Antibiograma refacut

  • View
    60

  • Download
    0

Embed Size (px)

Transcript

  • 5/25/2018 Antibiograma refacut

    1/30

  • 5/25/2018 Antibiograma refacut

    2/30

    2

    Introducere

    Metode de testare a sensibilitii la antibiotice Metoda diluiilor Metoda difuzimetric Factori ce afecteaz diametrul zonelor de inhibiie

    Controlul de calitate

    Principalele scopuri ale antibiogramei: Orientarea tratamentului

    Cunoaterea sensibilitii unui microorganism la anumite chimioterapice Determinarea concentraiei unui chimioterapic n esuturile sau fluidele organismului

    Instrument epidemiologic

    Supravegherea apariiei de tulpini rezistente a principalilor ageni patogeni (ex. Shigella, Salmonellatyphi) Supravegherea continu a patternului de rezisten a tulpinilor patogene (ex. Staphylococcus, bacili

    Gram negativi) Ageni antimicrobieni frecvent folosii n tratarea infeciilor sistemice

  • 5/25/2018 Antibiograma refacut

    3/30

    3

    Metoda difuzimetric Se dispun discuri ce conin o cantitate cunoscut de antibiotic pe un

    mediu solid nsmnat cu tulpina bacterian de testat Metoda diluiilor

    Variaz cantitatea de substane antimicrobiene incorporate n mediisolide sau lichide

    Ulterior se inoculeaz tulpina bacterian de testat

    Se folosesc discuri de hrtie impregnate cu antibiotice Se testeaz sensibilitatea la mai multe antibiotice prin msurarea

    diametrului zonelor de inhibiie S-a demonstrat c rezultatele metodei difuzimetrice cu discuri se

    coreleazbine cu rezultatele metodei diluiilor

  • 5/25/2018 Antibiograma refacut

    4/30

    4

    Materiale necesare: Inoculul bacterian reprezint tulpina bacterian de testat, izolat din

    produsele patologice i identificat. Inoculul este o cultur n mediu lichid de 18 ore obinut din 5-10 colonii

    izolate, standardizat nefelometric. Concentraia bacterian a inoculului este de 105UFC/ml (Unitati Formatoare de

    Colonii), cu o turbiditate de 0,5 uniti McFarland. Mediu de cultur solid pentru antibiogram (ex. geloz Mueller Hinton,

    geloz simpl etc.) turnat n plci Petri, cu grosimea de 3-4 mm i cu ocompoziie adecvat, n funcie de tulpina de testat i structurachimioterapicelor.

    Microcomprimate standardizate - discuri de hrtie de filtru cu diametrul de 6mm mbibate cu antibioticele de testat. Pe discuri este imprimat simbolulantibioticului i cantitatea n micrograme.

    Grosime: 4 mm pH Cationi * Magnesium

    * Calcium Condiii de stocare Trebuie uscate

    Trebuie adus la temperatura camerei

  • 5/25/2018 Antibiograma refacut

    5/30

    Condiii de incubare

    Aer ambiental, 35 0C pentru bacterii aerobe i facultativ anaerobe Perioada de incubare 16-18 h 24 h pentru S.aureusi enterococi 5% CO2pentru Haemophilus

    Teancurile de plci nu vor conine mai mult de 5 plci

    Trebuie stocate i manipulate corect Trebuie refrigerate, se scot de la frigider cu 1 h nainte de utilizare

    Se verific data de expirare Se aduc la temperatura camerei evitnd condensul Se plaseaza n 15 minute de la nsmnarea mediului

  • 5/25/2018 Antibiograma refacut

    6/30

    6

    Procedur(Kirby-Bauer modificat: National Committee for Clinical LaboratoryStandards. NCCLS/CLSI) Se prepar un inocul de105UFC/ml n ser fiziologic sau bulion soia-tripticaza

    (TSB)sau bulion Mueller-Hinton (5ml) Se prelev de pe plac 5-10 colonii izolate Se ajusteaz turbiditatea pentru a fi aceeai cu standardul McFarland No. 0.5.

    Se prelev din inocul cu tamponul i se descarc pe suprafaa gelozei Mueller-Hinton

    Se las 5-10 minute geloza pentru uscare Prepararea inoculului

  • 5/25/2018 Antibiograma refacut

    7/30

    Limita zonei de inhibiie

    7

    Procedur(continuare) Se plaseaza discurile cu antibiotice pe suprafaa gelozei

    insamantate cu inocul Plcile se incubeaz la 37oC, timp de 18-24 h Se msoar diametrul zonelor de inhibiie a creterii

    bacteriene n mm

    Cretere bacterian

    Metoda difuzimetrica

  • 5/25/2018 Antibiograma refacut

    8/30

    Insamantareainoculului

    Aplicarea discurilorcu antibiotice

    Dup o incubare de 18-24 ore la37 0C, se msoar diametrelezonelor de inhibiie

  • 5/25/2018 Antibiograma refacut

    9/30

  • 5/25/2018 Antibiograma refacut

    10/30

  • 5/25/2018 Antibiograma refacut

    11/30

    Plasare incorect a discurilor Plasare corect a discurilor

    Geloz prea subire

  • 5/25/2018 Antibiograma refacut

    12/30 12

    Metoda difuzimetric

    Msurarea diametrelor zonelor de inhibiie

    Se msoar de la marginea unde ncepe creterea, cu 3 excepii: n cazul sulfamidelor i cotrimoxazolului se ignora uoara cretere la

    marginea zonei Unele tulpini de Proteusspp. Pot invada n zona de inhibitie Dac se testeaz Streptococcus productor de beta-lactamaze i

    apare zone de inhibiie suprapuse se raporteaz ca rezistent

  • 5/25/2018 Antibiograma refacut

    13/30

    Metoda difuzimetric

    Msurarea diametrelor zonelor de inhibiie

    Se msoar de la marginea unde ncepe creterea, cu 3 excepii:

    n cazul sulfamidelor i cotrimoxazolului se ignora uoara cretere la marginea zoneiUnele tulpini de Proteusspp. Pot invada n zona de inhibitie

    Dac se testeaz Streptococcus productor de beta-lactamaze i apare zone de inhibiiesuprapuse se raporteaz ca rezistent

  • 5/25/2018 Antibiograma refacut

    14/30

    Teste de sinergie

    Se plaseaza alaturat discuri

    continand antibiotice cu efectsinergic Zonele de inhibitie se contopesc

  • 5/25/2018 Antibiograma refacut

    15/30

    Test pentru producereade beta-lactamaze

    Se plaseaza alaturat discuri continandantibiotic simplu si antibiotic cuinhibitor de beta-lactamaze

    In cazul producerii de beta-lactamaze,diametrul zonei de inhibitie din juruldiscului cu inhibitor este mult mai mareaspect de dop de sampanie

  • 5/25/2018 Antibiograma refacut

    16/30

    Test pentru producereade beta-lactamaze

    Ampicillin (A); Chlorampenicol (C);Streptomycin (S); Sulphonamides (Su);Tetracycline (T); Trimethoprim (Tm); Nalidixicacid (Na); Kanamycin (K); Ciprofloxacin (Cp);

    Ceftazidime (Cz); Gentamycin (Gm) andCefotaxime (Ctx).

  • 5/25/2018 Antibiograma refacut

    17/30

    17

    Metoda difuzimetric Interpretarea rezultatelor

    Prin compararea diametrelor obinute cu cele din tabele standardizate pentru tulpinilede referin

    Rezultatul se raporteaz ca: Sensibil Intermediar sensibil

    Antibiotice cu toxicitate mic: Moderat sensibil Antibiotice cu toxicitate mare: zon tampon ntre sensibil i rezistent

    Rezistent

    Test pentru producerea debeta-lactamaze

  • 5/25/2018 Antibiograma refacut

    18/30

    18

  • 5/25/2018 Antibiograma refacut

    19/30

    19

    Densitatea inoculului

    Timpul de aplicare a discurilor

    Temperatura de incubare

    Timpul de incubare Dimensiunea placii Grosimea gelozei (4 mm) Spaierea discurilor (2.5 cm)

    Zonele sunt mai mari cnd inoculul este slab iinvers

    Daca dup aplicarea discurilor placa este inut multla temperatura camerei se formeaza zone mai mici Zone mai mari la temperaturi > 35 oC Ideal 16-18 ore; incubarea mai scurta nu da rezultate

    interpretabile Plcile mai mici permit un numr mai mic de discuri Mediul subire duce la apariia de zone mari iinvers Evit suprapunerea zonelor

    Factori ce afecteaz diametrul zonelor de inhibiie

  • 5/25/2018 Antibiograma refacut

    20/30

    20

    Se efectueaz diluii de antibiotice n mediu

    lichid sau solid Permite obinerea de rezultate cantitative :

    Indic concentraia minim inhibitorie precum iconcentraia minim bactericid a chimioterapicului

    testatConcentraia Minim Inhibitorie (CMI) (Minimal

    Inhibitory Concentration = MIC) Reprezint cea mai mic concentraie de antibiotic care

    inhib multiplicarea bacterian

    Concentraia Minim Bactericid (CMB)(Minimal Bactericidal Concentration = MBC) Reprezint cea mai mic concentraie de antibiotic care permite

    supravieuirea a mai puin de 0,1 % din bacteriile din inocul

  • 5/25/2018 Antibiograma refacut

    21/30

    21

    Procedur Se efectueaz diluii binare de antibiotic n bulion Mueller-Hinton,

    Tryptic Soy Broth, Clark, ser fiziologic Sensmneazinoculul bacterian i se incubeaz

    Se folosesc martori frinocul i frantibiotic Se observ turbiditatea i se determin concentraia minim

    inhibitorie - CMI (ultima eprubetn care cultura bacteriannu a maicrescut imediul a rmaslimpede)

    Se subcultiv eprubetele limpezi pe medii de cultur solide i seincubeaz

    Se apreciaz concentraia minim bactericid - CMB n funcie deprezena sau absena creterii culturii bacteriene pe mediile solide.CMB este concentraia de antibiotic din ultima eprubet din careprin subcultivare nu s-a obinutcreterebacterian.

  • 5/25/2018 Antibiograma refacut

    22/30

    22

    Ziua 1

    Se adaug 1 ml inocul cubacteria de testat (1*106CFU/ml) n tuburi ncare s-au efectuat nprealabil diluii deantibiotic n mediu lichid

    Martori:

    C1 = Martor fr antibiotic

    Viabilitatea trebuie testatprin subcultivare pe mediulichidC2 = Martor fr inocul

    Concentraia inocului = 5*105CFU/ml

    Se incubeaz 35 oC, 18-24 ore

    128 64 32 16 8 4 2 C1 C2

    64 32 16 8 4 2 1 C1 C2

  • 5/25/2018 Antibiograma refacut

    23/30

    23

    Ziua 2

    Se observ turbiditateavizual - MIC = 16 mg/l

    Se subcultiv eprubetelelimpezi pe plci de gelozcu ansa de 0,01 ml

    64 32 16 8 4 2 1 C1 C2

    0.01 ml se nsmneaz, se incubeaz la 35oC, 18-24 ore

    64 32 16

    Ziua 3Se determin numrul de CFU peplci:La 16 mg/l = 700 CFU/ml > 0.1%of 5*105CFU/ml (inocul)

    In acest caz : MBC = 32 m