.

Metody

• W celu zidentyfikowania granic domen białkowych użyte zostało oprogramowanie DomainSplit (Wyrwicz L, Pas J. Unpublished).

• Zastosowana • Do zidentyfikowania sekwencji homologicznych Tenascyny-C

wykorzystanie zostało oprogramowanie: Gene Relate Sequence Database (GRDB) (von Grotthus M, Pas J, Rychlewski L)

• System ten zawiera profile sekwencyjne charakterystyczne dla wielu klasyfikacji domen białkowych (from Pfam, COG, the PDB7).

• Porównuje on poszukiwaną sekwencję z około 100 000 rodzin białkowy używając algorytmu Meta-BASIC który w przeciwieństwie do innych nie potrzebuje informacji na temat natywnej struktury białaka na etapie porównywania rodzin.

Metoda profil – profil (GRDB)*• Pierwsze przeszukiwanie

• Query sequence vs Sequence Database

• Drugie przeszukiwanie

• Query Profile vs Profile Database

alignment

alignment

* von Grotthuss M, Wyrwicz LS, Pas J, Rychlewski L Predicting protein structures accurately Science. 2004 Jun 11;304(5677):1597-9;

Ułożenie sekwencyjne domen EGF z Tenascyny-C.

Kolumny o identyczności powyżej 50% oznaczone są kolorem czarnym.

Ułożenie sekwencyjne domen Fibronektyny typu III

Analiza budowy transkryptu TN-CIzoform number

Exons and corresponding protein domains

HSP33,EGFHeptads

FNIII (1-5)

FNIII (6-9) FNIII (10) FNIII (11) FNIII (12) FNIII(13-15),

fibrinogen

Protein molecular mass

(kDa)

1 2-10 11-14 15 16 17 18-28240,8

2 2-10 - 15 - 17 18-28191,3

3 2-10 - 15 16 17 18-28201,3

4 2-10 11-14 15 - 17 18-28230,8

5 2-10 - - - 17 18-28181,5

6 2-10 - - - - 18-28171,3

Metody• W celu wykonania modeli domen Tn-C przeszukiwaliśmy bazę

danych PDB w celu znalezienia homologów zidentyfikowanych domen o znanej strukturze trzeciorzędowej.

• Modelowanie zostało wykonane z użyciem programu MODELER (Sali & Blundell, 1993).

• Aby ocenić lokalne kontakty pomiędzy aminokwasami w modelu i jednocześnie ocenić ich jakość zastosowany został program Verify3D program (Carugo & Pongor, 2002).

• Ocenia on struktury na poziomie aminokwasów, co pozwala użytkownikowi zlokalizować fragmenty białka mające prawidłową i błędną konformację. Program używa informacji o lokalnej strukturze drugorzędowej czy dostępie do rozpuszczalnika.

• Program ten został wykorzystany do poprawy ułożeń sekwencji oraz samych modeli.

Proces modelowaniaGRDB

3D Jury

Modeller Verrify 3D

Domain Split

Domain selection

Structure Prediction

(Profile)

Structure Evaluation

Molecular modelling Quality check

Alignment corection

Query sequence

Final Model

Przewidywanie struktury domen TN-C

a) domena HSP33, b) region heptad, c) EGF, d) fibronektyna typu III (FNIII) z motywem RGD, e) fibrynogen

Budowa TN -C

Dotychczasowe modele sugerują, iż Tenascyna-C może zaburzać procesy formowania się błon komórkowych oraz przyspieszenie produkcji włókien w komórkach.

Odziaływanie Tenascyny z komórką

Podsumowanie

• Budowa TN-C jest bardzo istotnym czynnikiem przekazywania informacji o stresie zwiazanym ze zmianami w błonie komórkowej w procesie nowotworzenia.

• Zmienność izoform TN-C może być kluczowa podczas tworzenia markerów specyficznych dla konkretnych typów nowotworów.

• Na podstawie przeprowadzonych badań określiliśmy kolejny cel badań – rak jajnika.

Pas J, Wyszko E, Rolle K, Rychlewskia L, Nowak C, Żukiel R, Barciszewski J.Analysis of structure and function of tenascin-CInternational Journal of Biochemistry and Cell Biology