199
Analyse der Effekte des hepatotropen Cyanobakterientoxins Microcystin und des Hepatitis B- Virus- x Proteins auf die Zellzyklus- Regulation Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Naturwissenschaften -Dr. rer. nat.- dem Fachbereich Biologie/Chemie der Universitt Bremen vorgelegt von Irina Nickeleit Bremen 2003

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Analyse der Effekte des hepatotropen Cyanobakterientoxins

Microcystin und des Hepatitis B- Virus- x Proteins auf die

Zellzyklus- Regulation

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades

eines Doktors der Naturwissenschaften

-Dr. rer. nat.-

dem Fachbereich Biologie/Chemie

der Universität Bremen vorgelegt

von

Irina Nickeleit

Bremen 2003

mb2000
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Gutachter:

Frau Prof. Dr. Angelika Vallbracht, Bremen

Herr Prof. Dr. Hans Will, Hamburg

Tag des öffentlichen Kolloquiums: 11. Dezember 2003

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Wenn wir uns ins Wissen, in die Wissenschaft begeben, geschieht es denn doch nur, um desto ausgerüsteter ins Leben wiederzukehren. Ideen zu einer Physiognomik der Gewächse von Alexander von Humboldt, Rezension

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Danksagung

Ich möchte mich bei all den Menschen bedanken, die mich in den letzten Jahren begleitet und

unterstützt haben.

Meiner Familie, Gabriela und Reinhard Weiß und den lustigen ײ Pflanzen ײ möchte ich besonders

danken. Insbesondere Rainer Hans danke ich für die tatkräftige Unterstützung bei den LSM-

Aufnahmen.

Außerdem ein herzliches Dankeschön an Frau Petra Ahmann und Frau Katrin Wagner-Prigge für

die hilfreiche Unterstützung und zahlreichen Diskussionen.

Ganz besonders möchte ich mich bei Frau Iris Berk für die gemeinsame lehrreiche, intensive und

einmalige Zeit bedanken. Auch bei unseren Perlen Frau Matthies und Frau Mester bedanke ich

mich für die freundliche Unterstützung in allen Bereichen.

Frau Dr. B. Slagle (Houston, TX (USA)) und Frau Dr. J. Stommel (La Jolla, CA (USA)) danke ich

für die freundliche Überlassung von Arbeitsmaterialien.

Mein besonderer Dank gilt Frau Prof. Dr. A. Vallbracht, die diese wissenschaftliche Arbeit in der

Abteilung für Virologie der Universität Bremen ermöglichte. Insbesondere möchte ich mich für die

Unterstützung bei der schriftlichen Darstellung der ermittelten Daten und Fakten in dieser

komplexen Arbeit bedanken.

An Herrn Prof. Dr. L. Rensing vom Institut für Zellbiologie der Universität Bremen geht mein

besonderer Dank für die wertvollen Anregungen und Diskussionen .

Herrn Prof. Dr. H. Will vom Heinrich-Pette-Institut in Hamburg danke ich für seine freundliche

Unterstützung und für die Erstellung des Zweitgutachtens für diese Dissertation.

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Abkürzungen

Abb. Abbildung

µ mikro

°C Grad Celsius

A.dest. destilliertes Wasser

Ak Antikörper

Amp Ampicillin - Resistenzgen

AS Aminosäuren bzw. Aminosäurenkette

ATM Ataxia telangiectasia mutated kinase

ATR A-T related kinase

bp Basenpaare

BSA Bovine Serum Albumin (Rinderserumalbumin)

CAK cyclin activating complex

cdk cyclin-dependent kinase

cDNA revers transkribierte DNA

Ci Curie

CK1/2 Casein-Kinase 1bzw.2

CKI Cyclin-abhängige-Kinase-Inhibitor

DNA-PK DNA-activated protein kinase

cm Zentimeter

CsCl Cäsiumclorid

dATP Desoxy - Adenosintriphosphat

dCTP Desoxy -Cytidintriphosphat

d Day

DEAE Diethyaminoethyl

DEPC Diethylpyrocarbonat

dGTP Desoxy - Guanosintriphosphat

DMEM Dullbecco`s modifiziertes Eagel `s Medium

DMSO Dimethylsulfoxid

DNA Desoxyribonukleinsäure

dNTP Desoxynukleosidtriphosdphat

ds Doppelstrang

dTTP Desoxythymidintriphospha

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

ERK extracellular ligand-regulated kinase

EtBr Ethidiumbromid

EtOH Ethanol

FCS Fötales Kälberserum

g Gramm

h Stunde

HBV Hepatitis B Virus

HBx Hepatitis B Virus X-Protein

IC50 halbmaximale Hemmkonzentration

IEF Isoelektrische Fokussierung

IgG Immunglobulin G

JNK Jun N-terminal kinase (syn.Stress Activated PK)

Kb Kilobasaen

Kbp Kilobasenpaare

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l Liter

LB - Medium Luria - Bertani - Medium

LCPS Lumescense Count per Second

LSM Lasers-Scanning -Mikroskop

m milli

M Molarität

Mab Monoklonaler Antikörper

MAP Kinase mitogen-activated protein kinase

Mdm-2 Murine Double Minute-2 Protoonkogenprodukt

Met Methionin

mg Milligramm

min Minuten

mL Mililiter

mM Milimolar

mRNA messenger Ribonukleinsäure

MCYST Microcystin

n nano

NES nuclear export signal

nm Nanometer

NTR nichttranslatierte Region

NTS nuclear trabsport signal

OD Optische Dichte

ori origin of replication

p pico

PBS Phoshat- gepufferte isotonische Lösung

PCR Polymerase chain reaction

Pen Penicillin

pH negativer dekadischer Logarithmus der Wasserstoffionenkonzentration

PI isoelektrischer Punkt

PK Ser/Thr-spezifische Proteinkinase

PK-C (Ca2+ abhängige ) Proteinkinase C

PMSF Phenylmethylsulfonyfluorid

PP1 Phospho-Ser/Thr-spezifische Proteinkinase 1

PP2A Phospho-Ser/Thr-spezifische Proteinkinase 2A

pRb Retinoblastomprotein

RNA Ribonukleinsäure

RNase Ribonukleasen

rpm Umdrehungen pro Minute

RT PCR Reverse Transkription PCR

RT Raumtemperatur

s Sekunden

SD Standardabweichung

SDS PAGE Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid

SDS Natriumdodecylsulfat

Ser Serin

ss einzelsträngig

SSC Natriumcitrat

Strep Streptomycin

Tab. Tabelle

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Taq Termus aquaticus

TBE Tris - Bor- EDTA

TBP TATA-Box bindenes Protein

TCA Trichloressigsäure

TE Tris - EDTA

TEMED N, N,N`, N´- Tetramethylethylendiamin

TF Transkriptionsfaktor

Thr Threonin

Tris Tris - (hydroxymethyl) - aminomethan

U Unitis/ Enzymaktivitätseinheiten

ÜN Übernacht - Kultur

UV Ultraviolettes

V Volt

v/v Volumen pro Volumen

Vol Volumen

w/v Gewicht pro Volumen

WAF wt-p53 induced factor

Wt Wildtyp

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Involvement of Hepatitis B virus X protein and cyanobacteria hepatotoxin microcystin in the etiology of HBV- associated HCC

Abstract

Hepatocellular carcinoma (HCC) is one of the major cancers in China. Epidemiological studies have suggested synergistic interactions between chronic hepatitis B virus (HBV) infection and microcystin (MCYST) exposure in the etiology of hepatocellular carcinoma (HCC). Recent reserach has found that MCYST is a secondary metabolic of cyanobacteria (blue-green algae), a contaminant of pond-ditch water, a source of drinking water and a strong promoter of HCC. As a potent inhibitor of protein phosphatase 1 and 2A could probably induce the hyperphosphorylation of tumorsuppressor proteins, retinoblastoma protein and p53, including their associated cell cyle proteins. The MCYST- mediated hyper-phosphorylation of pRb and p53 in HepG2 cells was confirmed by protein analytical methods and functinal transfection analysis with a luciferase reportergen system. Hyperphosphorylation of tumor suppressor proteins, mediated through inhibition of protein phosphatase 1 and 2A are involved in the deregulation of the cell cycle and a biochemical alternativly pathway of tumor promotion. In addition to prove the possibility of MCYST- associated functional inactivation of p53 we performed apoptosis assays and to consider the influence of MCYST of the subcellular localization of p53 using a p53-GFP- transfection system. The human hepatitis B virus x-protein (HBx) is suspected to play a role in the hepatocarcinogenic process by virtue of its capacity to transactivate oncogenes and serveral other cellular genes. We demonstrated confirmed by transient transfection assays with diverse specific luciferase reportergen systems that HBx is be able to stimulates the cell cycle progression and influence the checkpionts controll. Finally, with cotransfection analyses in HepG2 we showed that that MCYST and HBx in combination deregulate the activity of cell cycle proteins such as p53,pRb, E2F and c-myc. Taken together, our results indicate that MCYST and HBx in an initiated human hepatoma cell culture system (HepG2) alone and in combination affected the activity of essential regulators of the G1 �phase of the cell cycle.These datas suggest a molecular mechanism by which MCYST and HBx likely contributes to viral carcinogenesis. By promoting the proliferation of altered hepatocytes, in selection of cells that are genetically unstabl, which would accumulate transforming mutations.

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INHALTSVERZEICHNIS 1. Einleitung ....1

1.1 Allgemeiner Teil .......................................................................................................... 1

1.1.1 Epidemiologie des Hepatozellulären Karzinoms (HCC)........................................................ 1

1.1.2 Cyanobakterielle Hepatotoxine.............................................................................................. 3

1.1.3 Tumorgenese ........................................................................................................................ 5

1.2 Zellzyklus�Regulation ................................................................................................. 8

1.2.1 p53-Tumorsuppressorprotein .............................................................................................. 12

1.2.2 Retinoblastomaprotein......................................................................................................... 16

1.2.3 E2F-Transkriptionsfaktor ..................................................................................................... 18

1.2.4 Transkriptionsfaktor c-Myc................................................................................................... 19

1.3 Apoptose................................................................................................................... 21

1.4 Zelluläre Angiffspunkte von Hepatitis B-x Proteins (HBx)......................................... 23

1.5 Hepatotoxin Microcystin............................................................................................ 26

1.6 Fragestellung ............................................................................................................ 31

2 Material und Methoden ..33

2.1 Material ..................................................................................................................... 33

2.1.1 Zellen ................................................................................................................................... 33

2.1.2 Zellkulturmedium und Zusätze ............................................................................................ 33

2.1.3 Bakterien.............................................................................................................................. 33

2.1.4 Plasmide.............................................................................................................................. 33

2.1.5 Nukleotide, Nukleinsäuren................................................................................................... 35

2.1.6 RT PCR-Primer.................................................................................................................... 36

2.1.7 Enzyme, Antikörper und andere Proteine ........................................................................... 36

2.1.8 Chemikalien......................................................................................................................... 37

2.1.9 Puffer und Lösungen ......................................................................................................... 39

2.1.10 Kits..................................................................................................................................... 50

2.1.11 Verbrauchsmaterial ........................................................................................................... 51

2.1.12 Geräte und andere Hilfsmittel............................................................................................ 51

2.1.13 Radiochemikalien .............................................................................................................. 53

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2.2 Methoden.................................................................................................................. 54

2.2.1 Kultivierung von Zell-Linien ................................................................................................. 54

2.2.2 Kryokonservierung von Zellen............................................................................................. 54

2.2.3 Gewinnung und Reinigung von Nukleinsäuren ................................................................... 54

2.2.4 Photometrische Konzentrations-, Stoffmengen-und Reinheitsbestimmung

von Nukleinsäuren............................................................................................................... 56

2.2.5 Enzymatische Modifikation von Nukleinsäure..................................................................... 56

2.2.6 Vermehrung und Gewinnung von Plasmid DNA ................................................................. 57

2.2.7 RT-RCR zum Nachweis von HBx-RNA............................................................................... 59

2.2.8 Vitalitäts-Test ....................................................................................................................... 60

2.2.9 radioaktive Markierung ........................................................................................................ 62

2.2.10 Quantifizierung von Proteinen........................................................................................... 63

2.2.11 Darstellung und Auswertung von Proteingelen ................................................................ 64

2.2.12 Methoden der Proteinanalystik ......................................................................................... 65

2.2.13 Protein-Färbungen ........................................................................................................... 67

2.2.14 Funktionsanalyse .............................................................................................................. 68

2.2.15 Zellzyklus-Apoptose- Analytik ........................................................................................... 69

2.2.16 Laser-Scanning-Mikroskopie (nach Fa. Clontech) ........................................................... 71

2.2.17 Statistik .............................................................................................................................. 71

3 Resultate ..72

3.1 Einfluss von Microcystin auf die Vitalität und Metabolismus von HepG2-Zellen....... 72

3.1.1 Einfluss von Microcystin auf die Vitalität von HepG2-Zellen ............................................... 72

3.1.2 Microcystin-assoziierte Phosphorylierung und Stabilisierung von zellulären Proteinen ..... 74

3.1.3 Effekte von Microcystin auf die S-Phaserate....................................................................... 77

3.2 Einfluss von Microcystin auf die metabolische Stabiltität von p53 ........................... 79

3.2.1 Wirkung von Microcystin auf die Stabilität von p53 (Western-Blot- Analyse) ................... 79

3.2.2 Einfluss von Microcystin auf die Stabilität von 35S-Methionin markiertem p53 .................... 81

3.3 Einfluss von Microcystin auf die Hyperphosphorylierung von p53 und pRb ............. 82

3.3.1 Microcystin�induzierte Hyperphosphorylierung von 32 P-markiertem P53 ........................... 82

3.3.2 Nachweis von hyperphosphoryliertem p53 über die Isoelektrische Fokkussierung (IEF)... 84

3.3.3 Einfluss von Microcystin auf die Hyperphosphorylierung von pRb ..................................... 86

3.4 Die protektive Wirkung von Microcystin vor UV-induzierter Apoptose...................... 88

3.5 Einfluss von Microcystin auf die Kerntranslokation von p53 ..................................... 94

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3.6 Funktionelle Analyse des Effektes von Microcystin auf die Zellzyklus-Regulation ... 98

3.6.1 Effekte von Microcystin auf die Funktionalität von p53 ........................................................ 99

3.6.2 Effekte von Microcystin auf die Funktionalität von pRb ..................................................... 102

3.6.3 Effekte von Microcystin auf die Funktionalität von E2F..................................................... 104

3.6.4 Effekte von Microcystin auf die Funktionalität von c-Myc.................................................. 106

3.7 Analyse der Effekte von Microcystin und HBx auf die Zellzyklus-Regulation ......... 108

3.7.1 Effekte von Microcystin und HBx auf die Funktionalität von p 53 ...................................... 110

3.7.2 Effekte von Microcystin und HBx auf die Funktionalität von pRb ...................................... 115

3.7.3 Effekte von Microcystin und HBx auf die Funktionalität von E2F...................................... 118

3.7.4 Effekte von Microcystin und HBx auf die Funktionalität von c-Myc................................... 121

4 Diskussion 125

4.1 Microcystin-assoziierte Protein-Phosphorylierung,-Stabilisierung und -Synthese .. 127

4.2 Microcystin-vermittelte Stabilität und Phosphorylierung von p53 und pRb ............. 131

4.3 Protektive Wirkung von Microcystin vor UV-induzierter Apoptose ......................... 136

4.4 Darstellung der Effekte von Microcystin auf die Zellzyklus�Regulation.................. 144

4.4.1 Wirkung von Microcystin auf die Regulation der G1/S- Phase des Zellzyklus .................. 144

4.4.2 Wirkung von Microcystin und HBx auf die Aktivität von Regulatoren des Zellzyklus........ 147

5 Zusammenfassung 160 6 Literaturverzeichnis 164

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Einleitung

1

1. Einleitung

1.1. Allgemeiner Teil

1.1.1. Epidemiologie des Hepatozellulären Karzinoms (HCC)

Das Hepatozelluläre Karzinom (HCC) ist der weltweit am vierthäufigsten

vorkommende maligne Tumor des Menschen. Jährlich werden mehr als 250.000

Tumore diagnostiziert und weniger als 3 % von diesen Patienten überleben fünf oder

mehr Jahre (Madden et al., 2001). Während die Menschen in Europa und Amerika

eher selten ein HCC entwickeln, liegt die Tumor-Prävalenz in Asien und Afrika

signifikant höher (Hann, 1998; Lemon and Shapiro, 1992). Die Entwicklung eines

Leberzellkarzimons wird als mehrstufiger Prozess verstanden, der durch multiple

Faktoren induziert und gefördert wird. Wichtige Risikofaktoren bei der

Hepatokarzinogenese scheinen neben der chronischen Infektion mit dem Hepatitis B-

Virus (HBV), verschiedene Kofaktoren wie Umweltgifte (Aflatoxin B1), durch

Alkoholkonsum bedingte Leberzirrhose und chronisch entzündliche regenerative

Vorgänge der Leber darzustellen (Barraud, et al., 1999; Jia et al., 1999; Yan et al,

1996) (Abb.1.1)

Abb. 1.1: Modell für die Rolle von HBV in der Entwicklung eines Hepatokarzinoms (Butel et al.,

1996)

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Einleitung

2

Ein primärer Risikofaktor bei der Entstehung eines HCC ist die chronische Infektion

mit dem Hepatits B-Virus (Lemon and Shapiro., 1992; Madden, 2001). Das humane

Hepatits B-Virus (HBV) ist ein partiell doppelsträngiges DNA-Virus, das durch die

reverse Transkription von prägenomischer RNA repliziert und einen ausge-

sprochenen Leberzelltropismus aufweist (Choi et al., 2001). Die durch das HB-Virus

verursachte Hepatitis B-Infektion kann asymptomatisch, akut oder fulminant

verlaufen und im Ergebnis zur vollständigen Ausheilung, asymptomatischem HBsAg-

Trägertum oder zu einer chronischen Hepatitis führen (Abb. 1.2).

Abb. 1.2: Verschiedene Verlaufsformen einer HBV-Infektion (aus Meisel, 1993b)

Epidemiologische und molekularbiologische Analysen können eindeutig eine

Korrelation zwischen der chronischen HBV-Infektion und dem Auftreten des

Hepatozellulären Karzinoms (HCC) dokumentieren (Feitelson et al.,2002; Schlauder

et al.,1995). In den HBV-Hyperendemiegebieten Afrikas und Ostasiens werden 80 %

der manifestierten HCC als Resultat einer chronischen HBV-Infektion bewertet.

Chronische HBV- Träger entwickeln über 200 mal häufiger ein HCC (Butel et al.,

1996). Während einer chronischen Infektion wird die HBV-DNA häufig in die

Hepatozyten-DNA integriert.

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Einleitung

3

Die Integration der HBV-DNA dürfte zu einer Synthese von Virus-Zell-Proteinen mit

transformierenden Eigenschaften führen (Chang et al., 2001; Takada and Koike,

1990), die einen deregulierenden Einfluss auf die zelluläre Aktivität besitzen (Becker

et al., 1998; Chirillo et al., 1997; Feitelson et al.,1993, 1998; Kaufmann and

Kaufmann,1993; Takada et al.,1997; Slagle et al., 1994; Wang et al., 1994).

Die Frage, welche Wirkung die simultane Exposition von Kofaktoren auf die

Pathogenese eines HBV-assoziierten HCC hat, wird in verschiedenen Studien

diskutiert. Epidemiologische Studien postulieren eine synergistische Interaktion

zwischen einer chronischen Hepatitis B-Infektion und der Exposition mit Aflatoxin B1

(AFB1) in der Ätiologie eines Hepatozellulären Karzinoms (HCC), obgleich der

molekulare Mechanismus dieser Interaktionen noch nicht ganz verstanden ist

(Barraud et al., 1999; Cullen et al., 1990; Sell et al., 1991; Yan et al., 1996). Für

Individuen mit chronischer HBV-Infektion mit gleichzeitiger Aflatoxin-Exposition

erhöht sich die Wahrscheinlichkeit ein HCC zu entwickeln um das Dreifache (Madden

et al., 2001).

Neben den Aflatoxinen wird in jüngster Zeit auch das cyanobakterielle Hepatotoxin

Microcystin, als Kofaktor bei der Entwicklung eines HBV-assoziierten HCC eingestuft

(Yu, 1995). Ein Vergleich der Trinkwasserqualität zwischen Regionen Chinas

miteiner erhöhten HCC-Prävalenz und einer niedrigen HBV-Trägerschaft zeigte, dass

in den HCC-Hyperendemiegebieten deutlich höhere Konzentration von Microcystin

(MCYST) im Trinkwasser vorliegen. Welcher molekulare Mechanismus sich

möglicherweise hinter einer kombinatorischen Wirkung von Microcystin und dem

Auftreten chronischer Hepatits B-Virus-Infektionen bei der Hepatokarzinogenese

verbirgt, sollte in dieser Studie untersucht werden.

1.1.2. Cyanobakterielle Hepatotoxine

Cyanobakterien sind etwa 3,5 Milliarden Jahre alt, kommen vorwiegend im

Süsswasser sowie in Meeren vor und sind als Primärproduzenten wichtige Glieder

der Nahrungsketten (Fleming et al., 2000; Gilroy, 2000). Allerdings gibt es auch

toxische Vertreter unter den Cyanobakterien.

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Einleitung

4

Eine besondere Gefährdung geht von den toxischen Cyanobakterien aus, wenn sie

aufgrund bestimmter Umwelt-bedingungen (Eutrophierung) im Gewässer in Massen

auftreten. Massenentwicklungen von Cyanobakterien werden als �Algenblüten�

bezeichnet (Chorus and Bartram, 1999; Oliver and Ganf, 2000). Die Hepatotoxine

sind bioaktive Sekundärmetaboliten toxischer Cyanobakterien (Sivonen and Jones,

1999). Eine naheliegende Bedeutung der Toxine könnte in der Abwehr von

Wasserflöhen und anderen Vertretern des Zooplanktons liegen, die sich u.a. von

Cyanobakterien ernähren (Rohrlack et al., 1999). Ein weltweit im Süsswasser

verbreiteter Toxinproduzent ist Microcystis aeruginosa, eine einzellige

Cyanobakterienart. Das toxische Produkt dieser Art wird als Microcystin bezeichnet

und stellt einen potenten Tumorpromotor dar (Hirai et al., 1991; Rohrlack et al., 1999;

Watanabe et al., 1988). Bislang sind mehr als sechzig verschiedene Microcystine

identifiziert worden, die sich anhand ihres Gehaltes an zwei variablen L-Aminosäuren

an den Positionen 2 und 4 sowie in Modifikationen aller sieben Aminosäuren

unterscheiden (Sivonen and Jones., 1999). Die am häufigsten in Süsswasser

auftretende Variante ist Microcystin-LR.

Abb. 1.3: Strukturformel Microcystin (MCYST)- LR (Fujiki, H. and Suganuma, M.,1993)

Microcystin wird von den Menschen über das Trinkwasser aufgenommen und

gelangt über den Magen in das Ileum, von dort wird es über die Blutbahn in die

Hepatozyten transportiert und akkumuliert. Die chronische Exposition von

Microcystin�LR geht bei den Menschen mit einer Gefährdung der Gesundheit einher.

Bei Microcystin-exponierten Individuen werden Magen- und Darm-Reizungen, sowie

vor allem Leberschädigungen diagnostiziert (Gilroy., 2000; Kuiper-Goodman et al.,

1999).

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Einleitung

5

1.1.3. Tumorgenese

Die Entwicklung eines Hepatozellulären Karzinoms (HCC) ist, wie erwähnt, ein durch

Mutationen verursachter mehrstufiger Prozess, der mit vielfältigen weiteren

Veränderungen der Genexpression assoziiert ist, die mit dem Auftreten und der

Progression eines Tumors korrelieren. Bei vielen Tumor-Typen können Mutationen

im p53-Gen bzw. die funktionelle Inaktivierung des p53-Proteins diagnostiziert

werden, so auch bei der Ätiologie eines HCC (Greenblatt et al., 1997; Hollstein et al.,

1991; Robinson, 1994; Slagle et al., 1994; Ueda et al., 1995). Die chronische

Exposition mit dem Hepatokarzinogen Aflatoxin B1 wird als ein wesentlicher Induktor

von p53-Gen-Mutationen verstanden (Bressac et al., 1991; Hsu et al., 1991). Durch

eine Anzahl viraler Proteine von DNA-Tumorviren, die das p53-Protein binden, wird

die funktionelle Inaktivierung von p53 induziert (Levine, 1990). Diese und andere

Modifikationen können mit der Stimulation der Expression von G1-Cyclinen und

Hemmung von Cyclin-abhängigen Kinasen (CdK´s) einhergehen, was zur Deregu-

lation von wichtigen Kontrollpunkten des Zellzyklus oder zum Verlust von Apoptose-

Prozessen führen kann (Sherr, 1996).

Die Rolle des Hepatits B-Virus (HBV) bei der Enstehung eines HCC scheint sehr

komplex zu sein, und die in Frage kommenden Virus-vermittelten Mechanismen

können von direkter und/ oder indirekter Natur sein. Als zentrales Ereignis auf dem

Weg zur Entwicklung eines HBV-assoziierten HCC gilt die im Verlauf einer

chronischen HBV-Infektion zufällige Integration von Sequenzen des x-Gens in das

Wirtsgenom (Murakami et al., 1994; Poussin et al., 1999). Das Ereignis der

Integration der HBV-DNA in das Wirtsgenom ist assoziiert mit chromosomalen

Modifikationen (Feitelson et al., 2002; Takada and Koike, 1990) und dem Verlust von

Allelen, die letztendlich zu einer Aktivierung von Onkogenen und/ oder einer

Inaktivierung von Tumorsuppressorproteinen führen können. Die Integration des

HBV-Genoms in HepG2-Zellen führt zu einer chromosomalen Instabilität (Hino et al.,

1991). Bei den meisten HBV-Trägern, die Symptome wie Leberzirrhose und

Dysplasie aufweisen, wurde das HBx-Protein im Nukleus von Hepatozyten

nachgewiesen (Wang et al., 1991).

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Einleitung

6

Die nukleäre Lokalisation von HBx in Hepatozyten ist vermutlich ein wichtiger Schritt

in der Hepatokarzinogenese, da es dadurch möglicherweise zu Interaktionen mit

verschiedenen Transkriptionsfaktoren oder zellzyklusspezifischen Proteinen kommt

(Benn and Schneider, 1994; Caselmann, 1996; Maguire et al., 1991).

Eine HBx-induzierte Transformation sowohl von NIH3T3-Zellen (Shirakata et al.,

1989) als auch von einer normalen Hepatozyten-Zell-Linie der Maus (Hohne et al.,

1990) wurde beobachtet. Auch die Neigung eines persistent HBx-Gen exprimieren-

den Maus-Stammes zur Karzinombildung (Kim et al., 1991), weisen dem HBx-Protein

eine signifikante Rolle in der Pathogenese eines HCC zu.

Immunohistochemische Studien dokumentieren sogar eine direkte Korrelation

zwischen der Expression des HBx-Gens und dem Ausmaß einer chronischen

Hepatitis (Feitelson, 1998). Der Grund für diesen positiven x-Protein assoziierten

Einfluss auf die Pathogenese einer HBV-Infektion ist vermutlich eine hohe

Expression des x-Proteins, die durch den Verlust der Autorepression nach der

Integration erfolgt (Murakami et al., 1994; Poussin et al., 1999). In verschiedenen

Studien wird dem HBx-Gen ein onkogenes Potential zugesprochen, da die x-Region

der HBV-DNA die genetische Instabilität (Hino et al., 1991) fördert und das

Translationsprodukt des x-Gens (HBx) die Fähigkeit zur Transaktivierung von

zellulären Genen besitzt (Aufiero and Schneider, 1990; Barnabas et al., 1997; Benn

and Schneider, 1994; Cheong, et al., 1995). Die möglichen zellulären Angriffspunkte

des pleiotropen Transaktivators sind vermutlich die regulatorischen Proteine des

Zellzyklus.

In gewissen Regionen der Welt dürfte das Auftreten von verschiedenen

Umweltkarzinogenen eine fördernde Rolle bei der Entwicklung eines HBV-

assoziierten HCC spielen (Butel, et al., 1996; Cullen et al., 1990; Sell et al., 1991;

Yan et al., 1996) (Abb. 1.4).

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Einleitung

7

Abb. 1.4: Interaktion von Hepatitis, Aflatoxin und Microcystin in der Initiation oder Promotion eines HCC (Yu, 1995)

Der synergistische Beitrag dieser zwei Faktoren bei der Hepatokarzinogenese gibt

Anlass zur Spekulation, dass Hepatokarzinogene bei chronisch HBV-infizierten

Menschen eine besonders schädliche Wirkung entfalten (Butel et al., 1996). Ver-

mutlich bieten die bei einer chronischen Hepatitis B-Infektion aufgrund von immer

wieder auftretenden Phasen der Virus- und HBs-Ag-Synthese entstandenen

Leberläsionen, den Karzinogenen ein besonders günstiges zelluläres Milieu (Hagen

et al., 1994).

In Tiermodellen konnten die synergistischen Effekte einer Aflatoxin B1 (AFB1)-

Exposition und einer HBV-Infektion bei der Ätiologie des HCC bestätigt werden

(Barraud et al., 1999; Sell et al., 1991; Yan et al., 1996). Epidemiologische Studien

aus HCC-Hyperendemiegebieten weisen daraufhin, dass auch die chronische

Exposition mit cyanobakteriellen Hepatotoxinen (Yu, 1995) als bedeutender

Risikofaktor bei der Entstehung und Progression eines HBV-assoziierten Leberzell-

karzinoms eingestuft wird (Fujiki, 1992). In Regionen Chinas mit hohen Microcystin-

Konzentrationen im Trinkwasser entwickelten die Menschen achtmal häufiger ein

HCC als in Regionen, die eine bessere Trinkwasserqualität aufwiesen (Yu, 1995).

Möglicherweise korreliert die chronische Exposition mit Microcystin durch das

Trinkwasser mit der Entwicklung eines humanen Hepatokarzinoms.

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Einleitung

8

Auch hier schaffen vermutlich die virusbedingten chronischen Hepatozytenläsionen

die erforderliche Initiation für die Microcystin-assoziierte Tumorpromotion. Die

Aktivität von Tumorpromotoren kann sich förderlich auf die Zellproliferation auswirken

oder zu einer Schwächung der Immunreaktion führen (Fujiki, 1992; Fujiki and

Suganuma, 1993). Microcystin kann womöglich aufgrund seiner biochemischen

Aktivität als spezifischer Inhibitor der Proteinphosphatasen PP1/ PP2A zur

Deregulation von Zellzyklus-Kontrollmechanismen führen.

Einige denkbare Microcystin-abhängige Ereignisse, die sich förderlich auf die

zelluläre Aktivität und Transformation auswirken, könnten neben der Aktivierung des

MAPK-Signalweges auch die Induktion von unkontrollierten Zellzyklus-abhängigen

Prozessen sein. In diesem Kontext erhebt sich die Frage, ob möglicherweise

synergistische Effekte des pleiotropen Transaktivators HBx- und des Hepatotoxins

Microcystin als spezifischer Inhibitor der Proteinphosphatasen 1/2A bei der

Leberzellkarzinogese bestehen. Obgleich bislang diesbezüglich noch keine

experimentellen Daten vorliegen, sind aufgrund der biochemischen Eigenschaften

des HBx-Proteins und Microcystins kombinatorische Effekte der beiden

Tumorpromotoren auf die Zellzyklus-Regulation als Ursache für die Entwicklung und

Progression eines Hepatozellulären Karzinoms vorstellbar.

1.2. Zellzyklus�Regulation

Alle eukaryotischen Zellen besitzen ähnliche Kontroll-Mechanismen, die die

Progression des Zellzyklus zu regulieren. Die Kontrolle des Zyklus ist erforderlich, um

bei ungünstigen Wachstumsbedingungen oder bei auftretenden DNA-Schäden die

Progession anzuhalten und die Integrität und Stabilität des zellulären Genoms zu

bewahren. Insbesondere die Signalwege zur Regulation der G1-Phase haben dabei

eine essentielle Funktion (Gana and Reddy, 1995). Generell wird der Übergang der

Zellen von der G1- in die S-Phase des Zellzyklus durch eine Anzahl von spezifischen

Cyclin-abhängigen Kinasen (CdK 2,4,6) in Assoziation mit den Cyclinen (A, D, E)

reguliert (Alt et al., 2000), die vor allem die Aktivität von G1-Phase Proteinen wie Rb,

E2F und c-Myc über die Modulation ihres Phosphorylierungsmusters regulieren (Alt

et al., 2000).

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Einleitung

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Auch den Zellzyklus-stimulierende MAPK-Signalweg kann ebenfalls durch die

Modulation des Phosphorylierungsmusters des Retinoblastomaproteins mit Hilfe von

phasenspezifischen Cyclin-abhängigen Kinasen (CdK) die G1-Phase aktivieren (Dulic

et al., 1992) (Abb. 1.5.).

Abb. 1.5: Zellzyklus-Regulation (Lania et al., 1999 )

Über verschiedene Kinase-Inhibitorproteine wird die Aktivität der Cyclin-abhängigen

Kinasen gehemmt (Peter and Herskowitz, 1994). Die Inhibitoren unterbinden die zur

Aktivierung der Kinasen erforderliche Assoziation mit den Cyclinen. Der bekannteste

Vertreter der Kinase-Inhibitorproteine ist das p21-Protein, das an alle G1-aktiven

CdK-Moleküle bindet. Die p21-Gen-Expression wird maßgeblich durch das p53-

Protein initiiert (Dulic et al., 1994). Am Ende der G1-Phase ist ein sogenannter G1-

Restriktionspunkt lokalisiert, der die Übergang der Zellen von der G1- in die

Synthese-Phase (S-Phase) kontrolliert (Hullmann and Boostra, 2001).

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10

An diesem Kontrollpunkt kommt es als Antwort auf gentoxischen Stress oder bei

ungünstigen zellulären Wachstumsbedingungen durch die Aktivität von p53 oder von

pRb, die die wichtigsten Hauptregulatoren der G1-Phase darstellen, zur G1-

Arretierung der Zellen oder zur Induktion von Apoptose. Den Zellen wird der Eintritt in

die S-Phase des Zellzyklus blockiert, um so die Akkumulation und Fixierung von

Mutationen in der Synthese-Phase des Zellzyklus zu verhindern. Das Prinzip eines

wichtigen G1- Kontrollmechanismus nach einer Stress-Induktion von p53 ist in Abb.

1.6 dargestellt.

Abb. 1.6: Induktion eines G1-Zellzyklus-Arrestes durch p53 (Sionov and Haupt., 1999)

Mit Hilfe von p53 (Wt) wird das Auftreten von DNA-Schäden registriert und

entsprechende Maßnahmen wie ein G1-Arrest oder Apoptose initiiert. Der p53-

vermitttelte G1-Arrest wird nach DNA-Schäden induziert, um den Zellen die

Möglichkeit zu geben, diese zu reparieren und so unter anderem den Anfängen

neoplastischen Wachstums entgegen zu wirken (Dulic,et al., 1994). Das p53-

Molekül besitzt auch die Fähigkeit indirekt eine G1-Arretierung der Zellen über das

Retinoblastomaprotein zu induzieren (Price et al., 1995). Das wichtigste

transkriptionelle Target von p53 ist dabei das p21-Gen (Bouvard et al., 2000; El-Deiry

et al., 1993), das ein 21 kD Inhibitorprotein der Cyclin-abhängigen Kinasen codiert.

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Einleitung

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Das p21- Protein hemmt die Aktivität der Cyclin-abhängigen Kinasen, die das Rb-

Gen-Produkt phosphorylieren. In der hypophosphorylierten Form sequestriert das

pRb den Transkriptionsfaktor E2F, wodurch die Übergang der Zellen von der G1-

Phase in die S-Phase verhindert wird (Prives and Hall, 1999; Sionov and Haupt,

1999).

Auch über den MAP-Kinase-Pathway kann ein G1-Arrest der Zellen als Antwort auf

einen Mangel an Wachstumsfaktoren induziert werden (Abb. 1.7). Die Arretierung der

Zellen in der G1-Phase erfolgt hier direkt über die Hemmung der Rb-Kinasen

(Hullmann and Boonstra, 2001).

Abb. 1.7: Regulation der Retinoblastomaprotein-Phosphorylierung über den MAPK-Pathway

(Hullemann and Boonstra, 2001)

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Nach der Applikation eines mitogenen Stimulus wird der Zellzyklus-Arrest durch die

Phosphorylierung von pRb aufgehoben, und es erfolgt der Übergang der Zellen in die

Synthese-Phase. Desweiteren erfolgt die Eliminierung von defekten Zellen mittels

des programmierten Zelltodes (Apoptose) immer dann, wenn die Intensität der

Stress-Schäden so stark ansteigt, dass die zellulären Stress-Antworten nicht mehr in

der Lage sind diese Schäden zu kompensieren. Die Initiation der Apoptose kann

dabei sowohl p53-abhängig (Sionov and Haupt, 1999) oder auch über einen p53-

unabhängigen Pathway (Herwig and Strauss, 1997) eingeleitet werden.

1.2.1. Tumorsuppressorprotein p53

In mehr als 50% der humanen Tumore werden p53-Gen-Mutationen oder die

Inaktivierung von p53 durch die Interaktion mit zellulären oder viralen Proteinen

beobachtet (Levine, 1990). Das Tumorsuppressorprotein ist ein multifunktionelles

Protein, das als Antwort auf verschiedenartige Stress-Signale (DNA-Schäden;

Hypoxie; virale Infektionen etc.) (Chen et al., 1996; Giaccia and Kastan, 1998;

Kastan et al, 1991; Kastan, 2001) verschiedene Funktionen in der Zellzyklus-

Kontrolle, DNA-Reparatur, DNA-Rekombination, Initiation von Apoptose wahrnimmt

(Bates and Vousden, 1999; Kapoor and Lozano, 1998; Ko and Price, 1996). Diese

Funktionen werden von p53 durch verschiedene Aktivitäten als Transkriptionsfaktor

(TF), bei einer Transrepression, bei DNA-Annealing und als 3´-5´-Exonuklease

vermittelt (Janus et al., 1999; Levine, 1997; Prives and Hall,1999; Stein and Liang,

2002). Auch zelluläre und virale Proteine beeinflussen die Funktion von p53 (Attardi

and Jacks, 1999; Deppert et al., 1987). Als Antwort auf Stress-Signale erfolgen im

p53-Protein posttranslationale Modifikationen, die die Tetramerisierung, die

metabolische Stabilität, die biochemische Aktivität und die subzelluläre Lokalisation

von p53 wesentlich beeinflussen (Jayaraman and Prives, 1999, Martinez et al., 1997;

Meek et al., 1997; Shaulsky et al., 1990).

Eine entscheidende Rolle kommt dabei dem Phosphorylierungsmuster von p53 zu.

Die Phosphorylierung am p53-Protein erfolgt an zahlreichen Serin-Resten in den

Amino- und Carboxy- terminalen Dömanen, während die zentrale Domäne

anscheinend frei von posttranslationalen Modifikationen bleibt.

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Die Phosphorylierung der zahlreichen Serin- Reste des p53-Proteins in vitro und in

vivo wird von der Casein-Kinase 1 (Serin 6 und 9), DNA-PK (Serin 15 und 37;) ATM

und ATR (Serin 15), CdK-activating Kinase (CAK) (Serin 33; Ko et al., 1997), CdK2

und Cdk2 (Serin 315; Addison, et al., 1990; Bischoff et al., 1990; Price et al., 1995),

Protein-Kinase C (Serin 378) und Casein Kinase 2 (Serin 392) katalysiert (Appella

and Anderson, 2001; Hupp,1999; Meek et al.,1997).

Die Dephosphorylierung der entsprechenden Serin-Reste wird vermutlich

maßgeblich durch die Aktivität der Proteinphosphatasen (PP) 1 und 2A katalysiert

(Brautigan et al., 1990; Li et al., 2000). Takenaka et al. (1995) beobachteten, dass

die Aktivierung eines latenten rekombinierten p53-Proteins durch die

Phosphorylierung von Proteinkinase C nach der Behandlung mit der Protein-

Phosphatase 1 und 2A revertiert wurde.

In normalen ungestressten Zellen unterliegt das p53 (Wt)- Protein in der G1-Phase

einem ständigen nukleären Export (Ferrigno and Silver, 1999). Während der S- oder

G2-Phase befindet sich das p53-Protein überwiegend im Cytoplasma (Stommel et

al.,1999). In Folge einer Stress-Induktion wird das ansonsten in geringer Konzen-

tration konstitutiv exprimierte p53 (Sionov and Haupt, 1999; Stommel et al., 1999)

metabolisch stabilisiert und transloziert oder verbleibt im Nukleus (Sakaguchi et al.,

1997), wo es seiner Funktion nach als Transkriptionsfaktor die Transkription

verschiedener p53-Zielgene induziert oder reprimiert (El-deiry et al., 1993), um so

einen G1-Arrest oder Apoptose einzuleiten (Sionov and Haupt, 1999). Die Arretierung

der Zellen in der G1-Phase verhindert, wie erwähnt, nach auftretenden DNA-

Schäden den G1-/S-Übergang der Zellen und hilft so die Fixierung von Mutationen in

der Synthese-Phase des Zellzyklus zu vermeiden (Appella and Anderson, 2001). Die

p53-vermitttelte Induktion des programmierten Zelltods (Apoptose) und damit die

Eliminierung geschädigter Zellen erfolgt, wenn das Ausmaß der Schädigung die

Reparaturkapazität der Zelle überschreitet.

Verschiedene Strategien der chemischen oder physikalischen Anti-Tumor-Therapie

machen sich das Prinzip der DNA-Schaden vermittelten Induktion von p53 zu eigen,

um die Tumorzelle mittels Apoptose zu eliminieren (Rubbi and Milner, 2000).

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Die Fähigkeit des p53-Tumorsuppressorproteins, sich im Cytoplasma und/ oder

Nukleus aufzuhalten, ist abhängig von der zellulären Situation (Knippschild, et al.,

1996; Shaulsky et al., 1990), und wird über das in der C-terminalen Domäne

lokalisierte Strukturmotiv für die Tetramerisierung (AS 326-356), die drei nukleären

Translokationssignale (NLS) (AS 316-325; AS 369-375; AS 375-384) und das

nukleäre Exportsignal (NES) (AS 340-351) reguliert (Middeler et al., 1997; Stommel

et al., 1999). Zur Regulation der subzellulären Verteilung des p53-Proteins haben

Sionov and Haupt (1999) folgendes Modell entworfen (Abb. 1.8).

Abb. 1.8: Modell für die Regulation der subzellulären Verteilung von p53 (Sionov et al. 2001)

Das Tumorsuppressorprotein wird durch die Interaktion mit Mikrotubulin und dem

Proteinmotor Dynein in den Nukleus importiert.

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Dieser Import wird vermittelt durch die Interaktion des nukleären

Lokalisationssignales (NLS) mit dem nukleären Rezeptormolekül Importin α. Im

Nukleus wird das p53 in schmale Strukturen, so- genannte promyeloische Leukämie-

Protein-Nuclear Bodies (PML-NB) sequestriert. Diese Strukturen enthalten Proteine,

wie PML, Sumo-1, p300/CBP und HMG1, die in die Transkription-Regulation

involviert sind. Einige Formen der PML binden und verstärken die transkriptionale

Aktivität durch die Rekrutierung des Koaktivators p300/ CBP. Die p300/ CBP-

vermittelte Acetylierung des p53 an der Aminosäure (AS) Lys 382 führt schließlich zu

einer kompletten Aktivierung des p53- Moleküls als Response auf Stress (Guo et al.,

2000). Da die Überexpression von PML Apoptose induziert, dürfte dieser

Proteinstruktur eine zentrale regulatorische Rolle in der p53-vermitttelten Antwort auf

Stress zukommen. Der Export aus dem Nukleus erfolgt über die Mdm2 vermittelte

Ubiquitinisierung, die mit einer Freilegung des nukleären Export-Signales (NES)

einhergeht. Durch die Interaktion des nukleären Rezeptormoleküls CRM1 mit der

NES erfolgt schließlich der nukleäre Export.

Die Modulation der subzellulären Lokalisation des p53- Moleküls scheint dabei vor

allem durch die Phosphorylierung von Serin 315 durch die CdK2-Kinase zu erfolgen

(Denko et al., 2000; David-Pfeuty et al., 1999). Das phosphorylierte Serin 315 ist für

die transkriptionelle Aktivität von p53 weniger von Bedeutung, was auf eine andere

regulatorische Funktion dieser Phosphorylierung bei der p53-Aktivität hindeutet

(Addison et al., 1990; Price et al., 1995). Die CdK2-Kinase ist in der frühen G1-Phase

inaktiv (Bischoff et al., 1990; Price et al., 1995). Ihre Aktivierung ist erforderlich für die

Übergang der Zellen durch den G1/S-Kontrollpunkt (von Heuvel and Harlow, 1993;

Price et al., 1995). Die CdK2-Phosphorylierungsstelle (AS 316-325) befindet sich in

der Gelenkregion zwischen der DNA-Bindungsdomäne (AS 102-292) und dem

Tetramerisierungsmotiv (AS 326- 356). Sakaguchi et al. (1997) zeigten in vitro, dass

die Phosphorylierung von Ser 315 die Destabilisierung des p53-Tetramers zur Folge

hat, was zur Bildung von p53-Monomeren und -Dimeren führt. Die Dissoziation des

p53-Tetramers demaskiert das nukleäre Export- Signal (NES) und initiiert vermutlich

den nukleären Export von p53 (Stommel et al., 1999). Liang and Clarke (2001)

postulieren, dass das phosphorylierte Ser 315 möglicherweise den Zugang der

nukleären Lokalisationsequenzen (NLS) an den nukleären Import-Rezeptor Importin

α blockiert und so den nukleären Import von p53 verhindert.

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Aus diesem Grund kann man vermuten, dass die Phosphorylierung des Serin-Restes

315 durch die CdK2-Kinase die subzelluläre Lokalisation des p53-Proteins in einem

Zellzyklus-abhängigen Muster reguliert. Die Dephosphorylierung der entsprechenden

Domäne mittels Proteinphosphatasen PP2A hingegen führt zu einer Maskierung der

Tetramerisierungsdomäne oder Stimulation des nukleären Imports und schließlich

zur nukleären Akkumulation des Transkriptionsfaktors p53 (Fujiki, 1992; Shenolikar,

1994; Yatsumani et al., 1993).

1.2.2. Retinoblastomaprotein (pRb)

Der Funktionsverlust des Retinoblastomaproteins als Repressor von Transkriptions-

faktoren ist ein häufiges Ereignis in der Entwicklung von vielen Tumor-Typen des

Menschen (Dannenberg et al., 2000). Zahlreiche biochemische Studien

verdeutlichen die Wichtigkeit von pRb bei der Passage der Zellen von der G1- in die

S-Phase des Zellzyklus (Weinberg, 1995). Das Rb-Protein stellt somit einen

wichtigen Regulator des G1-Kontrollpunktes dar. Der Verlust dieses ��Checkpoints��

durch Mutation des Rb-Gens bzw. Inaktivierung des Proteins ist oft maßgeblich in

den mehrstufigen Prozess der Karzinogenese involviert. Das Rb-Protein existiert in

einer hypo (pRb)- und hyperphosphorylierten (ppRb) Form. In seinem hypophos-

phorylierten Zustand entfaltet das Protein seine Funktion als Transkriptions-

repressor, der letztendlich über den Zutritt der Zellen in der S-Phase des Zellzyklus

oder über die G1-Arretierung der Zellen entscheidet (Herwig and Strauss, 1997). In

ruhenden Zellen oder in der frühen G1-Phase des Zellzyklus sequestriert und

inaktiviert das aktive hypophosphorylierte Rb-Protein die Transkriptionsfaktoren der

Klasse E2F, die die Transkription von Genen der S-Phase aktivieren. Bei der

Überführung des hypophosphorylierten pRb in den hyperphosphorylierten Zustand

sind die CdK 2, 4, 6, wichtig, die in der frühen G1-Phase (Gu et al., 1992; Lees et al.,

1991) inaktiv sind und später durch die Komplexierung mit den Cyclinen D und E

aktiviert werden (Koff et al., 1992; von der Heuvel and Harlow, 1993) (Abb. 1.9).

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Abb. 1.9: Darstellung der Zellzyklus-abhängigen Phosphorylierung des Retinoblastomaprotein

mittels der verschiedenen Cyclin-CdK-Komplexe (Gana and Reddy, 1995)

Die Phosphorylierung von pRb durch die Aktivierung des Cyclin D-CdK 4, 6- und

Cyclin E-CdK2-Komplexes über den MAPK-Pathway hebt die Arretierung der Zellen

in der G1-Phase auf. Durch die Hyperphosphorylierung kommt es im Rb-Molekül zu

einer Konformationsänderung, die mit einer Dissoziation des pRb:E2F-Komplexes

einhergeht und die transkriptionale Aktivität von E2F induziert (Fan and Bertino,

1997; Lin et al., 1991; Lees et al., 1993; Mihara et al., 1989;Taya, 1997). In der Folge

kommt es zum Übergang der Zellen von der G1- in die Synthese-Phase des

Zellzyklus. Die Dephosphorylierung des ppRb-Proteins wird von der Protein-

phosphatase 1 katalysiert und ermöglicht anschließend eine erneute Komplexierung

von pRb-E2F in der frühen G1-Phase.

Einige Daten lassen die Vermutung zu, dass bei einer länger anhaltenden G1-

Arretierung der Zellen aufgrund von sehr ungünstigen Wachstumbedingungen das

Rb-Protein in seinem hypophosphorylierten Zustand verharrt und die Funktion eines

p53-unabhängigenl Apoptose-Promotors entfaltet (Herwig and Strauss, 1997). Auch

p53 kann nach Stress-Induktion über die Modulation des Phosphorylierungsmusters

des Rb- Proteins einen G1-Arrest oder Apoptose initiieren.

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Über eine p53-abhängige Expression des Kinase-Inhibitorproteins p21 wird die Cdk

4/6-assoziierte Phosphorylierung des Rb-Proteins gehemmt., so dass das Rb-Protein

in seiner aktiven hypophosphorylierten Form verbleibt und durch die Komplexierung

von Rb-E2F die G1-/S-Übergang der Zellen verhindert (Sionov and Haupt, 1999;

Weintraub et al., 1995).

1.2.3. Transkriptionsfaktor-E2F

Die Transkriptionsfaktoren der E2F-Familie spielen eine Schlüsselrolle bei der

Regulation der Zellproliferation. Sie sind für das Überschreiten des G1-Restriktions-

punktes essentiell (Hullemannn and Boostra, 2001; Weinberg, 1995). Die Aktivität

von E2F wird sowohl über das Phosphomuster des Rb-Proteins als auch durch die

Heterodimerisierung mit dem DP1-Protein und der Assoziation mit verschiedenen

Cyclin-abhängigen Kinasen moduliert (Helin et al., 1992; Krek et al., 1995; Srikumar

et al., 1991; Taya, 1997). Nach der Dissoziation aus dem Rb-E2F-Komplex aktiviert

der Transkriptionsfaktor E2F als Heterodimer mit dem DP1-Protein die Transkription

von Genen, die die Progression durch die S-Phase vermitteln (Chellappan et

al.,1991; De Gregori et al., 1995; Hullemann and Boonstra, 2001). Die

Translationsprodukte vieler E2F-induzierter Gene sind Komponenten entweder der

Zellzyklus- (Cyclin A, E, CdK´s, c-Myc) oder der DNA-Synthese- Maschinerie

(Dihydrofolate- Reduktase, Thymidinkinase oder DNA-Polymerase α) (Trimarchi and

Lees, 2002). Durch die Ligation von Cyclin A-CdK2 an denE2F-DP1-Komplex in der

späten G1-Phase und die damit einhergehende Phosphorylierung der Untereinheit

des DP1-Proteins verliert E2F seine DNA-Bindungsaktivität und damit seine

transkriptionale Fähigkeit (Dynlacht et al., 1994; Krek et al., 1995; Ottnad et al., 1997;

Taya, 1997; Yam et al., 2002) (Abb. 1.10).

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Abb. 1.10: Prinzip der Freisetzung des Transkriptionsfaktors E2F (Taya, 1997)

Für die Entwicklung einer antitumortherapeutischen Strategie stellt der E2F-Cyclin A-

Komplex damit ein interessantes Target dar.

1.2.4. Transkriptionsfaktor c- Myc

In humanen Tumoren findet man aufgrund von Mutationen im c-Myc-Gen oder

Mutationen in den entsprechenden c-Myc-assoziierten Signal-Pathways häufig eine

verstärkte Gen-Expression. Die Überexpression des c-Myc-Gens wird als

dominierender Faktor in der onkogenen Aktivierung von c-Myc angesehen, da hierbei

ein komplexes Netzwerk von interagierenden TF gestört wird. Das c-Myc-Protein ist

ein Schlüssel-Regulator der Proliferation (Avigan et al., 1990; Evan and Vousden,

2001; Lutterbach and Hann et al., 1994). Die Funktion von c-Myc ist es, die die

Progression der Zellen durch die G1-Phase über die Stimulation der Gentranskription

und Aktivierung von verschiedenen Transkriptionsfaktoren reguliert.

Aufgrund der deregulierten Aktivität von c-Myc kommt es zu einer übermässigen

Transkription von c-Myc-responsiven Genen, die mit einem malignen Wachstum

einhergehen können.

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Einleitung

20

In Zellkulturen induziert die konstitutive Expression von c-Myc die Zellproliferation

sogar bei vollständiger Abwesenheit von Wachstumsfaktoren (Alevizopoulos, et al.,

1997; Bouchard et al., 1998 ). Als Transkriptionsfaktor (TF) gehört es zu den Helix-

Loop-Helix Proteinen und kann über seine Leucin-Zipper-Dimerisierungsdomäne an

andere TF binden (Grandori and Eisenman, 1997). Als Heterodimer mit dem Protein

MAX bindet das c-Myc-Protein an die E-Box in der Promotor-Region verschiedener

Gene (cdc 25A, elf- 4e), die für die Zellproliferation erforderlich sind.

Eine mögliche Strategie von c-Myc, die Zellproliferation in ruhenden Zellen zu

fördern, ist die Verstärkung der Dissoziation des Kinase-Inhibitors p27 von dem

Cyclin E-CdK4�Komplex, wodurch das Bindungsmotiv für die Cdc 25A- Phosphatase

freigelegt wird. Die Cdc 25A-Phosphatase spielt bei der raschen Aktivierung von

Cyclin-abhängigen Kinasen eine essentielle Rolle. Die Phosphatase entfernt zwei

Phosphate an der CdK2-Kinase, die die Kinase-Aktivität inhibieren (Bouchard et al.,

1998) (Abb. 1.11).

Abb. 1.11: Kontrolle der G1-Phase Progression durch c-Myc (Bouchard et al., 1998)

Eine weitere Möglichkeit von c-Myc, die Proliferation der Zellen zu beeinflussen,

erfolgt über die Induktion der Retinoblastom- Kinasen Cyclin D/ E Cdk 2/4/ 6, die eine

rasche Hyperphosphorylierung von pRb initiieren und die damit einhergehende

Dissoziation des Rb-E2F-Komplexes und Freisetzung von E2F bewirken (Janssen-

Dürr et al, 1997; Leone et al., 1997). Wie viele andere nukleär lokalisierte

Regulatorproteine ist das c-Myc-Protein charakterisiert durch eine extrem schnelle

turn over Rate, und die Aktivierung erfolgt insbesondere über den MAPK-Pathway

(Gupta et al., 1993; Noguchi et al., 1999). Auch eine Interaktion mit dem p53-

Tumorsuppressorprotein bei der Regulation der c-Myc-Aktivität wird beschrieben

(Farmer et al., 1996; Goodrich and Lee, 1992; Wu and Levine, 1994).

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Einleitung

21

Der Transkriptionsfaktor E2F kontrolliert womöglich die Promotor Aktivität des c-

Myc� Gens. In Transfektionsexperimenten konnte gezeigt werden, dass die E2F-

Proteine den Myc-Promotor aktivieren können (Bouchard et al., 1998). Eine

Deregulation der c-Myc-Expression kann so mit einer Dysfunktion der E2F-Aktivität

interagieren und förderlich auf die Proliferation wirken (Evan and Vousden, et al.,

2001).

1.3. Apoptose

Neben der Zellproliferation und Zelldifferenzierung zählt die Apoptose zu den

wichtigsten zellulären Kontrollmechanismen. Apoptose ist eine spezielle Form des

Zelltodes und dient als Schutzmechanismus vor Infektionskrankheiten und Krebs.

Eine deregulierende Apoptose stellt somit einen wesentlichen Mechanismus der

Tumorpromotion dar. Durch eine verminderte bzw. gehemmt Apoptose kann die

Pathogenese zahlreicher Erkrankungen gefördert werden (Peter et al., 1997).

Verschiedene Studien postulieren, dass in Tumorzellen die Fähigkeit zur

Apoptoseinduktion verloren geht, und eine erhöhte Resistenzbildung gegenüber

verschiedenen apoptotischen Stimuli detektierbar ist (Hoffmann und Liebermann,

1994; Irmler et al., 1997; Kerr et al., 1994). Diese erhöhte Resistenzbildung bereitet

gerade bei der Tumortherapie grosse Probleme, da zahlreiche Chemotherapeutika

potente Apoptoseinduktoren darstellen (Hickmann et al., 1992; Kerr et al., 1994).

Neben den spezifischen Induktoren der Apoptose gibt es auch Inhibitoren, welche

die apoptotische Signalkaskade modulieren. Baxter and Lavin (1992) konnten

experimentell feststellen, dass der Phosphatase Inhibitor Okadasäure in der Lage ist,

apoptotische Prozesse zu inhibieren (Song and Lavin, 1993). Andere Studien

zeigten, dass gerade Proteinphosphatasen Inhibitoren in der Lage sind Apoptose

anhängig vom Zelltyp und Dauer der Exposition zu induzieren (Fladmark et al.,

2002).

Möglicherweise spielt die Aktivität von Proteinphosphatasen und Proteinkinasen bei

der Initiation apoptotischer Prozesse eine wichtige Rolle (Cross et al., 2000; Gjertsen

and Doskeland, 1995; Hale et al., 1996; Shutong et al., 2002).

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Einleitung

22

In der Regel sind alle Zellen eines multizellulären Organismus zur Apoptose fähig, da

alle essentiellen Komponeten des Apoptose-Apparates konstitutiv vorhanden sind

und die Aktivierung nach Stress-Induktion durch posttranslationale Modifikationen

vermittelt wird. Charakteristische Merkmale der Apoptose sind neben

Zellzahlveringerungen, schrumpfendes Cytoplasmavolumen, DNA-Fragmentierungen

und Aufrechterhaltung der Membranintegrität. Im Gegensatz zur Nekrose ist die

Apoptose ein regulierter, koordinierter Prozess. Wohingegen es sich bei der Nekrose

um eine passive, unkontrollierte, pathologische Form des Zelltodes handelt. Das

wichtigste Unter-scheidungskriterium zur Apoptose ist der Verlust der

Membranintegrität. Obgleich nekrotische und apoptotische Prozesse durch signifikant

verschiedene zelluläre Abläufe definiert werden, findet man in vitro und in vivo häufig

fließende Übergänge. Da apoptotische Zellen in Zellkulturen nicht phagozytiert

werden, treten hier Phänomene einer sekundären Nekrose auf (Cobb et al., 1996;

Kroemer et al., 1995). Der Apoptoseprozess wird generell in eine Initiations-, eine

Effektor- und eine Degradationsphase klassifiziert (Kroemer et al., 1995). Die

Initiationsphase geht mit der zelluären Registrierung des apoptotischen Reizes

einher. Diese heterogene Induktionsquelle umfasst virale Proteine (E1A; E7),

extrazelluläre Aktivierungen von Apoptose-Rezeptoren (CD95/FAS-APO),

deregulierte Signalkaskaden, Dysfunk-tionen der Protein-Phosphorylierung oder

chemisch-physikalische Stressfaktoren. Nach Überschreiten einer zellulären

Stresstoleranzgrenze oder Signalstärke je nach Zelltyp und Stress-Induktor erfolgt

der Übergang in die Effektorphase. Diese Phase ist durch die Aktivität von

degradierenden Enzymen (Proteasen/ Nukleasen) gekennzeichnet, die einen

kontrollierten Abbau von spezifischen Proteinen und Kern-DNA katalysieren

(Degradationsphase). Bei der Induktion der Apoptose können verschiedene Faktoren

beteiligt sein. Neben Komponenten der mitogenen oder antimitogenen

Signalkaskaden, können auch Phosphorylierungsprozesse und Regulatorproteine

des Zellzyklus (p53, pRb, E2F und c-Myc) involviert sein.

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Einleitung

23

1.4. Zelluläre Angiffspunkte des Hepatitis B x-Proteins (HBx)

Das Hepatits B-Virus x-Protein wird aufgrund seines pleiotropen transaktivierenden

Charakters als wesentlicher verursachender Faktor mit der Karzinogenität des HBV

bei chronischen Infektionsverläufen in Zusammenhang gebracht (Caselmann, 1996;

Cromlish, 1996). Die biologischen Effekte von HBx hinsichtlich der Fähigkeit zur

Transaktivierung und/ oder Tumorpromotion erfolgen vermutlich durch Protein-

Protein Interaktion mit zahlreichen zellulären Faktoren, da das x-Protein selbst keine

DNA-Bindungs-Aktivität besitzt (Maguire et al., 1991). Das HBx-Protein ist essentiell

für die in vivo HBV-Replikation. Es stellt einen funktionellen Antagonisten für die p53-

vermitttelte Hemmung der HBV-Replikation dar, der die Down-Regulation des

pregenomischen/ core Promotors verhindert. Auch andere DNA-Viren (Papilloma-

viren (E6); Adenovirus (E1b- 55 kDa Protein), Papovavirus (large T Antigen) codieren

ein Genprodukt, das mit dem p53-Protein interagiert. Solche Interaktionen unter-

drücken wahrscheinlich den ��Checkpoint�� für den induzierten G1-Zellzyklus Arrest

und/ oder die Apoptose als Antwort auf Stress (Feitelson et al., 2002).

Bei der Entwicklung eines HBV-assoziierten HCC scheinen weniger die Mutationen

im p53-Gen eine signifikante Rolle zu spielen, als vielmehr die funktionelle

Inaktivierung von p53 durch die Protein-Protein-Interaktion mit dem HBV-x Protein.

Ein mögliches Prinzip der Tumorpromotion bei der Entwicklung eines HBV-

assoziierten HCC scheint die x-Protein verursachte funktionelle Inaktivierung von p53

durch kompetitive Bindung der Tetramerisierungs- und DNA-Bindungsdomäne von

p53 durch HBx zu sein (Chirillo et al., 1997; Cromlish, 1996; Feitelson, 1998; Trunant

et al., 1995).

Aufgrund des HBx-induzierten Funktionsverlustes von p53 kommt es zu einer

genomischen Instabilität, in der Regel zu geringeren Apoptoseraten und zu einer

überlangen Lebensspanne von HBV-infizierten Zellen (Feitelson, 1998; Kim et al.,

1991). Die Akkumulation von Mutationen in den Virus-infizierten Hepatozyten

resultiert in einem transformierten Phänotyp der Zellen. Das HBx-Protein kann jedoch

ausser mit dem p53-Protein auch mit anderen regulatorischen Proteinen interagieren

(Kekule et al., 1993; Lee et al., 1995; Unger and Shaul, 1990).

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Einleitung

24

Die entsprechenden Proteine sind in der Transaktivierung von Promotoren (NF-KB;

CREB/ AFT; TBP), in der Regulation von Second-Messenger-Systemen (c-RAF/

ERK2/ RAS-abhängig) oder in die direkte Modulation der Transkriptionsmaschinerie

der Zellzyklus-Regulation involviert (Becker et al., 1998; Han et al., 2000; Kim et al.

1998; Klein and Schneider, 1997; Kwee et al., 1992; Lin et al., 1997; Lucito and

Schneider, 1992; Qadri et al., 1995; Wang et al., 1997; Williams and Andrisani,

1995).

Die HBx-assoziierte Deregulation des Zellzyklus führt vermutlich zur Selektion von

Zellen mit genetischer Instabilität und somit zur Akkumulation von Mutationen, die

sich auf den Beginn neoplastischen Wachstums von Zellen auswirken können

(Schuster et al., 2000). Feitelson (1998) postulierte ein mögliches Tumorpromotion-

Modell für die Interaktion von HBx mit den Regulatoren des Zellzyklus (Abb. 1.12).

Abb. 1.12: Modell für die Interaktion zwischen Hepatitis-x-Protein und dem Zellzyklus

(mod. Feitelson, 1998).

Die durchgezogenen Pfeile zeigen die Wirkungskette während der normalen Leber-Regeneration. Die

gepunkteten Pfeile geben die Beeinflussung von HBx in dieser Kette wieder.

In diesem Modell wird davon ausgegangen, dass es in Folge einer chronischen

Hepatitis zunächst zur Eliminierung von Virus infizierten Hepatozyten über die

cytotoxische Immunantwort (1) kommt.

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Einleitung

25

Die auftretenden Hepatozytenschäden führen zu erhöhten Regenerationsprozessen

in den Hepatozyten (2), die möglicherweise mit einer Stimulation des Zellzyklus

einhergehen. Dieser zelluläre regenerative Prozess ist notwendig, um die normale

Gewebs-Architektur und die physiologische zelluläre Aktivität wiederherzustellen (3).

Das HBx-Protein kann zusätzlich auf die bei den regenerativen Prozessen aktivierten

Transkriptionsfaktoren oder auf die Zellzyklus- Progression stimulierend wirken (3).

Bei einer geringen zellulären HBx-Konzentration sind diese stimulierenden Einflüsse

auf die Zellproliferation jedoch nur von geringer Dauer (4). Die Akkumulation des

HBx-Proteins während der chronischen Infektion (5) kann hingegen einen

anhaltenden deregulierenden Einfluss auf die Zellzyklus- Aktivität (6) ausüben, was

im Resultat schließlich die HBV-assoziierte Hepatokarzinogenese begünstigt (7). Auf

der Grundlage dieses Modells ist es vorstellbar, dass neben dem p53-Protein auch

die regulatorischen Proteine pRb, E2F und c-Myc putative Angriffspunkte für das

HBx-Protein darstellen.

Choi et al. (2001) diskutieren über eine mögliche Interaktion von HBx mit dem

Transkriptionsrepressor Retinoblastomaprotein in der frühen Phase der Leberzell-

karzinogenese. Su et al. (2001) berichteten über eine mögliche Interaktion von HBx

mit dem Transkriptionsfaktor c-Myc. Zahlreiche experimentelle Daten weisen

daraufhin, dass das HBx-Protein den Aufenthalt der Zellen in der G0-Phase verkürzt

und den Eintritt in die S-Phase fördert. Auch der beschleunigte Übergang der Zellen

durch die Kontrollen G0 /G1, G1/S und G2 /M wird beobachtet (Benn and Schneider,

1995; Sirma et al., 1999).

Das HBx-Protein besitzt ebenfalls die Fähigkeit, die cytoplasmatischen Zellzyklus-

assoziierten Signaltransduktions-Wege wie den MAPK-Pathway zu aktivieren (Benn

and Schneider, 1994; Wang et al., 1997) und so indirekt einen entscheidenden

Einfluss auf die Aktivität von essentiellen Zellzyklus-Regulatoren zu nehmen. Die

globale Betrachtung der verschiedenen Daten weist möglicherweise auf einen

molekularen Mechanismus hin, in dem sich HBx durch die deregulierende Wirkung

auf die Zellzyklus-Regulation in die Ätiologie der viralen Leberzell-Karzinogenese

involviert.

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Einleitung

26

1.5. Hepatotoxin Microcystin

Microcystin-LR ist ein cyclisches Heptapeptid, das von der Cyanobakterienart

Microcystis aeruginosa produziert wird und ein potentes Hepatotoxin darstellt

(Carmicheal, 1996,1997). Aufgrund seiner Polarität hat Microcystin Schwierigkeiten,

in kultivierte Fibroblasten aufgenommen zu werden, wohingegen es durch einen

spezifischen Carrier-vermittelten Transport (�Okadasäure-Rezeptor�) zu einer

leichten Inkorporation und Akkumulation in kultivierten Hepatozyten kommt (Fujiki,

1992).

Als Vertreter der Wirkstoffklasse der Okadasäure wird Microcystin als Tumor-

promotor bezeichnet, der in einem Gewebe Bedingungen schafft, die fördernd wirken

auf die Entwicklung eines bösartigen Tumors in Zellen, die bereits im Sinne einer

Initiation geschädigt sind. Microcystin ist ein spezifischer Proteinphosphatase-

Inhibitor der Klasse 1 (PP1) und 2A (PP2A), der irreversibel kovalent an die

katalytische Untereinheit der Proteinphosphatasen in den Hepatozyten bindet

(Falcorner and Yeung, 1992; Yoshizowa et al.,1990). Diese Eigenschaft von

Microcystin dürfte mit der Hepatotoxizität dieser Hepatopeptide korrelieren

(Matsushima et al., 1990; Yoshizawa et al., 1990).

Die tumorfördende Aktivität von Microcystin-LR konnte in Experimenten mit Diethyl-

nitrosamin (DEN) initiierten Ratten-Hepatozyten beobachtet werden (Fujiki, 1992;

Matsushima, 1990). Weitere Daten weisen darauf hin, dass die Zugabe von niedrigen

Microcystin-Konzentrationen zum Trinkwasser über einen langen Zeitraum die

Progression eines humanen Hepatozellulären Karzinomes bewirkt (Carmichael,

1997; Yu, 1995).

Die Proteinphosphatasen PP1 und PP2A stellen die Antagonisten der Ser/ Thr-

spezifischen Proteinkinasen (PK) dar und übernehmen eine bedeutende Rolle bei

der Regulation von PK-assoziierten Signalkaskaden (MacKintosk and MacKintosk,

1994). Die PP können dämpfend oder auch verstärkend auf die PK-vermittelten

Signalkaskaden wirken. Die Gesamtphosphorylierungsbilanz der Zelle wird durch ein

koordiniertes Zusammenwirken von Proteinkinasen (PK) und Proteinphosphatasen

(PP) bestimmt (MacKintosh and MacKintosh,1994).

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Einleitung

27

Insbesondere die Funktion von regulatorischen Proteinen des Zellzyklus wird über

die Aktivität der Proteinphosphatasen PP1/ PP2A beeinflusst (Cohen et al., 1990;

Shenolikar, 1994). Durfee et al. (1993) beobachteten eine Interaktion zwischen der

Proteinphosphatase (PP1) und dem Retinoblastomaprotein (pRb), wobei die PP1

bevorzugt das hypophosphorylierte Rb-Protein bindet. Desweiteren wurde gezeigt,

dass die PP1 mit den Rb- Molekül während der G0/G1-und mittleren G1-Phase

assoziiert. Die Assoziation der beiden Proteine geht während der S- und G2-

Progression der Zellen, wenn das Rb- Protein in seiner hyperphosphorylierten Form

vorliegt, verloren (Durfee et al., 1993). Ludlow et al. (1993) zeigten in der M-Phase

des Zellzyklus die Reassoziation von PP1 mit dem Rb-Protein. Die Komplexierung

von PP1 mit dem Rb-Molekül dürfte die unpassende Phosphorylierung von pRb in

den verschiedenen Phasen des Zellzyklus verhindern.

Der PP2A werden vor allem Interaktionen mit verschiedenen Komponenten des

MAPK-Pathway zugeschrieben (Chen et al., 1994; Damuni and Guo, 1993). Die

katalytische Aktivität der PP2A ist mutmaßlich auch an der Modulation des

Phosphorylierungsmusters von p53 involviert (Baxter and Lavin, 1992; Gjertsen and

Doskeland, 1995). Auch DNA-Tumorviren nehmen die PP2A zur Regulation der

viralen Replikation und der zellulären Transformation in Anspruch (Scheidtmann et

al., 1991; Walter and Mumby, 1993).

Die enzymatische Aktivität der PP selbst kann in einem Zellzyklus-abhängigen

Muster autoinhibitorisch durch die reversible Ligation eines phosphorylierten

Inhibitorproteins an die katalytische Untereinheit der PP gehemmt werden. Die

Phosphorylierung des Inhibitorproteins wird durch z.B. Cyclin-abhängige Kinasen

(Cyclin 4: CdK2; Cyclin 6: CdK2) katalysiert. Der Verlust oder die Funktionsun-

fähigkeit dieser Autohemmung der PP stört das dynamische Gleichgewicht der

Aktivität von Proteinkinasen und Proteinphosphatasen und kann zur Dysfunktion

zellulärer Kontrollmechanismen führen (Shenoliar, 1994).

Auch neuere Studien dokumentieren die Wichtigkeit der Funktion der PP bei der

Regulation zellulärer Aktivität, da Mutationen in den Genen der Proteinphosphatasen

ebenfalls wie Mutationen/ Deletionen in Tumorsuppressorgenen oder wie die

funktionelle Inaktivierung der entsprechenden Proteine signifikant mit neoplas-

tischem Zellwachstum korrelieren (Calin et al., 2000). Der Ausfall der Protein-

phosphatasen kann somit ein Beitrag zur Tumorpromotion sein.

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Einleitung

28

Über den beschriebenen biochemischen Mechanismus könnte Microcystin

maßgeblich in die Entwicklung eines HBV-assoziierten Hepatozellulären Karzinoms

eingreifen. Durch die Microcystin-induzierte kovalente irreversible Hemmung der

Proteinphosphatasen (PP) 1 und 2A kommt es zu einer sogenannten �apparenten

Aktivierung� von Proteinkinasen (PK), die letztendlich mit einer Akkumulation von

zellulären Phosphoproteinen in der Zelle einhergeht und unkontrolliert verstärkend

auf PK-assoziierte zelluläre Aktivität wirkt. Yoshizawa et al. (1990) berichteten von

Organotrophien in den Hepatozyten von Tieren nach der intraperitonealen (i.p.)

Verabreichung oder der oralen Aufnahme von Microcystin. Der Microcystin

vermittelte Ausfall der genannten Proteinphosphatasen führt zu einer zellulären

Akkumulation von Phosphoproteinen, die unter anderem zu morphologischen

Modifikationen in den Hepatozyten und zu einer Dysorganisation des Cytoskeletts

führen (Eriksson et. al., 1990). In vitro Studien zeigten, dass Microcystin die Aktivität

der Proteinphosphatasen in der cytoplasmatischen Fraktion von Maus-Hepatozyten

hemmt und die Protein-Phosphorylierung in kultivierten primären Ratten-Hepatozyten

erhöht (Matsushima et al., 1990). In Studien über die biochemische Aktivität von

Wirkstoffen der Okadasäureklasse wird berichtet, dass diese Wirkstoffe abhängig

von der Dauer der Applikation und des Zelltyps, neben der Förderung der

Tumorbildung (Fujiki, 1992; Carmichael et al., 1996) auch die Transformation

unterdrücken oder Apoptose induzieren oder inhibieren (Baxter and Lavin, 1992;

MacKintosh and MacKintosh, 1994; Song and Lavin, 1993) .

Da die Aktivität von p53 und pRb entscheidend über eine Protein-Phosphorylierung/ -

Dephosphorylierung reguliert wird, stellen sie theoretisch einen wichtigen zellulären

Angriffspunkt für das cyanobakterielle Microcystin dar. Yatsunami et al. (1993)

berichteten, dass Okadasäure über den sogenannten Okadasäure-Pathway

maßgeblich Einfluss auf die Hyperphosphorylierung von p53 und von pRb in

Fibroblasten nimmt. Fujiki (1992) hatte in diesem Kontext ein allgemeines Modell der

Tumorpromotion durch die Inaktivierung von Tumorsuppressoren über den

sogenannten Okadasäure-Pathway entworfen.

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Einleitung

29

Abb. 1.13: Darstellung der Inaktivierung der Tumorsuppressorproteine durch den Okadasäure-

Pathway (Fujiki and Suganuma, 1993)

In diesem Modell wird davon ausgegangen, dass durch die Hemmung von zellulären

Proteinphosphatasen durch Wirkstoffe der Okadasäureklasse die Tumorsuppressor-

proteine in ihren hyperphosphorylierten Zustand überführt werden und ähnlich wie

Mutationen oder Deletionen in den entsprechenden Genen, einen Funktionsverlust

der Proteine induzieren können.

Über den Einfluss von Microcystin auf das Phosphorylierungsmuster von Tumor-

suppressorproteinen hinsichtlich einer Hyperphosphorylierung liegen keine

experimentellen Daten vor. Microcystin könnte möglicherweise ähnlich wie Okada-

säure über den Okadasäure-Pathway die Hyperphosphorylierung der Tumor-

suppressorproteine p53/ pRb induzieren und so ein Aussetzen der Tumorsuppressor-

Funktion dieser Protein bewirken. Auch andere Zellzyklus-regulierendeProteine wie

E2F und c-Myc könnten in ihrer Aktivität von Microystin beeinflusst werden, da ihre

Funktion ebenfalls über Protein-Phosphorylierung moduliert wird. Der Funktions-

verlust von p53 nach der Exposition mit Wirkstoffen der Okadasäureklasse kann

womöglich mit der inhibitorischen Wirkung von verschiedenen Vertretern dieser

Stoffklasse auf Apoptose-Prozesse korrelieren (Baxter and Lavin, 1992).

Experimentelle Daten über mögliche inhibitorische Eigenschaften von Microcystin auf

Apoptose-Prozesse fehlen.

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Einleitung

30

Der über den Okadasäureweg modulierbare Phosphorylierungsstatus und damit

möglicherweise einhergehende Funktionsverlust der Tumorsuppressorproteine p53

und pRb im Zustand der Hyperphosphorylierung und die HBx-vermittelten

deregulierenden Effekte auf die Zellzyklus-Regulation könnten kombinatorisch die

Entwicklung und Progression eines HBV-assoziierten HCC beeinflussen.

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Fragestellung

31

1.6. Fragestellung

In dieser Studie sollte die Frage geklärt werden, ob das cyanobakterielle Hepatotoxin

Microcystin-LR und das Hepatits B-Virus x-Protein kombinatorische Effekte bei der

Genese eines HCC zeigen.

Mit Hilfe von in vitro Experimenten wurde der Versuch unternommen, die

verschiedenen Teilaspekte diese Fragestellung zu untersuchen. Experimentell galt

es zunächst die Frage zu klären, ob Microcystin als Inhibitor der

Proteinphosphatasen PP1/ PP2A die Fähigkeit besitzt, das Protein-Gesamt-

phosphorylierungsmuster in einem initiierten Hepatozytenzellkultursystem zu

beeinflussen. Bei der Klärung dieses Aspektes sollte insbesondere die Wirkung von

Microcystin auf die Phosphorylierung der Tumorsuppressorproteine im Sinne einer

Tumorpromotion über den Okadasäure-Pathway beobachtet werden. Von

besonderem Interesse war es in diesem Zusammenhang, zu überprüfen, ob der

durch Microcystin modulierbare Phosphorylierungsstatus der Tumorsuppressor-

proteine und assoziierten Proteine des Zellzyklus die Aktivität dieser Regulatoren

beeinflusst.

Zur Klärung dieser Fragestellung waren vor allem Experimente wichtig, die dazu

dienten, sowohl eine mögliche deregulierende Wirkung von Microcystin auf die

Zellzyklus-Regulation und Apoptose als auch die Microcystin-vermittelte

stimulierende Wirkung auf die G1/ S-Übergang der Zellen zu analysieren.

Im letzten Abschnitt dieser Arbeit wurde schließlich der Frage nachgegangen, welche

synergistischen Effekte von Microcystin und HBx auf die Funktionalität der

regulierenden Proteine des Zellzyklus hinsichtlich einer Deregulation von wichtigen

Kontrollmechanismen in diesem Modellsystem zu beobachten sind.

Um die kombinatorischen Effekte des HBx-Proteins und Microcystin auf die

Funktionalität dieser Regulatorproteine zu untersuchen, wurden die HepG2-Zellen

zunächst mit verschiedenen Luciferase-Plasmiden und einem HBx-

Expressionsvektor kotransfiziert und anschließend mit Microcystin exponiert.

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Fragestellung

32

Über die Modulation der durch die Regulatorproteine-vermittelten Expression des

Reportergens Luciferase nach der Microcystin-Exposition und Expression des HBx-

Gens sollte die Wirkung der beiden Effektoren auf die Funktion der Zellzyklus-

Proteine bestimmt werden.

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Material

33

2. Material und Methoden

2.1. Material

2.1.1. Zellen

HepG2-Zellen: Humane Hepatoma- Linie (American Type Culture Collection, Rockville,

Maryland (USA)

2.1.2. Zellkulturmedium und Zusätze

• DMEM-Flüssigmedium mit 4,5 g Glucose/l Sigma

• DMEM-Trockenmedium Instamed mit 1g Glukose/l Biochrom

• DMEM- ohne Methionin oder Phosphat ICN

• L-Glutamin, 200 mM Sigma

• Fötales Kälberserum Gibco BRL

• Fungizone (Amphotericin B ) Gibco BRL

• Penicillin (10000 U/ml) Sigma

• Trypsin- Na2- EDTA (Versen- Trypsin), 0,25 % Gibco BRL

2.1.3. Bakterien

• E. coli HB 101

2.1.4. Plasmide

2.1.4.1. pSVX- Plasmid

Das Plasmid pSVX (Abb. 2.1) kam aus dem Baylor College of Medicine, Department of

Molecular Virology, in Houston, TX (USA) und leitet sich von dem pSVneo-Vektor ab. Es

besteht aus 6164 bp und enthält die vollständige cDNA-Sequenz von HBx (464 bp) unter der

Kontrolle des CMV-Promotor. Als Selektionsmarker dient ein Ampicillin- und Neomycin-

Resistenzgen .

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Material

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Abb. 2.1: Plasmidkarte von pSVX

2.1.4.2. pSVneo-Kontrollplasmid

pSV2neo (5700 bp) diente als Kontrollvektor, steht unter Kontrolle des CMV-Promotors und

enthält als Selektionsmarker ein Ampicillin- und Neomycin-Resistenzgen.

2.1.4.3. pRc/CMVhp53-Plasmid

Das Plasmid pRc/CMVhp53 kam aus dem Baylor College of Medicine, Department of

Molecular Virology, in Houston ,TX (USA). Es besteht aus 6679 bp und enthält die

vollständige cDNA-Sequenz des humanen p53 (1179 bp) unter der Kontrolle eines CMV

Promotors. Als Selektionsmarker dient ein Ampicillin- und Neomycin-Resistenzgen

Abb. 2.2: Plasmidkarte von pRc/CMVhp53

2.1.4.4. Luciferase-Plasmide

Die verwendeten Luciferase-Konstrukte leiten sich von dem Ausgangsvektor pTA-Luc ab

(Abb.2.3). Der Ausgangsvektor verfügt über `multiple cloning sites´ (MCS), in die cis-aktive

Enhancer-Elemente einkloniert wurden (Fa. Clontech). Die Enhancer integrieren Response-

Elemente für die zellzyklusregulierenden Proteine p53, pRb E2Fund c-Myc. Als Promotor

fungiert eine TATA-Box (PTA), die eine optimale Induktion gewährleistet und gleichzeitig für

einen geringen Hintergrund sorgt.

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Material

35

Der Luciferase-codierenden Sequenz des Plasmids ist das `late´ SV40 Polyadenylations-

Signal nachgeschaltet, wodurch das optimale `Processing´ des Luciferase-Transkripts

garantiert wird. Upstream der MCS befindet sich ein synthetischer Transkriptionsblocker

(TB), der die Hintergrund-Transkription reduziert.

Abb. 2.3: Plasmidkarte von pTA-Luc mit Kennzeichnung dermultiple cloning sites´ (MCS)

2.1.4.5. p53-GFP-Plasmid

Das p53-GFP-Plasmid kam aus dem The Salk Institute in La Jolla,CA (USA) und ist ein

Abkömmling des Vektors pEGFP-N1( Clontech). Es besteht aus 5910 bp und enthält die

vollständige cDNA-Sequenz des humanen p53 (Wt), die C-terminal mit der Gensequenz von

EGFP fusioniert und unter der Kontrolle eines CMV-Promotors steht. Als Selektionsmarker

dienen ein Kanamycin-und Neomycin-Resistenzgen.

2.1.5. Nukleotide, Nukleinsäuren

• Monoribonukleosid- 5´- triphosphate Boehringer Mannheim

• Monodesoxyribonukleosid- 5´- triphosphate Boehringer Mannhein

• DNA- Längenstandard �1 kb- DNA- Leiter� Gibco BRL

• Oligonukleotidprimer MWG

Response- Elemente : • p53 • Rb-E2F • E2F-DP1 • Myc (E-box)

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Material

36

2.1.6. RT PCR-Primer

Px- X- AS (adr):

Sense- Primer 5´- ATG GGA TCC ATG GCT GCT AGG GTG TGC TG� 3´

(1376 nt- 1423 nt)

Px- X- S (adr):

Antisense Primer 5´- ATC CCT AGG TAG GCA GAG GTG AAA AAG TT- 3´

(1828 nt - 1838 nt)

2.1.7. Enzyme, Antikörper und andere Proteine

2.1.7.1. Enzyme

• Alkalische Phosphatase aus Kälberdarm mit

• 10 x Dephosphorylierungspuffer Boehringer Mannheim

• AMV-Reverse Transkriptase Promega

• DNase I, RNase- frei Boehringer Mannheim

• Lysozym Boehringer Mannheim

• Taq DNA-Polymerase mit 10x Puffer Boehringer Mannheim

• RNase A Boehringer Mannheim

• RNase A Typ III-A Promega

2.1.7.2. Restriktionsenzyme

• ACCI, ALW44I, BamHI, HindIII, Nhe I, Sac I,

• Sma I, Xba I, Xbo I mit 10x Inkubationspuffer Roche Diagnostics

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Material

37

2.1.7.3. Antikörper

• Monoklonaler Maus anti-p53 IgG 2ak (100µg/ml); Klon Pab421 Oncogene

• Monoklonaler Maus biotinylierter anti-p53 IgG (100µg/ml) Oncogene

• Monoklonaler Maus anti-Rb IgG2a (0,1ml); Klon XZ91 Neo Markers

• Monoklonaler Human anti-Rb IgG1 (0,1mg); Klon G3-245 Pharmingen

2.1.7.4. Proteine

• Rinderserumalbumin Fraktion V Boehringer

Mannheim

• Rnasin Ribonuklease-Inhibitor Promega

2.1.8. Chemikalien

• Aceton Merck

• Acrylamid Pharmacia

• Actinomycin Sigma

• Agar, Bacto - Difco

• Agarose Servaa

• Ammoniumpersulfat Serva

• N,N, Methylen- Bisacrylamid Pharmacia

• Bromphenolblau Serva

• Borsäure Janssen Chimica

• Cäsiumchlorid Serva

• Calciumphosphat Serva

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Material

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• DEPC Sigma

• Diethylether Riedel- de Haen

• N,N-Dimethyl-Formamid Sigma

• DTT Sigma

• EDTA- Natriumsalz, Versen Merck

• Essigsäure Kraft

• Ethanol Riedel- de Haen

• Ether Wasser gesättigt Riedel-de Haen

• Ethidiumbromid Sigma

• Formaldehyd Sigma

• Glycerol Sigma

• Harnstoff Pharmacia

• HCL, 37% Riedel- de Haen

• Isopropylal Janssen Chimica

• Kristallviolett Merk

• Natriumchlorid Janssen Chimica

• PCR- Öl Sigma

• SDS Serva

• Sucrose Serva

• TEMED Pharmacia

• Trichloressigsäure Sigma

• Tris Sigma

• Triton X-100 Serva

• Tween 20 Serva

2.1.9. Puffer und Lösungen

2.1.9.1. Diverse

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Material

39

• Ethidiumbromid: 10 g/l wässrige Lösung

• DEPC- H2O: 0,1 %ige (w/v) Lösung

→ über Nacht bei Raumtemperatur inkubieren und dann 2x autoklavieren

PBS-Puffer: (pH 7,4)

• 140 mM NaCl

• 2,7mM KCL

• 6,5 mM Na2HPO4

• 1,5 mM KH2PO4

Proteinbestimmung: Bradford-Reagenz Biorad

Toxinlösung: Microcystin-LR (C49 H 74 N10O12 ) Alexis

in DMSO gelöst

2.1.9.2. Phenol / Chloroform -Extraktion von Nukleinsäuren

• Tris/ EDTA Puffer-Phenol gesättigtes Roth/ D

• Tris/ EDTA-Puffer-Wasser- gesättigtes Phenol Roth/ RNA

• Phenol/ Chloroform / Isoamylalkohol (25:24:1)

• Chloroform/ Isoamylalkohol (24:1)

• Ethanol abs. �20°C

• 3M Na-Acetat (pH 4,8)

• 70% Ethanol(v/v)

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Material

40

2.1.9.3. Agarosegelelektrophorese

TAE - Puffer (50x) :

• 2M Tris

• 0,25 M Na - Acetat

• 0,05 M EDTA

pH 7,8

Probenpuffer :

(Nukleinsäure)

• 40,0 % (w/ v) Sucrose

• 1,0mM EDTA (pH 8,0)

• 0,1 % (w/v) SDS

• 0,05 % (w/v) Bromphenolblau

DNA-Marker :

• 60,0µl DNA ( 1µg /µl)

• 40,0µl 10 x TAE

• 300,0 µl Aqua dest.

2.1.9.4. Transfektionslösungen

Ca+2-Phosphat-Transfektion:

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Material

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TE-Lösung :

• 10,0mMTris

• 1,0mM EDTA

• pH 7,8 ;Lösung autoklvieren

2x HBS-Lösung :

• 50,0mM HEPES

• 1,5mM NA2HPO4

• 280,0mM NaCL:

• pH exakt 7,13 einstellen; steril filtrieren

Glycerol-Schocklösung :

• 15% (v/v) Glycerol in HBS Lösung bei 100°C autoklavieren

2.1.9.5. Proteinanalyse-Lösungen

Immunpräzipitation/ Westernblot:

Lysis-Puffer-Lösung:

• 25,0 mM Tris

• 50,0mM NaCl

• 0,5% SDS

• 2,0% Nonidet P-40

• 100,0 µl PMSF (1 mM )

• 167,0 µl Aprotinin (50µg/ ml)

SDS-Sample Puffer :

• 62,5 mM Tris (pH 6,8)

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Material

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• 5,0% Mercaptoethanol

• 2,3% SDS

• 10,0% Glycerol

• 0,001% Bromphenolblau

Protein A-Sepharose (1mg/ ml PBS)/ Sigma P-9424

Trenngel:

• 1,5 M Tris pH 8,8

• 0,4% SDS

• 10,0% Acrylamid

• 0,3% Bis- Acrylamid

Sammelgel (4%):

• 0,5M Tris pH6,8

• 0,4% SDS

• 4,0% Acrylamid

• 0,1% Bis-Acrylamid

Fixierlösung:

• 40,0% Methanol

• 10,0% Eisessig

Transferlösung:

• 25,0 mM Tris

• 192,0 mM Glycerin

• 20,0% Methanol pH 8,3

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Material

43

Blockierungslösung:

• 2,5 % BSA (fettfrei)

• 0,3% Tween-20

Primär Ak-Lösung :

• 2,5µg /ml Ak (p53)

• 1,0% BSA

• 0,3% Tween-20

Waschlösung:

• 0,3% Tween �20 (Tris)

Streptavidin-horseradish:

Peroxidase Konjugat

• 1:10.000 in primäre Ak- Lösung

Stripping-Puffer :

• 100,0 mM 2-Mercaptoethanol

• 2,0% SDS

• 62,5 mM Tris-HCL (pH 6,7)

Renaturierungs-Lösung:

• 5,0% BSA in Tris

• 0,1% Tween-20 (TBS-T)

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Material

44

2.1.9.5.2. Isoelektrische Fokussierung

Lysis-Proben-Puffer :

• 4,0% (w/v) CHAPS

• 40,0 mM Tris

• 65,0 mM DTE

• 0,2 M Harnstoff

• Spritzer Bromphenolblau

Anodenlösung:

• 10,0 mM Glutaminsäure

Kathodenlösung:

• 10,0 mM Lysin

2.1.9.6. Färbelösungen

2.1.9.6.1 Coomassie

Fixierungslösung:

• 12,5 % TCA

Waschlösung:

• 45,0% Methanol

• 9,0% Eisessig

Färbelösung:

• 1,0 g Coomassie Blue R- 250

• 450,0 ml Methanol

• 450,0 ml Aqua dest.

• 1000,0 ml Eisessig

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Material

45

Entfärbelösung:

• 30,0% Ethanol

• 10,0% Eisessig

2.1.9.6.2. Silberfärbung

Thiosulfatlösung:

• 0,2 g/l Natriumthiosulfat

Silbernitratlösung:

• 2,0 g/l Sibernitrat

• 0,5 m/l Formaldehydlösung

• 4,0 mg/l Natriumthiosulfat

Entwicklungslösung:

• 30 g/l Natriumcarbonat

• 0,5 ml Formaldehydlösung (37%)

• 4,0 mg/lNatriumthiosulfat

Stoplösung :

• 5,0 g/l Glycerin

2.1.9.6.3. Ponceau S-Färbung

• 0,1% Ponceau S- Konzentrat in 5% Essigsäure

→ mit 20,0 ml PBS/ Tween-20 verdünnen

2.1.9.7. Zellzahl-und Zellvitalitätsbestimmung

2.1.9.7.1. Neutralrot Test (NR)

Neutralrot:

• 4 mg/ ml Stamm-Lösung in DMEM 1:100 verdünnen;

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Material

46

→ über Nacht bei 37°C im Dunkeln präinkubieren

Extraktions-Lösung:

• 1% Essigsäure in 50% Ethanol

2.1.9.7.2 Trypanblau-Test

Trypanblau:

• 0,4% (w/v) Trypanblau in 0,81 % (w/v)NaCl/0,06% (w/v)K2HPO4 (Sigma)

2.1.9.8. Apoptose-Detektion

2.1.9.8.1. Darstellung von DNA- Fragmenten (Apoptose)

Lyse-Lösung:

• 0,5% (v/v) Triton X-100 in 10 mM Tris (pH 7,5)

2.1.9.8.2. Quantitativer Apoptose-Nachweis (FACS- Analyse)

RNase-A- Stammlösung (1000U/ ml) :

• RNase A Typ III in sterilem Aqua dest. lösen und aliquotiert bei -20°C lagern

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Material

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Probenpuffer:

• 0,1% (w/v) Glucose in PBS steril filtrieren (0,2 µm Filter)

Propidiumjodidlösung:

• 50,0µg /ml Propidiumjodid

• 100,0 U/ml RNase A in Probenpuffer

IsotonII (Coulter)

2.1.9.9 Bakterienkulturen

LB-Medium:

• 10,0 g Bacto Trypton

• 5,0 g Hefeextrakt

• 8,0 g NaCl

• 1ml N NaOH zugeben, pH 7,0 einstellen

• auf 1 l mit Aqua dest. auffüllen.

LB-Agar:

• LB- Medium mit 1,5 % (w/v) Agaranteil

LB+ Medium :

• LB-Medium mit 20 mM MgSO4 und 10 mM KCL

Ampicillin �Stammlösung:

• 50 mg Ampicillin /ml in sterilem Aqua dest. unter Zugabe von NaOH lösen und mit HCL

pH 7,3 einstellen, steril filtrieren und bei �20°C lagern

Chloramphenicol- Stammlösung:

• 34 mg/ml in Ethanol

2.1.9.10 Herstellung kompetenter Bakterien

TfB 1:

• 100,0 mM RbCl2

• 50,0 mM MnCl2

• 30,0 mM Kaliumacetat

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Material

48

• 10,0 mM CaCl 2

• 15,0 % (v/v) Glycerol

(pH 5,8)

TfB 2 :

• 75,0 mM CaCl 2

• 10,0 mM MOPS

• 10,0 mM CaCl 2

• 15,0 % (v/v) Glycerol

2.1.9.11 Nukleinsäure-Präparation

Schnellpräparation bakterieller Plasmid-DNA

Lösung1:

• 50,0 mM Glukose

• 10,0 mM EDTA

• 10,0 mM Tris, pH 8,0

• 2,0 mg/ml Lysozym vor Gebrauch zugeben

Lösung 2 :

• 0,2 M NaOH

• 1,0% (w/v) SDS

Lösung 3 :

• 3M Natriumacetat (pH 4,8)

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Material

49

Präparation von Plasmid-DNA :

STET-Puffer:

• 50,0mM Tris (pH 8,0)

• 50,0mM EDTA

• 8,0% (w/v) Sucrose

• 5,0% (v/v) Trition

TES :

• 50,0mM Tris (pH 8,0)

• 50,0mM NaCl

• 5,0mM EDTA

NaCl-gesättigtes Isopropanol:

• Isopropanol ausschütteln in 10 mM Tris (pH8,0)/ 1mM EDTA gesättigt mit NaCl

Lysozym-Lösung:

• 20 mg Lysozym / ml in 20 mM Tris (pH 8,0)

Sarkosyl-Lösung:

• 1% (w/v) Sarkosyl in 20 mM Tris (pH 8,0)

Ethidiumbromid-Lösung:

• 20 mg Ethidiumbromid-Lösung/ ml in 20 mM Tris (pH 8,0)

Cäsiumclorid-Lösung:

• 50g Cäsiumclorid auf 65 mL mit 20 mM Tris (pH 7,6 auffüllen)/

Refraktionsindex :1,3865

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Material

50

Dialyse :

• 5mM Tris (pH 8,0)

2.1.9.12 Isolierung zellulärer RNA

RBS:

• 10 mM Tris, pH 7,5

• 10mM NaCl

• 1% (v/v) Nonidet P40

2.1.10. Kits

• Luciferase Assay System Clontech

• Mycoplasmen Detection Kit Roche

• Mercury TM Cell Cycle Profiling System Clontech

• Biotinylated p53 Western Blotting System Oncogene

• Servalyt Precotes/ Servalyt PreNets Serva; Heidelberg

2.1.11. Verbrauchsmaterial

Nunc, Eppendorf:

• Reaktionsgefäße

• Pipettenspitzen

• Aufsätze für Multipipetten

• Greiner Falcon- Röhrchen

• ELISA Platten

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Material

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• Zellkulturgefäße

• Zellschaber

Filme:

• Filmtyp 667 Polaroid

• X-OMAT TM AR Kodak

Diverses:

• Dialyseschläuche Gibco BRL

• Kanülen Braun

• Mikrotiterplatten 1450-401 (96 Vertiefung) Wallac

• Papierelektroden Serva

• Pipettenspitzen Eppendorf

• PCR-Reaktionsgefässe Eppendorf

• Quick-Seal TM Röhrchen aus Polyallomer Beckmann

• NAP TM-% Säulen mit Sephadex TM G-25 Pharmacia

2.1.12. Geräte und andere Hilfsmittel

Zentrifugen und Rotoren:

• Beckmann Ultrazentrifuge LE-70 mit Rotor 65 und Ti 70

• Eppendorf Tischzentrifuge 5415 C

• Sorvall RC 28 S mit Rotor F-28/50 und F-16/250

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Material

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Mikroskope :

• Hund Wetzlar Wilovert S

• Leitz Labovert FS 7IF- Mikroskoskop ZEISS

• Zeiss LSM 410 (confokales Laser-Scanning-Mikroskop)

Diverses :

• Du 640 Spektralphotometer Beckmann

• pH-Meter PHI-10 Beckmann

• Gelkammer Bio Rad

• Mini-Polyacrylamidgel-Apparatur Bio Rad

• Thermomixer 5436 Eppendorf

• Begasungsbrutschrank Heraeus

• Sterilbank Lamin Air HB2448 und HB 2472 S Heraeus

• Kombipipette Eppendorf

• Mighty Bright UV-Leuchttisch Hoefer

• Minigelkammer Hoefer

• Müller-Geigerzähler Berthold

• Power Supply PS 500XT DC Hoefer

• Power Supply PS 1500 DC Hoefer

• LKB 2010 Macrophor Sequenziereinheit Pharmacia

• Gene Amp PCR-System 2400, Perkin Elmer

• Polaroid MP4+ Kamera Serva

• Speed Vac SC 110; Savant

• Vortex VF2 Janke und Kunkel

• Kühlschrank -20 °C Kirsch

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Material

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• Kühlschrank 4°C Kirsch

• Gefrierschrank -70°C Sepatech Heraeus

• 1450 Micro Beta Trilux Wallac, Berthold

• Durchflußzytometer Coulter

• Fuchs-Rosenthal Zählkammer Assistent

• Refraktometer Optronic

• UV-Lampe VL-60 Serva

• Spektralphotometer DU640 Beckmann

• Papierelektroden Serva

• Applikatorstreifen Serva

2.1.13. Radiochemikalien

• 32S-Methionin (3,7 MBq) ICN

• 32P-Orthophosphat (1850 MBq) ICN

• Szintillationsmix OptiPhase SuperMix Wallac

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Methoden

54

2.2. Methoden

2.2.1. Kultivierung von Zell-Linien

Die HepG2-Zellen wurden mit Dulbecco´s Modified Eagles Medium (DMEM) bei 37°C und

5% CO2 in Zellkulturflaschen kultiviert. Mit Hilfe des Lichtmikroskopes wurde die Wachstums-

dichte der Zellen kontrolliert. Nach Ausbildung eines sehr dichten Zellrasens oder nach

Bedarf wurden die Zellen im Verhältnis 1:2 oder 1:4 in neue Kulturflaschen umgesetzt. Die

Ablösung der Zellen erfolgte mit Trypsin/ 0,2 g/L Na2 EDTA. Die abtrypsinierten Zellen

wurden zunächst in DMEM mit 10% fötalen Kälberserum (FCS) gehalten, um die

Vermehrung der Zellen zu unterstützen. Bei gutem Wachstum der Zellen erfolgte die weitere

Kultivierung mit 1% FCS Erhaltungsmedium.

2.2.2. Kryokonservierung von Zellen

Zur Langzeitlagerung von HepG2-Zellen in flüssigem Stickstoff bei �196°C wurden die Zellen

abtrypsiniert, zweimal mit DMEM gewaschen und für 10 min bei 2500 rpm zentrifugiert. Das

Zellpellet wurde in 4 ml Einfriermedium (40% Medium mit 10%FCS; 40% FCS, 20 % DMSO)

resuspendiert, in Kryoröhrchen zu je 1 ml aliquotiert, für einen Tag bei �80°C gelagert und

dann in die Flüssigstickstoffbehälter überführt. Bei erneuter Kultivierung der Zellen wurden

die Aliquots bei 37°C kurz erwärmt, zweimal mit DMEM-Wachstumsmedium gewaschen und

anschließend in Wachstumsmedium kultiviert.

2.2.3. Gewinnung und Reinigung von Nukleinsäuren

2.2.3.1. Phenol/Chloroform- Extraktion und Ethanol- Präzipitation

Mit diesem Verfahren wurden Nukleinsäuren aus einer Lösung von störenden Faktoren

(Proteinen/Salzen) getrennt und gereinigt. Zur Fällung der Proteine wurde ein Volumenteil

einer wässrigen Nukleinsäure-Lösung mit einem Volumenanteil TE-Puffer-gesättigtem

Phenol vermischt und 2 min bei 14000 rpm zentrifugiert. Die wässrige obere Phase wurde

abgenommen und anschließend mit einem Volumenanteil eines Phenol/Chloroform/

Isoamylalkohol (25:24:1) Gemisches ausgeschüttelt und zentrifugiert (2 min/14000 rpm).

Dieser Vorgang wurde nochmals mit Chloroform/Isoamylalkohol (24:1) wiederholt, um

Phenolreste wieder zu eliminieren. Die Nukleinsäurefällung erfolgte durch Zugabe von 1/10

Volumen 3 M Natriumacetat-Lösung (pH 4,8) und dem 2,5-fachen Volumen absoluten

Ethanol bei -80°C für 30 min. Nach einer 30 min Zentrifugation bei 14000 rpm wurde der

Überstand verworfen, das Pellet einmalig mit 70%igen Ethanol (-20°C) gewaschen und das

Pellet unter Vakuum getrocknet. Das getrocknete Pellet wurde dann in einem geeigneten

Volumen DEPC-H20 aufgenommen.

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Methoden

55

2.2.3.2. Aufreinigung von Oligonukleotidprimern

Die Primer-Lyophillisate wurden in 500 µl Aqua dest. aufgenommen und zur Entfernung der

Salzrückstände mit Säulen aus Sephadex G-25 (NAP TM- 5 Säule) gereinigt. Zuvor

wurden die Säulen für die Reinigung präpariert, in dem sie dreimal mit 10 ml DEPC-H2O

gespült wurden. Danach wurde je 500 µl Primer-Lösung auf die Säule pipettiert und, sobald

die Primer-Lösung in die Säule eingedrungen war, mit 1 ml DEPC-H2O eluiert. Mit dem Eluat

erfolgte dann eine photometrische Konzentrations- und Reinheitsbestimmung.

2.2.3.3. Isolierung zellulärer RNA

Um die Expression des HBx-Gens in HepG2-Zellen zu detektieren, wurden die Zellen durch

das nicht ionische Detergenz NP-40 in einem hypotonen Puffer lysiert, wobei die Zellkerne

intakt bleiben und abgetrennt werden, so dass die RNA des Zytoplasmas im Anschluß durch

eine Phenol-/Chloroform-Extraktion isoliert werden kann. Nach der Entfernung des Mediums

wurden die in 6 Well- Platten kultivierten HepG2-Zellen mehrmals mit 1 ml PBS gewaschen

und schließlich mit 1 ml PBS abgeschabt. Nach der Überführung der Zellen in ein

Eppendorfcup erfolgte 1 min Zentrifugation bei 14000 rpm. Der Überstand wurde dekantiert

und das Zellpellet auf Eis mit 200µl RBS bis zur Schaumbildung resuspendiert. Die Zellkerne

wurden abzentrifugiert (1 min bei 14000 rpm) und der nukleinhaltige Überstand mehrmals mit

TE-Puffer gesättigtem Phenol-/Chloroform (1:1) extrahiert, bis die Interphase klar war. Aus

dem Überstand wurde die RNA mit Ethanol gefällt, abzentrifugiert und vakuumgetrocknet.

Die Präperationen wurden in 30 µL DEPC-H2O aufgenommen und als RNA-Template in die

RT-PCR eingesetzt.

2.2.3.4. Auftrennung der Nukleinsäure-Fragmente durch Agarosegelelektro-phorese

Die Auftrennung von Nukleinsäure-Fragmenten erfolgte mit horizontalen 0,6 -1%igen

Agarosegel in TAE-Puffer unter Zusatz von 0,4µg/ml Ethidiumbromid. Die Agarose

wurde in TAE-Puffer aufgekocht, nach Abkühlung mit Ethidiumbromid versetzt und in

einen abgedichteten Gelschlitten mit eingestecktem Kamm gegossen. Nach dem

Erstarren des Agarosegels wurde der Kamm entfernt und der Gelschlitten in die mit

TAE-Puffer gefüllten Gelkammer gelegt. Die Proben wurden mit 1/5 Volumen

Probenpuffer vermischt und in die Geltaschen pipettiert.

mb2000
mb2000
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Methoden

56

Zur Auftrennung der Fragmente wurde eine konstante Spannung von 1- 10 V/cm

Elektrodenabstand angelegt. Die Laufzeit betrug ca. 1 bis 2 h, je nach Länge der

Laufstrecke und angelegter Spannung. Als Marker zur Identifizierung der

Fragmentgrößen diente der 1 Kb DNA-Marker. Die Beurteilung der Gele erfolgte

unter UV-Licht mit einem UV-Transilluminator.

2.2.4. Photometrische Konzentrations-, Stoffmengen- und Reinheitsbestimmung von Nukleinsäuren

Zur Bestimmung der Nukleinsäure-Konzentration wurde ihre optische Dichte (OD) bei 260

nm gemessen.

1 OD bei DNA-Doppelstrang (ds) = 50 µg/ml

1 OD bei RNA-Einzelstrang (ss) = 40 µg/ml

Angaben über die Reinheit der Nukleinsäure-Lösung gewinnt man durch die Berechnung des

Quotienten OD260/ OD280 .

Bei einer reinen DNA-Lösung sollte der Quotient OD260/ OD280 bei 1,8-2,0 liegen.

2.2.5. Enzymatische Modifikation von Nukleinsäuren

DNA-Spaltung mit Restriktionsendonukleasen:

Die Enzymreaktion unterschiedlicher Restriktionsenzyme setzt den Gebrauch entsprechen-

der Puffer und Salzkonzentrationen voraus.

Ein Standardrezept für einen Restriktionsverdau lautet :

• 5 µg DNA

• 2 µl 10 x Enzympuffer

• 1 U/ µg Restriktionsenzym

• ad 20 µl Aqua dest.

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Methoden

57

Optimale Temperatur und entsprechender Inkubationspuffer wurden vom Hersteller

angegeben. Nach der Inkubation von 1-2 h bei optimaler Temperatur wurde die Reaktion per

Agarose-Gelelektrophorese kontrolliert.

2.2.6. Vermehrung und Gewinnung von Plasmid-DNA

2.2.6.1. Kompetente Bakterien für die Transformation

Für die Herstellung von kompetenten Bakterien wurden zunächst 3 ml LB+-Medium mit 20µl

einer Bakterienkolonie (Stamm HB 101) beimpft und über Nacht bei 37°C kultiviert. Mit 1ml

dieser Übernachtkultur wurden wiederum 100 ml LB + Medium beimpft und solange bei 37

°C kultiviert, bis sie eine OD660 von 0,40 bis 0,55 erreicht hatte. Dann wurde die Kultur 10 min

auf Eis gelagert und mehrmals geschüttelt. Nach einer 10 min Zentrifugation (3000 rpm in

F16/250 Rotor bei 4 °C) wurden die Bakterien in 30 ml kaltem TfB1 resuspendiert, 10 min auf

Eis inkubiert und für weitere 10 min bei 3000 rpm zentrifugiert (Rotor F-16/250 bei 4°C). Das

Pellet wurde in 4 ml kaltem TfB 2 aufgenommen und die Bakterienkultur aliquotiert und bei -

80°C gelagert. Zur Transformation durften die Bakterien frühstens 1 h nach dem Einfrieren

wieder aufgetaut werden.

2.2.6.2. Transformation mit kompetenten E. coli Bakterien

Die bei -80 °C gelagerten aliquotierten Bakterien (HB 101) wurden auf Eis (5-10 min)

aufgetaut. Zur Transformation wurden 80 µl kompetente E. coli Zellen entnommen,

zu 20 µl Plasmid-DNA pipettiert, vorsichtig gemischt und für 30 min auf Eis inkubiert.

Dann erfolgte ein Hitzeschock bei 42°C für 2 min und anschließend wurden die

Ansätze durch die Inkubation auf Eis (2 min) Kälte geschockt. Dann wurden jeweils

320 µl LB+-Medium zu den Ansätzen pipettiert, für 1 h in einem Schüttelinkubator bei

37°C inkubiert und an-schliessend wurden 100µl des Transformationsansatzes auf

LB-Agarplatten mit Ampicillin (100µg/ml) ausplattiert und bis zur Ausbildung der

Kolonien bei 37°C über Nacht inkubiert.

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Methoden

58

2.2.6.3. Plasmidisolierung (Schnellpräparation) aus E. coli

Mit diesem Verfahren wird eine ausreichende Menge Plasmid-DNA aus transformierten

Bakterien isoliert, um rekombinierte Bakterienklone anschließend durch eine Restriktions-

enzymspaltung ihrer Plasmid-DNA ermitteln zu können. Die Bakterienkolonien, die nach der

Transformation auf den Agarplatten entstanden waren, wurden isoliert, in je 3ml LB-Medium

(mit 100µg/ml Ampicillin) überführt und über Nacht bei 37°C auf einem Schüttler inkubiert.

Am nächsten Tag wurde 1 ml aus jeder Übernachtkultur in ein Eppendorf-Cup überführt, 30 s

bei 9000 rpm zentrifugiert, der Überstand dekantiert und das Pellet durch Vortexen in 100 µl

Lösung 1 (Resuspensions-Lsg.) resuspendiert und 5 min bei Raumtemperatur inkubiert.

Dann wurden die Ansätze jeweils mit 100 µl Lösung 2 (Denaturierungs-Lsg.) versetzt, gut

gemischt und 5 min bei 60°C inkubiert. Anschließend wurden 150 µl Lösung 3

(Neutralisierungs-Lsg.) zugegeben, kurz gevortext und 15 bis 30 min auf Eis inkubiert. Nach

einer 10 min Zentrifugation bei 14000 rpm wurde der DNA-haltige Überstand abgenommen

und zur Präzipitation der DNA wurden die Proben mit 1ml Ethanol abs. versetzt und für 15

min bei �80°C inkubiert. Anschließend wurde für 10 min bei 14000 rpm zentrifugiert und das

Pellet zweimal mit 70%igem Ethanol gewaschen und vakuum getrocknet. Das getrocknete

Pellet wurde in 50 µL DEPC-Aqua dest. aufgenommen.

2.2.6.4. Präparation von bakterieller Plasmid-DNA

Diese Methode wurde eingesetzt, um Plasmid-DNA in einer hohen Konzentration mit einem

hohen Reinheitsgrad zu isolieren. Nach der Präparation wurde die isolierte Plasmid-DNA für

die Transfektionsexperimente verwendet.

500 ml LB- Medium mit 100 µg/µl Ampicillin wurden mit 1 ml einer frischen Übernachtkultur

transformierter E. coli Bakterien beimpft und bei 37°C auf einem Schüttler inkubiert bis die

OD550 der Bakterienkultur zwischen 0,85-1,0 lag. Durch Zugabe von Chloramphenicol

(Endkonzentration 170µg/ mL) wurden die Kulturen über Nacht bei 37°C weiter geschüttelt.

Die Bakteriensuspension wurde bei 4°C für 20 min und 4000 rpm in einem F16/250-Rotor

(Sorvall) zentrifugiert. Der Überstand wurde vollständig entfernt, das Pellet in 20 ml TES-

Puffer gewaschen und die Bakteriensuspension erneut bei 5000 rpm für 10 min zentrifugiert.

Im Anschluss wurde das Pellet in 25 ml frisch angesetztem STET-Puffer resuspendiert und

in einen 100 ml Erlenmeyerkolben überführt. Durch die Zugabe von 1 ml Lysozym-Lösung

und anschließendem Aufkochen über dem Bunsenbrenner für 40 s wurden die Zellen lysiert.

Die zähflüssige Maße wurde im F28/50-Rotor (Sorvall) für 45 min bei 16000 rpm

zentrifugiert, der Überstand mit dem gleichen Volumen Isopropanol versetzt und zur

Präzipitation der DNA für 10 min bei �80°C inkubiert.

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Methoden

59

Anschließend wurde die DNA durch Zentrifugation für 60 min bei 12000 rpm im F28/50-Rotor

(Sorvall) pelletiert, 10 min im Vakuum getrocknet und in 8,7 ml Sarkosyl-Lösung

resuspendiert. Nach Zugabe von 9,4 g Cäsiumchlorid und 900 µl Ethidiumbromid-Lösung (20

mg/ ml) erfolgte eine isopyknische Zentrifugation für 24h bei 20°C und 50000 rpm im Typ FW

65- Rotor (Beckmann). Die Plasmidbande wurde unter UV-Licht mit einer Spritze (Kanüle

1,2x 50mm) abgezogen, auf 12 ml mit einer Cäsiumchlorid-Lösung (refraktiver Index 1,3865)

aufgefüllt und für 24h bei 20°C und 50000 rpm im Typ FW 65- Rotor zentrifugiert. Die

Plasmidbande wurde erneut abgezogen und die Lösung durch Ausschütteln mit NaCl-

gesättigtem Isopropanol vom Ethidiumbromid befreit. Anschließend wurde das

Cäsiumchlorid durch Dialyse über Nacht gegen 5 mM Tris-Puffer (pH 8,0) entfernt. Die DNA-

Konzentration sowie die Reinheit der Präparation wurde photometrisch bestimmt. Zur

Überprüfung der Plasmididentität wurde eine Restriktionsenzymspaltung durchgeführt.

2.2.6.5. DNase-Digestion

Der Verdau wurde im Anschluss an die RNA-Extraktion durchgeführt. Die Proben wurden mit

5 U DNase 1 / RNase frei für 15 min bei 37°C inkubiert und anschließend einer Phenol/

Chloroform-Extraktion und Ethanol-Fällung unterzogen. Durch die Digestion sollte eine

DNA-Kontamination bei der RT-PCR ausgeschlossen werden.

2.2.6.6. RNase-Digestion

Um RNA-Kontaminationen bei der Analyse von Apoptose in HepG2-Zellen mittels FACS und

DNA-Fragmentierung auszuschließen, wurde ein RNase-Verdau mit den extrahierten Proben

durchgeführt. In der Regel wurden 30-50µL Probenmaterial mit 1 µL RNase A (20 mg/ mL)

versetzt und 1 h bei 37°C inkubiert.

2.2.7. RT-PCR zum Nachweis von HBx-RNA

Als Template für die HBx-RT-PCR dienten 1-2 µl RNA-Präparation von den mit dem HBx-

Expressionsvektor transfizierten HepG2-Zellen. Die RNA wurde dabei in PCR-Puffer mit 50

pmol Sense- und Antisense Primer in 90% des Endvolumens gemischt und für 5 min bei

95°C denaturiert. Nachdem die Ansätze auf Eis abgekühlt waren, wurde das

Reaktionsvolumen auf 50 µl mit 2,5 U AMV-ReverseTranskriptase und 2U Taq-DNA-

Polymerase ergänzt.

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Methoden

60

Die reverse Transkription erfolgte in allen Fällen für 30 min bei 42°C, gefolgt von einem

Denaturierungsschritt von 2 min bei 94°C. Daran schlossen sich 30 PCR-Zyklen mit

folgenden Parametern:

• Denaturierung 1 min bei 94 °C

• Annealing 2 min bei 56 °C

• Extension 3 min bei 72 °C

Nach Beendigung der PCR wurden die Proben mit DNA-Probenpuffer versetzt und das PCR

Produkt durch Auftragen auf ein 0,6 -%iges Agarosegel nachgewiesen.

2.2.8. Vitalitäts-Test

2.2.8.1. Neutral Rot (NR)-Test

(Bulgchev et al. 1978)

Mit Hilfe des Neutral Rot-Test wurde der Effekt von Microcystin auf die Vitalität von HepG2-

Zellen analysiert. Im Vordergrund stand dabei den optimalen Dosisbereich für dieses

Testsystem zu ermitteln. Zur Durchführung des NR-Testes wurden in eine 96-Well

Mikrotiterplatten pro Vertiefung 1x 106 Zellen eingesaet und für zwei Tage bei 37°C/ 5% CO2

kultiviert. Danach wurden die HepG2-Zellen für 2h mit Mircrocystin in einer Konzentration

von 0,1 µM, 1 µM und 10 µM und verschiedenen DMSO-Lösungen (0,004%, 0,04%, 0,4%)

bei 37°C/ 5% CO2 im serumfreiem Medium exponiert. Die DMSO-Kontrollen wurden mit-

geführt, um die interferierenden Effekte des Lösungsmittels auf die Vitalität von HepG2-

Zellen darzustellen. Nach der Exposition wurde das Meduim der Zellen abgesaugt und

zweimal mit 1x PBS gespült. Anschließend wurden die Zellen mit jeweils 100 µl im Dunkeln

bei 37°C präinkubierter NR-Lösung pro Well für 3h in serumfreiem Medium bei 37°C/ 5%

CO2 inkubiert. Nach Verwerfen des Überstandes wurden die Zellen mehrmals mit 1x PBS

gewaschen und durch Zugabe von 100 µl Extraktions-Lösung extrahiert. Nach 10 min

vorsichtigen Schüttels wurde die Extinktion bei 540 nm bestimmt. Als Blank diente ein

Ansatz, bei dem das NR fehlte. Die gemessene Vitalität der mitgeführten Kontrolle, die

weder mit Microcystin noch DMSO exponiert wurde, diente als Bezuggrösse für die

Ermittlung der endozytotischen Aktivität der Microcystin- oder DMSO-exponierten Proben

und wurde gleich 100% Vitalität gesetzt.

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Methoden

61

Die Quantifizierung des extrahierten Farbstoffes aus den vitalen Zellen erfolgt mit den Elisa-

Reader, wobei die Absorbanz des Farbstoffes mit der Anzahl an vitalen Zellen korreliert.

2.2.8.2. Trypanblau-Test

Mit Hilfe des Trypanblau-Testes wurde die Membranpermeabilität von Zellen analysiert.

Dieser Test wurde einerseits zur generellen Zellzahlbestimmung, andererseits als

Vitalitätstest zur Ermittlung der protektiven Wirkung von Microcystin vor UV-induziertem

Zelltod in HepG2-Zellen eingesetzt. Trypanblau ist ein saurer Farbstoff, der von toten Zellen

aufgenommen wird und sie blau anfärbt. Lebende Zellen sind in der Lage den Farbstoff

auszuschliessen.

Für die Zellzahlbestimmung wurden in der Regel konfluent wachsende HepG2-Zellen einer

75er Kulturflasche abtrypsiniert und ein Volumenanteil der Zellsuspension mit einem

Volumenanteil Trypanblau-Lösung (0,2 -%ig) gemischt. Nach einer 2 min Inkubation bei RT

wurde die Zellzahl der vitalen unangefärbten Zellen mit Hilfe der Fuchs-Rosenthal Kammer

unter Berücksichtigung des Kammerfaktors und Verdünnungsfaktor ermittelt.

Zur Bestimmung des protektiven Einflusses von Microcystin vor UV-induziertem Zelltod

wurden konfluent wachsende HepG2-Zellen in einer 75er Kulturflasche mit 0 µM, 10 µM

Microcystin oder 0,4% DMSO in serumfreiem Erhaltungsmedium für 2h bei 37°C/ 5% CO2

präinkubiert. Anschließend wurden die Zellen nach mehrmaligem Spülen mit 1x PBS mit

Erhaltungsmedium versorgt und mit 100 J/m2 UV-Licht (254 nm) bestrahlt.

Nach einem erneuten Mediumwechsel wurden die Zellen für 24h bei 37°C/ 5% CO2 kultiviert.

Nach der mikroskopischen Kontrolle wurden die Zellen mittels einer Trypsin-EDTA-Lösung

aus der 75er Kulturflasche gelöst. Ein Volumenanteil der Zellsuspension wurde mit einem

Volumenanteil Trypanblau gemischt und von ca. 5 x 105 Zellen der Anteil (%) toter, blau

angefärbter- und vitaler Zellen bestimmt.

Die protektive Wirkung von Microcystin vor UV-induziertem Zelltod wurde letztendlich durch

den Vergleich des Anteils (%) toter Zellen der UV-induzierten Proben, unter Berück-

sichtigung der entsprechenden DMSO-Kontrolle, ermittelt. Die mitgeführten unbestrahlten

Ansätze dienten zur Ermittlung des Vitalitätszustandes der eingesetzten HepG2-Population.

Durch das Mitführen von Zellen, die nur mit DMSO oder Microcystin ohne UV-Bestrahlung

exponiert wurden, konnten Aussagen über die alleinige Wirkung beider Lösungen auf die

Zellvitalität gemacht werden. Generell wurden mit Hilfe der DMSO-Kontrolle interferierende

Effekte von DMSO in diesem Testsystem ermittelt. Der Prozentsatz an toten Zellen wurde

nach der folgenden Formel errechnet:

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Methoden

62

2.2.9. radioaktive Markierung

2.2.9.1. Metabolische Markierung von Zellen mit 32P- und 35S- Methionin

Um die Effekte von Microcystin auf die Akkumulation von Phosphoproteinen oder die

Hyperphosphorylierung der Tumorsuppressorproteine (p53/ pRb) oder die metabolische

Stabilisierung von p53 zu analysieren, wurden die HepG2-Zellen zunächst metabolisch

markiert. Generell konnte bei der metabolischen Markierung auf die aktivierende UV-

Induktion von p53 verzichtet werden, da Vorversuche zeigten, dass die Markierung mit

Radionukliden ausreicht um das p53- Molekül in HepG2-Zellen zu aktivieren.

Für die metabolische Markierung wurden die HepG2-Zellen in einer Dichte von 5x 105 Zellen

in 6-Wellplatten eingesaet und zwei Tage bei 37°C/ 5% CO2 kultiviert. Zur Vorbereitung auf

die Markierung wurden die Zellen für 14 h in einem Mangelmedium (ohne Phosphat, ohne

Methionin) kultiviert und dann durch den Zusatz von entweder 7,4 MBq/ml 32P oder

3,7MBq/ml 35S- Methionin im Mangelmedium für 3h metabolisch markiert. Nach der

Markierung wurde der radioaktive Überstand entsorgt, mehrmals mit 1x PBS gespült und die

Zellen mit 3 ml frischem, serumfreiem Medium versorgt. Im Anschluss wurden die markierten

Zellen mit verschiedenen Microcystin-Konzentrationen (0,1 µM, 1 µM, 10 µM) oder 0,4%

DMSO-Löung für 2h bei 37°C/ 5% CO2 exponiert. Nach der Exposition wurden die Zellen

mehrmals mit 1x PBS gespült, abgeschabt und mit 500 µl Proteinlysis-Puffer lysiert. Um die

zellulären Bestandteil zu entfernen folgte eine 10 min Zentrifugation bei 12000 rpm (4°C).

Um die quantitative Microcystin-vermittelte Akkumulation von Phosphoproteinen oder

metabolische Stabilisierung von p53 zu bestimmen, wurde mit äquivalenten Proteinmengen

eine Szintillations-Messung am Trilux 1450 Microbeta mit zuvor abgeglichenen Detektoren

(Normalisierung) durchgeführt. Um den Einfluss von Microcystin auf die metabolische

Stabilisierung von p53 und auf die Hyperphosphorylierung der Tumorsuppressorproteine zu

bestimmen, wurde nach der Markierung und Exposition mit DMSO und Microcystin eine

Immunpräzipitation durchgeführt.

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Methoden

63

2.2.9.2. Flüssigkeits-Szintillations-Messung von 32P und 35S-Methionin markierten HepG2-Gesamtzellproteinextrakten

Diese Technik eignet sich zur Quantifizierung von verschiedenen Radioisotopen (ß-Strahler).

Das Grundprinzip dieser Methode besteht darin, dass emittierte ß-Strahlung in der

markierten Probe von fluoreszierenden Molekülen absorbiert und als Lichtenergie

abgegeben wird (Szintillation). Die dabei entstehenden Lichtimpluse werden von einer

Photokathode registriert und danach weiterverarbeitet. Je höher der Wert für die maximale

Energie der ß- Strahlung ist (Emax), desto mehr Lösungsmittelmoleküle werden von dem ß-

Teilchen angeregt und desto stärker ist der abgegebene Lichtimpuls.

Für die Szintillations-Messung wurden äquivalente Mengen von 35S- oder 32P- markierten

HepG2-Lysaten mit 100 µl Szintillations-Mix gemischt und die Radioaktivität (cpm/µg Protein)

in den verschiedenen Proben mit Hilfe des Mikrobeta Trilux mit zuvor abgeglichenen

Detektoren (Normalisierung) gemessen. Anhand der gemessenen cpm/µg Protein werden

die Effekte von Microcystin auf die Proteinstabilität und Akkumulation von Phosphoproteinen

bestimmt. Die ermittelten cpm/µg Protein in der unbehandelten markierten HepG2-Probe

dienten unter Berücksichtigung der DMSO-Kontrolle als Bezugsgrösse für die Ermittlung des

Einflusses von Microcystin auf die Proteinstabilität und Akkumulation von Phosphoproteinen.

2.2.10. Quantifizierung von Proteinen

Proteinstimmung nach Bradford :

Zur Bestimmung äquivalenter Proteinmengen wurde die Proteinbestimmung nach Bradford

durchgeführt. Zur Messung des Proteingehaltes wurde jeweils aus den markierten und

unmarkierten HepG2-Zellextrakten 5 µl entnommen oder 5 µl des Lysis-Puffers (Blank), mit

795 µl Aqua bidest. und 200 µl Coomassie-Brillant-Blau G250 vermischt. Nach einer 5 min

Inkubation bei RT wurde die Absorption der Proben bei 595 nm am Photometer bestimmt.

Zur Standardisierung wurde Rinderserumalbumin von 1mg/ ml eingesetzt.

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Methoden

64

2.2.11. Darstellung und Auswertung von Proteingelen

2.2.11.1 SDS-PAGE

Die Proteine wurden mit Hilfe einer diskontinuierlichen, eindimensionalen SDS-PAGE nach

ihrem Molekulargewicht aufgetrennt. Die radioaktiv markierten Immunpräzipitate (2.2.9.1)

wurden auf einem 10%igen Trenngel (p53) oder auf einem 5- 15%igen Gradienten-Trenngel

(pRb) aufgetragen. Für die Western-Blot- Analyse (2.2.14) wurde ein 12%iges Trenngel

verwendet. Als Sammelgel wurde in der Regel ein 4%iges Gel gegossen. Zur Überprüfung

der Proteinbestimmung nach Bradford wurden in einigen Fällen die Gele mit Coomassie-

Blau gefärbt. Die optische Darstellung der 35S-markierten Immunpräzipitate erfolgte per

Fluorographie und die 32P-Orthophosphat markierten Immunpräzipitate via Autoradiographie.

Die Western-Blot-Analyse wurde durch die ECL-Reaktion visualisiert.

2.2.11.2. Autoradiographie

Die mit Hilfe der SDS- PAGE aufgetrennten 32P-markierten Immunpräzipitate wurden in 10%

Eisessig/40% Methanol-Lösung fixiert und auf einen Röntgenfilm bei �80°C exponiert. Die

Autoradiogramme wurden mittels der Software ImageLab Version 2.0 densitometrisch

quantifiziert.

2.2.11.3. Fluorographie

Mit der fluorographischen Darstellung wurden die 35S-Methionin markierten Immun-

präzipitate nachgewiesen. Nach der Fixierung der Proteingele in 10% Eisessig / 40%

Methanol erfolgte die Inkubation der Gele in einem Szintillationsmix für 30 Minuten. Dann

wurden die Vakuum-getrockneten Gele zum Nachweis der Immunpräzipitate bei �80°C auf

einem Röntgenfilm für 2-3 Tage exponiert. Die Fluorogramme wurden mittels der Software

ImageLab Version 2.0 densitometrisch quantifiziert.

2.2.11.4. Densitometrie

Die nach der Autoradiographie und Fluorographie auf dem Röntgenfilm nachgewiesenen

geschwärzten Proteinbanden wurden eingescannt und dann mittels der Software ImageLab

Version 2.0 densitometrisch quantifiziert. Das Densitometer zeichnet die Banden in

Abhängigkeit von der Schwärzung in Form von Peaks auf. Das Integral der Fläche unter den

erhaltenen Peaks gilt als relatives Maß für die Proteinmenge in den entsprechenden Banden

der Gele.

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Methoden

65

2.2.12. Methoden der Proteinanalytik

2.2.12.1. Immunpräzipitation mit Protein-A-Sepharose

Um die Effekte von Microcystin auf die metabolische Stabilisierung von p53 und

Hyperphosphorylierung von p53 und pRb zu analysieren, wurde mit den 35S-Methionin- und 32P-Orthophosphat markierten HepG2-Zellen eine Immunpräzipitation durchgeführt. Zur

Immunpräzipitation von p53 und pRb wurden zunächst 500µg des radioaktiv markiertem

HepG2-Lysat mit 20 µl Protein A für 1h bei 4°C präinkubiert, um unspezifische Bindungen

an den Protein A-Sepharose-Beads zu vermeiden. Das Lysat-Protein A-Gemisch wurde für

10 Minuten bei 14000 rpm (4°C) zentrifugiert und der Überstand für 2 h mit 1µg p53

Antikörper oder 1µg pRb Antikörper bei 4°C inkubiert. Im Anschluss wurde der

Immunkomplex durch eine 2h Inkubation (4°C) mit den Protein A-Sepharose-Beads

gesammelt und durch vorsichtiges Zentrifugieren bei 4°C mit 2000 rpm pelletiert. Das Pellet

fünfmal mit PBS gespült und nach der letzten Zentrifugation bei 2000 rpm mit 30 µl 2x SDS-

Loading Puffer resuspendiert. Zur Dissoziation des Immun-Beads-Komplexes erfolgte eine 4

min Erhitzung bei 95°C und anschließend eine 2 min Zentrifugation bei 14000 rpm. Die

Immunpräzipitate wurden mittels SDS-PAGE elektrophoretisch aufgetrennt. Mit Hilfe der

Beads-Kontrolle und Negativ-Kontrolle (Ak nicht gegen p53 oder pRb gerichtet) sollten

mögliche unspezifische Reaktionen bei der Immunpräzipitation erfasst werden.

Die Bestimmung der Wirkung von Microcystin auf die metabolische Stabilsierung von p53

und Hyperphosphorylierung von p53 und pRb wurde durch die qualitative Beurteilung der

Intensität der Proteinbanden bestimmt. Die Intensität der markierten unbehandelten Probe

unter Berücksichtigung der DMSO-Kontrolle diente dabei als Bezugsgrösse. Die quantitative

Bestimmung der Microcystin-assoziierten Effekte erfolgte per Densitometrie.

2.2.12.2. Isoelektrische Fokussierung (IEF)

Mit Hilfe der IEF wurde der Einfluss von Microcystin auf die Hyperphosphorylierung von p53

bestimmt. Die IEF bietet die Möglichkeit posttranslationale Modifikationen an Proteinen als

Mikroheterogenitäten elektrophoretisch darzustellen. Die Proteine wandern im elektrischen

Feld durch einen pH-Gradienten bis zu ihrem isoelektrischen Punkt (IP), der durch die

Nettoladung des Proteins bestimmt wird und an diesem Punkt Null beträgt. Die Nettoladung

eines Proteins ist die Summe aller negativen und positiven Ladungen an den Amino-

säurenseitengruppen. Protein-Modifikationen gehen mit der Änderung des Ladungs-

zustandes des Proteins einher und verschieben somit den IP.

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Methoden

66

Durch die Kombination der IEF mit der WB-Analyse können Microcystin-induzierte

Änderungen des Phosphorylierungs-musters von p53 (Hyperphosphorylierung) in der IEF

aufgetrennt werden und anschließend die entsprechenden Phosphostellen im p53-Protein

mit monoklonalen Antikörper nachgewiesen werden. In diesem Fall wurde ein biotinylierter

Antikörper gegen p53 Wt eingesetzt (s. WB- Analyse).

Bevor die IEF gestartet wurde, erfolgte die Hochregulation des p53-Proteins in den HepG2-

Zellen mit Hilfe einer 20h Inkubation mit 0,45 nM Actinomycin D. Anschließend erfolgte eine

Inkubation der Zellen mit 0 µM oder 10 µM Microcystin oder 0,4% DMSO für 2h. Danach

wurden die Zellen mit 600µl IEF-Lysis-Puffer lysiert und um die unlöslichen zellulären

Bestandteile zu entfernen für 5 min bei 14000 rpm (4°C) zentrifugiert. Der proteinhaltige

Überstand wurde bis zum IEF� Lauf auf Eis inkubiert.

Vor dem Start der IEF wurde die Kühlplatte der IEF- Apparatur auf 4°C vorgekühlt und mit

2 ml Kühlmittel benetzt. Dann wurde das IEF-Fertiggel (pH 5-7) luftblasenfrei aufgelegt und

mit Kathoden-/ Anodenpuffer getränkte Papierelektroden versehen. In den mittig aufgelegten

Applikatorstreifen wurden gleiche Mengen an Probenmaterial pipettiert und die Stab-

Elektroden auf die getränkten Papierelektroden gelegt, mit einer Glasplatte beschwert und

an die Spannungsquelle angeschlossen. Die Laufzeit der Fokkussierung betrug 3h bei 2000

V/3mA. Bevor das IEF-Gel auf eine Nitrozellulose Membran geblottet wurde, erfolgte partiell

die Überprüfung des Gellaufes mit Hilfe der Ponceau S-Färbung.

2.2.12.3. Western-Blot-Analyse

Mit Hilfe der WB- Analyse sollte der Effekt von Microcystin auf die metabolische Stabilität von

p53 analysiert werden. Für die WB- Analyse wurden die HepG2-Zellen (5x105) in eine 6-

Wellplatte eingesaet und für zwei Tage bei 37°C / 5% CO2 kultiviert. Mit Hilfe einer UV- Be-

strahlung (7J/m 2 /254nm) wurde das p53-Protein in HepG2-Zellen induziert. Nach der UV-

Induktion erfolgte zunächst ein Mediumwechsel und dann für 18 h eine Inkubation bei 37°C/

5% CO2. Die 18h Inkubation nach der UV-Induktion war für die Akkumulation des p53-

Proteins (endogen) in den HepG2-Zellen erforderlich. Bei der Induktion des p53-Proteins

mittels UV-Licht erfolgt eine langsame Phosphorylierung des p53-Proteins, die jedoch für

längere Zeit anhält (Appella and Anderson, 2001). Nach der 18h Inkubation wurden die

HepG2-Zellen für 2h mit Microcystin in einer Konzentration von 0,1 µM, 1 µM und 10 µM und

0,4 % DMSO bei 37°C/5% CO2 exponiert. Anschließend wurden die Zellen mehrmals mit 1x

PBS gespült, abgeschabt und in einen Proteinlysis-Puffer lysiert. Mit Hilfe des Elektroblotes

wurden die im Gel befindlichen Proteine auf eine Nitrozellulosemembran transferiert. Durch

die reversible Ponceau S-Färbung wurde die Protein-Konzentration und die Qualität des

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Methoden

67

Transfers überprüft. Um die unspezifischen Bindungsstellen zu blockieren wurde die

Membran für 30 min mit einer 0,2% Tween 20-Lösung in Tris (TBST) vor der Immunreaktion

inkubiert. Dann erfolgte die 1h Inkubation der Membran mit dem p53- biotinylierten

Antikörper bei RT. Um unspezifische Bindungen und überschüssigen Antikörper zu

eliminieren folgte ein dreimaliges Spülen der Membran mit TBST. Danach wurde die

Membran für 45 min mit dem Streptavidin-horseradisch Peroxidase Konjugat inkubiert. Nach

der Inkubation wurde die Membran mit TBST gespült und die Immunreaktion wurde auf

einem Röntgenfilm mittels Chemilumineszenz (ECL-Reaktion) visualisiert. Die Identität des

53 kDa Proteins wurde durch einen farbigen Molekular-Gewichtsmarker bestimmt. Anhand

der ermittelten Intensität der Proteinbanden in den entsprechenden Proben nach der ECL-

Reaktion wurde der Einfluss von Microcystin auf die metabolische Stabilisierung von p53

bestimmt.

2.2.13. Protein-Färbungen

2.2.13.1. Coomassie-Färbung

Direkt nach der SDS-PAGE wurden die Proteine im Gel unspezifisch mit Coomasie

angefärbt. Die Gele wurden in die Coomassie Blau-Farblösung überführt und für 20 min bis 1

h leicht schwenkend inkubiert. Anschließend wurde der überschüssige Farbstoff durch

mehrmaliges Austauschen der Entfärbe-Lösung entfernt und die Gele an der Luft getrocknet.

2.2.13.2. Silberfärbung (modifiziertes Protokoll nach Blum et al./ 1987)

Die Silberfärbung wurde mit den IEF-Gelen nach der Coomassie Blau-Färbung durchgeführt,

um die Qualität der durchgeführten IEF zu kontrollieren. Zur Fixierung der IEF Gele wurde

eine 20 min Inkubation in einer Methanol/ Eisessig-Lösung durchgeführt und anschließend

dreimalig in 30% Methanol gespült.

Es folgte eine 1 min Inkubation in Thiosulfat-Lösung, ein kurzes Spülen in Aqua bidest. und

schließlich eine 20 min Färbung in Silbernitrat-Lösung. Dann erfolgte wieder ein dreimaliges

Spülen in Aqua bidest. und eine 5 min Inkubation in der Entwicklungs-Lösung. Die Proteine

wurden dabei im Gel als bräunlich-schwarze Banden nachgewiesen. Das gefärbte Gel wurde

zweimal kurz in Aqua bidest. geschwenkt und für 5 min mit der Stop-Lösung überschichtet.

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Methoden

68

2.2.13.3. Ponceau S-Färbung

Nach der Western- Blot- Analyse wurde die Nitrocellulose-Membran kurz in Aqua.

bidest. geschwenkt. Anschließend erfolgte die Färbung der Nitrocellulose für ca. 1

min mit Ponceau-S-Lösung. Zur Entfärbung wurde die Membran 2x1 min in Aqua

bidest. geschwenkt. Zusätzlich folgte eine Entfärbung der Membran für 3x 5 min in

TBST und dann erfolgte die Immun-Detektion.

2.2.14. Funktionsanalyse

2.2.14.1. Induktion für die Transfektionsexperimente

Um die zellulären Proteine (p53, pRb, pE2F, cMyc) in HepG2-Zellen für die funktionelle

Analyse der kombinatorischen Effekte von Microcystin und dem HBx-Proteinauf die

Zellzyklus-Regulation zu induzieren, wurden verschiedene Techniken verwendet. Das

endogene p53-Protein wurde durch UV-Strahlung (7J/m2/254nm) und einer an-

schliessenden 18h Inkubation bei 37°C/ 5% CO2 in den HepG2-Zellen induziert. Die

Induktion der anderen Zellzyklus-Regulatoren (pRb, E2F, c-Myc), die vor allem die G1/ S-

Transition beeinflussen, wurden durch Serumentzug (2 Tage zur Synchronisation) und

nachfolgender Serumzugabe (1Tage) induziert (nach Fa. Clontech).

2.2.14.2. Transfektion mit Calcium-Phosphat-Präzipitate

Nach der Induktion der entsprechenden zellulären TF wurden die verschiedenen Luciferase-

Plasmide und die Expressionsvektoren HBx und p53 per Calcium- Phosphat- Technik

transient in die HepG2-Zellen eingeschleusst. Zunächst wurden die HepG2-Zellen für die

Transfektion in einer Dichte von 1 x 10 6Zellen/ Well in eine 6- Well Platte eingesaet und für

zwei Tage bei 37°C/ 5% CO2 kultiviert. Für die Transfektion wurde 1µg von den Luciferase-

Konstrukten (2.1.4.4) und 4µg von den Expressionsvektoren HBx (2.1.4.1) oder p53 (2.1.4.3)

mit TE-Puffer auf 438 µl aufgefüllt und 62 µl 2M Calciumchlorid-Lösung hinzugetropft. Dann

erfolgte die tropfenweise Zugabe von 500 µl 2x HBS und eine 30 min Inkubation auf Eis.

Anschließend wurde die Calcium- Phosphat-DNA-Präzipitat-Lösung langsam, tropfenweise

in das Medium pipettiert. Nach einer 2-3h Inkubation bei 37°C/5% CO2 folgte die Abnahme

des Mediums und eine Exposition der Zellen mit einer Glycerolschock-Lösung für 90s.

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Methoden

69

Nachfolgend wurden die Ansätze zwei- bis dreimal mit Erhaltungsmedium gespült und für

weitere 20h bei 37°C/5% CO2 kultiviert. Diese Zeit ist erforderlich für den Transport der

Expressionsvektoren in den Nukleus und zur allgemeinen Stabilisierung der Transkription

(persönliche Mitteilung der Fa. Clontech). Nach 18h wurde die Kultivierung unterbrochen und

es folgte für die restlichen 2 h die Exposition der Zellen mit 10 µM Microcystin oder 0,4%

DMSO in serumfreiem Medium bei 37°C/5% CO2.

Zum Lösen von Microcystin wurde DMSO eingesetzt, daher wurde zur Differenzierung der

Lösungmittel- und Microcystin- Wirkung auf die Zellzyklus-Regulation in HepG2-Zellen

jeweils zu jeder Microcystin-Konzentration eine DMSO-Kontrolle mitgeführt. Danach wurden

die Zellen mehrmals mit 1x PBS gespült und anschließend mit dem Clontech-Lyse-Puffer

lysiert. Die Zellen wurden zunächst mit 200 µl Lysis-Puffer (Clontech) für 20 min bei RT

lysiert. Zur Entfernung von unlöslichen zellulären Bestandteilen erfolgte eine Zentrifugation

bei 14000 rpm für 1 min (RT). Für die Messung wurden jeweils gleiche Mengen Protein-

Lysat (1µg Protein) in ein Well einer 96- Well Platte, die lichtundurchlässige Seitenwände

aufweist, pipettiert und mit 100 µL auf RT vorgewärmtes Reagenz A gemischt. Kurz vor der

Messung erfolgte die Zugabe des Reagenz B (RT vorgewärmt) und zügig die

Aktivitätsbestimmung am Trilux 1450 Microbeta-Coulter mit zuvor abgeglichenen Detektoren

(Normalisierung). Jede Probe wurde für 10 sec. gemessen. Die Angabe der Luciferase-

Aktivität wurde in LCPS/µg Protein angegeben. Die Effizienz der Transfektion wurde wie im

technischen Handbuch von Promega (www.promega.com) beschrieben ermittelt.

2.2.15. Zellzyklus-Apoptose-Analytik

2.2.15.1. Durchflusszytometrische-Analyse

Diese Methode dient sowohl der Zellzyklus-Analyse als auch der Ermittlung des relativen

Anteils apoptotischer Zellen in einer Zellpopulation. Über die durchflusszytometrische

Bestimmung des DNA-Gehaltes (2n, 2-4n, 4n) einzelner Propidium-Jodid gefärbter Zellen

kann der relative Anteil von Zellen in den verschiedenen Zellzyklusphasen (G 1, S, G2 /M)

ermittelt und quantifiziert werden. Auch bei der Analyse apoptotischer Zellen ist die

durchflusszytometrische Bestimmung des DNA-Gehaltes einzelner Zellen die Methode der

Wahl. Zusätzlich zu den einzelnen Zellzyklusphasen erhält man weitere Fluoreszenzsignale

im Sub-G1-Bereich. Diese Zellen haben einen hypodiploiden DNA-Gehalt (<2n) und besitzen

einen apoptotischen Charakter. Dieses durchflusscytometrische Verfahren wurde eingesetzt,

um die Effekte von Microcystin auf die S-Phaserate in einer HepG2-Population zu

bestimmen.

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Methoden

70

Zusätzlich sollte mit dieser Methode die protektive Wirkung von Microcystin vor UV-

induzierter Apoptose untersucht werden. Für die Ermittlung der Zahl der Zellen in der S-

Phase wurden die HepG2-Zellen in 6- Wellplatte eingesaet und für 2 Tage bei 37°C/ 5% CO2

kultiviert. Dann erfolgte die Exposition der Zellen in serumfreiem Medium mit Microcystin in

einer Konzentration von 10 µM und 0,4% DMSO (Lösungsmittel) für 2h bei 37°C/ 5% CO2.

Nach der Exposition wurden die Zellen mehrmalig mit 1x PBS gespült.

Zur Ermittlung der protektiven Wirkung von Microcystin vor UV-induzierter Apoptose wurden

die HepG2-Zellen in eine 75er Kulturflasche eingesaet und für zwei Tage bei 37°C/5% CO2

in Erhaltungsmedium kultiviert. Nach einem Mediumwechsel wurden die Zellen in serum-

freiem Medium mit 10 µM Microcystin oder 0,4% DMSO für 2h bei 37°C/5% CO2 präinkubiert.

Nach einem mehrmaligen Spülen mit 1x PBS wurden die Zellen mit Erhaltungsmedium

versorgt und mit UV-Licht (100 J/m2/254 nm) bestrahlt. Anschließend wurde erneut das

Medium gewechselt und die Zellen für 24 h bei 37°C/5% CO2 kultiviert.

Für die durchflusszytometrische Messung wurden die Zellen abtrypsiniert, in einem

Eppendorf-Cup zweimal mit PBS gewaschen, bei 9000 rpm für 2min zentrifugiert und 1x10 6

Zellen in 150µl PBS vorsichtig resuspendiert. Zur Fixierung der Zellen wurden unter

Schütteln 350µl Ethanol abs. zugetropft und die Zellen für mindestens 24 h bei 4°C gelagert.

Zur Entfernung des Ethanols wurden die Zellen bei 9000 rpm für 2 min zentrifugiert und das

Pellet in 100 µl Propidium-Jodid-Lösung resuspendiert. Nach der Inkubation für 30 min bei

RT im Dunkeln wurden die Zellen in 1 ml isotonischen Puffer (Isoton ® II) überführt.

Anschließend wurden die gefärbten Zellen in einem EPICS XL im Laserlicht mit der

Wellenlänge von 488 nm angeregt und die emittierte Fluoreszenz von 10000 Zellen

quantifiziert und in einem Histogramm dargestellt.

Da bei der Untersuchung der Apoptose die durchflusszytometrische DNA-Analyse nicht aus

reicht, wurden die aus dem Apoptose-Versuch gewonnenen Zell-Aliquots in den Trypanblau-

Test und für die elektrophoretische Darstellung der DNA-Fragmente eingesetzt.

2.2.15.2. Qualitative Analyse der DNA-Fragmentierung (DNA-Laddering)

Mit dieser Analyse wurde fragmentierte DNA aus apoptotischen Zellen gelelektrophoretisch

dargestellt. Die aus dem Apoptose-Versuch (2.2.15.1) gewonnenen Zellen wurden zweimal

mit 1x PBS gewaschen. Nach der Zentrifugation für 2 min bei 9000 rpm wurde das Pellet in

400 µl Lysepuffer resuspendiert (2.2.3.3) und für 30 min auf Eis inkubiert.

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Methoden

71

Anschließend wurden die Zellkerne bei 14000 rpm für 10 min abzentrifugiert und mit dem

Überstand eine Phenol-/Chloroform-Extraktion und Ethanol-Präzipitation durchgeführt. Nach

dem Trocknen wurde das Pellet in 30µl TE-Puffer mit 1µg/ µl RNase A resuspendiert und bei

37°C für 1h inkubiert. Nach dem RNase-Verdau erfolgte mit 1µg DNA in 10 µl DNA-

Probenpuffer pro Spur die elektrophoretische Auftrennung in einem 1,5%igen Agarosegel für

1,5h bei 70 V.

2.2.16. Laser-Scanning-Mikroskopie (nach Fa. Clontech)

HepG2-Zellen wurden mit Hilfe der Ca2+-Phosphat-Methode mit dem p53-GFP-

Expressionsvektor transfiziert. Nach 48h wurden die Zellen partiell für 2h mit 0,4% DMSO

oder 10µM Microcystin bei 37°C/5% CO2 präinkubiert .Nach dieser Inkubation erfolgte ein

Mediumwechsel und das Fusionsprotein wurde durch eine UV-Bestrahlung (7J/m2 bei

254nm) aktiviert, für 2h bei 37°C/5% CO2 inkubiert und dann wurden die Zellen fixiert. Zur

Fixierung der Zellen wurde das Medium entfernt, dreimal mit 1x PBS gespült, für 10 min in

4% Paraformaldehyd bei RT inkubiert und anschließend für 15 min bei -20°C in Methanol

gelagert. Nach mehrmaligen Spülen mit 1x PBS erfolgte die Analyse der subzellulären

Lokalisation des p53-GFP-Fusionsproteins nach UV-Induktion mit Hilfe des Laser-Scanning-

Mikroskopes (Öl/ 488 nm Argonlaser; Zeiss). Ein wichtiges Kriterium für der Nachweis war

die qualitative Bewertung der Akkumulation der Fluoreszenz (Nukleus/Cytoplasma) in den

HepG2-Zellen.

2.2.17. Statistik

Zur Untersuchung der statistischen Signifikanz der ermittelten Luciferase-Aktivitäten in den

Transfektionsexperimenten (3.6/3.7) wurde der double sided students t-test, der Krusal-

Wallis-Test und die Varianz-Analyse mit Hilfe der KyPlot® Version 2.0 Software für Windows

(Prof. Koichi Yoshioka) durchgeführt. Als Signifikanzschwellen wurden drei unterschiedliche

Irrtumswahrscheinlichkeiten festgelegt (p*< 0,05, p**< 0,01 und p*** < 0,001).

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Resultate

72

3. Resultate

3.1. Einfluss von Microcystin auf die Vitalität und den Metabolismus von HepG2-Zellen

Als Testsystem dienten initiierte HepG2-Zellen, die Abkömmlinge einer

differenzierten humanen Hepatoma Zell-Linie darstellen. Als Besonderheit weisen sie

eine normale Expression des p53-und pRb-Gens auf und zeichnen sich durch das

Fehlen einer integrierten HBV-DNA-Sequenz aus. Da sie zusätzlich nur geringfügig

in ihren phänotypischen und biochemischen Eigenschaften von einem gesunden

differenzierten Hepatozyten abweichen, stellen sie ein allgemein akzeptiertes

Testsystem für diese leberspezifische in vitro Tumorpromotor-Studie dar.

3.1.1. Einfluss von Microcystin auf die Vitalität von HepG2-Zellen

In diesem Vorversuch sollte im Neutralrot-Vitalitätstest (NR) geklärt werden, welchen

Einfluss verschiedene Microcystin-Konzentrationen auf die Vitalität von HepG2-

Zellen haben. Im Vordergrund stand dabei den �optimalen Dosisbereich� in diesem

Testsystem für die fortlaufenden Experimente zu ermitteln.

Für die Durchführung des Eppendorfcupes wurden HepG2-Zellen in eine 96er

Wellplatte eingesaet und für 2 h mit verschiedenen Microcystin-Konzentrationen und

den entsprechenden DMSO-Konzentrationen exponiert. Durch das Testen von

DMSO war es möglich, die interferierenden Effekte von DMSO in dem Testsystem

darzustellen. Der Einfluss von Microcystin auf die HepG2-Vitalität wurde über die

endozytotische Aktivität der Zellen bestimmt. Die ermittelte endozytotische Aktivität in

den unbehandelten Zellen wurde mit 100% Vitalität gleichgesetzt und für die

Ermittlung der Vitalität der Zellen nach einer DMSO- oder Microcystin-Exposition als

Bezugsgrösse eingesetzt. Der Einfluss von Microcystin oder DMSO auf die

apparente endozytotische Aktivität von HepG2-Zellen ist in Abb. 3.1 /3.1.1

dargestellt.

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Resultate

73

0 10 0 1 0 0,1 0 Microcystin (µM)

0 0,4 0,4 0,04 0,04 0,004 0,004 DMSO (%)

Abb. 3.1: Einfluss von Microcystin auf die Vitalität von HepG2-Zellen

Die Vitalität von HepG2-Zellen (1x106 pro Well) wurde nach der Exposition mit verschiedenen Microcystin-

Konzentrationen für 2h bei 37°C/ 5%CO2 im Neutralrot- Test bestimmt. DMSO diente als Lösungsmittel-Kontrolle.

Der %- Anteil an Vitalität in den verschiedenen Ansätzen wurde photometrisch bei 540 nm mit einem ELISA-

Reader gemessen. Die Graphik zeigt die Mittelwerte aus vier unabhängigen Versuchen +/- SD.

1.

0 10 1 0, 1 Microcystin (µM)

Abb. 3.1.1: Darstellung der optimale Dosis von Microcystin in einem Hepatozytenkultursystem

Abzüglich der interferierenden Wirkung von DMSO wurde die optimale Dosis von 10 µM Microcystin in diesem

Testsystem bestimmt

Im Vergleich zur Kontrolle (100%) konnte bei den HepG2-Zellen sowohl nach der

Microcystin- als auch nach einer DMSO-Exposition konzentrationsabhängig ein

Anstieg der Vitalität nachgewiesen werden.

0

50

100

150

200

Vita

lität

(%)

0

1 0 0

2 0 0

3 0 0

4 0 0

5 0 0

Vita

lität

(%)

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Resultate

74

Die Exposition der Zellen mit der eingesetzten maximalen Microcystin-

Konzentrationen (10 µM) führte zu einem ~3,9-fachen Anstieg der Vitalität, in der

entsprechenden DMSO-Kontrolle wurde ein ~2,1-facher Anstieg der Vitalität

gemessen.

Microcystin in einer Konzentration von 1 µM führte zu einer 3,7-fachen Steigerung

der endozytotischen Aktivität, bei der DMSO-Kontrolle (0,04%) wurde ein ~2,9-

facher Anstieg der Vitalität beobachtet.

Über die Wirkung einer 0,1 µM Microcystin-Konzentrationen auf die Vitalität von

HepG2-Zellen kann keine genaue Aussage getroffen werden, da hier kein

auflösbarer Unterschied zwischen der Wirkung von Microcystin und DMSO auf die

endozytotische Aktivität der HepG2-Zellen besteht.

Bei den anderen Microcystin-Konzentrationen konnte deutlich zwischen der Wirkung

von DMSO und Microcystin auf die Zellvitalität differenziert werden, wobei der

interferierende Effekt von DMSO in der 1 µM Microcystin-Konzentrationen stärker

ausfiel als bei der 10 µM Microcystin-Lösung.

Zusammenfassend kann man sagen, dass die 10 µM Microcystin-Lösung, unter

Berücksichtigung der interferierenden Wirkung von DMSO (Abb. 3.1.1), in diesem

Testsystem die optimale Dosis darstellt und aus diesem Grund vornehmlich für die

weiteren Analysen eingesetzt wurde.

3.1.2. Microcystin-assoziierte Phosphorylierung und Stabilisierung von zellulären Proteinen

Um den Einfluss von Microcystin auf die Akkumulation von zellulären Phospho-

proteinen zu analysieren, wurden die HepG2-Zellen für 3 h mit 32P-Orthophosphat

markiert und nach mehrmaligem Spülen mit 1x PBS für 2 h mit verschiedenen

Microcystin-Konzentrationen exponiert.

In diesem Experiment können aufgrund der hier gewählten Versuchsbedingungen

nur Aussagen über den Einfluss von Microcystin auf die Akkumulation von

Phosphoproteinen in der Zelle gemacht werden.

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Resultate

75

Die Wirkung von Microcystin auf die verschiedenen Zellzyklus-assoziierten

Signalkaskaden oder eine direkte Korrelation von Microcystin mit Zellzyklus-

Regulatoren wird zu einem späteren Zeitpunkt dargestellt.

Durch die Ermittlung der Radioaktivität in den HepG2-Gesamtzellproteinextrakten mit

Hilfe der Szintillations-Messungkonnte der Einfluss von Microcystin auf die

Proteinphosphorylierung bzw. Akkumulation von Phosphoproteinen bestimmt werden

(Abb. 3.2.)

0 0 0,1 1 10 Microcystin (µM)

0 0,4 0,004 0,04 0,4 DMSO (%)

Abb. 3.2:. Einfluss von Microcystin auf die Akkumulation von Phosphoproteinen in 32P-

markierten HepG2-Zellen

HepG2-Zellen (1x106) wurden für 14h im Mangelmedium kultiviert, 3h mit 32P-markiert und für 2h unbehandelt

(Kontrolle) oder mit DMSO (Lösungsmittel-Kontrolle) oder verschiedenen MCYST-Konzentrationen bei 37°C/ 5%

CO2 inkubiert. Mit äquivalenten Proteinmengen erfolgte anschließend die Szintillations-Messung. Über die

gemessenen cpm/ µg Protein in den verschiedenen Ansätzen wurde der Effekt von Microcystin auf die

Akkumulation von zellulären Phosphoproteinen bestimmt. Die Graphik zeigt die Mittelwerte aus vier

unabhängigen Versuchen +/- SD.

Die ermittelte Radioaktivität in der 32P-markierten Kontrolle diente als Bezugsgrösse

für die Ermittlung der Wirkung von DMSO und verschiedener Microcystin-

Konzentrationen auf die Induktion von Phosphoproteinen. Durch die Messung der

Radioaktivität in den verschiedenen Ansätzen konnten Microcystin-Konzentrationen

nachgewiesen werden, die sowohl hemmend als auch förderlich auf die Akkumulation

von Phosphoproteinen wirken.

02468

1 01 21 4

32P

cpm

/µg

Prot

ein

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Resultate

76

In der 0,4%igen DMSO-Lösung und in der 0,1 µM Microcystin-Lösung wurde eine

geringere Radioaktivität als in der Kontrolle (nur markierten) gemessen. Somit

besitzen die Lösungen in diesen Konzentrationen einen hemmenden Einfluss auf die

Akkumulation von Phosphoproteinen.

In der 1 µM und 10 µM Microcystin-Lösung wurde ein positiver Effekt auf die

Akkumulation von Phosphoproteinen nachgewiesen, wobei dieser in der eingesetzten

höchsten Microcystin-Lösung am deutlichsten bestimmt werden konnte.

In diesem Versuch wurde gezeigt, dass Microcystin über einen biochemischen

Pathway die Akkumulation von Phosphoproteinen in konzentrationsabhängigerweise

beeinflusst.

In einem weiteren Experiment konnte gezeigt werden, dass Microcystin auch die

Proteinstabilität bzw. -synthese in 35S-Methionin markierten HepG2-Zellen positiv

beeinflusst.

0 0 10 Microcystin (µM)

0 0,4 0,4 DMSO (%)

Abb. 3.3. Einfluss von Microcystin auf die Proteinstabilität bzw. -synthese in 35S-Methionin

markierten HepG2-Zellen

HepG2-Zellen (1x106) wurden für 14h im Mangelmedium kultiviert, 3h metabolisch mit 35 S-Methionin markiert und

für 2h unbehandelt (Kontrolle) oder mit DMSO (Lösungsmittel-Kontrolle) oder verschiedenen MCYST-Konzen-

trationen bei 37°C/ 5% CO2 exponiert. Mit äquivalenten Proteinmengen erfolgte anschließend die Szintillations-

Messung. Über die gemessenen cpm/ µg Protein in den verschiedenen Ansätzen wurde der Effekt von

Microcystin auf die Proteinstabilität bestimmt. Die Graphik zeigt die Mittelwerte aus vier unabhängigen Versuchen

+/- SD.

0

4

8

1 2

1 6

2 0

35Sc

pm/µ

g Pr

otei

n

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Resultate

77

Der Einfluss von Microcystin auf die Proteinstabilität bzw.-synthese wurde durch die

Messung der Radioaktivität in den verschiedenen HepG2-Gesamtzell-

proteinextrakten untersucht. Die gemessene Radioaktivität in der 35S-Methionin

markierten Kontrolle diente hier ebenfalls als Bezugsgrösse für die Ermittlung der

Wirkung von DMSO/ Microcystin auf die Proteinstabilität bzw. -synthese.

Eine hohe Radioaktivität (cpm/µg Protein) in den Microcystin-exponierten Proben

abzüglich der interferierenden Wirkung von DMSO deutet auf einen positiven Einfluss

von Microcystin auf die Proteinstabilität bzw.-synthese hin. Mit Hilfe der Szintillations-

Messung konnten in der mit 10 µM Microcystin-exponierten Probe 4,1 cpm/µg

Protein und in der mitgeführten DMSO-Kontrolle 2,9 cpm/µg Protein gemessen

werden. Da in der Kontrolle (nur markiert) ein Wert von 2,3 cpm/µg Protein

gemessen wurde, hatte die Exposition der HepG2-Zellen mit Microcystin einen

positiven Einfluss auf die Proteinsynthese bzw.-stabilität.

Die Inkubation der Zellen mit 0,4% DMSO hatte hingegen einen minimalen Einfluss

auf die Proteinstabilität bzw.-synthese.

In diesem Experiment konnte gezeigt werden, dass eine 10 µM Microcystin-Lösung

auf die Synthese bzw. Stabilität von 35S-Methionin markierten Proteinen in HepG2-

Zellen einen positiven Einfluss hat.

3.1.3. Effekte von Microcystin auf die S-Phaserate

In dem vorherigen Experiment wurde gezeigt, dass Microcystin die zelluläre

Akkumulation von Phosphoproteinen und vermutlich die Proteinstabilität über die

�apparente Aktivierung� von Proteinkinasen positiv beeinflusst.

Durch die Ermittlung des Einflusses von Microcystin auf die Zahl der Zellen in der S-

Phase mit Hilfe der FACS-Analyse sollte untersucht werden, ob auch sogenannte

Restriktionspunkte des Zellzyklus, die vor allem über Protein-De-/ Phosphorylierung

und über die Stabilität und Synthese von Proteinen modulierbar sind, beeinflusst

werden. Im Zellzyklus gibt es zwei Kontrollpunkte, an denen sich entscheidet, ob der

Zellzyklus fortgesetzt wird. Der sogenannte G1-Restriktionspunkt reguliert die G1/ S-

Übergang der Zellen und der zweite Punkt kontrolliert den Übergang der Zellen von

der G2-Phase in die Mitose.

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Resultate

78

Wird ein Restriktionspunkt erst einmal überschritten, durchlaufen die Zellen relativ

unabhängig von äusseren Faktoren den Zellzyklus, so dass eine Deregulation dieses

Kontrollpunktes zu beschleunigten Zellzyklusabläufen führen kann.

In dieser Zellzyklus-Analyse wurden HepG2-Zellen für 2 h mit 10 µM Microcystin

inkubiert und anschließend wurde über den relativen DNA-Gehalt von 104 Propidium-

Jodid gefärbten Zellkernen die Zahl der Zellen in der S-Phase durchflusszytometrisch

bestimmt. Ein deregulierender Effekt von Microcystin auf den G1/S-Übergang lässt

sich durch eine Zunahme der Zahl der Zellen in der S-Phase nach einer Microcystin-

Inkubation bestimmen.

Mit Hilfe der FACS-Messung wurde gezeigt, dass die Exposition einer HepG2-

Population mit Microcystin im Vergleich zur Kontrolle (unbehandelt) zu einem

100%igen Anstieg der Zahl der Zellen in der S-Phase führte. Da in der DMSO-

Kontrolle kein Anstieg der Zahl zu messen war, kann der Anstieg in der Microcystin-

inkubierten Probe eindeutig als spezifischer Effekte von Microcystin gewertet werden.

Das Hepatotoxin Microcystin besitzt damit Detektionlich die Fähigkeit, die Zeit, die

die HepG2-Zellen zum Eintritt in die S-Phase benötigen, zu verkürzen.

Tab. 3.1: Einfluss von Microcystin auf die Zahl der Zellen in der S-Phase

(FACS-Analyse )

Zellen in der S-Phase (%) SD +/-

Zellen ohne 3,76 0,70

DMSO/MCYST

Zellen mit 3,58 0,72

0,4% DMSO

Zellen mit 7,33 0,94

10µM MCYST

Mittelwerte (%) aus jeweils vier unabhängigen Experimenten pro Ansatz +/- SD

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Resultate

79

Bei einer Zellzyklus-Analyse, in der eine HepG2-Population nur mit 2,5 µM

Microcystin für zwei Stunden exponiert wurde, konnte diese Microcystin-assoziierte

Steigerung der Zahl der Zellen in der S-Phase nicht nachgewiesen werden.

3.2. Einfluss von Microcystin auf die metabolische Stabiltität von p53

3.2.1. Wirkung von Microcystin auf die Stabilität von p53 (Western-Blot-Analyse)

In diesem Experiment sollte die Wirkung von Microcystin auf die metabolische

Stabilisierung von p53 analysiert werden.

Verschiedene Studien berichten, dass eine unphysiologische Konzentration an

metabolisch stabilem p53-Protein mit einer funktionellen Inaktivierung einhergeht, die

wie strukturelle Mutationen im p53-Gen die Tumorbildung begünstigt (Levine et al.,

1991; Ueda et al., 1995).

In einer normalen Zelle kommt das inaktive p53-Protein aufgrund einer rapiden

Degradierung nur in einer geringen Konzentration vor. Die metabolische Stabilität

von p53 wird in der Regel durch eine verstärkte Translation- oder eine verlängerte

Halbwertszeit von p53 erreicht (Liang and Clarke, 2001). Da die Stabilität von p53

unter anderem über sein Phosphorylierungsmuster moduliert wird, kann Microcystin

über die �apparente Aktivierung� von Proteinkinasen maßgeblich in diese Modulation

eingreifen.

Experimentell wurde die Wirkung von Microcystin auf die metabolische Stabilisierung

des p53-Proteins zunächst mit Hilfe der Western-Blot-Analyse (WB) beobachtet. Ein

positiver Microcystin-Effekt auf die Proteinstabilität bzw. -synthese ist durch einen

Anstieg der p53-Konzentration detektierbar.

In der Abb. 3.4. ist die Microcystin-induzierte Zunahme der Konzentration von p53-

dargestellt.

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Resultate

80

0 0 0,1 1 10 Microcystin (µM)

0 0,4 0,004 0,04 0,4 DMSO (%)

Abb. 3.4: Die Wirkung von Microcystin auf die zelluläre Konzentration von p53

HepG2-Zellen (1x106) wurden mit UV-Licht (7 J/m2) bestrahlt, für 18h bei 37°C/ 5% CO2 inkubiert und

anschließend für weitere 2h unbehandelt (ohne), mit DMSO (Lösungsmittelkontroll) oder mit verschiedenen

MCYST-Konzentrationen inkubiert. Äqivalente Proteinmengen (100 µg) wurden per SDS-PAGE (10%) getrennt,

geblottet und per Western-Blot-Analyse mit einem biotinylierten p53-AK nachgewiesen. Der Effekt von

Microcystin auf die zelluläre Konzentration von p53 wurde durch einen Vergleich der Bandenintensität in den

einzelnen Proben bestimmt. Das Ergebnis wurde in zwei unabhängigen Experimenten reproduziert.

Die in der Kontrolle nachgewiesene Bandenintensität wurde als Bezugsgrösse für die

Bestimmung des Einflusses von Microcystin auf die Konzentration von p53

eingesetzt und diente ebenfalls als Kontrolle für die Induktion. Durch die DMSO-

Kontrolle war es möglich, interferierende Effekte des Lösungsmittels auf die

Konzentration von p53 darzustellen.

Nach der Exposition der HepG2-Zellen mit verschiedenen Microcystin-Konzen-

trationen wurden im Vergleich zu den Kontrollen stärkere Proteinbanden

nachgewiesen. Bei der eingesetzten maximalen Microcystin-Lösung (10 µM) wurde

die stärkste Bande bestimmt und zeigte damit den grössten Effekt auf die

Konzentration von p53. Eine DMSO-Inkubation (0,4%) hatte ebenfalls einen positiven

Einfluss auf die p53-Konzentration, der zwar geringer ausfiel als nach einer

Microcystin-Exposition, aber als interferierender Effekt bei der Bestimmung der

spezifischen Wirkung von Microcystin hier berücksichtigt wurde.

Zusammenfassend kann man sagen, dass Microcystin die metabolische Stabilität

von p53 positiv beeinflusst, wobei nicht eindeutig zu klären ist, ob diese Wirkung

durch eine Microcystin-assoziierte verzögerte Protein-Degradierung oder eine

verstärkte p53-Proteinsynthese resultiert.

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Resultate

81

3.2.2. Einfluss von Microcystin auf die Stabilität von 35S-Methionin markiertem p53

In dem folgenden Experiment sollte geklärt werden, ob Microcystin die metabolische

Stabilisierung des p53-Proteins durch eine verlangsamte Protein- Degradierung oder

gesteigerte Proteinsynthese beeinflusst.

Für diese Untersuchung wurden HepG2-Zellen mit 35S-Methionin markiert und erst

nach der Markierung mit Microcystin exponiert. Das markierte p53-Protein wurde per

Immunpräzipitation mit einem p53-Ak aus dem Proteinextrakt isoliert und durch eine

12% SDS-PAGE aufgetrennt. Die Kontrolle diente als Bezugsgrösse für die

Ermittlung der Wirkung von Microcystin auf die metabolische Stabilität von p53.

Durch die DMSO-Kontrolle war es möglich, interferierende Effekte des

Lösungsmittels auf die Proteinstabilität darzustellen.

Die Fluorographie (3.5) zeigt, dass eine 10 µM Microcystin-Lösung die Konzentration

von 35S-Methionin markiertem p53 deutlich erhöht. In den Kontrollansätzen wurden

deutlich schwächere Banden nachgewiesen. Aus diesem Grund ist anzunehmen,

dass der positive Einfluss von Microcystin auf die metabolische Stabilisierung von

p53 hier womöglich eher durch eine verlangsamte Protein-Degradierung bedingt ist.

p53→

0 0 10 Microcystin (µM)

0 0,4 0,4 DMSO (%)

Abb. 3.5: Einfluss von Microcystin auf die metabolische Stabilität von 35S-markiertem

p53 Protein

HepG2-Zellen wurden für 14h in Methionin freiem Medium kultiviert und dann mit 3,7 MBq/ ml S35 -Methionin für

3h markiert, anschließend für 2h unbehandelt (ohne), mit DMSO (Lösungsmittel-Kontrolle) oder einer Microcystin-

Konzentrationen von 10 µM bei 37°C/5% CO2 inkubiert. Die markierten p53-Proteine wurden durch Immun-

präzipitation mit einem p53- AK aus dem Zellextrakt isoliert und per SDS (10%) getrennt. Der Effekt von

Microcystin auf die metabolische Stabilisierung von p53 wurde durch den Vergleich der Bandenintensität in den

einzelnen Proben bestimmt. Bei den IP-Kontrollen (negative und Beads) konnten keine Banden nachgewiesen

werden (nicht dargestellt). Die Resultate konnten in zwei unabhängigen Experimenten reproduziert werden.

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Resultate

82

In weiteren Versuchen sollte nun gezeigt werden, dass die hier nachgewiesenen

Microcystin-Effekte auf die metabolische Stabilisierung des p53-Proteins mit einer

Modulation des Phophorylierungsmuster von p53 einhergeht. Hierbei wurde

besonders der Aspekt einer Microcystin-induzierten Hyperphosphorylierung des p53-

Moleküls berücksichtigt.

3.3. Einfluss von Microcystin auf die Hyperphosphory-lierung von p53 und pRb

3.3.1. Microcystin-induzierte Hyperphosphorylierung von 32P-markiertem p53

In diesem Versuch sollte gezeigt werden, dass auch Microcystin den

Phosphorylierungsstatus des p53-Proteins in HepG2-Zellen hinsichtlich einer

Hyperphosphorylierung maßgeblich beeinflusst.

Die Hyperphosphorylierung von p53 geht einher mit einer kurzfristigen kompletten

Durchphosphorylierung aller am N- und C-Terminus befindlichen Serin-und Threonin

Resten. In der Regel haben die Phosphorylierungen eine stabilisierende und

aktivitätssteigernde Wirkung auf die Funktion von p53. Eine Ausnahme stellt

möglicherweise das durch die CdK2/ cyclin B- und Cdk2/ cyclin A Kinase

phosphorylierte Ser 315 dar.

Microcystin kann als Inhibitor der PP1/ PP2A den Serin-Rest 315 in einem dauerhaft

phosphorylierten Zustand fixieren und so über die irreversible Hyper-

phosphorylierung des p53-Proteins ein Aussetzen der Tumorsuppressorfunktion

induzieren.

Für diese Untersuchung wurden HepG2-Zellen mit 32P-Orthophosphat markiert und

nach der Markierung mit verschiedenen Microcystin-Konzentrationen exponiert. Die

markierten p53-Proteine wurden über die Immunpräzipitation mit einem p53-Ak aus

dem Gesamtzellproteinextrakt isoliert, via SDS-PAGE aufgetrennt und optisch per

Autoradiographie dargestellt.

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Resultate

83

Um Aussagen über den Einfluss von Microcystin auf die Induktion einer

Hyperphosphorylierung von p53 zu treffen, wurde die Bandenstärke des 32P-

markiertem p53 nach der Immunpräzipitation qualitativ und quantitativ ausgewertet.

Die Autoradiographie zeigt (Abb. 3.6), dass eine Microcystin-Exposition die

Phosphorylierung von p53 signifikant beeinflusst.

Microcystin (µM) 0 0,1 1 0 10

DMSO (%) 0 0,004 0,04 0,4 0,4

Kontrolle Beads/ negativ Ak KB KN

Abb. 3.6: Einfluss von Microcystin auf die Induktion einer Hyperphosphorylierung von p53

HepG2-Zellen (1x106) wurden für 14h im Mangelmedium kultiviert und für 3 h mit 32P markiert. Dann erfolgte eine

2h Exposition mit DMSO (Lösungsmittel-Kontrolle) oder verschiedenen MCYST-Konzentrationen. Via Immun-

präzipitation mit einem p53-AK wurde das p53-Proteinaus Gesamtzellproteinextrakt isoliert und per SDS-PAGE

(12%) getrennt. Der Nachweis der 32P-markierten Immunpräzipitate erfolgte durch die Autoradiographie. Anhand

der Bandenintensität in den einzelnen Proben wurde der Effekt von Microcystin auf die Induktion der

Hyperphosphorylierung von p53 bestimmt. Bei den IP-Kontrollen (negative und Beads) konnten keine Banden

nachgewiesen werden. Die ermittelten Daten konnten in drei unabhängigen Experimenten reproduziert werden.

0 0 0,1 1 10 Microcystin (µM)

0 0,4 0,004 0,04 0,4 DMSO (%)

Abb. 3.6.1.: Densitometrische Auswertung der 32P- Autoradiographie von p53

Mit Hilfe der densitometrischen Auswertung der 32P-Autoradiographie von p53 (3.6) können quantitative

Aussagen über den Einfluss von Microcystin auf die Hyperphosphorylierung von p53 gemacht werden. Die

Messung erfolgte mit Hilfe ImageLab Software Version 2.0 .

← p53

0

2

4

6

8

Den

sitä

t

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Resultate

84

Microcystin in Konzentrationen von 0,1 µM, 1 µM und 10 µM erhöht signifikant die

Zunahme an phosphoryliertem p53, wobei die eingesetzte maximale Konzentration

von Microcystin die Zunahme am deutlichsten verstärkt. Eine 0,4%ige DMSO-

Lösung beeinflusst die Hyperphosphorylierung des p53-Proteins nicht.

Die densitometrische Auswertung (Abb. 3.6.1) der entsprechenden Banden ergab im

Vergleich zu den Kontrollen eine 2- 3-fach erhöhte Microcystin-assoziierte Induktion

der Phosphorylierung bzw. Hyperphosphorylierung von p53. Diese Ergebnisse

zeigen, dass Microcystin als Tumorpromotor in einem initiierten Testsystem

womöglich über die Hemmung der Proteinphoshatase 1 und 2A signifikant eine

irreversible Hyperphosphorylierung von p53 induziert. Bei den mitgeführten IP-

Kontrollen, Negativ-Ak (KN), der nicht gegen das p53 gerichtet war und die Beads-

Kontrolle (KB), konnten keine Banden nach der Autoradiographie nachgewiesen

werden.

3.3.2. Nachweis von hyperphosphoryliertem p53 über Isoelek-trische Fokkussierung (IEF)

Die IEF bietet in Kombination mit der Western-Blot-Analyse die Möglichkeit den

Einfluss von Microcystin auf die Phosphorylierung von p53 hinsichtlich einer

Hyperphosphorylierung durch die Änderung des Isoelektrischen Punktes (IP) des

p53-Proteins elektrophoretisch zu bestimmen.

Martinez et al. (1997) konnten mit einer 2D- Elektrophorese mindestens sechs nach

ihrem Phosphorylierungsmuster zu unterscheidenden Isoformen von p53 mit einem

IP zwischen pH 6,3- 7,3 detektieren.

In den HepG2-Zellen wurde zuächst p53 durch eine 20 h Inkubation mit Actinomycin

D induziert. Gleiche Mengen des Gesamtzellproteinextraktes wurden in einem IEF-

Gel elektrophoretisch aufgetrennt, für die WB-Analyse auf Nitrozellulose-Membran

immobilisiert und mit einem p53-biotinylierten Ak immunologisch nachgewiesen.

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Resultate

85

Die Abb. 3.7 zeigt die Unterschiede im Laufverhalten der einzelnen Proben.

0 0 1 0 Microcystin (µM)

0 0,4 0,4 DMSO (%)

Abb. 3.7: Nachweis des Einflusses von Microcystin auf das Phosphorylierungsmuster von p53 mittels IEF

In den HepG2-Zellen (1x106 ) wurde p53 durch eine 20h Inkubation mit Actinomycin D (0,45 nM) hochreguliert

und für 2h mit DMSO (Lösungsmittel-Kontrolle) und 10 µM Microcystin-Lösung exponiert. Mit äquivalenten

Proteinmengen wurde eine IEF durchgeführt und für die WB-Analyse auf eine Nitrocellulose-Membran

immobilisiert. Via Western-Blot wurde p53 mit einem p53-biotynilierten AK nachgewiesen und via ECL-Reaktion

dargestellt. Der Einfluss von Microcystin auf die Hyperphosphorylierung von p53 wurde anhand eines Bandenshift

in Richtung Anode bestimmt. Die ermittelten Daten konnten in zwei unabhängigen Experimenten reproduziert

werden.

Im Vergleich zur Kontrolle zeigte die Microcystin-exponierte Probe eine geringere

elektrophoretische Mobilität, die durch einen minimalen Bandenshift in Richtung

Anode gekennzeichnet ist und die Verschiebung des IP des p53-Proteins signalisiert.

In der DMSO-Kontrolle wurde dieser Bandenshift nicht nachgewiesen, so dass die

Verschiebung des IP von p53 als Microcystin-spezifischer Effekt bewertet werden

kann. Mit Hilfe der IEF konnte die Microcystin-vermittelte Hyperphosphorylierung

anhand eines minimalen Bandenshifts in Richtung Anode bestimmt werden.

p53→→

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Resultate

86

3.3.3. Einfluss von Microcystin auf die Hyperphosphorylierung von pRb

In diesem Experiment sollte gezeigt werden, dass Microcystin die Hyper-

phosphorylierung des Rb-Proteins induziert und so möglicherweise einen Beitrag bei

der Entwicklung und Progression eines HBV-assoziierten HCC leistet.

Für diesen Versuch wurden HepG2-Zellen mit 35S-Methionin markiert, mit einer 10µM

Microcystin-Lösung exponiert und via Immunpräzipitation mit einem Rb-AK aus dem

Gesamtzellproteinextrakt isoliert. Das radioaktiv markierte Rb-Immunpräzipitat wurde

nach der SDS-PAGE per Fluorographie dargestellt.

Um den Einfluss von Microcystin auf die Induktion der Hyperphosphorylierung von

pRb zu bestimmen, wurde die Bandenintensität von 35S-markiertem Rb-Protein nach

der Immunpräzitipation qualitativ und quantitativ ausgewertet. Das

hypophosphorylierte und das hyperphosphorylierte 35S-markierte Rb-Molekül kann in

der SDS-PAGE durch eine unterschiedliche elektrophoretische Mobilität identifiziert

werden (lt. Neo Markers). Die Microcystin-vermittelte Akkumulation des

hyperphosphorylierten pRb in der Zelle wurde in der Fluorographie durch eine

deutliche Zunahme der Bandenstärke im Vergleich zu den Kontrollen bestimmt. In

der Fluorographie (Abb. 3.8) repräsentiert die Bande mit dem geringeren

Molekulargewicht die hypophosphorylierte (pRb), wohingegen die Bande mit der

geringeren Mobilität die hyperphosphorylierte Form (ppRb) darstellte.

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Resultate

87

Microcystin (µM) 0 0 10

DMSO (%) 0 0,4 0,4

Kontrolle Beads/negativ Ak KN KB

Abb. 3.8: Einfluss von Microcystin auf die Hyperphosphorylierung von pRb

Zellen wurden für 14h in Methionin freiem Medium kultiviert, für 3h mit 35S-Methionin markiert und für 2h mit

DMSO (Lösungsmittel-Kontrolle) oder einer Toxin-Konzentration von 10µM bei 37°C/ 5% CO2 exponiert. Das 35S-

Methionin markierte Rb- Protein per Immunpräzipitation mit einem AK gegen pRb aus den Zellextrakt isoliert und

via SDS- PAGE aufgetrennt. Die markierten Immunpräzipitate wurden per Fluorographie dargestellt. Die obere

Bande entspricht der hyperphosphorylierten und die untere der hyopophosphorylierten Rb- Form. Anhand der

Bandenintensität des ppRb wurde der Effekt von Microcystin auf die Hyperphosphorylierung von pRb bestimmt.

Bei den IP-Kontrollen (negative und Beads) konnten keine Banden nachgewiesen werden. Die ermittelten Daten

konnten in drei unabhängigen Experimenten reproduziert werden.

Die qualitative Beurteilung der ppRb Bandenintensität in der Fluorographie zeigt,

dass Microcystin in einer Konzentration von 10 µM signifikant die Hyper-

phosphorylierung des Rb-Proteins (ppRb) stimuliert. Die densitometrische

Auswertung der entsprechenden Protein-Bande ergab im Vergleich zu den

Kontrollen eine 1,5- fache Zunahme an hyperphosphoryliertem Rb-Protein (ppRb).

Bei der DMSO-Kontrolle wurde ein minimaler Effekt auf die Hyperphosphorylierung

des Rb-Proteins bestimmt. Die Intensität dieser Bande war minimal stärker als die

Bandenstärke der markierten unbehandelten Kontrolle. Die densitometrische

Messung der Protein- Bande der DMSO-Kontrolle bestätigte dies.

pRb--

ppRb--

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Resultate

88

0 0 10 Microcystin (µM)

0 0,4 0,4 DMSO (%)

Abb. 3.8.1: Densitometrische Auswertung der 35S-Methionin�Fluorographie von ppRb

Mit Hilfe der densitometrischen Auswertung der 35S-Methionin�Fluorogrphie von pRb (Abb. 3.8)

konnten quantitative Aussagen über den Einfluss von Microcystin auf die Hyperphosphorylierung

getroffen werden. Die Messung erfolgt mit Hilfe ImageLab Software Version 2.0 .

Zusammenfassend kann man sagen, dass Microcystin in einer Konzentration von

10 µM deutlich die Konzentration von hyperphosphoryliertem Rb-Protein erhöht.

3.4. Die protektive Wirkung von Microcystin vor UV-induzierter Apoptose

Bei der Entstehung von Tumoren stellen verminderte oder gehemmte apoptotische

Prozesse einen wesentlichen Mechanismus der Tumorpromotion dar (Peter et al.,

1997). In verschiedenen Studien wird den Wirkstoffen der Okadasäure eine

protektive Wirkung vor apoptotischen Prozessen zu gesprochen. Es gibt Indizien,

dass bei der Initiation der Apoptose die Dephosphorylierung von zellulären Proteinen

eine essentielle Rolle spielt (Gjersten and Doskeland, 1995).

Inwieweit Microcystin in der Lage ist HepG2-Zellen, vor dem Zelltod zu schützen,

sollte in diesem Experiment analysiert werden. Um die protektive Wirkung von

Mircrocystin vor UV-induzierten Zelltod zu charakterisieren, wurden die HepG2-

Zellen für 2h mit einer 10 µM Microcystin-Lösung präinkubiert, UV-Licht (100J/ m2)

exponiert und für 24h bei 37°C/ 5% CO2 kultiviert.

0

5 0

1 0 0

1 5 0

2 0 0

2 5 0D

ensi

tät

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Resultate

89

Anschließend wurden die Zellen abtrypsiniert und jeweils ein Aliquot für den

Trypanblau-Test, die FACS-Analyse und für die elektrophoretische Darstellung von

DNA-Fragmenten eingesetzt.

Um generell die protektive Wirkung von Microcystin auf die Vitalität von UV-

induzierten HepG2-Zellen zu bestimmen, wurde zunächst der Trypanblau-Test

durchgeführt. Während vitale Zellen in der Lage sind, den Farbstoff auszuschliessen,

nehmen tote Zellen Trypanblau auf und sind blau gefärbt. Mit diesem Test kann

sensitiv das Ausmaß des UV-induzierten Zelltodes in Korrelation mit der schützenden

Wirkung von Microcystin quantitativ bestimmt werden. Der ermittelte Anteil (%) toter

Zellen im Trypanblau-Test ist in Abb. 3.9 dargestellt.

Abb. 3.9: Einfluss von

Microcystin auf UV-induzierte Zelltod-Prozesse

HepG2-Zellen wurden für 2h präinkubiert mit DMSO und Microcystin mit UV-Licht (100 J/ m2 ) bestrahlt und für

24h bei 37°C/ 5% CO2 inkubiert. Die Zellzahl wurde mit Hilfe der Fuchs- Rosenthal-Kammer bestimmt. Mit 1x106

Zellen pro Well wurde der Trypanblau-Test durchgeführt. Über die Bestimmung des Anteils (%) an toten Zellen

wurden Aussagen über die Effekte von Microcystin auf UV-induzierte Zelltod-Prozesse gemacht. Als Kontrolle

wurde eine DMSO-Kontrolle und zu jedem UV-induzierten Ansatz eine unbestrahlte Kontrolle mitgeführt. Die

Graphik stellt die Mittelwerte aus zwei unabhängigen Versuchen +/- SD dar.

Um sicher zu stellen, dass der ermittelte Anteil toter Zellen nach der UV-Induktion in

Korrelation mit der protektiven Wirkung von Microcystin steht, wurden verschiedene

Kontrollen durchgeführt. Zu den verschiedenen UV-induzierten Ansätzen wurde

jeweils eine unbestrahlte Kontrolle (ohne) mitgeführt, um deutlich darzustellen, dass

der Anteil toter Zellen auf die UV-Induktion zurückzuführen ist und die Reduktion des

Anteils an toten Zellen aus der protektiven Wirkung von Microcystin oder DMSO

resultiert.

0 20 40 60 80

Prozent toter Zellen

MCYST/ UV

MCYST

DMSO/ U V

DMSO

UV

ohne

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Resultate

90

Der ermittelte Anteil (%) toter Zellen in der UV-induzierten Kontrolle diente als

Bezugsgrösse für die Ermittlung der schützenden Wirkung von Microcystin vor UV-

induziertem Zelltod. Durch das Mitführen einer DMSO-Kontrolle wurden die

interferierenden Effekte von DMSO in UV-exponierten HepG2-Zellen dargestellt. Bei

der unbestrahlten Kontrolle (ohne) wurden 9,3% tote Zellen ermittelt. Nach einer UV-

Induktion stieg der Anteil an toten Zellen auf 65% an. Nach der Inkubation der Zellen

mit 0,4% DMSO wurden ~22 % tote Zellen bestimmt. Nach der UV-Induktion stieg

die Zahl toter Zellen auf ~41% tote Zellen an. Der Anteil an toten Zellen nach einer

2h Exposition mit einer 10 µM Microcystin-Lösung lag bei ~11% und wurde durch die

UV-Induktionauf ~22% erhöht.

Um zu ermitteln, inwiefern die gentoxische Wirkung einer UV-Induktion mit der

Induktion von Apoptose korreliert, erfolgte die FACS-Analyse. Dafür wurde das

entsprechende HepG2-Zellen-Aliquot zur Fixierung und Permeabilisierung für 24h bei

4°C in einer Ethanol/ PBS-Lösung inkubiert. Nach der Inkubation erfolgte die

Kernfärbung mit Propidium-Jodid für 35 min und anschließend wurde der Anteil

apoptotischer Zellen durchflusszytometrisch bestimmt. Bei der FACS-Messung

wurde der Anteil apoptotischer Zellen durch einen sub G1/G0 Peak (<2n) erfasst und

der prozentuale Anteil mit Hilfe der Software des EPICS XL quantifiziert. Die

Verteilung der übrigen Zellen in den verschiedenen Phasen des Zellzyklus wurde

durch die DNA-Histogramme dargestellt (Abb.3.10/ 3.10.1).

Durch das Mitführen verschiedener Kontrollen wurde der Anteil apoptotischer Zellen

in der eingesetzten HepG2-Population (ohne), das Ausmaß einer UV-Induktion (UV)

und die alleinige Wirkung von DMSO/ Microcystin auf das Testsystem bestimmt.

Diese Bezugsgrössen waren erforderlich, um über die präventive Wirkung von Micro-

cystin vor Apoptose Aussagen machen zu können.

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Resultate

91

DMSO-Kontrolle MCYST-Kontrolle Unbehandelt

UV

88

o

0 1024

A B C D F

88

o o

1024

A B C D F

88

o

o

1024

A B C D F

o

o

1024

A B C D F

DMSO-UV

A B C D F

1024

A B C D F

1024

o

o

o o

88

88

88

MCYST-UV

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Resultate

92

Abb. 3.10 + 3.10.1: Einfluss von Microcystin auf UV-induzierte Apoptose

HepG2-Zellen wurden für 2h präinkubiert mit DMSO und Microcystin, mit UV-Licht (100J/ m 2 ) bestrahlt und für

24h bei 37°C/ 5% CO2 inkubiert. Die fixierten Zellen (1x 106) wurden mit Propidium-Jodid (PI) gefärbt und der

DNA- Gehalt einzelner Zellen mit Hilfe eines Durchflusszytometers bestimmt. Die Zellzyklusverteilung der HepG2-

Zellen wurde durch DNA-Histogramme dargestellt. Bei den gezeigten Histogrammen ist der DNA-Gehalt (x-

Achse: Pi Fluoreszenzintensität) gegen die Zellzahl (y-Achse: 104 Zellen/ Messung) aufgetragen. Die Region

zwischen A und B spiegelt den Anteil an apoptotischen Zellen (sup-G1) wieder. Der Peak im Bereich B und C

stellt den Anteil der Zellen dar, die sich in der G1-Phase befinden. Die Region C-D stellt den Anteil der Zellen in

der S-Phase dar. Im Bereich D und F werden die Zellen gekennzeichnet, die sich in der G2/ M-Phase befinden.

Der quantitative Anteil (%) an apoptotischen Zellen wurde in Form eines Balkendiagrammes dargestellt. Als

Kontrolle wurde für jeden UV-bestrahten Ansatz eine unbestrahlte Probe mitgeführt. Die Graphik stellt die

Mittelwerte der verschiedenen Proben aus zwei unabhängigen Versuchen +/- SD dar, wobei jeder Wert sich aus

einer Doppelbestimmung ergab.

In der unbestrahlten Probe (ohne) wurden 12% apoptotische Zellen in der subG1-

Phase ermittelt. Der Hauptbestandteil der übrigen Zellen der HepG2-Population

befand sich in der G1-Phase, und der Rest der Zellen verteilte sich auf die S- und G2/

M-Phase. Eine UV-Bestrahlung (UV-Kontrolle) ging mit einer kompletten

Umverteilung der Zellen im Zyklus einher. Es wurden nur noch Zellen in der sub-G1-

Phase nachgewiesen. Der Anteil an apoptotischen Zellen stieg auf 80% an. Nach

einer Inkubation der Zellpopulation mit 0,4% DMSO (DMSO-Kontrolle) für 2h nahm

im Vergleich zur unbehandelten Probe der Anteil der Zellen in der subG1-Phase

minimal zu. Es zeigten 22% der Zellen apoptotische Merkmale. Desweiteren führte

der DMSO-induzierte G1-Arrest zu einer Erhöhung des Anteiles an Zellen in der G1-

Phase, so dass weniger Zellen in die S-Phase überführt wurden. Eine zusätzliche

UV-Bestrahlung der Zellen (DMSO/UV) führte zu einem signifikanten Anstieg der

subG1-Zellpopulation. Es zeigten 55% der Zellen apoptotische Merkmale.

UV

DM

SO/ U

V

DM

SO

ohne

MC

YST

MC

YST/

UV

0

20

40

60

80

100

120

apop

totis

che

Zelle

n (%

)

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Resultate

93

Außerdem verblieb ein geringer Anteil der Zellen in der G1-Phase. Nach einer

Exposition der Zellen mit 10 µM Microcystin (MCYST-Kontrolle) konnte im Vergleich

zur DMSO-Kontrolle, eine minimale Abnahme der sub-G1-Phase- Population und

eine geringfügige Zunahne der S-Phase Zellpopulation registiert werden. Microcystin

in einer Konzentration von 10 µM hatte im Vergleich zur Kontrolle keinen Einfluss auf

die Apoptoserate (17%). Eine Präinkubation der Zellen mit Microcystin vor der UV-

Induktion (Microcystin/UV) konnte den Anteil an Zellen in der sub-G1-Phase im

Vergleich zu der ermittelten Apoptoserate nach einer UV-Induktion deutlich

reduzieren. Die Apoptoserate betrug hier 35%. Ansonsten hatte die UV-Exposition

der Microcystin-präinkubierten Zellen kaum Auswirkungen auf die Verteilung der

Zellen in den einzelnen Phasen.

Eine Versuchsreihe, bei der die Zellen nur mit 2,5 µM Microcystin präinkubiert und

anschließend mit UV-Licht bestrahlt wurden, konnte die Wirkung von Microcystin

bezüglich einer Prävention vor UV-induzierter Apoptose nicht bestätigen. In allen

Ansätzen, ob mit DMSO oder Microcystin präinkubiert, konnte nach der UV-

Bestrahlung eine Apoptose-Rate von ~80-90% nachgewiesen werden (Daten nicht

dargestellt).

3.5. Einfluss von Microcystin auf die Kerntranslokation von p53

In diesem Experiment sollte analysiert werden, ob Microcystin über die Modulation

des Phosphorylierungsstatus von p53 Einfluss auf dessen subzelluläre Lokalisation

nimmt. In vorherigen Experimenten wurde gezeigt, dass Microcystin die metabolische

Stabilität und die Hyperphosphorylierung von p53 signifikant beeinflusst. Da beide

Zustände auch bei der Regulation der subzellulären Lokalisation von p53 involviert

sind, ist anzunehmen, dass Microcystin auch die Kerntanslokation von p53

beeinflusst.

Für die Aktivierung von p53 als TF ist die Tetramerisierung und die Translokation

vom Cytoplasma in den Nukleus essentiell.

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Resultate

94

Verschiedene Studien zeigen, dass der nukleäre Import und Export verschiedener

Proteine über Phosphorylierungen moduliert wird (Appella and Anderson, 2001;

Liang and Clarke, 2001). Auch der Einfluss von Phosphorylierungen auf die

subzelluläre Lokalisation von p53 wird diskutiert. Takahashi and Suzuki. (1993)

berichteten, dass in humanen Brustkrebszellen (MCF-7) die verstärkte p53-

Phosphorylierung mit einer Translokation des Proteins aus dem Nukleus ins

Cytoplasma korreliert.

Zur Analyse des Einflusses von Microcystin auf die subzelluläre Lokalisation des

p53-GFP-Proteins nach einer UV-Induktion wurden HepG2-Zellen mit einem p53-

GFP-Expressionsvektor transfiziert, für 48h bei 37°C/5% CO2 kultiviert und

anschließend für 2 h mit 10 µM Microcystin bei 37°C/5% CO2 päinkubiert. Zur

Aktivierung des p53-Fusionsproteins wurden die Zellen mit UV-Licht (7J/m2) bestrahlt

und nach einer 2h Inkubation bei 37°C/5% CO2 wurde mit Hilfe eines Laserstrahl-

Scanning-Mikroskopes (LSM) die subzelluläre Lokalisation des p53-Fusionsproteins

in den HepG2-Zellen bestimmt.

In der Abb. 3.11 a-e werden die gewonnenen Fluoreszenzaufnahmen aus dem p53-

GFP-Experiment dargestellt. Anhand der qualitativen Bewertung der Akkumulation

der Fluoreszenz in den HepG2-Zellen nach Stress-Induktion sollten Daten

hinsichtlich einer Microcystin-verursachten Beeinträchtigung des nukleären

Transportes des p53-GFP-Fusionsprotein nach UV-Induktion gewonnen werden.

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Resultate

95

Abb. 3.11: Einfluss von Microcystin auf die subzelluläre Lokalisation des p53- GFP- Fusionsproteins nach UV-Induktion

HepG2-Zellen wurden mit dem p53-GFP-Expressionsvektor transfiziert, für 48h bei 37°C/5% CO2 inkubiert und

anschließend für 2h mit DMSO/ Microcystin bei 37°C/5% CO2 präinkubiert. Nach der UV-Induktion(7J/m2) erfolgte

eine Inkubation für 2h bei 37°C/5% CO2 und anschließend die mikroskopisch Analyse mit dem Zeiss LSM 410

(63x/1,4NA (ÖL)/λ488/ 100%). Anhand der Fluoreszenz in den verschiedenen Zellkompartimenten können

Aussagen für die subzelluläre Lokalisation des Fusionsproteins gemacht werden. Für diese Analyse wurden 8

unabhängige Transfektionen durchgeführt.

a) gezeigt die nukleäre Akkumulation des p53-GFP-Proteins nach einer UV�Induktion

b) DMSO-Kontrolle; stellt die nukleäre Akkumulation des p53-GFP-Proteins nach einer UV�Induktion dar.

c) zeigt die Effekte einer Microcystin-Präinkubation; die nukleäre Translokation des p53-GFP-Proteins ist nach

der UV-Induktion vermindert, es kommt nur zu einer punktförmigen Fluoreszenz im Kern mit einer starken

cytoplasmatischen Akkumulation der Fluoreszenz

d) HBx-Kontrolle; stellt die cytoplasmatische Akkumulation des p53-GFP-Proteins dar.

e) Kontrolle zur Darstellung der Eigenfluoreszenz von HepG2-Zellen nach einer UV-Induktion

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Resultate

96

Nach einer UV-Induktionkam es zu einer deutlichen nukleären Akkumulation des

p53-GFP-Fusionsproteins. Es zeigte sich ein grün fluoreszierender leuchtender

Nukleus, wobei sich das Cytoplasma weniger grün fluoreszierend darstellte (a).

Eine Präinkubation mit 0,4% DMSO konnte nach einer UV-Induktion die nukleäre

Translokation des p53-GFP-Fusionsprotein nicht wirklich beeinträchtigen. Es zeigte

sich ein ähnliches Bild wie nach der alleinigen UV-Induktion. In der Regel zeigte sich

ein grün fluoreszierender Nukleus (b).

Nach einer 2h Microcystin-Präinkubation mit anschließender UV-Licht Expositon

wurde eine verminderte nukleäre Translokation des Fusionsproteins bzw. Zellkerne

ohne Fluoreszenz nachgewiesen (c). Es zeigte sich nur eine punktförmige nukleäre

grüne Fluoreszenz und ein fluoreszierendes Cytoplasma.

Im HBx-Kontrollansatz, bei dem die Zellen mit den pSVx-Expressionsvektor

kotransfiziert wurden, zeigte sich wie erwartet, eine grün fluoreszierende

cytoplasmastische Akkumulation des p53-GFP-Fusionsproteins mit ausgesparten

Kernen (d). Bekannterweise fungiert das HBx-Protein als sogenannter cytoplas-

matischer Adapter für das p53-Protein, so dass es zu einer cytoplasmatischen

Sequestrierung des Tumorsupressorproteins kommt.

Um die Spezifität dieser hier gewonnenen Ergebnisse zu steigern, wurde eine

Kontrolle mitgeführt, in der die Eigenfluoreszenz einer nicht transfizierten aber UV-

exponierten HepG2-Zelle gezeigt wird (e).

Zusammenfassend kann man sagen, dass diese Beobachtungen als Indiz für eine

Microcystin-assoziierte Beeinträchtigung der nukleären Beförderung des p53-GPF-

Fusionsproteins gedeutet werden können. Die Microcystin-vermittelte Hyper-

phosphorylierung von p53 bewirkt möglicherweise, dass das p53-GFP-

Fusionsproteins nicht mehr in der Lage ist, als Reaktion auf Stress komplett in den

Nukleus zu translozieren.

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Resultate

97

3.6. Funktionelle Analyse des Effektes von Microcystin auf die Zellzyklus-Regulation

In vorangegangenen Experimenten wurde gezeigt, dass Microcystin die

metabolische Stabilität von p53 (3.2) und die Akkumulation von p53 in seinem

hyperphoshorylierten Zustand (3.3) beeinflusst.

Die unphysiologische metabolische Stabilität von p53 steht im Verdacht mit einem

Verlust der Tumorsuppressorfunktion einherzugehen (Levine, 1990; Levine et al.,

1991). Auch eine Korrelation zwischen der Microcystin-modulierten Phosphorylierung

der Tumorsuppressorproteine (p53/ pRb) und der Fixierung dieser Proteine im

Zustand der Hyperphosphorylierung stellt möglicherweise ein allgemeines Modell der

Tumorpromotion dar.(Fujiki,1992). Weitere Indizien für eine Microcystin-induzierte

Beeinträchtigung der Funktionalität von p53 stellt die beobachtete inhibierende

Wirkung von Microcystin auf UV-induzierte Apoptose (3.4) und die Microcystin-

assoziierte verminderte Kerntranslokation eines GFP-p53-Fusionsproteins (Wt) nach

einer UV-Induktion dar (3.5).

Um festzustellen, ob diese gewonnenen Hinweise mit einer funktionellen

Inaktivierung der Tumorsuppressorproteine (p53/pRb) einhergehen, wurden

Transfektionsexperimente mit verschiedenen Luciferase-Konstrukten durchgeführt.

Mit Hilfe dieser Konstrukte ist es möglich über die Messung der Luciferase-Aktivität,

den Einfluss von Microcystin und dem HBx-Protein auf die Funktion der

verschiedenden Proteine des Zellzyklus zu bestimmen. Die verschiedenen Plasmide

zeichnen sich dadurch aus, dass die Expression des Reportergens Luciferase durch

das Binden jeweils eines der regulatorischen Proteine (p53, Rb, E2F und c-Myc) an

spezifische cis-acting Elemente in der Enhancer-Region, die dem TATA-Box-

Promotor vorgeschaltet sind, beeinflusst wird. Das Binden von p53, E2F und c-Myc

an das entsprechende DNA-Response-Motiv geht generell mit einer verstärkten

Expression des Luciferasegens einher. Hingegen führt das Binden des aktiven

Retinoblastomaproteines (hypophosphoryliert) zu einer Repression der Luci-

ferasegen-Expression. Bei einer Microcystin- und/ oder HBx-vermittelten

Deregulierung der Aktivität der Regulatoren des Zellzyklus kommt es im Verhältnis zu

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Resultate

98

den mitgeführten Kontrollen (unbehandelt/DMSO) zu einer Modulation der

gemessenen Luciferase-Aktivität.

Um generell Aussagen über die Spezifität der durch die Zellzyklus-Regulatoren-

vermittelte Expression des Luciferasegens zu treffen und den Einfluss von

Microcystin auf die durch die Zellzyklus-Regulatoren-vermittelte Genexpression zu

bestimmen, wurden die HepG2-Zellen mit dem Reportergen-Konstrukt pTA-Luc

transient transfiziert und anschließend mit Microcystin exponiert. In dem

Kontrollplasmid wurde die Expression des Luciferasegens ausschließlich über den

TATA-Box-Promotor initiiert, da in diesem Plasmid ein cis-acting Element mit einen

spezifischen DNA- Response-Motiv für die verschiedenen Zellzyklus-Regulatoren

fehlt. Die gemessene Luciferase-Aktivität in den entsprechenden HepG2-

Gesamtzellproteinextrakten wurde tabellarisch in den verschiedenen Abschnitten

dargestellt und war im Vergleich zu der ermittelten Lumineszenz in den Lysaten, die

die Reportergen-Konstrukte mit spezifischen DNA-Response-Element enthielten,

generell geringer. Da die eingesetzte Microcystin-Lösung DMSO als

Lösungsvermittler enthielt, wurde bei jeder Transfektion eine DMSO-Kontrolle

getestet, die als Bezugsgrösse für die Ermittlung der spezifischen Wirkung von

Microcystin auf die durch die Zellzyklus-Regulatoren-vermittelte Expression des

Luciferasegens diente.

Für die Standardisierung der Transfektion wurden die Zellen mit einem Vektor

cotransfiziert, der statt der Glühwürmchen Luciferase eine Quallen-Luciferase

(Renilla reniformis) enthält. Nach der Messung der Glühwürmchen Luciferase-

Aktivität wurde in dieselbe Probe ein Renilla-Puffer pipettiert, um die Aktivität der

Renilla-Luciferase zu messen.

3.6.1. Effekte von Microcystin auf die Funktionalität von p53

Die Wirkung von Microcystin auf die Aktivität von p53 wurde mit Hilfe des

Reportergen-Konstruktes pp53-TA-Luc analysiert. Dieses Konstrukt enthält in dem

vor dem TATA- Box-Promotor integrierten cis-acting Element ein DNA-Response

Motiv für das p53-Protein.

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Resultate

99

Nach dem Binden von p53 an das Response-Element kommt es zu einer

Verstärkung der ansonsten niedrigen Expression des Luciferasegens, die durch die

Assoziation des TATA-Box-bindenden Proteins (TBP) an den TATA-Box-Promotor

initiiert wird.

Das endogene p53-Protein wurde durch eine UV-Bestrahlung (7 J/m2) der HepG2-

Zellen induziert. Dann erfolgte die transiente Transfektion der Zellen mit dem pp53-

TA-Luc Reportergen-Plasmid und ein Inkubation für 20h bei 37°C/5% CO2..Um die

Wirkung von Microcystin auf die p53-vermitttelte Expression des Reportergens

Luciferase zu bestimmen, wurden die Zellen genau 2h vor Beendigung der

Inkubation mit 10 µM Microcystin oder 0,4% DMSO bei 37°C/5% CO2 inkubiert.

Um Aussagen über die spezifische Wirkung von Microcystin auf die Funktionalität

von p53 zu treffen, diente die p53-vermitttelte Expression des Reportergens nach

einer DMSO-Inkubation bzw. die gemessene Lumineszenz als Bezugsgrösse. In der

Abb. 3.12 wurde die Wirkung von Microcystin auf die p53-vermitttelte Expression des

Luciferasegens dargestellt. Die Expression des Reportergens wurde durch Messung

der Luciferase-Aktivität nachgewiesen.

Tab. 3.2.: Tabellarische Darstellung der p53-vermitttelten Luciferase-

Aktivität der verschiedenen Transfektionsansätze

Proben DMSO MCYST-LR LCPS SD +/-

pTA-Luc - - 1,7 0,2

pTA-Luc + - 1,5 0,4

p53-TA- Luc - - 8,7 2,0

p53-TA- Luc + - 58,0 7,0

pTA-Luc + + 2,0 1,0

p53-TA- Luc + + 8,3 1,0

pTA-Luc: Kontrollvektor; p53-TA-Luc: enthält DNA- Response Element für p53; MCYST-LR: Microcystin-LR; DMSO: Dimethylsulfoxid; LCPS: Lumineszenz pro counts; Die Mittelwerte ergeben sich aus vier unabhängigen

Ansätzen in Doppelbestimmung +/- SD

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Resultate

100

- + + DMSO

(0,4%)

Abb. 3.12: Einfluss von Microcystin auf die Funktionalität von p53

Nach der UV-Induktion wurden die Zellen mit dem p53-Luciferase-Vektor (pp53-TA-Luc) transient transfiziert,

anschließend 20h Inkubation bei 37°C/5% CO2 und für 2h vor Beendigung der Inkubation mit DMSO oder

Microcystin (MCYST) 10 µM exponiert. DMSO diente als Lösungsmittel-Kontrolle. Das Plus (+) bedeutet, dass die

Probe mit DMSO inkubiert wurde. Ein Minus (-) bedeutet keine DMSO-Exposition. Die Wirkung von Microcystin

auf die p53-vermitttelte Expression des Luciferasegens wurde indirekt über die gemessene Luciferase-Aktivität

bestimmt. Die relative Luciferase-Aktivität wurde pro µg Protein quantifiziert. Die Graphik zeigt die Mittelwerte aus

vier unabhängigen Experimenten +/- SD; Signifikanz gegenüber den Kontrollen p*<0,05, p** <0,01und p***

<0,001 Durch die transiente Transfektion der UV-induzierten HepG2-Zellen mit dem p53-

TA-Luc-Konstrukt (UV-Kontrolle) wurde die Induktion und die physiologische Aktivität

des induzierten p53-Proteins überprüft. Es wurde eine Lumineszenz von 8,7 LCPS/

µg Protein gemessen. Eine zusätzliche Exposition der Zellen mit einer 0,4%igen

DMSO-Lösung führte im Vergleich zur UV-Kontrolle zu einer signifikant verstärkten

Expression des Luciferasegens, die zu einem 6,6-fachen Anstieg der gemessenen

Luciferase- Aktivität führte (58 LCPS/ µg Protein). Microcystin in einer Konzentration

von 10 µM führte im Vergleich zur DMSO-Kontrolle zu einer deutlich verminderten

p53-induzierten Expression des Luciferasegens, die zu einer signifikanten Abnahme

der Lumineszenz führte ( 8,3 LCPS/µg Protein; p*** <0,001).

Die Reduktion der Luciferase-Aktivität nach der Microcystin-Exposition deutet auf

eine Microcystin-vermittelte funktionelle Inaktivierung des Tumorsuppressorproteins

hin.

MC

YST-

LR **

*

pp53- TA Luc

0

1020

3040

5060

70LC

PS/µ

g Pr

otei

n

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Resultate

101

3.6.2. Effekte von Microcystin auf die Funktionalität von pRb

Die Wirkung von Microcystin auf die Funktion des Transkriptionsrepressors pRb

wurde durch die transiente Transfektion von HepG2-Zellen mit dem Luciferase-

Reportergen- Konstrukt pRb-TA-Luc analysiert. Bei diesem Konstrukt wurde die TBP-

vermittelte niedrige Luciferasegen-Expression je nach Phosphorylierungsform des

Retinoblastomaproteins beeinflusst. Das Binden des hypophosphorylierten

Retinoblastomaprotein in Assoziation mit E2F führt zu einer Repression der pRb-

vermittelten Expression des Luciferasegens.

Um das aktive hypophosphorylierte Rb-Protein zu induzieren, wurden die Zellen

zunächst durch Serumentzug in der G1-Phase arretiert und am 3. Tag mit 10% FCS

stimuliert. Die Serumstimulation war notwendig, um die Konzentration an

hypoposphoryliertem pRb-Protein in der Zelle zu senken, da ansonsten aufgrund des

ungleichen Konzentrationsverhältnisses aller beteiligten Parameter keine Aussage

über die Wirkung von DMSO und Microcystin auf die pRb-vermittelte Expression des

Reportergens-Luciferase zu treffen war (Vorversuch).

Um die Effekte von Microcystin auf die pRb-vermittelte Expression des Reportergens

Luciferase zu bestimmen, wurden die Serum-stimulierten Zellen mit dem pRb-TA-

Luc-Plasmid transient transfiziert, 20h bei 37°C/ 5% CO2 inkubiert und genau 2h vor

Beendigung der Inkubation mit 10 µM Microcystin oder 0,4% DMSO exponiert. Mit

Hilfe der DMSO-Kontrolle wurde die Spezifität der Microcystin-vermittelten Wirkung

auf die Funktionalität des pRb-Proteins bestimmt.

In Tab. 3.3 wird die Wirkung von Microcystin auf die pRb-assoziierte Expression des

Luciferasegens in den HepG2-Zellen gezeigt.

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Resultate

102

Tab. 3.3: Tabellarische Darstellung der pRb-vermittelten Luciferase-

Aktivität der verschiedenenTransfektionsansätze

Proben DMSO MCYST-LR LCPS SD +/-

pTA-Luc - - 1,7 0,2

pTA-Luc + - 1,3 0,3

pRb/Luc - - 5,9 0,8

pRb/Luc + - 2,5 1,0

pTA-Luc + + 2,0 0,4

pRb/Luc + + 15,0 2,4

pTA-Luc: Kontrollvektor; pRb-TA-Luc: trägt das DNA- Response Element für pRb MCYST-LR: Microcystin-LR;

DMSO: Dimethylsulfoxid; LCPS: Lumineszenz pro counts; Die Mittelwerte ergeben sich aus vier unabhängigen

Ansätzen in Doppel-bestimmung, +/- SD

- + + DMSO (0,4%)

Abb. 3.13: Einfluss von Microcystin auf die Funktionalität von pRb

Nach der Serumstimulation (1d/ 10%) wurden die Zellen mit dem pRb-Luciferase-Vektor (pRb-TA-Luc) transient

transfiziert und für 2h vor Beendigung der 20h Inkubation mit DMSO oder Microcystin (MCYST) 10 µM exponiert

bei 37°C/5% CO2. DMSO diente als Lösungsmittel-Kontrolle. Das Plus (+) bedeutet, dass die Probe mit DMSO

inkubiert wurde. Ein Minus (-) bedeutet keine DMSO-Exposition. Die Wirkung von Microcystin auf die pRb-

vermittelte Expression des Luciferasegens wurde indirekt über die gemessene Luciferase-Aktivität bestimmt. Die

relative Luciferase-Aktivität wurde pro µg Protein quantifiziert. Die Graphik zeigt die Mittelwerte aus vier

unabhängigen Experimenten +/- SD; Signifikanz gegenüber den Kontrollen p*<0,05, p** <0,01und p*** <0,001.

pRb- TA Luc

MC

YST-

LR **

05

10152025303540

LCPS

/µg

Prot

ein

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Resultate

103

Durch die Lumineszenz-Messung in den Serum-stimulierten und mit dem pRb-TA-

Luc-Vektor transfizierten HepG2-Zellextrakten wurde die Induktion und die

Funktionalität des pRb-Proteins nachgewiesen.

Eine DMSO-Inkubation unterdrückte im Vergleich zur ermittelten Lumineszenz in den

Serum-stimulierten HepG2-Zellen das Ausmaß der Rb-vermittelten Expression des

Reportergens Luciferase. Nach der DMSO-Exposition wurde eine 2,4-fache

Abnahme der Luciferase-Aktivität gemessen (2,5 LCPS/ µg Protein).

Die Exposition der transfizierten Zellen mit 10 µM Microcystin führte im Vergleich zur

DMSO-Kontrolle zu einer 6-fachen Erhöhung der Lumineszenz (15 LCPS/ µg

Protein; p** <0,01).

Anhand der erworbenen Daten in diesem Transfektionsexperiment kann davon

ausgegangen werden, dass Microcystin durch die Hemmung der Protein-

phosphatasen die Aktivität von pRb partiell hemmt.

3.6.3. Effekte von Microcystin auf die Funktionalität von E2F

E2F bildet phasenspezifisch mit dem hypophosphorylierten Rb-Protein einen

Komplex. Durch eine Phosphorylierung des Rb-Proteins dissoziiert E2F aus diesem

Komplex und kann als aktiver Transkriptionsfaktor in Assoziation mit dem Protein

DP1 die Synthese von sogenannten S-Phasegenen initiieren. Aus diesem Grund ist

anzunehmen, da Microcystin die Phosphorylierung von pRb moduliert, dass

Microcystin indirekt die Aktivität von E2F hinsichtlich einer Aktivitätssteigerung

beeinflusst. Die Wirkung von Microcystin auf die E2F-vermittelte Expression des

Reportergens Luciferase ist in Tab. 3.4 und Abb.3.14 dargestellt.

Die Wirkung von Microcystin auf die Funktionalität des Transkriptionsfaktors E2F

wurde mit Hilfe des Luciferase- Reportergen-Konstruktes pE2F-TA-Luc bestimmt.

In dem pE2F-TA-Luc-Plasmid wird die TATA-Box initiierte Expression des

Luciferasegens über das in dem cis-acting Element befindliche DNA-Response-Motiv

für das E2F-Protein verstärkt, so dass das Binden von E2F-DP1 an das DNA-Motiv

mit einer messbar ansteigenden Luciferase-Aktivität einhergeht.

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Resultate

104

Tab. 3.4: Tabellarische Darstellung der E2F-vermittelten Luciferase-

Aktivität der verschiedenen Transfektionsansätze

Proben DMSO MCYST-LR LCPS SD(+/-)

pTA-Luc - - 2,2 0,6

pTA-Luc + - 2,0 0,7

pE2F-TA-Luc - - 5,0 1,2

pE2F-TA-Luc + - 3,2 0,5

pTA-Luc + + 2,2 0,4

pE2F-TA-Luc + + 8,2 1,1

pTA-Luc:Kontrollvektor; pE2F-TA-Luc: trägt das DNA-Response-Element für pE2F; MYST-LR:Microcystin-LR;

DMSO: Dimethylsulfoxid; LCPS: Lumineszenz pro counts;. Die Mittelwerte ergeben sich aus vier unabhängigen

Ansätzen in Doppelbestimmung, +/- SD

- + + DMSO

(0,4%)

Abb. 3.14: Einfluss von Microcystin auf die Funktionalität von E2F

Nach der Serumstimulation (1d/ 10%) wurden die Zellen mit dem pE2F-Luciferase-Vektor (pE2F-TA-Luc)

transient transfiziert und für 2h vor Beendigung der 20h Inkubation mit DMSO oder Microcystin (MCYST) 10µM

bei 37°C/5% CO2 exponiert. DMSO diente als Lösungsmittel-Kontrolle. Das Plus (+) bedeutet, dass die Probe mit

DMSO inkubiert wurde. Ein Minus (-) bedeutet keine DMSO-Exposition. Die Wirkung von Microcystin auf die E2F-

vermittelte Expression des Luciferasegens wurde indirekt über die gemessene Luciferase-Aktivität bestimmt. Die

relative Luciferase-Aktivität wurde pro µg Protein quantifiziert. Die Graphik zeigt die Mittelwerte aus vier

unabhängigen Experimenten +/- SD; Signifikanz gegenüber den Kontrollen: p*<0,05, p** <0,01und p*** <0,001.

MC

YST-

LR *

pE2F- TA Luc

0

5

10

15

20

LCPS

/µg

Prot

ein

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Resultate

105

Für diese funktionelle Analyse wurde zunächst die Assoziation von E2F und des

hypophosphorylierten pRb-Proteins durch einen zweitägigen Serumentzug forciert,

um dann durch die eintägige Serumstimulation der Zellen (10% FCS), die synchrone

Dissoziation des pRb-E2F-Komplexes und die Freisetzung von E2F zu induzieren.

Die Serum�stimulierten HepG2-Zellen wurden dann mit dem pE2F-TA-Luc

Reportergen-Konstrukt transient transfiziert, 20 h bei 37°C/ 5% CO2 inkubiert und wie

bei den anderen Transfektionen mit 10 µM Microcystin oder 0,4% DMSO 2 h vor

Ablauf der Inkubation exponiert.

Über die Lumineszenz-Messung in den Serum-stimulierten und transient mit dem

pE2F-TA-Luc-Vektor transfizierten HepG2-Zellen wurde die Funktionalität von E2F

nachgewiesen. Die Exposition der Zellen mit DMSO bewirkte eine Verringerung der

Luciferase- Aktivität. Nach der DMSO-Exposition wurde im Vergleich zur der

ermittelten Lumineszenz nach der Serumstimulation der HepG2-Zellen (5,0 LCPS/

µg Protein) eine Abnahme der Luciferase-Aktivität gemessen (3,2 LCPS/ µg Protein).

Microcystin in einer Konzentration von 10 µM revertierte die DMSO-vermittelte

Abnahme der Lumineszenz und führt zu einer verstärkten E2F-vermittelten

Expression des Luciferasegens, die mit einer Zunahme der Luciferase-Aktivität (8,2

LCPS/ µg Protein; p* <0,05) korrelierte.

Abschliessend kann festgestellt werden, dass der Tumorpromotor Microcystin einen

positiven Einfluss auf die Aktivität von E2F hat.

3.6.4. Effekte von Microcystin auf die Funktionalität von c-Myc

Das Myc-Protein wird als Proliferationsmarker bezeichnet, da es gleich nach der

Serumstimulation ruhender Zellen gebildet wird und diese zum Eintritt in den

Zellzyklus veranlasst. Als TF aktiviert es zum Beispiel das Gen, das für die Cdc25-

Phosphatase kodiert. Die Cdc25-Phosphatase ist erforderlich für die Aktivierung von

Cyclin-abhängigen Proteinkinasen, die eine essentielle Rolle bei der Regulation des

Zellzyklus übernehmen.

Die Wirkung von Microcystin auf die Funktionalität des c-Myc-Proteins wurde durch

die transiente Transfektion nach der Serumstimulation (1d) der HepG2-Zellen mit

dem pMyc-TA-Luc-Vektor nachgewiesen.

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Resultate

106

In diesem Konstrukt wird die TATA-Box initiierte Expression des Luciferasegens

durch das Binden von c-Myc als Heterodimer mit dem Protein MAX an das im cis-

acting-Element lokalisierte E-Box Motiv verstärkt.

Die Tab. 3.5 zeigt die gemessenen Luciferase-Aktivitäten nach einer transienten

Transfektion der Serum-stimulierten HepG2-Zellen mit dem pMyc-TA-Luc-Vektor.

Tab. 3.5: Tabellarische Darstellung der c-Myc-vermittelten Luciferase�

Aktivität der verschiedenenTransfektionsansätze

Proben DMSO MCYST-LR LCPS SD+/-

pTA-Luc - - 2,3 0,5

pTA-Luc + - 1,5 0,6

pMyc �TA-Luc - - 4,0 1,3

pMyc �TA-Luc + - 6,5 1,0

pTA-Luc + + 2,2 0,4

pMyc �TA-Luc + + 15,0 1,9

pTA-Luc: Kontrollvektor; pMyc�TA-Luc: trägt das DNA- Response Element für c-Myc; MCYST-LR: Microcystin-

LR; DMSO: Dimethylsulfoxid; LCPS: Lumineszenz pro counts. Die Mittelwerte ergeben sich aus vier

unabhängigen Ansätzen in Doppelbestimmung, +/- SD

- + + DMSO (0,4%)

Abb. 3.15: Einfluss von Microcystin auf die Funktionalität von c- Myc

Nach der Serumstimulation (1d/ 10%) wurden die Zellen mit dem pMyc-Luciferase-Vektor (pMyc-TA-Luc)

transient transfiziert und für 2h vor Beendigung der 20h Inkubation mit DMSO oder Microcystin (MCYST) 10 µM

bei 37°C/5% CO2 exponiert. DMSO diente als Lösungsmittel-Kontrolle. Das Plus (+) bedeutet, dass die Probe mit

DMSO inkubiert wurde. Ein Minus (-) bedeutet keine DMSO-Exposition. Die Wirkung von Microcystin auf die c-

Myc-vermittelte Expression des Luciferasegens wurde indirekt über die gemessene Luciferase-Aktivität bestimmt.

Die relative Luciferase-Aktivität wurde pro µg Protein quantifiziert. Die Graphik zeigt die Mittelwerte aus vier

unabhängigen Experimenten +/- SD; Signifikanz gegenüber den Kontrollen: p*<0,05, p** <0,01und p*** <0,001.

pc-Myc- TA Luc

MC

YST-

LR**

0

10

20

30

40

50

60

LCPS

/µg

Prot

ein

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Resultate

107

Durch die Messung der Luciferase-Aktivität in den Serum-stimulierten und transient

mit dem pMyc-TA-Luc-Vektor transfizierten HepG2-Zellen wurde die Induktion und

die Funktionalität von c-Myc in diesem Testsystem überprüft. Die Inkubation der

transfizierten Zellen mit DMSO führte im Vergleich zu einer Serumstimulation zu

einer höheren c-Myc-vermittelten Expression des Luciferasegens, was mit einem 1,6-

fachen Anstieg der Luciferase-Aktivität (6,5 LCPS/ µg Protein) einherging.

Microcystin in einer Konzentration von 10 µM hatte ebenfalls eine positive Wirkung

auf die c-Myc-vermittelte Expression des Luciferasegens. Es wurde im Vergleich zur

DMSO-Kontrolle ein 2,3-facher Anstieg der Luciferase-Aktivität gemessen (15 LCPS/

µg Protein; p** <0,01).

Abschliessend kann man sagen, dass die Funktion von c-Myc durch eine

Microcystin-Inkubation positiv beeinflusst wurde.

3.7. Analyse der Effekte von Microcystin und HBx auf die Zellzyklus-Regulation

Epidemiologische Studien zeigten, dass eine Kontamination des Trinkwasssers mit

Microcystin und eine Überexpression von HBx bei chronischen HBV-Infektionen bei

der Entwicklung eines HBV-assoziierten HCC wesentliche Risikofaktoren darstellen

(Caselmann et al., 1996; Cromish et al., 1996; Ganem and Varmus, 1996;

Matsushima et al., 1990; Yoshizawa et al., 1990; Yu, 1995).

In verschiedenen Studien wurde gezeigt, dass das x-Protein bei der Entstehung

eines HCC involviert ist. Über Protein-Protein-Interaktionen greift es dysregulierend

in Signalkaskaden (z.B. MAPK-Weg/TBP-Interaktion ) und in die Zellzyklus-

Regulation (p53-Adapter, Verkürzung der Zellzyklus-Phasen) ein (Feitelson, 1998;

Puisieux et al., 1995). Der Tumorpromotor Microcystin kann als Inhibitor der PP1/

PP2A in alle zellulären Regelmechanismen (MAPK-Weg, p53/ pRb Funktion)

eingreifen, die über De-/Phosphorylierungsprozesse aktiviert werden.

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Resultate

108

In diesem Experiment sollten vor allem die kombinatorischen (additive/ syner-

gistische) Effekte der beiden Tumorpromotoren auf die durch die Zellzyklus-

Regulatoren- (p53, Rb, E2F, c-Myc) vermittelte Expression des Reportergens

Luciferase dargestellt werden.

Dazu wurden in den HepG2-Zellen zunächst die Zellzyklus-regulierenden Proteine

über verschiedene Techniken induziert (3.6). Dann erfolgte die transiente

Kotransfektion der HepG2-Zellen mit jeweils einem der Luciferase-Vektoren (3.6.1-

3.6.4.) und dem Expressionsvektor pSVx, der die vollständige c-DNA-Sequenz des

HBx-Gens (Wt) enthält. Die Expression des HBx-Gens (Wt) erfolgt unter der

Kontrolle eines CMV-Promotors. Um die kombinatorischen Effekte von Microcystin

und dem HBx-Protein auf die Funktionalität der verschiedenen Zellzyklus-

Regulatoren zu analysieren, wurden die transient transfizierten Zellen 2h vor

Beendigung der 20h Inkubation mit DMSO (0,4%) oder 10 µM Microcystin bei 37°C/

5% CO 2 inkubiert. Die kombinatorischen Effekte der beiden Tumorpromotoren auf

die durch die Zellzyklus-Regulatoren- vermittelte Expression des Luciferasegens

wurden dabei über die Lumineszenz-Messung bestimmt.

Eine deregulierende Wirkung beider Effektoren auf die Funktionalität der Zellzyklus-

Regulatoren wird als synergistisch bezeichnet, wenn die errechnete Summe der

gemessenen Luciferase-Aktivität aus den HBx-cotransfizierten und Microcystin-

inkubierten Proben entweder grösser (pRb, E2F, c-Myc) oder kleiner (p53) ist als die

Summe, die man nach der Addition der gemessenen Lumineszenz aus den nur mit

Microcystin- oder HBx-exponierten Proben erhält. Eine deregulierende Wirkung von

Microcystin und HBx auf die Funktionalität der Zellzyklus-Regulatoren wird als additiv

bezeichnet, wenn die errechnete Summe der Lumineszenz aus den Proben, die

sowohl mit HBx als auch mit Microcystin-exponiert wurden, der Summe entspricht,

die sich nach der Addition der gemessenen Luciferase-Aktivität aus den nur mit HBx-

oder Microcystin-exponierten Proben ergibt.

In den folgenden Abb. 3.16�3.19 werden die gemessenen Luciferase-Aktivitäten

(LCPS/µg Protein) der verschiedenen Transfektionsansätze tabellarisch und

graphisch dargestellt. Um bei diesem Experiment die spezifischen Effekte von

Microcystin und dem HBx-Protein auf die Funktionalität der verschiedenen

Zellzyklus-Regulatoren zu bestimmen, wurden verschiedene Kontrollen mitgeführt.

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Resultate

109

Die gemessene Luciferase- Aktivität nach der Kotransfektion der HepG2-Zellen mit

dem Kontrollvektor pTA-Luc für die Luciferase-Konstrukte (3.6) und dem

Kontrollplasmid pneo für den pSVx-Expressionsvektor, der keine c-DNA-Sequenz

des HBx-Gen enthält, wurden tabellarisch in den entsprechenden Abschnitten

dargestellt und fielen generell geringer aus als die ermittelte Lumineszenz in den

Zellen, die mit den DNA- Response-Elementen und HBx-Gensequenz gefüllten

Konstrukten cotransfiziert wurden. Auch nach einer Exposition dieser Kontroll-

vektoren (pTA-Luc/ pneo) mit DMSO oder Microcystin wurden im Vergleich zur

ermittelten Lumineszenz in den Ansätzen, die mit den verschiedenen Luciferase-

Konstrukten (3.6) und dem pSVx-Vektor cotransfiziert wurden, eine geringere

Lumineszenz gemessen. Die Standardisierung der Transfektion erfolgte wie unter 3.6

beschrieben.

Die Expression des HBx-Gens in den HBx-transfizierten Ansätzen wurde mit Hilfe der

RT-PCR nachgewiesen (Daten nicht dargestellt).

3.7.1. Effekte von Microcystin und HBx auf die Funktionalität von p53

Das p53-Protein stellt für das HBx-Protein und Microcystin einen wichtigen zellulären

Angriffspunkt dar. Verschiedene Studien zeigen, dass das HBVx-Protein durch

Interaktionen mit dem Tumorsuppressorprotein p53 entscheidend in die Entwicklung

eines Hepatozellulären Karzinoms involviert ist (Feitelson, 1998; Feitelson et al.,

2001).

Wie in dieser Studie gezeigt, kann auch Microcystin als Inhibitor der

Proteinphosphatasen über die Modulation des Phosphorylierungsmusters von p53

möglicherweise die funktionelle Inaktivierung des p53-Proteins bewirken (3.6.1).

Bei der Entwicklung eines HBV-assoziierten HCC könnten das HBx-Protein und

Microcystin kombinatorisch die Funktion von p53 ausser Kraft setzen und so

schließlich durch die Akkumulation von Mutationen eine genomische Instabilität

initiieren, die letztendlich die Tumorprogression begünstigt.

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Resultate

110

Um die Wirkung von Microcystin und HBx auf die Funktionalität von p53 zu

analysieren, wurden die UV-induzierten HepG2-Zellen transient mit dem pp53-TA-

Luc- und dem HBx-Expressionsvektor pSVx cotransfiziert, 20 h bei 37°C/ 5%CO2

inkubiert und 2h vor Beendigung der Inkubation mit 10 µM Microcystin oder 0,4%

DMSO bei 37°C/ 5% CO2 exponiert.

In Tab. 3.6/Abb. 3.16 sind die gemessenen Luciferase-Aktivitäten der verschiedenen

Transfektionen tabellarisch und graphisch gezeigt.

Um spezifische Aussagen über die Effekte von Microcystin und das HBx-Protein auf

die p53-vermitttelte Expression des Reportergens Luciferase zu treffen, wurden

verschiedene Kontrollen mitgeführt.

Zur Bestimmung der Effekte von HBx auf die p53-vermitttelte Expression des

Luciferasegens zu bestimmen, wurde die gemessene Lumineszenz nach der UV-

Induktion als Bezugsgrösse eingesetzt. Zur Bewertung des Einflusses von

Microcystin auf die Aktivität von p53 wurde jeweils die gemessene Luciferase-

Aktivität in den Microcystin-exponierten Proben mit der ermittelten Lumineszenz nach

einer DMSO- Exposition verglichen (3.6.1). Um die kombinatorischen Effekte von

HBx und Microcystin auf die Funktionalität von p53 zu bestimmen, wurde die in den

HBx- cotransfizierten- und mit Microcystin-exponierten Proben gemessene

Luciferase- Aktivität mit der ermittelten Lumineszenz in der entsprechenden DMSO-

Kontrolle verglichen.

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Resultate

111

Tab. 3.6.: Tabellarische Darstellung der p53-vermitttelten Luciferase-Aktivität der

verschiedenen Transfektionsansätze

Proben DMSO MCYST-LR HBx LCPS SD +/-

pTA-Luc - - - 1,7 0,2

pTA-Luc + - - 1,5 0,4

pneo - - - 1,9 0,3

pneo + - - 2,0 0,7

pTA-Luc+neo - - - 1,7 0,3

pTA-Luc+neo + - - 1,2 0,5

p53-TA -Luc - - - 8,7 2,0

p53-TA -Luc + - - 58,0 7,0

pTA-Luc + + - 2,0 1,0

pneo + + - 2,2 0,7

pTA+pneo + + - 1,7 0,8

p53-TA -Luc + + - 8,3 1,0

pTA-Luc - - + 2,0 0,7

pTA-Luc + - + 1,0 0,1

p53-TA -Luc - - + 4,4 0,8

p53-TA -Luc + - + 80,0 4,5

pTA-Luc + + + 2,3 0,8

p53-TA -Luc + + + 6,3 0,6

pTA-Luc: Kontrollvektor; pneo: Kontrollvektor; p53-TA-Luc: enthält DNA-Response Element für p53; HBx:

Expressionsvektor HBx; MCYST- LR: Microcystin-LR; DMSO: Dimethylsulfoxid; LCPS: Lumineszenz pro counts;

Die Mittelwerte ergeben sich aus vier unabhängigen Ansätzen in Doppelbestimmung, +/- SD

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Resultate

112

- - + + + + DMSO (0,4%)

Abb. 3.16: Einflüsse von Microcystin und HBx auf die Funktionalität von p53

Nach der UV-Induktion wurden die Zellen mit dem pp53- Luciferase-Vektor (pp53- TA- Luc) und mit dem pSVx-

Vektor transient transfiziert und für 2h vor Beendigung der 20h Inkubation mit DMSO oder Microcystin (MCYST)

10 µM bei 37°C/5% CO2 exponiert. DMSO diente als Lösungsmittel-Kontrolle. Das Plus (+) bedeutet, dass die

Probe mit DMSO inkubiert wurde. Ein Minus (-) bedeutet keine DMSO-Exposition. Die Wirkung von Microcystin

auf die p53-vermitttelte Expression des Luciferasegens wurde indirekt über die gemessene Luciferase-Aktivität

bestimmt. Die relative Luciferase-Aktivität wurde pro µg Protein quantifiziert. Die Graphik zeigt die Mittelwerte aus

vier unabhängigen Experimenten +/- SD; Signifikanzen gegenüber den entsprechenden Ansätzen (#): p*<0,05,

p** <0,01und p*** <0,001

Durch die Messung der Lumineszenz in den UV-induzierten- und mit dem pp53-TA-

Luc�Vektor transfizierten HepG2-Zellen wurde die Induktionsmethode überprüft und

die Anwesenheit des p53-Proteins in dem Testsystem sichergestellt.

Die Anwesenheit von HBx in den HepG2-Zellen führte im Vergleich zur UV-Kontrolle

zu einer Abnahme der p53-vermitttelten Expression des Luciferasegens (4,4 LCPS/

µg Protein; p* <0,05). Durch eine zusätzliche DMSO-Exposition wurde die HBx-

vermittelte inhibierende Wirkung auf die p53-induzierte Expression des

Luciferasegens stark reduziert, was zu einem deutlich Anstieg der Luciferase-

Aktivität führte (80 LCPS /µg Protein).

Ähnlich wie das HBx-Protein führte auch Microcystin in einer Konzentration von

10 µM im Vergleich zur DMSO-Kontrolle zu einer signifikanten Reduktion der

Lumineszenz (8,3 LCPS/µg Protein; p*** <0,001). Diese Reduktion deutet an, dass

Microcystin in der Lage war, die Funktion von p53 partiell ausser Kraft zu setzen

(3.6.1). Nach einer alleinigen Inkubation der Zellen mit einer 0,4%igen DMSO-

Lösung wurde die Luciferase-Aktivität im Vergleich zur UV-induzierten Probe um ein

6,9 -faches gesteigert (58 LCPS/µg Protein).

HBx

HBx

*

pp53- TA Luc

MC

YST-

LR**

*

MC

YST-

LR

+ H

Bx**

*

020406080

100120

LCPS

/µg

Prot

ein

#

#

#

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Resultate

113

Durch die simultane Anwesenheit des HBx-Proteins und Microcystin in den HepG2-

Zellen wurde die Luciferase-Aktivität im Vergleich zu den entsprechenden Ansätzen

(HBx+ und MCYST;#) um ein Vielfaches veringert (6,3 LCPS/ µg Protein ; p***

<0,001).

Zusammenfassend kann man sagen, dass das HBx-Protein und das Hepatotoxin

Microcystin synergistisch die Funktion des p53-Proteins als Enhancer für die

Expression des Luciferasegens ausser Kraft setzen. Möglicherweise ist diese

kombinatorisch induzierte funktionelle Inaktivierung von p53 durch HBx und

Microcystin der Motor für die progressive Entwicklung eines HCC in HBV-Hoch-

endemiegebieten.

Die hier dargestellten Effekte der Tumorpromotoren (HBx und Microcystin) auf die

Funktion von p53 hinsichtlich einer kombinatorischen funktionellen Inaktivierung

wurden in einem Cotransfektionsexperimente mit einem rekombinierten p53-

Expressionsvektor bestätigt (Daten nicht gezeigt).

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Resultate

114

3.7.2. Effekte von Microcystin und HBx auf die Funktionalität von pRb

Ebenso wie das p53-Protein stellt auch das Rb-Protein als Regulator der

Zellproliferation, Differenzierung und Apoptose (Herwig and Strauss, 1997) einen

interessanten Angriffspunkt für beide Tumorpromotoren dar. Das HBx-Protein und

Microcystin könnten womöglich kombinatorisch über die Modulation der

Phosphorylierung von pRb die Funktionalität des Transkriptionsrepressor deregu-

lierend beeinflussen.

In dieser Studie wurde gezeigt, dass Microcystin möglicherweise über den

Okadasäure-Pathway die Funktion des Rb-Proteins als Transkriptionsrepressor

ausser Kraft gesetzt (3.6.2). Auch das HBx-Protein könnte über den MAPK-Pathway

womöglich die Hyperphosphorylierung von pRb-induzieren und dadurch ebenfalls

das Aussetzen der Tumorsuppressorfunktion bewirken. Das HBx-Protein könnte so

in Kombination mit der Microcystin-vermittelten funktionellen Inaktivierung von pRb

die Entwicklung eines HBV-assoziierten HCC forcieren.

Um die kombinatorische Wirkung von Microcystin und HBx auf die Funktionalität von

pRb zu bestimmen, wurden die Serum-stimulierten HepG2-Zellen transient mit dem

pRb-TA-Luc Vektor und dem HBx-Expressionsvektor pSVx kotransfiziert, für 20h bei

37°C/ 5% CO2 inkubiert und 2h vor Beendigung der Inkubation mit Microcystin in

einer Konzentration von 10 µM bei 37°C/ 5% CO2 inkubiert.

Die Tab. 3.7/ Abb. 3.17 zeigen die gemessenen Lumineszenzen (LCPS/ µg Protein)

in den verschiedenen Transfektionen.

Zur Bewertung des Einflusses von Microcystin auf die pRb-vermittelte Luciferasegen-

Expression wurde die nach der Microcystin-Exposition gemessene Lumineszenz mit

der ermittelten Luciferase- Aktivität aus der DMSO-Kontrolle verglichen (3.6.2). Bei

der Bestimmung des Effektes von HBx auf die Aktivität von pRb diente die

gemessene Luciferase-Aktivität in den Serum-stimulierten Zellen als Bezugsgrösse.

Für die Darstellung der kombinatorischen Wirkung von HBx und Microystin auf die

Aktivität von pRb diente die gemessene Luciferase-Aktivität in der entsprechenden

DMSO-Kontrolle als Bezugsgrösse.

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Resultate

115

Tab. 3.7: Tabellarische Darstellung der pRb-vermittelten Luciferase-Aktivität der

verschiedenen Transfektionsansätze

Proben DMSO MCYST-LR HBx LCPS SD +/-

pTA-Luc - - - 1,7 0,2

pTA-Luc + - - 1,3 0,3

pneo - - - 1,9 0,8

pneo + - - 2,1 0,6

pTA-Luc+neo - - - 1,7 0,2

pTA-Luc+neo + - - 2,0 0,3

pRb/Luc - - - 5,9 0,8

pRb/Luc + - - 2,5 1,0

pTA-Luc + + - 2,0 0,4

pneo + + - 2,4 0,3

pTA+pneo + + - 2,3 0,3

pRb/Luc + + - 15,0 2,4

pTA-Luc - - + 2,0 0,4

pTA-Luc + - + 2,1 2,4

pRb/Luc - - + 70,0 4,0

pRb/Luc + - + 21,0 0,5

pTA-Luc + + + 2,3 0,8

pRb/Luc + + + 44,0 3,2

pTA-Luc: Kontrollvektor; pneo: Kontrollvektor; pRb-TA-Luc: trägt das DNA-Response-Element für pRb; HBx:

Expressionsvektor HBx ; MCYST-LR: Microcystin-LR; DMSO: Dimethylsulfoxid; LCPS: Lumineszenz pro counts;

Die Mittelwerte ergeben sich aus vier unabhängigen Ansätzen in Doppelbestimmung, +/- SD

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Resultate

116

- - + + + + DMSO(0,4%)

Abb. 3.17: Analyse der Einflüsse von Microcystin und HBx auf die Funktionalität von pRb

Nach der Serumstimulation (1d/ 10%) wurden die Zellen mit dem pRb-Luciferase-Vektor (pRb-TA-Luc) und mit

dem pSVx-Vektor transient transfiziert und für 2h vor Beendigung der 20h Inkubation mit DMSO oder Microcystin

(MCYST) 10 µM bei 37°C/5% CO2 exponiert. DMSO diente als Lösungsmittel-Kontrolle. Das Plus (+) bedeutet,

dass die Probe mit DMSO inkubiert wurde. Ein Minus (-) bedeutet keine DMSO-Exposition. Die Wirkung von

Microcystin auf die pRb-vermittelte Expression des Luciferasegens wurde indirekt über die gemessene

Luciferase- Aktivität bestimmt. Die relative Luciferase-Aktivität wurde pro µg Protein quantifiziert. Die Graphik

zeigt die Mittelwerte aus vier unabhängigen Experimenten, +/- SD; Signifikanzen gegenüber den entsprechenden

Ansätzen (#): p*<0,05, p** <0,01und p*** <0,001

Durch die Messung der Lumineszenz in den Serum-stimulierten und mit dem pRb-

TA-Luc- Vektor transfizierten HepG2-Zellextrakten wurde die Induktion und die

Anwesenheit des pRb-Proteins nachgewiesen.

Das transiente Einbringen des HBx-Proteins in die HepG2-Zellen hatte zur Folge,

dass die Funktion des Rb-Proteins als Transkriptionsrepressor partiell gehemmt

wurde. Im Vergleich zu der ermittelten Luciferase-Aktivität in den Serum-stimulierten

HepG2-Zellen wurde hier eine 12-fache Erhöhung der Lumineszenz gemessen (70

LCPS/ µg Protein; p*** <0,001). Eine zusätzliche DMSO-Inkubation konnte das

Ausmaß der HBx-assoziierten Hemmung der Funktion von pRb beschränken und

eine 3,5-fachen Reduktion der gemessenen Lumineszenz bewirken. Die Exposition

der transfizierten Zellen mit 10 µM Microcystin führte, ähnlich wie die Kotransfektion

mit HBx, im Vergleich zur DMSO-Kontrolle zu einer 6-fachen Erhöhung der

Lumineszenz (15 LCPS/µg Protein; p** <0,01).

pR b- TA-Luc

HBx

***

HBx

MC

YST-

LR**

HBx

+MC

YST-

LR**

0102030405060708090

100110120

LCPS

/µg

Prot

ein

# #

#

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Resultate

117

Eine alleinige Inkubation der transfizierten HepG2-Zellen mit DMSO führte im

Vergleich zur ermittelten Lumineszenz in den Serum-stimulierten HepG2-Zellen zu

einer 2,4-fache Abnahme der Luciferase-Aktivität.

Durch das simultane Vorhandensein von HBx und Microcystin in den Zellen wurde

die Luciferase-Aktivität im Vergleich zu den entsprechenden Ansätzen (HBx+ und

MCYST;#) um 1,2-fach erhöht (44 LCPS/µg Protein; p** <0,01).

Anhand der erworbenen Daten in diesem Transfektionsexperiment kann davon

ausgegangen werden, dass das HBx-Protein und Microcystin synergistisch die

Funktion von pRb als Transkriptionsreppressor inhibieren.

3.7.3. Effekte von Microcystin und HBx auf die Funktionalität von E2F

Das HBx-Proteinund Microcystin haben Detektionlich einen signifikanten Einfluss auf

die Hyperphosphorylierung des Rb-Proteins (3.6.2/3.7.2), so dass beide Tumor-

promotoren möglicherweise auch eine deregulierende Wirkung auf die Aktivität von

E2F haben.

Die Einflüsse von Microcystin und HBx auf die Funktion von E2F wurden nach einer

transienten Kotransfektion von Serum-stimulierten HepG2-Zellen mit dem Plasmid

pE2F-TA-Luc und dem HBx-Expressionsvektor pSVx, einer 20h Inkubation bei 37°C/

5% CO2 und einer 2h Exposition der Zellen mit Microcystin vor Ablauf der Inkubation

bei 37°C/ 5% CO2 untersucht. In Tab. 3.8/ Abb. 3.18 sind die gemessenen

Luciferase-Aktivitäten der einzelnen Transfektionen tabellarisch und graphisch

dargestellt.

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Resultate

118

Tab. 3.8: Tabellarische Darstellung der E2F-vermittelten Luciferase-Aktivität in

den verschiedenenTransfektionsansätzen

Proben DMSO MCYST-LR HBx LCPS SD(+/-)

pTA-Luc - - - 2,2 0,6

pTA-Luc + - - 2,0 0,7

pneo - - - 1,9 0,5

pneo + - - 2,0 0,1

pTA-Luc+neo - - - 1,7 0,3

pTA-Luc+neo + - - 2,0 0,4

pE2F-TA-Luc - - - 5,0 1,2

pE2F-TA-Luc + - - 3,2 0,5

pTA-Luc + + - 2,2 0,4

pneo + + - 2,3 0,3

pTA+pneo + + - 2,3 0,4

pE2F-TA-Luc + + - 8,2 1,1

pTA-Luc - - + 2,0 0,4

pTA-Luc + - + 2,1 0,9

pE2F-TA-Luc - - + 11,0 1,8

pE2F-TA-Luc + - + 5,1 0,2

pTA-Luc + + + 2,3 0,5

pE2F-TA-Luc + + + 14,0 1,4

pTA-Luc: Kontrollvektor; pneo: Kontrollvektor; pE2F-TA-Luc: trägt das DNA-Response-Element für pE2F; HBx:

Expressionsvektor HBx; MCYST-LR: Microcystin-LR; DMSO: Dimethylsulfoxid; LCPS: Lumineszenz pro counts.

Die Mittelwerte ergeben sich aus vier unabhängigen Ansätzen in Doppelbestimmung, +/- SD

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Resultate

119

- - + + + + DMSO (0,4%)

Abb. 3.18: Analyse der Einflüsse von Microcystin/ HBx auf die Funktionalität von E2F

Nach der Serumstimulation (1d/ 10%) wurden die Zellen mit dem pE2F-Luciferase-Vektor (pE2F-TA- Luc) und mit

dem pSVx-Vektor transient transfiziert und für 2h vor Beendigung der 20h Inkubation mit DMSO oder Microcystin

(MCYST) 10 µM bei 37°C/5% CO2 exponiert. DMSO diente als Lösungsmittel-Kontrolle. Das Plus (+) bedeutet,

dass die Probe mit DMSO inkubiert wurde. Ein Minus (-) bedeutet keine DMSO-Exposition. Die Wirkung von

Microcystin auf die pE2F-vermittelte Expression des Luciferasegens wurde indirekt über die gemessene

Luciferase-Aktivität bestimmt. Die relative Luciferase-Aktivität wurde pro µg Protein quantifiziert. Die Graphik zeigt

die Mittelwerte aus vier unabhängigen Experimenten, +/- SD; Signifikanzen gegenüber den entsprechenden

Ansätzen (#) : p*<0,05, p** <0,01und p*** <0,001

Über die Messung der Lumineszenz in den Serum-stimulierten- und transient mit

dem pE2F-TA-Luc-Vektor transfizierten HepG2-Zellen wurde die Anwesenheit von

E2F nachgewiesen. Das Vorhandensein von HBx in den Zellen führte zu einer

deutlichen Erhöhung der Luciferase-Aktivität (11 LCPS/ µg Protein; p* <0,05). Durch

die zusätzliche Exposition der Zellen mit DMSO wurde letztendlich die stimulierende

Wirkung von HBx auf die E2F-vermittelte Expression des Reportergens Luciferase

vermindert (5,1 LCPS/ µg Protein). Diese inhibierende Wirkung von DMSO auf die

E2F-vermittelte Expression des Reportergens Luciferase wurde auch in den

Ansätzen, die nur mit dem pE2F-TA-Luc-Vektor transfizierten HepG2-Zellen

registriert. Die DMSO-Exposition ging im Vergleich zur gemessenen Lumineszenz in

den Serum-stimulierten Proben mit einer Abnahme der Luciferase-Aktivität einher

(3,2 LCPS/µg Protein; 3.6.2).

HBx

*

p E 2 F - T A - L u c

HBx

MC

YST-

LR*

HBx

+

MC

YST-

LR*

0

5

1 0

1 5

2 0

2 5LC

PS/µ

g Pr

otei

n

#

#

#

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Resultate

120

Microcystin in einer Konzentration von 10 µM revertierte die DMSO-assoziierte

Abnahme der E2F-vermittelten Expression des Luciferasegens und führte zu einer

Aktivitätssteigerung von E2F, die zu einer Zunahme der Luciferase-Aktivität führte

(8,2 LCPS/µg Protein). Die gleichzeitige Anwesenheit von HBx und Microcystin in der

Zelle führte im Vergleich zu den entsprechenden Ansätzen (HBx+ und MCYST;#) zu

einem 1,0-fachen Anstieg der E2F-vermittelte Luciferasegen-Expression (14,0

LCPS/µg; p*< 0,05).

Zusammenfassend kann man sagen, dass das HBx-Protein und Microcystin die

Aktivität von E2F additiv stimulieren.

3.7.4. Effekte von Microcystin und HBx auf die Funktionalität von c-Myc

Für die Analyse der kombinatorischen Effekte von Microcystin und HBx auf die

Aktivität von c-Myc wurden Serum-stimulierte HepG2-Zellen mit dem pMyc-TA-Luc-

Vektor (3.6.4) und dem HBx-Expressionsvektor pSVx transient cotransfiziert, 20h bei

37°C/ 5% CO2 inkubiert und 2h vor Ablauf der Inkubation mit 10 µM Microcystin oder

0,4% DMSO bei 37°C/ 5% CO2 exponiert.

Die Tab. 3.9/ Abb. 3.19 zeigen die gemessenen Luciferase-Aktivitäten in den

verschiedenen Transfektionen.

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Resultate

121

Tab. 3.9: Tabellarische Darstellung der c-Myc vermittelten Luciferase-Aktivität in

den verschiedenen Transfektionsansätze

Proben DMSO MCYST-LR HBx LCPS SD+/-

pTA-Luc - - - 2,3 0,5

pTA-Luc + - - 1,5 0,6

pneo - - - 1,9 0,1

pneo + - - 1,9 0,2

pTA-Luc+neo - - - 1,7 0,2

pTA-Luc+neo + - - 2,0 0,3

pMyc �TA-Luc - - - 4,0 1,3

pMyc �TA-Luc + - - 6,5 1,0

pTA-Luc + + - 2,2 0,4

pneo + + - 2,3 0,3

pTA+pneo + + - 2,3 2,3

pMyc �TA-Luc + + - 15,0 1,9

pTA-Luc - - + 2,0 0,4

pTA-Luc + - + 2,1 0,9

pMyc �TA-Luc - - + 20,0 4,3

pMyc �TA-Luc + - + 21,0 3,5

pTA-Luc + + + 2,3 0,2

pMyc �TA-Luc + + + 40,0 3,2

pTA-Luc: Kontrollvektor; pMyc�TA- Luc: trägt das DNA-Response Element für c-Myc; pneo: Kontrollvektor für den

HBx-Expressionsvektor pSVx; MCYST-LR: Microcystin-LR; DMSO: Dimethylsulfoxid; LCPS: Lumineszenz pro

counts. Die Mittelwerte ergeben sich aus vier unabhängigen Ansätzen in Doppelbestimmung, +/- SD

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Resultate

122

- - + + + + DMSO (0,4%)

Abb. 3.19: Einflüsse von Microcystin/ HBx auf die Funktionalität von c-Myc

Nach der Serum-Stimulation (1d/ 10%) wurden die Zellen mit dem pMyc- Luciferase-Vektor (pMyc-TA-Luc) und

mit pSVx-Vektor transient transfiziert und für 2h vor Beendigung der 20h Inkubation mit DMSO oder Microcystin

(MCYST) 10 µM bei 37°C/5% CO2 exponiert. DMSO diente als Lösungsmittel-Kontrolle. Das Plus (+) bedeutet,

dass die Probe mit DMSO inkubiert wurde. Ein Minus (-) bedeutet keine DMSO- Exposition. Die Wirkung von

Microcystin auf die c-Myc-vermittelte Expression des Luciferasegens wurde indirekt über die gemessene

Luciferase-Aktivität bestimmt. Die relative Luciferase-Aktivität wurde pro µg Protein quantifiziert. Die Graphik zeigt

die Mittelwerte aus vier unabhängigen Experimenten +/- SD; Signifikanzen gegenüber den entsprechenden

Ansätzen (#): p*<0,05, p** <0,01 und p*** <0,001.

Durch die Messung der Luciferase-Aktivität in den Serum-stimulierten und transient

mit dem pMyc-TA-Luc-Vektor transfizierten HepG2-Zellen wurde die Induktions-

technik und das Vorhandensein von c-Myc in dem Testsystem nachgewiesen (3.6.4).

Die transiente Expression des HBx-Gens in den Zellen führte zu einer Stimulation der

Aktivität von c-Myc. Es wurde eine deutlich verstärkte c-Myc-vermittelte Expression

der Reportergens Luciferase durch die Lumineszenz-Messung nachgewiesen (20

LCPS/ µg Protein; p** <0,01). Die zusätzliche Exposition der Zellen mit einer

0,4%igen DMSO-Lösung hatte keinen Einfluss auf die c-Myc-vermitttelte

Luciferasegen-Expression, die Luciferase-Aktivität blieb nahezu konstant. Eine

alleinige Inkubation der transfizierten Zellen mit DMSO führte im Vergleich zur

Serum-stimulierten Probe zu einem 1,6-fachen Anstieg der Luciferase-Aktivität (6,5

LCPS/ µg Protein).

HBx

+

MC

YST-

LR**

MC

YST-

LR**

HBx

p c - M y c - T A L u c

HBx

**

0

5

1 0

1 5

2 0

2 5

3 0

3 5

4 0

4 5

5 0

5 5

6 0

6 5

LCPS

/µg

Prot

ein

#

#

#

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Resultate

123

Diese Steigerung der c-Myc-Aktivität korreliert womöglich mit der Fähigkeit von c-

Myc, als Antagonist von pRb tätig zu werden, um so die Hyperphosphorylierung des

Rb-Proteins zu steigern (3.6.2). Microcystin in einer Konzentration von 10 µM hatte

ebenfalls eine positive Wirkung auf die c-Myc-vermittelte Expression des

Reportergens Luciferase. Es wurde im Vergleich zur DMSO-Kontrolle eine höhere

Luciferase-Aktivität gemessen (15 LCPS/ µg Protein ;3.6.4). Durch die gleichzeitige

Anwesenheit von HBx und Microcystin in den HepG2-Zellen wurde die Funktion von

c-Myc im Vergleich zu den entsprechenden Ansätzen (HBx+ und MCYST;# ) am

deutlichsten beeinflusst. In diesem Ansatz wurde die höchste Luciferase-Aktivität (40

LCPS/µg Protein; p** <0,001) gemessen.

Anhand der gewonnenen Daten in diesem Experiment kann davon ausgegangen

werden, dass das HBx-Protein und Microcystin die c-Myc-vermittelte Expression des

Luciferasegens synergistisch stimulierend beeinflussen.

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Diskussion

124

4. Diskussion

Ziel dieser Studie ist es, kombinatorische Effekte von HBx und Microcystin bei der

Deregulation der Aktivität von essentiellen Zellzykluskomponenten zu untersuchen.

Es besteht die Annahme, dass Zellzyklus-Regulatoren wie p53, pRb, E2F und c-Myc

wichtige zelluläre Angriffspunkte für beide Tumorpromotoren darstellen (Feitelson et

al., 2002; Fujiki, 1992). Das HBx-Protein fungiert als pleiotroper Transaktivator, der

auf verschiedene Zellzyklus-abhängige Prozesse Einfluss nimmt (Benn and

Schneider, 1994; Benn and Schneider, 1995).

Das cyanobakterielle Hepatotoxin Microcystin stellt neben dem HBx-Protein einen

Lebertumor-Promotor dar, der über einen biochemischen Mechanismus in wichtige

zelluläre Regelmechanismen eingreift (Bialojan and Takai, 1988; Feitelson et al.,

2002; Haystead et al., 1989). Da Tumorpromotoren nur nach erfolgter Initiation

förderlich auf die Karzinogenese wirken, musste für diese Studie ein initiiertes

Testsystem eingesetzt werden (Fujiki, 1992). Die HepG2-Zellen stellen als humane

Hepatoma Zell-Line ein initiiertes Kultursystem dar.

Microcystin ist ein potenter Inhibitor der Proteinphosphatasen 1 und 2 A (PP1/

PP2A). Die Proteinphosphatasen sind Antagonisten der Proteinkinasen und

terminieren die durch Kinasen-aktivierten Signalkaskaden (Kintosh et al., 1990;

Nishiwaki et al., 1991). Der Aktivitätsverlust der PP hat zur Folge, dass es in den

Hepatozyten zur Akkumulation von Phosphoproteinen kommt, die mit einer

�apparenten Aktivierung� von Proteinkinasen einhergeht (Kintosh et al., 1990;

Nishiwaki et al., 1991). Die Wirkung von Microcystin verläuft zeit- und dosis-

abhängig, wobei scheinbar auch der Zelltyp und die Verteilung der Zellen in den

verschiedenen Phasen des Zellzyklus eine wichtige Rolle spielen (Cohen et al.,

1990; Yatsunami et al., 1993).

Zunächst sollte mit Hilfe des Neutralrot (NR)-Testes die Wirkung und der �optimale

Dosisbereich� von Microcystin in diesem initiierten Hepatozytenkultursystem

charakterisiert werden.

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Diskussion

125

Zur Bestimmung des �optimalen Dosisbereiches� von Microcystin in diesem

Testsystem wurden letztendlich Microcystin-Konzentrationen von 0,1 µM, 1 µM und

10 µM eingesetzt. Verschiedene in vivo und vitro Studien zeigten, dass gerade

Wirkstoffe der Okadasäure in diesen Konzentrationen auf die zelluläre Aktivität

verschiedener Testsystemen signifikant Einfluss nehmen (Mackintosh et al., 1990;

Mackintosh and Mackintosh, 1994; Nishiwaki et al.,1991; Ohta et al., 1992

;Yatsunami et al, 1993). Bei transienten Analysen (2h Inkubation) lieferten vor allem

Microcystin-Konzentrationen von 1 µM und 10 µM die deutlichsten Ergebnisse.

Kurzfristig werden von den verschiedenen Testsystemen auch je nach Zelltyp höhere

Konzentrationen von den Zellen gut toleriert (Mackintosh and Mackintosh., 1994;

Shenolikar et al., 1994). In einem Versuch bei dem die HepG2-Zellen mit 20 µM und

50 µM Microcystin exponiert wurden, konnte diese Toleranz nicht beobachtet

werden. In diesen Ansätzen wurden die Zellen stark geschädigt. Es ist jedoch nicht

auszuschliessen, dass diese Zellschäden möglicherweise durch das in der

Microcystin-Lösung befindliche DMSO verursacht wurde, da eine alleinige DMSO-

Inkubation (DMSO-Kontrolle) ebenfalls zur Schädigung der Zellen führte. DMSO

dient als Lösungsvermittler bei der Herstellung der Microcystin-Lösung. Es wurde

gezeigt, dass DMSO selbst dosis- und zeit-abhängig die zelluläre Aktivität

beeinflusst, so dass bei der Bestimmung der Wirkung von Microcystin auf dieses

Testsystem jeweils die möglichen interferierenden DMSO-Effekte berüchsichtigt

werden mussten (Maehara et al., 1993).

Es konnte gezeigt werden, dass es sowohl nach der Exposition mit DMSO als auch

nach einer Microcystin-Inkubation der Zellen im Vergleich zur Kontrolle (Medium) zur

Steigerung der Vitalität kam.

Bei der Interpretation der im NR-Test erhaltenen Vitalitätsverhältnisse musste die

Eigenschaft von DMSO als kleines lipophiles Molekül besonders berücksichtigt

werden, da die Vitalität der Zellen über die endozytotische Aufnahme des Neutralrots

bestimmt wird. DMSO kann aufgrund seines lipophilen Charakters durch die

kurzfristig Erhöhung der Membranfluidität die Zellmembran-Permeabilität so

beeinflussen, dass es zu einer gesteigerten Aufnahme des Farbstoffes Neutralrot

kommt, die zu Artefakten bei der Vitalitätbestimmung hinsichtlich einer apparenten

Vitalitätssteigerung führt.

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Diskussion

126

Dieser Fähigkeit von DMSO ist es vermutlich zu zuschreiben, dass eine DMSO-

Exposition (0,04%) (Abb. 3.1) zu einer apparenten Vitalitätssteigerung führte. Diese

Annahme wurde durch die im Trypanblau-Test gewonnenen Ergebnisse nach einer

DMSO-Exposition bestätigt (3.4). Die DMSO-Exposition bewirkte im Vergleich zur

Kontrolle und den Microcystin-Ansätzen zu einer verminderten Vitalität der HepG2-

Zellen, die mit einem höheren Anteil (%) toter Zellen korrelierte (3.4).

Die deutlichste Wirkung von Microcystin auf die Zellvitalität von HepG2-Zellen (3,9-

facher Anstieg) und damit �optimale Dosis� für dieses Testsystem zeigte Microcystin

in einer Konzentration von 10µM. Gleichzeitig wurde in diesen Ansätzen auch die

geringste DMSO-Wirkung beobachtet (Abb. 3.1.1). DMSO in einer Konzentration von

0,4% zeigte weniger Einfluss auf die apparente Vitalität und erleichterte die

Bestimmung der Wirkung von Microcystin auf die HepG2-Vitalität. Weitere

Eigenschaften von DMSO als gentoxische Substanz und Effektor auf

Zellzyklusabläufe (Proliferation/ Differenzierung) werden später diskutiert.

Hingegen zeigte die Exposition der Zellen mit 1µM Microcystin im Vergleich zur

Medium-Kontrolle, abzüglich der Effekte von DMSO, eine minimale Reduktion der

Vitalität auf. Die Wirkung von Microcystin in einer Konzentration von 0,1µM konnte

nicht beurteilt werden, da es hier keinen auflösbaren Unterschied zwischen der

Wirkung von DMSO (0,004%) und Microcystin gab. Aus diesem Grund wurde in

dieser Studie die 10µM Microcystin-Lösung als �optimale Dosis� deklariert.

Die 0,1 µM und 1 µM Microcystin-Konzentrationen wurden jedoch partiell bei

Experimenten mitgeführt, um konzentrationsabhängige Aussagen über das

Wirkungsprofil von Microcystin auf verschiedene zelluläre Aktivitäten treffen zu

können.

4.1. Microcystin-assoziierte Protein-Phosphorylierung, -Stabilisierung und -Synthese

Nach dem die optimale Microcystin- Dosis für dieses Testsystem ermittelt war,

konnte gezielt die Wirkung von Microcystin auf die zelluläre Aktivität untersucht

werden. Bei der Regulation des zellulären Geschehens spielt die Funktion von

Enzymen und Proteinen eine wesentliche Rolle.

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Diskussion

127

Durch ein koordiniertes Zusammenspiel von Proteinkinasen und

Proteinphosphatasen werden die Enzym- und Protein-Aktivitäten kontinuierlich

während der Signaltransduktion und Zellzyklus-Regulation moduliert (Cohen, 1986).

In der Regel führt ein phosphoryliertes Protein zur Aktivierung der Signalkaskade und

die Protein-Dephosphorylierung terminiert oder dämpft das Signal (Haystead et al.,

1989; Hullmann and Boonstra, 2001; Shenolikar, 1994). Auch Microcystin könnte

durch die irreversible Hemmung der Proteinphosphatasen PP1/ PP2A deregulierend

auf diese zellulären Kontroll-mechanismen wirken. Durch den Verlust der PP kann

die Abspaltung von Phosphat-resten an den Proteinen, die die Wirkung der

Phosphorylierung revertiert, nicht katalysiert werden. Die akkumulierenden

Phosphoproteine wirken verstärkend auf PK-vermittelten Signalkaskaden, die unter

anderem die Funktion der regulatorischen Proteine im Zellzyklus modulieren. Auch

ein direkter Einfluss von Microcystin auf die Phosphorylierung von essentiellen

Zellzyklus-Regulatoren (p53/ pRb) ist möglich, da die Proteine durch den Verlust der

Proteinphosphatase-Aktivität in ihrer hyperphosphorylierten inaktiven Form

arretieren.

In verschiedenen Studien wurde gezeigt, dass die Exposition verschiedener

Testsysteme mit Wirkstoffen der Okadasäureklasse zu einer Akkumulation von

Phosphoproteinen in der Zelle führt (Erikkson et al., 1990; Nishiwaki et al., 1991). In

diesem Zusammenhang wird auch von einer apparenten �Aktivierung� von

Proteinkinasen gesprochen. In Versuchen mit Ratten-Hepatozyten, die mit

Microcystin-Konzentrationen von 0,01 µM - 10 µM exponiert wurden, konnten mittels

SDS-PAGE jeweils 10 verschiedene Phosphoproteine mit verschiedenen

Molekulargewichten (MW) nachgewiesen werden (Nishiwaki et al., 1991). Um die

Wirkung von Microcystin auf die Proteinphosphorylierung, -stabilisierung und -

synthese zu untersuchen, wurden 32P-und 35S-markierte HepG2-Zellen für 2h mit

verschiedenen Microcystin-Konzentrationen inkubiert.

Durch die Ermittlung der Höhe der Radioaktivität in den verschiedenen 32P-und 35S-

markierten Proben konnten indirekt Aussagen über die Effekte von Microcystin auf

die Phosphorylierung-, der Stabilität- und der Synthese zellulärer Proteine gemacht

werden. Auf eine qualitative Darstellung dieser Effekte mittels SDS-PAGE wurde

verzichtet. Anhand der gemessenen Radioaktivität in den 32P-markierten HepG2-

Gesamtzellproteinextrakten konnte deutlich eine konzentrationsabhängige Wirkung

von Microcystin auf die Proteinphosphorylierung bestimmt werden (Abb. 3.2).

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Diskussion

128

Nach der Inkubation der 32P-markierten Zellen mit der eingesetzten maximalen

Microcystin-Konzentrationen von 10 µM konnte eine deutlich höhere Radioaktivität

als in den Kontrollen und übrigen Microcystin-Konzentrationenen (0,1 µM/1 µM)

gemessen werden. Auch anhand von Literaturdaten konnte dieser deutliche Einfluss

einer 10 µM Microcystin-Lösung auf die Phosphorylierung von Proteinen bestätigt

werden (Mackintosh et al., 1990).

Es zeigte sich weiter, dass die Microcystin-Konzentrationen von 1 µM in den 32P-

markierten Ansätzen eine minimale positive Wirkung auf die Akkumulation von

zellulären Phosphoproteinen hatte, wobei die gemessene Radioaktivität nach der

Exposition der Zellen mit der 10 µM Microcystin in diesen Proben nicht erreicht

wurde. Möglicherweise entfaltet hier verstärkt das in der Microcystin-Lösung

befindlichen DMSO seine Wirkung. Die Inkubation der Zellen mit 0,1µM Microcystin

führte sogar zur Reduktion der gemessenen Radioaktivität. In diesen Proben sind

vermutlich ebenfalls die interferierenden Effekte von DMSO so stark, dass

Microcystin in dieser Konzentration seine spezifische Wirkung nicht entfalten kann.

Da die entsprechenden DMSO-Kontrollen nicht mitgeführt wurden, lassen sich

diesbezüglich keine deutlichen Aussagen machen. Nach der Exposition der 32P-

markierten Zellen mit DMSO in einer Konzentration von 0,4% wurde im Vergleich zur

nur markierten Kontrolle eine Reduktion der Radioaktivität gemessen (Abb. 3.2).

DMSO kann möglicherweise als Induktor von Differenzierungsprozessen, was mit

einem Anstieg von Proteinphosphatasen einhergeht, die Dephosphorylierung der 32P- markierten Proteine stimulieren und somit zu einer messbaren Reduktion der

Radioaktivität geführen haben. DMSO könnte aber hier auch als gentoxische Lösung

wirken und durch die generelle Herabsetzung der Zellvitalität die radioaktive

Markierung reduzieren.

Die Messung der Radiokativität in den 35S-Methionin markierten Proben, die zur

Bestimmung der Wirkung von Microcystin auf die Proteinsynthese bzw. -stabilität

durchgeführt wurde, ergab nach der DMSO-Inkubation hingegen eine geringe

Zunahme des Maßes an Radioaktivität (Abb.3.3). Die Zunahme an Radioaktivität

korreliert möglicherweise mit einem DMSO-induzierten ��Mitose-Arrest�� der Zellen.

DMSO stimuliert Differenzierungsprozesse in der Zelle, womöglich über die Arretier-

ung der Zellen in der Mitose, die wie bei einem G0 -Arrest ein Differen-zierungssignal

darstellt (Neumann et al., 1995).

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Diskussion

129

Zum Verlassen der Mitose muss der proteolytische Abbau von Cyclin B und die damit

einhergehende Inaktivierung der Mitosekinase erfolgen. DMSO wirkt aber förderlich

auf die Aktivität der Mitosekinase (Cdc2), in dem es die Akkumulation von Cyclin B

unterstützt, so dass die Zellen in der Mitose arretieren. Durch die DMSO-vermittelte

Aktivierung der Mitosekinase einerseits und die Akkumulation des Cyclin B

andererseits könnte eine erhöhte Proteinsynthese kurzfristig vorgetäuscht werden

(Neumann et. al., 1995). Diese Täuschung könnte in den 35S-markierten Proben

nach der DMSO-Inkubation im Vergleich zur Kontrolle

zu einer höheren Radioaktivität geführt haben. Nach der Inkubation der 35S-

markierten Zellen mit 10µM Microcystin wurde hier der stärkste Einfluss auf die

Proteinstabilität bzw. -synthese von zellulären Proteinen nachgewiesen.

Möglicherweise wird durch die Microcystin-verursachte irreversible Hemmung der PP

die Protein-Degradierung über den Ubiquitin-proteasomalen Pathway verzögert, so

dass es zu einer erhöhten Proteinstabilität kommt, die mit einer prolongierten Aktivität

von regulatorischen Proteinen einhergeht. Der gezielte Protein-Abbau stellt für die

Zelle ein wirkungsvolles Kontrollinstrument dar, um die Konzentration wichtiger

regulatorischer Proteine (Cycline/ p53) schnell und reversibel zu senken

(Jensenberger and Jentsch, 2002; Lania et al., 1999).

Auch eine Microcystin-assoziierte Phosphorylierung von Faktoren, die in ihrer

phosphorylierten Form für die Initiation der Proteinsynthese benötigt werden, ist

möglich. Die Wirkung von Microcystin auf die Proteinbiosynthese hätte man über die

Bestimmung der Incorporationsrate von 35S-Methionin während einer Microcystin-

Inkubation genauer ermitteln können. Durch die hier gewählten Versuchs-

bedingungen, die Microcystin-Exposition der HepG2-Zellen erfolgte erst nach dem

Einbau von 35S-Methionin, scheint diese Wirkung von Microcystin eher

unwahrscheinlich. Um jedoch eine Wirkung von Microcystin auf die Proteinsynthese

auszuschliessen, hätte der Einsatz von Proteinbiosynthese-Hemmer nach der

metabolischen Markierung helfen können.

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Diskussion

130

4.2. Microcystin-vermittelte Stabilität und Phosphory-lierung von p53 und pRb

Da die Aktivität von pRb und p53 maßgeblich durch die Proteinphosphorylierung,-

stabilisierung und- synthese moduliert wird, stellen diese Proteine einen möglichen

Angriffspunkt für Microcystin dar.

Verschiedene Analysen zeigten, dass eine kontinuierliche metabolische Stabilität von

p53 eine funktionelle Inaktivierung induziert und entscheidend zur Ausprägung eines

transformierten Phänotyps von Zellen beiträgt (Levine, 1990, Levine et al.,1991). Die

metabolische Stabilisierung von p53 wird vermutlich über eine verzögerte Protein-

Degradierung oder eine erhöhte Proteinbiosynthese erreicht (Liang and Clarke,

2001).

Zunächst sollte die mutmaßliche Microcystin-assoziierte Stabilisierung von p53 in

den HepG2-Zellen durch die Western-Blot-Analyse dargestellt werden.

In der WB- Analyse zeigte sich letztendlich in einem konzentrationsabhängigen

Muster deutlich die Microcystin-assoziierte Konzentrationszunahme von p53 (Abb.

3.2).In den Microcystin-exponierten Proben wurden im Vergleich zu den Kontrollen

die stärksten p53-Proteinbanden nachgewiesen, die mit einer Zunahme der p53-

Konzentration korrelieren. Die höchste Zunahme der p53- Konzentration konnte nach

der Inkubation der Zellen mit 10µM Microcystin bestimmt werden. Durch die

Exposition mit Microcystin in den Konzentrationen 1 µM und 0,1µM konnten

wiederum stärke p53-Banden als in den Kontrollen beobachtet werden. Über die

Spezifität dieser Ergebnisse kann man nur spekulieren, da über die Wirkung von

DMSO in diesen Microcystin-Lösungen keine Daten vorliegen. Es wurde jedoch

gezeigt, dass DMSO in einer Konzentration von 0,4% zu einem geringen Anstieg der

zellulären p53-Konzentration führte. Vermutlich entfaltet DMSO in dieser

Konzentration sein gentoxisches Potential (s. 3.4), das zur Stimulation der Synthese

von p53 führte.

Dieser DMSO-Befund macht deutlich, dass man mit Hilfe von Western-Blot Analysen

nicht eindeutig klären kann, ob die Microcystin-induzierte Stabilisierung von p53 aus

einer erhöhten Proteinsynthese oder aus einer verzögerten Protein- Degradierung

sich ergibt.

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Diskussion

131

Die Zunahme der Konzentration von p53 kann sowohl aus einer verlangsamten

Protein-Degradierung als auch aus einer gesteigerten Proteinsynthese resultieren.

Als Referenzmethode für die Untersuchung der Wirkung von Microcystin auf die

metabolische Stabilisierung von p53 wurden HepG2-Zellen metabolisch mit 35S-

Methionin markiert, das markierte p53-Protein mit einem p53- Ak aus gleichen

Proteinmengen per Immunpräzipitation isoliert und über die SDS-PAGE getrennt.

Die Abb. 3.5 zeigt in der mit 10 µM Microcystin exponierten 35S-markierten Probe im

Vergleich zu den Kontrollen die stärkste Bande. In der DMSO-Kontrolle ist im

Vergleich zur Kontrolle (nur markierten) eine schwächere Bande zu erkennen. Wie

erwähnt (4.1) kann auch hier durch die gewählten Versuchsbedingungen nicht

ausgeschlossen werden, dass die Microcystin-vermittelte metabolische Stabilisier-

ung von p53 aus einer erhöhten Translation von p53 resultiert. Da DMSO hier

anscheinend eine geringfügig inhibierende Wirkung auf die Stabilität von p53 besitzt,

liegt die Vermutung nahe, dass die Microcystin-assoziierte Stabilisierung von p53

hier das Ergebnis einer verzögerten Protein-Degradierung ist. Nach einer DMSO-

vermittelte Erhöhung der Proteinsynthese von p53 wäre im Vergleich zu der nur

markierten Kontrolle eine stärkere 35S-markierte p53-Bande zu erwarten gewesen

(Abb. 3.5). Auch die Beobachtung von Trare et al. (1999), dass Okadasäure in zell-

freien Systemen oder in Zellkulturen konzentrationsabhängig eine inhibierende

Wirkung auf die Proteinsynthese hat, kann ein weiterer Hinweis für die hier

angestellten Vermutungen sein.

Die Degradierung von p53 wird vor allem durch die Assoziation von p53 mit dem

Oncoprotein Mdm2 reguliert. In ungestressten Zellen assoziiert das p53-Protein mit

Mdm2, wodurch Mdm2 seine E3-ubiquitin-Ligase Aktivität entfaltet und die Hemmung

der transkriptionalen Aktivität von p53 durch die proteosomale Degradierung

vermittelt (Salomoni and Pandolfi, 2002; Yin et al., 2002). Als Antwort auf diverse

Stressfaktoren wird die Phosphorylierung des N-Terminus von p53 induziert. Die

Phosphorylierung in dieser p53-Domäne fördert die Stabilität von p53, weil dadurch

die Assoziation zwischen p53-Mdm2 nicht zustande kommt und so eine

Degradierung von p53 verhindert wird. Die Dephosphorylierung der N-terminalen

Region von p53 erfolgt durch die Proteinphosphatase PP2A (Yatsunami et al.,1993),

so dass die Microcystin-assoziierte Hemmung der PP2A zu einer irreversiblen

metabolischen Stabilisierung des p53-Proteins führen kann.

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Diskussion

132

Zusammenfassend betrachtet kann man sagen, dass Microcystin in einem

konzentrationsabhängigen Muster deutlich Einfluss auf die metabolische Stabilität

von p53 nimmt.

In einem weiteren Experiment sollte nun untersucht werden, ob Microcystin auch die

Phosphorylierung der Tumorsupressorproteine p53 und pRb moduliert. Die

Aktivierung des p53-Proteins geht mit einer Reihe von posttranslationalen

Modifikationen einher, dabei nimmt die Modulation des Phosphorylierungsmusters

von p53 eine zentrale Stellung ein. Die Korrelation zwischen einem veränderten

Phosphorylierungsstatus, DNA-Bindungsaktivität und Transaktivierung suggeriert,

dass eine transient reversible Hyperphosphorylierung für die Aktivierung von p53

essentiell ist (Appella and Anderson, 2001; Prives and Hall,1999).

Durch die Isolation von 32P-markiertem p53 und 35S-markiertem pRb per

Immunpräzipitation mit den entsprechenden Antikörpern (p53-Ak/pRb-Ak) wurde der

Einfluss von Mircocystin auf die Phosphorylierung der Tumorsuprressorproteine

bestimmt.

Auf eine Aktivierung von p53 durch eine UV-Induktion wurde verzichtet, da in

Vorversuchen festgestellt wurde, dass die radioaktive Markierung der HepG2-Zellen

schon zur Aktivierung von p53 ausreicht. Auch bei transienten Transfektionen von

HepG2-Zellen mit p53-responsiven Reportergensystemen wurde ohne vorherige

Induktion schon eine höhere Konzentration an aktiven p53-Protein nachgewiesen

(Lin et al., 1997).

Anhand der optischen Beurteilung der Intensität der gewonnenen p53-Banden in den

verschiedenen Proben wurde die Wirkung von Microcystin auf die p53-

Phosphorylierung erfasst. Wie in Abb. 3.6 gezeigt, konnte in einem

konzentrationsabhängigen Muster deutlich der Einflusse von Microcystin auf die

Phosphorylierung von p53 nachgewiesen werden.

Bei der eingesetzten maximalen Konzentration von 10 µM wurde ein deutlicher

Einfluss von Microcystin auf die Phosphorylierung von p53 bestimmt. Es konnte in

der Autoradiographie (Abb. 3.6) bei den mit 10 µM Microcystin-exponierten Proben

die stärkste p53-Bande nachgewiesen werden. Microcystin in einer Konzentration

von 0,1 µM und 1 µM zeigte im Vergleich zu den Kontrollen ebenfalls eine stärke

p53-Bande.

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Diskussion

133

Die ermittelten Ergebnisse aus der Immunpräzipitation konnten auch durch die

densitometrische Auswertung der Autoradiographie (Abb. 3.6.1) bestätigt werden. In

der mit 10 µM Microcystin-exponierten Probe wurde die höchste Densität ermittelt.

Nach der Inkubation der Zellen mit 0,1 µM und 1 µM Microcystin wurde im Vergleich

zu den Kontrollen ebenfalls eine höhere Densität gemessen.

Mit Hilfe der IEF sollte ebenfalls die Microcystin-vermittelte Hyperphosphorylierung

von p53 elektrophoretisch dargestellt werden.

In der IEF lassen sich Protein-Modifikationen wie Phosphorylierungen,

Glycosylierungen etc. als Mikroheterogenitäten elektrophoretisch detektieren. Es

kann davon ausgegangen werden, dass jeder verbleibende oder hinzugefügte

Phosphatrest zu einer Ansäuerung des p53-Proteins führt, die mit einer Änderung

des Ladungszustandes von p53 einhergeht und somit zu einer Verschiebung des IP

führt. Die Verschiebung des IP kann in der IEF in Kombination mit der Western-Blot

Analyse als Bandenshift dargestellt werden. Theoretisch kann die Microcystin-

induzierte Hyperphosphorylierung von p53, die möglicherweise aus der Arretierung

von Ser 315 in seinem phosphorylierten Zustand resultiert, im Vergleich zur

unbehandelten Probe durch einen minimalen Bandenshift in Richtung Anode

nachgewiesen werden. Der Literatur ist zu entnehmen, dass mittels der IEF und

anschließender SDS-PAGE mindestens 6 in ihrem Phosphorylierungsmuster nach zu

unterscheidende Isoformen des p53 identifiziert werden können (pI 6,3- 7,3)

(Martinez et al., 1997).

In diesem Experiment wird p53 durch eine 20h Inkubation mit Actinomycin D aktiviert,

dies geht schließlich mit einer Durchphosphorylierung der entsprechenden Dömänen

einher. In der Regel geht die Phosphorylierung von p53 mit einer Stimulation der

spezifischen DNA-Bindung und einer verstärkten Transaktivierung einher (Appella

and Anderson, 2001). Gerade unter Betrachtung dieses Aspektes scheint sich eine

Microcystin-Exposition eher förderlich auf die Funktion von p53 als

Transkriptionsfaktor auszuwirken. Die Phosphorylierung des Serin-Restes der AS

315 stellt vermutlich eine Ausnahme dar. In vitro konnten Daten erworben werden,

die einer solchen Hypothese überhaupt die Berechtigung geben (Liang and Clarke,

2001; Sakaguchi et al., 1997; Stommel et al, 1999). (Dieser Aspekt wird in einem

anderen Kontext später vertieft).

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Diskussion

134

Die Microcystin-vermittelte Hemmung der Proteinphosphatasen verhindert womöglich

die Dephosphorylierung von Ser 315 und führt so zu einem Anstieg der Nettoladung

von p53, die in der IEF als Bandenshift nachzuweisen ist. Leider kann diese

Annahme weder bestätigt noch negiert werden, da es im Moment keine Möglichkeit

gibt einen beweisführenden Nachweis mit Hilfe z.B. einer Immunreaktion

durchzuführen. Im Augenblick steht kein AK zur Verfügung, der den Serin-Rest 315

in seinem phosphorylierten Zustand erfasst. Aus diesem Grund ist es nicht

auszuschliessen, dass auch andere Ser/Thr-Reste durch die Microcystin-Inkubation

in ihren phosphoryliertem Zustand gehalten werden. Mittels der IEF konnte ebenfalls

nach der Microcystin-Exposition (10 µM) eine Modulation des

Phosphorylierungsmusters von p53 nachgewiesen werden (Abb. 3.7).

Auch die Microcystin-assoziierte Induktion der Hyperphosphorylierung von 35S-

markiertem pRb wurde beobachtet. Anhand der pRb-Fluorographie (Abb. 3.8) und

der densitometrischen Auswertung (Abb. 3.8.1) dieser Fluorographie konnte deutlich

eine Korrelation zwischen einer Microcystin-Exposition und der Zunahme von

hyperphosphoryliertem 35S-markierten Rb-Protein erfasst werden. Nach der

Exposition der Zellen mit 10 µM Microcystin nahm die Bandenintensität der

hyperphosphorylierten Form des Rb-Proteins (ppRb) im Vergleich zu den Kontrollen

signifikant zu bzw. es konnte die höchste Densität gemessen werden. Auf das

Mitführen von anderen Microcystin-Konzentrationenen wurde verzichtet, da die 10

µM Microcystin-Konzentration hier als optimale Dosis für dieses Testsystem ermittelt

wurde (3.1). Wie die Microcystin-stimulierende Hyperphosphorylierung von pRb in

Zusammenhang mit einer Beeinträchtigung der Funktion von pRb stehen könnte,

ergibt sich aus dem folgenden Kontext:

Die Aktivität von pRb wird maßgeblich über Phosphorylierungen reguliert (Taya,

1997). Die Hyperphosphorylierung von pRb durch die Cycline D,E,A in Verbindung

mit den Cyclin-abhängigen Kinasen CdK 4/6/2 führen phasenspezifisch zu einem

kurzweiligen reversiblen Funktionsverlust, der mit der Freisetzung von E2F

einhergeht, der die Expression von essentiellen S-Phasegenen induziert. Die

Dephosphorylierung von pRb durch die PP führt zur Wiederherstellung der

Tumorsuppressorfunktion und leitet durch die Sequestrierung von E2F die

Arretierung der Zellen in der G1-Phase ein (Gana and Reddy, 1995; Taya, 1997).

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Diskussion

135

Das Hepatotoxin Micorcystin kann als Tumorpromotor durch die �apparente

Aktivierung� von Proteinkinasen in den durch die HBV-Infektion initiierten

Hepatozyten das Rb-Protein in einem anhaltenden hyperphosphorylierten Zustand

fixieren und so die funktionelle Inaktivierung des Rb-Proteins induzieren. Die

Konsequenz ist eine Deregulation wichtiger zellulärer Kontrollmechanismen, die

synergistisch mit einer Überexpression von HBx die Entwicklung und Progression

eines HBV-assoziierten HCC begünstigt. Studien über HBV-assoziierte Leber-

karzinome haben gezeigt, dass eine abnormale Expression des Rb-Proteins

vorkommt (Luber et al., 1996).

Auch Yatsunami et al. (1993) beobachteten, dass verschiedene Konzentrationen von

Okadasäure Einfluss auf das Gesamtphosphorylierungmuster von pRb und p53 in

Fibroblasten nehmen. Auf der Grundlage einer von Fujiki (1992) postulierten

Arbeitshyphothese, können Tumorsuppressorproteine durch Okadasäure funktionell

inaktiviert werden. Durch die irreversible Hemmung der PP1/ PP2A durch Wirkstoffe

der Okadasäureklasse verbleiben die Proteine in ihrer hyperphosphorylierten Form,

was in Folge möglicherweise mit einer funktionellen Inaktivierung der

Tumorsuppressorproteine einhergeht.

4.3. Protektive Wirkung von Microcystin vor UV-induzierter Apoptose

In diesem Teil der Arbeit sollte nach weiteren Hinweisen für eine mögliche

Microcystin-vermittelte funktionelle Beeinträchtigung von p53 nach einer UV-

Induktion gesucht werden. Die Aktivierung von p53 als Reaktion auf induzierter DNA-

Schädigung kann entweder zur Arretierung von Zellen in der G1- oder G2-Phase des

Zellzyklus oder in die Apoptose führen (Bates and Vousden, 1999; Fogal et al, 2000;

Graeber et al, 1994; Hua et al., 1998; Komarova et al., 1997; Sionov and Haupt,

1999). Diese p53-initiierten Kontrollmechanismen des Zellzyklus sollen verhindern,

dass sich DNA-Schäden in Mutationen vor allem in der S-Phase fixieren und somit

den Übergang einer normalen Zelle zu einer Tumorzelle begünstigen.

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Diskussion

136

Ob das Tumorsuppressorprotein p53 nach einer Stress-Induktion einen Zellarrest

oder eine Apoptose initiiert, hängt vor allem vom Ausmaß der DNA-Schädigung, der

Gesamtsituation der Zellpopulation und auch vom Zelltyp selbst ab (Bates and

Vousden, 1999). Die funktionelle Inaktivierung von p53 führt somit zum Verlust eines

wichtigen Kontrollelementes des Zellzyklus.

Mit Hilfe einer UV-Induktion wurde eine p53-abhängige Apoptose in HepG2-Zellen

eingeleitet, die möglicherweise durch eine 2h Präinkubation der Zellen mit 10µM

Microcystin nur gedämpft verläuft oder komplett gehemmt wird.

In der Tat wurde gezeigt, dass Wirkstoffe der Okadasäureklasse Zellen vor Apoptose

schützen (Baxter and Lavin., 1992; Song and Lavin, 1993). Bekanntlich kann

Apoptose in eine Initiations-, eine Effektor- und eine Degradationsphase unterteilt

werden (Kroemer et al., 1995). Gerade in der Initiationsphase, in der die Zelle mit

Stressfaktoren konfrontiert wird, scheint dies vor allem mit dem Verlust von

Proteinkinasen bzw. Aktivierung von Proteinphosphatasen begleitet zu sein (Kroemer

et al., 1995). Da alle Wirkstoffe der Okadasäureklasse potente Inhibitoren der PP1/

PP2A darstellen, dürfte gerade die dadurch bedingte �apparente Aktivierung" der

Proteinkinasen bei diesen Ereignissen eine interessante Rolle spielen. In Hinsicht auf

die protektive Wirkung des cyanobakteriellen Microcystins vor UV-induzierter

Apoptose muss berücksichtigt werden, dass einige Cyanobakterien UV-

Schutzsubstanzen enthalten. Obgleich das charakteristische Wellenlängen-

Absorptionsmaximum von Microcystin im UV-C Bereich bei 238 nm liegt, ist es nicht

als UV-Schutzsubstanz zu bezeichnen (pers. Mitteilung: C. Wiedner, Berlin; Wiedner

et al., 2003). Schaeffner et al. (1999) zeigten, dass zur Entfernung von Microcystin

aus Gewässern eine UV-Bestrahlung im Vergleich zum chemischen Abbau von

Microcystin sehr viel günstiger ist. Die Einwirkung von UV-Licht auf Microcystin mit

Wellenlängen um dessen Absorptionsmaximum führte zu einem schnellen Abbau

(Tsuji et al., 1995). Die Halbwertszeit von Microcystin-LR nach einer UV-Bestrahlung

in einer Dosis von 147 µJ/cm 2 -2550µJ/ cm 2 betrug 10 min bis 1 min (254 nm)

(Schaeffner et al.,1999). Da in diesem Apoptose-Versuch die Microcystin-

präinkubierten Zellen mit einer viel höheren UV-Dosis (100 J/cm2 ) bei einer

Wellenlänge von 254 nm exponiert wurden, darf man davon ausgehen, dass die

Wirkung von Microcystin hier in Korrelation mit der spezifischen Hemmung der

Proteinphosphatasen steht.

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Diskussion

137

Über die Ermittlung des Anteils (%) toter Zellen durch den Trypanblau-Test und der

Charakterisierung des apoptischen Charakters dieser toten Zellen mit Hilfe der

FACS-Analyse und elektrophoretischen DNA-Fragmentierung, sollte die protektive

Eigenschaft von Microcystin vor UV-induzierter Apoptose dargestellt werden. Die

FACS-Analyse und die elektrophoretische DNA-Fragmentierung war erforderlich, da

mit dem Trypanblau-Test quantitativ nur der Anteil an toten Zellen (Nekrose)

bestimmt wird. In der Regel kommt es nach einer starken UV-Induktion in p53-Wt

exprimierenden Testsystemen zur Initiation einer p53-abhängigen Apoptose (Appella

and Anderson, 2001; Bates and Vousden, 1999). Aus diesem Grund ist durch die

gewählten Versuchsbedingungenan anzunehmen, dass der im Trypanblau-Test

ermittelte Anteil (%) toter Zellen einen apoptotischen Ursprung hat. Obgleich

nekrotische und apoptotische Prozesse durch signifikant verschiedene zelluläre

Abläufe definiert werden, kann bei apoptotischen Zellen in Zellkulturen das

Phänomen einer sekundären Nekrose auftreten. Diese Zellen werden im Trypanblau-

Test als nektrotisch erfasst, obwohl sie einen apoptotischen Ursprung hatten. Diese

Annahme konnte hier durch die elektrophoretische Darstellung der DNA-Fragmente

mit den entspechenden HepG2-Aliquots bestätigt werden (Daten nicht gezeigt).

Zur Klärung der Frage, ob die protektive Wirkung von Microcystin vor UV-Schäden

möglicherweise mit der Microcystin-induzierten Beeinträchtigung des nukleären

Importes von p53 korreliert (3.5), erfolgte die fluoreszenzmikroskopische Analyse der

subzellulären Lokalisation des p53-GFP-Fusionsproteins in UV-HepG2-Zellen. Nach

der UV-Induktion war zu erwarten, dass es zur Aktivierung des p53-GFP-

Fusionsproteins kommt, was mit einer nukleären Translokation und Akkumulation

des Fusionsproteins einhergeht. Insgesamt konnte bei allen durchgeführten

Experimenten, die der Analyse einer Microcystin-vermittelten Apoptose-Prävention

dienten, eine Microcystin-assoziierte Reduktion von Apoptoseereignissen und eine

verminderte nukleäre Translokation des p53-GFP-Proteins in den Microcystin-

präinkubierten und UV-induzierten Ansätzen (Abb. 3.11c ) ermittelt werden.

Sowohl die Auswertung des Trypanblau-Testes (Abb. 3.9) als auch die FACS-

Analyse (Abb. 3.10) zeigten, dass die Präinkubation mit Microcystin (10 µM) den

Zellen Schutz vor UV-induzierten Zelltod gewährt. Hingegen konnte die

Präinkubation der Zellen mit einer 2,5 µM Microcystin-Lösung diesen Schutz nicht

gewähren (Daten nicht gezeigt).

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Diskussion

138

Auch hier scheint die Wirkung von Microcystin auf Zellen konzentrationsabhängig zu

wirken. Eine alleinige Mircocystin-Exposition der Zellen im Vergleich zur

unbehandelten Probe hatte keine negative Wirkung auf die Zahl der toten bzw.

apoptotischen Zellen.

Die Präinkubation der Zellen mit DMSO vor der UV-Induktion zeigte im Trypanblau-

Test und auch in der FACS-Analyse im Vergleich zu den UV-induzierten Proben eine

minimale protektive Wirkung. Über mögliche Gründe für diesen Befund kann nur

spekuliert werden. Möglicherweise spielt die stabilisierende Eigenschaft von DMSO

auf die C-G-Basenpaarung während der Amplifikation von Nukleinsäure mit Hilfe

einer PCR hier eine Rolle. Durch eine alleinige Inkubation der Zellen mit DMSO

(0,4%) wurde die Zahl der toten bzw. apoptischen Zellen vermutlich durch die

gentoxische Wirkung von DMSO gesteigert.

Bei der fluoreszenzmikroskopische Auswertung der subzellulären Lokalisation des

p53- GFP- Fusionsproteins konnte gezeigt werden, dass eine Präinkubation der

Zellen mit Microcystin vor der UV-Induktion zu einer verminderten nukleären

Translokation des p53-Fusionsproteins führt. Das p53-GFP-Fusionsprotein konnte

geringfügig in Nukleus und vornehmlich im Cytoplasma nachgewiesen werden. Die

Fluoreszenzaufnahmen zeigen punktförmige nukleäre fluoreszenzierende Partikel

sowie ein fluoreszierendes Cytoplasma (Abb. 3.11c). Als Hinweis für eine Micro-

cystin-assoziierte funktionelle Beeinträchtigung des p53-GFP-Fusionsproteins kann

das nur punktförmige Vorhandensein des p53-Fusionsproteins im Nukleus und die

starke cytoplasmatische Akkumulation gewertet werden. Bei den UV-induzierten

Ansätzen wurde eine überwiegend komplette nukleäre Akkumulation des p53-GFP-

Fusionsproteins beobachtet. Die Zellen waren durch einen grün fluoreszierenden

Zellkern und ein wenig fluoreszierendes Cytoplasma gekennzeichnet (Abb. 3 11a).

Eine Präinkubation der Zellen mit 0,4% DMSO vor der UV-Induktion konnte die

nukleäre Translokation des p53-GFP-Fusionsproteins nur mininal reduzieren (Abb.

3.11b). Ähnlich wie bei den UV-induzierten Proben war in der Regel in den

Zellkernen deutlich Fluoreszenz zu erkennen.

Diese Ergebnisse korrelieren gut mit den ermittelten FACS- und Trypanblau-Daten,

die ebenfalls auf eine Microcystin-vermittelte Beeinträchtigung der Funktion von p53

hinweisen.

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Diskussion

139

Die insgesamt erworbenen Erkenntnisse bei dieser Analyse hinsichtlich einer

Microcystin-vermittelten Reduktion des Anteils (%) apoptotischer Zellen und der

Microcystin-verursachten verminderten nukleären Translokation des p53-GFP-

Fusionsproteins nach einer UV-Induktion lassen die Vermutung zu, dass der

protektive Charakter des Hepatotoxins Microcystin mit einer funktionellen

Inaktivierung des Tumorsuppressorproteins p53 korreliert.

Eine Interpretationsmöglichkeit dieser Resultate bietet die von Stommel, et al. (1999)

postulierte mechanische Hypothese, in der davon ausgegangen wird, dass die

subzelluläre Lokalisation von p53 über die am C-Terminus befindliche hoch-

konservierte nukleäre Exportsequenz (NES), den nukleären Translokationssignalen

(NLS) und der Tetramerisierungsdomäne reguliert wird.

Neuere Studien deuten daraufhin, dass die Zellzyklus-abhängige Lokalisation von

p53 maßgeblich über die Aktivität der Cyclin-abhängigen Kinase CdK2/ Cdk2

reguliert wird (Denko et al., 2000). Der Einsatz von Inhibitoren der Kinase Cyclin

E:CdK2 und Cyclin A: CdK2 führte schließlich zu einer nukleären Akkumulation von

p53 (David-Pfeuty et al., 1999).

Um die Expression von Genen zu induzieren, die einen Zellzyklus-Arrest oder

Apoptose initiieren, muss das p53 als TF in den Nukleus translozieren (Fujiki, 1992;

Shenolikar et al., 1994; Takenaka et al., 1995). In normalen ungestressten Zellen

liegt das p53-Proteinin der G1-Phase nukleär und während der S-und G2-Phase ist es

grösstenteils cytoplasmatisch lokalisiert (David-Pfeuty et al., 1996; Shaulsky et al.,

1990). Nach dem Überschreiten des G1-Restriktionspunktes kommt es am C-

Terminus von p53 zu Phosphorylierungen durch die CdK2-Kinase. Die Phosphory-

lierungen haben zur Folge, dass das p53-Molekül in das Cytoplasma transloziert, wo

es seine Funktion als Tumorsuppressor notwendigerweise reversibel verliert

(Bischoff et al., 1990; Price et al.,1995). Für die Dephosphorylierung von p53 wird in

der Regel die PP2A verantwortlich gemacht (Fjuiki, 1992; Shenolikar, 1994). Bei in

vitro Versuchen konnte ermittelt werden, dass eine Aktivierung von p53 durch die

PP1 und PP2A revertiert wird (Takenaka et al., 1995). Eine maßgebliche Beteiligung

an der Regulation der subzellulären Lokalisation von p53 wird dem Serin-Rest der

AS 315 zugeordnet.

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Diskussion

140

Die Phosphorylierung von Ser 315 dürfte unter normalen zellulären Umständen die

Aktivität von p53 als TF in einem Zellzyklus-abhängigen Muster unterbinden.

Sakaguchi et al. (1997) postulieren, dass womöglich die Phosphorylierung von Ser

392 zu einer Aktivierung von p53 führt und die Phosphorylierung von Ser 315 mit

einer Inaktivierung oder Verhinderung der Aktivierung von p53 korreliert.

Ser-315 dient der Cyclin-abhängigen Kinase CdK2/ Cdc2 als Substrat und kann je

nach Phosphorylierungszustand (De-/Phosphorylierung) die subzelluläre Lokalisation

des Transkriptionsfaktors p53 durch die Veränderung der Tetramer-Stabilität

(Stommel et al., 1999) oder über die Modulation des nukleären Importes von p53

(Liang and Clarke, 2001) entscheidend beeinflussen. Der nukleocytoplasmatische

Transport des p53-Tetramers wird durch die Verbindung der am C-Terminus

befindlichen nukleären Lokalisationssignale (NLS) und des nukleären Exportsignals

(NES) an die intrazellullären Rezeptormoleküle Importin α und CRM1 vermittelt.

Möglicherweise können Phosphorylierungen direkt oder indirekt die Zugänglichkeit

der NLS und NES zu ihren Rezeptormolekülen beeinflussen. Ser 315 liegt inmitten

der Tetramerisierungsdomäne, mehreren nukleären Lokalisationssequenzen (NLS)

und dem nukleären Exportsignal (NES) und stellt so ein interessantes Target für

regulierende Phosphorylierung durch die Cdk2/ cyclin B / Cdk2/ Cyclin A dar

(Bischoff et al., 1990; Price et al.,1995; Stommel et al., 1999). Das phosphorylierte

Ser 315 führt vermutlich zu einer Blockade der nukleocytoplasmatischen Beförderung

von p53 durch die Unzugänglichkeit des Rezeptormoleküls Importin α an die NLS

(Liang and Clarke, 2001) oder durch die Demaskierung der NES, die mit einer

Destabilisierung des p53-Tetramers einhergeht (Stommel et al., 1999). Durch die

Blockade des Kerntransportes kommt es zu einer cytoplasmatischen Sequestrierung

von p53, die mit einem Verlust des Proteins als sequenz-spezifischer Transaktivator

einhergeht. Durch die Proteinphosphatase 2A (PP2A)-vermittelte Dephosphory-

lierung von Ser 315 wird die Funktion von p53 als Tumorsuppressor wieder

hergestellt (Sakaguchi et al., 1997;Yatasunami, etz al., 1993).

Auch die notwendige Bildung des p53-Tetramers (McLure and Lee, 1998) für die

nukleäre Translokation von p53 aus Monomere und - Dimere kann durch

Phosphorylierungereignisse beeinflusst werden. Die hyperphosphorylierten p53-

Monomere sind vermutlich unfähig miteinander zu assoziieren, so dass die Tetramer-

Bildung von p53 verhindert wird (Yatsunami et al., 1993).

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Diskussion

141

Über die Konversion des p53-Tetramers in Monomeren- oder Dimeren wird die

Demaskierung der NES initiiert und somit das nukleäre-cytoplasmatische Shuttling

reguliert. In vitro konnte in der Tat gezeigt werden, dass die Phosphorylierung von

Ser 315 zu einer Reduktion der Tetramer-Stabilität führt (Sakaguchi et al., 1997).

Microcystin kann aufgrund seiner Eigenschaft als Proteinphosphatase-Inhibitor

maßgeblich in die Regulation der subzellulären Lokalisation von p53 eingreifen.

Durch die Microcystin-vermittelte Hemmung der Proteinphophatasen PP1/ PP2A

erfolgt vermutlich unter anderem die Phosphorylierung des Serin-Restes 315, was

möglicherweise zu einer Destabilisierung des p53-Tetramers führen kann, die mit

einer Demaskierung der NES (Stommel et al., 1999) korreliert oder mit einer

Blockade des nukleären Importes von p53 einhergeht (Liang and Clarke, 2001). Das

p53-Protein liegt dann in seiner sogenannten hyperphosphorylierten Form vor (Fuchs

et al.,1995; Fujiki, 1992).

Die Exposition von Zellen mit Microcystin kann somit neben den stabilisierenden und

aktivierenden Phosphorylierungen am p53-Protein auch zu Phosphorylierungen

führen, die womöglich das p53-Protein in seinem hyperphosphorylierten Zustand als

Tumorsuppressor funktionell ausser Kraft setzen (Fujiki, 1992).

Grundsätzlich kann jedoch nicht ausgeschlossen werden, dass die Microcystin -

induzierte metabolische Stabilität von p53 zu einer Inaktivierung der p53-Funktion

führt. In verschiedenen Studien konnte wie erwähnt gezeigt werden, dass eine

metabolische Stabilisierung von p53 einen aktiven zellulären Prozess darstellt, der

zur Akkumulation von p53 in den Zellen führt und letztendlich mit einem

transformierten Phänotyp einhergeht (Levine, 1990; Levine et al., 1991)

In vorherigen Experimenten wurde gezeigt, dass das cyanobakterielle Microcystin

durch die spezifische irreversible Hemmung der Proteinphosphatasen PP1/ PP2A

entscheidend auf die Stabilität (3.2) und Phosphorylierung (3.3) von p53 Einfluss

nehmen kann. Außerdem spricht theoretisch die generelle Aktivierung von p53, die

unter anderem über die Änderungen des Phosphorylierungsmusters reguliert wird,

für eine mögliche Microcystin-induzierte metabolische Stabilisierung von p53

(Grossmann, 2001).

Auf welchem Weg Microcystin seine protektive Wirkung vor UV-Schäden in den

Zellen vermittelt, ob nun über die �Mechanische Hypothese", die metabolische p53-

Stabilisierung oder die Blockierung des nukleären Transportes von p53, kann in

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Diskussion

142

dieser Studie nicht komplett geklärt werden. Schließlich kann auch das Mitwirken von

anderen Signalkaskaden bei diesen Microcystin-vermittelten Prozessen nicht

ausgeschlossen werden.

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Diskussion

143

Der MAPK-Weg stellt möglicherweise einen weiteren Angriffspunkt für den

Tumorpromotor Microcystin dar. Dieser Signalkaskade wird vor allem bei der

Regulation von Proliferation- und Differenzierung eine bedeutende Rolle zugeordnet

(später diskutiert).

In diesem Kontext stellt auch das Rb-Protein einen interessanten zellulären

Angriffspunkt dar. Neben dem p53-Protein übernimmt das pRb bei der Apoptose-

Initiation eine essentielle Rolle. Herwig und Strauss (1997) werten die

Dephosphorylierung von pRb als frühe Antwort auf eine initiierte p53-unabhängige

Apoptose, wobei die hyperphosphorylierte Form von Rb die Zellen vor Apoptose

rettet. Auch Wang (1997) spricht dem pRb in seiner hypophosphorylierten Form bei

einer p53-unabhängigen Apoptose eine bedeutende Aufgabe als Apoptose-Promotor

zu.

In der hier vorliegenden Studie konnte dargestellt werden, dass Microcystin in der

Lage ist die Hyperphosphorylierung von pRb signifikant zu stimulieren (3.3.3).

Hinsichtlich eines Microcystin-assoziierten Schutzes vor Stress-induzierter Apoptose

könnte nach der Microcystin-Applikation sowohl die Funktion von p53 als auch die

Aktivität von pRb als Apoptose-Induktor bzw.-Promotor nachteilig beeinflusst werden.

Die funktionelle Inaktivierung von p53 durch Microcystin führt nach einer Stress-

Induktion dazu, dass die initiierte Transaktivierung von p21 und die damit

verbundene Hemmung der Cyclin-abhängigen Rb-Kinasen nur partiell induziert wird.

In Folge kommt es nur zu einer ineffizienten Induktion des Zellzyklus-Arrests oder

Apoptose. Außerdem kann Microcystin zusätzlich direkt durch die Hemmung der PP1

Einfluss auf das Phosphorylierungsmuster von pRb nehmen (Gana and Reddy,

1995), indem das Retinoblastomaprotein nach der Microcystin-Exposition in seiner

inaktiven hyperphosphorylierten Form fixieren wird, so dass p53-unabhängige

Apoptose-Prozesse in der Zelle nicht initiiert werden können.

Joseph et al. (1995) beobachtete, dass eine Exposition der Zellen mit Okadasäure

zur Verminderung von Apoptose führt, die durch Apoptose-Induktoren initiiert

wurden. Die Konsequenz ist womöglich, dass das Nichtzustandekommen der

essentiellen Dephosphorylierung von pRb die Initiation der Apoptose stört.

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Diskussion

144

Die in diesem Experiment Detektionlich protektive Wirkung von Microcystin vor UV-

induzierter Apoptose, die mit einer Reduktion der Apoptose-Rate und einer

verminderten nukleären Translokation des p53-GFP-Fusionsproteins einhergeht,

stellt möglicherweise ein interessantes Tumorpromotion-Modell dar.

Microcystin als Vertreter der Okadasäureklasse kann als Inhibitor der

Proteinphosphatasen 1 und 2A theoretisch apoptotische Prozesse verzögern oder

sogar verhindern und so einen generellen Beitrag bei der Progression eines HBV-

assoziierten HCC leisten. Theoretisch kann Microcystin kombinatorisch mit der HBx-

vermittelten Inaktivierung von p53 apoptotische Prozesse in infizierten Hepatozyten

inhibieren, um so den Hepatozyten mit integrierter HBV-Sequenz einen klonal

selektiven Vorteil zu verschaffen (Elmore et al., 1997).

Welcher der hier erwähnten molekularen Mechanismen exakt hinter dieser

Microcystin-assoziierten Prävention vor UV-induzierter Apoptose steckt bleibt unklar.

Erschwert wird die Suche nach einem konkreten Erklärungsmodell auch durch die

partiell kontrovers ermittelten Resultate, die die Vermutung zulassen, dass gerade

die Inkubation mit Okadasäure apoptotische Signalkaskaden zelltypabhängig

einleitet (Gjertsen and Doskeland, 1995; MacKintosh and MacKintosh, 1994; Traore

et al., 1999; Fladmark et al., 2002).

Da p53 und pRb neben der Initiation von Apoptose maßgeblich an der Regulation

der Zellproliferation und Zelldifferenzierung involviert sind, folgt nun die Darstellung

der Wirkung von Microcystin auf die Kontrollmechanismen des Zellzyklus.

4.4. Darstellung der Effekte von Microcystin auf die Zellzyklus-Regulation

4.4.1. Wirkung von Microcystin auf die Regulation der G1/S-Phase des Zellzyklus

Um mehr Erkenntnisse über die Einflüsse von Microcystin auf die Zellzyklus-

Regulation in Erfahrung zu bringen, wurde zunächst eine FACS-Messung

durchgeführt.

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Diskussion

145

Mit Hilfe dieser durchflusszytometrischen Zellzyklus-Analyse sollte geklärt werden,

inwieweit die Microcystin-vermittelte Vitalitätssteigerung der HepG2-Zellen (Abb. 3.1)

und die zelluläre Akkumulation von Phosphoproteinen (3.3) den G1-

Restriktionspunkt des Zellzyklus beeinflussen. Hintergrund dieser Fragestellung war

der Aspekt, dass die PP bei der Regulierung des G1/S-Überganges der Zellen eine

bedeutende Rolle spielen (Gana and Reddy, 1995). Zum Beispiel wird der Übergang

der Zellen in die S-Phase durch die Phosphorylierung von pRb ermöglicht.

Die Proteinphatase1A kann wiederum physiologisch Phasen-abhängig oder spontan,

die Funktion von pRb als Transkriptionsrepressor wieder herstellen und so zu einem

G1-Arrest der Zellen führen. Durch die Exposition der Zellen mit Microcystin können

solche Regelmechanismen ausser Kraft gesetzt werden. Die Tumorsuppressor-

proteine verharren schließlich in ihrer hyperphosphorylierten Form, die mit einer

Dysfunktion dieser Proteine (p53/ pRb) einhergeht. Natürlich kann die Hemmung der

Proteinphosphatasen auch zu einer Deregulation von wichtigen Zellzyklus-

abhängigen Signalkaskaden (MAP-Kinase) führen, die ebenfalls den Übergang der

Zellen in die S-Phase begünstigen. Bei dem Übergang der Zellen von der G1- in die

S-Phase spielt die Cyclin D, E, A sowie die von ihnen kontrollierten Cyclin-

abhängigen Kinasen 4, 6 ,2 eine wichtige Rolle. Das Cyclin D, E, A in Assoziation mit

den CdK4, 6, 2 werden auch als Retinoblastoma-Kinasen bezeichnet, die die

Hyperphosphorylierung des Rb-Proteins katalysieren. Durch die damit einher-

gehende Freisetzung von E2F wird der G1-Restriktionspunkt überwunden und

schließlich die G1/S-Übergang der Zellen einleitet (Hullemann and and Boonstra,

2001). Die Expression des Cyclin D ist dabei mehr von äusseren Faktoren abhängig

als vom Zellzyklusstadium. Eine mitogene Stimulierung des MAPK-Pathways, bei der

die Übertragung von Phosphatresten auf verschiedene Proteine über Serin/

Threonin-spezifische Proteinkinasen katalysiert wird, kann die Cyclin D-Expression

initiieren. Die Termination dieser Signaltransduktion wird vorwiegend durch die

Aktivität der Serin/ Threonin-spezifischen Proteinphosphatasen 1 und 2A vermittelt.

Interessanterweise wird zunächst die PP-vermittelte Termination dieser

Signalkaskade durch die MAP-Kinase selbst verzögert. Während der Aktivierung

dieser Kaskade führen zunächst die MAP-Kinasen- vermittelten Phosphorylierungen

an der katalytischen- und regulatorischen Untereinheit der PP zu einer kurzzeitigen

reversiblen Inaktivierung. In dieser Phase wird vor allem die Expression von

essentiellen frühen Genen für die Proliferation gefördert (Shenolikar, 1994).

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Diskussion

146

Durch die Microcystin-vermittelte irreversible Hemmung der Proteinphosphatasen

1/2A könnte dieser Weg nicht revertiert werden. Die prolongierte Aktivität dieser

Signalkaskade kann letztendlich mit einer Deregulation des G1-Restriktionspunktes

einhergehen und ermöglicht den Zellen somit einen unkontrollierten Übergang in die

S-Phase des Zellzyklus.

Der Microcysin-assoziierte PP-Hemmungsmechanismus gestaltet sich vermutlich

ähnlich. Microcystin ligiert kovalent spezifisch irreversibel in die katalystische

Untereinheit der PP und führt ähnlich wie eine Phosphorylierung durch den MAP-

Kinase-Pathway zu einer Inaktivierung der Proteinphosphatasen (PP) (Shenolikar,

1994).

Bezogen auf den MAP-Kinase-Pathway kann die irreversiblen PP-Inaktivierung

mittels Microcystin additiv bzw. synergistisch auf die kurzzeitige reversible

Inaktivierung der PP durch die MAP-Kinase wirken.

Das Zusammentreffen dieser beiden Ereignisse würde zu einer kontinuierlichen

Synthese von genregulierenden Proteinen führen, die zur Deregulation von zellulären

Regelmechnismen beitragen und schließlich langfristig Potential für die Entwicklung

von Tumoren bieten.

Mittels der FACS-Analyse sollte nun überprüft werden, ob die Zahl der Zellen in der

S-Phase einer HepG2-Population durch eine 2h Microcystin-Exposition gesteigert

werden kann. Unsynchronisierte HepG2-Zellen wurden 2h mit 10 µM Microcystin-

exponiert und anschließend für die FACS-Messung präpariert. Wie der Tab. 3.1 zu

entnehmen ist, konnte in der Tat in den Microcystin exponierten Proben im Vergleich

zu den Kontrollen eine 100%ige Steigerung der Zahl der Zellen in der S-Phase

ermittelt werden. In einem weiteren Versuch sollte die Wirkung von Microcystin

konkret auf die Funktionalität von essentiellen Regulatoren des Zellzyklus beobachtet

werden.

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Diskussion

147

4.4.2. Wirkung von Microcystin und HBx auf die Aktivität von Regulatoren des Zellzyklus

Ein Motiv für die Durchführung dieses Experimentes waren epidemiologisch

erhobene Daten, die eine Korrelation zwischen dem Genuss von Microcystin-

kontaminiertem Trinkwasser und dem HBx-Protein, das bei einer chronischen HBV-

Infektion Detektionlich überexprimiert wird, bei der Entwicklung eines HCC vermuten

lassen (Caselmann et al., 1996; Cromlish et al., 1996; Ganem and Varmus, 1996;

Matsushima et al., 1990; Yoshizawa et al., 1990; Yu ,1995)

Mit Hilfe dieser funktionellen Zellzyklus-Analysen sollte schließlich der Einfluss von

Microcystin und HBx auf die Aktivität von essentiellen Regulatoren des Zellzyklus

(p53,pRb,E2F,c-Myc) bestimmt werden. Durch die Transfektion der HepG2-Zellen

mit verschiedenen Luciferase-Plasmiden, die vor ihrem TATA-Box-Promotor ein

Enhancer-Element mit jeweils einem Response-Motiv für die Proteine p53, pRb, E2F

oder c-Myc enthalten, wurden die kombinatorisch deregulierenden Einflüsse von

Microcystin und HBx auf die Aktivität dieser regulatorischen Proteine des Zellzyklus

untersucht. Die kombinatorische Wirkung (additiv/synergistisch) von HBx und

Microcystin auf die Funktionalität der verschiedenen Regulatoren wurde quantitativ

über die Modulation der durch die Zellzyklus-Regulatoren- vermittelte Expression des

Reportergens Luciferase nach der HBx-Expression und Microcystin-Exposition nach-

gewiesen.

Wie in Abb. 3.16 dargestellt, führt die Anwesenheit von HBx und /oder eine

Microcystin-Inkubation zu einer verminderten p53-vermitttelten Luciferase-Aktivität.

Die kombinatorische Wirkung von Microcystin und von HBx auf die Funktionalität von

p53 hinsichtlich einer Beeinträchtigung der Tumorsuppressorfunktion lassen sich als

synergistisch beschreiben (Abb 3.16).

Die Reduktion der Luciferase-Aktivität nach der Microcystin-Exposition (Abb. 3.12)

deutet auf eine Microcystin-vermittelte funktionelle Inaktivierung von p53 hin.

Mögliche Aspekte, die in das Microcystin-assoziierte Aussetzen der

Tumorsuppressorfunktion von p53 involviert sind, stellen die in den

vorangegangenden Experimenten erworbenen Befunde dar.

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Diskussion

148

In diesen Analysen wurde gezeigt, dass eine funktionelle Inaktivierung von p53

möglicherweise mit der Wirkung von Microcystin auf die Phosphorylierung von p53

korreliert. Nach der Exposition von radioaktiv markiertem p53 mit Microcystin wurde

neben einer unphysiologischen metabolischen p53-Stabilität (Abb.3.2) auch die

Akkumulation von p53 in seinem hyperphosphorylierten Zustand (Abb.3.3)

nachgewiesen. Die Microcystin-vermittelte metabolische Stabilität als auch die

Hyperphosphorylierung von p53 verursachten womöglich die verminderte nukleäre

Translokation des p53-GFP-Fusionsproteins in den Microcystin-präinkubierten- und

UV-exponierten HepG2-Zellen (3.5), die hier mutmaßlich auch zu dieser ermittelten

Reduktion der p53-induzierten Luciferase-Aktivität führte.

Bei der DMSO-Kontrolle hingegen konnte eine deutliche Erhöhung der p53-

assoziierten Luciferase-Aktivität nachgewiesen werden. Diese Zunahme der

Expression des Reportergens Luciferase könnte die Folge einer zusätzlichen p53-

vermitttelten Stressinduktion durch DMSO sein. Vermutlich verursacht DMSO

aufgrund seines gentoxischen Potentials in den UV-gestressten Zellen zusätzlichen

zellulären Stress, der zu einem rapiden Anstieg der p53-Konzentration in der Zelle

führte (s. 3.2). Der Anstieg der zellulären p53-Konzentration ging letztendlich mit

einer verstärkten p53-vermitttelten Luciferasegen-Expression einher, da die Bindung

von p53 an das p53-Response-Element häufiger erfolgte und so die Transkription

des Luciferasegens verstärkte. Die gentoxische Wirkung von DMSO wurde auch

durch die Arretierung der Zellen in der G1-Phase nach einer DMSO-Inkubation

deutlich (Abb. 3.10).

Die Anwesenheit von HBx in den HepG2-Zellen führte ähnlich wie nach einer

Microcystin-Inkubation zur Abnahme der p53-induzierten Expression des

Luciferasegens. Vermutlich wurde die Kerntranslokation des p53-Tetramers durch

die Protein-Protein-Interaktion mit dem HBx-Protein im Cytoplasma verhindert (Butel

et al., 1996; Feitelson et al., 2002) und somit das Binden von p53 an das p53-DNA-

Response Element vermindert, was zu einer Reduktion der p53-vermitttelten

Expression des Reportergens führte. Durch die zusätzliche DMSO-Inkubation wurde

die Konzentration von p53 in den UV-induzierten HepG2-Zellen nochmals gesteigert,

so dass die Konzentration von HBx (Abb. 3.16) nicht ausreichte, um die Bindung von

p53 an das p53-DNA-Response-Motiv zu verhindern. Dadurch konnte das p53-

Protein ungehindert an das Motiv binden und so verstärkt die Transkription des

Luciferasegens induzieren.

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Diskussion

149

Ein extra für diese Arbeit durchgeführtes Transfektionsexperiment, in dem die

Konzentration des eingesetzten p53- bzw. HBx-Expressionsvektors variierte, machte

diese Abhängigkeit deutlich. Je nach Konzentrationsverhältnis der beiden

Expressionsvektoren wurden HBx-vermittelte und/ oder Microcystin-assoziierte

Effekte auf die Aktivität von p53 bestimmt (Daten nicht dargestellt). Auch eine neuere

Studie zeigt, dass in HBx-exprimierenden Chang-Zellen (Chang x) nach Applikation

von Adriamycin die cytoplasmatische Sequestrierung des p53-Proteins aufgehoben

wurde und die transkriptionelle Aktivität von p53 wieder hergestellt wurde (Yun et al.,

2000).

Da in diesen Ansätzen jedoch im Vergleich zu einer alleinigen DMSO-Inkubation

eine sehr hohe Lumineszenz (80 LCPS/µg Protein) gemessen wurde, kann hier nicht

ausgeschlossen werden, dass das HBx hier auch seine Wirkung als Apoptose-

Stimulator entfaltet. Es konnte gezeigt werden, dass das HBx-Protein bei

ungünstigen zellulären Bedingungen selbst stimulierend auf die Initiation einer p53-

abhängigen Apoptose wirkt (Chirillo et al., 1997; Su et al., 2001). Möglicherweise

stellt sich durch den DMSO-vermittelten Anstieg der p53-Konzentration eine solche

Situation dar, was zu einem zusätzlichen HBx-vermittelten Anstieg der zellulären

Konzentration von p53 führte.

Bei der gleichzeitigen Anwesenheit von HBx und Microcystin in den HepG-2 Zellen

bewirkt womöglich das HBx-Protein über die Protein-Protein-Interaktion die

cytoplasmatische Sequestrierung des p53-Protein (Stommel et al., 1999; Zerrahn et

al., 1992) und Microcystin führte vermutlich über die metabolische Stabilisierung oder

Hyperphosphorylierung von p53 zu einer Blockade des nukleären Transportes. Das

Zusammenspiel des pleiotropen Transaktivators HBx und des Tumorpromotors

Microcystin könnten somit zu einer funktionellen Inaktivierung von p53 geführt haben.

Mehrere Studien postulieren, dass das HBVx-Protein in Korrelation mit p53

entscheidend bei der Entwicklung eines Hepatozellulären Karzinoms mitwirkt

(Feitelson et al., 2002). Ein essentieller Schritt auf diesem Weg ist die x-Protein-

assoziierte physikalische Bindung und die damit einhergehende funktionelle

Inaktivierung von p53. Die zentrale Funktion von p53, die genomische Stabilität

aufrecht zu erhalten, eine Progression im Zellzyklus nach gentoxischer Applikation zu

verhindern oder Apoptose zu induzieren, geht durch Assoziation mit dem x-Protein

verloren.

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Diskussion

150

Aus diesem Grund ist die p53-x-Protein Assoziation mit Merkmalen wie

Genominstabilität, Verlust der Zellzyklus-Kontrolle und einer geringeren Apoptose-

Rate eng verknüpft. Über die Wirkung von Microcystin auf die Funktionalität von p53

lagen bislang keine experimentellen Daten vor. Bislang wurden nur Experimente

durchgeführt, die die Hyperphosphorylierung von p53 durch Okadasäure zeigten

(Yatsunami et al., 1993).

In dieser Arbeit wird von der Annahme ausgegangen, dass die ermittelten Daten aus

einer funktionellen Inaktivierung des p53-Moleküls resultieren. Auch Shehar et al.

(1997) diskutieren die funktionelle Inaktivierung von p53 als möglichen

Tumorpromotion-Mechanismus. Es konnte gezeigt werden, dass das p53-Protein in

Korrelation mit dem x-Protein, ohne zusätzliche strukturelle Mutationen die maligne

Transformation in Hepatozyten induziert. Weiter wird davon ausgegangen, dass der

funktionelle Aktivitätsverlust von p53 die Basis für die im späten Stadium der

Tumorgenese Detektionbaren strukturellen Mutationen bietet (Ueda et al., 1995).

Auch neuere Beobachtungen über die Existenz von inaktivierenden Mutationen der

Proteinphosphatase 2A (PP 2A) als mögliche Ursache der Tumorgenese, deuten

daraufhin, dass den zellulären Aktivitäten der Proteinphosphatasen PP1 und PP2A

ein genereller Beitrag bei der Tumorprogression zukommt (Calin et al., 2000). Die

PP2A ist involviert in die Regulation von verschiedenen zellulären Aktivitäten,

einschließlich der Kontrollmechanismen der Zellproliferation. Die funktionelle

Inaktivierung der PP durch die physikalische Assoziation von viralen Tumorproteinen

(SV40/Tag/Polyoma) an die Untereinheit A der PP stellen einen Mechanismus dar,

der zu einer Deregulation der Zellproliferation führen kann. Ebenfalls führt die Virus-

vermittelte Phosphorylierung des Tyr-307-Restes der katalystischen Untereinheit C

der PP zu einem Verlust der Enzymaktivität (Scheidtmann et al., 1991).

In dem folgenden Abschnitt werden die ermittelten synergistischen oder additiven

Effekte von Microcystin und HBx auf die Funktionalität der Zellzyklus-Regulatoren

pRb, E2F und c-Myc dargestellt (Abb. 3.17- 3.19).

Die kombinatorischen Einflüsse der beiden Tumorpromotoren auf die Aktivität von

pRb können ebenfalls als synergistisch bezeichnet werden (Abb. 3.17). Die

synergistisch inhibierende Wirkung von Microcystin und HBx auf die Aktivität von pRb

und die daraus mutmaßlich resultierende funktionelle Inaktivierung von pRb könnten

durch die Deregulation von folgenden Regelmechanismen bedingt sein:

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Diskussion

151

Microcystin hat aufgrund seiner biochemischen Eigenschaften die Möglichkeit,

einerseits über die Aktivierung des MAPK-Weges, andererseits durch die Hemmung

der Proteinphosphatasen die direkte Phosphorylierung von pRb zu initiieren und so

die Funktion des Transkriptionsrepressors zu inhibieren. Schließlich besteht auch die

Möglichkeit, dass Microcystin über den MAP-Kinase-Weg dysregulierend auf die

Aktivität von pRb wirkt.

Der Tumorpromotor Microcystin hat somit die Fähigkeit die Funktionalität von pRb

über einen biochemischen Pathway negativ zu beeinflussen. DMSO kann

möglicherweise als gentoxische Lösung über die Aktivierung von p53 die Hemmung

der Rb-Kinasen und somit die Dephosphorylierung des Rb-Proteins initiierten. DMSO

fördert somit die Funktion von pRb als Transkriptionsreppressor.

Die Wirkung von Microcystin auf die pRb-vermittelte Expression des Luciferasegens

korreliert mit dem Ergebnis aus 3.3.3. In dieser Analyse wurde gezeigt, dass das

Hepatotoxin Microcystin signifikant zur Akkumulation von hyperphosphoryliertem pRb

führte. In seiner hyperphosphorylierten Form verliert das Rb-Protein seine Funktion

als Transkriptionsrepressor und initiiert durch die Freisetzung von E2F die Synthese

von S-Phasegenen.

Das HBx-Protein besitzt die Fähigkeit über den MAPK-Weg die Phosphorylierung

von pRb über die Induktion der Rb-Kinasen zu aktivieren. In seiner hyper-

phosphorylierten Form kann das pRb es nicht mehr an das entsprechende DNA-

Response- Element binden, was zu einer HBx-induzierten höheren Luciferase-

Aktivität führte.

Durch die zusätzliche DMSO-Inkubation wurde die HBx-vermittelte Rb-

Phosphorylierung geschwächt. Als gentoxische Lösung initiierte DMSO die p53-

abhängige Dephosphorylierung von pRb. Möglicherweise spielt hier auch die

Eigenschaft von DMSO, in Zellkulturen Differenzierungsprozesse zu initiieren, eine

Rolle. Die Regulation des Phosphorylierungsmusters von pRb findet sowohl während

der Proliferation als auch bei Differenzierungsprozessen statt (Cobrink et al., 1992).

Zur Einleitung der Differenzierung in der Zelle ist es erforderlich, dass das

Retinoblastomaprotein in seiner hypophosphorylierten Form vorliegt, um so die in der

S- und M-Phase aktiven Transkriptionsereignisse zu minimieren.

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Diskussion

152

Es konnte experimentell gezeigt werden, dass in humanen Leukämie-Zellen das Rb-

Protein durch DMSO- unabhängig vom G1-Restriktionspunkt auch in der S- und G2

/M Phase in seiner hypophosphorylierten Form vorkommt (Cooper and Shayman,

2001; Tsao et al., 1992).

Durch die kombinatorische Wirkung von Microcystin und dem HBx-Protein könnte die

Hyperphosphorylierung des Rb-Proteins durch die Aktivierung der Rb-Kinasen über

den MAPK-Pathway und/ oder direkt über Microcystin als spezifischer Inhibitor der

Proteinphosphatasen PP1 initiiert werden. Dadurch würde das Rb-Protein als

Transkriptionsrepressor ausser Kraft gesetzt werden und das Binden des

Transkriptionsrepressors an das pRb-DNA-Response Element verhindert. Diese

Annahme wurde durch die messbar ansteigende Luciferase-Aktivität in diesen

Ansätzen bestätigt (3.7.2).

Bei der Interpretation der Wirkung von HBx auf die Funktion der Zellzyklus-

Regulatoren muss gerade unter diesen experimentellen Bedingungen ein Aspekt

besonders beachtet werden. Wie schon erwähnt kann der Transaktivator HBx auch

durch die Interaktion mit dem TATA-Box-bindenen Protein (TBP) auf

transkriptioneller Ebene Einfluss auf die Genexpression nehmen. Das TBP ist

Mitglied des basalen Transkriptionskomplexes, stellt ein sequenz-spezifisches DNA-

Bindungsprotein dar und ist maßgeblich in regulierende Genexpressionen involviert.

Als Bestandteil von TFIID rekrutiert der TFIIB das TBP und es kommt zu einem

TFIIB-TBP-DNA-Komplex. Diese Protein-Korrelation ist wichtig für die Bildung eines

stabilen Komplexes am Promotor und sorgt für die korrekte Positionierung der RNA-

Polymerase am Promotor.

Das HBx kann als Chaperon auf die TBP-Bindung im Präinitiationskomplex

stabilisierend wirken und schließlich hier eine starke Gen-Expression initiieren.

Dieser Pathway kann hier jedoch ausgeschlossen werden, da bei der transienten

Transfektion mit dem Kontrollvektor pTA-Luc (enthält ein TBP-Response- Element),

hier keine gesteigerte TBP-vermittelte Expression des Reportergens Luciferase

gemessen wurde (Tab. 3.7). Die HBx-assoziierte Stabilisierung der Bindung

zwischen der TATA-Box und dem TBP hätte sicherlich zu einem deutlichen Anstieg

der Expression des Luciferasegens geführt. Die direkte Interaktion von TBP-HBx ist

vermutlich bei einer transienten Transfektion ausgeschlossen.

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Diskussion

153

Durch die Lokalisation beider Faktoren in verschiedenen zellulären Kompartimenten,

HBx befindet sich hier hauptsächlich in Cytoplasma und das TBP im Nukleus, ist eine

Protein-Protein Interaktion sehr unwahrscheinlich. Auch eine direkte Interaktion von

HBx mit der RNA-Polymerase III (Haviv et al., 1996, 1998; Wang et al., 1997) war

nicht zu erwarten.

Einige Studien weisen auch auf Sequenzhomologien zwischen dem pRb, TBP und

TFIIB hin (Cavanaugh et al., 1995; Voit et al., 1997; White et al., 1995, 1996).

Durch die Korrelation von pRb mit dem TBP wird die Interaktion mit dem TFIIB und

der RNA- Pol III blockiert. Je nachdem mit welchem Protein (Rb/TFIIB) das TBP

korreliert, können sowohl antirepressive als auch repressive Effekte auf die

Transkription bestimmt werden (Wang et al., 1995). In Korrelation mit dem Retino-

blastomprotein entfaltet das TBP eine repressive Wirkung. Durch eine Signal-

kaskaden-vermittelte Konzentrationserhöhung des TBP dissoziiert der pRb-TBP

Komplex und das TBP entfaltet seine antirepressive Eigenschaft durch die

Komplexierung mit den TFII B und der RNA-Polymerase (Wang et al., 1998). Die

Konsequenz daraus ist die Initiation einer RNA-Pol III abhängigen-Transkription. Im

Kontext mit der Regulation des Zellzyklus ist die verstärkte Transkriptionsaktivität vor

allem bei der Koordination der G1/S-Übergang erforderlich, um signifikant die

Transkription aller Klasse III Gene zu aktivieren. Während der verstärkten Pol III-

Aktivität dissoziiert auch der Rb-E2F-Komplex und der Transkriptionsfaktor E2F kann

die Expression von essentiellen S-Phasegenen aktivieren.

Einem ähnlichen Regulationsmechanismus unterliegt auch die Interaktion zwischen

dem TBP und dem Repressor Dr1. Durch die Bildung des Komplexes TBP-Dr1 wird

die Transkriptionsaktivität, ähnlich wie bei der Komplexbildung TPB-Rb, unterdrückt

(White et al., 1994). Die Erfassung dieses repressiven pRb-TBP-Komplexes, der

ebenfalls wie die Bindung pRb-E2F die pRb-induzierte Expression des

Luciferasegens beeinflusst, kann hier mit grosser Wahrscheinlichkeit ausgeschlossen

werden, da das DNA- Response-Motiv in dem pRb-TA-Luc-Plasmid den Komplex

pRb-E2F erkennt (lt. Clontech). Bei Bestimmung der Wirkung von HBx und

Microcystin auf die Funktion von pRb spielt es aber zunächst einmal keine Rolle, ob

pRb mit dem TBP oder E2F einen Komplex bildet. In beiden Fällen hätte HBx und

/oder Microcystin womöglich das pRb als Transkriptionsrepressor ausser Gefecht

gesetzt und zu einem Anstieg der Luciferaese-Aktivität geführt.

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Diskussion

154

Das HBx-Protein und/ oder Microcystin könnten über den MAPK-Weg die

Konzentration von TBP steigern (Benn and Schneider, 1994) und so die Dissoziation

des möglichen pRb-TBP- Komplexes bewirken. Auch eine von HBx-und/ oder

Microcystin-vermittelte Phosphorylierung von pRb könnte, wie bei dem pRb-E2F-

Komplex, die Freisetzung des TBP veranlassen und so die Funktion von pRb als

Transkriptionsrepressor ausser Kraft setzen. Das Aussetzen der repressiven Wirkung

von pRb auf die Transkription des Luciferasegens könnte hier experimentell anhand

einer Zunahme der Luciferase-Aktivität gezeigt werden.

Auch eine direkte Interaktion zwischen HBx und pRb als mögliche Ursache für diese

funktionelle Inaktivierung von pRb ist eher unwahrscheinlich. Aufgrund der

subzellulären Lokalisation von HBx (im Cytoplasma) und von pRb (im Nukleus) kann

es bei transienten Transfektionen ebenfalls zu keiner direkten Interaktion kommen.

Ein direkter Interaktionsmechanismus zwischen dem Rb-(E2F) und HBx-Protein ist

jedoch noch nicht verstanden. Copräzipitationsexperimente von HBx und pRb

konnten keine weiteren Erkenntnisse darlegen. In der jüngsten Studie von Choi et al.

(2001) wird aber vermutet, dass das HBx-Protein möglicherweise mit dem Promotor

des Rb-Gens interagiert und dadurch die Aktivität von pRb und von E2F beeinflusst.

Eine indirekte Interaktion von HBx und Microcystin mit dem Retinoblastomaprotein

über den MAP-Kinase-Pathway oder Cyclin-abhängigen Kinasen wird hier favorisiert

(Benn and Schneider, 1995; Choi et al., 2001). Es führen beide Wege zu einer

Stimulation der Zellzyklus-Aktivität, die mit einer beschleunigten Passage der Zellen

durch die Restriktionspunkte G0/G1 und G2/M einhergeht. Die Microcystin-vermittelten

Effekte hinsichtlich einer funktionellen Inaktivierung von pRb können jedoch auch

durch die direkte Hemmung der PP1 in der G1-Phase vermittelt werden. Die PP1

reguliert die Dephosphorylierung des Rb-Proteins von der Mitose bis zur frühen G1-

Phase. Am G1-Restriktionspunkt wird durch die Modulation des Phosphorylierungs-

status (hypo-/hyperphosphoryliert) von pRb in Korrelation mit dem TF E2F

entschieden, ob es zu einer G1/S-Transition der Zellen kommt (Gana and Reddy,

1995). Auch Puisieux et al., (1993) berichteten, dass HBV-assoziierte

Leberkarzinome eine abnormale Expression von pRb zeigen.

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Diskussion

155

Der erhöhte Level des Retinoblastomaproteins (ppRb) unterdrückt vermutlich die

HBV- assoziierte Apoptose in den infizierten Hepatozyten, um so förderlich für das

Überleben von neoplastischen Zellen zu wirken (Haas-Kogan et al., 1995). Luber et

al., (1996) vermutet weiter, dass möglicherweise eine Inakivierung von pRb durch

HBx in der frühen Phase der Hepatozyten-Transformation stattfindet, um so

neoplastischen Zellen vor der Wirkung der Tumorsuppressorproteine zu schützen.

In dieser Studie konnte eine Microcystin- und HBx-assoziierte funktionelle

Inaktivierung von pRb als möglicher Mechanismus der Tumorpromotion ermittelt

werden (Abb. 3.17).

Auch die Aktivität von E2F könnte durch HBx und Microcystin über die oben

beschriebenen Wege dereguliert werden (Abb. 3.18). Da die Aktivität von E2F

entscheidend durch die De-/ Phosphorylierungen von pRb reguliert wird, lassen sich

die ermittelten additiv stimulierenden Einflüsse von HBx und Microcystin auf die

Funktion von E2F (Tab. 3.8/Abb. 3.18) im Kontext mit den gewonnenen Resultate

aus Abb. 3.17 interpretieren.

Das HBx-Protein hatte vermutlich über die Aktivierung des MAPK-Weges indirekt

eine stimulierende Wirkung auf die E2F- Aktivität. Der freigesetzte TF E2F in

Assoziation mit dem DP1-Protein kann schließlich an das E2F-DNA-Response- Motiv

binden und die Expression des Luciferasegens verstärken.

Durch die zusätzliche Exposition der Zellen mit DMSO wurde letztendlich die

stimulierende Wirkung des HBx-Proteins auf die E2F-vermittelte Expression des

Reportergens Luciferase vermindert. DMSO induziert möglicherweise eine p53-

assoziierte Expression des p21-Kinase-Inhibitors, der die Phosphorylierung von pRb

über den HBx-vermittelten MAPK-Pathway unterbindet. Dadurch wurde die

Komplexierung von pRb-E2F aufrecht erhalten und die Freisetzung von E2F limitiert.

Andererseits könnte auch die generell durch DMSO-induzierte �apparente

Differenzierung� in der Zelle, die mit einem Anstieg der Konzentration der

Proteinphosphatasen einhergeht, die Hyperphosphorylierung des Transkriptions-

repressors pRb inhibieren und so die Komplexierung von pRb-E2F fördern, was

letztendlich zu einer Reduktion der E2F-vermittelten Luciferasegen-Expression führte

und mit einer Verringerung der Luciferase-Aktivität korrelierte.

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Diskussion

156

Microcystin in einer Konzentration von 10 µM konnte durch die Hemmung der PP die

DMSO-vermittelte Dephosphorylierung des Rb-Proteins revertieren und so zu einer

verstärkten E2F-vermittelten Expression des Luciferasegens führen. Möglicherweise

korreliert der stimulierende Einfluss von Microcystin auf die E2F-vermittelte

Expression des Luciferasegens auch mit dem 100%igen Anstieg der Zahl der Zellen

in der S-Phase nach der Microcystin-Exposition (Tab. 3.1).

Eine alleinige DMSO-Inkubation wie erwähnt induziert vermutlich über die Anhäufung

von PP in der Zelle die Dephosphorylierung des Rb-Proteins (Abb. 3.14), was zu

einer Komplexierung von pRb-E2F führte und somit einen hemmenden Einfluss auf

die Aktivität von E2F nimmt.

Vermutlich führte die kombinatorische Wirkung von Microcystin und dem HBx-

Proteinin der Zelle zu einer raschen Hyperphosphorylierung des Rb-Proteins, die

ebenso mit einer schnellen E2F-vermittelten Expression von S-Phasegenen korreliert

und zu einer rapiden G1/S-Phase-Übergang der Zellen führt. Der Übergang der

Zellen in die S-Phase wird dabei durch die in der späten G1-Phase induzierte

Phosphorylierung des E2F-DP1 Komplexes durch die aktivierte CdK2 in Assoziation

mit dem Cyclin A initiiert (Taya, 1997). Die Phosphorylierung des DP1-Proteins

bewirkt letztendlich die Dissoziation von DP1 aus dem Heterodimer E2F-DP1, was

mit einer Inaktivierung von E2F einhergeht und somit eine weitere Steigerung der

E2F-vermittelten Expression des Luciferasegens verhindert. Microcystin kann als

spezifischer Inhibitor der Proteinphosphatasen PP1/ PP2A förderlich auf die

Phosphorylierung des DP1-Proteins wirken und somit die HBx-vermittelte

Stimulierung der E2F-Aktivität drosseln.

Diese mutmaßlich in Frage kommende kombinatorische Wirkung der beiden

Tumorpromotoren kann schließlich zu der hier bestimmten additiven Wirkung von

HBx und Microcystin auf die E2F-vermittelte Expression des Luciferasegens geführt

haben. Dabei kann die zunächst eher weniger stimulierende Wirkung von Microcystin

durch die Assoziation von E2F mit einen anderen Vertreter aus der DP- Familie

schnell kompensiert werden, so dass schließlich die stimulierende Wirkung von

Microcystin auf die Aktivität von E2F im Vordergrund steht. Welche Auswirkung eine

kontinuierliche Phosphorylierung des E2F-assoziierten DP1-Proteins zur Folge hat,

konnte im Rahmen dieser Studie nicht geklärt werden.

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Diskussion

157

Die Aktivität von c-Myc wird von HBx und Microcystin synergistisch stimulierend

beeinflusst. Es wurde deutlich gezeigt, dass beide Tumorpromotoren synergistisch

stimulierend auf die Funktionalität des Proliferationsmarkers c-Myc wirken, der auch

als Antagonist des Rb- Proteins beschrieben wird (Tab. 3.9).

Als Transkriptionsfaktor (TF) ist das c-Myc-Protein vor allem bei der Regulation der

Zellproliferation und Differenzierung involviert. Generell wirkt es stimulierend auf die

Proliferation und dämpftend auf die Differenzierung (Steiner et al., 1995). Eine

stimulierende Wirkung auf die Proliferation übt c-Myc zum Beispiel in Korrelation mit

der Cdc25-Phosphatase aus. Die Cdc25-Phosphatase dient c-Myc als Substrat und

bewirkt die Dephosphorylierung des Thr 14- und Tyr 15-Restes der Cyclin-

abhängigen-Kinasen (Galaktionov et al., 1996; Steiner et al., 1995). Die

Dephosphorylierung dieser Reste durch die Cdc25-Phosphatasen ist essentiell für

die Aktivierung dieser Cyclin- abhängigen-Kinasen. Das c-Myc-Protein stimuliert über

die Cdc25-Phosphatase vor allem die Aktivität der Cyclin E- und Cyclin D-

abhängigen Kinasen CdK2/CdK4 (Galaktionov et al., 1996). Die Deaktivierung der

Cdc25-Phosphatasen wiederum wird durch die Aktivität der PP1/PP2A bewirkt. In

Folge einer Hemmung der Proteinphosphatasen durch Microcystin kann es zu einer

prolongierten Aktivität der Cdc25- Phosphatase kommen. Welche Angriffspunkte sich

hier für die Tumorpromotoren ergeben, bleibt in dieser Studie offen.

Janssen-Dürr et al. (1990) beobachteten nach einer deregulierten Expression des c-

Myc-Gens auch einen stimulierenden Einfluss auf die Genexpression von Cyclin A

und E, die wiederum die Aktivität von E2F beeinflussen. Die Initiation der Cyclin A-

Genexpression durch c-Myc ermöglicht eine Wachstumsfaktor-unabhängige

Assoziation von Cyclin A und Cdk2 und korreliert mit einer erhöhten E2F-Aktivität.

Auch dieser Aspekt sollte im Kontext mit einer Microcystin- und HBx-abhängigen

Tumorpromotion bei der Entwicklung eines HBV-assoziierten HCC beachtet werden.

In diesem Experiment wurde in Anwesenheit von HBx nach einer Microcystin-

Exposition (Abb. 3.19) im Vergleich zu den Kontrollen eine verstärkte c-Myc-

induzierte Expression des Reportergens Luciferase gemessen. Da die Funktion von

c-Myc vor allem über den MAPK-Weg reguliert wird (Steiner et al., 1995) könnten

HBx und Microcystin die Aktivität von c-Myc über diesen Signalweg beeinflussen.

Auch Su and Schneider (2001) beobachteten eine HBx-induzierte Stimulation der c-

Myc-Aktivität über den MAPK-Weg.

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Diskussion

158

Die Wirkstoffe der Okadasäureklasse können ebenfalls über diese Sigalkaskade

stimulierend in das zelluläre Geschehen eingreifen (MacKintosh and MacKintosh,

1994). Außerdem könnte Microcystin durch die Hemmung der Proteinphosphatasen

PP1/PP2A die kontinuierliche Phosphory-lierung des c-Myc-MAX-Komplexes

induzieren und so durch die Fixierung des Heterodimers in seinem phosphorylierten

Zustand die Zellproliferation unkontrolliert beeinflussen. Eine zusätzliche DMSO-

Inkubation der HBx-exprimierenden Zellen hatte keine Wirkung auf die c-Myc-

induzierte Expression des Luciferasegens. Dies bedeutet, dass weder der DMSO-

verursachte Anstieg der Proteinphosphatasen noch die durch DMSO-induzierte

Erhöhung der p53-Konzentration bzw. p53-abhängige Transkriptionsrepression die

Aktivität von c-Myc beeinflussen.

Auch Goodrich und Lee (1992) zeigten, dass das c-Myc-Protein scheinbar auch in

Anwesenheit von Inhibitoren der Cyclin-abhängigen-Kinasen (z.B p21) förderlich auf

Proliferation wirkt und so anscheinend eine p21-induzierte Fixierung von pRb in

seinem hypophosphorylierten Zustand kompensieren kann. In diesem Zusammen-

hang könnte möglicherweise auch die nach einer alleinigen DMSO-Inkubation im

Vergleich zur Serum-stimulierten Kontrolle höhere Luciferase-Aktivität stehen. Das

Myc-Protein besitzt die Fähigkeit die Hyperphosphorylierung von pRb zu steigern und

so die Proliferation der Zellen zu fördern. Um diese Aufgabe übernehmen zu können,

muss c-Myc möglicherweise zunächst erst seine eigene Expression stimulieren, die

in dieser funktionellen Anaylse mit einer messbar höheren Luciferase-Aktivität nach

der DMSO-Inkubation (pRb wird p53-abhängig dephosphoryliert) einergeht. Bei

gleichzeitiger Anwesenheit von HBx scheint ein Anstieg der zellulären c-Myc

Konzentration nicht erforderlich zu sein. Vermutlich kann HBx über den MAPK-Weg

die Konzentration von c-Myc auf das erforderlich Maß erhöhen. Außerdem konnte

beobachtet werden, dass c-Myc scheinbar weniger Einfluss auf die reprimierende

Wirkung von p53 durch die direkte Interaktion mit dem Transkriptions-

Präinitiationskomplex hat (Goodrich und Lee, 1992). Auch dieser Aspekt muss bei

der Interpretation der Ergebnisse berücksichtigt werden, da die Initiation der

Expression des Luciferasegens in diesen eingesetzten Plasmiden hier über die

TATA-Box initiiert wird.

Die gewonnenen Daten nach der DMSO-Inkubation zeigten, dass man hier eine

direkte Interaktion von p53 mit dem TBP ausschliessen kann.

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Diskussion

159

Nach der DMSO-Inkubation, die zur Akkumulation von p53 führte, hätte die

reprimierende Wirkung von p53 durch die direkte Interaktion mit den TBP zu einer

Reduktion der c-Myc-vermittelten Expression des Luciferasegens geführt. Da dies

nicht der Fall ist, kann unter diesen gewählten Versuchsbedingungen dieser Aspekt

vernachlässigt werden.

Abschliessend kann man sagen, dass HBx und Microcystin kombinatorisch

deregulierend auf die Zellzyklus-Regulation wirken.

Microcystin kann als hepatotroper Wirkstoff der Okadasäureklasse in den Virus-

initiierten Hepatozyten durch die �apparente Aktivierung� der Proteinkinasen das p53-

und Rb- Protein in eine irreversible hyperphosphorylierte Form überführen und

kombinatorisch mit dem HBx-Protein die funktionelle Inaktivierung der

Tumorsuppressorproteine bewirken (Butel et al., 1996; Fujiki, 1992).

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Zusammenfassung

160

5. Zusammenfassung

Epidemiologische Studien zeigten, dass eine Überexpression des HBVx-Gens und

eine Exposition mit dem cyanobakteriellen Hepatotoxin Microcystin wesentliche

Risikofaktoren bei der Entwicklung eines primären Hepatozellulären Karzinoms

(HCC) darstellen. Das HBx-Protein wirkt als pleiotroper Transaktivator dysregulierend

auf die Zellzyklus-Regulation und die verschiedenen Zellzyklus-assoziierten Signal-

Wege .

Die Tumorpromotion von Microcystin erfolgt möglicherweise über den sogenannten

Okadasäure-Pathway. Als Wirkstoff der Okadasäurestoffklasse kann Microcystin als

spezifischer Inhibitor der Proteinphosphatasen 1/2A maßgeblich in die Modulation

der Phosphorylierung zellulärer Proteine eingreifen und durch die �apparente

Aktivierung� von Proteinkinasen zur Akkumulation von Phosphoproteinen führen. Die

Akkumulation dieser Phosphoproteine bewirkt möglicherweise eine prolongierte

Aktivität von Proteinkinasen-assoziierten Signalkaskaden und führte schließlich zu

einer unkontrollierten Zellzyklus-Regulation.

Auch die mutmaßlich positive Wirkung von Microcystin auf die unphysiologische

Stabilität von Proteinen in der Zelle ist ein weiteres Indiz für die deregulierende

Wirkung des Hepatotoxins auf das zelluläre Geschehen.

In diesem Modell der Tumorpromotion scheinen insbesondere die Tumorsuppressor-

proteine putative Substrate für die biochemische Aktivität von Microcystin zu sein, da

sie im Zustand der Hyperphosphorylierung ihre Funktion als Tumorsuppressoren

verlieren. Im Rahmen dieser Studie wurde die kombinatorisch deregulierende

Wirkung von Microcystin und HBx auf die Zellzyklus-Regulation und Apoptose

untersucht.

Experimentell wurde zunächst die Wirkung und der �optimale Dosisbereich� von

Microcystin für das hier zum Einsatz kommende initiierte Hepatozytenkultursystem

mit Hilfe des Neutralrot-Vitalitätstestes bestimmt. Es konnte nach der Exposition der

HepG2-Zellen mit der eingesetzten maximalen Microcystin-Konzentrationen von

10 µM, abzüglich der DMSO-Effekte, der höchste Vitalitätsanstieg nachgewiesen

werden.

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Zusammenfassung

161

Die Wirkung von Microcystin auf die Phosphorylierung-, Stabilisierung- und Synthese

zellulärer Proteine wurde durch die Messung der Radioaktivität in radioaktiv

markierten HepG2-Gesamtzellproteinextrakten mit Hilfe der Szintillations-Messung

ermittelt.

Da Microcystin sowohl die Akkumulation von 32P-markierten zellulären Proteinen

fördert und auch eine stabilisierende Wirkung auf 35S-markierten Proteinen besitzt,

sollte weiter die Wirkung von Microcystin auf die Regulation der G1/S-Übergang der

Zellen im Zellzyklus näher zu betrachten. Dieser Übergang wird unter anderem durch

die Phosphorylierung-, Stabilisierung- und Synthese von regulatorischen Zellzyklus-

proteinen maßgeblich beeinflusst.

In den Microcystin-exponierten Proben wurde im Vergleich zu den Kontrollen mit

Hilfe der FACS-Analyse ein 100%iger Anstieg der Zahl der Zellen in der S-Phase

nachgewiesen.

Aufgrund der erhaltenen Resultate wurden weitere Experimente durchgeführt, die

dazu dienten, speziell die Wirkung von Microcystin auf die Stabilität von p53 und

Hyperphosphorylierung der Tumorsuppressorproteine (p53/ pRb) zu untersuchen. Es

bestand die Annahme, dass die Tumorsuppressorproteine p53 und pRb für

Microcystin putative zelluläre Angriffspunkte darstellen.

Mit Hilfe von Western-Blot-Analysen (WB) wurde gezeigt, dass Microcystin in einer

Konzentration von 10 µM signifikant einen Anstieg der zellulären p53-Konzentration

induziert. Die Fixierung von 32P-markiertem p53 sowie von 35S-markiertem pRb in

ihrem hyperphosphorylierten Zustand durch Microcystin konnte durch die

Immunpräzipitation nachgewiesen werden. Die Hyperphosphorylierung von p53 nach

einer Microcystin-Exposition wurde auch durch die Isoelektrische Fokussierung (IEF)

in Kombination mit der WB-Analyse verifiziert. Die Ergebnisse dieser Experimente

zeigten, dass Microcystin sowohl das p53-Protein stabilisiert als auch die

Tumorsuppressorproteine in ihrem hyperphosphorylierten Zustand fixiert, was im

Sinne von Fujiki (1992) mit einer möglichen funktionellen Inaktivierung der

Tumorsuppressorfunktion korreliert.

Um den Aspekt einer Microcystin-induzierten funktionellen Inaktivierung von p53

näher zu betrachten, sollte der möglicherweise protektive Charakter von Microcystin

vor UV-induzierten Zelltod-Prozessen in HepG2-Zellen durch den Trypanblau-Test

und der FACS-Analyse untersucht werden.

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Zusammenfassung

162

Der Trypanblau-Test ergab, dass die Präinkubation der Zellen mit Microcystin vor der

UV-Induktion im Vergleich zu den Kontrollen mit einer Reduktion des Anteils (%) toter

Zellen einhergeht. Auch die durchflusszytometrische Auswertung Propidium-Jodid

gefärbter HepG2-Zellen zeigte, dass eine Exposition der HepG2-Zellen mit

Microcystin vor einer UV-Bestrahlung zu einer Verringerung des Anteils (%)

apoptotischer Zellen führte. Der apoptotische Charakter der HepG2-Zellen wurde mit

der elektrophoretischen Darstellung der DNA-Fragmentierung bestätigt.

Um konkret zu überprüfen, ob die hier nachgewiesene protektive Wirkung von

Microcystin vor UV-induzierter Apoptose in HepG2-Zellen mit einer insuffizienten

nukleären Translokation von p53 korreliert, wurde der Einfluss von Microcystin auf

die UV-induzierte Kerntranslokation des p53-GFP-Proteins (Wt) analysiert.

Nach der UV-Induktion konnte durch die fluoreszenzmikroskopische Auswertung in

den Microcystin-exponierten Proben eine verminderte nukleäre Translokation des

p53-Fusionsproteins beobachtet werden. Diese verminderte nukleäre Lokalisation

des p53-GFP-Proteins nach der Microcystin Applikation war möglicherweise durch

eine funktionelle Inaktivierung von p53 bedingt, die womöglich durch die Fixierung

des Serin-Rest der Aminosäure 315 in seinem phosphorylierten Zustand und/ oder

durch die Microcystin-induzierte metabolische Stabilisierung von p53 verursacht

wurde.

Um weitere Hinweise auf eine funktionelle Inaktivierung von p53 und anderen

Zellzyklus-Regulatoren (pRb, E2F, c-Myc) nach einer Microcystin-Exposition zu

erhalten, wurde eine funktionelle Analyse mit verschiedenen Luciferase-Plasmiden

durchgeführt, die in ihrem cis-acting-Element ein DNA-Response-Motiv für jeweils

eines der Regulatorproteine enthalten. Der Einfluss von Microcystin auf die

Funktionalität dieser Proteine wurde durch Veränderungen der durch die

Regulatorproteine-vermittelte Expression des Luciferasegens nach der Microcystin-

Exposition bestimmt. In diesen Transfektionsexperimenten konnte gezeigt werden,

dass Microcystin sowohl die Funktionalität der Tumorsuppressorproteine p53 und

pRb als auch die Aktivität der von E2F und c-Myc signifikant beeinflusst.

Die p53-vermitttelte Expression des Reportergens Luciferase wurde nach der

Microcystin-Exposition der HepG2-Zellen signifikant reduziert. Die Abnahme der

Luciferase-Aktivität deutet auf eine Microcystin-vermittelte funktionelle Inaktivierung

von p53 hin.

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Zusammenfassung

163

Auf die Funktionalität von pRb hat das Hepatotoxin eine inhibierende Wirkung, die

pRb-vermittelte Expression des Luciferasegens nach der Microcystin-Exposition stieg

an.

Die Aktivitäten der Regulatorproteine E2F und c-Myc wurden durch Microcystin

gesteigert, es konnte eine Zunahme der Luciferase-Aktivität gemessen werden.

In transienten Cotransfektionsexperimenten mit einem der Luciferase-Plasmide und

dem pSVx-Expressionsvektor mit anschließend Exposition der HepG2-Zellen mit

Microcystin wurde darüber hinaus untersucht, welche kombinatorisch deregulierende

Wirkung Microcystin und HBx auf die Funktionalität der verschiedenen

Zellzyklusproteine haben. Die kombinatorische Wirkung der beiden Tumor-

promotoren auf die Aktivität der Tumorsuppressorproteine p53 und pRb lässt sich

anhand der gemessenen Luciferase- Aktivitäten als synergistisch inhibierend

bezeichen. Die Funktionalität von E2F wurde durch die Wirkung von HBx und

Microcystin additiv gesteigert. Die Aktivität von c-Myc konnte durch das

Zusammenwirken von HBx und Microcystin in seiner Aktivität synergistisch stimuliert

werden.

Zusammenfassend kann man sagen, dass sowohl die Tumorsuppressorproteine p53

und pRb als auch die Zellzyklus-assoziierten Proteine E2F und c-Myc wichtige

zelluläre Angriffspunkte für HBx und Microcystin bei der Tumorpromotion eines HCC

darstellen. In verschiedenen Versuchen wurde eine kombinatorisch deregulierende

Wirkung von HBx und Microcystin auf die Aktivität wichtiger Regulatoren des

Zellzyklus beobachtet. Das cyanobakterielle Hepatotoxin Microcystin und eine

Überexpression von HBx stellen somit wahrscheinlich wesentliche Risikofaktoren bei

der Entwicklung eines HBV-assoziierten HCC dar.

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Erklärung

185

Erklärung Hiermit bestätige ich, dass ich die vorliegende Dissertation selbständig verfaßt und nur die angegebenen Quellen und Hilfsmittel verwendet habe. Barnstorf, den 10. Oktober 2003

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I R I N A N I C K E L E I T

PERSÖNLICHE DATEN

Name: Nickeleit

Vorname: Irina Geburtsdatum: 01.12.66 Geburtsort: Bremen Familienstand: verheiratet

SCHULBILDUNG

1973 - 1977 Grundschule�Ellenerbrokweg Bremen 1977 - 1983 Orientierungsstufe-Graubündenerstr. Bremen 1983 - 1986 Oberstufe an der Walliser Str. Bremen

AUSBILDUNG

1986 - 1988 Lehranstalt für MTA- St. Jürgen Str. Bremen

BERUFSTÄTIGKEIT

8/ 1989 - 6/1991 Roland-Klinik (MS- Vertretung) Bremen

8/1991 - 1/1999 LaborärztlicheGemeinschaftspraxis Dres. Med. Nickel/Sandkamp Bremen

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STUDIUM

10/1992 - 1/1998 Biologiestudium an der Universität Bremen

1994/95 WS-1995/96 SS Projekt: Auswirkung der militärischen nutzung auf die heidelandschaft im Gebiet des Truppenübungsplatzes Garlstedt in Landkreis Osterholz bei Bremen

6/ 1997 - 12/1997 Diplomarbeit am Institut für Virologie:

Konstruktion und funktionelle Analyse nicht-infektiöser HAV- Replikons 01/1999 - 2/2002 wissenschaftliche Mitarbeiterin am Institut für Virologie mit der Möglichkeit zur Promotion: Thema: Analyse der Effekte des hepatotropen Cyanobakterientoxins Microcystin und HBV-X proteins auf die Zellzyklus-Regulation Der Disserationsvortrag fand am 11.12.03 statt 3/2002 - 12/2002 Mitarbeit am Projekt: Korrelation zwischen Bremen HAV und Zellzyklusproteinen 2002-2003 Mitarbeit am Forschungszentrum für Ozeanränder ;Arbeitsgruppe Prof. Dr. G. Wefer 2002-2003 Hochschule Bremen Internationaler Studiengang Angewandte Biologie (ISAB). Industrielle Mikrobiologie; Leitung Prof. Dr. T. Achstetter

WEITERBILDUNG

Interne Fortbildungsveranstaltungen der Laborpraxis Dres. med. Nickel/ Sandkamp Bremen

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BESONDERE INTERESSEN

Forschung, Ernährung, Natur, Kultur

HOBBYS

Sport, Gärtnern

Barnstorf, Dezember 2003 Irina Nickeleit