1

Aparatura do badań spektroskopowych

Spektrofotometr

Do rejestracji widm absorpcji używany jest spektrofotometr V-550 (Jasco) i

Specord UV-VIS (Zeiss) oraz jeśli to konieczne to także Cary-300 (Varian).

Spektrofotometry te są przyrządami dwuwiązkowymi.

Oznacza to, że jeżeli oprócz badanego związku absorbuje również

rozpuszczalnik i/lub zawarte w nim zanieczyszczenia (jeśli takowe się w nim znajdują),

to przy pomiarze, gdzie w torze referencyjnym znajdować się będzie kuweta z

rozpuszczalnikiem, którego używamy do badań, a w torze pomiarowym nasza próba, to

wartość absorbancji wskazywana przez przyrząd będzie oznaczała faktyczną

absorbancję próbki, a nie również rozpuszczalnika (i ewentualnych zanieczyszczeń)

ponieważ zostanie ten wpływ skompensowany.

Spektrofotometr do badania absorpcji elektronowej rejestruje stosunek

intensywności promieniowania wychodzącego z próbki (I) do intensywności

promieniowania padającego na próbkę (Io). Stosunek I/I0 nazywany jest transmitancją i

jest rejestrowany jako funkcja częstości padającego na próbkę promieniowania.

Rysunek 1 przedstawia typowy schemat układu optycznego spektrofotometru. Źródłem

światła w zakresie 350-700nm jest lampa wolframowa, a w zakresie 180-400nm lampa

wodorowa lub deuterowa. Podczas pomiaru absorpcji promieniowanie ze źródła światła

(odpowiedniej lampy) prowadzone jest wzdłuż głównej osi optycznej, a po przejściu

przez siatkę dyfrakcyjną coraz to inne częstości promieniowania padają na sektor

wirujący, który rozdziela wiązkę na dwie, z których jedna pada na próbkę, a druga na

odnośnik (zwykle rozpuszczalnik). Kolejny sektor wirujący miesza obie wiązki

wychodzące z próbki i kieruje na fotopowielacz, w którym następuje zamiana impulsów

świetlnych na elektryczne. Mierzony sygnał trafia do komputera gdzie obliczany jest

stosunek I/I0 dla danej, zadanej długości fali.

2

Rys.1 Schemat dwuwiązkowego spektrofotometru na przykładzie V-550 (Jasco).

Spektrofotometr Jasco V-550

Wszystkie funkcje spektrofotometru V-550 sterowane są za pomocą komputera.

Podstawowe parametry przyrządu zostały zebrane poniżej:

tryb fotometryczny:

ABS – pomiar absorbancji,

%T – pomiar transmitancji,

%R – pomiar reflektancji,

Sample – pomiar jednowiązkowy dla wiązki pomiarowej,

Reference - pomiar jednowiązkowy dla wiązki odniesienia,

czas uśredniania wartości pomiarowych:

Quick – ok. 0.03 s,

Fast – 0.25 s,

Medium – 1 s,

Slow – 4 s,

szerokość spektralna szczelin [nm]:

0.1; 0.2; 0.5; 1; 2; 5; 10,

prędkość skanowania długości fali [nm/min]:

10; 20; 40; 100; 200; 400; 1000; 2000; 4000,

zakres długości fali [nm]:

190 – 900,

powtarzalność długości fali [nm]:

0.1,

dokładność długości falowej [nm]:

± 0.3,

3

odległość punktów pomiarowych [nm]:

0.025; 0.05; 0.1; 0.2; 0.5; 1; 2,

dokładność fotometryczna:

±0.002 przy absorbancji 0.5,

stabilność linii bazowej:

± 0.0004 ABS / godzinę,

światło rozproszone:

0.015% przy 220 nm,

zakres pomiaru:

-2 do + 4 absorbancji,

kierunek zbierania widma:

od dłuższych do krótszy wartości długości fal.

Spektrofotometr Cary-300

Spektrofotometr Cary-300 firmy Varian jest także przyrządem dwuwiązkowym,

również sterowanym poprzez komputer z monochromatorem typu Czerny-Turner i pre-

monochromatorem. Charakteryzuje się nieco lepszymi parametrami pomiarowymi i

większą stabilnością pracy niż opisany powyżej spektrofotometr Jasco V-550:

tryb fotometryczny:

czas uśredniania wartości pomiarowych1 [s]:

0.033 – 1000,

szerokość spektralna szczelin [nm]:

0.2 – 4.0, z krokiem co 0.1 nm,

prędkość skanowania długości fali [nm/min]:

0.001 – 3000,

zakres długości fali [nm]:

190 - 900,

powtarzalność długości fali [nm]:

< 0.08,

dokładność długości fali [nm]:

± 0.2,

odległość punktów pomiarowych [nm]:

1 Parametry te są od siebie zależne – ręcznie można ustawić tylko dwa, trzeci ustawiany jest przez program.

4

0.02 – 10,

dokładność fotometryczna:

±0.0006 przy absorbancji 0.3,

stabilność linii bazowej:

< 0.0003 ABS / godzinę,

światło rozproszone:

0.0005% przy 220 nm,

zakres pomiaru:

+ 5 absorbancji,

kierunek zbierania widma:

od dłuższych do krótszy wartości długości fal.

Zmodernizowany spektrofluorymetr MPF-3

Budowę i zasadę działania spektrofluorymetru przedstawiono na przykładzie

spektrofluorymetru MPF-3 produkcji Perkin-Elmer-Hitachi. Schemat blokowy tego

aparatu zamieszczono na Rys. 2.

Rys.2 Schemat blokowy zmodernizowanego spektrofluorymetru MPF-3.

Spektrofluorymetr MPF-3 firmy Perkin-Elmer-Hitachi w stosunku do oryginału

został zmodyfikowany. Dodane zostały:

Monochromator

wzbudzenia

Zasilacz

lampy

ksenonowej

Zasilacz

F1

Zasilacz

układu

chłodzącego

PC

Monochromator

emisji

wzmacniacz wzmacniacz

F1

1 F2 Zasilacz

F2

próbka filtry

Lampa

ksenonowa

Rodamina B

filtry

Układ liczenia

fotonów

5

fotopowielacz referencyjny,

chłodzenie fotopowielacza pomiarowego,

detekcja z użyciem liczenia pojedynczych fotonów,

stabilniejsze źródło światła

sterowanie urządzeniem (nie wszystkie funkcje są dostępne, np. ustawianie

długości fali wzbudzenia, emisji, szerokości szczelin itp) i rejestracja widm za

pomocą komputera,

stabilizacja temperatury kuwety pomiarowej.

Źródłem światła jest lampa ksenonowa (o mocy 150W, firmy Hamamatsu),

która charakteryzuje się ciągłym widmem promieniowania z zakresu 200-1000nm i

wyjątkowo dużą stabilnością świecenia (zmiana I0<0.5% w czasie jednej godziny).

Promieniowanie to służy do wzbudzania badanego związku i jest kierowane przez układ

soczewek i zwierciadło płaskie do monochromatora toru wzbudzenia. Pomiędzy

monochromatorem wzbudzenia, a próbką znajduje się światłodzieląca płytka kwarcowa,

która kieruje część wiązki ( 8%) na kuwetę ze stężoną rodaminą B, absorbującą

całkowicie padające światło o dowolnej długości fali (w zakresie 200-580nm). Tor

referencyjny oprócz kuwety z rodaminą B składa się z filtru przepuszczającego

wyłącznie światło emitowane przez rodaminę oraz fotopowielacza odniesienia F2.

Układ ten umożliwia skorygowanie widm wzbudzenia poprzez uwzględnienie zmian

natężenia padającego promieniowania lampy, a także znajduje zastosowanie jako

licznik kwantów do pomiaru wartości natężenia światła padającego na próbkę w

przypadku pomiaru wydajności kwantowych emisji oraz porównania intensywności

widm emisji badanego związku dla różnych długości fali wzbudzenia.

Z monochromatora wzbudzenia, wiązka o wybranej długości fali i zadanej

szerokości spektralnej, określanej przez szerokość szczeliny pada na próbkę. Pod kątem

900 do kierunku padania światła wzbudzającego następuje zbieranie emisji

promieniowania pochodzącego od badanej próbki. Po zogniskowaniu przez soczewkę

promieniowanie to wchodzi do monochromatora emisji. Promieniowanie wychodzące z

monochromatora emisji jest ogniskowane przez soczewkę i rejestrowane przez

chłodzony (do temperatury –300C) fotopowielacz pomiarowy F1. Chłodzenie

fotopowielacza zapewnia znaczne (ponad 100 krotne) zmniejszenie ciemnego prądu

fotopowielacza. Sygnały z fotopowielaczy F1 i F2 (R928 Hamamatsu specjalnie

wyselekcjonowane do pomiarów liczenia pojedynczych fotonów) są przekazywane do

karty komputera za pomocą wzmacniaczy. Karta ta steruje również pracą

6

monochromatorów z użyciem silników krokowych. W celu zmniejszenia intensywności

światła rozproszonego oraz wyeliminowania promieniowania pochodzącego od

drugiego rzędu ugięcia siatki stosuje się odpowiednio dobrane filtry wstawione za

próbką. Inne parametry pomiarowe to:

maksymalna wartość mierzonego sygnału emisji [cps]:

500000,

szerokość spektralna szczelin wzbudzenia i emisji [nm]:

1 – 40,

krok pomiarowy [nm]:

0.1 – 1.0,

dokładność ustawienia długości fali wzbudzenia i emisji (wynikająca z działki)

[nm]:

2,

czas uśredniania wartości pomiarowych [ms]:

10 – 65000,

kierunek zbierania widma:

od krótszych do dłuższych wartości długości fal.

Układ liczenia fotonów (zarówno w torze pomiarowym jak i referencyjnym)

służy do rejestracji widm optycznych metodą zliczania pojedynczych fotonów, czyli

elektronicznym zliczaniu impulsów odpowiadających pojedynczym fotonom

emitowanym przez próbkę i padającym na fotokatodę fotopowielacza. Dzięki takiemu

rozwiązaniu możliwe jest badanie widm emisyjnych z równoczesną detekcją natężenia

światła wzbudzającego oraz badanie widm wzbudzenia emisji z równoczesną korekcją

na rozkład spektralny źródła światła wzbudzającego.

W celu zarejestrowania widm ustawia się ręcznie odpowiednie szerokości

szczelin wzbudzenia i emisji, które muszą być dobrane tak, aby intensywność emisji nie

przekroczyła 500 000 zliczeń na sekundę tak na fotopowielaczu F1 jak i F2. W tych

warunkach oba fotopowielacze pracują liniowo. Długość fali wzbudzenia i początkową

długość fali przy pomiarze widma emisji oraz analogicznie długość fali emisji i

początkową długość fali w widmie wzbudzenia ustawia się ręcznie.

Spektrofluorymetr MPF-3 jest przyrządem jednowiązkowym i dlatego osobno

rejestruje się w identycznych warunkach odpowiednie widma dla próbki, tj., dla

badanego związku w rozpuszczalniku i dla samego rozpuszczalnika. Widma są

rejestrowane na komputerze za pomocą programu „Easy Scan”, w którym wybiera się

7

typ rejestrowanego widma, początkową i końcową wartość długości fali emisji

(wzbudzenia) oraz długość fali wzbudzenia (emisji) w przypadku rejestracji widm

emisji (wzbudzenia emisji) oraz czas zliczania fotonów dla każdej długości fali w

widmie (tzw. czas trwania jednego kroku).

8

Metodyka pomiarów widm absorpcji

Pomiary absorpcyjne mogą być wykonywane na spektrofotometrze V-550

(Jasco), Specord UV-VIS (Zeiss), a także na Cary-300 (Varian). Pomiary te nie należą

do prostych gdy dla badanego związku, np. tetrafenylo porfiryny cynkowej (ZnTPP)

obserwuje się bardzo duże zmiany molowego współczynnika ekstynkcji ( ) ZnTPP w

całym zakresie widmowym (200-650nm), a przy tym bardzo duże zmiany (prawie o

trzy rzędy wielkości) w wąskim zakresie spektralnym pasma Soreta (zaledwie 25nm).

Dlatego w celu poprawnego i dokładnego pomiaru wartości absorbancji w szerokim

zakresie (10-4

-1.0) należy stosować specjalną metodykę.

W pierwszym etapie należy określić czas po jakim spektrofotometr od jego

uruchomienia zaczyna pracować stabilnie (co jest związane przede wszystkim z

wygrzaniem lamp), a także jaka jest jego stabilność w czasie pracy.

[nm]200 300 400 500 600 700 800

AB

S [

j.u

.]

-0.0004

-0.0002

0.0000

0.0002

0.0004

medium

0.5 medium

0.5 fast

czasy próbkowania:0.5 fast = 0.5 smedium = 1s0.5 medium = 2s

Rys.1 Linia zerowa pustego spektrofotometru Cary-300 dla różnych czasów próbkowania.

Wykonano szereg testujących pomiarów dla różnych parametrów pracy

spektrofotometru (czas zliczania, krok oraz czas zbierania widma w danym zakresie

spektralnym), co pozwoliło dobrać najkorzystniejsze warunki pomiarowe pozwalające

rejestrować najdokładniej widma absorpcyjne tak co do wartości absorbancji (absorpcji)

jak i długości fali, a zarazem przy największym stosunku mierzonego sygnału do szumu

elektroniki i największej powtarzalności pomiarów (Rys.1 i 2).

9

[nm]200 300 400 500 600 700 800

AB

S [

j.u

.]

-0.0004

-0.0002

0.0000

0.0002

0.0004

"medium" przed pomiarami

"medium" po 5h

0.5 "medium" przed pomiarami

0.5 "medium" po 5h

czasy próbkowania:0.5 fast = 0.5 smedium = 1s0.5 medium = 2s

Rys.2 Linia zerowa pustego spektrofotometru Cary-300 gotowego do pracy i po upływie pięciu

godzin pracy.

W oparciu o wyniki pomiarów absorpcyjnych można uzyskać ważne wnioski co

do własności spektralnych i fotofizycznych badanych związków. Podano to na

przykładzie porfiryny ZnTPP, dla której starano się stwierdzić:

a) obecność stanu S2’ – czy pojawią się zmiany w widmie absorbancji (jego

kształcie, wartościach max

, min

, 1/2

) wskazujące na obecność stanu S2’ oraz na

jego położenie w stosunku do stanu S2,

b) obecność w widmie absorbancji dimerów obok monomeru, a także

c) wyznaczyć wydajność kwantową fluorescencji ze stanu S1 ( F(S1)) przy

wzbudzeniu zarówno do stanu S2 jak i S1.

Punkty (a) i (b) wymagają bardzo dokładnych pomiarów widm absorbancji w całym

zakresie spektralnym, w którym porfiryny absorbują (tj. 200-650nm), zaś punkt (c)

pomiarów absorbancji przy wybranych długościach fal. Aby można wyciągnąć

wiarygodne wnioski z tych pomiarów konieczne było wyznaczenie błędu pojedynczego

pomiaru absorbancji oraz powtarzalności w pomiarach punktowych i ciągłych.

Przykładowe pomiary ilustrujące pracę spektrofotometru Cary-300 zamieszczono w

Tabeli 1 (błąd wyznaczenia wartości A obliczono ze wzorów na średnią ważoną).

Pomiary nr 1 i 5 to pomiary linii zerowej pustego spektrofotometru. Pomiary 2-4, to

10

pomiary absorbancji ZnTPP w n-hexanie, przy czym przed dokonaniem pomiaru nr 4

kuwetkę pomiarową wyjęto i ponownie włożono do spektrofotometru w celu

stwierdzenia jak duży błąd można popełnić przy wyznaczeniu absorbancji w wyniku

nieidentycznego ustawienie kuwety pomiarowej.

Tabela 1. Pomiary absorbancji ZnTPP w n-hexanie, szczelina 4nm,

czas integracji 4s.

Nr pomiaru = 361,5nm = 407,5nm = 414,5nm

A A A

Średnia Średnia Średnia

1. 0,0000

0,0000

0,0000

0,0000 0,0000

0,0000

0,0000

0,0000 0,0000

0,0000

0,0000

0,0000

2. 0,1003

0,1001

0,1002

0,1002 0,0525

0,0525

0,0525

0,0525 0,1400

0,1402

0,1402

0,1401

3. 0,1001

0,1002

0,1002

0,1002 0,0525

0,0525

0,0525

0,0525 0,1404

0,1405

0,1406

0,1405

4. 0,1000

0,1001

0,1003

0,1001 0,0526

0,0526

0,0526

0,0526 0,1405

0,1405

0,1405

0,1405

5. 0,0000

0,0000

0,0001

0,0000 0,0000

0,0000

0,0000

0,0000 0,0000

0,0000

0,0000

0,0000

AA 0,10017 0,00009 0,05253 0,00009 0,14038 0,00009

Błąd wyznaczenia A 0,09% 0,17% 0,06%

Otrzymane wyniki pokazują, że maksymalny błąd wyznaczenia wartości

absorbancji dla danej długości fali w pomiarach punktowych wynosił znacznie mniej

niż 1%. Ponadto na wielkość błędu nie wpływa ewentualna niepowtarzalność

wyjmowania i wkładania kuwetki z próbką.

11

Kolejnym ważnym krokiem było dobranie takich warunków pomiaru widm

absorbancji , aby nie były one zniekształcone przez niepoprawnie dobrane parametry

aparatury. W tym celu wykonano pomiary absorbancji w funkcji szerokości szczeliny

światła padającego (0.2, 1, 2 i 4nm). W przypadku pasma absorpcji S0 S2, które jest

pasmem bardzo wąskim spektralnie, dla szczeliny 0.2nm i 1nm nie obserwuje się

różnicy w kształcie widma. Poszerzenie pasma absorpcji zaczyna być już widoczne dla

szczeliny 2nm, a przy szczelinie 4nm dodatkowo można zaobserwować przesunięcie

maksimum absorpcji pasma S0 S2. W przypadku pasma absorpcji S0 S1 nie

obserwuje się aż tak wyraźnych zmian w jego kształcie, gdyż pasmo to nie jest tak

wąskie spektralnie jak pasmo absorpcji związane z przejściem do stanu S2.

Rys.3 Widma absorpcji S0 S2 dla ZnTPP (c=3.5 10-6

mol/dm-3

) w EtOH w funkcji szerokości

szczeliny.

Ze względu na duże różnice wartości molowych współczynników absorpcji przy

wzbudzeniu do stanu S2 i S1 (max

(S2) 25max

(S1)), w celu dokładnego zbadania widm

absorpcji dla obu tych stanów koniecznym było zastosowanie kuwet o różnych

długościach drogi optycznej. W ramach ustalenia odpowiednich parametrów dla

pomiaru widm absorpcji zarówno w wybranym zakresie spektralnym (widm „ciągłych”)

[nm]380 400 420 440

AB

S

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

0,2nm

1nm

2nm

4nm

[nm]

416 418 420 422 424 426 428 430

AB

S

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

12

jak i dla wybranych długości fal (pomiarów „punktowych”) opracowano również

właściwą metodykę pomiaru.

Jednym z ważnych czynników, jaki może wpływać na mierzony kształt widma

absorpcji badanego związku jest różnica (z reguły niewielka) widm kuwetki

pomiarowej i kuwetki odniesienia. Biorąc jednak pod uwagę oczekiwane nieznaczne

różnice widm absorpcji dla monomeru i dimeru ZnTPP i ZnP, jak również brak danych

odnośnie własności spektralnych stanu S2’ konieczne było wykonanie pomiarów

absorpcyjnych z jak najmniejszym błędem wynikającym z niepowtarzalności pomiarów

i z całkowitym wyeliminowaniem błędów systematycznych.

Do pomiarów zastosowano kuwety absorpcyjne oraz emisyjne, wykonane z

najwyższej jakości syntetycznego kwarcu (suprasil) o długości drogi optycznej: 5, 2, 1,

0.4, 0.2, oraz 0.1cm. Pomiar widm absorpcji (WA( )) oraz pomiar absorbancji dla

wybranej długości fali (A( )) wykonano w spektrometrze dwuwiązkowym. Jednak

każda kuwetka posiada swoje indywidualne widmo absorpcji, dlatego pomiary składały

się z dwóch kroków:

- krok pierwszy – pomiar widma absorpcji kuwetki pomiarowej.

Pomiar ten był wykonywany z udziałem użytego do badań rozpuszczalnika i tak np.

dla ZnTPP w etanolu, najpierw wykonywano pomiar w dwóch kuwetach

zawierających etanol, zarówno w torze pomiarowym jak i referencyjnym.

- krok drugi – pomiar widma absorpcji badanego związku.

Po usunięciu z kuwety pomiarowej rozpuszczalnika, przepłukiwano ją wielokrotnie

(5-10 krotnie) badanym roztworem (np. ZnTPP w etanolu), a następnie

wykonywano właściwy pomiar widma absorpcji tego roztworu.

Rzeczywiste widmo absorpcji badanego związku uzyskiwano poprzez wyeliminowanie wpływu różnicy

kuwet próbki i odnośnika. W tym celu od eksperymentalnego widma absorpcji badanego związku (krok

drugi) odejmowano widmo absorpcji kuwety pomiarowej zmierzone w kroku pierwszym.

W przypadku bardzo dokładnych pomiarów punktowych absorbancji (niekiedy o

bardzo małej wartości) poza koniecznością wyeliminowania wpływu nieidentyczności

kuwety pomiarowej i odniesienia należało również wyeliminować wpływ

niepowtarzalności pomiarów związany z wielokrotnym wkładaniem i wyjmowaniem

kuwety pomiarowej ze spektrofotometru oraz zbadać stabilność pracy aparatury. W tym

celu pomiar punktowy dla danej długości fali składał się z następujących kroków:

1) Krok pierwszy – pomiar absorbancji kuwetki pomiarowej:

- pomiar absorbancji pustego, „wyzerowanego” na daną długość fali

spektrofotometru,

13

- wielokrotny (najczęściej 3-krotny) pomiar absorbancji kuwetki pomiarowej

zawierającej rozpuszczalnik dla danej długości fali,

- wyjęcie i ponowne włożenie do spektrofotometru w torze pomiarowym kuwety

pomiarowej zawierającej rozpuszczalnik i wielokrotny pomiar absorbancji dla

danej długości fali,

- ponowne wyjęcie i włożenie do spektrofotometru w torze pomiarowym kuwety

pomiarowej zawierającej rozpuszczalnik i wielokrotny pomiar absorbancji dla

danej długości fali,

- pomiar absorbancji pustego aparatu pomiarowego w celu kontroli stabilności

jego pracy.

2) Krok drugi – pomiar absorbancji badanego związku:

- pomiar absorbancji pustego, „wyzerowanego” na daną długość fali

spektrofotometru,

- wielokrotny (najczęściej 3-krotny) pomiar absorbancji badanego związku dla

danej długości fali,

- wyjęcie i ponowne włożenie do spektrofotometru w torze pomiarowym kuwety

zawierającej badany związek i wielokrotny pomiar absorbancji dla danej

długości fali

- ponowne wyjęcie i włożenie do spektrofotometru w torze pomiarowym kuwety

zawierającej badany związek i wielokrotny pomiar absorbancji dla danej

długości fali

- pomiar absorbancji pustego aparatu pomiarowego w celu kontroli stabilności

jego pracy.

Przykładowe pomiary absorbancji dla danej długości fali (pomiary punktowe)

przedstawia Tabela 2.

Tabela 2. Pomiary absorbancji ZnTPP w benzenie dla długości fali =417nm i szczeliny 4nm.

(Końcowa wartość absorbancji A=0,6214+0,0068=0,6282).

Krok pierwszy Krok drugi

A średnia A średnia

1 Pomiar absorbancji

pustego spektrofotometru

0,0000 0,0000 1 Pomiar absorbancji

pustego spektrofotometru

0,0000 0,0000

0,0000 0,0000

0,0000 0,0000

14

2. Pomiar absorbancji

kuwetki pomiarowej

zawierającej rozpuszczalnik

-0,0068 -0,0068 2. Pomiar absorbancji

badanego związku

0,6214 0,6214

-0,0069 0,6214

-0,0068 0,6215

3. Ponowny pomiar

absorbancji kuwetki

pomiarowej zawierającej

rozpuszczalnik

-0,0068 -0,0068 3. Ponowny pomiar

absorbancji badanego

związku

0,6216 0,6215

-0,0068 0,6215

-0,0068 0,6215

4. Ponowny pomiar

absorbancji kuwetki

pomiarowej zawierającej

rozpuszczalnik

-0,0069 -0,0068 4. Ponowny pomiar

absorbancji badanego

związku

0,6214 0,6214

-0,0068 0,6214

-0,0068 0,6214

5. Pomiar absorbancji

pustego spektrofotometru

0,0000 0,0000 5. Pomiar absorbancji

pustego spektrofotometru

0,0000 0,0000

0,0001 0,0000

0,0000 0,0000

Pomimo iż spektrofotometry Cary-300 i V-550 cechują się dużą stabilnością pracy,

zawsze w danym dniu pomiarowym, po czasie, w którym osiągnęły one pełną

stabilność pracy, przed właściwymi pomiarami wykonywano najpierw pomiar linii

zerowej (bazowej) spektrofotometru. Droga optyczna kuwet pomiarowych była

dobierana tak, aby wartość absorbancji nie była większa niż 1.0 i nie była mniejsza niż

0.01. W takich warunkach błąd pomiaru absorbancji był najmniejszy.

W spektrofotometrze V-550 obserwuje się czasami mimo poprawnej linii zerowej

„przekrzywienie” widma absorbancji (patrz Dodatek) mierzonego związku – efekt ten

występuje tylko wtedy, gdy w torze pomiarowym znajduje się coś innego (np. kuweta z

badana próbką) niż w torze referencyjnym,

może być to efektem innego rozpraszania światła w torze pomiarowym i

referencyjnym w wyniku:

rysy, lub zabrudzenia na kuwecie pomiarowej,

w badanym związku znajdują się nierozpuszczone fragmenty próbki,

wytrąca się „coś” z roztworu,

kuwety w torze pomiarowym i referencyjnym mogą być ustawione pod

nieco innymi kątami w stosunku do wiązki światła wzbudzającego,

15

może to być problem związany z niestabilną pracą przyrządu,

Przed pomiarem widm absorpcji należy odpowiednio dobrać takie parametry jak:

szybkość skanowania, czas uśredniania wartości pomiarowych i odległość punktów

pomiarowych (niestety producent w dostarczonym oprogramowaniu nie sprzągł tych

parametrów ze sobą):

czas uśredniania wartości pomiarowych – jest to czas jaki potrzebuje

urządzenie na zmierzenie jednego punktu pomiarowego. Jeśli ustawimy,

że ma on wynosić np. 1 sekundę, to przez taki właśnie czas zbierany

powinien być sygnał z fotopowielacza,

odległość punktów pomiarowych – jest to wartość kroku pomiarowego,

czyli jak gęsto przyrząd ma dokonać pomiaru w funkcji długości fal.

Załóżmy, że krok ten ustawiony został na 0.5 nm,

szybkość skanowania – ile nm na minutę ma rejestrować

spektrofotometr, np. 100 nm/min,

wszystkie trzy parametry są zależne od siebie, bo jeżeli punkt stawiany

jest co 0.5 nm i w danym punkcie pomiar ma trwać 1 s, to szybkość

skanowania nie może być większa niż 30 nm/min

30nm/min60s

30nm

601s

600.5nm

1s

0.5nm, a nie wynosić 100 nm/min,

jak podane zostało powyżej,

poprzednie wyliczenia oparte były na prostym założeniu

matematycznym, w trakcie testów wykonany został szereg pomiarów dla

różnych parametrów i okazało się, że możliwe jest pewne odstępstwo od

wyliczonych wartości, nie powodując przy tym błędów pomiarowych

wymienionych poniżej. Tabela z możliwymi ustawieniami zamieszczona

została w Dodatku,

niedopasowanie tych parametrów, czyli ustawienie zbyt szybkiego

skanowania, zbyt długiego czasu uśredniania, lub zbyt gęstego

próbkowania, spowoduje zniekształcenie widma absorbancji nawet do

tego stopnia, że zafałszowane zostanie położenie maksimum pasma,

wartość absorbancji, a co za tym idzie kształt widma.

16

Metodyka pomiarów emisji

Pomiar widm emisji

Dla pomiarów stacjonarnych widm emisji2 trudno przyporządkować jeden

wspólny szablon z uwagi na różnorodność zastosowań tej metody badawczej. Poniżej

wyszczególnione zostało kilka możliwości z uwzględnieniem procedury użytkowania

spektrofluorymetru:

włączenie urządzeń polega na:

uruchomieniu spektrofluorymetrów, łącznie z włączeniem lampy,

zasileniu fotopowielaczy,

uruchomieniu chłodzenia fotopowielaczy pomiarowych,

fotopowielacze są chłodzone z uwagi na zależność rejestrowanych ilości

zliczeń od temperatury. Im niższa temperatura, tym szumy (tzw. prąd

ciemny) są mniejsze, co znacznie poprawia jakość wyników i pozwala z

większa dokładnością (dla mniejszych wartości) wykonywać pomiary

wydajności kwantowych emisji,

rozpoczęcie pomiarów może odbyć się dopiero po pewnym czasie od

wykonanych powyżej czynności z uwagi na konieczność:

schłodzenia się fotopowielaczy (zmniejszenia się tym samym wartości

prądu ciemnego),

ustabilizowania pracy fotopowielaczy,

wygrzanie się lampy wzbudzającej,

przystępując do właściwych badań należy wyznaczyć wartość prądu

ciemnego, czy wykonać pomiar ilości zliczeń jakie mierzy detektor bez

obecności światła wzbudzającego i próbki pomiarowej. Wartość ta jest

ważna z uwagi na późniejsze pomniejszenie widm emisji o tą właśnie

wartość,

pomiary mające na celu wyznaczenie własności spektroskopowych, czyli np.

wyznaczenie położenia maksimum pasma w widmie emisji, kształt widma

emisji itp.,

należy wykonać pomiar widma emisji dla badanego związku pamiętając o:

długość fali wzbudzenia podczas pomiaru widm emisji najlepiej ustawić

2 Stosowane na tym etapie wyrażenie „widmo emisji” odnosi się zarówno do widma emisji w klasycznym

rozumieniu (stała, ustalona wartość długości fali wzbudzenia i zmieniana wartość długości fali emisji), jak i

widma wzbudzenia emisji (stała ustalona wartość długości fali emisji i zmieniana wartość długości fali

wzbudzenia).

17

w maksimum najbardziej długofalowego pasma absorpcji, a podczas

pomiaru widma wzbudzenia emisji w maksimum pasma emisji,

szczelina monochromatora wzbudzenia podczas pomiaru widm emisji

może być dowolnie szeroka (należy uwzględnić szerokość pasma do

którego wzbudzamy itp), a przy widmach wzbudzenia emisji możliwie

wąska,

szczelina monochromatora emisji powinna być ustawiona odwrotnie niż

dla monochromatora wzbudzenia (widma emisji – możliwie wąska,

widma wzbudzenia emisji – dowolnie szeroka),

krok pomiaru powinien być wystarczająco mały celem dobrego

odwzorowania kształtu widma,

należy wykonać pomiar emisji dla rozpuszczalnika celem sprawdzenia jaki

jest jego wkład w sumaryczne (widmo emisji badanego związku i

rozpuszczalnika) widmo emisji zmierzone wcześniej. Pomiar ten musi być

wykonany w dokładnie takich samych warunkach jak poprzedni,

na etapie analizy (właściwa dla wszystkich widm emisji, niezależnie od

użytego spektrofluorymetru – SPF 500, MPF-3, TCSPC):

od zmierzonych widm (wyznaczonych zgodnie z dwoma powyższymi

punktami) odejmujemy zarejestrowaną wcześniej wartość średnią prądu

ciemnego (szumu),

przemnażamy widmo emisji rozpuszczalnika przez czynnik, który

uwzględnia fakt, że dla próbki z badanym związkiem część światła

wzbudzającego jest absorbowana (przez badany związek), a pozostała

część jest rozpraszana. W przypadku próbki z samym rozpuszczalnikiem

nic nie jest absorbowane (jeśli nie absorbuje rozpuszczalnik) i całe

wzbudzające światło jest rozpraszane. Dlatego tez należy uwzględnić ten

fakt (efekt jaki ma zostać uzyskany, ma doprowadzić do unormowania

rozpraszania w samym rozpuszczalniku do wartości takiej jak w

przypadku próbki z badanym związkiem) przemnażając widmo emisji

rozpuszczalnika przez czynnik x określony wzorem:

)(3.2

101)(

wzb

ABS

ABSx

wzb

1

gdzie ABS(λwzb) oznacza wartość absorbancji dla długości fali

wzbudzenia w kuwecie pomiarowej (w przypadku widm wzbudzenia

18

emisji każdy punkt takiego widma musi zostać przemnożony przez

odpowiadający mu czynnik x z uwagi na zmieniającą się wartość

absorbancji)

odejmujemy od widma emisji badanego związku widmo emisji

rozpuszczalnika przemnożone przez czynnik x.

korygujemy wyznaczone w taki sposób widmo przez odpowiednią

krzywą: korekcji emisji dla widm emisji, korekcji wzbudzenia emisji dla

widm wzbudzenia emisji otrzymując końcowe widmo emisji,

Wyznaczanie bezwzględnej wydajności kwantowej emisji (wykorzystanie

standardu emisyjnego)

wykonujemy pomiar absorbancji badanego związku dla długości fali

wzbudzenia, przy której mierzone będą widma emisji, pamiętając o tym,

żeby szczelina wzbudzenia na spektrofotometrze i na spektrofluorymetrze

(na którym wykonywane będą pomiary widm emisji) była taka sama,

wykonujemy pomiar widma emisji dla badanego związku pamiętając o:

długość fali wzbudzenie wybieramy w dowolny, ale zaplanowany

sposób, najczęściej w zakresie długofalowego pasma absorpcji badanego

związku, tj. do stanu S1, i tak aby nie absorbowal rozpuszczalnik,

szczelina monochromatora emisji powinna być ustawiona na taką

wartość, aby jakość otrzymanych widm była dobra, np. dla pomiaru

widm emisji ze stanu S1 dla porfiryn można stosować szczelinę 4 nm (w

przypadku MPF-3),

w tych samych warunkach wykonujemy pomiar widma emisji

rozpuszczalnika,

kolejnym koniecznym pomiarem do wykonania jest zmierzenie widma

emisji standardu,

najlepszym standardem byłby taki, który możemy wzbudzić tą samą

długością fali co badany związek, a jego emisja leżałaby w tym samym

zakresie co badanego związku,

najczęściej stosowanym standardem emisyjnym jest siarczan chininy

(QS) rozpuszczony w jedno normalnym wodnym roztworze kwasu

siarkowego, którego wydajność kwantowa świecenia emisji wynosi 0.52

[[Birks_JRNBS(US)_80A_1976_389]] dla długości fali wzbudzenia w

19

zakresie 280-360 nm.

pomiar dla standardu emisyjnego wykonany powinien być dla takich

samych parametrów pomiarowych, jak podczas mierzenia widma emisji

badanego związku,

wykonujemy pomiar widma emisji dla roztworu, w którym rozpuszczony

jest standard emisyjny,

analiza danych:

odejmowanie szumu i rozpuszczalnika dla widm emisji badanego

związku i standardu emisyjnego wykonujemy w taki sam sposób jak

poprzednio,

podstawiamy odpowiednie wartości pomiarowe do wzoru na wydajność

kwantową emisji (2), otrzymuje się wartość bezwzględnej wydajności

kwantowej emisji ( F) dla badanego związku przy określonej długości

fali wzbudzenia

kn

n

I

I

dI

dI

stABS

ABSst

st

em

emst

FFwzb

wzbst

2

2

)(

)(

0

0

101

101 2

gdzie indeks „st” oznacza wartości dla standardu, pierwszy człon określa

pole pod krzywą widma emisji (niezależnie od tego czy widmo

wykreślone jest w funkcji nanometrów, czy tez liczb falowych – patrz

Dodatek), drugi człon określa wartość intensywności wiązki

wzbudzającej, trzeci wartość zaabsorbowanego światła, czwarty

współczynniki załamania światła rozpuszczalnika i ostatni – czynnik

aparaturowy (korygujący np. efekty polaryzacyjne).

Wyznaczanie względnej wydajności kwantowej emisji

sposób pomiaru podobny jak powyżej, ale nie stosuje się standardu

emisyjnego, a uzyskane wyniki dla kilku próbek porównuje się do jednej

wybranej próbki, taki sposób pomiaru stosuje się wówczas, gdy np.:

stosuje się w pomiarach ten sam związek, ale zmienia jego stężenie,

stosuje się różne dlugości fali wzbudzenia,

zastosowanie standardu emisyjnego jest trudne do wykorzystania (inna

długość fali wzbudzenia, inny zakres widma emisji).

20

Pomiar widma wzbudzenia emisji

Widmo wzbudzenia emisji zazwyczaj mierzy się w celu porównania go z widmem

absorptancji3 próbki celem określenia czy zmierzone dla danej długości fali emisji

widmo pochodzi tylko od badanego związku:

wykonuje się pomiar widma wzbudzenia emisji badanego związku,

aby uzyskać rzeczywisty kształt widma szerokość spektralna wiązki

wzbudzającej nie powinna być większa niż 1/10 szerokości pasma do

którego wzbudzamy w połowie wysokości.

szczelina monochromatora emisji może być szeroka, np. 10 nm dla

MPF-3,

dobrać w odpowiedni sposób długość fali emisji – zazwyczaj maksimum

pasma emisji związku,

wykonać pomiar widma wzbudzenia emisji dla rozpuszczalnika w tych

samych warunkach co badanego związku,

analiza danych:

odejmowanie i korygowanie widm odbywa się dokładnie tak samo jak w

przypadku widm emisji, z tym wyjątkiem, że czynnik x zmienia swoją

wartość dla każdego punktu pomiarowego (inna wartość absorbancji dla

każdej długości fali),

porównanie widma wzbudzenia emisji z widmem absorptancji – należy

unormować widma w żądany sposób (np. w maksimum najbardziej

długofalowego pasma absorpcji).

Badania emisyjne, podobnie jak absorpcyjne, przedstawiono na przykładzie

porfiryny ZnTPP.

W celu zbadania widm fluorescencji ZnTPP w czterech stosowanych

rozpuszczalnikach, dokonano szeregu pomiarów testowych. Ich zadaniem było

określenie optymalnych warunków eksperymentalnych dla wykonania pomiarów

emisyjnych. W pomiarach testowych ustalono jakie będą stosowane szerokości szczelin

monochromatorów emisji i wzbudzenia, jaki będzie krok pomiarowy i czas integracji

(czas zliczania w jednym punkcie pomiarowym), przeprowadzono kalibrację

monochromatorów emisji i wzbudzenia, dobrano rodzaj kuwet pomiarowych (ze

3 Widmo absorptancji – jest to widmo otrzymane po przeliczeniu każdego punktu pomiarowego z widma

absorbancji za pomocą wyrażenia: 1− 10−ABS

21

względu na długość drogi optycznej promieniowania padającego i emitowanego) oraz

wyeliminowano wpływ efektów polaryzacyjnych na badane widma emisji.

W pierwszej kolejności wykonano pomiary, które pozwoliły ustalić właściwy

dobór szerokości szczelin monochromatorów wzbudzenia i emisji. Było to warunkiem

koniecznym do wykonania pomiaru rzeczywistych widm emisji i wzbudzenia emisji, a

także wyznaczenia poprawnych wartości wydajności kwantowych emisji, obarczonych

jak najmniejszym błędem. Istotnym problemem w badaniach emisyjnych porfiryn są ich

bardzo wąskie pasma absorpcji i emisji związane z przejściami między stanami S0 i S1

jak i S0 i S2. Ta cecha badanych w pracy związków zmusza do stosowania wąskich

szczelin emisji w pomiarze rzeczywistych widm emisji. W badaniach testujących

zastosowano szczeliny emisji em=2nm i 4nm. Aby uzyskać wystarczająco intensywne

widmo emisji należało użyć szerokiej szczeliny wzbudzenia wzb=(20-40)nm.

Zmierzone widma (Rys.4) mają taki sam kształt przy obu szczelinach emisji, dlatego we

właściwych badaniach stosowano szczelinę emisji 4nm, zapewniając znacznie lepszą

jakość mierzonego widma. Dla porównania zastosowana szeroka szczelina emisji

( em=20nm) powodowała wyraźne zniekształcenie mierzonego widma. W

przypadkach, gdy celem pomiarów było bardzo dokładne wyznaczenie położenie

maksimów pasm emisji, w szczególności przy wyznaczaniu przesunięcia Stokesa,

pomiary wykonywano na układzie SPC stosując em 0.9nm.

[nm]

1400015000160001700018000

I em

[j.u

.]

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

555 600 650 700 745

em 2nm; wzb = 20nm

em = 2nm; wzb = 30nm

em = 2nm; wzb = 40nm

em = 4nm; wzb = 20nm

em = 4nm; wzb = 30nm

em = 4nm; wzb = 40nm

em = 20nm; wzb = 4nm

SPC, em = 0.9nm; wzb <1nm

[cm-1

]

22

Rys.4. Unormowane widma fluorescencji S1 S0 ZnTPP (c=2.1 10-6

mol/dm3) w benzenie dla

wzb=417nm, w funkcji szerokości szczeliny wzbudzenia i emisji.

W badaniach, których celem było wyznaczenie F(S1) starano się tak dobrać

parametry pomiarowe, aby szczelina wzbudzenia była jak najmniejsza i taka sama jak w

pomiarze absorbancji na spektrofotometrze Cary-300. Było to konieczne aby

wyznaczone z pomiarów absorpcyjnych wartości absorptancji ( 1 10 wzbA

absI ) były

zgodne z rzeczywistymi wartościami Iabs w pomiarach widm emisji. W pomiarach tych

szczeliny monochromatora wzbudzenia wynosiły wzb=2nm i wzb=4nm (Rys.5).

Uzyskane widma emisji S0 S1 ZnTPP w EtOH w przypadku obu użytych szczelin

wzbudzenia nie różnią się kształtem, jednak zmniejszenie szczeliny wzb z 4nm do

2nm powoduje około sześciokrotne zmniejszenie intensywności fluorescencji. Znacznie

utrudnia to ilościowe pomiary emisyjne w przypadku próbek o małym stężeniu i przy

wzbudzeniu na długofalowym zboczu pasma Soreta, kiedy to uzyskuje się najmniejszy

sygnał emisji. Tymczasem bardzo dokładne wyznaczenie F(S1) właśnie w tych

warunkach wzbudzenia było jednym z najważniejszych celów pracy. W związku z tym

ustalono, że we wszystkich pomiarach widm emisji, wykonanych w celu wyznaczenia

F(S1) dla ZnTPP będą stosowane szczeliny wzb=4nm (dla monochromatora

wzbudzenia) i em=20nm (dla monochromatora emisji).

23

Rys.5. Rzeczywiste (A) i unormowane (B) widma fluorescencji S1 S0 ZnTPP (c=1.5 10-6

mol/dm3) w etanolu dla wzb=415nm, w funkcji szerokości szczeliny wzbudzenia, em=10nm.

W celu pomiaru poprawnych widm wzbudzenia fluorescencji badanych porfiryn i ich

ilościowego porównania z widmami absorptancji (wyznaczonymi z pomiarów widm

absorpcji) stosowano takie same wąskie szczeliny wzbudzenia, wzb=(2-4)nm.

1400015000160001700018000

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000550 600 650 700 750

[nm]

1400015000160001700018000

I em

[j.u

.]

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

[cm-1]

550 600 650 700 750

wzb=2nm

wzb=4nm

B

I em

[j.u

.]

[cm-1]

[nm]

Awzb=2nm

wzb=4nm

24

W drugiej kolejności wykonano szereg pomiarów, których celem był taki dobór

warunków eksperymentalnych, aby widma fluorescencji i widma wzbudzenia

fluorescencji były nie tylko poprawnie zmierzone, ale aby powtarzalność i

wiarygodność pomiarów była jak największa. Gwarantowało to możliwie najmniejsze

błędy przy wyznaczaniu maksimów pasm emisji, wartości wydajności kwantowych

fluorescencji oraz badanie wpływu stężenia porfiryny na kształt i położenie widm

fluorescencji i widm wzbudzenia fluorescencji. W tym celu wykonano pomiary widm

wzbudzenia emisji antracenu w etanolu, charakteryzującego się podobnie jak porfiryny,

wąskimi pasmami absorpcji i emisji. Pomiary te pozwoliły ustalić optymalny czas

integracji (czas zliczania w danym punkcie pomiarowym ilości wyemitowanych przez

próbkę kwantów światła) oraz krok pomiarowy, określający częstotliwość próbkowania.

Rys.6 przedstawia całą serię wielokrotnych pomiarów wykonanych dla czasu integracji

300ms i 1000ms oraz kroku pomiarowego 0.1, 0.3 i 1.0nm. Dla wszystkich tych

parametrów widma wzbudzenia fluorescencji zostały zmierzone trzykrotnie (cyfry (1),

(2) i (3) oznaczają kolejny pomiar). Łatwo można zauważyć, że najdokładniejsze

widma uzyskuje się dla parametrów 1000ms/0.1nm, ale zarazem całkowity czas

rejestracji całego widma przy takich ustawieniach znacznie się wydłuża (Rys.7).

Ustalono, że najkorzystniejszymi parametrami do badań emisyjnych ZnTPP

będzie czas integracji 300ms i krok pomiarowy co 0.1nm. Przy takich ustawieniach

spektrofluorymetru MPF-3 uzyskuje się widma emisji i widma wzbudzenia

fluorescencji o dużej wartości sygnału i bardzo dobrej powtarzalności oraz stosunkowo

niedługim czasie rejestracji całego widma.

25

I em

[j.

u.]

[nm]

[cm-1

] 255002700028500

0

5

10

15

20340 360 380 400

1000ms/1nm (1)

1000ms/1nm (2)

1000ms/1nm (3)

E

Rys.6. Widma wzbudzenia fluorescencji antracenu w etanolu (c~10

-5mol/dm

3) w funkcji czasu

integracji (A, B – 300ms; C, D, E – 1000ms) i kroku pomiarowego (0.1, 0.3 i 1nm);

em=421nm, wzb=4nm, em=10nm.

[nm]

255002700028500

0

5

10

15

20340 360 380 400

300ms/0.1nm (1) 300ms/0.1nm (2) 300ms/0.1nm (3)

255002700028500

0

5

10

15

20340 360 380 400

300ms/0.3nm (1) 300ms/0.3nm (2) 300ms/0.3nm (3)

I em

[j.

u.]

[nm]

I em

[j.

u.]

[cm-1

] [cm-1

]

A B

255002700028500

0

5

10

15

20340 360 380 400

1000ms/0.1nm (1)

1000ms/0.1nm (2)

1000ms/0.1nm (3)

C

I em

[j.

u.]

[nm]

[cm-1

] 255002700028500

0

5

10

15

20340 360 380 400

1000ms/0.3nm (1)

1000ms/0.3nm (2)

1000ms/0.3nm (3)

DI e

m [

j.u

.]

[nm]

[cm-1

]

26

Rys.7. Widma wzbudzenia fluorescencji antracenu w etanolu (c~10-5

mol/dm3) w funkcji czasu

integracji i kroku pomiarowego; em=421nm, wzb=4nm, em=10nm.

Ze względu na bardzo wąskie pasma emisji i wzbudzenia emisji porfiryn bardzo

ważnym zadaniem była dokładna kalibracja monochromatorów wzbudzenia i emisji

spektrofluorymetru MPF-3. Kalibrację monochromatora wzbudzenia przeprowadzono

za pomocą porównania kilku widm wzbudzenia fluorescencji z widmami absorptancji

(Iabs) antracenu w etanolu. Widma absorpcji zmierzono na spektrofotometrze Cary-300

lub V-550 używając szerokości szczeliny 2nm i 4nm, oraz krok pomiarowy co 0.1nm,

natomiast widma wzbudzenia fluorescencji zmierzono odpowiednio dla wzb=2nm i

4nm oraz em=10nm. Otrzymaną różnicę w położeniach pasm (0,1) pomiędzy

widmami absorptancji i wzbudzenia emisji, wynoszącą -1nm uznano za wartość o jaką

należy zawsze skorygować ustawienia monochromatora wzbudzenia.

Kalibrację monochromatora emisji przeprowadzono ustawiając monochromator

wzbudzenia na daną długość fali, np. 540nm, a następnie przesuwając monochromator

emisji w okolicach tej samej wartości 540nm i wyznaczano długość fali dla której ilość

emitowanych przez próbkę kwantów promieniowania będzie największa. Pomiary takie

wykonano dla kilku różnych długości fal. W ten sposób, znając poprawne wskazania

monochromatora wzbudzenia można było wyznaczyć poprawkę, którą trzeba

uwzględnić przy określaniu rzeczywistego położenia monochromatora emisji.

2500026000270002800029000

0

5

10

15

20340 360 380 400

300ms/0.1nm 1 (czas pomiaru ok 3 min)

300ms/0.3nm 1 (czas pomiaru ok 1min)

1000ms/0.1nm 1 (czas pomiaru ok 10 min)

1000ms/0.3nm 1 (czas pomiaru ok 3.5 min)

1000ms/1nm 1 (czas pomiaru ok 1 min)

I em

[j.u

.]

[nm]

[cm-1]

27

1cm

wzbudzenie

0.4cm 0,15cm 1cm

wzbudzenie

emisja

Stwierdzono, że ustawienia monochromatora emisji należy zawsze korygować o

wartość -5nm.

Kolejnym ważnym krokiem w opracowaniu metodyki pomiarów emisyjnych

było przeprowadzenie badań dotyczących wpływu kształtu i rozmiaru kuwet oraz ich

ustawienia, na widma fluorescencji badanych związków. Konieczność przeprowadzenia

tych badań wynikała przede wszystkim z bardzo silnego nakładania się widma absorpcji

i fluorescencji w zakresie pasma Soreta, a w rezultacie znacznej reabsorpcji

emitowanego promieniowania.

Do pomiarów używano najczęściej kuwet o długości drogi optycznej 1x0.4cm,

jak również 1x0.2cm, 1x0.1cm oraz 0.3x0.3cm i 0.15x0.15cm. Geometria pomiarów

wyglądała następująco:

(a) (b)

Rys.8. Geometria pomiarów emisyjnych

Kuweta pomiarowa była ustawiona tak (Rys.8(a)), że wzbudzenie następowało w

warstwie cieńszej, czyli w przypadku podanego wyżej wykresu wzbudzenie

następowało przez warstwę roztworu o grubości 0.4cm. Takie ustawienia kuwety

pomiarowej zapewnia uzyskanie maksymalnej intensywności świecenia próbki. Dla

porównania w kuwecie 1x1cm intensywność emisji (Iem) jest 2.3 razy mniejsza (dla

typowych szczelin emisji stosowanych w tej pracy) niż w kuwecie o geometrii

przedstawionej na Rys.8(a). Natomiast użycie kuwety pomiarowej o małych

rozmiarach, tj., mikrokuwety (Rys.8(b)) zapewnia zmniejszenie reabsorpcji

emitowanego promieniowania. Intensywność emisji w tej kuwecie jest jednak znacznie

mniejsza niż w kuwetach o rozmiarach 1.0 0.4, ponieważ tylko część promieniowania

emisja

28

wychodzącego z monochromatora wzbudzenia pada na próbkę znajdującą się w

mikrokuwecie.

Zjawisko reabsorpcji występuje w przypadku wielu związków, dla których

długofalowe pasmo w widmie absorpcji nakłada się (przynajmniej częściowo) na ich

widmo emisji. W przypadku porfiryn bardzo znaczna reabsorpcja jest związana z

silnym nakładaniem się na siebie bardzo blisko leżących pasm absorpcji S0 S2 i

fluorescencji S2 S0. Efekt ten powoduje znaczne zniekształcenie widma emisji w

zakresie krótkofalowym (jest on największy dla maksimum pasma absorpcji), zmianę

kształtu widma fluorescencji, a także błędne wyznaczenie zarówno przesunięcia Stokesa

S20,0

(A-F) jak i obniżenie mierzonej wydajności kwantowej fluorescencji ze stanu S2.

W przypadku fluorescencji ze stanu S1 nie ma specjalnego kłopotu z wyeliminowaniem

reabsorpcji fluorescencji, gdyż ze względu na stosunkowo dużą wartość F(S1) można

badać próbki o wystarczająco małej absorpcji.

Kształt widma fluorescencji S1 S0, a także położenie maksimum i jego

intensywność nie ulega zmianie w przypadku pasma (0,1) dla kuwet o różnych

długościach drogi optycznej w torze emisji (Rys.9). Obserwuje się niewielkie obniżenie

intensywności fluorescencji w maksimum pasma (0,0) dla kuwety 0.4 1cm, będące

wynikiem reabsorpcji emisji w tej kuwecie.

[cm-1

]1400015000160001700018000

I em

[j.u

.]

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

[nm]555 600 650 700 760

kuweta 0.4/1 cm

kuweta 0.3/0.3 cm

wzb=10nm; em=10nm

(0,0)

(0,1)

Rys.9. Unormowane widma fluorescencji S1 S0 ZnTPP (c = 8 10

-6 mol/dm

3) w etanolu dla

wzb=400nm, zmierzone w kuwetach o różnych drogach optycznych l=0.4/1cm, 0.3/0.3cm.

29

W celu wyznaczenia dla badanych porfiryn wartości F(S1) z jak najmniejszym

błędem wykonano wiele pomiarów intensywności padającego promieniowania I0 dla

tych wzb, które stosowano przy wyznaczaniu F(S1). Uśrednione wyniki tych

pomiarów przedstawiono w Tabeli 3. Zamieszczone dane zmierzono w kilku seriach (od

5 do 10), a każda z nich składała się z 10-krotnego zliczania impulsów w jednym

punkcie pomiarowym z czasem integracji 1000ms/punkt. Umożliwiło to precyzyjne

wyznaczenie względnych wartości intensywności I0 dla stosowanych w pracy wzb.

Tabela 3. Wartości intensywności I0 dla wybranych długości fal wzbudzenia.

[nm]

359 391 393 395 399 415 417 419 424 427 429 433 435 555

20

03-0

9-0

4 I0 2144 2594 2655 2569 2583 2698 2461

359

0

λ

0

I

I

1,00 0,83 0,81 0,83 0,83 0,79 0,87

20

03-1

0-1

6 I0 1499 1880 1788 1828

359

0

λ

0

I

I

1,00 0,80 0,84 0,82

20

03-1

1-0

6 I0 1742 2182 2053 2135

359

0

λ

0

I

I

1,00 0,80 0,85 0,82

20

04-0

1-1

6 I0 1789 2200 2232 2244 2130 2089 2087

359

0

λ

0

I

I

1,00 0,81 0,80 0,80 0,84 0,86 0,86

20

04-0

3-2

5 I0 1535 1825 1877 1929 1841 1851

359

0

λ

0

I

I

1,00 0,84 0,82 0,80 0,83 0,83

2 0 0 4 - 0 7 - 0 8 I0 2081 2485 2528 2453 2449 2474 2596 2371

30

359

0

λ

0

I

I

1,00 0,84 0,82 0,85 0,85 0,84 0,80 0,88

20

04-0

7-0

9 I0 2077 2442 2561 2661 2529

359

0

λ

0

I

I

1,00 0,85 0,81 0,78 0,82

średnia:

359

0λ

0

I

I

1,00 0,85 0,82 0,79 0,83 0,83 0,80 0,81 0,84 0,85 0,84 0,82 0,80 0,87

Wydajności kwantowe fluorescencji F porfiryn zostały wyznaczone metodą

względną, w oparciu o porównanie intensywności emisji badanej próbki z

intensywnością emisji wzorca. Jako wzorzec stosowano roztwór siarczanu chininy w

0,1 mol dm-3

wodnym roztworze kwasu siarkowego ( Fst=0,52). Wydajność kwantową

fluorescencji porfiryn wyznaczano ze wzoru:

2

0

2

0

(1 10 )

(1 10 ) ( )

st A stemst

F F kA stst

em

I d I nF

I nI d (5)

gdzie:

A – absorbancja roztworu dla długości fali, którą wzbudzano próbkę

Iem – intensywność emisji w funkcji jej częstotliwości

n – współczynnik załamania światła rozpuszczalnika,

I0 – intensywność promieniowania padającego na próbkę

Fk – czynnik korygujący związany z użyciem innego wzb dla badanego związku i dla standardu. st – indeks informujący o tym, że dana wielkość odnosi się do wzorca (standardu)

Ważnym zadaniem w opracowaniu pełnej metodyki badań emisyjnych było

wyznaczenie czynnika (Fk) korygującego efekty polaryzacyjne. Odgrywają one istotną

rolę w pomiarach widm wzbudzenia fluorescencji i przy badaniu wpływu wzb na

wartości F(S1). Konieczność wprowadzenia tej korekcji spektrofluorymetru wynika z

tego, że promieniowanie emitowane przez próbkę, które dochodzi do detektora emisji

(F1) przebywa inną drogę optyczną (w tym przez monochromator emisji) aniżeli

promieniowanie padające na próbkę, którego intensywność (I0) jest mierzona przez

31

licznik kwantów (F2), który znajduje się bezpośrednio przed nią. W związku z

powyższym przeprowadzono szereg pomiarów widm wzbudzenia emisji roztworu

Rodaminy B w glikolu etylenowym, w takiej samej kuwecie pomiarowej (trójkątnej) i o

takim samym stężeniu jak Rodamina B używana w spektrofluorymetrze MPF-3 jako

licznik kwantów. Różnice dróg optycznych promieniowania padającego na próbkę i

emitowanego przez nią są odpowiedzialne za wyznaczone krzywe korekcji (Rys.10).

Krzywe te wykorzystano do poprawnego wyznaczenia widm wzbudzenia emisji i

wartości wydajności kwantowych emisji badanych związków.

180002000022000240002600028000

50

60

70

80

90

340 400 450 500 560

2004-12-10

2004-12-13

2005-12-09

średnia

[cm-1]

[nm]

I em

[j.u

.]

Rys.10 Krzywa korekcji efektów polaryzacyjnych otrzymana przy pomiarze widma

wzbudzenia emisji Rodaminy B mierzonego w trójkątnej kuwecie, dla em=620nm.

W Tabeli 4 zamieszczono przykładowe wartości współczynnika korygującego

efekty polaryzacyjne dla wybranych wzb, najczęściej stosowanych w pracy przy

wyznaczaniu wartości F(S1). Wartości te zostały odniesione do długości fali =359nm,

którą używano do wzbudzania siarczanu chininy, stosowanego w pracy jako standard.

32

Tabela 4. Wartości współczynnika korygującego efekty polaryzacyjne (Fk) dla wybranych

długości fal.

[nm] Iem [j.u.] 1

kF Iem [j.u.] 2

kF Iem [j.u.] 3

kF średnie

kF

359 81,96 1,00 60,56 1,00 66,55 1,00 1,00

415 90,78 0,90 68,49 0,88 74,12 0,90 0,89

417 90,91 0,90 66,68 0,91 74,12 0,90 0,90

419 90,90 0,90 68,89 0,88 74,01 0,90 0,89

421 90,70 0,90 69,06 0,88 73,83 0,90 0,89

423 90,34 0,91 69,06 0,88 73,59 0,90 0,90

424 90,11 0,91 68,96 0,88 73,46 0,91 0,90

427 89,19 0,92 68,20 0,89 73,03 0,91 0,91

429 88,21 0,93 67,43 0,90 72,66 0,92 0,92

431 87,17 0,94 66,50 0,91 72,05 0,92 0,92

433 85,75 0,96 65,43 0,93 71,00 0,94 0,94

435 84,06 0,98 64,18 0,94 69,46 0,96 0,96

439 80,13 1,02 61,15 0,99 65,49 1,02 1,01

515 65,90 1,24 49,36 1,23 52,88 1,26 1,24

517 65,88 1,24 49,47 1,22 52,91 1,26 1,24

555 62,42 1,31 47,64 1,27 49,92 1,33 1,31

359

x

emk

em

IF

I;

12005-12-09;

22004-12-10;

32004-12-13.