• Inhibitoren der Transkription:Rifampicin, Actinomycinα-Amanitin

• Inhibitoren der Translation:Puromycin, Streptomycin, Tetracycline, ChloramphenicolDiphterie-Toxin

Antibiotika sind oft Inhibitoren der Genexpression

Rifamycin & Rifampicin inhibieren prokaryotische, aber nicht

eukaryotische RNA-Polymerasen

Rifampicin ist ein halbsynthetisches Derivat von Rifamycin B,das von Streptomyces mediterranei produziert wird.

• aus Streptomyces antibioticus• inhibiert DNA- und RNA-Polymerasen• interkaliert zwischen Basenpaare der

dsDNA

Actinomycin D

α-Amanitin (Amatoxine)

• aus Amanita phalloides (Grüner Knollenblätterpilz)

• Inhibiert v.a. eukaryotische RNA-Polymerase II u. III, aber nicht I, und nicht prokaryot. RNA-Polymerasen

Puromycin(inhibiert die Translation)

Bindet ohne EF-Tu die A-Stelle im Ribosom und es wird ein Peptidylpuromycin gebildet.

Eine weiter Transpeptidierung kann nicht stattfinden.

Bindet an die grosse Untereinheit und inhibiert die Peptidyltransferase Aktivität von prokaryotischen Ribosomen

Chloramphenicol

Binden an die kleine Untereinheit prokaryotischer Ribosomen und verhindert die Bindung von Aminoacyl-tRNAs.

Tetracycline

Streptomycin und andere Amino-glycoside inhibieren die Initiation (bei hoher Konzentration) und verursachen bereits bei niedriger Konzentration Fehleinbau

Streptomycin

Diphterie-Toxin(inhibiert die Translation)

Diptherie-Toxin ist ein Protein ausCorynebacterium diphteriae,das in der infizierten Zelle inzwei Fragmente gespalten wird.

Ein Fragment ist ein Enzym, dasADP-Ribose auf ein modifiziertesHistidin im EF-2 überträgt und dadurch EF-2 inaktiviert.

Methoden zur Analyse und Manipulation von DNA

Techniken der Protein- und Nukleinsäure-Biochemie

Klonierungin einen

Expressions-Vektor

Bestimmungder DNA-Sequenz

Transformation vonE.coli oder andere

Zellen

Präparation vonsynthetischen

Peptiden

Herstellung von spezifischenAntikörpern

Gen odercDNA

Protein

Protein

Bestimmungder Amino-

säuresequenz

SynthetischeOligonukleotide

als Sonden

Analyse einer cDNA Bank mit

Southern blotting

Herstellung spezifischerAntikörper

Expression einer DNALibrary und Analyse

durch Western blottingGen oder

cDNA

Klonierung von DNA

1.) Rekombinante DNA Techniken beruhen auf der Fähigkeit große Mengen an identischen DNA Molekülen (Klone) herzustellen.

2) Durch Einbau von DNA Stücken in Vektoren, die in eine Wirtszelle eingeführt werden, können Klone erzeugt werden.

3) Durch die Replikation des Vektors wird auch das DNA-Stück von Interesse vervielfältigt.

4) Die am häufigsten verwendeten Vektoren sind E.coli Plasmid Vektoren und λ Bakteriophagen Vektoren.

Eine Gen für eine Antibiotika-Resistenzerlaubt einfache Selektionder transformierten Zellen Ampicillin-Resistenz

Klonierung von DNA mit Plasmid Vektoren

Restriktionsendonucleasen schneiden dsDNA an spezifischen Sequenzen

Schnittstelle

Methylierte Basen an der Schnittstelle schützen die DNA vor dem Restriktionsenzym

Restriktionsenzyme aus verschiedenen Bakterien

schneiden unterschiedliche DNA-Sequenzen.

Diese Sequenzen sind meistens Palindrome.

7.1 Selected restriction enzymes

Restriktionsenzyme schneiden DNA in definierte Stücke

Figure 7-7

Restriktionsfragmente mit komplementären ‘sticky ends’ können leicht verknüpft werden

Modifizierte Plasmid Vektoren enthalten Polylinker, die eine Klonierungen mit unterschiedlichen

Restriktionsenzymen ermöglichen.

Figure 7-24

Durch Mehrfach-Restriktionsanalyse können DNA Fragmente identifziert werden

Restriktionsfragmente können durch Gel-Elektrophorese getrennt werden (Agarose Gel)

Visualisierung der DNA-Fragmente erfolgt durch Ethidiumbromid oder

radioaktive Markierung

Ethidium-bromid

DNA-Sequenzierung mit der Dideoxy- Methode

(oder Sanger- oder Kettenabbruch-Methode)

Es werden 4 getrennte DNA-Polymerase Reaktionen durchgefuehrt (jeweils mit einem der 4 Dideoxy-NTPs)

Die Sanger Methode

Die Sanger Methode (II)

Fluoreszenzfarbstoff-markierte Nucleotide werden für moderne DNA-Sequenziergeräte verwendet

Chemische Synthese von DNA Molekülen: Festphasen-Synthese

Chemische DNA Synthese

Synthetische Peptide werden auch durch eine Festphasen-

Methode hergestellt(Bruce Merrifield)

Kopplung der C-terminalen Aminosäure an das Säulenmaterial

Abspaltung der Schutzgruppe am Aminoende

Kopplung mit der nächsten Aminosäure

Ablösen des fertigen Peptids

DNA wird durch ‘Southern blotting’spezifisch nachgewiesen

mRNAs werden durch ‘Northern blotting’spezifisch nachgewiesen

Mit Hilfe der PCR kann eine bestimmte DNA Sequenz (z.B. Gen) durch Vervielfältigung aus einer großen Ansammlung von vielen unterschiedlichen DNA Sequenzen isoliert werden.

Allerdings muss zumindest eine kurzes Stück der DNA Sequenz am Anfang und am Ende des gewünschten Gens bekannt sein.

PCR (Polymerase Chain Reaction)

PCR (polymerase chain reaction)

PCR (polymerase chain reaction)

PCR (polymerase chain reaction)

Herstellung rekombinanter Proteine

Überexpression eines Gensoder cDNA in

- E. coli- S. cerevisiae- Insektenzellen (Bacculovirus-System)

Industrielle Produktion rekombinanter Proteine

KleinwuchsWachstumshormonVirushüllproteineImpfstoffeAnämie (Erythozytenprodukt.)ErythropoietinDiagnostikMonoklonale AntikörperHIV, Krebs, ImmunschwächeInterleukineVirusinfektionen, KrebsIntereferoneFaktor VIII (Hämophilie)GerinnungsfaktorenDiabetesInsulinBeispeil /AnwendungProtein

in vitro Mutagenese

• DeletionenN- oder C-terminale VerkürzungEntfernen von Domänen

• SubstitutionenGerichtete Mutagenese

• InsertionenCassetten Mutagenese

• Designer Gene

Gerichtete Mutagenese (site-directed mutagenesis)

mit Hilfe der PCR

Cassetten Mutagenese

Gezielter Genaustausch