“ANÁLISIS DE LA CLONALIDAD DE LA RESPUESTA INMUNITARIA …

I

UNIVERSIDAD DE CANTABRIA

Facultad de Medicina

Dpto. de Biología Molecular

“ANÁLISIS DE LA CLONALIDAD DE LA RESPUESTA

INMUNITARIA EN LA PANCREATITIS AUTOINMUNE”

Tesis doctoral presentada por María Sánchez Castañón para optar al Grado de

Doctor por la Universidad de Cantabria.

Santander, Diciembre de 2010

II

III

Facultad de Medicina

DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA MOLECULAR

D. MARCOS LÓPEZ HOYOS, Doctor en Medicina y Cirugía y Facultativo

Especialista de Área de Inmunología del Hospital Universitario Marqués de

Valdecilla

CERTIFICA QUE, el trabajo de investigación titulado “Análisis de la clonalidad

de la respuesta inmunitaria en la pancreatitis autoinmune” presentado por D.

MARÍA SÁNCHEZ CASTAÑÓN para optar al grado de Doctor en Biología, ha

sido realizado en el Departamento de Biología Molecular de la Universidad de

Cantabria y en el Servicio de Inmunología del Hospital Universitario Marqués

de Valdecilla bajo mi dirección.

Examinado el trabajo considero que está adecuadamente elaborado para su

lectura y defensa pública y ante la Comisión que ha de juzgar la Tesis Doctoral.

Y para que conste y surta los efectos oportunos, expido este certificado en

Santander a 1 de diciembre de 2010.

Hospital Universitario

Marqués de Valdecilla

IV

V

Jesús Merino Pérez, Catedrático de Inmunología de la Universidad

de Cantabria y Coordinador del grupo de investigación

“Inmunopatología”

EXPONE:

Que, desde abril de 2009, ha llevado a cabo las funciones de

TUTOR de la Licenciada en CC Biológicas y en Bioquímicas Maria

Sánchez Castañón durante el periodo de DOCTORADO en el

Programa Biología Molecular y Biomedicina. Durante este periodo

he desarrollado el proyecto de investigación titulado “Analisis de la

clonalidad de la respuesta inmunitaria en la pancreatitis

autoinmune” bajo la dirección científica del Dr Marcos López Hoyos,

Medico Adjunto de Inmunología del Hospital Universitario Marqués

de Valdecilla.

Lo que hace constar, a efectos de admisión de la Tesis Doctoral, en

Santander a 1 de diciembre de dos mil diez.

Fdo: Jesús Merino Pérez

VI

VII

AA mmii mmaaddrree,, ppoorr ssuu aammoorr iinnccoonnddiicciioonnaall

AA mmii hheerrmmaannoo llaa mmeejjoorr ppeerrssoonnaa qquuee ccoonnoozzccoo

AA mmii ttiioo LLuuiiss qquuee eess ccoommoo uunn ppaaddrree ppaarraa mmíí

AA mmii ppaaddrree yy mmiiss aabbuueellooss ppoorrqquuee ssoonn llooss

áánnggeelleess qquuee ddeessddee eell cciieelloo mmee pprrootteeggeenn

VIII

IX

QQuuee nnaaddiiee llee ddiiggaa lloo qquuee ttiieennee qquuee hhaacceerr aa aallgguuiieenn

qquuee yyaa hhaa ddeecciiddiiddoo ccuuááll ddeebbee sseerr ssuu ddeessttiinnoo

X

XI

AGRADECIMIENTOS

Al Dr. Marcos López Hoyos por confiar en mí desde el principio, por darme la

oportunidad de emprender este camino y por sus buenas ideas.

Al Dr. Gonzalo de las Heras del servicio de Digestivo por ser el primero en

preocuparse por unos pacientes con una enfermedad tan desconocida y

porque sin su inestimable ayuda y apoyo esta tesis no hubiera sido posible.

Al Dr. Andrés Insunza del servicio de Hematología porque ha sabido como

nadie trasmitirme sus conocimientos, que tanto me han servido en la

elaboración de esta tesis y que serán de gran utilidad en el futuro.

Al Dr. Javier Gómez Román y a Servando Lazuén del servicio de Anatomía

patológica por su colaboración en parte de este trabajo.

A todo el servicio de Inmunología que siempre ha estado ahí, en especial a

Carmen Gómez por su ayuda y apoyo en los malos momentos, a todos mis

compañeros de especialidad porque la unión hace la fuerza y a Carolina Santa

Cruz que siempre esta dispuesta a colaborar con su mejor sonrisa.

Al Dr. Francisco Leiva Cobian Jefe de Servicio y al Dr. Gonzalo Ocejo del

Servicio de Inmunología por los consejos que me dieron y no supe comprender.

A los Dr. Jesús y Ramón Merino por ayudarme y comprenderme en los

momentos difíciles y por aceptarme en su departamento como una más.

A los pacientes el verdadero motor de esta tesis, porque espero que toda

esta investigación les pueda ayudar en algo.

A mi hermano por sus excelentes diseños gráficos, como la portada de esta

tesis.

Por último, los más importantes en mi corazón, a toda mi familia y amigos

porque ellos nunca me fallarán.

XII

1

ÍNDICE

ÍÍÍÍÍÍÍÍNNNNNNNNDDDDDDDDIIIIIIIICCCCCCCCEEEEEEEE

2

3

ÍNDICE

ÍNDICE

Lista de tablas …………………………………………………………………….... 12

Lista de figuras ……………………………………………………………………... 15

Abreviaturas ……………………………………………………………………....... 20

1. INTRODUCCIÓN ………………………………………………………………... 24

1.1. Pancreatitis autoinmune. Antecedentes ……………………………….... 25

1.2. Definición y concepto ……………………………………………………… 26

1.3. Epidemiología ………………………………………………………………. 27

1.4. Patogénesis …...……………………………………………………………. 28

1.5. Pancreatitis autoinmune experimental en modelos animales ............... 34

1.6. Características clínicas ……………………………………………………. 37 1.7. Afectación extrapancreática en la ISD .................................................. 39

1.7.1. Afectación del tracto biliar ……………...………………………….. 39

1.7.2. Afectación hepática ..................................................................... 40

1.7.3. Afectación de la vesícula biliar ……………………………………. 41

1.7.4. Afectación del tracto gastrointestinal ……………………………... 42

1.7.5. Afectación del glándulas salivares y lacrimales ….……………… 42

1.7.6. Afectación renal .......................................................................... 44

1.7.7. Afectación del retroperitoneo y del mesenterio …………………. 45

1.7.8. Afectación del tiroides ................................................................. 46

1.7.9. Afectación de mamas ………………………………………………. 46

1.7.10. Afectación pulmonar ..…………………………………………….. 47

1.7.11. Afectación de la próstata …………………………………………. 48

4

ÍNDICE

1.7.12. Afectación de nódulos linfoides ………………………………….. 48

1.8. Histopatología ………………………………………………………………. 50

1.9. Estudios de imagen ………………………………………………………... 55

1.9.1. Ultrasonografía ……………………………………………………… 55

1.9.2. Tomografía computerizada (CT) ………………………………….. 55

1.9.3. Resonancia magnética (RM) y Colangio-pancreatografía por RM (CPRM) ................................................................................ 57

1.9.4. Colangio-pancreatografía retrógada endoscópica (CPRE) ……. 57

1.9.5. Ultrasonografía endoscópica (USE) ……………………………… 58

1.10. Marcadores serológicos …………………………………………………. 60

1.10.1. Niveles séricos elevados de inmunoglobulina G4 (IgG4) …….. 60

1.10.2 Autoanticuerpos ……………………………………………………. 65

1.10.2.1. Anticuerpos anti-anhidrasa carbónica (AC) .…………........ 66

1.10.2.1.a. Expresión de los isoenzimas de la CAen el páncreas 66

1.10.2.1.b. Papel fisiológico de los isoenzimas de la CA en el páncreas ..................................................................... 68

1.10.2.1.c. Las AC como dianas antigénicas en la PAI ………….. 69

1.10.2.1.d. Anticuerpos anti-AC II como marcadores serológicos en la PAI …………………………………………………. 72

1.10.2.2. Anticuerpos anti-lactoferrina (LF) …………………………… 73

1.10.2.3. Anticuerpos anti-amilasa α-2A (AMY α-2A) ……………….. 74

1.10.2.4. Anticuerpos anti-inhibidor de secreción de tripsina pancreática (PSTI) …………………………………………... 75

1.10.2.5. Anticuerpos anti-péptido de la proteína de unión al plaminógeno (PBP) …………………………………………… 77

1.10.2.6. Anticuerpos anti-tripsinógeno (PRSS) ……………………… 78

1.12. Diagnóstico de la PAI .......................................................................... 79

5

ÍNDICE

1.12.1. Criterios diagnósticos ................................................................ 79

1.12.1.1. Criterios diagnósticos Japoneses ……………………..……. 79

1.12.1.2. Criterios diagnósticos Coreanos ……………………………. 80

1.12.1.3. Criterios diagnósticos de Estados Unidos …………………. 81

1.12.1.4. Comparación de los tres criterios …………………………… 83

1.12.2. Diagnóstico de la PAI tipo 1 ……………………………………… 84

1.12.2.1. Estudios de imagen + serológía o histología compatibles .. 84

1.12.2.2. Diagnóstico histológico/inmunohistoquímico ………………. 84

1.12.2.3. Respuesta a esteroides ……………………………………… 85

1.12.3. Diagnóstico de la PAI tipo 2 ……………………………………… 85

1.13. Tratamiento ……………………………………………………………….. 86

1.14. Diagnóstico erróneo ……………………………………………………… 89

1.14.1. Diagnóstico erróneo de cáncer de páncreas como PAI ………. 89

1.14.2. Diagnóstico erróneo de dolor abdominal crónico como PAI …. 91

1.14.3. Diagnóstico erróneo de PAI como cáncer de páncreas ............ 92

1.15. Autoinmunidad y linfomagénesis ……………………………………….. 94

1.15.1. Enfermedades autoinmunes asociadas con riesgo de linfomas 95

1.15.1.1. Enfermedades asociadas con un riesgo significativo de linfomas ………………………………………………………... 95

1.15.1.2. Enfermedades asociadas probablemente con linfomas …. 96

1.15.2. Subtipos de linfomas asociados con enfermedades autoinmunes ……………………………………………………….. 97

1.15.3. Factores de riesgo ………………………………………………… 97

1.15.3.1. Factores de riesgo clínicos ………………………………….. 97

1.15.3.2. Factores de riesgo asociados con el tratamiento ………… 98

1.15.3.3. Factores de riesgo biológicos ……………………………….. 99

6

ÍNDICE

1.15.3.3.a. Selección antigénica …………………………………… 100

1.15.3.3.b. Papel de BAFF (BLyS) ………………………………… 100

1.15.4. Posibles modelos de autoinmunidad y linfomagénesis …….. 101

1.15.5. Linfomas en la enfermedad esclerosante asociada a IgG4 ... 104

2. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS …………………………………………………... 106

2.1. Hipótesis …………………………………………………………………… 107

2.2. Objetivos …………………………………………………………………... 108

2.2.1. Diagnóstico serológico diferencial de PAI ……………………… 108

2.2.2. Estudio de clonalidad en la PAI …………………………………. 108

2.2.3. Estudio del riesgo de cáncer en la PAI …………………………. 109

3. MATERIAL Y MÉTODOS …………………………………………………...... 110

3.1. Utilidad diagnóstica de los marcadores serológicos en la PAI ………. 111

3.1.1. Pacientes y diseño del estudio …………………………………... 111

3.1.2. Algoritmo diagnóstico de la PAI …………………………………. 113

3.1.3. Medición de los nivéles séricos de IgG y de IgG4 …………….. 114

3.1.4. Detección de los anticuerpos anti-AC II en suero ……………... 114

3.1.5. Detección de los anticuerpos anti-AMY α ………………………. 118

3.1.6. Análisis estadístico …………………………………………….….. 121

3.2. Utilidad diagnóstica de la IgG y la IgG4 en la PAI ……………………. 121


3.2.2. Medición de los nivéles séricos de IgG y de IgG4 ….…….…… 122

3.2.3. Análisis estadístico ……………………………………..…………. 122

7

ÍNDICE

3.3. Correlación entre la IgG4 y la afectación extrapancreática en la PAI 123


3.3.2. Medición de los nivéles séricos de IgG y de IgG4 …………….. 123

3.3.3. Análisis estadístico ……………………………………………….. 123

3.4. Caracterización clínica de los pacientes con PAI, sospecha de PAI y pancreatitis crónica idiopática …………………………………………… 124

3.5. Niveles séricos de CA 19.9 y utilidad diagnóstica de los anticuerpos anti-CA 19.9 ……………………………………………………………….. 125

3.5.1. Pacientes y diseño del estudio ……………………………………125

3.5.2. Detección de los anticuerpos anti-CA 19.9 en suero …………. 126

3.5.3. Análisis estadístico ................................................................... 128

3.6. Análisis de la presencia de anticuerpos anti-p53 ………………………129


3.6.2. Detección de los anticuerpos anti-p53 en suero ………………. 129

3.6.3. Análisis estadístico ………………………………………………... 131

3.7. Análisis de los niveles séricos de Interleucina-6 ……………………… 132


3.7.2. Cuantificación de los niveles séricos de IL-6 …………………... 132


3.8. Estudio de las subpoblaciones linfocitarias en pacientes con PAI, sospecha de PAI y pancreatitis crónica idiopática .............................. 135


3.8.2. Marcaje superficial por citometría de flujo ……………………… 136

3.8.3. Resultados …………………………………………………………. 139

3.8.4. Análisis estadístico ………………………………………………... 139 3.9. Análisis inmunofenotípico de las subpoblaciones de células B en pacientes con PAI, sospecha de PAI y pancreatitis crónica idiopática 140

8

ÍNDICE


3.9.2. Aislamiento de PBMCs …………………………………………… 141

3.9.3. Marcaje superficial por citometría de flujo ……………………… 141

3.9.4. Marcaje intracelular por citometría de flujo …………………….. 142

3.9.5. Análisis inmunofenotípico ………………………………………… 143

3.9.5.1.Clasificación IgD/CD27 …………………………………….. 144

3.9.5.2.Clasificación CD38/IgD …………………………………….. 145

3.9.5.3.Anális de clonalidad de células plasmáticas .................... 146


3.10. Estudio de cadenas ligeras libres y ratios Kappa/Lambda en pacientes con PAI, sospecha de PAI y pancreatitiscrónica idiopática 148

3.10.1. Pacientes y diseño del estudio …………………………………. 148

3.10.2. Cuantificación de las cadenas ligeras libres en suero ……….. 149

3.10.3. Interpretación de los resultados ………………………………... 149

3.10.4. Análisis estadístico ………………………………………………. 150

3.11. Estudio de proteínas monoclonales en pacientes con PAI, sospecha de PAI y pancreatitis crónica idiopática …………………...152


3.11.2. Detección de proteínas monoclonales ………………………… 152

3.11.3. Análisis estadístico ………………………………………………. 153

3.12. Analisis de clonalidad de células B en infiltrados linfoplasmocíticos en lesiones pancreáticas y extrapancreáticas en pacientes con PAI, sospecha de PAI y pancreatitis crónica idiopática …………………... 153


3.12.2. Análisis de reordemientos clonales del gen IgH ……………....154

3.12.2.1.Fundamentos del ensayo ………………………………… 154

9

ÍNDICE

3.12.2.2. Pasos previos …………………………………………….. 155

3.12.2.2.a. Extracción del DNA de tejidos embebidos en parafina ………………………………………………. 155

3.12.2.2.b. Cuantificación del DNA .......................................... 155

3.12.2.3. Protocolo de ensayo ……………………………………... 156

3.12.2.3.a. Reacción de amplificación …………………………. 156

3.12.2.3.b. Amplificación ………………………………………… 156

3.12.2.3.c. Análisis de los productos amplificados mediante electroforesis en gel ………………………………… 157

3.12.2.4. Interpretación de los resultados …………………………… 157

3.12.2.4.a. Control interno de amplificación (CI) ………………... 157

3.12.2.4.b. Reordenamientos de Fragmentos IgH………………. 158

3.12.2.4.b.1. Controles positivos y negativos de amplificación 158

3.12.2.4.b.2. Análisis de la muestra problema ………………… 159

3.13. Analisis mutacional de K-ras en páncreas y lesiones de pacientes con PAI, sospecha de PAI ypancreatitis crónica idiopática …….... 160


3.13.2. Análisisis mutacional de K-Ras ………………………………... 162

3.13.2.1. Fundamentos del ensayo .............................................. 162

3.13.2.1.a. Tecnología ARMS …………………………………... 163

3.13.2.1.b. Tecnología Scorpions ………………………………. 163

3.13.2.1.c. Análisis de los datos: método ∆Ct ………………... 163

3.13.2.2. Protocolo de ensayo ……………………………………... 164

3.12.2.2.a. Configuración experimental del sistema ABI7500 164

3.12.2.2.b. Configuración del equipo ABI7500 ………………... 166

3.12.2.2.c. Análisis de las muestras en el sistema ABI 7500 .. 166

10

ÍNDICE

3.13.2.3. Interpretación de los resultados del sistema ABI7500 .. 167

3.12.2.3.a. Valores de Ct de control ……………………………. 167

3.12.2.3.b. Valores de ∆Ct de la mezcla estándar …………… 168

3.12.2.3.c. Valores de ∆Ct de la muestra ………………………168

4. RESULTADOS ………………………………………………………………….170

4.1. Utilidad diagnóstica de los marcadores serológicos en la PAI ……….171

4.1.1. Prevalencia de los marcadores serológicos ………………….... 171

4.1.2. Valor diagnóstico de los niveles elevados de IgG4,los Abs anti-CA II, y los Abs anti-AMY α ………………………………… 175

4.1.3. Valor diagnóstico de la combinación de los marcadores serológicos ………………………………………………………… 177

4.2. Utilidad diagnóstica de la IgG y la IgG4 en la PAI ……………………. 179

4.3. Correlación entre la IgG4 y la afectación extrapancreática en la PAI 186

4.3.1. Diferencias entre PAI con IgG4 > 190 mg/dl e IgG4 < 190 mg/dl ........................................................................................ 187

4.3.2. Diferencias entre sospecha PAI con IgG4 >190 mg/dl e IgG4 <190 mg/dl ............................................................................... 189

4.3.3. Diferencias entre PCI con IgG4 >190 mg/dle IgG4 <190 mg/dl 190

4.3.4. Diferencias globales entre PAI,Sospecha PAI y PCI con IgG4 > 190mg/dl e IgG4 < 190 mg/dl …………………………………. 191

4.4. Caracterización clínica de los pacientes con PAI, sospecha de PAI y pancreatitis crónica idiopática ………………………………………….. 192

4.5. Niveles séricos de CA 19.9 y utilidad diagnóstica de los anticuerpos anti-CA 19.9 …………………………………………………………….... 196

4.6. Análisis de la presencia de anticuerpos anti-P53 …………………….. 201

4.7. Análisis de los niveles séricos de Interleucina-6 ……………………… 203

4.8. Estudio de las subpoblaciones linfocitarias en pacientes con PAI, sospecha de PAI y pancreatitis crónica idiopática ……………………. 204

11

ÍNDICE

4.9. Análisis inmunofenotípico de las subpoblaciones de células B en pacientes con PAI, sospecha de PAI y pancreatitis crónica idiopática 209

4.10. Estudio de cadenas ligeras libres y de los ratios Kappa/Lambda en pacientes con PAI, sospecha de PAI y pancreatitis crónica idiopática …………………………………………………………………. 222

4.10.1. Oscilaciones de los niveles de sFLC y de los ratios k/λ en pacientes con sospecha de PAI y PCI ………………………... 226

4.10.2. Influencia del tratamiento esteroideo en los niveles de sFLC y los ratios k/λ en pacientes con PAI ………………………… 227

4.10.3. Alteraciones al diagnóstico en los niveles de sFLCy de los ratios k/λ ………………………………………………………….. 228

4.10.4. Alteraciones en el tiempo de los niveles de sFLC y de los ratios k/λ ………………………………………………………….. 230

4.10.5. Cambios en los niveles desFLC y ratios k/λ en función de la ausencia/presencia de afectación extrapancreática ………… 232

4.10.6. Correlación entre los niveles de IgG4 y los de sFLC o los ratios k/λ ………………………………………………………….. 232

4.10.7. Monitorización de los niveles de sFLC y de los ratios k/λ en pacientes con PAI ………………………………………………. 233

4.11. Análisis de inmunoglobulinas monoclonales en pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI ………………………………………………… 238

4.12. Analisis de clonalidad de células B en infiltrados infoplasmocíticos en pacientes con PAI, sospecha de PAI y pancreatitis crónica idiopática ………………………………………………………………… 239

4.13. Analisis mutacional de K-ras en páncreas y lesiones extrapancreáticas de pacientes con PAI, sospecha de PAI y pancreatitis crónica idiopática …………………………………………. 241

5. DISCUSIÓN ……………………………………………………………………. 245

5.1. Utilidad diagnóstica de los marcadores serológicos en la PAI ……… 249

5.2. Utilidad de la IgG y la IgG4 en el diagnóstico de la PAI ……………... 254

5.3. Niveles séricos de IgG4 y afectación extrapancreática ……………... 255

12

ÍNDICE

5.4. Características clínicas de los pacientes ………………………………. 258

5.5. Niveles de CA 19.9 y anticuerpos anti-CA 19.9 en la PAI ………….. 261

5.6. Subpoblaciones linfocitarias en la PAI …………………………………. 264

5.7. Subpoblaciones de células B en la PAI ………………………………... 265

5.8. Anticuerpos anti-P53 en la PAI ………………………………………… 271

5.9. Niveles de IL-6 en la PAI ………………………………………………… 274

5.10. Cadenas ligeras libres en la PAI ………………………………………. 275

5.11. Inmunoglobulinas monoclonales circulantes en la PAI ……………... 280

5.12. Clonalidad de células B en infiltrados linfoplasmocíticos en la PAI .. 281

5.13. Analisis mutacional de K-ras en lo órganos afectados en la PAI ….. 283

5.14. Analisis global del riesgo de malignidad en la PAI ………………….. 286

6. CONCLUSIONES ..……………………………………………………………. 292

7. BIBLIOGRAFÍA ………………………………………………………………… 298

13

LISTA DE TABLAS

LISTA DE TABLAS

TABLA 1. Características de autoinmunidad encontradas en la PAI ………... 29

TABLA 2. Características clínicas de la pancreatitis autoinmune ................... 39

TABLA 3. Órganos afectados en la enfermedad esclerosante asociada a IgG4 …………………………………………………………………….. 49

TABLA 4. Datos demográficos, perfil clínico, tratamiento y seguimiento de PAI tipo 1 y 2 …………………………………………………………… 54

TABLA 5. Detalles de los 7 estudios sobre la utilidad de la IgG4 en el diagnóstico de la PAI ………………………………………………….. 64

TABLA 6. Detalles de los 7 estudios sobre la utilidad de la IgG4 en el diagnóstico de la PAI ...................................................................... 65

TABLA 7. Criterios diagnósticos para la PAI (2006) en Japón ……………….. 80

TABLA 8. Criterios diagnósticos para la PAI (2006) en Corea ....................... 81

TABLA 9. Criterios diagnósticos para la PAI ( Criterios HISORT, Clínica Mayo) .............................................................................................. 82

TABLA 10. Pautas cínicas que ayudan a evitar el diagnóstico erróneo de la PAI ……………………………………………………………………... 93

TABLA 11. Características generales de los pacientes incluidosen el estudio 112

TABLA 12. Características generales de los pacientes incluidosen el estudio 122

TABLA 13.Características generales de los pacientes incluidosen el estudio 123

TABLA 14.Características generales de los pacientes incluidos en el estudio 125






TABLA 20. Panel para el marcaje de células B ............................................. 143

TABLA 21. Perfil inmunofenotípico de las subpoblaciones de células B …… 144

14

LISTA DE TABLAS




TABLA 25. Muestras analizadas en los pacientes incluidos en el estudio …. 154

TABLA 26. Rango de tamaños esperado de los fragmentos amplificados .... 158


TABLA 28. Muestras analizadas en los pacientes incluidos en el estudio …. 161

TABLA 29. Mutaciones en el gen K-ras detectadas mediante el kit de DxS 162

TABLA 30. Volúmenes de “Master mix” ......................................................... 15

TABLA 31. Disposición de la placa de K-ras en el sistema ABI7500 ………. 166

TABLA 32. Ciclos en el sistema ABI 7500 ..................................................... 166

TABLA 33. Valores de ∆Ct de la mezcla estándar y puntos de corte del 1% en el sistema ABI7500Ciclos en el sistema ABI 7500 …………... 169

TABLA 34. Niveles séricos de IgG y de IgG4 en los sujetos de estudio ….... 172

TABLA 35. Marcadores serológicos de PAI en los grupos incluidos en el estudio .........................................................................................173

TABLA 36. Niveles séricos de IgG y de IgG4 en los sujetos de estudio ....... 180

TABLA 37. Diferencias en los niveles aumentados de IgG entre la PAI y el resto de grupos incluidos en el estudio ........................................ 181

TABLA 38. Diferencias en los niveles aumentados de IgG4 entre la PAI y el resto de grupos incluidos en el estudio ………………………….... 182 TABLA 39. Diferencias en los niveles aumentados de IgG entre la sospecha de PAI o y los grupos control incluidos en el estudio ................... 183

TABLA 40. Diferencias en los niveles aumentados de IgG4 entre la sospecha de PAI o PCI y los grupos control incluidos en el estudio ……………………………………………………………….. 184

TABLA 41. Diferencias demográficas, clínicas y en el grado de AEP entre los pacientes con PAI con IgG4 > 190 mg/dl y PAI con IgG4 < 190 mg/dl …………………………………………………………... 188

15

LISTA DE TABLAS

TABLA 42. Diferencias demográficas, clínicas y en el grado deAEP entre los pacientes con S.PAI con IgG4 > 190 mg/dl y S.PAI con IgG4 < 190 mg/dl ………………………………………………………….. 189

TABLA 43. Diferencias demográficas, clínicas y en el grado deAEP entre los pacientes con PCI con IgG4 > 190 mg/dl y PCI con IgG4 < 190 mg/dl …………………………………………………………... 190

TABLA 44. Diferencias demográficas, clínicas y en el grado deAEP entre los pacientes con PAI, S.PAI y PCI con IgG4 > 190 mg/dl y con IgG4 < 190 mg/dl ………………………………………………. 192

TABLA 45. Diferencias en la frecuencia de Abs anti-CA 19.9+ entre la PAI y el resto de grupos incluidos en el estudio ................................ 197

TABLA 46. Diferencias en la frecuencia de Abs anti-CA 19.9+ entre la sospecha de PAI o la PCI y los grupos control incluidos en el estudio ………………………………………………………………... 198

TABLA 47. Diferencias en la frecuencia de Abs anti-p53+ entre la PAI y el resto de grupos incluidos en el estudio ….................................. 202

TABLA 48. Diferencias en la frecuencia de anticuerpos anti-p53+ entre la sospecha de AI o la PCI y los grupos control incluidosen el estudio ……………………………………………………………….. 203

TABLA 49. Frecuencias absolutas de las subpoblaciones linfocitarias en pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI ………………………205

TABLA 50. Porcentaje de las subpoblaciones linfocitarias en pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI ……………………………………….. 206

TABLA 51. Frecuencias absolutas de las subpoblaciones de linfocitos B en pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI ................................ 213

TABLA 52. Frecuencias relativas de las subpoblaciones de linfocitos B en pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI ………………………. 216

TABLA 53. Analisis de reordenamientos clonales del gen IgH ...................... 240

TABLA 54. Analisis mutacional de K-ras ………………………………………. 243

TABLA 55. Riesgo de malignidad en la PAI .................................................. 287

TABLA 56. Riesgo de malignidad en pacientes con sospecha de PAI .......... 288

TABLA 57. Riesgo de malignidad en la PCI ................................................. 289

16

17

LISTA DE FIGURAS

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1. Ilustración esquemática mostrando la relación entre distintas enfermedades esclerosantes asociadas a IgG4 .......................... 27

FIGURA 2. Modelo propuesto de la patogénesis de la PAI ………………….. 34

FIGURA 3. Histopatología de la pancreatitis autoinmune .............................. 51

FIGURA 4. Patrón histológico de la pancreatitis autoinmune ......................... 53

FIGURA 5. PAI forma difusa ........................................................................... 56

FIGURA 6. CT de un paciente con PAI no tratada ......................................... 56

FIGURA 7. CPRE mostrando estenosis del conducto biliar común distal ...... 58

FIGURA 8. USE .............................................................................................. 60

FIGURA 9. Estructura molecular y localización subcelular de las isoenzimas de la anhidrasa carbónica (CA) ……………………………………. 67

FIGURA 10. Papel fisiológico de la anhidrasa carbónica (CA) II ..................... 69

FIGURA 11. Algoritmo para el tratamiento de la PAI …………………………... 88

FIGURA 12. Puntos de control del crecimiento de linfocitos ………………… 102

FIGURA 13. Factores inmunológicos implicados en el desarrollo de autoinmunidad y linfomas ……….............................................. 104

FIGURA 14. Plantilla IL-6 ………………………………………………………... 134

FIGURA 15. Identificación de los linfocitos en un dot plot CD45 vs SSC …. 138

FIGURA 16. Bead de recuento absoluto Trucount …………………………… 138

FIGURA 17. Identificación de linfocitos T citotóxicos (CD3+CD8+) y colaboradores (CD3+CD4+) en un dot plot CD4 vs CD8 ……… 138 FIGURA 18. Bead de recuento absoluto Trucount …………………………… 139

FIGURA 19. Identificación de linfocitos B (CD19+) y linfocitos NK (CD3–CD16+ o CD56+ o ambos) en una imagen de dot plot CD16 + CD56 vs CD19 …………………………………………… 139 FIGURA 20. Distribución de células B en sangre en función de la expresión en superficie de IgD y CD27 …………………………………….. 145

18

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 21. Distribución de células B CD19+ CD27- en sangre en función de la expresión en superficie de CD38 …………………………. 145

FIGURA 22. Análisis de clonalidad de células plasmáticas (CD19+ CD38++) en función del cociente kappa/lambda ………………………….. 146

FIGURA 23. Ejemplo de análisis de resultados en gel de agarosa 4% ……...160

FIGURA 24. Mediana de los nivéles séricos de IgG y de IgG4 en pacientes con PAI, PAI con cáncer de páncreas y cáncer de páncreas ... 174

FIGURA 25. Comparación de los marcadores serológicos entre pacientes con PAI, PAI con cancer de páncreas y cáncer de páncreas .. 175

FIGURA 26. Valor diagnóstico de los marcadores serológicos en la PAI ….. 176

FIGURA 27. Valor diagnóstico de los marcadores serológicos en la PAI, excluyendo la PCI como grupo control ………………………… 177

FIGURA 28. Valor diagnóstico de la combinación de los marcadores serológicos en la PAI ……………………………………………... 178

FIGURA 29. Valor diagnóstico de la combinación de los marcadores serológicos en la PAI, excluyendo la PCI como grupo control 179

FIGURA 30. Frecuencia de niveles aumentados de IgG y de IgG4 en los grupos de pacientes incluidos en el estudio ..................... 188

FIGURA 31. Curvas ROC de los niveles séricos de IgG y de IgG4 para el diagnóstico de la PAI ……………………………………………… 185

FIGURA 32. Curvas ROC de los niveles séricos de IgG y de IgG4 para diferenciar entre PAI con y sin afectación extrapancreática….. 187

FIGURA 33. Frecuencia de los síntomas de presentación el los pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI ............................................... 193

FIGURA 34. Frecuencia de la presencia de Diabetes Mellitus tipo 2 en los pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI .............................. 193

FIGURA 35. Frecuencia de la presencia de afectación extrapancreática en los pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI ………………… 194

FIGURA 36. Frecuencia del número de órganos afectados en los pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI ……………………………….. 195

FIGURA 37. Frecuencia de órganos afectados en los pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI ………………………………………….. 195

19

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 38. Frecuencia de anticuerpos anti-CA 19.9 positivos en los diferentes grupos de sujetos incluidos en el estudio ………….. 196

FIGURA 39. Valor diagnóstico de los anticuerpos anti-CA 19.9+ en la PAI .. 198

FIGURA 40. Niveles de CA 19.9 ………………………………………………... 200

FIGURA 41. Relación entre la concentración elevada de CA 19.9 y la presencia de anticuerpos anti-CA 19.9 ………………………… 200

FIGURA 42. Frecuencia de anticuerpos anti-p53 positivos en los diferentes grupos de pacientes incluidos en el estudio ............................. 201 FIGURA 43. Niveles de IL-6 (pg/ml) ………………………………………….. 204

FIGURA 44. Cociente LT CD4+/LT CD8+ en pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI …………………………………………………….. 207

FIGURA 45. Frecuencia de linfocitopenia B (% Linfocitos B < 6%) y de incremento de células NK (% NK >26%) en pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI …………………………………………. 208

FIGURA 46. Distribución de las subpoblaciones de células B en función de la expresión en superficie de CD19 y CD27 .............. 209

FIGURA 47. Distribución de las subpoblaciones de células B en función de la expresión en superficie de CD38 y de CD24 …….. 210

FIGURA 48. Distribución de las subpoblaciones de células B en función de la expresión en superficie de CD38 y de IgD …………… 210

FIGURA 49. Distribución de las subpoblaciones de células B en función de la expresión en superficie de IgD y de CD27 ....................... 210

FIGURA 50. Distribución de las células plasmáticas (CD19+ CD38++) en función de la expresión en superficie de CD138 ................. 211

FIGURA 51.Análisis de clonalidad de células plasmáticas (CD19+ CD38++) 211

FIGURA 52. Frecuencia del ratio k/λ en pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI …………………………………………………………….... 217

FIGURA 53. Frecuencia del aumento de células B transicionales y del descenso de células B pre-naive en pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI …………………………………………. 219

FIGURA 54. Frecuencia del descenso de células B naive en pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI ...…………………………………. 219

20

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 55. Frecuencia del aumento de células B memoria totales y memoria dobles negativas en pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI ………………………………………………………….. 220

FIGURA 56. Frecuencia del aumento de células plasmáticas totales, plasmáticas 138- y plasmáticas 138+ en pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI ………………………………………….. 220

FIGURA 57. Frecuencia del ratio Kappa/Lambda normal y disminuido de las células plasmáticas en pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI …………………………………………………………… 221

FIGURA 58. Niveles de cadenas ligeras libres kappa y lambda (mg/L) y del cociente entre cadenas ligeras libres kappa y lambda en muestras de suero al diagnóstico ……………………………….. 223

FIGURA 59. Niveles de cadenas ligeras libres kappa y lambda (mg/L) y del cociente entre cadenas ligeras libres kappa y lambda en las últimas muestras de suero disponibles de cada paciente ……. 225

FIGURA 60. Niveles de cadenas ligeras libres kappa y lambda (mg/L) y del cociente entre cadenas ligeras libres kappa y lambda en las muestras de suero post-tratamiento en pacientes con PAI …... 226

FIGURA 61. Niveles séricos de cadenas ligeras libres kappa y lambda (Log de la concentración (mg/L)) en muestras al diagnóstico en pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI …………………….. 229

FIGURA 62. Frecuencia del aumento de cadenas ligeras libres kappa (>19,4mg/L) y lambda (> 26,3 mg/L) y de la alteración del ratio k/λ (< 0,26 o > 1,65) al diagnóstico en pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI ………………………………………… 229

FIGURA 63. Niveles séricos de cadenas ligeras libres kappa y lambda (Log de la concentración (mg/L)) en las últimas muestras de suero extraídas en pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI …….. 231

FIGURA 64. Frecuencia del aumento de cadenas ligeras libres kappa (> 19,4mg/L) y lambda (> 26,3 mg/L) y de la alteración del ratio k/λ (< 0,26 o > 1,65) en las últimas muestras de suero extraídas pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI ………. 231

FIGURA 65.Monitorización de los niveles séricos de cadenas ligeras libres Kappa, Lambda y del ratio k/λ sFLC en los pacientes con PAI 238

FIGURA 66. Ejemplo gráfico de un paciente con análisis mutacional de K-ras negativo ........................................................................... 241

21

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 67. Ejemplo gráfico de un paciente con análisis mutacional de K-ras positivo ……………………………………………………… 241

FIGURA 68. Principales alteraciones en la distribución en sangre de las subpoblaciones de células B en la PAI ………………………... 266

FIGURA 69.Posible modelo de desarrollo de malignidad en la PAI ……….. 290

22

23

ABREVIATURAS

ABREVIATURAS

Ab: Absorbancia

AcMo: Anticuerpo monoclonal AC: Anhidrasa carbónica

AC II: Anhidrasa carbónica tipo II

Ag: Antígeno

APC: Aloficocianina

APCs: Células presentadoras de antígenos AMY α-2A: Amilasa α-2A

ANA: Anticuerpos anti-nucleares

AR: Artritis reumatoide

ASMA: Anticuerpos anti-músculo liso

BAFF: Factor activante de células B

BLyS: Factor estimulador de linfocitos B

BSA: Albúmina sérica bobina

C+: Control positivo

CEP: Colangitis esclerosante primaria

CEUS: Ultrasonografía aumentada por contraste

CMF: Citometría de flujo

CO: Cut off

CPRE: Colangio-pancreatografía retrógrada endoscópica

CPRM: Colangio- pancreatografía por resonancia magnética

CT: Tomografía computerizada

DE: Desviación estándar

24

ABREVIATURAS

DM: Diabetes mellitus

DM-1: Diabetes mellitus tipo 1

DMARDs: Drogas aintirreumáticas modificadoras de la enfermedad

EAI: Enfermedades autoinmunes

FITC: Feniliosotiocianato de fluoresceina

FN: Falsos negativos

FP: Falsos positivos

HPF: Campo de alta resolución

IAC: Colangitis asociada a IgG4

IBD: Enfermedad inflamatoria intestinal

IDCP: Pancreatitis idopática ductulo-céntrica

IFE: Electroforesis por inmunofijación

IL-6: Interleucina-6

ISD: Enfermedad esclerosante asociada a IgG4

LF: Lactoferrina

LES: Lupus eritematoso sistémico

LH: Linfomas Hodgking

LNH: Linfomas no Hodgking

LPSP: Pancreatitis esclerosante linfoplasmocitaria

LR: Límite de referencia

LT CD4+: Linfocitos T colaboradores

LT CD8+: Linfocitos T citotóxicos

MALT: Tejido linfoide asociado a las mucosas

MESA: Sialadenitis mioepitelial

25

ABREVIATURAS

MTX: Metotrexato

Nk: Natural killer

OR: Odd ratio

PAI: Pancreatitis autoinmune

PE: Ficoeritrina PerCP: Proteína peridin-clorofila PBMCs: Células mononucleares de sangre periférica PBP: Proteína de unión al plasminógeno

PBS: Tampón fosfato salino

PC: Pancreatitis crónica

PCI: Pancreatitis crónica idiopática

PRSS: Tripsinógeno

PSTI: Inhibidor de la secreción pancreática de tripsina

Ratio k/ λ sFLC: Cociente entre cadenas ligeras libres k y λ

RI: Respuesta inmunitaria

RM: Resonancia magnética

RT: Temperatura ambiente

sFLC: Cadenas ligeras libres en suero

sFLC K: Cadenas ligeras libres Kappa

sFLC λ: Cadenas ligeras libres Lambda

SPE: Electroforesis de proteínas séricas

SS: Síndrome de Sjögren

Tregs: T reguladoras

USE: Ultrasonografía endoscópica

26

ABREVIATURAS

USE-PAAF: Punción aspirativa con aguja fina guiada por USE

URB3: Ubiquitina-proteína ligasa E3

VN: Verdaderos negativos

VP: Verdaderos positivos

VPP: Valor predictivo positivo

VPN: Valor predictivo negativo

27

IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN

11111111........ IIIIIIIINNNNNNNNTTTTTTTTRRRRRRRROOOOOOOODDDDDDDDUUUUUUUUCCCCCCCCCCCCCCCCIIIIIIIIÓÓÓÓÓÓÓÓNNNNNNNN

28

29


1. INTRODUCCIÓN

1.1. Pancreatitis autoinmune. Antecedentes

La pancreatitis crónica es una enfermedad caracterizada por inflamación

crónica y fibrosis del páncreas, que conduce a cambios irreversibles en la

estructura y función pancreática [1]. El alcohol es la principal causa de

pancreatitis crónica, aunque factores metabólicos, genéticos y estructurales se

han asociado también con la enfermedad.

En 1961, Sarles et al [2, 3] describieron por primera vez un cuadro de

pancreatitis crónica asociado con marcada inflamación, infiltración linfocítica e

hipergammaglobulinemia no asociado con el consumo de alcohol, sugiriendo

la implicación de fenómenos autoinmunes en la patogénesis de la enfermedad.

A partir de ese momento se han descrito casos de pancreatitis asociados con

enfermedades autoinmunes.

La pancreatitis autoinmune (PAI) fue denominada por primera vez como

pancreatitis inflamatoria primaria, y clasificada en la reunión de Marsella-Roma

de 1988 como pancreatitis crónica inflamatoria [4]. Además la enfermedad ha

sido designada con otros nombres, como pancreatitis esclerosante

linfoplasmocitaria, pancreatitis crónica ductodestructiva no alcohólica y

pseudotumor inflamatorio. En la última década han surgido numerosas

evidencias de una existencia de una base autoinmune para ciertas formas de

pancreatitis crónica, y Yoshida et al [5] proponen el término de PAI en 1995.

Desde entonces, se han descrito múltiples casos, y la PAI se ha convertido en

una entidad reconocida mundialmente.

30


En el 2008, a partir del examen histológico e inmunohistoquímico de varios

órganos de pacientes con PAI, Kamisawa et al [6] proponen una nueva entidad

clinicopatológica, la enfermad esclerosante asociada a IgG4.

1.2. Definición y concepto

La PAI fue definida originalmente como un tipo de pancreatitis crónica

causada por un proceso inflamatorio autoinmune, caracterizado por la

presencia de un infiltrado linfocítico asociado con fibrosis del páncreas que

conduce a disfunción orgánica [7].

En el 2008, Kamisawa et al, proponen el concepto de enfermedad

esclerosante asociada a IgG4 (ISD). Se trata de una enfermedad sistémica

caracterizada por la existencia de una densa infiltración de células plasmáticas

IgG4+ y linfocitos T en varios órganos [6]. Las manifestaciones clínicas

aparecen en páncreas, conductos biliares, vesícula biliar, glándulas salivares,

retroperitoneo, riñones, pulmones, próstata, etc; donde se induce

patológicamente flebitis obliterativa y fibrosis tisular [6]. Esta entidad incluye

numerosas enfermedades como la PAI, colangitis esclerosante, colecistitis,

sialadenitis, fibrosis retroperitoneal, nefritis tubulointersticial, neumonía

intersticial, prostatitis, pseudotumor inflamatorio y linfadenopatía, todas ellas

asociadas a IgG4 [7]. De acuerdo con este nuevo concepto, la PAI podría

definirse en el momento actual, como la manifestación pancreática de esta

enfermedad fibroinflamatoria sistémica (Figura 1).

31


Figura 1 . Ilustración esquemática mostrando la relación entre distintas erfermedades esclerosantes asociadas a IgG4. World J Gastroenterol 2008;14:3948-55.

1.3. Epidemiología

Aunque el número de casos de PAI esta incrementando a lo largo del mundo,

hasta el momento actual no se ha determinado con exactitud la verdadera

incidencia y prevalencia de la enfermedad.

En el 2002 Nishimori et al [8] estimaron que la prevalencia de la PAI en

Japón era de 0,82 por 100000 habitantes. Otras series japonesas han descrito

una prevalencia entre un 5% y un 6% de todos los pacientes con pancreatitis

crónica [9, 10].

En Estados Unidos se desconoce la prevalencia de la enfermedad. Como la

PAI a menudo mimetiza el cáncer de páncreas, la mejor estimación se ha

hecho en pacientes sometidos a resección pancreática por sospecha de

cáncer de páncreas. En tres estudios recientes, 43 de 1808 (2,4%) resecciones

pancreáticas fueron reportadas como PAI, tras el examen histológico de la

muestra extirpada [11-13]. En otra evaluación retrospectiva realizada en la

32


Clínica Mayo, se diagnosticaron 27 casos de PAI de 245 (11%) muestras

patológicas de pacientes sometidos a resección por enfermedad pancreática

benigna [14].

En Europa los análisis son escasos, pero en un estudio multicéntrico italiano

coordinado por la universidad de Verona se diagnosticaron 23 (6%) casos de

PAI de 383 pacientes con pancreatitis crónica [15].

La PAI se presenta más frecuentemente en personas mayores entre los 60-

70 años. [16, 17]. La media de edad al diagnóstico es de 55 años [8], sin

embargo la enfermad se puede presentarse en un amplio rango, ya que se han

descrito casos de PAI en pacientes de tan sólo 10 años de edad [18].

Los varones son aproximadamente el doble de propensos a desarrollar PAI

que las mujeres [8]. En tres series quirúrgicas se ha reportado un ratio hombre:

mujer de 1,7:1-2:1 [11, 14, 19].

En aproximadamente un 20-40% de los pacientes, la PAI se asocia con

otras enfermedades autoinmunes, como el síndrome de Sjögren (SS), artritis

reumatoide (AR), colangitis esclerosante primaria, fibrosis retroperitoneal,

enfermedad de Crohn, cirrosis biliar primaria, hepatitis autoinmune, lupus

eritematoso sistémico (LES) y úlcera péptica [20-26].

1.4. Patogénesis

Aunque se desconoce la patogénesis precisa de la PAI, numerosas

evidencias apoyan la hipótesis de una causa autoinmune (Tabla 1).

Al igual que otras enfermedades autoinmunes, la PAI se asocia con ciertos

haplotipos HLA. En la población japonesa se ha descrito una asociación con el

haplotipo DRB1*0405-DQB1*0401 de clase II [27], y con la región ABCF1

33


TABLA 1 . Características de autoinmunidad encontradas en la PAI

Características Características

vistas en la PAI

Comentarios

RI frente a autoantigenos Probablemente Posibles autoantígenos: CAII, LF, PSTI

Predisposición femenina No Predominio masculino

Asociación HLA Probablemente HLA DRB1*0405-DQB1*0401 en la población japonesa

Inducción por sensibilización con autoantígenos

Probablemente

En ratones timectomizados inmunizados con CA-II y LF. Células Th1 implicadas en el desarrollo temprano de PAI murina

Respuesta a terapia inmunosupresora

Sí

Producción de la enfermedad por transferencia adoptiva de células autorreactivas y/o autoanticuerpos

Probablemente La transferencia adoptiva de células T CD4+ específicas de amilasa desencadena pancreatitis

Modelos animales espontáneos con idéntica especificidad antigénica

Probablemente Hay modelos animales espontáneos de PAI, pero no se ha identificado el autoantígeno

Afectación de niños y adultos

No

Distribución de autoantígenos asociada con la distribución de la enfermedad

Sí CA-II y LF están distribuidas en células de varios órganos exocrinos, incluyendo páncreas, glándulas salivares, conducto biliar y túbulos renales distales. La distribución de la enfermedad está altamente restringida

RI: Respuesta inmunitaria. PAI: Pancreatitis autoimmune. CA-II: Anhidrasa carbónica II. LF: Lactoferrina. PSTI: Inhibidor de la secreción pancreática de tripsina.

Gut 2009;58:1680-9.

proximal de la región HLA-E de clase I [28]. Además se ha descrito

recientemente la asociación de la PAI con polimorfismos de receptores Fc [29].

La PAI esta relacionada con hipergammaglobulinemia y niveles elevados en

suero de IgG4. Kamisawa et al [30] han descrito la asociación entre los niveles

séricos de IgG4 y la presencia de lesiones extrapancreáticas en pacientes con

34


PAI. Estos hallazgos sugieren que la IgG4 puede jugar un papel clave en la

patogénesis de la enfermedad.

Se desconocen los agentes desencadenantes de la PAI. En pacientes con

PAI se han detectado en suero autoanticuerpos como factor reumatoide,

anticuerpos anti-nucleares (ANA), anti-músculo liso (ASMA), anti-lactoferrina

(LF), anti-anhidrasa carbónica II (CA-II) y anti-amilasa α-2A (AMY α-2A) [31-33].

Se ha hipotetizado que una reacción autoinmunitaria frente a CA II o LF

mediada por Linfocitos T CD4+ tipo Th1 desempeñaría un papel esencial en la

patogénesis de la PAI [31]. El primer paso en el desarrollo de la enfermedad

podría ser una alteración antigénica en las células ductales y acinares del

páncreas, como la expresión aberrante de HLA-DR [34]. A continuación los

complejos HLA-DR/péptidos autoantigénicos serían reconocidos por linfocitos T

CD4+, induciendo probablemente apoptosis e infamación del páncreas [34].

Además de los genes HLA, hay estudios que apoyan la participación de

genes no HLA en el desarrollo de la PAI. En pacientes con PAI, se ha

demostrado la presencia de polimorfismos de CTLA4, un regulador clave de la

respuesta inmunitaria de linfocitos T [35]. En este sentido, Chang et al [35]

han demostrado que el haplotipo 2318C/+49A/CT60G confiere mayor

susceptibilidad a desarrollar la PAI. Por otro lado, el polimorfismo del promotor

del TNF-α, -863A, se ha correlacionado con afectación extrapancreática en

pacientes con PAI [35].

La PAI se ha asociado ocasionalmente con un descenso de los niveles del

complemento. Muraki et al [36] han observado altos niveles de

inmunocomplejos circulantes en pacientes con PAI y un descenso significativo

35


después del tratamiento con corticosteroides. En este estudio, se encontró una

asociación significativa entre niveles elevados de inmunocomplejos circulantes

y un incremento de IgG1 junto con un descenso de C4 y de C3 en suero. Estos

hallazgos sugieren que la PAI en un estado activo se asocia con altos niveles

de inmunocomplejos circulantes, que inducen la activación del complemento a

través de la vía clásica y causan un descenso de los niveles séricos de C3 y C4.

Recientemente los mismos investigadores describieron la existencia de

inmunocomplejos formados por IgG4 unida a IgG1, 2 y 3, mediante

interacciones Fc-Fc, en pacientes con PAI [37]. En consecuencia, han sugerido

que los inmunocomplejos tipo IgG1 desencadenan la activación del

complemento a través de la vía clásica, mientras que la IgG4 contribuye al

aclaramiento de los inmunocomplejos para amortiguar el proceso inflamatorio.

Otra posibilidad es que la IgG4 podría bloquear las funciones efectoras de la

IgG1 para frenar la respuesta inflamatoria.

Existen estudios que se han centrado en el papel de las células T

reguladoras (Tregs) en La PAI. Zen et al [38] han documentado que la

respuesta inmunitaria en la PAI esta mediada fundamentalmente por linfocitos

Th2 y por células Tregs en el de pacientes con colangitis esclerosante y PAI.

Miyoshi el al [39] han estudiado el papel de las células Tregs en la patogénesis

de la PAI, encontrando un descenso de células Tregs circulantes naive

y un incremento de células Tregs memoria circulantes en sangre de pacientes

con PAI. Estos autores sugieren que el incremento de células Tregs memoria

se correlaciona con la producción de IL-10 en sitios locales del páncreas y en

lesiones extrapancreáticas. A su vez, la IL10 conduce a la maduración de

36


células B a células plasmáticas productoras de IgG4 y a la secrección de IgG4

en suero.

El mimetismo molecular es un posible mecanismo utilizado por los

microorganismos para romper la tolerancia inmunitaria. Para ello, los agentes

infecciosos comparten uno o más epitopos con varios componentes

autorreacivos. Otra posibilidad es que los microorganismos pueden conducir a

la activación de células inmunitarias potencialmente autoagresivas.

Kountouras el al [34] han propuesto como agente etiológico, a través de

mimetismo molecular al microorganismo Helicobacter pylori. Estos autores han

sugerido que H. pylori puede desencadenar la enfermedad a través de la

inducción de autoinmunidad y apoptosis. De acuerdo con esta teoría Guarneri

et al [40] han encontrado una homología significativa entre CA-II y α-CA de H.

pylori, un enzima fundamental para la supervivencia y proliferación de la

bacteria en el ambiente gástrico. Además, los segmentos homólogos contienen

el motivo de unión de la molécula DRB1*0405 [40] y la posesión del genotipo

HLA DRB1*0405-DQB1*0401 confiere susceptibilidad al desarrollo de PAI.

Estos datos apoyan la hipótesis de que la infección gástrica por H. pylori puede

desencadenar PAI en individuos genéticamente predispuestos [40].

Finalmente, cambios en la microcirculación, incluyendo vasoconstricción,

estasis capilar, descenso de la saturación de oxígeno e isquema progresiva,

pueden conducir a fracaso microcirculatorio local, edema y amplificación del

daño pancreático [41]. A ello se suman radicales libres de oxígeno, citoquinas

proinflamatorias liberadas por granulocitos y macrófagos (TNF-α, IL-1, IL-6 e IL-

8), metabolitos del ácido araquidónico (prostaglandinas, factor activador de

37


plaquetas y leucotrienos) y enzimas proteolíticos y lipolíticos; interaccionan con

la microcirculación pancreática y aumentan la permeabilidad vascular,

conduciendo a necrosis pancreática [41]. La infección por H. Pylori puede

exacerbar estos eventos, promoviendo la agregación de plaquetas y de

plaquetas/leucocitos e induciendo la liberación de sustancias proinflamatorias y

vasoconstrictoras, como endotelina-1, IL-1, IL-6, IL-8, leucotrienos y

prostaglandinas [40].

Park et al [41] han propuesto un modelo posible para la patogénesis de la

PAI. Este modelo se basa la existencia de elementos bifásicos para la

iniciación y progresión de la PAI y en el mantenimiento por células Tregs

(Figura 2). La inducción de una respuesta a autoantígenos (LF, ACA II o PSTI)

y el mimetismo molecular (H.Pylori) puede conducir a la activación de células

presentadoras de antígenos. En este medio, bajo condiciones de depleción de

células Tregs, se produce la activación de células Th1 y la liberación de

citocinas inflamatorias (INF-γ, IL-2 y TNF-α), induciéndose así una respuesta

inmunitaria celular. En contraposición, bajo condiciones de activación de

Tregs (aunque insuficiente para suprimir el desarrollo de la PAI), se induce la

activación de células Th2 y la liberación de las citocinas IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 y

TGF-β, induciéndose así una respuesta inmunitaria humoral. Los

inmunocomplejos IgG4 pueden estar relacionados con la fase de diferenciación

de la PAI o con la función de las células Tregs. Finalmente, teniendo en cuenta

que se han identificado dos formas de PAI, tipo 1 y tipo 2, y que sólo la primera

se ha asociado con niveles aumentados de IgG4; los autores han especulado

38


Figura 2 . Modelo propuesto de la patogénesis de la PAI. La inducción de la respuesta a autoantígenos y el mimetismo molecular (H.Pylori) puede activar las células presentadoras de antígenos (APCs). En este medio, bajo condiciones de depleción de Tregs, se produce la activación de células Th1 y la liberación de citocinas inflamatorias (INF-γ, IL-2 y TNF-α), induciéndose así una respuesta inmunitaria celular. La activación del complemento por inmunocomplejos IgG1 es otra posible vía de iniciación de la PAI. Bajo condiciones de activación de Tregs, se desencadena la activación de células Th2 y la liberación de las citocinas IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 y TGF-β, induciéndose así una respuesta inmunitaria humoral. Finalmente los inmunocomplejos IgG4 estarían relacionados con la PAI IgG4+ (pancreatitis esclerosante linfoplasmocitaria (LPSP)), mientras que los immunocomplejos IgG1 estarían relacionados con la PAI-IgG4- (pancreatitis idiopática ducto-céntrica (IDCP)). CA-II: anhidrasa carbónica. PSTI: inhibidor de la secreción pancreática de tripsina. Gut 2009;58:1680-9.

que los inmunocomplejos IgG4 estarían relacionados con la PAI tipo 1 y los

immunocomplejos IgG1 con la PAI tipo 2.

1.5. Pancreatitis autoinmune experimental en modelo s animales

Hasta la fecha se han descrito dos modelos animales de PAI. Se han

encontrado similitudes entre estos dos modelos y la clasificación propuesta de

PAI [31, 38, 42].

El primer modelo implica la transferencia adoptiva de células T-CD4+

específicas para la amilasa (un antígeno localizado en las células acinares del

39


páncreas) a ratones singénicos [38]. Las lesiones histológicas de este modelo

mimetizan la reacción inflamatoria lóbulo-céntrica de la PAI tipo 1; ya que se

caracterizan por un predominio de linfocitos y algunas células plasmáticas,

neutrófilos, y mastocitos y por la destrucción del tejido acinar acompañada de

inflamación ductular. El análisis inmunhistoquímico revela la presencia de

numerosas células T CD4+ y CD8+, macrófagos y células dendríticas.

El segundo modelo ha sido desarrollado mediante inmunización de ratones

timectomizados neonatalmente con AC (un antígeno localizado en el epitelio

pancreático) y la transferencia posterior de células T CD4+. Las lesiones

histológicas de este modelo mimetizan el patrón ductulo-céntrico de la PAI tipo

2 [38].

Davidson et al [43] han desarrollado un modelo de rata específico de la

amilasa, donde células T específicas de AC-II o de LF no son capaces de

inducir PAI. Los autores han especulado que los anticuerpos frente a estos

enzimas representarían una consecuencia tardía de la destrucción tisular y no

un mecanismo patogénico de la enfermedad. En este sentido, estos

autoanticuerpos podrían originarse a través del fenómeno de expansión del

epitopo [43]. Recientemente, Kojima et al [44] han mostrado la existencia de un

patrón policlonal del receptor de células T y de genes IgH-FR3 en la PAI. Estos

hallazgos apoyan la teoría de “expansión del epitopo” en la PAI.

En otro modelo los ratones NTx-NFS/sld desarrollan espontáneamente una

forma de sialoadenitis donde la α-fodrina se ha implicado como autoantígeno.

Adicionalmente los anticuepos frente a la α-fodrina se han descrito en algunos

pacientes con SS y PAI [45].

40


En varios modelos animales sin especificidad antigénica, como los ratones

alinfoplásticos (aly-/aly-) [46] y los ratones MRL/lpr [47], se ha observado el

desarrollo espontáneo de pancreatitis o sialoadenitis, donde células CD4+ tipo

Th1 actuan como efectoras.

El TGF-β, un importante factor regulador en el mantenimiento de la

homeostasis inmunitaria, parece intervenir en el desarrollo de la PAI. En este

sentido, la pérdida de la señalización del TGF-β contribuye al desarrollo de PAI

en ratones mutantes dominantes negativos [48].

La afectación extrapancreática en la PAI se ha descrito en varios modelos

animales. La inmunización subcutánea con CA-II induce sialoadenitis en

ratones PL/J y SJL/JCr [49] . En ratones BALB/c y DBA/1 la inmunización

intraperitoneal con AC-II induce colangitis [50].

Recientemente se han propuesto dos nuevos modelos de PAI. El modelo de

rata WBN/Kob, asociado con la disminución congénita de células Tregs

periféricas, desarrolla espontáneamente sialoadenitis, tiroiditis, colangitis

esclerosante y nefritis tubulointersticial [51]. El otro modelo es el de ratones

NOD deficientes en células Tregs [52], donde los autoanticuerpos y las células

autorreactivas reconocen la amilasa pancreática.

Los modelos animales existentes de PAI tienen varias limitaciones [53]. En

la mayoría de ellos la PAI es inducida mediante la transferencia adoptiva de

células autorreactivas y/o anticuerpos, pero la enfermedad no se desarrolla

espontáneamente con idéntica especificidad antigénica. La distribución de las

lesiones desarrolladas en los modelos animales de PAI es variable, debido

probablemente a la diversidad de dianas antigénicas y al empleo de diferentes

41


cepas murinas. Por otro lado, los hallazgos histológicos típicos de la PAI

(infiltración linfoplasmocitaria con fibrosis, flebitis obliterativa y lesiones

epiteliales granulocíticas) se observan raramente en los modelos animales

existentes. En consecuencia es necesario desarrollar modelos animales

espontáneos con idénticos autontígenos y con los hallazgos histopatológicos

típicos de la PAI.

1.6. Características clínicas

La mayoría de los individuos con PAI son varones de más de 50 años de

edad [8, 54]. Sin embargo, los pacientes femeninos son más propensos a

presentar afectación de la glándula parótida [55].

La presentación clínica de la PAI es diversa (Tabla 2). Se puede clasificar en

función del modo de establecimiento de la enfermedad, en agudo y tardío; o en

función de los órganos afectados, en presentación pancreática o

extrapancreática.

La presentación aguda más común es la ictericia obstructiva sin dolor, en un

70-80% de los pacientes con PAI [7, 56]. Esta manifestación se relaciona con

la afectación de la cabeza pancreática en la forma focal de la enfermedad o

con el compromiso de la vía biliar. Es mucho menos frecuente la presentación

de la enfermedad como una pancreatitis aguda típica [57], con dolor abdominal

y elevación de enzimas pancreáticos. En estos casos el dolor agudo severo

es raro y la pancreatitis necrotizante no ha sido descrita nunca en la literatura

[58-60].

En la fase post-aguda la PAI se puede descubrir accidentalmente por la

presencia de una masa pancreática persistente, atrofia pancreática con o sin

42


calcificación o esteatorrea pancreática. Aunque los pacientes con PAI pueden

tener evidencias radiológicas de calcificación o atrofia pancreática, a diferencia

de la pancreatitis crónica, no existe dolor [57].

Las manifestaciones extrapancreáticas son muy diversas y se pueden

presentar simultáneamente a las pancreáticas, precederlas u ocurrir muchos

años después. La afectación extrapancreática más común es la del tracto biliar,

donde el compromiso biliar proximal puede mimetizar el cáncer de páncreas,

mientras que el compromiso biliar distal puede desencadenar la sospecha de

colangiocarcinoma. También puede existir afectación de glándulas salivares

simulando el SS, adenopatía mesenquimal simulando sarcoidosis, fibrosis

retroperitoneal o nefritis tubulointersticial [58-65].

La presentación aguda de la PAI con ictericia obstructiva y agrandamiento

del páncreas puede mimetizar la forma de presentación del cáncer de páncreas.

Adicionalmente, como los pacientes también experimentan pérdida de peso y

diabetes mellitus (DM) de establecimiento reciente, la distinción clínica entre

PAI y cáncer de páncreas se hace difícil. De hecho, antes de reconocimiento

de la PAI como una entidad clínica, muchos pacientes eran sometidos a

resecciones pancreáticas por sospecha de adenocarcinoma pancreático [54, 66,

67].

La ictericia generalmente es secundaria al atrapamiento del conducto biliar

intrahepático en la glándula inflamada [68-70]. Aunque se trata de la forma de

presentación clínica más común, se han descrito otros muchos síntomas, como

dolor abdominal, dolor de espalda, vómitos recurrentes y pérdida de peso [71,

72].

43


TABLA 2 . Características clínicas de la pancreatitis autoinm une

Síntomas típicos

(>50%)

Síntomas menos comunes

(10-50%)

Síntomas raros

(<10%)

Ictericia obstrutiva

Dolor abdominal

Pérdida de peso

Diabetes

Esteatorrea

Clínica de pancreatitis aguda

Asintomática

Curr Gastroenterol Rep 2005;7:101–6.

Muchos pacientes con PAI tienen alteraciones del páncreas endocrino y

desarrollan DM [73, 74]. En muchos casos, ambas enfermedades son

diagnosticadas simultáneamente, pero en otros se observa una exacerbación

de la DM pre-existente cuando se establece la PAI [75]. La DM se ha descrito

al diagnóstico de la PAI en un 50% de los pacientes [15, 76].

Aproximadamente la mitad de los pacientes presentan mejoría de su

intolerancia a la glucosa y resolución completa de la DM tras el tratamiento con

corticosteroides [75, 77].

1.7. Afectación extrapancreática en la ISD

La ISD se asocia frecuentemente con varias lesiones extrapancreáticas. La

afectación de otros órganos se describe en la Tabla 3, y la prevalencia y

distribución de lesiones extrapancreáticas se ha propuesto en un estudio

reciente [63]. La ISD puede afectar a un solo órgano, presentándose como

pseudotumor inflamatorio, o puede afectar a entre 2 y 4 órganos.

1.7.1. Afectación del tracto biliar

El tracto biliar se encuentra afectado en un 60-100% de los pacientes con

PAI [63, 69, 72, 78, 79]. Recientemente se ha introducido el término de

44


colangitis asociada a IgG4 (IAC) para definir las manifestaciones biliares en la

ISD [80]. Aunque la PAI esta presente en la mayoría de los pacientes con IAC,

se han descrito casos de IAC con afectación aislada del tracto biliar, en

ausencia de enfermedad pancreática [81, 82].

La IAC afecta a los conductos biliares intra- y extrahepáticos, principalmente

al conducto biliar común distal [83]. Histológicamente se puede observar un

infiltrado linfoplasmocitario rodeando los conductos biliares [4, 80, 84].

La IAC puede confundirse con la colangitis esclerosante primaria (CEP),

especialmente por los hallazgos radiológicos solapantes. La IAC difiere de la

CEP, en que en la primera la afectación intrahepática es menor [56, 85] y en la

menor asociación con la enfermedad inflamatoria intestinal [86]. Clínicamente,

la IAC ocurre de forma abrupta con ictericia obstructiva, mientras que la CEP

se presenta en individuos asintomáticos con alteraciones de las pruebas de

función hepática [87]. Por último, la IAC se caracteriza por la elevación en

suero de IgG4 y por la respuesta drástica al tratamiento esteroideo, a diferencia

de la CEP [68].

1.7.2. Afectación hepática

En la PAI, es frecuente observar disfunción hepática. Puede deberse a la

presencia de lesiones obstructivas extrapancreáticas o a un daño hepático

inflamatorio.

Hirano et al [69] han encontrado infiltración linfoplasmocitaria en el área portal

en 7 de 7 muestras de biopsia hepática de pacientes con PAI.

45


En otro estudio reciente [88] se ha propuesto en término de hepatopatía

asociada a IgG4 para definir las manifestaciones hepáticas en la ISD,

describiéndose 5 patrones histológicos en hígado:

Inflamación portal evidente con o sin hepatitis.

Gran obstrucción biliar ductal

Esclerosis portal

Hepatitis lobular

Colestasis canalicular

La afectación hepática en la ISD se puede poner también de manifiesto

como pseudotumores inflamatorios hepáticos [89, 90]. Zen et al [91] los han

clasificado en dos tipos, fibrohistiocitarios y linfoplasmocitarios. Como en el

segundo tipo las células plasmáticas IgG4+ son más numerosas [91], estos

autores han concluido que el tipo linfoplamocitario presenta unas

características histológicas similares a la PAI y pertenecería por tanto a la ISD.

También se ha asociado con la PAI la neumonía intersticial [92-94]. En estos

pacientes, se ha observado una densa infiltración de células plasmáticas IgG4+

en el septo alveolar adelgazado [92-94].

1.7.3. Afectación de la vesícula biliar

La afectación de la vesícula biliar en la PAI es frecuente, se caracteriza por

colecistitis alitiásica y linfoplasmocitaria [95-97].

Kamisawa et al [95] han encontrado afectación de la vesícula biliar en un

32% de los pacientes con PAI. En este grupo se ha observado un aumento de

las células plasmáticas IgG4+ y fibrosis transmural en la vesícula biliar.

46


1.7.4. Afectación del tracto gastrointestinal

En la mucosa gastrointestinal de individuos sanos suelen encontrarse

aisladamente células plasmáticas IgG4+.

Deheragoda et al [98] han encontrado un marcado incremento de células

plasmáticas IgG4+ en la mucosa gastrointestinal de pacientes con PAI.

La enfermedad inflamatoria intestinal (IBD) se asocia ocasionalmente con la

PAI [19, 99]. Se ha estimado que la incidencia de pancreatitis crónica en

pacientes con IBD es de un 1-2%, 250 veces mayor que en la población

general [100]. En los pacientes con PAI, la incidencia de IBD es de un 7,6%

[85].

Barthet et al [100] ha propuesto que la pancreatitis es una manifestación

extraintestinal de la IBD. En su estudio ha encontrado 11 pacientes con

pancreatitis de 427 con IBD en el Sur de Francia.

1.7.5. Afectación del glándulas salivares y lacrimales

Las glándulas salivares y lacrimales están afectadas frecuentemente en la

ISD [63, 101-103].

La sialadenitis esclerosante, también llamada tumor de Küttner, se presenta

como una inflamación crónica y asimétrica de las glándulas submandibulares

[104]. Kitagawa et al [102] han descrito una serie de 12 pacientes con tumor de

Küttner, 5 de los cuales con lesiones esclerosantes en tejidos glandulares

extrasalivares. Histológicamente, las glándulas salivares presentan una

marcada infiltración linfoplasmocitaria con fibrosis y destrucción de los lóbulos

glandulares. Inmunohistoquimicamente, la proporción de células

plasmáticas

47


IgG4+/IgG+ es de más de un 45% [102]. Estos hallazgos sugieren que la

sialadenitis esclerosante es la manifestación en glándulas salivares de la ISD.

La enfermedad de Mikulick se define como una inflamación idiopática,

asintomática, bilateral y simétrica de las glándulas lacrimales, parótidas y

submandibulares [105]. Histológicamente, se observa una marcada infiltración

linfoplasmocitaria, con folículos linfoides rodeando células epiteliales, fibrosis

estromal y atrofia acinar [105]. La enfermedad de Mikulick se ha considerado

un subtipo del SS por sus características histológicas similares. Sin

embargo existen varias diferencias entre ambas enfermedades. Los pacientes

con la enfermedad de Mikulick carecen de anticuerpos anti-SS-A y anti-SS-B,

presentan niveles elevados en suero de IgG4 y una infiltración de células

plasmáticas IgG4+ en glándulas salivares y lacrimales [103, 106-108]. En

consecuencia, la enfermedad de Mikulick es considerada actualmente como

una ISD.

El SS se observa ocasionalmente en pacientes con PAI [109-112]. Aunque

existen similitudes histológicas entre ambas enfermedades, algunos estudios

muestran que la glándula submandibular de pacientes con PAI difiere de la

encontrada típicamente en SS. En el SS, los niveles séricos de IgG4 son

significativamente menores que en pacientes con PAI [108, 113], y no suelen

observarse células plasmáticas IgG4+ [102, 114]. Estos datos sugieren que la

IgG4 no parece tener un papel importante en la patogénesis de esta

enfermedad.

48


1.7.6. Afectación renal

Las lesiones renales en la ISD suelen presentarse como nefritis

tubulointersticial. Esta enfermedad se puede asociar con la PAI, aunque se han

descrito algunos casos asociados con niveles séricos elevados de IgG4 sin

lesiones pancreáticas importantes [50, 115-118].

Clínicamente, la nefritis tubulointersticial se puede presentar como

insuficiencia renal, vasculitis o como una “masa renal”; estos síntomas a

menudo están asociados con PAI [50, 115, 118-122]. Histológicamente, las

lesiones renales se caracterizan por un denso infiltrado linfoplasmocitario

parcheado o difuso, con abundantes eosinófilos. Generalmente, existe tubulitis,

daño y atrofia tubular, adelgazamiento de la membrana basal tubular y

afectación glomerular [50, 121]. Inmunohistoquimicamente, se detecta un

denso infiltrado de células plasmáticas IgG4+ en el intersticio renal [50, 118,

120, 121]. También se han encontrado depósitos inmunes granulares en la

membrana basal tubular [121]. Según la distribución de estos infiltrados, las

lesiones se pueden clasificar en nefritis tubulointersticial difusa y en masas tipo

tumorales [50]. Algunos pacientes con PAI que presentan lesiones nodulares

en el riñón, simulando tumores metastáticos [115, 116]. Estas lesiones

consisten en masas tipo tumorales compuestas por numerosos agregados de

células plasmáticas y linfocitos en el intersticio renal [50].

En algunos casos, se ha descrito la asociación de la PAI con nefropatía

membranosa, donde se observan depósitos de células IgG4+ en el glomérulo o

en la membrana basal tubular [118].

49


1.7.7. Afectación del retroperitoneo y del mesenterio

La fibrosis retroperitoneal es una enfermedad caracterizada por la

proliferación de tejido fibroso en el retroperitoneo [122]. Las lesiones presentan

infiltrados inflamatorios activos y crónicos formados por células plasmáticas

IgG4+, esclerosis y folículos linfoides con centros germinales [122].

Clínicamente, la fibrosis retroperitoneal, se presenta como un síndrome

constitucional, con fatiga, fiebre, pérdida de peso y malestar [122]. El hallazgo

patognomónico de la enfermedad es una espesa masa fibrótica retroperitoneal

que cubre la aorta abdominal y comprime los uréteres. El proceso fibrótico

puede conducir a obstrucción de los uréteres, fracaso renal o hidronefrosis

[123].

Aproximadamente en un 70% de los casos de fibrosis retroperitoneal, la

causa es desconocida [124], aunque se han descrito casos asociados con la

PAI [99, 124-128]. En estos pacientes se ha observado una densa infiltración

de células plasmáticas IgG4+ en el páncreas y en las masas fibróticas

retroperitoneales [129]. Neild et al [124] han descrito los hallazgos histológicos

de 12 pacientes con fibrosis retroperitoneal idiopática, encontrando fibrosis y

densos infiltrados de linfocitos T y células plasmáticas IgG4+, junto con

venulitis y arteritis obliterativa. Estos hallazgos sugieren que algunos casos de

fibrosis retroperitoneal constituyen las lesiones retroperitoneales de la ISD.

La mesenteritis esclerosante es un raro trastorno fibroinflamatorio de

etiología desconocida, que afecta primariamente al mesenterio de intestino

delgado [130, 131]. Histológicamente, se observa intensa fibrosis, escasa

inflamación y necrosis [130]. Se ha descrito afectación del páncreas en

50


pacientes con mesenteritis esclerosante [130, 131]. Akram et al [132], han

encontrado abundantes infiltrados de células plasmática IgG4+ en un 33% de

los pacientes con mesenteritis esclerosante. Sugiriendo que la IgG4 podría

jugar un papel clave en la patogénesis de la enfermedad.

1.7.8. Afectación del tiroides

Aproximadamente la cuarta parte de los pacientes con PAI presentan

hipotiroidismo, generalmente con anticuerpos anti-tiroglobulina [133]. La

tiroiditis de Riedel es una forma rara de tiroiditis crónica, donde la glándula

tiroidea es reemplazada por tejido fibroso. Aunque se desconoce la causa de la

enfermedad, se considera que forma parte de un proceso fibroinflamatorio

sistémico que afecta también a otros órganos. Esta entidad se asocia no sólo

con tiroiditis, sino también con fibrosis retroperitoneal, mediastinitis

esclerosante, colangitis esclerosante o pseudotumor orbital [134, 135]. En la

tiroditis de Riedel se han observado numerosas células plasmáticas IgG4+, lo

que sugiere que podría constituir otra forma de ISD [136].

1.7.9. Afectación de mamas

Cheuk et al [137] han descrito 4 casos de mastitis esclerosante asociada a

IgG4, que se presentan como nódulos indoloros palpable, solitarios o múltiples.

Patológicamente, se observan densos infiltrados linfoplamocitarios con

formación de folículos linfoides, extensa esclerosis y atrofia de los lóbulos

mamarios. Inmunohistoquimicamente, se detectan abundantes células

plasmáticas IgG4+.

Zen el al [138] han descrito un caso de pseudotumor inflamatorio en la mama.

El paciente presentaba induración de la mama izquierda, con niveles séricos

51


elevados de IgG4 e incremento de células plasmáticas IgG4+ en la lesión.

Como las características histológicas de este caso parecen ser idénticas a las

descritas en la serie de Cheuk et al, se ha sugerido que esta entidad podría

constituir una manifestación de la ISD en la mama [137].

1.7.10. Afectación pulmonar

La afectación pulmonar en la ISD se puede presentar como neumonía

intersticial o como pseudotumor inflamatorio.

Hamed et al [139] han descrito un paciente con un nódulo pulmonar

mimentizando clínicamente el cáncer de pulmón. Este paciente presentaba

niveles séricos elevados de IgG4, lesiones inflamatorias en la próstata,

glándulas submandibulares y conductos biliares y numerosas células

plasmáticas IgG4+ en la biopsia del nódulo pulmonar. Todos estos hallazgos

llevaron al diagnóstico final de ISD.

Se han descrito dos casos de neumonía intersticial asociada a PAI.

Taniguchi et al [140] han descrito un paciente con PAI que desarrolló

neumonía intersticial bilateral durante el seguimiento. Histológicamente, se

observaron densos infiltrados linfoplasmocitarios y un incremento de células

plasmáticas IgG4+ en el pulmón. Nieminen et al [141] también han descrito un

caso de PAI asociada con colangitis esclerosante, sialadenitis y neumonía

intersticial nodular

Zen et al [142] han reportado 9 pacientes con pseudotumores pulmonares

inflamatorios. Histológicamente se caracterizan por la presencia densos

infiltrados linfoplamocitarios en el septo alveolar adelgazado, fibrosis,

infiltración eosinofílica, estrechamiento irregular de los bronquiolos y un

52


patrón de neumonía intersticial en los límites de los lóbulos. Además, se

observó arteritis obliterativa en 5 de ellos.

Shrestha et al [143] han descrito histológicamente las biopsias hepáticas de

6 pacientes con PAI. Las muestras presentaban endotelialitis de las venas

pulmonares, fibrosis activa, infiltrados inflamatorios ricos en células plasmáticas

e histiocitos y pleuritis. Inmunohistoquimicamente, se detectaron numerosas

células plasmáticas distribuidas difusamente en los nódulos.

1.7.11. Afectación de la próstata

Recientemente se ha descrito la prostatitis asociada a IgG4 en pacientes

con o sin PAI. Los síntomas se manifiestan en el tracto urinario inferior.

Histológicamente la próstata muestra densa infiltración de células plasmáticas

IgG4+ y linfocitos, flebitis obliterativa, atrofia glandular e intensa fibrosis [144-

146].

1.7.12. Afectación de nódulos linfoides

La linfadenopatía es común en la ISD [147-149].

Cheuk et al [150] han estudiado las características morfológicas de los

nódulos linfoides en la ISD, encontrando tres patrones:

Enfermedad tipo Castleman

Hiperplasia folicular

Expansión interfolicular por inmunoblastos y células plasmáticas

Los nódulos linfoides de los pacientes con linfadenopatía y PAI, presentan

un marcado incremento de células plasmáticas IgG4+/IgG+ [150]. Este hallazgo

sugiere que estos casos podrían representar la manifestación en nódulos

linfoides de la enfermedad.

53


TABLA 3 . Órganos afectados en la enfermedad esclerosante aso ciada a IgG4

Órgano o sitio

Características clinicopatológicas

Referencias

Páncreas Pancreatitis autoinmune tipo 1

Pancreatitis autoinmune tipo 2

7,19, 113, 151-153

9, 41, 71, 78, 154

Conductos biliares Colangitis esclerosante asociada a IgG4

Pseudotumor inflamatorio

85, 97

155, 156

Hígado

Colangitis esclerosante afectando a conductos intrahepáticos Inflamación portal con/sin hepatitis Obstrucción de conductos biliares Esclerosis portal Hepatitis lobular Colestasis canalicular Pseudotumor inflamatorio

69, 87, 88, 90, 91

Vesícula biliar Colecistitis difusa, acalculosa, linfoplasmocitaria 95-97

Tracto gastrointestinal Aumento de células IgG4+ en la mucosa

Enfermedad inflamatoria intestinal

19, 98, 101

79

Glándulas salivares y lacrimales

Tumor de Küttner ( Sialadenitis esclerosante)

Enfermedad de Mikulick

Dacrioadenitis crónica esclerosante

102, 103, 106-108, 157

Riñón Nefritis tubulointersticial

Glomerulopatía membranosa

115, 118-121, 158

Retroperitoneo y mesenterio

Fibrosis retroperitoneal

Mesenteritis esclerosante

122, 126-132

Tiroides Hipotiroidismo. Tiroiditis de Riedel 133-135

Mama Pseudotumor inflamatorio 138

Pulmón Neumonía intersticial


141-148

Aorta Aneurisma de la aorta abdominal 89, 159

Órbita Pseudotumor inflamatorio 160

Mediastino Mediastinitis esclerosante 161

Glándula pituitaria Hipofisitis


162

Próstata Prostatitis asociada a IgG4 144

Nódulos linfoides

Linfadenopatía tipo Enfermedad Castleman

Linfadenopatía con hiperplasia folicular

Linfadenopatía con expansión interfolicular

147-151

54


1.8. Histopatología

Desde el punto de vista histopatológico, la PAI puede considerarse una

forma única de pancreatitis [163]. En un examen grosero, se observa un

endurecimiento focal o difuso del páncreas [15].

Yoshida et al [15] describieron las 4 características histológicas cardinales

de la PAI (Figura 3).

Infiltración linfoplasmocitaria

Fibrosis intersticial

Infamación periductal

Periflebitis

Por tanto, el marcador histológico de la PAI es la densa infiltración del

espacio periductal por células inflamatorias. Asociado a este infiltrado, existe

destrucción acinar, flebitis obliterativa, y fibrosis del parénquima pancreático,

que se puede extender al tejido blando peripancreático adyacente [19, 56].

El infiltrado inflamatorio varía en celularidad y suele presentar una

distribución parcheada. Consiste fundamentalmente en linfocitos y células

plasmáticas (a menudo productoras de IgG4) con macrófagos, neutrófilos y

eosinófilos dispersos. El marcaje inmunohistoquímico muestra que los linfocitos

consisten fundamentalmente en células T CD4+, con algunas células T CD8+ y

células B [164]. Estos infiltrados predominan en conductos intralobulares de

tamaño medio y grande, afectando a menudo al conducto de Wirsung [11, 31,

167]. El infiltrado se localiza fundamentalmente en el área subepitelial con

la capa epitelial prácticamente intacta. Esto conduce a un plegamiento del

epitelio que comprime el lumen ductal formando una estructura tipo estrella.

55


a) Infiltración linfoplasmocitaria b) Fibrosis intersticial

c) Inflamación periductal d) Periflebitis

Figura 3 . Histopatología de la pancreatitis autoinmune. a) Infiltración linfoplasmocitaria, b) Fibrosis intersticial, c) Inflamación periductal, d) Periflebitis. British Journal of Surgery 2007;94:1067–74.

Además la fibrosis periductal conduce a adelgazamiento de las paredes

ductales [165, 166]. En el proceso inflamatorio se observa ocasionalmente un

predominio de eosinófilos y neutrófilos que destruye el epitelio ductal [168, 169].

La fibrosis intersticial con atrofia acinar es otra de las características

patológicas. Cuando afecta a un área de gran tamaño, se manifiesta como una

pancreatitis formadora de masas [170].

El elemento vasculítico, consiste generalmente en una flebitis de pequeñas

venas que puede progresar a una venulitis obliterativa [17, 151, 165, 166]. La

flebitis suele predominar en el tejido inflamado y a menudo se extiende a

tejidos peripancreáticos.

56


La PAI se puede clasificar histológicamente en 2 tipos [151, 171]:

El patrón histológico en la PAI tipo 1 es llamado pancreatitis

esclerosante linfoplasmocitaria (LPSP). La LPSP consiste en una

densa infiltración linfoplasmocitaria y fibrosis que afecta a los lóbulos y

conductos pancreáticos y al tejido adiposo peripancreático [41, 148,

171, 172]. La fibrosis en un patrón estoriforme y la flebitis obliterativa,

se consideran características diagnósticas de la LPSP. Los eosinófilos

pueden aparecer en los infiltrados inflamatorios, pero no se observan

neutrófilos (Figura 4A).

El patrón histológico en la PAI tipo 2 se denomina pancreatitis

idiopática ductulo-céntrica (IDCP). A diferencia de la LPSP, en la IDCP

el proceso inflamatorio se centra en el sistema pancreático exocrino

[151, 171, 174]. La infiltración neutrofílica en el lumen y el epitelio de

los conductos interlobulares se considera un rasgo característico de la

IDCP (Figura 4B). Estos infiltrados conducen a lesiones epiteliales

granulocíticas que pueden asociarse con daños en el epitelio ductal e

incluso obliteración ductal [151, 171]. Aunque se conoce menos de la

IDCP, parece no estar asociada con enfermedades sistémicas

(excepto con la IBD, presente en un 30% de los pacientes), ni con

ningún marcador serológico [41].

Notablemente, a diferencia de la IDCP, la LPSP se asocia con niveles

elevados en suero de IgG4 y con la presencia de numerosas células

plasmáticas IgG4+ (Figura 4C), sugiriendo que sólo la LPSP es la

manifestación pancreática de la ISD [172, 173].

57


Figura 4. Patrón histológico de la pancreatitis autoinmune.A) Fibrosis estoriforme y flebitis obliterativa (fechas) en LPSP. B) Infiltración neutrofílica (flechas) en el lumen ductal y el epitelio en la IDCP. C) Numerosas células plasmáticas IgG4 positivas en LPSP (inmunomarcaje de IgG4). Gastroenterology 2010;139:140–8.

Sah et al [154] han descrito el perfil clínico de una larga cohorte de pacientes

con PAI, incluyendo 78 casos de LPSP y 19 casos de IDCP (Tabla 4). La edad

al diagnóstico de IDCP es de más de una década menor, los pacientes con

IDCP son menos propensos a presentar niveles elevados de IgG4 en suero y

lesiones extrapancreáticas esclerosantes, tienden a presentar características

focales y sufren más comúnmente reseciones quirúrgicas debido a la dificultad

diagnóstica. Tanto la LPSP como la IDCP responden bien a la terapia

esteroidea, aunque la LPSP es más propensa recaída.

El páncreas y otros órganos afectados en la PAI presentan una densa

infiltración con numerosas células IgG4+. El inmunomarcaje del tejido

pancreático para IgG4 contribuye al diagnóstico de la PAI [152].

El diagnóstico histológico de la PAI requiere la preservación de la

arquitectura del tejido. En este sentido, el uso de la biopsia transendoscópica

guiada por ultrasonido ha emergido como una herramienta eficaz y segura

para obtener biopsias pancreáticas en la PAI [175-176]. Cuando se obtienen

mediante biopsias por punción con aguja gruesa, la sensibilidad diagnóstica

de la histología pancreática depende del tamaño de la muestra tisular.

58


TABLA 4 . Datos demográficos, perfil clínico, tratamiento y seguimiento de PAI tipo 1 y 2

PAI tipo 1 (n=50)

PAI tipo 2 (n=19)

Valor P

Edad (años) (media +/- DE) 6,5+/- 15,3 47,7 +/- 18,8 0,005

Sexo (M/F) 38/12 14/5 0,53

Presentación (pancreatitis aguda /otras con ictericia obstructiva)

6/46 6/13 0,059

Imagen Inflamación difusa Otras características

16 (30) 36 (70)

3 (16) 16 (84)

0,36

Niveles séricos elevados IgG4 (>140 mg/dl)

25/33 (76) 1/6 (17) 0,11

Afectación extrapancreática 26 (52) 0 <0,0001

IBD 2 (4) 3 (16) 0,12

Tratamiento inicial Corticosteroides Cirugía Tratamiento de soporte

21 (42) 25 (50) 4 (8)

6 (32) 13 (68)

0

0,39 0,17 0,33

Seguimiento clínico (meses) Mediana >1 año >3 años >5 años

42

70 (90) 48 (62) 23 (30)

29

16 (84) 9 (47) 8 (42)

_

45 44 (23-86) 14/31

Datos expresados n (%). DE: desviación estándar

Gastroenterology 2010;139:140–8

A menudo, el páncreas no esta afectado uniformemente por las características

clásicas de la PAI, por eso, cuando son biopsiadas áreas visiblemente no

implicadas, pueden producirse errores diagnósticos [177]. Además, el

inmunomarcaje de tejidos extrapancreáticos, como el árbol biliar, retroperitoneo

o colon, ha revelado positividad para IgG4 en pacientes con PAI [114].

Actualmente, no está claro cómo la histología pancreática puede predecir la

severidad o progresión de la insuficiencia pancreática exocrina o endocrina.

59


1.9. Estudios de imagen

1.9.1. Ultrasonografía

El papel de la ultrasonografía en el diagnóstico de la PAI no se ha

establecido con claridad. En general, las imágenes no son específicas ni

diagnósticas de la PAI. Típicamente se ha descrito hinchazón hipoecoica del

páncreas con compresión del conducto pancreático principal por el parénquima

(Figura 5) [57]. En la forma focal afectando a la cabeza pancreática, se han

descrito masas pancreáticas hipoecoicas únicas o múltiples, dilatación del

conducto biliar común, y menos frecuentemente dilatación por encima del

conducto pancreático principal [178-180]. La ultrasonografía aumentada por

contraste (CEUS) constituye una herramienta sensible para evaluar el patrón

de vascularización típica de la PAI. Además es un buen indicador para

monitorizar la eficacia de la terapia esteroidea [178, 181].

1.9.2. Tomografía computerizada (CT)

La forma clásica de la PAI en la CT abdominal se presenta como

alargamiento difuso del parénquima pancreático, dando a la glándula una forma

de salchicha, junto con borramiento de los límites pancreáticos (Figura 6) [16,

71, 78, 182]. Después de la inyección de medio de contraste, se observa un

aumento moderado del páncreas, ectasia de los conductos pancreáticos,

borramiento de la grasa peripancreática y una cápsula tipo anillo de baja

densidad rodeando a la glándula (halo de hipo-atenuación) [56, 183].

La forma focal, afectando mayoritariamente a la cabeza del páncreas y/o al

proceso uncinado, aparece como una masa hipo-atenuante o iso-atenuante

[57].

60


Figura 5. PAI forma difusa. Ultrasonografía transversa epigástrica mostrando aumento difuso del páncreas (flechas). Dig. Liver Dis 2010;42: 92–8.

Figura 6. CT de un paciente con PAI no tratada mostrando aumento difuso del parénquima pancreático (forma de salchica), con el contorno parenquimal suavizado. Gastroenterol Clin N Am 2008;37:439–60.

61


1.9.3. Resonancia magnética (RM) y Colangio-pancreatografía por RM (CPRM)

La imagen por RM revela aumento focal o difuso del páncreas con intensidad

de señal disminuida en T1 y aumentada en T2, y, ocasionalmente, una cápsula

tipo anillo en T2 [184].

La CPRM es útil en la caracterización de los conductos biliares y

pancreáticos. Permite observar múltiples estructuras intrahepáticas, la

dilatación de los conductos intrahepáticos y las características del conducto

biliar común [16].

La porción estrechada del conducto pancreático principal no se puede

visualizar en la CPRM, por esta razón, no permite diferenciar entre un

estrechamiento irregular del conducto pancreático principal y la estenosis típica

del cáncer de páncreas. Estos hallazgos sugieren que la CPRM puede ser útil

en el seguimiento de los pacientes en tratamiento, pero no en el diagnóstico de

la PAI [185].

1.9.4. Colangio-pancreatografía retrógada endoscópica (CPRE)

La CPRE es esencial en el diagnóstico de la PAI, ya que uno de los criterios

diagnósticos de la enfermedad, es el estrechamiento difuso o segmental del

conducto pancreático principal con pared irregular en la CPRE (Figura 7) [57].

En la forma focal, puede observarse dilatación adyacente o por encima del

conducto pancreático principal, junto con estenosis del conducto biliar común,

mimetizando la imagen típica del cáncer de páncreas [57].

Otra característica común en la CPRE, es el estrechamiento irregular de la

región hepática hiliar, y menos frecuentemente, de las estructuras

intrahepáticas ductales [186].

62


Figura 7. CPRE mostrando estenosis del conducto biliar común distal (flechas). Dig. Liver Dis 2010;42: 92–8.

Se ha visto que la CPRE constituye un método preciso para diferenciar la

PAI de la colangitis esclerosante primaria. Nakazawa et al [187] observado que

la presencia de una estructura tipo cinta, la apariencia de árbol podado y la

formación tipo divertículo son significativamente más frecuentes en pacientes

con colangitis esclerosante primaria. En contraste, el estrechamiento segmental,

la dilatación pre-estenótica y el estrechamiento del conducto biliar común distal

son significativamente más comunes en pacientes con PAI y colangitis

esclerosante.

1.9.5. Ultrasonografía endoscópica (USE)

La USE es la mejor técnica de imagen para detectar pequeñas masas

pancreáticas y para el diagnóstico de la PAI, ya que permite realizar biopsias

pancreáticas eficaces y seguras [188, 189].

63


En la PAI, la USE muestra una inflamación pancreática hipoecoica difusa,

y/o masas hipoecoicas en la cabeza del páncreas (Figura 8). Otro hallazgo

sugestivo de la PAI es la dilatación del conducto biliar común con

engrosamiento de su pared. El adelgazamiento de la pared del conducto biliar

presenta unas características únicas: es homogéneo, con una capa intermedia

hipoecoica y capas externa e interna hiperecoicas formando un patrón tipo

sándwich que puede alcanzar 5 mm de espesor (Figura 8) [190, 191]. En la

forma focal de la PAI se puede observar dilatación del conducto pancreático

principal mientras que en la forma difusa puede encontrarse comprimido por el

parénquima agrandado [190].

La punción aspirativa con aguja fina guiada por ultrasonografía endoscópica

(USE-PAAF) es una técnica sensible y específica para el diagnóstico de

malignidad pancreática. En contraste, el diagnóstico citopatológico de la PAI no

se encuentra estandarizado. La USE-PAAF de masas pancreáticas, de nódulos

linfoides y de la pared del conducto biliar común, revela la existencia de fibrosis

y de infiltrados linfoplasmocitarios; estos hallazgos se correlacionan con el

diagnóstico patológico [190]. Sin embrago, es difícil obtener suficiente tejido

pancreático para llegar a un diagnóstico definitivo sin hacer una laparotomía.

Se ha propuesto que el frotis citológico con fragmentos estromales ricos en

células inflamatorias y epiteliales es diagnóstico de la PAI [192].

La USE también proporciona la oportunidad de obtener biopsias por punción

con aguja gruesa. Levy et al [175] han estudiado su utilidad diagnóstica en tres

pacientes con sospecha de adenocarcinoma de páncreas. En dos de ellos la

PAI fue diagnosticada, mientras que en el otro se hizo el diagnóstico de

64


Figura 8. a) USE mostrando una lesión hipoecoica focal en la cabeza pancreática (PH) (flechas) y engrosamiento difuso de la pared del conducto biliar común (puntas de flecha). b) Patrón tipo sándwich de la pared del conducto biliar común, con una capa intermedia hipoecoica y capas externa e interna hiperecoicas (flechas). PV= Vena portal. Dig. Liver Dis 2010;42: 92–8. pancreatitis crónica. En todos ellos, esta técnica permitió evitar una cirugía

innecesaria.

1.10. Marcadores serológicos

Los pacientes con PAI presentan a menudo niveles séricos elevados de

enzimas pancreáticos, como amilasa y lipasa, aunque estos hallazgos no se

consideran específicos de la PAI [31, 54, 194]. Adicionalmente, la enfermedad

se asocia con hipergammaglobulinemia [6] y con niveles séricos elevados de

IgG4, y con la presencia en suero de varios autoanticuerpos, como los

anticuerpos anti-nucleares (ANA), anti-lactoferrina (LF), anti-anhidrasa

carbónica II (AC-II) ,anti-amilasa α-2A (AMY-2A) y anti-inhibidor de la secreción

de la tripsina pancreática (PSTI) [31-33, 193].

1.10.1. Niveles séricos elevados de inmunoglobulina G4 (IgG4)

La IgG4 es la subclase menos abundante en suero de IgG y representa de

un 3 a un 6% de la IgG total en individuos sanos. La IgG4 es la única subclase

de IgG que es incapaz de unir el C1q del complemento para activar la vía

clásica y que presenta baja afinidad por el antígeno diana [195].

65


Se han encontrado altas concentraciones séricas de IgG4 en un pequeño

número de condiciones patológicas, como en la dermatitis atópica [196],

enfermedades parasitarias [197], pénfigo vulgar y pénfigo foliáceo [198]. En

estas condiciones la IgG4 se considera un anticuerpo patológico. En pacientes

con dermatitis atópica, asma y en algunas enfermedades parasitarias, las

concentraciones séricas elevadas de IgE e IgG4 representan una respuesta

directa frente a antígenos exógenos [199]. En pacientes con pénfigo vulgar y

foliáceo, la IgG4 actúa como autoanticuerpo frente a las moléculas de adhesión,

desmogleina 1 y 3 [200, 201]. En pacientes con nefropatía membranosa se ha

escrito la presencia de inmunocomplejos con IgG4 en suero y de depósitos de

IgG4 en la superficie epitelial de la membrana basal glomerular [202, 203].

Hamano et al [113] fueron los primeros en mostrar que las elevaciones en

los niveles de IgG4 eran características de la PAI. Estos autores estudiaron 20

pacientes con PAI, 20 controles sanos y 154 pacientes con otras enfermedades,

incluyendo pancreatitis crónica, cáncer de páncreas, cirrosis biliar primaria,

CEP y SS, encontrando que los niveles séricos elevados de IgG4 (punto

de corte de 135 mg/dl) eran muy sensibles (95%) y específicos (97%) para

diferenciar la PAI del cáncer de páncreas

Aparisi et al [32] han analizado la importancia de los niveles séricos de IgG4

para el diagnóstico de la PAI. En este estudio multicéntrico participaron 227

sujetos de 5 hospitales españoles, incluyendo 54 pacientes con pancreatitis

crónica idiopática, 86 con pancreatitis crónica alcohólica, 33 con SS y 54

controles sanos. Estos autores concluyeron que los niveles séricos elevados de

IgG4 no son específicos de la PAI, ya que se encontraron en un 15% de los

66


pacientes con pancreatitis crónica idiopática y en un 8% de los pacientes con

pancreatitis crónica alcohólica [32].

Ghazale et al [204] han determinado la utilidad de la IgG4 sérica en el

diagnóstico de la PAI en una cohorte de 510 pacientes de Estados Unidos

Incluyendo 45 con PAI, 135 con cáncer de páncreas, 268 con otras

enfermedades pancreáticas y 62 sin enfermedad pancreática. La sensibilidad,

especificidad y valor predictivo positivo de los niveles séricos elevados de IgG4

(punto de corte de 140 mg/dl) para el diagnóstico de la PAI, fue de un 76%,

93% y 36%, respectivamente. Cuando usaron un punto de corte del doble de

los límites normales de IgG4 (280 mg/dl), los correspondientes valores fueron

de un 53%, 99% y 75%, respectivamente. En este estudio se encontraron

elevaciones de IgG4 en un 3-10% de pacientes sin PAI, incluyendo cáncer de

páncreas, pancreatitis aguda y crónica y ausencia de enfermedad pancreática.

Estos autores llegaron a la conclusión de que los niveles séricos elevados de

IgG4 son característicos pero no diagnósticos de la PAI [204].

Kamisawa et al [30], han analizado la correlación entre los niveles séricos de

IgG4 y la presencia de lesiones extrapancreáticas en la PAI. En 40 pacientes

con PAI, se midieron los niveles de IgG4 pre-tratamiento y se evaluaron

retrospectivamente 4 lesiones extrapancreáticas asociadas (colangitis

esclerosante, colecistitis esclerosante, sialadenitis esclerosante y fibrosis

retrperitoneal). Mediante un análisis, basado en curvas ROC, encontraron que

el punto de corte óptimo de los niveles de IgG4 en suero para diferenciar entre

pacientes con PAI sin y con lesiones extrapancreáticas, era de 220 mg/dl. En

consecuencia, los pacientes con niveles séricos de IgG4 superiores a 220

67


mg/dl tienen más lesiones extrapancreáticas asociadas y parecen presentar

una enfermedad más activa que aquellos con niveles inferiores a 220 mg/dl [30].

En el 2008 se ha publicado un meta-análisis donde se han revisado todos

los datos existentes en la literatura en ingles sobre el uso de los niveles séricos

de IgG4 en el diagnóstico y seguimiento de pacientes con PAI [205]. Se

seleccionaron 7 artículos acerca de la utilidad de la IgG4 en el diagnóstico de a

PAI, donde se incluyeron 159 pacientes con PAI y 1099 controles (Tabla 5).

Los criterios diagnósticos utilizados fueron, el japonés en 4 estudios [113, 173,

206, 207], el español en uno [32], el coreano en otro [208], y el de la Clínica

Mayo en el último [204]. Debido al uso de criterios diagnósticos diferentes, la

selección de los pacientes en los 7 estudios analizados fue heterogénea. El

punto de corte de los niveles elevados de IgG4 fue de 135 mg/dl en 5 de los

estudios [101, 173, 206-208], 130 mg/dl en uno [32] y 140 mg/dl en el restante

[204]. Globalmente, el rango de sensibilidad fue de un 66,7% a un 94,3% [206].

A pesar de la elevada heterogeneidad encontrada entre estos 7 estudios,

debido al empleo de diferentes criterios diagnóstico y controles, la sensibilidad

fue bastante alta, aunque serían necesarios nuevos estudios diseñados

específicamente, evitando estos factores de confusión, para determinar la

verdadera precisión de la IgG4 en el diagnóstico de la PAI [205]. Es importante

diferenciar la PAI del cáncer de páncreas, con respecto a ello se analizaron 4

estudios que comparaban la PAI con el cáncer de páncreas. La sensibilidad, la

especificidad y el OR (odd ratio) fueron significativamente heterogéneos entre

esos 4 estudios, aunque la IgG4 mostró una buena precisión para

la diferenciación entre esas dos condiciones.

68


TABLA 5. Detalles de los 7 estudios sobre la utilid ad de la IgG4 en el diagnóstico de la PAI

Estudio LR (mg/dl)

Criterios para PAI n Cáncer de páncreas

EAI Otras Nº total controles

Ghazale et al204 140 Criterios Clínica Mayo 45 135 - 330 465

Choi et al208 135 Criterios Coreanos 30 76 - 67 143

Hirano et al206 135 Criterios Japoneses 35 23 11 48 82

Hamano et al113 135 Criterios Japoneses 20 70 36 64 170

Aparisi et al32 130 Puntuación española 6 - 33 144 177

Uehara et al207 135 Criterios Japoneses 6 - 6 - 6

Kamisawa et al173 135 Criterios Japoneses 17 - 10 46 56

Total - - 159 304 96 699 1099

LR: Límite de referencia. EAI: Enfermedades autoinmunes

J Gastroenterol Hepatol 2009;24:15–36.

Con respecto a la utilidad de la IgG4 como marcador de eficacia del

tratamiento esteroideo en el seguimiento de pacientes con PAI, se incluyeron 4

estudios [88, 113, 164, 209] con un total de 34 pacientes. Los autores

concluyeron que la IgG4 era un marcador útil para evaluar la eficacia del

tratamiento esteroideo, sólo en pacientes con niveles séricos IgG4 elevados

previos al tratamiento. La tabla 6 muestra los datos de la literatura, subdivididos

de acuerdo a los tres análisis llevados a cabo: Análisis global de los 7 estudios

(análisis A), análisis de los 4 estudios que comparan la PAI con el cáncer de

páncreas (análisis B), análisis de los 5 estudios que comparan la PAI con

otras enfermedades autoinmunes no pancreáticas (análisis C).

69


TABLA 6. Detalles de los 7 estudios sobre la utilid ad de la IgG4 en el diagnóstico de la PAI

Estudio VP FP FN VN Sensibilidad (%)

Especificidad (%)

OR

Análisis A: PAI vs Co

Ghazale et al204

Choi et al208

Hirano et al206

Hamano et al113

Aparisi et al32

Uehara et al207

Kamisawa et al173

Total

34

22

33

18

4

6

14

131

32

9

4

0

8

0

6

59

11

8

2

2

2

0

3

28

433

134

78

170

169

6

50

1040

75,6(60,5-87,1)

73,3(54,1-87,7)

94,3(80,0-99,3)

90,0(88,3-98,8)

66,7(22,2-95,7)

100(54,1-100)

82,4(56,6-96,2)

82,4(75,6-88,0)

P=0,0078

93,1(90,4-95,2)

93,7(88,4-97,1)

95,1(88,0-98,7)

100(97,9-100)

95,5(91,3-98,0)

100(54,1-100)

89,3(78,1-96,0)

94,6(93,1-95,9)

P<0,001

40,0(18,8-85,3)

37,5(13,4-104,7)

233,8(47,3-54579)

2523(116,7–54579)

35,9(6,6–195,0)

169,0(2,9–9876)

32,2(7,7–133,8)

63.9(28.9–141.4)

P=0,071

Análisis B: PAI vs CP

Ghazale et al204

Choi et al208

Hirano et al206

Hamano et al113

Total

34

22

33

18

107

13

1

0

0

14

11

8

2

2

23

122

75

93

70

290

75,6(60,5–87,1)

73,3(54,1–87,7)

94,3(80,8–99,3)

90,0(68,3–98,8)

82,3(74,6–88,4)

P=0,043

90,4(84,1–94,8)

98,7 (92,9–100)

100(85,2–100)

100(94,9-100)

95,4(92,4–97,5)

P=0,001

27,2(11,4–65,1)

133,2(22,1–804,8)

629,8(28,9–13729)

1043(48,0–22685)

144,6 (24,l4–857,6)

P=0,021

Análisis C: PAI vs EAI

Hirano et al206

Hamano et al113

Aparisi et al32

Uehara et al207

Kamisawa et al173

Total

33

18

4

6

14

75

4

0

0

0

0

4

2

2

2

0

3

9

7

36

33

6

10

92

94,3(80,8–99,3)

90,0(68,3–98,8)

66,7(22,3–95,7)

100(54,1–100)

82,4(56,6–96,2)

89,3(80,6–95,0)

P=0,250

63,6(30,8–89,1)

100(90,3–100)

100(89,4–100)

100(54,1–100)

100(69,2–100)

95,8(89,7–98,9)

P=0,001

22,3(3,9–122,9)

540,2(24,6–11842)

120,6(5,0–2935)

169,0 (2,9–9876)

87,0(4,0–1870)

66,6(20,2–220,0)

0,444

Analisis A: Análisis global de los 7 estudios. Análisis B: Análisis de los 4 estudios que comparan la PAI con CP. Análisis C: Análisis de los 5 estudios que comparan la PAI con otras EAI. Valor P: test X2 de homogeneidad de sensibilidades, especificadades y OR entre los diferentes estudios. Entre paréntesis se muestra el intervalo de confianza de un 95% para la sensibilidad, especificidad y OR. Co: Controles. CP: Cáncer de páncreas. EAI: Enfermedades autoinmunes. OR: Odd ratio. FN: Falsos negativos. FP: Falsos positivos. VN: Verdaderos negativos. VP: Verdaderos positivos.

J Gastroenterol Hepatol 2009;24:15–36.

1.10.2 Autoanticuerpos

La PAI se asocia con la presencia en suero de numerosos autoanticuerpos,

principalmente los anticuerpos anti-LF, anti-AC II y anti-AMY-2A [31-33]. En

nuestra experiencia los anticuerpos anti-AC II junto con los nivéles séricos

elevados de IgG4 constituyen los marcadores serológicos más útiles para el

diagnóstico de la PAI [32].

70


11..1100..22..11.. AAnnttiiccuueerrppooss aannttii--aannhhiiddrraassaa ccaarrbbóónniiccaa ((AACC))

La AC es un metaloenzima dependiente de Zinc que cataliza la hidratación-

deshidratación reversible del CO2 y HCO3 mediante la siguiente reacción [210]:

CO2 + H2O ↔ H+ + HCO3

Como esta reacción es esencial en numerosos procesos fisiológicos, como

la respiración, el equilibrio ácido-base, el transporte iónico, la resorción ósea, la

acidificación renal, la gluconeogénesis o la ureagénesis; la AC se encuentra

presente en todos los tejidos y tipos celulares [211, 212]. La AC está

ampliamente distribuida en el tracto gastrointestinal, en particular en glándulas

salivares, duodeno, colon y tracto biliar [213]. Se han descrito 14 isoenzimas

de AC y AC asociadas a proteínas (AC-RP) [214]. Se pueden dividir en dos

tipos: intracelulares y extracelulares (Figura 9). Las ACs intracelulares incluyen

isoenzimas citoplasmáticos (AC I, II y III) e isoenzimas mitocondriales (AC VA y

VB). Las ACs extracelulares incluyen isoenzimas unidas a la membrana (AC

IV), una isoenzima secretada (AC VI) e isoformas de transmembrana (AC IX,

XII y XIV). En contraste a esas isoenzimas activas, la AC-RP VIII, IX Y XI se

consideran isoenzimas inactivas [215]. La actividad catalítica de la AC reside

en tres residuos de histidina de unión a Zinc [216].

1.10.2.1.a. Expresión de los isoenzimas de la AC en el páncreas

De todos los isoenzimas citoplasmáticos, la AC II es la que presenta mayor

actividad y una expresión más amplia en diferentes órganos y tipos celulares,

incluyendo el páncreas [211]. La AC II se encuentra en el citoplasma de las

células epiteliales de los conductos pancreáticos intra- e interlobulares [216].

71


Figura 9. Estructura molecular y localización subcelular de las isoenzimas de la anhidrasa carbónica (AC). Las isoenzimas se subdividen en 2 tipos: intracelulares y extracellares. GPI: glicofosfatidilinositol. PG: Dominios tipo proteoglicanos. TM: dominios transmembrana. IC: Cola intracitoplasmática. Dig Liver Dis 2001;33:68–74. En contraste, la AC I se expresa únicamente en las células A de los islotes

pancreáticos, mientras que la AC III no se expresa en la páncreas [216].

Con respecto a los isoenzimas mitocondriales, la AC VA y la AC VB

presentan una expresión específica de tejido, ya que la AC VA se expresa

únicamente en el hígado y la AC VB se encuentra en numerosos tejidos

incluyendo el páncreas (en las células B de los islotes pancreáticos), pero no

en el hígado [213].

En cuanto a los isoenzimas de transmembrana, la AC XII y la XIV también

muestran una expresión específica de tejido; la AC XII se expresa en páncreas

(en la membrana de las células epiteliales de los conductos pancreáticos),

riñones y glándulas salivares, mientras que la AC XIV se encuentra en hígado

y médula espinal [215]. Adicionalmente, la AC IX se expresa en páncreas (en

72


la membrana basolateral de las células epiteliales ductales), vesícula biliar y

tracto gastrointestinal [215].

Finalmente, de los isoenzimas unidos a la membrana, la AC IV se localiza en

el páncreas (en las células epiteliales ductales) [213], mientras que la CA VI se

encuentra en células acinares de páncreas y de glándulas salivares y

lacrimales [217, 218].

1.10.2.1.b. Papel fisiológico de los isoenzimas de la AC en el páncreas

La AC II, que abunda en el citoplasma de las células epiteliales ductales,

cataliza la hidratación del CO2 para generar HCO3. En consecuencia, la AC II

interviene en la producción del fluido isotónico rico en bicarbonato secretado

por las células ductales pancreáticas [219]. El bicarbonato secretado juega un

papel clave en el mantenimiento del jugo pancreático en un pH de neutro a

ligeramente básico, y en la neutralización del ácido gástrico en el tracto

intestinal superior para permitir la actuación de los enzimas digestivos [215].

Con respecto al papel fisiológico del resto de los isoenzimas de la AC en el

páncreas, Nishimori et al [215] han propuesto que las ACs juegan un

importante papel en la regulación del pH luminal en los conductos pancreáticos,

actuando como un mecanismo de defensa frente a la acidificación (figura 10).

El incremento de la presión intraduodenal conduce al reflujo ácido del

jugo duodenal a través del esfínter de Oddi hacia el sistema ductal pancreático.

El reflujo ácido puede inducir el daño de las células epiteliales del conducto

pancreático, conduciendo a la disminución del pH luminal. Un descenso del pH

por debajo de 6, conduce a la activación espontánea del tripsinógeno y de otras

proenzimas y a la agregación de proteínas secretoras [220], lo que puede

73


Figura 10. Papel fisiológico de la anhidrasa carbónica (AC) II. Hipótesis explicando la regulación del pH luminal en el páncreas. En páncreas, las células ductales tienen un contenido elevado de AC II en el citoplasma que cataliza la hidratación del CO2 a HCO3. Las células ductales también captan HCO3 mediante un cotransportador Na+/HCO3 en la membrana basolateral. Se cree que el HCO3 es secretado por una intercambiador Cl-/ HCO3 acoplado a un canal de Cl- regulado por cAMP. Se ha hipotetizado que la AC IV y probablemente la AC XII catalizan la reacción H+ + HCO3→ CO2 + H2O eliminado el exceso de ácido en forma de CO2

del lumen ductal. Esto constituye un sistema que mantiene el pH luminal en los conductos pancreáticos. CA: Anhidrasa carbonica. Dig Liver Dis 2001;33:68–74. desencadenar el desarrollo de pancreatitis y de otros procesos patológicos

[215]. Bajo estas condiciones ácidas, las AC extracelulares pueden catalizar la

reacción (H+ + HCO3→ CO2 + H2O) para eliminar el exceso de ácido del lumen

ductal.

1.10.2.1.c. Las AC como dianas antigénicas en la PAI

Nishimori et al [221-223] fueron los primeros en mostrar que pacientes con

pancreatitis crónica idiopática y SS, presentaban una respuesta inmunitaria

humoral y celular frente a una proteína de 60 kDa, que había sido aislada de

extractos pancreáticos porcinos y humanos. Para ello emplearon un anticuerpo

74


monoclonal, SP3-1, que además de dirigirse frente a esta proteína de 60 kDa,

también reaccionaba frente a las células ductales de numerosos órganos

exocrinos, incluyendo páncreas, glándulas salivares, lacrimales y esofágicas,

hígado (conductos biliares) y riñones (túbulos renales distales) [224].

Posteriormente este antígeno fue identificado como la AC II [49]. Desde

entonces, se han ido describiendo anticuerpos anti-AC II en el suero de

pacientes con enfermedades autoinmunes, como la PAI [31], colangitis

autoinmune [225], cirrosis biliar primaria [226, 227], LES [228, 229] y SS [228,

230]. La presencia de estos auto-anticuerpos puede representar la expresión

serológica de la participación del sistema inmunitario en un proceso

inflamatorio específico [231]. Adicionalmente, los anticuerpos anti-AC II podrían

desempeñar un papel patogénico en el desarrollo de enfermedades

autoinmunes en cepas de ratones predispuestas, ya que la inmunización activa

de ratones susceptibles con la AC II conduce a inflamación de glándulas

submandibulares [49] y a colangitis autoinmune [50].

La PAI se puede observar ocasionalmente como una complicación del SS, la

cirrosis biliar primaria, y/o la colangitis esclerosante [17, 165, 232, 233].

Basándose en estas evidencias clínicas, algunos autores han introducido el

concepto de “exocrinopatía autoinmune”, “síndrome seco” o “epitelitis

autoinmune” [234-236]; para hablar de una enfermedad compleja

desencadenada por una reacción inmunitaria frente a una diana antigénica

común expresada en las células epiteliales ductales de órganos exocrinos.

Uchida et al [237] han descrito el desarrollo de pancreatitis y sialoadenitis en

ratones timectomizados mediante la inmunización con AC II. Estos hallazgos

75


sugieren que la AC II puede ser una diana antigénica común en las células

epiteliales de múltiples órganos exocrinos [238].

En el suero de pacientes con pancreatitis crónica idiopática y SS, también se

han observado anticuerpos anti-AC I [109]. La AC I se expresa

mayoritariamente en glóbulos rojos, pero no en las células ductales de

glándulas exocrinas [211]. En esos pacientes los anticuerpos anti-AC I y anti-

AC II no presentan reactividad cruzada [109]. Una posible explicación de estos

hallazgos es que los autoanticuerpos inducidos primariamente por otro

isoenzima de la AC pueden presentar reactividad cruzada con la AC I y la AC

II [238]. Basándose en esta hipótesis, Nishimori et al [238] han estudiado la

presencia de anticuerpos frente a la CA IV, IX y XII, isoenzimas expresados en

las células ductales del páncreas, en el suero de pacientes con PAI y SS;

encontrando anticuerpos séricos anti-AC IV. La AC IV se expresa en las

células epiteliales de varios órganos; incluyendo la vesícula biliar y conductos

biliares [239], túbulo contorneado proximal y el asa de Henle [240], intestino

delgado y grueso [241], esófago [242], y glándulas salivares [243]. En contraste

con la expresión ubicua de la AC II [211], la presencia de la AC IV se

encuentra más restringida a los tejidos y tipos celulares donde se han

observado lesiones inflamatorias en pacientes con PAI y enfermedades

asociadas [238]. Por ello, se ha sugerido que la AC IV podría desempeñar un

importante papel en la patogénesis de la epitelitis autoinmune, incluyendo la

PAI y el SS.

76


1.10.2.1.d. Anticuerpos anti-AC II como marcadores serológicos en la PAI

Desde el nacimiento de la PAI como una nueva entidad clínica en 1995 [5],

los anticuerpos anti-AC II surgieron como marcadores serológicos candidatos

de la enfermedad [31, 231].

Ya en 1994, Nishimori et al [223] observaron que un 30% de pacientes con

pancreatitis crónica idiopática y un 27% de pacientes con SS, presentaban en

suero anticuerpos frente a una proteína pancreática desconocida , que fue

identificada posteriormente como AC II. En 1996, Kino-Ohsaki et al [230]

detectaron la presencia de anticuerpo anti-AC II en un 33% de pacientes con

pancreatitis crónica idiopática.

Frulloni et al [231] en el 2000, evaluaron la presencia de anticuerpos anti-AC

I y anti-AC II en un estudio prospectivo que incluyó 78 pacientes con

pancreatitis crónica, encontrando anticuerpos anti-AC I en un 26% de los

pacientes y anticuerpos anti-AC II en un 27%. En comparación con sujetos

sanos, la frecuencia de anticuerpos anti-AC II en pacientes con PAI fue de un

88,9%, sin embargo estos autoanticuerpos también se detectaron en pacientes

con otras enfermedades pancreáticas y en pacientes con SS. Estos hallazgos

sugieren que los anticuerpos anti-AC II no son un marcador específico de la

PAI.

Aparisi et al [32] en el 2004, analizaron la importancia de los anticuerpos

anti-AC II y de los niveles de IgG4 en suero para el diagnóstico de la PAI en un

estudio multicéntrico donde participaron 227 sujetos de 5 hospitales españoles.

Los anticuerpos anti-AC II se detectaron en un 28% de pacientes con

pancreatitis crónica idiopática. Adicionalmente, se encontró una fuerte

77


asociación entre los niveles séricos aumentados de IgG4, la presencia de

anticuerpos anti-CA II y las manifestaciones compatibles con la PAI.

11..1100..22..22.. AAnnttiiccuueerrppooss aannttii--llaaccttooffeerrrriinnaa ((LLFF))

La LF es una proteína de unión a hierro presente principalmente en

secreciones externas, como la leche materna, y en leucocitos

polimorfonucleares [244]. La proteína es liberada por leucocitos

polimorfonucleares activados, y su presencia en los fluidos corporales es

proporcional al flujo de neutrófilos [245, 246]. En consecuencia, la

determinación del contenido de LF en los fluidos corporales se considera un

marcador de inflamación [245].

La LF se encuentra normalmente presente a bajas concentraciones en las

secreciones pancreáticas y tiende a incrementarse en la pancreatitis crónica

[247].

La presencia de anticuerpos anti-LF se ha descrito en numerosas

enfermedades autoinmunes, como la PAI [31, 148, 165, 247-249], hepatitis

autoinmune [250, 251], LES [252], enfermedad de Crohn [165], colangitis

esclerosante primaria [250, 251], cirrosis biliar primaria [250], y DM tipo 1 (DM-

1) [73, 249].

Hardt et al analizaron la presencia de anticuerpos anti-LF en 48 pacientes

con pancreatitis crónica no alcohólica y 48 con DM-1, encontrando una

frecuencia de un 21% en los primeros y de un 8,3% en los segundos [249]. En

otro estudio realizado por Okazaki et al [53] los anticuerpos anti-LF se

detectaron en un 75% de 30 pacientes con PAI. Taniguchi et al también

observaron anticuerpos anti-LF en un 67% de 43 pacientes con DM-1.

78


En consecuencia, el valor diagnóstico y pronóstico de estos autoanticuerpos

en la pancreatitis PAI es limitado, debido a su baja sensibilidad y especificidad

[253].

Desde el punto de vista patogénico, la asociación de la PAI con

enfermedades autoinmunes extrapancreáticas y de los anticuerpos anti-LF con

la PAI y enfermedades hepáticas, sugiere que la LF podría ser una diana

antigénica común; ya que se encuentra presente en varios tejidos, incluyendo

el páncreas, hígado, tracto biliar y leucocitos. No esta claro si los anticuerpos

anti-LF son un simple epifenómeno del proceso autoinmune o si podrían jugar

un papel patogénico en la iniciación y perpetuación de la PAI [253].

11..1100..22..33.. AAnnttiiccuueerrppooss aannttii--aammiillaassaa αα--22AA ((AAMMYY αα--22AA))

La elevación de la amilasa en suero se considera un marcador típico de la

pancreatitis aguda, generalmente tres veces por encima de su valor normal.

Sin embargo, su especificidad es menor de un 70%, ya que se puede elevar en

otras muchas condiciones. En contraste, la mayoría de los pacientes con

pancreatitis crónica y PAI, suelen presentar niveles normales o ligeramente

aumentados de amilasa en suero.

En el 2002 Barera et al [254] describieron la existencia de hiperamilasemia

en una niña con enfermedad celiaca e hipotiroidismo. La hiperamilasemia

llevó a la sospecha de de pancreatitis crónica, sin embargo no se demostró

daño pancreático. En contraste observaron la presencia anticuerpos frente a la

amilasa porcina y su desaparición con la instauración de la dieta libre en gluten.

Este estudio constituye la primera evidencia de la presencia de

anticuerpos anti-amilasa en pacientes con ciertas enfermedades autoinmunes.

79


Endo et al [32] han analizado la presencia de anticuerpos frente a la AMY α

en pacientes con PAI. Los autores enfrentaron sueros de pacientes con PAI

con una librería de cDNA de páncreas humano y seleccionaron los clones

positivos. Mediante análisis de secuenciación observaron que 7 de 10 clones

positivos tenían una secuencia idéntica a la amilasa humana α-2A. A

continuación, desarrollaron una técnica de ELISA empleando una proteína

recombinante AMY α-2A, para detectar anticuerpos frente a la AMY α-2A en

15 pacientes con PAI, 25 con pancreatitis crónica alcohólica y 25 con cáncer

de páncreas. Los anticuerpos anti-AMY α-2A se encontraron en el 100% de los

pacientes con PAI, mientras que ninguno de los pacientes con pancreatitis

crónica alcohólica y cáncer de páncreas presentaron estos autoanticuerpos.

Adicionalmente estudiaron la presencia de anticuerpos anti-AC II y anti-LF en el

grupo de pacientes con PAI, encontrando una frecuencia de un 66% en los

primeros y de 53% en los segundos. En consecuencia concluyeron que los

anticuerpos anti-AMY α-2A podrían constituir un marcador mas sensible para el

diagnóstico de la PAI, que los anticuerpos anti-AC II y los anticuerpos anti-LF.

11..1100..22..44.. AAnnttiiccuueerrppooss aannttii--iinnhhiibbiiddoorr ddee sseeccrreecciióónn ddee ttrriippssiinnaa ppaannccrreeááttiiccaa ((PPSSTTII))

El PSTI es un péptido de 56 aminoácidos sintetizado en las células acinares

del páncreas que se colocaliza con el tripsinígeno en forma de gránulos de

zimógeno [255]. El PSTI inhibe aproximadamente el 20% de la actividad de

tripsina contenida en el páncreas mediante el bloqueo de su centro activo [255,

256]. En situaciones de estrés pancreático (por ejemplo, por una ingesta

excesiva de alcohol) se puede saturar la capacidad protectora del PSTI como

consecuencia de la activación aberrante del tripsinógeno, desencadenándose

80


pancreatitis [257-258]. Junto a su efecto protector en las células acinares del

páncreas, el PSTI también inhibe la activación del tripsinógeno en el conducto

pancreático principal [259]. Hay estudios que sugieren que la mutación exónica

N34S en el gen de la PSTI esta estrechamente asociada con la patogénesis de

la pancreatitis hereditaria y la pancreatitis crónica idiopática [260-261].

En el 2006, Asada et al [193] describieron la presencia anticuerpos anti-

PSTI en pacientes con PAI. En este estudio fueron reclutados 26 pacientes con

PAI, 53 con otras enfermedades pancreáticas y 12 sujetos sanos. Los

anticuerpos anti-PSTI se detectaron en un 42,3% mediante Western blot y en

un 30,8% mediante ELISA de los pacientes con PAI, mientras que ninguno de

los individuos de los otros dos grupos presentaron estos autoanticuerpos. Cabe

destacar que los anticuerpos anti-PSTI fueron de la subclase IgG1, y no de la

subclase IgG4, considerada más específica de la PAI. Adicionalmente,

estudiaron la presencia de anticuerpos anti-AC II y anti-LF en el grupo de

pacientes con PAI, encontrando un 90% de sueros positivos para alguno de

estos dos marcadores, y un 30% de positivos para los dos marcadores. Dentro

del 10% de pacientes sin anticuerpos anti-AC II y anti-LF, 2 de 3 tenían

anticuerpos anti-PSTI. En consecuencia, algunos pacientes con PAI podrían

ser diagnosticados únicamente con los anticuerpos anti-PSTI. Estos hallazgos

sugieren que los anticuerpos anti-PSTI son altamente específicos de la PAI, ya

que no se detectaron en pacientes con otras enfermedades pancreáticas, y

podrían constituir un nuevo marcador diagnóstico para diferenciar la PAI de

otras enfermedades pancreáticas.

81


Se desconoce cómo los anticuerpos anti-PSTI pueden contribuir al desarrollo

de PAI. Una posibilidad es que los autoanticuerpos podrían neutralizar e inhibir

la acción del PSTI, conduciendo a una activación excesiva de la tripsina en el

páncreas [193].

11..1100..22..55.. AAnnttiiccuueerrppooss aannttii--ppééppttiiddoo ddee llaa pprrootteeíínnaa ddee uunniióónn aall ppllaammiinnóóggeennoo ((PPBBPP))

Frulloni et al [262] buscaron dianas antigénicas relevantes en la patogénesis

de la PAI, mediante el enfrentamiento de una librería aleatoria de péptidos con

un pool de IgG obtenido de 20 pacientes con PAI, para obtener péptidos

recocidos específicamente por estos anticuerpos. Como la infección por

H.pylori se ha relacionado con la patogénesis de la PAI [25, 34, 40], los autores

compararon estos péptidos con secuencias proteicas conocidas de la bacteria,

encontrando un elevado grado de homología con un péptido de la proteína de

unión la plasminógeno (PBP) codificado por H.pylori. A continuación analizaron

la presencia de anticuerpos IgG frente a este péptido en 20 pacientes con PAI,

40 con cáncer de páncreas y 40 controles sanos, encontraron una frecuencia

de un 95% en los primeros y de un 10% en los segundos. En contraposición,

ninguno de los controles sanos presentó estos autoanticuerpos. Estos estudios

han permitido identificar un nuevo marcador serológico de la PAI, sin embargo

no es específico de la enfermedad, ya que se encuentra presente en algunos

pacientes con cáncer de páncreas.

Adicionalmente, se ha encontrado homología entre el péptido PBP y la

ubiquitina-proteína ligasa E3 (URB3) humana, expresada en niveles elevados

en células acinares del páncreas, sugierendo que las células acinares del

páncreas pueden constituir una diana antigénica importante en la PAI [262].

82


11..1100..22..66.. AAnnttiiccuueerrppooss aannttii--ttrriippssiinnóóggeennoo ((PPRRSSSS))

Como la PAI es un proceso inflamatorio mediado por una respuesta

inmunitaria dirigida frente a componentes epiteliales del páncreas, Löhr et al

[263] han buscado dianas antigénicas clave en este proceso inflamatorio. Para

ello han analizado el perfil de expresión génica y proteica en muestras de tejido

pancreático de 12 pacientes con PAI y lo han comparado con el de 8 con

pancreatitis cónica. El perfil de expresión génica de los pacientes con PAI

mostró 272 genes sobre-regulados, incluyendo los codificantes de

inmunoglobulinas y de quimiocinas y sus receptores, y 86 genes infra-

regulados, incluyendo los codificantes de proteasas pancreáticas, como las tres

isoenzimas del tripsinógeno (PRSS1, 2 y 3). El perfil de expresión proteica

mostró una reducción significativa de la expresión de proteasas pancreáticas,

como el tripsinógeno. Como estos enzimas son sintetizadas por las células

acinares del páncreas, los autores analizaron el número de células acinares

positivas para tripsina mediante inmunohistoquímica y Western blot,

encontrando que estaba correlacionado con la disminución de la expresión de

tripsinógeno observada en el perfil proteico. Estos hallazgos sugieren que el

proceso inflamatorio característico de la PAI podría conducir a la destrucción

irreversible de las células acinares del páncreas y, en consecuencia, a una

deficiencia de proteasas. Adicionalmente, se analizó la presencia de

anticuerpos dirigidos frente a los tres isoenzimas del tripsinógeno y frente al

PSTI, presentes en las células acinares del páncreas, en pacientes con PAI

y con pancreatitis crónica. Los autores encontraron anticuerpos frente a PRSS1

y 2, pero no contra el isoenzima 3, y frente al PSTI, en pacientes con PAI;

83


mientras que ninguno de los pacientes con pancreatitis crónica presentó estos

autoanticuerpos. Estos datos sugieren que no sólo los anticuerpos anti-PSTI,

sino también los anti-PRSS podrían constituir un marcador serológico

importante en la PAI.

1.12. Diagnóstico de la PAI

1.12.1. Criterios diagnósticos

En 1995 Yoshida et al [264] describieron una lista de 12 características

sugestivas de PAI, pero no llegaron a constituir unos criterios clínicos útiles

para su diagnóstico. Los primeros criterios diagnósticos para la PAI fueron

propuestos por la Sociedad Japonesa de Páncreas en el 2002 [265] y

revisados en el 2006 [266]. En el 2006, fueron propuestos los criterios

diagnósticos de Corea [267] y de Estados Unidos [268].

11..1122..11..11.. CCrriitteerriiooss ddiiaaggnnóóssttiiccooss jjaappoonneesseess

Los criterios diagnósticos japoneses [15, 265] del 2002, incluyen tres items:

1. Estudios de imagen: Aumento difuso del páncreas y estrechamiento

irregular del conducto pancreático principal (más de 1/3 del páncreas).

2. Datos de laboratorio: Incremento de los niveles séricos de

gammaglobulinas o de IgG, o la presencia de autoanticuerpos.

3. Examen histológico del páncreas: Infiltración linfoplasmocitaria y fibrosis.

El diagnostico de la PAI se hace cuando están presentes los tres items o el 1

junto con el 2 o el 3, siendo esencial la presencia de hallazgos radiológicos

compatibles con la enfermedad. Estos criterios fueron desarrollados para

poder diferenciar la PAI del cáncer de páncreas. A medida que se fueron

diagnosticando más casos de PAI, se pudo observar que en muchos de ellos

84


TABLA 7 . Criterios diagnósticos para la PAI (2006) en Japón

1. Estudios de imagen (US, CT o RM): Estrechamiento difuso o segmentario del conducto pancreático principal con pared irregular y aumento difuso o focal del páncreas.

2. Estudios de laboratorio: Aumento de γ-globulinas, IgG o IgG4 en suero, o presencia de autoanticuerpos como anticuerpos antinucleares y factor reumatoide.

3. Estudios histopatológicos: Marcada fibrosis interlobular e infiltración de linfocitos y células plasmáticas en el área periductal, ocasionalmente con folículos linfoides en el páncreas.

Diagnóstico de la PAI establecido cuando se cumple el criterio 1 junto con el 2 y/o el 3. Es necesario excluir enfermedades malignas, como cánceres de páncreas o biliar.

US:Ultrasonografía. CT:Tomografía computerizada.RM: Resonancia magnética.

J Clin Gastroenterol 2008;42:404–7

el grado de estrechamiento del conducto pancreático principal era inferior a 1/3

del páncreas y que los niveles séricos de IgG4 estaban siginificativamente

elevados. En consecuencia, los criterios fueron revisados en el 2006 [269]

(Tabla 7), sustituyendo el requerimiento de “más de 1/3 de de páncreas” por

estrechamiento segmentario el conducto pancreático principal y añadiendo los

niveles aumentados de IgG4 al criterio de laboratorio. Además los criterios del

2006 hacen énfasis en excluir enfermedades malignas como los cánceres de

páncreas y biliar, antes de hacer el diagnóstico de la PAI.

11..1122..11..22.. CCrriitteerriiooss ddiiaaggnnóóssttiiccooss ccoorreeaannooss

Los criterios diagnósticos coreanos [267], propuestos por el “Asan Medical

Center” en el 2006, estratifican la PAI en “definitiva”, “probable” y “posible”

(Tabla 8). Junto a los criterios japoneses, los coreanos incluyen respuesta a la

terapia esteroidea y la presencia de lesiones extrapancreáticas. La categoría

de PAI definitiva incluye los mismos criterios que los japoneses. Cuando los

pacientes presentan únicamente las características típicas de la PAI en los

85


TABLA 8 . Criterios diagnósticos para la PAI (2006) en Corea

1. Estudios de imagen (esencial): a. CT: Aumento difuso o focal del páncreas b. CPRE: Estrechamiento difuso o segmentario del conducto pancreático principal

2. Estudios de laboratorio: a. Aumento de IgG o IgG4 en suero b. Presencia de autoanticuerpos

3. Estudios histopatológicos: Marcada fibrosis interlobular e infiltración de linfoplamocítica

4. Asociación con otras enfermedades autoinmunes

Definitivo: Criterio 1+2+3+4 o 1+2+3 o 1+3 Probable: 1+4. Rediagnosticado como definitivo si existe respuesta a esteroides Posible: Sólo 1. Rediagnosticado como definitivo si existe respuesta a esteroides

Los pacientes son estratificados en: definitiva, posible y probable

US:Ultrasonografía. CPRE: Colangio-pancreatografía retrógada endoscópica

J Clin Gastroenterol 2008;42:404–7

estudios de imagen, o junto con varias lesiones extrapancreáticas, son

diagnosticados como PAI posible. La respuesta de los pacientes a la terapia

esteroidea conduce a la resolución del estrechamiento del conducto

pancreático principal y permite reasignarles en la categoría de PAI definitiva.

11..1122..11..33.. CCrriitteerriiooss ddiiaaggnnóóssttiiccooss ddee EEssttaaddooss UUnniiddooss

En Estados Unidos, los criterios diagnósticos de la PAI fueron propuestos

por la Clínica Mayo en el 2006 (criterios HISORt) [268]. Según estos criterios la

PAI puede ser diagnosticada en pacientes que cumplan ≥1 de los siguientes

ítems (Tabla 9):

1. Estudios histológicos: Pancreatitis esclerosante linfoplasmocitaria o

densa infiltración de células plasmáticas IgG4+.

2. Hallazgos de imagen compatibles en la CT junto con niveles séricos

aumentados de IgG4.

86

INTRODUCCIÓN

TABLA 9 . Criterios diagnósticos para la PAI ( Criterios HI SORT, Clínica Mayo)

1. Histología (al menos uno de los siguientes): a. Infiltrado linfoplasmocitario periductal, flebitis obliterativa y fibrosis estoriforme (LPSP) b. Infiltrado linfoplasmocitario con fibrosis estoriforme y abundantes células plasmáticas IgG4+ (10 células/HPF)

2. Estudios de imagen a. Típico: Aumento difuso del páncreas con una cápsula tipo anillo de baja densidad y estrechamiento irregular del conducto pancreático principal b. Otros: Masas pancreáticas focales/aumento, constricción ductal pancreática focal, atrofia pancreática, calcificación pancreática o pancreatitis.

3. Estudios serológicos: Niveles séricos aumentados de IgG4 (normal 8-140 mg/dl)

4. Otra afectación orgánica: Constricción biliar hiliar/intrahepática, constricción biliar distal persistente, afectación glandular parótida/lacrimal, linfadenopatía mediastinal, fibrosis retroperitoneal

5. Respuesta a la terapia esteroidea: Resolución/marcada mejoría de las manifestaciones pancreáticas/extrapancreáticas con la terapia esteroidea

Grupos diagnóstico a

Grupo A. Diagnóstico por histología pancreática (presencia ≥ 1 de los siguientes criterios):

* Muestra demostrando el espectro completo de LPSP * ≥ 10 células IgG4+/HPF en la inmunohistoquímica de infiltrados linfoplasmocitarios

Grupo B. Imagen típica + serología (presencia de los siguientes criterios):

* Aumento difuso del páncreas con cápsula tipo anillo de baja densidad mediante CT o RM * Pancreatograma mostrando el conducto pancreático difusamente irregular * Niveles séricos aumentados de IgG4

Grupo C. Respuesta a corticosteroides (presencia de los siguientes criterios):

* Enfermedad pancreática idiopática, después de descartar otras causas * Niveles séricos aumentados de IgG4 y otra afectación orgánica confirmada por la presencia de numerosas células IgG4+ * Resolución/marcada mejoría de las manifestaciones pancreáticas/extrapancreáticas con la terapia esteroidea

a:Los pacientes que cumple los criterios para 1 o más grupos son diagnosticados con PAI

HPF: Campo de alta resolución. CT: Tomografía computerizada. RM: Resonancia magnética. LPSP: Pancreatitis esclerosante linfoplasmocitaria.

Clin Gastroenterol Hepatol 2006;4:1010–6.

87

INTRODUCCIÓN

3. Respuesta a la terapia esteroidea de las lesiones pancreáticas y/o

extrapancreáticas.

EL criterio histológico constituye el “gold standard” para el diagnóstico de la

PAI, de modo que en la Clínica Mayo muchos pacientes son diagnosticados

utilizando únicamente este criterio.

11..1122..11..44.. CCoommppaarraacciióónn ddee llooss ttrreess ccrriitteerriiooss

Los criterios japoneses revisados [266] requieren de la presencia de los

hallazgos de imagen característicos de la PAI, y de al menos 1 de los criterios

de laboratorio o histopatológicos. Los criterios coreanos [267], añaden a los

japoneses la respuesta a la terapia esteroidea y la presencia de lesiones

extrapancreáticas. Usando los criterios de la Clínica Mayo [268], la PAI puede

ser diagnosticada únicamente en base a la existencia de hallazgos histológicos

compatibles, a la presencia del criterio de imagen junto con la elevación de los

niveles séricos de IgG4 y/o afectación extrapancreática.

Es importante evitar el diagnóstico erróneo de la PAI como cáncer de

páncreas y viceversa. Los criterios japoneses se basan en unas características

de consenso mínimas, para reducir el riesgo de diagnóstico erróneo de la PAI

como malignidad. Cuando se añade la respuesta a la terapia esteroidea a estos

criterios, aumenta la sensibilidad diagnóstica. Los investigadores coreanos

recomiendan realizar un ensayo de repuesta a terapia esteroidea en los casos

en que no se cumplan por completo los criterios diagnósticos japoneses. Como

la remisión del estrechamiento del conducto pancreático con la terapia

esteroidea se puede ver a las dos semanas del comienzo del tratamiento en

pacientes con PAI, los investigadores coreanos recomiendan realizar un

88

INTRODUCCIÓN

ensayo de respuesta a terapia esteroidea para diferenciar entre la PAI y el

cáncer de páncreas [267].

1.12.2. Diagnóstico de la PAI tipo 1

Se puede establecer mediante los criterios HISORt [268] y también,

salvando pequeñas diferencias, mediante los criterios consenso asiáticos [270].

11..1122..22..11.. EEssttuuddiiooss ddee iimmaaggeenn ++ sseerroollóóggííaa oo hhiissttoollooggííaa ccoommppaattiibblleess

En un paciente con hallazgos de imagen característicos (aumento difuso del

páncreas y estrechamiento irregular del conducto pancreático principal), y

elevación de los niveles séricos de IgG4 o histología compatible, se puede

diagnosticar con toda claridad la PAI tipo 1 [41]. La presencia de

autoanticuerpos, como los ANA o el factor reumatoide, podrían utilizarse como

marcadores serológicos, cuando no se han podido medir los niveles séricos de

IgG4 [271].

11..1122..22..22.. DDiiaaggnnóóssttiiccoo hhiissttoollóóggiiccoo//iinnmmuunnoohhiissttooqquuíímmiiccoo

De acuerdo con los criterios HISORt [271], los hallazgos histológicos son

suficientes para hacer el diagnóstico de la PAI tipo 1. En los criterios consenso

asiáticos también se han incluido los estudios histológicos [270], aunque a

diferencia de la Clínica Mayo, sólo se pueden realizar en muestras quirúrgicas

y no en biopsias pancreáticas.

La histología pancreática muestra las tres características clave de la LPSP

(densos infiltrados linfoplasmocitarios generalmente rodeando a pequeños

conductos, fibrosis estoriforme y flebitis obliterativa). De acuerdo con los

criterios HISORt, el diagnóstico de la PAI se puede realizar cuando estos

rasgos histológicos están presentes en, al menos, un 20% de las biopsias, o

89

INTRODUCCIÓN

mediante inmunomarcaje para IgG4, cuando se observan > 10 células IgG4+

por campo de alta resolución (HPF). Se han descrito inmunomarcajes para

IgG4 falsos positivos en pacientes con cáncer de páncreas [42, 152], en

consecuencia se debe evitar el diagnóstico de la PAI tipo 1 cuando se observan

células IgG4+ en ausencia del patrón histológico de la LPSP.

11..1122..22..33.. RReessppuueessttaa aa eesstteerrooiiddeess

Los pacientes con PAI tipo 1 responden drásticamente a la terapia

esteroidea [272]. En estos pacientes, la inflamación pancreática y el

estrechamiento del conducto pancreático principal se resuelve varias semanas

después del comienzo del tratamiento.

1.12.3. Diagnóstico de la PAI tipo 2

Todos los criterios diagnósticos publicados para la PAI están orientados

hacia el diagnóstico de la PAI tipo 1.

Una posible aproximación diagnóstica, es la presentación de la PAI tipo 2 en

pacientes jóvenes con ictericia obstructiva (descartando la existencia de cáncer

de páncreas), que no presentan ni marcadores serológicos, ni afectación

extrapancreática, con excepción de la enfermedad inflamatoria intestinal [41].

Sin embargo, más de un 25% de los pacientes con PAI tipo 1 (con confirmación

histológica) son seronegativos y un 30-40% no presentan afectación

extrapancreática [41]. En consecuencia, debido a la ausencia de un marcador

que se correlacione específicamente con el patrón histológico de la PAI tipo 2,

es difícil realizar un diagnóstico definitivo en ausencia de estudios histológicos.

Esta puede ser la razón por la cual el número de casos descritos de PAI tipo 2

es muy inferior al de casos de PAI tipo 1 [41].

90

INTRODUCCIÓN

1.13. Tratamiento

Los corticosteroides constituyen la primera línea de tratamiento en la PAI,

conduciendo a menudo a rápidas y drásticas tasas de respuesta [78, 113, 273-

275]. Aunque no se ha descrito la remisión espontánea en la PAI, el uso de

corticosteroides parece acelerar la recuperación y prevenir las recurrencias

[273].

Antes de iniciar el tratamiento, la sospecha de PAI debe de ser alta. Una vez

iniciada la terapia, los pacientes requieren de un seguimiento estrecho,

especialmente en caso de presentar algún síntoma más consistente con

malignidad que con PAI, como por ejemplo gran pérdida de peso, anorexia o

sudores nocturnos [276].

El tratamiento puede conducir a la desaparición de los síntomas clínicos

(como insuficiencia pancreática endocrina o síntomas de pancreatitis aguda) o

de las manifestaciones extrapancreáticas (como ictericia por afectación biliar o

sialadenitis) [75, 272, 273,277-279]. También puede llevar a la mejoría de las

alteraciones estructurales, por ejemplo del conducto pancreático principal [70].

El grado de respuesta estructural depende de la extensión de la fibrosis versus

inflamación; de modo que los pacientes con mayor grado de lesión inflamatoria

presentan mayor tasa de respuesta estructural, mientras que el predominio de

lesiones fibróticas no permite la remisión completa [273].

El protocolo de tratamiento corticosteroideo exacto en pacientes con PAI no

se encuentra estandarizado. La mayoría de los profesionales médicos inician la

terapia con 30-40 mg de prednisona diaria. Estas dosis son generalmente

efectivas para inducir la remisión. La resolución de los síntomas es

91

INTRODUCCIÓN

generalmente rápida, a las 2-3 semanas de inicio del tratamiento, mientras que

la remisión serológica (normalización de IgG4) y radiológica ocurre

generalmente en un periodo de semanas a meses [273].

En la Clínica Mayo, el tratamiento de los pacientes con PAI se realiza con

una disminución gradual de esteroides. La terapia se inicia con una dosis de

prednisona de 40 mg/día durante 4 semanas. Después de este periodo se

evalúa la respuesta clínica, radiológica y serológica al tratamiento. Si existe

respuesta, se va bajando la dosis de prednisona 5mg/semana hasta quitarla

por completo. Durante el tratamiento es necesario seguir los niveles de IgG4,

generalmente se produce un descenso (aunque no necesariamente

normalización) a las 4 semanas de inicio del tratamiento (Figura 11).

Entre un 30% y un 40% de pacientes presentan recaída clínica o radiológica

tras el tratamiento, requiriendo re-tratamientos durante un periodo prolongado

de tiempo [78, 85, 272, 280]. Las recaídas suelen ocurrir en un corto periodo de

tiempo, y pueden ser sintomáticas, serológicas o histológicas.

No esta claro si ciertos tipos de afectación orgánica son más propensos a

recaída que otros. Ghazale et al [85] observaron que en los pacientes con IAC

tratados con corticosteroides durante 11 semanas, aquellos que presentaban

afectación biliar proximal recaían con una tasa de un 65%, mientras que los

que presentaba constricción de la estructura biliar intrahepática del conducto

biliar común distal recaían con una tasa de un 25%. Cuando los pacientes

recaen tras el tratamiento con un segundo curso prolongado de esteroides, se

hace necesario el un tratamiento inmunosupresor crónico, como la terapia

92

INTRODUCCIÓN

Diagnóstico de Pancreatitis autoinmune

Comienzo Prednisona 40 mg/día. 4 Semanas

A las 4 semanas:Medir IgG4 y repetir estudios de imagen

Respuesta clínica, ↓ IgG4, mejoría radiológica

Sin cambios en síntomas, niveles de IgG4 o estudios radiológicos

Considerar diagnóstico alternativoDisminuir prednisona5 mg/semana hasta cero

Medir IgG4 y repetir estudios imagen a las 4-6 semanas de finalizar el tratamiento

No síntomas, ↓ IgG4, mejoría radiológica

Seguimiento clínico y radiológico seriado (6 meses inicialmente)

Recaída clínica, serológicao de imagen

> 1 recaída, iniciar terapia inmunosupresora crónica

Figura 11. Algoritmo para el tratamiento de la PAI. Datos recientes sugieren que la recaída de tras la retirada de la terapia esteroidea se produce en un 70% de pacientes con constricción de estructuras biliares extrahepáticas o intrahepáticas. Gastroenterology 2008;134:706–15.

93

INTRODUCCIÓN

crónica con prednisona, azatioprina o –mercaptopurina [276]. Aunque hay

pocos estudios que evalúen la eficacia del tratamiento a largo plazo de la PAI

con la terapia inmunosupresora, en la Clínica Mayo se han obtenido respuestas

favorables con este tipo de tratamientos [281].

1.14. Diagnóstico erróneo

La ausencia de un único test diagnóstico, el desconocimiento del espectro

clínico completo y la falta de consenso internacional en los criterios

diagnósticos de la PAI, ha conducido a un diagnóstico cambiante de la

enfermedad. Por otro lado, el aumento del conocimiento de la PAI ha

incrementado la probabilidad de considerara dentro del diagnóstico diferencial

de las distintas enfermedades pancreáticas. En consecuencia, el número de

pacientes diagnosticados erróneamente de PAI y a la inversa, ha ido

incrementando. El diagnóstico erróneo ocurre esencialmente en tres

situaciones [282]:

1. Pacientes con adenocarcinoma de páncreas o colangitis tratados con

corticosteroides a largo plazo y/o inmunoduladores.

2. Pacientes con dolor abdominal crónico tratados con corticosteroides

y/o inmunomoduladores.

3. Pacientes con PAI sometidos erróneamente a cirugía.

1.14.1. Diagnóstico erróneo de cáncer de páncreas como PAI

El diagnóstico erróneo de PAI en pacientes con adenocarcinoma de

páncreas supone la peor situación, ya que cualquier retraso en el diagnóstico

puede cerrar la estrecha ventana terapéutica para la resección quirúrgica del

adenocarcinoma de páncreas [282].

94

INTRODUCCIÓN

En pacientes con ictericia obstructiva, la malignidad pancreática debería de

ser considerada hasta que se demuestre lo contrario, especialmente si los

estudios radiológicos muestran masas pancreáticas hipoecoicas, dilatación de

los conductos pancreáticos o atrofia pancreática [282].

El estrechamiento irregular del conducto pancreático principal, constituye un

criterio de imagen esencial para el diagnóstico de la PAI. En contraposición, la

presencia de masas hipoecoicas o dilatación del conducto pancreático

incrementan la sospecha de cáncer de páncreas.

Es esencial que los pacientes con hallazgos de imagen atípicos, aunque

presenten un aumento difuso del páncreas con la apariencia característica de

“forma de salchicha”, presenten evidencias adicionales de PAI antes de

comenzar la terapia esteroidea. El tratamiento de masas pancreáticas con

corticosteroides únicamente en base a la existencia de niveles séricos elevados

de IgG4 supone un problema, ya que cerca de un 10% de pacientes con cáncer

de páncreas presentan niveles elevados de IgG4, generalmente inferiores al

doble de su valor normal. En consecuencia es esencial tener en cuenta que los

niveles séricos elevados de IgG4 por sí solos no son suficientes para el

diagnóstico de la PAI [193]. Los anticuerpos anti-AC II se consideran

marcadores serológicos inespecíficos de la PAI, ya que se encuentran

presentes en otras enfermedades pancreáticas. Sin embargo, Hosoda et al

[283] han encontrado estos marcadores en una elevada frecuencia en el suero

de pacientes con PAI en comparación con pacientes con cáncer de páncreas.

Estos hallazgos sugieren que los anticuerpos anti-AC II pueden constituir

una herramienta útil para diferenciar entre la PAI y el cáncer de páncreas [283].

95

INTRODUCCIÓN

El uso del ensayo de la respuesta a esteroides debe de restringirse a

pacientes seleccionados que presenten estudios negativos para cáncer de

páncreas, incluyendo biopsia pancreática, afectación extrapancreática y/o

niveles séricos elevados de IgG4. Adicionalmente, la respuesta se debe de

medir objetivamente e interpretar con precaución. Para realizar el diagnóstico

de la PAI, es esencial observar una mejoría objetiva de la apariencia del

páncreas en los estudios de imagen en un corto periodo de tiempo tras el inicio

del tratamiento. Por otro lado, en algunos pacientes con cáncer de páncreas y

niveles de IgG4 falsamente elevados, se ha observado una bajada de los

mismos con la terapia esteroidea. En consecuencia la disminución de los

niveles de IgG4 tras el tratamiento esteroideo, no se considera diagnóstico de

la PAI. Una mejoría clínica subjetiva, como disminución del dolor abdominal o

mejoría del apetito, tampoco se considera un criterio diagnóstico satisfactorio

de la PAI, ya que puede representar una respuesta inespecífica y transitoria a

la terapia con dosis elevadas de corticosteroides, incluso en el contexto de

cáncer de páncreas [282].

1.14.2. Diagnóstico erróneo de dolor abdominal crónico como PAI

Se han descrito casos de pacientes con síndromes de dolor abdominal

funcional que han sido diagnosticados erróneamente con PAI. Suele tratarse de

mujeres jóvenes con hinchazón abdominal, plenitud posprandial y dolor. El

hallazgo de elevaciones moderadas (< 2 o 3 veces) de los niveles de amilasa

y/o lipasa conduce a la sospecha de una etiología pancreática. La PAI puede

ser diagnosticada erróneamente en base a elevaciones de los niveles séricos

96

INTRODUCCIÓN

de IgG4, a la presencia de otros marcadores autoinmunes (ANA o factor

reumatoide), o a estudios de imagen falsamente positivos [282].

La dispepsia crónica no se ha descrito como forma de presentación de la PAI

[276]. Como el aumento de los niveles de IgG4 presenta un valor predictivo

positivo bajo, su elevación en pacientes con dispepsia crónica representa

probablemente un resultado falso positivo [193]. A diferencia de los pacientes

con PAI, donde el tratamiento puede inducir la remisión clínica completa, en

estos pacientes los corticosteriodes conducen únicamente a la mejoría

transitoria de los síntomas funcionales.

1.14.3. Diagnóstico erróneo de PAI como cáncer de páncreas

En la Clínica Mayo, de los pacientes que sufrieron resección de la cabeza

pancreática por enfermedad pancreática benigna desde 1985 hasta el 2001, un

11% fueron diagnosticados con PAI [14]. Cuando se aplican los tres criterios

diagnósticos existentes en la actualidad, es esencial obtener estudios de

imagen apropiados para hacer un diagnóstico correcto. Adicionalmente, se

debería de realizar una biopsia pancreática para evaluar la presencia de

infiltrados linfoplasmocitarios. Una vez tomada la decisión de aplicar el

tratamiento con corticosteroides o de realizar una resección quirúrgica, es

esencial reevaluar a los pacientes en un periodo inferior a 4 semanas [282]. En

un estudio prospectivo realizado por Moon et al, en 22 pacientes con sospecha

de PAI vs cáncer de páncreas, debido a la presencia de estudios de imagen

atípicos, el ensayo de respuesta al tratamiento esteroideo permitió en

diagnóstico de la PAI [284]. Sin embargo, si después de un corto ensayo de

97

INTRODUCCIÓN

respuesta a esteroides el diagnóstico continúa siendo dudoso, la resección

quirúrgica es razonable [282].

Con el fin de minimizar el diagnóstico erróneo de la PAI, Gardner et al [282]

han descrito varias pautas que pueden ayudar a los médicos realizar un

diagnóstico correcto (Tabla 10).

TABLA 10. Pautas cínicas que ayudan a evitar el diagnóstico e rróneo de la PAI

1. Utilizar los criterios diagnósticos de la Clínica Mayo, de Japón y de Corea contribuye a diferenciar entre la PAI y enfermedad maligna.

2. Recordar que la PAI es una enfermedad rara, mucho menos común que el adenocarcinoma de páncreas o el colangiocarcinoma.

3. Los niveles séricos de IgG4 están elevados en un 5% de pacientes sin enfermedad pancreática, 10% de pacientes con cáncer de páncreas y 6% con pancreatitis crónica. Un incremento de IgG4 no es específico de la PAI.

4. Los niveles séricos de IgG4 pueden disminuir en pacientes con cáncer de páncreas tratados inapropiadamente con corticoides.

5. Antes de iniciar la terapia con corticosteroides, identificar un marcador seguro para monitorizar una respuesta objetiva durante el tratamiento.

6. La respuesta a la terapia esteroidea se puede ver a las 2-4 semanas. Si no se encuentra respuesta objetiva dentro de las primeras 4 semanas, el diagnóstico de PAI es improbable.

7. Los coticosteroides conducen a menudo a una mejoría subjetiva de los síntomas, incluso en pacientes sin PAI.

8. Antes de iniciar el tratamiento se deben de examinar las masas pancreáticas focales.

Am J Gastroenterol 2009;104:1620–3.

98

INTRODUCCIÓN

1.15. Autoinmunidad y linfomagénesis

Las neoplasias linfoides constituyen un grupo heterogéneo de

malignidades desde el punto de vista etiológico [285], morfológico y clínico

[286]. Se piensa que la desregulación inmune juega un papel esencial en la

linfomagénesis, ya que se ha encontrado un aumento del riesgo de ciertos

linfomas tras el trasplante de órganos, infecciones, inmunodeficiencias y

enfermedades autoinmunes [287]. Desde hace más de 50 años, se ha descrito

la asociación entre autoinmunidad y linfomagénesis en numerosos estudios

humanos y animales. Se ha encontrado un incremento significativo del riesgo

de linfomas malignos en numerosas enfermedades autoinmunes, como la AR

[288-291], SS [292-293], LES [294-295], enfermedad celiaca [296-299],

tiroiditis autoinmune [300-302] y dermatitis herpetiforme [303-304]. En otras

enfermedades, como la enfermedad inflamatoria intestinal [305-306], la

psoriasis [307-308], y la esclerosis sistémica [309] se ha descrito una

asociación no significativa.

En los últimos años los estudios se han centrado en la investigación de las

variaciones en el riesgo de linfomas dentro de una misma enfermedad

autoinmune, en función del fenotipo de los pacientes o del tratamiento. En

pacientes con SS o AR el riesgo de linfoma esta fuertemente correlacionado

con la severidad de la enfermedad [310-311].

99

INTRODUCCIÓN

1.15.1. Enfermedades autoinmunes asociadas con riesgo de linfomas

11..1155..11..11.. EEnnffeerrmmeeddaaddeess aassoocciiaaddaass ccoonn uunn rriieessggoo ssiiggnniiffiiccaattiivvoo ddee lliinnffoommaass

En la AR, SS, LES, dermatitis herpetiforme y tiroiditis de Hashimoto, se ha

observado un aumento del riesgo de linfomas no Hodgking (LNH) en

numerosos estudios realizados en diferentes poblaciones [312]. Estudios en

grandes series de pacientes, han descrito un riesgo relativo promedio de

aproximadamente el doble en la AR [288-291, 310, 311], de 3 a 6 veces en el

LES [294, 295], de 2 a 10 veces en la dermatitis herpetiforme [303, 304], de 9 a

18 veces en el SS [292, 293], enfermedad celiaca [296-299] y tiroiditis

autoinmune [300-302].

Las investigaciones acerca de la asociación entre autoinmunidad y linfomas

Hodgkin (LH) son escasas, siendo el riesgo estimado más elevado, pero menos

preciso que para los LNH [313]. Tanto en la AR [288, 289, 314] como en el LES,

se ha observado un riesgo aumentado de LH de 3 a 5 veces [315].

Con respecto al riesgo de subtipos específicos de LNH, el SS, la tiroiditis de

Hashimoto y la enfermedad celiaca se ha asociado especificamente con el

desarrollo de linfomas en los órganos diana. En consecuencia, el SS se ha

asociado fuertemente con el linfoma del tejido linfoide asociado a las mucosas

(MALT) en la glándula parótida [316, 317], la tiroiditis de Hashimoto con el

linfoma MALT en la glándula tiroidea (trasformándose ocasionalmente a linfoma

de células B grande difuso) [301, 318], y la enfermedad celiaca con el linfoma

de células T tipo enteropático en el intestino delgado [286, 319].

Estudios recientes muestran la asociación entre numerosas enfermedades

autoinmunes y un subtipo concreto de LNH, el linfoma de células B grande

100

INTRODUCCIÓN

difuso. Theander et al [293] han observado que 7/12 LNH asociados con el SS,

son linfomas de células B grandes difusos (58%). En un análisis conjunto de

datos de estudios caso-control realizado por el Consorcio Internacional de

Epidemiología del Linfoma [320], el SS se ha asociado con un aumento del

riesgo de 9 veces con el linfoma de células B grande difuso y de 30 veces con

linfomas MALT. Baeklund et al [311], han analizado los linfomas presentes en

400 pacientes con AR, observando linfomas de células B grandes difusos en un

50% de ellos y caracterizándose posteriormente como de tipo centro no

germinal en su gran mayoría [311, 321]. Adicionalmente en el LES también se

ha encontrado una mayor incidencia de linfomas de células B grandes difusos

[295, 312, 320, 322], principalmente de tipo agresivo de centro no germinal

[322]. Finalmente, en enfermedad celiaca existen cada vez más evidencias de

un incidencia aumentada de linfomas de células B, además del linfoma de

células T tipo enteropático [297, 323].

11..1155..11..22.. EEnnffeerrmmeeddaaddeess aassoocciiaaddaass pprroobbaabblleemmeennttee ccoonn lliinnffoommaass

La psoriasis se ha relacionado con un mayor riesgo de LNH de células T [300,

307, 320], principalmente con el cutáneo de tipo micosis fungoide [307] y el

anaplásico de células grandes [300,320]. En pacientes con la enfermedad de

Crohn, se ha realizado estudios que muestran un aumento moderado, aunque

no significativo, del riesgo de LNH, de un 30 a un 40% [305, 306]. En la

esclerosis sistémica, el riesgo de LNH es del doble y tampoco es significativo

[309, 324, 325]. Finalmente, la sarcodosis se ha relacionado tanto con LH [326]

como con LNH [300, 314].

101

INTRODUCCIÓN

1.15.2 Subtipos de linfomas asociados con enfermedades autoinmunes

Los LH, se han asociado con enfermedades autoinmunes sistémicas. Dentro

de los LNH, el linfoma de células B grande difuso es el que se ha asociado más

fuertemente con enfermedades autoinmunes sistémicas. El linfoma de la zona

marginal y los linfomas de células T se han asociado tanto con las

enfermedades autoinmunes sistémicas como con las órgano-específicas. El

linfoma MALT se ha observado en condiciones inflamatorias crónicas, tanto

autoinmunes como infecciosas. Dentro de los subtipos más indolentes de

linfomas, el folicular y la macroglobulinemia de Waldenstrom se han asociado

con enfermedades autoinmunes sistémicas. Finalmente, no se ha encontrado

una asociación consistente entre las enfermedades autoinmunes y el mieloma

múltiple [327].

1.15.3. Factores de riesgo

11..1155..33..11.. FFaaccttoorreess ddee rriieessggoo ccllíínniiccooss

La severidad y las características propias de cada enfermedad autoinmune

se consideran factores de riesgo potenciales para el desarrollo de linfomas

[313].

En la AR, las primeras evidencias de la asociación entre severidad de la

enfermedad y linfoma provienen de estudios realizados en pacientes con el

síndrome de Felty [328], una complicación a largo plazo de la AR, donde se ha

observado un aumento del riesgo de LNH de aproximadamente 13 veces.

Baecklund et al [311] han estudiado los factores de riesgo potenciales de

linfoma en pacientes con AR, encontrando una fuerte asociación entre el riesgo

de linfomas, principalmente del linfomas de células B grandes difusos, y la

102

INTRODUCCIÓN

actividad acumulativa de la enfermedad. Estos hallazgos indican que las

células B periféricas activadas podrían desempeñar un papel importante en la

linfomagénesis en pacientes con AR.

En el SS, los marcadores de enfermedad severa, como púrpura palpable,

aumento de la glándula parótida e hipocomplementemia, permiten predecir el

desarrollo de linfomas [293, 317, 329-332]. Adicionalmente la presencia de

crioglobulinemia mixta monoclonal [293, 330] y de linfocitopenia CD4+ [293] en

pacientes con SS, se asocia con mayor riesgo de linfoma.

En el LES, la presencia de manifestaciones hematológicas de larga

evolución, de síntomas sicca y de afectación pulmonar se asocian con mayor

riesgo de LNH [322, 333].

En la enfermedad celiaca, se ha hipotetizado que la dieta libre en gluten

puede ejercer un efecto protector frente al desarrollo de linfomas [296], aunque

la mayoría de las evidencias se han basado en observaciones indirectas y en

estudios realizados con un reducido número de pacientes [299, 334, 335].

11..1155..33..22.. FFaaccttoorreess ddee rriieessggoo aassoocciiaaddooss ccoonn eell ttrraattaammiieennttoo

Dentro del grupo de las drogas aintirreumáticas modificadoras de la

enfermedad (DMARDs), el metotrexato (MTX) y la azatioprina se ha

relacionado con un mayor riesgo de linfoma [286, 311]. En este sentido, existen

numerosos estudios que relación el tratamiento con MTX con el desarrollo de

lesiones linfoproliferativas-virus de Epstein-Barr+ [286, 336, 337].

Los corticosteroides se han utilizado como tratamiento eficaz de numerosas

enfermedades autoinmunes. Numerosas estudios han permitido demostrar que

los esteroides no se asocian con un mayor riesgo de linfomas [311, 338-340].

103

INTRODUCCIÓN

En un estudio realizado en pacientes con arteritis de células gigantes y

polimialgia reumática [341], el tratamiento esteroideo a largo plazo codujo a

una reducción de la tasa de LNH, constituyendo una prueba convincente de

que los esteroides no aumentan el riesgo de linfoma.

Los fármacos biológicos se han convertido en la principal línea de

tratamiento de numerosas enfermedades autoinmunes. Los antagonistas del

TNF-α (adalimumab, etanercept e infliximab) se utilizan desde hace más de 10

años en el tratamiento de la AR, psoriasis, enfermedad de Crohn y colitis

ulcerosa, etc. En la mayoría de los estudios del riesgo de linfoma en pacientes

tratados con antagonistas del TNF, no se ha encontrado un riesgo significativo

en comparación con los DMARDs [290, 342, 343]. En dos meta-análisis

recientes [344, 345] se ha analizado el riesgo de linfoma en pacientes con AR

tratados con antagonistas del TNF-α, encontrándose sólo en uno de ello un

aumento del riesgo de linfoma [344]. En pacientes con la enfermedad

inflamatoria intestinal tratados con antagonistas del TNF, se han observado

varios casos de linfoma T hepatoesplénico [346].

11..1155..33..33.. FFaaccttoorreess ddee rriieessggoo bbiioollóóggiiccooss

Los dos elementos clave en la patogénesis de las enfermedades

autoinmunes son, la inflamación crónica y la activación persistente de células

B autorreactivas. En la AR se pueden encontrar signos tanto de inflamación

sistémica (hinchazón articular y elevación de la velocidad de sedimentación

globular y de la proteína C reactiva), como de activación de células B

autorreactivas (presencia de factor reumatoide, anticuerpos anti-péptidos

ciclicos citrulinados y cadenas ligeras libres). En contraste, en el SS sólo se

104

INTRODUCCIÓN

observan signos de activación de células B autorreactivas [347]. En

consecuencia es posible que esos dos mecanismos conduzcan a diferentes

tipos de linfomas [313]. En la AR, la actividad inflamatoria a largo plazo podría

desencadenar linfomas no localizados, como se pone en evidencia por el

mayor riesgo de linfomas de células B grandes difusos en la AR [311]. En

contraste la estimulación a largo plazo de células B autorreactivas podría ser

más relevante en la linfomagénesis en enfermedades autoinmunes órgano-

específicas, como por ejemplo el desarrollo del linfoma de células B de la zona

marginal en glándulas salivares activadas en el SS [316, 317]. Junto a ello, la

asociación reciente entre el SS y el linfoma de células B grande difuso [293]

podría explicarse por la posible existencia de un componente inflamatorio

sistémico en el SS [313].

1.15.3.3.a. Selección antigénica

En un estudio realizado en linfomas de glándulas salivares en pacientes con

SS, se ha observado una homología entre las regiones CDR3 de las

inmunoglobulinas de membrana de las células B y las de los factores

reumatoides. Estos hallazgos sugieren que la IgG, probablemente a través de

inmunocomplejos, podría ser la responsable de la activación de las células B

autorreactivas. [348].

1.15.3.3.b. Papel de BAFF (BLyS)

El aumento de la expresión del factor activante de células B (BAFF), una

citocina también llamada factor estimulador de linfocitos B (BLyS) [349],

podría explicar la activación patogénica de células B en varias enfermedades

autoinmunes y en linfomas [313]. BAFF es esencial en la maduración de

105

INTRODUCCIÓN

células B, la supervivencia de células plasmáticas y en la recombinación de

clase de las inmunoglobulinas [350]. En pacientes con LES y SS, se han

observado niveles séricos elevados de BAFF [351, 352], correlacionándose

además con los niveles de autoanticuerpos [352]. Además en los órganos

diana de ciertas enfermedades autoinmunes se puede observar la presencia de

niveles elevados de BAFF y su secreción por las células residentes, como las

células epiteliales salivares en el SS [353] o los sinoviocitos en la AR [354].

Por otro lado, los niveles de BAFF también están elevados en pacientes con

linfoma, donde es secretado por las células B linfomatosas y conduce a su

activación autocrina [355]. En consecuencia, los mecanismos relacionados con

los niveles de BAFF y/o su función representan un nexo común entre

autoinmunidad y linfomagénesis.

1.15.4. Posibles modelos de autoinmunidad y linfomagénesis

Existen varios mecanismos por los cuales la autoinmunidad podría conducir

al desarrollo de linfomas [356].

Goodnow [357] ha descrito las rutas y genes implicados en el desarrollo

tanto de enfermedades autoinmunes como de linfomas. El crecimiento de

células B inducido por autoantígenos, es inhibido por los mecanismos de

tolerancia inmunológica, que bloquean o limitan la señalización del receptor

antigénico mediada por NF-kB, PI3K/AKT, MYC y BCL-2/BCL-XL/A1 (Figura

12). Cuando estos mecanismos fallan, se desencadenan enfermedades

autoinmunes. Para este autor, tanto las enfermedades autoinmunes como los

linfomas son consecuencia de un proceso secuencial que conduce a la

eliminación de los puntos de control que inhiben el crecimiento descontrolado

106

INTRODUCCIÓN

Ras/ERK

Calcio/NFAT

Carma1/Bcl10/NFkB

PI3K/AKTReceptorAntigénico

Antígeno

Supervivencia

Crecimiento y división

Funciones efectoras

Aclaramiento de antígenos foraneos

Mutaciones en rutas de control

Autoantígenos que no pueden ser aclarados

Las células dejan de dividirse y se transforman en célulasde memoria o mueren

Crecimientodescontrolado ⇒

Linfoma, leucemia, mieloma

Estimulación descontrolada⇒ daño orgánico⇒Enfermedad autoinmune

Requerimiento de

Receptores inhibitorios y feedback intracelulares CTLA4, PD-1, FCRg2, SHP1, SHIP, CD5, CBL.B, Roquin

Inhibición por células TRegs

B7/CD28Componente microbiano/TLR

CD40L/CD40

IL-7, IL-15, BAFF

Mecanismos que inhiben el crecimiento

Apoptosis inducida por Bim

Apoptosis inducida por Fas

Mecanismos que limitan el crecimiento

Figura 12. Puntos de control del crecimiento de linfocitos. Múltiple mecanismos bloquean o limitan la capacidad de los receptores antigénicos de estimular el crecimiento de los linfocitos. La unión del antígeno a su receptor puede activar rutas de señalización de crecimiento y supervivencia (flechas negras). En los linfocitos que reconocen antígenos microbianos, esas señales conducen a su expansión clonal. Los autoantigenos no puedes ser aclarados por esta vía, conduciendo a la activación crónica del receptor antigénico y a la inducción ilimitada del crecimiento de los clones autorreactivos. La mutaciones que afectan a estos mecanismos, conducen a la extensión de los clones autorreactivos y al desarrollo de malignidades linfoides. Cell 2007;130:25–35.

de las células B, incluyendo las células B autorreactivas. Este proceso

secuencial esta asociado a la presencia de mutaciones somáticas y germinales

de genes que intervienen en estas rutas, como las que afectan al gen FAS, que

codifica para una mólécula implicada en la apoptosis de células B y T

autorreactivas, y que conducen al desarrollo de enfermedades autoinmunes y

de linfomas [358-362].

107

INTRODUCCIÓN

Hansen et al [363] han resumido los posibles mecanismos de progresión de

las enfermedades autoinmunes a linfomas, como la desregulación específica

de las células B autorreactivas, la hiperreactividad de las células B y las

alteraciones en las funciones de las células T.

Los principales factores inmunológicos que pueden contribuir a la

linfomagénesis se resumen en la figura 13. La autoinmunidad puede conducir a

la sobre-estimulación y apoptosis defectiva de las células B. Secundariamente,

la inflamación desencadenada por estimulación autoinmune puede promover

estos procesos. Adicionalmente, las infecciones asociadas con el proceso

autoinmune pueden actuar a través de las mismas vías [357]. Por otro lado los

factores genéticos también desempeñan un papel importante. En este sentido,

existen numerosos datos que demuestran el carácter hereditario tanto de las

enfermedades autoinmunes [364-367] como de los linfomas [368].

En base a estas observaciones se ha sugerido que las mutaciones

hereditarias podrían ser las responsables de la susceptibilidad a ambas

enfermedades [357].

Si esta hipótesis es cierta, debería de observarse agregación familiar de

enfermedades autoinmunes y de linfomas. Sin embargo todos los estudios

realizados hasta la fecha demuestran que una historia familiar de enfermedad

autoinmune, no es buena predictora del riesgo de linfoma [314, 300, 369].

108

INTRODUCCIÓN

LINFOMAGÉNESIS

Vigilancia inmunitaria- Adquirida (por ej. Infección por VIH, idiopática- Iatrogénica (por ej. transpante, fármacos)- Genética (por ej. Anemia de Fanconi, inmunodeficiencia 1ª)

Estimulación inmunitaria 1ª-Autoinmunidad- Infección- Inflamación crónica

Estimulación inmunitaria 2ª- Reactivación viral (por ej. VEB)- Disminución del control de agentes

infecciosos

Inflamación 2ª- Activación de células inmunitarias- Liberación de citoquinas y quimioquinas

Mutaciones somáticas y germinales

Figura 13. Factores inmunológicos implicados en el desarrollo de autoinmunidad y linfomas. Cell 2007;130:25–35.

1.15.5. Linfomas en la enfermedad esclerosante asociada a IgG4

Ochoa et al, han reportado un caso de linfoma MALT de la zona marginal en

la gándula submandibular, en un paciente con siladenitis esclerosante cónica

[371].

Cheuk et al [372] han descrito recientemente 3 casos de LNH ocular

adnexal en pacientes con dacrioadenitis esclerosante crónica asociada a IgG4.

Dos casos fueron linfomas de tipo marginal extranodal del MALT y uno fue

linfoma folicular de alto grado. Adicionalmente, Takahashi et al [373] han

reportado 3 casos de LNH en pacientes con ISD, dos de ellos en glandulas

salivares, y el otro extranodal. Estos hallazgos ponen de manifiesto la

concurrencia de la ISD y del linfoma en un mismo órgano.

109

INTRODUCCIÓN

Kim et al [373] han reportado un caso de LNH de tipo linfocítico de células

pequeñas afectando a nódulos linfoides mesentéricos un paciente con ISD. En

este sentido, los autores han especulado que la preexistencia de ISD podría

constituir un factor de predisposición para el desarrollo de este tipo de linfoma.

Finalmente Esposito et al [374] han descrito la presencia de oligoclonalidad

para el TCR-γ en un pseudotumor inflamatorio del páncreas.

110

111

HHIIPPÓÓTTEESSIISS YY OOBBJJEETTIIVVOOSS

22222222........ HHHHHHHHIIIIIIIIPPPPPPPPÓÓÓÓÓÓÓÓTTTTTTTTEEEEEEEESSSSSSSSIIIIIIIISSSSSSSS

YYYYYYYY

OOOOOOOOBBBBBBBBJJJJJJJJEEEEEEEETTTTTTTTIIIIIIIIVVVVVVVVOOOOOOOOSSSSSSSS

112

113

HIPÓTESIS Y OBJETIVOS

2. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS

2.1. Hipótesis

La PAI constituye una entidad emergente con un diagnóstico diferencial

frente a otras enfermedades pancreáticas, destacando el cáncer de páncreas,

complicado. Esta situación es debida a la ausencia de un único test diagnóstico,

al desconocimiento del espectro clínico completo y a la falta de consenso

internacional en los criterios diagnósticos de la PAI. En consecuencia, es

esencial caracterizar a los pacientes clínica, histológica y serológicamente y

establecer una batería de ensayos que permitan llegar al diagnóstico de la PAI

con la mayor precisión posible.

La clonalidad de células B se ha descrito en diversas enfermedades

autoinmunes, como el SS primario. Se ha sugerido que en pacientes con SS, la

expansión clonal de células B en glándulas salivares constituye un factor de

riesgo elevado de desarrollo de linfomas. De modo similar, en la PAI la

respuesta inmunológica podría estar mediada por unos pocos clones de células

B dirigidos frente a autoantígenos potenciales presentes en el páncreas. Si esta

hipótesis es cierta, poblaciones de células B oligoclonales o monoclonales

deberían de predominar tanto en lesiones pancreáticas y extrapacreáticas

como en sangre periférica de pacientes con PAI.

114


2.2. Objetivos

2.2.1. Diagnóstico serológico diferencial de PAI

Determinar la utilidad diagnóstica de los anticuerpos anti-CA II, anti-LF y

anti-AMY α-2A y de los niveles elevados de IgG4 en el suero de pacientes

con PAI.

Comparar la sensibilidad y especificidad de los niveles séricos de IgG y de

IgG4 en el diagnóstico de la PAI

Analizar la asociación entre losniveles séricos de IgG4 incrementados y la

presencia de lesiones extrapancreáticas en pacientes con PAI.

Determinar la utilidad diagnóstica de los anticuerpos anti-CA 19.9 y

correlacionarlos con los niveles séricos de CA 19.9 en pacientes con PAI.

Analizar la presencia de anticuerpos anti-p53 en pacientes con PAI,

sospecha de PAI, pancreatitis crónica idiopática, pancreatitis crónica y

cáncer de páncreas.

Examinar los niveles séricos de Interleucina-6 (IL-6) en pacientes con PAI,

sospecha de PAI, pancreatitis crónica idiopática, pancreatitis crónica y


2.2.2. Estudio de clonalidad en la PAI

Realizar el análisis inmunofenotípico de las poblaciones linfocitarias y de las

subpoblaciones de células B circulantes en pacientes con PAI, sospecha de

PAI y pancreatitis crónica idiopática

Cuantificar los niveles de cadenas ligeras libres y del cociente entre

cadenas ligeras libres Kappa y Lambda en el suero de pacientes con PAI,

sospecha de PAI y pancreatitis crónica idiopática.

115


Evaluar la presencia de proteínas monoclonales en el suero de pacientes

con PAI, sospecha de PAI y pancreatitis crónica idiopática.

Analizar la clonalidad de células B presentes en sangre y en infiltrados

linfoplasmocíticos presentes en lesiones pancreáticas y extrapancreáticas

en pacientes con PAI, sospecha de PAI y pancreatitis crónica idiopática.

2.2.3. Estudio del riesgo de cáncer en la PAI

Analizar la existencia de mutaciones de K-ras en el páncreas y en lesiones

extrapancreáticas de pacientes con PAI, sospecha de PAI y pancreatitis

crónica idiopática.

116

117

MMAATTEERRIIAALL YY MMÉÉTTOODDOOSS

33333333........ MMMMMMMMAAAAAAAATTTTTTTTEEEEEEEERRRRRRRRIIIIIIIIAAAAAAAALLLLLLLL

YYYYYYYY

MMMMMMMMÉÉÉÉÉÉÉÉTTTTTTTTOOOOOOOODDDDDDDDOOOOOOOOSSSSSSSS

118

119

MATERIAL Y MÉTODOS

3. MATERIAL Y METÓDOS

Todos los estudios planteados en el presente proyecto han sido aprobados

por el Comité de Ética e Investigación Clínica (CEIC) de Cantabria. El

consentimiento informado de los pacientes se obtuvo de acuerdo al Código

Internacional de Ética Médica (Declaración de Helsinki).

Los análisis estadísticos han sido realizados con el programa SPSS versión

15.0 para Windows (SPSS Inc, Chicago, Illinois, Estados Unidos).

La distribución normal de las variables cuantitativas fue analizada mediante

el test de Kolmogoroz-Smirnov.

3.1. Utilidad diagnóstica de los marcadores serológ icos en la PAI

3.1.1. Pacientes y diseño del estudio

En este estudio retrospectivo se incluyeron 93 pacientes con sospecha

clínica de PAI y 93 pacientes como grupos control. Para la detección de los

marcadores serológicos se emplearon muestras de suero obtenidas entre junio

del 2003 y octubre del 2009 y almacenadas a -80ºC en el Servicio de

Inmunología del Hospital Universitario Marqués de Valdecilla (HUMV).

Los pacientes con sospecha clínica de PAI, fueron subdivididos en función

del tipo de enfermedad pancreática en los siguientes grupos: PAI (n=12),

pancreatitis crónica (PC; n=23), pancreatitis crónica idiopática (PCI; n=26),

pancreatitis aguda (PA; n=11), cáncer de páncreas ( n=21). En el grupo de PC,

se incluyeron 15 casos de PC alcohólica, 5 de PC hereditaria y 3 de páncreas

divisum. Como grupos control se incluyeron 45 sujetos sanos, 9 pacientes con

síndrome de Sjögren (SS) y 40 pacientes con Diabetes Mellitus tipo 1 (DM-1).

Las características demográficas de los pacientes se muestran en la tabla 11.

120

MATERIAL Y MÉTODOS

TABLA 11 . Características generales de los pacientes inclui dos en el estudio

n Edad* Sexo (Masculino/Femenino)

Pancreatitis autoinmune 12 67 (16-78) 11/1

Pancreatitis crónica 23 44 (24-72) 22/1

Pancreatitis crónica idiopática 26 58 (20-87) 16/10

Pancreatitis aguda 11 59 (33-86) 5/6

Cáncer de páncreas 21 65 (38-84) 12/11

Síndrome de Sjögren 9 63 (45-71) 0/9

Diabetes Mellitus tipo 1 40 31 (5-67) 19/21

Sujetos sanos 45 44 (23-86) 14/31

*Datos expresados como mediana en años (rango)

El diagnóstico de PAI fue realizado de acuerdo con los criterios HISORt [268]

y el algoritmo diagnóstico de PAI propuesto por nuestro grupo [32]. El

diagnóstico de PC fue realizado en función de la existencia de disfunción del

páncreas exocrino, depósitos de calcio, cambios ductales o presencia de

piedras, todo ello demostrado mediante estudios funcionales y morfológicos.

Los pacientes fueron diagnosticados de PCI en base a la ausencia de causas

aparentes de PC, como alcoholismo, piedras o autoinmunidad según los

Criterios de Cambridge y Marsella [375, 376]. La pancreatitis aguda fue

diagnosticada en función de la elevación de los niveles séricos de amilasa junto

con la presencia de hallazgos clínicos y radiológicos característicos. El

diagnóstico del SS fue realizado según los criterios establecidos por el Grupo

de Estudio específico de la Comunidad Europea [377] y el de DM-1 según los

Criterios de la OMS [378].

121

MATERIAL Y MÉTODOS

3.1.2. Algoritmo diagnóstico de la PAI

Nuestro grupo en colaboración con otros grupos españoles ha propuesto el

siguiente algoritmo diagnóstico de la PAI [32].

En primer lugar se aplica un sistema de puntuación para identificar pacientes

con diagnóstico compatible con PAI según los siguientes criterios:

1. Manifestaciones clínicas: Ausencia de ataques agudos de pancreatitis,

ausencia de dolor abdominal, presencia de colestasis/ictericia y otras

enfermedades autoinmunes asociadas. Se da un valor de 1 cuando al

menos dos de esas condiciones están presentes y de 0 cuando una o

ninguna de ellas se cumple.

2. Parámetros morfológicos: Ausencia de calcificaciones y pseudoquistes,

presencia de masas pancreáticas o aumento del páncreas, y ausencia

de dilatación del conducto de Wirsung. Se da un valor de 1 cuando al

menos dos de esas condiciones están presentes y de 0 cuando una o

ninguna de ellas se cumple.

3. Parámetros de laboratorio: Aumento de los niveles de IgG y ANA en

suero. Se da un valor de 1 cuando al menos una de esas condiciones

están presentes y de 0 cuando ninguna de ellas se cumple.

Una puntuación total de 0 o 1 se considera como “probablemente no PAI”, de

1 como “posible PAI” y de 2 como “probable PAI”. A continuación, si existe un

diagnóstico compatible con PAI (“posible” o “probable”), se determinan la

presencia de niveles de IgG4 elevados (>130 mg/dl) y de anticuerpos anti-AC II

en suero. Finalmente si ambos marcadores son positivos se realizan los

122

MATERIAL Y MÉTODOS

estudios radiológicos de CPRE y se ensaya la respuesta al tratamiento

esteroideo para confirmar el diagnóstico.

3.1.3. Medición de los nivéles séricos de IgG y de IgG4

Los niveles séricos de IgG total y de IgG4 fueron medidos por nefelometría

(Nefelómetro BNII Siemens, Munich, Alemania). Se consideraron niveles

elevados aquellos valores por encima de los puntos de corte establecidos en

nuestro laboratorio y que son de 1200 mg/dl para la IgG total y de 130 mg/dl

para la IgG4 (estos valores han sido establecidos empleando 50 muestras de

suero de sujetos sanos).

3.1.4. Detección de los anticuerpos anti-AC II en suero

Los anticuerpos anti-AC II fueron determinados en suero mediante una

técnica de ELISA según habían descrito previamente Kino et al [109], con

pequeñas modificaciones, empleando el siguiente protocolo:

PPaassooss pprreevviiooss

-- Preparar el control positivo (C+). El C+ se realizará mezclando en

cantidades iguales un mínimo de 5 sueros de pacientes con

anticuerpos anti-AC II. Hacer alícuotas de 100 µl y congelar a

-20 ºC.

-- Preparar un pool de pacientes sanos. El pool se realizará

mezclando en cantidades iguales un mínimo de 15 sueros de

individuos sanos. Hacer alícuotas de 200 µl y congelar a -20ºC.

-- Preparar alícuotas de 50 µl del antígeno (Ag) AC II (Sigma

Chemical Co. St. Louis, MO) resuspendido en tampón carbonato

(1mg/ml) y congelar a -20ºC.

123

MATERIAL Y MÉTODOS

-- Preparar el tampón sustrato, pH 10,5: 8 mmol/L p-nitrofenil-fosfato

en 100 mmo/L de dietiletanolamina y 0,25 mmol/L MgCl2.

Conservar en un frasco opaco a temperatura ambiente.

DDííaa 11--RReeaalliizzaarr eell ““ccoottttiinngg””

El cotting se realiza en placas de micotitulación de fondo plano de 96 pocillos

(Linbro® 96-Well Microplates, LabWare ICN).

Con el fin de descartar la unión inespecífica de los sueros a los pocillos, en

paralelo a la placa cubierta con el antígeno diluido, se realizará una placa con

tampón carbonato sin antígeno.

- Diluir 50 µl del Ag AC II resuspendido (1mg/ml) en 10 ml de

tampón carbonato.

- Añadir 100 µl de antígeno diluido/pocillo en la placa “Con Ag”.

- Añadir 100 µl de tampón carbonato/pocillo en la placa “Sin Ag”.

- Incubar toda la noche a temperatura ambiente (RT).

DDííaa 22--BBllooqquueeaarr yy ccaarrggaarr llaass ppllaaccaass

- Lavar las placas 3 veces con PBS. Aspirar el contenido y lavar 3

veces con 250 µl/pocillo de PBS. Dejar la placa completamente

seca, golpeándola sobre un papel de filtro.

-- Añadir 200 µl de tampón bloqueo-diluyente (PBS-2% albúmina

sérica bovina o BSA)/pocillo.

- Tapar las placas e incubar 2 horas a 4ºC.

-- Diluir los sueros de los pacientes, el C+ y el pool 1/25 en tampón

bloqueo-diluyente.

124

MATERIAL Y MÉTODOS

-- Eliminar la solución de bloqueo. Secar la placa golpeándola sobre

un papel de filtro.

- Añadir 100 µl muestra/pocillo (El blanco se hace con el tampón

bloqueo-diluyente) en cada placa de acuerdo con la siguiente

plantilla:

11 22 33 44 55 66 77 88 99 1100 1111 1122

BL P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 pool pool

BL P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 pool pool

C+ P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 pool pool






BL: Blanco. C+: Control positivo. P1: Paciente 1. P2: Paciente 2…

- Incubar las tapas tapadas toda la noche a 4ºC.

DDííaa 33:: AAññaaddiirr ccoonnjjuuggaaddoo yy ssuussttrraattoo

- Diluir el conjugado (Anticuerpo anti-IgG humana conjugado con

fosfatasa alcalina (Sigma Chemical Co)) 1/1000 en tampón

bloqueo-diluyente.

- Lavar las placas 3 veces con PBS en las condiciones indicadas

anteriormente.

- Añadir 100 µl conjugado diluido/pocillo.

- Incubar las placas tapadas 2 horas a RT.

125

MATERIAL Y MÉTODOS

- Diluir el sustrato (fosfatasa alcalina (Sigma Chemical Co)) en el

tampon sustrato: 1 pastilla fosfatasa alcalina en 5ml tampón

sustrato.

- Lavar las placas 3 veces con PBS en las condiciones indicadas

anteriormente.

- Añadir 100 µl sustrato diluido/pocillo.

- Incubar las placas tapadas en oscuridad durante dos horas.

- Medir la absorbancia en el espectrofotómetro a una longitud de

onda de 405 nm.

IInntteerrpprreettaacciióónn ddee llooss rreessuullttaaddooss

Calcular la media (XM) de los valores de absorbancia (Ab) del C+, de los

pacientes y del pool, en la placa “Con Ag” y en la placa “Sin Ag”.

Los valores de Ab promedio obtenidos en la placa “Sin Ag”, implican uniones

inespecíficas de los sueros a la placa. Por tanto, para calcular el valor de Ab

promedio real de cada una de las muestras, es necesario obtener la diferencia

(Dif) entre el valor de Ab promedio de la muestra en la placa “Con Ag” y en la

placa “Sin Ag”, a partir de las siguientes fórmulas:

Dif Ab C+=X M (Abs C+) placa “Con Ag” - X M (Abs C+) placa “Sin Ag”

Dif Ab Pacientes= X M (Abs P1) placa “Con Ag”- X M (Abs P1) placa “Sin Ag”

Dif Ab pool= X M (Abs Pool) placa “Con Ag”- X M (Abs Pool) placa “Sin Ag”

El Cut-off (CO) se establece como las 3 desviaciones estándar (DE) por

encima de la diferencia entre el valor de Ab media del pool en la placa “Con Ag”

y en la placa “Sin Ag”, a partir de la siguiente fórmula:

XM (Dif Ab pool) + 3*DE (Abs pool) placa “Con Ag”

126

MATERIAL Y MÉTODOS

El valor de la Dif Ab C+ debe de ser superior al valor del CO. Cuando el valor

de la Dif Ab Paciente es superior al valor del CO, la muestra se considera

positiva; mientras que cuando es inferior, la muestra se considera negativa.

3.1.5. Detección de los anticuerpos anti-AMY α

Los anticuerpos anti-AMY α fueron determinados en suero mediante una

técnica de ELISA, empleando el siguiente protocolo:


- La preparación del control positivo y del pool de sujetos sanos se

realiza de forma similar a la descrita para los anticuerpos anti-AC

II

- Preparar el tampón BBS, pH 8,3-8,5: Ácido bórico 0,01 M +

Borax (Tetraborato sódico) 0,025 M + NaCl 0,075 M. Guardar a

4ºC.

-- Preparar alícuotas de 100 µl del Ag AMY α (Alpha amylase 1437

unidades/mg, pH 7,5. Sigma Chemical Co. St. Louis, MO) en

tampón BBS (100 µg/ml) y congelar a -20ºC.

- Preparar el tampón sustrato, pH 10,5: 8 mmol/L p-nitrofenil-fosfato

en 100 mmo/L de dietiletanolamina y 0,25 mmol/L MgCl2.

Conservar en un frasco opaco a temperatura ambiente.




- Diluir 100 µl del Ag AMY α resuspendido (100 µg/ml) en 10 ml de

tampón BBS.

127

MATERIAL Y MÉTODOS

- Añadir 100 µl de antígeno diluido/pocillo en la placa.

- Incubar toda la noche a 4ºC.


- Preparar el tampón de lavado: PBST (PBS + 0,05% Tween 20).

- Lavar la placa 3 veces con PBST. Aspirar el contenido y lavar 3



- Añadir 200 µl de tampón bloqueo-diluyente (PBS 1%BSA)/pocillo.

- Tapar la placa e incubar 2 horas a 4ºC.

- Diluir los sueros de los pacientes, el C+ y el pool 1/50 en tampón

de bloqueo-diluyente.

- Eliminar el bloqueo. Secar la placa golpeándola sobre un papel de

filtro.

-- Añadir 100 µl muestra/pocillo (el blanco será el tampón bloqueo-

diluyente) en la placa de de forma similar a los anticuerpos anti-

ACII.

-- Incubar la placa tapada 1 hora a RT.

AAññaaddiirr ccoonnjjuuggaaddoo yy ssuussttrraattoo

- Diluir el conjugado (anticuerpo anti-IgG humana conjugado con

fosfatasa alcalina) 1/1000 en tampón bloqueo-diluyente.

- Lavar las placas 3 veces con PBST en las condiciones indicadas

anteriormente.


- Incubar la placa tapada 1 hora a RT.

128

MATERIAL Y MÉTODOS

- Diluir el sustrato (fosfatasa alcalina (Sigma Chemical Co)) en el

tampón sustrato: 1 pastilla fosfatasa alcalina en 5ml tampón

sustrato.

- Lavar 3 veces con PBST en las condiciones indicadas

anteriormente.


- Incubar las placas tapadas en oscuridad durante dos horas.


onda de 405 nm.


Calcular la Media (XM) de los valores de absorbacia (Ab) del C+, de los

pacientes y del pool, en la placa.

El Cut-off (CO) se establece como las 3 desviaciones estándar (DE) por

encima del valor de Ab media del pool en la placa, a partir de la siguiente

fórmula:

XM (Ab pool) + 3*DE (Abs pool)

El valor de la Ab media del C+ debe de ser superior al valor del CO. Cuando

el valor de la Ab media de un paciente es superior al valor del CO, la muestra

se considera positiva; mientras que cuando es inferior, la muestra se considera

negativa.

129

MATERIAL Y MÉTODOS

3.1.6. Análisis estadístico

El análisis estadístico de las diferencias en la frecuencia de los marcadores

serológicos positivos entre la PAI y los diferentes grupos de pacientes y los

sujetos sanos fueron calculadas mediante el test Chi-cuadrado. Las diferencias

fueron consideradas significativas cuando P < 0,05.

El valor diagnóstico de cada marcador serológico por separado y de forma

combinada fue calculado como sensibilidad, especificidad, valor predictivo

positivo (VPP) y valor predictivo negativo (VPN).

3.2. Utilidad diagnóstica de la IgG y la IgG4 en la PAI


En este estudio retrospectivo se incluyeron 14 pacientes con PAI, 9 con

sospecha de PAI y 24 con PCI, diagnosticados entre marzo del 2004 y abril del

2010.

Como grupos control se incluyeron 25 pacientes con PC, 28 con pancreatitis

aguda, 25 con cáncer de páncreas y 45 sujetos sanos. En el grupo de PC, se

incluyeron 16 casos de PC alcohólica, 6 de PC hereditaria y 3 de páncreas

divisum. Las características demográficas de los pacientes se muestran en la

tabla 12.

Los pacientes fueron incluidos en el grupo “sospecha de PAI” cuando la

sospecha de PAI era alta, aunque el diagnóstico definitivo no se había

realizado aún debido al incumplimiento de alguno de los criterios diagnóstico de

la enfermedad.

130

MATERIAL Y MÉTODOS



Pancreatitis autoinmune 14 66,5 (16-78) 12/2

Sospecha PAI 9 51 (39-84) 5/4





Sujetos sanos 45 44 (23-86) 14/31

*Datos expresados como mediana en años (rango). PAI: Pancreatitis autoinmune



tal como se indica en el apartado 3.1.2.


Los análisis estadísticos de las diferencias en la frecuencia de los niveles

séricos elevados de IgG y de IgG4 entre la PAI, sospecha de PAI y PCI y los

diferentes grupos control fueron realizados mediante el test Chi-cuadrado o el

test exacto de Fisher, cuando alguna de las frecuencias esperadas fue inferior

a 5. Las diferencias fueron consideradas significativas cuando P < 0,05.

Mediante un análisis basado en curvas ROC, se determinaron los valores de

punto de corte óptimo de los niveles séricos de IgG y de IgG4 para el

diagnóstico de la PAI.

131

MATERIAL Y MÉTODOS

3.3. Correlación entre la IgG4 y la afectación extr apancreática en la PAI




2010.


Los niveles séricos de IgG total e IgG4 fueron medidos (mediante

nefelometría) en todos los pacientes al diagnóstico. En esos pacientes se

analizaron la presencia de lesiones extrapancreáticas y de factores

demográficos y clínicos, como la edad, sexo y síntomas iniciales.




Sospecha de Pancreatitis autoinmune 9 51 (37-84) 6/4





tal como se indica en el apartado 3.1.2.


Mediante un análisis basado en curvas ROC, se determinaron los valores

de punto de corte óptimo de los niveles séricos de IgG y de IgG4 para

diferenciar entre pacientes con PAI, sospecha de PAI o PCI; sin y con

lesiones extrapancreáticas. En función del punto de corte establecido para la

IgG4, los pacientes con PAI, sospecha de PAI o PCI, fueron divididos en dos

132

MATERIAL Y MÉTODOS

grupos: Con niveles de IgG4 superiores al punto de corte y con niveles de IgG4

inferiores al punto de corte.

Las diferencias en la presencia de lesiones extrapancreáticas entre estos

dos grupos fueron analizadas mediante el test exacto de Fisher. Las diferencias

fueron consideradas significativas cuando P < 0,05.

Las diferencias demográficas y clínicas entre los dos grupos fueron

determinadas mediante el test mediante el test Chi-cuadrado o el test exacto de

Fisher, cuando alguna de las frecuencias esperadas fue inferior a 5 en el caso

de variables cualitativas, y mediante el test de U de Mann-Withney en el caso

de variables cuantitativas. Las diferencias en el grado de afectación

extrapancreática fueron analizadas mediante el test de ANOVA con

aproximación de Welch o el test de U de Mann-Withney cuando no se

cumplieron las condiciones de normalidad. Las diferencias fueron consideradas

significativas cuando P < 0,05.

3.4. Caracterización clínica de los pacientes con P AI, sospecha de PAI y

pancreatitis crónica idiopática



2010.


Los datos clínicos fueron obtenidos mediante la revisión de las historias clínicas

de los pacientes.

133

MATERIAL Y MÉTODOS







3.5. Niveles séricos de CA 19.9 y utilidad diagnóst ica de los anticuerpos

anti-CA 19.9




2010.

Como grupos control se incluyeron 23 pacientes con pancreatitis aguda, 27

con PC, 26 con cáncer de páncreas y 45 sujetos sanos. En el grupo de PC, se

incluyeron 18 casos de PC alcohólica, 6 de PC hereditaria y 3 de páncreas

divisum. Las características demográficas de los pacientes se muestran en la

tabla 15.




Sospecha de PAI 7 39 (30-75) 3/4




Cáncer de páncreas 26 65,5 (32-87) 15/11

Sujetos sanos 45 44 (23-86) 14/31


134

MATERIAL Y MÉTODOS

Los datos de los niveles séricos del CA 19.9 al diagnóstico, fueron obtenidos

mediante técnica de quimiolumiscencia en el autoanalizador Immulite 2000

(Siemens, Munich, Alemania). Valores referencia: 1-37 U/ml.

3.5.2. Detección de los anticuerpos anti-CA 19.9 en suero

Los anticuerpos anti-CA 19.9 fueron determinados en suero mediante una

técnica de ELISA, empleando el siguiente protocolo:


- Preparación del C+ y pool de sanos de forma similar a otras

técnicas de anticuerpos descritas previamente.

- Resuspender el antígeno CA 19.9 (Gastrointestinal tumor antigen

17000 unidades/ml, pH 7,4) en 0,15 M PBS + 0,1% AZIDA Na,

(Sigma Chemical Co. St. Louis, MO).

-- Preparar el tampón sustrato, de igual modo que para los ELISA

descritos anteriormente.




- Diluir el antígeno CA 19.9 en 10 ml de PBS a una concentración

final de 17 U/ml). Añadir 100 µl de antígeno diluido/pocillo en la

placa.

- Incubar toda la noche a 4ºC.


- Preparar el tampón de lavado: PBST (PBS + 0,1% Tween 20).

135

MATERIAL Y MÉTODOS

- Preparar el tampón bloqueo-diluyente:

Albúmina sérica bovina (BSA) (Sigma Chemical Co) al 1% en

PBST 0,1%.

- Lavar la placa 3 veces con PBST. Aspirar el contenido y lavar 3



- Añadir 200 µl de tampón bloqueo-diluyente/pocillo.

- Tapar la placa e incubar 2 horas a 4ºC.

- Diluir los sueros de los pacientes, el C+ y el pool 1/100 en tampón

de bloqueo-diluyente.

- Eliminar el bloqueo. Secar la placa golpeándola sobre un papel de

filtro.

-- Añadir 100 µl muestra/pocillo (El blanco será el tampón bloqueo-

diluyente) siguiendo la plantilla descrita para los Acs anti-

anhidrasa carbónica II.

-- Incubar la placa tapada 1 hora y 30 minutos a temperatura

ambiente.

AAññaaddiirr ccoonnjjuuggaaddoo yy ssuussttrraattoo

- Diluir el conjugado (Anticuerpo anti-IgG humana conjugado con

fosfatasa alcalina (Sigma Chemical Co)) 1/1000 en BSA al 1% en

PBS (0,2 g BSA + 200 µl PBS).

- Lavar las placas 3 veces con PBST en las condiciones indicadas

anteriormente.


136

MATERIAL Y MÉTODOS

- Incubar las placas tapadas 1 hora a temperatura ambiente.

- Lavar 3 veces con PBST en las condiciones indicadas

anteriormente.


- Incubar las placas tapadas en oscuridad.


onda de 405 nm.


Se ha emplea un método semejante al descrito para el resto de

anticuerpos anteriores


El análisis estadístico de las diferencias en la frecuencia de los Abs anti-CA

19.9 positivos entre los pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI y el resto de

grupos fueron calculadas mediante el test Chi-cuadrado o el test exacto de

Fisher, cuando alguna de las frecuencias esperadas fue inferior a 5. Las

diferencias fueron consideradas significativas cuando P < 0,05. El valor

diagnóstico de los anti-CA 19.9 Abs fue calculado como sensibilidad,

especificidad, VPP y VPN.

Después de comprobar la distribución no normal de los niveles séricos de

CA 19.9, las diferencias en los niveles séricos de CA 19.9 en función de la

presencia de ictericia, niveles séricos aumentados de IgG4 o afectación

extrapancreática, en pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI fueron

analizadas mediante el test de U de Mann-Withney. Las diferencias fueron

consideradas significativas cuando P < 0,05.

137

MATERIAL Y MÉTODOS

La correlación entre la presencia de Abs anti-CA 19.9 positivos y de niveles

séricos aumentados de CA 19.9 fue analizada mediante el coeficiente de

contingencia de Pearson. Los valores del coeficiente oscilan de -1 a 1. El valor

absoluto del coeficiente indica el grado de la relación lineal entre las variables.

Los valores absolutos más próximos a 1 indican las relaciones más fuertes. El

signo del coeficiente indica la dirección de la relación (inversa: -1; directa: 1).

3.6. Análisis de la presencia de anticuerpos anti-p 53



sospecha de PAI y 33 con PCI entre marzo del 2004 y abril del 2010.

Como grupos control se incluyeron, 27 con PC y 26 con cáncer de páncreas.

En el grupo de PC se incluyeron 18 casos de PC alcohólica, 6 de PC

hereditaria y 3 de páncreas divisum. Las características demográficas de los

pacientes se muestran en la tabla 16.







Cáncer de páncreas 26 65,5 (32-87) 15/11


3.6.2. Detección de los anticuerpos anti-p53 en suero

Los anticuerpos anti-p53 fueron determinados en suero mediante una

técnica de ELISA comercial (p53 Ab ELISA, IBL international, Hamburgo,

Alemania) empleando el siguiente protocolo:

138

MATERIAL Y MÉTODOS


-- Preparar el tampón de lavado: 50 ml “wash buffer 20x” + 950 ml

de agua destilada.

-- Reconstituir el tampón de dilución de las muestras (liofilizado):

Añadir 12 ml de agua destilada.

- Diluir las muestras 1:100 con el tampón de dilución reconstituido.

PPrroottooccoolloo ddee eennssaayyoo

-- Añadir 200 µl de tampón de lavado diluido/pocillo de la placa

ELISA. Dejar 3 minutos. Eliminar con un golpe seco. Secar la

placa sobre un papel de filtro.

-- Reconstituir el tampón de dilución de las muestras (liofilizado):

Añadir 12 ml de agua destilada.

-- Añadir 100 µl/ pocillo de blanco (tampón de dilución), calibrador,

control negativo y muestras diluidas.

-- Incubar la placa tapada 1 hora a temperatura ambiente.

- Lavar la placa 5 veces con el tampón de lavado diluido. Dejar la

placa completamente seca, golpeándola sobre un papel de filtro.

- Añadir 100 µl/pocillo de conjugado.

- Incubar la placa tapada 1 hora a temperatura ambiente.

- Lavar la placa 5 veces con el tampón de lavado diluido en las

condiciones indicadas anteriormente.

- Añadir 100 µl/pocillo de solución sustrato (TMB).

- Incubar la placa tapada 30 minutos a temperatura ambiente en

oscuridad.

139

MATERIAL Y MÉTODOS

- Añadir 50 µl/pocillo de solución de parada (HCl 2M).

- Medir la absorbancia en el espectrofotómetro a 450 nm.


Teniendo en cuenta que 100 µl de calibrador contiene 1 unidad de actividad

de unión a p53. El Cut-off (CO) es calculado multiplicando el valor de la

absorbancia a 450nm del calibrador por un factor de corrección de 0,15:

CO= Ab 450nm Calibrador X 0,15

El control negativo ha de tener una Ab450nm inferior al valor del CO

establecido. Todos los sueros con una Ab450nm inferior o igual al valor del CO

son interpretados como negativos para la presencia de anticuerpos anti-p53,

mientras que aquellos con una Ab450nm superior al valor del CO son

interpretados como positivos para la presencia de anticuerpos anti-p53.


El análisis estadístico de las diferencias en la frecuencia de los anticuerpos

anti-p53+ entre la PAI, sospecha de PAI y PCI y el resto de grupos fueron

calculadas mediante el test Chi-cuadrado o el test exacto de Fisher, cuando

alguna de las frecuencias esperadas fue inferior a 5. Las diferencias fueron


La correlación entre la presencia de anticuerpos anti-p53 y de lesiones

extrapancreáticas fue analizada mediante el coeficiente de contingencia de

Pearson.

140

MATERIAL Y MÉTODOS

3.7. Análisis de los niveles séricos de Interleucin a-6



sospecha de PAI y 14 con pancreatitis crónica idiopática, diagnosticados entre

marzo del 2004 y abril del 2010.

Como grupos control se incluyeron, 21 con PC y 19 con cáncer de páncreas

y 18 controles sanos. En el grupo de PC se incluyeron 16 casos de PC

alcohólica, 4 de PC hereditaria y 1 de páncreas divisum. Las características

demográficas de los pacientes se muestran en la tabla 17.








Controles sanos 18 48 (23-86) 12/6


3.7.2. Cuantificación de los niveles séricos de IL-6

Los niveles de IL-6 fueron medidos en suero mediante una técnica de ELISA

comercial (Human IL-6 ELISA, Diaclone, Besancon Cedex, Francia) empleando

el siguiente protocolo:


-- Preparar el tampón de lavado: 10 ml “wash buffer 200x” + 2000 ml

de agua destilada.

-- Reconstituir el estándar IL-6 (liofilizado) con 1 ml del diluyente del

estándar, para producir una solución stock de 200 pg/ml.

141

MATERIAL Y MÉTODOS

-- Preparar el control: Reconstituir el control (liofilizado) con el

volumen del diluyente de estándar indicado en el vial.


- Preparar la curva estándar a partir del estándar A (200 pg/ml)

mediante diluciones ½ con solución de dilución. Las

concentraciones finales del estándar serán de 200, 100, 50, 25,

12.5, y 6.25 pg/ml en los pocillos A1, B1, C1, D1, E1 y F1,

respectivamente (Figura 14).

- Añadir 100 µl del tampón diluyente del estándar en el pocillo G1

(Blanco).

- Añadir 100 µl del control positivo en el pocillo H1.

- Añadir 100 µl de las muestras de suero de los pacientes, a partir

del pocillo A2.

- Preparar el anticuerpo anti-IL-6 biotinilado: 240 µl de anticuerpo

anti-IL-6 biotinilado + 6360 µl de diluyente del anticuerpo

biotinilado.

- Añadir 50 µl/pocillo de anticuerpo anti-IL-6 biotinilado diluido.

- Incubar la placa tapada 1 hora a temperatura ambiente.

- Lavar la placa 3 veces con el tampón de lavado diluido. Dejar la

placa completamente seca, golpeándola sobre un papel de filtro.

- Preparar la estreptavidina-HRP mediante una pre-dilución 1:100

de la streptavidina-HRP. Diluir 150 µl de la estreptavidina-HRP

prediluida con 10 ml del diluyente HRP

142

MATERIAL Y MÉTODOS

Figura 14. Plantilla IL-6 mostrando las diluciones seriadas del estándar y la posición del blanco, el control positivo y las muestras de suero de los pacientes. E200, E100, E50, E25, E12.5, E6.25: Curva estándar. BL: Blanco. C+: Control positivo.

- Añadir 100 µl/pocillo de estreptavidina-HRP diluida.

- Incubar la placa tapada 30 minutos a temperatura ambiente.

- Lavar la placa 3 veces con el tampón de lavado diluido, en las

condiciones indicadas anteriormente.

- Añadir 100 µl/pocillo de solución sustrato (TMB).

- Incubar la placa tapada de 12 a 15 minutos a temperatura

ambiente en oscuridad.

- Añadir 100 µl/pocillo de Solución de parada (H2SO4).

- Medir la absorbancia en el espectrofotómetro a 450 nm.

IL-6 ESTÁNDAR

200 µl

100 µl

100 µl

100 µl

100 µl

100 µl

Descartar 100 µl

E200

E100

E50

E25

E12.5

E6.25

BL

C+

MUESTRAS

143

MATERIAL Y MÉTODOS


Crear una curva estándar lineal mediante la representación gráfica de las

concentraciones del estándar en el eje de abscisas y del valor de absorbancia

a 450 nm en el eje de ordenadas.

El límite de detección del ensayo es de 2 pg/ml.


Después de comprobar la distribución no normal de los niveles séricos de IL-

6, las diferencias en los niveles séricos de IL-6 entre los pacientes con PAI,

sospecha de PAI y PCI y el resto de grupos incluidos en el estudio fueron

calculadas mediante el test de U de Mann-Withney. Las diferencias fueron


3.8. Estudio de las subpoblaciones linfocitarias en pacientes con PAI,

sospecha de PAI y pancreatitis crónica idiop ática


En este estudio prospectivo se incluyeron 10 pacientes con PAI, 5 con


2010.







*Datos expresados como Mediana, años (rango)

144

MATERIAL Y MÉTODOS

3.8.2. Marcaje superficial por citometría de flujo

El estudio de las subpoblaciones linfocitarias fue realizado por citometría de

flujo (CMF) utilizando el “BD Multitest™ kit” (Becton Dickinson, San José,

Estados Unidos), en muestras de sangre total anticoaguladas con EDTA y

procesadas durante las 24 horas siguientes a su extracción. Este kit consiste

en reactivos de inmunofluorescencia directa con combinaciones de cuatro

anticuerpos monoclonales conjugados a diferentes fluorocromos, que permiten

identificar y determinar el porcentaje y el número absoluto de las siguientes

subpoblaciones linfocitarias en sangre completa con eritrocitos lisados:

linfocitos B (CD19+), linfocitos T (LT) (CD3+), linfocitos T colaboradores (LT

CD4+) (CD3+ CD4+), linfocitos T citotóxicos (LT CD8+) (CD3+ CD8+), y linfocitos

natural killer (NK) (CD3- CD16+ y/o CD56+). Los tubos “BD Trucount™” fueron

empleados para determinar el recuento absoluto de cada una de las

subpoblaciones de linfocitos. Estos tubos utilizan el sistema de plataforma

única para cuantificar los números absolutos sin necesidad de extrapolar desde

el número de linfocitos obtenidos en el hemograma clásico. Los tubos “BD

Trucount™” permiten el marcaje directo de un volumen conocido de muestra.

Cuando el pelled liofilizado se disuelve en los tubos, libera una cantidad

conocida de cuentas fluorescentes. Durante el análisis el número absoluto de

células positivas en la muestra (células/µl) se determina comparando los

eventos celulares con los eventos de las cuentas fluorescentes.

145

MATERIAL Y MÉTODOS


- Para cada muestra marcar dos tubos de poliestireno de 12 X 75

mm (BD Falcon™. Becton Dickinson, San José, Estados Unidos),

como A y B; y dos tubos “BD Trucount” de igual modo, para el

recuento absoluto.

- Pipetear 20 µl del reactivo “BD Miltitest CD3/CD8/CD45/CD4 en el

fondo de cada tubo marcado como A.

- Pipetear 20 µl del reactivo “BD Miltitest CD3/CD16 +

CD56/CD45/CD19 en el fondo de cada tubo marcado como B.

- Pipetear 50 µl de sangre completa anticoagulada en el fondo de

cada tubo.

- Tapar los tubos y vortear.

- Incubar 15 minutos en oscuridad a RT.

- Añadir 450 µl de solución de lisis 1X “BD Multitest lysing solution”

(proteger los tubos de la luz).

- Tapar los tubos y vortear.

- Incubar 15 minutos en oscuridad a RT.

- Adquirir las muestras en el citómetro FACScalibur. - Analizar las muestras con el sofware BD CellQuest.

En la figuras 15, 16 y 17 se muestra un ejemplo de estudio para una

muestra de sangre de un adulto sano, marcada con CD3/CD8/CD45/CD4 en un

tubo BD Trucount.

146

MATERIAL Y MÉTODOS

Figura 15. Identificación de los linfocitos en un dot plot CD45 vs SSC

Figura 16. Bead de recuento absoluto Trucount

Figura 17. Identificación de linfocitos T citotóxicos (CD3+CD8+) y colaboradores (CD3+CD4+) en un dot plot CD4 vs CD8

CD3 FITC

CD

8 P

E

Beads recuento absoluto

CD45 PerCp

SS

C

Linfocitos CD45+

CD

4 A

PC

CD8 PE

147

MATERIAL Y MÉTODOS

En la figuras 18 y 19 se muestran los datos obtenidos para una muestra de

sangre de un adulto sano, marcada con CD3/CD16 + CD56/CD45/CD19 en un

tubo BD Trucount.

Figura 18. Bead de recuento absoluto Trucount

Figura 19. Identificación de linfocitos B (CD19+) y linfocitos NK (CD3–CD16+ o CD56+ o ambos) en una imagen de dot plot CD16 + CD56 vs CD19.

3.8.3. Resultados

Los resultados son informados como porcentaje de células positivas por

población de linfocitos o como número de células positivas por µl de sangre.


Después de comprobar la distribución no normal de las frecuencias de las

subpoblaciones linfocitarias, las diferencias en las frecuencias absolutas y

CD3 FITC

CD

16 + 56 P

E

CD19 APC

CD

16 + 56 P

E

Beads recuento absoluto

148

MATERIAL Y MÉTODOS

los porcentajes de cada una de las subpoblaciones linfocitarias y del cociente

entre células T CD4+/T CD8+ entre los pacientes con PAI, sospecha de PAI y

PCI fueron calculadas mediante el test de U de Mann-Withney. Las diferencias

fueron consideradas significativas cuando P < 0,05. El análisis estadístico de

las diferencias en la frecuencia de la presencia de linfocitopenia B (% linfocitos

B < 6%) y de aumento de células Nk (% células NK > 26%) entre los pacientes

con PAI, sospecha de PAI y PCI fueron calculadas mediante el test Chi-

cuadrado o el test exacto de Fisher, cuando alguna de las frecuencias

esperadas fue inferior a 5. Las diferencias fueron consideradas significativas

cuando P < 0,05. El análisis estadístico de las diferencias el porcentaje de

células Nk entre pacientes sin y con afectación extrapancreática fueron

determinadas mediante el test de U de Mann-Withney. Las diferencias fueron


3.9. Análisis inmunofenotípico de las subpoblacione s de células B en

pacientes con PAI, sospecha de PAI y pancreatitis c rónica idiopática


En este estudio prospectivo se incluyeron 10 pacientes con PAI, 5 con


2010.








149

MATERIAL Y MÉTODOS

3.9.2. Aislamiento de PBMCs

Las muestras de sangre total, anticoaguladas con EDTA, fueron procesadas

durante las 2 horas siguientes a su extracción.

Como las inmunoglobulinas solubles presentes en la sangre completa

pueden interferir en el marcaje de las inmunoglobulinas de superficie de

linfocitos B, las células mononucleares de sangre periférica (PMBCs) fueron

obtenidas mediante centrifugación en gradiente de densidad usando Ficoll-

Hstopaque (Sigma-Aldrich, Ayrshire, Reino Unido).

3.9.3. Marcaje superficial por citometría de flujo

El estudio de las subpoblaciones de células B fue realizado por CMF de 4

colores en las muestras de PBMCs.

Las PBMCs fueron marcadas con los anticuerpos monoclonales conjugados

con fluorocromos (AcMo-Fluorocromo) de acuerdo con el panel descrito en la

tabla 20. Todos los AcMo-Fluorocromos fueron obtenidos de Becton-Dickinson

(BD, San José, EEUU), excepto CD10-FITC, CD10-Per-CP y CD24-PE

(Inmunostep, Salamanca, España), CD38-PerCP (Biolegend, San Diego,

EEUU), CD5-FITC (Dako, Glostrup, Dinamarca) y CD138-FITC (Cytognos SL,

Salamanca, España).


- Añadir de 750000-800000 PBMCs/Tubo.

- Añadir los Ac-Mo-Fluorocromos según el panel de la tabla 19.

- Incubar 20 minutos en oscuridad a temperatura ambiente.

- Lavar dos veces con PBS-BSA: Añadir 2 ml de PBS-BSA,

centrifugar 1500 rpm 5-10 minutos y decantar el sobrenadante.

150

MATERIAL Y MÉTODOS

TABLA 20 . Panel para el marcaje de células B

AcMo - Fluorocromo/ Nº Tubo AcMo-FITC AcMo-PE AcMo-PerCP AcMo-APC

1 CD10 20 µl*

CD24 10 µl

CD38 3 µl

CD19 5 µl

2 CD 5 30 µl

CD24 10 µl

CD38 3 µl

CD19 5 µl

3 CD 27

3 µl IgD 2 µl

CD 19 10 µl

IgM 10 µl

4 CD 27

3 µl CD 25

3 µl CD 38

3 µl CD 19

5 µl

5 CD 27

3 µl IgD 2 µl

CD 38 3 µl

CD 19 5 µl

6 CD 27

3 µl CD 10

2 µl CD 38

3 µl CD 19

5 µl

7 CD 10 20 µl

IgD 2 µl

CD 38 3 µl

CD 19 5 µl

8 CD 138

3 µl CD 19

5 µl CD 38

3 µl CD 56

5 µl

9 CD 19 2,5 µl

Lambda 2,5 µl

CD 38 3 µl

Kappa 2,5 µl

AcMo: Anticuerpo monoclonal. AcMo-Fluorocromo: Anticuerpo monoclonal conjugado con fluorocromo. FITC: Isotiocianato de fluoresceína. PE: Ficoeritrina. PerCP: Proteína peridin-clorofila. APC: Aloficocianina. * Cantidad de AcMo-Fluorocrocromo añadida por tubo.

- Resuspender en 200 µl de PBS-BSA.

3.9.4. Marcaje intracelular por citometría de flujo

El reactivo triple TC669 (CD 19-FITC + Lambda PE + Kappa APC) (Dako,

Glostrup, Dinamarca), en combinación con CD38-PerCP (Becton Dickinson,

San José, Estados Unidos), fueron utilizados para el análisis de clonalidad de

las células plasmáticas.

151

MATERIAL Y MÉTODOS


- Rotular un tubo de poliestireno de 12 X 75 mm (BD Falcon™.

Becton Dickinson, San José, Estados Unidos) con el número 9.

- Añadir de 750000-800000 PBMCs/Tubo.

- Añadir 3 µl de CD 38-PerCP (Tubo 9 del panel descrito en la

figura 19).

- Incubar 20 minutos en oscuridad a temperatura ambiente.

- Lavar dos veces con PBS-BSA

- Añadir 500 µl de permeabilizante diluido 1/10 en agua destilada

(Fix/Perm, Becton Dickinson, San José, Estados Unidos).

- Incubar 10 minutos en oscuridad.

- Lavar dos veces con PBS-BSA.

- Lavar dos veces con PBS-BSA: Añadir 2 ml de PBS-BSA,

centrifugar 1500 rpm 5-10 minutos y decantar el sobrenadante.

- Resuspender en 200 µl de PBS-BSA.

Finalmente, todas las muestras fueron adquiridas en el citómetro FACS-

calibur.

3.9.5. Análisis inmunofenotípico

El análisis inmunofenotípico de las subpoblaciones de células B fue realizado

con el sofware “Paint A GATE”. En la tabla 21 se describe el perfil

inmunofenotípico de las subpoblaciones de células B analizadas.

152

MATERIAL Y MÉTODOS

TABLA 21 . Perfil inmunofenotípico de las subpoblaciones de células B

Subpoblaciones/

Marcador CD Transicionales Pre-Naive Naive Memoria Plasmáticas

CD5 ++* + + - -

CD10 + + - - -

CD19 + + + + +

CD 24 + +d +d + -

CD 25 - - + - -

CD 27 - - - + ++

CD 38 ++ + +d -/+d ++

CD 56 - - - - -

Cd 138 - - - - -/+

IgD + + + -/+ -

IgM + + + -/+ -

CD: Cluster de diferenciación. * Intensidad de marcaje expresada como -: Negativo, +d:

Positivo débil, +: Positivo, ++: Positivo fuerte -/+:Negativo o positivo.

33..99..55..11..CCllaassiiffiiccaacciióónn IIggDD//CCDD2277 El marcador universal de las células B memoria es el CD27, de modo que

permite diferenciar entre células B memoria (CD27+) y células B naive (CD27-

IgD+). Las células B memoria CD27+ se pueden subdividir en IgD+ (unswitched)

e IgD- (switched). Adicionalmente se ha identificado en los últimos años una

subpoblación de células B memoria que carece de la expresión tanto de CD27,

como de IgD: CD27- IgD- (dobles negativas). Las células plasmáticas expresan

niveles elevados de CD27 y carecen de la expresión de IgD: CD27++ IgD- [379,

380] (Figura 20).

153

MATERIAL Y MÉTODOS

Naive

Células plasmáticas

Memoria unswitched

Memoria Switched

Memoria DN

IgD

CD

27

IgD

CD

27

Figura 20. Distribución de células B en sangre en función de la expresión en superficie de IgD y CD27. N: Naive. NSM: Nonswitched memory. SM: Switched memory. DN: Memoria dobles negativas. PC: Células plasmáticas. 33..99..55..22..CCllaassiiffiiccaacciióónn CCDD3388//IIggDD Las células B CD19+ CD27- se subdividieron en función de los niveles de

expresión de CD38 en: naive (niveles bajos de CD38: CD38+d), pre-naive

(niveles intermedios de CD38: CD38+) y transicionales (niveles altos de CD38:

CD38++) [381] (Figura 21).

IgD

CD38

CD19+ CD27-

Figura 21. Distribución de células B CD19+ CD27- en sangre en función de la expresión en superficie de CD38: Naive (CD38+d), pre-naive (CD38+) y transicionales (cd38++). N: Naive. Int: Pre-naive. Tr: Transicionales.

154

MATERIAL Y MÉTODOS

33..99..55..33.. AAnnáálliissiiss ddee cclloonnaalliiddaadd ddee ccéélluullaass ppllaassmmááttiiccaass El estudio de la clonalidad de las células plasmáticas (CD19+ CD38++) fue

realizado mediante el cálculo del cociente entre las cadenas ligeras

intracitoplasmáticas kappa y lambda (ratio k/λ). Los ratios k/λ con valores

comprendidos entre 0,5 y 4 se corresponden con poblaciónes policlonales,

mientras que los valores por debajo o por encima se corresponden con

poblaciones monoclonales, con restricción kappa (ratio k/λ > 4) o lambda (ratio

k/λ < 0,5) (Figura 22).

Kappa

Lam

bda

CD19+ CD38++

Figura 22. Análisis de clonalidad de células plasmáticas (CD19+ CD38++) en función del cociente kappa/lambda. 3.9.6. Análisis estadístico

Después de comprobar la distribución no normal de las frecuencias

absolutas y de los porcentajes de las distintas subpoblaciones de linfocitos B y

del ratio k/λ, las diferencias en las frecuencias absolutas y de los porcentajes

de cada una de las subpoblaciones de linfocitos B y del ratio k/λ entre los

pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI fueron calculadas mediante el test

de U de Mann-Withney. Las diferencias fueron consideradas significativas

cuando P < 0,05.

155

MATERIAL Y MÉTODOS

El análisis estadístico de las diferencias en el aumento en la frecuencia de

células B memoria totales (rango normal: 28-68%), memoria dobles negativas

(valor normal < 5%), plasmaticas totales (rango normal: 0,5-1,4%), plasmáticas

CD138+ (rango normal: 0,28-0,8%) y plasmáticas CD138- (rango normal: 0,22-

0,6%); y en un descenso en la frecuencia de células B pre-naive (rango normal:

3-16%) y naive (rango normal: 57-73%); entre los pacientes con PAI, sospecha

de PAI y PCI fueron calculadas mediante el test Chi-cuadrado o el test exacto

de Fisher, cuando alguna de las frecuencias esperadas fue inferior a 5. Las

diferencias fueron consideradas significativas cuando P < 0,05.

El análisis estadístico de las diferencias en el porcentaje de células B

transicionales, prenaive, memoria totales, memoria dobles negativas y

plasmáticas entre pacientes sin y con afectación extrapancreática fue

determinado mediante el Test de U de Mann-Withney. Las diferencias fueron


El análisis estadístico de las diferencias en la frecuencia de la presencia de

un ratio k/λ normal (0,5-4) y disminuido (< 0,5) entre los pacientes con PAI,

sospecha de PAI y PCI fueron calculadas mediante el test Chi-cuadrado o el

test exacto de Fisher, cuando alguna de las frecuencias esperadas fue inferior

a 5. Las diferencias fueron consideradas significativas cuando P < 0,05.

156

MATERIAL Y MÉTODOS

3.10. Estudio de cadenas ligeras libres y ratios Ka ppa/Lambda en

pacientes con PAI, sospecha de PAI y pancre atitis crónica idiopática




2010.






Pancreatitis crónica idiopática 16 61,5 (31-83) 14/2


En pacientes con PAI se monitorizaron los niveles de cadenas ligeras libres

en suero k (sFLC k) y λ (sFLC λ) y los cocientes entre las cadenas ligeras

libres k y λ (ratio k/λ sFLC) en muestras de suero extraídas al diagnóstico y a

distintos tiempos tras el comienzo de la terapia esteroidea. El efecto del

tratamiento esteroideo sobre los niveles de sFLC y sobre los ratios sFLC k/λ

fue determinado a corto y a largo plazo. Para analizar la influencia a corto plazo

se compararon estos parámetros en las muestras de suero al diagnóstico y en

muestras extraídas durante los tres primeros meses tras el comienzo del

tratamiento esteroideo (muestras post-tratamiento). Para analizar la influencia a

largo plazo se compararon estos parámetros entre las muestras de suero al

diagnóstico y las últimas muestras de suero extraídas (un tiempo después del

comienzo del tratamiento esteroideo) (muestras finales).

157

MATERIAL Y MÉTODOS

En pacientes con sospecha de PAI y PCI, sin ningún tratamiento

farmacológico, se analizaron las oscilaciones en el tiempo de niveles de sFLC k,

sFLC λ los ratios k/λ sFLC, mediante la comparación de estos parámetros entre

las muestras de suero al diagnóstico y las últimas muestras de suero

extraídas (muestras finales).

3.10.2. Cuantificación de las cadenas ligeras libres en suero

Los niveles de sFLC k y sFLC λ fueron medidos por nefelometría

(Nefelómetro BNII Siemens, Munich, Alemania), utilizando en inmunoensayo

FreeliteTM (The Binding Site, Birmingham, Inglaterra). Los rangos de referencia

para sFLC y el ratio k/λ sFLC fueron publicados por Katzmann [379] et al:

sFLC k (3,3-19,4 mg/L), sFLC λ (5,7-26,3 mg/L) y ratio k/λ sFLC (0,26-1,65).

3.10.3. Interpretación de los resultados

La relación de cadenas ligeras libres en suero es un indicador potente de la

monoclonalidad y puede ayudar a distinguir una respuesta policlonal de una

monoclonal.

Los ratios k/λ sFLC anormales apoyarían el diagnóstico de gammapatias

monoclonales. Los ratios con valores inferiores a 0,26 serian indicativos de la

presencia de gammapatias monoclonales con restricción λ, mientras que

los ratios con valores superiores a 1,65 serian indicativos de gammapatias

monoclonales con restricción k.

Los incrementos de sFLC k (>19,4 mg/L), sFLC λ (>26,3 mg/L), o de ambas,

asociados con ratios k/λ sFLC normales (0,26-1,65); podría deberse a los

siguientes mecanismos:

158

MATERIAL Y MÉTODOS

Reducción del aclaramiento renal de sFLC.

Incremento en la producción policlonal de sFLC en procesos

inflamatorios y en enfermedades autoinmunes.

Los incrementos en suero de sFLC k (>19,4 mg/L), sFLC λ (>26,3

mg/L), o de ambas, asociados con ratios k/λ sFLC anormales,

sugerirían la combinación de la presencia de gammapatías

monoclonales, y de reducción del aclaramiento renal de sFLC,

incremento en la producción policlonal de sFLC, o de ambas.

Los descensos en suero de sFLC k (< 19,4 mg/L), sFLC λ (< 26,3

mg/L), o de ambas, indicarían un descenso en la producción de

sFLC en la médula ósea.


La ausencia de distribución normal de los niveles de sFLC k, sFLC λ, y del

ratio k/λ sFLC en las muestras al diagnóstico, post-tratamiento y finales, en

cada grupo de pacientes, fue determinada mediante el test de Kolmogoroz-

Smirnov.

Las diferencias en los niveles de sFLC k, sFLC λ, y el ratio k/λ en las

muestras al diagnóstico y finales entre los pacientes con PAI, sospecha de PAI

y PCI fueron calculadas mediante el test de U de Mann-Withney.

Las diferencias entre los niveles de sFLC k, sFLC λ, y el ratio k/λ entre las

muestras al diagnóstico y post-tratamiento en pacientes con PAI, fueron

determinadas mediante el test de Wilcoxon para muestras pareadas. Las

diferencias fueron consideradas significativas cuando P < 0,05.

159

MATERIAL Y MÉTODOS

Las diferencias entre los niveles de sFLC k, sFLC λ, y el ratio k/λ entre las

muestras al diagnóstico y finales en pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI,

fueron determinadas mediante el test de Wilcoxon para muestras pareadas.

Las diferencias fueron consideradas significativas cuando P < 0,05.

La significación estadística de las diferencias entre los niveles de sFLC k,

sFLC λ, y el ratio k/λ entre las muestras al diagnóstico y finales en pacientes

con PAI, sospecha de PAI y PCI, fue determinada mediante el test de Wilcoxon

para muestras pareadas. Las diferencias fueron consideradas significativas

cuando P < 0,05.

El análisis estadístico de las diferencias en la frecuencia de los niveles

aumentados de sFLC k (> 19,4 mg/L) y de sFLC λ (> 26,3 mg/L), y de la

presencia de ratios k/λ sFLC alterados (< 0,26 o > 1,65) fue realizado mediante

el test Chi-cuadrado o el test exacto de Fisher, cuando alguna de las

frecuencias esperadas fue inferior a 5. Las diferencias fueron consideradas

significativas cuando P < 0,05.

Las diferencias en los niveles de sFLC k, sFLC λ, y el ratio k/λ en los pacientes

sin y con afectación extrapancreática fueron determinadas mediante el test de

U de Mann-Withney.

La correlación entre los niveles séricos de IgG4 y los niveles de sFLC k, sFLC

λ o los ratios k/λ sFLC, en pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI, fue

analizada mediante el coeficiente de correlación de Spearman (ρ).

La correlación entre la presencia de ratios sFLC k/λ alterados y de afectación

extrapancreática, fue analizada mediante el coeficiente de contingencia de

Pearson.

160

MATERIAL Y MÉTODOS

3.11. Estudio de proteínas monoclonales en pacient es con PAI, sospecha

de PAI y pancreatitis crónica idiopática




2010.






Pancreatitis crónica idiopática 16 61,5 (31-83) 14/2


3.11.2. Detección de proteínas monoclonales

El análisis de las proteínas séricas fue realizado mediante electroforesis en

geles de agarosa (SPE). Las bandas obtenidas fueron cuantificadas mediante

escaneo del gel de SPE por densitometría. Las proteínas monoclonales son

generalmente visibles como una banda definida en la electroforesis o como un

pico angosto en el trazo densitométrico, generalmente en la región γ o β, y

raramente en la región α2. Los aumentos policlonales de proteínas se ven

como espigas de base ancha limitadas a la región γ. El tipo específico de

proteína monoclonal fue determinado mediante Inmunofijación electroforesis

(IFE) utilizando el sistema semi-automatizado de Sebia (Herví Francia), según

las condiciones indicadas por el fabricante.

161

MATERIAL Y MÉTODOS


El análisis estadístico de las diferencias en la frecuencia de la presencia de

inmunoglobulinas monoclonales fue calculado mediante el test Chi-cuadrado o

el test exacto de Fisher, cuando alguna de las frecuencias esperadas fue

inferior a 5. Las diferencias fueron consideradas significativas cuando P < 0,05.

La correlación entre la presencia de inmunoglobulinas monoclonales y de

afectación extrapancreática, fue analizada mediante el coeficiente de

contingencia de Pearson.

3.12. Analisis de clonalidad de células B en infilt rados linfoplasmocíticos

en lesiones pancreáticas y extrapancreátic as en pacientes con PAI,

sospecha de PAI y pancreatitis crónica idi opática



sospecha de PAI y 2 con PCI, en función de la disponibilidad de muestras de

biopsia de los tejidos afectados, diagnosticados entre marzo del 2004 y abril del

2010.








Las muestras analizadas en cada uno de los pacientes se describen en la

tabla 25.

162

MATERIAL Y MÉTODOS

TABLA 25 . Muestras analizadas en los pacientes incluidos en el estudio

Paciente Diagnóstico Muestras

1 Pancreatitis autoinmune Páncreas

Glándulas salivares


Glanglio cístico

3 Pancreatitis autoinmune Próstata

4 Pancreatitis autoinmune Vesícula biliar

Glandulas salivares

5 Pancreatitis autoinmune Próstata




9 Pancreatitis autoinmune Hígado

10 Pancreatitis autoinmune Papila duodenal

11 Sospecha de PAI Vesícula biliar

12 Sospecha de PAI Papila duodenal

13 Sospecha de PAI Páncreas

Médula ósea

14 Pancreatitis crónica idiopática Vesícula biliar

15 Pancreatitis crónica idiopática Estómago

3.12.2. Análisis de reordemientos clonales del gen IgH

33..1122..22..11.. FFuunnddaammeennttooss ddeell eennssaayyoo

Los reordenamientos del gen IgH en las muestras de DNA fueron

analizados mediante el “kit para el análisis molecular de reordenamientos

clonales del gen IgH” (Master Diagnóstica, Granada, España).

163

MATERIAL Y MÉTODOS

Este kit permite detectar la presencia de clonalidad en procesos

linfoproliferativos de células B, mediante la amplificación de los segmentos

reordenados VDJ de la región hipervariable de la cadena pesada de las

inmunoglobulinas (IgH), empleando múltiples cebadores consenso que hibridan

con regiones conservadas dentro de dichos genes.

33..1122..22..22.. PPaassooss pprreevviiooss

3.12.2.2.a. Extracción del DNA de tejidos embebidos en parafina

El DNA fue aislado de las muestras de tejidos embebidos en parafina

utilizando el “QIAamp DNA FFPE Tissue Kit” (Qiagen, Izasa, España), según

el protocolo indicado por el proveedor.

El procedimiento consiste básicamente en 6 pasos:

Eliminación de la parafina: La parafina es disuelta en xileno.

Lisis: La muestra es lisada en condiciones desnaturalizantes

con proteinasa k.

Calor: La incubación a 90º C revierte los puentes cruzados de

formalina.

Unión: El DNA se une a una membrana.

Lavado: Los contaminantes residuales son eliminados.

Elución: El DNA concentrado es eluido de la membrana.

3.12.2.2.b. Cuantificación del DNA

El DNA fue cuantificado con el fluorímetro NanoDropTM 2000 (Termo

Scientific, Wilmington, EEUU).

164

MATERIAL Y MÉTODOS

33..1122..22..33.. PPrroottooccoolloo ddee eennssaayyoo

3.12.2.3.a. Reacción de amplificación

Por cada muestra de DNA problema a analizar se amplificarán 4 mezclas:

una para cada fragmento FR1, FR2 y FR3 y otra para el control interno (CI).

Preservar las mezclas de la luz, ya que contienen cebadores marcados con

fluorescencia.

- Descongelar 1 tubo rojo (FR1-JH), 1 tubo verde (FR2-JH), un tubo

púrpura (FR3-JH) y un tubo amarillo (CI) por cada muestra y

mantener en hielo.

- Añadir a cada uno de ellos: 1 µl de enzima Taq-DNA polimerasa

(2U/µl) y 3 µl de la muestra de DNA (Añadir de 200-500 ng)

- Mezclar bien y centrifugar 5 segundos en una microcentrífuga

para eliminar las burbujas.

- Mantener los tubos en hielo hasta el momento de colocar en el

termociclador, para evitar uniones inespecíficas de los “primers”.

3.12.2.3.b.Amplificación

- Colocar todos los tubos en el termociclador y amplificar según el

siguiente programa:

94ºC 10 min 40 ciclos:

94ºC 45 seg 60ºC 45 seg 72ºC 90 seg

72ºC 10 min

- Mantener los tubos a 12-15 ºC cuando finalice la reacción. Si no

se van a procesar las muestras en el momento, se pueden

almacenar a 4 ºC o a -20 ºC hasta su uso.

165

MATERIAL Y MÉTODOS

3.12.2.3.c.Análisis de los productos amplificados mediante electroforesis en gel

- Con objeto de diferenciar productos derivados de poblaciones

mono ó policlonales, llevar a cabo un análisis de “heterodúplex”

de los productos de PCR, mediante desnaturalización

/renaturalización de los productos amplificados:

Desnaturalizar los productos de PCR a 94º C, 5 min.

Re-naturalizar transfiriendo rápidamente a hielo (4 ºC) y

mantener 10-60 min.

- Correr la muestras en un gel de poliacrilamida.

3.12.2.4. Interpretación de los resultados

3.12.2.4.a. Control interno de amplificación (CI)

En todas las muestras debe aparecer una banda intensa de 274 pares de

bases pb), lo que indica que el proceso de manipulación de la muestra y la

calidad del DNA han sido adecuados. Este control de amplificación es

imprescindible, sobre todo en muestras obtenidas de material incluido en

parafina, en donde la calidad y cantidad del DNA obtenido son desconocidas.

Si no aparece banda de amplificación con el CI, no se puede valorar un

resultado negativo de amplificación de los fragmentos IgH; ya que puede

deberse a que no se haya obtenido DNA suficiente en el proceso de extracción,

o a que el DNA esté parcialmente degradado. En estos casos se puede

mejorar el rendimiento y la calidad del DNA prolongando la incubación del

tejido con el tampón de lisis+proteasa durante 24-48 horas más. Si tras repetir

el proceso no se consigue amplificación, la muestra se conserará como: “no

valorable para análisis de fragmentos del gen IgH por PCR”.

166

MATERIAL Y MÉTODOS

3.12.2.4.b. Reordenamientos de Fragmentos IgH

En la tabla 26 se indica el rango de tamaños esperado de los fragmentos

amplificados para cada una de las mezclas de amplificación:

TABLA 26 . Rango de tamaños esperado de los fragmentos ampli ficados

Mezcla de cebadores Rango de Tamaño DNA control

positivo clonal Color

(Tubo de PCR)

FR1-JH 310-360 pb 338 pb Rojo

FR2-JH 250-295 pb 274 pb Verde

FR3-JH 100-170 pb 133 pb Púrpura

Pb: pares de bases

3.12.2.4.b.1. Controles positivos y negativos de amplificación

El control negativo de amplificación realizado con una muestra “blanco”

tendría que dar ausencia de amplificación en todas las mezclas ensayadas

(incluido CI). Si se detecta producto amplificado en alguna mezcla de PCR,

estaría indicando la presencia de contaminación de los reactivos y habría que

repetir el ensayo para validarlo.

El control positivo policlonal debería dar múltiples bandas (gel) o picos

(GeneScan) dentro del rango de tamaño indicado en la tabla 24 para cada

mezcla de amplificación.

El control positivo clonal dará una banda o pico único para cada una de las

mezclas de PCR ensayas, cuyo tamaño se indica en la tabla 25.

Cualquier resultado diferente al esperado, obtenido tras analizar los DNA

controles positivos, estaría indicando que el ensayo no es válido y las muestras

problema no podrían ser interpretadas.

167

MATERIAL Y MÉTODOS

.12.2.4.b.2. Análisis de la muestra problema

Antes de interpretar los resultados obtenidos con la muestra problema es

necesario que todos los controles incluidos en el test, tanto positivos como

negativos hayan sido correctos.

El reordenamiento clonal del gen IgH, se visualiza mediante electroforesis

por la presencia de una única banda intensa y nítida dentro del rango de

tamaño esperado (Figura 22). Se considera que una muestra es “positiva”

cuando se detecta una banda con todas o alguna de las tres mezclas de

amplificación ensayadas: FR1-JH, FR2-JH o FR3-JH.

Si no hay reordenamiento clonal y la muestra problema está compuesta por

una población heterogénea policlonal de células B, se formará un heterodúlex y

el resultado será una multitud de bandas dentro del rango de tamaño, que se

visualizan en el gel como una mancha o “smear” ancha y difusa (Figura 23).

168

MATERIAL Y MÉTODOS

Figura 23. Ejemplo de análisis de resultados en gel de agarosa 4%. A). Mix Fr1-JH: 1. escalera estándar de tamaño molecular, 2. muestra monoclonal B, 3. muestra monoclonal B, 4. muestra monoclonal B, 5. muestra policlonal B, 6. muestra monoclonal B, 7. Línea celular B, 8. Amígdala. B). Mix Fr2-JH: 1. escalera estándar de tamaño molecular, 2. Línea celular B, 3. muestra monoclonal B, 4. muestra monoclonal B, 5. muestra policlonal B, 6. muestra policlonal B, 7. muestra policlonal B, 8. Amígdala. C). Mix Fr3-JH: 1. escalera estándar de tamaño molecular, 2. amígdala, 3. Línea celular B, 4. caso monoclonal B, 5. caso policlonal B, 6. caso monoclonal B, 7. caso policlonal B.

3.13. Analisis mutacional de K-ras en páncreas y le siones extrapancreáticas

de pacientes con PAI, sospecha de PAI ypan creatitis crónica idiopática



sospecha de PAI y 2 con PCI, en función de la disponibilidad de muestras de

biopsia de los tejidos afectados, diagnosticados entre marzo del 2004 y abril del

2010.


169

MATERIAL Y MÉTODOS







Las muestras analizadas en cada uno de los pacientes se describen en la

tabla 28.

TABLA 28 . Muestras analizadas en los pacientes incluidos en el estudio

Paciente Diagnóstico Muestras




Glandulas salivares




Vesícula biliar

7 Sospecha de PAI Vesícula biliar

8 Sospecha de PAI Papila duodenal

9 Sospecha de PAI Páncreas

10 Pancreatitis crónica idiopática Vesícula biliar

11 Pancreatitis crónica idiopática Estómago

170

MATERIAL Y MÉTODOS

3.13.2. Análisisis mutacional de K-ras

33..1133..22..11.. FFuunnddaammeennttooss ddeell eennssaayyoo

El análisisis mutacional de K-ras fue realizado con el “Kit de mutaciones K-

RAS de DxS TheraScreen®” (Qiagen Manchester Ltd, Manchester,

Inglaterra).

El kit de mutaciones K-ras es una prueba de diagnóstico in vitro diseñada

para la detección de siete mutaciones somáticas en los codones 12 y 13 del

oncogen K-ras (Tabla 29), con el fin de proporcionar una validación cualitativa

del estado de las mutaciones. Este método es altamente selectivo.

Siempre que se disponga de suficientes copias de ADN, existe la posibilidad de

detectar aproximadamente un 1% de mutaciones en el ADN genómico normal.

TABLA 29 . Mutaciones en el gen K-ras detectadas mediante el kit de DxS

Mutación Cambio de base ID de Cosmic*

Gly12Ala (GGT>GCT) 522

Gly12Asp (GGT>GAT) 521

Gly12Arg (GGT>CGT) 518

Gly12Cys (GGT>TGT) 516

Gly12Ser (GGT>AGT) 517

Gly12Val (GGT>GTT) 520

Gly13Asp (GGC>GAC) 532

* Identificadores (ID) COSMIC del catálogo de mutaciones somáticas del cáncer (Catalogue of Somatic Mutations in Cancer). http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic/

El Kit de K-ras combina dos tecnologías, ARMS® y Scorpions® [380-382],

para la detección de las mutaciones mediante ensayos realizados con la

técnica de PCR en tiempo real.

171

MATERIAL Y MÉTODOS

3.13.2.1.a. Tecnología ARMS

La ARMS permite llevar a cabo una amplificación específica de los alelos o las

mutaciones. La enzima Taq DNA polimerasa resulta extremadamente eficaz

para diferenciar entre una coincidencia y un error de coincidencia en el extremo

3’ de un primer o cebador de PCR. Algunas secuencias mutadas se pueden

amplificar de forma selectiva, incluso en muestras cuya mayoría de secuencias

no presentan la mutación, por ejemplo:

Cuando la coincidencia con el “primer” es completa, la amplificación

se produce con total eficacia.

Cuando no hay coincidencia con la base 3’, únicamente tiene lugar

una amplificación complementaria de bajo nivel.

3.13.2.1.b. Tecnología Scorpions

La detección de la amplificación se realiza mediante Scorpions. Scorpions es

una técnica de moléculas bifuncionales que contienen un cebador de PCR

unido covalentemente a una sonda. El fluoróforo de esta sonda interactúa con

un “quencher” o silenciador, también incorporado en la sonda, lo que reduce la

fluorescencia. Durante la reacción de la PCR, cuando la sonda se une al

amplicón, se separan el fluoróforo y el silenciador. El resultado es un aumento

de la fluorescencia en el tubo de reacción.

3.13.2.1.c. Análisis de los datos: método ∆Ct

Los ensayos en tiempo real de Scorpions utilizan el número de ciclos de

PCR necesarios para detectar una señal de fluorescencia superior a la señal de

referencia como medida de las moléculas diana presentes al comienzo de la

172

MATERIAL Y MÉTODOS

reacción. El punto en el que se detecta una señal superior a la lectura de

fluorescencia de referencia se denomina "ciclo umbral" (Ct).

El cálculo de los valores de ∆Ct de una muestra se obtiene de la diferencia

entre el valor de Ct del ensayo de mutación y el valor de Ct del ensayo de

control de una misma muestra. Las muestras se clasifican como positivas para

mutaciones si su valor de ∆Ct es inferior al valor de ∆Ct del 1%

correspondiente a dicho ensayo. Por encima de este valor, se considera que la

muestra contiene menos de un 1% de mutaciones (por encima del límite de los

ensayos) o que la muestra es negativa para la mutación.

33..1133..22..22.. PPrroottooccoolloo ddee eennssaayyoo

Utilizar la mezcla para ensayo de control adicional suministrada con el Kit para

valorar el ADN total de la muestra. El ensayo de control amplifica una región

del exón 4 del gen K-RAS. Las muestras deben prepararse únicamente con el

ensayo de control y utilizando el estándar mezclado como control positivo y

agua como control sin plantilla (negativo).

3.12.2.2.a. Configuración experimental del sistema ABI7500

- Descongelar las mezclas de reacción y la mezcla estándar a

temperatura ambiente. Mezclar cada solución invirtiendo cada

tubo 10 veces. Preparar suficientes mezclas para las muestras de

ADN, la mezcla estándar y los controles sin DNA (controles

negativos), además de 2 reacciones adicionales por mezcla, tal y

como se indica en la tabla 30.

- No mezclar en vórtex la enzima Taq ni ninguna mezcla de

reacción que contenga Taq, ya que se podría inactivar.

173

MATERIAL Y MÉTODOS

- Atemperar la enzima Taq. Pipetear la cantidad indicada colocando

la punta de la pipeta bajo la superficie de la enzima Taq para

minimizar el riesgo de que la punta quede excesivamente

recubierta de Taq.

- Mezclar la “Master mix”, pipeteando con cuidado en la zona

superior e inferior.

TABLA 30 . Volúmenes de “Master mix”

“Master mix”

Ensayo Mezcla de reacción ( µl) x 1 Taq (µl) x 1 Mezcla de reacción ( µl)

x placa (x 14) Taq (µl) x placa

(x 14)

Ensayo control 19,8 0,2 277,2 2,8

Ensayo de mutación 19,8 0,2 277,2 2,8

- Añadir inmediatamente 20 µl de la “Master mix” de control en

cada pocillo de reacción.

- Añadir inmediatamente 5 µl de muestra, mezcla estándar o agua

(en el caso de los controles negativos) en los pocillos de reacción.

Cada muestra de ADN se debe analizar tanto con el ensayo de

control como con el ensayo de mutación. En la tabla 31 se ilustra

la configuración de la placa.

- Preparar la placa añadiendo la mezcla estándar al pocillo A1 y el

control negativo (agua) al pocillo A2. El resto de los pocillos que

se utilicen deben contener las muestras.

- Cerrar y girar brevemente la placa de PCR para que los reactivos

se depositen en el fondo de los pocillos.

174

MATERIAL Y MÉTODOS

TABLA 31. Disposición de la placa de K-ras en el si stema ABI7500

Disposición de 96 pocillos

ENSAYO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

CONTROL MEZCLA ESTÁNDAR

CN M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10

12ALA MEZCLA ESTÁNDAR CN M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10

12ASP MEZCLA ESTÁNDAR CN M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10

12ARG MEZCLA ESTÁNDAR CN M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10

12CYS MEZCLA ESTÁNDAR CN M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10

12SER MEZCLA ESTÁNDAR CN M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10

12VAL MEZCLA ESTÁNDAR CN M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10

13ASP MEZCLA ESTÁNDAR CN M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10

CN: Control negativo. M1, … M12: Muestras

3.12.2.2.b. Configuración del equipo ABI7500

TABLA 32 . Ciclos en el sistema ABI 7500

Temperatura Tiempo Ciclos Obtención de datos

Fase 1

95ºC 4 minutos 1

Fase 2

95ºC 30 segundos

60ºc 1 minuto 40 FAM, JOE

3.12.2.2.c. Análisis de las muestras en el sistema ABI 7500

- Asegurarse de que la referencia pasiva está definida en el valor

‘none’ en la pantalla de inspección de pocillos.

175

MATERIAL Y MÉTODOS

- Comprobar que cada pocillo emite una señal JOE desde el

ensayo de control exógeno.

Si el ensayo de control exógeno arroja un resultado positivo,

continuar con el análisis.

Si el ensayo de control exógeno es erróneo pero la reacción

de FAM se ha amplificado suficientemente, continuar con el

análisis puesto que la reacción de FAM tiene prioridad sobre

la reacción del control exógeno.

Si las dos reacciones, la de FAM y la del control exógeno, no

se producen correctamente, descarte los datos puesto que

puede haber inhibidores. Estos inhibidores podrían conducir a

falsos negativos.

- Analizar los datos y calcular el valor de ∆Ct de la siguiente forma:

[Ct del ensayo de mutación de la muestra] – [Ct del ensayo de control de la muestra] =∆Ct

33..1133..22..33.. IInntteerrpprreettaacciióónn ddee llooss rreessuullttaaddooss ddeell ssiisstteemmaa AABBII77550000

3.12.2.3.a. Valores de Ct de control

- El valor de Ct de control debe ser ≥ 24 para evitar una sobrecarga

del ensayo.

- Ct de control < 29: El kit ofrece una capacidad de detección hasta

un mínimo de un 1% de mutaciones en estas muestras.

- En las muestras con un Ct de control ≥ 29, el kit no detectará

mutaciones menores del 1%, aunque sí detectará mutaciones

de nivel más elevado.

176

MATERIAL Y MÉTODOS

- En las muestras con un Ct de control ≥ 35, sólo habrá presentes

algunas copias amplificables de ADN, y las mutaciones

únicamente son detectables si hay numerosas copias con

mutaciones.

- En el caso de un Ct de control ≥ 38, el ADN será limitado y no se

podrán usar los datos.

3.12.2.3.b. Valores de ∆Ct de la mezcla estándar

- Los valores de ∆Ct de la mezcla estándar deben ser los indicados

en la tabla 32, aunque se pueden producir variaciones de ±2

debido a configuraciones de umbrales distintas en equipos

diferentes.

3.12.2.3.c. Valores de ∆Ct de la muestra

- Si el valor de ∆Ct de la muestra es superior al valor del 1% (como

se indica en la tabla 33), la muestra de ADN será clasificada como

negativa para las mutaciones o por debajo de los límites del kit.

- Si el valor de ∆Ct es inferior al valor del 1%, el ADN de la muestra

se clasificará como positiva para las mutaciones.

- Los valores de Ct de mutación de 38 o superiores se deben

clasificar como negativos o por debajo de los límites del kit.

177

MATERIAL Y MÉTODOS

TABLA 33 . Valores de ∆Ct de la mezcla estándar y puntos de corte del 1% e n el sistema ABI7500Ciclos en el sist ema ABI 7500

Ensayos ∆ Ct de la mezcla estándar

Intervalo aceptable de la mezcla estándar

∆ Ct del 1% de la mezcla

12ALA -0,70 De -2,70 a 1,30 6,5

12ASP -1,04 De -3,04 a 0,96 8

12ARG -0,02 De -2,02 a 1,98 8

12CYS -0,98 Se -2,98 a 1,02 7

12SER 0,02 De -1,98 a 2,202 9

12VAL -0,19 De -2,19 a 1,81 6,5

13ASP -1,12 De -3,12 a 0,88 9

178

179

RREESSUULLTTAADDOOSS

44444444........ RRRRRRRREEEEEEEESSSSSSSSUUUUUUUULLLLLLLLTTTTTTTTAAAAAAAADDDDDDDDOOOOOOOOSSSSSSSS

180

181

RESULTADOS

4. RESULTADOS


4.1.1. Prevalencia de los marcadores serológicos

En la tabla 34 se describen los valores, expresados como mediana (rango), de

los niveles séricos de IgG y de IgG4 en los grupos incluidos en el estudio. La

frecuencia de niveles séricos elevados de IgG y de IgG4 y de anticuerpos anti-

AC II y AMY α positivos en los sujetos de estudio se describe en la tabla 35.

Dentro del grupo de 12 pacientes con PAI, 9 muestras de suero fueron

obtenidas antes de comenzar el tratamiento esteroideo y tres post-tratamiento.

En un 50% de los pacientes (6/12) se observaron niveles séricos elevados de

IgG y de IgG4. De ellos, 4 presentaron niveles séricos elevados tanto de IgG

como de IgG4, mientras que en los dos restantes sólo uno de estos

marcadores estuvo presente. La mediana de los niveles séricos de IgG y de

IgG4 fue de 1550 mg/dl (rango, 785-3110) y 136 mg/dl (rango, 26-4990),

respectivamente. Los anticuerpos anti-AC II y AMY α se detectaron en un 83%

de los pacientes (10/12).De ellos, 8 presentaron ambos marcadores.

Cabe destacar que 4 de los 12 pacientes con PAI (33%) desarrollaron cáncer

de páncreas durante el curso de la enfermedad. En un 75% de ellos (3/4) se

observaron niveles séricos elevados tanto de IgG como de IgG4. La mediana

de los niveles séricos de IgG y de IgG4 fue de 1905 mg/dl (rango 785-3110) y

273 mg/dl (rango 26-4990), respectivamente. Los anticuerpos anti-AC II y anti-

AMY α se detectaron en el suero de todos ellos (4/4).

182

RESULTADOS

TABLA 34. Niveles séricos de IgG y de IgG4 en los s ujetos de estudio

IgG (mg/dl)* IgG4 (mg/dl)*

PAI 1550 (785-3110) 136 (26-4490)

PC 1010 (564-1490) 28 (10-113)

PCI 1085 (495-1620) 50 (3-205)

Pancreatitis aguda 883 (789-1580) 17 (1-190)

Cáncer de páncreas 901 (523-2500) 32 (1-278)

SS 2300 (436-2630) 20 (0,32-32)

DM-1 ND 27 (1-218)

Sujetos sanos 871 (528-1230) 40 (2,27-164)

*Resultados expresados como mediana ( rango)

PAI: Pancreatitis autoinmune. PC: Pancreatitis crónica. PCI: Pancreatitis crónica

idiopática. SS: Síndrome de Sjögren. DM.1: Abs: Anticuerpos. ND: No

determinado.

Dentro del grupo de pacientes con cáncer de páncreas, se detectaron

niveles séricos elevados de IgG y de IgG4 en un 10% (2/21) y en un 14% (3/21)

respectivamente. La mediana de los niveles séricos de IgG y de IG4 fue de

901 mg/dl (rango, 523-2500) y de 32 mg/dl (rango, 1-278) respectivamente.

Loa anticuerpos anti-AC II se detectaron en un 29% de los pacientes (6/21),

mientras que los anticuerpos anti-AMY α no se encontraron en el suero de

ninguno de ellos.

183

RESULTADOS

TABLA 35. Marcadores serológicos de PAI en los grup os incluidos en el estudio

IgG ↑ IgG4 ↑ Abs anti-AC II + Abs anti-AMY α+

PAI 58 (7/12) a 58 (7/12) b 83 (10/12) c 83 (10/12) d

PC 17 (4/23) 0 (0/23) 9 (2/23) 13 (3/23)

PCI 38 (10/26) 8 (2/26) 50 (13/26) 31 (8/26)

Pancreatitis aguda 27 (3/11) 9 (1/11) 54 (6/11) 18 (2/11)

Cáncer de páncreas 10 (2/21) 14 (3/21) 29 (6/21) 0 (0/21)

SS 67 (6/9) 0 (0/9) 67 (6/9) 23 (2/9)

DM-1 ND 7 (3/40) 32 (13/40) 22 (9/40)

Sujetos sanos 0 (0/45) 2 (1/45) 8 (4/45) 2 (1/45)

Resultados expresados como porcentaje (número de casos positivos/número total de casos)

PAI: Pancreatitis autoinmune. PC: Pancreatitis crónica. PCI: Pancreatitis crónica idiopática.

SS: Síndrome de Sjögren. DM.1: Diabetes mellitus tipo 1. ↑ IgG: Niveles aumentados de

IgG. ↑ IgG4: Niveles aumentados de IgG4. Abs: Anticuerpos. AC II: Anhidrasa carbónica II.

AMY α: Amilasa α. ND: No determinado.

a. PAI vs PC: P=0,03; PAI vs PCI: P= 0,252; PAI vs cancer de páncreas: P =0,002; PAI vs sujetos sanos: P<0,0001. b. PAI vs PC: P<0,0001; PAI vs PCI: P=0,001; PAI vs pancreatitis aguda: P=0,013; PAI vs cáncer de páncreas: P=0,008; PAI vs SS: P=0,005; PAI vs DM-1: P<0,0001; PAI vs sujetos sanos: P<0,0001. c. PAI vs PC: P<0,0001; PAI vs PCI: P=0,05; PAI vs cáncer de páncreas: P=0,002; PAI vs DM-1: P=0,002; PAI vs sujetos sanos: P<0,0001. d. PAI vs PC: P <0.0001; PAI vs PCI: P=0.003; PAI vs pancreatitis aguda: P=0.002; PAI vs cancer de páncreas: P<0.0001; PAI vs SS: P=0.005; PAI vs DM-1: P<0.0001; AIP vs sujetos sanos: P<0.0001.

En la figura 24 se observa la mediana de los niveles séricos de IgG y de IgG4

en los pacientes con PAI aislada, PAI con cáncer de páncreas y cáncer de

páncreas aislado.

184

RESULTADOS

1190

136

1905

273

901

32

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

PAI sin cáncer

de páncreas

PAI con cáncer

de páncreas

Cáncer de

páncreas

IgG (mg/dl)

IgG4 (mg/dl)

Figura 24. Mediana de los nivéles séricos de IgG y de IgG4 en pacientes con PAI, PAI con cáncer de páncreas y cáncer de páncreas. Sólo fue significativa la diferencia entre PAI con cáncer de páncreas y cáncer de páncreas para los niveles de IgG. PAI: Pancreatitis autoinmune. La comparación de la presencia de los marcadores serológicos entre

pacientes con PAI aislada, PAI con cáncer de páncreas y cáncer de páncreas

aislado, se muestra en la figura 25. Las diferencias en las frecuencias de

marcadores serológicos positivos entre los pacientes con PAI aislada y los

pacientes con PAI y cáncer de páncreas no fueron significativas. Mientras que

las diferencias en las frecuencias de marcadores serológicos positivos entre

pacientes con PAI y pacientes con cáncer de páncreas fueron significativas

para todos ellos (IgG4 aumentada: P = 0,008; Abs anti-AC II+ P = 0,002; Abs

anti-AMY α: P < 0,0001).

185

RESULTADOS

75% 75%

55%

100% 100%

75%

29%

0%

14%

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

PAI sin cáncer

de páncreas

PAI con cáncer

de páncreas

Cáncer de

páncreas

Abs ant i-CA II+

Abs ant i-AMY-α+

IgG4 aumentada

Figura 25. Comparación de los marcadores serológicos entre pacientes con PAI, PAI con cancer de páncreas y cáncer de páncreas. PAI: Pancreatitis autoinmune. AC II Abs+:Anticuerpos anti-Anhidrasa carbónica II positivos. AMY α Abs+: Anticuerpos anti-amilasa α positivos.

4.1.2. Valor diagnóstico de los niveles elevados de IgG4, los Abs anti-CA II, y

los Abs anti-AMY α

En la figura 26 se muestra la sensibilidad, la especificidad, el VPP y el VPN

de los niveles elevados de IgG4, los Abs anti-CA II y los Abs anti-AMY α para el

diagnóstico de la PAI. Como grupos control se incluyeron los pacientes con PC,

PCI, pancreatitis aguda, cáncer de páncreas y los sujetos sanos.

Tanto los anticuerpos anti-AC II como los anticuerpos anti-AMY α presentan

la mayor sensibilidad (83%), aunque la especificidad es mayor para los

anticuerpos anti-AMY α (89%) que para los Abs anti-AC II (75%). Los niveles

aumentados de IgG4 constituyen el marcador serológico más específico (94%),

aunque con una sensibilidad baja (58%).

186

RESULTADOS

58%

83% 83%

94%

75%

89%

50%

24%

42%

96% 98%98%

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

Sensibilidad Especificidad VPP VPN

↑ IgG4

Abs anti-CA II

Abs anti-AMY α

Figura 26. Valor diagnóstico de los marcadores serológicos en la PAI. PAI: Pancreatitis autoinmune. VPP: Valor predictivo positivo. VPN: Valor predictivo negativo. ↑ IgG4: Nivéles aumentados de IgG4. Abs: anticuerpos. CA II: Anhidrasa carbónica II. AMY α: Amilasa α.

Como algunos individuos con PAI son diagnosticados erróneamente de PCI,

los pacientes con PCI han sido excluidos como grupo control para recalcular la

el valor diagnóstico de los marcadores serológicos en la PAI. Los resultados

muestran idéntica sensibilidad y VPN que en el análisis anterior para los tres

marcadores serológicos, un incremento de la especificidad de los anticuerpos

anti-AC II (81%) y de los anticuerpos anti-AMY α (94%) y del VPP de los

niveles aumentados de IgG4, los anticuerposs anti-AC II y los anticuerpos anti-

AMY α en un 58%, 64% y 34%, respectivamente (Figura 27).

187

RESULTADOS

58%

83%83%95%

81%

94%

58%

34%

63%

95%98%98%

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

Sensibilidad VPP

↑ IgG4

Abs anti-CA II

Abs anti-AMY α

Figura 27. Valor diagnóstico de los marcadores serológicos en la PAI, excluyendo la PCI como grupo control. PAI: Pancreatitis autoinmune. PCI: Pancreatitis crónica idiopática. VPP: Valor predictivo positivo. VPN: Valor predictivo negativo. ↑ IgG4: Niveles aumentados de IgG4. Abs: anticuerpos. CA II: Anhidrasa carbónica II. AMY α: Amilasa α.

4.1.3. Valor diagnóstico de la combinación de los marcadores serológicos

Las combinaciones de los niveles elevados de IgG4 y de los Abs anti-AMY α

o de los 3 marcadores serológicos muestran la mayor especificidad (99%) y

VPP (86%), aunque con una baja sensibilidad (50%). La combinación de los

anticuerpos anti-AC II y los Abs anti-AMY α presenta una elevada sensibilidad

(75%) y VPN (98%), aunque con una menor especificidad (93%) y VPP (50%)

(Figura 28).

188

RESULTADOS

50%50%

75%

50%

98% 99%93%

99%

67%

86%

50%

86%

95% 95%98%95%

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%


↑ IgG4 + CA II Abs

↑ IgG4 + AMY α Abs

CA II Abs + AMY α Abs

Los 3 marcadores

Figura 28. Valor diagnóstico de la combinación de los marcadores serológicos en la PAI. PAI: Pancreatitis autoinmune. VPP: Valor predictivo positivo. VPN: Valor predictivo negativo. ↑ IgG4: Niveles aumentados de IgG4. CA II Abs: Anticuerpos anti-anhidrasa carbónica II. AMY α Abs: Anticuerpos anti-amilasa α. Cuando se excluye la PCI como grupo control, los resultados muestran un

aumento de la especificidad y el VPP de la combinación de los niveles

aumentados de IgG4 y los anticuerpos anti-AMY α y/o los anticuerpos anti-AC II

en un 100%. La combinación de los anticuerpos anti-CA II y los anticuerpos

anti-AMY α, muestra la misma sensibilidad (75%), un aumento tanto de la

especificidad (97%) como del VPP (75%), y un descenso del VPN (97%)

(Figura 29).

189

RESULTADOS

50%50%

75%

50%

98%99%93%

99%

67%

86%

50%

86%95%95%98%95%

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%


↑ IgG4 + CA II Abs

↑ IgG4 + AMY α Abs

CA II Abs + AMY α Abs

Los 3 marcadores

Figura 29. Valor diagnóstico de la combinación de los marcadores serológicos en la PAI, excluyendo la PCI como grupo control. PAI: Pancreatitis autoinmune. PCI: Pancreatitis crónica idiopática. VPP: Valor predictivo positivo. VPN: Valor predictivo negativo. ↑ IgG4: Nivéles aumentados de IgG4. CA II Abs: Anticuerpos anti-anhidrasa carbónica II. AMY α Abs: Anticuerpos anti-amilasa α. 4.2. Utilidad diagnóstica de la IgG y la IgG4 en la PAI

El objetivo de este estudio ha sido determinar la sensibilidad y especificidad

diagnóstica de los niveles séricos elevados de la IgG y la IgG4 por encima de

los valores de puntos de corte empleados rutinariamente en nuestro laboratorio,

con el fin de compararlas con las obtenidas con los valores de puntos de corte

óptimos calculados mediante un análisis basado en curvas ROC.

En la tabla 36 se muestran los valores, expresados como mediana (rango),

de los niveles séricos de IgG y de IgG4 en los grupos de pacientes incluidos en

el estudio. Las frecuencias de los niveles séricos aumentados de IgG y de IgG4

se representan en la figura 30.

Dentro de los pacientes con PAI, la comparación de la presencia de niveles

séricos aumentados de IgG entre pacientes con PAI y el resto de grupos se

muestra en la tabla 37.

190

RESULTADOS

TABLA 36. Niveles séricos de IgG y de IgG4 en los sujetos de estudio

IgG (mg/dl)* Ig4 (mg/dl)*

Pancreatitis autoinmune 1525 (785-3110) 178,5 (19-4490)

Sospecha PAI 1360 (350-2060) 63 (29-315)

Pancreatitis crónica idiopática 1075 (722-1960) 70 (3-2979)

Pancreatitis aguda 1020 (564-1490) 30 (9-113)

Pancreatitis crónica 920 (325-1580) 24,5 (0,72-190)

Cáncer de páncreas 971 (497-2500) 48 (1,77-278)

Sujetos sanos 871 (528-1230) 33,9 (2,27-164)

*Resultados expresados como Mediana (rango).

57%

64%

56%

11%

38%

17%21%

7%

20%

0%

24%

20%

7%

2%

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

PA I Sospecha PA I PC I Pancreat i t isag uda

Pancreat i t iscró nica

Cáncer d ep ancreas

C ont ro lessano s

IgG aumentada

IgG4 aumentada

Figura 30. Frecuencia de niveles aumentados de IgG y de IgG4 en los grupos de pacientes incluidos en el estudio. PAI: Pancreatitis autoinmune. PCI: Pancreatitis crónica idiopática. IgG aumentada: Niveles séricos de IgG > 1200 mg/dl. IgG aumentada: Niveles séricos de IgG4 > 130 mg/dl.

191

RESULTADOS

Cuando los pacientes presentaron de niveles séricos aumentados de IgG,

por encima del valor de punto de corte utilizado en nuestro laboratorio (1200

mg/dl), comparamos la frecuencia de niveles elevados de IgG entre los

pacientes con PAI y el resto de grupos de sujetos (Tabla 37). La sensibilidad y

especificidad de los niveles aumentados de IgG para el diagnóstico de la PAI a

este valor de punto de corte fueron de un 57 % y un 84% respectivamente. En

el grupo de pacientes con PAI, la frecuencia de IgG aumentada fue

significativamente mayor que en pacientes con pancreatitis aguda, pancreatitis

crónica, cáncer de páncreas y controles sanos. En contraposición, cuando se

compararon el grupo de pacientes con PAI con el grupo de sospecha de PAI y

de PCI, no se observaron diferencias significativas.

TABLA 37. Diferencias en los niveles aumentados de IgG entre la PAI y el resto de grupos incluidos en el estudio

Grupos comparados Frecuencia IgG aumentada 1 Test estadístico Valor P

PAI vs Sospecha PAI 8/14 vs 5/9 Exacto de Fisher 1,00

PAI vs PCI 8/14 vs 9/24 Chi-cuadrado 0,24

PAI vs Pancreatitis aguda 814 vs 6/28 Exacto de Fisher 0,036*

PAI vs Pancreatitis crónica 8/14 vs 5/25 Exacto de Fisher 0,033*

PAI vs Cáncer de páncreas 8/14 vs 6/25 Chi-cuadrado 0,038 *

PAI vs Controles sanos 8/14 vs 3/45 Exacto de Fisher < 0,0001*

PAI vs Total controles 8/14 vs 20/123 Exacto de Fisher 0,001*

1Resultados expresados como nº casos positivos/nº total de casos. PAI: Pancreatitis

autoinmune. PCI: Pancreatitis crónica idiopática. Total controles: Pancreatitis aguda +

Pancretitis crónica + Cáncer de páncreas + Controles sanos.

*Diferencias significativas (P < 0,05).

192

RESULTADOS

Cuando los pacientes presentaron niveles séricos aumentados de IgG4, por

encima del valor de punto de corte utilizado en nuestro laboratorio (130 mg/dl),

comparamos la frecuencia de niveles aumentados de IgG4 entre los pacientes

con PAI y el resto de grupos de sujetos (Tabla 38). La sensibilidad y

especificidad de los niveles aumentados de IgG4 para el diagnóstico de la PAI

a este valor de punto de corte fueron de un 64 % y un 93% respectivamente.

En el grupo de pacientes con PAI, la frecuencia de IgG4 aumentada fue

significativamente mayor que en cada uno de los grupos control (pancreatitis

aguda, pancreatitis crónica, cáncer de páncreas y controles sanos).

Adicionalmente, cuando comparamos el grupo de pacientes con PAI con el

grupo de sospecha de PAI y de PCI, también encontramos diferencias

significativas.

TABLA 38. Diferencias en los niveles aumentados de IgG4 entre la PAI y el resto de grupos incluidos en el estudio


PAI vs Sospecha PAI 9/14 vs 1/9 Exacto de Fisher 0,029*

PAI vs PCI 9/14 vs 4/24 Exacto de Fisher 0,005*

PAI vs Pancreatitis aguda 9/14 vs 2/28 Exacto de Fisher <0,0001*

PAI vs Pancreatitis crónica 9/14 vs 0/25 Exacto de Fisher <0,0001*

PAI vs Cáncer de páncreas 9/14 vs 5/25 Chi-cuadrado 0,006*

PAI vs Controles sanos 9/14 vs 1/45 Exacto de Fisher <0,0001*

PAI vs Total controles 9/14 vs 8/123 Exacto de Fisher <0,0001*




* Diferencias significativas (P < 0,05).

193

RESULTADOS

La comparación de la frecuencia de niveles elevados de IgG entre el grupo

de pacientes con sospecha de PAI y el de pacientes con PCI, y el resto de

grupos control se muestra en la tabla 39. La frecuencia de IgG aumentada fue

significativamente mayor en los pacientes con sospecha de PAI (5/9) y con PCI

(9/24), que en los controles sanos (3/45) (P = 0,002 en ambos casos); mientras

que no se encontraron diferencias significativas con el resto de grupos control.

TABLA 39. Diferencias en los niveles aumentados de IgG entre la s ospecha de PAI o PCI y los grupos control inclui dos en el estudio


S.PAI vs Pancreatitis aguda 5/9 vs 6/28 Exacto de Fisher 0,091

S.PAI vs Pancreatitis crónica 5/9 vs 5/25 Exacto de Fisher 0,085

S.PAI vs Cáncer de páncreas 5/9 vs 6/25 Exacto de Fisher 0,111

S.PAI vs Controles sanos 5/9 vs 3/45 Exacto de Fisher 0,002*

S. PAI vs Total controles 5/9 vs 20/123 Exacto de Fisher 0,012*

PCI vs Pancreatitis aguda 9/24 vs 6/28 Chi-cuadrado 0,202

PCI vs Pancreatitis crónica 9/24 vs 5/25 Chi-cuadrado 0,175

PCI vs Cáncer de páncreas 9/24 vs 6/25 Chi-cuadrado 0,305

PCI vs Controles sanos 9/24 vs 3/45 Exacto de Fisher 0,002*

PCI vs Total de controles 9/24 vs 20/123 Chi-cuadrado 0,017*





194

RESULTADOS

En la tabla 40 se describe la comparación de la frecuencia de niveles

elevados de IgG4 entre el grupo de pacientes con sospecha de PAI y el de

pacientes con PCI, y el resto de grupos control. La frecuencia de IgG4

aumentada fue significativamente mayor en los pacientes con PCI (4/24) que

en los controles sanos (1/45) (P = 0,046), mientras que no se encontraron

diferencias significativas con el resto de grupos control.

TABLA 40. Diferencias en los niveles aumentados de IgG4 entre la sospecha de PAI o PCI y los grupos control inclui dos en el estudio





S.PAI vs Controles sanos 1/9 vs 1/45 Exacto de Fisher 0,308

S. PAI vs Total controles 1/9 vs 8/123 Exacto de Fisher 0,481

PCI vs Pancreatitis aguda 4/24 vs 2/28 Exacto de Fisher 0,284

PCI vs Pancreatitis crónica 4/24 vs 0/25 Exacto de Fisher 0,05

PCI vs Cáncer de páncreas 4/24 vs 5/25 Exacto de Fisher 1,00

PCI vs Controles sanos 4/24 vs 1/45 Exacto de Fisher 0,046*

PCI vs Total de controles 4/24 vs 8/123 Exacto de Fisher 0,109


autoinmune. S.PAI: Sospecha de pancreatitis autoinmune. PCI: Pancreatitis crónica

idiopática. Total controles: Pancreatitis aguda + Pancretitis crónica + Cáncer de páncreas +

Controles sanos. *Diferencias significativas (P < 0,05).

195

RESULTADOS

Los valores de punto de corte óptimo de los niveles aumentados de IgG y de

IgG4 usando curvas ROC se representan en la figura 31. El valor de punto de

corte más óptimo para la IgG fue de1494 mg/dl, con el cual se obtuvieron una

sensibilidad y especificidad de un 57% y un 96%, respectivamente (área bajo

la curva = 0,808). El valor de punto de corte más óptimo para la IgG4 fue de

137 mg/dl, con el cual se obtuvieron una sensibilidad y la especificidad de un

64% y un 94%, respectivamente (área bajo la curva = 0,807).

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

1 - Especificidad

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Sen

sibi

lidad

IgG 0,808IgG4 0,807

ABC

Figura 31. Curvas ROC de los niveles séricos de IgG y de IgG4 para el diagnóstico de la PAI. ABC: Área bajo la curva. La sensibilidad y la especificidad óptimas en el diagnóstico de la PAI de los niveles de IgG para un valor de 1495 mg//dl, fueron de un 57% y un 96% respectivamente. La sensibilidad y especificidad óptimas en el diagnóstico de la PAI de los niveles de IgG4 para un valor de 137 mg/dl, fueron de un 64% y un 94% respectivamente.

196

RESULTADOS

4.3. Correlación entre la IgG4 y la afectación extr apancreática en la PAI

La presencia de niveles de IgG4 superiores a 130 mg/dl fue detectada en un

64% (9/14), 11% (1/9) y 17% (4/24) de los pacientes con PAI, sospecha de PAI

y PCI, respectivamente. La afectación extrapancreática se encontró en un 57%

(8/14), 11% (1/9) y 8% (2/24) de los pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI,

respectivamente.

Los valores de punto de corte óptimo de los niveles de IgG y de IgG4 para

diferenciar entre pacientes con y sin afectación extrapancreática mediante un

análisis basado en curvas ROC se representan en la figura 32. El valor de

punto de corte óptimo de los niveles de IgG, fue de 1600 mg/dl, con el cual se

obtuvieron una sensibilidad y especificidad de un 64% y un 92%,

respectivamente (área bajo la curva = 0,913). El valor de punto de corte óptimo

de los niveles de IgG4 fue de 190 mg/dl, con el cual se obtuvieron una

sensibilidad y la especificidad de un 91% y un 100%, respectivamente (área

bajo la curva = 0,981).

197

RESULTADOS

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

1 - Especificidad

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Sen

sibi

lidad IgG 0,913

IgG4 0,981

ABC

Figura 32. Curvas ROC de los niveles séricos de IgG y de IgG4 para diferenciar entre PAI con y sin afectación extrapancreática. ABC: Área bajo la curva. La sensibilidad y la especificidad óptimas de los Ios niveles de IgG para un valor de 1600 mg//dl, fueron de un 64% y un 92% respectivamente. La sensibilidad y especificidad óptimas de los niveles de IgG4 para un valor de 190 mg/dl, fueron de un 91% y un 100% respectivamente.

4.3.1. Diferencias entre PAI con IgG4 > 190 mg/dl e IgG4 < 190 mg/dl

De los 14 pacientes con PAI, un 50% (7/14) presentaron niveles de IgG4

superiores a 190 mg/dl y el otro 50% (7/14%) presentaron niveles inferior a 190

mg/dl. Siete (100%) de los 7 pacientes con IgG4 superior a 190 mg/dl

presentaron afectación extrapancreática, mientras que uno (14%) de los 7

pacientes con niveles de IgG4 inferiores a 190 mg/dl presentó afectación

extrapancreática (P = 0,005).

198

RESULTADOS

No se encontraron diferencias significativas entre el grupo de pacientes con

PAI y niveles de IgG4 superiores a 190 mg/dl y el grupo de pacientes con

niveles de IgG4 inferiores a 190 mg/dl, en edad, sexo, frecuencia de ictericia,

dolor abdominal o ausencia de síntomas. Mientras que el grado de afectación

extrapancreática fue significativamente mayor en el grupo de pacientes con

niveles de IgG4 superiores a 190 mg/dl que en el grupo de pacientes con

niveles inferiores a 190 mg/dl (P = 0,002) (Tabla 41).

TABLA 41. Diferencias demográficas, clínicas y en el grad o de AEP entre los pacientes con PAI con IgG4 > 190 mg/dl y PAI con IgG4 < 190 mg/dl

IgG4 > 190 mg/dl 1 IgG4 < 190 mg/dl 2 Test estadístico Valor P

Frecuencia de casos 7/14 (50%) 7/14 (50%)

Media Edad (rango intercuartílico) 67 (66-77) 51,1 (30-76) U de Mann-

Withney 0,165

Sexo masculino 6/7 (86%) 6/7 (86%) F Fisher 1,00

Ictericia 2/7 (29%) 1/7 (14%) F Fisher 1,00

Dolor abdominal 3/7 (43%) 6/7 (85%) F Fisher 0,266

Asintomático 2/7 (29%) 0/7 (0%) F Fisher 0,462

Grado AEP

0 órganos: 0/7 (0%)

1 órgano: 2/7 (29%)

2 órganos: 2/7 (29%)

3 órganos: 2/7 (29%)

4 órganos: 1/7 (14%)

0 órganos: 6/7 (86%)

1 órgano: 1/7 (14%)

2 órganos: 0/7 (0%)

3 órganos: 0/7 (0%)

4 órganos: 0/7 (0%)

ANOVA con aproximación de Welch

0,002*

1,2Resultados expresados como nº casos positivos/nº total de casos (porcentaje).

PAI: Pancreatitis autoinmune. AEP: Afectación extrapancreática.


199

RESULTADOS

4.3.2. Diferencias entre sospecha PAI con IgG4 >190 mg/dl e IgG4 <190 mg/dl

De los 9 pacientes con sospecha de PAI, un 89% (8/9) presentaron niveles

de IgG4 superiores a 190 mg/dl y el otro 11% (1/9%) niveles inferior a 190

mg/dl. El único paciente (100%) con IgG4 superior a 190 mg/dl presentó

afectación extrapancreática, mientras que ninguno (0%) de los 8 pacientes con

niveles de IgG4 inferiores a 190 mg/dl presentaron afectación extrapancreática

(P = 0,111). Ninguno de los pacientes con sospecha de PAI presentó ictericia.

No se encontraron diferencias significativas entre el grupo de pacientes con

sospecha de PAI y niveles de IgG4 superiores a 190 mg/dl y el grupo de

pacientes con niveles de IgG4 inferiores a 190 mg/dl, en edad, sexo, frecuencia

de dolor abdominal o ausencia de síntomas. Mientras que el grado de

afectación extrapancreática fue significativamente mayor en el grupo de

pacientes con niveles de IgG4 superiores a 190 mg/dl que en el grupo de

pacientes con niveles inferiores a 190 mg/dl (P = 0,005) (Tabla 42).

TABLA 42. Diferencias demográficas, clínicas y en el grad o de AEP entre los pacientes con S.PAI con IgG4 > 1 90 mg/dl y S.PAI con IgG4 < 190 mg/dl



Mediana Edad (rango intercuartílico) 45 (45-45) 55 (40-80,25) U de Mann-

Whitney 0,699


Ictericia 0/0 (0%) 0/0 (0%) - -



Grado AEP 0 órganos: 0/1 (0%)

1 órgano: 1/1 (100%)

0 órganos: 8/8 (100%)

1 órgano: 0/8 (14%)

U de Mann-Whitney 0,005*

1,2Resultados expresados como nº casos positivos/nº total de casos (porcentaje). S.PAI: Sospecha de Pancreatitis autoinmune. AEP: Afectación extrapancreática. *Diferencias significativas (P < 0,05).

200

RESULTADOS

4.3.3. Diferencias entre PCI con IgG4 > 190 mg/dl e IgG4 < 190 mg/dl

De los 24 pacientes con PCI, un 8% (2/24) presentaron niveles de IgG4

superiores a 190 mg/dl y el otro 92% (22/24%) niveles inferior a 190 mg/dl. Los

2 pacientes (100%) con IgG4 superior a 190 mg/dl presentaron afectación

extrapancreática, mientras que ninguno (0%) de los 22 pacientes con niveles

de IgG4 inferiores a 190 mg/dl presentaron afectación extrapancreática (P =

0,004). Ninguno de los pacientes con PCI presentó ictericia. No se encontraron

diferencias significativas entre el grupo de pacientes con PCI y niveles de IgG4

superiores a 190 mg/dl y el grupo de pacientes con niveles de IgG4 inferiores a

190 mg/dl, en edad, sexo, frecuencia de dolor abdominal o ausencia de

síntomas. Mientras que el grado de afectación extrapancreática fue

significativamente mayor en el grupo de pacientes con niveles de IgG4

superiores a 190 mg/dl que en el grupo de pacientes con niveles inferiores a

190 mg/dl (P = 0,005) (Tabla 43).

TABLA 43. Diferencias demográficas, clínicas y en el grad o de AEP entre los pacientes con PCI con IgG4 > 190 mg/dl y PCI con IgG4 < 190 mg/dl



Mediana Edad +/- (rango intercuartílico) 71 (64-78) 59 (41,5-76) U de Mann-

Whitney 0,326


Ictericia 0/2 (0%) 0/20 (0%) - -



Grado AEP 0 órganos: 0/0 (0%)

1 órgano: 2/2 (100%)

0 órganos: 22/22 (100%)

1 órgano: 0/22 (0%)

U de Mann-Whitney <0,0001*

1,2Resultados expresados como nº casos positivos/nº total de casos (porcentaje). PCI: Pancreatitis crónica idiopática. AEP: Afectación extrapancreática. *Diferencias significativas (P < 0,05).

201

RESULTADOS

4.3.4. Diferencias globales entre PAI,Sospecha PAI y PCI con IgG4 > 190

mg/dl e IgG4 < 190 mg/dl

De los 47 pacientes con PAI, sopecha de PAI y PCI, un 21% (10/47)

presentaron niveles de IgG4 superiores a 190 mg/dl y el otro 79% (37/47)

niveles inferior a 190 mg/dl. Diez (100%) de los 10 pacientes con IgG4 superior

a 190 mg/dl presentaron afectación extrapancreática, mientras que 1 (9%) de

los 22 pacientes con niveles de IgG4 inferiores a 190 mg/dl presentaron

afectación extrapancreática (P = <0,0001). No se encontraron diferencias

significativas entre el grupo de pacientes con niveles de IgG4 superiores a 190

mg/dl y el grupo de pacientes con niveles de IgG4 inferiores a 190 mg/dl, en

edad, sexo, frecuencia de ictericia, dolor abdominal o ausencia de

síntomas. Mientras que el grado de afectación extrapancreática fue

significativamente mayor en el grupo de pacientes con niveles de IgG4

superiores a 190 mg/dl que en el grupo de pacientes con niveles inferiores a

190 mg/dl (P = <0,0001) (Tabla 44).

202

RESULTADOS

TABLA 44. Diferencias demográficas, clínicas y en el grad o de AEP entre los pacientes con PAI, S.PAI y PCI c on IgG4 > 190 mg/dl y con IgG4 < 190 mg/dl



Mediana Edad +/- (rango intercuartílico) 69 (59,25-77,25) 56 (40-75,75) U de Mann-

Whitney 0,236


Ictericia 2/10 (20%) 1/37 (3%) F Fisher 0,110



Grado AEP

0 órganos: 0/10 (0%)

1 órgano: 5/10 (50%)

2 órganos:2/10 (20%)

3 órganos:2/10 (20%)

4 órganos:1/10 (10%)

0 órganos: 36/37 (97%)

1 órgano: 1/37 (3%)

2 órganos:0/37 (0%)

3 órganos: 0/37 (0%)

4 órganos: 0/37 (0%)

U de Mann-Whitney <0,0001*

1,2Resultados expresados como nº casos positivos/nº total de casos (porcentaje). PCI: Pancreatitis crónica idiopática. AEP: Afectación extrapancreática. *Diferencias significativas (P < 0,05).

4.4. Caracterización clínica de los pacientes con P AI, sospecha de PAI y

pancreatitis crónica idiopática

De los 14 pacientes con PAI, 4 (29%) desarrollaron cáncer de páncreas

durante el curso de la enfermedad, mientras que ninguno de los pacientes con

sospecha de PAI y PCI desarrolló cáncer de páncreas.

En la figura 33 se muestra la frecuencia de los síntomas de presentación en

los pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI. El síntoma más frecuente fue el

dolor abdominal, presente en un 64% (9/14), 56% (5/9) y 95% (21/22) de los

pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI, respectivamente. La ictericia se

encontró en un 22% (3/14) de los pacientes con PAI, mientras que ninguno de

los pacientes con sospecha de PAI y PCI presentaron este síntoma.

203

RESULTADOS

64%

22%14%

56%

0%

44%

95%

0%5%

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

PAI Sospecha PAI PCI

Dolor abdominal

Ictericia

Asintomático

Figura 33. Frecuencia de los síntomas de presentación el los pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI. PAI: Pancreatitis autoinmune, PCI: Pancreatitis crónica idiopática. Un 14 % (2/14), 44% (4/9) y 5% (1/22) de los pacientes con PAI, sospecha de

PAI y PCI, respectivamente; se presentaron asintomáticos al diagnóstico.

La presencia de DM-2 fue detectada en un 43% (6/14), 11%(1/9) y 21%(5/25)

de los pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI, respectivamente (Figura 34).

43%

11%

21%

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%


Frecuencia Diabetes Mellitus tipo 2

Figura 34. Frecuencia de la presencia de Diabetes Mellitus tipo 2 en los pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI. PAI: Pancreatitis autoinmune, PCI: Pancreatitis crónica idiopática.

204

RESULTADOS

La afectación extrapancreática estuvo presente en un 57% (8/14), 11% (1/9)

y 8% (2/24) de los pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI, respectivamente

(Figura 35).

57%

11% 8%

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%


Frecuencia Afectación extrapancreática

Figura 35. Frecuencia de la presencia de afectación extrapancreática en los pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI. PAI: Pancreatitis autoinmune, PCI: Pancreatitis crónica idiopática. Dentro del grupo de pacientes con PAI, un 21% (3/14) presentaron

afectación de un único órgano, un 14% (2/14) afectación tanto de dos como de

tres órganos, y un 7% (1/14) afectación de 4 órganos. Un 11% (1/9) y 8% (2/24)

de los pacientes con sospecha de PAI y PCI, respectivamente; presentaron

afectación de un órgano. Mientras que ninguno de los pacientes con sospecha

de PAI y PCI presentó un mayor número de órganos afectados (Figura 36).

205

RESULTADOS

21%14%14%

7% 11%8%

0%

20%

40%

60%

80%

100%


Grado Afectación extrapancreática

1 órgano

2 órganos

3 órganos

4 órganos

Figura 36. Frecuencia del número de órganos afectados en los pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI. PAI: Pancreatitis autoinmune, PCI: Pancreatitis crónica idiopática. Tanto la vesícula biliar, como la próstata estuvieron afectadas con una mayor

frecuencia dentro del grupo de pacientes con PAI, en un 36% (5/14). La

afectación del tracto biliar se encontró en un 14% (2/14) y11% (1/9) de los

pacientes con PAI y sospecha de PAI, respectivamente; mientras que ninguno

de los pacientes con PCI presento afectación de este órgano. Dentro del grupo

de PCI, la afectación tanto de la próstata como la vesícula biliar fue encontrada

en un 4% (1/24) de los pacientes (Figura 37).

36%36%

14%7%7%7%

7% 11%4% 4%

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%


Vesícula biliar

Próstata

Tracto biliar

Retroperitoneo

Mesenterio

Riñón

Pulmón

Figura 37. Frecuencia de órganos afectados en los pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI. PAI: Pancreatitis autoinmune, PCI: Pancreatitis crónica idiopática.

206

RESULTADOS

4.5. Niveles séricos de CA 19.9 y utilidad diagnóst ica de los anticuerpos

anti-CA 19.9

La frecuencia de anticuerpos anti-CA 19.9 positivos en los diferentes grupos

de sujetos incluidos en el estudio se describe en la figura 38. Un 57%, 43% y

35% de los pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI, respectivamente;

presentaron anticuerpos anti-CA 19.9.

57%

43%35%

48%39%

39%

7%

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

Frecuencia Anticuerpos anti-CA 19.9 +

PAI

Sospecha PAI

PCI

Pancreatitis crónica

Pancreatitis aguda

Cáncer de páncreas

Controles sanos

Figura 38. Frecuencia de anticuerpos anti-CA 19.9 positivos en los diferentes grupos de sujetos incluidos en el estudio.

207

RESULTADOS

La comparación de la frecuencia de anticuerpos anti-CA 19.9 positivos entre

el grupo de pacientes con PAI y el resto de grupos de sujetos se describe en la

tabla 45. La frecuencia de anticuerpos anti-CA 19.9 positivos fue

significativamente mayor en pacientes con PAI (9/14) que en controles sanos

(3/45) (P < 0,0001), mientras que no se encontraron diferencias significativas

con el resto de grupos control.

TABLA 45 . Diferencias en la frecuencia de Abs anti-CA 19.9 + entre la PAI y el resto de grupos incluidos en el estudio

Grupos comparados Frec. Abs anti-CA 19.9 + 1 Test estadístico Valor P

PAI vs Sospecha PAI 9/14 vs 3/7 Exacto de Fisher 0,397

PAI vs PCI 9/14 vs 12/34 Chi-cuadrado 0,066

PAI vs Pancreatitis aguda 9/14 vs 9/23 Chi-cuadrado 0,138

PAI vs Pancreatitis crónica 9/14 vs 13/27 Chi-cuadrado 0,326

PAI vs Cáncer de páncreas 9/14 vs 11/26 Chi-cuadrado 0,185

PAI vs Controles sanos 9/14 vs 3/45 Exacto de Fisher <0,0001*

PAI vs Total controles 9/14 vs 36/121 Exacto de Fisher 0,015*

1Resultados expresados como nº casos positivos/nº total de casos. Frec. Abs anti-CA 19.9 +:

Frecuencia de anticuerpos anti-CA 19.9 positivos. PAI: Pancreatitis autoinmune. PCI:

Pancreatitis crónica idiopática. Total controles: Pancreatitis aguda + Pancretitis crónica +

Cáncer de páncreas + Controles sanos.


En la tabla 46 se describe la comparación de la frecuencia de anticuerpos

anti-CA 19.9 positivos entre el grupo de pacientes con sospecha de PAI y el de

PCI y el resto de grupos control. La frecuencia de anticuerpos anti-CA 19.9

positivos fue significativamente mayor en pacientes con sospecha de PAI (3/7)

y con PCI (12/34), que en controles sanos (3/45) (P = 0,026 y P = 0,001,

respectivamente); mientras que no se encontraron diferencias significativas con

el resto de grupos control.

208

RESULTADOS

TABLA 46. Diferencias en la frecuencia de Abs anti-CA 19. 9+ entre la sospecha de PAI o la PCI y los grupos control i ncluidos en el estudio

Grupos comparados Frec. anti-CA 19.9 Abs + 1 Test estadístico Valor P




S.PAI vs Controles sanos 3/7 vs 3/45 Exacto de Fisher 0,026*

PCI vs Pancreatitis aguda 12/34 vs 9/23 Chi-cuadrado 0,768



PCI vs Controles sanos 12/34 vs 3/45 Chi-cuadrado 0,001*


autoinmune. S.PAI: Sospecha de pancreatitis autoinmune. PCI: Pancreatitis crónica

idiopática.


La sensibilidad, la especificidad, el VPP y el VPN de los anticuerpos anti-CA

19.9 para el diagnóstico de la PAI fueron de un 57%, 69%, 14% y 95%,

respectivamente (Figura 39).

57%69%

14%

95%

0%

20%

40%

60%

80%

100%

SENSIBILIDAD ESPECIFICIDAD VPP VPN

Anticuerpos anti-CA 19.9 +

Figura 39. Valor diagnóstico de los anticuerpos anti-CA 19.9+ en la PAI.

209

RESULTADOS

La media, los percentiles (25 y 75) y el rango intercuartílico de los niveles

séricos de CA 19.9 en los pacientes con PAI, sospecha de PAI, PCI,

pancreatitis aguda y pancreatitis crónica se representa en la figura 40. La

mediana (rango intercuartílico) de los niveles séricos de CA 19.9 en pacientes

con cáncer de páncreas fue de 134 UI/ml (134-1425).

Los niveles de CA 19.9 estuvieron elevados por encima de su valor normal

(1-37 U/ml) en un 33% (4/12) y un 7% (4/24) de los pacientes con PAI (2 de

ellos con cáncer de páncreas) y PCI, respectivamente (uno de ellos con

adenocarcinoma gástrico); mientras que ninguno de los pacientes con

sospecha de PAI presentó niveles aumentados de CA 19.9.

Como los niveles de CA 19.9 se pueden elevar en situaciones de ictericia

obstructiva no maligna, se han estudiado los niveles séricos de CA 19.9 en

pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI sin y con ictericia. Adicionalmente,

se ha evaluado la asociación de los niveles séricos de CA 19.9 con la actividad

de la enfermedad. Para ello, se han comparado los niveles del marcador

tumoral en pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI, sin y con niveles de

IgG4 aumentados y en pacientes sin y con afectación extrapancreática. En este

sentido, no se han encontrado diferencias significativas en los niveles de CA

19.9 en función de la presencia de ictericia, niveles de IgG4 aumentados y

afectación extrapancreática en pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI.

Tampoco se ha encontrado una correlación significativa entre la presencia de

anticuerpos anti-CA 19.9 y de niveles aumentados de CA 19.9 (> 37 UI/ml)

(coeficiente de contingencia de Pearson = 0,052, P = 0,609) (Figura 41).

210

RESULTADOS

PAISOSPECHA.PAI

PCIP.AGUDA

P.CRÓNICA

0,00

25,00

50,00

75,00

100,00

125,00

150,00

175,00

NIV

ELE

S C

A19

.9 (U

/ml)

A

AS

S

S

SS

n=12 n=5 n=24 n=11 n=25

Figura 40. Niveles de CA 19.9. Se muestran los valores de la mediana, percentiles (25 Y 75) y el rango. Los círculos indican los valores atípicos y los asteriscos los valores extremos.

SI NO

Anticuerpos anti-CA19.9

10

15

20

25

30

35

40

Núm

ero

de p

acie

ntes

NIVELES AUMENTADOS CA19.9 (> 37 U/ml)

SI

NO

Figura 41. Relación entre la concentración elevada de CA 19.9 y la presencia de anticuerpos anti-CA 19.9.

211

RESULTADOS

4.6. Análisis de la presencia de anticuerpos anti-p 53

Dado que algunos individuos con lesiones premalignas y con distintos

tipos de cáncer, mediante un mecanismo desconocido, desarrollan anticuerpos

frente a la proteína p53 se ha analizado la presencia de anticuerpos anti-p53 en

los pacientes con PAI con el fin de evaluar el potencial maligno de la

enfermedad. Adicionalmente, se ha analizado la correlación entre la presencia

de estos anticuerpos y de lesiones extrapancreáticas (como marcador de

actividad de enfermedad).

La frecuencia de anticuerpos anti-p53 en los diferentes grupos de pacientes

incluidos en el estudio se describe en la figura 42. Un 71%, 22% y 12% de los

pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI, respectivamente, presentaron

anticuerpos anti-p53. Dentro de los grupos control, un 19% y un 15% de los

pacientes con cáncer de páncreas y PC, respectivamente, presentaron

anticuerpos anti-p53.

71%

22%

12% 19% 15%

0%

20%

40%

60%

80%

100%

Frecuencia de Abs anti-p53 +

PAI

Sospecha PAI

PCI

Cáncer de páncreas

Pancreatitis crónica

Figura 42. Frecuencia de anticuerpos anti-p53 positivos en los diferentes grupos de pacientes incluidos en el estudio.

212

RESULTADOS

La comparación de la frecuencia de anticuerpos anti-p53 positivos entre el

grupo de pacientes con PAI y el resto de grupos de pacientes se describe en la

tabla 47. La frecuencia de anticuerpos anti-p53 positivos fue significativamente

mayor en pacientes con PAI (11/14) que en pacientes con sospecha de PAI

(2/9) (P = 0,013), PCI (4/33) (P < 0,0001), PC (4/27) (P < 0,0001) y cáncer de

páncreas (4/26) (P < 0,0001).

TABLA 47. Diferencias en la frecuencia de Abs anti-p53 + entre la PAI y el resto de grupos incluidos en el estudio

Grupos comparados Frec. Abs anti-p53 + 1 Test estadístico Valor P

PAI vs Sospecha PAI 11/14 vs 2/9 Exacto de Fisher 0,013*

PAI vs PCI 11/14 vs 4/33 Exacto de Fisher <0,0001*

PAI vs Pancreatitis crónica 11/14 vs 4/27 Chi-cuadrado <0,0001*

PAI vs Cáncer de páncreas 11/14 vs 4/26 Chi-cuadrado <0,0001*

1Resultados expresados como nº casos positivos/nº total de casos. Frec. Abs anti-p53+:

Frecuencia de anticuerpos anti-p53 positivos. PAI: Pancreatitis autoinmune. PCI:

Pancreatitis crónica idiopática.


En la tabla 48 se describe la comparación de la frecuencia de anticuerpos

anti-p53 positivos entre el grupo de pacientes con sospecha de PAI y el de PCI

y el resto de grupos control. No se encontraron diferencias significativas en la

frecuencia de anticuerpos anti-p53 positivos entre los pacientes con sospecha

de PAI o PCI y los pacientes con PC o cáncer de páncreas, ni tampoco entre

los pacientes con PCI y los pacientes con PC o cáncer de páncreas.

213

RESULTADOS

TABLA 48. Diferencias en la frecuencia de anticuerpos ant i-p53+ entre la sospecha de PAI o la PCI y los grupos contr ol incluidos en el estudio

Grupos comparados Frec. anti-CA 19.9 Abs + 1 Test estadístico Valor P





1Resultados expresados como nº casos positivos/nº total de casos. PAI: Pancreatitis autoinmune. S.PAI: Sospecha de PAI. PCI: Pancreatitis crónica idiopática. *Diferencias significativas (P < 0,05).

Adicionalmente, se ha encontrado una correlación positiva entre la presencia

anticuerpos anti-p53 y de lesiones extrapancreáticas (coeficiente de

contingencia de Pearson = 0,53, P = < 0,001).

4.7. Análisis de los niveles séricos de interleucin a-6 (IL-6)

La IL-6 se ha propuesto como un marcador sensible pero inespecífico de

inflamación. Adicionalmente es esencial en la patogénesis y desarrollo de

malignidades. En el presente estudio se han determinado los niveles séricos de

IL-6 en los pacientes con PAI con el fin de evaluar su papel como citocina

proinflamatoria y marcador de malignidad.

La media, los percentiles (25 y 75) y el rango intercuartílico de los niveles de

IL-6 (pg/ml) en los pacientes con PAI, sospecha de PAI, PCI, PC, cáncer de

páncreas y controles sanos se representan en la figura 43. No se han

encontrado diferencias significativas en los niveles de IL-6 entre los pacientes

con PAI y los pacientes con pancreatitis crónica (P = 0,643) y cáncer de

páncreas (P = 0,496). Mientras que los niveles de IL-6 se encuentraron

214

RESULTADOS

PAIS.PAI

PCIPC

C.PANCREASC.SANOS

0,00

25,00

50,00

75,00

NIV

ELES IL

-6 (pg/m

l)

A

A

A

A

S

S

S

S

n=13 n=7 n=14 n=21 n=19 n=18

Figura 43. Niveles de IL-6 (pg/ml). Se muestran los valores de la mediana, percentiles 25 y 75) y el rango. Los círculos indican los valores atípicos y los asteriscos los valores extremos. PAI: Pancreatitis autoinmune. S.PAI: Sospecha de PAI. PCI: Pancreatitis crónica idiopática. PC: Pancreatitis crónica. C.Páncreas: Cáncer de páncreas. C.Sanos: Controles sanos.

significativamente más elevados en los pacientes con PAI que en controles

sanos (P= 0,045). En el grupo de sospecha de PAI no se han encontrado

diferencias significativas con el grupo de PC (P = 0,366) y el de cáncer de

páncreas (P = 0,532). Mientras que los niveles de IL-6 se encontraron

significativamente elevados en los pacientes con sospecha de PAI que en

controles sanos (P= 0,015). En el grupo de PCI no se han encontrado

diferencias significativas con el grupo de cáncer de páncreas (P = 0,373).

Mientras que los niveles de IL-6 se encontraron significativamente más

elevados en los pacientes con PCI que en el grupo de PC (P =0,033) y en

controles sanos (P= 0,0001).

215

RESULTADOS

4.8. Estudio de las subpoblaciones linfocitarias en pacientes con PAI,

sospecha de PAI y pancreatitis crónica idiop ática

En la tabla 49 se muestran los números absolutos por µl de sangre de los

linfocitos totales, células T, T CD4+, T CD8+, B y Nk, expresados como media

+/- desviación estándar y mediana (rango intercuatílico), en pacientes con PAI,

sospecha de PAI y PCI. No se han encontrado diferencias significativas entre

los tres grupos de pacientes, ni en el número absoluto de linfocitos totales, ni

en ninguna de las subpoblaciones linfocitarias analizadas.

TABLA 49. Frecuencias absolutas de las subpoblaciones lin focitarias en pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI

Subpoblaciones (rango normal)

PAI1

(n=10) Sospecha PAI 2

(n=5) PCI3

(n=13)

Linfocitos (1000-4800)

2098 +/- 774

1889,5 (1230-2766,5)

1607 +/- 456

1612,5 (1169,5-2038)

2182 +/- 765

2071 (1507-2972,5)

Linfocitos T (690-2540)

1368,5 +/- 426

1376,5 (968,5-1647,5)

185 +/- 437

1154 (789-1611,5)

1438 +/- 584

1318 (914-1916,5)

Linfocitos T CD4+ (410-1590)

797 +/- 306

695,5 (534-1074)

771 +/- 655

484 (380-1449,5)

858 +/- 284 827,5 (612-1106)

Linfocitos T CD8+ (190-1140)

431 +/- 108

449,5 (331,5-529)

596 +/- 271

634 (318,5-835,5)

452 +/- 258

388 (287,5-551)

Linfocitos B (90-660)

193 +/- 169

129 (75,5-275)

158,5 +/- 95

146 (76,5-253)

239 +/- 162

153 (129,5-398)

Células Nk (90-590)

583 +/- 433

484 (251-827)

218 +/- 122

250,5 (89,5-315)

423 +/- 224

407 (200,5-603,5)

1,2,3 Resultados expresados como Media +/- Desviación estandar (parte superior) y mediana (rango

intercuartílico) (parte inferior) de la frecuencia absoluta de células/µl. n= número de pacientes.

PAI: Pancreatitis autoinmune. PCI: Pancreatitis crónica idiopática.

216

RESULTADOS

En la tabla 50 se muestran los porcentajes de la frecuencia de cada una de

las subpoblaciones linfocitarias, con respecto al total de linfocitos, expresados

como media +/- desviación estándar y mediana (rango intercuatílico), en

pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI. Los valores medios y de la mediana

del porcentaje de todas las subpoblaciones linfocitaria estuvieron dentro del

rango normal en los tres grupos de pacientes, con excepción del valor de la

mediana del porcentaje de linfocitos B, que estuvo ligeramente disminuido en

pacientes con PAI (5,5%). La frecuencia relativa de LT CD8+ fue

significativamente mayor en pacientes con sospecha de PAI que en pacientes

con PCI (P = 0,041). Para el resto de subpoblaciones linfocitarias no se

encontraron diferencias significativas entre los tres grupos de pacientes.

TABLA 50. Porcentaje de las subpoblaciones linfocitarias en pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI

Subpoblaciones (rango normal)

PAI1


(n=5) PCI3

(n=13)

Linfocitos T (55-84%)

67% +/- 8,3

66% (60-74%)

72% +/- 6,6

71,5% (66,5-79%)

67% +/- 10,4

66% (60-76%)

Linfocitos T CD4 +

(31-60%) 42% +/- 5,1

41% 37-45%)

37,5% +/- 7

39% (30-43%)

43% +/- 7,5

42,5% (38-50%)

Linfocitos T CD8 + (13-41%)

23% +/- 8

20,5% (17-32%)

34% +/- 10

32,5% (25-44%)* a

22% +/- 7,3

19% (17,5-30%)

Linfocitos B (6-25%)

9% +/- 5,7

5,5% (5-14%)

9% +/- 4,4

9% (4-12,5%)

11% +/- 6,4

10% (5,5-17,5%)

Células Nk (5-26%)

23,5% +/- 9,5

21% (16-30%)

14% +/- 8,3

17,5% (5,5-20%)

18,5% +/- 8

16% (11,5-24%)

1,2,3 Resultados expresados como mediana (rango intercuartílico) de la frecuencia de cada

subpoblación con respecto al porcentaje total de linfocitos. n= número de pacientes. PAI:

Pancreatitis autoinmune. PCI: Pancreatitis crónica idiopática. a Sospecha de PAI vs PCI P = 0,041

*Diferencias significativas (P < 0,05)

217

RESULTADOS

En la figura 44 se muestran la frecuencias del cociente entre células T CD4+

y CD8+ (CD4/CD8) en pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI. El ratio

CD4/CD8 fue significativamente mayor en pacientes con PAI (2+/-0,74) que en

pacientes con sospecha de PAI (1,2+/-0,74), mientras que no se encontraron

diferencias significativas entre el resto de los grupos.

PAI SOSPECHA.PAI PCI

0,00

2,00

4,00

6,00

Co

cien

te C

D4/

CD

8

NS

NS

P = 0,034*

Figura 44. Cociente LT CD4+/LT CD8+ en pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI. PAI: Pancreatitis autoinmume. PCI: Pancreatitis crónica idiopática. NS: No significativo. Las barras representan la media y la desviación estandar. El cociente CD4/CD8 fue significativamente mayor en pacientes con PAI que en pacientes con sospecha de PAI ( P = 0,034). No se encontraron diferencias significativas entre el resto de grupos.

El recuento de linfocitos totales y las frecuencias de células T, T CD4+, T

CD8+ de la mayoría de los pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI,

estuvieron dentro de los rangos normales. Las principales alteraciones en las

subpoblaciones linfocitarias consistieron en un descenso en la frecuencia de

linfocitos B (rango normal: 6-25%) y en un incremento de células Nk (rango

normal: 5-26%). En la figura 45 se observa cómo un elevado porcentaje de

pacientes con PAI, presentaron linfocitopenia B (% linfocitos B < 6%) (50%)

218

RESULTADOS

50%

40% 40%

0%

23%15%

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%


Linfocitopenia B

Aumento NK

Figura 45. Frecuencia de linfocitopenia B (% Linfocitos B < 6%) y de incremento de células NK (% Nk >26%) en pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI. PAI: Pancreatitis autoinmume. PCI: Pancreatitis crónica idiopática.

y células Nk aumentadas (% células Nk > 26%) (40%). En el grupo de

sospecha de PAI, la frecuencia de linfocitopenia B fue de un 40%, mientras que

ninguno de los pacientes presento aumento de células Nk. En el grupo de PCI,

se observó la menor frecuencia de linfocitopenia B (23%), mientras que las

células Nk estuvieron aumentadas en un 15% de los pacientes. No se

encontraron diferencias significativas entre los tres grupos de pacientes.

Dado que las células Nk se han encontrado aumentadas en numerosas

enfermedades autoinmunes y podrían desempeñar un papel patogénico, se

analizaron las diferencias en el porcentaje de células Nk en función de la

presencia de afectación extrapancreática, observándose un aumento

significativo de la frecuencia de células Nk en los pacientes con afectación

extrapancreática que en aquellos sin afectación extrapancreática (mediana

(rango intercuartílico): 27% (17-34%) vs 16% (12,25-23%) (P = 0,026))

219

RESULTADOS

4.9. Análisis inmunofenotípico de las subpoblacione s de células B en

pacientes con PAI, sospecha de PAI y pancreatitis c rónica idiopática

Dado que la PAI se caracteriza por la estimulación crónica de las células B,

se ha analizado la distribución de las subpoblaciones de células B en esta

enfermedad.

En la figuras 46-51 se muestra un ejemplo práctico del análisis

inmunofenotípico de las subpoblaciones de las células B en un paciente con

PCI. Se muestra el porcentaje de cada una de las subpoblaciones con respecto

al total de linfocitos B y el análisis de clonalidad de las células plasmáticas

(CD19+ CD38++) mediante el cálculo del cociente entre las cadenas ligeras

intracitoplasmáticas kappa y lambda (ratio k/λ).

CD19 PerCP

CD

27 F

ITC

Plasmaticas 2%

Memoria 84%

Naive + Pre-naive + Transicionales 14%

Figura 46 . Distribución de las subpoblaciones de células B en función de la expresión en superficie de CD19 y CD27. CD19+CD27- (naive, pre-Naive y transicionales) CD19+CD27+ (memoria) y CD19+CD27++ (plasmáticas). Se muestra la frecuencia relativa de cada subpoblación con respecto al porcentaje total de linfocitos B.

220

RESULTADOS

CD38 PerCP

CD

24 P

E

Plasmaticas 2%

Transicionales 2%

CD38 PerCPIg

DP

E

Naive 10% Transicionales 2%Pre-naive 2%

CD

27 F

ITC

IgD PE

Memoria US 18%Memoria S 62%

Plasmaticas 2%

Memoria DN 4%

Naive + Pre-naive + Transicionales 14%

Figura 47 . Distribución de las subpoblaciones de células B en función de la expresión en superficie de CD38 y de CD24. CD24+CD38++ (transicionales) CD24-CD38++ (plasmáticas). Se muestra el porcentaje de la frecuencia de cada subpoblación con respecto al total de linfocitos B.

Figura 48 . Distribución de las subpoblaciones de células B en función de la expresión en superficie de CD38 y de IgD. IgD+CD38+d (naive) IgD+CD38+ (pre-naive) e IgD+CD38++

(transicionales). Se muestra el porcentaje de la frecuencia de cada subpoblación con respecto al total de linfocitos B.

Figura 49 . Distribución de las subpoblaciones de células B en función de la expresión en superficie de IgD y de CD27. IgD+CD27- (naive, pre-Naive y transicionales) IgD+CD27+ (memoria unswitched), IgD-CD27+ (memoria switched), IgD-CD27- (memoria dobles negativas) y IgD-CD27++ (plasmáticas). Se muestra el porcentaje de la frecuencia de cada subpoblación con respecto al total de linfocitos B. US: Unswitched, S: Switched, DN: Dobles negativas.

221

RESULTADOS

CD38 PecCP

CD

138

FIT

C

Plamáticas CD138 + 1%

Plasmáticas CD138 - 1,2%

Figura 50. Distribución de las células plasmáticas (CD19+ CD38++) en función de la expresión en superficie de CD138. CD38++CD138+ (Plasmáticas 138+) y CD38++CD138-

(plasmáticas 138-). Se muestra el porcentaje de la frecuencia de cada subpoblación con respecto al total de linfocitos B.

Figura 51. Análisis de clonalidad de células plasmáticas (CD19+ CD38++). Se muestra el porcentaje de expresión de kappa y lambda y el ratio kappa/lambda. El valor del ratio k/λ indica la presencia de una población monoclonal con resticción Lambda.

222

RESULTADOS

En la tabla 51 se muestran los números absolutos por µl de sangre de las

siguientes subpoblaciones de células B obtenidas según la estrategia de

“gating” en las citometrías comentadas anteriormente:

Transicionales

Pre-Naive

Naive

Memoria

Memoria unswitched

Memoria switched

Memoria dobles negativas

Plasmáticas

Plasmáticas CD 138+

Plasmáticas CD 138-

Los datos se han expresado como media +/- desviación estandar y mediana

(rango intercuatílico) en pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI. No se han

encontrado diferencias significativas entre los tres grupos de pacientes, en las

frecuencias absolutas para ninguna de las subpoblaciones de linfocitos B

analizadas.

223

RESULTADOS

TABLA 51. Frecuencias absolutas de las subpoblaciones de lin focitos B en pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI

Subpoblaciones (rango normal)*

PAI1


(n=5) PCI3

(n=13)

Transicionales (2-9)

6,4 +/- 5,9

5,2 (1,4-9,5)

4,7 +/- 4

3 (1,6-8,5)

16,6 +/- 17,1

17,1 (3,9-24,6)

Pre-naive (9-47)

9,1 +/- 4,9

9,7 (5,1-12,4)

7,3 +/- 5

9,4 (1,9-11,6)

17,1 +/- 14,2

11,7 (4,9-28,1)

Naive

(63-156) 76,2 +/- 59,6

64 (26,4-121,9)

98,6 +/- 70,9

75,6 (48,8-160)

125,4 +/- 100,3

82,8 (48,8-210)

Memoria (28-68)

93,9+/-125,8

41,4 (31,1-105,6)

40,1+/-25

36,1 (20,3-62)

73,7 +/- 60,7

37,4 (26,7-128,4)

Memoria unswitched

23,4 +/- 21,4

13,6 (5,3-46,2)

14 +/- 4,6

10,8 (4,6-25)

25 +/-21,8

17,9 (11,7-33,4)

Memoria switched 60,6 +/- 115,9

16,5 (12,7-50,4)

20,6 +/- 15

20 (9-32,5)

41,7 +/- 43,3

21,9 (10,4-64,8)

Memoria dobles negativas

12,7 +/- 11

7,5 (4,6-27,9)

5,4 +/- 3,8

5,4 (2,3-8,5)

7 +/- 4,7

6 (3,6-9,6)

Plasmáticas (0,6-2,9)

4,1+/-1,3

3,4 (1,3-6,9)

2 +/- 0,8

1,7 (1,4-2,8)

5,4 +/- 10,7

1,8 (1,3-3,7)

Plasmáticas CD138 +

(0,26-1,25) 2,3+/-2,3

1,5 (0,5-3,8)

1,2 +/- 0,9

0,9 (0,4-2)

1,9 +/ 2,7

0,8 (0,7-1,9)

Plasmáticas CD138 - (0,34-1,65)

1,8+/-2,2

1 (0,4-2,7)

0,9 +/- 0,8

0,6 (0,3-1,7)

3,5 +/- 7,8

1 (0,54-1,8)

* Los rangos de referencia (rango intercuartílico) de las frecuencias absolutas las células B

transicionales, naive, memoria y plasmáticas fueron establecidos por Caraux et al [382]. El rango

de referencia (rango intercuartílico) de las células B pre-naive fueron establecidos por Lee et al

[381].

1,2,3 Resultados expresados como media +/- desviación estandar (parte superior) y Mediana (Rango

intercuartílico) (parte inferior) de la frecuencia absoluta de células/µl. n= número de pacientes. PAI:

Pancreatitis autoinmune. PCI: Pancreatitis crónica idiopática.

224

RESULTADOS

En la tabla 52 se muestran los porcentajes de la frecuencia de cada una de

las subpoblaciones de linfocitos B, con respecto al total de linfocitos B,

expresados como media +/- desviación estándar y mediana (rango

intercuatílico), en pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI. Los valores

medios y de la mediana del porcentaje de células B pre-naive y naive

estuvieron dentro del rango normal en pacientes con PAI, sospecha de PAI y

PCI. Los valores medios y de la mediana de células B transicionales en

pacientes con PAI y sospecha de PAI estuvieron dentro del rango normal,

mientras que en pacientes con PCI estuvieron aumentados (6,7% y 6%,

respectivamente). Los valores medios y de la mediana de células B memoria

en pacientes con sospecha de PAI y PCI estuvieron dentro del rango normal,

mientras que en pacientes con PAI estuvieron aumentados (43,5% y 42,5%,

respectivamente). Los valores medios y de la mediana de células B memoria

unswitched estuvieron disminuidos en pacientes con PAI, sospecha de PAI y

PCI (media: 12,6%, 9,6 % y 12,3%, respectivamente; mediana: 10,5%, 8% y

9%, respectivamente. Los valores medios y de la mediana de células B

memoria “switched” en pacientes con sospecha de PAI y PCI estuvieron dentro

del rango normal, mientras que en pacientes con PAI el valor medio estuvo

aumentado (23,3%), aunque el valor de la mediana estuvo dentro del rango

normal. Los valores medios y de la mediana de células B memoria dobles

negativas en pacientes con sospecha de PAI y PCI estuvieron dentro del rango

normal, mientras que en pacientes con PAI el valor medio y de la mediana

estuvieron aumentados (7,9% y 6%, respectivamente). Los valores medios

de células plasmáticas en pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI

225

RESULTADOS

estuvieron aumentados (2,8%, 1,6% y 2%, respectivamente); similarmente, el

valor de la mediana también estuvo aumentado (1,8%, 1,8% y 1,6%,

respectivamente). Los valores medios y de la mediana de células plasmáticas

CD138+ en pacientes con sospecha de PAI y PCI estuvieron dentro del rango

normal, mientras que en pacientes con PAI el valor estuvieron aumentados

(1,6% en ambos casos). Los valores medios de células plasmáticas CD138- en

pacientes con PAI sospecha de PAI y PCI estuvieron aumentados (1,2%, 0,8%

y 1,3%, respectivamente). Similarmente, el valor de la mediana estuvo

aumentado en pacientes con PAI y sospecha de PAI (1,2% y 0,7%,

respectivamente), mientras que en pacientes con PCI estuvo dentro del rango

normal. Sin embargo, no se han encontrado diferencias significativas entre los

tres grupos de pacientes en el porcentaje de ninguna de las subpoblaciones de

linfocitos B analizadas.

En la figura 52 se muestran las frecuencias del cociente entre las cadenas

ligeras intracitoplasmáticas kappa y lambda (ratio k/λ) en pacientes con PAI,

sospecha de PAI y PCI. La frecuencia del ratio k/λ fue significativamente mayor

en pacientes con PAI (1,1+/-0,3) que en pacientes con sospecha de PAI (0,6+/-

0,3), mientras que no se encontraron diferencias significativas entre el resto de

los grupos.

226

RESULTADOS

TABLA 52. Frecuencias relativas de las subpoblaciones de linfocitos B en pacie ntes con PAI, sospecha de PAI y PCI

Subpoblaciones (rango normal)*

PAI1


(n=5) PCI3

(n=13)

Transicionales (1,8-4,5%)

4,5% +/- 5,5

2% (1-5,5%)

3,7% +/- 3,1

4% (0,7-6,5%)

6,7% +/- 4

6% (2,5-11%)

Pre-naive (3-16%)

6,6% +/- 4,2

5% (3-10,5%)

4,6% +/- 3

4% (2-7,5%)

7,2% +/- 3,4

8% (4,5-9%)

Naive

(57-73%) 41,7% +/- 18

47% (21,5-54%)

63% +/- 16,4

64% (47,5-78%)

50,1% +/- 19,9

59% (32-63,5%)

Memoria (22-39%)

43,5% +/- 18,4

42,5% (28,8-54,3%)

26,6% +/- 17,2

23% (14,5-40,5%)

33,8% +/- 21,6

26% (19-48%)

Memoria unswitched (13-21%)

12,6% +/- 9,5

10,5% (4,8-17%)

9,6% +/- 6,3

8% (5,5-14,5%)

12,3% +/- 9

9% (6-18,5%)

Memoria switched (9-19%)

23,3% +/- 20

16% (11-29,5%)

13,6% +/- 11,6

12% (5-23%)

17,9% +/- 16,6

11% (9-17%)

Memoria DN (< 5%)

7,9% +/- 8,1

6% (3-10,5%)

3,4% +/- 2,3

3% (1,5-5,5%)

3,6% +/- 2

3% (2-6%)

Plasmáticas (0,5-1,4%)

2,8% +/- 2,5

1,8% (1,5-3,4%)

1,6% +/- 0,6

1,8% (1-2%)

2% +/- 3

1,6% (0,7-2,1%)

Plasmáticas CD138 +

(0,28-0,8%) 1,6% +/- 1,9

1,1% (0,5-1,8%)

0,7% +/- 0,5

0,6% (0,4-1,2%)

0,78% +/- 0,8

0,54% (0,4-0,9%)

Plasmáticas CD138 - (0,22-0,6%)

1,2% +/- 1%

1,2% (0,1-1,5%)

0,8% +/- 0,7%

0,7% (0,3-1,5%)

1,3% +/- 2,4%

0,6% (0,3-1,3%)

* Los rangos de referencia (rango intercuartílico) de las frecuencias relativas de las células B

transicionales, naive, memoria y plasmáticas fueron establecidos por por Caraux et al [382]. El

rango de referencia (rango intercuartílico) de la frecuencia relativa de las células B pre-naive fueron

establecidos por Lee et al [381].

1,2,3 Resultados expresados como media +/- desviación estandar (parte superior) y mediana (rango

intercuartílico) (parte inferior) de la frecuencia relativa de cada subpoblación con respecto al

porcentaje total de linfocitos B. n= número de pacientes. PAI: Pancreatitis autoinmune. PCI:

Pancreatitis crónica idiopática. DN: Dobles negativas.

227

RESULTADOS

PAI SOSPECHA.PAI PCI

0,50

1,00

1,50

2,00

Rat

io k

/ λ

* P = 0,016

NS

NS

Figura 52. Frecuencia del ratio k/λ en pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI. PAI: Pancreatitis autoinmume. PCI:Pancreatitis crónica idiopática. NS: No significativo. Las barras representan la media y la desviación estandar. El ratio k/λ fue significativamente mayor en pacientes con PAI que en pacientes con sospecha de PAI (P = 0,016). No se encontraron diferencias significativas entre el resto de grupos.

Se han observado alteraciones en la distribución de las subpoblaciones de

células B en un porcentaje elevado de pacientes con PAI, sospecha de PAI y

PCI. Las principales alteraciones en distribución de las subpoblaciones de

linfocitos B consistieron en un aumento en la frecuencia de células B

transicionales (rango normal: 1,8-4,5%), memoria totales (rango normal: 28-

68%), memoria dobles negativas (valor normal < 5%), plasmaticas totales

(rango normal: 0,5-1,4%), plasmáticas CD138+ (rango normal: 0,28-0,8%) y

plasmáticas CD138- (rango normal: 0,22-0,6%); y en un descenso en la

frecuencia de células B pre-naive (rango normal: 3-16%) y naive (rango normal:

57-73%). Las células B transicionales estuvieron aumentadas en un, 20%,

40% y 62% de pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI

respectivamente; mientras que las células B prenaive estuvieron

228

RESULTADOS

disminuidas en un 10%, 40% y 15%, respectivamente (Figura 53). No se

encontraron diferencias significativas entre los tres grupos de pacientes, ni en

la frecuencia de células B transicionales aumentadas, ni de células B pre-naive

disminuidas. Las células B naive estuvieron disminuidas en un 90%, 40% y

31% de pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI, respectivamente (Figura

54). La frecuencia de células B naive disminuidas fue significativamente mayor

en pacientes con PAI que en pacientes con PCI (P = 0,010), mientras que no

se encontraron diferencias significativas entre el resto de grupos. Las células B

memoria totales estuvieron aumentadas en un 60%, 20% y 23% de pacientes

con PAI, sospecha de PAI y PCI, respectivamente; mientras que las células B

memoria dobles negativas estuvieron aumentadas en un 40%, 20% y 31%,

respectivamente (Figura 55). No se encontraron diferencias significativas entre

los tres grupos de pacientes, ni en la frecuencia de células B memoria totales

aumentadas, ni de células B memoria dobles negativas aumentadas. Las

células plasmáticas estuvieron aumentadas en un 80%, 80% y 31% de

pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI, respectivamente (Figura 56). No se

encontraron diferencias significativas entre los tres grupos de pacientes en la

frecuencia de células plasmáticas aumentadas. Las células plasmáticas

CD138- estuvieron aumentadas en un 70%, 60% y 54% de pacientes con PAI,

sospecha de PAI y PCI, respectivamente; mientras que las CD138+ estuvieron

aumentadas en un 50%, 40% y 23%; respectivamente. No se encontraron

diferencias significativas entre en la frecuencia de células plasmáticas CD138-

y CD138- aumentadas.

229

RESULTADOS

20%10%

40% 40%

62%

15%

0%

20%

40%

60%

80%

100%


↑ B-Transicionales↓ B Pre-Naive

Figura 53. Frecuencia del aumento de células B transicionales y del descenso de células B pre-naive en pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI. PAI: Pancreatitis autoinmume. PCI: Pancreatitis crónica idiopática.

90%

40%31%

0%

20%

40%

60%

80%

100%


↓ B-naive

* P = 0,010

Figura 54. Frecuencia del descenso de células B naive en pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI. PAI: Pancreatitis autoinmune. PCI: Pancreatitis crónica idiopática. Las diferencias fuero significativas entre el grupo de pacientes con PAI y el de PCI.

230

RESULTADOS

60%

40%

20% 20% 23%31%

0%

20%

40%

60%

80%

100%


↑ B-Memoria Totales

↑ B Memoria DN

Figura 55. Frecuencia del aumento de células B memoria totales y memoria dobles negativas en pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI. PAI: Pancreatitis autoinmune. PCI: Pancreatitis crónica idiopática.

80%

70%

50%

80%

60%

40%31%

54%

23%

0%

20%

40%

60%

80%

100%


↑ Plasmáticas

↑ Plasmáticas 138-

↑ Plasmáticas 138+

Figura 56. Frecuencia del aumento de células plasmáticas totales, plasmáticas 138- y plasmáticas 138+ en pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI. PAI: Pancreatitis autoinmune. PCI: Pancreatitis crónica idiopática.

Cuando se analizaron las diferencias en el porcentaje de los distintos tipos

de células B y plasmáticas en función de la presencia de afectación

extrapancreática, se observó un aumento significativo de las células B memoria

doble negativas y plasmáticas en los pacientes con afectación extrapancreática

que en aquellos sin afectación extrapancreática (mediana (rango intercuartílico):

6% (3-12%) vs 3% (2-5%) (P = 0,044) y 3% (1,7-9%) vs 1,3% (0,7-1,95%) (P =

0,013), respectivamente) y un descenso significativo de las células naive (23%

(17-43%) vs 58% (44,5-67%) (P = 0,021).

231

RESULTADOS

En la Figura 57 se muestra la frecuencia del ratio k/λ normal (0,5-4) y

disminuido (<0,5) de las células plasmáticas en pacientes con PAI, sospecha

de PAI y PCI. Todos los pacientes con PAI, presentaron un ratio k/λ normal de

las células plasmáticas. Se observó un ratio k/λ disminuido, indicando la

presencia de una población monoclonal con restricción λ, en un 20% y un 31%

de los pacientes con sospecha de PAI y PCI, respectivamente.

100%

0%

80%

20%

69%

31%

0%

20%

40%

60%

80%

100%


K/λ normal

↓ K/λ

Figura 57. Frecuencia del ratio Kappa/Lambda normal y disminuido de las células plasmáticas en pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI. PAI: Pancreatitis autoinmume. PCI: Pancreatitis crónica idiopática.

232

RESULTADOS

4.10. Estudio de cadenas ligeras libres y de los ra tios kappa/lambda en

pacientes con PAI, sospecha de PAI y pancr eatitis crónica idiopática

Dado que las cadenas ligeras libres pueden incrementarse en las

enfermedades autoinmunes como consecuencia de la estimulación de las

células B, podrán también alterarse en la PAI. Adicionalmente se han estudiado

los ratio κ/λ sFLC, ya que su alteración constituye un marcador temprano de la

presencia de malignidades de células B o de la existencia de de gammapatías

monoclonales.

En la figura 58 se muestran la media, los percentiles (25 y 75) y el rango

intercuartílico de los niveles de sFLC k, sFLC λ y de ratios k/λ sFLC en

muestras de suero al diagnóstico de pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI.

La mediana de los niveles de sFLC k estuvo dentro del rango normal (3,3-19,4)

en pacientes con PAI (16,35) y sospecha de PAI (15,9), mientras que se

encontró ligeramente elevado en pacientes con PCI (19,85). La mediana de los

niveles de sFLC λ estuvo dentro del rango normal (5,7-26,3) en pacientes con

PAI (17,4), sospecha de PAI (15,3) y PCI (17,1). La mediana de los ratios k/λ

sFLC estuvo dentro del rango normal (0,26-1,65) en pacientes con PAI (1,00),

sospecha de PAI (1,02) y PCI (1,01). No se han encontrado diferencias

significativas en los niveles de sFLC k, sFLC λ y en los ratios k/λ sFLC entre

ninguno de los grupos de pacientes analizados.

233

RESULTADOS

Figura 58. Niveles de cadenas ligeras libres kappa y lambda (mg/L) y del cociente entre cadenas ligeras libres kappa y lambda en muestras de suero al diagnóstico. Se muestran los valores de la mediana, percentiles (25 y 75) y el rango. En la representación de los ratios k/λ, los círculos indican los valores atípicos. No se muestran los valores atípicos para los niveles de cadenas ligeras libres kappa y lambda. PAI: Pancreatitis autoinmune. S.PAI: Sospecha de PAI. PCI: Pancreatitis crónica idiopática. sFLC k: Cadenas ligeras libres en suero kappa. sFLC λ: Cadenas ligeras libres en suero lambda. Ratio sFLC: Cociente entre cadenas ligeras libres kappa y lambda.

234

RESULTADOS

En la figura 59 se muestran la media, los percentiles (25 Y 75) el rango

intercuartílico de los niveles de sFLC k, sFLC λ y de ratios k/λ sFLC en las

últimas muestras de suero extraídas de cada paciente con PAI, sospecha de

PAI y PCI. La mediana de los niveles de sFLC k se mantuvo dentro del rango

normal en pacientes con sospecha de PAI (19), mientras que se encontró

elevada en pacientes con PAI (25,45) y PCI (21,8). La mediana de los niveles

de sFLC λ se mantuvo dentro del rango normal en pacientes con PAI (16,8),

sospecha de PAI (23,8) y PCI (19,1). La mediana de los ratios k/λ sFLC se

mantuvo dentro del rango normal en pacientes con PAI (1,21), sospecha de

PAI (0,81) y PCI (1,01). No se han encontrado diferencias significativas en los

niveles de sFLC k, sFLC λ y en los ratios k/λ sFLC entre ninguno de los grupos

de pacientes analizados.

235

RESULTADOS

Figura 59. Niveles de cadenas ligeras libres kappa y lambda (mg/L) y del cociente entre cadenas ligeras libres kappa y lambda en las últimas muestras de suero disponibles de cada paciente. Se muestran los valores de la mediana, percentiles (25 y 75) y el rango. En la representación de los ratios kappa/lambda, los círculos indican los valores atípicos. No se muestran los valores atípicos ni extremos para los niveles de cadenas ligeras libres kappa y lambda. PAI: Pancreatitis autoinmune. S.PAI: Sospecha de PAI. PCI: Pancreatitis crónica idiopática. sFLC k: Cadenas ligeras libres en suero kappa. sFLC λ: Cadenas ligeras libres en suero lambda. Ratio sFLC: Cociente entre cadenas ligeras libres kappa y lambda.

236

RESULTADOS

En la figura 60 se muestran la media, los percentiles (25 y 75) y el rango

intercuartílico de los niveles de sFLC k, sFLC λ y de ratios k/λ sFLC en

muestras de suero, extraídas durante los tres primeros meses tras el comienzo

del tratamiento esteroideo, de pacientes con PAI. La mediana de los niveles de

sFLC k (15,9), sFLC λ (13,3) y de los ratios k/λ (1,26) se mantuvieron dentro de

los rangos normales.

Figura 60. Niveles de cadenas ligeras libres kappa y lambda (mg/L) y del cociente entre cadenas ligeras libres kappa y lambda en las muestras de suero post-tratamiento en pacientes con PAI. Se muestran los valores de la mediana, percentiles (25 y 75) y el rango. No se muestran los valores atípicos, ni extremos para los niveles de cadenas ligeras libres kappa y lambda. PAI: Pancreatitis autoinmune. S.PAI: Sospecha de PAI. PCI: Pancreatitis crónica idiopática. sFLC k: Cadenas ligeras libres en suero kappa. sFLC λ: Cadenas ligeras libres en suero lambda. Ratio sFLC: Cociente entre cadenas ligeras libres kappa y lambda. 4.10.1. Oscilaciones de los niveles de sFLC y de los ratios k/λ en pacientes

con sospecha de PAI y PCI

Para analizar las oscilaciones en el tiempo de los niveles de sFLC k,

sFLC λ los ratios k/λ sFLC en pacientes con sospecha de PAI y PCI (sin

ningún tratamiento farmacológico), se han comparado estos parámetros

entre las muestras de suero al diagnóstico y las últimas muestras de

suero extraídas (muestras finales). En los pacientes con sospecha de PAI,

237

RESULTADOS

se ha observado un incremento de la mediana de los niveles de sFLC k (16,8

vs 19) y de sFLC λ (15,3 vs 23,8), y un descenso de la mediana del ratio k/λ

(1,2 vs 0,81) en las muestras finales con respecto a las muestras al diagnóstico,

aunque las diferencias no fueron significativas en ninguno de los casos. En los

pacientes con PCI se ha observado un incremento de la mediana de los niveles

de sFLC k (19,85 vs 21,4) y de sFLC λ (17,1 vs 19,1), mientras que la mediana

de los ratios k/λ sFLC se mantuvo prácticamente constante (1,02 vs 1,04) en

las muestras finales con respecto a las muestras al diagnóstico, aunque las

diferencias no fueron significativas en ninguno de los casos.

4.10.2. Influencia del tratamiento esteroideo en los niveles de sFLC y los

ratios k/λ en pacientes con PAI

Para analizar la influencia a corto plazo del tratamiento esteroideo sobre los

niveles de sFLC k, sFLC λ y los ratios k/λ sFLC en pacientes con PAI, se han

comparado estos parámetros en las muestras de suero al diagnóstico y en

muestras extraídas durante los tres primeros meses tras el comienzo del

tratamiento esteroideo (muestras post-tratamiento). Se ha observado un

descenso significativo de los niveles de sFLC k (16,35 vs 15,9) (P = 0,005), de

sFLC λ (17,4 vs 13,3) (P = 0,012) y un incremento no significativo del ratio k/λ

sFLC (1,02 vs 1,26) en las muestras post-tratamiento con respecto a las

muestras al diagnóstico.

Para analizar la influencia a largo plazo del tratamiento esteroideo sobre los

niveles de sFLC k, sFLC λ los ratios k/λ sFLC en pacientes con PAI, se han

comparado estos parámetros entre las muestras de suero al diagnóstico y las

últimas muestras extraídas ( tiempo medio de tratamiento esteroideo

238

RESULTADOS

= 32 meses) (muestras finales). Aunque hemos observado un incremento de

los niveles de sFLC k (25,45 vs 16,35) y de los ratios k/λ sFLC (1 vs 1,21), y

un ligero descenso de los niveles de sFLC λ (17,4 vs 16,8) en las muestras

finales con respecto a las muestras al diagnóstico; las diferencias no fueron

significativas en ninguno de los casos.

4.10.3. Alteraciones al diagnóstico en los niveles de sFLC y de los ratios k/λ

En la figura 61 se muestran los niveles de sFLC k y sFLC λ en muestras al

diagnóstico de pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI. Las líneas

punteadas rosas y azules separan las muestras con valores normales (en el

interior) y alterados (en el exterior) de sFLC k (3,3-19,4) y sFLC λ (5,7-26,3),

respectivamente. Adicionalmente, las lineas diagonales verdes separan las

muestras policlonales (en el interior) de las monoclonales (en el exterior), en

función del rango normal de ratio k/λ sFLC (0,26-1,65).

Los niveles de sFLC k al diagnóstico estuvieron aumentados en un 50%,

36% y 22% de los pacientes con PCI, PAI y sospecha de PAI, respectivamente.

Los niveles de sFLC λ al diagnóstico estuvieron aumentados en un 29% y un

19% de los pacientes con PAI y PCI, respectivamente; mientras que ninguno

de los pacientes con sospecha de PAI presentó un aumento de sFLC λ. El ratio

k/λ sFLC al diagnóstico estuvo alterado en un 21%, 13% y 11% de los

pacientes con PAI, PCI y sospecha de PAI, respectivamente (Figura 62). No

se han encontrado diferencias significativas en la frecuencia de la presencia de

niveles aumentados de sFLC k y de sFLC λ, ni de ratios k/λ sFLC alterados en

las muestras al diagnóstico entre ninguno de los grupos de pacientes

analizados.

239

RESULTADOS

Figura 61. Niveles séricos de cadenas ligeras libres kappa y lambda (Log de la concentración (mg/L)) en muestras al diagnóstico en pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI. Las líneas punteadas en rosa representan el rango de referencia de las cadenas ligeras kappa (3,3-19,4) y las líneas punteadas azules el rango de referencia de las cadenas ligeras lambda (5,7-26,3). Las lineas diagonales verdes separan las muestras policlonales (en el interior) de las monoclonales (en el exterior), en función del rango normal de ratio k/λ (0,26-1,65). PAI: Pancreatitis autoinmune. S.PAI: sospecha de PAI. PCI: Pancreatitis crónica idiopática. sFLC: Cadenas ligeras libres en suero.

36%

50%

22%29%

19%

0%

21%

13% 11%

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

k aumentada λ aumentada κ/λ alterado

PAI

PCI

Sospecha PAI

Figura 62. Frecuencia del aumento de cadenas ligeras libres kappa (> 19,4mg/L) y lambda (> 26,3 mg/L) y de la alteración del ratio k/λ sFLC (< 0,26 o > 1,65) al diagnóstico en pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI. PAI: Pancreatitis autoinmume. PCI: Pancreatitis crónica idiopática.

240

RESULTADOS

4.10.4. Alteraciones en el tiempo de los niveles de sFLC y de los ratios k/λ

En la figura 63 se muestran los niveles de sFLC k y sFLC λ en las últimas

muestras de suero extraídas (muestras finales) en los pacientes con PAI,

sospecha de PAI y PCI. Se han representado los valores de referencia de

sFLC k (3,3-19,4) y sFLC λ (5,7-26,3) y de los ratios k/ λ sFLC (0,26-1,65).

Los niveles de sFLC k en las muestras finales estuvieron aumentados en un

50% tanto de los pacientes con PAI como de los pacientes con PCI, y en un

33% de los pacientes con sospecha de PAI. Los niveles de sFLC λ en las

muestras finales estuvieron aumentados en un 29%,19% y 11% de los

pacientes con PAI, PCI, y sospecha de PAI, respectivamente. El ratio k/λ sFLC

en las muestras finales estuvo alterado en un 36%, 25% y 11% de los

pacientes con PAI, PCI y sospecha de PAI, respectivamente (Figura 64). No se

han encontrado diferencias significativas en la frecuencia de la presencia de

niveles aumentados de sFLC k y de sFLC λ, ni de ratios sFLC k/λ alterados en

las muestras finales, entre ninguno de los grupos de pacientes analizados.

Se ha encontrado una correlación positiva entre la presencia ratios sFLC k/λ

alterados y de afectación extrapancreática (coeficiente de contingencia de

Pearson = 0,342, P = 0,023),

241

RESULTADOS

Kappa sFLC

Lam

bda

sFLC

Figura 63. Niveles séricos de cadenas ligeras libres kappa y lambda (Log de la concentración (mg/L)) en las últimas muestras de suero extraídas en pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI. Las líneas punteadas en rosa representan el rango de referencia de las cadenas ligeras kappa (3,3-19,4) y las líneas punteadas azules el rango de referencia de las cadenas ligeras lambda (5,7-26,3). Las lineas diagonales verdes separan las muestras policlonales (en el interior) de las monoclonales (en el exterior), en función del rango normal de ratio k/λ (0,26-1,65). PAI: Pancreatitis autoinmune. S.PAI: Sospecha de PAI. PCI: Pancreatitis crónica idiopática. sFLC: Cadenas ligeras libres en suero.

50% 50%

33% 29%

19%11%

36%

25%

11%

0%

20%

40%

60%

80%

100%

k aumentada λ aumentada κ/λ alterado

PAI

PCI

Sospecha PAI

Figura 64. Frecuencia del aumento de cadenas ligeras libres kappa (> 19,4mg/L) y lambda (> 26,3 mg/L) y de la alteración del ratio k/λ (< 0,26 o > 1,65) en las últimas muestras de suero extraídas pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI. PAI: Pancreatitis autoinmume. PCI: Pancreatitis crónica idiopática.

242

RESULTADOS

Para estudiar la asociación de los niveles séricos de cadenas ligeras libres y

los ratio k/λ con la actividad de la enfermedad, se han comparado los niveles

de las mismas en pacientes sin y con afectación extrapancreática, y su relación

con los niveles de IgG4 en las muestras de suero tomadas al diagnóstico en

pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI.

4.10.5. Cambios en los niveles desFLC y ratios k/λ en función de la

ausencia/presencia de afectación extrapancreática

Los niveles de sFLC k fueron significativamente mayores en pacientes con

afectación extrapancreática que en aquellos sin afectación extrapancreática

(media: 28,6 vs 15,15, P = 0,012), mientras que no se encontraron diferencias

significativas en los niveles de sFLC λ, ni el los ratios k/λ sFLC entre los

pacientes con afectación extrapancreática.

4.10.6. Correlación entre los niveles de IgG4 y los de sFLC o los ratios k/λ

Se ha encontrado una correlación positiva entre los niveles de IgG4 y los de

sFLC k en pacientes con PAI (ρ = 0,710, P = 0,004), mientras que no se ha

encontrado correlación en pacientes con sospecha de PAI (ρ = 0,017,

P= 0,966), y PCI (ρ = 0362, P = 0,162).

No se ha encontrado correlación entre los niveles séricos de IgG4 y los

niveles de sFLC λ en pacientes con PAI (ρ = 0,499, P = 0,069), sospecha de

PAI (ρ = 0,3, P = 0,433) ni PCI (ρ = 0,216, P = 0,421).

Se ha encontrado una correlación positiva entre los niveles de IgG4 y los

ratios k/λ sFLC en pacientes con PAI (ρ = 0,601, P = 0,023), mientras que no

se ha encontrado correlación en pacientes con sospecha de PAI (ρ = -0,134,

P = 0,731) ni PCI (ρ = 0343, P = 0,194).

243

RESULTADOS

4.10.7. Monitorización de los niveles de sFLC y de los ratios k/λ en pacientes

con PAI

En la figura 65 se representa la monitorización de los niveles séricos de

sFLC y de los ratios k/λ en 13 de los 14 pacientes con PAI. En uno de los

pacientes con PAI no se ha realizado el análisis debido a la ausencia de

muestras post-tratamiento.

244

RESULTADOS

245

RESULTADOS

246

RESULTADOS

247

RESULTADOS

Figura 65. Monitorización de los niveles séricos de cadenas ligeras libres Kappa, Lambda y del ratio k/λ sFLC en los pacientes con PAI. Tiempo = 0: Muestra al diagnóstico.

248

RESULTADOS

4.11. Análisis de inmunoglobulinas monoclonales en pacientes con PAI,

sospecha de PAI y PCI

Dado que la estimulación crónica de las células B en la PAI podría conducir

a la producción de proteínas monoclonales en el suero, se ha evaluado su

presencia en estos pacientes.

De los 14 pacientes con PAI, en tres (21%) se detectaron inmunoglobulinas

monoclonales circulantes mediante IFE, de tipo IgG-kappa (ratio sFLC k/λ = 2),

IgA-lambda (ratio sFLC k/λ = 0,14) e IgM-kappa (ratio sFLC k/λ = 1,34),

respectivamente. Uno de los 9 pacientes con sospecha de PAI (11%), presentó

una inmunoglobulina monoclonal de tipo IgA-kappa (ratio sFLC k/λ = 2,04). En

contraste ninguno de los 16 pacientes con PCI presentó inmunoglobulinas

monoclonales circulantes. Sin embargo no se encontraron diferencias

significativas entre los tres grupos de pacientes.

La asociación entre la actividad de la enfermedad con el desarrollo de

inmunoglobulinas monoclonales en suero fue evaluado mediante el estudio la

correlación entre la presencia de afectación extrapancreática (marcador de

actividad) y de inmunoglobulinas monoclonales. En este sentido se ha

encontrado una correlación positiva entre ambos parámetros (coeficiente de

correlación de Peason = 0,355, P = 0,019).

249

RESULTADOS

4.12. Analisis de clonalidad de células B en infilt rados linfoplasmocíticos

en pacientes con PAI, sospecha de PAI y pa ncreatitis crónica

idiopática

Como la activación persistente de las células B presentes en los infiltrados

linfoplasmocíticos de las lesiones pancreáticas y extrapancreáticas de

pacientes con PAI podría conducir al desarrollo de procesos linfoproliferativos B,

se ha evaluado la presencia de clonalidad mediante el análisis de los

reordenamientos de las cadenas pesadas de las inmunoglobulinas.

En la tabla 53 se muestran los resultados del análisis de los reordenamientos

clonales del gen IgH en las secciones de tejido de las lesiones pancreáticas y

extrapancreáticas junto con el diagnóstico anatomopatológico de cada una de

las mismas; en pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI. De los 9 pacientes

con PAI analizados, siete presentaron reordenamientos policlonales en todas

las muestras evaluadas, mientras en los 2 restantes fueron monoclonales. En

uno de ellos se observaron reordenamientos monoclonales FR1-JH y FR3-JH

a nivel de las glándulas salivares (sin alteraciones desde el punto de vista

anatomopatológico), y en el otro reordenamientos monoclonales FR1-JH y

FR2-JH a nivel de la papila duodenal, (alteraciones anatomopatológicas:

Inflamación crónica con displasia epitelial).

Los 3 pacientes con sospecha de PAI presentaron reordenamientos

policlonales en todas las muestras analizadas. De los 2 pacientes con PCI, en

uno se observaron reordenamientos policlonales y en el otro se detectó un

reordenamiento biclonal FR1-JH a nivel del estómago (diagnóstico

anatomopatológico: Gastritis crónica).

250

RESULTADOS

TABLA 53 . Analisis de reordenamientos clonales del gen IgH

Px Diagnóstico Muestra: Diagnóstico Anatomopatológico Análisis clonalidad

1 PAI Páncreas: Pancreatitis crónica

Glándulas salivares: Sialoadenitis crónica

Policlonal

Policlonal

2 PAI Páncreas: Pancreatitis crónica

Glanglio cístico: Reactivo

Policlonal

Policlonal

3 PAI Próstata: Prostatitis crónica Policlonal

4 PAI

Vesícula biliar: Colecistitis crónica

Glándulas salivares: Sin alteraciones

Policlonal

Monoclonal FR1-JH Monoclonal FR3-JH

5 PAI Próstata: Prostatitis crónica Policlonal

6 PAI Páncreas: Pancreatitis crónica Policlonal

7 PAI Vesícula biliar: Colecistitis crónica Policlonal

8 PAI Páncreas: Pancreatitis crónica Policlonal

9 PAI Hígado: Adenocarcinoma Policlonal

10 PAI Papila duodenal: Inflamación crónica con displasia epitelial

Monoclonal FR1-JH Monoclonal FR2-JH

11 Sospecha PAI

Vesícula biliar: Colecistitis crónica Policlonal

12 Sospecha PAI

Papila duodenal: Inflamación crónica Policlonal

13 Sospecha PAI

Páncreas: Pancreatitis crónica

Médula ósea: Linfocitosis

Policlonal

Policlonal

14 PCI Vesícula biliar: Colecistitis crónica Policlonal

15 PCI Estómago: Gastritis crónica Biclonal FR1-JH

251

RESULTADOS

4.13. Analisis mutacional de K-ras en páncreas y le siones extrapancreáticas

de pacientes con PAI, sospecha de PAI y pancreatiti s crónica idiopática

Como se han descrito casos de PAI asociados con cáncer, se ha evaluado

el riesgo de cáncer páncreas y de otros órganos afectados mediante el

análisis mutacional del oncogén K-ras.

En la figura 66 se muestra un ejemplo gráfico de un paciente con análisis

mutacional de K-ras negativo y en la figura 67 un ejemplo gráfico de un paciente

con análisis mutacional de K-ras positivo.

Figura 66. Ejemplo gráfico de un paciente con análisis mutacional de K-ras negativo.

Figura 67. Ejemplo gráfico de un paciente con análisis mutacional de K-ras positivo.

252

RESULTADOS

En la tabla 54 se muestran los resultados del análisis de mutaciones K-ras

para la detección de siete mutaciones somáticas del oncogén K-ras en las

secciones de tejido de las lesiones pancreáticas y extrapancreáticas junto con

el diagnóstico anatomopatológico de cada una de las mismas en pacientes con

PAI, sospecha de PAI y PCI.

De los 6 pacientes con PAI, en 4 el análisis mutacional de K-ras fue negativo

a nivel de páncreas (diagnóstico anatomopatológico: Pancreatitis crónica, en

los 4 pacientes), y a nivel de vesícula biliar en uno de ellos (diagnóstico

anatomopatológico: Colecistitis crónica). En los 2 pacientes restantes el análisis

mutacional de K-ras fue positivo, en uno de ellos se detectó la mutación

Gly12Ser a nivel del páncreas (diagnóstico anatomopatológico: Pancreatitis

crónica y heteropia pancreática pseudotumoral en la pared duodenal), y en el

otro la mutación Gly12Ser a nivel de páncreas (diagnóstico anatomopatológico:

Adenocarcinoma). En el primero de ellos, diagnosticado con PAI en el 2002 a la

edad de 12 años, el estudio de K-ras fue realizado en una muestra de biopsia

pancreática realizada al diagnóstico. Los niveles de IgG4 fueron siempre

inferiores a 135 mg/dl. A pesar del diagnóstico de PAI, no se instauró el

tratamiento esteroideo por la negativa del paciente. Hasta el momento actual,

no ha desarrollado ninguna neoplasia maligna ni en páncreas ni en ningún

tejido extrapancreático. En el segundo de ellos, diagnosticado con PAI en

enero del 2009 a la edad de 77 años, el estudio de K-ras fue realizado en una

muestra de biopsia pancreática realizada al diagnóstico y en otra tomada 6

meses después del comienzo del tratamiento esteroideo. En este paciente,

los niveles séricos de IgG4 al diagnóstico fueron extremadamente

253

RESULTADOS

TABLA 54 . Analisis mutacional de K-ras

Px Diagnóstico Muestra: Diagnóstico Anatomopatológico Mutaciones K-Ras

1 PAI Páncreas: Pancreatitis crónica Negativo


3 PAI Vesícula biliar: Colecistitis crónica

Páncreas: Pancreatitis crónica

Negativo

Negativo


5 PAI Páncreas: Pancreatitis crónica 12SER

6 PAI Páncreas al diagnóstico: Pancreatitis crónica

Páncreas post-tratamiento: Adenocarcinoma

Negativo

12ASP

7 Sospecha PAI

Vesícula biliar: Colecistitis crónica Negativo

8 Sospecha PAI

Papila duodenal: Inflamación crónica Negativo

9 Sospecha PAI

Páncreas: Pancreatitis crónica 12VAL

10 PCI Vesícula biliar: Colecistitis crónica 12ASP

11 PCI Páncreas: Pancreatitis crónica Negativo

elevados, de 4500 mg/dl. El tratamiento esteroideo fue instaurado

inmediatamente después de realizar el diagnóstico, conduciendo a remisión

clínica, serológica y radiológica al cabo de un mes. Sin embargo tras 6 meses

de tratamiento, el paciente desarrolló colangitis y las biopsias a nivel de

páncreas y de vesícula biliar demostraron la existencia de adenocarcinoma en

ambos tejidos. El estudio de K-ras fue negativo en la biopsia pancreática al

diagnóstico, sin embargo, fue positivo en la muestra tomada 6 meses después

del comienzo del tratamiento esteroideo.

254

RESULTADOS

De los 3 pacientes con sospecha de PAI, en 2 el análisis mutacional de

K-ras fue negativo a nivel de vesícula biliar (diagnóstico anatomopatológico:

Colecistitis crónica) y papila duodenal (Alteraciones anatomopatológicas:

Inflamación crónica), respectivamente. En el paciente restante, el análisis

mutacional de K-ras fue positivo para 12VAL a nivel del páncreas (diagnóstico

anatomopatológico: Pancreatitis crónica). En este paciente, diagnosticado con

pancreatitis crónica en 1994 y con sospecha alta de PAI, el estudio de K-ras

fue realizado en una muestra de biopsia pancreática realizada en 1998. En

este paciente, los niveles séricos de IgG4 han sido siempre inferiores a135

mg/dl. No se ha instaurado el tratamiento esteroideo debido a la ausencia de

diagnóstico confirmatorio de PAI. Hasta el momento actual, no ha desarrollado

ninguna neoplasia maligna ni en páncreas ni en ningún tejido extrapancreático.

De los 2 pacientes con PCI, en uno de ellos el análisis mutacional de K-ras

fue negativo a nivel de páncreas (diagnóstico anatomopatológico: Pancreatitis

crónica), mientras que en el otro fue positivo para 12ASP a nivel de vesícula

biliar (diagnóstico anatomopatológico: Colecistitis crónica). En este paciente se

diagnostica una colangitis de repetición en el 2000 y una PCI en el 2005. El

estudio de K-ras fue realizado en una muestra de vesícula biliar realizada en

2000. En este paciente los niveles séricos de IgG4 han sido siempre inferiores

a 135 mg/dl. No se ha instaurado el tratamiento esteroide debido a la ausencia

de diagnóstico confirmatorio de PAI. Hasta el momento actual, no ha

desarrollado ninguna neoplasia maligna ni en páncreas ni en ningún tejido

extrapancreático.

255

DDIISSCCUUSSIIÓÓNN

55555555........ DDDDDDDDIIIIIIIISSSSSSSSCCCCCCCCUUUUUUUUSSSSSSSSIIIIIIIIÓÓÓÓÓÓÓÓNNNNNNNN

256

257

DISCUSIÓN

5. DISCUSIÓN

La PAI representa un tipo de enfermedad inflamatoria crónica, con un

diagnóstico diferencial frente a otras enfermedades pancreáticas,

principalmente el cáncer de páncreas, complicado. Esta situación es debida a

la ausencia de una única prueba diagnóstica, al desconocimiento del espectro

clínico completo y a la falta de consenso internacional en los criterios

diagnósticos de la PAI. En consecuencia, el número de pacientes

diagnosticados erróneamente de PAI ,y a la inversa, ha ido incrementando en

los últimos años. Con el fin de minimizar esta situación, uno de los objetivos de

esta tesis ha sido realizar una caracterización lo más detallada posible de los

pacientes desde el punto de vista clínico, histológico y serológico para

establecer una batería de ensayos que permitan llegar al diagnóstico de la PAI

con la mayor precisión posible.

La asociación entre autoinmunidad y linfomagénesis es conocida desde hace

más de 50 años. Se ha encontrado un incremento significativo del riesgo de

linfomas malignos en numerosas enfermedades autoinmunes, principalmente

en el síndrome de Sjögren primario (SSp) [292-293]. En este sentido, se ha

sugerido que los pacientes con expansión clonal de células B a nivel de

glándulas salivares presentan un riesgo elevado de desarrollar linfomas [383-

385]. Aunque el mecanismo de linfomagénesis en pacientes con enfermedades

autoinmunes se desconoce, la inflamación crónica y la activación persistente

de células B autorreactivas se han propuesto como factores de riesgo biológico

claves. Hay hipótesis que sugieren que cada uno de esos dos mecanismos

podría conducir a diferentes tipos de linfomas [313]. La actividad inflamatoria

258

DISCUSIÓN

crónica podría desencadenar linfomas no localizados, como los linfomas de

células B grandes difusos [311]. En contraste, la estimulación a largo plazo de

células B autorreactivas podría ser más relevante en la linfomagénesis en

enfermedades autoinmunes órgano-específicas, como por ejemplo el desarrollo

del linfoma de células B de la zona marginal en glándulas salivares activadas

en el SSp [316, 317]. En la patogénesis de la PAI se han implicado tanto un

componente inflamatorio crónico como la activación persistente de células B

autorreactivas. En consecuencia el desarrollo de linfomas en la PAI podría

ocurrir mediante ambos mecanismos. Para estudiar el riesgo de linfomagénesis

en la PAI, se ha analizado la clonalidad de células B en los infiltrados

linfoplasmociticos presentes en lesiones pancreáticas y extrapancreáticas de

estos pacientes. Adicionalmente como los linfocitos B circulantes además de

presentar una activación policlonal persistente (demostrada por la

producción de autoanticuerpos o la presencia de hipergammaglobulinemia

policlonal), podrían presentar un componente oligoclonal/monoclonal, se ha

evaluado la presencia de inmunoglobulinas monoclonales circulantes en los

pacientes con PAI. La presencia de inmunoglobulinas monoclonales circulantes

ha sido considerada como un estadio intermedio en la transición entre la

autoinmunidad y procesos linfoproliferativos malignos de células B

(principalmente el mieloma múltiple y los linfomas B) [386]. Estos, a su vez,

podrían haber evolucionado a partir de un precursor benigno (la gammapatía

monoclonal de significado incierto y el pseudolinfoma, respectivamente). En

este sentido, es necesario mencionar que la existencia de monoclonalidad no

implica necesariamente el desarrollo de un proceso linfoproliferativo maligno

259

DISCUSIÓN

[387-389]. En consecuencia es importante la caracterización y el seguimiento

de la presencia de inmunoglobulinas monoclonales circulantes, ya que se

puede considerar como un marcador temprano de malignidad [389]. Como en

muchos casos es complicado diferenciar entre un proceso linfoproliferativo

benigno y maligno, los análisis moleculares junto con el cuadro clínico concreto

de cada paciente, podrían ayudar a decidir cuando un proceso linfoproliferativo

benigno en la PAI, una gammapatía monoclonal de significado incierto (MGUS)

o un pseudolinfoma, evolucionará hacia malignidad, un mieloma múltiple o un

linfoma, respectivamente.

El análisis de la distribución de las subpoblaciones de células B periféricas

se ha realizado en numerosas enfermedades autoinmunes sistémicas, como la

AR, el LES y el SSp. Todos los datos sugieren que estas enfermedades,

caracterizadas por la estimulación crónica de las células B, presentan una

distribución única de las subpoblaciones de células B [390-395]. En

consecuencia el repertorio de células B periféricas en cada una de las

enfermedades autoinmunes y en las diferentes situaciones clínicas, podría

constituir un reflejo parcial de la diferenciación, activación, selección, migración

y recirculación de las mismas desde numerosos compartimentos, incluidos los

tejidos diana inflamados [396]. Hasta el momento actual, no se ha realizado

ningún estudio sobre la distribución de las subpoblaciones de células B en la

PAI. Como las células B desempeñan un papel importante en la patogénesis y

evolución de la PAI, hemos estudiado la distribución de las subpoblaciones de

células B periféricas con el fin de evaluar las alteraciones de las mismas en PAI.

260

DISCUSIÓN

En los últimos años se ha descrito el desarrollo de cáncer de páncreas en

pacientes con PAI, de forma simultánea o durante el seguimiento de la

enfermedad [397-399]. Para evaluar el riesgo de cáncer páncreas y de otros

órganos afectados en nuestra serie de pacientes con PAI, hemos realizado el

análisis mutacional del oncogén K-ras en los tejidos pancreáticos y

extrapancreáticos de los pacientes con PAI, ya que las mutaciones en K-ras

se han encontrado en más de un 90% de los adenocarcinomas de páncreas

[400, 401].


Actualmente no existe ningún marcador serológico que sea totalmente

específico de la PAI, en consecuencia, el diagnóstico se hace en base a la

presencia de la combinación de una serie de alteraciones clínicas, serológicas

e histopatológicas características de la enfermedad. Sin embargo, el

desconocimiento de su espectro clínico completo y la falta de consenso

internacional en los criterios diagnósticos, ha llevado en muchos casos a

diagnósticos erróneos. En esta tesis doctoral se ha buscado una batería de

ensayos serológicos que permita llegar al diagnóstico de la PAI con la mayor

precisión posible.

Este estudio se ha centrado en el análisis de tres marcadores serológicos,

los niveles séricos elevados de IgG4 (>135 mg/dl), los anticuerpos anti-AC II y

los anticuerpos anti-AMY α en pacientes con PAI y con otras enfermedades

pancreáticas, incluyendo la pancreatitis crónica, pancreatitis crónica idiopática

(PCI), pancreatitis aguda y cáncer de páncreas. La PCI se puede definir como

una forma de pancreatitis crónica de etiología desconocida, donde se han

261

DISCUSIÓN

descartado como agentes causales el alcoholismo, la presencia de piedras o la

autoinmunidad [375, 376]. Los dos primeros marcadores se han empleado

tradicionalmente en el diagnóstico de la PAI, aunque ambos se consideran

marcadores inespecíficos de la enfermedad [32, 204-208, 223, 230, 231].

Mientras que los anticuerpos anti-AMY α han surgido recientemente como los

marcadores serológicos más sensibles de la PAI [33].

En el presente estudio, la prevalencia de los niveles séricos elevados de

IgG4, los anticuerpos anti-AC II y los anticuerpos anti-AMY α fue

significativamente mayor en los pacientes con PAI (58%, 83% y 83%,

respectivamente) que en el resto de grupos de pacientes analizados. Cabe

destacar que un porcentaje apreciable de pacientes con PCI, presentaron estos

tres marcadores (8%, 50% y 31%, respectivamente). Esta situación podría

deberse a que en algunos casos la PCI representaría una forma de PAI oculta,

es decir, una forma de presentación atípica que no se ajusta por completo a los

criterios diagnósticos actuales de la PAI. Se podría establecer un cierto

paralelismo entre este hecho y lo que ocurre en la enfermedad celiaca que se

considera una enfermedad infradiagnosticada debido a la existencia de formas

de presentación atípicas, como la silente, la latente y la potencial; que tampoco

se ajustan con la enfermedad celiaca activa clásica.

Dada la importancia de diferenciar entre la PAI y el cáncer de páncreas, se

ha comparado la presencia de los tres marcadores serológicos entre pacientes

con PAI aislada, PAI con cáncer de páncreas y cáncer de páncreas aislado.

Los tres marcadores estaban presentes en la mayoría de los pacientes con

PAI, especialmente, en aquellos que desarrollaron cáncer durante el

262

DISCUSIÓN

seguimiento de la enfermedad. En pacientes con cáncer de páncreas aislado,

los niveles séricos elevados de IgG4 y los anticuerpos anti-AC II se detectaron

en un 14% y un 29% de los pacientes, respectivamente; mientras que los

anticuerpos anti-AMY α no se encontraron en ninguno de ellos. Como los anti-

AMY α no se detectaron en ninguno de los pacientes con cáncer de páncreas,

podrían constituir una herramienta útil para realizar el diagnóstico diferencial

entre ambas enfermedades. Aunque este hecho no descarta la posibilidad de

desarrollo de cáncer de páncreas en pacientes con PAI, de echo en nuestra

serie de pacientes, un 75% (4 de 14) desarrollaron cáncer de páncreas durante

el curso de la enfermedad. En este sentido, dado que la frecuencia de los tres

marcadores serológicos fue mayor en los pacientes con PAI y cáncer de

páncreas (100%, 100% y 75%, respectivamente) que en aquellos con PAI

aislada (75%, 75% y 55%, respectivamente), la coexistencia de niveles séricos

de IgG4 persistentemente elevados con los anticuerpos anti-AC II y AMY α en

pacientes con PAI podría constituir un factor de riesgo para el desarrollo de


En el análisis del valor diagnóstico de cada uno de los marcadores

serológicos, los anticuerpos anti-ACII y los anticuerpos anti AMY α presentaron

la mayor sensibilidad y VPN, aunque los anticuerpos anti AMY α fueron más

específicos, mientras que el VPP fue bastante bajo en ambos. Los niveles

elevados de IgG4 presentaron la mayor especificidad y VPP, aunque con

menor sensibilidad. En el presente estudio, la especificidad de los niveles

elevados de IgG4 fue similar a la obtenida por Hamano et al [113] y Ghazale et

263

DISCUSIÓN

al [204], mientras que sensibilidad fue menor (58% vs 95% y 75%

respectivamente). Una posible explicación de estas discrepancias podría ser

que alguno de nuestros pacientes presentara la PAI tipo 2, en vez de la forma

de presentación típica, la PAI tipo 1; ya que esta forma no se asocia con

niveles elevados de IgG4 en suero [172, 173]. Desgraciadamente en nuestros

pacientes no se realizó el estudio histológico, que se considera el único

parámetro que permite diferenciar entre la PAI tipo 1 y tipo 2. De acuerdo con

los estudios de Hosoda et al [283], se ha obtenido una sensibilidad mayor para

los anticuerpos anti-AC II. Sin embargo mientras que en el presente estudio los

anticuerpos anti-AC II se detectaron en un 29% de los pacientes con cáncer de

páncreas, en el de Hosoda et al [283] no se observaron en ninguno de ellos. En

consecuencia, mientras que estos autores concluyeron que los anticuerpos

anti-AC II constituían una herramienta útil para realizar el diagnóstico

diferencial entre la PAI y el cáncer de páncreas, los resultados del presente

estudio no permiten hacer la misma afirmación. En el presente estudio se ha

obtenido la misma sensibilidad para los anticuerpos anti-AMY α y anti-AC II

(83%), sin embargo la especificidad fue mayor para los anticuerpos anti-AMY α

(89%) que para los anticuerpos anti-AC II (75%). En consecuencia, de acuerdo

con los estudios de Endo et al [33], se ha postulado que los anticuerpos anti-

AMY α podrían constituir un marcador más útil para el diagnóstico de la PAI

que los anticuerpos anti-AC II.

Por último, en el análisis del valor diagnóstico de la combinación de los tres

marcadores serológicos, se ha observado un descenso de la sensibilidad a un

264

DISCUSIÓN

50%, como era de esperar, mientras que la especificidad y el valor predictivo

positivo aumentaron hasta un 99% y un 86%, respectivamente.

En conclusión, los dos marcadores serológicos empleados tradicionalmente

en la PAI, los niveles elevados de IgG4 y los anticuerpos anti-AC II, a pesar de

su buena sensibilidad, no se pueden considerar completamente específicos de

la PAI, ya que se pueden detectar en pacientes con otras enfermedades

pancreáticas y no pancreáticas, esta situación supone un problema importante,

ya que puede llevar a diagnósticos erróneos, principalmente del cáncer de

páncreas como PAI. En este sentido se ha estimado que cerca de un 10% de

pacientes con cáncer de páncreas presentan niveles elevados de IgG4. En

consecuencia es esencial tener en cuenta que los niveles séricos elevados de

IgG4 por sí solos no son suficientes para realizar el diagnóstico de la PAI [193].

Con respecto a los anticuerpos AC II, aunque fueron propuestos por Hosoda et

al [283] como una herramienta útil para diferenciar entre la PAI y el cáncer de

páncreas, nuestros datos no indican lo mismo. Combinado estos dos

marcadores con los anticuerpos anti-AMY α, se consiguió aumentar

notablemente la especificidad (99%), a espensas de una moderada sensibilidad.

Por tanto, en nuestra opinión, la combinación de los tres marcadores

serológicos constituye una herramienta útil para realizar el diagnóstico

diferencial entre la PAI y otras enfermedades pancreáticas, principalmente el


265

DISCUSIÓN

5.2. Utilidad de la IgG y la IgG4 en el diagnóstico de la PAI

La IgG y la IgG4 se encuentran elevadas en el suero de un porcentaje

elevado de pacientes con PAI [6, 113]. Sin embargo no existe un consenso

internacional acerca de cuales son valores de punto de corte de los niveles

séricos de la IgG y la IgG4 que deben de emplearse en el diagnóstico de la PAI.

En el presente estudio se ha comparado la sensibilidad y especificidad

diagnóstica de los niveles séricos elevados de la IgG y la IgG4, por encima

de los valores de punto de corte empleados rutinariamente en nuestro

laboratorio (1200 mg/dl y 130 mg/dl, respectivamente), con las obtenidas con

los valores de puntos de corte óptimos calculados mediante un análisis basado

en curvas ROC.

Cuando se empleó el valor de punto de corte rutinario para la IgG (1200

mg/dl), se obtuvo una sensibilidad de un 57% y una especificidad de un 84%,

mientras que con el valor de punto de corte óptimo (1496 mg/dl) se obtuvo una

mayor sensibilidad (96%) e idéntica especificidad. Según los criterios

diagnósticos Japoneses los niveles de IgG deberían de ser superiores a 1800

mg/dl [264], mientras que en un estudio coreano [208] se obtuvo un valor de

punto de corte ligeramente menor (1770 mg/dl). En este caso la sensibilidad y

especificidad fueron de un 57,1% y un 93,7%, respectivamente. Estos datos

contrastan con el valor obtenido en el presente estudio, bastante inferior a los

descritos en la bibliografía (1496 mg/dl). Sin embargo, la especificidad fue la

misma a la obtenida en el estudio coreano [208], mientras que la especificidad

fue mayor. Por tanto debido a la heterogeneidad en los valores de punto de

corte establecidos en las distintas series de pacientes, cada

266

DISCUSIÓN

laboratorio debería de establecer su propio valor de punto de corte para los

niveles de IgG en el diagnóstico de la PAI.

Cuando se empleó el valor de punto de corte rutinario para la IgG4 (130

mg/dl), se obtuvo una sensibilidad de un 64% y una especificidad de un 93%,

mientras que con el valor de punto de corte óptimo (137 mg/dl) se obtuvo una

sensibilidad ligeramente mayor (94%) e idéntica especificidad. El valor de punto

de corte de los niveles séricos de IgG4 comúnmente aceptado es de 135

mg/dl [113, 204, 266]. En la Clínica Mayo [78] emplean un valor de punto de

corte de 140 mg/dl, mientras que en un estudio coreano [208] obtuvieron un

valor ligeramente superior (141 mg/dl). En este caso la sensibilidad y

especificidad fueron de un 73,3% y un 95,1%, respectivamente. En el presente

estudio se ha obtenido un valor intermedio (137 mg/dl), aunque tanto la

sensibilidad como la especificidad fueron inferiores a las obtenidas en el

estudio coreano [208] (64% y 94%, respectivamente). Como todos los valores

de punto de corte se encuentran muy próximos, debería emplearse como valor

de punto de corte para los niveles de IgG4 en el diagnóstico de la PAI, el

aceptado por la mayoría de los grupos (135 mg/dl).

5.3. Niveles séricos de IgG4 y afectación extrapan creática

La afectación extrapancreática es frecuente en los pacientes con PAI,

principalmente del tracto biliar, vesícula biliar, hepática, retroperitoneal, de

nódulos linfoides y de glándulas salivares [63]. Generalmente, tanto el

páncreas como los otros órganos afectados en la PAI presentan una densa

infiltración con numerosas células plasmáticas IgG4+ [6, 152]. Adicionalmente,

la PAI está relacionada con niveles elevados en suero de IgG4. Estos hallazgos

267

DISCUSIÓN

sugieren que la IgG4 podría desempeñar un papel en la patogénesis de la

enfermedad.

En el presente estudio se ha estudiado el grado de afectación

extrapancreática en pacientes con PAI, sospecha de PAI y pancreatitis crónica

idopática (PCI) y se ha correlacionado con los niveles séricos de IgG4, con el

fin de evaluar su posible implicación en la PAI.

Los niveles séricos de IgG4 estuvieron elevados por encima del valor de

punto de corte de nuestro laboratorio (130 mg/dl) en un 64%, 11% y 17% de los

pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI, respectivamente. Mientras que la

afectación extrapancreática se encontró en un 57%, 11% y 8% de los pacientes

con PAI, sospecha de PAI y PCI, respectivamente. Cabe destacar la presencia

tanto de niveles elevados de IgG4 como de afectación extrapancreática en un

subgrupo de pacientes con PCI. Este hecho, apoya la hipótesis planteada

anteriormente, la existencia de una forma de presentación atípica de PAI en un

subgrupo de pacientes con PCI.

Mediante un análisis basado en curvas ROC, los valores de punto de corte

óptimo de los niveles séricos de IgG y de IgG4 para diferenciar entre pacientes

sin y con afectación extrapancreática, fueron de 1600 mg/dl y 190 mg/dl,

respectivamente. En consecuencia, los pacientes con niveles séricos de IgG y

de IgG4 superiores a 1600 mg/dl y a 190 mg/dl, respectivamente son más

propensos a presentar afectación extrapancreática. Todo ello podría indicar

que estos pacientes presentan un estado más activo de la enfermedad que

aquellos con niveles inferiores. En contraste, Kamisawa et al [30], obtuvieron

un valor de punto de corte bastante superior (220 mg/dl) en los niveles

268

DISCUSIÓN

séricos de IgG4, para diferenciar entre pacientes sin y con afectación

extrapancreática. Esta discrepancia podría deberse a que en el estudio de

Kamisawa et al [30] se incluyeron únicamente pacientes con diagnóstico

confirmado de PAI, mientras que en el presente estudio se incluyeron otros

dos grupos, los pacientes con sospecha de PAI y PCI, dentro de los cuales

podría haber pacientes con y sin PAI.

Dentro del grupo de pacientes con PAI, un 50% presentaron niveles de IgG4

superiores al punto de corte establecido para la IgG4 (190 mg/dl), todos ellos

con afectación extrapancreática; mientras que el otro 50% presentaron niveles

inferiores, de los cuales tan sólo un 14% tuvo afectación extrapancreática. No

se encontraron diferencias significativas en edad, sexo y síntomas entre estos

dos subgrupos, mientras que el grado de afectación extrapancreática fue

significativamente mayor en los pacientes con niveles de IgG4 superiores a 190

mg/dl. Estos resultados concuerdan con los obtenidos por Kamisawa et al [30],

que tampoco encontraron diferencias demográficas ni clínicas entre los

pacientes con niveles de IgG4 inferiores y superiores al valor de punto de corte

establecido y que también observaron un aumento significativo de las lesiones

extrapancreáticas en el grupo de pacientes con niveles séricos de IgG4

elevados. En contraste Ghazale et al [204] compararon los pacientes con PAI

con niveles séricos de IgG4 inferiores y superiores a 140 mg/dl, y observaron

que los primeros eran más jóvenes, con más probabilidad de ser mujeres y con

menor tendencia a presentar afectación extrapancreática, aunque no

encontraron diferencias en los síntomas. En base a estos hallazgos estos

autores sugirieron que este grupo de pacientes presentaban la variante

269

DISCUSIÓN

histológica de PAI descrita recientemente, la PAI tipo 2 o pancreatitis idiopática

ductulo-céntrica, ya que suele presentarse en pacientes de menor edad y con

menor propensión a presentar niveles séricos de IgG4 elevados y afectación

extrapancreática [154]. En consecuencia, los resultados del presente estudio

no permiten afirmar lo mismo; ya que no se encontraron diferencias en la edad,

sexo y síntomas entre ambos grupos y tampoco se disponía del estudio

histológico para confirmarlo. Sin embargo, de acuerdo con los estudios de

Kamisawa et al [30] y Ghazale el al [204] se ha encontrado un mayor grado de

afectación extrapancreática. En conclusión, la IgG4 parece guardar una

asociación con la actividad de la PAI, ya que los pacientes con niveles

séricos de IgG4 superiores a 190 mg/dl son más propensos a presentar

afectación extrapancreática y, además, en mayor grado.

5.4. Características clínicas de los pacientes

La PAI se suele presentar en varones de más de 50 años de edad [8, 54]. De

acuerdo con esta afirmación, el valor de la mediana de la edad de nuestra serie

de pacientes con PAI fue de 60,5 años (rango: 16-78 años) y el ratio

masculino:femenino de 12:2. En nuestras serie de pacientes con sospecha de

PAI y con PCI, los valores de la mediana de la edad también estuvieron por

encima de los 50 años; 51 años (rango: 37-84 años) y 61 años (rango: 31-91

años), respectivamente. En contraste, se diagnosticó un mayor número de

mujeres con sospecha de PAI y PCI (ratio masculino:femenino, 5:4 y 17:5,

respectivamente).

Las manifestaciones clínicas de la PAI son diversas, generalmente se

presenta como ictericia obstructiva sin dolor acompañada de aumento difuso

270

DISCUSIÓN

del páncreas, en un 70-80% de los pacientes [7, 56]. Otras manifestaciones

menos comunes son el dolor abdominal, la pérdida de peso o la diabetes

mellitus de establecimiento reciente, en un 10-50% de los pacientes [56]. En

raras ocasiones los pacientes se encuentran asintomáticos al diagnóstico, en

menos de un 10% [56]. La presentación aguda de la PAI con ictericia

obstructiva y agrandamiento del páncreas o con pérdida de peso acompañada

de diabetes mellitus (DM) puede mimetizar la forma de presentación del

cáncer de páncreas [54, 66, 67]. En nuestra serie de pacientes con PAI,

el síntoma de presentación más común fue el dolor abdominal (64%), seguido

de la ictericia obstructiva sin dolor (22%) y de la forma asintomática (14%).

Estos resultados contrastan claramente con los descritos en la bibliografía. En

este sentido, tanto en la serie japonesa [269] como en la de la Clínica Mayo

[204] y la coreana [416], el síntoma de presentación más común fue la ictericia

obstructiva sin dolor (81%, 73% y 65%, respectivamente), seguido de pérdida

de peso (sin datos, 49% y 35%, respectivamente) y dolor abdominal (22%, 33%

y 35%, respectivamente). Esta discrepancia podría ser consecuencia de la

influencia de factores ambientales y genéticos, diferentes en cada área

geográfica, sobre las manifestaciones clínicas de la enfermedad.

Adicionalmente, en nuestras serie de pacientes con sospecha de PAI y con PCI,

el síntoma de presentación más común también fue el dolor abdominal (64% y

95%, respectivamente), mientras que la ictericia obstructiva sin dolor no se

presentó en ninguno de los pacientes de ambos grupos.

La PAI suele asociarse con la presencia de diabetes mellitus (DM), como

consecuencia del desarrollo de alteraciones en el páncreas endocrino [73, 74].

271

DISCUSIÓN

En este sentido, la DM se ha descrito al diagnóstico de la PAI en un

50% de los pacientes [15, 76]. De acuerdo con esta afirmación la DM se

presentó en un 43% de los pacientes con PAI, mientras que en los pacientes

con sospecha de PAI y PCI, la frecuencia de DM fue mucho menor (11% y 21%,

respectivamente).

Como se comentó anteriormente, la PAI suele asociarse con la presencia

lesiones extrapancreáticas. En nuestra serie de pacientes con PAI, la

frecuencia de afectación extrapancreática fue de un 57%. Este dato se

aproxima bastante a los obtenidos en otras series de pacientes con PAI, en la

serie japonesa [30] y en la de la Clínica Mayo [204] la frecuencia de afectación

extrapancreática fue de un 55% y de un 64%, respectivamente. Adicionalmente,

las lesiones extrapancreáticas se pueden presentar en un único órgano o en

entre 2 y 4 órganos [63]. En este sentido, un 38%, 25%, 25% y 12% de los

pacientes con PAI y lesiones extrapancreáticas presentaron 1, 2, 3 y 4 órganos

afectados, respectivamente.

Las manifestaciones extrapancreáticas también son muy diversas y se

pueden presentar simultáneamente a las pancreáticas, precederlas u ocurrir

muchos años después. La afectación extrapancreática más común es la del

tracto biliar (>60%), también puede existir afectación de vesícula biliar (30%),

de glándulas salivares, retroperitoneal, de mesenterio, gastrointestinal, renal,

pulmonar y de próstata, etc [58-65]. Estos datos contrastan con los obtenidos

en el presente estudio, ya que los dos órganos afectados con mayor frecuencia

en nuestra serie de pacientes con PAI y afectación extrapancreática (57% de

los pacientes con PAI), fueron la vesícula biliar y la próstata (62% en ambos

272

DISCUSIÓN

casos), mientras que el tracto biliar estuvo afectado tan sólo en un 25%.

Adicionalmente, en los pacientes con sospecha de PAI el tracto biliar estuvo

afectado en el único paciente con afectación extrapancreática, mientras que en

los pacientes con PCI, dos pacientes presentaron afectación extrapancreática,

uno de vesícula biliar y otro de próstata.

5.5. Niveles de CA 19.9 y anticuerpos anti-CA 19.9 en la PAI

El antígeno carbohidrato CA 19.9 está presente en muchos tejidos fetales,

incluyendo las glándulas lacrimales y salivares, vías respiratorias y tracto

gastrointestinal. En los adultos sigue expresándose en el epitelio de los

conductos pancreáticos y glándulas salivares, mucosa de vesícula biliar y

epitelio del endocérvix. El CA 19.9 es un marcador tumoral empleado en la

detección y seguimiento de tumores gastrointestinales de origen epitelial,

especialmente el adenocarcinoma de páncreas. La especificidad y sensibilidad

del CA 19.9 en la detección del cáncer de páncreas dentro de una población de

alto riesgo es de un 70-90% y un 90% respectivamente [402]. Sin embargo, su

principal limitación es que puede elevarse en pacientes con ictericia obstructiva

no maligna (por ejemplo, por pancreatitis, colelitiasis, colestasis, cirrosis,

hepatitis, etc). Adicionalmente, puede encontrase elevado en ciertas

enfermedades autoinmunes, como la PAI, el SS, el LES, la esclerosis sistémica

y la AR [403-405]. En este sentido, se ha hipotetizado que el CA 19.9 a

través de sus motivos carbohidratos puede actuar como molécula de adhesión

contribuyendo a perpetuar la inflamación y desempeñar un papel patogénico.

Por ejemplo los niveles elevados de CA 19.9 se han correlacionado con la

afectación renal en el LES [406]. En los pacientes con PAI, el CA 19.9

273

DISCUSIÓN

podría elevarse como consecuencia de la presencia de ictericia obstructiva,

como un factor de riesgo de adenocarcinoma de páncreas, o por su posible

papel patogénico en la enfermedad. Con el fin de evaluar estas situaciones, se

han analizado los niveles séricos de CA 19.9 en nuestra serie de pacientes

con PAI.

En la patogénesis de la PAI, se ha postulado que la alteración antigénica en

las células ductales y acinares del páncreas podría desencadenar una reacción

autoinmunitaria, como el desarrollo de los anticuerpos frente a la anhidrasa

carbónica II, expresada en células epiteliales ductales del páncreas [31, 33].

En este sentido, dada la expresión del antígeno CA 19.9 en el epitelio de los

conductos pancreáticos, se ha analizado la existencia de anticuerpos frente al

CA 19.9 en el suero de los pacientes con PAI.

En el presente estudio los niveles de CA 19.9 estuvieron elevados en 4 de

de los 12 pacientes con PAI (33%) y en 4 de los 24 de los pacientes (17%) con

PCI, mientras que ninguno de los pacientes con sospecha de PAI presentaron

niveles aumentados de CA 19.9. La presencia simultánea de cáncer de

páncreas explicaría esta elevación en dos de los pacientes con PAI, mientras

que en los dos restantes la causa podría ser la propia enfermedad autoinmune,

ya que no se encontró una relación significativa entre los niveles aumentados

de CA 19.9 y la presencia de ictericia en los pacientes con PAI. En los

pacientes con PCI, la presencia simultánea de adenocarcinoma gástrico

explicaría esta elevación en uno de ellos, mientras que en los tres restantes la

causa podría ser la presencia de un proceso autoinmune subyacente, ya que

tampoco se encontró una relación significativa entre los niveles aumentados de

274

DISCUSIÓN

CA 19.9 y la presencia de ictericia en los pacientes con PCI. Sin embargo, no

se ha encontrado ninguna relación entre el aumento de los niveles de CA 19.9

con la elevación en suero de la IgG4 (implicada en la patogénesis de la PAI) ni

tampoco con la presencia de afectación extrapancreática (indicador de

enfermedad más activa ). En consecuencia la elevación del CA 19.9 en los

pacientes con PAI y PCI en unos casos sería resultado de la coexistencia de la

enfermedad con un fenómeno tumoral y en otros de su papel patogénico en el

proceso inflamatorio de la PAI, aunque no se ha podido demostrar su relación

con la actividad de la enfermedad.

Con respecto a los anticuerpos anti-CA 19.9, se han encontrado en una

frecuencia elevada en pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI (57%, 43% y

35%, respectivamente). Sin embargo, aunque prácticamente no se han

detectado en individuos sanos, se han observado en un porcentaje alto de

pacientes con otras enfermedades pancreáticas. En este sentido, la

sensibilidad, la especificidad, el VPP y el VPN de la presencia de anticuerpos

anti-CA 19.9 para el diagnóstico de la PAI fue de un 57%, 69%, 14% y 95%,

respectivamente. En conclusión, en el presente estudio se ha estudiado un

posible marcador serológico de la PAI el cual, debido a su baja sensibilidad y

especificidad, tiene una utilidad limitada en el diagnóstico diferencial de la PAI

con otras enfermedades pancreáticas.

5.6. Subpoblaciones linfocitarias en la PAI

En el presente estudio, las principales alteraciones en las subpoblaciones

linfocitarias consistieron en un descenso en la frecuencia de linfocitos B y en un

incremento de células Nk, presentes en un 50% y 40% de los pacientes con

275

DISCUSIÓN

PAI. Adicionalmente, la linfocitopenia B también se observo en pacientes con

sospecha de PAI y PCI (40% y 23%, respectivamente), y el incremento de

células Nk en un 15% de los pacientes con PCI, mientras que ninguno de los

pacientes con sospecha de PAI presentó esta alteración.

En este sentido, la linfocitopenia B también se ha descrito en pacientes con

LES, mientras que no suele presentarse en pacientes con SSp o AR [407, 408].

En contraposición, se ha descrito un descenso en la frecuencia de células

Nk en numerosas enfermedades autoinmunes, como la esclerosis sistémica,

AR, diabetes mellitus tipo 1, SS y miastenia gavis [408-412]. Se ha sugerido

que las células Nk podrían desempeñar un papel patogénico o protector en

función de las condiciones de una misma enfermedad autoinmune [413-416].

En el presente estudio, el porcentaje de células Nk fue significativamente

mayor en los pacientes con afectación extrapancreática (27%) que en aquellos

sin afectación extrapancreática (16%) (P = 0,028). En consecuencia el

incremento de células Nk en los pacientes con PAI podría estar implicado

en la progresión de la enfermedad, ya que la presencia de lesiones

extrapancreáticas estaría indicando una enfermedad más activa.

Adicionalmente, la presencia de ambas alteraciones, tanto en pacientes con

PAI como en pacientes con PCI, continúa confirmando la existencia de una

forma atípica de PAI dentro de este grupo de pacientes con PCI.

5.7. Subpoblaciones de células B en la PAI

En el análisis de la distribución en sangre de las subpoblaciones de células B

en los pacientes con PAI, las células transicionales, pre-naive y naive

estuvieron dentro de los rangos normales, mientras que se observó la

276

DISCUSIÓN

expansión tanto de células B memoria totales (mediana: 42,5%, rango normal:

22-39%) como de células plasmáticas (mediana: 1,8%, rango normal: 0,5-

1,4%). Dentro de las células B memoria, se encontró un descenso de las

células B CD27+IgD+ (unswitched) y un incremento de las CD27-IgD- (dobles

negativas), mientras que las CD27+IgD- (switched) estuvieron dentro del

rango normal. Dentro de las células plasmáticas, se observó un incremento

tanto de las células B 138+ como de las células B 138- . En contraste, en los

pacientes con sospecha de PAI la mayoría de las subpoblaciones de células B

estuvieron dentro de los rangos normales, con excepción de un descenso de

las células B memoria unswitched, de las células plasmáticas y, dentro de

éstas, de las 138-. Similarmente en los pacientes con PCI se observó un

descenso de las células B memoria unswitched y de las células plasmáticas.

Adicionalmente, sólo en este grupo se detectó la expansión de las células B

transicionales.

En el presente estudio, se han observado alteraciones importantes en la

distribución de las subpoblaciones de células B sanguíneas en una frecuencia

elevada de pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI. Las principales

alteraciones se muestran de forma esquemática en la figura 68.

Numerosos modelos animales y humanos han demostrado el papel

patogénico de las células B en las enfermedades autoinmunes, como el LES, el

SSp la AR [417]. Sin embargo, es en el LES donde más se ha estudiado el

papel de las células B en la patogénesis y actividad de la enfermedad, ya que

el LES se caracteriza por la hiperactividad de las células B y la producción de

autoanticuerpos.

277

DISCUSIÓN

TRANSICIONALES PRENAIVE NAIVE

MEMORIA

MEMORIA USWMEMORIA SW

MEMORIA DN

PLASMÁTICAS P 138+

P 138-

Figura 68. Principales alteraciones en la distribución en sangre de las subpoblaciones de células B en la PAI. Las flechas amarillas hacia arriba o hacia abajo, indican un incremento o un descenso de la subpoblación correspondiente. USW: unswitched. SW: switched. DN: dobles negativas. P: plasmáticas.

En los pacientes con LES, la distribución de las células B en sangre está

claramente alterada, ya que se ha encontrado un descenso de células B naive

y un incremento de células transicionales, pre-naive, memoria y plásmáticas

[453-423]. En este sentido, se ha sugerido que el incremento de células B

transicionales, podría ser un reflejo de la linfocitopenia B presente

característicamente en estos pacientes [421], mientras que el incremento de las

células plasmáticas se ha relacionado con la actividad de la enfermedad [424].

Con respecto a las células B memoria en el LES, recientemente se ha

descrito una nueva población carente de la expresión de CD27, las células B

memoria dobles negativas [425]. Diferentes grupos han observado la

expansión de células B memoria switched, generalmente acompañada de

la depleción de células B memoria unswitched, en los pacientes con LES [426].

278

DISCUSIÓN

Adicionalmente, en un estudio reciente se ha observado un incremento de las

células B memoria dobles negativas y su correlación con la actividad de la

enfermedad en pacientes con LES [427]. En este sentido se ha sugerido que el

incremento del pool de células B memoria en el LES podrían explicar la

patogénesis de la enfermedad y la resistencia al tratamiento observada en

algunos pacientes , ya que algunas de ellas muestran una elevada tasa de

hipermutación somática que las hace polireactivas y autoreactivas [428, 429].

Las células B pre-naive, con un fenotipo intermedio entre las células B

transicionales y naive, se han estudiado recientemente en el LES [423]. En este

sentido, se ha descrito el incremento de células B pre-naive y una correlación

entre su expansión y el grado de linfocitopenia B en los pacientes con LES. En

este sentido, se ha sugerido que las células B pre-naive pueden ser

amplificadas específicamente bajo ciertas condiciones que pueden alterar la

homeostasis de las células B [424].

En consecuencia, todas estas alteraciones en la homeostasis de las células B

en el LES, constituyen un reflejo de la pérdida de la tolerancia y de la activación

aberrante de las células B en la enfermedad [423].

En contraste con las observaciones descritas en el LES, en el SSp se ha

observado un incremento de las células B transicionales y naive, y descenso de

las células B memoria, especialmente de las células B memoria unswitched

[430-432]. Cabe destacar la presencia de esta misma distribución en los

pacientes con SIDA [433]. En este sentido, se ha sugerido que estas

alteraciones podrían ser consecuencia del descenso en la respuesta

inmunitaria T dependiente de las células B en sangre, debido a la presencia de

279

DISCUSIÓN

linfocitopenia T CD4+ en ambas patologías [434]. Adicionalmente, se ha

observado la acumulación tanto de las células T CD4+ como de las células B

memoria en los tejidos inflamados de los pacientes con SSp [430-432].

En otras enfermedades autoinmunes, como la AR se han encontrado menos

alteraciones en la distribución de las células B en sangre. En los pacientes con

AR, al igual que en el LES, también se ha encontrado un incremento de las

células B memoria, pero con una frecuencia normal de células B naive [425,

426].

En el presente estudio, al igual que en el LES, se ha observado un descenso

de las células B naive y una expansión de las células B memoria en los

pacientes con PAI, aunque sin alteraciones en el compartimiento de las células

B memoria switched [426, 428, 429]. Similarmente, se ha encontrado un

incremento de las células B memoria dobles negativas y, al igual que en el LES,

se ha correlacionado con la actividad de la enfermedad [427]. En este sentido,

el porcentaje de células B memoria dobles negativas fue significativamente

mayor en los pacientes con afectación extrapancreática que en aquellos sin

Afectación extrapancreática. En consecuencia, el incremento de células B

memoria dobles negativas en los pacientes con PAI podía estar implicado en la

progresión de la enfermedad. Adicionalmente el porcentaje de células B naive

fue significativamente menor en los pacientes con afectación extrapancreática

que en aquellos sin afectación extrapancreática. En contraste en el LES no se

ha encontrado ninguna relación entre el descenso de las células B naive y la

actividad de la enfermedad [420]. En consecuencia, el descenso de células B

280

DISCUSIÓN

naive en los pacientes con PAI, a diferencia del LES, podría estar también

relacionado con la actividad de la enfermedad.

Con respecto a las células B transicionales, al igual que en el LES y el SSp,

también se ha observado un incremento de las mismas en los pacientes con

PAI. Dado que tanto en los pacientes con LES como en los pacientes con PAI,

la linfocitopenia B es frecuente, es probable que esta alteración sea

responsable del incremento de células B transicionales en ambas

enfermedades [421]. Sin embargo, en el SSp los linfocitos B no suelen estar

disminuidos y, sin embargo, también se detecta esta misma alteración. Una

posible explicación, sería un fracaso en los mecanismos de tolerancia que

derivaría en la acumulación de células transicionales autorreactivas y, por tanto,

con un papel patogénico en estas enfermedades autoinmunes. En este sentido

se ha analizado la relación entre el aumento de células B transicionales y la

presencia de lesiones extrapancreáticas en nuestra serie de pacientes, sin

embargo no se ha encontrado ninguna asociación. En consecuencia el

significado clínico del incremento de esta subpoblación en la PAI esta por

determinar.

En lo que se refiere a las células B pre-naive, a diferencia que en el LES, se

ha observado un descenso de las mismas en los pacientes con PAI, junto con

la presencia de linfocitopenia B. En consecuencia, se desconoce el significado

del descenso de las células B pre-naive en nuestra serie de pacientes.

Por último, las células plasmáticas, al igual que en el LES, estuvieron

aumentadas y dicho aumento se corrrelacionó con la actividad de la

enfermedad. En este sentido, el porcentaje de células plasmáticas fue

281

DISCUSIÓN

significativamente mayor en los pacientes con afectación extrapancreática que

en aquellos sin afectación extrapancreática. En consecuencia, el incremento de

células plasmáticas en los pacientes con PAI podía estar implicado en la

actividad de la enfermedad.

Todos estos resultados demuestran la presencia de profundas alteraciones

en la homeostasis de las células B en los pacientes con PAI, muy similares a

las halladas en el LES, indicando que la pérdida de la tolerancia y la activación

aberrante de las células B constituyen dos factores clave en ambas

enfermedad [422].

En el estudio de la clonalidad de las células plasmáticas (CD19+ CD38++) por

citometría de flujo, todos los pacientes con PAI presentaron un ratio k/λ normal,

mientras que se observó un ratio k/λ disminuido, indicando la presencia de una

población monoclonal con restricción λ, en uno y en cuatro de los pacientes con

sospecha de PAI y PCI, respectivamente. Por lo tanto, el riesgo de desarrollar

procesos linfoproliferativos de células B sería teóricamente mayor en los

pacientes con PCI, y en menor medida en los pacientes con sospecha de PAI,

seguido de los pacientes con PAI. Dado que se ha postulado la existencia de

una forma atípica de PAI dentro de la PCI, es posible que esta forma de

presentación atípica predisponga al desarrollo de neoplasias de células B. Una

de las posibles explicaciones sería que los pacientes con PCI no están

sometidos a terapia inmunupresora ya que, en ausencia de tratamiento, tanto la

inflamación crónica como la activación persistente de células B autorreactivas,

se perpetuarían en el tiempo y podrían conducir a la proliferación clonal de las

células B.

282

DISCUSIÓN

5.8. Anticuerpos anti-p53 en la PAI

El gen p53 es un gen supresor de tumores que se encuentra mutado en

más de un 60% de todos los cánceres, como el de páncreas, esófago, pulmón,

ovarios, colorectal, linfomas, etc. Estas mutaciones conducen a la acumulación

de la proteína p53 alterada en las células tumorales. Algunos pacientes,

mediante un mecanismo desconocido, desarrollan anticuerpos frente a la

proteína p53 alterada [435]. La prevalencia de anticuerpos anti-p53 en

pacientes con cáncer descrita en la bibliografía oscila entre un 3% y un 65% y

su presencia se ha relacionado con menor supervivencia [436-443], ya que

refleja la existencia de una mayor carga antigénica en estadíos más avanzados

de la enfermedad [444]. Estos anticuerpos podrían promover el desarrollo

tumoral, bloqueando la eliminación de la proteína p53 alterada por las células

presentadoras de antígeno mediante la formación de inmunocomplejos [445,

446] y mediante la inducción de la secreción de citocinas supresoras de la

respuesta inmunitaria citotóxica frente a la proteína p53 [447]. Son pocos los

estudios que hayan analizado la presencia de anticuerpos anti-p53 en

individuos con estadíos tumorales premalignos [448, 449]. En este sentido,

la presencia de anticuerpos anti-p53 puede preceder en meses e incluso años

al desarrollo de enfermedad maligna [450] y se puede detectar en lesiones

premalignas o en fumadores intensos con riesgo elevado de desarrollar cáncer

de pulmón [448].

Por otro lado, los anticuerpos anti-p53 se han descrito en varias

enfermedades autoinmunes, como el LES, enfermedad de Graves, esclerosis

283

DISCUSIÓN

sistémica, vasculitis o hepatitis autoinmune. Se ha sugerido que su presencia

podría estar relacionada con un mayor riesgo de malignidad, aunque no existe

ningún estudio que demuestre esta hipótesis [451].

En el presente estudio los anticuerpos anti-p53 se han detectado en un

elevado porcentaje de los pacientes con PAI, significativamente mayor que

en pacientes con pancreatitis crónica (19%) y cáncer de páncreas (15%). Estos

datos podrían estar indicando el potencial maligno de la enfermedad, puesto

que los anticuerpos anti-p53 se han asociado con mayor riesgo de cáncer [448-

450]. Adicionalmente se ha encontrado una correlación significativa entre la

presencia de anticuerpos anti-p53 y de afectación extrapancreática. En

consecuencia, la presencia mayoritaria de los anticuerpos anti-p53 en los

pacientes con lesiones extrapancreáticas, podría sugerir que la afectación

sistémica en la PAI se asociaría con un mayor riesgo de cáncer. Una posible

explicación sería que la afectación sistémica en la PAI viene dada por una

mayor actividad inflamatoria, que puede preceder y contribuir al desarrollo

tumoral mediante la inducción de mutaciones oncogénicas, inestabilidad

genómica, crecimiento tumoral y angiogénesis [452]. En contraste, los

anticuerpos anti-p53 se han detectado en una frecuencia mucho menor en

los pacientes con cáncer de páncreas, aunque similar a la descrita en la

bibliografía [435, 443]. Esta discrepancia podría deberse a que la PAI no sólo

se asociaría con el cáncer de páncreas sino también con otras malignidades,

como lo indican los casos clínicos descritos en la bibliografía (cáncer de

páncreas, colon, glándulas salivares ,gastrointestinal y LNH) [164, 370-374,

453-458].

284

DISCUSIÓN

Adicionalmente, los anticuerpos anti-p53 se detectaron en un 22% y 12% de

los pacientes con sospecha de PAI y PCI. Teniendo en cuenta que dentro de

ambos grupos podría haber pacientes con PAI, su significado clínico sería el

mismo.

5.9. Niveles séricos de IL-6 en la PAI

La interleucina 6 (IL-6) es una citocina proinflamatoria con efectos

pleiotrópicos, que regula la proliferación, diferenciación y activación de

numerosos tipos celulares. A nivel de células B, induce su diferenciación a

células plasmáticas secretoras de anticuerpos y la proliferación de las células

plasmáticas. Los niveles séricos de IL-6 aumentan hasta 100 veces en

condiciones inflamatorias, lo que se ha propuesto como un marcador temprano

y sensible, pero inespecífico, de reacciones inflamatorias. Adicionalmente la IL-

6 juega un papel importante en la patogénesis y desarrollo de malignidades. En

este sentido induce el crecimiento de las células tumorales mediante inhibición

de la apoptosis y estimulación de la angiogénesis [459]. Son numerosos los

estudios que sugieren que niveles de IL-6 en suero elevados se correlacionan

con estadíos tumorales más avanzados y con una tasa menor de supervivencia

[460-465]. También es conocido el papel de la IL-6 en la patogénesis de

linfomas de células B y de mielomas, ya que actúa como factor de crecimiento

autocrino y paracrino de las células B neoplásicas [466-470]. Además los

niveles séricos elevados de IL-6 se han relacionado con enfermedades más

activas o con peor pronóstico [471-472].

En el presente estudio, los niveles de IL-6 estuvieron significativamente más

elevados en los pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI que en controles

285

DISCUSIÓN

sanos. En cambio, no se encontraron diferencias significativas con los

pacientes con PC y PCI. En consecuencia, dado que la IL-6 se ha encontrado

aumentada, prácticamente por igual, en pacientes PAI, PC y cáncer de

páncreas, no parece que los niveles de IL-6 en la PAI constituyan un marcador

de malignidad, sino que estarían actuando como un marcador inespecífico de

los procesos inflamatorios que afectan al páncreas.

5.10. Cadenas ligeras libres en suero en la PAI

Las inmunoglobulinas están constituidas por dos cadenas pesadas y dos

cadenas ligeras idénticas entre sí. Existen dos tipos de cadenas ligeras, κ y λ,

de modo que cada molécula de anticuerpo tiene dos cadenas ligeras k o dos λ.

Durante el proceso de síntesis de las inmunoglobulinas, las células plasmáticas

producen exceso de cadenas ligeras con respecto a las cadenas pesadas, de

modo que se pueden detectar en el suero como cadenas ligeras libres (sFLC).

Una relación anormal entre cadenas ligeras libres k y λ en el suero (ratio

κ/λ sFLC) indica un exceso de una de las cadenas ligeras con respecto a la

otra y es interpretado como una expansión clonal de las células plasmáticas.

Las principales aplicaciones clínicas de la mediada de las sFLC son para

pacientes con gammapatías monoclonales (GM). En este sentido un ratio κ/λ

sFLC alterado constituye un fuerte indicador de la presencia de una GM. Las

GM resultan de una expansión clonal de células plasmáticas que secretan

típicamente una inmunoglobulina homogénea (monoclonal) llamada

paraproteína o proteína M, y que expresan un único tipo de cadena ligera

(restricción de cadena ligera). Bajo el término de GM se incluye un amplio

espectro de enfermedades que abarcan desde la GM de significado incierto

286

DISCUSIÓN

(MGUS), la más prevalente y con un pronóstico generalmente benigno, hasta

enfermedades con mayor potencial maligno, como el mieloma múltiple (MM), la

leucemia de células plasmáticas o la amiloidosis primaria entre otras (AL). En

los pacientes con MGUS, un ratio κ/λ sFLC alterado constituye un factor

pronóstico adverso para la transformación en malignidades de células B, como

el MM, linfomas de células B o LLC [473]

En otras malignidades de células B, como la leucemia linfocítica crónica

(LLC) o los linfomas no Hodgkin (LNH) se puede detectar la secreción de una

proteína M [474, 475]. En un estudio realizado en la Clínica Mayo, se ha

detectado ratios κ/λ sFLC alterados en una proporción importante de pacientes

con LLC y LNH. En este sentido, se ha sugerido que el ensayo de sFLC podría

ser útil en la monitorización de estos pacientes [476].

Adicionalmente se ha postulado que la presencia de un ratio κ/λ sFLC

alterado en pacientes asintomáticos podría constituir un marcador temprano de

la presencia de malignidades de células B [474, 476].

Un rasgo común de numerosas enfermedades autoinmunes es la presencia

de hipergammaglobulinemia policlonal, debida a la activación policlonal de las

células B y que se puede traducir en un incremento en los niveles de sFLC, con

ratios κ/λ sFLC normales. Varios autores han mostrado la existencia de una

relación entre los niveles de sFLC y la actividad de la enfermedad en pacientes

con SSp, LES, AR y DM [477-480]. Adicionalmente, en pacientes con AR se ha

observado un rápido descenso de los niveles sFLC con el tratamiento. Estos

datos sugieren que las sFLC podrían constituir un marcador temprano de la

actividad de la enfermedad y de la respuesta al tratamiento [479].

287

DISCUSIÓN

En el presente estudio, un porcentaje elevado de los pacientes con PAI al

diagnóstico presentaron niveles elevados de sFLC κ (36%) y de sFLC λ

(29%). De las dos cadenas ligeras libres (κ y λ), sólo los niveles de sFLC k

estuvieron significativamente correlacionados con los de IgG4. Adicionalmente,

sólo los niveles medios de sFLC k fueron significativamente mayores en

los pacientes con afectación extrapancreática que en aquellos sin afectación

extrapancreática. En este sentido, dado que tanto el aumento en suero de la

IgG4 como la presencia de lesiones extrapancreáticas se han asociado con

una enfermedad más activa, los niveles de sFLC k se pueden considerar un

marcador de la actividad de la enfermedad en los pacientes con PAI. Estos

resultados contrastan en cierto modo con los descritos en la bibliografía, ya

que mientras que en el SSp, LES, AR y Diabetes mellitus, tanto las sFLC k

como las λ se han correlacionado con la actividad de la enfermedad, en la PAI

sólo se ha encontrado correlación para las sFLC k. En consecuencia, las sFLC

k podrían considerarse un marcador más fuerte de la estimulación de las

células B durante el proceso autoinmune que las sFLC λ.

En el presente estudio, también se ha analizado la influencia a corto y a

largo plazo del tratamiento esteroideo sobre los niveles de sFLC κ y λ en los

pacientes con PAI. Dentro de los tres primeros meses del comienzo del

tratamiento esteroideo, se ha observado un descenso significativo de los

niveles de sFLC κ y λ con respecto a los niveles medidos al diagnóstico. Dado

que las sFLC κ se han correlacionado con la actividad de la enfermedad, el

rápido descenso de los niveles de sFLC κ indicaría una respuesta rápida al

tratamiento en los pacientes con PAI. En contraste, a largo plazo, se ha

288

DISCUSIÓN

observado un incremento de los niveles de sFLC κ y un ligero descenso de los

niveles de sFLC λ con respecto a los niveles medidos al diagnóstico. En este

sentido un mayor porcentaje de pacientes con PAI desarrollaron alteraciones

en las concentraciones de sFLC κ a largo plazo, mientras que el

porcentaje de pacientes con alteraciones en los niveles de sFLC λ a largo

plazo, fue el mismo que al diagnóstico. En consecuencia dado que las sFLC κ

se consideran marcadores de la actividad de la PAI, el incremento en sus

niveles podría constituir un reflejo de un reactivación de la enfermedad a largo

plazo, y por tanto, de un mal pronóstico.

De estos resultados se puede concluir que las sFLC κ podrían representar

un biomarcador relevante en la respuesta al tratamiento en los pacientes con

PAI, y que estarían indicando la eficacia del tratamiento esteroideo a corto pero

no a largo plazo en la PAI.

En los pacientes con sospecha de PAI se observaron menos alteraciones al

diagnóstico en los niveles de sFLC que en los pacientes con PAI, ya que las

sFLC κ estuvieron elevadas en un 22% de los pacientes, mientras que ninguno

de ellos presentó alteraciones en las sFLC λ. A largo plazo, se observaron más

alteraciones, ya que un 33% y un 11% de los pacientes presentaron las sFLC κ

y λ aumentadas, respectivamente. Sin embargo, dado que no se encontró una

correlación significativa entre los niveles de ambas y la actividad de la

enfermedad, no parece que estos resultados tengan ningún significado clínico.

En consecuencia, teniendo en cuenta que dentro de este grupo algunos

pacientes podrían tener PAI, es probable que el incremento en el tiempo de las

sFLC k y λ, venga dado por el subgrupo de pacientes con PAI.

289

DISCUSIÓN

En contraste, en los pacientes con PCI se observaron más alteraciones al

diagnóstico en los niveles de sFLC κ que en los pacientes con PAI, ya que las

sFLC κ y λ estuvieron elevadas en un 50% y un 19% de los pacientes,

respectivamente. A largo plazo, se mantuvo el porcentaje de pacientes con

estas alteraciones, a diferencia del incremento detectado en los pacientes con

PAI y PCI. Aunque se observó un incremento en el tiempo de los niveles

medios de sFLC k y λ. Como en este grupo tampoco se encontró una

correlación significativa entre los niveles de sFLC y la actividad de la

enfermedad, no parece que estos resultados tengan ningún significado clínico.

En consecuencia, al igual que en el grupo de sospecha de PAI, los pacientes

con PAI presentes en este grupo serían los responsables del incremento en el

tiempo de las sFLC k y λ.

Por último, se observaron alteraciones al diagnóstico en los ratios sFLC k/λ

en 3 de los 14 pacientes con PAI, de los cuales dos presentaron restricción κ y

uno restricción λ. A largo plazo, dos pacientes más desarrollaron alteraciones

en los ratios sFLC k/λ, uno de ellos con restricción κ y el otro con restricción λ.

Por tanto, un total de 5 pacientes con PAI (36%) presentarían una expansión

clonal de las células plasmáticas, tres al diagnóstico y dos a largo plazo. Estos

datos apoyarían la asociación de la PAI con los procesos linfoproliferativos de

célula B. Adicionalmente, se encontró una correlación significativa entre la

presencia de ratios sFLC k/λ alterados y de afectación extrapancreática. Es

posible que la afectación extrapancreática en la PAI esté relacionada con una

estimulación más intensa de las células B y en consecuencia, con un mayor

riesgo de desarrollo de neoplasias de células B.

290

DISCUSIÓN

En los pacientes con sospecha de PAI y PCI se observaron menos

alteraciones al diagnóstico en los ratios sFLC k/λ que en los pacientes con PAI.

En este sentido, tan solo un paciente con PCI presento sFLC monoclonales k,

mientras que 2 de los 16 pacientes con PCI presentaron ratios sFLC k/λ

alterados ,uno de ellos con restricción κ y otro con restricción λ. A largo plazo

ninguno de los pacientes con sospecha de PAI desarrolló alteraciones en los

ratios sFLC k/λ, mientras que 2 pacientes más con PCI presentaron sFLC

monoclonales, uno de ellos κ y otro λ. Por tanto, un total de 4 pacientes con

PCI (25%) presentarían una expansión clonal de las células plasmáticas, dos al

diagnóstico y dos a largo plazo. Estos resultados continúan apoyando la

hipótesis de la existencia de una forma de PAI atípica dentro del grupo de PCI,

que presentaría al igual que la PAI clásica un riesgo elevado de linfomagénesis

de células B.

5.11. Inmunoglobulinas monoclonales circulantes en la PAI

La existencia de inmunogloblinas monoclonales circulantes indica la presencia

de una población monoclonal de células B detectable, asociada en muchos

casos con neoplasias malignas de células B (MM o Linfomas B) o con sus

precursores potenciales (MGUS o pseudolinfoma). En algunas enfermedades

autoinmunes, principalmente en el SSp, se ha detectado inmunoglobulinas

monoclonales circulantes [386, 388, 481, 482]. En un estudio español, se

observaron inmunoglobulinas monoclonales circulantes en un 20% de los

pacientes con SSp y se relacionaron con lapresencia hipergammaglobulinemia,

crioglobulinemia y neoplasias hematológicas [386]. En este sentido, se ha

sugerido que la presencia de inmunoglobulinas monoclonales circulantes

291

DISCUSIÓN

podría preceder al desarrollo de enfermedades linfoproliferativas de células B

[386, 482]. En el presente estudio, se han detectado inmunoglobulinas

monoclonales circulantes en una en un 21% de los pacientes con PAI (3 de

14), por tanto, en una proporción muy similar a la descrita en el SSp (20%).

Adicionalmente su presencia se ha correlacionado con la existencia de

afectación extrapancreática. En conclusión, al igual que los ratios sFLC k/λ

alterados, la presencia de inmunoglobulinas circulantes en la PAI podría

constituir un marcador temprano de desarrollo de neoplasias de células B,

principalmente en los pacientes con afectación extrapancreática, ya que la

afectación sistémica en la PAI implica una mayor actividad de la enfermedad.

En contraste, tan sólo uno de los 9 pacientes con sospecha de PAI (11%) y

ninguno de los pacientes con PCI presentó inmunoglobulinas monoclonales

circulantes. En consecuencia, el riesgo de desarrollo de enfermedades

linfoproliferativas de células B es mayor en los pacientes con PAI que en los

pacientes con sospecha de PAI y PCI.

5.12. Clonalidad de células B en infiltrados linfop lasmocíticos en la PAI

La clonalidad de células B y células T en infiltrados linfoplasmocíticos se ha

descrito en varias enfermedades autoinmunes, principalmente en el SSp [483-

6]. El marcador histológico característico del SSp, llamado sialadenitis

mioepitelial (MESA), consiste en la presencia de infiltrados glandulares

compuestos por linfocitos T CD4+, linfocitos B y células plasmáticas [394]. Se

ha postulado que el riesgo elevado de desarrollo de linfoma maligno en el

SSp[292, 293], sería consecuencia de la estimulación crónica exógena o

endógena en la MESA que conduciría a la progresión gradual de policlonal a

292

DISCUSIÓN

monoclonal en glándulas salivares y lacrimales [383-385]. Similarmente, el

marcador histológico de la PAI es la densa infiltración tanto de páncreas como

de tejidos extrapancreáticos afectados por células inflamatorias, principalmente

linfocitos T CD4+, linfocitos B y células plasmáticas. En consecuencia la

presencia de clonalidad en estos tejidos podría indicar, al igual que en el SSp,

un riesgo incrementado de linfomagénesis. En este sentido, Esposito et al [374]

han observado la presencia de oligoclonalidad del TCRγ en un pseudotumor

inflamatorio de un paciente con PAI, mientras que Kojima et al [44] han

descrito un patrón policlonal a nivel de las células B y T en las áreas

periductales de pacientes con PAI.

En el presente estudio, dos de los 9 pacientes con PAI (22%) presentaron

reordenamientos monoclonales, a nivel de las glándulas salivares, y a nivel de

la papila duodenal. Adicionalmente, de los 2 pacientes con PCI evaluados, en

uno se detectó un reordenamiento biclonal a nivel del estómago, mientras que

ninguno de los 3 pacientes con sospecha de PAI presentó reordenamientos

policlonales en las muestras analizadas. En conclusión, la presencia de

reordenamientos clonales en los órganos afectados en la PAI podría constituir

un marcador temprano de desarrollo de linfomas localizados, como

consecuencia de la estimulación persistente de las células B autorreactivas y la

inflamación crónica en los órganos diana. Esta hipótesis se apoya en el

diagnóstico anatomopatológico de inflamación crónica de la papila duodenal en

uno de los pacientes con PAI y de gastritis crónica en el paciente con PCI, en

contraste la ausencia de alteraciones de las glándulas salivares del otro

293

DISCUSIÓN

paciente con PAI podría ser un reflejo de la distribución parcheada de las

lesiones inflamatorias en la PAI. En este sentido se ha descrito el

desarrollo de un linfoma MALT de la zona marginal en la glándula

submandibular de un paciente con siladenitis esclerosante cónica [371], de

LNH ocular adnexal en 3 pacientes con dacrioadenitis esclerosante crónica

asociada a IgG4 ( dos de ellos linfomas de tipo marginal extranodal del MALT

y uno linfoma folicular de alto grado), de LNH en 3 pacientes con ISD (dos

de glandulas salivares y otro extranodal) y de LNH de tipo linfocítico de células

pequeñas afectando a nódulos linfoides mesentéricos un paciente con ISD.

5.13. Analisis mutacional de K-ras en lo órganos af ectados en la PAI

La PAI fue definida inicialmente como una forma de pancreatitis crónica que

revertía con la terapia esteroidea [487]. Sin embargo cada vez se encuentran

más casos en la bibliografía de desarrollo de cáncer de páncreas en pacientes

con PAI, de forma simultánea o durante el curso de la enfermedad [397-399].

En este sentido en nuestra serie de pacientes con PAI, 4 de 14 han

desarrollado cáncer de páncreas.

Las mutaciones del oncogén K-ras se han descrito en más de un 90% de los

adenocarcinomas de páncreas [400, 401], 40% de los cánceres de la papila

duodenal [488, 489], 8% de los cánceres de la mucosa gástrica [490] 32-44%

de los cánceres de cólon [491, 492], 20-100% cánceres de conductos biliares

[493] y en un 38-55% de los cánceres de vesícula biliar [494, 495].

Adicionalmente las mutaciones de K-ras se pueden detectar en la mucosa

hiperplásica del páncreas, colón y estómago en condiciones de inflamación

crónica como estadíos tempranos de carcinogénesis [492, 496-499]. En los

294

DISCUSIÓN

pacientes con PAI, Kamisawa et al han encontrado un aumento significativo de

las mutaciones de K-ras en las región pancreatobiliar y en el tracto

gastrointestinal, asociado con la presencia de lesiones fibroinflamatorias,

sugiriendo que la PAI podría constituir un factor de riesgo de desarrollo de

cáncer pancreatobiliar y gastrointestinal [500, 501].

En el presente estudio, 2 de los 6 pacientes con PAI, presentaron

mutaciones en k-ras a nivel de páncreas. Uno de ellos, a pesar de la presencia

de mutaciones en k-ras en la muestra de páncreas tomada al diagnóstico, tras

cuatro años de seguimiento de la enfermedad desde el diagnóstico hasta el

momento actual, no ha desarrollado ninguna neoplasia maligna ni en páncreas

ni en ningún tejido extrapancreático. Cabe destacar la presencia de niveles

séricos de IgG4 siempre dentro de los rangos normales, la ausencia de

afectación extrapancreática y de tratamiento esteroideo en este paciente. En el

otro paciente, el estudio de K-ras fue negativo en la biopsia pancreática al

diagnóstico, sin embargo fue positivo en la muestra de páncreas tomada 6

meses después del comienzo del tratamiento esteroideo. Cabe destacar la

presencia de niveles séricos de IgG4 extremadamente elevados al diagnóstico,

de 4500 mg/dl, la presencia de afectación extrapancreática y la instauración del

tratamiento esteroideo inmediatamente después del diagnóstico de la PAI, que

condujo a remisión clínica, serológica y radiológica al cabo de un mes. Sin

embargo tras 6 meses de tratamiento, el paciente desarrolló colangitis y las

biopsias a nivel de páncreas y de vesícula biliar demostraron la existencia de

adenocarcinoma en ambos tejidos. En consecuencia las mutaciones en k-ras

por sí sólas no incrementan el riesgo de cáncer, como se ha podido observar

295

DISCUSIÓN

en el primero de los pacientes, sino que sería necesarios otros factores

desencadenantes como serían la presencia de niveles elevados de IgG4 y de

afectación extrapancreática, que indicaría una enfermedad más activa y por

tanto mayor inflamación. Adicionalmente parece que en los pacientes con PAI y

afectación extrapancreática, el tratamiento esteroideo a pesar de conducir a

una mejoría aparente de la enfermedad, no evita el desarrollo de malignidades,

probablemente porque no consigue eliminar las células B autorreactivas

productoras de IgG4.

Similarmente, uno de los tres pacientes con sospecha de PAI y uno de los

dos pacientes con PCI, presentaron mutaciones de K-ras en muestras al

diagnóstico de páncreas y de vesícula biliar, respectivamente. Sin embargo,

ninguno de ellos, tras 12 y 10 años de seguimiento desde el diagnóstico hasta

el momento actual, respectivamente; han desarrollado ninguna neoplasia

maligna ni en páncreas ni en ningún tejido extrapancreático. Cabe destacar la

presencia de niveles normales de IgG4, la ausencia de afectación

extrapancreática y de tratamiento esteroideo en ambos pacientes. En

consecuencia, estas observaciones apoyan la hipótesis anterior; ya que parece

que en pacientes sin afectación extrapancreática, las lesiones, a pesar de la

presencia mutaciones en K-ras, no evolucionan a malignidad.

5.14. Analisis global del riesgo de malignidad en l a PAI

En nuestra serie de pacientes con PAI se ha observado un riesgo

incrementado de desarrollo de enfermedades linfoproliferativas de células B,

demostrado por la presencia de ratios k/λ sFLC y k/λ CMF alterados, bandas

monoclonales por IFE, y de reordenamientos clonales IgH en los linfocitos B

296

DISCUSIÓN

presentes en los infiltrados linfoplamocíticos; y de adenocarcinoma de

páncreas y probablemente gastrointestinal y biliar demostrado por la presencia

de cáncer de páncreas y de mutaciones de K-ras. Adicionalmente, la elevada

frecuencia de anticuerpos anti-p53 podría estar indicando el potencial maligno

de la enfermedad. Globalmente, un 71% de los pacientes con PAI presentaría

un riesgo incrementado de malignidad, un 50% de desarrollo de malignidades

de células B y un 29% de adenocarcinoma pancreatobiliar y gastrointestinal.

Cabe destacar la existencia de un mayor riesgo de malignidad en el grupo de

pacientes con afectación extrapancreática que en aquellos sin afectación

extrapancreática (88% vs 50%), tanto de malignidades de células B (63% vs

33%) como de adenocarcinoma pancreatobiliar y gastrointestinal (38% vs 17%)

(Tabla 55). En los pacientes con sospecha de PAI (Tabla 56), el riesgo global

de malignidad, de malignidades de células B de adenocarcinoma

pancreatobiliar y gastrointestinal fue menor, de un 33%, 22% y 11%,

respectivamente; mientras que en los pacientes con PCI (Tabla 57) se encontró

un riesgo de malignidad intermedio entre la PAI y la sospecha de PAI, de un

50%, 50% y 7% respectivamente. En consecuencia dentro de los pacientes con

PCI existiría un subgrupo con una forma de PAI atípica que se asociaría con un

riesgo elevado de malignidad.

297


TABLA 55 . Riesgo de malignidad en la PAI

Px Sexo Edad AEP Ratio k/ λ CMF

Ratio k/ λ SFLC IFE+ Reordenamientos

IgH/ órgano p53+

Mutaciones K-Ras

/Cáncer P (órgano)

1 M 67 SI Normal Clonal k NO Policlonal/ páncreas SI NO /NO

(pancreas)

2 M 71 SI Normal Clonal λ Banda IgA-λ

Policlonal /páncreas y GC SI NO /NO

(pancreas )

3 M 76 SI Normal Normal Banda IgM-κ

Policlonal /próstata SI SD/NO

4 M 73 SI Normal Normal NO Policlonal/ próstata SI SD/NO

5 F 77 SI SD Clonal k NO SD SI SD/NO

6 M 66 SI SD Normal NO Policlonal/VB SI SD/SI

7 M 37 SI SD Normal NO Policlonal/ hígado SI SD/SI

8 M 78 SI Normal Clonal k Banda IgG-κ

Monoclonal/ papila duodenal

SI SI/SI (páncreas)

9 M 58 NO Normal Normal NO Policlonal/ páncreas NO SD/NO

10 F 76 NO Normal Normal NO Policlonal/VB

Monoclonal/GS SI

NO/NO (páncreas y

VB)

11 M 52 NO SD Normal NO SD SI SD/NO

12 M 30 NO Normal Clonal λ NO Policlonal/ páncreas SI NO /NO

(páncreas)

13 M 50 NO Normal Normal NO SD NO SD/NO

14 M 16 NO Normal Normal NO Policlonal/ páncreas NO SI/NO

(páncreas)

AEP: Afectación extrapancreática. p53+: Anticuerpos anti-p53 positivos. Cáncer P: Cáncer de páncreas.

Px: Paciente. M:Masculino. F: Femenino. SD: Sin datos. GC: Ganglio cístico. VB: Vesícula biliar.

GS: Glándulas salivares.

298


TABLA 56 . Riesgo de malignidad en pacientes con sospecha de PAI



IgH/ órgano p53+

Mutaciones K-Ras


1 M 45 SI SD NO NO SD SI SD

2 F 75 NO NO NO NO SD NO SD/NO

3 F 39 NO SD NO NO SD NO SD/NO

4 F 59 NO SD NO NO SD NO SD/NO

5 M 43 NO SD NO NO Policlonal/ VB NO NO /NO (VB)

6 M 37 NO SD NO NO SD NO SD

7 F 82 NO NO NO NO Policlonal/ papila duodenal NO NO/NO (papila

duodenal)

8 M 84 NO Clonal λ NO NO SD SI SD

9 M 51 NO NO Clonal κ Banda IgA-κ

Policlonal/ páncreas y MO NO SI/NO

(pancreas)


Px: Paciente. M:Masculino. F: Femenino. SD: Sin datos. VB: Vesícula biliar. MO: Medula ósea.

299


TABLA 57 . Riesgo de malignidad en la PCI



IgH/ órgano p53+

Mutaciones K-Ras


1 M 64 SI Clonal λ Clonal k NO SD NO NO /NO (pancreas)

2 M 78 SI SD Normal SD SD NO NO /NO (pancreas )

3 M 72 NO SD Normal NO Policlonal /VB NO SD/NO

4 M 59 NO NO Normal NO SD SD NO/NO (páncreas)

5 M 64 NO NO Normal NO Biclonal/ estómago

SI SI/NO (VB)

6 M 78 NO Clonal λ Normal NO SD NO SD/NO

7 M 75 NO SD Clonal k NO SD NO SD/NO

8 M 50 NO SD Normal NO SD NO SD/NO

9 F 83 NO Clonal λ Normal NO SD NO SD/NO

10 M 77 NO Clonal λ Normal NO SD NO SD/NO


12 M 34 NO Normal Clonal λ NO SD NO SD/NO

13 F 39 NO Normal Normal NO SD NO SD/NO



16 M 31 NO Normal Clonal λ NO SD SD SD/NO


Px: Paciente. M:Masculino. F: Femenino. SD: Sin datos. GC: Ganglio cístico. VB: Vesícula biliar.

GS: Glándulas salivares.

En conclusión en el presente estudio se demuestra la existencia de una

conexión entre la PAI, la linfomagénesis y el desarrollo de tumores sólidos de

origen epitelial (Figura 68).

300


Figura 68. Posible modelo de desarrollo de malignidad en la PAI. AEP: Afectación Extrapancreática. Ab anti-p53: anticuerpos anti-p53.

Proteínas monoclonales en suero

Ab anti-p53

Ratios k/λ alterados

PPAANNCCRREEAATTIITTIISS AAUUTTOOIINNMMUUNNEE

AADDEENNOOCCAARRCCIINNOOMMAA NNEEOOPPLLAASSIIAASS CCÉÉLLUULLAASS BB

↑ IgG4 + plasma cells

↑ IgG4 suero

Mutaciones K-ras

↑ IgG4 suero

AEP Reordenamientos Clonales

301

CCOONNCCLLUUSSIIOONNEESS

66666666........ CCCCCCCCOOOOOOOONNNNNNNNCCCCCCCCLLLLLLLLUUUUUUUUSSSSSSSSIIIIIIIIOOOOOOOONNNNNNNNEEEEEEEESSSSSSSS

302

303


1. La combinación de los niveles séricos elevados de IgG4, los anticuerpos

anti-AC II y los anticuerpos anti-AMY α constituye una herramienta útil

para realizar el diagnóstico diferencial entre la PAI y otras enfermedades

pancreáticas, principalmente el cáncer de páncreas. Adicionalmente, la

coexistencia de niveles séricos de IgG4 persistentemente elevados con

los anticuerpos anti-AC II y AMY α en pacientes con PAI podría constituir

un factor de riesgo para el desarrollo de cáncer de páncreas.

2. Cada laboratorio debe de establecer su propio valor de punto de corte

óptimo para los niveles séricos elevados de IgG (1496 mg/dl en nuestro

grupo), mientras que para los niveles séricos elevados de IgG4 se

podría emplear el aceptado por la mayoría de los grupos, de 135 mg/dl,

en el diagnóstico de la PAI.

3. Los pacientes con niveles séricos de IgG4 superiores a 190 mg/dl son

más propensos a presentar afectación extrapancreática y en mayor

grado y, por tanto, una enfermedad más activa.

4. En nuestra serie de pacientes con PAI, el síntoma de presentación

más común fue el dolor abdominal, seguido de la ictericia obstructiva

sin dolor y de la forma asintomática.

5. La elevación del CA 19.9 en los pacientes con PAI en unos casos

sería consecuencia de la coexistencia de la enfermedad con un

fenómeno tumoral y en otros de su papel patogénico en el proceso

inflamatorio de la PAI, aunque no se ha podido demostrar su relación

con la actividad de la enfermedad. Los anticuerpos anti-CA 19.9 tienen

tienen una escasa utilidad en el diagnóstico diferencial de la PAI con

304


otras enfermedades pancreáticas debido a su baja sensibilidad y

especificidad.

6. En los pacientes con PAI las principales alteraciones en la distribución

de las subpoblaciones linfocitarias consistieron, en un descenso de

linfocitos B y en un incremento de células Nk. El incremento de células

Nk podría estar implicado en la progresión de la enfermedad.

7. El incremento de células B memoria dobles negativas y plamáticas, y

el descenso de células B naive en los pacientes con PAI podría estar

implicado en la progresión de la enfermedad, ya que fue

significativamente mayor en los pacientes con afectación

extrapancreática.

8. La presencia de anticuerpos anti-p53 en un elevado porcentaje de los

pacientes con PAI podría indicar el potencial maligno de la enfermedad.

Adionalmente, la presencia mayoritaria de los anticuerpos anti-p53 en

los pacientes con lesiones extrapancreáticas, indicaría que la afectación

sistémica en la PAI se asociaría con un mayor riesgo de cáncer.

9. La elevación de los niveles de IL-6 en la PAI constituye

un marcador inespecífico de los procesos inflamatorios que afectan al

páncreas.

10. Los niveles de sFLC k se pueden considerar un marcador de la actividad

de la enfermedad en los pacientes con PAI. Adicionalmente, las sFLC κ

podrían representar un biomarcador relevante de la respuesta al

tratamiento en los pacientes con PAI a corto plazo y del pronóstico de la

enfermedad a largo plazo.

305


11. La PAI supone un factor de riesgo de desarrollo de procesos

linfoproliferativos de células B y dicho riesgo se incrementa en caso de

presencia de afectación sistémica, dado la elevada frecuencia de ratios

k/λ sFLC alterados y de presencia de inmunoglobluinas monoclonales

circulantes.

12. La presencia de reordenamientos clonales en los órganos afectados en

la PAI podría constituir un marcador temprano de desarrollo de linfomas

localizados.

13. La presencia de mutaciones en K-ras en las lesiones pancreáticas y

extrapancreáticas en los pacientes con PAI pos sí sólas no incrementan

el riesgo de cáncer, sino que sería necesarios otros factores

desencadenantes como serían la presencia de niveles elevados de IgG4

y de afectación extrapancreática.

14. En los pacientes con PAI y afectación extrapancreática el tratamiento

esteroideo a pesar de conducir a una mejoría aparente de la enfermedad,

no evita el desarrollo de malignidades, probablemente porque no

consigue eliminar las células B autorreactivas productoras de IgG4.

15. La presencia de alteraciones similares a las descritas en la PAI en un

subgrupo de pacientes con PCI, indicaría la presencia de una forma

oculta de la PAI, es decir, una forma de presentación atípica que no se

ajustaría por completo a los criterios diagnósticos actuales de la PAI. Es

posible que en esta forma de presentación atípica tanto la inflamación

crónica como la activación persistente de células B autorreactivas, se

306


perpetuarían en el tiempo y podrían conducir a la proliferación clonal de

las células B.

307

BBIIBBLLIIOOGGRRAAFFÍÍAA

77777777........ BBBBBBBBIIIIIIIIBBBBBBBBLLLLLLLLIIIIIIIIOOOOOOOOGGGGGGGGRRRRRRRRAAAAAAAAFFFFFFFFÍÍÍÍÍÍÍÍAAAAAAAA

308

309

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