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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Curso de Graduação em Farmácia-Bioquímica
ANÁLISE DE FATORES EPIGENÉTICOS EM CÉLULAS-TRONCO
RETINIANAS DE MAMÍFEROS
Raquel Cecília Teles Rodrigues
Trabalho de Conclusão do Curso de
Farmácia-Bioquímica da Faculdade de
Ciências Farmacêuticas da Universidade
de São Paulo.
Orientador(a):
Prof.(a). Dr(a) Carolina Beltrame Del
Debbio
São Paulo
2017
1
SUMÁRIO
Pág.
Lista de Abreviaturas ....................................................................................... 3
RESUMO .......................................................................................................... 5
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................. 6
2. OBJETIVO .................................................................................................... 12
3. MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................ 12
3.1 ANIMAIS ........................................................................................ 12
3.2 EXTRAÇÃO DE RNA, QUANTIFICAÇÃO E SÍNTESE DE cDNA .. 12
3.3 PCR (POLIMERASE CHAIN REACTION) e PCR
CONVENCIONAL .................................................................................
13
3.4 qPCR (QUANTITATIVE POLIMERASE CHAIN REACTION.. 13
3.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA ................................................................ 14
4. RESULTADOS ............................................................................................. 14
4.1 EXPRESSÃO DE DNA METILTRANSFERASES ........................... 15
4.1.1 DNA Metiltransferase 1 .................................................... 15
4.1.2 DNA Metiltransferase 3A .................................................. 16
4.1.3 DNA Metiltransferase 3B .................................................. 17
2
4.2 EXPRESSÃO DE HISTONA ACETILTRANSFERASE.................... 17
4.3 EXPRESSÃO DE HISTONA DEACETILASES ............................... 18
4.3.1 Histona deacetilase 1........................................................ 18
4.3.2 Histona deacetilase 2 ....................................................... 19
4.3.3 Histona deacetilase 3 ....................................................... 20
4.3.4 Histona deacetilase 4 ....................................................... 21
4.3.5. Histona deacetilase 5 ...................................................... 22
4.4 EXPRESSÃO DE MARCADOR DE PROLIFERAÇÃO (ki67) .............. 23
5. DISCUSSÃO .............................................................................................. 24
5.1 DNA METILTRANSFERASES ........................................................ 24
5.2 HISTONA ACETILASE ................................................................... 26
5.3 HISTONA DEACETILASES ............................................................ 27
5.4 EXPRESSÃO DE ki67..................................................................... 31
6. CONCLUSÃO ............................................................................................... 31
7. BIBLIOGRAFIA ............................................................................................. 32
8. ANEXOS ....................................................................................................... 39
3
LISTA DE ABREVIATURAS
Acetil-CoA Acetil Coenzima A
CC
cDNA
CEUA
DNA
DNMTs
DNTPs
ENP
EP
EPR
HAT
HDACs
IBGE
ICB/USP
miRNA
OMS
PCR
qPCR
Corpo Ciliar
DNA Complementar
Comissão Ética no Uso de Animais
Ácido Desoxirribonucleico
DNA Metiltransferases
Desoxirribonucleotídeos Trifosfato
Epitélio Não-pigmentado
Epitélio Pigmentado
Epitélio Pigmentado Retiniano
Histona Acetiltransferase
Histonadeacetilases
Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística
Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo
MicroRNA
Organização Mundial da Saúde
Polimerase Chain Reaction
Quantitative Polimerase Chain Reaction
4
RNA
SBCAL
SD
shRNA
SNC
TSA
U.A.
ZCM
Ácido Ribonucleico
Sociedade Brasileira de Ciência de Animais em Laboratório
Sprague Dale
Short hairpin RNA
Sistema Nervoso Central
Tricostatina A
Unidade Arbitrária
Zona Ciliar Marginal
5
RESUMO
RODRIGUES, R. C.T. Análise de fatores epigenéticos em células-tronco
retinianas de mamíferos. 2017. Trabalho de Conclusão de Curso de Farmácia-
Bioquímica – Faculdade de Ciências Farmacêuticas – Universidade de São Paulo,
São Paulo, 2017.
Palavras-chave: células-tronco retinianas, corpo ciliar, epigenética.
INTRODUÇÃO: Diversas patologias levam à degeneração retiniana, e a perda
neuronal neste tecido é irreversível, uma vez que o SNC possui limitada capacidade
regenerativa. Atualmente, as células do Corpo Ciliar são uma promissora fonte de
células-tronco retinianas, e poderão ser utilizadas no futuro para o tratamento da
perda de visão por doença degenerativa, como uma Terapia Regenerativa Celular.
Porém, um fator limitante é que a eficiência de ativação destas células ainda é baixa.
A proposta desse trabalho foi estudar os fatores envolvidos na maquinaria
epigenética que possam estar influenciando a ativação de células-tronco retinianas e
estabelecer um padrão de expressão entre ratos normais e com degeneração em
curso. OBJETIVO: Identificar padrões epigenéticos em animais com degeneração
retiniana e normais (controle), avaliando possíveis diferenças na expressão de
genes relacionados à maquinaria epigenética. MATERIAIS E MÉTODOS: Foram
coletadas amostras de EP e ENP do CC e amostras de retina de ratos P23H (com
degeneração retiniana) e SD (controle) e analisados os transcritos de Dnmt1,
Dnmt3a, Dnmt3b, Hat1, Hdac 1,2,3,4,5 e ki67. RESULTADOS: Foi encontrada
diferença estatisticamente significante entre os EP de ratos com degeneração e
controle em relação à Dnmt1 e 3A, porém não em 3B. Não foi encontrada diferença
significativa entre os EP e Retina de Hat 1, Hdac 2, 4 e 5. Para Hdac1 nota-se
diferença significativa entre os ENP e para Hdac3 há diferença entre os três grupos
estudados. Observou-se uma tendência de redução da expressão de inibidores de
transcrição no EP de ratos com degeneração, o que pode estar relacionado a uma
tentativa de reativar a transcrição de fatores importantes e favorecer a atividade de
células-tronco retinianas. Também não foi observada diferença na expressão do
gene de proliferação celular ki67. CONCLUSÃO: De maneira geral, observou-se
uma tendência de redução na expressão dos fatores epigenéticos inibidores de
transcrição nos animais com degeneração retiniana em comparação com animais
normais, sugerindo que o organismo disponha destes mecanismos para tentar ativar
um possível processo de regeneração tecidual.
6
1. INTRODUÇÃO
A todo o momento recebemos diversas informações provenientes do
ambiente externo. Essas informações são captadas pelos sistemas sensoriais,
decodificadas e integradas pelo cérebro para gerar uma resposta, permitindo-nos
aprender sobre o mundo ao redor e garantir a nossa própria sobrevivência.
O olho (Figura 1) é uma estrutura primordial ao processo visual. O seu
funcionamento é semelhante ao de uma câmera fotográfica: o papel do diafragma é
feito pela pupila, cujo diâmetro é controlado pela intensidade da luz incidente e pela
ação de neurotransmissores; o cristalino é semelhante à lente, e a alteração da sua
forma para focalizar objetos próximos ou distantes (isto é, a sua acomodação) é
realizada pelo corpo ciliar (CC). Por fim, a retina (Figura 2) capta o sinal luminoso e o
converte num sinal elétrico que será conduzido ao cérebro, onde a imagem será
formada. (HALL, 2011).
Figura 1 – Desenho esquemático da estrutura do olho humano.
Fonte: VADLAPUDI et al., 2012.
Devido à posição anatômica, a retina (Figura 2) é suscetível a insultos que
podem resultar em degeneração e perda neuronal. Patologias como a retinose
pigmentar e a degeneração macular relacionada à idade podem levar à morte celular
e consequente perda funcional, causando diminuição da acuidade visual e, em
casos mais graves, perda total da visão.
7
Figura 2 – Corte histológico apresentando as camadas da retina.
Hematoxilina e eosina, x100.
Fonte: OUYANG et al., 2016
Por tratar-se de um tecido componente do Sistema Nervoso Central (SNC),
cuja capacidade regenerativa é limitada, a perda da visão causada por degeneração
retiniana é irreversível, não havendo atualmente tratamentos disponíveis que
possam reverter o quadro e restabelecer a visão. Neste âmbito, a Terapia
Regenerativa Celular, que visa utilizar células-tronco para substituir as células
danificadas e restabelecer a integridade e capacidade funcional do tecido é uma
abordagem promissora a ser desenvolvida.
A Organização Mundial da Saúde (OMS) estimou em 2014 haver cerca de
39 milhões de cegos no mundo. No Brasil, o último censo realizado em 2010 pelo
Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE) indicou que ao menos 729 mil
brasileiros apresentam cegueira completa, sendo o tipo de deficiência com maior
incidência em todas as faixas etárias. Estes dados demonstram a alta prevalência de
cegueira no Brasil e no mundo.
A cegueira é, portanto, uma importante questão de saúde pública. Um
estudo realizado na Irlanda estimou que, ao considerar custos diretos e indiretos
envolvidos na perda da visão foram gastos 276 milhões de euros em 2015, podendo
chegar a €370 milhões até 2020 (GREEN et al., 2016).
8
Assim, considerando-se a gravidade desta patologia e a ausência de terapia
atualmente, a pesquisa com células-tronco retinianas é fundamental, pois poderá
proporcionar, futuramente, tratamento curativo, melhorando a qualidade de vida e
reduzindo os custos de saúde associados.
Nos anos 50 já se sabia que anfíbios eram capazes de reconstituir a retina
após um processo degenerativo (STONE, L.S., 1950). A adição de camadas
celulares na regeneração retiniana nestes animais dá-se na forma de anéis
concêntricos, formando a Zona Ciliar Marginal (ZCM). Com o passar do tempo
observou-se que a ZCM está presente também em peixes e aves (FISCHER; REH,
2000; PERRON; HARRIS, 2000). Assim, partindo do pressuposto de uma origem
comum, iniciou-se uma busca por uma região análoga à ZCM em mamíferos, que
contivesse células-tronco capazes de restabelecer a retina morfologicamente e
funcionalmente.
Em 2000, dois grupos de pesquisa identificaram que células do epitélio
pigmentado do Corpo Ciliar, quando colocadas em cultura com fatores de
crescimento, perdiam algumas características de células epiteliais e eram capazes
de proliferar e formar neuroesferas. (TROPEPE et al., 2000; AHMAD et al., 2000).
O Corpo Ciliar (CC, Figura 3) é uma extensão da coróide, formado por duas
regiões, a pars plana e a pars plicata, e duas camadas de células, o epitélio
pigmentado (EP) e o epitélio não-pigmentado (ENP). Além da acomodação do
cristalino, o corpo ciliar é responsável pela secreção do humor aquoso e controle da
pressão intraocular. Atualmente não se considera que o epitélio ciliar constitua uma
ZCM clássica, mas sim um tecido epitelióide que pode, sob certas condições, agir
como um progenitor retiniano ou como célula-tronco retiniana. (FISCHER; BOSSE;
EL-HODIRI, 2014).
9
Figura 3 - Desenho esquemático do Corpo Ciliar de roedores.
O CC é um tecido adjacente à retina, composto por uma bicamada epitelial: Epitélio Pigmentado (EP)
e Epitélio Não-Pigmentado (ENP), morfologicamente classificado entre pars plana e pars plicata. A
seta indica o final da retina à esquerda e começo do CC à direita.
Fonte: DEL DEBBIO et al., 2014
As células do CC quando mantidas in vitro expostas a fatores de
crescimento específicos expressam marcadores de células-tronco (Sox2),
marcadores de genes progenitores retinianos (Six6\Optx2, Chx10 e Pax6), Nestina,
expressa por células-tronco neuroepiteliais, e marcadores de células retinianas já
diferenciadas (TROPEPE et al., 2000; AHMAD et al., 2000; AHMAD et al., 2004;
LORD-GRIGNON; ABDOUH; BERNIER, 2006; DEL DEBBIO et al., 2013).
In vivo, a capacidade progenitora e de diferenciação das células do CC foi
comprovada em roedores e humanos através de ativação local por meio de injeções
intraoculares de fatores de crescimento ou por transplante (CHACKO et al., 2003;
LORD-GRIGNON; ABDOUH & BERNIER, 2006).
Embora os estudos preliminares com o CC tenham sido promissores e a sua
localização seja uma vantagem à sua utilização, há uma baixa eficiência do
processo de formação das neuroesferas. (TROPEPE et al., 2000; XU et al., 2007).
Esta condição inviabiliza que surja, até este momento, uma abordagem terapêutica.
Dessa forma, observou-se a necessidade de verificar se fatores epigenéticos
poderiam estar influenciando a ativação e proliferação das células e resultando
nesta baixa eficiência.
10
O termo epigenética refere-se a alterações na expressão gênica que não
estão relacionadas a alterações genéticas (WOO; RICHARDS, 2008). Dentre as
modificações epigenéticas, pode-se citar a metilação do DNA, a modificações de
histonas (como acetilação, fosforilação, metilação e ubiquitinação) e a ação de
microRNAs (miRNAs) (MORGAN et al., 2005; CHUANG; JONES, 2005;
BANNISTER; KOUZARIDES, 2011).
A metilação do DNA é realizada pelas DNA metiltransferases (DNMTs),
enzimas que promovem a adição de um grupo metil no carbono 5 da molécula de
citosina, formando a 5-metilcitosina. Esta modificação é bastante presente em
regiões CpG, pequenas sequências de DNA ricas em Citosina e Guanina. Estima-se
que 80% das regiões CpG estejam metiladas em mamíferos (ZHAO et al., 2016).
Sabe-se que a metilação do DNA é um mecanismo utilizado pelos animais
desenvolvidos para o silenciamento de genes, como exemplificado na inativação do
cromossomo X extra e no desenvolvimento de mamíferos (OKANO et al., 1999;
JONES; TAKAI, 2001; HELMANN; CHESS, 2007).
O processo de metilação promove alterações profundas na interação da fita
do DNA com proteínas. (JONES; TAKAI, 2001). O mecanismo de silenciamento
gênico é complexo: além do impedimento estérico pela adição do grupo metil, a
interação com proteínas como a MDB (proteínas que contém o domínio de ligação a
Metil CpG) recruta histona deacetilases, tornando a cromatina mais compacta e
consequentemente menos acessível à interação com fatores de transcrição
(MOORE; LE; FAN, 2013; DU et al., 2015).
Dentre as isoformas das DNMTs as mais estudadas são a Dnmt 1, Dnmt 3a
e 3b. Estudos anteriores consideravam que DNMT1 era unicamente responsável
pela manutenção da metilação do DNA durante a replicação. Hoje, considera-se que
há participação de Dnmt 3a e 3b para manter estes padrões (JONES; LIANG, 2009;
JONES, J. P.A 2012, MOORE; LE; FAN, 2013). As isoformas 3a e 3b relacionam-se
principalmente à metilação de novo. (OKANO et al., 1999; MOORE; LE; FAN, 2013).
A histona acetiltransferase (hat) é uma enzima que promove a acetilação de
resíduos de lisina em histonas H4, H2A e H3 (em menor proporção) recém-
sintetizadas, promovendo a ativação da expressão gênica e replicação do DNA. O
mecanismo suposto para a sua ação é que a transferência do grupo acetil (um
11
derivado do ácido acético) a partir de uma molécula de acetil coenzima A (Acetil-
CoA) promove a neutralização da carga catiônica dos resíduos de lisina da porção
N-terminal das histonas, diminuindo a interação desta com o DNA (que possui
caráter aniônico). Dessa forma o acesso de fatores de transcrição e à RNA
polimerase é facilitado. (PARTHUN, M.R. 2012; WU et al., 2012; TAFROVA;
TAFROV, 2014).
A função das HATs ainda não está bem elucidada, porém estudos com Hat1
indicam que ela é importante no reparo do DNA (YANG et al., 2013) e na
proliferação celular de células cancerosas (TAFROVA; TAFROV, 2014; JIN; TIAN;
LI, 2016). A influência no desenvolvimento não está bem definida, porém sabe-se
que a deleção do gene Hat1 promove letalidade neonatal em murinos.
(NAGARAJAN et al., 2013)
A retirada do grupo acetil é realizada pelas histonas deacetilases (HDACs).
Existem ao menos 11 tipos de HDACs estudadas, dividindo-se em quatro classes
principais: a classe I corresponde as HDACs 1, 2, 3 e 8, normalmente presentes no
núcleo; a classe II divide-se em classe IIa, referindo-se às HDACs 4, 5, 7 e 9, cuja
ação ocorre no núcleo e citoplasma, e classe IIB, com as HDACs 6 e 10 e ação
predominantemente no citoplasma; e por fim, a classe IV se refere à HDAC 11. A
classe III é representada pelas sirtuinas e não por HDACs. (CHOO & CAVALLI,
2014; DESJARDINS et al., 2016).
As Hdac 1, 3, 4, 5 e 7 são expressas durante o desenvolvimento da retina
(CHEN; CEPKO, 2007) e a Hdac 2 é expressa nas células ganglionares e camada
nuclear interna da retina (FAN et al., 2013) e por isso foram inicialmente escolhidas
(excetuando-se Hdac 7) para a análise neste trabalho.
Assim, considerando-se que os mecanismos epigenéticos explicitados são
relevantes para o controle de importantes atividades celulares, o estudo dos padrões
epigenéticos presentes em células do CC se torna fundamental, não só para a
contribuição à literatura geral, que é escassa neste tema, mas também para
desvendar mecanismos de regulação cuja manipulação pode apresentar potencial
clínico no tratamento da perda de visão por degeneração retiniana.
Os resultados obtidos poderão ser utilizados para o desenvolvimento de
novas pesquisas e estratégias de ativação de células-tronco retinianas,
12
proporcionando futuramente uma nova abordagem farmacológica e terapêutica à
perda da visão.
2. OBJETIVO
Este trabalho teve por objetivo avaliar a expressão de transcritos de DNA
metiltransferases (DNMTs), histona acetiltransferase (HAT) e histona deacetilases
(HDACs) em amostras de EP, ENP e Retina de ratos com degeneração retiniana
(P23H) e normais (Sprague Dale - SD), a fim de identificar diferenças no padrão de
expressão entre os dois grupos.
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 ANIMAIS
Este projeto foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais
(CEUA) do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo
(ICB/USP), sendo o protocolo registrado sob nº 075, folhas 34, livro 03 tendo o
CEUA da Faculdade de Ciências Farmacêuticas tomado ciência em 19/02/2016, sob
ofício 4.2016.
O estudo foi realizado segundo os Princípios Éticos de Experimentação
Animal adotado pela Sociedade Brasileira de Ciência de Animal adotado pela
Sociedade Brasileira de Ciência de Animais de Laboratório (SBCAL).
Foram utilizados animais adultos, de aproximadamente 30 dias de duas
linhagens diferentes, com degeneração retiniana (P23H) e normais (SD) como
controle.
Os animais foram eutanaziados em câmara de CO2 e os globos oculares
enucleados. Em seguida procedeu-se a retirada das córneas e do corpo ciliar por
dissecção, e separados o EP, ENP e retina em tubos previamente identificados. As
amostras foram armazenadas a - 80 ºC até a sua utilização.
13
3.2 EXTRAÇÃO DE RNA, QUANTIFICAÇÃO E SÍNTESE DE cDNA
O RNA total das amostras foi extraído utilizando-se kit específico (Qiagen®)
segundo protocolo estabelecido pelo fabricante.
Após a extração, foi quantificada a concentração total de RNA em
espectrofotômetro a 260/280 nm.
Calculou-se o volume a ser utilizado de cada amostra de modo a obter-se
cDNA com concentração final igual a 1,0 ng/ml.
Para formação do cDNA, utilizou-se 2 µl da enzima transcriptase reversa
(Superscript RT), 5 µl do iniciador DTT 100 mM e 1 µl de RNAsin em uma reação
com volume final de 50 µl, contendo ainda 10 µl de solução tampão 5X, 2,5 µl de
desoxirribonucleotídeos trifosfato (dNTPs) 10mM. A reação de síntese de cDNA
realizada a 37 ºC por 60 min, 42 ºC por 30 min e 70 ºC por 10 min.
3.3 PCR (POLIMERASE CHAIN REACTION) e PCR CONVENCIONAL
A fim de avaliar se a síntese de cDNA havia sido realizada corretamente,
realizamos a amplificação do gene Gapdh, que codifica a família das proteínas
gliceraldeído 3-fosfato desidrogenases, expressa na maioria dos tipos celulares. O
mix da reação continha o 1 µl do da sequência forward e reverse do primer
específico para a reação (Anexo), 2 µl dNTPs, 0,5 µl de enzima Taq-Polimerase® e
2 µl de MgCl em solução tampão, e foi processada em termociclador por 50 ºC por 2
min e 95 ºC por 10 min (fase 1) e em seguida 35 ciclos de 95 ºC por 10 s, 60 ºC por
35 s (anelamento) e 72 ºC por 30 s (extensão).
O gene amplificado foi analisado em gel de agarose 2%, comparando-se o
peso da banda formada para cada amostra com o padrão molecular.
3.4 qPCR (QUANTITATIVE POLIMERASE CHAIN REACTION)
Após a confirmação de que a síntese de cDNA foi adequada, foram
realizados a amplificação e quantificação dos genes de interesse utilizando-se para
14
isso um mix contendo 12,5 µl Syber-Green® (Qiagen®), 1ul de amostra e 1 µl da
sequência forward e reverse de primers específicos (Anexo I) para histona
acetiltransferase 1 (HAT 1), DNA metiltransferase 1, 3A e 3B (Dnmt1, Dnmt 3a, Dnmt
3b), histona acetiltransferases 1, 2, 3, 4 e 5 (Hdac 1-5) e ki67 (proliferação). As
amostras foram colocadas em triplicata em placa de 96 wells.
Foi construída uma curva padrão realizando-se diluições sucessivas de
amostras de EP de ratos neonatos, visto que a expressão dos genes de interesse
seria provavelmente maior nestas amostras, não havendo o risco de obtermos
concentrações acima da curva obtida e garantindo assim a homogeneidade dos
ensaios.
Inicialmente a reação foi colocada por 50 ºC por 2 min e 95 ºC por 10 min
(fase 1) e em seguida 40 ciclos de 95 ºC por 10 s, 60 ºC por 35 s (anelamento) e 72
ºC por 30 s (extensão), com adição de curva de dissociação.
Foi avaliada o índice de correlação obtido na curva padrão e a curva de Melt
a fim de verificar a eficiência da reação.
As amostras foram normalizadas pela expressão do gene Gapdh, utilizado
como controle endógeno.
3.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Cada amostra foi preparada a partir de um pull de material obtido de 5-8
animais diferentes (1 pull = N1). Os resultados obtidos são referentes à análise de 2
ou 3 pulls diferentes (N2 e N3) de cada amostra. A coleta e análise da terceira
amostra daqueles resultados obtidos de apenas 2 (N2) estão sendo realizadas neste
momento. Os dados foram representados em unidades arbitrárias (U.A.), sendo o
valor estimado relativo ao valor da curva padrão (PCR). As diferenças estatísticas
entre os tratamentos foram avaliadas pelo test-T de Student dado pelo valor de P
<0,05 e os resultados estão representados pela média ±SD.
4 RESULTADOS
15
4.1 EXPRESSÃO DE DNA METILTRANSFERASES
4.1.1 DNA Metiltransferase 1
Os dados obtidos da expressão dos transcritos de Dnmt1 indicaram que os
animais com degeneração retiniana possuem menor expressão de Dnmt1
comparado ao grupo controle (Figura 4). A análise estatística identificou uma
diferença significativa entre as amostras de EP dos dois animais (SD= 0,4073 ±
0,01391, P23H= 0,2982 ± 0,01235). Apesar de não ser estatisticamente diferente, as
amostras de ENP dos animais com degeneração indicaram um padrão de expressão
menor que dos animais normais (SD= 0,3888 ± 0,02961, P23H= 0,3052 ± 0,02688).
Não foi observada diferença significativa de expressão gênica entre as
amostras de retina dos animais normais e com degeneração (SD= 0,2507 ± 0,02254,
P23H= 0,2358 ± 0,01621).
Figura 4 - Análise por qPCR da expressão dos transcritos de Dnmt1 em amostras células
derivadas do Epitélio Pigmentado (EP), Epitélio Não-Pigmentado (ENP) e Retina de animais
normais (SD) e com degeneração retiniana (P23H). SD = Sprague Dale. p<0,05.
Fonte: a autora.
16
4.1.2 DNA Metiltransferase 3A
Os dados obtidos da expressão dos transcritos de Dnmt3a indicaram que os
houve diferença entre a expressão de Dnmt3a entre o grupo degenerado e controle
para o EP (SD= 1,007 ± 0,04039; P23H= 0,8272 ± 0,03958), porém o mesmo não
ocorre ao compararmos o ENP dos dois grupos (SD= 0,171 ± 0,03407, P23H=
0,9054 ± 0,1629) (Figura 5). Como houve um grande desvio padrão dentro do grupo
P23H ENP, a sua análise será repetida.
Figura 5 - Análise por qPCR da expressão dos transcritos de Dnmt3a em amostras células
derivadas do Epitélio Pigmentado (EP), Epitélio Não-Pigmentado (ENP) e Retina de animais
normais (SD) e com degeneração retiniana (P23H). SD = Sprague Dale. p<0,05.
Fonte: a autora.
A análise estatística confirmou a diferença significativa somente entre os
EPs dos dois grupos testados (normais e com degeneração) e entre o EP e ENP do
grupo controle.
Observou-se, ainda, uma menor expressão de Dnmt3a nas amostras de
retina dos animais estudados em comparação com as amostras de EP e ENP dos
mesmos grupos. Não houve diferença estatística entre a expressão gênica na retina
comparando-se os grupos com degeneração e controle (SD = 0,4378 ± 0,02508,
P23H = 0,5190 ± 0,06602).
17
4.1.3 DNA Metiltransferase 3B
A análise dos dados obtidos da expressão de Dnmt3b indica não haver
diferenças significativas na expressão deste transcrito entre as amostras de EP e
ENP dos animais normais e os com degeneração retiniana (Figura 6). Da mesma
forma, não foi observada diferença estatística na expressão deste transcrito nas
amostras de retina (EP: SD = 8,575 ± 0,4843; P23H = 8,329 ± 0,2978. ENP: SD =
7,912 ± 0,7801; P23H = 9,499 ± 1,202. Retina: SD = 10,62 ± 0,9725; P23H = 8,690
± 1,126).
Figura 6 - Análise por qPCR da expressão dos transcritos de Dnmt3b em amostras células
derivadas do Epitélio Pigmentado (EP), Epitélio Não-Pigmentado (ENP) e Retina de animais
normais (SD) e com degeneração retiniana (P23H). SD = Sprague Dale. p<0,05.
Fonte: a autora.
4.2 EXPRESSÃO DE HISTONA ACETILTRANSFERASE
Os dados obtidos da expressão dos transcritos de Hat1 (Figura 7) não
indicaram diferença estatística significativa entre os grupos controle (SD) e o grupo
com degeneração retiniana (P23H), em nenhuma das amostras estudadas,
sugerindo que este gene não sofre modulação pelo processo degenerativo (EP: SD=
18
1,325 ± 0,1108; P23H= 1,416 ± 0,0075. ENP: SD= 1,301 ± 0,0529, P23H= 1,391.
Retina SD= 0,9910 ± 0,1565; P23H= 0,9208 ± 0,03053).
Figura 7 - Análise por qPCR da expressão dos transcritos de Hat1 em amostras células
derivadas do Epitélio Pigmentado (EP), Epitélio Não-Pigmentado (ENP) e Retina de animais
normais (SD) e com degeneração retiniana (P23H). SD = Sprague Dale. p<0,05.
Fonte: a autora.
4.3 EXPRESSÃO DE HISTONA DEACETILASES
4.3.1 Histona deacetilase 1
Os dados referentes à expressão dos transcritos de Hdac1 indicaram uma
sutil diferença na expressão deste gene, aparentemente diminuída nos animais com
degeneração em comparação com o animal normal (EP: SD= 1,003 ± 0,03830;
P23H= 0,8958 ± 0,03032. ENP: SD= 0,9818 ± 0,02498; P23H= 0,8393 ± 0,02189.
Retina: SD= 0,6328 ± 0,03799; P23H=0,6000 ± 0,02372). Embora observado um
aparente padrão de maior nível de expressão de Hdac1 no grupo dos animais
normais em comparação com os com degeneração retiniana, essa diferença só foi
confirmada pela análise de test-t para as células do ENP (p= 0,0016; p<0,05). Não
foram encontradas diferenças significativas na expressão das amostras de retina ou
o EP e tampouco entre os dois epitélios do mesmo tipo de animal.
19
Figura 8 - Análise por qPCR da expressão dos transcritos de Hdac1 em amostras células
derivadas do Epitélio Pigmentado (EP), Epitélio Não-Pigmentado (ENP) e Retina de animais
normais (SD) e com degeneração retiniana (P23H). SD = Sprague Dale. p<0,05.
Fonte: a autora.
4.3.2 Histona deacetilase 2
Nossos resultados indicaram uma maior expressão de Hdac2 nas amostras
derivadas da retina de animais normais quando comparamos os níveis observados
com o grupo com degeneração (SD= 17,32 ± 1,297; P23H= 15,17 ± 0,9026) (Figura
9).
Da mesma forma que Hdac1, não há diferença estatisticamente significativa
entre as amostras dos epitélios entre os diferentes grupos, assim como também não
foi significativa entre o EP e ENP do mesmo grupo de estudo. (EP: SD= 15,66 ±
0,6481; P23H= 15,46 ± 0,3617. ENP: SD= 17,32 ± 1,297; P23H= 15,17 ± 0,9026.
Retina: SD= 17,31 ± 1,499; P23H= 12,85 ± 0,4360).
20
Figura 9 - Análise por qPCR da expressão dos transcritos de Hdac2 em amostras células
derivadas do Epitélio Pigmentado (EP), Epitélio Não-Pigmentado (ENP) e Retina de animais
normais (SD) e com degeneração retiniana (P23H). SD = Sprague Dale. p<0,05.
Fonte: a autora.
4.3.3 Histona deacetilase 3
Os resultados obtidos da expressão de Hdac3 indicaram menor expressão
deste transcrito nas amostras do epitélio ciliar derivadas de animais com
degeneração retiniana em comparação com animais normais (Figura 10). A análise
estatística demonstrou que existe diferença significativa nas amostras derivadas dos
três grupos (EP: SD= 1,493 ± 0,06987; P23H= 1,227 ± 0,02879. ENP: SD= 1,412 ±
0,07421; P23H= 0,9860 ± 0,05222. Retina: SD= 0,8642 ± 0,03984; P23H= 0,7595 ±
0,01607).
Ao analisarmos a diferença entre os dois tipos diferentes de epitélios (EP x
ENP) derivados do mesmo animal, observamos que esta diferença só é significativa
em relação ao grupo dos animais com degeneração, sendo maior a expressão no
EP comparado ao ENP (SD EP= 1,493 ± 0,06987 X ENP= 1,412 ± 0,07421, p=
0,4510; P23H EP= 1,412 ± 0,07421 X ENP= 0,9860 ± 0,05222, p=0,0024).
21
Figura 10 - Análise por qPCR da expressão dos transcritos de Hdac3 em amostras células
derivadas do Epitélio Pigmentado (EP), Epitélio Não-Pigmentado (ENP) e Retina de animais
normais (SD) e com degeneração retiniana (P23H). SD = Sprague Dale. p<0,05.
Fonte: a autora.
4.3.4 Histona deacetilase 4
Os transcritos de Hdac4 apresentaram-se expressos em maior quantidade no
EP e no ENP do grupo controle (normal), em comparação ao grupo de animais que
apresentam degeneração retiniana (EP: SD= 1,448 ± 0,06570; P23H= 1,256 ±
0,07205. ENP: SD= 1,969 ± 0,1740; P23H= 1,328 ± 0,06917) (Figura 11).
Apesar de apresentar um claro padrão de maior nível de expressão de HDAC
4 no grupo dos animais normais em comparação com os que apresentam
degeneração retiniana na análise dos epitélios do CC, esta diferença não foi
observada na expressão deste gene entre as amostras de retinas dos dois grupos
de estudo (Retina: SD= 1,705 ± 0,02339; P23H= 1,710 ± 0,1034), assim como entre
o EP e ENP dentro do mesmo grupo de estudo.
22
Figura 11 - Análise por qPCR da expressão dos transcritos de Hdac4 em amostras células
derivadas do Epitélio Pigmentado (EP), Epitélio Não-Pigmentado (ENP) e Retina de animais
normais (SD) e com degeneração retiniana (P23H). SD = Sprague Dale. p<0,05.
Fonte: a autora.
4.3.5. Histona deacetilase 5
A primeira análise sobre os resultados da expressão de Hdac5 chamou a
atenção pela alta expressão destes transcritos no tecido retiniano em comparação
com o CC (Figura 12). Além disso, foi possível notar um padrão de expressão menor
nas amostras provenientes do grupo de animais com degeneração quando
comparado ao grupo controle.
Apesar deste padrão de expressão gênica diminuída nos animais com
degeneração, a análise estatística indicou diferença significante entre as amostras
de EP dos grupos com degeneração em comparação ao grupo normal, mas não
entre as amostras derivadas do ENP e retina (EP: SD= 1,077 ± 0,03449; P23H=
0,8400 ± 0,05336. ENP: SD= 0,9797 ± 0,04473; P23H= 0,8400 ± 0,05336. Retina:
SD= 1,661 ± 0,05667; P23H= 1,584 ± 0,09056).
23
Figura 12 - Análise por qPCR da expressão dos transcritos de Hdac5 em amostras células
derivadas do Epitélio Pigmentado (EP), Epitélio Não-Pigmentado (ENP) e Retina de animais
normais (SD) e com degeneração retiniana (P23H). SD = Sprague Dale. p<0,05.
Fonte: a autora.
4.4 EXPRESSÃO DE MARCADOR DE PROLIFERAÇÃO (ki67)
Foi avaliada a expressão do gene relacionado à proliferação ki67 (Figura 13)
nos animais com degeneração retiniana e animais normais adultos. Os resultados
obtidos foram plotados em gráfico e feita a análise estatística por test-T conforme a
metodologia definida anteriormente.
24
Figura 13 - Análise por qPCR da expressão dos transcritos de ki67
Fonte: a autora.
Os resultados não indicaram alteração na expressão dos transcritos de ki67
nas amostras de EP e ENP dos animais estudados (EP: SD= 12,51 ± 0,9725; P23H=
12,73 ± 0,5166. ENP: SD= 12,73 ± 0,5166; P23H= 12,32 ± 0,7402). A única
alteração significativa foi observada na retina dos animais com degeneração
retiniana, onde os transcritos deste gene se apresentaram menos expressos que o
grupo sem degeneração (Retina: SD= 12,56 ± 0,5586; P23H= 10,19 ± 0,3529,
p=0,050).
5 DISCUSSÃO
5.1 DNA METILTRANSFERASES
Nossos resultados indicaram, de maneira geral, uma constante diminuição
na expressão dos genes estudados nos tecidos derivados de animais com
degeneração retiniana. Dados recentes da literatura obtidos em zebrafish, indicaram
que genes ortólogos reduzem a expressão de DNMTs durante a regeneração
(TAKAYAMA et al, 2014). Estes dados demonstram que o organismo induz uma
25
alteração na expressão de DNMTs para proporcionar um ambiente permissivo a
regeneração.
Ao analisar os dados referentes à expressão de Dnmt 1 e 3a, verificou-se
uma diminuição de expressão nas células do EP de ratos com degeneração quando
comparado ao grupo controle. As células do EP são capazes de proliferar quando
estimuladas com fatores de crescimento e, posteriormente, darem origem à
neurônios retinianos, sendo consideradas células-tronco retinianas. Partindo do
princípio de que a metilação promove o silenciamento dos genes, incluindo genes
importantes para os processos de proliferação, pluripotência e progenitores, a
diminuição de expressão das DNMTs nestas células sugere uma possível tentativa
do organismo de prover um microambiente favorável à ativação de genes e evitar ou
reverter a degeneração em curso. A menor expressão de Dnmt 3a na retina também
corrobora para esta hipótese.
Sabe-se que células-tronco expressam uma maior quantidade de genes do
que células diferenciadas (ABEYTA, et al, 2004). Sungh e colaboradores cultivaram
células do gânglio da raiz dorsal para formação de neuroesferas e observaram que,
ao longo da diferenciação, houve um aumento na expressão Dnmt 1 e Dnmt 3a,
indicando que o processo de diferenciação requer um aumento na restrição gênica
(SINGH et al, 2009). Nesse contexto, nossos dados sugerem que a diminuição da
expressão de Dnmt 1 e 3a esteja associada a uma tentativa do organismo de
retornar as células ao estado de progenitores.
Em relação a Dnmt 3b, o primeiro ponto a ser discutido é que a expressão
de Dnmt 3b foi muito maior quando comparado a outra isoforma. Porém, deve-se
ressaltar que, como medimos somente a quantidade de RNAm, não é possível inferir
que haja maior expressão da proteína referente, visto que não há como garantir que
todo o RNAm medido foi traduzido numa proteína funcional. Para isso, serão
necessários experimentos adicionais para comprovar esta questão. Outro ponto
interessante é que, analisando o gráfico, foi possível notar que existe um padrão no
qual a retina apresentou uma expressão ligeiramente acentuada de Dnmt 3b em
comparação aos epitélios do corpo ciliar.
Estudos anteriores indicam que a lesão na retina leva a uma redução
transitória de Dnmt 3b em células gliais de Müller, com um concomitante aumento de
26
Oct4 e Nanog, genes marcadores de progenitores. Porém, após 24hs, essa
expressão não é mais detectável, o que sugere uma reativação da metilação do
gene de forma temporária. Bloqueando-se a atividade das DNMTs, a atividade de
Oct4 é mantida (REYES-AGUIRRE; LAMAS, 2016). Sabe-se que as células de
Müller também apresentam capacidade de reprogramação para células-tronco
retinianas e esta redução de DNMTs pode estar relacionada com a capacidade
regenerativa destas células.
Os nossos dados não apontaram diferenças na expressão de DNMTs nas
amostras de retina estudadas, sugerindo que a resposta regenerativa proveniente
das células neste tecido possa ocorrer precocemente, durante o início do processo
degenerativo, e não após o processo de degeneração estar avançado, como nas
amostras estudadas.
A hipermetilação, além de associada aos processos de diferenciação,
também está relacionada à morte celular (WAHLIN, K. 2013). Logo, uma outra
hipótese para a redução na expressão de transcritos de enzimas metilatórias é que a
redução das DNMTs pode ser um mecanismo compensatório para diminuir a morte
celular nas células da retina de animais com degeneração retiniana.
A expressão de DNMTs é importante para a diferenciação celular, incluindo
o desenvolvimento neuronal. Animais knockouts para os três genes (Dnmt 1, Dnmt
3a e Dnmt 3b) não foram capazes de formar uma camada de fotorreceptores e
possuíam uma camada nuclear externa reduzida em relação a um animal normal
(SINGH et al, 2016).
Aqui, nossos dados indicaram uma importante diminuição na expressão de
DNMTs 1 e 3a nas células do epitélio ciliar de animais com degeneração, o que
sugere uma tentativa do organismo de ativar as células-tronco desta região para
acionar um possível mecanismo de reparo.
5.2 HISTONA ACETILASE
Numa tentativa de reprogramar células somáticas humanas, Han e
colaboradores utilizaram inibidores de DNMTs e HDACs. Os autores observaram
que apenas a inibição dos dois não foi suficiente para ativar a transcrição de genes
27
progenitores como Oct4 e Nanog, sendo necessário utilizar, em conjunto, o ácido
retinóico, um fator que ativa histona acetilases. (HAN, J. SACHDEV, P.S. SIDHU,
K.S, 2010).
No nosso estudo não foram identificadas diferenças de expressão destes
genes entre os grupos de animais com degeneração e normais, porém,
considerando-se que utilizamos animais em estágio final da degeneração retiniana,
não se pode descartar a possibilidade da regulação e influência de HAT em estágios
anteriores. Para avaliar esta hipótese, será futuramente pesquisada a expressão de
HAT em diferentes idades de ratos com degeneração comparado a um grupo
controle normal.
5.3 HISTONA DEACETILASES
Sabe-se que ao longo do desenvolvimento existe uma grande variabilidade na
expressão de HDACs (LEE; HART; SKALNIK;, 2003). Num estudo conduzido por
CHEN e CEPKO em 2007, verificou-se que Hdac 1,3,4,5 e 6 são expressos na retina
durante o desenvolvimento. A inibição inespecífica destes genes leva a um aumento
da morte celular, diminuição da proliferação e redução quantitativa de células
fotorreceptoras. Logo, estes dados indicam a importância da expressão de HDACs
ao avaliarmos o desenvolvimento da retina, e, portanto, é possível que influenciem
também o desenvolvimento e ativação de progenitores retinianos.
Diversos estudos indicam ainda que a inibição de HDACs têm um efeito
protetor contra a degeneração de células neuronais. A inibição in vitro e in vivo
destes genes diminuiu a perda de cones em ratos que possuem degeneração. Uma
única injeção intraocular do inibidor promoveu a manutenção dos cones por pelo
menos duas semanas (TRIFUNOVIĆ et al, 2016). A inibição de Hdac 1 e 3
promoveu também a proteção de células ganglionares de uma injúria no nervo
óptico, evitando a morte celular. (CHINDASUB et al, 2013)
Embora nossa análise estatística não tenha indicado uma diferença
significativa, é interessante notar que existe um padrão de redução na expressão de
Hdac 1 e Hdac 2 nas células do epitélio ciliar e na retina de ratos que apresentam
degeneração retiniana quando comparado ao grupo controle, tal qual ocorre com as
28
DNMTs. No estudo, estudo conduzido por Ferreira et al. (2016), a inibição de Hdac 1
levou a manutenção da expressão de genes de progenitores como Chx10 e Hes1 e
reduziu a expressão de genes específicos de bastonetes. Sabe-se, ainda, que Hdac
1 inibe a transcrição de Pax 6, gene essencial para a retinogênese e a sua inibição
promove o aumento da transcrição (KIM et al, 2017).
Dessa forma, além do mecanismo de proteção contra a degeneração é
possível que exista uma tentativa, por parte das células do CC e da retina, de
diminuir a inibição da transcrição gênica através de modulação epigenética.
Possivelmente, esta modulação teria por objetivo desinibir a expressão de genes
progenitores retinianos e a desdiferenciação em células-tronco potenciais. Para
verificar se esta hipótese tem fundamento será futuramente avaliada a expressão de
genes de progenitores retinianos comparando-se os dois grupos de estudo. Se
confirmada esta diferença de expressão será realizada a análise de expressão de
HDAC especificamente nestes genes
A Hdac 2 é, como já dito anteriormente, expressa em células ganglionares e
na camada nuclear interna da retina. Em outro estudo, a análise de um animal
híbrido para deleção de Hdac 2 levou a uma perda dos corpos celulares e colapso
da camada nuclear interna. O tratamento com triscostatina A (TSA), um inibidor
inespecífico de HDACs teve efeito protetor. (FAN et al, 2013). Este dado também
nos remete a ideia de que a diminuição de HDAC ocorre com o objetivo de preservar
a retina.
Para avaliar se há efeito na ativação de células-tronco retinianas será
necessário promover a inibição farmacológica ou por short hairpin RNA (shRNA) de
HDACs e verificar se há alguma alteração na formação de neuroesferas. Porém, não
é possível ignorar que a inibição conjunta da atividade de HDACs pode ser deletéria.
Num estudo realizado in vivo, ratos nocaute para Hdac 1 e 2 em conjunto levou a
sérias alterações morfológicas e estruturais do cérebro e um bloqueio total da
diferenciação neuronal, além de letalidade 7 dias após o nascimento. A inibição
somente de Hdac 1 ou Hdac 2, entretanto, manteve a histoarquitetura normal e não
promoveu letalidade precoce (MONTGOMERY, et al. 2009).
A inibição de HDACs pode também prejudicar a diferenciação neuronal, que
será necessária após a ativação das células-tronco retinianas. Dados da literatura
29
indicam que HDACs de classe I, e mais especificamente Hdac 1 e 3 são essenciais
para o desenvolvimento dos fotorreceptores na retina. A inibição de Hdac 1
promoveu aumento da morte celular, diminuição da proliferação e redução em 60%
da expressão de rodopsina. A inibição de Hdac 3 teve um efeito menor, reduzindo
em e 25% esta expressão. Estes efeitos, porém, só são observados até 7 dias após
o nascimento. (FERREIRA, et al 2016).
Além disso, a expressão de HDACs varia conforme o estágio do
desenvolvimento. Em outro estudo, concluiu-se que a expressão de Hdac 2 é
importante no neurodesenvolvimento pós-natal, enquanto a Hdac 1 é mais expressa
em progenitores. Segundo o estudo, ratos com inibição de Hdac 2 apresentavam
maior proliferação celular e maior expressão de Sox 2, gene marcador de
progenitores, porém aumento de caspase-3 e morte neuronal durante a fase de
maturação (JAWERKA et al, 2010). Essa diferença na expressão de Hdac 1 e 2 é
presente também no desenvolvimento do cerebelo (YOO; LAROUCHE;
GOLDOWITZ, 2013). Neste caso, faz-se necessário identificar ainda a influência de
HDAC em cada estágio do desenvolvimento.
Em nossa análise, houve uma significativa redução na expressão de Hdac 3
nos dois epitélios do CC e na retina, o que nos remete a uma maior participação
desta isoforma na inibição da transcrição genes nos três epitélios. A menor
expressão ocorrer também no ENP é surpreendente: notavelmente, quando
colocadas em cultura apenas as células do EP foram capazes de formar
neuroesferas (TROPEPE et al 2000; AHMAD et al 2000). Se realmente as células
procuram diminuir a expressão de HDAC como um mecanismo de reparo, a
diminuição também em ENP pode indicar que este epitélio é também fosse capaz de
desdiferenciação, porém está sujeito a outros mecanismos inibitórios que impedem
esta propriedade.
Na literatura, porém, a inibição de Hdac 3 promoveu um aumento da
expressão de genes de diferenciação neuronal (CASTELO-BRANCO et al, 2014).
Neste caso, a diminuição de Hdac 3 pode também estar relacionada a uma tentativa
de, posteriormente a uma ativação de célula-tronco retiniana, promover a
diferenciação desta numa célula neuronal competente.
30
Este aparente paradoxo, no qual a inibição de HDACs classe I promove
ativação e não inibição da transcrição, deve-se possivelmente a um mecanismo
compensatório sobre a redução do gene expresso. (CUNLIFFE, V. T. 2008). Além
disso, deve-se considerar que os estudos na literatura utilizam diferentes
metodologias, tipos celulares e em diferentes fases do desenvolvimento, também
contribuindo para os resultados diversos. (JAWERKA et al, 2010; KRESTOVALI et
al, 2012).
Ao analisarmos a expressão de Hdac 4 e Hdac 5, mais uma vez foi possível
notar um padrão de redução da expressão destas enzimas em ratos com
degeneração retiniana quando comparado ao grupo controle. Outro dado
interessante é que, enquanto a expressão de Hdac 4 é semelhante entre a retina e
os epitélios do CC, quando analisamos Hdac 5 nota-se que há uma expressão muito
maior na retina. É notável, ainda, que a expressão de Hdac 4 no ENP é
significativamente maior do que no EP, o que poderia sugerir um mecanismo de
inibição maior no ENP do que no EP e estar relacionado a, por exemplo, a diferença
na propriedade de formação de neuroesferas. Não é possível, porém afirmar que
existe essa correlação, visto que seriam necessários ensaios para verificar se existe
alguma alteração após a inibição de Hdac 4.
Na literatura, a inibição de Hdac 4, 6 e 10 in vitro utilizando shRNA destinado
às células via transfecção viral aumentou a expressão de Oct4 e Nanog, genes
marcadores de pluripotência em fibroblastos bovinos (STASZKIEWIC et al, 2013).
No caso de Hdac 4 é possível também que a redução se deva a um efeito
protetor contra a degeneração em curso. Em animais normais e com degeneração
retiniana a inibição de Hdac 4 levou à apoptose. Quando, porém, aumenta-se a
expressão de Hdac 4, células bipolares que normalmente morreriam no 14º dia após
o nascimento permaneceram viáveis. O mesmo ensaio realizado em camundongos
rd, que tal qual os ratos P23H apresentam progressiva degeneração retiniana,
manteve as células fotorreceptoras viáveis por 2 meses, quando normalmente a
morte celular ocorreria a partir do 21º dia após o nascimento (CHEN; CEPKO, 2009).
Em relação à Hdac 5, sabe-se que a sua inibição permite a regeneração
axonal (CHO; CAVALLI, 2012). Assim, a maior expressão de Hdac 5 na retina pode
estar relacionada a uma tentativa de regeneração local.
31
5.4 EXPRESSÃO DE ki67
Dados da literatura indicam que o tratamento com inibidores de HDAC foi
capaz de aumentar a expressão de ki67 em células cerebrais (KIM et al, 2009).
Porém, nossos dados não apontaram uma modulação na expressão de ki67. É
possível que a modulação deste gene possa ocorrer em momento diferente do
estudado, sendo necessários mais estudos em tempos diferentes durante o
processo de degeneração.
O meio de cultura e a inibição conjunta de HDACs e DNMTs, aliado a
ativação de HAT pode ser necessária para a indução de células-tronco. (HAN, J.
SACHDEV, P.S. SIDHU, K.S, 2010). Faz-se necessário, portanto realizar estudos
individualizados dos fatores epigenéticos verificando-se os efeitos na ativação de
células-tronco retinianas.
6. CONCLUSÃO
No presente estudo foi identificada uma tendência de redução na expressão
de DNMTs e HDACs em ratos que apresentam degeneração retiniana comparado
ao grupo controle. Sugere-se que esta alteração possa estar relacionada com uma
possível tentativa do organismo de ativação de células-tronco do CC. Sabe-se que a
redução na metilação e mecanismos epigenéticos são capazes de permitir a
reativação de genes progenitores e de pluripotência, facilitando a regeneração
tecidual.
Deve-se ressaltar, porém, que o estudo apresenta algumas limitações. Não
é possível garantir que a alteração da expressão de qualquer um dos transcritos
estudados esteja diretamente relacionada com sua expressão proteica, pois esta
não foi analisada neste trabalho. Além disso, focamos em apenas um momento da
degeneração retiniana, onde o processo degenerativo já foi instalado, mas a retina
ainda não está altamente irresponsível, tendo ainda células saudáveis.
Apesar destas limitações, o presente estudo contribui para o esclarecimento
sobre o perfil de expressão de alguns fatores epigenéticos que podem contribuir
para o processo de regeneração durante o processo de degeneração retiniana
32
iniciado. Nossos dados indicaram a possibilidade destes fatores estarem
influenciando a ativação de células-tronco retinianas.
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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