INSTITUTO TECNOLGICO DEL VALLE DEL GUADIANA

Propagacin In Vitro de la Planta (Cactcea) Mammillaria haageana ssp san angelensis con diferentes RCV a distintas concentraciones LICENCIATURA EN BIOLOGIA

Presenta: Oscar Ivn Garbalena Guerrero Christian Manuel Snchez Macas Jos Guadalupe Duran Manqueros Nancy Guadalupe Rodrguez Tern Catedratico: Licenciado en Biologia Ariel Pulgarin Ros

Villa Montemorelos, Dgo. 13 de Abril del 2012

INDICE

Introduccin ------------------------------------------------------ 1 Planteamiento del Problema --------------------------------- 2 Pregunta de Investigacin------------------------------------- 2 Justificacin------------------------------------------------------- 2 Objetivo General------------------------------------------------ 2 Objetivo Especifico--------------------------------------------- 2 Hiptesis---------------------------------------------------------- 3 Antecedentes---------------------------------------------------- 3 - 8 Materiales y Mtodos o Metodologa---------------------- 9 - 15 Diseo Experimental y Tratamientos---------------------- 16 Referencias Bibliogrficas------------------------------------ 16 - 17 Recursos---------------------------------------------------------- 18 Anexos------------------------------------------------------------- 19 - 25

INDIC DE TABLAS Y FIGURAS Figura 3: Ejemplo de micropropagacion de cactceas. -------------- 8 Tabla 1: concentraciones de reguladores de crecimiento para induccin de brotes. -------------------------------------------------------------14 Tabla 2: concentraciones utilizadas en la evaluacin de cido indolactico (AIA) y cido Indolbutrico (AIB) para la induccin de formacin de raz en brotes de Mammillaria haageana ssp san angelensis generados in vitro. ---------------------------------------------- 15

IntroduccionLa micropropagacin es una tcnica, desarrollada para la produccin en masa de plantas, que ha sido utilizada con xito desde los aos 60. La principal ventaja de esta tcnica estriba en la multiplicacin rpida de material clonal libre de enfermedades. Esta caracterstica ha servido para introducir rpidamente en el mercado nuevas variedades de plantas obtenidas mediante seleccin, mutacin, programas de mejora o manipulacin gentica. Sin embargo, la industria de la micropropagacin presenta serias limitaciones debido a los elevados costes de produccin, reducindose la mayor parte de su actividad al sector de plantas ornamentales (Holdgate y Zandvoort, 1992). En la mayor parte de los procedimientos empleados actualmente no se hace referencia al control efectivo del desarrollo de las plantas in vitro. Sin embargo, las tasas de crecimiento, desarrollo y muchas de las caractersticas fisiolgicas y morfolgicas de las plantas formadas in vitro estn influenciadas por el ambiente fsico, qumico y gaseoso de los recipientes (Kozai et al., 1992a; BuddenfordJoosten y Woltering, 1994). Por tanto el estudio y control del ambiente de los cultivos tambin incidir positivamamente en la optimizacin de los procedimientos de micropropagacin.

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Planteamiento del problemaHoy en da la sobreexplotacin de los suelos donde encontramos especies de cactceas como lo es en este caso la Mammillaria haageana ssp San angelensis, ha puesto en riesgo su existencia a tal grado de llevarla a peligro de extincin; por ello encontramos la necesidad de ver alternativas para poder propagar esta especie endmica de Mxico DF y as evitar la extincin de la misma. De ah nos damos a la tarea de propagar esta especie de forma In Vitro.

Pregunta de investigacinCules sern los reguladores de control vegetal ms adecuados y en que concentraciones sern ms eficientes para la Propagacin In Vitro de la Planta (Cactcea) Mammillaria haageana ssp san angelensis?

JustificacinEste proyecto se hace con la finalidad de propagar la Planta (Cactcea) Mammillaria haageana ssp san angelensis para evitar la extincin y conocer con que RCV y cules son las concentraciones ms adecuadas para un mayor rendimiento.

Objetivo generalPropagacin In Vitro de la Planta (Cactcea) Mammillaria haageana ssp san angelensis.

Objetivo especificoIdentificar cual RCV y en que concentracin es el ms optimo.

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HiptesisHo = Los RCV BAP con una concentracin de 1mg y ANA con una concentracin 0.01 mg tienen un mayor ndice de reproduccin. HI= Los reguladores de crecimiento vegetal BAP y ANA no son los ms eficientes.

AntecedentesEn algunas cactceas del Desierto de Sonora, la raz primaria tiene crecimiento determinado: las clulas del meristemo apical de la raz pasan solamente por unos pocos ciclos celulares y despus se diferencian (Dubrovsky, 1997). La Familia Cactaceae, endmica del continente Americano est bien representada en la regin semirida del oriente del pas. Dentro de esta Familia existe una gran diversidad de acuerdo a la forma, hbito y tamao de sus tallos; los hay de gran porte arbreo, como Stenocereus eichlamii Britt. & Rose, Myrtillocactus eichlamii Britt. & Rose, Pereskiaau tumnalis (Eichlam) Rose, Contr. Y Pilosocereus leucocephalus Byles & Rowley, arbustivos como Opuntia Miller y Acanthocereus tetragonus (L.) Hummeliack y otros ms pequeos que apenas se distinguen de estrato herbceo, como, Mammillaria v oburnensis Scheer., Peniocereus hischtianus (Schum.) Britt. & Rose. Y Melocactus curvispinus Peiffer. Los trepadores como Hylocereus undatus (Haworth) Britt. & Rose. y los epfitos, que viven sobre rboles sin llegar a ser parsitos, como Epiphyllum biformis Lindl. Y Rhipsalis baccifera (Mill.) Stearn. Los cactus, como comnmente se les conoce, han desarrollado adaptaciones anatmicas y fisiolgicas asombrosas que les permiten enfrentar las condiciones climticas de esta regin, entre las cuales estn tallos gruesos y carnosos, hojas que la evolucin transform en espinas, su estructura crasa, areolas, espinacin diversa y un metabolismo de tipo cido crasulceo (CAM). Sin embargo, estas particulares plantas, de las cuales hay mucho por estudiar, se han visto seriamente amenazadas por la destruccin de su hbitat natural, la depredacin y el comercio ilegal que se ha producido, debido a su belleza como plantas ornamentales, colocndolas en riesgo de extincin si no se hace un alto y se ejecutan acciones de conservacin. El responsable de tal alteracin y destruccin, el ser humano, tambin posee las herramientas para el rescate y preservacin de estas especies en peligro de desaparecer. La Biotecnologa vegetal, con el cultivo in vitro, constituye una alternativa eficaz para este fin, ya que la micropropagacin tiene como principio la totipotencialidad de las clulas vegetales, donde a partir de Pgina 3

una porcin de tejido (explante) mantenido bajo condiciones fsicas y qumicas controladas puede originarse una nueva planta. Sin embargo, es necesario la accin balanceada de reguladores del crecimiento para estimular o modificar la respuesta morfogentica del tejido (Ordez, 1999). Los miembros de la Familia Cactaceae, comnmente se conocen como cactus; son nativos del continente Americano y se encuentran desde Canad hasta el sur de Argentina., desde el litoral hasta los 4000 metros de altura (Rha, 1991). Las cactceas habitan en lugares ridos y semirido del continente americano, sin embargo tambin se encuentran en zonas tropicales hmedas. En las regiones desrticas, semidesrticas, a veces cubiertas de bosques secos, chaparrales o matorrales espinosos de Amrica del Norte y de Centroamrica se encuentran la mayor variedad de cactus, los cuales llegan a dominar las asociaciones vegetales y determinar el paisaje (Rha,1991). Hay numerosas especies y variedades de las cuales algunas estn localizadas en pequeas reas, mientras otras se distribuyen en regiones ms bastas. En las regiones intertropicales y templadas de Amrica existen aproximadamente ms de 1500 especies (Paniagua, 1980). Morfologa Las cactceas han sufrido varias modificaciones para poder adaptarse y sobrevivir al ambiente al que estn expuestas. Adaptaciones morfolgicas y fisiolgicas que les permiten acumular agua durante los meses de sequa y al mismo tiempo evitar la evapotranspiracin (Bravo, 1995). Poseen estructuras especializadas debido al medio desrtico en el que crecen, adaptaciones para trepar en el caso de especies en las selvas tropicales hmedas y por el tipo de polinizacin tambin experimentan cambios. En la evolucin de sus estructuras han actuado diferentes tendencias morfolgicas como: fusin de partes de un rgano, reduccin del tallo, modificaciones de las hojas y cambio de simetra de las flores, tendencias que en conjunto han llevado a establecer posibles lneas filogenticas (Bravo, 1978). Las races de los cactus son originalmente terminales y fuertes. Las races de la planta le sirven para extraer agua y nutrientes, as como para fijarse al suelo. La raz principal de forma cnica se halla muy ramificada dando lugar a un sistema radicular esparcido. Las races principales penetran la tierra para fijacin mientras las secundarias se extienden horizontalmente cerca de la superficie y tienen como principal funcin la absorcin (Ballester, 1978; Paniagua, 1980; Bravo, 1995). Desde hace varias dcadas se han desarrollado estrategias para la propagacin de especies de cactceas en peligro de extincin, endmicas o raras, una de ellas es la micropropagacin in vitro por cultivo de tejidos (Starling&Dodds 1983; OrtizPgina 4

Montiel & Alcntara-Garca 1987; Martnez &Rubluo 1989; Hustenberger et al. 1992; Rubluo et al.1993). Esta tcnica permite la produccin de muchos organismos genticamente idnticos a partir de una pequea porcin de tejido asptico proveniente de un solo individuo, sin embargo, este mtodo presenta algunos problemas durante su aplicacin ya que un alto porcentaje de las plantas de algunas especies no sobreviven al ser transferidas a condiciones de invernadero o campo Pospilov et al. 1999). La micropropagacin consiste en la propagacin de un genotipo a gran escala a travs del empleo de tcnicas de cultivo de tejidos. El cultivo es as una herramienta muy til en los programas de mejoramiento, ya que tiene el potencial de producir plantas de calidad uniforme a escala comercial, a partir de un genotipo selecto y con una tasa de multiplicacin ilimitada. Esto es posible gracias a la propiedad de totipotencia que tienen las clulas vegetales; esto es la capacidad de regenerar una planta completa cuando estn sujetas a los estmulos adecuados. As, las clulas somticas de cualquier tejido podran formar tallos, races o embriones somticos de acuerdo con la competencia que posean y al estmulo que reciban. Esta regeneracin ocurre en fases consecutivas: la fase de desdiferenciacin, donde las clulas se vuelven competentes para responder ante cualquier estmulo organognico o embriognico; la fase de induccin, donde las clulas se determinan para formar un rgano o embrin, y la fase de realizacin, donde se forma el rgano o embrin propiamente dicho. Estas fases estn directamente afectadas por el balance hormonal del medio de cultivo, por lo cual la optimizacin de los protocolos de regeneracin debe realizarse teniendo en cuenta los requerimientos intrnsecos de cada genotipo en cada fase del cultivo. As, en general, puede decirse que el proceso de desdiferenciacin generalmente es promovido por una auxina, la fase de induccin por un balance hormonal especfico del rgano o embrin a formarse y la fase de realizacin, por una disminucin de la concentracin hormonal en el medio de cultivo. 2 Etapas de la micropropagacin La regeneracin de plantas in vitro presenta cuatro etapas principales: 1) Establecimiento del cultivo, 2) desarrollo y multiplicacin de vstagos, 3) enraizamiento y 4) aclimatacin de las plntulas. Generalmente, las etapas de enraizamiento y aclimatacin pueden combinarse en condiciones ex vitro. En algunos casos tiene importancia considerar una etapa previa (Etapa 0), que es la etapa de preparacin de los explantos para el establecimiento.

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Etapa 0: Preparacin del material vegetal El empleo de explantos que se encuentran expuestos a bajos niveles de patgenos puede resolver el problema de la contaminacin por hongos y bacterias durante el establecimiento del cultivo in vitro. Los factores que influyen sobre la calidad del explanto son: 1) El tipo de rgano que sirve como explanto, 2) la edad ontognica y fisiolgica del mismo, 3) la estacin en la cual se colecta el material vegetal, 4) el tamao y 5) el estado sanitario general de la planta donante. La planta donante debe elegirse sobre la base de una seleccin masal positiva para las caractersticas agronmicas deseables. Una vez seleccionados los individuos, es preciso definir el tipo de explanto a establecer en condiciones in vitro. En general, los rganos jvenes o bien rejuvenecidos son los que tienen mejor respuesta en el establecimiento que los obtenidos a partir de materiales adultos. Se recomienda colectar explantos primarios a campo durante la estacin primaveral y estival, cuando existe una brotacin activa de las yemas, ya que el empleo de yemas en estado de dormicin ocasiona serios problemas de contaminacin. A fin de lograr explantos de ptima calidad es conveniente hacer crecer las plantas donantes por un tiempo mnimo en condiciones de invernculo. De esta forma es posible incidir directamente sobre el estado sanitario y la calidad de los explantos mediante el control de la intensidad lumnica, temperatura y reguladores de crecimiento. Para especies ornamentales tropicales y subtropicales se recomienda mantener las plantas donantes en condiciones de alta temperatura (25C) y baja humedad relativa (75%), a fin de reducir la proliferacin de patgenos.Etapa 1: Establecimiento del cultivo El objetivo de esta etapa es establecer cultivos viables y axnicos. El xito est determinado por la edad de la planta donante, la edad fisiolgica, el estado de desarrollo y el tamao del explanto. En esta etapa los principales procesos a controlar son la seleccin, el aislamiento y la esterilizacin de los explantos. Etapa 2: Multiplicacin El objetivo de esta etapa es mantener y aumentar la cantidad de brotes para los nuevos ciclos de multiplicacin sucesivos y poder destinar parte de ellos a la siguiente etapa de produccin (enraizamiento, bulbificacin, etc.). Es importante sealar que en esta etapa, cualquiera que sea la va de regeneracin empleada, es conveniente evitar la formacin de callo para disminuir el riesgo de variacin somaclonal. En esta etapa, los medios de cultivo, los reguladores de crecimiento como auxinas, citocininas y cido giberlico y las condiciones de crecimiento juegan un papel crtico sobre la multiplicacin clonal de los explantos.

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Etapa 3: Enraizamiento y aclimatacin En esta etapa se produce la formacin de races adventicias. En las especies herbceas es relativamente fcil mientras que en las especies leosas es complicado por su limitada capacidad rizognica. El enraizamiento puede realizarse tanto en condiciones in vitro como ex vitro. En el primer caso pueden emplearse varios tipos de sustratos y reguladores de crecimiento (auxinas) para promover la rizognesis. Los sustratos incluyen: medio solidificado con agar, perlita y/o vermiculita humedecidas con medio nutritivo o agua.

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(Fig. 3 http://tesiuami.izt.uam.mx/uam/aspuam/presentatesis.php?recno=11789&doc s=UAMI11789.pdf, 2012).

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Materiales Mtodos o Metodologa250 Semillas de la Planta (Cactcea) Mammillaria haageana ssp san angelensis 50 Frascos para preparar medio de cultivo MS (Murashige y Skoog) (1962) lminas de polipropileno de 10x10 cms elsticos pinzas largas vasos precipitados placas petri bolsas papel kraft frascos de colados Agar Phytagel Nitrato de amonio Nitrato de potasio Soluciones A, B, C, D, E, F, G. Azcar agua destilada con baja conductividad elctrica papel toalla alcohol 70% con rociador revolvedor magntico "pescadito" microondas balanza analtica autoclave de vapor saturado 5 vasos de precipitados de 500 ml Probeta de 500ml Cmara fotogrfica digital Etiquetas Plstipack Aluminio tijeras.

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Etapa asptica Vaso de precipitados de 50 ml Semillas de la Planta: (Cactus) Genero (Mammillaria) haageana ssp san angelensis Cmara de flujo laminar Pinzas esterilizadas Bistur Esterilizado Caja petri esterilizada Mechero mas fuego Autoclave de vapor saturado Cloruro de Benzalconio Cloro al 5 % Alcohol comercial al 96 % (para desinfectarse las manos antes de la siembra). Alcohol comercial al 96 % mas fuego (sembrar). Agua destilada estril/no estril segn sea la situacin Cmara fotogrfica digital y cmara de celular Plstipack Frascos Etiquetas

Variables a medir La mejor concentracin de RCV Tasa de Reproduccin

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MetodologaDesinfeccin de semillas y germinacin Se procedi a la obtencin de las semillas a partir de los frutos colectados en una localidad ubicada en el municipio de Durango Dgo, para lo cual se abrieron los frutos y se colocaron en un colador, lavndose con agua a presin para eliminar la pulpa aislando las semillas. las cuales fueron sometidas en dos grupos a 5 diferentes condiciones de desinfeccin. Un grupo se someti a inmersin a 50 C por 5 min para inducir la germinacin y el otro grupo sin pre induccin para usarse como testigo. Se prepararon 50frascos con 5 semillas cada uno por tratamiento en medio Murashige y Skoog (MS), siendo un total de 250 semillas, y se colocaron en una incubadora a 27 2 C, con un fotoperiodo de 16 h. de luz, evalundose la presencia de germinacin y contaminacin diariamente. Los tratamientos consistieron en: ??? Tratamiento No. 1: Villavicencio et. al. 1999. a) Lavar las semillas en agua esterilizada y jabn por 5 min b) Colocarlas en etanol al 70 % por 6 min c) 20 min en hipoclorito de sodio concentracin comercial (6%) + 3 gotas de tween 20 por cada 100 mL de solucin. d) d) Cinco enjuagues con agua destilada ??? Tratamiento No. 2: Martnez-Vzquez y Rubluo, 1989. a) 20 min en hipoclorito de sodio concentracin comercial (6%) b) Enjuague tres veces con agua de lluvia ??? Tratamiento No. 3: Prez-Molphe et al 1998. a) Cinco enjuagues con extran 0.1 % b) 1 min en etanol al 70 %. c) 25 min en hipoclorito de sodio al 2% d) 4 enjuagues con agua estril ??? Tratamiento No. 4: Reyes-Santiago, 1997 a) 5 min en agua estril con cloro comercial al 30 % (30mL de cloro en 70 de agua) b) Lavar en una solucin de 1 g de Captan en 100 mL de agua estril

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??? Tratamiento No. 5: Propuesto en este trabajo a) Lavar las semillas por 5 min en extrn 0.1 % b) 5 min en etanol 70 % c) 10 min en una solucin de 1 g de Captan en 100 mL de agua estril. d) 20 min en hipoclorito de sodio concentracin comercial (6%) + 3 gotas de tween 20 por cada 100 mL de solucin. e) 5 enjuagues con agua esterilizada.

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Al mismo tiempo se procedi a determinar la respuesta de induccin de germinacin de semillas de la Cactcea Mammillaria haageana ssp san angelensis por el cido giberlico. Para esto se prepararon por triplicado frascos conteniendo cada uno lotes de 5 semillas evaluando las siguientes concentraciones (mg/L): 0.0, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 5.0, 7.5, 10.0, 15.0 y 20.0 utilizando para ello un total de 250 semillas. Por ltimo, y una vez determinado el procedimiento ms adecuado para desinfeccin de semillas, se coloc un lote de estas a germinar en sustrato esterilizado de tezontle fino, gravilla y tierra negra cernida en proporcin 2:2:1 para determinar si exista diferencia entre la germinacin in vitro y la germinacin en sustrato de uso comn. Obtencin de explantes

Como fuente de explantes se utilizaron plntulas obtenidas a partir de la germinacin de las semillas. Una vez que las plntulas alcanzaron un tamao aproximado de entre 5 y 7 mm, se obtuvieron los explantes de acuerdo a una modificacin de la metodologa Martnez-Vzquez y Rubluo (1989) obteniendo de cada plntula un explante apical y uno basal (Fig 4). Tambin se utilizaron plntulas completas como testigo, todo esto con el fin de determinar si hay diferencias en el nmero de brotes obtenidos por tipo de explante. Se colocaron 4 explantes por frasco, o plntulas en su caso, con tres repeticiones por concentracin de benzilaminopurina (BAP), siendo las concentraciones 0.0, 0.5, 1.0, 2.0 y 3.0 mg/L, todos con 0.1 mg/L de Acido Naftilacetico(Tabla 1), obteniendo un total de 180 sujetos experimentales.

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Todos los frascos contenan medio MS con 1.5 % de sacarosa y solidificado con 0.2 % de phytagel, ajustando el pH a 5.69, 5.7 o 5.71 mantenindose los frascos a 27 2 C con un fotoperiodo de 16/8 h luz/obscuridad con lmparas de luz de da a una intensidad de 1000 lux/m2. Los explantes se cambiaban a medio fresco cada cuatro semanas. CONCENTRACIN DE BAP (mg/L) 0.0 0.5 1.0 2.0 3.0 CONCENTRACIN DE ANA (mg/L) 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1

Tabla 1. Concentracin de reguladores del crecimiento para induccin de brotes

Induccin de formacin de raz Para la etapa de enraizamiento se colocaron brotes en medio MS. Para la induccin de formacin de raz se utilizaron el AIA y el AIB que de acuerdo a la revisin bibliogrfica son los reguladores que mejores resultados han proporcionado en el cultivo de cactceas in vito (anexo II), en las concentraciones mostradas en la tabla 2. Las concentraciones de 0.0 mg/L con y sin carbn activado son los testigos. La concentracin ms alta se determin en funcin a la concentracin mxima reportada en la literatura. Para cada concentracin se elaboraron tres repeticiones con 4 brotes en cada frasco, es decir 12 brotes evaluados por tratamiento, teniendo un total de 172 plntulas en experimentacin.

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CONCENTRACIN DE CIDO INDOLACTICO (mg/L) 0.0 0.0 + carbn activado 0.5 1.0 1.5 3.0 5.0 7.0

CONCENTRACIN DE CIDO INDOLBUTRICO (mg/L) 0.0 0.0 + carbn activado 0.5 1.0 1.5 3.0 5.0 7.0

TABLA 2. Concentraciones utilizadas en la evaluacin de cido indolactico (AIA) y cido Indolbutrico (AIB) para la induccin de formacin de raz en brotes de Mammillaria haageana ssp san angelensis generados in vitro. Aclimatacin a invernadero Una vez que se obtuvo la formacin de raz en los brotes, se procedi a aclimatarlos a condiciones de invernadero. Para esto se colocaron un total de 30 brotes en macetas individuales con una mezcla de tezontle-gravilla-tierra negra, previamente esterilizada. Durante los primeros das la mezcla se humedeci a saturacin y para evitar una deshidratacin de los brotes se cubrieron las macetas con la mitad inferior de botellas de plstico transparente (Fig. 5) Se colocaron en un invernadero a una intensidad luminosa de 60-70 % y una temperatura promedio de 30 C. Se revisaron diariamente y despus de dos semanas se comenz a perforar la cubierta plstica con el fin de aclimatar las plantas a condiciones ms secas, hasta retirar por completo la cubierta. Se registro el nmero de plantas sobrevivientes. Para los anlisis estadsticos de los resultados se utilizaron los anlisis de ANOVA, Tuckey y Chi cuadrada por medio del programa de computo SPSS versin 11.0 para Windows.

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Diseo Experimental y TratamientosSe cuantificara la Tasa de Reproduccin y Concentraciones de los RCV 50 Frascos 5 Tratamientos Para los anlisis estadsticos de los resultados se utilizaron los anlisis de ANOVA (Diseo de Bloques Completos al Azar con 5 Repeticiones), Tuckey y Chi cuadrada por medio del programa de cmputo SPSS versin 11.0 para Windows. Las variables de respuesta sern: Tasa de Reproduccin Total de la Planta (Cactcea) Mammillaria haageana ssp san angelensis, el mejor RCV y la concentracin mas optima.

Referencias BibliogrficasDubrovsky, J. G. 1997. Determinate primary-root growth in seedlings of Sonoran Desert Cactaceae; its organization, cellular basis, and ecological significance.Planta 203(1):85-92.ORDEZ CHOCANO, H. y FRANCO, E. 1999. reas y Lneas de Investigacin en Biotecnologa. Guatemala. CONCYT-FONACYT. 19 p. RHA, J. y SUBIK, R. 1991. Enciclopedia de los Cactus. Checoslovaquia. SUSAETA. Spektrum, Brno. 350 p.

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RecursosEste proyecto ser financiado por activos productivos para el campo SAGADER.

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Anexos

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