Embed Size (px)
Citation preview
ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
DOKTORA TEZİ
Salmonella enterica serotip Typhimurium’da stj FİMBRİYAL OPERONUNUN REGÜLASYONUNUN VE PATOJENİTEDE OYNADIĞI ROLÜN
TANIMLANMASI
Banu ÖZDEN
BİYOLOJİ ANABİLİM DALI
ANKARA 2008
Her hakkı saklıdır
i
ÖZET
Doktora Tezi
Salmonella enterica serotip Typhimurium’da stj FİMBRİYAL OPERONUNUN
REGÜLASYONUNUN VE PATOJENİTEDE OYNADIĞI ROLÜN TANIMLANMASI
Banu ÖZDEN
Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı
Danışman: Prof. Dr. Mustafa AKÇELİK
Stj fimbriyasının patojenitede oynadığı rolün tanımlanması amacıyla, stj operonu kanamisin gen kaseti ile bozulmuş mutant suş ve doğal S. Typhimurium AJB715 suşu arasında yarışma denemeleri yapılmıştır. İlk olarak stj fimbriyal operonunun 5 geninden biri olan stjA geninin kanamisin gen kaseti ile bozulması sonucu MA44 mutant suşu oluşturulmuştur. Ardından 6-8 haftalık dişi fareler oral yoldan MA44 mutant ve doğal tip AJB715 suşu ile enfekte edilmiştir. Fekal ve organ örneklerinde bakteri sayımları yapılmış ve istatistiki olarak MA44 mutant suşun doğal tip AJB715 suşuna kıyasla önemli (p < 0.05) ölçüde azaldığı tespit edilmiştir. stj operonunun regülatörünün tanımlanması amacıyla, stjE::lacZYA füzyonunu içeren S. Typhimurium MA2 suşuna transpozon mutasyonu gerçekleştirilmiştir. Seçilen transdüktantlar arasında Mudj mutantlarının T-POP mutantlarından daha yüksek β-galaktozidaz aktivitesine sahip olduğu belirlenmiştir. Sonrasında invörs PCR yöntemi ile 6 transdüktantta transpozon insersiyon bölgeleri çoğaltılmıştır. PCR ürünlerinin dizi analizine tabi tutulması ile mudj transpozonunun histidin operonunun ilk iki geni olan hisD ve hisG arasına girdiği tespit edilmiştir. Elde edilen tüm veriler ışığında stj fimbriyal operonunun ppGpp global regülatörünün de dahil olduğu ikili regülasyon sistemi ile düzenlendiği kanısına varılmıştır. Ekim 2008, 131 sayfa Anahtar Kelimeler: Salmonella Typhimurium, Stj fimbriya, patojenite, regülasyon
ii
ABSTRACT
Ph.D. Thesis
IDENTIFICATION OF THE REGULATION AND THE ROLE IN THE PATHOGENESIS OF THE stj FIMBRIAL OPERON IN Salmonella enterica serotype
Typhimurium
Banu ÖZDEN
Ankara University Graduate School of Natural and Applied Sciences
Department of Biology
Supervisor: Prof. Dr. Mustafa AKÇELİK
In order to describe the role of stj fimbria in the patogenesis, the competition tests were done between wild type S. Typhimurim AJB715 and mutant strain MA44 which were degenerated with kanamycin gene casette. Initially, MA44 mutant strain was generated in consequence of disturbing the one of the genes in stj operon, stjA, with the kanamycin gene casette. Next, 6-8 week female mice enfected orally with MA44 mutant strain and wild type strain AJB715. Bacteria numbers from faeces and organ samples were counted and it was observed that there was a statistically significant (p < 0.05) reduction in the number of the MA44 mutant strain in comparison with the wild type strain AJB715. In order to describe the regulator of the stj operon, transposon mutations were carried out to S. Typhimurium MA2 including stjE::lacZYA fusion. Among the selected transductants, it was determined that mudj mutants have a higher β-galactosidase activity than T-POP mutants. Afterwards in 6 transductants, transposon insertion regions were amplified by the method of inverse PCR. By subjected PCR products to sequence analysis it was determined that mudj transposon was inserted between primal two genes in the histidine operon, hisD and hisG genes. On the basis of the all data obtained, it was estimated that stj fimbrial operon was regulated by a two-component regulatory system included the global regulator ppGpp. October 2008, 131 pages Key Words: Salmonella Typhimurium, stj fimbria, pathogenicity, regulation
iii
TEŞEKKÜR
Çalışmalarımı yönlendiren, araştırmalarımın her aşamasında bilgi, öneri ve yardımlarını
esirgemeyerek gelişmeme katkıda bulunan danışman hocam Sayın Prof. Dr. Mustafa
AKÇELİK’e;
Tez izleme komitelerindeki değerli düşünce ve önerilerinden dolayı Hacettepe
Üniversitesi Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı öğretim üyesi Prof. Dr. Aykut AYTAÇ
ve Ankara Üniversitesi Biyoloji Anabilim Dalı öğretim üyesi Prof. Dr. Gönül
DÖNMEZ’e;
Tüm yardımları için laboratuvarda bulunan çalışma arkadaşlarıma;
En içten teşekkürlerimi sunarım.
Ayrıca maddi manevi destekleriyle bugüne gelmemi sağlayan, aldığım her kararda
yanımda olan ve anlayışlarını esirgemeyen, hayatım boyunca minettar kalacağım canım
aileme;
Acı ve tatlı günlerde sınırsız sevgi ve sabrıyla her zaman yanımda olan, elinden gelen
her türlü yardımı esirgemeyen müstakbel eşim Yrd. Doç. Dr. Yasin TUNCER’e
Sevgi ve saygılarımı sunmayı bir borç bilirim.
Bu tez çalışması, “Salmonella enterica serotip Typhimurim'un Patojenitesinde stj
Fimbriyal Operonunun Rolünün ve Bu Operonun Genetik Regülasyonunun
Tanımlanması (TÜBİTAK, TBAG, 107T459)” adlı proje tarafından desteklenmiştir.
Banu ÖZDEN
Ankara, Ekim 2008
iv
İÇİNDEKİLER
ÖZET ……………………………………………………………………………...... i
ABSTRACT…………………………………………………………………............ ii
TEŞEKKÜR………………………………………………………………............... iii
SİMGELER DİZİNİ……………………………………………………………….. vi
ŞEKİLLER DİZİNİ…………………………………………………………........... vii
ÇİZELGELER DİZİNİ……………………………………………………………. ix
1. GİRİŞ………………………………………………………………………... 1
2. KAYNAK ÖZETLERİ……………………………………………………... 3
2.1 Salmonella Cinsinin Genel Özellikleri…………………………………...... 3
2.2 Salmonella Enfeksiyonu…………………………………………………… 4
2.2.1 Salmonella patojenite adaları (SPI)..……………………………………… 7
2.2.2 Salgı izyolları………………………………………………………………... 9
2.3 Fimbriya Tipleri ve Enfeksiyon Sürecindeki Önemleri………………….. 13
2.3.1 Tip I fimbriya……………………………………………………………….. 17
2.3.2 Uzun polar fimbriya……………………………………………………....... 19
2.3.3 Plazmid kodlu fimbriya…………………………………………………….. 21
2.3.4 İnce agregatif fimbriya………………………………….………………..... 23
2.3.5 S. Typhimurium’da stj fimbriyası……………………………………........ 25
3. MATERYAL VE YÖNTEM……………………………………………… 27
3.1 Mikroorganizmalar ve Gelişme Koşulları……………………………….... 27
3.2 Yöntem………………………………………………………………………. 28
3.2.1 Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR)……………………………………...... 29
3.2.2 PCR ürününun stabilizasyonu için yapılan küt uçlu klonlama (PCR2.1) 30
3.2.3 Küçük ölçek plazmid izolasyonu…..………………………………………. 30
3.2.4 Büyük ölçek plazmid izolasyonu………………………………………....... 31
3.2.5 DNA bağlama reaksiyonu (ligasyon)............................................................ 32
3.2.6 Restriksiyon endonükleaz enzim kesimleri ve agaroz jel elektroforezi..... 33
3.2.7 Restriksiyon endonükleaz enzim kesimi ile oluşturulan DNA parçalarının ya da vektörlerin agaroz jelden geri alınması…………….... 35
3.2.8 Konjugasyon………………………………………………………………... 36
3.2.9 Bakterilerden genomik DNA’nın izolasyonu…………………………........ 37
3.2.10 Southern lekeleme (blot)…………………………………………………..... 38
v
3.2.11 Glutatiyon (S) transferaz füzyon proteini üretimi……………………… 40
3.2.12 Glutatiyon S transferaza (GST) bağlanan füzyon proteinlerinin büyük ölçek izolasyonu………………………………………………………...… 41
3.2.13 StjA proteini için poliklonal antibadilerin üretimi..................................... 43
3.2.14 Antibakteriyal antibadilerin antiseradan ayrılması................................... 43
3.2.15 Sodyum dodezil sülfat poliakrilamit jel elektroforezi (SDS-PAGE)........ 44
3.2.16 Western lekeleme (blot)………………………………………………….... 46
3.2.17 Kimyasal kompetent (transformasyon oranı yüksek) hücre hazırlanması.................................................................................................. 48
3.2.18 Transformasyon…………………………………………………………… 49
3.2.19 Elektrokompetent (elektroporasyon için transformasyon oranı yüksek) hücrelerin hazırlanması………………………………………………….... 50
3.2.20 Elektroporasyon……………………………………………………............ 50
3.2.21 Hayvan denemeleri…………………………………………………............ 51
3.2.22 Salmonella Typhimurium’da P22 faj lizatlarının hazırlanması………... 51
3.2.23 T-POP ve Mudj transpozon mutasyonu………………………………..... 52
3.2.24 Biyomanyetik protein G immun bağlanma testi (SIMPLE metodu)…… 53
3.2.25 β-Galaktozidaz testi………………………………………………………... 54
3.2.26 İnvörs (ters yön) PCR ile transpozonların bulunduğu gen bölgelerinin tayini............................................................................................................... 56
4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA………………………….. 58
4.1 stj Fimbriyal Operonunun Patojenitede Oynadığı Rolün Belirlenmesi... 58
4.1.1 stj operonu bozulmuş mutant suş elde etme çalışmaları............................ 58
4.1.2 Hayvan denemeleri………………………………………………………... 69
4.2 stj Operonu Regülatörünün Tanımlanması................................................ 71
4.2.1 stjE::lacZYA transkripsiyonel füzyonunun oluşturulması ………........... 71
4.2.2 Glutation (S) transferaz füzyon proteini üretimi....................................... 78
4.2.3 Transpozon mutasyonu ve regülatörün fonksiyonel tanısı …………....... 83
5. SONUÇ.......................................................................................................... 109
KAYNAKLAR............................................................................................................. 110
ÖZGEÇMİŞ................................................................................................................. 130
vi
SİMGELER DİZİNİ
aa Aminoasit
Amp Amfisilin
bç Baz çifti
Carb Karbenisilin
cm Santimetre
Cm Kloramfenikol
CTAB Hekzadezil Trimetil Amonyum Bromit
dk Dakika
DNA Deoksiribonükleik asit
EDTA Etilen Diamin Tetraasetik Asit
g Gram
IPTG isopropil-beta-D-tiogalaktopiranozit
kb Kilobaz
kDa Kilo Dalton
Km Kanamisin
M Molar
mg Miligram
ml Mililitre
µg Mikrogram
µl Mikrolitre
µm Mikrometre
µM Mikromolar
N Normal
Nal Nalidiksik
ng Nanogram
nm Nanometre
RNA Ribonükleik asit
SDS Sodyum Dodesil Sülfat
sn Saniye
TEMED N’N’N’N’-Tetra-metiletilendiamin
Tet Tetrasiklin
vii
ŞEKİLLER DİZİNİ
Şekil 2.1 Salmonella enterica serotype Typhimurium tarafından indüklenen
gastroenterit’in mekanizması………………………………………...... 7
Şekil 2.2 Tip I, II, III ve IV protein salgı sistemlerinin şematik gösterimi…........ 12
Şekil 2.3 Ototransporter salgı yolu……………………………………………..... 13
Şekil 2.4 Şaperon/uşer izyolu ile P pili biyosentezi…………………………....... 14
Şekil 2.5 S. Typhimurium’da 4 fimbriyal operon içinde genlerin organizasyonu. 16
Şekil 3.1 Protein büyüklüklerinin saptanmasında kullanılan protein standardının jel göç planı............................................................................................ 46
Şekil 4.1 stjA geninin sol ve sağ uç fragmentlerinin PCR ürünleri…………........ 60
Şekil 4.2 stjA sol uç fragmentinin PCR 2.1 plazmid vektöründen elde edilen BglII ve SalI restriksiyon endonükleaz kesim bantları……............... 61
Şekil 4.3 stjA sağ uç fragmentinin PCR 2.1 plazmid vektöründen elde edilen ve XbaI ve SalI restriksiyon endonükleaz kesim bantları……............ 62
Şekil 4.4 stj operonu bozulmuş mutant oluşturmak amacı ile kullanılan pGB704 plazmidinin genetik haritası……………………………….................... 62
Şekil 4.5 stjA sol uç fragmentinin pGB704 plazmid vektöründen elde edilen BglII ve SalI restriksiyon endonükleaz kesim bantları……………....... 63
Şekil 4.6 stjA sağ uç fragmentinin pGB704 plazmid vektöründen elde edilen XbaI ve SalI restriksiyon endonükleaz kesim bantları……………….... 64
Şekil 4.7 stjA sol uç ve sağ uç fragmentlerinin pGB704 plazmid vektöründen birlikte elde edildiği XbaI ve BglII restriksiyon endonükleaz kesim bantları………………………………………………………………..... 65
Şekil 4.8 Kanamisin kasetini içeren pUC4 plazmidinin genetik haritası............... 66
Şekil 4.9 pUC4 vektör plazmidi ve XhoI kesim bantları....................................... 66
Şekil 4.10 stjA sağ ve sol uç fragmentleri arasında kanamisin kasetini içeren pGB704 plazmidini taşıyan transformantların moleküler tanısı………. 67
Şekil 4.11 stjA geni sağ (FR-I) ve sol (FR-II) fragmentleri arasında kanamisin gen kaseti yerleştirilen pGB704 plazmidinin şematik görünümü........... 68
Şekil 4.12 Doğal suş ve konjugantlarda stjA probları ile hibridizasyon veren kromozomal DNA EcoRI fragmentleri………………………………. 60
Şekil 4.13 Fare fekal örneklerine ait S. Typhimurium AJB715/MA44 yarışma denemesi sonuçları…………………………………………………….. 71
Şekil 4.14 Fare doku örneklerine ait S. Typhimurium AJB715/MA44 yarışma denemesi sonuçları…………………………………………………….. 71
viii
Şekil 4.15 stjE geninin polimeraz zincir reaksiyonu ürünü…………………........ 73 Şekil 4.16 stjE genini içeren PCR2.1 plazmidine ait XbaI ve SmaI restriksiyon
endonükleaz kesim bantları……………………………....................... 74
Şekil 4.17 İntihar plazmidi pFUSE plazmidinin restriksiyon endonükleaz haritası ve stjE geni klonlama bölgesi……………………………….. 75
Şekil 4.18 Escherichia coli CC118 λ pir suşundan izole edilen rekombinant pFUSE plazmidinin XbaI ve EcoRV restriksiyon endonükleaz enzim kesim bantları………………………………………...………………. 76
Şekil 4.19 Escherichia coli S17 λ pir suşundan izole edilen rekombinant pFUSE plazmidinin XbaI ve EcoRV restriksiyon endonükleaz kesim bantları………………………………………………………............... 77
Şekil 4.20 S. Typhimurium LT2 ve pFUSE konjugantı S. Typhimurium MA2 suşunun kromozomal DNA’sına karşı geliştirilen stjE geni problarının Southern lekeleme (blot) profilleri……………………..... 78
Şekil 4.21 Primerler kullanılarak çoğaltılan stjA yapısal geni PCR ürünü…........ 79
Şekil 4.22 PCR2.1 vektörüne ilave edildikten sonra Escherichia coli Top 10 hücrelerine aktarılarak çoğaltılan stjA genini içeren transformantların tanısı…………………………………………….................................. 80
Şekil 4.23 GST-stjA (glutatiyon-S-transferaz stjA) füzyonunun gerçekleştirildiği pGEX-4T-2 vektörünün genetik haritası…………............................... 81
Şekil 4.24 Escherichia coli DH5α suşuna aktarılan GST-stjA füzyonunun gerçekleştirildiği pGEX-4T-2 vektörünün tanısı………….................. 82
Şekil 4.25 GST-StjA füzyon proteini saflaştırma süreçlerinde elde edilen değişik fraksiyonların SDS-PAGE görünümü ve antijen antibadi spesifitesinin Western lekeleme yöntemi ile tanısı…………………... 83
Şekil 4.26 Western lekelemede kullanılan transdüktantların SDS-PAGE profilleri………………………………………………........................ 102
Şekil 4.27 Western lekeleme…………………………………………………...... 103
Şekil 4.28 Transdüktantların invörs PCR ürünleri……………………………..... 105
Şekil 4.29 Transpozon insersiyon bölgesi dizi analizi………………………....... 106
Şekil 4.30 Histidin biyosentezi ve operonu…………………………………........ 107
ix
ÇİZELGELER DİZİNİ
Çizelge 2.1 S. Typhimurium’da genetik olarak tanımlanan fimbriyal lokusların özellikleri…………………………………………............................ 16
Çizelge 2.2 stj fimbriyal operonunda yer alan genler ve bu genlerin özellikleri……………………………………………………............ 26
Çizelge 3.1 Kullanılan mikroorganizmalar ve özellikleri……………………...... 28
Çizelge 4.1 T-POP transpozonu ile elde edilen transdüktanlarda β-galaktozidaz aktiviteleri .......................................................................................... 85
Çizelge 4.2 Mudj transpozonu ile elde edilen transdüktantlarda β-galaktozidaz aktiviteleri............................................................................................ 87
Çizelge 4.3 pH 5.0’da mudj transpozonu ile elde edilen transdüktantlarda β-galaktozidaz aktiviteleri...................................................................... 91
Çizelge 4.4 pH5.0 SIMPLE metodu uygulanarak mudj transpozonu ile elde edilen transdüktantlarda β-galaktozidaz aktiviteleri .....………......... 93
Çizelge 4.5 pH5.0 SIMPLE metodu uygulanarak T-POP transpozonu ile elde edilen transdüktantlarda β-galaktozidaz aktiviteleri........................... 95
Çizelge 4.6 Seçilen mutantlarda β-galaktozidaz üretim düzeyleri.......………...... 101
1
1. GİRİŞ
Birçok ülkede toplum sağlığını tehdit eden hastalıkların başında gelen Salmonella
kaynaklı salmonellozis, aynı zamanda ciddi ekonomik kayıplara neden olmaktadır.
Dünya genelinde her yıl milyonlarca insanın bu hastalığı geçirdiği ve bazılarının ölümle
sonuçlandığı bilinmektedir. Salmonella enfeksiyonları genelde kontamine olmuş gıda ve
suların tüketimi nedeniyle ortaya çıkmaktadır. Mikrobiyel gıda zehirlenmeleri arasında
dünyada en çok görülen salmonellozis, sadece Amerika Birleşik Devletleri’nde yılda 2-
4 milyon insanı etkilemekte ve bu sayı her geçen yıl artmaktadır. Salmonella’nın en çok
bulunduğu gıda maddelerinin başında hayvansal ürünler gelmektedir. Bunlar arasında
kümes hayvanları eti, kıyma, sosis, yumurta ürünleri, su ürünleri, dondurma, süt tozu ve
krema en yüksek risk içeren gıdalardır. Ayrıca çeşitli soslar ve salatalar, pudingler ve
diğer süt ürünleri de Salmonella riski taşıyan gıdalardır. Hammadde işleme teknolojisi,
depolama ve pazarlama koşulları Salmonella riskinin büyümesine neden olmaktadır.
Salmonella organizmaya girdikten sonra ince bağırsağın son bölümü olan ileum ve
kolonda kolonize olmaktadır. Salmonella enterica serotip Typhimurium enfeksiyonu
sırasında bakterinin konakçı bağırsak epitel hücrelerine tutunmasının, bu
mikroorganizmanın kolonizasyonunda ilk aşama olduğu düşünülmektedir. Ancak
Salmonella enfeksiyonlarında, söz konusu kolonizasyonu sağlayan adhezyon faktörleri
üzerinde yeterli bilgi bulunmamaktadır.
Fimbriyal yapılar ve ototransporter proteinler gibi adhezyon faktörlerinin
enfeksiyondaki rolleri (kolonizasyon), bağlanma spesifiteleri (ekstraselüler matrikse
bağlanma) ve regülasyonları (bağırsakta in vivo ifadelerinin gerçekleşmesi) dikkate
alındığında; ototransporter proteinler ile fimbriyaların, enfeksiyon sırasında birbirleriyle
etkileşerek hareket ettikleri görüşü güçlenmektedir. Virulens faktörlerin konakçı
sistemlerindeki etkinliklerinin belirlenmesi ve ifadelerini kontrol eden mekanizmaların
tanımlanması, Salmonella enterica serotip Typhimurium’un neden olduğu hastalığın
detaylı bir şekilde anlaşılması, bu hastalığa karşı etkin önlemlerin alınması ve tedavisi
açısından büyük önem taşımaktadır. Özellikle fimbriyaların patojenitedeki rolü yanında,
2
ifadelerini kontrol eden regülatör genlerin ve regülasyon sisteminin belirlenmesi,
hastalığın mekanizmasının tanımlanması açısından kritik önem taşımaktadır. Değişik
fimbriyal yapıların ve ototransporter proteinlerin salmonellozisteki etkinlikleri üzerinde
yoğun çalışmalar sürmektedir. Ancak sadece Salmonella enterica serotip
Typhimurium’a özgü olan Stj fimbriyasının, bu bakterideki rolü üzerinde henüz
herhangi bir çalışma bulunmamaktadır.
Bu çalışmada Salmonella enterica serotip Typhimurium’un 13 fimbriyasından biri olan
ve yalnız bu bakteride tanımlanan stj operonunun patojenitedeki rolü ve ifadesini
kontrol eden genin (veya genlerin) ve regülasyon mekanizmasının, transpozon
mutasyonu yolu ile tanımlanması amaçlanmıştır.
3
2. KAYNAK ÖZETLERİ
2.1 Salmonella Cinsinin Genel Özellikleri
Salmonella’nın klinik açıdan önemi, türlerin tanımlanmasında kullanılan modern
metotların (DNA-DNA homolojisi, 16S rDNA sekans analizi gibi) geliştirilmesinden
çok önce anlaşılmıştır. Tıp alanının bu cins üzerine yoğunlaşan ilgisi ve bakteriyel
grupların tanımlanmasında serotiplendirmenin kullanılması ile daha önce farklı türler
olarak adlandırılan birçok Salmonella serogrubunda fark edilir bir artma söz konusu
olmuştur. İsimlendirme karmaşasına bir son vermek için Salmonella cinsi Salmonella
bongori ve Salmonella enterica olarak adlandırılan 2 tür ile tanımlanmıştır. S. enterica
daha sonra: S. enterica, S. salamae, S. houtaenae, S. diarizonae, S. indica ve S.
arizonae olarak adlandırılan altı alt gruba ayrılmıştır. Salmonella enterica, 2700’den
fazla serotipe sahiptir (Wray and Wray 2000, Tindal et al. 2005).
İnsan ve hayvanlarda gastroenteridis gibi hastalıklara yol açan, Enterobacteriaceae
familyası üyesi Salmonella cinsi bakteriler; Gram-negatif, spor oluşturmayan,
2.0-5.0 µm boyunda ve 0.7-1.5 µm eninde çubuk şeklinde bakterilerdir. Laktozu
fermente edemeyen bu cins 20-40 ºC arasında üreyebilmektedir. Salmonella gallinarum
ve Salmonella pullorum hariç, diğer Salmonella türleri sahip oldukları flagellalar
sayesinde hareket etme yeteneğindedir (Singleton and Sainsbury 1996). Salmonella
cinsi O (somatik), Vi (kapsüler virülens) ve H (kirpik) olmak üzere 3 farklı antijenik
yapı içerebilmektedir. Polisakkarit yapısındaki O antijeni hareketli-hareketsiz tüm
Salmonella türlerinde bulunur. H kirpik antijeni ise S. gallinarum hariç diğer türlerde
bulunur ve protein yapısındadır. S. typhi, S. paratyphi A ve S. paratyphi C’de bulunan
Vi antijeni glikolipid yapısında ve O antijeni tarafından çevrelenmiş durumdadır. Vi
antijeni patojen saldırısına, fagositoza ve serumda bulunan bakterisidal maddelere karşı
koruma sağlamaktadır (Hess et al. 1996, Fitzgerald et al. 2003, Wain et al. 2005).
İnsan ve hayvanların bağırsak sisteminde bulunan bir patojen olan Salmonella’nın S.
enterica serovar Typhi gibi bazı üyeleri konakçıya adapte olmuş ya da konakçı
spesifiktir. Ancak çoğunluğu geniş konakçı dizgesi içerir (Tsolis et al. 1999, Galan
4
2001). En yaygın Salmonella taşıyıcıları tavuk, ördek, domuz, inek ve soğukkanlı
hayvanlardır. Besin zinciri ya da çevresel kontaminasyon yolu ile yayılma sağlanır.
İnsanlarda bakterinin vücuda alınmasından 8-48 saat sonrasında karın ağrısı, bulantı,
kusma, bazen ateş ile titreme ve ishal görülür. Hasta tedavi edilmezse semptomlar 2-5
gün içinde yok olur. ABD’de her yıl yaklaşık 1.4 milyon Salmonella tarafından
indüklenen enterokolit vakasının belirlendiği ve ölümle sonuçlanan en yaygın gıda
kaynaklı hastalık olduğu bildirilmiştir. Vakaların % 26’sının etmeni ise S. enterica
serovar Typhimurium olarak belirlenmiştir (Voetsch et al. 2004, Suar et al. 2006).
Türkiye’de Salmonella enfeksiyonlarına dair sağlıklı istatistikler mevcut değildir.
2.2 Salmonella Enfeksiyonu
Patojen mikroorganizma konakçıya girdiği zaman bir seri farklı çevresel koşul ile
karşılaşmaktadır. Her konakçı sıcaklık, pH, ozmolarite ve besin kaynakları gibi
birbirinden farklı fiziksel ve kimyasal özellikler içermektedir. Patojenin karşılaştığı
çevre ayrıca konakçının bağışıklık sistemine ait birçok molekül içermektedir.
Konakçıya ait bağışıklık sistemi elemanları, epitel dokunun anatomik olarak bariyer
fonksiyonu göstermesi ile başlamakta ve antimikrobiyal peptitler, tamamlayıcılar
(kanda bulunan ve amboseptör molekülü ile birleştiğinde bakterinin tahrip olmasını
sağlayan madde) ve fagositlerin antimikrobiyel etki göstermesine kadar uzanan geniş bir
yelpazeye sahiptir. Patojen mikroorganizmalar çevrelerinde meydana gelen bu
değişimleri algılayıp koordineli bir şekilde gen ifadelerini programlayarak yeni çevresel
koşula adapte olabilmelidir. Bu şekilde oluşturulan yanıtlar; çevresel stres koşullarına
adapte olmayı, konakçı bağışıklık sisteminden kaçmayı ve spesifik virülens
mekanizmaları aktive etmesini sağlar (Ohl and Miller 2001).
Tüm Salmonella enfeksiyonları kontamine olmuş gıda ya da suyun tüketilmesi ile
başlamaktadır. Mide asidini düşüren koşulların Salmonella enfeksiyon dozunu
azaltması, mide asitliğinin enfeksiyonun başlangıcında önemli bir bariyer olarak görev
yaptığını göstermektedir. Ancak Salmonella mide gibi asidik çevrede düşük pH’ya
maruz kaldığı zaman adaptif bir yanıt olarak asit toleransı oluşturabilmektedir
(Giannella et al. 1972, Garcia-del Portillo et al. 1993).
5
Bakteri ince bağırsağa girdikten sonra, bağırsak epitel hücrelerine tutunabilmek için
bağırsak yüzeyinde bulunan mukus tabakasının içinden geçmek zorundadır (Baumler et
al. 1996c). Fareler üzerinde yürütülen çalışmalar; Salmonella’nın tutunmak ve içine
girmek için öncelikli olarak bağırsak epitel hücrelerinden mikrofold hücrelerini (M
hücreleri) tercih ettiğini, ancak bunun yanında fagositik olmayan enterosit hücrelerini de
istila ettiğini göstermiştir (Jones et al. 1994). M hücreleri pinositoz ile bağırsak
antijenlerini içlerine almakta ve Peyer’s patches (ince barsakta ve esas olarak da
ileumda -incebağırsağın son kısmında- yer alan, lenfatik doku plakları) epitelinin altında
bulunan lenfoid hücrelere bu antijeni taşımaktadır. Bu aktivite mukozal bağışıklığa
hazırlık yapılması açısından önemlidir. Büyükbaş hayvanların bağırsak epitellerinde
Salmonella öncelikli olarak M hücrelerini tercih etmemektedir. Bu nedenle M
hücrelerinin ve Salmonella’nın farklı hayvanlarda enterositleri istila etme
fonksiyonlarının ayrıntılı olarak incelenmesi gerekmektedir. Çalışmalar sonucu elde
edilen bulgular, Salmonella’nın aynı zamanda fagositoz yolu ile CD18 antijenini üreten
fagositlerin yapısına katıldığı ve bu şekilde bağırsak epitel hücrelerinden oluşan bariyeri
aşabildiğini göstermiştir (Watson et al. 1995, Brandtzaeg 1999, Vazquez-Torres et al.
1999). Bağırsak epitel hücrelerinden oluşan bariyeri istila etmenin yanında, Salmonella
serotipleri epitellerin salgı yanıtı oluşturmasını tetiklemekte ve nötrofillerin toplanarak
bağırsak lümenine (boşluğa) sızmasına yol açmaktadır (Galyov et al. 1997). In-vitro
koşullarda yürütülen doku kültürü çalışmalarında nötrofil birikimi için bakteri ve epitel
hücrelerde çeşitli sitokinlerin üretimi ile ilişkili proteinlerin sentezlenmesinin zorunlu
olduğu saptanmıştır. Özellikle epitel hücreleri tarafından üretilen kemokin interlökin-8
aracılığı ile mukozal boşlukta nötrofil birikiminin teşvik edildiği tespit edilmiştir
(McCormick et al. 1993, Lee et al. 2000, Ohl and Miller 2001).
Salmonella bağırsak epitel hücrelerini geçtikten sonra, bir diğer bağışıklık sistemi
elemanı olan ve mukozal boşlukta yer alan makrofajlar içine girmektedir. Sistemik
enfeksiyona yol açan Salmonella serotipleri makropinositoz yolu ile makrofaj içine
girmekte ve fagositin antibakteriyel fonksiyonlarından kurtulmasını sağlayan virülens
mekanizmaları aktive etmektedir. Enfekte olmuş fagositlerin retikuloendotelyal
6
sistemde bulunan diğer organlara göç etmesi bakterinin konakçı içinde yayılmasını
kolaylaştırmaktadır (Alpuche-Aranda et al. 1994, Ohl and Miller 2001).
İnsan hücre kültürü modelleri bazı bakteriyel istila durumlarını ve konak hücre gen
ifadesini açıklamak amacıyla başarıyla kullanılmaktadır. Bağırsak epitel hücreleri ile
bakterinin interaksiyonu T84, CaCo-2 veya HT29 gibi insan karsinoma hücreleri
kullanılarak açıklanabilmektedir. S. Typhimurium ile insan hücreleri arasındaki
interaksiyon, makrofaj benzeri hücreler (THP-1 veya U937 hücreleri), makrofajlardan
türeyen monosit hücreleri veya birincil nötrofiller, söz konusu bakteri ile enfekte
edilmesi sonucu modellenmiştir (Vladoianu et al. 1990, Abshire and Neidhardt 1993,
Papp-Szabo et al. 1994, Bolton et al. 2000, Helms et al. 2005). Son zamanda ise insan
vücudundan alınan doku örnekleri S. Typhimurium ile insan bağırsak mukozası
arasındaki ilişkinin tanımlaması amacı ile kullanılmaktadır (Haque et al. 2004). İnsan
epitel hücrelerinin kullanıldığı bu çalışmalarda, S. Typhimurium’un Patojenite Adası-
1’de (SPI-1) kodlanan Tip 3 Salgı Sistemi-1 (T3SS-1) aracılığı ile konakçı hücre içine
efektör proteinleri enjekte ettiği tespit edilmiştir. Bu efektör proteinler, Rho ailesi
GTPaz’lar için iki değişim faktörü (SopE ve SopE2), bir inozitol fosfat fosfataz (SopB
ya da SigD), aktin bağlanma proteini (SipA ya da SspA) ve aktivitesi bilinmeyen iki
protein (SopA ve SopD) ile beraber toplam altı adettir (Zhou et al. 2001, Raffatellu et
al. 2005). SopB tarafından üretilen fosfatidilinozitol fosfatazlar ile SopE-SopE2
tarafından üretilen RhoGTPaz’lar beraber çalışarak S. Typhimurium istilası için gerekli
olan WASp/Scar proteinlerini aktive etmektedir (Unswort et al. 2004). WASp/Scar
proteinleri ise Arp2/3 kompleksini etkileyerek aktin flamentlerinin yeni dallar
oluşturmasını sağlamaktadır (Mullins et al. 1998). SipA proteini bu aşamada aktin
polimerizasyonu için gerekli olan kritik dal konsantrasyon miktarını düşürerek yeni
dalların oluşumunu hızlandırmakta ve aynı zamanda ADF/kofilin tarafından yönetilen
aktin çözülmelerini engellemektedir. Yeni aktin dallarının hızla büyümesi membranı
dışarı doğru itmekte ve membran kabartılarının oluşmasına, makropinozitoz ile
bakterinin içeri alınmasına öncülük etmektedir (Şekil 2.1) (Garcia-del Portillo and
Finlay 1994). Makrofajların içine girmeyi başaran S. Typhimurium’un bulunduğu
ortamda hayatta kalabilmesi, SPI-2’de kodlanan Tip 3 Salgılama Sistemi-2’nin (T3SS-
2) aktivitesine bağlıdır. T3SS-2’nin inaktive edildiği suşlar ile oral yoldan enfekte
7
edilmiş buzağı ve streptomisin uygulanmış farelerde enfeksiyondan 24 saat sonrasında
bağırsak mukozasında nötrofil sızmasının azaldığı ve bunun yanında bağırsak
dokularında bulunan S. Typhimurium sayısında düşme gözlendiği bildirilmiştir. Bu
durum da T3SS-2’nin bakterinin mukoza bağ dokusunda bulunan makrofajlar içinde
canlı kalabilmesi için gerekli olduğunun göstergesi olarak kabul edilmiştir (Tsolis et al.
1999).
Şekil 2.1 Salmonella enterica serotype Typhimurium tarafından indüklenen gastroenteritin mekanizması (Raffatellu et al. 2006).
2.2.1 Salmonella patojenite adaları (SPI)
“Patojenite Adası” terimi ilk kez üropatojenik E. coli suşlarının hemolitik aktivitesi ile
ilişkili genlerin genetik olarak stabil olmadığının tespiti sırasında kullanılmıştır (Hacker
et al. 1983). Patojenite adaları, kromozomun büyük ve stabil olmayan bölgeleridir.
8
Bakteriyel patojenlerin genetik yapıları incelenirken virülens genlerin kromozom
üzerinde bu bölgelerde kümelendiği tespit edilmiştir. Patojen bakterilerde çok sayıda
SPI tanımlanmasına rağmen, bu lokusların büyük bir bölümünün virülens aktivite ile
ilişkisi belirlenememiştir (Groisman and Ochman 1996).
SPI-1 içinde yer alan genler, patojen olmayan S. enterica suşlarının tanımlanması
çalışmalarında transpozon mutasyonu yolu ile belirlenmiştir (Galan and Curtiss 1989).
Devam eden çalışmalar istilacı fenotip için fazla sayıda gene ihtiyaç duyulduğunu
göstermiştir. Bu genler Salmonella kromozomunda sentizom 63 içinde yer almaktadır.
İki farklı elemana sahip bu lokus daha sonra SPI-1 olarak adlandırılmıştır (Mills et al.
1995). 40 kb büyüklüğe sahip olan bu lokusun yaklaşık 30 geninin kodladığı T3SS-1
aktivitesi ile hücre yüzeyinde iğne benzeri uzantılar oluşturulup Salmonella proteinlerini
konakçıya aktarılmasını sağlanmaktadır. Bu lokusun ikinci elemanı sitABCD genleri
istila ile ilişkili olmayıp demir yakalama sistemini kodlamaktadır (Zhou et al. 1999,
Lostroh and Lee 2001, Coombes et al. 2005).
SPI-2, Salmonella’nın sistemik enfeksiyonu gerçekleştirebilmesi ve konakçı
organlarında çoğalabilmesi için gereklidir. Bu virülens fenotipi, S. enterica’nın fagositik
hücrelerde yaşamda kalma ve çeşitli ökaryotik hücrelerde vakuoller içinde çoğalabilme
yeteneğini sağlar. SPI-2 lokusunun büyüklüğü de 40 kb’dır. Bu lokusta kodlanan ikinci
T3SS-2, Salmonella efektör proteinlerin konakçı hücreye lokasyonunu sağlamaktadır.
Bu salgı sistemi aynı zamanda patojeni vakuol içinde konakçı bağışıklık sisteminin
efektör fonksiyonlarına karşı da korumaktadır (Vasquez-Torres et al. 2000, Coombes et
al. 2005).
SPI-3 tarafından kodlanan virülens faktör, Salmonella’nın konakçı hücre içinde canlı
kalabilmesi için önemli olan yüksek afiniteli mağnezyum transport sistemidir (MgtCB).
MgtCB sistemindeki bozucu bir mutasyonu içeren suşların sistemik virülens etkilerinin
ve hücre içinde çoğalma miktarlarının az olduğu saptanmıştır (Blanc-Potard and
Groisman 1997, Blanc-Potard et al. 1999, Gunzel et al. 2006). Bu gen kümesi içinde yer
alan misL, bir ototransporter proteini kodlamaktadır. S. Typhimurium ile enfekte olmuş
9
tavuk ve farelerde bağırsak yüzeyinde bakteriyel kolonizasyonun gerçekleşmesi için
misL genin tam aktivitesini göstermesi gerektiği belirlenmiştir (Morgan et al. 2004,
Dorsey et al. 2005).
SPI-4’ün fonksiyonel özelliklerine dair henüz yeterli bilgi elde edilememiştir. Ancak
yapılan çalışmalar bu adada bulunan genlerin T3SS’e benzer sekans özelliği içerdiğini
göstermiştir. Bunun yanında transpozon mutasyonu denemeleri sonucunda
Salmonella’nın makrofaj içinde hayatta kalabilmesi için gerekli fonksiyonları içeren
birkaç lokus tanımlanmıştır. SPI-4 içinde yer alan bu lokuslardan biri ims94 olarak
adlandırılmıştır (Baumler et al. 1996c, Wong et al.1998). Son yıllarda yapılan deneyler
sonucunda, SPI-4’ün T3SS’e benzer bir mekanizma ile SiiE adı verilen bir adhezin
kodladığı tespit edilmiştir. Ancak bu adhezin, fimriyal adhezinlerden farklı bir
fonksiyon ile epitel hücrelere tutunmaya yardımcı olmaktadır (Gerlach et al 2007,
Morgan et al. 2007).
SPI-5, salgı sistemleri ile translokasyonları gerçekleştirilen efektör proteinleri
kodlamaktadır. T3SS-1 aracılığı ile translokasyonu yapılan ve sıvı salınımını başlatarak
diyareye neden olan SopB efektör proteini (Norris et al. 1998, Wood et al. 1998) ve
T3SS-2 aracığı ile translokasyonu gerçekleştirilen PipB efektör proteini bu lokusta
kodlanmaktadır (Knodler et al. 2002).
2.2.2 Salgı izyolları
Gram-negatif bakterilerde protein salgı sistemleri üzerine yürütülen moleküler
çalışmalar ile bu bakterilerin beş adet protein salgı sistemine sahip olduğu
belirlenmiştir. Bu salgı izyolları Gram-negatif bakteriler arasında oldukça korunmuş
sekanslar içermekte ve aynı zamanda membran transport sistemlerinden bağımsız olarak
fonksiyon göstermektedir (Lloyd et al. 2001, Gentschev et al. 2002, Pallen et al. 2003,
Gerlach and Hensel 2007).
10
Tip I protein salgı sistemi için en iyi örnek E. coli’de alfahemolizin (HlyA) salgılama
(TOSS) sistemidir (Şekil 2.2) (Gentschev et al. 2002). Bir lipoprotein olan HlyA,
kalsiyumu bağlayarak konakçı hücre ile ilişkinin oluşumunu yönlendiren 11-179 adet
amino asit tekrarı içermektedir. Bu interaksiyon sonucunda ökaryotik hücrenin plazma
membranı içine HlyA girişi teşvik edilmekte ve sitoplazmik içeriğin hücre dışına
akışına yol açan por oluşumu sağlanmaktadır (Ghigo and Wandersman 1992, Binscheck
et al. 1995). TOSS izyolu dış membranda por oluşturan protein (TolC), membran
birleştirici protein (MFP-HlyD) ve iç membran ATP-bağlayıcı protein kaseti (ABC)
(HlyB) olmak üzere üç proteinden oluşmaktadır. Salgılama süreci, salgılanan efektör
proteinin C-terminal bölgesinde bulunan salgı sinyalinin ABC transporter proteini ile
ilişkiye geçmesi ile başlar. Bu salgı sinyali sadece ABC transporter proteinin tanıyacağı
şekilde özelleşmiştir. Efektör proteinin bağlanmasını, teşvik edilen dış membran
proteini TolC ile HlyD’ nin ilişkilenmesi takip eder ve son aşamada efektör protein dış
yüzeye salgılanır. ABC proteini ile efektör proteininin bağlanması ya da TOSS
kompleksinin oluşturulması sırasında ATP hidrolizine ihtiyaç yoktur. Ancak efektör
proteinin hücre yüzeyine taşınması ATP bağımlı bir reaksiyondur (Koronakis et al.
1991, Koronakis 1995).
Sec-bağımlı genel salgı sisteminin (GSP) ana terminal dalı (MTB) olarak adlandırılan
Tip II salgı sistemi tek bir operon tarafından kodlanmaktadır (Sandkvist 2001). MTB
aracılığı ile gerçekleşen salgılanmanın en iyi örneği Klebsiella oxytoca’da pullulanazın
(PulA) salgılanmasıdır (Şekil 2.2). Nişasta hidrolizini gerçekleştiren PulA lipoproteini
dış çevreye salgılandığı anda misel oluşturmaktadır. Yapılan çalışmalarda MTB ile Tip
IV fimbriyal sistemin genetik ve yapısal olarak benzerlik taşıdığı tespit edilmiştir. Bu
durum fimbriyal biyosentez izyolunun Tip II salgı sistemi ile gerçekleştiği düşüncesini
doğurmuştur (Takizawa and Murooka 1985, Bitter et al. 1998).
TOSS sisteminde olduğu gibi, Tip III salgı sistemi de efektör moleküllerin iç ve dış
membran boyunca transportunu Sec-bağımlı olarak gerçekleştirmektedir. Bu salgı
sisteminde en az 20 proteinin etkinliği sonucu oluşan iğne benzeri yapılar dışa doğru
uzamaktadır. Sekretin benzeri proteinler ise merkezinde geniş porların bulunduğu halka
benzeri yapının oluşmasını ve bu sayede iğne benzeri yapının stabilizasyonu sağlanarak
11
efektör proteinlerinin salınmasına olanak sağlamaktadır. Bu oluşum deri altı
enjeksiyonu benzeri bir mekanizmayla iç ve dış membrana yayılmaktadır. Tip III salgı
sisteminin efektör proteinlerinin doğrudan ökaryotik hücre içine aktarabilmesi için,
bakterinin hedef hücreyle fiziksel temasının olması gerekmektedir. Bu nedenle bu salgı
sistemine “temasa bağımlı” salgı izyolu adı da verilmektedir (Şekil 2.2) (Zierler and
Galan 1995, Gentle et al. 2004).
Gram-negatif bakterilerde bulunan Tip IV salgı sistemi (TFSS) hakkında yeterli bilgi
bulunmamaktadır. Ancak bu sistemin atasal olarak konjugasyon mekanizması ile ilişkili
olduğu saptanmıştır. Bu salgı sisteminde efektör proteinler, konjugasyon
mekanizmasına benzer bir sistem ile bakteriden hedef hücreye doğrudan temas ile
aktarılmaktadır (Henderson et al. 2004). Bu salgı izyolunun tipik örneği Agrobacterium
tumefaciens’te T-DNA nükleoproteini transfer sistemidir. Bunun yanında Bordetella
pertussis Ptl (Farizo et al. 2000), Brucella suis (Boschiroli et al. 2002), Bartonella
henselae (Schulein and Dehlo 2002), Legionella pneumophila (Zink et al. 2004) ve
Helicobacter pylori (Bourzac and Guillemin 2005) gibi bazı patojen
mikroorganizmalarda farklı izyolları da saptanmıştır.
12
Şekil 2.2 Tip I, II, III ve IV protein salgı sistemlerinin şematik gösterimi (Henderson et
al. 2004) Tip I izyolu E. coli’de hemolizin A (HlyA) salgılanmasına; Tip III izyolu Yersinia’da Yop salgılanmasına; Tip II izyolu Klebsiella oxytoca’da pullulanaz salgılanmasına ve TipIV izyolu A. tumefaciens’de VirB salgılanmasına örnek olarak verilmiştir. EM, dış çevre; OM, dış membran; Peri, periplazma; IM, iç membran; Cyto, sitoplazma Tip V salgı izyolu içinde ototransporter sistemi (Va ya da AT-1 tipi), iki-bileşenli salgı
sistemi (Vb) ve son zamanda tanımlanan Vc (AT-2) sistemi yer almaktadır. Biyosentez
aşamaları ve primer yapıları benzer olan bu üç sistem, proteinlerin salgılanmasında da
benzer mekanizmaları kullanmaktadır. Ototransporterlar sitoplazma içinde preprotein,
proprotein ya da protein olarak sentezlenmekte ve periplazmaya proprotein formunda
salınmaktadır. Öncü proteinin C-terminal domaini aracığı ile dış membran yapısında β-
barrel por yapısı oluşturulmakta ve olgun protein otokatalitik aktivite ile dışarıya
salınmaktadır. Ototransporter proteinin dış membrandan translokasyonu ile sitoplazma
içinden hücre dışı ortama salınma tamamlanmaktadır (Şekil 2.3) (Henderson et al. 2004,
Desvaux et al. 2004).
13
Şekil 2.3 Ototransporter salgı yolu (Desvaux et al. 2004) (A) Ototransporterin primer yapısı. (B) Yolcu domaini, dış membrandan salgılanmayı yönetir. 1: β-domaininin dış membrana insersiyonu ve β-barrel por oluşumu, 2: bağlama bölgesi pordan salgılanmayı sağlar, 3: otoşaperon domaini yolcu domaininin β-barrel porundan çıkacak şekilde katlanmasını tetikler, 4: katlanan yolcu domaininin hücre yüzeyine translokasyonu gerçekleşir ve efektör molekül bir proteaz aktivitesi ile kesildikten sonra dış çevreye salgılanır. Peri: periplazma; OM: dış membran; EM: dış çevre. Kareler, polipeptidin katlanma halini sembolize etmektedir 2.3 Fimbriya Tipleri ve Enfeksiyon Sürecindeki Önemleri Pili, bakteri yüzeyinden dışa doğru çıkıntı halinde bulunan adhezif özelliğe sahip kısa
ve sert yapılardır. Daha sonra bakteriyel konjugasyonda rol aldıklarının belirlenmesi ile
bu yapılar “fimbriya” olarak adlandırılmıştır. İlk olarak sadece E. coli gibi Gram-negatif
organizmalarda tanımlanan söz konusu ipliksi yüzey yapıları, bakterinin dış
membranına sıkıca bağlı iskele benzeri çubukçuk ve bakteriyel yapışma faktörü ya da
çubukçuğun ucunda lokalize olmuş bağlanma spesifitesine sahip adhezin içermektedir.
Son yıllarda Gram-pozitif bakterilerin de pili içerdikleri saptanmıştır. Ancak bu
14
bakterilerde pili yapılarının patojenite ile ilişkisi halen araştırılmaktadır (Pizarro-Cerda
and Cossart 2006).
En iyi tanımlanan fimbriya, idrar yolunda kolonize olan ve böbrekleri enfekte eden
üropatojenik E. coli’de (UPEC) ifade edilen P pilidir. Bu fimbriyaya ait, fimbriyal alt
ünitelerin biyosentezi; şaperon proteinleri, dış membrana bağlanma üniteleri ve
regülatör proteinleri pap gen kümesi tarafından kodlanmaktadır. P pili biyosentezi
şaperon/uşer izyolu ile gerçekleşmektedir (Şekil 2.4). Periplazmik şaperon proteini olan
PapD, pilinin her bir alt ünitesini dış membrana taşıyarak burada fimbriyanın alt
ünitelerinin birleştirileceği platform/uşer PapC yapısını oluşturur. Böylece alt ünitelerin
bakteri yüzeyine translokasyonunu kolaylaştırmış olur (Thanassi et al. 1998). PapD
fimbriyal alt ünitelerin periplazmik boşlukta yanlış zamanda agregasyonunu engellemek
için bu alt ünitelere bağlanır ve aynı zamanda alt ünitelerin fimbriya montajı için
katlanma-kıvrılma olaylarına hazır olmalarını sağlar (Bann et al. 2004).
Şekil 2.4 Şaperon/uşer izyolu ile P pili biyosentezi (Pizarro-Cerda and Cossart 2006) i) piliyi oluşturacak moleküller, tip II salgı sistemi aracığı ile sitoplazmik membrandan geçerek periplazmaya taşınır. ii) PapD şaperonu yokluğunda pili alt üniteleri parçalanır. iii) PapD ortamda bulunduğu zaman alt üniteler stabilize edilir. iv) Ardından alt üniteler uşer PapC’ye taşınır. v) ilk önce pili ucunun montajı gerçekleşir. vi) Dördüncül yapı dış membranı geçtikten sonra oluşur
15
Enfeksiyonun başlangıcında bakterinin incebağırsak dokusunda bulunan birden fazla
farklı hücre tipine tutunması ve hücre içine girmesi gereklidir. Şimdiye kadar S.
Typhimurium’da genetik doğası tanımlanmış 4 tip fimbriya bulunmaktadır. Bunlar; tip I
fimbriya (Fim), plazmid kodlu fimbriya (PE), uzun polar fimbriya (LP) ve ince
agregatif fimbriyadır (curli-tafi) (Baumler et al. 1996b, Baumler et al. 1997). Yapılan
in-vitro çalışmalarda S. Typhimurium’un nötrofillerin epitelden sızmasını
indüklediğinin belirlenmesi (McCormick et al. 1995) ile enfeksiyonun bir aşamasında
fimbriyanın nötrofillerin yıkımında rol alabileceği hipotezi ortaya atılmıştır (Baumler et
al. 1997). Ancak devam eden araştırmalar ile, fimbriyanın nötrofil yıkımında rol
almadığı, patojen ile konakçı hücrenin fiziksel temasını sağlayarak epitel boyunca
efektör proteinlerin translokasyonunu sağladığı gösterilmiştir (Darwin and Miller 1999,
Gorvel 2000, Boekema et al. 2004, Tükel et al. 2005, Tükel et al. 2006, Tükel et al.
2007).
S. Typhimurium’da yer alan fimbriyaları kodlayan genlerin organizasyonu,
Enterobacteriaceae familyasına ait diğer yakın türlerde tanımlanan fimbriyal lokuslar
ile benzerlik taşımaktadır. Birçok fimbriyal proteinin fonksiyonu, en iyi tanımlanan
sistem olan tip I fimbriyanın fonksiyonları temel alınarak açıklanmaya çalışılmıştır
(Clegg and Swenson 1994, Althouse et al. 2003). Patojenik olmayan suşların da, bilinen
bir ya da daha fazla fimbriyal operon içermesi tüm fimbriyaların virülens özellikler ile
ilişkili olmadığına işaret etmektedir (Darwin and Miller 1999). Şekil 2.5 ve Çizelge
2.1’de S. Typhimurium’da tanımlanan 4 fimbriyal lokusun gen dizisi ve patojenite
özellikleri verilmiştir.
16
Şekil 2.5 S. Typhimurium’da 4 fimbriyal operon içinde genlerin organizasyonu (Darwin and Miller 1999)
Gen büyüklükleri baz çifti olarak her bir okuma kalıbının altında verilmiştir
Çizelge 2.1 S. Typhimurium’da genetik olarak tanımlanan fimbriyal lokusların
özellikleri
Lokus Haritadaki
pozisyona Doku spesifitesib Azalma derecesic
Fim 13 Tanımlanmamış 0.3
Lpf 80 Peyer’s patch 4.8
Pef pSLT İncebağırsak vilileri 2.4
agf/csg 26 Tanımlanmamış 3.3 a Harita pozisyonu sentizomları tanımlamaktadır (Baumler and Heffron 1995, Collinson et al. 1996b) pSLT, virülens plazmid (Friedrich et al. 1993) b Darwin and Miller 1999 cLD50 değerleri, doğrudan gastrik sistemden enfekte edilen farelerde hesaplanmıştır ve mutant suşun LD50 değerinin doğal tip S. Typhimurium suşunun LD50 değerine oranını göstermektedir (Darwin and Miller 1999)
17
2.3.1 Tip I fimbriya
S. Typhimurium’da tip I fimbriya, sentizom 15’te yer alan fimAICDHF operonu
tarafından kodlanmaktadır (Sanderson et al. 1995, Collinson et al. 1996a) ve E. coli’de
bulunan tip I fimbriyaya morfolojik olarak benzer ancak antijenik olarak oldukça
farklıdır (Korhonen et al. 1980, Kukkonen et al. 1998). E. coli ve Salmonella’da peritrik
olarak tanımlanan tip I fimbriya, 7 nm genişliğinde ve 0.2 µm uzunluğundadır
(Korhonen et al. 1980, Klemm and Krogfelt 1994). Şaperon-uşer izyolu ile biyosentezi
gerçekleşen bu fimbriya, çeşitli ökaryotik hücre tiplerinde α-D-mannoz reseptörlerine
spesifik olarak bağlanmaktadır. Bu nedenle mannoz-duyarlı olarak da tanımlanabilen bu
fimbriyanın in-vitro koşullarda ortama eklenen α-D-mannoz ile inhibe edilmesi suretiyle
bakterinin ökaryotik hücreye tutunması engellenebilmektedir (Clegg and Gerlach 1987,
Hultgren et al. 1991, Clegg and Swenson 1994, Klemm and Krogfelt 1994, Thanassi
and Hultgren 2000). Diğer Enterobacteriaceae üyelerinde olduğu gibi S. Typhimurium
tip I fimbriyası bir büyük alt ünite proteini (FimA, 21 kDA) ve FimH adhezini ile ilişkili
birkaç proteini de bünyesinde bulundurmaktadır (Clegg and Swenson 1994). FimH’nin
adhezin olarak fonksiyonu E. coli ve S. Typhimurium’da aynı olmakla birlikte, protein
yapıları ve bu proteinlerin bağlanma spesiteleri birbirinden oldukça farklıdır (Korhonen
et al. 1980, Firon et al. 1984, Kisiela et al. 2006).
S. Typhimurium’da fim gen kümesinde yer alan fimW, fimY ve fimZ regülatör genleri,
büyük alt üniteyi kodlayan fimA geninin ifadesini düzenlemektedir. Araştırmalar FimY
ve FimZ proteinlerinin her ikisinin de fim gen kümesinin ifadesi için gerekli olduğuna
işaret etmiştir. DNA bağlanma testleri, FimZ’nin fimA promotor genine bağlanmak için
FimY’ye gereksinim duymadığını göstermiştir (Swenson and Clegg 1992, Yeh et al.
1995). Aminoasit dizisi, yanıt regülatörleri olarak bilinen proteinlerle benzerlik
taşımaktadır (Yeh et al. 1995, Yeh et al. 2002). Ayrıca fimW geninin hemen yanında
bulunan fimU’nun arjinin tRNA molekülünü kodladığı ve fim operonunun translasyonal
regülasyonunda yer aldığı tespit edilmiştir (Swenson et al. 1994, Clouthier et al. 1998).
Son yıllarda yapılan çalışmalarda fimY ve fimU regülatör genleri arasında yer alan fimW
geni tarafından kodlanan FimW proteininin fimA promotoru üzerinde doğrudan
transkripsiyonu ya da dolaylı yoldan regülatör molekülleri represe ederek, fimbriyal
18
regülasyonda negatif regülatör olarak rol aldığı belirlenmiştir. FimW proteininin statik
sıvı ortamda kendi regülasyonunu negatif olarak regüle edebilme yeteneğine sahip
olması nedeni ile otoregülatör olduğu da düşünülmektedir (Tinker et al. 2001, Althouse
et al. 2003).
E. coli ve S. Typhimurium faz varyasyonu göstererek fimbriyalı veya fimbriyasız
duruma geçebilmektedir (Duguid et al. 1966). Gelişme koşullarının değişmesi ile fimA
ifadesinin azaldığı ya da arttığının bilinmesine rağmen hangi çevresel koşulların
fimbriya ifadesini etkilediği henüz tam anlamıyla açıklığa kavuşturulamamıştır (Clegg
et al. 1996). Ancak deneysel veriler, statik sıvı ortamda geliştirilen bakterilerde fimbriya
ifadesinin teşvik edildiğine, katı ortamda geliştirildiğinde ise fimbriya ifadesinin
engellendiğine işaret etmektedir (Duguid et al. 1966, Old and Duguid 1970). Ayrıca E.
coli ve S. Typhimurium’da tip I fimbriyanın faz varyasyonunu sağlayan mekanizmalar
birbirinden farklıdır. E. coli’de fimA ifadesi 314 bç’lik bir promotor bölge tarafından
düzenlenir. Söz konusu promotor katlanarak inversiyon yapmakta ve sonuçta “açık” ya
da “kapalı” konuma geçebilmektedir (Abraham et al. 1985). E. coli’den farklı olarak S.
Typhimurium’un fimbriya içeren ve içermeyen suşlarında promotorlar tek yönde yer
almakta ve fimA regülasyonu inversiyon gösteren bir DNA elementi aracılığı ile
gerçekleşmemektedir (Clegg et al. 1996). Bu nedenle S. Typhimurium’da, E. coli’nin
fimA promotorunun farklı inversiyon yönlerini kodlayan fimB ve fimE genleri
bulunmamaktadır (Klemm 1986). Diğer yandan E. coli fim lokusu da, S.
Typhimurium’da fimA geninin regülasyonunda önemli görevleri olan fimY ve fimW
genlerini içermemektedir (Yeh et al. 1995). S. Typhimurium’da FimZ proteini doğrudan
fimA genine bağlanarak, bu genin ifadesinde rol oynarken E. coli’de hiçbir fim geni
doğrudan fimA regülasyonunda görev almamaktadır. Bazı E. coli suşlarında argU
geninin 5' bölgesi FimZ proteini ile % 71 oranında benzerlik göstermektedir. Bu
benzerliğin E. coli’de fimbriya oluşumuna katkısı ise bilinmemektedir. E. coli’de
oluşturulan S. Typhimurium fimA-lacZ füzyon geninin ifadesinin doğal tip E. coli’de
fimA ifadesinden farklı olduğunun belirlenmesi, bu lokusun farklı mekanizmalar ile
regüle edilebileceğine işaret etmektedir (Swenson and Clegg 1992, Yeh et al. 1995).
19
In-vitro koşullarda yürütülen çalışmalar, S. Typhimurium tip I fimbriyasının HeLa
hücrelerine tutunmada görev aldığını göstermiştir. Bunun yanında Hep-2, T84 ve Int-
407 gibi diğer insan hücre tiplerine tutunmada her hangi bir rol oynamadığı saptanmıştır
(Baumler et al. 1996a). İki farklı araştırmada; fim operonunda delesyon içeren
mutantların, fim operonu aktif suşlara oranla daha az virülent oldukları gösterilmiştir
(Lockman and Curtiss 1992, van der Velden et al. 1998). Bu durum, tip I fimbriya
içeren E. coli ve S. Typhimurium suşlarının fare karaciğerlerinden daha kolay
alınmasını sağlamaktadır. Söz konusu bulgu, tip I fimbriyanın S. Typhimurium’un
virülensliğini ya da adhezyonunu etkilediğine işaret etmektedir (Leunk and Moon 1982,
Darwin and Miller 1999, Edwards et al. 2000, Zavialov et al. 2007).
2.3.2 Uzun polar fimbriya
lpfABCDE lokusunun varlığı, S. Typhimurium’da diğer Enterobacteriacea üyelerinde
bulunmayan kromozomal lokusların tanımlanması sırasında tespit edilmiştir (Baumler
and Heffron 1995). S. Typhimurium LT2 kromozom haritasında sentizom 80 bölgesinde
yer alan ve E. coli K12 suşu ile sekans homolojisi içeren bu operonun, S.
Typhimurium’un evrimsel sürecinde yatay gen transferi ile kazanıldığı
düşünülmektedir. Aralarında enterotoksijenik, enteroinvazif ve enteropatojenik E. coli
ve Shigella türlerinin de bulunduğu diğer Enterobacteriaceae üyelerinde bu homoloji
bulunmamaktadır. Bunun yanında S. Typhi ve S. arizoneae türlerinin lpf operonunu
yitirdiği ya da hiç sahip olmadıkları düşünülmektedir (Baumler et al.1997).
Fimbriya içermeyen E. coli türlerine lpf operonunun aktarımının sağlandığı
transformantlarda lpf operonunun ifadesi sonucunda polar filamentlerin oluştuğu
gözlenmiştir (Baumler and Heffron 1995). lpf tarafından kodlanan fimbriyanın bakteri
hücresinin yüzeyinde polar bir yerleşime sahip olmasına rağmen, Salmonella’da bu
fimbriyanın bölgesel spesifitesi henüz tanımlanamamıştır. lpf’nin gerçekten uzun polar
fimbriyayı kodladığına dair doğrudan bir kanıt yoktur. Bununla birlikte lpf’nin E. coli
kromozomunda bulunan kriptik fimbriyal genlerin ifadesini indükleme olasılığı
üzerinde durulmaktadır. Ayrıca lpf genlerinin organizasyonunun fim genlerine ve Lpf
20
proteinin amino asit dizisinin Fim proteinine benzerliğinin tespiti, lpf’nin fimbriya
bileşenlerini kodladığının güçlü göstergesi olarak kabul edilmiştir (Baumler and
Heffron 1995, Baumler et al.1997, Edwards et al. 2001).
S. Typhimurium enfeksiyonunun fare model sistemlerde incelenmesi sonucunda, uzun
polar fimbriyanın ince bağırsakta bulunan Peyer’s patches hücrelerine tutunmada
aracılık ettiği tespit edilmiştir (Baumler et al. 1996b). Fimbriyanın montajı için gerekli
olan dış membran uşer’ini kodlayan lpfC geninde meydana gelen bir mutasyon, Peyer’s
patch hücrelerinde bakteriyel kolonizasyonun azalmasına neden olmuş, ancak
enterositlerde böyle bir etkiye yol açmamıştır. lpfC’de meydana gelen mutasyonun
ortadan kalkmasıyla S. Typhimurium’un Peyer’s patch hücreleri ile bağlantıya geçme
yeteneğinin geri kazandığı ve incebağırsak villouslarında kolonize olma yeteneğini
arttırdığı tespit edilmiştir. Fare model sistemlerde, lpfC invA ikili mutasyonunu içeren
suşların, sadece lpfC mutasyonunu ya da sadece invA (Tip III salgı sisteminin bir
elemanı olan ve bakterinin konak hücreyi istila etmesi için gerekli olan InvA proteinini
kodlayan gen) mutasyonunu içeren suşlara kıyasla daha az virülens etkiye sahip olduğu
saptanmıştır. Organizmada patojenin LD50 değerine ulaşmak için, doğal suş ile
kıyaslandığında, lpfC mutasyonunu içeren suş ile 3 kat fazla, invA mutasyonunu içeren
suş ile 16-50 kat fazla, lpfC ve invA mutasyonlarını bir arada bulunduran suş ile
yaklaşık 150 kat fazla miktarda oral yol ile enfeksiyon gerçekleştirilmelidir. Karın içine
enjeksiyon ile gerçekleştirilen enfeksiyonlarda ise suşların tekli mutasyon ya da ikili
mutasyon içerip içermemesi, virülens etkide herhangi bir değişikliğe neden
olmamaktadır. Bu durum da S. Typhimurium’un ince bağırsak mukozası ile bağlantı
kurabilmesi için lpfC ve invA genlerine ihtiyaç duyduğu hipotezini desteklemektedir.
Salmonella’nın Tip III salgı sistemini kullanarak konak dokuları istila edebilmesi için
öncelikle hedef hücreler ile ilişkiye geçmesi gerekmektedir. Fare model sistemlerde
enfeksiyonun başlangıcını teşkil eden bu durum, Peyer’s patch hücreleri için spesifik
olduğu belirlenen uzun polar fimbriya ile gerçekleştirilmektedir (Jones et al. 1994,
Tatsuno et al. 2006, Zavialov et al. 2007).
21
In vitro ve in vivo koşullarda lpf operonunun ifadesini tanımlayabilmek için lpf::lacZYA
transkripsiyonel füzyonunu içeren bir suş kullanılmıştır. In vitro koşullarda Lac+- açık
konumdan Lac- kapalı konuma geçen koloni fenotipi 6.8x10-3 sıklığında, Lac- kapalı
konumundan Lac+- açık konuma geçen koloni tipi ise 2.4x10-4 sıklığında oluşmuştur.
lpf::lacZYA füzyonunu içeren suş ile enfekte edilen farelerin, Peyer’s patch
hücrelerinden izole edilen bakterilerde uzun polar fimbriya ifadesi açık konumunda
bulunan bakterilerin sayısında artış olduğu tespit edilmiştir. GST-LpfA füzyon proteini
kullanılarak bağışıklık kazandırılan farelerde, enfeksiyonun başlangıç aşamasında
Peyer’s patch hücrelerinde; uzun polar fimbriya ifadesi açık konumda olan bakteriler
ile, söz konusu protein arasında kuvvetli oranda bağlanma gerçekleşmiştir. Bu sonuçlar
uzun polar fimbriyanın oral yol ile gerçekleşen enfeksiyon sürecinde hastalığın
başlangıç basamağında oldukça önemli bir rol oynadığına işaret etmektedir. Uzun polar
fimbriyanın ifadesinin regülasyonu henüz tam anlamıyla tanımlanamamıştır. Ancak lpfA
geninin hemen yanında bulunan inversiyona uğramış tekrar dizilerinin, bu genin
inversiyonuna neden olduğu ve bu yolla lpfA geninin faz varyasyonu özelliği kazandığı
düşünülmektedir (Baumler and Heffron 1995, Norris et al. 1998, Tatsuno et al. 2006).
2.3.3 Plazmid kodlu fimbriya
Birçok Salmonella serotipi, büyüklüğü 50 ile 90 kb arasında değişen virülens plazmidler
içermektedir. S. Typhimurium, oral enfeksiyondan sonra tam bir virülens etki
göstermesi için gerekli 90 kb büyüklüğünde bir plazmid (pSLT) içermektedir (Gulig
and Curtiss 1987, Gulig 1990). Plazmidte kodlu virülens özelliklerin fonksiyonlarını
açıklığa kavuşturacak bilgiler henüz elde edilmemiştir. Ancak S. Typhimurium’un
virülens plazmidinin deney hayvanlarında oral enjeksiyondan sonra sistemik
enfeksiyona yol açtığı kabul gören bir yaklaşımdır (Gulig et al. 1992). spv (Salmonella
virülens plazmidi) ve rck (kanda bulunan komplemanın öldürücü etkisine direnç)
genlerinin de arasında bulunduğu bir çok virülens geni içeren lokuslar klonlanmış ve
tanımlanmıştır (Hackett et al. 1987, Gulig et al. 1993). Plazmidleri giderilmiş bir suşta
spv gen bölgesinin bulunması, o suşun enfektif özellik kazanması için yeterlidir. rck
geni ise serum duyarlı E. coli ve plazmidleri giderilmiş S. Typhimurium suşlarında
serum dirençliliğin oluşması için yeterlidir (Hackett et al. 1987, Heffernan et al. 1992,
22
Cirillo et al. 1996). rck geninin 5' ucunda 13.9 kb büyüklüğünde bir bölgenin sekans
analizi yapılmış ve pefBACD olarak tanımlanan farklı bir fimbriyal operon içerdiği
belirlenmiştir (Friedrich et al. 1993). pefA geni prob olarak kullanılarak gerçekleştirilen
DNA hibridizasyon denemeleri sonucunda, sadece S. Typhimurium, S. Enteritidis, S.
Choleraesuis ve S. Paratyphi serotiplerinin pef sekansını içerdiği tespit edilmiştir
(Baumler et al. 1997).
Fimbriya içermeyen E. coli suşuna klonlanan pef sekansının birden fazla peritrik
fimbriyanın oluşumuna yol açtığı, geçirimli elektron mikroskopu ile gözlemlenmiştir
(Friedrich et al. 1993, Baumler et al. 1996a). Bu şekilde plazmid kodlu fimbriya içeren
E. coli suşu, hiç fimbriya içermeyen E. coli suşuna kıyasla ince bağırsağın dokusal
kısmına daha etkili bir biçimde tutunabilmektedir (Baumler et al. 1996a). Dış membran
uşer geni olan pefC’de meydana gelen bir mutasyon, pef lokusunu taşıyan E. coli ya da
S. Typhimurium suşlarının insan hücreleri olan HeLa veya T84’e tutunma etkinliğini
değiştirmemektedir. Bu durum plazmidleri giderilmiş Salmonella suşlarının plazmid
içeren suşlar kadar CHO (Çin hamster yumurta hücresi) hücrelerine tutunma etkilerinin
belirlenmesi ile kesinlik kazanmıştır (Lockman and Curtiss 1992, Baumler et al. 1996b,
Tinker et al. 2001, Gebbink et al. 2005). pefC geninde meydana gelen mutasyonun
etkisi aynı zamanda organ (incebağırsak) kültür modelleri ile de incelenmiştir. Bu
modelde enfekte edilmiş BALB/c farelerinin incebağırsakları enfeksiyonun
başlangıcında çıkarılmış ve doku kültürü koşullarına alınmıştır. Bu koşullar altında,
pefC mutasyonunu içeren ve içermeyen doğal tip S. Typhimurium suşu ile beraber, aynı
doku örneği enfekte edilmiş ve mutant suşun ince bağırsağa doğal suşun tutunduğu
kadar etkili tutunamadığı tespit edilmiştir. Ayrıca pefC mutantları sütten kesilmemiş
fare yavrularının kullanıldığı model sistemlerde de incelenmiştir. Bu çalışmalarda
plazmid kodlu fimbriyanın ince bağırsağa tutunmada ve sıvı oluşumunda önemli olduğu
bulunmuştur. Kontrol olarak rck lokusunun 3' ucunda ve fim lokusunda mutasyon içeren
suşlar kullanılmış ve bunlarda sıvı birikiminde herhangi bir değişiklik saptanmamıştır
(Baumler et al. 1996a, Nicholson and Low 2000, Rahman et al. 2000, Zavialov et al.
2007).
23
2.3.4 İnce agregatif fimbriya
E. coli ve S. Typhimurium gibi enterik bakteriler, curli ya da tafi olarak da bilinen hücre
dışı protein doğasında fiber yapılar sentezlemektedir. Bu yapılar hücrelerin topluluk
oluşturma amaçlı iletişime geçmesini ve konakta kolonize olmasını sağlamaktadır
(Zogaj et al. 2001, Gophna et al. 2002, Zogaj et al. 2003). E. coli’de en az 6 proteini
kodlayan csgBA ve csgDEFG genlerinin, S. Typhimurium’da bulunan homologları
agfBA ve agfDEFG olarak tanımlanmıştır. S. Typhimurium’da agf operonu tarafından
kodlanan fibere “ince agregatif fimbriya-tafi”adı verilmiştir (Collinson et al. 1996a,
Romling et al. 1998). Tafi’nin “curli” olarak adlandırılmasının nedeni, hücre dışı
polisakkaritlerin (EPS) yokluğunda bu fimbriyaların kıvırcık morfolojiye sahip
olmalarıdır. EPS varlığında ise fimbriya karmaşık ve düzensiz bir matriks olarak
bulunur. Tafi ve EPS bir arada hücre dışı matriksi oluşturur ve bu matriks, Kongo
kırmızı agarda; kırmızı, düzgün çeperli hücre morfolojisinin oluşmasını sağlar (White et
al. 2003). Hücre dışı matriksin oluşumu için bulunması zorunlu olan tafi (White et al.
2006), çoklu hücresel agregasyonda (Romling et al. 2000), ince zar tabakasının
oluşumunda (Collinson et al. 1993), biyofilm oluşumunda (Austin et al. 1998, Prigent-
Combaret et al. 2000, Gerstel and Romling 2003), çevresel etkilere karşı direnç
gelişiminde (White et al. 2006) ve bitki dokularına tutunmada önemli rol oynar (Barak
et al. 2005). Ayrıca tafi’nin patojeniteyi etkileyen özellikler içerdiği de bilinmektedir.
Tafi, farelerde amilodozise (çözülebilir yapıda olmayan amiloid proteinlerin dokularda
depolanması) (Lundmark et al. 2005) neden olurken, fibronektinlere bağlanarak iltihap
oluşumunu teşvik eder (Bian et al. 2001, Olsen et al. 2002, Persson et al. 2003, Tükel et
al. 2005). Ayrıca patojenin ökaryotik hücrelere tutunma ve istila etme etkisinin tafi
varlığı ile arttığı tespit edilmiştir (Dibb-Fuller et al. 1999, La Regione et al. 2000, Kim
and Kim 2004, Zavialov et al. 2007).
Tafi üretimi; birbirine komşu, ancak birbirinden farklı olan fimbriya biyosentezi ve
montajında ihtiyaç duyulan agfBAC ve agfDEFG operonları tarafından organize
edilmektedir (Collinson et al. 1993, Collinson et al. 1996b). agfA büyük alt üniteyi,
agfB küçük alt üniteyi kodlarken (Bian and Normark 1997, White et al. 2001) agfD, tafi
ifadesini pozitif olarak regüle eden bir transkripsiyonel regülatörü kodlamaktadır
24
(Romling et al. 1998, Gerstel and Romling 2003). Aynı zamanda selüloz, O-Ag (O
antijen kapsülü) kapsülü ve serin hidroksimetiltransferaz regülasyonundan (Romling et
al. 2000, Chirwa and Herrington 2003, Gibson et al. 2006) sorumlu bulunan agfD geni,
biyofilm oluşumunu engelleyecek şekilde negatif regülatör olarak da görev yapmaktadır
(Prigent-Combaret et al. 2001, Gibson et al. 2007). AgfE ve AgfF proteinlerinin
fimbriya montajında oynadıkları rol halen tanımlanabilmiş değildir. Ancak son
zamanlarda AgfE’nin bir şaperon olduğu kararına varılmıştır (Chapman et al. 2002,
Gibson et al. 2007). agfC geninin herhangi bir transkipt oluşturmaması ve bu genin
inaktive edilmesi sonucunda herhangi bir fenotipik değişimin tanımlanamaması
nedeniyle, bu gen “orfC” olarak adlandırılmıştır (Hammar et al. 1995, Collinson et al.
1996a).
Tafi sentezinde CsgA ve CsgB proteinlerinin aynı hücreden ifade edilmesine gerek
yoktur. csgB geni mutasyona uğramış bir hücre; çözülebilir CsgA proteinini hücre
dışına salgılayarak, sadece csgB genini ifade eden bir başka hücrenin tafi sentezini
tamamlamasını sağlayabilmektedir. Hücre içi tamamlama olarak adlandırılabilen bu
olayda çözülebilir CsgA proteinini salgılayan suş verici, hücre yüzeyinde CsgB proteini
bulunduran suş ise alıcı olarak adlandırılır. E. coli’de bu durum hücreler birbirine birkaç
milimetre uzaklıkta geliştiği zaman meydana gelmektedir. S. enterica’da ise hücre içi
tamamlama şeklinde tafi oluşumu LPS içermeyen mutantlarda gerçekleşmektedir. Bu
durum da tafi ifadesini gerçekleştiren LPS içeren doğal suşlar için hücre içi tamamlama
olayının önemine işaret etmektedir. Çünkü tafi, EPS’nin stabilizasyonuna yardımcı
olurken EPS de tafi’nin çevrenin çeşitli olumsuz etkilerinden korunmasına yardımcı
olmaktadır. Böylece Salmonella’nın canlılığını sürdürmesi kolaylaşmaktadır (Hammar
et al. 1996, Chapman et al. 2002, White et al. 2003, Gibson et al. 2006, Zavialov et al.
2007).
Biyofilm oluşumu en az beş basamaktan oluşan karmaşık bir süreçtir. Öncelikle
bakterinin geri dönüşümlü olarak yüzeye tutunması, ardından geri dönüşümsüz
bağlanma, ekzopolisakkarit ve adhezin gibi yapışma özelliği içeren moleküllerin
üretilmesi ile mantar biçimli biyofilm oluşumu ve sonuçta biyofilmin olgunlaşması ve
dayanıklılığının artması gerçekleşir. Biyofilmler bakterilerin birada yaşaması sonucu
25
oluşan, karmaşık üç boyutlu yapıya sahip ve çevresel strese direnç oluşturabilen
yapılardır. Tafi oluşumu S. enteriditis’e teflon ve paslanmaz çelik gibi yüzeylere
tutunma olanağı sağlamakta ve kontaminasyonu kolaylaştırmaktadır. Bu nedenle gıda
endüstrisi ve tıp alanında çeşitli problemlere yol açabilen biyofilm oluşumu, E. coli ve
S. Typhimurium için oldukça önemlidir (Austin et al. 1998, White et al. 2003, Ngwai et
al. 2006).
2.3.5 S. Typhimurium’da Stj fimbriyası
S. Typhimurium genomunda agf (csg), fim, pef, lpf, bcf, saf, stb, stc, std, stf, sth, sti ve
stj olmak üzere 13 adet fimbriyal operonun bulunduğu tespit edilmiştir. stj fimbriyal
operonu, sadece S. Typhimurium’da tanımlanması ve diğer serotiplerde bulunan
fimbriyal operonlar ile hiçbir şekilde homoloji içermemesi ile bilinen fimbriyal
operonlardan ayrılmaktadır (McClelland et al. 2001). Aynı türün farklı serotiplerinde
farklı fimbriyal operonlarının bulunması ve Salmonella üyelerinde bu operonların sık
sık kaybolması veya tekrar ortaya çıkması dikkat çekicidir. Bu durum göz önüne
alındığında evrim sürecinde çeşitliliğin oluşması için, bu gen kümelerinin yatay gen
transferi ile çoklu insersiyon ve delesyon olaylarına maruz kaldığı düşünülmektedir
(Porwollik and McClelland 2003, Reen et al. 2005, Zavialov et al. 2007). S. enterica
serovar Typhimurium LT2 suşu ile yürütülen genom dizi analizi sonucunda stj fimbriyal
operonuna ait 5 adet gen tespit edilmiştir (McClelland et al. 2001). Çizelge 2.2’de stj
fimbriyal operonunda yer alan genler ve özellikleri verilmiştir.
26
Çizelge 2.2 stj fimbriyal operonunda yer alan genler ve bu genlerin özellikleri
Lokus ve Gen ID numarası Özellik
STM4571 - 1256097 (stjE) 3363-4240bç, 190aa, dış membran proteini, E. coli dış membran proteini (AAC76248.1) ile benzer
STM4572 - 1256098 (stjB) 4232-6640bç, 802aa fimbriyal uşer proteini, E. coli dış membran proteini (AAC76248.1) ile benzer
STM4573 - 1256099 (stjC) 6654-7361bç, 235aa, periplazmik şaperon proteini, E. coli şaperonu (AAC76247.1) ile benzer
STM4574 - 1256100 (stjA) 7439-8139bç, 229aa, dış membran proteini, E. coli transkripsiyonel regülatör (AAC76251.1) ile benzer
STM4575 1256101 (stjD) 8176-8870bç, 229aa, dış membran proteini, E. coli transkripsiyonel regülatör (AAC76251.1) ile benzer
bç; baz çifti, aa; aminoasit
27
3. MATERYAL VE YÖNTEM
3.1 Mikroorganizmalar ve Gelişme Koşulları
Doktora tezi kapsamında kullanılan ve genotipik özellikleri ile Çizelge 3.1’de verilen
Salmonella Typhimurium, Escherichia coli suşları ile bir adet bakteriyofaj Ankara
Üniversitesi Biyoloji Bölümü Kültür Koleksiyonu’ndan sağlanmıştır.
Mikroorganizmalar uygun antibiyotikleri içeren LB (Luria-Bertani) broth sıvı
besiyerinde 37 ºC’de 200 rpm çalkalama hızında ve LB agar katı besiyerinde 37 ºC’de
statik olarak geliştirilmiştir.
Çizelge 3.1 Kullanılan mikroorganizmalar ve özellikleri
Mikroorganizma adı Özellik
S. Typhimurium LT2 Doğal tip
S. Typhimurium TH340 pNK972 plazmidi (transpozaz geni) Carbr
S. Typhimurium TH3923 T-POP transpozonu, Carbr, Tetr
S. Typhimurium AJB181 Mudj transpozonu, Kmr
S. Typhimurium AJB254 KIXX Kanamisin kaseti, Kmr
S. Typhimurium IR715 14028 suşunun nalidiksik asit dirençli doğal mutantı, Nalr
S. Typhimurium AJB715 phoN mutantı, phoN::Kmr
E. coli S17 λ pir AJB 217 Konjugasyonda verici suş
E. coli CC118 λ pir Konjugasyonda ara konak suşu
E. coli C211 GST-StjA GST-StjA füzyon proteinini eksprese eden suş, Carbr
E. coli DH5α pFUSE plazmidi, Cmr
фP22 Salmonella fajı Carb: karbenisilin, Tet: tetrasiklin, Km: kanamisin, Nal: nalidiksik asit, KIXX: kanamisin kaseti
28
3.2 Yöntem
3.2.1 Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR)
Polimeraz zincir reksiyonlarında Thecne Thermal Cycler (TC 512, USA) cihazı
kullanılmıştır. Farklı amaçlarla yürütülen polimeraz zincir reaksiyonlarında, kullanılan
pimerler değişmekle birlikte, aşağıdaki sabit koşullar uygulanmıştır (Ausubel et al.
1994):
PCR Karışımı
Şablon DNA 1 µl
100 µM ileri (Fw) primer 1 µl
100 µM geri (Rv) primer 1 µl
Platinum® Taq DNA Polimeraz (High Fidelity) 47 µl
(Invitrogene, Calsbad, CA, USA)
PCR parametreleri
Aşama Sıcaklık ve Süre
1 94 ºC 2 dk
2 94 ºC 30 sn
3 55 ºC 1 dk
4 72 ºC 2 dk
5 72 ºC 10 dk
2-4 arası aşamalar 30 döngü tekrar edilmiştir.
29
3.2.2 PCR ürününun stabilizasyonu için yapılan küt uçlu klonlama (PCR2.1)
Çoğaltılan DNA fragmentleri, stabilizasyonlarının (yüksek oranda üretimi) sağlanması
amacı ile, öncelikle TOPO (PCR2.1) vektör sistemine (Blunt-TOPO Cloning,
Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) klonlandı. Burada çoğaltılan ürünler, daha sonra hedef
vektörlere bölüm 3.2.5 ve 3.2.6’da anlatılan kesim ve bağlanma reaksiyonları
kullanılarak aktarıldı.
TOPO Küt Uçlu Klonlama Reaksiyonu Karışımı
PCR Ürünü (yeni hazırlanmış) 2 µl
Tuz çözeltisi (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 1 µl
PCR2.1 vektör (TOPO, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 1 µl
Destile su 2 µl
Bu reaksiyon karışımı, oda sıcaklığında 5 dk inkübe edildikten sonra buz banyosuna
alındı. Reaksiyon karışımından alınan 2 µl örnek, kimyasal kompetent Escherichia coli
Top 10 hücrelerini içeren (One Shot Chemically Competent E. coli cells; Invitrogen,
Carlsbad, CA, USA) tüp ile (50 µl) karıştırıldı. Bu ortam buz banyosunda 30 dk
tutulduktan sonra, 42 ºC su banyosunda 30 saniye inkübe edildi (sıcaklık şoku). Tekrar
buz banyosuna alınan ortam, burada 3-4 dk bekletildi. Üzerine 500 µl LB broth aktarılıp
37 ºC’de 1 saat çalkalamalı olarak inkübe edildi. İnkübasyon süresi bitiminde
transforme edilen hücreler kanamisin (100 µg/ml; Sigma Chem. Co., USA) ve X-gal
(30 µg/ml; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) içeren LB agar plaklarına ekilerek (200 µl)
37 ºC’de 12 saat inkübe edildi ve beyaz koloniler seçildi (çünkü klonlamanın başarılı
olması halinde vektör içindeki β-galaktozidaz enzim geni bozulmaktadır).
3.2.3 Küçük ölçek plazmid izolasyonu
Küçük ölçek plazmid izolasyonunda kullanılan tüm çözeltiler Qiagen (Valencia, CA,
USA) firmasından sağlandı ve firma tarafından önerilen koşullar kullanıldı. LB broth’ta
30
geliştirilen (% 1 inokülasyon oranı, 37 ºC inkübasyon sıcaklığı, 200 rpm çalkalama hızı
ve 12 saat inkübasyon süresi) bakteri kültürlerinden 4 ml alındı ve 5000 rpm’de 10 dk
santrifüj işlemine tabi tutularak, hücreler çöktürüldü. Hücre çökeltisi 250 µl P1 tampon
(50 mM Tris-Cl; pH 8.0; 10 mM EDTA; 100 µg/ml RNaz A) içerisinde çözüldü. Daha
sonra bu ortama 250 µl P2 (200 mM NaOH; % 1 SDS) konuldu ve elde 6 kez
çevrilerek, yavaş bir şekilde karıştırıldı. Üzerine 350 µl N3 tampon çözeltisi ilave
edilerek aynı karıştırma işlemine tabi tutuldu. Bu bakteri lizatları 13200 rpm’de 10 dk
santrifüj edildi ve oluşan üst sıvı QIAprep (Qiagen, Valencia, CA, USA) kolonlarına
alındı. Bu kolonların içeriği 13200 rpm’de 1 dk santrifüj edildi ve alt sıvı atıldıktan
sonra, kolonlara 500 µl PB tampon uygulandı. Bu ortamlar 13200 rpm’de 1 dk santrifüj
edildi. Alt sıvı atıldı ve kolonlara 750 µl PE tamponu aktarıldı. 13200 rpm’de 1 dk
santrifüj edilen bu ortamlar, alt sıvı atıldıktan sonra, aynı süre ve hızda tekrar santrifüj
işlemine tabi tutuldu. Bu işlem bitiminde kolonlar 1.5 ml’lik mikrosantrifüj tüplerine
yerleştirildi, üzerine 30 µl steril destile su aktarıldı ve 13200 rpm’de 1 dk santrifüj
edildi. Mikrosantrifüj tüplerine geçen sıvı faz, küçük ölçek plazmid izolatları olarak
kullanılana kadar -20 ºC’de saklandı.
LB (Luria-Bertani) Broth ve Agar
Tripton 10 g
Maya özütü 5 g
NaCl 10 g
Destile su 1000 ml
2 N NaOH kullanılarak pH 7.2-7.5 arasına ayarlandı ve 121 ºC’de 15 dakika süre ile
sterilize edildi. Katı ortam için, bu karışıma 15 g/l olacak şekilde agar ilave edildi.
3.2.4 Büyük ölçek plazmid izolasyonu
Büyük ölçek plazmid izolasyonunda kullanılan tüm çözeltiler Qiagen (Valencia, CA,
USA) firmasından sağlandı ve firma tarafından önerilen koşullar kullanıldı. LB broth’ta
31
geliştirilen (% 1 inokülasyon oranı, 37 ºC inkübasyon sıcaklığı, 200 rpm çalkalama hızı
ve 12 saat inkübasyon süresi) bakteri kültürlerinden 100 ml alındı ve 5000 rpm’de 10 dk
santrifüj işlemine tabi tutularak, hücreler çöktürüldü. Hücre çökeltisi 4 ml P1 tampon
içerisinde çözüldü. Üzerine 4 ml P2 tamponu ilave edildi, elde 6 kez çevrilerek
karıştırıldı ve oda sıcaklığında 5 dk tutuldu. Bu süre bitiminde 4 ml P3 tamponu (3.0 M
potasyum asetat, pH 5.5) uygulandı ve aynı karıştırma işlemine tabi tutularak, buz
banyosunda 15 dk bekletildi. Buz banyosundan alınan tüpler 4 ºC’de 13000 rpm’de
30 dk santrifüj edildi (Sorwall RC5C Plus, Asheville, NC, USA). Üst sıvı tekrar 4 ºC’de
13000 rpm’de 15 dk santrifüj edildi (Sorvall RC5C Plus, Asheville, NC, USA). Burada
oluşan üst sıvı, QBT tampon (750 mM NaCl; 50 mM MOPS; pH 7.0; % 15 etanol,
hacim/hacim ve % 0.15 tritonX-100, hacim/hacim) ile dengelenmiş (kolonların
dengelenmesi için, kolonlara 4 ml QBT tampon konularak tamamen akması beklendi)
QIAGEN-tip 100 kolonlara (Qiagen, Valencia, CA, USA) aktarıldı ve sıvının kolondan
geçmesi beklendi. Bu aşamadan sonra kolon iki kez 10’ar ml QC yıkama tamponu
(1.0 M NaCl; 50 mM MOPS; pH 7.0; % 15 izopropanaol, hacim/hacim) ile yıkandı.
Yıkanan kolona 5 ml QF geri kazanım tamponu (1.25 M NaCl; 50 mM Tris.HCl;
pH 8.5; % 15 izopropanaol, hacim/hacim) konuldu ve kolondan DNA alındı. Bu sıvıya
3.5 ml izopropanol ilave edildi ve 4 ºC’de 11000 rpm’de 30 dk santrifüj işlemi yapıldı.
Üst sıvı atıldıktan sonra çökelti % 70 etanol ile yıkandı. Yıkanan ortam +4 ºC’de 11000
rpm’de 10 dk santrifüj edilerek çöktürüldü ve üst sıvı atıldı. Oda sıcaklığında DNA
çökeltisi kurutulduktan sonra (∼ 30 dk) 100 µl steril destile su içerisinde çözüldü. DNA
örnekleri kullanılana dek -20 ºC’de saklandı.
3.2.5 DNA bağlama reaksiyonu (ligasyon)
Agaroz jellerden geri kazanılan, PCR ürünleri ve restriksiyon endonükleaz muamelesi
ile kesilen DNA parçalarının klonlanması ya da yeni bir vektöre aktarılıp tekrar
kesilmesi için, bağlanma reaksiyonları yapıldı. DNA parçalarının bağlanma
reaksiyonlarında T4 DNA ligaz enzimi ve bu enzime ait tampon çözeltileri (Roche
Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) kullanıldı.
32
DNA Bağlanma Reksiyonu Karışımı
Vektör DNA (jelden izole edilen vektör örneği) 2 µl
Kesilen DNA örneği 6 µl
DNA seyreltme tamponu 2 µl
T4 DNA ligaz tamponu (2X) 10 µl
T4 DNA ligaz 1 µl
Önce vektör DNA, DNA parçası ve DNA seyreltme tamponu, tüp içerisinde karıştırıldı.
Ardından T4 DNA ligaz tamponu ve son aşamada da enzim ilave edildi. Bu karışım
16 ºC’de 12-16 saat tutularak bağlanma gerçekleştirildi. Eğer T4 Quick DNA ligaz
(New England Biolabs, Herts, UK) enzimi kullanılmış ise, reaksiyonda kesilen DNA
örneği 8 µl alınmış ve DNA seyreltme tamponu ilave edilmemiştir. Bu reaksiyon için
inkübasyon oda sıcaklığında 5 dk süre ile yapıldı. Oluşturulan vektör son aşamada,
doğrudan elektroporasyon ya da kimyasal transformasyon yolu ile konak hücrelere
aktarıldı.
3.2.6 Restriksiyon endonükleaz enzim kesimleri ve agaroz jel elektroforezi
Araştırmada kullanılan tüm restriksiyon endonükleaz enzimleri ve bu enzimlere ait
tampon çözeltiler New England Biolabs (Herts, UK) firmasından sağlanmıştır. Tüm
kesim reaksiyonları için, bu firma tarafından önerilen ve aşağıda verilen reaksiyon
karışımları kullanıldı:
Restriksiyon Endonükleaz Kesim Reaksiyon Karışımı
DNA (mini ölçek izolasyon) 10 µl
Restriksiyon Endonükleaz Enzimi I 1 µl
Restriksiyon Endonükleaz Enzimi II 1 µl
Restriksiyon Endonükleaz Tamponu (2X) 2 µl
Destile su 6 µl
33
Kesim reaksiyonlarında SmaI ve TaqI hariç diğer tüm restriksiyon endonükleaz
enzimleri için 37 ºC’de 1 saat inkübasyon uygulandı. Bu süreler; SmaI için 25 ºC’de
1 saat, TaqI için ise 65 ºC’de 1 saat olarak alındı. Farklı inkübasyon sıcaklıkları ve
sürelerine ihtiyaç duyan restriksiyon endonükleaz enzimleri için ise, önce düşük
sıcaklıkta aktif enzimin ve ardından da yüksek sıcaklıkta aktif enzimin optimum
inkübasyon koşulları oluşturuldu. Büyük ölçek DNA izolasyon örnekleri için, kesimde
5 µl DNA örneği alındı. Tek restriksiyon endonükleaz enzim kesimi yapıldığı
koşullarda, destile su miktarı 6 µl olarak alındı. Kesim sonuçları 1 kb marker
(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) kullanılmak suretiyle % 1 jel konsantrasyonu ile
hazırlanan agaroz jellerde kontrol edildi. İzole edilen DNA örnekleri jel kuyucuklarına
20 µl olacak şekilde yüklendi. Jel göçünün görülebilmesi için DNA örneklerine 5 µl
Orange-G yükleme tamponu ilave edildi. Agaroz jel elektroforezi 100 V sabit elektrik
akımında ve TAE (Tris-Asetat-EDTA) (Richter 2002) tamponda, 1 saat süreyle yapıldı.
Elektroforez işlemi sonrasında DNA bantları, TAE tampon içerisine 2 µg/ml olacak
şekilde etidyum bromit (Sigma Chem. Co., USA) ilave edilerek 1 saat süreyle boyandı
ve UV ışık altında görüntülenerek fotoğrafları alındı (Kodak Gel Logic 200 Imaging
System).
Tris-Asetat-EDTA (TAE) Tamponu (50X)
Tris.HCl 242 g
Glasiyel Asetik Asit 57.1 ml
EDTA (0.5 M) 100 ml (pH 8.0)
Destile su
pH 8.0
242 g Tris-Base, 700 ml destile suda çözüldü. Ayrı bir erlende 0.5 M EDTA (100 ml)
pH’sı 8.0 olacak şekilde ayarlandı. 700 ml destile su içerisinde eritilen Tris-Base
üzerine 57.1 ml glasiyel asetik asit ilave edilip karıştırıldı. Bu karışımın üzerine pH’sı
8.0’a ayarlanan 100 ml EDTA ilave edilip iyice karıştırıldı ve pH tekrar 8.0’a ayarlandı.
Tamponun son hacmi 1000 ml’ye tamamlandı.
34
Orange-G Yükleme Tamponu
TAE (50X) 6.25 ml
Gliserol 7.50 ml
Orange G 0.10 g
Bidestile Su 36.25 ml
Önce bidestile saf su ile gliserol iyice karıştırıldı. Ardından orange-G (Sigma Chem.
Co., USA) ve 50X TAE tampon ilave edildi. Bu ortam tekrar karıştırıldıktan sonra 1 ml
hacimlere bölündü ve -20 ºC’de saklandı.
3.2.7 Restriksiyon endonükleaz enzim kesimi ile oluşturulan DNA parçalarının ya
da vektörlerin agaroz jelden geri alınması DNA örneklerinin agaroz jel sistemlerinden geri kazanılmasında, Qiaex izolasyon kiti
ve üretici firmanın (Qiagen, Valencia, CA, USA) önerdiği yöntem kullanıldı. DNA
örneklerine ait bantlar bistüri aracılığı ile UV ışık altında (Kodak Gel Logic 200
Imaging System) agaroz jellerden kesilip alındı. Mikrosantrifüj tüplerine konulan bu jel
parçaları tartıldı ve ağırlığının üç katı oranında QXI tamponu (eritme tamponu, Qiagen,
Valencia, CA, USA) (∼ 600 µl) ilave edildi (100 bç ile 4 kb arasındaki DNA örnekleri
için bu oran idealdir). QIAEX II bilyeleri (Qiagen, Valencia, CA, USA) 30 sn
karıştırılıp süspanse edildi ve bu örnekler üzerine (10 µl) aktarıldı. Bu tüpler 50 ºC’de
10 dk tutuldu (10 dk süresince, 2 dk aralıklarla mekanik karıştırıcıda 10’ar sn
karıştırıldı). Bu aşamada rengin sarı oluşu, ortamın doğru pH değerini göstermektedir.
10 dk bitiminde 13200 rpm’de 30 sn santrifüj işlemi uygulandı ve dikkatli bir şekilde
üst sıvı atıldı. Çökelti, bir kez 500 µl QXI (Qiagen, Valencia, CA, USA) ve iki kez de
PE tampon (yıkama tamponu, Qiagen, Valencia, CA, USA) kullanılarak yıkandı.
13000 rpm’de 30 sn santrifüj işlemi uygulanarak çöktürülen örnek, üst sıvı atıldıktan
sonra oda sıcaklığında kurutuldu (10-15 dk). Kuruyarak beyazlaşan çökelti 25 µl steril
destile su içerisinde çözüldü. Örnek oda sıcaklığında 5 dk bekletildikten sonra,
13200 rpm’de 1 dk santrifüj işlemine tabi tutuldu ve DNA’yı içeren üst sıvı (20 µl) yeni
bir mikrosantrifüj tüpüne alındı. DNA ürünü % 1 agaroz jelde kontrol edildi.
35
3.2.8 Konjugasyon
Konjugasyon denemeleri için seçilen verici ve alıcı suş kültürleri, LB broth ortamında
hazırlandı. Konjugal eşleştirme için geç eksponensiyel fazdaki kültürler (37 ºC’de
6-8 saat 200 rpm’de karıştırılarak inkübe edilmek suretiyle üretildi) kullanıldı.
Mikrosantrifüj tüplerine 1 ml olarak alınan kültürler, 13000 rpm’de 30 sn santrifüj
edilerek çöktürüldü. Çöktürülen hücreler, 1 ml 10 mM MgSO4 içerisinde çözüldü. Her
bir suş için alınan 0.5 ml hacimler karıştırıldı ve daha sonra 0.45 µm por çapındaki
membran filtreye emdirildi (Millipore Co. Billerica, MA, USA). Bu işlemi takiben
filtreler LB agar ortamı üzerine kondu ve 37 ºC’de 4 saat inkübe edildi. Eşleştirme
denemelerinden sonra bakteri karışımı 1 ml 10 mM MgSO4 içerisinde çözüldü, PBS
(fosfat ile tamponlanmış tuz çözeltisi) içerisinde seri dilüsyonları hazırlandı ve seçici
antibiyotikleri içeren seçici LB agar ortamlarına ekildi. Yalnız verici ve alıcı suşların
ekildiği LB ortamları ise, şahit olarak kullanıldı. 37 ºC’de 12 saat inkübasyondan sonra
koloni sayımları yapılarak, verici hücre başına konjugasyon sıklığı saptandı (Ausubel et
al. 1994, Camacho and Casadesus 2002).
PBS
NaCl 8 g
KCl 0.2 g
Na2HPO4 1.44 g
KH2P04 0.24 g
Bu içerikler 800 ml destile su içerisinde çözüldükten sonra, 2 N HCl ile pH 7.4’e
ayarlanmış ve hacim destile su ile 1 litreye tamamlanmıştır. Sterilizasyon işlemi
121 ºC’de 15 dk süreyle yapılmıştır.
36
3.2.9 Bakterilerden genomik DNA’nın izolasyonu
Çalışılan bakteri suşunun 5 ml sıvı kültürü; LB broth ortamına % 1 oranında
inokülasyon yapılarak ve 37 ºC’de ve 200 rpm çalkalama hızında 12 saat geliştirilerek
hazırlandı. Bu süre bitiminde 1.5 ml kültür mikrosantrifüj tüplerine alındı ve
12000 rpm’de 2 dk santrifüj edilerek bakteri hücreleri çöktürüldü. Üst sıvı ortamdan
alındıktan sonra, bakteri çökeltisi 567 µl Tris-EDTA (TE) tampon içerisinde çözüldü.
Üzerine 25 µl % 10 sodium dodezil sülfat (SDS) ve 5 µl proteinaz K (20 mg/ml, Sigma
Chem Co., USA) aktarılıp karıştırıldı ve 37 ºC’de 1 saat tutuldu. Ortama 100 µl 5 M
NaCl ilave edilerek karıştırıldı. 80 µl CTAB (Hekzadezil Trimetil Amonyum
Bromit)/NaCl çözeltisinin ilavesinin ardından, kesik mikropipet uçları kullanılarak,
beyaz partikül yapısı oluşuncaya kadar iyice karıştırılan tüpler, 65 ºC’de 10 dk tutuldu.
Bu ortam üzerine 0.75 ml kloroform/izoamil alkol (24/1 hacim/hacim) aktarıldı ve
karıştırıldı. 12000 rpm’de 5 dk santrifüj edilen ortamda üst faz yeni mikrosantrifüj
tüplerine alındı. Alınan sıvı faz üzerine 750 µl fenol/kloroform/izomil alkol (25/24/1
hacim/hacim/hacim) ilave edildi ve 12000 rpm’de 5 dk santrifüj işlemine tabi tutuldu.
Santrifüj işlemi sonunda tüplerdeki üst sıvı yeni mikrosantrifuj tüplerine aktarıldı ve bu
sıvının üzerine, hacminin 0.6’sı (∼350 µl) oranında izopropanol ilave edildi. Ortam,
beyaz çökelti oluşuncaya dek, öne arkaya hareket ettirilerek elle karıştırıldı. Çökelti
oluştuğunda tüpler mikrosantrifüje yerleştirildi ve 12000 rpm’de 5 dk santrifüj işlemi
yapıldı. Üst sıvı döküldükten sonra çökelti % 70 etanol ile yıkandı (350 µl) ve tekrar
12000 rpm’de 5 dk santrifüj işlemine tabi tutuldu. Üst sıvı dikkatli bir şekilde ortamdan
uzaklaştırıldıktan sonra oda sıcaklığında kromozomal DNA örneği kurutuldu. Son
aşamada örnek 100 µl TE tampon içerisinde yaklaşık bir saat muamele edilerek çözüldü
(Ausubel et al. 1994, Baumler et al. 1996c, Richter 2002).
CTAB (Hekzadezil Trimetil Amonyum Bromit) / NaCl Çözeltisinin Hazırlanması
Önce 4.1 g NaCl 80 ml destile su içerisinde çözüldü ve üzerine 10 g CTAB yavaş yavaş
eklenerek karıştırıldı. CTAB’in çözülmesi için çözelti aralıklarla 65 ºC’ye kadar ısıtıldı.
Son aşamada toplam çözelti hacmi destile su ile 100 ml’ye tamamlandı.
37
Tris (Tris Hidroksimetil Amino Metan) / EDTA (Etilen Diamin Tetraasetik Asit)
Çözeltisi
Tris 1.21 g
EDTA 0.37 g
Destile Su 1000 ml
pH 7.4 (2 N HCl kullanıldı)
Sterilizasyon işlemi 121 ºC’de 15 dk süre ile yapıldı.
3.2.10 Southern lekeleme (blot)
Kromozomal DNA restriksiyon endonükleaz (stjA için EcoRI) fragmentleri 70 voltta,
% 0.7 agaroz jellerde 3 saat yürütüldü. Jel, fotoğrafları alındıktan sonra depurinasyon
çözeltisi içerisine kondu (0.25 M HCl), karıştırıcı üzerine yerleştirilen bu ortamda,
10 dk sonunda çözelti yenilendi ve toplam 20 dk depurinasyon işlemi yapıldı.
Depurinasyon çözeltisinden alınan jel, denatürasyon çözeltisine (0.5 M NaOH; 1.5 M
NaCl) kondu ve burada da toplam 20 dk aynı işleme tabi tutuldu. Denatürasyonun
ardından nötralizasyon çözeltisine (0.5 M Tris; pH 7.0; 3 M NaCl) alınan jel burada da
aynı süre ile karıştırılarak bekletildi. Nötralize edilen jellerden DNA transferi, naylon
membran sistemlerine yapıldı. Öncelikle bir tampon haznesine (payreks ya da plastik)
yaklaşık tabandan 1.5 cm yüksekliğe kadar 20X SSC çözeltisi (3M NaCl, 0.3M Sodyum
sitrat, pH 7.0) kondu. Bu haznenin üzerine yerleştirilen cam taşıyıcıya, haznedeki
tampon ile iki ucu da temas edecek şekilde bir Whatman kağıdı (Whatman 3MM
Chromatography Paper, Whatman International Ltd., Maidstone, England) kondu.
Hazırlanan jel dikkatli bir şekilde bu filtre kağıdı üzerine alındı. Jel boyutunda kesilen
ve 5X SSC çözeltisinde ıslatılan pozitif yüklü naylon membran (Positively Charged
Nylon Transfer Membran, Boehringer Mannheim, Germany) jel üzerine konduktan
sonra, yine 5X SSC çözeltisinde ıslatılan 3 parça Whatman kağıdı (Whatman 3MM
Cellulose Paper, Whatman International Ltd., Maidstone, England) ile kaplandı. Bir
cam pipet bu Whatman kağıtları üzerinde yuvarlanarak, içeride oluşan hava kabarcıkları
giderildi. Bu katmanların kenarı parafilm ile kaplanarak, transfer süresince jelin
38
kenarlarından sıvı akımı engellendi. Son aşamada yaklaşık 10 cm kalınlığında emici
kağıt en üste kondu ve ağırlık olarak da 2 adet 500 ml sıvı içeren şişe ile bastırıldı. Bu
sandviç 1 gece oda sıcaklığında tutuldu. Transfer gerçekleştiğinde membran üzerindeki
her şey kaldırıldı ve membran saran streç ile sarıldı (burada ıslak kalması sağlanıyor).
Bu durumdaki naylon membran çapraz bağlayıcıya (UV Stratalinker 1800, Stratagene,
La Jolla, CA, USA) yerleştirildi ve DNA’nın membrana çapraz bağlanması
gerçekleştirildi (0.12 joule, ∼35 sn). Su banyosunda 50 ºC’ye kadar ısıtılan ön
hibridizasyon çözeltisi [25 ml 5X SSC; % 1 SDS; % 5 dekstran sülfat; Blok ayıracı, %
0.5 (ağırlık/hacim), (GE healthcare, Amersham Biosciences, New Jersey, USA)],
transfer yapılan naylon filtrenin rulo edilerek yerleştirildiği hibridizasyon tüpüne kondu
ve bir adet de denge tüpü hazırlandı. Bu tüpler hibridizasyon inkübatörüne (VWR
International, West Chester PA, USA) yerleştirildi ve döndürülerek 65 ºC’de 1 saat
tutuldu. Ön hibridizasyon süresi dolmadan 15 dk önce prob (sonda) (Gene Images
Random Prime Labelling, GE healthcare, Amersham Biosciences, New Jersey, USA)
hazırlandı. Buna göre stjA geni PCR ürünü 2-25 ng/µL konsantrasyon olacak şekilde su
ile (toplam hacim en az 20 µL) seyreltildi. DNA örneği kaynar su banyosunda 5 dk
denatüre edildikten sonra buz üzerine yerleştirildi. 1.5 ml’lik bir mikrosantrifüj tüpü
içerisine; 10 µl nükleotit karışımı, 5 µl primer, 1 µl klenow enzim çözeltisi, 50 ng
denatüre DNA ilave edildikten sonra, karışım toplam hacim 50 µl olacak şekilde su ile
tamamlanarak, 37 ºC’de 1 saat tutuldu (Hazırlanan prob bu haliyle hemen kullanılabilir
ya da son konsantrasyonda 20 mM olacak şekilde EDTA ilave edilerek -20 ºC’de
tutulabilir). Hazırlanan prob üzerine 5 ml ön hibridizasyon çözeltisi konuldu, 5 dk
kaynar su banyosunda tutuldu ve 5 dk buz banyosuna alındı. Ön hibridizasyon süresi
bitiminde; membranın bulunduğu tüpe, probu içeren ön hibridizasyon çözeltisi aktarıldı.
Bu tüpe karşılık da bir denge tüpü hazırlandı, hibridizasyon inkübatörüne yerleştirildi ve
döndürülerek 65 ºC’de 1 gece tutuldu. Bu süre sonunda prob çözeltisi yeni bir tübe
alınarak, aluminyum folyo ile kaplandı ve -20 ºC’ye kondu. Naylon membran ilk
yıkama çözeltisine (1X SSC, % 0.1 SDS) alındı ve 65 ºC’de 15 dk bekletildi. Ardından
sıvı akıtıldı, membrana ikinci yıkama çözeltisi uygulandı (0.5X SSC; % 0.1 SDS) ve
65 ºC’de 15 dk tutuldu. Bu süre bitiminde ortamdan alınan naylon membran 1:10
oranında A tamponunda (100 mM Tris.HCl; 300 mM NaCl; pH 9.5) seyreltilmiş blok
ayıracı içeren hazneye yerleştirildi. Karıştırıcı üzerinde, oda sıcaklığında 1 saat tutuldu.
39
Bu işlem esnasında, % 0.5 buzağı serum albumini içeren 50 ml A tamponu içerisine,
0.01 ml antifloresan HRP antibadisi (Gene Images, GE Healthcare, Amersham
Biosciences, New Jersey, USA) aktarıldı (bu şişe daima aluminyum folyo ile kaplı
tutuldu). İnkübasyon süresi bitiminde, hazırlanan antibadi naylon membran üzerine
aktarıldı. İnkübasyon oda sıcaklığında 1 saat yapıldı. 1 saat sonunda bağlanmayan
antibadi, solüsyonun dökülmesi suretiyle ortamdan uzaklaştırıldı ve 10 dakikalık
sürelerle membran, % 0.3 oranında Tween 20 içeren A tampon içerisinde üç kez
yıkandı. Yıkama süresince yavaş bir karıştırma yapıldı. Bu ortamdan alınan membran
saran streç üzerine yerleştirildi ve tüm tamponun membran üzerinden streçe akması
sağlandıktan sonra üzeri belirleme ayıracı (Gene Images Direct Labeling and Detection
System; GE Healthcare, Amersham Biosciences, New Jersey, USA) ile kaplandı. Oda
sıcaklığında 2-5 dk yapılan bu uygulama sonunda belirleme çözeltisi akıtıldı ve
membranın ikinci yüzü de streç ile kaplanarak X-Ray film (Kodak Biomax MS film;
Kodak Health Imaging, Chelon, France) içeren kasete (Spectronics Co., Wetsbury, New
York, USA) kondu (naylon mebranın DNA transfer edilen yüzünün X-Ray film ile
temas etmesi sağlandı). Burada 15 dk tutuldu ve karanlık odada açılarak developer’a
(X-Ray Developer LX-24, Eastman Kodak Co., New York, USA) yerleştirildi ve
lekelemeler tanımlandı. İşlemi tamamlanan lekeleme membranları streç ile sarılı olarak
-20 ºC’de saklandı (Southern 1975, Sambrook and Russell 2001).
3.2.11 Glutatiyon (S) transferaz füzyon proteini üretimi
Stj proteininin in-vitro koşullarda üretilmemesi nedeniyle, glutatiyon (S) transferaz
kullanılarak (GST), füzyon proteini (GST-StjA) üretilmiştir. Bu yöntemde stjA geni
uygun primerler kullanılarak, polimeraz zincir reaksiyonu ile çoğaltılmıştır. stjA geni
için ileri primer: 5'CGGGATCCGTTGAATCCACTGCTGTATTAAAACTGAC3'
BamHI kesim bölgesi; stjA geni için geri primer:
5'GGAATTCTTACAGATATACGAGTGTAAAGGTCGC3' EcoRI kesim bölgesi
içerecek şekilde düzenlendi. Primer dizaynında MacVector (Accelryrs Software Inc.,
San Diego, CA, USA) programı kullanıldı. Tüm primerler, Operon Technologies
(Huntsville, AL, USA) firması tarafından üretildi.
40
PCR ürünü, PCR2.1 (Topo-TA-klonlama kiti, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)
vektörüne klonlandı. Klonlanan vektör E. coli Top10 hücrelerine, üretici firma
önerilerine uyularak, transforme edildi. Daha sonra QIAprep Spin Miniprep Kit
(Qiagen, Valencia, CA, USA) aracılığı ile izole edilen plazmidten, uygun restriksiyon
enzimleri (BamHI and EcoRI) ile kesilerek çıkarılan PCR ürünü, yine aynı enzimlerle
kesilen pGEX-4T-2 (Amersham, Pharmacia, New Jersey, USA) vektörüne klonlandı.
Oluşturulan bu yeni plazmid, E. coli DH5α hücrelerine transforme edildi
(transformantlar, 100 µg/ml amfisilin içeren LB agar ortamlarında seçildi) ve IPTG
(isopropil-beta-D-tiogalaktopiranozit) kullanılarak protein üretimi teşvik edildi. Bu
yolla üretilen protein, proteaz inhibitor kokteyli (Sigma Chem. Co., USA) kullanılarak
glutatiyon sefaroz (Amersham, Pharmacia, New Jersey, USA) afinite kromotografisi
tekniği ile saflaştırıldı (Humphries et al. 2003).
3.2.12 Glutatiyon S transferaza (GST) bağlanan füzyon proteinlerinin büyük ölçek
izolasyonu 100 µg/ml karbenisilin içeren (E. coli DH5α suşunun içerdiği antibiyotik dirençlilik) bir
adet 50 ml LB ortamı (10 mM glukoz ilave edilerek hazırlandı) GST vektör plazmid
pGEX-4T-2’yi içeren E. coli DH5α suşu ile % 1 oranında inoküle edildi ve 37 ºC’de
200 rpm çalkalama hızında 12 saat geliştirildi. 50 ml kültür, bir litrelik yeni hazırlanan
LB ortamına aktarıldı ve aynı inkübasyon koşullarında 3-4 saat tutuldu. Bu süre,
ortamın optik yoğunluğunun (OD600) 0.4-0.6 değerlerine ulaşması esas alınarak
tamamlandı. İnkübasyon süresi tamamlandığında 1 litrelik kültür ortamına 1 ml (1M)
IPTG (izopropil-beta-D-tiogalaktopiranozit, Ambion Inc., Austin, TX, USA) ilave
edilerek, diğerine ise hiç bir işlem yapılmadan, 4 saat daha inkübasyona devam edildi.
Nihai gelişme ortamlarından 0.5 ml örnek alındıktan sonra, 5000 rpm’de 10 dk (+4 ºC)
santrifüj işlemi ile hücreler çöktürüldü. Üst sıvı atıldı ve hücre çökeltileri buz
banyosunda 30 dk bekletildi. İlk gün yapılan bu işlemlerden sonra örnekler -20 ºC’de
saklandı. İkinci gün, 2 ml proteaz inhibitörü (Protease Inhibitor Coctail, Calbiochem,
Darmstadt, Germany) içeren 15 ml fosfat ile tamponlanmış tuz çözeltisinde (PBS)
hücreler süspanse edildi. Bu ortamdaki hücreler basınç (12000 psi) uygulaması ile
parçalandı (French Press, Thermo Electron Co., Waltham, MA, USA). Parçalanan hücre
41
kalıntıları 15000 rpm’de 30 dk santrifüj edilerek çöktürüldü. Bu süreçte glutatiyon
sefaroz 4B kolonu (GE Healthcare Life Sciences, New Jersey, USA) firma önerilerine
göre hazırlandı. Bu amaçla glutatiyon sefaroz iyice karıştırıldı ve içinden 1.5 ml
alınarak 50 ml’lik santrifüj tüpüne aktarıldı. Bu ortam 1580 rpm’de 5 dk santrifüj
işlemine tabi tutuldu ve üst faz (∼200 µl) atıldıktan sonra, buz banyosunda soğutulmuş
20 ml PBS, glutatiyon sefaroz üzerine aktarıldı. Tekrar 1580 rpm’de 5 dk santrifüj
işlemi uygulanıp üst faz uzaklaştırıldıktan sonra sefaroz üzerine 2 ml PBS aktarıldı.
French pres’de (French Press, Thermo Electron Co., Waltham, MA, USA)
parçalandıktan sonra çöktürülen hücre kalıntılarının üst sıvısı, hazırlanan glutatiyon
sefaroz ile muamele edildi ve 30 dk +4 ºC’de sallanarak karıştırıldı. Bu karışım
polipropilen kolona (Qiagen Inc., Valencia, CA, USA) uygulandı ve tam akış
gerçekleşene kadar beklendi. Akan sıvı, fraksiyonlar olarak alındı ve -20 ºC’de saklandı.
Kolon matriksi 3 kez 10’ar ml’lik soğuk PBS solüsyonu ile yıkandı. Burada oluşan
yıkama fraksiyonları 1, 2, 3 şeklinde işaretlenerek -20 ºC’de saklandı. Kolonun alt
kapağı bu aşamada kapatıldı ve kolona sefaroz geri kazanma tamponu (0.031 g
glutatiyon, 9.5 ml destile su ve 0.5 ml 1M Tris, pH 8.0) uygulanarak oda sıcaklığında
10 dk bekletildi. 10 dk sonunda alt kapak açılarak sıvı toplandı. Bu işlem 3 kez
tekrarlandı ve her aşamada geri kazanma sıvısı da 1, 2, 3 şeklinde işaretlenerek farklı
tüplere alındı. Tüm fraksiyonlar kullanılana dek -20 ºC’de saklandı. Saflaştırma sodyum
dodezil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) yöntemi ile kontrol edildi.
Bunun için, her fraksiyondan alınan 20 µl örnek, 20 µl 2X SDS yükleme tamponu (2X
SDS yükleme tamponu, bu tamponun 10X stok çözeltisinden hazırlandı. 10X SDS
yükleme çözeltisi: 0.5 M Tris-HCl, pH 6.8; 1 g SDS; 10 ml gliserol; 2.5 ml 2-
merkaptoetanol; 50 mg bromfenol mavisi) ile karıştırıldı ve 5 dk kaynar su banyosunda
tutulduktan sonra, SDS-PAGE jel kuyucuklarına 10 µl olacak şekilde yüklendi. İlk gün
alınan IPTG indüklenmiş ve indüklenmemiş hücreler için örnekler, 0.5 ml hacimlerden
hazırlandı. 12000 rpm’de 2 dk santrifuj edilerek çöktürülen 0.5 ml bakteri kültürü, 50 µl
steril destile suda çözüldü ve 50 µl 2X SDS yükleme tamponu ile karıştırıldı. Bu
örnekler 5 dk kaynar su banyosunda tutulduktan sonra, SDS-poliakrilamit jel
kuyucuklarına, 10 µl olacak şekilde yüklendi (Humphries et al. 2003).
42
3.2.13 StjA proteini için poliklonal antibadilerin üretimi
Bölüm 3.2.11 ve 3.2.12’ de tanımlandığı gibi, üretilerek saflaştırılan GST ile füzyona
uğratılmış StjA proteinine özgü antibadi üretimi için; 100 mg protein örneği, 500 ml
fosfat ile tamponlanmış tuz çözeltisinde (PBS) çözüldü ve üzerine 500 ml bakteri içeren
Freund immün sistem uyarıcısı (Pacific Immunology Corp., Ramona, CA, USA) ilave
edildi. Hazırlanan örnek derialtı enjeksiyonu yöntemi ile Yeni Zelanda tavşanlarına
(Western Oregon Rabbitt Company, Philomath, USA) verildi ve 15 gün beklendi. Bu
süre bitiminde aynı şekilde hazırlanan, ancak bakteri içermeyen Freund immün sistem
uyarıcısı (Pacific Immunology Corp., Ramona, CA, USA) ile muamele edilen
örneklerle ve iki hafta aralıklarla 5 kez daha enjeksiyon yapıldı. İmmünizasyon işlemi
tamamlandığında tavşanların tüm kanı alınarak koagülasyonun oluşumu için 37 ºC’de
1 saat tutuldu. Koagüle olan örneklere 4000 rpm’de 10 dk (oda sıcaklığında) santrifüj
işlemi uygulandı ve üst sıvı (serum, 70-80 ml) alındı (Harlow and Lane 1988).
3.2.14 Antibakteriyal antibadilerin antiseradan ayrılması
Yeni Zelanda tavşanlarında, GST-StjA proteinine karşı üretilen antiseralardan, spesifik
olmayan antibakteriyel antibadilerin ayrılmasında; sadece GST içeren pGEX vektöre
sahip E. coli DH5α suşu kullanıldı. Bu suş, 100 µg/ml karbenisilin içeren iki adet 50 ml
LB ortamına % 1 oranında inoküle edildi ve 37 ºC’de ve 200 rpm çalkalama hızında
12 saat geliştirildi. Her bir 50 ml kültür, ikişer litrelik aynı içeriğe sahip LB ortamlarına
aktarıldı ve aynı inkübasyon koşullarında optik yoğunluk (OD600) değeri 0.6 oluncaya
kadar tutuldu (yaklaşık 1.5 saat). Bu ortamlardan alınan 1 ml hacimdeki örnekler,
12000 rpm’de 2 dk santrifuj edilerek çöktürüldü ve üst sıvı atıldıktan sonra -80 ºC’de
saklandı. 2 lt’lik kültür ortamlarının herbirine 1 ml (1M) IPTG (izopropil-beta-D-
tiogalaktopiranozit, Ambion Inc., Austin, TX, USA) ilave edilerek, aynı koşullarda
4 saat daha tutuldu. İnkübasyon süresi bitiminde yine ortamlardan 1 ml örnekler alınıp,
12000 rpm’de 2 dk santrifüj edilerek çöktürüldü ve üst sıvı atıldıktan sonra -80 ºC’de
saklandı. 2 lt hacimdeki kültür ortamlarından biri otoklavda 121 ºC’de 1 saat süreyle
sterilize edildi. Diğerine ise, 13.5 ml % 38 formaldehit ilave edilerek 37 ºC’de 2 saat
43
karıştırıldı (200 rpm karıştırma hızında). Her bir 2 lt’lik kültür ortamı, 5000 rpm’de
20 dk santrifüj işlemine tabi tutularak çöktürüldü. Bu işlem sonunda üst sıvı atıldı ve
hücre çökeltisi 200 ml fosfat ile tamponlanmış tuz çözeltisinde (PBS) süspanse edildi.
Çözelti, 25’er ml hacimlerde sekiz farklı tübe bölündü. Burada yıkanan hücreler tekrar
santrifüj edilerek çöktürüldü (4000 rpm, +4 ºC, 10 dk). Üst sıvı atıldı ve hücre
çökeltileri kullanılana kadar -20 ºC’de saklandı. Bu örneklere uygulanacak olan ve Yeni
Zelanda tavşanlarında üretilen antisera, 1:5 oranında PBS ilave edilerek seyreltildi ve
içerisine % 1 oranında sodyum azid ilave edildi. Hazırlanan antisera (5 ml) ile, her bir
sekiz tübe bölünen hücrelere ait ilk tüp içeriği birleştirildikten sonra, StjA proteinleri
dışında antiserada bulunan antibakteriyel antibadilerin hücrelere tutunması için +4
ºC’de 8 saat karıştırma işlemi yapıldı. Bu süre bitiminde hücreler 4000 rpm’de 10 dk
santrifuj edilerek (+4 ºC’de) çöktürüldü ve üst sıvı, hücreleri içeren 2. tübe aktarıldı.
Aynı işlemler, sırayla her bir kültürden hazırlanan diğer 7 tüpte de tekrar edilerek,
spesifik olmayan antibakteriyel antibadilerden temizlenmiş antisera elde edildi (Gruber
and Zingales 1995).
3.2.15 Sodyum dodezil sülfat poliakrilamit jel elektroforezi (SDS-PAGE)
Protein jel, aşağıda belirtildiği şekilde ve % 12 ayırıcı jel konsantrasyonu esas alınarak
hazırlandı. Jel plakaları arasına önce: 6.0 ml akrilamit (% 30) / bisakrilamit (% 8);
3.75 ml 4x Tris-Cl/SDS, pH 8.8; 5.25 ml steril destile su; 50 µl % 10 amonyum
persülfat ve 10 µl TEMED (N’N’N’N’-Tetra-metiletilendiamin) içeren ayırıcı jel, tarak
yerleştirme bölgesinin 1 cm altına gelinceye kadar döküldü. Bu jelin üzerine, yığma
jelin döküleceği yere kadar (tarak yerleştirme seviyesi) steril destile su ilave edilerek,
polimerizasyonun gerçekleşmesi için 30-45 dk beklendi. Polimerizasyonun
gerçekleşmesinden sonra su akıtıldı ve tarak yerleştirme bölgesi seviyesine kadar;
0.65 ml akrilamit (% 30) / bisakrilamit (% 8), 1.25 ml 4x Tris-Cl/SDS, pH 6.8, 3.05 ml
steril destile su, 25 µl amonyum persülfat ve 5 µl TEMED içeren yığma jel döküldü. Bu
aşamada tarak yerleştirildi ve yığma jelin polimerizasyonu için 15-20 dk beklendi.
Polimerizasyon tamamlandığında Tris-Glisin tampon (elektroforez tamponu) dökülen
tanklara jeller yerleştirildi ve taraklar çıkarıldı. Tarak çıkarıldıktan sonra 10 µl protein
44
ve protein standart (Biorad Laboratories, Hercules, CA, USA) örneği yüklendi.
Elektroforez işlemi, 100 voltta 1.5 saat süreyle yapıldı. Örnekler ayırma jelin sonuna
geldiğinde elektrik akımı kesildi, jel tanktan çıkarıldı ve Commasie Brilliant Blue boya
çözeltisinde boyandı. Western lekelemede kullanılacak jellerde boyama işlemi
yapılmamıştır (Laemmli 1970).
4x Tris-Cl/SDS (pH 8.8)
Tris 91 g
Destile su 300 ml
pH 8.8 (1 N HCl ile)
Destile su ile toplam hacim 500 ml’ye tamamlandı ve 2 g SDS ilave edilip çözüldü.
4x Tris-Cl/SDS (pH 6.8)
Tris 6.05 g
Destile su 40 ml
pH 6.8 (1 N HCl ile)
Destile su ile toplam hacim 100 ml’ye tamamlandı ve 0.4 g SDS ilave edilip çözüldü.
% 30 Akrilamit / % 0.8 N, N' Bisakrilamit Çözeltisi
30 g akrilamit, 0.8 g N, N' bisakrilamit, toplam hacim 100 ml olacak şekilde destile su
içerisinde çözüldü. Çözelti 0.45 µm por çapındaki membran filtrelerden (Millipore Co.,
Billerica, MA, USA) geçirilerek sterilize edildi. Kullanılana kadar +4 ºC’de ve
karanlıkta saklandı.
Tris-Glisin Tamponu (5X)
Tris 15.1 g
Glisin 94 g
SDS (% 10) 50 ml
Bu karışım 700 ml destile su içerisinde çözüldü ve destile su ile toplam hacim 1000
ml’ye tamamlandı.
45
Commasie Brilliant Blue Boya Çözeltisi
Commasie Brilliant Blue R250 1 g
Metanol 400 ml
Glasiyel Asetik Asit 100 ml
Destile Su 500 ml
Şekil 3.1 Protein büyüklüklerinin saptanmasında kullanılan protein standardının jel göç planı (Biorad Laboratories, Hercules, CA, USA).
3.2.16 Western lekeleme (blot)
Protein belirlemede yarı sulu Western lekeleme yöntemi kullanıldı. Bu işlem için önce
SDS-PAGE jeli boyutunda kesilen Immobilon-P (PVDF) membran (Millipore Co.,
Billerica, MA, USA) metanol içerisine konarak 5 dk oda sıcaklığında karıştırma işlemi
uygulandı. Bundan sonra 4 kez 5’er dk’lık sürelerle bidestile steril saf su ile,
karıştırılarak yıkandı. Transfer tampon çözeltisi (20 ml 5X Tris-Glisin Tamponu,
20 mM Metanol, 6 ml Bidestile Saf Su) ile yıkanan Whatman kağıdı (Whatman 3MM
Cellulose Paper, Whatman International Ltd., Maidstone, England) Biorad (Trans-Blot
46
SD, Semi-Dry Cell) transfer hücresi (Biorad Lab. Inc., Richmond , CA, USA) alt
yüzeyine konuldu. Islatılarak, aynı tampon içerisinde yıkanan membran bu Whatman
kağıdı üzerine yerleştirildi ve üzerine jel kondu. Cam bir pipet jel üzerinde hafif bir
şekilde yuvarlanarak hava kabarcıkları alındı ve en üste transfer tampon çözeltisi
içerisinde ıslatılan 3 parça Whatman kağıdı (Whatman 3MM Cellulose Paper, Whatman
International Ltd., Maidstone, England) konuldu. Transfer hücresinin üst kapağı
kapatıldıktan sonra, 60 dk süresince sabit elektrik akımı (konulan jel başına 150 mA ve
en fazla 15 Volt) uygulandı. Transfer işleminden sonra membran 100 ml blok tampon
çözeltisine (25 g yağsız süt tozu; 250 µl Tween-20; 500 ml PBS, pH 7.4) ve karıştırıcı
üzerinde 1 saat ya da 1 gece (12 saat) inübasyona tabi tutuldu. 1 saatlik inkübasyonlar
oda sıcaklığında, 1 gecelik inkübasyonlar +4 ºC’de ve blok tampon çözeltisine % 0.1
oranında sodyum azid ilave edilerek gerçekleştirildi. Ardından membran, 50 ml blok
tampon çözeltisi içerisine 50 µl primer antibadi konarak hazırlanan primer antibadi
(StjA proteinine karşı Yeni Zelanda tavşanlarında üretilen antibadi) çözeltisi ile
muamele edildi ve oda sıcaklığında 1 saat yavaş bir şekilde karıştırılarak inkübasyona
tabi tutuldu. Primer antibadi uygulaması bitiminde membran, her seferinde blok tampon
içerisinde 5 dk süresince karıştırılarak (oda sıcaklığında) 3 kez yıkandı. Buradan alınan
membran ikinci antibadi (Goat anti-rabbit IgG, GAR-AP, Biorad Lab. Inc., Richmond
CA, USA) çözeltisini (50 ml blok tampon çözeltisi içerisine 2.5 µl ikinci antibadi
konarak hazırlandı) içeren plastik kaba aktarıldı ve aynı koşullarda 1 saat daha tutuldu.
İkinci antibadi uygulanan membran, 3 kez blok tampon ve 3 kez de steril PBS çözeltisi
kullanılarak son yıkama işleminden geçirildi (Membran sistemleri yeni işlem için
plastik kaplara transfer edilmeden önce daima bu kaplar % 70 etanol ile temizlendi).
Buradan alınarak saran streç membrana yerleştirilen transfer membranı üzerine Biorad
Immune-Star substratı uygulandı ve 1 dk oda sıcaklığında bekletildikten sonra substrat
akıtıldı. Membran naylon koruyucu içerisine kondu ve X-Ray film (Kodak Biomax MS
film; Kodak Health Imaging, Chelon, France) içeren kasete (Spectronics Co., Wetsbury,
New York, USA) yerleştirildi (transfer yüzeyi film ile temas edecek şekilde). Gelişim
için farklı sürelerde beklenen filmler developer’a (X-Ray Developer LX-24, Eastman
Kodak Co., New York, USA) yerleştirildi ve lekelemeler tanımlandı (Burnette 1981).
47
5XTris-Glisin Tampon Çözeltisi
Tris 15.1 g
Glisin 94.0 g
SDS (% 10) 50 ml
Bu içerikler 700 ml saf su içerisinde çözüldükten sonra toplam hacim 1 litreye
tamamlanmıştır.
3.2.17 Kimyasal kompetent (transformasyon oranı yüksek) hücre hazırlanması
Aktif kültürlerden LB broth ortamlarına % 1 oranında inokülasyonlar yapılarak
hazırlanan E. coli kültür ortamları, çalkalamalı inkübatörde (200 rpm) 37 ºC’de 12 saat
tutularak bakteriyel gelişim sağlandı. Bu kültürlerden 100 ml LB besiyerine 1/100
oranında ekim yapıldı ve optik yoğunluk (OD600) 0.4-0.5 düzeyine ulaşıncaya kadar
bakteriyel üremenin gerçekleşmesi için 37 ºC’de çalkalamalı inkübasyona tabi tutuldu
(200 rpm’de 3-3.5 saat). Bu süre sonunda kültürleri içeren tüpler 5 dk buzda bekletildi.
Soğutulan kültürler 4 ºC’de 5000 rpm’de 20 dk santrifüj edilerek çöktürüldü.
Çöktürülen hücreler 40 ml TBF1 çözeltisi kullanılarak süspanse edildi. Bu hücre
süspansiyonları 5 dk buz banyosunda bekletildi. Bu süre sonunda 4 ºC’de 5000 rpm’de
20 dk santrifüj işlemi gerçekleştirildi. Hücre çökeltisi, TBF2 çözeltisi kullanılarak
süspanse edildi ve tüpler 15 dk buz banyosunda tutuldu. Hazırlanan kompetent hücre
süspansiyonları 100 µl’lik hacimler halinde steril mikrosantrifüj tüplerine dağıtıldı ve
kullanılana dek -80 ºC’de korundu (Nishimura et al. 1990, Dorsey et al. 2005).
TBF1
Potasyum Asetat (CH3COOK) 2.94 g (30mM)
Potasyum Klörür (KCl) 7.46 g (100mM)
CaCl2.2H20 1.47 g (10mM)
MnCl2.4H20 9.90 g (50mM)
Destile su 1000 ml
pH 5.2 ( 2 N HCl)
Ortam 0.22 µm por çapında filtreden (Sartorius/Germany) geçirilerek sterilize edildi.
48
TBF2
MOPS (4-Morfolin propan sülfonik asit -omnipure usa-) 2.09 g (10mM)
CaCl2.2H20 11.03 g (75mM)
Potasyum Klorur (KCl) 0.75 g (10mM)
Gliserol 150 ml (% 15)
Destile su 850 ml
pH 6.5 (2 N KOH)
Ortam 0.22 µm por çapında filtreden (Sartorius/Germany) geçirilerek sterilize edildi.
3.2.18 Transformasyon
Küçük ölçek plazmid izolasyon yöntemi kullanılarak izole edilen 10 µl plazmid DNA,
100 µl kimyasal kompetent hücre üzerine aktarılarak karıştırıldı ve buz banyosunda
1 saat tutuldu. Bu süre bitiminde buz banyosundan alınan örnekler 42 ºC’de 30 saniye
bekletilerek, membran porlarının açılması için hücrelere ısı şoku uygulandı. Tekrar buz
banyosuna alınan örnekler, burada 5 dk daha tutularak transformasyon işlemi
tamamlandı. Bu ortamın üzerine 1 ml LB veya SOC ortamı aktarıldı ve transforme olan
hücrelerin kendini tamiri için 37 ºC’de 1 saat inkübasyon uygulandı. Son aşamada
transformasyon ortamları PBS (fosfat ile tamponlanmış tuz çözeltisi) içerisinde
seyreltilerek, seçici ortamlara inoküle edildi. 37 ºC’de 12-18 saat inkübasyondan sonra
seçici ortamda gelişen koloniler alındı (Miller 1972, Dagert and Erlich 1979).
SOC Ortamı
Tripton 2 g
NaCl 0.5 g
KCl (1M) 0.25 ml
MgSO4 (1 M) 2 ml
Bidestile Saf Su 98 ml
10 N NaOH kullanılarak pH 7.0’a ayarlandı ve 121 ºC’de 15 dk sıcaklık uygulaması ile
sterilize edildi. Ortam kullanılmadan hemen önce 2 ml 1M glukoz ilave edilerek
karıştırıldı.
49
3.2.19 Elektrokompetent (elektroporasyon için transformasyon oranı yüksek) hücrelerin hazırlanması
% 1 inokülasyon oranı ile LB broth ortamına aktarılan Salmonella suşları, 37 ºC’de ve
200 rpm çalkalama hızında 12 saat geliştirildi. Buradan 1 ml alınarak 100 ml LB
ortamına ekim yapıldı ve optik yoğunluk (OD600) 0.4-0.6 oranına ulaşıncaya kadar
(yaklaşık 3 saat) 37 ºC’de ve 200 rpm çalkalama hızında inkübasyona tabi tutuldu. Bu
zaman zarfında % 10 gliserol çözeltisi buz banyosunda soğutuldu. Hücreler
5000 rpm’de 10 dk santrifüj edilerek (+4 ºC) çöktürüldü. Çöktürülen hücreler, buz
banyosunda soğutulmuş steril destile su içerisinde (50 ml) çözüldü. Bu ortam tekrar
5000 rpm’de 10 dk santrifüj edilerek (+4 ºC) çöktürüldü ve 25 ml buz banyosunda
soğutulmuş steril destile su içerisinde çözüldü. Hücre süspansiyonu son santrifüj
işleminin ardından (5000 rpm, 4 ºC, 10 dk) 400 µl soğuk % 10 gliserol içerisinde
çözüldü. Buz banyosunda 30 dk bekletilen bu ortam, daha sonra 50 µl’lik hacimlere
bölündü ve tüpler -80 ºC’de saklandı (Miller 1972, Dagert and Erlich 1979).
3.2.20 Elektroporasyon
Plazmid ya da vektör DNA (>3 µg, <10 µg) örneği, 50 µl elektrokompetent hücre ile
karıştırıldı. Bu karışım daha önce buz banyosunda soğutulmuş elektroporatör (Bio-Rad
Gene Pulser, Hercules, CA, USA) küvetlerine (0.2 cm) aktarıldı. Elektroporasyon
25 µFd, 2.5 kvolt ve 200 ohm koşullarında sabit zamanlı olarak (tek vuruş)
gerçekleştirildi. Bu işlem sonunda hücreler 1 ml SOC (% 0.5 maya özütü; % 2 tripton;
10mM NaCl; 2.5 mM KCl; 10mM MgCl2; 20mM MgSO4; 20mM glukoz, Teknova,
Hollister, CA, USA) ortamına alındı ve 37 ºC’de 1 saat bekletildi (hücreler T7
polimeraz içeriyor ise, sıcaklık 30 ºC olarak değiştirildi).Hücreler 9000 rpm’de 5 dk
santrifüj edilerek çöktürüldü ve seçim ortamında elekrotransformantlar seçildi (Dagert
and Erlich 1979, Nishimura et al. 1990).
50
3.2.21 Hayvan denemeleri
Yarışma denemeleri için; Salmonella enfeksiyonuna dirençli CBA fareler, oral yolla S.
Typhimurium’un AJB715 ve stjA mutantlarının 1:1 oranındaki sıvı kültürlerinin
karışımları ile inoküle edilmiştir (1 ml ve yaklaşık 106 cfu/fare). 34 gün süresince (2-4
gün aralıklarla), fekal örnekler toplanmış ve 1 ml PBS (fosfat ile tamponlanmış tuzlu
su) içerisinde homojenize edilmiştir. Ayrıca; dalak, cecum (ince ve kalın bağırsağı
birleştiren organ) ve mezenterik lenf nodülleri (bağırsağa yapışık lenf nodülleri)
denemenin sonunda, fareler kesilerek alınmış ve 5 ml PBS içerisinde homojenize
edilmiştir (IKA-WERKE, T25-Ultraturrax, Wilmington, USA). Fekal örneklerden ve
homojenize organlardan yapılan dilüsyonlardan, kanamisin ve 5-bromo-4-kloro-3-
indolil fosfat (XP, 30 mg/l) içeren LB agar ortamına yayma ekimler gerçekleştirildi.
Sayımlar sonucunda elde edilen veriler, alınan çıktı oranının [(örneklerdeki oran = cfu
AJB715/ MA44 (stjA mutantı)], girdi oranına [(inokülümdeki oran = cfu AJB715/
MA44 (stjA mutantı)] bölünmesi suretiyle normalize edilmiştir. Tüm veriler logaritmik
(Log10) değerlere çevrildikten sonra geometrik ortalama hesaplanarak istatik analiz
gerçekleştirilmiştir. Student’s t-testi, enfekte edilmiş organlardan ve fekal örneklerden
elde edilen oranların, inokülümdaki 1:1 oranından belirgin olarak farklı olup
olmadığının tespitinde kullanılmıştır.
3.2.22 Salmonella Typhimurium’da P22 faj lizatlarının hazırlanması
% 1 inokülasyon oranı ile LB broth ortamına aktarılan Salmonella suşları 37 ºC’de ve
200 rpm çalkalama hızında 12 saat geliştirildi. Bu süre sonunda kültür ortamlarından
alınan 1 ml’lik hacimler üzerine 4 ml P22 (ya da 200 µl kültür + 800 µl P22
transdüksiyon broth) transdüksiyon ortamı aktarıldı. Bu ortamlar çalkalamalı koşulda
37 ºC’de 16 saat inkübasyona tabi tutuldu. İnkübasyon bitiminde ortam 8000 rpm’de
+4 ºC’de 10 dk santrifüj işlemine tabi tutularak bakteriler ve hücre kalıntıları çöktürüldü
(küçük hacimlerde 12000 rpm’de 2 dk yeterli). Üst sıvı yeni steril tüplere aktarıldı ve
üzerine 0.2 ml kloroform ilave edildi. Ortamda olası canlı bakteriler 30 sn karıştırma
işlemine tabi tutularak elimine edildi. Hazırlanan faj lizatları +4 ºC’de saklandı (İyi bir
51
lizat 1010-1011 plak oluşturma birimi/ml faj içerir) (Sanderson and Roth 1983, Margolin
1987, Casjens and Hayden 1988).
P22 Transdüksiyon Ortamı
LB 87 ml
Minimal E Ortami (50X) 2 ml
Glukoz (% 20) 1 ml
P22 faj lizatı 0.1 ml
Minimal E Ortamı
MgSO4.7H2O 28.9 g
Sitrik Asit 300 g
K2HPO4.3H2O 1965 g
NaNH4PO4.4H2O 525 g
Destile Su 3000 ml
(Eğer susuz MgSO4 ve K2HPO4 kullanılıyor ise, sırasıyla 7.05 g ve 1500 g alınmalıdır).
1000 ml destile su 3 litrelik bir behere konup kaynamamasına dikkat edilerek ısıtıldı.
MgSO4.7H2O ilave edilip tamamen çözüldü. Ardından aynı işlem, sırasıyla sitrik asit,
K2HPO4.3H2O ve NaNH4PO4.4H2O için tekrarlandı. Toplam hacim destile su ile 3
litreye tamamlandı. Ortam daha sonra 800 ml’lik hacimler halinde cam şişelere bölündü
ve her birinin üzerine, 25 ml kloroform ilave edildi.
3.2.23 T-POP ve Mudj transpozon mutasyonu
Mutasyon için moleküler teknikler ile hazır hale gelen klonlara son aşamada
transdüksiyon uygulanarak mutantlar seçildi. Transdüksiyon için ∼1010 pfu/ml
düzeyinde φP22 içeren faj solüsyonları kullanıldı. Önce bu faj T-POP transpozonunu
taşıyan S. Typhimurium TH3923 suşu üzerinde bir gece geliştirildi ve faj lizatları elde
edildi. Ardından söz konusu lizatlar kullanılarak MA2 klonu enfekte edildi ve hedef
52
transdüktantlar, tetrasiklin ve X-gal içeren (T-POP transpozonu tetrasiklin dirençlilik
içerdiği için) LB agar ortamlarında koyu mavi koloniler olarak tanımlandı. Bu
kolonilerin tetrasiklin içeren ve tetrasiklin içermeyen LB broth ortamlarında β-
galaktozidaz üretim özellikleri esas alınarak Stj regülatörünün özellikleri (negatif ya da
pozitif regülatör olup olmadığı) tespit edildi ve sonuçlar western lekeleme analizleri ile
doğrulandı. Regülatör genlerin tespitinde invörs (ters) PCR yöntemi kullanıldı ve PCR
ürünlerinin dizi analizleri yapılarak gen bölgeleri tanımlandı. Aynı yöntem kullanılarak
mudj transpozonu ile de mutasyon gerçekleştirildi. Bu amaçla φP22 fajı S.
Typhimurium AJB181 suşu üzerinde bir gece geliştirilerek faj lizatları elde edildi. Elde
edilen ve mudj transpozonunu içeren yeni faj lizatları ile MA2 suşu enfekte edildi.
Hedef transdüktantlar bu kez mudj transpozonunun içerdiği kanamisin dirençlilik
gözönüne alınarak kanamisin ve X-Gal içeren LB agar ortamlarında koyu mavi
koloniler olarak tanımlandı. Seçilen bu transdüktantların regülatör özellikleri ve
regülatör genlerinin belirlenmesi yukarıda açıklandığı şekilde gerçekleştirildi (Rappleye
and Roth 1997, Hidalgo et al. 2004).
3.2.24 Biyomanyetik protein G immun bağlanma testi (SIMPLE metodu)
Öncelikle transpozon mutasyonu ile elde edilen mutantlar 1 ml gelişme ortamında
yaklaşık 1000 koloni olacak şekilde toplanarak mutant havuzları oluşturuldu ve Stj
antiserumu aracılığı ile mutantlar seçildi. SIMPLE yönteminin kullanıldığı bu süreçte,
öncelikle 100 µl BioMag protein G (Qiagen Inc., Valencia, CA, USA) 1.5 ml steril
mikrosantrifüj tüplerine aktarıldı. BioMag partikülleri üç kez 750 µl protein G
tamponunda (TN tamponu) yıkandı. Her aşamada manyetik ayırıcı ile Bio-Mag
partikülleri ortamdan alındı. Yıkama işlemi sonrasında BioMag partikülleri üzerine
100 µl stj serum aktarıldı ve 1 saat süreyle oda sıcaklığında ve sabit hızda karıştırıldı
(Her 5 dakikada bir karıştırma işlemi uygulandı). Manyetik ayırıcı ile BioMag
partikülleri ayrılarak sıvı döküldü ve partiküller üç kez 750 µl protein G tamponunda
yıkandı. Hazırlanan Bio-Mag partikül ortamına, 1x108 oranında bakteri (bakterilerin
hazırlanması için önce 1 ml aktif bakteri kültürü 12000 rpm’de 2 dk santrifüj işlemine
tabi tutuldu ve üst sıvı atılarak bakteriler 1 ml protein G tamponunda çözüldü. Buradan
53
alınan 50 µl’lik hacim 450 µl kazein içeren protein G ortamına aktarıldı) ve % 1
oranında süt tozu içeren 500 µl protein G tamponu ilave edildi. Ortam oda sıcaklığında
1 saat sabit hızlı döndürücüde karıştırıldı (her 5 dakikada bir hızlı karıştırma işlemi
uygulandı) ve BioMag partikülleri manyetik ayırıcı kullanılarak ayrıldı. Ayrılan
partiküller 3 kez süt tozu içeren protein G tamponda yıkandıktan sonra, aynı tamponda
(200 µl) çözüldü. Buradan hazırlanan 100-10-6 arası dilüsyonlardan alınan 100 µl
hacimler gelişme ortamına ekildi ve 37 ºC’de 12 saat çalkalamalı olarak inkubasyona
bırakıldı. İnkübasyonun ardından T-POP mutant havuzları için tetrasiklin ve X-Gal;
mudj mutant havuzları için ise kanamisin ve X-Gal içeren LB agar plakalarına bakteri
gelişme ortamlarından 0.1 ml aktarılarak yayma ekim yapıldı. 37 ºC’de 12 saat inkübe
edilen petri plakalarında gelişen kolonilerden koyu mavi renkli olanlar, uygun
antibiyotiği içeren gelişme ortamlarına alındı (Bandoh et al. 1999, Nuccio et al. 2007).
Protein G Tamponu (TN tamponu)
0.1 M Tris-HCl
0.15 M NaCl
pH 7.4
3.2.25 β-Galaktozidaz testi
Test yapılacak bakteri kültürü LB broth ortamına %1 oranında inoküle edildi ve
37 ºC’de 200 rpm çalkalama hızında 12 saat geliştirildi. Negatif kontrol olarak,
β-Galaktozidaz aktivitesi içermeyen Salmonella Typhimurium LT2 (MA2) suşu
kullanıldı. Geliştirilen hücreler, uygun antibiyotiği içeren (T-POP için Tet 20 µg/ml,
Mudj için Km 100 µg/ml) ve içermeyen yeni LB ortamına inoküle edildi (% 1) ve 3 saat
yukarıda belirtilen inkübasyon koşullarında geliştirildi (logaritmik gelişme fazının ortası
OD600 0.4-0.6 arası olmalı). Bu kültürler 20 dk buz banyosunda bekletildikten sonra
2 ml kültür 4000 rpm’de 10 dk (+4 ºC’de) santrifüj işlemine tabi tutuldu. Üst sıvı
atılarak hücre çökeltisi, buzda soğutulan 2 ml Z tampon çözeltisi içerisinde çözüldü.
Hücrelerin optik yoğunluğu (OD600), Z tampon çözeltisi kör olarak kullanılmak
suretiyle ölçüldü ( UV-VIS spectrophotometer, Shimadzu, Japan). Bu ortamdan alınan
54
0.5 ml hücre süspansiyonu, 0.5 ml Z tampon çözeltisi ile seyreltildi. Seyreltilen hücre
süspansiyonu üzerine 100 µl kloroform ve 50 µl % 0.1 SDS ilave edilerek karıştırıldı.
28 ºC su banyosunda 5 dk inkübasyon uygulandı. Reaksiyon, 0.2 ml ONPG (ο-
nitrofenil-β-D-galaktozidaz, 4 mg/ml, BioVectra, Price Edward Island, Canada)
uygulanıp karıştırılarak başlatıldı ve sarı renk oluşuncaya kadar 28 ºC su banyosunda
bekletildi. Reaksiyon uygun sarı renk oluşuncaya kadar sürdürüldü. Uygun sarı renk
oluşumu, bu ortamın optik yoğunluğunun OD420’de 0.6-0.9 arasına ulaşması ile
değerlendirildi. Uygun sarı renk oluşumu saptandıktan sonra (genellikle 1-2 saat
arasında) 0.5 ml, 1 M Na2CO3 ilave edilerek reksiyon durduruldu. Bu ortamlardan
alınan 1 ml hacimler mikrosantrifüj tüplerine aktarıldı ve 12000 rpm’de 5 dk santrifüj
edilerek kloroform ve hücre çökeltisi uzaklaştırıldı. Her bir tüpte üst sıvının optik
yoğunluğu 420 nm ve 550 nm dalga boylarında ölçüldü. β-Galaktozidaz aktivitesi
aşağıdaki formül kullanılarak saptandı (Miller 1972, Griffith and Wolf 2002).
Miller Ünitesi= 1000 X {(OD420-1.75OD550}/(T X V X OD600)
* OD420 ve OD550 reaksiyon karışımlarının optik yoğunluğu
* OD600 yıkanan hücre süspansiyonlarının hücre yoğunluğu
T= Dakika olarak reaksiyon zamanları
V=Deneyde kullanılan kültürün ml olarak hacmi
Laktoz operonunun tam indüksiyonunda 1500 ünite, indüklenmemiş laktoz operonu için
ise 1.5-3 ünite arasi β-Galaktozidaz aktivite ölçümleri tipiktir.
Z Tampon Çözeltisi
Na2HPO4 .7H2O 0.80 g
NaH2HPO4 .H2O 0.28 g
KCl (1 M) 1 ml
MgSO4 (1 M) 0.05 ml
β-merkaptoetanol (0.05 M) 0.135 ml
55
Ortama, hacim 40 ml’ye ulaşıncaya kadar destile su ilave edildi. Tüm tuzlar çözüldü.
Ortam pH’sı 2N HCl kullanılarak 7.0 olacak şekilde ayarlandı. Destile su ilavesi ile
toplam hacim 50 ml’ye çıkarıldı. 0.45 µm por çapında membran filtreden (Sartorius,
Germany) geçirilmek suretiyle sterilize edildi. Hazırlanan çözelti +4 ºC’de saklandı.
ONPG (ο-nitrofenil-β-D-galaktozidaz) Çözeltisi
ONPG 0.004 g
Fosfat Tampon 1 ml
Fosfat Tampon Çözeltisi
Na2HPO4 .7H2O 1.61 g
NaH2HPO4 .H2O 0.55 g
Destile Su 100 ml
Ortam pH’sı (2N HCl kullanılarak) 7.0 olacak şekilde ayarlandı. 0.45 µm por çapında
membran filtreden (Sartorius, Germany) geçirilmek suretiyle sterilize edildi. Hazırlanan
çözelti +4 ºC’de saklandı.
3.2.26 İnvörs (ters yön) PCR ile transpozonların bulunduğu gen bölgelerinin tayini
S. Typhimurium’dan izole edilen kromozomal DNA AluI (Fermentas, USA)
restriksiyon endonükleaz enzimi ile kesildi. Kesim reaksiyonu için 85 µl küçük ölçek
kromozomal DNA izolasyon örneği, 5 µl AluI ve 10 µl kesim reaksiyonu tamponu
(Fermentas, USA) ile karıştırıldı ve 37 ºC’de 2 saat tutuldu. Bu reaksiyonun yapıldığı 3
tüp (toplam 300 µl) karıştırılıp üzerine 200 µl Tris-EDTA (TE) tamponu ilave edildi.
Ortam karıştırıldıktan sonra 500 µl fenol/kloroform/izoamil alkol (25/24/1
hacim/hacim/hacim) uygulanarak 12000 rpm’de 7.5 dk oda sıcaklığında santrifüj
işlemine tabi tutuldu. Üst faz mikropipet aracılığı ile yeni mikrosantrifüj tüpüne alındı
ve 35 µl 3M Sodyum asetat (pH 4.8) ve 700 µl saf etanol (EtOH, Gold Shield Chem.
Co., California, USA) ile yavaş bir şekilde karıştırıldı. Ortam -20 ºC’de 30 dk
bekletilerek DNA’nın yoğunlaşması sağlandı ve 12000 rpm’de 5 dk santrifüj edilerek
56
çöktürüldü. DNA çökeltisi % 75 etanol ile yıkanarak oda sıcaklığında kurutuldu. DNA
çökeltisi 75 µl steril destile su içerisinde çözüldükten sonra üzerine 20 µl T4 DNA ligaz
tamponu ve 5 µl T4 DNA ligaz enzimi ilave edildi (Fermentas, USA). Ortam 15 ºC’de
bir gece tutuldu. Tekrar 35 µl 3M Sodyum asetat ve 700 µl saf etanol ile karıştırılan
ortam -20 ºC’de 30 dk tutuldu ve 12000 rpm’de 5 dk santrifüj edilerek çöktürüldü. DNA
çökeltisi % 75 etanol ile yıkanarak oda sıcaklığında kurutuldu. Son aşamada DNA
örneği 10 µl saf su içerisinde çözülerek invörs PCR işleminde şablon olarak kullanıldı.
T-POP ve mudj üzerindeki AluI kesim bölgesi primer dizaynı için kullanıldı. Bu
primerler birbirine zıt iki yön esas alınarak oluşturuldu. Primer dizaynında MacVector
(Accelryrs Software Inc., San Diego, CA, USA) programı kullanıldı. Ters yön PCR
primerleri, Operon Technologies (Huntsville, AL, USA) firması tarafından üretildi.
T-POP için ters yön primerleri:
T-pop4 5'GCACTTGTCTCCTGTTTACTCC 3' geri (rv) (AluI T-POP üzerinde
primerin başlama ve bitiş bölgeleri 1956-1977 bç arası)
T-pop5 5'CGCTTTTCCCGAGATCATATG 3' ileri (fw) (AluI T-POP üzerinde
primerin başlama ve bitiş bölgeleri 2168-2188 bç arası)
Mudj için ters yön primerleri:
Mudout 5'CCGAATAATCCAATGTCCTCCCGGT 3' (AluI Mudj transpozonu
üzerinde primerin başlama ve bitiş bölgeleri 30-54 bç arası)
MudAlu 5'CGAAAAACAAAAACACTGCAAATCATTTCAATAAC 3'
(AluI Mudj transpozonu üzerinde primerin başlama ve bitiş bölgeleri 167-201 bç arası)
Bu aşamadan sonra Gradient PCR protokolü aşağıda verildiği şekilde uygulandı (Innis
et al. 1990).
57
PCR Karışımı
Şablon DNA 1 µl
100 µM ileri (Fw) primer 1 µl
100 µM geri (Rv) primer 1 µl
Platinum® Taq DNA Polimeraz (High Fidelity) 47 µl
(Invitrogene, Calsbad, CA, USA)
PCR parametreleri
Aşama Sıcaklık ve Süre
1 94 ºC 2 dk
2 94 ºC 30 sn
3 60 ºC- 62.5 ºC- 65 ºC 1 dk (Gradient)
4 72 ºC 5 dk
5 72 ºC 10 dk
2-4 arası aşamalar 30 döngü tekrar edilmiştir.
110
KAYNAKLAR Abraham, J.M., Freitag, C.S., Clements, J.R. and Eisenstein, B.I. 1985. An invertible
element of DNA controls phase variation of type I fimbriae in E. coli. PNAS, 82;
5724-5727.
Abshire, K.Z. and Neidhardt, F.C. 1993. Growth rate paradox of S. Typhimurium within
host macrophage. J. Bacteriol., 175; 3744-3748.
Alpuche-Aranda, C.M., Racoosin, E.L., Swanson, J.A. and Miller, S.I. 1994.
Salmonellae stimulate macrophage macropinocytosis and persist within spacious
phagosomes. J. Exp. Med., 179; 601–8.
Althouse, C., Patterson, S., Fedorka-Cray, P. and Isaacson, R.E. 2003. Type 1
fimbriae of Salmonella enterica serovar Typhimurium bind to enterocytes and
contribute to colonization of swine in vivo. Infect Immun. 71 (11); 6446-6452.
Austin, J.W., Sanders, G., Kay, W.W. and Collinson, S.K. 1998. Thin aggregative
fimbriae enhance Salmonella Enteritidis biofilm formation. FEMS Microbiol.
Lett., 162; 295–301.
Ausubel, F., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A. and
Struhl, K. 1994. Current Protocols in Molecular Biology, Volume 1, Unit 2, Jonh
Wiley & Sons Inc. USA.
Balzer, G.J. and McLean, R.J. 2002. The stringent response genes rela and spoT are
important for Escherichia coli biofilms under slow growth condition. Can. J.
Microbiol., 48; 675-680.
Bandoh, K., Aoki, J., Hosono, H., Kobayashi, S., Kobayashi, T., Murakami-Murofushi,
K., Tsujimoto, M., Arai, H. and Inoue, K. 1999. Molecular cloning and
characterization of a novel human G-protein-coupled receptor, EDG7, for
lysophosphatidic acid. J. Biol. Chem., 274; 27776-27785.
Bann, J.G., Pinkner, J.S., Frieden, C. and Hultgren, S.J. 2004. Catalysis of protein
folding by chaperones in pathogenic bacteria. PNAS, 101; 17389-17393.
Barak, J.D., Gorski, L., Naraghi-Arani, P. and Charkowski, A.O. 2005. Salmonella
enterica virulence genes are required for bacterial attachment to plant tissue.
Appl. Environ. Microbiol., 71; 5685–5691.
111
Barany, F. 1985. Single-stranded hexameric linkers: a system for in-phase insertion
mutagenesis and protein engineering. Gene, 37; 111-123.
Barnhart, M.M. and Chapman, M.R. 2006. Curli biogenesis and function. Annu. Rev.
Microbiol., 60; 131-147.
Baumler, A.J. and Heffron, F. 1995. Identification and sequence analysis of lpfABCDE,
a putative fimbrial operon of S. Typhimurium. J. Bacteriol., 177; 2087-2097.
Baumler, A.J., Tsolis, R.M., Bowe, F.A., Kusters, J.G., Hoffmann, S. and Heffron, F.
1996a. The pef fimbrial operon of S. Typhimurium mediates adhesion to murine
small intestine and is necessary for fluid accumulation in the infant mouse. Infect.
Immun., 64; 61-68.
Baumler, A.J., Tsolis, R.M. and Heffron, F. 1996b. Contribution of fimbrial operons to
attachment to and invasion of epithelial cell lines by S. Typhimurium. Infect.
Immun., 64; 61-68.
Baumler, A.J., Tsolis, R.M., Van der Velden, A., Stojilkovic, I. and Heffron, F. 1996c.
Identification of a new iron regulated locus of Salmonella typhi. J. Bacteriol., 183;
207-213.
Baumler, A.J., Tsolis, R.M. and Heffron, F. 1997. Fimbrial adhesins of S.
Typhimurium. Adv. Exp. Med. Biol., 412; 149-158.
Bian, Z. and Normark, S. 1997. Nucleator function of CsgB for the assembly of
adhesive surface organelles in Escherichia coli. EMBO J., 16; 5827–5836.
Bian, Z., Yan, Z.Q., Hansson, G.K., Thoren, P. and Normark, S. 2001. Activation of
inducible nitric oxide synthase/nitric oxide by curli fibers leads to a fall in blood
pressure during systemic Escherichia coli infection in mice. J. Infect. Dis., 183;
612–619.
Binscheck, T., Bartels, F., Bergel, H., Bigalke, H., S. Yamasaki, Hayashi, T., Niemann,
H. and Pohlner, J. 1995. IgA protease from Neisseria gonorrhoeae inhibits
exocytosis in bovine chromaffin cells like tetanus toxin. J. Biol. Chem., 270;
1770–1774.
Bitter, W., Koster, M., Latijnhouwers, M., de Cock, H. and Tommassen, J. 1998.
Formation of oligomeric rings by XcpQ and PilQ, which are involved in protein
transport across the outer membrane of Pseudomonas aeruginosa. Mol.
Microbiol., 27; 209–219.
112
Blanc-Potard, A.B. and Groisman, E.A. 1997. The Salmonella selC locus contains a
pathogenicitiy island mediating intramacrophage survival. EMBO J., 16; 5376-
5385.
Blanc-Potard, A.B., Solomon, F., Kayser, J. and Groisman, E.A. 1999. The SPI-3
pathogenicity island of Salmonella enterica. J. Bacteriol., 181; 998–1004.
Blasi, F., Bouton, R.W., Kovach, J.S. and Goldberger, R.F. 1971. Interaction between
the first enzyme for histidine biosynthesis and histidyl transfer ribonucleic acid. J.
Bacteriol., 106; 508-513.
Boekema, B.K.H.L., Van Putten, J.P.M., Stockhofe-Zurwieden, N. and Smith, H.E.
2004. Host cell contact-induced transcription of the Type IV fimbria gene cluster
of Actinobacillus pleuropneumoniae. Infect. Immun., 72 (2); 691-700.
Bolton, A.J., Osborne, M.P. and Stephen, J. 2000. Comparative study of the
invasiveness of Salmonella serotypes Typhimurium, Choleraesuis and Dublin for
Caco-2 cells, HEp-2 cells and rabbit ileal epithelia. J. Med. Microbiol., 49; 503-
511.
Boschiroli, M.L., Ouahrani-Bettache, S., Foulongne, V., Michaux-Charachon, S.,
Bourg, G., Allardet-Servent, A., Cazevieille,C., Lavigne, J. P., Liautard, J. P.,
Ramuz, M. and O’Callaghan, D. 2002. Type IV secretion and Brucella virulence.
Vet. Microbiol., 90; 341–348.
Bougdour, A. and Gottesman, S. 2007. ppGpp regulation of RpoS degradation via anti-
adaptor protein IraP. PNAS, 31: 12896-12901.
Bourzac, K.M. and Guillemin, K. 2005. Helicobacter pylori–host cell interactions
mediated by type IV secretion. Cellular Microbiology, 7 (7); 911-919.
Brandtzaeg P. 1999. Overview of the mucosal immune system. Curr. Top. Microbiol.
Immunol., 146;13–25
Brenner, M. and Ames, B.N. 1971. The histidine operon and its regulation, In H. J.
Vogel (ed.), Metabolic pathways, 5; 349-387. Academic Press, Inc.,New York.
Burnette, W.N. 1981. "Western blotting": electrophoretic transfer of proteins from
sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and
radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Anal.
Biochem., 112 (2); 195-203.
113
Camacho, E.M. and Casadesus, C. 2002. Conjugal transfer of the virulence plasmid of
Salmonella enterica is requlated by the leucine-responsive regulatory protein and
DNA adenine methylation. Molecular Microbiology, 44; 1589-1598.
Casjens, S. and Hayden, M. 1988. Analysis in vivo of the bacteriophage P22 headful
nuclease. Molecular Biology, 199; 467-474.
Chapman, M.R., Robinson, L.S., Pinkner, J.S., Roth, R., Heuser, J., Hammar, M.,
Normark, S. and Hultgren, S.J. 2002. Role of Escherichia coli curli operons in
directing amyloid fiber formation. Science, 295; 851-885.
Chessa, D., Winter, M.G., Nuccio, S.P., Tükel, C. and Baumler, A.J. 2008a. RossE
repress std fimbrial expression in Salmonella enterica serotype Typhimurium.
Mol. Microbiol., 68; 573-587.
Chessa, D., Dorsey, C.W., Winter, M.G. and Baumler, A.J. 2008b. Binding specificity
of Salmonella plasmid-encoded fimbriae assessed by glycomics. J. Biol. Chem.,
28; 8118-8124.
Chirwa, N.T. and Herrington, M.B. 2003. CsgD, a regulator of curli and cellulose
synthesis, also regulates serine hydroxymethyltransferase synthesis in Escherichia
coli K-12. Microbiology, 149; 525–535.
Cirillo, D.M., Heffernan, E.J., Wu, L., Harwood, J., Fierer, J. and Guiney, D.G. 1996.
Identification of a domain in rck, a product of the Salmonella Typhimurium
virulence plasmid, required for both serum resistance and cell invasion. Infect.
Immun., 64 (6); 2019-2023.
Clegg, S. and Gerlach, G.F. 1987. Enterobacterial fimbriae. J. Bacteriol., 169; 934-938.
Clegg, S. and Swenson, D.L. 1994. Salmonella fimbriae. In P. Klemm (ed), Fimbriae:
adhesion, genetics, biogenesis and vaccines. pp. 105-113. CRC Press, Inc., Boca
Raton, Fla.
Clegg, S., Hancox, L.S. and Yeh, K.S. 1996. Salmonella Typhimurium phase variation
and fimA expression. J. Bacteriol., 178; 542-545.
Clouthier, S.C., Collinson, S.K., White, A.P., Banser, P.A. and Kay, W.W. 1998. tRNA
(Arg) (fimU) and expression of SEF 14 and SEF 21 in Salmonella enteritidis. J.
Bacteriol., 180; 840–845.
114
Collinson, S.K., Doig, P.C., Doran, J.L., Clouthier, S., Trust, T.J. and Kay, W.W. 1993.
Thin, aggregative fimbriae mediate binding of Salmonella enteritidis to
fibronectin. J. Bacteriol., 175; 12–18.
Collinson, S.K., Clouthier, S.C., Doran, J.L., Banser, P.A. and Kay, W.W. 1996a.
Salmonella enteritidis agfBAC operon encoding thin, aggregative fimbriae. J.
Bacteriol., 178; 662–667.
Collinson, S.K., Liu, S.L., Clouthier, S.C., Banser, P.A., Doran, J.L., Sanderson, K.E.
and Kay, W.W. 1996b. The location of four fimbrin-encoding genes, agfA, fimA,
sefA and sefD, on the Salmonella enteritidis and/or S. Typhimurium XbaI-BlnI
genomic restriction maps. Gene, 169; 75-80.
Coombes, B.K., Coburn, B.A., Potter, A.A., Gomis, S., Mirakhur, K., Li, Y. and Finlay,
B.B. 2005. Analysis of the contribution of Salmonella pathogenicity islands 1 and
2 to enteric disease progression using a novel bovine ileal loop model and a
murine model of infectious enterocolitis. Infec. Immun., 73 (11); 7161-7169.
Dagert, M. and Erlich, S.D. 1979. Prolonged incubation in calcium chloride improves
the competence of Escherichia coli cells. Gene, 6; 23-28.
Darwin, K.H. and Miller, V.L. 1999. Molecular basis of the interaction of Salmonella
with the intestinal mucosa. Clinical Microbiology Rev., 12; 405-428.
Desvaux, M., Parham, N.J. and Henderson, I.R. 2004. The autotransporter secretion
system. Research in Microbiology, 155, 53–60.
Dibb-Fuller, M.P., Allen-Vercoe, E., Thorns, C.J. and Woodward, M.J. 1999. Fimbriae-
and flagella-mediated association with and invasion of cultured epithelial cells by
Salmonella enteritidis. Microbiology, 145; 1023–1031.
DiNocera, P.P., Alessandra, A. and Blasi, F. 1975. In vitro transcription of the
Escherichia coli histidine operon primed by dinucleotides. J. Biol. Chem., 250;
8376-8381.
Dorsey, C.W., Laarakker, M.C., Humphries, A.D., Weening, E.H. and Baumler, A.J.
2005. Salmonella enterica serotype Typhimurium MisL is an intestinal
colonization factor that binds fibronectin. Mol. Microbiol., 57; 196–211.
Duguid, J.P., Anderson, E.S. and Campbell, I. 1966. Fimbriae and adhesive properties
in Salmonellae. J. Path. Bacteriol., 92; 107-138.
115
Edhin, G. and Doini, P. 1971. Synthesis of guanosine 5'- diphosphate, 2'-(or 3'-)
diphosphate and related nucleotides in a variety of physiological conditions. J.
Biol. Chem., 246; 4371-4373.
Erickson, D.L., Lines, J.L., Pesci, E.C., Venturi, V. and Storey, D.G. 2004.
Pseudomonas aeruginosa relA contributes to virulence in drosophila
melanogaster. Infect. Immun., 72; 5638-5645.
Edwards, R.A., Schifferli, D.M. and Maloy, S.R. 2000. A role for Salmonella fimbriae
in intraperitoneal infections. PNAS, 97 (3); 1258-1262.
Edwards, R.A., Matlock, B.C. Heffernan, B.J. and Maloy, S.R. 2001. Genomic analysis
and growth-phase-dependent regulation of the SEF14 fimbriae of Salmonella
enterica serovar Enteritidis. Microbiology, 147; 2705-2715.
Farizo, K. M., Huang, T. and Burns, D.L. 2000. Importance of holotoxin assembly in
Ptl-mediated secretion of pertussis toxin from Bordetella pertussis. Infect.
Immun., 68; 4049–4054.
Firon, N., Ofek, I. and Sharon, N. 1984. Carbohydrate-binding sites of the mannose-
spesific fimbrial lectins of enterobacteria. Infec. Immun., 43; 1088-1090.
Fitzgerald, C., Sherwood, R., Gheesling, L.L., Brenner, F.W. and Patricia, I. 2003.
Fields molecular analysis of the rfb O antigen gene cluster of Salmonella enterica
serogroup O:6,14 and development of a serogroup-specific PCR assay. Appl.
Environ. Microbiol., 69 (10); 6099–6105.
Freiderich, M.J., Kinsey, N.E., Vila, J. and Kadner, R.J. 1993. Nucleotide sequence of a
13.9kb segment of the 90kb virulence plasmid of Salmonella Typhimurium: the
presence of fimbrial biosynthetic genes. Mol. Microbiol., 8; 543-558.
Frye, J., Karlinsey, J.E., Felise, H.R., Marzolf, B., Dowidor, N., McClelland, M. and
Huges, K.T. 2006. Identification of new flagellar genes of Salmonella enterica
serovar Typhimurium. J. Bacteriol., 188 (6); 2233-2243.
Galan, J.E. and Curtiss III, R . 1989.Virulence and vaccine potential of phoP mutants of
Salmonella Typhimurium. Microb. Pathog., 6 (6); 433-43.
Galan, J.E. 2001. Salmonella interactions with host cells: Type III secretion at work
Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 17; 53–86.
Galan, J.E. 2008. Energizing Type III secretion machines: what is fuel? Nat. Struc. Mol.
Biol., 15; 127-128.
116
Galyov, E.E., Wood, M.W., Rosqvist, R., Mullen, P.B., Watson, P.R., Hedges, S, and
Wallis, T.S. 1997. A secreted effector protein of Salmonella Dublin is
translocated into eukaryotic cells and mediates inflammation and fluid secretion in
infected ileal mucosa. Molecular Microbiology, 25; 903-912.
Garcia-del Portillo, F., Foster, J.W. and Finlay, B.B. 1993. Role of acid tolerance
response genes in Salmonella Typhimurium virulence. Infect. Immun., 61; 4489-
4492.
Garcia-del Portillo, F. and Finlay, B.B. 1994. Salmonella invasion of nonphagocytic
cells induces formation of macropinosomes in the host cell. Infect. Immun., 62;
4641–4645.
Gebbink, M.F.B.G., Claessen, D., Bouma, B., Dijkhuizen, L. and Wösten, H.A.B. 2005.
Amyloids - a functional coat for microorganisms. Nature Rev., 3; 333-341.
Gentle, I., Gabriel, K., Beech, P., Waller, R. and Lithgow, T. 2004. The Omp85 family
of proteins is essential for outer membrane biogenesis in mitochondria and
bacteria. J. Cell Biol., 164; 19–24.
Gentschev, I., Dietrich, G. and Goebel, W. 2002. The E. coli alpha-hemolysin secretion
system and its use in vaccine development. Trends Microbiol., 10; 39–45.
Gerlach, R.G. and Hensel, M. 2007. Protein secretion systems and adhesins: The
molecular armory of Gram-negative pathogens. International Journal of Medical
Microbiology, 297; 401–415.
Gerlach, R.G., Jackel, D., Stecher, B., Wagner, C., Lupas, A., Hardt, W.D. and Hensel
M. 2007. Salmonella pathogenicity island 4 encodes a giant non-fimbrial adhesin
and the cognate type 1 secretion system. Cell Microbiol., 9 (7); 1934-1950.
Gerstel, U. and Romling, U. 2003. The csgD promoter, a control unit for biofilm
formation in Salmonella Typhimurium. Res Microbiol., 154; 659–667.
Ghigo, J.M. and Wandersman, C. 1992. Cloning, nucleotide sequence and
characterization of the gene encoding the Erwinia chrysanthemi B374 PrtA
metalloprotease: a third metalloprotease secreted via a C-terminal secretion signal.
Mol. Gen. Genet., 236; 135–144.
Giannella, R.A., Broitman, S.A. and Zamcheck, N. 1972. Gastric acid barrier to
ingested microorganisms in man: studies in vivo and in vitro. Gut, 13; 251-256.
117
Gibson, D.L., White, A.P., Snyder, S.D., Martin, S., Heiss, C., Azadi, P., Surette, M.
and Kay, W.W. 2006. Salmonella produces an O-antigen capsule regulated by
AgfD and important for environmental persistence. J. Bacteriol., 188; 7722–7730.
Gibson, D.L., White, A.P., Rajotte, C.M. and Kay, W.W. 2007. AgfC and AgfE
facilitate extracellular thin aggregative fimbriae synthesis in Salmonella
Enteritidis. Microbiology, 153; 1131-1140.
Godfrey, H.P., Bugrysheva, J.V. and Cabello, F.C. 2002. The role of the stringent
response in the pathogenesis of bacterial infections. Trends in Microbiol., 10; 349-
351.
Goiten, R.K. and Persons, S.M. 1980. Possible regulation of the Salmonella
Typhimurium histidine operon by adenosine triphosphate
phosphoribosyltransferase: Large metabolic effects. J. Bacteriol., 144 (1); 337-
345.
Gophna, U., Oelschlaeger, T.A., Hacker, J. and Ron, E.Z. 2002. Role of fibronectin in
curli-mediated internalization. FEMS Microbiol. Lett., 212; 55-58.
Gorvel, J.-P. 2000. Pathogen-host cell molecular interactions. Cell, 103; 550-552.
Griffith, K.L. and Wolf, R.E. 2002. Measuring β-galactosidase activity in bacteria: cell
growth, permeabilization, and enzyme assays in 96 well arrays. Biochemical and
Biophysical Research Communications, 290; 397-402.
Groisman E.A. and Ochman, H. 1996. Pathogenicity islands: bacterial evolution in
quantum leaps. Cell, 87; 791–94.
Groisman, E.A., Blac-Potard, A.B. and Uchiya, K. 1999. Pathogenicity islands and
other mobile virulence elements. In: ASM Press, Kaper, J.B. and Hacker, J.H.
(eds), pp. 540. USA.
Gruber, A. and Zingales, B. 1995. Alternative method to remove antibacterial
antibodies from antisera used for screening of expression libraries. Biotechniques,
19; 28-30.
Gulig, P.A. 1990. Virulence plasmids of S. Typhimurium and other Salmonellae.
Microb. Pathog., 8; 3-11.
Gulig, P.A. and Curtiss III, R. 1987. Plasmid-associated virulence of S. Typhimurium.
Infec. Immun., 55; 2891-2901.
118
Gulig, P.A., Caldwell, A.L. and Chiodo, V.A. 1992. Identification, genetic analysis and
DNA sequence of a 7.8kb virulence region of the Salmonella Typhimurium
virulence plasmid. Mol. Microbiol., 6; 1395-1411.
Gulig, P.A., Danbara, H., Guiney, D.G., Lax, A.J., Norel, F. and Rhen, M. 1993.
Molecular analysis spv virulence genes of the Salmonella virulence plasmids.
Mol. Microbiol., 7; 825-830.
Gunzel, D., Kucharski, L.M., Kehres, D.G., Romero, M.F. and Maguire, M.E. 2006.
The MgtC virulence factor of Salmonella enterica serovar Typhimurium activates
Na+,K+-ATPase. J. Bacteriol., 188; 5586–5594.
Hacker, J., Knapp, S., and Goebel, W. 1983. Spontaneous deletions and flanking
regions of the chromosomal inherited hemolysin determinant of an Escherichia
coli 06 strain. J. Bacteriol., l54; 1145-1152.
Hackett, J., Wyk, P., Reeves, P. and Mathan, V. 1987. Mediation of serum resistance in
S. Typhimurium by an 11kDa polypeptide encoded by the criptic plasmid. J.
Infect. Dis., 155; 540-549.
Hammar, M., Bian, Z. and Normark, S. 1995. Expression of two csg operons is required
for production of fibronectin- and Congo red binding curli polymers in E. coli
K12. Mol. Microbiol., 18; 661-670.
Hammar, M., Bian, Z. and Normark, S. 1996. Nucleator-dependent intercellular
assembly of adhesive curli organelles in Escherichia coli. PNAS, 93; 6562-6566.
Haque, A., Bowe, F., Fitzhenry, R.J., Frankel, G., Thomson, M., Heuschkel, R., Murch,
S., Stevens, M.P., Wallis, T.S., Phillips, A.D. and Dougan, G. 2004. Early
interactions of S. Typhimurium with human small intestinal epithelial explants.
Gut, 53; 1424-1430.
Harlow, E. and Lane, D. 1988. Antibodies, A Laboratory Manuel. Cold Spring Harbor
Laboratory Press, pp, 139-245. Cold Sipring Harbor, New York, USA.
Heffernan, E.J., Harwood, J., Fierer, J. and Guiney, D. 1992. The S. Typhimurium
virulence plasmid complement resistance gene rck is homologues to a family of
virulence-related outer membrane protein genes, including pagC and ail. J.
Bacteriol., 174; 84-91.
Helms, M. Etherlberg, S. and Molbak, K. 2005. International Salmonella Typhimurium
DT104 infections, 1992-2001. Em. Infect. Dis., 11; 859-867.
119
Henderson, I.R., Navarro-Garcia, F., Desvaux, M., Fernandez, R.C. and Ala’Aldeen, D.
2004. Type V protein secretion pathway: the autotransporter story. Microbiology
and Molecular Biology Rev., 68; 692–744.
Hess, J., Gentschevt, I., Miko, D., Welzel, M., Ladel, C.W.G. and Kaufmann, S. 1996.
Superior efficacy of secreted over somatic antigen display in recombinant
Salmonella vaccine induced protection against listeriosis. PNAS, 93;1458-1463.
Hidalgo, A.A., Trombert, A.C., Castro-Alonso, J.C., Santiviago, C.A., Tesser, B.R.,
Youderian, P. and Mora, G.C. 2004. Insertions of mini-Tn10 transposon T-POP in
Salmonella enterica sv. typhi. Genetics, 167; 1067-1077.
Holzclaw, W.D. and Chapman, L.F. 1975. Properties of some norvaline-resistant
mutants of Bacillus subtilis. J. Gen. Microbiol., 88; 289-294.
Hultgren, S.J., Normark, S. and Abraham, S.N. 1991. Chaperone-assisted assembly and
molecular architecture of adhesive pili. Annu. Rev. Microbiol., 45; 383- 415.
Humphries, A.D., Townsend, S.M., Kingsley, R.A., Nicholson, T.L., Tsolis, R.M. and
Bäumler, A.J. 2001. Role of fimbriae as antigens and intestinal colonization
factors of Salmonella serovars. FEMS Microbiol. Lett., 201; 121–125.
Humphries, A.D., Raffatellu, M., Winter, S., Weening, E.H., Kingsley, R.A.,
Droleskey, R., Zhang, S., Figueiredo, J., Khare, S., Nunes, J., Adams, L.G.,
Tsolis, R.M. and Baumler, A.J. 2003. The use of flow cytometry to detect
expression of subunits encoded by 11 Salmonella enterica serotype Typhimurium
fimbrial operons. Mol. Microbiol., 48; 1357-376.
Humphries, A.D., DeRidder, S., and Baumler, A.J. 2005.Salmonella enterica serotype
Typhimurium fimbrial proteins serve as antigens during infection of mice. Infect.
Immun., 73; 5329–5338.
Innis, M.A., Gelfand, D.H., Sninsky, J.J. and White, T.J. 1990. PCR Protocols. A Guide
to Methods and Appplications. Academic Press Inc., 481 pp. 221-227. New York,
USA.
Jones, B.D., Ghori, N. and Falkow, S. 1994. Salmonella Typhimurium initiates murine
infection by penetrating and destroying the specialized epithelial M cells of the
Peyer’s patches. J. Exp. Med., 180; 15–23.
Jones, B.D. 2005. Salmonella invasion gene regulation: a story of environmental
awareness. J. Microbiol., 43(5); 110-117.
120
Kim, S.H. and Kim, Y.H. 2004. Escherichia coli O157 :H7 adherence to HEp-2 cells is
implicated with curli expression and outer membrane integrity. J. Vet. Sci., 5;
119–124.
Kisiela, D., Laskowska, A.S., Kuczkowski, M., Wieliczko, A. and Ugorski, M. 2006.
Functional characterization of the FimH adhesin from Salmonella enterica serovar
Enteritidis. Microbiology, 152; 1337–1346.
Klemm, P. 1986. Two regulatory fim genes, fimB and fimE control phase variation of
type I fimbriae in E. coli. EMDO J., 5; 1389-1393.
Klemm, P. and Krogfelt, K.A. 1994. Type I fimbria of E. coli. In P. Klemm (ed),
Fimbriae: adhesion, genetics, biogenesis and vaccines. CRC Press, Inc., pp. 9-26.
Boca Raton, Fla.
Knodler, L.A., Celli, J., Hardt, W.D., Vallance, B.A., Yip, C. and Finlay, B.B. 2002.
Salmonella effectors within a single pathogenicity island are differentially
expressed and translocated by separate type III secretion systems. Mol.
Microbiol., 43; 1089–1103.
Korhonen, T. K., Lounatmaa, K., Ranta, H. and Kuusi, N. 1980. Characterization of
type I pili of S. Typhimurium LT2. J. Bacteriol., 144; 800-805.
Koronakis, V., Hughes, C. and Koronakis, E. 1991. Energetically distinct early and late
stages of HlyB/HlyD-dependent secretion across both Escherichia coli
membranes. EMBO J., 10; 3263–3272.
Koronakis, E., Hughes, C., Milisav, I. and Koronakis, V. 1995. Protein exporter
function and in vitro ATPase activity are correlated in ABC domain mutants of
HlyB. Mol. Microbiol., 16; 87–96.
Kukkonen, M., Saarela, S., Lahteenmaki, K., Hynonen, U., Westerlund-Wikstrom, B.,
Rhen, M. and Korhonen, T.K. 1998. Identification of two laminin-binding
fimbriae, the type 1 fimbria of Salmonella enterica serovar Typhimurium and the
G fimbria of Escherichia coli, as plasminogen receptorsvol. Infect. Immun., 66
(10); 4965-4970.
La Ragione, R.M., Cooley, W.A. and Woodward, M.J. 2000. The role of fimbriae and
flagella in the adherence of avian strains of Escherichia coli O78:K80 to tissue
culture cells and tracheal and gut explants. J. Med. Microbiol., 49; 327–338.
121
Laemmli, U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of
bacteriophage T4. Nature, 227; 680-685.
Lee, C.A., Silva, M., Siber, A.M., Kelly, A., Galyov, J.E. and McCormick, B.A. 2000.
A secreted Salmonella protein induces a proinflammatory response in epithelial
cells, which promotes neutrophil migration. PNAS, 97 (22); 12283-12288.
Lee, C., Wozniak, C., Karlinsey, J.E. and Hughes, K.T. 2007. Genomic screening for
regulatory genes using the T-POP transposon. Methods Enzymol., 421; 159–167.
Leunk, R.D. and Moon, R.J. 1982. Association of type I pili with the ability of livers to
clear S. Typhimurium. Infect. Immun., 36; 1168-1174.
Lloyd, S.A., Forsberg, A., Wolf-Watz, H. and Francis, M. S. 2001. Targeting exported
substrates to the Yersinia TTSS: different functions for different signals? Trends
Microbiol., 9; 367–371.
Lockman, H.A. and Curtiss III, R. 1992. Virulence of non-type 1 fimbriated
nonflagellated Salmonella typhimurium mutants in murine typhoid fever. Infect.
Immun., 60; 491–496.
Lostroh, C.P. and Lee, C.A. 2001. The Salmonella pathogenicity island-1 type III
secretion system. Microbes Infect., 3; 1281-1291.
Lundmark, K., Westermark, G.T., Olsen, A. and Westermark, P. 2005. Protein fibrils in
nature can enhance amyloid protein a amyloidosis in mice: cross-seeding as a
disease mechanism. PNAS, 102; 6098–6102.
Magnusson, L.U., Farewell, A. and Nyström, T. 2005. ppGpp: a global regulator in
Escherichia coli. Trends in Microbiology, 13(5); 236-242.
Margolin, P. 1987. Generalized transduction. In: Neidhardt, F., Ingraham, K., Low, B.,
Schaechter, M, and Umbarger, H. Escherichia coli and Salmonella Typhimurium:
Cellular and Molecular Bilogy. American Society for Microbiology, pp. 2898,
Washington, D.C.
McClelland, M., Sanderson, K.E., Spieth, J., Clifton, S.W., Latreille, P., Courtney, L.,
Porwollik, S., Ali, J., Dante, M., Du, F., Hou, S., Layman, D., Leonard, S.,
Nguyen, C., Scott, K., Holmes, A., Grewal, N., Mulvaney, E., Ryan,E., Sun, H.,
Florea, L., Miller, W., Stoneking, T., Nhan, M., Waterston, R. and Wilson, R.K.
2001. Complete genome sequence of Salmonella enterica serovar Typhimurium
LT2. Nature, 413; 852–856.
122
McCormick, B.A., Colgan, S.P., Delp-Archer, C., Miller, S.I. and Madara, J.L. 1993.
Salmonella Typhimurium attachment to human intestinal epithelial monolayers:
transcellular signalling to subepithelial neutrophils. The Journal of Cell Biology,
123; 895-907.
McCormick, B.A., Miller, S.I., Carnes, D. and Madara, J.L. 1995. Transepithelial
signaling to neutrophils by Salmonellae: a novel virulence mechanism for
gastroenteritis. Infect. Immun., 63; 2302–2309.
Mercado-Pimentel, M.E., Jordan, N.C. and Aisemberg, G.O. 2002. Affinity purification
of GST fusion proteins for immunohistochemical studies of gene expression. J.
Protein Expr. Purif., 26 (2); 260-265.
Miller, J.H. 1972. Experiments in Molecular Genetics. Cold Spring Harbor Laboratory
Press, pp: 352-355. Cold Spring Harbor, New York, USA.
Miller, V.L. and Mekalanos, J.J. 1988. A novel suicide vector and its use in
construction of insertion mutations: osmoregulation of outer membrane proteins
and virulence determinants in Vibrio cholerae requires toxR. J. Bacteriol., 170;
2575-2583.
Mills, D.M., Bajaj, V. and Lee, C.A. 1995. A 40 kb chromosomal fragment encoding
Salmonella Typhimurium invasion genes is absent from the corresponding region
of the E. coli K-12 chromosom. Mol. Microbiol., 15;749–759.
Morgan, E., Campbell, J.D., Rowe, S.C., Bispham, J., Stevens, M.P. Bowen, A.J.,
Barrow, P.A., Maskell, D.J. and Wallis, T.S. 2004. Identification of host-specific
colonization factors of Salmonella enterica serovar Typhimurium. Mol.
Microbiol., 54; 994–1010.
Morgan, E., Bowen, A.J., Carnell, S.C., Wallis, T.S. and Stevens, M.P. 2007. SiiE is
secreted by the Salmonella enterica Serovar Typhimurium pathogenicity island 4-
encoded secretion system and contributes to intestinal colonization in cattle.
Infect. Immun., 75 (3); 1524-1533.
Mullins, R.D., Heuser, J.A. and Pollard, T.D. 1998. The interaction of Arp2/3 complex
with actin: nucleation, high affinity pointed end capping, and formation of
branching networks of filaments. PNAS, 95; 6181–6186.
123
Ngwai, Y.B., Adachi, Y., Ogawa, Y. and Hara, H. 2006. Characterization of biofilm-
forming abilities of antibiotic-resistant Salmonella Typhimurium DT104 on
hydrophobic abiotic surfaces. J. Microbiol. Immunol. Infect., 39(4); 278-91.
Nicholson, B. and Low, D. 2000. DNA methylation-dependent regulation of pef
expression in Salmonella typhimurium. Mol. Microbiol., 35 (4); 728-42.
Nishimura, A., Morita, M., Nishimura, Y. and Sugino, Y. 1990. A rapid and highly
efficient method for preparation of competent Escherichia coli cells. Nucleic Acid
Res., 18 (20); 6169.
Norris, T.L., Kingsley, R.A. and Baumler, A.J. 1998. In vivo expression and
transcriptional control of the S. Typhimurium lpf fimbrial operon by phase
variation. Mol. Microbiol., 29; 311-320.
Nuccio, S-P., Chessa, D., Weening, E.H., Raffatellu, M., Clegg, S. and Baumler, A.J.
2007. SIMPLE approach for isolating mutants expressing fimbriae. Appl.
Environ. Microbiol., 73 (14); 4455–4462.
Ohl, M.E. and Miller, S.I. 2001. Salmonella: A model for bacterial pathogenesis. Annu.
Rev. Med., 52; 259-274.
Old, D.C. and Duguid, J.P. 1970. Selective outgrowth of fimbriated bacteria in static
liquid medium. J. Bacteriol., 103; 447-456.
Olsen, A., Herwald, H., Wikstrom, M., Persson, K., Mattsson, E. and Bjorck, L. 2002.
Identification of two protein-binding and functional regions of curli, a surface
organelle and virulence determinant of Escherichia coli. J. Biol. Chem., 277;
34568–34572.
Pallen, M.J., Chaudhuri, R.R. and Henderson, I.R. 2003. Genomic analysis of secretion
systems. Curr. Opin. Microbiol., 6; 519–527.
Papp-Szabo, E., Firtel, M. and Jesphy, P.D. 1994. Comparison of sensitivities of S.
Typhimurium oxyR and katG mutants to killing by human neutrophils. Infect.
Immun., 62; 2662-2668.
Persson, K., Russell, W., Morgelin, M. and Herwald, H. 2003. The conversion of
fibrinogen to fibrin at the surface of curliated Escherichia coli bacteria leads to the
generation of proinflammatory fibrinopeptides. J. Biol. Chem., 278; 31884–
31890.
124
Pizarro-Cerda, J. and Tedin, K. 2004. The bacterial signal molecule, ppGpp, regulates
Salmonella virulence gene expression. Mol. Microb., 52; 1827-1844.
Pizarro-Cerda, J. and Cossart, P. 2006. Bacterial adhesion and entry into host cells. Cell,
124; 715-727.
Porwollik, S., Wong, R.M. and McClelland, M. 2002. Evolutionary genomics of
Salmonella: gene acquisitions revealed by microarray analysis. PNAS, 99; 8956-
8961.
Porwollik, S. and McClelland, M. 2003. Lateral gene transfer in Salmonella. Microbes
and Infection, 5; 977-989.
Prigent-Combaret, C., Prensier, G., Le Thi, T.T., Vidal, O., Lejeune, P. and Dorel, C.
2000. Developmental pathway for biofilm formation in curli-producing
Escherichia coli strains: role of flagella, curli and colanic acid. Environ.
Microbiol., 2; 450–464.
Prigent-Combaret, C., Brombacher, E., Vidal, O., Ambert, A., Lejeune, P., Landini, P.
and Dorel, C. 2001. Complex regulatory network controls initial adhesion and
biofilm formation in Escherichia coli via regulation of the csgD gene. J.
Bacteriol., 183; 7213–7223.
Raffatellu, M., Wilson, R.P., Chessa, D., Andrews-Polymenis, H., Tran, Q.T., Lawhon,
S., Khare, S., Adams, L.G. and Baumler, A.J. 2005. SipA, SopA, SopB, SopD,
and SopE2 contribute to Salmonella enterica serotype Typhimurium invasion of
epithelial cells. Infect. Immun., 73; 146–154.
Raffatellu, M., Chessa, D., Wilson, R.P., Tükel, Ç., Akçelik, M. and Baumler, A.J.
2006. Capsule-mediated immune evasion: a new hypothesis explaining aspects of
typhoid fever pathogenesis. Infect. Immun., 74; 19-27.
Rahman, H., Prager, R. and Tschape, H. 2000. Occurrence of sef and pef genes among
different serovars of Salmonella. Indian J. Med. Res., 111; 40-2.
Rappleye, C.A. and Roth, J.R. 1997. A Tn10 derivative (T-POP) for isolation of
insertions with conditional (tetracycline-dependent) phenotypes. J. Bacteriol., 179;
5827-5834.
Reen, F.J., Boyd, E.F., Porwollik, S., Murphy, B.P., Gilray, D., Fanning, S. and
McClelland, M. 2005. Genomic comparisons of Salmonella enterica serovar
Dublin, Agona and Typhimurium strains recently isolated from milk filters and
125
bovine samples from Ireland, using a Salmonella microarray. Appl. Environ.
Microbiol., 71; 1616-1625.
Richter, M. 2002. Identification and characterization of intracellular binding partners of
the CHL1 (close homologue of L1) neural cell recognition molecule Dissertation,
University of Bielefeld, pp 151.
Romling, U., Bian, Z., Hammar, M., Sierralta, W.D. and Normark, S. 1998. Curli fibers
are highly conserved between Salmonella Typhimurium and Escherichia coli with
respect to operon structure and regulation. J. Bacteriol., 180; 722–731.
Romling, U., Rohde, M., Olsen, A., Normark, S. and Reinkoster, J. 2000. AgfD, the
checkpoint of multicellular and aggregative behaviour in Salmonella
Typhimurium regulates at least two independent pathways. Mol. Microbiol., 36;
10–23.
Sambrook, J. and Russell, D.W. 2001. Molecular Cloning, A Laboratory Manual. Third
Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York,
USA.
Sanderson, K. and Roth, J. 1983. Linkage map of Salmonella Typhimurium. Microbiol.
Rev., 47; 410-453.
Sanderson, K.E., Hessel, A. and Rudd, K.E. 1995. Genetic map of Salmonella
Typhimurium. Edition VIII. Microbiol. Rev., 59; 241-303.
Sandkvist, M. 2001. Biology of type II secretion. Mol. Microbiol., 40; 271–283.
Schulein, R., and C. Dehlo. 2002. The VirB/VirD4 type IV secretion system of
Bartonella is essential for establishing intraerythrocytic infection. Mol.
Microbiol., 46; 1053–1067.
Singleton, P. and Sainsbury, D. 1996. Dictionary of Microbiology and Molecular
Biology. John Wiley and Sons.
Southern, E.M. 1975. Detection of specific sequences among DNA fragments separated
by gel electrophoresis. J. Mol. Biol., 98; 503-504.
Srivatsan, A. and Wang, J.D. 2008. Control of bacterial transcription, translation and
replication by (p)ppGpp. Current Opinion in Microbiology, 11;100–105.
Suar, M., Jantsch, J., Hapfelmeier, S., Kremer, M., Stallmach, T., Barrow, P.A. and
Hardt, W.-D. 2006. Virulence of broad- and narrow-host-range Salmonella
126
enterica serovars in the streptomycin-pretreated mouse model. Infect. Immun., 74
(1); 632–644.
Swenson, D.L. and Clegg, S. 1992. Identification of ancillary fim genes affecting fimA
expression in S. Typhimurium. J. Bacteriol., 174; 7697-7704.
Swenson, D.L. Kim, K.-J., Six, E.W. and Clegg, S. 1994. The gene fimU affects
expression of Salmonella type 1 fimbriae and is related to the E. coli tRNA gene
argU. Mol. Gen. Genet., 244; 216–218.
Takizawa, N., and Murooka, Y. 1985. Cloning of the pullulanase gene and over
production of pullulanase in Escherichia coli and Klebsiella aerogenes. Appl.
Environ. Microbiol., 49; 294–298.
Tatsuno, I., Mundy, R., Frankel, G., Chong, Y., Phillips, A.D., Torres, A.G. and Kaper,
J.B. 2006. The lpf gene cluster for long polar fimbriae is not involved in
adherence of enteropathogenic Escherichia coli or virulence of Citrobacter
rodentium. Infect. Immun., 74 (1); 265-272.
Teplitski, M., Al-Agely, A. and Ahmer, B.M.M. 2006. Contribution of the SirA regulon
to biofilm formation in Salmonella enterica serovar Typhimurium. Microbiology,
152 (11); 3411-3423.
Thanassi, D.G., Saulino, E.T. and Hultgren, S.J. 1998. The chaperone/usher pathway: a
major terminal branch of the general secretory pathway. Curr. Opin. Microbiol., 1;
223-231.
Thanassi, D.G. and Hultgren, S.J. 2000. Assembly of complex organels: pilus
biogenesis in Gram-negative bacteria as a model system. Methods, 20 (1); 111-
126.
Tindall, B.J., Grimant, P.A.D., Garrity, G.M. and Guzeby, J.P. 2005. Nomenclature and
taxonomy oft he genus Salmonella. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 55; 521-554.
Tinker, J.K., Hancox, L.S. and Clegg, S. 2001. FimW is a negative regulator affecting
type I fimbrial expression in Salmonella enterica serovar Typhimurium. J.
Bacteriol., 183; 435-442.
Traxler, M.F., Summers, S.M., Nguyen, H.-T., Zacharia, V.M., Hightower, G.A., Smith,
J.T. and Conway, T. 2008. The global, ppGpp-mediated stringent response to
amino acidstarvation in Escherichia coli. Mol. Microbiol., 68 (5); 1128–1148.
127
Tsolis, R.M., Townsend, S.M. Miao, E.A., Miller, S.I., Ficht, T.A., Adams, L.G. and
Baumler, A.J. 1999. Identification of a putative Salmonella enterica serotype
Typhimurium host range factor with homology to IpaH and YopM by signature-
tagged mutagenesis. Infect. Immun., 67 (12); 6385-6393.
Tükel, Ç., Raffatellu, M., Humphries, A.D., Wilson, R.P., Andrews-Polymenis, H.L.,
Gull, T., Figueiredo, J.F., Wong, M.H., Michelsen, K.S., Akçelik, M.,
Adams, L.G. and Baumler, A.J. 2005. CsgA is a pathogen-associated molecular
pattern of Salmonella enterica serotype Typhimurium that is recognized by Toll-
like receptor 2. Mol. Microbiol., 58; 289–304.
Tükel, Ç., Raffatellu, M., Chessa, D., Wilson, R. P., Akçelik, M. and Baumler, A.J.
2006. Neutrophil influx during non-typhoidal salmonellosis: who is in the driver's
seat? FEMS Immunology and Medical Microbiology, 46 (3); 320 – 329.
Tükel, Ç., Akçelik, M., de Jong, M.F. Şimşek, Ö., Tsolis, R.M. and Baumler, A.J. 2007.
MarT activates expression of the MisL autotransporter protein of Salmonella
enterica Serotype Typhimurium. J. Bacteriol., 189 (10); 3922-3926.
Unsworth, K.E., Way, M., McNiven, M., Machesky, L. and Holden, D.W. 2004.
Analysis of the mechanisms of Salmonella-induced actin assembly during
invasion of host cells and intracellular replication. Cell. Microbiol., 6; 1041–1055.
van der Velden, A.W., Baumler, A.J., Tsolis, R.M. and Heffron, F. 1998. Multiple
fimbrial adhesins are required for full virulence of Salmonella Typhimurium in
mice. Infect. Immun., 66; 2803–2808.
Vazquez-Torres, A., Jones-Carson, J., Baumler, A.J., Falkow, S., Brown, W., Le, M.,
Breggen, R., Parks, T. and Fang, F.C. 1999. Extraintestinal dissemination of
Salmonella via CD18-expressing phagocytes. Nature, 401; 804-808.
Vazquez-Torres, A., Xu, Y., Jones-Carson, J., Holden, D.W., Lucia, S.M., Dinauer, M.
C., Mastroeni, P. and Fang, F.C. 2000. Salmonella pathogenicity island 2-
dependent evasion of the phagocyte NADPH oxidase. Science, 287; 1655–1658.
Vladoianu, I.–R., Chang, H.R. and Pechére, J.–C. 1990. Expression of host resistance to
S. Typhi and S. Typhimurium: bacterial survival within macrophages of murine
and human origin. Microb. Pathogen., 8; 83-90.
Voetsch, A., Thomas, C., Van Gilder, J., Angulo, F., Monica, J., Farley, M., Shallow,
S., Marcus, R., Cieslak, P.R., Deneen, V.C. and Tauxe, R.V. 2004. The Emerging
128
Infections Program FoodNet Working Group, FoodNet Estimate of the Burden of
Illness Caused by Nontyphoidal Salmonella Infections in the United States.
Clinical Infectious Diseases, 38 ( 3); 127–34.
Wain, J., House, D., Zafar, A., Baker, S., Nair, S. and Kidgell, C., Bhutta, Z., Dougan,
G. and Hasan, R. 2005. Vi Antigen Expression in Salmonella enterica Serovar
Typhi Clinical Isolates from Pakistan. J. Clinic. Microbiol., 43 (3);1158–1165.
Watson, P.R., Paulin, S.M., Bland, A.P., Jones, P.W. and Wallis, T.S.1995.
Characterization of intestinal invasion by Salmonella Typhimurium and
Salmonella Dublin and effect of a mutation in the invH gene. Infect. Immun., 63;
2743–2754.
Watson, R.O. and Galan, J. 2008. Campylobacter jejuni survives within epithelial cells
avoiding delivery to lysozymes. Plos Pathogens, 4 (1); 69-83.
White, A.P., Collinson, S.K., Banser, P.A., Gibson, D.L., Paetzel, M., Strynadka, N.C.
and Kay, W.W. 2001. Structure and characterization of AgfB from Salmonella
enteritidis thin aggregative fimbriae. J. Mol. Biol., 311; 735–749.
White, A.P., Gibson, D.L., Collinson, S.K., Banser, P.A. and Kay, W.W. 2003.
Extracellular polysaccharides associated with thin aggregative fimbriae of
Salmonella enterica serovar Enteritidis. J. Bacteriol., 185; 5398-5407.
White, A.P., Gibson, D.L., Kim, W., Kay, W.W. and Surette, M.G. 2006. Thin
aggregative fimbriae and cellulose enhance long-term survival and persistence of
Salmonella. J. Bacteriol., 188; 3219–3227.
Wilson, R.P., Raffatellu, M., Chessa, D., Winter, S.E., Tükel, Ç. and Baumler, A.J.
2008. The Vi capsule prevents toll-like receptor4 recognition of Salmonella.
Cellular Microbiology, 10: 876-890.
Wong, K. K., McCelland, M., Stillwell, L.C., Sisk, E.C., Thurston, S.J. and Saffer J. D.
1998. Identification and sequence analysis of ay 27-kilobase chromosomal
fragment containing a Salmonella pathogenicity island located at 92 minutes on
the chromosome map of Salmonella enterica serovar Typhimurium LT2. Infect.
Immun., 66; 3365-3371.
Wood, M.W., Jones, M.A., Watson, P.R., Hedges, S., Wallis, T.S. and Galyov, E. E.
1998. Identification of a pathogenicity island required for Salmonella
enteropathogenicity. Mol. Microbiol., 29; 883–891.
129
Wray, C. and Wray, A. 2000. Salmonella in domestic animals. CABI publishing, p. 480.
Yeh, K.S., Hancox, L.S. and Clegg, S. 1995. Construction and characterization of a
fimZ mutant of S. Typhimurium. J. Bacteriol., 177; 6861-6865.
Yeh, K.S., Tinker, J.K. and Clegg, S. 2002. FimZ binds the S. Typhimurium fimA
promoter region and may regulate its own expression with FimY. Microbiol.
Immun., 46; 1-10.
Zavialov, A., Zavyalova, G., Korpela, T. and Zavyalov, V. 2007. FGL chaperone-
assembled¢mbrial polyadhesins: anti-immune armament of Gram-negative
bacterial pathogens. FEMS Microbiol. Rev., 31; 478–514.
Zhou, D., Mooseker, M.S. and Galan, J.E. 1999. Role of the Salmonella actin binding
protein SipA in bacterial internalization. Science, 283; 2092-2095.
Zhou, D., Chen, L.M., Hernandez, L., Shears, S.B. and Galan, J.E. 2001. A Salmonella
inositol polyphosphatase acts in conjunction with other bacterial effectors to
promote host cell actin cytoskeleton rearrangements and bacterial internalization.
Mol. Microbiol., 39; 248–259.
Zierler, M.K. and Galan, J.E. 1995. Contact with cultured epithelial cells stimulates
secretion of Salmonella Typhimurium invasion protein InvJ. Infect. Immun., 63;
4024–4028.
Zink, S.D., Pedersen, L., Cianciotto, N.P. and Abu-Kwaik, Y. 2004. The Dot/Icm type
IV secretion system of Legionella pneumophila is essential for the induction of
apoptosis in human macrophages. Infect. Immun., 70; 1657–1663.
Zogaj, X., Nimtz, M., Rohde, M., Bokranz, W. and Romling, U. 2001. The multicellular
morphotypes of S. Typhimurium and E. coli produce cellulose as the second
component of the extracellular matrix. Mol. Microbiol., 39; 1452-1463.
Zogaj, X., Bokranz, W., Nimtz, M. and Romling, U. 2003. Production of cellulose and
curli fimbriae by members of the family Enterobacteraceae isolated from the
human gastrointestinal tract. Infect. Immun.,s 71; 4151-4158.
130
ÖZGEÇMİŞ
Adı Soyadı : Banu ÖZDEN
Doğum Yeri : Balıkesir
Doğum Tarihi : 19/02/1979
Medeni Hali : Bekar
Yabancı Dili : İngilizce
Eğitim Durumu (Kurum ve Yıl)
Lise : Muhittin Güzelkılıç Süper Lisesi, 1993-1997, Konya
Lisans : Ankara Üniversitesi, Ziraat Fakültesi, Gıda Mühendisliği,
Bölümü, 1997-2002
Yüksek Lisans : Ankara üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Biyoloji
Anabilim Dalı, 2002-2005
Yayınları (SCI ve diğer)
Özden, B. and Akçelik, M. 2007. Genetic analyses of bacteriocin production ability and
phage adsorption inhibition type resistance system in six Lactococcus lactis
strains. ACTA Alimentaria. 37 (2); 167-179.
Özkalp, B., Özden, B., Tuncer, Y., Şanlibaba, P. and Akçelik, M. 2007. Technological
characterization of wild-type Lactococcus lactis strains isolated from raw milk
and traditional fermented milk products in Turkey. Lait, 87; 521-534.
Tükel, Ç., Şanlıbaba, P., Özden, B. and Akçelik, M. 2006. Identification of adsorption
inhibition, restriction-modification and abortive infection type phage Resistance
systems in Lactococcus lactis strains. Acta Biologica Hungarica, 57:3 377-385.
Tuncer, Y., Özden, B. ve Avşaroğlu, M.D. 2008. Bozanın bazı mikrobiyolojik
özelliklerinin ve laktik asit bakterisi izolatlarının antibakteriyel aktivitelerinin
belirlenmesi. Süleyman Demirel Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü Dergisi, 12
(1); 19-25.
Anayol, E., Şimşek, Ö., Özden, B., Avşaroğlu, M.D. ve Akçelik, M. 2006. Lactococcus
lactis subsp. lactis EYL38 suşunda nisin üretiminin genetik anlazi ve konjugal
aktarımı. 18. Ulusal Biyoloji Kongresi, Kuşadası/Aydın, s; 32-33.
131
Üstün, M., Özden, B., Tuncer, Y. ve Akçelik, M. 2006. Hücre duvarı protein profilleri
ve plazmid içerikleri esas alınarak Lactococcus lactis suşlarının tanımlanması. 18.
Ulusal Biyoloji Kongresi, 26-30 Haziran Kuşadası/Aydın, s; 34-35.
Özden, B. ve Akçelik, M. 2005. Türkiye kökenli bazı laktokok suşlarının ürettiği
bakteriyosinlerin kısmi karakterizasyonu. XIV. Ulusal Biyoteknoloji Kongresi, 31
Agustos- 2 Eylül 2005, Eskişehir. s: 371-375.
Tuncer, Y., Tükel, Ç., Özden, B. ve Akçelik, M. 2004. L. lactis subsp. lactis YML18
suşunda adsorbsiyonun engellenmesi tipte dirençlilik sistemi ve bakteriyosin
üretiminin analizi. XVII. Ulusal Biyoloji Kongresi, 21-24 Haziran 2004
Çukurova/Adana. s:32.
