ANÁLISIS CROMOSÓMICO POR MEDIO DE TÉCNICAS …bdigital.unal.edu.co/49961/1/5599284.2015.pdf · con estas patologías por medio de técnicas citogenéticas convencionales y moleculares

ANÁLISIS CROMOSÓMICO POR MEDIO DETÉCNICAS CITOGENÉTICAS CLÁSICAS Y

MOLECULARES EN UN GRUPO DE PACIENTESCON SÍNDROME MIELODISPLÁSICO Y LEUCEMIAMIELOIDE AGUDA DEL INSTITUTO NACIONAL DE

CANCEROLOGÍA

JULIA SAMANDA MARTÍNEZ RICO

Código: 05599284

Universidad Nacional de ColombiaFacultad de Medicina, Departamento de Morfología

Maestría en Genética HumanaBogotá, Colombia

2015

ANÁLISIS CROMOSÓMICO POR MEDIO DE TÉCNICASCITOGENÉTICAS CLÁSICAS Y MOLECULARES EN UN

GRUPO DE PACIENTES CON SÍNDROMEMIELODISPLÁSICO Y LEUCEMIA MIELOIDE AGUDA DEL

INSTITUTO NACIONAL DE CANCEROLOGÍA

JULIA SAMANDA MARTÍNEZ RICOCódigo: 05599284

Tesis o trabajo de investigación presentado como requisito parcial para optar altítulo de:

Magister en Genética Humana

Directora:Marta Lucía Bueno Angulo

Bióloga, Msc. Profesor Asociado – Departamento de BiologíaFacultad de Ciencias

Universidad Nacional de Colombia

Grupo de Investigación:Grupo de Identificación Cromosómica UN

Universidad Nacional de ColombiaFacultad de Medicina, Departamento de Morfología

Maestría en Genética HumanaBogotá, Colombia

2015

A mi mamá y a mi hermana por tenerme

mucha paciencia y más aún por brindarme su

amor, apoyo e impulso para continuar y sobre

todo a dos personas que aunque no están acá

presentes fueron el motivo de realización de

este proyecto.

Agradecimientos

A la profesora Marta Lucía Bueno por recibirme en su grupo de investigación y abrirme laspuertas del laboratorio para realizar este proyecto, por sus sabios consejos, por su sabiduríay por su amistad.

Al Dr. Leonardo Enciso por confiar en mí y brindar su apoyo incondicional en la consecuciónde las muestras y en el aprendizaje diario que se tenía con cada asesoría.

A Martha Lucia Diaz por el aprendizaje que se tuvo, por el tenerme paciencia en cuestionesadministrativas y por la motivación que me brindo para realizar el curso de buenas prácticasclinas.

Al grupo de laboratorio, Laura Rengifo y Camila Robayo por su apoyo, compañía y locurasque sacaron sonrisas en momentos difíciles.

A mis amigos que me presionaron hasta el final y aportaron su granito de arena como AndreaRobayo, José Pérez, Jairo Cuervo y Andrés Rodríguez.

A mis queridos compañeros de maestría que sin ellos esto no se hubiera podido realizar, porel aprendizaje obtenido de cada uno de ellos y el respaldo que nunca falto.

A la Maestría en Genética Humana, docentes y personal administrativo por la colaboracióny apoyo brindado.

A cada una de las personas consultadas para asesorar la estandarización de CGH, DusanKadlec, Kateřina Kašíková, Mariela Nieves y Joaquima Navarro

Al INC por aprobar la consecución de las muestras y poner a disposición los pacientes, elpersonal y la información necesaria para la realización del proyecto.

A la DIB por la financiación del proyecto ya que sin este dinero el proyecto hubiera quedadoen papel.

A la Facultad de Ciencias de la Universidad Nacional por brindar el apoyo financiero cuandomás se necesitaba.

A la Universidad Nacional de Colombia – Sede Bogotá que permitió la realización delproyecto y de un sueño.

Resumen y Abstract VI

Resumen

El Síndrome Mielodisplásico (SMD) y la Leucemia Mieloide Aguda (LMA) son neoplasias

hematológicas que se caracterizan por la falla hematopoyética y la proliferación

incontrolada de blastos en médula ósea. En estas enfermedades se reconocen

anomalías de las células madre médulares multipotentes que presentan alteraciones

morfológicas, cariotípicas y moleculares induciendo a procesos leucemiogénicos

(Catalá, 2012). El objetivo de este estudio es describir y/o caracterizar las alteraciones

cromosómicas presentes en pacientes del Instituto Nacional de Cancerología (INC)con estas patologías por medio de técnicas citogenéticas convencionales y moleculares.

Se analizaron 11 pacientes, 5 de estos con SMD con promedio de edad de 48 y 6 con

LMA promedio de edad de 48,2. Se realizó análisis citogenético convencional, donde se

encontró que el 82% de los pacientes en general presentaron 1, 2 o 3 anormalidades

cromosómicas presentes en el cariotipo, el 60% en SMD y el 67% en LMA. La mayoría

presentaron monosomías (58,9% vs 77,5%), en menor proporción las trisomías (10,7%

vs 2,5%) y rearreglos estructurales (7,1% vs 1,2%). Los resultados para las sondas

evaluadas por FISH fueron negativos para translocaciones como t(8;21) y t(16;16). Se

evidenció que para pacientes con SMD y LMA las monosomías son un factor de riesgo,

dos pacientes murieron por enfermedad primaria, de los cuales dos presentaron pérdida

parcial del cromosoma 11; solo dos pacientes con LMA lograron remisión completa a las

4 semanas uno con monosomía del cromosoma 19 en dos células y otro con cariotipo

normal.

Es de resaltar que la implementación adecuada de estas técnicas citogenéticas

repercute directamente en (1) la confirmación del diagnóstico, (2) la información útil para

la clasificación, la estadificación y el pronóstico, (3) la información para guiar la elección

apropiada de la terapia, y (4) determinación de la remisión o recaída (Micale, 2010).

Palabras clave: SMD, LMA, citogenética, monosomías, trisomías, translocaciones,

FISH

VII Análisis Cromosómico en un grupo pacientes con SMD y LMA

Abstract

The myelodisplastic syndrome (MDS) and the acute myeloid leukemia (AML) are

hematogenous neoplasias characterized by the uncontrolled blast proliferation in the

bone marrow. In these diseases, multiple multipotent medullary stem cell anomalies

are recognized, presenting morphological, karyotypical and molecular disturbances

that induce leukemogenic processes (Catalá, 2012). The objective of this study is to

describe and/or characterize the chromosomal anomalies found in a group of patients

of the National Cancerology Institute (INC) with these pathologies, using

conventional and molecular cytogenetic techniques.

11 patients were analyzed; 5 with MDS with an average age of 47 years; and 6 with

AML and an average age of 47.5 years. Conventional cytogenetics showed that 82%

of all patients had chromosomal anomalies, either 1, 2 or 3; 60% of the anomalies

were found in the MDS group and 67% on AML. Most of them were monosomies

(58,9% vs 77,5%), trysomies were less frequent (10,7% vs 2,5%) and structural

rearrengements (7,1% vs. 1,2%). FISH analyses were negative for translocations

such as t(8;21) and t(16;16). It was found that for patients with MDS and AML the

monosomies were a risk factor, 2 patients died of the primary disease and two of

them had a partial loss of chromosome 11; only two patients with AML achieved

complete remission at 4 weeks, one with chromosome 19 monosomy in two cells and

other with a normal karyotype.

It is important to highlight that the adequate implementation of these techniques and

their analysis has a direct effect on (1) the confirmation of the diagnosis, (2)

classification, staging and prognosis, (3) appropriate therapy choice, and (4)

determining the remission or relapse.

Key words: MDS, AML, FISH, conventional cytogenetics, monosomies, trysomies,

translocations.

Contenido VIII

CONTENIDO

Resumen VILista de figuras XIIILista de tablas XVLista de símbolos y abreviaturas XVIIntroducción 171. OBJETIVOS......................................................................................................21

2. MARCO DE REFERENCIA...............................................................................22

2.1 Hematopoyesis .......................................................................................... 22

2.1.1 Mielopoyesis:......................................................................................... 23

2.2 Enfermedades Hematopoyéticas .............................................................. 25

2.3 Alteraciones Cromosómicas en el Cáncer ...............................................26

2.3.1 Genes Fusión Quiméricos .....................................................................29

Genes Tirosina Quinasa.................................................................................29

Genes Factor de Transcripción ......................................................................30

2.3.2 Desequilibrios Cromosómicos ............................................................... 32

Ganancias Genómicas ...................................................................................33

Ganancias Genómicas a Gran Escala............................................................ 33

Ganancias Genómicas Focales......................................................................33

Pérdidas Genómicas ...................................................................................... 34

Pérdidas Genómicas a Gran Escala............................................................... 35

Pérdidas Genómicas que Afectan Genes No Codificantes ............................. 36

2.4 Síndrome Mielodisplásico (SMD).............................................................. 36

2.4.1 Clasificación .......................................................................................... 38

French-American-British (FAB):......................................................................39

Organización Mundial de la Salud (OMS):...................................................... 40

Clasificación Basada en el Pronóstico............................................................ 41

2.5 Hallazgos Citogenéticos en Síndrome Mielodisplásico (SMD) ...............42

2.5.1 Cariotipo Normal.................................................................................... 43

2.5.2 Pérdida del cromosoma Y .....................................................................43

2.5.3 Deleción del brazo largo del cromosoma 20 del(20q) ............................ 44

IX Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA

2.5.4 Rearreglos de cromosoma 5 o del(5q)...................................................44

2.5.5 Monosomía 7......................................................................................... 45

2.5.6 Ganancia del cromosoma 8 (+8) ........................................................... 46

2.5.7 Síndrome 17p-....................................................................................... 47

2.5.8 Rearreglos 3q........................................................................................ 48

2.5.9 Cariotipo Complejo y Monosomal .......................................................... 49

2.5.10 Translocación 11q23 ...........................................................................50

2.5.11 Translocaciones recurrentes raras:...................................................... 51

2.6 Evolución del Cariotipo .............................................................................51

2.7 Leucemia ....................................................................................................53

2.7.1 Mecanismos de Leucemogénesis.......................................................... 54

2.8 Leucemia Mieloide Aguda .........................................................................55

2.8.1 Impacto de la edad en frecuencias de anormalidades cromosómicas ...57

2.8.2 Clasificación .......................................................................................... 58

French-American-British (FAB).......................................................................58

MIC ................................................................................................................60

WHO ..............................................................................................................61

2.9 Pronóstico ..................................................................................................62

2.9.1 LMA DE PRONÓSTICO FAVORABLE ..................................................65

2.9.2 LMA de Pronóstico Intermedio............................................................... 66

2.9.3 LMA de Pronóstico Desfavorable .......................................................... 66

2.9.4 Otros Factores Pronósticos ...................................................................66

2.10 Alteraciones Cromosómicas en LMA ..................................................... 67

2.10.1 LMA con t(8;21)(q22;q22.3) .................................................................67

2.10.2 Inv(16)(p13.1q22.1) o t(16;16)(p13.1;q22.1) ........................................68

2.10.3 t(9;11)(p22;q23) y Otras Translocaciones en las que participa MLL ....68

2.10.3 LMA con t(6;9)(p23;q34.1)...................................................................69

2.10.4 inv(3)(q21.3q26.2) o t(3;3)(q 21.3 ;q 26.2 ) .........................................70

2.10.5 LMA Megacarioblástica con t(1;22)(p13.3;q13.1).................................70

2.11 Tratamiento SMD y LMA ..........................................................................71

2.11.1 Azacitidina ........................................................................................... 72

Contenido X

2.11.2 Citarabina............................................................................................ 72

2.11.3 Tratamiento de Inducción 7+3 ............................................................. 73

2.12 Mecanismos de Diagnóstico ...................................................................73

2.12.1 Citometría de flujo ...............................................................................73

Paneles inmunofenotípicos para el estudio de los síndromesmielodisplásicos: ............................................................................................ 75

Paneles inmunofenotípicos para el estudio de leucemias mieloblásticaaguda: ............................................................................................................76

2.13 Técnicas Citogenéticas ...........................................................................78

2.13.1 Convencional....................................................................................... 78

2.13.2 Molecular............................................................................................. 79

3. METODOLOGÍA ............................................................................................... 89

3.1 Aprobación del estudio .............................................................................89

3.2 Grupo de Casos ......................................................................................... 89

3.2.1 Criterios de Inclusión .............................................................................89

3.2.2 Criterios de Exclusión............................................................................90

3.2.3 Registro de Pacientes ...........................................................................90

3.3 Toma de Muestra de Médula Ósea............................................................ 90

3.4 Toma de Muestra de Sangre Periférica .................................................... 91

3.5 Citometría de Flujo .................................................................................... 91

3.6 Cultivo y Cosecha de Cromosomas Metafásicos a partir de SangrePeriférica y Médula Ósea.................................................................................92

3.6.1 Descripción del Procedimiento. ............................................................. 92

3.7 EVALUACIÓN CITOGENÉTICA .................................................................93

3.7.1 Descripción del Procedimiento. ............................................................. 93

3.8 Hibridación in situ Fluorescente (FISH) ...................................................94

3.9 Hibridación Genómica Comparada (CGH) ...............................................95

3.9.1 Preparación de Metafases Normales - Laminas Blanco para CGH........95

3.9.2 Realización Sonda.................................................................................96

3.9.3 Desnaturalización de la sonda e hibridación de la sonda a la láminaobjetivo o blanco ............................................................................................ 97

3.9.4 Post lavados de la Lámina.....................................................................97

XI Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA

3.9.5 Visualización de la Hibridación .............................................................. 98

3.9.6 Evaluación e Interpretación de los Resultados ......................................98

3.9.7 Estandarización y Validación .................................................................99

3.10 Análisis Descriptivo Univariado de los Datos .............................................99

4. RESULTADOS................................................................................................ 100

4.1 Citogenética Convencional .....................................................................103

4.1.1 Síndrome Mielodisplásico....................................................................104

4.1.2 Leucemia Mieloide Aguda.......................................................................114

4.1.2.1 Caracterización Pacientes LMA........................................................ 115

4.1.3Caracterización de Supervivencia ........................................................ 129

4.1.4 Análisis de Regresión Logística........................................................... 129

4.2. Hibridación In Situ Fluorescente ........................................................... 132

4.2.1 Caracterización FISH Pacientes SMD ................................................. 133

4.2.2 Caracterización FISH Pacientes LMA.................................................. 134

4.3 Hibridación Genómica Comparada (CGH) ............................................. 135

4.3.1 Extracción ADN.............................................................................. 135

4.3.2 Digestión con Enzima DpnII ..................................................................136

5. Discusión....................................................................................................141

6. Conclusiones y Recomendaciones .......................................................... 154

Anexo 1. Consentimiento informado para participar en un estudio de investigaciónmédica ................................................................................................................ 156

Anexo 2. Consentimiento informado INC ........................................................ 159

Anexo 3. Formatos ............................................................................................. 163

Anexo 4. Toma de Muestra de Médula Ósea...................................................... 167

Anexo 5. Toma de Muestra Sangre Periférica. ................................................... 168

Anexo 6. Cultivo y Cosecha de Cromosomas Metafásicos a partir de SangrePeriférica y Médula Ósea .................................................................................... 170

Reactivos y Materiales. ................................................................................ 170

Anexo 7. Bandas G ............................................................................................ 171

Reactivos y Materiales ................................................................................. 171

Descripción del Procedimiento. ....................................................................171

Anexo 8. Hibridación in situ Fluorescente (FISH)................................................ 174

Contenido XII

DIA 1: ........................................................................................................... 174


Descripción del Procedimiento. ....................................................................174

DIA 2: ........................................................................................................... 175

Anexo 9. Extracción por Cloroformo de Ácido Desoxirribonucleico (ADN) Controlesy Pacientes.......................................................................................................... 176

LISIS DE ERITROCITOS (Lavado de la Muestra) ........................................176

LISIS DE LEUCOCITOS (Digestión de Proteínas) .......................................176

EXTRACCIÓN DE ADN ............................................................................... 177

Anexo 10. Hibridación Genómica Comparada de Alta Resolución (HR-CGH) ....178


Anexo 11. Variables........................................................................................... 179

Bibliografía.......................................................................................................185

XIII Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA

Lista de Gráficas

Gráfica 2 - 1 Representación Esquemática de la Hematopoyesis Normal .............23Gráfica 2 - 2 Anormalidades cromosómicas en cáncer .........................................27Gráfica 2 - 3 Amplificación génica .........................................................................28Gráfica 2 - 4 Tasa de Supervivencia global de los pacientes con LMA según elriesgo citogenética definido por el grupo MRC. Modificado ..................................64Gráfica 2 - 5 Tasa de Detección de anormalidades ...............................................80Gráfica 2 - 6 HR-CGH. Umbrales Fijos y dinámicos. .............................................86Gráfica 3 - 1 Ejemplo sonda AML1/ETO dual fusión.95Gráfica 4 - 1 Diagrama de Barras eje X género, eje Y enfermedad primaria 100Gráfica 4 - 2 Pérdida Material Genético SMD. En el eje X número de células con laalteración y eje Y cromosoma implicado.............................................................. 104Gráfica 4 - 3 Ganancia Material Genético SMD. En el eje X número de células conla alteración y eje Y cromosoma implicado.......................................................... 105Gráfica 4 - 4 Evolución Clonal Paciente 323008................................................. 107Gráfica 4 - 5 Fotos cariotipos 323008 LUCIA 2.8 KARYO ...................................107Gráfica 4 - 6 Evolución Clonal Paciente 640124.................................................. 109Gráfica 4 - 7 . Fotos cariotipos 640124 LUCIA 2.8 KARYO ................................ 110Gráfica 4 - 8 Evolución Clonal Paciente 191286.................................................. 112Gráfica 4 - 9 Fotos cariotipos 191286 LUCIA 2.8 KARYO ...................................113Gráfica 4 - 10 Pérdida Material Genético LMA. En el eje X número de células conla alteración y eje Y cromosoma implicado.......................................................... 114Gráfica 4 - 11 Ganancia Material Genético LMA. En el eje X número de células conla alteración y eje Y cromosoma implicado.......................................................... 115Gráfica 4 - 12 Evolución Clonal Paciente 607410............................................... 116Gráfica 4 - 13 Fotos cariotipos 607410 LUCIA 2.8 KARYO ............................... 117Gráfica 4 - 14 Paciente 746799 .......................................................................... 119Gráfica 4 - 15 Fotos cariotipos 746799 LUCIA 2.8 KARYO ................................ 119Gráfica 4 - 16 Paciente 826210 .......................................................................... 121Gráfica 4 - 17 Fotos cariotipos 826210 LUCIA 2.8 KARYO ................................ 121Gráfica 4 - 18 Fotos cariotipos 212580 LUCIA 2.8 KARYO .................................123Gráfica 4 - 19 Evolución Clonal Paciente 099690............................................... 124Gráfica 4 - 20 Fotos cariotipos 099690 LUCIA 2.8 KARYO ................................ 125Gráfica 4 - 21 Fotos cariotipos 466066 LUCIA 2.8 KARYO ................................ 127Gráfica 4 - 22 Fotos núcleos y metafases sonda AML1/ETO. LUCIA 2.85 FISH 133Gráfica 4 - 23 Fotos núcleos y metafases sonda CBFß/MYH1. LUCIA 2.85 FISH............................................................................................................................ 133Gráfica 4 - 24 Fotos núcleos y metafases AML1/ETO. LUCIA 2.85 FISH........... 134

Contenido XIV

Gráfica 4 - 25 Fotos núcleos y metafases sonda CBFß/MYH1. LUCIA 2.85 FISH............................................................................................................................ 134Gráfica 4 - 26 Foto digestión enzima DpnII 150-2500 pb....................................136Gráfica 4 - 27 Hibridación Genómica Comparada. LUCIA 2.85 CGH ................. 137Gráfica 4 - 28 CGH intervalos fijos –X. LUCIA 2.85 CGH ...................................138Gráfica 4 - 29 HR-CGH umbrales móviles LUCIA 2.85 CGH............................... 139Gráfica 4 - 30 Interferencia Citoplasma con metafase/sonda.............................. 148Gráfica 4 - 31 Sobredesnaturalización metafase blanco.....................................149Gráfica 4 - 32 Aumento de temperatura en incubación.......................................150Gráfica 4 - 33 Desnaturalización con NaOH........................................................ 150Gráfica 4 - 34 Modificación post lavados ............................................................ 151

XV Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA

Lista de tablas

Tabla 2 - 1 Clasificación FAB para SMD ............................................................... 39Tabla 2 - 2 Clasificación OMS para SMD(Vardiman JW, Thiele J, 2009)...............41Tabla 2 - 3 Clasificación IPSS. ………………..........................................................43Tabla 2 - 4 Frecuencia anormalidades cromosómicas en estudios de pacientepediátricos vs adultos............................................................................................ 58Tabla 2 - 5 Clasificación FAB. Criterios morfológicos y citoquímicos. .................... 59Tabla 2 - 6 Clasificación MIC. Morfología – Inmunofenotipo – Citogenética…...… 61Tabla 2- 7 Clasificación WHO. Categorías de LMA en función de las anomalíasmoleculares ……………………………………………………………………………..63Tabla 2-8 Grupos de diagnóstico. Diferentes grupos de diagnóstico clasificados poralteraciones cromosómicas ………………………………………………........………64Tabla 2-9. European LeukemiaNet (ELN). (Mroźek et al., 2012). …...………….. 66Tabla 2-10 Cluster de Diferenciación:Marcadores celulares………..………… .…..76Tabla 2 - 11Combinación de anticuerpos: Inmunofenotipificaciónde síndromesmielodisplásicos………………………………………………………………… 78Tabla 2 - 12 Combinación de anticuerpos:inmunofenotipificación de leucemiamieloblástica aguda……………………………………………………………………..80Tabla 4 - 1 Frecuencia absoluta de los datos para las variables degénero/subclasificación para SMD y LMA

…………………………………………………………………………………... 101Tabla 4 - 2 Datos Hematimétricos LMA/SMD………………………………………..102Tabla 4 - 3 Número de anormalidades cromosómicas por enfermedad primaria 103Tabla 4 - 4 Clasificación de Moorman………………………………………… 104Tabla 4 - 5 Consolidado Citogenética Convencional ........................................... 128Tabla 4 - 6 ……………………………………………………………………………….133Tabla 4 - 7 Resultados sondas FISH AML1/ETO y CBFß/MYH11 …………….…132Tabla 4 – 8 Cuantificación ADN ………………………………………………………135Tabla 4 - 9 Controles CGH. LUCIA 2.85 CGH……………………………….………140

Contenido XVI

Lista de Símbolos y abreviaturasAbreviatura TerminoABL1 Tyrosine-protein kinase ABL1add AdiciónAPC Adenomatous polyposis coliARSA Arylsulfatase AATM ATM serine/threonine kinaseBCR Breakpoint cluster regionCBFB Core-binding factor, beta subunitCD38 CD 38 moleculeCGH Hibridación Genomica Comparativadel Delecióndmin Dobles minutosEGFR Epidermal growth factor receptorETV6 Ets variant 6EVI1 MDS1 and EVI1 complex locusFISH Hibridación in situ fluorescenteFLT3 fms-related tyrosine kinase 3GATA-1 GATA binding protein 1 (globin transcription factor 1)HOXA9 Homeobox A9HR-CGH Hibridación Genomica Comparativa de Alta resoluciónHSR Región de tinción Homogeneai IsocromosomaIL Interleukinsinv InversiónLMA Leucemia Mieloide AgudaMIC Myelocytomatosis oncogeneMLL Mixed lineage leukemiaMYH11 Myosin, heavy chain 11, smooth muscleNF1 Neurofibromin 1NPM Nucleophosmin (nucleolar phosphoprotein B23, numatrin)NUP98 Nucleoporin 98kDaPIK3CG Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase, catalytic subunit

gammaPML Promyelocytic leukemiaPTEN Phosphatase and tensin homologRARA Retinoic acid receptor, alphaRB1 Retinoblastoma 1RBM15 RNA binding motif protein 15RUNX1 Runt-related transcription factor 1SMD Sindrome MielodisplasicoSNP Single Nucleotid Polimorfict TranslocaciónTP53 Tumor protein p53

Introducción 17

Introducción 

El Síndrome Mielodisplásico (SMD) y la Leucemia Mieloide Aguda (LMA) son

desordenes clonales caracterizados inicialmente por la ineficiencia en la

hematopoyesis y por presentarse en población de edad avanzada con una media de

edad de 70 años al momento de diagnóstico y por el aumento de riesgo entre los

mayores de 70 años. El SMD tiene una incidencia de 3-5 en 100000 habitantes

(Schlegelberger, Göhring, Thol, & Heuser, 2012); mientras que en LMA la incidencia

aproximada es de 3,4 por 100000 habitantes por año (Morrissette & Bagg, 2011). La

epidemiologia en Colombia frente a estas enfermedades es aún un campo que está

iniciando, ya que la información está clara para leucemias mieloides agudas

pediátricas, más no para las patologías en general que incluirían niños, jóvenes y

adultos. En nuestro país los registros publicados sobre adultos con LMA son escasos

y no se cuenta con la información apropiada y completa sobre el comportamiento

clínico y epidemiológico, lo que dificulta la identificación de los grupos, perfiles de

riesgo, así como el diagnóstico temprano y con esto el tratamiento oportuno que

repercute directamente en el pronóstico de los pacientes (Ministerio de la Protección

Social e Instituto Nacional de Cancerología, 2007).

Las estimaciones de GLOBOCAN para el año 2012 evidencian que las leucemias

presentan una incidencia de 2628 (3,7 %) pacientes y una mortalidad de 1875 (4,9

%) en 100.000 habitantes por año, lo que indica que las leucemias son el noveno

cáncer con mayor frecuencia para el país, después de cánceres como el de próstata,

mama y estómago (http://globocan.iarc.fr/Pages/fact_sheets_population.aspx). Para

18 Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA

el año 2012 y según el Instituto Nacional de Salud, el reporte nacional es de 73

pacientes con leucemias mieloides agudas pediátricas. Datos proporcionados por el

Instituto Nacional de Cancerología de Colombia reportaron para el año 2010, 45

casos con leucemia mieloide aguda, de los cuales 19 son hombres y 26 son mujeres

(Instituto Nacional de Cancerología. Anuario Estadístico, 2010).

Es de importancia resaltar que existe una heterogeneidad en el abordaje clínico y

diagnóstico de pacientes con LMA y en las diferentes regiones del país; los

exámenes pronósticos básicos, clínicos y moleculares como son: detección de

cariotipo; marcadores moleculares y evaluación de enfermedad mínima residual

recomendadas por diferentes guías para el abordaje y tratamiento de esta

enfermedad, no se realizan de manera rutinaria en la práctica clínica diaria en

nuestro país (Ministerio de la Protección Social e Instituto Nacional de Cancerología,

2007). En Colombia, la ausencia y la falta de consolidación de este tipo de registros,

no permiten valorar la magnitud y la distribución de la morbilidad de forma adecuada

para las diferentes zonas del país (Díaz, Gordillo, Cruz, & Gálviz, 2011).

 El SMD y LMA son enfermedades muy graves que sin administración de tratamiento

su pronóstico es de evolución a leucemia en el caso de SMD y letal en pocas

semanas para LMA. En general, el pronóstico de estas enfermedades varía en

función de parámetros como la edad y principalmente de las características

biológicas propias de las enfermedades. Uno de los factores pronósticos más

importantes para la clasificación en grupos de riesgo tanto para SMD como LMA

(Garcia-Manero et al., 2008; Greenberg et al., 2012; Grimwade et al., 1998;

Kantarjian et al., 2008; Mrózek, Heerema, & Bloomfield, 2004; Slovak et al., 2000)

Introducción 19

son la presencia de anomalías cromosómicas recurrentes que permitan la aclaración

de regiones y posibles genes comprometidos en cada una de las patologías. 

La citogenética convencional es el método de elección para la evaluación inicial de

las anomalías cromosómicas en el cariotipo (Ministerio de la Protección Social,

Instituto Nacional de Cancerología, 2005), por tanto, los estudios citogenéticos

convencionales y citogenéticos moleculares como FISH, pueden proporcionar

apoyo clínico en los siguiente ítems: (1) la confirmación del diagnóstico, (2) la

información útil para la clasificación, la estadificación y el pronóstico, (3) la

información para guiar la elección apropiada de la terapia, y (4) determinación de la

remisión o recaída (Micale, 2011).

Se conoce que las alteraciones cromosómicas más frecuentes para estas entidades

a nivel mundial son: t(8;21), anomalías en la región 11q23 (deleciones, duplicaciones

en tándem y translocaciones), inv16 o t(16;16), t(9;22), monosomía del cromosoma

7, alteraciones en el cromosoma 5 (monosomías y deleciones), deleción del brazo

largo del cromosoma 20, trisomía 8 entre otras, que han sido visibles y detectadas

por citogenética convencional (Bandeo G), esta técnica identifica rearreglos y

desequilibrios génicos en un 33% de los casos; mientras que para citogenética

molecular que incluyen FISH y CGH, se detectan alteraciones en un 57% de los

casos, en conjunto las técnicas detectan en general un 75% (McGrattan, 2008).

Cabe resaltar que estos resultados citogenéticos son de relevancia clínica como se

mencionó anteriormente ya que repercutirán directamente en el pronóstico y

evolución de los pacientes, lo que quiere decir, que hasta el momento en el país, se


ofrece un panorama del 33% sobre el pronóstico y muchas veces en los protocolos

de tratamiento a los pacientes.

Este proyecto caracterizó por citogenética clásica (Bandeo G) y molecular (FISH)

once (11) pacientes con enfermedades hematológicas SMD/LMA remitidos por el

Instituto Nacional de Cancerología (INC), con el fin de describir alteraciones

cromosómicas frecuentes, puntos de ruptura específicos y genes implicados; es de

aclarar, que estas técnicas no se reemplazan una a la otra, si no que por el contrario

son técnicas complementarias que ayudan a esclarecer al médico tratante el

diagnóstico, pronóstico y evolución de la enfermedad. Adicionalmente se evaluaron

las características clínicas de los pacientes incluyendo tasas de remisión,

supervivencia global en relación con el tratamiento brindado y con las alteraciones

cromosómicas halladas (monosomías, trisomías, translocaciones, inversiones e

isocromosomas).

Con estos resultados se quiere evidenciar la necesidad de implementar de manera

adecuada tanto las técnicas como el análisis de las mismas para así refinar la

aplicación de la escala de riesgos citogenéticos ya establecida, fortaleciendo el

enfoque diagnóstico, el factor pronóstico, la respuesta de los pacientes al ciclo de

inducción y la determinación del tratamiento más adecuado en cada paciente. 

Objetivos 21

1.OBJETIVOS

1.1 Objetivo General

Analizar cromosómicamente un grupo de pacientes del Instituto Nacional de

Cancerología con Síndrome Mielodisplásico (SMD) y Leucemia Mieloide Aguda

(LMA) mediante técnicas citogenéticas Clásicas y Moleculares.

1.2 Objetivos Específicos

Caracterizar desequilibrios y reordenamientos cromosómicos a una

resolución de 10Mb (citogenética convencional) en un grupo de pacientes

con SMD y LMA

Caracterizar reordenamientos cromosómicos a una resolución de 5 Mb

(FISH) para 2 de los rearreglos más frecuentes asociados a LMA

Identificar microdeleciones y microduplicaciones a una resolución de 2 Mb

(HR-CGH) en un grupo de pacientes con SMD y LMA

Comparar la sensibilidad y especificidad de las 3 técnicas citogenéticas

empleadas para la detección de anormalidades cromosómicas en un grupo

de pacientes con SMD y LMA

Relacionar los hallazgos citogenéticos con las tasas de remisión de los

pacientes con SMD y LMA del Instituto Nacional de Cancerología.

Marco de Referencia 22

2. MARCO DE REFERENCIA

2.1 Hematopoyesis

La hematopoyesis es un vigoroso proceso, en adultos ocurre primordialmente en

médula ósea (Rodak & Carr, 2012) y es definida como la producción, desarrollo,

diferenciación y maduración de todas las células sanguíneas (Ciesla, 2012). Es un

proceso a través del cual las células troncales hematopoyéticas proliferan y se

diferencian, dando lugar a los distintos tipos de células maduras circulantes. La

hematopoyesis es necesaria para reabastecer las células que mueren con las

nuevas células de la sangre, esta tiene lugar en la médula ósea en donde una

intricada red de células estromales y sus productos, regulan cada una de las etapas

que conducen a la generación de células primitivas, intermedias y maduras (Flores,

Pelayo, & Mayani, 2007). Existen dos linajes principales de diferenciación de las

células sanguíneas, el linfoide y el mieloide. Los progenitores linfoides se diferencian

en los linfocitos B a través de células B precursoras de desarrollo en la médula ósea

o en los linfocitos T a través del desarrollo de precursores de células T en el timo.

Los otros tipos de células de la sangre se desarrollan a través del linaje mieloide

(Gráfica 2-1). Tan pronto como el proceso de diferenciación linfoide o mieloide se

completa, las células maduras son liberadas de la médula ósea o el timo en la

circulación sanguínea (Bellantuono, 2004). El papel clave de las células

hematopoyéticas es el mantenimiento de la homeostasis hematopoyético, la

inmunidad del huésped y la oxigenación de los tejidos.


Gráfica 2-1: Representación Esquemática de la Hematopoyesis Normal. Una

célula madre pluripotente da lugar a células progenitoras comprometidas de los

linajes linfoides y mieloides con la diferenciación de los tipos de células de la sangre

(Camús, & Esteve, 2007).

Gráfica 2 - 1 Representación Esquemática de la Hematopoyesis Normal

2.1.1 Mielopoyesis:

Las células de este grupo surgen en la cavidad médular central. Las células

sanguíneas de linaje mieloide que surgen en otras partes del cuerpo son designadas

como de origen “extra médular”. El sistema mieloide consiste en las siguientes

células: glóbulos rojos (eritrocitos), glóbulos blancos (neutrófilos, monocitos,

eosinófilos, basófilos y linfocitos) y plaquetas (trombocitos). Los neutrófilos,


eosinófilos y basófilos han sido llamados en conjunto “granulocitos” debido a que la

presencia y la naturaleza de sus gránulos citoplasmáticos definen su función

(Schmaier & Lazarus, 2012)

Eritrocitos: Son células anucleadas y bicóncavas que empaquetan la

hemoglobina, la proteína que es un vehículo de transporte del oxígeno. Los

eritrocitos se someten a la eritropoyesis por el que maduran a partir de una

célula progenitora temprana. Con su ausencia de núcleo y la flexibilidad de

su membrana es capaz de doblarse para atravesar capilares de 2-3 micras.

El proceso de eritropoyesis toma 4 días para producir el disco con las

características antes mencionadas, la duración de la vida de los glóbulos

rojos es de 120 días (Schmaier & Lazarus, 2012).

Neutrófilos: Contiene un núcleo que es generalmente una estructura

segmentada de 3-4 lóbulos y tarda normalmente 12-13 días para ser

producidos en la médula ósea. Su tiempo de vida en la circulación es de

aproximadamente 12 horas y pueden vivir en los tejidos durante varios días

Sus funciones son las de fagocitar y digerir bacterias, restos celulares y

tejido muerto (Schmaier & Lazarus, 2012).

Monocitos: Son células grandes mononucleares (en forma de riñón) una

vez que atraviesan a los tejidos se pueden diferenciar a macrófagos que

pueden sobrevivir en los tejidos durante periodos largos (hasta 80 días)

(Schmaier & Lazarus, 2012). Los monocitos se especializan en fagocitar


restos de células muertas, matriz envejecida, cuerpos extraños, bacterias

cubiertas de anticuerpo, células de tumores, entre otros (Welsch, 2008).

Eosinófilos: Generalmente son núcleos bilobulados que aumentan en

reacción a proteínas foráneas y por lo tanto se ven en las infecciones

parasitarias, condiciones alérgicas, el cáncer y ciertos medicamentos.

(Schmaier & Lazarus, 2012).

Basófilos: Poseen actividad fagocitaria y quimiotactica (Miale, 1985), los

basófilos también se caracterizan por contener gránulos de secreción. La

membrana posee receptores específicos para el fragmento Fc de la IgE que

se produce en respuesta a la presencia de alérgenos. (Ross y Pawlina, 200

7).

Plaquetas: Tienen una vida media de 7 a 10 días y sus primeros 1-2 día

s se gastan en el bazo. Desempeñan un papel central en la hemostasis,

también en la inflamación ya que contienen muchos factores de crecimiento

(Schmaier & Lazarus, 2012).

2.2 Enfermedades Hematopoyéticas

Se puede entender pues y según lo mencionado anteriormente que en el proceso

hematológico participan múltiples líneas celulares que permiten la producción de

células sanguíneas de manera controlada. La alteración en la hematopoyesis puede

conducir a situaciones de sobreproducción de las células hematopoyéticas (como


las leucemias), o a una producción deficiente de las mismas (como en la anemia

aplásica) (Flores et al., 2007) e incluso la muerte del individuo.

2.3 Alteraciones Cromosómicas en el Cáncer

Entre los rearreglos cromosómicos característicos del cáncer se tienen las

translocaciones reciprocas, inversiones e inserciones. Hay evidencia sustancial de

que estas alteraciones son principios de eventos tumorogénicos. Por otra parte, la

mayoría de los reordeamientos cromosómicos están estrechamente asociados con

tipos de tumores específicos, aunque los genes individuales involucrados como MLL,

ETV6 y NUP98 pueden participar en múltiples y diferentes translocaciones a veces

con asociaciones clínico-patológicas distintas (Mitelman, Johansson, & Mertens,

2007). En particular, ciertos reordenamientos cromosómicos, tales como el gen

fusión BCR-ABL1, sirve como indicadores sensibles en la evaluación de la respuesta

al tratamiento del cáncer (Hughes et al., 2006). Con respecto a sus consecuencias

funcionales, los reordenamientos cromosómicos recurrentes son de dos tipos

generales: (1) aberraciones balanceadas que resultan en la formación de un gen de

fusión quimérico con actividad nueva o alterada, o el rearreglo cromosómico que

conduce a la expresión desregulada de un gen estructuralmente normal (Fröhling &

Hartmut, 2008) (Gráfica 2-2); (2) Los rearreglos cromosómicos involucran ganancias

y pérdidas genómicas. Ganancias genómicas incluyen trisomías completas o

parciales y amplificaciones intracromosomica o extracromosómica (Fröhling &

Hartmut, 2008) pueden ser identificados citogenéticamente como regiones de tinción

homogénea (HSR) y/o dobles minuto (dmin). Las HSR son regiones cromosómicas

que no muestran un patrón típico de bandas y dmin que son cadenas de ADN de


replicación autónoma de diferentes tamaños y se pueden ver como fragmentos

circulares o acéntricos (Gráfica 2-3)

(http://gmein.uib.es/registro/informacion/investigadores/informacion384.htm

Gráfica 2-2 Anormalidades cromosómicas en cáncer (Fröhling & Hartmut, 2008)

La amplificación génica, es un suceso común en el desarrollo de las neoplasias, que

presumiblemente tiene lugar porque el incremento de la expresión de los genes

amplificados aporta una ventaja selectiva a las células tumorales. Ciertos oncogenes

pueden ser potenciados por amplificación de genes, como son los casos de RAS,

MYC, ERBb, etc. Esto puede tomar parte en el avance de las células tumorales a un

estado de mayor malignidad.


Gráfica 2-3: Amplificación génica: Relación dinámica entre las regiones HSR y los

cromosomas doble diminutos (Dmin)

(http://gmein.uib.es/registro/informacion/investigadores/informacion384.htm)

Gráfica 2-3 Amplificación génica.

Las pérdidas genómicas incluyen monosomías y pérdidas a gran escala o

submicroscópicas (Fröhling & Hartmut, 2008). En los años 90 los reordenamientos

cromosómicos se relacionaron principalmente con cánceres hematológicos y

tumores de origen mesenquimal (Rabbitts & Rabbitts, 1994; Rowley, 1998), esto

debido a que debido para tumores sólidos la situación es más compleja por las

múltiples complicaciones que son evidentes desde el crecimiento celular in vitro

hasta el enmascaramiento del análisis citogenético por múltiples cambios complejos

y a menudo la presencia de cariotipos inespecíficos (Fröhling & Hartmut, 2008).


2.3.1 Genes Fusión Quiméricos

La mayoría de los reordenamientos cromosómicos dan como resultado la formación

de un gen quimérico mediante la fusión de partes de genes implicados en las

rupturas. Dos grupos principales de genes han sido reportados con estas fusiones y

son los encargados de la codificación tirosin quinasa y los que codifican para factores

de transcripción.

Genes Tirosina Quinasa

El ejemplo clásico de una anormalidad citogenética que conduce a la formación de

un gen fusión quimérico es el cromosoma Filadelfia (Nowell & Hungerford, 1960),

un cromosoma truncado 22 que está presente en prácticamente todos los pacientes

con leucemia mieloide crónica (LMC), aproximadamente el 20% de pacientes con

leucemia linfoblástica aguda, y en casos raros en leucemia mieloide aguda. El

cromosoma filadelfia es el resultado de una translocación recíproca,

t(9;22)(q34.1;q11.23) (Rowley, 1973). La proteína quimérica resultante, BCR-ABL1,

contiene el dominio catalítico de ABL1 fusionado a un dominio BCR que es

responsable de la expresión constitutiva de la proteína (Goldman & Melo, 2003).

El descubrimiento del cromosoma Filadelfia y la comprensión de sus bases

moleculares se han tenido consecuencias de gran alcance. En primer lugar, estos

resultados proporcionan evidencia de que el cáncer humano puede surgir de

alteraciones genéticas adquiridas en las células somáticas. Segundo, la señal

aberrante tirosina quinasa en LMC conduce al uso de un inhibidor selectivo tirosina

quinasa, el Mesilato de Imatinib como droga blanco específico (Deininger,


Buchdunger, Druker, & Dc, 2012; Druker et al., 2006). Tercero, la presencia de

mutaciones en el dominio quinasa genera resistencia al Imatinib lo que se ha

identificado como una causa importante de recaída durante el tratamiento. Este

hallazgo ha conducido al desarrollo de inhibidores de segunda generación dirigidos

a la quimera de BCR-ABL tales como Dasatinib y Nilotinib (Kantarjian et al., 2006;

Weisberg et al., 2005).

En complemento a la conocida t(9;22)(q34.1;q11.23), nuevas translocaciones se han

reportado formando la proteínas fusión con actividad enzimática tirosina quinasa

constitutiva (Krause & Etten, 2005), y algunas de estas fusiones también confieren

sensibilidad a inhibidores de tirosina quinasa (Chultheis, Ross, & Oldman, 2002;

David et al., 2007). Estas observaciones ponen en manifiesto la gran utilidad del

análisis cromosómico convencional y en especial complementado con técnicas

citogenéticas moleculares como la hibridación fluorescente in situ (FISH) (Ota et al.,

1990), ya que mejora la detección de reordenamientos genómicos, esclareciendo los

puntos de ruptura para guiar el desarrollo de nuevos agentes contra el cáncer, y

servir como base para nuevos tratamientos (Baccarani et al., 2007; Graux et al.,

2004).

Genes Factor de Transcripción

Existen reordenamientos cromosómicos que alteran los genes del factor de

transcripción que pueden resultar en proteínas de fusión con actividad

transcripcional aumentada, aberrante o proteínas fusión que median la represión

trancripcional. El papel funcional de muchos factores de transcripción oncogénicos

ha sido bien caracterizados. Aún así, la inhibición selectiva de actividad


transcripcional anormal ha demostrado ser un objetivo farmacológico menos

manejable que la inhibición de la actividad tirosina quinasa constitutiva (Fröhling &

Hartmut, 2008)

Los reordenamientos cromosómicos que implican la represión transcripcional

aberrante ocurren en una proporción sustancial en pacientes con leucemia mieloide

aguda (Mrózek, Heerema, & Bloomfield, 2004). Por ejemplo, las proteínas

quiméricas resultantes de la fusión de genes tales como PML-RARA

t(15;17)(q22;q21), RUNX1-RUNX1T1 t(8;21)(q22;q22.3), CBFB-MYH11

inv(16)(p13.11q22.1), RBM15-MKL1 t(1;22)(p13;q13), NUP98-HOXA9 t(7;11)(p15-

p14;p15.5) y MLL-MLLT3 t(9;11)(p22;q23) todas contienen un factor de transcripción

que conserva el motivo de unión al ADN y a una proteína no relacionada que

interactúa con los inhibidores de genes transcripcionales. Como resultado, la unión

de los factores de transcripción quiméricos a sus genes diana, que incluyen genes

necesarios para la diferenciación mieloide normal, causa la represión transcripcional

aberrante, contribuyendo así a la acumulación de células mieloides inmaduras en la

característico de la leucemia mieloide aguda (Licht & Sternberg, 2005).

Los ácidos retinoicos trans y trióxido de arsénico revierten la represión

transcripcional causada por la proteína fusión PML-RARA (Leucemia promielocítica

aguda) al forzar la liberación de inhibidores de la transcripción, de la proteína de

fusión o al estimular la degradación de PML-RARA o ambos, estos dos mecanismos

son muy eficaces en LPA (Sanz, 2006), lo que ha permitido mejorar la evolución

clínica y el pronóstico de la enfermedad. Es así como esta variedad de leucemia


paso de ser una de las más agresivas y de peor pronostica por su alta mortalidad, a

ser la leucemia mieloide de más fácil manejo y de mayor porcentaje de curación.

2.3.2 Desequilibrios Cromosómicos

Desequilibrios cromosómicos - ganancias o pérdidas de material genético - puede

variar desde alteraciones que abarcan cromosomas enteros a duplicaciones o

deleciones intragénicas. El determinar las implicaciones de algunas pérdidas o

ganancias cromosómicas donde participa solo un gen ha sido relativamente sencillo,

pero la mayoría de los desequilibrios afectan grandes regiones genómicas que

contienen múltiples genes, y muchos tumores tienen numerosas anomalías

cromosómicas desbalanceadas. Aunque este grado de complejidad genética ha

obstaculizado la delimitación de las funciones individuales de ganancias

cromosómicas o pérdidas en el cáncer, estudios recientes sugieren que la

integración del análisis de todo el genoma, la dosis génica, perfiles de expresión

genética global, y las técnicas de genómica podría identificar genes funcionalmente

relevantes dentro regiones genómicas que son afectadas por desequilibrios

cromosómicos (Kim & Hahn, 2007).

Las Ganancias frecuentes en SMD y LMA están relacionadas con trisomía del

cromosoma 8, amplificación del cromosoma 13 en la banda q12.3 donde se

compromete el gen CDX2 y amplificación del cromosoma 21 banda q22.3 gen ERG.

En cuanto las pérdidas son frecuentes del(5q), del(7q), del(11q), del(20q) donde en

algunos casos no son claros los genes blanco implicados; mientras que para

del(5)(q32) gen implicado RPS14 y del(12)(p13) gen implicado ETV6.


Ganancias Genómicas

La mayoría de las ganancias genómicas recurrentes probablemente contribuyen a

la tumorigénesis mediante el aumento de la actividad de genes específicos en las

regiones cromosómicas afectadas. Algunos de estos genes codifican para proteínas

que pueden ser objetivo específicamente de nuevos agentes anticancerígenos

(Fröhling & Hartmut, 2008)

Ganancias Genómicas a Gran Escala

Las ganancias genómicas comúnmente surgen de la no disyunción cromosómica o

de translocaciones desequilibradas, que causan trisomías cromosómicas completas

o parciales, o de eventos de amplificación que afectan a los segmentos de ADN de

diferentes tamaños (Gráfica 2-2,) (Gráfica2-3). Dado que tales aberraciones

involucran múltiples genes, la identificación de sus objetivos funcionalmente

relevantes ha demostrado ser difícil. Una forma de "filtro" de los genes dentro de las

regiones de ganancia es el número de copias de ADN identificándolo que también

se modifica a nivel de ARN o proteína, en el supuesto de que los genes cuyo

aumento de la dosis se traduce en el aumento de la expresión son más propensos

a estar involucrados en la transformación maligna (Fröhling & Hartmut, 2008).

Ganancias Genómicas Focales

Estas ganancias afectan a las pequeñas regiones genómicas o incluso genes

individuales que se han descrito con menor frecuencia en comparación con grandes

ganancias. Sin embargo, ahora es posible identificar las ganancias focales mediante

el escaneo del genomas del cáncer en cuanto variaciones en el número de copias

del ADN con nuevos métodos de alta resolución, tales como la hibridación genómica


comparativa (CGH) y polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) genotipo (Fröhling

& Hartmut, 2008). El análisis de los genes que se amplifican de forma recurrente en

los tumores también puede revelar mecanismos patogénicos alternativos que

pueden ser explotadas terapéuticamente como es el caso del receptor EGFR en

pacientes con cáncer de pulmón que está asociado con la respuesta al Gefitinib y

Erlotinib inhibidores de la quinasa (Sharma, Bell, Settleman, & Haber, 2007).

Por el contrario, las ganancias genómicas también pueden subyacer adquiriendo

resistencia a la terapia dirigida contra el cáncer, como se ejemplifica en el

descubrimiento de la amplificación y la sobreexpresión del gen que codifica para el

receptor MET de la tirosina quinasa en la banda 7q31 y que puede restaurar la

transducción de señales aberrante corriente abajo del receptor EGFR en cáncer de

pulmón (Engelman et al., 2007).

Pérdidas Genómicas

El espectro de las pérdidas genómicas oscila entre alteraciones citogenéticamente

visibles, como monosomías cromosómicas completas o parciales, a deleciones en

solo un gen e intragénicas que solo son detectables mediante técnicas que

proporcionan una alta resolución (CGH, SNP o Secuenciación). La mayoría de las

pérdidas genómicas recurrentes probablemente contribuyen a la transformación

maligna mediante la reducción de la función de genes específicos en las regiones

cromosómicas afectadas (Fröhling & Hartmut, 2008).


Pérdidas Genómicas a Gran Escala

Deleciones genómicas extensas que afectan a múltiples genes son frecuentes en

los tumores, lo que hace difícil la identificación y contribución al desarrollo del cáncer.

El enfoque clásico para la identificación de un gen supresor de tumores es comparar

múltiples tumores con una deleción cromosómica específica para determinar la

región genómica mínima que se pierde en todos los casos. Los genes candidatos a

estas regiones se investigan luego por modificaciones en deleciones, mutaciones, o

epigenética que inactivan el alelo restante (Hinds & Weinberg, 1994; Knudson,

2001). Mediante esta estrategia ha sido identificada en importantes genes

supresores tumorales tales como RB1 (banda 13q14.2), TP53 (17p13.1), APC

(5q21-q22), NF1 (17q11.2), PTEN (10q23), y ATM (11q22-q23).

Sin embargo para muchas pérdidas genómicas recurrentes como deleción 1p en

neuroblastoma (Okawa et al., 2008), deleción 3p en cáncer de pulmón (Zabarovsky,

Lerman, & Minna, 2002), y deleción 7q en canceres mieloides (Curtiss et al., 2005;

K. Döhner et al., 1998), los genes críticos son desconocidos. Independientemente

de si los genes de las enfermedades respectivas han sido identificados, algunos

supresores han demostrado ser de gran valor para determinar el pronóstico y

orientar las decisiones de tratamiento, como lo demuestra la deleción del

cromosoma 5q en la leucemia mieloide aguda (Mrózek, Heinonen, & Bloomfield,

2001) clasificada como anormalidad de buen pronóstico; deleciones de los

cromosomas 11q, 13q y 17p en la leucemia linfocítica crónica (H. Döhner et al., 2000)

y leucemia mieloide aguda son clasificadas como pronósticos intermedios y

adversos (Haase et al., 2007), la deleción simultánea de los cromosomas 1p y 19q

en los oligodendrogliomas anaplásicos (Cairncross et al., 2006).


Pérdidas Genómicas que Afectan Genes NoCodificantes

Pérdidas cromosómicas asociadas con el cáncer pueden actuar a través de la

inactivación de genes que no codifican para proteínas. Por ejemplo, varias regiones

genómicas que son pérdidas recurrentemente en una variedad de tumores y

contienen genes de microARN (Calin et al., 2004; Zhang et al., 2006). Estos genes

codifican ARNs pequeños implicados en la regulación post-transcripcional de la

expresión génica, existe evidencia creciente de que la pérdida de microRNAs

específicos se relaciona con la actividad supresora tumoral contribuyendo así a la

tumorigénesis (Fröhling & Hartmut, 2008).

2.4 Síndrome Mielodisplásico (SMD)

Es un desorden clonal caracterizado inicialmente por ineficiencia en la

hematopoyesis y subsecuentemente por el desarrollo a leucemia aguda. Citopenias

en sangre periférica en combinación con médula ósea hipercelular exhibe cambios

displásicos y que son el sello distintivo en SMD (Boyiadzis, Frame, Kohler, & Fojo,

2014). Progenitores hematopoyéticos en SMD muestra una disminución en la

diferenciación y una tendencia al aumento de la apoptosis conduciendo a la

inefectividad de la hematopoyesis. Con el tiempo muchos pacientes desarrollan un

aumento de blastos en médula ósea; cerca del 30% desarrolla Leucemia Mieloide

Aguda (LMA) (Ritchie & Lachs, 2009).


El SMD es una enfermedad que afecta a los ancianos con una edad media de 70

años y una incidencia de 3-5/100000 personas, el riesgo aumenta de >20/100000

entre los mayores de 70 años (Schlegelberger, Göhring, Thol, & Heuser, 2012).

El defecto inicial en la mayoría a de los casos es a nivel de la célula madre mieloide

debido a que células mieloides, eritroides y megacariociticas son las primeras en ser

afectadas. La célula madre anormal puede ser el resultado de efectos acumulativos

a exposición ambiental en individuos susceptibles. La célula madre mutada produce

líneas clónales patológicas que crecen en tamaño a expensas de la población de

células normales, debido a que cada mutación produce un clon único con un defecto

celular especifico (Bernadette, Fritsman, & Keohane, 2012). Mencionan Komrokji y

Bennett en el 2006, que la patogénesis de SMD es bien vista como un proceso

multiple-hit donde se incluyen y contribuyen factores como la predisposición genética

e inmunológica, ambiental y factores iatrogénicos.

La médula ósea de pacientes SMD puede revelar disminución de la maduración

mieloide normal con el aumento de los precursores mieloides pero disminución de

granulocitos maduros. El número de megacariocitos puede ser normal o

aumentados, y hay formas de megacariocitos anormales incluyendo

micromegacariocitos, células con múltiples núcleos dispersos y grandes células

mononucleares o hipogranulares. Neutropenia absoluta se produce hasta en el 50%

de los pacientes con SMD. La trombocitopenia está presente en aproximadamente

el 25-50% de los pacientes con SMD. Trombocitosis es menos común pero se puede

ver en algunos casos con anormalidades 5q- y 3q21q26 (Schmaier & Lazarus, 2012).


En 1982 el grupo de estudio cooperativo en leucemias propone terminología y un

conjunto especifico de criterios morfológicos para describir lo que ahora se conoce

como síndromes mielodisplásicos. En 1997 un grupo de la organización mundial de

la salud (OMS) propone una nueva clasificación que incluye criterios inmunológicos,

citogenéticos y moleculares en adición a las características morfológicas (Bernadette

et al., 2012).

2.4.1 Clasificación

Para el Síndrome Mielodisplásico se cuenta con las siguientes clasificaciones

French – American – British (FAB), la de la Organización Mundial de la Salud (OMS)

y la del Sistema Internacional de Puntuación Pronostica (IPSS por sus siglas en

ingles). Cada una de estas clasificaciones tiene limitaciones. Las clasificaciones de

la FAB y la de la OMS no incluyen edad o citogenética y por lo tanto tiene un valor

limitado en la evaluación específica del riesgo del paciente. La de las IPSS son más

completas incluyen el porcentaje de blastos, las alteraciones citogenéticas y número

de citopenias, que permite estimar la supervivencia global y el riesgo de

transformación a LMA basado en la edad del paciente. Debido a que la mayoría de

los pacientes analizados en el estudio original IPSS no habían recibido terapia, IPSS

es actualmente la mejor herramienta para predecir la evolución natural de SMD no

tratado. A pesar de sus ventajas, la clasificación IPSS tiene varias limitaciones, la

más importante es que no identifica a los pacientes con enfermedad de bajo riesgo

(IPSS bajo o intermedio – 1 de riesgo) y pobre pronóstico (Garcia-Manero et al.,

2008).


French-American-British (FAB): En un esfuerzo por

estandarizar el diagnóstico de SMD, la FAB crea cinco clases de SMD

(Tabla 2-1), cada uno con un específico set de criterios morfológicos.

Las categorías fueron definidas por la cantidad de displasia y número

de blastos en médula ósea. El diagnóstico de leucemia aguda

requiere de al menos el 30% de blastos en la médula ósea

(Bernadette et al., 2012). La clasificación FAB incluye:

Tabla 2 – 1 Clasificación FAB para SMD (Bennett et al., 1982)

Clasificación FAB (1982)

Subclase

Blastos ensangre

periférica

Blastos enmédula

óseaAnemiaRefractaria (AR) < 1% < 5%Anemia refractariacon sideroblastosen anillo (ARSA) < 1% < 5%Anemia refractariacon exceso deblastos (AREB) < 5% 5-20Anemia refractariacon exceso deblastos entransformación(AREB-t) > 5% 21-30 %Leucemiamielomonociticacrónica (LMMC) < 5% 5-20 %


Organización Mundial de la Salud (OMS): Esta

clasificación se basa en la FAB. La clasificación de OMS (Tabla 2-2)

confirma su utilidad como un mejor sistema de clasificación pronóstico

y como una herramienta capaz de predecir las respuestas clínicas

(Komrokji & Bennett, 2006). Las modificaciones originales de la

clasificación FAB de SMD incluye una reducción en el porcentaje de

blastos requeridos para el diagnóstico de LMA de 30% a 20% y el

reconocimiento de dos nuevas clasificaciones: citopenia refractaria

con displasia multilinaje y síndrome del (5q) (Bernadette et al., 2012).

Esta clasificación incorpora e interrelaciona morfología, citogenética,

genética molecular y marcadores inmunológicos en un intento de

construir una clasificación aplicable universalmente válida para el

pronóstico.


Tabla 2 - 1 Clasificación OMS para SMD (Vardiman JW, Thiele J, 2009)

Clasificación OMS (2008)

Subclase de SMD Sangre periférica Médula óseaCitopenia refractaria condisplasia unilinaje

Anemia refractaria (AR)Anemia < 1 % deblastos

Displasia eritroide unilineal (en ≥ 10%de las células) < 5% de blastos

Neutropenia Refractaria (NT) Neutropenia< 1 % deblastos

Displasia granulocítica uni-lineal < 5%de blastos

Trombocitopenia refractaria(TR)

Trombocitopenia < 1 %de blastos.

Displasia megacariocítica < 5% deblastos.

Anemia refractaria consideroblastos en anillo (ASA) Anemia; < 1 % de

blastos

Displasia eritroide (de eritrocitos); <5% de blastos;≥15 % de sideroblastosen anillo.

Citopenia refractaria condisplasia multilinaje (CRDM)

Citopenia; < % deblastos; sin blastos deAuer

Displasia multilinea +/- sideroblastosen anillo < 5% de blastos, sinbastones de Auer

Anemia refractaria conexceso de blastos tipo 1AREB-1

Citopenia; < 5 % deblastos; sin bastones deAuer

Displasia mono- o multi-linaje 5-9 %de blastos; sin bastones de Auer.

Anemia refractaria conexceso de blastos tipo 2AREB-2

Citopenia (s) 5%-19%de blastos ± bastonesde Auer

Displasia uni o multilinaje 10%-19%blastos ± bastones de Auer.

SMD asociada con deleciónaislada 5q Del (5q)

Anemia; < 1 % deblastos Plaquetasnormales oaumentadas.

Deleción aislada 5q, Anemia,megacariocitos hipolobulados, <5 %de blastos.

SMD no clasificable MDS-UCitopenias ≤ 1 % deblastos

No se ajusta claramente a otrascategorías de displasia < 5% deblastos; si no hay displasia ni cariotipoasociado a SMD

Clasificación Basada en el Pronóstico

Adicionalmente se han propuesto una variedad de sistemas de clasificación

patológica y de riesgos para predecir la supervivencia general de los pacientes con

SMD a LMA. Los sistemas más importantes de clasificación pronostica es la

International Prognostic Scoring System (IPSS) (Tabla 2-3) revisado como IPSS-R

(Greenberg et al., 2012); WHO Prognostic Scoring System (WPSS) y los MD

Anderson Cancer Center Prognostic Scoring Systems (Garcia-Manero et al., 2008;

Kantarjian et al., 2008). Las variables clínicas evaluadas en estos sistemas


incluyeron porcentajes de mieloblastocitos en la sangre y la médula ósea, citopenias

específicas, requisitos de transfusión, edad, nivel funcional y anomalías

citogenéticas en médula ósea.

Tabla2-2. Clasificación IPSS (Greenberg et al., 2012)

Clasificación IPSSSubgruposPronósticos Anormalidad Citogenética

Muy Bueno -Y, del(11q)Bueno Normal, del(5q), del(12p), del(20q), dos incluyendo del(5q)

Intermediodel(7q), +8, +19, i(17q) y otros clones independientes dobleso únicos

Pobre7, inv(3)/t(3q)/del(3q), dos incluyendo 7/del(7q), complejo: 3anormalidades

Muy Pobre Complejo:> 3 anormalidades

2.5 Hallazgos Ciogenéticos en SíndromeMielodisplásico (SMD)

Aproximadamente el 50% de todos los pacientes con SMD primario tienen

alteraciones cromosómicas identificadas citogenéticamente al momento del

diagnóstico.

Sumado a esto, estas alteraciones cromosómicas proporcionan evidencia de la

naturaleza clonal de este desorden siendo importante como indicador pronóstico.

Alteraciones cromosómicas numéricas más frecuentes son trisomía 8, del(5q),

monosomía 7 y del(20q), que se pueden utilizar para caracterizar el clon SMD.

(Boultwood & Wainscoat, 2001).


2.5.1 Cariotipo Normal

En el SMD, entre el 30 – 60% de los pacientes tienen un cariotipo normal. Este grupo

de pacientes muy probablemente es genéticamente heterogéneo donde por los

factores técnicos complejos característicos de los cultivos in vitro, pudieron haber

impedido la detección de células cromosómicamente anormales o con alteraciones

leucemogénicas a nivel molecular no detectables con los métodos citogenéticos

estándar (Deeg et al., 2013).

No obstante, a pesar de esta heterogeneidad, estos casos son una referencia

estándar para la comparación de los resultados. Los pacientes con un cariotipo

normal entran dentro del grupo de riesgo favorable. La mediana de supervivencia

para estos pacientes es de 3,8 años y el tiempo de progresión a LMA (25%) es del

5.6 años en los pacientes de esta cohorte (Deeg et al., 2013).

2.5.2 Pérdida del cromosoma Y

La significancia clínica y biológica de la pérdida del Y es desconocida, esta ha sido

observada en un número de enfermedades malignas pero también se ha informado

de que es un fenómeno asociado con el envejecimiento (Pierre & Hoagland, 1972).

La pérdida del Y puede ser identificada en el 7.7% de pacientes sin enfermedades

malignas hematológicas y en un 10.7% de pacientes con SMD y por lo tanto su

importancia como marcador de la enfermedad no está claramente definido (Deeg et

al., 2013). Sin embargo Wiktor en el 2000 señala la pérdida del Y como la única

anomalía citogenética en 215 hombres con SMD y se valoró la importancia clínica

de la pérdida del cromosoma Y después de ajustar la edad.


2.5.3 Deleción del brazo largo del cromosoma 20

del(20q)

Esta es una anormalidad común en desordenes mieloides malignos. Esta deleción

es vista en aproximadamente 5% de casos con SMD y 7% en casos de SMD en

transformación (Angel, Sanz, & Vallespí, 1998) características clínicas que describen

a pacientes con SMD con del(20) incluye bajo riesgo de la enfermedad (usualmente

AR), baja tasa de progresión a LMA y supervivencia prolongada (Morel et al., 1993).

Morfológicamente, la presencia de la del(20q) es asociada con displasia prominente

en linajes eritroides y megacariocítica (Kurtin et al., 1996). El grupo internacional de

análisis del riesgo SMD evidencia que pacientes con esta deleción se asocian con

la identificación de cariotipos complejos (Greenberg et al., 1997). Estos datos

sugieren que la del(20q) en SMD puede estar asociado con un resultado favorable

cuando aparece como la única anomalía pero con un pronóstico menos favorable en

el contexto de un cariotipo complejo (Deeg et al., 2013).

2.5.4 Rearreglos de cromosoma 5 o del(5q)

En SMD o LMA derivada de NOVO, rearreglos del brazo largo del cromosoma 5 o

deleción -5/del(5q), son observadas en un 10-20% de los pacientes, mientras en

SMD-t/LMA-t es identificada en un 40% de pacientes (Angel et al., 1998; Godley &

Larson., 2008; Smith et al., 2003). Sin embargo deleciones intersticiales son más

comunes. Otros rearreglos tales como translocaciones desbalanceadas también

ocurren. (Deeg et al., 2013). Se sugiere que anormalidades de los cromosoma 5 o 7

pueden ser un marcador de mutagénesis inducida en enfermedades hematológicas


malignas (West et al., 2000). Cuando los pacientes con SMD primario, presentan

anormalidades del cromosoma 5, conocido como, el síndrome 5q- más común en

RAEB 1, 2 de la clasificación WHO en asociación con un cariotipo complejo, tienen

un pobre pronóstico con temprana progresión a leucemia, resistencia al tratamiento

y corta supervivencia (Deeg et al., 2013).

Los puntos de ruptura reportados en región del 5q son muy variables, pero la región

más crítica está entre 5q31 y 5q33. Varios genes codifican como factores de

crecimiento hematopoyético y receptores que comprenden IL-3, IL-4, IL-5, M-CSF

(CSF-I), GM-CSF y el receptor M-CSF (CSF-1R), están localizados en el brazo largo

del cromosoma 5, por lo que la pérdida de uno o más de estos genes puede ser

crítica y asociada a la patogénesis de SMD (Hirai, 2002). El síndrome es mucho más

común en mujeres que en hombres (mujeres:hombres=3:1) y cuentan con la mayor

incidencia entre los 60 y 65 años de edad (Bernasconi et al., 2006).

2.5.5 Monosomía 7

Monosomía del 7 y -7q son anormalidades más frecuentes en SMD, y son asociadas

con pobre pronóstico en términos de corta supervivencia o evolución leucemogénica.

Esta anormalidad sola es observada aproximadamente en el 5% de pacientes

adultos con SMD y aproximadamente en un 55% de pacientes con SMD en terapia

(Godley & Larson., 2008; Smith et al., 2003). Sin embargo los genes del cromosoma

7 que sean responsables del fenotipo de la enfermedad no están identificados, Hirai

en el 2002 reporta como una región crítica 7q22.1 por la presencia de un potencial

gen supresor tumoral mieloide, PIK3CG. Esta pérdida está asociada con tres


situaciones clínicas (1) SMD y LMA de novo, (2) leucemia mieloide asociada con

predisposición constitucional y (3) t-SMD/t-LMA (Deeg et al., 2013).

2.5.6 Ganancia del cromosoma 8 (+8)

La incidencia de ganancia de un cromosoma 8 en SMD es de aproximadamente el

5-10%. Esta anormalidad es observada en todos los subgrupos y varia con la edad,

el género y el pretratamiento con agentes citotóxicos o radiación (Angel et al., 1998;

Greenberg et al., 1997; Paulsson, Säll, Fioretos, Mitelman, & Johansson, 2001). La

presencia de un cromosoma 8 de más ha sido asociado con LMA subtipos M4 y M5

con SMD con un componente monocitico. La media de supervivencia en pacientes

con SMD con trisomía 8 está entre un rango de 25 a 57 meses (Angel et al., 1998).

Para el 2012 Coleman y Ebert señalan esta trisomía como anormalidad

independiente, presente en el 5% de SMD y es asociada con riesgo pronóstico

intermedio con una mediana de supervivencia global de 23 meses (Haase et al.,

2007; Schanz et al., 2012).

La ganancia del cromosoma 8 parece representar un evento tardío en la patogénesis

de SMD, ocurre en progenitores restringidos mieloides y no son fáciles de detectar

en compartimientos de células madre CD34+, CD38-, CD90+ que se cree que

contienen el clon de iniciación de la enfermedad (Nilsson et al., 2002). Progenitores

hematopoyéticos que albergan +8 expresan altos niveles de genes antiapoptóticos

y son resistentes a estimulo apoptótico experimental, sugiriendo un posible

mecanismo de ventaja clonal (Sloand et al., 2007).


2.5.7 Síndrome 17p-

Pérdida del brazo corto del cromosoma 17 (17p-) ha sido reportado en más del 5%

de los pacientes con SMD. Esta pérdida se puede evidenciar anormalidades,

incluyendo deleciones simples, translocaciones desbalanceadas, rearreglos

dicéntricos (particularmente con el cromosoma 5) o menos a menudo la monosomía

total de 17 o formación del isocromosoma 17q (Johansson, Mertens, & Mitelman,

1993). La deleción 17p está siempre acompañada por otros defectos cromosómicos

y a menudo participan en cariotipos complejos (≥ 3 anormalidades cromosómicas)

(Bernasconi et al., 2006). La mayoría de los pacientes tiene por lo menos dos

rearreglos citogenéticos diferentes (Coleman & Ebert, 2012).

Morfológicamente, el síndrome 17p- es asociado con formas características de

disgranulopoyesis combinada de hipolobulación pseudo-Pelger-Huet y la presencia

de pequeños gránulos en granulocitos. Clínicamente, la enfermedad es agresiva con

resistencia al tratamiento y supervivencia corta. El gen TP53 (p53), un importante

gen supresor tumoral que funciona en la respuesta celular al daño del ADN, es

localizado en la región 17p13.1. En este caso, un alelo de TP53 es típicamente

perdido como resultado de la anormalidad de 17p; una mutación de inactivación en

el segundo alelo restante causa la pérdida total de la función de p53 (Deeg et al.,

2013).


2.5.8 Rearreglos 3q

Aproximadamente el 2% de pacientes con SMD tiene rearreglos en 3q, ya sea

inv(3)(q21q26), t(3;5)(q25q34), t(3;3)(q21q26) u otras anormalidades menos

frecuentes. Estos defectos cromosomales son más comunes en pacientes mujeres

jóvenes (edad ≤ 55 años), son frecuentemente asociados con -7/7q- y 5q- y

determina una corta supervivencia y una respuesta pobre a la quimioterapia

(Bernasconi et al., 2006).

Estos pacientes presentan casi siempre un exceso de blastos en la médula y del 30

al 50% de los casos se relaciona con la terapia que es por lo general pobre con

supervivencia corta (Angel et al., 1998).

El gen EVI1 localizado en 3q26 codifica una proteína de unión al ADN dedos de zinc

descrito originalmente como un gen transformante asociado con un sitio común de

inserción viral ecotropico en leucemias mieloides. Los puntos de ruptura

cromosómica 3q26 en t(3;3)(q21q26) ocurren aproximadamente 330 Kb corriente

arriba del gen EVI1 y la inv(3)(q21q26) ocurre corriente abajo del gen EVI1, ambas

situaciones pueden llevar a una inactivación inapropiada que pueda interferir con

diferenciación normal. Este gen puede bloquear la actividad transcripcional de

GATA-1, un factor requerido para la diferenciación eritropoyetica normal en líneas

celulares (Angel et al., 1998).

Se ha demostrado que otros puntos de ruptura como (3q21) presente junto a la t(3;3)

e inv(3) son agrupadas sobre una región de 50 Kb corriente abajo del gen Riboforina

I y puede resultar en la activación transcripcional del gen EVI1 por aumento de los


elementos asociados con el gen Riboforina I (Suzukawa et al., 1994); Sin embargo

el gen EVI1 es también activado en cerca del 30% de SMD sin necesidad de

presentar rearreglos en 3q y ser prácticamente exclusive de anemias refractarias

con exceso de blastos en transformación (AREB y AREB-T). Por último otro gen

importante y localizado en el mismo punto 3q26 es THPO, distante a EVI1 por cerca

de 600 Kb y no se reordena en translocación o inversión de 3q (Angel et al., 1998),

estos son los 3 posibles genes que se verían alterados en función con rearreglos

cromosómicos como translocaciones o inversiones.

2.5.9 Cariotipo Complejo y Monosomal

Un cariotipo complejo es definido como la participación de 3 o más anormalidades

cromosómicas. La mayoría de casos con cariotipo complejo envuelven

anormalidades cromosómicas desbalanceadas provocando la pérdida o ganancia de

material genético. Los cariotipos complejos son observados en por lo menos el 20%

de los pacientes con SMD primaria y hasta en el 90% de pacientes con SMD-t

(Godley & Larson, 2008; Smith et al., 2003). Las anomalías que involucran los

cromosomas 5, 7 o ambos se identifican en la mayoría de los casos con cariotipos

complejos. En el consenso general un cariotipo complejo conlleva a un pobre

pronóstico (Haase et al., 2007; Malcovati et al., 2007).

Pacientes con cariotipos complejos que presenten más de tres anormalidades

parecen tener un peor pronóstico que aquellas con tres anomalías (Haase et al.,

2007). En el 2008 se introduce la nueva definición de cariotipo monosomal como la

presencia de al menos dos monosomías autosómicas o la presencia de una

monosomía autosómica y al menos una anormalidad estructural, como un factor


pronóstico pobre en adultos con LMA (Breems et al., 2008). Existe información

limitada en cuanto la importancia pronostica de un cariotipo monosomal en SMD

(Raza et al., 2011). En una serie de 421 pacientes argentinos, cariotipos con

monosomías autosómicas fueron asociado con una supervivencia media de 16

meses, comparando con la supervivencia media de pacientes con otros pobres

riesgos citogenéticos (Belli et al., 2011).

Otro estudio demuestra en 127 pacientes con cariotipo complejo y que a su vez

tenían cariotipo monosomal tuvieron un peor pronóstico que los pacientes con un

cariotipo complejo sin monosomías. Pacientes con un “cariotipo estructuralmente

complejo” definido como más de o igual a tres aberraciones cromosómicas,

incluyendo al menos una aberración estructural, tenían una probabilidad de

supervivencia muy corta de solo el 14% (Patnaik et al., 2011). Cabe destacar que la

presencia de un “cariotipo estructuralmente complejo” fue un mejor predictor de un

pronóstico muy desfavorable en niños con SMD que la presencia de un cariotipo

monosomal (Schlegelberger et al., 2012).

2.5.10 Translocación 11q23

El gen MLL (Leucemia Linaje Mixto) (también conocido como ALL1, HTRX, HRX)

participa en rearreglos con 71 asociaciones de genes en leucemia (Marschalek,

2011). Otras anormalidades incluyen cariotipo complejo y -7/del(7q), frecuentemente

acompañan la anormalidad 11q23 en SMD primario y SMD-t. No se identificaron

asociaciones con subgrupos FAB, sin embargo AR fue excesivamente

representativa y ARSA insuficientemente representada en comparación con la

mayoría de series de pacientes con SMD. La media de supervivencia fue corta (19


meses) con transformación a leucemia en al menos el 20% de casos. Las más

comunes translocaciones en las que se involucra esta región fueron

t(9;11)(p22;q23), t(11;19)(q23;p13.1) y t(11;16)(q23;p113.3) (Deeg et al., 2013).

2.5.11 Translocaciones recurrentes raras:

La identificación de genes implicados en anomalías citogenéticas recurrentes ha

sido de gran utilidad en la obtención de conocimientos sobre sus funciones normales

y su papel en la leucemiogénesis (Look, 1997; Rowley, 2000). La consecuencia de

las translocaciones recurrentes es la desregulación de la expresión génica con una

mayor producción de un producto normal de las proteínas o la generación de un gen

fusión y la producción de una proteína fusión. Hasta el momento la mayoría de las

translocaciones recurrentes clonales en desordenes mieloides malignos dan lugar a

proteínas fusión. En SMD, varias de estas translocaciones han sido identificados y

examinados por análisis molecular (Deeg et al., 2013).

2.6 Evolución del Cariotipo

La identificación de nuevas anormalidades en el cariotipo suelen coincidir con un

cambio en el comportamiento de la enfermedad, por lo general a un curso más

agresivo y puede anunciar la incipiente leucemia.

La progresión clonal es un proceso evolutivo en presencia de muchas mutaciones

genéticas que demuestran diversidad en la línea celular y la selección conduce a la

expansión de más de una forma de subclon (Jan & Majeti, 2012) a esto se le

denomina como evolución citogenética definida como la aparición de un clon


anormal en el que solo las células normales se han visto anteriormente, o la

progresión de la presencia de un único clon para múltiples relacionados, o de vez en

cuando, clones anormales no relacionados. Los clones anormales pueden

evolucionar adquiriendo anomalías adicionales con la progresión de la enfermedad,

y por lo general resolver con la remisión de la enfermedad después del tratamiento.

En los estudios publicados, la mayoría de los pacientes con SMD mueren de

insuficiencia en médula ósea, cerca de la mitad progresan a leucemia mieloide

aguda y algunos mueren de enfermedades intercurrentes (Deeg et al., 2013)

Así pues la historia natural del SMD se caracteriza generalmente por uno de los tres

escenarios clínicos: (1) un empeoramiento gradual de pancitopenia, donde el

recuento de blastos en médula ósea tiende a estar en aumentando, (2) un curso

clínico relativamente estable seguido de un cambio brusco a una clara

transformación leucémica, y (3) un curso estable a lo largo de muchos años sin

cambio significativo en los conteos de blastos en médula cuando son reevaluados

(Hamblin & Oscier, 1987). En el primer grupo el cariotipo normalmente se mantiene

estable y la progresión a leucemia se basa en el hallazgo relativamente arbitrario de

más del 20% de blastos en médula ósea, haciendo la transición a LMA definido como

un mal evento. En el segundo grupo, un cambio en el cariotipo con la ganancia de

clones secundarios y cariotipos complejos es típico. Tanto el cariotipo como la

enfermedad tienden a permanecer estables en el tercer grupo. Sin embargo, la

evolución del cariotipo en SMD se asocia con la transformación a leucemia aguda

en aproximadamente el 60% de los casos y reducción de la supervivencia, en

particular para aquellos pacientes que evolucionan dentro de un corto periodo de

tiempo (Deeg et al., 2013; Geddes, Bowen, & Jacobs, 1990).


Como se describe anteriormente, muchas de las anormalidades cromosómicas

recurrentes en SMD conducen a la pérdida de material genético. Dichas pérdidas

son las características de genes supresores tumorales, que normalmente funcionan

para controlar el crecimiento celular, la respuesta al daño del ADN y la apoptosis.

Un modelo simple conocido como “doble hit” (Modelo Knudson) implica que un gen

supresor tumoral blanco debe anteceder la pérdida de función de ambos alelos para

que ocurra la expresión del fenotipo maligno (Knudson, 1971). La pérdida de función

de los genes pueden ocurrir por deleciones o pérdidas cromosomales, puntos de

mutación o metilación de elementos regulatorios de los genes (silenciamiento

transcripcional) (Deeg et al., 2013).

2.7 Leucemia

La leucemia es generalmente definida como la proliferación incontrolada o la

expansión de las células hematopoyéticas que no retienen la capacidad de

diferenciarse normalmente a células sanguíneas maduras. De acuerdo con esta

definición, algunos trastornos hematológicos no son estrictamente leucemias porque

muestran sólo una parte del fenotipo leucémico, ya sea la expansión del crecimiento

(síndromes mieloproliferativos, MPS) o el bloqueo de la diferenciación (síndromes

mielodisplásicos, SMD) descrito anteriormente. Sin embargo, ambos pueden

progresar a leucemia aguda y son algunas veces llamados trastornos pre-

leucémicos (Sawyers, Wittet, & Angeles, 1991)

Por lo general, la leucemia se divide en dos clases principales: leucemia aguda y

crónica. La leucemia aguda presenta un cuadro clínico rápido y puede causar la


muerte en un período relativamente corto de tiempo. Esta se caracteriza por la

presencia de células muy inmaduras (leucemias blásticas), mientras que la leucemia

crónica generalmente es menos agresiva y un paciente puede vivir con esta

enfermedad durante varios años aún sin tratamiento. La leucemia crónica por su

parte se caracteriza por, al menos inicialmente presentar leucocitos bien maduros

(Benner, et al., 2003). Ambas leucemias tanto aguda como crónica se subdividen en

diferentes categorías dependiendo del tipo de linaje y de células involucradas (Jaffe,

et al., 2001).

El crecimiento excesivo de las células leucémicas, la proliferación descontrolada de

células hematopoyéticas con bloqueo de la diferenciación, puede resultar en un

número reducido de células sanguíneas normales en médula ósea presentando

manifestaciones clínicas como anemia (bajo conteo de glóbulos rojos),

trombocitopenia, neutropenia, lo que conlleva a la fatiga, problemas con la

coagulación de la sangre (por ejemplo, sangrado prolongado y moretones) y las

pancitopénias que dan mayor susceptibilidad a infecciones (Jaffe et al., 2001).

2.7.1 Mecanismos de Leucemogénesis

En la patogénesis de la LMA se han implicado múltiples alteraciones moleculares

que interrumpen procesos celulares diversos, tales como la regulación de la

proliferación, diferenciación, supervivencia, control del ciclo celular, reparación del

ADN y estabilidad de la cromatina. Las anomalías habitualmente observadas son

translocaciones cromosómicas y mutaciones que se evidenció anteriormente y que

pueden producir un aumento de la función del gen implicado, o por el contrario, una


pérdida o disminución de su función. En otras ocasiones se produce una anomalía

a nivel epigenético, con el resultado del silenciamiento o activación de una

determinada diana celular. Estos eventos moleculares actúan en diferentes etapas,

y pueden sistematizarse en dos grupos complementarios. Un grupo de alteraciones,

conocido como tipo II, que comprende las anomalías que afectan a factores de

transcripción o correguladores, que conllevan un bloqueo de la diferenciación

hematopoyética y/o adquisición aberrante de propiedades de auto-renovación de los

progenitores hematopoyéticos. El otro grupo, tipo I incluye las mutaciones que

activan vías de transducción de señales, lo que resulta en un aumento de la

proliferación y/o supervivencia de los progenitores hematopoyéticos (Fröhling,

Scholl, Gilliland, & Levine, 2005; Hiddemann et al., 2005; Steffen, Müller-Tidow,

Schwäble, Berdel, & Serve, 2005). Estos dos tipos de anomalías moleculares

presentarían una gran interdependencia entre ellos y es frecuente observar la

coexistencia de alteraciones de los dos grupos en un mismo paciente; por el

contrario, raramente parecen coincidir dos alteraciones del mismo tipo en un mismo

caso.

2.8 Leucemia Mieloide Aguda

La leucemia mieloide aguda (LMA) es una enfermedad en la que se produce una

expansión clonal de células neoplásicas de estirpe mieloide denominadas

mieloblastos, cuyo origen radica en la transformación maligna de precursores

hematopoyéticos (Lowenberg, Downing, & Burnett, 1999). La definición de LMA

según la Organización Mundial de la Salud (World Health Organization, WHO)

requiere la presencia de al menos un 20% a 30% de blastos en médula ósea como


un umbral mínimo de diagnóstico, cifra que la distingue de los síndromes

mielodisplásicos (SMD), en los que el porcentaje de blastos en médula ósea es

menor del 5% (Cheson et al., 2003; Harris et al., 1999). La LMA comprende, en

realidad, un grupo heterogéneo de enfermedades que se caracterizan por presentar

un bloqueo de la maduración de las células mieloides y un aumento de la

proliferación de las mismas, como consecuencia de diversos eventos moleculares

complementarios (Lowenberg et al., 1999).

LMA es una enfermedad heterogénea que resulta de mutaciones genotípicamente

cooperantes de varios pasos en precursores hematopoyéticos. Mutaciones de Clase

I confieren proliferación y/o ventaja de supervivencia por lo general como

consecuencia de la activación aberrante de las rutas de transducción de señal tal

como mutación en las vías de señalización de tipo fmstirosina quinasa 3 (FLT3) y

RAS. Mutaciones de clase II perjudican la diferenciación hematopoyética

generalmente como resultado de mutaciones en factores de transcripción o co-

activadores importantes para el desarrollo hematopoyético normal. A veces este tipo

de mutaciones incluyen translocaciones cromosómicas causadas por reordenación

de partes entre los cromosomas no homólogos, creando una fusión entre los dos

genes separados de otro modo, y conferir propiedades tales como el deterioro de la

diferenciación o la capacidad proliferativa mejorada. Ejemplos de tales

translocaciones se producen en las leucemias llamadas core- binding factor (CBF)

que implican t(8;21) e inv(16)/t(16; 16). Estos dos cambios dan lugar a mayor número

de células malignas clonales y la supresión de elementos normales (Schmaier &

Lazarus, 2012).


La Leucemia Mieloide Aguda es más común en población de edad avanzada, con

incidencia aproximadamente de 3,4 por 100000 habitantes año y una mediana de

edad de 70 años al momento del diagnóstico (Morrissette & Bagg, 2011).

Para Colombia se implementó el proyecto GLOBOCAN que tenía como objetivo

proporcionar las estimaciones actuales de incidencia y mortalidad de los principales

tipos de cáncer, a nivel nacional, y para todos los países del mundo. Las

estimaciones GLOBOCAN se presentan para el año 2008 evidencias de una

incidencia para leucemias de 2073 y una mortalidad de 1560 pacientes, lo que indica

que las leucemias son el 9 cáncer con mayor frecuencia para Colombia después de

canceres como el de próstata, mama y útero (http://globocan.iarc.fr/factsheet.asp).

Datos proporcionados por el Instituto Nacional de Cancerología de Colombia reporta

45 casos con leucemia mieloide aguda para el año 2010 de cuales 19 son hombres

y 26 son mujeres (Instituto Nacional de Cancerología. Anuario Estadístico, 2010).

2.8.1 Impacto de la edad en frecuencias deanormalidades cromosómicas

Numerosos estudios muestran que en LMA pediátrica son más frecuentes las

anormalidades cariotípicas que en LMA en adultos (Tabla 2-4). En general, cambios

clonales son encontrados en mayor frecuencia entre un 70-80% en casos infantiles

mientras que para LMA en adultos corresponde a un 50-60%.


Tabla 2-3. Frecuencia anormalidades cromosómicas en estudios de paciente

pediátricos vs adultos

LMA pediátrica LMA adultosFrecuencia Referencia Frecuencia Referencia

68% (147/217) Lampert et al., (1991) 52% (631/1213) Byrd et al., (2002)73% (249/340) Grimwade et al.,(1998) 52% (1335/2555) Bacher et al., (2005)73% (211/288) Forestier et al., (2003) 54% (683/1272) Grimwade et al., (1998)76% (560/736) Dusenbery et al., (2003) 55% (653/1192) Sanderson et al., (2006)76% (826/1083) Barbaric et al., (2007) 57% (575/1003) Schnittger et al., (2002)77% (369/478) Raimondi et al., (1999) 59% (728/1225) Schoch et al., (2004)

2.8.2 Clasificación

Existen diversos subtipos de LMA causados por distintos mecanismos patogénicos,

que se traducirán en entidades con un comportamiento clínico y biológico diferente.

En los últimos años el avance en las técnicas diagnósticas ha permitido ampliar de

forma notable el conocimiento de la biología de las leucemias; este hecho queda

reflejado en las sucesivas clasificaciones de la LMA que se han utilizado en las

últimas décadas.

French-American-British (FAB)

La primera de las clasificaciones de las LMA fue la del grupo FAB (Francés-

Americano-Británico). Esta clasificación se basó inicialmente en criterios

morfológicos y citoquímicos, identificando el equivalente leucémico de las células

mieloides para cada estadio de diferenciación. Inicialmente se definieron 6

categorías M1 y M6 (Flandrin et al., 1976) pero en revisiones posteriores se


añadieron las definiciones de los subtipos M0 y M7 al incorporar criterios

inmunológicos (Bennett et al., 1989) (Tabla 2.5).

Tabla 2-4. Clasificación FAB. Criterios morfológicos y citoquímicos (Flandrin et al.,

1976)

Clasificación FABComportamiento

CitoquímicoSubtipoFAB

Denominación % deCasos

MPO/NS EsterasasInespecíficas

M0 LMA con diferenciaciónmínima

< 5 - -**

M1 LMA sin maduración 15 – 20 + -M2 LMA con maduración 15 -25 + -M3 Leucemia aguda

promielocítica5 – 10 + -

M4 Leucemia agudamielomonocítica

20 + +

M4 Eo Leucemia agudamielomonocítica coneosinofília

5 – 10 + +

M5 Leucemia aguda monocítica 10 – 20 - +M6 Eritroleucemia 3 – 5 + -M7* Leucemia aguda

megalocarioblástica< 5 - +†

Nota: MPO: Mieloperoxidasa. NS: Negro Sudán.*Subtipos definidos posteriormente incorporando criterios inmunológicos.**Las células son positivas para algún antígeno mieloide por inmunofenotipo.†Las células son positivas para a-naftil-butirato-esterasa.


MIC

La clasificación MIC (morphology– immunophenotype - cytogenetics) fue posterior e

integra a los subtipos FAB, los datos morfológicos – citoquímicos, el inmunofenotipo

y la citogenética (tabla 2.6) (Hage- & Group, 1988)

Tabla 2-5.Clasificación MIC. Morfología – Inmunofenotipo – Citogenética (Hage- &

Group, 1988).

Clasificación MIC

Anomalía cromosómica FAB Frecuencia Genes implicados

t(8;21)(q22;q22) M2 ̴ 5 – 10% AML1-ETOt(15;17)(q22;q21) M3 ̴ 10 – 15% PML-RARa

inv(16)/t(16;16) M4 ̴ 5 – 10% CBFB-MYH11

Anomalías 11q23 M4/M5 ̴ 5 – 10% MLL

-t(9;11)(p21-22;q23) M5 ̴ 5 – 10% AF9-MLL

-t(11;19)(q23;p13.1) MLL-ELL

-t(11;19)(q23;p13.3) MLL-ENL

-Otras

t(6;9)(q23;q34) M2/M4 ̴ 1% ▫EK-CAN

t(8;16)(p11;p13) M4/M5 < 1% MOZ-CBP

Anomalías en 3q26

-inv(3)(q21;q26)/t(3;3) M4 3 -5% EVI1

-t(3;21)(q26;q22) 1% EVI1-AML1

-t(1;3)(p36;q21) < 1% EVI1

t(9;22)(q34;q11) M1 3% BCR-ABL

t(1;2)(p13;q13) M7 < 1% OTT-MAL


WHO

La clasificación de la organización mundial de la salud (WHO) es la más reciente y

define las principales categorías de LMA en función de las anomalías moleculares

subyacentes. Además, esta clasificación ha aportado el reconocimiento de nuevas

subentidades como la LMA con displasia multilínea (LMA-DM), o la consideración de

los antecedentes de hemopatía previa o de exposición a leucemógenos que definen

la leucemia como secundaria (Harris et al., 1999; Vardiman, Harris, & Brunning,

2002) (Tabla 2.7). De esta manera, esta clasificación estratifica las LMA en cuatro

grupos principales: el primero lo constituye aquellos subtipos con anomalías

citogenéticas y moleculares recurrentes, como las LMA con t(15;17), la inv(16) y las

anomalías de cromosoma 11 en la zona 11q23, afectando el gen leucemia linfoide

mieloide o leucemia de linaje mixto (MLL). Por otro lado se define la LMA-DM, ya

sea secundaria y SMD/SMPC previo. Se reconoce un tercer grupo de leucemias

secundarias a tratamientos químicos o radioterápeuticos. El resto de pacientes no

definidos en las categorías descritas son clasificados según su estirpe y el grado de

diferenciación de los blastos (Vardiman JW, Thiele J, 2009).


Tabla 2-6. Clasificación WHO. Categorías de LMA en función de las anomalías

moleculares (Vardiman JW, Thiele J, 2009)

Clasificación WHO

LMA con anomalías genéticas recurrentes*

LMA con t(8;21)(q22;q22), (RUNX1-RUNX1T1 o AML1-ETO) LMA con eosinófilos anormales en médula ósea e inv(16)(p13;q22) o

t(16;16)(p13;q22), (CBFβ-MYH11) Leucemia promielocítica aguda con t(15;17)(q22;q12), (PML-RARα) y

variantes LMA con anomalías en 11q23 (MLL)

LMA con displasia multilínea

Relacionados con tratamientos alquilantes / radiaciones ionizantes Relacionados con inhibidores de la topoisomerasa II Otros

LMA no clasificable por los criterios anteriores

LMA mínimamente diferenciada (FAB M0) LMA sin maduración (FAB M1) LMA con maduración (FAB M2) Leucemia aguda mielomonocítica (FAB M4) Leucemia aguda monoblástica y monocítica (FAB M5a y M5b) Leucemia aguda eritroide (eritroide/mieloide y eritroleucemia pura) (FAB M6a

y M6b) Leucemia aguda megacarioblástica (FAB M7) LMA/trastorno mieloproliferativo transitorio en el síndrome de down Leucemia aguda de basófilos Panmielosis aguda con mielofibrosis Sarcoma mieloide Leucemias agudas de linaje ambiguo

2.9 Pronóstico

La LMA es una enfermedad muy grave y sin la administración de tratamiento su

pronóstico es letal en pocas semanas. Sin embargo, el uso de tratamientos

intensivos ha permitido que hasta una tercera parte de los pacientes adultos con

LMA se curen de su enfermedad. En general, el pronóstico de la LMA varía en


función de diversos parámetros como la edad y principalmente las características

biológicas de la propia enfermedad que se describieron anteriormente.

Más de la mitad de los pacientes adultos con LMA presentan aberraciones

cromosómicas recurrentes, como translocaciones reciprocas, inversiones,

deleciones, trisomías y monosomías. Por citogenética se distinguen tres grupos

diferentes de pronósticos: favorable, intermedio y desfavorable (Calgb et al., 2002;

Grimwade et al., 1998; Slovak et al., 2000) (Tabla 2-8).

Tabla 2-7.Grupos de diagnóstico. Diferentes grupos de diagnóstico clasificados por

alteraciones cromosómicas (Camús & Esteve, 2007).

Riesgo MRC SWOG/ECOG CALGB*

Favorable t(8;21) t(8;21) t(8;21)

inv(16)/t(16;16) inv(16)/t(16;16)/del(16q) inv(16)/t(16;16)t(15;17) t(15;17) **

del(9q)***Intermedio Cariotipo normal Cariotipo normal Cariotipo normal

+8 +8del(7q) del(7q)

-Y -YAnomalías 11q23 t(9;11)

del(11q)+11

del(12p) Anomalías 12p+21 +21+22 +6 +13

del(9q) del(5q)Otras anomalías del(20q)

del(9q)***Desfavorable Anomalías 3q Anomalías 3q inv(3)/t(3;3)

-7 -7/del(7q) -7-5/del(5q) -5/del(5q)Complejo Complejo Complejo


t(6;9) t(6;9)Anomalías 11q t(11;19)

t(6;11)t(9;22) +8Anomalías 9qAnomalías 17pAnomalías 20qAnomalías 21q

Cada uno de estos grupos de diagnóstico tiene diferencias en cuanto a la tasa de

remisión completas (RC) y supervivencia global (SG) (Gráfica 2.4).

Gráfica 2 - 4 Tasa de Supervivencia global de los pacientes con LMA según el

riesgo citogenética definido por el grupo MRC. Modificado (Grimwade et al., 1998).

Las guías en línea llamadas International European LeukemiaNet (ELN) permiten

evaluar la evolución y la significación del pronóstico con relación a las alteraciones

genéticas que se presente (Mroźek et al., 2012).


Tabla 2-9. European LeukemiaNet (ELN). (Mroźek et al., 2012).

European LeukemiaNet (ELN)Grupo Genético Subset

FAVORABLE

t(8;21)(q22;q22); RUNX1-RUNX1T1 inv(16)(p13.1q22) ot(16;16)(p13.1;q22); CBFB-MYH11Mutación NPM1 sin FLT3-ITD (cariotipo normal)Mutación CEBPA (cariotipo normal)

INTERMEDIO I

Mutación NPM1 sin FLT3-ITD (cariotipo normal)Wild-type NPM1 y FLT3-ITD (cariotipo normal)Wild-type NPM1 sin FLT3-ITD (cariotipo normal)t(9;11)(p22;q23);

INTERMEDIO II

t(9;11)(p22;q23); MLLT3-MLLAnormalidades citogenéticas no clasificadas comofavorable o adversas.

ADVERSO

inv(3)(q21q26.2) o t(3;3)(q21;q26.2); RPN1-EVI1t(6;9)(p23;q34); DEK-NUP214 t(v;11)(v;q23); MLLAlteraciones –5 or del(5q) –7Cariotipos Complejos

Cariotipo Complejo definido como tres o más anormalidades

(ISCN, 2013)

2.9.1 LMA DE PRONÓSTICO FAVORABLE

El grupo de LMA consideradas de buen pronóstico incluye la LPA y las leucemias

con translocaciones que involucran al core- binding factor (CBF). Las leucemias CBF

(LMA-CBF) están constituidas por la LMA con translocación t(8;21)(q22;q22) y la

LMA con inv(16)(p13;q22) o más raramente t(16;16)(p13;q22). En estas leucemias

se hallan involucradas alguna de las dos subunidades, alfa y beta, respectivamente,

del CBF un factor de transcripción fundamental en la regulación de la hematopoyesis

normal (Steffen et al., 2005). Globalmente, este subgrupo de leucemias (LPA y LMA-


CBF) presentan una supervivencia a largo plazo superior al 64% (Grimwade et al.,

2001).

2.9.2 LMA de Pronóstico Intermedio

El amplio conjunto de leucemias que integran el grupo de pronóstico intermedio, con

una supervivencia de alrededor del 30-41% con los protocolos terapéuticos

actualmente empleados, es heterogéneo. En el se incluye tanto los casos con

citogenética normal como aquellos que presentan +8, del(7q), anomalías 11q23,

+21, +22, del(9q) junto a otras anomalías (Mroźek et al., 2012).

2.9.3 LMA de Pronóstico Desfavorable

La presencia de un cariotipo complejo, la deleción o monosomía de los cromosomas

5 y/o 7 y las anomalías de cromosoma 3q definen un grupo de LMA de pronóstico

desfavorable. En este grupo de leucemias se caracterizan por una pobre respuesta

a la quimioterapia y un alto riesgo de residual, lo que se traduce en una supervivencia

inferior al 20% (Grimwade et al., 1998).

2.9.4 Otros Factores Pronósticos

Se ha sugerido un valor pronóstico para diferentes anomalías biológicas como la

leucocitosis, la presencia de proteínas transportadoras transmembrana que

confieren una resistencia al tratamiento o las mutaciones o sobreexpresión de genes

específicos como FLT3 (Kiyoi et al., 1999; Kottaridis et al., 2001; Thiede et al., 2001),

nucleofosmina (NPM) (Fröhling et al., 2005; Preudhomme et al., 2002; Valk et al.,

2004), EVI1 (Valk et al., 2004), c-KIT (Care et al., 2003; Paschka et al., 2006),


BAALC (Baldus et al., 2006), ERG (Marcucci et al., 2005) o BCL2-BAX (Köhler et al.,

2002).

2.10 Alteraciones Cromosómicas en LMA

2.10.1 LMA con t(8;21)(q22;q22.3)

Esta representa una de los core binding factor (CBF) en leucemias mieloides, afecta

a aproximadamente el 8-10% de los pacientes con LMA, principalmente adultos

(Paschka, 2008). La t(8;21) conduce a una fusión de RUNX1- RUNXT1

(anteriormente AML1-ETO) y generalmente se asocia con un pronóstico favorable

(Perea et al., 2006; Peterson & Zhang, 2004). Esta particular LMA es también

conocida como LMA con maduración y como subtipo M2 de acuerdo a la clasificación

FAB (Klaus et al., 2004). Con menor frecuencia t(8;21) puede ser visto también en

LMMA (FAB M4) y relacionada con la terapia SMD/LMA (Meloni-ehrig, 2013).

Variantes de la translocación, que usualmente afectan un tercer cromosoma, han

sido reportado en el 3% de los casos (Bae et al., 2010; Kelly, Meloni-Ehrig, Manley,

& Altura, 2009; Udayakumar, Alkindi, Pathare, & Raeburn, 2008). La presencia de

anormalidades adicionales es común (aproximadamente el 70% de los casos), la

anormalidad adicional más frecuente es la pérdida de un cromosoma sexual (Y en

los hombres), seguido de del(9q), del(7q), 8, y/o 21, aunque la mayoría de estas

anomalías adicionales no parecen afectar el pronóstico favorable asociado con

t(8;21), la ganancia del cromosoma 6 se observa también y algunos informes e

indican una evolución de la enfermedad con pronóstico menos favorable cuando la

trisomía 6 es parte del cariotipo (Choi et al., 2010; Kelly et al., 2009).

Independientemente de la presencia o la ausencia de anormalidades adicionales,


los pacientes presentan una buena respuesta a la quimioterapia junto con una alta

tasa de remisión completa y la supervivencia libre de enfermedad. Sin embargo, el

resultado de pronóstico favorable es sin excepción alterado por la presencia de

mutaciones de KIT (Lück et al., 2010; Monma et al., 2007).

2.10.2 Inv(16)(p13.1q22.1) o t(16;16)(p13.1;q22.1)

La característica de esta LMA es la presencia de blastos mielomonociticos y

eosinófilos atípicos. También conocida como LMA M4Eo de acuerdo a la

clasificación FAB constituye un 7–10% de los casos con LMA y es generalmente

asociada con un pronóstico favorable (Paschka, 2008). Los adultos son más

frecuentemente afectados que los niños. El sello distintivo de esta LMA es la

inv(16)(p13.1q22.1) o con menos frecuencia la t(16;16)(p13.1;q22.1). Esta

anormalidad conduce a la fusión de MYH11 en 16p13.1 con CBFB en 16q22.1

(Hernández et al., 2000). Anormalidades cromosómicas adicionales a inv(16) o

t(16;16) son detectadas en aproximadamente 30% de los casos (Appelbaum et al.,

2006), el más común es el +22, que se considera una pista por muchos

citogenetistas, en particular cuando la presencia de inv(16) o t(16; 16) no es obvia.

Otras anomalías cromosómicas adicionales incluyen 8, del(7q), y/o 21 (Lück et al.,

2010).

2.10.3 t(9;11)(p22;q23) y Otras Translocaciones en lasque participa MLL

Esta translocación conduce a la fusión de MLLT3 en 9p22 con MLL en 11q23 y se

encuentra en AML con un fenotipo monocítica o mielomonocítica, la falta de


expresión de CD34, y las mutaciones RAS frecuentes (DiMartino & Cleary, 1999).

Esta es la translocación más común relacionada con MLL (Swerdllow, S. H, 2008).

Entre aproximadamente 85 translocaciones conocidas implicando el gen MLL,

t(9;11) se cree que están asociadas con un de mejor pronóstico (Rubnitz et al.,

2002). Con citogenética convencional, translocaciones del gen MLL están

usualmente presentes en todas o casi todas las metafases analizadas. Anomalías

adicionales pueden ser vistas, y las más comunes son la pérdida de un cromosoma

sexual (-Y en los hombres) y +8 (Swansbury, Slater, Bain, Moorman, & Secker-

Walker, 1998). Otra translocación MLL frecuente es la t(11;19) con variantes en

puntos de ruptura en el cromosoma 19, específicamente, el punto de corte es en

19p13.1 (ELL) y se observa principalmente en los adultos, mientras que el punto de

corte en 19p13.3 (MLLT1) es típica de LMA infantil (Biggerstaff et al., 2006). Se han

observado dos translocaciones recurrentes que afectan a los cromosomas 10 y 11,

la más común consiste en el gen MLLT10 en 10p12.3 y la fusión con MLL es a

menudo el resultado de una inserción invertida de un segmento variante del

cromosoma 11 que contiene la porción 3´ del gen MLL en el brazo corto del

cromosoma 10 en lugar de una translocación recíproca (Stasevich et al., 2006). La

otra es la t(10;11)(q21.3;q23) con fusión TET1 con MLL.

2.10.3 LMA con t(6;9)(p23;q34.1)

Es una translocación rara que da como resultado la fusión de los genes DEK en

6p23 con NUP214 en 9q34.1. La t(6;9) es probablemente la anormalidad más

frecuente y está asociada con basofilia y se ha visto tanto en pacientes pediátricos

como adultos (Oancea, Rüster, Henschler, Puccetti, & Ruthardt, 2010). En la


mayoría de los casos, esta anormalidad está presente como único cambio, pero

también puede ser vista en cariotipos complejos particularmente junto con ganancias

de cromosomas 8, 13 y/o 21 (Chi, Lindgren, Quigley, & Gaitonde, 2008).

2.10.4 inv(3)(q21.3q26.2) o t(3;3)(q21.3;q26.2 )

Estas dos anomalías tienen en común la participación de dos genes asociados con

un resultado de pronóstico desfavorable. RPN1 en 3q21.3 y MECOM (EVI1) en

3q26.2 (Fonatsch, C, 1994). Hay otros reordenamientos equilibradas y

desequilibradas que implican estas dos regiones, incluyendo 1p36, 2p15, 3p12,

3p24, 3q23, 5q31.2, 5q34, 7q21, 8q24, 11p15, 12p13, 12q21, 17q22, 18q11, y

21q22.3. (Martinelli et al., 2003; Morishita et al., 1992). Las anormalidades

adicionales más comunes se acompañan de rearreglo -7 y con menos frecuencia

del(5q) (Igarashi et al., 1998).

2.10.5 LMA Megacarioblástica con t(1;22)(p13.3;q13.1)

Leucemia megacarioblástica aguda (FAB M7) es una neoplasia de células madre

clonal que constituye alrededor del 3-15% de todos los casos de LMA (Dastugue et

al., 2002). Este subtipo de leucemia es vista más en niños con una edad media entre

1 y 8 años (Dastugue et al., 2002; Oki et al., 2014). Los rearreglos más comunes que

participan o acompañan esta anormalidad son 3q21.3 and 3q26.2. Adicionalmente

la anormalidad cromosómica incluye −5/del(5q), −7/del(7q), y +8 (Dastugue et al.,

2002), esta t(1;22) no ha sido vista en adultos.


2.11 Tratamiento SMD y LMA

En el momento del diagnóstico, la mayor parte de los SMD se presentan en lo que

se conoce como formas de bajo riesgo (baja probabilidad de evolución a LMA y una

supervivencia esperada superior a 30 meses). El problema más habitual en estos

pacientes es la presencia de anemia, presente en un 90% de los casos (Bennett et

al., 1982).

El Tratamiento de pacientes con SMD de bajo riesgo a diferencia de los de alto riesgo

en general está destinado a modificar la historia natural de la enfermedad y a

prolongar la supervivencia global (SG) que de otra forma estaría claramente

reducida en relación con la esperanza de vida de los pacientes. Para pacientes con

SMD de bajo riesgo el objetivo terapéutico es mejorar las citopenias y la

sintomatología de los pacientes, en especial la anemia. Además esta se ha asociado

a mayor mortalidad (Malcovati et al., 2005), de modo que su corrección podría

suponer una mejoría de la supervivencia (Itzykson et al., 2012).

Los cambios epigenéticos constituyen uno de los fenómenos más importantes en

SMD. La hipermetilación en algunas zonas del genoma, induciría cambios

transcripcionales. Existen 2 drogas hipometilantes aprobadas por la FDA (Food and

Drug Administration) y por ANMAT: Azacitidina (AZA) y Decitabina (DAC)

(Silverman, 2001). Ambas inhiben la ADN metiltransferasa induciendo de esta forma

hipometilación.


2.11.1 Azacitidina

Se cree que la Azacitidina ejerce sus efectos antineoplásicos mediante diversos

mecanismos, que incluyen citotoxicidad sobre las células hematopoyéticas

anormales en la médula ósea e hipometilación del ADN (Andalucía, 2009). Los

efectos citotóxicos de la Azacitidina pueden deberse a diversos mecanismos, que

incluyen la inhibición del ADN, el ARN y la síntesis de proteínas, la incorporación en

el ARN y en el ADN, y la activación de las vías que causan daño en el ADN. Las

células no proliferativas son relativamente insensibles a la Azacitidina. La

incorporación de Azacitidina en el ADN produce la inhibición de las ADN

metiltransferasas, lo que lleva a la hipometilación del ADN. La hipometilación del

ADN da genes metilados aberrantes. Estos genes intervienen en las vías de

regulación normal del ciclo celular, diferenciación y muerte pudiendo producir la re-

expresión de genes y el restablecimiento de funciones supresoras del cáncer en las

células cancerosas. No se ha establecido la importancia relativa de la hipometilación

del ADN frente a la citotoxicidad u otras actividades de la Azacitidina con los

desenlaces clínicos (Iastrebner, Flores, & Benasayag, 2009).

2.11.2 Citarabina

La Citarabina se ha empleado en el tratamiento de LMA por aproximadamente 40

años (Chalmers, 1988) es un agente antineoplásico específico de una fase del ciclo

celular, que afecta sólo a las células durante la fase S de la división celular. En el

interior de la célula, Citarabina es convertida en Citarabina-5-trifosfato (ara-CTP),

que es el metabolito activo. El mecanismo de acción no está comprendido


totalmente, pero parece ser que el ara-CTP actúa fundamentalmente a través de la

inhibición de la síntesis de ADN. La incorporación al ADN y al ARN puede contribuir

también a la toxicidad de Citarabina.

2.11.3 Tratamiento de Inducción 7+3

La Citarabina (arabinosido de citosina: Ara-C) es el principal citostático utilizado en

la quimioterapia de inducción a la remisión. Las dosis de Citarabina son de 100-200

mg/m2, por vía intravenosa y en infusión continua durante 7 días. A ésta se añade

una Antraciclina: la Daunorubicina a dosis de 30-60 mg/m2 o la Idarubicina

(Lowenberg, Downing, & Burnett, 1972) 12 mg/m2, por vía intravenosa los primeros

3 días, siguiendo el acrónimo 7+3 (Sala, Blanco, & Perez, 2002).

2.12 Mecanismos de Diagnóstico

2.12.1 Citometría de flujo

Es invaluable en el diagnóstico y clasificación de neoplasias hematológicas,

determina el pronóstico y monitorea la respuesta a la terapia (Jaffe, Harris,

Vardiman, Campo, & Arber, 2011). Una técnica que mide las características físicas,

propiedades químicas, fenotipo de células y define el estado de maduración celular.

Esta metodología utiliza principios de la dispersión de luz, excitación de la luz y

emisión de fluorocromo para generar datos específicos de células o partículas. Los

datos obtenidos permiten la medición de a cantidad, el tamaño, la morfología y la

estructura interna y externa de las células en cuestión. Estas aplicaciones se utilizan

para el diagnóstico, pronóstico y seguimiento de la enfermedad. Las señales


fluorescentes emitidas por los colorantes que se unen a los anticuerpos

monoclonales específicos tienen muchas aplicaciones en el diagnóstico de

neoplasias malignas hematológicas (Tabla 2-10), como lo son

inmunofenotipificación, diagnóstico y estadificación, análisis de contenido de ADN y

RNA y estudio enzimático (Ciesla, 2012).

Tabla 2-10. Cluster de Diferenciación: Marcadores celulares (Ciesla, 2012)

Cluster de DiferenciaciónInmaduroCD34 Células MadreCD38 HematopoyéticasCD117 Células MadreTdT Precursores linfoidesHLA-DR HematopoyéticasCélulas BCD10 Precursores BCD19 Precursores y maduración BCD20 Activación de células B

CD22Activación citoplasmática concélulas B

Kappa Receptor Fc con células BLambdaFMC7 Células BCélulas TCD2 TempranaCD3 Pan-células TCD4 Subconjunto de células TCD5 Células TCD7 TempranaCD8 Células TCD56 Subconjunto de células TMegacariocitosCD31CD41 GP IIb/IiaCD42CD61 GP IIb/IiaGranulocitosCD13 Pan mieloideCD33 Pan mieloideCD15 PromielocíticaCD11b Mielocito


MPO MieloideMonocitoCD11B Granulocitos y monocitosCD13 Monocitos tempranosCD14 Monocitos maduradosCD33 Granulocitos y monocitosHLA-DR Monocitos madurados

CD, Designación cluster; GP, glicoproteinas; HLA,Antígeno leucocitario humano; MPO,Mieloperoxidasa; TdT, Desoxinucleotidil transferasaterminal

Paneles inmunofenotípicos para el estudio delos síndromes mielodisplásicos:

Es útil para el diagnóstico de la enfermedad y su diferenciación respecto a las

citopenias de otro origen o monocitosis reactivas, especialmente en Citopenias

ideopáticas; además contribuye a la identificación y caracterización fenotípica de

subgrupos específicos de SMD (Saavedra et al., 2010).

Los estudios inmunofenotípicos de síndromes mielodisplásicos mediante citometría

de flujo han reportado diferentes alteraciones en la médula ósea, que incluyen patrón

es alterados de tamaño y complejidad de los mieloblastos y otras subpoblaciones

celulares, aberraciones fenotípicas (aumento o disminución de la expresión

antigénica, pérdida de expresión de antígenos, infidelidad de línea y bloqueos

madurativos), además de alteraciones en la distribución numérica de diferentes

subpoblaciones celulares (Matarraz et al., 2008; Van De Loosdrecht et al., 2009).


El estudio inmunológico permite, además, establecer un sistema de puntuación para

estratificar a los pacientes en grupos de mayor o menor riesgo (Malcovati & Nimer,

2008) y para el seguimiento después del tratamiento. No obstante, en este consenso,

no se estimó el diseño de paneles enfocados a explorar el papel de la citometría de

flujo en relación con el pronóstico de los síndromes mielodisplásicos, y éstos se

centraron más en el diagnóstico y la clasificación de la enfermedad, mediante el

análisis de la maduración de distintas poblaciones celulares, incluyendo neutrófilos

y monocitos junto a los precursores CD34+ (Tabla 2-11) (Saavedra et al., 2010)

Tabla 2-8.Combinación de anticuerpos: Inmunofenotipificación de síndromes

mielodisplásicos (Saavedra et al., 2010)

Marcadores Fenotípicos

CD11b/CD13/CD45/CD34CD7/CD56/CD45/CD34HLA-DR/CD117/CD45/CD34CD36/CD64/CD45/CD14TdT/MPO/CD45/CD34

Paneles inmunofenotípicos para el estudio deleucemias mieloblástica aguda:

En la leucemia mieloide aguda, se consideró que el uso de la citometría de flujo

confirma el diagnóstico de leucemia aguda y permite diferenciarla de otras entidades

como los síndromes mielodisplásicos y los síndromes mieloproliferativos crónicos

(Saavedra et al., 2010).


Para los anticuerpos propuestos, se tiene en cuenta que la detección de la

mieloperoxidasa en los mieloblastos es de gran utilidad para la caracterización del

linaje y que, en los casos negativos para mieloperoxidasa, deben identificarse como

positivos más de dos antígenos mieloides para confirmar el linaje (Matarraz et al.,

2008). En el caso de algunas leucemias mieloides agudas con anomalías genéticas

recurrentes, debe tenerse en cuenta que el porcentaje de mieloblastos puede ser

inferior a 20%; asimismo, se considera que en los estudios por citometría de flujo la

equivalencia a la definición morfológica de mieloblasto correspondería a células

precursoras que generalmente, expresan CD34, CD117 y HLA-DR o muestran

compromiso madurativo a monocito (CD34-, CD117-/+,HLADR+, CD64+fuerte y

CD14-/+débil), que incluyen marcadores aberrantes detectados en el momento del

diagnóstico (Del Cañizo et al., 2003).

Sin duda, la caracterización inmunológica de la leucemia promielocítica aguda

porcitometría de flujo permite demostrar un inmunofenotipo muy característico de la

presencia de la anomalía genética característica de esta entidad t(15;17)

(reordenamiento PML-RARα) al establecerla existencia de promielocitos aberrantes

que expresan, generalmente, CD34-/+ débil, CD15-/+débil, CD33++, CD2-/+ débil,

y CD13+ heterogéneo.

Otras anomalías genéticas, como la inv(16)/t(16;16), se relacionan con expresión

fuerte de mieloperoxidasa, CD2-/+ débil y presencia de monocitos aberrantes. Por

otra parte, los casos con t(8;21) muestran frecuentemente expresión de CD19 y

CD56, mientras que los casos con anomalías a nivel de 11q23 se asocian a fenotipo

CD56+, 7.1-/+, CD2-/+ y CD19-/+ débil (Orfao, Ortuño, de Santiago, Lopez, & San

Miguel, 2004). Se recomendaron anticuerpos básicos para el diagnóstico y la


clasificación de las leucemias mieloides agudas y el rastreo de alteraciones

genéticas características de diferentes subtipos de la enfermedad (Tabla 2-12).

Tabla 2-12. Combinación de anticuerpos: inmunofenotipificación de leucemia

mieloblástica aguda (Saavedra et al., 2010)

LINAJEa MADURACIÓN SUBCLASIFICACIÓN ALTERACIONESGENÉTICAS

OPCIONAL

MPO(citoplasmatica)

HLA-DR CD15 CD56 CD36

CD3(citoplasmatica)

CD34 CD13 CD64

CD19 CD45 CD33 CD123CD79a(citoplasmatica)

CD117a CD11b CD61

CD14

a: para definir el linaje de células mieloides, debe demostrarse la expresión de doso más marcadores asociados a linaje mieloide en los blastos según estos seanMPO+ o MPO-, respectivamente.MPO: mieloperoxidas

2.13 Técnicas Citogenéticas

2.13.1 Convencional

Según la guía Europea LeukemiaNet (ELN) -Workpackage la citogenética y el

análisis del cariotipo convencional (CC) es obligatoria para diagnosticar

correctamente y clasificar las neoplasias malignas hematológicas. Al revelar las

aberraciones cromosómicas subyacentes, balanceadas y no balanceadas, se puede

proporcionar (1) confirmación del diagnóstico; (2) información útil para la

clasificación, puesta en marcha y pronóstico; (3) información para guiar la elección

adecuada de la terapia; y (4) evidencia de remisión o recaída (Micale, 2011).

Como se describió anteriormente, las aberraciones cromosómicas pueden ocurrir

como anomalías fácilmente visibles, con el intercambio de partes grandes o de


diferentes cromosomas, o como reordenamientos crípticos. Estos últimos son el

resultado del intercambio de pequeños fragmentos con similares patrones de

bandas, que se confunden fácilmente con citogenética convencional y posiblemente

explican una proporción de casos de leucemias agudas con cariotipos

aparentemente normales o clones con anomalías cromosómicas inespecíficas.

Análisis por citogenética convencional de leucemias en cultivos de sangre y/o

médula ósea permite una evaluación completa del genoma y de las anomalías que

presente, sin embargo, a veces se ve obstaculizada por el bajo índice mitótico, la

mala morfología de los cromosomas, considerando cariotipos complejos como

cariotipos normales (Micale & Mohamed, 2012). Además, el origen de cromosomas

marcadores no puede ser dilucidado mediante las técnicas de bandeo

convencionales en la mayoría de los casos.

2.13.2 Molecular

En los últimos 30 años, los nuevos avances técnicos han conducido a una revolución

en la citogenética. Las técnicas de hibridación in situ fluorescente (FISH), y las

variantes más recientes de esta técnica, permiten la identificación de secuencias

específicas de ácidos nucleicos en una alta sensibilidad y de manera rápida (Micale

& Mohamed, 2012) y han permitido dilucidar nuevos reordenamientos cromosómicos

crípticos, origen y composición de los cromosomas marcadores.

Las alteraciones cromosómicas de un tamaño < 5 Mb o de las reorganizaciones

complejas son muy difíciles de identificar mediante las técnicas de bandas

convencionales. Las modernas técnicas de citogenética molecular, basadas en FISH


y que combinan la citogenética convencional con la genética molecular, intentan

mitigar dicha limitación. La Gráfica 2-5 ilustra las tasas de detección de

anormalidades de los métodos seleccionados individuales e integrados (McGrattan

et al., 2008).

Gráfica 2 - 5 Tasa de Detección de anormalidades.

Detección de anormalidades con diferentes técnicas citogenéticas en pacientes con

LA (McGrattan et al., 2008).

2.13.2.1Hibridación In situ Fluorescente (FISH)

Hoy en día, las técnicas de FISH son de gran relevancia tanto en el campo de

investigación como en el diagnóstico clínico debido a su alta sensibilidad,

especificidad y la rapidez lo que ha hecho con esta técnica una importante estrategia

diagnostica con numerosas aplicaciones (Gozzetti & Le Beau, 2000).


Tipos de sondas utilizadas en FISH convencional

Se reconocen cuatro tipos de sondas, determinadas por la función de las estructuras

que son capaces de detectar ya sea en el núcleo celular o en metafase: estas son

sondas gen o locus específicas, sondas centroméricas, sondas subteloméricas y

sondas de pintado cromosómico.

- Sondas Locus Específico

Estas sondas se caracterizan porque hibridan con una secuencia única de ADN, son

específicas para un locus determinado. Se conocen como sondas LSI (locus specific

identifier). En función de su diana, tienen un tamaño de 1-10 Kb (plásmidos) o son

vectores más largos 80Kb - 1Mb (Bacterial artificial chromosomes -BACs, Yeast

artificial chromosomes -YACs). Este tipo de sonda permite detectar reordenamientos

estructurales de genes o de regiones cromosómicas concretas e identificar

deleciones y duplicaciones submicroscópicas de hasta 3 Mb (Ledbetter y Ballabio,

1995).

- Sondas Centroméricas

Reconocen los centrómeros, los cuales a pesar de ser prácticamente idénticos para

todos los cromosomas, se distinguen en 2-3% de su secuencia, lo que permite que

la mayor parte de los centrómeros individuales puedan ser distinguidos a excepción

de los centrómeros de los cromosomas 13 y 21, y de los centrómeros de los


cromosomas 14 y 22. Permiten detectar cromosomas concretos e identifica

alteraciones de tipo numérico, especialmente monosomías, trisomías y otras

aneuploidías en metafases y también en núcleos interfásicos. Se conocen como

sondas CEP (chromosome enumeration probe) (Gozzetti & Le Beau, 2000)

- Sondas de Pintado Cromosómico

Con la sonda de pintado cromosómico simple correspondiente a un determinado

cromosoma se consigue pintar sólo los cromosomas homólogos correspondientes,

permitiendo así detectar de forma rápida, alteraciones numéricas y estructurales

intercromosómicas que afecten a ese cromosoma específico (Cremer, Lichter,

Borden, Ward, & Manuelidis, 1988). Así, tras la hibridación aparece pintado

uniformemente todo el cromosoma. Estas sondas, también conocidas como sondas

WCP (whole chromosome painting) sirven fundamentalmente para detectar

translocaciones difíciles de identificar con las técnicas de citogenética convencional,

así como para identificar el origen de material adicional presente en un cromosoma

derivativo o en pequeños marcadores supernumerarios. Si bien se pueden utilizar

en interfase, se aconseja su uso sobre metafases. Los principales inconvenientes

de la utilización de estas sondas son la no detección de inversiones

paracentroméricas y su baja resolución, que impide detectar pequeñas deleciones,

duplicaciones y translocaciones (< 2-3 Mb) (Gozzetti & Le Beau, 2000).

2.13.2.2 Hibridación Genómica Comparativa

La técnica de CGH permite el rastreo de desequilibrios globales presentes en el

genoma en una única hibridación y sin necesidad de obtener células en división


(Kallioniemi et al., 1992). Ha sido una de las primeras técnicas combinadas de

citogenética e hibridación in situ fluorescente que ha permitido realizar un análisis

global del genoma. Aunque inicialmente se describió como una valiosa técnica para

el análisis de desequilibrios en el número de copias de ADN en tumores (Gray &

Collins, 2000; James, 1999; Kallioniemi et al., 1992), en la actualidad es de gran

utilidad para el análisis de desequilibrios cromosómicos constitucionales a partir de

cualquier tipo de muestra.

Básicamente, la técnica consiste en marcar los ADN’s genómicos de la muestra

problema y de un individuo control con fluorocromos distintos y cohibridizarlos en

presencia de Human Cot-1 ADN (bloquea regiones repetitivas de A-T) sobre una

preparación cromosómica de un individuo normal. Las señales fluorescentes son

detectadas y analizadas mediante análisis digital haciendo uso de un software

específico. De este modo se puede analizar las regiones de copia única de cada

cromosoma. A partir del análisis de un mínimo de 10-20 metafases se obtiene el

valor promedio y se generan los perfiles de ganancias y pérdidas (por encima del

umbral 1.25 se considera ganancia y por debajo del 0,75 pérdida) (Weiss et al., 1999)

Con esta técnica pueden detectarse un amplio rango de desequilibrios del genoma,

incluyendo duplicaciones y deleciones a nivel de banda o sub-banda cromosómica

en una única hibridación y con muy poca cantidad de ADN (200 ng-1 µg). Si bien

algunos autores (Joos et al., 1993) han podido detectar con esta técnica

amplificaciones de hasta 2 Mb, en general se acepta que la sensibilidad de este

método para la detección de ganancias y pérdidas es menor de 5Mb (Kallioniemi et

al., 1992; McGrattan et al., 2008). La ventaja principal de la aplicación de esta técnica


es la identificación de pequeños desequilibrios genéticos sin la necesidad de obtener

metafases.

Entre las limitaciones que presenta esta técnica se destaca la imposibilidad de

detectar anomalías cromosómicas equilibradas (como translocaciones o

inversiones) o aquellas que afectan a regiones pericentroméricas, teloméricas o

ricas en heterocromatina (Kallioniemi et al., 1992). También hay problemas de

identificación en aquellos casos en los que el desequilibrio cromosómico se presenta

como un mosaicismos inferior al 30% (Lomax, Lestou, Barrett, & Kalousek, 1998).

Estas limitaciones evidencian la necesidad de combinar la utilización de la CGH con

las técnicas citogenéticas clásicas y FISH.

2.13.2.4 Hibridación Genómica Comparativa DeAlta Resolución

Tal como se ha comentado anteriormente, la CGH alcanza una resolución similar a

la citogenética convencional de alta resolución. La modificación del software, CGH

de alta resolución (HR-CGH), ha permitido aumentar dicha resolución pudiendo

identificar desequilibrios cromosómicos de hasta 2 Mb (Kirchhoff et al., 1999).

En la HR-CGH, las anomalías son detectadas con base a la utilización de un

intervalo dinámico de referencia estándar creado a partir de la media del análisis de

15-20 casos control. Este intervalo es especialmente amplio en aquellas regiones

donde los valores de CGH son generalmente conflictivos. Así se obtiene un perfil

característico para cada cromosoma, el cual se desvía en algunas regiones


cromosómicas sin por ello representar un desequilibrio cromosómico (Mentzlová,

Oltová, Filková, Slerba, & Kuglík, 2008; Weiss et al., 1999).

Umbrales fijados convencionalmente se utilizan para detectar aberraciones

cromosómicas en CGH. Sin embargo, se sabe que este método a menudo detecta

falsos positivos en ciertas regiones cromosómicas. En consecuencia, estas regiones

son a menudo excluidas de la interpretación. Se ha desarrollado un método de

detección en donde los perfiles de relación son evaluados por un intervalo de

referencia dinámico estándar en lugar de los umbrales fijos como en el caso de CGH

clásico. El intervalo de referencia dinámico estándar se basa en un promedio de 16

análisis CGH normal (Mentzlová et al., 2008) para normarlizar los umbrales. La base

para el uso de un estándar normal son observaciones de los perfiles relacionados

de hibridaciones con el ADN normal. El grado de desviación es diferente del análisis,

sin embargo, siempre se correlacionan todos los cromosomas en el análisis

individual. Las desviaciones características del intervalo de referencia dinámico

estándar se correlacionan con el patrón de bandas de los cromosomas con pintado

DAPI. El estándar de referencia dinámica se mueve normalmente a la izquierda en

bandas oscuras y hacia la derecha en las bandas claras. El intervalo dinámico de

referencia estándar se puede ampliar para adaptarse a cualquier análisis (Jeuken,

Sprenger, Wesseling, & Ph, 2002; Weiss et al., 1999).

Se compara la media de los perfiles de los ratios de cada caso, con un intervalo de

confianza del 95% a 99.9% según criterio del investigador, con la media de los

perfiles de controles normales con el mismo intervalo de confianza. Las regiones


alteradas son aquellas en que los intervalos de confianza de la muestra y el control

no se superponen (Gráfica 2-6) (Mentzlová et al., 2008).

Gráfica 2 - 6 HR-CGH. Umbrales Fijos y dinámicos.

Se ha utilizado la HR-CGH en los estudios de varios tumores, así como en el

laboratorio de citogenética clínica siendo habitual desde 1997. Ambas aplicaciones

han demostrado que en comparación con los umbrales fijados HR-CGH detecta

aberraciones más pequeñas con mayor especificidad.

(http://www.chromosomelab.dk/cgh/cgh.html).

Metodología 89

3. METODOLOGÍA

3.1 Aprobación del estudio

El proyecto de investigación junto al asentimiento y consentimiento informado

(Anexo 1) fue aprobado por la Universidad Nacional de Colombia, y se sometieron

al Hospital de Bosa y al Instituto Nacional de Cancerología (INC). La aprobación

para la obtención del material biológico la realizó el INC junto a un nuevo

consentimiento informado (Anexo 2) y formatos de registros generales de

información (Anexo 3).

3.2 Grupo de Casos

Se obtuvieron muestras de pacientes con SMD y LMA de Novo, estas muestras

fueron facilitadas por el Instituto Nacional de Cancerología (INC) con el respaldo

del médico asesor Leonardo José Enciso Olivera. El reclutamiento de los pacientes

se realizó por consultas y rondas de piso por parte del médico y según los criterios

del mismo todos aquellos pacientes con sospecha de SMD y LMA fueron invitados

a participar en el estudio.

3.2.1 Criterios de Inclusión

Se tuvieron en cuenta pacientes mujeres y hombres mayores de edad, con

diagnóstico presuntivo de Síndrome Mielodisplásico o Leucemia Mieloide Aguda y


que se encuentren confirmados por la técnica de citometría de flujo junto al

asentimiento por parte de los mismos para participar en el estudio con la respectiva

firma del consentimiento informado (Anexo 2).

3.2.2 Criterios de Exclusión

Fue motivo de exclusión del estudio aquellos pacientes que ya hayan iniciado un

protocolo de tratamiento junto con la duda en el diagnóstico (leucemias agudas de

linaje ambiguo).

3.2.3 Registro de Pacientes

El registro de los pacientes que decidieron participar en el estudio inicio con la

asignación de un número aleatorio de modo tal que no se pudiera identificar los datos

como nombre, número de cédula o historia clínica para así mantener la privacidad

de los pacientes. La toma de muestra de biopsia de Médula ósea por parte del

médico y la toma de muestra sangre periférica por parte de la enfermera a cargo

fueron designados con el mismo número aleatorio puesto en el registro inicial, la

información de la historia clínica y de los resultados de laboratorio fueron ingresados

a los formatos de registros generales de información (Anexo 3) y de uso exclusivo

del médico tratante, investigador principal y de los miembros del equipo de

investigación con el fin de conocer las condiciones iníciales de la enfermedad y

tratamiento que siguió.

3.3 Toma de Muestra de Médula Ósea.

Este procedimiento fue realizado por el médico hematólogo asesor y no tuvo

Metodología 91

diferencias en cuanto a la técnica que se realiza habitualmente a los pacientes con

esta enfermedad. Para los pacientes que decidieron participar en el estudio y que

su condición lo permitió, se realizó un aspirado y biopsia de médula ósea (Anexo

4), se tomaron dos muestras adicionales de cuatro (4) centímetros cúbicos de

sangre obtenida a partir de la Médula ósea, las muestras se depositaron en tubos

con anticoagulante Heparina Sódica y EDTA para la obtención de las células

requeridas y del ADN necesario para la realización de las diferentes técnicas que

repercutirían en la correcta clasificación de la enfermedad, así como en los

procedimiento empleados en este estudio (Citogenética clásica, FISH, y CGH).

3.4 Toma de Muestra de Sangre Periférica

Este procedimiento fue ejecutado por la enfermera a cargo a los pacientes que

decidieron participar en el estudio y que su condición lo permitió, se realizó por

sistema de extracción con vacío (Anexo 5). Se tomaron dos muestra de cuatro (4)

centímetros cúbicos de sangre. Las muestras se depositaron en tubos con

anticoagulante Heparina Sódica y EDTA para la obtención de las células requeridas

y del ADN necesario para la realización de las diferentes técnicas empleadas en

este estudio (Citogenética clásica, FISH, y CGH).

3.5 Citometría de FlujoSe realizó citometría de flujo de los pacientes con diagnóstico presuntivo de SMD y

LMA, este procedimiento se realizó en el Laboratorio de Genética del Instituto

Nacional de Cancerología. Los análisis se practicaron utilizando el citómetro de 4

colores marca BECTON DICKINSONTM FACS CANTO II® y según protocolos


Euroflow (van Dongen et al., 2012), se emplearon marcadores para determinar

inmunofenotipos ya sean células en diferenciación celular o maduración como lo son

CD1, CD2, CD3, CD5, CD7, CD10, CD13, CD14, CD16, CD 9, CD20, CD22, CD33,

CD34, CD36, CD45, CD79, CD117, HLA-DR, MPO, Tdt y cadenas mu.

3.6 Cultivo y Cosecha de Cromosomas Metafásicos apartir de Sangre Periférica y Médula Ósea

3.6.1 Descripción del Procedimiento.

Los cultivos se realizaron por triplicado de corto y mediano plazo (24 y 48 Horas) sin

Fitohemaglutinina (agente mitogénico) y de largo plazo (72 horas) con

Fitohemaglutinina. Cada cultivo contenía 4.5 ml de medio McCoy´s 5A (médula

ósea) o RPMI 1640 (sangre periférica), 0.5 ml de suero fetal bovino, 100 ul penicilina

y 75 ul del agente mitogénico (Fitohemaglutinina) en el caso de cultivos de 72 horas

(Anexo 6), la cantidad de muestra dependió del estado médico del paciente siendo

el rango normal de 4000 a 10000 y agregando para estos 500 ul. Los cultivos fueron

incubados a 37°C por 24, 48 o 72 horas según corresponda.

Se realizaron cultivos a las 72 con estimulo (Fitohemaglutinina) con el fin de

determinar si las anormalidades vistas en los pacientes con SMD y LMA son

constitutivas o se pueden atribuir a la evolución clonal propia de la malignidad. Es

de mencionar que para estudios citogenéticos en enfermedades mieloides existen

mitógeno específicos que estimulen cada una de las líneas que se ven afectadas

con estas enfermedades, entre ellos están G-CSF, GM-CSF, IL-3, SCF,

Thrombopoietein y Erythropoietin.

Metodología 93

Completado el tiempo de incubación se procedió a realizar la cosecha y extracción

de cromosomas metafásicos, añadiendo 80 ul de colchicina a los cultivos de 24 y 48

horas por 45 minutos y 80 ul por 20 minutos a cultivos de 72 horas, posterior a esto

se separaron las células del medio y demás sustancias por centrifugación, se

descartó el sobrenadante y se agregó 8 ml de solución hipotónica KCl 0.075M por

un tiempo de 30 minutos para cultivos de 24/48 horas y 10 minutos para cultivos de

72 horas, la fijación del contenido celular se efectuó con fijador Carnoy (metanol:

ácido acético proporción 3:1), seguido de 3 lavados para eliminar rastros

citoplasmaticos.

Se extendieron 2 portaobjetos o láminas por cada cultivo (24, 48 y 72 Horas) las

cuales se utilizaron para citogenética convencional y 2 porta objetos o láminas para

la técnica de hibridación in situ (FISH) con sondas t(8;21) y t(16;16).

3.7 EVALUACIÓN CITOGENÉTICA

3.7.1 Descripción del Procedimiento.

Los pacientes remitidos fueron evaluados por citogenética tradicional con las

láminas obtenidas en los cultivos cortos (24 y 48 horas) y largos (72 horas), se realizó

bandeo G con colorante wright (Anexo 7).

El análisis inicial se realizó en 25 metafases y la presencia de clones implicaba

ampliar el conteo a 100 metafases por individuo si las condiciones médicas del

paciente lo permitían. La nomenclatura se realizó según el ISCN 2013 (Shaffer, L.


G. et al., 2013). Se empleó el microscopio (ZEISS Axiophot); la organización del

cariotipo se hizo con el software LUCIA G 2.85 KARYO y se tomaron imágenes de

los diferentes clones hallados con la cámara ProgRes® C3- Jenoptikpara así tener

un reporte por cada individuo.

3.8 Hibridación in situ Fluorescente (FISH)

Se realizó análisis de Hibridación in situ Fluorescente (FISH) para detectar

translocaciones en pacientes con SMD y LMA, evaluando las sondas AML1/ETO

(RUNX1/RUNX1T1) Translocation, Dual Fusion t(8;21) y CBFß/MYH11

Translocation, Dual Fusion inv(16), Esta técnica demanda dos días de tratamiento

siguiendo los protocolos descritos por el proveerdor (Cytocell) (Anexo 8).

Para cada paciente se seleccionaron con filtro azul 10 metafases y 100 interfases,

dependiendo del tipo de sonda usada y del color de la misma se cambia el filtro a

la longitud de onda deseada ya sea DAPI (358 nm) anteriormente mencionado o

SpectrumGreen (495 nm) y Spectrumred (558 nm) (ZEISS), se verificó la cantidad

de señales observadas y ubicación de las mismas. Las imágenes se digitalizaron y

evaluaron usando el software LUCIA G 2.85 FISH.

Metodología 95

Gráfica 3 - 1 Ejemplo sonda AML1/ETO dual fusión.

3.9 Hibridación Genómica Comparada (CGH)

3.9.1 Preparación de Metafases Normales - LaminasBlanco para CGH

Se obtuvieron las metafases de 10 pacientes normales (5 hombres y 5 mujeres) que

decidieron donar 4 ml de sangre periférica y que previamente fueron analizados por

citogenética convencional. Estas metafases se prepararon de acuerdo con los

protocolos estándares basados en la estimulación de linfocitos agregando

fitohemaglutinina y extendidos sobre laminas limpias. Se procedió a desnaturalizar

la lámina blanco después de gotear o máximo un día después.

Se precalentó en baño de maría un coplin con formamida 70%/2XSSC a una

temperatura de 50°C, se colocó la lámina blanco en esta solución durante 2 minutos,

se sacó la lámina e inmediatamente se pasó a deshidratar en una serie de etanoles


fríos al 70, 80 y 100% seguido de etanol al 100% a temperatura ambiente por 2

minutos cada uno (Anexo 10).

3.9.2 Realización Sonda

La primera fase de la estandarización de la técnica fue la obtención de ADN

mediante extracción con cloroformo de sangre periférica y/o médula ósea (Anexo 9)

de un grupo de 10 controles y a los que se les realizo también citogenética

convencional para determinar posibles anormalidades, la extracción también se

realizó a pacientes con SMD/LMA, la pureza del ADN (relación 260/280) debió estar

entre 1.8 a 2.0 para garantizar que el marcaje se hiciera sobre ADN y no en proteínas

o RNA, la cuantificación de ADN se realizó en el equipo NanoDrop (Thermo

Scientific). El ADN genómico de los controles antes mencionados, el ADN de

pacientes y el ADN de referencia que consiste en un pool de 10 individuos normales

(Promega) fueron digeridos en fragmentos de tamaño de 100-2000 pb, incubados

por 4 horas con DpnII (New England Biolabs Inc) a 37°C y revisados en un gel de

agarosa al 2%. Los fragmentos de ADN fueron purificados usando QIAquick PCR

purification kit (Qiagen GmbH). Un microgramo (1 µg) del ADN digerido por DnpII y

purificado fue marcado directamente por Universal Linkage System ULS, en el caso

del ADN del paciente con PlatinumBrightTM Nucleic Acid Labeling Kit (495 Green) y

para el ADN de referencia PlatinumBrightTM Nucleic Acid Labeling Kit (550

Red/Orange) siguiendo protocolos de la casa fabricante (Kreatech) y con 20

reacciones cada uno. Los fragmentos de ADN tanto de paciente como de control

fueron mezclados junto a 10 µg de Human Cot1-ADN (Solución de Bloqueo de

regiones de secuencias repetitivas A-T centrómeros y telómeros - Invitrogen) y

Metodología 97

precipitados con etanol. El pellet fue secado al aire y resuspendido en buffer de

hibridación dependiendo de la concentración de ADN (Jeuken et al., 2002; Weiss et

al., 1999).

3.9.3 Desnaturalización de la sonda e hibridación de lasonda a la lámina objetivo o blanco

Se procedió a desnaturalizar la mezcla en calor a 75°C por 10 minutos en el baño

de maría, se agregó de 5 a 10 µl de la mezcla dependiendo de la concentración de

ADN sobre la lámina blanco previamente punteada y desnaturalizada como se indica

en la sección 3.9.1, inmediatamente se cubrió con una laminilla y se sellaron los

bordes con pegante a base de caucho, se colocó la lámina sellada en una cámara

húmeda con 2XSSC y se dejó incubando por 92 horas a 37°C.

3.9.4 Post lavados de la Lámina

Previamente se calentó un coplin con 0.4 X SSC (solución de lavado) a 73°C,

posterior a esto se removió el pegante y la laminilla de la lámina e inmediatamente

se colocó en la solución de lavado por 2 minutos, sin dejar secar se pasó la lámina

a un coplin con solución 2 X SSC a temperatura ambiente por 30 segundos (Anexo

10).


3.9.5 Visualización de la Hibridación

Se aplicó 4 µl de DAPI sobre la zona hibridada y se cubrió con una laminilla limpia

para su posterior visualización y evaluación.

3.9.6 Evaluación e Interpretación de los Resultados

La evaluación de la hibridación genómica comparada (CGH) se realizó con el

software de análisis de imagen LUCIA 2.85 CGH, este software se usó para adquirir

10 imágenes de metafases, en su mayoría sin cruces entre cromosomas para así

determinar los perfiles de relación de las intensidades de fluorescencias junto a un

análisis estadístico de los mismos. Los cromosomas fueron contrastados con DAPI

lo que dio como resultado patrones de banda Q que fueron empleados para la

identificación cromosómica. Después de organizar cada metafase, el software

calculó los perfiles de intensidad tanto en verde (495 nm)(Paciente) como en rojo

(550 nm)(Control de referencia) para cada cromosoma.

Las regiones cromosómicas fueron consideradas como pérdidas o como ganancias

cuando la relación verde (paciente): rojo (control) excede los perfiles de los intervalos

dinámicos de referencia, usando un intervalo de confidencia del 95% o 99.5% para

el caso de Hibridación Genómica Comparada de Alta Resolución.

Metodología 99

3.9.7 Estandarización y Validación

La estandarización y validación se realizó con diez (10) muestras de individuos, cinco

(5) mujeres y cinco (5) hombres, a estos controles previamente se les realizaron

cariotipo convencional (Bandas G de alta resolución) para determinar anormalidades

si era posible. Los botones o pellet con las metafases de los individuos normales

confirmados citogenéticamente fueron utilizados como controles para las láminas

blanco, para la obtención de los perfiles característicos de cada cromosoma y a su

vez la estandarización de los umbrales del software.

3.10 Análisis Descriptivo Univariado de los Datos

Este es un estudio de corte descriptivo longitudinal y el número de muestras a

evaluar fue determinado a conveniencia.

Se realizó un análisis descriptivo de cada una de las variables, medidas de

tendencia central (media, moda y mediana) de la edad, del sexo, frecuencia

de las aberraciones cromosómicas y otras variables evaluadas (Anexo 11).

Caracterización de la supervivencia global: Se realizó un modelo de riesgos

proporcionales como función de sobrevida Weibull (Sayehmiri, et al.,

2008).

Análisis de regresión logística (Jovell, 1995) para evaluar tasas de

remisión con tratamiento.


Los datos obtenidos en el presente estudio fueron organizados y procesados con el

paquete estadístico R (http://www.r-project.org/) y weibull

(http://www.isograph.com/software/availability-workbench/weibull-

analysis/?gclid=Cj0KEQjwy7qrBRC4lp7_hM3dgIoBEiQA72pCnmflFZ3rCKsyM3bS3

vsFWkDP9A2M94gp7JPaYMrbgsIaAmlT8P8HAQ).

Resultados 100

4. RESULTADOS

Se recibieron 24 muestras de pacientes con diagnóstico presuntivo de Síndrome

Mielodisplásico (SMD) y Leucemia Mieloide Aguda (LMA), de estos, cinco (5)

pacientes fueron confirmados por citometría de flujo como SMD y de la misma

manera seis (6) pacientes para LMA; los marcadores para diferenciación se

relacionaron anteriormente.

Un total once (11) pacientes fueron incluidos en el estudio cumpliendo los criterios

de inclusión. Seis (6) pacientes de género femenino y cinco (5) de género masculino.

De los cuales cinco (5) presentaban SMD (3 hombres y 2 mujeres) y seis (6) LMA (2

hombres y 4 mujeres) (Gráfica 4-1).

Gráfica 4 - 1 Diagrama de Barras eje X género, eje Y enfermedad primaria

En la tabla 4-1 se puede observar que dos (2) pacientes mujeres con SMD

presentaron transformación a LMA, dos (2) pacientes masculinos fueron

diagnosticados con subclase areb-1 y uno (1) con areb-2, mientras que los pacientes


con LMA se subclasificaron de la siguiente manera: dos (2) pacientes con M2

(femenino y masculino), uno (1) con M4 (femenino), uno (1) con M5b (masculino) y

dos (2) con M6 (femenino).

Tabla 4-1. Frecuencia absoluta de los datos para las variables de

género/subclasificación para SMD y LMA

CUENTA SEXO

Enfermedad Primaria Subclasificación F M Total FilaLMA

M2 1 1 2M4 1 1M5b 1 1M6 2 2

TOTAL LMA 4 2 6SMD AREB-1 2 2

AREB-2 1 1LMAt 2 2

TOTAL SMD 2 3 5TOTAL COLUMNA 6 5 11

Se presentó un rango de edad para SMD de 24 a 64 años con una media de 48

años. Se realizó conteo celular de leucocitos con intervalos de 580 a 8400 con una

mediana de 1390 (Cel/µl), linfocitos de 280 a 3050 con una mediana de 1050 (Cel/µl),

neutrófilos de 60 a 5020 con una mediana de 140 (Cel/µl) en sangre periférica y el

porcentaje de blastos en médula ósea mostró un promedio de 12,92%. El nivel de

hemoglobina presentó un promedio de 8,5 g/dL (Tabla 4-2).

Resultados 102

El intervalo de edad para pacientes con LMA fue de 32 a 70 años con una media de

48,2 años. Para pacientes con LMA, el conteo celular en sangre periférica presentó

un intervalo de 4230 a 60090 con una mediana de 27165 leucocitos (Cel/µl), de 2403

a 11681 con una mediana de 4067 linfocitos (Cel/µl), de 250 a 19750 con una

mediana de 1745 neutrófilos (Cel/µl), el porcentaje de blastos en médula ósea

evidenció un promedio de 56,6% y el nivel de hemoglobina presentó un promedio de

8,3 g/dL (Tabla 4-2).

Tabla 4-2. Datos Hematimétricos LMA/SMD

Característica LMA SMDEdadIntervalo 32-70 24-64Media 48,2 48Leucocitos(Cel/µl)Intervalo 4230-60090 580-8400Mediana 27165 1390Linfocitos (Cel/µl)Intervalo 2403-11681 280-3050Mediana 4067 1050Neutrófilos(Cel/µl)Intervalo 250-19750 60-5020Mediana 1745 140CantidadHemoglobina(g/dl)

Intervalo 7,5-10 6,6-9,6Media 8,3 8,5Blastos (%)Total 5-92,6 2,6-28% Blasto 56,5 12,9


4.1 Citogenética Convencional

De once pacientes recibidos, se analizaron por citogenética convencional nueve (9)

los cuales presentaron una (1), dos (2) o tres (3) alteraciones cromosómicas en su

cariotipo (81,8%), mientras que los dos (2) pacientes restantes no presentaron índice

mitótico para el respectivo análisis (18,2%) (Tabla 4-3).

Tabla 4-3. Número de anormalidades cromosómicas por enfermedad primaria

Número deAnormalidades

en Cariotipo

LMA SMD

Cariotipo Normal1 5 12 1 13 1

No Índice Mitótico 2

La Tabla 4-4 muestra los porcentajes para cada anormalidad cromosómica y para

cada enfermedad primaria.

Tabla 4-4. Clasificación de Moorman. Frecuencias de Anormalidades

Cromosómicas (Moorman et al., 2001).

Clasificación deMoorman

LMA (n=80) SMD (n=56)

Monosomías 62 (77,50) 33 (58,93)Trisomías 2 (2,50) 6(10,71)Translocaciones 1 (1,25) 4 (7,14)Inversiones 3 (3,75) 4 (7,14)Isocromosomas 0 (0,0) 3 (5,36)Poliploidías 5 (6,25) 2 (3,57)Nulisomías 7 (8,75) 4 (7,14)

Resultados 104

4.1.1 Síndrome Mielodisplásico

Se observó por citogenética convencional cinco (5) pacientes de los cuales el 60%

presenta anormalidades cromosómicas numéricas y estructurales y se describirán a

continuación iniciando con monosomías recurrentes en pacientes con SMD (Gráfica

4-2).

Gráfica 4 - 2 Pérdida Material Genético SMD. En el eje X número de células con la

alteración y eje Y cromosoma implicado.

El 58,93% de anormalidades cromosómicas en estos pacientes son pérdidas de

información genética ya sea total o parcial en el cromosomas sexual X

representando el 21,21% del total de las monosomías halladas seguido de los

cromosomas 21 con 18,18% y 17 con 9,09%.

En cuanto a las ganancias del material genético se observó que correspondían al

11,32% del total de anormalidades cromosómicas, la trisomía del cromosoma 8


(33,33%) seguido de las ganancias de los cromosoma 1, 2, 9 y 18 (16,67%) son las

más frecuentes de estos pacientes (Gráfica 4-3).

Gráfica 4-3 Ganancia Material Genético SMD. En el eje X número de células con la

alteración y eje Y cromosoma implicado

4.1.1.1 Caracterización Pacientes SMD

4.1.1.1.1CP 498620

Clínica

Paciente del género femenino con 41 años de edad diagnosticada el 28/11/2013

con Síndrome Mielodisplásico en transición a Leucemia Mieloide Aguda, el

hemograma en sangre periférica al momento del diagnóstico reporta 1390 cel/µl

de leucocitos, 810 cel/µl de linfocitos, 430 cel/µl de neutrófilos (Leucopenia

marcada, linfopenia absoluta y neutropenia absoluta), porcentaje de blastos en

médula ósea del 22% y la concentración de hemoglobina de 9,6 g/dL (anemia

Resultados 106

moderada), no inicia tratamiento y la última fecha de contacto fue el 03/12/2013

el estado vital para la fecha era muerto.

Citogenética

Debido a las condiciones clínicas en las que se encontraba el paciente no fue

posible la obtención de cultivos positivos para el análisis citogenético.

4.1.1.1.2 CP 323008

Clínica

Paciente del género femenino con 64 años de edad diagnosticada 26/12/2013

por citometría de flujo con Síndrome Mielodisplásico en transición a Leucemia

Mieloide Aguda, el hemograma en sangre periférica al momento del diagnóstico

reporta 3290 cel/µl de leucocitos, 2790 cel/µl de linfocitos, 80 cel/µl de neutrófilos

(Leucopenia marcada y neutropenia absoluta), porcentaje de blastos en médula

ósea del 28% y la concentración de hemoglobina de 9,3 g/dL (anemia

moderada). Inicia el primer ciclo del tratamiento con Citarabina el 23/01/2014 y

a las cuatro semanas no logra remisión, la última fecha de contacto fue el

26/02/2014 el estado vital para la fecha era vivo.

Citogenética

Paciente con complemento cromosómico anormal en cultivos de 24 y 48 horas

sin estimulo, presenta cariotipo 45,X,-X[5]/45,XX,-21[2]/44,X,-X,-21[2] (Gráfica

4-5), se observaron 3 líneas celulares en 9 células analizadas, en la primera se

evidencia la pérdida recurrente del cromosoma sexual X en 5 células, en la

segunda línea se observó la pérdida del cromosoma 21 en 2 células, en la


tercera línea 2 células presentaron pérdidas de los cromosomas X y 21 lo que

indica una evolución clonal (Gráfica 4-4). En el cultivo de 72 horas con estimulo

se observó un cariotipo con complemento cromosómico normal femenino 46,XX

en 91 células analizadas.

El número de pérdidas totales de este paciente fueron 14 (100%) donde la

pérdida más representativa fue la del cromosoma sexual X (50%), seguido del

cromosoma 21 (28,6%) y 10 (14,3%) la última no fue definida como clon y se

halló en cultivos de 24 y 48 horas

Gráfica 4 - 4 Evolución Clonal Paciente 323008

Gráfica 4 - 5 Fotos cariotipos 323008. 45,X,-X / 44,X,-X-21. LUCIA 2.8 KARYO

46,XX

45,X,-X 45,XX,-21

44,X,-X,-21

Resultados 108

El pronóstico para este paciente según lo propuesto por García, 2008 y Haseen

et al., 2007 fue BUENO ya que la mediana de supervivencia para la pérdida total

del X fue 56.4 meses mientras que para la monosomía 21 de 32 meses. Según

Schanz et al., 2012 todas aquellas dobles anormalidades que no incluyan -5/-

5q, -7/7q o inv(3)/t(3q) son consideradas de pronóstico INTERMEDIO y con una

mediana de supervivencia de 28 meses.

4.1.1.1.3 CP 640124

Clínica

Paciente del género masculino con 24 años de edad diagnosticado el 07/03/2014

por citometría de flujo con Síndrome Mielodisplásico, subclasificación areb-1, el


de leucocitos, 3050 cel/µl de linfocitos, 5020 cel/µl de neutrófilos, porcentaje de

blastos en médula ósea del 5% y la concentración de hemoglobina de 9,3 g/dL

(anemia moderada). Inicia el primer ciclo del tratamiento con Azacitidina el

27/06/2014 y a las cuatro semanas no logra remisión, la última fecha de contacto

fue el 20/07/2014 el estado vital para la fecha era vivo.

Citogenética

Paciente con complemento cromosómico masculino anormal en cultivos de 24 y

48 horas sin estimulo, presenta cariotipo

46,XY,i(17)(q10)[1]/46,XY,idem,t(4;9)(p15;p23)[2]/46,XY[18] (Gráfica 4-7), se

observaron 3 líneas celulares en 21 células analizadas, en la primera se evidencia

un isocromosoma del brazo largo del cromosoma 17 en 1 célula, en la segunda


línea se observa el mismo isocromosoma 17 junto una translocación

posiblemente balanceada entre brazos cortos de los cromosomas 4 y 9 en las

regiones p15 y p23 en 2 células, la tercera línea muestra normalidad en el

complemento cromosómico 46,XY en 18 células, este proceso indico evolución

clonal en el paciente (Gráfica 4-6). En el cultivo de 72 horas con estimulo se

observó un cariotipo con complemento cromosómico masculino normal 46,XY en

79 células analizadas.

El número de pérdidas totales de este paciente fueron 14 (100%) donde se

encontraron monosomías en el cromosoma 17 (20%) los cromosomas 8, 21 y Y con

46,XY

46,XY,i(17)(q10)

46,XY,ídem,t(4;9)(p15;p23)

Gráfica 4-6 Evolución Clonal Paciente 640124

Resultados 110

el 13 % para cada una. Ganancia total del cromosoma 8 fue evidente en una célula.

Estas pérdidas y la ganancia no fueron definidas como clones y se hallaron en

cultivos de 24 y 48 horas.

El pronóstico para este paciente según propuesto por Haseen et al., 2007 y

Greenberg et al., 2012 fue INTERMEDIO con una mediana de supervivencia para

isocromosoma del brazo largo del cromosoma 17 de 28 meses sin conocer la

mediana de supervivencia de la translocación por no estar reportada en estudios

previos.

4.1.1.1.4 CP 656335

Clínica


por citometría de flujo con Síndrome Mielodisplásico, subclasificación AREB-1, el


Gráfica 4-7.Fotos cariotipos 640124. 46,XY,i(17)(q10)[1]/46,XY,idem,t(4;9)(p15;p23)[2].

LUCIA 2.8 KARYO


de leucocitos, 280 cel/µl de linfocitos, 1400 cel/µl de neutrófilos (leucopenia

marcada, linfopenia absoluta, y neutropenia absoluta), el porcentaje de blastos

en médula ósea fue del 7% y la concentración de hemoglobina de 6,6 g/dL

(anemia marcada). Inicia el primer ciclo del tratamiento con esquema 7+3 el

26/03/2014 y a las cuatro semanas no logra remisión, la última fecha de contacto

fue el 06/04/2014 el estado vital para la fecha era muerto.

Citogenética

Debido a las condiciones clínicas en las que se encontraba el paciente no fue

posible la obtención de cultivos positivos para el análisis citogenético.

4.1.1.5 CP 191286

Clínica


por citometría de flujo con Síndrome Mielodisplásico, subclasificación areb-2, el


de leucocitos, 1050 cel/µl de linfocitos, 60 cel/µl de neutrófilos (Leucopenia

marcada, linfopenia absoluta y neutropenia absoluta), el porcentaje de blastos en

médula ósea del 2,6% y la concentración de hemoglobina de 7,7 g/dL (anemia

marcada). Inicia el primer ciclo del tratamiento con Azacitidina el 08/07/2014 y a

las cuatro semanas no logra remisión, la última fecha de contacto fue el


Resultados 112

Citogenética


48 horas sin estimulo, presenta cariotipo 46,XY,inv(7)(p21p15)[4]/46,XY[20]

(Gráfica 4-9), se observaron 2 líneas celulares en 24 células analizadas, en la

primera se evidencia una inversión del brazo corto del cromosoma 7 de las

regiones p21 y p15 en 4 células, la segunda línea muestra normalidad en el

complemento cromosómico 46,XY en 20 células (Gráfica 4-8). En el cultivo de 72

horas con estimulo se observó un cariotipo con complemento cromosómico

masculino normal 46,XY en 29 células analizadas. Adicionalmente se observó un

aumento en el tamaño de la heterocromatina terminal del brazo largo del

cromosoma Y (Yqh+), este hallazgo considerado como un polimorfismo es decir

una variante normal.


encontraron monosomías totales en los cromosomas 5 y 7 representando el 40%

para cada una, así mismo fue evidente ganancias totales de los cromosomas 2 y

46,XY

6,XY,inv(7)(p21p15)

Gráfica 4-8 Evolución Clonal Paciente 191286


8, se observó una duplicación del cromosoma 9 en las regiones q21 y q22 estas

alteraciones representaron el 33.3% para cada uno. Las pérdidas y ganancia no

fueron definidas como clones y se hallaron en cultivos de 24 y 48 horas.

Gráfica 4-9 Fotos cariotipos 191286 LUCIA 2.8 KARYO

El pronóstico para este paciente según propuesto por Haseen et al., 2007 y

Greenberg et al., 2012 es INTERMEDIO ya que no se tiene reporte alguno sobre

esta anormalidad y el pronóstico de la misma.

Resultados 114

4.1.2 Leucemia Mieloide AgudaPara los pacientes con LMA se encontró que el 67% de ellos presentaron

anormalidades cromosómicas, las pérdidas representaron el 77,5% del total de

anormalidades presentes en estos pacientes, las más recurrentes se presentaron

en el cromosoma 11 (16,13%), 21 (11,29%) y X (11,29) (Gráfica 4-10).

Gráfica 4-10 Pérdida Material Genético LMA. En el eje X número de células con

la alteración y eje Y cromosoma implicado

Las ganancias cromosómicas encontradas en LMA (Gráfica 4-11) representan el

2,50% del total de anormalidades cromosómicas, se evidencio trisomía del

cromosoma 2 (100%) en dos pacientes diferentes.


Gráfica 4-11 Ganancia Material Genético LMA. En el eje X número de células con la

alteración y eje Y cromosoma implicado

Para cada uno de los pacientes se realizara una descripción de los hallazgos

clínicos y citogenéticos:

4.1.2.1 Caracterización Pacientes LMA

4.1.2.1.1 CP 607410

Clínica

Paciente del género masculino con 32 años de edad diagnosticado por citometría

de flujo con Leucemia Mieloide Aguda el 27/11/2013, subclasificación M2, el


de leucocitos, 510 cel/µl de neutrófilos (leucocitosis moderada y neutropenia

marcada), porcentaje de blastos en médula ósea del 92,6% y la concentración de

hemoglobina de 7,8 g/dL (anemia marcada). Inicia el primer ciclo del tratamiento

con esquema 7+3 el 04/12/2013, el 31/12/2013 se realizó una valoración a la

Resultados 116

respuesta el tratamiento y para la fecha tenía 53% blastos en médula ósea por lo

cual no logra remisión, la última fecha de contacto fue el 24/01/2014 el estado

vital para la fecha era muerto.

Citogenética


48 horas sin estimulo, presenta cariotipo 46,XY,del(11)(q21q23)[6] en 6 células

analizadas, se observó una deleción parcial del cromosoma 11 en las regiones

q21 a q23 (Gráfica 4-12 y 4-13). En el cultivo de 72 horas con estimulo se observó

un cariotipo con complemento cromosómico masculino normal 46,XY en 94

células analizadas.

46,XY

46,XY,del(11)(q21q23) [6]

Gráfica 4-12. Evolución Clonal Paciente 607410



encontraron pérdidas en los cromosomas 11 (28,6%), 9, 18 y cromosoma sexual

Y con un 9,5% cada uno. La deleción del cromosoma 11 fue la más significativa

y la que permitió confirmar clonalidad en cultivos de 24 y 48 horas.

Gráfica 4-13 Fotos cariotipos 607410. 46,XY,del(11)(q21q23)[6]. LUCIA 2.8

KARYO

El pronóstico para este paciente según propuesto por la clasificación de riesgo

European LeukemiaNet (ELN) es ADVERSO con una mediana de supervivencia

12.2 meses (Mrózek et al., 2012), según Grimwade, et al., 2010 lo clasifica como

de riesgo INTERMEDIO.

Resultados 118

4.1.2.1.2 CP 746799

Clínica

Paciente del género femenino con 49 años de edad diagnosticada por citometría



de leucocitos, 3300 cel/µl de linfocitos, 250 cel/µl de neutrófilos (leucopenia ligera

y neutropenia absoluta), porcentaje de blastos en médula ósea del 5% y la

concentración de hemoglobina de 8 g/dL (anemia moderada). Inicia el primer ciclo

del tratamiento con esquema 7+3 el 08/02/2014, el 07/03/2014 se realizó una

valoración a la respuesta el tratamiento y para la fecha no tenía blastos en médula

ósea por lo cual logra remisión, la última fecha de contacto fue el 08/03/2014 el

estado vital para la fecha era vivo.

Citogenética

Paciente con complemento cromosómico femenino normal en cultivos de 24 y 48

horas sin estimulo, presenta cariotipo 46,XX[5] en cinco células de 7 analizadas

(Gráfica 4-15), es importante resaltar que se observaron 2 células con pérdida de

uno de los cromosomas 19, las cuales no representan evolución clonal. En el

cultivo de 72 horas con estimulo se observó un complemento cromosómico

femenino normal 46,XX en 93 células analizadas. Adicionalmente es evidente un

aumento en el tamaño de la heterocromatina del brazo lago del cromosoma 1

(1qh+).



encontraron pérdidas casuales en los cromosomas 19 (33,3%), 5, 17, 22 y

cromosoma sexual X representando el 6,7% cada uno, sin ser definidos como

clones. No se evidenciaron ganancias totales o parciales de cromosomas en este

paciente.

Gráfica 4-15 Fotos cariotipos 746799. 45,XX,-19[2]. LUCIA 2.8 KARYO

Gráfica 4-14. Paciente 746799

46,XX

45,XX,-19

Resultados 120

El pronóstico para este paciente según propuesto por la clasificación de riesgo

European LeukemiaNet (ELN) es INTERMEDIO (Mrózek et al., 2012) ya que el

mismo grupo de clasificación tiene un ítem donde integran “algún otro clon

independiente”.

4.1.2.1.3 CP 826210

Clínica




leucocitos, 2403 cel/µl linfocitos, 3604 cel/µl neutrófilos (leucocitosis moderada),

porcentaje de blastos en médula ósea del 77% y la concentración de hemoglobina

de 8,2 g/dL (anemias moderadas). Inicia el primer ciclo del tratamiento con

esquema 7+3 el 27/02/2014, el 17/03/2014 se realizó una valoración a la

respuesta el tratamiento y para la fecha tenía 12% blastos en médula ósea por lo

cual no logra remisión, la última fecha de contacto fue el 25/03/2014 el estado

vital para la fecha era vivo.

Citogenética


horas sin estimulo, presento cariotipo 46,XX en 37 células. En el cultivo de 72

horas con estimulo un complemento cromosómico femenino anormal se observó

mos 45,X,-X[4]/46,XX[63] (Gráfica 4-16 y 4-17), es evidente la pérdida recurrente

del cromosoma sexual X (30%) en 4 células sin definirse como clon y 63 células


presentaron complemento cromosómico normal 46,XX. El pronóstico para este

paciente con cariotipo normal en cultivos de 24 y 48 horas propuesto por Foran,

et al., 2010 es INTERMEDIO.


encontraron pérdidas adicionales a la ya antes mencionada en cultivos directos

de los cromosomas 2, 7, 11 (7,7% cada uno) y 13, 18, 21 (15,4% cada uno) estas

pérdidas no se definieron como clones.

Gráfica 4-17 Fotos cariotipos 826210. Mos 45,X,-X[4]/46,XX[63]. LUCIA 2.8

KARYO

46,XX

45,X,-X

72 HORAS

Gráfica 4-16 Paciente 826210

Resultados 122

4.1.2.1.4 CP 212580

Clínica

Paciente del género masculino con 70 años de edad diagnosticado por citometría

de flujo con Leucemia Mieloide Aguda el 21/04/2014, subclasificación M5b, el


de leucocitos, 3780 cel/µl de linfocitos, 2980 cel/µl de neutrófilos (leucocitosis

marcada), porcentaje de blastos en médula ósea del 70% y la concentración de

hemoglobina de 10 g/dL (anemia ligera). Inicia el primer ciclo del tratamiento con

Citarabina el 23/04/2014, no logra remisión y la última fecha de contacto fue el


Citogenética

Paciente con complemento cromosómico masculino normal en cultivos de 24 y

48 horas sin estimulo 46,XY en 5 células. En el cultivo de 72 horas con estimulo

se observó un complemento cromosómico masculino normal 46,XY en 61 células

(Gráfica 4-18), se evidencio en todas las células analizadas la inversión o el

heteromorfismo del cromosoma 9 en las regiones p12 y 13. El número de pérdidas

totales de este paciente fueron 7 (100%) en los cromosomas 18, 19 y 20 (28,6%

cada uno) estas pérdidas no fueron definidas como clones. El pronóstico para

este paciente con cariotipo normal propuesto por la European LeukemiaNet (ELN)

y Foran, et al., 2010 es INTERMEDIO.


Gráfica 4-18 Fotos cariotipos 212580. 46,XY. LUCIA 2.8 KARYO

4.1.2.1.5 CP 099690

Clínica





marcada y neutropenia absoluta), porcentaje de blastos en médula ósea del 79%

y la concentración de hemoglobina de 8,1 g/dL (anemia moderada). Inicia el

primer ciclo del tratamiento con esquema 7+3 el 05/05/2014, no logra remisión y

la última fecha de contacto fue el 26/05/2014 el estado vital para la fecha era

muerto.

Resultados 124

Citogenética

Paciente con complemento cromosómico femenino anormal en cultivos de 24 y

48 horas sin estimulo, presento cariotipo 46,XX,del(11)(q21q23)[1]/46,XX,idem,

inv(3)(p26q22)[2]/46,XX[24] (Gráfica 4-20), se evidencian 3 líneas clonales la

primera en 1 célula y que presento una deleción parcial del cromosoma 11 en las

regiones q21 y q23, en la segunda línea se presentó 2 células con la misma

deleción junto a la inversión en el cromosoma 3 entre las regiones p26 y q22 y

una tercera línea presento cariotipo normal 46,XX en 24 células (Gráfica 4-19).

En el cultivo de 72 horas con estimulo un complemento cromosómico femenino

normal se observó en 37 células 46,XX.

46,XX

46,XX,del(11)(q21q23)

46,XX,ídem,inv(3)(p26q22)

Gráfica 4-19. Evolución Clonal Paciente 099690


El número de pérdidas totales de este paciente fueron 10 (100%) de los

cromosomas 11 (27,3%) y X, 10, 19 y 21 (18,2% cada uno) este último grupo no

se definieron como clones. El pronóstico para este paciente según propuesto por

la clasificación de riesgo European LeukemiaNet (ELN) es ADVERSO con una

mediana de supervivencia 12.2 meses (Mrózek et al., 2012), mientras que

Grimwade, et al., 2010 lo clasifica como de riesgo INTERMEDIO esta relación se

realizó con base en la pérdida del brazo largo del cromosoma 11 ya que no se

encontró reporte para la inversión acá presentada entre brazo corto y largo del

cromosoma 3, más sin embargo el mismo grupo de clasificación tiene un ítem

donde integran “algún otro clon independiente”.

Gráfica 4-20 Fotos cariotipos 099690.

46,XX,del(11)(q21q23)[1]/46,XX,idem,inv(3)(p26q22)[2]. LUCIA 2.8 KARYO

Resultados 126

4.1.2.1.6 CP 466066

Clínica





marcada, linfocitosis absoluta y neutrofilia absoluta), porcentaje de blastos en

médula ósea del 16% y la concentración de hemoglobina de 7,5 g/dL (anemia

marcada). Inicia el primer ciclo del tratamiento con esquema 7+3 el 19/07/2014,

el 11/08/2014 se realizó una valoración a la respuesta del tratamiento y para la

fecha no tenía blastos en médula ósea por lo cual logra remisión y el estado vital

era vivo.

Citogenética


horas sin estimulo, presento cariotipo 46,XX[20]. En el cultivo de 72 horas con

estimulo un complemento cromosómico femenino normal se observó en 80

células 46,XX (Gráfica 4-21). Las pérdidas totales de este paciente fueron 5

(100%) de los cromosomas 11 y 21 con el 40% cada uno sobre el total de las

pérdidas es de resaltar que no se definieron como clones. El pronóstico para este

paciente según propuesto por Foran, et al., 2010 para cariotipos normales es

INTERMEDIO.


Gráfica 4-21 Fotos cariotipos 466066. 46,XX. LUCIA 2.8 KARYO

Resultados 128

Tabla 4-5 Consolidado Citogenética Convencional

Nota: E.P: Enfermedad Primaria

CODIGOPACIENTE

E.P CARIOTIPO COVENCIONAL DE 24 y 48HORAS

CARIOTIPOCONVENCIONAL 72HORAS

CARIOTIPO

607410 LMA 46,XY,del(11)(q21q23)[6] 46,XY[94] 46,XY,del(11)(q21q23)[6]/46,XY[94]498620 SMD N/M No Índice Mitótico N/M No Índice Mitótico N/M No Índice Mitótico323008 SMD 45,X,-X[5]/45,XX,-21[2]/44,X,-X,-21[2] 46,XX[91] 45,X,-X[5]/45,XX,-21[2]/44,X,-X,-21[2]/46,XX[91]746799 LMA 46,XX[5] 46,XX[93] 46,XX[98]826210 LMA 46,XX[37] mos 45,X,-X[4]/46,XX[59] mos 45,X,-X[4]/46,XX[96]640124 SMD 46,XY,i(17)(q10)[1]/46,XY,idem,t(4;9)(p15;p

23)[2]/46,XY[18]46,XY[79] 46,XY,i(17)(q10)[1]/46,XY,idem,t(4;9)(p15;p23)[2]/

46,XY[97]656335 SMD N/M No Índice Mitótico N/M No Índice Mitótico N/M No Índice Mitótico212580 LMA 46,XY[5] 46,XY [61] 46,XY[66]191286 SMD 46,XY,inv(7)(p21p15)[4]/46,XY[20] 46,XY[29] 46,XY,inv(7)(p21p15)[4]/46,XY[49]099690 LMA 46,XX,del(11)(q21q23)[1]/46,XX,idem,

inv(3)(p26q22)[2]46,XX[37] 46,XX,del(11)(q21q23)[1]/46,XX,idem,

inv(3)(p26q22)[2]/46,XY[61]466066 LMA 46,XX[20] 46,XX[80] 46,XX[100]

Resultados 129

4.1.3 Caracterización de Supervivencia

La caracterización de supervivencia realizada a través de un modelo de riesgos

permitió identificar en el caso de los pacientes con SMD que el intervalo de días

dado por la supervivencia desde la fecha de diagnóstico hasta la última fecha de

contacto fue de 15 a 62 días y que la presencia de pérdidas y ganancias totales y

parciales de cromosomas generan un riesgo en los pacientes con relación a los días

de supervivencia y el estado vital. De igual manera para los pacientes con LMA las

pérdidas totales y parciales fueron consideradas como riesgosas y el intervalo de

días fue 16 a 58, indicando mayor riesgo de muerte para los pacientes de este

estudio con LMA.

4.1.4 Análisis de Regresión Logística

Este análisis se realizó solo a pacientes con LMA ya que en este grupo fue mayor la

proporción que alcanzaron la remisión completa y esto cuando se aplicó el esquema

7+3 en comparación con los que se les recibieron tratamiento con Citarabina.


Tabla 4-6: En las siguientes matrices se relacionan las fechas de diagnóstico, de inicio de tratamiento y de último contacto, junto a la relación en días delas mismas, estado vital a las cuatro semanas, Clasificación de Moorman anormalidades cromosómicas y tratamiento.

Matriz de Datos SMD

Matriz de Datos LMA

CP: Código del Paciente; EP: Enfermedad Primaria; FDX: Fecha Diagnóstico; DS: Días Supervivencia; FIT: Fecha Inicio Tratamiento; UC: Ultimo Contacto; DST: Días Supervivencia Tratamiento; EV: Estado Vital (V: vivo, M: muerto);RC: Remisión completa (0: No; 1: Si); Mono: Monosomías; Triso: Trisomías; Trans: Translocaciones; Inv: Inversiones; Iso: Isocromosoma; Pol: Poliploidia; Nul: Nulisomia; Inducción 7x3; Citarabina; Decitabine; Azacitidine; Otros (0:No; 1: Si)

CP EP FDX DS FIT UC DST EV RC Mono Triso Trans Inv Iso Pol Nul Inducción7x3

Citarabina Deitabine Azacitidine Otros

498620 SMD 28/11/2013 5 NA 03/12/2013 NA M 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

323008 SMD 26/12/2013 62 23/01/2014 26/02/2014 34 V 0 14 2 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0

640124 SMD 11/06/2014 39 27/06/2014 20/07/2014 23 V 0 14 1 2 0 3 1 2 0 0 0 1 0

656335 SMD 14/03/2014 23 26/03/2014 06/04/2014 11 M 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0

191286 SMD 07/07/2014 15 08/07/2014 22/07/2014 14 V 0 5 3 1 4 0 0 2 0 0 0 1 0

CP EP FDX DS FIT UC DST EV RC Mono Triso Trans Inv Iso Pol Nul Inducción7x3

Citarabina Deitabine Azacitidine Otros

607410 LMA 27/11/2013 58 04/12/2013 24/01/2014 51 M 0 21 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0

746799 LMA 07/02/2014 29 08/02/2014 08/03/2014 28 V 1 6 0 0 0 0 2 0 1 0 0 0 0

826210 LMA 25/02/2014 28 27/02/2014 25/03/2014 26 V 0 13 1 0 0 0 1 4 1 0 0 0 0

212580 LMA 21/04/2014 16 23/04/2014 07/05/2014 14 V 0 7 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0

099690 LMA 25/04/2014 31 05/05/2014 26/05/2014 21 M 0 10 0 1 3 0 1 3 1 0 0 0 0

466066 LMA 16/07/2014 26 19/07/2014 11/08/2014 23 V 1 5 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0

Resultados 132

4.2. Hibridación In Situ Fluorescente

Once (11) pacientes fueron evaluados con las sondas AML1/ETO

(RUNX1/RUNX1T1) Translocation, Dual Fusion y CBFß/MYH11 Translocation, Dual

Fusion (Cytocell). A nueve (9) pacientes se les realizo análisis por FISH en 10

metafases y 100 interfases y a dos pacientes con cultivos negativos para metafases

se les realizó el análisis en 100 interfases. Los resultados obtenidos para los once

(11) pacientes fueron negativos para estas dos sondas que son consideradas como

los rearreglos frecuentes (Tabla 4-6).

Tabla 4-7. Resultados sondas FISH AML1/ETO y CBFß/MYH11

CODIGOPACIETE

ENFERMEDADPRIMARIA

FISHt(8;21)

AML1/ETO

FISH t(16;16)CBFß/MYH11

607410 LMA N N498620 SMD N N323008 SMD N N746799 LMA N N826210 LMA N N640124 SMD N N656335 SMD N N212580 LMA N N191286 SMD N N099690 LMA N N466066 LMA N N


4.2.1 Caracterización FISH Pacientes SMD

Sonda AML1/ETO

Gráfica 4 - 22 Fotos núcleos y metafases sonda AML1/ETO. LUCIA 2.85 FISH

AML1 Cromosoma 21 señal roja; ETO Cromosoma 8 señal verde

Sonda CBFß/MYH11

Gráfica 4 - 23 Fotos núcleos y metafases sonda CBFß/MYH1. LUCIA 2.85 FISH

CBFβ Cromosoma 16 señal roja; MYH11 Cromosoma 16 señal verde

Resultados 134

4.2.2 Caracterización FISH Pacientes LMA

Sonda AML1/ETO

Gráfica 4 - 24 Fotos núcleos y metafases AML1/ETO. LUCIA 2.85 FISH

AML1 Cromosoma 21 señal roja; ETO Cromosoma 8 señal verde

Sonda CBFß/MYH11

Gráfica 4 - 25 Fotos núcleos y metafases sonda CBFß/MYH1. LUCIA 2.85 FISH

CBFβ Cromosoma 16 señal roja; MYH11 Cromosoma 16 señal verde


4.3 Hibridación Genómica Comparada(CGH)

4.3.1 Extracción ADN

La obtención de ADN se realizó con el método de extracción con cloroformo en

muestras de sangre periférica y médula ósea, las concentraciones de ADN con este

método fueron entre 50 y 5000 ng/µl dependiendo del estado de la muestra del

paciente. Cabe resaltar que esta cantidad de ADN es la óptima para tener buenos

resultados y que se ha determinado por diferentes protocolos. La pureza es también

un factor crítico que hace referencia a la relación de absorbancia entre 260nm y

280nm, ya que permitió asegurar que no se estuviera marcando proteínas o ARN;

por lo tanto para poder procesar las muestras, estas debían estar en un rango de

1.8 a 2.0 de pureza. Las muestras de ADN se congelaron a -20°C.

Tabla 4-8. Cuantificación ADN

PACIENTE T.MUESTRA CONCENTRACIÓN A230 A260 A280 A320 A260/A280 A260/A230

CTR 1 SP 1305,00 12,1 26,24 14,93 0.126 1,76 2,10

CTR 2 SP 153,00 3,71 3,73 2,49 0,67 1,68 1,00

CTR 3 SP 864,30 8,02 17,61 9.91 0,32 1,80 2,24

CTR 4 SP 623,00 5,79 12,87 7,34 0,41 1,79 2,31

CTR 5 SP 364,50 3,39 7,26 3,98 -0,03 1,81 2,13

CTR 6 SP 161,00 3,17 3,45 2,03 0,23 1,78 1,09

CTR 7 SP 176,00 1,81 3,48 1,91 -0,03 1,80 1,90

CTR 8 SP 628,00 5,98 12,98 7,39 0,42 1,80 2,25

CTR 9 SP 699,50 6,58 13,86 8,14 0,86 1,78 2,27

CTR 10 SP 615,00 5,68 12,60 7,30 0,39 1,76 2,29

607410 SP 537,50 5,33 11,72 6,92 0,97 1,80 2,46

498620 SP 59,00 1,82 2,08 1,54 0,90 1,84 1,28

498620 M 6,90 0,33 0,23 0,17 0,09 1,87 0,58

323008 M 528,50 5,14 11,23 6,55 0,66 1,79 2,35

323008 SP 246,50 1,81 3,48 1,91 -0,03 1,80 1,90

746799 SP 808,00 6,85 16,11 8,84 -0,04 1,81 2,34

Resultados 136

4.3.2 Digestión con Enzima DpnII

Con esta enzima se obtuvieron fragmentos de ADN entre 100 a 2000 pb que

permitieron la realización de la sonda de pacientes y controles.

Gráfica 4-26.

M.Marcador 100-1000 pb; 1.1-1.2.Digestión DpnII Control 1; 2.1-2.2. Digestión DpnII Control 2; 3.1-3.2.Digestión DpnII Control 3; 4.1-4.2. Digestión DpnII Control 4; 5.1-5.2. Digestión DpnII Control 5; 6.1-6.2. Digestión DpnII Paciente 607410; 7.1-7.2. Digestión DpnII Paciente 323008; M.Marcador 100-1000pb; 8.1-8.2. Digestión DpnII Paciente 498620; 9.1-9.2 Digestión DpnII Paciente 746799; 10.1-10.2Digestión DpnII Paciente 746799; 11.1-11.2 Digestión DpnII Paciente 826210; 12.1-12.2 DigestiónDpnII Paciente 640124; 13.1-13.2 Digestión DpnII Paciente 212580; 14.1-14.2 Digestión DpnII Paciente099690.

826210 SP 1565,00 14,41 31,65 18,45 0,35 1,72 2,26

826210 M 757,00 6,55 15,18 8,41 0,04 1,80 2,32

640124 SP 1508,00 18,44 31,18 21,79 1,01 1,45 1,73

656335 M 6,30 0,26 0,17 0,14 0,04 1,31 0,58

212580 M 3666,00 33,82 73,70 42,06 0,38 1,75 2,10

099690 SP 5109,00 62,00 102,24 72,34 0,05 1,07 1,42

099690 M 3345,00 2,86 6,50 3,57 0,19 1,80 2,25

191286 M 930,0 3,4 7,3 4,0 0,0 1,8 2,1

191286 SP 750,0 8,0 17,6 9.91 0,3 1,8 2,2

466066 SP 1000,0 3,4 7,3 4,0 0,0 1,8 2,1

466066 M 830,0 5,7 12,6 7,3 0,4 1,8 2,3

Gráfica 4 - 26 Foto digestión enzima DpnII 100-2000 pb

M 1.1 1.2 2.1 2.2 3.1 3.2 4.1 4.24 5.1 5.2

466.1 6.2 7.1 7.2

M 8.1 8.2 9.1 9.2 10.1 10.2 11.1 11.2 12.1 12.2 13.1 13.2 14.1 14.2


Los fragmentos de ADN de pacientes (Verde) y ADN de referencias (Rojo) fueron

purificados y marcados directamente (PlatinumBrightTM Nucleic Acid Labeling Kit -

Kreatech). La sonda y la lámina blanco se desnaturalizaron por separado según

anexo 10 después de las 92 horas se visualizó de la siguiente manera (Gráfica 4-

27).

Gráfica 4-27 Hibridación Genómica Comparada. LUCIA 2.85 CGH

A.Visualización con DAPI (Contraste). B. Visualización con verde (495 nm). C. Visualización con rojo(547 nm). D. Superposición de los tres paneles A, B y C.

Este procedimiento se realizó para obtener la base de datos de controles (5

femeninos y 5 cinco masculinos) con el fin de determinar los perfiles de relación de

las intensidades de fluorescencias junto a un análisis estadístico de los mismos que

permitió obtener la normalización de los perfiles característicos de cada cromosoma

Resultados 138

y a su vez la estandarización de los umbrales del software ya sean fijos (CGH) o

móviles (HR-CGH).Para umbrales o intervalos fijos el número de controles

evaluados fue suficiente para obtener normalidad en los perfiles y la posterior

detección de pérdidas y ganancias. No fue posible la normalización de los intervalos

dinámicos, debido a que el software LUCIA-CGH 2.85 no permitió el ingreso de más

de 15 controles (10 controles realizados por el laboratorio y 5 que venían incluidos

en el software).

Gráfica 4-28 CGH intervalos fijos –X. LUCIA 2.85 CGH


Gráfica 4-29 HR-CGH umbrales móviles LUCIA 2.85 CGH: Se observa pérdida

parcial del cromosoma X

Como ya se había mencionado la caracterización de pérdidas y ganancias se realizó

en 10 controles (Tabla 4-8) evaluando 10 metafases (fotos) para cada uno de ellos,

uno (1) de género femenino presento pérdida parcial del cromosoma sexual X.

Resultados 140

Tabla 4-9. Controles CGH. LUCIA 2.85 CGH

Control CGH HR-CGH1 rev ish XX rev ish XX2 rev ish XX rev ish XX3 rev ish XX rev ish XX4 ish cgh dim (X)(q21q25) ish cgh dim (X)(q21q25)5 rev ish XX rev ish XX6 rev ish XY rev ish XY7 rev ish XY rev ish XY8 rev ish XY rev ish XY9 rev ish XY rev ish XY10 rev ish XY rev ish XY

Posteriormente a la normalización de los perfiles por el software se procesaron las

muestras de los 11 pacientes siguiendo el mismo protocolo de los controles,

obteniendo resultados negativos para la hibridación de las sondas.

Discusión 141

5. Discusión

Este estudio proporciona la oportunidad de generar un espacio en la investigación

en cuanto a la identificación anormalidades cromosómicas en pacientes que

conforman una enfermedad que es considera la novena causas de muerte en

población colombiana (http://globocan.iarc.fr/Pages/fact_sheets_population.aspx).

En el país la información apropiada y completa sobre el comportamiento clínico y

epidemiológico de estas enfermedades es escaso, lo que dificulta la identificación

de los grupos, perfiles de riesgo, así como el diagnóstico temprano y el tratamiento

oportuno que repercute directamente en el pronóstico de los pacientes, por esto nace

la necesidad de dar un primer paso en el campo y si bien es cierto que en los últimos

años se han realizado esfuerzos para mejorar el panorama de leucemias agudas en

el país implementando programas como el PILAC (Programa de investigación e

innovación en Leucemia Aguda y Crónica) donde su principal objetivo es desarrollar,

mejorar e implementar estrategias de vigilancia, diagnóstico, tratamiento y

evaluación del pronóstico aún faltan políticas, investigaciones y recursos que

permitan fortalecer estos factores.

En este estudio se presentaron las características clínicas y citogenéticas

(convencional y molecular) de un grupo de pacientes con Síndrome mielodisplásico

(SMD) y Leucemia mieloide Aguda (LMA), es importante resaltar que los datos

citogenéticos en el 81.8% de los pacientes fueron exitosos y en el 18.2% fallaron

como resultado de las condiciones clínicas propias de los pacientes (leucopenia

marcada, linfopenia absoluta, neutropenia absoluta y anemia).


Queda claro que estas enfermedades son grupos heterogéneos y que cada una

tiene sus características clínicas, morfológicas, fenotípicas y citogenéticas. Las

anomalías cromosómicas y los reordenamientos moleculares resultantes pueden

proporcionar información sobre la patogenia de cada enfermedad en cada paciente.

En el presente estudio el rango de edad al diagnóstico en pacientes con SMD fue 24

a 64 con una media de 48 años, otros estudios reportan una edad media de 65-70

años (Schlegelberger, Göhring, Thol, & Heuser, 2012) para los pacientes con LMA

incluidos el intervalo fue de 32 a 70 con una media de 48,2 años, otros estudios

reportan esta enfermedad en pacientes de más de 70 años (Morrissette & Bagg,

2011). Lo que indicaría que en el grupo de pacientes de este estudio el diagnóstico

de la enfermedad fue más temprano comparando con lo reportado en la mayoría de

la literatura.

En cuanto la información clínica de los pacientes con SMD cuatro (4) presentan

leucopenia, tres (3) linfopenia, cuatro (4) neutropenia y todos (5) presentaron

anemia. Para LMA cinco (5) presentaron leucocitosis, tres (3) presentan neutropenia,

uno (1) neutrofilia y todos (6) anemia, lo que concuerda con las características

clínicas de cada enfermedad previamente reportado (Jaffe & Harris, 2011; Schmaier,

Alvin H., 2012).

En este proyecto las anormalidades cromosómicas fueron detectadas en el 60% de

los pacientes con SMD y que concuerda con lo mencionado por Tiu en el 2011, que

describió anormalidades en el cariotipo del 46-50% de los casos, contrastando con

el 14% que reporta Schanz en el 2012. En pacientes con LMA se evidenciaron

Discusión 143

anormalidades en el cariotipo en un 67%; Cheng en el 2009 y Dohner en el 2008

reporta que para adultos con LMA de Novo, aproximadamente el 56% de

anormalidades cromosómicas fueron detectadas.

El número de anormalidades presentes en el cariotipo juegan un papel importante

como indicador pronóstico de los pacientes, permitiendo clasificarlos en cariotipos

monosomales y cariotipos complejos (Chin, Noor, Ismail, Ahid, & Zakaria, 2013). En

nuestro estudio el número de anormalidades cromosómicas presentes en el cariotipo

de los pacientes con SMD fue de una (1), dos (2) o tres (3) y en pacientes con LMA

de una (1) o dos (2), así que no se presentaron cariotipos monosomales ni

complejos.

En SMD dos pacientes linfopenicos presentaron cultivos celulares sin índice mitótico,

los demás presentaron cultivos positivos, evidenciado pérdidas cromosómicas

frecuentes de X (21,21%), 21 (18,18%) y 17 (9,09%), en LMA las seis (6) muestras

cultivos presentaron índice mitotico, las pérdidas recurrentes fueron en cromosoma

11 (16,13%), 21 (11,29%) y X (11,29%).

La pérdida de los cromosomas sexuales (pérdida de Y en los hombres y X en las

mujeres) es un fenómeno relacionado con la edad avanzada según varios autores

pero también puede ser asociado con malignidades hematológicas, la pérdida del

cromosoma Y está contemplada dentro de los cambios citogenéticos y se ha

evaluado el pronóstico o la escala de riesgo del mismo en LMA, mas sin embargo,

no está claro si la anormalidad es un marcador para el clon leucémico (Bakshi, 2004).

En dos (2) de nuestros pacientes de género masculino (1 SMD y 1 LMA) se


identificaron células con la única pérdida del cromosoma Y (640124 y 607410); esta

pérdida se reporta como característica de pacientes con LMA-M2 siendo el caso

para el paciente 607410.

Ahora bien, presentar la pérdida del cromosoma X en mujeres es una rara

anormalidad en SMD y LMA y se ha descrito que ocurre como una sola anormalidad

en el 0.2 - 0.3% de pacientes con estas malignidades hematológicas y en 1,5%

acompañada de otras alteraciones (Schanz et al., 2012). En la evaluación

citogenética inicial en grupos de pacientes jóvenes con LMA de novo se ha

comprobado que presentan cariotipo con monosomía del X y después del

tratamiento este clon desaparece (Abruzzese et al., 1997; Bakshi, 2004; Mohanty,

2004; Zeidana & Phatakb, 2008), por lo tanto, estos resultados sugieren que éstas

pérdidas pueden no ser un efecto de la edad y se apoya la hipótesis de que la pérdida

de cromosomas sexuales se debe a la evolución de un clon maligno que

acompañado de otras anormalidades hace pensar que éste puede ser la base para

dar origen a eventos neoplásicos, como en nuestro caso la paciente 323008.

Monosomías del cromosoma 21 presentes en 1, 2 o 3 células por paciente fueron

recurrentes en SMD (18,18%) (323008-640124) y LMA (11,29%) (826210-099690-

466066). Dicha monosomía es una anormalidad rara con frecuencia en SMD de

0,3% cuando se presenta sola, también puede ocurrir en combinación con más

alteraciones cromosómicas en una frecuencia de 0,5% (Bacher, Schanz, Braulke, &

Haase, 2015).Uno de los genes que se ve afectado por la pérdida o rearreglo del

mismo es el AML1 (RUNX1) que se cree, participa en el desarrollo de la

hematopoyesis normal (Hirai, 2002).

Discusión 145

El isocromosoma de 17 se presentó en el paciente 640124 con SMD; según reportes,

anormalidades en el cromosoma 17 se presentan en un 2% de pacientes con SMD

de novo, y tienen un pronóstico intermedio ya que esta anomalía citogenética es

producto de la rotura o división inadecuada de la región pericentromérica

conduciendo a la duplicación de brazo largo y a la pérdida del brazo corto del

cromosoma 17; así pues, la pérdida del gen supresor tumoral TP53 ubicado en ese

brazo, puede ocurrir sola o acompañada de otra anormalidad como en el caso de

este paciente que presento una t(4;9)(p15;p23) de la cual no aparece reporte en el

atlas Genetics Oncology ni artículos. Se ha reportado que en la región 4p15 se

encuentra el gen CD38 un receptor leucocitario con función inmunitaria y mediador

de apoptosis (Ferrero, Saccucci, & Malavasi, 1999) la mutación en el gen y por tanto

en la expresión del mismo, puede derivar en la enfermedad en estudio. En el locus

9p23 se encuentra un gen llamado JAK2 y sus mutaciones son tumorogénicas en

neoplasias mieloproliferativas, las translocaciones que implican los locus de JAK2

son de importancia oncogénica en leucemias agudas y síndromes

mielodisplásicos/mieloproliferativos (Hoeller, Walz, Reiter, Dirnhofer, & Tzankov,

2011), esta es una forma de caracterizar la translocación encontrada y brindar una

posible causa al fenotipo que presenta el paciente, por otro lado no existe reporte

alguno de la supervivencia relacionada con esta anormalidad pero si para el

i(17)(q10).

Se conoce que las deleciones dificultan la identificación de los genes que están

interviniendo en el proceso tumorigénico y que muy posiblemente pueden incluir

genes supresores tumorales (Fröhling, Scholl, Gilliland, & Levine, 2005). Las

pérdidas de información cromosómica se consideran raras en enfermedades


mieloides con una prevalencia reportada de 0.7% en LMA y SMD. La deleción del

cromosoma 11, es de gran importancia ya que permitió conocer la heterogeneidad

a nivel molecular de la región q23, allí se ubica un gen llamado MLL que

dependiendo de los puntos de ruptura, puede o no guardar su integridad o

presentarse en forma monoalélica lo que podría relacionarse con la iniciación o

progresión de malignidades mieloides (Ma et al., 2002); como es el caso de los

pacientes 607410 (46,XY,del(11)(q21q23)[6]) y 099690 (46,XX,del(11)(q21q23)[1]/

46,XX,idem, inv(3)(p26q22)[2]).

Las inversiones se caracterizan básicamente por presentar dos puntos de ruptura y

la región ubicada entre ellos realiza un giro de 180°, lo que genera un

reordenamiento de la información genética, cambios en la expresión de proteínas y

diferentes asociaciones génicas que puedan estar provocando la malignidad. Los

cromosomas implicados en estas anormalidades fueron el 7 y 3. La inversión del

cromosoma 7 y la inversión del cromosoma 3 se presentaron en el brazo corto y de

estas no se tienen reportes que indiquen características, genes implicados y factor

pronóstico de las mismas para SMD y LMA. Se conoce que el cromosoma 7 activa

oncogenes e inactiva genes supresores tumorales que juegan roles críticos en la

génesis y progresión de neoplasias (K. Döhner et al., 1998).

En cultivo de 72 horas estimulado con fitohemaglutinina, una paciente presento

alteraciones cromosómicas (monosomías), este resultado se considera extraño ya

que la fitohemaglutinina es un mitógeno que reconoce línea celular linfoide

específicamente linfocitos T, que se esperaría, no verse afectada tratándose de

enfermedades de línea mieloides; por tal motivo se realizó la revisión por segunda

Discusión 147

vez del caso pensando que podría ser constitutivo del paciente; se logró identificar

que la muestra recibida era de sangre periférica con un porcentaje promedio de

blastos del 70%, esta podría estar explicando en parte la presencia de células -X en

estos cultivos. Cabe resaltar que la única diferencia entre los cultivos directos e

indirectos es el agregar el mitógeno, de resto todas las demás condiciones son las

mismas para inducir el crecimiento y proliferación celular, lo que pudo haber

generado un ambiente propicio para mantener las células blasticas, mas sin

embargo también se sugiere que la perdida pueda estar relacionada con la edad

propia del paciente.

Las Ganancias cromosómicas se presentaron en menor proporción en LMA en

comparación con SMD donde se observó ganancias frecuentes del cromosoma 8

que concuerda con lo reportado por la literatura para estos pacientes, pero estas

ganancias no fueron significativas para el paciente como tal ya que no se

consideraron clones por su presencia en una o dos células, más sin embargo al

realizar el análisis en todos los pacientes esta resultaba ser la más frecuente.

Si bien es cierto los resultados para las dos sondas de FISH evaluadas t(8;21) y

t(16;16) fueron negativos para los 11 pacientes, es importante mencionar que para

el paciente (323008) se presentaron seis (6) interfases con una única señal roja

indicando la posible pérdida del gen AML1 ubicado en cromosomas 21, cabe resaltar

que la pérdida del gen no está directamente relacionado con la pérdida total del

cromosoma 21 para así asociarlo con los resultados obtenidos por citogenética

convencional, también podría sugerirse una aberración más compleja (translocación


criptica) o considerando el número de interfases con la presencia de la anormalidad

a la sobreposición como tal de la señal.

Para la técnica de CGH es de resaltar que los controles se realizaron con el protocolo

mencionado en el capítulo 3 pero al momento de procesar los pacientes con

SMD/LMA se presentaron dificultades como:

La reconstitución de citoplasma en las láminas blanco lo que pudo haber

interferido en la desnaturalización de la lámina y por tanto la hibridación de

la sonda. Ante esta situación se decidió realizar nuevos cultivos de linfocitos

de controles de láminas blanco y trabajar con botón o pellet fresco agregando

lavados con fijador carnoy (1:1). Según (Karhu et al., 1997) la preparación de

las láminas blanco influye dramáticamente en la hibridación y

consecuentemente en el análisis de CGH.

Gráfica 5-1. Interferencia Citoplasma con metafase/sonda

Identificando que el posible problema de la no hibridación era el citoplasma

se decide controlar dentro de lo posible los niveles de temperatura y

Discusión 149

humedad con calentadores y deshumidificadores; por otro lado se

implementó un método de digestión enzimática con pepsina para mejorar la

calidad de las láminas blanco y se procede a desnaturalizar de la manera ya

mencionada sin obtener resultados positivos de hibridación. Según Karhur

(1998) las condiciones ambientales resultan ser críticas y difíciles de

mantener.

Al trabajar con botones frescos el proceso de desnaturalización de la lámina

blanco se complica, ya que el tratamiento con formamida al 70% a 50°C

empleado previamente generó una sobre-desnaturalización sobre los

cromosomas blanco lo que se vio reflejado en la hibridación de la sonda pero

en los bordes del cromosoma (scaffold) ya que no tenían en si la estructura

cromosómica.

Gráfica 5-2. Sobredesnaturalización metafase blanco

Se procede a aumentar la temperatura de incubación de 37°C a 42°C por 92

horas, lo que posiblemente acrecentó la hibridación inespecífica obteniendo


como resultado la hibridación a lo largo de los cromosomas de manera no

homogénea (moteada) y no apta para el análisis con el software.

Gráfica 5.3. Aumento de temperatura en incubación

Se buscó dar solución al problema de la desnaturalización de la lámina

blanco implementando otro método basado en la desnaturalización con

NaOH mejorando los resultados de hibridación pero sin ser óptima para los

respectivos análisis.

Gráfica 5.4. Desnaturalización con NaOH

Discusión 151

Los post lavados se modificaron para no hacerlos tan astringentes sin

obtener resultados uniformes en la hibridación y aumentando en el

background (exceso de la sonda no hibridada) condiciones no óptimas para

el análisis.

Gráfica 5.5. Modificación post lavados

Cabe mencionar que también se modificó la realización de las sondas

marcadas directamente al aumentar el tiempo y la temperatura de

desnaturalización de la misma, efectuando un pre-annealing a 37°C por 1

hora antes de colocar la sonda en la lámina blanco, diluyendo los ADNs en

menor cantidad de solución de hibridación para así aumentar la

concentración, pero estas modificaciones no permitieron obtener resultados

positivos para la hibridación de manera uniforme y óptima para el análisis por

el software como si se tuvieron en los controles.

Se hace importante señalar que este método no es utilizado de manera rutinaria en

el diagnóstico clínico debido a lo dispendiosa y a los inconvenientes de la técnica


per se (Lichter& Bentz, 2000), tal vez esto pueda ser la causa de su aplicación solo

en investigación o casos especiales y posiblemente del desuso de la técnica en

países desarrollados, ya que se realizó contacto con diferentes universidades y

hospitales internacionales con el fin de buscar asesoría al respecto y muchos de

ellos informaron que la técnica ya no se estaba realizando por las mismas causas

mencionadas anteriormente, pero sin embargo se realizaron sugerencias con el fin

de dar solución a los inconvenientes antes mencionados. (Laboratoř molekulár ní

cytogenetiky, OLG FN Brno – Republica Checa; Laboratory Imaging, LUCIA -

Republica Checa; Grupo de Biología Celular, UAB – Barcelona; Grupo de Biología

Evolutiva, UBA - Buenos Aires).

Estos resultados permiten sugerir la implementación nuevas técnicas de análisis

como CGH array que sin necesidad de depender de metafases fortalecería el

diagnóstico, pronóstico, posible tratamiento y evolución de los pacientes con

enfermedades tan complejas como el cáncer. De igual manera resaltar la necesidad

de implementar guías internacionales en citogenética que permitan generar

estándares o unificar criterios entre los laboratorios que prestan estos servicios

sobre el manejo de la muestra y el análisis de la misma.

La supervivencia y tasa de remisión de los pacientes participantes en este estudio

fue relativamente bajo ya que 4 pacientes fallecieron (2 (40%) SMD y 2 (33,3%)

LMA) sin alcanzar a cumplir las 4 semanas de terapia de inducción y de observación.

Lo que revela problemas en elección del tratamiento para estos pacientes, que esta

se hace muchas veces por análisis citogenético clásico y molecular, lo que

Discusión 153

posiblemente se relacione con fallas en el desarrollo y análisis de las técnicas que

permita identificar marcadores cromosómicos para cada una de las enfermedades.

La baja tasa de remisión (2 LMA) de los pacientes permite confirmar la problemática

en la elección del tratamiento. Una de estas remisiones se presentó en un paciente

con cariotipo normal y que para la clasificación de riesgo ELN es intermedio. Es

entendible que en el país se dificulte realizar investigaciones en este campo por

factores como la financiación, la tecnología y demás limitantes, pero también es

importante resaltar que la mayoría de estos pacientes no superan la terapia de

inducción, que es muy probable que se desencadene en pérdidas fatales y que las

manifestaciones de la enfermedad se están dando tempranamente a diferencia de

otras regiones del mundo.

Conclusiones y Recomendaciones 154

6. Conclusiones y Recomendaciones Se identificaron anormalidades cromosómicas recurrentes en el 82% de los

pacientes con SMD y LMA lo que permitió analizar la evolución clonal en

cultivos directos (24 y 48 horas), La presencia de alteraciones cromosómicas

tuvieron mayor frecuencia en pacientes con LMA lo que se relaciona con la

progresión tumorogénica y el daño genómico que se pueda estar

presentando.

Monosomías frecuentes –X y -21 se encontraron presentes en este estudio

tanto para SMD como para LMA, indicando asociación entre enfermedades

y en el caso de SMD la evolución a LMA.

Las monosomías totales y parciales son las más recurrentes y riesgosas para

los paciente que conforman este estudio, lo que se evidencia con la

del(11)(q21q23) presente en dos pacientes y los cuales fallecieron antes de

terminar el ciclo de inducción, por lo que se ratifica el pronóstico ADVERSO

La identificación por citogenética convencional de (una) translocación y dos

(2) inversiones que no se habían reportado previamente, permiten proponer

posibles genes candidatos que expliquen el desenlace leucemogénico.


La descripción de estos hallazgos podrían llevar al desarrollo de nuevas

estrategias terapéuticas que beneficien la supervivencia de los pacientes con

SMD y LMA.

Aumentar el número de muestras que permitan caracterizar la población

colombiana para estas enfermedades y dar respuesta a la posible función

tumorogénica de los cromosomas sexuales.

Dar a conocer la importancia que tiene el realizar un análisis citogenético

integral, cumpliendo normativas internacionales como la European gen Test

(Hastings, Howell, Bricarelli, Kristoffersson, & Cavani, 2012). Esto debido a

que a nivel nacional no se cuentan con las guías que garanticen el buen

desarrollo tanto de la técnica como del análisis.

Resaltar la importancia de cada una de las técnicas desarrolladas en este

proyecto, ya que cada una brinda información que permite la caracterización

de los pacientes, por tanto no son técnicas que se reemplacen entre ella si

no por lo contrario son técnicas complementarias que permitirán refinar la

clasificación de los pacientes.

Como recomendación para la técnica de CGH se sugiere controlar las

condiciones ambientales del laboratorio.

Anexos 156

1.Anexos

Anexo 1. Consentimiento informado para participar enun estudio de investigación médica

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA- SEDEBOGOTÁ

INSTITUTO DE GENÉTICA

LABOTARIO DE CITOGENÉTICA

FECHA HORA CODIGO

Título del protocolo: ANÁLISIS CROMÓSOMICO POR MEDIO DE TÉCNICASCITOGENÉTICAS CLÁSICAS Y MOLECULARES EN UN GRUPO DEPACIENTES COLOMBIANOS CON LEUCEMIA MIELOIDE AGUDA

Investigador Principal: Julia Samanda Martínez RicoSede donde se realizará el estudio: Universidad Nacional de Colombia SedeBogotá – Instituto de GenéticaNombre del Paciente:

A usted se le está invitando a participar en este estudio de investigación médicatitulado ANÁLISIS CROMÓSOMICO POR MEDIO DE TÉCNICASCITOGENÉTICAS CLÁSICAS Y MOLECULARES EN UN GRUPO DE PACIENTESCOLOMBIANOS CON LEUCEMIA MIELOIDE AGUDA. Antes de decidir si participao no, debe conocer y comprender cada uno de los siguientes apartados.

Este proceso se conoce como consentimiento informado. Siéntase con absolutalibertad para preguntar sobre cualquier aspecto que le ayude a aclarar sus dudas alrespecto. Una vez que haya comprendido el estudio y si usted desea participar,entonces se le pedirá que firme esta forma de consentimiento, de la cual se leentregará una copia firmada y fechada.

Se le está invitando a participar en un estudio de investigación que tiene comoobjetivos Analizar cromosómicamente un grupo de pacientes colombianos conLeucemia Mieloide Aguda (LMA) por medio de técnicas citogenéticas clásicas ymoleculares para la detección de nuevas alteraciones a nivel cromosómico y asídelimitar nuevas regiones donde se puedan encontrar genes responsables de laaparición de esta enfermedad ofreciendo un soporte en el pronóstico y ladeterminación de la evolución de los pacientes con Leucemia Mieloide Aguda (LMA).


Como quiera que usted ha sido recientemente diagnosticado con LMA y aún no seha iniciado su tratamiento, si acepta participar, le solicitaremos que nos done unamuestra de 5 ml de sangre y si en el proceso su Médico Hematólogo decide para eldiagnóstico preciso de su condición, extraerle material de la médula ósea, lesolicitaremos adicionalmente a él, que nos facilite parte de ese material.

Queremos explicarle que la toma de muestra de sangre será llevada a cabo porpersonal capacitado de la Institución Hospitalaria en condiciones adecuadas dehigiene, lo cual hace que este procedimiento tenga un riesgo mínimo, sin ningunaconsecuencia en la mayoría de los casos. En cuanto a la biopsia de médula ósea,este es un procedimiento que realizará su Hematólogo tratante de acuerdo con losestrictos protocolos de la Institución Hospitalaria y solo se llevará a cabo si él loconsidera indicado como parte del proceso de diagnóstico y de seguimiento, enningún caso se tomará solo para propósitos de la presente investigación.

En cuanto al beneficio derivado de su participación, este, le ofrecerá un soporte enla determinación de la evolución y el pronóstico de su enfermedad a través de uncompleto estudio citogenético con técnicas clásicas y moleculares que permitandetectar las diferentes alteraciones cromosómicas presentes y será de utilidad a suHematólogo para observar el desarrollo de la enfermedad y la respuesta altratamiento.

Adicionalmente, el grupo de investigación se compromete a tomar las medidasnecesarias para preservar su privacidad y la confidencialidad de sus datospersonales y los de su historia clínica. Sin embargo, tal como lo hemosmencionado, los datos derivados del presente estudio serán enviados a su MédicoHematólogo por la utilidad que ellos representan en el manejo de su enfermedad yserán entregados a usted personalmente en caso de solicitarlos.

Igualmente le reiteramos que su participación es voluntaria y que si aceptaparticipar, en cualquier momento puede retirarse, sin que esto cambie el tratamientomédico o la buena disposición de su médico tratante

En ningún caso las pruebas realizadas tendrán costo para usted o su familia, puestoque este proyecto será presentado para su financiamiento a la División deinvestigación de la Universidad Nacional y de obtener los recursos, estos cubriránla totalidad de la investigación, siendo los resultados finales, propiedad de la mismaUniversidad Nacional.

En caso de cualquier duda sobre su participación en la investigación o los adelantosde los resultados puede contactarse directamente con la Doctora Marta Bueno o

Anexos 158

con la Doctora Samanda Martínez, investigadoras principales, en el Instituto deGenética de la Universidad Nacional en el teléfono 3165000 extensión 11631.

Una vez leída y comprendida esta información y resueltas mis dudas con losinvestigadores, acepto participar en la presenta investigación

CARTA DE CONSENTIMIENTO INFORMADOYo,______________________________________________he leído ycomprendido la información anterior y mis preguntas han sido respondidas demanera satisfactoria. He sido informado y entiendo que los datos obtenidos en elestudio pueden ser publicados o difundidos con fines científicos. Convengo enparticipar en este estudio de investigación con la toma de muestra de 5 ml desangre periférica o 2 ml de médula ósea según lo indique el médico tratante.Recibiré una copia firmada y fechada de esta forma de consentimiento.

Nombre del Paciente Firma del Testigo

C.C

Firma del Paciente / Representante Legal Firma del Testigo C.CC.C

Fecha


Anexo 2. Consentimiento informado INC

¿QUE SE ESTA BUSCANDO CON LA REALIZACION DE ESTE ESTUDIO?

El propósito de esta investigación en convenio con la Universidad Nacional deColombia es determinar mediante pruebas citogenéticas de laboratorio que secaracterizan por ser el estudio de los cromosomas y que contienen la informacióngenética, este estudio se realizará en las muestras tomadas de biopsia en médulaósea y de sangre que se realiza normalmente a todos los pacientes con leucemia;el fin del mismo es la detección de nuevas alteraciones a nivel cromosómico paraasí delimitar nuevas regiones donde se puedan encontrar genes responsables de laaparición de esta enfermedad y a su vez relacionarlos con la tasa de remisión a las4 semanas. Este proceso ofrecerá (1) la confirmación del diagnóstico, (2) lainformación útil para la clasificación, la estadificación y el pronóstico, (3) lainformación para guiar la elección apropiada de la terapia, y (4) la prueba de laremisión o la recaída en leucemias.

¿QUE CONDICIONES DEBO CUMPLIR PARA INGRESAR AL ESTUDIO?

Ser paciente hombre o mujer mayor de 18 años de edad y tener diagnósticopresuntivo de leucemia y que durante el procedimiento de aspirado y biopsia demédula ósea realizada para confirmar el diagnóstico de su enfermedad, se puedaobtener una muestra adicional para el análisis citogenético. Así mismo, es necesarioque se confirme el diagnóstico de leucemia mieloide aguda por un método especialllamado citometría de flujo.

¿QUE TIPO DE PROCEDIMIENTOS ME REALIZARAN?

Los pacientes con sospecha de leucemia aguda requieren para su diagnóstico, larealización del procedimiento conocido como aspirado y biopsia de médula ósea.Durante este procedimiento se toman muestran para realizar diferentes técnicasnecesarias para una adecuada clasificación de la enfermedad lo que permite planearun tratamiento

CONSENTIMIENTO INFORMADO

COMITÉ DE ETICA INDEPENDIENTE

VERSIÓN 1.0: INSTITUTO NACIONAL DECANCEROLOGIA

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA –SEDE BOGOTÁ

FECHA: 25 DE SEPTIEMBRE DE 2013PAGINA: 2/4

CONFIDENCIAL

Anexos 160

adecuado. Para los pacientes que voluntariamente acepten participar, se les tomarádurante el mismo procedimiento una muestra adicional consistente en dos tubos(Heparina EDTA) de tres centímetros cúbicos cada uno con sangre obtenida a partirde la médula ósea, este procedimiento será realizado por el médico hematólogo -investigador secundario del estudio (Dr. Leonardo Enciso) y no tendrá diferencias encuanto a la técnica con la que se realiza habitualmente para los pacientes con estaenfermedad, así mismo se tomarán dos tubo de cuatro centímetros cúbicos desangre periférica tomada por la enfermera a cargo para posteriormente sertransportadas a la Universidad Nacional de Colombia – Instituto de Genética –Laboratorio de Citogenética (6).

¿QUE BENEFICIO ESPERO RECIBIR POR PARTICIPAR EN ESTE ESTUDIO?

No recibirá ningún beneficio económico por su participación en este estudio deinvestigación. Al participar en el mismo, tendrá la posibilidad de colaborar con lainvestigación en esta área en pacientes colombianos. El conocimiento que se generede este tipo de investigaciones puede permitir a los médicos y otros científicosdesarrollar formas de diagnóstico, tratamiento y seguimiento más efectivas para estaenfermedad. Esto podrá beneficiar a otros pacientes con esta misma enfermedad ygenerar nuevo conocimiento sobre la misma. Si tiene alguna inquietud o preguntaconcerniente a sus derechos, por favor comunicarse con el investigador olaenfermera/coordinadora del estudio (datos adjuntos).

¿EN QUE CASO DE TENER ALGUN DAÑO POR PARTICIPAR EN ESTEESTUDIO QUE DEBO HACER?

Como no se realizarán procedimientos adicionales a los que usted requiere para eldiagnóstico de su enfermedad y únicamente se tomará una pequeña muestraadicional durante el primer procedimiento que se le realice, no se espera ningúndaño por la participación en este estudio. En caso de dudas preguntarle alinvestigador principal/secundario o a cualquiera de los miembros del equipo deinvestigación.




UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA – SEDEBOGOTÁ


CONFIDENCIAL


¿DE QUE MANERA SE PROTEGERA MI PRIVACIDAD?

Si usted decide participar en este estudio, el médico del estudio y el equipo deinvestigación utilizarán la información de su historia clínica y los resultados delaboratorio, para conocer la evolución de su enfermedad.

Las muestras que se tomen para los análisis requeridos para el estudio seránidentificadas con un número asignado completamente al azar de manera que no sepueda identificar quien es el dueño de cada muestra. Esta información será deconocimiento exclusive del investigador principal/secundario y de los miembros delequipo de investigación que el mismo designe. A sus muestras no se les realizaráningún procedimiento adicional al análisis citogenético como se ha explicado en esteconsentimiento.

Los datos que se obtengan serán registrados en un formulario que estará identificadocon el mismo número de sus muestras el cual será asignado completamente al azary en ningún caso se identificara por su nombre, número de cedula o de historiaclínica.

¿QUE ACEPTO AL FIRMAR ESTE DOCUMENTO?

• Que he leído y comprendido este formato de consentimiento• Que he tenido la oportunidad de formular preguntas y estas han sidocontestadas• Que entiendo que mi participación en este estudio es voluntaria• Que doy permiso para que se use y comparta la información sobre mí salud,tal como se describe en este formato• Que doy permiso para que se recoja una muestra adicional de mí médulaósea durante el mismo procedimiento de aspirado y biopsia de médula óseay una muestra adicional de sangre periférica necesarias para mi diagnósticoy para que se analicen cromosómicamente.• Puedo elegir no participar en el estudio o abandonarlo en cualquiermomento, comunicándoselo al médico del estudio. No perderé ningúnbeneficio.• Recibiré una copia firmada de este formato de consentimiento






CONFIDENCIAL

Anexos 162

NÚMERO DE ASIGNACIÓN EN ESTE ESTUDIO __________________________

SE DEBE DILIGENCIAR ESTE FORMATO EN EL ORDEN EN QUE APARECE

IMPORTANTELA FIRMA, FECHA Y HORA DE ESTA SECCIÓN DEL FORMATO DEBEN SER DILIGENCIADOS SOLO POR ELPACIENTE VOLUNTARIO/A QUE ACEPTE PARTICIPAR EN LA INVESTIGACIÓN

NOMBRES Y APELLIDOS

FIRMA

N° DE DOCUMENTO DE IDENTIFICACIÓN

FECHADD/MM/AAAA

HORA/MINUTOS

AM/PM

IMPORTANTELA FIRMA, FECHA Y HORA DE ESTA SECCIÓN DEL FORMATO DEBEN SER DILIGENCIADOS SOLO POR LOSTESTIGOS

TESTIGO 1

NOMBRES Y APELLIDOS

FIRMA


FECHADD/MM/AAAA

RELACIÓN CON PACIENTE

DIRECCIÓN

TESTIGO 2

NOMBRES Y APELLIDOS

FIRMA


FECHADD/MM/AAAA

RELACIÓN CON PACIENTE

DIRECCIÓN






CONFIDENCIAL


Anexo 3. Formatos

Anexos 164


Anexos 166


Anexo 4. Toma de Muestra de Médula Ósea.

Descripción del Procedimiento.

- Posicionamiento en decúbito lateral izquierdo o derecho

- Ubicación de los reparos anatómicos e identificación de la cresta iliaca

posterior superior. En casos excepcionales se realizara aspirado esternal

siendo imposible realizar biopsia en esta localización anatomía.

- Asepsia y antisepsia con técnicas estándar y colocación de campos estériles

- Aplicación de anestesia local que incluye piel, tejido celular subcutáneo y

periostio

- Punción con aguja de aspirado de médula ósea de acuerdo a técnicas

estándar y aspiración con jeringa de 20 cc

- Una vez realizadas las láminas para el laboratorio de morfología, se tomaran

las muestras para diagnóstico y para el estudio. Distribución de tubos.

Tubo 1 (EDTA): Laboratorio citometría de Flujo INC

Tubo 2 (EDTA): Laboratorio de Genética Molecular INC

Tubo 3 (Heparina): Laboratorio Citogenética INC

Tubo 4 (Heparina): Laboratorio Citogenética UNAL

Tubo 5 (EDTA): Laboratorio Citogenética UNAL

- Punción con aguja de biopsia de médula ósea realizando la misma técnica

estándar

- Verificación de hemostasia y colocación de vendaje compresivo

- Retiro de campos y tras lado del paciente a la habitación

Anexos 168

Anexo 5. Toma de Muestra Sangre Periférica.

Se realizó la toma de esta muestra por sistema de extracción con vacio, para el

mismo se necesitaron los siguientes materiales:

- Guantes

- Algodón

- Alcohol

- Torniquete

- Agujas

- Soporte Vacutainer

- Tubos Vacutainer con Heparina Sodica (Tapa Verde)

- Tubos Vacutainer con EDTA (Tapa Lila)

Procedimiento

Se seleccionó el lugar del cuerpo donde se realizó la punción para tomar la muestra,

sea en región venosa antecubital o región venosa superficial del dorso de la mano:

Golpear suavemente la vena (solo en caso de venas no prominentes)

Limpiar el área seleccionada para la extracción de la muestra con una torunda

impregnada de alcohol antiséptico, empezando desde el centro y extendiéndose en

forma circular hasta la periferia. Repetir el procedimiento las veces que sea

necesario para asegurar la asepsia de la zona.

Dejar secar el alcohol.


Provocar un extasis venoso con un torniquete, durante no más de un minuto

Venopunción: Enrroscar la aguja en el portatubos o soporte vacutainer y después

canalizarla en la vena del paciente, con la mano libre, introducir el tubo de vacío con

tapa verde (heparina) en portatubos (con el tapón del tubo hacia arriba), asegurarse

que la goma del tapón sea perforado completamente.

Extraer entre 1 a 5 ml de sangre.

Repetir el procedimiento con el tubo tapa lila (EDTA)

Retirar el torniquete tan pronto como la sangre empiece a fluir.

Extraer la aguja cuidadosamente y hacer presión fuerte con un algodón humedecido

con alcohol antiséptico en el lugar de punción.

Desechar la aguja empleada durante el procedimiento en el guardián

Mezclar suavemente la muestra por inversión para evitar su coagulación.

Rotular el tubo que contiene la muestra con el código asignado. Guardar la muestra

en el contenedor (triple embalaje) destinado para dicho propósito.

Transporte al Laboratorio 6 Universidad Nacional de Colombia según normativa para

el transporte de muestras biológicas (triple embalaje).

Las muestras serán procesadas el mismo día de la toma y en el caso que exista

algún cultivo negativo la muestra se guardara por un periodo de 4 días a una

temperatura de 4°C, en caso que se requiera un segundo cultivo.

Anexos 170

Anexo 6.Cultivo y Cosecha de CromosomasMetafásicos a partir de Sangre Periférica y Médula Ósea

Reactivos y Materiales.

- Incubadora de Co2

- Frascos de cultivo 25 cm2

- Falcon de 15 mL

- Pipetas Pasteur

- Pipetas de 5 y 10 mL

- Puntas de 100 ul

- Medio de Cultivo McCoy´s 5A (médula ósea) o RPMI 1640 (sangre periférica)

- Suero fetal bovino

- Fitohemaglutinina

- Penicilina

- Solución Hipotonica KCl 0.075M


Anexo 7. Bandas G

Reactivos y Materiales

- Colorante Wright

- Buffer Fosfato M/15 pH6,8

- Solución salina citratada 1X(1xSSC).

- Solución ácido clorhídrico HCl 0,025N.

- Agua destilada desionizada.

- Láminas porta objetos extendidas con la preparación cromosómica a tratar.

- Frasco ámbar.

- Probeta de 50ml.

- Pipeta de1mly10ml.

- Pipeta pasteur plástica.

- Jarras Coplin con capacidad de 10 láminas.

- Pinzas.

- Pera para secado.


Se realizó bandas G con colorante Wright, técnica basada en digestión enzimática

diferencial para visualización de las láminas predispuestas para citogenética

convencional. Según protocolos expuestos por (Sole y Woessner, 1992).

- Las láminas de 2 o 3 días de extendidas son llevadas al Horno100°C, durante3

horas.

Anexos 172

- Marcar tres Jarras Coplin con esparadrapo. La primera marcada como

“1xSSC”,la segunda (que debe ser de vidrio) como “HCl0,025N” y la tercera

como “agua destilada”

- Agregar en la jarra Coplin“HCl0,025N”,80ml de la solución. Llenos los

siguientes coplins con agua destilada desionizada fresca y“1xSSC”.

- Se precalentó lajarraCoplin“1xSSC” al horno ajustado a 45±1°C, por 30 minutos

antes de su uso para permitir que la solución alcance la temperatura deseada.

Manteniendo la jarra en el horno durante todo el proceso

- Una vez cumplido el tiempo de incubación de las láminas, se retiraron del horno

y permitir que enfríen completamente.

- Con pinzas, se sumergieron las láminas en la jarra Coplin “HCl 0,025N”, por 3

segundos.

- Se lavó inmediatamente con abundante agua corriente, posteriormente se

sumergieron las láminas en el agua contenida en la jarra coplin“agua destilada”.

- Se sacaron las láminas de la jarra y se secaron con pera de secado.

- Las láminas se llevaron al Horno45°C y sumergir las láminas en la

solución1XSSC contenida en la jarra marcada“1xSSC”. Dejar por 10 minutos.

- Se sacaron las láminas y lavaron con abundante agua corriente

- Se secaron con pera de secado.


- Las láminas se colocaronsobre un soporte para coloración y preparar la solución

colorante de Wright.

- Enfrasco ámbar se agregaron y mezclaron Buffer fosfato M/15 pH 6,8 y

colorante Wright previamente filtrado en proporción 3:1.

- Con Pipeta Pasteur, se tomó el colorante recién preparado y se cubrió las

láminas con la mezcla; dejar el colorante por 2 minutos.

- Lavado y Secado con pera de secado.

Anexos 174

Anexo 8. Hibridación in situ Fluorescente (FISH)

Gotear láminas a trabajar con un día de anticipación

DIA 1:


- Solución 2xSSC a temperatura ambiente

- Alcoholes al 70, 90 y 100%

- Plancha calentadora a 74°C

- Laminillas

- Pegante a base de caucho


- Se colocó la lámina del paciente en el Coplin con la solución de 2xSSC y se dejó

allí durante 2 minutos.

- Se quitó el exceso de solución de la lámina, sin secar, con ayuda de una gasa.

- Se sumergió la lámina en alcohol al 70%, sin secar, se pasó al alcohol de 90% y

por ultimo al alcohol de 100% cada uno por 2 minutos.

- Se realizó un proceso de secado de la lámina con ayuda de una pera o al

ambiente

- Vortex a las sondas empleadas con la máxima agitación por 5 segundos

- Un spin del vial que contenía la sonda (esto con el fin de precipitar todo el

contenido de la sonda al fondo del vial) durante 5 segundos

- Con la micropipeta se succiono 4 µl de la sonda


- La sonda se agregó en el área demarcada para hibridación

- La lámina se montó con una laminilla limpia del tamaño del área de hibridación

- Se sellaron los bordes de la laminilla con pegante a base de caucho

- El montaje se colocó en plancha calentadora a 74°C y se dejó allí por 3 minutos.

- Se sacó la preparación y llevó a cámara húmeda a 37°C por 17 horas (OverNight)

DIA 2:

- Se retiró la cámara húmeda del homo y la laminilla con pinzas.

- Se colocó la lámina en un Coplin con 0.4xSSC a 73°C, que se encontraba en el

baño de María por un tiempo de 2 minutes

- La lámina se retiró y sin secar se llevó a un Coplin con 2XSSC a temperatura

ambiente por 30 segundos.

- Con la micropipeta se succionaron 3 µl de contrastante DAPI sobre el área

hibridada

- Se montó con la laminilla limpia del tamaño del área de trabajo,

- Se mantuvo en oscuridad hasta el momento de observación al microscopio de

fluorescencia.

Anexos 176

Anexo 9. Extracción por Cloroformo de ÁcidoDesoxirribonucleico (ADN) Controles y Pacientes

Para la extracción del ADN en sangre periférica y en médula ósea de pacientes y

controles metafásicos (CGH) se realizó el siguiente protocolo.

LISIS DE ERITROCITOS (Lavado de la Muestra)

En tubos de 10 mL agregar

- 4 mL de sangre o médula ósea

- 6 mL de suero fisiológico

- Centrifugar 8 min a 2500 rpm a 4 °C

Aspirar el sobrenadante

- Se adiciono hasta 10 mL con TLE

- Posteriormente se agito suavemente hasta deshacer el pellet y se dejó

en hielo de 5 a 10 min

- Centrifugar 15 min a 3000 rpm y a 4 °C

Aspirar el sobrenadante

- Se realizaron lavados adicionando hasta 10 mL con TLE

- Agitando suavemente hasta disolver el botón

- Se centrifugó 15 min a 3000 rpm y a 4 °C

- Se realizó el mismo procedimiento de 3 o 4 veces (hasta que el pellet

quede blando)

Aspirar sobrenadante

LISIS DE LEUCOCITOS (Digestión de Proteínas)

- Resuspender el pellet


- Se añadió a cada tubo 3 mL de TLL

- 200 µL de SDS 10%

- 50 µL de PK

- Agitación por vortex hasta obtener una solución de aspecto homogéneo

- Dejar en la estufa a 37 °C todo la noche

EXTRACCIÓN DE ADN- Se agregó 1 mL de solución saturada de NaCl 5M

- Agitando en el vortex 15-20 seg hasta obtener una emulsión

- Centrifugar 15 min a 3000 rpm a 4 °C (eliminar sales)

- Se repartió el sobrenadante a un tubo de polipropileno de 10 mL (resistente al

cloroformo)

- Se agregó cloroformo v/v

- Agitando manualmente 15-20 segundos hasta obtener una emulsión homogénea

- Se centrifugo 15 min a 3500 rpm a 4 °C

- Se transfirió con una pipeta Pasteur la parte superior de la muestra

- Se agregó etanol absoluto 2 v/v, agitando con suavidad hasta que aparezca la

medusa de ADN

- Pescar el ADN con una pipeta Pasteur y se pasó a un epperdorf que contiene 1

mL de etanol absoluto 100%

- Centrifugar a 1200 rpm por 5 min

- Decantar el etanol del epperdorf y añadir 1 mL de etanol al 70%

- Centrifugar a 1200 rpm por 5 min

- Decanto y se secó el exceso al aire

- Se disolvió el ADN en agua ultrapura previamente calentado a 37 °C

Anexos 178

- Guardar el ADN a 4 °C

Anexo 10. Hibridación Genómica Comparada de AltaResolución (HR-CGH)


- ADN paciente concentración 1 µg

- ADN control (mujer y hombre). Promega

- Enzima DpnII. NEB

- Kit de purificación Qiaquick. Qiagen GmbH

- Human Cot- 1 ADN. Invitrogen

- PlatinumBrightTM Nucleic Acid Labeling Kit (495 Green). Kreatech

Biotechnology

- PlatinumBrightTM Nucleic Acid Labeling Kit (550 Red/Orange). Kreatech

Biotechnology

- Laminas Control

- Formamida al 70%

- Etanol 70%, 80%, 100% (fríos)

- Pegante a base de caucho

- Cámara Húmeda

- 0.4 X SSC

- 2 X SSC

- DAPI. Kreatech Biotechnology


Anexo 11. Variables

VARIABLE TIPO DE VARIABLE VALORESDEFINICIÓN DE LAS

VARIABLES

EdadVariable Cuantitativa

discreta Rango Años Cumplidos

SexoVariable Cualitativa

nominalFemenino Género con el que llega

el pacienteMasculino

Diagnóstico Definitivo Variable Cualitativanominal

M0

Ultimo diagnóstico dadoal paciente después dehaber realizado pruebas

confirmatoria

M1M2M3M4M5M6M7

Leucocitos Variable CuantitativoContinua

Células/µl

Linfocitos Variable CuantitativoContinua Células/ µl

Neutrófilos Variable CuantitativoContinua Células/ µl

Hemoglobina enSangre

Variable CuantitativoContinua

Mujeres: 12.1 a15.1 gm/dL

Hombres: 13.8 a17.2 gm/dL

Porcentaje de Blastosen Médula

Variable CuantitativoContinua

Análisis Citogenético Variable CualitativaNORMAL Reporte del Cariotipo

convencional por bandasGANORMAL

Cariotipo AnormalVariable Cuantitativo

discreta

1Presencia de 1, 2 o 3anormalidades en un2

Anexos 180

3mismo individuo con SMD

o LMA

No clasificado

MonosomíasVariable Cuantitativo

discreta

1

Determinar frecuencia depérdidas cromosómicastotales o parciales porenfermedad primaria y

por paciente

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

X


Y

Trisomía Total oParcial

Variable CuantitativoDiscreta

1

Determinar frecuencia deganancias cromosómicas

totales o parciales porenfermedad primaria y

por paciente

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

X

Anexos 182

Y

TranslocacionesVariable Cuantitativo

Discreta

Determinar lastranslocaciones más

frecuentes porenfermedad primaria y

por paciente

InversionesVariable Cuantitativo

Discreta

Determinar inversionesmás frecuentes por

enfermedad primaria ypor paciente

IsocromosomasVariable Cuantitativo

Discreta

Determinar frecuencia deisocromosomas por

enfermedad primaria ypor paciente

PoliploidíasVariable Cuantitativo

DiscretaEstablecer frecuencias de

poliploidias 3n, 4n …

NulisomíasVariable Cuantitativo

Discreta

1

Establecer frecuencias denulisomías porcromosomas …

2

3

4

5

6

7

8

9


10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

21

22

X

Y

FISH Variable Cualitativa

Presencia deAlteración

Se determinó por lapresencia o ausencia dealteraciones según las

señales de hibridación decada una de las sondas

empleadasAusencia deAlteración

Datos HR-CGH Variable Cualitativa

Determinarmicrodeleciones omicroduplicaciones

Variable Cualitativa ordinal FAVORABLE

Anexos 184

PronósticoCitogenético

INTERMEDIO Jerarquización de loshallazgos citogenético deacuerdo a la malignidad

de la patología conrespecto al tiempo de

sobrevida en un periodomáximo de 4 semanas

DESCONOCIDO

DESFAVORABLE

Tasas de Remisión Variable Cualitativa

Remisión Se evaluó la tasa deremisión de los 11

pacientes evaluados a las4 semanas de

diagnosticados.No remisión

Supervivencia Global Variable Cuantitativa Días

Evaluación de lasupervivencia vs

tratamiento y alteracióncromosómica

Bibliografía 185

Bibliografía

Abruzzese, E., Rao, P. N., Slatkoff, M., Cruz, J., Powell, B. L., Jackle, B., & Pettenati,M. J. (1997). Monosomy X as a recurring sole cytogenetic abnormalityassociated with myelodysplastic diseases. Cancer genetics and cytogenetics,93(2), 140-146.

Andalucía, H. de. (2009). Guía Farmacoterapéutica: Resumen de las características

del producto Vidaza, 1–31.

Angel, M., Sanz, G., & Vallespí, T. (1998). Diagnosis, classification, and cytogenetics

of myelodysplastic syndromes, 258–275.

Appelbaum, F. R., Kopecky, K. J., Tallman, M. S., Slovak, M. L., Gundacker, H. M.,

Kim, H. T., Estey, E. H. (2006). The clinical spectrum of adult acute myeloid

leukaemia associated with core binding factor translocations. British Journal of

Haematology, 135(2), 165–173. doi:10.1111/j.1365-2141.2006.06276.x

Baccarani, M., Cilloni, D., Rondoni, M., Ottaviani, E., Messa, F., Merante, S.,

Martinelli, G. (2007). The efficacy of imatinib mesylate in patients with FIP1L1-

PDGFR -positive hypereosinophilic syndrome. Results of a multicenter

prospective study. Haematologica, 92(9), 1173–1179.

doi:10.3324/haematol.11420

Bacher, U., Schanz, J., Braulke, F., & Haase, D. (2015). Rare Cytogenetic

Abnormalities in Myelodysplastic Syndromes. Mediterranean journal of

hematology and infectious diseases, 7(1).

Bae, S. Y., Kim, J. S., Ryeu, B. J., Lee, K. N., Lee, C. K., Kim, Y. K., Yoon, S. Y.

(2010). Acute myeloid leukemia (AML-M2) associated with variant t(8;21): report

of three cases. Cancer Genetics and Cytogenetics, 199(1), 31–37.

doi:10.1016/j.cancergencyto.2009.10.002

Bakshi, S. R., Kakadia, P. M., Brahmbhatt, M. M., Trivedi, P. J., Rawal, S. M., Bhatt,

S. S., ... & Shah, P. M. (2004). Loss of sex chromosome in acute myeloid

leukemia. Indian Journal of Human Genetics, 10(1), 22.

Baldus, C. D., Thiede, C., Soucek, S., Bloomfield, C. D., Thiel, E., & Ehninger, G.

(2006). BAALC expression and FLT3 internal tandem duplication mutations in

acute myeloid leukemia patients with normal cytogenetics: Prognostic


implications. Journal of Clinical Oncology, 24(5), 790–797.

doi:10.1200/JCO.2005.01.6253

Beaudet al., Sly WS, Valle D (eds) The metabolic and molecular bases of inherited

disease. Vol 1.McGraw-Hill, New York, pp 811– 839

Bellantuono, I. (2004). Haemopoietic stem cells. The International Journal of

Biochemistry & Cell Biology, 36(4), 607–20. doi:10.1016/j.biocel.2003.10.008

Belli, C. B., Bengió, R., Aranguren, P. N., Sakamoto, F., Flores, M. G., Watman, N.,

Larripa, I. (2011). Partial and total monosomal karyotypes in myelodysplastic

syndromes: Comparative prognostic relevance among 421 patients. American

Journal of Hematology, 86(March), 540–545. doi:10.1002/ajh.22034

Bennett, J. ., Catovsky, D., Daniel, M., Flandrin, G., Galton, D., Gralnick, H., & Sultan,

C. (1982).Proposals for the classification of the myelodysplastic

syndromes.British Journal of Haematology, 51, 189–199. doi:10.1111/j.1365-

2141.1976.tb03563.x

Bennett, J. M., Catovsky, D., Daniel, I. M., Flandrin, G., Galton, D. A. G., Gralnick, H.

R, French-american-, T. H. E. (1989).Proposals for the classification of chronic

(mature) B and T lymphoid leukaemias, 567–584.

Bernadette, F., Fritsman, G., & Keohane, E. (2012). Hematology Clinical Principles

And Applications. Elsevier Inc.

Bernasconi, P., Boni, M., Cavigliano, P. M., Calatroni, S., Giardini, I., Rocca, B.,

Caresana, M. (2006). Clinical relevance of cytogenetics in myelodysplastic

syndromes. Annals of the New York Academy of Sciences, 1089, 395–410.

doi:10.1196/annals.1386.034

Biggerstaff, J. S., Liu, W., Slovak, M. L., Bobadilla, D., Bryant, E., Glotzbach, C., &

Shaffer, L. G. (2006). A dual-color FISH assay distinguishes between ELL and

MLLT1 (ENL) gene rearrangements in t(11;19)-positive acute leukemia.

Leukemia : Official Journal of the Leukemia Society of America, Leukemia

Research Fund, U.K, 20(11), 2046–2050. doi:10.1038/sj.leu.2404371

Boultwood, J. & Wainscoat, J. S. (2001). Clonality in the Myelodysplastic Syndromes,

411–415.

Boyiadzis, M., Frame, J., Kohler, R., & Fojo, T. (2014). Hematology-Oncology

Therapy (2da ed.). Mexico: McGraw-Hill.

Bibliografía 187

Boyiadzis, M., Lebowitz, P., Frame, J., Kohler, D., & Fojo, T. (2007). Hematology-

Oncology Therapy, 2/e.

Breems, D. a., Van Putten, W. L. J., De Greef, G. E., Van Zelderen-Bhola, S. L.,

Gerssen-Schoorl, K. B. J., Mellink, C. H. M., Löwenberg, B. (2008). Monosomal

karyotype in acute myeloid leukemia: A better indicator of poor prognosis than

a complex karyotype. Journal of Clinical Oncology, 26(29), 4791–4797.

doi:10.1200/JCO.2008.16.0259

Cairncross, G., Berkey, B., Shaw, E., Jenkins, R., Scheithauer, B., Brachman, D.,

Curran, W. (2006). Phase III trial of chemotherapy plus radiotherapy compared

with radiotherapy alone for pure and mixed anaplastic oligodendroglioma:

Intergroup Radiation Therapy Oncology Group trial 9402. Journal of Clinical

Oncology, 24(18), 2707–2714. doi:10.1200/JCO.2005.04.3414

Calgb, L. G. B., Calgb, L. G. B., Byrd, J. C., Byrd, J. C., Mro, K., Mro, K., Bloom, C.

D. (2002). Pretreatment cytogenetic abnormalities are predictive of induction

success, cumulative incidence of relapse, and overall survival in adult patients

with de novo acute myeloid leukemia: results from Cancer and Leukemia Group

B (CALGB 8461). Cytogenetics, 100(13), 4325–4336. doi:10.1182/blood-2002-

03-0772.Supported

Calin, G. A., Sevignani, C., Dumitru, C. D., Hyslop, T., Noch, E., Yendamuri, S.,

Croce, C. M. (2004). Human microRNA genes are frequently located at fragile

sites and genomic regions involved in cancers. Proceedings of the National

Academy of Sciences of the United States of America, 101(9), 2999–3004.

doi:10.1073/pnas.0307323101

Camús, M., & Esteve, J. (2007). CARACTERIZACIÓN BIOLÓGICA DE LA

LEUCEMIA MIELOIDE AGUDA CON TRANSLOCACIÓN t (8 ;16)(p11;p13) Y

REORDENAMIENTO MYST3-CREBBP.

Care, R. S., Valk, P. J. M., Goodeve, A. C., Abu-Duhier, F. M., Geertsma-Kleinekoort,

W. M. C., Wilson, G. a., Reilly, J. T. (2003). Incidence and prognosis of c-KIT

and FLT3 mutations in core binding factor (CBF) acute myeloid leukaemias.

British Journal of Haematology, 121(1999), 775–777. doi:10.1046/j.1365-

2141.2003.04362.x


Chalmers, J. (1988). Clinical presentation. Current Orthopaedics, 2(3), 135–140.

doi:10.1016/0268-0890(88)90018-7

Chan, L., & Wil-, D. (1986). ( MIC ) Working Classification of Acute Lymphoblastic

Leukemias Report of the Workshop Held in Leuven , Belgium , April 22-23 ,

1985, 197(Mic), 189–197.

Cheng, Y., Wang, Y., Wang, H., Chen, Z., Lou, J., Xu, H., & Jin, J. (2009).

Cytogenetic profile of de novo acute myeloid leukemia: a study based on 1432

patients in a single institution of China. Leukemia, 23(10), 1801-1806.

Cheson, B., Bennett, J., Kopecky, K., Büchner, T., Willman, C., Estey, E., Bloomfield,

C. (2003).Revised Recommendations of the International Working Group for

Diagnosis, Standardization of Response Criteria, Treatment Outcomes, and

Reporting Standards for Therapeutic Trials in Acute Myeloid Leukemia. Journal

of Clinical Oncology, 21(24), 4642–4649. doi:10.1200/JCO.2004.12.904

Chi, Y., Lindgren, V., Quigley, S., & Gaitonde, S. (2008). Acute myelogenous

leukemia with t(6;9)(p23;q34) and marrow basophilia: An overview. Archives of

Pathology and Laboratory Medicine, 132(11), 1835–1837.

doi:10.1043%2F1543-2165-132.11.1835

Chin, Y. M., Noor, P. J., Ismail, A., Ahid, M. F. M., & Zakaria, Z. Cytogenetic Profile

of Monosomal Karyotype in Adult Acute Myeloid Leukemia.

Choi, J., Song, J., Kim, S. J., Choi, J. R., Kim, S. J., Min, Y. H., Kim, M. J. (2010).

Prognostic significance of trisomy 6 in an adult acute myeloid leukemia with

t(8;21). Cancer Genetics and Cytogenetics, 202, 141–143.


Chultheis, B. E. S., Ross, N. I. C. P. C., & Oldman, J. O. H. N. M. G. (2002). Imat Inib

Me Syl At E in Ch R Onic My Eloprolifer Ativ E D Is Eas Es Response To Imatinib

Mesylate in Patients With Chronic Myeloproliferative Diseases With

Rearrangements of the Platelet-Derived Growth Factor Receptor Beta. English

Journal, 347(7), 481–487.

Ciesla, B. (2012). hematology in Practice. (D. Company, Ed.) (2da ed.). Davis

Company.

Bibliografía 189

Coleman, R., & Ebert, L. (2012). Molecular Pathophysiology of Myelodysplastic

Syndromes. Changes, 29(4), 997–1003.

doi:10.1016/j.biotechadv.2011.08.021.Secreted

Cremer, T., Lichter, P., Borden, J., Ward, D. C., & Manuelidis, L. (1988). Detection of

chromosome aberrations in metaphase and interphase tumor cells by in situ

hybridization using chromosome-specific library probes. Human Genetics,

80(3), 235–246. doi:10.1007/BF01790091

Curtiss, N. P., Bonifas, J. M., Lauchle, J. O., Balkman, J. D., Kratz, C. P., Emerling,

B. M., Shannon, K. M. (2005). Isolation and analysis of candidate myeloid tumor

suppressor genes from a commonly deleted segment of 7q22. Genomics, 85(5),

600–607. doi:10.1016/j.ygeno.2005.01.013

Dastugue, N., Lafage-Pochitaloff, M., Pages, M. P., Radford, I., Bastard, C., Talmant,

P., Berger, R. (2002). Cytogenetic profile of childhood and adult

megakaryoblastic leukemia (M7): A study of the Groupe Fraņais de

Cytogénétique Hématologique (GFCH). Blood, 100(2), 618–626.

doi:10.1182/blood-2001-12-0241

David, M., Cross, N. C. P., Burgstaller, S., Chase, A., Curtis, C., Dang, R., Apperley,

J. F. (2007). Brief report Durable responses to imatinib in patients with PDGFRB

fusion gene – positive and BCR-ABL – negative chronic myeloproliferative

disorders. Hematology, 109(1), 61–64. doi:10.1182/blood-2006-05-024828.The

Deeg, H. J., Bowen, D. T., Gore, S. D., Haferlach, T., Le Beau, M. M., & Niemeyer,

C. (2013). Myelodysplastic Syndromes. Berlin, Heidelberg: Springer Berlin

Heidelberg. doi:10.1007/978-3-642-36229-3

Deininger, M., Buchdunger, E., Druker, B. J., & Dc, W. (2012). The development of

imatinib as a therapeutic agent for chronic myeloid leukemia Review in

translational hematology The development of imatinib as a therapeutic agent for

chronic myeloid leukemia. Development, 105(7), 2640–2653.

doi:10.1182/blood-2004-08-3097

Del Cañizo, M. C., Fernández, E., Lopez, A., Vidriales, B., Villarón, E., Arroyo, J. L.,

San Miguel, J. F. (2003). Immunophenotypic analysis of myelodysplastic

syndromes. Haematologica, 88, 402–407. doi:10.1016/S0145-2126(07)70022-

X


Díaz, M. M., Gordillo, C. E. N., Cruz, P. C. G., & Gálviz, M. P. (2011). Estudio de

supervivencia en pacientes pediátricos con cáncer atendidos en el Centro

Javeriano de Oncología. Revista Universitas Médica, 53(2), 120–125.

DiMartino, J. F., & Cleary, M. L. (1999). MLL rearrangements in haematological

malignancies: Lessons from clinical and biological studies. British Journal of

Haematology, 106(3), 614–626. doi:10.1046/j.1365-2141.1999.01439.x

Döhner, H., Stilgenbauer, S., Benner, A., Leupolt, E., Kröber, A., Bullinger, L., Lichter,

P. (2000). Genomic Aberrations and Survival in Chronic Lymphocytic Leukemia.

New England Journal of Medicine, 343(26), 1910–1916.

doi:10.1056/NEJM200012283432602

Döhner, K., Brown, J., Hehmann, U., Hetzel, C., Stewart, J., Lowther, G., Döhner, H.

(1998). Molecular cytogenetic characterization of a critical region in bands 7q35-

q36 commonly deleted in malignant myeloid disorders. Blood, 92(11), 4031–

4035.

Druker, B. J., Guilhot, F., O'Brien, S. G., Gathmann, I., Kantarjian, H.,

Gattermann, N., Investigators, I. (2006). Five-year follow-up of patients receiving

imatinib for chronic myeloid leukemia. The New England Journal of Medicine,

355(23), 2408–2417. doi:10.1056/NEJMoa062867

Engelman, J. a, Zejnullahu, K., Mitsudomi, T., Song, Y., Hyland, C., Park, J. O.,

Jänne, P. a. (2007). MET amplification leads to gefitinib resistance in lung

cancer by activating ERBB3 signaling. Science (New York, N.Y.), 316(5827),

1039–1043. doi:10.1126/science.1141478

Flandrin, G., Bennett, J., Catovsky, D., Daniel, M., Galton, D., Gralnicks, H., & Sultan,

C. (1976).Proposals for the Classification of the Acute Leukaemias. British

Journal of Haematology, 33(45).

Ferrero, E., Saccucci, F., & Malavasi, F. (1999). The human CD38 gene:

polymorphism, CpG island, and linkage to the CD157 (BST-1) gene.

Immunogenetics, 49(7-8), 597-604.

Foran, J. M. (2010). New prognostic markers in acute myeloid leukemia: perspective

from the clinic. ASH Education Program Book, 2010(1), 47-55.

Flores, E., Pelayo, R., & Mayani, H. (2007). Hematopoyesis, 2, 95–107.

Bibliografía 191

Fonatsch, C., Gudat, H., Lengfelder, E., Wandt, H., Silling-Engelhardt, G., Ludwig,

W. D., & Schwieder, G. (1994). Correlation of cytogenetic findings with clinical

features in 18 patients with inv (3)(q21q26) or t (3; 3)(q21;

q26).Leukemia, 8(8), 1318-1326.

Fröhling, S., & Hartmut, D. (2008). Chromosomal Abnormalities in Cancer. The New

England Journal of Medicine Review, 359, 722–34.

Fröhling, S., Scholl, C., Gilliland, D. G., & Levine, R. L. (2005). Genetics of myeloid

malignancies: Pathogenetic and clinical implications. Journal of Clinical

Oncology, 23(26), 6285–6295. doi:10.1200/JCO.2005.05.010

Garcia-Manero, G., Shan, J., Faderl, S., Cortes, J., Ravandi, F., Borthakur, G.,

Kantarjian, H. (2008). A prognostic score for patients with lower risk

myelodysplastic syndrome. Leukemia, 22(3), 538–43.

doi:10.1038/sj.leu.2405070

Geddes, a a, Bowen, D. T., & Jacobs, a. (1990). Clonal karyotype abnormalities and

clinical progress in the myelodysplastic syndrome. British Journal of

Haematology, 76, 194–202.

GLOBOCAN 2012: Estimated Cancer Incidence, Mortality y Prevalence Worldwide

in 2012. Disponible en

http://globocan.iarc.fr/Pages/fact_sheets_population.aspx.

Godley, L. a., & Larson, R. a. (2008).Therapy-Related Myeloid Leukemia.Seminars

in Oncology, 35(4), 418–429. doi:10.1053/j.seminoncol.2008.04.012

Goldman, J., & Melo, J. (2003). Chronic Myeloid Leukemia — Advances in Biology

and New Approaches to Treatment. The New England Journal of Medicine, 349,

1451–1464. Retrieved from

http://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMra020777

Gozzetti, A., & Le Beau, M. M. (2000). Fluorescence in situ hybridization: uses and

limitations. Seminars in Hematology, 37(4), 320–333.

Graux, C., Cools, J., Melotte, C., Quentmeier, H., Ferrando, a, Levine, R.,

Hagemeijer, A. (2004). Fusion of NUP214 to ABL1 on amplified episomes in T-

cell acute lymphoblastic leukemia. Nature Genetics, 36(10), 1084–1089.

doi:10.1038/ng1425


Gray, J. W., & Collins, C. (2000). Genome changes and gene expression in human

solid tumors. Carcinogenesis, 21(3), 443–452. doi:10.1093/carcin/21.3.443

Greenberg, P., Cox, C., LeBeau, M. M., Fenaux, P., Morel, P., Sanz, G., Bennett, J.

(1997). International scoring system for evaluating prognosis in myelodysplastic

syndromes. Blood, 89, 2079–2088.

Greenberg, P., Tuechler, H., Schanz, J., Sanz, G., Garcia-Manero, G., Solé, F.,

Haase, D. (2012). Revised international prognostic scoring system for

myelodysplastic syndromes. Blood, 120(12), 2454–65. doi:10.1182/blood-2012-

03-420489

Grimwade, D., Walker, H., Harrison, G., Oliver, F., Chatters, S., Harrison, C.,

Goldstone, A. (2001). The predictive value of hierarchical cytogenetic

classification in older adults with acute myeloid leukemia (AML): Analysis of

1065 patients entered into the United Kingdom Medical Research Council

AML11 trial. Blood, 98(5), 1312–1320. doi:10.1182/blood.V98.5.1312

Grimwade, D., Walker, H., Oliver, F., Wheatley, K., Harrison, C., Harrison, G.,

Goldstone, a. (1998). The importance of diagnostic cytogenetics on outcome in

AML: analysis of 1,612 patients entered into the MRC AML 10 trial. The Medical

Research Council Adult and Children’s Leukaemia Working Parties. Blood, 92,

2322–2333.

Haase, D., Germing, U., Schanz, J., Pfeilstöcker, M., Nösslinger, T., Hildebrandt, B.,

Steidl, C. (2007). New insights into the prognostic impact of the karyotype in

MDS and correlation with subtypes: Evidence from a core dataset of 2124

patients. Blood, 110(13), 4385–4395. doi:10.1182/blood-2007-03-082404

Hage-, A., & Group, S. (1988). (MIC) Working Classification of the Acute Myeloid

Leukemias Report of the Workshop Held in Leuven , Second MIC Cooperative

Study Group *, 15(Mic), 1–15.

Hamblin, T. J., & Oscier, D. G. (1987). The myelodysplastic syndrome—a practical

guide. Journal of the National Medical Association, 79 (September 1986), 781–

784.

Harris, N. L., Jaffe, E. S., Diebold, J., Flandrin, G., Vardiman, J., Lister, T. A., &

Bloomfield, C. D. (1999). Commentary The World Health Organization

Classification of Neoplastic Diseases of the Hematopoietic and Lymphoid

Bibliografía 193

Tissues Report of the Clinical Advisory Committee Meeting , Airlie House,

Virginia , November , 1997, 1419–1432.

Hastings, R., Howell, R., Bricarelli, F. D., Kristoffersson, U., & Cavani, S. (2012).

General Guidelines and Quality Assurance for Cytogenetics, (29), 7–25.

Hernández, J. González, M., Granada, I., Gutiérrez, N., Chillon, C., Ramos, F., San

Miguel, J. (2000). Detection of inv(16) and t(16;16) by fluorescence in situ

hybridization in acute myeloid leukemia M4Eo. Haematologica, 84(July), 656–

657.

Hiddemann, W., Kneba, M., Dreyling, M., Schmitz, N., Lengfelder, E., Reiser, M., Wo,

B. (2005). Frontline therapy with rituximab added to the combination of

significantly improves the outcome for patients with advanced-stage follicular

lymphoma compared with therapy with CHOP alone : results of a prospective

randomized study of the German Low-Grade, 106(12), 3725–3732.

doi:10.1182/blood-2005-01-0016

High resolution metaphase comparative genomic hybridization. Retomado de

http://www.chromosomelab.dk/cgh/cgh.html

Hinds, P. W., & Weinberg, R. a. (1994). Tumor suppressor genes. Current Opinion

in Genetics & Development, 4(1), 135–141. doi:10.1016/0959-437X(94)90102-

3

Hirai, H. (2002). Molecular pathogenesis of MDS. International Journal of

Hematology, 76(S2), 213–221. doi:10.1007/BF03165120

Hoeller, S., Walz, C., Reiter, A., Dirnhofer, S., & Tzankov, A. (2011). PCM1-JAK2-

fusion: a potential treatment target in myelodysplastic-myeloproliferative and

other hemato-lymphoid neoplasms. Expert opinion on therapeutic targets,15(1),

53-62.

Hughes, T., Deininger, M., Hochhaus, A., Branford, S., Radich, J., Kaeda, J.,

Goldman, J. M. (2006). Monitoring CML patients responding to treatment with

tyrosine kinase inhibitors: Review and recommendations for harmonizing

current methodology for detecting BCR-ABL transcripts and kinase domain

mutations and for expressing results. Blood, 108(1), 28–37. doi:10.1182/blood-

2006-01-0092


Iastrebner, M., Flores, A., & Benasayag, S. (2009). Tratamiento hipometilante de los

Síndromes Mielodisplásicos . De la fisiopatogenia y la farmacología a la práctica

clínica . ( Revisión ).

Igarashi, T., Shimizu, S., Morishita, K., Ohtsu, T., Itoh, K., Minami, H., Mukai, K.

(1998). Acute myelogenous leukemia with monosomy 7, inv(3) (q21q26),

involving activated EVI 1 gene occurring after a complete remission of

lymphoblastic lymphoma: a case report. Japanese Journal of Clinical Oncology,

28(11), 688–695.

Instituto Nacional de Cancerología. Anuario Estadístico 2010. Buenos y Creativos S

A S

Itzykson, R., Thépot, S., Quesnel, B., Dreyfus, F., Beyne-rauzy, O., Vey, N., …

Francophone, G. (2012). Prognostic factors for response and overall survival in

282 patients with higher-risk myelodysplastic syndromes treated with azacitidine

Prognostic factors for response and overall survival in 282 patients with higher-

risk myelodysplastic syndromes treate, 117(2), 403–411. doi:10.1182/blood-

2010-06-289280

Jaffe, E. S., Harris, N. L., Vardiman, J., Campo, E., & Arber, D. (2011).

Hematopathology. St. Louis, USA: Elsevier Inc.

Jaffe, E.S., et al., (2001). “Pathology and Genetics of Tumours of Haematopoietic

and Lymphoid Tissues. World Health Organization Classification of Tumours.”

ed. P. Kleihues and L.H. Sobin., Lyon: IARCPress.

James, L. a. (1999). Comparative genomic hybridization as a tool in tumour

cytogenetics. Journal of Pathology, 187(4), 385–395. doi:10.1002/(SICI)1096-

9896(199903)187:4<385::AID-PATH290>3.0.CO;2-5

Jan, M., & Majeti, R. (2012). Clonal evolution of acute leukemia genomes. Oncogene,

(January), 1–6. doi:10.1038/onc.2012.48

Jeuken, J. W. M., Sprenger, P. D. S. H. E., Wesseling, P., & Ph, D. (2002).

Comparative Genomic Hybridization : Practical Guidelines, 11(4), 193–203.

Johansson, B., Mertens, F., & Mitelman, F. (1993). Cytogenetic deletion maps of

hematologic neoplasms: Circumstantial evidence for tumor suppressor loci.

Genes Chromosomes and Cancer, 8, 205–218. doi:10.1002/gcc.2870080402

Bibliografía 195

Joos, S., Scherthan, H., Speicher, M. R., Schlegep, J., Cremer, T., & I, P. L. (1993).

Detection of amplified DNA sequences by reverse chromosome painting using

genomic tumor DNA as probe, 584–589.

Jovell, A. J. (1995). Análisis de regresión logística. Centro de Investigaciones

Sociológicas

Kallioniemi, A., Kallioniemi, O.-P., Sudar, D., Rutovitz, D., Gray, J. W., Waldman, F.,

& Pinkel, D. (1992). Comparative Genomic Hybridization for Molecular

Cytogenetic Analysis of Solid Tumors. Science, 258(5083), 818–820.

Kantarjian, H., Giles, F., Wunderle, L., Bhalla, K., O’Brien, S., Wassmann, B.,

Ottmann, O. G. (2006). Nilotinib in imatinib-resistant CML and Philadelphia

chromosome-positive ALL. The New England Journal of Medicine, 354(24),

2542–2551. doi:10.1056/NEJMoa055104

Kantarjian, H., O’Brien, S., Ravandi, F., Cortes, J., Shan, J., Bennett, J. M., Garcia-

Manero, G. (2008). Proposal for a new risk model in myelodysplastic syndrome

that accounts for events not considered in the original International Prognostic

Scoring System. Cancer, 113(6), 1351–61. doi:10.1002/cncr.23697

Karhu, R., Kähkönen, M., Kuukasjärvi, T., Pennanen, S., Tirkkonen, M., &

Kallioniemi, O. (1997). Quality control of CGH: Impact of metaphase

chromosomes and the dynamic range of hybridization. Cytometry, 28(3), 198–

205. doi:10.1002/(SICI)1097-0320(19970701)28:3<198::AID-

CYTO3>3.0.CO;2-A

Keagle, M. B., & Gersen, S. L. (2005). The principles of clinical cytogenetics.

Springer. Ed 2. Editorial Humana Press Inc. Cap 17

Kelly, M. J., Meloni-Ehrig, A. M., Manley, P. E., & Altura, R. a. (2009). Poor outcome

in a pediatric patient with acute myeloid leukemia associated with a variant

t(8;21) and trisomy 6. Cancer Genetics and Cytogenetics, 189(1), 48–52.


Kim, S. Y., & Hahn, W. C. (2007). Cancer genomics: Integrating form and function.

Carcinogenesis, 28(7), 1387–1392. doi:10.1093/carcin/bgm086

Kirchhoff M, Rose H, Maahr J, Gerdes T, Bugge M, Tommerup N, Tumer Z,

Lespinasse J, Jensen PK, Wirth J, Lundsteen C. (2000). High resolution

comparative genomic hybridisation analysis reveals imbalances in


dyschromosomal patients with normal or apparently balanced conventional

karyotypes. Eur J Hum Genet 8: 661-8.

Kiyoi, H., Naoe, T., Nakano, Y., Yokota, S., Minami, S., Miyawaki, S., … Ueda, R.

(1999). Prognostic implication of FLT3 and N-RAS gene mutations in acute

myeloid leukemia. Blood, 93(9), 3074–3080.

Klaus, M., Haferlach, T., Schnittger, S., Kern, W., Hiddemann, W., & Schoch, C.

(2004). Cytogenetic profile in de novo acute myeloid leukemia with FAB

subtypes M0, M1, and M2: A study based on 652 cases analyzed with

morphology, cytogenetics, and fluorescence in situ hybridization. Cancer

Genetics and Cytogenetics, 155, 47–56.


Knudson, a G. (1971). Mutation and cancer: statistical study of retinoblastoma.

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of

America, 68(4), 820–823. doi:10.1073/pnas.68.4.820

Knudson, a G. (2001). Two genetic hits (more or less) to cancer. Nature Reviews.

Cancer, 1(2), 157–162. doi:10.1038/35101031

Köhler, T., Schill, C., Deininger, M. W., Krahl, R., Borchert, S., Hasenclever, D., …

Niederwieser, D. (2002). High Bad and Bax mRNA expression correlate with

negative outcome in acute myeloid leukemia (AML). Leukemia : Official Journal

of the Leukemia Society of America, Leukemia Research Fund, U.K, 16(May

2001), 22–29. doi:10.1038/sj.leu.2402340

Komrokji, R. S., & Bennett, J. M. (2006). Who is WHO in myelodysplastic syndromes?

Clinical implications of the WHO classification. Current Hematologic Malignancy

Reports, 1(1), 9–15. doi:10.1007/s11899-006-0011-x

Kottaridis, P. D., Gale, R. E., Frew, M. E., Harrison, G., Langabeer, S. E., Belton, A.

A., … Linch, D. C. (2001). The presence of a FLT3 internal tandem duplication

in patients with acute myeloid leukemia (AML) adds important prognostic

information to cytogenetic patients from the United Kingdom Medical Research

Council AML 10 and 12 .pdf, 98(6), 1752–1760.

Krause, D. S., & Etten, R. a Van. (2005). Tyrosine Kinases as Targets for Cancer

Therapy, 172–187.

Bibliografía 197

Kurtin PJ, Dewald GW et al (1996) Hematologic disorders associated with deletions

of chromosome 20q: a clinicopathologic study of 107 patients. Am J Clin Pathol

106(5):680–688

Ledbetter DH, Ballabio A. (1995). Molecular cytogenetics of contigous gene

syndromes: Mechanisms and consequences of gene dosage imbalances; In

The metabolic and molecular bases of inherited disease. Vol 1. (Scriver, C.

R., Beaudet, A. L., Sly, W. S., and Valle, D., eds.), McGraw-Hill, New York,

pp. 811–839.

Licht, J. D., & Sternberg, D. W. (2005). The molecular pathology of acute myeloid

leukemia. Hematology / the Education Program of the American Society of

Hematology. American Society of Hematology. Education Program, (212), 137–

142. doi:10.1182/asheducation-2005.1.137

Lichter, P., & Bentz, M. (2000). Comparative Genomic Uses and Limitations

Hybridization: Seminars in Hematology, 4(4), 348–357.

Lomax, B. L., Lestou, V. S., Barrett, I. J., & Kalousek, D. K. (1998). Confined placental

mosaicism for chromosome 7 detected by comparative genomic hybridization.

Prenatal Diagnosis, 18(7), 752–754. doi:10.1002/(SICI)1097-

0223(199807)18:7<752::AID-PD313>3.0.CO;2-1

Longo, D. (2010). Harrison's hematology and oncology. McGraw Hill Professional.

Look, a T. (1997). Oncogenic transcription factors in the human acute leukemias.

Science (New York, N.Y.), 278, 1059–1064.

doi:10.1126/science.278.5340.1059

Lowenberg, B., Downing, J. R., & Burnett, A. (1972). Acute Myeloid Leukemia. The

New England Journal of Medicine, 12, 11–20.

doi:10.3109/05678067209173973

Lowenberg, B., Downing, J., & Burnett, A. (1999). Acute Myeloid Leukemia. The New

England Journal of Medicine, 341(14), 1051–1062.

Lück, S. C., Russ, A. C., Du, J., Gaidzik, V., Schlenk, R. F., Pollack, J. R., Bullinger,

L. (2010). KIT mutations confer a distinct gene expression signature in core

binding factor leukaemia: Research paper. British Journal of Haematology,

148(January), 925–937. doi:10.1111/j.1365-2141.2009.08035.x


Ma, S. K., Wan, T. S. K., Au, W. Y., Fung, L. F., So, C. K., & Chan, L. C. (2002).

Chromosome 11q deletion in myeloid malignancies. Leukemia : Official Journal

of the Leukemia Society of America, Leukemia Research Fund, U.K, 16(5), 953–

955. doi:10.1038/sj.leu.2402442

Malcovati, L., & Nimer, S. D. (2008). Myelodysplastic syndromes: diagnosis and

staging. Cancer Control : Journal of the Moffitt Cancer Center, 15 Suppl(4), 4–

13.

Malcovati, L., Della Porta, M. G., Pascutto, C., Invernizzi, R., Boni, M., Travaglino,

E., Cazzola, M. (2005). Prognostic factors and life expectancy in

myelodysplastic syndromes classified according to WHO criteria: A basis for

clinical decision making. Journal of Clinical Oncology, 23(30), 7594–7603.

doi:10.1200/JCO.2005.01.7038

Malcovati, L., Germing, U., Kuendgen, A., Della Porta, M. G., Pascutto, C., Invernizzi,

R., Cazzola, M. (2007). Time-dependent prognostic scoring system for

predicting survival and leukemic evolution in myelodysplastic syndromes.

Journal of Clinical Oncology, 25(23), 3503–3510.

doi:10.1200/JCO.2006.08.5696

Marcucci, G., Baldus, C. D., Ruppert, A. S., Radmacher, M. D., Mrózek, K., Whitman,

S. P., Bloomfield, C. D. (2005). Overexpression of the ETS-related gene, ERG,

predicts a worse outcome in acute myeloid leukemia with normal karyotype: A

Cancer and Leukemia Group B study. Journal of Clinical Oncology, 23(36),

9234–9242. doi:10.1200/JCO.2005.03.6137

Martinelli, G., Ottaviani, E., Buonamici, S., Isidori, A., Borsaru, G., Visani, G.,

Baccarani, M. (2003). Association of 3q21q26 syndrome with different

RPN1/EVI1 fusion transcripts. Haematologica, 88(11), 1221–1228.

Marschalek, R. (2011). Mechanisms of leukemogenesis by MLL fusion proteins.

British journal of haematology, 152(2), 141-154.

Matarraz, S., López, a, Barrena, S., Fernandez, C., Jensen, E., Flores, J., Orfao, a.

(2008). The immunophenotype of different immature, myeloid and B-cell

lineage-committed CD34+ hematopoietic cells allows discrimination between

normal/reactive and myelodysplastic syndrome precursors. Leukemia : Official

Bibliografía 199

Journal of the Leukemia Society of America, Leukemia Research Fund, U.K, 22,

1175–1183. doi:10.1038/leu.2008.49

Mayani, H., Flores-Figueroa, E., Pelayo, R., Montesinos, J., Flores-Guzmán, P., &

Chávez-González, A. (2007). Hematopoyesis. Cancerología, 2, 95-107.

McGrattan, P., Campbell, S., Cuthbert, R., Jones, F. G. C., McMullin, M. F., &

Humphreys, M. (2008). Integration of conventional cytogenetics, comparative

genomic hybridisation and interphase fluorescence in situ hybridisation for the

detection of genomic rearrangements in acute leukaemia. Journal of Clinical

Pathology, 61(8), 903–8. doi:10.1136/jcp.2008.056465

Meloni-ehrig, A. (2013). The Principles of Clinical Cytogenetics. (S. L. Gersen & M.

B. Keagle, Eds.). New York, NY: Springer New York. doi:10.1007/978-1-4419-

1688-4

Mentzlová, D., Oltová, A., Filková, D. Z. H., Slerba, D. M. J., & Kuglík, P. (2008).

Efficacy oC high-resolution comparative genomic hybridization ( HR-CGH ) in

detection oC chromosomal abnormalities in children with acute leukaemia, 477–

483.

Miale, J. (1985). Hematología: medicina de laboratorio. Reverté.

Micale, M. A. (2011). Hematopathology. (D. Crisan, Ed.). Totowa, NJ: Humana

Press. doi:10.1007/978-1-60761-262-9

Micale, M. A., & Mohamed, A. N. (2012). Molecular Cytogenetic (FISH) Analysis of

Hematolymphoid Disorders.

Ministerio de la Protección Social e Instituto Nacional de Cancerología, I. N. D. S.

(2007). Guía De Práctica Clínica Para La Detección, Tratamiento Y Seguimiento

De Leucemias Linfoide Y Mieloide Y Linfoma No Hodgkin En Población Mayor

De 18 Años, 1–6.

Ministerio de la Protección Social, Instituto Nacional de Cancerología, I. N. D. S.

(2005). Protocolo de vigilancia centinela en salud pública de las leucemias

agudas pediátricas, 1–13.

Mitelman, F., Johansson, B., & Mertens, F. (2007). The impact of translocations and

gene fusions on cancer causation. Nature Reviews. Cancer, 7(4), 233–245.

doi:10.1038/nrc2091


Mohanty, D. (2004). Sex chromosome loss and malignancy: Does a relationship

established?. Indian Journal of Human Genetics, 10(1), 3.

Monma, F., Nishii, K., Shiga, J., Sugahara, H., Lorenzo V, F., Watanabe, Y., Shiku,

H. (2007). Detection of the CBFB/MYH11 fusion gene in de novo acute myeloid

leukemia (AML): A single-institution study of 224 Japanese AML patients.

Leukemia Research, 31, 471–476. doi:10.1016/j.leukres.2006.08.009

Moorman, A. V, Roman, E., Willett, E. V, Dovey, G. J., Cartwright, R. A., & Morgan,

G. J. (2001). Karyotype and age in acute myeloid leukemia. Are they

linked ?,126, 155–161.

Morel P, Hebbar M et al (1993) Cytogenetic analysis has strong independent

prognostic value in de novo myelodysplastic syndromes and can be

incorporated in a new scoring system: a report on 408 cases. Leukemia

7(9):1315–1323

Morishita, K., Parganas, E., William, C. L., Whittaker, M. H., Drabkin, H., Oval, J.,

Ihle, J. N. (1992). Activation of EVI1 gene expression in human acute

myelogenous leukemias by translocations spanning 300-400 kilobases on

chromosome band 3q26. Proceedings of the National Academy of Sciences of

the United States of America, 89(9), 3937–3941. doi:10.1073/pnas.89.9.3937

Morrissette, J. J. D., & Bagg, A. (2011). Acute myeloid leukemia: conventional

cytogenetics, FISH, and moleculocentric methodologies. Clinics in Laboratory

Medicine, 31(4), 659–86, x. doi:10.1016/j.cll.2011.08.006

Mrózek, K., Heerema, N. a, & Bloomfield, C. D. (2004). Cytogenetics in acute

leukemia. Blood Reviews, 18(2), 115–36. doi:10.1016/S0268-960X(03)00040-7

Mrózek, K., Heinonen, K., & Bloomfield, C. D. (2001). Clinical importance of

cytogenetics in acute myeloid leukaemia. Best Practice & Research. Clinical

Haematology, 14(1), 19–47. doi:10.1053/beha.2000.0114

Mrózek, K., Marcucci, G., Nicolet, D., Maharry, K. S., Becker, H., Whitman, S. P.,

Bloomfield, C. D. (2012). Prognostic significance of the European LeukemiaNet

standardized system for reporting cytogenetic and molecular alterations in

adults with acute myeloid leukemia. Journal of Clinical Oncology : Official

Journal of the American Society of Clinical Oncology, 30(36), 4515–23.

doi:10.1200/JCO.2012.43.4738

Bibliografía 201

Nilsson, L., Åstrand-Grundstro, I., Anderson, K., Arvidsson, I., Hokland, P., Bryder,

D., Jacobsen, S. E. W. (2002). Involvement and functional impairment of the

CD34 ϩ CD38 Ϫ Thy-1 ϩ hematopoietic stem cell pool in myelodysplastic

syndromes with trisomy 8. Stem Cells, 100(1), 259–267. doi:10.1182/blood-

2001-12-0188.Supported

Nowell, P. C., & Hungerford, D. a. (1960). Chromosome studies on normal and

leukemic human leukocytes. Journal of the National Cancer Institute, 25, 85–

109. doi:10.1093/jnci/25.1.85

Oancea, C., Rüster, B., Henschler, R., Puccetti, E., & Ruthardt, M. (2010). The t(6;9)

associated DEK/CAN fusion protein targets a population of long-term

repopulating hematopoietic stem cells for leukemogenic transformation.


Research Fund, U.K, 24(11), 1910–1919. doi:10.1038/leu.2010.180

Okawa, E. R., Gotoh, T., Manne, J., Igarashi, J., Fujita, T., Silverman, K. a, Brodeur,

G. M. (2008). Expression and sequence analysis of candidates for the 1p36.31

tumor suppressor gene deleted in neuroblastomas. Oncogene, 27(6), 803–810.

doi:10.1038/sj.onc.1210675

Oki, Y., Kantarjian, H. M., Zhou, X., Cortes, J., Faderl, S., Verstovsek, S., Keating,

M. J. (2014). Adult acute megakaryocytic leukemia : an analysis of 37 patients

treated Adult acute megakaryocytic leukemia : an analysis of 37 patients treated

at M . D . Anderson Cancer Center, 107(3), 880–884. doi:10.1182/blood-2005-

06-2450

Orfao, A., Ortuño, F., de Santiago, M., Lopez, A., & San Miguel, J. (2004).

Immunophenotyping of acute leukemias and myelodysplastic syndromes.

Cytometry. Part A : The Journal of the International Society for Analytical

Cytology, 58, 62–71. doi:10.1002/cyto.a.10104

Ota, K., Makoto, M., Milford, E. L., Mackin, G. a., Weiner, H. L., & Hafler, D. a. (1990).

Is non-isotopic in situ hybridization finally coming of age? Letters To Nature,

346, 183–187. doi:10.1038/346183a0

Paschka, P. (2008). Core Binding Factor Acute Myeloid Leukemia. Seminars in

Oncology, 35(4), 410–417. doi:10.1053/j.seminoncol.2008.04.011


Paschka, P., Marcucci, G., Ruppert, A. S., Mrózek, K., Chen, H., Kittles, R. a.,

Bloomfield, C. D. (2006). Adverse prognostic significance of KIT mutations in

adult acute myeloid leukemia with inv(16) and t(8;21): A Cancer and Leukemia

Group B study. Journal of Clinical Oncology, 24(24), 3904–3911.

doi:10.1200/JCO.2006.06.9500

Patnaik, M. M., Hanson, C. a, Hodnefield, J. M., Knudson, R., Van Dyke, D. L., &

Tefferi, a. (2011). Monosomal karyotype in myelodysplastic syndromes, with or

without monosomy 7 or 5, is prognostically worse than an otherwise complex

karyotype. Leukemia : Official Journal of the Leukemia Society of America,

Leukemia Research Fund, U.K, 25(2), 266–270. doi:10.1038/leu.2010.258

Paulsson, K., Säll, T., Fioretos, T., Mitelman, F., & Johansson, B. (2001). The

incidence of trisomy 8 as a sole chromosomal aberration in myeloid

malignancies varies in relation to gender, age, prior iatrogenic genotoxic

exposure, and morphology. Cancer Genetics and Cytogenetics, 130, 160–165.

doi:10.1016/S0165-4608(01)00486-1

Perea, G., Lasa, a, Aventín, a, Domingo, a, Villamor, N., Queipo de Llano, M. P.,

Nomdedéu, J. F. (2006). Prognostic value of minimal residual disease (MRD) in

acute myeloid leukemia (AML) with favorable cytogenetics [t(8;21) and inv(16)].


Research Fund, U.K, 20, 87–94. doi:10.1038/sj.leu.2404015

Peterson, L. F., & Zhang, D.-E. (2004). The 8;21 translocation in leukemogenesis.

Oncogene, 23, 4255–4262. doi:10.1038/sj.onc.1207727

Pierre, R. V., & Hoagland, H. C. (1972). Age-associated aneuploidy: Loss of Y

chromosome from human bone marrow cells with aging. Cancer, 30(4), 889–

894. doi:10.1002/1097-0142(197210)30:4<889::AID-

CNCR2820300405>3.0.CO;2-1

Preudhomme, C., Sagot, C., Boissel, N., Cayuela, J., Tigaud, I., Botton, D., Fenaux,

P. (2002). Favorable prognostic significance of CEBPA mutations in patients

with de novo acute myeloid leukemia : a study from the Acute Leukemia French

Association (ALFA). October, 100(8), 2717–2723. doi:10.1182/blood-2002-03-

0990.Supported

Bibliografía 203

Rabbitts, T. H., & Rabbitts, T. H. (1994). Chromosomal translocations in human

cancer. Nature, 372(6502), 143–9. doi:10.1038/372143a0

Raza, S., Tahernazerhussain, F., Patnaik, M., Knudson, R., Van Dyke, D., & Tefferi,

A. (2011). Autosomal monosomies among 24,262 consecutive cytogenetic

studies: Prevalence, chromosomal distribution and clinicopathologic correlates

of sole abnormalities. American Journal of Hematology, 86(January), 353–356.

doi:10.1002/ajh.21988

Relación dinámica entre las regiones HSR y los cromosomas doble diminutos

(Dmin). Retomado de

(http://gmein.uib.es/registro/informacion/investigadores/informacion384.htm)

Ritchie, E. K., & Lachs, M. S. (2009). Management of myelodysplastic syndromes in

the geriatric patient. Current Hematologic Malignancy Reports, 4(1), 3–9.

doi:10.1007/s11899-009-0001-x

Rodak, B.F., & Carr, J.H. (2012).Clinical Hematology Atlas.Elsevier Health

Sciences.Schmaier, A. H., & Lazarus, H. M. (Eds.).(2011). Concise Guide to

Hematology.John Wiley & Sons.

Ross, M. H., & Pawlina, W. (2007). Histología.Ed. Médica Panamericana.

Rowley, J. D. (1973). Letter: A new consistent chromosomal abnormality in chronic

myelogenous leukaemia identified by quinacrine fluorescence and Giemsa

staining. Nature, 243(5405), 290–293. doi:10.1038/243290a0

Rowley, J. D. (1998). The critical role of chromosome translocations in human

leukemias. Annual Review of Genetics, 32, 495–519.

doi:10.1146/annurev.genet.32.1.495

Rowley, J. D. (2000). Molecular genetics in acute leukemia. Leukemia, 14(August

1999), 513–517. doi:10.1038/sj.leu.2401600

Rubnitz, J.E., Raimondi, S.C., Tong, X., Srivastava, D.K., Razzouk, B .I., Shurtleff,

S. A., & Downing, J.R., Pui, C.H., Ribeiro, R.C. and Behm, F. G. (2002).

Favorable Impact of the t(9;1 1) in Childhood Acute Myeloid Leukemia. Journal

of Clinical Oncology, 20, 2302–2309. doi:10.1200/JCO.2002.08.023


Saavedra, C., Quijano, S. M., Romero, M., Jaramillo, R., Orduz, R., Echeverri, C.,

Orfao, A. (2010). Reporte del Primer Consenso Colombiano de Citometría de

Flujo para el estudio de trastornos hematológicos. Biomédica, 30, 11–21.

Sala M, Blanco B, Perez M, P. M. (2002). 10. Hematología clínica. Farmacia

Hospitalaria, 1031–1076.

Sanz, M. A. (2006). Treatment of acute promyelocytic leukemia. The New England

Journal of Medicine, 2006, 147–155. doi:10.1056/NEJMc1309895#SA1

Sawyers, C. L., Wittet, O. N., & Angeles, L. (1991). Leukemia and the Disruption of

Normal Hematopoiesis, 64, 1991.

Sayehmiri, K., Eshraghian, M. R., Mohammad, K., Alimoghaddam, K., Foroushani,

A. R., Zeraati, H.,& Ghavamzadeh, A. (2008). Prognostic factors of survival

time after hematopoietic stem cell transplant in acute lymphoblastic leukemia

patients: Cox proportional hazard versus accelerated failure time

models. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research, 27(1), 1-9.

Shaffer, L. G., McGowan-Jordan, J., & Schmid, M. (Eds.). (2013). ISCN 2013: An

International System for Human Cytogenetic Nomenclature (2013). Karger

Medical and Scientific Publishers

Schanz, J., Tüchler, H., Solé, F., Mallo, M., Luño, E., Cervera, J., … Haase, D.

(2012). New comprehensive cytogenetic scoring system for primary

myelodysplastic syndromes (MDS) and oligoblastic acute myeloid leukemia

after MDS derived from an international database merge. Journal of Clinical

Oncology, 30(8), 820–829. doi:10.1200/JCO.2011.35.6394

Schlegelberger, B., Göhring, G., Thol, F., & Heuser, M. (2012). Update on

cytogenetic and molecular changes in myelodysplastic syndromes. Leukemia &

Lymphoma, 53(4), 525–36. doi:10.3109/10428194.2011.618235

Schmaier, A., & Lazarus, H. M. (2012).Concise Guide to Hematology. (Wiley-

Blackwell, Ed.) (1st ed.). Blackwell Publishing Ltda.

Sharma, S. V, Bell, D. W., Settleman, J., & Haber, D. a. (2007). Epidermal growth

factor receptor mutations in lung cancer. Nature Reviews. Cancer, 7(3), 169–

181. doi:10.1038/nrc2088

Bibliografía 205

Silverman, L. R. (2001). Targeting hypomethylation of DNA to achieve cellular

differentiation in myelodysplastic syndromes (MDS).The Oncologist, 6 Suppl

5(suppl 5), 8–14. doi:10.1634/theoncologist.6-suppl_5-8

Sloand, E. M., Pfannes, L., Chen, G., Shah, S., Solomou, E. E., Barrett, J., & Young,

N. S. (2007). CD34 cells from patients with trisomy 8 myelodysplastic syndrome

(MDS) express early apoptotic markers but avoid programmed cell death by up-

regulation of antiapoptotic proteins. Blood, 109(6), 2399–2405.

doi:10.1182/blood-2006-01-030643

Slovak, M. L., Kopecky, K. J., Cassileth, P. a, Harrington, D. H., Theil, K. S., Paietta,

E., Mohamed, A. (2000). Karyotypic analysis predicts outcome of preremission

and postremission therapy in adult acute myeloid leukemia : a Southwest

Oncology Group / Eastern Cooperative Oncology Group study Karyotypic

analysis predicts outcome of preremission and postremission t, 96(13), 4075–

4083.

Smith, S. M., Le Beau, M. M., Huo, D., Karrison, T., Sobecks, R. M., Anastasi, J.,

Larson, R. a. (2003). Clinical-cytogenetic associations in 306 patients with

therapy-related myelodysplasia and myeloid leukemia: The University of

Chicago series. Blood, 102(1), 43–52. doi:10.1182/blood-2002-11-3343

Stasevich, I., Utskevich, R., Kustanovich, A., Litvinko, N., Savitskaya, T.,

Chernyavskaya, S., Aleinikova, O. (2006). Translocation (10;11)(p12;q23) in

childhood acute myeloid leukemia: incidence and complex mechanism. Cancer

Genetics and Cytogenetics, 169(2), 114–120.


Steffen, B., Müller-Tidow, C., Schwäble, J., Berdel, W. E., & Serve, H. (2005). The

molecular pathogenesis of acute myeloid leukemia. Critical Reviews in

Oncology/hematology, 56(2), 195–221. doi:10.1016/j.critrevonc.2004.10.012

Suzukawa, B. K., Parganas, E., Gajjar, A., Abe, T., Takahashi, S., Tani, K., James,

N. (1994). Identification of a Breakpoint Cluster Region 3’ of the Ribophorin I

Gene at 3q21 Associated With the Transcriptional Activation of the EVIl Gene

in Acute Myelogenous Leukemias With inv(3)(q21q26), 84(8), 2681–2688.

Swansbury, G. J., Slater, R., Bain, B. J., Moorman, a V, & Secker-Walker, L. M.

(1998). Hematological malignancies with t(9;11)(p21-22;q23)--a laboratory and


clinical study of 125 cases. European 11q23 Workshop participants. Leukemia :

Official Journal of the Leukemia Society of America, Leukemia Research Fund,

U.K, 12(5), 792–800.

Swerdllow, S. H., Campo, E., & Harris, N. L. (2008). WHO classification of tumours

of haematopoietic and lymphoid tissues.France: IARC Press, 2008.

Tiu, R. V., Visconte, V., Traina, F., Schwandt, A., & Maciejewski, J. P. (2011).

Updates in cytogenetics and molecular markers in MDS. Current hematologic

malignancy reports, 6(2), 126-135.

Thiede, C., Steudel, C., Mohr, B., Schaich, M., Schaekel, U., Bornhaeuser, M., Illmer,

T. (2001). Analysis of FLT3-activating mutations in 713 patients with acute

myelogenous leukemia (AML): High prevalence in FAB-subtype M5 and

identification of subgroups with poor prognosis. Blood, 98(12), 2994.

Udayakumar, A. M., Alkindi, S., Pathare, A. V., & Raeburn, J. A. (2008). Complex

t(8;13;21)(q22;q14;q22)-A Novel Variant of t(8;21) in a Patient with Acute

Myeloid Leukemia (AML-M2). Archives of Medical Research, 39(0188), 252–

256. doi:10.1016/j.arcmed.2007.09.002

Valk, P. J. M., Verhaak, R. G. W., Beijen, M. A., Erpelinck, C. a J., Barjesteh van

Waalwijk van Doorn-Khosrovani, S., Boer, J. M., Delwel, R. (2004).

Prognostically useful gene-expression profiles in acute myeloid leukemia. The

New England Journal of Medicine, 350, 1617–1628.

doi:10.1056/NEJMoa040465

Vallespí, T., Imbert, M., Mecucci, C., Preudhomme, C., & Pierre, F. (1998).

Diagnosis, classification, and cytogenetics of myelodysplastic syndromes, 258–

275.

Van De Loosdrecht, A. a., Alhan, C., Béné, M. C., Della Porta, M. G., Dräger, A. M.,

Feuillard, J., Westers, T. M. (2009). Standardization of flow cytometry in

myelodysplastic syndromes: Report from the first European LeukemiaNet

working conference on flow cytometry in myelodysplastic syndromes.

Haematologica, 94, 1124–1134. doi:10.3324/haematol.2009.005801

Van Dongen, J. J. M., Lhermitte, L., Böttcher, S., Almeida, J., van der Velden, V. H.

J., Flores-Montero, J., Orfao, a. (2012). EuroFlow antibody panels for

Bibliografía 207

standardized n-dimensional flow cytometric immunophenotyping of normal,

reactive and malignant leukocytes. Leukemia, 26(9), 1908–1975.

doi:10.1038/leu.2012.120

Vardiman JW, Thiele J, A. D. E. A. (2009). The 2008 revision of the WHO

classification of myeloid neoplasms and acute leukemia: rationale and important

changes., 114(5), 937–952. doi:10.1182/blood-2009-03-209262.

Vardiman, J. W., Harris, N. L., & Brunning, R. D. (2002). The World Health

Organization (WHO) classification of the myeloid neoplasms. Blood, 100(7),

2292–302. doi:10.1182/blood-2002-04-1199

Weibull Analysis. .(http://www.isograph.com/software/availability-workbench/weibull-

analysis/?gclid=Cj0KEQjwy7qrBRC4lp7_hM3dgIoBEiQA72pCnmflFZ3rCKsy

M3bS3vsFWkDP9A2M94gp7JPaYMrbgsIaAmlT8P8HAQ)

Weisberg, E., Manley, P. W., Breitenstein, W., Brüggen, J., Cowan-Jacob, S. W.,

Ray, A., Griffin, J. D. (2005). Characterization of AMN107, a selective inhibitor

of native and mutant Bcr-Abl. Cancer Cell, 7(2), 129–141.

doi:10.1016/j.ccr.2005.01.007

Weiss, M. M., Hermsen, M. a., Meijer, G. a., van Grieken, N. C., Baak, J. P., Kuipers,

E. J., & van Diest, P. J. (1999). Comparative genomic hybridisation. Molecular

Pathology, 52(5), 243–251. doi:10.1136/mp.52.5.243

Welsch, U. (2008). Histología. Ed. Médica Panamericana.

West, R. R., Stafford, D. A., White, A. D., Bowen, D. T., & Padua, R. A. (2000).

Cytogenetic abnormalities in the myelodysplastic syndromes and

occupational or environmental exposure. Blood, 95(6), 2093-2097.

Wiktor, A., Rybicki, B. A., Piao, Z. S., Shurafa, M., Barthel, B., Maeda, K., & Van

Dyke, D. L. (2000). Clinical significance of Y chromosome loss in hematologic

disease. Genes, Chromosomes and Cancer, 27(1), 11-16.

Zabarovsky, E. R., Lerman, M. I., & Minna, J. D. (2002). Tumor suppressor genes on

chromosome 3p involved in the pathogenesis of lung and other cancers.

Oncogene, 21(45), 6915–6935. doi:10.1038/sj.onc.1205835


Zeidan, A., & Phatak, P. (2008). Acquired biclonal chromosome X aberrations without

autosomal chromosomal anomalies in acute myeloid leukemia. Cancer genetics

and cytogenetics, 181(2), 125-130.

Zhang, L., Huang, J., Yang, N., Greshock, J., Megraw, M. S., Giannakakis, A., …

Coukos, G. (2006). microRNAs exhibit high frequency genomic alterations in

human cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United

States of America, 103(24), 9136–9141. doi:10.1073/pnas.0508889103

Documents

ANÁLISIS CROMOSÓMICO POR MEDIO DE TÉCNICAS …bdigital.unal.edu.co/49961/1/5599284.2015.pdf · con estas patologías por medio de técnicas citogenéticas convencionales y moleculares