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Analyse der Effekte des hepatotropen Cyanobakterientoxins
Microcystin und des Hepatitis B- Virus- x Proteins auf die
Zellzyklus- Regulation
Dissertation
zur Erlangung des akademischen Grades
eines Doktors der Naturwissenschaften
-Dr. rer. nat.-
dem Fachbereich Biologie/Chemie
der Universität Bremen vorgelegt
von
Irina Nickeleit
Bremen 2003
Gutachter:
Frau Prof. Dr. Angelika Vallbracht, Bremen
Herr Prof. Dr. Hans Will, Hamburg
Tag des öffentlichen Kolloquiums: 11. Dezember 2003
Wenn wir uns ins Wissen, in die Wissenschaft begeben, geschieht es denn doch nur, um desto ausgerüsteter ins Leben wiederzukehren. Ideen zu einer Physiognomik der Gewächse von Alexander von Humboldt, Rezension
Danksagung
Ich möchte mich bei all den Menschen bedanken, die mich in den letzten Jahren begleitet und
unterstützt haben.
Meiner Familie, Gabriela und Reinhard Weiß und den lustigen ײ Pflanzen ײ möchte ich besonders
danken. Insbesondere Rainer Hans danke ich für die tatkräftige Unterstützung bei den LSM-
Aufnahmen.
Außerdem ein herzliches Dankeschön an Frau Petra Ahmann und Frau Katrin Wagner-Prigge für
die hilfreiche Unterstützung und zahlreichen Diskussionen.
Ganz besonders möchte ich mich bei Frau Iris Berk für die gemeinsame lehrreiche, intensive und
einmalige Zeit bedanken. Auch bei unseren Perlen Frau Matthies und Frau Mester bedanke ich
mich für die freundliche Unterstützung in allen Bereichen.
Frau Dr. B. Slagle (Houston, TX (USA)) und Frau Dr. J. Stommel (La Jolla, CA (USA)) danke ich
für die freundliche Überlassung von Arbeitsmaterialien.
Mein besonderer Dank gilt Frau Prof. Dr. A. Vallbracht, die diese wissenschaftliche Arbeit in der
Abteilung für Virologie der Universität Bremen ermöglichte. Insbesondere möchte ich mich für die
Unterstützung bei der schriftlichen Darstellung der ermittelten Daten und Fakten in dieser
komplexen Arbeit bedanken.
An Herrn Prof. Dr. L. Rensing vom Institut für Zellbiologie der Universität Bremen geht mein
besonderer Dank für die wertvollen Anregungen und Diskussionen .
Herrn Prof. Dr. H. Will vom Heinrich-Pette-Institut in Hamburg danke ich für seine freundliche
Unterstützung und für die Erstellung des Zweitgutachtens für diese Dissertation.
Abkürzungen
Abb. Abbildung
µ mikro
°C Grad Celsius
A.dest. destilliertes Wasser
Ak Antikörper
Amp Ampicillin - Resistenzgen
AS Aminosäuren bzw. Aminosäurenkette
ATM Ataxia telangiectasia mutated kinase
ATR A-T related kinase
bp Basenpaare
BSA Bovine Serum Albumin (Rinderserumalbumin)
CAK cyclin activating complex
cdk cyclin-dependent kinase
cDNA revers transkribierte DNA
Ci Curie
CK1/2 Casein-Kinase 1bzw.2
CKI Cyclin-abhängige-Kinase-Inhibitor
DNA-PK DNA-activated protein kinase
cm Zentimeter
CsCl Cäsiumclorid
dATP Desoxy - Adenosintriphosphat
dCTP Desoxy -Cytidintriphosphat
d Day
DEAE Diethyaminoethyl
DEPC Diethylpyrocarbonat
dGTP Desoxy - Guanosintriphosphat
DMEM Dullbecco`s modifiziertes Eagel `s Medium
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonukleinsäure
dNTP Desoxynukleosidtriphosdphat
ds Doppelstrang
dTTP Desoxythymidintriphospha
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
ERK extracellular ligand-regulated kinase
EtBr Ethidiumbromid
EtOH Ethanol
FCS Fötales Kälberserum
g Gramm
h Stunde
HBV Hepatitis B Virus
HBx Hepatitis B Virus X-Protein
IC50 halbmaximale Hemmkonzentration
IEF Isoelektrische Fokussierung
IgG Immunglobulin G
JNK Jun N-terminal kinase (syn.Stress Activated PK)
Kb Kilobasaen
Kbp Kilobasenpaare
l Liter
LB - Medium Luria - Bertani - Medium
LCPS Lumescense Count per Second
LSM Lasers-Scanning -Mikroskop
m milli
M Molarität
Mab Monoklonaler Antikörper
MAP Kinase mitogen-activated protein kinase
Mdm-2 Murine Double Minute-2 Protoonkogenprodukt
Met Methionin
mg Milligramm
min Minuten
mL Mililiter
mM Milimolar
mRNA messenger Ribonukleinsäure
MCYST Microcystin
n nano
NES nuclear export signal
nm Nanometer
NTR nichttranslatierte Region
NTS nuclear trabsport signal
OD Optische Dichte
ori origin of replication
p pico
PBS Phoshat- gepufferte isotonische Lösung
PCR Polymerase chain reaction
Pen Penicillin
pH negativer dekadischer Logarithmus der Wasserstoffionenkonzentration
PI isoelektrischer Punkt
PK Ser/Thr-spezifische Proteinkinase
PK-C (Ca2+ abhängige ) Proteinkinase C
PMSF Phenylmethylsulfonyfluorid
PP1 Phospho-Ser/Thr-spezifische Proteinkinase 1
PP2A Phospho-Ser/Thr-spezifische Proteinkinase 2A
pRb Retinoblastomprotein
RNA Ribonukleinsäure
RNase Ribonukleasen
rpm Umdrehungen pro Minute
RT PCR Reverse Transkription PCR
RT Raumtemperatur
s Sekunden
SD Standardabweichung
SDS PAGE Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid
SDS Natriumdodecylsulfat
Ser Serin
ss einzelsträngig
SSC Natriumcitrat
Strep Streptomycin
Tab. Tabelle
Taq Termus aquaticus
TBE Tris - Bor- EDTA
TBP TATA-Box bindenes Protein
TCA Trichloressigsäure
TE Tris - EDTA
TEMED N, N,N`, N´- Tetramethylethylendiamin
TF Transkriptionsfaktor
Thr Threonin
Tris Tris - (hydroxymethyl) - aminomethan
U Unitis/ Enzymaktivitätseinheiten
ÜN Übernacht - Kultur
UV Ultraviolettes
V Volt
v/v Volumen pro Volumen
Vol Volumen
w/v Gewicht pro Volumen
WAF wt-p53 induced factor
Wt Wildtyp
Involvement of Hepatitis B virus X protein and cyanobacteria hepatotoxin microcystin in the etiology of HBV- associated HCC
Abstract
Hepatocellular carcinoma (HCC) is one of the major cancers in China. Epidemiological studies have suggested synergistic interactions between chronic hepatitis B virus (HBV) infection and microcystin (MCYST) exposure in the etiology of hepatocellular carcinoma (HCC). Recent reserach has found that MCYST is a secondary metabolic of cyanobacteria (blue-green algae), a contaminant of pond-ditch water, a source of drinking water and a strong promoter of HCC. As a potent inhibitor of protein phosphatase 1 and 2A could probably induce the hyperphosphorylation of tumorsuppressor proteins, retinoblastoma protein and p53, including their associated cell cyle proteins. The MCYST- mediated hyper-phosphorylation of pRb and p53 in HepG2 cells was confirmed by protein analytical methods and functinal transfection analysis with a luciferase reportergen system. Hyperphosphorylation of tumor suppressor proteins, mediated through inhibition of protein phosphatase 1 and 2A are involved in the deregulation of the cell cycle and a biochemical alternativly pathway of tumor promotion. In addition to prove the possibility of MCYST- associated functional inactivation of p53 we performed apoptosis assays and to consider the influence of MCYST of the subcellular localization of p53 using a p53-GFP- transfection system. The human hepatitis B virus x-protein (HBx) is suspected to play a role in the hepatocarcinogenic process by virtue of its capacity to transactivate oncogenes and serveral other cellular genes. We demonstrated confirmed by transient transfection assays with diverse specific luciferase reportergen systems that HBx is be able to stimulates the cell cycle progression and influence the checkpionts controll. Finally, with cotransfection analyses in HepG2 we showed that that MCYST and HBx in combination deregulate the activity of cell cycle proteins such as p53,pRb, E2F and c-myc. Taken together, our results indicate that MCYST and HBx in an initiated human hepatoma cell culture system (HepG2) alone and in combination affected the activity of essential regulators of the G1 �phase of the cell cycle.These datas suggest a molecular mechanism by which MCYST and HBx likely contributes to viral carcinogenesis. By promoting the proliferation of altered hepatocytes, in selection of cells that are genetically unstabl, which would accumulate transforming mutations.
INHALTSVERZEICHNIS 1. Einleitung ....1
1.1 Allgemeiner Teil .......................................................................................................... 1
1.1.1 Epidemiologie des Hepatozellulären Karzinoms (HCC)........................................................ 1
1.1.2 Cyanobakterielle Hepatotoxine.............................................................................................. 3
1.1.3 Tumorgenese ........................................................................................................................ 5
1.2 Zellzyklus�Regulation ................................................................................................. 8
1.2.1 p53-Tumorsuppressorprotein .............................................................................................. 12
1.2.2 Retinoblastomaprotein......................................................................................................... 16
1.2.3 E2F-Transkriptionsfaktor ..................................................................................................... 18
1.2.4 Transkriptionsfaktor c-Myc................................................................................................... 19
1.3 Apoptose................................................................................................................... 21
1.4 Zelluläre Angiffspunkte von Hepatitis B-x Proteins (HBx)......................................... 23
1.5 Hepatotoxin Microcystin............................................................................................ 26
1.6 Fragestellung ............................................................................................................ 31
2 Material und Methoden ..33
2.1 Material ..................................................................................................................... 33
2.1.1 Zellen ................................................................................................................................... 33
2.1.2 Zellkulturmedium und Zusätze ............................................................................................ 33
2.1.3 Bakterien.............................................................................................................................. 33
2.1.4 Plasmide.............................................................................................................................. 33
2.1.5 Nukleotide, Nukleinsäuren................................................................................................... 35
2.1.6 RT PCR-Primer.................................................................................................................... 36
2.1.7 Enzyme, Antikörper und andere Proteine ........................................................................... 36
2.1.8 Chemikalien......................................................................................................................... 37
2.1.9 Puffer und Lösungen ......................................................................................................... 39
2.1.10 Kits..................................................................................................................................... 50
2.1.11 Verbrauchsmaterial ........................................................................................................... 51
2.1.12 Geräte und andere Hilfsmittel............................................................................................ 51
2.1.13 Radiochemikalien .............................................................................................................. 53
2.2 Methoden.................................................................................................................. 54
2.2.1 Kultivierung von Zell-Linien ................................................................................................. 54
2.2.2 Kryokonservierung von Zellen............................................................................................. 54
2.2.3 Gewinnung und Reinigung von Nukleinsäuren ................................................................... 54
2.2.4 Photometrische Konzentrations-, Stoffmengen-und Reinheitsbestimmung
von Nukleinsäuren............................................................................................................... 56
2.2.5 Enzymatische Modifikation von Nukleinsäure..................................................................... 56
2.2.6 Vermehrung und Gewinnung von Plasmid DNA ................................................................. 57
2.2.7 RT-RCR zum Nachweis von HBx-RNA............................................................................... 59
2.2.8 Vitalitäts-Test ....................................................................................................................... 60
2.2.9 radioaktive Markierung ........................................................................................................ 62
2.2.10 Quantifizierung von Proteinen........................................................................................... 63
2.2.11 Darstellung und Auswertung von Proteingelen ................................................................ 64
2.2.12 Methoden der Proteinanalystik ......................................................................................... 65
2.2.13 Protein-Färbungen ........................................................................................................... 67
2.2.14 Funktionsanalyse .............................................................................................................. 68
2.2.15 Zellzyklus-Apoptose- Analytik ........................................................................................... 69
2.2.16 Laser-Scanning-Mikroskopie (nach Fa. Clontech) ........................................................... 71
2.2.17 Statistik .............................................................................................................................. 71
3 Resultate ..72
3.1 Einfluss von Microcystin auf die Vitalität und Metabolismus von HepG2-Zellen....... 72
3.1.1 Einfluss von Microcystin auf die Vitalität von HepG2-Zellen ............................................... 72
3.1.2 Microcystin-assoziierte Phosphorylierung und Stabilisierung von zellulären Proteinen ..... 74
3.1.3 Effekte von Microcystin auf die S-Phaserate....................................................................... 77
3.2 Einfluss von Microcystin auf die metabolische Stabiltität von p53 ........................... 79
3.2.1 Wirkung von Microcystin auf die Stabilität von p53 (Western-Blot- Analyse) ................... 79
3.2.2 Einfluss von Microcystin auf die Stabilität von 35S-Methionin markiertem p53 .................... 81
3.3 Einfluss von Microcystin auf die Hyperphosphorylierung von p53 und pRb ............. 82
3.3.1 Microcystin�induzierte Hyperphosphorylierung von 32 P-markiertem P53 ........................... 82
3.3.2 Nachweis von hyperphosphoryliertem p53 über die Isoelektrische Fokkussierung (IEF)... 84
3.3.3 Einfluss von Microcystin auf die Hyperphosphorylierung von pRb ..................................... 86
3.4 Die protektive Wirkung von Microcystin vor UV-induzierter Apoptose...................... 88
3.5 Einfluss von Microcystin auf die Kerntranslokation von p53 ..................................... 94
3.6 Funktionelle Analyse des Effektes von Microcystin auf die Zellzyklus-Regulation ... 98
3.6.1 Effekte von Microcystin auf die Funktionalität von p53 ........................................................ 99
3.6.2 Effekte von Microcystin auf die Funktionalität von pRb ..................................................... 102
3.6.3 Effekte von Microcystin auf die Funktionalität von E2F..................................................... 104
3.6.4 Effekte von Microcystin auf die Funktionalität von c-Myc.................................................. 106
3.7 Analyse der Effekte von Microcystin und HBx auf die Zellzyklus-Regulation ......... 108
3.7.1 Effekte von Microcystin und HBx auf die Funktionalität von p 53 ...................................... 110
3.7.2 Effekte von Microcystin und HBx auf die Funktionalität von pRb ...................................... 115
3.7.3 Effekte von Microcystin und HBx auf die Funktionalität von E2F...................................... 118
3.7.4 Effekte von Microcystin und HBx auf die Funktionalität von c-Myc................................... 121
4 Diskussion 125
4.1 Microcystin-assoziierte Protein-Phosphorylierung,-Stabilisierung und -Synthese .. 127
4.2 Microcystin-vermittelte Stabilität und Phosphorylierung von p53 und pRb ............. 131
4.3 Protektive Wirkung von Microcystin vor UV-induzierter Apoptose ......................... 136
4.4 Darstellung der Effekte von Microcystin auf die Zellzyklus�Regulation.................. 144
4.4.1 Wirkung von Microcystin auf die Regulation der G1/S- Phase des Zellzyklus .................. 144
4.4.2 Wirkung von Microcystin und HBx auf die Aktivität von Regulatoren des Zellzyklus........ 147
5 Zusammenfassung 160 6 Literaturverzeichnis 164
Einleitung
1
1. Einleitung
1.1. Allgemeiner Teil
1.1.1. Epidemiologie des Hepatozellulären Karzinoms (HCC)
Das Hepatozelluläre Karzinom (HCC) ist der weltweit am vierthäufigsten
vorkommende maligne Tumor des Menschen. Jährlich werden mehr als 250.000
Tumore diagnostiziert und weniger als 3 % von diesen Patienten überleben fünf oder
mehr Jahre (Madden et al., 2001). Während die Menschen in Europa und Amerika
eher selten ein HCC entwickeln, liegt die Tumor-Prävalenz in Asien und Afrika
signifikant höher (Hann, 1998; Lemon and Shapiro, 1992). Die Entwicklung eines
Leberzellkarzimons wird als mehrstufiger Prozess verstanden, der durch multiple
Faktoren induziert und gefördert wird. Wichtige Risikofaktoren bei der
Hepatokarzinogenese scheinen neben der chronischen Infektion mit dem Hepatitis B-
Virus (HBV), verschiedene Kofaktoren wie Umweltgifte (Aflatoxin B1), durch
Alkoholkonsum bedingte Leberzirrhose und chronisch entzündliche regenerative
Vorgänge der Leber darzustellen (Barraud, et al., 1999; Jia et al., 1999; Yan et al,
1996) (Abb.1.1)
Abb. 1.1: Modell für die Rolle von HBV in der Entwicklung eines Hepatokarzinoms (Butel et al.,
1996)
Einleitung
2
Ein primärer Risikofaktor bei der Entstehung eines HCC ist die chronische Infektion
mit dem Hepatits B-Virus (Lemon and Shapiro., 1992; Madden, 2001). Das humane
Hepatits B-Virus (HBV) ist ein partiell doppelsträngiges DNA-Virus, das durch die
reverse Transkription von prägenomischer RNA repliziert und einen ausge-
sprochenen Leberzelltropismus aufweist (Choi et al., 2001). Die durch das HB-Virus
verursachte Hepatitis B-Infektion kann asymptomatisch, akut oder fulminant
verlaufen und im Ergebnis zur vollständigen Ausheilung, asymptomatischem HBsAg-
Trägertum oder zu einer chronischen Hepatitis führen (Abb. 1.2).
Abb. 1.2: Verschiedene Verlaufsformen einer HBV-Infektion (aus Meisel, 1993b)
Epidemiologische und molekularbiologische Analysen können eindeutig eine
Korrelation zwischen der chronischen HBV-Infektion und dem Auftreten des
Hepatozellulären Karzinoms (HCC) dokumentieren (Feitelson et al.,2002; Schlauder
et al.,1995). In den HBV-Hyperendemiegebieten Afrikas und Ostasiens werden 80 %
der manifestierten HCC als Resultat einer chronischen HBV-Infektion bewertet.
Chronische HBV- Träger entwickeln über 200 mal häufiger ein HCC (Butel et al.,
1996). Während einer chronischen Infektion wird die HBV-DNA häufig in die
Hepatozyten-DNA integriert.
Einleitung
3
Die Integration der HBV-DNA dürfte zu einer Synthese von Virus-Zell-Proteinen mit
transformierenden Eigenschaften führen (Chang et al., 2001; Takada and Koike,
1990), die einen deregulierenden Einfluss auf die zelluläre Aktivität besitzen (Becker
et al., 1998; Chirillo et al., 1997; Feitelson et al.,1993, 1998; Kaufmann and
Kaufmann,1993; Takada et al.,1997; Slagle et al., 1994; Wang et al., 1994).
Die Frage, welche Wirkung die simultane Exposition von Kofaktoren auf die
Pathogenese eines HBV-assoziierten HCC hat, wird in verschiedenen Studien
diskutiert. Epidemiologische Studien postulieren eine synergistische Interaktion
zwischen einer chronischen Hepatitis B-Infektion und der Exposition mit Aflatoxin B1
(AFB1) in der Ätiologie eines Hepatozellulären Karzinoms (HCC), obgleich der
molekulare Mechanismus dieser Interaktionen noch nicht ganz verstanden ist
(Barraud et al., 1999; Cullen et al., 1990; Sell et al., 1991; Yan et al., 1996). Für
Individuen mit chronischer HBV-Infektion mit gleichzeitiger Aflatoxin-Exposition
erhöht sich die Wahrscheinlichkeit ein HCC zu entwickeln um das Dreifache (Madden
et al., 2001).
Neben den Aflatoxinen wird in jüngster Zeit auch das cyanobakterielle Hepatotoxin
Microcystin, als Kofaktor bei der Entwicklung eines HBV-assoziierten HCC eingestuft
(Yu, 1995). Ein Vergleich der Trinkwasserqualität zwischen Regionen Chinas
miteiner erhöhten HCC-Prävalenz und einer niedrigen HBV-Trägerschaft zeigte, dass
in den HCC-Hyperendemiegebieten deutlich höhere Konzentration von Microcystin
(MCYST) im Trinkwasser vorliegen. Welcher molekulare Mechanismus sich
möglicherweise hinter einer kombinatorischen Wirkung von Microcystin und dem
Auftreten chronischer Hepatits B-Virus-Infektionen bei der Hepatokarzinogenese
verbirgt, sollte in dieser Studie untersucht werden.
1.1.2. Cyanobakterielle Hepatotoxine
Cyanobakterien sind etwa 3,5 Milliarden Jahre alt, kommen vorwiegend im
Süsswasser sowie in Meeren vor und sind als Primärproduzenten wichtige Glieder
der Nahrungsketten (Fleming et al., 2000; Gilroy, 2000). Allerdings gibt es auch
toxische Vertreter unter den Cyanobakterien.
Einleitung
4
Eine besondere Gefährdung geht von den toxischen Cyanobakterien aus, wenn sie
aufgrund bestimmter Umwelt-bedingungen (Eutrophierung) im Gewässer in Massen
auftreten. Massenentwicklungen von Cyanobakterien werden als �Algenblüten�
bezeichnet (Chorus and Bartram, 1999; Oliver and Ganf, 2000). Die Hepatotoxine
sind bioaktive Sekundärmetaboliten toxischer Cyanobakterien (Sivonen and Jones,
1999). Eine naheliegende Bedeutung der Toxine könnte in der Abwehr von
Wasserflöhen und anderen Vertretern des Zooplanktons liegen, die sich u.a. von
Cyanobakterien ernähren (Rohrlack et al., 1999). Ein weltweit im Süsswasser
verbreiteter Toxinproduzent ist Microcystis aeruginosa, eine einzellige
Cyanobakterienart. Das toxische Produkt dieser Art wird als Microcystin bezeichnet
und stellt einen potenten Tumorpromotor dar (Hirai et al., 1991; Rohrlack et al., 1999;
Watanabe et al., 1988). Bislang sind mehr als sechzig verschiedene Microcystine
identifiziert worden, die sich anhand ihres Gehaltes an zwei variablen L-Aminosäuren
an den Positionen 2 und 4 sowie in Modifikationen aller sieben Aminosäuren
unterscheiden (Sivonen and Jones., 1999). Die am häufigsten in Süsswasser
auftretende Variante ist Microcystin-LR.
Abb. 1.3: Strukturformel Microcystin (MCYST)- LR (Fujiki, H. and Suganuma, M.,1993)
Microcystin wird von den Menschen über das Trinkwasser aufgenommen und
gelangt über den Magen in das Ileum, von dort wird es über die Blutbahn in die
Hepatozyten transportiert und akkumuliert. Die chronische Exposition von
Microcystin�LR geht bei den Menschen mit einer Gefährdung der Gesundheit einher.
Bei Microcystin-exponierten Individuen werden Magen- und Darm-Reizungen, sowie
vor allem Leberschädigungen diagnostiziert (Gilroy., 2000; Kuiper-Goodman et al.,
1999).
Einleitung
5
1.1.3. Tumorgenese
Die Entwicklung eines Hepatozellulären Karzinoms (HCC) ist, wie erwähnt, ein durch
Mutationen verursachter mehrstufiger Prozess, der mit vielfältigen weiteren
Veränderungen der Genexpression assoziiert ist, die mit dem Auftreten und der
Progression eines Tumors korrelieren. Bei vielen Tumor-Typen können Mutationen
im p53-Gen bzw. die funktionelle Inaktivierung des p53-Proteins diagnostiziert
werden, so auch bei der Ätiologie eines HCC (Greenblatt et al., 1997; Hollstein et al.,
1991; Robinson, 1994; Slagle et al., 1994; Ueda et al., 1995). Die chronische
Exposition mit dem Hepatokarzinogen Aflatoxin B1 wird als ein wesentlicher Induktor
von p53-Gen-Mutationen verstanden (Bressac et al., 1991; Hsu et al., 1991). Durch
eine Anzahl viraler Proteine von DNA-Tumorviren, die das p53-Protein binden, wird
die funktionelle Inaktivierung von p53 induziert (Levine, 1990). Diese und andere
Modifikationen können mit der Stimulation der Expression von G1-Cyclinen und
Hemmung von Cyclin-abhängigen Kinasen (CdK´s) einhergehen, was zur Deregu-
lation von wichtigen Kontrollpunkten des Zellzyklus oder zum Verlust von Apoptose-
Prozessen führen kann (Sherr, 1996).
Die Rolle des Hepatits B-Virus (HBV) bei der Enstehung eines HCC scheint sehr
komplex zu sein, und die in Frage kommenden Virus-vermittelten Mechanismen
können von direkter und/ oder indirekter Natur sein. Als zentrales Ereignis auf dem
Weg zur Entwicklung eines HBV-assoziierten HCC gilt die im Verlauf einer
chronischen HBV-Infektion zufällige Integration von Sequenzen des x-Gens in das
Wirtsgenom (Murakami et al., 1994; Poussin et al., 1999). Das Ereignis der
Integration der HBV-DNA in das Wirtsgenom ist assoziiert mit chromosomalen
Modifikationen (Feitelson et al., 2002; Takada and Koike, 1990) und dem Verlust von
Allelen, die letztendlich zu einer Aktivierung von Onkogenen und/ oder einer
Inaktivierung von Tumorsuppressorproteinen führen können. Die Integration des
HBV-Genoms in HepG2-Zellen führt zu einer chromosomalen Instabilität (Hino et al.,
1991). Bei den meisten HBV-Trägern, die Symptome wie Leberzirrhose und
Dysplasie aufweisen, wurde das HBx-Protein im Nukleus von Hepatozyten
nachgewiesen (Wang et al., 1991).
Einleitung
6
Die nukleäre Lokalisation von HBx in Hepatozyten ist vermutlich ein wichtiger Schritt
in der Hepatokarzinogenese, da es dadurch möglicherweise zu Interaktionen mit
verschiedenen Transkriptionsfaktoren oder zellzyklusspezifischen Proteinen kommt
(Benn and Schneider, 1994; Caselmann, 1996; Maguire et al., 1991).
Eine HBx-induzierte Transformation sowohl von NIH3T3-Zellen (Shirakata et al.,
1989) als auch von einer normalen Hepatozyten-Zell-Linie der Maus (Hohne et al.,
1990) wurde beobachtet. Auch die Neigung eines persistent HBx-Gen exprimieren-
den Maus-Stammes zur Karzinombildung (Kim et al., 1991), weisen dem HBx-Protein
eine signifikante Rolle in der Pathogenese eines HCC zu.
Immunohistochemische Studien dokumentieren sogar eine direkte Korrelation
zwischen der Expression des HBx-Gens und dem Ausmaß einer chronischen
Hepatitis (Feitelson, 1998). Der Grund für diesen positiven x-Protein assoziierten
Einfluss auf die Pathogenese einer HBV-Infektion ist vermutlich eine hohe
Expression des x-Proteins, die durch den Verlust der Autorepression nach der
Integration erfolgt (Murakami et al., 1994; Poussin et al., 1999). In verschiedenen
Studien wird dem HBx-Gen ein onkogenes Potential zugesprochen, da die x-Region
der HBV-DNA die genetische Instabilität (Hino et al., 1991) fördert und das
Translationsprodukt des x-Gens (HBx) die Fähigkeit zur Transaktivierung von
zellulären Genen besitzt (Aufiero and Schneider, 1990; Barnabas et al., 1997; Benn
and Schneider, 1994; Cheong, et al., 1995). Die möglichen zellulären Angriffspunkte
des pleiotropen Transaktivators sind vermutlich die regulatorischen Proteine des
Zellzyklus.
In gewissen Regionen der Welt dürfte das Auftreten von verschiedenen
Umweltkarzinogenen eine fördernde Rolle bei der Entwicklung eines HBV-
assoziierten HCC spielen (Butel, et al., 1996; Cullen et al., 1990; Sell et al., 1991;
Yan et al., 1996) (Abb. 1.4).
Einleitung
7
Abb. 1.4: Interaktion von Hepatitis, Aflatoxin und Microcystin in der Initiation oder Promotion eines HCC (Yu, 1995)
Der synergistische Beitrag dieser zwei Faktoren bei der Hepatokarzinogenese gibt
Anlass zur Spekulation, dass Hepatokarzinogene bei chronisch HBV-infizierten
Menschen eine besonders schädliche Wirkung entfalten (Butel et al., 1996). Ver-
mutlich bieten die bei einer chronischen Hepatitis B-Infektion aufgrund von immer
wieder auftretenden Phasen der Virus- und HBs-Ag-Synthese entstandenen
Leberläsionen, den Karzinogenen ein besonders günstiges zelluläres Milieu (Hagen
et al., 1994).
In Tiermodellen konnten die synergistischen Effekte einer Aflatoxin B1 (AFB1)-
Exposition und einer HBV-Infektion bei der Ätiologie des HCC bestätigt werden
(Barraud et al., 1999; Sell et al., 1991; Yan et al., 1996). Epidemiologische Studien
aus HCC-Hyperendemiegebieten weisen daraufhin, dass auch die chronische
Exposition mit cyanobakteriellen Hepatotoxinen (Yu, 1995) als bedeutender
Risikofaktor bei der Entstehung und Progression eines HBV-assoziierten Leberzell-
karzinoms eingestuft wird (Fujiki, 1992). In Regionen Chinas mit hohen Microcystin-
Konzentrationen im Trinkwasser entwickelten die Menschen achtmal häufiger ein
HCC als in Regionen, die eine bessere Trinkwasserqualität aufwiesen (Yu, 1995).
Möglicherweise korreliert die chronische Exposition mit Microcystin durch das
Trinkwasser mit der Entwicklung eines humanen Hepatokarzinoms.
Einleitung
8
Auch hier schaffen vermutlich die virusbedingten chronischen Hepatozytenläsionen
die erforderliche Initiation für die Microcystin-assoziierte Tumorpromotion. Die
Aktivität von Tumorpromotoren kann sich förderlich auf die Zellproliferation auswirken
oder zu einer Schwächung der Immunreaktion führen (Fujiki, 1992; Fujiki and
Suganuma, 1993). Microcystin kann womöglich aufgrund seiner biochemischen
Aktivität als spezifischer Inhibitor der Proteinphosphatasen PP1/ PP2A zur
Deregulation von Zellzyklus-Kontrollmechanismen führen.
Einige denkbare Microcystin-abhängige Ereignisse, die sich förderlich auf die
zelluläre Aktivität und Transformation auswirken, könnten neben der Aktivierung des
MAPK-Signalweges auch die Induktion von unkontrollierten Zellzyklus-abhängigen
Prozessen sein. In diesem Kontext erhebt sich die Frage, ob möglicherweise
synergistische Effekte des pleiotropen Transaktivators HBx- und des Hepatotoxins
Microcystin als spezifischer Inhibitor der Proteinphosphatasen 1/2A bei der
Leberzellkarzinogese bestehen. Obgleich bislang diesbezüglich noch keine
experimentellen Daten vorliegen, sind aufgrund der biochemischen Eigenschaften
des HBx-Proteins und Microcystins kombinatorische Effekte der beiden
Tumorpromotoren auf die Zellzyklus-Regulation als Ursache für die Entwicklung und
Progression eines Hepatozellulären Karzinoms vorstellbar.
1.2. Zellzyklus�Regulation
Alle eukaryotischen Zellen besitzen ähnliche Kontroll-Mechanismen, die die
Progression des Zellzyklus zu regulieren. Die Kontrolle des Zyklus ist erforderlich, um
bei ungünstigen Wachstumsbedingungen oder bei auftretenden DNA-Schäden die
Progession anzuhalten und die Integrität und Stabilität des zellulären Genoms zu
bewahren. Insbesondere die Signalwege zur Regulation der G1-Phase haben dabei
eine essentielle Funktion (Gana and Reddy, 1995). Generell wird der Übergang der
Zellen von der G1- in die S-Phase des Zellzyklus durch eine Anzahl von spezifischen
Cyclin-abhängigen Kinasen (CdK 2,4,6) in Assoziation mit den Cyclinen (A, D, E)
reguliert (Alt et al., 2000), die vor allem die Aktivität von G1-Phase Proteinen wie Rb,
E2F und c-Myc über die Modulation ihres Phosphorylierungsmusters regulieren (Alt
et al., 2000).
Einleitung
9
Auch den Zellzyklus-stimulierende MAPK-Signalweg kann ebenfalls durch die
Modulation des Phosphorylierungsmusters des Retinoblastomaproteins mit Hilfe von
phasenspezifischen Cyclin-abhängigen Kinasen (CdK) die G1-Phase aktivieren (Dulic
et al., 1992) (Abb. 1.5.).
Abb. 1.5: Zellzyklus-Regulation (Lania et al., 1999 )
Über verschiedene Kinase-Inhibitorproteine wird die Aktivität der Cyclin-abhängigen
Kinasen gehemmt (Peter and Herskowitz, 1994). Die Inhibitoren unterbinden die zur
Aktivierung der Kinasen erforderliche Assoziation mit den Cyclinen. Der bekannteste
Vertreter der Kinase-Inhibitorproteine ist das p21-Protein, das an alle G1-aktiven
CdK-Moleküle bindet. Die p21-Gen-Expression wird maßgeblich durch das p53-
Protein initiiert (Dulic et al., 1994). Am Ende der G1-Phase ist ein sogenannter G1-
Restriktionspunkt lokalisiert, der die Übergang der Zellen von der G1- in die
Synthese-Phase (S-Phase) kontrolliert (Hullmann and Boostra, 2001).
Einleitung
10
An diesem Kontrollpunkt kommt es als Antwort auf gentoxischen Stress oder bei
ungünstigen zellulären Wachstumsbedingungen durch die Aktivität von p53 oder von
pRb, die die wichtigsten Hauptregulatoren der G1-Phase darstellen, zur G1-
Arretierung der Zellen oder zur Induktion von Apoptose. Den Zellen wird der Eintritt in
die S-Phase des Zellzyklus blockiert, um so die Akkumulation und Fixierung von
Mutationen in der Synthese-Phase des Zellzyklus zu verhindern. Das Prinzip eines
wichtigen G1- Kontrollmechanismus nach einer Stress-Induktion von p53 ist in Abb.
1.6 dargestellt.
Abb. 1.6: Induktion eines G1-Zellzyklus-Arrestes durch p53 (Sionov and Haupt., 1999)
Mit Hilfe von p53 (Wt) wird das Auftreten von DNA-Schäden registriert und
entsprechende Maßnahmen wie ein G1-Arrest oder Apoptose initiiert. Der p53-
vermitttelte G1-Arrest wird nach DNA-Schäden induziert, um den Zellen die
Möglichkeit zu geben, diese zu reparieren und so unter anderem den Anfängen
neoplastischen Wachstums entgegen zu wirken (Dulic,et al., 1994). Das p53-
Molekül besitzt auch die Fähigkeit indirekt eine G1-Arretierung der Zellen über das
Retinoblastomaprotein zu induzieren (Price et al., 1995). Das wichtigste
transkriptionelle Target von p53 ist dabei das p21-Gen (Bouvard et al., 2000; El-Deiry
et al., 1993), das ein 21 kD Inhibitorprotein der Cyclin-abhängigen Kinasen codiert.
Einleitung
11
Das p21- Protein hemmt die Aktivität der Cyclin-abhängigen Kinasen, die das Rb-
Gen-Produkt phosphorylieren. In der hypophosphorylierten Form sequestriert das
pRb den Transkriptionsfaktor E2F, wodurch die Übergang der Zellen von der G1-
Phase in die S-Phase verhindert wird (Prives and Hall, 1999; Sionov and Haupt,
1999).
Auch über den MAP-Kinase-Pathway kann ein G1-Arrest der Zellen als Antwort auf
einen Mangel an Wachstumsfaktoren induziert werden (Abb. 1.7). Die Arretierung der
Zellen in der G1-Phase erfolgt hier direkt über die Hemmung der Rb-Kinasen
(Hullmann and Boonstra, 2001).
Abb. 1.7: Regulation der Retinoblastomaprotein-Phosphorylierung über den MAPK-Pathway
(Hullemann and Boonstra, 2001)
Einleitung
12
Nach der Applikation eines mitogenen Stimulus wird der Zellzyklus-Arrest durch die
Phosphorylierung von pRb aufgehoben, und es erfolgt der Übergang der Zellen in die
Synthese-Phase. Desweiteren erfolgt die Eliminierung von defekten Zellen mittels
des programmierten Zelltodes (Apoptose) immer dann, wenn die Intensität der
Stress-Schäden so stark ansteigt, dass die zellulären Stress-Antworten nicht mehr in
der Lage sind diese Schäden zu kompensieren. Die Initiation der Apoptose kann
dabei sowohl p53-abhängig (Sionov and Haupt, 1999) oder auch über einen p53-
unabhängigen Pathway (Herwig and Strauss, 1997) eingeleitet werden.
1.2.1. Tumorsuppressorprotein p53
In mehr als 50% der humanen Tumore werden p53-Gen-Mutationen oder die
Inaktivierung von p53 durch die Interaktion mit zellulären oder viralen Proteinen
beobachtet (Levine, 1990). Das Tumorsuppressorprotein ist ein multifunktionelles
Protein, das als Antwort auf verschiedenartige Stress-Signale (DNA-Schäden;
Hypoxie; virale Infektionen etc.) (Chen et al., 1996; Giaccia and Kastan, 1998;
Kastan et al, 1991; Kastan, 2001) verschiedene Funktionen in der Zellzyklus-
Kontrolle, DNA-Reparatur, DNA-Rekombination, Initiation von Apoptose wahrnimmt
(Bates and Vousden, 1999; Kapoor and Lozano, 1998; Ko and Price, 1996). Diese
Funktionen werden von p53 durch verschiedene Aktivitäten als Transkriptionsfaktor
(TF), bei einer Transrepression, bei DNA-Annealing und als 3´-5´-Exonuklease
vermittelt (Janus et al., 1999; Levine, 1997; Prives and Hall,1999; Stein and Liang,
2002). Auch zelluläre und virale Proteine beeinflussen die Funktion von p53 (Attardi
and Jacks, 1999; Deppert et al., 1987). Als Antwort auf Stress-Signale erfolgen im
p53-Protein posttranslationale Modifikationen, die die Tetramerisierung, die
metabolische Stabilität, die biochemische Aktivität und die subzelluläre Lokalisation
von p53 wesentlich beeinflussen (Jayaraman and Prives, 1999, Martinez et al., 1997;
Meek et al., 1997; Shaulsky et al., 1990).
Eine entscheidende Rolle kommt dabei dem Phosphorylierungsmuster von p53 zu.
Die Phosphorylierung am p53-Protein erfolgt an zahlreichen Serin-Resten in den
Amino- und Carboxy- terminalen Dömanen, während die zentrale Domäne
anscheinend frei von posttranslationalen Modifikationen bleibt.
Einleitung
13
Die Phosphorylierung der zahlreichen Serin- Reste des p53-Proteins in vitro und in
vivo wird von der Casein-Kinase 1 (Serin 6 und 9), DNA-PK (Serin 15 und 37;) ATM
und ATR (Serin 15), CdK-activating Kinase (CAK) (Serin 33; Ko et al., 1997), CdK2
und Cdk2 (Serin 315; Addison, et al., 1990; Bischoff et al., 1990; Price et al., 1995),
Protein-Kinase C (Serin 378) und Casein Kinase 2 (Serin 392) katalysiert (Appella
and Anderson, 2001; Hupp,1999; Meek et al.,1997).
Die Dephosphorylierung der entsprechenden Serin-Reste wird vermutlich
maßgeblich durch die Aktivität der Proteinphosphatasen (PP) 1 und 2A katalysiert
(Brautigan et al., 1990; Li et al., 2000). Takenaka et al. (1995) beobachteten, dass
die Aktivierung eines latenten rekombinierten p53-Proteins durch die
Phosphorylierung von Proteinkinase C nach der Behandlung mit der Protein-
Phosphatase 1 und 2A revertiert wurde.
In normalen ungestressten Zellen unterliegt das p53 (Wt)- Protein in der G1-Phase
einem ständigen nukleären Export (Ferrigno and Silver, 1999). Während der S- oder
G2-Phase befindet sich das p53-Protein überwiegend im Cytoplasma (Stommel et
al.,1999). In Folge einer Stress-Induktion wird das ansonsten in geringer Konzen-
tration konstitutiv exprimierte p53 (Sionov and Haupt, 1999; Stommel et al., 1999)
metabolisch stabilisiert und transloziert oder verbleibt im Nukleus (Sakaguchi et al.,
1997), wo es seiner Funktion nach als Transkriptionsfaktor die Transkription
verschiedener p53-Zielgene induziert oder reprimiert (El-deiry et al., 1993), um so
einen G1-Arrest oder Apoptose einzuleiten (Sionov and Haupt, 1999). Die Arretierung
der Zellen in der G1-Phase verhindert, wie erwähnt, nach auftretenden DNA-
Schäden den G1-/S-Übergang der Zellen und hilft so die Fixierung von Mutationen in
der Synthese-Phase des Zellzyklus zu vermeiden (Appella and Anderson, 2001). Die
p53-vermitttelte Induktion des programmierten Zelltods (Apoptose) und damit die
Eliminierung geschädigter Zellen erfolgt, wenn das Ausmaß der Schädigung die
Reparaturkapazität der Zelle überschreitet.
Verschiedene Strategien der chemischen oder physikalischen Anti-Tumor-Therapie
machen sich das Prinzip der DNA-Schaden vermittelten Induktion von p53 zu eigen,
um die Tumorzelle mittels Apoptose zu eliminieren (Rubbi and Milner, 2000).
Einleitung
14
Die Fähigkeit des p53-Tumorsuppressorproteins, sich im Cytoplasma und/ oder
Nukleus aufzuhalten, ist abhängig von der zellulären Situation (Knippschild, et al.,
1996; Shaulsky et al., 1990), und wird über das in der C-terminalen Domäne
lokalisierte Strukturmotiv für die Tetramerisierung (AS 326-356), die drei nukleären
Translokationssignale (NLS) (AS 316-325; AS 369-375; AS 375-384) und das
nukleäre Exportsignal (NES) (AS 340-351) reguliert (Middeler et al., 1997; Stommel
et al., 1999). Zur Regulation der subzellulären Verteilung des p53-Proteins haben
Sionov and Haupt (1999) folgendes Modell entworfen (Abb. 1.8).
Abb. 1.8: Modell für die Regulation der subzellulären Verteilung von p53 (Sionov et al. 2001)
Das Tumorsuppressorprotein wird durch die Interaktion mit Mikrotubulin und dem
Proteinmotor Dynein in den Nukleus importiert.
Einleitung
15
Dieser Import wird vermittelt durch die Interaktion des nukleären
Lokalisationssignales (NLS) mit dem nukleären Rezeptormolekül Importin α. Im
Nukleus wird das p53 in schmale Strukturen, so- genannte promyeloische Leukämie-
Protein-Nuclear Bodies (PML-NB) sequestriert. Diese Strukturen enthalten Proteine,
wie PML, Sumo-1, p300/CBP und HMG1, die in die Transkription-Regulation
involviert sind. Einige Formen der PML binden und verstärken die transkriptionale
Aktivität durch die Rekrutierung des Koaktivators p300/ CBP. Die p300/ CBP-
vermittelte Acetylierung des p53 an der Aminosäure (AS) Lys 382 führt schließlich zu
einer kompletten Aktivierung des p53- Moleküls als Response auf Stress (Guo et al.,
2000). Da die Überexpression von PML Apoptose induziert, dürfte dieser
Proteinstruktur eine zentrale regulatorische Rolle in der p53-vermitttelten Antwort auf
Stress zukommen. Der Export aus dem Nukleus erfolgt über die Mdm2 vermittelte
Ubiquitinisierung, die mit einer Freilegung des nukleären Export-Signales (NES)
einhergeht. Durch die Interaktion des nukleären Rezeptormoleküls CRM1 mit der
NES erfolgt schließlich der nukleäre Export.
Die Modulation der subzellulären Lokalisation des p53- Moleküls scheint dabei vor
allem durch die Phosphorylierung von Serin 315 durch die CdK2-Kinase zu erfolgen
(Denko et al., 2000; David-Pfeuty et al., 1999). Das phosphorylierte Serin 315 ist für
die transkriptionelle Aktivität von p53 weniger von Bedeutung, was auf eine andere
regulatorische Funktion dieser Phosphorylierung bei der p53-Aktivität hindeutet
(Addison et al., 1990; Price et al., 1995). Die CdK2-Kinase ist in der frühen G1-Phase
inaktiv (Bischoff et al., 1990; Price et al., 1995). Ihre Aktivierung ist erforderlich für die
Übergang der Zellen durch den G1/S-Kontrollpunkt (von Heuvel and Harlow, 1993;
Price et al., 1995). Die CdK2-Phosphorylierungsstelle (AS 316-325) befindet sich in
der Gelenkregion zwischen der DNA-Bindungsdomäne (AS 102-292) und dem
Tetramerisierungsmotiv (AS 326- 356). Sakaguchi et al. (1997) zeigten in vitro, dass
die Phosphorylierung von Ser 315 die Destabilisierung des p53-Tetramers zur Folge
hat, was zur Bildung von p53-Monomeren und -Dimeren führt. Die Dissoziation des
p53-Tetramers demaskiert das nukleäre Export- Signal (NES) und initiiert vermutlich
den nukleären Export von p53 (Stommel et al., 1999). Liang and Clarke (2001)
postulieren, dass das phosphorylierte Ser 315 möglicherweise den Zugang der
nukleären Lokalisationsequenzen (NLS) an den nukleären Import-Rezeptor Importin
α blockiert und so den nukleären Import von p53 verhindert.
Einleitung
16
Aus diesem Grund kann man vermuten, dass die Phosphorylierung des Serin-Restes
315 durch die CdK2-Kinase die subzelluläre Lokalisation des p53-Proteins in einem
Zellzyklus-abhängigen Muster reguliert. Die Dephosphorylierung der entsprechenden
Domäne mittels Proteinphosphatasen PP2A hingegen führt zu einer Maskierung der
Tetramerisierungsdomäne oder Stimulation des nukleären Imports und schließlich
zur nukleären Akkumulation des Transkriptionsfaktors p53 (Fujiki, 1992; Shenolikar,
1994; Yatsumani et al., 1993).
1.2.2. Retinoblastomaprotein (pRb)
Der Funktionsverlust des Retinoblastomaproteins als Repressor von Transkriptions-
faktoren ist ein häufiges Ereignis in der Entwicklung von vielen Tumor-Typen des
Menschen (Dannenberg et al., 2000). Zahlreiche biochemische Studien
verdeutlichen die Wichtigkeit von pRb bei der Passage der Zellen von der G1- in die
S-Phase des Zellzyklus (Weinberg, 1995). Das Rb-Protein stellt somit einen
wichtigen Regulator des G1-Kontrollpunktes dar. Der Verlust dieses ��Checkpoints��
durch Mutation des Rb-Gens bzw. Inaktivierung des Proteins ist oft maßgeblich in
den mehrstufigen Prozess der Karzinogenese involviert. Das Rb-Protein existiert in
einer hypo (pRb)- und hyperphosphorylierten (ppRb) Form. In seinem hypophos-
phorylierten Zustand entfaltet das Protein seine Funktion als Transkriptions-
repressor, der letztendlich über den Zutritt der Zellen in der S-Phase des Zellzyklus
oder über die G1-Arretierung der Zellen entscheidet (Herwig and Strauss, 1997). In
ruhenden Zellen oder in der frühen G1-Phase des Zellzyklus sequestriert und
inaktiviert das aktive hypophosphorylierte Rb-Protein die Transkriptionsfaktoren der
Klasse E2F, die die Transkription von Genen der S-Phase aktivieren. Bei der
Überführung des hypophosphorylierten pRb in den hyperphosphorylierten Zustand
sind die CdK 2, 4, 6, wichtig, die in der frühen G1-Phase (Gu et al., 1992; Lees et al.,
1991) inaktiv sind und später durch die Komplexierung mit den Cyclinen D und E
aktiviert werden (Koff et al., 1992; von der Heuvel and Harlow, 1993) (Abb. 1.9).
Einleitung
17
Abb. 1.9: Darstellung der Zellzyklus-abhängigen Phosphorylierung des Retinoblastomaprotein
mittels der verschiedenen Cyclin-CdK-Komplexe (Gana and Reddy, 1995)
Die Phosphorylierung von pRb durch die Aktivierung des Cyclin D-CdK 4, 6- und
Cyclin E-CdK2-Komplexes über den MAPK-Pathway hebt die Arretierung der Zellen
in der G1-Phase auf. Durch die Hyperphosphorylierung kommt es im Rb-Molekül zu
einer Konformationsänderung, die mit einer Dissoziation des pRb:E2F-Komplexes
einhergeht und die transkriptionale Aktivität von E2F induziert (Fan and Bertino,
1997; Lin et al., 1991; Lees et al., 1993; Mihara et al., 1989;Taya, 1997). In der Folge
kommt es zum Übergang der Zellen von der G1- in die Synthese-Phase des
Zellzyklus. Die Dephosphorylierung des ppRb-Proteins wird von der Protein-
phosphatase 1 katalysiert und ermöglicht anschließend eine erneute Komplexierung
von pRb-E2F in der frühen G1-Phase.
Einige Daten lassen die Vermutung zu, dass bei einer länger anhaltenden G1-
Arretierung der Zellen aufgrund von sehr ungünstigen Wachstumbedingungen das
Rb-Protein in seinem hypophosphorylierten Zustand verharrt und die Funktion eines
p53-unabhängigenl Apoptose-Promotors entfaltet (Herwig and Strauss, 1997). Auch
p53 kann nach Stress-Induktion über die Modulation des Phosphorylierungsmusters
des Rb- Proteins einen G1-Arrest oder Apoptose initiieren.
Einleitung
18
Über eine p53-abhängige Expression des Kinase-Inhibitorproteins p21 wird die Cdk
4/6-assoziierte Phosphorylierung des Rb-Proteins gehemmt., so dass das Rb-Protein
in seiner aktiven hypophosphorylierten Form verbleibt und durch die Komplexierung
von Rb-E2F die G1-/S-Übergang der Zellen verhindert (Sionov and Haupt, 1999;
Weintraub et al., 1995).
1.2.3. Transkriptionsfaktor-E2F
Die Transkriptionsfaktoren der E2F-Familie spielen eine Schlüsselrolle bei der
Regulation der Zellproliferation. Sie sind für das Überschreiten des G1-Restriktions-
punktes essentiell (Hullemannn and Boostra, 2001; Weinberg, 1995). Die Aktivität
von E2F wird sowohl über das Phosphomuster des Rb-Proteins als auch durch die
Heterodimerisierung mit dem DP1-Protein und der Assoziation mit verschiedenen
Cyclin-abhängigen Kinasen moduliert (Helin et al., 1992; Krek et al., 1995; Srikumar
et al., 1991; Taya, 1997). Nach der Dissoziation aus dem Rb-E2F-Komplex aktiviert
der Transkriptionsfaktor E2F als Heterodimer mit dem DP1-Protein die Transkription
von Genen, die die Progression durch die S-Phase vermitteln (Chellappan et
al.,1991; De Gregori et al., 1995; Hullemann and Boonstra, 2001). Die
Translationsprodukte vieler E2F-induzierter Gene sind Komponenten entweder der
Zellzyklus- (Cyclin A, E, CdK´s, c-Myc) oder der DNA-Synthese- Maschinerie
(Dihydrofolate- Reduktase, Thymidinkinase oder DNA-Polymerase α) (Trimarchi and
Lees, 2002). Durch die Ligation von Cyclin A-CdK2 an denE2F-DP1-Komplex in der
späten G1-Phase und die damit einhergehende Phosphorylierung der Untereinheit
des DP1-Proteins verliert E2F seine DNA-Bindungsaktivität und damit seine
transkriptionale Fähigkeit (Dynlacht et al., 1994; Krek et al., 1995; Ottnad et al., 1997;
Taya, 1997; Yam et al., 2002) (Abb. 1.10).
Einleitung
19
Abb. 1.10: Prinzip der Freisetzung des Transkriptionsfaktors E2F (Taya, 1997)
Für die Entwicklung einer antitumortherapeutischen Strategie stellt der E2F-Cyclin A-
Komplex damit ein interessantes Target dar.
1.2.4. Transkriptionsfaktor c- Myc
In humanen Tumoren findet man aufgrund von Mutationen im c-Myc-Gen oder
Mutationen in den entsprechenden c-Myc-assoziierten Signal-Pathways häufig eine
verstärkte Gen-Expression. Die Überexpression des c-Myc-Gens wird als
dominierender Faktor in der onkogenen Aktivierung von c-Myc angesehen, da hierbei
ein komplexes Netzwerk von interagierenden TF gestört wird. Das c-Myc-Protein ist
ein Schlüssel-Regulator der Proliferation (Avigan et al., 1990; Evan and Vousden,
2001; Lutterbach and Hann et al., 1994). Die Funktion von c-Myc ist es, die die
Progression der Zellen durch die G1-Phase über die Stimulation der Gentranskription
und Aktivierung von verschiedenen Transkriptionsfaktoren reguliert.
Aufgrund der deregulierten Aktivität von c-Myc kommt es zu einer übermässigen
Transkription von c-Myc-responsiven Genen, die mit einem malignen Wachstum
einhergehen können.
Einleitung
20
In Zellkulturen induziert die konstitutive Expression von c-Myc die Zellproliferation
sogar bei vollständiger Abwesenheit von Wachstumsfaktoren (Alevizopoulos, et al.,
1997; Bouchard et al., 1998 ). Als Transkriptionsfaktor (TF) gehört es zu den Helix-
Loop-Helix Proteinen und kann über seine Leucin-Zipper-Dimerisierungsdomäne an
andere TF binden (Grandori and Eisenman, 1997). Als Heterodimer mit dem Protein
MAX bindet das c-Myc-Protein an die E-Box in der Promotor-Region verschiedener
Gene (cdc 25A, elf- 4e), die für die Zellproliferation erforderlich sind.
Eine mögliche Strategie von c-Myc, die Zellproliferation in ruhenden Zellen zu
fördern, ist die Verstärkung der Dissoziation des Kinase-Inhibitors p27 von dem
Cyclin E-CdK4�Komplex, wodurch das Bindungsmotiv für die Cdc 25A- Phosphatase
freigelegt wird. Die Cdc 25A-Phosphatase spielt bei der raschen Aktivierung von
Cyclin-abhängigen Kinasen eine essentielle Rolle. Die Phosphatase entfernt zwei
Phosphate an der CdK2-Kinase, die die Kinase-Aktivität inhibieren (Bouchard et al.,
1998) (Abb. 1.11).
Abb. 1.11: Kontrolle der G1-Phase Progression durch c-Myc (Bouchard et al., 1998)
Eine weitere Möglichkeit von c-Myc, die Proliferation der Zellen zu beeinflussen,
erfolgt über die Induktion der Retinoblastom- Kinasen Cyclin D/ E Cdk 2/4/ 6, die eine
rasche Hyperphosphorylierung von pRb initiieren und die damit einhergehende
Dissoziation des Rb-E2F-Komplexes und Freisetzung von E2F bewirken (Janssen-
Dürr et al, 1997; Leone et al., 1997). Wie viele andere nukleär lokalisierte
Regulatorproteine ist das c-Myc-Protein charakterisiert durch eine extrem schnelle
turn over Rate, und die Aktivierung erfolgt insbesondere über den MAPK-Pathway
(Gupta et al., 1993; Noguchi et al., 1999). Auch eine Interaktion mit dem p53-
Tumorsuppressorprotein bei der Regulation der c-Myc-Aktivität wird beschrieben
(Farmer et al., 1996; Goodrich and Lee, 1992; Wu and Levine, 1994).
Einleitung
21
Der Transkriptionsfaktor E2F kontrolliert womöglich die Promotor Aktivität des c-
Myc� Gens. In Transfektionsexperimenten konnte gezeigt werden, dass die E2F-
Proteine den Myc-Promotor aktivieren können (Bouchard et al., 1998). Eine
Deregulation der c-Myc-Expression kann so mit einer Dysfunktion der E2F-Aktivität
interagieren und förderlich auf die Proliferation wirken (Evan and Vousden, et al.,
2001).
1.3. Apoptose
Neben der Zellproliferation und Zelldifferenzierung zählt die Apoptose zu den
wichtigsten zellulären Kontrollmechanismen. Apoptose ist eine spezielle Form des
Zelltodes und dient als Schutzmechanismus vor Infektionskrankheiten und Krebs.
Eine deregulierende Apoptose stellt somit einen wesentlichen Mechanismus der
Tumorpromotion dar. Durch eine verminderte bzw. gehemmt Apoptose kann die
Pathogenese zahlreicher Erkrankungen gefördert werden (Peter et al., 1997).
Verschiedene Studien postulieren, dass in Tumorzellen die Fähigkeit zur
Apoptoseinduktion verloren geht, und eine erhöhte Resistenzbildung gegenüber
verschiedenen apoptotischen Stimuli detektierbar ist (Hoffmann und Liebermann,
1994; Irmler et al., 1997; Kerr et al., 1994). Diese erhöhte Resistenzbildung bereitet
gerade bei der Tumortherapie grosse Probleme, da zahlreiche Chemotherapeutika
potente Apoptoseinduktoren darstellen (Hickmann et al., 1992; Kerr et al., 1994).
Neben den spezifischen Induktoren der Apoptose gibt es auch Inhibitoren, welche
die apoptotische Signalkaskade modulieren. Baxter and Lavin (1992) konnten
experimentell feststellen, dass der Phosphatase Inhibitor Okadasäure in der Lage ist,
apoptotische Prozesse zu inhibieren (Song and Lavin, 1993). Andere Studien
zeigten, dass gerade Proteinphosphatasen Inhibitoren in der Lage sind Apoptose
anhängig vom Zelltyp und Dauer der Exposition zu induzieren (Fladmark et al.,
2002).
Möglicherweise spielt die Aktivität von Proteinphosphatasen und Proteinkinasen bei
der Initiation apoptotischer Prozesse eine wichtige Rolle (Cross et al., 2000; Gjertsen
and Doskeland, 1995; Hale et al., 1996; Shutong et al., 2002).
Einleitung
22
In der Regel sind alle Zellen eines multizellulären Organismus zur Apoptose fähig, da
alle essentiellen Komponeten des Apoptose-Apparates konstitutiv vorhanden sind
und die Aktivierung nach Stress-Induktion durch posttranslationale Modifikationen
vermittelt wird. Charakteristische Merkmale der Apoptose sind neben
Zellzahlveringerungen, schrumpfendes Cytoplasmavolumen, DNA-Fragmentierungen
und Aufrechterhaltung der Membranintegrität. Im Gegensatz zur Nekrose ist die
Apoptose ein regulierter, koordinierter Prozess. Wohingegen es sich bei der Nekrose
um eine passive, unkontrollierte, pathologische Form des Zelltodes handelt. Das
wichtigste Unter-scheidungskriterium zur Apoptose ist der Verlust der
Membranintegrität. Obgleich nekrotische und apoptotische Prozesse durch signifikant
verschiedene zelluläre Abläufe definiert werden, findet man in vitro und in vivo häufig
fließende Übergänge. Da apoptotische Zellen in Zellkulturen nicht phagozytiert
werden, treten hier Phänomene einer sekundären Nekrose auf (Cobb et al., 1996;
Kroemer et al., 1995). Der Apoptoseprozess wird generell in eine Initiations-, eine
Effektor- und eine Degradationsphase klassifiziert (Kroemer et al., 1995). Die
Initiationsphase geht mit der zelluären Registrierung des apoptotischen Reizes
einher. Diese heterogene Induktionsquelle umfasst virale Proteine (E1A; E7),
extrazelluläre Aktivierungen von Apoptose-Rezeptoren (CD95/FAS-APO),
deregulierte Signalkaskaden, Dysfunk-tionen der Protein-Phosphorylierung oder
chemisch-physikalische Stressfaktoren. Nach Überschreiten einer zellulären
Stresstoleranzgrenze oder Signalstärke je nach Zelltyp und Stress-Induktor erfolgt
der Übergang in die Effektorphase. Diese Phase ist durch die Aktivität von
degradierenden Enzymen (Proteasen/ Nukleasen) gekennzeichnet, die einen
kontrollierten Abbau von spezifischen Proteinen und Kern-DNA katalysieren
(Degradationsphase). Bei der Induktion der Apoptose können verschiedene Faktoren
beteiligt sein. Neben Komponenten der mitogenen oder antimitogenen
Signalkaskaden, können auch Phosphorylierungsprozesse und Regulatorproteine
des Zellzyklus (p53, pRb, E2F und c-Myc) involviert sein.
Einleitung
23
1.4. Zelluläre Angiffspunkte des Hepatitis B x-Proteins (HBx)
Das Hepatits B-Virus x-Protein wird aufgrund seines pleiotropen transaktivierenden
Charakters als wesentlicher verursachender Faktor mit der Karzinogenität des HBV
bei chronischen Infektionsverläufen in Zusammenhang gebracht (Caselmann, 1996;
Cromlish, 1996). Die biologischen Effekte von HBx hinsichtlich der Fähigkeit zur
Transaktivierung und/ oder Tumorpromotion erfolgen vermutlich durch Protein-
Protein Interaktion mit zahlreichen zellulären Faktoren, da das x-Protein selbst keine
DNA-Bindungs-Aktivität besitzt (Maguire et al., 1991). Das HBx-Protein ist essentiell
für die in vivo HBV-Replikation. Es stellt einen funktionellen Antagonisten für die p53-
vermitttelte Hemmung der HBV-Replikation dar, der die Down-Regulation des
pregenomischen/ core Promotors verhindert. Auch andere DNA-Viren (Papilloma-
viren (E6); Adenovirus (E1b- 55 kDa Protein), Papovavirus (large T Antigen) codieren
ein Genprodukt, das mit dem p53-Protein interagiert. Solche Interaktionen unter-
drücken wahrscheinlich den ��Checkpoint�� für den induzierten G1-Zellzyklus Arrest
und/ oder die Apoptose als Antwort auf Stress (Feitelson et al., 2002).
Bei der Entwicklung eines HBV-assoziierten HCC scheinen weniger die Mutationen
im p53-Gen eine signifikante Rolle zu spielen, als vielmehr die funktionelle
Inaktivierung von p53 durch die Protein-Protein-Interaktion mit dem HBV-x Protein.
Ein mögliches Prinzip der Tumorpromotion bei der Entwicklung eines HBV-
assoziierten HCC scheint die x-Protein verursachte funktionelle Inaktivierung von p53
durch kompetitive Bindung der Tetramerisierungs- und DNA-Bindungsdomäne von
p53 durch HBx zu sein (Chirillo et al., 1997; Cromlish, 1996; Feitelson, 1998; Trunant
et al., 1995).
Aufgrund des HBx-induzierten Funktionsverlustes von p53 kommt es zu einer
genomischen Instabilität, in der Regel zu geringeren Apoptoseraten und zu einer
überlangen Lebensspanne von HBV-infizierten Zellen (Feitelson, 1998; Kim et al.,
1991). Die Akkumulation von Mutationen in den Virus-infizierten Hepatozyten
resultiert in einem transformierten Phänotyp der Zellen. Das HBx-Protein kann jedoch
ausser mit dem p53-Protein auch mit anderen regulatorischen Proteinen interagieren
(Kekule et al., 1993; Lee et al., 1995; Unger and Shaul, 1990).
Einleitung
24
Die entsprechenden Proteine sind in der Transaktivierung von Promotoren (NF-KB;
CREB/ AFT; TBP), in der Regulation von Second-Messenger-Systemen (c-RAF/
ERK2/ RAS-abhängig) oder in die direkte Modulation der Transkriptionsmaschinerie
der Zellzyklus-Regulation involviert (Becker et al., 1998; Han et al., 2000; Kim et al.
1998; Klein and Schneider, 1997; Kwee et al., 1992; Lin et al., 1997; Lucito and
Schneider, 1992; Qadri et al., 1995; Wang et al., 1997; Williams and Andrisani,
1995).
Die HBx-assoziierte Deregulation des Zellzyklus führt vermutlich zur Selektion von
Zellen mit genetischer Instabilität und somit zur Akkumulation von Mutationen, die
sich auf den Beginn neoplastischen Wachstums von Zellen auswirken können
(Schuster et al., 2000). Feitelson (1998) postulierte ein mögliches Tumorpromotion-
Modell für die Interaktion von HBx mit den Regulatoren des Zellzyklus (Abb. 1.12).
Abb. 1.12: Modell für die Interaktion zwischen Hepatitis-x-Protein und dem Zellzyklus
(mod. Feitelson, 1998).
Die durchgezogenen Pfeile zeigen die Wirkungskette während der normalen Leber-Regeneration. Die
gepunkteten Pfeile geben die Beeinflussung von HBx in dieser Kette wieder.
In diesem Modell wird davon ausgegangen, dass es in Folge einer chronischen
Hepatitis zunächst zur Eliminierung von Virus infizierten Hepatozyten über die
cytotoxische Immunantwort (1) kommt.
Einleitung
25
Die auftretenden Hepatozytenschäden führen zu erhöhten Regenerationsprozessen
in den Hepatozyten (2), die möglicherweise mit einer Stimulation des Zellzyklus
einhergehen. Dieser zelluläre regenerative Prozess ist notwendig, um die normale
Gewebs-Architektur und die physiologische zelluläre Aktivität wiederherzustellen (3).
Das HBx-Protein kann zusätzlich auf die bei den regenerativen Prozessen aktivierten
Transkriptionsfaktoren oder auf die Zellzyklus- Progression stimulierend wirken (3).
Bei einer geringen zellulären HBx-Konzentration sind diese stimulierenden Einflüsse
auf die Zellproliferation jedoch nur von geringer Dauer (4). Die Akkumulation des
HBx-Proteins während der chronischen Infektion (5) kann hingegen einen
anhaltenden deregulierenden Einfluss auf die Zellzyklus- Aktivität (6) ausüben, was
im Resultat schließlich die HBV-assoziierte Hepatokarzinogenese begünstigt (7). Auf
der Grundlage dieses Modells ist es vorstellbar, dass neben dem p53-Protein auch
die regulatorischen Proteine pRb, E2F und c-Myc putative Angriffspunkte für das
HBx-Protein darstellen.
Choi et al. (2001) diskutieren über eine mögliche Interaktion von HBx mit dem
Transkriptionsrepressor Retinoblastomaprotein in der frühen Phase der Leberzell-
karzinogenese. Su et al. (2001) berichteten über eine mögliche Interaktion von HBx
mit dem Transkriptionsfaktor c-Myc. Zahlreiche experimentelle Daten weisen
daraufhin, dass das HBx-Protein den Aufenthalt der Zellen in der G0-Phase verkürzt
und den Eintritt in die S-Phase fördert. Auch der beschleunigte Übergang der Zellen
durch die Kontrollen G0 /G1, G1/S und G2 /M wird beobachtet (Benn and Schneider,
1995; Sirma et al., 1999).
Das HBx-Protein besitzt ebenfalls die Fähigkeit, die cytoplasmatischen Zellzyklus-
assoziierten Signaltransduktions-Wege wie den MAPK-Pathway zu aktivieren (Benn
and Schneider, 1994; Wang et al., 1997) und so indirekt einen entscheidenden
Einfluss auf die Aktivität von essentiellen Zellzyklus-Regulatoren zu nehmen. Die
globale Betrachtung der verschiedenen Daten weist möglicherweise auf einen
molekularen Mechanismus hin, in dem sich HBx durch die deregulierende Wirkung
auf die Zellzyklus-Regulation in die Ätiologie der viralen Leberzell-Karzinogenese
involviert.
Einleitung
26
1.5. Hepatotoxin Microcystin
Microcystin-LR ist ein cyclisches Heptapeptid, das von der Cyanobakterienart
Microcystis aeruginosa produziert wird und ein potentes Hepatotoxin darstellt
(Carmicheal, 1996,1997). Aufgrund seiner Polarität hat Microcystin Schwierigkeiten,
in kultivierte Fibroblasten aufgenommen zu werden, wohingegen es durch einen
spezifischen Carrier-vermittelten Transport (�Okadasäure-Rezeptor�) zu einer
leichten Inkorporation und Akkumulation in kultivierten Hepatozyten kommt (Fujiki,
1992).
Als Vertreter der Wirkstoffklasse der Okadasäure wird Microcystin als Tumor-
promotor bezeichnet, der in einem Gewebe Bedingungen schafft, die fördernd wirken
auf die Entwicklung eines bösartigen Tumors in Zellen, die bereits im Sinne einer
Initiation geschädigt sind. Microcystin ist ein spezifischer Proteinphosphatase-
Inhibitor der Klasse 1 (PP1) und 2A (PP2A), der irreversibel kovalent an die
katalytische Untereinheit der Proteinphosphatasen in den Hepatozyten bindet
(Falcorner and Yeung, 1992; Yoshizowa et al.,1990). Diese Eigenschaft von
Microcystin dürfte mit der Hepatotoxizität dieser Hepatopeptide korrelieren
(Matsushima et al., 1990; Yoshizawa et al., 1990).
Die tumorfördende Aktivität von Microcystin-LR konnte in Experimenten mit Diethyl-
nitrosamin (DEN) initiierten Ratten-Hepatozyten beobachtet werden (Fujiki, 1992;
Matsushima, 1990). Weitere Daten weisen darauf hin, dass die Zugabe von niedrigen
Microcystin-Konzentrationen zum Trinkwasser über einen langen Zeitraum die
Progression eines humanen Hepatozellulären Karzinomes bewirkt (Carmichael,
1997; Yu, 1995).
Die Proteinphosphatasen PP1 und PP2A stellen die Antagonisten der Ser/ Thr-
spezifischen Proteinkinasen (PK) dar und übernehmen eine bedeutende Rolle bei
der Regulation von PK-assoziierten Signalkaskaden (MacKintosk and MacKintosk,
1994). Die PP können dämpfend oder auch verstärkend auf die PK-vermittelten
Signalkaskaden wirken. Die Gesamtphosphorylierungsbilanz der Zelle wird durch ein
koordiniertes Zusammenwirken von Proteinkinasen (PK) und Proteinphosphatasen
(PP) bestimmt (MacKintosh and MacKintosh,1994).
Einleitung
27
Insbesondere die Funktion von regulatorischen Proteinen des Zellzyklus wird über
die Aktivität der Proteinphosphatasen PP1/ PP2A beeinflusst (Cohen et al., 1990;
Shenolikar, 1994). Durfee et al. (1993) beobachteten eine Interaktion zwischen der
Proteinphosphatase (PP1) und dem Retinoblastomaprotein (pRb), wobei die PP1
bevorzugt das hypophosphorylierte Rb-Protein bindet. Desweiteren wurde gezeigt,
dass die PP1 mit den Rb- Molekül während der G0/G1-und mittleren G1-Phase
assoziiert. Die Assoziation der beiden Proteine geht während der S- und G2-
Progression der Zellen, wenn das Rb- Protein in seiner hyperphosphorylierten Form
vorliegt, verloren (Durfee et al., 1993). Ludlow et al. (1993) zeigten in der M-Phase
des Zellzyklus die Reassoziation von PP1 mit dem Rb-Protein. Die Komplexierung
von PP1 mit dem Rb-Molekül dürfte die unpassende Phosphorylierung von pRb in
den verschiedenen Phasen des Zellzyklus verhindern.
Der PP2A werden vor allem Interaktionen mit verschiedenen Komponenten des
MAPK-Pathway zugeschrieben (Chen et al., 1994; Damuni and Guo, 1993). Die
katalytische Aktivität der PP2A ist mutmaßlich auch an der Modulation des
Phosphorylierungsmusters von p53 involviert (Baxter and Lavin, 1992; Gjertsen and
Doskeland, 1995). Auch DNA-Tumorviren nehmen die PP2A zur Regulation der
viralen Replikation und der zellulären Transformation in Anspruch (Scheidtmann et
al., 1991; Walter and Mumby, 1993).
Die enzymatische Aktivität der PP selbst kann in einem Zellzyklus-abhängigen
Muster autoinhibitorisch durch die reversible Ligation eines phosphorylierten
Inhibitorproteins an die katalytische Untereinheit der PP gehemmt werden. Die
Phosphorylierung des Inhibitorproteins wird durch z.B. Cyclin-abhängige Kinasen
(Cyclin 4: CdK2; Cyclin 6: CdK2) katalysiert. Der Verlust oder die Funktionsun-
fähigkeit dieser Autohemmung der PP stört das dynamische Gleichgewicht der
Aktivität von Proteinkinasen und Proteinphosphatasen und kann zur Dysfunktion
zellulärer Kontrollmechanismen führen (Shenoliar, 1994).
Auch neuere Studien dokumentieren die Wichtigkeit der Funktion der PP bei der
Regulation zellulärer Aktivität, da Mutationen in den Genen der Proteinphosphatasen
ebenfalls wie Mutationen/ Deletionen in Tumorsuppressorgenen oder wie die
funktionelle Inaktivierung der entsprechenden Proteine signifikant mit neoplas-
tischem Zellwachstum korrelieren (Calin et al., 2000). Der Ausfall der Protein-
phosphatasen kann somit ein Beitrag zur Tumorpromotion sein.
Einleitung
28
Über den beschriebenen biochemischen Mechanismus könnte Microcystin
maßgeblich in die Entwicklung eines HBV-assoziierten Hepatozellulären Karzinoms
eingreifen. Durch die Microcystin-induzierte kovalente irreversible Hemmung der
Proteinphosphatasen (PP) 1 und 2A kommt es zu einer sogenannten �apparenten
Aktivierung� von Proteinkinasen (PK), die letztendlich mit einer Akkumulation von
zellulären Phosphoproteinen in der Zelle einhergeht und unkontrolliert verstärkend
auf PK-assoziierte zelluläre Aktivität wirkt. Yoshizawa et al. (1990) berichteten von
Organotrophien in den Hepatozyten von Tieren nach der intraperitonealen (i.p.)
Verabreichung oder der oralen Aufnahme von Microcystin. Der Microcystin
vermittelte Ausfall der genannten Proteinphosphatasen führt zu einer zellulären
Akkumulation von Phosphoproteinen, die unter anderem zu morphologischen
Modifikationen in den Hepatozyten und zu einer Dysorganisation des Cytoskeletts
führen (Eriksson et. al., 1990). In vitro Studien zeigten, dass Microcystin die Aktivität
der Proteinphosphatasen in der cytoplasmatischen Fraktion von Maus-Hepatozyten
hemmt und die Protein-Phosphorylierung in kultivierten primären Ratten-Hepatozyten
erhöht (Matsushima et al., 1990). In Studien über die biochemische Aktivität von
Wirkstoffen der Okadasäureklasse wird berichtet, dass diese Wirkstoffe abhängig
von der Dauer der Applikation und des Zelltyps, neben der Förderung der
Tumorbildung (Fujiki, 1992; Carmichael et al., 1996) auch die Transformation
unterdrücken oder Apoptose induzieren oder inhibieren (Baxter and Lavin, 1992;
MacKintosh and MacKintosh, 1994; Song and Lavin, 1993) .
Da die Aktivität von p53 und pRb entscheidend über eine Protein-Phosphorylierung/ -
Dephosphorylierung reguliert wird, stellen sie theoretisch einen wichtigen zellulären
Angriffspunkt für das cyanobakterielle Microcystin dar. Yatsunami et al. (1993)
berichteten, dass Okadasäure über den sogenannten Okadasäure-Pathway
maßgeblich Einfluss auf die Hyperphosphorylierung von p53 und von pRb in
Fibroblasten nimmt. Fujiki (1992) hatte in diesem Kontext ein allgemeines Modell der
Tumorpromotion durch die Inaktivierung von Tumorsuppressoren über den
sogenannten Okadasäure-Pathway entworfen.
Einleitung
29
Abb. 1.13: Darstellung der Inaktivierung der Tumorsuppressorproteine durch den Okadasäure-
Pathway (Fujiki and Suganuma, 1993)
In diesem Modell wird davon ausgegangen, dass durch die Hemmung von zellulären
Proteinphosphatasen durch Wirkstoffe der Okadasäureklasse die Tumorsuppressor-
proteine in ihren hyperphosphorylierten Zustand überführt werden und ähnlich wie
Mutationen oder Deletionen in den entsprechenden Genen, einen Funktionsverlust
der Proteine induzieren können.
Über den Einfluss von Microcystin auf das Phosphorylierungsmuster von Tumor-
suppressorproteinen hinsichtlich einer Hyperphosphorylierung liegen keine
experimentellen Daten vor. Microcystin könnte möglicherweise ähnlich wie Okada-
säure über den Okadasäure-Pathway die Hyperphosphorylierung der Tumor-
suppressorproteine p53/ pRb induzieren und so ein Aussetzen der Tumorsuppressor-
Funktion dieser Protein bewirken. Auch andere Zellzyklus-regulierendeProteine wie
E2F und c-Myc könnten in ihrer Aktivität von Microystin beeinflusst werden, da ihre
Funktion ebenfalls über Protein-Phosphorylierung moduliert wird. Der Funktions-
verlust von p53 nach der Exposition mit Wirkstoffen der Okadasäureklasse kann
womöglich mit der inhibitorischen Wirkung von verschiedenen Vertretern dieser
Stoffklasse auf Apoptose-Prozesse korrelieren (Baxter and Lavin, 1992).
Experimentelle Daten über mögliche inhibitorische Eigenschaften von Microcystin auf
Apoptose-Prozesse fehlen.
Einleitung
30
Der über den Okadasäureweg modulierbare Phosphorylierungsstatus und damit
möglicherweise einhergehende Funktionsverlust der Tumorsuppressorproteine p53
und pRb im Zustand der Hyperphosphorylierung und die HBx-vermittelten
deregulierenden Effekte auf die Zellzyklus-Regulation könnten kombinatorisch die
Entwicklung und Progression eines HBV-assoziierten HCC beeinflussen.
Fragestellung
31
1.6. Fragestellung
In dieser Studie sollte die Frage geklärt werden, ob das cyanobakterielle Hepatotoxin
Microcystin-LR und das Hepatits B-Virus x-Protein kombinatorische Effekte bei der
Genese eines HCC zeigen.
Mit Hilfe von in vitro Experimenten wurde der Versuch unternommen, die
verschiedenen Teilaspekte diese Fragestellung zu untersuchen. Experimentell galt
es zunächst die Frage zu klären, ob Microcystin als Inhibitor der
Proteinphosphatasen PP1/ PP2A die Fähigkeit besitzt, das Protein-Gesamt-
phosphorylierungsmuster in einem initiierten Hepatozytenzellkultursystem zu
beeinflussen. Bei der Klärung dieses Aspektes sollte insbesondere die Wirkung von
Microcystin auf die Phosphorylierung der Tumorsuppressorproteine im Sinne einer
Tumorpromotion über den Okadasäure-Pathway beobachtet werden. Von
besonderem Interesse war es in diesem Zusammenhang, zu überprüfen, ob der
durch Microcystin modulierbare Phosphorylierungsstatus der Tumorsuppressor-
proteine und assoziierten Proteine des Zellzyklus die Aktivität dieser Regulatoren
beeinflusst.
Zur Klärung dieser Fragestellung waren vor allem Experimente wichtig, die dazu
dienten, sowohl eine mögliche deregulierende Wirkung von Microcystin auf die
Zellzyklus-Regulation und Apoptose als auch die Microcystin-vermittelte
stimulierende Wirkung auf die G1/ S-Übergang der Zellen zu analysieren.
Im letzten Abschnitt dieser Arbeit wurde schließlich der Frage nachgegangen, welche
synergistischen Effekte von Microcystin und HBx auf die Funktionalität der
regulierenden Proteine des Zellzyklus hinsichtlich einer Deregulation von wichtigen
Kontrollmechanismen in diesem Modellsystem zu beobachten sind.
Um die kombinatorischen Effekte des HBx-Proteins und Microcystin auf die
Funktionalität dieser Regulatorproteine zu untersuchen, wurden die HepG2-Zellen
zunächst mit verschiedenen Luciferase-Plasmiden und einem HBx-
Expressionsvektor kotransfiziert und anschließend mit Microcystin exponiert.
Fragestellung
32
Über die Modulation der durch die Regulatorproteine-vermittelten Expression des
Reportergens Luciferase nach der Microcystin-Exposition und Expression des HBx-
Gens sollte die Wirkung der beiden Effektoren auf die Funktion der Zellzyklus-
Proteine bestimmt werden.
Material
33
2. Material und Methoden
2.1. Material
2.1.1. Zellen
HepG2-Zellen: Humane Hepatoma- Linie (American Type Culture Collection, Rockville,
Maryland (USA)
2.1.2. Zellkulturmedium und Zusätze
• DMEM-Flüssigmedium mit 4,5 g Glucose/l Sigma
• DMEM-Trockenmedium Instamed mit 1g Glukose/l Biochrom
• DMEM- ohne Methionin oder Phosphat ICN
• L-Glutamin, 200 mM Sigma
• Fötales Kälberserum Gibco BRL
• Fungizone (Amphotericin B ) Gibco BRL
• Penicillin (10000 U/ml) Sigma
• Trypsin- Na2- EDTA (Versen- Trypsin), 0,25 % Gibco BRL
2.1.3. Bakterien
• E. coli HB 101
2.1.4. Plasmide
2.1.4.1. pSVX- Plasmid
Das Plasmid pSVX (Abb. 2.1) kam aus dem Baylor College of Medicine, Department of
Molecular Virology, in Houston, TX (USA) und leitet sich von dem pSVneo-Vektor ab. Es
besteht aus 6164 bp und enthält die vollständige cDNA-Sequenz von HBx (464 bp) unter der
Kontrolle des CMV-Promotor. Als Selektionsmarker dient ein Ampicillin- und Neomycin-
Resistenzgen .
Material
34
Abb. 2.1: Plasmidkarte von pSVX
2.1.4.2. pSVneo-Kontrollplasmid
pSV2neo (5700 bp) diente als Kontrollvektor, steht unter Kontrolle des CMV-Promotors und
enthält als Selektionsmarker ein Ampicillin- und Neomycin-Resistenzgen.
2.1.4.3. pRc/CMVhp53-Plasmid
Das Plasmid pRc/CMVhp53 kam aus dem Baylor College of Medicine, Department of
Molecular Virology, in Houston ,TX (USA). Es besteht aus 6679 bp und enthält die
vollständige cDNA-Sequenz des humanen p53 (1179 bp) unter der Kontrolle eines CMV
Promotors. Als Selektionsmarker dient ein Ampicillin- und Neomycin-Resistenzgen
Abb. 2.2: Plasmidkarte von pRc/CMVhp53
2.1.4.4. Luciferase-Plasmide
Die verwendeten Luciferase-Konstrukte leiten sich von dem Ausgangsvektor pTA-Luc ab
(Abb.2.3). Der Ausgangsvektor verfügt über `multiple cloning sites´ (MCS), in die cis-aktive
Enhancer-Elemente einkloniert wurden (Fa. Clontech). Die Enhancer integrieren Response-
Elemente für die zellzyklusregulierenden Proteine p53, pRb E2Fund c-Myc. Als Promotor
fungiert eine TATA-Box (PTA), die eine optimale Induktion gewährleistet und gleichzeitig für
einen geringen Hintergrund sorgt.
Material
35
Der Luciferase-codierenden Sequenz des Plasmids ist das `late´ SV40 Polyadenylations-
Signal nachgeschaltet, wodurch das optimale `Processing´ des Luciferase-Transkripts
garantiert wird. Upstream der MCS befindet sich ein synthetischer Transkriptionsblocker
(TB), der die Hintergrund-Transkription reduziert.
Abb. 2.3: Plasmidkarte von pTA-Luc mit Kennzeichnung dermultiple cloning sites´ (MCS)
2.1.4.5. p53-GFP-Plasmid
Das p53-GFP-Plasmid kam aus dem The Salk Institute in La Jolla,CA (USA) und ist ein
Abkömmling des Vektors pEGFP-N1( Clontech). Es besteht aus 5910 bp und enthält die
vollständige cDNA-Sequenz des humanen p53 (Wt), die C-terminal mit der Gensequenz von
EGFP fusioniert und unter der Kontrolle eines CMV-Promotors steht. Als Selektionsmarker
dienen ein Kanamycin-und Neomycin-Resistenzgen.
2.1.5. Nukleotide, Nukleinsäuren
• Monoribonukleosid- 5´- triphosphate Boehringer Mannheim
• Monodesoxyribonukleosid- 5´- triphosphate Boehringer Mannhein
• DNA- Längenstandard �1 kb- DNA- Leiter� Gibco BRL
• Oligonukleotidprimer MWG
Response- Elemente : • p53 • Rb-E2F • E2F-DP1 • Myc (E-box)
Material
36
2.1.6. RT PCR-Primer
Px- X- AS (adr):
Sense- Primer 5´- ATG GGA TCC ATG GCT GCT AGG GTG TGC TG� 3´
(1376 nt- 1423 nt)
Px- X- S (adr):
Antisense Primer 5´- ATC CCT AGG TAG GCA GAG GTG AAA AAG TT- 3´
(1828 nt - 1838 nt)
2.1.7. Enzyme, Antikörper und andere Proteine
2.1.7.1. Enzyme
• Alkalische Phosphatase aus Kälberdarm mit
• 10 x Dephosphorylierungspuffer Boehringer Mannheim
• AMV-Reverse Transkriptase Promega
• DNase I, RNase- frei Boehringer Mannheim
• Lysozym Boehringer Mannheim
• Taq DNA-Polymerase mit 10x Puffer Boehringer Mannheim
• RNase A Boehringer Mannheim
• RNase A Typ III-A Promega
2.1.7.2. Restriktionsenzyme
• ACCI, ALW44I, BamHI, HindIII, Nhe I, Sac I,
• Sma I, Xba I, Xbo I mit 10x Inkubationspuffer Roche Diagnostics
Material
37
2.1.7.3. Antikörper
• Monoklonaler Maus anti-p53 IgG 2ak (100µg/ml); Klon Pab421 Oncogene
• Monoklonaler Maus biotinylierter anti-p53 IgG (100µg/ml) Oncogene
• Monoklonaler Maus anti-Rb IgG2a (0,1ml); Klon XZ91 Neo Markers
• Monoklonaler Human anti-Rb IgG1 (0,1mg); Klon G3-245 Pharmingen
2.1.7.4. Proteine
• Rinderserumalbumin Fraktion V Boehringer
Mannheim
• Rnasin Ribonuklease-Inhibitor Promega
2.1.8. Chemikalien
• Aceton Merck
• Acrylamid Pharmacia
• Actinomycin Sigma
• Agar, Bacto - Difco
• Agarose Servaa
• Ammoniumpersulfat Serva
• N,N, Methylen- Bisacrylamid Pharmacia
• Bromphenolblau Serva
• Borsäure Janssen Chimica
• Cäsiumchlorid Serva
• Calciumphosphat Serva
Material
38
• DEPC Sigma
• Diethylether Riedel- de Haen
• N,N-Dimethyl-Formamid Sigma
• DTT Sigma
• EDTA- Natriumsalz, Versen Merck
• Essigsäure Kraft
• Ethanol Riedel- de Haen
• Ether Wasser gesättigt Riedel-de Haen
• Ethidiumbromid Sigma
• Formaldehyd Sigma
• Glycerol Sigma
• Harnstoff Pharmacia
• HCL, 37% Riedel- de Haen
• Isopropylal Janssen Chimica
• Kristallviolett Merk
• Natriumchlorid Janssen Chimica
• PCR- Öl Sigma
• SDS Serva
• Sucrose Serva
• TEMED Pharmacia
• Trichloressigsäure Sigma
• Tris Sigma
• Triton X-100 Serva
• Tween 20 Serva
2.1.9. Puffer und Lösungen
2.1.9.1. Diverse
Material
39
• Ethidiumbromid: 10 g/l wässrige Lösung
• DEPC- H2O: 0,1 %ige (w/v) Lösung
→ über Nacht bei Raumtemperatur inkubieren und dann 2x autoklavieren
PBS-Puffer: (pH 7,4)
• 140 mM NaCl
• 2,7mM KCL
• 6,5 mM Na2HPO4
• 1,5 mM KH2PO4
Proteinbestimmung: Bradford-Reagenz Biorad
Toxinlösung: Microcystin-LR (C49 H 74 N10O12 ) Alexis
in DMSO gelöst
2.1.9.2. Phenol / Chloroform -Extraktion von Nukleinsäuren
• Tris/ EDTA Puffer-Phenol gesättigtes Roth/ D
• Tris/ EDTA-Puffer-Wasser- gesättigtes Phenol Roth/ RNA
• Phenol/ Chloroform / Isoamylalkohol (25:24:1)
• Chloroform/ Isoamylalkohol (24:1)
• Ethanol abs. �20°C
• 3M Na-Acetat (pH 4,8)
• 70% Ethanol(v/v)
Material
40
2.1.9.3. Agarosegelelektrophorese
TAE - Puffer (50x) :
• 2M Tris
• 0,25 M Na - Acetat
• 0,05 M EDTA
pH 7,8
Probenpuffer :
(Nukleinsäure)
• 40,0 % (w/ v) Sucrose
• 1,0mM EDTA (pH 8,0)
• 0,1 % (w/v) SDS
• 0,05 % (w/v) Bromphenolblau
DNA-Marker :
• 60,0µl DNA ( 1µg /µl)
• 40,0µl 10 x TAE
• 300,0 µl Aqua dest.
2.1.9.4. Transfektionslösungen
Ca+2-Phosphat-Transfektion:
Material
41
TE-Lösung :
• 10,0mMTris
• 1,0mM EDTA
• pH 7,8 ;Lösung autoklvieren
2x HBS-Lösung :
• 50,0mM HEPES
• 1,5mM NA2HPO4
• 280,0mM NaCL:
• pH exakt 7,13 einstellen; steril filtrieren
Glycerol-Schocklösung :
• 15% (v/v) Glycerol in HBS Lösung bei 100°C autoklavieren
2.1.9.5. Proteinanalyse-Lösungen
Immunpräzipitation/ Westernblot:
Lysis-Puffer-Lösung:
• 25,0 mM Tris
• 50,0mM NaCl
• 0,5% SDS
• 2,0% Nonidet P-40
• 100,0 µl PMSF (1 mM )
• 167,0 µl Aprotinin (50µg/ ml)
SDS-Sample Puffer :
• 62,5 mM Tris (pH 6,8)
Material
42
• 5,0% Mercaptoethanol
• 2,3% SDS
• 10,0% Glycerol
• 0,001% Bromphenolblau
Protein A-Sepharose (1mg/ ml PBS)/ Sigma P-9424
Trenngel:
• 1,5 M Tris pH 8,8
• 0,4% SDS
• 10,0% Acrylamid
• 0,3% Bis- Acrylamid
Sammelgel (4%):
• 0,5M Tris pH6,8
• 0,4% SDS
• 4,0% Acrylamid
• 0,1% Bis-Acrylamid
Fixierlösung:
• 40,0% Methanol
• 10,0% Eisessig
Transferlösung:
• 25,0 mM Tris
• 192,0 mM Glycerin
• 20,0% Methanol pH 8,3
Material
43
Blockierungslösung:
• 2,5 % BSA (fettfrei)
• 0,3% Tween-20
Primär Ak-Lösung :
• 2,5µg /ml Ak (p53)
• 1,0% BSA
• 0,3% Tween-20
Waschlösung:
• 0,3% Tween �20 (Tris)
Streptavidin-horseradish:
Peroxidase Konjugat
• 1:10.000 in primäre Ak- Lösung
Stripping-Puffer :
• 100,0 mM 2-Mercaptoethanol
• 2,0% SDS
• 62,5 mM Tris-HCL (pH 6,7)
Renaturierungs-Lösung:
• 5,0% BSA in Tris
• 0,1% Tween-20 (TBS-T)
Material
44
2.1.9.5.2. Isoelektrische Fokussierung
Lysis-Proben-Puffer :
• 4,0% (w/v) CHAPS
• 40,0 mM Tris
• 65,0 mM DTE
• 0,2 M Harnstoff
• Spritzer Bromphenolblau
Anodenlösung:
• 10,0 mM Glutaminsäure
Kathodenlösung:
• 10,0 mM Lysin
2.1.9.6. Färbelösungen
2.1.9.6.1 Coomassie
Fixierungslösung:
• 12,5 % TCA
Waschlösung:
• 45,0% Methanol
• 9,0% Eisessig
Färbelösung:
• 1,0 g Coomassie Blue R- 250
• 450,0 ml Methanol
• 450,0 ml Aqua dest.
• 1000,0 ml Eisessig
Material
45
Entfärbelösung:
• 30,0% Ethanol
• 10,0% Eisessig
2.1.9.6.2. Silberfärbung
Thiosulfatlösung:
• 0,2 g/l Natriumthiosulfat
Silbernitratlösung:
• 2,0 g/l Sibernitrat
• 0,5 m/l Formaldehydlösung
• 4,0 mg/l Natriumthiosulfat
Entwicklungslösung:
• 30 g/l Natriumcarbonat
• 0,5 ml Formaldehydlösung (37%)
• 4,0 mg/lNatriumthiosulfat
Stoplösung :
• 5,0 g/l Glycerin
2.1.9.6.3. Ponceau S-Färbung
• 0,1% Ponceau S- Konzentrat in 5% Essigsäure
→ mit 20,0 ml PBS/ Tween-20 verdünnen
2.1.9.7. Zellzahl-und Zellvitalitätsbestimmung
2.1.9.7.1. Neutralrot Test (NR)
Neutralrot:
• 4 mg/ ml Stamm-Lösung in DMEM 1:100 verdünnen;
Material
46
→ über Nacht bei 37°C im Dunkeln präinkubieren
Extraktions-Lösung:
• 1% Essigsäure in 50% Ethanol
2.1.9.7.2 Trypanblau-Test
Trypanblau:
• 0,4% (w/v) Trypanblau in 0,81 % (w/v)NaCl/0,06% (w/v)K2HPO4 (Sigma)
2.1.9.8. Apoptose-Detektion
2.1.9.8.1. Darstellung von DNA- Fragmenten (Apoptose)
Lyse-Lösung:
• 0,5% (v/v) Triton X-100 in 10 mM Tris (pH 7,5)
2.1.9.8.2. Quantitativer Apoptose-Nachweis (FACS- Analyse)
RNase-A- Stammlösung (1000U/ ml) :
• RNase A Typ III in sterilem Aqua dest. lösen und aliquotiert bei -20°C lagern
Material
47
Probenpuffer:
• 0,1% (w/v) Glucose in PBS steril filtrieren (0,2 µm Filter)
Propidiumjodidlösung:
• 50,0µg /ml Propidiumjodid
• 100,0 U/ml RNase A in Probenpuffer
IsotonII (Coulter)
2.1.9.9 Bakterienkulturen
LB-Medium:
• 10,0 g Bacto Trypton
• 5,0 g Hefeextrakt
• 8,0 g NaCl
• 1ml N NaOH zugeben, pH 7,0 einstellen
• auf 1 l mit Aqua dest. auffüllen.
LB-Agar:
• LB- Medium mit 1,5 % (w/v) Agaranteil
LB+ Medium :
• LB-Medium mit 20 mM MgSO4 und 10 mM KCL
Ampicillin �Stammlösung:
• 50 mg Ampicillin /ml in sterilem Aqua dest. unter Zugabe von NaOH lösen und mit HCL
pH 7,3 einstellen, steril filtrieren und bei �20°C lagern
Chloramphenicol- Stammlösung:
• 34 mg/ml in Ethanol
2.1.9.10 Herstellung kompetenter Bakterien
TfB 1:
• 100,0 mM RbCl2
• 50,0 mM MnCl2
• 30,0 mM Kaliumacetat
Material
48
• 10,0 mM CaCl 2
• 15,0 % (v/v) Glycerol
(pH 5,8)
TfB 2 :
• 75,0 mM CaCl 2
• 10,0 mM MOPS
• 10,0 mM CaCl 2
• 15,0 % (v/v) Glycerol
2.1.9.11 Nukleinsäure-Präparation
Schnellpräparation bakterieller Plasmid-DNA
Lösung1:
• 50,0 mM Glukose
• 10,0 mM EDTA
• 10,0 mM Tris, pH 8,0
• 2,0 mg/ml Lysozym vor Gebrauch zugeben
Lösung 2 :
• 0,2 M NaOH
• 1,0% (w/v) SDS
Lösung 3 :
• 3M Natriumacetat (pH 4,8)
Material
49
Präparation von Plasmid-DNA :
STET-Puffer:
• 50,0mM Tris (pH 8,0)
• 50,0mM EDTA
• 8,0% (w/v) Sucrose
• 5,0% (v/v) Trition
TES :
• 50,0mM Tris (pH 8,0)
• 50,0mM NaCl
• 5,0mM EDTA
NaCl-gesättigtes Isopropanol:
• Isopropanol ausschütteln in 10 mM Tris (pH8,0)/ 1mM EDTA gesättigt mit NaCl
Lysozym-Lösung:
• 20 mg Lysozym / ml in 20 mM Tris (pH 8,0)
Sarkosyl-Lösung:
• 1% (w/v) Sarkosyl in 20 mM Tris (pH 8,0)
Ethidiumbromid-Lösung:
• 20 mg Ethidiumbromid-Lösung/ ml in 20 mM Tris (pH 8,0)
Cäsiumclorid-Lösung:
• 50g Cäsiumclorid auf 65 mL mit 20 mM Tris (pH 7,6 auffüllen)/
Refraktionsindex :1,3865
Material
50
Dialyse :
• 5mM Tris (pH 8,0)
2.1.9.12 Isolierung zellulärer RNA
RBS:
• 10 mM Tris, pH 7,5
• 10mM NaCl
• 1% (v/v) Nonidet P40
2.1.10. Kits
• Luciferase Assay System Clontech
• Mycoplasmen Detection Kit Roche
• Mercury TM Cell Cycle Profiling System Clontech
• Biotinylated p53 Western Blotting System Oncogene
• Servalyt Precotes/ Servalyt PreNets Serva; Heidelberg
2.1.11. Verbrauchsmaterial
Nunc, Eppendorf:
• Reaktionsgefäße
• Pipettenspitzen
• Aufsätze für Multipipetten
• Greiner Falcon- Röhrchen
• ELISA Platten
Material
51
• Zellkulturgefäße
• Zellschaber
Filme:
• Filmtyp 667 Polaroid
• X-OMAT TM AR Kodak
Diverses:
• Dialyseschläuche Gibco BRL
• Kanülen Braun
• Mikrotiterplatten 1450-401 (96 Vertiefung) Wallac
• Papierelektroden Serva
• Pipettenspitzen Eppendorf
• PCR-Reaktionsgefässe Eppendorf
• Quick-Seal TM Röhrchen aus Polyallomer Beckmann
• NAP TM-% Säulen mit Sephadex TM G-25 Pharmacia
2.1.12. Geräte und andere Hilfsmittel
Zentrifugen und Rotoren:
• Beckmann Ultrazentrifuge LE-70 mit Rotor 65 und Ti 70
• Eppendorf Tischzentrifuge 5415 C
• Sorvall RC 28 S mit Rotor F-28/50 und F-16/250
Material
52
Mikroskope :
• Hund Wetzlar Wilovert S
• Leitz Labovert FS 7IF- Mikroskoskop ZEISS
• Zeiss LSM 410 (confokales Laser-Scanning-Mikroskop)
Diverses :
• Du 640 Spektralphotometer Beckmann
• pH-Meter PHI-10 Beckmann
• Gelkammer Bio Rad
• Mini-Polyacrylamidgel-Apparatur Bio Rad
• Thermomixer 5436 Eppendorf
• Begasungsbrutschrank Heraeus
• Sterilbank Lamin Air HB2448 und HB 2472 S Heraeus
• Kombipipette Eppendorf
• Mighty Bright UV-Leuchttisch Hoefer
• Minigelkammer Hoefer
• Müller-Geigerzähler Berthold
• Power Supply PS 500XT DC Hoefer
• Power Supply PS 1500 DC Hoefer
• LKB 2010 Macrophor Sequenziereinheit Pharmacia
• Gene Amp PCR-System 2400, Perkin Elmer
• Polaroid MP4+ Kamera Serva
• Speed Vac SC 110; Savant
• Vortex VF2 Janke und Kunkel
• Kühlschrank -20 °C Kirsch
Material
53
• Kühlschrank 4°C Kirsch
• Gefrierschrank -70°C Sepatech Heraeus
• 1450 Micro Beta Trilux Wallac, Berthold
• Durchflußzytometer Coulter
• Fuchs-Rosenthal Zählkammer Assistent
• Refraktometer Optronic
• UV-Lampe VL-60 Serva
• Spektralphotometer DU640 Beckmann
• Papierelektroden Serva
• Applikatorstreifen Serva
2.1.13. Radiochemikalien
• 32S-Methionin (3,7 MBq) ICN
• 32P-Orthophosphat (1850 MBq) ICN
• Szintillationsmix OptiPhase SuperMix Wallac
Methoden
54
2.2. Methoden
2.2.1. Kultivierung von Zell-Linien
Die HepG2-Zellen wurden mit Dulbecco´s Modified Eagles Medium (DMEM) bei 37°C und
5% CO2 in Zellkulturflaschen kultiviert. Mit Hilfe des Lichtmikroskopes wurde die Wachstums-
dichte der Zellen kontrolliert. Nach Ausbildung eines sehr dichten Zellrasens oder nach
Bedarf wurden die Zellen im Verhältnis 1:2 oder 1:4 in neue Kulturflaschen umgesetzt. Die
Ablösung der Zellen erfolgte mit Trypsin/ 0,2 g/L Na2 EDTA. Die abtrypsinierten Zellen
wurden zunächst in DMEM mit 10% fötalen Kälberserum (FCS) gehalten, um die
Vermehrung der Zellen zu unterstützen. Bei gutem Wachstum der Zellen erfolgte die weitere
Kultivierung mit 1% FCS Erhaltungsmedium.
2.2.2. Kryokonservierung von Zellen
Zur Langzeitlagerung von HepG2-Zellen in flüssigem Stickstoff bei �196°C wurden die Zellen
abtrypsiniert, zweimal mit DMEM gewaschen und für 10 min bei 2500 rpm zentrifugiert. Das
Zellpellet wurde in 4 ml Einfriermedium (40% Medium mit 10%FCS; 40% FCS, 20 % DMSO)
resuspendiert, in Kryoröhrchen zu je 1 ml aliquotiert, für einen Tag bei �80°C gelagert und
dann in die Flüssigstickstoffbehälter überführt. Bei erneuter Kultivierung der Zellen wurden
die Aliquots bei 37°C kurz erwärmt, zweimal mit DMEM-Wachstumsmedium gewaschen und
anschließend in Wachstumsmedium kultiviert.
2.2.3. Gewinnung und Reinigung von Nukleinsäuren
2.2.3.1. Phenol/Chloroform- Extraktion und Ethanol- Präzipitation
Mit diesem Verfahren wurden Nukleinsäuren aus einer Lösung von störenden Faktoren
(Proteinen/Salzen) getrennt und gereinigt. Zur Fällung der Proteine wurde ein Volumenteil
einer wässrigen Nukleinsäure-Lösung mit einem Volumenanteil TE-Puffer-gesättigtem
Phenol vermischt und 2 min bei 14000 rpm zentrifugiert. Die wässrige obere Phase wurde
abgenommen und anschließend mit einem Volumenanteil eines Phenol/Chloroform/
Isoamylalkohol (25:24:1) Gemisches ausgeschüttelt und zentrifugiert (2 min/14000 rpm).
Dieser Vorgang wurde nochmals mit Chloroform/Isoamylalkohol (24:1) wiederholt, um
Phenolreste wieder zu eliminieren. Die Nukleinsäurefällung erfolgte durch Zugabe von 1/10
Volumen 3 M Natriumacetat-Lösung (pH 4,8) und dem 2,5-fachen Volumen absoluten
Ethanol bei -80°C für 30 min. Nach einer 30 min Zentrifugation bei 14000 rpm wurde der
Überstand verworfen, das Pellet einmalig mit 70%igen Ethanol (-20°C) gewaschen und das
Pellet unter Vakuum getrocknet. Das getrocknete Pellet wurde dann in einem geeigneten
Volumen DEPC-H20 aufgenommen.
Methoden
55
2.2.3.2. Aufreinigung von Oligonukleotidprimern
Die Primer-Lyophillisate wurden in 500 µl Aqua dest. aufgenommen und zur Entfernung der
Salzrückstände mit Säulen aus Sephadex G-25 (NAP TM- 5 Säule) gereinigt. Zuvor
wurden die Säulen für die Reinigung präpariert, in dem sie dreimal mit 10 ml DEPC-H2O
gespült wurden. Danach wurde je 500 µl Primer-Lösung auf die Säule pipettiert und, sobald
die Primer-Lösung in die Säule eingedrungen war, mit 1 ml DEPC-H2O eluiert. Mit dem Eluat
erfolgte dann eine photometrische Konzentrations- und Reinheitsbestimmung.
2.2.3.3. Isolierung zellulärer RNA
Um die Expression des HBx-Gens in HepG2-Zellen zu detektieren, wurden die Zellen durch
das nicht ionische Detergenz NP-40 in einem hypotonen Puffer lysiert, wobei die Zellkerne
intakt bleiben und abgetrennt werden, so dass die RNA des Zytoplasmas im Anschluß durch
eine Phenol-/Chloroform-Extraktion isoliert werden kann. Nach der Entfernung des Mediums
wurden die in 6 Well- Platten kultivierten HepG2-Zellen mehrmals mit 1 ml PBS gewaschen
und schließlich mit 1 ml PBS abgeschabt. Nach der Überführung der Zellen in ein
Eppendorfcup erfolgte 1 min Zentrifugation bei 14000 rpm. Der Überstand wurde dekantiert
und das Zellpellet auf Eis mit 200µl RBS bis zur Schaumbildung resuspendiert. Die Zellkerne
wurden abzentrifugiert (1 min bei 14000 rpm) und der nukleinhaltige Überstand mehrmals mit
TE-Puffer gesättigtem Phenol-/Chloroform (1:1) extrahiert, bis die Interphase klar war. Aus
dem Überstand wurde die RNA mit Ethanol gefällt, abzentrifugiert und vakuumgetrocknet.
Die Präperationen wurden in 30 µL DEPC-H2O aufgenommen und als RNA-Template in die
RT-PCR eingesetzt.
2.2.3.4. Auftrennung der Nukleinsäure-Fragmente durch Agarosegelelektro-phorese
Die Auftrennung von Nukleinsäure-Fragmenten erfolgte mit horizontalen 0,6 -1%igen
Agarosegel in TAE-Puffer unter Zusatz von 0,4µg/ml Ethidiumbromid. Die Agarose
wurde in TAE-Puffer aufgekocht, nach Abkühlung mit Ethidiumbromid versetzt und in
einen abgedichteten Gelschlitten mit eingestecktem Kamm gegossen. Nach dem
Erstarren des Agarosegels wurde der Kamm entfernt und der Gelschlitten in die mit
TAE-Puffer gefüllten Gelkammer gelegt. Die Proben wurden mit 1/5 Volumen
Probenpuffer vermischt und in die Geltaschen pipettiert.
Methoden
56
Zur Auftrennung der Fragmente wurde eine konstante Spannung von 1- 10 V/cm
Elektrodenabstand angelegt. Die Laufzeit betrug ca. 1 bis 2 h, je nach Länge der
Laufstrecke und angelegter Spannung. Als Marker zur Identifizierung der
Fragmentgrößen diente der 1 Kb DNA-Marker. Die Beurteilung der Gele erfolgte
unter UV-Licht mit einem UV-Transilluminator.
2.2.4. Photometrische Konzentrations-, Stoffmengen- und Reinheitsbestimmung von Nukleinsäuren
Zur Bestimmung der Nukleinsäure-Konzentration wurde ihre optische Dichte (OD) bei 260
nm gemessen.
1 OD bei DNA-Doppelstrang (ds) = 50 µg/ml
1 OD bei RNA-Einzelstrang (ss) = 40 µg/ml
Angaben über die Reinheit der Nukleinsäure-Lösung gewinnt man durch die Berechnung des
Quotienten OD260/ OD280 .
Bei einer reinen DNA-Lösung sollte der Quotient OD260/ OD280 bei 1,8-2,0 liegen.
2.2.5. Enzymatische Modifikation von Nukleinsäuren
DNA-Spaltung mit Restriktionsendonukleasen:
Die Enzymreaktion unterschiedlicher Restriktionsenzyme setzt den Gebrauch entsprechen-
der Puffer und Salzkonzentrationen voraus.
Ein Standardrezept für einen Restriktionsverdau lautet :
• 5 µg DNA
• 2 µl 10 x Enzympuffer
• 1 U/ µg Restriktionsenzym
• ad 20 µl Aqua dest.
Methoden
57
Optimale Temperatur und entsprechender Inkubationspuffer wurden vom Hersteller
angegeben. Nach der Inkubation von 1-2 h bei optimaler Temperatur wurde die Reaktion per
Agarose-Gelelektrophorese kontrolliert.
2.2.6. Vermehrung und Gewinnung von Plasmid-DNA
2.2.6.1. Kompetente Bakterien für die Transformation
Für die Herstellung von kompetenten Bakterien wurden zunächst 3 ml LB+-Medium mit 20µl
einer Bakterienkolonie (Stamm HB 101) beimpft und über Nacht bei 37°C kultiviert. Mit 1ml
dieser Übernachtkultur wurden wiederum 100 ml LB + Medium beimpft und solange bei 37
°C kultiviert, bis sie eine OD660 von 0,40 bis 0,55 erreicht hatte. Dann wurde die Kultur 10 min
auf Eis gelagert und mehrmals geschüttelt. Nach einer 10 min Zentrifugation (3000 rpm in
F16/250 Rotor bei 4 °C) wurden die Bakterien in 30 ml kaltem TfB1 resuspendiert, 10 min auf
Eis inkubiert und für weitere 10 min bei 3000 rpm zentrifugiert (Rotor F-16/250 bei 4°C). Das
Pellet wurde in 4 ml kaltem TfB 2 aufgenommen und die Bakterienkultur aliquotiert und bei -
80°C gelagert. Zur Transformation durften die Bakterien frühstens 1 h nach dem Einfrieren
wieder aufgetaut werden.
2.2.6.2. Transformation mit kompetenten E. coli Bakterien
Die bei -80 °C gelagerten aliquotierten Bakterien (HB 101) wurden auf Eis (5-10 min)
aufgetaut. Zur Transformation wurden 80 µl kompetente E. coli Zellen entnommen,
zu 20 µl Plasmid-DNA pipettiert, vorsichtig gemischt und für 30 min auf Eis inkubiert.
Dann erfolgte ein Hitzeschock bei 42°C für 2 min und anschließend wurden die
Ansätze durch die Inkubation auf Eis (2 min) Kälte geschockt. Dann wurden jeweils
320 µl LB+-Medium zu den Ansätzen pipettiert, für 1 h in einem Schüttelinkubator bei
37°C inkubiert und an-schliessend wurden 100µl des Transformationsansatzes auf
LB-Agarplatten mit Ampicillin (100µg/ml) ausplattiert und bis zur Ausbildung der
Kolonien bei 37°C über Nacht inkubiert.
Methoden
58
2.2.6.3. Plasmidisolierung (Schnellpräparation) aus E. coli
Mit diesem Verfahren wird eine ausreichende Menge Plasmid-DNA aus transformierten
Bakterien isoliert, um rekombinierte Bakterienklone anschließend durch eine Restriktions-
enzymspaltung ihrer Plasmid-DNA ermitteln zu können. Die Bakterienkolonien, die nach der
Transformation auf den Agarplatten entstanden waren, wurden isoliert, in je 3ml LB-Medium
(mit 100µg/ml Ampicillin) überführt und über Nacht bei 37°C auf einem Schüttler inkubiert.
Am nächsten Tag wurde 1 ml aus jeder Übernachtkultur in ein Eppendorf-Cup überführt, 30 s
bei 9000 rpm zentrifugiert, der Überstand dekantiert und das Pellet durch Vortexen in 100 µl
Lösung 1 (Resuspensions-Lsg.) resuspendiert und 5 min bei Raumtemperatur inkubiert.
Dann wurden die Ansätze jeweils mit 100 µl Lösung 2 (Denaturierungs-Lsg.) versetzt, gut
gemischt und 5 min bei 60°C inkubiert. Anschließend wurden 150 µl Lösung 3
(Neutralisierungs-Lsg.) zugegeben, kurz gevortext und 15 bis 30 min auf Eis inkubiert. Nach
einer 10 min Zentrifugation bei 14000 rpm wurde der DNA-haltige Überstand abgenommen
und zur Präzipitation der DNA wurden die Proben mit 1ml Ethanol abs. versetzt und für 15
min bei �80°C inkubiert. Anschließend wurde für 10 min bei 14000 rpm zentrifugiert und das
Pellet zweimal mit 70%igem Ethanol gewaschen und vakuum getrocknet. Das getrocknete
Pellet wurde in 50 µL DEPC-Aqua dest. aufgenommen.
2.2.6.4. Präparation von bakterieller Plasmid-DNA
Diese Methode wurde eingesetzt, um Plasmid-DNA in einer hohen Konzentration mit einem
hohen Reinheitsgrad zu isolieren. Nach der Präparation wurde die isolierte Plasmid-DNA für
die Transfektionsexperimente verwendet.
500 ml LB- Medium mit 100 µg/µl Ampicillin wurden mit 1 ml einer frischen Übernachtkultur
transformierter E. coli Bakterien beimpft und bei 37°C auf einem Schüttler inkubiert bis die
OD550 der Bakterienkultur zwischen 0,85-1,0 lag. Durch Zugabe von Chloramphenicol
(Endkonzentration 170µg/ mL) wurden die Kulturen über Nacht bei 37°C weiter geschüttelt.
Die Bakteriensuspension wurde bei 4°C für 20 min und 4000 rpm in einem F16/250-Rotor
(Sorvall) zentrifugiert. Der Überstand wurde vollständig entfernt, das Pellet in 20 ml TES-
Puffer gewaschen und die Bakteriensuspension erneut bei 5000 rpm für 10 min zentrifugiert.
Im Anschluss wurde das Pellet in 25 ml frisch angesetztem STET-Puffer resuspendiert und
in einen 100 ml Erlenmeyerkolben überführt. Durch die Zugabe von 1 ml Lysozym-Lösung
und anschließendem Aufkochen über dem Bunsenbrenner für 40 s wurden die Zellen lysiert.
Die zähflüssige Maße wurde im F28/50-Rotor (Sorvall) für 45 min bei 16000 rpm
zentrifugiert, der Überstand mit dem gleichen Volumen Isopropanol versetzt und zur
Präzipitation der DNA für 10 min bei �80°C inkubiert.
Methoden
59
Anschließend wurde die DNA durch Zentrifugation für 60 min bei 12000 rpm im F28/50-Rotor
(Sorvall) pelletiert, 10 min im Vakuum getrocknet und in 8,7 ml Sarkosyl-Lösung
resuspendiert. Nach Zugabe von 9,4 g Cäsiumchlorid und 900 µl Ethidiumbromid-Lösung (20
mg/ ml) erfolgte eine isopyknische Zentrifugation für 24h bei 20°C und 50000 rpm im Typ FW
65- Rotor (Beckmann). Die Plasmidbande wurde unter UV-Licht mit einer Spritze (Kanüle
1,2x 50mm) abgezogen, auf 12 ml mit einer Cäsiumchlorid-Lösung (refraktiver Index 1,3865)
aufgefüllt und für 24h bei 20°C und 50000 rpm im Typ FW 65- Rotor zentrifugiert. Die
Plasmidbande wurde erneut abgezogen und die Lösung durch Ausschütteln mit NaCl-
gesättigtem Isopropanol vom Ethidiumbromid befreit. Anschließend wurde das
Cäsiumchlorid durch Dialyse über Nacht gegen 5 mM Tris-Puffer (pH 8,0) entfernt. Die DNA-
Konzentration sowie die Reinheit der Präparation wurde photometrisch bestimmt. Zur
Überprüfung der Plasmididentität wurde eine Restriktionsenzymspaltung durchgeführt.
2.2.6.5. DNase-Digestion
Der Verdau wurde im Anschluss an die RNA-Extraktion durchgeführt. Die Proben wurden mit
5 U DNase 1 / RNase frei für 15 min bei 37°C inkubiert und anschließend einer Phenol/
Chloroform-Extraktion und Ethanol-Fällung unterzogen. Durch die Digestion sollte eine
DNA-Kontamination bei der RT-PCR ausgeschlossen werden.
2.2.6.6. RNase-Digestion
Um RNA-Kontaminationen bei der Analyse von Apoptose in HepG2-Zellen mittels FACS und
DNA-Fragmentierung auszuschließen, wurde ein RNase-Verdau mit den extrahierten Proben
durchgeführt. In der Regel wurden 30-50µL Probenmaterial mit 1 µL RNase A (20 mg/ mL)
versetzt und 1 h bei 37°C inkubiert.
2.2.7. RT-PCR zum Nachweis von HBx-RNA
Als Template für die HBx-RT-PCR dienten 1-2 µl RNA-Präparation von den mit dem HBx-
Expressionsvektor transfizierten HepG2-Zellen. Die RNA wurde dabei in PCR-Puffer mit 50
pmol Sense- und Antisense Primer in 90% des Endvolumens gemischt und für 5 min bei
95°C denaturiert. Nachdem die Ansätze auf Eis abgekühlt waren, wurde das
Reaktionsvolumen auf 50 µl mit 2,5 U AMV-ReverseTranskriptase und 2U Taq-DNA-
Polymerase ergänzt.
Methoden
60
Die reverse Transkription erfolgte in allen Fällen für 30 min bei 42°C, gefolgt von einem
Denaturierungsschritt von 2 min bei 94°C. Daran schlossen sich 30 PCR-Zyklen mit
folgenden Parametern:
• Denaturierung 1 min bei 94 °C
• Annealing 2 min bei 56 °C
• Extension 3 min bei 72 °C
Nach Beendigung der PCR wurden die Proben mit DNA-Probenpuffer versetzt und das PCR
Produkt durch Auftragen auf ein 0,6 -%iges Agarosegel nachgewiesen.
2.2.8. Vitalitäts-Test
2.2.8.1. Neutral Rot (NR)-Test
(Bulgchev et al. 1978)
Mit Hilfe des Neutral Rot-Test wurde der Effekt von Microcystin auf die Vitalität von HepG2-
Zellen analysiert. Im Vordergrund stand dabei den optimalen Dosisbereich für dieses
Testsystem zu ermitteln. Zur Durchführung des NR-Testes wurden in eine 96-Well
Mikrotiterplatten pro Vertiefung 1x 106 Zellen eingesaet und für zwei Tage bei 37°C/ 5% CO2
kultiviert. Danach wurden die HepG2-Zellen für 2h mit Mircrocystin in einer Konzentration
von 0,1 µM, 1 µM und 10 µM und verschiedenen DMSO-Lösungen (0,004%, 0,04%, 0,4%)
bei 37°C/ 5% CO2 im serumfreiem Medium exponiert. Die DMSO-Kontrollen wurden mit-
geführt, um die interferierenden Effekte des Lösungsmittels auf die Vitalität von HepG2-
Zellen darzustellen. Nach der Exposition wurde das Meduim der Zellen abgesaugt und
zweimal mit 1x PBS gespült. Anschließend wurden die Zellen mit jeweils 100 µl im Dunkeln
bei 37°C präinkubierter NR-Lösung pro Well für 3h in serumfreiem Medium bei 37°C/ 5%
CO2 inkubiert. Nach Verwerfen des Überstandes wurden die Zellen mehrmals mit 1x PBS
gewaschen und durch Zugabe von 100 µl Extraktions-Lösung extrahiert. Nach 10 min
vorsichtigen Schüttels wurde die Extinktion bei 540 nm bestimmt. Als Blank diente ein
Ansatz, bei dem das NR fehlte. Die gemessene Vitalität der mitgeführten Kontrolle, die
weder mit Microcystin noch DMSO exponiert wurde, diente als Bezuggrösse für die
Ermittlung der endozytotischen Aktivität der Microcystin- oder DMSO-exponierten Proben
und wurde gleich 100% Vitalität gesetzt.
Methoden
61
Die Quantifizierung des extrahierten Farbstoffes aus den vitalen Zellen erfolgt mit den Elisa-
Reader, wobei die Absorbanz des Farbstoffes mit der Anzahl an vitalen Zellen korreliert.
2.2.8.2. Trypanblau-Test
Mit Hilfe des Trypanblau-Testes wurde die Membranpermeabilität von Zellen analysiert.
Dieser Test wurde einerseits zur generellen Zellzahlbestimmung, andererseits als
Vitalitätstest zur Ermittlung der protektiven Wirkung von Microcystin vor UV-induziertem
Zelltod in HepG2-Zellen eingesetzt. Trypanblau ist ein saurer Farbstoff, der von toten Zellen
aufgenommen wird und sie blau anfärbt. Lebende Zellen sind in der Lage den Farbstoff
auszuschliessen.
Für die Zellzahlbestimmung wurden in der Regel konfluent wachsende HepG2-Zellen einer
75er Kulturflasche abtrypsiniert und ein Volumenanteil der Zellsuspension mit einem
Volumenanteil Trypanblau-Lösung (0,2 -%ig) gemischt. Nach einer 2 min Inkubation bei RT
wurde die Zellzahl der vitalen unangefärbten Zellen mit Hilfe der Fuchs-Rosenthal Kammer
unter Berücksichtigung des Kammerfaktors und Verdünnungsfaktor ermittelt.
Zur Bestimmung des protektiven Einflusses von Microcystin vor UV-induziertem Zelltod
wurden konfluent wachsende HepG2-Zellen in einer 75er Kulturflasche mit 0 µM, 10 µM
Microcystin oder 0,4% DMSO in serumfreiem Erhaltungsmedium für 2h bei 37°C/ 5% CO2
präinkubiert. Anschließend wurden die Zellen nach mehrmaligem Spülen mit 1x PBS mit
Erhaltungsmedium versorgt und mit 100 J/m2 UV-Licht (254 nm) bestrahlt.
Nach einem erneuten Mediumwechsel wurden die Zellen für 24h bei 37°C/ 5% CO2 kultiviert.
Nach der mikroskopischen Kontrolle wurden die Zellen mittels einer Trypsin-EDTA-Lösung
aus der 75er Kulturflasche gelöst. Ein Volumenanteil der Zellsuspension wurde mit einem
Volumenanteil Trypanblau gemischt und von ca. 5 x 105 Zellen der Anteil (%) toter, blau
angefärbter- und vitaler Zellen bestimmt.
Die protektive Wirkung von Microcystin vor UV-induziertem Zelltod wurde letztendlich durch
den Vergleich des Anteils (%) toter Zellen der UV-induzierten Proben, unter Berück-
sichtigung der entsprechenden DMSO-Kontrolle, ermittelt. Die mitgeführten unbestrahlten
Ansätze dienten zur Ermittlung des Vitalitätszustandes der eingesetzten HepG2-Population.
Durch das Mitführen von Zellen, die nur mit DMSO oder Microcystin ohne UV-Bestrahlung
exponiert wurden, konnten Aussagen über die alleinige Wirkung beider Lösungen auf die
Zellvitalität gemacht werden. Generell wurden mit Hilfe der DMSO-Kontrolle interferierende
Effekte von DMSO in diesem Testsystem ermittelt. Der Prozentsatz an toten Zellen wurde
nach der folgenden Formel errechnet:
Methoden
62
2.2.9. radioaktive Markierung
2.2.9.1. Metabolische Markierung von Zellen mit 32P- und 35S- Methionin
Um die Effekte von Microcystin auf die Akkumulation von Phosphoproteinen oder die
Hyperphosphorylierung der Tumorsuppressorproteine (p53/ pRb) oder die metabolische
Stabilisierung von p53 zu analysieren, wurden die HepG2-Zellen zunächst metabolisch
markiert. Generell konnte bei der metabolischen Markierung auf die aktivierende UV-
Induktion von p53 verzichtet werden, da Vorversuche zeigten, dass die Markierung mit
Radionukliden ausreicht um das p53- Molekül in HepG2-Zellen zu aktivieren.
Für die metabolische Markierung wurden die HepG2-Zellen in einer Dichte von 5x 105 Zellen
in 6-Wellplatten eingesaet und zwei Tage bei 37°C/ 5% CO2 kultiviert. Zur Vorbereitung auf
die Markierung wurden die Zellen für 14 h in einem Mangelmedium (ohne Phosphat, ohne
Methionin) kultiviert und dann durch den Zusatz von entweder 7,4 MBq/ml 32P oder
3,7MBq/ml 35S- Methionin im Mangelmedium für 3h metabolisch markiert. Nach der
Markierung wurde der radioaktive Überstand entsorgt, mehrmals mit 1x PBS gespült und die
Zellen mit 3 ml frischem, serumfreiem Medium versorgt. Im Anschluss wurden die markierten
Zellen mit verschiedenen Microcystin-Konzentrationen (0,1 µM, 1 µM, 10 µM) oder 0,4%
DMSO-Löung für 2h bei 37°C/ 5% CO2 exponiert. Nach der Exposition wurden die Zellen
mehrmals mit 1x PBS gespült, abgeschabt und mit 500 µl Proteinlysis-Puffer lysiert. Um die
zellulären Bestandteil zu entfernen folgte eine 10 min Zentrifugation bei 12000 rpm (4°C).
Um die quantitative Microcystin-vermittelte Akkumulation von Phosphoproteinen oder
metabolische Stabilisierung von p53 zu bestimmen, wurde mit äquivalenten Proteinmengen
eine Szintillations-Messung am Trilux 1450 Microbeta mit zuvor abgeglichenen Detektoren
(Normalisierung) durchgeführt. Um den Einfluss von Microcystin auf die metabolische
Stabilisierung von p53 und auf die Hyperphosphorylierung der Tumorsuppressorproteine zu
bestimmen, wurde nach der Markierung und Exposition mit DMSO und Microcystin eine
Immunpräzipitation durchgeführt.
Methoden
63
2.2.9.2. Flüssigkeits-Szintillations-Messung von 32P und 35S-Methionin markierten HepG2-Gesamtzellproteinextrakten
Diese Technik eignet sich zur Quantifizierung von verschiedenen Radioisotopen (ß-Strahler).
Das Grundprinzip dieser Methode besteht darin, dass emittierte ß-Strahlung in der
markierten Probe von fluoreszierenden Molekülen absorbiert und als Lichtenergie
abgegeben wird (Szintillation). Die dabei entstehenden Lichtimpluse werden von einer
Photokathode registriert und danach weiterverarbeitet. Je höher der Wert für die maximale
Energie der ß- Strahlung ist (Emax), desto mehr Lösungsmittelmoleküle werden von dem ß-
Teilchen angeregt und desto stärker ist der abgegebene Lichtimpuls.
Für die Szintillations-Messung wurden äquivalente Mengen von 35S- oder 32P- markierten
HepG2-Lysaten mit 100 µl Szintillations-Mix gemischt und die Radioaktivität (cpm/µg Protein)
in den verschiedenen Proben mit Hilfe des Mikrobeta Trilux mit zuvor abgeglichenen
Detektoren (Normalisierung) gemessen. Anhand der gemessenen cpm/µg Protein werden
die Effekte von Microcystin auf die Proteinstabilität und Akkumulation von Phosphoproteinen
bestimmt. Die ermittelten cpm/µg Protein in der unbehandelten markierten HepG2-Probe
dienten unter Berücksichtigung der DMSO-Kontrolle als Bezugsgrösse für die Ermittlung des
Einflusses von Microcystin auf die Proteinstabilität und Akkumulation von Phosphoproteinen.
2.2.10. Quantifizierung von Proteinen
Proteinstimmung nach Bradford :
Zur Bestimmung äquivalenter Proteinmengen wurde die Proteinbestimmung nach Bradford
durchgeführt. Zur Messung des Proteingehaltes wurde jeweils aus den markierten und
unmarkierten HepG2-Zellextrakten 5 µl entnommen oder 5 µl des Lysis-Puffers (Blank), mit
795 µl Aqua bidest. und 200 µl Coomassie-Brillant-Blau G250 vermischt. Nach einer 5 min
Inkubation bei RT wurde die Absorption der Proben bei 595 nm am Photometer bestimmt.
Zur Standardisierung wurde Rinderserumalbumin von 1mg/ ml eingesetzt.
Methoden
64
2.2.11. Darstellung und Auswertung von Proteingelen
2.2.11.1 SDS-PAGE
Die Proteine wurden mit Hilfe einer diskontinuierlichen, eindimensionalen SDS-PAGE nach
ihrem Molekulargewicht aufgetrennt. Die radioaktiv markierten Immunpräzipitate (2.2.9.1)
wurden auf einem 10%igen Trenngel (p53) oder auf einem 5- 15%igen Gradienten-Trenngel
(pRb) aufgetragen. Für die Western-Blot- Analyse (2.2.14) wurde ein 12%iges Trenngel
verwendet. Als Sammelgel wurde in der Regel ein 4%iges Gel gegossen. Zur Überprüfung
der Proteinbestimmung nach Bradford wurden in einigen Fällen die Gele mit Coomassie-
Blau gefärbt. Die optische Darstellung der 35S-markierten Immunpräzipitate erfolgte per
Fluorographie und die 32P-Orthophosphat markierten Immunpräzipitate via Autoradiographie.
Die Western-Blot-Analyse wurde durch die ECL-Reaktion visualisiert.
2.2.11.2. Autoradiographie
Die mit Hilfe der SDS- PAGE aufgetrennten 32P-markierten Immunpräzipitate wurden in 10%
Eisessig/40% Methanol-Lösung fixiert und auf einen Röntgenfilm bei �80°C exponiert. Die
Autoradiogramme wurden mittels der Software ImageLab Version 2.0 densitometrisch
quantifiziert.
2.2.11.3. Fluorographie
Mit der fluorographischen Darstellung wurden die 35S-Methionin markierten Immun-
präzipitate nachgewiesen. Nach der Fixierung der Proteingele in 10% Eisessig / 40%
Methanol erfolgte die Inkubation der Gele in einem Szintillationsmix für 30 Minuten. Dann
wurden die Vakuum-getrockneten Gele zum Nachweis der Immunpräzipitate bei �80°C auf
einem Röntgenfilm für 2-3 Tage exponiert. Die Fluorogramme wurden mittels der Software
ImageLab Version 2.0 densitometrisch quantifiziert.
2.2.11.4. Densitometrie
Die nach der Autoradiographie und Fluorographie auf dem Röntgenfilm nachgewiesenen
geschwärzten Proteinbanden wurden eingescannt und dann mittels der Software ImageLab
Version 2.0 densitometrisch quantifiziert. Das Densitometer zeichnet die Banden in
Abhängigkeit von der Schwärzung in Form von Peaks auf. Das Integral der Fläche unter den
erhaltenen Peaks gilt als relatives Maß für die Proteinmenge in den entsprechenden Banden
der Gele.
Methoden
65
2.2.12. Methoden der Proteinanalytik
2.2.12.1. Immunpräzipitation mit Protein-A-Sepharose
Um die Effekte von Microcystin auf die metabolische Stabilisierung von p53 und
Hyperphosphorylierung von p53 und pRb zu analysieren, wurde mit den 35S-Methionin- und 32P-Orthophosphat markierten HepG2-Zellen eine Immunpräzipitation durchgeführt. Zur
Immunpräzipitation von p53 und pRb wurden zunächst 500µg des radioaktiv markiertem
HepG2-Lysat mit 20 µl Protein A für 1h bei 4°C präinkubiert, um unspezifische Bindungen
an den Protein A-Sepharose-Beads zu vermeiden. Das Lysat-Protein A-Gemisch wurde für
10 Minuten bei 14000 rpm (4°C) zentrifugiert und der Überstand für 2 h mit 1µg p53
Antikörper oder 1µg pRb Antikörper bei 4°C inkubiert. Im Anschluss wurde der
Immunkomplex durch eine 2h Inkubation (4°C) mit den Protein A-Sepharose-Beads
gesammelt und durch vorsichtiges Zentrifugieren bei 4°C mit 2000 rpm pelletiert. Das Pellet
fünfmal mit PBS gespült und nach der letzten Zentrifugation bei 2000 rpm mit 30 µl 2x SDS-
Loading Puffer resuspendiert. Zur Dissoziation des Immun-Beads-Komplexes erfolgte eine 4
min Erhitzung bei 95°C und anschließend eine 2 min Zentrifugation bei 14000 rpm. Die
Immunpräzipitate wurden mittels SDS-PAGE elektrophoretisch aufgetrennt. Mit Hilfe der
Beads-Kontrolle und Negativ-Kontrolle (Ak nicht gegen p53 oder pRb gerichtet) sollten
mögliche unspezifische Reaktionen bei der Immunpräzipitation erfasst werden.
Die Bestimmung der Wirkung von Microcystin auf die metabolische Stabilsierung von p53
und Hyperphosphorylierung von p53 und pRb wurde durch die qualitative Beurteilung der
Intensität der Proteinbanden bestimmt. Die Intensität der markierten unbehandelten Probe
unter Berücksichtigung der DMSO-Kontrolle diente dabei als Bezugsgrösse. Die quantitative
Bestimmung der Microcystin-assoziierten Effekte erfolgte per Densitometrie.
2.2.12.2. Isoelektrische Fokussierung (IEF)
Mit Hilfe der IEF wurde der Einfluss von Microcystin auf die Hyperphosphorylierung von p53
bestimmt. Die IEF bietet die Möglichkeit posttranslationale Modifikationen an Proteinen als
Mikroheterogenitäten elektrophoretisch darzustellen. Die Proteine wandern im elektrischen
Feld durch einen pH-Gradienten bis zu ihrem isoelektrischen Punkt (IP), der durch die
Nettoladung des Proteins bestimmt wird und an diesem Punkt Null beträgt. Die Nettoladung
eines Proteins ist die Summe aller negativen und positiven Ladungen an den Amino-
säurenseitengruppen. Protein-Modifikationen gehen mit der Änderung des Ladungs-
zustandes des Proteins einher und verschieben somit den IP.
Methoden
66
Durch die Kombination der IEF mit der WB-Analyse können Microcystin-induzierte
Änderungen des Phosphorylierungs-musters von p53 (Hyperphosphorylierung) in der IEF
aufgetrennt werden und anschließend die entsprechenden Phosphostellen im p53-Protein
mit monoklonalen Antikörper nachgewiesen werden. In diesem Fall wurde ein biotinylierter
Antikörper gegen p53 Wt eingesetzt (s. WB- Analyse).
Bevor die IEF gestartet wurde, erfolgte die Hochregulation des p53-Proteins in den HepG2-
Zellen mit Hilfe einer 20h Inkubation mit 0,45 nM Actinomycin D. Anschließend erfolgte eine
Inkubation der Zellen mit 0 µM oder 10 µM Microcystin oder 0,4% DMSO für 2h. Danach
wurden die Zellen mit 600µl IEF-Lysis-Puffer lysiert und um die unlöslichen zellulären
Bestandteile zu entfernen für 5 min bei 14000 rpm (4°C) zentrifugiert. Der proteinhaltige
Überstand wurde bis zum IEF� Lauf auf Eis inkubiert.
Vor dem Start der IEF wurde die Kühlplatte der IEF- Apparatur auf 4°C vorgekühlt und mit
2 ml Kühlmittel benetzt. Dann wurde das IEF-Fertiggel (pH 5-7) luftblasenfrei aufgelegt und
mit Kathoden-/ Anodenpuffer getränkte Papierelektroden versehen. In den mittig aufgelegten
Applikatorstreifen wurden gleiche Mengen an Probenmaterial pipettiert und die Stab-
Elektroden auf die getränkten Papierelektroden gelegt, mit einer Glasplatte beschwert und
an die Spannungsquelle angeschlossen. Die Laufzeit der Fokkussierung betrug 3h bei 2000
V/3mA. Bevor das IEF-Gel auf eine Nitrozellulose Membran geblottet wurde, erfolgte partiell
die Überprüfung des Gellaufes mit Hilfe der Ponceau S-Färbung.
2.2.12.3. Western-Blot-Analyse
Mit Hilfe der WB- Analyse sollte der Effekt von Microcystin auf die metabolische Stabilität von
p53 analysiert werden. Für die WB- Analyse wurden die HepG2-Zellen (5x105) in eine 6-
Wellplatte eingesaet und für zwei Tage bei 37°C / 5% CO2 kultiviert. Mit Hilfe einer UV- Be-
strahlung (7J/m 2 /254nm) wurde das p53-Protein in HepG2-Zellen induziert. Nach der UV-
Induktion erfolgte zunächst ein Mediumwechsel und dann für 18 h eine Inkubation bei 37°C/
5% CO2. Die 18h Inkubation nach der UV-Induktion war für die Akkumulation des p53-
Proteins (endogen) in den HepG2-Zellen erforderlich. Bei der Induktion des p53-Proteins
mittels UV-Licht erfolgt eine langsame Phosphorylierung des p53-Proteins, die jedoch für
längere Zeit anhält (Appella and Anderson, 2001). Nach der 18h Inkubation wurden die
HepG2-Zellen für 2h mit Microcystin in einer Konzentration von 0,1 µM, 1 µM und 10 µM und
0,4 % DMSO bei 37°C/5% CO2 exponiert. Anschließend wurden die Zellen mehrmals mit 1x
PBS gespült, abgeschabt und in einen Proteinlysis-Puffer lysiert. Mit Hilfe des Elektroblotes
wurden die im Gel befindlichen Proteine auf eine Nitrozellulosemembran transferiert. Durch
die reversible Ponceau S-Färbung wurde die Protein-Konzentration und die Qualität des
Methoden
67
Transfers überprüft. Um die unspezifischen Bindungsstellen zu blockieren wurde die
Membran für 30 min mit einer 0,2% Tween 20-Lösung in Tris (TBST) vor der Immunreaktion
inkubiert. Dann erfolgte die 1h Inkubation der Membran mit dem p53- biotinylierten
Antikörper bei RT. Um unspezifische Bindungen und überschüssigen Antikörper zu
eliminieren folgte ein dreimaliges Spülen der Membran mit TBST. Danach wurde die
Membran für 45 min mit dem Streptavidin-horseradisch Peroxidase Konjugat inkubiert. Nach
der Inkubation wurde die Membran mit TBST gespült und die Immunreaktion wurde auf
einem Röntgenfilm mittels Chemilumineszenz (ECL-Reaktion) visualisiert. Die Identität des
53 kDa Proteins wurde durch einen farbigen Molekular-Gewichtsmarker bestimmt. Anhand
der ermittelten Intensität der Proteinbanden in den entsprechenden Proben nach der ECL-
Reaktion wurde der Einfluss von Microcystin auf die metabolische Stabilisierung von p53
bestimmt.
2.2.13. Protein-Färbungen
2.2.13.1. Coomassie-Färbung
Direkt nach der SDS-PAGE wurden die Proteine im Gel unspezifisch mit Coomasie
angefärbt. Die Gele wurden in die Coomassie Blau-Farblösung überführt und für 20 min bis 1
h leicht schwenkend inkubiert. Anschließend wurde der überschüssige Farbstoff durch
mehrmaliges Austauschen der Entfärbe-Lösung entfernt und die Gele an der Luft getrocknet.
2.2.13.2. Silberfärbung (modifiziertes Protokoll nach Blum et al./ 1987)
Die Silberfärbung wurde mit den IEF-Gelen nach der Coomassie Blau-Färbung durchgeführt,
um die Qualität der durchgeführten IEF zu kontrollieren. Zur Fixierung der IEF Gele wurde
eine 20 min Inkubation in einer Methanol/ Eisessig-Lösung durchgeführt und anschließend
dreimalig in 30% Methanol gespült.
Es folgte eine 1 min Inkubation in Thiosulfat-Lösung, ein kurzes Spülen in Aqua bidest. und
schließlich eine 20 min Färbung in Silbernitrat-Lösung. Dann erfolgte wieder ein dreimaliges
Spülen in Aqua bidest. und eine 5 min Inkubation in der Entwicklungs-Lösung. Die Proteine
wurden dabei im Gel als bräunlich-schwarze Banden nachgewiesen. Das gefärbte Gel wurde
zweimal kurz in Aqua bidest. geschwenkt und für 5 min mit der Stop-Lösung überschichtet.
Methoden
68
2.2.13.3. Ponceau S-Färbung
Nach der Western- Blot- Analyse wurde die Nitrocellulose-Membran kurz in Aqua.
bidest. geschwenkt. Anschließend erfolgte die Färbung der Nitrocellulose für ca. 1
min mit Ponceau-S-Lösung. Zur Entfärbung wurde die Membran 2x1 min in Aqua
bidest. geschwenkt. Zusätzlich folgte eine Entfärbung der Membran für 3x 5 min in
TBST und dann erfolgte die Immun-Detektion.
2.2.14. Funktionsanalyse
2.2.14.1. Induktion für die Transfektionsexperimente
Um die zellulären Proteine (p53, pRb, pE2F, cMyc) in HepG2-Zellen für die funktionelle
Analyse der kombinatorischen Effekte von Microcystin und dem HBx-Proteinauf die
Zellzyklus-Regulation zu induzieren, wurden verschiedene Techniken verwendet. Das
endogene p53-Protein wurde durch UV-Strahlung (7J/m2/254nm) und einer an-
schliessenden 18h Inkubation bei 37°C/ 5% CO2 in den HepG2-Zellen induziert. Die
Induktion der anderen Zellzyklus-Regulatoren (pRb, E2F, c-Myc), die vor allem die G1/ S-
Transition beeinflussen, wurden durch Serumentzug (2 Tage zur Synchronisation) und
nachfolgender Serumzugabe (1Tage) induziert (nach Fa. Clontech).
2.2.14.2. Transfektion mit Calcium-Phosphat-Präzipitate
Nach der Induktion der entsprechenden zellulären TF wurden die verschiedenen Luciferase-
Plasmide und die Expressionsvektoren HBx und p53 per Calcium- Phosphat- Technik
transient in die HepG2-Zellen eingeschleusst. Zunächst wurden die HepG2-Zellen für die
Transfektion in einer Dichte von 1 x 10 6Zellen/ Well in eine 6- Well Platte eingesaet und für
zwei Tage bei 37°C/ 5% CO2 kultiviert. Für die Transfektion wurde 1µg von den Luciferase-
Konstrukten (2.1.4.4) und 4µg von den Expressionsvektoren HBx (2.1.4.1) oder p53 (2.1.4.3)
mit TE-Puffer auf 438 µl aufgefüllt und 62 µl 2M Calciumchlorid-Lösung hinzugetropft. Dann
erfolgte die tropfenweise Zugabe von 500 µl 2x HBS und eine 30 min Inkubation auf Eis.
Anschließend wurde die Calcium- Phosphat-DNA-Präzipitat-Lösung langsam, tropfenweise
in das Medium pipettiert. Nach einer 2-3h Inkubation bei 37°C/5% CO2 folgte die Abnahme
des Mediums und eine Exposition der Zellen mit einer Glycerolschock-Lösung für 90s.
Methoden
69
Nachfolgend wurden die Ansätze zwei- bis dreimal mit Erhaltungsmedium gespült und für
weitere 20h bei 37°C/5% CO2 kultiviert. Diese Zeit ist erforderlich für den Transport der
Expressionsvektoren in den Nukleus und zur allgemeinen Stabilisierung der Transkription
(persönliche Mitteilung der Fa. Clontech). Nach 18h wurde die Kultivierung unterbrochen und
es folgte für die restlichen 2 h die Exposition der Zellen mit 10 µM Microcystin oder 0,4%
DMSO in serumfreiem Medium bei 37°C/5% CO2.
Zum Lösen von Microcystin wurde DMSO eingesetzt, daher wurde zur Differenzierung der
Lösungmittel- und Microcystin- Wirkung auf die Zellzyklus-Regulation in HepG2-Zellen
jeweils zu jeder Microcystin-Konzentration eine DMSO-Kontrolle mitgeführt. Danach wurden
die Zellen mehrmals mit 1x PBS gespült und anschließend mit dem Clontech-Lyse-Puffer
lysiert. Die Zellen wurden zunächst mit 200 µl Lysis-Puffer (Clontech) für 20 min bei RT
lysiert. Zur Entfernung von unlöslichen zellulären Bestandteilen erfolgte eine Zentrifugation
bei 14000 rpm für 1 min (RT). Für die Messung wurden jeweils gleiche Mengen Protein-
Lysat (1µg Protein) in ein Well einer 96- Well Platte, die lichtundurchlässige Seitenwände
aufweist, pipettiert und mit 100 µL auf RT vorgewärmtes Reagenz A gemischt. Kurz vor der
Messung erfolgte die Zugabe des Reagenz B (RT vorgewärmt) und zügig die
Aktivitätsbestimmung am Trilux 1450 Microbeta-Coulter mit zuvor abgeglichenen Detektoren
(Normalisierung). Jede Probe wurde für 10 sec. gemessen. Die Angabe der Luciferase-
Aktivität wurde in LCPS/µg Protein angegeben. Die Effizienz der Transfektion wurde wie im
technischen Handbuch von Promega (www.promega.com) beschrieben ermittelt.
2.2.15. Zellzyklus-Apoptose-Analytik
2.2.15.1. Durchflusszytometrische-Analyse
Diese Methode dient sowohl der Zellzyklus-Analyse als auch der Ermittlung des relativen
Anteils apoptotischer Zellen in einer Zellpopulation. Über die durchflusszytometrische
Bestimmung des DNA-Gehaltes (2n, 2-4n, 4n) einzelner Propidium-Jodid gefärbter Zellen
kann der relative Anteil von Zellen in den verschiedenen Zellzyklusphasen (G 1, S, G2 /M)
ermittelt und quantifiziert werden. Auch bei der Analyse apoptotischer Zellen ist die
durchflusszytometrische Bestimmung des DNA-Gehaltes einzelner Zellen die Methode der
Wahl. Zusätzlich zu den einzelnen Zellzyklusphasen erhält man weitere Fluoreszenzsignale
im Sub-G1-Bereich. Diese Zellen haben einen hypodiploiden DNA-Gehalt (<2n) und besitzen
einen apoptotischen Charakter. Dieses durchflusscytometrische Verfahren wurde eingesetzt,
um die Effekte von Microcystin auf die S-Phaserate in einer HepG2-Population zu
bestimmen.
Methoden
70
Zusätzlich sollte mit dieser Methode die protektive Wirkung von Microcystin vor UV-
induzierter Apoptose untersucht werden. Für die Ermittlung der Zahl der Zellen in der S-
Phase wurden die HepG2-Zellen in 6- Wellplatte eingesaet und für 2 Tage bei 37°C/ 5% CO2
kultiviert. Dann erfolgte die Exposition der Zellen in serumfreiem Medium mit Microcystin in
einer Konzentration von 10 µM und 0,4% DMSO (Lösungsmittel) für 2h bei 37°C/ 5% CO2.
Nach der Exposition wurden die Zellen mehrmalig mit 1x PBS gespült.
Zur Ermittlung der protektiven Wirkung von Microcystin vor UV-induzierter Apoptose wurden
die HepG2-Zellen in eine 75er Kulturflasche eingesaet und für zwei Tage bei 37°C/5% CO2
in Erhaltungsmedium kultiviert. Nach einem Mediumwechsel wurden die Zellen in serum-
freiem Medium mit 10 µM Microcystin oder 0,4% DMSO für 2h bei 37°C/5% CO2 präinkubiert.
Nach einem mehrmaligen Spülen mit 1x PBS wurden die Zellen mit Erhaltungsmedium
versorgt und mit UV-Licht (100 J/m2/254 nm) bestrahlt. Anschließend wurde erneut das
Medium gewechselt und die Zellen für 24 h bei 37°C/5% CO2 kultiviert.
Für die durchflusszytometrische Messung wurden die Zellen abtrypsiniert, in einem
Eppendorf-Cup zweimal mit PBS gewaschen, bei 9000 rpm für 2min zentrifugiert und 1x10 6
Zellen in 150µl PBS vorsichtig resuspendiert. Zur Fixierung der Zellen wurden unter
Schütteln 350µl Ethanol abs. zugetropft und die Zellen für mindestens 24 h bei 4°C gelagert.
Zur Entfernung des Ethanols wurden die Zellen bei 9000 rpm für 2 min zentrifugiert und das
Pellet in 100 µl Propidium-Jodid-Lösung resuspendiert. Nach der Inkubation für 30 min bei
RT im Dunkeln wurden die Zellen in 1 ml isotonischen Puffer (Isoton ® II) überführt.
Anschließend wurden die gefärbten Zellen in einem EPICS XL im Laserlicht mit der
Wellenlänge von 488 nm angeregt und die emittierte Fluoreszenz von 10000 Zellen
quantifiziert und in einem Histogramm dargestellt.
Da bei der Untersuchung der Apoptose die durchflusszytometrische DNA-Analyse nicht aus
reicht, wurden die aus dem Apoptose-Versuch gewonnenen Zell-Aliquots in den Trypanblau-
Test und für die elektrophoretische Darstellung der DNA-Fragmente eingesetzt.
2.2.15.2. Qualitative Analyse der DNA-Fragmentierung (DNA-Laddering)
Mit dieser Analyse wurde fragmentierte DNA aus apoptotischen Zellen gelelektrophoretisch
dargestellt. Die aus dem Apoptose-Versuch (2.2.15.1) gewonnenen Zellen wurden zweimal
mit 1x PBS gewaschen. Nach der Zentrifugation für 2 min bei 9000 rpm wurde das Pellet in
400 µl Lysepuffer resuspendiert (2.2.3.3) und für 30 min auf Eis inkubiert.
Methoden
71
Anschließend wurden die Zellkerne bei 14000 rpm für 10 min abzentrifugiert und mit dem
Überstand eine Phenol-/Chloroform-Extraktion und Ethanol-Präzipitation durchgeführt. Nach
dem Trocknen wurde das Pellet in 30µl TE-Puffer mit 1µg/ µl RNase A resuspendiert und bei
37°C für 1h inkubiert. Nach dem RNase-Verdau erfolgte mit 1µg DNA in 10 µl DNA-
Probenpuffer pro Spur die elektrophoretische Auftrennung in einem 1,5%igen Agarosegel für
1,5h bei 70 V.
2.2.16. Laser-Scanning-Mikroskopie (nach Fa. Clontech)
HepG2-Zellen wurden mit Hilfe der Ca2+-Phosphat-Methode mit dem p53-GFP-
Expressionsvektor transfiziert. Nach 48h wurden die Zellen partiell für 2h mit 0,4% DMSO
oder 10µM Microcystin bei 37°C/5% CO2 präinkubiert .Nach dieser Inkubation erfolgte ein
Mediumwechsel und das Fusionsprotein wurde durch eine UV-Bestrahlung (7J/m2 bei
254nm) aktiviert, für 2h bei 37°C/5% CO2 inkubiert und dann wurden die Zellen fixiert. Zur
Fixierung der Zellen wurde das Medium entfernt, dreimal mit 1x PBS gespült, für 10 min in
4% Paraformaldehyd bei RT inkubiert und anschließend für 15 min bei -20°C in Methanol
gelagert. Nach mehrmaligen Spülen mit 1x PBS erfolgte die Analyse der subzellulären
Lokalisation des p53-GFP-Fusionsproteins nach UV-Induktion mit Hilfe des Laser-Scanning-
Mikroskopes (Öl/ 488 nm Argonlaser; Zeiss). Ein wichtiges Kriterium für der Nachweis war
die qualitative Bewertung der Akkumulation der Fluoreszenz (Nukleus/Cytoplasma) in den
HepG2-Zellen.
2.2.17. Statistik
Zur Untersuchung der statistischen Signifikanz der ermittelten Luciferase-Aktivitäten in den
Transfektionsexperimenten (3.6/3.7) wurde der double sided students t-test, der Krusal-
Wallis-Test und die Varianz-Analyse mit Hilfe der KyPlot® Version 2.0 Software für Windows
(Prof. Koichi Yoshioka) durchgeführt. Als Signifikanzschwellen wurden drei unterschiedliche
Irrtumswahrscheinlichkeiten festgelegt (p*< 0,05, p**< 0,01 und p*** < 0,001).
Resultate
72
3. Resultate
3.1. Einfluss von Microcystin auf die Vitalität und den Metabolismus von HepG2-Zellen
Als Testsystem dienten initiierte HepG2-Zellen, die Abkömmlinge einer
differenzierten humanen Hepatoma Zell-Linie darstellen. Als Besonderheit weisen sie
eine normale Expression des p53-und pRb-Gens auf und zeichnen sich durch das
Fehlen einer integrierten HBV-DNA-Sequenz aus. Da sie zusätzlich nur geringfügig
in ihren phänotypischen und biochemischen Eigenschaften von einem gesunden
differenzierten Hepatozyten abweichen, stellen sie ein allgemein akzeptiertes
Testsystem für diese leberspezifische in vitro Tumorpromotor-Studie dar.
3.1.1. Einfluss von Microcystin auf die Vitalität von HepG2-Zellen
In diesem Vorversuch sollte im Neutralrot-Vitalitätstest (NR) geklärt werden, welchen
Einfluss verschiedene Microcystin-Konzentrationen auf die Vitalität von HepG2-
Zellen haben. Im Vordergrund stand dabei den �optimalen Dosisbereich� in diesem
Testsystem für die fortlaufenden Experimente zu ermitteln.
Für die Durchführung des Eppendorfcupes wurden HepG2-Zellen in eine 96er
Wellplatte eingesaet und für 2 h mit verschiedenen Microcystin-Konzentrationen und
den entsprechenden DMSO-Konzentrationen exponiert. Durch das Testen von
DMSO war es möglich, die interferierenden Effekte von DMSO in dem Testsystem
darzustellen. Der Einfluss von Microcystin auf die HepG2-Vitalität wurde über die
endozytotische Aktivität der Zellen bestimmt. Die ermittelte endozytotische Aktivität in
den unbehandelten Zellen wurde mit 100% Vitalität gleichgesetzt und für die
Ermittlung der Vitalität der Zellen nach einer DMSO- oder Microcystin-Exposition als
Bezugsgrösse eingesetzt. Der Einfluss von Microcystin oder DMSO auf die
apparente endozytotische Aktivität von HepG2-Zellen ist in Abb. 3.1 /3.1.1
dargestellt.
Resultate
73
0 10 0 1 0 0,1 0 Microcystin (µM)
0 0,4 0,4 0,04 0,04 0,004 0,004 DMSO (%)
Abb. 3.1: Einfluss von Microcystin auf die Vitalität von HepG2-Zellen
Die Vitalität von HepG2-Zellen (1x106 pro Well) wurde nach der Exposition mit verschiedenen Microcystin-
Konzentrationen für 2h bei 37°C/ 5%CO2 im Neutralrot- Test bestimmt. DMSO diente als Lösungsmittel-Kontrolle.
Der %- Anteil an Vitalität in den verschiedenen Ansätzen wurde photometrisch bei 540 nm mit einem ELISA-
Reader gemessen. Die Graphik zeigt die Mittelwerte aus vier unabhängigen Versuchen +/- SD.
1.
0 10 1 0, 1 Microcystin (µM)
Abb. 3.1.1: Darstellung der optimale Dosis von Microcystin in einem Hepatozytenkultursystem
Abzüglich der interferierenden Wirkung von DMSO wurde die optimale Dosis von 10 µM Microcystin in diesem
Testsystem bestimmt
Im Vergleich zur Kontrolle (100%) konnte bei den HepG2-Zellen sowohl nach der
Microcystin- als auch nach einer DMSO-Exposition konzentrationsabhängig ein
Anstieg der Vitalität nachgewiesen werden.
0
50
100
150
200
Vita
lität
(%)
0
1 0 0
2 0 0
3 0 0
4 0 0
5 0 0
Vita
lität
(%)
Resultate
74
Die Exposition der Zellen mit der eingesetzten maximalen Microcystin-
Konzentrationen (10 µM) führte zu einem ~3,9-fachen Anstieg der Vitalität, in der
entsprechenden DMSO-Kontrolle wurde ein ~2,1-facher Anstieg der Vitalität
gemessen.
Microcystin in einer Konzentration von 1 µM führte zu einer 3,7-fachen Steigerung
der endozytotischen Aktivität, bei der DMSO-Kontrolle (0,04%) wurde ein ~2,9-
facher Anstieg der Vitalität beobachtet.
Über die Wirkung einer 0,1 µM Microcystin-Konzentrationen auf die Vitalität von
HepG2-Zellen kann keine genaue Aussage getroffen werden, da hier kein
auflösbarer Unterschied zwischen der Wirkung von Microcystin und DMSO auf die
endozytotische Aktivität der HepG2-Zellen besteht.
Bei den anderen Microcystin-Konzentrationen konnte deutlich zwischen der Wirkung
von DMSO und Microcystin auf die Zellvitalität differenziert werden, wobei der
interferierende Effekt von DMSO in der 1 µM Microcystin-Konzentrationen stärker
ausfiel als bei der 10 µM Microcystin-Lösung.
Zusammenfassend kann man sagen, dass die 10 µM Microcystin-Lösung, unter
Berücksichtigung der interferierenden Wirkung von DMSO (Abb. 3.1.1), in diesem
Testsystem die optimale Dosis darstellt und aus diesem Grund vornehmlich für die
weiteren Analysen eingesetzt wurde.
3.1.2. Microcystin-assoziierte Phosphorylierung und Stabilisierung von zellulären Proteinen
Um den Einfluss von Microcystin auf die Akkumulation von zellulären Phospho-
proteinen zu analysieren, wurden die HepG2-Zellen für 3 h mit 32P-Orthophosphat
markiert und nach mehrmaligem Spülen mit 1x PBS für 2 h mit verschiedenen
Microcystin-Konzentrationen exponiert.
In diesem Experiment können aufgrund der hier gewählten Versuchsbedingungen
nur Aussagen über den Einfluss von Microcystin auf die Akkumulation von
Phosphoproteinen in der Zelle gemacht werden.
Resultate
75
Die Wirkung von Microcystin auf die verschiedenen Zellzyklus-assoziierten
Signalkaskaden oder eine direkte Korrelation von Microcystin mit Zellzyklus-
Regulatoren wird zu einem späteren Zeitpunkt dargestellt.
Durch die Ermittlung der Radioaktivität in den HepG2-Gesamtzellproteinextrakten mit
Hilfe der Szintillations-Messungkonnte der Einfluss von Microcystin auf die
Proteinphosphorylierung bzw. Akkumulation von Phosphoproteinen bestimmt werden
(Abb. 3.2.)
0 0 0,1 1 10 Microcystin (µM)
0 0,4 0,004 0,04 0,4 DMSO (%)
Abb. 3.2:. Einfluss von Microcystin auf die Akkumulation von Phosphoproteinen in 32P-
markierten HepG2-Zellen
HepG2-Zellen (1x106) wurden für 14h im Mangelmedium kultiviert, 3h mit 32P-markiert und für 2h unbehandelt
(Kontrolle) oder mit DMSO (Lösungsmittel-Kontrolle) oder verschiedenen MCYST-Konzentrationen bei 37°C/ 5%
CO2 inkubiert. Mit äquivalenten Proteinmengen erfolgte anschließend die Szintillations-Messung. Über die
gemessenen cpm/ µg Protein in den verschiedenen Ansätzen wurde der Effekt von Microcystin auf die
Akkumulation von zellulären Phosphoproteinen bestimmt. Die Graphik zeigt die Mittelwerte aus vier
unabhängigen Versuchen +/- SD.
Die ermittelte Radioaktivität in der 32P-markierten Kontrolle diente als Bezugsgrösse
für die Ermittlung der Wirkung von DMSO und verschiedener Microcystin-
Konzentrationen auf die Induktion von Phosphoproteinen. Durch die Messung der
Radioaktivität in den verschiedenen Ansätzen konnten Microcystin-Konzentrationen
nachgewiesen werden, die sowohl hemmend als auch förderlich auf die Akkumulation
von Phosphoproteinen wirken.
02468
1 01 21 4
32P
cpm
/µg
Prot
ein
Resultate
76
In der 0,4%igen DMSO-Lösung und in der 0,1 µM Microcystin-Lösung wurde eine
geringere Radioaktivität als in der Kontrolle (nur markierten) gemessen. Somit
besitzen die Lösungen in diesen Konzentrationen einen hemmenden Einfluss auf die
Akkumulation von Phosphoproteinen.
In der 1 µM und 10 µM Microcystin-Lösung wurde ein positiver Effekt auf die
Akkumulation von Phosphoproteinen nachgewiesen, wobei dieser in der eingesetzten
höchsten Microcystin-Lösung am deutlichsten bestimmt werden konnte.
In diesem Versuch wurde gezeigt, dass Microcystin über einen biochemischen
Pathway die Akkumulation von Phosphoproteinen in konzentrationsabhängigerweise
beeinflusst.
In einem weiteren Experiment konnte gezeigt werden, dass Microcystin auch die
Proteinstabilität bzw. -synthese in 35S-Methionin markierten HepG2-Zellen positiv
beeinflusst.
0 0 10 Microcystin (µM)
0 0,4 0,4 DMSO (%)
Abb. 3.3. Einfluss von Microcystin auf die Proteinstabilität bzw. -synthese in 35S-Methionin
markierten HepG2-Zellen
HepG2-Zellen (1x106) wurden für 14h im Mangelmedium kultiviert, 3h metabolisch mit 35 S-Methionin markiert und
für 2h unbehandelt (Kontrolle) oder mit DMSO (Lösungsmittel-Kontrolle) oder verschiedenen MCYST-Konzen-
trationen bei 37°C/ 5% CO2 exponiert. Mit äquivalenten Proteinmengen erfolgte anschließend die Szintillations-
Messung. Über die gemessenen cpm/ µg Protein in den verschiedenen Ansätzen wurde der Effekt von
Microcystin auf die Proteinstabilität bestimmt. Die Graphik zeigt die Mittelwerte aus vier unabhängigen Versuchen
+/- SD.
0
4
8
1 2
1 6
2 0
35Sc
pm/µ
g Pr
otei
n
Resultate
77
Der Einfluss von Microcystin auf die Proteinstabilität bzw.-synthese wurde durch die
Messung der Radioaktivität in den verschiedenen HepG2-Gesamtzell-
proteinextrakten untersucht. Die gemessene Radioaktivität in der 35S-Methionin
markierten Kontrolle diente hier ebenfalls als Bezugsgrösse für die Ermittlung der
Wirkung von DMSO/ Microcystin auf die Proteinstabilität bzw. -synthese.
Eine hohe Radioaktivität (cpm/µg Protein) in den Microcystin-exponierten Proben
abzüglich der interferierenden Wirkung von DMSO deutet auf einen positiven Einfluss
von Microcystin auf die Proteinstabilität bzw.-synthese hin. Mit Hilfe der Szintillations-
Messung konnten in der mit 10 µM Microcystin-exponierten Probe 4,1 cpm/µg
Protein und in der mitgeführten DMSO-Kontrolle 2,9 cpm/µg Protein gemessen
werden. Da in der Kontrolle (nur markiert) ein Wert von 2,3 cpm/µg Protein
gemessen wurde, hatte die Exposition der HepG2-Zellen mit Microcystin einen
positiven Einfluss auf die Proteinsynthese bzw.-stabilität.
Die Inkubation der Zellen mit 0,4% DMSO hatte hingegen einen minimalen Einfluss
auf die Proteinstabilität bzw.-synthese.
In diesem Experiment konnte gezeigt werden, dass eine 10 µM Microcystin-Lösung
auf die Synthese bzw. Stabilität von 35S-Methionin markierten Proteinen in HepG2-
Zellen einen positiven Einfluss hat.
3.1.3. Effekte von Microcystin auf die S-Phaserate
In dem vorherigen Experiment wurde gezeigt, dass Microcystin die zelluläre
Akkumulation von Phosphoproteinen und vermutlich die Proteinstabilität über die
�apparente Aktivierung� von Proteinkinasen positiv beeinflusst.
Durch die Ermittlung des Einflusses von Microcystin auf die Zahl der Zellen in der S-
Phase mit Hilfe der FACS-Analyse sollte untersucht werden, ob auch sogenannte
Restriktionspunkte des Zellzyklus, die vor allem über Protein-De-/ Phosphorylierung
und über die Stabilität und Synthese von Proteinen modulierbar sind, beeinflusst
werden. Im Zellzyklus gibt es zwei Kontrollpunkte, an denen sich entscheidet, ob der
Zellzyklus fortgesetzt wird. Der sogenannte G1-Restriktionspunkt reguliert die G1/ S-
Übergang der Zellen und der zweite Punkt kontrolliert den Übergang der Zellen von
der G2-Phase in die Mitose.
Resultate
78
Wird ein Restriktionspunkt erst einmal überschritten, durchlaufen die Zellen relativ
unabhängig von äusseren Faktoren den Zellzyklus, so dass eine Deregulation dieses
Kontrollpunktes zu beschleunigten Zellzyklusabläufen führen kann.
In dieser Zellzyklus-Analyse wurden HepG2-Zellen für 2 h mit 10 µM Microcystin
inkubiert und anschließend wurde über den relativen DNA-Gehalt von 104 Propidium-
Jodid gefärbten Zellkernen die Zahl der Zellen in der S-Phase durchflusszytometrisch
bestimmt. Ein deregulierender Effekt von Microcystin auf den G1/S-Übergang lässt
sich durch eine Zunahme der Zahl der Zellen in der S-Phase nach einer Microcystin-
Inkubation bestimmen.
Mit Hilfe der FACS-Messung wurde gezeigt, dass die Exposition einer HepG2-
Population mit Microcystin im Vergleich zur Kontrolle (unbehandelt) zu einem
100%igen Anstieg der Zahl der Zellen in der S-Phase führte. Da in der DMSO-
Kontrolle kein Anstieg der Zahl zu messen war, kann der Anstieg in der Microcystin-
inkubierten Probe eindeutig als spezifischer Effekte von Microcystin gewertet werden.
Das Hepatotoxin Microcystin besitzt damit Detektionlich die Fähigkeit, die Zeit, die
die HepG2-Zellen zum Eintritt in die S-Phase benötigen, zu verkürzen.
Tab. 3.1: Einfluss von Microcystin auf die Zahl der Zellen in der S-Phase
(FACS-Analyse )
Zellen in der S-Phase (%) SD +/-
Zellen ohne 3,76 0,70
DMSO/MCYST
Zellen mit 3,58 0,72
0,4% DMSO
Zellen mit 7,33 0,94
10µM MCYST
Mittelwerte (%) aus jeweils vier unabhängigen Experimenten pro Ansatz +/- SD
Resultate
79
Bei einer Zellzyklus-Analyse, in der eine HepG2-Population nur mit 2,5 µM
Microcystin für zwei Stunden exponiert wurde, konnte diese Microcystin-assoziierte
Steigerung der Zahl der Zellen in der S-Phase nicht nachgewiesen werden.
3.2. Einfluss von Microcystin auf die metabolische Stabiltität von p53
3.2.1. Wirkung von Microcystin auf die Stabilität von p53 (Western-Blot-Analyse)
In diesem Experiment sollte die Wirkung von Microcystin auf die metabolische
Stabilisierung von p53 analysiert werden.
Verschiedene Studien berichten, dass eine unphysiologische Konzentration an
metabolisch stabilem p53-Protein mit einer funktionellen Inaktivierung einhergeht, die
wie strukturelle Mutationen im p53-Gen die Tumorbildung begünstigt (Levine et al.,
1991; Ueda et al., 1995).
In einer normalen Zelle kommt das inaktive p53-Protein aufgrund einer rapiden
Degradierung nur in einer geringen Konzentration vor. Die metabolische Stabilität
von p53 wird in der Regel durch eine verstärkte Translation- oder eine verlängerte
Halbwertszeit von p53 erreicht (Liang and Clarke, 2001). Da die Stabilität von p53
unter anderem über sein Phosphorylierungsmuster moduliert wird, kann Microcystin
über die �apparente Aktivierung� von Proteinkinasen maßgeblich in diese Modulation
eingreifen.
Experimentell wurde die Wirkung von Microcystin auf die metabolische Stabilisierung
des p53-Proteins zunächst mit Hilfe der Western-Blot-Analyse (WB) beobachtet. Ein
positiver Microcystin-Effekt auf die Proteinstabilität bzw. -synthese ist durch einen
Anstieg der p53-Konzentration detektierbar.
In der Abb. 3.4. ist die Microcystin-induzierte Zunahme der Konzentration von p53-
dargestellt.
Resultate
80
0 0 0,1 1 10 Microcystin (µM)
0 0,4 0,004 0,04 0,4 DMSO (%)
Abb. 3.4: Die Wirkung von Microcystin auf die zelluläre Konzentration von p53
HepG2-Zellen (1x106) wurden mit UV-Licht (7 J/m2) bestrahlt, für 18h bei 37°C/ 5% CO2 inkubiert und
anschließend für weitere 2h unbehandelt (ohne), mit DMSO (Lösungsmittelkontroll) oder mit verschiedenen
MCYST-Konzentrationen inkubiert. Äqivalente Proteinmengen (100 µg) wurden per SDS-PAGE (10%) getrennt,
geblottet und per Western-Blot-Analyse mit einem biotinylierten p53-AK nachgewiesen. Der Effekt von
Microcystin auf die zelluläre Konzentration von p53 wurde durch einen Vergleich der Bandenintensität in den
einzelnen Proben bestimmt. Das Ergebnis wurde in zwei unabhängigen Experimenten reproduziert.
Die in der Kontrolle nachgewiesene Bandenintensität wurde als Bezugsgrösse für die
Bestimmung des Einflusses von Microcystin auf die Konzentration von p53
eingesetzt und diente ebenfalls als Kontrolle für die Induktion. Durch die DMSO-
Kontrolle war es möglich, interferierende Effekte des Lösungsmittels auf die
Konzentration von p53 darzustellen.
Nach der Exposition der HepG2-Zellen mit verschiedenen Microcystin-Konzen-
trationen wurden im Vergleich zu den Kontrollen stärkere Proteinbanden
nachgewiesen. Bei der eingesetzten maximalen Microcystin-Lösung (10 µM) wurde
die stärkste Bande bestimmt und zeigte damit den grössten Effekt auf die
Konzentration von p53. Eine DMSO-Inkubation (0,4%) hatte ebenfalls einen positiven
Einfluss auf die p53-Konzentration, der zwar geringer ausfiel als nach einer
Microcystin-Exposition, aber als interferierender Effekt bei der Bestimmung der
spezifischen Wirkung von Microcystin hier berücksichtigt wurde.
Zusammenfassend kann man sagen, dass Microcystin die metabolische Stabilität
von p53 positiv beeinflusst, wobei nicht eindeutig zu klären ist, ob diese Wirkung
durch eine Microcystin-assoziierte verzögerte Protein-Degradierung oder eine
verstärkte p53-Proteinsynthese resultiert.
Resultate
81
3.2.2. Einfluss von Microcystin auf die Stabilität von 35S-Methionin markiertem p53
In dem folgenden Experiment sollte geklärt werden, ob Microcystin die metabolische
Stabilisierung des p53-Proteins durch eine verlangsamte Protein- Degradierung oder
gesteigerte Proteinsynthese beeinflusst.
Für diese Untersuchung wurden HepG2-Zellen mit 35S-Methionin markiert und erst
nach der Markierung mit Microcystin exponiert. Das markierte p53-Protein wurde per
Immunpräzipitation mit einem p53-Ak aus dem Proteinextrakt isoliert und durch eine
12% SDS-PAGE aufgetrennt. Die Kontrolle diente als Bezugsgrösse für die
Ermittlung der Wirkung von Microcystin auf die metabolische Stabilität von p53.
Durch die DMSO-Kontrolle war es möglich, interferierende Effekte des
Lösungsmittels auf die Proteinstabilität darzustellen.
Die Fluorographie (3.5) zeigt, dass eine 10 µM Microcystin-Lösung die Konzentration
von 35S-Methionin markiertem p53 deutlich erhöht. In den Kontrollansätzen wurden
deutlich schwächere Banden nachgewiesen. Aus diesem Grund ist anzunehmen,
dass der positive Einfluss von Microcystin auf die metabolische Stabilisierung von
p53 hier womöglich eher durch eine verlangsamte Protein-Degradierung bedingt ist.
p53→
0 0 10 Microcystin (µM)
0 0,4 0,4 DMSO (%)
Abb. 3.5: Einfluss von Microcystin auf die metabolische Stabilität von 35S-markiertem
p53 Protein
HepG2-Zellen wurden für 14h in Methionin freiem Medium kultiviert und dann mit 3,7 MBq/ ml S35 -Methionin für
3h markiert, anschließend für 2h unbehandelt (ohne), mit DMSO (Lösungsmittel-Kontrolle) oder einer Microcystin-
Konzentrationen von 10 µM bei 37°C/5% CO2 inkubiert. Die markierten p53-Proteine wurden durch Immun-
präzipitation mit einem p53- AK aus dem Zellextrakt isoliert und per SDS (10%) getrennt. Der Effekt von
Microcystin auf die metabolische Stabilisierung von p53 wurde durch den Vergleich der Bandenintensität in den
einzelnen Proben bestimmt. Bei den IP-Kontrollen (negative und Beads) konnten keine Banden nachgewiesen
werden (nicht dargestellt). Die Resultate konnten in zwei unabhängigen Experimenten reproduziert werden.
Resultate
82
In weiteren Versuchen sollte nun gezeigt werden, dass die hier nachgewiesenen
Microcystin-Effekte auf die metabolische Stabilisierung des p53-Proteins mit einer
Modulation des Phophorylierungsmuster von p53 einhergeht. Hierbei wurde
besonders der Aspekt einer Microcystin-induzierten Hyperphosphorylierung des p53-
Moleküls berücksichtigt.
3.3. Einfluss von Microcystin auf die Hyperphosphory-lierung von p53 und pRb
3.3.1. Microcystin-induzierte Hyperphosphorylierung von 32P-markiertem p53
In diesem Versuch sollte gezeigt werden, dass auch Microcystin den
Phosphorylierungsstatus des p53-Proteins in HepG2-Zellen hinsichtlich einer
Hyperphosphorylierung maßgeblich beeinflusst.
Die Hyperphosphorylierung von p53 geht einher mit einer kurzfristigen kompletten
Durchphosphorylierung aller am N- und C-Terminus befindlichen Serin-und Threonin
Resten. In der Regel haben die Phosphorylierungen eine stabilisierende und
aktivitätssteigernde Wirkung auf die Funktion von p53. Eine Ausnahme stellt
möglicherweise das durch die CdK2/ cyclin B- und Cdk2/ cyclin A Kinase
phosphorylierte Ser 315 dar.
Microcystin kann als Inhibitor der PP1/ PP2A den Serin-Rest 315 in einem dauerhaft
phosphorylierten Zustand fixieren und so über die irreversible Hyper-
phosphorylierung des p53-Proteins ein Aussetzen der Tumorsuppressorfunktion
induzieren.
Für diese Untersuchung wurden HepG2-Zellen mit 32P-Orthophosphat markiert und
nach der Markierung mit verschiedenen Microcystin-Konzentrationen exponiert. Die
markierten p53-Proteine wurden über die Immunpräzipitation mit einem p53-Ak aus
dem Gesamtzellproteinextrakt isoliert, via SDS-PAGE aufgetrennt und optisch per
Autoradiographie dargestellt.
Resultate
83
Um Aussagen über den Einfluss von Microcystin auf die Induktion einer
Hyperphosphorylierung von p53 zu treffen, wurde die Bandenstärke des 32P-
markiertem p53 nach der Immunpräzipitation qualitativ und quantitativ ausgewertet.
Die Autoradiographie zeigt (Abb. 3.6), dass eine Microcystin-Exposition die
Phosphorylierung von p53 signifikant beeinflusst.
Microcystin (µM) 0 0,1 1 0 10
DMSO (%) 0 0,004 0,04 0,4 0,4
Kontrolle Beads/ negativ Ak KB KN
Abb. 3.6: Einfluss von Microcystin auf die Induktion einer Hyperphosphorylierung von p53
HepG2-Zellen (1x106) wurden für 14h im Mangelmedium kultiviert und für 3 h mit 32P markiert. Dann erfolgte eine
2h Exposition mit DMSO (Lösungsmittel-Kontrolle) oder verschiedenen MCYST-Konzentrationen. Via Immun-
präzipitation mit einem p53-AK wurde das p53-Proteinaus Gesamtzellproteinextrakt isoliert und per SDS-PAGE
(12%) getrennt. Der Nachweis der 32P-markierten Immunpräzipitate erfolgte durch die Autoradiographie. Anhand
der Bandenintensität in den einzelnen Proben wurde der Effekt von Microcystin auf die Induktion der
Hyperphosphorylierung von p53 bestimmt. Bei den IP-Kontrollen (negative und Beads) konnten keine Banden
nachgewiesen werden. Die ermittelten Daten konnten in drei unabhängigen Experimenten reproduziert werden.
0 0 0,1 1 10 Microcystin (µM)
0 0,4 0,004 0,04 0,4 DMSO (%)
Abb. 3.6.1.: Densitometrische Auswertung der 32P- Autoradiographie von p53
Mit Hilfe der densitometrischen Auswertung der 32P-Autoradiographie von p53 (3.6) können quantitative
Aussagen über den Einfluss von Microcystin auf die Hyperphosphorylierung von p53 gemacht werden. Die
Messung erfolgte mit Hilfe ImageLab Software Version 2.0 .
← p53
0
2
4
6
8
Den
sitä
t
Resultate
84
Microcystin in Konzentrationen von 0,1 µM, 1 µM und 10 µM erhöht signifikant die
Zunahme an phosphoryliertem p53, wobei die eingesetzte maximale Konzentration
von Microcystin die Zunahme am deutlichsten verstärkt. Eine 0,4%ige DMSO-
Lösung beeinflusst die Hyperphosphorylierung des p53-Proteins nicht.
Die densitometrische Auswertung (Abb. 3.6.1) der entsprechenden Banden ergab im
Vergleich zu den Kontrollen eine 2- 3-fach erhöhte Microcystin-assoziierte Induktion
der Phosphorylierung bzw. Hyperphosphorylierung von p53. Diese Ergebnisse
zeigen, dass Microcystin als Tumorpromotor in einem initiierten Testsystem
womöglich über die Hemmung der Proteinphoshatase 1 und 2A signifikant eine
irreversible Hyperphosphorylierung von p53 induziert. Bei den mitgeführten IP-
Kontrollen, Negativ-Ak (KN), der nicht gegen das p53 gerichtet war und die Beads-
Kontrolle (KB), konnten keine Banden nach der Autoradiographie nachgewiesen
werden.
3.3.2. Nachweis von hyperphosphoryliertem p53 über Isoelek-trische Fokkussierung (IEF)
Die IEF bietet in Kombination mit der Western-Blot-Analyse die Möglichkeit den
Einfluss von Microcystin auf die Phosphorylierung von p53 hinsichtlich einer
Hyperphosphorylierung durch die Änderung des Isoelektrischen Punktes (IP) des
p53-Proteins elektrophoretisch zu bestimmen.
Martinez et al. (1997) konnten mit einer 2D- Elektrophorese mindestens sechs nach
ihrem Phosphorylierungsmuster zu unterscheidenden Isoformen von p53 mit einem
IP zwischen pH 6,3- 7,3 detektieren.
In den HepG2-Zellen wurde zuächst p53 durch eine 20 h Inkubation mit Actinomycin
D induziert. Gleiche Mengen des Gesamtzellproteinextraktes wurden in einem IEF-
Gel elektrophoretisch aufgetrennt, für die WB-Analyse auf Nitrozellulose-Membran
immobilisiert und mit einem p53-biotinylierten Ak immunologisch nachgewiesen.
Resultate
85
Die Abb. 3.7 zeigt die Unterschiede im Laufverhalten der einzelnen Proben.
0 0 1 0 Microcystin (µM)
0 0,4 0,4 DMSO (%)
Abb. 3.7: Nachweis des Einflusses von Microcystin auf das Phosphorylierungsmuster von p53 mittels IEF
In den HepG2-Zellen (1x106 ) wurde p53 durch eine 20h Inkubation mit Actinomycin D (0,45 nM) hochreguliert
und für 2h mit DMSO (Lösungsmittel-Kontrolle) und 10 µM Microcystin-Lösung exponiert. Mit äquivalenten
Proteinmengen wurde eine IEF durchgeführt und für die WB-Analyse auf eine Nitrocellulose-Membran
immobilisiert. Via Western-Blot wurde p53 mit einem p53-biotynilierten AK nachgewiesen und via ECL-Reaktion
dargestellt. Der Einfluss von Microcystin auf die Hyperphosphorylierung von p53 wurde anhand eines Bandenshift
in Richtung Anode bestimmt. Die ermittelten Daten konnten in zwei unabhängigen Experimenten reproduziert
werden.
Im Vergleich zur Kontrolle zeigte die Microcystin-exponierte Probe eine geringere
elektrophoretische Mobilität, die durch einen minimalen Bandenshift in Richtung
Anode gekennzeichnet ist und die Verschiebung des IP des p53-Proteins signalisiert.
In der DMSO-Kontrolle wurde dieser Bandenshift nicht nachgewiesen, so dass die
Verschiebung des IP von p53 als Microcystin-spezifischer Effekt bewertet werden
kann. Mit Hilfe der IEF konnte die Microcystin-vermittelte Hyperphosphorylierung
anhand eines minimalen Bandenshifts in Richtung Anode bestimmt werden.
p53→→
Resultate
86
3.3.3. Einfluss von Microcystin auf die Hyperphosphorylierung von pRb
In diesem Experiment sollte gezeigt werden, dass Microcystin die Hyper-
phosphorylierung des Rb-Proteins induziert und so möglicherweise einen Beitrag bei
der Entwicklung und Progression eines HBV-assoziierten HCC leistet.
Für diesen Versuch wurden HepG2-Zellen mit 35S-Methionin markiert, mit einer 10µM
Microcystin-Lösung exponiert und via Immunpräzipitation mit einem Rb-AK aus dem
Gesamtzellproteinextrakt isoliert. Das radioaktiv markierte Rb-Immunpräzipitat wurde
nach der SDS-PAGE per Fluorographie dargestellt.
Um den Einfluss von Microcystin auf die Induktion der Hyperphosphorylierung von
pRb zu bestimmen, wurde die Bandenintensität von 35S-markiertem Rb-Protein nach
der Immunpräzitipation qualitativ und quantitativ ausgewertet. Das
hypophosphorylierte und das hyperphosphorylierte 35S-markierte Rb-Molekül kann in
der SDS-PAGE durch eine unterschiedliche elektrophoretische Mobilität identifiziert
werden (lt. Neo Markers). Die Microcystin-vermittelte Akkumulation des
hyperphosphorylierten pRb in der Zelle wurde in der Fluorographie durch eine
deutliche Zunahme der Bandenstärke im Vergleich zu den Kontrollen bestimmt. In
der Fluorographie (Abb. 3.8) repräsentiert die Bande mit dem geringeren
Molekulargewicht die hypophosphorylierte (pRb), wohingegen die Bande mit der
geringeren Mobilität die hyperphosphorylierte Form (ppRb) darstellte.
Resultate
87
Microcystin (µM) 0 0 10
DMSO (%) 0 0,4 0,4
Kontrolle Beads/negativ Ak KN KB
Abb. 3.8: Einfluss von Microcystin auf die Hyperphosphorylierung von pRb
Zellen wurden für 14h in Methionin freiem Medium kultiviert, für 3h mit 35S-Methionin markiert und für 2h mit
DMSO (Lösungsmittel-Kontrolle) oder einer Toxin-Konzentration von 10µM bei 37°C/ 5% CO2 exponiert. Das 35S-
Methionin markierte Rb- Protein per Immunpräzipitation mit einem AK gegen pRb aus den Zellextrakt isoliert und
via SDS- PAGE aufgetrennt. Die markierten Immunpräzipitate wurden per Fluorographie dargestellt. Die obere
Bande entspricht der hyperphosphorylierten und die untere der hyopophosphorylierten Rb- Form. Anhand der
Bandenintensität des ppRb wurde der Effekt von Microcystin auf die Hyperphosphorylierung von pRb bestimmt.
Bei den IP-Kontrollen (negative und Beads) konnten keine Banden nachgewiesen werden. Die ermittelten Daten
konnten in drei unabhängigen Experimenten reproduziert werden.
Die qualitative Beurteilung der ppRb Bandenintensität in der Fluorographie zeigt,
dass Microcystin in einer Konzentration von 10 µM signifikant die Hyper-
phosphorylierung des Rb-Proteins (ppRb) stimuliert. Die densitometrische
Auswertung der entsprechenden Protein-Bande ergab im Vergleich zu den
Kontrollen eine 1,5- fache Zunahme an hyperphosphoryliertem Rb-Protein (ppRb).
Bei der DMSO-Kontrolle wurde ein minimaler Effekt auf die Hyperphosphorylierung
des Rb-Proteins bestimmt. Die Intensität dieser Bande war minimal stärker als die
Bandenstärke der markierten unbehandelten Kontrolle. Die densitometrische
Messung der Protein- Bande der DMSO-Kontrolle bestätigte dies.
pRb--
ppRb--
Resultate
88
0 0 10 Microcystin (µM)
0 0,4 0,4 DMSO (%)
Abb. 3.8.1: Densitometrische Auswertung der 35S-Methionin�Fluorographie von ppRb
Mit Hilfe der densitometrischen Auswertung der 35S-Methionin�Fluorogrphie von pRb (Abb. 3.8)
konnten quantitative Aussagen über den Einfluss von Microcystin auf die Hyperphosphorylierung
getroffen werden. Die Messung erfolgt mit Hilfe ImageLab Software Version 2.0 .
Zusammenfassend kann man sagen, dass Microcystin in einer Konzentration von
10 µM deutlich die Konzentration von hyperphosphoryliertem Rb-Protein erhöht.
3.4. Die protektive Wirkung von Microcystin vor UV-induzierter Apoptose
Bei der Entstehung von Tumoren stellen verminderte oder gehemmte apoptotische
Prozesse einen wesentlichen Mechanismus der Tumorpromotion dar (Peter et al.,
1997). In verschiedenen Studien wird den Wirkstoffen der Okadasäure eine
protektive Wirkung vor apoptotischen Prozessen zu gesprochen. Es gibt Indizien,
dass bei der Initiation der Apoptose die Dephosphorylierung von zellulären Proteinen
eine essentielle Rolle spielt (Gjersten and Doskeland, 1995).
Inwieweit Microcystin in der Lage ist HepG2-Zellen, vor dem Zelltod zu schützen,
sollte in diesem Experiment analysiert werden. Um die protektive Wirkung von
Mircrocystin vor UV-induzierten Zelltod zu charakterisieren, wurden die HepG2-
Zellen für 2h mit einer 10 µM Microcystin-Lösung präinkubiert, UV-Licht (100J/ m2)
exponiert und für 24h bei 37°C/ 5% CO2 kultiviert.
0
5 0
1 0 0
1 5 0
2 0 0
2 5 0D
ensi
tät
Resultate
89
Anschließend wurden die Zellen abtrypsiniert und jeweils ein Aliquot für den
Trypanblau-Test, die FACS-Analyse und für die elektrophoretische Darstellung von
DNA-Fragmenten eingesetzt.
Um generell die protektive Wirkung von Microcystin auf die Vitalität von UV-
induzierten HepG2-Zellen zu bestimmen, wurde zunächst der Trypanblau-Test
durchgeführt. Während vitale Zellen in der Lage sind, den Farbstoff auszuschliessen,
nehmen tote Zellen Trypanblau auf und sind blau gefärbt. Mit diesem Test kann
sensitiv das Ausmaß des UV-induzierten Zelltodes in Korrelation mit der schützenden
Wirkung von Microcystin quantitativ bestimmt werden. Der ermittelte Anteil (%) toter
Zellen im Trypanblau-Test ist in Abb. 3.9 dargestellt.
Abb. 3.9: Einfluss von
Microcystin auf UV-induzierte Zelltod-Prozesse
HepG2-Zellen wurden für 2h präinkubiert mit DMSO und Microcystin mit UV-Licht (100 J/ m2 ) bestrahlt und für
24h bei 37°C/ 5% CO2 inkubiert. Die Zellzahl wurde mit Hilfe der Fuchs- Rosenthal-Kammer bestimmt. Mit 1x106
Zellen pro Well wurde der Trypanblau-Test durchgeführt. Über die Bestimmung des Anteils (%) an toten Zellen
wurden Aussagen über die Effekte von Microcystin auf UV-induzierte Zelltod-Prozesse gemacht. Als Kontrolle
wurde eine DMSO-Kontrolle und zu jedem UV-induzierten Ansatz eine unbestrahlte Kontrolle mitgeführt. Die
Graphik stellt die Mittelwerte aus zwei unabhängigen Versuchen +/- SD dar.
Um sicher zu stellen, dass der ermittelte Anteil toter Zellen nach der UV-Induktion in
Korrelation mit der protektiven Wirkung von Microcystin steht, wurden verschiedene
Kontrollen durchgeführt. Zu den verschiedenen UV-induzierten Ansätzen wurde
jeweils eine unbestrahlte Kontrolle (ohne) mitgeführt, um deutlich darzustellen, dass
der Anteil toter Zellen auf die UV-Induktion zurückzuführen ist und die Reduktion des
Anteils an toten Zellen aus der protektiven Wirkung von Microcystin oder DMSO
resultiert.
0 20 40 60 80
Prozent toter Zellen
MCYST/ UV
MCYST
DMSO/ U V
DMSO
UV
ohne
Resultate
90
Der ermittelte Anteil (%) toter Zellen in der UV-induzierten Kontrolle diente als
Bezugsgrösse für die Ermittlung der schützenden Wirkung von Microcystin vor UV-
induziertem Zelltod. Durch das Mitführen einer DMSO-Kontrolle wurden die
interferierenden Effekte von DMSO in UV-exponierten HepG2-Zellen dargestellt. Bei
der unbestrahlten Kontrolle (ohne) wurden 9,3% tote Zellen ermittelt. Nach einer UV-
Induktion stieg der Anteil an toten Zellen auf 65% an. Nach der Inkubation der Zellen
mit 0,4% DMSO wurden ~22 % tote Zellen bestimmt. Nach der UV-Induktion stieg
die Zahl toter Zellen auf ~41% tote Zellen an. Der Anteil an toten Zellen nach einer
2h Exposition mit einer 10 µM Microcystin-Lösung lag bei ~11% und wurde durch die
UV-Induktionauf ~22% erhöht.
Um zu ermitteln, inwiefern die gentoxische Wirkung einer UV-Induktion mit der
Induktion von Apoptose korreliert, erfolgte die FACS-Analyse. Dafür wurde das
entsprechende HepG2-Zellen-Aliquot zur Fixierung und Permeabilisierung für 24h bei
4°C in einer Ethanol/ PBS-Lösung inkubiert. Nach der Inkubation erfolgte die
Kernfärbung mit Propidium-Jodid für 35 min und anschließend wurde der Anteil
apoptotischer Zellen durchflusszytometrisch bestimmt. Bei der FACS-Messung
wurde der Anteil apoptotischer Zellen durch einen sub G1/G0 Peak (<2n) erfasst und
der prozentuale Anteil mit Hilfe der Software des EPICS XL quantifiziert. Die
Verteilung der übrigen Zellen in den verschiedenen Phasen des Zellzyklus wurde
durch die DNA-Histogramme dargestellt (Abb.3.10/ 3.10.1).
Durch das Mitführen verschiedener Kontrollen wurde der Anteil apoptotischer Zellen
in der eingesetzten HepG2-Population (ohne), das Ausmaß einer UV-Induktion (UV)
und die alleinige Wirkung von DMSO/ Microcystin auf das Testsystem bestimmt.
Diese Bezugsgrössen waren erforderlich, um über die präventive Wirkung von Micro-
cystin vor Apoptose Aussagen machen zu können.
Resultate
91
DMSO-Kontrolle MCYST-Kontrolle Unbehandelt
UV
88
o
0 1024
A B C D F
88
o o
1024
A B C D F
88
o
o
1024
A B C D F
o
o
1024
A B C D F
DMSO-UV
A B C D F
1024
A B C D F
1024
o
o
o o
88
88
88
MCYST-UV
Resultate
92
Abb. 3.10 + 3.10.1: Einfluss von Microcystin auf UV-induzierte Apoptose
HepG2-Zellen wurden für 2h präinkubiert mit DMSO und Microcystin, mit UV-Licht (100J/ m 2 ) bestrahlt und für
24h bei 37°C/ 5% CO2 inkubiert. Die fixierten Zellen (1x 106) wurden mit Propidium-Jodid (PI) gefärbt und der
DNA- Gehalt einzelner Zellen mit Hilfe eines Durchflusszytometers bestimmt. Die Zellzyklusverteilung der HepG2-
Zellen wurde durch DNA-Histogramme dargestellt. Bei den gezeigten Histogrammen ist der DNA-Gehalt (x-
Achse: Pi Fluoreszenzintensität) gegen die Zellzahl (y-Achse: 104 Zellen/ Messung) aufgetragen. Die Region
zwischen A und B spiegelt den Anteil an apoptotischen Zellen (sup-G1) wieder. Der Peak im Bereich B und C
stellt den Anteil der Zellen dar, die sich in der G1-Phase befinden. Die Region C-D stellt den Anteil der Zellen in
der S-Phase dar. Im Bereich D und F werden die Zellen gekennzeichnet, die sich in der G2/ M-Phase befinden.
Der quantitative Anteil (%) an apoptotischen Zellen wurde in Form eines Balkendiagrammes dargestellt. Als
Kontrolle wurde für jeden UV-bestrahten Ansatz eine unbestrahlte Probe mitgeführt. Die Graphik stellt die
Mittelwerte der verschiedenen Proben aus zwei unabhängigen Versuchen +/- SD dar, wobei jeder Wert sich aus
einer Doppelbestimmung ergab.
In der unbestrahlten Probe (ohne) wurden 12% apoptotische Zellen in der subG1-
Phase ermittelt. Der Hauptbestandteil der übrigen Zellen der HepG2-Population
befand sich in der G1-Phase, und der Rest der Zellen verteilte sich auf die S- und G2/
M-Phase. Eine UV-Bestrahlung (UV-Kontrolle) ging mit einer kompletten
Umverteilung der Zellen im Zyklus einher. Es wurden nur noch Zellen in der sub-G1-
Phase nachgewiesen. Der Anteil an apoptotischen Zellen stieg auf 80% an. Nach
einer Inkubation der Zellpopulation mit 0,4% DMSO (DMSO-Kontrolle) für 2h nahm
im Vergleich zur unbehandelten Probe der Anteil der Zellen in der subG1-Phase
minimal zu. Es zeigten 22% der Zellen apoptotische Merkmale. Desweiteren führte
der DMSO-induzierte G1-Arrest zu einer Erhöhung des Anteiles an Zellen in der G1-
Phase, so dass weniger Zellen in die S-Phase überführt wurden. Eine zusätzliche
UV-Bestrahlung der Zellen (DMSO/UV) führte zu einem signifikanten Anstieg der
subG1-Zellpopulation. Es zeigten 55% der Zellen apoptotische Merkmale.
UV
DM
SO/ U
V
DM
SO
ohne
MC
YST
MC
YST/
UV
0
20
40
60
80
100
120
apop
totis
che
Zelle
n (%
)
Resultate
93
Außerdem verblieb ein geringer Anteil der Zellen in der G1-Phase. Nach einer
Exposition der Zellen mit 10 µM Microcystin (MCYST-Kontrolle) konnte im Vergleich
zur DMSO-Kontrolle, eine minimale Abnahme der sub-G1-Phase- Population und
eine geringfügige Zunahne der S-Phase Zellpopulation registiert werden. Microcystin
in einer Konzentration von 10 µM hatte im Vergleich zur Kontrolle keinen Einfluss auf
die Apoptoserate (17%). Eine Präinkubation der Zellen mit Microcystin vor der UV-
Induktion (Microcystin/UV) konnte den Anteil an Zellen in der sub-G1-Phase im
Vergleich zu der ermittelten Apoptoserate nach einer UV-Induktion deutlich
reduzieren. Die Apoptoserate betrug hier 35%. Ansonsten hatte die UV-Exposition
der Microcystin-präinkubierten Zellen kaum Auswirkungen auf die Verteilung der
Zellen in den einzelnen Phasen.
Eine Versuchsreihe, bei der die Zellen nur mit 2,5 µM Microcystin präinkubiert und
anschließend mit UV-Licht bestrahlt wurden, konnte die Wirkung von Microcystin
bezüglich einer Prävention vor UV-induzierter Apoptose nicht bestätigen. In allen
Ansätzen, ob mit DMSO oder Microcystin präinkubiert, konnte nach der UV-
Bestrahlung eine Apoptose-Rate von ~80-90% nachgewiesen werden (Daten nicht
dargestellt).
3.5. Einfluss von Microcystin auf die Kerntranslokation von p53
In diesem Experiment sollte analysiert werden, ob Microcystin über die Modulation
des Phosphorylierungsstatus von p53 Einfluss auf dessen subzelluläre Lokalisation
nimmt. In vorherigen Experimenten wurde gezeigt, dass Microcystin die metabolische
Stabilität und die Hyperphosphorylierung von p53 signifikant beeinflusst. Da beide
Zustände auch bei der Regulation der subzellulären Lokalisation von p53 involviert
sind, ist anzunehmen, dass Microcystin auch die Kerntanslokation von p53
beeinflusst.
Für die Aktivierung von p53 als TF ist die Tetramerisierung und die Translokation
vom Cytoplasma in den Nukleus essentiell.
Resultate
94
Verschiedene Studien zeigen, dass der nukleäre Import und Export verschiedener
Proteine über Phosphorylierungen moduliert wird (Appella and Anderson, 2001;
Liang and Clarke, 2001). Auch der Einfluss von Phosphorylierungen auf die
subzelluläre Lokalisation von p53 wird diskutiert. Takahashi and Suzuki. (1993)
berichteten, dass in humanen Brustkrebszellen (MCF-7) die verstärkte p53-
Phosphorylierung mit einer Translokation des Proteins aus dem Nukleus ins
Cytoplasma korreliert.
Zur Analyse des Einflusses von Microcystin auf die subzelluläre Lokalisation des
p53-GFP-Proteins nach einer UV-Induktion wurden HepG2-Zellen mit einem p53-
GFP-Expressionsvektor transfiziert, für 48h bei 37°C/5% CO2 kultiviert und
anschließend für 2 h mit 10 µM Microcystin bei 37°C/5% CO2 päinkubiert. Zur
Aktivierung des p53-Fusionsproteins wurden die Zellen mit UV-Licht (7J/m2) bestrahlt
und nach einer 2h Inkubation bei 37°C/5% CO2 wurde mit Hilfe eines Laserstrahl-
Scanning-Mikroskopes (LSM) die subzelluläre Lokalisation des p53-Fusionsproteins
in den HepG2-Zellen bestimmt.
In der Abb. 3.11 a-e werden die gewonnenen Fluoreszenzaufnahmen aus dem p53-
GFP-Experiment dargestellt. Anhand der qualitativen Bewertung der Akkumulation
der Fluoreszenz in den HepG2-Zellen nach Stress-Induktion sollten Daten
hinsichtlich einer Microcystin-verursachten Beeinträchtigung des nukleären
Transportes des p53-GFP-Fusionsprotein nach UV-Induktion gewonnen werden.
Resultate
95
Abb. 3.11: Einfluss von Microcystin auf die subzelluläre Lokalisation des p53- GFP- Fusionsproteins nach UV-Induktion
HepG2-Zellen wurden mit dem p53-GFP-Expressionsvektor transfiziert, für 48h bei 37°C/5% CO2 inkubiert und
anschließend für 2h mit DMSO/ Microcystin bei 37°C/5% CO2 präinkubiert. Nach der UV-Induktion(7J/m2) erfolgte
eine Inkubation für 2h bei 37°C/5% CO2 und anschließend die mikroskopisch Analyse mit dem Zeiss LSM 410
(63x/1,4NA (ÖL)/λ488/ 100%). Anhand der Fluoreszenz in den verschiedenen Zellkompartimenten können
Aussagen für die subzelluläre Lokalisation des Fusionsproteins gemacht werden. Für diese Analyse wurden 8
unabhängige Transfektionen durchgeführt.
a) gezeigt die nukleäre Akkumulation des p53-GFP-Proteins nach einer UV�Induktion
b) DMSO-Kontrolle; stellt die nukleäre Akkumulation des p53-GFP-Proteins nach einer UV�Induktion dar.
c) zeigt die Effekte einer Microcystin-Präinkubation; die nukleäre Translokation des p53-GFP-Proteins ist nach
der UV-Induktion vermindert, es kommt nur zu einer punktförmigen Fluoreszenz im Kern mit einer starken
cytoplasmatischen Akkumulation der Fluoreszenz
d) HBx-Kontrolle; stellt die cytoplasmatische Akkumulation des p53-GFP-Proteins dar.
e) Kontrolle zur Darstellung der Eigenfluoreszenz von HepG2-Zellen nach einer UV-Induktion
Resultate
96
Nach einer UV-Induktionkam es zu einer deutlichen nukleären Akkumulation des
p53-GFP-Fusionsproteins. Es zeigte sich ein grün fluoreszierender leuchtender
Nukleus, wobei sich das Cytoplasma weniger grün fluoreszierend darstellte (a).
Eine Präinkubation mit 0,4% DMSO konnte nach einer UV-Induktion die nukleäre
Translokation des p53-GFP-Fusionsprotein nicht wirklich beeinträchtigen. Es zeigte
sich ein ähnliches Bild wie nach der alleinigen UV-Induktion. In der Regel zeigte sich
ein grün fluoreszierender Nukleus (b).
Nach einer 2h Microcystin-Präinkubation mit anschließender UV-Licht Expositon
wurde eine verminderte nukleäre Translokation des Fusionsproteins bzw. Zellkerne
ohne Fluoreszenz nachgewiesen (c). Es zeigte sich nur eine punktförmige nukleäre
grüne Fluoreszenz und ein fluoreszierendes Cytoplasma.
Im HBx-Kontrollansatz, bei dem die Zellen mit den pSVx-Expressionsvektor
kotransfiziert wurden, zeigte sich wie erwartet, eine grün fluoreszierende
cytoplasmastische Akkumulation des p53-GFP-Fusionsproteins mit ausgesparten
Kernen (d). Bekannterweise fungiert das HBx-Protein als sogenannter cytoplas-
matischer Adapter für das p53-Protein, so dass es zu einer cytoplasmatischen
Sequestrierung des Tumorsupressorproteins kommt.
Um die Spezifität dieser hier gewonnenen Ergebnisse zu steigern, wurde eine
Kontrolle mitgeführt, in der die Eigenfluoreszenz einer nicht transfizierten aber UV-
exponierten HepG2-Zelle gezeigt wird (e).
Zusammenfassend kann man sagen, dass diese Beobachtungen als Indiz für eine
Microcystin-assoziierte Beeinträchtigung der nukleären Beförderung des p53-GPF-
Fusionsproteins gedeutet werden können. Die Microcystin-vermittelte Hyper-
phosphorylierung von p53 bewirkt möglicherweise, dass das p53-GFP-
Fusionsproteins nicht mehr in der Lage ist, als Reaktion auf Stress komplett in den
Nukleus zu translozieren.
Resultate
97
3.6. Funktionelle Analyse des Effektes von Microcystin auf die Zellzyklus-Regulation
In vorangegangenen Experimenten wurde gezeigt, dass Microcystin die
metabolische Stabilität von p53 (3.2) und die Akkumulation von p53 in seinem
hyperphoshorylierten Zustand (3.3) beeinflusst.
Die unphysiologische metabolische Stabilität von p53 steht im Verdacht mit einem
Verlust der Tumorsuppressorfunktion einherzugehen (Levine, 1990; Levine et al.,
1991). Auch eine Korrelation zwischen der Microcystin-modulierten Phosphorylierung
der Tumorsuppressorproteine (p53/ pRb) und der Fixierung dieser Proteine im
Zustand der Hyperphosphorylierung stellt möglicherweise ein allgemeines Modell der
Tumorpromotion dar.(Fujiki,1992). Weitere Indizien für eine Microcystin-induzierte
Beeinträchtigung der Funktionalität von p53 stellt die beobachtete inhibierende
Wirkung von Microcystin auf UV-induzierte Apoptose (3.4) und die Microcystin-
assoziierte verminderte Kerntranslokation eines GFP-p53-Fusionsproteins (Wt) nach
einer UV-Induktion dar (3.5).
Um festzustellen, ob diese gewonnenen Hinweise mit einer funktionellen
Inaktivierung der Tumorsuppressorproteine (p53/pRb) einhergehen, wurden
Transfektionsexperimente mit verschiedenen Luciferase-Konstrukten durchgeführt.
Mit Hilfe dieser Konstrukte ist es möglich über die Messung der Luciferase-Aktivität,
den Einfluss von Microcystin und dem HBx-Protein auf die Funktion der
verschiedenden Proteine des Zellzyklus zu bestimmen. Die verschiedenen Plasmide
zeichnen sich dadurch aus, dass die Expression des Reportergens Luciferase durch
das Binden jeweils eines der regulatorischen Proteine (p53, Rb, E2F und c-Myc) an
spezifische cis-acting Elemente in der Enhancer-Region, die dem TATA-Box-
Promotor vorgeschaltet sind, beeinflusst wird. Das Binden von p53, E2F und c-Myc
an das entsprechende DNA-Response-Motiv geht generell mit einer verstärkten
Expression des Luciferasegens einher. Hingegen führt das Binden des aktiven
Retinoblastomaproteines (hypophosphoryliert) zu einer Repression der Luci-
ferasegen-Expression. Bei einer Microcystin- und/ oder HBx-vermittelten
Deregulierung der Aktivität der Regulatoren des Zellzyklus kommt es im Verhältnis zu
Resultate
98
den mitgeführten Kontrollen (unbehandelt/DMSO) zu einer Modulation der
gemessenen Luciferase-Aktivität.
Um generell Aussagen über die Spezifität der durch die Zellzyklus-Regulatoren-
vermittelte Expression des Luciferasegens zu treffen und den Einfluss von
Microcystin auf die durch die Zellzyklus-Regulatoren-vermittelte Genexpression zu
bestimmen, wurden die HepG2-Zellen mit dem Reportergen-Konstrukt pTA-Luc
transient transfiziert und anschließend mit Microcystin exponiert. In dem
Kontrollplasmid wurde die Expression des Luciferasegens ausschließlich über den
TATA-Box-Promotor initiiert, da in diesem Plasmid ein cis-acting Element mit einen
spezifischen DNA- Response-Motiv für die verschiedenen Zellzyklus-Regulatoren
fehlt. Die gemessene Luciferase-Aktivität in den entsprechenden HepG2-
Gesamtzellproteinextrakten wurde tabellarisch in den verschiedenen Abschnitten
dargestellt und war im Vergleich zu der ermittelten Lumineszenz in den Lysaten, die
die Reportergen-Konstrukte mit spezifischen DNA-Response-Element enthielten,
generell geringer. Da die eingesetzte Microcystin-Lösung DMSO als
Lösungsvermittler enthielt, wurde bei jeder Transfektion eine DMSO-Kontrolle
getestet, die als Bezugsgrösse für die Ermittlung der spezifischen Wirkung von
Microcystin auf die durch die Zellzyklus-Regulatoren-vermittelte Expression des
Luciferasegens diente.
Für die Standardisierung der Transfektion wurden die Zellen mit einem Vektor
cotransfiziert, der statt der Glühwürmchen Luciferase eine Quallen-Luciferase
(Renilla reniformis) enthält. Nach der Messung der Glühwürmchen Luciferase-
Aktivität wurde in dieselbe Probe ein Renilla-Puffer pipettiert, um die Aktivität der
Renilla-Luciferase zu messen.
3.6.1. Effekte von Microcystin auf die Funktionalität von p53
Die Wirkung von Microcystin auf die Aktivität von p53 wurde mit Hilfe des
Reportergen-Konstruktes pp53-TA-Luc analysiert. Dieses Konstrukt enthält in dem
vor dem TATA- Box-Promotor integrierten cis-acting Element ein DNA-Response
Motiv für das p53-Protein.
Resultate
99
Nach dem Binden von p53 an das Response-Element kommt es zu einer
Verstärkung der ansonsten niedrigen Expression des Luciferasegens, die durch die
Assoziation des TATA-Box-bindenden Proteins (TBP) an den TATA-Box-Promotor
initiiert wird.
Das endogene p53-Protein wurde durch eine UV-Bestrahlung (7 J/m2) der HepG2-
Zellen induziert. Dann erfolgte die transiente Transfektion der Zellen mit dem pp53-
TA-Luc Reportergen-Plasmid und ein Inkubation für 20h bei 37°C/5% CO2..Um die
Wirkung von Microcystin auf die p53-vermitttelte Expression des Reportergens
Luciferase zu bestimmen, wurden die Zellen genau 2h vor Beendigung der
Inkubation mit 10 µM Microcystin oder 0,4% DMSO bei 37°C/5% CO2 inkubiert.
Um Aussagen über die spezifische Wirkung von Microcystin auf die Funktionalität
von p53 zu treffen, diente die p53-vermitttelte Expression des Reportergens nach
einer DMSO-Inkubation bzw. die gemessene Lumineszenz als Bezugsgrösse. In der
Abb. 3.12 wurde die Wirkung von Microcystin auf die p53-vermitttelte Expression des
Luciferasegens dargestellt. Die Expression des Reportergens wurde durch Messung
der Luciferase-Aktivität nachgewiesen.
Tab. 3.2.: Tabellarische Darstellung der p53-vermitttelten Luciferase-
Aktivität der verschiedenen Transfektionsansätze
Proben DMSO MCYST-LR LCPS SD +/-
pTA-Luc - - 1,7 0,2
pTA-Luc + - 1,5 0,4
p53-TA- Luc - - 8,7 2,0
p53-TA- Luc + - 58,0 7,0
pTA-Luc + + 2,0 1,0
p53-TA- Luc + + 8,3 1,0
pTA-Luc: Kontrollvektor; p53-TA-Luc: enthält DNA- Response Element für p53; MCYST-LR: Microcystin-LR; DMSO: Dimethylsulfoxid; LCPS: Lumineszenz pro counts; Die Mittelwerte ergeben sich aus vier unabhängigen
Ansätzen in Doppelbestimmung +/- SD
Resultate
100
- + + DMSO
(0,4%)
Abb. 3.12: Einfluss von Microcystin auf die Funktionalität von p53
Nach der UV-Induktion wurden die Zellen mit dem p53-Luciferase-Vektor (pp53-TA-Luc) transient transfiziert,
anschließend 20h Inkubation bei 37°C/5% CO2 und für 2h vor Beendigung der Inkubation mit DMSO oder
Microcystin (MCYST) 10 µM exponiert. DMSO diente als Lösungsmittel-Kontrolle. Das Plus (+) bedeutet, dass die
Probe mit DMSO inkubiert wurde. Ein Minus (-) bedeutet keine DMSO-Exposition. Die Wirkung von Microcystin
auf die p53-vermitttelte Expression des Luciferasegens wurde indirekt über die gemessene Luciferase-Aktivität
bestimmt. Die relative Luciferase-Aktivität wurde pro µg Protein quantifiziert. Die Graphik zeigt die Mittelwerte aus
vier unabhängigen Experimenten +/- SD; Signifikanz gegenüber den Kontrollen p*<0,05, p** <0,01und p***
<0,001 Durch die transiente Transfektion der UV-induzierten HepG2-Zellen mit dem p53-
TA-Luc-Konstrukt (UV-Kontrolle) wurde die Induktion und die physiologische Aktivität
des induzierten p53-Proteins überprüft. Es wurde eine Lumineszenz von 8,7 LCPS/
µg Protein gemessen. Eine zusätzliche Exposition der Zellen mit einer 0,4%igen
DMSO-Lösung führte im Vergleich zur UV-Kontrolle zu einer signifikant verstärkten
Expression des Luciferasegens, die zu einem 6,6-fachen Anstieg der gemessenen
Luciferase- Aktivität führte (58 LCPS/ µg Protein). Microcystin in einer Konzentration
von 10 µM führte im Vergleich zur DMSO-Kontrolle zu einer deutlich verminderten
p53-induzierten Expression des Luciferasegens, die zu einer signifikanten Abnahme
der Lumineszenz führte ( 8,3 LCPS/µg Protein; p*** <0,001).
Die Reduktion der Luciferase-Aktivität nach der Microcystin-Exposition deutet auf
eine Microcystin-vermittelte funktionelle Inaktivierung des Tumorsuppressorproteins
hin.
MC
YST-
LR **
*
pp53- TA Luc
0
1020
3040
5060
70LC
PS/µ
g Pr
otei
n
Resultate
101
3.6.2. Effekte von Microcystin auf die Funktionalität von pRb
Die Wirkung von Microcystin auf die Funktion des Transkriptionsrepressors pRb
wurde durch die transiente Transfektion von HepG2-Zellen mit dem Luciferase-
Reportergen- Konstrukt pRb-TA-Luc analysiert. Bei diesem Konstrukt wurde die TBP-
vermittelte niedrige Luciferasegen-Expression je nach Phosphorylierungsform des
Retinoblastomaproteins beeinflusst. Das Binden des hypophosphorylierten
Retinoblastomaprotein in Assoziation mit E2F führt zu einer Repression der pRb-
vermittelten Expression des Luciferasegens.
Um das aktive hypophosphorylierte Rb-Protein zu induzieren, wurden die Zellen
zunächst durch Serumentzug in der G1-Phase arretiert und am 3. Tag mit 10% FCS
stimuliert. Die Serumstimulation war notwendig, um die Konzentration an
hypoposphoryliertem pRb-Protein in der Zelle zu senken, da ansonsten aufgrund des
ungleichen Konzentrationsverhältnisses aller beteiligten Parameter keine Aussage
über die Wirkung von DMSO und Microcystin auf die pRb-vermittelte Expression des
Reportergens-Luciferase zu treffen war (Vorversuch).
Um die Effekte von Microcystin auf die pRb-vermittelte Expression des Reportergens
Luciferase zu bestimmen, wurden die Serum-stimulierten Zellen mit dem pRb-TA-
Luc-Plasmid transient transfiziert, 20h bei 37°C/ 5% CO2 inkubiert und genau 2h vor
Beendigung der Inkubation mit 10 µM Microcystin oder 0,4% DMSO exponiert. Mit
Hilfe der DMSO-Kontrolle wurde die Spezifität der Microcystin-vermittelten Wirkung
auf die Funktionalität des pRb-Proteins bestimmt.
In Tab. 3.3 wird die Wirkung von Microcystin auf die pRb-assoziierte Expression des
Luciferasegens in den HepG2-Zellen gezeigt.
Resultate
102
Tab. 3.3: Tabellarische Darstellung der pRb-vermittelten Luciferase-
Aktivität der verschiedenenTransfektionsansätze
Proben DMSO MCYST-LR LCPS SD +/-
pTA-Luc - - 1,7 0,2
pTA-Luc + - 1,3 0,3
pRb/Luc - - 5,9 0,8
pRb/Luc + - 2,5 1,0
pTA-Luc + + 2,0 0,4
pRb/Luc + + 15,0 2,4
pTA-Luc: Kontrollvektor; pRb-TA-Luc: trägt das DNA- Response Element für pRb MCYST-LR: Microcystin-LR;
DMSO: Dimethylsulfoxid; LCPS: Lumineszenz pro counts; Die Mittelwerte ergeben sich aus vier unabhängigen
Ansätzen in Doppel-bestimmung, +/- SD
- + + DMSO (0,4%)
Abb. 3.13: Einfluss von Microcystin auf die Funktionalität von pRb
Nach der Serumstimulation (1d/ 10%) wurden die Zellen mit dem pRb-Luciferase-Vektor (pRb-TA-Luc) transient
transfiziert und für 2h vor Beendigung der 20h Inkubation mit DMSO oder Microcystin (MCYST) 10 µM exponiert
bei 37°C/5% CO2. DMSO diente als Lösungsmittel-Kontrolle. Das Plus (+) bedeutet, dass die Probe mit DMSO
inkubiert wurde. Ein Minus (-) bedeutet keine DMSO-Exposition. Die Wirkung von Microcystin auf die pRb-
vermittelte Expression des Luciferasegens wurde indirekt über die gemessene Luciferase-Aktivität bestimmt. Die
relative Luciferase-Aktivität wurde pro µg Protein quantifiziert. Die Graphik zeigt die Mittelwerte aus vier
unabhängigen Experimenten +/- SD; Signifikanz gegenüber den Kontrollen p*<0,05, p** <0,01und p*** <0,001.
pRb- TA Luc
MC
YST-
LR **
05
10152025303540
LCPS
/µg
Prot
ein
Resultate
103
Durch die Lumineszenz-Messung in den Serum-stimulierten und mit dem pRb-TA-
Luc-Vektor transfizierten HepG2-Zellextrakten wurde die Induktion und die
Funktionalität des pRb-Proteins nachgewiesen.
Eine DMSO-Inkubation unterdrückte im Vergleich zur ermittelten Lumineszenz in den
Serum-stimulierten HepG2-Zellen das Ausmaß der Rb-vermittelten Expression des
Reportergens Luciferase. Nach der DMSO-Exposition wurde eine 2,4-fache
Abnahme der Luciferase-Aktivität gemessen (2,5 LCPS/ µg Protein).
Die Exposition der transfizierten Zellen mit 10 µM Microcystin führte im Vergleich zur
DMSO-Kontrolle zu einer 6-fachen Erhöhung der Lumineszenz (15 LCPS/ µg
Protein; p** <0,01).
Anhand der erworbenen Daten in diesem Transfektionsexperiment kann davon
ausgegangen werden, dass Microcystin durch die Hemmung der Protein-
phosphatasen die Aktivität von pRb partiell hemmt.
3.6.3. Effekte von Microcystin auf die Funktionalität von E2F
E2F bildet phasenspezifisch mit dem hypophosphorylierten Rb-Protein einen
Komplex. Durch eine Phosphorylierung des Rb-Proteins dissoziiert E2F aus diesem
Komplex und kann als aktiver Transkriptionsfaktor in Assoziation mit dem Protein
DP1 die Synthese von sogenannten S-Phasegenen initiieren. Aus diesem Grund ist
anzunehmen, da Microcystin die Phosphorylierung von pRb moduliert, dass
Microcystin indirekt die Aktivität von E2F hinsichtlich einer Aktivitätssteigerung
beeinflusst. Die Wirkung von Microcystin auf die E2F-vermittelte Expression des
Reportergens Luciferase ist in Tab. 3.4 und Abb.3.14 dargestellt.
Die Wirkung von Microcystin auf die Funktionalität des Transkriptionsfaktors E2F
wurde mit Hilfe des Luciferase- Reportergen-Konstruktes pE2F-TA-Luc bestimmt.
In dem pE2F-TA-Luc-Plasmid wird die TATA-Box initiierte Expression des
Luciferasegens über das in dem cis-acting Element befindliche DNA-Response-Motiv
für das E2F-Protein verstärkt, so dass das Binden von E2F-DP1 an das DNA-Motiv
mit einer messbar ansteigenden Luciferase-Aktivität einhergeht.
Resultate
104
Tab. 3.4: Tabellarische Darstellung der E2F-vermittelten Luciferase-
Aktivität der verschiedenen Transfektionsansätze
Proben DMSO MCYST-LR LCPS SD(+/-)
pTA-Luc - - 2,2 0,6
pTA-Luc + - 2,0 0,7
pE2F-TA-Luc - - 5,0 1,2
pE2F-TA-Luc + - 3,2 0,5
pTA-Luc + + 2,2 0,4
pE2F-TA-Luc + + 8,2 1,1
pTA-Luc:Kontrollvektor; pE2F-TA-Luc: trägt das DNA-Response-Element für pE2F; MYST-LR:Microcystin-LR;
DMSO: Dimethylsulfoxid; LCPS: Lumineszenz pro counts;. Die Mittelwerte ergeben sich aus vier unabhängigen
Ansätzen in Doppelbestimmung, +/- SD
- + + DMSO
(0,4%)
Abb. 3.14: Einfluss von Microcystin auf die Funktionalität von E2F
Nach der Serumstimulation (1d/ 10%) wurden die Zellen mit dem pE2F-Luciferase-Vektor (pE2F-TA-Luc)
transient transfiziert und für 2h vor Beendigung der 20h Inkubation mit DMSO oder Microcystin (MCYST) 10µM
bei 37°C/5% CO2 exponiert. DMSO diente als Lösungsmittel-Kontrolle. Das Plus (+) bedeutet, dass die Probe mit
DMSO inkubiert wurde. Ein Minus (-) bedeutet keine DMSO-Exposition. Die Wirkung von Microcystin auf die E2F-
vermittelte Expression des Luciferasegens wurde indirekt über die gemessene Luciferase-Aktivität bestimmt. Die
relative Luciferase-Aktivität wurde pro µg Protein quantifiziert. Die Graphik zeigt die Mittelwerte aus vier
unabhängigen Experimenten +/- SD; Signifikanz gegenüber den Kontrollen: p*<0,05, p** <0,01und p*** <0,001.
MC
YST-
LR *
pE2F- TA Luc
0
5
10
15
20
LCPS
/µg
Prot
ein
Resultate
105
Für diese funktionelle Analyse wurde zunächst die Assoziation von E2F und des
hypophosphorylierten pRb-Proteins durch einen zweitägigen Serumentzug forciert,
um dann durch die eintägige Serumstimulation der Zellen (10% FCS), die synchrone
Dissoziation des pRb-E2F-Komplexes und die Freisetzung von E2F zu induzieren.
Die Serum�stimulierten HepG2-Zellen wurden dann mit dem pE2F-TA-Luc
Reportergen-Konstrukt transient transfiziert, 20 h bei 37°C/ 5% CO2 inkubiert und wie
bei den anderen Transfektionen mit 10 µM Microcystin oder 0,4% DMSO 2 h vor
Ablauf der Inkubation exponiert.
Über die Lumineszenz-Messung in den Serum-stimulierten und transient mit dem
pE2F-TA-Luc-Vektor transfizierten HepG2-Zellen wurde die Funktionalität von E2F
nachgewiesen. Die Exposition der Zellen mit DMSO bewirkte eine Verringerung der
Luciferase- Aktivität. Nach der DMSO-Exposition wurde im Vergleich zur der
ermittelten Lumineszenz nach der Serumstimulation der HepG2-Zellen (5,0 LCPS/
µg Protein) eine Abnahme der Luciferase-Aktivität gemessen (3,2 LCPS/ µg Protein).
Microcystin in einer Konzentration von 10 µM revertierte die DMSO-vermittelte
Abnahme der Lumineszenz und führt zu einer verstärkten E2F-vermittelten
Expression des Luciferasegens, die mit einer Zunahme der Luciferase-Aktivität (8,2
LCPS/ µg Protein; p* <0,05) korrelierte.
Abschliessend kann festgestellt werden, dass der Tumorpromotor Microcystin einen
positiven Einfluss auf die Aktivität von E2F hat.
3.6.4. Effekte von Microcystin auf die Funktionalität von c-Myc
Das Myc-Protein wird als Proliferationsmarker bezeichnet, da es gleich nach der
Serumstimulation ruhender Zellen gebildet wird und diese zum Eintritt in den
Zellzyklus veranlasst. Als TF aktiviert es zum Beispiel das Gen, das für die Cdc25-
Phosphatase kodiert. Die Cdc25-Phosphatase ist erforderlich für die Aktivierung von
Cyclin-abhängigen Proteinkinasen, die eine essentielle Rolle bei der Regulation des
Zellzyklus übernehmen.
Die Wirkung von Microcystin auf die Funktionalität des c-Myc-Proteins wurde durch
die transiente Transfektion nach der Serumstimulation (1d) der HepG2-Zellen mit
dem pMyc-TA-Luc-Vektor nachgewiesen.
Resultate
106
In diesem Konstrukt wird die TATA-Box initiierte Expression des Luciferasegens
durch das Binden von c-Myc als Heterodimer mit dem Protein MAX an das im cis-
acting-Element lokalisierte E-Box Motiv verstärkt.
Die Tab. 3.5 zeigt die gemessenen Luciferase-Aktivitäten nach einer transienten
Transfektion der Serum-stimulierten HepG2-Zellen mit dem pMyc-TA-Luc-Vektor.
Tab. 3.5: Tabellarische Darstellung der c-Myc-vermittelten Luciferase�
Aktivität der verschiedenenTransfektionsansätze
Proben DMSO MCYST-LR LCPS SD+/-
pTA-Luc - - 2,3 0,5
pTA-Luc + - 1,5 0,6
pMyc �TA-Luc - - 4,0 1,3
pMyc �TA-Luc + - 6,5 1,0
pTA-Luc + + 2,2 0,4
pMyc �TA-Luc + + 15,0 1,9
pTA-Luc: Kontrollvektor; pMyc�TA-Luc: trägt das DNA- Response Element für c-Myc; MCYST-LR: Microcystin-
LR; DMSO: Dimethylsulfoxid; LCPS: Lumineszenz pro counts. Die Mittelwerte ergeben sich aus vier
unabhängigen Ansätzen in Doppelbestimmung, +/- SD
- + + DMSO (0,4%)
Abb. 3.15: Einfluss von Microcystin auf die Funktionalität von c- Myc
Nach der Serumstimulation (1d/ 10%) wurden die Zellen mit dem pMyc-Luciferase-Vektor (pMyc-TA-Luc)
transient transfiziert und für 2h vor Beendigung der 20h Inkubation mit DMSO oder Microcystin (MCYST) 10 µM
bei 37°C/5% CO2 exponiert. DMSO diente als Lösungsmittel-Kontrolle. Das Plus (+) bedeutet, dass die Probe mit
DMSO inkubiert wurde. Ein Minus (-) bedeutet keine DMSO-Exposition. Die Wirkung von Microcystin auf die c-
Myc-vermittelte Expression des Luciferasegens wurde indirekt über die gemessene Luciferase-Aktivität bestimmt.
Die relative Luciferase-Aktivität wurde pro µg Protein quantifiziert. Die Graphik zeigt die Mittelwerte aus vier
unabhängigen Experimenten +/- SD; Signifikanz gegenüber den Kontrollen: p*<0,05, p** <0,01und p*** <0,001.
pc-Myc- TA Luc
MC
YST-
LR**
0
10
20
30
40
50
60
LCPS
/µg
Prot
ein
Resultate
107
Durch die Messung der Luciferase-Aktivität in den Serum-stimulierten und transient
mit dem pMyc-TA-Luc-Vektor transfizierten HepG2-Zellen wurde die Induktion und
die Funktionalität von c-Myc in diesem Testsystem überprüft. Die Inkubation der
transfizierten Zellen mit DMSO führte im Vergleich zu einer Serumstimulation zu
einer höheren c-Myc-vermittelten Expression des Luciferasegens, was mit einem 1,6-
fachen Anstieg der Luciferase-Aktivität (6,5 LCPS/ µg Protein) einherging.
Microcystin in einer Konzentration von 10 µM hatte ebenfalls eine positive Wirkung
auf die c-Myc-vermittelte Expression des Luciferasegens. Es wurde im Vergleich zur
DMSO-Kontrolle ein 2,3-facher Anstieg der Luciferase-Aktivität gemessen (15 LCPS/
µg Protein; p** <0,01).
Abschliessend kann man sagen, dass die Funktion von c-Myc durch eine
Microcystin-Inkubation positiv beeinflusst wurde.
3.7. Analyse der Effekte von Microcystin und HBx auf die Zellzyklus-Regulation
Epidemiologische Studien zeigten, dass eine Kontamination des Trinkwasssers mit
Microcystin und eine Überexpression von HBx bei chronischen HBV-Infektionen bei
der Entwicklung eines HBV-assoziierten HCC wesentliche Risikofaktoren darstellen
(Caselmann et al., 1996; Cromish et al., 1996; Ganem and Varmus, 1996;
Matsushima et al., 1990; Yoshizawa et al., 1990; Yu, 1995).
In verschiedenen Studien wurde gezeigt, dass das x-Protein bei der Entstehung
eines HCC involviert ist. Über Protein-Protein-Interaktionen greift es dysregulierend
in Signalkaskaden (z.B. MAPK-Weg/TBP-Interaktion ) und in die Zellzyklus-
Regulation (p53-Adapter, Verkürzung der Zellzyklus-Phasen) ein (Feitelson, 1998;
Puisieux et al., 1995). Der Tumorpromotor Microcystin kann als Inhibitor der PP1/
PP2A in alle zellulären Regelmechanismen (MAPK-Weg, p53/ pRb Funktion)
eingreifen, die über De-/Phosphorylierungsprozesse aktiviert werden.
Resultate
108
In diesem Experiment sollten vor allem die kombinatorischen (additive/ syner-
gistische) Effekte der beiden Tumorpromotoren auf die durch die Zellzyklus-
Regulatoren- (p53, Rb, E2F, c-Myc) vermittelte Expression des Reportergens
Luciferase dargestellt werden.
Dazu wurden in den HepG2-Zellen zunächst die Zellzyklus-regulierenden Proteine
über verschiedene Techniken induziert (3.6). Dann erfolgte die transiente
Kotransfektion der HepG2-Zellen mit jeweils einem der Luciferase-Vektoren (3.6.1-
3.6.4.) und dem Expressionsvektor pSVx, der die vollständige c-DNA-Sequenz des
HBx-Gens (Wt) enthält. Die Expression des HBx-Gens (Wt) erfolgt unter der
Kontrolle eines CMV-Promotors. Um die kombinatorischen Effekte von Microcystin
und dem HBx-Protein auf die Funktionalität der verschiedenen Zellzyklus-
Regulatoren zu analysieren, wurden die transient transfizierten Zellen 2h vor
Beendigung der 20h Inkubation mit DMSO (0,4%) oder 10 µM Microcystin bei 37°C/
5% CO 2 inkubiert. Die kombinatorischen Effekte der beiden Tumorpromotoren auf
die durch die Zellzyklus-Regulatoren- vermittelte Expression des Luciferasegens
wurden dabei über die Lumineszenz-Messung bestimmt.
Eine deregulierende Wirkung beider Effektoren auf die Funktionalität der Zellzyklus-
Regulatoren wird als synergistisch bezeichnet, wenn die errechnete Summe der
gemessenen Luciferase-Aktivität aus den HBx-cotransfizierten und Microcystin-
inkubierten Proben entweder grösser (pRb, E2F, c-Myc) oder kleiner (p53) ist als die
Summe, die man nach der Addition der gemessenen Lumineszenz aus den nur mit
Microcystin- oder HBx-exponierten Proben erhält. Eine deregulierende Wirkung von
Microcystin und HBx auf die Funktionalität der Zellzyklus-Regulatoren wird als additiv
bezeichnet, wenn die errechnete Summe der Lumineszenz aus den Proben, die
sowohl mit HBx als auch mit Microcystin-exponiert wurden, der Summe entspricht,
die sich nach der Addition der gemessenen Luciferase-Aktivität aus den nur mit HBx-
oder Microcystin-exponierten Proben ergibt.
In den folgenden Abb. 3.16�3.19 werden die gemessenen Luciferase-Aktivitäten
(LCPS/µg Protein) der verschiedenen Transfektionsansätze tabellarisch und
graphisch dargestellt. Um bei diesem Experiment die spezifischen Effekte von
Microcystin und dem HBx-Protein auf die Funktionalität der verschiedenen
Zellzyklus-Regulatoren zu bestimmen, wurden verschiedene Kontrollen mitgeführt.
Resultate
109
Die gemessene Luciferase- Aktivität nach der Kotransfektion der HepG2-Zellen mit
dem Kontrollvektor pTA-Luc für die Luciferase-Konstrukte (3.6) und dem
Kontrollplasmid pneo für den pSVx-Expressionsvektor, der keine c-DNA-Sequenz
des HBx-Gen enthält, wurden tabellarisch in den entsprechenden Abschnitten
dargestellt und fielen generell geringer aus als die ermittelte Lumineszenz in den
Zellen, die mit den DNA- Response-Elementen und HBx-Gensequenz gefüllten
Konstrukten cotransfiziert wurden. Auch nach einer Exposition dieser Kontroll-
vektoren (pTA-Luc/ pneo) mit DMSO oder Microcystin wurden im Vergleich zur
ermittelten Lumineszenz in den Ansätzen, die mit den verschiedenen Luciferase-
Konstrukten (3.6) und dem pSVx-Vektor cotransfiziert wurden, eine geringere
Lumineszenz gemessen. Die Standardisierung der Transfektion erfolgte wie unter 3.6
beschrieben.
Die Expression des HBx-Gens in den HBx-transfizierten Ansätzen wurde mit Hilfe der
RT-PCR nachgewiesen (Daten nicht dargestellt).
3.7.1. Effekte von Microcystin und HBx auf die Funktionalität von p53
Das p53-Protein stellt für das HBx-Protein und Microcystin einen wichtigen zellulären
Angriffspunkt dar. Verschiedene Studien zeigen, dass das HBVx-Protein durch
Interaktionen mit dem Tumorsuppressorprotein p53 entscheidend in die Entwicklung
eines Hepatozellulären Karzinoms involviert ist (Feitelson, 1998; Feitelson et al.,
2001).
Wie in dieser Studie gezeigt, kann auch Microcystin als Inhibitor der
Proteinphosphatasen über die Modulation des Phosphorylierungsmusters von p53
möglicherweise die funktionelle Inaktivierung des p53-Proteins bewirken (3.6.1).
Bei der Entwicklung eines HBV-assoziierten HCC könnten das HBx-Protein und
Microcystin kombinatorisch die Funktion von p53 ausser Kraft setzen und so
schließlich durch die Akkumulation von Mutationen eine genomische Instabilität
initiieren, die letztendlich die Tumorprogression begünstigt.
Resultate
110
Um die Wirkung von Microcystin und HBx auf die Funktionalität von p53 zu
analysieren, wurden die UV-induzierten HepG2-Zellen transient mit dem pp53-TA-
Luc- und dem HBx-Expressionsvektor pSVx cotransfiziert, 20 h bei 37°C/ 5%CO2
inkubiert und 2h vor Beendigung der Inkubation mit 10 µM Microcystin oder 0,4%
DMSO bei 37°C/ 5% CO2 exponiert.
In Tab. 3.6/Abb. 3.16 sind die gemessenen Luciferase-Aktivitäten der verschiedenen
Transfektionen tabellarisch und graphisch gezeigt.
Um spezifische Aussagen über die Effekte von Microcystin und das HBx-Protein auf
die p53-vermitttelte Expression des Reportergens Luciferase zu treffen, wurden
verschiedene Kontrollen mitgeführt.
Zur Bestimmung der Effekte von HBx auf die p53-vermitttelte Expression des
Luciferasegens zu bestimmen, wurde die gemessene Lumineszenz nach der UV-
Induktion als Bezugsgrösse eingesetzt. Zur Bewertung des Einflusses von
Microcystin auf die Aktivität von p53 wurde jeweils die gemessene Luciferase-
Aktivität in den Microcystin-exponierten Proben mit der ermittelten Lumineszenz nach
einer DMSO- Exposition verglichen (3.6.1). Um die kombinatorischen Effekte von
HBx und Microcystin auf die Funktionalität von p53 zu bestimmen, wurde die in den
HBx- cotransfizierten- und mit Microcystin-exponierten Proben gemessene
Luciferase- Aktivität mit der ermittelten Lumineszenz in der entsprechenden DMSO-
Kontrolle verglichen.
Resultate
111
Tab. 3.6.: Tabellarische Darstellung der p53-vermitttelten Luciferase-Aktivität der
verschiedenen Transfektionsansätze
Proben DMSO MCYST-LR HBx LCPS SD +/-
pTA-Luc - - - 1,7 0,2
pTA-Luc + - - 1,5 0,4
pneo - - - 1,9 0,3
pneo + - - 2,0 0,7
pTA-Luc+neo - - - 1,7 0,3
pTA-Luc+neo + - - 1,2 0,5
p53-TA -Luc - - - 8,7 2,0
p53-TA -Luc + - - 58,0 7,0
pTA-Luc + + - 2,0 1,0
pneo + + - 2,2 0,7
pTA+pneo + + - 1,7 0,8
p53-TA -Luc + + - 8,3 1,0
pTA-Luc - - + 2,0 0,7
pTA-Luc + - + 1,0 0,1
p53-TA -Luc - - + 4,4 0,8
p53-TA -Luc + - + 80,0 4,5
pTA-Luc + + + 2,3 0,8
p53-TA -Luc + + + 6,3 0,6
pTA-Luc: Kontrollvektor; pneo: Kontrollvektor; p53-TA-Luc: enthält DNA-Response Element für p53; HBx:
Expressionsvektor HBx; MCYST- LR: Microcystin-LR; DMSO: Dimethylsulfoxid; LCPS: Lumineszenz pro counts;
Die Mittelwerte ergeben sich aus vier unabhängigen Ansätzen in Doppelbestimmung, +/- SD
Resultate
112
- - + + + + DMSO (0,4%)
Abb. 3.16: Einflüsse von Microcystin und HBx auf die Funktionalität von p53
Nach der UV-Induktion wurden die Zellen mit dem pp53- Luciferase-Vektor (pp53- TA- Luc) und mit dem pSVx-
Vektor transient transfiziert und für 2h vor Beendigung der 20h Inkubation mit DMSO oder Microcystin (MCYST)
10 µM bei 37°C/5% CO2 exponiert. DMSO diente als Lösungsmittel-Kontrolle. Das Plus (+) bedeutet, dass die
Probe mit DMSO inkubiert wurde. Ein Minus (-) bedeutet keine DMSO-Exposition. Die Wirkung von Microcystin
auf die p53-vermitttelte Expression des Luciferasegens wurde indirekt über die gemessene Luciferase-Aktivität
bestimmt. Die relative Luciferase-Aktivität wurde pro µg Protein quantifiziert. Die Graphik zeigt die Mittelwerte aus
vier unabhängigen Experimenten +/- SD; Signifikanzen gegenüber den entsprechenden Ansätzen (#): p*<0,05,
p** <0,01und p*** <0,001
Durch die Messung der Lumineszenz in den UV-induzierten- und mit dem pp53-TA-
Luc�Vektor transfizierten HepG2-Zellen wurde die Induktionsmethode überprüft und
die Anwesenheit des p53-Proteins in dem Testsystem sichergestellt.
Die Anwesenheit von HBx in den HepG2-Zellen führte im Vergleich zur UV-Kontrolle
zu einer Abnahme der p53-vermitttelten Expression des Luciferasegens (4,4 LCPS/
µg Protein; p* <0,05). Durch eine zusätzliche DMSO-Exposition wurde die HBx-
vermittelte inhibierende Wirkung auf die p53-induzierte Expression des
Luciferasegens stark reduziert, was zu einem deutlich Anstieg der Luciferase-
Aktivität führte (80 LCPS /µg Protein).
Ähnlich wie das HBx-Protein führte auch Microcystin in einer Konzentration von
10 µM im Vergleich zur DMSO-Kontrolle zu einer signifikanten Reduktion der
Lumineszenz (8,3 LCPS/µg Protein; p*** <0,001). Diese Reduktion deutet an, dass
Microcystin in der Lage war, die Funktion von p53 partiell ausser Kraft zu setzen
(3.6.1). Nach einer alleinigen Inkubation der Zellen mit einer 0,4%igen DMSO-
Lösung wurde die Luciferase-Aktivität im Vergleich zur UV-induzierten Probe um ein
6,9 -faches gesteigert (58 LCPS/µg Protein).
HBx
HBx
*
pp53- TA Luc
MC
YST-
LR**
*
MC
YST-
LR
+ H
Bx**
*
020406080
100120
LCPS
/µg
Prot
ein
#
#
#
Resultate
113
Durch die simultane Anwesenheit des HBx-Proteins und Microcystin in den HepG2-
Zellen wurde die Luciferase-Aktivität im Vergleich zu den entsprechenden Ansätzen
(HBx+ und MCYST;#) um ein Vielfaches veringert (6,3 LCPS/ µg Protein ; p***
<0,001).
Zusammenfassend kann man sagen, dass das HBx-Protein und das Hepatotoxin
Microcystin synergistisch die Funktion des p53-Proteins als Enhancer für die
Expression des Luciferasegens ausser Kraft setzen. Möglicherweise ist diese
kombinatorisch induzierte funktionelle Inaktivierung von p53 durch HBx und
Microcystin der Motor für die progressive Entwicklung eines HCC in HBV-Hoch-
endemiegebieten.
Die hier dargestellten Effekte der Tumorpromotoren (HBx und Microcystin) auf die
Funktion von p53 hinsichtlich einer kombinatorischen funktionellen Inaktivierung
wurden in einem Cotransfektionsexperimente mit einem rekombinierten p53-
Expressionsvektor bestätigt (Daten nicht gezeigt).
Resultate
114
3.7.2. Effekte von Microcystin und HBx auf die Funktionalität von pRb
Ebenso wie das p53-Protein stellt auch das Rb-Protein als Regulator der
Zellproliferation, Differenzierung und Apoptose (Herwig and Strauss, 1997) einen
interessanten Angriffspunkt für beide Tumorpromotoren dar. Das HBx-Protein und
Microcystin könnten womöglich kombinatorisch über die Modulation der
Phosphorylierung von pRb die Funktionalität des Transkriptionsrepressor deregu-
lierend beeinflussen.
In dieser Studie wurde gezeigt, dass Microcystin möglicherweise über den
Okadasäure-Pathway die Funktion des Rb-Proteins als Transkriptionsrepressor
ausser Kraft gesetzt (3.6.2). Auch das HBx-Protein könnte über den MAPK-Pathway
womöglich die Hyperphosphorylierung von pRb-induzieren und dadurch ebenfalls
das Aussetzen der Tumorsuppressorfunktion bewirken. Das HBx-Protein könnte so
in Kombination mit der Microcystin-vermittelten funktionellen Inaktivierung von pRb
die Entwicklung eines HBV-assoziierten HCC forcieren.
Um die kombinatorische Wirkung von Microcystin und HBx auf die Funktionalität von
pRb zu bestimmen, wurden die Serum-stimulierten HepG2-Zellen transient mit dem
pRb-TA-Luc Vektor und dem HBx-Expressionsvektor pSVx kotransfiziert, für 20h bei
37°C/ 5% CO2 inkubiert und 2h vor Beendigung der Inkubation mit Microcystin in
einer Konzentration von 10 µM bei 37°C/ 5% CO2 inkubiert.
Die Tab. 3.7/ Abb. 3.17 zeigen die gemessenen Lumineszenzen (LCPS/ µg Protein)
in den verschiedenen Transfektionen.
Zur Bewertung des Einflusses von Microcystin auf die pRb-vermittelte Luciferasegen-
Expression wurde die nach der Microcystin-Exposition gemessene Lumineszenz mit
der ermittelten Luciferase- Aktivität aus der DMSO-Kontrolle verglichen (3.6.2). Bei
der Bestimmung des Effektes von HBx auf die Aktivität von pRb diente die
gemessene Luciferase-Aktivität in den Serum-stimulierten Zellen als Bezugsgrösse.
Für die Darstellung der kombinatorischen Wirkung von HBx und Microystin auf die
Aktivität von pRb diente die gemessene Luciferase-Aktivität in der entsprechenden
DMSO-Kontrolle als Bezugsgrösse.
Resultate
115
Tab. 3.7: Tabellarische Darstellung der pRb-vermittelten Luciferase-Aktivität der
verschiedenen Transfektionsansätze
Proben DMSO MCYST-LR HBx LCPS SD +/-
pTA-Luc - - - 1,7 0,2
pTA-Luc + - - 1,3 0,3
pneo - - - 1,9 0,8
pneo + - - 2,1 0,6
pTA-Luc+neo - - - 1,7 0,2
pTA-Luc+neo + - - 2,0 0,3
pRb/Luc - - - 5,9 0,8
pRb/Luc + - - 2,5 1,0
pTA-Luc + + - 2,0 0,4
pneo + + - 2,4 0,3
pTA+pneo + + - 2,3 0,3
pRb/Luc + + - 15,0 2,4
pTA-Luc - - + 2,0 0,4
pTA-Luc + - + 2,1 2,4
pRb/Luc - - + 70,0 4,0
pRb/Luc + - + 21,0 0,5
pTA-Luc + + + 2,3 0,8
pRb/Luc + + + 44,0 3,2
pTA-Luc: Kontrollvektor; pneo: Kontrollvektor; pRb-TA-Luc: trägt das DNA-Response-Element für pRb; HBx:
Expressionsvektor HBx ; MCYST-LR: Microcystin-LR; DMSO: Dimethylsulfoxid; LCPS: Lumineszenz pro counts;
Die Mittelwerte ergeben sich aus vier unabhängigen Ansätzen in Doppelbestimmung, +/- SD
Resultate
116
- - + + + + DMSO(0,4%)
Abb. 3.17: Analyse der Einflüsse von Microcystin und HBx auf die Funktionalität von pRb
Nach der Serumstimulation (1d/ 10%) wurden die Zellen mit dem pRb-Luciferase-Vektor (pRb-TA-Luc) und mit
dem pSVx-Vektor transient transfiziert und für 2h vor Beendigung der 20h Inkubation mit DMSO oder Microcystin
(MCYST) 10 µM bei 37°C/5% CO2 exponiert. DMSO diente als Lösungsmittel-Kontrolle. Das Plus (+) bedeutet,
dass die Probe mit DMSO inkubiert wurde. Ein Minus (-) bedeutet keine DMSO-Exposition. Die Wirkung von
Microcystin auf die pRb-vermittelte Expression des Luciferasegens wurde indirekt über die gemessene
Luciferase- Aktivität bestimmt. Die relative Luciferase-Aktivität wurde pro µg Protein quantifiziert. Die Graphik
zeigt die Mittelwerte aus vier unabhängigen Experimenten, +/- SD; Signifikanzen gegenüber den entsprechenden
Ansätzen (#): p*<0,05, p** <0,01und p*** <0,001
Durch die Messung der Lumineszenz in den Serum-stimulierten und mit dem pRb-
TA-Luc- Vektor transfizierten HepG2-Zellextrakten wurde die Induktion und die
Anwesenheit des pRb-Proteins nachgewiesen.
Das transiente Einbringen des HBx-Proteins in die HepG2-Zellen hatte zur Folge,
dass die Funktion des Rb-Proteins als Transkriptionsrepressor partiell gehemmt
wurde. Im Vergleich zu der ermittelten Luciferase-Aktivität in den Serum-stimulierten
HepG2-Zellen wurde hier eine 12-fache Erhöhung der Lumineszenz gemessen (70
LCPS/ µg Protein; p*** <0,001). Eine zusätzliche DMSO-Inkubation konnte das
Ausmaß der HBx-assoziierten Hemmung der Funktion von pRb beschränken und
eine 3,5-fachen Reduktion der gemessenen Lumineszenz bewirken. Die Exposition
der transfizierten Zellen mit 10 µM Microcystin führte, ähnlich wie die Kotransfektion
mit HBx, im Vergleich zur DMSO-Kontrolle zu einer 6-fachen Erhöhung der
Lumineszenz (15 LCPS/µg Protein; p** <0,01).
pR b- TA-Luc
HBx
***
HBx
MC
YST-
LR**
HBx
+MC
YST-
LR**
0102030405060708090
100110120
LCPS
/µg
Prot
ein
# #
#
Resultate
117
Eine alleinige Inkubation der transfizierten HepG2-Zellen mit DMSO führte im
Vergleich zur ermittelten Lumineszenz in den Serum-stimulierten HepG2-Zellen zu
einer 2,4-fache Abnahme der Luciferase-Aktivität.
Durch das simultane Vorhandensein von HBx und Microcystin in den Zellen wurde
die Luciferase-Aktivität im Vergleich zu den entsprechenden Ansätzen (HBx+ und
MCYST;#) um 1,2-fach erhöht (44 LCPS/µg Protein; p** <0,01).
Anhand der erworbenen Daten in diesem Transfektionsexperiment kann davon
ausgegangen werden, dass das HBx-Protein und Microcystin synergistisch die
Funktion von pRb als Transkriptionsreppressor inhibieren.
3.7.3. Effekte von Microcystin und HBx auf die Funktionalität von E2F
Das HBx-Proteinund Microcystin haben Detektionlich einen signifikanten Einfluss auf
die Hyperphosphorylierung des Rb-Proteins (3.6.2/3.7.2), so dass beide Tumor-
promotoren möglicherweise auch eine deregulierende Wirkung auf die Aktivität von
E2F haben.
Die Einflüsse von Microcystin und HBx auf die Funktion von E2F wurden nach einer
transienten Kotransfektion von Serum-stimulierten HepG2-Zellen mit dem Plasmid
pE2F-TA-Luc und dem HBx-Expressionsvektor pSVx, einer 20h Inkubation bei 37°C/
5% CO2 und einer 2h Exposition der Zellen mit Microcystin vor Ablauf der Inkubation
bei 37°C/ 5% CO2 untersucht. In Tab. 3.8/ Abb. 3.18 sind die gemessenen
Luciferase-Aktivitäten der einzelnen Transfektionen tabellarisch und graphisch
dargestellt.
Resultate
118
Tab. 3.8: Tabellarische Darstellung der E2F-vermittelten Luciferase-Aktivität in
den verschiedenenTransfektionsansätzen
Proben DMSO MCYST-LR HBx LCPS SD(+/-)
pTA-Luc - - - 2,2 0,6
pTA-Luc + - - 2,0 0,7
pneo - - - 1,9 0,5
pneo + - - 2,0 0,1
pTA-Luc+neo - - - 1,7 0,3
pTA-Luc+neo + - - 2,0 0,4
pE2F-TA-Luc - - - 5,0 1,2
pE2F-TA-Luc + - - 3,2 0,5
pTA-Luc + + - 2,2 0,4
pneo + + - 2,3 0,3
pTA+pneo + + - 2,3 0,4
pE2F-TA-Luc + + - 8,2 1,1
pTA-Luc - - + 2,0 0,4
pTA-Luc + - + 2,1 0,9
pE2F-TA-Luc - - + 11,0 1,8
pE2F-TA-Luc + - + 5,1 0,2
pTA-Luc + + + 2,3 0,5
pE2F-TA-Luc + + + 14,0 1,4
pTA-Luc: Kontrollvektor; pneo: Kontrollvektor; pE2F-TA-Luc: trägt das DNA-Response-Element für pE2F; HBx:
Expressionsvektor HBx; MCYST-LR: Microcystin-LR; DMSO: Dimethylsulfoxid; LCPS: Lumineszenz pro counts.
Die Mittelwerte ergeben sich aus vier unabhängigen Ansätzen in Doppelbestimmung, +/- SD
Resultate
119
- - + + + + DMSO (0,4%)
Abb. 3.18: Analyse der Einflüsse von Microcystin/ HBx auf die Funktionalität von E2F
Nach der Serumstimulation (1d/ 10%) wurden die Zellen mit dem pE2F-Luciferase-Vektor (pE2F-TA- Luc) und mit
dem pSVx-Vektor transient transfiziert und für 2h vor Beendigung der 20h Inkubation mit DMSO oder Microcystin
(MCYST) 10 µM bei 37°C/5% CO2 exponiert. DMSO diente als Lösungsmittel-Kontrolle. Das Plus (+) bedeutet,
dass die Probe mit DMSO inkubiert wurde. Ein Minus (-) bedeutet keine DMSO-Exposition. Die Wirkung von
Microcystin auf die pE2F-vermittelte Expression des Luciferasegens wurde indirekt über die gemessene
Luciferase-Aktivität bestimmt. Die relative Luciferase-Aktivität wurde pro µg Protein quantifiziert. Die Graphik zeigt
die Mittelwerte aus vier unabhängigen Experimenten, +/- SD; Signifikanzen gegenüber den entsprechenden
Ansätzen (#) : p*<0,05, p** <0,01und p*** <0,001
Über die Messung der Lumineszenz in den Serum-stimulierten- und transient mit
dem pE2F-TA-Luc-Vektor transfizierten HepG2-Zellen wurde die Anwesenheit von
E2F nachgewiesen. Das Vorhandensein von HBx in den Zellen führte zu einer
deutlichen Erhöhung der Luciferase-Aktivität (11 LCPS/ µg Protein; p* <0,05). Durch
die zusätzliche Exposition der Zellen mit DMSO wurde letztendlich die stimulierende
Wirkung von HBx auf die E2F-vermittelte Expression des Reportergens Luciferase
vermindert (5,1 LCPS/ µg Protein). Diese inhibierende Wirkung von DMSO auf die
E2F-vermittelte Expression des Reportergens Luciferase wurde auch in den
Ansätzen, die nur mit dem pE2F-TA-Luc-Vektor transfizierten HepG2-Zellen
registriert. Die DMSO-Exposition ging im Vergleich zur gemessenen Lumineszenz in
den Serum-stimulierten Proben mit einer Abnahme der Luciferase-Aktivität einher
(3,2 LCPS/µg Protein; 3.6.2).
HBx
*
p E 2 F - T A - L u c
HBx
MC
YST-
LR*
HBx
+
MC
YST-
LR*
0
5
1 0
1 5
2 0
2 5LC
PS/µ
g Pr
otei
n
#
#
#
Resultate
120
Microcystin in einer Konzentration von 10 µM revertierte die DMSO-assoziierte
Abnahme der E2F-vermittelten Expression des Luciferasegens und führte zu einer
Aktivitätssteigerung von E2F, die zu einer Zunahme der Luciferase-Aktivität führte
(8,2 LCPS/µg Protein). Die gleichzeitige Anwesenheit von HBx und Microcystin in der
Zelle führte im Vergleich zu den entsprechenden Ansätzen (HBx+ und MCYST;#) zu
einem 1,0-fachen Anstieg der E2F-vermittelte Luciferasegen-Expression (14,0
LCPS/µg; p*< 0,05).
Zusammenfassend kann man sagen, dass das HBx-Protein und Microcystin die
Aktivität von E2F additiv stimulieren.
3.7.4. Effekte von Microcystin und HBx auf die Funktionalität von c-Myc
Für die Analyse der kombinatorischen Effekte von Microcystin und HBx auf die
Aktivität von c-Myc wurden Serum-stimulierte HepG2-Zellen mit dem pMyc-TA-Luc-
Vektor (3.6.4) und dem HBx-Expressionsvektor pSVx transient cotransfiziert, 20h bei
37°C/ 5% CO2 inkubiert und 2h vor Ablauf der Inkubation mit 10 µM Microcystin oder
0,4% DMSO bei 37°C/ 5% CO2 exponiert.
Die Tab. 3.9/ Abb. 3.19 zeigen die gemessenen Luciferase-Aktivitäten in den
verschiedenen Transfektionen.
Resultate
121
Tab. 3.9: Tabellarische Darstellung der c-Myc vermittelten Luciferase-Aktivität in
den verschiedenen Transfektionsansätze
Proben DMSO MCYST-LR HBx LCPS SD+/-
pTA-Luc - - - 2,3 0,5
pTA-Luc + - - 1,5 0,6
pneo - - - 1,9 0,1
pneo + - - 1,9 0,2
pTA-Luc+neo - - - 1,7 0,2
pTA-Luc+neo + - - 2,0 0,3
pMyc �TA-Luc - - - 4,0 1,3
pMyc �TA-Luc + - - 6,5 1,0
pTA-Luc + + - 2,2 0,4
pneo + + - 2,3 0,3
pTA+pneo + + - 2,3 2,3
pMyc �TA-Luc + + - 15,0 1,9
pTA-Luc - - + 2,0 0,4
pTA-Luc + - + 2,1 0,9
pMyc �TA-Luc - - + 20,0 4,3
pMyc �TA-Luc + - + 21,0 3,5
pTA-Luc + + + 2,3 0,2
pMyc �TA-Luc + + + 40,0 3,2
pTA-Luc: Kontrollvektor; pMyc�TA- Luc: trägt das DNA-Response Element für c-Myc; pneo: Kontrollvektor für den
HBx-Expressionsvektor pSVx; MCYST-LR: Microcystin-LR; DMSO: Dimethylsulfoxid; LCPS: Lumineszenz pro
counts. Die Mittelwerte ergeben sich aus vier unabhängigen Ansätzen in Doppelbestimmung, +/- SD
Resultate
122
- - + + + + DMSO (0,4%)
Abb. 3.19: Einflüsse von Microcystin/ HBx auf die Funktionalität von c-Myc
Nach der Serum-Stimulation (1d/ 10%) wurden die Zellen mit dem pMyc- Luciferase-Vektor (pMyc-TA-Luc) und
mit pSVx-Vektor transient transfiziert und für 2h vor Beendigung der 20h Inkubation mit DMSO oder Microcystin
(MCYST) 10 µM bei 37°C/5% CO2 exponiert. DMSO diente als Lösungsmittel-Kontrolle. Das Plus (+) bedeutet,
dass die Probe mit DMSO inkubiert wurde. Ein Minus (-) bedeutet keine DMSO- Exposition. Die Wirkung von
Microcystin auf die c-Myc-vermittelte Expression des Luciferasegens wurde indirekt über die gemessene
Luciferase-Aktivität bestimmt. Die relative Luciferase-Aktivität wurde pro µg Protein quantifiziert. Die Graphik zeigt
die Mittelwerte aus vier unabhängigen Experimenten +/- SD; Signifikanzen gegenüber den entsprechenden
Ansätzen (#): p*<0,05, p** <0,01 und p*** <0,001.
Durch die Messung der Luciferase-Aktivität in den Serum-stimulierten und transient
mit dem pMyc-TA-Luc-Vektor transfizierten HepG2-Zellen wurde die Induktions-
technik und das Vorhandensein von c-Myc in dem Testsystem nachgewiesen (3.6.4).
Die transiente Expression des HBx-Gens in den Zellen führte zu einer Stimulation der
Aktivität von c-Myc. Es wurde eine deutlich verstärkte c-Myc-vermittelte Expression
der Reportergens Luciferase durch die Lumineszenz-Messung nachgewiesen (20
LCPS/ µg Protein; p** <0,01). Die zusätzliche Exposition der Zellen mit einer
0,4%igen DMSO-Lösung hatte keinen Einfluss auf die c-Myc-vermitttelte
Luciferasegen-Expression, die Luciferase-Aktivität blieb nahezu konstant. Eine
alleinige Inkubation der transfizierten Zellen mit DMSO führte im Vergleich zur
Serum-stimulierten Probe zu einem 1,6-fachen Anstieg der Luciferase-Aktivität (6,5
LCPS/ µg Protein).
HBx
+
MC
YST-
LR**
MC
YST-
LR**
HBx
p c - M y c - T A L u c
HBx
**
0
5
1 0
1 5
2 0
2 5
3 0
3 5
4 0
4 5
5 0
5 5
6 0
6 5
LCPS
/µg
Prot
ein
#
#
#
Resultate
123
Diese Steigerung der c-Myc-Aktivität korreliert womöglich mit der Fähigkeit von c-
Myc, als Antagonist von pRb tätig zu werden, um so die Hyperphosphorylierung des
Rb-Proteins zu steigern (3.6.2). Microcystin in einer Konzentration von 10 µM hatte
ebenfalls eine positive Wirkung auf die c-Myc-vermittelte Expression des
Reportergens Luciferase. Es wurde im Vergleich zur DMSO-Kontrolle eine höhere
Luciferase-Aktivität gemessen (15 LCPS/ µg Protein ;3.6.4). Durch die gleichzeitige
Anwesenheit von HBx und Microcystin in den HepG2-Zellen wurde die Funktion von
c-Myc im Vergleich zu den entsprechenden Ansätzen (HBx+ und MCYST;# ) am
deutlichsten beeinflusst. In diesem Ansatz wurde die höchste Luciferase-Aktivität (40
LCPS/µg Protein; p** <0,001) gemessen.
Anhand der gewonnenen Daten in diesem Experiment kann davon ausgegangen
werden, dass das HBx-Protein und Microcystin die c-Myc-vermittelte Expression des
Luciferasegens synergistisch stimulierend beeinflussen.
Diskussion
124
4. Diskussion
Ziel dieser Studie ist es, kombinatorische Effekte von HBx und Microcystin bei der
Deregulation der Aktivität von essentiellen Zellzykluskomponenten zu untersuchen.
Es besteht die Annahme, dass Zellzyklus-Regulatoren wie p53, pRb, E2F und c-Myc
wichtige zelluläre Angriffspunkte für beide Tumorpromotoren darstellen (Feitelson et
al., 2002; Fujiki, 1992). Das HBx-Protein fungiert als pleiotroper Transaktivator, der
auf verschiedene Zellzyklus-abhängige Prozesse Einfluss nimmt (Benn and
Schneider, 1994; Benn and Schneider, 1995).
Das cyanobakterielle Hepatotoxin Microcystin stellt neben dem HBx-Protein einen
Lebertumor-Promotor dar, der über einen biochemischen Mechanismus in wichtige
zelluläre Regelmechanismen eingreift (Bialojan and Takai, 1988; Feitelson et al.,
2002; Haystead et al., 1989). Da Tumorpromotoren nur nach erfolgter Initiation
förderlich auf die Karzinogenese wirken, musste für diese Studie ein initiiertes
Testsystem eingesetzt werden (Fujiki, 1992). Die HepG2-Zellen stellen als humane
Hepatoma Zell-Line ein initiiertes Kultursystem dar.
Microcystin ist ein potenter Inhibitor der Proteinphosphatasen 1 und 2 A (PP1/
PP2A). Die Proteinphosphatasen sind Antagonisten der Proteinkinasen und
terminieren die durch Kinasen-aktivierten Signalkaskaden (Kintosh et al., 1990;
Nishiwaki et al., 1991). Der Aktivitätsverlust der PP hat zur Folge, dass es in den
Hepatozyten zur Akkumulation von Phosphoproteinen kommt, die mit einer
�apparenten Aktivierung� von Proteinkinasen einhergeht (Kintosh et al., 1990;
Nishiwaki et al., 1991). Die Wirkung von Microcystin verläuft zeit- und dosis-
abhängig, wobei scheinbar auch der Zelltyp und die Verteilung der Zellen in den
verschiedenen Phasen des Zellzyklus eine wichtige Rolle spielen (Cohen et al.,
1990; Yatsunami et al., 1993).
Zunächst sollte mit Hilfe des Neutralrot (NR)-Testes die Wirkung und der �optimale
Dosisbereich� von Microcystin in diesem initiierten Hepatozytenkultursystem
charakterisiert werden.
Diskussion
125
Zur Bestimmung des �optimalen Dosisbereiches� von Microcystin in diesem
Testsystem wurden letztendlich Microcystin-Konzentrationen von 0,1 µM, 1 µM und
10 µM eingesetzt. Verschiedene in vivo und vitro Studien zeigten, dass gerade
Wirkstoffe der Okadasäure in diesen Konzentrationen auf die zelluläre Aktivität
verschiedener Testsystemen signifikant Einfluss nehmen (Mackintosh et al., 1990;
Mackintosh and Mackintosh, 1994; Nishiwaki et al.,1991; Ohta et al., 1992
;Yatsunami et al, 1993). Bei transienten Analysen (2h Inkubation) lieferten vor allem
Microcystin-Konzentrationen von 1 µM und 10 µM die deutlichsten Ergebnisse.
Kurzfristig werden von den verschiedenen Testsystemen auch je nach Zelltyp höhere
Konzentrationen von den Zellen gut toleriert (Mackintosh and Mackintosh., 1994;
Shenolikar et al., 1994). In einem Versuch bei dem die HepG2-Zellen mit 20 µM und
50 µM Microcystin exponiert wurden, konnte diese Toleranz nicht beobachtet
werden. In diesen Ansätzen wurden die Zellen stark geschädigt. Es ist jedoch nicht
auszuschliessen, dass diese Zellschäden möglicherweise durch das in der
Microcystin-Lösung befindliche DMSO verursacht wurde, da eine alleinige DMSO-
Inkubation (DMSO-Kontrolle) ebenfalls zur Schädigung der Zellen führte. DMSO
dient als Lösungsvermittler bei der Herstellung der Microcystin-Lösung. Es wurde
gezeigt, dass DMSO selbst dosis- und zeit-abhängig die zelluläre Aktivität
beeinflusst, so dass bei der Bestimmung der Wirkung von Microcystin auf dieses
Testsystem jeweils die möglichen interferierenden DMSO-Effekte berüchsichtigt
werden mussten (Maehara et al., 1993).
Es konnte gezeigt werden, dass es sowohl nach der Exposition mit DMSO als auch
nach einer Microcystin-Inkubation der Zellen im Vergleich zur Kontrolle (Medium) zur
Steigerung der Vitalität kam.
Bei der Interpretation der im NR-Test erhaltenen Vitalitätsverhältnisse musste die
Eigenschaft von DMSO als kleines lipophiles Molekül besonders berücksichtigt
werden, da die Vitalität der Zellen über die endozytotische Aufnahme des Neutralrots
bestimmt wird. DMSO kann aufgrund seines lipophilen Charakters durch die
kurzfristig Erhöhung der Membranfluidität die Zellmembran-Permeabilität so
beeinflussen, dass es zu einer gesteigerten Aufnahme des Farbstoffes Neutralrot
kommt, die zu Artefakten bei der Vitalitätbestimmung hinsichtlich einer apparenten
Vitalitätssteigerung führt.
Diskussion
126
Dieser Fähigkeit von DMSO ist es vermutlich zu zuschreiben, dass eine DMSO-
Exposition (0,04%) (Abb. 3.1) zu einer apparenten Vitalitätssteigerung führte. Diese
Annahme wurde durch die im Trypanblau-Test gewonnenen Ergebnisse nach einer
DMSO-Exposition bestätigt (3.4). Die DMSO-Exposition bewirkte im Vergleich zur
Kontrolle und den Microcystin-Ansätzen zu einer verminderten Vitalität der HepG2-
Zellen, die mit einem höheren Anteil (%) toter Zellen korrelierte (3.4).
Die deutlichste Wirkung von Microcystin auf die Zellvitalität von HepG2-Zellen (3,9-
facher Anstieg) und damit �optimale Dosis� für dieses Testsystem zeigte Microcystin
in einer Konzentration von 10µM. Gleichzeitig wurde in diesen Ansätzen auch die
geringste DMSO-Wirkung beobachtet (Abb. 3.1.1). DMSO in einer Konzentration von
0,4% zeigte weniger Einfluss auf die apparente Vitalität und erleichterte die
Bestimmung der Wirkung von Microcystin auf die HepG2-Vitalität. Weitere
Eigenschaften von DMSO als gentoxische Substanz und Effektor auf
Zellzyklusabläufe (Proliferation/ Differenzierung) werden später diskutiert.
Hingegen zeigte die Exposition der Zellen mit 1µM Microcystin im Vergleich zur
Medium-Kontrolle, abzüglich der Effekte von DMSO, eine minimale Reduktion der
Vitalität auf. Die Wirkung von Microcystin in einer Konzentration von 0,1µM konnte
nicht beurteilt werden, da es hier keinen auflösbaren Unterschied zwischen der
Wirkung von DMSO (0,004%) und Microcystin gab. Aus diesem Grund wurde in
dieser Studie die 10µM Microcystin-Lösung als �optimale Dosis� deklariert.
Die 0,1 µM und 1 µM Microcystin-Konzentrationen wurden jedoch partiell bei
Experimenten mitgeführt, um konzentrationsabhängige Aussagen über das
Wirkungsprofil von Microcystin auf verschiedene zelluläre Aktivitäten treffen zu
können.
4.1. Microcystin-assoziierte Protein-Phosphorylierung, -Stabilisierung und -Synthese
Nach dem die optimale Microcystin- Dosis für dieses Testsystem ermittelt war,
konnte gezielt die Wirkung von Microcystin auf die zelluläre Aktivität untersucht
werden. Bei der Regulation des zellulären Geschehens spielt die Funktion von
Enzymen und Proteinen eine wesentliche Rolle.
Diskussion
127
Durch ein koordiniertes Zusammenspiel von Proteinkinasen und
Proteinphosphatasen werden die Enzym- und Protein-Aktivitäten kontinuierlich
während der Signaltransduktion und Zellzyklus-Regulation moduliert (Cohen, 1986).
In der Regel führt ein phosphoryliertes Protein zur Aktivierung der Signalkaskade und
die Protein-Dephosphorylierung terminiert oder dämpft das Signal (Haystead et al.,
1989; Hullmann and Boonstra, 2001; Shenolikar, 1994). Auch Microcystin könnte
durch die irreversible Hemmung der Proteinphosphatasen PP1/ PP2A deregulierend
auf diese zellulären Kontroll-mechanismen wirken. Durch den Verlust der PP kann
die Abspaltung von Phosphat-resten an den Proteinen, die die Wirkung der
Phosphorylierung revertiert, nicht katalysiert werden. Die akkumulierenden
Phosphoproteine wirken verstärkend auf PK-vermittelten Signalkaskaden, die unter
anderem die Funktion der regulatorischen Proteine im Zellzyklus modulieren. Auch
ein direkter Einfluss von Microcystin auf die Phosphorylierung von essentiellen
Zellzyklus-Regulatoren (p53/ pRb) ist möglich, da die Proteine durch den Verlust der
Proteinphosphatase-Aktivität in ihrer hyperphosphorylierten inaktiven Form
arretieren.
In verschiedenen Studien wurde gezeigt, dass die Exposition verschiedener
Testsysteme mit Wirkstoffen der Okadasäureklasse zu einer Akkumulation von
Phosphoproteinen in der Zelle führt (Erikkson et al., 1990; Nishiwaki et al., 1991). In
diesem Zusammenhang wird auch von einer apparenten �Aktivierung� von
Proteinkinasen gesprochen. In Versuchen mit Ratten-Hepatozyten, die mit
Microcystin-Konzentrationen von 0,01 µM - 10 µM exponiert wurden, konnten mittels
SDS-PAGE jeweils 10 verschiedene Phosphoproteine mit verschiedenen
Molekulargewichten (MW) nachgewiesen werden (Nishiwaki et al., 1991). Um die
Wirkung von Microcystin auf die Proteinphosphorylierung, -stabilisierung und -
synthese zu untersuchen, wurden 32P-und 35S-markierte HepG2-Zellen für 2h mit
verschiedenen Microcystin-Konzentrationen inkubiert.
Durch die Ermittlung der Höhe der Radioaktivität in den verschiedenen 32P-und 35S-
markierten Proben konnten indirekt Aussagen über die Effekte von Microcystin auf
die Phosphorylierung-, der Stabilität- und der Synthese zellulärer Proteine gemacht
werden. Auf eine qualitative Darstellung dieser Effekte mittels SDS-PAGE wurde
verzichtet. Anhand der gemessenen Radioaktivität in den 32P-markierten HepG2-
Gesamtzellproteinextrakten konnte deutlich eine konzentrationsabhängige Wirkung
von Microcystin auf die Proteinphosphorylierung bestimmt werden (Abb. 3.2).
Diskussion
128
Nach der Inkubation der 32P-markierten Zellen mit der eingesetzten maximalen
Microcystin-Konzentrationen von 10 µM konnte eine deutlich höhere Radioaktivität
als in den Kontrollen und übrigen Microcystin-Konzentrationenen (0,1 µM/1 µM)
gemessen werden. Auch anhand von Literaturdaten konnte dieser deutliche Einfluss
einer 10 µM Microcystin-Lösung auf die Phosphorylierung von Proteinen bestätigt
werden (Mackintosh et al., 1990).
Es zeigte sich weiter, dass die Microcystin-Konzentrationen von 1 µM in den 32P-
markierten Ansätzen eine minimale positive Wirkung auf die Akkumulation von
zellulären Phosphoproteinen hatte, wobei die gemessene Radioaktivität nach der
Exposition der Zellen mit der 10 µM Microcystin in diesen Proben nicht erreicht
wurde. Möglicherweise entfaltet hier verstärkt das in der Microcystin-Lösung
befindlichen DMSO seine Wirkung. Die Inkubation der Zellen mit 0,1µM Microcystin
führte sogar zur Reduktion der gemessenen Radioaktivität. In diesen Proben sind
vermutlich ebenfalls die interferierenden Effekte von DMSO so stark, dass
Microcystin in dieser Konzentration seine spezifische Wirkung nicht entfalten kann.
Da die entsprechenden DMSO-Kontrollen nicht mitgeführt wurden, lassen sich
diesbezüglich keine deutlichen Aussagen machen. Nach der Exposition der 32P-
markierten Zellen mit DMSO in einer Konzentration von 0,4% wurde im Vergleich zur
nur markierten Kontrolle eine Reduktion der Radioaktivität gemessen (Abb. 3.2).
DMSO kann möglicherweise als Induktor von Differenzierungsprozessen, was mit
einem Anstieg von Proteinphosphatasen einhergeht, die Dephosphorylierung der 32P- markierten Proteine stimulieren und somit zu einer messbaren Reduktion der
Radioaktivität geführen haben. DMSO könnte aber hier auch als gentoxische Lösung
wirken und durch die generelle Herabsetzung der Zellvitalität die radioaktive
Markierung reduzieren.
Die Messung der Radiokativität in den 35S-Methionin markierten Proben, die zur
Bestimmung der Wirkung von Microcystin auf die Proteinsynthese bzw. -stabilität
durchgeführt wurde, ergab nach der DMSO-Inkubation hingegen eine geringe
Zunahme des Maßes an Radioaktivität (Abb.3.3). Die Zunahme an Radioaktivität
korreliert möglicherweise mit einem DMSO-induzierten ��Mitose-Arrest�� der Zellen.
DMSO stimuliert Differenzierungsprozesse in der Zelle, womöglich über die Arretier-
ung der Zellen in der Mitose, die wie bei einem G0 -Arrest ein Differen-zierungssignal
darstellt (Neumann et al., 1995).
Diskussion
129
Zum Verlassen der Mitose muss der proteolytische Abbau von Cyclin B und die damit
einhergehende Inaktivierung der Mitosekinase erfolgen. DMSO wirkt aber förderlich
auf die Aktivität der Mitosekinase (Cdc2), in dem es die Akkumulation von Cyclin B
unterstützt, so dass die Zellen in der Mitose arretieren. Durch die DMSO-vermittelte
Aktivierung der Mitosekinase einerseits und die Akkumulation des Cyclin B
andererseits könnte eine erhöhte Proteinsynthese kurzfristig vorgetäuscht werden
(Neumann et. al., 1995). Diese Täuschung könnte in den 35S-markierten Proben
nach der DMSO-Inkubation im Vergleich zur Kontrolle
zu einer höheren Radioaktivität geführt haben. Nach der Inkubation der 35S-
markierten Zellen mit 10µM Microcystin wurde hier der stärkste Einfluss auf die
Proteinstabilität bzw. -synthese von zellulären Proteinen nachgewiesen.
Möglicherweise wird durch die Microcystin-verursachte irreversible Hemmung der PP
die Protein-Degradierung über den Ubiquitin-proteasomalen Pathway verzögert, so
dass es zu einer erhöhten Proteinstabilität kommt, die mit einer prolongierten Aktivität
von regulatorischen Proteinen einhergeht. Der gezielte Protein-Abbau stellt für die
Zelle ein wirkungsvolles Kontrollinstrument dar, um die Konzentration wichtiger
regulatorischer Proteine (Cycline/ p53) schnell und reversibel zu senken
(Jensenberger and Jentsch, 2002; Lania et al., 1999).
Auch eine Microcystin-assoziierte Phosphorylierung von Faktoren, die in ihrer
phosphorylierten Form für die Initiation der Proteinsynthese benötigt werden, ist
möglich. Die Wirkung von Microcystin auf die Proteinbiosynthese hätte man über die
Bestimmung der Incorporationsrate von 35S-Methionin während einer Microcystin-
Inkubation genauer ermitteln können. Durch die hier gewählten Versuchs-
bedingungen, die Microcystin-Exposition der HepG2-Zellen erfolgte erst nach dem
Einbau von 35S-Methionin, scheint diese Wirkung von Microcystin eher
unwahrscheinlich. Um jedoch eine Wirkung von Microcystin auf die Proteinsynthese
auszuschliessen, hätte der Einsatz von Proteinbiosynthese-Hemmer nach der
metabolischen Markierung helfen können.
Diskussion
130
4.2. Microcystin-vermittelte Stabilität und Phosphory-lierung von p53 und pRb
Da die Aktivität von pRb und p53 maßgeblich durch die Proteinphosphorylierung,-
stabilisierung und- synthese moduliert wird, stellen diese Proteine einen möglichen
Angriffspunkt für Microcystin dar.
Verschiedene Analysen zeigten, dass eine kontinuierliche metabolische Stabilität von
p53 eine funktionelle Inaktivierung induziert und entscheidend zur Ausprägung eines
transformierten Phänotyps von Zellen beiträgt (Levine, 1990, Levine et al.,1991). Die
metabolische Stabilisierung von p53 wird vermutlich über eine verzögerte Protein-
Degradierung oder eine erhöhte Proteinbiosynthese erreicht (Liang and Clarke,
2001).
Zunächst sollte die mutmaßliche Microcystin-assoziierte Stabilisierung von p53 in
den HepG2-Zellen durch die Western-Blot-Analyse dargestellt werden.
In der WB- Analyse zeigte sich letztendlich in einem konzentrationsabhängigen
Muster deutlich die Microcystin-assoziierte Konzentrationszunahme von p53 (Abb.
3.2).In den Microcystin-exponierten Proben wurden im Vergleich zu den Kontrollen
die stärksten p53-Proteinbanden nachgewiesen, die mit einer Zunahme der p53-
Konzentration korrelieren. Die höchste Zunahme der p53- Konzentration konnte nach
der Inkubation der Zellen mit 10µM Microcystin bestimmt werden. Durch die
Exposition mit Microcystin in den Konzentrationen 1 µM und 0,1µM konnten
wiederum stärke p53-Banden als in den Kontrollen beobachtet werden. Über die
Spezifität dieser Ergebnisse kann man nur spekulieren, da über die Wirkung von
DMSO in diesen Microcystin-Lösungen keine Daten vorliegen. Es wurde jedoch
gezeigt, dass DMSO in einer Konzentration von 0,4% zu einem geringen Anstieg der
zellulären p53-Konzentration führte. Vermutlich entfaltet DMSO in dieser
Konzentration sein gentoxisches Potential (s. 3.4), das zur Stimulation der Synthese
von p53 führte.
Dieser DMSO-Befund macht deutlich, dass man mit Hilfe von Western-Blot Analysen
nicht eindeutig klären kann, ob die Microcystin-induzierte Stabilisierung von p53 aus
einer erhöhten Proteinsynthese oder aus einer verzögerten Protein- Degradierung
sich ergibt.
Diskussion
131
Die Zunahme der Konzentration von p53 kann sowohl aus einer verlangsamten
Protein-Degradierung als auch aus einer gesteigerten Proteinsynthese resultieren.
Als Referenzmethode für die Untersuchung der Wirkung von Microcystin auf die
metabolische Stabilisierung von p53 wurden HepG2-Zellen metabolisch mit 35S-
Methionin markiert, das markierte p53-Protein mit einem p53- Ak aus gleichen
Proteinmengen per Immunpräzipitation isoliert und über die SDS-PAGE getrennt.
Die Abb. 3.5 zeigt in der mit 10 µM Microcystin exponierten 35S-markierten Probe im
Vergleich zu den Kontrollen die stärkste Bande. In der DMSO-Kontrolle ist im
Vergleich zur Kontrolle (nur markierten) eine schwächere Bande zu erkennen. Wie
erwähnt (4.1) kann auch hier durch die gewählten Versuchsbedingungen nicht
ausgeschlossen werden, dass die Microcystin-vermittelte metabolische Stabilisier-
ung von p53 aus einer erhöhten Translation von p53 resultiert. Da DMSO hier
anscheinend eine geringfügig inhibierende Wirkung auf die Stabilität von p53 besitzt,
liegt die Vermutung nahe, dass die Microcystin-assoziierte Stabilisierung von p53
hier das Ergebnis einer verzögerten Protein-Degradierung ist. Nach einer DMSO-
vermittelte Erhöhung der Proteinsynthese von p53 wäre im Vergleich zu der nur
markierten Kontrolle eine stärkere 35S-markierte p53-Bande zu erwarten gewesen
(Abb. 3.5). Auch die Beobachtung von Trare et al. (1999), dass Okadasäure in zell-
freien Systemen oder in Zellkulturen konzentrationsabhängig eine inhibierende
Wirkung auf die Proteinsynthese hat, kann ein weiterer Hinweis für die hier
angestellten Vermutungen sein.
Die Degradierung von p53 wird vor allem durch die Assoziation von p53 mit dem
Oncoprotein Mdm2 reguliert. In ungestressten Zellen assoziiert das p53-Protein mit
Mdm2, wodurch Mdm2 seine E3-ubiquitin-Ligase Aktivität entfaltet und die Hemmung
der transkriptionalen Aktivität von p53 durch die proteosomale Degradierung
vermittelt (Salomoni and Pandolfi, 2002; Yin et al., 2002). Als Antwort auf diverse
Stressfaktoren wird die Phosphorylierung des N-Terminus von p53 induziert. Die
Phosphorylierung in dieser p53-Domäne fördert die Stabilität von p53, weil dadurch
die Assoziation zwischen p53-Mdm2 nicht zustande kommt und so eine
Degradierung von p53 verhindert wird. Die Dephosphorylierung der N-terminalen
Region von p53 erfolgt durch die Proteinphosphatase PP2A (Yatsunami et al.,1993),
so dass die Microcystin-assoziierte Hemmung der PP2A zu einer irreversiblen
metabolischen Stabilisierung des p53-Proteins führen kann.
Diskussion
132
Zusammenfassend betrachtet kann man sagen, dass Microcystin in einem
konzentrationsabhängigen Muster deutlich Einfluss auf die metabolische Stabilität
von p53 nimmt.
In einem weiteren Experiment sollte nun untersucht werden, ob Microcystin auch die
Phosphorylierung der Tumorsupressorproteine p53 und pRb moduliert. Die
Aktivierung des p53-Proteins geht mit einer Reihe von posttranslationalen
Modifikationen einher, dabei nimmt die Modulation des Phosphorylierungsmusters
von p53 eine zentrale Stellung ein. Die Korrelation zwischen einem veränderten
Phosphorylierungsstatus, DNA-Bindungsaktivität und Transaktivierung suggeriert,
dass eine transient reversible Hyperphosphorylierung für die Aktivierung von p53
essentiell ist (Appella and Anderson, 2001; Prives and Hall,1999).
Durch die Isolation von 32P-markiertem p53 und 35S-markiertem pRb per
Immunpräzipitation mit den entsprechenden Antikörpern (p53-Ak/pRb-Ak) wurde der
Einfluss von Mircocystin auf die Phosphorylierung der Tumorsuprressorproteine
bestimmt.
Auf eine Aktivierung von p53 durch eine UV-Induktion wurde verzichtet, da in
Vorversuchen festgestellt wurde, dass die radioaktive Markierung der HepG2-Zellen
schon zur Aktivierung von p53 ausreicht. Auch bei transienten Transfektionen von
HepG2-Zellen mit p53-responsiven Reportergensystemen wurde ohne vorherige
Induktion schon eine höhere Konzentration an aktiven p53-Protein nachgewiesen
(Lin et al., 1997).
Anhand der optischen Beurteilung der Intensität der gewonnenen p53-Banden in den
verschiedenen Proben wurde die Wirkung von Microcystin auf die p53-
Phosphorylierung erfasst. Wie in Abb. 3.6 gezeigt, konnte in einem
konzentrationsabhängigen Muster deutlich der Einflusse von Microcystin auf die
Phosphorylierung von p53 nachgewiesen werden.
Bei der eingesetzten maximalen Konzentration von 10 µM wurde ein deutlicher
Einfluss von Microcystin auf die Phosphorylierung von p53 bestimmt. Es konnte in
der Autoradiographie (Abb. 3.6) bei den mit 10 µM Microcystin-exponierten Proben
die stärkste p53-Bande nachgewiesen werden. Microcystin in einer Konzentration
von 0,1 µM und 1 µM zeigte im Vergleich zu den Kontrollen ebenfalls eine stärke
p53-Bande.
Diskussion
133
Die ermittelten Ergebnisse aus der Immunpräzipitation konnten auch durch die
densitometrische Auswertung der Autoradiographie (Abb. 3.6.1) bestätigt werden. In
der mit 10 µM Microcystin-exponierten Probe wurde die höchste Densität ermittelt.
Nach der Inkubation der Zellen mit 0,1 µM und 1 µM Microcystin wurde im Vergleich
zu den Kontrollen ebenfalls eine höhere Densität gemessen.
Mit Hilfe der IEF sollte ebenfalls die Microcystin-vermittelte Hyperphosphorylierung
von p53 elektrophoretisch dargestellt werden.
In der IEF lassen sich Protein-Modifikationen wie Phosphorylierungen,
Glycosylierungen etc. als Mikroheterogenitäten elektrophoretisch detektieren. Es
kann davon ausgegangen werden, dass jeder verbleibende oder hinzugefügte
Phosphatrest zu einer Ansäuerung des p53-Proteins führt, die mit einer Änderung
des Ladungszustandes von p53 einhergeht und somit zu einer Verschiebung des IP
führt. Die Verschiebung des IP kann in der IEF in Kombination mit der Western-Blot
Analyse als Bandenshift dargestellt werden. Theoretisch kann die Microcystin-
induzierte Hyperphosphorylierung von p53, die möglicherweise aus der Arretierung
von Ser 315 in seinem phosphorylierten Zustand resultiert, im Vergleich zur
unbehandelten Probe durch einen minimalen Bandenshift in Richtung Anode
nachgewiesen werden. Der Literatur ist zu entnehmen, dass mittels der IEF und
anschließender SDS-PAGE mindestens 6 in ihrem Phosphorylierungsmuster nach zu
unterscheidende Isoformen des p53 identifiziert werden können (pI 6,3- 7,3)
(Martinez et al., 1997).
In diesem Experiment wird p53 durch eine 20h Inkubation mit Actinomycin D aktiviert,
dies geht schließlich mit einer Durchphosphorylierung der entsprechenden Dömänen
einher. In der Regel geht die Phosphorylierung von p53 mit einer Stimulation der
spezifischen DNA-Bindung und einer verstärkten Transaktivierung einher (Appella
and Anderson, 2001). Gerade unter Betrachtung dieses Aspektes scheint sich eine
Microcystin-Exposition eher förderlich auf die Funktion von p53 als
Transkriptionsfaktor auszuwirken. Die Phosphorylierung des Serin-Restes der AS
315 stellt vermutlich eine Ausnahme dar. In vitro konnten Daten erworben werden,
die einer solchen Hypothese überhaupt die Berechtigung geben (Liang and Clarke,
2001; Sakaguchi et al., 1997; Stommel et al, 1999). (Dieser Aspekt wird in einem
anderen Kontext später vertieft).
Diskussion
134
Die Microcystin-vermittelte Hemmung der Proteinphosphatasen verhindert womöglich
die Dephosphorylierung von Ser 315 und führt so zu einem Anstieg der Nettoladung
von p53, die in der IEF als Bandenshift nachzuweisen ist. Leider kann diese
Annahme weder bestätigt noch negiert werden, da es im Moment keine Möglichkeit
gibt einen beweisführenden Nachweis mit Hilfe z.B. einer Immunreaktion
durchzuführen. Im Augenblick steht kein AK zur Verfügung, der den Serin-Rest 315
in seinem phosphorylierten Zustand erfasst. Aus diesem Grund ist es nicht
auszuschliessen, dass auch andere Ser/Thr-Reste durch die Microcystin-Inkubation
in ihren phosphoryliertem Zustand gehalten werden. Mittels der IEF konnte ebenfalls
nach der Microcystin-Exposition (10 µM) eine Modulation des
Phosphorylierungsmusters von p53 nachgewiesen werden (Abb. 3.7).
Auch die Microcystin-assoziierte Induktion der Hyperphosphorylierung von 35S-
markiertem pRb wurde beobachtet. Anhand der pRb-Fluorographie (Abb. 3.8) und
der densitometrischen Auswertung (Abb. 3.8.1) dieser Fluorographie konnte deutlich
eine Korrelation zwischen einer Microcystin-Exposition und der Zunahme von
hyperphosphoryliertem 35S-markierten Rb-Protein erfasst werden. Nach der
Exposition der Zellen mit 10 µM Microcystin nahm die Bandenintensität der
hyperphosphorylierten Form des Rb-Proteins (ppRb) im Vergleich zu den Kontrollen
signifikant zu bzw. es konnte die höchste Densität gemessen werden. Auf das
Mitführen von anderen Microcystin-Konzentrationenen wurde verzichtet, da die 10
µM Microcystin-Konzentration hier als optimale Dosis für dieses Testsystem ermittelt
wurde (3.1). Wie die Microcystin-stimulierende Hyperphosphorylierung von pRb in
Zusammenhang mit einer Beeinträchtigung der Funktion von pRb stehen könnte,
ergibt sich aus dem folgenden Kontext:
Die Aktivität von pRb wird maßgeblich über Phosphorylierungen reguliert (Taya,
1997). Die Hyperphosphorylierung von pRb durch die Cycline D,E,A in Verbindung
mit den Cyclin-abhängigen Kinasen CdK 4/6/2 führen phasenspezifisch zu einem
kurzweiligen reversiblen Funktionsverlust, der mit der Freisetzung von E2F
einhergeht, der die Expression von essentiellen S-Phasegenen induziert. Die
Dephosphorylierung von pRb durch die PP führt zur Wiederherstellung der
Tumorsuppressorfunktion und leitet durch die Sequestrierung von E2F die
Arretierung der Zellen in der G1-Phase ein (Gana and Reddy, 1995; Taya, 1997).
Diskussion
135
Das Hepatotoxin Micorcystin kann als Tumorpromotor durch die �apparente
Aktivierung� von Proteinkinasen in den durch die HBV-Infektion initiierten
Hepatozyten das Rb-Protein in einem anhaltenden hyperphosphorylierten Zustand
fixieren und so die funktionelle Inaktivierung des Rb-Proteins induzieren. Die
Konsequenz ist eine Deregulation wichtiger zellulärer Kontrollmechanismen, die
synergistisch mit einer Überexpression von HBx die Entwicklung und Progression
eines HBV-assoziierten HCC begünstigt. Studien über HBV-assoziierte Leber-
karzinome haben gezeigt, dass eine abnormale Expression des Rb-Proteins
vorkommt (Luber et al., 1996).
Auch Yatsunami et al. (1993) beobachteten, dass verschiedene Konzentrationen von
Okadasäure Einfluss auf das Gesamtphosphorylierungmuster von pRb und p53 in
Fibroblasten nehmen. Auf der Grundlage einer von Fujiki (1992) postulierten
Arbeitshyphothese, können Tumorsuppressorproteine durch Okadasäure funktionell
inaktiviert werden. Durch die irreversible Hemmung der PP1/ PP2A durch Wirkstoffe
der Okadasäureklasse verbleiben die Proteine in ihrer hyperphosphorylierten Form,
was in Folge möglicherweise mit einer funktionellen Inaktivierung der
Tumorsuppressorproteine einhergeht.
4.3. Protektive Wirkung von Microcystin vor UV-induzierter Apoptose
In diesem Teil der Arbeit sollte nach weiteren Hinweisen für eine mögliche
Microcystin-vermittelte funktionelle Beeinträchtigung von p53 nach einer UV-
Induktion gesucht werden. Die Aktivierung von p53 als Reaktion auf induzierter DNA-
Schädigung kann entweder zur Arretierung von Zellen in der G1- oder G2-Phase des
Zellzyklus oder in die Apoptose führen (Bates and Vousden, 1999; Fogal et al, 2000;
Graeber et al, 1994; Hua et al., 1998; Komarova et al., 1997; Sionov and Haupt,
1999). Diese p53-initiierten Kontrollmechanismen des Zellzyklus sollen verhindern,
dass sich DNA-Schäden in Mutationen vor allem in der S-Phase fixieren und somit
den Übergang einer normalen Zelle zu einer Tumorzelle begünstigen.
Diskussion
136
Ob das Tumorsuppressorprotein p53 nach einer Stress-Induktion einen Zellarrest
oder eine Apoptose initiiert, hängt vor allem vom Ausmaß der DNA-Schädigung, der
Gesamtsituation der Zellpopulation und auch vom Zelltyp selbst ab (Bates and
Vousden, 1999). Die funktionelle Inaktivierung von p53 führt somit zum Verlust eines
wichtigen Kontrollelementes des Zellzyklus.
Mit Hilfe einer UV-Induktion wurde eine p53-abhängige Apoptose in HepG2-Zellen
eingeleitet, die möglicherweise durch eine 2h Präinkubation der Zellen mit 10µM
Microcystin nur gedämpft verläuft oder komplett gehemmt wird.
In der Tat wurde gezeigt, dass Wirkstoffe der Okadasäureklasse Zellen vor Apoptose
schützen (Baxter and Lavin., 1992; Song and Lavin, 1993). Bekanntlich kann
Apoptose in eine Initiations-, eine Effektor- und eine Degradationsphase unterteilt
werden (Kroemer et al., 1995). Gerade in der Initiationsphase, in der die Zelle mit
Stressfaktoren konfrontiert wird, scheint dies vor allem mit dem Verlust von
Proteinkinasen bzw. Aktivierung von Proteinphosphatasen begleitet zu sein (Kroemer
et al., 1995). Da alle Wirkstoffe der Okadasäureklasse potente Inhibitoren der PP1/
PP2A darstellen, dürfte gerade die dadurch bedingte �apparente Aktivierung" der
Proteinkinasen bei diesen Ereignissen eine interessante Rolle spielen. In Hinsicht auf
die protektive Wirkung des cyanobakteriellen Microcystins vor UV-induzierter
Apoptose muss berücksichtigt werden, dass einige Cyanobakterien UV-
Schutzsubstanzen enthalten. Obgleich das charakteristische Wellenlängen-
Absorptionsmaximum von Microcystin im UV-C Bereich bei 238 nm liegt, ist es nicht
als UV-Schutzsubstanz zu bezeichnen (pers. Mitteilung: C. Wiedner, Berlin; Wiedner
et al., 2003). Schaeffner et al. (1999) zeigten, dass zur Entfernung von Microcystin
aus Gewässern eine UV-Bestrahlung im Vergleich zum chemischen Abbau von
Microcystin sehr viel günstiger ist. Die Einwirkung von UV-Licht auf Microcystin mit
Wellenlängen um dessen Absorptionsmaximum führte zu einem schnellen Abbau
(Tsuji et al., 1995). Die Halbwertszeit von Microcystin-LR nach einer UV-Bestrahlung
in einer Dosis von 147 µJ/cm 2 -2550µJ/ cm 2 betrug 10 min bis 1 min (254 nm)
(Schaeffner et al.,1999). Da in diesem Apoptose-Versuch die Microcystin-
präinkubierten Zellen mit einer viel höheren UV-Dosis (100 J/cm2 ) bei einer
Wellenlänge von 254 nm exponiert wurden, darf man davon ausgehen, dass die
Wirkung von Microcystin hier in Korrelation mit der spezifischen Hemmung der
Proteinphosphatasen steht.
Diskussion
137
Über die Ermittlung des Anteils (%) toter Zellen durch den Trypanblau-Test und der
Charakterisierung des apoptischen Charakters dieser toten Zellen mit Hilfe der
FACS-Analyse und elektrophoretischen DNA-Fragmentierung, sollte die protektive
Eigenschaft von Microcystin vor UV-induzierter Apoptose dargestellt werden. Die
FACS-Analyse und die elektrophoretische DNA-Fragmentierung war erforderlich, da
mit dem Trypanblau-Test quantitativ nur der Anteil an toten Zellen (Nekrose)
bestimmt wird. In der Regel kommt es nach einer starken UV-Induktion in p53-Wt
exprimierenden Testsystemen zur Initiation einer p53-abhängigen Apoptose (Appella
and Anderson, 2001; Bates and Vousden, 1999). Aus diesem Grund ist durch die
gewählten Versuchsbedingungenan anzunehmen, dass der im Trypanblau-Test
ermittelte Anteil (%) toter Zellen einen apoptotischen Ursprung hat. Obgleich
nekrotische und apoptotische Prozesse durch signifikant verschiedene zelluläre
Abläufe definiert werden, kann bei apoptotischen Zellen in Zellkulturen das
Phänomen einer sekundären Nekrose auftreten. Diese Zellen werden im Trypanblau-
Test als nektrotisch erfasst, obwohl sie einen apoptotischen Ursprung hatten. Diese
Annahme konnte hier durch die elektrophoretische Darstellung der DNA-Fragmente
mit den entspechenden HepG2-Aliquots bestätigt werden (Daten nicht gezeigt).
Zur Klärung der Frage, ob die protektive Wirkung von Microcystin vor UV-Schäden
möglicherweise mit der Microcystin-induzierten Beeinträchtigung des nukleären
Importes von p53 korreliert (3.5), erfolgte die fluoreszenzmikroskopische Analyse der
subzellulären Lokalisation des p53-GFP-Fusionsproteins in UV-HepG2-Zellen. Nach
der UV-Induktion war zu erwarten, dass es zur Aktivierung des p53-GFP-
Fusionsproteins kommt, was mit einer nukleären Translokation und Akkumulation
des Fusionsproteins einhergeht. Insgesamt konnte bei allen durchgeführten
Experimenten, die der Analyse einer Microcystin-vermittelten Apoptose-Prävention
dienten, eine Microcystin-assoziierte Reduktion von Apoptoseereignissen und eine
verminderte nukleäre Translokation des p53-GFP-Proteins in den Microcystin-
präinkubierten und UV-induzierten Ansätzen (Abb. 3.11c ) ermittelt werden.
Sowohl die Auswertung des Trypanblau-Testes (Abb. 3.9) als auch die FACS-
Analyse (Abb. 3.10) zeigten, dass die Präinkubation mit Microcystin (10 µM) den
Zellen Schutz vor UV-induzierten Zelltod gewährt. Hingegen konnte die
Präinkubation der Zellen mit einer 2,5 µM Microcystin-Lösung diesen Schutz nicht
gewähren (Daten nicht gezeigt).
Diskussion
138
Auch hier scheint die Wirkung von Microcystin auf Zellen konzentrationsabhängig zu
wirken. Eine alleinige Mircocystin-Exposition der Zellen im Vergleich zur
unbehandelten Probe hatte keine negative Wirkung auf die Zahl der toten bzw.
apoptotischen Zellen.
Die Präinkubation der Zellen mit DMSO vor der UV-Induktion zeigte im Trypanblau-
Test und auch in der FACS-Analyse im Vergleich zu den UV-induzierten Proben eine
minimale protektive Wirkung. Über mögliche Gründe für diesen Befund kann nur
spekuliert werden. Möglicherweise spielt die stabilisierende Eigenschaft von DMSO
auf die C-G-Basenpaarung während der Amplifikation von Nukleinsäure mit Hilfe
einer PCR hier eine Rolle. Durch eine alleinige Inkubation der Zellen mit DMSO
(0,4%) wurde die Zahl der toten bzw. apoptischen Zellen vermutlich durch die
gentoxische Wirkung von DMSO gesteigert.
Bei der fluoreszenzmikroskopische Auswertung der subzellulären Lokalisation des
p53- GFP- Fusionsproteins konnte gezeigt werden, dass eine Präinkubation der
Zellen mit Microcystin vor der UV-Induktion zu einer verminderten nukleären
Translokation des p53-Fusionsproteins führt. Das p53-GFP-Fusionsprotein konnte
geringfügig in Nukleus und vornehmlich im Cytoplasma nachgewiesen werden. Die
Fluoreszenzaufnahmen zeigen punktförmige nukleäre fluoreszenzierende Partikel
sowie ein fluoreszierendes Cytoplasma (Abb. 3.11c). Als Hinweis für eine Micro-
cystin-assoziierte funktionelle Beeinträchtigung des p53-GFP-Fusionsproteins kann
das nur punktförmige Vorhandensein des p53-Fusionsproteins im Nukleus und die
starke cytoplasmatische Akkumulation gewertet werden. Bei den UV-induzierten
Ansätzen wurde eine überwiegend komplette nukleäre Akkumulation des p53-GFP-
Fusionsproteins beobachtet. Die Zellen waren durch einen grün fluoreszierenden
Zellkern und ein wenig fluoreszierendes Cytoplasma gekennzeichnet (Abb. 3 11a).
Eine Präinkubation der Zellen mit 0,4% DMSO vor der UV-Induktion konnte die
nukleäre Translokation des p53-GFP-Fusionsproteins nur mininal reduzieren (Abb.
3.11b). Ähnlich wie bei den UV-induzierten Proben war in der Regel in den
Zellkernen deutlich Fluoreszenz zu erkennen.
Diese Ergebnisse korrelieren gut mit den ermittelten FACS- und Trypanblau-Daten,
die ebenfalls auf eine Microcystin-vermittelte Beeinträchtigung der Funktion von p53
hinweisen.
Diskussion
139
Die insgesamt erworbenen Erkenntnisse bei dieser Analyse hinsichtlich einer
Microcystin-vermittelten Reduktion des Anteils (%) apoptotischer Zellen und der
Microcystin-verursachten verminderten nukleären Translokation des p53-GFP-
Fusionsproteins nach einer UV-Induktion lassen die Vermutung zu, dass der
protektive Charakter des Hepatotoxins Microcystin mit einer funktionellen
Inaktivierung des Tumorsuppressorproteins p53 korreliert.
Eine Interpretationsmöglichkeit dieser Resultate bietet die von Stommel, et al. (1999)
postulierte mechanische Hypothese, in der davon ausgegangen wird, dass die
subzelluläre Lokalisation von p53 über die am C-Terminus befindliche hoch-
konservierte nukleäre Exportsequenz (NES), den nukleären Translokationssignalen
(NLS) und der Tetramerisierungsdomäne reguliert wird.
Neuere Studien deuten daraufhin, dass die Zellzyklus-abhängige Lokalisation von
p53 maßgeblich über die Aktivität der Cyclin-abhängigen Kinase CdK2/ Cdk2
reguliert wird (Denko et al., 2000). Der Einsatz von Inhibitoren der Kinase Cyclin
E:CdK2 und Cyclin A: CdK2 führte schließlich zu einer nukleären Akkumulation von
p53 (David-Pfeuty et al., 1999).
Um die Expression von Genen zu induzieren, die einen Zellzyklus-Arrest oder
Apoptose initiieren, muss das p53 als TF in den Nukleus translozieren (Fujiki, 1992;
Shenolikar et al., 1994; Takenaka et al., 1995). In normalen ungestressten Zellen
liegt das p53-Proteinin der G1-Phase nukleär und während der S-und G2-Phase ist es
grösstenteils cytoplasmatisch lokalisiert (David-Pfeuty et al., 1996; Shaulsky et al.,
1990). Nach dem Überschreiten des G1-Restriktionspunktes kommt es am C-
Terminus von p53 zu Phosphorylierungen durch die CdK2-Kinase. Die Phosphory-
lierungen haben zur Folge, dass das p53-Molekül in das Cytoplasma transloziert, wo
es seine Funktion als Tumorsuppressor notwendigerweise reversibel verliert
(Bischoff et al., 1990; Price et al.,1995). Für die Dephosphorylierung von p53 wird in
der Regel die PP2A verantwortlich gemacht (Fjuiki, 1992; Shenolikar, 1994). Bei in
vitro Versuchen konnte ermittelt werden, dass eine Aktivierung von p53 durch die
PP1 und PP2A revertiert wird (Takenaka et al., 1995). Eine maßgebliche Beteiligung
an der Regulation der subzellulären Lokalisation von p53 wird dem Serin-Rest der
AS 315 zugeordnet.
Diskussion
140
Die Phosphorylierung von Ser 315 dürfte unter normalen zellulären Umständen die
Aktivität von p53 als TF in einem Zellzyklus-abhängigen Muster unterbinden.
Sakaguchi et al. (1997) postulieren, dass womöglich die Phosphorylierung von Ser
392 zu einer Aktivierung von p53 führt und die Phosphorylierung von Ser 315 mit
einer Inaktivierung oder Verhinderung der Aktivierung von p53 korreliert.
Ser-315 dient der Cyclin-abhängigen Kinase CdK2/ Cdc2 als Substrat und kann je
nach Phosphorylierungszustand (De-/Phosphorylierung) die subzelluläre Lokalisation
des Transkriptionsfaktors p53 durch die Veränderung der Tetramer-Stabilität
(Stommel et al., 1999) oder über die Modulation des nukleären Importes von p53
(Liang and Clarke, 2001) entscheidend beeinflussen. Der nukleocytoplasmatische
Transport des p53-Tetramers wird durch die Verbindung der am C-Terminus
befindlichen nukleären Lokalisationssignale (NLS) und des nukleären Exportsignals
(NES) an die intrazellullären Rezeptormoleküle Importin α und CRM1 vermittelt.
Möglicherweise können Phosphorylierungen direkt oder indirekt die Zugänglichkeit
der NLS und NES zu ihren Rezeptormolekülen beeinflussen. Ser 315 liegt inmitten
der Tetramerisierungsdomäne, mehreren nukleären Lokalisationssequenzen (NLS)
und dem nukleären Exportsignal (NES) und stellt so ein interessantes Target für
regulierende Phosphorylierung durch die Cdk2/ cyclin B / Cdk2/ Cyclin A dar
(Bischoff et al., 1990; Price et al.,1995; Stommel et al., 1999). Das phosphorylierte
Ser 315 führt vermutlich zu einer Blockade der nukleocytoplasmatischen Beförderung
von p53 durch die Unzugänglichkeit des Rezeptormoleküls Importin α an die NLS
(Liang and Clarke, 2001) oder durch die Demaskierung der NES, die mit einer
Destabilisierung des p53-Tetramers einhergeht (Stommel et al., 1999). Durch die
Blockade des Kerntransportes kommt es zu einer cytoplasmatischen Sequestrierung
von p53, die mit einem Verlust des Proteins als sequenz-spezifischer Transaktivator
einhergeht. Durch die Proteinphosphatase 2A (PP2A)-vermittelte Dephosphory-
lierung von Ser 315 wird die Funktion von p53 als Tumorsuppressor wieder
hergestellt (Sakaguchi et al., 1997;Yatasunami, etz al., 1993).
Auch die notwendige Bildung des p53-Tetramers (McLure and Lee, 1998) für die
nukleäre Translokation von p53 aus Monomere und - Dimere kann durch
Phosphorylierungereignisse beeinflusst werden. Die hyperphosphorylierten p53-
Monomere sind vermutlich unfähig miteinander zu assoziieren, so dass die Tetramer-
Bildung von p53 verhindert wird (Yatsunami et al., 1993).
Diskussion
141
Über die Konversion des p53-Tetramers in Monomeren- oder Dimeren wird die
Demaskierung der NES initiiert und somit das nukleäre-cytoplasmatische Shuttling
reguliert. In vitro konnte in der Tat gezeigt werden, dass die Phosphorylierung von
Ser 315 zu einer Reduktion der Tetramer-Stabilität führt (Sakaguchi et al., 1997).
Microcystin kann aufgrund seiner Eigenschaft als Proteinphosphatase-Inhibitor
maßgeblich in die Regulation der subzellulären Lokalisation von p53 eingreifen.
Durch die Microcystin-vermittelte Hemmung der Proteinphophatasen PP1/ PP2A
erfolgt vermutlich unter anderem die Phosphorylierung des Serin-Restes 315, was
möglicherweise zu einer Destabilisierung des p53-Tetramers führen kann, die mit
einer Demaskierung der NES (Stommel et al., 1999) korreliert oder mit einer
Blockade des nukleären Importes von p53 einhergeht (Liang and Clarke, 2001). Das
p53-Protein liegt dann in seiner sogenannten hyperphosphorylierten Form vor (Fuchs
et al.,1995; Fujiki, 1992).
Die Exposition von Zellen mit Microcystin kann somit neben den stabilisierenden und
aktivierenden Phosphorylierungen am p53-Protein auch zu Phosphorylierungen
führen, die womöglich das p53-Protein in seinem hyperphosphorylierten Zustand als
Tumorsuppressor funktionell ausser Kraft setzen (Fujiki, 1992).
Grundsätzlich kann jedoch nicht ausgeschlossen werden, dass die Microcystin -
induzierte metabolische Stabilität von p53 zu einer Inaktivierung der p53-Funktion
führt. In verschiedenen Studien konnte wie erwähnt gezeigt werden, dass eine
metabolische Stabilisierung von p53 einen aktiven zellulären Prozess darstellt, der
zur Akkumulation von p53 in den Zellen führt und letztendlich mit einem
transformierten Phänotyp einhergeht (Levine, 1990; Levine et al., 1991)
In vorherigen Experimenten wurde gezeigt, dass das cyanobakterielle Microcystin
durch die spezifische irreversible Hemmung der Proteinphosphatasen PP1/ PP2A
entscheidend auf die Stabilität (3.2) und Phosphorylierung (3.3) von p53 Einfluss
nehmen kann. Außerdem spricht theoretisch die generelle Aktivierung von p53, die
unter anderem über die Änderungen des Phosphorylierungsmusters reguliert wird,
für eine mögliche Microcystin-induzierte metabolische Stabilisierung von p53
(Grossmann, 2001).
Auf welchem Weg Microcystin seine protektive Wirkung vor UV-Schäden in den
Zellen vermittelt, ob nun über die �Mechanische Hypothese", die metabolische p53-
Stabilisierung oder die Blockierung des nukleären Transportes von p53, kann in
Diskussion
142
dieser Studie nicht komplett geklärt werden. Schließlich kann auch das Mitwirken von
anderen Signalkaskaden bei diesen Microcystin-vermittelten Prozessen nicht
ausgeschlossen werden.
Diskussion
143
Der MAPK-Weg stellt möglicherweise einen weiteren Angriffspunkt für den
Tumorpromotor Microcystin dar. Dieser Signalkaskade wird vor allem bei der
Regulation von Proliferation- und Differenzierung eine bedeutende Rolle zugeordnet
(später diskutiert).
In diesem Kontext stellt auch das Rb-Protein einen interessanten zellulären
Angriffspunkt dar. Neben dem p53-Protein übernimmt das pRb bei der Apoptose-
Initiation eine essentielle Rolle. Herwig und Strauss (1997) werten die
Dephosphorylierung von pRb als frühe Antwort auf eine initiierte p53-unabhängige
Apoptose, wobei die hyperphosphorylierte Form von Rb die Zellen vor Apoptose
rettet. Auch Wang (1997) spricht dem pRb in seiner hypophosphorylierten Form bei
einer p53-unabhängigen Apoptose eine bedeutende Aufgabe als Apoptose-Promotor
zu.
In der hier vorliegenden Studie konnte dargestellt werden, dass Microcystin in der
Lage ist die Hyperphosphorylierung von pRb signifikant zu stimulieren (3.3.3).
Hinsichtlich eines Microcystin-assoziierten Schutzes vor Stress-induzierter Apoptose
könnte nach der Microcystin-Applikation sowohl die Funktion von p53 als auch die
Aktivität von pRb als Apoptose-Induktor bzw.-Promotor nachteilig beeinflusst werden.
Die funktionelle Inaktivierung von p53 durch Microcystin führt nach einer Stress-
Induktion dazu, dass die initiierte Transaktivierung von p21 und die damit
verbundene Hemmung der Cyclin-abhängigen Rb-Kinasen nur partiell induziert wird.
In Folge kommt es nur zu einer ineffizienten Induktion des Zellzyklus-Arrests oder
Apoptose. Außerdem kann Microcystin zusätzlich direkt durch die Hemmung der PP1
Einfluss auf das Phosphorylierungsmuster von pRb nehmen (Gana and Reddy,
1995), indem das Retinoblastomaprotein nach der Microcystin-Exposition in seiner
inaktiven hyperphosphorylierten Form fixieren wird, so dass p53-unabhängige
Apoptose-Prozesse in der Zelle nicht initiiert werden können.
Joseph et al. (1995) beobachtete, dass eine Exposition der Zellen mit Okadasäure
zur Verminderung von Apoptose führt, die durch Apoptose-Induktoren initiiert
wurden. Die Konsequenz ist womöglich, dass das Nichtzustandekommen der
essentiellen Dephosphorylierung von pRb die Initiation der Apoptose stört.
Diskussion
144
Die in diesem Experiment Detektionlich protektive Wirkung von Microcystin vor UV-
induzierter Apoptose, die mit einer Reduktion der Apoptose-Rate und einer
verminderten nukleären Translokation des p53-GFP-Fusionsproteins einhergeht,
stellt möglicherweise ein interessantes Tumorpromotion-Modell dar.
Microcystin als Vertreter der Okadasäureklasse kann als Inhibitor der
Proteinphosphatasen 1 und 2A theoretisch apoptotische Prozesse verzögern oder
sogar verhindern und so einen generellen Beitrag bei der Progression eines HBV-
assoziierten HCC leisten. Theoretisch kann Microcystin kombinatorisch mit der HBx-
vermittelten Inaktivierung von p53 apoptotische Prozesse in infizierten Hepatozyten
inhibieren, um so den Hepatozyten mit integrierter HBV-Sequenz einen klonal
selektiven Vorteil zu verschaffen (Elmore et al., 1997).
Welcher der hier erwähnten molekularen Mechanismen exakt hinter dieser
Microcystin-assoziierten Prävention vor UV-induzierter Apoptose steckt bleibt unklar.
Erschwert wird die Suche nach einem konkreten Erklärungsmodell auch durch die
partiell kontrovers ermittelten Resultate, die die Vermutung zulassen, dass gerade
die Inkubation mit Okadasäure apoptotische Signalkaskaden zelltypabhängig
einleitet (Gjertsen and Doskeland, 1995; MacKintosh and MacKintosh, 1994; Traore
et al., 1999; Fladmark et al., 2002).
Da p53 und pRb neben der Initiation von Apoptose maßgeblich an der Regulation
der Zellproliferation und Zelldifferenzierung involviert sind, folgt nun die Darstellung
der Wirkung von Microcystin auf die Kontrollmechanismen des Zellzyklus.
4.4. Darstellung der Effekte von Microcystin auf die Zellzyklus-Regulation
4.4.1. Wirkung von Microcystin auf die Regulation der G1/S-Phase des Zellzyklus
Um mehr Erkenntnisse über die Einflüsse von Microcystin auf die Zellzyklus-
Regulation in Erfahrung zu bringen, wurde zunächst eine FACS-Messung
durchgeführt.
Diskussion
145
Mit Hilfe dieser durchflusszytometrischen Zellzyklus-Analyse sollte geklärt werden,
inwieweit die Microcystin-vermittelte Vitalitätssteigerung der HepG2-Zellen (Abb. 3.1)
und die zelluläre Akkumulation von Phosphoproteinen (3.3) den G1-
Restriktionspunkt des Zellzyklus beeinflussen. Hintergrund dieser Fragestellung war
der Aspekt, dass die PP bei der Regulierung des G1/S-Überganges der Zellen eine
bedeutende Rolle spielen (Gana and Reddy, 1995). Zum Beispiel wird der Übergang
der Zellen in die S-Phase durch die Phosphorylierung von pRb ermöglicht.
Die Proteinphatase1A kann wiederum physiologisch Phasen-abhängig oder spontan,
die Funktion von pRb als Transkriptionsrepressor wieder herstellen und so zu einem
G1-Arrest der Zellen führen. Durch die Exposition der Zellen mit Microcystin können
solche Regelmechanismen ausser Kraft gesetzt werden. Die Tumorsuppressor-
proteine verharren schließlich in ihrer hyperphosphorylierten Form, die mit einer
Dysfunktion dieser Proteine (p53/ pRb) einhergeht. Natürlich kann die Hemmung der
Proteinphosphatasen auch zu einer Deregulation von wichtigen Zellzyklus-
abhängigen Signalkaskaden (MAP-Kinase) führen, die ebenfalls den Übergang der
Zellen in die S-Phase begünstigen. Bei dem Übergang der Zellen von der G1- in die
S-Phase spielt die Cyclin D, E, A sowie die von ihnen kontrollierten Cyclin-
abhängigen Kinasen 4, 6 ,2 eine wichtige Rolle. Das Cyclin D, E, A in Assoziation mit
den CdK4, 6, 2 werden auch als Retinoblastoma-Kinasen bezeichnet, die die
Hyperphosphorylierung des Rb-Proteins katalysieren. Durch die damit einher-
gehende Freisetzung von E2F wird der G1-Restriktionspunkt überwunden und
schließlich die G1/S-Übergang der Zellen einleitet (Hullemann and and Boonstra,
2001). Die Expression des Cyclin D ist dabei mehr von äusseren Faktoren abhängig
als vom Zellzyklusstadium. Eine mitogene Stimulierung des MAPK-Pathways, bei der
die Übertragung von Phosphatresten auf verschiedene Proteine über Serin/
Threonin-spezifische Proteinkinasen katalysiert wird, kann die Cyclin D-Expression
initiieren. Die Termination dieser Signaltransduktion wird vorwiegend durch die
Aktivität der Serin/ Threonin-spezifischen Proteinphosphatasen 1 und 2A vermittelt.
Interessanterweise wird zunächst die PP-vermittelte Termination dieser
Signalkaskade durch die MAP-Kinase selbst verzögert. Während der Aktivierung
dieser Kaskade führen zunächst die MAP-Kinasen- vermittelten Phosphorylierungen
an der katalytischen- und regulatorischen Untereinheit der PP zu einer kurzzeitigen
reversiblen Inaktivierung. In dieser Phase wird vor allem die Expression von
essentiellen frühen Genen für die Proliferation gefördert (Shenolikar, 1994).
Diskussion
146
Durch die Microcystin-vermittelte irreversible Hemmung der Proteinphosphatasen
1/2A könnte dieser Weg nicht revertiert werden. Die prolongierte Aktivität dieser
Signalkaskade kann letztendlich mit einer Deregulation des G1-Restriktionspunktes
einhergehen und ermöglicht den Zellen somit einen unkontrollierten Übergang in die
S-Phase des Zellzyklus.
Der Microcysin-assoziierte PP-Hemmungsmechanismus gestaltet sich vermutlich
ähnlich. Microcystin ligiert kovalent spezifisch irreversibel in die katalystische
Untereinheit der PP und führt ähnlich wie eine Phosphorylierung durch den MAP-
Kinase-Pathway zu einer Inaktivierung der Proteinphosphatasen (PP) (Shenolikar,
1994).
Bezogen auf den MAP-Kinase-Pathway kann die irreversiblen PP-Inaktivierung
mittels Microcystin additiv bzw. synergistisch auf die kurzzeitige reversible
Inaktivierung der PP durch die MAP-Kinase wirken.
Das Zusammentreffen dieser beiden Ereignisse würde zu einer kontinuierlichen
Synthese von genregulierenden Proteinen führen, die zur Deregulation von zellulären
Regelmechnismen beitragen und schließlich langfristig Potential für die Entwicklung
von Tumoren bieten.
Mittels der FACS-Analyse sollte nun überprüft werden, ob die Zahl der Zellen in der
S-Phase einer HepG2-Population durch eine 2h Microcystin-Exposition gesteigert
werden kann. Unsynchronisierte HepG2-Zellen wurden 2h mit 10 µM Microcystin-
exponiert und anschließend für die FACS-Messung präpariert. Wie der Tab. 3.1 zu
entnehmen ist, konnte in der Tat in den Microcystin exponierten Proben im Vergleich
zu den Kontrollen eine 100%ige Steigerung der Zahl der Zellen in der S-Phase
ermittelt werden. In einem weiteren Versuch sollte die Wirkung von Microcystin
konkret auf die Funktionalität von essentiellen Regulatoren des Zellzyklus beobachtet
werden.
Diskussion
147
4.4.2. Wirkung von Microcystin und HBx auf die Aktivität von Regulatoren des Zellzyklus
Ein Motiv für die Durchführung dieses Experimentes waren epidemiologisch
erhobene Daten, die eine Korrelation zwischen dem Genuss von Microcystin-
kontaminiertem Trinkwasser und dem HBx-Protein, das bei einer chronischen HBV-
Infektion Detektionlich überexprimiert wird, bei der Entwicklung eines HCC vermuten
lassen (Caselmann et al., 1996; Cromlish et al., 1996; Ganem and Varmus, 1996;
Matsushima et al., 1990; Yoshizawa et al., 1990; Yu ,1995)
Mit Hilfe dieser funktionellen Zellzyklus-Analysen sollte schließlich der Einfluss von
Microcystin und HBx auf die Aktivität von essentiellen Regulatoren des Zellzyklus
(p53,pRb,E2F,c-Myc) bestimmt werden. Durch die Transfektion der HepG2-Zellen
mit verschiedenen Luciferase-Plasmiden, die vor ihrem TATA-Box-Promotor ein
Enhancer-Element mit jeweils einem Response-Motiv für die Proteine p53, pRb, E2F
oder c-Myc enthalten, wurden die kombinatorisch deregulierenden Einflüsse von
Microcystin und HBx auf die Aktivität dieser regulatorischen Proteine des Zellzyklus
untersucht. Die kombinatorische Wirkung (additiv/synergistisch) von HBx und
Microcystin auf die Funktionalität der verschiedenen Regulatoren wurde quantitativ
über die Modulation der durch die Zellzyklus-Regulatoren- vermittelte Expression des
Reportergens Luciferase nach der HBx-Expression und Microcystin-Exposition nach-
gewiesen.
Wie in Abb. 3.16 dargestellt, führt die Anwesenheit von HBx und /oder eine
Microcystin-Inkubation zu einer verminderten p53-vermitttelten Luciferase-Aktivität.
Die kombinatorische Wirkung von Microcystin und von HBx auf die Funktionalität von
p53 hinsichtlich einer Beeinträchtigung der Tumorsuppressorfunktion lassen sich als
synergistisch beschreiben (Abb 3.16).
Die Reduktion der Luciferase-Aktivität nach der Microcystin-Exposition (Abb. 3.12)
deutet auf eine Microcystin-vermittelte funktionelle Inaktivierung von p53 hin.
Mögliche Aspekte, die in das Microcystin-assoziierte Aussetzen der
Tumorsuppressorfunktion von p53 involviert sind, stellen die in den
vorangegangenden Experimenten erworbenen Befunde dar.
Diskussion
148
In diesen Analysen wurde gezeigt, dass eine funktionelle Inaktivierung von p53
möglicherweise mit der Wirkung von Microcystin auf die Phosphorylierung von p53
korreliert. Nach der Exposition von radioaktiv markiertem p53 mit Microcystin wurde
neben einer unphysiologischen metabolischen p53-Stabilität (Abb.3.2) auch die
Akkumulation von p53 in seinem hyperphosphorylierten Zustand (Abb.3.3)
nachgewiesen. Die Microcystin-vermittelte metabolische Stabilität als auch die
Hyperphosphorylierung von p53 verursachten womöglich die verminderte nukleäre
Translokation des p53-GFP-Fusionsproteins in den Microcystin-präinkubierten- und
UV-exponierten HepG2-Zellen (3.5), die hier mutmaßlich auch zu dieser ermittelten
Reduktion der p53-induzierten Luciferase-Aktivität führte.
Bei der DMSO-Kontrolle hingegen konnte eine deutliche Erhöhung der p53-
assoziierten Luciferase-Aktivität nachgewiesen werden. Diese Zunahme der
Expression des Reportergens Luciferase könnte die Folge einer zusätzlichen p53-
vermitttelten Stressinduktion durch DMSO sein. Vermutlich verursacht DMSO
aufgrund seines gentoxischen Potentials in den UV-gestressten Zellen zusätzlichen
zellulären Stress, der zu einem rapiden Anstieg der p53-Konzentration in der Zelle
führte (s. 3.2). Der Anstieg der zellulären p53-Konzentration ging letztendlich mit
einer verstärkten p53-vermitttelten Luciferasegen-Expression einher, da die Bindung
von p53 an das p53-Response-Element häufiger erfolgte und so die Transkription
des Luciferasegens verstärkte. Die gentoxische Wirkung von DMSO wurde auch
durch die Arretierung der Zellen in der G1-Phase nach einer DMSO-Inkubation
deutlich (Abb. 3.10).
Die Anwesenheit von HBx in den HepG2-Zellen führte ähnlich wie nach einer
Microcystin-Inkubation zur Abnahme der p53-induzierten Expression des
Luciferasegens. Vermutlich wurde die Kerntranslokation des p53-Tetramers durch
die Protein-Protein-Interaktion mit dem HBx-Protein im Cytoplasma verhindert (Butel
et al., 1996; Feitelson et al., 2002) und somit das Binden von p53 an das p53-DNA-
Response Element vermindert, was zu einer Reduktion der p53-vermitttelten
Expression des Reportergens führte. Durch die zusätzliche DMSO-Inkubation wurde
die Konzentration von p53 in den UV-induzierten HepG2-Zellen nochmals gesteigert,
so dass die Konzentration von HBx (Abb. 3.16) nicht ausreichte, um die Bindung von
p53 an das p53-DNA-Response-Motiv zu verhindern. Dadurch konnte das p53-
Protein ungehindert an das Motiv binden und so verstärkt die Transkription des
Luciferasegens induzieren.
Diskussion
149
Ein extra für diese Arbeit durchgeführtes Transfektionsexperiment, in dem die
Konzentration des eingesetzten p53- bzw. HBx-Expressionsvektors variierte, machte
diese Abhängigkeit deutlich. Je nach Konzentrationsverhältnis der beiden
Expressionsvektoren wurden HBx-vermittelte und/ oder Microcystin-assoziierte
Effekte auf die Aktivität von p53 bestimmt (Daten nicht dargestellt). Auch eine neuere
Studie zeigt, dass in HBx-exprimierenden Chang-Zellen (Chang x) nach Applikation
von Adriamycin die cytoplasmatische Sequestrierung des p53-Proteins aufgehoben
wurde und die transkriptionelle Aktivität von p53 wieder hergestellt wurde (Yun et al.,
2000).
Da in diesen Ansätzen jedoch im Vergleich zu einer alleinigen DMSO-Inkubation
eine sehr hohe Lumineszenz (80 LCPS/µg Protein) gemessen wurde, kann hier nicht
ausgeschlossen werden, dass das HBx hier auch seine Wirkung als Apoptose-
Stimulator entfaltet. Es konnte gezeigt werden, dass das HBx-Protein bei
ungünstigen zellulären Bedingungen selbst stimulierend auf die Initiation einer p53-
abhängigen Apoptose wirkt (Chirillo et al., 1997; Su et al., 2001). Möglicherweise
stellt sich durch den DMSO-vermittelten Anstieg der p53-Konzentration eine solche
Situation dar, was zu einem zusätzlichen HBx-vermittelten Anstieg der zellulären
Konzentration von p53 führte.
Bei der gleichzeitigen Anwesenheit von HBx und Microcystin in den HepG-2 Zellen
bewirkt womöglich das HBx-Protein über die Protein-Protein-Interaktion die
cytoplasmatische Sequestrierung des p53-Protein (Stommel et al., 1999; Zerrahn et
al., 1992) und Microcystin führte vermutlich über die metabolische Stabilisierung oder
Hyperphosphorylierung von p53 zu einer Blockade des nukleären Transportes. Das
Zusammenspiel des pleiotropen Transaktivators HBx und des Tumorpromotors
Microcystin könnten somit zu einer funktionellen Inaktivierung von p53 geführt haben.
Mehrere Studien postulieren, dass das HBVx-Protein in Korrelation mit p53
entscheidend bei der Entwicklung eines Hepatozellulären Karzinoms mitwirkt
(Feitelson et al., 2002). Ein essentieller Schritt auf diesem Weg ist die x-Protein-
assoziierte physikalische Bindung und die damit einhergehende funktionelle
Inaktivierung von p53. Die zentrale Funktion von p53, die genomische Stabilität
aufrecht zu erhalten, eine Progression im Zellzyklus nach gentoxischer Applikation zu
verhindern oder Apoptose zu induzieren, geht durch Assoziation mit dem x-Protein
verloren.
Diskussion
150
Aus diesem Grund ist die p53-x-Protein Assoziation mit Merkmalen wie
Genominstabilität, Verlust der Zellzyklus-Kontrolle und einer geringeren Apoptose-
Rate eng verknüpft. Über die Wirkung von Microcystin auf die Funktionalität von p53
lagen bislang keine experimentellen Daten vor. Bislang wurden nur Experimente
durchgeführt, die die Hyperphosphorylierung von p53 durch Okadasäure zeigten
(Yatsunami et al., 1993).
In dieser Arbeit wird von der Annahme ausgegangen, dass die ermittelten Daten aus
einer funktionellen Inaktivierung des p53-Moleküls resultieren. Auch Shehar et al.
(1997) diskutieren die funktionelle Inaktivierung von p53 als möglichen
Tumorpromotion-Mechanismus. Es konnte gezeigt werden, dass das p53-Protein in
Korrelation mit dem x-Protein, ohne zusätzliche strukturelle Mutationen die maligne
Transformation in Hepatozyten induziert. Weiter wird davon ausgegangen, dass der
funktionelle Aktivitätsverlust von p53 die Basis für die im späten Stadium der
Tumorgenese Detektionbaren strukturellen Mutationen bietet (Ueda et al., 1995).
Auch neuere Beobachtungen über die Existenz von inaktivierenden Mutationen der
Proteinphosphatase 2A (PP 2A) als mögliche Ursache der Tumorgenese, deuten
daraufhin, dass den zellulären Aktivitäten der Proteinphosphatasen PP1 und PP2A
ein genereller Beitrag bei der Tumorprogression zukommt (Calin et al., 2000). Die
PP2A ist involviert in die Regulation von verschiedenen zellulären Aktivitäten,
einschließlich der Kontrollmechanismen der Zellproliferation. Die funktionelle
Inaktivierung der PP durch die physikalische Assoziation von viralen Tumorproteinen
(SV40/Tag/Polyoma) an die Untereinheit A der PP stellen einen Mechanismus dar,
der zu einer Deregulation der Zellproliferation führen kann. Ebenfalls führt die Virus-
vermittelte Phosphorylierung des Tyr-307-Restes der katalystischen Untereinheit C
der PP zu einem Verlust der Enzymaktivität (Scheidtmann et al., 1991).
In dem folgenden Abschnitt werden die ermittelten synergistischen oder additiven
Effekte von Microcystin und HBx auf die Funktionalität der Zellzyklus-Regulatoren
pRb, E2F und c-Myc dargestellt (Abb. 3.17- 3.19).
Die kombinatorischen Einflüsse der beiden Tumorpromotoren auf die Aktivität von
pRb können ebenfalls als synergistisch bezeichnet werden (Abb. 3.17). Die
synergistisch inhibierende Wirkung von Microcystin und HBx auf die Aktivität von pRb
und die daraus mutmaßlich resultierende funktionelle Inaktivierung von pRb könnten
durch die Deregulation von folgenden Regelmechanismen bedingt sein:
Diskussion
151
Microcystin hat aufgrund seiner biochemischen Eigenschaften die Möglichkeit,
einerseits über die Aktivierung des MAPK-Weges, andererseits durch die Hemmung
der Proteinphosphatasen die direkte Phosphorylierung von pRb zu initiieren und so
die Funktion des Transkriptionsrepressors zu inhibieren. Schließlich besteht auch die
Möglichkeit, dass Microcystin über den MAP-Kinase-Weg dysregulierend auf die
Aktivität von pRb wirkt.
Der Tumorpromotor Microcystin hat somit die Fähigkeit die Funktionalität von pRb
über einen biochemischen Pathway negativ zu beeinflussen. DMSO kann
möglicherweise als gentoxische Lösung über die Aktivierung von p53 die Hemmung
der Rb-Kinasen und somit die Dephosphorylierung des Rb-Proteins initiierten. DMSO
fördert somit die Funktion von pRb als Transkriptionsreppressor.
Die Wirkung von Microcystin auf die pRb-vermittelte Expression des Luciferasegens
korreliert mit dem Ergebnis aus 3.3.3. In dieser Analyse wurde gezeigt, dass das
Hepatotoxin Microcystin signifikant zur Akkumulation von hyperphosphoryliertem pRb
führte. In seiner hyperphosphorylierten Form verliert das Rb-Protein seine Funktion
als Transkriptionsrepressor und initiiert durch die Freisetzung von E2F die Synthese
von S-Phasegenen.
Das HBx-Protein besitzt die Fähigkeit über den MAPK-Weg die Phosphorylierung
von pRb über die Induktion der Rb-Kinasen zu aktivieren. In seiner hyper-
phosphorylierten Form kann das pRb es nicht mehr an das entsprechende DNA-
Response- Element binden, was zu einer HBx-induzierten höheren Luciferase-
Aktivität führte.
Durch die zusätzliche DMSO-Inkubation wurde die HBx-vermittelte Rb-
Phosphorylierung geschwächt. Als gentoxische Lösung initiierte DMSO die p53-
abhängige Dephosphorylierung von pRb. Möglicherweise spielt hier auch die
Eigenschaft von DMSO, in Zellkulturen Differenzierungsprozesse zu initiieren, eine
Rolle. Die Regulation des Phosphorylierungsmusters von pRb findet sowohl während
der Proliferation als auch bei Differenzierungsprozessen statt (Cobrink et al., 1992).
Zur Einleitung der Differenzierung in der Zelle ist es erforderlich, dass das
Retinoblastomaprotein in seiner hypophosphorylierten Form vorliegt, um so die in der
S- und M-Phase aktiven Transkriptionsereignisse zu minimieren.
Diskussion
152
Es konnte experimentell gezeigt werden, dass in humanen Leukämie-Zellen das Rb-
Protein durch DMSO- unabhängig vom G1-Restriktionspunkt auch in der S- und G2
/M Phase in seiner hypophosphorylierten Form vorkommt (Cooper and Shayman,
2001; Tsao et al., 1992).
Durch die kombinatorische Wirkung von Microcystin und dem HBx-Protein könnte die
Hyperphosphorylierung des Rb-Proteins durch die Aktivierung der Rb-Kinasen über
den MAPK-Pathway und/ oder direkt über Microcystin als spezifischer Inhibitor der
Proteinphosphatasen PP1 initiiert werden. Dadurch würde das Rb-Protein als
Transkriptionsrepressor ausser Kraft gesetzt werden und das Binden des
Transkriptionsrepressors an das pRb-DNA-Response Element verhindert. Diese
Annahme wurde durch die messbar ansteigende Luciferase-Aktivität in diesen
Ansätzen bestätigt (3.7.2).
Bei der Interpretation der Wirkung von HBx auf die Funktion der Zellzyklus-
Regulatoren muss gerade unter diesen experimentellen Bedingungen ein Aspekt
besonders beachtet werden. Wie schon erwähnt kann der Transaktivator HBx auch
durch die Interaktion mit dem TATA-Box-bindenen Protein (TBP) auf
transkriptioneller Ebene Einfluss auf die Genexpression nehmen. Das TBP ist
Mitglied des basalen Transkriptionskomplexes, stellt ein sequenz-spezifisches DNA-
Bindungsprotein dar und ist maßgeblich in regulierende Genexpressionen involviert.
Als Bestandteil von TFIID rekrutiert der TFIIB das TBP und es kommt zu einem
TFIIB-TBP-DNA-Komplex. Diese Protein-Korrelation ist wichtig für die Bildung eines
stabilen Komplexes am Promotor und sorgt für die korrekte Positionierung der RNA-
Polymerase am Promotor.
Das HBx kann als Chaperon auf die TBP-Bindung im Präinitiationskomplex
stabilisierend wirken und schließlich hier eine starke Gen-Expression initiieren.
Dieser Pathway kann hier jedoch ausgeschlossen werden, da bei der transienten
Transfektion mit dem Kontrollvektor pTA-Luc (enthält ein TBP-Response- Element),
hier keine gesteigerte TBP-vermittelte Expression des Reportergens Luciferase
gemessen wurde (Tab. 3.7). Die HBx-assoziierte Stabilisierung der Bindung
zwischen der TATA-Box und dem TBP hätte sicherlich zu einem deutlichen Anstieg
der Expression des Luciferasegens geführt. Die direkte Interaktion von TBP-HBx ist
vermutlich bei einer transienten Transfektion ausgeschlossen.
Diskussion
153
Durch die Lokalisation beider Faktoren in verschiedenen zellulären Kompartimenten,
HBx befindet sich hier hauptsächlich in Cytoplasma und das TBP im Nukleus, ist eine
Protein-Protein Interaktion sehr unwahrscheinlich. Auch eine direkte Interaktion von
HBx mit der RNA-Polymerase III (Haviv et al., 1996, 1998; Wang et al., 1997) war
nicht zu erwarten.
Einige Studien weisen auch auf Sequenzhomologien zwischen dem pRb, TBP und
TFIIB hin (Cavanaugh et al., 1995; Voit et al., 1997; White et al., 1995, 1996).
Durch die Korrelation von pRb mit dem TBP wird die Interaktion mit dem TFIIB und
der RNA- Pol III blockiert. Je nachdem mit welchem Protein (Rb/TFIIB) das TBP
korreliert, können sowohl antirepressive als auch repressive Effekte auf die
Transkription bestimmt werden (Wang et al., 1995). In Korrelation mit dem Retino-
blastomprotein entfaltet das TBP eine repressive Wirkung. Durch eine Signal-
kaskaden-vermittelte Konzentrationserhöhung des TBP dissoziiert der pRb-TBP
Komplex und das TBP entfaltet seine antirepressive Eigenschaft durch die
Komplexierung mit den TFII B und der RNA-Polymerase (Wang et al., 1998). Die
Konsequenz daraus ist die Initiation einer RNA-Pol III abhängigen-Transkription. Im
Kontext mit der Regulation des Zellzyklus ist die verstärkte Transkriptionsaktivität vor
allem bei der Koordination der G1/S-Übergang erforderlich, um signifikant die
Transkription aller Klasse III Gene zu aktivieren. Während der verstärkten Pol III-
Aktivität dissoziiert auch der Rb-E2F-Komplex und der Transkriptionsfaktor E2F kann
die Expression von essentiellen S-Phasegenen aktivieren.
Einem ähnlichen Regulationsmechanismus unterliegt auch die Interaktion zwischen
dem TBP und dem Repressor Dr1. Durch die Bildung des Komplexes TBP-Dr1 wird
die Transkriptionsaktivität, ähnlich wie bei der Komplexbildung TPB-Rb, unterdrückt
(White et al., 1994). Die Erfassung dieses repressiven pRb-TBP-Komplexes, der
ebenfalls wie die Bindung pRb-E2F die pRb-induzierte Expression des
Luciferasegens beeinflusst, kann hier mit grosser Wahrscheinlichkeit ausgeschlossen
werden, da das DNA- Response-Motiv in dem pRb-TA-Luc-Plasmid den Komplex
pRb-E2F erkennt (lt. Clontech). Bei Bestimmung der Wirkung von HBx und
Microcystin auf die Funktion von pRb spielt es aber zunächst einmal keine Rolle, ob
pRb mit dem TBP oder E2F einen Komplex bildet. In beiden Fällen hätte HBx und
/oder Microcystin womöglich das pRb als Transkriptionsrepressor ausser Gefecht
gesetzt und zu einem Anstieg der Luciferaese-Aktivität geführt.
Diskussion
154
Das HBx-Protein und/ oder Microcystin könnten über den MAPK-Weg die
Konzentration von TBP steigern (Benn and Schneider, 1994) und so die Dissoziation
des möglichen pRb-TBP- Komplexes bewirken. Auch eine von HBx-und/ oder
Microcystin-vermittelte Phosphorylierung von pRb könnte, wie bei dem pRb-E2F-
Komplex, die Freisetzung des TBP veranlassen und so die Funktion von pRb als
Transkriptionsrepressor ausser Kraft setzen. Das Aussetzen der repressiven Wirkung
von pRb auf die Transkription des Luciferasegens könnte hier experimentell anhand
einer Zunahme der Luciferase-Aktivität gezeigt werden.
Auch eine direkte Interaktion zwischen HBx und pRb als mögliche Ursache für diese
funktionelle Inaktivierung von pRb ist eher unwahrscheinlich. Aufgrund der
subzellulären Lokalisation von HBx (im Cytoplasma) und von pRb (im Nukleus) kann
es bei transienten Transfektionen ebenfalls zu keiner direkten Interaktion kommen.
Ein direkter Interaktionsmechanismus zwischen dem Rb-(E2F) und HBx-Protein ist
jedoch noch nicht verstanden. Copräzipitationsexperimente von HBx und pRb
konnten keine weiteren Erkenntnisse darlegen. In der jüngsten Studie von Choi et al.
(2001) wird aber vermutet, dass das HBx-Protein möglicherweise mit dem Promotor
des Rb-Gens interagiert und dadurch die Aktivität von pRb und von E2F beeinflusst.
Eine indirekte Interaktion von HBx und Microcystin mit dem Retinoblastomaprotein
über den MAP-Kinase-Pathway oder Cyclin-abhängigen Kinasen wird hier favorisiert
(Benn and Schneider, 1995; Choi et al., 2001). Es führen beide Wege zu einer
Stimulation der Zellzyklus-Aktivität, die mit einer beschleunigten Passage der Zellen
durch die Restriktionspunkte G0/G1 und G2/M einhergeht. Die Microcystin-vermittelten
Effekte hinsichtlich einer funktionellen Inaktivierung von pRb können jedoch auch
durch die direkte Hemmung der PP1 in der G1-Phase vermittelt werden. Die PP1
reguliert die Dephosphorylierung des Rb-Proteins von der Mitose bis zur frühen G1-
Phase. Am G1-Restriktionspunkt wird durch die Modulation des Phosphorylierungs-
status (hypo-/hyperphosphoryliert) von pRb in Korrelation mit dem TF E2F
entschieden, ob es zu einer G1/S-Transition der Zellen kommt (Gana and Reddy,
1995). Auch Puisieux et al., (1993) berichteten, dass HBV-assoziierte
Leberkarzinome eine abnormale Expression von pRb zeigen.
Diskussion
155
Der erhöhte Level des Retinoblastomaproteins (ppRb) unterdrückt vermutlich die
HBV- assoziierte Apoptose in den infizierten Hepatozyten, um so förderlich für das
Überleben von neoplastischen Zellen zu wirken (Haas-Kogan et al., 1995). Luber et
al., (1996) vermutet weiter, dass möglicherweise eine Inakivierung von pRb durch
HBx in der frühen Phase der Hepatozyten-Transformation stattfindet, um so
neoplastischen Zellen vor der Wirkung der Tumorsuppressorproteine zu schützen.
In dieser Studie konnte eine Microcystin- und HBx-assoziierte funktionelle
Inaktivierung von pRb als möglicher Mechanismus der Tumorpromotion ermittelt
werden (Abb. 3.17).
Auch die Aktivität von E2F könnte durch HBx und Microcystin über die oben
beschriebenen Wege dereguliert werden (Abb. 3.18). Da die Aktivität von E2F
entscheidend durch die De-/ Phosphorylierungen von pRb reguliert wird, lassen sich
die ermittelten additiv stimulierenden Einflüsse von HBx und Microcystin auf die
Funktion von E2F (Tab. 3.8/Abb. 3.18) im Kontext mit den gewonnenen Resultate
aus Abb. 3.17 interpretieren.
Das HBx-Protein hatte vermutlich über die Aktivierung des MAPK-Weges indirekt
eine stimulierende Wirkung auf die E2F- Aktivität. Der freigesetzte TF E2F in
Assoziation mit dem DP1-Protein kann schließlich an das E2F-DNA-Response- Motiv
binden und die Expression des Luciferasegens verstärken.
Durch die zusätzliche Exposition der Zellen mit DMSO wurde letztendlich die
stimulierende Wirkung des HBx-Proteins auf die E2F-vermittelte Expression des
Reportergens Luciferase vermindert. DMSO induziert möglicherweise eine p53-
assoziierte Expression des p21-Kinase-Inhibitors, der die Phosphorylierung von pRb
über den HBx-vermittelten MAPK-Pathway unterbindet. Dadurch wurde die
Komplexierung von pRb-E2F aufrecht erhalten und die Freisetzung von E2F limitiert.
Andererseits könnte auch die generell durch DMSO-induzierte �apparente
Differenzierung� in der Zelle, die mit einem Anstieg der Konzentration der
Proteinphosphatasen einhergeht, die Hyperphosphorylierung des Transkriptions-
repressors pRb inhibieren und so die Komplexierung von pRb-E2F fördern, was
letztendlich zu einer Reduktion der E2F-vermittelten Luciferasegen-Expression führte
und mit einer Verringerung der Luciferase-Aktivität korrelierte.
Diskussion
156
Microcystin in einer Konzentration von 10 µM konnte durch die Hemmung der PP die
DMSO-vermittelte Dephosphorylierung des Rb-Proteins revertieren und so zu einer
verstärkten E2F-vermittelten Expression des Luciferasegens führen. Möglicherweise
korreliert der stimulierende Einfluss von Microcystin auf die E2F-vermittelte
Expression des Luciferasegens auch mit dem 100%igen Anstieg der Zahl der Zellen
in der S-Phase nach der Microcystin-Exposition (Tab. 3.1).
Eine alleinige DMSO-Inkubation wie erwähnt induziert vermutlich über die Anhäufung
von PP in der Zelle die Dephosphorylierung des Rb-Proteins (Abb. 3.14), was zu
einer Komplexierung von pRb-E2F führte und somit einen hemmenden Einfluss auf
die Aktivität von E2F nimmt.
Vermutlich führte die kombinatorische Wirkung von Microcystin und dem HBx-
Proteinin der Zelle zu einer raschen Hyperphosphorylierung des Rb-Proteins, die
ebenso mit einer schnellen E2F-vermittelten Expression von S-Phasegenen korreliert
und zu einer rapiden G1/S-Phase-Übergang der Zellen führt. Der Übergang der
Zellen in die S-Phase wird dabei durch die in der späten G1-Phase induzierte
Phosphorylierung des E2F-DP1 Komplexes durch die aktivierte CdK2 in Assoziation
mit dem Cyclin A initiiert (Taya, 1997). Die Phosphorylierung des DP1-Proteins
bewirkt letztendlich die Dissoziation von DP1 aus dem Heterodimer E2F-DP1, was
mit einer Inaktivierung von E2F einhergeht und somit eine weitere Steigerung der
E2F-vermittelten Expression des Luciferasegens verhindert. Microcystin kann als
spezifischer Inhibitor der Proteinphosphatasen PP1/ PP2A förderlich auf die
Phosphorylierung des DP1-Proteins wirken und somit die HBx-vermittelte
Stimulierung der E2F-Aktivität drosseln.
Diese mutmaßlich in Frage kommende kombinatorische Wirkung der beiden
Tumorpromotoren kann schließlich zu der hier bestimmten additiven Wirkung von
HBx und Microcystin auf die E2F-vermittelte Expression des Luciferasegens geführt
haben. Dabei kann die zunächst eher weniger stimulierende Wirkung von Microcystin
durch die Assoziation von E2F mit einen anderen Vertreter aus der DP- Familie
schnell kompensiert werden, so dass schließlich die stimulierende Wirkung von
Microcystin auf die Aktivität von E2F im Vordergrund steht. Welche Auswirkung eine
kontinuierliche Phosphorylierung des E2F-assoziierten DP1-Proteins zur Folge hat,
konnte im Rahmen dieser Studie nicht geklärt werden.
Diskussion
157
Die Aktivität von c-Myc wird von HBx und Microcystin synergistisch stimulierend
beeinflusst. Es wurde deutlich gezeigt, dass beide Tumorpromotoren synergistisch
stimulierend auf die Funktionalität des Proliferationsmarkers c-Myc wirken, der auch
als Antagonist des Rb- Proteins beschrieben wird (Tab. 3.9).
Als Transkriptionsfaktor (TF) ist das c-Myc-Protein vor allem bei der Regulation der
Zellproliferation und Differenzierung involviert. Generell wirkt es stimulierend auf die
Proliferation und dämpftend auf die Differenzierung (Steiner et al., 1995). Eine
stimulierende Wirkung auf die Proliferation übt c-Myc zum Beispiel in Korrelation mit
der Cdc25-Phosphatase aus. Die Cdc25-Phosphatase dient c-Myc als Substrat und
bewirkt die Dephosphorylierung des Thr 14- und Tyr 15-Restes der Cyclin-
abhängigen-Kinasen (Galaktionov et al., 1996; Steiner et al., 1995). Die
Dephosphorylierung dieser Reste durch die Cdc25-Phosphatasen ist essentiell für
die Aktivierung dieser Cyclin- abhängigen-Kinasen. Das c-Myc-Protein stimuliert über
die Cdc25-Phosphatase vor allem die Aktivität der Cyclin E- und Cyclin D-
abhängigen Kinasen CdK2/CdK4 (Galaktionov et al., 1996). Die Deaktivierung der
Cdc25-Phosphatasen wiederum wird durch die Aktivität der PP1/PP2A bewirkt. In
Folge einer Hemmung der Proteinphosphatasen durch Microcystin kann es zu einer
prolongierten Aktivität der Cdc25- Phosphatase kommen. Welche Angriffspunkte sich
hier für die Tumorpromotoren ergeben, bleibt in dieser Studie offen.
Janssen-Dürr et al. (1990) beobachteten nach einer deregulierten Expression des c-
Myc-Gens auch einen stimulierenden Einfluss auf die Genexpression von Cyclin A
und E, die wiederum die Aktivität von E2F beeinflussen. Die Initiation der Cyclin A-
Genexpression durch c-Myc ermöglicht eine Wachstumsfaktor-unabhängige
Assoziation von Cyclin A und Cdk2 und korreliert mit einer erhöhten E2F-Aktivität.
Auch dieser Aspekt sollte im Kontext mit einer Microcystin- und HBx-abhängigen
Tumorpromotion bei der Entwicklung eines HBV-assoziierten HCC beachtet werden.
In diesem Experiment wurde in Anwesenheit von HBx nach einer Microcystin-
Exposition (Abb. 3.19) im Vergleich zu den Kontrollen eine verstärkte c-Myc-
induzierte Expression des Reportergens Luciferase gemessen. Da die Funktion von
c-Myc vor allem über den MAPK-Weg reguliert wird (Steiner et al., 1995) könnten
HBx und Microcystin die Aktivität von c-Myc über diesen Signalweg beeinflussen.
Auch Su and Schneider (2001) beobachteten eine HBx-induzierte Stimulation der c-
Myc-Aktivität über den MAPK-Weg.
Diskussion
158
Die Wirkstoffe der Okadasäureklasse können ebenfalls über diese Sigalkaskade
stimulierend in das zelluläre Geschehen eingreifen (MacKintosh and MacKintosh,
1994). Außerdem könnte Microcystin durch die Hemmung der Proteinphosphatasen
PP1/PP2A die kontinuierliche Phosphory-lierung des c-Myc-MAX-Komplexes
induzieren und so durch die Fixierung des Heterodimers in seinem phosphorylierten
Zustand die Zellproliferation unkontrolliert beeinflussen. Eine zusätzliche DMSO-
Inkubation der HBx-exprimierenden Zellen hatte keine Wirkung auf die c-Myc-
induzierte Expression des Luciferasegens. Dies bedeutet, dass weder der DMSO-
verursachte Anstieg der Proteinphosphatasen noch die durch DMSO-induzierte
Erhöhung der p53-Konzentration bzw. p53-abhängige Transkriptionsrepression die
Aktivität von c-Myc beeinflussen.
Auch Goodrich und Lee (1992) zeigten, dass das c-Myc-Protein scheinbar auch in
Anwesenheit von Inhibitoren der Cyclin-abhängigen-Kinasen (z.B p21) förderlich auf
Proliferation wirkt und so anscheinend eine p21-induzierte Fixierung von pRb in
seinem hypophosphorylierten Zustand kompensieren kann. In diesem Zusammen-
hang könnte möglicherweise auch die nach einer alleinigen DMSO-Inkubation im
Vergleich zur Serum-stimulierten Kontrolle höhere Luciferase-Aktivität stehen. Das
Myc-Protein besitzt die Fähigkeit die Hyperphosphorylierung von pRb zu steigern und
so die Proliferation der Zellen zu fördern. Um diese Aufgabe übernehmen zu können,
muss c-Myc möglicherweise zunächst erst seine eigene Expression stimulieren, die
in dieser funktionellen Anaylse mit einer messbar höheren Luciferase-Aktivität nach
der DMSO-Inkubation (pRb wird p53-abhängig dephosphoryliert) einergeht. Bei
gleichzeitiger Anwesenheit von HBx scheint ein Anstieg der zellulären c-Myc
Konzentration nicht erforderlich zu sein. Vermutlich kann HBx über den MAPK-Weg
die Konzentration von c-Myc auf das erforderlich Maß erhöhen. Außerdem konnte
beobachtet werden, dass c-Myc scheinbar weniger Einfluss auf die reprimierende
Wirkung von p53 durch die direkte Interaktion mit dem Transkriptions-
Präinitiationskomplex hat (Goodrich und Lee, 1992). Auch dieser Aspekt muss bei
der Interpretation der Ergebnisse berücksichtigt werden, da die Initiation der
Expression des Luciferasegens in diesen eingesetzten Plasmiden hier über die
TATA-Box initiiert wird.
Die gewonnenen Daten nach der DMSO-Inkubation zeigten, dass man hier eine
direkte Interaktion von p53 mit dem TBP ausschliessen kann.
Diskussion
159
Nach der DMSO-Inkubation, die zur Akkumulation von p53 führte, hätte die
reprimierende Wirkung von p53 durch die direkte Interaktion mit den TBP zu einer
Reduktion der c-Myc-vermittelten Expression des Luciferasegens geführt. Da dies
nicht der Fall ist, kann unter diesen gewählten Versuchsbedingungen dieser Aspekt
vernachlässigt werden.
Abschliessend kann man sagen, dass HBx und Microcystin kombinatorisch
deregulierend auf die Zellzyklus-Regulation wirken.
Microcystin kann als hepatotroper Wirkstoff der Okadasäureklasse in den Virus-
initiierten Hepatozyten durch die �apparente Aktivierung� der Proteinkinasen das p53-
und Rb- Protein in eine irreversible hyperphosphorylierte Form überführen und
kombinatorisch mit dem HBx-Protein die funktionelle Inaktivierung der
Tumorsuppressorproteine bewirken (Butel et al., 1996; Fujiki, 1992).
Zusammenfassung
160
5. Zusammenfassung
Epidemiologische Studien zeigten, dass eine Überexpression des HBVx-Gens und
eine Exposition mit dem cyanobakteriellen Hepatotoxin Microcystin wesentliche
Risikofaktoren bei der Entwicklung eines primären Hepatozellulären Karzinoms
(HCC) darstellen. Das HBx-Protein wirkt als pleiotroper Transaktivator dysregulierend
auf die Zellzyklus-Regulation und die verschiedenen Zellzyklus-assoziierten Signal-
Wege .
Die Tumorpromotion von Microcystin erfolgt möglicherweise über den sogenannten
Okadasäure-Pathway. Als Wirkstoff der Okadasäurestoffklasse kann Microcystin als
spezifischer Inhibitor der Proteinphosphatasen 1/2A maßgeblich in die Modulation
der Phosphorylierung zellulärer Proteine eingreifen und durch die �apparente
Aktivierung� von Proteinkinasen zur Akkumulation von Phosphoproteinen führen. Die
Akkumulation dieser Phosphoproteine bewirkt möglicherweise eine prolongierte
Aktivität von Proteinkinasen-assoziierten Signalkaskaden und führte schließlich zu
einer unkontrollierten Zellzyklus-Regulation.
Auch die mutmaßlich positive Wirkung von Microcystin auf die unphysiologische
Stabilität von Proteinen in der Zelle ist ein weiteres Indiz für die deregulierende
Wirkung des Hepatotoxins auf das zelluläre Geschehen.
In diesem Modell der Tumorpromotion scheinen insbesondere die Tumorsuppressor-
proteine putative Substrate für die biochemische Aktivität von Microcystin zu sein, da
sie im Zustand der Hyperphosphorylierung ihre Funktion als Tumorsuppressoren
verlieren. Im Rahmen dieser Studie wurde die kombinatorisch deregulierende
Wirkung von Microcystin und HBx auf die Zellzyklus-Regulation und Apoptose
untersucht.
Experimentell wurde zunächst die Wirkung und der �optimale Dosisbereich� von
Microcystin für das hier zum Einsatz kommende initiierte Hepatozytenkultursystem
mit Hilfe des Neutralrot-Vitalitätstestes bestimmt. Es konnte nach der Exposition der
HepG2-Zellen mit der eingesetzten maximalen Microcystin-Konzentrationen von
10 µM, abzüglich der DMSO-Effekte, der höchste Vitalitätsanstieg nachgewiesen
werden.
Zusammenfassung
161
Die Wirkung von Microcystin auf die Phosphorylierung-, Stabilisierung- und Synthese
zellulärer Proteine wurde durch die Messung der Radioaktivität in radioaktiv
markierten HepG2-Gesamtzellproteinextrakten mit Hilfe der Szintillations-Messung
ermittelt.
Da Microcystin sowohl die Akkumulation von 32P-markierten zellulären Proteinen
fördert und auch eine stabilisierende Wirkung auf 35S-markierten Proteinen besitzt,
sollte weiter die Wirkung von Microcystin auf die Regulation der G1/S-Übergang der
Zellen im Zellzyklus näher zu betrachten. Dieser Übergang wird unter anderem durch
die Phosphorylierung-, Stabilisierung- und Synthese von regulatorischen Zellzyklus-
proteinen maßgeblich beeinflusst.
In den Microcystin-exponierten Proben wurde im Vergleich zu den Kontrollen mit
Hilfe der FACS-Analyse ein 100%iger Anstieg der Zahl der Zellen in der S-Phase
nachgewiesen.
Aufgrund der erhaltenen Resultate wurden weitere Experimente durchgeführt, die
dazu dienten, speziell die Wirkung von Microcystin auf die Stabilität von p53 und
Hyperphosphorylierung der Tumorsuppressorproteine (p53/ pRb) zu untersuchen. Es
bestand die Annahme, dass die Tumorsuppressorproteine p53 und pRb für
Microcystin putative zelluläre Angriffspunkte darstellen.
Mit Hilfe von Western-Blot-Analysen (WB) wurde gezeigt, dass Microcystin in einer
Konzentration von 10 µM signifikant einen Anstieg der zellulären p53-Konzentration
induziert. Die Fixierung von 32P-markiertem p53 sowie von 35S-markiertem pRb in
ihrem hyperphosphorylierten Zustand durch Microcystin konnte durch die
Immunpräzipitation nachgewiesen werden. Die Hyperphosphorylierung von p53 nach
einer Microcystin-Exposition wurde auch durch die Isoelektrische Fokussierung (IEF)
in Kombination mit der WB-Analyse verifiziert. Die Ergebnisse dieser Experimente
zeigten, dass Microcystin sowohl das p53-Protein stabilisiert als auch die
Tumorsuppressorproteine in ihrem hyperphosphorylierten Zustand fixiert, was im
Sinne von Fujiki (1992) mit einer möglichen funktionellen Inaktivierung der
Tumorsuppressorfunktion korreliert.
Um den Aspekt einer Microcystin-induzierten funktionellen Inaktivierung von p53
näher zu betrachten, sollte der möglicherweise protektive Charakter von Microcystin
vor UV-induzierten Zelltod-Prozessen in HepG2-Zellen durch den Trypanblau-Test
und der FACS-Analyse untersucht werden.
Zusammenfassung
162
Der Trypanblau-Test ergab, dass die Präinkubation der Zellen mit Microcystin vor der
UV-Induktion im Vergleich zu den Kontrollen mit einer Reduktion des Anteils (%) toter
Zellen einhergeht. Auch die durchflusszytometrische Auswertung Propidium-Jodid
gefärbter HepG2-Zellen zeigte, dass eine Exposition der HepG2-Zellen mit
Microcystin vor einer UV-Bestrahlung zu einer Verringerung des Anteils (%)
apoptotischer Zellen führte. Der apoptotische Charakter der HepG2-Zellen wurde mit
der elektrophoretischen Darstellung der DNA-Fragmentierung bestätigt.
Um konkret zu überprüfen, ob die hier nachgewiesene protektive Wirkung von
Microcystin vor UV-induzierter Apoptose in HepG2-Zellen mit einer insuffizienten
nukleären Translokation von p53 korreliert, wurde der Einfluss von Microcystin auf
die UV-induzierte Kerntranslokation des p53-GFP-Proteins (Wt) analysiert.
Nach der UV-Induktion konnte durch die fluoreszenzmikroskopische Auswertung in
den Microcystin-exponierten Proben eine verminderte nukleäre Translokation des
p53-Fusionsproteins beobachtet werden. Diese verminderte nukleäre Lokalisation
des p53-GFP-Proteins nach der Microcystin Applikation war möglicherweise durch
eine funktionelle Inaktivierung von p53 bedingt, die womöglich durch die Fixierung
des Serin-Rest der Aminosäure 315 in seinem phosphorylierten Zustand und/ oder
durch die Microcystin-induzierte metabolische Stabilisierung von p53 verursacht
wurde.
Um weitere Hinweise auf eine funktionelle Inaktivierung von p53 und anderen
Zellzyklus-Regulatoren (pRb, E2F, c-Myc) nach einer Microcystin-Exposition zu
erhalten, wurde eine funktionelle Analyse mit verschiedenen Luciferase-Plasmiden
durchgeführt, die in ihrem cis-acting-Element ein DNA-Response-Motiv für jeweils
eines der Regulatorproteine enthalten. Der Einfluss von Microcystin auf die
Funktionalität dieser Proteine wurde durch Veränderungen der durch die
Regulatorproteine-vermittelte Expression des Luciferasegens nach der Microcystin-
Exposition bestimmt. In diesen Transfektionsexperimenten konnte gezeigt werden,
dass Microcystin sowohl die Funktionalität der Tumorsuppressorproteine p53 und
pRb als auch die Aktivität der von E2F und c-Myc signifikant beeinflusst.
Die p53-vermitttelte Expression des Reportergens Luciferase wurde nach der
Microcystin-Exposition der HepG2-Zellen signifikant reduziert. Die Abnahme der
Luciferase-Aktivität deutet auf eine Microcystin-vermittelte funktionelle Inaktivierung
von p53 hin.
Zusammenfassung
163
Auf die Funktionalität von pRb hat das Hepatotoxin eine inhibierende Wirkung, die
pRb-vermittelte Expression des Luciferasegens nach der Microcystin-Exposition stieg
an.
Die Aktivitäten der Regulatorproteine E2F und c-Myc wurden durch Microcystin
gesteigert, es konnte eine Zunahme der Luciferase-Aktivität gemessen werden.
In transienten Cotransfektionsexperimenten mit einem der Luciferase-Plasmide und
dem pSVx-Expressionsvektor mit anschließend Exposition der HepG2-Zellen mit
Microcystin wurde darüber hinaus untersucht, welche kombinatorisch deregulierende
Wirkung Microcystin und HBx auf die Funktionalität der verschiedenen
Zellzyklusproteine haben. Die kombinatorische Wirkung der beiden Tumor-
promotoren auf die Aktivität der Tumorsuppressorproteine p53 und pRb lässt sich
anhand der gemessenen Luciferase- Aktivitäten als synergistisch inhibierend
bezeichen. Die Funktionalität von E2F wurde durch die Wirkung von HBx und
Microcystin additiv gesteigert. Die Aktivität von c-Myc konnte durch das
Zusammenwirken von HBx und Microcystin in seiner Aktivität synergistisch stimuliert
werden.
Zusammenfassend kann man sagen, dass sowohl die Tumorsuppressorproteine p53
und pRb als auch die Zellzyklus-assoziierten Proteine E2F und c-Myc wichtige
zelluläre Angriffspunkte für HBx und Microcystin bei der Tumorpromotion eines HCC
darstellen. In verschiedenen Versuchen wurde eine kombinatorisch deregulierende
Wirkung von HBx und Microcystin auf die Aktivität wichtiger Regulatoren des
Zellzyklus beobachtet. Das cyanobakterielle Hepatotoxin Microcystin und eine
Überexpression von HBx stellen somit wahrscheinlich wesentliche Risikofaktoren bei
der Entwicklung eines HBV-assoziierten HCC dar.
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Erklärung
185
Erklärung Hiermit bestätige ich, dass ich die vorliegende Dissertation selbständig verfaßt und nur die angegebenen Quellen und Hilfsmittel verwendet habe. Barnstorf, den 10. Oktober 2003
I R I N A N I C K E L E I T
PERSÖNLICHE DATEN
Name: Nickeleit
Vorname: Irina Geburtsdatum: 01.12.66 Geburtsort: Bremen Familienstand: verheiratet
SCHULBILDUNG
1973 - 1977 Grundschule�Ellenerbrokweg Bremen 1977 - 1983 Orientierungsstufe-Graubündenerstr. Bremen 1983 - 1986 Oberstufe an der Walliser Str. Bremen
AUSBILDUNG
1986 - 1988 Lehranstalt für MTA- St. Jürgen Str. Bremen
BERUFSTÄTIGKEIT
8/ 1989 - 6/1991 Roland-Klinik (MS- Vertretung) Bremen
8/1991 - 1/1999 LaborärztlicheGemeinschaftspraxis Dres. Med. Nickel/Sandkamp Bremen
STUDIUM
10/1992 - 1/1998 Biologiestudium an der Universität Bremen
1994/95 WS-1995/96 SS Projekt: Auswirkung der militärischen nutzung auf die heidelandschaft im Gebiet des Truppenübungsplatzes Garlstedt in Landkreis Osterholz bei Bremen
6/ 1997 - 12/1997 Diplomarbeit am Institut für Virologie:
Konstruktion und funktionelle Analyse nicht-infektiöser HAV- Replikons 01/1999 - 2/2002 wissenschaftliche Mitarbeiterin am Institut für Virologie mit der Möglichkeit zur Promotion: Thema: Analyse der Effekte des hepatotropen Cyanobakterientoxins Microcystin und HBV-X proteins auf die Zellzyklus-Regulation Der Disserationsvortrag fand am 11.12.03 statt 3/2002 - 12/2002 Mitarbeit am Projekt: Korrelation zwischen Bremen HAV und Zellzyklusproteinen 2002-2003 Mitarbeit am Forschungszentrum für Ozeanränder ;Arbeitsgruppe Prof. Dr. G. Wefer 2002-2003 Hochschule Bremen Internationaler Studiengang Angewandte Biologie (ISAB). Industrielle Mikrobiologie; Leitung Prof. Dr. T. Achstetter
WEITERBILDUNG
Interne Fortbildungsveranstaltungen der Laborpraxis Dres. med. Nickel/ Sandkamp Bremen
BESONDERE INTERESSEN
Forschung, Ernährung, Natur, Kultur
HOBBYS
Sport, Gärtnern
Barnstorf, Dezember 2003 Irina Nickeleit