Anul II – BIOTEHNOLOGII CELULARE I MICROBIENE

Curs „Biotehnologii enzimatice”

Enzimologia reprezintă ramura biochimiei ce cunoaste o dezvoltare extrem de rapidă în ultimul timp. Multitudinea cercetărilor de enzimologie ce se fac în toate laboratoarele si institutele de profil din lume este justificată, în primul rând de faptul că investigarea diferitelor căi si secvenţe metabolice din celula vie nu poate fi realizată fără elucidarea mecanismelor enzimatice ale transformărilor biochimice ce stau la baza lor, iar pe de altă parte, modificarea activităţii catalitice a unor enzime poate fi corelată cu multe aspecte patologice din care cauză determinarea activităţilor enzimatice prezintă o importanţă deosebită pentru practica medicală. Si în alte domenii ale activităţii practice enzimele sunt utilizate cu succes în cele mai diverse procese de biotransformare. Este suficient să amintim utilizarea preparatelor enzimatice în industria de biosinteză si semisinteză, chimia analitică, industria alimentară, industria textilă, industria pielăriei, epurarea biologică a apelor reziduale etc.

Elucidarea proceselor metabolice ce au loc în celula vie precum si utilizarea practică a enzimelor în cele mai diverse domenii ale activităţii umane nu sunt posibile fără un studiu cât mai complet al acestor biocatalizatori, studiu ce include următoarele aspecte:

determinarea structurii primare, secundare, terţiare si eventual cuaternare a enzimelor;

determinarea transformării chimice catalizate de enzima luată în studiu;

evaluarea parametrilor cinetici si funcţionali ai enzimelor;

separarea si purificarea enzimelor din surse biologice;

imobilizarea enzimelor pe suporturi solide, insolubile, în vederea obţinerii de

biocatalizatori heterogeni;

determinarea caracteristicilor cinetice si funcţionale ale imobilizatelor enzimatice

comparativ cu enzimele native;

determinarea condiţiilor optime de reacţie în cazul realizării unei transformări enzimaticein vitro, atât cu enzime libere cât si imobilizate.

I. IMPORTANŢA I LIMITELE ANALIZEI ENZIMATICE

I.1. GENERALITĂŢI

Analiza enzimatică, apărută iniţial ca o ramură a chimiei analitice, nu este un dome niu nou. Astfel, în 1845, Osann utilizează peroxideza în analiza cantitativă a apei oxigenate, iar Schonbein stabileste în l851 că valoarea minimă detectabilă a concentraţiei H2O2 prin această metodă corespunde unei diluţii de 1:2.000.000.

Analiza enzimatică presupune realizarea in vitro a reacţiilor biochimice ce au loc in vivo în condiţii fizicochimice cât mai apropiate posibil d e cele asigurate de celula vie. Folosirea enzimelor ca reactivi face posibilă utilizarea reac ţiilor biochimice catalizate de acestea la dozarea substratelor, respectiv a produsilor de reacţie. De exemplu, lactatdehidrogenaza participă in vivo la realizarea echilibrului redox între lactat si piruvat.

In vitro, aceeasi enzimă permite conversia acidului piruvic în acid lactic si invers în funcţie de condiţiile de reacţie (când se realizează o hidrogenare, respectiv o dehidrogenare), ceea ce face posibilă dozarea lactatului sau piruvatului întrun mediu dat. De aceea, prin analiză enzimatică se pot doza atât substratele enzimelor cât si produsii reacţiilor catalizate de acestea, precum si efectorii specifici (activatori si/sau inhibitori) nedozabili prin metode chimice din cauza concentraţiei lor extrem de mici.

Importanţa practică a analizei enzimatice constă, în primul rând, în posibilitatea determinării specifice a unor substanţe întrun mediu dat, chiar dacă acestea se găsesc în concentraţii extrem de mici. Conceptul de "analiză enzimatică" include trei aspecte principale:

a) Determinarea diferitelor substanţe cu ajutorul enzimelor. Datorită specificităţii de acţiune, enzimele pot fi utilizate la dozarea cu mare exactitate a substratelor, produsilor de reacţie si a efectorilor. Deoarece reacţiile enzimatice au loc în condiţii fiziologic normale de pH, temperatură, presiune osmotică etc., analiza enzimatică permite si dozarea substanţelor labile.

b) Determinarea activităţii catalitice a enzimelor. Analiza enzimatică presupune si determinarea activităţii acestor catalizatori, des utilizată în diferite domenii ale societăţii umane. Dintrun motiv sau altul, activitatea diferitelor enzime se determină în lichide biologice precum si în ţesuturi si organe de origine animală sau vegetală.

c) Determinarea unor substanţe cu ajutorul reactivilor "marcaţi" enzimatic. Astăzi există posibilitatea de a fixa enzimele prin legare covalentă pe diferite molecule

cu o structură extrem de diversă, fără pierderea activităţii catalitice. Preparatele obţinute poartă numele de reactivi "marcaţi" enzimatic. Datorită specificităţii interacţiunilor antigenanticorp, precum si datorită existenţei proteinelor ale căror molecule conţin receptori specifici, au putut fi puse la punct metode imunoenzimatice de analiză extrem de sensibile cu ajutorul cărora se pot doza proteinele cu proprietăţi imunologice dar lipsite de activitate enzimatică.

I.2. IMPORTANŢA ANALIZEI ENZIMATICE

Datorită performanţelor sale, analiza enzimatică este utilizată astăzi în mai multe domenii ale activităţii umane.

a) Biochimia generală. Analiza enzimatică prezintă o importanţă deosebită în primul rând pentru progresul biochimiei în ansamblu, cercetările de enzimologie contribuind la o mai bună înţelegere a căilor metabolice si mecanismelor de realizare a acestora, a structurii chimice si rolului biologic al glucidelor, lipidelor, proteinelor si chiar al vitaminelor si hormonilor. Din acest punct de vedere, Hess afirma în 1974: "biochimia enzimelor este mama metodelor enzimatice. În acelasi timp noile metode au o contribuţie substanţială nu numai la dezvoltarea si progresul biochimiei enzimelor ci, în egală măsură, la dezvoltarea biochimiei în ansamblu, printrun mecanism de tip feed back".

b) Chimia alimentară. În acest domeniu enzimele se utilizează din ce în ce mai mult, în special pentru dozarea glucidelor (mono, oligo si polizaharidelor), unor acizi organici (acid citric, lactic, malic etc.), unor alcooli (etanol, glicerină, sorbitol etc.), aminoacizilor etc. În produsele alimentare si în materiile prime folosite în industria alimentară.

c) Industria de cosmetice. De regulă, standardele aplicate în industria alimentară se aplică si în cosmetică în majoritatea ţărilor care posedă această ramură industrială. Foarte des se utilizează analiza enzimatică pentru determinarea glicerolului, glucozei, fructozei, colesterolului, acizilor lactic si citric, etanolului etc. în diferite creme de întreţinere si tratament.

d) Agrochimie. Metodele enzimatice sunt utilizate din ce în ce mai mult pentru studiul metabolismului plantelor în vederea cresterii rezistenţei la secetă, boli etc., precum si pentru evaluarea comportamentului la stocare al produselor vegetale. Aceste metode se aplică în egală măsură la studiul biologiei solului.

e) Microbiologie. În microbiologie, analiza enzimatică este folosită, în principal, la evaluarea cresterii si dezvoltării microorganismelor precum si la studiul metabolismului microbian. În cazul în care cultivarea microorganismelor se face în

scopul obţinerii de enzime, mediul nutritiv are o compoziţie adecvată în asa fel încât să fie indusă biosinteza enzimei vizate. De exemplu, lichidul de cultură pentru Candida mycoderma va conţine si glicerină care va induce biosinteza glicerolkinazei.

f) Biochimia clinică. Atât în medicina umană cât si în cea veterinară, enzimologia în general si analiza enzimatică în special prezintă o importanţă deosebită atât în diagnostic cât si în urmărirea evoluţiei bolii în perioada de spitalizare. În ultimul timp enzimologia este considerată, de altfel, o specialitate medicală importantă. În laboratoarele clinice de biochimie se determină în mod curent activitatea aminotransferazelor, creatinkinazei, fosfomonoesterazelor alcalină si acidă, amilazei etc., iar pentru dozarea altor parametri biochimici (glucoza, trigliceridele, colesterolul, ureea, acidul uric etc.) se folosesc cu succes metodele enzimatice de analiză.

I.3. PRINCIPII GENERALE DE DETERMINARE A ACTIVITĂŢII ENZIMELOR

Orice lucrare practică de enzimologie trebuie să înceapă cu aprofundarea metodelor de determinare a activităţii enzimei respective si stabilirea condiţiilor care să asigure viteza maximă de reacţie. Spre deosebire de majoritatea celorlalţi compusi biochimici, cantitatea unei enzime nu poate fi măsurată, cu unele excepţii, în valori absolute, adică în mg sau moli de enzimă. De aceea, cantitatea unei enzime se estimează indirect, în funcţie de activitatea ei sau, altfel spus, în funcţie de viteza reacţiei catalizată de enzima respectivă.

Activitatea catalitică a enzimelor se poate evalua în mod diferit: fie după viteza de acumulare a produsilor reacţiei enzimatice date, fie după viteza de epuizare (diminuare) a substratelor si cofactorilor întrun interval de timp dat. Se recomandă ca activitatea catalitică a enzimelor să se determine în funcţie de viteza iniţială de reacţie deoarece în acest interval de timp există un exces de substrat, iar produsii de reacţie nu sau acumulat încă în cantităţi prea mari. Mai exact, este de dorit ca determinarea activităţii enzimelor să se efectueze în condiţiile în care cantitatea de substrat transformată să nu depăsească 20% din cea iniţială. Sa constatat experimental că în aceste condiţii există o dependenţă liniară (de tipul y = ax sau y = ax + b) între cantitatea de substrat transformată si timpul de incubare.

Pentru determinarea activităţii enzimelor se pot utiliza, în funcţie de tipul reacţiei catalizate, metodele de analiză colorimetrice, spectrofotometrice, fluorimetrice, manometrice, conductimetrice, vâscozimetrice, cromatografice, electroforetice etc. În laboratoarele clinice, de cercetare sau industriale cu profil de biochimie se utilizează cel mai adesea metodele colorimetrice si spectrofotometrice de analiză.

Metodele colorimetrice se bazează pe măsurarea intensităţii culorii substanţei ce se formează prin interacţiunea substratului sau a produsului de reacţie cu un reactiv specific care se adaugă în probă după stoparea reacţiei enzimatice. La baza metodelor spectrofotometrice de analiză se află absorbţia luminii în domenii determinate ale spectrului, de către substratele sau produsii de reacţie, uneori de către cofactorii enzimelor bicomponente. Spectrele acestor substanţe pot avea maximele de absorbţie la o lungime de undă determinată, atât în domeniul ultraviolet cât si în cel vizibil sau infrarosu.

Pentru eliminarea factorilor de eroare, la determinarea activităţii unei enzime este necesar să se efectueze, pe lângă proba propriuzisă (proba de cercetat sau proba cu enzimă activă) si un martor în care enzima se inactivează în prealabil prin fierbere sau prin modificarea puternică a pHului. Acest martor este absolut necesar deoarece, în unele cazuri, pot avea loc modificări spontane ale substratului, necorelate direct cu activitatea catalitică a enzimei. Exprimarea activităţii enzimelor, indiferent de metoda folosită la determinarea acesteia, se poate face în mai multe moduri:

-unitatea internaţională a activităţii enzimatice se defineste ca fiind cantitatea de enzimă ce poate modifica un micromol de substrat întrun minut în condiţii standard de reacţie.

-activitatea specifică este egală cu masa enzimei exprimată în miligrame ce poate transforma un micromol de substrat întrun minut în condiţii standard si se exprimă în micromol/min -mg proteină. În acelasi timp, activitatea specifică este si o măsură a purităţii enzimei, ea creste în timpul purificării si devine maximă si constantă atunci când enzima este în stare pură.

- activitatea molară sau moleculară, numită i număr de turnover, reprezintă numărul de molecule de substrat transformate întrun minut de către o singură moleculă de enzimă, când acesta reprezintă factorul limitant al vitezei. Activitatea moleculară a unei enzime cu un singur centru activ poate fi calculată din valoarea V maxi din masa sa moleculară.

O nouă unitate de activitate enzimatică recomandată de Comisia de Enzimologie este katalul (prescurtat kat), definită ca fiind acea cantitate de enzimă ce transformă un mol de substrat întro secundă în condiţii standard de reacţie. În funcţie de viteza de reacţie, se pot folosi multiplii si submultiplii ( de exemplu microkatali, nanokatali etc.). Dei metodele de determinarea activităţii catalitice diferă foarte mult de la o enzimă la alta, există unele principii comune sI unele manevre experimentale ce se respectă în toate cazurile. Astfel, pentru determinarea practică a activităţii oricărei enzime se va realiza întotdeauna o probă de analizat i un martor în care mediul de

reacţie are, în final, aceeai compoziţie. Singura diferenţă constă în faptul că în probă enzima acţionează asupra substratului transformândul, iar în martor, printro modalitate sau alta, se face în aa fel încât enzima să nu acţioneze asupra substratului.

Deoarece viteza de reacţie se raportează întotdeauna la unitatea de timp este necesar ca procesul catalitic să se desfăoare întrun interval de timp bine determinat. Pentru aceasta se cronometrează timpul de reacţie din momentul în care enzima intră în contact cu substratul, iar stoparea reacţiei se face de regulă prin modificarea bruscă a pHului mediului de incubare. În unele metode colorimetrice de analiză reactivul de culoare folosit pentru dozarea produsului de reacţie sau a substratului rămas netransformat poate fi, în acelai timp i un factor ce stopează procesul biocatalitic (de exemplu, soluţia de dinitrofenilhidrazină folosită ca reactiv de culoare în determinarea activităţii aminotransferazelor).

Unii factori de mediu (temperatura, pHul, presiunea osmotică etc.), manifestă o puternică influenţă asupra vitezei reacţiilor enzimatice. Din această cauză, în mediul de incubare trebuie să se realizeze condiţiile optime de reacţie, condiţii care să se apropie cît mai mult de condiţiile naturale în care enzima respectivă acţionează in vivo. Pe de altă parte, viteza unei reacţii enzimatice se modifică în funcţie de concentraţia enzimei, concentraţia substratului, natura I concentraţia soluţiei tampon etc.

I.5. SURSE DE ENZIME

Din punctul de vedere al localizării lor, enzimele se clasifică în două grupe principale:

a) enzime solubilizate în diferite lichide biologice (sânge, urină, lichid cerebrospinal, lichid interstiţial, spermă, salivă, citoplasmă, mediu de cultură pentru microorganisme, sevă etc.);

b) enzime fixate pe diferite structuri tisulare i subcelulare. În acest din urmă caz, multe enzime sunt puternic legate de diferite componente ale membranelor biologice, făcând parte din structura lor. Alegerea sursei optime pentru izolarea i purificarea unei enzime date se face în funcţie de mai multe criterii. În primul rând se alege materialul biologic cel mai bogat în enzima respectivă.

Enzimele ce se utilizează în calitate de biocatalizatori în industria alimentară, farmaceutică, textilă, de pielărie etc. pot fi obţinute practic din toate sursele biologice, existând din acest punct de vedere trei categorii de enzime:

– enzime de origine vegetală;

– enzime de origine animală;

– enzime de origine microbiană.

a) Enzimele de origine vegetală

Din sursele vegetale se obţine o gamă largă de enzime, mai importante din punct de vedere practic fiind enzimele proteolitice: papaina sintetizată de o plantă din zonele tropicale (Carica papaya), bromelina sintetizată de ananas (Ananas comosus Merr), ficina din Ficus glabrata i altele. Toate aceste enzime sunt proteinaze tiolice deoarece conţin în centrul lor activ o grupare tiolică liberă (un rest de cisteină) indispensabilă activităţii lor catalitice. Arborele de papaya este o plantă foarte răspândită în zonele tropicale, iar papaina brută sau purificată se obţine industrial în cantităţi foarte mari datorită numeroaselor sale aplicaţii practice în domeniul industrial i terapeutic.

Cantităţile cele mai mari de papaină (aproximativ 12% din substanţa uscată) se găsesc în fructele de papaia, înainte de coacere. Pentru obţinerea industrială a papainei pure se recoltează latexul care se depozitează la rece (+4 oC). Pentru înlăturarea impurităţilor se diluează cu apă distilată, se agită i se centrifughează sau se filtrează pe kiesselguhr, după care se liofilizează sub vid la 50 oC. Se obţine o pudră de culoare albă care însă se oxidează relativ uor, devenind brună, datorită prezenţei grupelor –SH libere. Din această cauză, ambalarea se face în condiţii care împiedică atât oxidarea cât i contaminarea microbiană.

Activitatea proteolitică a papainei industriale astfel obţinute oscilează între 40.000 i 84.000 U.P. (unităţi proteazice). Prin electroforeză pe acetat de celuloză sa demonstrat faptul că preparatele industriale de papaină conţin trei componente majore: papaina (EC 3.4.22.2), chimopapaina (EC 3.4.22.6) i lizozimul sau muramidaza (EC 3.2.1.17).

Papaina înalt purificată a fost cristalizată prima dată în 1937 de către Balls, T. et al. Ea este o enzimă tiolică ce conţine 211 resturi de aminoacizi i are o masă moleculară de 23 kDa. Temperatura optimă de acţiune se situează între 55 – 60oC, enzima având o termostabilitate crescută (denaturarea termică se observă abia la 65– 70°C), iar pHul optim se înscrie în domeniul de pH 5,0 – 7,0 ceea ce facilitează utilizarea sa în diferite procese biotehnologice. Este o enzimă foarte rezistentă la acţiunea denaturantă a solvenţilor organici. Specificitatea de acţiune a papainei este relativ largă, ea recunoscând nu mai puţin de apte aminoacizi. Scindează însă preferenţial legăturile peptidice realizate de resturile fenilalanină din interiorul catenelor polipeptidice, fiind o endopeptidază.

Dei este o enzimă foarte stabilă, orice modificare, chiar i minoră în structura sa primară conduce la rezultate spectaculoase. Astfel, prin substituirea restului Cys25 cu un derivat izoaloxazinic

Anul II – BIOTEHNOLOGII CELULARE I MICROBIENE

Curs „Biotehnologii enzimatice”

Enzimologia

reprezintă ramura biochimiei ce cunoate o dezvolt

are extrem de rapidă

în ultimul timp. Multitudinea cercetărilor de enzim

ologie ce se fac în toate laboratoarele i insti

tutele de profil din lume este justificată, în prim

ul rând de faptul că investigarea diferitelor căi

i

secvenţe metabolice din celula vie nu poate fi real

izată fără elucidarea mecanismelor enzimatice

ale transformărilor biochimice ce stau la baza lor,

iar pe de altă parte, modificarea activităţii cata

litice a unor enzime poate fi corelată cu multe asp

ecte patologice din care cauză determinarea

activităţilor enzimatice prezintă o importanţă deos

ebită pentru practica medicală. !i în alte do

menii ale activităţii practice enzimele sunt utiliz

ate cu succes în cele mai diverse procese de

biotransformare. Este suficient să amintim utilizar

ea preparatelor enzimatice în industria de bio

sinteză i semisinteză, chimia analitică, industria

alimentară, industria textilă, industria pielăriei

,

epurarea biologică a apelor reziduale etc.

Elucidarea proceselor metabolice ce au loc în celu

la vie precum i utilizarea practică

a enzimelor în cele mai diverse domenii ale activit

ăţii umane nu sunt posibile fără un studiu cât

mai complet al acestor biocatalizatori, studiu ce i

nclude următoarele aspecte:

determinarea structurii primare, secundare, terţ

iare i eventual cuaternare a enzime

lor;

determinarea transformării chimice catalizate de

enzima luată în studiu;

evaluarea parametrilor cinetici i funcţionali a

i enzimelor;

separarea i purificarea enzimelor din surse bio

logice;

imobilizarea enzimelor pe suporturi solide, inso

lubile, în vederea obţinerii de

biocatalizatori heterogeni;

determinarea caracteristicilor cinetice i funcţ

ionale ale imobilizatelor enzimatice

comparativ cu enzimele native;

determinarea condiţiilor optime de reacţie în ca

zul realizării unei transformări en

zimatice

in vitro

, atât cu enzime libere cât i imobilizate.

I. IMPORTANŢA I LIMITELE ANALIZEI ENZIMATICE

I.1. GENERALITĂŢI

Analiza enzimatică, apărută iniţial ca o ramură

a chimiei analitice, nu este un dome

niu nou. Astfel, în 1845, Osann utilizează peroxida

za în analiza cantitativă a apei oxigenate, iar

Schonbein stabilete în l851 că valoarea minimă det

ectabilă a concentraţiei H

2

O

2

prin această

metodă corespunde unei diluţii de 1:2.000.000.

Analiza enzimatică presupune realizarea

in vitro

a reacţiilor biochimice ce au loc

in

vivo

în

condiţii fizicochimice cât mai apropiate posibil d

e cele asigurate de celula vie. Folosirea

enzimelor ca reactivi face posibilă utilizarea reac

ţiilor biochimice catalizate de acestea la dozarea

substratelor, respectiv a produilor de reacţie. De

exemplu, lactatdehidrogenaza participă

in vivo

la realizarea echilibrului redox între lactat i pi

ruvat.

In vitro

, aceeai enzimă permite conversia

acidului piruvic în acid lactic i invers în funcţi

e de condiţiile de reacţie (când se realizează o

hidrogenare, respectiv o dehidrogenare), ceea ce fa

ce posibilă dozarea lactatului sau piruvatului

întrun mediu dat. De aceea, prin analiză enzimatic

ă se pot doza atât substratele enzimelor cât i

2

produii reacţiilor catalizate de acestea, precum

i efectorii specifici (activatori i/sau inhibitori

)

nedozabili prin metode chimice din cauza concentraţ

iei lor extrem de mici.

Importanţa practică a analizei enzimatice constă,

în primul rând, în posibilitatea de

terminării specifice a unor substanţe întrun mediu

dat, chiar dacă acestea se găsesc în concentra

ţii extrem de mici. Conceptul de "analiză enzimatic

ă" include trei aspecte principale:

a) Determinarea diferitelor substanţe cu ajutorul e

nzimelor.

Datorită specificităţii de

acţiune, enzimele pot fi utilizate la dozarea cu ma

re exactitate a substratelor, produilor de reac

ţie i a efectorilor. Deoarece reacţiile enzimatice

au loc în condiţii fiziologic normale de pH,

temperatură, presiune osmotică etc., analiza enzima

tică permite i dozarea substanţelor labile.

b) Determinarea activităţii catalitice a enzimelor.

Analiza enzimatică presupune i

determinarea activităţii acestor catalizatori, des

utilizată în diferite domenii ale societăţii umane.

Dintrun motiv sau altul, activitatea diferitelor e

nzime se determină în lichide biologice precum

i în ţesuturi i organe de origine animală sau veg

etală.

c) Determinarea unor substanţe cu ajutorul reactivi

lor "marcaţi" enzimatic.

Astăzi

există posibilitatea de a fixa enzimele prin legare

covalentă pe diferite molecule cu o structură

extrem de diversă, fără pierderea activităţii catal

itice. Preparatele obţinute poartă numele de reac

tivi "marcaţi" enzimatic. Datorită specificităţii i

nteracţiunilor antigenanticorp, precum i datorită

existenţei proteinelor ale căror molecule conţin re

ceptori specifici, au putut fi puse la punct me

tode imunoenzimatice de analiză extrem de sensibile

cu ajutorul cărora se pot doza proteinele cu

proprietăţi imunologice dar lipsite de activitate e

nzimatică.

I.2. IMPORTANŢA ANALIZEI ENZIMATICE

Datorită performanţelor sale, analiza enzimatică e

ste utilizată astăzi în mai multe

domenii ale activităţii umane.

a) Biochimia generală.

Analiza enzimatică prezintă o importanţă deosebită

în primul

rând pentru progresul biochimiei în ansamblu, cerce

tările de enzimologie contribuind la o mai

bună înţelegere a căilor metabolice i mecanismelor

de realizare a acestora, a structurii chimice

i rolului biologic al glucidelor, lipidelor, prote

inelor i chiar al vitaminelor i hormonilor. Din

acest punct de vedere, Hess afirma în 1974: "biochi

mia enzimelor este mama metodelor enzima

tice. În acelai timp noile metode au o contribuţie

substanţială nu numai la dezvoltarea i progre

sul biochimiei enzimelor ci, în egală măsură, la de

zvoltarea biochimiei în ansamblu, printrun

mecanism de tip

feed back

".

b) Chimia alimentară.

În acest domeniu enzimele se utilizează din ce în

ce mai mult,

în special pentru dozarea glucidelor (mono, oligo

i polizaharidelor), unor acizi organici (acid

citric, lactic, malic etc.), unor alcooli (etanol,

glicerină, sorbitol etc.), aminoacizilor etc. În pr

o

dusele alimentare i în materiile prime folosite în

industria alimentară.

c) Industria de cosmetice

. De regulă, standardele aplicate în industria alim

entară se

aplică i în cosmetică în majoritatea ţărilor care

posedă această ramură industrială. Foarte des se

utilizează analiza enzimatică pentru determinarea g

licerolului, glucozei, fructozei, colesterolului,

acizilor lactic i citric, etanolului etc. în difer

ite creme de întreţinere i tratament.

d) Agrochimie.

Metodele enzimatice sunt utilizate din ce în ce mai

mult pentru studi

ul metabolismului plantelor în vederea creterii re

zistenţei la secetă, boli etc., precum i pentru

evaluarea comportamentului la stocare al produselor

vegetale. Aceste metode se aplică în egală

măsură la studiul biologiei solului.

e) Microbiologie. În

microbiologie, analiza enzimatică este folosită, î

n principal, la

evaluarea creterii i dezvoltării microorganismelo

r precum i la studiul metabolismului micro

bian. În cazul în care cultivarea microorganismelor

se face în scopul obţinerii de enzime, mediul

nutritiv are o compoziţie adecvată în aa fel încât

să fie indusă biosinteza enzimei vizate. De

exemplu, lichidul de cultură pentru

Candida mycoderma

va

conţine i glicerină care va induce

biosinteza glicerolkinazei.

3

f) Biochimia clinică.

Atât în medicina umană cât i în cea veterinară, en

zimologia în

general i analiza enzimatică în special prezintă o

importanţă deosebită atât în diagnostic cât i în

urmărirea evoluţiei bolii în perioada de spitalizar

e. În ultimul timp enzimologia este considerată,

de altfel, o specialitate medicală importantă.

În laboratoarele clinice de biochimie se determină

în mod curent activitatea

aminotransferazelor, creatinkinazei, fosfomonoester

azelor alcalină i acidă, amilazei etc., iar

pentru dozarea altor parametri biochimici (glucoza,

trigliceridele, colesterolul, ureea, acidul uric

etc.) se folosesc cu succes metodele enzimatice de

analiză.

I.3. PRINCIPII GENERALE DE DETERMINARE A ACTIVI-

TĂŢII ENZIMELOR

Orice lucrare practică de enzimologie trebuie să în

ceapă cu aprofundarea metodelor

de determinare a activităţii enzimei respective i

stabilirea condiţiilor care să asigure viteza ma

ximă de reacţie. Spre deosebire de majoritatea celo

rlalţi compui biochimici, cantitatea unei en

zime nu poate fi măsurată, cu unele excepţii, în va

lori absolute, adică în mg sau moli de enzimă.

De aceea, cantitatea unei enzime se estimează indir

ect, în funcţie de activitatea ei sau, altfel spus,

în funcţie de viteza reacţiei catalizată de enzima

respectivă.

Activitatea catalitică a enzimelor se poate evalua

în mod diferit: fie după viteza de

acumulare a produilor reacţiei enzimatice date, fi

e după viteza de epuizare (diminuare) a

substratelor i cofactorilor întrun interval de ti

mp dat.

Se recomandă ca activitatea catalitică a enzimelor

să se determine în funcţie de viteza

iniţială de reacţie deoarece în acest interval de t

imp există un exces de substrat, iar produii de

reacţie nu sau acumulat încă în cantităţi prea mar

i. Mai exact, este de dorit ca determinarea acti

vităţii enzimelor să se efectueze în condiţiile în

care cantitatea de substrat transformată să nu

depăească 20% din cea iniţială.

Sa constatat experimental că în aceste condiţii e

xistă o dependenţă liniară (de tipul

y = ax

sau

y = ax + b

) între cantitatea de substrat transformată i timp

ul de incubare.

Pentru determinarea activităţii enzimelor se pot u

tiliza, în funcţie de tipul reacţiei

catalizate, metodele de analiză colorimetrice, spec

trofotometrice, fluorimetrice, manometrice,

conductimetrice, vâscozimetrice, cromatografice, el

ectroforetice etc. În laboratoarele clinice, de

cercetare sau industriale cu profil de biochimie se

utilizează cel mai adesea metodele colorime

trice i spectrofotometrice de analiză.

Metodele colorimetrice

se bazează pe măsurarea intensităţii culorii subst

anţei ce se

formează prin interacţiunea substratului sau a prod

usului de reacţie cu un reactiv specific care se

adaugă în probă după stoparea reacţiei enzimatice.

La baza

metodelor spectrofotometrice

de

analiză se află absorbţia luminii în domenii

determinate ale spectrului, de către substratele sa

u produii de reacţie, uneori de către cofactorii

enzimelor bicomponente. Spectrele acestor substanţe

pot avea maximele de absorbţie la o lungi

me de undă determinată, atât în domeniul ultraviole

t cât i în cel vizibil sau infrarou.

Pentru eliminarea factorilor de eroare, la determi

narea activităţii unei enzime este

necesar să se efectueze, pe lângă proba propriuzis

ă (proba de cercetat sau proba cu enzimă acti

vă) i un martor în care enzima se inactivează în p

realabil prin fierbere sau prin modificarea

puternică a pHului. Acest martor este absolut nece

sar deoarece, în unele cazuri, pot avea loc

modificări spontane ale substratului, necorelate di

rect cu activitatea catalitică a enzimei. Expri

marea activităţii enzimelor, indiferent de metoda f

olosită la determinarea acesteia, se poate face

în mai multe moduri:

unitatea internaţională

a activităţii enzimatice se definete ca fiind cant

itatea de

enzimă ce poate modifica un micromol de substrat în

trun minut în condiţii standard de reacţie.

activitatea specifică

este egală cu masa enzimei exprimată în miligrame

ce poate

transforma un micromol de substrat întrun minut în

condiţii standard i se exprimă în

micromol/min ⋅mg proteină. În acelai timp, activitatea specific

ă este i o măsură a purităţii en

4

zimei, ea crete în timpul purificării i devine ma

ximă i constantă atunci când enzima este în

stare pură.

- activitatea molară

sau moleculară, numită i număr de turnover, repre

zintă numă

rul de molecule de substrat transformate întrun mi

nut de către o singură moleculă de enzimă,

când acesta reprezintă factorul limitant al vitezei

. Activitatea moleculară a unei enzime cu un

singur centru activ poate fi calculată din valoarea

V

max

i din masa sa moleculară.

O nouă

unitate

de activitate enzimatică recomandată de Comisia de

Enzimologie

este

katal

ul (prescurtat

kat

), definită ca fiind acea cantitate de enzimă ce t

ransformă un mol de

substrat întro secundă în condiţii standard de rea

cţie. În funcţie de viteza de reacţie, se pot folos

i

multiplii i submultiplii ( de exemplu microkatali,

nanokatali etc.). Dei metodele de determinare

a activităţii catalitice diferă foarte mult de la o

enzimă la alta, există unele principii comune i

unele manevre experimentale ce se respectă în toate

cazurile. Astfel, pentru determinarea practi

că a activităţii oricărei enzime se va realiza înto

tdeauna o probă de analizat i un martor în care

mediul de reacţie are, în final, aceeai compoziţie

. Singura diferenţă constă în faptul că în probă

enzima acţionează asupra substratului transformându

l, iar în martor, printro modalitate sau alta,

se face în aa fel încât enzima să nu acţioneze asu

pra substratului.

Deoarece viteza de reacţie se raportează întotdeau

na la unitatea de timp este necesar

ca procesul catalitic să se desfăoare întrun inte

rval de timp bine determinat. Pentru aceasta se

cronometrează timpul de reacţie din momentul în car

e enzima intră în contact cu substratul, iar

stoparea reacţiei se face de regulă prin modificare

a bruscă a pHului mediului de incubare. În

unele metode colorimetrice de analiză reactivul de

culoare folosit pentru dozarea produsului de

reacţie sau a substratului rămas netransformat poat

e fi, în acelai timp i un factor ce stopează

procesul biocatalitic (de exemplu, soluţia de dinit

rofenilhidrazină folosită ca reactiv de culoare în

determinarea activităţii aminotransferazelor).

Unii factori de mediu (temperatura, pHul, presiun

ea osmotică etc.), manifestă o pu

ternică influenţă asupra vitezei reacţiilor enzimat

ice. Din această cauză, în mediul de incubare

trebuie să se realizeze condiţiile optime de reacţi

e, condiţii care să se apropie cît mai mult de

condiţiile naturale în care enzima respectivă acţio

nează

in vivo.

Pe de altă parte, viteza unei reac

ţii enzimatice se modifică în funcţie de concentraţ

ia enzimei, concentraţia substratului, natura i

concentraţia soluţiei tampon etc.

I.4. LIMITELE ANALIZEI ENZIMATICE

Analiza enzimatică se utilizează, cu precădere, la

dozarea substratelor enzimatice sau a

unor substanţe capabile să influenţeze pozitiv sau

negativ activitatea catalitică a enzimelor. La

determinarea activităţii enzimelor nu există practi

c factori limitanţi. În mod similar, la dozarea

unor substanţe lipsite de activitate catalitică dar

active din punct de vedere imunologic nu se în

trevăd actualmente limite de aplicabilitate. Celela

lte aspecte ale analizei enzimatice prezintă însă

anumite limite de aplicabilitate ce depind de eroar

ea de metodă, respectiv de aspectele economi

ce.

a) Limite metodologice.

Spre deosebire de celelalte metode de analiză, ana

liza enzi

matică se caracterizează printro mare sensibilitat

e. Dacă metodele fotometrice pot detecta con

centraţii ale anumitor compui de ordinul micromoli

lor, metodele enzimatice permit analiza unor

cantităţi mult mai mici, de ordinul nanomolilor. Ac

eastă sensibilitate este multiplicată de două

sau chiar de trei ori dacă analiza enzimatică se re

alizează prin metode fluorimetrice.

Ca i în cazul celorlalte metode analitice, există

i limite ale analizei enzimatice, mai

ales atunci când acestea se fac cu ajutorul analiza

toarelor automate. Deseori, aceste aparate nu

permit determinarea simultană a probelor i martor

ilor, dar nici realizarea unor reacţii prelimina

re. De aceea, este necesară modificare tehnicilor c

lasice. De exemplu se poate iniţia reacţia cu

ajutorul unui reactiv diferit de cel utilizat în me

todele manuale.

5

b) Limite economice.

Noţiunea de "reactiv enzimatic înalt purificat" est

e asociată, de

regulă, cu noţiunea de "reactiv scump". În realitat

e nu trebuie făcută această similitudine deoare

ce tehnicile respective presupun utilizarea unor ca

ntităţi extrem de mici de preparate enzimatice.

Cu toate acestea, unele metode practice, în specia

l cele utilizate în chimia alimentară, presupun

un preţ de cost mult mai ridicat comparativ cu meto

dele fizicochimice. Acest dezavantaj este

însă anulat de exactitatea i specificitatea metode

lor enzimatice, precum i de timpul mult mai

scurt afectat analizei respective.

I.5. SURSE DE ENZIME

Din punctul de vedere al localizării lor, enzimele

se clasifică în două grupe principale:

a)

enzime solubilizate

în diferite lichide biologice (sânge, urină, lichid

cerebrospinal, li

chid interstiţial, spermă, salivă, citoplasmă, medi

u de cultură pentru microorganisme, sevă etc.);

b)

enzime fixate

pe diferite structuri tisulare i subcelulare. În a

cest din urmă caz, multe enzime

sunt puternic legate de diferite componente ale mem

branelor biologice, făcând parte din structura

lor. Alegerea sursei optime pentru izolarea i puri

ficarea unei enzime date se face în funcţie de

mai multe criterii. În primul rând se alege materia

lul biologic cel mai bogat în enzima respectivă.

Enzimele ce se utilizează în calitate de biocataliz

atori în industria alimentară, farmaceuti

că, textilă, de pielărie etc. pot fi obţinute pract

ic din toate sursele biologice, existând din acest

punct de vedere trei categorii de enzime:

– enzime de origine vegetală;

– enzime de origine animală;

– enzime de origine microbiană.

a) Enzimele de origine vegetală

Din sursele vegetale se obţine o gamă largă de enzi

me, mai importante din punct de vede

re practic fiind enzimele proteolitice:

papaina

sintetizată de o plantă din zonele tropicale (

Carica

papaya

),

bromelina

sintetizată de ananas (

Ananas comosus

Merr),

ficina

din

Ficus glabrata

i

altele. Toate aceste enzime sunt proteinaze tiolice

deoarece conţin în centrul lor activ o grupare

tiolică liberă (un rest de cisteină) indispensabilă

activităţii lor catalitice. Arborele de papaya est

e

o plantă foarte răspândită în zonele tropicale, iar

papaina brută sau purificată se obţine industrial

în cantităţi foarte mari datorită numeroaselor sale

aplicaţii practice în domeniul industrial i tera

peutic.

Cantităţile cele mai mari de papaină (aproximativ 1

2% din substanţa uscată) se găsesc în

fructele de papaia, înainte de coacere. Pentru obţi

nerea industrială a papainei pure se recoltează

latexul care se depozitează la rece (+4

o

C). Pentru înlăturarea impurităţilor se diluează cu

apă

distilată, se agită i se centrifughează sau se fil

trează pe kiesselguhr, după care se liofilizează su

b

vid la 50

o

C. Se obţine o pudră de culoare albă care însă se o

xidează relativ uor, devenind brună,

datorită prezenţei grupelor –SH libere. Din această

cauză, ambalarea se face în condiţii care îm

piedică atât oxidarea cât i contaminarea microbian

ă.

Activitatea proteolitică a papainei industriale ast

fel obţinute oscilează între 40.000 i

84.000 U.P. (unităţi proteazice). Prin electroforez

ă pe acetat de celuloză sa demonstrat faptul că

preparatele industriale de papaină conţin trei comp

onente majore:

papaina

(EC 3.4.22.2),

chimopapaina

(EC 3.4.22.6) i

lizozimul

sau

muramidaza

(EC 3.2.1.17).

Papaina

înalt purificată a fost cristalizată prima dată în

1937 de către

Balls, T

. et al. Ea

este o enzimă tiolică ce conţine 211 resturi de ami

noacizi i are o masă moleculară de 23 kDa.

Temperatura optimă de acţiune se situează între 55

– 60oC, enzima având o termostabilitate

crescută (denaturarea termică se observă abia la 65

– 70°C), iar pHul optim se înscrie în dome

niul de pH 5,0 – 7,0 ceea ce facilitează utilizarea

sa în diferite procese biotehnologice. Este o

enzimă foarte rezistentă la acţiunea denaturantă a

solvenţilor organici. Specificitatea de acţiune a

papainei este relativ largă, ea recunoscând nu mai

puţin de apte aminoacizi. Scindează însă pre

ferenţial legăturile peptidice realizate de resturi

le fenilalanină din interiorul catenelor

polipeptidice, fiind o endopeptidază.

Dei este o enzimă foarte stabilă, orice modificare

, chiar i minoră în structura sa primară condu

ce la rezultate spectaculoase. Astfel, prin substit

uirea restului

Cys25

cu un derivat izoaloxazinic

6

cu acţiune inhibitoare, papaina îi pierde complet

activitatea peptidazică, în schimb capătă pro

prietatea de a oxida unii analogi ai NADHului.

Papaina se utilizează în multe domenii industriale.

Din cele aproximativ 300 de tone cât

este consumul anual, aproximativ 75% reprezintă con

sumul în industria berii, 10% în industria

cărnii, 5% în fabricarea hidrolizatelor de pete i

capete de pasăre pentru nutriţia animalelor, 2%

în industria chimicofarmaceutică etc. Preparatele

de papaină imobilizată se folosesc la hidroliza

latexului de arahide, hidrolizatele obţinute utili

zânduse la stabilizarea fizicochimică a sucurilor

de struguri i mere.

Chimopapaina

este o altă proteinază tiolică sintetizată de

Carrica papaya

. Ea se deose

bete de papaină printro solubilitate mai mare i

printro

mai bună stabilitate la valori acide de

pH. În latexul arborelui de papaya,

conţinutul în chimopapaină este cu mult mai mare de

cât cel

de papaină, iar

masa sa moleculară este cuprinsă între 27 – 33 kDa.

În afară de proteine,

chimopapaina mai hidrolizează i alte substrate cum

ar fi peptidele, poliamidele

i esterii ami

noacizilor. Prin electroforeză pe acetat de celuloz

ă, fracţiunea

proteică reprezentată de

chimopapaină se separă în două subfracţiuni care

au fost catalogate ca fiind chimopapaina A i

respectiv chimopapaina B.

Ficina

numită i

ficaină

sau

debricină

,

(EC 3.4.22.3) este o proteinază

tiolică din latexul

plantelor aparţinând genului

Ficus

. Molecula sa conţine o

singură catenă polipeptidică i are ma

sa moleculară de aproximativ 26 kDa.

Specificitatea de substrat a ficinei este relativ l

argă, iar

activitatea catalitică

maximă se manifestă întrun interval larg de pH.

b) Enzimele de origine animală

În prezent, dintre enzimele de origine animală, cea

mai mare importanţă pentru industrie

o prezintă

pepsina

porcină i bovină. Pepsina bovină este un constitue

nt normal al cheagului,

secreţia sa fiind abundentă după înţărcare. Utiliza

rea practică a pepsinei porcine a început în pe

rioada anilor ’30 din secolul XX dar a cunoscut o a

mploare deosebită după 1960.

Pentru obţinerea sa la scară industrială, se utiliz

ează mucoasa gastrică de porc unde pep

sina se găsete sub forma precursorului său inactiv

numit

pepsinogen

. Pentru obţinerea pepsinei

se pot utiliza mai multe metode, cea mai des folosi

tă fiind extracţia, din mucoasa raclată, cu apă

distilată acidulată cu acid clorhidric în prezenţă

de cloroform. După filtrare se concentrează prin

liofilizare, obţinânduse o pulbere albă, solubilă

în apă (

Scriban, R. – 1993

).

Activarea pepsinogenului se realizează la pH < 6,0

i constă întro proteoliză limitată prin

care se clivează mai multe peptide. Această convers

ie a pepsinogenului în pepsină activă se rea

lizează practic prin menţinerea zimogenului timp de

patru minute la pH = 2,0 – 2,5 sau timp de

12 ore la pH = 3,0.

Pepsina obţinută este de fapt un amestec de trei en

zime:

pepsina A

(EC 3.4.23.1),

pepsi'

na B

(EC 3.4.23.2) i

pepsina C

(EC 3.4.23.3), iar activitatea catalitică este cons

iderabilă în in

tervalul de pH 1,0 – 4,0 cu un pH optim de acţiune

de 1,8 dar care poate însă oscila în funcţie de

natura substratului.

La temperaturi mai mari de 55°C pepsina aflată în s

oluţie apoasă este termolabilă, fapt ce

îi limitează utilizarea în diferite procese biotehn

ologice, însă anumite tratamente de corecţie îi

conservă capacitatea de coagulare a cazeinei, propr

ietate ce stă la baza fabricării brânzeturilor.

Astfel, modificarea unei grupe –COOH libere (de exe

mplu prin esterificare) în molecula pepsinei

porcine conduce la o modificare profundă a specific

ităţii de acţiune i a proprietăţilor catalitice i

fizicochimice. Sub această formă modificată pepsin

a îi conservă însă capacitatea de a coagula

proteinele putând fi folosită în industria laptelui

. Actualmente, pepsina se folosete în industria

băuturilor răcoritoare, în industria berii la stabi

lizarea coloidală în timpul pasteurizării etc. Toat

e

aceste utilizări se bazează pe proprietatea pepsine

i de a precipita proteinele i polipeptidele (efec

tul

clotting

) în sucuri, bere, lapte etc.

Mai menţionăm faptul că pepsina poate realiza scind

area hidrolitică a unor enzime cum ar

fi amilazele, tripsina, papaina etc., fapt de care

trebuie să se ţină cont la utilizarea sa practică.

Au

mai fost obţinute preparate de pepsină i din stoma

cul altor animale, cea mai intens studiată fiind

pepsina din morunul din Oceanul Atlantic. La 15°C a

ceastă pepsină prezintă o capacitate de coa

7

gulare a laptelui mult mai mare decât cheagul de vi

ţel, fiind astăzi utilizată în procesul tehnolo

gic de obţinere a cacavalului Cheddar. Aceleai br

ânzeturi se pot fabrica i prin utilizarea pepsi

nei de găină cu condiţia ca maturarea să nu depăea

scă trei luni. Aproximativ 50% din cacavalul

fabricat în Israel se obţine cu ajutorul pepsinei d

e găină, iar în Canada sau obţinut rezultate foar

te bune în fabricarea cacavalului Cheddar prin uti

lizarea pepsinei de focă (

Shamsuzzaman, K. et

al.

– 1985).

c) Enzimele de origine microbiană

Obţinerea enzimelor de origine microbiană a luat o

amploare deosebită după clarificarea

mecanismelor de biosinteză a enzimelor de către mic

roorganisme.

Spre deosebire de sursele de origine vegetală i an

imală, folosirea surselor microbiene de

enzime prezintă unele avantaje majore:

– producţia de enzime de natură microbiană nu depin

de de condiţiile climaterice i geo

grafice;

– se utilizează materii prime regenerabile ce pot f

i reprezentate deseori de deeuri din alte

industrii;

– randamentele pot fi mărite prin optimizarea condi

ţiilor de cultivare i prin alegerea de

tulpini microbiene performante.

Toate aceste avantaje au făcut ca producţia mondial

ă de enzime de origine microbiană să

cunoască o dezvoltare importantă în ultimele deceni

i, pentru obţinerea lor fiind necesară parcur

gerea mai multor etape obligatorii:

○ Stabilirea enzimei ce urmează a fi obţinută

În obţinerea unei enzime de uz industrial se ţine c

ont, în primul rând, de procesele de

biotransformare în care va fi utilizată enzima resp

ectivă. Este absolut obligatorie determinarea

principalelor caracteristici ale enzimei în cauză,

cele mai importante fiind următoarele:

–

Specificitatea de acţiune

. Din acest punct de vedere o problemă extrem de im

portantă

o constituie activitatea globală a preparatelor enz

imatice comerciale dată fiind probabilitatea

existenţei i altor capacităţi catalitice pe lângă

cea principală, activităţi ce pot realiza transfor

mări indezirabile.

În cazul pectinazei de exemplu (enzimă utilizată pe

scară largă în industria de cofetărie),

preparatele enzimatice pot conţine de fapt trei enz

ime cu activităţi catalitice diferite. În funcţie d

e

procesele ce urmează a se realiza, se aleg preparat

ele enzimatice convenabile a căror specificitate

de acţiune se manifestă faţă de substratele de care

dispunem.

–

pH-ul optim de acţiune

. Acest factor poate manifesta o influenţă hotărâto

are asupra

bunei desfăurări a proceselor biotehnologice reali

zate de enzime. În general, se aleg enzime ce

îi menţin activitatea catalitică întrun interval

cât mai larg posibil de pH.

–

Temperatura optimă de acţiune

. În general, în industrie sunt preferate enzimele

a că

ror temperatură optimă de acţiune este cât mai mare

posibil deoarece la temperaturi relativ cres

cute este facilitată menţinerea sterilităţii mediul

ui.

○ Alegerea tulpinii microbiene

Microorganismele capabile să sintetizeze în cantită

ţi crescute anumite enzime se întâl

nesc, în condiţii naturale, în acele habitaturi car

e conţin substratele enzimelor respective, acesta

fiind un factor extrem de important de care se ţine

cont în alegerea tulpinii producătoare. De

exemplu, dacă se intenţionează să se obţină enzime

celulozolitice, tulpinile microbiene producă

toare se vor izola din medii naturale bogate în cel

uloză. Iniţial cele mai multe microorganisme se

izolau din sol. Actualmente însă aria cercetărilor

a fost mult extinsă, fiind studiată posibilitatea

izolării producătorilor industriali de enzime i di

n alte surse: ape reziduale, reziduuri din indus

tria celulozei, a pielăriei, cea alimentară etc., r

eziduuri din zootehnie i altele.

Pentru izolarea tulpinilor microbiene producătoare

de enzime se folosesc metodele clasi

ce, cea mai importantă fiind metoda cultivării pe m

edii îmbogăţite urmată de realizarea de sub

culturi pe medii selective. Întrun mediu selectiv

ideal, substratul enzimei în cauză reprezintă

unica sursă a unuia din elementele vitale (de exemp

lu unica sursă de carbon). Astfel, pentru obţi

8

nerea de amilaze, mediul selectiv trebuie să conţin

ă amidonul ca unică sursă de carbon i ener

gie.

Pentru obţinerea de enzime la scară industrială, tu

lpinile microbiene producătoare trebuie să în

deplinească o serie de condiţii:

să se dezvolte pe medii cât mai simple cu putinţă

i ieftine;

să producă cât mai puţini metaboliţi secundari;

enzima ce urmează a fi obţinută să fie exportată

în mediul de incubare în aa fel încât să

fie uor de izolat i purificat;

să nu fie poluante;

să nu fie patogene i să nu producă metaboliţi to

xici.

Dacă enzimele în cauză urmează să fie utilizate în

industria alimentară, tulpinile microbiene pro

ducătoare trebuie să îndeplinească toate condiţiile

impuse produselor alimentare. De aceea, orice

nouă tulpină studiată, înainte de a fi utilizată în

producerea de enzime, este supusă unui minuţios

examen toxicologic, ceea ce necesită mult timp.

Acesta este motivul datorită căruia majoritatea cer

cetătorilor preferă tulpinile microbiene

deja incluse în cataloagele GRAS. După alegerea tul

pinii producătoare se pot face numeroase

studii de optimizare a proceselor fermentative, iar

ingineria genetică oferă posibilităţi teoretic

infinite de ameliorare. Se apelează foarte des la r

ealizarea de mutante în vederea obţinerii unor

tulpini producătoare de enzime cu randamente superi

oare.

În acelai timp, prin mutaţii pot fi suprimate acel

e caractere ale tulpinii sălbatice care in

fluenţează negativ producţia industrială a enzimelo

r, dat fiind faptul că, deseori, tulpinile sălbati

ce produc unii metaboliţi secundari, alte enzime de

cât cea care ne interesează, antibiotice etc.,

compui ce se elimină relativ greu. De exemplu, în

cazul obţinerii glucoamilazei, preparatele

rezultate conţin de multe ori cantităţi relativ mar

i de transglucozidază, iar proteaza

produsă de

Bacillus licheniformis

este impurificată cu bacitracină. Cea mai eficientă

metodă con

stă în obţinerea unor mutante care să nu producă me

taboliţii secundari respectivi.

În ultimul timp, ingineria genetică oferă noi posib

ilităţi de obţinere a enzimelor de interes

industrial. Cel mai adesea se recurge la clonarea g

enei responsabile de biosinteza unei enzime

dintrun microorganism incompatibil cu industria al

imentară întrun al microorganism agreat de

G.R.A.S.

○ Cultivarea tulpinii producătoare

Iniţial, enzimele de origine microbiană se obţineau

prin realizarea culturilor de suprafaţă

pe medii solide sau semisolide. Această metodă se m

ai utilizează încă la obţinerea unor enzime

de origine fungică cum ar fi amilazele (

Aspergillus sp.

), proteazele (

Aspergillus sp.

i

Mucor

sp.

), pectinazele (

Penicillium sp.

) i altele. Actualmente sunt însă preferate cultur

ile submerse

deoarece în cazul culturilor pe mediu solid apar di

ficultăţi în ceea ce privete controlul tempera

turii, umidităţii i aerării. Culturile în mediu li

chid reduc riscul contaminării i permit controlul

periodic al parametrilor biochimici i microbiologi

ci.

○ Extracţia ,i purificarea enzimelor

La sfâritul perioadei de cultivare, enzimele trebu

ie extrase din celule i/sau lichidul de

cultură după care sunt supuse unui ir de operaţiun

i pentru obţinerea preparatelor comerciale. Cel

mai adesea se folosete centrifugarea, filtrarea, e

vaporarea, precipitarea reversibilă, liofilizarea

.a., iar preparatele enzimatice obţinute se pot co

mercializa sub formă de pudre, soluţii, cristale,

sub formă imobilizată etc.

15

II.1.4 Enzimele în oncologie

Terapeutica anticanceroasă a cunoscut un impuls imp

ortant când sa observat că serul de

cobai posedă activitate antitumorală. Acest fenomen

constă în degradarea Lasparaginei sub ac

ţiunea asparaginazei din ser cu efecte letale asupr

a celulelor tumorale, în special leucemice.

Enzimoterapia leucozelor nu este realizabilă actual

mente decât cu ajutorul asparaginazei extrasă

din

Escherichia coli

. Au fost purificate două asparaginaze, A i B, ide

ntice imunologic, dar dis

tincte prin punctul lor izoelectric. Aceste două en

zime posedă aceeai activitate catalitică i au

aceeai masă moleculară (130 kDa) dar se deosebesc

prin perioada de înjumătăţire. L

asparaginaza A este principiul activ al preparatulu

i farmaceutic cunoscut sub denumirea comer

cială de

Crasnitine

. Acest preparat a dat rezultate bune în leucemiile

limfoblastice acute la copii.

Această afecţiune răspunde relativ bine i la chimi

oterapie, tendinţa actuală fiind de a asocia L

asparaginaza cu chimioterapia.

După cum au demonstrat experienţele pe animale i o

bservaţiile clinice asupra efectelor

secundare, o întreagă serie de celule normale neces

ită asparaginază exogenă întro măsură mai

mare sau mai mică. Cercetări de mare anvergură asup

ra acestor aspecte au permis jalonarea unui

principiu pentru cercetările viitoare asupra enzime

lor ce catabolizează aminoacizii, alţii decât

asparagina. În urmă cu câţiva ani sa propus experi

mentarea preparatelor de arginază în oncolo

gie deoarece arginina stimulează creterea unor t

umori. În unele laboratoare se experimentează

Lglutaminaza, rezultatele nefiind deocamdată concl

udente.

II.2 UTILIZAREA ENZIMELOR ÎN INDUSTRIE

Enzimele se utilizează de multă vreme cu succes în

diferite procese de biosinteză. Speci

ficitatea de acţiune a acestora, viteza mare de rea

cţie, posibilitatea realizării diferitelor procesel

e

de biotransformare în condiţii blânde de reacţie, l

ipsa produilor secundari indezirabili constituie

o parte din factorii care facilitează utilizarea en

zimelor în calitate de catalizatori ai multor proce

se de biotransformare. În organismul viu au loc zec

i de mii de reacţii enzimatice diferite. Pro

blema obţinerii anumitor produi ai acestor reacţii

in vitro

este pe deplin realizabilă.

II.2.1 Utilizarea enzimelor în industria alimentară

Toate ramurile industriei alimentare reprezintă do

menii importante de aplicabilitate pen

tru enzimologie. Multe procese utilizate astăzi în

industria alimentară sunt cunoscute de foarte

mult timp și sunt realizate de către microorganisme

prin echipamentele lor enzimatice: fermenta

rea mustului în vinificaţie, oţetirea vinului, ferm

entarea aluatului în panificaţie, obţinerea brânze

turilor prin fermentaţie lactică etc.

Industria alimentară modernă are la bază procesele

clasice, unele din ele cunoscute încă

din antichitate, aceste procese fiind modernizate p

rin diferite modificări printre care și folosirea

unor enzime. Multe firme de prestigiu din industria

de panificaţie de exemplu, folosesc diferite

preparate enzimatice, în special amilaze și unele p

roteinaze, introduse în cocă în concentraţii

determinate în vederea îmbunătăţirii caracteristici

lor fizice și organoleptice ale pâinii, iar lipaza

este utilizată ca emulgator natural.

Este cunoscut faptul că soluţiile de zaharoză, chi

ar și cele concentrate, reprezintă medii

optime pentru dezvoltarea unor mucegaiuri și altor

microorganisme. Datorită acestui fapt, produ

sele de cofetărie au un termen de valabilitate foar

te redus. Pe de altă parte, capacitatea de îndul

cire a zahărului invertit (amestec echimolecular de

glucoză și fructoză) este aproape dublă faţă

de zaharoza pură. Din această cauză, mierea de albi

ne pură nu este fermentescibilă. Plecând de la

aceste considerente, în industria de cofetărie se u

tilizează cu succes

invertaza

care hidrolizează

zaharoza cu formare de zahăr invertit mult mai dulc

e, nefermentescibil și cu o solubilitate cres

16

cută. Se realizează totodată importante reduceri al

e consumului de zahăr. Aceeai enzimă se uti

lizează și la fabricarea mierii artificiale ca înlo

cuitor al mierii de albine.

Fabricarea berii prin utilizarea glucozei ca mater

ie primă ar crete enorm preţul de cost al

acestui produs. De aceea se folosete ca materie pr

imă amidonul, mult mai ieftin, îmbogăţind

mediul de fermentaţie cu

α−

α−α−

α−

amilază

sub formă de malţ. Unele firme folosesc și

proteinaze

pen

tru scindarea hidrolitică a proteinelor care confer

ă un anumit grad de turbiditate al berii. Hidroli

za acestor proteine până la aminoacizi limpezete b

erea și conferă un gust uor dulce prin ami

noacizii formaţi.

Coagularea laptelui în industria brânzeturilor se

realizează cu ajutorul

reninei

datorită

acţiunii sale proteolitice. Determinarea activităţi

i unor enzime (fosfatazele, peroxidazele, amila

zele etc.) este utilizată în determinarea gradului

de pasteurizare a laptelui. Marea diversitate a

brânzeturilor obţinute de diferite firme din indust

ria laptelui este datorată nu numai utilizării di

feritelor tulpini microbiene ci și unor prelucrări

enzimatice specifice. În ţările aflate în curs de

dezvoltare din zonele călduroase ale globului este

imposibilă efectuarea transportului laptelui de

la producători la firmele de prelucrare în autocist

erne frigorifice din raţionamente economice.

Temperatura crescută a mediului ambiant, precum și

faptul că laptele constituie un substrat ideal

pentru multiplicarea microorganismelor, determină o

încărcare microbiană a acestuia. Adăugarea

perhidrolului (15 ml la fiecare 100 l de lapte) îm

piedică contaminarea microbiană, laptele ajun

gând la firmă aproape steril. Deoarece catalaza din

lapte este insuficientă pentru descompunerea

H

2

O

2

se adaugă mici cantităţi de catalază pură înainte

ca laptele să intre în procesele tehnologice.

!i alte domenii ale industriei alimentare benefici

ază de aportul enzimelor pentru îmbună

tăţirea calităţii produselor: industria cărnii, ind

ustria furajelor sub forma concentratelor vitamino

proteice, industria băuturilor răcoritoare etc.

II.2.2 Utilizarea enzimelor în industria farmaceuti

că

Industria chimicofarmaceutică poate folosi diferi

te preparate enzimatice în două scopuri

:

obţinerea de preparate farmaceutice sub formă de

tablete, unguente etc. conţinând dife

rite enzime "medicament" utilizate în tratament;

utilizarea enzimelor în diferite procese de sint

eză și semisinteză în vederea obţinerii de

noi medicamente. Un exemplu concret în acest sens î

l reprezintă utilizarea

penicilinazei

. Este

cunoscut faptul că utilizarea repetată a peniciline

i determină apariţia fenomenului de rezistenţă

care constă în inducerea biosintezei penicilinazelo

r de către flora microbiană din tubul digestiv.

Pentru a evita apariţia acestui fenomen, este neces

ară înlocuirea periodică a tratamentului clasic

prin utilizarea altor peniciline. Pentru aceasta se

fabrică penicilina clasică prin procedeele cunos

cute după care aceasta este supusă acţiunii hidrol

itice a penicilinazelor din

Escherichia coli

cu

obţinerea în final de

acid 6-aminopenicilanic

. Prin condensarea și esterificarea acestuia cu dif

e

riţi compui se obţin penicilinele de semisinteză c

are nu sunt recunoscute de penicilinaze.

II.2.3 Utilizarea enzimelor în alte domenii

!i alte ramuri industriale beneficiază de utilizăr

ile practice ale enzimologiei. Astfel în

industria chimică

sau făcut pai importanţi în obţinerea aa numiţi

lor detergenţi biologici cu

calităţi de înmuiere și spălare superioare. Acetia

conţin atât substanţe tensioactive cât și unele

enzime (lipaza, diferite proteinaze, amilaze) care,

prin acţiunea lor hidrolitică asupra impurităţi

lor de natură lipidică, proteică și glucidică, măre

sc considerabil capacitatea de spălare.

Prin utilizarea transferazelor au putut fi obţinute

noi substanţe organice care se obţin greu

prin sinteză organică și în stare impură. În mod si

milar a devenit posibilă separarea antipozilor

optici din amestecurile racemice sub acţiunea izome

razelor specifice.

17

Utilizarea enzimelor în

industria pielăriei

se bazează pe faptul că pieile de animale folo

site ca materii prime sunt produse biologice, iar d

iferitele tratamente enzimatice pot completa

procesele chimice de prelucrare în aa fel încât să

se obţină produse finale cu calităţi superioare.

Nu lipsite de interes sunt implicaţiile enzimelor

în procesele de

epurare a apelor rezi-

duale

, epurarea biologică fiind tot mai mult preferată.

Enzimele îi găsesc o largă aplicabilitate

și în

microbiologie

. Microorganismele se cultivă pe diferite medii de

cultură în vederea obţinerii

unei game variate de substanţe organice. Introducer

ea în mediul de cultură a unui substrat induce

biosinteza enzimei ce catalizează transformarea ace

stuia.

III ENZIME IMOBILIZATE

III.1 NOŢIUNEA DE ENZIMĂ IMOBILIZATĂ

Unul din domeniile principale ale biotehnologiei îl

reprezintă obţinerea, studiul i utilizarea

biocatalizatorilor heterogeni sub formă de enzime i

mobilizate. Noţiunea de

enzimă imobilizată

desemnează catalizatorul heterogen obţinut prin fix

area uneia sau mai multor enzime, sau a or

ganitelor subcelulare i a celulelor întregi pe sup

orturi insolubile, cu păstrarea capacităţii catalit

i

ce.

Dezvoltarea cercetărilor privind obţinerea enzimelo

r imobilizate este dictată atât de consi

derente fundamentale, cât mai ales aplicative. În u

ltimele 23 decenii sa acordat o atenţie tot mai

mare tehnologiilor enzimatice plecând de la dezvolt

area extensivă i intensivă a metodelor de

imobilizare i stabilizare a enzimelor. Cercetările

efectuate pe plan mondial sunt numeroase i au

scopul ambiţios de a substitui treptat sintezele ch

imice sau transformările i tratamentele chimice

aplicate industrial. În general, procedeele biocata

litice industriale se pot clasifica în funcţie de

tipul i starea biocatalizatorului astfel:

a)

biocatalize enzimatice

:

cu enzime în sistem liber;

cu enzime imobilizate;

b)

biocatalize realizate de celule

:

cu celule în sistem liber;

cu celule imobilizate.

Cercetările în acest domeniu întreprinse pe plan mo

ndial au condus la rezultate promiţă

toare, atât din punct de vedere fundamental cât i

aplicativ. Problema obţinerii enzimelor imobi

lizate cere îmbinarea unor cercetări multidisciplin

are cum ar fi:

cercetări de enzimologie i biologie moleculară p

rivind studiul structurii i stabilităţii

enzimelor libere i imobilizate;

cercetări în domeniul compuilor macromoleculari

i a materialelor anorganice poroase

în vederea obţinerii de suporturi solide pentru imo

bilizare;

cercetări în domeniul chimiei fizice i coloidale

de alegere a metodelor optime de imo

bilizare pentru fiecare enzimă i suport în parte;

cercetări de cinetica catalizei heterogene.

III.2 METODE DE IMOBILIZARE

Metodele de imobilizare a enzimelor se pot clasific

a în funcţie de natura interacţiunilor ce

au loc între enzimă i suport în procesul de imobil

izare. O primă clasificare a fost făcută de

Durand G. et al

. care consideră că există două categorii de metode

de imobilizare:

prin includere (entrapare ENT i microencapsula

re MEC);

prin legare (adsorbţie ADS i covalentă CVB).

Mai târziu sa făcut o altă clasificare, raţională,

a metodelor de imobilizare. Conform aces

tei clasificări metodele de imobilizare se împart î

n două mari grupe, fiecare conţinând alte sub

grupe de metode :

18

grupa A:

metode fizice de imobilizare

(metode de imobilizare prin adsorbţie, metode de

includere mecanică a moleculelor enzimatice în supo

rt prin reticulare, microîncapsulare, include

re în membrane de ultrafiltrare etc.);

grupa B:

metode chimice de imobilizare

(imobilizarea prin legare covalentă i imobili

zarea cu ajutorul liganzilor).

III.2.1 Metode fizice de imobilizare a enzimelor

Metodele de imobilizare prin care enzima se leagă d

e suport fără formare de legături cova

lente reprezintă metodele fizice de imobilizare. Ac

estea la rândul lor se împart în două subgrupe:

imobilizarea prin adsorbţie i respectiv includerea

mecanică a moleculelor enzimatice în suport

(includere în geluri, microîncapsulare etc.).

În cazul adsorbţiei, enzimele sunt menţinute la sup

rafaţa suportului datorită interacţiunilor

electrostatice, a legăturilor hidrofobe, punţilor d

e hidrogen etc. Includerea mecanică în suport

presupune utilizarea unor geluri reticulate, microc

apsule, fibre, membrane de ultrafiltrare etc.

Dei metodele fizice de imobilizare a enzimelor sun

t, în general, simple, rapide i eficiente, aria

de aplicabilitate este relativ restrânsă, datorită

faptului că menţinerea moleculelor de protein

enzimă la suprafaţa suportului este asigurată de le

gături relativ slabe, ceea ce face ca să existe

pericolul unei eluţii parţiale sau chiar totale a e

nzimelor în cazul utilizării de substrate în soluţi

i

de forţă ionică superioară.

III.2.1.1 Imobilizarea enzimelor prin adsorbţie

Dintre metodele fizice, imobilizarea prin adsorbţie

este cel mai des utilizată, reprezentând

cel mai economic procedeu de insolubilizare a enzim

elor. Enzimele sunt fixate la suprafaţa su

portului datorită următoarelor tipuri de legături c

e intervin în adsorbţie:

interacţiuni van der Waals

interacţiuni electrostatice între atomi sau mole

cule cu mo

ment de dipol;

punţi de hidrogen

ce se formează în cazul grupărilor OH, COOH, NH

2

;

transfer de sarcină

adică toate interacţiunile între substanţe elect

rofile i nucleofile;

schimb de ioni

.

Cantitatea de enzimă legată de suport în cazul adso

rbţiei depinde de următorii parametri:

a)

concentraţia proteică

a soluţiei enzimatice influent; masa de enzimă fix

ată crete pro

porţional cu concentraţia până la o valoare limită

când adsorbantul se saturează.

b)

timpul de contact

: viteza de adsorbţie este determinată de caracteri

sticile fizicochimice

ale adsorbantului i ale proteinei adsorbite (dimen

siunile moleculelor i ale particulelor suportu

lui, prezenţa i natura sarcinilor electrice etc.).

În condiţii obinuite, timpul necesar pentru obţi

nerea unui preparat enzimatic imobilizat este, în g

eneral, scurt, nedepăind câteva ore;

c)

temperatura de reacţie

: viteza de adsorbţie, depinzând de caracteristicil

e difuzionale ale

moleculelor, va crete cu temperatura până la o val

oare optimă a acesteia;

d)

influenţa pH'ului

: sa constatat experimental că adsorbţia maximă es

te, de regulă, în

vecinătatea punctului izoelectric al enzimei adsorb

ite.

III.2.1.2 Imobilizarea enzimelor prin includere în

geluri

Simplitatea obţinerii, lipsa modificărilor chimice

în structura enzimelor întrun interval

larg al compoziţiei i structurii gelului, stabilit

atea ridicată a preparatelor enzimatice obţinute

sunt factori ce determină utilizarea largă a metode

i de imobilizare a enzimelor prin includere în

geluri.

În ultimul timp sau propus noi tehnici de includer

e în geluri i noi tipuri de geluri. De

exemplu, polimerizarea în emulsie constând dintro

fază apoasă (solvent pentru monomer, iniţia

tor i enzimă) i o fază hidrofobă (amestec de tolu

en i cloroform) permite obţinerea unui hidro

gel sub formă de particule sferice a căror dimensiu

ne poate fi controlată prin schimbarea condiţi

ilor de polimerizare. În cazul în care emulsia este

îngheţată înaintea polimerizării se obţin parti

cule poroase cu o suprafaţă specifică mare.

19

O răspândire largă, în prezent, o are metoda polime

rizării iniţiată de radiaţiile

γ

, nefiind

nevoie de acţiunea iniţiatorilor chimici care pot i

nactiva enzimele.

În prezent, pentru imobilizarea enzimelor cel mai a

desea se folosesc gelurile de poliacril

amidă (fig. 1). Calităţile acestor geluri pot fi îm

bunătăţite utilizând metoda radiopolimerizării.

Gelurile astfel obţinute au o structură poroasă, cu

suprafaţă activă mare, iar elasticitatea

crete considerabil dacă polimerizarea are loc în p

rezenţa amidonului 5 %, crescând totodată i

termostabilitatea enzimei imobilizate.

Acrilamidã

BIS

n CH

2

= CH

CONH

2

CH

2

– CH

C = O

NH

CH

2

NH

C = O

CH

2

– CH

+ n +

Enzimã

K

2

S

2

O

8

sau

DMAPN

– CH

2

– CH – CH

2

– CH – CH

2

– CH – CH

2

– CH – CH

2

– CH –

Enzimã

CONH

2

C = O

NH

CH

2

NH

C = O

– CH

2

– CH – CH

2

– CH – CH

2

– CH – CH

2

– CH – CH

2

– CH –

C = O

NH

CH

2

NH

C = O

CONH

2

CONH

2

CONH

2

Fig. 1. Reacţiile de copolimerizare ce au loc în ti

mpul imobilizării enzimelor prin includere în gel d

e

poliacrilamidă

are

21

III.2.2 Metode chimice de imobilizarea enzimelor

După cum am arătat mai sus, în cazul metodelor fizi

ce de imobilizare, între suport i enzi

mă iau natere o serie de interacţiuni i se formea

ză legături relativ slabe, astfel că, în procesul d

e

exploatare poate avea loc eluţia parţială sau total

ă a enzimei, în funcţie de concentraţia substratu

lui i de forţa ionică a soluţiei acestuia. Pentru

o mai bună fixare a enzimelor pe suport, mulţi

cercetători au recurs la metode chimice de imobiliz

are care constau în formarea de legături cova

lente fie direct între enzimă i suport fie prin in

termediul liganzilor. În cazul legării directe, leg

ă

turile covalente iau natere între grupările funcţi

onale ale suportului i cele ale proteinenzimei,

grupări aflate, de regulă, în afara situsului activ

enzimatic.

Randamentele reacţiilor enzimatice catalizate de ac

est tip de catalizatori heterogeni, com

parativ cu enzimele libere sunt, în general, ceva m

ai mici decât în cazul imobilizării prin metode

fizice, probabil din cauza unor uoare modificări l

a nivelul structurii cuaternare sau chiar terţiare

a proteinenzimei ce se pot produce prin formarea l

egăturilor covalente. Cu toate acestea, prin

legare covalentă se obţin preparate cu o stabilitat

e operaţională mai mare, fapt ce anulează dez

avantajul mai sus menţionat.

Imobilizarea chimică a enzimelor pe suporturi soli

de poate fi executată i prin intermedi

ul liganzilor care sunt, în general, compui chimic

i bifuncţionali sau nesaturaţi. !i în acest caz se

asigură o fixare puternică a enzimei pe suport.

III.2.2.1 Imobilizarea enzimelor prin legare covale

ntă

În principiu, prin imobilizarea enzimelor prin lega

re covalentă se poate utiliza orice tip de

suport anorganic sau organic, natural, semisintetic

sau sintetic care prezintă grupe funcţionale

adecvate formării de legături covalente. În acest c

az suportul se alege în funcţie de natura grupă

rilor funcţionale ale proteinenzimei ce urmează a

se imobiliza. Formarea legăturilor covalente

poate induce, probabil, uoare modificări în struct

ura terţiară i cuaternară a enzimei, manifes

tând în felul acesta o oarecare influenţă asupra ce

ntrului activ enzimatic ce se repercutează asu

pra activităţii catalitice a preparatului obţinut.

În cazul legăturilor covalente, ce sunt legături ch

imice puternice, este înlăturată practic po

sibilitatea eluţiei parţiale a enzimei de pe suport

în timpul exploatării. Din această cauză nume

roi cercetători utilizează această metodă pentru i

mobilizarea enzimelor de importanţă practică.

III.2.2.2 Imobilizarea enzimelor cu ajutorul liganz

ilor

O altă metodă de imobilizare covalentă a enzimelor

o reprezintă fixarea acestora cu ajuto

rul liganzilor. Acetia sunt substanţe bisau mult

ifuncţionale sau substanţe nesaturate. În proce

sul de imobilizare se formează câte două legături c

ovalente pentru fiecare moleculă proteică:

ligandul se fixează de suport prin intermediul unei

a din grupările sale funcţionale, cealaltă rămâ

nând disponibilă pentru fixarea enzimei. În cazul f

olosirii în calitate de ligand a unor compui

nesaturaţi, acetia dau reacţii de polimerizare sau

policondensare (în speţă trimerizare respectiv

tricondensare suport –ligand enzimă), cu formarea

de legături covalente între cei trei compo

nenţi ai sistemului.

Avantajul acestei metode constă în faptul că se poa

te realiza o imobilizare optimă alegând

ligandul specific în funcţie de natura grupărilor f

uncţionale ale suportului i respectiv enzimei ce

urmează a se imobiliza. În tabelul II redăm câteva

metode de activare a grupărilor funcţionale

din suporturi cu ajutorul liganzilor. Metoda de imo

bilizare a enzimelor pe suporturi solide cu

ajutorul liganzilor este din ce în ce mai des folos

ită în ultimii ani.

Analizând literatura de specialitate se poate concl

uziona că aldehida glutarică este ligandul

consacrat, tot mai mulţi cercetători folosind acest

reactiv în vederea activării celor mai diferite

suporturi. Cele mai multe cercetări au testat posib

ilitatea imobilizării unor enzime (catalaza,

ureaza etc.) pe fibre de celuloză prin reticulare c

u aldehidă glutarică. Pentru obţinerea unor ca

racteristici optime, în mediul de cuplare sa intro

dus o proteină inertă (serumalbumina) care par

ticipă la procesul de reticulare (fig. 3). Reacţiil

e sau realizat la

+

4

o

C timp de 2024 de ore după

22

care preparatele au fost spălate cu soluţii tampon

adecvate pentru înlăturarea excesului de enzi

mă.

Suport

inert

suport

+

E – NH

2

+

H

2

N –

A

– NH

2

NH

2

NH

2

+

OHC – (CH

2

)

3

– CHO

Enzimã Albuminã Glutaraldehidã

E – N = CH – (CH

2

)

3

– CH = N –

A

– N = CH – (CH

2

)

3

– CH = N –.

........

N

CH

N

CH

(CH

2

)

3

CH

N

E – N = CH – (CH

2

)

3

– CH = N –

A

– N = CH – (CH

2

)

3

– CH = N –.

........

CH

N

suport

suport

Fig. 3. Reprezentarea schematică a imobilizării enz

imelor pe fibre de celuloză prin reticulare cu alde

hidă

glutarică

III.2.3 Metode de imobilizare a celulelor întregi

În general, pentru imobilizarea celulelor se folose

sc aceleai tipuri de suport i aceleai me

tode ca în cazul enzimelor. Rezultate superioare se

obţin, de regulă, la celulele imobilizate prin

includere în geluri (entrapare) sau reticulare în (

co)polimeri, deoarece prin aceste metode se

evită blocarea grupărilor funcţionale ale constitue

nţilor peretelui celular, imobilizarea

efectuânduse prin simpla „reţinere” mecanică a cel

ulelor în structura suportului.

Cu toate acestea, în cazuri speciale, se obţin rezu

ltate bune i prin folosirea altor metode de

imobilizare. În literatura de specialitate predomin

ă însă metodele de includere a celulelor micro

biene în diferite geluri cum ar fi gelul de poliacr

ilamidă, alginat, carrageenan, alcool polivinilic

V. Noţiuni generale asupra metodelor imunoenzimati

ce de analiză

Generalităţi

Metodele imunologice sunt, în special, cantitative

i se bazează pe reacţiile antigen

anticorp. Actualmente, majoritatea metodelor de imu

noanaliză utilizează i un al treilea ele

ment, aanumitul

trasor

.

Acesta rezultă prin asocierea antigenului sau antic

orpului cu un

marker.

Era metodelor imunologice de analiză a debutat în

1959 când

Yalow & Berson

dozează

insulina. În perioada următoare, cercetările în ace

st domeniu au fost considerabil lărgite, ceea ce

a determinat apariţia a numeroase modificări menite

să mărească exactitatea i reproductibilitatea

rezultatelor.

28

Progresele înregistrate în imunologie au permis, î

n primul rând, posibilitatea obţinerii de

anticorpi policlonali specifici atât pentru biomole

culele micromoleculare cât i pentru cele cu

masă moleculară mare. Specificitatea i sensibilita

tea anticorpilor au fost considerabil mărite în

urma obţinerii anticorpilor monoclinali de către

Köhler & Milstein

în 1975.

Rezultatele încurajatoare obţinute în cercetările

privind separarea, purificarea i conserva

rea diferitelor biomolecule au avut drept rezultat

obţinerea de etaloane de o calitate deosebită.

Mărirea numărului acestora a determinat Organizaţia

Mondială a Sănătăţii să pună la punct un

sistem de standardizare internaţională astfel încât

astăzi, un mare număr de biomolecule posedă

etaloanele sale specifice.

Un moment important în studiul acestor metode de an

aliză la reprezentat obţinerea de

noi markeri. Timp îndelungat sau utilizat doar mar

kerii radioactivi. Avantajul acestora constă în

proprietăţile de emisie care nu depind de natura fi

zicochimică a mediului i în capacitatea de a fi

detectaţi uor i cu mare exactitate.

Utilizarea markerilor radioactivi prezintă însă i

unele inconveniente, principalul dez

avantaj constând în posibilitatea folosirii limitat

e a elementelor radioactive în condiţiile labora

toarelor obinuite de enzimologie. Din aceste motiv

e, în anii ’60 ai secolului XX au început să

fie utilizaţi alţi markeri, cei mai importanţi fiin

d cei enzimatici i cei luminiscenţi.

Noţiuni generale privind structura chimică Ai rolul

biologic al anticorpi-

lor

Este cunoscut faptul că atunci când unui animal de

experienţă îi este injectat un antigen,

răspunsul imunitar determină, printre altele, secre

ţia de anticorpi. Anticorpii (imunoglobulinele)

sunt glicoproteine sintetizate în limfocitele B (ac

tivate sub formă de plasmocite) i exportaţi în

plasma sanguină i lichidul interstiţial. Imunoglo

bulinele conţin situsuri speciale numite

epitopi

capabile să recunoască specific antigenele.

Structura chimică a anticorpilor a fost clarificată

în urma unor studii asupra imunoglobuli

nelor provenite de la o clonă de celule mielomatoas

e (

Edelman; G. M

. – 1973). Conform acestor

studii, imunoglobulinele conţin în moleculă aanum

itele catene grele H (

heavy

) i respectiv ca

tene uoare L (

light

) (fig. 5).

Catenele H sunt unite între ele prin intermediul a

minimum două punţi disulfidice

intercatenare în timp ce fiecare catenă de tip L se

leagă de câte o catenă H printro punte

disulfidică. Se cunosc mai multe catene de tip H no

tate convenţional

γ, α, , δ

γ, α, , δ

γ, α, , δ

γ, α, , δ

i

ε

εε

ε

care stau la

baza clasificării imunoglobulinelor

-

IgG, IgA, IgM, IgD i respectiv IgE (

Bach, J. F

. – 1986).

La rândul lor, catenele L sunt de două tipuri (

κ

κκ

κ

i

λ

λλ

λ

) în funcţie de capacitatea lor antigenică.

Schema redată în figura 157 corespunde imunoglobuli

nelor G (IgG) ce conţin două catene de tip

H i două de tip L i au masa moleculară de 150 kDa

.

Molecula acestora poate fi scindată enzimatic cu fo

rmarea mai multor fragmente. În

1959,

Porter R. R

. reuete să scindeze molecula de IgG cu ajutorul

papainei în prezenţă de

cisteină cu obţinerea a trei fragmente: unul notat

cu

Fc

(fragment cristalizabil din mediu apos) cu

masa moleculară de 50 kDa i altele două identice n

otate

Fab

(

fragment antigen bindig

) cu ma

sele moleculare de câte 45 kDa. Fiecare din cele do

uă fragmente Fab poate interacţiona cu anti

genul specific.

29

H

2

N —

— COOH

catenã L

catenã H

H

2

N —

H

2

N —

H

2

N —

— COOH

Fig. 5. Reprezentarea schematică a structurii imuno

globulinelor

Un an mai târziu (

Nisonoff, A

. et al. – 1960) sa reuit scindarea imunoglobulin

elor G sub

acţiunea pepsinei cu obţinerea mai multor peptide

i a unui fragment F(ab)

2

ce conţine două

situsuri de legare a antigenelor. Prin reducere, di

merul F(ab)

2

generează cele două fragmente Fab

ce îi conservă capacitatea de a interacţiona cu an

tigenele specifice.

Fiecare catenă peptidică din structura acestor frag

mente conţine câte un domeniu constant

i unul variabil, structura acestuia din urmă depin

zând de tipul imunoglobulinei din care provine.

Zonele variabile interesează secvenţele de aminoaci

zi de la extremităţile Nterminale ale catene

lor de tip H i respectiv L, restul structurii prim

are rămânând nemodificat. Zonele variabile au

fost notate cu V

L

pentru catenele uoare i respectiv V

H

pentru cele grele, iar domeniile constante

au fost notate cu C

L

i respectiv C

H

. La rândul lor, domeniile constante ale catenelor

H conţin trei

regiuni notate C

H1

, C

H2

i respectiv C

H3

(fig. 6).

Situsuri de

legare a

antigenului

V

L

V

H

C

L

C

H1

C

H2

C

H3

Fig. 6. Structura de bază a IgG (Nisonoff, A. et a

l. – 1960)

Imunoglobulinele cunoscute în prezent au fost împăr

ţite în cinci clase în funcţie de struc

tura catenelor lor de tip H: IgG, IgA, IgM, IgD i

IgE.

Imunoglobulinele G

(IgG) reprezintă aproximativ 75% din totalul imuno

globulinelor din

sistemul circulator, au o masă moleculară de 150 kD

a i o constantă de sedimentare de 7,5 S. la

rândul lor, IgG se împart în patru subclase în func

ţie de natura i ponderea componentei glucidi

ce a catenelor H: IgG

1

, IgG

2

, IgG

3

i respectiv IgG

4

. Pentru organismul uman, toate imunoglobu

linele G, cu excepţia IgG

3

, au capacitatea de a forma compleci insolubili cu

proteina A din pere

tele celular al

Staphylococcus aureus

.

Imunoglobulinele M

(IgM) au masa moleculară de 900 kDa i sunt alcătu

ite din cinci

subunităţi. Ele conţin în moleculă zece situsuri de

legare a antigenelor dei, din motive sterice,

nu toate sunt funcţionale

23

III.3 TEHNICI DE IMOBILIZARE A ENZIMELOR I CELULEL

OR

Tehnicile de imobilizare a enzimelor i celulelor î

ntregi se împart în următoarele două gru

pe:

a) tehnici de imobilizare în sistemul „

coloană

” care constau în trecerea soluţiei enzimatice

sau a suspensiei celulare printro coloană umplută

cu suportul de imobilizare ce a fost în preala

bil activat i echilibrat;

b) tehnici de imobilizare în sistemul „

baie

”, când imobilizarea se face sub agitare continuă

în vase speciale, apoi, după spălare, preparatul ob

ţinut se trece în coloana de reacţie în vederea

exploatării.

Alegerea tehnicilor de imobilizare se face în funcţ

ie de metoda de insolubilizare utilizată.

Astfel, imobilizarea prin adsorbţie sau prin alte m

etode fizice se face cu precădere în sistemul

„coloană”, în timp ce imobilizarea prin includere î

n geluri, reticulare sau legare covalentă se fa

ce, în general, în sistemul „baie”, tehnică ce asig

ură crearea condiţiilor optime pentru reacţiile

chimice ce au loc.

În ceea ce privete tehnica de imobilizare în siste

mul „coloană”, singurele probleme mai

dificile care se pun sunt cele legate de crearea co

ndiţiilor optime de fixare (pH, temperatură etc.)

condiţii care să nu ducă la inactivarea enzimelor.

Această tehnică este similară cromatografiei pe

coloană executânduse în condiţii identice.

Tehnicile de imobilizare în sistemul „baie” sunt c

eva mai complexe din cauza condiţiilor

aspre în care au loc reacţiile chimice. În general,

aceste tehnici se aseamănă cu cele din sinteza

chimică organică cu deosebirea că se fac anumite mo

dificări în scopul creării unor condiţii mai

blânde de reacţie care să nu denatureze proteinele.

De obicei, în cazul imobilizării prin legare coval

entă directă, prin reticulare sau includere,

formarea suportului are loc concomitent cu imobiliz

area (în cazul suporturilor sintetice), reacţiile

chimice respective executânduse în mod obligatoriu

în condiţii fiziologice normale de pH i

temperatură.

Există suporturi ce conţin un număr mare i variat

de grupări funcţionale i care, din acest

punct de vedere, prezintă calităţi optime de imobil

izare. Totui, formarea de legături chimice

între enzimă i suport necesită condiţii aspre de r

eacţie, motiv pentru care se recurge la folosirea

liganzilor. Scopul utilizării acestora este de a în

locui grupările funcţionale ale suportului cu alte

le, la fel de reactive sau mai reactive, dar în con

diţii mai blânde.

Astfel, reactivul Woodward (Netilfenil5izoxozal

in3'sulfonat) asigură transformarea

grupării carboxil în grupare ester reactivă în cond

iţii relativ blânde. Un alt exemplu îl constituie

activarea cu azotit de sodiu a suporturilor conţinâ

nd grupări aminice.

Utilizarea în calitate de ligand a clorurilor acide

conduce la transformarea grupărilor

carboxilice (–COOH) ale suportului în cloruri acide

(–COCl) după care imobilizarea are loc prin

legare covalentă însoţită de eliminarea unei molecu

le de HCl dintre clorura acidă i gruparea

funcţională –NH

2

din molecula enzimatică. Pentru a evita denaturare

a enzimei este necesar să se

neutralizeze continuu acidul clorhidric eliberat în

proces.

III. 4. CARACTERISTICILE CINETICE I FUNCŢIONALE AL

E

ENZIMELOR IMOBILIZATE

Formarea diferitelor tipuri de legături între enzim

ă i suport în procesul de imobilizare,

poate induce apariţia unor modificări conformaţiona

le ale macromoleculelor de proteinenzimă

cu repercusiuni asupra capacităţii catalitice. În a

fară de parametrii cinetici ce caracterizează en

zimele native, imobilizatele enzimatice prezintă i

unele proprietăţi specifice. În general, la imo

bilizarea oricărei enzime se urmăresc următoarele a

specte:

a) alegerea condiţiilor optime de imobilizare:

alegerea suportului optim;

alegerea metodei optime de imobilizare în f

uncţie de numărul i natura grupelor

funcţionale ale suportului, precum i în funcţie de

scopul final urmărit;

alegerea tehnicii de imobilizare;

24

alegerea condiţiilor optime de pH, temperatură e

tc. în care să se realizeze imobilizarea.

b) determinarea principalilor parametri cinetici i

funcţionali ai imobilizatelor enzimatice

obţinute:

determinarea capacităţii de imobilizare (mg enz

imă/g suport);

studiul influenţei pHului i temperaturii mediu

lui asupra vitezei reacţiei catalizate de

enzima imobilizată respectivă;

studiul influenţei concentraţiei substratului as

upra vitezei de reacţie i determinarea

constantei K

M

;

determinarea timpului de stocare operaţională;

determinarea timpului de înjumătăţire a activită

ţii catalitice.

III.4.1 Alegerea condiţiilor optime de imobilizare

Acest aspect este extrem de important, dat fiind fa

ptul că în funcţie de condiţiile în care se

realizează cuplarea va depinde activitatea cataliti

că a preparatului obţinut. Deoarece capacitatea

catalitică a oricărei enzime imobilizate diferă de

valoarea aceluiai parametru specifică formelor

libere, fiind de regulă inferioară acesteia, activi

tatea enzimatică a preparatelor imobilizate poartă

numele de

activitate remanentă

.

Pentru ca aceasta să fie cât mai mare posibil,

alegerea suportului

se face în aa fel încât

procesul de cuplare să inactiveze cât mai puţin enz

ima. De obicei alegerea suportului se face în

funcţie de metoda de imobilizare ce urmează a fi fo

losită (legare prin interacţiuni fizice sau prin

covalenţă) i în funcţie de grupele funcţionale pe

care acesta le conţine i care pot fi implicate în

interacţiunile dintre enzimă i suport.

Alegerea metodei

optime de imobilizare se face, în principal, în fu

ncţie de procesul de

transformare în care va fi folosit viitorul prepara

t. De exemplu, dacă aceste transformări presu

pun utilizarea unor soluţii (soluţii tampon, soluţi

i de substrat etc.) cu forţe ionice superioare, se

vor utiliza preponderent metodele chimice de cuplar

e în aa fel încât în procesul de exploatare a

preparatului să nu aibă loc eluţia enzimei de pe su

port. Dintre metodele fizice de imobilizare, în

acest caz se utilizează cel mai adesea reticularea

în diferite geluri precum i imobilizarea prin

microîncapsulare. Atunci când nu există pericolul e

luţiei enzimei de pe suport, se utilizează imo

bilizarea prin adsorbţie sau alte metode fizice de

cuplare datorită simplităţii i rapidităţii cu care

pot fi executate.

Alegerea tehnicii de imobilizare

pune mai puţine probleme. În diferite situaţii poa

te fi uti

lizată atât imobilizarea în

sistemul coloană

, cât i în

sistemul baie

, cu condiţia să se realizeze un

contact cât mai intim între enzimă i suport. Mulţi

autori preferă sistemul baie deoarece se poate

realiza cuplarea sub agitare continuă în aa fel în

cât suspensia ce formează mediul de reacţie să

se omogenizeze cât mai bine.

Alegerea condiţiilor fizico-chimice

optime de imobilizare este extrem de importantă

deoarece aceasta determină în mod direct nivelul ac

tivităţii remanente. Formarea interacţiunilor

fizicochimice i chimice între enzimă i suport de

pinde în mare măsură de temperatura mediului

de cuplare.

Deoarece există pericolul inactivării termice a enz

imelor, cuplarea se realizează de obicei

la rece (0

÷

+4

o

C) chiar dacă este necesară pentru aceasta prelungi

rea timpului de sinteză. Imen

sa majoritate a datelor din literatură atestă faptu

l că randamentele cele mai bune se obţin atunci

când procesul de imobilizare este condus în medii d

e reacţie cu valori de pH apropiate de pHul

optim de acţiune al enzimei respective. Timpul de i

mobilizare este în general scurt, nedepăind

câteva ore.

Obţinerea unor preparate enzimatice sub formă imobi

lizată cu caracteristici superioare mai

depinde i de alţi factori: alegerea unui raport op

tim suport/enzimă, alegerea unui timp optim de

cuplare, stabilirea raportului optim suport/ligand

etc.

!i în cazul imobilizării celulelor întregi se obser

vă o strânsă interdependenţă între activita

tea catalitică a acestora i condiţiile de imobiliz

are.

25

III.4.2 Determinarea parametrilor cinetici Ai funcţ

ionali ai enzimelor

imobilizate

Prin

capacitate de imobilizare

se înţelege cantitatea de enzimă, exprimată în mil

igrame, fi

xată pe unitatea de masă (gram) sau volum (mililitr

u) de suport. Acest parametru oscilează între

limite valorice relativ largi de la o enzimă la alt

a sau de la un suport la altul. În general, metodel

e

fizice de cuplare asigură obţinerea unor capacităţi

de imobilizare de până la câteva mg/g (ml), în

timp ce prin utilizarea metodelor chimice de imobil

izare se pot obţine valori mai mari.

Determinarea practică a capacităţii de imobilizare

se poate face în mai multe moduri: fie că

se execută eluţia enzimei de pe suport după care se

dozează concentraţia proteică în eluat prin

metode specifice, fie că se determină concentraţia

enzimei în soluţia influent, în efluent i în

tamponul de spălare, după care se calculează prin d

iferenţă capacitatea de imobilizare.

Studiul influenţei pH'ului

mediului de incubare asupra vitezei reacţiilor cat

alizate de en

zimele imobilizate se face în mod similar ca i pen

tru enzimele libere, în sensul că se determină

activitatea catalitică în condiţii standard dar la

valori diferite de pH. Datele din literatura de spe

cialitate atestă faptul că prin imobilizare enzimel

e nu îi modifică, sau îi modifică foarte puţin

valoarea pHului optim de acţiune.

Dacă valoarea pHului optim de acţiune a enzimelor

se modifică foarte puţin prin imobili

zare, nu acelai lucru se poate spune în privinţa s

tabilităţii acestora faţă de reacţia mediului. În

majoritatea cazurilor se observă o cretere a stabi

lităţii enzimelor imobilizate comparativ cu for

mele libere faţă de pHul mediului, concomitent cu

o cretere a intervalului de pH în care enzima

este activă. Graficul dependenţei vitezei reacţiilo

r enzimatice de pHul mediului de incubare are

acelai aspect gaussian, dar cu o deschidere mai ma

re (fig. 4).

v (%)

pH

pH

opt

a

b

O

Fig. 4. Reprezentarea grafică a influenţei pH9ului

mediului de incubare asupra activităţii

enzimelor libere (a) @i imobilizate (b)

Creterea stabilităţii enzimelor prin imobilizare s

e explică, printre altele, prin faptul că în

jurul macromoleculei de proteinenzimă legată de un

suport insolubil se creează un micromediu

în care modificarea pHului se face mai lent. Cu al

te cuvinte, în jurul fiecărei molecule enzimati

ce se creează un gradient de pH în sens crescător

sau descrescător în funcţie de pHul mediului,

în aa fel încât în imediata vecinătate a enzimei,

pHul este mai apropiat de pHul optim de acţi

une comparativ cu zonele mai îndepărtate.

Determinarea

temperaturii optime de acţiune

i a influenţei acestui factor fizic asupra vi

tezei de reacţie se face în mod similar ca în cazul

evaluării influenţei pHului mediului. Determi

narea acestor parametri cinetici este de o importan

ţă majoră întrucât, prin utilizarea practică a

enzimelor imobilizate în diferite procese de biotra

nsformare nu este posibilă întotdeauna menţi

nerea cu mare exactitate a pHului i temperaturii

mediului la valori constante.

!i în cazul

constantei Michaelis K

M

au loc modificări prin imobilizare. În unele situa

ţii

constanta K

M

nu se modifică, în foarte puţine cazuri aceasta se

micorează, iar pentru marea ma

v

max

26

joritate a enzimelor se observă o cretere a valori

i constantei K

M

prin imobilizare, ceea ce presu

pune o scădere a afinităţii enzimei pentru substrat

. În general, aceste modificări ale valorilor con

stantelor K

M

sunt minore pentru enzimele imobilizate prin metod

e fizice i mai puternice în cazul

metodelor chimice de cuplare. Prin utilizarea acest

or metode se realizează reacţii în care se for

mează legături covalente fie direct între enzimă i

suport, fie prin intermediul diferiţilor liganzi.

În formarea acestor legături sunt implicate grupe f

uncţionale specifice din structura enzimelor,

altele decât cele ce fac parte din constituţia cent

rului activ. Dei aceste grupări funcţionale sunt

localizate în afara situsului catalitic, interacţiu

nea lor cu grupe funcţionale corespunzătoare din

suport determină apariţia unor modificări conformaţ

ionale ale moleculei enzimatice în ansamblu

i, implicit, ale centrului activ. Aceste modificăr

i conformaţionale mai mult sau mai puţin pro

funde determină o modificare corespunzătoare a afin

ităţii enzimei pentru substrat deci i a valorii

constantei K

M

.

După cum sa arătat mai sus, pentru imensa majorita

te a enzimelor se observă o modificare

a constantei K

M

prin imobilizare. Deoarece semnificaţia biochimică

a acestui parametru este ace

eai, precum i datorită faptului că ea se referă l

a aceeai pereche enzimăsubstrat, această con

stantă cinetică a enzimelor imobilizate poartă nume

le de

constantă Michaelis aparentă

i se

notează cu

K'

M

.

Chiar dacă K'

M

> K

M

pentru marea majoritate a enzimelor imobilizate, i

mportanţa practică a

acesteia nu scade, acest dezavantaj fiind anulat ch

iar i numai de avantajul net al posibilei utili

zării repetate a aceluiai preparat enzimatic spre

deosebire de biotehnologiile bazate pe folosirea

enzimelor libere ce pot fi întrebuinţate o singură

dată, iar produsul transformării trebuie apoi

purificat de urmele de proteină.

Enzimele imobilizate pot fi caracterizate i prin d

oi parametri funcţionali importanţi care

reflectă gradul de inactivare în timp a acestor bio

catalizatori prin stocare în condiţii optime de

conservare i respectiv prin utilizarea lor periodi

că în procese de biotransformare specifice. Este

vorba de timpul de stocare operaţională i respecti

v timpul de înjumătăţire a activităţii enzimati

ce.

Prin

timp de stocare operaţională

se înţelege intervalul de timp în care un preparat

enzi

matic imobilizat poate realiza cicluri de transform

are fără ca activitatea enzimatică să scadă

semnificativ. Mulţi autori consideră timpul de stoc

are operaţională ca fiind intervalul de timp în

care, catalizând reacţii specifice în procese conti

nue sau discontinue, enzima imobilizată respec

tivă îi diminuează capacitatea catalitică cu cel m

ult 20 %, adică prezintă o activitate remanentă

de minimum 80 %.

Prin

timp de înjumătăţire

a activităţii catalitice se înţelege intervalul de

timp în care, prin

utilizare continuă sau discontinuă, preparatul enzi

matic respectiv îi diminuează activitatea cu 50

% faţă de capacitatea sa catalitică iniţială. !i ac

est parametru oscilează între limite valorice des

tul de largi, depinzând de suportul i metoda de im

obilizare i diferă de la o enzimă la alta. De

terminarea acestor doi parametri funcţionali prezin

tă o importanţă practică deosebită, ei repre

zentând un adevărat „termen de garanţie” al fiecăru

i preparat.

Enzimele imobilizate pot prezenta un comportament d

iferit de cel al formelor native faţă

de acţiunea

efectorilor

i în special a

inhibitorilor

. În majoritatea cercetărilor noastre am studiat

i acest aspect, obţinând rezultate interesante în

studiul comparativ al acţiunii inhibitorilor speci

fici asupra activităţii catalazei libere i imobili

zate prin legare covalentă.

III.5. APLICAŢIILE PRACTICE ALE ENZIMELOR IMOBILIZA

TE

Utilizarea enzimelor imobilizate în diferite domen

ii ale activităţii umane prezintă o serie

de avantaje certe comparativ cu enzimele libere. În

primul rând este posibilă folosirea repetată a

aceluiai biocatalizator în realizarea mai multor c

icluri de transformare. Pe de altă parte se obţin

produi de reacţie mult mai puri, nefiind nevoie de

anumite etape costisitoare de purificare. Prin

utilizarea enzimelor imobilizate în scop terapeutic

se evită, în primul rând, degradarea acestora

sub acţiunea enzimelor din tubul digestiv sau tisul

are. În ultimul timp au fost realizate o serie de

27

cercetări ingenioase asupra imobilizării enzimelor

de interes terapeutic în fantome eritrocitare

sau în diferite structuri subcelulare, fiind comple

t înlăturat fenomenul de incompatibilitate. Au

mai fost efectuate cercetări asupra includerii enzi

melor în unguente, comprese și medicamente cu

aplicaţie locală.

Rezultate spectaculoase sau obţinut în domeniul s

enzorilor enzimatici care pot fi folosiţi

ca orice alt electrod ionoselectiv. În principiu, a

ceti senzori sunt reprezentaţi de electrozi sensi

bili faţă de diferiţi compui chimici, ce au supraf

aa activă acoperită cu o peliculă sintetică în care

sau imobilizat în prealabil una sau mai multe enzi

me. De exemplu senzorul pentru dozarea glu

cozei în diferite medii este format dintrun electr

od de oxigen acoperit cu o peliculă în care sa

imobilizat prin reticulare glucozooxidaza și catala

za.

În procesul de exploatare are loc o oxidare a gluco

zei cu formare de acid gluconic și apă

oxigenată. Aceasta din urmă este descompusă de cata

lază cu formarea unei cantităţi stoechiome

trice de oxigen ce poate fi dozat de oxigenometru.

Aparatul poate fi gradat direct în unităţi ale

concentraţiei de glucoză dacă se ţine cont de stoec

hiometria transformărilor.

Multe firme de renume (Orion, Corning, Sorgent ș.a

.) produc deja senzori enzimatici pen

tru determinarea ureei, aminoacizilor, penicilinei

etc. În funcţionarea unui senzor enzimatic se

disting cinci faze:

contactarea suprafeţei active a senzorului de că

tre substrat;

difuzia moleculelor substratului prin reţeaua po

limerului și accesul acestora la centrul

activ al enzimei;

reacţia enzimatică propriuzisă;

"exportul" produsului de reacţie prin membrana s

enzorului spre suprafaţa activă a elec

trodului de bază;

evaluarea concentraţiei acestuia la suprafaţa el

ectrodului. În tabelul următor sunt siste

matizate principalele date din literatură privind u

tilizarea senzorilor enzimatici.

Principalii senzori enzimatici și caracteristicile

lor

Nr.

crt.

Substanţa

dozată

Enzima din

senzor

Stabilitate

senzor

Timp de

lucru

Sensibilitatea

(moli/l)

1 uree urează 3 săpt. 30 sec. 10

2

10

5

2 glucoză glucozooxidază 6 luni 15 sec. 10

2

10

4

3 aminoacizi oxidaze specifice 6 luni 15 sec. 10

3

10

5

4 acid lactic LDH 1 săpt. 3 min. 10

3

10

4

5 acid succinic succinatDH 1 lună 1 min. 10

2

10

4

6 acid acetic alcoolDH 5 luni 30 sec. 10

1

10

4

7 penicilină penicilinaza 3 săpt. 1 min. 10

2

10

4

8 acid uric uratoxidaza 4 luni 30 sec. 10

2

10

4

9 colesterol colesteroloxidaza 3 luni 2 min. 10

1

10

4

IV. Noţiuni generale asupra metodelor imunoenzimati

ce de analiză

Generalităţi

Metodele imunologice sunt, în special, cantitative

i se bazează pe reacţiile antigen

anticorp. Actualmente, majoritatea metodelor de imu

noanaliză utilizează i un al treilea ele

ment, aanumitul

trasor

.

Acesta rezultă prin asocierea antigenului sau antic

orpului cu un

marker.

Era metodelor imunologice de analiză a debutat în

1959 când

Yalow & Berson

dozează

insulina. În perioada următoare, cercetările în ace

st domeniu au fost considerabil lărgite, ceea ce

a determinat apariţia a numeroase modificări menite

să mărească exactitatea i reproductibilitatea

rezultatelor.

28

Progresele înregistrate în imunologie au permis, î

n primul rând, posibilitatea obţinerii de

anticorpi policlonali specifici atât pentru biomole

culele micromoleculare cât i pentru cele cu

masă moleculară mare. Specificitatea i sensibilita

tea anticorpilor au fost considerabil mărite în

urma obţinerii anticorpilor monoclinali de către

Köhler & Milstein

în 1975.

Rezultatele încurajatoare obţinute în cercetările

privind separarea, purificarea i conserva

rea diferitelor biomolecule au avut drept rezultat

obţinerea de etaloane de o calitate deosebită.

Mărirea numărului acestora a determinat Organizaţia

Mondială a Sănătăţii să pună la punct un

sistem de standardizare internaţională astfel încât

astăzi, un mare număr de biomolecule posedă

etaloanele sale specifice.

Un moment important în studiul acestor metode de an

aliză la reprezentat obţinerea de

noi markeri. Timp îndelungat sau utilizat doar mar

kerii radioactivi. Avantajul acestora constă în

proprietăţile de emisie care nu depind de natura fi

zicochimică a mediului i în capacitatea de a fi

detectaţi uor i cu mare exactitate.

Utilizarea markerilor radioactivi prezintă însă i

unele inconveniente, principalul dez

avantaj constând în posibilitatea folosirii limitat

e a elementelor radioactive în condiţiile labora

toarelor obinuite de enzimologie. Din aceste motiv

e, în anii ’60 ai secolului XX au început să

fie utilizaţi alţi markeri, cei mai importanţi fiin

d cei enzimatici i cei luminiscenţi.

Noţiuni generale privind structura chimică Ai rolul

biologic al anticorpi-

lor

Este cunoscut faptul că atunci când unui animal de

experienţă îi este injectat un antigen,

răspunsul imunitar determină, printre altele, secre

ţia de anticorpi. Anticorpii (imunoglobulinele)

sunt glicoproteine sintetizate în limfocitele B (ac

tivate sub formă de plasmocite) i exportaţi în

plasma sanguină i lichidul interstiţial. Imunoglo

bulinele conţin situsuri speciale numite

epitopi

capabile să recunoască specific antigenele.

Structura chimică a anticorpilor a fost clarificată

în urma unor studii asupra imunoglobuli

nelor provenite de la o clonă de celule mielomatoas

e (

Edelman; G. M

. – 1973). Conform acestor

studii, imunoglobulinele conţin în moleculă aanum

itele catene grele H (

heavy

) i respectiv ca

tene uoare L (

light

) (fig. 5).

Catenele H sunt unite între ele prin intermediul a

minimum două punţi disulfidice

intercatenare în timp ce fiecare catenă de tip L se

leagă de câte o catenă H printro punte

disulfidică. Se cunosc mai multe catene de tip H no

tate convenţional

γ, α, , δ

γ, α, , δ

γ, α, , δ

γ, α, , δ

i

ε

εε

ε

care stau la

baza clasificării imunoglobulinelor

-

IgG, IgA, IgM, IgD i respectiv IgE (

Bach, J. F

. – 1986).

La rândul lor, catenele L sunt de două tipuri (

κ

κκ

κ

i

λ

λλ

λ

) în funcţie de capacitatea lor antigenică.

Schema redată în figura 157 corespunde imunoglobuli

nelor G (IgG) ce conţin două catene de tip

H i două de tip L i au masa moleculară de 150 kDa

.

Molecula acestora poate fi scindată enzimatic cu fo

rmarea mai multor fragmente. În

1959,

Porter R. R

. reuete să scindeze molecula de IgG cu ajutorul

papainei în prezenţă de

cisteină cu obţinerea a trei fragmente: unul notat

cu

Fc

(fragment cristalizabil din mediu apos) cu

masa moleculară de 50 kDa i altele două identice n

otate

Fab

(

fragment antigen bindig

) cu ma

sele moleculare de câte 45 kDa. Fiecare din cele do

uă fragmente Fab poate interacţiona cu anti

genul specific.

29

H

2

N —

— COOH

catenã L

catenã H

H

2

N —

H

2

N —

H

2

N —

— COOH

Fig. 5. Reprezentarea schematică a structurii imuno

globulinelor

Un an mai târziu (

Nisonoff, A

. et al. – 1960) sa reuit scindarea imunoglobulin

elor G sub

acţiunea pepsinei cu obţinerea mai multor peptide

i a unui fragment F(ab)

2

ce conţine două

situsuri de legare a antigenelor. Prin reducere, di

merul F(ab)

2

generează cele două fragmente Fab

ce îi conservă capacitatea de a interacţiona cu an

tigenele specifice.

Fiecare catenă peptidică din structura acestor frag

mente conţine câte un domeniu constant

i unul variabil, structura acestuia din urmă depin

zând de tipul imunoglobulinei din care provine.

Zonele variabile interesează secvenţele de aminoaci

zi de la extremităţile Nterminale ale catene

lor de tip H i respectiv L, restul structurii prim

are rămânând nemodificat. Zonele variabile au

fost notate cu V

L

pentru catenele uoare i respectiv V

H

pentru cele grele, iar domeniile constante

au fost notate cu C

L

i respectiv C

H

. La rândul lor, domeniile constante ale catenelor

H conţin trei

regiuni notate C

H1

, C

H2

i respectiv C

H3

(fig. 6).

Situsuri de

legare a

antigenului

V

L

V

H

C

L

C

H1

C

H2

C

H3

Fig. 6. Structura de bază a IgG (Nisonoff, A. et a

l. – 1960)

Imunoglobulinele cunoscute în prezent au fost împăr

ţite în cinci clase în funcţie de struc

tura catenelor lor de tip H: IgG, IgA, IgM, IgD i

IgE.

Imunoglobulinele G

(IgG) reprezintă aproximativ 75% din totalul imuno

globulinelor din

sistemul circulator, au o masă moleculară de 150 kD

a i o constantă de sedimentare de 7,5 S. la

rândul lor, IgG se împart în patru subclase în func

ţie de natura i ponderea componentei glucidi

ce a catenelor H: IgG

1

, IgG

2

, IgG

3

i respectiv IgG

4

. Pentru organismul uman, toate imunoglobu

linele G, cu excepţia IgG

3

, au capacitatea de a forma compleci insolubili cu

proteina A din pere

tele celular al

Staphylococcus aureus

.

Imunoglobulinele M

(IgM) au masa moleculară de 900 kDa i sunt alcătu

ite din cinci

subunităţi. Ele conţin în moleculă zece situsuri de

legare a antigenelor dei, din motive sterice,

nu toate sunt funcţionale.

30

Imunoglobuliele A

(IgA) au masa moleculară de 380 kDa i constanta d

e sedimentare de

11 S, fiind prezente preponderent în salivă, lapte,

secreţiile genitourinare etc.

Imunoglobulinele D

(IgD) au o masă moleculară de 175 kDa i se găsesc

în cantitate

mare în membranele limfocitelor B sin sânge.

În fine,

imunoglobulinele E

(IgE) au masa moleculară de 190 kDa i sunt respon

sabile

de reacţiile anafilactice ce determină eliberarea d

e histamină.

Imunoglobulinele sunt sintetizate de către limfocit

ele B i sunt secretate în mediul extra

celular în timpul transformării acestora în plasmoc

ite. În esenţă, mecanismul biosintezei anticor

pilor este următorul: un antigen dat interacţioneaz

ă specific cu limfocitele B capabile săl recu

noască. În urma acestei interacţiuni este indusă pr

oliferarea i transformarea limfocitelor B urma

tă de biosinteza intensă i eliberarea anticorpilor

specifici (

Roitt, I. et al

. – 1985). Mecanismul

reglării acestui proces rămâne însă deocamdată inco

mplet elucidat. Majoritatea cercetătorilor

consideră că prezenţa continuă a antigenelor joacă

un rol hotărâtor în stimularea biosintezei imu

noglobulinelor.

În urma acţiunii unor antigene date este indusă pro

ducţia de anticorpi deci, implicit, a

imunoserurilor. Un imunoser destinat utilizării ca

reactiv se caracterizează prin titru, afinitate i

specificitate faţă de un anumit antigen.

Titrul

antiserului se definete ca fiind diluţia la care

se realizează legarea a 50% dintrun

antigen marcat i are drept unitate de măsură inver

sul factorului de diluţie.

Afinitatea

unui imunoser se evaluează prin determinarea const

antei de asociere K

a

la

echilibru i se exprimă în mol

1

.

Specificitatea

unui imunoser faţă de un anumit antigen se define

te ca fiind capacitatea

sa de a recunoate numai antigenul respectiv.

În prezent se obţin imunoseruri ce conţin mai multe

tipuri de anticorpi care recunosc

epitopi diferiţi ai antigenelor. În afară de aceast

a, mediul de incubare poate conţine o serie de

specii moleculare ce prezintă o oarecare analogie s

tructurală cu antigenele. Toate acestea fac ca

în mediul de incubare să se producă aanumitele

reacţii încruciAate

în sensul că imunoserul

poate interacţiona i cu o serie de specii molecula

re, altele decât antigenele. Metodele folosite

astăzi permit însă evaluarea aceste „nonspecificit

ăţi” i a raportului dintre concentraţia antigenu

lui i concentraţia speciilor moleculare ce interfe

ră.

Anticorpi policlonali

. Imunoserurile utilizate în imunoanaliză sunt seru

ri ce conţin canti

tăţi mari ale mai multor anticorpi care manifestă s

pecificitate faţă de diferiţi epitopi ai aceluiai

antigen, adică sunt seruri policlonale. Prin extrap

olare, anticorpii conţinuţi întrun astfel de

imunoser poartă numele de

anticorpi policlonali

.

Anticorpi monoclonali

. Încă din 1950,

Mac Farlane Burnet

a elaborat o teorie asupra se

lecţiei clonale conform căreia fiecare limfocit B r

ecunoate un singur determinant antigenic, ceea

ce înseamnă că sintetizează un singur tip de antico

rpi. Implicit, fiecare antigen va interacţiona

numai cu celulele capabile săl recunoască. Această

interacţiune determină proliferarea i matu

rarea limfocitelor respective fapt ce conduce la ap

ariţia celulelor cu „memorie” de lungă durată,

anticorpii secretaţi fiind denumiţi

anticorpi monoclonali

. Abia după 25 de ani de la elaborarea

acestei teorii au fost obţinuţi

in vitro

primii anticorpi monoclonali (

Köhler, G. et al

. – 1975).

Obţinerea imunoserurilor

. Metodele de imunizare utilizate astăzi sunt încă

empirice,

neexistând reguli bine stabilite. La obţinerea de i

munoseruri se ţine cont de mai mulţi factori:

specia animalului de experienţă, natura antigenului

, necesitatea asocierii mai multor antigene,

utilizarea unor adjuvanţi, calea de administrare i

doza necesară, succesiunea administrării etc. În

funcţie de răspunsul imun, antigenele pot fi de dou

ă tipuri:

antigene cu capacitate imunogenă

imediată

i respectiv

haptene

. Haptenele sunt specii moleculare (cu masă molecul

ară mică) ce

nu prezintă capacitate imunogenă decât după cuplare

a cu un „purtător” cu masă moleculară mai

mare de 1000 Da.

Pentru ca o haptenă să poată fi fixată puternic, p

rin legare covalentă, pe un purtător este

necesar ca ea să prezinte grupe funcţionale complem

entare celor existente în molecula purtătoru

lui. Dacă însă haptena nu posedă asemenea grupe fun

cţionale, ea poate fi activată prin utilizarea

24

alegerea condiţiilor optime de pH, temperatură e

tc. în care să se realizeze imobilizarea.

b) determinarea principalilor parametri cinetici i

funcţionali ai imobilizatelor enzimatice

obţinute:

determinarea capacităţii de imobilizare (mg enz

imă/g suport);

studiul influenţei pHului i temperaturii mediu

lui asupra vitezei reacţiei catalizate de

enzima imobilizată respectivă;

studiul influenţei concentraţiei substratului as

upra vitezei de reacţie i determinarea

constantei K

M

;

determinarea timpului de stocare operaţională;

determinarea timpului de înjumătăţire a activită

ţii catalitice.

III.4.1 Alegerea condiţiilor optime de imobilizare

Acest aspect este extrem de important, dat fiind fa

ptul că în funcţie de condiţiile în care se

realizează cuplarea va depinde activitatea cataliti

că a preparatului obţinut. Deoarece capacitatea

catalitică a oricărei enzime imobilizate diferă de

valoarea aceluiai parametru specifică formelor

libere, fiind de regulă inferioară acesteia, activi

tatea enzimatică a preparatelor imobilizate poartă

numele de

activitate remanentă

.

Pentru ca aceasta să fie cât mai mare posibil,

alegerea suportului

se face în aa fel încât

procesul de cuplare să inactiveze cât mai puţin enz

ima. De obicei alegerea suportului se face în

funcţie de metoda de imobilizare ce urmează a fi fo

losită (legare prin interacţiuni fizice sau prin

covalenţă) i în funcţie de grupele funcţionale pe

care acesta le conţine i care pot fi implicate în

interacţiunile dintre enzimă i suport.

Alegerea metodei

optime de imobilizare se face, în principal, în fu

ncţie de procesul de

transformare în care va fi folosit viitorul prepara

t. De exemplu, dacă aceste transformări presu

pun utilizarea unor soluţii (soluţii tampon, soluţi

i de substrat etc.) cu forţe ionice superioare, se

vor utiliza preponderent metodele chimice de cuplar

e în aa fel încât în procesul de exploatare a

preparatului să nu aibă loc eluţia enzimei de pe su

port. Dintre metodele fizice de imobilizare, în

acest caz se utilizează cel mai adesea reticularea

în diferite geluri precum i imobilizarea prin

microîncapsulare. Atunci când nu există pericolul e

luţiei enzimei de pe suport, se utilizează imo

bilizarea prin adsorbţie sau alte metode fizice de

cuplare datorită simplităţii i rapidităţii cu care

pot fi executate.

Alegerea tehnicii de imobilizare

pune mai puţine probleme. În diferite situaţii poa

te fi uti

lizată atât imobilizarea în

sistemul coloană

, cât i în

sistemul baie

, cu condiţia să se realizeze un

contact cât mai intim între enzimă i suport. Mulţi

autori preferă sistemul baie deoarece se poate

realiza cuplarea sub agitare continuă în aa fel în

cât suspensia ce formează mediul de reacţie să

se omogenizeze cât mai bine.

Alegerea condiţiilor fizico-chimice

optime de imobilizare este extrem de importantă

deoarece aceasta determină în mod direct nivelul ac

tivităţii remanente. Formarea interacţiunilor

fizicochimice i chimice între enzimă i suport de

pinde în mare măsură de temperatura mediului

de cuplare.

Deoarece există pericolul inactivării termice a enz

imelor, cuplarea se realizează de obicei

la rece (0

÷

+4

o

C) chiar dacă este necesară pentru aceasta prelungi

rea timpului de sinteză. Imen

sa majoritate a datelor din literatură atestă faptu

l că randamentele cele mai bune se obţin atunci

când procesul de imobilizare este condus în medii d

e reacţie cu valori de pH apropiate de pHul

optim de acţiune al enzimei respective. Timpul de i

mobilizare este în general scurt, nedepăind

câteva ore.

Obţinerea unor preparate enzimatice sub formă imobi

lizată cu caracteristici superioare mai

depinde i de alţi factori: alegerea unui raport op

tim suport/enzimă, alegerea unui timp optim de

cuplare, stabilirea raportului optim suport/ligand

etc.

!i în cazul imobilizării celulelor întregi se obser

vă o strânsă interdependenţă între activita

tea catalitică a acestora i condiţiile de imobiliz

are.

25

III.4.2 Determinarea parametrilor cinetici Ai funcţ

ionali ai enzimelor

imobilizate

Prin

capacitate de imobilizare

se înţelege cantitatea de enzimă, exprimată în mil

igrame, fi

xată pe unitatea de masă (gram) sau volum (mililitr

u) de suport. Acest parametru oscilează între

limite valorice relativ largi de la o enzimă la alt

a sau de la un suport la altul. În general, metodel

e

fizice de cuplare asigură obţinerea unor capacităţi

de imobilizare de până la câteva mg/g (ml), în

timp ce prin utilizarea metodelor chimice de imobil

izare se pot obţine valori mai mari.

Determinarea practică a capacităţii de imobilizare

se poate face în mai multe moduri: fie că

se execută eluţia enzimei de pe suport după care se

dozează concentraţia proteică în eluat prin

metode specifice, fie că se determină concentraţia

enzimei în soluţia influent, în efluent i în

tamponul de spălare, după care se calculează prin d

iferenţă capacitatea de imobilizare.

Studiul influenţei pH'ului

mediului de incubare asupra vitezei reacţiilor cat

alizate de en

zimele imobilizate se face în mod similar ca i pen

tru enzimele libere, în sensul că se determină

activitatea catalitică în condiţii standard dar la

valori diferite de pH. Datele din literatura de spe

cialitate atestă faptul că prin imobilizare enzimel

e nu îi modifică, sau îi modifică foarte puţin

valoarea pHului optim de acţiune.

Dacă valoarea pHului optim de acţiune a enzimelor

se modifică foarte puţin prin imobili

zare, nu acelai lucru se poate spune în privinţa s

tabilităţii acestora faţă de reacţia mediului. În

majoritatea cazurilor se observă o cretere a stabi

lităţii enzimelor imobilizate comparativ cu for

mele libere faţă de pHul mediului, concomitent cu

o cretere a intervalului de pH în care enzima

este activă. Graficul dependenţei vitezei reacţiilo

r enzimatice de pHul mediului de incubare are

acelai aspect gaussian, dar cu o deschidere mai ma

re (fig. 4).

v (%)

pH

pH

opt

a

b

O

Fig. 4. Reprezentarea grafică a influenţei pH9ului

mediului de incubare asupra activităţii

enzimelor libere (a) @i imobilizate (b)

Creterea stabilităţii enzimelor prin imobilizare s

e explică, printre altele, prin faptul că în

jurul macromoleculei de proteinenzimă legată de un

suport insolubil se creează un micromediu

în care modificarea pHului se face mai lent. Cu al

te cuvinte, în jurul fiecărei molecule enzimati

ce se creează un gradient de pH în sens crescător

sau descrescător în funcţie de pHul mediului,

în aa fel încât în imediata vecinătate a enzimei,

pHul este mai apropiat de pHul optim de acţi

une comparativ cu zonele mai îndepărtate.

Determinarea

temperaturii optime de acţiune

i a influenţei acestui factor fizic asupra vi

tezei de reacţie se face în mod similar ca în cazul

evaluării influenţei pHului mediului. Determi

narea acestor parametri cinetici este de o importan

ţă majoră întrucât, prin utilizarea practică a

enzimelor imobilizate în diferite procese de biotra

nsformare nu este posibilă întotdeauna menţi

nerea cu mare exactitate a pHului i temperaturii

mediului la valori constante.

!i în cazul

constantei Michaelis K

M

au loc modificări prin imobilizare. În unele situa

ţii

constanta K

M

nu se modifică, în foarte puţine cazuri aceasta se

micorează, iar pentru marea ma

v

max

26

joritate a enzimelor se observă o cretere a valori

i constantei K

M

prin imobilizare, ceea ce presu

pune o scădere a afinităţii enzimei pentru substrat

. În general, aceste modificări ale valorilor con

stantelor K

M

sunt minore pentru enzimele imobilizate prin metod

e fizice i mai puternice în cazul

metodelor chimice de cuplare. Prin utilizarea acest

or metode se realizează reacţii în care se for

mează legături covalente fie direct între enzimă i

suport, fie prin intermediul diferiţilor liganzi.

În formarea acestor legături sunt implicate grupe f

uncţionale specifice din structura enzimelor,

altele decât cele ce fac parte din constituţia cent

rului activ. Dei aceste grupări funcţionale sunt

localizate în afara situsului catalitic, interacţiu

nea lor cu grupe funcţionale corespunzătoare din

suport determină apariţia unor modificări conformaţ

ionale ale moleculei enzimatice în ansamblu

i, implicit, ale centrului activ. Aceste modificăr

i conformaţionale mai mult sau mai puţin pro

funde determină o modificare corespunzătoare a afin

ităţii enzimei pentru substrat deci i a valorii

constantei K

M

.

După cum sa arătat mai sus, pentru imensa majorita

te a enzimelor se observă o modificare

a constantei K

M

prin imobilizare. Deoarece semnificaţia biochimică

a acestui parametru este ace

eai, precum i datorită faptului că ea se referă l

a aceeai pereche enzimăsubstrat, această con

stantă cinetică a enzimelor imobilizate poartă nume

le de

constantă Michaelis aparentă

i se

notează cu

K'

M

.

Chiar dacă K'

M

> K

M

pentru marea majoritate a enzimelor imobilizate, i

mportanţa practică a

acesteia nu scade, acest dezavantaj fiind anulat ch

iar i numai de avantajul net al posibilei utili

zării repetate a aceluiai preparat enzimatic spre

deosebire de biotehnologiile bazate pe folosirea

enzimelor libere ce pot fi întrebuinţate o singură

dată, iar produsul transformării trebuie apoi

purificat de urmele de proteină.

Enzimele imobilizate pot fi caracterizate i prin d

oi parametri funcţionali importanţi care

reflectă gradul de inactivare în timp a acestor bio

catalizatori prin stocare în condiţii optime de

conservare i respectiv prin utilizarea lor periodi

că în procese de biotransformare specifice. Este

vorba de timpul de stocare operaţională i respecti

v timpul de înjumătăţire a activităţii enzimati

ce.

Prin

timp de stocare operaţională

se înţelege intervalul de timp în care un preparat

enzi

matic imobilizat poate realiza cicluri de transform

are fără ca activitatea enzimatică să scadă

semnificativ. Mulţi autori consideră timpul de stoc

are operaţională ca fiind intervalul de timp în

care, catalizând reacţii specifice în procese conti

nue sau discontinue, enzima imobilizată respec

tivă îi diminuează capacitatea catalitică cu cel m

ult 20 %, adică prezintă o activitate remanentă

de minimum 80 %.

Prin

timp de înjumătăţire

a activităţii catalitice se înţelege intervalul de

timp în care, prin

utilizare continuă sau discontinuă, preparatul enzi

matic respectiv îi diminuează activitatea cu 50

% faţă de capacitatea sa catalitică iniţială. !i ac

est parametru oscilează între limite valorice des

tul de largi, depinzând de suportul i metoda de im

obilizare i diferă de la o enzimă la alta. De

terminarea acestor doi parametri funcţionali prezin

tă o importanţă practică deosebită, ei repre

zentând un adevărat „termen de garanţie” al fiecăru

i preparat.

Enzimele imobilizate pot prezenta un comportament d

iferit de cel al formelor native faţă

de acţiunea

efectorilor

i în special a

inhibitorilor

. În majoritatea cercetărilor noastre am studiat

i acest aspect, obţinând rezultate interesante în

studiul comparativ al acţiunii inhibitorilor speci

fici asupra activităţii catalazei libere i imobili

zate prin legare covalentă.

III.5. APLICAŢIILE PRACTICE ALE ENZIMELOR IMOBILIZA

TE

Utilizarea enzimelor imobilizate în diferite domen

ii ale activităţii umane prezintă o serie

de avantaje certe comparativ cu enzimele libere. În

primul rând este posibilă folosirea repetată a

aceluiai biocatalizator în realizarea mai multor c

icluri de transformare. Pe de altă parte se obţin

produi de reacţie mult mai puri, nefiind nevoie de

anumite etape costisitoare de purificare. Prin

utilizarea enzimelor imobilizate în scop terapeutic

se evită, în primul rând, degradarea acestora

sub acţiunea enzimelor din tubul digestiv sau tisul

are. În ultimul timp au fost realizate o serie de

27

cercetări ingenioase asupra imobilizării enzimelor

de interes terapeutic în fantome eritrocitare

sau în diferite structuri subcelulare, fiind comple

t înlăturat fenomenul de incompatibilitate. Au

mai fost efectuate cercetări asupra includerii enzi

melor în unguente, comprese și medicamente cu

aplicaţie locală.

Rezultate spectaculoase sau obţinut în domeniul s

enzorilor enzimatici care pot fi folosiţi

ca orice alt electrod ionoselectiv. În principiu, a

ceti senzori sunt reprezentaţi de electrozi sensi

bili faţă de diferiţi compui chimici, ce au supraf

aa activă acoperită cu o peliculă sintetică în care

sau imobilizat în prealabil una sau mai multe enzi

me. De exemplu senzorul pentru dozarea glu

cozei în diferite medii este format dintrun electr

od de oxigen acoperit cu o peliculă în care sa

imobilizat prin reticulare glucozooxidaza și catala

za.

În procesul de exploatare are loc o oxidare a gluco

zei cu formare de acid gluconic și apă

oxigenată. Aceasta din urmă este descompusă de cata

lază cu formarea unei cantităţi stoechiome

trice de oxigen ce poate fi dozat de oxigenometru.

Aparatul poate fi gradat direct în unităţi ale

concentraţiei de glucoză dacă se ţine cont de stoec

hiometria transformărilor.

Multe firme de renume (Orion, Corning, Sorgent ș.a

.) produc deja senzori enzimatici pen

tru determinarea ureei, aminoacizilor, penicilinei

etc. În funcţionarea unui senzor enzimatic se

disting cinci faze:

contactarea suprafeţei active a senzorului de că

tre substrat;

difuzia moleculelor substratului prin reţeaua po

limerului și accesul acestora la centrul

activ al enzimei;

reacţia enzimatică propriuzisă;

"exportul" produsului de reacţie prin membrana s

enzorului spre suprafaţa activă a elec

trodului de bază;

evaluarea concentraţiei acestuia la suprafaţa el

ectrodului. În tabelul următor sunt siste

matizate principalele date din literatură privind u

tilizarea senzorilor enzimatici.

Principalii senzori enzimatici și caracteristicile

lor

Nr.

crt.

Substanţa

dozată

Enzima din

senzor

Stabilitate

senzor

Timp de

lucru

Sensibilitatea

(moli/l)

1 uree urează 3 săpt. 30 sec. 10

2

10

5

2 glucoză glucozooxidază 6 luni 15 sec. 10

2

10

4

3 aminoacizi oxidaze specifice 6 luni 15 sec. 10

3

10

5

4 acid lactic LDH 1 săpt. 3 min. 10

3

10

4

5 acid succinic succinatDH 1 lună 1 min. 10

2

10

4

6 acid acetic alcoolDH 5 luni 30 sec. 10

1

10

4

7 penicilină penicilinaza 3 săpt. 1 min. 10

2

10

4

8 acid uric uratoxidaza 4 luni 30 sec. 10

2

10

4

9 colesterol colesteroloxidaza 3 luni 2 min. 10

1

10

4

IV. Noţiuni generale asupra metodelor imunoenzimati

ce de analiză

Generalităţi

Metodele imunologice sunt, în special, cantitative

i se bazează pe reacţiile antigen

anticorp. Actualmente, majoritatea metodelor de imu

noanaliză utilizează i un al treilea ele

ment, aanumitul

trasor

.

Acesta rezultă prin asocierea antigenului sau antic

orpului cu un

marker.

Era metodelor imunologice de analiză a debutat în

1959 când

Yalow & Berson

dozează

insulina. În perioada următoare, cercetările în ace

st domeniu au fost considerabil lărgite, ceea ce

a determinat apariţia a numeroase modificări menite

să mărească exactitatea i reproductibilitatea

rezultatelor.

28

Progresele înregistrate în imunologie au permis, î

n primul rând, posibilitatea obţinerii de

anticorpi policlonali specifici atât pentru biomole

culele micromoleculare cât i pentru cele cu

masă moleculară mare. Specificitatea i sensibilita

tea anticorpilor au fost considerabil mărite în

urma obţinerii anticorpilor monoclinali de către

Köhler & Milstein

în 1975.

Rezultatele încurajatoare obţinute în cercetările

privind separarea, purificarea i conserva

rea diferitelor biomolecule au avut drept rezultat

obţinerea de etaloane de o calitate deosebită.

Mărirea numărului acestora a determinat Organizaţia

Mondială a Sănătăţii să pună la punct un

sistem de standardizare internaţională astfel încât

astăzi, un mare număr de biomolecule posedă

etaloanele sale specifice.

Un moment important în studiul acestor metode de an

aliză la reprezentat obţinerea de

noi markeri. Timp îndelungat sau utilizat doar mar

kerii radioactivi. Avantajul acestora constă în

proprietăţile de emisie care nu depind de natura fi

zicochimică a mediului i în capacitatea de a fi

detectaţi uor i cu mare exactitate.

Utilizarea markerilor radioactivi prezintă însă i

unele inconveniente, principalul dez

avantaj constând în posibilitatea folosirii limitat

e a elementelor radioactive în condiţiile labora

toarelor obinuite de enzimologie. Din aceste motiv

e, în anii ’60 ai secolului XX au început să

fie utilizaţi alţi markeri, cei mai importanţi fiin

d cei enzimatici i cei luminiscenţi.

Noţiuni generale privind structura chimică Ai rolul

biologic al anticorpi-

lor

Este cunoscut faptul că atunci când unui animal de

experienţă îi este injectat un antigen,

răspunsul imunitar determină, printre altele, secre

ţia de anticorpi. Anticorpii (imunoglobulinele)

sunt glicoproteine sintetizate în limfocitele B (ac

tivate sub formă de plasmocite) i exportaţi în

plasma sanguină i lichidul interstiţial. Imunoglo

bulinele conţin situsuri speciale numite

epitopi

capabile să recunoască specific antigenele.

Structura chimică a anticorpilor a fost clarificată

în urma unor studii asupra imunoglobuli

nelor provenite de la o clonă de celule mielomatoas

e (

Edelman; G. M

. – 1973). Conform acestor

studii, imunoglobulinele conţin în moleculă aanum

itele catene grele H (

heavy

) i respectiv ca

tene uoare L (

light

) (fig. 5).

Catenele H sunt unite între ele prin intermediul a

minimum două punţi disulfidice

intercatenare în timp ce fiecare catenă de tip L se

leagă de câte o catenă H printro punte

disulfidică. Se cunosc mai multe catene de tip H no

tate convenţional

γ, α, , δ

γ, α, , δ

γ, α, , δ

γ, α, , δ

i

ε

εε

ε

care stau la

baza clasificării imunoglobulinelor

-

IgG, IgA, IgM, IgD i respectiv IgE (

Bach, J. F

. – 1986).

La rândul lor, catenele L sunt de două tipuri (

κ

κκ

κ

i

λ

λλ

λ

) în funcţie de capacitatea lor antigenică.

Schema redată în figura 157 corespunde imunoglobuli

nelor G (IgG) ce conţin două catene de tip

H i două de tip L i au masa moleculară de 150 kDa

.

Molecula acestora poate fi scindată enzimatic cu fo

rmarea mai multor fragmente. În

1959,

Porter R. R

. reuete să scindeze molecula de IgG cu ajutorul

papainei în prezenţă de

cisteină cu obţinerea a trei fragmente: unul notat

cu

Fc

(fragment cristalizabil din mediu apos) cu

masa moleculară de 50 kDa i altele două identice n

otate

Fab

(

fragment antigen bindig

) cu ma

sele moleculare de câte 45 kDa. Fiecare din cele do

uă fragmente Fab poate interacţiona cu anti

genul specific.

29

H

2

N —

— COOH

catenã L

catenã H

H

2

N —

H

2

N —

H

2

N —

— COOH

Fig. 5. Reprezentarea schematică a structurii imuno

globulinelor

Un an mai târziu (

Nisonoff, A

. et al. – 1960) sa reuit scindarea imunoglobulin

elor G sub

acţiunea pepsinei cu obţinerea mai multor peptide

i a unui fragment F(ab)

2

ce conţine două

situsuri de legare a antigenelor. Prin reducere, di

merul F(ab)

2

generează cele două fragmente Fab

ce îi conservă capacitatea de a interacţiona cu an

tigenele specifice.

Fiecare catenă peptidică din structura acestor frag

mente conţine câte un domeniu constant

i unul variabil, structura acestuia din urmă depin

zând de tipul imunoglobulinei din care provine.

Zonele variabile interesează secvenţele de aminoaci

zi de la extremităţile Nterminale ale catene

lor de tip H i respectiv L, restul structurii prim

are rămânând nemodificat. Zonele variabile au

fost notate cu V

L

pentru catenele uoare i respectiv V

H

pentru cele grele, iar domeniile constante

au fost notate cu C

L

i respectiv C

H

. La rândul lor, domeniile constante ale catenelor

H conţin trei

regiuni notate C

H1

, C

H2

i respectiv C

H3

(fig. 6).

Situsuri de

legare a

antigenului

V

L

V

H

C

L

C

H1

C

H2

C

H3

Fig. 6. Structura de bază a IgG (Nisonoff, A. et a

l. – 1960)

Imunoglobulinele cunoscute în prezent au fost împăr

ţite în cinci clase în funcţie de struc

tura catenelor lor de tip H: IgG, IgA, IgM, IgD i

IgE.

Imunoglobulinele G

(IgG) reprezintă aproximativ 75% din totalul imuno

globulinelor din

sistemul circulator, au o masă moleculară de 150 kD

a i o constantă de sedimentare de 7,5 S. la

rândul lor, IgG se împart în patru subclase în func

ţie de natura i ponderea componentei glucidi

ce a catenelor H: IgG

1

, IgG

2

, IgG

3

i respectiv IgG

4

. Pentru organismul uman, toate imunoglobu

linele G, cu excepţia IgG

3

, au capacitatea de a forma compleci insolubili cu

proteina A din pere

tele celular al

Staphylococcus aureus

.

Imunoglobulinele M

(IgM) au masa moleculară de 900 kDa i sunt alcătu

ite din cinci

subunităţi. Ele conţin în moleculă zece situsuri de

legare a antigenelor dei, din motive sterice,

nu toate sunt funcţionale.

30

Imunoglobuliele A

(IgA) au masa moleculară de 380 kDa i constanta d

e sedimentare de

11 S, fiind prezente preponderent în salivă, lapte,

secreţiile genitourinare etc.

Imunoglobulinele D

(IgD) au o masă moleculară de 175 kDa i se găsesc

în cantitate

mare în membranele limfocitelor B sin sânge.

În fine,

imunoglobulinele E

(IgE) au masa moleculară de 190 kDa i sunt respon

sabile

de reacţiile anafilactice ce determină eliberarea d

e histamină.

Imunoglobulinele sunt sintetizate de către limfocit

ele B i sunt secretate în mediul extra

celular în timpul transformării acestora în plasmoc

ite. În esenţă, mecanismul biosintezei anticor

pilor este următorul: un antigen dat interacţioneaz

ă specific cu limfocitele B capabile săl recu

noască. În urma acestei interacţiuni este indusă pr

oliferarea i transformarea limfocitelor B urma

tă de biosinteza intensă i eliberarea anticorpilor

specifici (

Roitt, I. et al

. – 1985). Mecanismul

reglării acestui proces rămâne însă deocamdată inco

mplet elucidat. Majoritatea cercetătorilor

consideră că prezenţa continuă a antigenelor joacă

un rol hotărâtor în stimularea biosintezei imu

noglobulinelor.

În urma acţiunii unor antigene date este indusă pro

ducţia de anticorpi deci, implicit, a

imunoserurilor. Un imunoser destinat utilizării ca

reactiv se caracterizează prin titru, afinitate i

specificitate faţă de un anumit antigen.

Titrul

antiserului se definete ca fiind diluţia la care

se realizează legarea a 50% dintrun

antigen marcat i are drept unitate de măsură inver

sul factorului de diluţie.

Afinitatea

unui imunoser se evaluează prin determinarea const

antei de asociere K

a

la

echilibru i se exprimă în mol

1

.

Specificitatea

unui imunoser faţă de un anumit antigen se define

te ca fiind capacitatea

sa de a recunoate numai antigenul respectiv.

În prezent se obţin imunoseruri ce conţin mai multe

tipuri de anticorpi care recunosc

epitopi diferiţi ai antigenelor. În afară de aceast

a, mediul de incubare poate conţine o serie de

specii moleculare ce prezintă o oarecare analogie s

tructurală cu antigenele. Toate acestea fac ca

în mediul de incubare să se producă aanumitele

reacţii încruciAate

în sensul că imunoserul

poate interacţiona i cu o serie de specii molecula

re, altele decât antigenele. Metodele folosite

astăzi permit însă evaluarea aceste „nonspecificit

ăţi” i a raportului dintre concentraţia antigenu

lui i concentraţia speciilor moleculare ce interfe

ră.

Anticorpi policlonali

. Imunoserurile utilizate în imunoanaliză sunt seru

ri ce conţin canti

tăţi mari ale mai multor anticorpi care manifestă s

pecificitate faţă de diferiţi epitopi ai aceluiai

antigen, adică sunt seruri policlonale. Prin extrap

olare, anticorpii conţinuţi întrun astfel de

imunoser poartă numele de

anticorpi policlonali

.

Anticorpi monoclonali

. Încă din 1950,

Mac Farlane Burnet

a elaborat o teorie asupra se

lecţiei clonale conform căreia fiecare limfocit B r

ecunoate un singur determinant antigenic, ceea

ce înseamnă că sintetizează un singur tip de antico

rpi. Implicit, fiecare antigen va interacţiona

numai cu celulele capabile săl recunoască. Această

interacţiune determină proliferarea i matu

rarea limfocitelor respective fapt ce conduce la ap

ariţia celulelor cu „memorie” de lungă durată,

anticorpii secretaţi fiind denumiţi

anticorpi monoclonali

. Abia după 25 de ani de la elaborarea

acestei teorii au fost obţinuţi

in vitro

primii anticorpi monoclonali (

Köhler, G. et al

. – 1975).

Obţinerea imunoserurilor

. Metodele de imunizare utilizate astăzi sunt încă

empirice,

neexistând reguli bine stabilite. La obţinerea de i

munoseruri se ţine cont de mai mulţi factori:

specia animalului de experienţă, natura antigenului

, necesitatea asocierii mai multor antigene,

utilizarea unor adjuvanţi, calea de administrare i

doza necesară, succesiunea administrării etc. În

funcţie de răspunsul imun, antigenele pot fi de dou

ă tipuri:

antigene cu capacitate imunogenă

imediată

i respectiv

haptene

. Haptenele sunt specii moleculare (cu masă molecul

ară mică) ce

nu prezintă capacitate imunogenă decât după cuplare

a cu un „purtător” cu masă moleculară mai

mare de 1000 Da.

Pentru ca o haptenă să poată fi fixată puternic, p

rin legare covalentă, pe un purtător este

necesar ca ea să prezinte grupe funcţionale complem

entare celor existente în molecula purtătoru

lui. Dacă însă haptena nu posedă asemenea grupe fun

cţionale, ea poate fi activată prin utilizarea

31

unor tehnici de sinteză chimică organică. Sa mai c

onstatat faptul că pentru obţinerea de anti

corpi cu specificitate înaltă este necesar ca fixar

ea haptenei să se facă prin formarea de legături

covalente la care să participe 1 – 5 atomi de carbo

n.

În prezent, în calitate de purtător cel mai adesea

se utilizează o serie de proteine cum ar fi

albumina serică bovină i tiroglobulina. Obţinerea

unor astfel de compleci se face, în general, în

două etape: a) obţinerea unui derivat al haptenei

i b) legarea covalentă a acestuia de o proteină

purtătoare cu ajutorul unui agent de cuplare. De re

gulă, agentul de cuplare este un compus

bifuncţional. Una din grupele sale funcţionale reac

ţionează cu o grupare corespunzătoare din

molecula haptenei (respectiv a derivatului său), ia

r cealaltă are rolul de a se lega covalent de pro

teina purtătoare. În prezent se folosesc cu succes

mai multe metode de cuplare a haptenelor cu

proteinele purtătoare.

a)

Cuplarea cu ajutorul carbodiimidei

se face conform reacţiilor:

R

1

– N = C = N – R

2

haptenã carbodiimidã

Hap. — COOH

+

R

1

– NH – C = N – R

2

O

C = O

Hap.

+

Prot. — NH

2

conjugat

derivat de uree

O

Hap. — C – NH — Prot.

O

R

1

– NH – C – NH – R

2

Dintre carbodiimidele solubile în apă, cel mai ade

sea se folosesc 1ciclohexil3(2

morfolinoetil)carbodiimidametoptoluensulfonatu

l (CMC) i respectiv 1etil3(3dimetil

aminopropil)carbodiimida (EDAC), excesul de reacti

v eliminânduse prin dializă. Această me

todă se folosete preponderent la cuplarea peptidel

or cu masă moleculară mică, a hormonilor, a

unor medicamente, a AMPului ciclic etc.

b) Cuplarea cu ajutorul diizocianatului

. Din această categorie de compui, cel mai ade

sea se folosete toluen2,4diizocianatul care este

capabil să lege două grupări aminice de la două

molecule diferite conform reacţiei:

haptenã

+

O = C = N –

CH

3

N = C = O

toluen-diizocianat

+

H

2

N — Prot.

Hap. — NH

2

Hap. — NH – C

CH

3

O

NH

NH – C – NH —

O

— Prot.

conjuga

●

Metode de detecţie

În prezent se utilizează două tipuri de metode de d

etecţie i măsurare a semnalului: meto

de bazate pe fotometria de absorbţie i metode lumi

nometrice, primele fiind cel mai des utiliza

te.

a) Spectrofotometria de absorbţie

În cursul unei dozări imunoenzimatice, reacţia en

zimatică propriuzisă determină modi

ficarea unui cromogen (substratul sau o specie mole

culară asociată acestuia) cu formarea unui

produs ce prezintă o bandă de absorbţie caracterist

ică în domeniul vizibil sau ultraviolet. În ma

rea majoritate a cazurilor, cantitatea de produs es

te proporţională cu cantitatea de enzimă (adică

marker), iar absorbanţa reprezintă un semnal indire

ct necesar trasării curbei de etalonare.

Absorbanţa unei substanţe se determină experimenta

l prin măsurători fotometrice. Un

fascicul luminos paralel, monocromatic, cu intensit

atea incidentă I

o

traversează substanţa. No

47

tând cu I intensitatea transmisă, absorbanţa A (sau

densitatea optică) a substanţei respective se

definete ca fiind:

I

I

lg

A

0

=

În domeniul vizibil i ultraviolet, fiecare specie

moleculară prezintă un spectru de absorb

ţie caracteristic descris de funcţia:

A = f(l)

Graficul acestei funcţii prezintă de obicei un pic

relativ larg (în intervalul a câtorva zeci

de nanometri). Lungimea de undă la care se înregist

rează absorbţia maximă este o caracteristică

a fiecărei specii moleculare, aceasta fiind lungime

a de undă la care se măsoară absorbanţa în

metodele spectrofotometrice de dozare.

Pentru soluţii, legea BeerLambert definete o rel

aţie de proporţionalitate între absorbanţa

A i concentraţia C ale unei specii moleculare:

A = e ⋅⋅⋅⋅d ⋅⋅⋅⋅C

unde e este absorbţia substanţei la lungimea de und

ă la care se face citirea. Aplicarea acestei legi

este limitată, ea fiind valabilă doar pentru soluţi

ile diluate i nefluorescente.

Realizarea metodelor de dozare prin spectrofotomet

rie de absorbţie se face utilizând

spec9

trofotometrul de absorbţie

în domeniul vizibil i/sau ultraviolet.

b) Luminometria

Metodele imunoenzimatice de analiză bazate pe chem

iluminiscenţă i fotoluminiscenţă

vor fi descrise în subcapitolul următor.

Metode de dozare

Ca i în cazul celorlalte metode de imunoanaliză, m

etodele imunoenzimatice se bazează

pe evaluarea ponderii trasorului liber sau legat în

timpul sau la sfâritul reacţiei imunologice.

Aceasta se poate face prin două tipuri de metode:

a)

metode prin deficit de anticorpi

sau

metode prin competiţie;

b) metode prin exces de anticorpi

sau

metode imunometrice.

Cu toate acestea, clasificarea metodelor imunoenzim

atice de analiză se face în funcţie de

proprietăţile markerilor deoarece activitatea unui

marker enzimatic poate fi diferită dacă trasorul

este sau nu legat întrun complex antigen anticor

p.

Această modificare a activităţii trasorului (crete

re sau diminuare după caz) stă la baza

metodelor

în fază omogenă

care permit determinarea directă a trasorului liber

sau legat, omiţând

etapa de separare. Metodele care necesită o etapă d

e separare a complecilor se numesc metode

în fază heterogenă

.

a) Metode în fază omogenă

Acestea reprezintă majoritatea metodelor prin comp

etiţie i se aplică în special în cazul

haptenelor. Metodele în fază omogenă se bazează pe

principiul

EMIT (

Enzyme Multiplied

ImmunoAssay Test)

utilizat foarte des la dozarea medicamentelor i a

hormonilor cu masă mo

leculară mică (tiroxină, cortizol etc.) (fig. 9). Î

n cazul acestor metode, legătura dintre conjugat i

anticorp maschează centrul activ al enzimei care, î

n felul acesta, nu poate ataca substratul. Canti

tatea de enzimă activă, deci implicit semnalul măsu

rat, crete o dată cu creterea concentraţiei

antigenului dozat.

) Metode în fază heterogenă

Dintre metodele în fază heterogenă, cel mai adesea

se utilizează metodele

ELISA

(

Enzyme Linked Immunosorbent Assay)

.

La rândul lor, metodele ELISA se împart în două gr

upe principale:

metode prin competi9

ţie (

ELISA competition

) @i metode imunometrice (

ELISA

sandwich

)

(fig. 10 i 11

49

Fig. 11. Reprezentarea schematică a principiului me

todei ELISA sandwich

Deseori se utilizează o variantă ELISA pentru dozar

ea anticorpilor: antigenul corespunză

tor este fixat în exces pe un suport solid. Întro

primă etapă, anticorpii se leagă de acesta după

care se adaugă în exces un al doilea anticorp marca

t, specific imunoglobulinelor umane.

●

Metode imunoenzimatice de analiză cu markeri fotolu

miniscenţi Ai

chemiluminiscenţi.

În ultimul deceniu sa recurs la o alternativă a ut

ilizării markerilor radioactivi care constă

în cuplarea de luminofori cu anticorpi sau antigene

specifice. Prin

luminofor

se înţelege orice

moleculă sau orice grupă funcţională capabilă să em

ită lumină sub acţiunea unei excitaţii.

Este cunoscut faptul că energia unei molecule repr

ezintă suma a trei energii componente:

energia

E

r

care determină momentul de rotaţie a moleculei în

jurul centrului său de greutate,

energia

E

v

care determină vibraţiile atomilor moleculei respe

ctive unii în raport cu alţii i ener

gia electronică

E

e

care depinde de repartiţia electronilor.

O moleculă care absoarbe suficientă energie pentru

a trece la un nivel de energie (elec

tronică E

e

, de vibraţie E

v

sau de rotaţie E

r

) superior (nivel excitat), revine spontan la nivel

ul

fundamental de energie. Această revenire se poate f

ace cu emisia unui foton, fenomenul respec

tiv stând la baza luminiscenţei.

Fotoluminiscenţa

, care include fluorescenţa i fosforescenţa, este

un fenomen de emisie

ce are loc în urma unei excitaţii luminoase.

Fluorescenţa

se caracterizează printro tranziţie elec

tronică de la starea de singlet excitat la cea de s

inglet fundamental (S*

→

S).

Această tranziţie este un fenomen foarte rapid, du

rata medie de viaţă a stării excitate fiind

de ordinul a 10

9

10

8

secunde.

Fosforescenţa

se caracterizează prin tranziţia de la starea de

triplet excitat la cea de singlet fundamental (T*

→

S) i este un fenomen foarte lent (t = 10

8

se

cunde).

Chemiluminiscenţa

este fenomenul ce are loc în urma unei reacţii chi

mice produsă de o

specie moleculară aflată în stare excitată.

Bioluminisceţa

reprezintă un caz particular de

chemiluminiscenţă ce are loc în urma unor reacţii e

nzimatice.

Principala proprietate a markerilor chemiluminisce

nţi o constituie specificitatea de sem

nal. Din această cauză, spre deosebire de fluorofor

i, emisia nu este perturbată de lumina parazită.

În prezent se utilizează mai mulţi markeri chemilum

iniscenţi consacraţi.