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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SAtildeO PAULO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRAtildeO PRETO
Aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA e
avaliaccedilatildeo da eficaacutecia no tratamento de hemaacutecias
com teste direto da antiglobulina positivo
Ceacutelia Kazue Abiko
RIBEIRAtildeO PRETO
2017
Aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA e
avaliaccedilatildeo da eficaacutecia no tratamento de hemaacutecias
com teste direto da antiglobulina positivo
Dissertaccedilatildeo apresentada agrave Faculdade de Medicina de
Ribeiratildeo Preto da Universidade de Satildeo Paulo para
obtenccedilatildeo do tiacutetulo de Mestre em Ciecircncias
Aacuterea de concentraccedilatildeo Hemoterapia e Medicina
Transfusional
Orientador Prof Dr Dimas Tadeu Covas
RIBEIRAtildeO PRETO
2017
CEacuteLIA KAZUE ABIKO
Aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA e
avaliaccedilatildeo da eficaacutecia no tratamento de hemaacutecias
com teste direto da antiglobulina positivo
Dissertaccedilatildeo apresentada agrave Faculdade de Medicina de
Ribeiratildeo Preto da Universidade de Satildeo Paulo para
obtenccedilatildeo do tiacutetulo de Mestre em Ciecircncias
Aacuterea de concentraccedilatildeo Hemoterapia e Biotecnologia
Orientador Prof Dr Dimas Tadeu Covas
APROVADO ____________
BANCA EXAMINADORA
________________________________
Profordf Dra Fabiacuteola Traina
________________________________
Prof Dr Amauri Antiquera Leite
________________________________
Profordf Dra Ana Paula Costa Nunes da Cunha Cozac
DEDICATOacuteRIA
Dedico este trabalho aos meus filhos Pedro e Maria que sirva de incentivo para a busca do
conhecimento sucesso e realizaccedilatildeo profissional
Aos colegas de trabalho Ana Paula Cristiane Igor Mara Rita e Simone pelo
companheirismo e pela agradaacutevel convivecircncia no dia dia
A todos os colegas do Hemonuacutecleo de Araccedilatuba e aos profissionais da aacuterea da sauacutede que
amam a profissatildeo trabalham com eacutetica e que se dedicam buscando o bem estar dos
pacientes
AGRADECIMENTOS
A DEUS pelo dom da vida e a graccedila de colocar em minha vida pessoas especiais que me
ajudaram a chegar ateacute aqui
Aos meus pais que me ensinaram respeito honestidade perseveranccedila e pelo incentivo aos
estudos
A dra Flaacutevia Leite Souza Santos que me ajudou durante todo o trabalho e contribuiu de
forma valiosa com todas as suas orientaccedilotildees
Ao meu esposo Abidias que de forma especial e carinhosa me deu forccedila e coragem me
apoiando nos momentos de dificuldade
Ao dr Dimas Tadeu Covas pela oportunidade de poder realizar este trabalho e pela ajuda na
definiccedilatildeo do tema
A dra Eugenia Amorim Ubialli pelo apoio e pela prestreza em ajudar sempre que necessitei
Ao dr Wolney Gois Barreto diretor do Hemonuacutecleo de Araccedilatuba pelo incentivo para
realizaccedilatildeo do mestrado
A minha irmatilde Leda que apoiou e ajudou nas horas em que precisei e que natildeo foram poucas
A Raquel Botelho pela sua atenccedilatildeo e prontidatildeo para ajudar
Aos colegas do mestrado aos com os quais convivi durante todo o ano de 2014 e que
guardarei eternamente em minha memoacuteria
A Eacutemile que me ajudou com as amostras e as valiosas informaccedilotildees
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 1
11TESTES PREacute-TRANSFUSIONAIS 1
111 TIPAGEM ABORh 2
112 ANTICORPOS ANTI-ERITROCITAacuteRIOS 3
113 PESQUISA E IDENTIFICACcedilAtildeO DE ANTICORPOS IRREGULARES 4
114 PROVA DE COMPATIBILIDADE 5
115 FENOTIPAGEM PARA OUTROS SISTEMAS 6
12 METODOLOGIAS APLICADOS Agrave ROTINA IMUNO-HEMATOLOacuteGICA 7
121 MEacuteTODOS DE FASE FLUacuteIDA 8
122 COLUNAS DE GEL 9
123 BIOLOGIA MOLECULAR 9
13 TESTE DA ANTIGLOBULINA 10
131 TESTE DIRETO DA ANTIGLOBULINA 11
132 TESTE INDIRETO DA ANTIGLOBULINA 12
133 CONDICcedilOtildeES CLIacuteNICAS COM TDA POSITIVO 13
134 ANEMIA HEMOLIacuteTICA AUTOIMUNE 15
135 TRATAMENTO DE HEMAacuteCIAS COM TDA POSITIVO 16
1351 TEacuteCNICA DE BLOQUEIO 17
1352 TRATAMENTO DE HEMAacuteCIAS COM ZZAP 17
1353 CLOROQUINA 17
1353 GLICINA-AacuteCIDAEDTA 18
2 OBJETIVOS 20
21 OBJETIVO GERAL 20
22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 20
3 JUSTIFICATIVA 21
4 METODOL OGIA 22
41 AMOSTRAS DE DOADORES 22
411 FENOTIPAGEM 23
412 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS HEMAacuteCIAS 24
413 TRATAMENTO DAS AMOSTRAS 25
42 PREPARO DA GLICINA AacuteCIDA-EDTA 25
421 TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA 26
43 PREPARO DA CLOROQUINA 26
431 TEacuteCNICA DA CLOROQUINA 26
44 VERIFICACcedilAtildeO DA EFETIVIDADE DOS TESTES 27
45 TESTE DO ELUATO 27
46 AMOSTRA DE PACIENTE 27
5 RESULTADOS 28
51 REAGENTES 28
52 AMOSTRAS DE DOADORES 28
521 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS AMOSTRAS 28
522 TRATAMENTO DAS HEMAacuteCIAS 29
523 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS TEacuteCNICAS 30
524 TESTAGEM DO ELUATO 33
525 EFEITO DA ELUICcedilAtildeO SOBRE OS ANTIacuteGENOS ERITROCITAacuteRIOS 34
526 AMOSTRA DE PACIENTE 35
527 TEMPO DE EXECUCcedilAtildeO DA TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA 36
528 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 40
6 DISCUSSAtildeO 42
7 CONCLUSAtildeO 45
8 REFEREcircNCIA BIBLIOGRAacuteFICA 46
9 ANEXOS 50
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Princiacutepio da teacutecnica direta da antiglobulinapaacutegina11
Figura 2 - Princiacutepio da teacutecnica indireta da antiglobulinapaacutegina 13
Figura 3 ndash Teste da soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem apoacutes sensibilizaccedilatildeo das hemaacuteciaspaacutegina 29
Figura 4 - TDA das amostras apoacutes sensibilizaccedilatildeo com anticorpospaacutegina 30
Figura 5 - Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com
cloroquina paacutegina 31
Figura 6 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA
paacutegina 32
Figura 7 - Painel do eluato da amostra 21 apresentando especificidade anti-Cpaacutegina 34
Figura 8 - Painel do eluato da amostra 47 apresentando especificidade anti-
K paacutegina 34
Figura 9 - Fenotipagem das amostras 24 e 50 para antiacutegeno K apoacutes tratamento com glicina-
aacutecidaEDTApagina 36
Figura 10 ndash TDA monoespeciacutefico Amostra sensibilizadardquo in vivordquo com anticorpo anti-
IgGpaacutegina 38
Figura 11 ndash TDA apoacutes o tratamentopaacutegina 38
Figura 12 ndash Resultado da fenotipagem da amostra sensibilizada ldquoin vivordquo por anti-
IgGpaacutegina 39
Figura 13 ndash Painel do eluato poacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA paacutegina 39
Figura 14 ndash Painel do eluato poacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA paacutegina 39
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Resultado geral do tratamento das hemaacutecias com glicina e
cloroquinapaacutegina 32
Tabela 2 - Resultados do TDA apoacutes tratamento da hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo
sensibilizadopaacutegina 33
Tabela 3 - Resultado apoacutes o segundo tratamento das hemaacutecias com glicina-
aacutecidaEDTApaacutegina 33
Tabela 4 - Resultado do Eluato das amostras tratadas com glicina-
aacutecidaEDTA paacutegina 34
Tabela 5 ndash Verificaccedilatildeo da interferecircncia do tratamento da hemaacutecias com cloroquina e glicina-
aacutecidaEDTA nos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e spaacutegina 35
Tabela 6 - Resultado da sensibilizaccedilatildeo das amostras efetividade do tratamento com
cloroquina glicina e o eluato poacutes tratamento com glicinapaacutegina 37
LISTA DE GRAFICOS
Graacutefico 1 - Nuacutemero de amostras sensibilizadas por especificidade de
anticorpopaacutegina 31
Graacutefico 2 - Teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla entre as teacutecnicas
aplicadaspaacutegina 41
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 - Preparo dos Reagentes da glicina-aacutecidaEDTApaacutegina 25
Quadro 2 - Preparo da Cloroquinapaacutegina 26
Quadro 3 - Resultados comparativos entre as teacutecnicas utilizadas paacutegina 40
LISTA DE FLUXOGRAMAS
Fluxograma 1 - Fluxograma da pesquisa utilizando as amostras de
doadorespaacutegina 22
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ABO
AHAI
Bg
c
C
C
C3
C3b
C3d
D
DHFRN
DNA
DTT
E
e
EDTA
Fc
Fya
Fyb
HCl
IgA
IgD
IgE
IgM
Mm
NaCl
PA
PAI
PBS
PCR
PEG
pH
Rh
rpm
S
s
SIDA
SBS
TCLE
TDA
TIA
TRIS
ZZAP
microL
Sistema Sanguiacuteneo ABO
Anemia Hemoliacutetica Autoimune
Antiacutegeno Bg
Antiacutegeno c
Celsius
Antiacutegeno C
Complemento
Fraccedilatildeo do complemento
Fraccedilatildeo do complemento
Antiacutegeno D
Doenccedila Hemoliacutetica do Feto e do Receacutem-nascido
Aacutecido desoxirribonucleico
Dithiothreitol
Antiacutegeno E
Antiacutegeno e
Aacutecido Etileno Diamino Tetraceacutetico
Porccedilatildeo do anticorpo
Antiacutegeno Duffy a
Antiacutegeno Duffy b
Aacutecido cloriacutedrico
Imunoglobulina A
Imunoglobulina D
Imunoglobulina E
Imunoglobulina M
Miliacutemetros
Cloreto de soacutedio
Puro para anaacutelise
Pesquisa de anticorpos irregulares
Tampatildeo fosfato salino
Reaccedilao em cadeia de polimerase
Polietilenoglicol
Potencial hidrogeniocircnico
Sistema sanguiacuteneo Rh
Rotaccedilotildees por minuto
Antiacutegeno S
Antiacutegeno s
Siacutendrome da Imunodeficiecircncia adquirida
Sistema de banco de sangue
Termo de consentimento livre e esclarecido
Teste direto da antiglobulina
Teste indireto da antiglobulina
Hidrometil aminometano
Sulphydryl-Proteolytic Enzyme
Microlitros
RESUMO
Os testes preacute-transfusionais satildeo o conjunto de teacutecnicas imuno-hematoloacutegicas aplicadas nas
amostras do receptor e do doador com a finalidade de fornecer uma unidade de hemaacutecias
compatiacutevel e segura para a transfusatildeo Aleacutem da fenotipagem ABO e Rh obrigatoacuteria nos testes
preacute-transfusionais a determinaccedilatildeo do perfil antigecircnico de outros antiacutegenos eritrocitaacuterios de
importacircncia cliacutenica melhora a seguranccedila transfusional especialmente para pacientes
previamente aloimunizados ou candidatos agrave transfusatildeo crocircnica Para tais pacientes conhecer o
fenoacutetipo eritrocitaacuterio permite a seleccedilatildeo de concentrados de hemaacutecias com o mesmo fenoacutetipo
o que previne reaccedilotildees transfusionais hemoliacuteticas assim como nova aloimunizaccedilatildeo
Indiviacuteduos que apresentam as hemaacutecias sensibilizadas ldquoin vivordquo por anticorpos anti-
eritrocitaacuterios como ocorre na anemia hemoliacutetica autoimune (AHAI) teratildeo o teste direto da
antiglobulina (TDA) positivo dificultando a realizaccedilatildeo da fenotipagem O TDA positivo
provoca resultados falsos positivos especialmente quando satildeo utilizados para a fenotipagem
soros comerciais da classe IgG que exigem a fase de antiglobulina humana ou teste indireto
da antiglobulina (TIA) para leitura Em 1982 Edwards Moulds e Judd propuseram a
utilizaccedilatildeo da teacutecnica da cloroquina para dissociar os complexos de antiacutegeno-anticorpo
preservando a membrana eritrocitaacuteria e permitindo a fenotipagem Atualmente eacute a teacutecnica
mais utilizada nos centros brasileiros A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA foi primeiramente
descrita por Louie Jieng e Zeroulis em 1986 poreacutem eacute pouco utilizada por natildeo haver os
reagentes prontos comercialmente no mercado brasileiro O presente estudo avaliou a teacutecnica
da glicina-aacutecida-EDTA com reagentes preparados ldquoin houserdquo em paralelo agrave teacutecnica da
cloroquina que eacute atualmente a teacutecnica aplicada no Hemocentro de Ribeiratildeo Preto Para isso
amostras de hemaacutecias de doadores (n=50) com fenoacutetipo conhecido foram sensibilizadas com
anticorpos humanos de especificidade conhecida e ambas as teacutecnicas foram aplicadas Foi
verificado ainda o efeito da teacutecnica sobre a expressatildeo dos antiacutegenos eritrocitaacuterios (Fya Fy
b
Jka Jk
b S e s) atraveacutes da fenotipagem das amostras que tiveram o TDA negativado A
viabiliadade dos anticorpos presentes no eluato recuperado apoacutes tratamento com a glicina-
aacutecidaEDTA tambeacutem foi testada A glicina-aacutecidaEDTA foi efetiva em negativar o TDA em
33 amostras (66) comparaacutevel com a cloroquina que negativou 28 amostras (56) O eluato
apresentou-se viaacutevel no tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA e natildeo foi constatada destruiccedilatildeo
dos antiacutegenos eritrocitaacuterios apoacutes o tratamento Concluiacutemos que a teacutecnica da glicina-
aacutecidaEDTA pode ser utilizada como uma opccedilatildeo no tratamento de hemaacutecias com TDA
positivo com a vantagem de seu tempo de execuccedilatildeo ser inferior ao da cloroquina (2minutos x
30 a 120 minutos) o que lhe torna uacutetil em situaccedilotildees de maior urgecircncia Quando ambas as
teacutecnicas satildeo utilizadas em hemaacutecias diferentes de uma mesma amostra a efetividade estaacute
significativamente aumentada (plt005)
Palavras chave Glicina-aacutecidaEDTA Teste direto da antiglobulina AHAI fenotipagem
ABSTRACT
The pre-transfusion tests are the group of immunohematology techniques applied in the
receptor and donor samples in order to provide a unit of red blood cells compatible and safe
for transfusion In addition to the obligatory ABO and Rh phenotyping in the pre-transfusion
tests the determination of the antigenic profile of other red cells antigens of clinical
importance improves transfusion safety especially for patients previously alloimmunized or
candidates for chronic transfusion For such patients knowing the phenotype allows the
selection of red blood cell concentrates with the same phenotype which prevents hemolytic
transfusion reactions as well as new alloimmunization Individuals who have antibody-coated
red blood cells sensitized in vivo such as in autoimmune hemolytic anemia (AHAI) will
have a direct antiglobulin test (DAT) positive making it difficult to perform phenotyping
Positive DAT causes false positive results especially when commercially available IgG
serums which require the human antiglobulin phase or indirect antiglobulin test (IAT) for
reading are used for phenotyping In 1982 Edwards Molds and Judd proposed the use of the
chloroquine technique to dissociate antigen-antibody complexes by preserving the erythrocyte
membrane and allowing phenotyping It is currently the most used technique in Brazilian
centers The EDTAglycine-acid technique was first described by Louie Jieng and Zeroulis in
1986 but it is little used because commercially available reagents are not available in the
Brazilian market The present study evaluated the EDTAglycine-acid technique with reagents
prepared in house in parallel to the chloroquine technique which is currently the technique
applied at the Hemocentro de Ribeiratildeo Preto For this donor red cells samples (n = 50) with
known phenotype were sensitized with human antibodies of known specificity and both
techniques were applied The effect of the technique on the expression of erythrocyte antigens
(Fya Fy
b Jk
a Jk
b S and s) was also verified by the phenotyping of the samples that had
negative DAT The viability of the antibodies present in the recovered eluate after treatment
with EDTAglycine-acid A was also tested EDTAglycine-acid was effective in negatively
affecting DAT in 33 samples (66) comparable to chloroquine that negatived 28 samples
(56) The eluate was viable in treatment with EDTAglycine-acid and no destruction of
erythrocyte antigens after treatment We conclude that the EDTA glycine-acid technique can
be used as an option in the treatment of red cells with TDA positive with the advantage that
its execution time is inferior to that of chloroquine (2 minutes x 30 to 120 minutes) which
makes it useful in emergency situations When both techniques are used in different
erythrocytes of the same sample the effectiveness is significantly increased (p lt005)
Key words EDTAglycine-acid direct antiglobulin test AIHA phenotyping
1 INTRODUCcedilAtildeO
A transfusatildeo de hemaacutecias eacute um recurso terapecircutico muito importante e eficaz e tem se
mostrado como um grande aliado no tratamento de diversas patologias auxiliando na
melhoria da sobrevida e qualidade de vida de diversos pacientes quando indicada de forma
correta Eacute provavelmente a modalidade de terapia mais utilizada no mundo sendo
considerada a forma mais antiga de terapia celular A transfusatildeo de hemaacutecias em pacientes
com anemia grave ou sangramento agudo reestabelece o niacutevel de hemoglobina moleacutecula
responsaacutevel pelo transporte de oxigecircnio para os tecidos melhorando a isquemia tecidual
(BARJAS-CASTRO 2013 ZAGO 2014)
A transfusatildeo de componentes celulares como o concentrado de hemaacutecias deve ser
bem avaliada quanto aos riscos e benefiacutecios Os testes preacute-transfusionais satildeo parte obrigatoacuteria
do processo transfusional e tecircm como funccedilatildeo assegurar que o melhor hemocomponente seja
selecionado para o paciente reduzindo assim a chance de transfusotildees incompatiacuteveis e reaccedilotildees
transfusionais (BARJAS-CASTRO 2013)
11TESTES PREacute-TRANSFUSIONAIS
Os testes preacute-transfusionais tecircm a finalidade de evitar a ocorrecircncia de reaccedilotildees
hemoliacuteticas no receptor decorrentes da transfusatildeo de hemaacutecias incompatiacuteveis do doador
(DOWNES e SHULMAN 2011) Tem como propoacutesito selecionar hemaacutecias que apoacutes
transfusatildeo deveratildeo ter sobrevida normal ou mais proacutexima do normal (MELO 2007)
Os testes preacute-transfusionais que consistem no conjunto de teacutecnicas
imunohematoloacutegicas aplicadas agraves amostras do receptor e doador devem ser realizados antes
de toda transfusatildeo A aplicaccedilatildeo desses testes tem como finalidade fornecer uma unidade de
hemaacutecias compatiacutevel e elevar a seguranccedila da transfusatildeo Os testes preacute-transfusionais aliados
a utilizaccedilatildeo de novas tecnologias tem historicamente evitado reaccedilotildees transfusionais
hemoliacuteticas garantindo a seguranccedila transfusional em cerca de 95 dos pacientes que recebem
transfusatildeo Eacute imprescindiacutevel poreacutem a execuccedilatildeo correta das teacutecnicas envolvidas nos testes preacute-
transfusionais e ainda garantir a identificaccedilatildeo correta do receptor e das amostras de sangue e
das unidades de hemaacutecias (CASTILHO 2000 MELO 2007 BARJAS-CASTRO 2013)
2
Todos os testes que compotildeem a rotina preacute-transfusional usam meacutetodos soroloacutegicos
que envolvem a reaccedilatildeo antiacutegeno x anticorpo Ao testar a presenccedila de um antiacutegeno na
superfiacutecie da hemaacutecia eacute necessaacuterio dispor de um soro com especificidade conhecida para
aquele antiacutegeno Por outro lado testar a presenccedila de um determinado anticorpo no soro ou no
plasma exige o uso de hemaacutecias com perfil antigecircnico conhecido Os testes preacute-transfusionais
incluem tipagem ABO (direta e reversa) tipagem Rh pesquisa de anticorpos irregulares no
sangue do receptor retipagem ABO e Rh do hemocomponente e prova de compatibilidade
entre as hemaacutecias do doador e soro ou plasma do receptor em caso de transfusatildeo de hemaacutecias
ou hemocomponentes que contenham mais de 2 mL de volume eritrocitaacuterio como o
concentrado de granuloacutecitos (BRASIL 2016 GANZELLA 2014 SANTOS 2014)
Aleacutem dos testes regularmente realizados a determinaccedilatildeo do fenoacutetipo para outros
antiacutegenos eritrocitaacuterios do doador e do receptor pode ser indicada A fenotipagem eritrocitaacuteria
determina o perfil antigecircnico para outros antiacutegenos de importacircncia cliacutenica aleacutem do sistema
ABO e do antiacutegeno RhD Ela pode auxiliar a confirmaccedilatildeo de uma especificidade de anticorpo
encontrada no soro do paciente uma vez que espera-se que a sua hemaacutecia natildeo expresse o
antiacutegeno correspondente e simultaneamente eacute utilizada para selecionar um concentrado de
hemaacutecias negativo para o respectivo antiacutegeno evitando reaccedilotildees hemoliacuteticas transfusionais A
fenotipagem de candidatos a transfusotildees crocircnicas tambeacutem eacute recomendada pois esse grupo de
pacientes deve se beneficiar com a transfusatildeo profilaacutetica de unidades de hemaacutecias com
mesmo fenoacutetipo evitando assim a aloimunizaccedilatildeo assim como reaccedilotildees hemoliacuteticas provocadas
por anticorpos previamente existentes e em baixo tiacutetulo natildeo identificados pela triagem de
anticorpos (CASTILHO JUNIOR e REID 2015 DOWNES e SHULMAN 2011)
111 TIPAGEM ABORh
O sistema ABO (ISBT001) foi o primeiro sistema de grupo sanguiacuteneo a ser
descoberto Ele foi descrito em 1900 por Karl Landsteiner e eacute considerado o sistema de maior
importacircncia na praacutetica transfusional Ele eacute composto por quatro antiacutegenos A1 (ABO1) B
(ABO2) AB (ABO3) e A1 (ABO4) e eacute caracterizado pela presenccedila dos anticorpos naturais
ou seja anticorpos que surgem sem a exposiccedilatildeo preacutevia aos antiacutegenos atraveacutes de transfusatildeo ou
gestaccedilatildeo Os anticorpos ABO satildeo predominantemente da classe IgM satildeo capazes de fixar o
complemento e de provocar hemoacutelise grave intravascular caso ocorra transfusatildeo ABO
incompatiacutevel Por apresentar essa caracteriacutestica peculiar a tipagem do sistema ABO eacute
composta de duas etapas a prova direta e a prova reversa Na prova direta eacute realizada a
pesquisa dos antiacutegenos na superfiacutecie das hemaacutecias que satildeo testadas com soros comerciais
3
Anti-A e Anti-B A prova reversa por sua vez pesquisa a presenccedila de anticorpos ABO ao
testar o soro ou plasma do pacientedoador com hemaacutecias A1 e B Ambas as provas satildeo
obrigatoacuterias e devem ser concordantes para interpretaccedilatildeo do fenoacutetipo ABO (COOLING
2011 SANTOS 2014)
O sistema Rh (ISBT004) eacute o maior e mais complexo sistema de grupos sanguiacuteneos
compreendendo atualmente 54 antiacutegenos (ISBT 2016) Satildeo cinco os principais antiacutegenos do
sistema Rh D (RH1) C (RH2) E (RH3) c (RH4) e e (RH5) Esses antiacutegenos possuem alta
capacidade imunogecircnica e seus respectivos anticorpos estatildeo envolvidos na doenccedila hemoliacutetica
perinatal e em reaccedilotildees transfusionais hemoliacuteticas Os autoanticorpos quentes como ocorre na
anemia hemoliacutetica quente satildeo representados em grande parte por anticorpos contra antiacutegenos
puacuteblicos do sistema Rh (CASTILHO 2007 CHOU e WESTHOFF 2011 BARJAS-
CASTRO 2013) A tipagem RhD pesquisa o antiacutegeno D na membrana eritrocitaacuteria ao testar a
hemaacutecia com antissoros comerciais Atualmente a maior parte dos soros Anti-D
comercializados satildeo monoclonais
112 ANTICORPOS ANTI-ERITROCITAacuteRIOS
Anticorpos satildeo proteiacutenas presentes no plasma tambeacutem denominadas imunoglobulinas
Satildeo produzidas pelo sistema imune em resposta a um determinado antiacutegeno Podem ser
classificadas de acordo com suas caracteriacutesticas e propriedades em cinco classes de
imunoglobulinas IgG IgM IgA IgE e IgD (BARJAS-CASTRO 2013)
A ligaccedilatildeo entre o antiacutegeno e o anticorpo envolvem ligaccedilotildees natildeo covalentes que satildeo
reversiacuteveis Vaacuterios tipos de interaccedilotildees natildeo covalentes podem contribuir para a ligaccedilatildeo do
antiacutegeno pelo anticorpo incluindo forccedilas eletrostaacuteticas pontes de hidrogecircnio forccedilas de Van
der Walls e interaccedilotildees hidrofoacutebicas (ABBAS LICHTMAN e PILLAI 2008)
As interaccedilotildees antiacutegeno-anticorpo satildeo constituiacutedas por ligaccedilotildees dinacircmicas que sofrem
interferecircncia de alteraccedilotildees fiacutesico-quiacutemicas no meio como mudanccedilas na temperatura na forccedila
eletrostaacutetica na concentraccedilatildeo do antiacutegeno e do anticorpo e no pH O melhor pH para a reaccedilatildeo
eacute em torno de 70 no entanto raros anticorpos podem exigir acidificaccedilatildeo do meio para serem
identificados (SANTOS 2014)
Em imunohematologia satildeo pesquisados os anticorpos que reconhecem os antiacutegenos
eritrocitaacuterios de grupo sanguiacuteneo ldquoin vivordquo esses anticorpos dependendo de seu significado
cliacutenico satildeo capazes de reconhecer seus respectivos antiacutegenos sobre a hemaacutecia podendo levar
a sua destruiccedilatildeo por dois mecanismos fagocitose por macroacutefagos no sistema
4
reticuloendotelial ou por ativaccedilatildeo do sistema complemento com a formaccedilatildeo do complexo de
ataque a membrana e hemoacutelise intravascular As duas classes de anticorpos de maior
importacircncia em imunohematologia satildeo as imunoglobulinas IgG e a IgM (SANTOS 2014)
Devido a sua estrutura pentameacuterica os anticorpos da classe IgM se ligam aos
antiacutegenos localizados na superfiacutecie da membrana de hemaacutecias proacuteximas e promovem
aglutinaccedilatildeo das mesmas em meio salino ldquoin vitrordquo Anticorpos da classe IgG por sua vez
satildeo denominados ldquonatildeo aglutinantesrdquo ou ldquoincompletosrdquo pois sua estrutura de monocircmero eacute
pequena o que desfavorece a aglutinaccedilatildeo direta uma vez que uma mesma moleacutecula de IgG
natildeo alcanccedila antiacutegenos alvos em duas hemaacutecias proacuteximas Os anticorpos IgM aleacutem de terem
um tamanho maior apresentam 750 vezes maior eficiecircncia de aglutinaccedilatildeo que os anticorpos
IgG permitindo maior facilidade nas ligaccedilotildees entre as hemaacutecias (CARRUCIO e WISE 2012
GREEN e KLOSTERMANN 2012)
Nos testes ldquoin vitrordquo satildeo simulados reaccedilotildees que poderiam ocorrer ldquoin vivordquo causando
reaccedilotildees indesejaacuteveis A fase de sensibilizaccedilatildeo em que o anticorpo se liga ao antiacutegeno
correspondente natildeo eacute identificada macroscopicamente poreacutem uma vez que o anticorpo
aproxima as hemaacutecias e vence a forccedila eletrostaacutetica que naturalmente as repele chamada de
potencial zeta ocorre a aglutinaccedilatildeo Dependendo das caracteriacutesticas do anticorpo e de sua
capacidade de fixar complemento pode ocorrer tambeacutem a hemoacutelise (SANTOS 2014)
113 PESQUISA E IDENTIFICACcedilAtildeO DE ANTICORPOS IRREGULARES
A pesquisa de anticorpos irregulares eacute teste obrigatoacuterio nos testes preacute-transfusionais e
tem a finalidade de detectar anticorpos ldquoin vitrordquo que possam causar reaccedilatildeo ldquoin vivordquo
Dependendo da populaccedilatildeo estudada (pacientes x doadores) e ainda da sensibilidade do
teste a frequecircncia de anticorpos irregulares pode variar de 03 a 38 A imunizaccedilatildeo pode
ocorrer por transfusatildeo gestaccedilatildeo transplante ou injeccedilatildeo de material imunogecircnico (WALKER
2011)
Os anticorpos irregulares podem ser classificados como aloanticorpos que satildeo
voltados contra antiacutegenos ausentes na hemaacutecia autoacuteloga ou como autoanticorpos os quais
reconhecem antiacutegenos eritrocitaacuterios proacuteprios Os autoanticorpos antieritrocitaacuterios surgem em
decorrecircncia da desregulaccedilatildeo da autotoleracircncia imune relacionada agrave condiccedilotildees diversas como
doenccedilas hematoloacutegicas doenccedilas inflamatoacuterias autoimunes neoplasias infecccedilotildees e uso de
medicaccedilotildees A presenccedila do autoanticorpo associado a um quadro de anemia hemoliacutetica
caracteriza a anemia hemoliacutetica autoimune (AHAI) seja ela primaacuteria ou secundaacuteria agrave outra
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patologia Ateacute 12 a 40 dos pacientes com autoanticorpos quentes podem apresentar
aloanticorpos de significado cliacutenico mascarados pelos autoanticorpos (SHIREY et al 2002)
Eacute importante detectar a presenccedila de anticorpos no plasmasoro de um receptor de
transfusatildeo para garantir que seja transfundido sangue compatiacutevel Quando a pesquisa de
anticorpo irregular resultar positiva para um ou mais anticorpos de relevacircncia clinica eacute
necessaacuterio confirmar a ausecircncia do respectivo antiacutegeno na hemaacutecia do receptor assim como
selecionar para transfusatildeo concentrados de hemaacutecias tambeacutem negativos para aqueles
antiacutegenos evitando assim reaccedilotildees transfusionais (WALKER 2011)
A detecccedilatildeo de um anticorpo irregular eacute inicialmente realizada pela triagem de
anticorpos na qual o soroplasma do receptor eacute testado com 2 a 3 hemaacutecias do tipo ldquoOrdquo O
conjunto de fenoacutetipos dessas hemaacutecias deve contemplar os antiacutegenos de maior importacircncia
cliacutenica Como os anticorpos irregulares de maior interesse cliacutenico satildeo na maior parte das
vezes imunes portanto da classe IgG eacute obrigatoacuteria a fase de antiglobulina (AGH) do teste
ou teste indireto da antiglobulina (TIA) uma vez que esses anticorpos satildeo incompletos
(CASTILHO JUNIOR e REID 2015) O teste de triagem estando positivo deve-se fazer a
identificaccedilatildeo da especificidade do anticorpo utilizando um painel com maior nuacutemero de
hemaacutecias fenotipadas
114 PROVA DE COMPATIBILIDADE
A prova de compatibilidade eacute um teste obrigatoacuterio em caso de transfusatildeo de
componentes eritrocitaacuterios Tambeacutem chamada de prova de compatibilidade maior deve ser
realizada antes da administraccedilatildeo de sangue total ou concentrado de hemaacutecias utilizando-se
hemaacutecias obtidas do tubo coletor da bolsa a ser transfundida e o soro ou plasma do receptor
(BRASIL 2016)
Eacute definido como o procedimento para excluir a incompatibilidade entre o doador e o
receptor Tem o objetivo de detectar anticorpos que podem natildeo ter sido encontrados na
pesquisa de anticorpos devido a ausecircncia ou pouca expressatildeo de antiacutegenos no painel de
hemaacutecias aleacutem da possibilidade de terem ocorrido erros teacutecnicos ou notacionais durante a
realizaccedilatildeo da pesquisa (MELO 2007)
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115 FENOTIPAGEM PARA OUTROS SISTEMAS
Aleacutem da pesquisa de ABORh que eacute realizado rotineiramente a fenotipagem para
outros sistemas tambeacutem denominado ldquofenotipagem estendidardquo determina a presenccedila ou
ausecircncia de antiacutegenos considerados de importacircncia cliacutenica A fenotipagem natildeo eacute obrigatoacuteria
nos testes preacute-transfusionais poreacutem a legislaccedilatildeo atual recomenda a realizaccedilatildeo da fenotipagem
eritrocitaacuteria dos antiacutegenos C (RH2) E (RH3) c (RH4) e (RH5) K (KELL1) Fya (FY1) Fy
b
(FY2) Jka
(JK1) Jkb (JK2) S (MNS3) e s (MNS4) para pacientes aloimunizados e pacientes
com indicaccedilatildeo de transfusatildeo crocircnica (BRASIL 2016)
A seleccedilatildeo de concentrados de hemaacutecias com o mesmo fenoacutetipo do receptor para
transfusatildeo pode evitar reaccedilotildees transfusionais hemoliacuteticas no paciente previamente
aloimunizado tambeacutem previne a sensibilizaccedilatildeo por outros antiacutegenos o que normalmente
torna as transfusotildees seguintes ainda mais complicadas A fenotipagem do paciente tambeacutem
auxilia na identificaccedilatildeo dos anticorpos pois espera-se que nas hemaacutecias do paciente o
antiacutegeno seja negativo para o anticorpo encontrado servindo de guia para teste de exclusatildeo de
anticorpos (SANTOS 2014 WALKER 2011)
A incidecircncia de aloanticorpos aumenta com o nuacutemero de transfusotildees no entanto a
implantaccedilatildeo de rotina de fenotipagem com transfusatildeo profilaacutetica de hemaacutecias com fenoacutetipo
compatiacutevel para pacientes candidatos agrave politransfusatildeo como os portadores de doenccedila
falciforme talassemia anemia aplaacutestica doenccedilas linfo e mieloproliferativas renais crocircnicos e
anemias refrataacuterias pode contribuir para o baixo iacutendice de sensibilizaccedilatildeo nessas populaccedilotildees
(FLUIT KUNST e DRENTHE-SCHONK 1999 MARTINS et al 2008 e VICHINSKY et
al 2001) Outro grupo de pacientes que se beneficia com a transfusatildeo de mesmo fenoacutetipo satildeo
os pacientes com AHAI uma vez que o autoanticorpo pode mascarar a presenccedila de um
aloanticorpo de significado cliacutenico em ateacute 40 dos casos Mesmo com as teacutecnicas utilizadas
ldquoin vitrordquo para remover a interferecircncia do autoanticorpo no soro um aloanticorpo pode natildeo
ser identificado e dessa forma transfundir o mesmo fenoacutetipo do paciente evitaria reaccedilatildeo
hemoliacutetica pelos anticorpos voltados contra antiacutegenos de maior importacircncia cliacutenica e de
frequecircncia intermediaacuteria Aleacutem disso os pacientes com AHAI satildeo fortes respondedores e a
transfusatildeo profilaacutetica do mesmo fenoacutetipo previne a aloimunizaccedilatildeo (SHIREY et al 2002)
Aleacutem de fenotipar o receptor eacute importante tambeacutem que os bancos de sangue tenham
rotinas de fenotipagem de doadores para atender as necessidade dos pacientes aloimunizados
ou em esquema de transfusatildeo crocircnica (PINTO BRAGA e SANTOS 2011)
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Rotineiramente eacute inviaacutevel estabelecer o fenoacutetipo eritrocitaacuterio completo de um
indiviacuteduo pela grande diversidade de sistemas sanguiacuteneos descritos Ate junho de 2015 jaacute
haviam sido classificados 308 antiacutegenos atribuiacutedos a 36 sistemas definidos pela Sociedade
Internacional de Transfusatildeo de Sangue (ISBT) (CASTILHO JUNIOR e REID 2015)
Portanto o paciente eacute normalmente fenotipado para os antiacutegenos de maior importacircncia
clinica
Alguns fatores podem limitar a realizaccedilatildeo da fenotipagem eritrocitaacuteria Um dos fatores
eacute a transfusatildeo alogecircnica realizada haacute menos de 90 dias Neste caso podem ocorrer resultados
falso positivos para determinados antiacutegenos devido agrave presenccedila de hemaacutecias do doador
(LAINE et al 2000)
Outro fator eacute a presenccedila de anticorpo sensibilizando a hemaacutecia do paciente e
provocando positividade do teste direto da antiglobulina humana (TDA) Os soros
normalmente utilizados para fenotipagem especialmente para os antiacutegenos Fya
(FY1) Fyb
(FY2) Jka
(JK1) Jkb
(JK2) S (MNS3) e s (MNS4) necessitam da fase de antiglobulina
humana (AGH) para que ocorra aglutinacatildeo Amostras que apresentam o TDA positivo
aglutinam apoacutes reaccedilatildeo com a AGH natildeo pela real presenccedila do antiacutegeno em sua superfiacutecie mas
pela interaccedilatildeo da AGH com o anticorpo que estaacute sensibilizando o eritroacutecito A interferecircncia
do TDA positivo pode ser anulada atraveacutes de algumas teacutecnicas capazes de dissociar o
anticorpo como por exemplo o tratamento da hemaacutecia sensibilizada com cloroquina ou com
glicina-aacutecida-EDTA (BRANCH e PETZ 1999 SHIREY et al 2002 e LEGER 2011)
12 METODOLOGIAS APLICADOS Agrave ROTINA IMUNO-HEMATOLOacuteGICA
Todos os testes que compotildeem a rotina preacute-transfusional usam meacutetodos soroloacutegicos
que envolvem a reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo e tem como objetivo determinar o perfil antigecircnico
eritrocitaacuterio do receptor e do doador assim como identificar em seu soro a presenccedila de
anticorpos contra antiacutegenos eritrocitaacuterios que possam comprometer a sobrevida das hemaacutecias
transfundidas Para testar o antiacutegeno na superfiacutecie da hemaacutecia eacute necessaacuterio dispor de um
antissoro com especificidade conhecida para aquele antiacutegeno Por outro lado para testar a
presenccedila de um determinado anticorpo no soro ou plasma do receptor eacute necessaacuterio o uso de
hemaacutecias com perfil antigecircnico conhecido (SANTOS 2014)
Diversas metodologias satildeo aplicadas nos laboratoacuterios de imunohematologia Cada
serviccedilo de hemoterapia faz a escolha do meacutetodo que seraacute aplicado de acordo com o perfil do
laboratoacuterio com o volume de exames diaacuterios e tambeacutem com o custo envolvido Todas essas
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teacutecnicas tecircm como objetivo comum demonstrar a reaccedilatildeo entre antiacutegeno e anticorpo no
entanto elas se baseiam em diferentes princiacutepios Muitas metodologias satildeo atualmente
aplicadas agrave imunohematologia entre elas o sistema de fase soacutelida a tecnologia de hemaacutecias
magnetizadas a biologia molecular e ateacute mesmo a citometria de fluxo no entanto os meacutetodos
mais tradicionais satildeo aqueles baseados no princiacutepio de hemaglutinaccedilatildeo
121 MEacuteTODOS DE FASE FLUacuteIDA
Os meacutetodos de fase fluiacuteda satildeo testes baseados na hemaglutinaccedilatildeo e incluem o teste em
tubo e o teste em microplacas Uma suspensatildeo de hemaacutecias eacute adicionada ao plasma ou soro
em seguida eacute realizada a centrifugaccedilatildeo e por fim eacute feita a leitura do resultado que eacute
considerado positivo se for observado algum grau de aglutinaccedilatildeo ou hemoacutelise A intensidade
de aglutinaccedilatildeo eacute graduada de acordo com o tamanho dos agregados desprendidos da
superfiacutecie apoacutes agitaccedilatildeo delicada do tubo ou microplaca Os meacutetodos de hemaglutinaccedilatildeo satildeo
aplicados a todos os testes preacute-transfusionais Como os anticorpos ABO satildeo aglutininas frias
a tipagem eacute realizada em temperatura ambiente (22degC) no entanto ao investigar a presenccedila
de anticorpos irregulares que como jaacute mencionado eacute na maioria das vezes anticorpos
incompletos da classe IgG eacute essencial que a reaccedilatildeo seja incubada a 37degC As reaccedilotildees satildeo
facilitadas com a utilizaccedilatildeo de potencializadores e da antiglobulina humana (WALKER e
HARMENING 2012 AABB 2011)
Nos meacutetodos de fase fluiacuteda nos quais a AGH eacute empregada a fase de lavagem eacute
fundamental Apoacutes a incubaccedilatildeo do soro com as hemaacutecias deve ser realizada a lavagem da
reaccedilatildeo para remover o excesso de anticorpos natildeo ligados agraves hemaacutecias jaacute que os anticorpos
livres podem bloquear a AGH quando ela eacute adicionada e levar a resultados falso negativos
(AABB 2011)
Os testes de hemaglutinaccedilatildeo satildeo os mais tradicionais entre os meacutetodos ainda hoje
aplicados agrave rotina de bancos de sangue A vantagem desses meacutetodos eacute o baixo custo quando
comparado agraves teacutecnicas mais modernas mas apresentam tambeacutem desvantagens A teacutecnica em
tubo por exemplo natildeo permite automaccedilatildeo eacute trabalhosa e exige matildeo-de-obra bastante treinada
na execuccedilatildeo das diversas etapas do teste e mesmo assim pode haver subjetividade na
interpretaccedilatildeo dos resultados aleacutem de resultados falso-negativos (DOWNES 2011 ZANTEK
et al 2012)
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122 COLUNAS DE GEL
A teacutecnica em gel iniciada na deacutecada de 90 representou uma grande revoluccedilatildeo na
rotina laboratorial tornando-se muito popular Aleacutem de ser sensiacutevel a teacutecnica dispensa a fase
de lavagem antes da adiccedilatildeo da AGH assim como a agitaccedilatildeo do teste para leitura reduzindo o
nuacutemero de resultados falsos negativos decorrentes dessas duas etapas e o tempo para
execuccedilatildeo dos testes (LAPIERRE et al 1989 NOVARETTI et al 2000 NOVARETTI et
al 2004) Os reagentes satildeo comercializados na forma de cartotildees plaacutesticos contendo
microtubos preenchidos por gel composto por microesferas de acrilamida-dextran Nesta
metodologia tambeacutem baseada na hemaglutinaccedilatildeo a suspensatildeo de hemaacutecias e o soro satildeo
depositados em uma cacircmara acima da coluna de gel e em seguida procede-se com a
centrifugaccedilatildeo dos cartotildees As microesferas atuam como uma malha que permite a passagem
em direccedilatildeo ao fundo do microtubo apenas das hemaacutecias natildeo aglutinadas enquanto as
hemaacutecias aglutinadas ficam retidas na parte superior da coluna ou ao longo dela (GREEN e
KLOSTERMANN 2012) Portanto quanto maior a agregaccedilatildeo mais hemaacutecias ficam retidas
no topo da coluna Dependendo do tipo de teste a ser realizado pode ser utilizado gel neutro
ou gel especiacutefico impregnado pelo anticorpo desejado e o gel contendo antiglobulina humana
que satildeo utilizados para os testes diretos e indiretos da antiglobulina (LAPIERRE et al 1989)
A coluna de gel ainda permite a visualizaccedilatildeo clara de duas populaccedilotildees distintas de hemaacutecias
como em pacientes receacutem transfundidos
123 BIOLOGIA MOLECULAR
A biologia molecular ou genotipagem estaacute sendo cada vez mais aplicada aos grupos
sanguiacuteneos pois fornece resultados seguros e precisos especialmente nos casos em que natildeo eacute
possiacutevel a realizaccedilatildeo da fenotipagem como em pacientes receacutem-transfundidos e pacientes
com TDA positivo Na genotipagem eacute possiacutevel determinar atraveacutes do DNA do paciente
extraiacutedo de seus leucoacutecitos de sangue perifeacuterico o fenoacutetipo eritrocitaacuterio deduzido sem
qualquer interferecircncia do anticorpo que sensibiliza a hemaacutecia ou de hemaacutecias alogecircnicas
transfundidas Sua realizaccedilatildeo no entanto exige o treinamento de equipe especializada e capaz
de interpretar os resultados em conjunto com os achados soroloacutegicos (JUNIOR e OLIVATO
2007)
Apesar de ser uma ferramenta de grande importacircncia hoje na imuno-hematologia
ainda estaacute restrito aos grandes centros de hemoterapia no Brasil poucos serviccedilos puacuteblicos de
sauacutede dispotildeem desse recurso e utilizam teacutecnicas de genotipagem de grupos sanguiacuteneos para
atendimento a seus pacientes Esta abordagem poreacutem vem sendo introduzida em algumas
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instituiccedilotildees de reconhecida competecircncia na hemoterapia mas sua disponibilizaccedilatildeo deve
tornar-se mais generalizada atraveacutes da formaccedilatildeo de centros de referecircncia para atendimento
das diversas unidades de hemoterapia (MARTINS et al 2009) Dessa forma muitas decisotildees
transfusionais especialmente em urgecircncias ainda devem ser tomadas sem o resultado da
genotipagem eritrocitaacuteria
13 TESTE DA ANTIGLOBULINA
Coombs Mourant e Race descreveram em 1945 uma teacutecnica com utilizando soro de
coelho contendo antiglobulina humana (AGH) que posteriormente foi chamada de ldquosoro de
Coombsrdquo O meacutetodo foi desenvolvido inicialmente para ampliar o efeito de aglutininas fracas
do sistema Rh anticorpos ldquoincompletosrdquo que normalmente natildeo apresentavam aglutinaccedilatildeo
visiacutevel O teste foi concebido como um instrumento de investigaccedilatildeo de doenccedila hemoliacutetica do
receacutem-nascido e de reaccedilotildees transfusionais causadas por anticorpos Rh que estavam presentes
no soro dos paciente poreacutem que natildeo eram demonstraacuteveis pelas teacutecnicas ateacute entatildeo existentes
A maior parte dos anticorpos de significado cliacutenico assim como seus respectivos
antiacutegenos foram descritos apoacutes o surgimento do ldquosoro de Coombsrdquo em 1945 sendo assim o
teste da antiglobulina representa ateacute hoje a forma mais importante de aglutinaccedilatildeo artificial em
imunohematologia permitindo revelar a presenccedila de anticorpos na membrana da hemaacutecia A
antiglobulina humana eacute constituiacuteda por anticorpo especiacutefico contra a porccedilatildeo Fc de outro
anticorpo Quando um anticorpo ldquoincompletordquo sensibiliza a hemaacutecia normalmente natildeo
provoca aglutinaccedilatildeo visiacutevel Apoacutes a adiccedilatildeo da AGH ao meio esta reconhece e se liga agraves
porccedilotildees Fc dos anticorpos que sensibilizam a hemaacutecia formando assim uma malha e
provocando aglutinaccedilatildeo visiacutevel (BARJAS-CASTRO 2013)
Os reagentes de antiglobulina podem ser poliespeciacuteficos ou monoespeciacuteficos Os
poliespeciacuteficos satildeo uma mistura de anticorpos ant-IgG e anti-C3d (fraccedilatildeo C3d do
complemento) Os reagentes monoespecificos podem ser anti-IgG anti-IgM anti-IgA anti-
complemento podendo ser anti-C3d e anti-C3b
O teste da antiglobulina pode ser usado para detectar hemaacutecias sensibilizadas com
aloanticorpos IgG autoanticorpos IgG e componentes do complemento A sensibilizaccedilatildeo
pode ocorrer ldquoin vivordquo ou ldquoin vitrordquo O uso do AGH para detectar a sensibilizaccedilatildeo ldquoin vitrordquo
tem dois estaacutegios e eacute denominado teste indireto da antiglobulina A sensibilizaccedilatildeo ldquoin vivordquo eacute
detectada em procedimento de um uacutenico estagio chamado teste direto da antiglobulina (TDA)
11
Os testes direto e indireto satildeo ateacute hoje amplamente aplicados como princiacutepio de inuacutemeros
testes soroloacutegicos em imuno-hematologia (GREEN e KLOSTERMANN 2012)
131 TESTE DIRETO DA ANTIGLOBULINA
O teste direto da antiglobulina humana revela a presenccedila de anticorpo eou fraccedilatildeo do
complemento ligados agrave superfiacutecie das hemaacutecias As sensibilizaccedilatildeo das hemaacutecias ocorrida ldquoin
vivordquo natildeo eacute visualizada mas apoacutes a adiccedilatildeo da antiglobulina humana ocorre a aglutinaccedilatildeo que
eacute visualizada macroscopicamente (Figura 1)
Figura 1 - Princiacutepio da teacutecnica direta da antiglobulina Teste utilizado para demonstrar a sensibilizaccedilatildeo ldquoin
vivordquo das hemaacutecias O sangue total eacute coletado do paciente em tubo contendo anticoagulante EDTA Na teacutecnica
realizada em tubo uma suspensatildeo de hemaacutecias 5 em soluccedilatildeo de salina eacute preparada Uma gota dessa suspensatildeo
eacute lavada 3 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica para retirada de anticorpos que estatildeo livres no plasma Toda soluccedilatildeo eacute
retirada e adiciona-se o soro de Coombs (antiglobulina humana) O soro de Coombs reconhece os anticorpos que
estatildeo ligados agrave superfiacutecie das hemaacutecias fazendo com que ocorra aglutinaccedilatildeo visiacutevel macroscopicamente
Apesar de natildeo ser um teste preacute-transfusional obrigatoacuterio o TDA eacute um dos testes mais
importantes para investigar e classificar quadros hemoliacuteticos como de origem imune ou natildeo
imune O seu valor preditivo positivo em vigecircncia de anemia hemoliacutetica eacute de 83 poreacutem natildeo
havendo sinais de hemoacutelise seu valor preditivo eacute apenas 14 Eacute por esse motivo que a
interpretaccedilatildeo do TDA positivo deve levar em consideraccedilatildeo a histoacuteria cliacutenica e os resultados
dos outros exames laboratoriais A realizaccedilatildeo do TDA eacute obrigatoacuteria na investigaccedilatildeo
12
laboratorial de diversos quadros hemoliacuteticos entre eles a anemia hemoliacutetica autoimune
(AHAI) a reaccedilatildeo hemoliacutetica imune poacutes-transfusional a siacutendrome do linfoacutecito passageiro a
doenccedila hemoliacutetica perinatal e a hemoacutelise droga-dependente (LEGER 2011)
Resultados de TDA positivos foram tambeacutem observados em indiviacuteduos com niacuteveis
seacutericos elevados de IgG ou complemento sem evidecircncia de anemia hemoliacutetica imune como
em pacientes com doenccedila falciforme talassemia doenccedila renal crocircnica mieloma muacuteltiplo
doenccedilas autoimunes e siacutendrome da imunodeficiecircncia adquirida (SIDA) Aleacutem disso pequenas
quantidades de IgG (5 a 90 moleacuteculas por hemaacutecia) e complemento (5 a 40 moleacuteculas por
hemaacutecia) podem estar presentes nas hemaacutecias de indiviacuteduos saudaacuteveis sem associaccedilatildeo com
reduccedilatildeo na sobrevida das mesmas A positividade do TDA depende da populaccedilatildeo estudada e
pode variar de 01 entre doadores de sangue sem qualquer sinal cliacutenico de hemoacutelise ateacute
15 em pacientes hospitalizados (CASTILHO JUNIOR e REID 2015 LEGER 2011)
Indiviacuteduos que apresentam TDA positivo seja agraves custas de IgG eou complemento
com ou sem sinais cliacutenicos de hemoacutelise teratildeo a fenotipagem eritrocitaacuteria prejudicada A
fenotipagem de indiviacuteduos com TDA positivo especialmente quando utilizado o teste indireto
da antiglobulina pode acarretar resultados falsos positivos e levar a seleccedilatildeo de fenoacutetipo
incorreto para transfusatildeo
132 TESTE INDIRETO DA ANTIGLOBULINA
O teste indireto da antiglobulina (TIA) eacute utilizado para revelar a sensibilizaccedilatildeo ldquoin
vitrordquo das hemaacutecias e eacute aplicado a diversos testes soroloacutegicos em imunohematologia entre
eles a pesquisa de anticorpos identificaccedilatildeo de anticorpos testes de compatibilidade
fenotipagem eritrocitaacuteria e titulaccedilatildeo de anticorpos Na teacutecnica indireta a hemaacutecia que contecircm
o antiacutegeno eacute colocada em contato ldquoin vitrordquo com o anticorpo que se liga mas natildeo promove a
aglutinaccedilatildeo visiacutevel A adiccedilatildeo da AGH forma uma malha entre os anticorpos que sensibilizam
as hemaacutecias e provoca a aglutinaccedilatildeo macroscoacutepica (figura 2)
Caso a amostra de hemaacutecia estudada seja previamente sensibilizada resultados falsos
positivos podem ser obtidos no TIA jaacute que a AGH reagiraacute com a moleacutecula que sensibilizava
anteriormente a hemaacutecia mesmo se o anticorpo especiacutefico natildeo tiver se ligado ao antiacutegeno
correspondente
13
133 CONDICcedilOtildeES CLIacuteNICAS COM TDA POSITIVO
O TDA positivo deve ser interpretado cuidadosamente sempre em conjunto com o
quadro cliacutenico do paciente A positividade isolada do TDA natildeo significa hemoacutelise A
interpretaccedilatildeo do teste positivo requer o conhecimento do diagnoacutestico do paciente da presenccedila
de sinais e sintomas sugestivos de hemoacutelise assim como de seu histoacuterico transfusional
gestacional e de informaccedilotildees sobre o uso recente de medicaccedilotildees (LEGER 2011)
Figura 2 ndash Princiacutepio do teste indireto da antiglobulina O TIA pode ser utilizado na pesquisa de anticorpos de
especificidades desconhecidas livres no soroplasma como eacute o caso da pesquisa e identificaccedilatildeo de anticorpos
irregulares Ele eacute tambeacutem utilizado para determinar a presenccedila de antiacutegenos na membrana da hemaacutecia quando
satildeo empregados soros de especificidades conhecidas da classe IgG No primeiro caso o soroplasma contendo o
anticorpo desconhecido eacute colocado em contato com hemaacutecias cujo perfil antigecircnico eacute conhecido No segundo
caso utiliza-se soro de especificidade conhecida da classe IgG para determinar a presenccedila ou ausecircncia de um
antiacutegeno na membrana O anticorpo encontra o antiacutegeno correspondente e ocorre a ligaccedilatildeo do anticorpo agrave
hemaacutecia mas natildeo ocorre aglutinaccedilatildeo Apoacutes a adiccedilatildeo da AGH que se liga aos anticorpos formando uma malha
ocorre a aglutinaccedilatildeo visiacutevel
O TDA positivo eacute uma achado claacutessico de algumas condiccedilotildees cliacutenicas como a reaccedilatildeo
transfusional hemoliacutetica a doenccedila hemoliacutetica do feto e do receacutem-nascido (DHFRN) a anemia
hemoliacutetica induzida por drogas a siacutendrome do linfoacutecito passageiro e a anemia hemoliacutetica
autoimune (AHAI) Portanto o TDA positivo pode ser decorrente da sensibilizaccedilatildeo da
hemaacutecia autoacuteloga por um autoanticorpo ou por um aloanticorpo ligado agrave hemaacutecia alogecircnica
circulante A positividade do TDA pode ainda ocorrer de forma passiva em pacientes que
14
recebem imunoglobulinas humanas ou ainda pela transfusatildeo de plaquetas ABO natildeo idecircntico
(LEGER 2011 RALPH 2012 ZANTEK et al 2012)
Nas reaccedilotildees transfusionais hemoliacuteticas imunes o aloanticorpo do receptor sensibiliza
as hemaacutecias transfundidas do doador e reduz sua sobrevida ao removecirc-la precocemente da
circulaccedilatildeo pela fagocitose no sistema retiacuteculo-endotelial ou pela hemoacutelise intravascular As
reaccedilotildees podem ser agudas se ocorrem ateacute 24 horas ou tardias quando ocorrem apoacutes 24 horas
da transfusatildeo A gravidade das reaccedilotildees hemoliacuteticas pode variar de um simples rendimento
transfusional inadequado agrave quadros graves de hemoacutelise intravascular evoluindo ateacute mesmo
com choque vascular e oacutebito O TDA pode resultar negativo caso toda massa eritrocitaacuteria
transfundida tenha sido destruiacuteda (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
Na doenccedila hemoliacutetica do feto e do receacutem-nascido (DHFRN) anticorpos maternos da
classe IgG atravessam a barreira placentaacuteria e sensibilizam as hemaacutecias fetais que seratildeo
destruiacutedas precocemente levando agrave anemia fetal Apesar da incompatibilidade ABO feto-
materna ser a causa mais frequente de DHFRN raramente ela eacute responsaacutevel pela ocorrecircncia
de quadros graves Por outro lado anticorpos contra antiacutegenos do sistema Rh e Kell
especialmente Anti-D (Anti-RH1) Anti-c (Anti-RH4) e Anti-Kell (Anti-KELL1) satildeo
conhecidos por causar DHFRN severa Raramente outros anticorpos tambeacutem podem estar
implicados na DHFRN como os anticorpos contra antiacutegenos do sistema Kidd Duffy MNS e
Diego (ZANTEK et al 2012)
A hemoacutelise droga-dependente eacute causada pela produccedilatildeo de um anticorpo voltado contra
a droga ligada agrave membrana eritrocitaacuteria ou ainda contra o complexo droga-membrana A
classe de medicaccedilotildees mais comumente envolvida eacute a dos antimicrobianos betalactacircmicos
(penicilinas e cefalosporinas) mas outras classes como quimioteraacutepicos e anti-inflamatoacuterios
tambeacutem satildeo descritos (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
Apoacutes transplante de ceacutelulas progenitoras hematopoieacuteticas em que o doador possui
anticorpos contra antiacutegenos eritrocitaacuterios do receptor o linfoacutecito de memoacuteria do doador pode
resistir ao esquema imunossupressor utilizado e continuar a produccedilatildeo de anticorpos que
reconhecem a hemaacutecia incompatiacutevel do receptor ainda circulante O quadro cliacutenico pode
variar de um simples TDA positivo sem outros sinais ou sintomas ateacute um quadro hemoliacutetico
grave e abrupto (LEGER 2011)
15
134 ANEMIA HEMOLIacuteTICA AUTOIMUNE
A anemia hemoliacutetica autoimune eacute caracterizada pela destruiccedilatildeo precoce das hemaacutecias
autoacutelogas por autoanticorpos que sensibilizam as hemaacutecias e levam agrave fagocitose pelos
macroacutefagos no sistema reticulo-endotelial ou hemoacutelise intravascular O diagnoacutestico da AHAI
baseia-se na presenccedila de hemoacutelise cliacutenica associada agrave evidecircncia de fator imune representado
pelo TDA positivo As classes de anticorpos envolvidas em quadros de AHAI satildeo IgG IgM e
raramente IgA (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012) Satildeo raros os casos de AHAI com TDA
negativo que podem estar relacionados a um autoanticorpo de baixa avidez de densidade
inferior agrave detecccedilatildeo do meacutetodo ou ainda de classe de imunoglobulina natildeo avaliada pelo
meacutetodo utilizado para o teste (GARRATY 2005)
A AHAI pode ser classificada em dois grupos principais de acordo com a melhor
temperatura de reaccedilatildeo do autoanticorpo As anemias hemoliacuteticas causadas por anticorpos
quentes que reagem melhor a 37oC e geralmente IgG representam 80 dos casos de AHAI
Nas AHAI por anticorpo quente o TDA pode ser positivo para IgG mais complemento (67)
somente IgG (20) ou somente por complemento (13) As anemias causadas por
anticorpos frios geralmente da classe IgM e que reagem melhor em temperatura ambiente ou
a 4oC representam aproximadamente 20 dos casos de AHAI Por exibirem amplitude
teacutermica esses anticorpos ligam-se agraves hemaacutecias ao atingirem a circulaccedilatildeo nas extremidades do
corpo fixam o complemento e desprendem-se da hemaacutecia apoacutes retornar para partes mais
quentes Por esse motivo em AHAI por anticorpos frios o TDA eacute positivo apenas agraves custas
de C3 e normalmente o IgM natildeo eacute detectado (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
A presenccedila do autoanticorpo IgG pode ser confirmada atraveacutes da eluiccedilatildeo do anticorpo
da hemaacutecia Tipicamente o eluato na AHAI por anticorpo quente reage com todas as ceacutelulas
testadas de um painel de hemaacutecias alogecircnicas do tipo ldquoOrdquo ou pode eventualmente exibir uma
especificidade conhecida como Anti-e (Anti-RH5) Nas AHAI a frio por sua vez espera-se
um eluato negativo (LEGER 2011)
Os autoanticorpos satildeo com frequecircncia encontrados livres no plasma e natildeo somente
ligados agraves hemaacutecias autoacutelogas Eles podem interferir em todas as fases dos testes preacute-
transfusionais nas quais o plasma eacute testado especialmente os autoanticorpos quentes que
acarretam resultados positivos em todos os testes levados agrave fase de antiglobulina humana
Esses anticorpos portanto positivam a pesquisa de anticorpos irregulares e mascaram a
presenccedila de aloanticorpos de significado cliacutenico Aproximadamente 60 dos pacientes que
apresentam AHAI a quente apresentam anticorpos que reagem em meio salino mas se forem
16
levados em conta meacutetodos mais sensiacuteveis como PEG enzima e estudo em gel a positividade
pode ser superior a 90 (LEGER 2011)
Aleacutem da eficaacutecia da transfusatildeo ser comprometida pela diminuiccedilatildeo da vida-meacutedia das
hemaacutecias a presenccedila do autoanticorpo dificulta a realizaccedilatildeo dos testes preacute-transfusionais e
compromete a seguranccedila transfusional Os autoanticorpos reagem normalmente como
panaglutininas pois satildeo normalmente voltados contra antiacutegenos puacuteblicos na maior parte das
vezes contra antiacutegenos do sistema Rh Por apresentarem essas caracteriacutesticas podem ainda
mascarar a presenccedila de aloanticorpos de significado clinico e levar a testes de compatibilidade
positivos exigindo uma avaliaccedilatildeo criteriosa da necessidade da transfusatildeo (BRANCH e PETZ
1999 JUNIOR e OLIVATO 2004)
Remover a interferecircncia do autoanticorpo para avaliar a presenccedila de aloanticorpos
mascarados nem sempre eacute possiacutevel mesmo utilizando teacutecnicas de autoadsorccedilatildeo ou
aloadsorccedilatildeo que aleacutem de tudo satildeo demoradas e exigem de 2 a 6 horas para conclusatildeo
(GARRATY e GEORGE 2002) Nesses casos a fenotipagem eritrocitaacuteria do paciente eacute de
extrema utilidade especialmente em situaccedilotildees de urgecircncia A definiccedilatildeo do fenoacutetipo do
paciente para os antiacutegenos de maior importacircncia cliacutenica pode auxiliar a seleccedilatildeo de unidades
de hemaacutecias com mesmo fenoacutetipo o que garante que eventuais aloanticorpos natildeo
identificados sejam respeitados e tambeacutem evita nova sensibilizaccedilatildeo (JUNIOR e OLIVATO
2004 SHIREY et al 2002)
135 TRATAMENTO DE HEMAacuteCIAS COM TDA POSITIVO
O TDA positivo impede a fenotipagem eritrocitaacutecia por meacutetodos que exigem a fase de
AGH uma vez que a aglutinaccedilatildeo ocorreraacute devido agrave interaccedilatildeo da AGH com o autoanticorpo
que sensibiliza a hemaacutecia do paciente levando a resultados falso positivos Em algumas
situaccedilotildees como na AHAI por anticorpo quente a fenotipagem eacute especialmente importante
pois o autoanticorpo interfere na triagem e identificaccedilatildeo de anticorpos assim como no teste de
compatibilidade e dificultam a detecccedilatildeo de aloanticorpos de significado cliacutenico que
obrigatoriamente devem ser respeitados Nessas situaccedilotildees a fenotipagem eritrocitaacuteria
determina o perfil antigecircnico do paciente e possibilita o fornecimento de unidades de
hemaacutecias com o mesmo fenoacutetipo para a transfusatildeo evitando a sensibilizaccedilatildeo para novos
antiacutegenos assim como reaccedilotildees hemoliacuteticas transfusionais No entanto eacute necessaacuterio aplicar
meacutetodos que natildeo sofram interferecircncia do TDA positivo ou seja meacutetodos que natildeo necessitem
da fase de AGH ou meacutetodos de bloqueio do anticorpo sem bloquear o antiacutegeno Uma opccedilatildeo eacute
a utilizaccedilatildeo de soros monoclonais IgM (salinos ou de meio proteico natildeo concentrado) mas
17
nem sempre esses reagentes estatildeo disponiacuteveis especialmente os reagentes monoclonais para
os antiacutegenos dos sistemas Duffy ( Fya Fy
b) Kidd ( Jk
a Jk
b) e MNS (S s) (JUNIOR e
OLIVATO 2004) Outra opccedilatildeo eacute a teacutecnica de bloqueio que pode ser utilizada para tratar
hemaacutecias para posterior fenotipagem em casos de TDA positivos com reatividade le2+
Em casos onde a positividade do TDA eacute maior que 2+ estaacute indicada a tratamento
quiacutemico para remoccedilatildeo da interferecircncia do autoanticorpo antes de realizar a fenotipagem Entre
as teacutecnicas utilizadas atualmente estatildeo o ZZAP a cloroquina e a glicina aacutecidaEDTA
1351 TEacuteCNICA DE BLOQUEIO
A teacutecnica de bloqueio se baseia na utilizaccedilatildeo de anti-IgG (Coombs monoespeciacutefico)
para tratar as hemaacutecias com TDA positivo O anticorpo anti-IgG se liga aos anticorpos que
estatildeo sensibilizando a hemaacutecias poreacutem sem o bloquear os antiacutegenos Os antiacutegenos que natildeo
estatildeo sensibilizados podem ser detectados atraveacutes dos antissoros especiacuteficos (SERERAT
VEIDT E DUTCHED 2000)
1352 TRATAMENTO DE HEMAacuteCIAS COM ZZAP
O Sulphydryl-Proteolytic Enzyme (ZZAP) que eacute uma mistura de ditiotreitol (DTT)
mais papaiacutena ativada com cisteiacutena eacute um reagente capaz de dissociar imunoglobulinas da
classe IgG ligadas a membrana dos eritroacutecitos enquanto trata enzimaticamente as hemaacutecias
O tratamento enzimaacutetico tambeacutem potencializa a ligaccedilatildeo do autoanticorpo ao antiacutegeno e
acelera o processo de autoadsorccedilatildeo O ZZAP pode desnaturar os antiacutegenos do sistema Duffy
MNS e Kell o que limita sua aplicaccedilatildeo para fins de fenotipagem (BRANCH e PETZ 1982)
1353 CLOROQUINA
Em 1982 Edwards Moulds e Judd propuseram a utilizaccedilatildeo da teacutecnica da cloroquina
que dissociava os complexos antiacutegeno-anticorpo e mantinha a membrana das hemaacutecias
iacutentegras Os derivados quinolecircicos jaacute haviam sido descritos anteriormente por Domokos e
Aszody em 1964 e Holtz Mantel e Buck em 1973 (apud Edwards Moulds e Judd 1982) pela
sua capacidade de separar imunocomplexos e inibir as reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo reduzindo
as cargas eleacutetricas das superfiacutecie das hemaacutecias A teacutecnica eacute uma das mais utilizadas nos
centros brasileiros para remover a interferecircncia do autoanticorpo e eacute tambeacutem a teacutecnica
atualmente adotada pelo laboratoacuterio de imunohematologia do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto
18
Edwards Moulds e Judd (1982) demonstraram que a teacutecnica da cloroquina para
dissociaccedilatildeo de anticorpos eacute uma teacutecnica simples efetiva e confiaacutevel para dissociar
imunoglobulina das hemaacutecias Desde que a membrana das hemaacutecias permaneccedila intacta natildeo
haacute perda da reatividade dos antiacutegenos e a sua maior aplicaccedilatildeo eacute a fenotipagem de hemaacutecias
com TDA positivo Os autores verificaram que em 83 das amostras sensibilizadas in vivo e
22 amostras (no total de 40) sensibilizadas ldquoin vitrordquo apresentaram TDA negativo e
puderam ser fenotipadas A teacutecnica poreacutem natildeo consegue remover os componentes do
complemento na maioria dos casos
Champagne e colaboradores (1999) testaram a teacutecnica da cloroquina para dissociar
antiacutegenos Bg comparando com a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA e verificaram vantagem em
relaccedilatildeo ao uso de um uacutenico reagente diminuindo a manipulaccedilatildeo e verificou que o mesmo natildeo
destroacutei antiacutegeno Kell
A cloroquina tambeacutem mostrou-se pouco efetivo em remover anticorpos do sistema
Duffy da superfiacutecie das hemaacutecias (EDWARDS MOUDS e JUDD 1982 ROZIERS e
SQUALI 1997)
1353 GLICINA-AacuteCIDAEDTA
A afinidade e a estabilidade entre a ligaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo eacute definida como a
resultante entre forccedilas atrativas e repulsivas entre ambos (CARUCIO e WISE 2012) e resulta
da somatoacuteria de forccedilas quiacutemicas dinacircmicas e fracas (natildeo covalentes) como pontes de
hidrogecircnio forcas eletrostaacuteticas forca de Van der Waals e pontes hidrofoacutebicas A estabilidade
dessa ligaccedilatildeo eacute facilmente abalada por alteraccedilotildees quiacutemicas e fiacutesicas no meio da reaccedilatildeo como
a alteraccedilatildeo do pH A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA se baseia na mudanccedila do pH para a
quebra da ligaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo (KOSANKE 2012)
A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA foi primeiramente descrita em 1986 por Louie Jieng
e Zeroulis que utilizaram 50 amostras de doadores sensibilizados ldquoin vitrordquo com anticorpos A
teacutecnica foi efetiva em 48 amostras permitindo o estudo do eluato assim como a fenotipagem
das hemaacutecias Os autores testaram tambeacutem a teacutecnica em 100 hemaacutecias TDA positivo que
puderam ser utilizadas para teacutecnicas de autoadsorccedilatildeo
Byrne (1991) descreveu a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA modificada e tambeacutem
verificou como uma opccedilatildeo para o tratamento de hemaacutecias com TDA positivo que deixava as
hemaacutecias intactas e o eluato viaacutevel para ser fenotipado
19
Roziers e Squali (1997) e Katharia e Chaudhary (2013) compararam a teacutecnica da
glicina-aacutecidaEDTA com as teacutecnicas da cloroquina e do aquecimento Verificaram maior
eficiecircncia da glicina-aacutecidaEDTA em relaccedilatildeo as outras duas teacutecnicas pois com uma mesma
quantidade de amostra produzia as hemaacutecias livres de anticorpo e tambeacutem o eluato Mostrou-
se ainda superior devido ao menor tempo exigido para sua realizaccedilatildeo o que favorece seu uso
em situaccedilotildees de urgecircncia e emergecircncia
As duas desvantagens da teacutecnica poreacutem eacute o fato de destruir os antiacutegenos do sistema
Kell e o fato de natildeo remover fraccedilotildees do complemento ligadas agrave hemaacutecia (PALLAS WILER e
McGEE 1991 ROZIERS e SQUALLI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012
e KATHARIA e CHAUNDHARY 2013)
20
2 OBJETIVOS
21 OBJETIVO GERAL
211 Avaliar a eficaacutecia da glicina-aacutecidaEDTA em remover os anticorpos ligados agraves
hemaacutecias sensibilizadas por anticorpos da classe IgG
22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
221 Preparaccedilatildeo dos reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
verificaccedilatildeo da estabilidade dos mesmos e avaliar custos
222 Testar a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA em amostras de hemaacutecias
sensibilizadas por anticorpos antieritrocitaacuterios humanos
223 Comparar a efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA com a teacutecnica da
cloroquina quanto a capacidade de remover a interferecircncia do anticorpo ligado
a hemaacutecia
224 Testar o eluato das amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA
225 Verificar se houve destruiccedilatildeo dos antiacutegenos eritrocitaacuterios apoacutes o tratamento
com glicina-aacutecidaEDTA e com cloroquina
226 Verificar se o tempo de execuccedilatildeo da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA descrito
nos textos de referecircncia eacute reprodutiacutevel
21
3 JUSTIFICATIVA
Algumas condiccedilotildees cliacutenicas podem levar ao depoacutesito ldquoin vivordquo de anticorpos eou
fraccedilotildees do complemento sobre as hemaacutecias Entre elas estatildeo as reaccedilotildees hemoliacuteticas poacutes-
transfusionais a doenccedila hemoliacutetica perinatal o uso de medicamentos e principalmente a
AHAI Na AHAI um anticorpo normalmente da classe IgG ou IgM reconhece antiacutegenos
proacuteprios na membrana eritrocitaacuteria e reduz a sobrevida da hemaacutecia levando a sua destruiccedilatildeo
pelos macroacutefagos no sistema reticulo-endotelial ou agrave ativaccedilatildeo do complexo de ataque agrave
membrana e agrave lise intravascular Os autoanticorpos satildeo voltados na maioria das vezes contra
antiacutegenos eritrocitaacuterios de alta frequecircncia populacional conhecidos como antiacutegenos puacuteblicos
e por este motivo reconhecem tanto hemaacutecias autoacutelogas quanto alogecircnicas
Devido agrave presenccedila do autoanticorpo livre no plasma e tambeacutem do anticorpo eou
complemento ligado agrave hemaacutecia o banco de sangue pode encontrar dificuldades em todas as
fases dos testes preacute-transfusionais do paciente com AHAI e deve utilizar teacutecnicas que
auxiliem na escolha do melhor hemocomponente melhorando a seguranccedila transfusional Essas
teacutecnicas visam remover a interferecircncia do autoanticorpo livre no soro e do autoanticorpo
ligado agrave hemaacutecia permitindo a detecccedilatildeo de aloanticorpos associados e a realizaccedilatildeo da
fenotipagem eritrocitaacuteria respectivamente
A finalizaccedilatildeo dos testes preacute-tranfusionais na presenccedila de autoanticorpo pode levar
algumas horas e nem sempre o paciente poderaacute aguardar Nesse contexto torna-se vantajosa a
aplicaccedilatildeo de teacutecnicas de raacutepida execuccedilatildeo
O presente estudo propotildee aplicar e avaliar a eficaacutecia da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
em remover os anticorpos ligados agrave hemaacutecia o que permite a fenotipagem eritrocitaacuteria
estendida e a seleccedilatildeo de concentrados de hemaacutecias com mesmo fenoacutetipo do paciente
Atualmente no Hemocentro de Ribeiratildeo Preto a teacutecnica utilizada para esse fim eacute o
tratamento das hemaacutecias com difosfato de cloroquina cujo tempo de execuccedilatildeo pode demorar
ateacute duas horas enquanto a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser realizada em apenas dois
minutos o que a tornaria opccedilatildeo de escolha especialmente em situaccedilotildees de urgecircncia Ao
contraacuterio da cloroquina a glicina-aacutecidaEDTA permite tambeacutem o estudo do eluato das
hemaacutecias tratadas
22
4 METODOL OGIA
41 AMOSTRAS DE DOADORES
Foram coletados 50 amostras de doadores de sangue que compareceram ao
Hemonuacutecleo de Araccedilatuba no periacuteodo de junho a agosto de 2016 Foram convidados a
participar da pesquisa doadores de repeticcedilatildeo do tipo sanguiacuteneo ldquoOrdquo RhD positivo
cadastrados no sistema de banco de sangue (SBS) do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto
Todos os doadores que concordaram em participar da pesquisa assinaram o termo de
consentimento livre e esclarecido (TCLE)
No momento da doaccedilatildeo foram coletados adicionalmente 5 mL de sangue total em
soluccedilatildeo anticoagulante EDTA (aacutecido dietilenoaminoaceacutetico) dispensando punccedilatildeo venosa
adicional para coleta da amostra O fluxograma 1 resume as etapas desenvolvidas no projeto
Fluxograma 1 - Fluxo da pesquisa utilizando as amostras de doadores
23
411 FENOTIPAGEM
Foram verificados se os doadores jaacute tinham fenotipagem para outros sistemas de
grupos sanguiacuteneos aleacutem do sistema ABORh que eacute realizado rotineiramente
A fenotipagem eritrocitaacuteria para outros sistemas ou fenotipagem estendida eacute realizada
para identificar a presenccedila ou ausecircncia de antiacutegenos considerados de importacircncia cliacutenica No
Hemonuacutecleo de Araccedilatuba uma parcela de doadores de repeticcedilatildeo satildeo fenotipados para os
antiacutegenos dos sistemas de grupo sanguiacuteneo Rh (antiacutegenos C c E e e) Kell (antiacutegeno K)
Duffy (antiacutegenos Fya e Fy
b) Kidd (antiacutegenos Jk
a e Jk
b) e sistema MNSs (antiacutegenos S e s)
A fenotipagem para o Rh e Kell eacute realizada por metodologia de microplaca utilizando
25 microL de hemaacutecia lavada e diluiacuteda a 5 em salina e 25 microL do antissoro comercial especiacutefico
A reaccedilatildeo eacute incubada 15 minutos a temperatura ambiente e centrifugadas para leitura Para os
antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s a metolodogia utilizado eacute gel contendo antiglobulina
humana (gel LissCoombs poliespeciacutefico) da marca BIO-RAD onde se utiliza suspensatildeo de
hemaacutecia em LISS (Soluccedilatildeo de baixa forccedila iocircnica) A suspensatildeo eacute preparada atraveacutes da
diluiccedilatildeo de 10 microL de hemaacutecia em 1000 microL de LISS Pipetado 50 microL dessa diluiccedilatildeo no gel e
adicionado 25 microL do antissoro especiacutefico Incuba-se em banho seco por 15 minutos a 37 deg
Celsius e eacute centrifugado em centriacutefuga especiacutefica Os antissoros utilizados eram das marcas
Fresenius e Lorne
Foi verificado a fenotipagem do doador no banco de dados do Hemocentro Os
registros dos fenoacutetipos dos doadores ficam armazenadas no sistema de banco de sangue
(SBS) Para doadores que natildeo tinham fenotipagem estendida preacutevia para antiacutegenos do sistema
Rh (C c E e e) e Kell (K) foi realizada a fenotipagem para esses antiacutegenos
O tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA e cloroquina para dissociar
anticorpos pode inativar enfraquecer ou destruir os antiacutegenos presentes nas hemaacutecias
alterando assim os resultados da fenotipagem Para verificar se houve destruiccedilatildeo dos
antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a e Jk
b S e s nas amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes
tratamento foram novamente fenotipadas ao final para os antiacutegenos que eram inicialmente
positivas
A repeticcedilatildeo da fenotipagem foi realizada nas amostras que apresentaram efetividade
no tratamento da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eou da cloroquina e a detecccedilatildeo do antiacutegeno
na amostra preacute-tratamento
24
412 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS HEMAacuteCIAS
As hemaacutecias foram sensibilizadas com antissoros policlonais humanos de amostras de
plasma fresco congelado de doadores com resultado de pesquisa de anticorpo irregular
positivos
A escolha do anticorpo para sensibilizar as hemaacutecias foi definida de acordo com o
fenoacutetipo do doador que deveria ser positivo para o respectivo antiacutegeno
Para a sensibilizaccedilatildeo um volume de antissoro (1 mL) e um volume (1 mL) de
hemaacutecias lavadas quatro vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica foram adicionadas a um tubo de 12 x
75 mm A mistura foi homogeneizada e incubada em banho maria (BM) a 37deg C por 60
minutos A seguir as hemaacutecias foram novamente lavadas 4 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica
para retirada dos anticorpos que natildeo se ligaram A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada
como controle negativo O teste da uacuteltima lavagem eacute importante para assegurar que os
anticorpos que poderatildeo ser detectados no eluato apoacutes o tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA
sejam aqueles que estavam ligados agraves hemaacutecias e natildeo aqueles livres no plasma O controle
negativo mostra que todo o anticorpo livre foi retirado (LEGER 2011)
Para o teste de presenccedila de anticorpo na soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foram incubadas
com hemaacutecias de triagem de anticorpos irregulares (ID-Diacell BIO-RAD) contendo os
antiacutegenos especiacuteficos Realizado a teacutecnica em gel LissCoombs com anti-IgG+C3d Incubado
no tempo de 15 minutos a temperatura de 37deg C e centrifugado 10 minutos em centriacutefuga
proacutepria
As 50 amostras de doadores foram sensibilizadas com os anticorpos policlonais
humanos
Apoacutes sensibilizadas rdquoin vitrordquo e lavadas as hemaacutecias foram diluiacutedas em soluccedilatildeo de
baixa forccedila iocircnica (LISS) na quantidade de 10 microL de hemaacutecia para 1000 microL de soluccedilatildeo A
suspensatildeo foi pipetada (50 microL) em coluna-gel-teste LissCoombs (BIO-RAD) que contecircm
antiglobulina poliespeciacutefico (IgG+C3d) e centrifugada em baixa rotaccedilatildeo conforme orientaccedilatildeo
do fabricante durante 10 minutos
As amostras deveriam apresentar aglutinaccedilatildeo com reatividade 3 a 4+ no TDA As
amostras que apresentaram reaccedilatildeo menor que 3+ foram novamente sensibilizadas com nova
aliacutequota do antissoro
25
413 TRATAMENTO DAS AMOSTRAS
As amostras sensibilizadas apresentando o TDA positivo 3 ou 4+ foram divididas em
duas aliacutequotas e submetidas a duas teacutecnicas diferentes com o objetivo de dissociar o anticorpo
ligado Uma aliacutequota da amostra foi tratada com soluccedilatildeo de difosfato de cloroquina enquanto
a outra aliacutequota foi tratada com glicina-aacutecidaEDTA
42 PREPARO DA GLICINA AacuteCIDA-EDTA
A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA utiliza 3 soluccedilotildees diferentes a glicina aacutecida o
EDTA e o tampatildeo TRIS
Os reagentes foram preparados utilizando os sais para anaacutelise (PA) de EDTA
(Na2EDTA2H2O) TRIS (C4H11NO3) Glicina (H2NCH2CO2H) NaCl e a soluccedilatildeo de aacutecido
cloriacutedrico (HCl) 12 N todos reagentes da marca SYNTH (quadro 1)
Para o preparo do tampatildeo glicina-acida eacute necessaacuterio o ajuste do pH para 15 Para esse
ajuste utiliza-se aacutecido cloriacutedrico (HCl) concentrado O pH foi medido com fitas reativas de pH
com escala de 1 a 14 da marca MERCK Posteriormente a soluccedilatildeo foi enviada ao laboratoacuterio
de controle de qualidade do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto e o pH medido no peagacircmetro O
tampatildeo glicina-aacutecida foi armazenado a 4deg e o tampatildeo tris e o EDTA em temperatura ambiente
controlada (20 a 24deg Celsius)
Apoacutes o preparo e durante a realizaccedilatildeo dos testes foram feitas inspeccedilotildees visuais para
verificaccedilatildeo de turvaccedilatildeo do meio e presenccedila de precipitados
Reagente Material Quantidade Preparo e
Conservaccedilatildeo
EDTA
EDTA
(Na2EDTA2H2O)
5 gramas Mistura ateacute
dissoluccedilatildeo do sal e
conserva em
temperatura ambiente Aacutegua Destilada 50 Ml
Tris
TRIS (C4H11NO3) 121 gramas Conservar em
temperatura ambiente NaCl 525g
Aacutegua destilada 100ml
Gliacutecina-aacutecida
Glicina
(H2NCH2CO2H) 15 gramas
Conservar a 4oC NaCl 116gramas
Aacutegua Destilada 200ml
HCL 12N Ajutar o pH para 15
Quadro 1 - Preparo dos Reagentes da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
Fonte - Manual teacutecnico AABB 2011
26
O tampatildeo glicina-aacutecida e o tampatildeo TRIS satildeo estaacuteveis por 7 meses O reagente EDTA
precipitou mesmo estando em temperatura em ambiente controlado Houve necessidade de
preparo de novo reagente
421 TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
1 Em um tubo de ensaio 12x75 mm eacute adicionado 08 mL da soluccedilatildeo de glicina-aacutecida A
esta soluccedilatildeo adiciona-se 02 mL de EDTA e mistura
2 Adiciona-se 02 mL de hemaacutecias sensibilizadas (lavada 4 vezes) A mistura eacute
homogeneizada e incubada por exatamente 2 minutos
3 A seguir 01 mL de tampatildeo TRIS eacute adicionado agrave mistura que eacute novamente
homogeneizada e centrifugada por 2 minutos a 3400 rpm O pH deve estar entre 7 a 75
4 Apoacutes centrifugaccedilatildeo separa-se em outro tubo o sobrenadante (eluato) e as hemaacutecias
que permanecem satildeo lavadas 4 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica para retirada de todo o
reagente e anticorpos livres
43 PREPARO DA CLOROQUINA
A cloroquina eacute diluiacuteda em tampatildeo PBS na concentraccedilatildeo de 20 (Quadro 2) e
armazenado a 4deg Celsius sua validade apoacutes o preparo eacute de 1 mecircs
A teacutecnica da cloroquina jaacute estaacute padronizada para rotina do laboratoacuterio de
imunohematologia do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto e suas unidades
Reagente Reagentes Quantidade PreparoConservaccedilatildeo
Cloroquina
Difosfato de cloroquina
(C18H32ClN3O8P2)
20 gramas
Conservar a 4deg Celsius
Tampatildeo PBS 100ml
NaOH 01 N Acertar o pH para
51
Quadro 2 - Preparo da Cloroquina Fonte - Manual teacutecnico da AABB 2011
431 TEacuteCNICA DA CLOROQUINA
1 4 partes da soluccedilatildeo pronta eacute adicionada a uma parte de hemaacutecias lavadas 4 vezes com
soluccedilatildeo fisioloacutegica
2 A mistura eacute incubada em temperatura ambiente por ateacute duas horas
3 Centrifugar a 3400 rpm por 2 minutos
27
4 Remover o sobrenadante lavar as hemaacutecias novamente com soluccedilatildeo fisioloacutegica 4
vezes
44 VERIFICACcedilAtildeO DA EFETIVIDADE DOS TESTES
Apoacutes tratamento pelas duas teacutecnicas o TDA foi repetido em todas as amostras para
verificar se os tratamentos foram efetivos e houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo Para as
amostras tratadas pela teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA que permaneceram com TDA positivo
novo tratamento foi realizado
45 TESTE DO ELUATO
O eluato resultante das amostras tratadas com glicina-acidaEDTA foi testado com
hemaacutecias de triagem A soluccedilatildeo do eluato foi incubada com as hemaacutecias de triagem de
anticorpos (ID-Diacell BIO-RAD) pela teacutecnica em gel LissCoombs O teste foi incubado 15
minutos a 37deg Celsius e centrifugado por 10 minutos em centrifuga proacutepria para a teacutecnica em
gel Os eluatos que apresentaram resultados positivos foram testados em painel de 11
hemaacutecias (ID-Diapanel BIO-RAD) para a identificaccedilatildeo do anticorpo
46 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente que apresentou TDA positivo por IgG e pesquisa
de anticorpo irregular positivo com presenccedila de autoanticorpo com reatividade panaglutinina
A amostra foi tratada em paralelo pelas duas teacutecnicas descritas e foi enviada para o
Hemocentro para genotipagem eritrocitaacuteria que foi realizado por metodologia PCR em tempo
real no equipamento Real-time system PCR 7500 ( Applied Biosystems Califoacuternia EUA)
28
5 RESULTADOS
51 REAGENTES
Para aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA satildeo necessaacuterios 3 diferentes
reagentes que podem ser encontrados em forma de kit pronto para uso No entanto esses kits
natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil Os reagentes satildeo tampatildeo glicina-aacutecida o EDTA e o tampatildeo
Tris
Todos os reagentes foram preparados rdquoin houserdquo a partir dos sais e soluccedilotildees PA (puro
para anaacutelise) da marca SYNTH que foram adquiridos para a pesquisa O custo estimado para
cada teste foi aproximadamente R$ 020 reais
Apoacutes o preparo os reagentes poderiam ser armazenados em condiccedilotildees adequadas pelo
periacuteodo de 1 ano (AABB 2011) Ao final do preparo e durante o periacuteodo de armazenamento
de fevereiro a setembro de 2016 foi realizada inspeccedilatildeo visual para verificar a presenccedila de
precipitados ou turvaccedilatildeo A soluccedilatildeo de glicina e o tampatildeo TRIS mostraram-se estaacuteveis ateacute o
final do periacuteodo Por sua vez o reagente EDTA precipitou mesmo estando armazenado em
temperatura ambiente controlada e foi necessaacuterio novo preparo
52 AMOSTRAS DE DOADORES
521 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS AMOSTRAS
Apoacutes incubaccedilatildeo da hemaacutecia com o antissoro a mesma foi lavada 4 vezes para retirada
dos anticorpos livres A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada Caso houvesse positividade na
soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem a etapa era repetida (figura 3) Das 50 amostras sensibilizadas a
uacuteltima lavagem foi positiva somente em 3 delas Nas 3 amostras o anticorpo utilizado para
sensibilizaccedilatildeo foi o anti-K Apoacutes repetido nova etapa de lavagem os resultados se
apresentaram negativos
Em todas as amostras sensibilizadas ldquoin vitrordquo o TDA foi testado e verificado a
intensidade do teste Entre as 50 amostras 47 alcanccedilaram TDA com intensidade 3-4+ apoacutes a
primeira sensibilizaccedilatildeo enquanto 3 amostras necessitaram uma segunda incubaccedilatildeo com
anticorpo (figura 4)
A escolha dos anticorpos para sensibilizar as hemaacutecias foi feita de acordo com o
fenoacutetipo do doador e foram utilizados sete diferentes especificidades de anticorpos policlonais
humanos conforme mostra o graacutefico1
29
Figura 3 - Soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada com hemaacutecia de triagem de
anticorpos em gel LissCoombs (BIO-RAD) A finalidade eacute verificar a presenccedila de anticorpos livres na
suspensatildeo que possam interferir na pesquisa do eluato As soluccedilotildees de lavagem das amostras na figura a tiveram
resultados negativos Na figura b duas amostras a 47 e 50 apresentaram resultado positivo Nova etapa de
lavagem foi realizada e o resultado final foi negativo
522 TRATAMENTO DAS HEMAacuteCIAS
Apoacutes a sensibilizaccedilatildeo e obtenccedilatildeo de resultados de TDA com intensidade de 3 a 4+
cada uma das amostras foi dividida em duas aliacutequotas e tratada separadamente pelas teacutecnicas
de glicinaaacutecida-EDTA e cloroquina
As teacutecnicas foram consideradas efetivas quando obteve-se a completa dissociaccedilatildeo do
anticorpo verificada atraveacutes do TDA negativo na amostra poacutes tratamento conforme figuras 5
e 6 Dentre as amostras tratadas com cloroquina 2850 tiveram o TDA negativado A glicina-
aacutecidaEDTA negativou o TDA em 33 das 50 amostras tratadas Apenas 17 amostras tratadas
com glicina-aacutecidaEDTA permaneceram com o TDA positivo e foram submetidas a um novo
tratamento
30
Figura 4 - TDA das amostras apoacutes sensibilizaccedilatildeo com anticorpos policlonais humanos Amostras na
figura a com intensidades de 3-4+ Na figura b amostras 4 e 7 com intensidade menor que 3+ e portanto foram
novamente sensibilizadas com nova aliacutequota de soro Anti-D e anti-S Apoacutes a segunda sensibilizaccedilatildeo
apresentaram reatividade 4 e 3+ respectivamente Os anticorpos utilizados para sensibilizaccedilatildeo foram D S c E
C e K
523 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS TEacuteCNICAS
No tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA houve dissociaccedilatildeo completa do anticorpo
em 33 amostras (66) das 50 amostras testadas enquanto que com a cloroquina foram 28
amostras (56) (tabela 1)
31
Graacutefico 1- Nuacutemero de amostras sesnsibilizadas por especificidade de anticorpo Entre as 50 amostras 12
foram sensibilizadas com anti-D 10 com anti-C 9 com anti-E 8 com anti-c 7 com anti-S 3 com anti-K e 1
com anti-Dia As especificidades dos anticorpos foram definidas de acordo o fenoacutetipo do doador
Figura 5 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com cloroquina Nas amostras onde houve
a dissociaccedilatildeo do anticorpo ( 2 21 a 23 26 39 a 42 45 46 e 49) a hemaacutecia se deposita no fundo no microtubo
apoacutes a centrifugaccedilatildeo (TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (1 3 24 25 43 44 47
48 e 50) o anticorpo ligado agraves hemaacutecias eacute alvo da AGH presente no gel (TDA positivo)
Anti-D 12
Anti-C 10
Anti-E 9
Anti-c 8
Anti-S 7
Anti-K 3 Anti-Dia 1
32
Figura 6 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA Nas amostras
onde houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo (4 6 7 12 a 15 17 34 35 37 e 38) a hemaacutecia se deposita no fundo no
microtubo apoacutes a centrifugaccedilatildeo ( TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (5 16 18
19 20 33 e 36 ) o AGH presente no gel se liga ao anticorpo ligado agraves hemaacutecias que ficam retidas no gel (TDA
positivo)
Tabela 1-Resultado geral do tratamento das hemaacutecias com glicina e cloroquina
Teacutecnica utilizada TDA negativo TDA positivo Total
Glicina-aacutecidaEDTA 33 17 50
Cloroquina 28 22 50
A glicina-aacutecidaEDTA conseguiu negativar mais amostras sensibilizadas com Anti-D
e anti-K que a cloroquina Para as hemaacutecias sensibilizadas com anti-E Anti-S e Anti-Dia
ambas as teacutecnicas dissociaram o anticorpo em 100 das amostras Os resultados detalhados
por especificidade do anticorpo apoacutes o primeiro tratamento com glicina-aacutecidaEDTA e com
cloroquina estatildeo na tabela 2
Para as amostras que permaneceram positivas (17 amostras) apoacutes o tratamento com a
glicina-aacutecidaEDTA foi realizado um novo tratamento Houve dissociaccedilatildeo do anticorpo em 3
amostras (18) apoacutes a segunda tentativa Nas demais 14 (82) amostras tratadas pela
segunda vez 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise
33
Tabela 2 - Resultados do TDA apoacutes tratamento das hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo
sensibilizado
ANTICORPOS
SENSIBILIZADOS
1ordm TRATAMENTO COM
GLICINA
TRATAMENTO COM
CLOROQUINA
TOTAL TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
Anti-D 8 4 0 12 12
Anti-C 6 4 10 0 10
Anti-E 9 0 9 0 9
Anti-c 0 8 1 7 8
Anti-S 7 0 7 0 7
Anti-K 2 1 0 3 3
Anti-Dia 1 0 1 0 1
TOTAL 33 17 28 22 50
A hemoacutelise foi verificada durante o procedimento de lavagem final das hemaacutecias com
soluccedilatildeo fisioloacutegica para a retirada dos reagentes As soluccedilotildees de lavagem ficaram
avermelhadas e as hemaacutecias com coloraccedilatildeo escura As amostras foram descartadas Dentre as
6 amostras que ainda puderam ser testadas para o TDA trecircs amostras negativaram sendo 1
sensibilizada com anti-D e 2 com anti-C (tabela 3)
Tabela 3 - Resultado apoacutes o segundo tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA
Tratamento com
glicina-aacutecidaEDTA
TDA Negativo TDA Positvo Hemoacutelise Total
Segundo tratamento 3 3 11 17
524 TESTAGEM DO ELUATO
Apoacutes o tratamento com a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA a soluccedilatildeo do eluato foi
testada para verificar a viabilidade dos anticorpos que foram dissociados ou eluiacutedos Dentre
as 50 amostras 41 apresentaram eluato positivo As nove amostras cujos eluatos foram
negativos haviam sido sensibilizadas com as seguintes especificidades de anticorpos anti-E 6
amostras (67) anti-S 2 amostras (40) e anti-D 1 amostra (8) (tabela 4) O eluato de
todas as amostras sensibilizadas com os anticorpos anti-C anti-c Anti-K e Anti-Dia foram
positivos Os eluatos positivos na triagem de anticorpos foram testados com paineacuteis de
identificaccedilatildeo para confirmar a especificidade e a viabilidade dos anticorpos (figuras 7 e 8)
34
525 EFEITO DA ELUICcedilAtildeO SOBRE OS ANTIacuteGENOS ERITROCITAacuteRIOS
Para verificar o efeito do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA e com a cloroquina
sobre a expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s foi realizada a fenotipagem das
amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes tratamento com ambas as teacutecnicas Foi avaliado
se o tratamento destruiu os antiacutegenos expressos antes do tratamento
Tabela 4- Resultado do Eluato das amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA
Anticorpos Eluato positvo Eluato negativo Total
Anti-D 11 1 12
Anti-C 10 0 10
Anti-E 3 6 9
Anti-c 8 0 8
Anti-S 5 2 7
Anti-K 3 0 3
Anti-Dia 1 0 1
Total 41 9 50
Figura 7 ndash Painel do eluato da amostra 21 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-C que foi
recuperado no eluato
Figura 8 ndash Painel do eluato da amostra 47 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-K que foi
recuperado no eluato
35
Dentre as 50 amostras 26 eram previamente fenotipadas para os antiacutegenos Fya Fy
b
Jka Jk
b S e s Dentre elas 20 alcanccedilaram TDA negativo apoacutes tratamento com a glicina-
aacutecidaEDTA e 20 negativaram apoacutes tratamento com cloroquina (tabela 5) Apoacutes ambas as
teacutecnicas os antiacutegenos originalmente expressos permaneceram positivos comprovando que natildeo
houve destruiccedilatildeo dos mesmos
Tabela 5 ndash Verificaccedilatildeo da interferecircncia do tratamento da hemaacutecias com cloroquina e glicina-
aacuteicdaEDTA sobre os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
AMOSTRAS
COM
FENOTIPAGEM
PREacuteVIA
TRATADAS COM
CLOROQUINA
TRATADAS COM
GLICINA
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
26
20
20
20
20
As amostras 24 47 e 50 eram positivas para o antiacutegeno K A cloroquina natildeo dissociou
o anticorpo em nenhuma das 3 amostras enquanto a glicina-aacutecidaEDTA foi efetiva nas
amostras 24 e 50 Foi testada a expressatildeo do antiacutegeno K nas amostras 24 e 50 apoacutes o
tratamento utilizando meacutetodo indireto em gel contendo AGH Apesar de natildeo ter sido avaliado
a intensidade de reaccedilatildeo de expressatildeo dos antiacutegenos podemos verificar na figura 9 que nas
duas amostras em que a teacutecnica foi efetiva e dissociou o anticorpo a expressatildeo do antiacutegeno K
continua presente mas a reatividade observada pode ser considerada 1+ sugerindo que houve
diminuiccedilatildeo da expressatildeo do antiacutegeno quando comparado com a expressatildeo observada em
hemaacutecia natildeo tratada
Os resultados individuais de cada amostra em ambas as teacutecnicas encontram-se
resumidas na tabela 6
526 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente onde foi constatada a presenccedila de autoanticorpo
a quente da classe IgG pelo TDA monoespeciacutefico (figura 10)O autoanticorpo tambeacutem
interferia na pesquisa e identificaccedilatildeo de anticorpos irregulares pois apresentava caracteriacutestica
de panaglutinina As hemaacutecias da paciente sensibilizadas ldquoin vivordquo foram tratadas com
cloroquina e com glicina-aacutecidaEDTA
36
Figura 9 ndash Fenotipagem das amostras 24 e 50 para antiacutegeno K apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
O teste positivo indica a presenccedila do antiacutegeno poreacutem a reatividade fraca (1+) sugere que houve enfraquecimento
de sua expressatildeo A direita a expressatildeo forte (4+) do antiacutegeno Kell em hemaacutecia controle natildeo tratada utilizada
como controle positivo
A cloroquina natildeo foi efetiva na retirada do anticorpo ligado as hemaacutecias ao contraacuterio
do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA que dissociou o anticorpo (figura 11)
A hemaacutecia tratada com glicina foi fenotipada para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
(figura 12) A fenotipagem para o sistema Rh (C c E e e) e Kell foi realizada em gel
especiacutefico monoclonal sem interferecircncia do TDA positivo (controle da reaccedilatildeo negativo)
O eluato resultante do tratamento com glicina-aacutecidaEDTA foi testada em gel com
hemaacutecias de painel de identificaccedilatildeo de anticorpos e apresentou resultado positivo com todas
as ceacutelulas (figura 13 e 14)
A amostra foi enviada para genotipagem e o resultado da genotipagem confirmou o
resultado da fenotipagem apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
527 TEMPO DE EXECUCcedilAtildeO DA TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
O tempo de reaccedilatildeo da glicina-aacutecidaEDTA eacute de 2 minutos Todas as amostras foram
tratadas obedecendo ao tempo descrito na literatura demonstrando que o mesmo eacute
reprodutiacutevel
37
Tabela 6- Resultados individuais por amostra
Amostra Especificidade
dos anticorpos
Intensidade do
TDA apoacutes
sensibilizaccedilatildeo
Tratamento
efetivo com
cloroquina
Tratamento
efetivo com
glicina
Eluato
poacutes
glicina
1 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 2 Dia 3+ Sim Sim 3+ 3 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 4 D 4+ Natildeo Sim 4+ 5 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 6 E 3+ Sim Sim Negativo 7 S 4+ Sim Sim 3+ 8 E 3+ Sim Sim 1+ 9 E 3+ Sim Sim 2+
10 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 11 D 4+ Natildeo Sim 4+ 12 D 4+ Natildeo Sim 4+ 13 S 3+ Sim Sim 3+ 14 S 3+ Sim Sim 3+ 15 D 3+ Natildeo Sim 3+ 16 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 17 E 3+ Sim Sim (+) 18 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 19 D 4+ Natildeo Natildeo 3+ 20 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 21 C 3+ Sim Sim 4+ 22 C 3+ Sim Sim 4+ 23 C 3+ Sim Sim 4+ 24 K 4+ Natildeo Sim 4+ 25 D 3+ Natildeo Natildeo Negativo 26 E 4+ Sim Sim Negativo 27 S 3+ Sim Sim 3+ 28 C 3+ Sim Natildeo 4+ 29 C 3+ Sim Sim 4+ 30 C 3+ Sim Sim 4+ 31 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 32 E 3+ Sim Sim Negativo 33 C 3+ Sim Natildeo 4+ 34 S 3+ Sim Sim Negativo 35 S 3+ Sim Sim Negativo 36 C 4+ Sim Natildeo 4+ 37 c 4+ Natildeo Natildeo 4+ 38 D 4+ Natildeo Sim 4+ 39 S 3+ Sim Sim 3+ 40 c 4+ Sim Natildeo 2+ 41 C 4+ Sim Natildeo 4+ 42 E 3+ Sim Sim Negativo 43 D 3+ Natildeo Sim 2+ 44 D 3+ Natildeo Sim 2+ 45 E 3+ Sim Sim Negativo 46 C 3+ Sim Sim 4+ 47 K 4+ Natildeo Natildeo 4+ 48 D 3+ Natildeo Sim 2+ 49 E 3+ Sim Sim Negativo 50 K 4+ Natildeo Sim 4+
TOTAL 50 28 33 41
38
Figura 10 ndash TDA monoespeciacutefico da amostra de paciente Hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo da classe
IgG
oacute Figura 11 ndash TDA apoacutes o tratamento com glicina-aacutecidaEDTA (esquerda) e cloroquina (direita) A glicina
negativou completamente o TDA enquanto a hemaacutecia tratada com cloroquina persistiu positiva (1+)
39
Figura 12 ndash Fenotipagem da amostra tratada com glicina-aacutecidaEDTA Fy(a+b+) Jk(a-b+) S+s+
Figura 13 ndash Painel em gel (LissAGH) do eluato apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de
intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
Figura 14 ndash ndash Painel ezimaacutetico (hemaacutecias tratadas com bromelina) do eluato em gel neutro apoacutes
tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
40
528 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Quanto a efetividade das teacutecnicas em negativar o TDA foi verificado que a glicina-
aacutecidaEDTA foi efetiva em 66 das amostras testadas no primeiro tratamento (3350
amostras) enquanto a cloroquina conseguiu negativar 56 (2850) Esses resultados natildeo
apresentam diferenccedila significativa (pgt005) demostrando que a teacutecnica da glicina-
aacutecidaEDTA natildeo eacute superior mas eacute tatildeo efetiva quanto a da cloroquina
Quando aliamos os resultados de ambas as teacutecnicas verificamos que em 76 (3850)
das amostras o TDA foi negativado Esse dado indica que ainda que uma teacutecnica natildeo seja
eficaz na remoccedilatildeo do anticorpo eacute uma boa alternativa tentar a segunda teacutecnica jaacute que a falha
em remover o anticorpo utilizando uma delas natildeo prevecirc necessariamente a falha com a outra
Quando se utiliza o teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla (graacutefico 2) para comparar a utilizaccedilatildeo das
duas teacutecnicas com o resultado de cada uma isolada (somente a cloroquina ou somente a
glicina) verificamos que os resultados apresentam diferenccedila significativa (plt005) (quadro 3)
TRATAMENTO EFETIVO COM TOTAL PORCENTAGEM
Glicina ou cloroquina 38 76
Glicina e cloroquina 23 46
Glicina apenas 10 20
Cloroquina apenas 5 10
Nenhuma das teacutecnicas 12 24
Quadro 3 - Resultados comparativos entre as teacutecnicas utilizadas
41
Graacutefico 2 - Teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla entre as teacutecnicas aplicadas A- Glicina e Cloroquina B-Cloroquina C-
Glicina ( plt005)
42
6 DISCUSSAtildeO
Os reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA podem ser adquiridos em
forma de kit comercial prontos para uso poreacutem natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil A preparaccedilatildeo
dos reagentes ldquoin houserdquo a partir de sais comerciais adquiridos se mostrou viaacutevel Os
reagentes glicina e o tampatildeo Tris armazenados de forma correta se mantiveram estaacuteveis por
um periacuteodo de 7 meses Somente o reagente EDTA precipitou mesmo armazenado em
condiccedilotildees adequadas sugerindo que o mesmo deve ser preparado em menor quantidade e
armazenado em aliacutequotas A soluccedilatildeo de cloroquina tambeacutem pode ser preparada ldquoin houserdquo e
pode ser armazenado por um mecircs A legislaccedilatildeo brasileira autoriza a utilizaccedilatildeo de reagentes
preparados a partir de sais comerciais como a cloroquina e a glicina-aacutecidaEDTA desde que
os sais tenham autorizaccedilatildeo da vigilacircncia sanitaacuteria para a comercializaccedilatildeo (BRASIL 2001)
A comparaccedilatildeo quanto a efetividade em dissociar anticorpos em amostras com TDA
positivos entre a teacutecnica da glicina e a teacutecnica da cloroquina mostrou que natildeo haacute diferenccedila
estatiacutestica entre elas e que ambas satildeo igualmente eficientes Se utilizadas conjuntamente haacute
maior possibilidade de elucidaccedilatildeo dos casos
Uma vantagem da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eacute que ela permite numa mesma
amostra eluir o anticorpo ligado aacute hemaacutecia assim como fenotipar a hemaacutecia tratada Devido a
sua dupla utilidade a teacutecnica eacute vantajosa principalmente em pacientes em que pouco volume
de amostra pode ser coletado como em casos de crianccedilas e receacutem-nascidos
A fenotipagem poacutes tratamento se mostrou viaacutevel jaacute que os antiacutegenos de maior
importacircncia natildeo sofreram alteraccedilotildees Nas 20 amostras que foram fenotipadas antes e apoacutes
tratamento para verificar a influecircncia dos reagentes na expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a
Jkb S e s natildeo houve destruiccedilatildeo dos mesmos por nenhuma das duas teacutecnicas
Para as amostras positivas para o antiacutegeno Kell (350) e sensibilizadas com o
respectivo anticorpo a teacutecnica da glicina foi efetiva em negativar o TDA em apenas duas
delas mas apoacutes o tratamento foi verificada uma fraca reatividade da reaccedilatildeo antiacutegeno-
anticorpo sugerindo que houve um enfraquecimento da expressatildeo do antiacutegeno conforme
esperado e descrito na literatura (BYRNE 1991 PALLAS WILER E MCGEE 1991
ROZIERS e SQUALI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012 e KATHARIA e
CHAUDHARY 2013) A accedilatildeo da glicina sobre o antigeno Kell natildeo representa impedimento
para seu uso uma vez que na impossibilidade de testar o antiacutegeno Kell o banco de sangue
consegue facilmente atender a solicitaccedilatildeo de transfusatildeo com unidades de hemaacutecias Kell
43
negativas jaacute que eacute um antiacutegeno de baixa prevalecircncia na populaccedilatildeo variando de 15 na
populaccedilatildeo africana a 9 nos europeus (DANIELS 2011)
A soluccedilatildeo resultante da dissociaccedilatildeo do anticorpo pela teacutecnica da glicina pode ainda ser
utilizada como eluato podendo substituir a teacutecnica de eluiccedilatildeo com reagentes comercias (kits
de eluiccedilatildeo aacutecida) que tem alto custo aproximadamente entre R$2000 a R$2500 por teste
Em 41 amostras (82) houve a dissociaccedilatildeo e recuperaccedilatildeo do anticorpo que estava
sensibilizando as hemaacutecias Em 9 amostras (18) os anticorpos foram eluiacutedos poreacutem
apresentaram reaccedilatildeo negativa quando testadas com hemaacutecias de triagem entre eles o anti-E
(6) anti-S (2) e Anti-D (1) Eacute possiacutevel que a correccedilatildeo pH do meio (WALKER 2011) natildeo
tenha sido adequada o que pode ter desfavorecido a reatividade do anticorpo
Para as amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA nas quais natildeo houve dissociaccedilatildeo do
anticorpo pelo primeiro tratamento (1750) o segundo tratamento natildeo se mostrou eficaz jaacute
que 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise O tempo de
armazenagem natildeo parece ter influenciado jaacute que todas as amostras foram testadas dentro de
48 horas apoacutes a coleta Outros fatores que natildeo foram verificados podem ter levado a
hemoacutelise Apesar da literatura (LOUIE JIENG e ZEROULIS 1986 e BYRNE 1991)
recomendar um segundo tratamento ele eacute pouco eficaz tendo negativado apenas 3 das 17
amostras testadas
A amostra de paciente que apresentou sensibilizaccedilatildeo ldquoin vivordquo mostrou melhor
efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA sobre a da cloroquina possibilitando
fenotipagem para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s que natildeo foram destruiacutedos apoacutes o
tratamento comprovado atraveacutes da genotipagem
A presenccedila de autoanticorpo a quente com presenccedila de hemoacutelise (AHAI) ou natildeo pode
mascarar a presenccedila de aloanticorpo interferindo na rotina soroloacutegica da fenotipagem que eacute
uma importante ferramenta para auxiliar na seleccedilatildeo de hemaacutecias para transfusatildeo (SHIREY et
al 2002) Esses pacientes frequentemente possuem aloanticorpos associados ao
autoanticorpo e a prevalecircncia de aloimunizaccedilatildeo entre eles varia entre 12 a 40 (LEGER e
GARRATY 1999 BRANCH e PETZ 1999) o que dificulta ainda mais a escolha do melhor
componente a ser transfundido aleacutem de aumentar a possibilidade reaccedilotildees hemoliacuteticas imunes
poacutes-transfusionais
Nesses casos as teacutecnicas de dissociaccedilatildeo de anticorpos satildeo importantes para tratar
amostras de pacientes e a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser usada como uma opccedilatildeo
pois se mostrou eficaz na dissociaccedilatildeo anticorpo ligado agraves hemaacutecias deixando livre a
superfiacutecie das mesmas permitindo a fenotipagem por antisoros IgG Paralelamente os
44
anticorpos eluiacutedos tambeacutem puderam ser estudados O mesmo natildeo ocorre com a cloroquina
que permite apenas a fenotipagem e tampouco com os kits de eluiccedilatildeo aacutecida disponiacuteveis no
mercado nacional que satildeo destinados a realizaccedilatildeo do eluato mas destroem as hemaacutecias
O tempo de tratamento na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA tambeacutem eacute uma vantagem
pois foi possiacutevel reproduzir no tempo determinado de 2 minutos enquanto a cloroquina
demora ateacute duas horas
Ainda que a aplicaccedilatildeo das teacutecnicas por biologia molecular estejam cada vez mais
presentes na rotina imuno-hematoloacutegica e possibilitam estabelecer o fenoacutetipo deduzido do
genoacutetipo elas natildeo estatildeo disponiacuteveis na maioria dos centros e sua realizaccedilatildeo exige algumas
horas A resoluccedilatildeo imediata do problema transfusional necessita dos resultados soroloacutegicos
pois com frequecircncia natildeo eacute possiacutevel aguardar o resultado do teste molecular Dessa forma
apesar da crescente importacircncia da genotipagem eritrocitaacuteria teacutecnicas soroloacutegicas aplicadas
corretamente e no momento propiacutecio satildeo de grande utilidade para resolver problemas imuno-
hematoloacutegicos como ocorre com a fenotipagem em pacientes com TDA positivo
45
7 CONCLUSAtildeO
A teacutecnica da glicina aacutecidaEDTA mostrou-se efetiva em remover os anticorpos que
sensibilizavam as hemaacutecias e pode ser utilizada com seguranccedila antes da fenotipagem
eritrocitaacuteria Por ser uma teacutecnica de raacutepida execuccedilatildeo eacute uma alternativa aplicaacutevel
principalmente em casos urgentes de pacientes que apresentam autoanticorpos
46
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50
9 ANEXOS
51
FUNDACcedilAtildeO HEMOCENTRO DE RIBEIRAtildeO PRETO
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE)
Tiacutetulo da pesquisa Aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina aacutecida-EDTA e avaliaccedilatildeo da
eficaacutecia no tratamento de hemaacutecias com teste direto da antiglobulina positivo
Pesquisadora responsaacutevel Ceacutelia Kazue Abiko
Orientador Prof Dimas Tadeu Covas
Co-orientadora Dra Flaacutevia Leite Souza Santos
Objetivo da pesquisa Vocecirc estaacute sendo convidado a participar de uma pesquisa que tem
como objetivo padronizar uma nova teacutecnica para auxiliar na tipagem sanguiacutenea de pacientes
A tipagem sanguiacutenea pode sofrer interferecircncia da presenccedila de anticorpos ligados aos gloacutebulos
vermelhos do sangue Nessas situaccedilotildees eacute difiacutecil selecionar o melhor sangue para o paciente e
eacute preciso a utilizaccedilatildeo de teacutecnicas adicionais para remover essas interferecircncias
Esta pesquisa tem como objetivo estudar outra teacutecnica para remover esses anticorpos e
comparaacute-la com a teacutecnica atualmente utilizada Para isso precisamos de amostras de pacientes
e doadores voluntaacuterios
Se vocecirc eacute um doador eacute necessaacuterio que vocecirc autorize a coleta de 5 ml (1 tubo) a mais
de seu sangue
Se vocecirc eacute um paciente natildeo haveraacute necessidade de nova amostra pois utilizaremos as
amostras jaacute coletadas para os testes preacute-transfusionais e os resultados encontrados nesta
pesquisa natildeo iratildeo interferir na escolha da (s) bolsa (s) de sangue que vocecirc possa vir a receber
Se vocecirc concordar em participar leia com atenccedilatildeo o texto abaixo e assine as duas vias
rubricando todas as paacuteginas deste termo de consentimento Uma via original assinada e
rubricada por vocecirc e pela pesquisadora ficaraacute com vocecirc
As suas informaccedilotildees seratildeo mantidas em sigilo pela pesquisadora e natildeo haveraacute
armazenamento de material para pesquisas posteriores Os seus dados seratildeo usados apenas
neste estudo e quando o trabalho for publicado seu nome e qualquer outra informaccedilatildeo que
possam identificaacute-lo natildeo seratildeo revelados
Eacute pouco provaacutevel que o que noacutes aprendermos com este estudo tenha um benefiacutecio
direto para vocecirc assim como natildeo poderemos dar nada em troca pela sua participaccedilatildeo na
pesquisa
Nosso objetivo com esta pesquisa eacute que os resultados poderatildeo ser uacuteteis para o
tratamento de pacientes no futuro Os riscos da participaccedilatildeo satildeo miacutenimos Se vocecirc eacute um
doador de sangue a amostra seraacute coletada no momento da doaccedilatildeo natildeo exigindo punccedilatildeo
venosa adicional
52
Eacute seu direito ter acesso aos resultados dos testes da pesquisa Esses resultados natildeo
seratildeo fornecidos automaticamente a vocecirc mas caso vocecirc se interesse em saber o resultado ou
tiver alguma duacutevida sobre a sua participaccedilatildeo neste estudo deveraacute entrar em contato com Ceacutelia
Kazue Abiko pelo telefone (18) 99718-3551
Vocecirc tem total liberdade de optar por natildeo participar da pesquisa Caso aceite
participar poderaacute desistir a qualquer momento ou retirar seu consentimento mesmo apoacutes ter
coletado o sangue Para cancelar sua participaccedilatildeo basta avisar a pesquisadora e os seus dados
seratildeo retirados do projeto
Qualquer duacutevida eacutetica sobre a pesquisa poderaacute entrar em contato com o Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa do Hospital das Cliacutenicas e da Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto
(CAMPUS UNIVERSITAacuteRIO bairro Monte Alegre CEP 14048-900 Ribeiratildeo Preto-SP
Telefone (16) 3602-2228 FAX (16) 3633-1144 e-mail cephcrpuspbr)
Consentimento de participaccedilatildeo
A Consentimento do participante
Li as informaccedilotildees acima sobre o estudo e recebi explicaccedilotildees sobre a participaccedilatildeo no estudo
Portanto dou o meu consentimento para participar do estudo
___________________________________________________________________________
Nome completo
___________________________________________________________________________
Assinatura
___________
Data
__________________________________________________________________________________
Nome completo da pesquisadora
___________________________________________________________________________
Assinatura
_____________
Data
Aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA e
avaliaccedilatildeo da eficaacutecia no tratamento de hemaacutecias
com teste direto da antiglobulina positivo
Dissertaccedilatildeo apresentada agrave Faculdade de Medicina de
Ribeiratildeo Preto da Universidade de Satildeo Paulo para
obtenccedilatildeo do tiacutetulo de Mestre em Ciecircncias
Aacuterea de concentraccedilatildeo Hemoterapia e Medicina
Transfusional
Orientador Prof Dr Dimas Tadeu Covas
RIBEIRAtildeO PRETO
2017
CEacuteLIA KAZUE ABIKO
Aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA e
avaliaccedilatildeo da eficaacutecia no tratamento de hemaacutecias
com teste direto da antiglobulina positivo
Dissertaccedilatildeo apresentada agrave Faculdade de Medicina de
Ribeiratildeo Preto da Universidade de Satildeo Paulo para
obtenccedilatildeo do tiacutetulo de Mestre em Ciecircncias
Aacuterea de concentraccedilatildeo Hemoterapia e Biotecnologia
Orientador Prof Dr Dimas Tadeu Covas
APROVADO ____________
BANCA EXAMINADORA
________________________________
Profordf Dra Fabiacuteola Traina
________________________________
Prof Dr Amauri Antiquera Leite
________________________________
Profordf Dra Ana Paula Costa Nunes da Cunha Cozac
DEDICATOacuteRIA
Dedico este trabalho aos meus filhos Pedro e Maria que sirva de incentivo para a busca do
conhecimento sucesso e realizaccedilatildeo profissional
Aos colegas de trabalho Ana Paula Cristiane Igor Mara Rita e Simone pelo
companheirismo e pela agradaacutevel convivecircncia no dia dia
A todos os colegas do Hemonuacutecleo de Araccedilatuba e aos profissionais da aacuterea da sauacutede que
amam a profissatildeo trabalham com eacutetica e que se dedicam buscando o bem estar dos
pacientes
AGRADECIMENTOS
A DEUS pelo dom da vida e a graccedila de colocar em minha vida pessoas especiais que me
ajudaram a chegar ateacute aqui
Aos meus pais que me ensinaram respeito honestidade perseveranccedila e pelo incentivo aos
estudos
A dra Flaacutevia Leite Souza Santos que me ajudou durante todo o trabalho e contribuiu de
forma valiosa com todas as suas orientaccedilotildees
Ao meu esposo Abidias que de forma especial e carinhosa me deu forccedila e coragem me
apoiando nos momentos de dificuldade
Ao dr Dimas Tadeu Covas pela oportunidade de poder realizar este trabalho e pela ajuda na
definiccedilatildeo do tema
A dra Eugenia Amorim Ubialli pelo apoio e pela prestreza em ajudar sempre que necessitei
Ao dr Wolney Gois Barreto diretor do Hemonuacutecleo de Araccedilatuba pelo incentivo para
realizaccedilatildeo do mestrado
A minha irmatilde Leda que apoiou e ajudou nas horas em que precisei e que natildeo foram poucas
A Raquel Botelho pela sua atenccedilatildeo e prontidatildeo para ajudar
Aos colegas do mestrado aos com os quais convivi durante todo o ano de 2014 e que
guardarei eternamente em minha memoacuteria
A Eacutemile que me ajudou com as amostras e as valiosas informaccedilotildees
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 1
11TESTES PREacute-TRANSFUSIONAIS 1
111 TIPAGEM ABORh 2
112 ANTICORPOS ANTI-ERITROCITAacuteRIOS 3
113 PESQUISA E IDENTIFICACcedilAtildeO DE ANTICORPOS IRREGULARES 4
114 PROVA DE COMPATIBILIDADE 5
115 FENOTIPAGEM PARA OUTROS SISTEMAS 6
12 METODOLOGIAS APLICADOS Agrave ROTINA IMUNO-HEMATOLOacuteGICA 7
121 MEacuteTODOS DE FASE FLUacuteIDA 8
122 COLUNAS DE GEL 9
123 BIOLOGIA MOLECULAR 9
13 TESTE DA ANTIGLOBULINA 10
131 TESTE DIRETO DA ANTIGLOBULINA 11
132 TESTE INDIRETO DA ANTIGLOBULINA 12
133 CONDICcedilOtildeES CLIacuteNICAS COM TDA POSITIVO 13
134 ANEMIA HEMOLIacuteTICA AUTOIMUNE 15
135 TRATAMENTO DE HEMAacuteCIAS COM TDA POSITIVO 16
1351 TEacuteCNICA DE BLOQUEIO 17
1352 TRATAMENTO DE HEMAacuteCIAS COM ZZAP 17
1353 CLOROQUINA 17
1353 GLICINA-AacuteCIDAEDTA 18
2 OBJETIVOS 20
21 OBJETIVO GERAL 20
22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 20
3 JUSTIFICATIVA 21
4 METODOL OGIA 22
41 AMOSTRAS DE DOADORES 22
411 FENOTIPAGEM 23
412 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS HEMAacuteCIAS 24
413 TRATAMENTO DAS AMOSTRAS 25
42 PREPARO DA GLICINA AacuteCIDA-EDTA 25
421 TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA 26
43 PREPARO DA CLOROQUINA 26
431 TEacuteCNICA DA CLOROQUINA 26
44 VERIFICACcedilAtildeO DA EFETIVIDADE DOS TESTES 27
45 TESTE DO ELUATO 27
46 AMOSTRA DE PACIENTE 27
5 RESULTADOS 28
51 REAGENTES 28
52 AMOSTRAS DE DOADORES 28
521 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS AMOSTRAS 28
522 TRATAMENTO DAS HEMAacuteCIAS 29
523 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS TEacuteCNICAS 30
524 TESTAGEM DO ELUATO 33
525 EFEITO DA ELUICcedilAtildeO SOBRE OS ANTIacuteGENOS ERITROCITAacuteRIOS 34
526 AMOSTRA DE PACIENTE 35
527 TEMPO DE EXECUCcedilAtildeO DA TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA 36
528 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 40
6 DISCUSSAtildeO 42
7 CONCLUSAtildeO 45
8 REFEREcircNCIA BIBLIOGRAacuteFICA 46
9 ANEXOS 50
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Princiacutepio da teacutecnica direta da antiglobulinapaacutegina11
Figura 2 - Princiacutepio da teacutecnica indireta da antiglobulinapaacutegina 13
Figura 3 ndash Teste da soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem apoacutes sensibilizaccedilatildeo das hemaacuteciaspaacutegina 29
Figura 4 - TDA das amostras apoacutes sensibilizaccedilatildeo com anticorpospaacutegina 30
Figura 5 - Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com
cloroquina paacutegina 31
Figura 6 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA
paacutegina 32
Figura 7 - Painel do eluato da amostra 21 apresentando especificidade anti-Cpaacutegina 34
Figura 8 - Painel do eluato da amostra 47 apresentando especificidade anti-
K paacutegina 34
Figura 9 - Fenotipagem das amostras 24 e 50 para antiacutegeno K apoacutes tratamento com glicina-
aacutecidaEDTApagina 36
Figura 10 ndash TDA monoespeciacutefico Amostra sensibilizadardquo in vivordquo com anticorpo anti-
IgGpaacutegina 38
Figura 11 ndash TDA apoacutes o tratamentopaacutegina 38
Figura 12 ndash Resultado da fenotipagem da amostra sensibilizada ldquoin vivordquo por anti-
IgGpaacutegina 39
Figura 13 ndash Painel do eluato poacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA paacutegina 39
Figura 14 ndash Painel do eluato poacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA paacutegina 39
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Resultado geral do tratamento das hemaacutecias com glicina e
cloroquinapaacutegina 32
Tabela 2 - Resultados do TDA apoacutes tratamento da hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo
sensibilizadopaacutegina 33
Tabela 3 - Resultado apoacutes o segundo tratamento das hemaacutecias com glicina-
aacutecidaEDTApaacutegina 33
Tabela 4 - Resultado do Eluato das amostras tratadas com glicina-
aacutecidaEDTA paacutegina 34
Tabela 5 ndash Verificaccedilatildeo da interferecircncia do tratamento da hemaacutecias com cloroquina e glicina-
aacutecidaEDTA nos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e spaacutegina 35
Tabela 6 - Resultado da sensibilizaccedilatildeo das amostras efetividade do tratamento com
cloroquina glicina e o eluato poacutes tratamento com glicinapaacutegina 37
LISTA DE GRAFICOS
Graacutefico 1 - Nuacutemero de amostras sensibilizadas por especificidade de
anticorpopaacutegina 31
Graacutefico 2 - Teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla entre as teacutecnicas
aplicadaspaacutegina 41
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 - Preparo dos Reagentes da glicina-aacutecidaEDTApaacutegina 25
Quadro 2 - Preparo da Cloroquinapaacutegina 26
Quadro 3 - Resultados comparativos entre as teacutecnicas utilizadas paacutegina 40
LISTA DE FLUXOGRAMAS
Fluxograma 1 - Fluxograma da pesquisa utilizando as amostras de
doadorespaacutegina 22
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ABO
AHAI
Bg
c
C
C
C3
C3b
C3d
D
DHFRN
DNA
DTT
E
e
EDTA
Fc
Fya
Fyb
HCl
IgA
IgD
IgE
IgM
Mm
NaCl
PA
PAI
PBS
PCR
PEG
pH
Rh
rpm
S
s
SIDA
SBS
TCLE
TDA
TIA
TRIS
ZZAP
microL
Sistema Sanguiacuteneo ABO
Anemia Hemoliacutetica Autoimune
Antiacutegeno Bg
Antiacutegeno c
Celsius
Antiacutegeno C
Complemento
Fraccedilatildeo do complemento
Fraccedilatildeo do complemento
Antiacutegeno D
Doenccedila Hemoliacutetica do Feto e do Receacutem-nascido
Aacutecido desoxirribonucleico
Dithiothreitol
Antiacutegeno E
Antiacutegeno e
Aacutecido Etileno Diamino Tetraceacutetico
Porccedilatildeo do anticorpo
Antiacutegeno Duffy a
Antiacutegeno Duffy b
Aacutecido cloriacutedrico
Imunoglobulina A
Imunoglobulina D
Imunoglobulina E
Imunoglobulina M
Miliacutemetros
Cloreto de soacutedio
Puro para anaacutelise
Pesquisa de anticorpos irregulares
Tampatildeo fosfato salino
Reaccedilao em cadeia de polimerase
Polietilenoglicol
Potencial hidrogeniocircnico
Sistema sanguiacuteneo Rh
Rotaccedilotildees por minuto
Antiacutegeno S
Antiacutegeno s
Siacutendrome da Imunodeficiecircncia adquirida
Sistema de banco de sangue
Termo de consentimento livre e esclarecido
Teste direto da antiglobulina
Teste indireto da antiglobulina
Hidrometil aminometano
Sulphydryl-Proteolytic Enzyme
Microlitros
RESUMO
Os testes preacute-transfusionais satildeo o conjunto de teacutecnicas imuno-hematoloacutegicas aplicadas nas
amostras do receptor e do doador com a finalidade de fornecer uma unidade de hemaacutecias
compatiacutevel e segura para a transfusatildeo Aleacutem da fenotipagem ABO e Rh obrigatoacuteria nos testes
preacute-transfusionais a determinaccedilatildeo do perfil antigecircnico de outros antiacutegenos eritrocitaacuterios de
importacircncia cliacutenica melhora a seguranccedila transfusional especialmente para pacientes
previamente aloimunizados ou candidatos agrave transfusatildeo crocircnica Para tais pacientes conhecer o
fenoacutetipo eritrocitaacuterio permite a seleccedilatildeo de concentrados de hemaacutecias com o mesmo fenoacutetipo
o que previne reaccedilotildees transfusionais hemoliacuteticas assim como nova aloimunizaccedilatildeo
Indiviacuteduos que apresentam as hemaacutecias sensibilizadas ldquoin vivordquo por anticorpos anti-
eritrocitaacuterios como ocorre na anemia hemoliacutetica autoimune (AHAI) teratildeo o teste direto da
antiglobulina (TDA) positivo dificultando a realizaccedilatildeo da fenotipagem O TDA positivo
provoca resultados falsos positivos especialmente quando satildeo utilizados para a fenotipagem
soros comerciais da classe IgG que exigem a fase de antiglobulina humana ou teste indireto
da antiglobulina (TIA) para leitura Em 1982 Edwards Moulds e Judd propuseram a
utilizaccedilatildeo da teacutecnica da cloroquina para dissociar os complexos de antiacutegeno-anticorpo
preservando a membrana eritrocitaacuteria e permitindo a fenotipagem Atualmente eacute a teacutecnica
mais utilizada nos centros brasileiros A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA foi primeiramente
descrita por Louie Jieng e Zeroulis em 1986 poreacutem eacute pouco utilizada por natildeo haver os
reagentes prontos comercialmente no mercado brasileiro O presente estudo avaliou a teacutecnica
da glicina-aacutecida-EDTA com reagentes preparados ldquoin houserdquo em paralelo agrave teacutecnica da
cloroquina que eacute atualmente a teacutecnica aplicada no Hemocentro de Ribeiratildeo Preto Para isso
amostras de hemaacutecias de doadores (n=50) com fenoacutetipo conhecido foram sensibilizadas com
anticorpos humanos de especificidade conhecida e ambas as teacutecnicas foram aplicadas Foi
verificado ainda o efeito da teacutecnica sobre a expressatildeo dos antiacutegenos eritrocitaacuterios (Fya Fy
b
Jka Jk
b S e s) atraveacutes da fenotipagem das amostras que tiveram o TDA negativado A
viabiliadade dos anticorpos presentes no eluato recuperado apoacutes tratamento com a glicina-
aacutecidaEDTA tambeacutem foi testada A glicina-aacutecidaEDTA foi efetiva em negativar o TDA em
33 amostras (66) comparaacutevel com a cloroquina que negativou 28 amostras (56) O eluato
apresentou-se viaacutevel no tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA e natildeo foi constatada destruiccedilatildeo
dos antiacutegenos eritrocitaacuterios apoacutes o tratamento Concluiacutemos que a teacutecnica da glicina-
aacutecidaEDTA pode ser utilizada como uma opccedilatildeo no tratamento de hemaacutecias com TDA
positivo com a vantagem de seu tempo de execuccedilatildeo ser inferior ao da cloroquina (2minutos x
30 a 120 minutos) o que lhe torna uacutetil em situaccedilotildees de maior urgecircncia Quando ambas as
teacutecnicas satildeo utilizadas em hemaacutecias diferentes de uma mesma amostra a efetividade estaacute
significativamente aumentada (plt005)
Palavras chave Glicina-aacutecidaEDTA Teste direto da antiglobulina AHAI fenotipagem
ABSTRACT
The pre-transfusion tests are the group of immunohematology techniques applied in the
receptor and donor samples in order to provide a unit of red blood cells compatible and safe
for transfusion In addition to the obligatory ABO and Rh phenotyping in the pre-transfusion
tests the determination of the antigenic profile of other red cells antigens of clinical
importance improves transfusion safety especially for patients previously alloimmunized or
candidates for chronic transfusion For such patients knowing the phenotype allows the
selection of red blood cell concentrates with the same phenotype which prevents hemolytic
transfusion reactions as well as new alloimmunization Individuals who have antibody-coated
red blood cells sensitized in vivo such as in autoimmune hemolytic anemia (AHAI) will
have a direct antiglobulin test (DAT) positive making it difficult to perform phenotyping
Positive DAT causes false positive results especially when commercially available IgG
serums which require the human antiglobulin phase or indirect antiglobulin test (IAT) for
reading are used for phenotyping In 1982 Edwards Molds and Judd proposed the use of the
chloroquine technique to dissociate antigen-antibody complexes by preserving the erythrocyte
membrane and allowing phenotyping It is currently the most used technique in Brazilian
centers The EDTAglycine-acid technique was first described by Louie Jieng and Zeroulis in
1986 but it is little used because commercially available reagents are not available in the
Brazilian market The present study evaluated the EDTAglycine-acid technique with reagents
prepared in house in parallel to the chloroquine technique which is currently the technique
applied at the Hemocentro de Ribeiratildeo Preto For this donor red cells samples (n = 50) with
known phenotype were sensitized with human antibodies of known specificity and both
techniques were applied The effect of the technique on the expression of erythrocyte antigens
(Fya Fy
b Jk
a Jk
b S and s) was also verified by the phenotyping of the samples that had
negative DAT The viability of the antibodies present in the recovered eluate after treatment
with EDTAglycine-acid A was also tested EDTAglycine-acid was effective in negatively
affecting DAT in 33 samples (66) comparable to chloroquine that negatived 28 samples
(56) The eluate was viable in treatment with EDTAglycine-acid and no destruction of
erythrocyte antigens after treatment We conclude that the EDTA glycine-acid technique can
be used as an option in the treatment of red cells with TDA positive with the advantage that
its execution time is inferior to that of chloroquine (2 minutes x 30 to 120 minutes) which
makes it useful in emergency situations When both techniques are used in different
erythrocytes of the same sample the effectiveness is significantly increased (p lt005)
Key words EDTAglycine-acid direct antiglobulin test AIHA phenotyping
1 INTRODUCcedilAtildeO
A transfusatildeo de hemaacutecias eacute um recurso terapecircutico muito importante e eficaz e tem se
mostrado como um grande aliado no tratamento de diversas patologias auxiliando na
melhoria da sobrevida e qualidade de vida de diversos pacientes quando indicada de forma
correta Eacute provavelmente a modalidade de terapia mais utilizada no mundo sendo
considerada a forma mais antiga de terapia celular A transfusatildeo de hemaacutecias em pacientes
com anemia grave ou sangramento agudo reestabelece o niacutevel de hemoglobina moleacutecula
responsaacutevel pelo transporte de oxigecircnio para os tecidos melhorando a isquemia tecidual
(BARJAS-CASTRO 2013 ZAGO 2014)
A transfusatildeo de componentes celulares como o concentrado de hemaacutecias deve ser
bem avaliada quanto aos riscos e benefiacutecios Os testes preacute-transfusionais satildeo parte obrigatoacuteria
do processo transfusional e tecircm como funccedilatildeo assegurar que o melhor hemocomponente seja
selecionado para o paciente reduzindo assim a chance de transfusotildees incompatiacuteveis e reaccedilotildees
transfusionais (BARJAS-CASTRO 2013)
11TESTES PREacute-TRANSFUSIONAIS
Os testes preacute-transfusionais tecircm a finalidade de evitar a ocorrecircncia de reaccedilotildees
hemoliacuteticas no receptor decorrentes da transfusatildeo de hemaacutecias incompatiacuteveis do doador
(DOWNES e SHULMAN 2011) Tem como propoacutesito selecionar hemaacutecias que apoacutes
transfusatildeo deveratildeo ter sobrevida normal ou mais proacutexima do normal (MELO 2007)
Os testes preacute-transfusionais que consistem no conjunto de teacutecnicas
imunohematoloacutegicas aplicadas agraves amostras do receptor e doador devem ser realizados antes
de toda transfusatildeo A aplicaccedilatildeo desses testes tem como finalidade fornecer uma unidade de
hemaacutecias compatiacutevel e elevar a seguranccedila da transfusatildeo Os testes preacute-transfusionais aliados
a utilizaccedilatildeo de novas tecnologias tem historicamente evitado reaccedilotildees transfusionais
hemoliacuteticas garantindo a seguranccedila transfusional em cerca de 95 dos pacientes que recebem
transfusatildeo Eacute imprescindiacutevel poreacutem a execuccedilatildeo correta das teacutecnicas envolvidas nos testes preacute-
transfusionais e ainda garantir a identificaccedilatildeo correta do receptor e das amostras de sangue e
das unidades de hemaacutecias (CASTILHO 2000 MELO 2007 BARJAS-CASTRO 2013)
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Todos os testes que compotildeem a rotina preacute-transfusional usam meacutetodos soroloacutegicos
que envolvem a reaccedilatildeo antiacutegeno x anticorpo Ao testar a presenccedila de um antiacutegeno na
superfiacutecie da hemaacutecia eacute necessaacuterio dispor de um soro com especificidade conhecida para
aquele antiacutegeno Por outro lado testar a presenccedila de um determinado anticorpo no soro ou no
plasma exige o uso de hemaacutecias com perfil antigecircnico conhecido Os testes preacute-transfusionais
incluem tipagem ABO (direta e reversa) tipagem Rh pesquisa de anticorpos irregulares no
sangue do receptor retipagem ABO e Rh do hemocomponente e prova de compatibilidade
entre as hemaacutecias do doador e soro ou plasma do receptor em caso de transfusatildeo de hemaacutecias
ou hemocomponentes que contenham mais de 2 mL de volume eritrocitaacuterio como o
concentrado de granuloacutecitos (BRASIL 2016 GANZELLA 2014 SANTOS 2014)
Aleacutem dos testes regularmente realizados a determinaccedilatildeo do fenoacutetipo para outros
antiacutegenos eritrocitaacuterios do doador e do receptor pode ser indicada A fenotipagem eritrocitaacuteria
determina o perfil antigecircnico para outros antiacutegenos de importacircncia cliacutenica aleacutem do sistema
ABO e do antiacutegeno RhD Ela pode auxiliar a confirmaccedilatildeo de uma especificidade de anticorpo
encontrada no soro do paciente uma vez que espera-se que a sua hemaacutecia natildeo expresse o
antiacutegeno correspondente e simultaneamente eacute utilizada para selecionar um concentrado de
hemaacutecias negativo para o respectivo antiacutegeno evitando reaccedilotildees hemoliacuteticas transfusionais A
fenotipagem de candidatos a transfusotildees crocircnicas tambeacutem eacute recomendada pois esse grupo de
pacientes deve se beneficiar com a transfusatildeo profilaacutetica de unidades de hemaacutecias com
mesmo fenoacutetipo evitando assim a aloimunizaccedilatildeo assim como reaccedilotildees hemoliacuteticas provocadas
por anticorpos previamente existentes e em baixo tiacutetulo natildeo identificados pela triagem de
anticorpos (CASTILHO JUNIOR e REID 2015 DOWNES e SHULMAN 2011)
111 TIPAGEM ABORh
O sistema ABO (ISBT001) foi o primeiro sistema de grupo sanguiacuteneo a ser
descoberto Ele foi descrito em 1900 por Karl Landsteiner e eacute considerado o sistema de maior
importacircncia na praacutetica transfusional Ele eacute composto por quatro antiacutegenos A1 (ABO1) B
(ABO2) AB (ABO3) e A1 (ABO4) e eacute caracterizado pela presenccedila dos anticorpos naturais
ou seja anticorpos que surgem sem a exposiccedilatildeo preacutevia aos antiacutegenos atraveacutes de transfusatildeo ou
gestaccedilatildeo Os anticorpos ABO satildeo predominantemente da classe IgM satildeo capazes de fixar o
complemento e de provocar hemoacutelise grave intravascular caso ocorra transfusatildeo ABO
incompatiacutevel Por apresentar essa caracteriacutestica peculiar a tipagem do sistema ABO eacute
composta de duas etapas a prova direta e a prova reversa Na prova direta eacute realizada a
pesquisa dos antiacutegenos na superfiacutecie das hemaacutecias que satildeo testadas com soros comerciais
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Anti-A e Anti-B A prova reversa por sua vez pesquisa a presenccedila de anticorpos ABO ao
testar o soro ou plasma do pacientedoador com hemaacutecias A1 e B Ambas as provas satildeo
obrigatoacuterias e devem ser concordantes para interpretaccedilatildeo do fenoacutetipo ABO (COOLING
2011 SANTOS 2014)
O sistema Rh (ISBT004) eacute o maior e mais complexo sistema de grupos sanguiacuteneos
compreendendo atualmente 54 antiacutegenos (ISBT 2016) Satildeo cinco os principais antiacutegenos do
sistema Rh D (RH1) C (RH2) E (RH3) c (RH4) e e (RH5) Esses antiacutegenos possuem alta
capacidade imunogecircnica e seus respectivos anticorpos estatildeo envolvidos na doenccedila hemoliacutetica
perinatal e em reaccedilotildees transfusionais hemoliacuteticas Os autoanticorpos quentes como ocorre na
anemia hemoliacutetica quente satildeo representados em grande parte por anticorpos contra antiacutegenos
puacuteblicos do sistema Rh (CASTILHO 2007 CHOU e WESTHOFF 2011 BARJAS-
CASTRO 2013) A tipagem RhD pesquisa o antiacutegeno D na membrana eritrocitaacuteria ao testar a
hemaacutecia com antissoros comerciais Atualmente a maior parte dos soros Anti-D
comercializados satildeo monoclonais
112 ANTICORPOS ANTI-ERITROCITAacuteRIOS
Anticorpos satildeo proteiacutenas presentes no plasma tambeacutem denominadas imunoglobulinas
Satildeo produzidas pelo sistema imune em resposta a um determinado antiacutegeno Podem ser
classificadas de acordo com suas caracteriacutesticas e propriedades em cinco classes de
imunoglobulinas IgG IgM IgA IgE e IgD (BARJAS-CASTRO 2013)
A ligaccedilatildeo entre o antiacutegeno e o anticorpo envolvem ligaccedilotildees natildeo covalentes que satildeo
reversiacuteveis Vaacuterios tipos de interaccedilotildees natildeo covalentes podem contribuir para a ligaccedilatildeo do
antiacutegeno pelo anticorpo incluindo forccedilas eletrostaacuteticas pontes de hidrogecircnio forccedilas de Van
der Walls e interaccedilotildees hidrofoacutebicas (ABBAS LICHTMAN e PILLAI 2008)
As interaccedilotildees antiacutegeno-anticorpo satildeo constituiacutedas por ligaccedilotildees dinacircmicas que sofrem
interferecircncia de alteraccedilotildees fiacutesico-quiacutemicas no meio como mudanccedilas na temperatura na forccedila
eletrostaacutetica na concentraccedilatildeo do antiacutegeno e do anticorpo e no pH O melhor pH para a reaccedilatildeo
eacute em torno de 70 no entanto raros anticorpos podem exigir acidificaccedilatildeo do meio para serem
identificados (SANTOS 2014)
Em imunohematologia satildeo pesquisados os anticorpos que reconhecem os antiacutegenos
eritrocitaacuterios de grupo sanguiacuteneo ldquoin vivordquo esses anticorpos dependendo de seu significado
cliacutenico satildeo capazes de reconhecer seus respectivos antiacutegenos sobre a hemaacutecia podendo levar
a sua destruiccedilatildeo por dois mecanismos fagocitose por macroacutefagos no sistema
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reticuloendotelial ou por ativaccedilatildeo do sistema complemento com a formaccedilatildeo do complexo de
ataque a membrana e hemoacutelise intravascular As duas classes de anticorpos de maior
importacircncia em imunohematologia satildeo as imunoglobulinas IgG e a IgM (SANTOS 2014)
Devido a sua estrutura pentameacuterica os anticorpos da classe IgM se ligam aos
antiacutegenos localizados na superfiacutecie da membrana de hemaacutecias proacuteximas e promovem
aglutinaccedilatildeo das mesmas em meio salino ldquoin vitrordquo Anticorpos da classe IgG por sua vez
satildeo denominados ldquonatildeo aglutinantesrdquo ou ldquoincompletosrdquo pois sua estrutura de monocircmero eacute
pequena o que desfavorece a aglutinaccedilatildeo direta uma vez que uma mesma moleacutecula de IgG
natildeo alcanccedila antiacutegenos alvos em duas hemaacutecias proacuteximas Os anticorpos IgM aleacutem de terem
um tamanho maior apresentam 750 vezes maior eficiecircncia de aglutinaccedilatildeo que os anticorpos
IgG permitindo maior facilidade nas ligaccedilotildees entre as hemaacutecias (CARRUCIO e WISE 2012
GREEN e KLOSTERMANN 2012)
Nos testes ldquoin vitrordquo satildeo simulados reaccedilotildees que poderiam ocorrer ldquoin vivordquo causando
reaccedilotildees indesejaacuteveis A fase de sensibilizaccedilatildeo em que o anticorpo se liga ao antiacutegeno
correspondente natildeo eacute identificada macroscopicamente poreacutem uma vez que o anticorpo
aproxima as hemaacutecias e vence a forccedila eletrostaacutetica que naturalmente as repele chamada de
potencial zeta ocorre a aglutinaccedilatildeo Dependendo das caracteriacutesticas do anticorpo e de sua
capacidade de fixar complemento pode ocorrer tambeacutem a hemoacutelise (SANTOS 2014)
113 PESQUISA E IDENTIFICACcedilAtildeO DE ANTICORPOS IRREGULARES
A pesquisa de anticorpos irregulares eacute teste obrigatoacuterio nos testes preacute-transfusionais e
tem a finalidade de detectar anticorpos ldquoin vitrordquo que possam causar reaccedilatildeo ldquoin vivordquo
Dependendo da populaccedilatildeo estudada (pacientes x doadores) e ainda da sensibilidade do
teste a frequecircncia de anticorpos irregulares pode variar de 03 a 38 A imunizaccedilatildeo pode
ocorrer por transfusatildeo gestaccedilatildeo transplante ou injeccedilatildeo de material imunogecircnico (WALKER
2011)
Os anticorpos irregulares podem ser classificados como aloanticorpos que satildeo
voltados contra antiacutegenos ausentes na hemaacutecia autoacuteloga ou como autoanticorpos os quais
reconhecem antiacutegenos eritrocitaacuterios proacuteprios Os autoanticorpos antieritrocitaacuterios surgem em
decorrecircncia da desregulaccedilatildeo da autotoleracircncia imune relacionada agrave condiccedilotildees diversas como
doenccedilas hematoloacutegicas doenccedilas inflamatoacuterias autoimunes neoplasias infecccedilotildees e uso de
medicaccedilotildees A presenccedila do autoanticorpo associado a um quadro de anemia hemoliacutetica
caracteriza a anemia hemoliacutetica autoimune (AHAI) seja ela primaacuteria ou secundaacuteria agrave outra
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patologia Ateacute 12 a 40 dos pacientes com autoanticorpos quentes podem apresentar
aloanticorpos de significado cliacutenico mascarados pelos autoanticorpos (SHIREY et al 2002)
Eacute importante detectar a presenccedila de anticorpos no plasmasoro de um receptor de
transfusatildeo para garantir que seja transfundido sangue compatiacutevel Quando a pesquisa de
anticorpo irregular resultar positiva para um ou mais anticorpos de relevacircncia clinica eacute
necessaacuterio confirmar a ausecircncia do respectivo antiacutegeno na hemaacutecia do receptor assim como
selecionar para transfusatildeo concentrados de hemaacutecias tambeacutem negativos para aqueles
antiacutegenos evitando assim reaccedilotildees transfusionais (WALKER 2011)
A detecccedilatildeo de um anticorpo irregular eacute inicialmente realizada pela triagem de
anticorpos na qual o soroplasma do receptor eacute testado com 2 a 3 hemaacutecias do tipo ldquoOrdquo O
conjunto de fenoacutetipos dessas hemaacutecias deve contemplar os antiacutegenos de maior importacircncia
cliacutenica Como os anticorpos irregulares de maior interesse cliacutenico satildeo na maior parte das
vezes imunes portanto da classe IgG eacute obrigatoacuteria a fase de antiglobulina (AGH) do teste
ou teste indireto da antiglobulina (TIA) uma vez que esses anticorpos satildeo incompletos
(CASTILHO JUNIOR e REID 2015) O teste de triagem estando positivo deve-se fazer a
identificaccedilatildeo da especificidade do anticorpo utilizando um painel com maior nuacutemero de
hemaacutecias fenotipadas
114 PROVA DE COMPATIBILIDADE
A prova de compatibilidade eacute um teste obrigatoacuterio em caso de transfusatildeo de
componentes eritrocitaacuterios Tambeacutem chamada de prova de compatibilidade maior deve ser
realizada antes da administraccedilatildeo de sangue total ou concentrado de hemaacutecias utilizando-se
hemaacutecias obtidas do tubo coletor da bolsa a ser transfundida e o soro ou plasma do receptor
(BRASIL 2016)
Eacute definido como o procedimento para excluir a incompatibilidade entre o doador e o
receptor Tem o objetivo de detectar anticorpos que podem natildeo ter sido encontrados na
pesquisa de anticorpos devido a ausecircncia ou pouca expressatildeo de antiacutegenos no painel de
hemaacutecias aleacutem da possibilidade de terem ocorrido erros teacutecnicos ou notacionais durante a
realizaccedilatildeo da pesquisa (MELO 2007)
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115 FENOTIPAGEM PARA OUTROS SISTEMAS
Aleacutem da pesquisa de ABORh que eacute realizado rotineiramente a fenotipagem para
outros sistemas tambeacutem denominado ldquofenotipagem estendidardquo determina a presenccedila ou
ausecircncia de antiacutegenos considerados de importacircncia cliacutenica A fenotipagem natildeo eacute obrigatoacuteria
nos testes preacute-transfusionais poreacutem a legislaccedilatildeo atual recomenda a realizaccedilatildeo da fenotipagem
eritrocitaacuteria dos antiacutegenos C (RH2) E (RH3) c (RH4) e (RH5) K (KELL1) Fya (FY1) Fy
b
(FY2) Jka
(JK1) Jkb (JK2) S (MNS3) e s (MNS4) para pacientes aloimunizados e pacientes
com indicaccedilatildeo de transfusatildeo crocircnica (BRASIL 2016)
A seleccedilatildeo de concentrados de hemaacutecias com o mesmo fenoacutetipo do receptor para
transfusatildeo pode evitar reaccedilotildees transfusionais hemoliacuteticas no paciente previamente
aloimunizado tambeacutem previne a sensibilizaccedilatildeo por outros antiacutegenos o que normalmente
torna as transfusotildees seguintes ainda mais complicadas A fenotipagem do paciente tambeacutem
auxilia na identificaccedilatildeo dos anticorpos pois espera-se que nas hemaacutecias do paciente o
antiacutegeno seja negativo para o anticorpo encontrado servindo de guia para teste de exclusatildeo de
anticorpos (SANTOS 2014 WALKER 2011)
A incidecircncia de aloanticorpos aumenta com o nuacutemero de transfusotildees no entanto a
implantaccedilatildeo de rotina de fenotipagem com transfusatildeo profilaacutetica de hemaacutecias com fenoacutetipo
compatiacutevel para pacientes candidatos agrave politransfusatildeo como os portadores de doenccedila
falciforme talassemia anemia aplaacutestica doenccedilas linfo e mieloproliferativas renais crocircnicos e
anemias refrataacuterias pode contribuir para o baixo iacutendice de sensibilizaccedilatildeo nessas populaccedilotildees
(FLUIT KUNST e DRENTHE-SCHONK 1999 MARTINS et al 2008 e VICHINSKY et
al 2001) Outro grupo de pacientes que se beneficia com a transfusatildeo de mesmo fenoacutetipo satildeo
os pacientes com AHAI uma vez que o autoanticorpo pode mascarar a presenccedila de um
aloanticorpo de significado cliacutenico em ateacute 40 dos casos Mesmo com as teacutecnicas utilizadas
ldquoin vitrordquo para remover a interferecircncia do autoanticorpo no soro um aloanticorpo pode natildeo
ser identificado e dessa forma transfundir o mesmo fenoacutetipo do paciente evitaria reaccedilatildeo
hemoliacutetica pelos anticorpos voltados contra antiacutegenos de maior importacircncia cliacutenica e de
frequecircncia intermediaacuteria Aleacutem disso os pacientes com AHAI satildeo fortes respondedores e a
transfusatildeo profilaacutetica do mesmo fenoacutetipo previne a aloimunizaccedilatildeo (SHIREY et al 2002)
Aleacutem de fenotipar o receptor eacute importante tambeacutem que os bancos de sangue tenham
rotinas de fenotipagem de doadores para atender as necessidade dos pacientes aloimunizados
ou em esquema de transfusatildeo crocircnica (PINTO BRAGA e SANTOS 2011)
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Rotineiramente eacute inviaacutevel estabelecer o fenoacutetipo eritrocitaacuterio completo de um
indiviacuteduo pela grande diversidade de sistemas sanguiacuteneos descritos Ate junho de 2015 jaacute
haviam sido classificados 308 antiacutegenos atribuiacutedos a 36 sistemas definidos pela Sociedade
Internacional de Transfusatildeo de Sangue (ISBT) (CASTILHO JUNIOR e REID 2015)
Portanto o paciente eacute normalmente fenotipado para os antiacutegenos de maior importacircncia
clinica
Alguns fatores podem limitar a realizaccedilatildeo da fenotipagem eritrocitaacuteria Um dos fatores
eacute a transfusatildeo alogecircnica realizada haacute menos de 90 dias Neste caso podem ocorrer resultados
falso positivos para determinados antiacutegenos devido agrave presenccedila de hemaacutecias do doador
(LAINE et al 2000)
Outro fator eacute a presenccedila de anticorpo sensibilizando a hemaacutecia do paciente e
provocando positividade do teste direto da antiglobulina humana (TDA) Os soros
normalmente utilizados para fenotipagem especialmente para os antiacutegenos Fya
(FY1) Fyb
(FY2) Jka
(JK1) Jkb
(JK2) S (MNS3) e s (MNS4) necessitam da fase de antiglobulina
humana (AGH) para que ocorra aglutinacatildeo Amostras que apresentam o TDA positivo
aglutinam apoacutes reaccedilatildeo com a AGH natildeo pela real presenccedila do antiacutegeno em sua superfiacutecie mas
pela interaccedilatildeo da AGH com o anticorpo que estaacute sensibilizando o eritroacutecito A interferecircncia
do TDA positivo pode ser anulada atraveacutes de algumas teacutecnicas capazes de dissociar o
anticorpo como por exemplo o tratamento da hemaacutecia sensibilizada com cloroquina ou com
glicina-aacutecida-EDTA (BRANCH e PETZ 1999 SHIREY et al 2002 e LEGER 2011)
12 METODOLOGIAS APLICADOS Agrave ROTINA IMUNO-HEMATOLOacuteGICA
Todos os testes que compotildeem a rotina preacute-transfusional usam meacutetodos soroloacutegicos
que envolvem a reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo e tem como objetivo determinar o perfil antigecircnico
eritrocitaacuterio do receptor e do doador assim como identificar em seu soro a presenccedila de
anticorpos contra antiacutegenos eritrocitaacuterios que possam comprometer a sobrevida das hemaacutecias
transfundidas Para testar o antiacutegeno na superfiacutecie da hemaacutecia eacute necessaacuterio dispor de um
antissoro com especificidade conhecida para aquele antiacutegeno Por outro lado para testar a
presenccedila de um determinado anticorpo no soro ou plasma do receptor eacute necessaacuterio o uso de
hemaacutecias com perfil antigecircnico conhecido (SANTOS 2014)
Diversas metodologias satildeo aplicadas nos laboratoacuterios de imunohematologia Cada
serviccedilo de hemoterapia faz a escolha do meacutetodo que seraacute aplicado de acordo com o perfil do
laboratoacuterio com o volume de exames diaacuterios e tambeacutem com o custo envolvido Todas essas
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teacutecnicas tecircm como objetivo comum demonstrar a reaccedilatildeo entre antiacutegeno e anticorpo no
entanto elas se baseiam em diferentes princiacutepios Muitas metodologias satildeo atualmente
aplicadas agrave imunohematologia entre elas o sistema de fase soacutelida a tecnologia de hemaacutecias
magnetizadas a biologia molecular e ateacute mesmo a citometria de fluxo no entanto os meacutetodos
mais tradicionais satildeo aqueles baseados no princiacutepio de hemaglutinaccedilatildeo
121 MEacuteTODOS DE FASE FLUacuteIDA
Os meacutetodos de fase fluiacuteda satildeo testes baseados na hemaglutinaccedilatildeo e incluem o teste em
tubo e o teste em microplacas Uma suspensatildeo de hemaacutecias eacute adicionada ao plasma ou soro
em seguida eacute realizada a centrifugaccedilatildeo e por fim eacute feita a leitura do resultado que eacute
considerado positivo se for observado algum grau de aglutinaccedilatildeo ou hemoacutelise A intensidade
de aglutinaccedilatildeo eacute graduada de acordo com o tamanho dos agregados desprendidos da
superfiacutecie apoacutes agitaccedilatildeo delicada do tubo ou microplaca Os meacutetodos de hemaglutinaccedilatildeo satildeo
aplicados a todos os testes preacute-transfusionais Como os anticorpos ABO satildeo aglutininas frias
a tipagem eacute realizada em temperatura ambiente (22degC) no entanto ao investigar a presenccedila
de anticorpos irregulares que como jaacute mencionado eacute na maioria das vezes anticorpos
incompletos da classe IgG eacute essencial que a reaccedilatildeo seja incubada a 37degC As reaccedilotildees satildeo
facilitadas com a utilizaccedilatildeo de potencializadores e da antiglobulina humana (WALKER e
HARMENING 2012 AABB 2011)
Nos meacutetodos de fase fluiacuteda nos quais a AGH eacute empregada a fase de lavagem eacute
fundamental Apoacutes a incubaccedilatildeo do soro com as hemaacutecias deve ser realizada a lavagem da
reaccedilatildeo para remover o excesso de anticorpos natildeo ligados agraves hemaacutecias jaacute que os anticorpos
livres podem bloquear a AGH quando ela eacute adicionada e levar a resultados falso negativos
(AABB 2011)
Os testes de hemaglutinaccedilatildeo satildeo os mais tradicionais entre os meacutetodos ainda hoje
aplicados agrave rotina de bancos de sangue A vantagem desses meacutetodos eacute o baixo custo quando
comparado agraves teacutecnicas mais modernas mas apresentam tambeacutem desvantagens A teacutecnica em
tubo por exemplo natildeo permite automaccedilatildeo eacute trabalhosa e exige matildeo-de-obra bastante treinada
na execuccedilatildeo das diversas etapas do teste e mesmo assim pode haver subjetividade na
interpretaccedilatildeo dos resultados aleacutem de resultados falso-negativos (DOWNES 2011 ZANTEK
et al 2012)
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122 COLUNAS DE GEL
A teacutecnica em gel iniciada na deacutecada de 90 representou uma grande revoluccedilatildeo na
rotina laboratorial tornando-se muito popular Aleacutem de ser sensiacutevel a teacutecnica dispensa a fase
de lavagem antes da adiccedilatildeo da AGH assim como a agitaccedilatildeo do teste para leitura reduzindo o
nuacutemero de resultados falsos negativos decorrentes dessas duas etapas e o tempo para
execuccedilatildeo dos testes (LAPIERRE et al 1989 NOVARETTI et al 2000 NOVARETTI et
al 2004) Os reagentes satildeo comercializados na forma de cartotildees plaacutesticos contendo
microtubos preenchidos por gel composto por microesferas de acrilamida-dextran Nesta
metodologia tambeacutem baseada na hemaglutinaccedilatildeo a suspensatildeo de hemaacutecias e o soro satildeo
depositados em uma cacircmara acima da coluna de gel e em seguida procede-se com a
centrifugaccedilatildeo dos cartotildees As microesferas atuam como uma malha que permite a passagem
em direccedilatildeo ao fundo do microtubo apenas das hemaacutecias natildeo aglutinadas enquanto as
hemaacutecias aglutinadas ficam retidas na parte superior da coluna ou ao longo dela (GREEN e
KLOSTERMANN 2012) Portanto quanto maior a agregaccedilatildeo mais hemaacutecias ficam retidas
no topo da coluna Dependendo do tipo de teste a ser realizado pode ser utilizado gel neutro
ou gel especiacutefico impregnado pelo anticorpo desejado e o gel contendo antiglobulina humana
que satildeo utilizados para os testes diretos e indiretos da antiglobulina (LAPIERRE et al 1989)
A coluna de gel ainda permite a visualizaccedilatildeo clara de duas populaccedilotildees distintas de hemaacutecias
como em pacientes receacutem transfundidos
123 BIOLOGIA MOLECULAR
A biologia molecular ou genotipagem estaacute sendo cada vez mais aplicada aos grupos
sanguiacuteneos pois fornece resultados seguros e precisos especialmente nos casos em que natildeo eacute
possiacutevel a realizaccedilatildeo da fenotipagem como em pacientes receacutem-transfundidos e pacientes
com TDA positivo Na genotipagem eacute possiacutevel determinar atraveacutes do DNA do paciente
extraiacutedo de seus leucoacutecitos de sangue perifeacuterico o fenoacutetipo eritrocitaacuterio deduzido sem
qualquer interferecircncia do anticorpo que sensibiliza a hemaacutecia ou de hemaacutecias alogecircnicas
transfundidas Sua realizaccedilatildeo no entanto exige o treinamento de equipe especializada e capaz
de interpretar os resultados em conjunto com os achados soroloacutegicos (JUNIOR e OLIVATO
2007)
Apesar de ser uma ferramenta de grande importacircncia hoje na imuno-hematologia
ainda estaacute restrito aos grandes centros de hemoterapia no Brasil poucos serviccedilos puacuteblicos de
sauacutede dispotildeem desse recurso e utilizam teacutecnicas de genotipagem de grupos sanguiacuteneos para
atendimento a seus pacientes Esta abordagem poreacutem vem sendo introduzida em algumas
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instituiccedilotildees de reconhecida competecircncia na hemoterapia mas sua disponibilizaccedilatildeo deve
tornar-se mais generalizada atraveacutes da formaccedilatildeo de centros de referecircncia para atendimento
das diversas unidades de hemoterapia (MARTINS et al 2009) Dessa forma muitas decisotildees
transfusionais especialmente em urgecircncias ainda devem ser tomadas sem o resultado da
genotipagem eritrocitaacuteria
13 TESTE DA ANTIGLOBULINA
Coombs Mourant e Race descreveram em 1945 uma teacutecnica com utilizando soro de
coelho contendo antiglobulina humana (AGH) que posteriormente foi chamada de ldquosoro de
Coombsrdquo O meacutetodo foi desenvolvido inicialmente para ampliar o efeito de aglutininas fracas
do sistema Rh anticorpos ldquoincompletosrdquo que normalmente natildeo apresentavam aglutinaccedilatildeo
visiacutevel O teste foi concebido como um instrumento de investigaccedilatildeo de doenccedila hemoliacutetica do
receacutem-nascido e de reaccedilotildees transfusionais causadas por anticorpos Rh que estavam presentes
no soro dos paciente poreacutem que natildeo eram demonstraacuteveis pelas teacutecnicas ateacute entatildeo existentes
A maior parte dos anticorpos de significado cliacutenico assim como seus respectivos
antiacutegenos foram descritos apoacutes o surgimento do ldquosoro de Coombsrdquo em 1945 sendo assim o
teste da antiglobulina representa ateacute hoje a forma mais importante de aglutinaccedilatildeo artificial em
imunohematologia permitindo revelar a presenccedila de anticorpos na membrana da hemaacutecia A
antiglobulina humana eacute constituiacuteda por anticorpo especiacutefico contra a porccedilatildeo Fc de outro
anticorpo Quando um anticorpo ldquoincompletordquo sensibiliza a hemaacutecia normalmente natildeo
provoca aglutinaccedilatildeo visiacutevel Apoacutes a adiccedilatildeo da AGH ao meio esta reconhece e se liga agraves
porccedilotildees Fc dos anticorpos que sensibilizam a hemaacutecia formando assim uma malha e
provocando aglutinaccedilatildeo visiacutevel (BARJAS-CASTRO 2013)
Os reagentes de antiglobulina podem ser poliespeciacuteficos ou monoespeciacuteficos Os
poliespeciacuteficos satildeo uma mistura de anticorpos ant-IgG e anti-C3d (fraccedilatildeo C3d do
complemento) Os reagentes monoespecificos podem ser anti-IgG anti-IgM anti-IgA anti-
complemento podendo ser anti-C3d e anti-C3b
O teste da antiglobulina pode ser usado para detectar hemaacutecias sensibilizadas com
aloanticorpos IgG autoanticorpos IgG e componentes do complemento A sensibilizaccedilatildeo
pode ocorrer ldquoin vivordquo ou ldquoin vitrordquo O uso do AGH para detectar a sensibilizaccedilatildeo ldquoin vitrordquo
tem dois estaacutegios e eacute denominado teste indireto da antiglobulina A sensibilizaccedilatildeo ldquoin vivordquo eacute
detectada em procedimento de um uacutenico estagio chamado teste direto da antiglobulina (TDA)
11
Os testes direto e indireto satildeo ateacute hoje amplamente aplicados como princiacutepio de inuacutemeros
testes soroloacutegicos em imuno-hematologia (GREEN e KLOSTERMANN 2012)
131 TESTE DIRETO DA ANTIGLOBULINA
O teste direto da antiglobulina humana revela a presenccedila de anticorpo eou fraccedilatildeo do
complemento ligados agrave superfiacutecie das hemaacutecias As sensibilizaccedilatildeo das hemaacutecias ocorrida ldquoin
vivordquo natildeo eacute visualizada mas apoacutes a adiccedilatildeo da antiglobulina humana ocorre a aglutinaccedilatildeo que
eacute visualizada macroscopicamente (Figura 1)
Figura 1 - Princiacutepio da teacutecnica direta da antiglobulina Teste utilizado para demonstrar a sensibilizaccedilatildeo ldquoin
vivordquo das hemaacutecias O sangue total eacute coletado do paciente em tubo contendo anticoagulante EDTA Na teacutecnica
realizada em tubo uma suspensatildeo de hemaacutecias 5 em soluccedilatildeo de salina eacute preparada Uma gota dessa suspensatildeo
eacute lavada 3 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica para retirada de anticorpos que estatildeo livres no plasma Toda soluccedilatildeo eacute
retirada e adiciona-se o soro de Coombs (antiglobulina humana) O soro de Coombs reconhece os anticorpos que
estatildeo ligados agrave superfiacutecie das hemaacutecias fazendo com que ocorra aglutinaccedilatildeo visiacutevel macroscopicamente
Apesar de natildeo ser um teste preacute-transfusional obrigatoacuterio o TDA eacute um dos testes mais
importantes para investigar e classificar quadros hemoliacuteticos como de origem imune ou natildeo
imune O seu valor preditivo positivo em vigecircncia de anemia hemoliacutetica eacute de 83 poreacutem natildeo
havendo sinais de hemoacutelise seu valor preditivo eacute apenas 14 Eacute por esse motivo que a
interpretaccedilatildeo do TDA positivo deve levar em consideraccedilatildeo a histoacuteria cliacutenica e os resultados
dos outros exames laboratoriais A realizaccedilatildeo do TDA eacute obrigatoacuteria na investigaccedilatildeo
12
laboratorial de diversos quadros hemoliacuteticos entre eles a anemia hemoliacutetica autoimune
(AHAI) a reaccedilatildeo hemoliacutetica imune poacutes-transfusional a siacutendrome do linfoacutecito passageiro a
doenccedila hemoliacutetica perinatal e a hemoacutelise droga-dependente (LEGER 2011)
Resultados de TDA positivos foram tambeacutem observados em indiviacuteduos com niacuteveis
seacutericos elevados de IgG ou complemento sem evidecircncia de anemia hemoliacutetica imune como
em pacientes com doenccedila falciforme talassemia doenccedila renal crocircnica mieloma muacuteltiplo
doenccedilas autoimunes e siacutendrome da imunodeficiecircncia adquirida (SIDA) Aleacutem disso pequenas
quantidades de IgG (5 a 90 moleacuteculas por hemaacutecia) e complemento (5 a 40 moleacuteculas por
hemaacutecia) podem estar presentes nas hemaacutecias de indiviacuteduos saudaacuteveis sem associaccedilatildeo com
reduccedilatildeo na sobrevida das mesmas A positividade do TDA depende da populaccedilatildeo estudada e
pode variar de 01 entre doadores de sangue sem qualquer sinal cliacutenico de hemoacutelise ateacute
15 em pacientes hospitalizados (CASTILHO JUNIOR e REID 2015 LEGER 2011)
Indiviacuteduos que apresentam TDA positivo seja agraves custas de IgG eou complemento
com ou sem sinais cliacutenicos de hemoacutelise teratildeo a fenotipagem eritrocitaacuteria prejudicada A
fenotipagem de indiviacuteduos com TDA positivo especialmente quando utilizado o teste indireto
da antiglobulina pode acarretar resultados falsos positivos e levar a seleccedilatildeo de fenoacutetipo
incorreto para transfusatildeo
132 TESTE INDIRETO DA ANTIGLOBULINA
O teste indireto da antiglobulina (TIA) eacute utilizado para revelar a sensibilizaccedilatildeo ldquoin
vitrordquo das hemaacutecias e eacute aplicado a diversos testes soroloacutegicos em imunohematologia entre
eles a pesquisa de anticorpos identificaccedilatildeo de anticorpos testes de compatibilidade
fenotipagem eritrocitaacuteria e titulaccedilatildeo de anticorpos Na teacutecnica indireta a hemaacutecia que contecircm
o antiacutegeno eacute colocada em contato ldquoin vitrordquo com o anticorpo que se liga mas natildeo promove a
aglutinaccedilatildeo visiacutevel A adiccedilatildeo da AGH forma uma malha entre os anticorpos que sensibilizam
as hemaacutecias e provoca a aglutinaccedilatildeo macroscoacutepica (figura 2)
Caso a amostra de hemaacutecia estudada seja previamente sensibilizada resultados falsos
positivos podem ser obtidos no TIA jaacute que a AGH reagiraacute com a moleacutecula que sensibilizava
anteriormente a hemaacutecia mesmo se o anticorpo especiacutefico natildeo tiver se ligado ao antiacutegeno
correspondente
13
133 CONDICcedilOtildeES CLIacuteNICAS COM TDA POSITIVO
O TDA positivo deve ser interpretado cuidadosamente sempre em conjunto com o
quadro cliacutenico do paciente A positividade isolada do TDA natildeo significa hemoacutelise A
interpretaccedilatildeo do teste positivo requer o conhecimento do diagnoacutestico do paciente da presenccedila
de sinais e sintomas sugestivos de hemoacutelise assim como de seu histoacuterico transfusional
gestacional e de informaccedilotildees sobre o uso recente de medicaccedilotildees (LEGER 2011)
Figura 2 ndash Princiacutepio do teste indireto da antiglobulina O TIA pode ser utilizado na pesquisa de anticorpos de
especificidades desconhecidas livres no soroplasma como eacute o caso da pesquisa e identificaccedilatildeo de anticorpos
irregulares Ele eacute tambeacutem utilizado para determinar a presenccedila de antiacutegenos na membrana da hemaacutecia quando
satildeo empregados soros de especificidades conhecidas da classe IgG No primeiro caso o soroplasma contendo o
anticorpo desconhecido eacute colocado em contato com hemaacutecias cujo perfil antigecircnico eacute conhecido No segundo
caso utiliza-se soro de especificidade conhecida da classe IgG para determinar a presenccedila ou ausecircncia de um
antiacutegeno na membrana O anticorpo encontra o antiacutegeno correspondente e ocorre a ligaccedilatildeo do anticorpo agrave
hemaacutecia mas natildeo ocorre aglutinaccedilatildeo Apoacutes a adiccedilatildeo da AGH que se liga aos anticorpos formando uma malha
ocorre a aglutinaccedilatildeo visiacutevel
O TDA positivo eacute uma achado claacutessico de algumas condiccedilotildees cliacutenicas como a reaccedilatildeo
transfusional hemoliacutetica a doenccedila hemoliacutetica do feto e do receacutem-nascido (DHFRN) a anemia
hemoliacutetica induzida por drogas a siacutendrome do linfoacutecito passageiro e a anemia hemoliacutetica
autoimune (AHAI) Portanto o TDA positivo pode ser decorrente da sensibilizaccedilatildeo da
hemaacutecia autoacuteloga por um autoanticorpo ou por um aloanticorpo ligado agrave hemaacutecia alogecircnica
circulante A positividade do TDA pode ainda ocorrer de forma passiva em pacientes que
14
recebem imunoglobulinas humanas ou ainda pela transfusatildeo de plaquetas ABO natildeo idecircntico
(LEGER 2011 RALPH 2012 ZANTEK et al 2012)
Nas reaccedilotildees transfusionais hemoliacuteticas imunes o aloanticorpo do receptor sensibiliza
as hemaacutecias transfundidas do doador e reduz sua sobrevida ao removecirc-la precocemente da
circulaccedilatildeo pela fagocitose no sistema retiacuteculo-endotelial ou pela hemoacutelise intravascular As
reaccedilotildees podem ser agudas se ocorrem ateacute 24 horas ou tardias quando ocorrem apoacutes 24 horas
da transfusatildeo A gravidade das reaccedilotildees hemoliacuteticas pode variar de um simples rendimento
transfusional inadequado agrave quadros graves de hemoacutelise intravascular evoluindo ateacute mesmo
com choque vascular e oacutebito O TDA pode resultar negativo caso toda massa eritrocitaacuteria
transfundida tenha sido destruiacuteda (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
Na doenccedila hemoliacutetica do feto e do receacutem-nascido (DHFRN) anticorpos maternos da
classe IgG atravessam a barreira placentaacuteria e sensibilizam as hemaacutecias fetais que seratildeo
destruiacutedas precocemente levando agrave anemia fetal Apesar da incompatibilidade ABO feto-
materna ser a causa mais frequente de DHFRN raramente ela eacute responsaacutevel pela ocorrecircncia
de quadros graves Por outro lado anticorpos contra antiacutegenos do sistema Rh e Kell
especialmente Anti-D (Anti-RH1) Anti-c (Anti-RH4) e Anti-Kell (Anti-KELL1) satildeo
conhecidos por causar DHFRN severa Raramente outros anticorpos tambeacutem podem estar
implicados na DHFRN como os anticorpos contra antiacutegenos do sistema Kidd Duffy MNS e
Diego (ZANTEK et al 2012)
A hemoacutelise droga-dependente eacute causada pela produccedilatildeo de um anticorpo voltado contra
a droga ligada agrave membrana eritrocitaacuteria ou ainda contra o complexo droga-membrana A
classe de medicaccedilotildees mais comumente envolvida eacute a dos antimicrobianos betalactacircmicos
(penicilinas e cefalosporinas) mas outras classes como quimioteraacutepicos e anti-inflamatoacuterios
tambeacutem satildeo descritos (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
Apoacutes transplante de ceacutelulas progenitoras hematopoieacuteticas em que o doador possui
anticorpos contra antiacutegenos eritrocitaacuterios do receptor o linfoacutecito de memoacuteria do doador pode
resistir ao esquema imunossupressor utilizado e continuar a produccedilatildeo de anticorpos que
reconhecem a hemaacutecia incompatiacutevel do receptor ainda circulante O quadro cliacutenico pode
variar de um simples TDA positivo sem outros sinais ou sintomas ateacute um quadro hemoliacutetico
grave e abrupto (LEGER 2011)
15
134 ANEMIA HEMOLIacuteTICA AUTOIMUNE
A anemia hemoliacutetica autoimune eacute caracterizada pela destruiccedilatildeo precoce das hemaacutecias
autoacutelogas por autoanticorpos que sensibilizam as hemaacutecias e levam agrave fagocitose pelos
macroacutefagos no sistema reticulo-endotelial ou hemoacutelise intravascular O diagnoacutestico da AHAI
baseia-se na presenccedila de hemoacutelise cliacutenica associada agrave evidecircncia de fator imune representado
pelo TDA positivo As classes de anticorpos envolvidas em quadros de AHAI satildeo IgG IgM e
raramente IgA (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012) Satildeo raros os casos de AHAI com TDA
negativo que podem estar relacionados a um autoanticorpo de baixa avidez de densidade
inferior agrave detecccedilatildeo do meacutetodo ou ainda de classe de imunoglobulina natildeo avaliada pelo
meacutetodo utilizado para o teste (GARRATY 2005)
A AHAI pode ser classificada em dois grupos principais de acordo com a melhor
temperatura de reaccedilatildeo do autoanticorpo As anemias hemoliacuteticas causadas por anticorpos
quentes que reagem melhor a 37oC e geralmente IgG representam 80 dos casos de AHAI
Nas AHAI por anticorpo quente o TDA pode ser positivo para IgG mais complemento (67)
somente IgG (20) ou somente por complemento (13) As anemias causadas por
anticorpos frios geralmente da classe IgM e que reagem melhor em temperatura ambiente ou
a 4oC representam aproximadamente 20 dos casos de AHAI Por exibirem amplitude
teacutermica esses anticorpos ligam-se agraves hemaacutecias ao atingirem a circulaccedilatildeo nas extremidades do
corpo fixam o complemento e desprendem-se da hemaacutecia apoacutes retornar para partes mais
quentes Por esse motivo em AHAI por anticorpos frios o TDA eacute positivo apenas agraves custas
de C3 e normalmente o IgM natildeo eacute detectado (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
A presenccedila do autoanticorpo IgG pode ser confirmada atraveacutes da eluiccedilatildeo do anticorpo
da hemaacutecia Tipicamente o eluato na AHAI por anticorpo quente reage com todas as ceacutelulas
testadas de um painel de hemaacutecias alogecircnicas do tipo ldquoOrdquo ou pode eventualmente exibir uma
especificidade conhecida como Anti-e (Anti-RH5) Nas AHAI a frio por sua vez espera-se
um eluato negativo (LEGER 2011)
Os autoanticorpos satildeo com frequecircncia encontrados livres no plasma e natildeo somente
ligados agraves hemaacutecias autoacutelogas Eles podem interferir em todas as fases dos testes preacute-
transfusionais nas quais o plasma eacute testado especialmente os autoanticorpos quentes que
acarretam resultados positivos em todos os testes levados agrave fase de antiglobulina humana
Esses anticorpos portanto positivam a pesquisa de anticorpos irregulares e mascaram a
presenccedila de aloanticorpos de significado cliacutenico Aproximadamente 60 dos pacientes que
apresentam AHAI a quente apresentam anticorpos que reagem em meio salino mas se forem
16
levados em conta meacutetodos mais sensiacuteveis como PEG enzima e estudo em gel a positividade
pode ser superior a 90 (LEGER 2011)
Aleacutem da eficaacutecia da transfusatildeo ser comprometida pela diminuiccedilatildeo da vida-meacutedia das
hemaacutecias a presenccedila do autoanticorpo dificulta a realizaccedilatildeo dos testes preacute-transfusionais e
compromete a seguranccedila transfusional Os autoanticorpos reagem normalmente como
panaglutininas pois satildeo normalmente voltados contra antiacutegenos puacuteblicos na maior parte das
vezes contra antiacutegenos do sistema Rh Por apresentarem essas caracteriacutesticas podem ainda
mascarar a presenccedila de aloanticorpos de significado clinico e levar a testes de compatibilidade
positivos exigindo uma avaliaccedilatildeo criteriosa da necessidade da transfusatildeo (BRANCH e PETZ
1999 JUNIOR e OLIVATO 2004)
Remover a interferecircncia do autoanticorpo para avaliar a presenccedila de aloanticorpos
mascarados nem sempre eacute possiacutevel mesmo utilizando teacutecnicas de autoadsorccedilatildeo ou
aloadsorccedilatildeo que aleacutem de tudo satildeo demoradas e exigem de 2 a 6 horas para conclusatildeo
(GARRATY e GEORGE 2002) Nesses casos a fenotipagem eritrocitaacuteria do paciente eacute de
extrema utilidade especialmente em situaccedilotildees de urgecircncia A definiccedilatildeo do fenoacutetipo do
paciente para os antiacutegenos de maior importacircncia cliacutenica pode auxiliar a seleccedilatildeo de unidades
de hemaacutecias com mesmo fenoacutetipo o que garante que eventuais aloanticorpos natildeo
identificados sejam respeitados e tambeacutem evita nova sensibilizaccedilatildeo (JUNIOR e OLIVATO
2004 SHIREY et al 2002)
135 TRATAMENTO DE HEMAacuteCIAS COM TDA POSITIVO
O TDA positivo impede a fenotipagem eritrocitaacutecia por meacutetodos que exigem a fase de
AGH uma vez que a aglutinaccedilatildeo ocorreraacute devido agrave interaccedilatildeo da AGH com o autoanticorpo
que sensibiliza a hemaacutecia do paciente levando a resultados falso positivos Em algumas
situaccedilotildees como na AHAI por anticorpo quente a fenotipagem eacute especialmente importante
pois o autoanticorpo interfere na triagem e identificaccedilatildeo de anticorpos assim como no teste de
compatibilidade e dificultam a detecccedilatildeo de aloanticorpos de significado cliacutenico que
obrigatoriamente devem ser respeitados Nessas situaccedilotildees a fenotipagem eritrocitaacuteria
determina o perfil antigecircnico do paciente e possibilita o fornecimento de unidades de
hemaacutecias com o mesmo fenoacutetipo para a transfusatildeo evitando a sensibilizaccedilatildeo para novos
antiacutegenos assim como reaccedilotildees hemoliacuteticas transfusionais No entanto eacute necessaacuterio aplicar
meacutetodos que natildeo sofram interferecircncia do TDA positivo ou seja meacutetodos que natildeo necessitem
da fase de AGH ou meacutetodos de bloqueio do anticorpo sem bloquear o antiacutegeno Uma opccedilatildeo eacute
a utilizaccedilatildeo de soros monoclonais IgM (salinos ou de meio proteico natildeo concentrado) mas
17
nem sempre esses reagentes estatildeo disponiacuteveis especialmente os reagentes monoclonais para
os antiacutegenos dos sistemas Duffy ( Fya Fy
b) Kidd ( Jk
a Jk
b) e MNS (S s) (JUNIOR e
OLIVATO 2004) Outra opccedilatildeo eacute a teacutecnica de bloqueio que pode ser utilizada para tratar
hemaacutecias para posterior fenotipagem em casos de TDA positivos com reatividade le2+
Em casos onde a positividade do TDA eacute maior que 2+ estaacute indicada a tratamento
quiacutemico para remoccedilatildeo da interferecircncia do autoanticorpo antes de realizar a fenotipagem Entre
as teacutecnicas utilizadas atualmente estatildeo o ZZAP a cloroquina e a glicina aacutecidaEDTA
1351 TEacuteCNICA DE BLOQUEIO
A teacutecnica de bloqueio se baseia na utilizaccedilatildeo de anti-IgG (Coombs monoespeciacutefico)
para tratar as hemaacutecias com TDA positivo O anticorpo anti-IgG se liga aos anticorpos que
estatildeo sensibilizando a hemaacutecias poreacutem sem o bloquear os antiacutegenos Os antiacutegenos que natildeo
estatildeo sensibilizados podem ser detectados atraveacutes dos antissoros especiacuteficos (SERERAT
VEIDT E DUTCHED 2000)
1352 TRATAMENTO DE HEMAacuteCIAS COM ZZAP
O Sulphydryl-Proteolytic Enzyme (ZZAP) que eacute uma mistura de ditiotreitol (DTT)
mais papaiacutena ativada com cisteiacutena eacute um reagente capaz de dissociar imunoglobulinas da
classe IgG ligadas a membrana dos eritroacutecitos enquanto trata enzimaticamente as hemaacutecias
O tratamento enzimaacutetico tambeacutem potencializa a ligaccedilatildeo do autoanticorpo ao antiacutegeno e
acelera o processo de autoadsorccedilatildeo O ZZAP pode desnaturar os antiacutegenos do sistema Duffy
MNS e Kell o que limita sua aplicaccedilatildeo para fins de fenotipagem (BRANCH e PETZ 1982)
1353 CLOROQUINA
Em 1982 Edwards Moulds e Judd propuseram a utilizaccedilatildeo da teacutecnica da cloroquina
que dissociava os complexos antiacutegeno-anticorpo e mantinha a membrana das hemaacutecias
iacutentegras Os derivados quinolecircicos jaacute haviam sido descritos anteriormente por Domokos e
Aszody em 1964 e Holtz Mantel e Buck em 1973 (apud Edwards Moulds e Judd 1982) pela
sua capacidade de separar imunocomplexos e inibir as reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo reduzindo
as cargas eleacutetricas das superfiacutecie das hemaacutecias A teacutecnica eacute uma das mais utilizadas nos
centros brasileiros para remover a interferecircncia do autoanticorpo e eacute tambeacutem a teacutecnica
atualmente adotada pelo laboratoacuterio de imunohematologia do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto
18
Edwards Moulds e Judd (1982) demonstraram que a teacutecnica da cloroquina para
dissociaccedilatildeo de anticorpos eacute uma teacutecnica simples efetiva e confiaacutevel para dissociar
imunoglobulina das hemaacutecias Desde que a membrana das hemaacutecias permaneccedila intacta natildeo
haacute perda da reatividade dos antiacutegenos e a sua maior aplicaccedilatildeo eacute a fenotipagem de hemaacutecias
com TDA positivo Os autores verificaram que em 83 das amostras sensibilizadas in vivo e
22 amostras (no total de 40) sensibilizadas ldquoin vitrordquo apresentaram TDA negativo e
puderam ser fenotipadas A teacutecnica poreacutem natildeo consegue remover os componentes do
complemento na maioria dos casos
Champagne e colaboradores (1999) testaram a teacutecnica da cloroquina para dissociar
antiacutegenos Bg comparando com a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA e verificaram vantagem em
relaccedilatildeo ao uso de um uacutenico reagente diminuindo a manipulaccedilatildeo e verificou que o mesmo natildeo
destroacutei antiacutegeno Kell
A cloroquina tambeacutem mostrou-se pouco efetivo em remover anticorpos do sistema
Duffy da superfiacutecie das hemaacutecias (EDWARDS MOUDS e JUDD 1982 ROZIERS e
SQUALI 1997)
1353 GLICINA-AacuteCIDAEDTA
A afinidade e a estabilidade entre a ligaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo eacute definida como a
resultante entre forccedilas atrativas e repulsivas entre ambos (CARUCIO e WISE 2012) e resulta
da somatoacuteria de forccedilas quiacutemicas dinacircmicas e fracas (natildeo covalentes) como pontes de
hidrogecircnio forcas eletrostaacuteticas forca de Van der Waals e pontes hidrofoacutebicas A estabilidade
dessa ligaccedilatildeo eacute facilmente abalada por alteraccedilotildees quiacutemicas e fiacutesicas no meio da reaccedilatildeo como
a alteraccedilatildeo do pH A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA se baseia na mudanccedila do pH para a
quebra da ligaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo (KOSANKE 2012)
A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA foi primeiramente descrita em 1986 por Louie Jieng
e Zeroulis que utilizaram 50 amostras de doadores sensibilizados ldquoin vitrordquo com anticorpos A
teacutecnica foi efetiva em 48 amostras permitindo o estudo do eluato assim como a fenotipagem
das hemaacutecias Os autores testaram tambeacutem a teacutecnica em 100 hemaacutecias TDA positivo que
puderam ser utilizadas para teacutecnicas de autoadsorccedilatildeo
Byrne (1991) descreveu a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA modificada e tambeacutem
verificou como uma opccedilatildeo para o tratamento de hemaacutecias com TDA positivo que deixava as
hemaacutecias intactas e o eluato viaacutevel para ser fenotipado
19
Roziers e Squali (1997) e Katharia e Chaudhary (2013) compararam a teacutecnica da
glicina-aacutecidaEDTA com as teacutecnicas da cloroquina e do aquecimento Verificaram maior
eficiecircncia da glicina-aacutecidaEDTA em relaccedilatildeo as outras duas teacutecnicas pois com uma mesma
quantidade de amostra produzia as hemaacutecias livres de anticorpo e tambeacutem o eluato Mostrou-
se ainda superior devido ao menor tempo exigido para sua realizaccedilatildeo o que favorece seu uso
em situaccedilotildees de urgecircncia e emergecircncia
As duas desvantagens da teacutecnica poreacutem eacute o fato de destruir os antiacutegenos do sistema
Kell e o fato de natildeo remover fraccedilotildees do complemento ligadas agrave hemaacutecia (PALLAS WILER e
McGEE 1991 ROZIERS e SQUALLI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012
e KATHARIA e CHAUNDHARY 2013)
20
2 OBJETIVOS
21 OBJETIVO GERAL
211 Avaliar a eficaacutecia da glicina-aacutecidaEDTA em remover os anticorpos ligados agraves
hemaacutecias sensibilizadas por anticorpos da classe IgG
22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
221 Preparaccedilatildeo dos reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
verificaccedilatildeo da estabilidade dos mesmos e avaliar custos
222 Testar a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA em amostras de hemaacutecias
sensibilizadas por anticorpos antieritrocitaacuterios humanos
223 Comparar a efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA com a teacutecnica da
cloroquina quanto a capacidade de remover a interferecircncia do anticorpo ligado
a hemaacutecia
224 Testar o eluato das amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA
225 Verificar se houve destruiccedilatildeo dos antiacutegenos eritrocitaacuterios apoacutes o tratamento
com glicina-aacutecidaEDTA e com cloroquina
226 Verificar se o tempo de execuccedilatildeo da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA descrito
nos textos de referecircncia eacute reprodutiacutevel
21
3 JUSTIFICATIVA
Algumas condiccedilotildees cliacutenicas podem levar ao depoacutesito ldquoin vivordquo de anticorpos eou
fraccedilotildees do complemento sobre as hemaacutecias Entre elas estatildeo as reaccedilotildees hemoliacuteticas poacutes-
transfusionais a doenccedila hemoliacutetica perinatal o uso de medicamentos e principalmente a
AHAI Na AHAI um anticorpo normalmente da classe IgG ou IgM reconhece antiacutegenos
proacuteprios na membrana eritrocitaacuteria e reduz a sobrevida da hemaacutecia levando a sua destruiccedilatildeo
pelos macroacutefagos no sistema reticulo-endotelial ou agrave ativaccedilatildeo do complexo de ataque agrave
membrana e agrave lise intravascular Os autoanticorpos satildeo voltados na maioria das vezes contra
antiacutegenos eritrocitaacuterios de alta frequecircncia populacional conhecidos como antiacutegenos puacuteblicos
e por este motivo reconhecem tanto hemaacutecias autoacutelogas quanto alogecircnicas
Devido agrave presenccedila do autoanticorpo livre no plasma e tambeacutem do anticorpo eou
complemento ligado agrave hemaacutecia o banco de sangue pode encontrar dificuldades em todas as
fases dos testes preacute-transfusionais do paciente com AHAI e deve utilizar teacutecnicas que
auxiliem na escolha do melhor hemocomponente melhorando a seguranccedila transfusional Essas
teacutecnicas visam remover a interferecircncia do autoanticorpo livre no soro e do autoanticorpo
ligado agrave hemaacutecia permitindo a detecccedilatildeo de aloanticorpos associados e a realizaccedilatildeo da
fenotipagem eritrocitaacuteria respectivamente
A finalizaccedilatildeo dos testes preacute-tranfusionais na presenccedila de autoanticorpo pode levar
algumas horas e nem sempre o paciente poderaacute aguardar Nesse contexto torna-se vantajosa a
aplicaccedilatildeo de teacutecnicas de raacutepida execuccedilatildeo
O presente estudo propotildee aplicar e avaliar a eficaacutecia da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
em remover os anticorpos ligados agrave hemaacutecia o que permite a fenotipagem eritrocitaacuteria
estendida e a seleccedilatildeo de concentrados de hemaacutecias com mesmo fenoacutetipo do paciente
Atualmente no Hemocentro de Ribeiratildeo Preto a teacutecnica utilizada para esse fim eacute o
tratamento das hemaacutecias com difosfato de cloroquina cujo tempo de execuccedilatildeo pode demorar
ateacute duas horas enquanto a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser realizada em apenas dois
minutos o que a tornaria opccedilatildeo de escolha especialmente em situaccedilotildees de urgecircncia Ao
contraacuterio da cloroquina a glicina-aacutecidaEDTA permite tambeacutem o estudo do eluato das
hemaacutecias tratadas
22
4 METODOL OGIA
41 AMOSTRAS DE DOADORES
Foram coletados 50 amostras de doadores de sangue que compareceram ao
Hemonuacutecleo de Araccedilatuba no periacuteodo de junho a agosto de 2016 Foram convidados a
participar da pesquisa doadores de repeticcedilatildeo do tipo sanguiacuteneo ldquoOrdquo RhD positivo
cadastrados no sistema de banco de sangue (SBS) do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto
Todos os doadores que concordaram em participar da pesquisa assinaram o termo de
consentimento livre e esclarecido (TCLE)
No momento da doaccedilatildeo foram coletados adicionalmente 5 mL de sangue total em
soluccedilatildeo anticoagulante EDTA (aacutecido dietilenoaminoaceacutetico) dispensando punccedilatildeo venosa
adicional para coleta da amostra O fluxograma 1 resume as etapas desenvolvidas no projeto
Fluxograma 1 - Fluxo da pesquisa utilizando as amostras de doadores
23
411 FENOTIPAGEM
Foram verificados se os doadores jaacute tinham fenotipagem para outros sistemas de
grupos sanguiacuteneos aleacutem do sistema ABORh que eacute realizado rotineiramente
A fenotipagem eritrocitaacuteria para outros sistemas ou fenotipagem estendida eacute realizada
para identificar a presenccedila ou ausecircncia de antiacutegenos considerados de importacircncia cliacutenica No
Hemonuacutecleo de Araccedilatuba uma parcela de doadores de repeticcedilatildeo satildeo fenotipados para os
antiacutegenos dos sistemas de grupo sanguiacuteneo Rh (antiacutegenos C c E e e) Kell (antiacutegeno K)
Duffy (antiacutegenos Fya e Fy
b) Kidd (antiacutegenos Jk
a e Jk
b) e sistema MNSs (antiacutegenos S e s)
A fenotipagem para o Rh e Kell eacute realizada por metodologia de microplaca utilizando
25 microL de hemaacutecia lavada e diluiacuteda a 5 em salina e 25 microL do antissoro comercial especiacutefico
A reaccedilatildeo eacute incubada 15 minutos a temperatura ambiente e centrifugadas para leitura Para os
antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s a metolodogia utilizado eacute gel contendo antiglobulina
humana (gel LissCoombs poliespeciacutefico) da marca BIO-RAD onde se utiliza suspensatildeo de
hemaacutecia em LISS (Soluccedilatildeo de baixa forccedila iocircnica) A suspensatildeo eacute preparada atraveacutes da
diluiccedilatildeo de 10 microL de hemaacutecia em 1000 microL de LISS Pipetado 50 microL dessa diluiccedilatildeo no gel e
adicionado 25 microL do antissoro especiacutefico Incuba-se em banho seco por 15 minutos a 37 deg
Celsius e eacute centrifugado em centriacutefuga especiacutefica Os antissoros utilizados eram das marcas
Fresenius e Lorne
Foi verificado a fenotipagem do doador no banco de dados do Hemocentro Os
registros dos fenoacutetipos dos doadores ficam armazenadas no sistema de banco de sangue
(SBS) Para doadores que natildeo tinham fenotipagem estendida preacutevia para antiacutegenos do sistema
Rh (C c E e e) e Kell (K) foi realizada a fenotipagem para esses antiacutegenos
O tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA e cloroquina para dissociar
anticorpos pode inativar enfraquecer ou destruir os antiacutegenos presentes nas hemaacutecias
alterando assim os resultados da fenotipagem Para verificar se houve destruiccedilatildeo dos
antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a e Jk
b S e s nas amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes
tratamento foram novamente fenotipadas ao final para os antiacutegenos que eram inicialmente
positivas
A repeticcedilatildeo da fenotipagem foi realizada nas amostras que apresentaram efetividade
no tratamento da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eou da cloroquina e a detecccedilatildeo do antiacutegeno
na amostra preacute-tratamento
24
412 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS HEMAacuteCIAS
As hemaacutecias foram sensibilizadas com antissoros policlonais humanos de amostras de
plasma fresco congelado de doadores com resultado de pesquisa de anticorpo irregular
positivos
A escolha do anticorpo para sensibilizar as hemaacutecias foi definida de acordo com o
fenoacutetipo do doador que deveria ser positivo para o respectivo antiacutegeno
Para a sensibilizaccedilatildeo um volume de antissoro (1 mL) e um volume (1 mL) de
hemaacutecias lavadas quatro vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica foram adicionadas a um tubo de 12 x
75 mm A mistura foi homogeneizada e incubada em banho maria (BM) a 37deg C por 60
minutos A seguir as hemaacutecias foram novamente lavadas 4 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica
para retirada dos anticorpos que natildeo se ligaram A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada
como controle negativo O teste da uacuteltima lavagem eacute importante para assegurar que os
anticorpos que poderatildeo ser detectados no eluato apoacutes o tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA
sejam aqueles que estavam ligados agraves hemaacutecias e natildeo aqueles livres no plasma O controle
negativo mostra que todo o anticorpo livre foi retirado (LEGER 2011)
Para o teste de presenccedila de anticorpo na soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foram incubadas
com hemaacutecias de triagem de anticorpos irregulares (ID-Diacell BIO-RAD) contendo os
antiacutegenos especiacuteficos Realizado a teacutecnica em gel LissCoombs com anti-IgG+C3d Incubado
no tempo de 15 minutos a temperatura de 37deg C e centrifugado 10 minutos em centriacutefuga
proacutepria
As 50 amostras de doadores foram sensibilizadas com os anticorpos policlonais
humanos
Apoacutes sensibilizadas rdquoin vitrordquo e lavadas as hemaacutecias foram diluiacutedas em soluccedilatildeo de
baixa forccedila iocircnica (LISS) na quantidade de 10 microL de hemaacutecia para 1000 microL de soluccedilatildeo A
suspensatildeo foi pipetada (50 microL) em coluna-gel-teste LissCoombs (BIO-RAD) que contecircm
antiglobulina poliespeciacutefico (IgG+C3d) e centrifugada em baixa rotaccedilatildeo conforme orientaccedilatildeo
do fabricante durante 10 minutos
As amostras deveriam apresentar aglutinaccedilatildeo com reatividade 3 a 4+ no TDA As
amostras que apresentaram reaccedilatildeo menor que 3+ foram novamente sensibilizadas com nova
aliacutequota do antissoro
25
413 TRATAMENTO DAS AMOSTRAS
As amostras sensibilizadas apresentando o TDA positivo 3 ou 4+ foram divididas em
duas aliacutequotas e submetidas a duas teacutecnicas diferentes com o objetivo de dissociar o anticorpo
ligado Uma aliacutequota da amostra foi tratada com soluccedilatildeo de difosfato de cloroquina enquanto
a outra aliacutequota foi tratada com glicina-aacutecidaEDTA
42 PREPARO DA GLICINA AacuteCIDA-EDTA
A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA utiliza 3 soluccedilotildees diferentes a glicina aacutecida o
EDTA e o tampatildeo TRIS
Os reagentes foram preparados utilizando os sais para anaacutelise (PA) de EDTA
(Na2EDTA2H2O) TRIS (C4H11NO3) Glicina (H2NCH2CO2H) NaCl e a soluccedilatildeo de aacutecido
cloriacutedrico (HCl) 12 N todos reagentes da marca SYNTH (quadro 1)
Para o preparo do tampatildeo glicina-acida eacute necessaacuterio o ajuste do pH para 15 Para esse
ajuste utiliza-se aacutecido cloriacutedrico (HCl) concentrado O pH foi medido com fitas reativas de pH
com escala de 1 a 14 da marca MERCK Posteriormente a soluccedilatildeo foi enviada ao laboratoacuterio
de controle de qualidade do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto e o pH medido no peagacircmetro O
tampatildeo glicina-aacutecida foi armazenado a 4deg e o tampatildeo tris e o EDTA em temperatura ambiente
controlada (20 a 24deg Celsius)
Apoacutes o preparo e durante a realizaccedilatildeo dos testes foram feitas inspeccedilotildees visuais para
verificaccedilatildeo de turvaccedilatildeo do meio e presenccedila de precipitados
Reagente Material Quantidade Preparo e
Conservaccedilatildeo
EDTA
EDTA
(Na2EDTA2H2O)
5 gramas Mistura ateacute
dissoluccedilatildeo do sal e
conserva em
temperatura ambiente Aacutegua Destilada 50 Ml
Tris
TRIS (C4H11NO3) 121 gramas Conservar em
temperatura ambiente NaCl 525g
Aacutegua destilada 100ml
Gliacutecina-aacutecida
Glicina
(H2NCH2CO2H) 15 gramas
Conservar a 4oC NaCl 116gramas
Aacutegua Destilada 200ml
HCL 12N Ajutar o pH para 15
Quadro 1 - Preparo dos Reagentes da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
Fonte - Manual teacutecnico AABB 2011
26
O tampatildeo glicina-aacutecida e o tampatildeo TRIS satildeo estaacuteveis por 7 meses O reagente EDTA
precipitou mesmo estando em temperatura em ambiente controlado Houve necessidade de
preparo de novo reagente
421 TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
1 Em um tubo de ensaio 12x75 mm eacute adicionado 08 mL da soluccedilatildeo de glicina-aacutecida A
esta soluccedilatildeo adiciona-se 02 mL de EDTA e mistura
2 Adiciona-se 02 mL de hemaacutecias sensibilizadas (lavada 4 vezes) A mistura eacute
homogeneizada e incubada por exatamente 2 minutos
3 A seguir 01 mL de tampatildeo TRIS eacute adicionado agrave mistura que eacute novamente
homogeneizada e centrifugada por 2 minutos a 3400 rpm O pH deve estar entre 7 a 75
4 Apoacutes centrifugaccedilatildeo separa-se em outro tubo o sobrenadante (eluato) e as hemaacutecias
que permanecem satildeo lavadas 4 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica para retirada de todo o
reagente e anticorpos livres
43 PREPARO DA CLOROQUINA
A cloroquina eacute diluiacuteda em tampatildeo PBS na concentraccedilatildeo de 20 (Quadro 2) e
armazenado a 4deg Celsius sua validade apoacutes o preparo eacute de 1 mecircs
A teacutecnica da cloroquina jaacute estaacute padronizada para rotina do laboratoacuterio de
imunohematologia do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto e suas unidades
Reagente Reagentes Quantidade PreparoConservaccedilatildeo
Cloroquina
Difosfato de cloroquina
(C18H32ClN3O8P2)
20 gramas
Conservar a 4deg Celsius
Tampatildeo PBS 100ml
NaOH 01 N Acertar o pH para
51
Quadro 2 - Preparo da Cloroquina Fonte - Manual teacutecnico da AABB 2011
431 TEacuteCNICA DA CLOROQUINA
1 4 partes da soluccedilatildeo pronta eacute adicionada a uma parte de hemaacutecias lavadas 4 vezes com
soluccedilatildeo fisioloacutegica
2 A mistura eacute incubada em temperatura ambiente por ateacute duas horas
3 Centrifugar a 3400 rpm por 2 minutos
27
4 Remover o sobrenadante lavar as hemaacutecias novamente com soluccedilatildeo fisioloacutegica 4
vezes
44 VERIFICACcedilAtildeO DA EFETIVIDADE DOS TESTES
Apoacutes tratamento pelas duas teacutecnicas o TDA foi repetido em todas as amostras para
verificar se os tratamentos foram efetivos e houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo Para as
amostras tratadas pela teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA que permaneceram com TDA positivo
novo tratamento foi realizado
45 TESTE DO ELUATO
O eluato resultante das amostras tratadas com glicina-acidaEDTA foi testado com
hemaacutecias de triagem A soluccedilatildeo do eluato foi incubada com as hemaacutecias de triagem de
anticorpos (ID-Diacell BIO-RAD) pela teacutecnica em gel LissCoombs O teste foi incubado 15
minutos a 37deg Celsius e centrifugado por 10 minutos em centrifuga proacutepria para a teacutecnica em
gel Os eluatos que apresentaram resultados positivos foram testados em painel de 11
hemaacutecias (ID-Diapanel BIO-RAD) para a identificaccedilatildeo do anticorpo
46 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente que apresentou TDA positivo por IgG e pesquisa
de anticorpo irregular positivo com presenccedila de autoanticorpo com reatividade panaglutinina
A amostra foi tratada em paralelo pelas duas teacutecnicas descritas e foi enviada para o
Hemocentro para genotipagem eritrocitaacuteria que foi realizado por metodologia PCR em tempo
real no equipamento Real-time system PCR 7500 ( Applied Biosystems Califoacuternia EUA)
28
5 RESULTADOS
51 REAGENTES
Para aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA satildeo necessaacuterios 3 diferentes
reagentes que podem ser encontrados em forma de kit pronto para uso No entanto esses kits
natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil Os reagentes satildeo tampatildeo glicina-aacutecida o EDTA e o tampatildeo
Tris
Todos os reagentes foram preparados rdquoin houserdquo a partir dos sais e soluccedilotildees PA (puro
para anaacutelise) da marca SYNTH que foram adquiridos para a pesquisa O custo estimado para
cada teste foi aproximadamente R$ 020 reais
Apoacutes o preparo os reagentes poderiam ser armazenados em condiccedilotildees adequadas pelo
periacuteodo de 1 ano (AABB 2011) Ao final do preparo e durante o periacuteodo de armazenamento
de fevereiro a setembro de 2016 foi realizada inspeccedilatildeo visual para verificar a presenccedila de
precipitados ou turvaccedilatildeo A soluccedilatildeo de glicina e o tampatildeo TRIS mostraram-se estaacuteveis ateacute o
final do periacuteodo Por sua vez o reagente EDTA precipitou mesmo estando armazenado em
temperatura ambiente controlada e foi necessaacuterio novo preparo
52 AMOSTRAS DE DOADORES
521 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS AMOSTRAS
Apoacutes incubaccedilatildeo da hemaacutecia com o antissoro a mesma foi lavada 4 vezes para retirada
dos anticorpos livres A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada Caso houvesse positividade na
soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem a etapa era repetida (figura 3) Das 50 amostras sensibilizadas a
uacuteltima lavagem foi positiva somente em 3 delas Nas 3 amostras o anticorpo utilizado para
sensibilizaccedilatildeo foi o anti-K Apoacutes repetido nova etapa de lavagem os resultados se
apresentaram negativos
Em todas as amostras sensibilizadas ldquoin vitrordquo o TDA foi testado e verificado a
intensidade do teste Entre as 50 amostras 47 alcanccedilaram TDA com intensidade 3-4+ apoacutes a
primeira sensibilizaccedilatildeo enquanto 3 amostras necessitaram uma segunda incubaccedilatildeo com
anticorpo (figura 4)
A escolha dos anticorpos para sensibilizar as hemaacutecias foi feita de acordo com o
fenoacutetipo do doador e foram utilizados sete diferentes especificidades de anticorpos policlonais
humanos conforme mostra o graacutefico1
29
Figura 3 - Soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada com hemaacutecia de triagem de
anticorpos em gel LissCoombs (BIO-RAD) A finalidade eacute verificar a presenccedila de anticorpos livres na
suspensatildeo que possam interferir na pesquisa do eluato As soluccedilotildees de lavagem das amostras na figura a tiveram
resultados negativos Na figura b duas amostras a 47 e 50 apresentaram resultado positivo Nova etapa de
lavagem foi realizada e o resultado final foi negativo
522 TRATAMENTO DAS HEMAacuteCIAS
Apoacutes a sensibilizaccedilatildeo e obtenccedilatildeo de resultados de TDA com intensidade de 3 a 4+
cada uma das amostras foi dividida em duas aliacutequotas e tratada separadamente pelas teacutecnicas
de glicinaaacutecida-EDTA e cloroquina
As teacutecnicas foram consideradas efetivas quando obteve-se a completa dissociaccedilatildeo do
anticorpo verificada atraveacutes do TDA negativo na amostra poacutes tratamento conforme figuras 5
e 6 Dentre as amostras tratadas com cloroquina 2850 tiveram o TDA negativado A glicina-
aacutecidaEDTA negativou o TDA em 33 das 50 amostras tratadas Apenas 17 amostras tratadas
com glicina-aacutecidaEDTA permaneceram com o TDA positivo e foram submetidas a um novo
tratamento
30
Figura 4 - TDA das amostras apoacutes sensibilizaccedilatildeo com anticorpos policlonais humanos Amostras na
figura a com intensidades de 3-4+ Na figura b amostras 4 e 7 com intensidade menor que 3+ e portanto foram
novamente sensibilizadas com nova aliacutequota de soro Anti-D e anti-S Apoacutes a segunda sensibilizaccedilatildeo
apresentaram reatividade 4 e 3+ respectivamente Os anticorpos utilizados para sensibilizaccedilatildeo foram D S c E
C e K
523 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS TEacuteCNICAS
No tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA houve dissociaccedilatildeo completa do anticorpo
em 33 amostras (66) das 50 amostras testadas enquanto que com a cloroquina foram 28
amostras (56) (tabela 1)
31
Graacutefico 1- Nuacutemero de amostras sesnsibilizadas por especificidade de anticorpo Entre as 50 amostras 12
foram sensibilizadas com anti-D 10 com anti-C 9 com anti-E 8 com anti-c 7 com anti-S 3 com anti-K e 1
com anti-Dia As especificidades dos anticorpos foram definidas de acordo o fenoacutetipo do doador
Figura 5 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com cloroquina Nas amostras onde houve
a dissociaccedilatildeo do anticorpo ( 2 21 a 23 26 39 a 42 45 46 e 49) a hemaacutecia se deposita no fundo no microtubo
apoacutes a centrifugaccedilatildeo (TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (1 3 24 25 43 44 47
48 e 50) o anticorpo ligado agraves hemaacutecias eacute alvo da AGH presente no gel (TDA positivo)
Anti-D 12
Anti-C 10
Anti-E 9
Anti-c 8
Anti-S 7
Anti-K 3 Anti-Dia 1
32
Figura 6 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA Nas amostras
onde houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo (4 6 7 12 a 15 17 34 35 37 e 38) a hemaacutecia se deposita no fundo no
microtubo apoacutes a centrifugaccedilatildeo ( TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (5 16 18
19 20 33 e 36 ) o AGH presente no gel se liga ao anticorpo ligado agraves hemaacutecias que ficam retidas no gel (TDA
positivo)
Tabela 1-Resultado geral do tratamento das hemaacutecias com glicina e cloroquina
Teacutecnica utilizada TDA negativo TDA positivo Total
Glicina-aacutecidaEDTA 33 17 50
Cloroquina 28 22 50
A glicina-aacutecidaEDTA conseguiu negativar mais amostras sensibilizadas com Anti-D
e anti-K que a cloroquina Para as hemaacutecias sensibilizadas com anti-E Anti-S e Anti-Dia
ambas as teacutecnicas dissociaram o anticorpo em 100 das amostras Os resultados detalhados
por especificidade do anticorpo apoacutes o primeiro tratamento com glicina-aacutecidaEDTA e com
cloroquina estatildeo na tabela 2
Para as amostras que permaneceram positivas (17 amostras) apoacutes o tratamento com a
glicina-aacutecidaEDTA foi realizado um novo tratamento Houve dissociaccedilatildeo do anticorpo em 3
amostras (18) apoacutes a segunda tentativa Nas demais 14 (82) amostras tratadas pela
segunda vez 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise
33
Tabela 2 - Resultados do TDA apoacutes tratamento das hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo
sensibilizado
ANTICORPOS
SENSIBILIZADOS
1ordm TRATAMENTO COM
GLICINA
TRATAMENTO COM
CLOROQUINA
TOTAL TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
Anti-D 8 4 0 12 12
Anti-C 6 4 10 0 10
Anti-E 9 0 9 0 9
Anti-c 0 8 1 7 8
Anti-S 7 0 7 0 7
Anti-K 2 1 0 3 3
Anti-Dia 1 0 1 0 1
TOTAL 33 17 28 22 50
A hemoacutelise foi verificada durante o procedimento de lavagem final das hemaacutecias com
soluccedilatildeo fisioloacutegica para a retirada dos reagentes As soluccedilotildees de lavagem ficaram
avermelhadas e as hemaacutecias com coloraccedilatildeo escura As amostras foram descartadas Dentre as
6 amostras que ainda puderam ser testadas para o TDA trecircs amostras negativaram sendo 1
sensibilizada com anti-D e 2 com anti-C (tabela 3)
Tabela 3 - Resultado apoacutes o segundo tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA
Tratamento com
glicina-aacutecidaEDTA
TDA Negativo TDA Positvo Hemoacutelise Total
Segundo tratamento 3 3 11 17
524 TESTAGEM DO ELUATO
Apoacutes o tratamento com a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA a soluccedilatildeo do eluato foi
testada para verificar a viabilidade dos anticorpos que foram dissociados ou eluiacutedos Dentre
as 50 amostras 41 apresentaram eluato positivo As nove amostras cujos eluatos foram
negativos haviam sido sensibilizadas com as seguintes especificidades de anticorpos anti-E 6
amostras (67) anti-S 2 amostras (40) e anti-D 1 amostra (8) (tabela 4) O eluato de
todas as amostras sensibilizadas com os anticorpos anti-C anti-c Anti-K e Anti-Dia foram
positivos Os eluatos positivos na triagem de anticorpos foram testados com paineacuteis de
identificaccedilatildeo para confirmar a especificidade e a viabilidade dos anticorpos (figuras 7 e 8)
34
525 EFEITO DA ELUICcedilAtildeO SOBRE OS ANTIacuteGENOS ERITROCITAacuteRIOS
Para verificar o efeito do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA e com a cloroquina
sobre a expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s foi realizada a fenotipagem das
amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes tratamento com ambas as teacutecnicas Foi avaliado
se o tratamento destruiu os antiacutegenos expressos antes do tratamento
Tabela 4- Resultado do Eluato das amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA
Anticorpos Eluato positvo Eluato negativo Total
Anti-D 11 1 12
Anti-C 10 0 10
Anti-E 3 6 9
Anti-c 8 0 8
Anti-S 5 2 7
Anti-K 3 0 3
Anti-Dia 1 0 1
Total 41 9 50
Figura 7 ndash Painel do eluato da amostra 21 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-C que foi
recuperado no eluato
Figura 8 ndash Painel do eluato da amostra 47 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-K que foi
recuperado no eluato
35
Dentre as 50 amostras 26 eram previamente fenotipadas para os antiacutegenos Fya Fy
b
Jka Jk
b S e s Dentre elas 20 alcanccedilaram TDA negativo apoacutes tratamento com a glicina-
aacutecidaEDTA e 20 negativaram apoacutes tratamento com cloroquina (tabela 5) Apoacutes ambas as
teacutecnicas os antiacutegenos originalmente expressos permaneceram positivos comprovando que natildeo
houve destruiccedilatildeo dos mesmos
Tabela 5 ndash Verificaccedilatildeo da interferecircncia do tratamento da hemaacutecias com cloroquina e glicina-
aacuteicdaEDTA sobre os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
AMOSTRAS
COM
FENOTIPAGEM
PREacuteVIA
TRATADAS COM
CLOROQUINA
TRATADAS COM
GLICINA
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
26
20
20
20
20
As amostras 24 47 e 50 eram positivas para o antiacutegeno K A cloroquina natildeo dissociou
o anticorpo em nenhuma das 3 amostras enquanto a glicina-aacutecidaEDTA foi efetiva nas
amostras 24 e 50 Foi testada a expressatildeo do antiacutegeno K nas amostras 24 e 50 apoacutes o
tratamento utilizando meacutetodo indireto em gel contendo AGH Apesar de natildeo ter sido avaliado
a intensidade de reaccedilatildeo de expressatildeo dos antiacutegenos podemos verificar na figura 9 que nas
duas amostras em que a teacutecnica foi efetiva e dissociou o anticorpo a expressatildeo do antiacutegeno K
continua presente mas a reatividade observada pode ser considerada 1+ sugerindo que houve
diminuiccedilatildeo da expressatildeo do antiacutegeno quando comparado com a expressatildeo observada em
hemaacutecia natildeo tratada
Os resultados individuais de cada amostra em ambas as teacutecnicas encontram-se
resumidas na tabela 6
526 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente onde foi constatada a presenccedila de autoanticorpo
a quente da classe IgG pelo TDA monoespeciacutefico (figura 10)O autoanticorpo tambeacutem
interferia na pesquisa e identificaccedilatildeo de anticorpos irregulares pois apresentava caracteriacutestica
de panaglutinina As hemaacutecias da paciente sensibilizadas ldquoin vivordquo foram tratadas com
cloroquina e com glicina-aacutecidaEDTA
36
Figura 9 ndash Fenotipagem das amostras 24 e 50 para antiacutegeno K apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
O teste positivo indica a presenccedila do antiacutegeno poreacutem a reatividade fraca (1+) sugere que houve enfraquecimento
de sua expressatildeo A direita a expressatildeo forte (4+) do antiacutegeno Kell em hemaacutecia controle natildeo tratada utilizada
como controle positivo
A cloroquina natildeo foi efetiva na retirada do anticorpo ligado as hemaacutecias ao contraacuterio
do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA que dissociou o anticorpo (figura 11)
A hemaacutecia tratada com glicina foi fenotipada para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
(figura 12) A fenotipagem para o sistema Rh (C c E e e) e Kell foi realizada em gel
especiacutefico monoclonal sem interferecircncia do TDA positivo (controle da reaccedilatildeo negativo)
O eluato resultante do tratamento com glicina-aacutecidaEDTA foi testada em gel com
hemaacutecias de painel de identificaccedilatildeo de anticorpos e apresentou resultado positivo com todas
as ceacutelulas (figura 13 e 14)
A amostra foi enviada para genotipagem e o resultado da genotipagem confirmou o
resultado da fenotipagem apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
527 TEMPO DE EXECUCcedilAtildeO DA TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
O tempo de reaccedilatildeo da glicina-aacutecidaEDTA eacute de 2 minutos Todas as amostras foram
tratadas obedecendo ao tempo descrito na literatura demonstrando que o mesmo eacute
reprodutiacutevel
37
Tabela 6- Resultados individuais por amostra
Amostra Especificidade
dos anticorpos
Intensidade do
TDA apoacutes
sensibilizaccedilatildeo
Tratamento
efetivo com
cloroquina
Tratamento
efetivo com
glicina
Eluato
poacutes
glicina
1 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 2 Dia 3+ Sim Sim 3+ 3 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 4 D 4+ Natildeo Sim 4+ 5 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 6 E 3+ Sim Sim Negativo 7 S 4+ Sim Sim 3+ 8 E 3+ Sim Sim 1+ 9 E 3+ Sim Sim 2+
10 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 11 D 4+ Natildeo Sim 4+ 12 D 4+ Natildeo Sim 4+ 13 S 3+ Sim Sim 3+ 14 S 3+ Sim Sim 3+ 15 D 3+ Natildeo Sim 3+ 16 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 17 E 3+ Sim Sim (+) 18 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 19 D 4+ Natildeo Natildeo 3+ 20 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 21 C 3+ Sim Sim 4+ 22 C 3+ Sim Sim 4+ 23 C 3+ Sim Sim 4+ 24 K 4+ Natildeo Sim 4+ 25 D 3+ Natildeo Natildeo Negativo 26 E 4+ Sim Sim Negativo 27 S 3+ Sim Sim 3+ 28 C 3+ Sim Natildeo 4+ 29 C 3+ Sim Sim 4+ 30 C 3+ Sim Sim 4+ 31 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 32 E 3+ Sim Sim Negativo 33 C 3+ Sim Natildeo 4+ 34 S 3+ Sim Sim Negativo 35 S 3+ Sim Sim Negativo 36 C 4+ Sim Natildeo 4+ 37 c 4+ Natildeo Natildeo 4+ 38 D 4+ Natildeo Sim 4+ 39 S 3+ Sim Sim 3+ 40 c 4+ Sim Natildeo 2+ 41 C 4+ Sim Natildeo 4+ 42 E 3+ Sim Sim Negativo 43 D 3+ Natildeo Sim 2+ 44 D 3+ Natildeo Sim 2+ 45 E 3+ Sim Sim Negativo 46 C 3+ Sim Sim 4+ 47 K 4+ Natildeo Natildeo 4+ 48 D 3+ Natildeo Sim 2+ 49 E 3+ Sim Sim Negativo 50 K 4+ Natildeo Sim 4+
TOTAL 50 28 33 41
38
Figura 10 ndash TDA monoespeciacutefico da amostra de paciente Hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo da classe
IgG
oacute Figura 11 ndash TDA apoacutes o tratamento com glicina-aacutecidaEDTA (esquerda) e cloroquina (direita) A glicina
negativou completamente o TDA enquanto a hemaacutecia tratada com cloroquina persistiu positiva (1+)
39
Figura 12 ndash Fenotipagem da amostra tratada com glicina-aacutecidaEDTA Fy(a+b+) Jk(a-b+) S+s+
Figura 13 ndash Painel em gel (LissAGH) do eluato apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de
intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
Figura 14 ndash ndash Painel ezimaacutetico (hemaacutecias tratadas com bromelina) do eluato em gel neutro apoacutes
tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
40
528 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Quanto a efetividade das teacutecnicas em negativar o TDA foi verificado que a glicina-
aacutecidaEDTA foi efetiva em 66 das amostras testadas no primeiro tratamento (3350
amostras) enquanto a cloroquina conseguiu negativar 56 (2850) Esses resultados natildeo
apresentam diferenccedila significativa (pgt005) demostrando que a teacutecnica da glicina-
aacutecidaEDTA natildeo eacute superior mas eacute tatildeo efetiva quanto a da cloroquina
Quando aliamos os resultados de ambas as teacutecnicas verificamos que em 76 (3850)
das amostras o TDA foi negativado Esse dado indica que ainda que uma teacutecnica natildeo seja
eficaz na remoccedilatildeo do anticorpo eacute uma boa alternativa tentar a segunda teacutecnica jaacute que a falha
em remover o anticorpo utilizando uma delas natildeo prevecirc necessariamente a falha com a outra
Quando se utiliza o teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla (graacutefico 2) para comparar a utilizaccedilatildeo das
duas teacutecnicas com o resultado de cada uma isolada (somente a cloroquina ou somente a
glicina) verificamos que os resultados apresentam diferenccedila significativa (plt005) (quadro 3)
TRATAMENTO EFETIVO COM TOTAL PORCENTAGEM
Glicina ou cloroquina 38 76
Glicina e cloroquina 23 46
Glicina apenas 10 20
Cloroquina apenas 5 10
Nenhuma das teacutecnicas 12 24
Quadro 3 - Resultados comparativos entre as teacutecnicas utilizadas
41
Graacutefico 2 - Teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla entre as teacutecnicas aplicadas A- Glicina e Cloroquina B-Cloroquina C-
Glicina ( plt005)
42
6 DISCUSSAtildeO
Os reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA podem ser adquiridos em
forma de kit comercial prontos para uso poreacutem natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil A preparaccedilatildeo
dos reagentes ldquoin houserdquo a partir de sais comerciais adquiridos se mostrou viaacutevel Os
reagentes glicina e o tampatildeo Tris armazenados de forma correta se mantiveram estaacuteveis por
um periacuteodo de 7 meses Somente o reagente EDTA precipitou mesmo armazenado em
condiccedilotildees adequadas sugerindo que o mesmo deve ser preparado em menor quantidade e
armazenado em aliacutequotas A soluccedilatildeo de cloroquina tambeacutem pode ser preparada ldquoin houserdquo e
pode ser armazenado por um mecircs A legislaccedilatildeo brasileira autoriza a utilizaccedilatildeo de reagentes
preparados a partir de sais comerciais como a cloroquina e a glicina-aacutecidaEDTA desde que
os sais tenham autorizaccedilatildeo da vigilacircncia sanitaacuteria para a comercializaccedilatildeo (BRASIL 2001)
A comparaccedilatildeo quanto a efetividade em dissociar anticorpos em amostras com TDA
positivos entre a teacutecnica da glicina e a teacutecnica da cloroquina mostrou que natildeo haacute diferenccedila
estatiacutestica entre elas e que ambas satildeo igualmente eficientes Se utilizadas conjuntamente haacute
maior possibilidade de elucidaccedilatildeo dos casos
Uma vantagem da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eacute que ela permite numa mesma
amostra eluir o anticorpo ligado aacute hemaacutecia assim como fenotipar a hemaacutecia tratada Devido a
sua dupla utilidade a teacutecnica eacute vantajosa principalmente em pacientes em que pouco volume
de amostra pode ser coletado como em casos de crianccedilas e receacutem-nascidos
A fenotipagem poacutes tratamento se mostrou viaacutevel jaacute que os antiacutegenos de maior
importacircncia natildeo sofreram alteraccedilotildees Nas 20 amostras que foram fenotipadas antes e apoacutes
tratamento para verificar a influecircncia dos reagentes na expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a
Jkb S e s natildeo houve destruiccedilatildeo dos mesmos por nenhuma das duas teacutecnicas
Para as amostras positivas para o antiacutegeno Kell (350) e sensibilizadas com o
respectivo anticorpo a teacutecnica da glicina foi efetiva em negativar o TDA em apenas duas
delas mas apoacutes o tratamento foi verificada uma fraca reatividade da reaccedilatildeo antiacutegeno-
anticorpo sugerindo que houve um enfraquecimento da expressatildeo do antiacutegeno conforme
esperado e descrito na literatura (BYRNE 1991 PALLAS WILER E MCGEE 1991
ROZIERS e SQUALI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012 e KATHARIA e
CHAUDHARY 2013) A accedilatildeo da glicina sobre o antigeno Kell natildeo representa impedimento
para seu uso uma vez que na impossibilidade de testar o antiacutegeno Kell o banco de sangue
consegue facilmente atender a solicitaccedilatildeo de transfusatildeo com unidades de hemaacutecias Kell
43
negativas jaacute que eacute um antiacutegeno de baixa prevalecircncia na populaccedilatildeo variando de 15 na
populaccedilatildeo africana a 9 nos europeus (DANIELS 2011)
A soluccedilatildeo resultante da dissociaccedilatildeo do anticorpo pela teacutecnica da glicina pode ainda ser
utilizada como eluato podendo substituir a teacutecnica de eluiccedilatildeo com reagentes comercias (kits
de eluiccedilatildeo aacutecida) que tem alto custo aproximadamente entre R$2000 a R$2500 por teste
Em 41 amostras (82) houve a dissociaccedilatildeo e recuperaccedilatildeo do anticorpo que estava
sensibilizando as hemaacutecias Em 9 amostras (18) os anticorpos foram eluiacutedos poreacutem
apresentaram reaccedilatildeo negativa quando testadas com hemaacutecias de triagem entre eles o anti-E
(6) anti-S (2) e Anti-D (1) Eacute possiacutevel que a correccedilatildeo pH do meio (WALKER 2011) natildeo
tenha sido adequada o que pode ter desfavorecido a reatividade do anticorpo
Para as amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA nas quais natildeo houve dissociaccedilatildeo do
anticorpo pelo primeiro tratamento (1750) o segundo tratamento natildeo se mostrou eficaz jaacute
que 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise O tempo de
armazenagem natildeo parece ter influenciado jaacute que todas as amostras foram testadas dentro de
48 horas apoacutes a coleta Outros fatores que natildeo foram verificados podem ter levado a
hemoacutelise Apesar da literatura (LOUIE JIENG e ZEROULIS 1986 e BYRNE 1991)
recomendar um segundo tratamento ele eacute pouco eficaz tendo negativado apenas 3 das 17
amostras testadas
A amostra de paciente que apresentou sensibilizaccedilatildeo ldquoin vivordquo mostrou melhor
efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA sobre a da cloroquina possibilitando
fenotipagem para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s que natildeo foram destruiacutedos apoacutes o
tratamento comprovado atraveacutes da genotipagem
A presenccedila de autoanticorpo a quente com presenccedila de hemoacutelise (AHAI) ou natildeo pode
mascarar a presenccedila de aloanticorpo interferindo na rotina soroloacutegica da fenotipagem que eacute
uma importante ferramenta para auxiliar na seleccedilatildeo de hemaacutecias para transfusatildeo (SHIREY et
al 2002) Esses pacientes frequentemente possuem aloanticorpos associados ao
autoanticorpo e a prevalecircncia de aloimunizaccedilatildeo entre eles varia entre 12 a 40 (LEGER e
GARRATY 1999 BRANCH e PETZ 1999) o que dificulta ainda mais a escolha do melhor
componente a ser transfundido aleacutem de aumentar a possibilidade reaccedilotildees hemoliacuteticas imunes
poacutes-transfusionais
Nesses casos as teacutecnicas de dissociaccedilatildeo de anticorpos satildeo importantes para tratar
amostras de pacientes e a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser usada como uma opccedilatildeo
pois se mostrou eficaz na dissociaccedilatildeo anticorpo ligado agraves hemaacutecias deixando livre a
superfiacutecie das mesmas permitindo a fenotipagem por antisoros IgG Paralelamente os
44
anticorpos eluiacutedos tambeacutem puderam ser estudados O mesmo natildeo ocorre com a cloroquina
que permite apenas a fenotipagem e tampouco com os kits de eluiccedilatildeo aacutecida disponiacuteveis no
mercado nacional que satildeo destinados a realizaccedilatildeo do eluato mas destroem as hemaacutecias
O tempo de tratamento na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA tambeacutem eacute uma vantagem
pois foi possiacutevel reproduzir no tempo determinado de 2 minutos enquanto a cloroquina
demora ateacute duas horas
Ainda que a aplicaccedilatildeo das teacutecnicas por biologia molecular estejam cada vez mais
presentes na rotina imuno-hematoloacutegica e possibilitam estabelecer o fenoacutetipo deduzido do
genoacutetipo elas natildeo estatildeo disponiacuteveis na maioria dos centros e sua realizaccedilatildeo exige algumas
horas A resoluccedilatildeo imediata do problema transfusional necessita dos resultados soroloacutegicos
pois com frequecircncia natildeo eacute possiacutevel aguardar o resultado do teste molecular Dessa forma
apesar da crescente importacircncia da genotipagem eritrocitaacuteria teacutecnicas soroloacutegicas aplicadas
corretamente e no momento propiacutecio satildeo de grande utilidade para resolver problemas imuno-
hematoloacutegicos como ocorre com a fenotipagem em pacientes com TDA positivo
45
7 CONCLUSAtildeO
A teacutecnica da glicina aacutecidaEDTA mostrou-se efetiva em remover os anticorpos que
sensibilizavam as hemaacutecias e pode ser utilizada com seguranccedila antes da fenotipagem
eritrocitaacuteria Por ser uma teacutecnica de raacutepida execuccedilatildeo eacute uma alternativa aplicaacutevel
principalmente em casos urgentes de pacientes que apresentam autoanticorpos
46
8 REFEREcircNCIA BIBLIOGRAacuteFICA
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aplicaccedilatildeo do sangue seus componentes e derivados estabelece o ordenamento institucional
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50
9 ANEXOS
51
FUNDACcedilAtildeO HEMOCENTRO DE RIBEIRAtildeO PRETO
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE)
Tiacutetulo da pesquisa Aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina aacutecida-EDTA e avaliaccedilatildeo da
eficaacutecia no tratamento de hemaacutecias com teste direto da antiglobulina positivo
Pesquisadora responsaacutevel Ceacutelia Kazue Abiko
Orientador Prof Dimas Tadeu Covas
Co-orientadora Dra Flaacutevia Leite Souza Santos
Objetivo da pesquisa Vocecirc estaacute sendo convidado a participar de uma pesquisa que tem
como objetivo padronizar uma nova teacutecnica para auxiliar na tipagem sanguiacutenea de pacientes
A tipagem sanguiacutenea pode sofrer interferecircncia da presenccedila de anticorpos ligados aos gloacutebulos
vermelhos do sangue Nessas situaccedilotildees eacute difiacutecil selecionar o melhor sangue para o paciente e
eacute preciso a utilizaccedilatildeo de teacutecnicas adicionais para remover essas interferecircncias
Esta pesquisa tem como objetivo estudar outra teacutecnica para remover esses anticorpos e
comparaacute-la com a teacutecnica atualmente utilizada Para isso precisamos de amostras de pacientes
e doadores voluntaacuterios
Se vocecirc eacute um doador eacute necessaacuterio que vocecirc autorize a coleta de 5 ml (1 tubo) a mais
de seu sangue
Se vocecirc eacute um paciente natildeo haveraacute necessidade de nova amostra pois utilizaremos as
amostras jaacute coletadas para os testes preacute-transfusionais e os resultados encontrados nesta
pesquisa natildeo iratildeo interferir na escolha da (s) bolsa (s) de sangue que vocecirc possa vir a receber
Se vocecirc concordar em participar leia com atenccedilatildeo o texto abaixo e assine as duas vias
rubricando todas as paacuteginas deste termo de consentimento Uma via original assinada e
rubricada por vocecirc e pela pesquisadora ficaraacute com vocecirc
As suas informaccedilotildees seratildeo mantidas em sigilo pela pesquisadora e natildeo haveraacute
armazenamento de material para pesquisas posteriores Os seus dados seratildeo usados apenas
neste estudo e quando o trabalho for publicado seu nome e qualquer outra informaccedilatildeo que
possam identificaacute-lo natildeo seratildeo revelados
Eacute pouco provaacutevel que o que noacutes aprendermos com este estudo tenha um benefiacutecio
direto para vocecirc assim como natildeo poderemos dar nada em troca pela sua participaccedilatildeo na
pesquisa
Nosso objetivo com esta pesquisa eacute que os resultados poderatildeo ser uacuteteis para o
tratamento de pacientes no futuro Os riscos da participaccedilatildeo satildeo miacutenimos Se vocecirc eacute um
doador de sangue a amostra seraacute coletada no momento da doaccedilatildeo natildeo exigindo punccedilatildeo
venosa adicional
52
Eacute seu direito ter acesso aos resultados dos testes da pesquisa Esses resultados natildeo
seratildeo fornecidos automaticamente a vocecirc mas caso vocecirc se interesse em saber o resultado ou
tiver alguma duacutevida sobre a sua participaccedilatildeo neste estudo deveraacute entrar em contato com Ceacutelia
Kazue Abiko pelo telefone (18) 99718-3551
Vocecirc tem total liberdade de optar por natildeo participar da pesquisa Caso aceite
participar poderaacute desistir a qualquer momento ou retirar seu consentimento mesmo apoacutes ter
coletado o sangue Para cancelar sua participaccedilatildeo basta avisar a pesquisadora e os seus dados
seratildeo retirados do projeto
Qualquer duacutevida eacutetica sobre a pesquisa poderaacute entrar em contato com o Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa do Hospital das Cliacutenicas e da Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto
(CAMPUS UNIVERSITAacuteRIO bairro Monte Alegre CEP 14048-900 Ribeiratildeo Preto-SP
Telefone (16) 3602-2228 FAX (16) 3633-1144 e-mail cephcrpuspbr)
Consentimento de participaccedilatildeo
A Consentimento do participante
Li as informaccedilotildees acima sobre o estudo e recebi explicaccedilotildees sobre a participaccedilatildeo no estudo
Portanto dou o meu consentimento para participar do estudo
___________________________________________________________________________
Nome completo
___________________________________________________________________________
Assinatura
___________
Data
__________________________________________________________________________________
Nome completo da pesquisadora
___________________________________________________________________________
Assinatura
_____________
Data
CEacuteLIA KAZUE ABIKO
Aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA e
avaliaccedilatildeo da eficaacutecia no tratamento de hemaacutecias
com teste direto da antiglobulina positivo
Dissertaccedilatildeo apresentada agrave Faculdade de Medicina de
Ribeiratildeo Preto da Universidade de Satildeo Paulo para
obtenccedilatildeo do tiacutetulo de Mestre em Ciecircncias
Aacuterea de concentraccedilatildeo Hemoterapia e Biotecnologia
Orientador Prof Dr Dimas Tadeu Covas
APROVADO ____________
BANCA EXAMINADORA
________________________________
Profordf Dra Fabiacuteola Traina
________________________________
Prof Dr Amauri Antiquera Leite
________________________________
Profordf Dra Ana Paula Costa Nunes da Cunha Cozac
DEDICATOacuteRIA
Dedico este trabalho aos meus filhos Pedro e Maria que sirva de incentivo para a busca do
conhecimento sucesso e realizaccedilatildeo profissional
Aos colegas de trabalho Ana Paula Cristiane Igor Mara Rita e Simone pelo
companheirismo e pela agradaacutevel convivecircncia no dia dia
A todos os colegas do Hemonuacutecleo de Araccedilatuba e aos profissionais da aacuterea da sauacutede que
amam a profissatildeo trabalham com eacutetica e que se dedicam buscando o bem estar dos
pacientes
AGRADECIMENTOS
A DEUS pelo dom da vida e a graccedila de colocar em minha vida pessoas especiais que me
ajudaram a chegar ateacute aqui
Aos meus pais que me ensinaram respeito honestidade perseveranccedila e pelo incentivo aos
estudos
A dra Flaacutevia Leite Souza Santos que me ajudou durante todo o trabalho e contribuiu de
forma valiosa com todas as suas orientaccedilotildees
Ao meu esposo Abidias que de forma especial e carinhosa me deu forccedila e coragem me
apoiando nos momentos de dificuldade
Ao dr Dimas Tadeu Covas pela oportunidade de poder realizar este trabalho e pela ajuda na
definiccedilatildeo do tema
A dra Eugenia Amorim Ubialli pelo apoio e pela prestreza em ajudar sempre que necessitei
Ao dr Wolney Gois Barreto diretor do Hemonuacutecleo de Araccedilatuba pelo incentivo para
realizaccedilatildeo do mestrado
A minha irmatilde Leda que apoiou e ajudou nas horas em que precisei e que natildeo foram poucas
A Raquel Botelho pela sua atenccedilatildeo e prontidatildeo para ajudar
Aos colegas do mestrado aos com os quais convivi durante todo o ano de 2014 e que
guardarei eternamente em minha memoacuteria
A Eacutemile que me ajudou com as amostras e as valiosas informaccedilotildees
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 1
11TESTES PREacute-TRANSFUSIONAIS 1
111 TIPAGEM ABORh 2
112 ANTICORPOS ANTI-ERITROCITAacuteRIOS 3
113 PESQUISA E IDENTIFICACcedilAtildeO DE ANTICORPOS IRREGULARES 4
114 PROVA DE COMPATIBILIDADE 5
115 FENOTIPAGEM PARA OUTROS SISTEMAS 6
12 METODOLOGIAS APLICADOS Agrave ROTINA IMUNO-HEMATOLOacuteGICA 7
121 MEacuteTODOS DE FASE FLUacuteIDA 8
122 COLUNAS DE GEL 9
123 BIOLOGIA MOLECULAR 9
13 TESTE DA ANTIGLOBULINA 10
131 TESTE DIRETO DA ANTIGLOBULINA 11
132 TESTE INDIRETO DA ANTIGLOBULINA 12
133 CONDICcedilOtildeES CLIacuteNICAS COM TDA POSITIVO 13
134 ANEMIA HEMOLIacuteTICA AUTOIMUNE 15
135 TRATAMENTO DE HEMAacuteCIAS COM TDA POSITIVO 16
1351 TEacuteCNICA DE BLOQUEIO 17
1352 TRATAMENTO DE HEMAacuteCIAS COM ZZAP 17
1353 CLOROQUINA 17
1353 GLICINA-AacuteCIDAEDTA 18
2 OBJETIVOS 20
21 OBJETIVO GERAL 20
22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 20
3 JUSTIFICATIVA 21
4 METODOL OGIA 22
41 AMOSTRAS DE DOADORES 22
411 FENOTIPAGEM 23
412 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS HEMAacuteCIAS 24
413 TRATAMENTO DAS AMOSTRAS 25
42 PREPARO DA GLICINA AacuteCIDA-EDTA 25
421 TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA 26
43 PREPARO DA CLOROQUINA 26
431 TEacuteCNICA DA CLOROQUINA 26
44 VERIFICACcedilAtildeO DA EFETIVIDADE DOS TESTES 27
45 TESTE DO ELUATO 27
46 AMOSTRA DE PACIENTE 27
5 RESULTADOS 28
51 REAGENTES 28
52 AMOSTRAS DE DOADORES 28
521 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS AMOSTRAS 28
522 TRATAMENTO DAS HEMAacuteCIAS 29
523 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS TEacuteCNICAS 30
524 TESTAGEM DO ELUATO 33
525 EFEITO DA ELUICcedilAtildeO SOBRE OS ANTIacuteGENOS ERITROCITAacuteRIOS 34
526 AMOSTRA DE PACIENTE 35
527 TEMPO DE EXECUCcedilAtildeO DA TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA 36
528 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 40
6 DISCUSSAtildeO 42
7 CONCLUSAtildeO 45
8 REFEREcircNCIA BIBLIOGRAacuteFICA 46
9 ANEXOS 50
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Princiacutepio da teacutecnica direta da antiglobulinapaacutegina11
Figura 2 - Princiacutepio da teacutecnica indireta da antiglobulinapaacutegina 13
Figura 3 ndash Teste da soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem apoacutes sensibilizaccedilatildeo das hemaacuteciaspaacutegina 29
Figura 4 - TDA das amostras apoacutes sensibilizaccedilatildeo com anticorpospaacutegina 30
Figura 5 - Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com
cloroquina paacutegina 31
Figura 6 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA
paacutegina 32
Figura 7 - Painel do eluato da amostra 21 apresentando especificidade anti-Cpaacutegina 34
Figura 8 - Painel do eluato da amostra 47 apresentando especificidade anti-
K paacutegina 34
Figura 9 - Fenotipagem das amostras 24 e 50 para antiacutegeno K apoacutes tratamento com glicina-
aacutecidaEDTApagina 36
Figura 10 ndash TDA monoespeciacutefico Amostra sensibilizadardquo in vivordquo com anticorpo anti-
IgGpaacutegina 38
Figura 11 ndash TDA apoacutes o tratamentopaacutegina 38
Figura 12 ndash Resultado da fenotipagem da amostra sensibilizada ldquoin vivordquo por anti-
IgGpaacutegina 39
Figura 13 ndash Painel do eluato poacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA paacutegina 39
Figura 14 ndash Painel do eluato poacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA paacutegina 39
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Resultado geral do tratamento das hemaacutecias com glicina e
cloroquinapaacutegina 32
Tabela 2 - Resultados do TDA apoacutes tratamento da hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo
sensibilizadopaacutegina 33
Tabela 3 - Resultado apoacutes o segundo tratamento das hemaacutecias com glicina-
aacutecidaEDTApaacutegina 33
Tabela 4 - Resultado do Eluato das amostras tratadas com glicina-
aacutecidaEDTA paacutegina 34
Tabela 5 ndash Verificaccedilatildeo da interferecircncia do tratamento da hemaacutecias com cloroquina e glicina-
aacutecidaEDTA nos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e spaacutegina 35
Tabela 6 - Resultado da sensibilizaccedilatildeo das amostras efetividade do tratamento com
cloroquina glicina e o eluato poacutes tratamento com glicinapaacutegina 37
LISTA DE GRAFICOS
Graacutefico 1 - Nuacutemero de amostras sensibilizadas por especificidade de
anticorpopaacutegina 31
Graacutefico 2 - Teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla entre as teacutecnicas
aplicadaspaacutegina 41
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 - Preparo dos Reagentes da glicina-aacutecidaEDTApaacutegina 25
Quadro 2 - Preparo da Cloroquinapaacutegina 26
Quadro 3 - Resultados comparativos entre as teacutecnicas utilizadas paacutegina 40
LISTA DE FLUXOGRAMAS
Fluxograma 1 - Fluxograma da pesquisa utilizando as amostras de
doadorespaacutegina 22
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ABO
AHAI
Bg
c
C
C
C3
C3b
C3d
D
DHFRN
DNA
DTT
E
e
EDTA
Fc
Fya
Fyb
HCl
IgA
IgD
IgE
IgM
Mm
NaCl
PA
PAI
PBS
PCR
PEG
pH
Rh
rpm
S
s
SIDA
SBS
TCLE
TDA
TIA
TRIS
ZZAP
microL
Sistema Sanguiacuteneo ABO
Anemia Hemoliacutetica Autoimune
Antiacutegeno Bg
Antiacutegeno c
Celsius
Antiacutegeno C
Complemento
Fraccedilatildeo do complemento
Fraccedilatildeo do complemento
Antiacutegeno D
Doenccedila Hemoliacutetica do Feto e do Receacutem-nascido
Aacutecido desoxirribonucleico
Dithiothreitol
Antiacutegeno E
Antiacutegeno e
Aacutecido Etileno Diamino Tetraceacutetico
Porccedilatildeo do anticorpo
Antiacutegeno Duffy a
Antiacutegeno Duffy b
Aacutecido cloriacutedrico
Imunoglobulina A
Imunoglobulina D
Imunoglobulina E
Imunoglobulina M
Miliacutemetros
Cloreto de soacutedio
Puro para anaacutelise
Pesquisa de anticorpos irregulares
Tampatildeo fosfato salino
Reaccedilao em cadeia de polimerase
Polietilenoglicol
Potencial hidrogeniocircnico
Sistema sanguiacuteneo Rh
Rotaccedilotildees por minuto
Antiacutegeno S
Antiacutegeno s
Siacutendrome da Imunodeficiecircncia adquirida
Sistema de banco de sangue
Termo de consentimento livre e esclarecido
Teste direto da antiglobulina
Teste indireto da antiglobulina
Hidrometil aminometano
Sulphydryl-Proteolytic Enzyme
Microlitros
RESUMO
Os testes preacute-transfusionais satildeo o conjunto de teacutecnicas imuno-hematoloacutegicas aplicadas nas
amostras do receptor e do doador com a finalidade de fornecer uma unidade de hemaacutecias
compatiacutevel e segura para a transfusatildeo Aleacutem da fenotipagem ABO e Rh obrigatoacuteria nos testes
preacute-transfusionais a determinaccedilatildeo do perfil antigecircnico de outros antiacutegenos eritrocitaacuterios de
importacircncia cliacutenica melhora a seguranccedila transfusional especialmente para pacientes
previamente aloimunizados ou candidatos agrave transfusatildeo crocircnica Para tais pacientes conhecer o
fenoacutetipo eritrocitaacuterio permite a seleccedilatildeo de concentrados de hemaacutecias com o mesmo fenoacutetipo
o que previne reaccedilotildees transfusionais hemoliacuteticas assim como nova aloimunizaccedilatildeo
Indiviacuteduos que apresentam as hemaacutecias sensibilizadas ldquoin vivordquo por anticorpos anti-
eritrocitaacuterios como ocorre na anemia hemoliacutetica autoimune (AHAI) teratildeo o teste direto da
antiglobulina (TDA) positivo dificultando a realizaccedilatildeo da fenotipagem O TDA positivo
provoca resultados falsos positivos especialmente quando satildeo utilizados para a fenotipagem
soros comerciais da classe IgG que exigem a fase de antiglobulina humana ou teste indireto
da antiglobulina (TIA) para leitura Em 1982 Edwards Moulds e Judd propuseram a
utilizaccedilatildeo da teacutecnica da cloroquina para dissociar os complexos de antiacutegeno-anticorpo
preservando a membrana eritrocitaacuteria e permitindo a fenotipagem Atualmente eacute a teacutecnica
mais utilizada nos centros brasileiros A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA foi primeiramente
descrita por Louie Jieng e Zeroulis em 1986 poreacutem eacute pouco utilizada por natildeo haver os
reagentes prontos comercialmente no mercado brasileiro O presente estudo avaliou a teacutecnica
da glicina-aacutecida-EDTA com reagentes preparados ldquoin houserdquo em paralelo agrave teacutecnica da
cloroquina que eacute atualmente a teacutecnica aplicada no Hemocentro de Ribeiratildeo Preto Para isso
amostras de hemaacutecias de doadores (n=50) com fenoacutetipo conhecido foram sensibilizadas com
anticorpos humanos de especificidade conhecida e ambas as teacutecnicas foram aplicadas Foi
verificado ainda o efeito da teacutecnica sobre a expressatildeo dos antiacutegenos eritrocitaacuterios (Fya Fy
b
Jka Jk
b S e s) atraveacutes da fenotipagem das amostras que tiveram o TDA negativado A
viabiliadade dos anticorpos presentes no eluato recuperado apoacutes tratamento com a glicina-
aacutecidaEDTA tambeacutem foi testada A glicina-aacutecidaEDTA foi efetiva em negativar o TDA em
33 amostras (66) comparaacutevel com a cloroquina que negativou 28 amostras (56) O eluato
apresentou-se viaacutevel no tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA e natildeo foi constatada destruiccedilatildeo
dos antiacutegenos eritrocitaacuterios apoacutes o tratamento Concluiacutemos que a teacutecnica da glicina-
aacutecidaEDTA pode ser utilizada como uma opccedilatildeo no tratamento de hemaacutecias com TDA
positivo com a vantagem de seu tempo de execuccedilatildeo ser inferior ao da cloroquina (2minutos x
30 a 120 minutos) o que lhe torna uacutetil em situaccedilotildees de maior urgecircncia Quando ambas as
teacutecnicas satildeo utilizadas em hemaacutecias diferentes de uma mesma amostra a efetividade estaacute
significativamente aumentada (plt005)
Palavras chave Glicina-aacutecidaEDTA Teste direto da antiglobulina AHAI fenotipagem
ABSTRACT
The pre-transfusion tests are the group of immunohematology techniques applied in the
receptor and donor samples in order to provide a unit of red blood cells compatible and safe
for transfusion In addition to the obligatory ABO and Rh phenotyping in the pre-transfusion
tests the determination of the antigenic profile of other red cells antigens of clinical
importance improves transfusion safety especially for patients previously alloimmunized or
candidates for chronic transfusion For such patients knowing the phenotype allows the
selection of red blood cell concentrates with the same phenotype which prevents hemolytic
transfusion reactions as well as new alloimmunization Individuals who have antibody-coated
red blood cells sensitized in vivo such as in autoimmune hemolytic anemia (AHAI) will
have a direct antiglobulin test (DAT) positive making it difficult to perform phenotyping
Positive DAT causes false positive results especially when commercially available IgG
serums which require the human antiglobulin phase or indirect antiglobulin test (IAT) for
reading are used for phenotyping In 1982 Edwards Molds and Judd proposed the use of the
chloroquine technique to dissociate antigen-antibody complexes by preserving the erythrocyte
membrane and allowing phenotyping It is currently the most used technique in Brazilian
centers The EDTAglycine-acid technique was first described by Louie Jieng and Zeroulis in
1986 but it is little used because commercially available reagents are not available in the
Brazilian market The present study evaluated the EDTAglycine-acid technique with reagents
prepared in house in parallel to the chloroquine technique which is currently the technique
applied at the Hemocentro de Ribeiratildeo Preto For this donor red cells samples (n = 50) with
known phenotype were sensitized with human antibodies of known specificity and both
techniques were applied The effect of the technique on the expression of erythrocyte antigens
(Fya Fy
b Jk
a Jk
b S and s) was also verified by the phenotyping of the samples that had
negative DAT The viability of the antibodies present in the recovered eluate after treatment
with EDTAglycine-acid A was also tested EDTAglycine-acid was effective in negatively
affecting DAT in 33 samples (66) comparable to chloroquine that negatived 28 samples
(56) The eluate was viable in treatment with EDTAglycine-acid and no destruction of
erythrocyte antigens after treatment We conclude that the EDTA glycine-acid technique can
be used as an option in the treatment of red cells with TDA positive with the advantage that
its execution time is inferior to that of chloroquine (2 minutes x 30 to 120 minutes) which
makes it useful in emergency situations When both techniques are used in different
erythrocytes of the same sample the effectiveness is significantly increased (p lt005)
Key words EDTAglycine-acid direct antiglobulin test AIHA phenotyping
1 INTRODUCcedilAtildeO
A transfusatildeo de hemaacutecias eacute um recurso terapecircutico muito importante e eficaz e tem se
mostrado como um grande aliado no tratamento de diversas patologias auxiliando na
melhoria da sobrevida e qualidade de vida de diversos pacientes quando indicada de forma
correta Eacute provavelmente a modalidade de terapia mais utilizada no mundo sendo
considerada a forma mais antiga de terapia celular A transfusatildeo de hemaacutecias em pacientes
com anemia grave ou sangramento agudo reestabelece o niacutevel de hemoglobina moleacutecula
responsaacutevel pelo transporte de oxigecircnio para os tecidos melhorando a isquemia tecidual
(BARJAS-CASTRO 2013 ZAGO 2014)
A transfusatildeo de componentes celulares como o concentrado de hemaacutecias deve ser
bem avaliada quanto aos riscos e benefiacutecios Os testes preacute-transfusionais satildeo parte obrigatoacuteria
do processo transfusional e tecircm como funccedilatildeo assegurar que o melhor hemocomponente seja
selecionado para o paciente reduzindo assim a chance de transfusotildees incompatiacuteveis e reaccedilotildees
transfusionais (BARJAS-CASTRO 2013)
11TESTES PREacute-TRANSFUSIONAIS
Os testes preacute-transfusionais tecircm a finalidade de evitar a ocorrecircncia de reaccedilotildees
hemoliacuteticas no receptor decorrentes da transfusatildeo de hemaacutecias incompatiacuteveis do doador
(DOWNES e SHULMAN 2011) Tem como propoacutesito selecionar hemaacutecias que apoacutes
transfusatildeo deveratildeo ter sobrevida normal ou mais proacutexima do normal (MELO 2007)
Os testes preacute-transfusionais que consistem no conjunto de teacutecnicas
imunohematoloacutegicas aplicadas agraves amostras do receptor e doador devem ser realizados antes
de toda transfusatildeo A aplicaccedilatildeo desses testes tem como finalidade fornecer uma unidade de
hemaacutecias compatiacutevel e elevar a seguranccedila da transfusatildeo Os testes preacute-transfusionais aliados
a utilizaccedilatildeo de novas tecnologias tem historicamente evitado reaccedilotildees transfusionais
hemoliacuteticas garantindo a seguranccedila transfusional em cerca de 95 dos pacientes que recebem
transfusatildeo Eacute imprescindiacutevel poreacutem a execuccedilatildeo correta das teacutecnicas envolvidas nos testes preacute-
transfusionais e ainda garantir a identificaccedilatildeo correta do receptor e das amostras de sangue e
das unidades de hemaacutecias (CASTILHO 2000 MELO 2007 BARJAS-CASTRO 2013)
2
Todos os testes que compotildeem a rotina preacute-transfusional usam meacutetodos soroloacutegicos
que envolvem a reaccedilatildeo antiacutegeno x anticorpo Ao testar a presenccedila de um antiacutegeno na
superfiacutecie da hemaacutecia eacute necessaacuterio dispor de um soro com especificidade conhecida para
aquele antiacutegeno Por outro lado testar a presenccedila de um determinado anticorpo no soro ou no
plasma exige o uso de hemaacutecias com perfil antigecircnico conhecido Os testes preacute-transfusionais
incluem tipagem ABO (direta e reversa) tipagem Rh pesquisa de anticorpos irregulares no
sangue do receptor retipagem ABO e Rh do hemocomponente e prova de compatibilidade
entre as hemaacutecias do doador e soro ou plasma do receptor em caso de transfusatildeo de hemaacutecias
ou hemocomponentes que contenham mais de 2 mL de volume eritrocitaacuterio como o
concentrado de granuloacutecitos (BRASIL 2016 GANZELLA 2014 SANTOS 2014)
Aleacutem dos testes regularmente realizados a determinaccedilatildeo do fenoacutetipo para outros
antiacutegenos eritrocitaacuterios do doador e do receptor pode ser indicada A fenotipagem eritrocitaacuteria
determina o perfil antigecircnico para outros antiacutegenos de importacircncia cliacutenica aleacutem do sistema
ABO e do antiacutegeno RhD Ela pode auxiliar a confirmaccedilatildeo de uma especificidade de anticorpo
encontrada no soro do paciente uma vez que espera-se que a sua hemaacutecia natildeo expresse o
antiacutegeno correspondente e simultaneamente eacute utilizada para selecionar um concentrado de
hemaacutecias negativo para o respectivo antiacutegeno evitando reaccedilotildees hemoliacuteticas transfusionais A
fenotipagem de candidatos a transfusotildees crocircnicas tambeacutem eacute recomendada pois esse grupo de
pacientes deve se beneficiar com a transfusatildeo profilaacutetica de unidades de hemaacutecias com
mesmo fenoacutetipo evitando assim a aloimunizaccedilatildeo assim como reaccedilotildees hemoliacuteticas provocadas
por anticorpos previamente existentes e em baixo tiacutetulo natildeo identificados pela triagem de
anticorpos (CASTILHO JUNIOR e REID 2015 DOWNES e SHULMAN 2011)
111 TIPAGEM ABORh
O sistema ABO (ISBT001) foi o primeiro sistema de grupo sanguiacuteneo a ser
descoberto Ele foi descrito em 1900 por Karl Landsteiner e eacute considerado o sistema de maior
importacircncia na praacutetica transfusional Ele eacute composto por quatro antiacutegenos A1 (ABO1) B
(ABO2) AB (ABO3) e A1 (ABO4) e eacute caracterizado pela presenccedila dos anticorpos naturais
ou seja anticorpos que surgem sem a exposiccedilatildeo preacutevia aos antiacutegenos atraveacutes de transfusatildeo ou
gestaccedilatildeo Os anticorpos ABO satildeo predominantemente da classe IgM satildeo capazes de fixar o
complemento e de provocar hemoacutelise grave intravascular caso ocorra transfusatildeo ABO
incompatiacutevel Por apresentar essa caracteriacutestica peculiar a tipagem do sistema ABO eacute
composta de duas etapas a prova direta e a prova reversa Na prova direta eacute realizada a
pesquisa dos antiacutegenos na superfiacutecie das hemaacutecias que satildeo testadas com soros comerciais
3
Anti-A e Anti-B A prova reversa por sua vez pesquisa a presenccedila de anticorpos ABO ao
testar o soro ou plasma do pacientedoador com hemaacutecias A1 e B Ambas as provas satildeo
obrigatoacuterias e devem ser concordantes para interpretaccedilatildeo do fenoacutetipo ABO (COOLING
2011 SANTOS 2014)
O sistema Rh (ISBT004) eacute o maior e mais complexo sistema de grupos sanguiacuteneos
compreendendo atualmente 54 antiacutegenos (ISBT 2016) Satildeo cinco os principais antiacutegenos do
sistema Rh D (RH1) C (RH2) E (RH3) c (RH4) e e (RH5) Esses antiacutegenos possuem alta
capacidade imunogecircnica e seus respectivos anticorpos estatildeo envolvidos na doenccedila hemoliacutetica
perinatal e em reaccedilotildees transfusionais hemoliacuteticas Os autoanticorpos quentes como ocorre na
anemia hemoliacutetica quente satildeo representados em grande parte por anticorpos contra antiacutegenos
puacuteblicos do sistema Rh (CASTILHO 2007 CHOU e WESTHOFF 2011 BARJAS-
CASTRO 2013) A tipagem RhD pesquisa o antiacutegeno D na membrana eritrocitaacuteria ao testar a
hemaacutecia com antissoros comerciais Atualmente a maior parte dos soros Anti-D
comercializados satildeo monoclonais
112 ANTICORPOS ANTI-ERITROCITAacuteRIOS
Anticorpos satildeo proteiacutenas presentes no plasma tambeacutem denominadas imunoglobulinas
Satildeo produzidas pelo sistema imune em resposta a um determinado antiacutegeno Podem ser
classificadas de acordo com suas caracteriacutesticas e propriedades em cinco classes de
imunoglobulinas IgG IgM IgA IgE e IgD (BARJAS-CASTRO 2013)
A ligaccedilatildeo entre o antiacutegeno e o anticorpo envolvem ligaccedilotildees natildeo covalentes que satildeo
reversiacuteveis Vaacuterios tipos de interaccedilotildees natildeo covalentes podem contribuir para a ligaccedilatildeo do
antiacutegeno pelo anticorpo incluindo forccedilas eletrostaacuteticas pontes de hidrogecircnio forccedilas de Van
der Walls e interaccedilotildees hidrofoacutebicas (ABBAS LICHTMAN e PILLAI 2008)
As interaccedilotildees antiacutegeno-anticorpo satildeo constituiacutedas por ligaccedilotildees dinacircmicas que sofrem
interferecircncia de alteraccedilotildees fiacutesico-quiacutemicas no meio como mudanccedilas na temperatura na forccedila
eletrostaacutetica na concentraccedilatildeo do antiacutegeno e do anticorpo e no pH O melhor pH para a reaccedilatildeo
eacute em torno de 70 no entanto raros anticorpos podem exigir acidificaccedilatildeo do meio para serem
identificados (SANTOS 2014)
Em imunohematologia satildeo pesquisados os anticorpos que reconhecem os antiacutegenos
eritrocitaacuterios de grupo sanguiacuteneo ldquoin vivordquo esses anticorpos dependendo de seu significado
cliacutenico satildeo capazes de reconhecer seus respectivos antiacutegenos sobre a hemaacutecia podendo levar
a sua destruiccedilatildeo por dois mecanismos fagocitose por macroacutefagos no sistema
4
reticuloendotelial ou por ativaccedilatildeo do sistema complemento com a formaccedilatildeo do complexo de
ataque a membrana e hemoacutelise intravascular As duas classes de anticorpos de maior
importacircncia em imunohematologia satildeo as imunoglobulinas IgG e a IgM (SANTOS 2014)
Devido a sua estrutura pentameacuterica os anticorpos da classe IgM se ligam aos
antiacutegenos localizados na superfiacutecie da membrana de hemaacutecias proacuteximas e promovem
aglutinaccedilatildeo das mesmas em meio salino ldquoin vitrordquo Anticorpos da classe IgG por sua vez
satildeo denominados ldquonatildeo aglutinantesrdquo ou ldquoincompletosrdquo pois sua estrutura de monocircmero eacute
pequena o que desfavorece a aglutinaccedilatildeo direta uma vez que uma mesma moleacutecula de IgG
natildeo alcanccedila antiacutegenos alvos em duas hemaacutecias proacuteximas Os anticorpos IgM aleacutem de terem
um tamanho maior apresentam 750 vezes maior eficiecircncia de aglutinaccedilatildeo que os anticorpos
IgG permitindo maior facilidade nas ligaccedilotildees entre as hemaacutecias (CARRUCIO e WISE 2012
GREEN e KLOSTERMANN 2012)
Nos testes ldquoin vitrordquo satildeo simulados reaccedilotildees que poderiam ocorrer ldquoin vivordquo causando
reaccedilotildees indesejaacuteveis A fase de sensibilizaccedilatildeo em que o anticorpo se liga ao antiacutegeno
correspondente natildeo eacute identificada macroscopicamente poreacutem uma vez que o anticorpo
aproxima as hemaacutecias e vence a forccedila eletrostaacutetica que naturalmente as repele chamada de
potencial zeta ocorre a aglutinaccedilatildeo Dependendo das caracteriacutesticas do anticorpo e de sua
capacidade de fixar complemento pode ocorrer tambeacutem a hemoacutelise (SANTOS 2014)
113 PESQUISA E IDENTIFICACcedilAtildeO DE ANTICORPOS IRREGULARES
A pesquisa de anticorpos irregulares eacute teste obrigatoacuterio nos testes preacute-transfusionais e
tem a finalidade de detectar anticorpos ldquoin vitrordquo que possam causar reaccedilatildeo ldquoin vivordquo
Dependendo da populaccedilatildeo estudada (pacientes x doadores) e ainda da sensibilidade do
teste a frequecircncia de anticorpos irregulares pode variar de 03 a 38 A imunizaccedilatildeo pode
ocorrer por transfusatildeo gestaccedilatildeo transplante ou injeccedilatildeo de material imunogecircnico (WALKER
2011)
Os anticorpos irregulares podem ser classificados como aloanticorpos que satildeo
voltados contra antiacutegenos ausentes na hemaacutecia autoacuteloga ou como autoanticorpos os quais
reconhecem antiacutegenos eritrocitaacuterios proacuteprios Os autoanticorpos antieritrocitaacuterios surgem em
decorrecircncia da desregulaccedilatildeo da autotoleracircncia imune relacionada agrave condiccedilotildees diversas como
doenccedilas hematoloacutegicas doenccedilas inflamatoacuterias autoimunes neoplasias infecccedilotildees e uso de
medicaccedilotildees A presenccedila do autoanticorpo associado a um quadro de anemia hemoliacutetica
caracteriza a anemia hemoliacutetica autoimune (AHAI) seja ela primaacuteria ou secundaacuteria agrave outra
5
patologia Ateacute 12 a 40 dos pacientes com autoanticorpos quentes podem apresentar
aloanticorpos de significado cliacutenico mascarados pelos autoanticorpos (SHIREY et al 2002)
Eacute importante detectar a presenccedila de anticorpos no plasmasoro de um receptor de
transfusatildeo para garantir que seja transfundido sangue compatiacutevel Quando a pesquisa de
anticorpo irregular resultar positiva para um ou mais anticorpos de relevacircncia clinica eacute
necessaacuterio confirmar a ausecircncia do respectivo antiacutegeno na hemaacutecia do receptor assim como
selecionar para transfusatildeo concentrados de hemaacutecias tambeacutem negativos para aqueles
antiacutegenos evitando assim reaccedilotildees transfusionais (WALKER 2011)
A detecccedilatildeo de um anticorpo irregular eacute inicialmente realizada pela triagem de
anticorpos na qual o soroplasma do receptor eacute testado com 2 a 3 hemaacutecias do tipo ldquoOrdquo O
conjunto de fenoacutetipos dessas hemaacutecias deve contemplar os antiacutegenos de maior importacircncia
cliacutenica Como os anticorpos irregulares de maior interesse cliacutenico satildeo na maior parte das
vezes imunes portanto da classe IgG eacute obrigatoacuteria a fase de antiglobulina (AGH) do teste
ou teste indireto da antiglobulina (TIA) uma vez que esses anticorpos satildeo incompletos
(CASTILHO JUNIOR e REID 2015) O teste de triagem estando positivo deve-se fazer a
identificaccedilatildeo da especificidade do anticorpo utilizando um painel com maior nuacutemero de
hemaacutecias fenotipadas
114 PROVA DE COMPATIBILIDADE
A prova de compatibilidade eacute um teste obrigatoacuterio em caso de transfusatildeo de
componentes eritrocitaacuterios Tambeacutem chamada de prova de compatibilidade maior deve ser
realizada antes da administraccedilatildeo de sangue total ou concentrado de hemaacutecias utilizando-se
hemaacutecias obtidas do tubo coletor da bolsa a ser transfundida e o soro ou plasma do receptor
(BRASIL 2016)
Eacute definido como o procedimento para excluir a incompatibilidade entre o doador e o
receptor Tem o objetivo de detectar anticorpos que podem natildeo ter sido encontrados na
pesquisa de anticorpos devido a ausecircncia ou pouca expressatildeo de antiacutegenos no painel de
hemaacutecias aleacutem da possibilidade de terem ocorrido erros teacutecnicos ou notacionais durante a
realizaccedilatildeo da pesquisa (MELO 2007)
6
115 FENOTIPAGEM PARA OUTROS SISTEMAS
Aleacutem da pesquisa de ABORh que eacute realizado rotineiramente a fenotipagem para
outros sistemas tambeacutem denominado ldquofenotipagem estendidardquo determina a presenccedila ou
ausecircncia de antiacutegenos considerados de importacircncia cliacutenica A fenotipagem natildeo eacute obrigatoacuteria
nos testes preacute-transfusionais poreacutem a legislaccedilatildeo atual recomenda a realizaccedilatildeo da fenotipagem
eritrocitaacuteria dos antiacutegenos C (RH2) E (RH3) c (RH4) e (RH5) K (KELL1) Fya (FY1) Fy
b
(FY2) Jka
(JK1) Jkb (JK2) S (MNS3) e s (MNS4) para pacientes aloimunizados e pacientes
com indicaccedilatildeo de transfusatildeo crocircnica (BRASIL 2016)
A seleccedilatildeo de concentrados de hemaacutecias com o mesmo fenoacutetipo do receptor para
transfusatildeo pode evitar reaccedilotildees transfusionais hemoliacuteticas no paciente previamente
aloimunizado tambeacutem previne a sensibilizaccedilatildeo por outros antiacutegenos o que normalmente
torna as transfusotildees seguintes ainda mais complicadas A fenotipagem do paciente tambeacutem
auxilia na identificaccedilatildeo dos anticorpos pois espera-se que nas hemaacutecias do paciente o
antiacutegeno seja negativo para o anticorpo encontrado servindo de guia para teste de exclusatildeo de
anticorpos (SANTOS 2014 WALKER 2011)
A incidecircncia de aloanticorpos aumenta com o nuacutemero de transfusotildees no entanto a
implantaccedilatildeo de rotina de fenotipagem com transfusatildeo profilaacutetica de hemaacutecias com fenoacutetipo
compatiacutevel para pacientes candidatos agrave politransfusatildeo como os portadores de doenccedila
falciforme talassemia anemia aplaacutestica doenccedilas linfo e mieloproliferativas renais crocircnicos e
anemias refrataacuterias pode contribuir para o baixo iacutendice de sensibilizaccedilatildeo nessas populaccedilotildees
(FLUIT KUNST e DRENTHE-SCHONK 1999 MARTINS et al 2008 e VICHINSKY et
al 2001) Outro grupo de pacientes que se beneficia com a transfusatildeo de mesmo fenoacutetipo satildeo
os pacientes com AHAI uma vez que o autoanticorpo pode mascarar a presenccedila de um
aloanticorpo de significado cliacutenico em ateacute 40 dos casos Mesmo com as teacutecnicas utilizadas
ldquoin vitrordquo para remover a interferecircncia do autoanticorpo no soro um aloanticorpo pode natildeo
ser identificado e dessa forma transfundir o mesmo fenoacutetipo do paciente evitaria reaccedilatildeo
hemoliacutetica pelos anticorpos voltados contra antiacutegenos de maior importacircncia cliacutenica e de
frequecircncia intermediaacuteria Aleacutem disso os pacientes com AHAI satildeo fortes respondedores e a
transfusatildeo profilaacutetica do mesmo fenoacutetipo previne a aloimunizaccedilatildeo (SHIREY et al 2002)
Aleacutem de fenotipar o receptor eacute importante tambeacutem que os bancos de sangue tenham
rotinas de fenotipagem de doadores para atender as necessidade dos pacientes aloimunizados
ou em esquema de transfusatildeo crocircnica (PINTO BRAGA e SANTOS 2011)
7
Rotineiramente eacute inviaacutevel estabelecer o fenoacutetipo eritrocitaacuterio completo de um
indiviacuteduo pela grande diversidade de sistemas sanguiacuteneos descritos Ate junho de 2015 jaacute
haviam sido classificados 308 antiacutegenos atribuiacutedos a 36 sistemas definidos pela Sociedade
Internacional de Transfusatildeo de Sangue (ISBT) (CASTILHO JUNIOR e REID 2015)
Portanto o paciente eacute normalmente fenotipado para os antiacutegenos de maior importacircncia
clinica
Alguns fatores podem limitar a realizaccedilatildeo da fenotipagem eritrocitaacuteria Um dos fatores
eacute a transfusatildeo alogecircnica realizada haacute menos de 90 dias Neste caso podem ocorrer resultados
falso positivos para determinados antiacutegenos devido agrave presenccedila de hemaacutecias do doador
(LAINE et al 2000)
Outro fator eacute a presenccedila de anticorpo sensibilizando a hemaacutecia do paciente e
provocando positividade do teste direto da antiglobulina humana (TDA) Os soros
normalmente utilizados para fenotipagem especialmente para os antiacutegenos Fya
(FY1) Fyb
(FY2) Jka
(JK1) Jkb
(JK2) S (MNS3) e s (MNS4) necessitam da fase de antiglobulina
humana (AGH) para que ocorra aglutinacatildeo Amostras que apresentam o TDA positivo
aglutinam apoacutes reaccedilatildeo com a AGH natildeo pela real presenccedila do antiacutegeno em sua superfiacutecie mas
pela interaccedilatildeo da AGH com o anticorpo que estaacute sensibilizando o eritroacutecito A interferecircncia
do TDA positivo pode ser anulada atraveacutes de algumas teacutecnicas capazes de dissociar o
anticorpo como por exemplo o tratamento da hemaacutecia sensibilizada com cloroquina ou com
glicina-aacutecida-EDTA (BRANCH e PETZ 1999 SHIREY et al 2002 e LEGER 2011)
12 METODOLOGIAS APLICADOS Agrave ROTINA IMUNO-HEMATOLOacuteGICA
Todos os testes que compotildeem a rotina preacute-transfusional usam meacutetodos soroloacutegicos
que envolvem a reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo e tem como objetivo determinar o perfil antigecircnico
eritrocitaacuterio do receptor e do doador assim como identificar em seu soro a presenccedila de
anticorpos contra antiacutegenos eritrocitaacuterios que possam comprometer a sobrevida das hemaacutecias
transfundidas Para testar o antiacutegeno na superfiacutecie da hemaacutecia eacute necessaacuterio dispor de um
antissoro com especificidade conhecida para aquele antiacutegeno Por outro lado para testar a
presenccedila de um determinado anticorpo no soro ou plasma do receptor eacute necessaacuterio o uso de
hemaacutecias com perfil antigecircnico conhecido (SANTOS 2014)
Diversas metodologias satildeo aplicadas nos laboratoacuterios de imunohematologia Cada
serviccedilo de hemoterapia faz a escolha do meacutetodo que seraacute aplicado de acordo com o perfil do
laboratoacuterio com o volume de exames diaacuterios e tambeacutem com o custo envolvido Todas essas
8
teacutecnicas tecircm como objetivo comum demonstrar a reaccedilatildeo entre antiacutegeno e anticorpo no
entanto elas se baseiam em diferentes princiacutepios Muitas metodologias satildeo atualmente
aplicadas agrave imunohematologia entre elas o sistema de fase soacutelida a tecnologia de hemaacutecias
magnetizadas a biologia molecular e ateacute mesmo a citometria de fluxo no entanto os meacutetodos
mais tradicionais satildeo aqueles baseados no princiacutepio de hemaglutinaccedilatildeo
121 MEacuteTODOS DE FASE FLUacuteIDA
Os meacutetodos de fase fluiacuteda satildeo testes baseados na hemaglutinaccedilatildeo e incluem o teste em
tubo e o teste em microplacas Uma suspensatildeo de hemaacutecias eacute adicionada ao plasma ou soro
em seguida eacute realizada a centrifugaccedilatildeo e por fim eacute feita a leitura do resultado que eacute
considerado positivo se for observado algum grau de aglutinaccedilatildeo ou hemoacutelise A intensidade
de aglutinaccedilatildeo eacute graduada de acordo com o tamanho dos agregados desprendidos da
superfiacutecie apoacutes agitaccedilatildeo delicada do tubo ou microplaca Os meacutetodos de hemaglutinaccedilatildeo satildeo
aplicados a todos os testes preacute-transfusionais Como os anticorpos ABO satildeo aglutininas frias
a tipagem eacute realizada em temperatura ambiente (22degC) no entanto ao investigar a presenccedila
de anticorpos irregulares que como jaacute mencionado eacute na maioria das vezes anticorpos
incompletos da classe IgG eacute essencial que a reaccedilatildeo seja incubada a 37degC As reaccedilotildees satildeo
facilitadas com a utilizaccedilatildeo de potencializadores e da antiglobulina humana (WALKER e
HARMENING 2012 AABB 2011)
Nos meacutetodos de fase fluiacuteda nos quais a AGH eacute empregada a fase de lavagem eacute
fundamental Apoacutes a incubaccedilatildeo do soro com as hemaacutecias deve ser realizada a lavagem da
reaccedilatildeo para remover o excesso de anticorpos natildeo ligados agraves hemaacutecias jaacute que os anticorpos
livres podem bloquear a AGH quando ela eacute adicionada e levar a resultados falso negativos
(AABB 2011)
Os testes de hemaglutinaccedilatildeo satildeo os mais tradicionais entre os meacutetodos ainda hoje
aplicados agrave rotina de bancos de sangue A vantagem desses meacutetodos eacute o baixo custo quando
comparado agraves teacutecnicas mais modernas mas apresentam tambeacutem desvantagens A teacutecnica em
tubo por exemplo natildeo permite automaccedilatildeo eacute trabalhosa e exige matildeo-de-obra bastante treinada
na execuccedilatildeo das diversas etapas do teste e mesmo assim pode haver subjetividade na
interpretaccedilatildeo dos resultados aleacutem de resultados falso-negativos (DOWNES 2011 ZANTEK
et al 2012)
9
122 COLUNAS DE GEL
A teacutecnica em gel iniciada na deacutecada de 90 representou uma grande revoluccedilatildeo na
rotina laboratorial tornando-se muito popular Aleacutem de ser sensiacutevel a teacutecnica dispensa a fase
de lavagem antes da adiccedilatildeo da AGH assim como a agitaccedilatildeo do teste para leitura reduzindo o
nuacutemero de resultados falsos negativos decorrentes dessas duas etapas e o tempo para
execuccedilatildeo dos testes (LAPIERRE et al 1989 NOVARETTI et al 2000 NOVARETTI et
al 2004) Os reagentes satildeo comercializados na forma de cartotildees plaacutesticos contendo
microtubos preenchidos por gel composto por microesferas de acrilamida-dextran Nesta
metodologia tambeacutem baseada na hemaglutinaccedilatildeo a suspensatildeo de hemaacutecias e o soro satildeo
depositados em uma cacircmara acima da coluna de gel e em seguida procede-se com a
centrifugaccedilatildeo dos cartotildees As microesferas atuam como uma malha que permite a passagem
em direccedilatildeo ao fundo do microtubo apenas das hemaacutecias natildeo aglutinadas enquanto as
hemaacutecias aglutinadas ficam retidas na parte superior da coluna ou ao longo dela (GREEN e
KLOSTERMANN 2012) Portanto quanto maior a agregaccedilatildeo mais hemaacutecias ficam retidas
no topo da coluna Dependendo do tipo de teste a ser realizado pode ser utilizado gel neutro
ou gel especiacutefico impregnado pelo anticorpo desejado e o gel contendo antiglobulina humana
que satildeo utilizados para os testes diretos e indiretos da antiglobulina (LAPIERRE et al 1989)
A coluna de gel ainda permite a visualizaccedilatildeo clara de duas populaccedilotildees distintas de hemaacutecias
como em pacientes receacutem transfundidos
123 BIOLOGIA MOLECULAR
A biologia molecular ou genotipagem estaacute sendo cada vez mais aplicada aos grupos
sanguiacuteneos pois fornece resultados seguros e precisos especialmente nos casos em que natildeo eacute
possiacutevel a realizaccedilatildeo da fenotipagem como em pacientes receacutem-transfundidos e pacientes
com TDA positivo Na genotipagem eacute possiacutevel determinar atraveacutes do DNA do paciente
extraiacutedo de seus leucoacutecitos de sangue perifeacuterico o fenoacutetipo eritrocitaacuterio deduzido sem
qualquer interferecircncia do anticorpo que sensibiliza a hemaacutecia ou de hemaacutecias alogecircnicas
transfundidas Sua realizaccedilatildeo no entanto exige o treinamento de equipe especializada e capaz
de interpretar os resultados em conjunto com os achados soroloacutegicos (JUNIOR e OLIVATO
2007)
Apesar de ser uma ferramenta de grande importacircncia hoje na imuno-hematologia
ainda estaacute restrito aos grandes centros de hemoterapia no Brasil poucos serviccedilos puacuteblicos de
sauacutede dispotildeem desse recurso e utilizam teacutecnicas de genotipagem de grupos sanguiacuteneos para
atendimento a seus pacientes Esta abordagem poreacutem vem sendo introduzida em algumas
10
instituiccedilotildees de reconhecida competecircncia na hemoterapia mas sua disponibilizaccedilatildeo deve
tornar-se mais generalizada atraveacutes da formaccedilatildeo de centros de referecircncia para atendimento
das diversas unidades de hemoterapia (MARTINS et al 2009) Dessa forma muitas decisotildees
transfusionais especialmente em urgecircncias ainda devem ser tomadas sem o resultado da
genotipagem eritrocitaacuteria
13 TESTE DA ANTIGLOBULINA
Coombs Mourant e Race descreveram em 1945 uma teacutecnica com utilizando soro de
coelho contendo antiglobulina humana (AGH) que posteriormente foi chamada de ldquosoro de
Coombsrdquo O meacutetodo foi desenvolvido inicialmente para ampliar o efeito de aglutininas fracas
do sistema Rh anticorpos ldquoincompletosrdquo que normalmente natildeo apresentavam aglutinaccedilatildeo
visiacutevel O teste foi concebido como um instrumento de investigaccedilatildeo de doenccedila hemoliacutetica do
receacutem-nascido e de reaccedilotildees transfusionais causadas por anticorpos Rh que estavam presentes
no soro dos paciente poreacutem que natildeo eram demonstraacuteveis pelas teacutecnicas ateacute entatildeo existentes
A maior parte dos anticorpos de significado cliacutenico assim como seus respectivos
antiacutegenos foram descritos apoacutes o surgimento do ldquosoro de Coombsrdquo em 1945 sendo assim o
teste da antiglobulina representa ateacute hoje a forma mais importante de aglutinaccedilatildeo artificial em
imunohematologia permitindo revelar a presenccedila de anticorpos na membrana da hemaacutecia A
antiglobulina humana eacute constituiacuteda por anticorpo especiacutefico contra a porccedilatildeo Fc de outro
anticorpo Quando um anticorpo ldquoincompletordquo sensibiliza a hemaacutecia normalmente natildeo
provoca aglutinaccedilatildeo visiacutevel Apoacutes a adiccedilatildeo da AGH ao meio esta reconhece e se liga agraves
porccedilotildees Fc dos anticorpos que sensibilizam a hemaacutecia formando assim uma malha e
provocando aglutinaccedilatildeo visiacutevel (BARJAS-CASTRO 2013)
Os reagentes de antiglobulina podem ser poliespeciacuteficos ou monoespeciacuteficos Os
poliespeciacuteficos satildeo uma mistura de anticorpos ant-IgG e anti-C3d (fraccedilatildeo C3d do
complemento) Os reagentes monoespecificos podem ser anti-IgG anti-IgM anti-IgA anti-
complemento podendo ser anti-C3d e anti-C3b
O teste da antiglobulina pode ser usado para detectar hemaacutecias sensibilizadas com
aloanticorpos IgG autoanticorpos IgG e componentes do complemento A sensibilizaccedilatildeo
pode ocorrer ldquoin vivordquo ou ldquoin vitrordquo O uso do AGH para detectar a sensibilizaccedilatildeo ldquoin vitrordquo
tem dois estaacutegios e eacute denominado teste indireto da antiglobulina A sensibilizaccedilatildeo ldquoin vivordquo eacute
detectada em procedimento de um uacutenico estagio chamado teste direto da antiglobulina (TDA)
11
Os testes direto e indireto satildeo ateacute hoje amplamente aplicados como princiacutepio de inuacutemeros
testes soroloacutegicos em imuno-hematologia (GREEN e KLOSTERMANN 2012)
131 TESTE DIRETO DA ANTIGLOBULINA
O teste direto da antiglobulina humana revela a presenccedila de anticorpo eou fraccedilatildeo do
complemento ligados agrave superfiacutecie das hemaacutecias As sensibilizaccedilatildeo das hemaacutecias ocorrida ldquoin
vivordquo natildeo eacute visualizada mas apoacutes a adiccedilatildeo da antiglobulina humana ocorre a aglutinaccedilatildeo que
eacute visualizada macroscopicamente (Figura 1)
Figura 1 - Princiacutepio da teacutecnica direta da antiglobulina Teste utilizado para demonstrar a sensibilizaccedilatildeo ldquoin
vivordquo das hemaacutecias O sangue total eacute coletado do paciente em tubo contendo anticoagulante EDTA Na teacutecnica
realizada em tubo uma suspensatildeo de hemaacutecias 5 em soluccedilatildeo de salina eacute preparada Uma gota dessa suspensatildeo
eacute lavada 3 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica para retirada de anticorpos que estatildeo livres no plasma Toda soluccedilatildeo eacute
retirada e adiciona-se o soro de Coombs (antiglobulina humana) O soro de Coombs reconhece os anticorpos que
estatildeo ligados agrave superfiacutecie das hemaacutecias fazendo com que ocorra aglutinaccedilatildeo visiacutevel macroscopicamente
Apesar de natildeo ser um teste preacute-transfusional obrigatoacuterio o TDA eacute um dos testes mais
importantes para investigar e classificar quadros hemoliacuteticos como de origem imune ou natildeo
imune O seu valor preditivo positivo em vigecircncia de anemia hemoliacutetica eacute de 83 poreacutem natildeo
havendo sinais de hemoacutelise seu valor preditivo eacute apenas 14 Eacute por esse motivo que a
interpretaccedilatildeo do TDA positivo deve levar em consideraccedilatildeo a histoacuteria cliacutenica e os resultados
dos outros exames laboratoriais A realizaccedilatildeo do TDA eacute obrigatoacuteria na investigaccedilatildeo
12
laboratorial de diversos quadros hemoliacuteticos entre eles a anemia hemoliacutetica autoimune
(AHAI) a reaccedilatildeo hemoliacutetica imune poacutes-transfusional a siacutendrome do linfoacutecito passageiro a
doenccedila hemoliacutetica perinatal e a hemoacutelise droga-dependente (LEGER 2011)
Resultados de TDA positivos foram tambeacutem observados em indiviacuteduos com niacuteveis
seacutericos elevados de IgG ou complemento sem evidecircncia de anemia hemoliacutetica imune como
em pacientes com doenccedila falciforme talassemia doenccedila renal crocircnica mieloma muacuteltiplo
doenccedilas autoimunes e siacutendrome da imunodeficiecircncia adquirida (SIDA) Aleacutem disso pequenas
quantidades de IgG (5 a 90 moleacuteculas por hemaacutecia) e complemento (5 a 40 moleacuteculas por
hemaacutecia) podem estar presentes nas hemaacutecias de indiviacuteduos saudaacuteveis sem associaccedilatildeo com
reduccedilatildeo na sobrevida das mesmas A positividade do TDA depende da populaccedilatildeo estudada e
pode variar de 01 entre doadores de sangue sem qualquer sinal cliacutenico de hemoacutelise ateacute
15 em pacientes hospitalizados (CASTILHO JUNIOR e REID 2015 LEGER 2011)
Indiviacuteduos que apresentam TDA positivo seja agraves custas de IgG eou complemento
com ou sem sinais cliacutenicos de hemoacutelise teratildeo a fenotipagem eritrocitaacuteria prejudicada A
fenotipagem de indiviacuteduos com TDA positivo especialmente quando utilizado o teste indireto
da antiglobulina pode acarretar resultados falsos positivos e levar a seleccedilatildeo de fenoacutetipo
incorreto para transfusatildeo
132 TESTE INDIRETO DA ANTIGLOBULINA
O teste indireto da antiglobulina (TIA) eacute utilizado para revelar a sensibilizaccedilatildeo ldquoin
vitrordquo das hemaacutecias e eacute aplicado a diversos testes soroloacutegicos em imunohematologia entre
eles a pesquisa de anticorpos identificaccedilatildeo de anticorpos testes de compatibilidade
fenotipagem eritrocitaacuteria e titulaccedilatildeo de anticorpos Na teacutecnica indireta a hemaacutecia que contecircm
o antiacutegeno eacute colocada em contato ldquoin vitrordquo com o anticorpo que se liga mas natildeo promove a
aglutinaccedilatildeo visiacutevel A adiccedilatildeo da AGH forma uma malha entre os anticorpos que sensibilizam
as hemaacutecias e provoca a aglutinaccedilatildeo macroscoacutepica (figura 2)
Caso a amostra de hemaacutecia estudada seja previamente sensibilizada resultados falsos
positivos podem ser obtidos no TIA jaacute que a AGH reagiraacute com a moleacutecula que sensibilizava
anteriormente a hemaacutecia mesmo se o anticorpo especiacutefico natildeo tiver se ligado ao antiacutegeno
correspondente
13
133 CONDICcedilOtildeES CLIacuteNICAS COM TDA POSITIVO
O TDA positivo deve ser interpretado cuidadosamente sempre em conjunto com o
quadro cliacutenico do paciente A positividade isolada do TDA natildeo significa hemoacutelise A
interpretaccedilatildeo do teste positivo requer o conhecimento do diagnoacutestico do paciente da presenccedila
de sinais e sintomas sugestivos de hemoacutelise assim como de seu histoacuterico transfusional
gestacional e de informaccedilotildees sobre o uso recente de medicaccedilotildees (LEGER 2011)
Figura 2 ndash Princiacutepio do teste indireto da antiglobulina O TIA pode ser utilizado na pesquisa de anticorpos de
especificidades desconhecidas livres no soroplasma como eacute o caso da pesquisa e identificaccedilatildeo de anticorpos
irregulares Ele eacute tambeacutem utilizado para determinar a presenccedila de antiacutegenos na membrana da hemaacutecia quando
satildeo empregados soros de especificidades conhecidas da classe IgG No primeiro caso o soroplasma contendo o
anticorpo desconhecido eacute colocado em contato com hemaacutecias cujo perfil antigecircnico eacute conhecido No segundo
caso utiliza-se soro de especificidade conhecida da classe IgG para determinar a presenccedila ou ausecircncia de um
antiacutegeno na membrana O anticorpo encontra o antiacutegeno correspondente e ocorre a ligaccedilatildeo do anticorpo agrave
hemaacutecia mas natildeo ocorre aglutinaccedilatildeo Apoacutes a adiccedilatildeo da AGH que se liga aos anticorpos formando uma malha
ocorre a aglutinaccedilatildeo visiacutevel
O TDA positivo eacute uma achado claacutessico de algumas condiccedilotildees cliacutenicas como a reaccedilatildeo
transfusional hemoliacutetica a doenccedila hemoliacutetica do feto e do receacutem-nascido (DHFRN) a anemia
hemoliacutetica induzida por drogas a siacutendrome do linfoacutecito passageiro e a anemia hemoliacutetica
autoimune (AHAI) Portanto o TDA positivo pode ser decorrente da sensibilizaccedilatildeo da
hemaacutecia autoacuteloga por um autoanticorpo ou por um aloanticorpo ligado agrave hemaacutecia alogecircnica
circulante A positividade do TDA pode ainda ocorrer de forma passiva em pacientes que
14
recebem imunoglobulinas humanas ou ainda pela transfusatildeo de plaquetas ABO natildeo idecircntico
(LEGER 2011 RALPH 2012 ZANTEK et al 2012)
Nas reaccedilotildees transfusionais hemoliacuteticas imunes o aloanticorpo do receptor sensibiliza
as hemaacutecias transfundidas do doador e reduz sua sobrevida ao removecirc-la precocemente da
circulaccedilatildeo pela fagocitose no sistema retiacuteculo-endotelial ou pela hemoacutelise intravascular As
reaccedilotildees podem ser agudas se ocorrem ateacute 24 horas ou tardias quando ocorrem apoacutes 24 horas
da transfusatildeo A gravidade das reaccedilotildees hemoliacuteticas pode variar de um simples rendimento
transfusional inadequado agrave quadros graves de hemoacutelise intravascular evoluindo ateacute mesmo
com choque vascular e oacutebito O TDA pode resultar negativo caso toda massa eritrocitaacuteria
transfundida tenha sido destruiacuteda (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
Na doenccedila hemoliacutetica do feto e do receacutem-nascido (DHFRN) anticorpos maternos da
classe IgG atravessam a barreira placentaacuteria e sensibilizam as hemaacutecias fetais que seratildeo
destruiacutedas precocemente levando agrave anemia fetal Apesar da incompatibilidade ABO feto-
materna ser a causa mais frequente de DHFRN raramente ela eacute responsaacutevel pela ocorrecircncia
de quadros graves Por outro lado anticorpos contra antiacutegenos do sistema Rh e Kell
especialmente Anti-D (Anti-RH1) Anti-c (Anti-RH4) e Anti-Kell (Anti-KELL1) satildeo
conhecidos por causar DHFRN severa Raramente outros anticorpos tambeacutem podem estar
implicados na DHFRN como os anticorpos contra antiacutegenos do sistema Kidd Duffy MNS e
Diego (ZANTEK et al 2012)
A hemoacutelise droga-dependente eacute causada pela produccedilatildeo de um anticorpo voltado contra
a droga ligada agrave membrana eritrocitaacuteria ou ainda contra o complexo droga-membrana A
classe de medicaccedilotildees mais comumente envolvida eacute a dos antimicrobianos betalactacircmicos
(penicilinas e cefalosporinas) mas outras classes como quimioteraacutepicos e anti-inflamatoacuterios
tambeacutem satildeo descritos (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
Apoacutes transplante de ceacutelulas progenitoras hematopoieacuteticas em que o doador possui
anticorpos contra antiacutegenos eritrocitaacuterios do receptor o linfoacutecito de memoacuteria do doador pode
resistir ao esquema imunossupressor utilizado e continuar a produccedilatildeo de anticorpos que
reconhecem a hemaacutecia incompatiacutevel do receptor ainda circulante O quadro cliacutenico pode
variar de um simples TDA positivo sem outros sinais ou sintomas ateacute um quadro hemoliacutetico
grave e abrupto (LEGER 2011)
15
134 ANEMIA HEMOLIacuteTICA AUTOIMUNE
A anemia hemoliacutetica autoimune eacute caracterizada pela destruiccedilatildeo precoce das hemaacutecias
autoacutelogas por autoanticorpos que sensibilizam as hemaacutecias e levam agrave fagocitose pelos
macroacutefagos no sistema reticulo-endotelial ou hemoacutelise intravascular O diagnoacutestico da AHAI
baseia-se na presenccedila de hemoacutelise cliacutenica associada agrave evidecircncia de fator imune representado
pelo TDA positivo As classes de anticorpos envolvidas em quadros de AHAI satildeo IgG IgM e
raramente IgA (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012) Satildeo raros os casos de AHAI com TDA
negativo que podem estar relacionados a um autoanticorpo de baixa avidez de densidade
inferior agrave detecccedilatildeo do meacutetodo ou ainda de classe de imunoglobulina natildeo avaliada pelo
meacutetodo utilizado para o teste (GARRATY 2005)
A AHAI pode ser classificada em dois grupos principais de acordo com a melhor
temperatura de reaccedilatildeo do autoanticorpo As anemias hemoliacuteticas causadas por anticorpos
quentes que reagem melhor a 37oC e geralmente IgG representam 80 dos casos de AHAI
Nas AHAI por anticorpo quente o TDA pode ser positivo para IgG mais complemento (67)
somente IgG (20) ou somente por complemento (13) As anemias causadas por
anticorpos frios geralmente da classe IgM e que reagem melhor em temperatura ambiente ou
a 4oC representam aproximadamente 20 dos casos de AHAI Por exibirem amplitude
teacutermica esses anticorpos ligam-se agraves hemaacutecias ao atingirem a circulaccedilatildeo nas extremidades do
corpo fixam o complemento e desprendem-se da hemaacutecia apoacutes retornar para partes mais
quentes Por esse motivo em AHAI por anticorpos frios o TDA eacute positivo apenas agraves custas
de C3 e normalmente o IgM natildeo eacute detectado (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
A presenccedila do autoanticorpo IgG pode ser confirmada atraveacutes da eluiccedilatildeo do anticorpo
da hemaacutecia Tipicamente o eluato na AHAI por anticorpo quente reage com todas as ceacutelulas
testadas de um painel de hemaacutecias alogecircnicas do tipo ldquoOrdquo ou pode eventualmente exibir uma
especificidade conhecida como Anti-e (Anti-RH5) Nas AHAI a frio por sua vez espera-se
um eluato negativo (LEGER 2011)
Os autoanticorpos satildeo com frequecircncia encontrados livres no plasma e natildeo somente
ligados agraves hemaacutecias autoacutelogas Eles podem interferir em todas as fases dos testes preacute-
transfusionais nas quais o plasma eacute testado especialmente os autoanticorpos quentes que
acarretam resultados positivos em todos os testes levados agrave fase de antiglobulina humana
Esses anticorpos portanto positivam a pesquisa de anticorpos irregulares e mascaram a
presenccedila de aloanticorpos de significado cliacutenico Aproximadamente 60 dos pacientes que
apresentam AHAI a quente apresentam anticorpos que reagem em meio salino mas se forem
16
levados em conta meacutetodos mais sensiacuteveis como PEG enzima e estudo em gel a positividade
pode ser superior a 90 (LEGER 2011)
Aleacutem da eficaacutecia da transfusatildeo ser comprometida pela diminuiccedilatildeo da vida-meacutedia das
hemaacutecias a presenccedila do autoanticorpo dificulta a realizaccedilatildeo dos testes preacute-transfusionais e
compromete a seguranccedila transfusional Os autoanticorpos reagem normalmente como
panaglutininas pois satildeo normalmente voltados contra antiacutegenos puacuteblicos na maior parte das
vezes contra antiacutegenos do sistema Rh Por apresentarem essas caracteriacutesticas podem ainda
mascarar a presenccedila de aloanticorpos de significado clinico e levar a testes de compatibilidade
positivos exigindo uma avaliaccedilatildeo criteriosa da necessidade da transfusatildeo (BRANCH e PETZ
1999 JUNIOR e OLIVATO 2004)
Remover a interferecircncia do autoanticorpo para avaliar a presenccedila de aloanticorpos
mascarados nem sempre eacute possiacutevel mesmo utilizando teacutecnicas de autoadsorccedilatildeo ou
aloadsorccedilatildeo que aleacutem de tudo satildeo demoradas e exigem de 2 a 6 horas para conclusatildeo
(GARRATY e GEORGE 2002) Nesses casos a fenotipagem eritrocitaacuteria do paciente eacute de
extrema utilidade especialmente em situaccedilotildees de urgecircncia A definiccedilatildeo do fenoacutetipo do
paciente para os antiacutegenos de maior importacircncia cliacutenica pode auxiliar a seleccedilatildeo de unidades
de hemaacutecias com mesmo fenoacutetipo o que garante que eventuais aloanticorpos natildeo
identificados sejam respeitados e tambeacutem evita nova sensibilizaccedilatildeo (JUNIOR e OLIVATO
2004 SHIREY et al 2002)
135 TRATAMENTO DE HEMAacuteCIAS COM TDA POSITIVO
O TDA positivo impede a fenotipagem eritrocitaacutecia por meacutetodos que exigem a fase de
AGH uma vez que a aglutinaccedilatildeo ocorreraacute devido agrave interaccedilatildeo da AGH com o autoanticorpo
que sensibiliza a hemaacutecia do paciente levando a resultados falso positivos Em algumas
situaccedilotildees como na AHAI por anticorpo quente a fenotipagem eacute especialmente importante
pois o autoanticorpo interfere na triagem e identificaccedilatildeo de anticorpos assim como no teste de
compatibilidade e dificultam a detecccedilatildeo de aloanticorpos de significado cliacutenico que
obrigatoriamente devem ser respeitados Nessas situaccedilotildees a fenotipagem eritrocitaacuteria
determina o perfil antigecircnico do paciente e possibilita o fornecimento de unidades de
hemaacutecias com o mesmo fenoacutetipo para a transfusatildeo evitando a sensibilizaccedilatildeo para novos
antiacutegenos assim como reaccedilotildees hemoliacuteticas transfusionais No entanto eacute necessaacuterio aplicar
meacutetodos que natildeo sofram interferecircncia do TDA positivo ou seja meacutetodos que natildeo necessitem
da fase de AGH ou meacutetodos de bloqueio do anticorpo sem bloquear o antiacutegeno Uma opccedilatildeo eacute
a utilizaccedilatildeo de soros monoclonais IgM (salinos ou de meio proteico natildeo concentrado) mas
17
nem sempre esses reagentes estatildeo disponiacuteveis especialmente os reagentes monoclonais para
os antiacutegenos dos sistemas Duffy ( Fya Fy
b) Kidd ( Jk
a Jk
b) e MNS (S s) (JUNIOR e
OLIVATO 2004) Outra opccedilatildeo eacute a teacutecnica de bloqueio que pode ser utilizada para tratar
hemaacutecias para posterior fenotipagem em casos de TDA positivos com reatividade le2+
Em casos onde a positividade do TDA eacute maior que 2+ estaacute indicada a tratamento
quiacutemico para remoccedilatildeo da interferecircncia do autoanticorpo antes de realizar a fenotipagem Entre
as teacutecnicas utilizadas atualmente estatildeo o ZZAP a cloroquina e a glicina aacutecidaEDTA
1351 TEacuteCNICA DE BLOQUEIO
A teacutecnica de bloqueio se baseia na utilizaccedilatildeo de anti-IgG (Coombs monoespeciacutefico)
para tratar as hemaacutecias com TDA positivo O anticorpo anti-IgG se liga aos anticorpos que
estatildeo sensibilizando a hemaacutecias poreacutem sem o bloquear os antiacutegenos Os antiacutegenos que natildeo
estatildeo sensibilizados podem ser detectados atraveacutes dos antissoros especiacuteficos (SERERAT
VEIDT E DUTCHED 2000)
1352 TRATAMENTO DE HEMAacuteCIAS COM ZZAP
O Sulphydryl-Proteolytic Enzyme (ZZAP) que eacute uma mistura de ditiotreitol (DTT)
mais papaiacutena ativada com cisteiacutena eacute um reagente capaz de dissociar imunoglobulinas da
classe IgG ligadas a membrana dos eritroacutecitos enquanto trata enzimaticamente as hemaacutecias
O tratamento enzimaacutetico tambeacutem potencializa a ligaccedilatildeo do autoanticorpo ao antiacutegeno e
acelera o processo de autoadsorccedilatildeo O ZZAP pode desnaturar os antiacutegenos do sistema Duffy
MNS e Kell o que limita sua aplicaccedilatildeo para fins de fenotipagem (BRANCH e PETZ 1982)
1353 CLOROQUINA
Em 1982 Edwards Moulds e Judd propuseram a utilizaccedilatildeo da teacutecnica da cloroquina
que dissociava os complexos antiacutegeno-anticorpo e mantinha a membrana das hemaacutecias
iacutentegras Os derivados quinolecircicos jaacute haviam sido descritos anteriormente por Domokos e
Aszody em 1964 e Holtz Mantel e Buck em 1973 (apud Edwards Moulds e Judd 1982) pela
sua capacidade de separar imunocomplexos e inibir as reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo reduzindo
as cargas eleacutetricas das superfiacutecie das hemaacutecias A teacutecnica eacute uma das mais utilizadas nos
centros brasileiros para remover a interferecircncia do autoanticorpo e eacute tambeacutem a teacutecnica
atualmente adotada pelo laboratoacuterio de imunohematologia do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto
18
Edwards Moulds e Judd (1982) demonstraram que a teacutecnica da cloroquina para
dissociaccedilatildeo de anticorpos eacute uma teacutecnica simples efetiva e confiaacutevel para dissociar
imunoglobulina das hemaacutecias Desde que a membrana das hemaacutecias permaneccedila intacta natildeo
haacute perda da reatividade dos antiacutegenos e a sua maior aplicaccedilatildeo eacute a fenotipagem de hemaacutecias
com TDA positivo Os autores verificaram que em 83 das amostras sensibilizadas in vivo e
22 amostras (no total de 40) sensibilizadas ldquoin vitrordquo apresentaram TDA negativo e
puderam ser fenotipadas A teacutecnica poreacutem natildeo consegue remover os componentes do
complemento na maioria dos casos
Champagne e colaboradores (1999) testaram a teacutecnica da cloroquina para dissociar
antiacutegenos Bg comparando com a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA e verificaram vantagem em
relaccedilatildeo ao uso de um uacutenico reagente diminuindo a manipulaccedilatildeo e verificou que o mesmo natildeo
destroacutei antiacutegeno Kell
A cloroquina tambeacutem mostrou-se pouco efetivo em remover anticorpos do sistema
Duffy da superfiacutecie das hemaacutecias (EDWARDS MOUDS e JUDD 1982 ROZIERS e
SQUALI 1997)
1353 GLICINA-AacuteCIDAEDTA
A afinidade e a estabilidade entre a ligaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo eacute definida como a
resultante entre forccedilas atrativas e repulsivas entre ambos (CARUCIO e WISE 2012) e resulta
da somatoacuteria de forccedilas quiacutemicas dinacircmicas e fracas (natildeo covalentes) como pontes de
hidrogecircnio forcas eletrostaacuteticas forca de Van der Waals e pontes hidrofoacutebicas A estabilidade
dessa ligaccedilatildeo eacute facilmente abalada por alteraccedilotildees quiacutemicas e fiacutesicas no meio da reaccedilatildeo como
a alteraccedilatildeo do pH A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA se baseia na mudanccedila do pH para a
quebra da ligaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo (KOSANKE 2012)
A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA foi primeiramente descrita em 1986 por Louie Jieng
e Zeroulis que utilizaram 50 amostras de doadores sensibilizados ldquoin vitrordquo com anticorpos A
teacutecnica foi efetiva em 48 amostras permitindo o estudo do eluato assim como a fenotipagem
das hemaacutecias Os autores testaram tambeacutem a teacutecnica em 100 hemaacutecias TDA positivo que
puderam ser utilizadas para teacutecnicas de autoadsorccedilatildeo
Byrne (1991) descreveu a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA modificada e tambeacutem
verificou como uma opccedilatildeo para o tratamento de hemaacutecias com TDA positivo que deixava as
hemaacutecias intactas e o eluato viaacutevel para ser fenotipado
19
Roziers e Squali (1997) e Katharia e Chaudhary (2013) compararam a teacutecnica da
glicina-aacutecidaEDTA com as teacutecnicas da cloroquina e do aquecimento Verificaram maior
eficiecircncia da glicina-aacutecidaEDTA em relaccedilatildeo as outras duas teacutecnicas pois com uma mesma
quantidade de amostra produzia as hemaacutecias livres de anticorpo e tambeacutem o eluato Mostrou-
se ainda superior devido ao menor tempo exigido para sua realizaccedilatildeo o que favorece seu uso
em situaccedilotildees de urgecircncia e emergecircncia
As duas desvantagens da teacutecnica poreacutem eacute o fato de destruir os antiacutegenos do sistema
Kell e o fato de natildeo remover fraccedilotildees do complemento ligadas agrave hemaacutecia (PALLAS WILER e
McGEE 1991 ROZIERS e SQUALLI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012
e KATHARIA e CHAUNDHARY 2013)
20
2 OBJETIVOS
21 OBJETIVO GERAL
211 Avaliar a eficaacutecia da glicina-aacutecidaEDTA em remover os anticorpos ligados agraves
hemaacutecias sensibilizadas por anticorpos da classe IgG
22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
221 Preparaccedilatildeo dos reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
verificaccedilatildeo da estabilidade dos mesmos e avaliar custos
222 Testar a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA em amostras de hemaacutecias
sensibilizadas por anticorpos antieritrocitaacuterios humanos
223 Comparar a efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA com a teacutecnica da
cloroquina quanto a capacidade de remover a interferecircncia do anticorpo ligado
a hemaacutecia
224 Testar o eluato das amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA
225 Verificar se houve destruiccedilatildeo dos antiacutegenos eritrocitaacuterios apoacutes o tratamento
com glicina-aacutecidaEDTA e com cloroquina
226 Verificar se o tempo de execuccedilatildeo da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA descrito
nos textos de referecircncia eacute reprodutiacutevel
21
3 JUSTIFICATIVA
Algumas condiccedilotildees cliacutenicas podem levar ao depoacutesito ldquoin vivordquo de anticorpos eou
fraccedilotildees do complemento sobre as hemaacutecias Entre elas estatildeo as reaccedilotildees hemoliacuteticas poacutes-
transfusionais a doenccedila hemoliacutetica perinatal o uso de medicamentos e principalmente a
AHAI Na AHAI um anticorpo normalmente da classe IgG ou IgM reconhece antiacutegenos
proacuteprios na membrana eritrocitaacuteria e reduz a sobrevida da hemaacutecia levando a sua destruiccedilatildeo
pelos macroacutefagos no sistema reticulo-endotelial ou agrave ativaccedilatildeo do complexo de ataque agrave
membrana e agrave lise intravascular Os autoanticorpos satildeo voltados na maioria das vezes contra
antiacutegenos eritrocitaacuterios de alta frequecircncia populacional conhecidos como antiacutegenos puacuteblicos
e por este motivo reconhecem tanto hemaacutecias autoacutelogas quanto alogecircnicas
Devido agrave presenccedila do autoanticorpo livre no plasma e tambeacutem do anticorpo eou
complemento ligado agrave hemaacutecia o banco de sangue pode encontrar dificuldades em todas as
fases dos testes preacute-transfusionais do paciente com AHAI e deve utilizar teacutecnicas que
auxiliem na escolha do melhor hemocomponente melhorando a seguranccedila transfusional Essas
teacutecnicas visam remover a interferecircncia do autoanticorpo livre no soro e do autoanticorpo
ligado agrave hemaacutecia permitindo a detecccedilatildeo de aloanticorpos associados e a realizaccedilatildeo da
fenotipagem eritrocitaacuteria respectivamente
A finalizaccedilatildeo dos testes preacute-tranfusionais na presenccedila de autoanticorpo pode levar
algumas horas e nem sempre o paciente poderaacute aguardar Nesse contexto torna-se vantajosa a
aplicaccedilatildeo de teacutecnicas de raacutepida execuccedilatildeo
O presente estudo propotildee aplicar e avaliar a eficaacutecia da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
em remover os anticorpos ligados agrave hemaacutecia o que permite a fenotipagem eritrocitaacuteria
estendida e a seleccedilatildeo de concentrados de hemaacutecias com mesmo fenoacutetipo do paciente
Atualmente no Hemocentro de Ribeiratildeo Preto a teacutecnica utilizada para esse fim eacute o
tratamento das hemaacutecias com difosfato de cloroquina cujo tempo de execuccedilatildeo pode demorar
ateacute duas horas enquanto a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser realizada em apenas dois
minutos o que a tornaria opccedilatildeo de escolha especialmente em situaccedilotildees de urgecircncia Ao
contraacuterio da cloroquina a glicina-aacutecidaEDTA permite tambeacutem o estudo do eluato das
hemaacutecias tratadas
22
4 METODOL OGIA
41 AMOSTRAS DE DOADORES
Foram coletados 50 amostras de doadores de sangue que compareceram ao
Hemonuacutecleo de Araccedilatuba no periacuteodo de junho a agosto de 2016 Foram convidados a
participar da pesquisa doadores de repeticcedilatildeo do tipo sanguiacuteneo ldquoOrdquo RhD positivo
cadastrados no sistema de banco de sangue (SBS) do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto
Todos os doadores que concordaram em participar da pesquisa assinaram o termo de
consentimento livre e esclarecido (TCLE)
No momento da doaccedilatildeo foram coletados adicionalmente 5 mL de sangue total em
soluccedilatildeo anticoagulante EDTA (aacutecido dietilenoaminoaceacutetico) dispensando punccedilatildeo venosa
adicional para coleta da amostra O fluxograma 1 resume as etapas desenvolvidas no projeto
Fluxograma 1 - Fluxo da pesquisa utilizando as amostras de doadores
23
411 FENOTIPAGEM
Foram verificados se os doadores jaacute tinham fenotipagem para outros sistemas de
grupos sanguiacuteneos aleacutem do sistema ABORh que eacute realizado rotineiramente
A fenotipagem eritrocitaacuteria para outros sistemas ou fenotipagem estendida eacute realizada
para identificar a presenccedila ou ausecircncia de antiacutegenos considerados de importacircncia cliacutenica No
Hemonuacutecleo de Araccedilatuba uma parcela de doadores de repeticcedilatildeo satildeo fenotipados para os
antiacutegenos dos sistemas de grupo sanguiacuteneo Rh (antiacutegenos C c E e e) Kell (antiacutegeno K)
Duffy (antiacutegenos Fya e Fy
b) Kidd (antiacutegenos Jk
a e Jk
b) e sistema MNSs (antiacutegenos S e s)
A fenotipagem para o Rh e Kell eacute realizada por metodologia de microplaca utilizando
25 microL de hemaacutecia lavada e diluiacuteda a 5 em salina e 25 microL do antissoro comercial especiacutefico
A reaccedilatildeo eacute incubada 15 minutos a temperatura ambiente e centrifugadas para leitura Para os
antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s a metolodogia utilizado eacute gel contendo antiglobulina
humana (gel LissCoombs poliespeciacutefico) da marca BIO-RAD onde se utiliza suspensatildeo de
hemaacutecia em LISS (Soluccedilatildeo de baixa forccedila iocircnica) A suspensatildeo eacute preparada atraveacutes da
diluiccedilatildeo de 10 microL de hemaacutecia em 1000 microL de LISS Pipetado 50 microL dessa diluiccedilatildeo no gel e
adicionado 25 microL do antissoro especiacutefico Incuba-se em banho seco por 15 minutos a 37 deg
Celsius e eacute centrifugado em centriacutefuga especiacutefica Os antissoros utilizados eram das marcas
Fresenius e Lorne
Foi verificado a fenotipagem do doador no banco de dados do Hemocentro Os
registros dos fenoacutetipos dos doadores ficam armazenadas no sistema de banco de sangue
(SBS) Para doadores que natildeo tinham fenotipagem estendida preacutevia para antiacutegenos do sistema
Rh (C c E e e) e Kell (K) foi realizada a fenotipagem para esses antiacutegenos
O tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA e cloroquina para dissociar
anticorpos pode inativar enfraquecer ou destruir os antiacutegenos presentes nas hemaacutecias
alterando assim os resultados da fenotipagem Para verificar se houve destruiccedilatildeo dos
antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a e Jk
b S e s nas amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes
tratamento foram novamente fenotipadas ao final para os antiacutegenos que eram inicialmente
positivas
A repeticcedilatildeo da fenotipagem foi realizada nas amostras que apresentaram efetividade
no tratamento da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eou da cloroquina e a detecccedilatildeo do antiacutegeno
na amostra preacute-tratamento
24
412 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS HEMAacuteCIAS
As hemaacutecias foram sensibilizadas com antissoros policlonais humanos de amostras de
plasma fresco congelado de doadores com resultado de pesquisa de anticorpo irregular
positivos
A escolha do anticorpo para sensibilizar as hemaacutecias foi definida de acordo com o
fenoacutetipo do doador que deveria ser positivo para o respectivo antiacutegeno
Para a sensibilizaccedilatildeo um volume de antissoro (1 mL) e um volume (1 mL) de
hemaacutecias lavadas quatro vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica foram adicionadas a um tubo de 12 x
75 mm A mistura foi homogeneizada e incubada em banho maria (BM) a 37deg C por 60
minutos A seguir as hemaacutecias foram novamente lavadas 4 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica
para retirada dos anticorpos que natildeo se ligaram A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada
como controle negativo O teste da uacuteltima lavagem eacute importante para assegurar que os
anticorpos que poderatildeo ser detectados no eluato apoacutes o tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA
sejam aqueles que estavam ligados agraves hemaacutecias e natildeo aqueles livres no plasma O controle
negativo mostra que todo o anticorpo livre foi retirado (LEGER 2011)
Para o teste de presenccedila de anticorpo na soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foram incubadas
com hemaacutecias de triagem de anticorpos irregulares (ID-Diacell BIO-RAD) contendo os
antiacutegenos especiacuteficos Realizado a teacutecnica em gel LissCoombs com anti-IgG+C3d Incubado
no tempo de 15 minutos a temperatura de 37deg C e centrifugado 10 minutos em centriacutefuga
proacutepria
As 50 amostras de doadores foram sensibilizadas com os anticorpos policlonais
humanos
Apoacutes sensibilizadas rdquoin vitrordquo e lavadas as hemaacutecias foram diluiacutedas em soluccedilatildeo de
baixa forccedila iocircnica (LISS) na quantidade de 10 microL de hemaacutecia para 1000 microL de soluccedilatildeo A
suspensatildeo foi pipetada (50 microL) em coluna-gel-teste LissCoombs (BIO-RAD) que contecircm
antiglobulina poliespeciacutefico (IgG+C3d) e centrifugada em baixa rotaccedilatildeo conforme orientaccedilatildeo
do fabricante durante 10 minutos
As amostras deveriam apresentar aglutinaccedilatildeo com reatividade 3 a 4+ no TDA As
amostras que apresentaram reaccedilatildeo menor que 3+ foram novamente sensibilizadas com nova
aliacutequota do antissoro
25
413 TRATAMENTO DAS AMOSTRAS
As amostras sensibilizadas apresentando o TDA positivo 3 ou 4+ foram divididas em
duas aliacutequotas e submetidas a duas teacutecnicas diferentes com o objetivo de dissociar o anticorpo
ligado Uma aliacutequota da amostra foi tratada com soluccedilatildeo de difosfato de cloroquina enquanto
a outra aliacutequota foi tratada com glicina-aacutecidaEDTA
42 PREPARO DA GLICINA AacuteCIDA-EDTA
A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA utiliza 3 soluccedilotildees diferentes a glicina aacutecida o
EDTA e o tampatildeo TRIS
Os reagentes foram preparados utilizando os sais para anaacutelise (PA) de EDTA
(Na2EDTA2H2O) TRIS (C4H11NO3) Glicina (H2NCH2CO2H) NaCl e a soluccedilatildeo de aacutecido
cloriacutedrico (HCl) 12 N todos reagentes da marca SYNTH (quadro 1)
Para o preparo do tampatildeo glicina-acida eacute necessaacuterio o ajuste do pH para 15 Para esse
ajuste utiliza-se aacutecido cloriacutedrico (HCl) concentrado O pH foi medido com fitas reativas de pH
com escala de 1 a 14 da marca MERCK Posteriormente a soluccedilatildeo foi enviada ao laboratoacuterio
de controle de qualidade do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto e o pH medido no peagacircmetro O
tampatildeo glicina-aacutecida foi armazenado a 4deg e o tampatildeo tris e o EDTA em temperatura ambiente
controlada (20 a 24deg Celsius)
Apoacutes o preparo e durante a realizaccedilatildeo dos testes foram feitas inspeccedilotildees visuais para
verificaccedilatildeo de turvaccedilatildeo do meio e presenccedila de precipitados
Reagente Material Quantidade Preparo e
Conservaccedilatildeo
EDTA
EDTA
(Na2EDTA2H2O)
5 gramas Mistura ateacute
dissoluccedilatildeo do sal e
conserva em
temperatura ambiente Aacutegua Destilada 50 Ml
Tris
TRIS (C4H11NO3) 121 gramas Conservar em
temperatura ambiente NaCl 525g
Aacutegua destilada 100ml
Gliacutecina-aacutecida
Glicina
(H2NCH2CO2H) 15 gramas
Conservar a 4oC NaCl 116gramas
Aacutegua Destilada 200ml
HCL 12N Ajutar o pH para 15
Quadro 1 - Preparo dos Reagentes da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
Fonte - Manual teacutecnico AABB 2011
26
O tampatildeo glicina-aacutecida e o tampatildeo TRIS satildeo estaacuteveis por 7 meses O reagente EDTA
precipitou mesmo estando em temperatura em ambiente controlado Houve necessidade de
preparo de novo reagente
421 TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
1 Em um tubo de ensaio 12x75 mm eacute adicionado 08 mL da soluccedilatildeo de glicina-aacutecida A
esta soluccedilatildeo adiciona-se 02 mL de EDTA e mistura
2 Adiciona-se 02 mL de hemaacutecias sensibilizadas (lavada 4 vezes) A mistura eacute
homogeneizada e incubada por exatamente 2 minutos
3 A seguir 01 mL de tampatildeo TRIS eacute adicionado agrave mistura que eacute novamente
homogeneizada e centrifugada por 2 minutos a 3400 rpm O pH deve estar entre 7 a 75
4 Apoacutes centrifugaccedilatildeo separa-se em outro tubo o sobrenadante (eluato) e as hemaacutecias
que permanecem satildeo lavadas 4 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica para retirada de todo o
reagente e anticorpos livres
43 PREPARO DA CLOROQUINA
A cloroquina eacute diluiacuteda em tampatildeo PBS na concentraccedilatildeo de 20 (Quadro 2) e
armazenado a 4deg Celsius sua validade apoacutes o preparo eacute de 1 mecircs
A teacutecnica da cloroquina jaacute estaacute padronizada para rotina do laboratoacuterio de
imunohematologia do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto e suas unidades
Reagente Reagentes Quantidade PreparoConservaccedilatildeo
Cloroquina
Difosfato de cloroquina
(C18H32ClN3O8P2)
20 gramas
Conservar a 4deg Celsius
Tampatildeo PBS 100ml
NaOH 01 N Acertar o pH para
51
Quadro 2 - Preparo da Cloroquina Fonte - Manual teacutecnico da AABB 2011
431 TEacuteCNICA DA CLOROQUINA
1 4 partes da soluccedilatildeo pronta eacute adicionada a uma parte de hemaacutecias lavadas 4 vezes com
soluccedilatildeo fisioloacutegica
2 A mistura eacute incubada em temperatura ambiente por ateacute duas horas
3 Centrifugar a 3400 rpm por 2 minutos
27
4 Remover o sobrenadante lavar as hemaacutecias novamente com soluccedilatildeo fisioloacutegica 4
vezes
44 VERIFICACcedilAtildeO DA EFETIVIDADE DOS TESTES
Apoacutes tratamento pelas duas teacutecnicas o TDA foi repetido em todas as amostras para
verificar se os tratamentos foram efetivos e houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo Para as
amostras tratadas pela teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA que permaneceram com TDA positivo
novo tratamento foi realizado
45 TESTE DO ELUATO
O eluato resultante das amostras tratadas com glicina-acidaEDTA foi testado com
hemaacutecias de triagem A soluccedilatildeo do eluato foi incubada com as hemaacutecias de triagem de
anticorpos (ID-Diacell BIO-RAD) pela teacutecnica em gel LissCoombs O teste foi incubado 15
minutos a 37deg Celsius e centrifugado por 10 minutos em centrifuga proacutepria para a teacutecnica em
gel Os eluatos que apresentaram resultados positivos foram testados em painel de 11
hemaacutecias (ID-Diapanel BIO-RAD) para a identificaccedilatildeo do anticorpo
46 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente que apresentou TDA positivo por IgG e pesquisa
de anticorpo irregular positivo com presenccedila de autoanticorpo com reatividade panaglutinina
A amostra foi tratada em paralelo pelas duas teacutecnicas descritas e foi enviada para o
Hemocentro para genotipagem eritrocitaacuteria que foi realizado por metodologia PCR em tempo
real no equipamento Real-time system PCR 7500 ( Applied Biosystems Califoacuternia EUA)
28
5 RESULTADOS
51 REAGENTES
Para aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA satildeo necessaacuterios 3 diferentes
reagentes que podem ser encontrados em forma de kit pronto para uso No entanto esses kits
natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil Os reagentes satildeo tampatildeo glicina-aacutecida o EDTA e o tampatildeo
Tris
Todos os reagentes foram preparados rdquoin houserdquo a partir dos sais e soluccedilotildees PA (puro
para anaacutelise) da marca SYNTH que foram adquiridos para a pesquisa O custo estimado para
cada teste foi aproximadamente R$ 020 reais
Apoacutes o preparo os reagentes poderiam ser armazenados em condiccedilotildees adequadas pelo
periacuteodo de 1 ano (AABB 2011) Ao final do preparo e durante o periacuteodo de armazenamento
de fevereiro a setembro de 2016 foi realizada inspeccedilatildeo visual para verificar a presenccedila de
precipitados ou turvaccedilatildeo A soluccedilatildeo de glicina e o tampatildeo TRIS mostraram-se estaacuteveis ateacute o
final do periacuteodo Por sua vez o reagente EDTA precipitou mesmo estando armazenado em
temperatura ambiente controlada e foi necessaacuterio novo preparo
52 AMOSTRAS DE DOADORES
521 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS AMOSTRAS
Apoacutes incubaccedilatildeo da hemaacutecia com o antissoro a mesma foi lavada 4 vezes para retirada
dos anticorpos livres A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada Caso houvesse positividade na
soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem a etapa era repetida (figura 3) Das 50 amostras sensibilizadas a
uacuteltima lavagem foi positiva somente em 3 delas Nas 3 amostras o anticorpo utilizado para
sensibilizaccedilatildeo foi o anti-K Apoacutes repetido nova etapa de lavagem os resultados se
apresentaram negativos
Em todas as amostras sensibilizadas ldquoin vitrordquo o TDA foi testado e verificado a
intensidade do teste Entre as 50 amostras 47 alcanccedilaram TDA com intensidade 3-4+ apoacutes a
primeira sensibilizaccedilatildeo enquanto 3 amostras necessitaram uma segunda incubaccedilatildeo com
anticorpo (figura 4)
A escolha dos anticorpos para sensibilizar as hemaacutecias foi feita de acordo com o
fenoacutetipo do doador e foram utilizados sete diferentes especificidades de anticorpos policlonais
humanos conforme mostra o graacutefico1
29
Figura 3 - Soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada com hemaacutecia de triagem de
anticorpos em gel LissCoombs (BIO-RAD) A finalidade eacute verificar a presenccedila de anticorpos livres na
suspensatildeo que possam interferir na pesquisa do eluato As soluccedilotildees de lavagem das amostras na figura a tiveram
resultados negativos Na figura b duas amostras a 47 e 50 apresentaram resultado positivo Nova etapa de
lavagem foi realizada e o resultado final foi negativo
522 TRATAMENTO DAS HEMAacuteCIAS
Apoacutes a sensibilizaccedilatildeo e obtenccedilatildeo de resultados de TDA com intensidade de 3 a 4+
cada uma das amostras foi dividida em duas aliacutequotas e tratada separadamente pelas teacutecnicas
de glicinaaacutecida-EDTA e cloroquina
As teacutecnicas foram consideradas efetivas quando obteve-se a completa dissociaccedilatildeo do
anticorpo verificada atraveacutes do TDA negativo na amostra poacutes tratamento conforme figuras 5
e 6 Dentre as amostras tratadas com cloroquina 2850 tiveram o TDA negativado A glicina-
aacutecidaEDTA negativou o TDA em 33 das 50 amostras tratadas Apenas 17 amostras tratadas
com glicina-aacutecidaEDTA permaneceram com o TDA positivo e foram submetidas a um novo
tratamento
30
Figura 4 - TDA das amostras apoacutes sensibilizaccedilatildeo com anticorpos policlonais humanos Amostras na
figura a com intensidades de 3-4+ Na figura b amostras 4 e 7 com intensidade menor que 3+ e portanto foram
novamente sensibilizadas com nova aliacutequota de soro Anti-D e anti-S Apoacutes a segunda sensibilizaccedilatildeo
apresentaram reatividade 4 e 3+ respectivamente Os anticorpos utilizados para sensibilizaccedilatildeo foram D S c E
C e K
523 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS TEacuteCNICAS
No tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA houve dissociaccedilatildeo completa do anticorpo
em 33 amostras (66) das 50 amostras testadas enquanto que com a cloroquina foram 28
amostras (56) (tabela 1)
31
Graacutefico 1- Nuacutemero de amostras sesnsibilizadas por especificidade de anticorpo Entre as 50 amostras 12
foram sensibilizadas com anti-D 10 com anti-C 9 com anti-E 8 com anti-c 7 com anti-S 3 com anti-K e 1
com anti-Dia As especificidades dos anticorpos foram definidas de acordo o fenoacutetipo do doador
Figura 5 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com cloroquina Nas amostras onde houve
a dissociaccedilatildeo do anticorpo ( 2 21 a 23 26 39 a 42 45 46 e 49) a hemaacutecia se deposita no fundo no microtubo
apoacutes a centrifugaccedilatildeo (TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (1 3 24 25 43 44 47
48 e 50) o anticorpo ligado agraves hemaacutecias eacute alvo da AGH presente no gel (TDA positivo)
Anti-D 12
Anti-C 10
Anti-E 9
Anti-c 8
Anti-S 7
Anti-K 3 Anti-Dia 1
32
Figura 6 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA Nas amostras
onde houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo (4 6 7 12 a 15 17 34 35 37 e 38) a hemaacutecia se deposita no fundo no
microtubo apoacutes a centrifugaccedilatildeo ( TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (5 16 18
19 20 33 e 36 ) o AGH presente no gel se liga ao anticorpo ligado agraves hemaacutecias que ficam retidas no gel (TDA
positivo)
Tabela 1-Resultado geral do tratamento das hemaacutecias com glicina e cloroquina
Teacutecnica utilizada TDA negativo TDA positivo Total
Glicina-aacutecidaEDTA 33 17 50
Cloroquina 28 22 50
A glicina-aacutecidaEDTA conseguiu negativar mais amostras sensibilizadas com Anti-D
e anti-K que a cloroquina Para as hemaacutecias sensibilizadas com anti-E Anti-S e Anti-Dia
ambas as teacutecnicas dissociaram o anticorpo em 100 das amostras Os resultados detalhados
por especificidade do anticorpo apoacutes o primeiro tratamento com glicina-aacutecidaEDTA e com
cloroquina estatildeo na tabela 2
Para as amostras que permaneceram positivas (17 amostras) apoacutes o tratamento com a
glicina-aacutecidaEDTA foi realizado um novo tratamento Houve dissociaccedilatildeo do anticorpo em 3
amostras (18) apoacutes a segunda tentativa Nas demais 14 (82) amostras tratadas pela
segunda vez 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise
33
Tabela 2 - Resultados do TDA apoacutes tratamento das hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo
sensibilizado
ANTICORPOS
SENSIBILIZADOS
1ordm TRATAMENTO COM
GLICINA
TRATAMENTO COM
CLOROQUINA
TOTAL TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
Anti-D 8 4 0 12 12
Anti-C 6 4 10 0 10
Anti-E 9 0 9 0 9
Anti-c 0 8 1 7 8
Anti-S 7 0 7 0 7
Anti-K 2 1 0 3 3
Anti-Dia 1 0 1 0 1
TOTAL 33 17 28 22 50
A hemoacutelise foi verificada durante o procedimento de lavagem final das hemaacutecias com
soluccedilatildeo fisioloacutegica para a retirada dos reagentes As soluccedilotildees de lavagem ficaram
avermelhadas e as hemaacutecias com coloraccedilatildeo escura As amostras foram descartadas Dentre as
6 amostras que ainda puderam ser testadas para o TDA trecircs amostras negativaram sendo 1
sensibilizada com anti-D e 2 com anti-C (tabela 3)
Tabela 3 - Resultado apoacutes o segundo tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA
Tratamento com
glicina-aacutecidaEDTA
TDA Negativo TDA Positvo Hemoacutelise Total
Segundo tratamento 3 3 11 17
524 TESTAGEM DO ELUATO
Apoacutes o tratamento com a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA a soluccedilatildeo do eluato foi
testada para verificar a viabilidade dos anticorpos que foram dissociados ou eluiacutedos Dentre
as 50 amostras 41 apresentaram eluato positivo As nove amostras cujos eluatos foram
negativos haviam sido sensibilizadas com as seguintes especificidades de anticorpos anti-E 6
amostras (67) anti-S 2 amostras (40) e anti-D 1 amostra (8) (tabela 4) O eluato de
todas as amostras sensibilizadas com os anticorpos anti-C anti-c Anti-K e Anti-Dia foram
positivos Os eluatos positivos na triagem de anticorpos foram testados com paineacuteis de
identificaccedilatildeo para confirmar a especificidade e a viabilidade dos anticorpos (figuras 7 e 8)
34
525 EFEITO DA ELUICcedilAtildeO SOBRE OS ANTIacuteGENOS ERITROCITAacuteRIOS
Para verificar o efeito do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA e com a cloroquina
sobre a expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s foi realizada a fenotipagem das
amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes tratamento com ambas as teacutecnicas Foi avaliado
se o tratamento destruiu os antiacutegenos expressos antes do tratamento
Tabela 4- Resultado do Eluato das amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA
Anticorpos Eluato positvo Eluato negativo Total
Anti-D 11 1 12
Anti-C 10 0 10
Anti-E 3 6 9
Anti-c 8 0 8
Anti-S 5 2 7
Anti-K 3 0 3
Anti-Dia 1 0 1
Total 41 9 50
Figura 7 ndash Painel do eluato da amostra 21 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-C que foi
recuperado no eluato
Figura 8 ndash Painel do eluato da amostra 47 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-K que foi
recuperado no eluato
35
Dentre as 50 amostras 26 eram previamente fenotipadas para os antiacutegenos Fya Fy
b
Jka Jk
b S e s Dentre elas 20 alcanccedilaram TDA negativo apoacutes tratamento com a glicina-
aacutecidaEDTA e 20 negativaram apoacutes tratamento com cloroquina (tabela 5) Apoacutes ambas as
teacutecnicas os antiacutegenos originalmente expressos permaneceram positivos comprovando que natildeo
houve destruiccedilatildeo dos mesmos
Tabela 5 ndash Verificaccedilatildeo da interferecircncia do tratamento da hemaacutecias com cloroquina e glicina-
aacuteicdaEDTA sobre os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
AMOSTRAS
COM
FENOTIPAGEM
PREacuteVIA
TRATADAS COM
CLOROQUINA
TRATADAS COM
GLICINA
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
26
20
20
20
20
As amostras 24 47 e 50 eram positivas para o antiacutegeno K A cloroquina natildeo dissociou
o anticorpo em nenhuma das 3 amostras enquanto a glicina-aacutecidaEDTA foi efetiva nas
amostras 24 e 50 Foi testada a expressatildeo do antiacutegeno K nas amostras 24 e 50 apoacutes o
tratamento utilizando meacutetodo indireto em gel contendo AGH Apesar de natildeo ter sido avaliado
a intensidade de reaccedilatildeo de expressatildeo dos antiacutegenos podemos verificar na figura 9 que nas
duas amostras em que a teacutecnica foi efetiva e dissociou o anticorpo a expressatildeo do antiacutegeno K
continua presente mas a reatividade observada pode ser considerada 1+ sugerindo que houve
diminuiccedilatildeo da expressatildeo do antiacutegeno quando comparado com a expressatildeo observada em
hemaacutecia natildeo tratada
Os resultados individuais de cada amostra em ambas as teacutecnicas encontram-se
resumidas na tabela 6
526 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente onde foi constatada a presenccedila de autoanticorpo
a quente da classe IgG pelo TDA monoespeciacutefico (figura 10)O autoanticorpo tambeacutem
interferia na pesquisa e identificaccedilatildeo de anticorpos irregulares pois apresentava caracteriacutestica
de panaglutinina As hemaacutecias da paciente sensibilizadas ldquoin vivordquo foram tratadas com
cloroquina e com glicina-aacutecidaEDTA
36
Figura 9 ndash Fenotipagem das amostras 24 e 50 para antiacutegeno K apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
O teste positivo indica a presenccedila do antiacutegeno poreacutem a reatividade fraca (1+) sugere que houve enfraquecimento
de sua expressatildeo A direita a expressatildeo forte (4+) do antiacutegeno Kell em hemaacutecia controle natildeo tratada utilizada
como controle positivo
A cloroquina natildeo foi efetiva na retirada do anticorpo ligado as hemaacutecias ao contraacuterio
do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA que dissociou o anticorpo (figura 11)
A hemaacutecia tratada com glicina foi fenotipada para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
(figura 12) A fenotipagem para o sistema Rh (C c E e e) e Kell foi realizada em gel
especiacutefico monoclonal sem interferecircncia do TDA positivo (controle da reaccedilatildeo negativo)
O eluato resultante do tratamento com glicina-aacutecidaEDTA foi testada em gel com
hemaacutecias de painel de identificaccedilatildeo de anticorpos e apresentou resultado positivo com todas
as ceacutelulas (figura 13 e 14)
A amostra foi enviada para genotipagem e o resultado da genotipagem confirmou o
resultado da fenotipagem apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
527 TEMPO DE EXECUCcedilAtildeO DA TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
O tempo de reaccedilatildeo da glicina-aacutecidaEDTA eacute de 2 minutos Todas as amostras foram
tratadas obedecendo ao tempo descrito na literatura demonstrando que o mesmo eacute
reprodutiacutevel
37
Tabela 6- Resultados individuais por amostra
Amostra Especificidade
dos anticorpos
Intensidade do
TDA apoacutes
sensibilizaccedilatildeo
Tratamento
efetivo com
cloroquina
Tratamento
efetivo com
glicina
Eluato
poacutes
glicina
1 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 2 Dia 3+ Sim Sim 3+ 3 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 4 D 4+ Natildeo Sim 4+ 5 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 6 E 3+ Sim Sim Negativo 7 S 4+ Sim Sim 3+ 8 E 3+ Sim Sim 1+ 9 E 3+ Sim Sim 2+
10 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 11 D 4+ Natildeo Sim 4+ 12 D 4+ Natildeo Sim 4+ 13 S 3+ Sim Sim 3+ 14 S 3+ Sim Sim 3+ 15 D 3+ Natildeo Sim 3+ 16 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 17 E 3+ Sim Sim (+) 18 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 19 D 4+ Natildeo Natildeo 3+ 20 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 21 C 3+ Sim Sim 4+ 22 C 3+ Sim Sim 4+ 23 C 3+ Sim Sim 4+ 24 K 4+ Natildeo Sim 4+ 25 D 3+ Natildeo Natildeo Negativo 26 E 4+ Sim Sim Negativo 27 S 3+ Sim Sim 3+ 28 C 3+ Sim Natildeo 4+ 29 C 3+ Sim Sim 4+ 30 C 3+ Sim Sim 4+ 31 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 32 E 3+ Sim Sim Negativo 33 C 3+ Sim Natildeo 4+ 34 S 3+ Sim Sim Negativo 35 S 3+ Sim Sim Negativo 36 C 4+ Sim Natildeo 4+ 37 c 4+ Natildeo Natildeo 4+ 38 D 4+ Natildeo Sim 4+ 39 S 3+ Sim Sim 3+ 40 c 4+ Sim Natildeo 2+ 41 C 4+ Sim Natildeo 4+ 42 E 3+ Sim Sim Negativo 43 D 3+ Natildeo Sim 2+ 44 D 3+ Natildeo Sim 2+ 45 E 3+ Sim Sim Negativo 46 C 3+ Sim Sim 4+ 47 K 4+ Natildeo Natildeo 4+ 48 D 3+ Natildeo Sim 2+ 49 E 3+ Sim Sim Negativo 50 K 4+ Natildeo Sim 4+
TOTAL 50 28 33 41
38
Figura 10 ndash TDA monoespeciacutefico da amostra de paciente Hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo da classe
IgG
oacute Figura 11 ndash TDA apoacutes o tratamento com glicina-aacutecidaEDTA (esquerda) e cloroquina (direita) A glicina
negativou completamente o TDA enquanto a hemaacutecia tratada com cloroquina persistiu positiva (1+)
39
Figura 12 ndash Fenotipagem da amostra tratada com glicina-aacutecidaEDTA Fy(a+b+) Jk(a-b+) S+s+
Figura 13 ndash Painel em gel (LissAGH) do eluato apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de
intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
Figura 14 ndash ndash Painel ezimaacutetico (hemaacutecias tratadas com bromelina) do eluato em gel neutro apoacutes
tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
40
528 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Quanto a efetividade das teacutecnicas em negativar o TDA foi verificado que a glicina-
aacutecidaEDTA foi efetiva em 66 das amostras testadas no primeiro tratamento (3350
amostras) enquanto a cloroquina conseguiu negativar 56 (2850) Esses resultados natildeo
apresentam diferenccedila significativa (pgt005) demostrando que a teacutecnica da glicina-
aacutecidaEDTA natildeo eacute superior mas eacute tatildeo efetiva quanto a da cloroquina
Quando aliamos os resultados de ambas as teacutecnicas verificamos que em 76 (3850)
das amostras o TDA foi negativado Esse dado indica que ainda que uma teacutecnica natildeo seja
eficaz na remoccedilatildeo do anticorpo eacute uma boa alternativa tentar a segunda teacutecnica jaacute que a falha
em remover o anticorpo utilizando uma delas natildeo prevecirc necessariamente a falha com a outra
Quando se utiliza o teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla (graacutefico 2) para comparar a utilizaccedilatildeo das
duas teacutecnicas com o resultado de cada uma isolada (somente a cloroquina ou somente a
glicina) verificamos que os resultados apresentam diferenccedila significativa (plt005) (quadro 3)
TRATAMENTO EFETIVO COM TOTAL PORCENTAGEM
Glicina ou cloroquina 38 76
Glicina e cloroquina 23 46
Glicina apenas 10 20
Cloroquina apenas 5 10
Nenhuma das teacutecnicas 12 24
Quadro 3 - Resultados comparativos entre as teacutecnicas utilizadas
41
Graacutefico 2 - Teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla entre as teacutecnicas aplicadas A- Glicina e Cloroquina B-Cloroquina C-
Glicina ( plt005)
42
6 DISCUSSAtildeO
Os reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA podem ser adquiridos em
forma de kit comercial prontos para uso poreacutem natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil A preparaccedilatildeo
dos reagentes ldquoin houserdquo a partir de sais comerciais adquiridos se mostrou viaacutevel Os
reagentes glicina e o tampatildeo Tris armazenados de forma correta se mantiveram estaacuteveis por
um periacuteodo de 7 meses Somente o reagente EDTA precipitou mesmo armazenado em
condiccedilotildees adequadas sugerindo que o mesmo deve ser preparado em menor quantidade e
armazenado em aliacutequotas A soluccedilatildeo de cloroquina tambeacutem pode ser preparada ldquoin houserdquo e
pode ser armazenado por um mecircs A legislaccedilatildeo brasileira autoriza a utilizaccedilatildeo de reagentes
preparados a partir de sais comerciais como a cloroquina e a glicina-aacutecidaEDTA desde que
os sais tenham autorizaccedilatildeo da vigilacircncia sanitaacuteria para a comercializaccedilatildeo (BRASIL 2001)
A comparaccedilatildeo quanto a efetividade em dissociar anticorpos em amostras com TDA
positivos entre a teacutecnica da glicina e a teacutecnica da cloroquina mostrou que natildeo haacute diferenccedila
estatiacutestica entre elas e que ambas satildeo igualmente eficientes Se utilizadas conjuntamente haacute
maior possibilidade de elucidaccedilatildeo dos casos
Uma vantagem da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eacute que ela permite numa mesma
amostra eluir o anticorpo ligado aacute hemaacutecia assim como fenotipar a hemaacutecia tratada Devido a
sua dupla utilidade a teacutecnica eacute vantajosa principalmente em pacientes em que pouco volume
de amostra pode ser coletado como em casos de crianccedilas e receacutem-nascidos
A fenotipagem poacutes tratamento se mostrou viaacutevel jaacute que os antiacutegenos de maior
importacircncia natildeo sofreram alteraccedilotildees Nas 20 amostras que foram fenotipadas antes e apoacutes
tratamento para verificar a influecircncia dos reagentes na expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a
Jkb S e s natildeo houve destruiccedilatildeo dos mesmos por nenhuma das duas teacutecnicas
Para as amostras positivas para o antiacutegeno Kell (350) e sensibilizadas com o
respectivo anticorpo a teacutecnica da glicina foi efetiva em negativar o TDA em apenas duas
delas mas apoacutes o tratamento foi verificada uma fraca reatividade da reaccedilatildeo antiacutegeno-
anticorpo sugerindo que houve um enfraquecimento da expressatildeo do antiacutegeno conforme
esperado e descrito na literatura (BYRNE 1991 PALLAS WILER E MCGEE 1991
ROZIERS e SQUALI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012 e KATHARIA e
CHAUDHARY 2013) A accedilatildeo da glicina sobre o antigeno Kell natildeo representa impedimento
para seu uso uma vez que na impossibilidade de testar o antiacutegeno Kell o banco de sangue
consegue facilmente atender a solicitaccedilatildeo de transfusatildeo com unidades de hemaacutecias Kell
43
negativas jaacute que eacute um antiacutegeno de baixa prevalecircncia na populaccedilatildeo variando de 15 na
populaccedilatildeo africana a 9 nos europeus (DANIELS 2011)
A soluccedilatildeo resultante da dissociaccedilatildeo do anticorpo pela teacutecnica da glicina pode ainda ser
utilizada como eluato podendo substituir a teacutecnica de eluiccedilatildeo com reagentes comercias (kits
de eluiccedilatildeo aacutecida) que tem alto custo aproximadamente entre R$2000 a R$2500 por teste
Em 41 amostras (82) houve a dissociaccedilatildeo e recuperaccedilatildeo do anticorpo que estava
sensibilizando as hemaacutecias Em 9 amostras (18) os anticorpos foram eluiacutedos poreacutem
apresentaram reaccedilatildeo negativa quando testadas com hemaacutecias de triagem entre eles o anti-E
(6) anti-S (2) e Anti-D (1) Eacute possiacutevel que a correccedilatildeo pH do meio (WALKER 2011) natildeo
tenha sido adequada o que pode ter desfavorecido a reatividade do anticorpo
Para as amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA nas quais natildeo houve dissociaccedilatildeo do
anticorpo pelo primeiro tratamento (1750) o segundo tratamento natildeo se mostrou eficaz jaacute
que 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise O tempo de
armazenagem natildeo parece ter influenciado jaacute que todas as amostras foram testadas dentro de
48 horas apoacutes a coleta Outros fatores que natildeo foram verificados podem ter levado a
hemoacutelise Apesar da literatura (LOUIE JIENG e ZEROULIS 1986 e BYRNE 1991)
recomendar um segundo tratamento ele eacute pouco eficaz tendo negativado apenas 3 das 17
amostras testadas
A amostra de paciente que apresentou sensibilizaccedilatildeo ldquoin vivordquo mostrou melhor
efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA sobre a da cloroquina possibilitando
fenotipagem para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s que natildeo foram destruiacutedos apoacutes o
tratamento comprovado atraveacutes da genotipagem
A presenccedila de autoanticorpo a quente com presenccedila de hemoacutelise (AHAI) ou natildeo pode
mascarar a presenccedila de aloanticorpo interferindo na rotina soroloacutegica da fenotipagem que eacute
uma importante ferramenta para auxiliar na seleccedilatildeo de hemaacutecias para transfusatildeo (SHIREY et
al 2002) Esses pacientes frequentemente possuem aloanticorpos associados ao
autoanticorpo e a prevalecircncia de aloimunizaccedilatildeo entre eles varia entre 12 a 40 (LEGER e
GARRATY 1999 BRANCH e PETZ 1999) o que dificulta ainda mais a escolha do melhor
componente a ser transfundido aleacutem de aumentar a possibilidade reaccedilotildees hemoliacuteticas imunes
poacutes-transfusionais
Nesses casos as teacutecnicas de dissociaccedilatildeo de anticorpos satildeo importantes para tratar
amostras de pacientes e a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser usada como uma opccedilatildeo
pois se mostrou eficaz na dissociaccedilatildeo anticorpo ligado agraves hemaacutecias deixando livre a
superfiacutecie das mesmas permitindo a fenotipagem por antisoros IgG Paralelamente os
44
anticorpos eluiacutedos tambeacutem puderam ser estudados O mesmo natildeo ocorre com a cloroquina
que permite apenas a fenotipagem e tampouco com os kits de eluiccedilatildeo aacutecida disponiacuteveis no
mercado nacional que satildeo destinados a realizaccedilatildeo do eluato mas destroem as hemaacutecias
O tempo de tratamento na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA tambeacutem eacute uma vantagem
pois foi possiacutevel reproduzir no tempo determinado de 2 minutos enquanto a cloroquina
demora ateacute duas horas
Ainda que a aplicaccedilatildeo das teacutecnicas por biologia molecular estejam cada vez mais
presentes na rotina imuno-hematoloacutegica e possibilitam estabelecer o fenoacutetipo deduzido do
genoacutetipo elas natildeo estatildeo disponiacuteveis na maioria dos centros e sua realizaccedilatildeo exige algumas
horas A resoluccedilatildeo imediata do problema transfusional necessita dos resultados soroloacutegicos
pois com frequecircncia natildeo eacute possiacutevel aguardar o resultado do teste molecular Dessa forma
apesar da crescente importacircncia da genotipagem eritrocitaacuteria teacutecnicas soroloacutegicas aplicadas
corretamente e no momento propiacutecio satildeo de grande utilidade para resolver problemas imuno-
hematoloacutegicos como ocorre com a fenotipagem em pacientes com TDA positivo
45
7 CONCLUSAtildeO
A teacutecnica da glicina aacutecidaEDTA mostrou-se efetiva em remover os anticorpos que
sensibilizavam as hemaacutecias e pode ser utilizada com seguranccedila antes da fenotipagem
eritrocitaacuteria Por ser uma teacutecnica de raacutepida execuccedilatildeo eacute uma alternativa aplicaacutevel
principalmente em casos urgentes de pacientes que apresentam autoanticorpos
46
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ZAGO M A Apresentaccedilatildeo In Covas D T Ubialli E M A De Santis G C Manual de
Medicina Transfusional 2ordf ed Satildeo Paulo Atheneu 2014
50
9 ANEXOS
51
FUNDACcedilAtildeO HEMOCENTRO DE RIBEIRAtildeO PRETO
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE)
Tiacutetulo da pesquisa Aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina aacutecida-EDTA e avaliaccedilatildeo da
eficaacutecia no tratamento de hemaacutecias com teste direto da antiglobulina positivo
Pesquisadora responsaacutevel Ceacutelia Kazue Abiko
Orientador Prof Dimas Tadeu Covas
Co-orientadora Dra Flaacutevia Leite Souza Santos
Objetivo da pesquisa Vocecirc estaacute sendo convidado a participar de uma pesquisa que tem
como objetivo padronizar uma nova teacutecnica para auxiliar na tipagem sanguiacutenea de pacientes
A tipagem sanguiacutenea pode sofrer interferecircncia da presenccedila de anticorpos ligados aos gloacutebulos
vermelhos do sangue Nessas situaccedilotildees eacute difiacutecil selecionar o melhor sangue para o paciente e
eacute preciso a utilizaccedilatildeo de teacutecnicas adicionais para remover essas interferecircncias
Esta pesquisa tem como objetivo estudar outra teacutecnica para remover esses anticorpos e
comparaacute-la com a teacutecnica atualmente utilizada Para isso precisamos de amostras de pacientes
e doadores voluntaacuterios
Se vocecirc eacute um doador eacute necessaacuterio que vocecirc autorize a coleta de 5 ml (1 tubo) a mais
de seu sangue
Se vocecirc eacute um paciente natildeo haveraacute necessidade de nova amostra pois utilizaremos as
amostras jaacute coletadas para os testes preacute-transfusionais e os resultados encontrados nesta
pesquisa natildeo iratildeo interferir na escolha da (s) bolsa (s) de sangue que vocecirc possa vir a receber
Se vocecirc concordar em participar leia com atenccedilatildeo o texto abaixo e assine as duas vias
rubricando todas as paacuteginas deste termo de consentimento Uma via original assinada e
rubricada por vocecirc e pela pesquisadora ficaraacute com vocecirc
As suas informaccedilotildees seratildeo mantidas em sigilo pela pesquisadora e natildeo haveraacute
armazenamento de material para pesquisas posteriores Os seus dados seratildeo usados apenas
neste estudo e quando o trabalho for publicado seu nome e qualquer outra informaccedilatildeo que
possam identificaacute-lo natildeo seratildeo revelados
Eacute pouco provaacutevel que o que noacutes aprendermos com este estudo tenha um benefiacutecio
direto para vocecirc assim como natildeo poderemos dar nada em troca pela sua participaccedilatildeo na
pesquisa
Nosso objetivo com esta pesquisa eacute que os resultados poderatildeo ser uacuteteis para o
tratamento de pacientes no futuro Os riscos da participaccedilatildeo satildeo miacutenimos Se vocecirc eacute um
doador de sangue a amostra seraacute coletada no momento da doaccedilatildeo natildeo exigindo punccedilatildeo
venosa adicional
52
Eacute seu direito ter acesso aos resultados dos testes da pesquisa Esses resultados natildeo
seratildeo fornecidos automaticamente a vocecirc mas caso vocecirc se interesse em saber o resultado ou
tiver alguma duacutevida sobre a sua participaccedilatildeo neste estudo deveraacute entrar em contato com Ceacutelia
Kazue Abiko pelo telefone (18) 99718-3551
Vocecirc tem total liberdade de optar por natildeo participar da pesquisa Caso aceite
participar poderaacute desistir a qualquer momento ou retirar seu consentimento mesmo apoacutes ter
coletado o sangue Para cancelar sua participaccedilatildeo basta avisar a pesquisadora e os seus dados
seratildeo retirados do projeto
Qualquer duacutevida eacutetica sobre a pesquisa poderaacute entrar em contato com o Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa do Hospital das Cliacutenicas e da Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto
(CAMPUS UNIVERSITAacuteRIO bairro Monte Alegre CEP 14048-900 Ribeiratildeo Preto-SP
Telefone (16) 3602-2228 FAX (16) 3633-1144 e-mail cephcrpuspbr)
Consentimento de participaccedilatildeo
A Consentimento do participante
Li as informaccedilotildees acima sobre o estudo e recebi explicaccedilotildees sobre a participaccedilatildeo no estudo
Portanto dou o meu consentimento para participar do estudo
___________________________________________________________________________
Nome completo
___________________________________________________________________________
Assinatura
___________
Data
__________________________________________________________________________________
Nome completo da pesquisadora
___________________________________________________________________________
Assinatura
_____________
Data
DEDICATOacuteRIA
Dedico este trabalho aos meus filhos Pedro e Maria que sirva de incentivo para a busca do
conhecimento sucesso e realizaccedilatildeo profissional
Aos colegas de trabalho Ana Paula Cristiane Igor Mara Rita e Simone pelo
companheirismo e pela agradaacutevel convivecircncia no dia dia
A todos os colegas do Hemonuacutecleo de Araccedilatuba e aos profissionais da aacuterea da sauacutede que
amam a profissatildeo trabalham com eacutetica e que se dedicam buscando o bem estar dos
pacientes
AGRADECIMENTOS
A DEUS pelo dom da vida e a graccedila de colocar em minha vida pessoas especiais que me
ajudaram a chegar ateacute aqui
Aos meus pais que me ensinaram respeito honestidade perseveranccedila e pelo incentivo aos
estudos
A dra Flaacutevia Leite Souza Santos que me ajudou durante todo o trabalho e contribuiu de
forma valiosa com todas as suas orientaccedilotildees
Ao meu esposo Abidias que de forma especial e carinhosa me deu forccedila e coragem me
apoiando nos momentos de dificuldade
Ao dr Dimas Tadeu Covas pela oportunidade de poder realizar este trabalho e pela ajuda na
definiccedilatildeo do tema
A dra Eugenia Amorim Ubialli pelo apoio e pela prestreza em ajudar sempre que necessitei
Ao dr Wolney Gois Barreto diretor do Hemonuacutecleo de Araccedilatuba pelo incentivo para
realizaccedilatildeo do mestrado
A minha irmatilde Leda que apoiou e ajudou nas horas em que precisei e que natildeo foram poucas
A Raquel Botelho pela sua atenccedilatildeo e prontidatildeo para ajudar
Aos colegas do mestrado aos com os quais convivi durante todo o ano de 2014 e que
guardarei eternamente em minha memoacuteria
A Eacutemile que me ajudou com as amostras e as valiosas informaccedilotildees
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 1
11TESTES PREacute-TRANSFUSIONAIS 1
111 TIPAGEM ABORh 2
112 ANTICORPOS ANTI-ERITROCITAacuteRIOS 3
113 PESQUISA E IDENTIFICACcedilAtildeO DE ANTICORPOS IRREGULARES 4
114 PROVA DE COMPATIBILIDADE 5
115 FENOTIPAGEM PARA OUTROS SISTEMAS 6
12 METODOLOGIAS APLICADOS Agrave ROTINA IMUNO-HEMATOLOacuteGICA 7
121 MEacuteTODOS DE FASE FLUacuteIDA 8
122 COLUNAS DE GEL 9
123 BIOLOGIA MOLECULAR 9
13 TESTE DA ANTIGLOBULINA 10
131 TESTE DIRETO DA ANTIGLOBULINA 11
132 TESTE INDIRETO DA ANTIGLOBULINA 12
133 CONDICcedilOtildeES CLIacuteNICAS COM TDA POSITIVO 13
134 ANEMIA HEMOLIacuteTICA AUTOIMUNE 15
135 TRATAMENTO DE HEMAacuteCIAS COM TDA POSITIVO 16
1351 TEacuteCNICA DE BLOQUEIO 17
1352 TRATAMENTO DE HEMAacuteCIAS COM ZZAP 17
1353 CLOROQUINA 17
1353 GLICINA-AacuteCIDAEDTA 18
2 OBJETIVOS 20
21 OBJETIVO GERAL 20
22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 20
3 JUSTIFICATIVA 21
4 METODOL OGIA 22
41 AMOSTRAS DE DOADORES 22
411 FENOTIPAGEM 23
412 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS HEMAacuteCIAS 24
413 TRATAMENTO DAS AMOSTRAS 25
42 PREPARO DA GLICINA AacuteCIDA-EDTA 25
421 TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA 26
43 PREPARO DA CLOROQUINA 26
431 TEacuteCNICA DA CLOROQUINA 26
44 VERIFICACcedilAtildeO DA EFETIVIDADE DOS TESTES 27
45 TESTE DO ELUATO 27
46 AMOSTRA DE PACIENTE 27
5 RESULTADOS 28
51 REAGENTES 28
52 AMOSTRAS DE DOADORES 28
521 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS AMOSTRAS 28
522 TRATAMENTO DAS HEMAacuteCIAS 29
523 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS TEacuteCNICAS 30
524 TESTAGEM DO ELUATO 33
525 EFEITO DA ELUICcedilAtildeO SOBRE OS ANTIacuteGENOS ERITROCITAacuteRIOS 34
526 AMOSTRA DE PACIENTE 35
527 TEMPO DE EXECUCcedilAtildeO DA TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA 36
528 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 40
6 DISCUSSAtildeO 42
7 CONCLUSAtildeO 45
8 REFEREcircNCIA BIBLIOGRAacuteFICA 46
9 ANEXOS 50
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Princiacutepio da teacutecnica direta da antiglobulinapaacutegina11
Figura 2 - Princiacutepio da teacutecnica indireta da antiglobulinapaacutegina 13
Figura 3 ndash Teste da soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem apoacutes sensibilizaccedilatildeo das hemaacuteciaspaacutegina 29
Figura 4 - TDA das amostras apoacutes sensibilizaccedilatildeo com anticorpospaacutegina 30
Figura 5 - Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com
cloroquina paacutegina 31
Figura 6 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA
paacutegina 32
Figura 7 - Painel do eluato da amostra 21 apresentando especificidade anti-Cpaacutegina 34
Figura 8 - Painel do eluato da amostra 47 apresentando especificidade anti-
K paacutegina 34
Figura 9 - Fenotipagem das amostras 24 e 50 para antiacutegeno K apoacutes tratamento com glicina-
aacutecidaEDTApagina 36
Figura 10 ndash TDA monoespeciacutefico Amostra sensibilizadardquo in vivordquo com anticorpo anti-
IgGpaacutegina 38
Figura 11 ndash TDA apoacutes o tratamentopaacutegina 38
Figura 12 ndash Resultado da fenotipagem da amostra sensibilizada ldquoin vivordquo por anti-
IgGpaacutegina 39
Figura 13 ndash Painel do eluato poacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA paacutegina 39
Figura 14 ndash Painel do eluato poacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA paacutegina 39
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Resultado geral do tratamento das hemaacutecias com glicina e
cloroquinapaacutegina 32
Tabela 2 - Resultados do TDA apoacutes tratamento da hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo
sensibilizadopaacutegina 33
Tabela 3 - Resultado apoacutes o segundo tratamento das hemaacutecias com glicina-
aacutecidaEDTApaacutegina 33
Tabela 4 - Resultado do Eluato das amostras tratadas com glicina-
aacutecidaEDTA paacutegina 34
Tabela 5 ndash Verificaccedilatildeo da interferecircncia do tratamento da hemaacutecias com cloroquina e glicina-
aacutecidaEDTA nos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e spaacutegina 35
Tabela 6 - Resultado da sensibilizaccedilatildeo das amostras efetividade do tratamento com
cloroquina glicina e o eluato poacutes tratamento com glicinapaacutegina 37
LISTA DE GRAFICOS
Graacutefico 1 - Nuacutemero de amostras sensibilizadas por especificidade de
anticorpopaacutegina 31
Graacutefico 2 - Teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla entre as teacutecnicas
aplicadaspaacutegina 41
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 - Preparo dos Reagentes da glicina-aacutecidaEDTApaacutegina 25
Quadro 2 - Preparo da Cloroquinapaacutegina 26
Quadro 3 - Resultados comparativos entre as teacutecnicas utilizadas paacutegina 40
LISTA DE FLUXOGRAMAS
Fluxograma 1 - Fluxograma da pesquisa utilizando as amostras de
doadorespaacutegina 22
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ABO
AHAI
Bg
c
C
C
C3
C3b
C3d
D
DHFRN
DNA
DTT
E
e
EDTA
Fc
Fya
Fyb
HCl
IgA
IgD
IgE
IgM
Mm
NaCl
PA
PAI
PBS
PCR
PEG
pH
Rh
rpm
S
s
SIDA
SBS
TCLE
TDA
TIA
TRIS
ZZAP
microL
Sistema Sanguiacuteneo ABO
Anemia Hemoliacutetica Autoimune
Antiacutegeno Bg
Antiacutegeno c
Celsius
Antiacutegeno C
Complemento
Fraccedilatildeo do complemento
Fraccedilatildeo do complemento
Antiacutegeno D
Doenccedila Hemoliacutetica do Feto e do Receacutem-nascido
Aacutecido desoxirribonucleico
Dithiothreitol
Antiacutegeno E
Antiacutegeno e
Aacutecido Etileno Diamino Tetraceacutetico
Porccedilatildeo do anticorpo
Antiacutegeno Duffy a
Antiacutegeno Duffy b
Aacutecido cloriacutedrico
Imunoglobulina A
Imunoglobulina D
Imunoglobulina E
Imunoglobulina M
Miliacutemetros
Cloreto de soacutedio
Puro para anaacutelise
Pesquisa de anticorpos irregulares
Tampatildeo fosfato salino
Reaccedilao em cadeia de polimerase
Polietilenoglicol
Potencial hidrogeniocircnico
Sistema sanguiacuteneo Rh
Rotaccedilotildees por minuto
Antiacutegeno S
Antiacutegeno s
Siacutendrome da Imunodeficiecircncia adquirida
Sistema de banco de sangue
Termo de consentimento livre e esclarecido
Teste direto da antiglobulina
Teste indireto da antiglobulina
Hidrometil aminometano
Sulphydryl-Proteolytic Enzyme
Microlitros
RESUMO
Os testes preacute-transfusionais satildeo o conjunto de teacutecnicas imuno-hematoloacutegicas aplicadas nas
amostras do receptor e do doador com a finalidade de fornecer uma unidade de hemaacutecias
compatiacutevel e segura para a transfusatildeo Aleacutem da fenotipagem ABO e Rh obrigatoacuteria nos testes
preacute-transfusionais a determinaccedilatildeo do perfil antigecircnico de outros antiacutegenos eritrocitaacuterios de
importacircncia cliacutenica melhora a seguranccedila transfusional especialmente para pacientes
previamente aloimunizados ou candidatos agrave transfusatildeo crocircnica Para tais pacientes conhecer o
fenoacutetipo eritrocitaacuterio permite a seleccedilatildeo de concentrados de hemaacutecias com o mesmo fenoacutetipo
o que previne reaccedilotildees transfusionais hemoliacuteticas assim como nova aloimunizaccedilatildeo
Indiviacuteduos que apresentam as hemaacutecias sensibilizadas ldquoin vivordquo por anticorpos anti-
eritrocitaacuterios como ocorre na anemia hemoliacutetica autoimune (AHAI) teratildeo o teste direto da
antiglobulina (TDA) positivo dificultando a realizaccedilatildeo da fenotipagem O TDA positivo
provoca resultados falsos positivos especialmente quando satildeo utilizados para a fenotipagem
soros comerciais da classe IgG que exigem a fase de antiglobulina humana ou teste indireto
da antiglobulina (TIA) para leitura Em 1982 Edwards Moulds e Judd propuseram a
utilizaccedilatildeo da teacutecnica da cloroquina para dissociar os complexos de antiacutegeno-anticorpo
preservando a membrana eritrocitaacuteria e permitindo a fenotipagem Atualmente eacute a teacutecnica
mais utilizada nos centros brasileiros A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA foi primeiramente
descrita por Louie Jieng e Zeroulis em 1986 poreacutem eacute pouco utilizada por natildeo haver os
reagentes prontos comercialmente no mercado brasileiro O presente estudo avaliou a teacutecnica
da glicina-aacutecida-EDTA com reagentes preparados ldquoin houserdquo em paralelo agrave teacutecnica da
cloroquina que eacute atualmente a teacutecnica aplicada no Hemocentro de Ribeiratildeo Preto Para isso
amostras de hemaacutecias de doadores (n=50) com fenoacutetipo conhecido foram sensibilizadas com
anticorpos humanos de especificidade conhecida e ambas as teacutecnicas foram aplicadas Foi
verificado ainda o efeito da teacutecnica sobre a expressatildeo dos antiacutegenos eritrocitaacuterios (Fya Fy
b
Jka Jk
b S e s) atraveacutes da fenotipagem das amostras que tiveram o TDA negativado A
viabiliadade dos anticorpos presentes no eluato recuperado apoacutes tratamento com a glicina-
aacutecidaEDTA tambeacutem foi testada A glicina-aacutecidaEDTA foi efetiva em negativar o TDA em
33 amostras (66) comparaacutevel com a cloroquina que negativou 28 amostras (56) O eluato
apresentou-se viaacutevel no tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA e natildeo foi constatada destruiccedilatildeo
dos antiacutegenos eritrocitaacuterios apoacutes o tratamento Concluiacutemos que a teacutecnica da glicina-
aacutecidaEDTA pode ser utilizada como uma opccedilatildeo no tratamento de hemaacutecias com TDA
positivo com a vantagem de seu tempo de execuccedilatildeo ser inferior ao da cloroquina (2minutos x
30 a 120 minutos) o que lhe torna uacutetil em situaccedilotildees de maior urgecircncia Quando ambas as
teacutecnicas satildeo utilizadas em hemaacutecias diferentes de uma mesma amostra a efetividade estaacute
significativamente aumentada (plt005)
Palavras chave Glicina-aacutecidaEDTA Teste direto da antiglobulina AHAI fenotipagem
ABSTRACT
The pre-transfusion tests are the group of immunohematology techniques applied in the
receptor and donor samples in order to provide a unit of red blood cells compatible and safe
for transfusion In addition to the obligatory ABO and Rh phenotyping in the pre-transfusion
tests the determination of the antigenic profile of other red cells antigens of clinical
importance improves transfusion safety especially for patients previously alloimmunized or
candidates for chronic transfusion For such patients knowing the phenotype allows the
selection of red blood cell concentrates with the same phenotype which prevents hemolytic
transfusion reactions as well as new alloimmunization Individuals who have antibody-coated
red blood cells sensitized in vivo such as in autoimmune hemolytic anemia (AHAI) will
have a direct antiglobulin test (DAT) positive making it difficult to perform phenotyping
Positive DAT causes false positive results especially when commercially available IgG
serums which require the human antiglobulin phase or indirect antiglobulin test (IAT) for
reading are used for phenotyping In 1982 Edwards Molds and Judd proposed the use of the
chloroquine technique to dissociate antigen-antibody complexes by preserving the erythrocyte
membrane and allowing phenotyping It is currently the most used technique in Brazilian
centers The EDTAglycine-acid technique was first described by Louie Jieng and Zeroulis in
1986 but it is little used because commercially available reagents are not available in the
Brazilian market The present study evaluated the EDTAglycine-acid technique with reagents
prepared in house in parallel to the chloroquine technique which is currently the technique
applied at the Hemocentro de Ribeiratildeo Preto For this donor red cells samples (n = 50) with
known phenotype were sensitized with human antibodies of known specificity and both
techniques were applied The effect of the technique on the expression of erythrocyte antigens
(Fya Fy
b Jk
a Jk
b S and s) was also verified by the phenotyping of the samples that had
negative DAT The viability of the antibodies present in the recovered eluate after treatment
with EDTAglycine-acid A was also tested EDTAglycine-acid was effective in negatively
affecting DAT in 33 samples (66) comparable to chloroquine that negatived 28 samples
(56) The eluate was viable in treatment with EDTAglycine-acid and no destruction of
erythrocyte antigens after treatment We conclude that the EDTA glycine-acid technique can
be used as an option in the treatment of red cells with TDA positive with the advantage that
its execution time is inferior to that of chloroquine (2 minutes x 30 to 120 minutes) which
makes it useful in emergency situations When both techniques are used in different
erythrocytes of the same sample the effectiveness is significantly increased (p lt005)
Key words EDTAglycine-acid direct antiglobulin test AIHA phenotyping
1 INTRODUCcedilAtildeO
A transfusatildeo de hemaacutecias eacute um recurso terapecircutico muito importante e eficaz e tem se
mostrado como um grande aliado no tratamento de diversas patologias auxiliando na
melhoria da sobrevida e qualidade de vida de diversos pacientes quando indicada de forma
correta Eacute provavelmente a modalidade de terapia mais utilizada no mundo sendo
considerada a forma mais antiga de terapia celular A transfusatildeo de hemaacutecias em pacientes
com anemia grave ou sangramento agudo reestabelece o niacutevel de hemoglobina moleacutecula
responsaacutevel pelo transporte de oxigecircnio para os tecidos melhorando a isquemia tecidual
(BARJAS-CASTRO 2013 ZAGO 2014)
A transfusatildeo de componentes celulares como o concentrado de hemaacutecias deve ser
bem avaliada quanto aos riscos e benefiacutecios Os testes preacute-transfusionais satildeo parte obrigatoacuteria
do processo transfusional e tecircm como funccedilatildeo assegurar que o melhor hemocomponente seja
selecionado para o paciente reduzindo assim a chance de transfusotildees incompatiacuteveis e reaccedilotildees
transfusionais (BARJAS-CASTRO 2013)
11TESTES PREacute-TRANSFUSIONAIS
Os testes preacute-transfusionais tecircm a finalidade de evitar a ocorrecircncia de reaccedilotildees
hemoliacuteticas no receptor decorrentes da transfusatildeo de hemaacutecias incompatiacuteveis do doador
(DOWNES e SHULMAN 2011) Tem como propoacutesito selecionar hemaacutecias que apoacutes
transfusatildeo deveratildeo ter sobrevida normal ou mais proacutexima do normal (MELO 2007)
Os testes preacute-transfusionais que consistem no conjunto de teacutecnicas
imunohematoloacutegicas aplicadas agraves amostras do receptor e doador devem ser realizados antes
de toda transfusatildeo A aplicaccedilatildeo desses testes tem como finalidade fornecer uma unidade de
hemaacutecias compatiacutevel e elevar a seguranccedila da transfusatildeo Os testes preacute-transfusionais aliados
a utilizaccedilatildeo de novas tecnologias tem historicamente evitado reaccedilotildees transfusionais
hemoliacuteticas garantindo a seguranccedila transfusional em cerca de 95 dos pacientes que recebem
transfusatildeo Eacute imprescindiacutevel poreacutem a execuccedilatildeo correta das teacutecnicas envolvidas nos testes preacute-
transfusionais e ainda garantir a identificaccedilatildeo correta do receptor e das amostras de sangue e
das unidades de hemaacutecias (CASTILHO 2000 MELO 2007 BARJAS-CASTRO 2013)
2
Todos os testes que compotildeem a rotina preacute-transfusional usam meacutetodos soroloacutegicos
que envolvem a reaccedilatildeo antiacutegeno x anticorpo Ao testar a presenccedila de um antiacutegeno na
superfiacutecie da hemaacutecia eacute necessaacuterio dispor de um soro com especificidade conhecida para
aquele antiacutegeno Por outro lado testar a presenccedila de um determinado anticorpo no soro ou no
plasma exige o uso de hemaacutecias com perfil antigecircnico conhecido Os testes preacute-transfusionais
incluem tipagem ABO (direta e reversa) tipagem Rh pesquisa de anticorpos irregulares no
sangue do receptor retipagem ABO e Rh do hemocomponente e prova de compatibilidade
entre as hemaacutecias do doador e soro ou plasma do receptor em caso de transfusatildeo de hemaacutecias
ou hemocomponentes que contenham mais de 2 mL de volume eritrocitaacuterio como o
concentrado de granuloacutecitos (BRASIL 2016 GANZELLA 2014 SANTOS 2014)
Aleacutem dos testes regularmente realizados a determinaccedilatildeo do fenoacutetipo para outros
antiacutegenos eritrocitaacuterios do doador e do receptor pode ser indicada A fenotipagem eritrocitaacuteria
determina o perfil antigecircnico para outros antiacutegenos de importacircncia cliacutenica aleacutem do sistema
ABO e do antiacutegeno RhD Ela pode auxiliar a confirmaccedilatildeo de uma especificidade de anticorpo
encontrada no soro do paciente uma vez que espera-se que a sua hemaacutecia natildeo expresse o
antiacutegeno correspondente e simultaneamente eacute utilizada para selecionar um concentrado de
hemaacutecias negativo para o respectivo antiacutegeno evitando reaccedilotildees hemoliacuteticas transfusionais A
fenotipagem de candidatos a transfusotildees crocircnicas tambeacutem eacute recomendada pois esse grupo de
pacientes deve se beneficiar com a transfusatildeo profilaacutetica de unidades de hemaacutecias com
mesmo fenoacutetipo evitando assim a aloimunizaccedilatildeo assim como reaccedilotildees hemoliacuteticas provocadas
por anticorpos previamente existentes e em baixo tiacutetulo natildeo identificados pela triagem de
anticorpos (CASTILHO JUNIOR e REID 2015 DOWNES e SHULMAN 2011)
111 TIPAGEM ABORh
O sistema ABO (ISBT001) foi o primeiro sistema de grupo sanguiacuteneo a ser
descoberto Ele foi descrito em 1900 por Karl Landsteiner e eacute considerado o sistema de maior
importacircncia na praacutetica transfusional Ele eacute composto por quatro antiacutegenos A1 (ABO1) B
(ABO2) AB (ABO3) e A1 (ABO4) e eacute caracterizado pela presenccedila dos anticorpos naturais
ou seja anticorpos que surgem sem a exposiccedilatildeo preacutevia aos antiacutegenos atraveacutes de transfusatildeo ou
gestaccedilatildeo Os anticorpos ABO satildeo predominantemente da classe IgM satildeo capazes de fixar o
complemento e de provocar hemoacutelise grave intravascular caso ocorra transfusatildeo ABO
incompatiacutevel Por apresentar essa caracteriacutestica peculiar a tipagem do sistema ABO eacute
composta de duas etapas a prova direta e a prova reversa Na prova direta eacute realizada a
pesquisa dos antiacutegenos na superfiacutecie das hemaacutecias que satildeo testadas com soros comerciais
3
Anti-A e Anti-B A prova reversa por sua vez pesquisa a presenccedila de anticorpos ABO ao
testar o soro ou plasma do pacientedoador com hemaacutecias A1 e B Ambas as provas satildeo
obrigatoacuterias e devem ser concordantes para interpretaccedilatildeo do fenoacutetipo ABO (COOLING
2011 SANTOS 2014)
O sistema Rh (ISBT004) eacute o maior e mais complexo sistema de grupos sanguiacuteneos
compreendendo atualmente 54 antiacutegenos (ISBT 2016) Satildeo cinco os principais antiacutegenos do
sistema Rh D (RH1) C (RH2) E (RH3) c (RH4) e e (RH5) Esses antiacutegenos possuem alta
capacidade imunogecircnica e seus respectivos anticorpos estatildeo envolvidos na doenccedila hemoliacutetica
perinatal e em reaccedilotildees transfusionais hemoliacuteticas Os autoanticorpos quentes como ocorre na
anemia hemoliacutetica quente satildeo representados em grande parte por anticorpos contra antiacutegenos
puacuteblicos do sistema Rh (CASTILHO 2007 CHOU e WESTHOFF 2011 BARJAS-
CASTRO 2013) A tipagem RhD pesquisa o antiacutegeno D na membrana eritrocitaacuteria ao testar a
hemaacutecia com antissoros comerciais Atualmente a maior parte dos soros Anti-D
comercializados satildeo monoclonais
112 ANTICORPOS ANTI-ERITROCITAacuteRIOS
Anticorpos satildeo proteiacutenas presentes no plasma tambeacutem denominadas imunoglobulinas
Satildeo produzidas pelo sistema imune em resposta a um determinado antiacutegeno Podem ser
classificadas de acordo com suas caracteriacutesticas e propriedades em cinco classes de
imunoglobulinas IgG IgM IgA IgE e IgD (BARJAS-CASTRO 2013)
A ligaccedilatildeo entre o antiacutegeno e o anticorpo envolvem ligaccedilotildees natildeo covalentes que satildeo
reversiacuteveis Vaacuterios tipos de interaccedilotildees natildeo covalentes podem contribuir para a ligaccedilatildeo do
antiacutegeno pelo anticorpo incluindo forccedilas eletrostaacuteticas pontes de hidrogecircnio forccedilas de Van
der Walls e interaccedilotildees hidrofoacutebicas (ABBAS LICHTMAN e PILLAI 2008)
As interaccedilotildees antiacutegeno-anticorpo satildeo constituiacutedas por ligaccedilotildees dinacircmicas que sofrem
interferecircncia de alteraccedilotildees fiacutesico-quiacutemicas no meio como mudanccedilas na temperatura na forccedila
eletrostaacutetica na concentraccedilatildeo do antiacutegeno e do anticorpo e no pH O melhor pH para a reaccedilatildeo
eacute em torno de 70 no entanto raros anticorpos podem exigir acidificaccedilatildeo do meio para serem
identificados (SANTOS 2014)
Em imunohematologia satildeo pesquisados os anticorpos que reconhecem os antiacutegenos
eritrocitaacuterios de grupo sanguiacuteneo ldquoin vivordquo esses anticorpos dependendo de seu significado
cliacutenico satildeo capazes de reconhecer seus respectivos antiacutegenos sobre a hemaacutecia podendo levar
a sua destruiccedilatildeo por dois mecanismos fagocitose por macroacutefagos no sistema
4
reticuloendotelial ou por ativaccedilatildeo do sistema complemento com a formaccedilatildeo do complexo de
ataque a membrana e hemoacutelise intravascular As duas classes de anticorpos de maior
importacircncia em imunohematologia satildeo as imunoglobulinas IgG e a IgM (SANTOS 2014)
Devido a sua estrutura pentameacuterica os anticorpos da classe IgM se ligam aos
antiacutegenos localizados na superfiacutecie da membrana de hemaacutecias proacuteximas e promovem
aglutinaccedilatildeo das mesmas em meio salino ldquoin vitrordquo Anticorpos da classe IgG por sua vez
satildeo denominados ldquonatildeo aglutinantesrdquo ou ldquoincompletosrdquo pois sua estrutura de monocircmero eacute
pequena o que desfavorece a aglutinaccedilatildeo direta uma vez que uma mesma moleacutecula de IgG
natildeo alcanccedila antiacutegenos alvos em duas hemaacutecias proacuteximas Os anticorpos IgM aleacutem de terem
um tamanho maior apresentam 750 vezes maior eficiecircncia de aglutinaccedilatildeo que os anticorpos
IgG permitindo maior facilidade nas ligaccedilotildees entre as hemaacutecias (CARRUCIO e WISE 2012
GREEN e KLOSTERMANN 2012)
Nos testes ldquoin vitrordquo satildeo simulados reaccedilotildees que poderiam ocorrer ldquoin vivordquo causando
reaccedilotildees indesejaacuteveis A fase de sensibilizaccedilatildeo em que o anticorpo se liga ao antiacutegeno
correspondente natildeo eacute identificada macroscopicamente poreacutem uma vez que o anticorpo
aproxima as hemaacutecias e vence a forccedila eletrostaacutetica que naturalmente as repele chamada de
potencial zeta ocorre a aglutinaccedilatildeo Dependendo das caracteriacutesticas do anticorpo e de sua
capacidade de fixar complemento pode ocorrer tambeacutem a hemoacutelise (SANTOS 2014)
113 PESQUISA E IDENTIFICACcedilAtildeO DE ANTICORPOS IRREGULARES
A pesquisa de anticorpos irregulares eacute teste obrigatoacuterio nos testes preacute-transfusionais e
tem a finalidade de detectar anticorpos ldquoin vitrordquo que possam causar reaccedilatildeo ldquoin vivordquo
Dependendo da populaccedilatildeo estudada (pacientes x doadores) e ainda da sensibilidade do
teste a frequecircncia de anticorpos irregulares pode variar de 03 a 38 A imunizaccedilatildeo pode
ocorrer por transfusatildeo gestaccedilatildeo transplante ou injeccedilatildeo de material imunogecircnico (WALKER
2011)
Os anticorpos irregulares podem ser classificados como aloanticorpos que satildeo
voltados contra antiacutegenos ausentes na hemaacutecia autoacuteloga ou como autoanticorpos os quais
reconhecem antiacutegenos eritrocitaacuterios proacuteprios Os autoanticorpos antieritrocitaacuterios surgem em
decorrecircncia da desregulaccedilatildeo da autotoleracircncia imune relacionada agrave condiccedilotildees diversas como
doenccedilas hematoloacutegicas doenccedilas inflamatoacuterias autoimunes neoplasias infecccedilotildees e uso de
medicaccedilotildees A presenccedila do autoanticorpo associado a um quadro de anemia hemoliacutetica
caracteriza a anemia hemoliacutetica autoimune (AHAI) seja ela primaacuteria ou secundaacuteria agrave outra
5
patologia Ateacute 12 a 40 dos pacientes com autoanticorpos quentes podem apresentar
aloanticorpos de significado cliacutenico mascarados pelos autoanticorpos (SHIREY et al 2002)
Eacute importante detectar a presenccedila de anticorpos no plasmasoro de um receptor de
transfusatildeo para garantir que seja transfundido sangue compatiacutevel Quando a pesquisa de
anticorpo irregular resultar positiva para um ou mais anticorpos de relevacircncia clinica eacute
necessaacuterio confirmar a ausecircncia do respectivo antiacutegeno na hemaacutecia do receptor assim como
selecionar para transfusatildeo concentrados de hemaacutecias tambeacutem negativos para aqueles
antiacutegenos evitando assim reaccedilotildees transfusionais (WALKER 2011)
A detecccedilatildeo de um anticorpo irregular eacute inicialmente realizada pela triagem de
anticorpos na qual o soroplasma do receptor eacute testado com 2 a 3 hemaacutecias do tipo ldquoOrdquo O
conjunto de fenoacutetipos dessas hemaacutecias deve contemplar os antiacutegenos de maior importacircncia
cliacutenica Como os anticorpos irregulares de maior interesse cliacutenico satildeo na maior parte das
vezes imunes portanto da classe IgG eacute obrigatoacuteria a fase de antiglobulina (AGH) do teste
ou teste indireto da antiglobulina (TIA) uma vez que esses anticorpos satildeo incompletos
(CASTILHO JUNIOR e REID 2015) O teste de triagem estando positivo deve-se fazer a
identificaccedilatildeo da especificidade do anticorpo utilizando um painel com maior nuacutemero de
hemaacutecias fenotipadas
114 PROVA DE COMPATIBILIDADE
A prova de compatibilidade eacute um teste obrigatoacuterio em caso de transfusatildeo de
componentes eritrocitaacuterios Tambeacutem chamada de prova de compatibilidade maior deve ser
realizada antes da administraccedilatildeo de sangue total ou concentrado de hemaacutecias utilizando-se
hemaacutecias obtidas do tubo coletor da bolsa a ser transfundida e o soro ou plasma do receptor
(BRASIL 2016)
Eacute definido como o procedimento para excluir a incompatibilidade entre o doador e o
receptor Tem o objetivo de detectar anticorpos que podem natildeo ter sido encontrados na
pesquisa de anticorpos devido a ausecircncia ou pouca expressatildeo de antiacutegenos no painel de
hemaacutecias aleacutem da possibilidade de terem ocorrido erros teacutecnicos ou notacionais durante a
realizaccedilatildeo da pesquisa (MELO 2007)
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115 FENOTIPAGEM PARA OUTROS SISTEMAS
Aleacutem da pesquisa de ABORh que eacute realizado rotineiramente a fenotipagem para
outros sistemas tambeacutem denominado ldquofenotipagem estendidardquo determina a presenccedila ou
ausecircncia de antiacutegenos considerados de importacircncia cliacutenica A fenotipagem natildeo eacute obrigatoacuteria
nos testes preacute-transfusionais poreacutem a legislaccedilatildeo atual recomenda a realizaccedilatildeo da fenotipagem
eritrocitaacuteria dos antiacutegenos C (RH2) E (RH3) c (RH4) e (RH5) K (KELL1) Fya (FY1) Fy
b
(FY2) Jka
(JK1) Jkb (JK2) S (MNS3) e s (MNS4) para pacientes aloimunizados e pacientes
com indicaccedilatildeo de transfusatildeo crocircnica (BRASIL 2016)
A seleccedilatildeo de concentrados de hemaacutecias com o mesmo fenoacutetipo do receptor para
transfusatildeo pode evitar reaccedilotildees transfusionais hemoliacuteticas no paciente previamente
aloimunizado tambeacutem previne a sensibilizaccedilatildeo por outros antiacutegenos o que normalmente
torna as transfusotildees seguintes ainda mais complicadas A fenotipagem do paciente tambeacutem
auxilia na identificaccedilatildeo dos anticorpos pois espera-se que nas hemaacutecias do paciente o
antiacutegeno seja negativo para o anticorpo encontrado servindo de guia para teste de exclusatildeo de
anticorpos (SANTOS 2014 WALKER 2011)
A incidecircncia de aloanticorpos aumenta com o nuacutemero de transfusotildees no entanto a
implantaccedilatildeo de rotina de fenotipagem com transfusatildeo profilaacutetica de hemaacutecias com fenoacutetipo
compatiacutevel para pacientes candidatos agrave politransfusatildeo como os portadores de doenccedila
falciforme talassemia anemia aplaacutestica doenccedilas linfo e mieloproliferativas renais crocircnicos e
anemias refrataacuterias pode contribuir para o baixo iacutendice de sensibilizaccedilatildeo nessas populaccedilotildees
(FLUIT KUNST e DRENTHE-SCHONK 1999 MARTINS et al 2008 e VICHINSKY et
al 2001) Outro grupo de pacientes que se beneficia com a transfusatildeo de mesmo fenoacutetipo satildeo
os pacientes com AHAI uma vez que o autoanticorpo pode mascarar a presenccedila de um
aloanticorpo de significado cliacutenico em ateacute 40 dos casos Mesmo com as teacutecnicas utilizadas
ldquoin vitrordquo para remover a interferecircncia do autoanticorpo no soro um aloanticorpo pode natildeo
ser identificado e dessa forma transfundir o mesmo fenoacutetipo do paciente evitaria reaccedilatildeo
hemoliacutetica pelos anticorpos voltados contra antiacutegenos de maior importacircncia cliacutenica e de
frequecircncia intermediaacuteria Aleacutem disso os pacientes com AHAI satildeo fortes respondedores e a
transfusatildeo profilaacutetica do mesmo fenoacutetipo previne a aloimunizaccedilatildeo (SHIREY et al 2002)
Aleacutem de fenotipar o receptor eacute importante tambeacutem que os bancos de sangue tenham
rotinas de fenotipagem de doadores para atender as necessidade dos pacientes aloimunizados
ou em esquema de transfusatildeo crocircnica (PINTO BRAGA e SANTOS 2011)
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Rotineiramente eacute inviaacutevel estabelecer o fenoacutetipo eritrocitaacuterio completo de um
indiviacuteduo pela grande diversidade de sistemas sanguiacuteneos descritos Ate junho de 2015 jaacute
haviam sido classificados 308 antiacutegenos atribuiacutedos a 36 sistemas definidos pela Sociedade
Internacional de Transfusatildeo de Sangue (ISBT) (CASTILHO JUNIOR e REID 2015)
Portanto o paciente eacute normalmente fenotipado para os antiacutegenos de maior importacircncia
clinica
Alguns fatores podem limitar a realizaccedilatildeo da fenotipagem eritrocitaacuteria Um dos fatores
eacute a transfusatildeo alogecircnica realizada haacute menos de 90 dias Neste caso podem ocorrer resultados
falso positivos para determinados antiacutegenos devido agrave presenccedila de hemaacutecias do doador
(LAINE et al 2000)
Outro fator eacute a presenccedila de anticorpo sensibilizando a hemaacutecia do paciente e
provocando positividade do teste direto da antiglobulina humana (TDA) Os soros
normalmente utilizados para fenotipagem especialmente para os antiacutegenos Fya
(FY1) Fyb
(FY2) Jka
(JK1) Jkb
(JK2) S (MNS3) e s (MNS4) necessitam da fase de antiglobulina
humana (AGH) para que ocorra aglutinacatildeo Amostras que apresentam o TDA positivo
aglutinam apoacutes reaccedilatildeo com a AGH natildeo pela real presenccedila do antiacutegeno em sua superfiacutecie mas
pela interaccedilatildeo da AGH com o anticorpo que estaacute sensibilizando o eritroacutecito A interferecircncia
do TDA positivo pode ser anulada atraveacutes de algumas teacutecnicas capazes de dissociar o
anticorpo como por exemplo o tratamento da hemaacutecia sensibilizada com cloroquina ou com
glicina-aacutecida-EDTA (BRANCH e PETZ 1999 SHIREY et al 2002 e LEGER 2011)
12 METODOLOGIAS APLICADOS Agrave ROTINA IMUNO-HEMATOLOacuteGICA
Todos os testes que compotildeem a rotina preacute-transfusional usam meacutetodos soroloacutegicos
que envolvem a reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo e tem como objetivo determinar o perfil antigecircnico
eritrocitaacuterio do receptor e do doador assim como identificar em seu soro a presenccedila de
anticorpos contra antiacutegenos eritrocitaacuterios que possam comprometer a sobrevida das hemaacutecias
transfundidas Para testar o antiacutegeno na superfiacutecie da hemaacutecia eacute necessaacuterio dispor de um
antissoro com especificidade conhecida para aquele antiacutegeno Por outro lado para testar a
presenccedila de um determinado anticorpo no soro ou plasma do receptor eacute necessaacuterio o uso de
hemaacutecias com perfil antigecircnico conhecido (SANTOS 2014)
Diversas metodologias satildeo aplicadas nos laboratoacuterios de imunohematologia Cada
serviccedilo de hemoterapia faz a escolha do meacutetodo que seraacute aplicado de acordo com o perfil do
laboratoacuterio com o volume de exames diaacuterios e tambeacutem com o custo envolvido Todas essas
8
teacutecnicas tecircm como objetivo comum demonstrar a reaccedilatildeo entre antiacutegeno e anticorpo no
entanto elas se baseiam em diferentes princiacutepios Muitas metodologias satildeo atualmente
aplicadas agrave imunohematologia entre elas o sistema de fase soacutelida a tecnologia de hemaacutecias
magnetizadas a biologia molecular e ateacute mesmo a citometria de fluxo no entanto os meacutetodos
mais tradicionais satildeo aqueles baseados no princiacutepio de hemaglutinaccedilatildeo
121 MEacuteTODOS DE FASE FLUacuteIDA
Os meacutetodos de fase fluiacuteda satildeo testes baseados na hemaglutinaccedilatildeo e incluem o teste em
tubo e o teste em microplacas Uma suspensatildeo de hemaacutecias eacute adicionada ao plasma ou soro
em seguida eacute realizada a centrifugaccedilatildeo e por fim eacute feita a leitura do resultado que eacute
considerado positivo se for observado algum grau de aglutinaccedilatildeo ou hemoacutelise A intensidade
de aglutinaccedilatildeo eacute graduada de acordo com o tamanho dos agregados desprendidos da
superfiacutecie apoacutes agitaccedilatildeo delicada do tubo ou microplaca Os meacutetodos de hemaglutinaccedilatildeo satildeo
aplicados a todos os testes preacute-transfusionais Como os anticorpos ABO satildeo aglutininas frias
a tipagem eacute realizada em temperatura ambiente (22degC) no entanto ao investigar a presenccedila
de anticorpos irregulares que como jaacute mencionado eacute na maioria das vezes anticorpos
incompletos da classe IgG eacute essencial que a reaccedilatildeo seja incubada a 37degC As reaccedilotildees satildeo
facilitadas com a utilizaccedilatildeo de potencializadores e da antiglobulina humana (WALKER e
HARMENING 2012 AABB 2011)
Nos meacutetodos de fase fluiacuteda nos quais a AGH eacute empregada a fase de lavagem eacute
fundamental Apoacutes a incubaccedilatildeo do soro com as hemaacutecias deve ser realizada a lavagem da
reaccedilatildeo para remover o excesso de anticorpos natildeo ligados agraves hemaacutecias jaacute que os anticorpos
livres podem bloquear a AGH quando ela eacute adicionada e levar a resultados falso negativos
(AABB 2011)
Os testes de hemaglutinaccedilatildeo satildeo os mais tradicionais entre os meacutetodos ainda hoje
aplicados agrave rotina de bancos de sangue A vantagem desses meacutetodos eacute o baixo custo quando
comparado agraves teacutecnicas mais modernas mas apresentam tambeacutem desvantagens A teacutecnica em
tubo por exemplo natildeo permite automaccedilatildeo eacute trabalhosa e exige matildeo-de-obra bastante treinada
na execuccedilatildeo das diversas etapas do teste e mesmo assim pode haver subjetividade na
interpretaccedilatildeo dos resultados aleacutem de resultados falso-negativos (DOWNES 2011 ZANTEK
et al 2012)
9
122 COLUNAS DE GEL
A teacutecnica em gel iniciada na deacutecada de 90 representou uma grande revoluccedilatildeo na
rotina laboratorial tornando-se muito popular Aleacutem de ser sensiacutevel a teacutecnica dispensa a fase
de lavagem antes da adiccedilatildeo da AGH assim como a agitaccedilatildeo do teste para leitura reduzindo o
nuacutemero de resultados falsos negativos decorrentes dessas duas etapas e o tempo para
execuccedilatildeo dos testes (LAPIERRE et al 1989 NOVARETTI et al 2000 NOVARETTI et
al 2004) Os reagentes satildeo comercializados na forma de cartotildees plaacutesticos contendo
microtubos preenchidos por gel composto por microesferas de acrilamida-dextran Nesta
metodologia tambeacutem baseada na hemaglutinaccedilatildeo a suspensatildeo de hemaacutecias e o soro satildeo
depositados em uma cacircmara acima da coluna de gel e em seguida procede-se com a
centrifugaccedilatildeo dos cartotildees As microesferas atuam como uma malha que permite a passagem
em direccedilatildeo ao fundo do microtubo apenas das hemaacutecias natildeo aglutinadas enquanto as
hemaacutecias aglutinadas ficam retidas na parte superior da coluna ou ao longo dela (GREEN e
KLOSTERMANN 2012) Portanto quanto maior a agregaccedilatildeo mais hemaacutecias ficam retidas
no topo da coluna Dependendo do tipo de teste a ser realizado pode ser utilizado gel neutro
ou gel especiacutefico impregnado pelo anticorpo desejado e o gel contendo antiglobulina humana
que satildeo utilizados para os testes diretos e indiretos da antiglobulina (LAPIERRE et al 1989)
A coluna de gel ainda permite a visualizaccedilatildeo clara de duas populaccedilotildees distintas de hemaacutecias
como em pacientes receacutem transfundidos
123 BIOLOGIA MOLECULAR
A biologia molecular ou genotipagem estaacute sendo cada vez mais aplicada aos grupos
sanguiacuteneos pois fornece resultados seguros e precisos especialmente nos casos em que natildeo eacute
possiacutevel a realizaccedilatildeo da fenotipagem como em pacientes receacutem-transfundidos e pacientes
com TDA positivo Na genotipagem eacute possiacutevel determinar atraveacutes do DNA do paciente
extraiacutedo de seus leucoacutecitos de sangue perifeacuterico o fenoacutetipo eritrocitaacuterio deduzido sem
qualquer interferecircncia do anticorpo que sensibiliza a hemaacutecia ou de hemaacutecias alogecircnicas
transfundidas Sua realizaccedilatildeo no entanto exige o treinamento de equipe especializada e capaz
de interpretar os resultados em conjunto com os achados soroloacutegicos (JUNIOR e OLIVATO
2007)
Apesar de ser uma ferramenta de grande importacircncia hoje na imuno-hematologia
ainda estaacute restrito aos grandes centros de hemoterapia no Brasil poucos serviccedilos puacuteblicos de
sauacutede dispotildeem desse recurso e utilizam teacutecnicas de genotipagem de grupos sanguiacuteneos para
atendimento a seus pacientes Esta abordagem poreacutem vem sendo introduzida em algumas
10
instituiccedilotildees de reconhecida competecircncia na hemoterapia mas sua disponibilizaccedilatildeo deve
tornar-se mais generalizada atraveacutes da formaccedilatildeo de centros de referecircncia para atendimento
das diversas unidades de hemoterapia (MARTINS et al 2009) Dessa forma muitas decisotildees
transfusionais especialmente em urgecircncias ainda devem ser tomadas sem o resultado da
genotipagem eritrocitaacuteria
13 TESTE DA ANTIGLOBULINA
Coombs Mourant e Race descreveram em 1945 uma teacutecnica com utilizando soro de
coelho contendo antiglobulina humana (AGH) que posteriormente foi chamada de ldquosoro de
Coombsrdquo O meacutetodo foi desenvolvido inicialmente para ampliar o efeito de aglutininas fracas
do sistema Rh anticorpos ldquoincompletosrdquo que normalmente natildeo apresentavam aglutinaccedilatildeo
visiacutevel O teste foi concebido como um instrumento de investigaccedilatildeo de doenccedila hemoliacutetica do
receacutem-nascido e de reaccedilotildees transfusionais causadas por anticorpos Rh que estavam presentes
no soro dos paciente poreacutem que natildeo eram demonstraacuteveis pelas teacutecnicas ateacute entatildeo existentes
A maior parte dos anticorpos de significado cliacutenico assim como seus respectivos
antiacutegenos foram descritos apoacutes o surgimento do ldquosoro de Coombsrdquo em 1945 sendo assim o
teste da antiglobulina representa ateacute hoje a forma mais importante de aglutinaccedilatildeo artificial em
imunohematologia permitindo revelar a presenccedila de anticorpos na membrana da hemaacutecia A
antiglobulina humana eacute constituiacuteda por anticorpo especiacutefico contra a porccedilatildeo Fc de outro
anticorpo Quando um anticorpo ldquoincompletordquo sensibiliza a hemaacutecia normalmente natildeo
provoca aglutinaccedilatildeo visiacutevel Apoacutes a adiccedilatildeo da AGH ao meio esta reconhece e se liga agraves
porccedilotildees Fc dos anticorpos que sensibilizam a hemaacutecia formando assim uma malha e
provocando aglutinaccedilatildeo visiacutevel (BARJAS-CASTRO 2013)
Os reagentes de antiglobulina podem ser poliespeciacuteficos ou monoespeciacuteficos Os
poliespeciacuteficos satildeo uma mistura de anticorpos ant-IgG e anti-C3d (fraccedilatildeo C3d do
complemento) Os reagentes monoespecificos podem ser anti-IgG anti-IgM anti-IgA anti-
complemento podendo ser anti-C3d e anti-C3b
O teste da antiglobulina pode ser usado para detectar hemaacutecias sensibilizadas com
aloanticorpos IgG autoanticorpos IgG e componentes do complemento A sensibilizaccedilatildeo
pode ocorrer ldquoin vivordquo ou ldquoin vitrordquo O uso do AGH para detectar a sensibilizaccedilatildeo ldquoin vitrordquo
tem dois estaacutegios e eacute denominado teste indireto da antiglobulina A sensibilizaccedilatildeo ldquoin vivordquo eacute
detectada em procedimento de um uacutenico estagio chamado teste direto da antiglobulina (TDA)
11
Os testes direto e indireto satildeo ateacute hoje amplamente aplicados como princiacutepio de inuacutemeros
testes soroloacutegicos em imuno-hematologia (GREEN e KLOSTERMANN 2012)
131 TESTE DIRETO DA ANTIGLOBULINA
O teste direto da antiglobulina humana revela a presenccedila de anticorpo eou fraccedilatildeo do
complemento ligados agrave superfiacutecie das hemaacutecias As sensibilizaccedilatildeo das hemaacutecias ocorrida ldquoin
vivordquo natildeo eacute visualizada mas apoacutes a adiccedilatildeo da antiglobulina humana ocorre a aglutinaccedilatildeo que
eacute visualizada macroscopicamente (Figura 1)
Figura 1 - Princiacutepio da teacutecnica direta da antiglobulina Teste utilizado para demonstrar a sensibilizaccedilatildeo ldquoin
vivordquo das hemaacutecias O sangue total eacute coletado do paciente em tubo contendo anticoagulante EDTA Na teacutecnica
realizada em tubo uma suspensatildeo de hemaacutecias 5 em soluccedilatildeo de salina eacute preparada Uma gota dessa suspensatildeo
eacute lavada 3 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica para retirada de anticorpos que estatildeo livres no plasma Toda soluccedilatildeo eacute
retirada e adiciona-se o soro de Coombs (antiglobulina humana) O soro de Coombs reconhece os anticorpos que
estatildeo ligados agrave superfiacutecie das hemaacutecias fazendo com que ocorra aglutinaccedilatildeo visiacutevel macroscopicamente
Apesar de natildeo ser um teste preacute-transfusional obrigatoacuterio o TDA eacute um dos testes mais
importantes para investigar e classificar quadros hemoliacuteticos como de origem imune ou natildeo
imune O seu valor preditivo positivo em vigecircncia de anemia hemoliacutetica eacute de 83 poreacutem natildeo
havendo sinais de hemoacutelise seu valor preditivo eacute apenas 14 Eacute por esse motivo que a
interpretaccedilatildeo do TDA positivo deve levar em consideraccedilatildeo a histoacuteria cliacutenica e os resultados
dos outros exames laboratoriais A realizaccedilatildeo do TDA eacute obrigatoacuteria na investigaccedilatildeo
12
laboratorial de diversos quadros hemoliacuteticos entre eles a anemia hemoliacutetica autoimune
(AHAI) a reaccedilatildeo hemoliacutetica imune poacutes-transfusional a siacutendrome do linfoacutecito passageiro a
doenccedila hemoliacutetica perinatal e a hemoacutelise droga-dependente (LEGER 2011)
Resultados de TDA positivos foram tambeacutem observados em indiviacuteduos com niacuteveis
seacutericos elevados de IgG ou complemento sem evidecircncia de anemia hemoliacutetica imune como
em pacientes com doenccedila falciforme talassemia doenccedila renal crocircnica mieloma muacuteltiplo
doenccedilas autoimunes e siacutendrome da imunodeficiecircncia adquirida (SIDA) Aleacutem disso pequenas
quantidades de IgG (5 a 90 moleacuteculas por hemaacutecia) e complemento (5 a 40 moleacuteculas por
hemaacutecia) podem estar presentes nas hemaacutecias de indiviacuteduos saudaacuteveis sem associaccedilatildeo com
reduccedilatildeo na sobrevida das mesmas A positividade do TDA depende da populaccedilatildeo estudada e
pode variar de 01 entre doadores de sangue sem qualquer sinal cliacutenico de hemoacutelise ateacute
15 em pacientes hospitalizados (CASTILHO JUNIOR e REID 2015 LEGER 2011)
Indiviacuteduos que apresentam TDA positivo seja agraves custas de IgG eou complemento
com ou sem sinais cliacutenicos de hemoacutelise teratildeo a fenotipagem eritrocitaacuteria prejudicada A
fenotipagem de indiviacuteduos com TDA positivo especialmente quando utilizado o teste indireto
da antiglobulina pode acarretar resultados falsos positivos e levar a seleccedilatildeo de fenoacutetipo
incorreto para transfusatildeo
132 TESTE INDIRETO DA ANTIGLOBULINA
O teste indireto da antiglobulina (TIA) eacute utilizado para revelar a sensibilizaccedilatildeo ldquoin
vitrordquo das hemaacutecias e eacute aplicado a diversos testes soroloacutegicos em imunohematologia entre
eles a pesquisa de anticorpos identificaccedilatildeo de anticorpos testes de compatibilidade
fenotipagem eritrocitaacuteria e titulaccedilatildeo de anticorpos Na teacutecnica indireta a hemaacutecia que contecircm
o antiacutegeno eacute colocada em contato ldquoin vitrordquo com o anticorpo que se liga mas natildeo promove a
aglutinaccedilatildeo visiacutevel A adiccedilatildeo da AGH forma uma malha entre os anticorpos que sensibilizam
as hemaacutecias e provoca a aglutinaccedilatildeo macroscoacutepica (figura 2)
Caso a amostra de hemaacutecia estudada seja previamente sensibilizada resultados falsos
positivos podem ser obtidos no TIA jaacute que a AGH reagiraacute com a moleacutecula que sensibilizava
anteriormente a hemaacutecia mesmo se o anticorpo especiacutefico natildeo tiver se ligado ao antiacutegeno
correspondente
13
133 CONDICcedilOtildeES CLIacuteNICAS COM TDA POSITIVO
O TDA positivo deve ser interpretado cuidadosamente sempre em conjunto com o
quadro cliacutenico do paciente A positividade isolada do TDA natildeo significa hemoacutelise A
interpretaccedilatildeo do teste positivo requer o conhecimento do diagnoacutestico do paciente da presenccedila
de sinais e sintomas sugestivos de hemoacutelise assim como de seu histoacuterico transfusional
gestacional e de informaccedilotildees sobre o uso recente de medicaccedilotildees (LEGER 2011)
Figura 2 ndash Princiacutepio do teste indireto da antiglobulina O TIA pode ser utilizado na pesquisa de anticorpos de
especificidades desconhecidas livres no soroplasma como eacute o caso da pesquisa e identificaccedilatildeo de anticorpos
irregulares Ele eacute tambeacutem utilizado para determinar a presenccedila de antiacutegenos na membrana da hemaacutecia quando
satildeo empregados soros de especificidades conhecidas da classe IgG No primeiro caso o soroplasma contendo o
anticorpo desconhecido eacute colocado em contato com hemaacutecias cujo perfil antigecircnico eacute conhecido No segundo
caso utiliza-se soro de especificidade conhecida da classe IgG para determinar a presenccedila ou ausecircncia de um
antiacutegeno na membrana O anticorpo encontra o antiacutegeno correspondente e ocorre a ligaccedilatildeo do anticorpo agrave
hemaacutecia mas natildeo ocorre aglutinaccedilatildeo Apoacutes a adiccedilatildeo da AGH que se liga aos anticorpos formando uma malha
ocorre a aglutinaccedilatildeo visiacutevel
O TDA positivo eacute uma achado claacutessico de algumas condiccedilotildees cliacutenicas como a reaccedilatildeo
transfusional hemoliacutetica a doenccedila hemoliacutetica do feto e do receacutem-nascido (DHFRN) a anemia
hemoliacutetica induzida por drogas a siacutendrome do linfoacutecito passageiro e a anemia hemoliacutetica
autoimune (AHAI) Portanto o TDA positivo pode ser decorrente da sensibilizaccedilatildeo da
hemaacutecia autoacuteloga por um autoanticorpo ou por um aloanticorpo ligado agrave hemaacutecia alogecircnica
circulante A positividade do TDA pode ainda ocorrer de forma passiva em pacientes que
14
recebem imunoglobulinas humanas ou ainda pela transfusatildeo de plaquetas ABO natildeo idecircntico
(LEGER 2011 RALPH 2012 ZANTEK et al 2012)
Nas reaccedilotildees transfusionais hemoliacuteticas imunes o aloanticorpo do receptor sensibiliza
as hemaacutecias transfundidas do doador e reduz sua sobrevida ao removecirc-la precocemente da
circulaccedilatildeo pela fagocitose no sistema retiacuteculo-endotelial ou pela hemoacutelise intravascular As
reaccedilotildees podem ser agudas se ocorrem ateacute 24 horas ou tardias quando ocorrem apoacutes 24 horas
da transfusatildeo A gravidade das reaccedilotildees hemoliacuteticas pode variar de um simples rendimento
transfusional inadequado agrave quadros graves de hemoacutelise intravascular evoluindo ateacute mesmo
com choque vascular e oacutebito O TDA pode resultar negativo caso toda massa eritrocitaacuteria
transfundida tenha sido destruiacuteda (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
Na doenccedila hemoliacutetica do feto e do receacutem-nascido (DHFRN) anticorpos maternos da
classe IgG atravessam a barreira placentaacuteria e sensibilizam as hemaacutecias fetais que seratildeo
destruiacutedas precocemente levando agrave anemia fetal Apesar da incompatibilidade ABO feto-
materna ser a causa mais frequente de DHFRN raramente ela eacute responsaacutevel pela ocorrecircncia
de quadros graves Por outro lado anticorpos contra antiacutegenos do sistema Rh e Kell
especialmente Anti-D (Anti-RH1) Anti-c (Anti-RH4) e Anti-Kell (Anti-KELL1) satildeo
conhecidos por causar DHFRN severa Raramente outros anticorpos tambeacutem podem estar
implicados na DHFRN como os anticorpos contra antiacutegenos do sistema Kidd Duffy MNS e
Diego (ZANTEK et al 2012)
A hemoacutelise droga-dependente eacute causada pela produccedilatildeo de um anticorpo voltado contra
a droga ligada agrave membrana eritrocitaacuteria ou ainda contra o complexo droga-membrana A
classe de medicaccedilotildees mais comumente envolvida eacute a dos antimicrobianos betalactacircmicos
(penicilinas e cefalosporinas) mas outras classes como quimioteraacutepicos e anti-inflamatoacuterios
tambeacutem satildeo descritos (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
Apoacutes transplante de ceacutelulas progenitoras hematopoieacuteticas em que o doador possui
anticorpos contra antiacutegenos eritrocitaacuterios do receptor o linfoacutecito de memoacuteria do doador pode
resistir ao esquema imunossupressor utilizado e continuar a produccedilatildeo de anticorpos que
reconhecem a hemaacutecia incompatiacutevel do receptor ainda circulante O quadro cliacutenico pode
variar de um simples TDA positivo sem outros sinais ou sintomas ateacute um quadro hemoliacutetico
grave e abrupto (LEGER 2011)
15
134 ANEMIA HEMOLIacuteTICA AUTOIMUNE
A anemia hemoliacutetica autoimune eacute caracterizada pela destruiccedilatildeo precoce das hemaacutecias
autoacutelogas por autoanticorpos que sensibilizam as hemaacutecias e levam agrave fagocitose pelos
macroacutefagos no sistema reticulo-endotelial ou hemoacutelise intravascular O diagnoacutestico da AHAI
baseia-se na presenccedila de hemoacutelise cliacutenica associada agrave evidecircncia de fator imune representado
pelo TDA positivo As classes de anticorpos envolvidas em quadros de AHAI satildeo IgG IgM e
raramente IgA (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012) Satildeo raros os casos de AHAI com TDA
negativo que podem estar relacionados a um autoanticorpo de baixa avidez de densidade
inferior agrave detecccedilatildeo do meacutetodo ou ainda de classe de imunoglobulina natildeo avaliada pelo
meacutetodo utilizado para o teste (GARRATY 2005)
A AHAI pode ser classificada em dois grupos principais de acordo com a melhor
temperatura de reaccedilatildeo do autoanticorpo As anemias hemoliacuteticas causadas por anticorpos
quentes que reagem melhor a 37oC e geralmente IgG representam 80 dos casos de AHAI
Nas AHAI por anticorpo quente o TDA pode ser positivo para IgG mais complemento (67)
somente IgG (20) ou somente por complemento (13) As anemias causadas por
anticorpos frios geralmente da classe IgM e que reagem melhor em temperatura ambiente ou
a 4oC representam aproximadamente 20 dos casos de AHAI Por exibirem amplitude
teacutermica esses anticorpos ligam-se agraves hemaacutecias ao atingirem a circulaccedilatildeo nas extremidades do
corpo fixam o complemento e desprendem-se da hemaacutecia apoacutes retornar para partes mais
quentes Por esse motivo em AHAI por anticorpos frios o TDA eacute positivo apenas agraves custas
de C3 e normalmente o IgM natildeo eacute detectado (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
A presenccedila do autoanticorpo IgG pode ser confirmada atraveacutes da eluiccedilatildeo do anticorpo
da hemaacutecia Tipicamente o eluato na AHAI por anticorpo quente reage com todas as ceacutelulas
testadas de um painel de hemaacutecias alogecircnicas do tipo ldquoOrdquo ou pode eventualmente exibir uma
especificidade conhecida como Anti-e (Anti-RH5) Nas AHAI a frio por sua vez espera-se
um eluato negativo (LEGER 2011)
Os autoanticorpos satildeo com frequecircncia encontrados livres no plasma e natildeo somente
ligados agraves hemaacutecias autoacutelogas Eles podem interferir em todas as fases dos testes preacute-
transfusionais nas quais o plasma eacute testado especialmente os autoanticorpos quentes que
acarretam resultados positivos em todos os testes levados agrave fase de antiglobulina humana
Esses anticorpos portanto positivam a pesquisa de anticorpos irregulares e mascaram a
presenccedila de aloanticorpos de significado cliacutenico Aproximadamente 60 dos pacientes que
apresentam AHAI a quente apresentam anticorpos que reagem em meio salino mas se forem
16
levados em conta meacutetodos mais sensiacuteveis como PEG enzima e estudo em gel a positividade
pode ser superior a 90 (LEGER 2011)
Aleacutem da eficaacutecia da transfusatildeo ser comprometida pela diminuiccedilatildeo da vida-meacutedia das
hemaacutecias a presenccedila do autoanticorpo dificulta a realizaccedilatildeo dos testes preacute-transfusionais e
compromete a seguranccedila transfusional Os autoanticorpos reagem normalmente como
panaglutininas pois satildeo normalmente voltados contra antiacutegenos puacuteblicos na maior parte das
vezes contra antiacutegenos do sistema Rh Por apresentarem essas caracteriacutesticas podem ainda
mascarar a presenccedila de aloanticorpos de significado clinico e levar a testes de compatibilidade
positivos exigindo uma avaliaccedilatildeo criteriosa da necessidade da transfusatildeo (BRANCH e PETZ
1999 JUNIOR e OLIVATO 2004)
Remover a interferecircncia do autoanticorpo para avaliar a presenccedila de aloanticorpos
mascarados nem sempre eacute possiacutevel mesmo utilizando teacutecnicas de autoadsorccedilatildeo ou
aloadsorccedilatildeo que aleacutem de tudo satildeo demoradas e exigem de 2 a 6 horas para conclusatildeo
(GARRATY e GEORGE 2002) Nesses casos a fenotipagem eritrocitaacuteria do paciente eacute de
extrema utilidade especialmente em situaccedilotildees de urgecircncia A definiccedilatildeo do fenoacutetipo do
paciente para os antiacutegenos de maior importacircncia cliacutenica pode auxiliar a seleccedilatildeo de unidades
de hemaacutecias com mesmo fenoacutetipo o que garante que eventuais aloanticorpos natildeo
identificados sejam respeitados e tambeacutem evita nova sensibilizaccedilatildeo (JUNIOR e OLIVATO
2004 SHIREY et al 2002)
135 TRATAMENTO DE HEMAacuteCIAS COM TDA POSITIVO
O TDA positivo impede a fenotipagem eritrocitaacutecia por meacutetodos que exigem a fase de
AGH uma vez que a aglutinaccedilatildeo ocorreraacute devido agrave interaccedilatildeo da AGH com o autoanticorpo
que sensibiliza a hemaacutecia do paciente levando a resultados falso positivos Em algumas
situaccedilotildees como na AHAI por anticorpo quente a fenotipagem eacute especialmente importante
pois o autoanticorpo interfere na triagem e identificaccedilatildeo de anticorpos assim como no teste de
compatibilidade e dificultam a detecccedilatildeo de aloanticorpos de significado cliacutenico que
obrigatoriamente devem ser respeitados Nessas situaccedilotildees a fenotipagem eritrocitaacuteria
determina o perfil antigecircnico do paciente e possibilita o fornecimento de unidades de
hemaacutecias com o mesmo fenoacutetipo para a transfusatildeo evitando a sensibilizaccedilatildeo para novos
antiacutegenos assim como reaccedilotildees hemoliacuteticas transfusionais No entanto eacute necessaacuterio aplicar
meacutetodos que natildeo sofram interferecircncia do TDA positivo ou seja meacutetodos que natildeo necessitem
da fase de AGH ou meacutetodos de bloqueio do anticorpo sem bloquear o antiacutegeno Uma opccedilatildeo eacute
a utilizaccedilatildeo de soros monoclonais IgM (salinos ou de meio proteico natildeo concentrado) mas
17
nem sempre esses reagentes estatildeo disponiacuteveis especialmente os reagentes monoclonais para
os antiacutegenos dos sistemas Duffy ( Fya Fy
b) Kidd ( Jk
a Jk
b) e MNS (S s) (JUNIOR e
OLIVATO 2004) Outra opccedilatildeo eacute a teacutecnica de bloqueio que pode ser utilizada para tratar
hemaacutecias para posterior fenotipagem em casos de TDA positivos com reatividade le2+
Em casos onde a positividade do TDA eacute maior que 2+ estaacute indicada a tratamento
quiacutemico para remoccedilatildeo da interferecircncia do autoanticorpo antes de realizar a fenotipagem Entre
as teacutecnicas utilizadas atualmente estatildeo o ZZAP a cloroquina e a glicina aacutecidaEDTA
1351 TEacuteCNICA DE BLOQUEIO
A teacutecnica de bloqueio se baseia na utilizaccedilatildeo de anti-IgG (Coombs monoespeciacutefico)
para tratar as hemaacutecias com TDA positivo O anticorpo anti-IgG se liga aos anticorpos que
estatildeo sensibilizando a hemaacutecias poreacutem sem o bloquear os antiacutegenos Os antiacutegenos que natildeo
estatildeo sensibilizados podem ser detectados atraveacutes dos antissoros especiacuteficos (SERERAT
VEIDT E DUTCHED 2000)
1352 TRATAMENTO DE HEMAacuteCIAS COM ZZAP
O Sulphydryl-Proteolytic Enzyme (ZZAP) que eacute uma mistura de ditiotreitol (DTT)
mais papaiacutena ativada com cisteiacutena eacute um reagente capaz de dissociar imunoglobulinas da
classe IgG ligadas a membrana dos eritroacutecitos enquanto trata enzimaticamente as hemaacutecias
O tratamento enzimaacutetico tambeacutem potencializa a ligaccedilatildeo do autoanticorpo ao antiacutegeno e
acelera o processo de autoadsorccedilatildeo O ZZAP pode desnaturar os antiacutegenos do sistema Duffy
MNS e Kell o que limita sua aplicaccedilatildeo para fins de fenotipagem (BRANCH e PETZ 1982)
1353 CLOROQUINA
Em 1982 Edwards Moulds e Judd propuseram a utilizaccedilatildeo da teacutecnica da cloroquina
que dissociava os complexos antiacutegeno-anticorpo e mantinha a membrana das hemaacutecias
iacutentegras Os derivados quinolecircicos jaacute haviam sido descritos anteriormente por Domokos e
Aszody em 1964 e Holtz Mantel e Buck em 1973 (apud Edwards Moulds e Judd 1982) pela
sua capacidade de separar imunocomplexos e inibir as reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo reduzindo
as cargas eleacutetricas das superfiacutecie das hemaacutecias A teacutecnica eacute uma das mais utilizadas nos
centros brasileiros para remover a interferecircncia do autoanticorpo e eacute tambeacutem a teacutecnica
atualmente adotada pelo laboratoacuterio de imunohematologia do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto
18
Edwards Moulds e Judd (1982) demonstraram que a teacutecnica da cloroquina para
dissociaccedilatildeo de anticorpos eacute uma teacutecnica simples efetiva e confiaacutevel para dissociar
imunoglobulina das hemaacutecias Desde que a membrana das hemaacutecias permaneccedila intacta natildeo
haacute perda da reatividade dos antiacutegenos e a sua maior aplicaccedilatildeo eacute a fenotipagem de hemaacutecias
com TDA positivo Os autores verificaram que em 83 das amostras sensibilizadas in vivo e
22 amostras (no total de 40) sensibilizadas ldquoin vitrordquo apresentaram TDA negativo e
puderam ser fenotipadas A teacutecnica poreacutem natildeo consegue remover os componentes do
complemento na maioria dos casos
Champagne e colaboradores (1999) testaram a teacutecnica da cloroquina para dissociar
antiacutegenos Bg comparando com a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA e verificaram vantagem em
relaccedilatildeo ao uso de um uacutenico reagente diminuindo a manipulaccedilatildeo e verificou que o mesmo natildeo
destroacutei antiacutegeno Kell
A cloroquina tambeacutem mostrou-se pouco efetivo em remover anticorpos do sistema
Duffy da superfiacutecie das hemaacutecias (EDWARDS MOUDS e JUDD 1982 ROZIERS e
SQUALI 1997)
1353 GLICINA-AacuteCIDAEDTA
A afinidade e a estabilidade entre a ligaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo eacute definida como a
resultante entre forccedilas atrativas e repulsivas entre ambos (CARUCIO e WISE 2012) e resulta
da somatoacuteria de forccedilas quiacutemicas dinacircmicas e fracas (natildeo covalentes) como pontes de
hidrogecircnio forcas eletrostaacuteticas forca de Van der Waals e pontes hidrofoacutebicas A estabilidade
dessa ligaccedilatildeo eacute facilmente abalada por alteraccedilotildees quiacutemicas e fiacutesicas no meio da reaccedilatildeo como
a alteraccedilatildeo do pH A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA se baseia na mudanccedila do pH para a
quebra da ligaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo (KOSANKE 2012)
A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA foi primeiramente descrita em 1986 por Louie Jieng
e Zeroulis que utilizaram 50 amostras de doadores sensibilizados ldquoin vitrordquo com anticorpos A
teacutecnica foi efetiva em 48 amostras permitindo o estudo do eluato assim como a fenotipagem
das hemaacutecias Os autores testaram tambeacutem a teacutecnica em 100 hemaacutecias TDA positivo que
puderam ser utilizadas para teacutecnicas de autoadsorccedilatildeo
Byrne (1991) descreveu a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA modificada e tambeacutem
verificou como uma opccedilatildeo para o tratamento de hemaacutecias com TDA positivo que deixava as
hemaacutecias intactas e o eluato viaacutevel para ser fenotipado
19
Roziers e Squali (1997) e Katharia e Chaudhary (2013) compararam a teacutecnica da
glicina-aacutecidaEDTA com as teacutecnicas da cloroquina e do aquecimento Verificaram maior
eficiecircncia da glicina-aacutecidaEDTA em relaccedilatildeo as outras duas teacutecnicas pois com uma mesma
quantidade de amostra produzia as hemaacutecias livres de anticorpo e tambeacutem o eluato Mostrou-
se ainda superior devido ao menor tempo exigido para sua realizaccedilatildeo o que favorece seu uso
em situaccedilotildees de urgecircncia e emergecircncia
As duas desvantagens da teacutecnica poreacutem eacute o fato de destruir os antiacutegenos do sistema
Kell e o fato de natildeo remover fraccedilotildees do complemento ligadas agrave hemaacutecia (PALLAS WILER e
McGEE 1991 ROZIERS e SQUALLI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012
e KATHARIA e CHAUNDHARY 2013)
20
2 OBJETIVOS
21 OBJETIVO GERAL
211 Avaliar a eficaacutecia da glicina-aacutecidaEDTA em remover os anticorpos ligados agraves
hemaacutecias sensibilizadas por anticorpos da classe IgG
22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
221 Preparaccedilatildeo dos reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
verificaccedilatildeo da estabilidade dos mesmos e avaliar custos
222 Testar a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA em amostras de hemaacutecias
sensibilizadas por anticorpos antieritrocitaacuterios humanos
223 Comparar a efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA com a teacutecnica da
cloroquina quanto a capacidade de remover a interferecircncia do anticorpo ligado
a hemaacutecia
224 Testar o eluato das amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA
225 Verificar se houve destruiccedilatildeo dos antiacutegenos eritrocitaacuterios apoacutes o tratamento
com glicina-aacutecidaEDTA e com cloroquina
226 Verificar se o tempo de execuccedilatildeo da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA descrito
nos textos de referecircncia eacute reprodutiacutevel
21
3 JUSTIFICATIVA
Algumas condiccedilotildees cliacutenicas podem levar ao depoacutesito ldquoin vivordquo de anticorpos eou
fraccedilotildees do complemento sobre as hemaacutecias Entre elas estatildeo as reaccedilotildees hemoliacuteticas poacutes-
transfusionais a doenccedila hemoliacutetica perinatal o uso de medicamentos e principalmente a
AHAI Na AHAI um anticorpo normalmente da classe IgG ou IgM reconhece antiacutegenos
proacuteprios na membrana eritrocitaacuteria e reduz a sobrevida da hemaacutecia levando a sua destruiccedilatildeo
pelos macroacutefagos no sistema reticulo-endotelial ou agrave ativaccedilatildeo do complexo de ataque agrave
membrana e agrave lise intravascular Os autoanticorpos satildeo voltados na maioria das vezes contra
antiacutegenos eritrocitaacuterios de alta frequecircncia populacional conhecidos como antiacutegenos puacuteblicos
e por este motivo reconhecem tanto hemaacutecias autoacutelogas quanto alogecircnicas
Devido agrave presenccedila do autoanticorpo livre no plasma e tambeacutem do anticorpo eou
complemento ligado agrave hemaacutecia o banco de sangue pode encontrar dificuldades em todas as
fases dos testes preacute-transfusionais do paciente com AHAI e deve utilizar teacutecnicas que
auxiliem na escolha do melhor hemocomponente melhorando a seguranccedila transfusional Essas
teacutecnicas visam remover a interferecircncia do autoanticorpo livre no soro e do autoanticorpo
ligado agrave hemaacutecia permitindo a detecccedilatildeo de aloanticorpos associados e a realizaccedilatildeo da
fenotipagem eritrocitaacuteria respectivamente
A finalizaccedilatildeo dos testes preacute-tranfusionais na presenccedila de autoanticorpo pode levar
algumas horas e nem sempre o paciente poderaacute aguardar Nesse contexto torna-se vantajosa a
aplicaccedilatildeo de teacutecnicas de raacutepida execuccedilatildeo
O presente estudo propotildee aplicar e avaliar a eficaacutecia da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
em remover os anticorpos ligados agrave hemaacutecia o que permite a fenotipagem eritrocitaacuteria
estendida e a seleccedilatildeo de concentrados de hemaacutecias com mesmo fenoacutetipo do paciente
Atualmente no Hemocentro de Ribeiratildeo Preto a teacutecnica utilizada para esse fim eacute o
tratamento das hemaacutecias com difosfato de cloroquina cujo tempo de execuccedilatildeo pode demorar
ateacute duas horas enquanto a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser realizada em apenas dois
minutos o que a tornaria opccedilatildeo de escolha especialmente em situaccedilotildees de urgecircncia Ao
contraacuterio da cloroquina a glicina-aacutecidaEDTA permite tambeacutem o estudo do eluato das
hemaacutecias tratadas
22
4 METODOL OGIA
41 AMOSTRAS DE DOADORES
Foram coletados 50 amostras de doadores de sangue que compareceram ao
Hemonuacutecleo de Araccedilatuba no periacuteodo de junho a agosto de 2016 Foram convidados a
participar da pesquisa doadores de repeticcedilatildeo do tipo sanguiacuteneo ldquoOrdquo RhD positivo
cadastrados no sistema de banco de sangue (SBS) do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto
Todos os doadores que concordaram em participar da pesquisa assinaram o termo de
consentimento livre e esclarecido (TCLE)
No momento da doaccedilatildeo foram coletados adicionalmente 5 mL de sangue total em
soluccedilatildeo anticoagulante EDTA (aacutecido dietilenoaminoaceacutetico) dispensando punccedilatildeo venosa
adicional para coleta da amostra O fluxograma 1 resume as etapas desenvolvidas no projeto
Fluxograma 1 - Fluxo da pesquisa utilizando as amostras de doadores
23
411 FENOTIPAGEM
Foram verificados se os doadores jaacute tinham fenotipagem para outros sistemas de
grupos sanguiacuteneos aleacutem do sistema ABORh que eacute realizado rotineiramente
A fenotipagem eritrocitaacuteria para outros sistemas ou fenotipagem estendida eacute realizada
para identificar a presenccedila ou ausecircncia de antiacutegenos considerados de importacircncia cliacutenica No
Hemonuacutecleo de Araccedilatuba uma parcela de doadores de repeticcedilatildeo satildeo fenotipados para os
antiacutegenos dos sistemas de grupo sanguiacuteneo Rh (antiacutegenos C c E e e) Kell (antiacutegeno K)
Duffy (antiacutegenos Fya e Fy
b) Kidd (antiacutegenos Jk
a e Jk
b) e sistema MNSs (antiacutegenos S e s)
A fenotipagem para o Rh e Kell eacute realizada por metodologia de microplaca utilizando
25 microL de hemaacutecia lavada e diluiacuteda a 5 em salina e 25 microL do antissoro comercial especiacutefico
A reaccedilatildeo eacute incubada 15 minutos a temperatura ambiente e centrifugadas para leitura Para os
antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s a metolodogia utilizado eacute gel contendo antiglobulina
humana (gel LissCoombs poliespeciacutefico) da marca BIO-RAD onde se utiliza suspensatildeo de
hemaacutecia em LISS (Soluccedilatildeo de baixa forccedila iocircnica) A suspensatildeo eacute preparada atraveacutes da
diluiccedilatildeo de 10 microL de hemaacutecia em 1000 microL de LISS Pipetado 50 microL dessa diluiccedilatildeo no gel e
adicionado 25 microL do antissoro especiacutefico Incuba-se em banho seco por 15 minutos a 37 deg
Celsius e eacute centrifugado em centriacutefuga especiacutefica Os antissoros utilizados eram das marcas
Fresenius e Lorne
Foi verificado a fenotipagem do doador no banco de dados do Hemocentro Os
registros dos fenoacutetipos dos doadores ficam armazenadas no sistema de banco de sangue
(SBS) Para doadores que natildeo tinham fenotipagem estendida preacutevia para antiacutegenos do sistema
Rh (C c E e e) e Kell (K) foi realizada a fenotipagem para esses antiacutegenos
O tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA e cloroquina para dissociar
anticorpos pode inativar enfraquecer ou destruir os antiacutegenos presentes nas hemaacutecias
alterando assim os resultados da fenotipagem Para verificar se houve destruiccedilatildeo dos
antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a e Jk
b S e s nas amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes
tratamento foram novamente fenotipadas ao final para os antiacutegenos que eram inicialmente
positivas
A repeticcedilatildeo da fenotipagem foi realizada nas amostras que apresentaram efetividade
no tratamento da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eou da cloroquina e a detecccedilatildeo do antiacutegeno
na amostra preacute-tratamento
24
412 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS HEMAacuteCIAS
As hemaacutecias foram sensibilizadas com antissoros policlonais humanos de amostras de
plasma fresco congelado de doadores com resultado de pesquisa de anticorpo irregular
positivos
A escolha do anticorpo para sensibilizar as hemaacutecias foi definida de acordo com o
fenoacutetipo do doador que deveria ser positivo para o respectivo antiacutegeno
Para a sensibilizaccedilatildeo um volume de antissoro (1 mL) e um volume (1 mL) de
hemaacutecias lavadas quatro vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica foram adicionadas a um tubo de 12 x
75 mm A mistura foi homogeneizada e incubada em banho maria (BM) a 37deg C por 60
minutos A seguir as hemaacutecias foram novamente lavadas 4 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica
para retirada dos anticorpos que natildeo se ligaram A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada
como controle negativo O teste da uacuteltima lavagem eacute importante para assegurar que os
anticorpos que poderatildeo ser detectados no eluato apoacutes o tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA
sejam aqueles que estavam ligados agraves hemaacutecias e natildeo aqueles livres no plasma O controle
negativo mostra que todo o anticorpo livre foi retirado (LEGER 2011)
Para o teste de presenccedila de anticorpo na soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foram incubadas
com hemaacutecias de triagem de anticorpos irregulares (ID-Diacell BIO-RAD) contendo os
antiacutegenos especiacuteficos Realizado a teacutecnica em gel LissCoombs com anti-IgG+C3d Incubado
no tempo de 15 minutos a temperatura de 37deg C e centrifugado 10 minutos em centriacutefuga
proacutepria
As 50 amostras de doadores foram sensibilizadas com os anticorpos policlonais
humanos
Apoacutes sensibilizadas rdquoin vitrordquo e lavadas as hemaacutecias foram diluiacutedas em soluccedilatildeo de
baixa forccedila iocircnica (LISS) na quantidade de 10 microL de hemaacutecia para 1000 microL de soluccedilatildeo A
suspensatildeo foi pipetada (50 microL) em coluna-gel-teste LissCoombs (BIO-RAD) que contecircm
antiglobulina poliespeciacutefico (IgG+C3d) e centrifugada em baixa rotaccedilatildeo conforme orientaccedilatildeo
do fabricante durante 10 minutos
As amostras deveriam apresentar aglutinaccedilatildeo com reatividade 3 a 4+ no TDA As
amostras que apresentaram reaccedilatildeo menor que 3+ foram novamente sensibilizadas com nova
aliacutequota do antissoro
25
413 TRATAMENTO DAS AMOSTRAS
As amostras sensibilizadas apresentando o TDA positivo 3 ou 4+ foram divididas em
duas aliacutequotas e submetidas a duas teacutecnicas diferentes com o objetivo de dissociar o anticorpo
ligado Uma aliacutequota da amostra foi tratada com soluccedilatildeo de difosfato de cloroquina enquanto
a outra aliacutequota foi tratada com glicina-aacutecidaEDTA
42 PREPARO DA GLICINA AacuteCIDA-EDTA
A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA utiliza 3 soluccedilotildees diferentes a glicina aacutecida o
EDTA e o tampatildeo TRIS
Os reagentes foram preparados utilizando os sais para anaacutelise (PA) de EDTA
(Na2EDTA2H2O) TRIS (C4H11NO3) Glicina (H2NCH2CO2H) NaCl e a soluccedilatildeo de aacutecido
cloriacutedrico (HCl) 12 N todos reagentes da marca SYNTH (quadro 1)
Para o preparo do tampatildeo glicina-acida eacute necessaacuterio o ajuste do pH para 15 Para esse
ajuste utiliza-se aacutecido cloriacutedrico (HCl) concentrado O pH foi medido com fitas reativas de pH
com escala de 1 a 14 da marca MERCK Posteriormente a soluccedilatildeo foi enviada ao laboratoacuterio
de controle de qualidade do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto e o pH medido no peagacircmetro O
tampatildeo glicina-aacutecida foi armazenado a 4deg e o tampatildeo tris e o EDTA em temperatura ambiente
controlada (20 a 24deg Celsius)
Apoacutes o preparo e durante a realizaccedilatildeo dos testes foram feitas inspeccedilotildees visuais para
verificaccedilatildeo de turvaccedilatildeo do meio e presenccedila de precipitados
Reagente Material Quantidade Preparo e
Conservaccedilatildeo
EDTA
EDTA
(Na2EDTA2H2O)
5 gramas Mistura ateacute
dissoluccedilatildeo do sal e
conserva em
temperatura ambiente Aacutegua Destilada 50 Ml
Tris
TRIS (C4H11NO3) 121 gramas Conservar em
temperatura ambiente NaCl 525g
Aacutegua destilada 100ml
Gliacutecina-aacutecida
Glicina
(H2NCH2CO2H) 15 gramas
Conservar a 4oC NaCl 116gramas
Aacutegua Destilada 200ml
HCL 12N Ajutar o pH para 15
Quadro 1 - Preparo dos Reagentes da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
Fonte - Manual teacutecnico AABB 2011
26
O tampatildeo glicina-aacutecida e o tampatildeo TRIS satildeo estaacuteveis por 7 meses O reagente EDTA
precipitou mesmo estando em temperatura em ambiente controlado Houve necessidade de
preparo de novo reagente
421 TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
1 Em um tubo de ensaio 12x75 mm eacute adicionado 08 mL da soluccedilatildeo de glicina-aacutecida A
esta soluccedilatildeo adiciona-se 02 mL de EDTA e mistura
2 Adiciona-se 02 mL de hemaacutecias sensibilizadas (lavada 4 vezes) A mistura eacute
homogeneizada e incubada por exatamente 2 minutos
3 A seguir 01 mL de tampatildeo TRIS eacute adicionado agrave mistura que eacute novamente
homogeneizada e centrifugada por 2 minutos a 3400 rpm O pH deve estar entre 7 a 75
4 Apoacutes centrifugaccedilatildeo separa-se em outro tubo o sobrenadante (eluato) e as hemaacutecias
que permanecem satildeo lavadas 4 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica para retirada de todo o
reagente e anticorpos livres
43 PREPARO DA CLOROQUINA
A cloroquina eacute diluiacuteda em tampatildeo PBS na concentraccedilatildeo de 20 (Quadro 2) e
armazenado a 4deg Celsius sua validade apoacutes o preparo eacute de 1 mecircs
A teacutecnica da cloroquina jaacute estaacute padronizada para rotina do laboratoacuterio de
imunohematologia do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto e suas unidades
Reagente Reagentes Quantidade PreparoConservaccedilatildeo
Cloroquina
Difosfato de cloroquina
(C18H32ClN3O8P2)
20 gramas
Conservar a 4deg Celsius
Tampatildeo PBS 100ml
NaOH 01 N Acertar o pH para
51
Quadro 2 - Preparo da Cloroquina Fonte - Manual teacutecnico da AABB 2011
431 TEacuteCNICA DA CLOROQUINA
1 4 partes da soluccedilatildeo pronta eacute adicionada a uma parte de hemaacutecias lavadas 4 vezes com
soluccedilatildeo fisioloacutegica
2 A mistura eacute incubada em temperatura ambiente por ateacute duas horas
3 Centrifugar a 3400 rpm por 2 minutos
27
4 Remover o sobrenadante lavar as hemaacutecias novamente com soluccedilatildeo fisioloacutegica 4
vezes
44 VERIFICACcedilAtildeO DA EFETIVIDADE DOS TESTES
Apoacutes tratamento pelas duas teacutecnicas o TDA foi repetido em todas as amostras para
verificar se os tratamentos foram efetivos e houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo Para as
amostras tratadas pela teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA que permaneceram com TDA positivo
novo tratamento foi realizado
45 TESTE DO ELUATO
O eluato resultante das amostras tratadas com glicina-acidaEDTA foi testado com
hemaacutecias de triagem A soluccedilatildeo do eluato foi incubada com as hemaacutecias de triagem de
anticorpos (ID-Diacell BIO-RAD) pela teacutecnica em gel LissCoombs O teste foi incubado 15
minutos a 37deg Celsius e centrifugado por 10 minutos em centrifuga proacutepria para a teacutecnica em
gel Os eluatos que apresentaram resultados positivos foram testados em painel de 11
hemaacutecias (ID-Diapanel BIO-RAD) para a identificaccedilatildeo do anticorpo
46 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente que apresentou TDA positivo por IgG e pesquisa
de anticorpo irregular positivo com presenccedila de autoanticorpo com reatividade panaglutinina
A amostra foi tratada em paralelo pelas duas teacutecnicas descritas e foi enviada para o
Hemocentro para genotipagem eritrocitaacuteria que foi realizado por metodologia PCR em tempo
real no equipamento Real-time system PCR 7500 ( Applied Biosystems Califoacuternia EUA)
28
5 RESULTADOS
51 REAGENTES
Para aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA satildeo necessaacuterios 3 diferentes
reagentes que podem ser encontrados em forma de kit pronto para uso No entanto esses kits
natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil Os reagentes satildeo tampatildeo glicina-aacutecida o EDTA e o tampatildeo
Tris
Todos os reagentes foram preparados rdquoin houserdquo a partir dos sais e soluccedilotildees PA (puro
para anaacutelise) da marca SYNTH que foram adquiridos para a pesquisa O custo estimado para
cada teste foi aproximadamente R$ 020 reais
Apoacutes o preparo os reagentes poderiam ser armazenados em condiccedilotildees adequadas pelo
periacuteodo de 1 ano (AABB 2011) Ao final do preparo e durante o periacuteodo de armazenamento
de fevereiro a setembro de 2016 foi realizada inspeccedilatildeo visual para verificar a presenccedila de
precipitados ou turvaccedilatildeo A soluccedilatildeo de glicina e o tampatildeo TRIS mostraram-se estaacuteveis ateacute o
final do periacuteodo Por sua vez o reagente EDTA precipitou mesmo estando armazenado em
temperatura ambiente controlada e foi necessaacuterio novo preparo
52 AMOSTRAS DE DOADORES
521 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS AMOSTRAS
Apoacutes incubaccedilatildeo da hemaacutecia com o antissoro a mesma foi lavada 4 vezes para retirada
dos anticorpos livres A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada Caso houvesse positividade na
soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem a etapa era repetida (figura 3) Das 50 amostras sensibilizadas a
uacuteltima lavagem foi positiva somente em 3 delas Nas 3 amostras o anticorpo utilizado para
sensibilizaccedilatildeo foi o anti-K Apoacutes repetido nova etapa de lavagem os resultados se
apresentaram negativos
Em todas as amostras sensibilizadas ldquoin vitrordquo o TDA foi testado e verificado a
intensidade do teste Entre as 50 amostras 47 alcanccedilaram TDA com intensidade 3-4+ apoacutes a
primeira sensibilizaccedilatildeo enquanto 3 amostras necessitaram uma segunda incubaccedilatildeo com
anticorpo (figura 4)
A escolha dos anticorpos para sensibilizar as hemaacutecias foi feita de acordo com o
fenoacutetipo do doador e foram utilizados sete diferentes especificidades de anticorpos policlonais
humanos conforme mostra o graacutefico1
29
Figura 3 - Soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada com hemaacutecia de triagem de
anticorpos em gel LissCoombs (BIO-RAD) A finalidade eacute verificar a presenccedila de anticorpos livres na
suspensatildeo que possam interferir na pesquisa do eluato As soluccedilotildees de lavagem das amostras na figura a tiveram
resultados negativos Na figura b duas amostras a 47 e 50 apresentaram resultado positivo Nova etapa de
lavagem foi realizada e o resultado final foi negativo
522 TRATAMENTO DAS HEMAacuteCIAS
Apoacutes a sensibilizaccedilatildeo e obtenccedilatildeo de resultados de TDA com intensidade de 3 a 4+
cada uma das amostras foi dividida em duas aliacutequotas e tratada separadamente pelas teacutecnicas
de glicinaaacutecida-EDTA e cloroquina
As teacutecnicas foram consideradas efetivas quando obteve-se a completa dissociaccedilatildeo do
anticorpo verificada atraveacutes do TDA negativo na amostra poacutes tratamento conforme figuras 5
e 6 Dentre as amostras tratadas com cloroquina 2850 tiveram o TDA negativado A glicina-
aacutecidaEDTA negativou o TDA em 33 das 50 amostras tratadas Apenas 17 amostras tratadas
com glicina-aacutecidaEDTA permaneceram com o TDA positivo e foram submetidas a um novo
tratamento
30
Figura 4 - TDA das amostras apoacutes sensibilizaccedilatildeo com anticorpos policlonais humanos Amostras na
figura a com intensidades de 3-4+ Na figura b amostras 4 e 7 com intensidade menor que 3+ e portanto foram
novamente sensibilizadas com nova aliacutequota de soro Anti-D e anti-S Apoacutes a segunda sensibilizaccedilatildeo
apresentaram reatividade 4 e 3+ respectivamente Os anticorpos utilizados para sensibilizaccedilatildeo foram D S c E
C e K
523 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS TEacuteCNICAS
No tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA houve dissociaccedilatildeo completa do anticorpo
em 33 amostras (66) das 50 amostras testadas enquanto que com a cloroquina foram 28
amostras (56) (tabela 1)
31
Graacutefico 1- Nuacutemero de amostras sesnsibilizadas por especificidade de anticorpo Entre as 50 amostras 12
foram sensibilizadas com anti-D 10 com anti-C 9 com anti-E 8 com anti-c 7 com anti-S 3 com anti-K e 1
com anti-Dia As especificidades dos anticorpos foram definidas de acordo o fenoacutetipo do doador
Figura 5 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com cloroquina Nas amostras onde houve
a dissociaccedilatildeo do anticorpo ( 2 21 a 23 26 39 a 42 45 46 e 49) a hemaacutecia se deposita no fundo no microtubo
apoacutes a centrifugaccedilatildeo (TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (1 3 24 25 43 44 47
48 e 50) o anticorpo ligado agraves hemaacutecias eacute alvo da AGH presente no gel (TDA positivo)
Anti-D 12
Anti-C 10
Anti-E 9
Anti-c 8
Anti-S 7
Anti-K 3 Anti-Dia 1
32
Figura 6 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA Nas amostras
onde houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo (4 6 7 12 a 15 17 34 35 37 e 38) a hemaacutecia se deposita no fundo no
microtubo apoacutes a centrifugaccedilatildeo ( TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (5 16 18
19 20 33 e 36 ) o AGH presente no gel se liga ao anticorpo ligado agraves hemaacutecias que ficam retidas no gel (TDA
positivo)
Tabela 1-Resultado geral do tratamento das hemaacutecias com glicina e cloroquina
Teacutecnica utilizada TDA negativo TDA positivo Total
Glicina-aacutecidaEDTA 33 17 50
Cloroquina 28 22 50
A glicina-aacutecidaEDTA conseguiu negativar mais amostras sensibilizadas com Anti-D
e anti-K que a cloroquina Para as hemaacutecias sensibilizadas com anti-E Anti-S e Anti-Dia
ambas as teacutecnicas dissociaram o anticorpo em 100 das amostras Os resultados detalhados
por especificidade do anticorpo apoacutes o primeiro tratamento com glicina-aacutecidaEDTA e com
cloroquina estatildeo na tabela 2
Para as amostras que permaneceram positivas (17 amostras) apoacutes o tratamento com a
glicina-aacutecidaEDTA foi realizado um novo tratamento Houve dissociaccedilatildeo do anticorpo em 3
amostras (18) apoacutes a segunda tentativa Nas demais 14 (82) amostras tratadas pela
segunda vez 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise
33
Tabela 2 - Resultados do TDA apoacutes tratamento das hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo
sensibilizado
ANTICORPOS
SENSIBILIZADOS
1ordm TRATAMENTO COM
GLICINA
TRATAMENTO COM
CLOROQUINA
TOTAL TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
Anti-D 8 4 0 12 12
Anti-C 6 4 10 0 10
Anti-E 9 0 9 0 9
Anti-c 0 8 1 7 8
Anti-S 7 0 7 0 7
Anti-K 2 1 0 3 3
Anti-Dia 1 0 1 0 1
TOTAL 33 17 28 22 50
A hemoacutelise foi verificada durante o procedimento de lavagem final das hemaacutecias com
soluccedilatildeo fisioloacutegica para a retirada dos reagentes As soluccedilotildees de lavagem ficaram
avermelhadas e as hemaacutecias com coloraccedilatildeo escura As amostras foram descartadas Dentre as
6 amostras que ainda puderam ser testadas para o TDA trecircs amostras negativaram sendo 1
sensibilizada com anti-D e 2 com anti-C (tabela 3)
Tabela 3 - Resultado apoacutes o segundo tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA
Tratamento com
glicina-aacutecidaEDTA
TDA Negativo TDA Positvo Hemoacutelise Total
Segundo tratamento 3 3 11 17
524 TESTAGEM DO ELUATO
Apoacutes o tratamento com a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA a soluccedilatildeo do eluato foi
testada para verificar a viabilidade dos anticorpos que foram dissociados ou eluiacutedos Dentre
as 50 amostras 41 apresentaram eluato positivo As nove amostras cujos eluatos foram
negativos haviam sido sensibilizadas com as seguintes especificidades de anticorpos anti-E 6
amostras (67) anti-S 2 amostras (40) e anti-D 1 amostra (8) (tabela 4) O eluato de
todas as amostras sensibilizadas com os anticorpos anti-C anti-c Anti-K e Anti-Dia foram
positivos Os eluatos positivos na triagem de anticorpos foram testados com paineacuteis de
identificaccedilatildeo para confirmar a especificidade e a viabilidade dos anticorpos (figuras 7 e 8)
34
525 EFEITO DA ELUICcedilAtildeO SOBRE OS ANTIacuteGENOS ERITROCITAacuteRIOS
Para verificar o efeito do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA e com a cloroquina
sobre a expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s foi realizada a fenotipagem das
amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes tratamento com ambas as teacutecnicas Foi avaliado
se o tratamento destruiu os antiacutegenos expressos antes do tratamento
Tabela 4- Resultado do Eluato das amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA
Anticorpos Eluato positvo Eluato negativo Total
Anti-D 11 1 12
Anti-C 10 0 10
Anti-E 3 6 9
Anti-c 8 0 8
Anti-S 5 2 7
Anti-K 3 0 3
Anti-Dia 1 0 1
Total 41 9 50
Figura 7 ndash Painel do eluato da amostra 21 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-C que foi
recuperado no eluato
Figura 8 ndash Painel do eluato da amostra 47 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-K que foi
recuperado no eluato
35
Dentre as 50 amostras 26 eram previamente fenotipadas para os antiacutegenos Fya Fy
b
Jka Jk
b S e s Dentre elas 20 alcanccedilaram TDA negativo apoacutes tratamento com a glicina-
aacutecidaEDTA e 20 negativaram apoacutes tratamento com cloroquina (tabela 5) Apoacutes ambas as
teacutecnicas os antiacutegenos originalmente expressos permaneceram positivos comprovando que natildeo
houve destruiccedilatildeo dos mesmos
Tabela 5 ndash Verificaccedilatildeo da interferecircncia do tratamento da hemaacutecias com cloroquina e glicina-
aacuteicdaEDTA sobre os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
AMOSTRAS
COM
FENOTIPAGEM
PREacuteVIA
TRATADAS COM
CLOROQUINA
TRATADAS COM
GLICINA
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
26
20
20
20
20
As amostras 24 47 e 50 eram positivas para o antiacutegeno K A cloroquina natildeo dissociou
o anticorpo em nenhuma das 3 amostras enquanto a glicina-aacutecidaEDTA foi efetiva nas
amostras 24 e 50 Foi testada a expressatildeo do antiacutegeno K nas amostras 24 e 50 apoacutes o
tratamento utilizando meacutetodo indireto em gel contendo AGH Apesar de natildeo ter sido avaliado
a intensidade de reaccedilatildeo de expressatildeo dos antiacutegenos podemos verificar na figura 9 que nas
duas amostras em que a teacutecnica foi efetiva e dissociou o anticorpo a expressatildeo do antiacutegeno K
continua presente mas a reatividade observada pode ser considerada 1+ sugerindo que houve
diminuiccedilatildeo da expressatildeo do antiacutegeno quando comparado com a expressatildeo observada em
hemaacutecia natildeo tratada
Os resultados individuais de cada amostra em ambas as teacutecnicas encontram-se
resumidas na tabela 6
526 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente onde foi constatada a presenccedila de autoanticorpo
a quente da classe IgG pelo TDA monoespeciacutefico (figura 10)O autoanticorpo tambeacutem
interferia na pesquisa e identificaccedilatildeo de anticorpos irregulares pois apresentava caracteriacutestica
de panaglutinina As hemaacutecias da paciente sensibilizadas ldquoin vivordquo foram tratadas com
cloroquina e com glicina-aacutecidaEDTA
36
Figura 9 ndash Fenotipagem das amostras 24 e 50 para antiacutegeno K apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
O teste positivo indica a presenccedila do antiacutegeno poreacutem a reatividade fraca (1+) sugere que houve enfraquecimento
de sua expressatildeo A direita a expressatildeo forte (4+) do antiacutegeno Kell em hemaacutecia controle natildeo tratada utilizada
como controle positivo
A cloroquina natildeo foi efetiva na retirada do anticorpo ligado as hemaacutecias ao contraacuterio
do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA que dissociou o anticorpo (figura 11)
A hemaacutecia tratada com glicina foi fenotipada para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
(figura 12) A fenotipagem para o sistema Rh (C c E e e) e Kell foi realizada em gel
especiacutefico monoclonal sem interferecircncia do TDA positivo (controle da reaccedilatildeo negativo)
O eluato resultante do tratamento com glicina-aacutecidaEDTA foi testada em gel com
hemaacutecias de painel de identificaccedilatildeo de anticorpos e apresentou resultado positivo com todas
as ceacutelulas (figura 13 e 14)
A amostra foi enviada para genotipagem e o resultado da genotipagem confirmou o
resultado da fenotipagem apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
527 TEMPO DE EXECUCcedilAtildeO DA TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
O tempo de reaccedilatildeo da glicina-aacutecidaEDTA eacute de 2 minutos Todas as amostras foram
tratadas obedecendo ao tempo descrito na literatura demonstrando que o mesmo eacute
reprodutiacutevel
37
Tabela 6- Resultados individuais por amostra
Amostra Especificidade
dos anticorpos
Intensidade do
TDA apoacutes
sensibilizaccedilatildeo
Tratamento
efetivo com
cloroquina
Tratamento
efetivo com
glicina
Eluato
poacutes
glicina
1 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 2 Dia 3+ Sim Sim 3+ 3 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 4 D 4+ Natildeo Sim 4+ 5 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 6 E 3+ Sim Sim Negativo 7 S 4+ Sim Sim 3+ 8 E 3+ Sim Sim 1+ 9 E 3+ Sim Sim 2+
10 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 11 D 4+ Natildeo Sim 4+ 12 D 4+ Natildeo Sim 4+ 13 S 3+ Sim Sim 3+ 14 S 3+ Sim Sim 3+ 15 D 3+ Natildeo Sim 3+ 16 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 17 E 3+ Sim Sim (+) 18 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 19 D 4+ Natildeo Natildeo 3+ 20 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 21 C 3+ Sim Sim 4+ 22 C 3+ Sim Sim 4+ 23 C 3+ Sim Sim 4+ 24 K 4+ Natildeo Sim 4+ 25 D 3+ Natildeo Natildeo Negativo 26 E 4+ Sim Sim Negativo 27 S 3+ Sim Sim 3+ 28 C 3+ Sim Natildeo 4+ 29 C 3+ Sim Sim 4+ 30 C 3+ Sim Sim 4+ 31 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 32 E 3+ Sim Sim Negativo 33 C 3+ Sim Natildeo 4+ 34 S 3+ Sim Sim Negativo 35 S 3+ Sim Sim Negativo 36 C 4+ Sim Natildeo 4+ 37 c 4+ Natildeo Natildeo 4+ 38 D 4+ Natildeo Sim 4+ 39 S 3+ Sim Sim 3+ 40 c 4+ Sim Natildeo 2+ 41 C 4+ Sim Natildeo 4+ 42 E 3+ Sim Sim Negativo 43 D 3+ Natildeo Sim 2+ 44 D 3+ Natildeo Sim 2+ 45 E 3+ Sim Sim Negativo 46 C 3+ Sim Sim 4+ 47 K 4+ Natildeo Natildeo 4+ 48 D 3+ Natildeo Sim 2+ 49 E 3+ Sim Sim Negativo 50 K 4+ Natildeo Sim 4+
TOTAL 50 28 33 41
38
Figura 10 ndash TDA monoespeciacutefico da amostra de paciente Hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo da classe
IgG
oacute Figura 11 ndash TDA apoacutes o tratamento com glicina-aacutecidaEDTA (esquerda) e cloroquina (direita) A glicina
negativou completamente o TDA enquanto a hemaacutecia tratada com cloroquina persistiu positiva (1+)
39
Figura 12 ndash Fenotipagem da amostra tratada com glicina-aacutecidaEDTA Fy(a+b+) Jk(a-b+) S+s+
Figura 13 ndash Painel em gel (LissAGH) do eluato apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de
intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
Figura 14 ndash ndash Painel ezimaacutetico (hemaacutecias tratadas com bromelina) do eluato em gel neutro apoacutes
tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
40
528 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Quanto a efetividade das teacutecnicas em negativar o TDA foi verificado que a glicina-
aacutecidaEDTA foi efetiva em 66 das amostras testadas no primeiro tratamento (3350
amostras) enquanto a cloroquina conseguiu negativar 56 (2850) Esses resultados natildeo
apresentam diferenccedila significativa (pgt005) demostrando que a teacutecnica da glicina-
aacutecidaEDTA natildeo eacute superior mas eacute tatildeo efetiva quanto a da cloroquina
Quando aliamos os resultados de ambas as teacutecnicas verificamos que em 76 (3850)
das amostras o TDA foi negativado Esse dado indica que ainda que uma teacutecnica natildeo seja
eficaz na remoccedilatildeo do anticorpo eacute uma boa alternativa tentar a segunda teacutecnica jaacute que a falha
em remover o anticorpo utilizando uma delas natildeo prevecirc necessariamente a falha com a outra
Quando se utiliza o teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla (graacutefico 2) para comparar a utilizaccedilatildeo das
duas teacutecnicas com o resultado de cada uma isolada (somente a cloroquina ou somente a
glicina) verificamos que os resultados apresentam diferenccedila significativa (plt005) (quadro 3)
TRATAMENTO EFETIVO COM TOTAL PORCENTAGEM
Glicina ou cloroquina 38 76
Glicina e cloroquina 23 46
Glicina apenas 10 20
Cloroquina apenas 5 10
Nenhuma das teacutecnicas 12 24
Quadro 3 - Resultados comparativos entre as teacutecnicas utilizadas
41
Graacutefico 2 - Teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla entre as teacutecnicas aplicadas A- Glicina e Cloroquina B-Cloroquina C-
Glicina ( plt005)
42
6 DISCUSSAtildeO
Os reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA podem ser adquiridos em
forma de kit comercial prontos para uso poreacutem natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil A preparaccedilatildeo
dos reagentes ldquoin houserdquo a partir de sais comerciais adquiridos se mostrou viaacutevel Os
reagentes glicina e o tampatildeo Tris armazenados de forma correta se mantiveram estaacuteveis por
um periacuteodo de 7 meses Somente o reagente EDTA precipitou mesmo armazenado em
condiccedilotildees adequadas sugerindo que o mesmo deve ser preparado em menor quantidade e
armazenado em aliacutequotas A soluccedilatildeo de cloroquina tambeacutem pode ser preparada ldquoin houserdquo e
pode ser armazenado por um mecircs A legislaccedilatildeo brasileira autoriza a utilizaccedilatildeo de reagentes
preparados a partir de sais comerciais como a cloroquina e a glicina-aacutecidaEDTA desde que
os sais tenham autorizaccedilatildeo da vigilacircncia sanitaacuteria para a comercializaccedilatildeo (BRASIL 2001)
A comparaccedilatildeo quanto a efetividade em dissociar anticorpos em amostras com TDA
positivos entre a teacutecnica da glicina e a teacutecnica da cloroquina mostrou que natildeo haacute diferenccedila
estatiacutestica entre elas e que ambas satildeo igualmente eficientes Se utilizadas conjuntamente haacute
maior possibilidade de elucidaccedilatildeo dos casos
Uma vantagem da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eacute que ela permite numa mesma
amostra eluir o anticorpo ligado aacute hemaacutecia assim como fenotipar a hemaacutecia tratada Devido a
sua dupla utilidade a teacutecnica eacute vantajosa principalmente em pacientes em que pouco volume
de amostra pode ser coletado como em casos de crianccedilas e receacutem-nascidos
A fenotipagem poacutes tratamento se mostrou viaacutevel jaacute que os antiacutegenos de maior
importacircncia natildeo sofreram alteraccedilotildees Nas 20 amostras que foram fenotipadas antes e apoacutes
tratamento para verificar a influecircncia dos reagentes na expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a
Jkb S e s natildeo houve destruiccedilatildeo dos mesmos por nenhuma das duas teacutecnicas
Para as amostras positivas para o antiacutegeno Kell (350) e sensibilizadas com o
respectivo anticorpo a teacutecnica da glicina foi efetiva em negativar o TDA em apenas duas
delas mas apoacutes o tratamento foi verificada uma fraca reatividade da reaccedilatildeo antiacutegeno-
anticorpo sugerindo que houve um enfraquecimento da expressatildeo do antiacutegeno conforme
esperado e descrito na literatura (BYRNE 1991 PALLAS WILER E MCGEE 1991
ROZIERS e SQUALI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012 e KATHARIA e
CHAUDHARY 2013) A accedilatildeo da glicina sobre o antigeno Kell natildeo representa impedimento
para seu uso uma vez que na impossibilidade de testar o antiacutegeno Kell o banco de sangue
consegue facilmente atender a solicitaccedilatildeo de transfusatildeo com unidades de hemaacutecias Kell
43
negativas jaacute que eacute um antiacutegeno de baixa prevalecircncia na populaccedilatildeo variando de 15 na
populaccedilatildeo africana a 9 nos europeus (DANIELS 2011)
A soluccedilatildeo resultante da dissociaccedilatildeo do anticorpo pela teacutecnica da glicina pode ainda ser
utilizada como eluato podendo substituir a teacutecnica de eluiccedilatildeo com reagentes comercias (kits
de eluiccedilatildeo aacutecida) que tem alto custo aproximadamente entre R$2000 a R$2500 por teste
Em 41 amostras (82) houve a dissociaccedilatildeo e recuperaccedilatildeo do anticorpo que estava
sensibilizando as hemaacutecias Em 9 amostras (18) os anticorpos foram eluiacutedos poreacutem
apresentaram reaccedilatildeo negativa quando testadas com hemaacutecias de triagem entre eles o anti-E
(6) anti-S (2) e Anti-D (1) Eacute possiacutevel que a correccedilatildeo pH do meio (WALKER 2011) natildeo
tenha sido adequada o que pode ter desfavorecido a reatividade do anticorpo
Para as amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA nas quais natildeo houve dissociaccedilatildeo do
anticorpo pelo primeiro tratamento (1750) o segundo tratamento natildeo se mostrou eficaz jaacute
que 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise O tempo de
armazenagem natildeo parece ter influenciado jaacute que todas as amostras foram testadas dentro de
48 horas apoacutes a coleta Outros fatores que natildeo foram verificados podem ter levado a
hemoacutelise Apesar da literatura (LOUIE JIENG e ZEROULIS 1986 e BYRNE 1991)
recomendar um segundo tratamento ele eacute pouco eficaz tendo negativado apenas 3 das 17
amostras testadas
A amostra de paciente que apresentou sensibilizaccedilatildeo ldquoin vivordquo mostrou melhor
efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA sobre a da cloroquina possibilitando
fenotipagem para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s que natildeo foram destruiacutedos apoacutes o
tratamento comprovado atraveacutes da genotipagem
A presenccedila de autoanticorpo a quente com presenccedila de hemoacutelise (AHAI) ou natildeo pode
mascarar a presenccedila de aloanticorpo interferindo na rotina soroloacutegica da fenotipagem que eacute
uma importante ferramenta para auxiliar na seleccedilatildeo de hemaacutecias para transfusatildeo (SHIREY et
al 2002) Esses pacientes frequentemente possuem aloanticorpos associados ao
autoanticorpo e a prevalecircncia de aloimunizaccedilatildeo entre eles varia entre 12 a 40 (LEGER e
GARRATY 1999 BRANCH e PETZ 1999) o que dificulta ainda mais a escolha do melhor
componente a ser transfundido aleacutem de aumentar a possibilidade reaccedilotildees hemoliacuteticas imunes
poacutes-transfusionais
Nesses casos as teacutecnicas de dissociaccedilatildeo de anticorpos satildeo importantes para tratar
amostras de pacientes e a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser usada como uma opccedilatildeo
pois se mostrou eficaz na dissociaccedilatildeo anticorpo ligado agraves hemaacutecias deixando livre a
superfiacutecie das mesmas permitindo a fenotipagem por antisoros IgG Paralelamente os
44
anticorpos eluiacutedos tambeacutem puderam ser estudados O mesmo natildeo ocorre com a cloroquina
que permite apenas a fenotipagem e tampouco com os kits de eluiccedilatildeo aacutecida disponiacuteveis no
mercado nacional que satildeo destinados a realizaccedilatildeo do eluato mas destroem as hemaacutecias
O tempo de tratamento na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA tambeacutem eacute uma vantagem
pois foi possiacutevel reproduzir no tempo determinado de 2 minutos enquanto a cloroquina
demora ateacute duas horas
Ainda que a aplicaccedilatildeo das teacutecnicas por biologia molecular estejam cada vez mais
presentes na rotina imuno-hematoloacutegica e possibilitam estabelecer o fenoacutetipo deduzido do
genoacutetipo elas natildeo estatildeo disponiacuteveis na maioria dos centros e sua realizaccedilatildeo exige algumas
horas A resoluccedilatildeo imediata do problema transfusional necessita dos resultados soroloacutegicos
pois com frequecircncia natildeo eacute possiacutevel aguardar o resultado do teste molecular Dessa forma
apesar da crescente importacircncia da genotipagem eritrocitaacuteria teacutecnicas soroloacutegicas aplicadas
corretamente e no momento propiacutecio satildeo de grande utilidade para resolver problemas imuno-
hematoloacutegicos como ocorre com a fenotipagem em pacientes com TDA positivo
45
7 CONCLUSAtildeO
A teacutecnica da glicina aacutecidaEDTA mostrou-se efetiva em remover os anticorpos que
sensibilizavam as hemaacutecias e pode ser utilizada com seguranccedila antes da fenotipagem
eritrocitaacuteria Por ser uma teacutecnica de raacutepida execuccedilatildeo eacute uma alternativa aplicaacutevel
principalmente em casos urgentes de pacientes que apresentam autoanticorpos
46
8 REFEREcircNCIA BIBLIOGRAacuteFICA
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50
9 ANEXOS
51
FUNDACcedilAtildeO HEMOCENTRO DE RIBEIRAtildeO PRETO
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE)
Tiacutetulo da pesquisa Aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina aacutecida-EDTA e avaliaccedilatildeo da
eficaacutecia no tratamento de hemaacutecias com teste direto da antiglobulina positivo
Pesquisadora responsaacutevel Ceacutelia Kazue Abiko
Orientador Prof Dimas Tadeu Covas
Co-orientadora Dra Flaacutevia Leite Souza Santos
Objetivo da pesquisa Vocecirc estaacute sendo convidado a participar de uma pesquisa que tem
como objetivo padronizar uma nova teacutecnica para auxiliar na tipagem sanguiacutenea de pacientes
A tipagem sanguiacutenea pode sofrer interferecircncia da presenccedila de anticorpos ligados aos gloacutebulos
vermelhos do sangue Nessas situaccedilotildees eacute difiacutecil selecionar o melhor sangue para o paciente e
eacute preciso a utilizaccedilatildeo de teacutecnicas adicionais para remover essas interferecircncias
Esta pesquisa tem como objetivo estudar outra teacutecnica para remover esses anticorpos e
comparaacute-la com a teacutecnica atualmente utilizada Para isso precisamos de amostras de pacientes
e doadores voluntaacuterios
Se vocecirc eacute um doador eacute necessaacuterio que vocecirc autorize a coleta de 5 ml (1 tubo) a mais
de seu sangue
Se vocecirc eacute um paciente natildeo haveraacute necessidade de nova amostra pois utilizaremos as
amostras jaacute coletadas para os testes preacute-transfusionais e os resultados encontrados nesta
pesquisa natildeo iratildeo interferir na escolha da (s) bolsa (s) de sangue que vocecirc possa vir a receber
Se vocecirc concordar em participar leia com atenccedilatildeo o texto abaixo e assine as duas vias
rubricando todas as paacuteginas deste termo de consentimento Uma via original assinada e
rubricada por vocecirc e pela pesquisadora ficaraacute com vocecirc
As suas informaccedilotildees seratildeo mantidas em sigilo pela pesquisadora e natildeo haveraacute
armazenamento de material para pesquisas posteriores Os seus dados seratildeo usados apenas
neste estudo e quando o trabalho for publicado seu nome e qualquer outra informaccedilatildeo que
possam identificaacute-lo natildeo seratildeo revelados
Eacute pouco provaacutevel que o que noacutes aprendermos com este estudo tenha um benefiacutecio
direto para vocecirc assim como natildeo poderemos dar nada em troca pela sua participaccedilatildeo na
pesquisa
Nosso objetivo com esta pesquisa eacute que os resultados poderatildeo ser uacuteteis para o
tratamento de pacientes no futuro Os riscos da participaccedilatildeo satildeo miacutenimos Se vocecirc eacute um
doador de sangue a amostra seraacute coletada no momento da doaccedilatildeo natildeo exigindo punccedilatildeo
venosa adicional
52
Eacute seu direito ter acesso aos resultados dos testes da pesquisa Esses resultados natildeo
seratildeo fornecidos automaticamente a vocecirc mas caso vocecirc se interesse em saber o resultado ou
tiver alguma duacutevida sobre a sua participaccedilatildeo neste estudo deveraacute entrar em contato com Ceacutelia
Kazue Abiko pelo telefone (18) 99718-3551
Vocecirc tem total liberdade de optar por natildeo participar da pesquisa Caso aceite
participar poderaacute desistir a qualquer momento ou retirar seu consentimento mesmo apoacutes ter
coletado o sangue Para cancelar sua participaccedilatildeo basta avisar a pesquisadora e os seus dados
seratildeo retirados do projeto
Qualquer duacutevida eacutetica sobre a pesquisa poderaacute entrar em contato com o Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa do Hospital das Cliacutenicas e da Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto
(CAMPUS UNIVERSITAacuteRIO bairro Monte Alegre CEP 14048-900 Ribeiratildeo Preto-SP
Telefone (16) 3602-2228 FAX (16) 3633-1144 e-mail cephcrpuspbr)
Consentimento de participaccedilatildeo
A Consentimento do participante
Li as informaccedilotildees acima sobre o estudo e recebi explicaccedilotildees sobre a participaccedilatildeo no estudo
Portanto dou o meu consentimento para participar do estudo
___________________________________________________________________________
Nome completo
___________________________________________________________________________
Assinatura
___________
Data
__________________________________________________________________________________
Nome completo da pesquisadora
___________________________________________________________________________
Assinatura
_____________
Data
AGRADECIMENTOS
A DEUS pelo dom da vida e a graccedila de colocar em minha vida pessoas especiais que me
ajudaram a chegar ateacute aqui
Aos meus pais que me ensinaram respeito honestidade perseveranccedila e pelo incentivo aos
estudos
A dra Flaacutevia Leite Souza Santos que me ajudou durante todo o trabalho e contribuiu de
forma valiosa com todas as suas orientaccedilotildees
Ao meu esposo Abidias que de forma especial e carinhosa me deu forccedila e coragem me
apoiando nos momentos de dificuldade
Ao dr Dimas Tadeu Covas pela oportunidade de poder realizar este trabalho e pela ajuda na
definiccedilatildeo do tema
A dra Eugenia Amorim Ubialli pelo apoio e pela prestreza em ajudar sempre que necessitei
Ao dr Wolney Gois Barreto diretor do Hemonuacutecleo de Araccedilatuba pelo incentivo para
realizaccedilatildeo do mestrado
A minha irmatilde Leda que apoiou e ajudou nas horas em que precisei e que natildeo foram poucas
A Raquel Botelho pela sua atenccedilatildeo e prontidatildeo para ajudar
Aos colegas do mestrado aos com os quais convivi durante todo o ano de 2014 e que
guardarei eternamente em minha memoacuteria
A Eacutemile que me ajudou com as amostras e as valiosas informaccedilotildees
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 1
11TESTES PREacute-TRANSFUSIONAIS 1
111 TIPAGEM ABORh 2
112 ANTICORPOS ANTI-ERITROCITAacuteRIOS 3
113 PESQUISA E IDENTIFICACcedilAtildeO DE ANTICORPOS IRREGULARES 4
114 PROVA DE COMPATIBILIDADE 5
115 FENOTIPAGEM PARA OUTROS SISTEMAS 6
12 METODOLOGIAS APLICADOS Agrave ROTINA IMUNO-HEMATOLOacuteGICA 7
121 MEacuteTODOS DE FASE FLUacuteIDA 8
122 COLUNAS DE GEL 9
123 BIOLOGIA MOLECULAR 9
13 TESTE DA ANTIGLOBULINA 10
131 TESTE DIRETO DA ANTIGLOBULINA 11
132 TESTE INDIRETO DA ANTIGLOBULINA 12
133 CONDICcedilOtildeES CLIacuteNICAS COM TDA POSITIVO 13
134 ANEMIA HEMOLIacuteTICA AUTOIMUNE 15
135 TRATAMENTO DE HEMAacuteCIAS COM TDA POSITIVO 16
1351 TEacuteCNICA DE BLOQUEIO 17
1352 TRATAMENTO DE HEMAacuteCIAS COM ZZAP 17
1353 CLOROQUINA 17
1353 GLICINA-AacuteCIDAEDTA 18
2 OBJETIVOS 20
21 OBJETIVO GERAL 20
22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 20
3 JUSTIFICATIVA 21
4 METODOL OGIA 22
41 AMOSTRAS DE DOADORES 22
411 FENOTIPAGEM 23
412 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS HEMAacuteCIAS 24
413 TRATAMENTO DAS AMOSTRAS 25
42 PREPARO DA GLICINA AacuteCIDA-EDTA 25
421 TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA 26
43 PREPARO DA CLOROQUINA 26
431 TEacuteCNICA DA CLOROQUINA 26
44 VERIFICACcedilAtildeO DA EFETIVIDADE DOS TESTES 27
45 TESTE DO ELUATO 27
46 AMOSTRA DE PACIENTE 27
5 RESULTADOS 28
51 REAGENTES 28
52 AMOSTRAS DE DOADORES 28
521 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS AMOSTRAS 28
522 TRATAMENTO DAS HEMAacuteCIAS 29
523 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS TEacuteCNICAS 30
524 TESTAGEM DO ELUATO 33
525 EFEITO DA ELUICcedilAtildeO SOBRE OS ANTIacuteGENOS ERITROCITAacuteRIOS 34
526 AMOSTRA DE PACIENTE 35
527 TEMPO DE EXECUCcedilAtildeO DA TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA 36
528 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 40
6 DISCUSSAtildeO 42
7 CONCLUSAtildeO 45
8 REFEREcircNCIA BIBLIOGRAacuteFICA 46
9 ANEXOS 50
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Princiacutepio da teacutecnica direta da antiglobulinapaacutegina11
Figura 2 - Princiacutepio da teacutecnica indireta da antiglobulinapaacutegina 13
Figura 3 ndash Teste da soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem apoacutes sensibilizaccedilatildeo das hemaacuteciaspaacutegina 29
Figura 4 - TDA das amostras apoacutes sensibilizaccedilatildeo com anticorpospaacutegina 30
Figura 5 - Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com
cloroquina paacutegina 31
Figura 6 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA
paacutegina 32
Figura 7 - Painel do eluato da amostra 21 apresentando especificidade anti-Cpaacutegina 34
Figura 8 - Painel do eluato da amostra 47 apresentando especificidade anti-
K paacutegina 34
Figura 9 - Fenotipagem das amostras 24 e 50 para antiacutegeno K apoacutes tratamento com glicina-
aacutecidaEDTApagina 36
Figura 10 ndash TDA monoespeciacutefico Amostra sensibilizadardquo in vivordquo com anticorpo anti-
IgGpaacutegina 38
Figura 11 ndash TDA apoacutes o tratamentopaacutegina 38
Figura 12 ndash Resultado da fenotipagem da amostra sensibilizada ldquoin vivordquo por anti-
IgGpaacutegina 39
Figura 13 ndash Painel do eluato poacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA paacutegina 39
Figura 14 ndash Painel do eluato poacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA paacutegina 39
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Resultado geral do tratamento das hemaacutecias com glicina e
cloroquinapaacutegina 32
Tabela 2 - Resultados do TDA apoacutes tratamento da hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo
sensibilizadopaacutegina 33
Tabela 3 - Resultado apoacutes o segundo tratamento das hemaacutecias com glicina-
aacutecidaEDTApaacutegina 33
Tabela 4 - Resultado do Eluato das amostras tratadas com glicina-
aacutecidaEDTA paacutegina 34
Tabela 5 ndash Verificaccedilatildeo da interferecircncia do tratamento da hemaacutecias com cloroquina e glicina-
aacutecidaEDTA nos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e spaacutegina 35
Tabela 6 - Resultado da sensibilizaccedilatildeo das amostras efetividade do tratamento com
cloroquina glicina e o eluato poacutes tratamento com glicinapaacutegina 37
LISTA DE GRAFICOS
Graacutefico 1 - Nuacutemero de amostras sensibilizadas por especificidade de
anticorpopaacutegina 31
Graacutefico 2 - Teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla entre as teacutecnicas
aplicadaspaacutegina 41
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 - Preparo dos Reagentes da glicina-aacutecidaEDTApaacutegina 25
Quadro 2 - Preparo da Cloroquinapaacutegina 26
Quadro 3 - Resultados comparativos entre as teacutecnicas utilizadas paacutegina 40
LISTA DE FLUXOGRAMAS
Fluxograma 1 - Fluxograma da pesquisa utilizando as amostras de
doadorespaacutegina 22
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ABO
AHAI
Bg
c
C
C
C3
C3b
C3d
D
DHFRN
DNA
DTT
E
e
EDTA
Fc
Fya
Fyb
HCl
IgA
IgD
IgE
IgM
Mm
NaCl
PA
PAI
PBS
PCR
PEG
pH
Rh
rpm
S
s
SIDA
SBS
TCLE
TDA
TIA
TRIS
ZZAP
microL
Sistema Sanguiacuteneo ABO
Anemia Hemoliacutetica Autoimune
Antiacutegeno Bg
Antiacutegeno c
Celsius
Antiacutegeno C
Complemento
Fraccedilatildeo do complemento
Fraccedilatildeo do complemento
Antiacutegeno D
Doenccedila Hemoliacutetica do Feto e do Receacutem-nascido
Aacutecido desoxirribonucleico
Dithiothreitol
Antiacutegeno E
Antiacutegeno e
Aacutecido Etileno Diamino Tetraceacutetico
Porccedilatildeo do anticorpo
Antiacutegeno Duffy a
Antiacutegeno Duffy b
Aacutecido cloriacutedrico
Imunoglobulina A
Imunoglobulina D
Imunoglobulina E
Imunoglobulina M
Miliacutemetros
Cloreto de soacutedio
Puro para anaacutelise
Pesquisa de anticorpos irregulares
Tampatildeo fosfato salino
Reaccedilao em cadeia de polimerase
Polietilenoglicol
Potencial hidrogeniocircnico
Sistema sanguiacuteneo Rh
Rotaccedilotildees por minuto
Antiacutegeno S
Antiacutegeno s
Siacutendrome da Imunodeficiecircncia adquirida
Sistema de banco de sangue
Termo de consentimento livre e esclarecido
Teste direto da antiglobulina
Teste indireto da antiglobulina
Hidrometil aminometano
Sulphydryl-Proteolytic Enzyme
Microlitros
RESUMO
Os testes preacute-transfusionais satildeo o conjunto de teacutecnicas imuno-hematoloacutegicas aplicadas nas
amostras do receptor e do doador com a finalidade de fornecer uma unidade de hemaacutecias
compatiacutevel e segura para a transfusatildeo Aleacutem da fenotipagem ABO e Rh obrigatoacuteria nos testes
preacute-transfusionais a determinaccedilatildeo do perfil antigecircnico de outros antiacutegenos eritrocitaacuterios de
importacircncia cliacutenica melhora a seguranccedila transfusional especialmente para pacientes
previamente aloimunizados ou candidatos agrave transfusatildeo crocircnica Para tais pacientes conhecer o
fenoacutetipo eritrocitaacuterio permite a seleccedilatildeo de concentrados de hemaacutecias com o mesmo fenoacutetipo
o que previne reaccedilotildees transfusionais hemoliacuteticas assim como nova aloimunizaccedilatildeo
Indiviacuteduos que apresentam as hemaacutecias sensibilizadas ldquoin vivordquo por anticorpos anti-
eritrocitaacuterios como ocorre na anemia hemoliacutetica autoimune (AHAI) teratildeo o teste direto da
antiglobulina (TDA) positivo dificultando a realizaccedilatildeo da fenotipagem O TDA positivo
provoca resultados falsos positivos especialmente quando satildeo utilizados para a fenotipagem
soros comerciais da classe IgG que exigem a fase de antiglobulina humana ou teste indireto
da antiglobulina (TIA) para leitura Em 1982 Edwards Moulds e Judd propuseram a
utilizaccedilatildeo da teacutecnica da cloroquina para dissociar os complexos de antiacutegeno-anticorpo
preservando a membrana eritrocitaacuteria e permitindo a fenotipagem Atualmente eacute a teacutecnica
mais utilizada nos centros brasileiros A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA foi primeiramente
descrita por Louie Jieng e Zeroulis em 1986 poreacutem eacute pouco utilizada por natildeo haver os
reagentes prontos comercialmente no mercado brasileiro O presente estudo avaliou a teacutecnica
da glicina-aacutecida-EDTA com reagentes preparados ldquoin houserdquo em paralelo agrave teacutecnica da
cloroquina que eacute atualmente a teacutecnica aplicada no Hemocentro de Ribeiratildeo Preto Para isso
amostras de hemaacutecias de doadores (n=50) com fenoacutetipo conhecido foram sensibilizadas com
anticorpos humanos de especificidade conhecida e ambas as teacutecnicas foram aplicadas Foi
verificado ainda o efeito da teacutecnica sobre a expressatildeo dos antiacutegenos eritrocitaacuterios (Fya Fy
b
Jka Jk
b S e s) atraveacutes da fenotipagem das amostras que tiveram o TDA negativado A
viabiliadade dos anticorpos presentes no eluato recuperado apoacutes tratamento com a glicina-
aacutecidaEDTA tambeacutem foi testada A glicina-aacutecidaEDTA foi efetiva em negativar o TDA em
33 amostras (66) comparaacutevel com a cloroquina que negativou 28 amostras (56) O eluato
apresentou-se viaacutevel no tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA e natildeo foi constatada destruiccedilatildeo
dos antiacutegenos eritrocitaacuterios apoacutes o tratamento Concluiacutemos que a teacutecnica da glicina-
aacutecidaEDTA pode ser utilizada como uma opccedilatildeo no tratamento de hemaacutecias com TDA
positivo com a vantagem de seu tempo de execuccedilatildeo ser inferior ao da cloroquina (2minutos x
30 a 120 minutos) o que lhe torna uacutetil em situaccedilotildees de maior urgecircncia Quando ambas as
teacutecnicas satildeo utilizadas em hemaacutecias diferentes de uma mesma amostra a efetividade estaacute
significativamente aumentada (plt005)
Palavras chave Glicina-aacutecidaEDTA Teste direto da antiglobulina AHAI fenotipagem
ABSTRACT
The pre-transfusion tests are the group of immunohematology techniques applied in the
receptor and donor samples in order to provide a unit of red blood cells compatible and safe
for transfusion In addition to the obligatory ABO and Rh phenotyping in the pre-transfusion
tests the determination of the antigenic profile of other red cells antigens of clinical
importance improves transfusion safety especially for patients previously alloimmunized or
candidates for chronic transfusion For such patients knowing the phenotype allows the
selection of red blood cell concentrates with the same phenotype which prevents hemolytic
transfusion reactions as well as new alloimmunization Individuals who have antibody-coated
red blood cells sensitized in vivo such as in autoimmune hemolytic anemia (AHAI) will
have a direct antiglobulin test (DAT) positive making it difficult to perform phenotyping
Positive DAT causes false positive results especially when commercially available IgG
serums which require the human antiglobulin phase or indirect antiglobulin test (IAT) for
reading are used for phenotyping In 1982 Edwards Molds and Judd proposed the use of the
chloroquine technique to dissociate antigen-antibody complexes by preserving the erythrocyte
membrane and allowing phenotyping It is currently the most used technique in Brazilian
centers The EDTAglycine-acid technique was first described by Louie Jieng and Zeroulis in
1986 but it is little used because commercially available reagents are not available in the
Brazilian market The present study evaluated the EDTAglycine-acid technique with reagents
prepared in house in parallel to the chloroquine technique which is currently the technique
applied at the Hemocentro de Ribeiratildeo Preto For this donor red cells samples (n = 50) with
known phenotype were sensitized with human antibodies of known specificity and both
techniques were applied The effect of the technique on the expression of erythrocyte antigens
(Fya Fy
b Jk
a Jk
b S and s) was also verified by the phenotyping of the samples that had
negative DAT The viability of the antibodies present in the recovered eluate after treatment
with EDTAglycine-acid A was also tested EDTAglycine-acid was effective in negatively
affecting DAT in 33 samples (66) comparable to chloroquine that negatived 28 samples
(56) The eluate was viable in treatment with EDTAglycine-acid and no destruction of
erythrocyte antigens after treatment We conclude that the EDTA glycine-acid technique can
be used as an option in the treatment of red cells with TDA positive with the advantage that
its execution time is inferior to that of chloroquine (2 minutes x 30 to 120 minutes) which
makes it useful in emergency situations When both techniques are used in different
erythrocytes of the same sample the effectiveness is significantly increased (p lt005)
Key words EDTAglycine-acid direct antiglobulin test AIHA phenotyping
1 INTRODUCcedilAtildeO
A transfusatildeo de hemaacutecias eacute um recurso terapecircutico muito importante e eficaz e tem se
mostrado como um grande aliado no tratamento de diversas patologias auxiliando na
melhoria da sobrevida e qualidade de vida de diversos pacientes quando indicada de forma
correta Eacute provavelmente a modalidade de terapia mais utilizada no mundo sendo
considerada a forma mais antiga de terapia celular A transfusatildeo de hemaacutecias em pacientes
com anemia grave ou sangramento agudo reestabelece o niacutevel de hemoglobina moleacutecula
responsaacutevel pelo transporte de oxigecircnio para os tecidos melhorando a isquemia tecidual
(BARJAS-CASTRO 2013 ZAGO 2014)
A transfusatildeo de componentes celulares como o concentrado de hemaacutecias deve ser
bem avaliada quanto aos riscos e benefiacutecios Os testes preacute-transfusionais satildeo parte obrigatoacuteria
do processo transfusional e tecircm como funccedilatildeo assegurar que o melhor hemocomponente seja
selecionado para o paciente reduzindo assim a chance de transfusotildees incompatiacuteveis e reaccedilotildees
transfusionais (BARJAS-CASTRO 2013)
11TESTES PREacute-TRANSFUSIONAIS
Os testes preacute-transfusionais tecircm a finalidade de evitar a ocorrecircncia de reaccedilotildees
hemoliacuteticas no receptor decorrentes da transfusatildeo de hemaacutecias incompatiacuteveis do doador
(DOWNES e SHULMAN 2011) Tem como propoacutesito selecionar hemaacutecias que apoacutes
transfusatildeo deveratildeo ter sobrevida normal ou mais proacutexima do normal (MELO 2007)
Os testes preacute-transfusionais que consistem no conjunto de teacutecnicas
imunohematoloacutegicas aplicadas agraves amostras do receptor e doador devem ser realizados antes
de toda transfusatildeo A aplicaccedilatildeo desses testes tem como finalidade fornecer uma unidade de
hemaacutecias compatiacutevel e elevar a seguranccedila da transfusatildeo Os testes preacute-transfusionais aliados
a utilizaccedilatildeo de novas tecnologias tem historicamente evitado reaccedilotildees transfusionais
hemoliacuteticas garantindo a seguranccedila transfusional em cerca de 95 dos pacientes que recebem
transfusatildeo Eacute imprescindiacutevel poreacutem a execuccedilatildeo correta das teacutecnicas envolvidas nos testes preacute-
transfusionais e ainda garantir a identificaccedilatildeo correta do receptor e das amostras de sangue e
das unidades de hemaacutecias (CASTILHO 2000 MELO 2007 BARJAS-CASTRO 2013)
2
Todos os testes que compotildeem a rotina preacute-transfusional usam meacutetodos soroloacutegicos
que envolvem a reaccedilatildeo antiacutegeno x anticorpo Ao testar a presenccedila de um antiacutegeno na
superfiacutecie da hemaacutecia eacute necessaacuterio dispor de um soro com especificidade conhecida para
aquele antiacutegeno Por outro lado testar a presenccedila de um determinado anticorpo no soro ou no
plasma exige o uso de hemaacutecias com perfil antigecircnico conhecido Os testes preacute-transfusionais
incluem tipagem ABO (direta e reversa) tipagem Rh pesquisa de anticorpos irregulares no
sangue do receptor retipagem ABO e Rh do hemocomponente e prova de compatibilidade
entre as hemaacutecias do doador e soro ou plasma do receptor em caso de transfusatildeo de hemaacutecias
ou hemocomponentes que contenham mais de 2 mL de volume eritrocitaacuterio como o
concentrado de granuloacutecitos (BRASIL 2016 GANZELLA 2014 SANTOS 2014)
Aleacutem dos testes regularmente realizados a determinaccedilatildeo do fenoacutetipo para outros
antiacutegenos eritrocitaacuterios do doador e do receptor pode ser indicada A fenotipagem eritrocitaacuteria
determina o perfil antigecircnico para outros antiacutegenos de importacircncia cliacutenica aleacutem do sistema
ABO e do antiacutegeno RhD Ela pode auxiliar a confirmaccedilatildeo de uma especificidade de anticorpo
encontrada no soro do paciente uma vez que espera-se que a sua hemaacutecia natildeo expresse o
antiacutegeno correspondente e simultaneamente eacute utilizada para selecionar um concentrado de
hemaacutecias negativo para o respectivo antiacutegeno evitando reaccedilotildees hemoliacuteticas transfusionais A
fenotipagem de candidatos a transfusotildees crocircnicas tambeacutem eacute recomendada pois esse grupo de
pacientes deve se beneficiar com a transfusatildeo profilaacutetica de unidades de hemaacutecias com
mesmo fenoacutetipo evitando assim a aloimunizaccedilatildeo assim como reaccedilotildees hemoliacuteticas provocadas
por anticorpos previamente existentes e em baixo tiacutetulo natildeo identificados pela triagem de
anticorpos (CASTILHO JUNIOR e REID 2015 DOWNES e SHULMAN 2011)
111 TIPAGEM ABORh
O sistema ABO (ISBT001) foi o primeiro sistema de grupo sanguiacuteneo a ser
descoberto Ele foi descrito em 1900 por Karl Landsteiner e eacute considerado o sistema de maior
importacircncia na praacutetica transfusional Ele eacute composto por quatro antiacutegenos A1 (ABO1) B
(ABO2) AB (ABO3) e A1 (ABO4) e eacute caracterizado pela presenccedila dos anticorpos naturais
ou seja anticorpos que surgem sem a exposiccedilatildeo preacutevia aos antiacutegenos atraveacutes de transfusatildeo ou
gestaccedilatildeo Os anticorpos ABO satildeo predominantemente da classe IgM satildeo capazes de fixar o
complemento e de provocar hemoacutelise grave intravascular caso ocorra transfusatildeo ABO
incompatiacutevel Por apresentar essa caracteriacutestica peculiar a tipagem do sistema ABO eacute
composta de duas etapas a prova direta e a prova reversa Na prova direta eacute realizada a
pesquisa dos antiacutegenos na superfiacutecie das hemaacutecias que satildeo testadas com soros comerciais
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Anti-A e Anti-B A prova reversa por sua vez pesquisa a presenccedila de anticorpos ABO ao
testar o soro ou plasma do pacientedoador com hemaacutecias A1 e B Ambas as provas satildeo
obrigatoacuterias e devem ser concordantes para interpretaccedilatildeo do fenoacutetipo ABO (COOLING
2011 SANTOS 2014)
O sistema Rh (ISBT004) eacute o maior e mais complexo sistema de grupos sanguiacuteneos
compreendendo atualmente 54 antiacutegenos (ISBT 2016) Satildeo cinco os principais antiacutegenos do
sistema Rh D (RH1) C (RH2) E (RH3) c (RH4) e e (RH5) Esses antiacutegenos possuem alta
capacidade imunogecircnica e seus respectivos anticorpos estatildeo envolvidos na doenccedila hemoliacutetica
perinatal e em reaccedilotildees transfusionais hemoliacuteticas Os autoanticorpos quentes como ocorre na
anemia hemoliacutetica quente satildeo representados em grande parte por anticorpos contra antiacutegenos
puacuteblicos do sistema Rh (CASTILHO 2007 CHOU e WESTHOFF 2011 BARJAS-
CASTRO 2013) A tipagem RhD pesquisa o antiacutegeno D na membrana eritrocitaacuteria ao testar a
hemaacutecia com antissoros comerciais Atualmente a maior parte dos soros Anti-D
comercializados satildeo monoclonais
112 ANTICORPOS ANTI-ERITROCITAacuteRIOS
Anticorpos satildeo proteiacutenas presentes no plasma tambeacutem denominadas imunoglobulinas
Satildeo produzidas pelo sistema imune em resposta a um determinado antiacutegeno Podem ser
classificadas de acordo com suas caracteriacutesticas e propriedades em cinco classes de
imunoglobulinas IgG IgM IgA IgE e IgD (BARJAS-CASTRO 2013)
A ligaccedilatildeo entre o antiacutegeno e o anticorpo envolvem ligaccedilotildees natildeo covalentes que satildeo
reversiacuteveis Vaacuterios tipos de interaccedilotildees natildeo covalentes podem contribuir para a ligaccedilatildeo do
antiacutegeno pelo anticorpo incluindo forccedilas eletrostaacuteticas pontes de hidrogecircnio forccedilas de Van
der Walls e interaccedilotildees hidrofoacutebicas (ABBAS LICHTMAN e PILLAI 2008)
As interaccedilotildees antiacutegeno-anticorpo satildeo constituiacutedas por ligaccedilotildees dinacircmicas que sofrem
interferecircncia de alteraccedilotildees fiacutesico-quiacutemicas no meio como mudanccedilas na temperatura na forccedila
eletrostaacutetica na concentraccedilatildeo do antiacutegeno e do anticorpo e no pH O melhor pH para a reaccedilatildeo
eacute em torno de 70 no entanto raros anticorpos podem exigir acidificaccedilatildeo do meio para serem
identificados (SANTOS 2014)
Em imunohematologia satildeo pesquisados os anticorpos que reconhecem os antiacutegenos
eritrocitaacuterios de grupo sanguiacuteneo ldquoin vivordquo esses anticorpos dependendo de seu significado
cliacutenico satildeo capazes de reconhecer seus respectivos antiacutegenos sobre a hemaacutecia podendo levar
a sua destruiccedilatildeo por dois mecanismos fagocitose por macroacutefagos no sistema
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reticuloendotelial ou por ativaccedilatildeo do sistema complemento com a formaccedilatildeo do complexo de
ataque a membrana e hemoacutelise intravascular As duas classes de anticorpos de maior
importacircncia em imunohematologia satildeo as imunoglobulinas IgG e a IgM (SANTOS 2014)
Devido a sua estrutura pentameacuterica os anticorpos da classe IgM se ligam aos
antiacutegenos localizados na superfiacutecie da membrana de hemaacutecias proacuteximas e promovem
aglutinaccedilatildeo das mesmas em meio salino ldquoin vitrordquo Anticorpos da classe IgG por sua vez
satildeo denominados ldquonatildeo aglutinantesrdquo ou ldquoincompletosrdquo pois sua estrutura de monocircmero eacute
pequena o que desfavorece a aglutinaccedilatildeo direta uma vez que uma mesma moleacutecula de IgG
natildeo alcanccedila antiacutegenos alvos em duas hemaacutecias proacuteximas Os anticorpos IgM aleacutem de terem
um tamanho maior apresentam 750 vezes maior eficiecircncia de aglutinaccedilatildeo que os anticorpos
IgG permitindo maior facilidade nas ligaccedilotildees entre as hemaacutecias (CARRUCIO e WISE 2012
GREEN e KLOSTERMANN 2012)
Nos testes ldquoin vitrordquo satildeo simulados reaccedilotildees que poderiam ocorrer ldquoin vivordquo causando
reaccedilotildees indesejaacuteveis A fase de sensibilizaccedilatildeo em que o anticorpo se liga ao antiacutegeno
correspondente natildeo eacute identificada macroscopicamente poreacutem uma vez que o anticorpo
aproxima as hemaacutecias e vence a forccedila eletrostaacutetica que naturalmente as repele chamada de
potencial zeta ocorre a aglutinaccedilatildeo Dependendo das caracteriacutesticas do anticorpo e de sua
capacidade de fixar complemento pode ocorrer tambeacutem a hemoacutelise (SANTOS 2014)
113 PESQUISA E IDENTIFICACcedilAtildeO DE ANTICORPOS IRREGULARES
A pesquisa de anticorpos irregulares eacute teste obrigatoacuterio nos testes preacute-transfusionais e
tem a finalidade de detectar anticorpos ldquoin vitrordquo que possam causar reaccedilatildeo ldquoin vivordquo
Dependendo da populaccedilatildeo estudada (pacientes x doadores) e ainda da sensibilidade do
teste a frequecircncia de anticorpos irregulares pode variar de 03 a 38 A imunizaccedilatildeo pode
ocorrer por transfusatildeo gestaccedilatildeo transplante ou injeccedilatildeo de material imunogecircnico (WALKER
2011)
Os anticorpos irregulares podem ser classificados como aloanticorpos que satildeo
voltados contra antiacutegenos ausentes na hemaacutecia autoacuteloga ou como autoanticorpos os quais
reconhecem antiacutegenos eritrocitaacuterios proacuteprios Os autoanticorpos antieritrocitaacuterios surgem em
decorrecircncia da desregulaccedilatildeo da autotoleracircncia imune relacionada agrave condiccedilotildees diversas como
doenccedilas hematoloacutegicas doenccedilas inflamatoacuterias autoimunes neoplasias infecccedilotildees e uso de
medicaccedilotildees A presenccedila do autoanticorpo associado a um quadro de anemia hemoliacutetica
caracteriza a anemia hemoliacutetica autoimune (AHAI) seja ela primaacuteria ou secundaacuteria agrave outra
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patologia Ateacute 12 a 40 dos pacientes com autoanticorpos quentes podem apresentar
aloanticorpos de significado cliacutenico mascarados pelos autoanticorpos (SHIREY et al 2002)
Eacute importante detectar a presenccedila de anticorpos no plasmasoro de um receptor de
transfusatildeo para garantir que seja transfundido sangue compatiacutevel Quando a pesquisa de
anticorpo irregular resultar positiva para um ou mais anticorpos de relevacircncia clinica eacute
necessaacuterio confirmar a ausecircncia do respectivo antiacutegeno na hemaacutecia do receptor assim como
selecionar para transfusatildeo concentrados de hemaacutecias tambeacutem negativos para aqueles
antiacutegenos evitando assim reaccedilotildees transfusionais (WALKER 2011)
A detecccedilatildeo de um anticorpo irregular eacute inicialmente realizada pela triagem de
anticorpos na qual o soroplasma do receptor eacute testado com 2 a 3 hemaacutecias do tipo ldquoOrdquo O
conjunto de fenoacutetipos dessas hemaacutecias deve contemplar os antiacutegenos de maior importacircncia
cliacutenica Como os anticorpos irregulares de maior interesse cliacutenico satildeo na maior parte das
vezes imunes portanto da classe IgG eacute obrigatoacuteria a fase de antiglobulina (AGH) do teste
ou teste indireto da antiglobulina (TIA) uma vez que esses anticorpos satildeo incompletos
(CASTILHO JUNIOR e REID 2015) O teste de triagem estando positivo deve-se fazer a
identificaccedilatildeo da especificidade do anticorpo utilizando um painel com maior nuacutemero de
hemaacutecias fenotipadas
114 PROVA DE COMPATIBILIDADE
A prova de compatibilidade eacute um teste obrigatoacuterio em caso de transfusatildeo de
componentes eritrocitaacuterios Tambeacutem chamada de prova de compatibilidade maior deve ser
realizada antes da administraccedilatildeo de sangue total ou concentrado de hemaacutecias utilizando-se
hemaacutecias obtidas do tubo coletor da bolsa a ser transfundida e o soro ou plasma do receptor
(BRASIL 2016)
Eacute definido como o procedimento para excluir a incompatibilidade entre o doador e o
receptor Tem o objetivo de detectar anticorpos que podem natildeo ter sido encontrados na
pesquisa de anticorpos devido a ausecircncia ou pouca expressatildeo de antiacutegenos no painel de
hemaacutecias aleacutem da possibilidade de terem ocorrido erros teacutecnicos ou notacionais durante a
realizaccedilatildeo da pesquisa (MELO 2007)
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115 FENOTIPAGEM PARA OUTROS SISTEMAS
Aleacutem da pesquisa de ABORh que eacute realizado rotineiramente a fenotipagem para
outros sistemas tambeacutem denominado ldquofenotipagem estendidardquo determina a presenccedila ou
ausecircncia de antiacutegenos considerados de importacircncia cliacutenica A fenotipagem natildeo eacute obrigatoacuteria
nos testes preacute-transfusionais poreacutem a legislaccedilatildeo atual recomenda a realizaccedilatildeo da fenotipagem
eritrocitaacuteria dos antiacutegenos C (RH2) E (RH3) c (RH4) e (RH5) K (KELL1) Fya (FY1) Fy
b
(FY2) Jka
(JK1) Jkb (JK2) S (MNS3) e s (MNS4) para pacientes aloimunizados e pacientes
com indicaccedilatildeo de transfusatildeo crocircnica (BRASIL 2016)
A seleccedilatildeo de concentrados de hemaacutecias com o mesmo fenoacutetipo do receptor para
transfusatildeo pode evitar reaccedilotildees transfusionais hemoliacuteticas no paciente previamente
aloimunizado tambeacutem previne a sensibilizaccedilatildeo por outros antiacutegenos o que normalmente
torna as transfusotildees seguintes ainda mais complicadas A fenotipagem do paciente tambeacutem
auxilia na identificaccedilatildeo dos anticorpos pois espera-se que nas hemaacutecias do paciente o
antiacutegeno seja negativo para o anticorpo encontrado servindo de guia para teste de exclusatildeo de
anticorpos (SANTOS 2014 WALKER 2011)
A incidecircncia de aloanticorpos aumenta com o nuacutemero de transfusotildees no entanto a
implantaccedilatildeo de rotina de fenotipagem com transfusatildeo profilaacutetica de hemaacutecias com fenoacutetipo
compatiacutevel para pacientes candidatos agrave politransfusatildeo como os portadores de doenccedila
falciforme talassemia anemia aplaacutestica doenccedilas linfo e mieloproliferativas renais crocircnicos e
anemias refrataacuterias pode contribuir para o baixo iacutendice de sensibilizaccedilatildeo nessas populaccedilotildees
(FLUIT KUNST e DRENTHE-SCHONK 1999 MARTINS et al 2008 e VICHINSKY et
al 2001) Outro grupo de pacientes que se beneficia com a transfusatildeo de mesmo fenoacutetipo satildeo
os pacientes com AHAI uma vez que o autoanticorpo pode mascarar a presenccedila de um
aloanticorpo de significado cliacutenico em ateacute 40 dos casos Mesmo com as teacutecnicas utilizadas
ldquoin vitrordquo para remover a interferecircncia do autoanticorpo no soro um aloanticorpo pode natildeo
ser identificado e dessa forma transfundir o mesmo fenoacutetipo do paciente evitaria reaccedilatildeo
hemoliacutetica pelos anticorpos voltados contra antiacutegenos de maior importacircncia cliacutenica e de
frequecircncia intermediaacuteria Aleacutem disso os pacientes com AHAI satildeo fortes respondedores e a
transfusatildeo profilaacutetica do mesmo fenoacutetipo previne a aloimunizaccedilatildeo (SHIREY et al 2002)
Aleacutem de fenotipar o receptor eacute importante tambeacutem que os bancos de sangue tenham
rotinas de fenotipagem de doadores para atender as necessidade dos pacientes aloimunizados
ou em esquema de transfusatildeo crocircnica (PINTO BRAGA e SANTOS 2011)
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Rotineiramente eacute inviaacutevel estabelecer o fenoacutetipo eritrocitaacuterio completo de um
indiviacuteduo pela grande diversidade de sistemas sanguiacuteneos descritos Ate junho de 2015 jaacute
haviam sido classificados 308 antiacutegenos atribuiacutedos a 36 sistemas definidos pela Sociedade
Internacional de Transfusatildeo de Sangue (ISBT) (CASTILHO JUNIOR e REID 2015)
Portanto o paciente eacute normalmente fenotipado para os antiacutegenos de maior importacircncia
clinica
Alguns fatores podem limitar a realizaccedilatildeo da fenotipagem eritrocitaacuteria Um dos fatores
eacute a transfusatildeo alogecircnica realizada haacute menos de 90 dias Neste caso podem ocorrer resultados
falso positivos para determinados antiacutegenos devido agrave presenccedila de hemaacutecias do doador
(LAINE et al 2000)
Outro fator eacute a presenccedila de anticorpo sensibilizando a hemaacutecia do paciente e
provocando positividade do teste direto da antiglobulina humana (TDA) Os soros
normalmente utilizados para fenotipagem especialmente para os antiacutegenos Fya
(FY1) Fyb
(FY2) Jka
(JK1) Jkb
(JK2) S (MNS3) e s (MNS4) necessitam da fase de antiglobulina
humana (AGH) para que ocorra aglutinacatildeo Amostras que apresentam o TDA positivo
aglutinam apoacutes reaccedilatildeo com a AGH natildeo pela real presenccedila do antiacutegeno em sua superfiacutecie mas
pela interaccedilatildeo da AGH com o anticorpo que estaacute sensibilizando o eritroacutecito A interferecircncia
do TDA positivo pode ser anulada atraveacutes de algumas teacutecnicas capazes de dissociar o
anticorpo como por exemplo o tratamento da hemaacutecia sensibilizada com cloroquina ou com
glicina-aacutecida-EDTA (BRANCH e PETZ 1999 SHIREY et al 2002 e LEGER 2011)
12 METODOLOGIAS APLICADOS Agrave ROTINA IMUNO-HEMATOLOacuteGICA
Todos os testes que compotildeem a rotina preacute-transfusional usam meacutetodos soroloacutegicos
que envolvem a reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo e tem como objetivo determinar o perfil antigecircnico
eritrocitaacuterio do receptor e do doador assim como identificar em seu soro a presenccedila de
anticorpos contra antiacutegenos eritrocitaacuterios que possam comprometer a sobrevida das hemaacutecias
transfundidas Para testar o antiacutegeno na superfiacutecie da hemaacutecia eacute necessaacuterio dispor de um
antissoro com especificidade conhecida para aquele antiacutegeno Por outro lado para testar a
presenccedila de um determinado anticorpo no soro ou plasma do receptor eacute necessaacuterio o uso de
hemaacutecias com perfil antigecircnico conhecido (SANTOS 2014)
Diversas metodologias satildeo aplicadas nos laboratoacuterios de imunohematologia Cada
serviccedilo de hemoterapia faz a escolha do meacutetodo que seraacute aplicado de acordo com o perfil do
laboratoacuterio com o volume de exames diaacuterios e tambeacutem com o custo envolvido Todas essas
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teacutecnicas tecircm como objetivo comum demonstrar a reaccedilatildeo entre antiacutegeno e anticorpo no
entanto elas se baseiam em diferentes princiacutepios Muitas metodologias satildeo atualmente
aplicadas agrave imunohematologia entre elas o sistema de fase soacutelida a tecnologia de hemaacutecias
magnetizadas a biologia molecular e ateacute mesmo a citometria de fluxo no entanto os meacutetodos
mais tradicionais satildeo aqueles baseados no princiacutepio de hemaglutinaccedilatildeo
121 MEacuteTODOS DE FASE FLUacuteIDA
Os meacutetodos de fase fluiacuteda satildeo testes baseados na hemaglutinaccedilatildeo e incluem o teste em
tubo e o teste em microplacas Uma suspensatildeo de hemaacutecias eacute adicionada ao plasma ou soro
em seguida eacute realizada a centrifugaccedilatildeo e por fim eacute feita a leitura do resultado que eacute
considerado positivo se for observado algum grau de aglutinaccedilatildeo ou hemoacutelise A intensidade
de aglutinaccedilatildeo eacute graduada de acordo com o tamanho dos agregados desprendidos da
superfiacutecie apoacutes agitaccedilatildeo delicada do tubo ou microplaca Os meacutetodos de hemaglutinaccedilatildeo satildeo
aplicados a todos os testes preacute-transfusionais Como os anticorpos ABO satildeo aglutininas frias
a tipagem eacute realizada em temperatura ambiente (22degC) no entanto ao investigar a presenccedila
de anticorpos irregulares que como jaacute mencionado eacute na maioria das vezes anticorpos
incompletos da classe IgG eacute essencial que a reaccedilatildeo seja incubada a 37degC As reaccedilotildees satildeo
facilitadas com a utilizaccedilatildeo de potencializadores e da antiglobulina humana (WALKER e
HARMENING 2012 AABB 2011)
Nos meacutetodos de fase fluiacuteda nos quais a AGH eacute empregada a fase de lavagem eacute
fundamental Apoacutes a incubaccedilatildeo do soro com as hemaacutecias deve ser realizada a lavagem da
reaccedilatildeo para remover o excesso de anticorpos natildeo ligados agraves hemaacutecias jaacute que os anticorpos
livres podem bloquear a AGH quando ela eacute adicionada e levar a resultados falso negativos
(AABB 2011)
Os testes de hemaglutinaccedilatildeo satildeo os mais tradicionais entre os meacutetodos ainda hoje
aplicados agrave rotina de bancos de sangue A vantagem desses meacutetodos eacute o baixo custo quando
comparado agraves teacutecnicas mais modernas mas apresentam tambeacutem desvantagens A teacutecnica em
tubo por exemplo natildeo permite automaccedilatildeo eacute trabalhosa e exige matildeo-de-obra bastante treinada
na execuccedilatildeo das diversas etapas do teste e mesmo assim pode haver subjetividade na
interpretaccedilatildeo dos resultados aleacutem de resultados falso-negativos (DOWNES 2011 ZANTEK
et al 2012)
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122 COLUNAS DE GEL
A teacutecnica em gel iniciada na deacutecada de 90 representou uma grande revoluccedilatildeo na
rotina laboratorial tornando-se muito popular Aleacutem de ser sensiacutevel a teacutecnica dispensa a fase
de lavagem antes da adiccedilatildeo da AGH assim como a agitaccedilatildeo do teste para leitura reduzindo o
nuacutemero de resultados falsos negativos decorrentes dessas duas etapas e o tempo para
execuccedilatildeo dos testes (LAPIERRE et al 1989 NOVARETTI et al 2000 NOVARETTI et
al 2004) Os reagentes satildeo comercializados na forma de cartotildees plaacutesticos contendo
microtubos preenchidos por gel composto por microesferas de acrilamida-dextran Nesta
metodologia tambeacutem baseada na hemaglutinaccedilatildeo a suspensatildeo de hemaacutecias e o soro satildeo
depositados em uma cacircmara acima da coluna de gel e em seguida procede-se com a
centrifugaccedilatildeo dos cartotildees As microesferas atuam como uma malha que permite a passagem
em direccedilatildeo ao fundo do microtubo apenas das hemaacutecias natildeo aglutinadas enquanto as
hemaacutecias aglutinadas ficam retidas na parte superior da coluna ou ao longo dela (GREEN e
KLOSTERMANN 2012) Portanto quanto maior a agregaccedilatildeo mais hemaacutecias ficam retidas
no topo da coluna Dependendo do tipo de teste a ser realizado pode ser utilizado gel neutro
ou gel especiacutefico impregnado pelo anticorpo desejado e o gel contendo antiglobulina humana
que satildeo utilizados para os testes diretos e indiretos da antiglobulina (LAPIERRE et al 1989)
A coluna de gel ainda permite a visualizaccedilatildeo clara de duas populaccedilotildees distintas de hemaacutecias
como em pacientes receacutem transfundidos
123 BIOLOGIA MOLECULAR
A biologia molecular ou genotipagem estaacute sendo cada vez mais aplicada aos grupos
sanguiacuteneos pois fornece resultados seguros e precisos especialmente nos casos em que natildeo eacute
possiacutevel a realizaccedilatildeo da fenotipagem como em pacientes receacutem-transfundidos e pacientes
com TDA positivo Na genotipagem eacute possiacutevel determinar atraveacutes do DNA do paciente
extraiacutedo de seus leucoacutecitos de sangue perifeacuterico o fenoacutetipo eritrocitaacuterio deduzido sem
qualquer interferecircncia do anticorpo que sensibiliza a hemaacutecia ou de hemaacutecias alogecircnicas
transfundidas Sua realizaccedilatildeo no entanto exige o treinamento de equipe especializada e capaz
de interpretar os resultados em conjunto com os achados soroloacutegicos (JUNIOR e OLIVATO
2007)
Apesar de ser uma ferramenta de grande importacircncia hoje na imuno-hematologia
ainda estaacute restrito aos grandes centros de hemoterapia no Brasil poucos serviccedilos puacuteblicos de
sauacutede dispotildeem desse recurso e utilizam teacutecnicas de genotipagem de grupos sanguiacuteneos para
atendimento a seus pacientes Esta abordagem poreacutem vem sendo introduzida em algumas
10
instituiccedilotildees de reconhecida competecircncia na hemoterapia mas sua disponibilizaccedilatildeo deve
tornar-se mais generalizada atraveacutes da formaccedilatildeo de centros de referecircncia para atendimento
das diversas unidades de hemoterapia (MARTINS et al 2009) Dessa forma muitas decisotildees
transfusionais especialmente em urgecircncias ainda devem ser tomadas sem o resultado da
genotipagem eritrocitaacuteria
13 TESTE DA ANTIGLOBULINA
Coombs Mourant e Race descreveram em 1945 uma teacutecnica com utilizando soro de
coelho contendo antiglobulina humana (AGH) que posteriormente foi chamada de ldquosoro de
Coombsrdquo O meacutetodo foi desenvolvido inicialmente para ampliar o efeito de aglutininas fracas
do sistema Rh anticorpos ldquoincompletosrdquo que normalmente natildeo apresentavam aglutinaccedilatildeo
visiacutevel O teste foi concebido como um instrumento de investigaccedilatildeo de doenccedila hemoliacutetica do
receacutem-nascido e de reaccedilotildees transfusionais causadas por anticorpos Rh que estavam presentes
no soro dos paciente poreacutem que natildeo eram demonstraacuteveis pelas teacutecnicas ateacute entatildeo existentes
A maior parte dos anticorpos de significado cliacutenico assim como seus respectivos
antiacutegenos foram descritos apoacutes o surgimento do ldquosoro de Coombsrdquo em 1945 sendo assim o
teste da antiglobulina representa ateacute hoje a forma mais importante de aglutinaccedilatildeo artificial em
imunohematologia permitindo revelar a presenccedila de anticorpos na membrana da hemaacutecia A
antiglobulina humana eacute constituiacuteda por anticorpo especiacutefico contra a porccedilatildeo Fc de outro
anticorpo Quando um anticorpo ldquoincompletordquo sensibiliza a hemaacutecia normalmente natildeo
provoca aglutinaccedilatildeo visiacutevel Apoacutes a adiccedilatildeo da AGH ao meio esta reconhece e se liga agraves
porccedilotildees Fc dos anticorpos que sensibilizam a hemaacutecia formando assim uma malha e
provocando aglutinaccedilatildeo visiacutevel (BARJAS-CASTRO 2013)
Os reagentes de antiglobulina podem ser poliespeciacuteficos ou monoespeciacuteficos Os
poliespeciacuteficos satildeo uma mistura de anticorpos ant-IgG e anti-C3d (fraccedilatildeo C3d do
complemento) Os reagentes monoespecificos podem ser anti-IgG anti-IgM anti-IgA anti-
complemento podendo ser anti-C3d e anti-C3b
O teste da antiglobulina pode ser usado para detectar hemaacutecias sensibilizadas com
aloanticorpos IgG autoanticorpos IgG e componentes do complemento A sensibilizaccedilatildeo
pode ocorrer ldquoin vivordquo ou ldquoin vitrordquo O uso do AGH para detectar a sensibilizaccedilatildeo ldquoin vitrordquo
tem dois estaacutegios e eacute denominado teste indireto da antiglobulina A sensibilizaccedilatildeo ldquoin vivordquo eacute
detectada em procedimento de um uacutenico estagio chamado teste direto da antiglobulina (TDA)
11
Os testes direto e indireto satildeo ateacute hoje amplamente aplicados como princiacutepio de inuacutemeros
testes soroloacutegicos em imuno-hematologia (GREEN e KLOSTERMANN 2012)
131 TESTE DIRETO DA ANTIGLOBULINA
O teste direto da antiglobulina humana revela a presenccedila de anticorpo eou fraccedilatildeo do
complemento ligados agrave superfiacutecie das hemaacutecias As sensibilizaccedilatildeo das hemaacutecias ocorrida ldquoin
vivordquo natildeo eacute visualizada mas apoacutes a adiccedilatildeo da antiglobulina humana ocorre a aglutinaccedilatildeo que
eacute visualizada macroscopicamente (Figura 1)
Figura 1 - Princiacutepio da teacutecnica direta da antiglobulina Teste utilizado para demonstrar a sensibilizaccedilatildeo ldquoin
vivordquo das hemaacutecias O sangue total eacute coletado do paciente em tubo contendo anticoagulante EDTA Na teacutecnica
realizada em tubo uma suspensatildeo de hemaacutecias 5 em soluccedilatildeo de salina eacute preparada Uma gota dessa suspensatildeo
eacute lavada 3 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica para retirada de anticorpos que estatildeo livres no plasma Toda soluccedilatildeo eacute
retirada e adiciona-se o soro de Coombs (antiglobulina humana) O soro de Coombs reconhece os anticorpos que
estatildeo ligados agrave superfiacutecie das hemaacutecias fazendo com que ocorra aglutinaccedilatildeo visiacutevel macroscopicamente
Apesar de natildeo ser um teste preacute-transfusional obrigatoacuterio o TDA eacute um dos testes mais
importantes para investigar e classificar quadros hemoliacuteticos como de origem imune ou natildeo
imune O seu valor preditivo positivo em vigecircncia de anemia hemoliacutetica eacute de 83 poreacutem natildeo
havendo sinais de hemoacutelise seu valor preditivo eacute apenas 14 Eacute por esse motivo que a
interpretaccedilatildeo do TDA positivo deve levar em consideraccedilatildeo a histoacuteria cliacutenica e os resultados
dos outros exames laboratoriais A realizaccedilatildeo do TDA eacute obrigatoacuteria na investigaccedilatildeo
12
laboratorial de diversos quadros hemoliacuteticos entre eles a anemia hemoliacutetica autoimune
(AHAI) a reaccedilatildeo hemoliacutetica imune poacutes-transfusional a siacutendrome do linfoacutecito passageiro a
doenccedila hemoliacutetica perinatal e a hemoacutelise droga-dependente (LEGER 2011)
Resultados de TDA positivos foram tambeacutem observados em indiviacuteduos com niacuteveis
seacutericos elevados de IgG ou complemento sem evidecircncia de anemia hemoliacutetica imune como
em pacientes com doenccedila falciforme talassemia doenccedila renal crocircnica mieloma muacuteltiplo
doenccedilas autoimunes e siacutendrome da imunodeficiecircncia adquirida (SIDA) Aleacutem disso pequenas
quantidades de IgG (5 a 90 moleacuteculas por hemaacutecia) e complemento (5 a 40 moleacuteculas por
hemaacutecia) podem estar presentes nas hemaacutecias de indiviacuteduos saudaacuteveis sem associaccedilatildeo com
reduccedilatildeo na sobrevida das mesmas A positividade do TDA depende da populaccedilatildeo estudada e
pode variar de 01 entre doadores de sangue sem qualquer sinal cliacutenico de hemoacutelise ateacute
15 em pacientes hospitalizados (CASTILHO JUNIOR e REID 2015 LEGER 2011)
Indiviacuteduos que apresentam TDA positivo seja agraves custas de IgG eou complemento
com ou sem sinais cliacutenicos de hemoacutelise teratildeo a fenotipagem eritrocitaacuteria prejudicada A
fenotipagem de indiviacuteduos com TDA positivo especialmente quando utilizado o teste indireto
da antiglobulina pode acarretar resultados falsos positivos e levar a seleccedilatildeo de fenoacutetipo
incorreto para transfusatildeo
132 TESTE INDIRETO DA ANTIGLOBULINA
O teste indireto da antiglobulina (TIA) eacute utilizado para revelar a sensibilizaccedilatildeo ldquoin
vitrordquo das hemaacutecias e eacute aplicado a diversos testes soroloacutegicos em imunohematologia entre
eles a pesquisa de anticorpos identificaccedilatildeo de anticorpos testes de compatibilidade
fenotipagem eritrocitaacuteria e titulaccedilatildeo de anticorpos Na teacutecnica indireta a hemaacutecia que contecircm
o antiacutegeno eacute colocada em contato ldquoin vitrordquo com o anticorpo que se liga mas natildeo promove a
aglutinaccedilatildeo visiacutevel A adiccedilatildeo da AGH forma uma malha entre os anticorpos que sensibilizam
as hemaacutecias e provoca a aglutinaccedilatildeo macroscoacutepica (figura 2)
Caso a amostra de hemaacutecia estudada seja previamente sensibilizada resultados falsos
positivos podem ser obtidos no TIA jaacute que a AGH reagiraacute com a moleacutecula que sensibilizava
anteriormente a hemaacutecia mesmo se o anticorpo especiacutefico natildeo tiver se ligado ao antiacutegeno
correspondente
13
133 CONDICcedilOtildeES CLIacuteNICAS COM TDA POSITIVO
O TDA positivo deve ser interpretado cuidadosamente sempre em conjunto com o
quadro cliacutenico do paciente A positividade isolada do TDA natildeo significa hemoacutelise A
interpretaccedilatildeo do teste positivo requer o conhecimento do diagnoacutestico do paciente da presenccedila
de sinais e sintomas sugestivos de hemoacutelise assim como de seu histoacuterico transfusional
gestacional e de informaccedilotildees sobre o uso recente de medicaccedilotildees (LEGER 2011)
Figura 2 ndash Princiacutepio do teste indireto da antiglobulina O TIA pode ser utilizado na pesquisa de anticorpos de
especificidades desconhecidas livres no soroplasma como eacute o caso da pesquisa e identificaccedilatildeo de anticorpos
irregulares Ele eacute tambeacutem utilizado para determinar a presenccedila de antiacutegenos na membrana da hemaacutecia quando
satildeo empregados soros de especificidades conhecidas da classe IgG No primeiro caso o soroplasma contendo o
anticorpo desconhecido eacute colocado em contato com hemaacutecias cujo perfil antigecircnico eacute conhecido No segundo
caso utiliza-se soro de especificidade conhecida da classe IgG para determinar a presenccedila ou ausecircncia de um
antiacutegeno na membrana O anticorpo encontra o antiacutegeno correspondente e ocorre a ligaccedilatildeo do anticorpo agrave
hemaacutecia mas natildeo ocorre aglutinaccedilatildeo Apoacutes a adiccedilatildeo da AGH que se liga aos anticorpos formando uma malha
ocorre a aglutinaccedilatildeo visiacutevel
O TDA positivo eacute uma achado claacutessico de algumas condiccedilotildees cliacutenicas como a reaccedilatildeo
transfusional hemoliacutetica a doenccedila hemoliacutetica do feto e do receacutem-nascido (DHFRN) a anemia
hemoliacutetica induzida por drogas a siacutendrome do linfoacutecito passageiro e a anemia hemoliacutetica
autoimune (AHAI) Portanto o TDA positivo pode ser decorrente da sensibilizaccedilatildeo da
hemaacutecia autoacuteloga por um autoanticorpo ou por um aloanticorpo ligado agrave hemaacutecia alogecircnica
circulante A positividade do TDA pode ainda ocorrer de forma passiva em pacientes que
14
recebem imunoglobulinas humanas ou ainda pela transfusatildeo de plaquetas ABO natildeo idecircntico
(LEGER 2011 RALPH 2012 ZANTEK et al 2012)
Nas reaccedilotildees transfusionais hemoliacuteticas imunes o aloanticorpo do receptor sensibiliza
as hemaacutecias transfundidas do doador e reduz sua sobrevida ao removecirc-la precocemente da
circulaccedilatildeo pela fagocitose no sistema retiacuteculo-endotelial ou pela hemoacutelise intravascular As
reaccedilotildees podem ser agudas se ocorrem ateacute 24 horas ou tardias quando ocorrem apoacutes 24 horas
da transfusatildeo A gravidade das reaccedilotildees hemoliacuteticas pode variar de um simples rendimento
transfusional inadequado agrave quadros graves de hemoacutelise intravascular evoluindo ateacute mesmo
com choque vascular e oacutebito O TDA pode resultar negativo caso toda massa eritrocitaacuteria
transfundida tenha sido destruiacuteda (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
Na doenccedila hemoliacutetica do feto e do receacutem-nascido (DHFRN) anticorpos maternos da
classe IgG atravessam a barreira placentaacuteria e sensibilizam as hemaacutecias fetais que seratildeo
destruiacutedas precocemente levando agrave anemia fetal Apesar da incompatibilidade ABO feto-
materna ser a causa mais frequente de DHFRN raramente ela eacute responsaacutevel pela ocorrecircncia
de quadros graves Por outro lado anticorpos contra antiacutegenos do sistema Rh e Kell
especialmente Anti-D (Anti-RH1) Anti-c (Anti-RH4) e Anti-Kell (Anti-KELL1) satildeo
conhecidos por causar DHFRN severa Raramente outros anticorpos tambeacutem podem estar
implicados na DHFRN como os anticorpos contra antiacutegenos do sistema Kidd Duffy MNS e
Diego (ZANTEK et al 2012)
A hemoacutelise droga-dependente eacute causada pela produccedilatildeo de um anticorpo voltado contra
a droga ligada agrave membrana eritrocitaacuteria ou ainda contra o complexo droga-membrana A
classe de medicaccedilotildees mais comumente envolvida eacute a dos antimicrobianos betalactacircmicos
(penicilinas e cefalosporinas) mas outras classes como quimioteraacutepicos e anti-inflamatoacuterios
tambeacutem satildeo descritos (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
Apoacutes transplante de ceacutelulas progenitoras hematopoieacuteticas em que o doador possui
anticorpos contra antiacutegenos eritrocitaacuterios do receptor o linfoacutecito de memoacuteria do doador pode
resistir ao esquema imunossupressor utilizado e continuar a produccedilatildeo de anticorpos que
reconhecem a hemaacutecia incompatiacutevel do receptor ainda circulante O quadro cliacutenico pode
variar de um simples TDA positivo sem outros sinais ou sintomas ateacute um quadro hemoliacutetico
grave e abrupto (LEGER 2011)
15
134 ANEMIA HEMOLIacuteTICA AUTOIMUNE
A anemia hemoliacutetica autoimune eacute caracterizada pela destruiccedilatildeo precoce das hemaacutecias
autoacutelogas por autoanticorpos que sensibilizam as hemaacutecias e levam agrave fagocitose pelos
macroacutefagos no sistema reticulo-endotelial ou hemoacutelise intravascular O diagnoacutestico da AHAI
baseia-se na presenccedila de hemoacutelise cliacutenica associada agrave evidecircncia de fator imune representado
pelo TDA positivo As classes de anticorpos envolvidas em quadros de AHAI satildeo IgG IgM e
raramente IgA (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012) Satildeo raros os casos de AHAI com TDA
negativo que podem estar relacionados a um autoanticorpo de baixa avidez de densidade
inferior agrave detecccedilatildeo do meacutetodo ou ainda de classe de imunoglobulina natildeo avaliada pelo
meacutetodo utilizado para o teste (GARRATY 2005)
A AHAI pode ser classificada em dois grupos principais de acordo com a melhor
temperatura de reaccedilatildeo do autoanticorpo As anemias hemoliacuteticas causadas por anticorpos
quentes que reagem melhor a 37oC e geralmente IgG representam 80 dos casos de AHAI
Nas AHAI por anticorpo quente o TDA pode ser positivo para IgG mais complemento (67)
somente IgG (20) ou somente por complemento (13) As anemias causadas por
anticorpos frios geralmente da classe IgM e que reagem melhor em temperatura ambiente ou
a 4oC representam aproximadamente 20 dos casos de AHAI Por exibirem amplitude
teacutermica esses anticorpos ligam-se agraves hemaacutecias ao atingirem a circulaccedilatildeo nas extremidades do
corpo fixam o complemento e desprendem-se da hemaacutecia apoacutes retornar para partes mais
quentes Por esse motivo em AHAI por anticorpos frios o TDA eacute positivo apenas agraves custas
de C3 e normalmente o IgM natildeo eacute detectado (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
A presenccedila do autoanticorpo IgG pode ser confirmada atraveacutes da eluiccedilatildeo do anticorpo
da hemaacutecia Tipicamente o eluato na AHAI por anticorpo quente reage com todas as ceacutelulas
testadas de um painel de hemaacutecias alogecircnicas do tipo ldquoOrdquo ou pode eventualmente exibir uma
especificidade conhecida como Anti-e (Anti-RH5) Nas AHAI a frio por sua vez espera-se
um eluato negativo (LEGER 2011)
Os autoanticorpos satildeo com frequecircncia encontrados livres no plasma e natildeo somente
ligados agraves hemaacutecias autoacutelogas Eles podem interferir em todas as fases dos testes preacute-
transfusionais nas quais o plasma eacute testado especialmente os autoanticorpos quentes que
acarretam resultados positivos em todos os testes levados agrave fase de antiglobulina humana
Esses anticorpos portanto positivam a pesquisa de anticorpos irregulares e mascaram a
presenccedila de aloanticorpos de significado cliacutenico Aproximadamente 60 dos pacientes que
apresentam AHAI a quente apresentam anticorpos que reagem em meio salino mas se forem
16
levados em conta meacutetodos mais sensiacuteveis como PEG enzima e estudo em gel a positividade
pode ser superior a 90 (LEGER 2011)
Aleacutem da eficaacutecia da transfusatildeo ser comprometida pela diminuiccedilatildeo da vida-meacutedia das
hemaacutecias a presenccedila do autoanticorpo dificulta a realizaccedilatildeo dos testes preacute-transfusionais e
compromete a seguranccedila transfusional Os autoanticorpos reagem normalmente como
panaglutininas pois satildeo normalmente voltados contra antiacutegenos puacuteblicos na maior parte das
vezes contra antiacutegenos do sistema Rh Por apresentarem essas caracteriacutesticas podem ainda
mascarar a presenccedila de aloanticorpos de significado clinico e levar a testes de compatibilidade
positivos exigindo uma avaliaccedilatildeo criteriosa da necessidade da transfusatildeo (BRANCH e PETZ
1999 JUNIOR e OLIVATO 2004)
Remover a interferecircncia do autoanticorpo para avaliar a presenccedila de aloanticorpos
mascarados nem sempre eacute possiacutevel mesmo utilizando teacutecnicas de autoadsorccedilatildeo ou
aloadsorccedilatildeo que aleacutem de tudo satildeo demoradas e exigem de 2 a 6 horas para conclusatildeo
(GARRATY e GEORGE 2002) Nesses casos a fenotipagem eritrocitaacuteria do paciente eacute de
extrema utilidade especialmente em situaccedilotildees de urgecircncia A definiccedilatildeo do fenoacutetipo do
paciente para os antiacutegenos de maior importacircncia cliacutenica pode auxiliar a seleccedilatildeo de unidades
de hemaacutecias com mesmo fenoacutetipo o que garante que eventuais aloanticorpos natildeo
identificados sejam respeitados e tambeacutem evita nova sensibilizaccedilatildeo (JUNIOR e OLIVATO
2004 SHIREY et al 2002)
135 TRATAMENTO DE HEMAacuteCIAS COM TDA POSITIVO
O TDA positivo impede a fenotipagem eritrocitaacutecia por meacutetodos que exigem a fase de
AGH uma vez que a aglutinaccedilatildeo ocorreraacute devido agrave interaccedilatildeo da AGH com o autoanticorpo
que sensibiliza a hemaacutecia do paciente levando a resultados falso positivos Em algumas
situaccedilotildees como na AHAI por anticorpo quente a fenotipagem eacute especialmente importante
pois o autoanticorpo interfere na triagem e identificaccedilatildeo de anticorpos assim como no teste de
compatibilidade e dificultam a detecccedilatildeo de aloanticorpos de significado cliacutenico que
obrigatoriamente devem ser respeitados Nessas situaccedilotildees a fenotipagem eritrocitaacuteria
determina o perfil antigecircnico do paciente e possibilita o fornecimento de unidades de
hemaacutecias com o mesmo fenoacutetipo para a transfusatildeo evitando a sensibilizaccedilatildeo para novos
antiacutegenos assim como reaccedilotildees hemoliacuteticas transfusionais No entanto eacute necessaacuterio aplicar
meacutetodos que natildeo sofram interferecircncia do TDA positivo ou seja meacutetodos que natildeo necessitem
da fase de AGH ou meacutetodos de bloqueio do anticorpo sem bloquear o antiacutegeno Uma opccedilatildeo eacute
a utilizaccedilatildeo de soros monoclonais IgM (salinos ou de meio proteico natildeo concentrado) mas
17
nem sempre esses reagentes estatildeo disponiacuteveis especialmente os reagentes monoclonais para
os antiacutegenos dos sistemas Duffy ( Fya Fy
b) Kidd ( Jk
a Jk
b) e MNS (S s) (JUNIOR e
OLIVATO 2004) Outra opccedilatildeo eacute a teacutecnica de bloqueio que pode ser utilizada para tratar
hemaacutecias para posterior fenotipagem em casos de TDA positivos com reatividade le2+
Em casos onde a positividade do TDA eacute maior que 2+ estaacute indicada a tratamento
quiacutemico para remoccedilatildeo da interferecircncia do autoanticorpo antes de realizar a fenotipagem Entre
as teacutecnicas utilizadas atualmente estatildeo o ZZAP a cloroquina e a glicina aacutecidaEDTA
1351 TEacuteCNICA DE BLOQUEIO
A teacutecnica de bloqueio se baseia na utilizaccedilatildeo de anti-IgG (Coombs monoespeciacutefico)
para tratar as hemaacutecias com TDA positivo O anticorpo anti-IgG se liga aos anticorpos que
estatildeo sensibilizando a hemaacutecias poreacutem sem o bloquear os antiacutegenos Os antiacutegenos que natildeo
estatildeo sensibilizados podem ser detectados atraveacutes dos antissoros especiacuteficos (SERERAT
VEIDT E DUTCHED 2000)
1352 TRATAMENTO DE HEMAacuteCIAS COM ZZAP
O Sulphydryl-Proteolytic Enzyme (ZZAP) que eacute uma mistura de ditiotreitol (DTT)
mais papaiacutena ativada com cisteiacutena eacute um reagente capaz de dissociar imunoglobulinas da
classe IgG ligadas a membrana dos eritroacutecitos enquanto trata enzimaticamente as hemaacutecias
O tratamento enzimaacutetico tambeacutem potencializa a ligaccedilatildeo do autoanticorpo ao antiacutegeno e
acelera o processo de autoadsorccedilatildeo O ZZAP pode desnaturar os antiacutegenos do sistema Duffy
MNS e Kell o que limita sua aplicaccedilatildeo para fins de fenotipagem (BRANCH e PETZ 1982)
1353 CLOROQUINA
Em 1982 Edwards Moulds e Judd propuseram a utilizaccedilatildeo da teacutecnica da cloroquina
que dissociava os complexos antiacutegeno-anticorpo e mantinha a membrana das hemaacutecias
iacutentegras Os derivados quinolecircicos jaacute haviam sido descritos anteriormente por Domokos e
Aszody em 1964 e Holtz Mantel e Buck em 1973 (apud Edwards Moulds e Judd 1982) pela
sua capacidade de separar imunocomplexos e inibir as reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo reduzindo
as cargas eleacutetricas das superfiacutecie das hemaacutecias A teacutecnica eacute uma das mais utilizadas nos
centros brasileiros para remover a interferecircncia do autoanticorpo e eacute tambeacutem a teacutecnica
atualmente adotada pelo laboratoacuterio de imunohematologia do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto
18
Edwards Moulds e Judd (1982) demonstraram que a teacutecnica da cloroquina para
dissociaccedilatildeo de anticorpos eacute uma teacutecnica simples efetiva e confiaacutevel para dissociar
imunoglobulina das hemaacutecias Desde que a membrana das hemaacutecias permaneccedila intacta natildeo
haacute perda da reatividade dos antiacutegenos e a sua maior aplicaccedilatildeo eacute a fenotipagem de hemaacutecias
com TDA positivo Os autores verificaram que em 83 das amostras sensibilizadas in vivo e
22 amostras (no total de 40) sensibilizadas ldquoin vitrordquo apresentaram TDA negativo e
puderam ser fenotipadas A teacutecnica poreacutem natildeo consegue remover os componentes do
complemento na maioria dos casos
Champagne e colaboradores (1999) testaram a teacutecnica da cloroquina para dissociar
antiacutegenos Bg comparando com a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA e verificaram vantagem em
relaccedilatildeo ao uso de um uacutenico reagente diminuindo a manipulaccedilatildeo e verificou que o mesmo natildeo
destroacutei antiacutegeno Kell
A cloroquina tambeacutem mostrou-se pouco efetivo em remover anticorpos do sistema
Duffy da superfiacutecie das hemaacutecias (EDWARDS MOUDS e JUDD 1982 ROZIERS e
SQUALI 1997)
1353 GLICINA-AacuteCIDAEDTA
A afinidade e a estabilidade entre a ligaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo eacute definida como a
resultante entre forccedilas atrativas e repulsivas entre ambos (CARUCIO e WISE 2012) e resulta
da somatoacuteria de forccedilas quiacutemicas dinacircmicas e fracas (natildeo covalentes) como pontes de
hidrogecircnio forcas eletrostaacuteticas forca de Van der Waals e pontes hidrofoacutebicas A estabilidade
dessa ligaccedilatildeo eacute facilmente abalada por alteraccedilotildees quiacutemicas e fiacutesicas no meio da reaccedilatildeo como
a alteraccedilatildeo do pH A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA se baseia na mudanccedila do pH para a
quebra da ligaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo (KOSANKE 2012)
A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA foi primeiramente descrita em 1986 por Louie Jieng
e Zeroulis que utilizaram 50 amostras de doadores sensibilizados ldquoin vitrordquo com anticorpos A
teacutecnica foi efetiva em 48 amostras permitindo o estudo do eluato assim como a fenotipagem
das hemaacutecias Os autores testaram tambeacutem a teacutecnica em 100 hemaacutecias TDA positivo que
puderam ser utilizadas para teacutecnicas de autoadsorccedilatildeo
Byrne (1991) descreveu a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA modificada e tambeacutem
verificou como uma opccedilatildeo para o tratamento de hemaacutecias com TDA positivo que deixava as
hemaacutecias intactas e o eluato viaacutevel para ser fenotipado
19
Roziers e Squali (1997) e Katharia e Chaudhary (2013) compararam a teacutecnica da
glicina-aacutecidaEDTA com as teacutecnicas da cloroquina e do aquecimento Verificaram maior
eficiecircncia da glicina-aacutecidaEDTA em relaccedilatildeo as outras duas teacutecnicas pois com uma mesma
quantidade de amostra produzia as hemaacutecias livres de anticorpo e tambeacutem o eluato Mostrou-
se ainda superior devido ao menor tempo exigido para sua realizaccedilatildeo o que favorece seu uso
em situaccedilotildees de urgecircncia e emergecircncia
As duas desvantagens da teacutecnica poreacutem eacute o fato de destruir os antiacutegenos do sistema
Kell e o fato de natildeo remover fraccedilotildees do complemento ligadas agrave hemaacutecia (PALLAS WILER e
McGEE 1991 ROZIERS e SQUALLI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012
e KATHARIA e CHAUNDHARY 2013)
20
2 OBJETIVOS
21 OBJETIVO GERAL
211 Avaliar a eficaacutecia da glicina-aacutecidaEDTA em remover os anticorpos ligados agraves
hemaacutecias sensibilizadas por anticorpos da classe IgG
22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
221 Preparaccedilatildeo dos reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
verificaccedilatildeo da estabilidade dos mesmos e avaliar custos
222 Testar a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA em amostras de hemaacutecias
sensibilizadas por anticorpos antieritrocitaacuterios humanos
223 Comparar a efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA com a teacutecnica da
cloroquina quanto a capacidade de remover a interferecircncia do anticorpo ligado
a hemaacutecia
224 Testar o eluato das amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA
225 Verificar se houve destruiccedilatildeo dos antiacutegenos eritrocitaacuterios apoacutes o tratamento
com glicina-aacutecidaEDTA e com cloroquina
226 Verificar se o tempo de execuccedilatildeo da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA descrito
nos textos de referecircncia eacute reprodutiacutevel
21
3 JUSTIFICATIVA
Algumas condiccedilotildees cliacutenicas podem levar ao depoacutesito ldquoin vivordquo de anticorpos eou
fraccedilotildees do complemento sobre as hemaacutecias Entre elas estatildeo as reaccedilotildees hemoliacuteticas poacutes-
transfusionais a doenccedila hemoliacutetica perinatal o uso de medicamentos e principalmente a
AHAI Na AHAI um anticorpo normalmente da classe IgG ou IgM reconhece antiacutegenos
proacuteprios na membrana eritrocitaacuteria e reduz a sobrevida da hemaacutecia levando a sua destruiccedilatildeo
pelos macroacutefagos no sistema reticulo-endotelial ou agrave ativaccedilatildeo do complexo de ataque agrave
membrana e agrave lise intravascular Os autoanticorpos satildeo voltados na maioria das vezes contra
antiacutegenos eritrocitaacuterios de alta frequecircncia populacional conhecidos como antiacutegenos puacuteblicos
e por este motivo reconhecem tanto hemaacutecias autoacutelogas quanto alogecircnicas
Devido agrave presenccedila do autoanticorpo livre no plasma e tambeacutem do anticorpo eou
complemento ligado agrave hemaacutecia o banco de sangue pode encontrar dificuldades em todas as
fases dos testes preacute-transfusionais do paciente com AHAI e deve utilizar teacutecnicas que
auxiliem na escolha do melhor hemocomponente melhorando a seguranccedila transfusional Essas
teacutecnicas visam remover a interferecircncia do autoanticorpo livre no soro e do autoanticorpo
ligado agrave hemaacutecia permitindo a detecccedilatildeo de aloanticorpos associados e a realizaccedilatildeo da
fenotipagem eritrocitaacuteria respectivamente
A finalizaccedilatildeo dos testes preacute-tranfusionais na presenccedila de autoanticorpo pode levar
algumas horas e nem sempre o paciente poderaacute aguardar Nesse contexto torna-se vantajosa a
aplicaccedilatildeo de teacutecnicas de raacutepida execuccedilatildeo
O presente estudo propotildee aplicar e avaliar a eficaacutecia da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
em remover os anticorpos ligados agrave hemaacutecia o que permite a fenotipagem eritrocitaacuteria
estendida e a seleccedilatildeo de concentrados de hemaacutecias com mesmo fenoacutetipo do paciente
Atualmente no Hemocentro de Ribeiratildeo Preto a teacutecnica utilizada para esse fim eacute o
tratamento das hemaacutecias com difosfato de cloroquina cujo tempo de execuccedilatildeo pode demorar
ateacute duas horas enquanto a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser realizada em apenas dois
minutos o que a tornaria opccedilatildeo de escolha especialmente em situaccedilotildees de urgecircncia Ao
contraacuterio da cloroquina a glicina-aacutecidaEDTA permite tambeacutem o estudo do eluato das
hemaacutecias tratadas
22
4 METODOL OGIA
41 AMOSTRAS DE DOADORES
Foram coletados 50 amostras de doadores de sangue que compareceram ao
Hemonuacutecleo de Araccedilatuba no periacuteodo de junho a agosto de 2016 Foram convidados a
participar da pesquisa doadores de repeticcedilatildeo do tipo sanguiacuteneo ldquoOrdquo RhD positivo
cadastrados no sistema de banco de sangue (SBS) do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto
Todos os doadores que concordaram em participar da pesquisa assinaram o termo de
consentimento livre e esclarecido (TCLE)
No momento da doaccedilatildeo foram coletados adicionalmente 5 mL de sangue total em
soluccedilatildeo anticoagulante EDTA (aacutecido dietilenoaminoaceacutetico) dispensando punccedilatildeo venosa
adicional para coleta da amostra O fluxograma 1 resume as etapas desenvolvidas no projeto
Fluxograma 1 - Fluxo da pesquisa utilizando as amostras de doadores
23
411 FENOTIPAGEM
Foram verificados se os doadores jaacute tinham fenotipagem para outros sistemas de
grupos sanguiacuteneos aleacutem do sistema ABORh que eacute realizado rotineiramente
A fenotipagem eritrocitaacuteria para outros sistemas ou fenotipagem estendida eacute realizada
para identificar a presenccedila ou ausecircncia de antiacutegenos considerados de importacircncia cliacutenica No
Hemonuacutecleo de Araccedilatuba uma parcela de doadores de repeticcedilatildeo satildeo fenotipados para os
antiacutegenos dos sistemas de grupo sanguiacuteneo Rh (antiacutegenos C c E e e) Kell (antiacutegeno K)
Duffy (antiacutegenos Fya e Fy
b) Kidd (antiacutegenos Jk
a e Jk
b) e sistema MNSs (antiacutegenos S e s)
A fenotipagem para o Rh e Kell eacute realizada por metodologia de microplaca utilizando
25 microL de hemaacutecia lavada e diluiacuteda a 5 em salina e 25 microL do antissoro comercial especiacutefico
A reaccedilatildeo eacute incubada 15 minutos a temperatura ambiente e centrifugadas para leitura Para os
antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s a metolodogia utilizado eacute gel contendo antiglobulina
humana (gel LissCoombs poliespeciacutefico) da marca BIO-RAD onde se utiliza suspensatildeo de
hemaacutecia em LISS (Soluccedilatildeo de baixa forccedila iocircnica) A suspensatildeo eacute preparada atraveacutes da
diluiccedilatildeo de 10 microL de hemaacutecia em 1000 microL de LISS Pipetado 50 microL dessa diluiccedilatildeo no gel e
adicionado 25 microL do antissoro especiacutefico Incuba-se em banho seco por 15 minutos a 37 deg
Celsius e eacute centrifugado em centriacutefuga especiacutefica Os antissoros utilizados eram das marcas
Fresenius e Lorne
Foi verificado a fenotipagem do doador no banco de dados do Hemocentro Os
registros dos fenoacutetipos dos doadores ficam armazenadas no sistema de banco de sangue
(SBS) Para doadores que natildeo tinham fenotipagem estendida preacutevia para antiacutegenos do sistema
Rh (C c E e e) e Kell (K) foi realizada a fenotipagem para esses antiacutegenos
O tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA e cloroquina para dissociar
anticorpos pode inativar enfraquecer ou destruir os antiacutegenos presentes nas hemaacutecias
alterando assim os resultados da fenotipagem Para verificar se houve destruiccedilatildeo dos
antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a e Jk
b S e s nas amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes
tratamento foram novamente fenotipadas ao final para os antiacutegenos que eram inicialmente
positivas
A repeticcedilatildeo da fenotipagem foi realizada nas amostras que apresentaram efetividade
no tratamento da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eou da cloroquina e a detecccedilatildeo do antiacutegeno
na amostra preacute-tratamento
24
412 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS HEMAacuteCIAS
As hemaacutecias foram sensibilizadas com antissoros policlonais humanos de amostras de
plasma fresco congelado de doadores com resultado de pesquisa de anticorpo irregular
positivos
A escolha do anticorpo para sensibilizar as hemaacutecias foi definida de acordo com o
fenoacutetipo do doador que deveria ser positivo para o respectivo antiacutegeno
Para a sensibilizaccedilatildeo um volume de antissoro (1 mL) e um volume (1 mL) de
hemaacutecias lavadas quatro vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica foram adicionadas a um tubo de 12 x
75 mm A mistura foi homogeneizada e incubada em banho maria (BM) a 37deg C por 60
minutos A seguir as hemaacutecias foram novamente lavadas 4 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica
para retirada dos anticorpos que natildeo se ligaram A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada
como controle negativo O teste da uacuteltima lavagem eacute importante para assegurar que os
anticorpos que poderatildeo ser detectados no eluato apoacutes o tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA
sejam aqueles que estavam ligados agraves hemaacutecias e natildeo aqueles livres no plasma O controle
negativo mostra que todo o anticorpo livre foi retirado (LEGER 2011)
Para o teste de presenccedila de anticorpo na soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foram incubadas
com hemaacutecias de triagem de anticorpos irregulares (ID-Diacell BIO-RAD) contendo os
antiacutegenos especiacuteficos Realizado a teacutecnica em gel LissCoombs com anti-IgG+C3d Incubado
no tempo de 15 minutos a temperatura de 37deg C e centrifugado 10 minutos em centriacutefuga
proacutepria
As 50 amostras de doadores foram sensibilizadas com os anticorpos policlonais
humanos
Apoacutes sensibilizadas rdquoin vitrordquo e lavadas as hemaacutecias foram diluiacutedas em soluccedilatildeo de
baixa forccedila iocircnica (LISS) na quantidade de 10 microL de hemaacutecia para 1000 microL de soluccedilatildeo A
suspensatildeo foi pipetada (50 microL) em coluna-gel-teste LissCoombs (BIO-RAD) que contecircm
antiglobulina poliespeciacutefico (IgG+C3d) e centrifugada em baixa rotaccedilatildeo conforme orientaccedilatildeo
do fabricante durante 10 minutos
As amostras deveriam apresentar aglutinaccedilatildeo com reatividade 3 a 4+ no TDA As
amostras que apresentaram reaccedilatildeo menor que 3+ foram novamente sensibilizadas com nova
aliacutequota do antissoro
25
413 TRATAMENTO DAS AMOSTRAS
As amostras sensibilizadas apresentando o TDA positivo 3 ou 4+ foram divididas em
duas aliacutequotas e submetidas a duas teacutecnicas diferentes com o objetivo de dissociar o anticorpo
ligado Uma aliacutequota da amostra foi tratada com soluccedilatildeo de difosfato de cloroquina enquanto
a outra aliacutequota foi tratada com glicina-aacutecidaEDTA
42 PREPARO DA GLICINA AacuteCIDA-EDTA
A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA utiliza 3 soluccedilotildees diferentes a glicina aacutecida o
EDTA e o tampatildeo TRIS
Os reagentes foram preparados utilizando os sais para anaacutelise (PA) de EDTA
(Na2EDTA2H2O) TRIS (C4H11NO3) Glicina (H2NCH2CO2H) NaCl e a soluccedilatildeo de aacutecido
cloriacutedrico (HCl) 12 N todos reagentes da marca SYNTH (quadro 1)
Para o preparo do tampatildeo glicina-acida eacute necessaacuterio o ajuste do pH para 15 Para esse
ajuste utiliza-se aacutecido cloriacutedrico (HCl) concentrado O pH foi medido com fitas reativas de pH
com escala de 1 a 14 da marca MERCK Posteriormente a soluccedilatildeo foi enviada ao laboratoacuterio
de controle de qualidade do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto e o pH medido no peagacircmetro O
tampatildeo glicina-aacutecida foi armazenado a 4deg e o tampatildeo tris e o EDTA em temperatura ambiente
controlada (20 a 24deg Celsius)
Apoacutes o preparo e durante a realizaccedilatildeo dos testes foram feitas inspeccedilotildees visuais para
verificaccedilatildeo de turvaccedilatildeo do meio e presenccedila de precipitados
Reagente Material Quantidade Preparo e
Conservaccedilatildeo
EDTA
EDTA
(Na2EDTA2H2O)
5 gramas Mistura ateacute
dissoluccedilatildeo do sal e
conserva em
temperatura ambiente Aacutegua Destilada 50 Ml
Tris
TRIS (C4H11NO3) 121 gramas Conservar em
temperatura ambiente NaCl 525g
Aacutegua destilada 100ml
Gliacutecina-aacutecida
Glicina
(H2NCH2CO2H) 15 gramas
Conservar a 4oC NaCl 116gramas
Aacutegua Destilada 200ml
HCL 12N Ajutar o pH para 15
Quadro 1 - Preparo dos Reagentes da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
Fonte - Manual teacutecnico AABB 2011
26
O tampatildeo glicina-aacutecida e o tampatildeo TRIS satildeo estaacuteveis por 7 meses O reagente EDTA
precipitou mesmo estando em temperatura em ambiente controlado Houve necessidade de
preparo de novo reagente
421 TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
1 Em um tubo de ensaio 12x75 mm eacute adicionado 08 mL da soluccedilatildeo de glicina-aacutecida A
esta soluccedilatildeo adiciona-se 02 mL de EDTA e mistura
2 Adiciona-se 02 mL de hemaacutecias sensibilizadas (lavada 4 vezes) A mistura eacute
homogeneizada e incubada por exatamente 2 minutos
3 A seguir 01 mL de tampatildeo TRIS eacute adicionado agrave mistura que eacute novamente
homogeneizada e centrifugada por 2 minutos a 3400 rpm O pH deve estar entre 7 a 75
4 Apoacutes centrifugaccedilatildeo separa-se em outro tubo o sobrenadante (eluato) e as hemaacutecias
que permanecem satildeo lavadas 4 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica para retirada de todo o
reagente e anticorpos livres
43 PREPARO DA CLOROQUINA
A cloroquina eacute diluiacuteda em tampatildeo PBS na concentraccedilatildeo de 20 (Quadro 2) e
armazenado a 4deg Celsius sua validade apoacutes o preparo eacute de 1 mecircs
A teacutecnica da cloroquina jaacute estaacute padronizada para rotina do laboratoacuterio de
imunohematologia do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto e suas unidades
Reagente Reagentes Quantidade PreparoConservaccedilatildeo
Cloroquina
Difosfato de cloroquina
(C18H32ClN3O8P2)
20 gramas
Conservar a 4deg Celsius
Tampatildeo PBS 100ml
NaOH 01 N Acertar o pH para
51
Quadro 2 - Preparo da Cloroquina Fonte - Manual teacutecnico da AABB 2011
431 TEacuteCNICA DA CLOROQUINA
1 4 partes da soluccedilatildeo pronta eacute adicionada a uma parte de hemaacutecias lavadas 4 vezes com
soluccedilatildeo fisioloacutegica
2 A mistura eacute incubada em temperatura ambiente por ateacute duas horas
3 Centrifugar a 3400 rpm por 2 minutos
27
4 Remover o sobrenadante lavar as hemaacutecias novamente com soluccedilatildeo fisioloacutegica 4
vezes
44 VERIFICACcedilAtildeO DA EFETIVIDADE DOS TESTES
Apoacutes tratamento pelas duas teacutecnicas o TDA foi repetido em todas as amostras para
verificar se os tratamentos foram efetivos e houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo Para as
amostras tratadas pela teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA que permaneceram com TDA positivo
novo tratamento foi realizado
45 TESTE DO ELUATO
O eluato resultante das amostras tratadas com glicina-acidaEDTA foi testado com
hemaacutecias de triagem A soluccedilatildeo do eluato foi incubada com as hemaacutecias de triagem de
anticorpos (ID-Diacell BIO-RAD) pela teacutecnica em gel LissCoombs O teste foi incubado 15
minutos a 37deg Celsius e centrifugado por 10 minutos em centrifuga proacutepria para a teacutecnica em
gel Os eluatos que apresentaram resultados positivos foram testados em painel de 11
hemaacutecias (ID-Diapanel BIO-RAD) para a identificaccedilatildeo do anticorpo
46 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente que apresentou TDA positivo por IgG e pesquisa
de anticorpo irregular positivo com presenccedila de autoanticorpo com reatividade panaglutinina
A amostra foi tratada em paralelo pelas duas teacutecnicas descritas e foi enviada para o
Hemocentro para genotipagem eritrocitaacuteria que foi realizado por metodologia PCR em tempo
real no equipamento Real-time system PCR 7500 ( Applied Biosystems Califoacuternia EUA)
28
5 RESULTADOS
51 REAGENTES
Para aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA satildeo necessaacuterios 3 diferentes
reagentes que podem ser encontrados em forma de kit pronto para uso No entanto esses kits
natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil Os reagentes satildeo tampatildeo glicina-aacutecida o EDTA e o tampatildeo
Tris
Todos os reagentes foram preparados rdquoin houserdquo a partir dos sais e soluccedilotildees PA (puro
para anaacutelise) da marca SYNTH que foram adquiridos para a pesquisa O custo estimado para
cada teste foi aproximadamente R$ 020 reais
Apoacutes o preparo os reagentes poderiam ser armazenados em condiccedilotildees adequadas pelo
periacuteodo de 1 ano (AABB 2011) Ao final do preparo e durante o periacuteodo de armazenamento
de fevereiro a setembro de 2016 foi realizada inspeccedilatildeo visual para verificar a presenccedila de
precipitados ou turvaccedilatildeo A soluccedilatildeo de glicina e o tampatildeo TRIS mostraram-se estaacuteveis ateacute o
final do periacuteodo Por sua vez o reagente EDTA precipitou mesmo estando armazenado em
temperatura ambiente controlada e foi necessaacuterio novo preparo
52 AMOSTRAS DE DOADORES
521 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS AMOSTRAS
Apoacutes incubaccedilatildeo da hemaacutecia com o antissoro a mesma foi lavada 4 vezes para retirada
dos anticorpos livres A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada Caso houvesse positividade na
soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem a etapa era repetida (figura 3) Das 50 amostras sensibilizadas a
uacuteltima lavagem foi positiva somente em 3 delas Nas 3 amostras o anticorpo utilizado para
sensibilizaccedilatildeo foi o anti-K Apoacutes repetido nova etapa de lavagem os resultados se
apresentaram negativos
Em todas as amostras sensibilizadas ldquoin vitrordquo o TDA foi testado e verificado a
intensidade do teste Entre as 50 amostras 47 alcanccedilaram TDA com intensidade 3-4+ apoacutes a
primeira sensibilizaccedilatildeo enquanto 3 amostras necessitaram uma segunda incubaccedilatildeo com
anticorpo (figura 4)
A escolha dos anticorpos para sensibilizar as hemaacutecias foi feita de acordo com o
fenoacutetipo do doador e foram utilizados sete diferentes especificidades de anticorpos policlonais
humanos conforme mostra o graacutefico1
29
Figura 3 - Soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada com hemaacutecia de triagem de
anticorpos em gel LissCoombs (BIO-RAD) A finalidade eacute verificar a presenccedila de anticorpos livres na
suspensatildeo que possam interferir na pesquisa do eluato As soluccedilotildees de lavagem das amostras na figura a tiveram
resultados negativos Na figura b duas amostras a 47 e 50 apresentaram resultado positivo Nova etapa de
lavagem foi realizada e o resultado final foi negativo
522 TRATAMENTO DAS HEMAacuteCIAS
Apoacutes a sensibilizaccedilatildeo e obtenccedilatildeo de resultados de TDA com intensidade de 3 a 4+
cada uma das amostras foi dividida em duas aliacutequotas e tratada separadamente pelas teacutecnicas
de glicinaaacutecida-EDTA e cloroquina
As teacutecnicas foram consideradas efetivas quando obteve-se a completa dissociaccedilatildeo do
anticorpo verificada atraveacutes do TDA negativo na amostra poacutes tratamento conforme figuras 5
e 6 Dentre as amostras tratadas com cloroquina 2850 tiveram o TDA negativado A glicina-
aacutecidaEDTA negativou o TDA em 33 das 50 amostras tratadas Apenas 17 amostras tratadas
com glicina-aacutecidaEDTA permaneceram com o TDA positivo e foram submetidas a um novo
tratamento
30
Figura 4 - TDA das amostras apoacutes sensibilizaccedilatildeo com anticorpos policlonais humanos Amostras na
figura a com intensidades de 3-4+ Na figura b amostras 4 e 7 com intensidade menor que 3+ e portanto foram
novamente sensibilizadas com nova aliacutequota de soro Anti-D e anti-S Apoacutes a segunda sensibilizaccedilatildeo
apresentaram reatividade 4 e 3+ respectivamente Os anticorpos utilizados para sensibilizaccedilatildeo foram D S c E
C e K
523 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS TEacuteCNICAS
No tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA houve dissociaccedilatildeo completa do anticorpo
em 33 amostras (66) das 50 amostras testadas enquanto que com a cloroquina foram 28
amostras (56) (tabela 1)
31
Graacutefico 1- Nuacutemero de amostras sesnsibilizadas por especificidade de anticorpo Entre as 50 amostras 12
foram sensibilizadas com anti-D 10 com anti-C 9 com anti-E 8 com anti-c 7 com anti-S 3 com anti-K e 1
com anti-Dia As especificidades dos anticorpos foram definidas de acordo o fenoacutetipo do doador
Figura 5 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com cloroquina Nas amostras onde houve
a dissociaccedilatildeo do anticorpo ( 2 21 a 23 26 39 a 42 45 46 e 49) a hemaacutecia se deposita no fundo no microtubo
apoacutes a centrifugaccedilatildeo (TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (1 3 24 25 43 44 47
48 e 50) o anticorpo ligado agraves hemaacutecias eacute alvo da AGH presente no gel (TDA positivo)
Anti-D 12
Anti-C 10
Anti-E 9
Anti-c 8
Anti-S 7
Anti-K 3 Anti-Dia 1
32
Figura 6 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA Nas amostras
onde houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo (4 6 7 12 a 15 17 34 35 37 e 38) a hemaacutecia se deposita no fundo no
microtubo apoacutes a centrifugaccedilatildeo ( TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (5 16 18
19 20 33 e 36 ) o AGH presente no gel se liga ao anticorpo ligado agraves hemaacutecias que ficam retidas no gel (TDA
positivo)
Tabela 1-Resultado geral do tratamento das hemaacutecias com glicina e cloroquina
Teacutecnica utilizada TDA negativo TDA positivo Total
Glicina-aacutecidaEDTA 33 17 50
Cloroquina 28 22 50
A glicina-aacutecidaEDTA conseguiu negativar mais amostras sensibilizadas com Anti-D
e anti-K que a cloroquina Para as hemaacutecias sensibilizadas com anti-E Anti-S e Anti-Dia
ambas as teacutecnicas dissociaram o anticorpo em 100 das amostras Os resultados detalhados
por especificidade do anticorpo apoacutes o primeiro tratamento com glicina-aacutecidaEDTA e com
cloroquina estatildeo na tabela 2
Para as amostras que permaneceram positivas (17 amostras) apoacutes o tratamento com a
glicina-aacutecidaEDTA foi realizado um novo tratamento Houve dissociaccedilatildeo do anticorpo em 3
amostras (18) apoacutes a segunda tentativa Nas demais 14 (82) amostras tratadas pela
segunda vez 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise
33
Tabela 2 - Resultados do TDA apoacutes tratamento das hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo
sensibilizado
ANTICORPOS
SENSIBILIZADOS
1ordm TRATAMENTO COM
GLICINA
TRATAMENTO COM
CLOROQUINA
TOTAL TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
Anti-D 8 4 0 12 12
Anti-C 6 4 10 0 10
Anti-E 9 0 9 0 9
Anti-c 0 8 1 7 8
Anti-S 7 0 7 0 7
Anti-K 2 1 0 3 3
Anti-Dia 1 0 1 0 1
TOTAL 33 17 28 22 50
A hemoacutelise foi verificada durante o procedimento de lavagem final das hemaacutecias com
soluccedilatildeo fisioloacutegica para a retirada dos reagentes As soluccedilotildees de lavagem ficaram
avermelhadas e as hemaacutecias com coloraccedilatildeo escura As amostras foram descartadas Dentre as
6 amostras que ainda puderam ser testadas para o TDA trecircs amostras negativaram sendo 1
sensibilizada com anti-D e 2 com anti-C (tabela 3)
Tabela 3 - Resultado apoacutes o segundo tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA
Tratamento com
glicina-aacutecidaEDTA
TDA Negativo TDA Positvo Hemoacutelise Total
Segundo tratamento 3 3 11 17
524 TESTAGEM DO ELUATO
Apoacutes o tratamento com a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA a soluccedilatildeo do eluato foi
testada para verificar a viabilidade dos anticorpos que foram dissociados ou eluiacutedos Dentre
as 50 amostras 41 apresentaram eluato positivo As nove amostras cujos eluatos foram
negativos haviam sido sensibilizadas com as seguintes especificidades de anticorpos anti-E 6
amostras (67) anti-S 2 amostras (40) e anti-D 1 amostra (8) (tabela 4) O eluato de
todas as amostras sensibilizadas com os anticorpos anti-C anti-c Anti-K e Anti-Dia foram
positivos Os eluatos positivos na triagem de anticorpos foram testados com paineacuteis de
identificaccedilatildeo para confirmar a especificidade e a viabilidade dos anticorpos (figuras 7 e 8)
34
525 EFEITO DA ELUICcedilAtildeO SOBRE OS ANTIacuteGENOS ERITROCITAacuteRIOS
Para verificar o efeito do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA e com a cloroquina
sobre a expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s foi realizada a fenotipagem das
amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes tratamento com ambas as teacutecnicas Foi avaliado
se o tratamento destruiu os antiacutegenos expressos antes do tratamento
Tabela 4- Resultado do Eluato das amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA
Anticorpos Eluato positvo Eluato negativo Total
Anti-D 11 1 12
Anti-C 10 0 10
Anti-E 3 6 9
Anti-c 8 0 8
Anti-S 5 2 7
Anti-K 3 0 3
Anti-Dia 1 0 1
Total 41 9 50
Figura 7 ndash Painel do eluato da amostra 21 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-C que foi
recuperado no eluato
Figura 8 ndash Painel do eluato da amostra 47 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-K que foi
recuperado no eluato
35
Dentre as 50 amostras 26 eram previamente fenotipadas para os antiacutegenos Fya Fy
b
Jka Jk
b S e s Dentre elas 20 alcanccedilaram TDA negativo apoacutes tratamento com a glicina-
aacutecidaEDTA e 20 negativaram apoacutes tratamento com cloroquina (tabela 5) Apoacutes ambas as
teacutecnicas os antiacutegenos originalmente expressos permaneceram positivos comprovando que natildeo
houve destruiccedilatildeo dos mesmos
Tabela 5 ndash Verificaccedilatildeo da interferecircncia do tratamento da hemaacutecias com cloroquina e glicina-
aacuteicdaEDTA sobre os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
AMOSTRAS
COM
FENOTIPAGEM
PREacuteVIA
TRATADAS COM
CLOROQUINA
TRATADAS COM
GLICINA
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
26
20
20
20
20
As amostras 24 47 e 50 eram positivas para o antiacutegeno K A cloroquina natildeo dissociou
o anticorpo em nenhuma das 3 amostras enquanto a glicina-aacutecidaEDTA foi efetiva nas
amostras 24 e 50 Foi testada a expressatildeo do antiacutegeno K nas amostras 24 e 50 apoacutes o
tratamento utilizando meacutetodo indireto em gel contendo AGH Apesar de natildeo ter sido avaliado
a intensidade de reaccedilatildeo de expressatildeo dos antiacutegenos podemos verificar na figura 9 que nas
duas amostras em que a teacutecnica foi efetiva e dissociou o anticorpo a expressatildeo do antiacutegeno K
continua presente mas a reatividade observada pode ser considerada 1+ sugerindo que houve
diminuiccedilatildeo da expressatildeo do antiacutegeno quando comparado com a expressatildeo observada em
hemaacutecia natildeo tratada
Os resultados individuais de cada amostra em ambas as teacutecnicas encontram-se
resumidas na tabela 6
526 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente onde foi constatada a presenccedila de autoanticorpo
a quente da classe IgG pelo TDA monoespeciacutefico (figura 10)O autoanticorpo tambeacutem
interferia na pesquisa e identificaccedilatildeo de anticorpos irregulares pois apresentava caracteriacutestica
de panaglutinina As hemaacutecias da paciente sensibilizadas ldquoin vivordquo foram tratadas com
cloroquina e com glicina-aacutecidaEDTA
36
Figura 9 ndash Fenotipagem das amostras 24 e 50 para antiacutegeno K apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
O teste positivo indica a presenccedila do antiacutegeno poreacutem a reatividade fraca (1+) sugere que houve enfraquecimento
de sua expressatildeo A direita a expressatildeo forte (4+) do antiacutegeno Kell em hemaacutecia controle natildeo tratada utilizada
como controle positivo
A cloroquina natildeo foi efetiva na retirada do anticorpo ligado as hemaacutecias ao contraacuterio
do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA que dissociou o anticorpo (figura 11)
A hemaacutecia tratada com glicina foi fenotipada para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
(figura 12) A fenotipagem para o sistema Rh (C c E e e) e Kell foi realizada em gel
especiacutefico monoclonal sem interferecircncia do TDA positivo (controle da reaccedilatildeo negativo)
O eluato resultante do tratamento com glicina-aacutecidaEDTA foi testada em gel com
hemaacutecias de painel de identificaccedilatildeo de anticorpos e apresentou resultado positivo com todas
as ceacutelulas (figura 13 e 14)
A amostra foi enviada para genotipagem e o resultado da genotipagem confirmou o
resultado da fenotipagem apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
527 TEMPO DE EXECUCcedilAtildeO DA TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
O tempo de reaccedilatildeo da glicina-aacutecidaEDTA eacute de 2 minutos Todas as amostras foram
tratadas obedecendo ao tempo descrito na literatura demonstrando que o mesmo eacute
reprodutiacutevel
37
Tabela 6- Resultados individuais por amostra
Amostra Especificidade
dos anticorpos
Intensidade do
TDA apoacutes
sensibilizaccedilatildeo
Tratamento
efetivo com
cloroquina
Tratamento
efetivo com
glicina
Eluato
poacutes
glicina
1 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 2 Dia 3+ Sim Sim 3+ 3 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 4 D 4+ Natildeo Sim 4+ 5 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 6 E 3+ Sim Sim Negativo 7 S 4+ Sim Sim 3+ 8 E 3+ Sim Sim 1+ 9 E 3+ Sim Sim 2+
10 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 11 D 4+ Natildeo Sim 4+ 12 D 4+ Natildeo Sim 4+ 13 S 3+ Sim Sim 3+ 14 S 3+ Sim Sim 3+ 15 D 3+ Natildeo Sim 3+ 16 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 17 E 3+ Sim Sim (+) 18 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 19 D 4+ Natildeo Natildeo 3+ 20 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 21 C 3+ Sim Sim 4+ 22 C 3+ Sim Sim 4+ 23 C 3+ Sim Sim 4+ 24 K 4+ Natildeo Sim 4+ 25 D 3+ Natildeo Natildeo Negativo 26 E 4+ Sim Sim Negativo 27 S 3+ Sim Sim 3+ 28 C 3+ Sim Natildeo 4+ 29 C 3+ Sim Sim 4+ 30 C 3+ Sim Sim 4+ 31 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 32 E 3+ Sim Sim Negativo 33 C 3+ Sim Natildeo 4+ 34 S 3+ Sim Sim Negativo 35 S 3+ Sim Sim Negativo 36 C 4+ Sim Natildeo 4+ 37 c 4+ Natildeo Natildeo 4+ 38 D 4+ Natildeo Sim 4+ 39 S 3+ Sim Sim 3+ 40 c 4+ Sim Natildeo 2+ 41 C 4+ Sim Natildeo 4+ 42 E 3+ Sim Sim Negativo 43 D 3+ Natildeo Sim 2+ 44 D 3+ Natildeo Sim 2+ 45 E 3+ Sim Sim Negativo 46 C 3+ Sim Sim 4+ 47 K 4+ Natildeo Natildeo 4+ 48 D 3+ Natildeo Sim 2+ 49 E 3+ Sim Sim Negativo 50 K 4+ Natildeo Sim 4+
TOTAL 50 28 33 41
38
Figura 10 ndash TDA monoespeciacutefico da amostra de paciente Hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo da classe
IgG
oacute Figura 11 ndash TDA apoacutes o tratamento com glicina-aacutecidaEDTA (esquerda) e cloroquina (direita) A glicina
negativou completamente o TDA enquanto a hemaacutecia tratada com cloroquina persistiu positiva (1+)
39
Figura 12 ndash Fenotipagem da amostra tratada com glicina-aacutecidaEDTA Fy(a+b+) Jk(a-b+) S+s+
Figura 13 ndash Painel em gel (LissAGH) do eluato apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de
intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
Figura 14 ndash ndash Painel ezimaacutetico (hemaacutecias tratadas com bromelina) do eluato em gel neutro apoacutes
tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
40
528 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Quanto a efetividade das teacutecnicas em negativar o TDA foi verificado que a glicina-
aacutecidaEDTA foi efetiva em 66 das amostras testadas no primeiro tratamento (3350
amostras) enquanto a cloroquina conseguiu negativar 56 (2850) Esses resultados natildeo
apresentam diferenccedila significativa (pgt005) demostrando que a teacutecnica da glicina-
aacutecidaEDTA natildeo eacute superior mas eacute tatildeo efetiva quanto a da cloroquina
Quando aliamos os resultados de ambas as teacutecnicas verificamos que em 76 (3850)
das amostras o TDA foi negativado Esse dado indica que ainda que uma teacutecnica natildeo seja
eficaz na remoccedilatildeo do anticorpo eacute uma boa alternativa tentar a segunda teacutecnica jaacute que a falha
em remover o anticorpo utilizando uma delas natildeo prevecirc necessariamente a falha com a outra
Quando se utiliza o teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla (graacutefico 2) para comparar a utilizaccedilatildeo das
duas teacutecnicas com o resultado de cada uma isolada (somente a cloroquina ou somente a
glicina) verificamos que os resultados apresentam diferenccedila significativa (plt005) (quadro 3)
TRATAMENTO EFETIVO COM TOTAL PORCENTAGEM
Glicina ou cloroquina 38 76
Glicina e cloroquina 23 46
Glicina apenas 10 20
Cloroquina apenas 5 10
Nenhuma das teacutecnicas 12 24
Quadro 3 - Resultados comparativos entre as teacutecnicas utilizadas
41
Graacutefico 2 - Teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla entre as teacutecnicas aplicadas A- Glicina e Cloroquina B-Cloroquina C-
Glicina ( plt005)
42
6 DISCUSSAtildeO
Os reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA podem ser adquiridos em
forma de kit comercial prontos para uso poreacutem natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil A preparaccedilatildeo
dos reagentes ldquoin houserdquo a partir de sais comerciais adquiridos se mostrou viaacutevel Os
reagentes glicina e o tampatildeo Tris armazenados de forma correta se mantiveram estaacuteveis por
um periacuteodo de 7 meses Somente o reagente EDTA precipitou mesmo armazenado em
condiccedilotildees adequadas sugerindo que o mesmo deve ser preparado em menor quantidade e
armazenado em aliacutequotas A soluccedilatildeo de cloroquina tambeacutem pode ser preparada ldquoin houserdquo e
pode ser armazenado por um mecircs A legislaccedilatildeo brasileira autoriza a utilizaccedilatildeo de reagentes
preparados a partir de sais comerciais como a cloroquina e a glicina-aacutecidaEDTA desde que
os sais tenham autorizaccedilatildeo da vigilacircncia sanitaacuteria para a comercializaccedilatildeo (BRASIL 2001)
A comparaccedilatildeo quanto a efetividade em dissociar anticorpos em amostras com TDA
positivos entre a teacutecnica da glicina e a teacutecnica da cloroquina mostrou que natildeo haacute diferenccedila
estatiacutestica entre elas e que ambas satildeo igualmente eficientes Se utilizadas conjuntamente haacute
maior possibilidade de elucidaccedilatildeo dos casos
Uma vantagem da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eacute que ela permite numa mesma
amostra eluir o anticorpo ligado aacute hemaacutecia assim como fenotipar a hemaacutecia tratada Devido a
sua dupla utilidade a teacutecnica eacute vantajosa principalmente em pacientes em que pouco volume
de amostra pode ser coletado como em casos de crianccedilas e receacutem-nascidos
A fenotipagem poacutes tratamento se mostrou viaacutevel jaacute que os antiacutegenos de maior
importacircncia natildeo sofreram alteraccedilotildees Nas 20 amostras que foram fenotipadas antes e apoacutes
tratamento para verificar a influecircncia dos reagentes na expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a
Jkb S e s natildeo houve destruiccedilatildeo dos mesmos por nenhuma das duas teacutecnicas
Para as amostras positivas para o antiacutegeno Kell (350) e sensibilizadas com o
respectivo anticorpo a teacutecnica da glicina foi efetiva em negativar o TDA em apenas duas
delas mas apoacutes o tratamento foi verificada uma fraca reatividade da reaccedilatildeo antiacutegeno-
anticorpo sugerindo que houve um enfraquecimento da expressatildeo do antiacutegeno conforme
esperado e descrito na literatura (BYRNE 1991 PALLAS WILER E MCGEE 1991
ROZIERS e SQUALI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012 e KATHARIA e
CHAUDHARY 2013) A accedilatildeo da glicina sobre o antigeno Kell natildeo representa impedimento
para seu uso uma vez que na impossibilidade de testar o antiacutegeno Kell o banco de sangue
consegue facilmente atender a solicitaccedilatildeo de transfusatildeo com unidades de hemaacutecias Kell
43
negativas jaacute que eacute um antiacutegeno de baixa prevalecircncia na populaccedilatildeo variando de 15 na
populaccedilatildeo africana a 9 nos europeus (DANIELS 2011)
A soluccedilatildeo resultante da dissociaccedilatildeo do anticorpo pela teacutecnica da glicina pode ainda ser
utilizada como eluato podendo substituir a teacutecnica de eluiccedilatildeo com reagentes comercias (kits
de eluiccedilatildeo aacutecida) que tem alto custo aproximadamente entre R$2000 a R$2500 por teste
Em 41 amostras (82) houve a dissociaccedilatildeo e recuperaccedilatildeo do anticorpo que estava
sensibilizando as hemaacutecias Em 9 amostras (18) os anticorpos foram eluiacutedos poreacutem
apresentaram reaccedilatildeo negativa quando testadas com hemaacutecias de triagem entre eles o anti-E
(6) anti-S (2) e Anti-D (1) Eacute possiacutevel que a correccedilatildeo pH do meio (WALKER 2011) natildeo
tenha sido adequada o que pode ter desfavorecido a reatividade do anticorpo
Para as amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA nas quais natildeo houve dissociaccedilatildeo do
anticorpo pelo primeiro tratamento (1750) o segundo tratamento natildeo se mostrou eficaz jaacute
que 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise O tempo de
armazenagem natildeo parece ter influenciado jaacute que todas as amostras foram testadas dentro de
48 horas apoacutes a coleta Outros fatores que natildeo foram verificados podem ter levado a
hemoacutelise Apesar da literatura (LOUIE JIENG e ZEROULIS 1986 e BYRNE 1991)
recomendar um segundo tratamento ele eacute pouco eficaz tendo negativado apenas 3 das 17
amostras testadas
A amostra de paciente que apresentou sensibilizaccedilatildeo ldquoin vivordquo mostrou melhor
efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA sobre a da cloroquina possibilitando
fenotipagem para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s que natildeo foram destruiacutedos apoacutes o
tratamento comprovado atraveacutes da genotipagem
A presenccedila de autoanticorpo a quente com presenccedila de hemoacutelise (AHAI) ou natildeo pode
mascarar a presenccedila de aloanticorpo interferindo na rotina soroloacutegica da fenotipagem que eacute
uma importante ferramenta para auxiliar na seleccedilatildeo de hemaacutecias para transfusatildeo (SHIREY et
al 2002) Esses pacientes frequentemente possuem aloanticorpos associados ao
autoanticorpo e a prevalecircncia de aloimunizaccedilatildeo entre eles varia entre 12 a 40 (LEGER e
GARRATY 1999 BRANCH e PETZ 1999) o que dificulta ainda mais a escolha do melhor
componente a ser transfundido aleacutem de aumentar a possibilidade reaccedilotildees hemoliacuteticas imunes
poacutes-transfusionais
Nesses casos as teacutecnicas de dissociaccedilatildeo de anticorpos satildeo importantes para tratar
amostras de pacientes e a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser usada como uma opccedilatildeo
pois se mostrou eficaz na dissociaccedilatildeo anticorpo ligado agraves hemaacutecias deixando livre a
superfiacutecie das mesmas permitindo a fenotipagem por antisoros IgG Paralelamente os
44
anticorpos eluiacutedos tambeacutem puderam ser estudados O mesmo natildeo ocorre com a cloroquina
que permite apenas a fenotipagem e tampouco com os kits de eluiccedilatildeo aacutecida disponiacuteveis no
mercado nacional que satildeo destinados a realizaccedilatildeo do eluato mas destroem as hemaacutecias
O tempo de tratamento na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA tambeacutem eacute uma vantagem
pois foi possiacutevel reproduzir no tempo determinado de 2 minutos enquanto a cloroquina
demora ateacute duas horas
Ainda que a aplicaccedilatildeo das teacutecnicas por biologia molecular estejam cada vez mais
presentes na rotina imuno-hematoloacutegica e possibilitam estabelecer o fenoacutetipo deduzido do
genoacutetipo elas natildeo estatildeo disponiacuteveis na maioria dos centros e sua realizaccedilatildeo exige algumas
horas A resoluccedilatildeo imediata do problema transfusional necessita dos resultados soroloacutegicos
pois com frequecircncia natildeo eacute possiacutevel aguardar o resultado do teste molecular Dessa forma
apesar da crescente importacircncia da genotipagem eritrocitaacuteria teacutecnicas soroloacutegicas aplicadas
corretamente e no momento propiacutecio satildeo de grande utilidade para resolver problemas imuno-
hematoloacutegicos como ocorre com a fenotipagem em pacientes com TDA positivo
45
7 CONCLUSAtildeO
A teacutecnica da glicina aacutecidaEDTA mostrou-se efetiva em remover os anticorpos que
sensibilizavam as hemaacutecias e pode ser utilizada com seguranccedila antes da fenotipagem
eritrocitaacuteria Por ser uma teacutecnica de raacutepida execuccedilatildeo eacute uma alternativa aplicaacutevel
principalmente em casos urgentes de pacientes que apresentam autoanticorpos
46
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50
9 ANEXOS
51
FUNDACcedilAtildeO HEMOCENTRO DE RIBEIRAtildeO PRETO
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE)
Tiacutetulo da pesquisa Aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina aacutecida-EDTA e avaliaccedilatildeo da
eficaacutecia no tratamento de hemaacutecias com teste direto da antiglobulina positivo
Pesquisadora responsaacutevel Ceacutelia Kazue Abiko
Orientador Prof Dimas Tadeu Covas
Co-orientadora Dra Flaacutevia Leite Souza Santos
Objetivo da pesquisa Vocecirc estaacute sendo convidado a participar de uma pesquisa que tem
como objetivo padronizar uma nova teacutecnica para auxiliar na tipagem sanguiacutenea de pacientes
A tipagem sanguiacutenea pode sofrer interferecircncia da presenccedila de anticorpos ligados aos gloacutebulos
vermelhos do sangue Nessas situaccedilotildees eacute difiacutecil selecionar o melhor sangue para o paciente e
eacute preciso a utilizaccedilatildeo de teacutecnicas adicionais para remover essas interferecircncias
Esta pesquisa tem como objetivo estudar outra teacutecnica para remover esses anticorpos e
comparaacute-la com a teacutecnica atualmente utilizada Para isso precisamos de amostras de pacientes
e doadores voluntaacuterios
Se vocecirc eacute um doador eacute necessaacuterio que vocecirc autorize a coleta de 5 ml (1 tubo) a mais
de seu sangue
Se vocecirc eacute um paciente natildeo haveraacute necessidade de nova amostra pois utilizaremos as
amostras jaacute coletadas para os testes preacute-transfusionais e os resultados encontrados nesta
pesquisa natildeo iratildeo interferir na escolha da (s) bolsa (s) de sangue que vocecirc possa vir a receber
Se vocecirc concordar em participar leia com atenccedilatildeo o texto abaixo e assine as duas vias
rubricando todas as paacuteginas deste termo de consentimento Uma via original assinada e
rubricada por vocecirc e pela pesquisadora ficaraacute com vocecirc
As suas informaccedilotildees seratildeo mantidas em sigilo pela pesquisadora e natildeo haveraacute
armazenamento de material para pesquisas posteriores Os seus dados seratildeo usados apenas
neste estudo e quando o trabalho for publicado seu nome e qualquer outra informaccedilatildeo que
possam identificaacute-lo natildeo seratildeo revelados
Eacute pouco provaacutevel que o que noacutes aprendermos com este estudo tenha um benefiacutecio
direto para vocecirc assim como natildeo poderemos dar nada em troca pela sua participaccedilatildeo na
pesquisa
Nosso objetivo com esta pesquisa eacute que os resultados poderatildeo ser uacuteteis para o
tratamento de pacientes no futuro Os riscos da participaccedilatildeo satildeo miacutenimos Se vocecirc eacute um
doador de sangue a amostra seraacute coletada no momento da doaccedilatildeo natildeo exigindo punccedilatildeo
venosa adicional
52
Eacute seu direito ter acesso aos resultados dos testes da pesquisa Esses resultados natildeo
seratildeo fornecidos automaticamente a vocecirc mas caso vocecirc se interesse em saber o resultado ou
tiver alguma duacutevida sobre a sua participaccedilatildeo neste estudo deveraacute entrar em contato com Ceacutelia
Kazue Abiko pelo telefone (18) 99718-3551
Vocecirc tem total liberdade de optar por natildeo participar da pesquisa Caso aceite
participar poderaacute desistir a qualquer momento ou retirar seu consentimento mesmo apoacutes ter
coletado o sangue Para cancelar sua participaccedilatildeo basta avisar a pesquisadora e os seus dados
seratildeo retirados do projeto
Qualquer duacutevida eacutetica sobre a pesquisa poderaacute entrar em contato com o Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa do Hospital das Cliacutenicas e da Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto
(CAMPUS UNIVERSITAacuteRIO bairro Monte Alegre CEP 14048-900 Ribeiratildeo Preto-SP
Telefone (16) 3602-2228 FAX (16) 3633-1144 e-mail cephcrpuspbr)
Consentimento de participaccedilatildeo
A Consentimento do participante
Li as informaccedilotildees acima sobre o estudo e recebi explicaccedilotildees sobre a participaccedilatildeo no estudo
Portanto dou o meu consentimento para participar do estudo
___________________________________________________________________________
Nome completo
___________________________________________________________________________
Assinatura
___________
Data
__________________________________________________________________________________
Nome completo da pesquisadora
___________________________________________________________________________
Assinatura
_____________
Data
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 1
11TESTES PREacute-TRANSFUSIONAIS 1
111 TIPAGEM ABORh 2
112 ANTICORPOS ANTI-ERITROCITAacuteRIOS 3
113 PESQUISA E IDENTIFICACcedilAtildeO DE ANTICORPOS IRREGULARES 4
114 PROVA DE COMPATIBILIDADE 5
115 FENOTIPAGEM PARA OUTROS SISTEMAS 6
12 METODOLOGIAS APLICADOS Agrave ROTINA IMUNO-HEMATOLOacuteGICA 7
121 MEacuteTODOS DE FASE FLUacuteIDA 8
122 COLUNAS DE GEL 9
123 BIOLOGIA MOLECULAR 9
13 TESTE DA ANTIGLOBULINA 10
131 TESTE DIRETO DA ANTIGLOBULINA 11
132 TESTE INDIRETO DA ANTIGLOBULINA 12
133 CONDICcedilOtildeES CLIacuteNICAS COM TDA POSITIVO 13
134 ANEMIA HEMOLIacuteTICA AUTOIMUNE 15
135 TRATAMENTO DE HEMAacuteCIAS COM TDA POSITIVO 16
1351 TEacuteCNICA DE BLOQUEIO 17
1352 TRATAMENTO DE HEMAacuteCIAS COM ZZAP 17
1353 CLOROQUINA 17
1353 GLICINA-AacuteCIDAEDTA 18
2 OBJETIVOS 20
21 OBJETIVO GERAL 20
22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 20
3 JUSTIFICATIVA 21
4 METODOL OGIA 22
41 AMOSTRAS DE DOADORES 22
411 FENOTIPAGEM 23
412 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS HEMAacuteCIAS 24
413 TRATAMENTO DAS AMOSTRAS 25
42 PREPARO DA GLICINA AacuteCIDA-EDTA 25
421 TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA 26
43 PREPARO DA CLOROQUINA 26
431 TEacuteCNICA DA CLOROQUINA 26
44 VERIFICACcedilAtildeO DA EFETIVIDADE DOS TESTES 27
45 TESTE DO ELUATO 27
46 AMOSTRA DE PACIENTE 27
5 RESULTADOS 28
51 REAGENTES 28
52 AMOSTRAS DE DOADORES 28
521 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS AMOSTRAS 28
522 TRATAMENTO DAS HEMAacuteCIAS 29
523 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS TEacuteCNICAS 30
524 TESTAGEM DO ELUATO 33
525 EFEITO DA ELUICcedilAtildeO SOBRE OS ANTIacuteGENOS ERITROCITAacuteRIOS 34
526 AMOSTRA DE PACIENTE 35
527 TEMPO DE EXECUCcedilAtildeO DA TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA 36
528 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 40
6 DISCUSSAtildeO 42
7 CONCLUSAtildeO 45
8 REFEREcircNCIA BIBLIOGRAacuteFICA 46
9 ANEXOS 50
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Princiacutepio da teacutecnica direta da antiglobulinapaacutegina11
Figura 2 - Princiacutepio da teacutecnica indireta da antiglobulinapaacutegina 13
Figura 3 ndash Teste da soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem apoacutes sensibilizaccedilatildeo das hemaacuteciaspaacutegina 29
Figura 4 - TDA das amostras apoacutes sensibilizaccedilatildeo com anticorpospaacutegina 30
Figura 5 - Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com
cloroquina paacutegina 31
Figura 6 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA
paacutegina 32
Figura 7 - Painel do eluato da amostra 21 apresentando especificidade anti-Cpaacutegina 34
Figura 8 - Painel do eluato da amostra 47 apresentando especificidade anti-
K paacutegina 34
Figura 9 - Fenotipagem das amostras 24 e 50 para antiacutegeno K apoacutes tratamento com glicina-
aacutecidaEDTApagina 36
Figura 10 ndash TDA monoespeciacutefico Amostra sensibilizadardquo in vivordquo com anticorpo anti-
IgGpaacutegina 38
Figura 11 ndash TDA apoacutes o tratamentopaacutegina 38
Figura 12 ndash Resultado da fenotipagem da amostra sensibilizada ldquoin vivordquo por anti-
IgGpaacutegina 39
Figura 13 ndash Painel do eluato poacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA paacutegina 39
Figura 14 ndash Painel do eluato poacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA paacutegina 39
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Resultado geral do tratamento das hemaacutecias com glicina e
cloroquinapaacutegina 32
Tabela 2 - Resultados do TDA apoacutes tratamento da hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo
sensibilizadopaacutegina 33
Tabela 3 - Resultado apoacutes o segundo tratamento das hemaacutecias com glicina-
aacutecidaEDTApaacutegina 33
Tabela 4 - Resultado do Eluato das amostras tratadas com glicina-
aacutecidaEDTA paacutegina 34
Tabela 5 ndash Verificaccedilatildeo da interferecircncia do tratamento da hemaacutecias com cloroquina e glicina-
aacutecidaEDTA nos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e spaacutegina 35
Tabela 6 - Resultado da sensibilizaccedilatildeo das amostras efetividade do tratamento com
cloroquina glicina e o eluato poacutes tratamento com glicinapaacutegina 37
LISTA DE GRAFICOS
Graacutefico 1 - Nuacutemero de amostras sensibilizadas por especificidade de
anticorpopaacutegina 31
Graacutefico 2 - Teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla entre as teacutecnicas
aplicadaspaacutegina 41
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 - Preparo dos Reagentes da glicina-aacutecidaEDTApaacutegina 25
Quadro 2 - Preparo da Cloroquinapaacutegina 26
Quadro 3 - Resultados comparativos entre as teacutecnicas utilizadas paacutegina 40
LISTA DE FLUXOGRAMAS
Fluxograma 1 - Fluxograma da pesquisa utilizando as amostras de
doadorespaacutegina 22
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ABO
AHAI
Bg
c
C
C
C3
C3b
C3d
D
DHFRN
DNA
DTT
E
e
EDTA
Fc
Fya
Fyb
HCl
IgA
IgD
IgE
IgM
Mm
NaCl
PA
PAI
PBS
PCR
PEG
pH
Rh
rpm
S
s
SIDA
SBS
TCLE
TDA
TIA
TRIS
ZZAP
microL
Sistema Sanguiacuteneo ABO
Anemia Hemoliacutetica Autoimune
Antiacutegeno Bg
Antiacutegeno c
Celsius
Antiacutegeno C
Complemento
Fraccedilatildeo do complemento
Fraccedilatildeo do complemento
Antiacutegeno D
Doenccedila Hemoliacutetica do Feto e do Receacutem-nascido
Aacutecido desoxirribonucleico
Dithiothreitol
Antiacutegeno E
Antiacutegeno e
Aacutecido Etileno Diamino Tetraceacutetico
Porccedilatildeo do anticorpo
Antiacutegeno Duffy a
Antiacutegeno Duffy b
Aacutecido cloriacutedrico
Imunoglobulina A
Imunoglobulina D
Imunoglobulina E
Imunoglobulina M
Miliacutemetros
Cloreto de soacutedio
Puro para anaacutelise
Pesquisa de anticorpos irregulares
Tampatildeo fosfato salino
Reaccedilao em cadeia de polimerase
Polietilenoglicol
Potencial hidrogeniocircnico
Sistema sanguiacuteneo Rh
Rotaccedilotildees por minuto
Antiacutegeno S
Antiacutegeno s
Siacutendrome da Imunodeficiecircncia adquirida
Sistema de banco de sangue
Termo de consentimento livre e esclarecido
Teste direto da antiglobulina
Teste indireto da antiglobulina
Hidrometil aminometano
Sulphydryl-Proteolytic Enzyme
Microlitros
RESUMO
Os testes preacute-transfusionais satildeo o conjunto de teacutecnicas imuno-hematoloacutegicas aplicadas nas
amostras do receptor e do doador com a finalidade de fornecer uma unidade de hemaacutecias
compatiacutevel e segura para a transfusatildeo Aleacutem da fenotipagem ABO e Rh obrigatoacuteria nos testes
preacute-transfusionais a determinaccedilatildeo do perfil antigecircnico de outros antiacutegenos eritrocitaacuterios de
importacircncia cliacutenica melhora a seguranccedila transfusional especialmente para pacientes
previamente aloimunizados ou candidatos agrave transfusatildeo crocircnica Para tais pacientes conhecer o
fenoacutetipo eritrocitaacuterio permite a seleccedilatildeo de concentrados de hemaacutecias com o mesmo fenoacutetipo
o que previne reaccedilotildees transfusionais hemoliacuteticas assim como nova aloimunizaccedilatildeo
Indiviacuteduos que apresentam as hemaacutecias sensibilizadas ldquoin vivordquo por anticorpos anti-
eritrocitaacuterios como ocorre na anemia hemoliacutetica autoimune (AHAI) teratildeo o teste direto da
antiglobulina (TDA) positivo dificultando a realizaccedilatildeo da fenotipagem O TDA positivo
provoca resultados falsos positivos especialmente quando satildeo utilizados para a fenotipagem
soros comerciais da classe IgG que exigem a fase de antiglobulina humana ou teste indireto
da antiglobulina (TIA) para leitura Em 1982 Edwards Moulds e Judd propuseram a
utilizaccedilatildeo da teacutecnica da cloroquina para dissociar os complexos de antiacutegeno-anticorpo
preservando a membrana eritrocitaacuteria e permitindo a fenotipagem Atualmente eacute a teacutecnica
mais utilizada nos centros brasileiros A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA foi primeiramente
descrita por Louie Jieng e Zeroulis em 1986 poreacutem eacute pouco utilizada por natildeo haver os
reagentes prontos comercialmente no mercado brasileiro O presente estudo avaliou a teacutecnica
da glicina-aacutecida-EDTA com reagentes preparados ldquoin houserdquo em paralelo agrave teacutecnica da
cloroquina que eacute atualmente a teacutecnica aplicada no Hemocentro de Ribeiratildeo Preto Para isso
amostras de hemaacutecias de doadores (n=50) com fenoacutetipo conhecido foram sensibilizadas com
anticorpos humanos de especificidade conhecida e ambas as teacutecnicas foram aplicadas Foi
verificado ainda o efeito da teacutecnica sobre a expressatildeo dos antiacutegenos eritrocitaacuterios (Fya Fy
b
Jka Jk
b S e s) atraveacutes da fenotipagem das amostras que tiveram o TDA negativado A
viabiliadade dos anticorpos presentes no eluato recuperado apoacutes tratamento com a glicina-
aacutecidaEDTA tambeacutem foi testada A glicina-aacutecidaEDTA foi efetiva em negativar o TDA em
33 amostras (66) comparaacutevel com a cloroquina que negativou 28 amostras (56) O eluato
apresentou-se viaacutevel no tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA e natildeo foi constatada destruiccedilatildeo
dos antiacutegenos eritrocitaacuterios apoacutes o tratamento Concluiacutemos que a teacutecnica da glicina-
aacutecidaEDTA pode ser utilizada como uma opccedilatildeo no tratamento de hemaacutecias com TDA
positivo com a vantagem de seu tempo de execuccedilatildeo ser inferior ao da cloroquina (2minutos x
30 a 120 minutos) o que lhe torna uacutetil em situaccedilotildees de maior urgecircncia Quando ambas as
teacutecnicas satildeo utilizadas em hemaacutecias diferentes de uma mesma amostra a efetividade estaacute
significativamente aumentada (plt005)
Palavras chave Glicina-aacutecidaEDTA Teste direto da antiglobulina AHAI fenotipagem
ABSTRACT
The pre-transfusion tests are the group of immunohematology techniques applied in the
receptor and donor samples in order to provide a unit of red blood cells compatible and safe
for transfusion In addition to the obligatory ABO and Rh phenotyping in the pre-transfusion
tests the determination of the antigenic profile of other red cells antigens of clinical
importance improves transfusion safety especially for patients previously alloimmunized or
candidates for chronic transfusion For such patients knowing the phenotype allows the
selection of red blood cell concentrates with the same phenotype which prevents hemolytic
transfusion reactions as well as new alloimmunization Individuals who have antibody-coated
red blood cells sensitized in vivo such as in autoimmune hemolytic anemia (AHAI) will
have a direct antiglobulin test (DAT) positive making it difficult to perform phenotyping
Positive DAT causes false positive results especially when commercially available IgG
serums which require the human antiglobulin phase or indirect antiglobulin test (IAT) for
reading are used for phenotyping In 1982 Edwards Molds and Judd proposed the use of the
chloroquine technique to dissociate antigen-antibody complexes by preserving the erythrocyte
membrane and allowing phenotyping It is currently the most used technique in Brazilian
centers The EDTAglycine-acid technique was first described by Louie Jieng and Zeroulis in
1986 but it is little used because commercially available reagents are not available in the
Brazilian market The present study evaluated the EDTAglycine-acid technique with reagents
prepared in house in parallel to the chloroquine technique which is currently the technique
applied at the Hemocentro de Ribeiratildeo Preto For this donor red cells samples (n = 50) with
known phenotype were sensitized with human antibodies of known specificity and both
techniques were applied The effect of the technique on the expression of erythrocyte antigens
(Fya Fy
b Jk
a Jk
b S and s) was also verified by the phenotyping of the samples that had
negative DAT The viability of the antibodies present in the recovered eluate after treatment
with EDTAglycine-acid A was also tested EDTAglycine-acid was effective in negatively
affecting DAT in 33 samples (66) comparable to chloroquine that negatived 28 samples
(56) The eluate was viable in treatment with EDTAglycine-acid and no destruction of
erythrocyte antigens after treatment We conclude that the EDTA glycine-acid technique can
be used as an option in the treatment of red cells with TDA positive with the advantage that
its execution time is inferior to that of chloroquine (2 minutes x 30 to 120 minutes) which
makes it useful in emergency situations When both techniques are used in different
erythrocytes of the same sample the effectiveness is significantly increased (p lt005)
Key words EDTAglycine-acid direct antiglobulin test AIHA phenotyping
1 INTRODUCcedilAtildeO
A transfusatildeo de hemaacutecias eacute um recurso terapecircutico muito importante e eficaz e tem se
mostrado como um grande aliado no tratamento de diversas patologias auxiliando na
melhoria da sobrevida e qualidade de vida de diversos pacientes quando indicada de forma
correta Eacute provavelmente a modalidade de terapia mais utilizada no mundo sendo
considerada a forma mais antiga de terapia celular A transfusatildeo de hemaacutecias em pacientes
com anemia grave ou sangramento agudo reestabelece o niacutevel de hemoglobina moleacutecula
responsaacutevel pelo transporte de oxigecircnio para os tecidos melhorando a isquemia tecidual
(BARJAS-CASTRO 2013 ZAGO 2014)
A transfusatildeo de componentes celulares como o concentrado de hemaacutecias deve ser
bem avaliada quanto aos riscos e benefiacutecios Os testes preacute-transfusionais satildeo parte obrigatoacuteria
do processo transfusional e tecircm como funccedilatildeo assegurar que o melhor hemocomponente seja
selecionado para o paciente reduzindo assim a chance de transfusotildees incompatiacuteveis e reaccedilotildees
transfusionais (BARJAS-CASTRO 2013)
11TESTES PREacute-TRANSFUSIONAIS
Os testes preacute-transfusionais tecircm a finalidade de evitar a ocorrecircncia de reaccedilotildees
hemoliacuteticas no receptor decorrentes da transfusatildeo de hemaacutecias incompatiacuteveis do doador
(DOWNES e SHULMAN 2011) Tem como propoacutesito selecionar hemaacutecias que apoacutes
transfusatildeo deveratildeo ter sobrevida normal ou mais proacutexima do normal (MELO 2007)
Os testes preacute-transfusionais que consistem no conjunto de teacutecnicas
imunohematoloacutegicas aplicadas agraves amostras do receptor e doador devem ser realizados antes
de toda transfusatildeo A aplicaccedilatildeo desses testes tem como finalidade fornecer uma unidade de
hemaacutecias compatiacutevel e elevar a seguranccedila da transfusatildeo Os testes preacute-transfusionais aliados
a utilizaccedilatildeo de novas tecnologias tem historicamente evitado reaccedilotildees transfusionais
hemoliacuteticas garantindo a seguranccedila transfusional em cerca de 95 dos pacientes que recebem
transfusatildeo Eacute imprescindiacutevel poreacutem a execuccedilatildeo correta das teacutecnicas envolvidas nos testes preacute-
transfusionais e ainda garantir a identificaccedilatildeo correta do receptor e das amostras de sangue e
das unidades de hemaacutecias (CASTILHO 2000 MELO 2007 BARJAS-CASTRO 2013)
2
Todos os testes que compotildeem a rotina preacute-transfusional usam meacutetodos soroloacutegicos
que envolvem a reaccedilatildeo antiacutegeno x anticorpo Ao testar a presenccedila de um antiacutegeno na
superfiacutecie da hemaacutecia eacute necessaacuterio dispor de um soro com especificidade conhecida para
aquele antiacutegeno Por outro lado testar a presenccedila de um determinado anticorpo no soro ou no
plasma exige o uso de hemaacutecias com perfil antigecircnico conhecido Os testes preacute-transfusionais
incluem tipagem ABO (direta e reversa) tipagem Rh pesquisa de anticorpos irregulares no
sangue do receptor retipagem ABO e Rh do hemocomponente e prova de compatibilidade
entre as hemaacutecias do doador e soro ou plasma do receptor em caso de transfusatildeo de hemaacutecias
ou hemocomponentes que contenham mais de 2 mL de volume eritrocitaacuterio como o
concentrado de granuloacutecitos (BRASIL 2016 GANZELLA 2014 SANTOS 2014)
Aleacutem dos testes regularmente realizados a determinaccedilatildeo do fenoacutetipo para outros
antiacutegenos eritrocitaacuterios do doador e do receptor pode ser indicada A fenotipagem eritrocitaacuteria
determina o perfil antigecircnico para outros antiacutegenos de importacircncia cliacutenica aleacutem do sistema
ABO e do antiacutegeno RhD Ela pode auxiliar a confirmaccedilatildeo de uma especificidade de anticorpo
encontrada no soro do paciente uma vez que espera-se que a sua hemaacutecia natildeo expresse o
antiacutegeno correspondente e simultaneamente eacute utilizada para selecionar um concentrado de
hemaacutecias negativo para o respectivo antiacutegeno evitando reaccedilotildees hemoliacuteticas transfusionais A
fenotipagem de candidatos a transfusotildees crocircnicas tambeacutem eacute recomendada pois esse grupo de
pacientes deve se beneficiar com a transfusatildeo profilaacutetica de unidades de hemaacutecias com
mesmo fenoacutetipo evitando assim a aloimunizaccedilatildeo assim como reaccedilotildees hemoliacuteticas provocadas
por anticorpos previamente existentes e em baixo tiacutetulo natildeo identificados pela triagem de
anticorpos (CASTILHO JUNIOR e REID 2015 DOWNES e SHULMAN 2011)
111 TIPAGEM ABORh
O sistema ABO (ISBT001) foi o primeiro sistema de grupo sanguiacuteneo a ser
descoberto Ele foi descrito em 1900 por Karl Landsteiner e eacute considerado o sistema de maior
importacircncia na praacutetica transfusional Ele eacute composto por quatro antiacutegenos A1 (ABO1) B
(ABO2) AB (ABO3) e A1 (ABO4) e eacute caracterizado pela presenccedila dos anticorpos naturais
ou seja anticorpos que surgem sem a exposiccedilatildeo preacutevia aos antiacutegenos atraveacutes de transfusatildeo ou
gestaccedilatildeo Os anticorpos ABO satildeo predominantemente da classe IgM satildeo capazes de fixar o
complemento e de provocar hemoacutelise grave intravascular caso ocorra transfusatildeo ABO
incompatiacutevel Por apresentar essa caracteriacutestica peculiar a tipagem do sistema ABO eacute
composta de duas etapas a prova direta e a prova reversa Na prova direta eacute realizada a
pesquisa dos antiacutegenos na superfiacutecie das hemaacutecias que satildeo testadas com soros comerciais
3
Anti-A e Anti-B A prova reversa por sua vez pesquisa a presenccedila de anticorpos ABO ao
testar o soro ou plasma do pacientedoador com hemaacutecias A1 e B Ambas as provas satildeo
obrigatoacuterias e devem ser concordantes para interpretaccedilatildeo do fenoacutetipo ABO (COOLING
2011 SANTOS 2014)
O sistema Rh (ISBT004) eacute o maior e mais complexo sistema de grupos sanguiacuteneos
compreendendo atualmente 54 antiacutegenos (ISBT 2016) Satildeo cinco os principais antiacutegenos do
sistema Rh D (RH1) C (RH2) E (RH3) c (RH4) e e (RH5) Esses antiacutegenos possuem alta
capacidade imunogecircnica e seus respectivos anticorpos estatildeo envolvidos na doenccedila hemoliacutetica
perinatal e em reaccedilotildees transfusionais hemoliacuteticas Os autoanticorpos quentes como ocorre na
anemia hemoliacutetica quente satildeo representados em grande parte por anticorpos contra antiacutegenos
puacuteblicos do sistema Rh (CASTILHO 2007 CHOU e WESTHOFF 2011 BARJAS-
CASTRO 2013) A tipagem RhD pesquisa o antiacutegeno D na membrana eritrocitaacuteria ao testar a
hemaacutecia com antissoros comerciais Atualmente a maior parte dos soros Anti-D
comercializados satildeo monoclonais
112 ANTICORPOS ANTI-ERITROCITAacuteRIOS
Anticorpos satildeo proteiacutenas presentes no plasma tambeacutem denominadas imunoglobulinas
Satildeo produzidas pelo sistema imune em resposta a um determinado antiacutegeno Podem ser
classificadas de acordo com suas caracteriacutesticas e propriedades em cinco classes de
imunoglobulinas IgG IgM IgA IgE e IgD (BARJAS-CASTRO 2013)
A ligaccedilatildeo entre o antiacutegeno e o anticorpo envolvem ligaccedilotildees natildeo covalentes que satildeo
reversiacuteveis Vaacuterios tipos de interaccedilotildees natildeo covalentes podem contribuir para a ligaccedilatildeo do
antiacutegeno pelo anticorpo incluindo forccedilas eletrostaacuteticas pontes de hidrogecircnio forccedilas de Van
der Walls e interaccedilotildees hidrofoacutebicas (ABBAS LICHTMAN e PILLAI 2008)
As interaccedilotildees antiacutegeno-anticorpo satildeo constituiacutedas por ligaccedilotildees dinacircmicas que sofrem
interferecircncia de alteraccedilotildees fiacutesico-quiacutemicas no meio como mudanccedilas na temperatura na forccedila
eletrostaacutetica na concentraccedilatildeo do antiacutegeno e do anticorpo e no pH O melhor pH para a reaccedilatildeo
eacute em torno de 70 no entanto raros anticorpos podem exigir acidificaccedilatildeo do meio para serem
identificados (SANTOS 2014)
Em imunohematologia satildeo pesquisados os anticorpos que reconhecem os antiacutegenos
eritrocitaacuterios de grupo sanguiacuteneo ldquoin vivordquo esses anticorpos dependendo de seu significado
cliacutenico satildeo capazes de reconhecer seus respectivos antiacutegenos sobre a hemaacutecia podendo levar
a sua destruiccedilatildeo por dois mecanismos fagocitose por macroacutefagos no sistema
4
reticuloendotelial ou por ativaccedilatildeo do sistema complemento com a formaccedilatildeo do complexo de
ataque a membrana e hemoacutelise intravascular As duas classes de anticorpos de maior
importacircncia em imunohematologia satildeo as imunoglobulinas IgG e a IgM (SANTOS 2014)
Devido a sua estrutura pentameacuterica os anticorpos da classe IgM se ligam aos
antiacutegenos localizados na superfiacutecie da membrana de hemaacutecias proacuteximas e promovem
aglutinaccedilatildeo das mesmas em meio salino ldquoin vitrordquo Anticorpos da classe IgG por sua vez
satildeo denominados ldquonatildeo aglutinantesrdquo ou ldquoincompletosrdquo pois sua estrutura de monocircmero eacute
pequena o que desfavorece a aglutinaccedilatildeo direta uma vez que uma mesma moleacutecula de IgG
natildeo alcanccedila antiacutegenos alvos em duas hemaacutecias proacuteximas Os anticorpos IgM aleacutem de terem
um tamanho maior apresentam 750 vezes maior eficiecircncia de aglutinaccedilatildeo que os anticorpos
IgG permitindo maior facilidade nas ligaccedilotildees entre as hemaacutecias (CARRUCIO e WISE 2012
GREEN e KLOSTERMANN 2012)
Nos testes ldquoin vitrordquo satildeo simulados reaccedilotildees que poderiam ocorrer ldquoin vivordquo causando
reaccedilotildees indesejaacuteveis A fase de sensibilizaccedilatildeo em que o anticorpo se liga ao antiacutegeno
correspondente natildeo eacute identificada macroscopicamente poreacutem uma vez que o anticorpo
aproxima as hemaacutecias e vence a forccedila eletrostaacutetica que naturalmente as repele chamada de
potencial zeta ocorre a aglutinaccedilatildeo Dependendo das caracteriacutesticas do anticorpo e de sua
capacidade de fixar complemento pode ocorrer tambeacutem a hemoacutelise (SANTOS 2014)
113 PESQUISA E IDENTIFICACcedilAtildeO DE ANTICORPOS IRREGULARES
A pesquisa de anticorpos irregulares eacute teste obrigatoacuterio nos testes preacute-transfusionais e
tem a finalidade de detectar anticorpos ldquoin vitrordquo que possam causar reaccedilatildeo ldquoin vivordquo
Dependendo da populaccedilatildeo estudada (pacientes x doadores) e ainda da sensibilidade do
teste a frequecircncia de anticorpos irregulares pode variar de 03 a 38 A imunizaccedilatildeo pode
ocorrer por transfusatildeo gestaccedilatildeo transplante ou injeccedilatildeo de material imunogecircnico (WALKER
2011)
Os anticorpos irregulares podem ser classificados como aloanticorpos que satildeo
voltados contra antiacutegenos ausentes na hemaacutecia autoacuteloga ou como autoanticorpos os quais
reconhecem antiacutegenos eritrocitaacuterios proacuteprios Os autoanticorpos antieritrocitaacuterios surgem em
decorrecircncia da desregulaccedilatildeo da autotoleracircncia imune relacionada agrave condiccedilotildees diversas como
doenccedilas hematoloacutegicas doenccedilas inflamatoacuterias autoimunes neoplasias infecccedilotildees e uso de
medicaccedilotildees A presenccedila do autoanticorpo associado a um quadro de anemia hemoliacutetica
caracteriza a anemia hemoliacutetica autoimune (AHAI) seja ela primaacuteria ou secundaacuteria agrave outra
5
patologia Ateacute 12 a 40 dos pacientes com autoanticorpos quentes podem apresentar
aloanticorpos de significado cliacutenico mascarados pelos autoanticorpos (SHIREY et al 2002)
Eacute importante detectar a presenccedila de anticorpos no plasmasoro de um receptor de
transfusatildeo para garantir que seja transfundido sangue compatiacutevel Quando a pesquisa de
anticorpo irregular resultar positiva para um ou mais anticorpos de relevacircncia clinica eacute
necessaacuterio confirmar a ausecircncia do respectivo antiacutegeno na hemaacutecia do receptor assim como
selecionar para transfusatildeo concentrados de hemaacutecias tambeacutem negativos para aqueles
antiacutegenos evitando assim reaccedilotildees transfusionais (WALKER 2011)
A detecccedilatildeo de um anticorpo irregular eacute inicialmente realizada pela triagem de
anticorpos na qual o soroplasma do receptor eacute testado com 2 a 3 hemaacutecias do tipo ldquoOrdquo O
conjunto de fenoacutetipos dessas hemaacutecias deve contemplar os antiacutegenos de maior importacircncia
cliacutenica Como os anticorpos irregulares de maior interesse cliacutenico satildeo na maior parte das
vezes imunes portanto da classe IgG eacute obrigatoacuteria a fase de antiglobulina (AGH) do teste
ou teste indireto da antiglobulina (TIA) uma vez que esses anticorpos satildeo incompletos
(CASTILHO JUNIOR e REID 2015) O teste de triagem estando positivo deve-se fazer a
identificaccedilatildeo da especificidade do anticorpo utilizando um painel com maior nuacutemero de
hemaacutecias fenotipadas
114 PROVA DE COMPATIBILIDADE
A prova de compatibilidade eacute um teste obrigatoacuterio em caso de transfusatildeo de
componentes eritrocitaacuterios Tambeacutem chamada de prova de compatibilidade maior deve ser
realizada antes da administraccedilatildeo de sangue total ou concentrado de hemaacutecias utilizando-se
hemaacutecias obtidas do tubo coletor da bolsa a ser transfundida e o soro ou plasma do receptor
(BRASIL 2016)
Eacute definido como o procedimento para excluir a incompatibilidade entre o doador e o
receptor Tem o objetivo de detectar anticorpos que podem natildeo ter sido encontrados na
pesquisa de anticorpos devido a ausecircncia ou pouca expressatildeo de antiacutegenos no painel de
hemaacutecias aleacutem da possibilidade de terem ocorrido erros teacutecnicos ou notacionais durante a
realizaccedilatildeo da pesquisa (MELO 2007)
6
115 FENOTIPAGEM PARA OUTROS SISTEMAS
Aleacutem da pesquisa de ABORh que eacute realizado rotineiramente a fenotipagem para
outros sistemas tambeacutem denominado ldquofenotipagem estendidardquo determina a presenccedila ou
ausecircncia de antiacutegenos considerados de importacircncia cliacutenica A fenotipagem natildeo eacute obrigatoacuteria
nos testes preacute-transfusionais poreacutem a legislaccedilatildeo atual recomenda a realizaccedilatildeo da fenotipagem
eritrocitaacuteria dos antiacutegenos C (RH2) E (RH3) c (RH4) e (RH5) K (KELL1) Fya (FY1) Fy
b
(FY2) Jka
(JK1) Jkb (JK2) S (MNS3) e s (MNS4) para pacientes aloimunizados e pacientes
com indicaccedilatildeo de transfusatildeo crocircnica (BRASIL 2016)
A seleccedilatildeo de concentrados de hemaacutecias com o mesmo fenoacutetipo do receptor para
transfusatildeo pode evitar reaccedilotildees transfusionais hemoliacuteticas no paciente previamente
aloimunizado tambeacutem previne a sensibilizaccedilatildeo por outros antiacutegenos o que normalmente
torna as transfusotildees seguintes ainda mais complicadas A fenotipagem do paciente tambeacutem
auxilia na identificaccedilatildeo dos anticorpos pois espera-se que nas hemaacutecias do paciente o
antiacutegeno seja negativo para o anticorpo encontrado servindo de guia para teste de exclusatildeo de
anticorpos (SANTOS 2014 WALKER 2011)
A incidecircncia de aloanticorpos aumenta com o nuacutemero de transfusotildees no entanto a
implantaccedilatildeo de rotina de fenotipagem com transfusatildeo profilaacutetica de hemaacutecias com fenoacutetipo
compatiacutevel para pacientes candidatos agrave politransfusatildeo como os portadores de doenccedila
falciforme talassemia anemia aplaacutestica doenccedilas linfo e mieloproliferativas renais crocircnicos e
anemias refrataacuterias pode contribuir para o baixo iacutendice de sensibilizaccedilatildeo nessas populaccedilotildees
(FLUIT KUNST e DRENTHE-SCHONK 1999 MARTINS et al 2008 e VICHINSKY et
al 2001) Outro grupo de pacientes que se beneficia com a transfusatildeo de mesmo fenoacutetipo satildeo
os pacientes com AHAI uma vez que o autoanticorpo pode mascarar a presenccedila de um
aloanticorpo de significado cliacutenico em ateacute 40 dos casos Mesmo com as teacutecnicas utilizadas
ldquoin vitrordquo para remover a interferecircncia do autoanticorpo no soro um aloanticorpo pode natildeo
ser identificado e dessa forma transfundir o mesmo fenoacutetipo do paciente evitaria reaccedilatildeo
hemoliacutetica pelos anticorpos voltados contra antiacutegenos de maior importacircncia cliacutenica e de
frequecircncia intermediaacuteria Aleacutem disso os pacientes com AHAI satildeo fortes respondedores e a
transfusatildeo profilaacutetica do mesmo fenoacutetipo previne a aloimunizaccedilatildeo (SHIREY et al 2002)
Aleacutem de fenotipar o receptor eacute importante tambeacutem que os bancos de sangue tenham
rotinas de fenotipagem de doadores para atender as necessidade dos pacientes aloimunizados
ou em esquema de transfusatildeo crocircnica (PINTO BRAGA e SANTOS 2011)
7
Rotineiramente eacute inviaacutevel estabelecer o fenoacutetipo eritrocitaacuterio completo de um
indiviacuteduo pela grande diversidade de sistemas sanguiacuteneos descritos Ate junho de 2015 jaacute
haviam sido classificados 308 antiacutegenos atribuiacutedos a 36 sistemas definidos pela Sociedade
Internacional de Transfusatildeo de Sangue (ISBT) (CASTILHO JUNIOR e REID 2015)
Portanto o paciente eacute normalmente fenotipado para os antiacutegenos de maior importacircncia
clinica
Alguns fatores podem limitar a realizaccedilatildeo da fenotipagem eritrocitaacuteria Um dos fatores
eacute a transfusatildeo alogecircnica realizada haacute menos de 90 dias Neste caso podem ocorrer resultados
falso positivos para determinados antiacutegenos devido agrave presenccedila de hemaacutecias do doador
(LAINE et al 2000)
Outro fator eacute a presenccedila de anticorpo sensibilizando a hemaacutecia do paciente e
provocando positividade do teste direto da antiglobulina humana (TDA) Os soros
normalmente utilizados para fenotipagem especialmente para os antiacutegenos Fya
(FY1) Fyb
(FY2) Jka
(JK1) Jkb
(JK2) S (MNS3) e s (MNS4) necessitam da fase de antiglobulina
humana (AGH) para que ocorra aglutinacatildeo Amostras que apresentam o TDA positivo
aglutinam apoacutes reaccedilatildeo com a AGH natildeo pela real presenccedila do antiacutegeno em sua superfiacutecie mas
pela interaccedilatildeo da AGH com o anticorpo que estaacute sensibilizando o eritroacutecito A interferecircncia
do TDA positivo pode ser anulada atraveacutes de algumas teacutecnicas capazes de dissociar o
anticorpo como por exemplo o tratamento da hemaacutecia sensibilizada com cloroquina ou com
glicina-aacutecida-EDTA (BRANCH e PETZ 1999 SHIREY et al 2002 e LEGER 2011)
12 METODOLOGIAS APLICADOS Agrave ROTINA IMUNO-HEMATOLOacuteGICA
Todos os testes que compotildeem a rotina preacute-transfusional usam meacutetodos soroloacutegicos
que envolvem a reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo e tem como objetivo determinar o perfil antigecircnico
eritrocitaacuterio do receptor e do doador assim como identificar em seu soro a presenccedila de
anticorpos contra antiacutegenos eritrocitaacuterios que possam comprometer a sobrevida das hemaacutecias
transfundidas Para testar o antiacutegeno na superfiacutecie da hemaacutecia eacute necessaacuterio dispor de um
antissoro com especificidade conhecida para aquele antiacutegeno Por outro lado para testar a
presenccedila de um determinado anticorpo no soro ou plasma do receptor eacute necessaacuterio o uso de
hemaacutecias com perfil antigecircnico conhecido (SANTOS 2014)
Diversas metodologias satildeo aplicadas nos laboratoacuterios de imunohematologia Cada
serviccedilo de hemoterapia faz a escolha do meacutetodo que seraacute aplicado de acordo com o perfil do
laboratoacuterio com o volume de exames diaacuterios e tambeacutem com o custo envolvido Todas essas
8
teacutecnicas tecircm como objetivo comum demonstrar a reaccedilatildeo entre antiacutegeno e anticorpo no
entanto elas se baseiam em diferentes princiacutepios Muitas metodologias satildeo atualmente
aplicadas agrave imunohematologia entre elas o sistema de fase soacutelida a tecnologia de hemaacutecias
magnetizadas a biologia molecular e ateacute mesmo a citometria de fluxo no entanto os meacutetodos
mais tradicionais satildeo aqueles baseados no princiacutepio de hemaglutinaccedilatildeo
121 MEacuteTODOS DE FASE FLUacuteIDA
Os meacutetodos de fase fluiacuteda satildeo testes baseados na hemaglutinaccedilatildeo e incluem o teste em
tubo e o teste em microplacas Uma suspensatildeo de hemaacutecias eacute adicionada ao plasma ou soro
em seguida eacute realizada a centrifugaccedilatildeo e por fim eacute feita a leitura do resultado que eacute
considerado positivo se for observado algum grau de aglutinaccedilatildeo ou hemoacutelise A intensidade
de aglutinaccedilatildeo eacute graduada de acordo com o tamanho dos agregados desprendidos da
superfiacutecie apoacutes agitaccedilatildeo delicada do tubo ou microplaca Os meacutetodos de hemaglutinaccedilatildeo satildeo
aplicados a todos os testes preacute-transfusionais Como os anticorpos ABO satildeo aglutininas frias
a tipagem eacute realizada em temperatura ambiente (22degC) no entanto ao investigar a presenccedila
de anticorpos irregulares que como jaacute mencionado eacute na maioria das vezes anticorpos
incompletos da classe IgG eacute essencial que a reaccedilatildeo seja incubada a 37degC As reaccedilotildees satildeo
facilitadas com a utilizaccedilatildeo de potencializadores e da antiglobulina humana (WALKER e
HARMENING 2012 AABB 2011)
Nos meacutetodos de fase fluiacuteda nos quais a AGH eacute empregada a fase de lavagem eacute
fundamental Apoacutes a incubaccedilatildeo do soro com as hemaacutecias deve ser realizada a lavagem da
reaccedilatildeo para remover o excesso de anticorpos natildeo ligados agraves hemaacutecias jaacute que os anticorpos
livres podem bloquear a AGH quando ela eacute adicionada e levar a resultados falso negativos
(AABB 2011)
Os testes de hemaglutinaccedilatildeo satildeo os mais tradicionais entre os meacutetodos ainda hoje
aplicados agrave rotina de bancos de sangue A vantagem desses meacutetodos eacute o baixo custo quando
comparado agraves teacutecnicas mais modernas mas apresentam tambeacutem desvantagens A teacutecnica em
tubo por exemplo natildeo permite automaccedilatildeo eacute trabalhosa e exige matildeo-de-obra bastante treinada
na execuccedilatildeo das diversas etapas do teste e mesmo assim pode haver subjetividade na
interpretaccedilatildeo dos resultados aleacutem de resultados falso-negativos (DOWNES 2011 ZANTEK
et al 2012)
9
122 COLUNAS DE GEL
A teacutecnica em gel iniciada na deacutecada de 90 representou uma grande revoluccedilatildeo na
rotina laboratorial tornando-se muito popular Aleacutem de ser sensiacutevel a teacutecnica dispensa a fase
de lavagem antes da adiccedilatildeo da AGH assim como a agitaccedilatildeo do teste para leitura reduzindo o
nuacutemero de resultados falsos negativos decorrentes dessas duas etapas e o tempo para
execuccedilatildeo dos testes (LAPIERRE et al 1989 NOVARETTI et al 2000 NOVARETTI et
al 2004) Os reagentes satildeo comercializados na forma de cartotildees plaacutesticos contendo
microtubos preenchidos por gel composto por microesferas de acrilamida-dextran Nesta
metodologia tambeacutem baseada na hemaglutinaccedilatildeo a suspensatildeo de hemaacutecias e o soro satildeo
depositados em uma cacircmara acima da coluna de gel e em seguida procede-se com a
centrifugaccedilatildeo dos cartotildees As microesferas atuam como uma malha que permite a passagem
em direccedilatildeo ao fundo do microtubo apenas das hemaacutecias natildeo aglutinadas enquanto as
hemaacutecias aglutinadas ficam retidas na parte superior da coluna ou ao longo dela (GREEN e
KLOSTERMANN 2012) Portanto quanto maior a agregaccedilatildeo mais hemaacutecias ficam retidas
no topo da coluna Dependendo do tipo de teste a ser realizado pode ser utilizado gel neutro
ou gel especiacutefico impregnado pelo anticorpo desejado e o gel contendo antiglobulina humana
que satildeo utilizados para os testes diretos e indiretos da antiglobulina (LAPIERRE et al 1989)
A coluna de gel ainda permite a visualizaccedilatildeo clara de duas populaccedilotildees distintas de hemaacutecias
como em pacientes receacutem transfundidos
123 BIOLOGIA MOLECULAR
A biologia molecular ou genotipagem estaacute sendo cada vez mais aplicada aos grupos
sanguiacuteneos pois fornece resultados seguros e precisos especialmente nos casos em que natildeo eacute
possiacutevel a realizaccedilatildeo da fenotipagem como em pacientes receacutem-transfundidos e pacientes
com TDA positivo Na genotipagem eacute possiacutevel determinar atraveacutes do DNA do paciente
extraiacutedo de seus leucoacutecitos de sangue perifeacuterico o fenoacutetipo eritrocitaacuterio deduzido sem
qualquer interferecircncia do anticorpo que sensibiliza a hemaacutecia ou de hemaacutecias alogecircnicas
transfundidas Sua realizaccedilatildeo no entanto exige o treinamento de equipe especializada e capaz
de interpretar os resultados em conjunto com os achados soroloacutegicos (JUNIOR e OLIVATO
2007)
Apesar de ser uma ferramenta de grande importacircncia hoje na imuno-hematologia
ainda estaacute restrito aos grandes centros de hemoterapia no Brasil poucos serviccedilos puacuteblicos de
sauacutede dispotildeem desse recurso e utilizam teacutecnicas de genotipagem de grupos sanguiacuteneos para
atendimento a seus pacientes Esta abordagem poreacutem vem sendo introduzida em algumas
10
instituiccedilotildees de reconhecida competecircncia na hemoterapia mas sua disponibilizaccedilatildeo deve
tornar-se mais generalizada atraveacutes da formaccedilatildeo de centros de referecircncia para atendimento
das diversas unidades de hemoterapia (MARTINS et al 2009) Dessa forma muitas decisotildees
transfusionais especialmente em urgecircncias ainda devem ser tomadas sem o resultado da
genotipagem eritrocitaacuteria
13 TESTE DA ANTIGLOBULINA
Coombs Mourant e Race descreveram em 1945 uma teacutecnica com utilizando soro de
coelho contendo antiglobulina humana (AGH) que posteriormente foi chamada de ldquosoro de
Coombsrdquo O meacutetodo foi desenvolvido inicialmente para ampliar o efeito de aglutininas fracas
do sistema Rh anticorpos ldquoincompletosrdquo que normalmente natildeo apresentavam aglutinaccedilatildeo
visiacutevel O teste foi concebido como um instrumento de investigaccedilatildeo de doenccedila hemoliacutetica do
receacutem-nascido e de reaccedilotildees transfusionais causadas por anticorpos Rh que estavam presentes
no soro dos paciente poreacutem que natildeo eram demonstraacuteveis pelas teacutecnicas ateacute entatildeo existentes
A maior parte dos anticorpos de significado cliacutenico assim como seus respectivos
antiacutegenos foram descritos apoacutes o surgimento do ldquosoro de Coombsrdquo em 1945 sendo assim o
teste da antiglobulina representa ateacute hoje a forma mais importante de aglutinaccedilatildeo artificial em
imunohematologia permitindo revelar a presenccedila de anticorpos na membrana da hemaacutecia A
antiglobulina humana eacute constituiacuteda por anticorpo especiacutefico contra a porccedilatildeo Fc de outro
anticorpo Quando um anticorpo ldquoincompletordquo sensibiliza a hemaacutecia normalmente natildeo
provoca aglutinaccedilatildeo visiacutevel Apoacutes a adiccedilatildeo da AGH ao meio esta reconhece e se liga agraves
porccedilotildees Fc dos anticorpos que sensibilizam a hemaacutecia formando assim uma malha e
provocando aglutinaccedilatildeo visiacutevel (BARJAS-CASTRO 2013)
Os reagentes de antiglobulina podem ser poliespeciacuteficos ou monoespeciacuteficos Os
poliespeciacuteficos satildeo uma mistura de anticorpos ant-IgG e anti-C3d (fraccedilatildeo C3d do
complemento) Os reagentes monoespecificos podem ser anti-IgG anti-IgM anti-IgA anti-
complemento podendo ser anti-C3d e anti-C3b
O teste da antiglobulina pode ser usado para detectar hemaacutecias sensibilizadas com
aloanticorpos IgG autoanticorpos IgG e componentes do complemento A sensibilizaccedilatildeo
pode ocorrer ldquoin vivordquo ou ldquoin vitrordquo O uso do AGH para detectar a sensibilizaccedilatildeo ldquoin vitrordquo
tem dois estaacutegios e eacute denominado teste indireto da antiglobulina A sensibilizaccedilatildeo ldquoin vivordquo eacute
detectada em procedimento de um uacutenico estagio chamado teste direto da antiglobulina (TDA)
11
Os testes direto e indireto satildeo ateacute hoje amplamente aplicados como princiacutepio de inuacutemeros
testes soroloacutegicos em imuno-hematologia (GREEN e KLOSTERMANN 2012)
131 TESTE DIRETO DA ANTIGLOBULINA
O teste direto da antiglobulina humana revela a presenccedila de anticorpo eou fraccedilatildeo do
complemento ligados agrave superfiacutecie das hemaacutecias As sensibilizaccedilatildeo das hemaacutecias ocorrida ldquoin
vivordquo natildeo eacute visualizada mas apoacutes a adiccedilatildeo da antiglobulina humana ocorre a aglutinaccedilatildeo que
eacute visualizada macroscopicamente (Figura 1)
Figura 1 - Princiacutepio da teacutecnica direta da antiglobulina Teste utilizado para demonstrar a sensibilizaccedilatildeo ldquoin
vivordquo das hemaacutecias O sangue total eacute coletado do paciente em tubo contendo anticoagulante EDTA Na teacutecnica
realizada em tubo uma suspensatildeo de hemaacutecias 5 em soluccedilatildeo de salina eacute preparada Uma gota dessa suspensatildeo
eacute lavada 3 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica para retirada de anticorpos que estatildeo livres no plasma Toda soluccedilatildeo eacute
retirada e adiciona-se o soro de Coombs (antiglobulina humana) O soro de Coombs reconhece os anticorpos que
estatildeo ligados agrave superfiacutecie das hemaacutecias fazendo com que ocorra aglutinaccedilatildeo visiacutevel macroscopicamente
Apesar de natildeo ser um teste preacute-transfusional obrigatoacuterio o TDA eacute um dos testes mais
importantes para investigar e classificar quadros hemoliacuteticos como de origem imune ou natildeo
imune O seu valor preditivo positivo em vigecircncia de anemia hemoliacutetica eacute de 83 poreacutem natildeo
havendo sinais de hemoacutelise seu valor preditivo eacute apenas 14 Eacute por esse motivo que a
interpretaccedilatildeo do TDA positivo deve levar em consideraccedilatildeo a histoacuteria cliacutenica e os resultados
dos outros exames laboratoriais A realizaccedilatildeo do TDA eacute obrigatoacuteria na investigaccedilatildeo
12
laboratorial de diversos quadros hemoliacuteticos entre eles a anemia hemoliacutetica autoimune
(AHAI) a reaccedilatildeo hemoliacutetica imune poacutes-transfusional a siacutendrome do linfoacutecito passageiro a
doenccedila hemoliacutetica perinatal e a hemoacutelise droga-dependente (LEGER 2011)
Resultados de TDA positivos foram tambeacutem observados em indiviacuteduos com niacuteveis
seacutericos elevados de IgG ou complemento sem evidecircncia de anemia hemoliacutetica imune como
em pacientes com doenccedila falciforme talassemia doenccedila renal crocircnica mieloma muacuteltiplo
doenccedilas autoimunes e siacutendrome da imunodeficiecircncia adquirida (SIDA) Aleacutem disso pequenas
quantidades de IgG (5 a 90 moleacuteculas por hemaacutecia) e complemento (5 a 40 moleacuteculas por
hemaacutecia) podem estar presentes nas hemaacutecias de indiviacuteduos saudaacuteveis sem associaccedilatildeo com
reduccedilatildeo na sobrevida das mesmas A positividade do TDA depende da populaccedilatildeo estudada e
pode variar de 01 entre doadores de sangue sem qualquer sinal cliacutenico de hemoacutelise ateacute
15 em pacientes hospitalizados (CASTILHO JUNIOR e REID 2015 LEGER 2011)
Indiviacuteduos que apresentam TDA positivo seja agraves custas de IgG eou complemento
com ou sem sinais cliacutenicos de hemoacutelise teratildeo a fenotipagem eritrocitaacuteria prejudicada A
fenotipagem de indiviacuteduos com TDA positivo especialmente quando utilizado o teste indireto
da antiglobulina pode acarretar resultados falsos positivos e levar a seleccedilatildeo de fenoacutetipo
incorreto para transfusatildeo
132 TESTE INDIRETO DA ANTIGLOBULINA
O teste indireto da antiglobulina (TIA) eacute utilizado para revelar a sensibilizaccedilatildeo ldquoin
vitrordquo das hemaacutecias e eacute aplicado a diversos testes soroloacutegicos em imunohematologia entre
eles a pesquisa de anticorpos identificaccedilatildeo de anticorpos testes de compatibilidade
fenotipagem eritrocitaacuteria e titulaccedilatildeo de anticorpos Na teacutecnica indireta a hemaacutecia que contecircm
o antiacutegeno eacute colocada em contato ldquoin vitrordquo com o anticorpo que se liga mas natildeo promove a
aglutinaccedilatildeo visiacutevel A adiccedilatildeo da AGH forma uma malha entre os anticorpos que sensibilizam
as hemaacutecias e provoca a aglutinaccedilatildeo macroscoacutepica (figura 2)
Caso a amostra de hemaacutecia estudada seja previamente sensibilizada resultados falsos
positivos podem ser obtidos no TIA jaacute que a AGH reagiraacute com a moleacutecula que sensibilizava
anteriormente a hemaacutecia mesmo se o anticorpo especiacutefico natildeo tiver se ligado ao antiacutegeno
correspondente
13
133 CONDICcedilOtildeES CLIacuteNICAS COM TDA POSITIVO
O TDA positivo deve ser interpretado cuidadosamente sempre em conjunto com o
quadro cliacutenico do paciente A positividade isolada do TDA natildeo significa hemoacutelise A
interpretaccedilatildeo do teste positivo requer o conhecimento do diagnoacutestico do paciente da presenccedila
de sinais e sintomas sugestivos de hemoacutelise assim como de seu histoacuterico transfusional
gestacional e de informaccedilotildees sobre o uso recente de medicaccedilotildees (LEGER 2011)
Figura 2 ndash Princiacutepio do teste indireto da antiglobulina O TIA pode ser utilizado na pesquisa de anticorpos de
especificidades desconhecidas livres no soroplasma como eacute o caso da pesquisa e identificaccedilatildeo de anticorpos
irregulares Ele eacute tambeacutem utilizado para determinar a presenccedila de antiacutegenos na membrana da hemaacutecia quando
satildeo empregados soros de especificidades conhecidas da classe IgG No primeiro caso o soroplasma contendo o
anticorpo desconhecido eacute colocado em contato com hemaacutecias cujo perfil antigecircnico eacute conhecido No segundo
caso utiliza-se soro de especificidade conhecida da classe IgG para determinar a presenccedila ou ausecircncia de um
antiacutegeno na membrana O anticorpo encontra o antiacutegeno correspondente e ocorre a ligaccedilatildeo do anticorpo agrave
hemaacutecia mas natildeo ocorre aglutinaccedilatildeo Apoacutes a adiccedilatildeo da AGH que se liga aos anticorpos formando uma malha
ocorre a aglutinaccedilatildeo visiacutevel
O TDA positivo eacute uma achado claacutessico de algumas condiccedilotildees cliacutenicas como a reaccedilatildeo
transfusional hemoliacutetica a doenccedila hemoliacutetica do feto e do receacutem-nascido (DHFRN) a anemia
hemoliacutetica induzida por drogas a siacutendrome do linfoacutecito passageiro e a anemia hemoliacutetica
autoimune (AHAI) Portanto o TDA positivo pode ser decorrente da sensibilizaccedilatildeo da
hemaacutecia autoacuteloga por um autoanticorpo ou por um aloanticorpo ligado agrave hemaacutecia alogecircnica
circulante A positividade do TDA pode ainda ocorrer de forma passiva em pacientes que
14
recebem imunoglobulinas humanas ou ainda pela transfusatildeo de plaquetas ABO natildeo idecircntico
(LEGER 2011 RALPH 2012 ZANTEK et al 2012)
Nas reaccedilotildees transfusionais hemoliacuteticas imunes o aloanticorpo do receptor sensibiliza
as hemaacutecias transfundidas do doador e reduz sua sobrevida ao removecirc-la precocemente da
circulaccedilatildeo pela fagocitose no sistema retiacuteculo-endotelial ou pela hemoacutelise intravascular As
reaccedilotildees podem ser agudas se ocorrem ateacute 24 horas ou tardias quando ocorrem apoacutes 24 horas
da transfusatildeo A gravidade das reaccedilotildees hemoliacuteticas pode variar de um simples rendimento
transfusional inadequado agrave quadros graves de hemoacutelise intravascular evoluindo ateacute mesmo
com choque vascular e oacutebito O TDA pode resultar negativo caso toda massa eritrocitaacuteria
transfundida tenha sido destruiacuteda (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
Na doenccedila hemoliacutetica do feto e do receacutem-nascido (DHFRN) anticorpos maternos da
classe IgG atravessam a barreira placentaacuteria e sensibilizam as hemaacutecias fetais que seratildeo
destruiacutedas precocemente levando agrave anemia fetal Apesar da incompatibilidade ABO feto-
materna ser a causa mais frequente de DHFRN raramente ela eacute responsaacutevel pela ocorrecircncia
de quadros graves Por outro lado anticorpos contra antiacutegenos do sistema Rh e Kell
especialmente Anti-D (Anti-RH1) Anti-c (Anti-RH4) e Anti-Kell (Anti-KELL1) satildeo
conhecidos por causar DHFRN severa Raramente outros anticorpos tambeacutem podem estar
implicados na DHFRN como os anticorpos contra antiacutegenos do sistema Kidd Duffy MNS e
Diego (ZANTEK et al 2012)
A hemoacutelise droga-dependente eacute causada pela produccedilatildeo de um anticorpo voltado contra
a droga ligada agrave membrana eritrocitaacuteria ou ainda contra o complexo droga-membrana A
classe de medicaccedilotildees mais comumente envolvida eacute a dos antimicrobianos betalactacircmicos
(penicilinas e cefalosporinas) mas outras classes como quimioteraacutepicos e anti-inflamatoacuterios
tambeacutem satildeo descritos (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
Apoacutes transplante de ceacutelulas progenitoras hematopoieacuteticas em que o doador possui
anticorpos contra antiacutegenos eritrocitaacuterios do receptor o linfoacutecito de memoacuteria do doador pode
resistir ao esquema imunossupressor utilizado e continuar a produccedilatildeo de anticorpos que
reconhecem a hemaacutecia incompatiacutevel do receptor ainda circulante O quadro cliacutenico pode
variar de um simples TDA positivo sem outros sinais ou sintomas ateacute um quadro hemoliacutetico
grave e abrupto (LEGER 2011)
15
134 ANEMIA HEMOLIacuteTICA AUTOIMUNE
A anemia hemoliacutetica autoimune eacute caracterizada pela destruiccedilatildeo precoce das hemaacutecias
autoacutelogas por autoanticorpos que sensibilizam as hemaacutecias e levam agrave fagocitose pelos
macroacutefagos no sistema reticulo-endotelial ou hemoacutelise intravascular O diagnoacutestico da AHAI
baseia-se na presenccedila de hemoacutelise cliacutenica associada agrave evidecircncia de fator imune representado
pelo TDA positivo As classes de anticorpos envolvidas em quadros de AHAI satildeo IgG IgM e
raramente IgA (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012) Satildeo raros os casos de AHAI com TDA
negativo que podem estar relacionados a um autoanticorpo de baixa avidez de densidade
inferior agrave detecccedilatildeo do meacutetodo ou ainda de classe de imunoglobulina natildeo avaliada pelo
meacutetodo utilizado para o teste (GARRATY 2005)
A AHAI pode ser classificada em dois grupos principais de acordo com a melhor
temperatura de reaccedilatildeo do autoanticorpo As anemias hemoliacuteticas causadas por anticorpos
quentes que reagem melhor a 37oC e geralmente IgG representam 80 dos casos de AHAI
Nas AHAI por anticorpo quente o TDA pode ser positivo para IgG mais complemento (67)
somente IgG (20) ou somente por complemento (13) As anemias causadas por
anticorpos frios geralmente da classe IgM e que reagem melhor em temperatura ambiente ou
a 4oC representam aproximadamente 20 dos casos de AHAI Por exibirem amplitude
teacutermica esses anticorpos ligam-se agraves hemaacutecias ao atingirem a circulaccedilatildeo nas extremidades do
corpo fixam o complemento e desprendem-se da hemaacutecia apoacutes retornar para partes mais
quentes Por esse motivo em AHAI por anticorpos frios o TDA eacute positivo apenas agraves custas
de C3 e normalmente o IgM natildeo eacute detectado (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
A presenccedila do autoanticorpo IgG pode ser confirmada atraveacutes da eluiccedilatildeo do anticorpo
da hemaacutecia Tipicamente o eluato na AHAI por anticorpo quente reage com todas as ceacutelulas
testadas de um painel de hemaacutecias alogecircnicas do tipo ldquoOrdquo ou pode eventualmente exibir uma
especificidade conhecida como Anti-e (Anti-RH5) Nas AHAI a frio por sua vez espera-se
um eluato negativo (LEGER 2011)
Os autoanticorpos satildeo com frequecircncia encontrados livres no plasma e natildeo somente
ligados agraves hemaacutecias autoacutelogas Eles podem interferir em todas as fases dos testes preacute-
transfusionais nas quais o plasma eacute testado especialmente os autoanticorpos quentes que
acarretam resultados positivos em todos os testes levados agrave fase de antiglobulina humana
Esses anticorpos portanto positivam a pesquisa de anticorpos irregulares e mascaram a
presenccedila de aloanticorpos de significado cliacutenico Aproximadamente 60 dos pacientes que
apresentam AHAI a quente apresentam anticorpos que reagem em meio salino mas se forem
16
levados em conta meacutetodos mais sensiacuteveis como PEG enzima e estudo em gel a positividade
pode ser superior a 90 (LEGER 2011)
Aleacutem da eficaacutecia da transfusatildeo ser comprometida pela diminuiccedilatildeo da vida-meacutedia das
hemaacutecias a presenccedila do autoanticorpo dificulta a realizaccedilatildeo dos testes preacute-transfusionais e
compromete a seguranccedila transfusional Os autoanticorpos reagem normalmente como
panaglutininas pois satildeo normalmente voltados contra antiacutegenos puacuteblicos na maior parte das
vezes contra antiacutegenos do sistema Rh Por apresentarem essas caracteriacutesticas podem ainda
mascarar a presenccedila de aloanticorpos de significado clinico e levar a testes de compatibilidade
positivos exigindo uma avaliaccedilatildeo criteriosa da necessidade da transfusatildeo (BRANCH e PETZ
1999 JUNIOR e OLIVATO 2004)
Remover a interferecircncia do autoanticorpo para avaliar a presenccedila de aloanticorpos
mascarados nem sempre eacute possiacutevel mesmo utilizando teacutecnicas de autoadsorccedilatildeo ou
aloadsorccedilatildeo que aleacutem de tudo satildeo demoradas e exigem de 2 a 6 horas para conclusatildeo
(GARRATY e GEORGE 2002) Nesses casos a fenotipagem eritrocitaacuteria do paciente eacute de
extrema utilidade especialmente em situaccedilotildees de urgecircncia A definiccedilatildeo do fenoacutetipo do
paciente para os antiacutegenos de maior importacircncia cliacutenica pode auxiliar a seleccedilatildeo de unidades
de hemaacutecias com mesmo fenoacutetipo o que garante que eventuais aloanticorpos natildeo
identificados sejam respeitados e tambeacutem evita nova sensibilizaccedilatildeo (JUNIOR e OLIVATO
2004 SHIREY et al 2002)
135 TRATAMENTO DE HEMAacuteCIAS COM TDA POSITIVO
O TDA positivo impede a fenotipagem eritrocitaacutecia por meacutetodos que exigem a fase de
AGH uma vez que a aglutinaccedilatildeo ocorreraacute devido agrave interaccedilatildeo da AGH com o autoanticorpo
que sensibiliza a hemaacutecia do paciente levando a resultados falso positivos Em algumas
situaccedilotildees como na AHAI por anticorpo quente a fenotipagem eacute especialmente importante
pois o autoanticorpo interfere na triagem e identificaccedilatildeo de anticorpos assim como no teste de
compatibilidade e dificultam a detecccedilatildeo de aloanticorpos de significado cliacutenico que
obrigatoriamente devem ser respeitados Nessas situaccedilotildees a fenotipagem eritrocitaacuteria
determina o perfil antigecircnico do paciente e possibilita o fornecimento de unidades de
hemaacutecias com o mesmo fenoacutetipo para a transfusatildeo evitando a sensibilizaccedilatildeo para novos
antiacutegenos assim como reaccedilotildees hemoliacuteticas transfusionais No entanto eacute necessaacuterio aplicar
meacutetodos que natildeo sofram interferecircncia do TDA positivo ou seja meacutetodos que natildeo necessitem
da fase de AGH ou meacutetodos de bloqueio do anticorpo sem bloquear o antiacutegeno Uma opccedilatildeo eacute
a utilizaccedilatildeo de soros monoclonais IgM (salinos ou de meio proteico natildeo concentrado) mas
17
nem sempre esses reagentes estatildeo disponiacuteveis especialmente os reagentes monoclonais para
os antiacutegenos dos sistemas Duffy ( Fya Fy
b) Kidd ( Jk
a Jk
b) e MNS (S s) (JUNIOR e
OLIVATO 2004) Outra opccedilatildeo eacute a teacutecnica de bloqueio que pode ser utilizada para tratar
hemaacutecias para posterior fenotipagem em casos de TDA positivos com reatividade le2+
Em casos onde a positividade do TDA eacute maior que 2+ estaacute indicada a tratamento
quiacutemico para remoccedilatildeo da interferecircncia do autoanticorpo antes de realizar a fenotipagem Entre
as teacutecnicas utilizadas atualmente estatildeo o ZZAP a cloroquina e a glicina aacutecidaEDTA
1351 TEacuteCNICA DE BLOQUEIO
A teacutecnica de bloqueio se baseia na utilizaccedilatildeo de anti-IgG (Coombs monoespeciacutefico)
para tratar as hemaacutecias com TDA positivo O anticorpo anti-IgG se liga aos anticorpos que
estatildeo sensibilizando a hemaacutecias poreacutem sem o bloquear os antiacutegenos Os antiacutegenos que natildeo
estatildeo sensibilizados podem ser detectados atraveacutes dos antissoros especiacuteficos (SERERAT
VEIDT E DUTCHED 2000)
1352 TRATAMENTO DE HEMAacuteCIAS COM ZZAP
O Sulphydryl-Proteolytic Enzyme (ZZAP) que eacute uma mistura de ditiotreitol (DTT)
mais papaiacutena ativada com cisteiacutena eacute um reagente capaz de dissociar imunoglobulinas da
classe IgG ligadas a membrana dos eritroacutecitos enquanto trata enzimaticamente as hemaacutecias
O tratamento enzimaacutetico tambeacutem potencializa a ligaccedilatildeo do autoanticorpo ao antiacutegeno e
acelera o processo de autoadsorccedilatildeo O ZZAP pode desnaturar os antiacutegenos do sistema Duffy
MNS e Kell o que limita sua aplicaccedilatildeo para fins de fenotipagem (BRANCH e PETZ 1982)
1353 CLOROQUINA
Em 1982 Edwards Moulds e Judd propuseram a utilizaccedilatildeo da teacutecnica da cloroquina
que dissociava os complexos antiacutegeno-anticorpo e mantinha a membrana das hemaacutecias
iacutentegras Os derivados quinolecircicos jaacute haviam sido descritos anteriormente por Domokos e
Aszody em 1964 e Holtz Mantel e Buck em 1973 (apud Edwards Moulds e Judd 1982) pela
sua capacidade de separar imunocomplexos e inibir as reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo reduzindo
as cargas eleacutetricas das superfiacutecie das hemaacutecias A teacutecnica eacute uma das mais utilizadas nos
centros brasileiros para remover a interferecircncia do autoanticorpo e eacute tambeacutem a teacutecnica
atualmente adotada pelo laboratoacuterio de imunohematologia do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto
18
Edwards Moulds e Judd (1982) demonstraram que a teacutecnica da cloroquina para
dissociaccedilatildeo de anticorpos eacute uma teacutecnica simples efetiva e confiaacutevel para dissociar
imunoglobulina das hemaacutecias Desde que a membrana das hemaacutecias permaneccedila intacta natildeo
haacute perda da reatividade dos antiacutegenos e a sua maior aplicaccedilatildeo eacute a fenotipagem de hemaacutecias
com TDA positivo Os autores verificaram que em 83 das amostras sensibilizadas in vivo e
22 amostras (no total de 40) sensibilizadas ldquoin vitrordquo apresentaram TDA negativo e
puderam ser fenotipadas A teacutecnica poreacutem natildeo consegue remover os componentes do
complemento na maioria dos casos
Champagne e colaboradores (1999) testaram a teacutecnica da cloroquina para dissociar
antiacutegenos Bg comparando com a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA e verificaram vantagem em
relaccedilatildeo ao uso de um uacutenico reagente diminuindo a manipulaccedilatildeo e verificou que o mesmo natildeo
destroacutei antiacutegeno Kell
A cloroquina tambeacutem mostrou-se pouco efetivo em remover anticorpos do sistema
Duffy da superfiacutecie das hemaacutecias (EDWARDS MOUDS e JUDD 1982 ROZIERS e
SQUALI 1997)
1353 GLICINA-AacuteCIDAEDTA
A afinidade e a estabilidade entre a ligaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo eacute definida como a
resultante entre forccedilas atrativas e repulsivas entre ambos (CARUCIO e WISE 2012) e resulta
da somatoacuteria de forccedilas quiacutemicas dinacircmicas e fracas (natildeo covalentes) como pontes de
hidrogecircnio forcas eletrostaacuteticas forca de Van der Waals e pontes hidrofoacutebicas A estabilidade
dessa ligaccedilatildeo eacute facilmente abalada por alteraccedilotildees quiacutemicas e fiacutesicas no meio da reaccedilatildeo como
a alteraccedilatildeo do pH A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA se baseia na mudanccedila do pH para a
quebra da ligaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo (KOSANKE 2012)
A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA foi primeiramente descrita em 1986 por Louie Jieng
e Zeroulis que utilizaram 50 amostras de doadores sensibilizados ldquoin vitrordquo com anticorpos A
teacutecnica foi efetiva em 48 amostras permitindo o estudo do eluato assim como a fenotipagem
das hemaacutecias Os autores testaram tambeacutem a teacutecnica em 100 hemaacutecias TDA positivo que
puderam ser utilizadas para teacutecnicas de autoadsorccedilatildeo
Byrne (1991) descreveu a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA modificada e tambeacutem
verificou como uma opccedilatildeo para o tratamento de hemaacutecias com TDA positivo que deixava as
hemaacutecias intactas e o eluato viaacutevel para ser fenotipado
19
Roziers e Squali (1997) e Katharia e Chaudhary (2013) compararam a teacutecnica da
glicina-aacutecidaEDTA com as teacutecnicas da cloroquina e do aquecimento Verificaram maior
eficiecircncia da glicina-aacutecidaEDTA em relaccedilatildeo as outras duas teacutecnicas pois com uma mesma
quantidade de amostra produzia as hemaacutecias livres de anticorpo e tambeacutem o eluato Mostrou-
se ainda superior devido ao menor tempo exigido para sua realizaccedilatildeo o que favorece seu uso
em situaccedilotildees de urgecircncia e emergecircncia
As duas desvantagens da teacutecnica poreacutem eacute o fato de destruir os antiacutegenos do sistema
Kell e o fato de natildeo remover fraccedilotildees do complemento ligadas agrave hemaacutecia (PALLAS WILER e
McGEE 1991 ROZIERS e SQUALLI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012
e KATHARIA e CHAUNDHARY 2013)
20
2 OBJETIVOS
21 OBJETIVO GERAL
211 Avaliar a eficaacutecia da glicina-aacutecidaEDTA em remover os anticorpos ligados agraves
hemaacutecias sensibilizadas por anticorpos da classe IgG
22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
221 Preparaccedilatildeo dos reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
verificaccedilatildeo da estabilidade dos mesmos e avaliar custos
222 Testar a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA em amostras de hemaacutecias
sensibilizadas por anticorpos antieritrocitaacuterios humanos
223 Comparar a efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA com a teacutecnica da
cloroquina quanto a capacidade de remover a interferecircncia do anticorpo ligado
a hemaacutecia
224 Testar o eluato das amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA
225 Verificar se houve destruiccedilatildeo dos antiacutegenos eritrocitaacuterios apoacutes o tratamento
com glicina-aacutecidaEDTA e com cloroquina
226 Verificar se o tempo de execuccedilatildeo da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA descrito
nos textos de referecircncia eacute reprodutiacutevel
21
3 JUSTIFICATIVA
Algumas condiccedilotildees cliacutenicas podem levar ao depoacutesito ldquoin vivordquo de anticorpos eou
fraccedilotildees do complemento sobre as hemaacutecias Entre elas estatildeo as reaccedilotildees hemoliacuteticas poacutes-
transfusionais a doenccedila hemoliacutetica perinatal o uso de medicamentos e principalmente a
AHAI Na AHAI um anticorpo normalmente da classe IgG ou IgM reconhece antiacutegenos
proacuteprios na membrana eritrocitaacuteria e reduz a sobrevida da hemaacutecia levando a sua destruiccedilatildeo
pelos macroacutefagos no sistema reticulo-endotelial ou agrave ativaccedilatildeo do complexo de ataque agrave
membrana e agrave lise intravascular Os autoanticorpos satildeo voltados na maioria das vezes contra
antiacutegenos eritrocitaacuterios de alta frequecircncia populacional conhecidos como antiacutegenos puacuteblicos
e por este motivo reconhecem tanto hemaacutecias autoacutelogas quanto alogecircnicas
Devido agrave presenccedila do autoanticorpo livre no plasma e tambeacutem do anticorpo eou
complemento ligado agrave hemaacutecia o banco de sangue pode encontrar dificuldades em todas as
fases dos testes preacute-transfusionais do paciente com AHAI e deve utilizar teacutecnicas que
auxiliem na escolha do melhor hemocomponente melhorando a seguranccedila transfusional Essas
teacutecnicas visam remover a interferecircncia do autoanticorpo livre no soro e do autoanticorpo
ligado agrave hemaacutecia permitindo a detecccedilatildeo de aloanticorpos associados e a realizaccedilatildeo da
fenotipagem eritrocitaacuteria respectivamente
A finalizaccedilatildeo dos testes preacute-tranfusionais na presenccedila de autoanticorpo pode levar
algumas horas e nem sempre o paciente poderaacute aguardar Nesse contexto torna-se vantajosa a
aplicaccedilatildeo de teacutecnicas de raacutepida execuccedilatildeo
O presente estudo propotildee aplicar e avaliar a eficaacutecia da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
em remover os anticorpos ligados agrave hemaacutecia o que permite a fenotipagem eritrocitaacuteria
estendida e a seleccedilatildeo de concentrados de hemaacutecias com mesmo fenoacutetipo do paciente
Atualmente no Hemocentro de Ribeiratildeo Preto a teacutecnica utilizada para esse fim eacute o
tratamento das hemaacutecias com difosfato de cloroquina cujo tempo de execuccedilatildeo pode demorar
ateacute duas horas enquanto a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser realizada em apenas dois
minutos o que a tornaria opccedilatildeo de escolha especialmente em situaccedilotildees de urgecircncia Ao
contraacuterio da cloroquina a glicina-aacutecidaEDTA permite tambeacutem o estudo do eluato das
hemaacutecias tratadas
22
4 METODOL OGIA
41 AMOSTRAS DE DOADORES
Foram coletados 50 amostras de doadores de sangue que compareceram ao
Hemonuacutecleo de Araccedilatuba no periacuteodo de junho a agosto de 2016 Foram convidados a
participar da pesquisa doadores de repeticcedilatildeo do tipo sanguiacuteneo ldquoOrdquo RhD positivo
cadastrados no sistema de banco de sangue (SBS) do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto
Todos os doadores que concordaram em participar da pesquisa assinaram o termo de
consentimento livre e esclarecido (TCLE)
No momento da doaccedilatildeo foram coletados adicionalmente 5 mL de sangue total em
soluccedilatildeo anticoagulante EDTA (aacutecido dietilenoaminoaceacutetico) dispensando punccedilatildeo venosa
adicional para coleta da amostra O fluxograma 1 resume as etapas desenvolvidas no projeto
Fluxograma 1 - Fluxo da pesquisa utilizando as amostras de doadores
23
411 FENOTIPAGEM
Foram verificados se os doadores jaacute tinham fenotipagem para outros sistemas de
grupos sanguiacuteneos aleacutem do sistema ABORh que eacute realizado rotineiramente
A fenotipagem eritrocitaacuteria para outros sistemas ou fenotipagem estendida eacute realizada
para identificar a presenccedila ou ausecircncia de antiacutegenos considerados de importacircncia cliacutenica No
Hemonuacutecleo de Araccedilatuba uma parcela de doadores de repeticcedilatildeo satildeo fenotipados para os
antiacutegenos dos sistemas de grupo sanguiacuteneo Rh (antiacutegenos C c E e e) Kell (antiacutegeno K)
Duffy (antiacutegenos Fya e Fy
b) Kidd (antiacutegenos Jk
a e Jk
b) e sistema MNSs (antiacutegenos S e s)
A fenotipagem para o Rh e Kell eacute realizada por metodologia de microplaca utilizando
25 microL de hemaacutecia lavada e diluiacuteda a 5 em salina e 25 microL do antissoro comercial especiacutefico
A reaccedilatildeo eacute incubada 15 minutos a temperatura ambiente e centrifugadas para leitura Para os
antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s a metolodogia utilizado eacute gel contendo antiglobulina
humana (gel LissCoombs poliespeciacutefico) da marca BIO-RAD onde se utiliza suspensatildeo de
hemaacutecia em LISS (Soluccedilatildeo de baixa forccedila iocircnica) A suspensatildeo eacute preparada atraveacutes da
diluiccedilatildeo de 10 microL de hemaacutecia em 1000 microL de LISS Pipetado 50 microL dessa diluiccedilatildeo no gel e
adicionado 25 microL do antissoro especiacutefico Incuba-se em banho seco por 15 minutos a 37 deg
Celsius e eacute centrifugado em centriacutefuga especiacutefica Os antissoros utilizados eram das marcas
Fresenius e Lorne
Foi verificado a fenotipagem do doador no banco de dados do Hemocentro Os
registros dos fenoacutetipos dos doadores ficam armazenadas no sistema de banco de sangue
(SBS) Para doadores que natildeo tinham fenotipagem estendida preacutevia para antiacutegenos do sistema
Rh (C c E e e) e Kell (K) foi realizada a fenotipagem para esses antiacutegenos
O tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA e cloroquina para dissociar
anticorpos pode inativar enfraquecer ou destruir os antiacutegenos presentes nas hemaacutecias
alterando assim os resultados da fenotipagem Para verificar se houve destruiccedilatildeo dos
antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a e Jk
b S e s nas amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes
tratamento foram novamente fenotipadas ao final para os antiacutegenos que eram inicialmente
positivas
A repeticcedilatildeo da fenotipagem foi realizada nas amostras que apresentaram efetividade
no tratamento da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eou da cloroquina e a detecccedilatildeo do antiacutegeno
na amostra preacute-tratamento
24
412 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS HEMAacuteCIAS
As hemaacutecias foram sensibilizadas com antissoros policlonais humanos de amostras de
plasma fresco congelado de doadores com resultado de pesquisa de anticorpo irregular
positivos
A escolha do anticorpo para sensibilizar as hemaacutecias foi definida de acordo com o
fenoacutetipo do doador que deveria ser positivo para o respectivo antiacutegeno
Para a sensibilizaccedilatildeo um volume de antissoro (1 mL) e um volume (1 mL) de
hemaacutecias lavadas quatro vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica foram adicionadas a um tubo de 12 x
75 mm A mistura foi homogeneizada e incubada em banho maria (BM) a 37deg C por 60
minutos A seguir as hemaacutecias foram novamente lavadas 4 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica
para retirada dos anticorpos que natildeo se ligaram A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada
como controle negativo O teste da uacuteltima lavagem eacute importante para assegurar que os
anticorpos que poderatildeo ser detectados no eluato apoacutes o tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA
sejam aqueles que estavam ligados agraves hemaacutecias e natildeo aqueles livres no plasma O controle
negativo mostra que todo o anticorpo livre foi retirado (LEGER 2011)
Para o teste de presenccedila de anticorpo na soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foram incubadas
com hemaacutecias de triagem de anticorpos irregulares (ID-Diacell BIO-RAD) contendo os
antiacutegenos especiacuteficos Realizado a teacutecnica em gel LissCoombs com anti-IgG+C3d Incubado
no tempo de 15 minutos a temperatura de 37deg C e centrifugado 10 minutos em centriacutefuga
proacutepria
As 50 amostras de doadores foram sensibilizadas com os anticorpos policlonais
humanos
Apoacutes sensibilizadas rdquoin vitrordquo e lavadas as hemaacutecias foram diluiacutedas em soluccedilatildeo de
baixa forccedila iocircnica (LISS) na quantidade de 10 microL de hemaacutecia para 1000 microL de soluccedilatildeo A
suspensatildeo foi pipetada (50 microL) em coluna-gel-teste LissCoombs (BIO-RAD) que contecircm
antiglobulina poliespeciacutefico (IgG+C3d) e centrifugada em baixa rotaccedilatildeo conforme orientaccedilatildeo
do fabricante durante 10 minutos
As amostras deveriam apresentar aglutinaccedilatildeo com reatividade 3 a 4+ no TDA As
amostras que apresentaram reaccedilatildeo menor que 3+ foram novamente sensibilizadas com nova
aliacutequota do antissoro
25
413 TRATAMENTO DAS AMOSTRAS
As amostras sensibilizadas apresentando o TDA positivo 3 ou 4+ foram divididas em
duas aliacutequotas e submetidas a duas teacutecnicas diferentes com o objetivo de dissociar o anticorpo
ligado Uma aliacutequota da amostra foi tratada com soluccedilatildeo de difosfato de cloroquina enquanto
a outra aliacutequota foi tratada com glicina-aacutecidaEDTA
42 PREPARO DA GLICINA AacuteCIDA-EDTA
A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA utiliza 3 soluccedilotildees diferentes a glicina aacutecida o
EDTA e o tampatildeo TRIS
Os reagentes foram preparados utilizando os sais para anaacutelise (PA) de EDTA
(Na2EDTA2H2O) TRIS (C4H11NO3) Glicina (H2NCH2CO2H) NaCl e a soluccedilatildeo de aacutecido
cloriacutedrico (HCl) 12 N todos reagentes da marca SYNTH (quadro 1)
Para o preparo do tampatildeo glicina-acida eacute necessaacuterio o ajuste do pH para 15 Para esse
ajuste utiliza-se aacutecido cloriacutedrico (HCl) concentrado O pH foi medido com fitas reativas de pH
com escala de 1 a 14 da marca MERCK Posteriormente a soluccedilatildeo foi enviada ao laboratoacuterio
de controle de qualidade do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto e o pH medido no peagacircmetro O
tampatildeo glicina-aacutecida foi armazenado a 4deg e o tampatildeo tris e o EDTA em temperatura ambiente
controlada (20 a 24deg Celsius)
Apoacutes o preparo e durante a realizaccedilatildeo dos testes foram feitas inspeccedilotildees visuais para
verificaccedilatildeo de turvaccedilatildeo do meio e presenccedila de precipitados
Reagente Material Quantidade Preparo e
Conservaccedilatildeo
EDTA
EDTA
(Na2EDTA2H2O)
5 gramas Mistura ateacute
dissoluccedilatildeo do sal e
conserva em
temperatura ambiente Aacutegua Destilada 50 Ml
Tris
TRIS (C4H11NO3) 121 gramas Conservar em
temperatura ambiente NaCl 525g
Aacutegua destilada 100ml
Gliacutecina-aacutecida
Glicina
(H2NCH2CO2H) 15 gramas
Conservar a 4oC NaCl 116gramas
Aacutegua Destilada 200ml
HCL 12N Ajutar o pH para 15
Quadro 1 - Preparo dos Reagentes da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
Fonte - Manual teacutecnico AABB 2011
26
O tampatildeo glicina-aacutecida e o tampatildeo TRIS satildeo estaacuteveis por 7 meses O reagente EDTA
precipitou mesmo estando em temperatura em ambiente controlado Houve necessidade de
preparo de novo reagente
421 TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
1 Em um tubo de ensaio 12x75 mm eacute adicionado 08 mL da soluccedilatildeo de glicina-aacutecida A
esta soluccedilatildeo adiciona-se 02 mL de EDTA e mistura
2 Adiciona-se 02 mL de hemaacutecias sensibilizadas (lavada 4 vezes) A mistura eacute
homogeneizada e incubada por exatamente 2 minutos
3 A seguir 01 mL de tampatildeo TRIS eacute adicionado agrave mistura que eacute novamente
homogeneizada e centrifugada por 2 minutos a 3400 rpm O pH deve estar entre 7 a 75
4 Apoacutes centrifugaccedilatildeo separa-se em outro tubo o sobrenadante (eluato) e as hemaacutecias
que permanecem satildeo lavadas 4 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica para retirada de todo o
reagente e anticorpos livres
43 PREPARO DA CLOROQUINA
A cloroquina eacute diluiacuteda em tampatildeo PBS na concentraccedilatildeo de 20 (Quadro 2) e
armazenado a 4deg Celsius sua validade apoacutes o preparo eacute de 1 mecircs
A teacutecnica da cloroquina jaacute estaacute padronizada para rotina do laboratoacuterio de
imunohematologia do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto e suas unidades
Reagente Reagentes Quantidade PreparoConservaccedilatildeo
Cloroquina
Difosfato de cloroquina
(C18H32ClN3O8P2)
20 gramas
Conservar a 4deg Celsius
Tampatildeo PBS 100ml
NaOH 01 N Acertar o pH para
51
Quadro 2 - Preparo da Cloroquina Fonte - Manual teacutecnico da AABB 2011
431 TEacuteCNICA DA CLOROQUINA
1 4 partes da soluccedilatildeo pronta eacute adicionada a uma parte de hemaacutecias lavadas 4 vezes com
soluccedilatildeo fisioloacutegica
2 A mistura eacute incubada em temperatura ambiente por ateacute duas horas
3 Centrifugar a 3400 rpm por 2 minutos
27
4 Remover o sobrenadante lavar as hemaacutecias novamente com soluccedilatildeo fisioloacutegica 4
vezes
44 VERIFICACcedilAtildeO DA EFETIVIDADE DOS TESTES
Apoacutes tratamento pelas duas teacutecnicas o TDA foi repetido em todas as amostras para
verificar se os tratamentos foram efetivos e houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo Para as
amostras tratadas pela teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA que permaneceram com TDA positivo
novo tratamento foi realizado
45 TESTE DO ELUATO
O eluato resultante das amostras tratadas com glicina-acidaEDTA foi testado com
hemaacutecias de triagem A soluccedilatildeo do eluato foi incubada com as hemaacutecias de triagem de
anticorpos (ID-Diacell BIO-RAD) pela teacutecnica em gel LissCoombs O teste foi incubado 15
minutos a 37deg Celsius e centrifugado por 10 minutos em centrifuga proacutepria para a teacutecnica em
gel Os eluatos que apresentaram resultados positivos foram testados em painel de 11
hemaacutecias (ID-Diapanel BIO-RAD) para a identificaccedilatildeo do anticorpo
46 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente que apresentou TDA positivo por IgG e pesquisa
de anticorpo irregular positivo com presenccedila de autoanticorpo com reatividade panaglutinina
A amostra foi tratada em paralelo pelas duas teacutecnicas descritas e foi enviada para o
Hemocentro para genotipagem eritrocitaacuteria que foi realizado por metodologia PCR em tempo
real no equipamento Real-time system PCR 7500 ( Applied Biosystems Califoacuternia EUA)
28
5 RESULTADOS
51 REAGENTES
Para aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA satildeo necessaacuterios 3 diferentes
reagentes que podem ser encontrados em forma de kit pronto para uso No entanto esses kits
natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil Os reagentes satildeo tampatildeo glicina-aacutecida o EDTA e o tampatildeo
Tris
Todos os reagentes foram preparados rdquoin houserdquo a partir dos sais e soluccedilotildees PA (puro
para anaacutelise) da marca SYNTH que foram adquiridos para a pesquisa O custo estimado para
cada teste foi aproximadamente R$ 020 reais
Apoacutes o preparo os reagentes poderiam ser armazenados em condiccedilotildees adequadas pelo
periacuteodo de 1 ano (AABB 2011) Ao final do preparo e durante o periacuteodo de armazenamento
de fevereiro a setembro de 2016 foi realizada inspeccedilatildeo visual para verificar a presenccedila de
precipitados ou turvaccedilatildeo A soluccedilatildeo de glicina e o tampatildeo TRIS mostraram-se estaacuteveis ateacute o
final do periacuteodo Por sua vez o reagente EDTA precipitou mesmo estando armazenado em
temperatura ambiente controlada e foi necessaacuterio novo preparo
52 AMOSTRAS DE DOADORES
521 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS AMOSTRAS
Apoacutes incubaccedilatildeo da hemaacutecia com o antissoro a mesma foi lavada 4 vezes para retirada
dos anticorpos livres A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada Caso houvesse positividade na
soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem a etapa era repetida (figura 3) Das 50 amostras sensibilizadas a
uacuteltima lavagem foi positiva somente em 3 delas Nas 3 amostras o anticorpo utilizado para
sensibilizaccedilatildeo foi o anti-K Apoacutes repetido nova etapa de lavagem os resultados se
apresentaram negativos
Em todas as amostras sensibilizadas ldquoin vitrordquo o TDA foi testado e verificado a
intensidade do teste Entre as 50 amostras 47 alcanccedilaram TDA com intensidade 3-4+ apoacutes a
primeira sensibilizaccedilatildeo enquanto 3 amostras necessitaram uma segunda incubaccedilatildeo com
anticorpo (figura 4)
A escolha dos anticorpos para sensibilizar as hemaacutecias foi feita de acordo com o
fenoacutetipo do doador e foram utilizados sete diferentes especificidades de anticorpos policlonais
humanos conforme mostra o graacutefico1
29
Figura 3 - Soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada com hemaacutecia de triagem de
anticorpos em gel LissCoombs (BIO-RAD) A finalidade eacute verificar a presenccedila de anticorpos livres na
suspensatildeo que possam interferir na pesquisa do eluato As soluccedilotildees de lavagem das amostras na figura a tiveram
resultados negativos Na figura b duas amostras a 47 e 50 apresentaram resultado positivo Nova etapa de
lavagem foi realizada e o resultado final foi negativo
522 TRATAMENTO DAS HEMAacuteCIAS
Apoacutes a sensibilizaccedilatildeo e obtenccedilatildeo de resultados de TDA com intensidade de 3 a 4+
cada uma das amostras foi dividida em duas aliacutequotas e tratada separadamente pelas teacutecnicas
de glicinaaacutecida-EDTA e cloroquina
As teacutecnicas foram consideradas efetivas quando obteve-se a completa dissociaccedilatildeo do
anticorpo verificada atraveacutes do TDA negativo na amostra poacutes tratamento conforme figuras 5
e 6 Dentre as amostras tratadas com cloroquina 2850 tiveram o TDA negativado A glicina-
aacutecidaEDTA negativou o TDA em 33 das 50 amostras tratadas Apenas 17 amostras tratadas
com glicina-aacutecidaEDTA permaneceram com o TDA positivo e foram submetidas a um novo
tratamento
30
Figura 4 - TDA das amostras apoacutes sensibilizaccedilatildeo com anticorpos policlonais humanos Amostras na
figura a com intensidades de 3-4+ Na figura b amostras 4 e 7 com intensidade menor que 3+ e portanto foram
novamente sensibilizadas com nova aliacutequota de soro Anti-D e anti-S Apoacutes a segunda sensibilizaccedilatildeo
apresentaram reatividade 4 e 3+ respectivamente Os anticorpos utilizados para sensibilizaccedilatildeo foram D S c E
C e K
523 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS TEacuteCNICAS
No tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA houve dissociaccedilatildeo completa do anticorpo
em 33 amostras (66) das 50 amostras testadas enquanto que com a cloroquina foram 28
amostras (56) (tabela 1)
31
Graacutefico 1- Nuacutemero de amostras sesnsibilizadas por especificidade de anticorpo Entre as 50 amostras 12
foram sensibilizadas com anti-D 10 com anti-C 9 com anti-E 8 com anti-c 7 com anti-S 3 com anti-K e 1
com anti-Dia As especificidades dos anticorpos foram definidas de acordo o fenoacutetipo do doador
Figura 5 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com cloroquina Nas amostras onde houve
a dissociaccedilatildeo do anticorpo ( 2 21 a 23 26 39 a 42 45 46 e 49) a hemaacutecia se deposita no fundo no microtubo
apoacutes a centrifugaccedilatildeo (TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (1 3 24 25 43 44 47
48 e 50) o anticorpo ligado agraves hemaacutecias eacute alvo da AGH presente no gel (TDA positivo)
Anti-D 12
Anti-C 10
Anti-E 9
Anti-c 8
Anti-S 7
Anti-K 3 Anti-Dia 1
32
Figura 6 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA Nas amostras
onde houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo (4 6 7 12 a 15 17 34 35 37 e 38) a hemaacutecia se deposita no fundo no
microtubo apoacutes a centrifugaccedilatildeo ( TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (5 16 18
19 20 33 e 36 ) o AGH presente no gel se liga ao anticorpo ligado agraves hemaacutecias que ficam retidas no gel (TDA
positivo)
Tabela 1-Resultado geral do tratamento das hemaacutecias com glicina e cloroquina
Teacutecnica utilizada TDA negativo TDA positivo Total
Glicina-aacutecidaEDTA 33 17 50
Cloroquina 28 22 50
A glicina-aacutecidaEDTA conseguiu negativar mais amostras sensibilizadas com Anti-D
e anti-K que a cloroquina Para as hemaacutecias sensibilizadas com anti-E Anti-S e Anti-Dia
ambas as teacutecnicas dissociaram o anticorpo em 100 das amostras Os resultados detalhados
por especificidade do anticorpo apoacutes o primeiro tratamento com glicina-aacutecidaEDTA e com
cloroquina estatildeo na tabela 2
Para as amostras que permaneceram positivas (17 amostras) apoacutes o tratamento com a
glicina-aacutecidaEDTA foi realizado um novo tratamento Houve dissociaccedilatildeo do anticorpo em 3
amostras (18) apoacutes a segunda tentativa Nas demais 14 (82) amostras tratadas pela
segunda vez 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise
33
Tabela 2 - Resultados do TDA apoacutes tratamento das hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo
sensibilizado
ANTICORPOS
SENSIBILIZADOS
1ordm TRATAMENTO COM
GLICINA
TRATAMENTO COM
CLOROQUINA
TOTAL TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
Anti-D 8 4 0 12 12
Anti-C 6 4 10 0 10
Anti-E 9 0 9 0 9
Anti-c 0 8 1 7 8
Anti-S 7 0 7 0 7
Anti-K 2 1 0 3 3
Anti-Dia 1 0 1 0 1
TOTAL 33 17 28 22 50
A hemoacutelise foi verificada durante o procedimento de lavagem final das hemaacutecias com
soluccedilatildeo fisioloacutegica para a retirada dos reagentes As soluccedilotildees de lavagem ficaram
avermelhadas e as hemaacutecias com coloraccedilatildeo escura As amostras foram descartadas Dentre as
6 amostras que ainda puderam ser testadas para o TDA trecircs amostras negativaram sendo 1
sensibilizada com anti-D e 2 com anti-C (tabela 3)
Tabela 3 - Resultado apoacutes o segundo tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA
Tratamento com
glicina-aacutecidaEDTA
TDA Negativo TDA Positvo Hemoacutelise Total
Segundo tratamento 3 3 11 17
524 TESTAGEM DO ELUATO
Apoacutes o tratamento com a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA a soluccedilatildeo do eluato foi
testada para verificar a viabilidade dos anticorpos que foram dissociados ou eluiacutedos Dentre
as 50 amostras 41 apresentaram eluato positivo As nove amostras cujos eluatos foram
negativos haviam sido sensibilizadas com as seguintes especificidades de anticorpos anti-E 6
amostras (67) anti-S 2 amostras (40) e anti-D 1 amostra (8) (tabela 4) O eluato de
todas as amostras sensibilizadas com os anticorpos anti-C anti-c Anti-K e Anti-Dia foram
positivos Os eluatos positivos na triagem de anticorpos foram testados com paineacuteis de
identificaccedilatildeo para confirmar a especificidade e a viabilidade dos anticorpos (figuras 7 e 8)
34
525 EFEITO DA ELUICcedilAtildeO SOBRE OS ANTIacuteGENOS ERITROCITAacuteRIOS
Para verificar o efeito do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA e com a cloroquina
sobre a expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s foi realizada a fenotipagem das
amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes tratamento com ambas as teacutecnicas Foi avaliado
se o tratamento destruiu os antiacutegenos expressos antes do tratamento
Tabela 4- Resultado do Eluato das amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA
Anticorpos Eluato positvo Eluato negativo Total
Anti-D 11 1 12
Anti-C 10 0 10
Anti-E 3 6 9
Anti-c 8 0 8
Anti-S 5 2 7
Anti-K 3 0 3
Anti-Dia 1 0 1
Total 41 9 50
Figura 7 ndash Painel do eluato da amostra 21 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-C que foi
recuperado no eluato
Figura 8 ndash Painel do eluato da amostra 47 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-K que foi
recuperado no eluato
35
Dentre as 50 amostras 26 eram previamente fenotipadas para os antiacutegenos Fya Fy
b
Jka Jk
b S e s Dentre elas 20 alcanccedilaram TDA negativo apoacutes tratamento com a glicina-
aacutecidaEDTA e 20 negativaram apoacutes tratamento com cloroquina (tabela 5) Apoacutes ambas as
teacutecnicas os antiacutegenos originalmente expressos permaneceram positivos comprovando que natildeo
houve destruiccedilatildeo dos mesmos
Tabela 5 ndash Verificaccedilatildeo da interferecircncia do tratamento da hemaacutecias com cloroquina e glicina-
aacuteicdaEDTA sobre os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
AMOSTRAS
COM
FENOTIPAGEM
PREacuteVIA
TRATADAS COM
CLOROQUINA
TRATADAS COM
GLICINA
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
26
20
20
20
20
As amostras 24 47 e 50 eram positivas para o antiacutegeno K A cloroquina natildeo dissociou
o anticorpo em nenhuma das 3 amostras enquanto a glicina-aacutecidaEDTA foi efetiva nas
amostras 24 e 50 Foi testada a expressatildeo do antiacutegeno K nas amostras 24 e 50 apoacutes o
tratamento utilizando meacutetodo indireto em gel contendo AGH Apesar de natildeo ter sido avaliado
a intensidade de reaccedilatildeo de expressatildeo dos antiacutegenos podemos verificar na figura 9 que nas
duas amostras em que a teacutecnica foi efetiva e dissociou o anticorpo a expressatildeo do antiacutegeno K
continua presente mas a reatividade observada pode ser considerada 1+ sugerindo que houve
diminuiccedilatildeo da expressatildeo do antiacutegeno quando comparado com a expressatildeo observada em
hemaacutecia natildeo tratada
Os resultados individuais de cada amostra em ambas as teacutecnicas encontram-se
resumidas na tabela 6
526 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente onde foi constatada a presenccedila de autoanticorpo
a quente da classe IgG pelo TDA monoespeciacutefico (figura 10)O autoanticorpo tambeacutem
interferia na pesquisa e identificaccedilatildeo de anticorpos irregulares pois apresentava caracteriacutestica
de panaglutinina As hemaacutecias da paciente sensibilizadas ldquoin vivordquo foram tratadas com
cloroquina e com glicina-aacutecidaEDTA
36
Figura 9 ndash Fenotipagem das amostras 24 e 50 para antiacutegeno K apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
O teste positivo indica a presenccedila do antiacutegeno poreacutem a reatividade fraca (1+) sugere que houve enfraquecimento
de sua expressatildeo A direita a expressatildeo forte (4+) do antiacutegeno Kell em hemaacutecia controle natildeo tratada utilizada
como controle positivo
A cloroquina natildeo foi efetiva na retirada do anticorpo ligado as hemaacutecias ao contraacuterio
do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA que dissociou o anticorpo (figura 11)
A hemaacutecia tratada com glicina foi fenotipada para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
(figura 12) A fenotipagem para o sistema Rh (C c E e e) e Kell foi realizada em gel
especiacutefico monoclonal sem interferecircncia do TDA positivo (controle da reaccedilatildeo negativo)
O eluato resultante do tratamento com glicina-aacutecidaEDTA foi testada em gel com
hemaacutecias de painel de identificaccedilatildeo de anticorpos e apresentou resultado positivo com todas
as ceacutelulas (figura 13 e 14)
A amostra foi enviada para genotipagem e o resultado da genotipagem confirmou o
resultado da fenotipagem apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
527 TEMPO DE EXECUCcedilAtildeO DA TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
O tempo de reaccedilatildeo da glicina-aacutecidaEDTA eacute de 2 minutos Todas as amostras foram
tratadas obedecendo ao tempo descrito na literatura demonstrando que o mesmo eacute
reprodutiacutevel
37
Tabela 6- Resultados individuais por amostra
Amostra Especificidade
dos anticorpos
Intensidade do
TDA apoacutes
sensibilizaccedilatildeo
Tratamento
efetivo com
cloroquina
Tratamento
efetivo com
glicina
Eluato
poacutes
glicina
1 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 2 Dia 3+ Sim Sim 3+ 3 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 4 D 4+ Natildeo Sim 4+ 5 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 6 E 3+ Sim Sim Negativo 7 S 4+ Sim Sim 3+ 8 E 3+ Sim Sim 1+ 9 E 3+ Sim Sim 2+
10 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 11 D 4+ Natildeo Sim 4+ 12 D 4+ Natildeo Sim 4+ 13 S 3+ Sim Sim 3+ 14 S 3+ Sim Sim 3+ 15 D 3+ Natildeo Sim 3+ 16 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 17 E 3+ Sim Sim (+) 18 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 19 D 4+ Natildeo Natildeo 3+ 20 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 21 C 3+ Sim Sim 4+ 22 C 3+ Sim Sim 4+ 23 C 3+ Sim Sim 4+ 24 K 4+ Natildeo Sim 4+ 25 D 3+ Natildeo Natildeo Negativo 26 E 4+ Sim Sim Negativo 27 S 3+ Sim Sim 3+ 28 C 3+ Sim Natildeo 4+ 29 C 3+ Sim Sim 4+ 30 C 3+ Sim Sim 4+ 31 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 32 E 3+ Sim Sim Negativo 33 C 3+ Sim Natildeo 4+ 34 S 3+ Sim Sim Negativo 35 S 3+ Sim Sim Negativo 36 C 4+ Sim Natildeo 4+ 37 c 4+ Natildeo Natildeo 4+ 38 D 4+ Natildeo Sim 4+ 39 S 3+ Sim Sim 3+ 40 c 4+ Sim Natildeo 2+ 41 C 4+ Sim Natildeo 4+ 42 E 3+ Sim Sim Negativo 43 D 3+ Natildeo Sim 2+ 44 D 3+ Natildeo Sim 2+ 45 E 3+ Sim Sim Negativo 46 C 3+ Sim Sim 4+ 47 K 4+ Natildeo Natildeo 4+ 48 D 3+ Natildeo Sim 2+ 49 E 3+ Sim Sim Negativo 50 K 4+ Natildeo Sim 4+
TOTAL 50 28 33 41
38
Figura 10 ndash TDA monoespeciacutefico da amostra de paciente Hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo da classe
IgG
oacute Figura 11 ndash TDA apoacutes o tratamento com glicina-aacutecidaEDTA (esquerda) e cloroquina (direita) A glicina
negativou completamente o TDA enquanto a hemaacutecia tratada com cloroquina persistiu positiva (1+)
39
Figura 12 ndash Fenotipagem da amostra tratada com glicina-aacutecidaEDTA Fy(a+b+) Jk(a-b+) S+s+
Figura 13 ndash Painel em gel (LissAGH) do eluato apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de
intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
Figura 14 ndash ndash Painel ezimaacutetico (hemaacutecias tratadas com bromelina) do eluato em gel neutro apoacutes
tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
40
528 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Quanto a efetividade das teacutecnicas em negativar o TDA foi verificado que a glicina-
aacutecidaEDTA foi efetiva em 66 das amostras testadas no primeiro tratamento (3350
amostras) enquanto a cloroquina conseguiu negativar 56 (2850) Esses resultados natildeo
apresentam diferenccedila significativa (pgt005) demostrando que a teacutecnica da glicina-
aacutecidaEDTA natildeo eacute superior mas eacute tatildeo efetiva quanto a da cloroquina
Quando aliamos os resultados de ambas as teacutecnicas verificamos que em 76 (3850)
das amostras o TDA foi negativado Esse dado indica que ainda que uma teacutecnica natildeo seja
eficaz na remoccedilatildeo do anticorpo eacute uma boa alternativa tentar a segunda teacutecnica jaacute que a falha
em remover o anticorpo utilizando uma delas natildeo prevecirc necessariamente a falha com a outra
Quando se utiliza o teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla (graacutefico 2) para comparar a utilizaccedilatildeo das
duas teacutecnicas com o resultado de cada uma isolada (somente a cloroquina ou somente a
glicina) verificamos que os resultados apresentam diferenccedila significativa (plt005) (quadro 3)
TRATAMENTO EFETIVO COM TOTAL PORCENTAGEM
Glicina ou cloroquina 38 76
Glicina e cloroquina 23 46
Glicina apenas 10 20
Cloroquina apenas 5 10
Nenhuma das teacutecnicas 12 24
Quadro 3 - Resultados comparativos entre as teacutecnicas utilizadas
41
Graacutefico 2 - Teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla entre as teacutecnicas aplicadas A- Glicina e Cloroquina B-Cloroquina C-
Glicina ( plt005)
42
6 DISCUSSAtildeO
Os reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA podem ser adquiridos em
forma de kit comercial prontos para uso poreacutem natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil A preparaccedilatildeo
dos reagentes ldquoin houserdquo a partir de sais comerciais adquiridos se mostrou viaacutevel Os
reagentes glicina e o tampatildeo Tris armazenados de forma correta se mantiveram estaacuteveis por
um periacuteodo de 7 meses Somente o reagente EDTA precipitou mesmo armazenado em
condiccedilotildees adequadas sugerindo que o mesmo deve ser preparado em menor quantidade e
armazenado em aliacutequotas A soluccedilatildeo de cloroquina tambeacutem pode ser preparada ldquoin houserdquo e
pode ser armazenado por um mecircs A legislaccedilatildeo brasileira autoriza a utilizaccedilatildeo de reagentes
preparados a partir de sais comerciais como a cloroquina e a glicina-aacutecidaEDTA desde que
os sais tenham autorizaccedilatildeo da vigilacircncia sanitaacuteria para a comercializaccedilatildeo (BRASIL 2001)
A comparaccedilatildeo quanto a efetividade em dissociar anticorpos em amostras com TDA
positivos entre a teacutecnica da glicina e a teacutecnica da cloroquina mostrou que natildeo haacute diferenccedila
estatiacutestica entre elas e que ambas satildeo igualmente eficientes Se utilizadas conjuntamente haacute
maior possibilidade de elucidaccedilatildeo dos casos
Uma vantagem da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eacute que ela permite numa mesma
amostra eluir o anticorpo ligado aacute hemaacutecia assim como fenotipar a hemaacutecia tratada Devido a
sua dupla utilidade a teacutecnica eacute vantajosa principalmente em pacientes em que pouco volume
de amostra pode ser coletado como em casos de crianccedilas e receacutem-nascidos
A fenotipagem poacutes tratamento se mostrou viaacutevel jaacute que os antiacutegenos de maior
importacircncia natildeo sofreram alteraccedilotildees Nas 20 amostras que foram fenotipadas antes e apoacutes
tratamento para verificar a influecircncia dos reagentes na expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a
Jkb S e s natildeo houve destruiccedilatildeo dos mesmos por nenhuma das duas teacutecnicas
Para as amostras positivas para o antiacutegeno Kell (350) e sensibilizadas com o
respectivo anticorpo a teacutecnica da glicina foi efetiva em negativar o TDA em apenas duas
delas mas apoacutes o tratamento foi verificada uma fraca reatividade da reaccedilatildeo antiacutegeno-
anticorpo sugerindo que houve um enfraquecimento da expressatildeo do antiacutegeno conforme
esperado e descrito na literatura (BYRNE 1991 PALLAS WILER E MCGEE 1991
ROZIERS e SQUALI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012 e KATHARIA e
CHAUDHARY 2013) A accedilatildeo da glicina sobre o antigeno Kell natildeo representa impedimento
para seu uso uma vez que na impossibilidade de testar o antiacutegeno Kell o banco de sangue
consegue facilmente atender a solicitaccedilatildeo de transfusatildeo com unidades de hemaacutecias Kell
43
negativas jaacute que eacute um antiacutegeno de baixa prevalecircncia na populaccedilatildeo variando de 15 na
populaccedilatildeo africana a 9 nos europeus (DANIELS 2011)
A soluccedilatildeo resultante da dissociaccedilatildeo do anticorpo pela teacutecnica da glicina pode ainda ser
utilizada como eluato podendo substituir a teacutecnica de eluiccedilatildeo com reagentes comercias (kits
de eluiccedilatildeo aacutecida) que tem alto custo aproximadamente entre R$2000 a R$2500 por teste
Em 41 amostras (82) houve a dissociaccedilatildeo e recuperaccedilatildeo do anticorpo que estava
sensibilizando as hemaacutecias Em 9 amostras (18) os anticorpos foram eluiacutedos poreacutem
apresentaram reaccedilatildeo negativa quando testadas com hemaacutecias de triagem entre eles o anti-E
(6) anti-S (2) e Anti-D (1) Eacute possiacutevel que a correccedilatildeo pH do meio (WALKER 2011) natildeo
tenha sido adequada o que pode ter desfavorecido a reatividade do anticorpo
Para as amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA nas quais natildeo houve dissociaccedilatildeo do
anticorpo pelo primeiro tratamento (1750) o segundo tratamento natildeo se mostrou eficaz jaacute
que 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise O tempo de
armazenagem natildeo parece ter influenciado jaacute que todas as amostras foram testadas dentro de
48 horas apoacutes a coleta Outros fatores que natildeo foram verificados podem ter levado a
hemoacutelise Apesar da literatura (LOUIE JIENG e ZEROULIS 1986 e BYRNE 1991)
recomendar um segundo tratamento ele eacute pouco eficaz tendo negativado apenas 3 das 17
amostras testadas
A amostra de paciente que apresentou sensibilizaccedilatildeo ldquoin vivordquo mostrou melhor
efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA sobre a da cloroquina possibilitando
fenotipagem para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s que natildeo foram destruiacutedos apoacutes o
tratamento comprovado atraveacutes da genotipagem
A presenccedila de autoanticorpo a quente com presenccedila de hemoacutelise (AHAI) ou natildeo pode
mascarar a presenccedila de aloanticorpo interferindo na rotina soroloacutegica da fenotipagem que eacute
uma importante ferramenta para auxiliar na seleccedilatildeo de hemaacutecias para transfusatildeo (SHIREY et
al 2002) Esses pacientes frequentemente possuem aloanticorpos associados ao
autoanticorpo e a prevalecircncia de aloimunizaccedilatildeo entre eles varia entre 12 a 40 (LEGER e
GARRATY 1999 BRANCH e PETZ 1999) o que dificulta ainda mais a escolha do melhor
componente a ser transfundido aleacutem de aumentar a possibilidade reaccedilotildees hemoliacuteticas imunes
poacutes-transfusionais
Nesses casos as teacutecnicas de dissociaccedilatildeo de anticorpos satildeo importantes para tratar
amostras de pacientes e a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser usada como uma opccedilatildeo
pois se mostrou eficaz na dissociaccedilatildeo anticorpo ligado agraves hemaacutecias deixando livre a
superfiacutecie das mesmas permitindo a fenotipagem por antisoros IgG Paralelamente os
44
anticorpos eluiacutedos tambeacutem puderam ser estudados O mesmo natildeo ocorre com a cloroquina
que permite apenas a fenotipagem e tampouco com os kits de eluiccedilatildeo aacutecida disponiacuteveis no
mercado nacional que satildeo destinados a realizaccedilatildeo do eluato mas destroem as hemaacutecias
O tempo de tratamento na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA tambeacutem eacute uma vantagem
pois foi possiacutevel reproduzir no tempo determinado de 2 minutos enquanto a cloroquina
demora ateacute duas horas
Ainda que a aplicaccedilatildeo das teacutecnicas por biologia molecular estejam cada vez mais
presentes na rotina imuno-hematoloacutegica e possibilitam estabelecer o fenoacutetipo deduzido do
genoacutetipo elas natildeo estatildeo disponiacuteveis na maioria dos centros e sua realizaccedilatildeo exige algumas
horas A resoluccedilatildeo imediata do problema transfusional necessita dos resultados soroloacutegicos
pois com frequecircncia natildeo eacute possiacutevel aguardar o resultado do teste molecular Dessa forma
apesar da crescente importacircncia da genotipagem eritrocitaacuteria teacutecnicas soroloacutegicas aplicadas
corretamente e no momento propiacutecio satildeo de grande utilidade para resolver problemas imuno-
hematoloacutegicos como ocorre com a fenotipagem em pacientes com TDA positivo
45
7 CONCLUSAtildeO
A teacutecnica da glicina aacutecidaEDTA mostrou-se efetiva em remover os anticorpos que
sensibilizavam as hemaacutecias e pode ser utilizada com seguranccedila antes da fenotipagem
eritrocitaacuteria Por ser uma teacutecnica de raacutepida execuccedilatildeo eacute uma alternativa aplicaacutevel
principalmente em casos urgentes de pacientes que apresentam autoanticorpos
46
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50
9 ANEXOS
51
FUNDACcedilAtildeO HEMOCENTRO DE RIBEIRAtildeO PRETO
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE)
Tiacutetulo da pesquisa Aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina aacutecida-EDTA e avaliaccedilatildeo da
eficaacutecia no tratamento de hemaacutecias com teste direto da antiglobulina positivo
Pesquisadora responsaacutevel Ceacutelia Kazue Abiko
Orientador Prof Dimas Tadeu Covas
Co-orientadora Dra Flaacutevia Leite Souza Santos
Objetivo da pesquisa Vocecirc estaacute sendo convidado a participar de uma pesquisa que tem
como objetivo padronizar uma nova teacutecnica para auxiliar na tipagem sanguiacutenea de pacientes
A tipagem sanguiacutenea pode sofrer interferecircncia da presenccedila de anticorpos ligados aos gloacutebulos
vermelhos do sangue Nessas situaccedilotildees eacute difiacutecil selecionar o melhor sangue para o paciente e
eacute preciso a utilizaccedilatildeo de teacutecnicas adicionais para remover essas interferecircncias
Esta pesquisa tem como objetivo estudar outra teacutecnica para remover esses anticorpos e
comparaacute-la com a teacutecnica atualmente utilizada Para isso precisamos de amostras de pacientes
e doadores voluntaacuterios
Se vocecirc eacute um doador eacute necessaacuterio que vocecirc autorize a coleta de 5 ml (1 tubo) a mais
de seu sangue
Se vocecirc eacute um paciente natildeo haveraacute necessidade de nova amostra pois utilizaremos as
amostras jaacute coletadas para os testes preacute-transfusionais e os resultados encontrados nesta
pesquisa natildeo iratildeo interferir na escolha da (s) bolsa (s) de sangue que vocecirc possa vir a receber
Se vocecirc concordar em participar leia com atenccedilatildeo o texto abaixo e assine as duas vias
rubricando todas as paacuteginas deste termo de consentimento Uma via original assinada e
rubricada por vocecirc e pela pesquisadora ficaraacute com vocecirc
As suas informaccedilotildees seratildeo mantidas em sigilo pela pesquisadora e natildeo haveraacute
armazenamento de material para pesquisas posteriores Os seus dados seratildeo usados apenas
neste estudo e quando o trabalho for publicado seu nome e qualquer outra informaccedilatildeo que
possam identificaacute-lo natildeo seratildeo revelados
Eacute pouco provaacutevel que o que noacutes aprendermos com este estudo tenha um benefiacutecio
direto para vocecirc assim como natildeo poderemos dar nada em troca pela sua participaccedilatildeo na
pesquisa
Nosso objetivo com esta pesquisa eacute que os resultados poderatildeo ser uacuteteis para o
tratamento de pacientes no futuro Os riscos da participaccedilatildeo satildeo miacutenimos Se vocecirc eacute um
doador de sangue a amostra seraacute coletada no momento da doaccedilatildeo natildeo exigindo punccedilatildeo
venosa adicional
52
Eacute seu direito ter acesso aos resultados dos testes da pesquisa Esses resultados natildeo
seratildeo fornecidos automaticamente a vocecirc mas caso vocecirc se interesse em saber o resultado ou
tiver alguma duacutevida sobre a sua participaccedilatildeo neste estudo deveraacute entrar em contato com Ceacutelia
Kazue Abiko pelo telefone (18) 99718-3551
Vocecirc tem total liberdade de optar por natildeo participar da pesquisa Caso aceite
participar poderaacute desistir a qualquer momento ou retirar seu consentimento mesmo apoacutes ter
coletado o sangue Para cancelar sua participaccedilatildeo basta avisar a pesquisadora e os seus dados
seratildeo retirados do projeto
Qualquer duacutevida eacutetica sobre a pesquisa poderaacute entrar em contato com o Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa do Hospital das Cliacutenicas e da Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto
(CAMPUS UNIVERSITAacuteRIO bairro Monte Alegre CEP 14048-900 Ribeiratildeo Preto-SP
Telefone (16) 3602-2228 FAX (16) 3633-1144 e-mail cephcrpuspbr)
Consentimento de participaccedilatildeo
A Consentimento do participante
Li as informaccedilotildees acima sobre o estudo e recebi explicaccedilotildees sobre a participaccedilatildeo no estudo
Portanto dou o meu consentimento para participar do estudo
___________________________________________________________________________
Nome completo
___________________________________________________________________________
Assinatura
___________
Data
__________________________________________________________________________________
Nome completo da pesquisadora
___________________________________________________________________________
Assinatura
_____________
Data
51 REAGENTES 28
52 AMOSTRAS DE DOADORES 28
521 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS AMOSTRAS 28
522 TRATAMENTO DAS HEMAacuteCIAS 29
523 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS TEacuteCNICAS 30
524 TESTAGEM DO ELUATO 33
525 EFEITO DA ELUICcedilAtildeO SOBRE OS ANTIacuteGENOS ERITROCITAacuteRIOS 34
526 AMOSTRA DE PACIENTE 35
527 TEMPO DE EXECUCcedilAtildeO DA TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA 36
528 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 40
6 DISCUSSAtildeO 42
7 CONCLUSAtildeO 45
8 REFEREcircNCIA BIBLIOGRAacuteFICA 46
9 ANEXOS 50
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Princiacutepio da teacutecnica direta da antiglobulinapaacutegina11
Figura 2 - Princiacutepio da teacutecnica indireta da antiglobulinapaacutegina 13
Figura 3 ndash Teste da soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem apoacutes sensibilizaccedilatildeo das hemaacuteciaspaacutegina 29
Figura 4 - TDA das amostras apoacutes sensibilizaccedilatildeo com anticorpospaacutegina 30
Figura 5 - Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com
cloroquina paacutegina 31
Figura 6 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA
paacutegina 32
Figura 7 - Painel do eluato da amostra 21 apresentando especificidade anti-Cpaacutegina 34
Figura 8 - Painel do eluato da amostra 47 apresentando especificidade anti-
K paacutegina 34
Figura 9 - Fenotipagem das amostras 24 e 50 para antiacutegeno K apoacutes tratamento com glicina-
aacutecidaEDTApagina 36
Figura 10 ndash TDA monoespeciacutefico Amostra sensibilizadardquo in vivordquo com anticorpo anti-
IgGpaacutegina 38
Figura 11 ndash TDA apoacutes o tratamentopaacutegina 38
Figura 12 ndash Resultado da fenotipagem da amostra sensibilizada ldquoin vivordquo por anti-
IgGpaacutegina 39
Figura 13 ndash Painel do eluato poacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA paacutegina 39
Figura 14 ndash Painel do eluato poacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA paacutegina 39
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Resultado geral do tratamento das hemaacutecias com glicina e
cloroquinapaacutegina 32
Tabela 2 - Resultados do TDA apoacutes tratamento da hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo
sensibilizadopaacutegina 33
Tabela 3 - Resultado apoacutes o segundo tratamento das hemaacutecias com glicina-
aacutecidaEDTApaacutegina 33
Tabela 4 - Resultado do Eluato das amostras tratadas com glicina-
aacutecidaEDTA paacutegina 34
Tabela 5 ndash Verificaccedilatildeo da interferecircncia do tratamento da hemaacutecias com cloroquina e glicina-
aacutecidaEDTA nos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e spaacutegina 35
Tabela 6 - Resultado da sensibilizaccedilatildeo das amostras efetividade do tratamento com
cloroquina glicina e o eluato poacutes tratamento com glicinapaacutegina 37
LISTA DE GRAFICOS
Graacutefico 1 - Nuacutemero de amostras sensibilizadas por especificidade de
anticorpopaacutegina 31
Graacutefico 2 - Teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla entre as teacutecnicas
aplicadaspaacutegina 41
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 - Preparo dos Reagentes da glicina-aacutecidaEDTApaacutegina 25
Quadro 2 - Preparo da Cloroquinapaacutegina 26
Quadro 3 - Resultados comparativos entre as teacutecnicas utilizadas paacutegina 40
LISTA DE FLUXOGRAMAS
Fluxograma 1 - Fluxograma da pesquisa utilizando as amostras de
doadorespaacutegina 22
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ABO
AHAI
Bg
c
C
C
C3
C3b
C3d
D
DHFRN
DNA
DTT
E
e
EDTA
Fc
Fya
Fyb
HCl
IgA
IgD
IgE
IgM
Mm
NaCl
PA
PAI
PBS
PCR
PEG
pH
Rh
rpm
S
s
SIDA
SBS
TCLE
TDA
TIA
TRIS
ZZAP
microL
Sistema Sanguiacuteneo ABO
Anemia Hemoliacutetica Autoimune
Antiacutegeno Bg
Antiacutegeno c
Celsius
Antiacutegeno C
Complemento
Fraccedilatildeo do complemento
Fraccedilatildeo do complemento
Antiacutegeno D
Doenccedila Hemoliacutetica do Feto e do Receacutem-nascido
Aacutecido desoxirribonucleico
Dithiothreitol
Antiacutegeno E
Antiacutegeno e
Aacutecido Etileno Diamino Tetraceacutetico
Porccedilatildeo do anticorpo
Antiacutegeno Duffy a
Antiacutegeno Duffy b
Aacutecido cloriacutedrico
Imunoglobulina A
Imunoglobulina D
Imunoglobulina E
Imunoglobulina M
Miliacutemetros
Cloreto de soacutedio
Puro para anaacutelise
Pesquisa de anticorpos irregulares
Tampatildeo fosfato salino
Reaccedilao em cadeia de polimerase
Polietilenoglicol
Potencial hidrogeniocircnico
Sistema sanguiacuteneo Rh
Rotaccedilotildees por minuto
Antiacutegeno S
Antiacutegeno s
Siacutendrome da Imunodeficiecircncia adquirida
Sistema de banco de sangue
Termo de consentimento livre e esclarecido
Teste direto da antiglobulina
Teste indireto da antiglobulina
Hidrometil aminometano
Sulphydryl-Proteolytic Enzyme
Microlitros
RESUMO
Os testes preacute-transfusionais satildeo o conjunto de teacutecnicas imuno-hematoloacutegicas aplicadas nas
amostras do receptor e do doador com a finalidade de fornecer uma unidade de hemaacutecias
compatiacutevel e segura para a transfusatildeo Aleacutem da fenotipagem ABO e Rh obrigatoacuteria nos testes
preacute-transfusionais a determinaccedilatildeo do perfil antigecircnico de outros antiacutegenos eritrocitaacuterios de
importacircncia cliacutenica melhora a seguranccedila transfusional especialmente para pacientes
previamente aloimunizados ou candidatos agrave transfusatildeo crocircnica Para tais pacientes conhecer o
fenoacutetipo eritrocitaacuterio permite a seleccedilatildeo de concentrados de hemaacutecias com o mesmo fenoacutetipo
o que previne reaccedilotildees transfusionais hemoliacuteticas assim como nova aloimunizaccedilatildeo
Indiviacuteduos que apresentam as hemaacutecias sensibilizadas ldquoin vivordquo por anticorpos anti-
eritrocitaacuterios como ocorre na anemia hemoliacutetica autoimune (AHAI) teratildeo o teste direto da
antiglobulina (TDA) positivo dificultando a realizaccedilatildeo da fenotipagem O TDA positivo
provoca resultados falsos positivos especialmente quando satildeo utilizados para a fenotipagem
soros comerciais da classe IgG que exigem a fase de antiglobulina humana ou teste indireto
da antiglobulina (TIA) para leitura Em 1982 Edwards Moulds e Judd propuseram a
utilizaccedilatildeo da teacutecnica da cloroquina para dissociar os complexos de antiacutegeno-anticorpo
preservando a membrana eritrocitaacuteria e permitindo a fenotipagem Atualmente eacute a teacutecnica
mais utilizada nos centros brasileiros A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA foi primeiramente
descrita por Louie Jieng e Zeroulis em 1986 poreacutem eacute pouco utilizada por natildeo haver os
reagentes prontos comercialmente no mercado brasileiro O presente estudo avaliou a teacutecnica
da glicina-aacutecida-EDTA com reagentes preparados ldquoin houserdquo em paralelo agrave teacutecnica da
cloroquina que eacute atualmente a teacutecnica aplicada no Hemocentro de Ribeiratildeo Preto Para isso
amostras de hemaacutecias de doadores (n=50) com fenoacutetipo conhecido foram sensibilizadas com
anticorpos humanos de especificidade conhecida e ambas as teacutecnicas foram aplicadas Foi
verificado ainda o efeito da teacutecnica sobre a expressatildeo dos antiacutegenos eritrocitaacuterios (Fya Fy
b
Jka Jk
b S e s) atraveacutes da fenotipagem das amostras que tiveram o TDA negativado A
viabiliadade dos anticorpos presentes no eluato recuperado apoacutes tratamento com a glicina-
aacutecidaEDTA tambeacutem foi testada A glicina-aacutecidaEDTA foi efetiva em negativar o TDA em
33 amostras (66) comparaacutevel com a cloroquina que negativou 28 amostras (56) O eluato
apresentou-se viaacutevel no tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA e natildeo foi constatada destruiccedilatildeo
dos antiacutegenos eritrocitaacuterios apoacutes o tratamento Concluiacutemos que a teacutecnica da glicina-
aacutecidaEDTA pode ser utilizada como uma opccedilatildeo no tratamento de hemaacutecias com TDA
positivo com a vantagem de seu tempo de execuccedilatildeo ser inferior ao da cloroquina (2minutos x
30 a 120 minutos) o que lhe torna uacutetil em situaccedilotildees de maior urgecircncia Quando ambas as
teacutecnicas satildeo utilizadas em hemaacutecias diferentes de uma mesma amostra a efetividade estaacute
significativamente aumentada (plt005)
Palavras chave Glicina-aacutecidaEDTA Teste direto da antiglobulina AHAI fenotipagem
ABSTRACT
The pre-transfusion tests are the group of immunohematology techniques applied in the
receptor and donor samples in order to provide a unit of red blood cells compatible and safe
for transfusion In addition to the obligatory ABO and Rh phenotyping in the pre-transfusion
tests the determination of the antigenic profile of other red cells antigens of clinical
importance improves transfusion safety especially for patients previously alloimmunized or
candidates for chronic transfusion For such patients knowing the phenotype allows the
selection of red blood cell concentrates with the same phenotype which prevents hemolytic
transfusion reactions as well as new alloimmunization Individuals who have antibody-coated
red blood cells sensitized in vivo such as in autoimmune hemolytic anemia (AHAI) will
have a direct antiglobulin test (DAT) positive making it difficult to perform phenotyping
Positive DAT causes false positive results especially when commercially available IgG
serums which require the human antiglobulin phase or indirect antiglobulin test (IAT) for
reading are used for phenotyping In 1982 Edwards Molds and Judd proposed the use of the
chloroquine technique to dissociate antigen-antibody complexes by preserving the erythrocyte
membrane and allowing phenotyping It is currently the most used technique in Brazilian
centers The EDTAglycine-acid technique was first described by Louie Jieng and Zeroulis in
1986 but it is little used because commercially available reagents are not available in the
Brazilian market The present study evaluated the EDTAglycine-acid technique with reagents
prepared in house in parallel to the chloroquine technique which is currently the technique
applied at the Hemocentro de Ribeiratildeo Preto For this donor red cells samples (n = 50) with
known phenotype were sensitized with human antibodies of known specificity and both
techniques were applied The effect of the technique on the expression of erythrocyte antigens
(Fya Fy
b Jk
a Jk
b S and s) was also verified by the phenotyping of the samples that had
negative DAT The viability of the antibodies present in the recovered eluate after treatment
with EDTAglycine-acid A was also tested EDTAglycine-acid was effective in negatively
affecting DAT in 33 samples (66) comparable to chloroquine that negatived 28 samples
(56) The eluate was viable in treatment with EDTAglycine-acid and no destruction of
erythrocyte antigens after treatment We conclude that the EDTA glycine-acid technique can
be used as an option in the treatment of red cells with TDA positive with the advantage that
its execution time is inferior to that of chloroquine (2 minutes x 30 to 120 minutes) which
makes it useful in emergency situations When both techniques are used in different
erythrocytes of the same sample the effectiveness is significantly increased (p lt005)
Key words EDTAglycine-acid direct antiglobulin test AIHA phenotyping
1 INTRODUCcedilAtildeO
A transfusatildeo de hemaacutecias eacute um recurso terapecircutico muito importante e eficaz e tem se
mostrado como um grande aliado no tratamento de diversas patologias auxiliando na
melhoria da sobrevida e qualidade de vida de diversos pacientes quando indicada de forma
correta Eacute provavelmente a modalidade de terapia mais utilizada no mundo sendo
considerada a forma mais antiga de terapia celular A transfusatildeo de hemaacutecias em pacientes
com anemia grave ou sangramento agudo reestabelece o niacutevel de hemoglobina moleacutecula
responsaacutevel pelo transporte de oxigecircnio para os tecidos melhorando a isquemia tecidual
(BARJAS-CASTRO 2013 ZAGO 2014)
A transfusatildeo de componentes celulares como o concentrado de hemaacutecias deve ser
bem avaliada quanto aos riscos e benefiacutecios Os testes preacute-transfusionais satildeo parte obrigatoacuteria
do processo transfusional e tecircm como funccedilatildeo assegurar que o melhor hemocomponente seja
selecionado para o paciente reduzindo assim a chance de transfusotildees incompatiacuteveis e reaccedilotildees
transfusionais (BARJAS-CASTRO 2013)
11TESTES PREacute-TRANSFUSIONAIS
Os testes preacute-transfusionais tecircm a finalidade de evitar a ocorrecircncia de reaccedilotildees
hemoliacuteticas no receptor decorrentes da transfusatildeo de hemaacutecias incompatiacuteveis do doador
(DOWNES e SHULMAN 2011) Tem como propoacutesito selecionar hemaacutecias que apoacutes
transfusatildeo deveratildeo ter sobrevida normal ou mais proacutexima do normal (MELO 2007)
Os testes preacute-transfusionais que consistem no conjunto de teacutecnicas
imunohematoloacutegicas aplicadas agraves amostras do receptor e doador devem ser realizados antes
de toda transfusatildeo A aplicaccedilatildeo desses testes tem como finalidade fornecer uma unidade de
hemaacutecias compatiacutevel e elevar a seguranccedila da transfusatildeo Os testes preacute-transfusionais aliados
a utilizaccedilatildeo de novas tecnologias tem historicamente evitado reaccedilotildees transfusionais
hemoliacuteticas garantindo a seguranccedila transfusional em cerca de 95 dos pacientes que recebem
transfusatildeo Eacute imprescindiacutevel poreacutem a execuccedilatildeo correta das teacutecnicas envolvidas nos testes preacute-
transfusionais e ainda garantir a identificaccedilatildeo correta do receptor e das amostras de sangue e
das unidades de hemaacutecias (CASTILHO 2000 MELO 2007 BARJAS-CASTRO 2013)
2
Todos os testes que compotildeem a rotina preacute-transfusional usam meacutetodos soroloacutegicos
que envolvem a reaccedilatildeo antiacutegeno x anticorpo Ao testar a presenccedila de um antiacutegeno na
superfiacutecie da hemaacutecia eacute necessaacuterio dispor de um soro com especificidade conhecida para
aquele antiacutegeno Por outro lado testar a presenccedila de um determinado anticorpo no soro ou no
plasma exige o uso de hemaacutecias com perfil antigecircnico conhecido Os testes preacute-transfusionais
incluem tipagem ABO (direta e reversa) tipagem Rh pesquisa de anticorpos irregulares no
sangue do receptor retipagem ABO e Rh do hemocomponente e prova de compatibilidade
entre as hemaacutecias do doador e soro ou plasma do receptor em caso de transfusatildeo de hemaacutecias
ou hemocomponentes que contenham mais de 2 mL de volume eritrocitaacuterio como o
concentrado de granuloacutecitos (BRASIL 2016 GANZELLA 2014 SANTOS 2014)
Aleacutem dos testes regularmente realizados a determinaccedilatildeo do fenoacutetipo para outros
antiacutegenos eritrocitaacuterios do doador e do receptor pode ser indicada A fenotipagem eritrocitaacuteria
determina o perfil antigecircnico para outros antiacutegenos de importacircncia cliacutenica aleacutem do sistema
ABO e do antiacutegeno RhD Ela pode auxiliar a confirmaccedilatildeo de uma especificidade de anticorpo
encontrada no soro do paciente uma vez que espera-se que a sua hemaacutecia natildeo expresse o
antiacutegeno correspondente e simultaneamente eacute utilizada para selecionar um concentrado de
hemaacutecias negativo para o respectivo antiacutegeno evitando reaccedilotildees hemoliacuteticas transfusionais A
fenotipagem de candidatos a transfusotildees crocircnicas tambeacutem eacute recomendada pois esse grupo de
pacientes deve se beneficiar com a transfusatildeo profilaacutetica de unidades de hemaacutecias com
mesmo fenoacutetipo evitando assim a aloimunizaccedilatildeo assim como reaccedilotildees hemoliacuteticas provocadas
por anticorpos previamente existentes e em baixo tiacutetulo natildeo identificados pela triagem de
anticorpos (CASTILHO JUNIOR e REID 2015 DOWNES e SHULMAN 2011)
111 TIPAGEM ABORh
O sistema ABO (ISBT001) foi o primeiro sistema de grupo sanguiacuteneo a ser
descoberto Ele foi descrito em 1900 por Karl Landsteiner e eacute considerado o sistema de maior
importacircncia na praacutetica transfusional Ele eacute composto por quatro antiacutegenos A1 (ABO1) B
(ABO2) AB (ABO3) e A1 (ABO4) e eacute caracterizado pela presenccedila dos anticorpos naturais
ou seja anticorpos que surgem sem a exposiccedilatildeo preacutevia aos antiacutegenos atraveacutes de transfusatildeo ou
gestaccedilatildeo Os anticorpos ABO satildeo predominantemente da classe IgM satildeo capazes de fixar o
complemento e de provocar hemoacutelise grave intravascular caso ocorra transfusatildeo ABO
incompatiacutevel Por apresentar essa caracteriacutestica peculiar a tipagem do sistema ABO eacute
composta de duas etapas a prova direta e a prova reversa Na prova direta eacute realizada a
pesquisa dos antiacutegenos na superfiacutecie das hemaacutecias que satildeo testadas com soros comerciais
3
Anti-A e Anti-B A prova reversa por sua vez pesquisa a presenccedila de anticorpos ABO ao
testar o soro ou plasma do pacientedoador com hemaacutecias A1 e B Ambas as provas satildeo
obrigatoacuterias e devem ser concordantes para interpretaccedilatildeo do fenoacutetipo ABO (COOLING
2011 SANTOS 2014)
O sistema Rh (ISBT004) eacute o maior e mais complexo sistema de grupos sanguiacuteneos
compreendendo atualmente 54 antiacutegenos (ISBT 2016) Satildeo cinco os principais antiacutegenos do
sistema Rh D (RH1) C (RH2) E (RH3) c (RH4) e e (RH5) Esses antiacutegenos possuem alta
capacidade imunogecircnica e seus respectivos anticorpos estatildeo envolvidos na doenccedila hemoliacutetica
perinatal e em reaccedilotildees transfusionais hemoliacuteticas Os autoanticorpos quentes como ocorre na
anemia hemoliacutetica quente satildeo representados em grande parte por anticorpos contra antiacutegenos
puacuteblicos do sistema Rh (CASTILHO 2007 CHOU e WESTHOFF 2011 BARJAS-
CASTRO 2013) A tipagem RhD pesquisa o antiacutegeno D na membrana eritrocitaacuteria ao testar a
hemaacutecia com antissoros comerciais Atualmente a maior parte dos soros Anti-D
comercializados satildeo monoclonais
112 ANTICORPOS ANTI-ERITROCITAacuteRIOS
Anticorpos satildeo proteiacutenas presentes no plasma tambeacutem denominadas imunoglobulinas
Satildeo produzidas pelo sistema imune em resposta a um determinado antiacutegeno Podem ser
classificadas de acordo com suas caracteriacutesticas e propriedades em cinco classes de
imunoglobulinas IgG IgM IgA IgE e IgD (BARJAS-CASTRO 2013)
A ligaccedilatildeo entre o antiacutegeno e o anticorpo envolvem ligaccedilotildees natildeo covalentes que satildeo
reversiacuteveis Vaacuterios tipos de interaccedilotildees natildeo covalentes podem contribuir para a ligaccedilatildeo do
antiacutegeno pelo anticorpo incluindo forccedilas eletrostaacuteticas pontes de hidrogecircnio forccedilas de Van
der Walls e interaccedilotildees hidrofoacutebicas (ABBAS LICHTMAN e PILLAI 2008)
As interaccedilotildees antiacutegeno-anticorpo satildeo constituiacutedas por ligaccedilotildees dinacircmicas que sofrem
interferecircncia de alteraccedilotildees fiacutesico-quiacutemicas no meio como mudanccedilas na temperatura na forccedila
eletrostaacutetica na concentraccedilatildeo do antiacutegeno e do anticorpo e no pH O melhor pH para a reaccedilatildeo
eacute em torno de 70 no entanto raros anticorpos podem exigir acidificaccedilatildeo do meio para serem
identificados (SANTOS 2014)
Em imunohematologia satildeo pesquisados os anticorpos que reconhecem os antiacutegenos
eritrocitaacuterios de grupo sanguiacuteneo ldquoin vivordquo esses anticorpos dependendo de seu significado
cliacutenico satildeo capazes de reconhecer seus respectivos antiacutegenos sobre a hemaacutecia podendo levar
a sua destruiccedilatildeo por dois mecanismos fagocitose por macroacutefagos no sistema
4
reticuloendotelial ou por ativaccedilatildeo do sistema complemento com a formaccedilatildeo do complexo de
ataque a membrana e hemoacutelise intravascular As duas classes de anticorpos de maior
importacircncia em imunohematologia satildeo as imunoglobulinas IgG e a IgM (SANTOS 2014)
Devido a sua estrutura pentameacuterica os anticorpos da classe IgM se ligam aos
antiacutegenos localizados na superfiacutecie da membrana de hemaacutecias proacuteximas e promovem
aglutinaccedilatildeo das mesmas em meio salino ldquoin vitrordquo Anticorpos da classe IgG por sua vez
satildeo denominados ldquonatildeo aglutinantesrdquo ou ldquoincompletosrdquo pois sua estrutura de monocircmero eacute
pequena o que desfavorece a aglutinaccedilatildeo direta uma vez que uma mesma moleacutecula de IgG
natildeo alcanccedila antiacutegenos alvos em duas hemaacutecias proacuteximas Os anticorpos IgM aleacutem de terem
um tamanho maior apresentam 750 vezes maior eficiecircncia de aglutinaccedilatildeo que os anticorpos
IgG permitindo maior facilidade nas ligaccedilotildees entre as hemaacutecias (CARRUCIO e WISE 2012
GREEN e KLOSTERMANN 2012)
Nos testes ldquoin vitrordquo satildeo simulados reaccedilotildees que poderiam ocorrer ldquoin vivordquo causando
reaccedilotildees indesejaacuteveis A fase de sensibilizaccedilatildeo em que o anticorpo se liga ao antiacutegeno
correspondente natildeo eacute identificada macroscopicamente poreacutem uma vez que o anticorpo
aproxima as hemaacutecias e vence a forccedila eletrostaacutetica que naturalmente as repele chamada de
potencial zeta ocorre a aglutinaccedilatildeo Dependendo das caracteriacutesticas do anticorpo e de sua
capacidade de fixar complemento pode ocorrer tambeacutem a hemoacutelise (SANTOS 2014)
113 PESQUISA E IDENTIFICACcedilAtildeO DE ANTICORPOS IRREGULARES
A pesquisa de anticorpos irregulares eacute teste obrigatoacuterio nos testes preacute-transfusionais e
tem a finalidade de detectar anticorpos ldquoin vitrordquo que possam causar reaccedilatildeo ldquoin vivordquo
Dependendo da populaccedilatildeo estudada (pacientes x doadores) e ainda da sensibilidade do
teste a frequecircncia de anticorpos irregulares pode variar de 03 a 38 A imunizaccedilatildeo pode
ocorrer por transfusatildeo gestaccedilatildeo transplante ou injeccedilatildeo de material imunogecircnico (WALKER
2011)
Os anticorpos irregulares podem ser classificados como aloanticorpos que satildeo
voltados contra antiacutegenos ausentes na hemaacutecia autoacuteloga ou como autoanticorpos os quais
reconhecem antiacutegenos eritrocitaacuterios proacuteprios Os autoanticorpos antieritrocitaacuterios surgem em
decorrecircncia da desregulaccedilatildeo da autotoleracircncia imune relacionada agrave condiccedilotildees diversas como
doenccedilas hematoloacutegicas doenccedilas inflamatoacuterias autoimunes neoplasias infecccedilotildees e uso de
medicaccedilotildees A presenccedila do autoanticorpo associado a um quadro de anemia hemoliacutetica
caracteriza a anemia hemoliacutetica autoimune (AHAI) seja ela primaacuteria ou secundaacuteria agrave outra
5
patologia Ateacute 12 a 40 dos pacientes com autoanticorpos quentes podem apresentar
aloanticorpos de significado cliacutenico mascarados pelos autoanticorpos (SHIREY et al 2002)
Eacute importante detectar a presenccedila de anticorpos no plasmasoro de um receptor de
transfusatildeo para garantir que seja transfundido sangue compatiacutevel Quando a pesquisa de
anticorpo irregular resultar positiva para um ou mais anticorpos de relevacircncia clinica eacute
necessaacuterio confirmar a ausecircncia do respectivo antiacutegeno na hemaacutecia do receptor assim como
selecionar para transfusatildeo concentrados de hemaacutecias tambeacutem negativos para aqueles
antiacutegenos evitando assim reaccedilotildees transfusionais (WALKER 2011)
A detecccedilatildeo de um anticorpo irregular eacute inicialmente realizada pela triagem de
anticorpos na qual o soroplasma do receptor eacute testado com 2 a 3 hemaacutecias do tipo ldquoOrdquo O
conjunto de fenoacutetipos dessas hemaacutecias deve contemplar os antiacutegenos de maior importacircncia
cliacutenica Como os anticorpos irregulares de maior interesse cliacutenico satildeo na maior parte das
vezes imunes portanto da classe IgG eacute obrigatoacuteria a fase de antiglobulina (AGH) do teste
ou teste indireto da antiglobulina (TIA) uma vez que esses anticorpos satildeo incompletos
(CASTILHO JUNIOR e REID 2015) O teste de triagem estando positivo deve-se fazer a
identificaccedilatildeo da especificidade do anticorpo utilizando um painel com maior nuacutemero de
hemaacutecias fenotipadas
114 PROVA DE COMPATIBILIDADE
A prova de compatibilidade eacute um teste obrigatoacuterio em caso de transfusatildeo de
componentes eritrocitaacuterios Tambeacutem chamada de prova de compatibilidade maior deve ser
realizada antes da administraccedilatildeo de sangue total ou concentrado de hemaacutecias utilizando-se
hemaacutecias obtidas do tubo coletor da bolsa a ser transfundida e o soro ou plasma do receptor
(BRASIL 2016)
Eacute definido como o procedimento para excluir a incompatibilidade entre o doador e o
receptor Tem o objetivo de detectar anticorpos que podem natildeo ter sido encontrados na
pesquisa de anticorpos devido a ausecircncia ou pouca expressatildeo de antiacutegenos no painel de
hemaacutecias aleacutem da possibilidade de terem ocorrido erros teacutecnicos ou notacionais durante a
realizaccedilatildeo da pesquisa (MELO 2007)
6
115 FENOTIPAGEM PARA OUTROS SISTEMAS
Aleacutem da pesquisa de ABORh que eacute realizado rotineiramente a fenotipagem para
outros sistemas tambeacutem denominado ldquofenotipagem estendidardquo determina a presenccedila ou
ausecircncia de antiacutegenos considerados de importacircncia cliacutenica A fenotipagem natildeo eacute obrigatoacuteria
nos testes preacute-transfusionais poreacutem a legislaccedilatildeo atual recomenda a realizaccedilatildeo da fenotipagem
eritrocitaacuteria dos antiacutegenos C (RH2) E (RH3) c (RH4) e (RH5) K (KELL1) Fya (FY1) Fy
b
(FY2) Jka
(JK1) Jkb (JK2) S (MNS3) e s (MNS4) para pacientes aloimunizados e pacientes
com indicaccedilatildeo de transfusatildeo crocircnica (BRASIL 2016)
A seleccedilatildeo de concentrados de hemaacutecias com o mesmo fenoacutetipo do receptor para
transfusatildeo pode evitar reaccedilotildees transfusionais hemoliacuteticas no paciente previamente
aloimunizado tambeacutem previne a sensibilizaccedilatildeo por outros antiacutegenos o que normalmente
torna as transfusotildees seguintes ainda mais complicadas A fenotipagem do paciente tambeacutem
auxilia na identificaccedilatildeo dos anticorpos pois espera-se que nas hemaacutecias do paciente o
antiacutegeno seja negativo para o anticorpo encontrado servindo de guia para teste de exclusatildeo de
anticorpos (SANTOS 2014 WALKER 2011)
A incidecircncia de aloanticorpos aumenta com o nuacutemero de transfusotildees no entanto a
implantaccedilatildeo de rotina de fenotipagem com transfusatildeo profilaacutetica de hemaacutecias com fenoacutetipo
compatiacutevel para pacientes candidatos agrave politransfusatildeo como os portadores de doenccedila
falciforme talassemia anemia aplaacutestica doenccedilas linfo e mieloproliferativas renais crocircnicos e
anemias refrataacuterias pode contribuir para o baixo iacutendice de sensibilizaccedilatildeo nessas populaccedilotildees
(FLUIT KUNST e DRENTHE-SCHONK 1999 MARTINS et al 2008 e VICHINSKY et
al 2001) Outro grupo de pacientes que se beneficia com a transfusatildeo de mesmo fenoacutetipo satildeo
os pacientes com AHAI uma vez que o autoanticorpo pode mascarar a presenccedila de um
aloanticorpo de significado cliacutenico em ateacute 40 dos casos Mesmo com as teacutecnicas utilizadas
ldquoin vitrordquo para remover a interferecircncia do autoanticorpo no soro um aloanticorpo pode natildeo
ser identificado e dessa forma transfundir o mesmo fenoacutetipo do paciente evitaria reaccedilatildeo
hemoliacutetica pelos anticorpos voltados contra antiacutegenos de maior importacircncia cliacutenica e de
frequecircncia intermediaacuteria Aleacutem disso os pacientes com AHAI satildeo fortes respondedores e a
transfusatildeo profilaacutetica do mesmo fenoacutetipo previne a aloimunizaccedilatildeo (SHIREY et al 2002)
Aleacutem de fenotipar o receptor eacute importante tambeacutem que os bancos de sangue tenham
rotinas de fenotipagem de doadores para atender as necessidade dos pacientes aloimunizados
ou em esquema de transfusatildeo crocircnica (PINTO BRAGA e SANTOS 2011)
7
Rotineiramente eacute inviaacutevel estabelecer o fenoacutetipo eritrocitaacuterio completo de um
indiviacuteduo pela grande diversidade de sistemas sanguiacuteneos descritos Ate junho de 2015 jaacute
haviam sido classificados 308 antiacutegenos atribuiacutedos a 36 sistemas definidos pela Sociedade
Internacional de Transfusatildeo de Sangue (ISBT) (CASTILHO JUNIOR e REID 2015)
Portanto o paciente eacute normalmente fenotipado para os antiacutegenos de maior importacircncia
clinica
Alguns fatores podem limitar a realizaccedilatildeo da fenotipagem eritrocitaacuteria Um dos fatores
eacute a transfusatildeo alogecircnica realizada haacute menos de 90 dias Neste caso podem ocorrer resultados
falso positivos para determinados antiacutegenos devido agrave presenccedila de hemaacutecias do doador
(LAINE et al 2000)
Outro fator eacute a presenccedila de anticorpo sensibilizando a hemaacutecia do paciente e
provocando positividade do teste direto da antiglobulina humana (TDA) Os soros
normalmente utilizados para fenotipagem especialmente para os antiacutegenos Fya
(FY1) Fyb
(FY2) Jka
(JK1) Jkb
(JK2) S (MNS3) e s (MNS4) necessitam da fase de antiglobulina
humana (AGH) para que ocorra aglutinacatildeo Amostras que apresentam o TDA positivo
aglutinam apoacutes reaccedilatildeo com a AGH natildeo pela real presenccedila do antiacutegeno em sua superfiacutecie mas
pela interaccedilatildeo da AGH com o anticorpo que estaacute sensibilizando o eritroacutecito A interferecircncia
do TDA positivo pode ser anulada atraveacutes de algumas teacutecnicas capazes de dissociar o
anticorpo como por exemplo o tratamento da hemaacutecia sensibilizada com cloroquina ou com
glicina-aacutecida-EDTA (BRANCH e PETZ 1999 SHIREY et al 2002 e LEGER 2011)
12 METODOLOGIAS APLICADOS Agrave ROTINA IMUNO-HEMATOLOacuteGICA
Todos os testes que compotildeem a rotina preacute-transfusional usam meacutetodos soroloacutegicos
que envolvem a reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo e tem como objetivo determinar o perfil antigecircnico
eritrocitaacuterio do receptor e do doador assim como identificar em seu soro a presenccedila de
anticorpos contra antiacutegenos eritrocitaacuterios que possam comprometer a sobrevida das hemaacutecias
transfundidas Para testar o antiacutegeno na superfiacutecie da hemaacutecia eacute necessaacuterio dispor de um
antissoro com especificidade conhecida para aquele antiacutegeno Por outro lado para testar a
presenccedila de um determinado anticorpo no soro ou plasma do receptor eacute necessaacuterio o uso de
hemaacutecias com perfil antigecircnico conhecido (SANTOS 2014)
Diversas metodologias satildeo aplicadas nos laboratoacuterios de imunohematologia Cada
serviccedilo de hemoterapia faz a escolha do meacutetodo que seraacute aplicado de acordo com o perfil do
laboratoacuterio com o volume de exames diaacuterios e tambeacutem com o custo envolvido Todas essas
8
teacutecnicas tecircm como objetivo comum demonstrar a reaccedilatildeo entre antiacutegeno e anticorpo no
entanto elas se baseiam em diferentes princiacutepios Muitas metodologias satildeo atualmente
aplicadas agrave imunohematologia entre elas o sistema de fase soacutelida a tecnologia de hemaacutecias
magnetizadas a biologia molecular e ateacute mesmo a citometria de fluxo no entanto os meacutetodos
mais tradicionais satildeo aqueles baseados no princiacutepio de hemaglutinaccedilatildeo
121 MEacuteTODOS DE FASE FLUacuteIDA
Os meacutetodos de fase fluiacuteda satildeo testes baseados na hemaglutinaccedilatildeo e incluem o teste em
tubo e o teste em microplacas Uma suspensatildeo de hemaacutecias eacute adicionada ao plasma ou soro
em seguida eacute realizada a centrifugaccedilatildeo e por fim eacute feita a leitura do resultado que eacute
considerado positivo se for observado algum grau de aglutinaccedilatildeo ou hemoacutelise A intensidade
de aglutinaccedilatildeo eacute graduada de acordo com o tamanho dos agregados desprendidos da
superfiacutecie apoacutes agitaccedilatildeo delicada do tubo ou microplaca Os meacutetodos de hemaglutinaccedilatildeo satildeo
aplicados a todos os testes preacute-transfusionais Como os anticorpos ABO satildeo aglutininas frias
a tipagem eacute realizada em temperatura ambiente (22degC) no entanto ao investigar a presenccedila
de anticorpos irregulares que como jaacute mencionado eacute na maioria das vezes anticorpos
incompletos da classe IgG eacute essencial que a reaccedilatildeo seja incubada a 37degC As reaccedilotildees satildeo
facilitadas com a utilizaccedilatildeo de potencializadores e da antiglobulina humana (WALKER e
HARMENING 2012 AABB 2011)
Nos meacutetodos de fase fluiacuteda nos quais a AGH eacute empregada a fase de lavagem eacute
fundamental Apoacutes a incubaccedilatildeo do soro com as hemaacutecias deve ser realizada a lavagem da
reaccedilatildeo para remover o excesso de anticorpos natildeo ligados agraves hemaacutecias jaacute que os anticorpos
livres podem bloquear a AGH quando ela eacute adicionada e levar a resultados falso negativos
(AABB 2011)
Os testes de hemaglutinaccedilatildeo satildeo os mais tradicionais entre os meacutetodos ainda hoje
aplicados agrave rotina de bancos de sangue A vantagem desses meacutetodos eacute o baixo custo quando
comparado agraves teacutecnicas mais modernas mas apresentam tambeacutem desvantagens A teacutecnica em
tubo por exemplo natildeo permite automaccedilatildeo eacute trabalhosa e exige matildeo-de-obra bastante treinada
na execuccedilatildeo das diversas etapas do teste e mesmo assim pode haver subjetividade na
interpretaccedilatildeo dos resultados aleacutem de resultados falso-negativos (DOWNES 2011 ZANTEK
et al 2012)
9
122 COLUNAS DE GEL
A teacutecnica em gel iniciada na deacutecada de 90 representou uma grande revoluccedilatildeo na
rotina laboratorial tornando-se muito popular Aleacutem de ser sensiacutevel a teacutecnica dispensa a fase
de lavagem antes da adiccedilatildeo da AGH assim como a agitaccedilatildeo do teste para leitura reduzindo o
nuacutemero de resultados falsos negativos decorrentes dessas duas etapas e o tempo para
execuccedilatildeo dos testes (LAPIERRE et al 1989 NOVARETTI et al 2000 NOVARETTI et
al 2004) Os reagentes satildeo comercializados na forma de cartotildees plaacutesticos contendo
microtubos preenchidos por gel composto por microesferas de acrilamida-dextran Nesta
metodologia tambeacutem baseada na hemaglutinaccedilatildeo a suspensatildeo de hemaacutecias e o soro satildeo
depositados em uma cacircmara acima da coluna de gel e em seguida procede-se com a
centrifugaccedilatildeo dos cartotildees As microesferas atuam como uma malha que permite a passagem
em direccedilatildeo ao fundo do microtubo apenas das hemaacutecias natildeo aglutinadas enquanto as
hemaacutecias aglutinadas ficam retidas na parte superior da coluna ou ao longo dela (GREEN e
KLOSTERMANN 2012) Portanto quanto maior a agregaccedilatildeo mais hemaacutecias ficam retidas
no topo da coluna Dependendo do tipo de teste a ser realizado pode ser utilizado gel neutro
ou gel especiacutefico impregnado pelo anticorpo desejado e o gel contendo antiglobulina humana
que satildeo utilizados para os testes diretos e indiretos da antiglobulina (LAPIERRE et al 1989)
A coluna de gel ainda permite a visualizaccedilatildeo clara de duas populaccedilotildees distintas de hemaacutecias
como em pacientes receacutem transfundidos
123 BIOLOGIA MOLECULAR
A biologia molecular ou genotipagem estaacute sendo cada vez mais aplicada aos grupos
sanguiacuteneos pois fornece resultados seguros e precisos especialmente nos casos em que natildeo eacute
possiacutevel a realizaccedilatildeo da fenotipagem como em pacientes receacutem-transfundidos e pacientes
com TDA positivo Na genotipagem eacute possiacutevel determinar atraveacutes do DNA do paciente
extraiacutedo de seus leucoacutecitos de sangue perifeacuterico o fenoacutetipo eritrocitaacuterio deduzido sem
qualquer interferecircncia do anticorpo que sensibiliza a hemaacutecia ou de hemaacutecias alogecircnicas
transfundidas Sua realizaccedilatildeo no entanto exige o treinamento de equipe especializada e capaz
de interpretar os resultados em conjunto com os achados soroloacutegicos (JUNIOR e OLIVATO
2007)
Apesar de ser uma ferramenta de grande importacircncia hoje na imuno-hematologia
ainda estaacute restrito aos grandes centros de hemoterapia no Brasil poucos serviccedilos puacuteblicos de
sauacutede dispotildeem desse recurso e utilizam teacutecnicas de genotipagem de grupos sanguiacuteneos para
atendimento a seus pacientes Esta abordagem poreacutem vem sendo introduzida em algumas
10
instituiccedilotildees de reconhecida competecircncia na hemoterapia mas sua disponibilizaccedilatildeo deve
tornar-se mais generalizada atraveacutes da formaccedilatildeo de centros de referecircncia para atendimento
das diversas unidades de hemoterapia (MARTINS et al 2009) Dessa forma muitas decisotildees
transfusionais especialmente em urgecircncias ainda devem ser tomadas sem o resultado da
genotipagem eritrocitaacuteria
13 TESTE DA ANTIGLOBULINA
Coombs Mourant e Race descreveram em 1945 uma teacutecnica com utilizando soro de
coelho contendo antiglobulina humana (AGH) que posteriormente foi chamada de ldquosoro de
Coombsrdquo O meacutetodo foi desenvolvido inicialmente para ampliar o efeito de aglutininas fracas
do sistema Rh anticorpos ldquoincompletosrdquo que normalmente natildeo apresentavam aglutinaccedilatildeo
visiacutevel O teste foi concebido como um instrumento de investigaccedilatildeo de doenccedila hemoliacutetica do
receacutem-nascido e de reaccedilotildees transfusionais causadas por anticorpos Rh que estavam presentes
no soro dos paciente poreacutem que natildeo eram demonstraacuteveis pelas teacutecnicas ateacute entatildeo existentes
A maior parte dos anticorpos de significado cliacutenico assim como seus respectivos
antiacutegenos foram descritos apoacutes o surgimento do ldquosoro de Coombsrdquo em 1945 sendo assim o
teste da antiglobulina representa ateacute hoje a forma mais importante de aglutinaccedilatildeo artificial em
imunohematologia permitindo revelar a presenccedila de anticorpos na membrana da hemaacutecia A
antiglobulina humana eacute constituiacuteda por anticorpo especiacutefico contra a porccedilatildeo Fc de outro
anticorpo Quando um anticorpo ldquoincompletordquo sensibiliza a hemaacutecia normalmente natildeo
provoca aglutinaccedilatildeo visiacutevel Apoacutes a adiccedilatildeo da AGH ao meio esta reconhece e se liga agraves
porccedilotildees Fc dos anticorpos que sensibilizam a hemaacutecia formando assim uma malha e
provocando aglutinaccedilatildeo visiacutevel (BARJAS-CASTRO 2013)
Os reagentes de antiglobulina podem ser poliespeciacuteficos ou monoespeciacuteficos Os
poliespeciacuteficos satildeo uma mistura de anticorpos ant-IgG e anti-C3d (fraccedilatildeo C3d do
complemento) Os reagentes monoespecificos podem ser anti-IgG anti-IgM anti-IgA anti-
complemento podendo ser anti-C3d e anti-C3b
O teste da antiglobulina pode ser usado para detectar hemaacutecias sensibilizadas com
aloanticorpos IgG autoanticorpos IgG e componentes do complemento A sensibilizaccedilatildeo
pode ocorrer ldquoin vivordquo ou ldquoin vitrordquo O uso do AGH para detectar a sensibilizaccedilatildeo ldquoin vitrordquo
tem dois estaacutegios e eacute denominado teste indireto da antiglobulina A sensibilizaccedilatildeo ldquoin vivordquo eacute
detectada em procedimento de um uacutenico estagio chamado teste direto da antiglobulina (TDA)
11
Os testes direto e indireto satildeo ateacute hoje amplamente aplicados como princiacutepio de inuacutemeros
testes soroloacutegicos em imuno-hematologia (GREEN e KLOSTERMANN 2012)
131 TESTE DIRETO DA ANTIGLOBULINA
O teste direto da antiglobulina humana revela a presenccedila de anticorpo eou fraccedilatildeo do
complemento ligados agrave superfiacutecie das hemaacutecias As sensibilizaccedilatildeo das hemaacutecias ocorrida ldquoin
vivordquo natildeo eacute visualizada mas apoacutes a adiccedilatildeo da antiglobulina humana ocorre a aglutinaccedilatildeo que
eacute visualizada macroscopicamente (Figura 1)
Figura 1 - Princiacutepio da teacutecnica direta da antiglobulina Teste utilizado para demonstrar a sensibilizaccedilatildeo ldquoin
vivordquo das hemaacutecias O sangue total eacute coletado do paciente em tubo contendo anticoagulante EDTA Na teacutecnica
realizada em tubo uma suspensatildeo de hemaacutecias 5 em soluccedilatildeo de salina eacute preparada Uma gota dessa suspensatildeo
eacute lavada 3 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica para retirada de anticorpos que estatildeo livres no plasma Toda soluccedilatildeo eacute
retirada e adiciona-se o soro de Coombs (antiglobulina humana) O soro de Coombs reconhece os anticorpos que
estatildeo ligados agrave superfiacutecie das hemaacutecias fazendo com que ocorra aglutinaccedilatildeo visiacutevel macroscopicamente
Apesar de natildeo ser um teste preacute-transfusional obrigatoacuterio o TDA eacute um dos testes mais
importantes para investigar e classificar quadros hemoliacuteticos como de origem imune ou natildeo
imune O seu valor preditivo positivo em vigecircncia de anemia hemoliacutetica eacute de 83 poreacutem natildeo
havendo sinais de hemoacutelise seu valor preditivo eacute apenas 14 Eacute por esse motivo que a
interpretaccedilatildeo do TDA positivo deve levar em consideraccedilatildeo a histoacuteria cliacutenica e os resultados
dos outros exames laboratoriais A realizaccedilatildeo do TDA eacute obrigatoacuteria na investigaccedilatildeo
12
laboratorial de diversos quadros hemoliacuteticos entre eles a anemia hemoliacutetica autoimune
(AHAI) a reaccedilatildeo hemoliacutetica imune poacutes-transfusional a siacutendrome do linfoacutecito passageiro a
doenccedila hemoliacutetica perinatal e a hemoacutelise droga-dependente (LEGER 2011)
Resultados de TDA positivos foram tambeacutem observados em indiviacuteduos com niacuteveis
seacutericos elevados de IgG ou complemento sem evidecircncia de anemia hemoliacutetica imune como
em pacientes com doenccedila falciforme talassemia doenccedila renal crocircnica mieloma muacuteltiplo
doenccedilas autoimunes e siacutendrome da imunodeficiecircncia adquirida (SIDA) Aleacutem disso pequenas
quantidades de IgG (5 a 90 moleacuteculas por hemaacutecia) e complemento (5 a 40 moleacuteculas por
hemaacutecia) podem estar presentes nas hemaacutecias de indiviacuteduos saudaacuteveis sem associaccedilatildeo com
reduccedilatildeo na sobrevida das mesmas A positividade do TDA depende da populaccedilatildeo estudada e
pode variar de 01 entre doadores de sangue sem qualquer sinal cliacutenico de hemoacutelise ateacute
15 em pacientes hospitalizados (CASTILHO JUNIOR e REID 2015 LEGER 2011)
Indiviacuteduos que apresentam TDA positivo seja agraves custas de IgG eou complemento
com ou sem sinais cliacutenicos de hemoacutelise teratildeo a fenotipagem eritrocitaacuteria prejudicada A
fenotipagem de indiviacuteduos com TDA positivo especialmente quando utilizado o teste indireto
da antiglobulina pode acarretar resultados falsos positivos e levar a seleccedilatildeo de fenoacutetipo
incorreto para transfusatildeo
132 TESTE INDIRETO DA ANTIGLOBULINA
O teste indireto da antiglobulina (TIA) eacute utilizado para revelar a sensibilizaccedilatildeo ldquoin
vitrordquo das hemaacutecias e eacute aplicado a diversos testes soroloacutegicos em imunohematologia entre
eles a pesquisa de anticorpos identificaccedilatildeo de anticorpos testes de compatibilidade
fenotipagem eritrocitaacuteria e titulaccedilatildeo de anticorpos Na teacutecnica indireta a hemaacutecia que contecircm
o antiacutegeno eacute colocada em contato ldquoin vitrordquo com o anticorpo que se liga mas natildeo promove a
aglutinaccedilatildeo visiacutevel A adiccedilatildeo da AGH forma uma malha entre os anticorpos que sensibilizam
as hemaacutecias e provoca a aglutinaccedilatildeo macroscoacutepica (figura 2)
Caso a amostra de hemaacutecia estudada seja previamente sensibilizada resultados falsos
positivos podem ser obtidos no TIA jaacute que a AGH reagiraacute com a moleacutecula que sensibilizava
anteriormente a hemaacutecia mesmo se o anticorpo especiacutefico natildeo tiver se ligado ao antiacutegeno
correspondente
13
133 CONDICcedilOtildeES CLIacuteNICAS COM TDA POSITIVO
O TDA positivo deve ser interpretado cuidadosamente sempre em conjunto com o
quadro cliacutenico do paciente A positividade isolada do TDA natildeo significa hemoacutelise A
interpretaccedilatildeo do teste positivo requer o conhecimento do diagnoacutestico do paciente da presenccedila
de sinais e sintomas sugestivos de hemoacutelise assim como de seu histoacuterico transfusional
gestacional e de informaccedilotildees sobre o uso recente de medicaccedilotildees (LEGER 2011)
Figura 2 ndash Princiacutepio do teste indireto da antiglobulina O TIA pode ser utilizado na pesquisa de anticorpos de
especificidades desconhecidas livres no soroplasma como eacute o caso da pesquisa e identificaccedilatildeo de anticorpos
irregulares Ele eacute tambeacutem utilizado para determinar a presenccedila de antiacutegenos na membrana da hemaacutecia quando
satildeo empregados soros de especificidades conhecidas da classe IgG No primeiro caso o soroplasma contendo o
anticorpo desconhecido eacute colocado em contato com hemaacutecias cujo perfil antigecircnico eacute conhecido No segundo
caso utiliza-se soro de especificidade conhecida da classe IgG para determinar a presenccedila ou ausecircncia de um
antiacutegeno na membrana O anticorpo encontra o antiacutegeno correspondente e ocorre a ligaccedilatildeo do anticorpo agrave
hemaacutecia mas natildeo ocorre aglutinaccedilatildeo Apoacutes a adiccedilatildeo da AGH que se liga aos anticorpos formando uma malha
ocorre a aglutinaccedilatildeo visiacutevel
O TDA positivo eacute uma achado claacutessico de algumas condiccedilotildees cliacutenicas como a reaccedilatildeo
transfusional hemoliacutetica a doenccedila hemoliacutetica do feto e do receacutem-nascido (DHFRN) a anemia
hemoliacutetica induzida por drogas a siacutendrome do linfoacutecito passageiro e a anemia hemoliacutetica
autoimune (AHAI) Portanto o TDA positivo pode ser decorrente da sensibilizaccedilatildeo da
hemaacutecia autoacuteloga por um autoanticorpo ou por um aloanticorpo ligado agrave hemaacutecia alogecircnica
circulante A positividade do TDA pode ainda ocorrer de forma passiva em pacientes que
14
recebem imunoglobulinas humanas ou ainda pela transfusatildeo de plaquetas ABO natildeo idecircntico
(LEGER 2011 RALPH 2012 ZANTEK et al 2012)
Nas reaccedilotildees transfusionais hemoliacuteticas imunes o aloanticorpo do receptor sensibiliza
as hemaacutecias transfundidas do doador e reduz sua sobrevida ao removecirc-la precocemente da
circulaccedilatildeo pela fagocitose no sistema retiacuteculo-endotelial ou pela hemoacutelise intravascular As
reaccedilotildees podem ser agudas se ocorrem ateacute 24 horas ou tardias quando ocorrem apoacutes 24 horas
da transfusatildeo A gravidade das reaccedilotildees hemoliacuteticas pode variar de um simples rendimento
transfusional inadequado agrave quadros graves de hemoacutelise intravascular evoluindo ateacute mesmo
com choque vascular e oacutebito O TDA pode resultar negativo caso toda massa eritrocitaacuteria
transfundida tenha sido destruiacuteda (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
Na doenccedila hemoliacutetica do feto e do receacutem-nascido (DHFRN) anticorpos maternos da
classe IgG atravessam a barreira placentaacuteria e sensibilizam as hemaacutecias fetais que seratildeo
destruiacutedas precocemente levando agrave anemia fetal Apesar da incompatibilidade ABO feto-
materna ser a causa mais frequente de DHFRN raramente ela eacute responsaacutevel pela ocorrecircncia
de quadros graves Por outro lado anticorpos contra antiacutegenos do sistema Rh e Kell
especialmente Anti-D (Anti-RH1) Anti-c (Anti-RH4) e Anti-Kell (Anti-KELL1) satildeo
conhecidos por causar DHFRN severa Raramente outros anticorpos tambeacutem podem estar
implicados na DHFRN como os anticorpos contra antiacutegenos do sistema Kidd Duffy MNS e
Diego (ZANTEK et al 2012)
A hemoacutelise droga-dependente eacute causada pela produccedilatildeo de um anticorpo voltado contra
a droga ligada agrave membrana eritrocitaacuteria ou ainda contra o complexo droga-membrana A
classe de medicaccedilotildees mais comumente envolvida eacute a dos antimicrobianos betalactacircmicos
(penicilinas e cefalosporinas) mas outras classes como quimioteraacutepicos e anti-inflamatoacuterios
tambeacutem satildeo descritos (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
Apoacutes transplante de ceacutelulas progenitoras hematopoieacuteticas em que o doador possui
anticorpos contra antiacutegenos eritrocitaacuterios do receptor o linfoacutecito de memoacuteria do doador pode
resistir ao esquema imunossupressor utilizado e continuar a produccedilatildeo de anticorpos que
reconhecem a hemaacutecia incompatiacutevel do receptor ainda circulante O quadro cliacutenico pode
variar de um simples TDA positivo sem outros sinais ou sintomas ateacute um quadro hemoliacutetico
grave e abrupto (LEGER 2011)
15
134 ANEMIA HEMOLIacuteTICA AUTOIMUNE
A anemia hemoliacutetica autoimune eacute caracterizada pela destruiccedilatildeo precoce das hemaacutecias
autoacutelogas por autoanticorpos que sensibilizam as hemaacutecias e levam agrave fagocitose pelos
macroacutefagos no sistema reticulo-endotelial ou hemoacutelise intravascular O diagnoacutestico da AHAI
baseia-se na presenccedila de hemoacutelise cliacutenica associada agrave evidecircncia de fator imune representado
pelo TDA positivo As classes de anticorpos envolvidas em quadros de AHAI satildeo IgG IgM e
raramente IgA (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012) Satildeo raros os casos de AHAI com TDA
negativo que podem estar relacionados a um autoanticorpo de baixa avidez de densidade
inferior agrave detecccedilatildeo do meacutetodo ou ainda de classe de imunoglobulina natildeo avaliada pelo
meacutetodo utilizado para o teste (GARRATY 2005)
A AHAI pode ser classificada em dois grupos principais de acordo com a melhor
temperatura de reaccedilatildeo do autoanticorpo As anemias hemoliacuteticas causadas por anticorpos
quentes que reagem melhor a 37oC e geralmente IgG representam 80 dos casos de AHAI
Nas AHAI por anticorpo quente o TDA pode ser positivo para IgG mais complemento (67)
somente IgG (20) ou somente por complemento (13) As anemias causadas por
anticorpos frios geralmente da classe IgM e que reagem melhor em temperatura ambiente ou
a 4oC representam aproximadamente 20 dos casos de AHAI Por exibirem amplitude
teacutermica esses anticorpos ligam-se agraves hemaacutecias ao atingirem a circulaccedilatildeo nas extremidades do
corpo fixam o complemento e desprendem-se da hemaacutecia apoacutes retornar para partes mais
quentes Por esse motivo em AHAI por anticorpos frios o TDA eacute positivo apenas agraves custas
de C3 e normalmente o IgM natildeo eacute detectado (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
A presenccedila do autoanticorpo IgG pode ser confirmada atraveacutes da eluiccedilatildeo do anticorpo
da hemaacutecia Tipicamente o eluato na AHAI por anticorpo quente reage com todas as ceacutelulas
testadas de um painel de hemaacutecias alogecircnicas do tipo ldquoOrdquo ou pode eventualmente exibir uma
especificidade conhecida como Anti-e (Anti-RH5) Nas AHAI a frio por sua vez espera-se
um eluato negativo (LEGER 2011)
Os autoanticorpos satildeo com frequecircncia encontrados livres no plasma e natildeo somente
ligados agraves hemaacutecias autoacutelogas Eles podem interferir em todas as fases dos testes preacute-
transfusionais nas quais o plasma eacute testado especialmente os autoanticorpos quentes que
acarretam resultados positivos em todos os testes levados agrave fase de antiglobulina humana
Esses anticorpos portanto positivam a pesquisa de anticorpos irregulares e mascaram a
presenccedila de aloanticorpos de significado cliacutenico Aproximadamente 60 dos pacientes que
apresentam AHAI a quente apresentam anticorpos que reagem em meio salino mas se forem
16
levados em conta meacutetodos mais sensiacuteveis como PEG enzima e estudo em gel a positividade
pode ser superior a 90 (LEGER 2011)
Aleacutem da eficaacutecia da transfusatildeo ser comprometida pela diminuiccedilatildeo da vida-meacutedia das
hemaacutecias a presenccedila do autoanticorpo dificulta a realizaccedilatildeo dos testes preacute-transfusionais e
compromete a seguranccedila transfusional Os autoanticorpos reagem normalmente como
panaglutininas pois satildeo normalmente voltados contra antiacutegenos puacuteblicos na maior parte das
vezes contra antiacutegenos do sistema Rh Por apresentarem essas caracteriacutesticas podem ainda
mascarar a presenccedila de aloanticorpos de significado clinico e levar a testes de compatibilidade
positivos exigindo uma avaliaccedilatildeo criteriosa da necessidade da transfusatildeo (BRANCH e PETZ
1999 JUNIOR e OLIVATO 2004)
Remover a interferecircncia do autoanticorpo para avaliar a presenccedila de aloanticorpos
mascarados nem sempre eacute possiacutevel mesmo utilizando teacutecnicas de autoadsorccedilatildeo ou
aloadsorccedilatildeo que aleacutem de tudo satildeo demoradas e exigem de 2 a 6 horas para conclusatildeo
(GARRATY e GEORGE 2002) Nesses casos a fenotipagem eritrocitaacuteria do paciente eacute de
extrema utilidade especialmente em situaccedilotildees de urgecircncia A definiccedilatildeo do fenoacutetipo do
paciente para os antiacutegenos de maior importacircncia cliacutenica pode auxiliar a seleccedilatildeo de unidades
de hemaacutecias com mesmo fenoacutetipo o que garante que eventuais aloanticorpos natildeo
identificados sejam respeitados e tambeacutem evita nova sensibilizaccedilatildeo (JUNIOR e OLIVATO
2004 SHIREY et al 2002)
135 TRATAMENTO DE HEMAacuteCIAS COM TDA POSITIVO
O TDA positivo impede a fenotipagem eritrocitaacutecia por meacutetodos que exigem a fase de
AGH uma vez que a aglutinaccedilatildeo ocorreraacute devido agrave interaccedilatildeo da AGH com o autoanticorpo
que sensibiliza a hemaacutecia do paciente levando a resultados falso positivos Em algumas
situaccedilotildees como na AHAI por anticorpo quente a fenotipagem eacute especialmente importante
pois o autoanticorpo interfere na triagem e identificaccedilatildeo de anticorpos assim como no teste de
compatibilidade e dificultam a detecccedilatildeo de aloanticorpos de significado cliacutenico que
obrigatoriamente devem ser respeitados Nessas situaccedilotildees a fenotipagem eritrocitaacuteria
determina o perfil antigecircnico do paciente e possibilita o fornecimento de unidades de
hemaacutecias com o mesmo fenoacutetipo para a transfusatildeo evitando a sensibilizaccedilatildeo para novos
antiacutegenos assim como reaccedilotildees hemoliacuteticas transfusionais No entanto eacute necessaacuterio aplicar
meacutetodos que natildeo sofram interferecircncia do TDA positivo ou seja meacutetodos que natildeo necessitem
da fase de AGH ou meacutetodos de bloqueio do anticorpo sem bloquear o antiacutegeno Uma opccedilatildeo eacute
a utilizaccedilatildeo de soros monoclonais IgM (salinos ou de meio proteico natildeo concentrado) mas
17
nem sempre esses reagentes estatildeo disponiacuteveis especialmente os reagentes monoclonais para
os antiacutegenos dos sistemas Duffy ( Fya Fy
b) Kidd ( Jk
a Jk
b) e MNS (S s) (JUNIOR e
OLIVATO 2004) Outra opccedilatildeo eacute a teacutecnica de bloqueio que pode ser utilizada para tratar
hemaacutecias para posterior fenotipagem em casos de TDA positivos com reatividade le2+
Em casos onde a positividade do TDA eacute maior que 2+ estaacute indicada a tratamento
quiacutemico para remoccedilatildeo da interferecircncia do autoanticorpo antes de realizar a fenotipagem Entre
as teacutecnicas utilizadas atualmente estatildeo o ZZAP a cloroquina e a glicina aacutecidaEDTA
1351 TEacuteCNICA DE BLOQUEIO
A teacutecnica de bloqueio se baseia na utilizaccedilatildeo de anti-IgG (Coombs monoespeciacutefico)
para tratar as hemaacutecias com TDA positivo O anticorpo anti-IgG se liga aos anticorpos que
estatildeo sensibilizando a hemaacutecias poreacutem sem o bloquear os antiacutegenos Os antiacutegenos que natildeo
estatildeo sensibilizados podem ser detectados atraveacutes dos antissoros especiacuteficos (SERERAT
VEIDT E DUTCHED 2000)
1352 TRATAMENTO DE HEMAacuteCIAS COM ZZAP
O Sulphydryl-Proteolytic Enzyme (ZZAP) que eacute uma mistura de ditiotreitol (DTT)
mais papaiacutena ativada com cisteiacutena eacute um reagente capaz de dissociar imunoglobulinas da
classe IgG ligadas a membrana dos eritroacutecitos enquanto trata enzimaticamente as hemaacutecias
O tratamento enzimaacutetico tambeacutem potencializa a ligaccedilatildeo do autoanticorpo ao antiacutegeno e
acelera o processo de autoadsorccedilatildeo O ZZAP pode desnaturar os antiacutegenos do sistema Duffy
MNS e Kell o que limita sua aplicaccedilatildeo para fins de fenotipagem (BRANCH e PETZ 1982)
1353 CLOROQUINA
Em 1982 Edwards Moulds e Judd propuseram a utilizaccedilatildeo da teacutecnica da cloroquina
que dissociava os complexos antiacutegeno-anticorpo e mantinha a membrana das hemaacutecias
iacutentegras Os derivados quinolecircicos jaacute haviam sido descritos anteriormente por Domokos e
Aszody em 1964 e Holtz Mantel e Buck em 1973 (apud Edwards Moulds e Judd 1982) pela
sua capacidade de separar imunocomplexos e inibir as reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo reduzindo
as cargas eleacutetricas das superfiacutecie das hemaacutecias A teacutecnica eacute uma das mais utilizadas nos
centros brasileiros para remover a interferecircncia do autoanticorpo e eacute tambeacutem a teacutecnica
atualmente adotada pelo laboratoacuterio de imunohematologia do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto
18
Edwards Moulds e Judd (1982) demonstraram que a teacutecnica da cloroquina para
dissociaccedilatildeo de anticorpos eacute uma teacutecnica simples efetiva e confiaacutevel para dissociar
imunoglobulina das hemaacutecias Desde que a membrana das hemaacutecias permaneccedila intacta natildeo
haacute perda da reatividade dos antiacutegenos e a sua maior aplicaccedilatildeo eacute a fenotipagem de hemaacutecias
com TDA positivo Os autores verificaram que em 83 das amostras sensibilizadas in vivo e
22 amostras (no total de 40) sensibilizadas ldquoin vitrordquo apresentaram TDA negativo e
puderam ser fenotipadas A teacutecnica poreacutem natildeo consegue remover os componentes do
complemento na maioria dos casos
Champagne e colaboradores (1999) testaram a teacutecnica da cloroquina para dissociar
antiacutegenos Bg comparando com a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA e verificaram vantagem em
relaccedilatildeo ao uso de um uacutenico reagente diminuindo a manipulaccedilatildeo e verificou que o mesmo natildeo
destroacutei antiacutegeno Kell
A cloroquina tambeacutem mostrou-se pouco efetivo em remover anticorpos do sistema
Duffy da superfiacutecie das hemaacutecias (EDWARDS MOUDS e JUDD 1982 ROZIERS e
SQUALI 1997)
1353 GLICINA-AacuteCIDAEDTA
A afinidade e a estabilidade entre a ligaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo eacute definida como a
resultante entre forccedilas atrativas e repulsivas entre ambos (CARUCIO e WISE 2012) e resulta
da somatoacuteria de forccedilas quiacutemicas dinacircmicas e fracas (natildeo covalentes) como pontes de
hidrogecircnio forcas eletrostaacuteticas forca de Van der Waals e pontes hidrofoacutebicas A estabilidade
dessa ligaccedilatildeo eacute facilmente abalada por alteraccedilotildees quiacutemicas e fiacutesicas no meio da reaccedilatildeo como
a alteraccedilatildeo do pH A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA se baseia na mudanccedila do pH para a
quebra da ligaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo (KOSANKE 2012)
A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA foi primeiramente descrita em 1986 por Louie Jieng
e Zeroulis que utilizaram 50 amostras de doadores sensibilizados ldquoin vitrordquo com anticorpos A
teacutecnica foi efetiva em 48 amostras permitindo o estudo do eluato assim como a fenotipagem
das hemaacutecias Os autores testaram tambeacutem a teacutecnica em 100 hemaacutecias TDA positivo que
puderam ser utilizadas para teacutecnicas de autoadsorccedilatildeo
Byrne (1991) descreveu a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA modificada e tambeacutem
verificou como uma opccedilatildeo para o tratamento de hemaacutecias com TDA positivo que deixava as
hemaacutecias intactas e o eluato viaacutevel para ser fenotipado
19
Roziers e Squali (1997) e Katharia e Chaudhary (2013) compararam a teacutecnica da
glicina-aacutecidaEDTA com as teacutecnicas da cloroquina e do aquecimento Verificaram maior
eficiecircncia da glicina-aacutecidaEDTA em relaccedilatildeo as outras duas teacutecnicas pois com uma mesma
quantidade de amostra produzia as hemaacutecias livres de anticorpo e tambeacutem o eluato Mostrou-
se ainda superior devido ao menor tempo exigido para sua realizaccedilatildeo o que favorece seu uso
em situaccedilotildees de urgecircncia e emergecircncia
As duas desvantagens da teacutecnica poreacutem eacute o fato de destruir os antiacutegenos do sistema
Kell e o fato de natildeo remover fraccedilotildees do complemento ligadas agrave hemaacutecia (PALLAS WILER e
McGEE 1991 ROZIERS e SQUALLI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012
e KATHARIA e CHAUNDHARY 2013)
20
2 OBJETIVOS
21 OBJETIVO GERAL
211 Avaliar a eficaacutecia da glicina-aacutecidaEDTA em remover os anticorpos ligados agraves
hemaacutecias sensibilizadas por anticorpos da classe IgG
22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
221 Preparaccedilatildeo dos reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
verificaccedilatildeo da estabilidade dos mesmos e avaliar custos
222 Testar a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA em amostras de hemaacutecias
sensibilizadas por anticorpos antieritrocitaacuterios humanos
223 Comparar a efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA com a teacutecnica da
cloroquina quanto a capacidade de remover a interferecircncia do anticorpo ligado
a hemaacutecia
224 Testar o eluato das amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA
225 Verificar se houve destruiccedilatildeo dos antiacutegenos eritrocitaacuterios apoacutes o tratamento
com glicina-aacutecidaEDTA e com cloroquina
226 Verificar se o tempo de execuccedilatildeo da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA descrito
nos textos de referecircncia eacute reprodutiacutevel
21
3 JUSTIFICATIVA
Algumas condiccedilotildees cliacutenicas podem levar ao depoacutesito ldquoin vivordquo de anticorpos eou
fraccedilotildees do complemento sobre as hemaacutecias Entre elas estatildeo as reaccedilotildees hemoliacuteticas poacutes-
transfusionais a doenccedila hemoliacutetica perinatal o uso de medicamentos e principalmente a
AHAI Na AHAI um anticorpo normalmente da classe IgG ou IgM reconhece antiacutegenos
proacuteprios na membrana eritrocitaacuteria e reduz a sobrevida da hemaacutecia levando a sua destruiccedilatildeo
pelos macroacutefagos no sistema reticulo-endotelial ou agrave ativaccedilatildeo do complexo de ataque agrave
membrana e agrave lise intravascular Os autoanticorpos satildeo voltados na maioria das vezes contra
antiacutegenos eritrocitaacuterios de alta frequecircncia populacional conhecidos como antiacutegenos puacuteblicos
e por este motivo reconhecem tanto hemaacutecias autoacutelogas quanto alogecircnicas
Devido agrave presenccedila do autoanticorpo livre no plasma e tambeacutem do anticorpo eou
complemento ligado agrave hemaacutecia o banco de sangue pode encontrar dificuldades em todas as
fases dos testes preacute-transfusionais do paciente com AHAI e deve utilizar teacutecnicas que
auxiliem na escolha do melhor hemocomponente melhorando a seguranccedila transfusional Essas
teacutecnicas visam remover a interferecircncia do autoanticorpo livre no soro e do autoanticorpo
ligado agrave hemaacutecia permitindo a detecccedilatildeo de aloanticorpos associados e a realizaccedilatildeo da
fenotipagem eritrocitaacuteria respectivamente
A finalizaccedilatildeo dos testes preacute-tranfusionais na presenccedila de autoanticorpo pode levar
algumas horas e nem sempre o paciente poderaacute aguardar Nesse contexto torna-se vantajosa a
aplicaccedilatildeo de teacutecnicas de raacutepida execuccedilatildeo
O presente estudo propotildee aplicar e avaliar a eficaacutecia da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
em remover os anticorpos ligados agrave hemaacutecia o que permite a fenotipagem eritrocitaacuteria
estendida e a seleccedilatildeo de concentrados de hemaacutecias com mesmo fenoacutetipo do paciente
Atualmente no Hemocentro de Ribeiratildeo Preto a teacutecnica utilizada para esse fim eacute o
tratamento das hemaacutecias com difosfato de cloroquina cujo tempo de execuccedilatildeo pode demorar
ateacute duas horas enquanto a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser realizada em apenas dois
minutos o que a tornaria opccedilatildeo de escolha especialmente em situaccedilotildees de urgecircncia Ao
contraacuterio da cloroquina a glicina-aacutecidaEDTA permite tambeacutem o estudo do eluato das
hemaacutecias tratadas
22
4 METODOL OGIA
41 AMOSTRAS DE DOADORES
Foram coletados 50 amostras de doadores de sangue que compareceram ao
Hemonuacutecleo de Araccedilatuba no periacuteodo de junho a agosto de 2016 Foram convidados a
participar da pesquisa doadores de repeticcedilatildeo do tipo sanguiacuteneo ldquoOrdquo RhD positivo
cadastrados no sistema de banco de sangue (SBS) do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto
Todos os doadores que concordaram em participar da pesquisa assinaram o termo de
consentimento livre e esclarecido (TCLE)
No momento da doaccedilatildeo foram coletados adicionalmente 5 mL de sangue total em
soluccedilatildeo anticoagulante EDTA (aacutecido dietilenoaminoaceacutetico) dispensando punccedilatildeo venosa
adicional para coleta da amostra O fluxograma 1 resume as etapas desenvolvidas no projeto
Fluxograma 1 - Fluxo da pesquisa utilizando as amostras de doadores
23
411 FENOTIPAGEM
Foram verificados se os doadores jaacute tinham fenotipagem para outros sistemas de
grupos sanguiacuteneos aleacutem do sistema ABORh que eacute realizado rotineiramente
A fenotipagem eritrocitaacuteria para outros sistemas ou fenotipagem estendida eacute realizada
para identificar a presenccedila ou ausecircncia de antiacutegenos considerados de importacircncia cliacutenica No
Hemonuacutecleo de Araccedilatuba uma parcela de doadores de repeticcedilatildeo satildeo fenotipados para os
antiacutegenos dos sistemas de grupo sanguiacuteneo Rh (antiacutegenos C c E e e) Kell (antiacutegeno K)
Duffy (antiacutegenos Fya e Fy
b) Kidd (antiacutegenos Jk
a e Jk
b) e sistema MNSs (antiacutegenos S e s)
A fenotipagem para o Rh e Kell eacute realizada por metodologia de microplaca utilizando
25 microL de hemaacutecia lavada e diluiacuteda a 5 em salina e 25 microL do antissoro comercial especiacutefico
A reaccedilatildeo eacute incubada 15 minutos a temperatura ambiente e centrifugadas para leitura Para os
antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s a metolodogia utilizado eacute gel contendo antiglobulina
humana (gel LissCoombs poliespeciacutefico) da marca BIO-RAD onde se utiliza suspensatildeo de
hemaacutecia em LISS (Soluccedilatildeo de baixa forccedila iocircnica) A suspensatildeo eacute preparada atraveacutes da
diluiccedilatildeo de 10 microL de hemaacutecia em 1000 microL de LISS Pipetado 50 microL dessa diluiccedilatildeo no gel e
adicionado 25 microL do antissoro especiacutefico Incuba-se em banho seco por 15 minutos a 37 deg
Celsius e eacute centrifugado em centriacutefuga especiacutefica Os antissoros utilizados eram das marcas
Fresenius e Lorne
Foi verificado a fenotipagem do doador no banco de dados do Hemocentro Os
registros dos fenoacutetipos dos doadores ficam armazenadas no sistema de banco de sangue
(SBS) Para doadores que natildeo tinham fenotipagem estendida preacutevia para antiacutegenos do sistema
Rh (C c E e e) e Kell (K) foi realizada a fenotipagem para esses antiacutegenos
O tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA e cloroquina para dissociar
anticorpos pode inativar enfraquecer ou destruir os antiacutegenos presentes nas hemaacutecias
alterando assim os resultados da fenotipagem Para verificar se houve destruiccedilatildeo dos
antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a e Jk
b S e s nas amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes
tratamento foram novamente fenotipadas ao final para os antiacutegenos que eram inicialmente
positivas
A repeticcedilatildeo da fenotipagem foi realizada nas amostras que apresentaram efetividade
no tratamento da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eou da cloroquina e a detecccedilatildeo do antiacutegeno
na amostra preacute-tratamento
24
412 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS HEMAacuteCIAS
As hemaacutecias foram sensibilizadas com antissoros policlonais humanos de amostras de
plasma fresco congelado de doadores com resultado de pesquisa de anticorpo irregular
positivos
A escolha do anticorpo para sensibilizar as hemaacutecias foi definida de acordo com o
fenoacutetipo do doador que deveria ser positivo para o respectivo antiacutegeno
Para a sensibilizaccedilatildeo um volume de antissoro (1 mL) e um volume (1 mL) de
hemaacutecias lavadas quatro vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica foram adicionadas a um tubo de 12 x
75 mm A mistura foi homogeneizada e incubada em banho maria (BM) a 37deg C por 60
minutos A seguir as hemaacutecias foram novamente lavadas 4 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica
para retirada dos anticorpos que natildeo se ligaram A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada
como controle negativo O teste da uacuteltima lavagem eacute importante para assegurar que os
anticorpos que poderatildeo ser detectados no eluato apoacutes o tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA
sejam aqueles que estavam ligados agraves hemaacutecias e natildeo aqueles livres no plasma O controle
negativo mostra que todo o anticorpo livre foi retirado (LEGER 2011)
Para o teste de presenccedila de anticorpo na soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foram incubadas
com hemaacutecias de triagem de anticorpos irregulares (ID-Diacell BIO-RAD) contendo os
antiacutegenos especiacuteficos Realizado a teacutecnica em gel LissCoombs com anti-IgG+C3d Incubado
no tempo de 15 minutos a temperatura de 37deg C e centrifugado 10 minutos em centriacutefuga
proacutepria
As 50 amostras de doadores foram sensibilizadas com os anticorpos policlonais
humanos
Apoacutes sensibilizadas rdquoin vitrordquo e lavadas as hemaacutecias foram diluiacutedas em soluccedilatildeo de
baixa forccedila iocircnica (LISS) na quantidade de 10 microL de hemaacutecia para 1000 microL de soluccedilatildeo A
suspensatildeo foi pipetada (50 microL) em coluna-gel-teste LissCoombs (BIO-RAD) que contecircm
antiglobulina poliespeciacutefico (IgG+C3d) e centrifugada em baixa rotaccedilatildeo conforme orientaccedilatildeo
do fabricante durante 10 minutos
As amostras deveriam apresentar aglutinaccedilatildeo com reatividade 3 a 4+ no TDA As
amostras que apresentaram reaccedilatildeo menor que 3+ foram novamente sensibilizadas com nova
aliacutequota do antissoro
25
413 TRATAMENTO DAS AMOSTRAS
As amostras sensibilizadas apresentando o TDA positivo 3 ou 4+ foram divididas em
duas aliacutequotas e submetidas a duas teacutecnicas diferentes com o objetivo de dissociar o anticorpo
ligado Uma aliacutequota da amostra foi tratada com soluccedilatildeo de difosfato de cloroquina enquanto
a outra aliacutequota foi tratada com glicina-aacutecidaEDTA
42 PREPARO DA GLICINA AacuteCIDA-EDTA
A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA utiliza 3 soluccedilotildees diferentes a glicina aacutecida o
EDTA e o tampatildeo TRIS
Os reagentes foram preparados utilizando os sais para anaacutelise (PA) de EDTA
(Na2EDTA2H2O) TRIS (C4H11NO3) Glicina (H2NCH2CO2H) NaCl e a soluccedilatildeo de aacutecido
cloriacutedrico (HCl) 12 N todos reagentes da marca SYNTH (quadro 1)
Para o preparo do tampatildeo glicina-acida eacute necessaacuterio o ajuste do pH para 15 Para esse
ajuste utiliza-se aacutecido cloriacutedrico (HCl) concentrado O pH foi medido com fitas reativas de pH
com escala de 1 a 14 da marca MERCK Posteriormente a soluccedilatildeo foi enviada ao laboratoacuterio
de controle de qualidade do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto e o pH medido no peagacircmetro O
tampatildeo glicina-aacutecida foi armazenado a 4deg e o tampatildeo tris e o EDTA em temperatura ambiente
controlada (20 a 24deg Celsius)
Apoacutes o preparo e durante a realizaccedilatildeo dos testes foram feitas inspeccedilotildees visuais para
verificaccedilatildeo de turvaccedilatildeo do meio e presenccedila de precipitados
Reagente Material Quantidade Preparo e
Conservaccedilatildeo
EDTA
EDTA
(Na2EDTA2H2O)
5 gramas Mistura ateacute
dissoluccedilatildeo do sal e
conserva em
temperatura ambiente Aacutegua Destilada 50 Ml
Tris
TRIS (C4H11NO3) 121 gramas Conservar em
temperatura ambiente NaCl 525g
Aacutegua destilada 100ml
Gliacutecina-aacutecida
Glicina
(H2NCH2CO2H) 15 gramas
Conservar a 4oC NaCl 116gramas
Aacutegua Destilada 200ml
HCL 12N Ajutar o pH para 15
Quadro 1 - Preparo dos Reagentes da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
Fonte - Manual teacutecnico AABB 2011
26
O tampatildeo glicina-aacutecida e o tampatildeo TRIS satildeo estaacuteveis por 7 meses O reagente EDTA
precipitou mesmo estando em temperatura em ambiente controlado Houve necessidade de
preparo de novo reagente
421 TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
1 Em um tubo de ensaio 12x75 mm eacute adicionado 08 mL da soluccedilatildeo de glicina-aacutecida A
esta soluccedilatildeo adiciona-se 02 mL de EDTA e mistura
2 Adiciona-se 02 mL de hemaacutecias sensibilizadas (lavada 4 vezes) A mistura eacute
homogeneizada e incubada por exatamente 2 minutos
3 A seguir 01 mL de tampatildeo TRIS eacute adicionado agrave mistura que eacute novamente
homogeneizada e centrifugada por 2 minutos a 3400 rpm O pH deve estar entre 7 a 75
4 Apoacutes centrifugaccedilatildeo separa-se em outro tubo o sobrenadante (eluato) e as hemaacutecias
que permanecem satildeo lavadas 4 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica para retirada de todo o
reagente e anticorpos livres
43 PREPARO DA CLOROQUINA
A cloroquina eacute diluiacuteda em tampatildeo PBS na concentraccedilatildeo de 20 (Quadro 2) e
armazenado a 4deg Celsius sua validade apoacutes o preparo eacute de 1 mecircs
A teacutecnica da cloroquina jaacute estaacute padronizada para rotina do laboratoacuterio de
imunohematologia do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto e suas unidades
Reagente Reagentes Quantidade PreparoConservaccedilatildeo
Cloroquina
Difosfato de cloroquina
(C18H32ClN3O8P2)
20 gramas
Conservar a 4deg Celsius
Tampatildeo PBS 100ml
NaOH 01 N Acertar o pH para
51
Quadro 2 - Preparo da Cloroquina Fonte - Manual teacutecnico da AABB 2011
431 TEacuteCNICA DA CLOROQUINA
1 4 partes da soluccedilatildeo pronta eacute adicionada a uma parte de hemaacutecias lavadas 4 vezes com
soluccedilatildeo fisioloacutegica
2 A mistura eacute incubada em temperatura ambiente por ateacute duas horas
3 Centrifugar a 3400 rpm por 2 minutos
27
4 Remover o sobrenadante lavar as hemaacutecias novamente com soluccedilatildeo fisioloacutegica 4
vezes
44 VERIFICACcedilAtildeO DA EFETIVIDADE DOS TESTES
Apoacutes tratamento pelas duas teacutecnicas o TDA foi repetido em todas as amostras para
verificar se os tratamentos foram efetivos e houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo Para as
amostras tratadas pela teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA que permaneceram com TDA positivo
novo tratamento foi realizado
45 TESTE DO ELUATO
O eluato resultante das amostras tratadas com glicina-acidaEDTA foi testado com
hemaacutecias de triagem A soluccedilatildeo do eluato foi incubada com as hemaacutecias de triagem de
anticorpos (ID-Diacell BIO-RAD) pela teacutecnica em gel LissCoombs O teste foi incubado 15
minutos a 37deg Celsius e centrifugado por 10 minutos em centrifuga proacutepria para a teacutecnica em
gel Os eluatos que apresentaram resultados positivos foram testados em painel de 11
hemaacutecias (ID-Diapanel BIO-RAD) para a identificaccedilatildeo do anticorpo
46 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente que apresentou TDA positivo por IgG e pesquisa
de anticorpo irregular positivo com presenccedila de autoanticorpo com reatividade panaglutinina
A amostra foi tratada em paralelo pelas duas teacutecnicas descritas e foi enviada para o
Hemocentro para genotipagem eritrocitaacuteria que foi realizado por metodologia PCR em tempo
real no equipamento Real-time system PCR 7500 ( Applied Biosystems Califoacuternia EUA)
28
5 RESULTADOS
51 REAGENTES
Para aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA satildeo necessaacuterios 3 diferentes
reagentes que podem ser encontrados em forma de kit pronto para uso No entanto esses kits
natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil Os reagentes satildeo tampatildeo glicina-aacutecida o EDTA e o tampatildeo
Tris
Todos os reagentes foram preparados rdquoin houserdquo a partir dos sais e soluccedilotildees PA (puro
para anaacutelise) da marca SYNTH que foram adquiridos para a pesquisa O custo estimado para
cada teste foi aproximadamente R$ 020 reais
Apoacutes o preparo os reagentes poderiam ser armazenados em condiccedilotildees adequadas pelo
periacuteodo de 1 ano (AABB 2011) Ao final do preparo e durante o periacuteodo de armazenamento
de fevereiro a setembro de 2016 foi realizada inspeccedilatildeo visual para verificar a presenccedila de
precipitados ou turvaccedilatildeo A soluccedilatildeo de glicina e o tampatildeo TRIS mostraram-se estaacuteveis ateacute o
final do periacuteodo Por sua vez o reagente EDTA precipitou mesmo estando armazenado em
temperatura ambiente controlada e foi necessaacuterio novo preparo
52 AMOSTRAS DE DOADORES
521 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS AMOSTRAS
Apoacutes incubaccedilatildeo da hemaacutecia com o antissoro a mesma foi lavada 4 vezes para retirada
dos anticorpos livres A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada Caso houvesse positividade na
soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem a etapa era repetida (figura 3) Das 50 amostras sensibilizadas a
uacuteltima lavagem foi positiva somente em 3 delas Nas 3 amostras o anticorpo utilizado para
sensibilizaccedilatildeo foi o anti-K Apoacutes repetido nova etapa de lavagem os resultados se
apresentaram negativos
Em todas as amostras sensibilizadas ldquoin vitrordquo o TDA foi testado e verificado a
intensidade do teste Entre as 50 amostras 47 alcanccedilaram TDA com intensidade 3-4+ apoacutes a
primeira sensibilizaccedilatildeo enquanto 3 amostras necessitaram uma segunda incubaccedilatildeo com
anticorpo (figura 4)
A escolha dos anticorpos para sensibilizar as hemaacutecias foi feita de acordo com o
fenoacutetipo do doador e foram utilizados sete diferentes especificidades de anticorpos policlonais
humanos conforme mostra o graacutefico1
29
Figura 3 - Soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada com hemaacutecia de triagem de
anticorpos em gel LissCoombs (BIO-RAD) A finalidade eacute verificar a presenccedila de anticorpos livres na
suspensatildeo que possam interferir na pesquisa do eluato As soluccedilotildees de lavagem das amostras na figura a tiveram
resultados negativos Na figura b duas amostras a 47 e 50 apresentaram resultado positivo Nova etapa de
lavagem foi realizada e o resultado final foi negativo
522 TRATAMENTO DAS HEMAacuteCIAS
Apoacutes a sensibilizaccedilatildeo e obtenccedilatildeo de resultados de TDA com intensidade de 3 a 4+
cada uma das amostras foi dividida em duas aliacutequotas e tratada separadamente pelas teacutecnicas
de glicinaaacutecida-EDTA e cloroquina
As teacutecnicas foram consideradas efetivas quando obteve-se a completa dissociaccedilatildeo do
anticorpo verificada atraveacutes do TDA negativo na amostra poacutes tratamento conforme figuras 5
e 6 Dentre as amostras tratadas com cloroquina 2850 tiveram o TDA negativado A glicina-
aacutecidaEDTA negativou o TDA em 33 das 50 amostras tratadas Apenas 17 amostras tratadas
com glicina-aacutecidaEDTA permaneceram com o TDA positivo e foram submetidas a um novo
tratamento
30
Figura 4 - TDA das amostras apoacutes sensibilizaccedilatildeo com anticorpos policlonais humanos Amostras na
figura a com intensidades de 3-4+ Na figura b amostras 4 e 7 com intensidade menor que 3+ e portanto foram
novamente sensibilizadas com nova aliacutequota de soro Anti-D e anti-S Apoacutes a segunda sensibilizaccedilatildeo
apresentaram reatividade 4 e 3+ respectivamente Os anticorpos utilizados para sensibilizaccedilatildeo foram D S c E
C e K
523 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS TEacuteCNICAS
No tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA houve dissociaccedilatildeo completa do anticorpo
em 33 amostras (66) das 50 amostras testadas enquanto que com a cloroquina foram 28
amostras (56) (tabela 1)
31
Graacutefico 1- Nuacutemero de amostras sesnsibilizadas por especificidade de anticorpo Entre as 50 amostras 12
foram sensibilizadas com anti-D 10 com anti-C 9 com anti-E 8 com anti-c 7 com anti-S 3 com anti-K e 1
com anti-Dia As especificidades dos anticorpos foram definidas de acordo o fenoacutetipo do doador
Figura 5 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com cloroquina Nas amostras onde houve
a dissociaccedilatildeo do anticorpo ( 2 21 a 23 26 39 a 42 45 46 e 49) a hemaacutecia se deposita no fundo no microtubo
apoacutes a centrifugaccedilatildeo (TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (1 3 24 25 43 44 47
48 e 50) o anticorpo ligado agraves hemaacutecias eacute alvo da AGH presente no gel (TDA positivo)
Anti-D 12
Anti-C 10
Anti-E 9
Anti-c 8
Anti-S 7
Anti-K 3 Anti-Dia 1
32
Figura 6 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA Nas amostras
onde houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo (4 6 7 12 a 15 17 34 35 37 e 38) a hemaacutecia se deposita no fundo no
microtubo apoacutes a centrifugaccedilatildeo ( TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (5 16 18
19 20 33 e 36 ) o AGH presente no gel se liga ao anticorpo ligado agraves hemaacutecias que ficam retidas no gel (TDA
positivo)
Tabela 1-Resultado geral do tratamento das hemaacutecias com glicina e cloroquina
Teacutecnica utilizada TDA negativo TDA positivo Total
Glicina-aacutecidaEDTA 33 17 50
Cloroquina 28 22 50
A glicina-aacutecidaEDTA conseguiu negativar mais amostras sensibilizadas com Anti-D
e anti-K que a cloroquina Para as hemaacutecias sensibilizadas com anti-E Anti-S e Anti-Dia
ambas as teacutecnicas dissociaram o anticorpo em 100 das amostras Os resultados detalhados
por especificidade do anticorpo apoacutes o primeiro tratamento com glicina-aacutecidaEDTA e com
cloroquina estatildeo na tabela 2
Para as amostras que permaneceram positivas (17 amostras) apoacutes o tratamento com a
glicina-aacutecidaEDTA foi realizado um novo tratamento Houve dissociaccedilatildeo do anticorpo em 3
amostras (18) apoacutes a segunda tentativa Nas demais 14 (82) amostras tratadas pela
segunda vez 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise
33
Tabela 2 - Resultados do TDA apoacutes tratamento das hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo
sensibilizado
ANTICORPOS
SENSIBILIZADOS
1ordm TRATAMENTO COM
GLICINA
TRATAMENTO COM
CLOROQUINA
TOTAL TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
Anti-D 8 4 0 12 12
Anti-C 6 4 10 0 10
Anti-E 9 0 9 0 9
Anti-c 0 8 1 7 8
Anti-S 7 0 7 0 7
Anti-K 2 1 0 3 3
Anti-Dia 1 0 1 0 1
TOTAL 33 17 28 22 50
A hemoacutelise foi verificada durante o procedimento de lavagem final das hemaacutecias com
soluccedilatildeo fisioloacutegica para a retirada dos reagentes As soluccedilotildees de lavagem ficaram
avermelhadas e as hemaacutecias com coloraccedilatildeo escura As amostras foram descartadas Dentre as
6 amostras que ainda puderam ser testadas para o TDA trecircs amostras negativaram sendo 1
sensibilizada com anti-D e 2 com anti-C (tabela 3)
Tabela 3 - Resultado apoacutes o segundo tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA
Tratamento com
glicina-aacutecidaEDTA
TDA Negativo TDA Positvo Hemoacutelise Total
Segundo tratamento 3 3 11 17
524 TESTAGEM DO ELUATO
Apoacutes o tratamento com a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA a soluccedilatildeo do eluato foi
testada para verificar a viabilidade dos anticorpos que foram dissociados ou eluiacutedos Dentre
as 50 amostras 41 apresentaram eluato positivo As nove amostras cujos eluatos foram
negativos haviam sido sensibilizadas com as seguintes especificidades de anticorpos anti-E 6
amostras (67) anti-S 2 amostras (40) e anti-D 1 amostra (8) (tabela 4) O eluato de
todas as amostras sensibilizadas com os anticorpos anti-C anti-c Anti-K e Anti-Dia foram
positivos Os eluatos positivos na triagem de anticorpos foram testados com paineacuteis de
identificaccedilatildeo para confirmar a especificidade e a viabilidade dos anticorpos (figuras 7 e 8)
34
525 EFEITO DA ELUICcedilAtildeO SOBRE OS ANTIacuteGENOS ERITROCITAacuteRIOS
Para verificar o efeito do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA e com a cloroquina
sobre a expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s foi realizada a fenotipagem das
amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes tratamento com ambas as teacutecnicas Foi avaliado
se o tratamento destruiu os antiacutegenos expressos antes do tratamento
Tabela 4- Resultado do Eluato das amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA
Anticorpos Eluato positvo Eluato negativo Total
Anti-D 11 1 12
Anti-C 10 0 10
Anti-E 3 6 9
Anti-c 8 0 8
Anti-S 5 2 7
Anti-K 3 0 3
Anti-Dia 1 0 1
Total 41 9 50
Figura 7 ndash Painel do eluato da amostra 21 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-C que foi
recuperado no eluato
Figura 8 ndash Painel do eluato da amostra 47 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-K que foi
recuperado no eluato
35
Dentre as 50 amostras 26 eram previamente fenotipadas para os antiacutegenos Fya Fy
b
Jka Jk
b S e s Dentre elas 20 alcanccedilaram TDA negativo apoacutes tratamento com a glicina-
aacutecidaEDTA e 20 negativaram apoacutes tratamento com cloroquina (tabela 5) Apoacutes ambas as
teacutecnicas os antiacutegenos originalmente expressos permaneceram positivos comprovando que natildeo
houve destruiccedilatildeo dos mesmos
Tabela 5 ndash Verificaccedilatildeo da interferecircncia do tratamento da hemaacutecias com cloroquina e glicina-
aacuteicdaEDTA sobre os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
AMOSTRAS
COM
FENOTIPAGEM
PREacuteVIA
TRATADAS COM
CLOROQUINA
TRATADAS COM
GLICINA
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
26
20
20
20
20
As amostras 24 47 e 50 eram positivas para o antiacutegeno K A cloroquina natildeo dissociou
o anticorpo em nenhuma das 3 amostras enquanto a glicina-aacutecidaEDTA foi efetiva nas
amostras 24 e 50 Foi testada a expressatildeo do antiacutegeno K nas amostras 24 e 50 apoacutes o
tratamento utilizando meacutetodo indireto em gel contendo AGH Apesar de natildeo ter sido avaliado
a intensidade de reaccedilatildeo de expressatildeo dos antiacutegenos podemos verificar na figura 9 que nas
duas amostras em que a teacutecnica foi efetiva e dissociou o anticorpo a expressatildeo do antiacutegeno K
continua presente mas a reatividade observada pode ser considerada 1+ sugerindo que houve
diminuiccedilatildeo da expressatildeo do antiacutegeno quando comparado com a expressatildeo observada em
hemaacutecia natildeo tratada
Os resultados individuais de cada amostra em ambas as teacutecnicas encontram-se
resumidas na tabela 6
526 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente onde foi constatada a presenccedila de autoanticorpo
a quente da classe IgG pelo TDA monoespeciacutefico (figura 10)O autoanticorpo tambeacutem
interferia na pesquisa e identificaccedilatildeo de anticorpos irregulares pois apresentava caracteriacutestica
de panaglutinina As hemaacutecias da paciente sensibilizadas ldquoin vivordquo foram tratadas com
cloroquina e com glicina-aacutecidaEDTA
36
Figura 9 ndash Fenotipagem das amostras 24 e 50 para antiacutegeno K apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
O teste positivo indica a presenccedila do antiacutegeno poreacutem a reatividade fraca (1+) sugere que houve enfraquecimento
de sua expressatildeo A direita a expressatildeo forte (4+) do antiacutegeno Kell em hemaacutecia controle natildeo tratada utilizada
como controle positivo
A cloroquina natildeo foi efetiva na retirada do anticorpo ligado as hemaacutecias ao contraacuterio
do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA que dissociou o anticorpo (figura 11)
A hemaacutecia tratada com glicina foi fenotipada para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
(figura 12) A fenotipagem para o sistema Rh (C c E e e) e Kell foi realizada em gel
especiacutefico monoclonal sem interferecircncia do TDA positivo (controle da reaccedilatildeo negativo)
O eluato resultante do tratamento com glicina-aacutecidaEDTA foi testada em gel com
hemaacutecias de painel de identificaccedilatildeo de anticorpos e apresentou resultado positivo com todas
as ceacutelulas (figura 13 e 14)
A amostra foi enviada para genotipagem e o resultado da genotipagem confirmou o
resultado da fenotipagem apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
527 TEMPO DE EXECUCcedilAtildeO DA TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
O tempo de reaccedilatildeo da glicina-aacutecidaEDTA eacute de 2 minutos Todas as amostras foram
tratadas obedecendo ao tempo descrito na literatura demonstrando que o mesmo eacute
reprodutiacutevel
37
Tabela 6- Resultados individuais por amostra
Amostra Especificidade
dos anticorpos
Intensidade do
TDA apoacutes
sensibilizaccedilatildeo
Tratamento
efetivo com
cloroquina
Tratamento
efetivo com
glicina
Eluato
poacutes
glicina
1 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 2 Dia 3+ Sim Sim 3+ 3 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 4 D 4+ Natildeo Sim 4+ 5 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 6 E 3+ Sim Sim Negativo 7 S 4+ Sim Sim 3+ 8 E 3+ Sim Sim 1+ 9 E 3+ Sim Sim 2+
10 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 11 D 4+ Natildeo Sim 4+ 12 D 4+ Natildeo Sim 4+ 13 S 3+ Sim Sim 3+ 14 S 3+ Sim Sim 3+ 15 D 3+ Natildeo Sim 3+ 16 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 17 E 3+ Sim Sim (+) 18 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 19 D 4+ Natildeo Natildeo 3+ 20 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 21 C 3+ Sim Sim 4+ 22 C 3+ Sim Sim 4+ 23 C 3+ Sim Sim 4+ 24 K 4+ Natildeo Sim 4+ 25 D 3+ Natildeo Natildeo Negativo 26 E 4+ Sim Sim Negativo 27 S 3+ Sim Sim 3+ 28 C 3+ Sim Natildeo 4+ 29 C 3+ Sim Sim 4+ 30 C 3+ Sim Sim 4+ 31 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 32 E 3+ Sim Sim Negativo 33 C 3+ Sim Natildeo 4+ 34 S 3+ Sim Sim Negativo 35 S 3+ Sim Sim Negativo 36 C 4+ Sim Natildeo 4+ 37 c 4+ Natildeo Natildeo 4+ 38 D 4+ Natildeo Sim 4+ 39 S 3+ Sim Sim 3+ 40 c 4+ Sim Natildeo 2+ 41 C 4+ Sim Natildeo 4+ 42 E 3+ Sim Sim Negativo 43 D 3+ Natildeo Sim 2+ 44 D 3+ Natildeo Sim 2+ 45 E 3+ Sim Sim Negativo 46 C 3+ Sim Sim 4+ 47 K 4+ Natildeo Natildeo 4+ 48 D 3+ Natildeo Sim 2+ 49 E 3+ Sim Sim Negativo 50 K 4+ Natildeo Sim 4+
TOTAL 50 28 33 41
38
Figura 10 ndash TDA monoespeciacutefico da amostra de paciente Hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo da classe
IgG
oacute Figura 11 ndash TDA apoacutes o tratamento com glicina-aacutecidaEDTA (esquerda) e cloroquina (direita) A glicina
negativou completamente o TDA enquanto a hemaacutecia tratada com cloroquina persistiu positiva (1+)
39
Figura 12 ndash Fenotipagem da amostra tratada com glicina-aacutecidaEDTA Fy(a+b+) Jk(a-b+) S+s+
Figura 13 ndash Painel em gel (LissAGH) do eluato apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de
intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
Figura 14 ndash ndash Painel ezimaacutetico (hemaacutecias tratadas com bromelina) do eluato em gel neutro apoacutes
tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
40
528 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Quanto a efetividade das teacutecnicas em negativar o TDA foi verificado que a glicina-
aacutecidaEDTA foi efetiva em 66 das amostras testadas no primeiro tratamento (3350
amostras) enquanto a cloroquina conseguiu negativar 56 (2850) Esses resultados natildeo
apresentam diferenccedila significativa (pgt005) demostrando que a teacutecnica da glicina-
aacutecidaEDTA natildeo eacute superior mas eacute tatildeo efetiva quanto a da cloroquina
Quando aliamos os resultados de ambas as teacutecnicas verificamos que em 76 (3850)
das amostras o TDA foi negativado Esse dado indica que ainda que uma teacutecnica natildeo seja
eficaz na remoccedilatildeo do anticorpo eacute uma boa alternativa tentar a segunda teacutecnica jaacute que a falha
em remover o anticorpo utilizando uma delas natildeo prevecirc necessariamente a falha com a outra
Quando se utiliza o teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla (graacutefico 2) para comparar a utilizaccedilatildeo das
duas teacutecnicas com o resultado de cada uma isolada (somente a cloroquina ou somente a
glicina) verificamos que os resultados apresentam diferenccedila significativa (plt005) (quadro 3)
TRATAMENTO EFETIVO COM TOTAL PORCENTAGEM
Glicina ou cloroquina 38 76
Glicina e cloroquina 23 46
Glicina apenas 10 20
Cloroquina apenas 5 10
Nenhuma das teacutecnicas 12 24
Quadro 3 - Resultados comparativos entre as teacutecnicas utilizadas
41
Graacutefico 2 - Teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla entre as teacutecnicas aplicadas A- Glicina e Cloroquina B-Cloroquina C-
Glicina ( plt005)
42
6 DISCUSSAtildeO
Os reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA podem ser adquiridos em
forma de kit comercial prontos para uso poreacutem natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil A preparaccedilatildeo
dos reagentes ldquoin houserdquo a partir de sais comerciais adquiridos se mostrou viaacutevel Os
reagentes glicina e o tampatildeo Tris armazenados de forma correta se mantiveram estaacuteveis por
um periacuteodo de 7 meses Somente o reagente EDTA precipitou mesmo armazenado em
condiccedilotildees adequadas sugerindo que o mesmo deve ser preparado em menor quantidade e
armazenado em aliacutequotas A soluccedilatildeo de cloroquina tambeacutem pode ser preparada ldquoin houserdquo e
pode ser armazenado por um mecircs A legislaccedilatildeo brasileira autoriza a utilizaccedilatildeo de reagentes
preparados a partir de sais comerciais como a cloroquina e a glicina-aacutecidaEDTA desde que
os sais tenham autorizaccedilatildeo da vigilacircncia sanitaacuteria para a comercializaccedilatildeo (BRASIL 2001)
A comparaccedilatildeo quanto a efetividade em dissociar anticorpos em amostras com TDA
positivos entre a teacutecnica da glicina e a teacutecnica da cloroquina mostrou que natildeo haacute diferenccedila
estatiacutestica entre elas e que ambas satildeo igualmente eficientes Se utilizadas conjuntamente haacute
maior possibilidade de elucidaccedilatildeo dos casos
Uma vantagem da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eacute que ela permite numa mesma
amostra eluir o anticorpo ligado aacute hemaacutecia assim como fenotipar a hemaacutecia tratada Devido a
sua dupla utilidade a teacutecnica eacute vantajosa principalmente em pacientes em que pouco volume
de amostra pode ser coletado como em casos de crianccedilas e receacutem-nascidos
A fenotipagem poacutes tratamento se mostrou viaacutevel jaacute que os antiacutegenos de maior
importacircncia natildeo sofreram alteraccedilotildees Nas 20 amostras que foram fenotipadas antes e apoacutes
tratamento para verificar a influecircncia dos reagentes na expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a
Jkb S e s natildeo houve destruiccedilatildeo dos mesmos por nenhuma das duas teacutecnicas
Para as amostras positivas para o antiacutegeno Kell (350) e sensibilizadas com o
respectivo anticorpo a teacutecnica da glicina foi efetiva em negativar o TDA em apenas duas
delas mas apoacutes o tratamento foi verificada uma fraca reatividade da reaccedilatildeo antiacutegeno-
anticorpo sugerindo que houve um enfraquecimento da expressatildeo do antiacutegeno conforme
esperado e descrito na literatura (BYRNE 1991 PALLAS WILER E MCGEE 1991
ROZIERS e SQUALI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012 e KATHARIA e
CHAUDHARY 2013) A accedilatildeo da glicina sobre o antigeno Kell natildeo representa impedimento
para seu uso uma vez que na impossibilidade de testar o antiacutegeno Kell o banco de sangue
consegue facilmente atender a solicitaccedilatildeo de transfusatildeo com unidades de hemaacutecias Kell
43
negativas jaacute que eacute um antiacutegeno de baixa prevalecircncia na populaccedilatildeo variando de 15 na
populaccedilatildeo africana a 9 nos europeus (DANIELS 2011)
A soluccedilatildeo resultante da dissociaccedilatildeo do anticorpo pela teacutecnica da glicina pode ainda ser
utilizada como eluato podendo substituir a teacutecnica de eluiccedilatildeo com reagentes comercias (kits
de eluiccedilatildeo aacutecida) que tem alto custo aproximadamente entre R$2000 a R$2500 por teste
Em 41 amostras (82) houve a dissociaccedilatildeo e recuperaccedilatildeo do anticorpo que estava
sensibilizando as hemaacutecias Em 9 amostras (18) os anticorpos foram eluiacutedos poreacutem
apresentaram reaccedilatildeo negativa quando testadas com hemaacutecias de triagem entre eles o anti-E
(6) anti-S (2) e Anti-D (1) Eacute possiacutevel que a correccedilatildeo pH do meio (WALKER 2011) natildeo
tenha sido adequada o que pode ter desfavorecido a reatividade do anticorpo
Para as amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA nas quais natildeo houve dissociaccedilatildeo do
anticorpo pelo primeiro tratamento (1750) o segundo tratamento natildeo se mostrou eficaz jaacute
que 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise O tempo de
armazenagem natildeo parece ter influenciado jaacute que todas as amostras foram testadas dentro de
48 horas apoacutes a coleta Outros fatores que natildeo foram verificados podem ter levado a
hemoacutelise Apesar da literatura (LOUIE JIENG e ZEROULIS 1986 e BYRNE 1991)
recomendar um segundo tratamento ele eacute pouco eficaz tendo negativado apenas 3 das 17
amostras testadas
A amostra de paciente que apresentou sensibilizaccedilatildeo ldquoin vivordquo mostrou melhor
efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA sobre a da cloroquina possibilitando
fenotipagem para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s que natildeo foram destruiacutedos apoacutes o
tratamento comprovado atraveacutes da genotipagem
A presenccedila de autoanticorpo a quente com presenccedila de hemoacutelise (AHAI) ou natildeo pode
mascarar a presenccedila de aloanticorpo interferindo na rotina soroloacutegica da fenotipagem que eacute
uma importante ferramenta para auxiliar na seleccedilatildeo de hemaacutecias para transfusatildeo (SHIREY et
al 2002) Esses pacientes frequentemente possuem aloanticorpos associados ao
autoanticorpo e a prevalecircncia de aloimunizaccedilatildeo entre eles varia entre 12 a 40 (LEGER e
GARRATY 1999 BRANCH e PETZ 1999) o que dificulta ainda mais a escolha do melhor
componente a ser transfundido aleacutem de aumentar a possibilidade reaccedilotildees hemoliacuteticas imunes
poacutes-transfusionais
Nesses casos as teacutecnicas de dissociaccedilatildeo de anticorpos satildeo importantes para tratar
amostras de pacientes e a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser usada como uma opccedilatildeo
pois se mostrou eficaz na dissociaccedilatildeo anticorpo ligado agraves hemaacutecias deixando livre a
superfiacutecie das mesmas permitindo a fenotipagem por antisoros IgG Paralelamente os
44
anticorpos eluiacutedos tambeacutem puderam ser estudados O mesmo natildeo ocorre com a cloroquina
que permite apenas a fenotipagem e tampouco com os kits de eluiccedilatildeo aacutecida disponiacuteveis no
mercado nacional que satildeo destinados a realizaccedilatildeo do eluato mas destroem as hemaacutecias
O tempo de tratamento na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA tambeacutem eacute uma vantagem
pois foi possiacutevel reproduzir no tempo determinado de 2 minutos enquanto a cloroquina
demora ateacute duas horas
Ainda que a aplicaccedilatildeo das teacutecnicas por biologia molecular estejam cada vez mais
presentes na rotina imuno-hematoloacutegica e possibilitam estabelecer o fenoacutetipo deduzido do
genoacutetipo elas natildeo estatildeo disponiacuteveis na maioria dos centros e sua realizaccedilatildeo exige algumas
horas A resoluccedilatildeo imediata do problema transfusional necessita dos resultados soroloacutegicos
pois com frequecircncia natildeo eacute possiacutevel aguardar o resultado do teste molecular Dessa forma
apesar da crescente importacircncia da genotipagem eritrocitaacuteria teacutecnicas soroloacutegicas aplicadas
corretamente e no momento propiacutecio satildeo de grande utilidade para resolver problemas imuno-
hematoloacutegicos como ocorre com a fenotipagem em pacientes com TDA positivo
45
7 CONCLUSAtildeO
A teacutecnica da glicina aacutecidaEDTA mostrou-se efetiva em remover os anticorpos que
sensibilizavam as hemaacutecias e pode ser utilizada com seguranccedila antes da fenotipagem
eritrocitaacuteria Por ser uma teacutecnica de raacutepida execuccedilatildeo eacute uma alternativa aplicaacutevel
principalmente em casos urgentes de pacientes que apresentam autoanticorpos
46
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50
9 ANEXOS
51
FUNDACcedilAtildeO HEMOCENTRO DE RIBEIRAtildeO PRETO
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE)
Tiacutetulo da pesquisa Aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina aacutecida-EDTA e avaliaccedilatildeo da
eficaacutecia no tratamento de hemaacutecias com teste direto da antiglobulina positivo
Pesquisadora responsaacutevel Ceacutelia Kazue Abiko
Orientador Prof Dimas Tadeu Covas
Co-orientadora Dra Flaacutevia Leite Souza Santos
Objetivo da pesquisa Vocecirc estaacute sendo convidado a participar de uma pesquisa que tem
como objetivo padronizar uma nova teacutecnica para auxiliar na tipagem sanguiacutenea de pacientes
A tipagem sanguiacutenea pode sofrer interferecircncia da presenccedila de anticorpos ligados aos gloacutebulos
vermelhos do sangue Nessas situaccedilotildees eacute difiacutecil selecionar o melhor sangue para o paciente e
eacute preciso a utilizaccedilatildeo de teacutecnicas adicionais para remover essas interferecircncias
Esta pesquisa tem como objetivo estudar outra teacutecnica para remover esses anticorpos e
comparaacute-la com a teacutecnica atualmente utilizada Para isso precisamos de amostras de pacientes
e doadores voluntaacuterios
Se vocecirc eacute um doador eacute necessaacuterio que vocecirc autorize a coleta de 5 ml (1 tubo) a mais
de seu sangue
Se vocecirc eacute um paciente natildeo haveraacute necessidade de nova amostra pois utilizaremos as
amostras jaacute coletadas para os testes preacute-transfusionais e os resultados encontrados nesta
pesquisa natildeo iratildeo interferir na escolha da (s) bolsa (s) de sangue que vocecirc possa vir a receber
Se vocecirc concordar em participar leia com atenccedilatildeo o texto abaixo e assine as duas vias
rubricando todas as paacuteginas deste termo de consentimento Uma via original assinada e
rubricada por vocecirc e pela pesquisadora ficaraacute com vocecirc
As suas informaccedilotildees seratildeo mantidas em sigilo pela pesquisadora e natildeo haveraacute
armazenamento de material para pesquisas posteriores Os seus dados seratildeo usados apenas
neste estudo e quando o trabalho for publicado seu nome e qualquer outra informaccedilatildeo que
possam identificaacute-lo natildeo seratildeo revelados
Eacute pouco provaacutevel que o que noacutes aprendermos com este estudo tenha um benefiacutecio
direto para vocecirc assim como natildeo poderemos dar nada em troca pela sua participaccedilatildeo na
pesquisa
Nosso objetivo com esta pesquisa eacute que os resultados poderatildeo ser uacuteteis para o
tratamento de pacientes no futuro Os riscos da participaccedilatildeo satildeo miacutenimos Se vocecirc eacute um
doador de sangue a amostra seraacute coletada no momento da doaccedilatildeo natildeo exigindo punccedilatildeo
venosa adicional
52
Eacute seu direito ter acesso aos resultados dos testes da pesquisa Esses resultados natildeo
seratildeo fornecidos automaticamente a vocecirc mas caso vocecirc se interesse em saber o resultado ou
tiver alguma duacutevida sobre a sua participaccedilatildeo neste estudo deveraacute entrar em contato com Ceacutelia
Kazue Abiko pelo telefone (18) 99718-3551
Vocecirc tem total liberdade de optar por natildeo participar da pesquisa Caso aceite
participar poderaacute desistir a qualquer momento ou retirar seu consentimento mesmo apoacutes ter
coletado o sangue Para cancelar sua participaccedilatildeo basta avisar a pesquisadora e os seus dados
seratildeo retirados do projeto
Qualquer duacutevida eacutetica sobre a pesquisa poderaacute entrar em contato com o Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa do Hospital das Cliacutenicas e da Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto
(CAMPUS UNIVERSITAacuteRIO bairro Monte Alegre CEP 14048-900 Ribeiratildeo Preto-SP
Telefone (16) 3602-2228 FAX (16) 3633-1144 e-mail cephcrpuspbr)
Consentimento de participaccedilatildeo
A Consentimento do participante
Li as informaccedilotildees acima sobre o estudo e recebi explicaccedilotildees sobre a participaccedilatildeo no estudo
Portanto dou o meu consentimento para participar do estudo
___________________________________________________________________________
Nome completo
___________________________________________________________________________
Assinatura
___________
Data
__________________________________________________________________________________
Nome completo da pesquisadora
___________________________________________________________________________
Assinatura
_____________
Data
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Princiacutepio da teacutecnica direta da antiglobulinapaacutegina11
Figura 2 - Princiacutepio da teacutecnica indireta da antiglobulinapaacutegina 13
Figura 3 ndash Teste da soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem apoacutes sensibilizaccedilatildeo das hemaacuteciaspaacutegina 29
Figura 4 - TDA das amostras apoacutes sensibilizaccedilatildeo com anticorpospaacutegina 30
Figura 5 - Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com
cloroquina paacutegina 31
Figura 6 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA
paacutegina 32
Figura 7 - Painel do eluato da amostra 21 apresentando especificidade anti-Cpaacutegina 34
Figura 8 - Painel do eluato da amostra 47 apresentando especificidade anti-
K paacutegina 34
Figura 9 - Fenotipagem das amostras 24 e 50 para antiacutegeno K apoacutes tratamento com glicina-
aacutecidaEDTApagina 36
Figura 10 ndash TDA monoespeciacutefico Amostra sensibilizadardquo in vivordquo com anticorpo anti-
IgGpaacutegina 38
Figura 11 ndash TDA apoacutes o tratamentopaacutegina 38
Figura 12 ndash Resultado da fenotipagem da amostra sensibilizada ldquoin vivordquo por anti-
IgGpaacutegina 39
Figura 13 ndash Painel do eluato poacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA paacutegina 39
Figura 14 ndash Painel do eluato poacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA paacutegina 39
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Resultado geral do tratamento das hemaacutecias com glicina e
cloroquinapaacutegina 32
Tabela 2 - Resultados do TDA apoacutes tratamento da hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo
sensibilizadopaacutegina 33
Tabela 3 - Resultado apoacutes o segundo tratamento das hemaacutecias com glicina-
aacutecidaEDTApaacutegina 33
Tabela 4 - Resultado do Eluato das amostras tratadas com glicina-
aacutecidaEDTA paacutegina 34
Tabela 5 ndash Verificaccedilatildeo da interferecircncia do tratamento da hemaacutecias com cloroquina e glicina-
aacutecidaEDTA nos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e spaacutegina 35
Tabela 6 - Resultado da sensibilizaccedilatildeo das amostras efetividade do tratamento com
cloroquina glicina e o eluato poacutes tratamento com glicinapaacutegina 37
LISTA DE GRAFICOS
Graacutefico 1 - Nuacutemero de amostras sensibilizadas por especificidade de
anticorpopaacutegina 31
Graacutefico 2 - Teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla entre as teacutecnicas
aplicadaspaacutegina 41
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 - Preparo dos Reagentes da glicina-aacutecidaEDTApaacutegina 25
Quadro 2 - Preparo da Cloroquinapaacutegina 26
Quadro 3 - Resultados comparativos entre as teacutecnicas utilizadas paacutegina 40
LISTA DE FLUXOGRAMAS
Fluxograma 1 - Fluxograma da pesquisa utilizando as amostras de
doadorespaacutegina 22
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ABO
AHAI
Bg
c
C
C
C3
C3b
C3d
D
DHFRN
DNA
DTT
E
e
EDTA
Fc
Fya
Fyb
HCl
IgA
IgD
IgE
IgM
Mm
NaCl
PA
PAI
PBS
PCR
PEG
pH
Rh
rpm
S
s
SIDA
SBS
TCLE
TDA
TIA
TRIS
ZZAP
microL
Sistema Sanguiacuteneo ABO
Anemia Hemoliacutetica Autoimune
Antiacutegeno Bg
Antiacutegeno c
Celsius
Antiacutegeno C
Complemento
Fraccedilatildeo do complemento
Fraccedilatildeo do complemento
Antiacutegeno D
Doenccedila Hemoliacutetica do Feto e do Receacutem-nascido
Aacutecido desoxirribonucleico
Dithiothreitol
Antiacutegeno E
Antiacutegeno e
Aacutecido Etileno Diamino Tetraceacutetico
Porccedilatildeo do anticorpo
Antiacutegeno Duffy a
Antiacutegeno Duffy b
Aacutecido cloriacutedrico
Imunoglobulina A
Imunoglobulina D
Imunoglobulina E
Imunoglobulina M
Miliacutemetros
Cloreto de soacutedio
Puro para anaacutelise
Pesquisa de anticorpos irregulares
Tampatildeo fosfato salino
Reaccedilao em cadeia de polimerase
Polietilenoglicol
Potencial hidrogeniocircnico
Sistema sanguiacuteneo Rh
Rotaccedilotildees por minuto
Antiacutegeno S
Antiacutegeno s
Siacutendrome da Imunodeficiecircncia adquirida
Sistema de banco de sangue
Termo de consentimento livre e esclarecido
Teste direto da antiglobulina
Teste indireto da antiglobulina
Hidrometil aminometano
Sulphydryl-Proteolytic Enzyme
Microlitros
RESUMO
Os testes preacute-transfusionais satildeo o conjunto de teacutecnicas imuno-hematoloacutegicas aplicadas nas
amostras do receptor e do doador com a finalidade de fornecer uma unidade de hemaacutecias
compatiacutevel e segura para a transfusatildeo Aleacutem da fenotipagem ABO e Rh obrigatoacuteria nos testes
preacute-transfusionais a determinaccedilatildeo do perfil antigecircnico de outros antiacutegenos eritrocitaacuterios de
importacircncia cliacutenica melhora a seguranccedila transfusional especialmente para pacientes
previamente aloimunizados ou candidatos agrave transfusatildeo crocircnica Para tais pacientes conhecer o
fenoacutetipo eritrocitaacuterio permite a seleccedilatildeo de concentrados de hemaacutecias com o mesmo fenoacutetipo
o que previne reaccedilotildees transfusionais hemoliacuteticas assim como nova aloimunizaccedilatildeo
Indiviacuteduos que apresentam as hemaacutecias sensibilizadas ldquoin vivordquo por anticorpos anti-
eritrocitaacuterios como ocorre na anemia hemoliacutetica autoimune (AHAI) teratildeo o teste direto da
antiglobulina (TDA) positivo dificultando a realizaccedilatildeo da fenotipagem O TDA positivo
provoca resultados falsos positivos especialmente quando satildeo utilizados para a fenotipagem
soros comerciais da classe IgG que exigem a fase de antiglobulina humana ou teste indireto
da antiglobulina (TIA) para leitura Em 1982 Edwards Moulds e Judd propuseram a
utilizaccedilatildeo da teacutecnica da cloroquina para dissociar os complexos de antiacutegeno-anticorpo
preservando a membrana eritrocitaacuteria e permitindo a fenotipagem Atualmente eacute a teacutecnica
mais utilizada nos centros brasileiros A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA foi primeiramente
descrita por Louie Jieng e Zeroulis em 1986 poreacutem eacute pouco utilizada por natildeo haver os
reagentes prontos comercialmente no mercado brasileiro O presente estudo avaliou a teacutecnica
da glicina-aacutecida-EDTA com reagentes preparados ldquoin houserdquo em paralelo agrave teacutecnica da
cloroquina que eacute atualmente a teacutecnica aplicada no Hemocentro de Ribeiratildeo Preto Para isso
amostras de hemaacutecias de doadores (n=50) com fenoacutetipo conhecido foram sensibilizadas com
anticorpos humanos de especificidade conhecida e ambas as teacutecnicas foram aplicadas Foi
verificado ainda o efeito da teacutecnica sobre a expressatildeo dos antiacutegenos eritrocitaacuterios (Fya Fy
b
Jka Jk
b S e s) atraveacutes da fenotipagem das amostras que tiveram o TDA negativado A
viabiliadade dos anticorpos presentes no eluato recuperado apoacutes tratamento com a glicina-
aacutecidaEDTA tambeacutem foi testada A glicina-aacutecidaEDTA foi efetiva em negativar o TDA em
33 amostras (66) comparaacutevel com a cloroquina que negativou 28 amostras (56) O eluato
apresentou-se viaacutevel no tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA e natildeo foi constatada destruiccedilatildeo
dos antiacutegenos eritrocitaacuterios apoacutes o tratamento Concluiacutemos que a teacutecnica da glicina-
aacutecidaEDTA pode ser utilizada como uma opccedilatildeo no tratamento de hemaacutecias com TDA
positivo com a vantagem de seu tempo de execuccedilatildeo ser inferior ao da cloroquina (2minutos x
30 a 120 minutos) o que lhe torna uacutetil em situaccedilotildees de maior urgecircncia Quando ambas as
teacutecnicas satildeo utilizadas em hemaacutecias diferentes de uma mesma amostra a efetividade estaacute
significativamente aumentada (plt005)
Palavras chave Glicina-aacutecidaEDTA Teste direto da antiglobulina AHAI fenotipagem
ABSTRACT
The pre-transfusion tests are the group of immunohematology techniques applied in the
receptor and donor samples in order to provide a unit of red blood cells compatible and safe
for transfusion In addition to the obligatory ABO and Rh phenotyping in the pre-transfusion
tests the determination of the antigenic profile of other red cells antigens of clinical
importance improves transfusion safety especially for patients previously alloimmunized or
candidates for chronic transfusion For such patients knowing the phenotype allows the
selection of red blood cell concentrates with the same phenotype which prevents hemolytic
transfusion reactions as well as new alloimmunization Individuals who have antibody-coated
red blood cells sensitized in vivo such as in autoimmune hemolytic anemia (AHAI) will
have a direct antiglobulin test (DAT) positive making it difficult to perform phenotyping
Positive DAT causes false positive results especially when commercially available IgG
serums which require the human antiglobulin phase or indirect antiglobulin test (IAT) for
reading are used for phenotyping In 1982 Edwards Molds and Judd proposed the use of the
chloroquine technique to dissociate antigen-antibody complexes by preserving the erythrocyte
membrane and allowing phenotyping It is currently the most used technique in Brazilian
centers The EDTAglycine-acid technique was first described by Louie Jieng and Zeroulis in
1986 but it is little used because commercially available reagents are not available in the
Brazilian market The present study evaluated the EDTAglycine-acid technique with reagents
prepared in house in parallel to the chloroquine technique which is currently the technique
applied at the Hemocentro de Ribeiratildeo Preto For this donor red cells samples (n = 50) with
known phenotype were sensitized with human antibodies of known specificity and both
techniques were applied The effect of the technique on the expression of erythrocyte antigens
(Fya Fy
b Jk
a Jk
b S and s) was also verified by the phenotyping of the samples that had
negative DAT The viability of the antibodies present in the recovered eluate after treatment
with EDTAglycine-acid A was also tested EDTAglycine-acid was effective in negatively
affecting DAT in 33 samples (66) comparable to chloroquine that negatived 28 samples
(56) The eluate was viable in treatment with EDTAglycine-acid and no destruction of
erythrocyte antigens after treatment We conclude that the EDTA glycine-acid technique can
be used as an option in the treatment of red cells with TDA positive with the advantage that
its execution time is inferior to that of chloroquine (2 minutes x 30 to 120 minutes) which
makes it useful in emergency situations When both techniques are used in different
erythrocytes of the same sample the effectiveness is significantly increased (p lt005)
Key words EDTAglycine-acid direct antiglobulin test AIHA phenotyping
1 INTRODUCcedilAtildeO
A transfusatildeo de hemaacutecias eacute um recurso terapecircutico muito importante e eficaz e tem se
mostrado como um grande aliado no tratamento de diversas patologias auxiliando na
melhoria da sobrevida e qualidade de vida de diversos pacientes quando indicada de forma
correta Eacute provavelmente a modalidade de terapia mais utilizada no mundo sendo
considerada a forma mais antiga de terapia celular A transfusatildeo de hemaacutecias em pacientes
com anemia grave ou sangramento agudo reestabelece o niacutevel de hemoglobina moleacutecula
responsaacutevel pelo transporte de oxigecircnio para os tecidos melhorando a isquemia tecidual
(BARJAS-CASTRO 2013 ZAGO 2014)
A transfusatildeo de componentes celulares como o concentrado de hemaacutecias deve ser
bem avaliada quanto aos riscos e benefiacutecios Os testes preacute-transfusionais satildeo parte obrigatoacuteria
do processo transfusional e tecircm como funccedilatildeo assegurar que o melhor hemocomponente seja
selecionado para o paciente reduzindo assim a chance de transfusotildees incompatiacuteveis e reaccedilotildees
transfusionais (BARJAS-CASTRO 2013)
11TESTES PREacute-TRANSFUSIONAIS
Os testes preacute-transfusionais tecircm a finalidade de evitar a ocorrecircncia de reaccedilotildees
hemoliacuteticas no receptor decorrentes da transfusatildeo de hemaacutecias incompatiacuteveis do doador
(DOWNES e SHULMAN 2011) Tem como propoacutesito selecionar hemaacutecias que apoacutes
transfusatildeo deveratildeo ter sobrevida normal ou mais proacutexima do normal (MELO 2007)
Os testes preacute-transfusionais que consistem no conjunto de teacutecnicas
imunohematoloacutegicas aplicadas agraves amostras do receptor e doador devem ser realizados antes
de toda transfusatildeo A aplicaccedilatildeo desses testes tem como finalidade fornecer uma unidade de
hemaacutecias compatiacutevel e elevar a seguranccedila da transfusatildeo Os testes preacute-transfusionais aliados
a utilizaccedilatildeo de novas tecnologias tem historicamente evitado reaccedilotildees transfusionais
hemoliacuteticas garantindo a seguranccedila transfusional em cerca de 95 dos pacientes que recebem
transfusatildeo Eacute imprescindiacutevel poreacutem a execuccedilatildeo correta das teacutecnicas envolvidas nos testes preacute-
transfusionais e ainda garantir a identificaccedilatildeo correta do receptor e das amostras de sangue e
das unidades de hemaacutecias (CASTILHO 2000 MELO 2007 BARJAS-CASTRO 2013)
2
Todos os testes que compotildeem a rotina preacute-transfusional usam meacutetodos soroloacutegicos
que envolvem a reaccedilatildeo antiacutegeno x anticorpo Ao testar a presenccedila de um antiacutegeno na
superfiacutecie da hemaacutecia eacute necessaacuterio dispor de um soro com especificidade conhecida para
aquele antiacutegeno Por outro lado testar a presenccedila de um determinado anticorpo no soro ou no
plasma exige o uso de hemaacutecias com perfil antigecircnico conhecido Os testes preacute-transfusionais
incluem tipagem ABO (direta e reversa) tipagem Rh pesquisa de anticorpos irregulares no
sangue do receptor retipagem ABO e Rh do hemocomponente e prova de compatibilidade
entre as hemaacutecias do doador e soro ou plasma do receptor em caso de transfusatildeo de hemaacutecias
ou hemocomponentes que contenham mais de 2 mL de volume eritrocitaacuterio como o
concentrado de granuloacutecitos (BRASIL 2016 GANZELLA 2014 SANTOS 2014)
Aleacutem dos testes regularmente realizados a determinaccedilatildeo do fenoacutetipo para outros
antiacutegenos eritrocitaacuterios do doador e do receptor pode ser indicada A fenotipagem eritrocitaacuteria
determina o perfil antigecircnico para outros antiacutegenos de importacircncia cliacutenica aleacutem do sistema
ABO e do antiacutegeno RhD Ela pode auxiliar a confirmaccedilatildeo de uma especificidade de anticorpo
encontrada no soro do paciente uma vez que espera-se que a sua hemaacutecia natildeo expresse o
antiacutegeno correspondente e simultaneamente eacute utilizada para selecionar um concentrado de
hemaacutecias negativo para o respectivo antiacutegeno evitando reaccedilotildees hemoliacuteticas transfusionais A
fenotipagem de candidatos a transfusotildees crocircnicas tambeacutem eacute recomendada pois esse grupo de
pacientes deve se beneficiar com a transfusatildeo profilaacutetica de unidades de hemaacutecias com
mesmo fenoacutetipo evitando assim a aloimunizaccedilatildeo assim como reaccedilotildees hemoliacuteticas provocadas
por anticorpos previamente existentes e em baixo tiacutetulo natildeo identificados pela triagem de
anticorpos (CASTILHO JUNIOR e REID 2015 DOWNES e SHULMAN 2011)
111 TIPAGEM ABORh
O sistema ABO (ISBT001) foi o primeiro sistema de grupo sanguiacuteneo a ser
descoberto Ele foi descrito em 1900 por Karl Landsteiner e eacute considerado o sistema de maior
importacircncia na praacutetica transfusional Ele eacute composto por quatro antiacutegenos A1 (ABO1) B
(ABO2) AB (ABO3) e A1 (ABO4) e eacute caracterizado pela presenccedila dos anticorpos naturais
ou seja anticorpos que surgem sem a exposiccedilatildeo preacutevia aos antiacutegenos atraveacutes de transfusatildeo ou
gestaccedilatildeo Os anticorpos ABO satildeo predominantemente da classe IgM satildeo capazes de fixar o
complemento e de provocar hemoacutelise grave intravascular caso ocorra transfusatildeo ABO
incompatiacutevel Por apresentar essa caracteriacutestica peculiar a tipagem do sistema ABO eacute
composta de duas etapas a prova direta e a prova reversa Na prova direta eacute realizada a
pesquisa dos antiacutegenos na superfiacutecie das hemaacutecias que satildeo testadas com soros comerciais
3
Anti-A e Anti-B A prova reversa por sua vez pesquisa a presenccedila de anticorpos ABO ao
testar o soro ou plasma do pacientedoador com hemaacutecias A1 e B Ambas as provas satildeo
obrigatoacuterias e devem ser concordantes para interpretaccedilatildeo do fenoacutetipo ABO (COOLING
2011 SANTOS 2014)
O sistema Rh (ISBT004) eacute o maior e mais complexo sistema de grupos sanguiacuteneos
compreendendo atualmente 54 antiacutegenos (ISBT 2016) Satildeo cinco os principais antiacutegenos do
sistema Rh D (RH1) C (RH2) E (RH3) c (RH4) e e (RH5) Esses antiacutegenos possuem alta
capacidade imunogecircnica e seus respectivos anticorpos estatildeo envolvidos na doenccedila hemoliacutetica
perinatal e em reaccedilotildees transfusionais hemoliacuteticas Os autoanticorpos quentes como ocorre na
anemia hemoliacutetica quente satildeo representados em grande parte por anticorpos contra antiacutegenos
puacuteblicos do sistema Rh (CASTILHO 2007 CHOU e WESTHOFF 2011 BARJAS-
CASTRO 2013) A tipagem RhD pesquisa o antiacutegeno D na membrana eritrocitaacuteria ao testar a
hemaacutecia com antissoros comerciais Atualmente a maior parte dos soros Anti-D
comercializados satildeo monoclonais
112 ANTICORPOS ANTI-ERITROCITAacuteRIOS
Anticorpos satildeo proteiacutenas presentes no plasma tambeacutem denominadas imunoglobulinas
Satildeo produzidas pelo sistema imune em resposta a um determinado antiacutegeno Podem ser
classificadas de acordo com suas caracteriacutesticas e propriedades em cinco classes de
imunoglobulinas IgG IgM IgA IgE e IgD (BARJAS-CASTRO 2013)
A ligaccedilatildeo entre o antiacutegeno e o anticorpo envolvem ligaccedilotildees natildeo covalentes que satildeo
reversiacuteveis Vaacuterios tipos de interaccedilotildees natildeo covalentes podem contribuir para a ligaccedilatildeo do
antiacutegeno pelo anticorpo incluindo forccedilas eletrostaacuteticas pontes de hidrogecircnio forccedilas de Van
der Walls e interaccedilotildees hidrofoacutebicas (ABBAS LICHTMAN e PILLAI 2008)
As interaccedilotildees antiacutegeno-anticorpo satildeo constituiacutedas por ligaccedilotildees dinacircmicas que sofrem
interferecircncia de alteraccedilotildees fiacutesico-quiacutemicas no meio como mudanccedilas na temperatura na forccedila
eletrostaacutetica na concentraccedilatildeo do antiacutegeno e do anticorpo e no pH O melhor pH para a reaccedilatildeo
eacute em torno de 70 no entanto raros anticorpos podem exigir acidificaccedilatildeo do meio para serem
identificados (SANTOS 2014)
Em imunohematologia satildeo pesquisados os anticorpos que reconhecem os antiacutegenos
eritrocitaacuterios de grupo sanguiacuteneo ldquoin vivordquo esses anticorpos dependendo de seu significado
cliacutenico satildeo capazes de reconhecer seus respectivos antiacutegenos sobre a hemaacutecia podendo levar
a sua destruiccedilatildeo por dois mecanismos fagocitose por macroacutefagos no sistema
4
reticuloendotelial ou por ativaccedilatildeo do sistema complemento com a formaccedilatildeo do complexo de
ataque a membrana e hemoacutelise intravascular As duas classes de anticorpos de maior
importacircncia em imunohematologia satildeo as imunoglobulinas IgG e a IgM (SANTOS 2014)
Devido a sua estrutura pentameacuterica os anticorpos da classe IgM se ligam aos
antiacutegenos localizados na superfiacutecie da membrana de hemaacutecias proacuteximas e promovem
aglutinaccedilatildeo das mesmas em meio salino ldquoin vitrordquo Anticorpos da classe IgG por sua vez
satildeo denominados ldquonatildeo aglutinantesrdquo ou ldquoincompletosrdquo pois sua estrutura de monocircmero eacute
pequena o que desfavorece a aglutinaccedilatildeo direta uma vez que uma mesma moleacutecula de IgG
natildeo alcanccedila antiacutegenos alvos em duas hemaacutecias proacuteximas Os anticorpos IgM aleacutem de terem
um tamanho maior apresentam 750 vezes maior eficiecircncia de aglutinaccedilatildeo que os anticorpos
IgG permitindo maior facilidade nas ligaccedilotildees entre as hemaacutecias (CARRUCIO e WISE 2012
GREEN e KLOSTERMANN 2012)
Nos testes ldquoin vitrordquo satildeo simulados reaccedilotildees que poderiam ocorrer ldquoin vivordquo causando
reaccedilotildees indesejaacuteveis A fase de sensibilizaccedilatildeo em que o anticorpo se liga ao antiacutegeno
correspondente natildeo eacute identificada macroscopicamente poreacutem uma vez que o anticorpo
aproxima as hemaacutecias e vence a forccedila eletrostaacutetica que naturalmente as repele chamada de
potencial zeta ocorre a aglutinaccedilatildeo Dependendo das caracteriacutesticas do anticorpo e de sua
capacidade de fixar complemento pode ocorrer tambeacutem a hemoacutelise (SANTOS 2014)
113 PESQUISA E IDENTIFICACcedilAtildeO DE ANTICORPOS IRREGULARES
A pesquisa de anticorpos irregulares eacute teste obrigatoacuterio nos testes preacute-transfusionais e
tem a finalidade de detectar anticorpos ldquoin vitrordquo que possam causar reaccedilatildeo ldquoin vivordquo
Dependendo da populaccedilatildeo estudada (pacientes x doadores) e ainda da sensibilidade do
teste a frequecircncia de anticorpos irregulares pode variar de 03 a 38 A imunizaccedilatildeo pode
ocorrer por transfusatildeo gestaccedilatildeo transplante ou injeccedilatildeo de material imunogecircnico (WALKER
2011)
Os anticorpos irregulares podem ser classificados como aloanticorpos que satildeo
voltados contra antiacutegenos ausentes na hemaacutecia autoacuteloga ou como autoanticorpos os quais
reconhecem antiacutegenos eritrocitaacuterios proacuteprios Os autoanticorpos antieritrocitaacuterios surgem em
decorrecircncia da desregulaccedilatildeo da autotoleracircncia imune relacionada agrave condiccedilotildees diversas como
doenccedilas hematoloacutegicas doenccedilas inflamatoacuterias autoimunes neoplasias infecccedilotildees e uso de
medicaccedilotildees A presenccedila do autoanticorpo associado a um quadro de anemia hemoliacutetica
caracteriza a anemia hemoliacutetica autoimune (AHAI) seja ela primaacuteria ou secundaacuteria agrave outra
5
patologia Ateacute 12 a 40 dos pacientes com autoanticorpos quentes podem apresentar
aloanticorpos de significado cliacutenico mascarados pelos autoanticorpos (SHIREY et al 2002)
Eacute importante detectar a presenccedila de anticorpos no plasmasoro de um receptor de
transfusatildeo para garantir que seja transfundido sangue compatiacutevel Quando a pesquisa de
anticorpo irregular resultar positiva para um ou mais anticorpos de relevacircncia clinica eacute
necessaacuterio confirmar a ausecircncia do respectivo antiacutegeno na hemaacutecia do receptor assim como
selecionar para transfusatildeo concentrados de hemaacutecias tambeacutem negativos para aqueles
antiacutegenos evitando assim reaccedilotildees transfusionais (WALKER 2011)
A detecccedilatildeo de um anticorpo irregular eacute inicialmente realizada pela triagem de
anticorpos na qual o soroplasma do receptor eacute testado com 2 a 3 hemaacutecias do tipo ldquoOrdquo O
conjunto de fenoacutetipos dessas hemaacutecias deve contemplar os antiacutegenos de maior importacircncia
cliacutenica Como os anticorpos irregulares de maior interesse cliacutenico satildeo na maior parte das
vezes imunes portanto da classe IgG eacute obrigatoacuteria a fase de antiglobulina (AGH) do teste
ou teste indireto da antiglobulina (TIA) uma vez que esses anticorpos satildeo incompletos
(CASTILHO JUNIOR e REID 2015) O teste de triagem estando positivo deve-se fazer a
identificaccedilatildeo da especificidade do anticorpo utilizando um painel com maior nuacutemero de
hemaacutecias fenotipadas
114 PROVA DE COMPATIBILIDADE
A prova de compatibilidade eacute um teste obrigatoacuterio em caso de transfusatildeo de
componentes eritrocitaacuterios Tambeacutem chamada de prova de compatibilidade maior deve ser
realizada antes da administraccedilatildeo de sangue total ou concentrado de hemaacutecias utilizando-se
hemaacutecias obtidas do tubo coletor da bolsa a ser transfundida e o soro ou plasma do receptor
(BRASIL 2016)
Eacute definido como o procedimento para excluir a incompatibilidade entre o doador e o
receptor Tem o objetivo de detectar anticorpos que podem natildeo ter sido encontrados na
pesquisa de anticorpos devido a ausecircncia ou pouca expressatildeo de antiacutegenos no painel de
hemaacutecias aleacutem da possibilidade de terem ocorrido erros teacutecnicos ou notacionais durante a
realizaccedilatildeo da pesquisa (MELO 2007)
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115 FENOTIPAGEM PARA OUTROS SISTEMAS
Aleacutem da pesquisa de ABORh que eacute realizado rotineiramente a fenotipagem para
outros sistemas tambeacutem denominado ldquofenotipagem estendidardquo determina a presenccedila ou
ausecircncia de antiacutegenos considerados de importacircncia cliacutenica A fenotipagem natildeo eacute obrigatoacuteria
nos testes preacute-transfusionais poreacutem a legislaccedilatildeo atual recomenda a realizaccedilatildeo da fenotipagem
eritrocitaacuteria dos antiacutegenos C (RH2) E (RH3) c (RH4) e (RH5) K (KELL1) Fya (FY1) Fy
b
(FY2) Jka
(JK1) Jkb (JK2) S (MNS3) e s (MNS4) para pacientes aloimunizados e pacientes
com indicaccedilatildeo de transfusatildeo crocircnica (BRASIL 2016)
A seleccedilatildeo de concentrados de hemaacutecias com o mesmo fenoacutetipo do receptor para
transfusatildeo pode evitar reaccedilotildees transfusionais hemoliacuteticas no paciente previamente
aloimunizado tambeacutem previne a sensibilizaccedilatildeo por outros antiacutegenos o que normalmente
torna as transfusotildees seguintes ainda mais complicadas A fenotipagem do paciente tambeacutem
auxilia na identificaccedilatildeo dos anticorpos pois espera-se que nas hemaacutecias do paciente o
antiacutegeno seja negativo para o anticorpo encontrado servindo de guia para teste de exclusatildeo de
anticorpos (SANTOS 2014 WALKER 2011)
A incidecircncia de aloanticorpos aumenta com o nuacutemero de transfusotildees no entanto a
implantaccedilatildeo de rotina de fenotipagem com transfusatildeo profilaacutetica de hemaacutecias com fenoacutetipo
compatiacutevel para pacientes candidatos agrave politransfusatildeo como os portadores de doenccedila
falciforme talassemia anemia aplaacutestica doenccedilas linfo e mieloproliferativas renais crocircnicos e
anemias refrataacuterias pode contribuir para o baixo iacutendice de sensibilizaccedilatildeo nessas populaccedilotildees
(FLUIT KUNST e DRENTHE-SCHONK 1999 MARTINS et al 2008 e VICHINSKY et
al 2001) Outro grupo de pacientes que se beneficia com a transfusatildeo de mesmo fenoacutetipo satildeo
os pacientes com AHAI uma vez que o autoanticorpo pode mascarar a presenccedila de um
aloanticorpo de significado cliacutenico em ateacute 40 dos casos Mesmo com as teacutecnicas utilizadas
ldquoin vitrordquo para remover a interferecircncia do autoanticorpo no soro um aloanticorpo pode natildeo
ser identificado e dessa forma transfundir o mesmo fenoacutetipo do paciente evitaria reaccedilatildeo
hemoliacutetica pelos anticorpos voltados contra antiacutegenos de maior importacircncia cliacutenica e de
frequecircncia intermediaacuteria Aleacutem disso os pacientes com AHAI satildeo fortes respondedores e a
transfusatildeo profilaacutetica do mesmo fenoacutetipo previne a aloimunizaccedilatildeo (SHIREY et al 2002)
Aleacutem de fenotipar o receptor eacute importante tambeacutem que os bancos de sangue tenham
rotinas de fenotipagem de doadores para atender as necessidade dos pacientes aloimunizados
ou em esquema de transfusatildeo crocircnica (PINTO BRAGA e SANTOS 2011)
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Rotineiramente eacute inviaacutevel estabelecer o fenoacutetipo eritrocitaacuterio completo de um
indiviacuteduo pela grande diversidade de sistemas sanguiacuteneos descritos Ate junho de 2015 jaacute
haviam sido classificados 308 antiacutegenos atribuiacutedos a 36 sistemas definidos pela Sociedade
Internacional de Transfusatildeo de Sangue (ISBT) (CASTILHO JUNIOR e REID 2015)
Portanto o paciente eacute normalmente fenotipado para os antiacutegenos de maior importacircncia
clinica
Alguns fatores podem limitar a realizaccedilatildeo da fenotipagem eritrocitaacuteria Um dos fatores
eacute a transfusatildeo alogecircnica realizada haacute menos de 90 dias Neste caso podem ocorrer resultados
falso positivos para determinados antiacutegenos devido agrave presenccedila de hemaacutecias do doador
(LAINE et al 2000)
Outro fator eacute a presenccedila de anticorpo sensibilizando a hemaacutecia do paciente e
provocando positividade do teste direto da antiglobulina humana (TDA) Os soros
normalmente utilizados para fenotipagem especialmente para os antiacutegenos Fya
(FY1) Fyb
(FY2) Jka
(JK1) Jkb
(JK2) S (MNS3) e s (MNS4) necessitam da fase de antiglobulina
humana (AGH) para que ocorra aglutinacatildeo Amostras que apresentam o TDA positivo
aglutinam apoacutes reaccedilatildeo com a AGH natildeo pela real presenccedila do antiacutegeno em sua superfiacutecie mas
pela interaccedilatildeo da AGH com o anticorpo que estaacute sensibilizando o eritroacutecito A interferecircncia
do TDA positivo pode ser anulada atraveacutes de algumas teacutecnicas capazes de dissociar o
anticorpo como por exemplo o tratamento da hemaacutecia sensibilizada com cloroquina ou com
glicina-aacutecida-EDTA (BRANCH e PETZ 1999 SHIREY et al 2002 e LEGER 2011)
12 METODOLOGIAS APLICADOS Agrave ROTINA IMUNO-HEMATOLOacuteGICA
Todos os testes que compotildeem a rotina preacute-transfusional usam meacutetodos soroloacutegicos
que envolvem a reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo e tem como objetivo determinar o perfil antigecircnico
eritrocitaacuterio do receptor e do doador assim como identificar em seu soro a presenccedila de
anticorpos contra antiacutegenos eritrocitaacuterios que possam comprometer a sobrevida das hemaacutecias
transfundidas Para testar o antiacutegeno na superfiacutecie da hemaacutecia eacute necessaacuterio dispor de um
antissoro com especificidade conhecida para aquele antiacutegeno Por outro lado para testar a
presenccedila de um determinado anticorpo no soro ou plasma do receptor eacute necessaacuterio o uso de
hemaacutecias com perfil antigecircnico conhecido (SANTOS 2014)
Diversas metodologias satildeo aplicadas nos laboratoacuterios de imunohematologia Cada
serviccedilo de hemoterapia faz a escolha do meacutetodo que seraacute aplicado de acordo com o perfil do
laboratoacuterio com o volume de exames diaacuterios e tambeacutem com o custo envolvido Todas essas
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teacutecnicas tecircm como objetivo comum demonstrar a reaccedilatildeo entre antiacutegeno e anticorpo no
entanto elas se baseiam em diferentes princiacutepios Muitas metodologias satildeo atualmente
aplicadas agrave imunohematologia entre elas o sistema de fase soacutelida a tecnologia de hemaacutecias
magnetizadas a biologia molecular e ateacute mesmo a citometria de fluxo no entanto os meacutetodos
mais tradicionais satildeo aqueles baseados no princiacutepio de hemaglutinaccedilatildeo
121 MEacuteTODOS DE FASE FLUacuteIDA
Os meacutetodos de fase fluiacuteda satildeo testes baseados na hemaglutinaccedilatildeo e incluem o teste em
tubo e o teste em microplacas Uma suspensatildeo de hemaacutecias eacute adicionada ao plasma ou soro
em seguida eacute realizada a centrifugaccedilatildeo e por fim eacute feita a leitura do resultado que eacute
considerado positivo se for observado algum grau de aglutinaccedilatildeo ou hemoacutelise A intensidade
de aglutinaccedilatildeo eacute graduada de acordo com o tamanho dos agregados desprendidos da
superfiacutecie apoacutes agitaccedilatildeo delicada do tubo ou microplaca Os meacutetodos de hemaglutinaccedilatildeo satildeo
aplicados a todos os testes preacute-transfusionais Como os anticorpos ABO satildeo aglutininas frias
a tipagem eacute realizada em temperatura ambiente (22degC) no entanto ao investigar a presenccedila
de anticorpos irregulares que como jaacute mencionado eacute na maioria das vezes anticorpos
incompletos da classe IgG eacute essencial que a reaccedilatildeo seja incubada a 37degC As reaccedilotildees satildeo
facilitadas com a utilizaccedilatildeo de potencializadores e da antiglobulina humana (WALKER e
HARMENING 2012 AABB 2011)
Nos meacutetodos de fase fluiacuteda nos quais a AGH eacute empregada a fase de lavagem eacute
fundamental Apoacutes a incubaccedilatildeo do soro com as hemaacutecias deve ser realizada a lavagem da
reaccedilatildeo para remover o excesso de anticorpos natildeo ligados agraves hemaacutecias jaacute que os anticorpos
livres podem bloquear a AGH quando ela eacute adicionada e levar a resultados falso negativos
(AABB 2011)
Os testes de hemaglutinaccedilatildeo satildeo os mais tradicionais entre os meacutetodos ainda hoje
aplicados agrave rotina de bancos de sangue A vantagem desses meacutetodos eacute o baixo custo quando
comparado agraves teacutecnicas mais modernas mas apresentam tambeacutem desvantagens A teacutecnica em
tubo por exemplo natildeo permite automaccedilatildeo eacute trabalhosa e exige matildeo-de-obra bastante treinada
na execuccedilatildeo das diversas etapas do teste e mesmo assim pode haver subjetividade na
interpretaccedilatildeo dos resultados aleacutem de resultados falso-negativos (DOWNES 2011 ZANTEK
et al 2012)
9
122 COLUNAS DE GEL
A teacutecnica em gel iniciada na deacutecada de 90 representou uma grande revoluccedilatildeo na
rotina laboratorial tornando-se muito popular Aleacutem de ser sensiacutevel a teacutecnica dispensa a fase
de lavagem antes da adiccedilatildeo da AGH assim como a agitaccedilatildeo do teste para leitura reduzindo o
nuacutemero de resultados falsos negativos decorrentes dessas duas etapas e o tempo para
execuccedilatildeo dos testes (LAPIERRE et al 1989 NOVARETTI et al 2000 NOVARETTI et
al 2004) Os reagentes satildeo comercializados na forma de cartotildees plaacutesticos contendo
microtubos preenchidos por gel composto por microesferas de acrilamida-dextran Nesta
metodologia tambeacutem baseada na hemaglutinaccedilatildeo a suspensatildeo de hemaacutecias e o soro satildeo
depositados em uma cacircmara acima da coluna de gel e em seguida procede-se com a
centrifugaccedilatildeo dos cartotildees As microesferas atuam como uma malha que permite a passagem
em direccedilatildeo ao fundo do microtubo apenas das hemaacutecias natildeo aglutinadas enquanto as
hemaacutecias aglutinadas ficam retidas na parte superior da coluna ou ao longo dela (GREEN e
KLOSTERMANN 2012) Portanto quanto maior a agregaccedilatildeo mais hemaacutecias ficam retidas
no topo da coluna Dependendo do tipo de teste a ser realizado pode ser utilizado gel neutro
ou gel especiacutefico impregnado pelo anticorpo desejado e o gel contendo antiglobulina humana
que satildeo utilizados para os testes diretos e indiretos da antiglobulina (LAPIERRE et al 1989)
A coluna de gel ainda permite a visualizaccedilatildeo clara de duas populaccedilotildees distintas de hemaacutecias
como em pacientes receacutem transfundidos
123 BIOLOGIA MOLECULAR
A biologia molecular ou genotipagem estaacute sendo cada vez mais aplicada aos grupos
sanguiacuteneos pois fornece resultados seguros e precisos especialmente nos casos em que natildeo eacute
possiacutevel a realizaccedilatildeo da fenotipagem como em pacientes receacutem-transfundidos e pacientes
com TDA positivo Na genotipagem eacute possiacutevel determinar atraveacutes do DNA do paciente
extraiacutedo de seus leucoacutecitos de sangue perifeacuterico o fenoacutetipo eritrocitaacuterio deduzido sem
qualquer interferecircncia do anticorpo que sensibiliza a hemaacutecia ou de hemaacutecias alogecircnicas
transfundidas Sua realizaccedilatildeo no entanto exige o treinamento de equipe especializada e capaz
de interpretar os resultados em conjunto com os achados soroloacutegicos (JUNIOR e OLIVATO
2007)
Apesar de ser uma ferramenta de grande importacircncia hoje na imuno-hematologia
ainda estaacute restrito aos grandes centros de hemoterapia no Brasil poucos serviccedilos puacuteblicos de
sauacutede dispotildeem desse recurso e utilizam teacutecnicas de genotipagem de grupos sanguiacuteneos para
atendimento a seus pacientes Esta abordagem poreacutem vem sendo introduzida em algumas
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instituiccedilotildees de reconhecida competecircncia na hemoterapia mas sua disponibilizaccedilatildeo deve
tornar-se mais generalizada atraveacutes da formaccedilatildeo de centros de referecircncia para atendimento
das diversas unidades de hemoterapia (MARTINS et al 2009) Dessa forma muitas decisotildees
transfusionais especialmente em urgecircncias ainda devem ser tomadas sem o resultado da
genotipagem eritrocitaacuteria
13 TESTE DA ANTIGLOBULINA
Coombs Mourant e Race descreveram em 1945 uma teacutecnica com utilizando soro de
coelho contendo antiglobulina humana (AGH) que posteriormente foi chamada de ldquosoro de
Coombsrdquo O meacutetodo foi desenvolvido inicialmente para ampliar o efeito de aglutininas fracas
do sistema Rh anticorpos ldquoincompletosrdquo que normalmente natildeo apresentavam aglutinaccedilatildeo
visiacutevel O teste foi concebido como um instrumento de investigaccedilatildeo de doenccedila hemoliacutetica do
receacutem-nascido e de reaccedilotildees transfusionais causadas por anticorpos Rh que estavam presentes
no soro dos paciente poreacutem que natildeo eram demonstraacuteveis pelas teacutecnicas ateacute entatildeo existentes
A maior parte dos anticorpos de significado cliacutenico assim como seus respectivos
antiacutegenos foram descritos apoacutes o surgimento do ldquosoro de Coombsrdquo em 1945 sendo assim o
teste da antiglobulina representa ateacute hoje a forma mais importante de aglutinaccedilatildeo artificial em
imunohematologia permitindo revelar a presenccedila de anticorpos na membrana da hemaacutecia A
antiglobulina humana eacute constituiacuteda por anticorpo especiacutefico contra a porccedilatildeo Fc de outro
anticorpo Quando um anticorpo ldquoincompletordquo sensibiliza a hemaacutecia normalmente natildeo
provoca aglutinaccedilatildeo visiacutevel Apoacutes a adiccedilatildeo da AGH ao meio esta reconhece e se liga agraves
porccedilotildees Fc dos anticorpos que sensibilizam a hemaacutecia formando assim uma malha e
provocando aglutinaccedilatildeo visiacutevel (BARJAS-CASTRO 2013)
Os reagentes de antiglobulina podem ser poliespeciacuteficos ou monoespeciacuteficos Os
poliespeciacuteficos satildeo uma mistura de anticorpos ant-IgG e anti-C3d (fraccedilatildeo C3d do
complemento) Os reagentes monoespecificos podem ser anti-IgG anti-IgM anti-IgA anti-
complemento podendo ser anti-C3d e anti-C3b
O teste da antiglobulina pode ser usado para detectar hemaacutecias sensibilizadas com
aloanticorpos IgG autoanticorpos IgG e componentes do complemento A sensibilizaccedilatildeo
pode ocorrer ldquoin vivordquo ou ldquoin vitrordquo O uso do AGH para detectar a sensibilizaccedilatildeo ldquoin vitrordquo
tem dois estaacutegios e eacute denominado teste indireto da antiglobulina A sensibilizaccedilatildeo ldquoin vivordquo eacute
detectada em procedimento de um uacutenico estagio chamado teste direto da antiglobulina (TDA)
11
Os testes direto e indireto satildeo ateacute hoje amplamente aplicados como princiacutepio de inuacutemeros
testes soroloacutegicos em imuno-hematologia (GREEN e KLOSTERMANN 2012)
131 TESTE DIRETO DA ANTIGLOBULINA
O teste direto da antiglobulina humana revela a presenccedila de anticorpo eou fraccedilatildeo do
complemento ligados agrave superfiacutecie das hemaacutecias As sensibilizaccedilatildeo das hemaacutecias ocorrida ldquoin
vivordquo natildeo eacute visualizada mas apoacutes a adiccedilatildeo da antiglobulina humana ocorre a aglutinaccedilatildeo que
eacute visualizada macroscopicamente (Figura 1)
Figura 1 - Princiacutepio da teacutecnica direta da antiglobulina Teste utilizado para demonstrar a sensibilizaccedilatildeo ldquoin
vivordquo das hemaacutecias O sangue total eacute coletado do paciente em tubo contendo anticoagulante EDTA Na teacutecnica
realizada em tubo uma suspensatildeo de hemaacutecias 5 em soluccedilatildeo de salina eacute preparada Uma gota dessa suspensatildeo
eacute lavada 3 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica para retirada de anticorpos que estatildeo livres no plasma Toda soluccedilatildeo eacute
retirada e adiciona-se o soro de Coombs (antiglobulina humana) O soro de Coombs reconhece os anticorpos que
estatildeo ligados agrave superfiacutecie das hemaacutecias fazendo com que ocorra aglutinaccedilatildeo visiacutevel macroscopicamente
Apesar de natildeo ser um teste preacute-transfusional obrigatoacuterio o TDA eacute um dos testes mais
importantes para investigar e classificar quadros hemoliacuteticos como de origem imune ou natildeo
imune O seu valor preditivo positivo em vigecircncia de anemia hemoliacutetica eacute de 83 poreacutem natildeo
havendo sinais de hemoacutelise seu valor preditivo eacute apenas 14 Eacute por esse motivo que a
interpretaccedilatildeo do TDA positivo deve levar em consideraccedilatildeo a histoacuteria cliacutenica e os resultados
dos outros exames laboratoriais A realizaccedilatildeo do TDA eacute obrigatoacuteria na investigaccedilatildeo
12
laboratorial de diversos quadros hemoliacuteticos entre eles a anemia hemoliacutetica autoimune
(AHAI) a reaccedilatildeo hemoliacutetica imune poacutes-transfusional a siacutendrome do linfoacutecito passageiro a
doenccedila hemoliacutetica perinatal e a hemoacutelise droga-dependente (LEGER 2011)
Resultados de TDA positivos foram tambeacutem observados em indiviacuteduos com niacuteveis
seacutericos elevados de IgG ou complemento sem evidecircncia de anemia hemoliacutetica imune como
em pacientes com doenccedila falciforme talassemia doenccedila renal crocircnica mieloma muacuteltiplo
doenccedilas autoimunes e siacutendrome da imunodeficiecircncia adquirida (SIDA) Aleacutem disso pequenas
quantidades de IgG (5 a 90 moleacuteculas por hemaacutecia) e complemento (5 a 40 moleacuteculas por
hemaacutecia) podem estar presentes nas hemaacutecias de indiviacuteduos saudaacuteveis sem associaccedilatildeo com
reduccedilatildeo na sobrevida das mesmas A positividade do TDA depende da populaccedilatildeo estudada e
pode variar de 01 entre doadores de sangue sem qualquer sinal cliacutenico de hemoacutelise ateacute
15 em pacientes hospitalizados (CASTILHO JUNIOR e REID 2015 LEGER 2011)
Indiviacuteduos que apresentam TDA positivo seja agraves custas de IgG eou complemento
com ou sem sinais cliacutenicos de hemoacutelise teratildeo a fenotipagem eritrocitaacuteria prejudicada A
fenotipagem de indiviacuteduos com TDA positivo especialmente quando utilizado o teste indireto
da antiglobulina pode acarretar resultados falsos positivos e levar a seleccedilatildeo de fenoacutetipo
incorreto para transfusatildeo
132 TESTE INDIRETO DA ANTIGLOBULINA
O teste indireto da antiglobulina (TIA) eacute utilizado para revelar a sensibilizaccedilatildeo ldquoin
vitrordquo das hemaacutecias e eacute aplicado a diversos testes soroloacutegicos em imunohematologia entre
eles a pesquisa de anticorpos identificaccedilatildeo de anticorpos testes de compatibilidade
fenotipagem eritrocitaacuteria e titulaccedilatildeo de anticorpos Na teacutecnica indireta a hemaacutecia que contecircm
o antiacutegeno eacute colocada em contato ldquoin vitrordquo com o anticorpo que se liga mas natildeo promove a
aglutinaccedilatildeo visiacutevel A adiccedilatildeo da AGH forma uma malha entre os anticorpos que sensibilizam
as hemaacutecias e provoca a aglutinaccedilatildeo macroscoacutepica (figura 2)
Caso a amostra de hemaacutecia estudada seja previamente sensibilizada resultados falsos
positivos podem ser obtidos no TIA jaacute que a AGH reagiraacute com a moleacutecula que sensibilizava
anteriormente a hemaacutecia mesmo se o anticorpo especiacutefico natildeo tiver se ligado ao antiacutegeno
correspondente
13
133 CONDICcedilOtildeES CLIacuteNICAS COM TDA POSITIVO
O TDA positivo deve ser interpretado cuidadosamente sempre em conjunto com o
quadro cliacutenico do paciente A positividade isolada do TDA natildeo significa hemoacutelise A
interpretaccedilatildeo do teste positivo requer o conhecimento do diagnoacutestico do paciente da presenccedila
de sinais e sintomas sugestivos de hemoacutelise assim como de seu histoacuterico transfusional
gestacional e de informaccedilotildees sobre o uso recente de medicaccedilotildees (LEGER 2011)
Figura 2 ndash Princiacutepio do teste indireto da antiglobulina O TIA pode ser utilizado na pesquisa de anticorpos de
especificidades desconhecidas livres no soroplasma como eacute o caso da pesquisa e identificaccedilatildeo de anticorpos
irregulares Ele eacute tambeacutem utilizado para determinar a presenccedila de antiacutegenos na membrana da hemaacutecia quando
satildeo empregados soros de especificidades conhecidas da classe IgG No primeiro caso o soroplasma contendo o
anticorpo desconhecido eacute colocado em contato com hemaacutecias cujo perfil antigecircnico eacute conhecido No segundo
caso utiliza-se soro de especificidade conhecida da classe IgG para determinar a presenccedila ou ausecircncia de um
antiacutegeno na membrana O anticorpo encontra o antiacutegeno correspondente e ocorre a ligaccedilatildeo do anticorpo agrave
hemaacutecia mas natildeo ocorre aglutinaccedilatildeo Apoacutes a adiccedilatildeo da AGH que se liga aos anticorpos formando uma malha
ocorre a aglutinaccedilatildeo visiacutevel
O TDA positivo eacute uma achado claacutessico de algumas condiccedilotildees cliacutenicas como a reaccedilatildeo
transfusional hemoliacutetica a doenccedila hemoliacutetica do feto e do receacutem-nascido (DHFRN) a anemia
hemoliacutetica induzida por drogas a siacutendrome do linfoacutecito passageiro e a anemia hemoliacutetica
autoimune (AHAI) Portanto o TDA positivo pode ser decorrente da sensibilizaccedilatildeo da
hemaacutecia autoacuteloga por um autoanticorpo ou por um aloanticorpo ligado agrave hemaacutecia alogecircnica
circulante A positividade do TDA pode ainda ocorrer de forma passiva em pacientes que
14
recebem imunoglobulinas humanas ou ainda pela transfusatildeo de plaquetas ABO natildeo idecircntico
(LEGER 2011 RALPH 2012 ZANTEK et al 2012)
Nas reaccedilotildees transfusionais hemoliacuteticas imunes o aloanticorpo do receptor sensibiliza
as hemaacutecias transfundidas do doador e reduz sua sobrevida ao removecirc-la precocemente da
circulaccedilatildeo pela fagocitose no sistema retiacuteculo-endotelial ou pela hemoacutelise intravascular As
reaccedilotildees podem ser agudas se ocorrem ateacute 24 horas ou tardias quando ocorrem apoacutes 24 horas
da transfusatildeo A gravidade das reaccedilotildees hemoliacuteticas pode variar de um simples rendimento
transfusional inadequado agrave quadros graves de hemoacutelise intravascular evoluindo ateacute mesmo
com choque vascular e oacutebito O TDA pode resultar negativo caso toda massa eritrocitaacuteria
transfundida tenha sido destruiacuteda (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
Na doenccedila hemoliacutetica do feto e do receacutem-nascido (DHFRN) anticorpos maternos da
classe IgG atravessam a barreira placentaacuteria e sensibilizam as hemaacutecias fetais que seratildeo
destruiacutedas precocemente levando agrave anemia fetal Apesar da incompatibilidade ABO feto-
materna ser a causa mais frequente de DHFRN raramente ela eacute responsaacutevel pela ocorrecircncia
de quadros graves Por outro lado anticorpos contra antiacutegenos do sistema Rh e Kell
especialmente Anti-D (Anti-RH1) Anti-c (Anti-RH4) e Anti-Kell (Anti-KELL1) satildeo
conhecidos por causar DHFRN severa Raramente outros anticorpos tambeacutem podem estar
implicados na DHFRN como os anticorpos contra antiacutegenos do sistema Kidd Duffy MNS e
Diego (ZANTEK et al 2012)
A hemoacutelise droga-dependente eacute causada pela produccedilatildeo de um anticorpo voltado contra
a droga ligada agrave membrana eritrocitaacuteria ou ainda contra o complexo droga-membrana A
classe de medicaccedilotildees mais comumente envolvida eacute a dos antimicrobianos betalactacircmicos
(penicilinas e cefalosporinas) mas outras classes como quimioteraacutepicos e anti-inflamatoacuterios
tambeacutem satildeo descritos (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
Apoacutes transplante de ceacutelulas progenitoras hematopoieacuteticas em que o doador possui
anticorpos contra antiacutegenos eritrocitaacuterios do receptor o linfoacutecito de memoacuteria do doador pode
resistir ao esquema imunossupressor utilizado e continuar a produccedilatildeo de anticorpos que
reconhecem a hemaacutecia incompatiacutevel do receptor ainda circulante O quadro cliacutenico pode
variar de um simples TDA positivo sem outros sinais ou sintomas ateacute um quadro hemoliacutetico
grave e abrupto (LEGER 2011)
15
134 ANEMIA HEMOLIacuteTICA AUTOIMUNE
A anemia hemoliacutetica autoimune eacute caracterizada pela destruiccedilatildeo precoce das hemaacutecias
autoacutelogas por autoanticorpos que sensibilizam as hemaacutecias e levam agrave fagocitose pelos
macroacutefagos no sistema reticulo-endotelial ou hemoacutelise intravascular O diagnoacutestico da AHAI
baseia-se na presenccedila de hemoacutelise cliacutenica associada agrave evidecircncia de fator imune representado
pelo TDA positivo As classes de anticorpos envolvidas em quadros de AHAI satildeo IgG IgM e
raramente IgA (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012) Satildeo raros os casos de AHAI com TDA
negativo que podem estar relacionados a um autoanticorpo de baixa avidez de densidade
inferior agrave detecccedilatildeo do meacutetodo ou ainda de classe de imunoglobulina natildeo avaliada pelo
meacutetodo utilizado para o teste (GARRATY 2005)
A AHAI pode ser classificada em dois grupos principais de acordo com a melhor
temperatura de reaccedilatildeo do autoanticorpo As anemias hemoliacuteticas causadas por anticorpos
quentes que reagem melhor a 37oC e geralmente IgG representam 80 dos casos de AHAI
Nas AHAI por anticorpo quente o TDA pode ser positivo para IgG mais complemento (67)
somente IgG (20) ou somente por complemento (13) As anemias causadas por
anticorpos frios geralmente da classe IgM e que reagem melhor em temperatura ambiente ou
a 4oC representam aproximadamente 20 dos casos de AHAI Por exibirem amplitude
teacutermica esses anticorpos ligam-se agraves hemaacutecias ao atingirem a circulaccedilatildeo nas extremidades do
corpo fixam o complemento e desprendem-se da hemaacutecia apoacutes retornar para partes mais
quentes Por esse motivo em AHAI por anticorpos frios o TDA eacute positivo apenas agraves custas
de C3 e normalmente o IgM natildeo eacute detectado (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
A presenccedila do autoanticorpo IgG pode ser confirmada atraveacutes da eluiccedilatildeo do anticorpo
da hemaacutecia Tipicamente o eluato na AHAI por anticorpo quente reage com todas as ceacutelulas
testadas de um painel de hemaacutecias alogecircnicas do tipo ldquoOrdquo ou pode eventualmente exibir uma
especificidade conhecida como Anti-e (Anti-RH5) Nas AHAI a frio por sua vez espera-se
um eluato negativo (LEGER 2011)
Os autoanticorpos satildeo com frequecircncia encontrados livres no plasma e natildeo somente
ligados agraves hemaacutecias autoacutelogas Eles podem interferir em todas as fases dos testes preacute-
transfusionais nas quais o plasma eacute testado especialmente os autoanticorpos quentes que
acarretam resultados positivos em todos os testes levados agrave fase de antiglobulina humana
Esses anticorpos portanto positivam a pesquisa de anticorpos irregulares e mascaram a
presenccedila de aloanticorpos de significado cliacutenico Aproximadamente 60 dos pacientes que
apresentam AHAI a quente apresentam anticorpos que reagem em meio salino mas se forem
16
levados em conta meacutetodos mais sensiacuteveis como PEG enzima e estudo em gel a positividade
pode ser superior a 90 (LEGER 2011)
Aleacutem da eficaacutecia da transfusatildeo ser comprometida pela diminuiccedilatildeo da vida-meacutedia das
hemaacutecias a presenccedila do autoanticorpo dificulta a realizaccedilatildeo dos testes preacute-transfusionais e
compromete a seguranccedila transfusional Os autoanticorpos reagem normalmente como
panaglutininas pois satildeo normalmente voltados contra antiacutegenos puacuteblicos na maior parte das
vezes contra antiacutegenos do sistema Rh Por apresentarem essas caracteriacutesticas podem ainda
mascarar a presenccedila de aloanticorpos de significado clinico e levar a testes de compatibilidade
positivos exigindo uma avaliaccedilatildeo criteriosa da necessidade da transfusatildeo (BRANCH e PETZ
1999 JUNIOR e OLIVATO 2004)
Remover a interferecircncia do autoanticorpo para avaliar a presenccedila de aloanticorpos
mascarados nem sempre eacute possiacutevel mesmo utilizando teacutecnicas de autoadsorccedilatildeo ou
aloadsorccedilatildeo que aleacutem de tudo satildeo demoradas e exigem de 2 a 6 horas para conclusatildeo
(GARRATY e GEORGE 2002) Nesses casos a fenotipagem eritrocitaacuteria do paciente eacute de
extrema utilidade especialmente em situaccedilotildees de urgecircncia A definiccedilatildeo do fenoacutetipo do
paciente para os antiacutegenos de maior importacircncia cliacutenica pode auxiliar a seleccedilatildeo de unidades
de hemaacutecias com mesmo fenoacutetipo o que garante que eventuais aloanticorpos natildeo
identificados sejam respeitados e tambeacutem evita nova sensibilizaccedilatildeo (JUNIOR e OLIVATO
2004 SHIREY et al 2002)
135 TRATAMENTO DE HEMAacuteCIAS COM TDA POSITIVO
O TDA positivo impede a fenotipagem eritrocitaacutecia por meacutetodos que exigem a fase de
AGH uma vez que a aglutinaccedilatildeo ocorreraacute devido agrave interaccedilatildeo da AGH com o autoanticorpo
que sensibiliza a hemaacutecia do paciente levando a resultados falso positivos Em algumas
situaccedilotildees como na AHAI por anticorpo quente a fenotipagem eacute especialmente importante
pois o autoanticorpo interfere na triagem e identificaccedilatildeo de anticorpos assim como no teste de
compatibilidade e dificultam a detecccedilatildeo de aloanticorpos de significado cliacutenico que
obrigatoriamente devem ser respeitados Nessas situaccedilotildees a fenotipagem eritrocitaacuteria
determina o perfil antigecircnico do paciente e possibilita o fornecimento de unidades de
hemaacutecias com o mesmo fenoacutetipo para a transfusatildeo evitando a sensibilizaccedilatildeo para novos
antiacutegenos assim como reaccedilotildees hemoliacuteticas transfusionais No entanto eacute necessaacuterio aplicar
meacutetodos que natildeo sofram interferecircncia do TDA positivo ou seja meacutetodos que natildeo necessitem
da fase de AGH ou meacutetodos de bloqueio do anticorpo sem bloquear o antiacutegeno Uma opccedilatildeo eacute
a utilizaccedilatildeo de soros monoclonais IgM (salinos ou de meio proteico natildeo concentrado) mas
17
nem sempre esses reagentes estatildeo disponiacuteveis especialmente os reagentes monoclonais para
os antiacutegenos dos sistemas Duffy ( Fya Fy
b) Kidd ( Jk
a Jk
b) e MNS (S s) (JUNIOR e
OLIVATO 2004) Outra opccedilatildeo eacute a teacutecnica de bloqueio que pode ser utilizada para tratar
hemaacutecias para posterior fenotipagem em casos de TDA positivos com reatividade le2+
Em casos onde a positividade do TDA eacute maior que 2+ estaacute indicada a tratamento
quiacutemico para remoccedilatildeo da interferecircncia do autoanticorpo antes de realizar a fenotipagem Entre
as teacutecnicas utilizadas atualmente estatildeo o ZZAP a cloroquina e a glicina aacutecidaEDTA
1351 TEacuteCNICA DE BLOQUEIO
A teacutecnica de bloqueio se baseia na utilizaccedilatildeo de anti-IgG (Coombs monoespeciacutefico)
para tratar as hemaacutecias com TDA positivo O anticorpo anti-IgG se liga aos anticorpos que
estatildeo sensibilizando a hemaacutecias poreacutem sem o bloquear os antiacutegenos Os antiacutegenos que natildeo
estatildeo sensibilizados podem ser detectados atraveacutes dos antissoros especiacuteficos (SERERAT
VEIDT E DUTCHED 2000)
1352 TRATAMENTO DE HEMAacuteCIAS COM ZZAP
O Sulphydryl-Proteolytic Enzyme (ZZAP) que eacute uma mistura de ditiotreitol (DTT)
mais papaiacutena ativada com cisteiacutena eacute um reagente capaz de dissociar imunoglobulinas da
classe IgG ligadas a membrana dos eritroacutecitos enquanto trata enzimaticamente as hemaacutecias
O tratamento enzimaacutetico tambeacutem potencializa a ligaccedilatildeo do autoanticorpo ao antiacutegeno e
acelera o processo de autoadsorccedilatildeo O ZZAP pode desnaturar os antiacutegenos do sistema Duffy
MNS e Kell o que limita sua aplicaccedilatildeo para fins de fenotipagem (BRANCH e PETZ 1982)
1353 CLOROQUINA
Em 1982 Edwards Moulds e Judd propuseram a utilizaccedilatildeo da teacutecnica da cloroquina
que dissociava os complexos antiacutegeno-anticorpo e mantinha a membrana das hemaacutecias
iacutentegras Os derivados quinolecircicos jaacute haviam sido descritos anteriormente por Domokos e
Aszody em 1964 e Holtz Mantel e Buck em 1973 (apud Edwards Moulds e Judd 1982) pela
sua capacidade de separar imunocomplexos e inibir as reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo reduzindo
as cargas eleacutetricas das superfiacutecie das hemaacutecias A teacutecnica eacute uma das mais utilizadas nos
centros brasileiros para remover a interferecircncia do autoanticorpo e eacute tambeacutem a teacutecnica
atualmente adotada pelo laboratoacuterio de imunohematologia do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto
18
Edwards Moulds e Judd (1982) demonstraram que a teacutecnica da cloroquina para
dissociaccedilatildeo de anticorpos eacute uma teacutecnica simples efetiva e confiaacutevel para dissociar
imunoglobulina das hemaacutecias Desde que a membrana das hemaacutecias permaneccedila intacta natildeo
haacute perda da reatividade dos antiacutegenos e a sua maior aplicaccedilatildeo eacute a fenotipagem de hemaacutecias
com TDA positivo Os autores verificaram que em 83 das amostras sensibilizadas in vivo e
22 amostras (no total de 40) sensibilizadas ldquoin vitrordquo apresentaram TDA negativo e
puderam ser fenotipadas A teacutecnica poreacutem natildeo consegue remover os componentes do
complemento na maioria dos casos
Champagne e colaboradores (1999) testaram a teacutecnica da cloroquina para dissociar
antiacutegenos Bg comparando com a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA e verificaram vantagem em
relaccedilatildeo ao uso de um uacutenico reagente diminuindo a manipulaccedilatildeo e verificou que o mesmo natildeo
destroacutei antiacutegeno Kell
A cloroquina tambeacutem mostrou-se pouco efetivo em remover anticorpos do sistema
Duffy da superfiacutecie das hemaacutecias (EDWARDS MOUDS e JUDD 1982 ROZIERS e
SQUALI 1997)
1353 GLICINA-AacuteCIDAEDTA
A afinidade e a estabilidade entre a ligaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo eacute definida como a
resultante entre forccedilas atrativas e repulsivas entre ambos (CARUCIO e WISE 2012) e resulta
da somatoacuteria de forccedilas quiacutemicas dinacircmicas e fracas (natildeo covalentes) como pontes de
hidrogecircnio forcas eletrostaacuteticas forca de Van der Waals e pontes hidrofoacutebicas A estabilidade
dessa ligaccedilatildeo eacute facilmente abalada por alteraccedilotildees quiacutemicas e fiacutesicas no meio da reaccedilatildeo como
a alteraccedilatildeo do pH A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA se baseia na mudanccedila do pH para a
quebra da ligaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo (KOSANKE 2012)
A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA foi primeiramente descrita em 1986 por Louie Jieng
e Zeroulis que utilizaram 50 amostras de doadores sensibilizados ldquoin vitrordquo com anticorpos A
teacutecnica foi efetiva em 48 amostras permitindo o estudo do eluato assim como a fenotipagem
das hemaacutecias Os autores testaram tambeacutem a teacutecnica em 100 hemaacutecias TDA positivo que
puderam ser utilizadas para teacutecnicas de autoadsorccedilatildeo
Byrne (1991) descreveu a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA modificada e tambeacutem
verificou como uma opccedilatildeo para o tratamento de hemaacutecias com TDA positivo que deixava as
hemaacutecias intactas e o eluato viaacutevel para ser fenotipado
19
Roziers e Squali (1997) e Katharia e Chaudhary (2013) compararam a teacutecnica da
glicina-aacutecidaEDTA com as teacutecnicas da cloroquina e do aquecimento Verificaram maior
eficiecircncia da glicina-aacutecidaEDTA em relaccedilatildeo as outras duas teacutecnicas pois com uma mesma
quantidade de amostra produzia as hemaacutecias livres de anticorpo e tambeacutem o eluato Mostrou-
se ainda superior devido ao menor tempo exigido para sua realizaccedilatildeo o que favorece seu uso
em situaccedilotildees de urgecircncia e emergecircncia
As duas desvantagens da teacutecnica poreacutem eacute o fato de destruir os antiacutegenos do sistema
Kell e o fato de natildeo remover fraccedilotildees do complemento ligadas agrave hemaacutecia (PALLAS WILER e
McGEE 1991 ROZIERS e SQUALLI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012
e KATHARIA e CHAUNDHARY 2013)
20
2 OBJETIVOS
21 OBJETIVO GERAL
211 Avaliar a eficaacutecia da glicina-aacutecidaEDTA em remover os anticorpos ligados agraves
hemaacutecias sensibilizadas por anticorpos da classe IgG
22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
221 Preparaccedilatildeo dos reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
verificaccedilatildeo da estabilidade dos mesmos e avaliar custos
222 Testar a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA em amostras de hemaacutecias
sensibilizadas por anticorpos antieritrocitaacuterios humanos
223 Comparar a efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA com a teacutecnica da
cloroquina quanto a capacidade de remover a interferecircncia do anticorpo ligado
a hemaacutecia
224 Testar o eluato das amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA
225 Verificar se houve destruiccedilatildeo dos antiacutegenos eritrocitaacuterios apoacutes o tratamento
com glicina-aacutecidaEDTA e com cloroquina
226 Verificar se o tempo de execuccedilatildeo da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA descrito
nos textos de referecircncia eacute reprodutiacutevel
21
3 JUSTIFICATIVA
Algumas condiccedilotildees cliacutenicas podem levar ao depoacutesito ldquoin vivordquo de anticorpos eou
fraccedilotildees do complemento sobre as hemaacutecias Entre elas estatildeo as reaccedilotildees hemoliacuteticas poacutes-
transfusionais a doenccedila hemoliacutetica perinatal o uso de medicamentos e principalmente a
AHAI Na AHAI um anticorpo normalmente da classe IgG ou IgM reconhece antiacutegenos
proacuteprios na membrana eritrocitaacuteria e reduz a sobrevida da hemaacutecia levando a sua destruiccedilatildeo
pelos macroacutefagos no sistema reticulo-endotelial ou agrave ativaccedilatildeo do complexo de ataque agrave
membrana e agrave lise intravascular Os autoanticorpos satildeo voltados na maioria das vezes contra
antiacutegenos eritrocitaacuterios de alta frequecircncia populacional conhecidos como antiacutegenos puacuteblicos
e por este motivo reconhecem tanto hemaacutecias autoacutelogas quanto alogecircnicas
Devido agrave presenccedila do autoanticorpo livre no plasma e tambeacutem do anticorpo eou
complemento ligado agrave hemaacutecia o banco de sangue pode encontrar dificuldades em todas as
fases dos testes preacute-transfusionais do paciente com AHAI e deve utilizar teacutecnicas que
auxiliem na escolha do melhor hemocomponente melhorando a seguranccedila transfusional Essas
teacutecnicas visam remover a interferecircncia do autoanticorpo livre no soro e do autoanticorpo
ligado agrave hemaacutecia permitindo a detecccedilatildeo de aloanticorpos associados e a realizaccedilatildeo da
fenotipagem eritrocitaacuteria respectivamente
A finalizaccedilatildeo dos testes preacute-tranfusionais na presenccedila de autoanticorpo pode levar
algumas horas e nem sempre o paciente poderaacute aguardar Nesse contexto torna-se vantajosa a
aplicaccedilatildeo de teacutecnicas de raacutepida execuccedilatildeo
O presente estudo propotildee aplicar e avaliar a eficaacutecia da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
em remover os anticorpos ligados agrave hemaacutecia o que permite a fenotipagem eritrocitaacuteria
estendida e a seleccedilatildeo de concentrados de hemaacutecias com mesmo fenoacutetipo do paciente
Atualmente no Hemocentro de Ribeiratildeo Preto a teacutecnica utilizada para esse fim eacute o
tratamento das hemaacutecias com difosfato de cloroquina cujo tempo de execuccedilatildeo pode demorar
ateacute duas horas enquanto a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser realizada em apenas dois
minutos o que a tornaria opccedilatildeo de escolha especialmente em situaccedilotildees de urgecircncia Ao
contraacuterio da cloroquina a glicina-aacutecidaEDTA permite tambeacutem o estudo do eluato das
hemaacutecias tratadas
22
4 METODOL OGIA
41 AMOSTRAS DE DOADORES
Foram coletados 50 amostras de doadores de sangue que compareceram ao
Hemonuacutecleo de Araccedilatuba no periacuteodo de junho a agosto de 2016 Foram convidados a
participar da pesquisa doadores de repeticcedilatildeo do tipo sanguiacuteneo ldquoOrdquo RhD positivo
cadastrados no sistema de banco de sangue (SBS) do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto
Todos os doadores que concordaram em participar da pesquisa assinaram o termo de
consentimento livre e esclarecido (TCLE)
No momento da doaccedilatildeo foram coletados adicionalmente 5 mL de sangue total em
soluccedilatildeo anticoagulante EDTA (aacutecido dietilenoaminoaceacutetico) dispensando punccedilatildeo venosa
adicional para coleta da amostra O fluxograma 1 resume as etapas desenvolvidas no projeto
Fluxograma 1 - Fluxo da pesquisa utilizando as amostras de doadores
23
411 FENOTIPAGEM
Foram verificados se os doadores jaacute tinham fenotipagem para outros sistemas de
grupos sanguiacuteneos aleacutem do sistema ABORh que eacute realizado rotineiramente
A fenotipagem eritrocitaacuteria para outros sistemas ou fenotipagem estendida eacute realizada
para identificar a presenccedila ou ausecircncia de antiacutegenos considerados de importacircncia cliacutenica No
Hemonuacutecleo de Araccedilatuba uma parcela de doadores de repeticcedilatildeo satildeo fenotipados para os
antiacutegenos dos sistemas de grupo sanguiacuteneo Rh (antiacutegenos C c E e e) Kell (antiacutegeno K)
Duffy (antiacutegenos Fya e Fy
b) Kidd (antiacutegenos Jk
a e Jk
b) e sistema MNSs (antiacutegenos S e s)
A fenotipagem para o Rh e Kell eacute realizada por metodologia de microplaca utilizando
25 microL de hemaacutecia lavada e diluiacuteda a 5 em salina e 25 microL do antissoro comercial especiacutefico
A reaccedilatildeo eacute incubada 15 minutos a temperatura ambiente e centrifugadas para leitura Para os
antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s a metolodogia utilizado eacute gel contendo antiglobulina
humana (gel LissCoombs poliespeciacutefico) da marca BIO-RAD onde se utiliza suspensatildeo de
hemaacutecia em LISS (Soluccedilatildeo de baixa forccedila iocircnica) A suspensatildeo eacute preparada atraveacutes da
diluiccedilatildeo de 10 microL de hemaacutecia em 1000 microL de LISS Pipetado 50 microL dessa diluiccedilatildeo no gel e
adicionado 25 microL do antissoro especiacutefico Incuba-se em banho seco por 15 minutos a 37 deg
Celsius e eacute centrifugado em centriacutefuga especiacutefica Os antissoros utilizados eram das marcas
Fresenius e Lorne
Foi verificado a fenotipagem do doador no banco de dados do Hemocentro Os
registros dos fenoacutetipos dos doadores ficam armazenadas no sistema de banco de sangue
(SBS) Para doadores que natildeo tinham fenotipagem estendida preacutevia para antiacutegenos do sistema
Rh (C c E e e) e Kell (K) foi realizada a fenotipagem para esses antiacutegenos
O tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA e cloroquina para dissociar
anticorpos pode inativar enfraquecer ou destruir os antiacutegenos presentes nas hemaacutecias
alterando assim os resultados da fenotipagem Para verificar se houve destruiccedilatildeo dos
antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a e Jk
b S e s nas amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes
tratamento foram novamente fenotipadas ao final para os antiacutegenos que eram inicialmente
positivas
A repeticcedilatildeo da fenotipagem foi realizada nas amostras que apresentaram efetividade
no tratamento da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eou da cloroquina e a detecccedilatildeo do antiacutegeno
na amostra preacute-tratamento
24
412 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS HEMAacuteCIAS
As hemaacutecias foram sensibilizadas com antissoros policlonais humanos de amostras de
plasma fresco congelado de doadores com resultado de pesquisa de anticorpo irregular
positivos
A escolha do anticorpo para sensibilizar as hemaacutecias foi definida de acordo com o
fenoacutetipo do doador que deveria ser positivo para o respectivo antiacutegeno
Para a sensibilizaccedilatildeo um volume de antissoro (1 mL) e um volume (1 mL) de
hemaacutecias lavadas quatro vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica foram adicionadas a um tubo de 12 x
75 mm A mistura foi homogeneizada e incubada em banho maria (BM) a 37deg C por 60
minutos A seguir as hemaacutecias foram novamente lavadas 4 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica
para retirada dos anticorpos que natildeo se ligaram A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada
como controle negativo O teste da uacuteltima lavagem eacute importante para assegurar que os
anticorpos que poderatildeo ser detectados no eluato apoacutes o tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA
sejam aqueles que estavam ligados agraves hemaacutecias e natildeo aqueles livres no plasma O controle
negativo mostra que todo o anticorpo livre foi retirado (LEGER 2011)
Para o teste de presenccedila de anticorpo na soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foram incubadas
com hemaacutecias de triagem de anticorpos irregulares (ID-Diacell BIO-RAD) contendo os
antiacutegenos especiacuteficos Realizado a teacutecnica em gel LissCoombs com anti-IgG+C3d Incubado
no tempo de 15 minutos a temperatura de 37deg C e centrifugado 10 minutos em centriacutefuga
proacutepria
As 50 amostras de doadores foram sensibilizadas com os anticorpos policlonais
humanos
Apoacutes sensibilizadas rdquoin vitrordquo e lavadas as hemaacutecias foram diluiacutedas em soluccedilatildeo de
baixa forccedila iocircnica (LISS) na quantidade de 10 microL de hemaacutecia para 1000 microL de soluccedilatildeo A
suspensatildeo foi pipetada (50 microL) em coluna-gel-teste LissCoombs (BIO-RAD) que contecircm
antiglobulina poliespeciacutefico (IgG+C3d) e centrifugada em baixa rotaccedilatildeo conforme orientaccedilatildeo
do fabricante durante 10 minutos
As amostras deveriam apresentar aglutinaccedilatildeo com reatividade 3 a 4+ no TDA As
amostras que apresentaram reaccedilatildeo menor que 3+ foram novamente sensibilizadas com nova
aliacutequota do antissoro
25
413 TRATAMENTO DAS AMOSTRAS
As amostras sensibilizadas apresentando o TDA positivo 3 ou 4+ foram divididas em
duas aliacutequotas e submetidas a duas teacutecnicas diferentes com o objetivo de dissociar o anticorpo
ligado Uma aliacutequota da amostra foi tratada com soluccedilatildeo de difosfato de cloroquina enquanto
a outra aliacutequota foi tratada com glicina-aacutecidaEDTA
42 PREPARO DA GLICINA AacuteCIDA-EDTA
A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA utiliza 3 soluccedilotildees diferentes a glicina aacutecida o
EDTA e o tampatildeo TRIS
Os reagentes foram preparados utilizando os sais para anaacutelise (PA) de EDTA
(Na2EDTA2H2O) TRIS (C4H11NO3) Glicina (H2NCH2CO2H) NaCl e a soluccedilatildeo de aacutecido
cloriacutedrico (HCl) 12 N todos reagentes da marca SYNTH (quadro 1)
Para o preparo do tampatildeo glicina-acida eacute necessaacuterio o ajuste do pH para 15 Para esse
ajuste utiliza-se aacutecido cloriacutedrico (HCl) concentrado O pH foi medido com fitas reativas de pH
com escala de 1 a 14 da marca MERCK Posteriormente a soluccedilatildeo foi enviada ao laboratoacuterio
de controle de qualidade do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto e o pH medido no peagacircmetro O
tampatildeo glicina-aacutecida foi armazenado a 4deg e o tampatildeo tris e o EDTA em temperatura ambiente
controlada (20 a 24deg Celsius)
Apoacutes o preparo e durante a realizaccedilatildeo dos testes foram feitas inspeccedilotildees visuais para
verificaccedilatildeo de turvaccedilatildeo do meio e presenccedila de precipitados
Reagente Material Quantidade Preparo e
Conservaccedilatildeo
EDTA
EDTA
(Na2EDTA2H2O)
5 gramas Mistura ateacute
dissoluccedilatildeo do sal e
conserva em
temperatura ambiente Aacutegua Destilada 50 Ml
Tris
TRIS (C4H11NO3) 121 gramas Conservar em
temperatura ambiente NaCl 525g
Aacutegua destilada 100ml
Gliacutecina-aacutecida
Glicina
(H2NCH2CO2H) 15 gramas
Conservar a 4oC NaCl 116gramas
Aacutegua Destilada 200ml
HCL 12N Ajutar o pH para 15
Quadro 1 - Preparo dos Reagentes da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
Fonte - Manual teacutecnico AABB 2011
26
O tampatildeo glicina-aacutecida e o tampatildeo TRIS satildeo estaacuteveis por 7 meses O reagente EDTA
precipitou mesmo estando em temperatura em ambiente controlado Houve necessidade de
preparo de novo reagente
421 TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
1 Em um tubo de ensaio 12x75 mm eacute adicionado 08 mL da soluccedilatildeo de glicina-aacutecida A
esta soluccedilatildeo adiciona-se 02 mL de EDTA e mistura
2 Adiciona-se 02 mL de hemaacutecias sensibilizadas (lavada 4 vezes) A mistura eacute
homogeneizada e incubada por exatamente 2 minutos
3 A seguir 01 mL de tampatildeo TRIS eacute adicionado agrave mistura que eacute novamente
homogeneizada e centrifugada por 2 minutos a 3400 rpm O pH deve estar entre 7 a 75
4 Apoacutes centrifugaccedilatildeo separa-se em outro tubo o sobrenadante (eluato) e as hemaacutecias
que permanecem satildeo lavadas 4 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica para retirada de todo o
reagente e anticorpos livres
43 PREPARO DA CLOROQUINA
A cloroquina eacute diluiacuteda em tampatildeo PBS na concentraccedilatildeo de 20 (Quadro 2) e
armazenado a 4deg Celsius sua validade apoacutes o preparo eacute de 1 mecircs
A teacutecnica da cloroquina jaacute estaacute padronizada para rotina do laboratoacuterio de
imunohematologia do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto e suas unidades
Reagente Reagentes Quantidade PreparoConservaccedilatildeo
Cloroquina
Difosfato de cloroquina
(C18H32ClN3O8P2)
20 gramas
Conservar a 4deg Celsius
Tampatildeo PBS 100ml
NaOH 01 N Acertar o pH para
51
Quadro 2 - Preparo da Cloroquina Fonte - Manual teacutecnico da AABB 2011
431 TEacuteCNICA DA CLOROQUINA
1 4 partes da soluccedilatildeo pronta eacute adicionada a uma parte de hemaacutecias lavadas 4 vezes com
soluccedilatildeo fisioloacutegica
2 A mistura eacute incubada em temperatura ambiente por ateacute duas horas
3 Centrifugar a 3400 rpm por 2 minutos
27
4 Remover o sobrenadante lavar as hemaacutecias novamente com soluccedilatildeo fisioloacutegica 4
vezes
44 VERIFICACcedilAtildeO DA EFETIVIDADE DOS TESTES
Apoacutes tratamento pelas duas teacutecnicas o TDA foi repetido em todas as amostras para
verificar se os tratamentos foram efetivos e houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo Para as
amostras tratadas pela teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA que permaneceram com TDA positivo
novo tratamento foi realizado
45 TESTE DO ELUATO
O eluato resultante das amostras tratadas com glicina-acidaEDTA foi testado com
hemaacutecias de triagem A soluccedilatildeo do eluato foi incubada com as hemaacutecias de triagem de
anticorpos (ID-Diacell BIO-RAD) pela teacutecnica em gel LissCoombs O teste foi incubado 15
minutos a 37deg Celsius e centrifugado por 10 minutos em centrifuga proacutepria para a teacutecnica em
gel Os eluatos que apresentaram resultados positivos foram testados em painel de 11
hemaacutecias (ID-Diapanel BIO-RAD) para a identificaccedilatildeo do anticorpo
46 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente que apresentou TDA positivo por IgG e pesquisa
de anticorpo irregular positivo com presenccedila de autoanticorpo com reatividade panaglutinina
A amostra foi tratada em paralelo pelas duas teacutecnicas descritas e foi enviada para o
Hemocentro para genotipagem eritrocitaacuteria que foi realizado por metodologia PCR em tempo
real no equipamento Real-time system PCR 7500 ( Applied Biosystems Califoacuternia EUA)
28
5 RESULTADOS
51 REAGENTES
Para aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA satildeo necessaacuterios 3 diferentes
reagentes que podem ser encontrados em forma de kit pronto para uso No entanto esses kits
natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil Os reagentes satildeo tampatildeo glicina-aacutecida o EDTA e o tampatildeo
Tris
Todos os reagentes foram preparados rdquoin houserdquo a partir dos sais e soluccedilotildees PA (puro
para anaacutelise) da marca SYNTH que foram adquiridos para a pesquisa O custo estimado para
cada teste foi aproximadamente R$ 020 reais
Apoacutes o preparo os reagentes poderiam ser armazenados em condiccedilotildees adequadas pelo
periacuteodo de 1 ano (AABB 2011) Ao final do preparo e durante o periacuteodo de armazenamento
de fevereiro a setembro de 2016 foi realizada inspeccedilatildeo visual para verificar a presenccedila de
precipitados ou turvaccedilatildeo A soluccedilatildeo de glicina e o tampatildeo TRIS mostraram-se estaacuteveis ateacute o
final do periacuteodo Por sua vez o reagente EDTA precipitou mesmo estando armazenado em
temperatura ambiente controlada e foi necessaacuterio novo preparo
52 AMOSTRAS DE DOADORES
521 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS AMOSTRAS
Apoacutes incubaccedilatildeo da hemaacutecia com o antissoro a mesma foi lavada 4 vezes para retirada
dos anticorpos livres A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada Caso houvesse positividade na
soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem a etapa era repetida (figura 3) Das 50 amostras sensibilizadas a
uacuteltima lavagem foi positiva somente em 3 delas Nas 3 amostras o anticorpo utilizado para
sensibilizaccedilatildeo foi o anti-K Apoacutes repetido nova etapa de lavagem os resultados se
apresentaram negativos
Em todas as amostras sensibilizadas ldquoin vitrordquo o TDA foi testado e verificado a
intensidade do teste Entre as 50 amostras 47 alcanccedilaram TDA com intensidade 3-4+ apoacutes a
primeira sensibilizaccedilatildeo enquanto 3 amostras necessitaram uma segunda incubaccedilatildeo com
anticorpo (figura 4)
A escolha dos anticorpos para sensibilizar as hemaacutecias foi feita de acordo com o
fenoacutetipo do doador e foram utilizados sete diferentes especificidades de anticorpos policlonais
humanos conforme mostra o graacutefico1
29
Figura 3 - Soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada com hemaacutecia de triagem de
anticorpos em gel LissCoombs (BIO-RAD) A finalidade eacute verificar a presenccedila de anticorpos livres na
suspensatildeo que possam interferir na pesquisa do eluato As soluccedilotildees de lavagem das amostras na figura a tiveram
resultados negativos Na figura b duas amostras a 47 e 50 apresentaram resultado positivo Nova etapa de
lavagem foi realizada e o resultado final foi negativo
522 TRATAMENTO DAS HEMAacuteCIAS
Apoacutes a sensibilizaccedilatildeo e obtenccedilatildeo de resultados de TDA com intensidade de 3 a 4+
cada uma das amostras foi dividida em duas aliacutequotas e tratada separadamente pelas teacutecnicas
de glicinaaacutecida-EDTA e cloroquina
As teacutecnicas foram consideradas efetivas quando obteve-se a completa dissociaccedilatildeo do
anticorpo verificada atraveacutes do TDA negativo na amostra poacutes tratamento conforme figuras 5
e 6 Dentre as amostras tratadas com cloroquina 2850 tiveram o TDA negativado A glicina-
aacutecidaEDTA negativou o TDA em 33 das 50 amostras tratadas Apenas 17 amostras tratadas
com glicina-aacutecidaEDTA permaneceram com o TDA positivo e foram submetidas a um novo
tratamento
30
Figura 4 - TDA das amostras apoacutes sensibilizaccedilatildeo com anticorpos policlonais humanos Amostras na
figura a com intensidades de 3-4+ Na figura b amostras 4 e 7 com intensidade menor que 3+ e portanto foram
novamente sensibilizadas com nova aliacutequota de soro Anti-D e anti-S Apoacutes a segunda sensibilizaccedilatildeo
apresentaram reatividade 4 e 3+ respectivamente Os anticorpos utilizados para sensibilizaccedilatildeo foram D S c E
C e K
523 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS TEacuteCNICAS
No tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA houve dissociaccedilatildeo completa do anticorpo
em 33 amostras (66) das 50 amostras testadas enquanto que com a cloroquina foram 28
amostras (56) (tabela 1)
31
Graacutefico 1- Nuacutemero de amostras sesnsibilizadas por especificidade de anticorpo Entre as 50 amostras 12
foram sensibilizadas com anti-D 10 com anti-C 9 com anti-E 8 com anti-c 7 com anti-S 3 com anti-K e 1
com anti-Dia As especificidades dos anticorpos foram definidas de acordo o fenoacutetipo do doador
Figura 5 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com cloroquina Nas amostras onde houve
a dissociaccedilatildeo do anticorpo ( 2 21 a 23 26 39 a 42 45 46 e 49) a hemaacutecia se deposita no fundo no microtubo
apoacutes a centrifugaccedilatildeo (TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (1 3 24 25 43 44 47
48 e 50) o anticorpo ligado agraves hemaacutecias eacute alvo da AGH presente no gel (TDA positivo)
Anti-D 12
Anti-C 10
Anti-E 9
Anti-c 8
Anti-S 7
Anti-K 3 Anti-Dia 1
32
Figura 6 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA Nas amostras
onde houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo (4 6 7 12 a 15 17 34 35 37 e 38) a hemaacutecia se deposita no fundo no
microtubo apoacutes a centrifugaccedilatildeo ( TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (5 16 18
19 20 33 e 36 ) o AGH presente no gel se liga ao anticorpo ligado agraves hemaacutecias que ficam retidas no gel (TDA
positivo)
Tabela 1-Resultado geral do tratamento das hemaacutecias com glicina e cloroquina
Teacutecnica utilizada TDA negativo TDA positivo Total
Glicina-aacutecidaEDTA 33 17 50
Cloroquina 28 22 50
A glicina-aacutecidaEDTA conseguiu negativar mais amostras sensibilizadas com Anti-D
e anti-K que a cloroquina Para as hemaacutecias sensibilizadas com anti-E Anti-S e Anti-Dia
ambas as teacutecnicas dissociaram o anticorpo em 100 das amostras Os resultados detalhados
por especificidade do anticorpo apoacutes o primeiro tratamento com glicina-aacutecidaEDTA e com
cloroquina estatildeo na tabela 2
Para as amostras que permaneceram positivas (17 amostras) apoacutes o tratamento com a
glicina-aacutecidaEDTA foi realizado um novo tratamento Houve dissociaccedilatildeo do anticorpo em 3
amostras (18) apoacutes a segunda tentativa Nas demais 14 (82) amostras tratadas pela
segunda vez 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise
33
Tabela 2 - Resultados do TDA apoacutes tratamento das hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo
sensibilizado
ANTICORPOS
SENSIBILIZADOS
1ordm TRATAMENTO COM
GLICINA
TRATAMENTO COM
CLOROQUINA
TOTAL TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
Anti-D 8 4 0 12 12
Anti-C 6 4 10 0 10
Anti-E 9 0 9 0 9
Anti-c 0 8 1 7 8
Anti-S 7 0 7 0 7
Anti-K 2 1 0 3 3
Anti-Dia 1 0 1 0 1
TOTAL 33 17 28 22 50
A hemoacutelise foi verificada durante o procedimento de lavagem final das hemaacutecias com
soluccedilatildeo fisioloacutegica para a retirada dos reagentes As soluccedilotildees de lavagem ficaram
avermelhadas e as hemaacutecias com coloraccedilatildeo escura As amostras foram descartadas Dentre as
6 amostras que ainda puderam ser testadas para o TDA trecircs amostras negativaram sendo 1
sensibilizada com anti-D e 2 com anti-C (tabela 3)
Tabela 3 - Resultado apoacutes o segundo tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA
Tratamento com
glicina-aacutecidaEDTA
TDA Negativo TDA Positvo Hemoacutelise Total
Segundo tratamento 3 3 11 17
524 TESTAGEM DO ELUATO
Apoacutes o tratamento com a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA a soluccedilatildeo do eluato foi
testada para verificar a viabilidade dos anticorpos que foram dissociados ou eluiacutedos Dentre
as 50 amostras 41 apresentaram eluato positivo As nove amostras cujos eluatos foram
negativos haviam sido sensibilizadas com as seguintes especificidades de anticorpos anti-E 6
amostras (67) anti-S 2 amostras (40) e anti-D 1 amostra (8) (tabela 4) O eluato de
todas as amostras sensibilizadas com os anticorpos anti-C anti-c Anti-K e Anti-Dia foram
positivos Os eluatos positivos na triagem de anticorpos foram testados com paineacuteis de
identificaccedilatildeo para confirmar a especificidade e a viabilidade dos anticorpos (figuras 7 e 8)
34
525 EFEITO DA ELUICcedilAtildeO SOBRE OS ANTIacuteGENOS ERITROCITAacuteRIOS
Para verificar o efeito do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA e com a cloroquina
sobre a expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s foi realizada a fenotipagem das
amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes tratamento com ambas as teacutecnicas Foi avaliado
se o tratamento destruiu os antiacutegenos expressos antes do tratamento
Tabela 4- Resultado do Eluato das amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA
Anticorpos Eluato positvo Eluato negativo Total
Anti-D 11 1 12
Anti-C 10 0 10
Anti-E 3 6 9
Anti-c 8 0 8
Anti-S 5 2 7
Anti-K 3 0 3
Anti-Dia 1 0 1
Total 41 9 50
Figura 7 ndash Painel do eluato da amostra 21 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-C que foi
recuperado no eluato
Figura 8 ndash Painel do eluato da amostra 47 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-K que foi
recuperado no eluato
35
Dentre as 50 amostras 26 eram previamente fenotipadas para os antiacutegenos Fya Fy
b
Jka Jk
b S e s Dentre elas 20 alcanccedilaram TDA negativo apoacutes tratamento com a glicina-
aacutecidaEDTA e 20 negativaram apoacutes tratamento com cloroquina (tabela 5) Apoacutes ambas as
teacutecnicas os antiacutegenos originalmente expressos permaneceram positivos comprovando que natildeo
houve destruiccedilatildeo dos mesmos
Tabela 5 ndash Verificaccedilatildeo da interferecircncia do tratamento da hemaacutecias com cloroquina e glicina-
aacuteicdaEDTA sobre os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
AMOSTRAS
COM
FENOTIPAGEM
PREacuteVIA
TRATADAS COM
CLOROQUINA
TRATADAS COM
GLICINA
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
26
20
20
20
20
As amostras 24 47 e 50 eram positivas para o antiacutegeno K A cloroquina natildeo dissociou
o anticorpo em nenhuma das 3 amostras enquanto a glicina-aacutecidaEDTA foi efetiva nas
amostras 24 e 50 Foi testada a expressatildeo do antiacutegeno K nas amostras 24 e 50 apoacutes o
tratamento utilizando meacutetodo indireto em gel contendo AGH Apesar de natildeo ter sido avaliado
a intensidade de reaccedilatildeo de expressatildeo dos antiacutegenos podemos verificar na figura 9 que nas
duas amostras em que a teacutecnica foi efetiva e dissociou o anticorpo a expressatildeo do antiacutegeno K
continua presente mas a reatividade observada pode ser considerada 1+ sugerindo que houve
diminuiccedilatildeo da expressatildeo do antiacutegeno quando comparado com a expressatildeo observada em
hemaacutecia natildeo tratada
Os resultados individuais de cada amostra em ambas as teacutecnicas encontram-se
resumidas na tabela 6
526 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente onde foi constatada a presenccedila de autoanticorpo
a quente da classe IgG pelo TDA monoespeciacutefico (figura 10)O autoanticorpo tambeacutem
interferia na pesquisa e identificaccedilatildeo de anticorpos irregulares pois apresentava caracteriacutestica
de panaglutinina As hemaacutecias da paciente sensibilizadas ldquoin vivordquo foram tratadas com
cloroquina e com glicina-aacutecidaEDTA
36
Figura 9 ndash Fenotipagem das amostras 24 e 50 para antiacutegeno K apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
O teste positivo indica a presenccedila do antiacutegeno poreacutem a reatividade fraca (1+) sugere que houve enfraquecimento
de sua expressatildeo A direita a expressatildeo forte (4+) do antiacutegeno Kell em hemaacutecia controle natildeo tratada utilizada
como controle positivo
A cloroquina natildeo foi efetiva na retirada do anticorpo ligado as hemaacutecias ao contraacuterio
do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA que dissociou o anticorpo (figura 11)
A hemaacutecia tratada com glicina foi fenotipada para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
(figura 12) A fenotipagem para o sistema Rh (C c E e e) e Kell foi realizada em gel
especiacutefico monoclonal sem interferecircncia do TDA positivo (controle da reaccedilatildeo negativo)
O eluato resultante do tratamento com glicina-aacutecidaEDTA foi testada em gel com
hemaacutecias de painel de identificaccedilatildeo de anticorpos e apresentou resultado positivo com todas
as ceacutelulas (figura 13 e 14)
A amostra foi enviada para genotipagem e o resultado da genotipagem confirmou o
resultado da fenotipagem apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
527 TEMPO DE EXECUCcedilAtildeO DA TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
O tempo de reaccedilatildeo da glicina-aacutecidaEDTA eacute de 2 minutos Todas as amostras foram
tratadas obedecendo ao tempo descrito na literatura demonstrando que o mesmo eacute
reprodutiacutevel
37
Tabela 6- Resultados individuais por amostra
Amostra Especificidade
dos anticorpos
Intensidade do
TDA apoacutes
sensibilizaccedilatildeo
Tratamento
efetivo com
cloroquina
Tratamento
efetivo com
glicina
Eluato
poacutes
glicina
1 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 2 Dia 3+ Sim Sim 3+ 3 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 4 D 4+ Natildeo Sim 4+ 5 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 6 E 3+ Sim Sim Negativo 7 S 4+ Sim Sim 3+ 8 E 3+ Sim Sim 1+ 9 E 3+ Sim Sim 2+
10 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 11 D 4+ Natildeo Sim 4+ 12 D 4+ Natildeo Sim 4+ 13 S 3+ Sim Sim 3+ 14 S 3+ Sim Sim 3+ 15 D 3+ Natildeo Sim 3+ 16 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 17 E 3+ Sim Sim (+) 18 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 19 D 4+ Natildeo Natildeo 3+ 20 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 21 C 3+ Sim Sim 4+ 22 C 3+ Sim Sim 4+ 23 C 3+ Sim Sim 4+ 24 K 4+ Natildeo Sim 4+ 25 D 3+ Natildeo Natildeo Negativo 26 E 4+ Sim Sim Negativo 27 S 3+ Sim Sim 3+ 28 C 3+ Sim Natildeo 4+ 29 C 3+ Sim Sim 4+ 30 C 3+ Sim Sim 4+ 31 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 32 E 3+ Sim Sim Negativo 33 C 3+ Sim Natildeo 4+ 34 S 3+ Sim Sim Negativo 35 S 3+ Sim Sim Negativo 36 C 4+ Sim Natildeo 4+ 37 c 4+ Natildeo Natildeo 4+ 38 D 4+ Natildeo Sim 4+ 39 S 3+ Sim Sim 3+ 40 c 4+ Sim Natildeo 2+ 41 C 4+ Sim Natildeo 4+ 42 E 3+ Sim Sim Negativo 43 D 3+ Natildeo Sim 2+ 44 D 3+ Natildeo Sim 2+ 45 E 3+ Sim Sim Negativo 46 C 3+ Sim Sim 4+ 47 K 4+ Natildeo Natildeo 4+ 48 D 3+ Natildeo Sim 2+ 49 E 3+ Sim Sim Negativo 50 K 4+ Natildeo Sim 4+
TOTAL 50 28 33 41
38
Figura 10 ndash TDA monoespeciacutefico da amostra de paciente Hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo da classe
IgG
oacute Figura 11 ndash TDA apoacutes o tratamento com glicina-aacutecidaEDTA (esquerda) e cloroquina (direita) A glicina
negativou completamente o TDA enquanto a hemaacutecia tratada com cloroquina persistiu positiva (1+)
39
Figura 12 ndash Fenotipagem da amostra tratada com glicina-aacutecidaEDTA Fy(a+b+) Jk(a-b+) S+s+
Figura 13 ndash Painel em gel (LissAGH) do eluato apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de
intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
Figura 14 ndash ndash Painel ezimaacutetico (hemaacutecias tratadas com bromelina) do eluato em gel neutro apoacutes
tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
40
528 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Quanto a efetividade das teacutecnicas em negativar o TDA foi verificado que a glicina-
aacutecidaEDTA foi efetiva em 66 das amostras testadas no primeiro tratamento (3350
amostras) enquanto a cloroquina conseguiu negativar 56 (2850) Esses resultados natildeo
apresentam diferenccedila significativa (pgt005) demostrando que a teacutecnica da glicina-
aacutecidaEDTA natildeo eacute superior mas eacute tatildeo efetiva quanto a da cloroquina
Quando aliamos os resultados de ambas as teacutecnicas verificamos que em 76 (3850)
das amostras o TDA foi negativado Esse dado indica que ainda que uma teacutecnica natildeo seja
eficaz na remoccedilatildeo do anticorpo eacute uma boa alternativa tentar a segunda teacutecnica jaacute que a falha
em remover o anticorpo utilizando uma delas natildeo prevecirc necessariamente a falha com a outra
Quando se utiliza o teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla (graacutefico 2) para comparar a utilizaccedilatildeo das
duas teacutecnicas com o resultado de cada uma isolada (somente a cloroquina ou somente a
glicina) verificamos que os resultados apresentam diferenccedila significativa (plt005) (quadro 3)
TRATAMENTO EFETIVO COM TOTAL PORCENTAGEM
Glicina ou cloroquina 38 76
Glicina e cloroquina 23 46
Glicina apenas 10 20
Cloroquina apenas 5 10
Nenhuma das teacutecnicas 12 24
Quadro 3 - Resultados comparativos entre as teacutecnicas utilizadas
41
Graacutefico 2 - Teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla entre as teacutecnicas aplicadas A- Glicina e Cloroquina B-Cloroquina C-
Glicina ( plt005)
42
6 DISCUSSAtildeO
Os reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA podem ser adquiridos em
forma de kit comercial prontos para uso poreacutem natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil A preparaccedilatildeo
dos reagentes ldquoin houserdquo a partir de sais comerciais adquiridos se mostrou viaacutevel Os
reagentes glicina e o tampatildeo Tris armazenados de forma correta se mantiveram estaacuteveis por
um periacuteodo de 7 meses Somente o reagente EDTA precipitou mesmo armazenado em
condiccedilotildees adequadas sugerindo que o mesmo deve ser preparado em menor quantidade e
armazenado em aliacutequotas A soluccedilatildeo de cloroquina tambeacutem pode ser preparada ldquoin houserdquo e
pode ser armazenado por um mecircs A legislaccedilatildeo brasileira autoriza a utilizaccedilatildeo de reagentes
preparados a partir de sais comerciais como a cloroquina e a glicina-aacutecidaEDTA desde que
os sais tenham autorizaccedilatildeo da vigilacircncia sanitaacuteria para a comercializaccedilatildeo (BRASIL 2001)
A comparaccedilatildeo quanto a efetividade em dissociar anticorpos em amostras com TDA
positivos entre a teacutecnica da glicina e a teacutecnica da cloroquina mostrou que natildeo haacute diferenccedila
estatiacutestica entre elas e que ambas satildeo igualmente eficientes Se utilizadas conjuntamente haacute
maior possibilidade de elucidaccedilatildeo dos casos
Uma vantagem da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eacute que ela permite numa mesma
amostra eluir o anticorpo ligado aacute hemaacutecia assim como fenotipar a hemaacutecia tratada Devido a
sua dupla utilidade a teacutecnica eacute vantajosa principalmente em pacientes em que pouco volume
de amostra pode ser coletado como em casos de crianccedilas e receacutem-nascidos
A fenotipagem poacutes tratamento se mostrou viaacutevel jaacute que os antiacutegenos de maior
importacircncia natildeo sofreram alteraccedilotildees Nas 20 amostras que foram fenotipadas antes e apoacutes
tratamento para verificar a influecircncia dos reagentes na expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a
Jkb S e s natildeo houve destruiccedilatildeo dos mesmos por nenhuma das duas teacutecnicas
Para as amostras positivas para o antiacutegeno Kell (350) e sensibilizadas com o
respectivo anticorpo a teacutecnica da glicina foi efetiva em negativar o TDA em apenas duas
delas mas apoacutes o tratamento foi verificada uma fraca reatividade da reaccedilatildeo antiacutegeno-
anticorpo sugerindo que houve um enfraquecimento da expressatildeo do antiacutegeno conforme
esperado e descrito na literatura (BYRNE 1991 PALLAS WILER E MCGEE 1991
ROZIERS e SQUALI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012 e KATHARIA e
CHAUDHARY 2013) A accedilatildeo da glicina sobre o antigeno Kell natildeo representa impedimento
para seu uso uma vez que na impossibilidade de testar o antiacutegeno Kell o banco de sangue
consegue facilmente atender a solicitaccedilatildeo de transfusatildeo com unidades de hemaacutecias Kell
43
negativas jaacute que eacute um antiacutegeno de baixa prevalecircncia na populaccedilatildeo variando de 15 na
populaccedilatildeo africana a 9 nos europeus (DANIELS 2011)
A soluccedilatildeo resultante da dissociaccedilatildeo do anticorpo pela teacutecnica da glicina pode ainda ser
utilizada como eluato podendo substituir a teacutecnica de eluiccedilatildeo com reagentes comercias (kits
de eluiccedilatildeo aacutecida) que tem alto custo aproximadamente entre R$2000 a R$2500 por teste
Em 41 amostras (82) houve a dissociaccedilatildeo e recuperaccedilatildeo do anticorpo que estava
sensibilizando as hemaacutecias Em 9 amostras (18) os anticorpos foram eluiacutedos poreacutem
apresentaram reaccedilatildeo negativa quando testadas com hemaacutecias de triagem entre eles o anti-E
(6) anti-S (2) e Anti-D (1) Eacute possiacutevel que a correccedilatildeo pH do meio (WALKER 2011) natildeo
tenha sido adequada o que pode ter desfavorecido a reatividade do anticorpo
Para as amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA nas quais natildeo houve dissociaccedilatildeo do
anticorpo pelo primeiro tratamento (1750) o segundo tratamento natildeo se mostrou eficaz jaacute
que 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise O tempo de
armazenagem natildeo parece ter influenciado jaacute que todas as amostras foram testadas dentro de
48 horas apoacutes a coleta Outros fatores que natildeo foram verificados podem ter levado a
hemoacutelise Apesar da literatura (LOUIE JIENG e ZEROULIS 1986 e BYRNE 1991)
recomendar um segundo tratamento ele eacute pouco eficaz tendo negativado apenas 3 das 17
amostras testadas
A amostra de paciente que apresentou sensibilizaccedilatildeo ldquoin vivordquo mostrou melhor
efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA sobre a da cloroquina possibilitando
fenotipagem para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s que natildeo foram destruiacutedos apoacutes o
tratamento comprovado atraveacutes da genotipagem
A presenccedila de autoanticorpo a quente com presenccedila de hemoacutelise (AHAI) ou natildeo pode
mascarar a presenccedila de aloanticorpo interferindo na rotina soroloacutegica da fenotipagem que eacute
uma importante ferramenta para auxiliar na seleccedilatildeo de hemaacutecias para transfusatildeo (SHIREY et
al 2002) Esses pacientes frequentemente possuem aloanticorpos associados ao
autoanticorpo e a prevalecircncia de aloimunizaccedilatildeo entre eles varia entre 12 a 40 (LEGER e
GARRATY 1999 BRANCH e PETZ 1999) o que dificulta ainda mais a escolha do melhor
componente a ser transfundido aleacutem de aumentar a possibilidade reaccedilotildees hemoliacuteticas imunes
poacutes-transfusionais
Nesses casos as teacutecnicas de dissociaccedilatildeo de anticorpos satildeo importantes para tratar
amostras de pacientes e a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser usada como uma opccedilatildeo
pois se mostrou eficaz na dissociaccedilatildeo anticorpo ligado agraves hemaacutecias deixando livre a
superfiacutecie das mesmas permitindo a fenotipagem por antisoros IgG Paralelamente os
44
anticorpos eluiacutedos tambeacutem puderam ser estudados O mesmo natildeo ocorre com a cloroquina
que permite apenas a fenotipagem e tampouco com os kits de eluiccedilatildeo aacutecida disponiacuteveis no
mercado nacional que satildeo destinados a realizaccedilatildeo do eluato mas destroem as hemaacutecias
O tempo de tratamento na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA tambeacutem eacute uma vantagem
pois foi possiacutevel reproduzir no tempo determinado de 2 minutos enquanto a cloroquina
demora ateacute duas horas
Ainda que a aplicaccedilatildeo das teacutecnicas por biologia molecular estejam cada vez mais
presentes na rotina imuno-hematoloacutegica e possibilitam estabelecer o fenoacutetipo deduzido do
genoacutetipo elas natildeo estatildeo disponiacuteveis na maioria dos centros e sua realizaccedilatildeo exige algumas
horas A resoluccedilatildeo imediata do problema transfusional necessita dos resultados soroloacutegicos
pois com frequecircncia natildeo eacute possiacutevel aguardar o resultado do teste molecular Dessa forma
apesar da crescente importacircncia da genotipagem eritrocitaacuteria teacutecnicas soroloacutegicas aplicadas
corretamente e no momento propiacutecio satildeo de grande utilidade para resolver problemas imuno-
hematoloacutegicos como ocorre com a fenotipagem em pacientes com TDA positivo
45
7 CONCLUSAtildeO
A teacutecnica da glicina aacutecidaEDTA mostrou-se efetiva em remover os anticorpos que
sensibilizavam as hemaacutecias e pode ser utilizada com seguranccedila antes da fenotipagem
eritrocitaacuteria Por ser uma teacutecnica de raacutepida execuccedilatildeo eacute uma alternativa aplicaacutevel
principalmente em casos urgentes de pacientes que apresentam autoanticorpos
46
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50
9 ANEXOS
51
FUNDACcedilAtildeO HEMOCENTRO DE RIBEIRAtildeO PRETO
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE)
Tiacutetulo da pesquisa Aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina aacutecida-EDTA e avaliaccedilatildeo da
eficaacutecia no tratamento de hemaacutecias com teste direto da antiglobulina positivo
Pesquisadora responsaacutevel Ceacutelia Kazue Abiko
Orientador Prof Dimas Tadeu Covas
Co-orientadora Dra Flaacutevia Leite Souza Santos
Objetivo da pesquisa Vocecirc estaacute sendo convidado a participar de uma pesquisa que tem
como objetivo padronizar uma nova teacutecnica para auxiliar na tipagem sanguiacutenea de pacientes
A tipagem sanguiacutenea pode sofrer interferecircncia da presenccedila de anticorpos ligados aos gloacutebulos
vermelhos do sangue Nessas situaccedilotildees eacute difiacutecil selecionar o melhor sangue para o paciente e
eacute preciso a utilizaccedilatildeo de teacutecnicas adicionais para remover essas interferecircncias
Esta pesquisa tem como objetivo estudar outra teacutecnica para remover esses anticorpos e
comparaacute-la com a teacutecnica atualmente utilizada Para isso precisamos de amostras de pacientes
e doadores voluntaacuterios
Se vocecirc eacute um doador eacute necessaacuterio que vocecirc autorize a coleta de 5 ml (1 tubo) a mais
de seu sangue
Se vocecirc eacute um paciente natildeo haveraacute necessidade de nova amostra pois utilizaremos as
amostras jaacute coletadas para os testes preacute-transfusionais e os resultados encontrados nesta
pesquisa natildeo iratildeo interferir na escolha da (s) bolsa (s) de sangue que vocecirc possa vir a receber
Se vocecirc concordar em participar leia com atenccedilatildeo o texto abaixo e assine as duas vias
rubricando todas as paacuteginas deste termo de consentimento Uma via original assinada e
rubricada por vocecirc e pela pesquisadora ficaraacute com vocecirc
As suas informaccedilotildees seratildeo mantidas em sigilo pela pesquisadora e natildeo haveraacute
armazenamento de material para pesquisas posteriores Os seus dados seratildeo usados apenas
neste estudo e quando o trabalho for publicado seu nome e qualquer outra informaccedilatildeo que
possam identificaacute-lo natildeo seratildeo revelados
Eacute pouco provaacutevel que o que noacutes aprendermos com este estudo tenha um benefiacutecio
direto para vocecirc assim como natildeo poderemos dar nada em troca pela sua participaccedilatildeo na
pesquisa
Nosso objetivo com esta pesquisa eacute que os resultados poderatildeo ser uacuteteis para o
tratamento de pacientes no futuro Os riscos da participaccedilatildeo satildeo miacutenimos Se vocecirc eacute um
doador de sangue a amostra seraacute coletada no momento da doaccedilatildeo natildeo exigindo punccedilatildeo
venosa adicional
52
Eacute seu direito ter acesso aos resultados dos testes da pesquisa Esses resultados natildeo
seratildeo fornecidos automaticamente a vocecirc mas caso vocecirc se interesse em saber o resultado ou
tiver alguma duacutevida sobre a sua participaccedilatildeo neste estudo deveraacute entrar em contato com Ceacutelia
Kazue Abiko pelo telefone (18) 99718-3551
Vocecirc tem total liberdade de optar por natildeo participar da pesquisa Caso aceite
participar poderaacute desistir a qualquer momento ou retirar seu consentimento mesmo apoacutes ter
coletado o sangue Para cancelar sua participaccedilatildeo basta avisar a pesquisadora e os seus dados
seratildeo retirados do projeto
Qualquer duacutevida eacutetica sobre a pesquisa poderaacute entrar em contato com o Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa do Hospital das Cliacutenicas e da Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto
(CAMPUS UNIVERSITAacuteRIO bairro Monte Alegre CEP 14048-900 Ribeiratildeo Preto-SP
Telefone (16) 3602-2228 FAX (16) 3633-1144 e-mail cephcrpuspbr)
Consentimento de participaccedilatildeo
A Consentimento do participante
Li as informaccedilotildees acima sobre o estudo e recebi explicaccedilotildees sobre a participaccedilatildeo no estudo
Portanto dou o meu consentimento para participar do estudo
___________________________________________________________________________
Nome completo
___________________________________________________________________________
Assinatura
___________
Data
__________________________________________________________________________________
Nome completo da pesquisadora
___________________________________________________________________________
Assinatura
_____________
Data
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Resultado geral do tratamento das hemaacutecias com glicina e
cloroquinapaacutegina 32
Tabela 2 - Resultados do TDA apoacutes tratamento da hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo
sensibilizadopaacutegina 33
Tabela 3 - Resultado apoacutes o segundo tratamento das hemaacutecias com glicina-
aacutecidaEDTApaacutegina 33
Tabela 4 - Resultado do Eluato das amostras tratadas com glicina-
aacutecidaEDTA paacutegina 34
Tabela 5 ndash Verificaccedilatildeo da interferecircncia do tratamento da hemaacutecias com cloroquina e glicina-
aacutecidaEDTA nos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e spaacutegina 35
Tabela 6 - Resultado da sensibilizaccedilatildeo das amostras efetividade do tratamento com
cloroquina glicina e o eluato poacutes tratamento com glicinapaacutegina 37
LISTA DE GRAFICOS
Graacutefico 1 - Nuacutemero de amostras sensibilizadas por especificidade de
anticorpopaacutegina 31
Graacutefico 2 - Teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla entre as teacutecnicas
aplicadaspaacutegina 41
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 - Preparo dos Reagentes da glicina-aacutecidaEDTApaacutegina 25
Quadro 2 - Preparo da Cloroquinapaacutegina 26
Quadro 3 - Resultados comparativos entre as teacutecnicas utilizadas paacutegina 40
LISTA DE FLUXOGRAMAS
Fluxograma 1 - Fluxograma da pesquisa utilizando as amostras de
doadorespaacutegina 22
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ABO
AHAI
Bg
c
C
C
C3
C3b
C3d
D
DHFRN
DNA
DTT
E
e
EDTA
Fc
Fya
Fyb
HCl
IgA
IgD
IgE
IgM
Mm
NaCl
PA
PAI
PBS
PCR
PEG
pH
Rh
rpm
S
s
SIDA
SBS
TCLE
TDA
TIA
TRIS
ZZAP
microL
Sistema Sanguiacuteneo ABO
Anemia Hemoliacutetica Autoimune
Antiacutegeno Bg
Antiacutegeno c
Celsius
Antiacutegeno C
Complemento
Fraccedilatildeo do complemento
Fraccedilatildeo do complemento
Antiacutegeno D
Doenccedila Hemoliacutetica do Feto e do Receacutem-nascido
Aacutecido desoxirribonucleico
Dithiothreitol
Antiacutegeno E
Antiacutegeno e
Aacutecido Etileno Diamino Tetraceacutetico
Porccedilatildeo do anticorpo
Antiacutegeno Duffy a
Antiacutegeno Duffy b
Aacutecido cloriacutedrico
Imunoglobulina A
Imunoglobulina D
Imunoglobulina E
Imunoglobulina M
Miliacutemetros
Cloreto de soacutedio
Puro para anaacutelise
Pesquisa de anticorpos irregulares
Tampatildeo fosfato salino
Reaccedilao em cadeia de polimerase
Polietilenoglicol
Potencial hidrogeniocircnico
Sistema sanguiacuteneo Rh
Rotaccedilotildees por minuto
Antiacutegeno S
Antiacutegeno s
Siacutendrome da Imunodeficiecircncia adquirida
Sistema de banco de sangue
Termo de consentimento livre e esclarecido
Teste direto da antiglobulina
Teste indireto da antiglobulina
Hidrometil aminometano
Sulphydryl-Proteolytic Enzyme
Microlitros
RESUMO
Os testes preacute-transfusionais satildeo o conjunto de teacutecnicas imuno-hematoloacutegicas aplicadas nas
amostras do receptor e do doador com a finalidade de fornecer uma unidade de hemaacutecias
compatiacutevel e segura para a transfusatildeo Aleacutem da fenotipagem ABO e Rh obrigatoacuteria nos testes
preacute-transfusionais a determinaccedilatildeo do perfil antigecircnico de outros antiacutegenos eritrocitaacuterios de
importacircncia cliacutenica melhora a seguranccedila transfusional especialmente para pacientes
previamente aloimunizados ou candidatos agrave transfusatildeo crocircnica Para tais pacientes conhecer o
fenoacutetipo eritrocitaacuterio permite a seleccedilatildeo de concentrados de hemaacutecias com o mesmo fenoacutetipo
o que previne reaccedilotildees transfusionais hemoliacuteticas assim como nova aloimunizaccedilatildeo
Indiviacuteduos que apresentam as hemaacutecias sensibilizadas ldquoin vivordquo por anticorpos anti-
eritrocitaacuterios como ocorre na anemia hemoliacutetica autoimune (AHAI) teratildeo o teste direto da
antiglobulina (TDA) positivo dificultando a realizaccedilatildeo da fenotipagem O TDA positivo
provoca resultados falsos positivos especialmente quando satildeo utilizados para a fenotipagem
soros comerciais da classe IgG que exigem a fase de antiglobulina humana ou teste indireto
da antiglobulina (TIA) para leitura Em 1982 Edwards Moulds e Judd propuseram a
utilizaccedilatildeo da teacutecnica da cloroquina para dissociar os complexos de antiacutegeno-anticorpo
preservando a membrana eritrocitaacuteria e permitindo a fenotipagem Atualmente eacute a teacutecnica
mais utilizada nos centros brasileiros A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA foi primeiramente
descrita por Louie Jieng e Zeroulis em 1986 poreacutem eacute pouco utilizada por natildeo haver os
reagentes prontos comercialmente no mercado brasileiro O presente estudo avaliou a teacutecnica
da glicina-aacutecida-EDTA com reagentes preparados ldquoin houserdquo em paralelo agrave teacutecnica da
cloroquina que eacute atualmente a teacutecnica aplicada no Hemocentro de Ribeiratildeo Preto Para isso
amostras de hemaacutecias de doadores (n=50) com fenoacutetipo conhecido foram sensibilizadas com
anticorpos humanos de especificidade conhecida e ambas as teacutecnicas foram aplicadas Foi
verificado ainda o efeito da teacutecnica sobre a expressatildeo dos antiacutegenos eritrocitaacuterios (Fya Fy
b
Jka Jk
b S e s) atraveacutes da fenotipagem das amostras que tiveram o TDA negativado A
viabiliadade dos anticorpos presentes no eluato recuperado apoacutes tratamento com a glicina-
aacutecidaEDTA tambeacutem foi testada A glicina-aacutecidaEDTA foi efetiva em negativar o TDA em
33 amostras (66) comparaacutevel com a cloroquina que negativou 28 amostras (56) O eluato
apresentou-se viaacutevel no tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA e natildeo foi constatada destruiccedilatildeo
dos antiacutegenos eritrocitaacuterios apoacutes o tratamento Concluiacutemos que a teacutecnica da glicina-
aacutecidaEDTA pode ser utilizada como uma opccedilatildeo no tratamento de hemaacutecias com TDA
positivo com a vantagem de seu tempo de execuccedilatildeo ser inferior ao da cloroquina (2minutos x
30 a 120 minutos) o que lhe torna uacutetil em situaccedilotildees de maior urgecircncia Quando ambas as
teacutecnicas satildeo utilizadas em hemaacutecias diferentes de uma mesma amostra a efetividade estaacute
significativamente aumentada (plt005)
Palavras chave Glicina-aacutecidaEDTA Teste direto da antiglobulina AHAI fenotipagem
ABSTRACT
The pre-transfusion tests are the group of immunohematology techniques applied in the
receptor and donor samples in order to provide a unit of red blood cells compatible and safe
for transfusion In addition to the obligatory ABO and Rh phenotyping in the pre-transfusion
tests the determination of the antigenic profile of other red cells antigens of clinical
importance improves transfusion safety especially for patients previously alloimmunized or
candidates for chronic transfusion For such patients knowing the phenotype allows the
selection of red blood cell concentrates with the same phenotype which prevents hemolytic
transfusion reactions as well as new alloimmunization Individuals who have antibody-coated
red blood cells sensitized in vivo such as in autoimmune hemolytic anemia (AHAI) will
have a direct antiglobulin test (DAT) positive making it difficult to perform phenotyping
Positive DAT causes false positive results especially when commercially available IgG
serums which require the human antiglobulin phase or indirect antiglobulin test (IAT) for
reading are used for phenotyping In 1982 Edwards Molds and Judd proposed the use of the
chloroquine technique to dissociate antigen-antibody complexes by preserving the erythrocyte
membrane and allowing phenotyping It is currently the most used technique in Brazilian
centers The EDTAglycine-acid technique was first described by Louie Jieng and Zeroulis in
1986 but it is little used because commercially available reagents are not available in the
Brazilian market The present study evaluated the EDTAglycine-acid technique with reagents
prepared in house in parallel to the chloroquine technique which is currently the technique
applied at the Hemocentro de Ribeiratildeo Preto For this donor red cells samples (n = 50) with
known phenotype were sensitized with human antibodies of known specificity and both
techniques were applied The effect of the technique on the expression of erythrocyte antigens
(Fya Fy
b Jk
a Jk
b S and s) was also verified by the phenotyping of the samples that had
negative DAT The viability of the antibodies present in the recovered eluate after treatment
with EDTAglycine-acid A was also tested EDTAglycine-acid was effective in negatively
affecting DAT in 33 samples (66) comparable to chloroquine that negatived 28 samples
(56) The eluate was viable in treatment with EDTAglycine-acid and no destruction of
erythrocyte antigens after treatment We conclude that the EDTA glycine-acid technique can
be used as an option in the treatment of red cells with TDA positive with the advantage that
its execution time is inferior to that of chloroquine (2 minutes x 30 to 120 minutes) which
makes it useful in emergency situations When both techniques are used in different
erythrocytes of the same sample the effectiveness is significantly increased (p lt005)
Key words EDTAglycine-acid direct antiglobulin test AIHA phenotyping
1 INTRODUCcedilAtildeO
A transfusatildeo de hemaacutecias eacute um recurso terapecircutico muito importante e eficaz e tem se
mostrado como um grande aliado no tratamento de diversas patologias auxiliando na
melhoria da sobrevida e qualidade de vida de diversos pacientes quando indicada de forma
correta Eacute provavelmente a modalidade de terapia mais utilizada no mundo sendo
considerada a forma mais antiga de terapia celular A transfusatildeo de hemaacutecias em pacientes
com anemia grave ou sangramento agudo reestabelece o niacutevel de hemoglobina moleacutecula
responsaacutevel pelo transporte de oxigecircnio para os tecidos melhorando a isquemia tecidual
(BARJAS-CASTRO 2013 ZAGO 2014)
A transfusatildeo de componentes celulares como o concentrado de hemaacutecias deve ser
bem avaliada quanto aos riscos e benefiacutecios Os testes preacute-transfusionais satildeo parte obrigatoacuteria
do processo transfusional e tecircm como funccedilatildeo assegurar que o melhor hemocomponente seja
selecionado para o paciente reduzindo assim a chance de transfusotildees incompatiacuteveis e reaccedilotildees
transfusionais (BARJAS-CASTRO 2013)
11TESTES PREacute-TRANSFUSIONAIS
Os testes preacute-transfusionais tecircm a finalidade de evitar a ocorrecircncia de reaccedilotildees
hemoliacuteticas no receptor decorrentes da transfusatildeo de hemaacutecias incompatiacuteveis do doador
(DOWNES e SHULMAN 2011) Tem como propoacutesito selecionar hemaacutecias que apoacutes
transfusatildeo deveratildeo ter sobrevida normal ou mais proacutexima do normal (MELO 2007)
Os testes preacute-transfusionais que consistem no conjunto de teacutecnicas
imunohematoloacutegicas aplicadas agraves amostras do receptor e doador devem ser realizados antes
de toda transfusatildeo A aplicaccedilatildeo desses testes tem como finalidade fornecer uma unidade de
hemaacutecias compatiacutevel e elevar a seguranccedila da transfusatildeo Os testes preacute-transfusionais aliados
a utilizaccedilatildeo de novas tecnologias tem historicamente evitado reaccedilotildees transfusionais
hemoliacuteticas garantindo a seguranccedila transfusional em cerca de 95 dos pacientes que recebem
transfusatildeo Eacute imprescindiacutevel poreacutem a execuccedilatildeo correta das teacutecnicas envolvidas nos testes preacute-
transfusionais e ainda garantir a identificaccedilatildeo correta do receptor e das amostras de sangue e
das unidades de hemaacutecias (CASTILHO 2000 MELO 2007 BARJAS-CASTRO 2013)
2
Todos os testes que compotildeem a rotina preacute-transfusional usam meacutetodos soroloacutegicos
que envolvem a reaccedilatildeo antiacutegeno x anticorpo Ao testar a presenccedila de um antiacutegeno na
superfiacutecie da hemaacutecia eacute necessaacuterio dispor de um soro com especificidade conhecida para
aquele antiacutegeno Por outro lado testar a presenccedila de um determinado anticorpo no soro ou no
plasma exige o uso de hemaacutecias com perfil antigecircnico conhecido Os testes preacute-transfusionais
incluem tipagem ABO (direta e reversa) tipagem Rh pesquisa de anticorpos irregulares no
sangue do receptor retipagem ABO e Rh do hemocomponente e prova de compatibilidade
entre as hemaacutecias do doador e soro ou plasma do receptor em caso de transfusatildeo de hemaacutecias
ou hemocomponentes que contenham mais de 2 mL de volume eritrocitaacuterio como o
concentrado de granuloacutecitos (BRASIL 2016 GANZELLA 2014 SANTOS 2014)
Aleacutem dos testes regularmente realizados a determinaccedilatildeo do fenoacutetipo para outros
antiacutegenos eritrocitaacuterios do doador e do receptor pode ser indicada A fenotipagem eritrocitaacuteria
determina o perfil antigecircnico para outros antiacutegenos de importacircncia cliacutenica aleacutem do sistema
ABO e do antiacutegeno RhD Ela pode auxiliar a confirmaccedilatildeo de uma especificidade de anticorpo
encontrada no soro do paciente uma vez que espera-se que a sua hemaacutecia natildeo expresse o
antiacutegeno correspondente e simultaneamente eacute utilizada para selecionar um concentrado de
hemaacutecias negativo para o respectivo antiacutegeno evitando reaccedilotildees hemoliacuteticas transfusionais A
fenotipagem de candidatos a transfusotildees crocircnicas tambeacutem eacute recomendada pois esse grupo de
pacientes deve se beneficiar com a transfusatildeo profilaacutetica de unidades de hemaacutecias com
mesmo fenoacutetipo evitando assim a aloimunizaccedilatildeo assim como reaccedilotildees hemoliacuteticas provocadas
por anticorpos previamente existentes e em baixo tiacutetulo natildeo identificados pela triagem de
anticorpos (CASTILHO JUNIOR e REID 2015 DOWNES e SHULMAN 2011)
111 TIPAGEM ABORh
O sistema ABO (ISBT001) foi o primeiro sistema de grupo sanguiacuteneo a ser
descoberto Ele foi descrito em 1900 por Karl Landsteiner e eacute considerado o sistema de maior
importacircncia na praacutetica transfusional Ele eacute composto por quatro antiacutegenos A1 (ABO1) B
(ABO2) AB (ABO3) e A1 (ABO4) e eacute caracterizado pela presenccedila dos anticorpos naturais
ou seja anticorpos que surgem sem a exposiccedilatildeo preacutevia aos antiacutegenos atraveacutes de transfusatildeo ou
gestaccedilatildeo Os anticorpos ABO satildeo predominantemente da classe IgM satildeo capazes de fixar o
complemento e de provocar hemoacutelise grave intravascular caso ocorra transfusatildeo ABO
incompatiacutevel Por apresentar essa caracteriacutestica peculiar a tipagem do sistema ABO eacute
composta de duas etapas a prova direta e a prova reversa Na prova direta eacute realizada a
pesquisa dos antiacutegenos na superfiacutecie das hemaacutecias que satildeo testadas com soros comerciais
3
Anti-A e Anti-B A prova reversa por sua vez pesquisa a presenccedila de anticorpos ABO ao
testar o soro ou plasma do pacientedoador com hemaacutecias A1 e B Ambas as provas satildeo
obrigatoacuterias e devem ser concordantes para interpretaccedilatildeo do fenoacutetipo ABO (COOLING
2011 SANTOS 2014)
O sistema Rh (ISBT004) eacute o maior e mais complexo sistema de grupos sanguiacuteneos
compreendendo atualmente 54 antiacutegenos (ISBT 2016) Satildeo cinco os principais antiacutegenos do
sistema Rh D (RH1) C (RH2) E (RH3) c (RH4) e e (RH5) Esses antiacutegenos possuem alta
capacidade imunogecircnica e seus respectivos anticorpos estatildeo envolvidos na doenccedila hemoliacutetica
perinatal e em reaccedilotildees transfusionais hemoliacuteticas Os autoanticorpos quentes como ocorre na
anemia hemoliacutetica quente satildeo representados em grande parte por anticorpos contra antiacutegenos
puacuteblicos do sistema Rh (CASTILHO 2007 CHOU e WESTHOFF 2011 BARJAS-
CASTRO 2013) A tipagem RhD pesquisa o antiacutegeno D na membrana eritrocitaacuteria ao testar a
hemaacutecia com antissoros comerciais Atualmente a maior parte dos soros Anti-D
comercializados satildeo monoclonais
112 ANTICORPOS ANTI-ERITROCITAacuteRIOS
Anticorpos satildeo proteiacutenas presentes no plasma tambeacutem denominadas imunoglobulinas
Satildeo produzidas pelo sistema imune em resposta a um determinado antiacutegeno Podem ser
classificadas de acordo com suas caracteriacutesticas e propriedades em cinco classes de
imunoglobulinas IgG IgM IgA IgE e IgD (BARJAS-CASTRO 2013)
A ligaccedilatildeo entre o antiacutegeno e o anticorpo envolvem ligaccedilotildees natildeo covalentes que satildeo
reversiacuteveis Vaacuterios tipos de interaccedilotildees natildeo covalentes podem contribuir para a ligaccedilatildeo do
antiacutegeno pelo anticorpo incluindo forccedilas eletrostaacuteticas pontes de hidrogecircnio forccedilas de Van
der Walls e interaccedilotildees hidrofoacutebicas (ABBAS LICHTMAN e PILLAI 2008)
As interaccedilotildees antiacutegeno-anticorpo satildeo constituiacutedas por ligaccedilotildees dinacircmicas que sofrem
interferecircncia de alteraccedilotildees fiacutesico-quiacutemicas no meio como mudanccedilas na temperatura na forccedila
eletrostaacutetica na concentraccedilatildeo do antiacutegeno e do anticorpo e no pH O melhor pH para a reaccedilatildeo
eacute em torno de 70 no entanto raros anticorpos podem exigir acidificaccedilatildeo do meio para serem
identificados (SANTOS 2014)
Em imunohematologia satildeo pesquisados os anticorpos que reconhecem os antiacutegenos
eritrocitaacuterios de grupo sanguiacuteneo ldquoin vivordquo esses anticorpos dependendo de seu significado
cliacutenico satildeo capazes de reconhecer seus respectivos antiacutegenos sobre a hemaacutecia podendo levar
a sua destruiccedilatildeo por dois mecanismos fagocitose por macroacutefagos no sistema
4
reticuloendotelial ou por ativaccedilatildeo do sistema complemento com a formaccedilatildeo do complexo de
ataque a membrana e hemoacutelise intravascular As duas classes de anticorpos de maior
importacircncia em imunohematologia satildeo as imunoglobulinas IgG e a IgM (SANTOS 2014)
Devido a sua estrutura pentameacuterica os anticorpos da classe IgM se ligam aos
antiacutegenos localizados na superfiacutecie da membrana de hemaacutecias proacuteximas e promovem
aglutinaccedilatildeo das mesmas em meio salino ldquoin vitrordquo Anticorpos da classe IgG por sua vez
satildeo denominados ldquonatildeo aglutinantesrdquo ou ldquoincompletosrdquo pois sua estrutura de monocircmero eacute
pequena o que desfavorece a aglutinaccedilatildeo direta uma vez que uma mesma moleacutecula de IgG
natildeo alcanccedila antiacutegenos alvos em duas hemaacutecias proacuteximas Os anticorpos IgM aleacutem de terem
um tamanho maior apresentam 750 vezes maior eficiecircncia de aglutinaccedilatildeo que os anticorpos
IgG permitindo maior facilidade nas ligaccedilotildees entre as hemaacutecias (CARRUCIO e WISE 2012
GREEN e KLOSTERMANN 2012)
Nos testes ldquoin vitrordquo satildeo simulados reaccedilotildees que poderiam ocorrer ldquoin vivordquo causando
reaccedilotildees indesejaacuteveis A fase de sensibilizaccedilatildeo em que o anticorpo se liga ao antiacutegeno
correspondente natildeo eacute identificada macroscopicamente poreacutem uma vez que o anticorpo
aproxima as hemaacutecias e vence a forccedila eletrostaacutetica que naturalmente as repele chamada de
potencial zeta ocorre a aglutinaccedilatildeo Dependendo das caracteriacutesticas do anticorpo e de sua
capacidade de fixar complemento pode ocorrer tambeacutem a hemoacutelise (SANTOS 2014)
113 PESQUISA E IDENTIFICACcedilAtildeO DE ANTICORPOS IRREGULARES
A pesquisa de anticorpos irregulares eacute teste obrigatoacuterio nos testes preacute-transfusionais e
tem a finalidade de detectar anticorpos ldquoin vitrordquo que possam causar reaccedilatildeo ldquoin vivordquo
Dependendo da populaccedilatildeo estudada (pacientes x doadores) e ainda da sensibilidade do
teste a frequecircncia de anticorpos irregulares pode variar de 03 a 38 A imunizaccedilatildeo pode
ocorrer por transfusatildeo gestaccedilatildeo transplante ou injeccedilatildeo de material imunogecircnico (WALKER
2011)
Os anticorpos irregulares podem ser classificados como aloanticorpos que satildeo
voltados contra antiacutegenos ausentes na hemaacutecia autoacuteloga ou como autoanticorpos os quais
reconhecem antiacutegenos eritrocitaacuterios proacuteprios Os autoanticorpos antieritrocitaacuterios surgem em
decorrecircncia da desregulaccedilatildeo da autotoleracircncia imune relacionada agrave condiccedilotildees diversas como
doenccedilas hematoloacutegicas doenccedilas inflamatoacuterias autoimunes neoplasias infecccedilotildees e uso de
medicaccedilotildees A presenccedila do autoanticorpo associado a um quadro de anemia hemoliacutetica
caracteriza a anemia hemoliacutetica autoimune (AHAI) seja ela primaacuteria ou secundaacuteria agrave outra
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patologia Ateacute 12 a 40 dos pacientes com autoanticorpos quentes podem apresentar
aloanticorpos de significado cliacutenico mascarados pelos autoanticorpos (SHIREY et al 2002)
Eacute importante detectar a presenccedila de anticorpos no plasmasoro de um receptor de
transfusatildeo para garantir que seja transfundido sangue compatiacutevel Quando a pesquisa de
anticorpo irregular resultar positiva para um ou mais anticorpos de relevacircncia clinica eacute
necessaacuterio confirmar a ausecircncia do respectivo antiacutegeno na hemaacutecia do receptor assim como
selecionar para transfusatildeo concentrados de hemaacutecias tambeacutem negativos para aqueles
antiacutegenos evitando assim reaccedilotildees transfusionais (WALKER 2011)
A detecccedilatildeo de um anticorpo irregular eacute inicialmente realizada pela triagem de
anticorpos na qual o soroplasma do receptor eacute testado com 2 a 3 hemaacutecias do tipo ldquoOrdquo O
conjunto de fenoacutetipos dessas hemaacutecias deve contemplar os antiacutegenos de maior importacircncia
cliacutenica Como os anticorpos irregulares de maior interesse cliacutenico satildeo na maior parte das
vezes imunes portanto da classe IgG eacute obrigatoacuteria a fase de antiglobulina (AGH) do teste
ou teste indireto da antiglobulina (TIA) uma vez que esses anticorpos satildeo incompletos
(CASTILHO JUNIOR e REID 2015) O teste de triagem estando positivo deve-se fazer a
identificaccedilatildeo da especificidade do anticorpo utilizando um painel com maior nuacutemero de
hemaacutecias fenotipadas
114 PROVA DE COMPATIBILIDADE
A prova de compatibilidade eacute um teste obrigatoacuterio em caso de transfusatildeo de
componentes eritrocitaacuterios Tambeacutem chamada de prova de compatibilidade maior deve ser
realizada antes da administraccedilatildeo de sangue total ou concentrado de hemaacutecias utilizando-se
hemaacutecias obtidas do tubo coletor da bolsa a ser transfundida e o soro ou plasma do receptor
(BRASIL 2016)
Eacute definido como o procedimento para excluir a incompatibilidade entre o doador e o
receptor Tem o objetivo de detectar anticorpos que podem natildeo ter sido encontrados na
pesquisa de anticorpos devido a ausecircncia ou pouca expressatildeo de antiacutegenos no painel de
hemaacutecias aleacutem da possibilidade de terem ocorrido erros teacutecnicos ou notacionais durante a
realizaccedilatildeo da pesquisa (MELO 2007)
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115 FENOTIPAGEM PARA OUTROS SISTEMAS
Aleacutem da pesquisa de ABORh que eacute realizado rotineiramente a fenotipagem para
outros sistemas tambeacutem denominado ldquofenotipagem estendidardquo determina a presenccedila ou
ausecircncia de antiacutegenos considerados de importacircncia cliacutenica A fenotipagem natildeo eacute obrigatoacuteria
nos testes preacute-transfusionais poreacutem a legislaccedilatildeo atual recomenda a realizaccedilatildeo da fenotipagem
eritrocitaacuteria dos antiacutegenos C (RH2) E (RH3) c (RH4) e (RH5) K (KELL1) Fya (FY1) Fy
b
(FY2) Jka
(JK1) Jkb (JK2) S (MNS3) e s (MNS4) para pacientes aloimunizados e pacientes
com indicaccedilatildeo de transfusatildeo crocircnica (BRASIL 2016)
A seleccedilatildeo de concentrados de hemaacutecias com o mesmo fenoacutetipo do receptor para
transfusatildeo pode evitar reaccedilotildees transfusionais hemoliacuteticas no paciente previamente
aloimunizado tambeacutem previne a sensibilizaccedilatildeo por outros antiacutegenos o que normalmente
torna as transfusotildees seguintes ainda mais complicadas A fenotipagem do paciente tambeacutem
auxilia na identificaccedilatildeo dos anticorpos pois espera-se que nas hemaacutecias do paciente o
antiacutegeno seja negativo para o anticorpo encontrado servindo de guia para teste de exclusatildeo de
anticorpos (SANTOS 2014 WALKER 2011)
A incidecircncia de aloanticorpos aumenta com o nuacutemero de transfusotildees no entanto a
implantaccedilatildeo de rotina de fenotipagem com transfusatildeo profilaacutetica de hemaacutecias com fenoacutetipo
compatiacutevel para pacientes candidatos agrave politransfusatildeo como os portadores de doenccedila
falciforme talassemia anemia aplaacutestica doenccedilas linfo e mieloproliferativas renais crocircnicos e
anemias refrataacuterias pode contribuir para o baixo iacutendice de sensibilizaccedilatildeo nessas populaccedilotildees
(FLUIT KUNST e DRENTHE-SCHONK 1999 MARTINS et al 2008 e VICHINSKY et
al 2001) Outro grupo de pacientes que se beneficia com a transfusatildeo de mesmo fenoacutetipo satildeo
os pacientes com AHAI uma vez que o autoanticorpo pode mascarar a presenccedila de um
aloanticorpo de significado cliacutenico em ateacute 40 dos casos Mesmo com as teacutecnicas utilizadas
ldquoin vitrordquo para remover a interferecircncia do autoanticorpo no soro um aloanticorpo pode natildeo
ser identificado e dessa forma transfundir o mesmo fenoacutetipo do paciente evitaria reaccedilatildeo
hemoliacutetica pelos anticorpos voltados contra antiacutegenos de maior importacircncia cliacutenica e de
frequecircncia intermediaacuteria Aleacutem disso os pacientes com AHAI satildeo fortes respondedores e a
transfusatildeo profilaacutetica do mesmo fenoacutetipo previne a aloimunizaccedilatildeo (SHIREY et al 2002)
Aleacutem de fenotipar o receptor eacute importante tambeacutem que os bancos de sangue tenham
rotinas de fenotipagem de doadores para atender as necessidade dos pacientes aloimunizados
ou em esquema de transfusatildeo crocircnica (PINTO BRAGA e SANTOS 2011)
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Rotineiramente eacute inviaacutevel estabelecer o fenoacutetipo eritrocitaacuterio completo de um
indiviacuteduo pela grande diversidade de sistemas sanguiacuteneos descritos Ate junho de 2015 jaacute
haviam sido classificados 308 antiacutegenos atribuiacutedos a 36 sistemas definidos pela Sociedade
Internacional de Transfusatildeo de Sangue (ISBT) (CASTILHO JUNIOR e REID 2015)
Portanto o paciente eacute normalmente fenotipado para os antiacutegenos de maior importacircncia
clinica
Alguns fatores podem limitar a realizaccedilatildeo da fenotipagem eritrocitaacuteria Um dos fatores
eacute a transfusatildeo alogecircnica realizada haacute menos de 90 dias Neste caso podem ocorrer resultados
falso positivos para determinados antiacutegenos devido agrave presenccedila de hemaacutecias do doador
(LAINE et al 2000)
Outro fator eacute a presenccedila de anticorpo sensibilizando a hemaacutecia do paciente e
provocando positividade do teste direto da antiglobulina humana (TDA) Os soros
normalmente utilizados para fenotipagem especialmente para os antiacutegenos Fya
(FY1) Fyb
(FY2) Jka
(JK1) Jkb
(JK2) S (MNS3) e s (MNS4) necessitam da fase de antiglobulina
humana (AGH) para que ocorra aglutinacatildeo Amostras que apresentam o TDA positivo
aglutinam apoacutes reaccedilatildeo com a AGH natildeo pela real presenccedila do antiacutegeno em sua superfiacutecie mas
pela interaccedilatildeo da AGH com o anticorpo que estaacute sensibilizando o eritroacutecito A interferecircncia
do TDA positivo pode ser anulada atraveacutes de algumas teacutecnicas capazes de dissociar o
anticorpo como por exemplo o tratamento da hemaacutecia sensibilizada com cloroquina ou com
glicina-aacutecida-EDTA (BRANCH e PETZ 1999 SHIREY et al 2002 e LEGER 2011)
12 METODOLOGIAS APLICADOS Agrave ROTINA IMUNO-HEMATOLOacuteGICA
Todos os testes que compotildeem a rotina preacute-transfusional usam meacutetodos soroloacutegicos
que envolvem a reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo e tem como objetivo determinar o perfil antigecircnico
eritrocitaacuterio do receptor e do doador assim como identificar em seu soro a presenccedila de
anticorpos contra antiacutegenos eritrocitaacuterios que possam comprometer a sobrevida das hemaacutecias
transfundidas Para testar o antiacutegeno na superfiacutecie da hemaacutecia eacute necessaacuterio dispor de um
antissoro com especificidade conhecida para aquele antiacutegeno Por outro lado para testar a
presenccedila de um determinado anticorpo no soro ou plasma do receptor eacute necessaacuterio o uso de
hemaacutecias com perfil antigecircnico conhecido (SANTOS 2014)
Diversas metodologias satildeo aplicadas nos laboratoacuterios de imunohematologia Cada
serviccedilo de hemoterapia faz a escolha do meacutetodo que seraacute aplicado de acordo com o perfil do
laboratoacuterio com o volume de exames diaacuterios e tambeacutem com o custo envolvido Todas essas
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teacutecnicas tecircm como objetivo comum demonstrar a reaccedilatildeo entre antiacutegeno e anticorpo no
entanto elas se baseiam em diferentes princiacutepios Muitas metodologias satildeo atualmente
aplicadas agrave imunohematologia entre elas o sistema de fase soacutelida a tecnologia de hemaacutecias
magnetizadas a biologia molecular e ateacute mesmo a citometria de fluxo no entanto os meacutetodos
mais tradicionais satildeo aqueles baseados no princiacutepio de hemaglutinaccedilatildeo
121 MEacuteTODOS DE FASE FLUacuteIDA
Os meacutetodos de fase fluiacuteda satildeo testes baseados na hemaglutinaccedilatildeo e incluem o teste em
tubo e o teste em microplacas Uma suspensatildeo de hemaacutecias eacute adicionada ao plasma ou soro
em seguida eacute realizada a centrifugaccedilatildeo e por fim eacute feita a leitura do resultado que eacute
considerado positivo se for observado algum grau de aglutinaccedilatildeo ou hemoacutelise A intensidade
de aglutinaccedilatildeo eacute graduada de acordo com o tamanho dos agregados desprendidos da
superfiacutecie apoacutes agitaccedilatildeo delicada do tubo ou microplaca Os meacutetodos de hemaglutinaccedilatildeo satildeo
aplicados a todos os testes preacute-transfusionais Como os anticorpos ABO satildeo aglutininas frias
a tipagem eacute realizada em temperatura ambiente (22degC) no entanto ao investigar a presenccedila
de anticorpos irregulares que como jaacute mencionado eacute na maioria das vezes anticorpos
incompletos da classe IgG eacute essencial que a reaccedilatildeo seja incubada a 37degC As reaccedilotildees satildeo
facilitadas com a utilizaccedilatildeo de potencializadores e da antiglobulina humana (WALKER e
HARMENING 2012 AABB 2011)
Nos meacutetodos de fase fluiacuteda nos quais a AGH eacute empregada a fase de lavagem eacute
fundamental Apoacutes a incubaccedilatildeo do soro com as hemaacutecias deve ser realizada a lavagem da
reaccedilatildeo para remover o excesso de anticorpos natildeo ligados agraves hemaacutecias jaacute que os anticorpos
livres podem bloquear a AGH quando ela eacute adicionada e levar a resultados falso negativos
(AABB 2011)
Os testes de hemaglutinaccedilatildeo satildeo os mais tradicionais entre os meacutetodos ainda hoje
aplicados agrave rotina de bancos de sangue A vantagem desses meacutetodos eacute o baixo custo quando
comparado agraves teacutecnicas mais modernas mas apresentam tambeacutem desvantagens A teacutecnica em
tubo por exemplo natildeo permite automaccedilatildeo eacute trabalhosa e exige matildeo-de-obra bastante treinada
na execuccedilatildeo das diversas etapas do teste e mesmo assim pode haver subjetividade na
interpretaccedilatildeo dos resultados aleacutem de resultados falso-negativos (DOWNES 2011 ZANTEK
et al 2012)
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122 COLUNAS DE GEL
A teacutecnica em gel iniciada na deacutecada de 90 representou uma grande revoluccedilatildeo na
rotina laboratorial tornando-se muito popular Aleacutem de ser sensiacutevel a teacutecnica dispensa a fase
de lavagem antes da adiccedilatildeo da AGH assim como a agitaccedilatildeo do teste para leitura reduzindo o
nuacutemero de resultados falsos negativos decorrentes dessas duas etapas e o tempo para
execuccedilatildeo dos testes (LAPIERRE et al 1989 NOVARETTI et al 2000 NOVARETTI et
al 2004) Os reagentes satildeo comercializados na forma de cartotildees plaacutesticos contendo
microtubos preenchidos por gel composto por microesferas de acrilamida-dextran Nesta
metodologia tambeacutem baseada na hemaglutinaccedilatildeo a suspensatildeo de hemaacutecias e o soro satildeo
depositados em uma cacircmara acima da coluna de gel e em seguida procede-se com a
centrifugaccedilatildeo dos cartotildees As microesferas atuam como uma malha que permite a passagem
em direccedilatildeo ao fundo do microtubo apenas das hemaacutecias natildeo aglutinadas enquanto as
hemaacutecias aglutinadas ficam retidas na parte superior da coluna ou ao longo dela (GREEN e
KLOSTERMANN 2012) Portanto quanto maior a agregaccedilatildeo mais hemaacutecias ficam retidas
no topo da coluna Dependendo do tipo de teste a ser realizado pode ser utilizado gel neutro
ou gel especiacutefico impregnado pelo anticorpo desejado e o gel contendo antiglobulina humana
que satildeo utilizados para os testes diretos e indiretos da antiglobulina (LAPIERRE et al 1989)
A coluna de gel ainda permite a visualizaccedilatildeo clara de duas populaccedilotildees distintas de hemaacutecias
como em pacientes receacutem transfundidos
123 BIOLOGIA MOLECULAR
A biologia molecular ou genotipagem estaacute sendo cada vez mais aplicada aos grupos
sanguiacuteneos pois fornece resultados seguros e precisos especialmente nos casos em que natildeo eacute
possiacutevel a realizaccedilatildeo da fenotipagem como em pacientes receacutem-transfundidos e pacientes
com TDA positivo Na genotipagem eacute possiacutevel determinar atraveacutes do DNA do paciente
extraiacutedo de seus leucoacutecitos de sangue perifeacuterico o fenoacutetipo eritrocitaacuterio deduzido sem
qualquer interferecircncia do anticorpo que sensibiliza a hemaacutecia ou de hemaacutecias alogecircnicas
transfundidas Sua realizaccedilatildeo no entanto exige o treinamento de equipe especializada e capaz
de interpretar os resultados em conjunto com os achados soroloacutegicos (JUNIOR e OLIVATO
2007)
Apesar de ser uma ferramenta de grande importacircncia hoje na imuno-hematologia
ainda estaacute restrito aos grandes centros de hemoterapia no Brasil poucos serviccedilos puacuteblicos de
sauacutede dispotildeem desse recurso e utilizam teacutecnicas de genotipagem de grupos sanguiacuteneos para
atendimento a seus pacientes Esta abordagem poreacutem vem sendo introduzida em algumas
10
instituiccedilotildees de reconhecida competecircncia na hemoterapia mas sua disponibilizaccedilatildeo deve
tornar-se mais generalizada atraveacutes da formaccedilatildeo de centros de referecircncia para atendimento
das diversas unidades de hemoterapia (MARTINS et al 2009) Dessa forma muitas decisotildees
transfusionais especialmente em urgecircncias ainda devem ser tomadas sem o resultado da
genotipagem eritrocitaacuteria
13 TESTE DA ANTIGLOBULINA
Coombs Mourant e Race descreveram em 1945 uma teacutecnica com utilizando soro de
coelho contendo antiglobulina humana (AGH) que posteriormente foi chamada de ldquosoro de
Coombsrdquo O meacutetodo foi desenvolvido inicialmente para ampliar o efeito de aglutininas fracas
do sistema Rh anticorpos ldquoincompletosrdquo que normalmente natildeo apresentavam aglutinaccedilatildeo
visiacutevel O teste foi concebido como um instrumento de investigaccedilatildeo de doenccedila hemoliacutetica do
receacutem-nascido e de reaccedilotildees transfusionais causadas por anticorpos Rh que estavam presentes
no soro dos paciente poreacutem que natildeo eram demonstraacuteveis pelas teacutecnicas ateacute entatildeo existentes
A maior parte dos anticorpos de significado cliacutenico assim como seus respectivos
antiacutegenos foram descritos apoacutes o surgimento do ldquosoro de Coombsrdquo em 1945 sendo assim o
teste da antiglobulina representa ateacute hoje a forma mais importante de aglutinaccedilatildeo artificial em
imunohematologia permitindo revelar a presenccedila de anticorpos na membrana da hemaacutecia A
antiglobulina humana eacute constituiacuteda por anticorpo especiacutefico contra a porccedilatildeo Fc de outro
anticorpo Quando um anticorpo ldquoincompletordquo sensibiliza a hemaacutecia normalmente natildeo
provoca aglutinaccedilatildeo visiacutevel Apoacutes a adiccedilatildeo da AGH ao meio esta reconhece e se liga agraves
porccedilotildees Fc dos anticorpos que sensibilizam a hemaacutecia formando assim uma malha e
provocando aglutinaccedilatildeo visiacutevel (BARJAS-CASTRO 2013)
Os reagentes de antiglobulina podem ser poliespeciacuteficos ou monoespeciacuteficos Os
poliespeciacuteficos satildeo uma mistura de anticorpos ant-IgG e anti-C3d (fraccedilatildeo C3d do
complemento) Os reagentes monoespecificos podem ser anti-IgG anti-IgM anti-IgA anti-
complemento podendo ser anti-C3d e anti-C3b
O teste da antiglobulina pode ser usado para detectar hemaacutecias sensibilizadas com
aloanticorpos IgG autoanticorpos IgG e componentes do complemento A sensibilizaccedilatildeo
pode ocorrer ldquoin vivordquo ou ldquoin vitrordquo O uso do AGH para detectar a sensibilizaccedilatildeo ldquoin vitrordquo
tem dois estaacutegios e eacute denominado teste indireto da antiglobulina A sensibilizaccedilatildeo ldquoin vivordquo eacute
detectada em procedimento de um uacutenico estagio chamado teste direto da antiglobulina (TDA)
11
Os testes direto e indireto satildeo ateacute hoje amplamente aplicados como princiacutepio de inuacutemeros
testes soroloacutegicos em imuno-hematologia (GREEN e KLOSTERMANN 2012)
131 TESTE DIRETO DA ANTIGLOBULINA
O teste direto da antiglobulina humana revela a presenccedila de anticorpo eou fraccedilatildeo do
complemento ligados agrave superfiacutecie das hemaacutecias As sensibilizaccedilatildeo das hemaacutecias ocorrida ldquoin
vivordquo natildeo eacute visualizada mas apoacutes a adiccedilatildeo da antiglobulina humana ocorre a aglutinaccedilatildeo que
eacute visualizada macroscopicamente (Figura 1)
Figura 1 - Princiacutepio da teacutecnica direta da antiglobulina Teste utilizado para demonstrar a sensibilizaccedilatildeo ldquoin
vivordquo das hemaacutecias O sangue total eacute coletado do paciente em tubo contendo anticoagulante EDTA Na teacutecnica
realizada em tubo uma suspensatildeo de hemaacutecias 5 em soluccedilatildeo de salina eacute preparada Uma gota dessa suspensatildeo
eacute lavada 3 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica para retirada de anticorpos que estatildeo livres no plasma Toda soluccedilatildeo eacute
retirada e adiciona-se o soro de Coombs (antiglobulina humana) O soro de Coombs reconhece os anticorpos que
estatildeo ligados agrave superfiacutecie das hemaacutecias fazendo com que ocorra aglutinaccedilatildeo visiacutevel macroscopicamente
Apesar de natildeo ser um teste preacute-transfusional obrigatoacuterio o TDA eacute um dos testes mais
importantes para investigar e classificar quadros hemoliacuteticos como de origem imune ou natildeo
imune O seu valor preditivo positivo em vigecircncia de anemia hemoliacutetica eacute de 83 poreacutem natildeo
havendo sinais de hemoacutelise seu valor preditivo eacute apenas 14 Eacute por esse motivo que a
interpretaccedilatildeo do TDA positivo deve levar em consideraccedilatildeo a histoacuteria cliacutenica e os resultados
dos outros exames laboratoriais A realizaccedilatildeo do TDA eacute obrigatoacuteria na investigaccedilatildeo
12
laboratorial de diversos quadros hemoliacuteticos entre eles a anemia hemoliacutetica autoimune
(AHAI) a reaccedilatildeo hemoliacutetica imune poacutes-transfusional a siacutendrome do linfoacutecito passageiro a
doenccedila hemoliacutetica perinatal e a hemoacutelise droga-dependente (LEGER 2011)
Resultados de TDA positivos foram tambeacutem observados em indiviacuteduos com niacuteveis
seacutericos elevados de IgG ou complemento sem evidecircncia de anemia hemoliacutetica imune como
em pacientes com doenccedila falciforme talassemia doenccedila renal crocircnica mieloma muacuteltiplo
doenccedilas autoimunes e siacutendrome da imunodeficiecircncia adquirida (SIDA) Aleacutem disso pequenas
quantidades de IgG (5 a 90 moleacuteculas por hemaacutecia) e complemento (5 a 40 moleacuteculas por
hemaacutecia) podem estar presentes nas hemaacutecias de indiviacuteduos saudaacuteveis sem associaccedilatildeo com
reduccedilatildeo na sobrevida das mesmas A positividade do TDA depende da populaccedilatildeo estudada e
pode variar de 01 entre doadores de sangue sem qualquer sinal cliacutenico de hemoacutelise ateacute
15 em pacientes hospitalizados (CASTILHO JUNIOR e REID 2015 LEGER 2011)
Indiviacuteduos que apresentam TDA positivo seja agraves custas de IgG eou complemento
com ou sem sinais cliacutenicos de hemoacutelise teratildeo a fenotipagem eritrocitaacuteria prejudicada A
fenotipagem de indiviacuteduos com TDA positivo especialmente quando utilizado o teste indireto
da antiglobulina pode acarretar resultados falsos positivos e levar a seleccedilatildeo de fenoacutetipo
incorreto para transfusatildeo
132 TESTE INDIRETO DA ANTIGLOBULINA
O teste indireto da antiglobulina (TIA) eacute utilizado para revelar a sensibilizaccedilatildeo ldquoin
vitrordquo das hemaacutecias e eacute aplicado a diversos testes soroloacutegicos em imunohematologia entre
eles a pesquisa de anticorpos identificaccedilatildeo de anticorpos testes de compatibilidade
fenotipagem eritrocitaacuteria e titulaccedilatildeo de anticorpos Na teacutecnica indireta a hemaacutecia que contecircm
o antiacutegeno eacute colocada em contato ldquoin vitrordquo com o anticorpo que se liga mas natildeo promove a
aglutinaccedilatildeo visiacutevel A adiccedilatildeo da AGH forma uma malha entre os anticorpos que sensibilizam
as hemaacutecias e provoca a aglutinaccedilatildeo macroscoacutepica (figura 2)
Caso a amostra de hemaacutecia estudada seja previamente sensibilizada resultados falsos
positivos podem ser obtidos no TIA jaacute que a AGH reagiraacute com a moleacutecula que sensibilizava
anteriormente a hemaacutecia mesmo se o anticorpo especiacutefico natildeo tiver se ligado ao antiacutegeno
correspondente
13
133 CONDICcedilOtildeES CLIacuteNICAS COM TDA POSITIVO
O TDA positivo deve ser interpretado cuidadosamente sempre em conjunto com o
quadro cliacutenico do paciente A positividade isolada do TDA natildeo significa hemoacutelise A
interpretaccedilatildeo do teste positivo requer o conhecimento do diagnoacutestico do paciente da presenccedila
de sinais e sintomas sugestivos de hemoacutelise assim como de seu histoacuterico transfusional
gestacional e de informaccedilotildees sobre o uso recente de medicaccedilotildees (LEGER 2011)
Figura 2 ndash Princiacutepio do teste indireto da antiglobulina O TIA pode ser utilizado na pesquisa de anticorpos de
especificidades desconhecidas livres no soroplasma como eacute o caso da pesquisa e identificaccedilatildeo de anticorpos
irregulares Ele eacute tambeacutem utilizado para determinar a presenccedila de antiacutegenos na membrana da hemaacutecia quando
satildeo empregados soros de especificidades conhecidas da classe IgG No primeiro caso o soroplasma contendo o
anticorpo desconhecido eacute colocado em contato com hemaacutecias cujo perfil antigecircnico eacute conhecido No segundo
caso utiliza-se soro de especificidade conhecida da classe IgG para determinar a presenccedila ou ausecircncia de um
antiacutegeno na membrana O anticorpo encontra o antiacutegeno correspondente e ocorre a ligaccedilatildeo do anticorpo agrave
hemaacutecia mas natildeo ocorre aglutinaccedilatildeo Apoacutes a adiccedilatildeo da AGH que se liga aos anticorpos formando uma malha
ocorre a aglutinaccedilatildeo visiacutevel
O TDA positivo eacute uma achado claacutessico de algumas condiccedilotildees cliacutenicas como a reaccedilatildeo
transfusional hemoliacutetica a doenccedila hemoliacutetica do feto e do receacutem-nascido (DHFRN) a anemia
hemoliacutetica induzida por drogas a siacutendrome do linfoacutecito passageiro e a anemia hemoliacutetica
autoimune (AHAI) Portanto o TDA positivo pode ser decorrente da sensibilizaccedilatildeo da
hemaacutecia autoacuteloga por um autoanticorpo ou por um aloanticorpo ligado agrave hemaacutecia alogecircnica
circulante A positividade do TDA pode ainda ocorrer de forma passiva em pacientes que
14
recebem imunoglobulinas humanas ou ainda pela transfusatildeo de plaquetas ABO natildeo idecircntico
(LEGER 2011 RALPH 2012 ZANTEK et al 2012)
Nas reaccedilotildees transfusionais hemoliacuteticas imunes o aloanticorpo do receptor sensibiliza
as hemaacutecias transfundidas do doador e reduz sua sobrevida ao removecirc-la precocemente da
circulaccedilatildeo pela fagocitose no sistema retiacuteculo-endotelial ou pela hemoacutelise intravascular As
reaccedilotildees podem ser agudas se ocorrem ateacute 24 horas ou tardias quando ocorrem apoacutes 24 horas
da transfusatildeo A gravidade das reaccedilotildees hemoliacuteticas pode variar de um simples rendimento
transfusional inadequado agrave quadros graves de hemoacutelise intravascular evoluindo ateacute mesmo
com choque vascular e oacutebito O TDA pode resultar negativo caso toda massa eritrocitaacuteria
transfundida tenha sido destruiacuteda (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
Na doenccedila hemoliacutetica do feto e do receacutem-nascido (DHFRN) anticorpos maternos da
classe IgG atravessam a barreira placentaacuteria e sensibilizam as hemaacutecias fetais que seratildeo
destruiacutedas precocemente levando agrave anemia fetal Apesar da incompatibilidade ABO feto-
materna ser a causa mais frequente de DHFRN raramente ela eacute responsaacutevel pela ocorrecircncia
de quadros graves Por outro lado anticorpos contra antiacutegenos do sistema Rh e Kell
especialmente Anti-D (Anti-RH1) Anti-c (Anti-RH4) e Anti-Kell (Anti-KELL1) satildeo
conhecidos por causar DHFRN severa Raramente outros anticorpos tambeacutem podem estar
implicados na DHFRN como os anticorpos contra antiacutegenos do sistema Kidd Duffy MNS e
Diego (ZANTEK et al 2012)
A hemoacutelise droga-dependente eacute causada pela produccedilatildeo de um anticorpo voltado contra
a droga ligada agrave membrana eritrocitaacuteria ou ainda contra o complexo droga-membrana A
classe de medicaccedilotildees mais comumente envolvida eacute a dos antimicrobianos betalactacircmicos
(penicilinas e cefalosporinas) mas outras classes como quimioteraacutepicos e anti-inflamatoacuterios
tambeacutem satildeo descritos (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
Apoacutes transplante de ceacutelulas progenitoras hematopoieacuteticas em que o doador possui
anticorpos contra antiacutegenos eritrocitaacuterios do receptor o linfoacutecito de memoacuteria do doador pode
resistir ao esquema imunossupressor utilizado e continuar a produccedilatildeo de anticorpos que
reconhecem a hemaacutecia incompatiacutevel do receptor ainda circulante O quadro cliacutenico pode
variar de um simples TDA positivo sem outros sinais ou sintomas ateacute um quadro hemoliacutetico
grave e abrupto (LEGER 2011)
15
134 ANEMIA HEMOLIacuteTICA AUTOIMUNE
A anemia hemoliacutetica autoimune eacute caracterizada pela destruiccedilatildeo precoce das hemaacutecias
autoacutelogas por autoanticorpos que sensibilizam as hemaacutecias e levam agrave fagocitose pelos
macroacutefagos no sistema reticulo-endotelial ou hemoacutelise intravascular O diagnoacutestico da AHAI
baseia-se na presenccedila de hemoacutelise cliacutenica associada agrave evidecircncia de fator imune representado
pelo TDA positivo As classes de anticorpos envolvidas em quadros de AHAI satildeo IgG IgM e
raramente IgA (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012) Satildeo raros os casos de AHAI com TDA
negativo que podem estar relacionados a um autoanticorpo de baixa avidez de densidade
inferior agrave detecccedilatildeo do meacutetodo ou ainda de classe de imunoglobulina natildeo avaliada pelo
meacutetodo utilizado para o teste (GARRATY 2005)
A AHAI pode ser classificada em dois grupos principais de acordo com a melhor
temperatura de reaccedilatildeo do autoanticorpo As anemias hemoliacuteticas causadas por anticorpos
quentes que reagem melhor a 37oC e geralmente IgG representam 80 dos casos de AHAI
Nas AHAI por anticorpo quente o TDA pode ser positivo para IgG mais complemento (67)
somente IgG (20) ou somente por complemento (13) As anemias causadas por
anticorpos frios geralmente da classe IgM e que reagem melhor em temperatura ambiente ou
a 4oC representam aproximadamente 20 dos casos de AHAI Por exibirem amplitude
teacutermica esses anticorpos ligam-se agraves hemaacutecias ao atingirem a circulaccedilatildeo nas extremidades do
corpo fixam o complemento e desprendem-se da hemaacutecia apoacutes retornar para partes mais
quentes Por esse motivo em AHAI por anticorpos frios o TDA eacute positivo apenas agraves custas
de C3 e normalmente o IgM natildeo eacute detectado (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
A presenccedila do autoanticorpo IgG pode ser confirmada atraveacutes da eluiccedilatildeo do anticorpo
da hemaacutecia Tipicamente o eluato na AHAI por anticorpo quente reage com todas as ceacutelulas
testadas de um painel de hemaacutecias alogecircnicas do tipo ldquoOrdquo ou pode eventualmente exibir uma
especificidade conhecida como Anti-e (Anti-RH5) Nas AHAI a frio por sua vez espera-se
um eluato negativo (LEGER 2011)
Os autoanticorpos satildeo com frequecircncia encontrados livres no plasma e natildeo somente
ligados agraves hemaacutecias autoacutelogas Eles podem interferir em todas as fases dos testes preacute-
transfusionais nas quais o plasma eacute testado especialmente os autoanticorpos quentes que
acarretam resultados positivos em todos os testes levados agrave fase de antiglobulina humana
Esses anticorpos portanto positivam a pesquisa de anticorpos irregulares e mascaram a
presenccedila de aloanticorpos de significado cliacutenico Aproximadamente 60 dos pacientes que
apresentam AHAI a quente apresentam anticorpos que reagem em meio salino mas se forem
16
levados em conta meacutetodos mais sensiacuteveis como PEG enzima e estudo em gel a positividade
pode ser superior a 90 (LEGER 2011)
Aleacutem da eficaacutecia da transfusatildeo ser comprometida pela diminuiccedilatildeo da vida-meacutedia das
hemaacutecias a presenccedila do autoanticorpo dificulta a realizaccedilatildeo dos testes preacute-transfusionais e
compromete a seguranccedila transfusional Os autoanticorpos reagem normalmente como
panaglutininas pois satildeo normalmente voltados contra antiacutegenos puacuteblicos na maior parte das
vezes contra antiacutegenos do sistema Rh Por apresentarem essas caracteriacutesticas podem ainda
mascarar a presenccedila de aloanticorpos de significado clinico e levar a testes de compatibilidade
positivos exigindo uma avaliaccedilatildeo criteriosa da necessidade da transfusatildeo (BRANCH e PETZ
1999 JUNIOR e OLIVATO 2004)
Remover a interferecircncia do autoanticorpo para avaliar a presenccedila de aloanticorpos
mascarados nem sempre eacute possiacutevel mesmo utilizando teacutecnicas de autoadsorccedilatildeo ou
aloadsorccedilatildeo que aleacutem de tudo satildeo demoradas e exigem de 2 a 6 horas para conclusatildeo
(GARRATY e GEORGE 2002) Nesses casos a fenotipagem eritrocitaacuteria do paciente eacute de
extrema utilidade especialmente em situaccedilotildees de urgecircncia A definiccedilatildeo do fenoacutetipo do
paciente para os antiacutegenos de maior importacircncia cliacutenica pode auxiliar a seleccedilatildeo de unidades
de hemaacutecias com mesmo fenoacutetipo o que garante que eventuais aloanticorpos natildeo
identificados sejam respeitados e tambeacutem evita nova sensibilizaccedilatildeo (JUNIOR e OLIVATO
2004 SHIREY et al 2002)
135 TRATAMENTO DE HEMAacuteCIAS COM TDA POSITIVO
O TDA positivo impede a fenotipagem eritrocitaacutecia por meacutetodos que exigem a fase de
AGH uma vez que a aglutinaccedilatildeo ocorreraacute devido agrave interaccedilatildeo da AGH com o autoanticorpo
que sensibiliza a hemaacutecia do paciente levando a resultados falso positivos Em algumas
situaccedilotildees como na AHAI por anticorpo quente a fenotipagem eacute especialmente importante
pois o autoanticorpo interfere na triagem e identificaccedilatildeo de anticorpos assim como no teste de
compatibilidade e dificultam a detecccedilatildeo de aloanticorpos de significado cliacutenico que
obrigatoriamente devem ser respeitados Nessas situaccedilotildees a fenotipagem eritrocitaacuteria
determina o perfil antigecircnico do paciente e possibilita o fornecimento de unidades de
hemaacutecias com o mesmo fenoacutetipo para a transfusatildeo evitando a sensibilizaccedilatildeo para novos
antiacutegenos assim como reaccedilotildees hemoliacuteticas transfusionais No entanto eacute necessaacuterio aplicar
meacutetodos que natildeo sofram interferecircncia do TDA positivo ou seja meacutetodos que natildeo necessitem
da fase de AGH ou meacutetodos de bloqueio do anticorpo sem bloquear o antiacutegeno Uma opccedilatildeo eacute
a utilizaccedilatildeo de soros monoclonais IgM (salinos ou de meio proteico natildeo concentrado) mas
17
nem sempre esses reagentes estatildeo disponiacuteveis especialmente os reagentes monoclonais para
os antiacutegenos dos sistemas Duffy ( Fya Fy
b) Kidd ( Jk
a Jk
b) e MNS (S s) (JUNIOR e
OLIVATO 2004) Outra opccedilatildeo eacute a teacutecnica de bloqueio que pode ser utilizada para tratar
hemaacutecias para posterior fenotipagem em casos de TDA positivos com reatividade le2+
Em casos onde a positividade do TDA eacute maior que 2+ estaacute indicada a tratamento
quiacutemico para remoccedilatildeo da interferecircncia do autoanticorpo antes de realizar a fenotipagem Entre
as teacutecnicas utilizadas atualmente estatildeo o ZZAP a cloroquina e a glicina aacutecidaEDTA
1351 TEacuteCNICA DE BLOQUEIO
A teacutecnica de bloqueio se baseia na utilizaccedilatildeo de anti-IgG (Coombs monoespeciacutefico)
para tratar as hemaacutecias com TDA positivo O anticorpo anti-IgG se liga aos anticorpos que
estatildeo sensibilizando a hemaacutecias poreacutem sem o bloquear os antiacutegenos Os antiacutegenos que natildeo
estatildeo sensibilizados podem ser detectados atraveacutes dos antissoros especiacuteficos (SERERAT
VEIDT E DUTCHED 2000)
1352 TRATAMENTO DE HEMAacuteCIAS COM ZZAP
O Sulphydryl-Proteolytic Enzyme (ZZAP) que eacute uma mistura de ditiotreitol (DTT)
mais papaiacutena ativada com cisteiacutena eacute um reagente capaz de dissociar imunoglobulinas da
classe IgG ligadas a membrana dos eritroacutecitos enquanto trata enzimaticamente as hemaacutecias
O tratamento enzimaacutetico tambeacutem potencializa a ligaccedilatildeo do autoanticorpo ao antiacutegeno e
acelera o processo de autoadsorccedilatildeo O ZZAP pode desnaturar os antiacutegenos do sistema Duffy
MNS e Kell o que limita sua aplicaccedilatildeo para fins de fenotipagem (BRANCH e PETZ 1982)
1353 CLOROQUINA
Em 1982 Edwards Moulds e Judd propuseram a utilizaccedilatildeo da teacutecnica da cloroquina
que dissociava os complexos antiacutegeno-anticorpo e mantinha a membrana das hemaacutecias
iacutentegras Os derivados quinolecircicos jaacute haviam sido descritos anteriormente por Domokos e
Aszody em 1964 e Holtz Mantel e Buck em 1973 (apud Edwards Moulds e Judd 1982) pela
sua capacidade de separar imunocomplexos e inibir as reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo reduzindo
as cargas eleacutetricas das superfiacutecie das hemaacutecias A teacutecnica eacute uma das mais utilizadas nos
centros brasileiros para remover a interferecircncia do autoanticorpo e eacute tambeacutem a teacutecnica
atualmente adotada pelo laboratoacuterio de imunohematologia do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto
18
Edwards Moulds e Judd (1982) demonstraram que a teacutecnica da cloroquina para
dissociaccedilatildeo de anticorpos eacute uma teacutecnica simples efetiva e confiaacutevel para dissociar
imunoglobulina das hemaacutecias Desde que a membrana das hemaacutecias permaneccedila intacta natildeo
haacute perda da reatividade dos antiacutegenos e a sua maior aplicaccedilatildeo eacute a fenotipagem de hemaacutecias
com TDA positivo Os autores verificaram que em 83 das amostras sensibilizadas in vivo e
22 amostras (no total de 40) sensibilizadas ldquoin vitrordquo apresentaram TDA negativo e
puderam ser fenotipadas A teacutecnica poreacutem natildeo consegue remover os componentes do
complemento na maioria dos casos
Champagne e colaboradores (1999) testaram a teacutecnica da cloroquina para dissociar
antiacutegenos Bg comparando com a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA e verificaram vantagem em
relaccedilatildeo ao uso de um uacutenico reagente diminuindo a manipulaccedilatildeo e verificou que o mesmo natildeo
destroacutei antiacutegeno Kell
A cloroquina tambeacutem mostrou-se pouco efetivo em remover anticorpos do sistema
Duffy da superfiacutecie das hemaacutecias (EDWARDS MOUDS e JUDD 1982 ROZIERS e
SQUALI 1997)
1353 GLICINA-AacuteCIDAEDTA
A afinidade e a estabilidade entre a ligaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo eacute definida como a
resultante entre forccedilas atrativas e repulsivas entre ambos (CARUCIO e WISE 2012) e resulta
da somatoacuteria de forccedilas quiacutemicas dinacircmicas e fracas (natildeo covalentes) como pontes de
hidrogecircnio forcas eletrostaacuteticas forca de Van der Waals e pontes hidrofoacutebicas A estabilidade
dessa ligaccedilatildeo eacute facilmente abalada por alteraccedilotildees quiacutemicas e fiacutesicas no meio da reaccedilatildeo como
a alteraccedilatildeo do pH A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA se baseia na mudanccedila do pH para a
quebra da ligaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo (KOSANKE 2012)
A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA foi primeiramente descrita em 1986 por Louie Jieng
e Zeroulis que utilizaram 50 amostras de doadores sensibilizados ldquoin vitrordquo com anticorpos A
teacutecnica foi efetiva em 48 amostras permitindo o estudo do eluato assim como a fenotipagem
das hemaacutecias Os autores testaram tambeacutem a teacutecnica em 100 hemaacutecias TDA positivo que
puderam ser utilizadas para teacutecnicas de autoadsorccedilatildeo
Byrne (1991) descreveu a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA modificada e tambeacutem
verificou como uma opccedilatildeo para o tratamento de hemaacutecias com TDA positivo que deixava as
hemaacutecias intactas e o eluato viaacutevel para ser fenotipado
19
Roziers e Squali (1997) e Katharia e Chaudhary (2013) compararam a teacutecnica da
glicina-aacutecidaEDTA com as teacutecnicas da cloroquina e do aquecimento Verificaram maior
eficiecircncia da glicina-aacutecidaEDTA em relaccedilatildeo as outras duas teacutecnicas pois com uma mesma
quantidade de amostra produzia as hemaacutecias livres de anticorpo e tambeacutem o eluato Mostrou-
se ainda superior devido ao menor tempo exigido para sua realizaccedilatildeo o que favorece seu uso
em situaccedilotildees de urgecircncia e emergecircncia
As duas desvantagens da teacutecnica poreacutem eacute o fato de destruir os antiacutegenos do sistema
Kell e o fato de natildeo remover fraccedilotildees do complemento ligadas agrave hemaacutecia (PALLAS WILER e
McGEE 1991 ROZIERS e SQUALLI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012
e KATHARIA e CHAUNDHARY 2013)
20
2 OBJETIVOS
21 OBJETIVO GERAL
211 Avaliar a eficaacutecia da glicina-aacutecidaEDTA em remover os anticorpos ligados agraves
hemaacutecias sensibilizadas por anticorpos da classe IgG
22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
221 Preparaccedilatildeo dos reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
verificaccedilatildeo da estabilidade dos mesmos e avaliar custos
222 Testar a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA em amostras de hemaacutecias
sensibilizadas por anticorpos antieritrocitaacuterios humanos
223 Comparar a efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA com a teacutecnica da
cloroquina quanto a capacidade de remover a interferecircncia do anticorpo ligado
a hemaacutecia
224 Testar o eluato das amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA
225 Verificar se houve destruiccedilatildeo dos antiacutegenos eritrocitaacuterios apoacutes o tratamento
com glicina-aacutecidaEDTA e com cloroquina
226 Verificar se o tempo de execuccedilatildeo da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA descrito
nos textos de referecircncia eacute reprodutiacutevel
21
3 JUSTIFICATIVA
Algumas condiccedilotildees cliacutenicas podem levar ao depoacutesito ldquoin vivordquo de anticorpos eou
fraccedilotildees do complemento sobre as hemaacutecias Entre elas estatildeo as reaccedilotildees hemoliacuteticas poacutes-
transfusionais a doenccedila hemoliacutetica perinatal o uso de medicamentos e principalmente a
AHAI Na AHAI um anticorpo normalmente da classe IgG ou IgM reconhece antiacutegenos
proacuteprios na membrana eritrocitaacuteria e reduz a sobrevida da hemaacutecia levando a sua destruiccedilatildeo
pelos macroacutefagos no sistema reticulo-endotelial ou agrave ativaccedilatildeo do complexo de ataque agrave
membrana e agrave lise intravascular Os autoanticorpos satildeo voltados na maioria das vezes contra
antiacutegenos eritrocitaacuterios de alta frequecircncia populacional conhecidos como antiacutegenos puacuteblicos
e por este motivo reconhecem tanto hemaacutecias autoacutelogas quanto alogecircnicas
Devido agrave presenccedila do autoanticorpo livre no plasma e tambeacutem do anticorpo eou
complemento ligado agrave hemaacutecia o banco de sangue pode encontrar dificuldades em todas as
fases dos testes preacute-transfusionais do paciente com AHAI e deve utilizar teacutecnicas que
auxiliem na escolha do melhor hemocomponente melhorando a seguranccedila transfusional Essas
teacutecnicas visam remover a interferecircncia do autoanticorpo livre no soro e do autoanticorpo
ligado agrave hemaacutecia permitindo a detecccedilatildeo de aloanticorpos associados e a realizaccedilatildeo da
fenotipagem eritrocitaacuteria respectivamente
A finalizaccedilatildeo dos testes preacute-tranfusionais na presenccedila de autoanticorpo pode levar
algumas horas e nem sempre o paciente poderaacute aguardar Nesse contexto torna-se vantajosa a
aplicaccedilatildeo de teacutecnicas de raacutepida execuccedilatildeo
O presente estudo propotildee aplicar e avaliar a eficaacutecia da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
em remover os anticorpos ligados agrave hemaacutecia o que permite a fenotipagem eritrocitaacuteria
estendida e a seleccedilatildeo de concentrados de hemaacutecias com mesmo fenoacutetipo do paciente
Atualmente no Hemocentro de Ribeiratildeo Preto a teacutecnica utilizada para esse fim eacute o
tratamento das hemaacutecias com difosfato de cloroquina cujo tempo de execuccedilatildeo pode demorar
ateacute duas horas enquanto a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser realizada em apenas dois
minutos o que a tornaria opccedilatildeo de escolha especialmente em situaccedilotildees de urgecircncia Ao
contraacuterio da cloroquina a glicina-aacutecidaEDTA permite tambeacutem o estudo do eluato das
hemaacutecias tratadas
22
4 METODOL OGIA
41 AMOSTRAS DE DOADORES
Foram coletados 50 amostras de doadores de sangue que compareceram ao
Hemonuacutecleo de Araccedilatuba no periacuteodo de junho a agosto de 2016 Foram convidados a
participar da pesquisa doadores de repeticcedilatildeo do tipo sanguiacuteneo ldquoOrdquo RhD positivo
cadastrados no sistema de banco de sangue (SBS) do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto
Todos os doadores que concordaram em participar da pesquisa assinaram o termo de
consentimento livre e esclarecido (TCLE)
No momento da doaccedilatildeo foram coletados adicionalmente 5 mL de sangue total em
soluccedilatildeo anticoagulante EDTA (aacutecido dietilenoaminoaceacutetico) dispensando punccedilatildeo venosa
adicional para coleta da amostra O fluxograma 1 resume as etapas desenvolvidas no projeto
Fluxograma 1 - Fluxo da pesquisa utilizando as amostras de doadores
23
411 FENOTIPAGEM
Foram verificados se os doadores jaacute tinham fenotipagem para outros sistemas de
grupos sanguiacuteneos aleacutem do sistema ABORh que eacute realizado rotineiramente
A fenotipagem eritrocitaacuteria para outros sistemas ou fenotipagem estendida eacute realizada
para identificar a presenccedila ou ausecircncia de antiacutegenos considerados de importacircncia cliacutenica No
Hemonuacutecleo de Araccedilatuba uma parcela de doadores de repeticcedilatildeo satildeo fenotipados para os
antiacutegenos dos sistemas de grupo sanguiacuteneo Rh (antiacutegenos C c E e e) Kell (antiacutegeno K)
Duffy (antiacutegenos Fya e Fy
b) Kidd (antiacutegenos Jk
a e Jk
b) e sistema MNSs (antiacutegenos S e s)
A fenotipagem para o Rh e Kell eacute realizada por metodologia de microplaca utilizando
25 microL de hemaacutecia lavada e diluiacuteda a 5 em salina e 25 microL do antissoro comercial especiacutefico
A reaccedilatildeo eacute incubada 15 minutos a temperatura ambiente e centrifugadas para leitura Para os
antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s a metolodogia utilizado eacute gel contendo antiglobulina
humana (gel LissCoombs poliespeciacutefico) da marca BIO-RAD onde se utiliza suspensatildeo de
hemaacutecia em LISS (Soluccedilatildeo de baixa forccedila iocircnica) A suspensatildeo eacute preparada atraveacutes da
diluiccedilatildeo de 10 microL de hemaacutecia em 1000 microL de LISS Pipetado 50 microL dessa diluiccedilatildeo no gel e
adicionado 25 microL do antissoro especiacutefico Incuba-se em banho seco por 15 minutos a 37 deg
Celsius e eacute centrifugado em centriacutefuga especiacutefica Os antissoros utilizados eram das marcas
Fresenius e Lorne
Foi verificado a fenotipagem do doador no banco de dados do Hemocentro Os
registros dos fenoacutetipos dos doadores ficam armazenadas no sistema de banco de sangue
(SBS) Para doadores que natildeo tinham fenotipagem estendida preacutevia para antiacutegenos do sistema
Rh (C c E e e) e Kell (K) foi realizada a fenotipagem para esses antiacutegenos
O tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA e cloroquina para dissociar
anticorpos pode inativar enfraquecer ou destruir os antiacutegenos presentes nas hemaacutecias
alterando assim os resultados da fenotipagem Para verificar se houve destruiccedilatildeo dos
antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a e Jk
b S e s nas amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes
tratamento foram novamente fenotipadas ao final para os antiacutegenos que eram inicialmente
positivas
A repeticcedilatildeo da fenotipagem foi realizada nas amostras que apresentaram efetividade
no tratamento da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eou da cloroquina e a detecccedilatildeo do antiacutegeno
na amostra preacute-tratamento
24
412 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS HEMAacuteCIAS
As hemaacutecias foram sensibilizadas com antissoros policlonais humanos de amostras de
plasma fresco congelado de doadores com resultado de pesquisa de anticorpo irregular
positivos
A escolha do anticorpo para sensibilizar as hemaacutecias foi definida de acordo com o
fenoacutetipo do doador que deveria ser positivo para o respectivo antiacutegeno
Para a sensibilizaccedilatildeo um volume de antissoro (1 mL) e um volume (1 mL) de
hemaacutecias lavadas quatro vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica foram adicionadas a um tubo de 12 x
75 mm A mistura foi homogeneizada e incubada em banho maria (BM) a 37deg C por 60
minutos A seguir as hemaacutecias foram novamente lavadas 4 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica
para retirada dos anticorpos que natildeo se ligaram A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada
como controle negativo O teste da uacuteltima lavagem eacute importante para assegurar que os
anticorpos que poderatildeo ser detectados no eluato apoacutes o tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA
sejam aqueles que estavam ligados agraves hemaacutecias e natildeo aqueles livres no plasma O controle
negativo mostra que todo o anticorpo livre foi retirado (LEGER 2011)
Para o teste de presenccedila de anticorpo na soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foram incubadas
com hemaacutecias de triagem de anticorpos irregulares (ID-Diacell BIO-RAD) contendo os
antiacutegenos especiacuteficos Realizado a teacutecnica em gel LissCoombs com anti-IgG+C3d Incubado
no tempo de 15 minutos a temperatura de 37deg C e centrifugado 10 minutos em centriacutefuga
proacutepria
As 50 amostras de doadores foram sensibilizadas com os anticorpos policlonais
humanos
Apoacutes sensibilizadas rdquoin vitrordquo e lavadas as hemaacutecias foram diluiacutedas em soluccedilatildeo de
baixa forccedila iocircnica (LISS) na quantidade de 10 microL de hemaacutecia para 1000 microL de soluccedilatildeo A
suspensatildeo foi pipetada (50 microL) em coluna-gel-teste LissCoombs (BIO-RAD) que contecircm
antiglobulina poliespeciacutefico (IgG+C3d) e centrifugada em baixa rotaccedilatildeo conforme orientaccedilatildeo
do fabricante durante 10 minutos
As amostras deveriam apresentar aglutinaccedilatildeo com reatividade 3 a 4+ no TDA As
amostras que apresentaram reaccedilatildeo menor que 3+ foram novamente sensibilizadas com nova
aliacutequota do antissoro
25
413 TRATAMENTO DAS AMOSTRAS
As amostras sensibilizadas apresentando o TDA positivo 3 ou 4+ foram divididas em
duas aliacutequotas e submetidas a duas teacutecnicas diferentes com o objetivo de dissociar o anticorpo
ligado Uma aliacutequota da amostra foi tratada com soluccedilatildeo de difosfato de cloroquina enquanto
a outra aliacutequota foi tratada com glicina-aacutecidaEDTA
42 PREPARO DA GLICINA AacuteCIDA-EDTA
A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA utiliza 3 soluccedilotildees diferentes a glicina aacutecida o
EDTA e o tampatildeo TRIS
Os reagentes foram preparados utilizando os sais para anaacutelise (PA) de EDTA
(Na2EDTA2H2O) TRIS (C4H11NO3) Glicina (H2NCH2CO2H) NaCl e a soluccedilatildeo de aacutecido
cloriacutedrico (HCl) 12 N todos reagentes da marca SYNTH (quadro 1)
Para o preparo do tampatildeo glicina-acida eacute necessaacuterio o ajuste do pH para 15 Para esse
ajuste utiliza-se aacutecido cloriacutedrico (HCl) concentrado O pH foi medido com fitas reativas de pH
com escala de 1 a 14 da marca MERCK Posteriormente a soluccedilatildeo foi enviada ao laboratoacuterio
de controle de qualidade do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto e o pH medido no peagacircmetro O
tampatildeo glicina-aacutecida foi armazenado a 4deg e o tampatildeo tris e o EDTA em temperatura ambiente
controlada (20 a 24deg Celsius)
Apoacutes o preparo e durante a realizaccedilatildeo dos testes foram feitas inspeccedilotildees visuais para
verificaccedilatildeo de turvaccedilatildeo do meio e presenccedila de precipitados
Reagente Material Quantidade Preparo e
Conservaccedilatildeo
EDTA
EDTA
(Na2EDTA2H2O)
5 gramas Mistura ateacute
dissoluccedilatildeo do sal e
conserva em
temperatura ambiente Aacutegua Destilada 50 Ml
Tris
TRIS (C4H11NO3) 121 gramas Conservar em
temperatura ambiente NaCl 525g
Aacutegua destilada 100ml
Gliacutecina-aacutecida
Glicina
(H2NCH2CO2H) 15 gramas
Conservar a 4oC NaCl 116gramas
Aacutegua Destilada 200ml
HCL 12N Ajutar o pH para 15
Quadro 1 - Preparo dos Reagentes da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
Fonte - Manual teacutecnico AABB 2011
26
O tampatildeo glicina-aacutecida e o tampatildeo TRIS satildeo estaacuteveis por 7 meses O reagente EDTA
precipitou mesmo estando em temperatura em ambiente controlado Houve necessidade de
preparo de novo reagente
421 TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
1 Em um tubo de ensaio 12x75 mm eacute adicionado 08 mL da soluccedilatildeo de glicina-aacutecida A
esta soluccedilatildeo adiciona-se 02 mL de EDTA e mistura
2 Adiciona-se 02 mL de hemaacutecias sensibilizadas (lavada 4 vezes) A mistura eacute
homogeneizada e incubada por exatamente 2 minutos
3 A seguir 01 mL de tampatildeo TRIS eacute adicionado agrave mistura que eacute novamente
homogeneizada e centrifugada por 2 minutos a 3400 rpm O pH deve estar entre 7 a 75
4 Apoacutes centrifugaccedilatildeo separa-se em outro tubo o sobrenadante (eluato) e as hemaacutecias
que permanecem satildeo lavadas 4 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica para retirada de todo o
reagente e anticorpos livres
43 PREPARO DA CLOROQUINA
A cloroquina eacute diluiacuteda em tampatildeo PBS na concentraccedilatildeo de 20 (Quadro 2) e
armazenado a 4deg Celsius sua validade apoacutes o preparo eacute de 1 mecircs
A teacutecnica da cloroquina jaacute estaacute padronizada para rotina do laboratoacuterio de
imunohematologia do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto e suas unidades
Reagente Reagentes Quantidade PreparoConservaccedilatildeo
Cloroquina
Difosfato de cloroquina
(C18H32ClN3O8P2)
20 gramas
Conservar a 4deg Celsius
Tampatildeo PBS 100ml
NaOH 01 N Acertar o pH para
51
Quadro 2 - Preparo da Cloroquina Fonte - Manual teacutecnico da AABB 2011
431 TEacuteCNICA DA CLOROQUINA
1 4 partes da soluccedilatildeo pronta eacute adicionada a uma parte de hemaacutecias lavadas 4 vezes com
soluccedilatildeo fisioloacutegica
2 A mistura eacute incubada em temperatura ambiente por ateacute duas horas
3 Centrifugar a 3400 rpm por 2 minutos
27
4 Remover o sobrenadante lavar as hemaacutecias novamente com soluccedilatildeo fisioloacutegica 4
vezes
44 VERIFICACcedilAtildeO DA EFETIVIDADE DOS TESTES
Apoacutes tratamento pelas duas teacutecnicas o TDA foi repetido em todas as amostras para
verificar se os tratamentos foram efetivos e houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo Para as
amostras tratadas pela teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA que permaneceram com TDA positivo
novo tratamento foi realizado
45 TESTE DO ELUATO
O eluato resultante das amostras tratadas com glicina-acidaEDTA foi testado com
hemaacutecias de triagem A soluccedilatildeo do eluato foi incubada com as hemaacutecias de triagem de
anticorpos (ID-Diacell BIO-RAD) pela teacutecnica em gel LissCoombs O teste foi incubado 15
minutos a 37deg Celsius e centrifugado por 10 minutos em centrifuga proacutepria para a teacutecnica em
gel Os eluatos que apresentaram resultados positivos foram testados em painel de 11
hemaacutecias (ID-Diapanel BIO-RAD) para a identificaccedilatildeo do anticorpo
46 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente que apresentou TDA positivo por IgG e pesquisa
de anticorpo irregular positivo com presenccedila de autoanticorpo com reatividade panaglutinina
A amostra foi tratada em paralelo pelas duas teacutecnicas descritas e foi enviada para o
Hemocentro para genotipagem eritrocitaacuteria que foi realizado por metodologia PCR em tempo
real no equipamento Real-time system PCR 7500 ( Applied Biosystems Califoacuternia EUA)
28
5 RESULTADOS
51 REAGENTES
Para aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA satildeo necessaacuterios 3 diferentes
reagentes que podem ser encontrados em forma de kit pronto para uso No entanto esses kits
natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil Os reagentes satildeo tampatildeo glicina-aacutecida o EDTA e o tampatildeo
Tris
Todos os reagentes foram preparados rdquoin houserdquo a partir dos sais e soluccedilotildees PA (puro
para anaacutelise) da marca SYNTH que foram adquiridos para a pesquisa O custo estimado para
cada teste foi aproximadamente R$ 020 reais
Apoacutes o preparo os reagentes poderiam ser armazenados em condiccedilotildees adequadas pelo
periacuteodo de 1 ano (AABB 2011) Ao final do preparo e durante o periacuteodo de armazenamento
de fevereiro a setembro de 2016 foi realizada inspeccedilatildeo visual para verificar a presenccedila de
precipitados ou turvaccedilatildeo A soluccedilatildeo de glicina e o tampatildeo TRIS mostraram-se estaacuteveis ateacute o
final do periacuteodo Por sua vez o reagente EDTA precipitou mesmo estando armazenado em
temperatura ambiente controlada e foi necessaacuterio novo preparo
52 AMOSTRAS DE DOADORES
521 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS AMOSTRAS
Apoacutes incubaccedilatildeo da hemaacutecia com o antissoro a mesma foi lavada 4 vezes para retirada
dos anticorpos livres A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada Caso houvesse positividade na
soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem a etapa era repetida (figura 3) Das 50 amostras sensibilizadas a
uacuteltima lavagem foi positiva somente em 3 delas Nas 3 amostras o anticorpo utilizado para
sensibilizaccedilatildeo foi o anti-K Apoacutes repetido nova etapa de lavagem os resultados se
apresentaram negativos
Em todas as amostras sensibilizadas ldquoin vitrordquo o TDA foi testado e verificado a
intensidade do teste Entre as 50 amostras 47 alcanccedilaram TDA com intensidade 3-4+ apoacutes a
primeira sensibilizaccedilatildeo enquanto 3 amostras necessitaram uma segunda incubaccedilatildeo com
anticorpo (figura 4)
A escolha dos anticorpos para sensibilizar as hemaacutecias foi feita de acordo com o
fenoacutetipo do doador e foram utilizados sete diferentes especificidades de anticorpos policlonais
humanos conforme mostra o graacutefico1
29
Figura 3 - Soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada com hemaacutecia de triagem de
anticorpos em gel LissCoombs (BIO-RAD) A finalidade eacute verificar a presenccedila de anticorpos livres na
suspensatildeo que possam interferir na pesquisa do eluato As soluccedilotildees de lavagem das amostras na figura a tiveram
resultados negativos Na figura b duas amostras a 47 e 50 apresentaram resultado positivo Nova etapa de
lavagem foi realizada e o resultado final foi negativo
522 TRATAMENTO DAS HEMAacuteCIAS
Apoacutes a sensibilizaccedilatildeo e obtenccedilatildeo de resultados de TDA com intensidade de 3 a 4+
cada uma das amostras foi dividida em duas aliacutequotas e tratada separadamente pelas teacutecnicas
de glicinaaacutecida-EDTA e cloroquina
As teacutecnicas foram consideradas efetivas quando obteve-se a completa dissociaccedilatildeo do
anticorpo verificada atraveacutes do TDA negativo na amostra poacutes tratamento conforme figuras 5
e 6 Dentre as amostras tratadas com cloroquina 2850 tiveram o TDA negativado A glicina-
aacutecidaEDTA negativou o TDA em 33 das 50 amostras tratadas Apenas 17 amostras tratadas
com glicina-aacutecidaEDTA permaneceram com o TDA positivo e foram submetidas a um novo
tratamento
30
Figura 4 - TDA das amostras apoacutes sensibilizaccedilatildeo com anticorpos policlonais humanos Amostras na
figura a com intensidades de 3-4+ Na figura b amostras 4 e 7 com intensidade menor que 3+ e portanto foram
novamente sensibilizadas com nova aliacutequota de soro Anti-D e anti-S Apoacutes a segunda sensibilizaccedilatildeo
apresentaram reatividade 4 e 3+ respectivamente Os anticorpos utilizados para sensibilizaccedilatildeo foram D S c E
C e K
523 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS TEacuteCNICAS
No tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA houve dissociaccedilatildeo completa do anticorpo
em 33 amostras (66) das 50 amostras testadas enquanto que com a cloroquina foram 28
amostras (56) (tabela 1)
31
Graacutefico 1- Nuacutemero de amostras sesnsibilizadas por especificidade de anticorpo Entre as 50 amostras 12
foram sensibilizadas com anti-D 10 com anti-C 9 com anti-E 8 com anti-c 7 com anti-S 3 com anti-K e 1
com anti-Dia As especificidades dos anticorpos foram definidas de acordo o fenoacutetipo do doador
Figura 5 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com cloroquina Nas amostras onde houve
a dissociaccedilatildeo do anticorpo ( 2 21 a 23 26 39 a 42 45 46 e 49) a hemaacutecia se deposita no fundo no microtubo
apoacutes a centrifugaccedilatildeo (TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (1 3 24 25 43 44 47
48 e 50) o anticorpo ligado agraves hemaacutecias eacute alvo da AGH presente no gel (TDA positivo)
Anti-D 12
Anti-C 10
Anti-E 9
Anti-c 8
Anti-S 7
Anti-K 3 Anti-Dia 1
32
Figura 6 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA Nas amostras
onde houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo (4 6 7 12 a 15 17 34 35 37 e 38) a hemaacutecia se deposita no fundo no
microtubo apoacutes a centrifugaccedilatildeo ( TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (5 16 18
19 20 33 e 36 ) o AGH presente no gel se liga ao anticorpo ligado agraves hemaacutecias que ficam retidas no gel (TDA
positivo)
Tabela 1-Resultado geral do tratamento das hemaacutecias com glicina e cloroquina
Teacutecnica utilizada TDA negativo TDA positivo Total
Glicina-aacutecidaEDTA 33 17 50
Cloroquina 28 22 50
A glicina-aacutecidaEDTA conseguiu negativar mais amostras sensibilizadas com Anti-D
e anti-K que a cloroquina Para as hemaacutecias sensibilizadas com anti-E Anti-S e Anti-Dia
ambas as teacutecnicas dissociaram o anticorpo em 100 das amostras Os resultados detalhados
por especificidade do anticorpo apoacutes o primeiro tratamento com glicina-aacutecidaEDTA e com
cloroquina estatildeo na tabela 2
Para as amostras que permaneceram positivas (17 amostras) apoacutes o tratamento com a
glicina-aacutecidaEDTA foi realizado um novo tratamento Houve dissociaccedilatildeo do anticorpo em 3
amostras (18) apoacutes a segunda tentativa Nas demais 14 (82) amostras tratadas pela
segunda vez 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise
33
Tabela 2 - Resultados do TDA apoacutes tratamento das hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo
sensibilizado
ANTICORPOS
SENSIBILIZADOS
1ordm TRATAMENTO COM
GLICINA
TRATAMENTO COM
CLOROQUINA
TOTAL TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
Anti-D 8 4 0 12 12
Anti-C 6 4 10 0 10
Anti-E 9 0 9 0 9
Anti-c 0 8 1 7 8
Anti-S 7 0 7 0 7
Anti-K 2 1 0 3 3
Anti-Dia 1 0 1 0 1
TOTAL 33 17 28 22 50
A hemoacutelise foi verificada durante o procedimento de lavagem final das hemaacutecias com
soluccedilatildeo fisioloacutegica para a retirada dos reagentes As soluccedilotildees de lavagem ficaram
avermelhadas e as hemaacutecias com coloraccedilatildeo escura As amostras foram descartadas Dentre as
6 amostras que ainda puderam ser testadas para o TDA trecircs amostras negativaram sendo 1
sensibilizada com anti-D e 2 com anti-C (tabela 3)
Tabela 3 - Resultado apoacutes o segundo tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA
Tratamento com
glicina-aacutecidaEDTA
TDA Negativo TDA Positvo Hemoacutelise Total
Segundo tratamento 3 3 11 17
524 TESTAGEM DO ELUATO
Apoacutes o tratamento com a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA a soluccedilatildeo do eluato foi
testada para verificar a viabilidade dos anticorpos que foram dissociados ou eluiacutedos Dentre
as 50 amostras 41 apresentaram eluato positivo As nove amostras cujos eluatos foram
negativos haviam sido sensibilizadas com as seguintes especificidades de anticorpos anti-E 6
amostras (67) anti-S 2 amostras (40) e anti-D 1 amostra (8) (tabela 4) O eluato de
todas as amostras sensibilizadas com os anticorpos anti-C anti-c Anti-K e Anti-Dia foram
positivos Os eluatos positivos na triagem de anticorpos foram testados com paineacuteis de
identificaccedilatildeo para confirmar a especificidade e a viabilidade dos anticorpos (figuras 7 e 8)
34
525 EFEITO DA ELUICcedilAtildeO SOBRE OS ANTIacuteGENOS ERITROCITAacuteRIOS
Para verificar o efeito do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA e com a cloroquina
sobre a expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s foi realizada a fenotipagem das
amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes tratamento com ambas as teacutecnicas Foi avaliado
se o tratamento destruiu os antiacutegenos expressos antes do tratamento
Tabela 4- Resultado do Eluato das amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA
Anticorpos Eluato positvo Eluato negativo Total
Anti-D 11 1 12
Anti-C 10 0 10
Anti-E 3 6 9
Anti-c 8 0 8
Anti-S 5 2 7
Anti-K 3 0 3
Anti-Dia 1 0 1
Total 41 9 50
Figura 7 ndash Painel do eluato da amostra 21 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-C que foi
recuperado no eluato
Figura 8 ndash Painel do eluato da amostra 47 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-K que foi
recuperado no eluato
35
Dentre as 50 amostras 26 eram previamente fenotipadas para os antiacutegenos Fya Fy
b
Jka Jk
b S e s Dentre elas 20 alcanccedilaram TDA negativo apoacutes tratamento com a glicina-
aacutecidaEDTA e 20 negativaram apoacutes tratamento com cloroquina (tabela 5) Apoacutes ambas as
teacutecnicas os antiacutegenos originalmente expressos permaneceram positivos comprovando que natildeo
houve destruiccedilatildeo dos mesmos
Tabela 5 ndash Verificaccedilatildeo da interferecircncia do tratamento da hemaacutecias com cloroquina e glicina-
aacuteicdaEDTA sobre os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
AMOSTRAS
COM
FENOTIPAGEM
PREacuteVIA
TRATADAS COM
CLOROQUINA
TRATADAS COM
GLICINA
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
26
20
20
20
20
As amostras 24 47 e 50 eram positivas para o antiacutegeno K A cloroquina natildeo dissociou
o anticorpo em nenhuma das 3 amostras enquanto a glicina-aacutecidaEDTA foi efetiva nas
amostras 24 e 50 Foi testada a expressatildeo do antiacutegeno K nas amostras 24 e 50 apoacutes o
tratamento utilizando meacutetodo indireto em gel contendo AGH Apesar de natildeo ter sido avaliado
a intensidade de reaccedilatildeo de expressatildeo dos antiacutegenos podemos verificar na figura 9 que nas
duas amostras em que a teacutecnica foi efetiva e dissociou o anticorpo a expressatildeo do antiacutegeno K
continua presente mas a reatividade observada pode ser considerada 1+ sugerindo que houve
diminuiccedilatildeo da expressatildeo do antiacutegeno quando comparado com a expressatildeo observada em
hemaacutecia natildeo tratada
Os resultados individuais de cada amostra em ambas as teacutecnicas encontram-se
resumidas na tabela 6
526 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente onde foi constatada a presenccedila de autoanticorpo
a quente da classe IgG pelo TDA monoespeciacutefico (figura 10)O autoanticorpo tambeacutem
interferia na pesquisa e identificaccedilatildeo de anticorpos irregulares pois apresentava caracteriacutestica
de panaglutinina As hemaacutecias da paciente sensibilizadas ldquoin vivordquo foram tratadas com
cloroquina e com glicina-aacutecidaEDTA
36
Figura 9 ndash Fenotipagem das amostras 24 e 50 para antiacutegeno K apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
O teste positivo indica a presenccedila do antiacutegeno poreacutem a reatividade fraca (1+) sugere que houve enfraquecimento
de sua expressatildeo A direita a expressatildeo forte (4+) do antiacutegeno Kell em hemaacutecia controle natildeo tratada utilizada
como controle positivo
A cloroquina natildeo foi efetiva na retirada do anticorpo ligado as hemaacutecias ao contraacuterio
do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA que dissociou o anticorpo (figura 11)
A hemaacutecia tratada com glicina foi fenotipada para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
(figura 12) A fenotipagem para o sistema Rh (C c E e e) e Kell foi realizada em gel
especiacutefico monoclonal sem interferecircncia do TDA positivo (controle da reaccedilatildeo negativo)
O eluato resultante do tratamento com glicina-aacutecidaEDTA foi testada em gel com
hemaacutecias de painel de identificaccedilatildeo de anticorpos e apresentou resultado positivo com todas
as ceacutelulas (figura 13 e 14)
A amostra foi enviada para genotipagem e o resultado da genotipagem confirmou o
resultado da fenotipagem apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
527 TEMPO DE EXECUCcedilAtildeO DA TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
O tempo de reaccedilatildeo da glicina-aacutecidaEDTA eacute de 2 minutos Todas as amostras foram
tratadas obedecendo ao tempo descrito na literatura demonstrando que o mesmo eacute
reprodutiacutevel
37
Tabela 6- Resultados individuais por amostra
Amostra Especificidade
dos anticorpos
Intensidade do
TDA apoacutes
sensibilizaccedilatildeo
Tratamento
efetivo com
cloroquina
Tratamento
efetivo com
glicina
Eluato
poacutes
glicina
1 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 2 Dia 3+ Sim Sim 3+ 3 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 4 D 4+ Natildeo Sim 4+ 5 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 6 E 3+ Sim Sim Negativo 7 S 4+ Sim Sim 3+ 8 E 3+ Sim Sim 1+ 9 E 3+ Sim Sim 2+
10 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 11 D 4+ Natildeo Sim 4+ 12 D 4+ Natildeo Sim 4+ 13 S 3+ Sim Sim 3+ 14 S 3+ Sim Sim 3+ 15 D 3+ Natildeo Sim 3+ 16 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 17 E 3+ Sim Sim (+) 18 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 19 D 4+ Natildeo Natildeo 3+ 20 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 21 C 3+ Sim Sim 4+ 22 C 3+ Sim Sim 4+ 23 C 3+ Sim Sim 4+ 24 K 4+ Natildeo Sim 4+ 25 D 3+ Natildeo Natildeo Negativo 26 E 4+ Sim Sim Negativo 27 S 3+ Sim Sim 3+ 28 C 3+ Sim Natildeo 4+ 29 C 3+ Sim Sim 4+ 30 C 3+ Sim Sim 4+ 31 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 32 E 3+ Sim Sim Negativo 33 C 3+ Sim Natildeo 4+ 34 S 3+ Sim Sim Negativo 35 S 3+ Sim Sim Negativo 36 C 4+ Sim Natildeo 4+ 37 c 4+ Natildeo Natildeo 4+ 38 D 4+ Natildeo Sim 4+ 39 S 3+ Sim Sim 3+ 40 c 4+ Sim Natildeo 2+ 41 C 4+ Sim Natildeo 4+ 42 E 3+ Sim Sim Negativo 43 D 3+ Natildeo Sim 2+ 44 D 3+ Natildeo Sim 2+ 45 E 3+ Sim Sim Negativo 46 C 3+ Sim Sim 4+ 47 K 4+ Natildeo Natildeo 4+ 48 D 3+ Natildeo Sim 2+ 49 E 3+ Sim Sim Negativo 50 K 4+ Natildeo Sim 4+
TOTAL 50 28 33 41
38
Figura 10 ndash TDA monoespeciacutefico da amostra de paciente Hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo da classe
IgG
oacute Figura 11 ndash TDA apoacutes o tratamento com glicina-aacutecidaEDTA (esquerda) e cloroquina (direita) A glicina
negativou completamente o TDA enquanto a hemaacutecia tratada com cloroquina persistiu positiva (1+)
39
Figura 12 ndash Fenotipagem da amostra tratada com glicina-aacutecidaEDTA Fy(a+b+) Jk(a-b+) S+s+
Figura 13 ndash Painel em gel (LissAGH) do eluato apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de
intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
Figura 14 ndash ndash Painel ezimaacutetico (hemaacutecias tratadas com bromelina) do eluato em gel neutro apoacutes
tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
40
528 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Quanto a efetividade das teacutecnicas em negativar o TDA foi verificado que a glicina-
aacutecidaEDTA foi efetiva em 66 das amostras testadas no primeiro tratamento (3350
amostras) enquanto a cloroquina conseguiu negativar 56 (2850) Esses resultados natildeo
apresentam diferenccedila significativa (pgt005) demostrando que a teacutecnica da glicina-
aacutecidaEDTA natildeo eacute superior mas eacute tatildeo efetiva quanto a da cloroquina
Quando aliamos os resultados de ambas as teacutecnicas verificamos que em 76 (3850)
das amostras o TDA foi negativado Esse dado indica que ainda que uma teacutecnica natildeo seja
eficaz na remoccedilatildeo do anticorpo eacute uma boa alternativa tentar a segunda teacutecnica jaacute que a falha
em remover o anticorpo utilizando uma delas natildeo prevecirc necessariamente a falha com a outra
Quando se utiliza o teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla (graacutefico 2) para comparar a utilizaccedilatildeo das
duas teacutecnicas com o resultado de cada uma isolada (somente a cloroquina ou somente a
glicina) verificamos que os resultados apresentam diferenccedila significativa (plt005) (quadro 3)
TRATAMENTO EFETIVO COM TOTAL PORCENTAGEM
Glicina ou cloroquina 38 76
Glicina e cloroquina 23 46
Glicina apenas 10 20
Cloroquina apenas 5 10
Nenhuma das teacutecnicas 12 24
Quadro 3 - Resultados comparativos entre as teacutecnicas utilizadas
41
Graacutefico 2 - Teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla entre as teacutecnicas aplicadas A- Glicina e Cloroquina B-Cloroquina C-
Glicina ( plt005)
42
6 DISCUSSAtildeO
Os reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA podem ser adquiridos em
forma de kit comercial prontos para uso poreacutem natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil A preparaccedilatildeo
dos reagentes ldquoin houserdquo a partir de sais comerciais adquiridos se mostrou viaacutevel Os
reagentes glicina e o tampatildeo Tris armazenados de forma correta se mantiveram estaacuteveis por
um periacuteodo de 7 meses Somente o reagente EDTA precipitou mesmo armazenado em
condiccedilotildees adequadas sugerindo que o mesmo deve ser preparado em menor quantidade e
armazenado em aliacutequotas A soluccedilatildeo de cloroquina tambeacutem pode ser preparada ldquoin houserdquo e
pode ser armazenado por um mecircs A legislaccedilatildeo brasileira autoriza a utilizaccedilatildeo de reagentes
preparados a partir de sais comerciais como a cloroquina e a glicina-aacutecidaEDTA desde que
os sais tenham autorizaccedilatildeo da vigilacircncia sanitaacuteria para a comercializaccedilatildeo (BRASIL 2001)
A comparaccedilatildeo quanto a efetividade em dissociar anticorpos em amostras com TDA
positivos entre a teacutecnica da glicina e a teacutecnica da cloroquina mostrou que natildeo haacute diferenccedila
estatiacutestica entre elas e que ambas satildeo igualmente eficientes Se utilizadas conjuntamente haacute
maior possibilidade de elucidaccedilatildeo dos casos
Uma vantagem da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eacute que ela permite numa mesma
amostra eluir o anticorpo ligado aacute hemaacutecia assim como fenotipar a hemaacutecia tratada Devido a
sua dupla utilidade a teacutecnica eacute vantajosa principalmente em pacientes em que pouco volume
de amostra pode ser coletado como em casos de crianccedilas e receacutem-nascidos
A fenotipagem poacutes tratamento se mostrou viaacutevel jaacute que os antiacutegenos de maior
importacircncia natildeo sofreram alteraccedilotildees Nas 20 amostras que foram fenotipadas antes e apoacutes
tratamento para verificar a influecircncia dos reagentes na expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a
Jkb S e s natildeo houve destruiccedilatildeo dos mesmos por nenhuma das duas teacutecnicas
Para as amostras positivas para o antiacutegeno Kell (350) e sensibilizadas com o
respectivo anticorpo a teacutecnica da glicina foi efetiva em negativar o TDA em apenas duas
delas mas apoacutes o tratamento foi verificada uma fraca reatividade da reaccedilatildeo antiacutegeno-
anticorpo sugerindo que houve um enfraquecimento da expressatildeo do antiacutegeno conforme
esperado e descrito na literatura (BYRNE 1991 PALLAS WILER E MCGEE 1991
ROZIERS e SQUALI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012 e KATHARIA e
CHAUDHARY 2013) A accedilatildeo da glicina sobre o antigeno Kell natildeo representa impedimento
para seu uso uma vez que na impossibilidade de testar o antiacutegeno Kell o banco de sangue
consegue facilmente atender a solicitaccedilatildeo de transfusatildeo com unidades de hemaacutecias Kell
43
negativas jaacute que eacute um antiacutegeno de baixa prevalecircncia na populaccedilatildeo variando de 15 na
populaccedilatildeo africana a 9 nos europeus (DANIELS 2011)
A soluccedilatildeo resultante da dissociaccedilatildeo do anticorpo pela teacutecnica da glicina pode ainda ser
utilizada como eluato podendo substituir a teacutecnica de eluiccedilatildeo com reagentes comercias (kits
de eluiccedilatildeo aacutecida) que tem alto custo aproximadamente entre R$2000 a R$2500 por teste
Em 41 amostras (82) houve a dissociaccedilatildeo e recuperaccedilatildeo do anticorpo que estava
sensibilizando as hemaacutecias Em 9 amostras (18) os anticorpos foram eluiacutedos poreacutem
apresentaram reaccedilatildeo negativa quando testadas com hemaacutecias de triagem entre eles o anti-E
(6) anti-S (2) e Anti-D (1) Eacute possiacutevel que a correccedilatildeo pH do meio (WALKER 2011) natildeo
tenha sido adequada o que pode ter desfavorecido a reatividade do anticorpo
Para as amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA nas quais natildeo houve dissociaccedilatildeo do
anticorpo pelo primeiro tratamento (1750) o segundo tratamento natildeo se mostrou eficaz jaacute
que 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise O tempo de
armazenagem natildeo parece ter influenciado jaacute que todas as amostras foram testadas dentro de
48 horas apoacutes a coleta Outros fatores que natildeo foram verificados podem ter levado a
hemoacutelise Apesar da literatura (LOUIE JIENG e ZEROULIS 1986 e BYRNE 1991)
recomendar um segundo tratamento ele eacute pouco eficaz tendo negativado apenas 3 das 17
amostras testadas
A amostra de paciente que apresentou sensibilizaccedilatildeo ldquoin vivordquo mostrou melhor
efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA sobre a da cloroquina possibilitando
fenotipagem para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s que natildeo foram destruiacutedos apoacutes o
tratamento comprovado atraveacutes da genotipagem
A presenccedila de autoanticorpo a quente com presenccedila de hemoacutelise (AHAI) ou natildeo pode
mascarar a presenccedila de aloanticorpo interferindo na rotina soroloacutegica da fenotipagem que eacute
uma importante ferramenta para auxiliar na seleccedilatildeo de hemaacutecias para transfusatildeo (SHIREY et
al 2002) Esses pacientes frequentemente possuem aloanticorpos associados ao
autoanticorpo e a prevalecircncia de aloimunizaccedilatildeo entre eles varia entre 12 a 40 (LEGER e
GARRATY 1999 BRANCH e PETZ 1999) o que dificulta ainda mais a escolha do melhor
componente a ser transfundido aleacutem de aumentar a possibilidade reaccedilotildees hemoliacuteticas imunes
poacutes-transfusionais
Nesses casos as teacutecnicas de dissociaccedilatildeo de anticorpos satildeo importantes para tratar
amostras de pacientes e a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser usada como uma opccedilatildeo
pois se mostrou eficaz na dissociaccedilatildeo anticorpo ligado agraves hemaacutecias deixando livre a
superfiacutecie das mesmas permitindo a fenotipagem por antisoros IgG Paralelamente os
44
anticorpos eluiacutedos tambeacutem puderam ser estudados O mesmo natildeo ocorre com a cloroquina
que permite apenas a fenotipagem e tampouco com os kits de eluiccedilatildeo aacutecida disponiacuteveis no
mercado nacional que satildeo destinados a realizaccedilatildeo do eluato mas destroem as hemaacutecias
O tempo de tratamento na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA tambeacutem eacute uma vantagem
pois foi possiacutevel reproduzir no tempo determinado de 2 minutos enquanto a cloroquina
demora ateacute duas horas
Ainda que a aplicaccedilatildeo das teacutecnicas por biologia molecular estejam cada vez mais
presentes na rotina imuno-hematoloacutegica e possibilitam estabelecer o fenoacutetipo deduzido do
genoacutetipo elas natildeo estatildeo disponiacuteveis na maioria dos centros e sua realizaccedilatildeo exige algumas
horas A resoluccedilatildeo imediata do problema transfusional necessita dos resultados soroloacutegicos
pois com frequecircncia natildeo eacute possiacutevel aguardar o resultado do teste molecular Dessa forma
apesar da crescente importacircncia da genotipagem eritrocitaacuteria teacutecnicas soroloacutegicas aplicadas
corretamente e no momento propiacutecio satildeo de grande utilidade para resolver problemas imuno-
hematoloacutegicos como ocorre com a fenotipagem em pacientes com TDA positivo
45
7 CONCLUSAtildeO
A teacutecnica da glicina aacutecidaEDTA mostrou-se efetiva em remover os anticorpos que
sensibilizavam as hemaacutecias e pode ser utilizada com seguranccedila antes da fenotipagem
eritrocitaacuteria Por ser uma teacutecnica de raacutepida execuccedilatildeo eacute uma alternativa aplicaacutevel
principalmente em casos urgentes de pacientes que apresentam autoanticorpos
46
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50
9 ANEXOS
51
FUNDACcedilAtildeO HEMOCENTRO DE RIBEIRAtildeO PRETO
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE)
Tiacutetulo da pesquisa Aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina aacutecida-EDTA e avaliaccedilatildeo da
eficaacutecia no tratamento de hemaacutecias com teste direto da antiglobulina positivo
Pesquisadora responsaacutevel Ceacutelia Kazue Abiko
Orientador Prof Dimas Tadeu Covas
Co-orientadora Dra Flaacutevia Leite Souza Santos
Objetivo da pesquisa Vocecirc estaacute sendo convidado a participar de uma pesquisa que tem
como objetivo padronizar uma nova teacutecnica para auxiliar na tipagem sanguiacutenea de pacientes
A tipagem sanguiacutenea pode sofrer interferecircncia da presenccedila de anticorpos ligados aos gloacutebulos
vermelhos do sangue Nessas situaccedilotildees eacute difiacutecil selecionar o melhor sangue para o paciente e
eacute preciso a utilizaccedilatildeo de teacutecnicas adicionais para remover essas interferecircncias
Esta pesquisa tem como objetivo estudar outra teacutecnica para remover esses anticorpos e
comparaacute-la com a teacutecnica atualmente utilizada Para isso precisamos de amostras de pacientes
e doadores voluntaacuterios
Se vocecirc eacute um doador eacute necessaacuterio que vocecirc autorize a coleta de 5 ml (1 tubo) a mais
de seu sangue
Se vocecirc eacute um paciente natildeo haveraacute necessidade de nova amostra pois utilizaremos as
amostras jaacute coletadas para os testes preacute-transfusionais e os resultados encontrados nesta
pesquisa natildeo iratildeo interferir na escolha da (s) bolsa (s) de sangue que vocecirc possa vir a receber
Se vocecirc concordar em participar leia com atenccedilatildeo o texto abaixo e assine as duas vias
rubricando todas as paacuteginas deste termo de consentimento Uma via original assinada e
rubricada por vocecirc e pela pesquisadora ficaraacute com vocecirc
As suas informaccedilotildees seratildeo mantidas em sigilo pela pesquisadora e natildeo haveraacute
armazenamento de material para pesquisas posteriores Os seus dados seratildeo usados apenas
neste estudo e quando o trabalho for publicado seu nome e qualquer outra informaccedilatildeo que
possam identificaacute-lo natildeo seratildeo revelados
Eacute pouco provaacutevel que o que noacutes aprendermos com este estudo tenha um benefiacutecio
direto para vocecirc assim como natildeo poderemos dar nada em troca pela sua participaccedilatildeo na
pesquisa
Nosso objetivo com esta pesquisa eacute que os resultados poderatildeo ser uacuteteis para o
tratamento de pacientes no futuro Os riscos da participaccedilatildeo satildeo miacutenimos Se vocecirc eacute um
doador de sangue a amostra seraacute coletada no momento da doaccedilatildeo natildeo exigindo punccedilatildeo
venosa adicional
52
Eacute seu direito ter acesso aos resultados dos testes da pesquisa Esses resultados natildeo
seratildeo fornecidos automaticamente a vocecirc mas caso vocecirc se interesse em saber o resultado ou
tiver alguma duacutevida sobre a sua participaccedilatildeo neste estudo deveraacute entrar em contato com Ceacutelia
Kazue Abiko pelo telefone (18) 99718-3551
Vocecirc tem total liberdade de optar por natildeo participar da pesquisa Caso aceite
participar poderaacute desistir a qualquer momento ou retirar seu consentimento mesmo apoacutes ter
coletado o sangue Para cancelar sua participaccedilatildeo basta avisar a pesquisadora e os seus dados
seratildeo retirados do projeto
Qualquer duacutevida eacutetica sobre a pesquisa poderaacute entrar em contato com o Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa do Hospital das Cliacutenicas e da Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto
(CAMPUS UNIVERSITAacuteRIO bairro Monte Alegre CEP 14048-900 Ribeiratildeo Preto-SP
Telefone (16) 3602-2228 FAX (16) 3633-1144 e-mail cephcrpuspbr)
Consentimento de participaccedilatildeo
A Consentimento do participante
Li as informaccedilotildees acima sobre o estudo e recebi explicaccedilotildees sobre a participaccedilatildeo no estudo
Portanto dou o meu consentimento para participar do estudo
___________________________________________________________________________
Nome completo
___________________________________________________________________________
Assinatura
___________
Data
__________________________________________________________________________________
Nome completo da pesquisadora
___________________________________________________________________________
Assinatura
_____________
Data
LISTA DE GRAFICOS
Graacutefico 1 - Nuacutemero de amostras sensibilizadas por especificidade de
anticorpopaacutegina 31
Graacutefico 2 - Teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla entre as teacutecnicas
aplicadaspaacutegina 41
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 - Preparo dos Reagentes da glicina-aacutecidaEDTApaacutegina 25
Quadro 2 - Preparo da Cloroquinapaacutegina 26
Quadro 3 - Resultados comparativos entre as teacutecnicas utilizadas paacutegina 40
LISTA DE FLUXOGRAMAS
Fluxograma 1 - Fluxograma da pesquisa utilizando as amostras de
doadorespaacutegina 22
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ABO
AHAI
Bg
c
C
C
C3
C3b
C3d
D
DHFRN
DNA
DTT
E
e
EDTA
Fc
Fya
Fyb
HCl
IgA
IgD
IgE
IgM
Mm
NaCl
PA
PAI
PBS
PCR
PEG
pH
Rh
rpm
S
s
SIDA
SBS
TCLE
TDA
TIA
TRIS
ZZAP
microL
Sistema Sanguiacuteneo ABO
Anemia Hemoliacutetica Autoimune
Antiacutegeno Bg
Antiacutegeno c
Celsius
Antiacutegeno C
Complemento
Fraccedilatildeo do complemento
Fraccedilatildeo do complemento
Antiacutegeno D
Doenccedila Hemoliacutetica do Feto e do Receacutem-nascido
Aacutecido desoxirribonucleico
Dithiothreitol
Antiacutegeno E
Antiacutegeno e
Aacutecido Etileno Diamino Tetraceacutetico
Porccedilatildeo do anticorpo
Antiacutegeno Duffy a
Antiacutegeno Duffy b
Aacutecido cloriacutedrico
Imunoglobulina A
Imunoglobulina D
Imunoglobulina E
Imunoglobulina M
Miliacutemetros
Cloreto de soacutedio
Puro para anaacutelise
Pesquisa de anticorpos irregulares
Tampatildeo fosfato salino
Reaccedilao em cadeia de polimerase
Polietilenoglicol
Potencial hidrogeniocircnico
Sistema sanguiacuteneo Rh
Rotaccedilotildees por minuto
Antiacutegeno S
Antiacutegeno s
Siacutendrome da Imunodeficiecircncia adquirida
Sistema de banco de sangue
Termo de consentimento livre e esclarecido
Teste direto da antiglobulina
Teste indireto da antiglobulina
Hidrometil aminometano
Sulphydryl-Proteolytic Enzyme
Microlitros
RESUMO
Os testes preacute-transfusionais satildeo o conjunto de teacutecnicas imuno-hematoloacutegicas aplicadas nas
amostras do receptor e do doador com a finalidade de fornecer uma unidade de hemaacutecias
compatiacutevel e segura para a transfusatildeo Aleacutem da fenotipagem ABO e Rh obrigatoacuteria nos testes
preacute-transfusionais a determinaccedilatildeo do perfil antigecircnico de outros antiacutegenos eritrocitaacuterios de
importacircncia cliacutenica melhora a seguranccedila transfusional especialmente para pacientes
previamente aloimunizados ou candidatos agrave transfusatildeo crocircnica Para tais pacientes conhecer o
fenoacutetipo eritrocitaacuterio permite a seleccedilatildeo de concentrados de hemaacutecias com o mesmo fenoacutetipo
o que previne reaccedilotildees transfusionais hemoliacuteticas assim como nova aloimunizaccedilatildeo
Indiviacuteduos que apresentam as hemaacutecias sensibilizadas ldquoin vivordquo por anticorpos anti-
eritrocitaacuterios como ocorre na anemia hemoliacutetica autoimune (AHAI) teratildeo o teste direto da
antiglobulina (TDA) positivo dificultando a realizaccedilatildeo da fenotipagem O TDA positivo
provoca resultados falsos positivos especialmente quando satildeo utilizados para a fenotipagem
soros comerciais da classe IgG que exigem a fase de antiglobulina humana ou teste indireto
da antiglobulina (TIA) para leitura Em 1982 Edwards Moulds e Judd propuseram a
utilizaccedilatildeo da teacutecnica da cloroquina para dissociar os complexos de antiacutegeno-anticorpo
preservando a membrana eritrocitaacuteria e permitindo a fenotipagem Atualmente eacute a teacutecnica
mais utilizada nos centros brasileiros A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA foi primeiramente
descrita por Louie Jieng e Zeroulis em 1986 poreacutem eacute pouco utilizada por natildeo haver os
reagentes prontos comercialmente no mercado brasileiro O presente estudo avaliou a teacutecnica
da glicina-aacutecida-EDTA com reagentes preparados ldquoin houserdquo em paralelo agrave teacutecnica da
cloroquina que eacute atualmente a teacutecnica aplicada no Hemocentro de Ribeiratildeo Preto Para isso
amostras de hemaacutecias de doadores (n=50) com fenoacutetipo conhecido foram sensibilizadas com
anticorpos humanos de especificidade conhecida e ambas as teacutecnicas foram aplicadas Foi
verificado ainda o efeito da teacutecnica sobre a expressatildeo dos antiacutegenos eritrocitaacuterios (Fya Fy
b
Jka Jk
b S e s) atraveacutes da fenotipagem das amostras que tiveram o TDA negativado A
viabiliadade dos anticorpos presentes no eluato recuperado apoacutes tratamento com a glicina-
aacutecidaEDTA tambeacutem foi testada A glicina-aacutecidaEDTA foi efetiva em negativar o TDA em
33 amostras (66) comparaacutevel com a cloroquina que negativou 28 amostras (56) O eluato
apresentou-se viaacutevel no tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA e natildeo foi constatada destruiccedilatildeo
dos antiacutegenos eritrocitaacuterios apoacutes o tratamento Concluiacutemos que a teacutecnica da glicina-
aacutecidaEDTA pode ser utilizada como uma opccedilatildeo no tratamento de hemaacutecias com TDA
positivo com a vantagem de seu tempo de execuccedilatildeo ser inferior ao da cloroquina (2minutos x
30 a 120 minutos) o que lhe torna uacutetil em situaccedilotildees de maior urgecircncia Quando ambas as
teacutecnicas satildeo utilizadas em hemaacutecias diferentes de uma mesma amostra a efetividade estaacute
significativamente aumentada (plt005)
Palavras chave Glicina-aacutecidaEDTA Teste direto da antiglobulina AHAI fenotipagem
ABSTRACT
The pre-transfusion tests are the group of immunohematology techniques applied in the
receptor and donor samples in order to provide a unit of red blood cells compatible and safe
for transfusion In addition to the obligatory ABO and Rh phenotyping in the pre-transfusion
tests the determination of the antigenic profile of other red cells antigens of clinical
importance improves transfusion safety especially for patients previously alloimmunized or
candidates for chronic transfusion For such patients knowing the phenotype allows the
selection of red blood cell concentrates with the same phenotype which prevents hemolytic
transfusion reactions as well as new alloimmunization Individuals who have antibody-coated
red blood cells sensitized in vivo such as in autoimmune hemolytic anemia (AHAI) will
have a direct antiglobulin test (DAT) positive making it difficult to perform phenotyping
Positive DAT causes false positive results especially when commercially available IgG
serums which require the human antiglobulin phase or indirect antiglobulin test (IAT) for
reading are used for phenotyping In 1982 Edwards Molds and Judd proposed the use of the
chloroquine technique to dissociate antigen-antibody complexes by preserving the erythrocyte
membrane and allowing phenotyping It is currently the most used technique in Brazilian
centers The EDTAglycine-acid technique was first described by Louie Jieng and Zeroulis in
1986 but it is little used because commercially available reagents are not available in the
Brazilian market The present study evaluated the EDTAglycine-acid technique with reagents
prepared in house in parallel to the chloroquine technique which is currently the technique
applied at the Hemocentro de Ribeiratildeo Preto For this donor red cells samples (n = 50) with
known phenotype were sensitized with human antibodies of known specificity and both
techniques were applied The effect of the technique on the expression of erythrocyte antigens
(Fya Fy
b Jk
a Jk
b S and s) was also verified by the phenotyping of the samples that had
negative DAT The viability of the antibodies present in the recovered eluate after treatment
with EDTAglycine-acid A was also tested EDTAglycine-acid was effective in negatively
affecting DAT in 33 samples (66) comparable to chloroquine that negatived 28 samples
(56) The eluate was viable in treatment with EDTAglycine-acid and no destruction of
erythrocyte antigens after treatment We conclude that the EDTA glycine-acid technique can
be used as an option in the treatment of red cells with TDA positive with the advantage that
its execution time is inferior to that of chloroquine (2 minutes x 30 to 120 minutes) which
makes it useful in emergency situations When both techniques are used in different
erythrocytes of the same sample the effectiveness is significantly increased (p lt005)
Key words EDTAglycine-acid direct antiglobulin test AIHA phenotyping
1 INTRODUCcedilAtildeO
A transfusatildeo de hemaacutecias eacute um recurso terapecircutico muito importante e eficaz e tem se
mostrado como um grande aliado no tratamento de diversas patologias auxiliando na
melhoria da sobrevida e qualidade de vida de diversos pacientes quando indicada de forma
correta Eacute provavelmente a modalidade de terapia mais utilizada no mundo sendo
considerada a forma mais antiga de terapia celular A transfusatildeo de hemaacutecias em pacientes
com anemia grave ou sangramento agudo reestabelece o niacutevel de hemoglobina moleacutecula
responsaacutevel pelo transporte de oxigecircnio para os tecidos melhorando a isquemia tecidual
(BARJAS-CASTRO 2013 ZAGO 2014)
A transfusatildeo de componentes celulares como o concentrado de hemaacutecias deve ser
bem avaliada quanto aos riscos e benefiacutecios Os testes preacute-transfusionais satildeo parte obrigatoacuteria
do processo transfusional e tecircm como funccedilatildeo assegurar que o melhor hemocomponente seja
selecionado para o paciente reduzindo assim a chance de transfusotildees incompatiacuteveis e reaccedilotildees
transfusionais (BARJAS-CASTRO 2013)
11TESTES PREacute-TRANSFUSIONAIS
Os testes preacute-transfusionais tecircm a finalidade de evitar a ocorrecircncia de reaccedilotildees
hemoliacuteticas no receptor decorrentes da transfusatildeo de hemaacutecias incompatiacuteveis do doador
(DOWNES e SHULMAN 2011) Tem como propoacutesito selecionar hemaacutecias que apoacutes
transfusatildeo deveratildeo ter sobrevida normal ou mais proacutexima do normal (MELO 2007)
Os testes preacute-transfusionais que consistem no conjunto de teacutecnicas
imunohematoloacutegicas aplicadas agraves amostras do receptor e doador devem ser realizados antes
de toda transfusatildeo A aplicaccedilatildeo desses testes tem como finalidade fornecer uma unidade de
hemaacutecias compatiacutevel e elevar a seguranccedila da transfusatildeo Os testes preacute-transfusionais aliados
a utilizaccedilatildeo de novas tecnologias tem historicamente evitado reaccedilotildees transfusionais
hemoliacuteticas garantindo a seguranccedila transfusional em cerca de 95 dos pacientes que recebem
transfusatildeo Eacute imprescindiacutevel poreacutem a execuccedilatildeo correta das teacutecnicas envolvidas nos testes preacute-
transfusionais e ainda garantir a identificaccedilatildeo correta do receptor e das amostras de sangue e
das unidades de hemaacutecias (CASTILHO 2000 MELO 2007 BARJAS-CASTRO 2013)
2
Todos os testes que compotildeem a rotina preacute-transfusional usam meacutetodos soroloacutegicos
que envolvem a reaccedilatildeo antiacutegeno x anticorpo Ao testar a presenccedila de um antiacutegeno na
superfiacutecie da hemaacutecia eacute necessaacuterio dispor de um soro com especificidade conhecida para
aquele antiacutegeno Por outro lado testar a presenccedila de um determinado anticorpo no soro ou no
plasma exige o uso de hemaacutecias com perfil antigecircnico conhecido Os testes preacute-transfusionais
incluem tipagem ABO (direta e reversa) tipagem Rh pesquisa de anticorpos irregulares no
sangue do receptor retipagem ABO e Rh do hemocomponente e prova de compatibilidade
entre as hemaacutecias do doador e soro ou plasma do receptor em caso de transfusatildeo de hemaacutecias
ou hemocomponentes que contenham mais de 2 mL de volume eritrocitaacuterio como o
concentrado de granuloacutecitos (BRASIL 2016 GANZELLA 2014 SANTOS 2014)
Aleacutem dos testes regularmente realizados a determinaccedilatildeo do fenoacutetipo para outros
antiacutegenos eritrocitaacuterios do doador e do receptor pode ser indicada A fenotipagem eritrocitaacuteria
determina o perfil antigecircnico para outros antiacutegenos de importacircncia cliacutenica aleacutem do sistema
ABO e do antiacutegeno RhD Ela pode auxiliar a confirmaccedilatildeo de uma especificidade de anticorpo
encontrada no soro do paciente uma vez que espera-se que a sua hemaacutecia natildeo expresse o
antiacutegeno correspondente e simultaneamente eacute utilizada para selecionar um concentrado de
hemaacutecias negativo para o respectivo antiacutegeno evitando reaccedilotildees hemoliacuteticas transfusionais A
fenotipagem de candidatos a transfusotildees crocircnicas tambeacutem eacute recomendada pois esse grupo de
pacientes deve se beneficiar com a transfusatildeo profilaacutetica de unidades de hemaacutecias com
mesmo fenoacutetipo evitando assim a aloimunizaccedilatildeo assim como reaccedilotildees hemoliacuteticas provocadas
por anticorpos previamente existentes e em baixo tiacutetulo natildeo identificados pela triagem de
anticorpos (CASTILHO JUNIOR e REID 2015 DOWNES e SHULMAN 2011)
111 TIPAGEM ABORh
O sistema ABO (ISBT001) foi o primeiro sistema de grupo sanguiacuteneo a ser
descoberto Ele foi descrito em 1900 por Karl Landsteiner e eacute considerado o sistema de maior
importacircncia na praacutetica transfusional Ele eacute composto por quatro antiacutegenos A1 (ABO1) B
(ABO2) AB (ABO3) e A1 (ABO4) e eacute caracterizado pela presenccedila dos anticorpos naturais
ou seja anticorpos que surgem sem a exposiccedilatildeo preacutevia aos antiacutegenos atraveacutes de transfusatildeo ou
gestaccedilatildeo Os anticorpos ABO satildeo predominantemente da classe IgM satildeo capazes de fixar o
complemento e de provocar hemoacutelise grave intravascular caso ocorra transfusatildeo ABO
incompatiacutevel Por apresentar essa caracteriacutestica peculiar a tipagem do sistema ABO eacute
composta de duas etapas a prova direta e a prova reversa Na prova direta eacute realizada a
pesquisa dos antiacutegenos na superfiacutecie das hemaacutecias que satildeo testadas com soros comerciais
3
Anti-A e Anti-B A prova reversa por sua vez pesquisa a presenccedila de anticorpos ABO ao
testar o soro ou plasma do pacientedoador com hemaacutecias A1 e B Ambas as provas satildeo
obrigatoacuterias e devem ser concordantes para interpretaccedilatildeo do fenoacutetipo ABO (COOLING
2011 SANTOS 2014)
O sistema Rh (ISBT004) eacute o maior e mais complexo sistema de grupos sanguiacuteneos
compreendendo atualmente 54 antiacutegenos (ISBT 2016) Satildeo cinco os principais antiacutegenos do
sistema Rh D (RH1) C (RH2) E (RH3) c (RH4) e e (RH5) Esses antiacutegenos possuem alta
capacidade imunogecircnica e seus respectivos anticorpos estatildeo envolvidos na doenccedila hemoliacutetica
perinatal e em reaccedilotildees transfusionais hemoliacuteticas Os autoanticorpos quentes como ocorre na
anemia hemoliacutetica quente satildeo representados em grande parte por anticorpos contra antiacutegenos
puacuteblicos do sistema Rh (CASTILHO 2007 CHOU e WESTHOFF 2011 BARJAS-
CASTRO 2013) A tipagem RhD pesquisa o antiacutegeno D na membrana eritrocitaacuteria ao testar a
hemaacutecia com antissoros comerciais Atualmente a maior parte dos soros Anti-D
comercializados satildeo monoclonais
112 ANTICORPOS ANTI-ERITROCITAacuteRIOS
Anticorpos satildeo proteiacutenas presentes no plasma tambeacutem denominadas imunoglobulinas
Satildeo produzidas pelo sistema imune em resposta a um determinado antiacutegeno Podem ser
classificadas de acordo com suas caracteriacutesticas e propriedades em cinco classes de
imunoglobulinas IgG IgM IgA IgE e IgD (BARJAS-CASTRO 2013)
A ligaccedilatildeo entre o antiacutegeno e o anticorpo envolvem ligaccedilotildees natildeo covalentes que satildeo
reversiacuteveis Vaacuterios tipos de interaccedilotildees natildeo covalentes podem contribuir para a ligaccedilatildeo do
antiacutegeno pelo anticorpo incluindo forccedilas eletrostaacuteticas pontes de hidrogecircnio forccedilas de Van
der Walls e interaccedilotildees hidrofoacutebicas (ABBAS LICHTMAN e PILLAI 2008)
As interaccedilotildees antiacutegeno-anticorpo satildeo constituiacutedas por ligaccedilotildees dinacircmicas que sofrem
interferecircncia de alteraccedilotildees fiacutesico-quiacutemicas no meio como mudanccedilas na temperatura na forccedila
eletrostaacutetica na concentraccedilatildeo do antiacutegeno e do anticorpo e no pH O melhor pH para a reaccedilatildeo
eacute em torno de 70 no entanto raros anticorpos podem exigir acidificaccedilatildeo do meio para serem
identificados (SANTOS 2014)
Em imunohematologia satildeo pesquisados os anticorpos que reconhecem os antiacutegenos
eritrocitaacuterios de grupo sanguiacuteneo ldquoin vivordquo esses anticorpos dependendo de seu significado
cliacutenico satildeo capazes de reconhecer seus respectivos antiacutegenos sobre a hemaacutecia podendo levar
a sua destruiccedilatildeo por dois mecanismos fagocitose por macroacutefagos no sistema
4
reticuloendotelial ou por ativaccedilatildeo do sistema complemento com a formaccedilatildeo do complexo de
ataque a membrana e hemoacutelise intravascular As duas classes de anticorpos de maior
importacircncia em imunohematologia satildeo as imunoglobulinas IgG e a IgM (SANTOS 2014)
Devido a sua estrutura pentameacuterica os anticorpos da classe IgM se ligam aos
antiacutegenos localizados na superfiacutecie da membrana de hemaacutecias proacuteximas e promovem
aglutinaccedilatildeo das mesmas em meio salino ldquoin vitrordquo Anticorpos da classe IgG por sua vez
satildeo denominados ldquonatildeo aglutinantesrdquo ou ldquoincompletosrdquo pois sua estrutura de monocircmero eacute
pequena o que desfavorece a aglutinaccedilatildeo direta uma vez que uma mesma moleacutecula de IgG
natildeo alcanccedila antiacutegenos alvos em duas hemaacutecias proacuteximas Os anticorpos IgM aleacutem de terem
um tamanho maior apresentam 750 vezes maior eficiecircncia de aglutinaccedilatildeo que os anticorpos
IgG permitindo maior facilidade nas ligaccedilotildees entre as hemaacutecias (CARRUCIO e WISE 2012
GREEN e KLOSTERMANN 2012)
Nos testes ldquoin vitrordquo satildeo simulados reaccedilotildees que poderiam ocorrer ldquoin vivordquo causando
reaccedilotildees indesejaacuteveis A fase de sensibilizaccedilatildeo em que o anticorpo se liga ao antiacutegeno
correspondente natildeo eacute identificada macroscopicamente poreacutem uma vez que o anticorpo
aproxima as hemaacutecias e vence a forccedila eletrostaacutetica que naturalmente as repele chamada de
potencial zeta ocorre a aglutinaccedilatildeo Dependendo das caracteriacutesticas do anticorpo e de sua
capacidade de fixar complemento pode ocorrer tambeacutem a hemoacutelise (SANTOS 2014)
113 PESQUISA E IDENTIFICACcedilAtildeO DE ANTICORPOS IRREGULARES
A pesquisa de anticorpos irregulares eacute teste obrigatoacuterio nos testes preacute-transfusionais e
tem a finalidade de detectar anticorpos ldquoin vitrordquo que possam causar reaccedilatildeo ldquoin vivordquo
Dependendo da populaccedilatildeo estudada (pacientes x doadores) e ainda da sensibilidade do
teste a frequecircncia de anticorpos irregulares pode variar de 03 a 38 A imunizaccedilatildeo pode
ocorrer por transfusatildeo gestaccedilatildeo transplante ou injeccedilatildeo de material imunogecircnico (WALKER
2011)
Os anticorpos irregulares podem ser classificados como aloanticorpos que satildeo
voltados contra antiacutegenos ausentes na hemaacutecia autoacuteloga ou como autoanticorpos os quais
reconhecem antiacutegenos eritrocitaacuterios proacuteprios Os autoanticorpos antieritrocitaacuterios surgem em
decorrecircncia da desregulaccedilatildeo da autotoleracircncia imune relacionada agrave condiccedilotildees diversas como
doenccedilas hematoloacutegicas doenccedilas inflamatoacuterias autoimunes neoplasias infecccedilotildees e uso de
medicaccedilotildees A presenccedila do autoanticorpo associado a um quadro de anemia hemoliacutetica
caracteriza a anemia hemoliacutetica autoimune (AHAI) seja ela primaacuteria ou secundaacuteria agrave outra
5
patologia Ateacute 12 a 40 dos pacientes com autoanticorpos quentes podem apresentar
aloanticorpos de significado cliacutenico mascarados pelos autoanticorpos (SHIREY et al 2002)
Eacute importante detectar a presenccedila de anticorpos no plasmasoro de um receptor de
transfusatildeo para garantir que seja transfundido sangue compatiacutevel Quando a pesquisa de
anticorpo irregular resultar positiva para um ou mais anticorpos de relevacircncia clinica eacute
necessaacuterio confirmar a ausecircncia do respectivo antiacutegeno na hemaacutecia do receptor assim como
selecionar para transfusatildeo concentrados de hemaacutecias tambeacutem negativos para aqueles
antiacutegenos evitando assim reaccedilotildees transfusionais (WALKER 2011)
A detecccedilatildeo de um anticorpo irregular eacute inicialmente realizada pela triagem de
anticorpos na qual o soroplasma do receptor eacute testado com 2 a 3 hemaacutecias do tipo ldquoOrdquo O
conjunto de fenoacutetipos dessas hemaacutecias deve contemplar os antiacutegenos de maior importacircncia
cliacutenica Como os anticorpos irregulares de maior interesse cliacutenico satildeo na maior parte das
vezes imunes portanto da classe IgG eacute obrigatoacuteria a fase de antiglobulina (AGH) do teste
ou teste indireto da antiglobulina (TIA) uma vez que esses anticorpos satildeo incompletos
(CASTILHO JUNIOR e REID 2015) O teste de triagem estando positivo deve-se fazer a
identificaccedilatildeo da especificidade do anticorpo utilizando um painel com maior nuacutemero de
hemaacutecias fenotipadas
114 PROVA DE COMPATIBILIDADE
A prova de compatibilidade eacute um teste obrigatoacuterio em caso de transfusatildeo de
componentes eritrocitaacuterios Tambeacutem chamada de prova de compatibilidade maior deve ser
realizada antes da administraccedilatildeo de sangue total ou concentrado de hemaacutecias utilizando-se
hemaacutecias obtidas do tubo coletor da bolsa a ser transfundida e o soro ou plasma do receptor
(BRASIL 2016)
Eacute definido como o procedimento para excluir a incompatibilidade entre o doador e o
receptor Tem o objetivo de detectar anticorpos que podem natildeo ter sido encontrados na
pesquisa de anticorpos devido a ausecircncia ou pouca expressatildeo de antiacutegenos no painel de
hemaacutecias aleacutem da possibilidade de terem ocorrido erros teacutecnicos ou notacionais durante a
realizaccedilatildeo da pesquisa (MELO 2007)
6
115 FENOTIPAGEM PARA OUTROS SISTEMAS
Aleacutem da pesquisa de ABORh que eacute realizado rotineiramente a fenotipagem para
outros sistemas tambeacutem denominado ldquofenotipagem estendidardquo determina a presenccedila ou
ausecircncia de antiacutegenos considerados de importacircncia cliacutenica A fenotipagem natildeo eacute obrigatoacuteria
nos testes preacute-transfusionais poreacutem a legislaccedilatildeo atual recomenda a realizaccedilatildeo da fenotipagem
eritrocitaacuteria dos antiacutegenos C (RH2) E (RH3) c (RH4) e (RH5) K (KELL1) Fya (FY1) Fy
b
(FY2) Jka
(JK1) Jkb (JK2) S (MNS3) e s (MNS4) para pacientes aloimunizados e pacientes
com indicaccedilatildeo de transfusatildeo crocircnica (BRASIL 2016)
A seleccedilatildeo de concentrados de hemaacutecias com o mesmo fenoacutetipo do receptor para
transfusatildeo pode evitar reaccedilotildees transfusionais hemoliacuteticas no paciente previamente
aloimunizado tambeacutem previne a sensibilizaccedilatildeo por outros antiacutegenos o que normalmente
torna as transfusotildees seguintes ainda mais complicadas A fenotipagem do paciente tambeacutem
auxilia na identificaccedilatildeo dos anticorpos pois espera-se que nas hemaacutecias do paciente o
antiacutegeno seja negativo para o anticorpo encontrado servindo de guia para teste de exclusatildeo de
anticorpos (SANTOS 2014 WALKER 2011)
A incidecircncia de aloanticorpos aumenta com o nuacutemero de transfusotildees no entanto a
implantaccedilatildeo de rotina de fenotipagem com transfusatildeo profilaacutetica de hemaacutecias com fenoacutetipo
compatiacutevel para pacientes candidatos agrave politransfusatildeo como os portadores de doenccedila
falciforme talassemia anemia aplaacutestica doenccedilas linfo e mieloproliferativas renais crocircnicos e
anemias refrataacuterias pode contribuir para o baixo iacutendice de sensibilizaccedilatildeo nessas populaccedilotildees
(FLUIT KUNST e DRENTHE-SCHONK 1999 MARTINS et al 2008 e VICHINSKY et
al 2001) Outro grupo de pacientes que se beneficia com a transfusatildeo de mesmo fenoacutetipo satildeo
os pacientes com AHAI uma vez que o autoanticorpo pode mascarar a presenccedila de um
aloanticorpo de significado cliacutenico em ateacute 40 dos casos Mesmo com as teacutecnicas utilizadas
ldquoin vitrordquo para remover a interferecircncia do autoanticorpo no soro um aloanticorpo pode natildeo
ser identificado e dessa forma transfundir o mesmo fenoacutetipo do paciente evitaria reaccedilatildeo
hemoliacutetica pelos anticorpos voltados contra antiacutegenos de maior importacircncia cliacutenica e de
frequecircncia intermediaacuteria Aleacutem disso os pacientes com AHAI satildeo fortes respondedores e a
transfusatildeo profilaacutetica do mesmo fenoacutetipo previne a aloimunizaccedilatildeo (SHIREY et al 2002)
Aleacutem de fenotipar o receptor eacute importante tambeacutem que os bancos de sangue tenham
rotinas de fenotipagem de doadores para atender as necessidade dos pacientes aloimunizados
ou em esquema de transfusatildeo crocircnica (PINTO BRAGA e SANTOS 2011)
7
Rotineiramente eacute inviaacutevel estabelecer o fenoacutetipo eritrocitaacuterio completo de um
indiviacuteduo pela grande diversidade de sistemas sanguiacuteneos descritos Ate junho de 2015 jaacute
haviam sido classificados 308 antiacutegenos atribuiacutedos a 36 sistemas definidos pela Sociedade
Internacional de Transfusatildeo de Sangue (ISBT) (CASTILHO JUNIOR e REID 2015)
Portanto o paciente eacute normalmente fenotipado para os antiacutegenos de maior importacircncia
clinica
Alguns fatores podem limitar a realizaccedilatildeo da fenotipagem eritrocitaacuteria Um dos fatores
eacute a transfusatildeo alogecircnica realizada haacute menos de 90 dias Neste caso podem ocorrer resultados
falso positivos para determinados antiacutegenos devido agrave presenccedila de hemaacutecias do doador
(LAINE et al 2000)
Outro fator eacute a presenccedila de anticorpo sensibilizando a hemaacutecia do paciente e
provocando positividade do teste direto da antiglobulina humana (TDA) Os soros
normalmente utilizados para fenotipagem especialmente para os antiacutegenos Fya
(FY1) Fyb
(FY2) Jka
(JK1) Jkb
(JK2) S (MNS3) e s (MNS4) necessitam da fase de antiglobulina
humana (AGH) para que ocorra aglutinacatildeo Amostras que apresentam o TDA positivo
aglutinam apoacutes reaccedilatildeo com a AGH natildeo pela real presenccedila do antiacutegeno em sua superfiacutecie mas
pela interaccedilatildeo da AGH com o anticorpo que estaacute sensibilizando o eritroacutecito A interferecircncia
do TDA positivo pode ser anulada atraveacutes de algumas teacutecnicas capazes de dissociar o
anticorpo como por exemplo o tratamento da hemaacutecia sensibilizada com cloroquina ou com
glicina-aacutecida-EDTA (BRANCH e PETZ 1999 SHIREY et al 2002 e LEGER 2011)
12 METODOLOGIAS APLICADOS Agrave ROTINA IMUNO-HEMATOLOacuteGICA
Todos os testes que compotildeem a rotina preacute-transfusional usam meacutetodos soroloacutegicos
que envolvem a reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo e tem como objetivo determinar o perfil antigecircnico
eritrocitaacuterio do receptor e do doador assim como identificar em seu soro a presenccedila de
anticorpos contra antiacutegenos eritrocitaacuterios que possam comprometer a sobrevida das hemaacutecias
transfundidas Para testar o antiacutegeno na superfiacutecie da hemaacutecia eacute necessaacuterio dispor de um
antissoro com especificidade conhecida para aquele antiacutegeno Por outro lado para testar a
presenccedila de um determinado anticorpo no soro ou plasma do receptor eacute necessaacuterio o uso de
hemaacutecias com perfil antigecircnico conhecido (SANTOS 2014)
Diversas metodologias satildeo aplicadas nos laboratoacuterios de imunohematologia Cada
serviccedilo de hemoterapia faz a escolha do meacutetodo que seraacute aplicado de acordo com o perfil do
laboratoacuterio com o volume de exames diaacuterios e tambeacutem com o custo envolvido Todas essas
8
teacutecnicas tecircm como objetivo comum demonstrar a reaccedilatildeo entre antiacutegeno e anticorpo no
entanto elas se baseiam em diferentes princiacutepios Muitas metodologias satildeo atualmente
aplicadas agrave imunohematologia entre elas o sistema de fase soacutelida a tecnologia de hemaacutecias
magnetizadas a biologia molecular e ateacute mesmo a citometria de fluxo no entanto os meacutetodos
mais tradicionais satildeo aqueles baseados no princiacutepio de hemaglutinaccedilatildeo
121 MEacuteTODOS DE FASE FLUacuteIDA
Os meacutetodos de fase fluiacuteda satildeo testes baseados na hemaglutinaccedilatildeo e incluem o teste em
tubo e o teste em microplacas Uma suspensatildeo de hemaacutecias eacute adicionada ao plasma ou soro
em seguida eacute realizada a centrifugaccedilatildeo e por fim eacute feita a leitura do resultado que eacute
considerado positivo se for observado algum grau de aglutinaccedilatildeo ou hemoacutelise A intensidade
de aglutinaccedilatildeo eacute graduada de acordo com o tamanho dos agregados desprendidos da
superfiacutecie apoacutes agitaccedilatildeo delicada do tubo ou microplaca Os meacutetodos de hemaglutinaccedilatildeo satildeo
aplicados a todos os testes preacute-transfusionais Como os anticorpos ABO satildeo aglutininas frias
a tipagem eacute realizada em temperatura ambiente (22degC) no entanto ao investigar a presenccedila
de anticorpos irregulares que como jaacute mencionado eacute na maioria das vezes anticorpos
incompletos da classe IgG eacute essencial que a reaccedilatildeo seja incubada a 37degC As reaccedilotildees satildeo
facilitadas com a utilizaccedilatildeo de potencializadores e da antiglobulina humana (WALKER e
HARMENING 2012 AABB 2011)
Nos meacutetodos de fase fluiacuteda nos quais a AGH eacute empregada a fase de lavagem eacute
fundamental Apoacutes a incubaccedilatildeo do soro com as hemaacutecias deve ser realizada a lavagem da
reaccedilatildeo para remover o excesso de anticorpos natildeo ligados agraves hemaacutecias jaacute que os anticorpos
livres podem bloquear a AGH quando ela eacute adicionada e levar a resultados falso negativos
(AABB 2011)
Os testes de hemaglutinaccedilatildeo satildeo os mais tradicionais entre os meacutetodos ainda hoje
aplicados agrave rotina de bancos de sangue A vantagem desses meacutetodos eacute o baixo custo quando
comparado agraves teacutecnicas mais modernas mas apresentam tambeacutem desvantagens A teacutecnica em
tubo por exemplo natildeo permite automaccedilatildeo eacute trabalhosa e exige matildeo-de-obra bastante treinada
na execuccedilatildeo das diversas etapas do teste e mesmo assim pode haver subjetividade na
interpretaccedilatildeo dos resultados aleacutem de resultados falso-negativos (DOWNES 2011 ZANTEK
et al 2012)
9
122 COLUNAS DE GEL
A teacutecnica em gel iniciada na deacutecada de 90 representou uma grande revoluccedilatildeo na
rotina laboratorial tornando-se muito popular Aleacutem de ser sensiacutevel a teacutecnica dispensa a fase
de lavagem antes da adiccedilatildeo da AGH assim como a agitaccedilatildeo do teste para leitura reduzindo o
nuacutemero de resultados falsos negativos decorrentes dessas duas etapas e o tempo para
execuccedilatildeo dos testes (LAPIERRE et al 1989 NOVARETTI et al 2000 NOVARETTI et
al 2004) Os reagentes satildeo comercializados na forma de cartotildees plaacutesticos contendo
microtubos preenchidos por gel composto por microesferas de acrilamida-dextran Nesta
metodologia tambeacutem baseada na hemaglutinaccedilatildeo a suspensatildeo de hemaacutecias e o soro satildeo
depositados em uma cacircmara acima da coluna de gel e em seguida procede-se com a
centrifugaccedilatildeo dos cartotildees As microesferas atuam como uma malha que permite a passagem
em direccedilatildeo ao fundo do microtubo apenas das hemaacutecias natildeo aglutinadas enquanto as
hemaacutecias aglutinadas ficam retidas na parte superior da coluna ou ao longo dela (GREEN e
KLOSTERMANN 2012) Portanto quanto maior a agregaccedilatildeo mais hemaacutecias ficam retidas
no topo da coluna Dependendo do tipo de teste a ser realizado pode ser utilizado gel neutro
ou gel especiacutefico impregnado pelo anticorpo desejado e o gel contendo antiglobulina humana
que satildeo utilizados para os testes diretos e indiretos da antiglobulina (LAPIERRE et al 1989)
A coluna de gel ainda permite a visualizaccedilatildeo clara de duas populaccedilotildees distintas de hemaacutecias
como em pacientes receacutem transfundidos
123 BIOLOGIA MOLECULAR
A biologia molecular ou genotipagem estaacute sendo cada vez mais aplicada aos grupos
sanguiacuteneos pois fornece resultados seguros e precisos especialmente nos casos em que natildeo eacute
possiacutevel a realizaccedilatildeo da fenotipagem como em pacientes receacutem-transfundidos e pacientes
com TDA positivo Na genotipagem eacute possiacutevel determinar atraveacutes do DNA do paciente
extraiacutedo de seus leucoacutecitos de sangue perifeacuterico o fenoacutetipo eritrocitaacuterio deduzido sem
qualquer interferecircncia do anticorpo que sensibiliza a hemaacutecia ou de hemaacutecias alogecircnicas
transfundidas Sua realizaccedilatildeo no entanto exige o treinamento de equipe especializada e capaz
de interpretar os resultados em conjunto com os achados soroloacutegicos (JUNIOR e OLIVATO
2007)
Apesar de ser uma ferramenta de grande importacircncia hoje na imuno-hematologia
ainda estaacute restrito aos grandes centros de hemoterapia no Brasil poucos serviccedilos puacuteblicos de
sauacutede dispotildeem desse recurso e utilizam teacutecnicas de genotipagem de grupos sanguiacuteneos para
atendimento a seus pacientes Esta abordagem poreacutem vem sendo introduzida em algumas
10
instituiccedilotildees de reconhecida competecircncia na hemoterapia mas sua disponibilizaccedilatildeo deve
tornar-se mais generalizada atraveacutes da formaccedilatildeo de centros de referecircncia para atendimento
das diversas unidades de hemoterapia (MARTINS et al 2009) Dessa forma muitas decisotildees
transfusionais especialmente em urgecircncias ainda devem ser tomadas sem o resultado da
genotipagem eritrocitaacuteria
13 TESTE DA ANTIGLOBULINA
Coombs Mourant e Race descreveram em 1945 uma teacutecnica com utilizando soro de
coelho contendo antiglobulina humana (AGH) que posteriormente foi chamada de ldquosoro de
Coombsrdquo O meacutetodo foi desenvolvido inicialmente para ampliar o efeito de aglutininas fracas
do sistema Rh anticorpos ldquoincompletosrdquo que normalmente natildeo apresentavam aglutinaccedilatildeo
visiacutevel O teste foi concebido como um instrumento de investigaccedilatildeo de doenccedila hemoliacutetica do
receacutem-nascido e de reaccedilotildees transfusionais causadas por anticorpos Rh que estavam presentes
no soro dos paciente poreacutem que natildeo eram demonstraacuteveis pelas teacutecnicas ateacute entatildeo existentes
A maior parte dos anticorpos de significado cliacutenico assim como seus respectivos
antiacutegenos foram descritos apoacutes o surgimento do ldquosoro de Coombsrdquo em 1945 sendo assim o
teste da antiglobulina representa ateacute hoje a forma mais importante de aglutinaccedilatildeo artificial em
imunohematologia permitindo revelar a presenccedila de anticorpos na membrana da hemaacutecia A
antiglobulina humana eacute constituiacuteda por anticorpo especiacutefico contra a porccedilatildeo Fc de outro
anticorpo Quando um anticorpo ldquoincompletordquo sensibiliza a hemaacutecia normalmente natildeo
provoca aglutinaccedilatildeo visiacutevel Apoacutes a adiccedilatildeo da AGH ao meio esta reconhece e se liga agraves
porccedilotildees Fc dos anticorpos que sensibilizam a hemaacutecia formando assim uma malha e
provocando aglutinaccedilatildeo visiacutevel (BARJAS-CASTRO 2013)
Os reagentes de antiglobulina podem ser poliespeciacuteficos ou monoespeciacuteficos Os
poliespeciacuteficos satildeo uma mistura de anticorpos ant-IgG e anti-C3d (fraccedilatildeo C3d do
complemento) Os reagentes monoespecificos podem ser anti-IgG anti-IgM anti-IgA anti-
complemento podendo ser anti-C3d e anti-C3b
O teste da antiglobulina pode ser usado para detectar hemaacutecias sensibilizadas com
aloanticorpos IgG autoanticorpos IgG e componentes do complemento A sensibilizaccedilatildeo
pode ocorrer ldquoin vivordquo ou ldquoin vitrordquo O uso do AGH para detectar a sensibilizaccedilatildeo ldquoin vitrordquo
tem dois estaacutegios e eacute denominado teste indireto da antiglobulina A sensibilizaccedilatildeo ldquoin vivordquo eacute
detectada em procedimento de um uacutenico estagio chamado teste direto da antiglobulina (TDA)
11
Os testes direto e indireto satildeo ateacute hoje amplamente aplicados como princiacutepio de inuacutemeros
testes soroloacutegicos em imuno-hematologia (GREEN e KLOSTERMANN 2012)
131 TESTE DIRETO DA ANTIGLOBULINA
O teste direto da antiglobulina humana revela a presenccedila de anticorpo eou fraccedilatildeo do
complemento ligados agrave superfiacutecie das hemaacutecias As sensibilizaccedilatildeo das hemaacutecias ocorrida ldquoin
vivordquo natildeo eacute visualizada mas apoacutes a adiccedilatildeo da antiglobulina humana ocorre a aglutinaccedilatildeo que
eacute visualizada macroscopicamente (Figura 1)
Figura 1 - Princiacutepio da teacutecnica direta da antiglobulina Teste utilizado para demonstrar a sensibilizaccedilatildeo ldquoin
vivordquo das hemaacutecias O sangue total eacute coletado do paciente em tubo contendo anticoagulante EDTA Na teacutecnica
realizada em tubo uma suspensatildeo de hemaacutecias 5 em soluccedilatildeo de salina eacute preparada Uma gota dessa suspensatildeo
eacute lavada 3 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica para retirada de anticorpos que estatildeo livres no plasma Toda soluccedilatildeo eacute
retirada e adiciona-se o soro de Coombs (antiglobulina humana) O soro de Coombs reconhece os anticorpos que
estatildeo ligados agrave superfiacutecie das hemaacutecias fazendo com que ocorra aglutinaccedilatildeo visiacutevel macroscopicamente
Apesar de natildeo ser um teste preacute-transfusional obrigatoacuterio o TDA eacute um dos testes mais
importantes para investigar e classificar quadros hemoliacuteticos como de origem imune ou natildeo
imune O seu valor preditivo positivo em vigecircncia de anemia hemoliacutetica eacute de 83 poreacutem natildeo
havendo sinais de hemoacutelise seu valor preditivo eacute apenas 14 Eacute por esse motivo que a
interpretaccedilatildeo do TDA positivo deve levar em consideraccedilatildeo a histoacuteria cliacutenica e os resultados
dos outros exames laboratoriais A realizaccedilatildeo do TDA eacute obrigatoacuteria na investigaccedilatildeo
12
laboratorial de diversos quadros hemoliacuteticos entre eles a anemia hemoliacutetica autoimune
(AHAI) a reaccedilatildeo hemoliacutetica imune poacutes-transfusional a siacutendrome do linfoacutecito passageiro a
doenccedila hemoliacutetica perinatal e a hemoacutelise droga-dependente (LEGER 2011)
Resultados de TDA positivos foram tambeacutem observados em indiviacuteduos com niacuteveis
seacutericos elevados de IgG ou complemento sem evidecircncia de anemia hemoliacutetica imune como
em pacientes com doenccedila falciforme talassemia doenccedila renal crocircnica mieloma muacuteltiplo
doenccedilas autoimunes e siacutendrome da imunodeficiecircncia adquirida (SIDA) Aleacutem disso pequenas
quantidades de IgG (5 a 90 moleacuteculas por hemaacutecia) e complemento (5 a 40 moleacuteculas por
hemaacutecia) podem estar presentes nas hemaacutecias de indiviacuteduos saudaacuteveis sem associaccedilatildeo com
reduccedilatildeo na sobrevida das mesmas A positividade do TDA depende da populaccedilatildeo estudada e
pode variar de 01 entre doadores de sangue sem qualquer sinal cliacutenico de hemoacutelise ateacute
15 em pacientes hospitalizados (CASTILHO JUNIOR e REID 2015 LEGER 2011)
Indiviacuteduos que apresentam TDA positivo seja agraves custas de IgG eou complemento
com ou sem sinais cliacutenicos de hemoacutelise teratildeo a fenotipagem eritrocitaacuteria prejudicada A
fenotipagem de indiviacuteduos com TDA positivo especialmente quando utilizado o teste indireto
da antiglobulina pode acarretar resultados falsos positivos e levar a seleccedilatildeo de fenoacutetipo
incorreto para transfusatildeo
132 TESTE INDIRETO DA ANTIGLOBULINA
O teste indireto da antiglobulina (TIA) eacute utilizado para revelar a sensibilizaccedilatildeo ldquoin
vitrordquo das hemaacutecias e eacute aplicado a diversos testes soroloacutegicos em imunohematologia entre
eles a pesquisa de anticorpos identificaccedilatildeo de anticorpos testes de compatibilidade
fenotipagem eritrocitaacuteria e titulaccedilatildeo de anticorpos Na teacutecnica indireta a hemaacutecia que contecircm
o antiacutegeno eacute colocada em contato ldquoin vitrordquo com o anticorpo que se liga mas natildeo promove a
aglutinaccedilatildeo visiacutevel A adiccedilatildeo da AGH forma uma malha entre os anticorpos que sensibilizam
as hemaacutecias e provoca a aglutinaccedilatildeo macroscoacutepica (figura 2)
Caso a amostra de hemaacutecia estudada seja previamente sensibilizada resultados falsos
positivos podem ser obtidos no TIA jaacute que a AGH reagiraacute com a moleacutecula que sensibilizava
anteriormente a hemaacutecia mesmo se o anticorpo especiacutefico natildeo tiver se ligado ao antiacutegeno
correspondente
13
133 CONDICcedilOtildeES CLIacuteNICAS COM TDA POSITIVO
O TDA positivo deve ser interpretado cuidadosamente sempre em conjunto com o
quadro cliacutenico do paciente A positividade isolada do TDA natildeo significa hemoacutelise A
interpretaccedilatildeo do teste positivo requer o conhecimento do diagnoacutestico do paciente da presenccedila
de sinais e sintomas sugestivos de hemoacutelise assim como de seu histoacuterico transfusional
gestacional e de informaccedilotildees sobre o uso recente de medicaccedilotildees (LEGER 2011)
Figura 2 ndash Princiacutepio do teste indireto da antiglobulina O TIA pode ser utilizado na pesquisa de anticorpos de
especificidades desconhecidas livres no soroplasma como eacute o caso da pesquisa e identificaccedilatildeo de anticorpos
irregulares Ele eacute tambeacutem utilizado para determinar a presenccedila de antiacutegenos na membrana da hemaacutecia quando
satildeo empregados soros de especificidades conhecidas da classe IgG No primeiro caso o soroplasma contendo o
anticorpo desconhecido eacute colocado em contato com hemaacutecias cujo perfil antigecircnico eacute conhecido No segundo
caso utiliza-se soro de especificidade conhecida da classe IgG para determinar a presenccedila ou ausecircncia de um
antiacutegeno na membrana O anticorpo encontra o antiacutegeno correspondente e ocorre a ligaccedilatildeo do anticorpo agrave
hemaacutecia mas natildeo ocorre aglutinaccedilatildeo Apoacutes a adiccedilatildeo da AGH que se liga aos anticorpos formando uma malha
ocorre a aglutinaccedilatildeo visiacutevel
O TDA positivo eacute uma achado claacutessico de algumas condiccedilotildees cliacutenicas como a reaccedilatildeo
transfusional hemoliacutetica a doenccedila hemoliacutetica do feto e do receacutem-nascido (DHFRN) a anemia
hemoliacutetica induzida por drogas a siacutendrome do linfoacutecito passageiro e a anemia hemoliacutetica
autoimune (AHAI) Portanto o TDA positivo pode ser decorrente da sensibilizaccedilatildeo da
hemaacutecia autoacuteloga por um autoanticorpo ou por um aloanticorpo ligado agrave hemaacutecia alogecircnica
circulante A positividade do TDA pode ainda ocorrer de forma passiva em pacientes que
14
recebem imunoglobulinas humanas ou ainda pela transfusatildeo de plaquetas ABO natildeo idecircntico
(LEGER 2011 RALPH 2012 ZANTEK et al 2012)
Nas reaccedilotildees transfusionais hemoliacuteticas imunes o aloanticorpo do receptor sensibiliza
as hemaacutecias transfundidas do doador e reduz sua sobrevida ao removecirc-la precocemente da
circulaccedilatildeo pela fagocitose no sistema retiacuteculo-endotelial ou pela hemoacutelise intravascular As
reaccedilotildees podem ser agudas se ocorrem ateacute 24 horas ou tardias quando ocorrem apoacutes 24 horas
da transfusatildeo A gravidade das reaccedilotildees hemoliacuteticas pode variar de um simples rendimento
transfusional inadequado agrave quadros graves de hemoacutelise intravascular evoluindo ateacute mesmo
com choque vascular e oacutebito O TDA pode resultar negativo caso toda massa eritrocitaacuteria
transfundida tenha sido destruiacuteda (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
Na doenccedila hemoliacutetica do feto e do receacutem-nascido (DHFRN) anticorpos maternos da
classe IgG atravessam a barreira placentaacuteria e sensibilizam as hemaacutecias fetais que seratildeo
destruiacutedas precocemente levando agrave anemia fetal Apesar da incompatibilidade ABO feto-
materna ser a causa mais frequente de DHFRN raramente ela eacute responsaacutevel pela ocorrecircncia
de quadros graves Por outro lado anticorpos contra antiacutegenos do sistema Rh e Kell
especialmente Anti-D (Anti-RH1) Anti-c (Anti-RH4) e Anti-Kell (Anti-KELL1) satildeo
conhecidos por causar DHFRN severa Raramente outros anticorpos tambeacutem podem estar
implicados na DHFRN como os anticorpos contra antiacutegenos do sistema Kidd Duffy MNS e
Diego (ZANTEK et al 2012)
A hemoacutelise droga-dependente eacute causada pela produccedilatildeo de um anticorpo voltado contra
a droga ligada agrave membrana eritrocitaacuteria ou ainda contra o complexo droga-membrana A
classe de medicaccedilotildees mais comumente envolvida eacute a dos antimicrobianos betalactacircmicos
(penicilinas e cefalosporinas) mas outras classes como quimioteraacutepicos e anti-inflamatoacuterios
tambeacutem satildeo descritos (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
Apoacutes transplante de ceacutelulas progenitoras hematopoieacuteticas em que o doador possui
anticorpos contra antiacutegenos eritrocitaacuterios do receptor o linfoacutecito de memoacuteria do doador pode
resistir ao esquema imunossupressor utilizado e continuar a produccedilatildeo de anticorpos que
reconhecem a hemaacutecia incompatiacutevel do receptor ainda circulante O quadro cliacutenico pode
variar de um simples TDA positivo sem outros sinais ou sintomas ateacute um quadro hemoliacutetico
grave e abrupto (LEGER 2011)
15
134 ANEMIA HEMOLIacuteTICA AUTOIMUNE
A anemia hemoliacutetica autoimune eacute caracterizada pela destruiccedilatildeo precoce das hemaacutecias
autoacutelogas por autoanticorpos que sensibilizam as hemaacutecias e levam agrave fagocitose pelos
macroacutefagos no sistema reticulo-endotelial ou hemoacutelise intravascular O diagnoacutestico da AHAI
baseia-se na presenccedila de hemoacutelise cliacutenica associada agrave evidecircncia de fator imune representado
pelo TDA positivo As classes de anticorpos envolvidas em quadros de AHAI satildeo IgG IgM e
raramente IgA (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012) Satildeo raros os casos de AHAI com TDA
negativo que podem estar relacionados a um autoanticorpo de baixa avidez de densidade
inferior agrave detecccedilatildeo do meacutetodo ou ainda de classe de imunoglobulina natildeo avaliada pelo
meacutetodo utilizado para o teste (GARRATY 2005)
A AHAI pode ser classificada em dois grupos principais de acordo com a melhor
temperatura de reaccedilatildeo do autoanticorpo As anemias hemoliacuteticas causadas por anticorpos
quentes que reagem melhor a 37oC e geralmente IgG representam 80 dos casos de AHAI
Nas AHAI por anticorpo quente o TDA pode ser positivo para IgG mais complemento (67)
somente IgG (20) ou somente por complemento (13) As anemias causadas por
anticorpos frios geralmente da classe IgM e que reagem melhor em temperatura ambiente ou
a 4oC representam aproximadamente 20 dos casos de AHAI Por exibirem amplitude
teacutermica esses anticorpos ligam-se agraves hemaacutecias ao atingirem a circulaccedilatildeo nas extremidades do
corpo fixam o complemento e desprendem-se da hemaacutecia apoacutes retornar para partes mais
quentes Por esse motivo em AHAI por anticorpos frios o TDA eacute positivo apenas agraves custas
de C3 e normalmente o IgM natildeo eacute detectado (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
A presenccedila do autoanticorpo IgG pode ser confirmada atraveacutes da eluiccedilatildeo do anticorpo
da hemaacutecia Tipicamente o eluato na AHAI por anticorpo quente reage com todas as ceacutelulas
testadas de um painel de hemaacutecias alogecircnicas do tipo ldquoOrdquo ou pode eventualmente exibir uma
especificidade conhecida como Anti-e (Anti-RH5) Nas AHAI a frio por sua vez espera-se
um eluato negativo (LEGER 2011)
Os autoanticorpos satildeo com frequecircncia encontrados livres no plasma e natildeo somente
ligados agraves hemaacutecias autoacutelogas Eles podem interferir em todas as fases dos testes preacute-
transfusionais nas quais o plasma eacute testado especialmente os autoanticorpos quentes que
acarretam resultados positivos em todos os testes levados agrave fase de antiglobulina humana
Esses anticorpos portanto positivam a pesquisa de anticorpos irregulares e mascaram a
presenccedila de aloanticorpos de significado cliacutenico Aproximadamente 60 dos pacientes que
apresentam AHAI a quente apresentam anticorpos que reagem em meio salino mas se forem
16
levados em conta meacutetodos mais sensiacuteveis como PEG enzima e estudo em gel a positividade
pode ser superior a 90 (LEGER 2011)
Aleacutem da eficaacutecia da transfusatildeo ser comprometida pela diminuiccedilatildeo da vida-meacutedia das
hemaacutecias a presenccedila do autoanticorpo dificulta a realizaccedilatildeo dos testes preacute-transfusionais e
compromete a seguranccedila transfusional Os autoanticorpos reagem normalmente como
panaglutininas pois satildeo normalmente voltados contra antiacutegenos puacuteblicos na maior parte das
vezes contra antiacutegenos do sistema Rh Por apresentarem essas caracteriacutesticas podem ainda
mascarar a presenccedila de aloanticorpos de significado clinico e levar a testes de compatibilidade
positivos exigindo uma avaliaccedilatildeo criteriosa da necessidade da transfusatildeo (BRANCH e PETZ
1999 JUNIOR e OLIVATO 2004)
Remover a interferecircncia do autoanticorpo para avaliar a presenccedila de aloanticorpos
mascarados nem sempre eacute possiacutevel mesmo utilizando teacutecnicas de autoadsorccedilatildeo ou
aloadsorccedilatildeo que aleacutem de tudo satildeo demoradas e exigem de 2 a 6 horas para conclusatildeo
(GARRATY e GEORGE 2002) Nesses casos a fenotipagem eritrocitaacuteria do paciente eacute de
extrema utilidade especialmente em situaccedilotildees de urgecircncia A definiccedilatildeo do fenoacutetipo do
paciente para os antiacutegenos de maior importacircncia cliacutenica pode auxiliar a seleccedilatildeo de unidades
de hemaacutecias com mesmo fenoacutetipo o que garante que eventuais aloanticorpos natildeo
identificados sejam respeitados e tambeacutem evita nova sensibilizaccedilatildeo (JUNIOR e OLIVATO
2004 SHIREY et al 2002)
135 TRATAMENTO DE HEMAacuteCIAS COM TDA POSITIVO
O TDA positivo impede a fenotipagem eritrocitaacutecia por meacutetodos que exigem a fase de
AGH uma vez que a aglutinaccedilatildeo ocorreraacute devido agrave interaccedilatildeo da AGH com o autoanticorpo
que sensibiliza a hemaacutecia do paciente levando a resultados falso positivos Em algumas
situaccedilotildees como na AHAI por anticorpo quente a fenotipagem eacute especialmente importante
pois o autoanticorpo interfere na triagem e identificaccedilatildeo de anticorpos assim como no teste de
compatibilidade e dificultam a detecccedilatildeo de aloanticorpos de significado cliacutenico que
obrigatoriamente devem ser respeitados Nessas situaccedilotildees a fenotipagem eritrocitaacuteria
determina o perfil antigecircnico do paciente e possibilita o fornecimento de unidades de
hemaacutecias com o mesmo fenoacutetipo para a transfusatildeo evitando a sensibilizaccedilatildeo para novos
antiacutegenos assim como reaccedilotildees hemoliacuteticas transfusionais No entanto eacute necessaacuterio aplicar
meacutetodos que natildeo sofram interferecircncia do TDA positivo ou seja meacutetodos que natildeo necessitem
da fase de AGH ou meacutetodos de bloqueio do anticorpo sem bloquear o antiacutegeno Uma opccedilatildeo eacute
a utilizaccedilatildeo de soros monoclonais IgM (salinos ou de meio proteico natildeo concentrado) mas
17
nem sempre esses reagentes estatildeo disponiacuteveis especialmente os reagentes monoclonais para
os antiacutegenos dos sistemas Duffy ( Fya Fy
b) Kidd ( Jk
a Jk
b) e MNS (S s) (JUNIOR e
OLIVATO 2004) Outra opccedilatildeo eacute a teacutecnica de bloqueio que pode ser utilizada para tratar
hemaacutecias para posterior fenotipagem em casos de TDA positivos com reatividade le2+
Em casos onde a positividade do TDA eacute maior que 2+ estaacute indicada a tratamento
quiacutemico para remoccedilatildeo da interferecircncia do autoanticorpo antes de realizar a fenotipagem Entre
as teacutecnicas utilizadas atualmente estatildeo o ZZAP a cloroquina e a glicina aacutecidaEDTA
1351 TEacuteCNICA DE BLOQUEIO
A teacutecnica de bloqueio se baseia na utilizaccedilatildeo de anti-IgG (Coombs monoespeciacutefico)
para tratar as hemaacutecias com TDA positivo O anticorpo anti-IgG se liga aos anticorpos que
estatildeo sensibilizando a hemaacutecias poreacutem sem o bloquear os antiacutegenos Os antiacutegenos que natildeo
estatildeo sensibilizados podem ser detectados atraveacutes dos antissoros especiacuteficos (SERERAT
VEIDT E DUTCHED 2000)
1352 TRATAMENTO DE HEMAacuteCIAS COM ZZAP
O Sulphydryl-Proteolytic Enzyme (ZZAP) que eacute uma mistura de ditiotreitol (DTT)
mais papaiacutena ativada com cisteiacutena eacute um reagente capaz de dissociar imunoglobulinas da
classe IgG ligadas a membrana dos eritroacutecitos enquanto trata enzimaticamente as hemaacutecias
O tratamento enzimaacutetico tambeacutem potencializa a ligaccedilatildeo do autoanticorpo ao antiacutegeno e
acelera o processo de autoadsorccedilatildeo O ZZAP pode desnaturar os antiacutegenos do sistema Duffy
MNS e Kell o que limita sua aplicaccedilatildeo para fins de fenotipagem (BRANCH e PETZ 1982)
1353 CLOROQUINA
Em 1982 Edwards Moulds e Judd propuseram a utilizaccedilatildeo da teacutecnica da cloroquina
que dissociava os complexos antiacutegeno-anticorpo e mantinha a membrana das hemaacutecias
iacutentegras Os derivados quinolecircicos jaacute haviam sido descritos anteriormente por Domokos e
Aszody em 1964 e Holtz Mantel e Buck em 1973 (apud Edwards Moulds e Judd 1982) pela
sua capacidade de separar imunocomplexos e inibir as reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo reduzindo
as cargas eleacutetricas das superfiacutecie das hemaacutecias A teacutecnica eacute uma das mais utilizadas nos
centros brasileiros para remover a interferecircncia do autoanticorpo e eacute tambeacutem a teacutecnica
atualmente adotada pelo laboratoacuterio de imunohematologia do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto
18
Edwards Moulds e Judd (1982) demonstraram que a teacutecnica da cloroquina para
dissociaccedilatildeo de anticorpos eacute uma teacutecnica simples efetiva e confiaacutevel para dissociar
imunoglobulina das hemaacutecias Desde que a membrana das hemaacutecias permaneccedila intacta natildeo
haacute perda da reatividade dos antiacutegenos e a sua maior aplicaccedilatildeo eacute a fenotipagem de hemaacutecias
com TDA positivo Os autores verificaram que em 83 das amostras sensibilizadas in vivo e
22 amostras (no total de 40) sensibilizadas ldquoin vitrordquo apresentaram TDA negativo e
puderam ser fenotipadas A teacutecnica poreacutem natildeo consegue remover os componentes do
complemento na maioria dos casos
Champagne e colaboradores (1999) testaram a teacutecnica da cloroquina para dissociar
antiacutegenos Bg comparando com a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA e verificaram vantagem em
relaccedilatildeo ao uso de um uacutenico reagente diminuindo a manipulaccedilatildeo e verificou que o mesmo natildeo
destroacutei antiacutegeno Kell
A cloroquina tambeacutem mostrou-se pouco efetivo em remover anticorpos do sistema
Duffy da superfiacutecie das hemaacutecias (EDWARDS MOUDS e JUDD 1982 ROZIERS e
SQUALI 1997)
1353 GLICINA-AacuteCIDAEDTA
A afinidade e a estabilidade entre a ligaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo eacute definida como a
resultante entre forccedilas atrativas e repulsivas entre ambos (CARUCIO e WISE 2012) e resulta
da somatoacuteria de forccedilas quiacutemicas dinacircmicas e fracas (natildeo covalentes) como pontes de
hidrogecircnio forcas eletrostaacuteticas forca de Van der Waals e pontes hidrofoacutebicas A estabilidade
dessa ligaccedilatildeo eacute facilmente abalada por alteraccedilotildees quiacutemicas e fiacutesicas no meio da reaccedilatildeo como
a alteraccedilatildeo do pH A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA se baseia na mudanccedila do pH para a
quebra da ligaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo (KOSANKE 2012)
A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA foi primeiramente descrita em 1986 por Louie Jieng
e Zeroulis que utilizaram 50 amostras de doadores sensibilizados ldquoin vitrordquo com anticorpos A
teacutecnica foi efetiva em 48 amostras permitindo o estudo do eluato assim como a fenotipagem
das hemaacutecias Os autores testaram tambeacutem a teacutecnica em 100 hemaacutecias TDA positivo que
puderam ser utilizadas para teacutecnicas de autoadsorccedilatildeo
Byrne (1991) descreveu a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA modificada e tambeacutem
verificou como uma opccedilatildeo para o tratamento de hemaacutecias com TDA positivo que deixava as
hemaacutecias intactas e o eluato viaacutevel para ser fenotipado
19
Roziers e Squali (1997) e Katharia e Chaudhary (2013) compararam a teacutecnica da
glicina-aacutecidaEDTA com as teacutecnicas da cloroquina e do aquecimento Verificaram maior
eficiecircncia da glicina-aacutecidaEDTA em relaccedilatildeo as outras duas teacutecnicas pois com uma mesma
quantidade de amostra produzia as hemaacutecias livres de anticorpo e tambeacutem o eluato Mostrou-
se ainda superior devido ao menor tempo exigido para sua realizaccedilatildeo o que favorece seu uso
em situaccedilotildees de urgecircncia e emergecircncia
As duas desvantagens da teacutecnica poreacutem eacute o fato de destruir os antiacutegenos do sistema
Kell e o fato de natildeo remover fraccedilotildees do complemento ligadas agrave hemaacutecia (PALLAS WILER e
McGEE 1991 ROZIERS e SQUALLI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012
e KATHARIA e CHAUNDHARY 2013)
20
2 OBJETIVOS
21 OBJETIVO GERAL
211 Avaliar a eficaacutecia da glicina-aacutecidaEDTA em remover os anticorpos ligados agraves
hemaacutecias sensibilizadas por anticorpos da classe IgG
22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
221 Preparaccedilatildeo dos reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
verificaccedilatildeo da estabilidade dos mesmos e avaliar custos
222 Testar a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA em amostras de hemaacutecias
sensibilizadas por anticorpos antieritrocitaacuterios humanos
223 Comparar a efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA com a teacutecnica da
cloroquina quanto a capacidade de remover a interferecircncia do anticorpo ligado
a hemaacutecia
224 Testar o eluato das amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA
225 Verificar se houve destruiccedilatildeo dos antiacutegenos eritrocitaacuterios apoacutes o tratamento
com glicina-aacutecidaEDTA e com cloroquina
226 Verificar se o tempo de execuccedilatildeo da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA descrito
nos textos de referecircncia eacute reprodutiacutevel
21
3 JUSTIFICATIVA
Algumas condiccedilotildees cliacutenicas podem levar ao depoacutesito ldquoin vivordquo de anticorpos eou
fraccedilotildees do complemento sobre as hemaacutecias Entre elas estatildeo as reaccedilotildees hemoliacuteticas poacutes-
transfusionais a doenccedila hemoliacutetica perinatal o uso de medicamentos e principalmente a
AHAI Na AHAI um anticorpo normalmente da classe IgG ou IgM reconhece antiacutegenos
proacuteprios na membrana eritrocitaacuteria e reduz a sobrevida da hemaacutecia levando a sua destruiccedilatildeo
pelos macroacutefagos no sistema reticulo-endotelial ou agrave ativaccedilatildeo do complexo de ataque agrave
membrana e agrave lise intravascular Os autoanticorpos satildeo voltados na maioria das vezes contra
antiacutegenos eritrocitaacuterios de alta frequecircncia populacional conhecidos como antiacutegenos puacuteblicos
e por este motivo reconhecem tanto hemaacutecias autoacutelogas quanto alogecircnicas
Devido agrave presenccedila do autoanticorpo livre no plasma e tambeacutem do anticorpo eou
complemento ligado agrave hemaacutecia o banco de sangue pode encontrar dificuldades em todas as
fases dos testes preacute-transfusionais do paciente com AHAI e deve utilizar teacutecnicas que
auxiliem na escolha do melhor hemocomponente melhorando a seguranccedila transfusional Essas
teacutecnicas visam remover a interferecircncia do autoanticorpo livre no soro e do autoanticorpo
ligado agrave hemaacutecia permitindo a detecccedilatildeo de aloanticorpos associados e a realizaccedilatildeo da
fenotipagem eritrocitaacuteria respectivamente
A finalizaccedilatildeo dos testes preacute-tranfusionais na presenccedila de autoanticorpo pode levar
algumas horas e nem sempre o paciente poderaacute aguardar Nesse contexto torna-se vantajosa a
aplicaccedilatildeo de teacutecnicas de raacutepida execuccedilatildeo
O presente estudo propotildee aplicar e avaliar a eficaacutecia da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
em remover os anticorpos ligados agrave hemaacutecia o que permite a fenotipagem eritrocitaacuteria
estendida e a seleccedilatildeo de concentrados de hemaacutecias com mesmo fenoacutetipo do paciente
Atualmente no Hemocentro de Ribeiratildeo Preto a teacutecnica utilizada para esse fim eacute o
tratamento das hemaacutecias com difosfato de cloroquina cujo tempo de execuccedilatildeo pode demorar
ateacute duas horas enquanto a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser realizada em apenas dois
minutos o que a tornaria opccedilatildeo de escolha especialmente em situaccedilotildees de urgecircncia Ao
contraacuterio da cloroquina a glicina-aacutecidaEDTA permite tambeacutem o estudo do eluato das
hemaacutecias tratadas
22
4 METODOL OGIA
41 AMOSTRAS DE DOADORES
Foram coletados 50 amostras de doadores de sangue que compareceram ao
Hemonuacutecleo de Araccedilatuba no periacuteodo de junho a agosto de 2016 Foram convidados a
participar da pesquisa doadores de repeticcedilatildeo do tipo sanguiacuteneo ldquoOrdquo RhD positivo
cadastrados no sistema de banco de sangue (SBS) do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto
Todos os doadores que concordaram em participar da pesquisa assinaram o termo de
consentimento livre e esclarecido (TCLE)
No momento da doaccedilatildeo foram coletados adicionalmente 5 mL de sangue total em
soluccedilatildeo anticoagulante EDTA (aacutecido dietilenoaminoaceacutetico) dispensando punccedilatildeo venosa
adicional para coleta da amostra O fluxograma 1 resume as etapas desenvolvidas no projeto
Fluxograma 1 - Fluxo da pesquisa utilizando as amostras de doadores
23
411 FENOTIPAGEM
Foram verificados se os doadores jaacute tinham fenotipagem para outros sistemas de
grupos sanguiacuteneos aleacutem do sistema ABORh que eacute realizado rotineiramente
A fenotipagem eritrocitaacuteria para outros sistemas ou fenotipagem estendida eacute realizada
para identificar a presenccedila ou ausecircncia de antiacutegenos considerados de importacircncia cliacutenica No
Hemonuacutecleo de Araccedilatuba uma parcela de doadores de repeticcedilatildeo satildeo fenotipados para os
antiacutegenos dos sistemas de grupo sanguiacuteneo Rh (antiacutegenos C c E e e) Kell (antiacutegeno K)
Duffy (antiacutegenos Fya e Fy
b) Kidd (antiacutegenos Jk
a e Jk
b) e sistema MNSs (antiacutegenos S e s)
A fenotipagem para o Rh e Kell eacute realizada por metodologia de microplaca utilizando
25 microL de hemaacutecia lavada e diluiacuteda a 5 em salina e 25 microL do antissoro comercial especiacutefico
A reaccedilatildeo eacute incubada 15 minutos a temperatura ambiente e centrifugadas para leitura Para os
antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s a metolodogia utilizado eacute gel contendo antiglobulina
humana (gel LissCoombs poliespeciacutefico) da marca BIO-RAD onde se utiliza suspensatildeo de
hemaacutecia em LISS (Soluccedilatildeo de baixa forccedila iocircnica) A suspensatildeo eacute preparada atraveacutes da
diluiccedilatildeo de 10 microL de hemaacutecia em 1000 microL de LISS Pipetado 50 microL dessa diluiccedilatildeo no gel e
adicionado 25 microL do antissoro especiacutefico Incuba-se em banho seco por 15 minutos a 37 deg
Celsius e eacute centrifugado em centriacutefuga especiacutefica Os antissoros utilizados eram das marcas
Fresenius e Lorne
Foi verificado a fenotipagem do doador no banco de dados do Hemocentro Os
registros dos fenoacutetipos dos doadores ficam armazenadas no sistema de banco de sangue
(SBS) Para doadores que natildeo tinham fenotipagem estendida preacutevia para antiacutegenos do sistema
Rh (C c E e e) e Kell (K) foi realizada a fenotipagem para esses antiacutegenos
O tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA e cloroquina para dissociar
anticorpos pode inativar enfraquecer ou destruir os antiacutegenos presentes nas hemaacutecias
alterando assim os resultados da fenotipagem Para verificar se houve destruiccedilatildeo dos
antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a e Jk
b S e s nas amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes
tratamento foram novamente fenotipadas ao final para os antiacutegenos que eram inicialmente
positivas
A repeticcedilatildeo da fenotipagem foi realizada nas amostras que apresentaram efetividade
no tratamento da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eou da cloroquina e a detecccedilatildeo do antiacutegeno
na amostra preacute-tratamento
24
412 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS HEMAacuteCIAS
As hemaacutecias foram sensibilizadas com antissoros policlonais humanos de amostras de
plasma fresco congelado de doadores com resultado de pesquisa de anticorpo irregular
positivos
A escolha do anticorpo para sensibilizar as hemaacutecias foi definida de acordo com o
fenoacutetipo do doador que deveria ser positivo para o respectivo antiacutegeno
Para a sensibilizaccedilatildeo um volume de antissoro (1 mL) e um volume (1 mL) de
hemaacutecias lavadas quatro vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica foram adicionadas a um tubo de 12 x
75 mm A mistura foi homogeneizada e incubada em banho maria (BM) a 37deg C por 60
minutos A seguir as hemaacutecias foram novamente lavadas 4 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica
para retirada dos anticorpos que natildeo se ligaram A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada
como controle negativo O teste da uacuteltima lavagem eacute importante para assegurar que os
anticorpos que poderatildeo ser detectados no eluato apoacutes o tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA
sejam aqueles que estavam ligados agraves hemaacutecias e natildeo aqueles livres no plasma O controle
negativo mostra que todo o anticorpo livre foi retirado (LEGER 2011)
Para o teste de presenccedila de anticorpo na soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foram incubadas
com hemaacutecias de triagem de anticorpos irregulares (ID-Diacell BIO-RAD) contendo os
antiacutegenos especiacuteficos Realizado a teacutecnica em gel LissCoombs com anti-IgG+C3d Incubado
no tempo de 15 minutos a temperatura de 37deg C e centrifugado 10 minutos em centriacutefuga
proacutepria
As 50 amostras de doadores foram sensibilizadas com os anticorpos policlonais
humanos
Apoacutes sensibilizadas rdquoin vitrordquo e lavadas as hemaacutecias foram diluiacutedas em soluccedilatildeo de
baixa forccedila iocircnica (LISS) na quantidade de 10 microL de hemaacutecia para 1000 microL de soluccedilatildeo A
suspensatildeo foi pipetada (50 microL) em coluna-gel-teste LissCoombs (BIO-RAD) que contecircm
antiglobulina poliespeciacutefico (IgG+C3d) e centrifugada em baixa rotaccedilatildeo conforme orientaccedilatildeo
do fabricante durante 10 minutos
As amostras deveriam apresentar aglutinaccedilatildeo com reatividade 3 a 4+ no TDA As
amostras que apresentaram reaccedilatildeo menor que 3+ foram novamente sensibilizadas com nova
aliacutequota do antissoro
25
413 TRATAMENTO DAS AMOSTRAS
As amostras sensibilizadas apresentando o TDA positivo 3 ou 4+ foram divididas em
duas aliacutequotas e submetidas a duas teacutecnicas diferentes com o objetivo de dissociar o anticorpo
ligado Uma aliacutequota da amostra foi tratada com soluccedilatildeo de difosfato de cloroquina enquanto
a outra aliacutequota foi tratada com glicina-aacutecidaEDTA
42 PREPARO DA GLICINA AacuteCIDA-EDTA
A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA utiliza 3 soluccedilotildees diferentes a glicina aacutecida o
EDTA e o tampatildeo TRIS
Os reagentes foram preparados utilizando os sais para anaacutelise (PA) de EDTA
(Na2EDTA2H2O) TRIS (C4H11NO3) Glicina (H2NCH2CO2H) NaCl e a soluccedilatildeo de aacutecido
cloriacutedrico (HCl) 12 N todos reagentes da marca SYNTH (quadro 1)
Para o preparo do tampatildeo glicina-acida eacute necessaacuterio o ajuste do pH para 15 Para esse
ajuste utiliza-se aacutecido cloriacutedrico (HCl) concentrado O pH foi medido com fitas reativas de pH
com escala de 1 a 14 da marca MERCK Posteriormente a soluccedilatildeo foi enviada ao laboratoacuterio
de controle de qualidade do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto e o pH medido no peagacircmetro O
tampatildeo glicina-aacutecida foi armazenado a 4deg e o tampatildeo tris e o EDTA em temperatura ambiente
controlada (20 a 24deg Celsius)
Apoacutes o preparo e durante a realizaccedilatildeo dos testes foram feitas inspeccedilotildees visuais para
verificaccedilatildeo de turvaccedilatildeo do meio e presenccedila de precipitados
Reagente Material Quantidade Preparo e
Conservaccedilatildeo
EDTA
EDTA
(Na2EDTA2H2O)
5 gramas Mistura ateacute
dissoluccedilatildeo do sal e
conserva em
temperatura ambiente Aacutegua Destilada 50 Ml
Tris
TRIS (C4H11NO3) 121 gramas Conservar em
temperatura ambiente NaCl 525g
Aacutegua destilada 100ml
Gliacutecina-aacutecida
Glicina
(H2NCH2CO2H) 15 gramas
Conservar a 4oC NaCl 116gramas
Aacutegua Destilada 200ml
HCL 12N Ajutar o pH para 15
Quadro 1 - Preparo dos Reagentes da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
Fonte - Manual teacutecnico AABB 2011
26
O tampatildeo glicina-aacutecida e o tampatildeo TRIS satildeo estaacuteveis por 7 meses O reagente EDTA
precipitou mesmo estando em temperatura em ambiente controlado Houve necessidade de
preparo de novo reagente
421 TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
1 Em um tubo de ensaio 12x75 mm eacute adicionado 08 mL da soluccedilatildeo de glicina-aacutecida A
esta soluccedilatildeo adiciona-se 02 mL de EDTA e mistura
2 Adiciona-se 02 mL de hemaacutecias sensibilizadas (lavada 4 vezes) A mistura eacute
homogeneizada e incubada por exatamente 2 minutos
3 A seguir 01 mL de tampatildeo TRIS eacute adicionado agrave mistura que eacute novamente
homogeneizada e centrifugada por 2 minutos a 3400 rpm O pH deve estar entre 7 a 75
4 Apoacutes centrifugaccedilatildeo separa-se em outro tubo o sobrenadante (eluato) e as hemaacutecias
que permanecem satildeo lavadas 4 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica para retirada de todo o
reagente e anticorpos livres
43 PREPARO DA CLOROQUINA
A cloroquina eacute diluiacuteda em tampatildeo PBS na concentraccedilatildeo de 20 (Quadro 2) e
armazenado a 4deg Celsius sua validade apoacutes o preparo eacute de 1 mecircs
A teacutecnica da cloroquina jaacute estaacute padronizada para rotina do laboratoacuterio de
imunohematologia do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto e suas unidades
Reagente Reagentes Quantidade PreparoConservaccedilatildeo
Cloroquina
Difosfato de cloroquina
(C18H32ClN3O8P2)
20 gramas
Conservar a 4deg Celsius
Tampatildeo PBS 100ml
NaOH 01 N Acertar o pH para
51
Quadro 2 - Preparo da Cloroquina Fonte - Manual teacutecnico da AABB 2011
431 TEacuteCNICA DA CLOROQUINA
1 4 partes da soluccedilatildeo pronta eacute adicionada a uma parte de hemaacutecias lavadas 4 vezes com
soluccedilatildeo fisioloacutegica
2 A mistura eacute incubada em temperatura ambiente por ateacute duas horas
3 Centrifugar a 3400 rpm por 2 minutos
27
4 Remover o sobrenadante lavar as hemaacutecias novamente com soluccedilatildeo fisioloacutegica 4
vezes
44 VERIFICACcedilAtildeO DA EFETIVIDADE DOS TESTES
Apoacutes tratamento pelas duas teacutecnicas o TDA foi repetido em todas as amostras para
verificar se os tratamentos foram efetivos e houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo Para as
amostras tratadas pela teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA que permaneceram com TDA positivo
novo tratamento foi realizado
45 TESTE DO ELUATO
O eluato resultante das amostras tratadas com glicina-acidaEDTA foi testado com
hemaacutecias de triagem A soluccedilatildeo do eluato foi incubada com as hemaacutecias de triagem de
anticorpos (ID-Diacell BIO-RAD) pela teacutecnica em gel LissCoombs O teste foi incubado 15
minutos a 37deg Celsius e centrifugado por 10 minutos em centrifuga proacutepria para a teacutecnica em
gel Os eluatos que apresentaram resultados positivos foram testados em painel de 11
hemaacutecias (ID-Diapanel BIO-RAD) para a identificaccedilatildeo do anticorpo
46 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente que apresentou TDA positivo por IgG e pesquisa
de anticorpo irregular positivo com presenccedila de autoanticorpo com reatividade panaglutinina
A amostra foi tratada em paralelo pelas duas teacutecnicas descritas e foi enviada para o
Hemocentro para genotipagem eritrocitaacuteria que foi realizado por metodologia PCR em tempo
real no equipamento Real-time system PCR 7500 ( Applied Biosystems Califoacuternia EUA)
28
5 RESULTADOS
51 REAGENTES
Para aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA satildeo necessaacuterios 3 diferentes
reagentes que podem ser encontrados em forma de kit pronto para uso No entanto esses kits
natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil Os reagentes satildeo tampatildeo glicina-aacutecida o EDTA e o tampatildeo
Tris
Todos os reagentes foram preparados rdquoin houserdquo a partir dos sais e soluccedilotildees PA (puro
para anaacutelise) da marca SYNTH que foram adquiridos para a pesquisa O custo estimado para
cada teste foi aproximadamente R$ 020 reais
Apoacutes o preparo os reagentes poderiam ser armazenados em condiccedilotildees adequadas pelo
periacuteodo de 1 ano (AABB 2011) Ao final do preparo e durante o periacuteodo de armazenamento
de fevereiro a setembro de 2016 foi realizada inspeccedilatildeo visual para verificar a presenccedila de
precipitados ou turvaccedilatildeo A soluccedilatildeo de glicina e o tampatildeo TRIS mostraram-se estaacuteveis ateacute o
final do periacuteodo Por sua vez o reagente EDTA precipitou mesmo estando armazenado em
temperatura ambiente controlada e foi necessaacuterio novo preparo
52 AMOSTRAS DE DOADORES
521 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS AMOSTRAS
Apoacutes incubaccedilatildeo da hemaacutecia com o antissoro a mesma foi lavada 4 vezes para retirada
dos anticorpos livres A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada Caso houvesse positividade na
soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem a etapa era repetida (figura 3) Das 50 amostras sensibilizadas a
uacuteltima lavagem foi positiva somente em 3 delas Nas 3 amostras o anticorpo utilizado para
sensibilizaccedilatildeo foi o anti-K Apoacutes repetido nova etapa de lavagem os resultados se
apresentaram negativos
Em todas as amostras sensibilizadas ldquoin vitrordquo o TDA foi testado e verificado a
intensidade do teste Entre as 50 amostras 47 alcanccedilaram TDA com intensidade 3-4+ apoacutes a
primeira sensibilizaccedilatildeo enquanto 3 amostras necessitaram uma segunda incubaccedilatildeo com
anticorpo (figura 4)
A escolha dos anticorpos para sensibilizar as hemaacutecias foi feita de acordo com o
fenoacutetipo do doador e foram utilizados sete diferentes especificidades de anticorpos policlonais
humanos conforme mostra o graacutefico1
29
Figura 3 - Soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada com hemaacutecia de triagem de
anticorpos em gel LissCoombs (BIO-RAD) A finalidade eacute verificar a presenccedila de anticorpos livres na
suspensatildeo que possam interferir na pesquisa do eluato As soluccedilotildees de lavagem das amostras na figura a tiveram
resultados negativos Na figura b duas amostras a 47 e 50 apresentaram resultado positivo Nova etapa de
lavagem foi realizada e o resultado final foi negativo
522 TRATAMENTO DAS HEMAacuteCIAS
Apoacutes a sensibilizaccedilatildeo e obtenccedilatildeo de resultados de TDA com intensidade de 3 a 4+
cada uma das amostras foi dividida em duas aliacutequotas e tratada separadamente pelas teacutecnicas
de glicinaaacutecida-EDTA e cloroquina
As teacutecnicas foram consideradas efetivas quando obteve-se a completa dissociaccedilatildeo do
anticorpo verificada atraveacutes do TDA negativo na amostra poacutes tratamento conforme figuras 5
e 6 Dentre as amostras tratadas com cloroquina 2850 tiveram o TDA negativado A glicina-
aacutecidaEDTA negativou o TDA em 33 das 50 amostras tratadas Apenas 17 amostras tratadas
com glicina-aacutecidaEDTA permaneceram com o TDA positivo e foram submetidas a um novo
tratamento
30
Figura 4 - TDA das amostras apoacutes sensibilizaccedilatildeo com anticorpos policlonais humanos Amostras na
figura a com intensidades de 3-4+ Na figura b amostras 4 e 7 com intensidade menor que 3+ e portanto foram
novamente sensibilizadas com nova aliacutequota de soro Anti-D e anti-S Apoacutes a segunda sensibilizaccedilatildeo
apresentaram reatividade 4 e 3+ respectivamente Os anticorpos utilizados para sensibilizaccedilatildeo foram D S c E
C e K
523 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS TEacuteCNICAS
No tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA houve dissociaccedilatildeo completa do anticorpo
em 33 amostras (66) das 50 amostras testadas enquanto que com a cloroquina foram 28
amostras (56) (tabela 1)
31
Graacutefico 1- Nuacutemero de amostras sesnsibilizadas por especificidade de anticorpo Entre as 50 amostras 12
foram sensibilizadas com anti-D 10 com anti-C 9 com anti-E 8 com anti-c 7 com anti-S 3 com anti-K e 1
com anti-Dia As especificidades dos anticorpos foram definidas de acordo o fenoacutetipo do doador
Figura 5 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com cloroquina Nas amostras onde houve
a dissociaccedilatildeo do anticorpo ( 2 21 a 23 26 39 a 42 45 46 e 49) a hemaacutecia se deposita no fundo no microtubo
apoacutes a centrifugaccedilatildeo (TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (1 3 24 25 43 44 47
48 e 50) o anticorpo ligado agraves hemaacutecias eacute alvo da AGH presente no gel (TDA positivo)
Anti-D 12
Anti-C 10
Anti-E 9
Anti-c 8
Anti-S 7
Anti-K 3 Anti-Dia 1
32
Figura 6 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA Nas amostras
onde houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo (4 6 7 12 a 15 17 34 35 37 e 38) a hemaacutecia se deposita no fundo no
microtubo apoacutes a centrifugaccedilatildeo ( TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (5 16 18
19 20 33 e 36 ) o AGH presente no gel se liga ao anticorpo ligado agraves hemaacutecias que ficam retidas no gel (TDA
positivo)
Tabela 1-Resultado geral do tratamento das hemaacutecias com glicina e cloroquina
Teacutecnica utilizada TDA negativo TDA positivo Total
Glicina-aacutecidaEDTA 33 17 50
Cloroquina 28 22 50
A glicina-aacutecidaEDTA conseguiu negativar mais amostras sensibilizadas com Anti-D
e anti-K que a cloroquina Para as hemaacutecias sensibilizadas com anti-E Anti-S e Anti-Dia
ambas as teacutecnicas dissociaram o anticorpo em 100 das amostras Os resultados detalhados
por especificidade do anticorpo apoacutes o primeiro tratamento com glicina-aacutecidaEDTA e com
cloroquina estatildeo na tabela 2
Para as amostras que permaneceram positivas (17 amostras) apoacutes o tratamento com a
glicina-aacutecidaEDTA foi realizado um novo tratamento Houve dissociaccedilatildeo do anticorpo em 3
amostras (18) apoacutes a segunda tentativa Nas demais 14 (82) amostras tratadas pela
segunda vez 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise
33
Tabela 2 - Resultados do TDA apoacutes tratamento das hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo
sensibilizado
ANTICORPOS
SENSIBILIZADOS
1ordm TRATAMENTO COM
GLICINA
TRATAMENTO COM
CLOROQUINA
TOTAL TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
Anti-D 8 4 0 12 12
Anti-C 6 4 10 0 10
Anti-E 9 0 9 0 9
Anti-c 0 8 1 7 8
Anti-S 7 0 7 0 7
Anti-K 2 1 0 3 3
Anti-Dia 1 0 1 0 1
TOTAL 33 17 28 22 50
A hemoacutelise foi verificada durante o procedimento de lavagem final das hemaacutecias com
soluccedilatildeo fisioloacutegica para a retirada dos reagentes As soluccedilotildees de lavagem ficaram
avermelhadas e as hemaacutecias com coloraccedilatildeo escura As amostras foram descartadas Dentre as
6 amostras que ainda puderam ser testadas para o TDA trecircs amostras negativaram sendo 1
sensibilizada com anti-D e 2 com anti-C (tabela 3)
Tabela 3 - Resultado apoacutes o segundo tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA
Tratamento com
glicina-aacutecidaEDTA
TDA Negativo TDA Positvo Hemoacutelise Total
Segundo tratamento 3 3 11 17
524 TESTAGEM DO ELUATO
Apoacutes o tratamento com a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA a soluccedilatildeo do eluato foi
testada para verificar a viabilidade dos anticorpos que foram dissociados ou eluiacutedos Dentre
as 50 amostras 41 apresentaram eluato positivo As nove amostras cujos eluatos foram
negativos haviam sido sensibilizadas com as seguintes especificidades de anticorpos anti-E 6
amostras (67) anti-S 2 amostras (40) e anti-D 1 amostra (8) (tabela 4) O eluato de
todas as amostras sensibilizadas com os anticorpos anti-C anti-c Anti-K e Anti-Dia foram
positivos Os eluatos positivos na triagem de anticorpos foram testados com paineacuteis de
identificaccedilatildeo para confirmar a especificidade e a viabilidade dos anticorpos (figuras 7 e 8)
34
525 EFEITO DA ELUICcedilAtildeO SOBRE OS ANTIacuteGENOS ERITROCITAacuteRIOS
Para verificar o efeito do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA e com a cloroquina
sobre a expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s foi realizada a fenotipagem das
amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes tratamento com ambas as teacutecnicas Foi avaliado
se o tratamento destruiu os antiacutegenos expressos antes do tratamento
Tabela 4- Resultado do Eluato das amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA
Anticorpos Eluato positvo Eluato negativo Total
Anti-D 11 1 12
Anti-C 10 0 10
Anti-E 3 6 9
Anti-c 8 0 8
Anti-S 5 2 7
Anti-K 3 0 3
Anti-Dia 1 0 1
Total 41 9 50
Figura 7 ndash Painel do eluato da amostra 21 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-C que foi
recuperado no eluato
Figura 8 ndash Painel do eluato da amostra 47 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-K que foi
recuperado no eluato
35
Dentre as 50 amostras 26 eram previamente fenotipadas para os antiacutegenos Fya Fy
b
Jka Jk
b S e s Dentre elas 20 alcanccedilaram TDA negativo apoacutes tratamento com a glicina-
aacutecidaEDTA e 20 negativaram apoacutes tratamento com cloroquina (tabela 5) Apoacutes ambas as
teacutecnicas os antiacutegenos originalmente expressos permaneceram positivos comprovando que natildeo
houve destruiccedilatildeo dos mesmos
Tabela 5 ndash Verificaccedilatildeo da interferecircncia do tratamento da hemaacutecias com cloroquina e glicina-
aacuteicdaEDTA sobre os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
AMOSTRAS
COM
FENOTIPAGEM
PREacuteVIA
TRATADAS COM
CLOROQUINA
TRATADAS COM
GLICINA
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
26
20
20
20
20
As amostras 24 47 e 50 eram positivas para o antiacutegeno K A cloroquina natildeo dissociou
o anticorpo em nenhuma das 3 amostras enquanto a glicina-aacutecidaEDTA foi efetiva nas
amostras 24 e 50 Foi testada a expressatildeo do antiacutegeno K nas amostras 24 e 50 apoacutes o
tratamento utilizando meacutetodo indireto em gel contendo AGH Apesar de natildeo ter sido avaliado
a intensidade de reaccedilatildeo de expressatildeo dos antiacutegenos podemos verificar na figura 9 que nas
duas amostras em que a teacutecnica foi efetiva e dissociou o anticorpo a expressatildeo do antiacutegeno K
continua presente mas a reatividade observada pode ser considerada 1+ sugerindo que houve
diminuiccedilatildeo da expressatildeo do antiacutegeno quando comparado com a expressatildeo observada em
hemaacutecia natildeo tratada
Os resultados individuais de cada amostra em ambas as teacutecnicas encontram-se
resumidas na tabela 6
526 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente onde foi constatada a presenccedila de autoanticorpo
a quente da classe IgG pelo TDA monoespeciacutefico (figura 10)O autoanticorpo tambeacutem
interferia na pesquisa e identificaccedilatildeo de anticorpos irregulares pois apresentava caracteriacutestica
de panaglutinina As hemaacutecias da paciente sensibilizadas ldquoin vivordquo foram tratadas com
cloroquina e com glicina-aacutecidaEDTA
36
Figura 9 ndash Fenotipagem das amostras 24 e 50 para antiacutegeno K apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
O teste positivo indica a presenccedila do antiacutegeno poreacutem a reatividade fraca (1+) sugere que houve enfraquecimento
de sua expressatildeo A direita a expressatildeo forte (4+) do antiacutegeno Kell em hemaacutecia controle natildeo tratada utilizada
como controle positivo
A cloroquina natildeo foi efetiva na retirada do anticorpo ligado as hemaacutecias ao contraacuterio
do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA que dissociou o anticorpo (figura 11)
A hemaacutecia tratada com glicina foi fenotipada para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
(figura 12) A fenotipagem para o sistema Rh (C c E e e) e Kell foi realizada em gel
especiacutefico monoclonal sem interferecircncia do TDA positivo (controle da reaccedilatildeo negativo)
O eluato resultante do tratamento com glicina-aacutecidaEDTA foi testada em gel com
hemaacutecias de painel de identificaccedilatildeo de anticorpos e apresentou resultado positivo com todas
as ceacutelulas (figura 13 e 14)
A amostra foi enviada para genotipagem e o resultado da genotipagem confirmou o
resultado da fenotipagem apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
527 TEMPO DE EXECUCcedilAtildeO DA TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
O tempo de reaccedilatildeo da glicina-aacutecidaEDTA eacute de 2 minutos Todas as amostras foram
tratadas obedecendo ao tempo descrito na literatura demonstrando que o mesmo eacute
reprodutiacutevel
37
Tabela 6- Resultados individuais por amostra
Amostra Especificidade
dos anticorpos
Intensidade do
TDA apoacutes
sensibilizaccedilatildeo
Tratamento
efetivo com
cloroquina
Tratamento
efetivo com
glicina
Eluato
poacutes
glicina
1 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 2 Dia 3+ Sim Sim 3+ 3 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 4 D 4+ Natildeo Sim 4+ 5 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 6 E 3+ Sim Sim Negativo 7 S 4+ Sim Sim 3+ 8 E 3+ Sim Sim 1+ 9 E 3+ Sim Sim 2+
10 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 11 D 4+ Natildeo Sim 4+ 12 D 4+ Natildeo Sim 4+ 13 S 3+ Sim Sim 3+ 14 S 3+ Sim Sim 3+ 15 D 3+ Natildeo Sim 3+ 16 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 17 E 3+ Sim Sim (+) 18 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 19 D 4+ Natildeo Natildeo 3+ 20 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 21 C 3+ Sim Sim 4+ 22 C 3+ Sim Sim 4+ 23 C 3+ Sim Sim 4+ 24 K 4+ Natildeo Sim 4+ 25 D 3+ Natildeo Natildeo Negativo 26 E 4+ Sim Sim Negativo 27 S 3+ Sim Sim 3+ 28 C 3+ Sim Natildeo 4+ 29 C 3+ Sim Sim 4+ 30 C 3+ Sim Sim 4+ 31 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 32 E 3+ Sim Sim Negativo 33 C 3+ Sim Natildeo 4+ 34 S 3+ Sim Sim Negativo 35 S 3+ Sim Sim Negativo 36 C 4+ Sim Natildeo 4+ 37 c 4+ Natildeo Natildeo 4+ 38 D 4+ Natildeo Sim 4+ 39 S 3+ Sim Sim 3+ 40 c 4+ Sim Natildeo 2+ 41 C 4+ Sim Natildeo 4+ 42 E 3+ Sim Sim Negativo 43 D 3+ Natildeo Sim 2+ 44 D 3+ Natildeo Sim 2+ 45 E 3+ Sim Sim Negativo 46 C 3+ Sim Sim 4+ 47 K 4+ Natildeo Natildeo 4+ 48 D 3+ Natildeo Sim 2+ 49 E 3+ Sim Sim Negativo 50 K 4+ Natildeo Sim 4+
TOTAL 50 28 33 41
38
Figura 10 ndash TDA monoespeciacutefico da amostra de paciente Hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo da classe
IgG
oacute Figura 11 ndash TDA apoacutes o tratamento com glicina-aacutecidaEDTA (esquerda) e cloroquina (direita) A glicina
negativou completamente o TDA enquanto a hemaacutecia tratada com cloroquina persistiu positiva (1+)
39
Figura 12 ndash Fenotipagem da amostra tratada com glicina-aacutecidaEDTA Fy(a+b+) Jk(a-b+) S+s+
Figura 13 ndash Painel em gel (LissAGH) do eluato apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de
intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
Figura 14 ndash ndash Painel ezimaacutetico (hemaacutecias tratadas com bromelina) do eluato em gel neutro apoacutes
tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
40
528 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Quanto a efetividade das teacutecnicas em negativar o TDA foi verificado que a glicina-
aacutecidaEDTA foi efetiva em 66 das amostras testadas no primeiro tratamento (3350
amostras) enquanto a cloroquina conseguiu negativar 56 (2850) Esses resultados natildeo
apresentam diferenccedila significativa (pgt005) demostrando que a teacutecnica da glicina-
aacutecidaEDTA natildeo eacute superior mas eacute tatildeo efetiva quanto a da cloroquina
Quando aliamos os resultados de ambas as teacutecnicas verificamos que em 76 (3850)
das amostras o TDA foi negativado Esse dado indica que ainda que uma teacutecnica natildeo seja
eficaz na remoccedilatildeo do anticorpo eacute uma boa alternativa tentar a segunda teacutecnica jaacute que a falha
em remover o anticorpo utilizando uma delas natildeo prevecirc necessariamente a falha com a outra
Quando se utiliza o teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla (graacutefico 2) para comparar a utilizaccedilatildeo das
duas teacutecnicas com o resultado de cada uma isolada (somente a cloroquina ou somente a
glicina) verificamos que os resultados apresentam diferenccedila significativa (plt005) (quadro 3)
TRATAMENTO EFETIVO COM TOTAL PORCENTAGEM
Glicina ou cloroquina 38 76
Glicina e cloroquina 23 46
Glicina apenas 10 20
Cloroquina apenas 5 10
Nenhuma das teacutecnicas 12 24
Quadro 3 - Resultados comparativos entre as teacutecnicas utilizadas
41
Graacutefico 2 - Teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla entre as teacutecnicas aplicadas A- Glicina e Cloroquina B-Cloroquina C-
Glicina ( plt005)
42
6 DISCUSSAtildeO
Os reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA podem ser adquiridos em
forma de kit comercial prontos para uso poreacutem natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil A preparaccedilatildeo
dos reagentes ldquoin houserdquo a partir de sais comerciais adquiridos se mostrou viaacutevel Os
reagentes glicina e o tampatildeo Tris armazenados de forma correta se mantiveram estaacuteveis por
um periacuteodo de 7 meses Somente o reagente EDTA precipitou mesmo armazenado em
condiccedilotildees adequadas sugerindo que o mesmo deve ser preparado em menor quantidade e
armazenado em aliacutequotas A soluccedilatildeo de cloroquina tambeacutem pode ser preparada ldquoin houserdquo e
pode ser armazenado por um mecircs A legislaccedilatildeo brasileira autoriza a utilizaccedilatildeo de reagentes
preparados a partir de sais comerciais como a cloroquina e a glicina-aacutecidaEDTA desde que
os sais tenham autorizaccedilatildeo da vigilacircncia sanitaacuteria para a comercializaccedilatildeo (BRASIL 2001)
A comparaccedilatildeo quanto a efetividade em dissociar anticorpos em amostras com TDA
positivos entre a teacutecnica da glicina e a teacutecnica da cloroquina mostrou que natildeo haacute diferenccedila
estatiacutestica entre elas e que ambas satildeo igualmente eficientes Se utilizadas conjuntamente haacute
maior possibilidade de elucidaccedilatildeo dos casos
Uma vantagem da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eacute que ela permite numa mesma
amostra eluir o anticorpo ligado aacute hemaacutecia assim como fenotipar a hemaacutecia tratada Devido a
sua dupla utilidade a teacutecnica eacute vantajosa principalmente em pacientes em que pouco volume
de amostra pode ser coletado como em casos de crianccedilas e receacutem-nascidos
A fenotipagem poacutes tratamento se mostrou viaacutevel jaacute que os antiacutegenos de maior
importacircncia natildeo sofreram alteraccedilotildees Nas 20 amostras que foram fenotipadas antes e apoacutes
tratamento para verificar a influecircncia dos reagentes na expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a
Jkb S e s natildeo houve destruiccedilatildeo dos mesmos por nenhuma das duas teacutecnicas
Para as amostras positivas para o antiacutegeno Kell (350) e sensibilizadas com o
respectivo anticorpo a teacutecnica da glicina foi efetiva em negativar o TDA em apenas duas
delas mas apoacutes o tratamento foi verificada uma fraca reatividade da reaccedilatildeo antiacutegeno-
anticorpo sugerindo que houve um enfraquecimento da expressatildeo do antiacutegeno conforme
esperado e descrito na literatura (BYRNE 1991 PALLAS WILER E MCGEE 1991
ROZIERS e SQUALI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012 e KATHARIA e
CHAUDHARY 2013) A accedilatildeo da glicina sobre o antigeno Kell natildeo representa impedimento
para seu uso uma vez que na impossibilidade de testar o antiacutegeno Kell o banco de sangue
consegue facilmente atender a solicitaccedilatildeo de transfusatildeo com unidades de hemaacutecias Kell
43
negativas jaacute que eacute um antiacutegeno de baixa prevalecircncia na populaccedilatildeo variando de 15 na
populaccedilatildeo africana a 9 nos europeus (DANIELS 2011)
A soluccedilatildeo resultante da dissociaccedilatildeo do anticorpo pela teacutecnica da glicina pode ainda ser
utilizada como eluato podendo substituir a teacutecnica de eluiccedilatildeo com reagentes comercias (kits
de eluiccedilatildeo aacutecida) que tem alto custo aproximadamente entre R$2000 a R$2500 por teste
Em 41 amostras (82) houve a dissociaccedilatildeo e recuperaccedilatildeo do anticorpo que estava
sensibilizando as hemaacutecias Em 9 amostras (18) os anticorpos foram eluiacutedos poreacutem
apresentaram reaccedilatildeo negativa quando testadas com hemaacutecias de triagem entre eles o anti-E
(6) anti-S (2) e Anti-D (1) Eacute possiacutevel que a correccedilatildeo pH do meio (WALKER 2011) natildeo
tenha sido adequada o que pode ter desfavorecido a reatividade do anticorpo
Para as amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA nas quais natildeo houve dissociaccedilatildeo do
anticorpo pelo primeiro tratamento (1750) o segundo tratamento natildeo se mostrou eficaz jaacute
que 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise O tempo de
armazenagem natildeo parece ter influenciado jaacute que todas as amostras foram testadas dentro de
48 horas apoacutes a coleta Outros fatores que natildeo foram verificados podem ter levado a
hemoacutelise Apesar da literatura (LOUIE JIENG e ZEROULIS 1986 e BYRNE 1991)
recomendar um segundo tratamento ele eacute pouco eficaz tendo negativado apenas 3 das 17
amostras testadas
A amostra de paciente que apresentou sensibilizaccedilatildeo ldquoin vivordquo mostrou melhor
efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA sobre a da cloroquina possibilitando
fenotipagem para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s que natildeo foram destruiacutedos apoacutes o
tratamento comprovado atraveacutes da genotipagem
A presenccedila de autoanticorpo a quente com presenccedila de hemoacutelise (AHAI) ou natildeo pode
mascarar a presenccedila de aloanticorpo interferindo na rotina soroloacutegica da fenotipagem que eacute
uma importante ferramenta para auxiliar na seleccedilatildeo de hemaacutecias para transfusatildeo (SHIREY et
al 2002) Esses pacientes frequentemente possuem aloanticorpos associados ao
autoanticorpo e a prevalecircncia de aloimunizaccedilatildeo entre eles varia entre 12 a 40 (LEGER e
GARRATY 1999 BRANCH e PETZ 1999) o que dificulta ainda mais a escolha do melhor
componente a ser transfundido aleacutem de aumentar a possibilidade reaccedilotildees hemoliacuteticas imunes
poacutes-transfusionais
Nesses casos as teacutecnicas de dissociaccedilatildeo de anticorpos satildeo importantes para tratar
amostras de pacientes e a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser usada como uma opccedilatildeo
pois se mostrou eficaz na dissociaccedilatildeo anticorpo ligado agraves hemaacutecias deixando livre a
superfiacutecie das mesmas permitindo a fenotipagem por antisoros IgG Paralelamente os
44
anticorpos eluiacutedos tambeacutem puderam ser estudados O mesmo natildeo ocorre com a cloroquina
que permite apenas a fenotipagem e tampouco com os kits de eluiccedilatildeo aacutecida disponiacuteveis no
mercado nacional que satildeo destinados a realizaccedilatildeo do eluato mas destroem as hemaacutecias
O tempo de tratamento na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA tambeacutem eacute uma vantagem
pois foi possiacutevel reproduzir no tempo determinado de 2 minutos enquanto a cloroquina
demora ateacute duas horas
Ainda que a aplicaccedilatildeo das teacutecnicas por biologia molecular estejam cada vez mais
presentes na rotina imuno-hematoloacutegica e possibilitam estabelecer o fenoacutetipo deduzido do
genoacutetipo elas natildeo estatildeo disponiacuteveis na maioria dos centros e sua realizaccedilatildeo exige algumas
horas A resoluccedilatildeo imediata do problema transfusional necessita dos resultados soroloacutegicos
pois com frequecircncia natildeo eacute possiacutevel aguardar o resultado do teste molecular Dessa forma
apesar da crescente importacircncia da genotipagem eritrocitaacuteria teacutecnicas soroloacutegicas aplicadas
corretamente e no momento propiacutecio satildeo de grande utilidade para resolver problemas imuno-
hematoloacutegicos como ocorre com a fenotipagem em pacientes com TDA positivo
45
7 CONCLUSAtildeO
A teacutecnica da glicina aacutecidaEDTA mostrou-se efetiva em remover os anticorpos que
sensibilizavam as hemaacutecias e pode ser utilizada com seguranccedila antes da fenotipagem
eritrocitaacuteria Por ser uma teacutecnica de raacutepida execuccedilatildeo eacute uma alternativa aplicaacutevel
principalmente em casos urgentes de pacientes que apresentam autoanticorpos
46
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50
9 ANEXOS
51
FUNDACcedilAtildeO HEMOCENTRO DE RIBEIRAtildeO PRETO
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE)
Tiacutetulo da pesquisa Aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina aacutecida-EDTA e avaliaccedilatildeo da
eficaacutecia no tratamento de hemaacutecias com teste direto da antiglobulina positivo
Pesquisadora responsaacutevel Ceacutelia Kazue Abiko
Orientador Prof Dimas Tadeu Covas
Co-orientadora Dra Flaacutevia Leite Souza Santos
Objetivo da pesquisa Vocecirc estaacute sendo convidado a participar de uma pesquisa que tem
como objetivo padronizar uma nova teacutecnica para auxiliar na tipagem sanguiacutenea de pacientes
A tipagem sanguiacutenea pode sofrer interferecircncia da presenccedila de anticorpos ligados aos gloacutebulos
vermelhos do sangue Nessas situaccedilotildees eacute difiacutecil selecionar o melhor sangue para o paciente e
eacute preciso a utilizaccedilatildeo de teacutecnicas adicionais para remover essas interferecircncias
Esta pesquisa tem como objetivo estudar outra teacutecnica para remover esses anticorpos e
comparaacute-la com a teacutecnica atualmente utilizada Para isso precisamos de amostras de pacientes
e doadores voluntaacuterios
Se vocecirc eacute um doador eacute necessaacuterio que vocecirc autorize a coleta de 5 ml (1 tubo) a mais
de seu sangue
Se vocecirc eacute um paciente natildeo haveraacute necessidade de nova amostra pois utilizaremos as
amostras jaacute coletadas para os testes preacute-transfusionais e os resultados encontrados nesta
pesquisa natildeo iratildeo interferir na escolha da (s) bolsa (s) de sangue que vocecirc possa vir a receber
Se vocecirc concordar em participar leia com atenccedilatildeo o texto abaixo e assine as duas vias
rubricando todas as paacuteginas deste termo de consentimento Uma via original assinada e
rubricada por vocecirc e pela pesquisadora ficaraacute com vocecirc
As suas informaccedilotildees seratildeo mantidas em sigilo pela pesquisadora e natildeo haveraacute
armazenamento de material para pesquisas posteriores Os seus dados seratildeo usados apenas
neste estudo e quando o trabalho for publicado seu nome e qualquer outra informaccedilatildeo que
possam identificaacute-lo natildeo seratildeo revelados
Eacute pouco provaacutevel que o que noacutes aprendermos com este estudo tenha um benefiacutecio
direto para vocecirc assim como natildeo poderemos dar nada em troca pela sua participaccedilatildeo na
pesquisa
Nosso objetivo com esta pesquisa eacute que os resultados poderatildeo ser uacuteteis para o
tratamento de pacientes no futuro Os riscos da participaccedilatildeo satildeo miacutenimos Se vocecirc eacute um
doador de sangue a amostra seraacute coletada no momento da doaccedilatildeo natildeo exigindo punccedilatildeo
venosa adicional
52
Eacute seu direito ter acesso aos resultados dos testes da pesquisa Esses resultados natildeo
seratildeo fornecidos automaticamente a vocecirc mas caso vocecirc se interesse em saber o resultado ou
tiver alguma duacutevida sobre a sua participaccedilatildeo neste estudo deveraacute entrar em contato com Ceacutelia
Kazue Abiko pelo telefone (18) 99718-3551
Vocecirc tem total liberdade de optar por natildeo participar da pesquisa Caso aceite
participar poderaacute desistir a qualquer momento ou retirar seu consentimento mesmo apoacutes ter
coletado o sangue Para cancelar sua participaccedilatildeo basta avisar a pesquisadora e os seus dados
seratildeo retirados do projeto
Qualquer duacutevida eacutetica sobre a pesquisa poderaacute entrar em contato com o Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa do Hospital das Cliacutenicas e da Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto
(CAMPUS UNIVERSITAacuteRIO bairro Monte Alegre CEP 14048-900 Ribeiratildeo Preto-SP
Telefone (16) 3602-2228 FAX (16) 3633-1144 e-mail cephcrpuspbr)
Consentimento de participaccedilatildeo
A Consentimento do participante
Li as informaccedilotildees acima sobre o estudo e recebi explicaccedilotildees sobre a participaccedilatildeo no estudo
Portanto dou o meu consentimento para participar do estudo
___________________________________________________________________________
Nome completo
___________________________________________________________________________
Assinatura
___________
Data
__________________________________________________________________________________
Nome completo da pesquisadora
___________________________________________________________________________
Assinatura
_____________
Data
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 - Preparo dos Reagentes da glicina-aacutecidaEDTApaacutegina 25
Quadro 2 - Preparo da Cloroquinapaacutegina 26
Quadro 3 - Resultados comparativos entre as teacutecnicas utilizadas paacutegina 40
LISTA DE FLUXOGRAMAS
Fluxograma 1 - Fluxograma da pesquisa utilizando as amostras de
doadorespaacutegina 22
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ABO
AHAI
Bg
c
C
C
C3
C3b
C3d
D
DHFRN
DNA
DTT
E
e
EDTA
Fc
Fya
Fyb
HCl
IgA
IgD
IgE
IgM
Mm
NaCl
PA
PAI
PBS
PCR
PEG
pH
Rh
rpm
S
s
SIDA
SBS
TCLE
TDA
TIA
TRIS
ZZAP
microL
Sistema Sanguiacuteneo ABO
Anemia Hemoliacutetica Autoimune
Antiacutegeno Bg
Antiacutegeno c
Celsius
Antiacutegeno C
Complemento
Fraccedilatildeo do complemento
Fraccedilatildeo do complemento
Antiacutegeno D
Doenccedila Hemoliacutetica do Feto e do Receacutem-nascido
Aacutecido desoxirribonucleico
Dithiothreitol
Antiacutegeno E
Antiacutegeno e
Aacutecido Etileno Diamino Tetraceacutetico
Porccedilatildeo do anticorpo
Antiacutegeno Duffy a
Antiacutegeno Duffy b
Aacutecido cloriacutedrico
Imunoglobulina A
Imunoglobulina D
Imunoglobulina E
Imunoglobulina M
Miliacutemetros
Cloreto de soacutedio
Puro para anaacutelise
Pesquisa de anticorpos irregulares
Tampatildeo fosfato salino
Reaccedilao em cadeia de polimerase
Polietilenoglicol
Potencial hidrogeniocircnico
Sistema sanguiacuteneo Rh
Rotaccedilotildees por minuto
Antiacutegeno S
Antiacutegeno s
Siacutendrome da Imunodeficiecircncia adquirida
Sistema de banco de sangue
Termo de consentimento livre e esclarecido
Teste direto da antiglobulina
Teste indireto da antiglobulina
Hidrometil aminometano
Sulphydryl-Proteolytic Enzyme
Microlitros
RESUMO
Os testes preacute-transfusionais satildeo o conjunto de teacutecnicas imuno-hematoloacutegicas aplicadas nas
amostras do receptor e do doador com a finalidade de fornecer uma unidade de hemaacutecias
compatiacutevel e segura para a transfusatildeo Aleacutem da fenotipagem ABO e Rh obrigatoacuteria nos testes
preacute-transfusionais a determinaccedilatildeo do perfil antigecircnico de outros antiacutegenos eritrocitaacuterios de
importacircncia cliacutenica melhora a seguranccedila transfusional especialmente para pacientes
previamente aloimunizados ou candidatos agrave transfusatildeo crocircnica Para tais pacientes conhecer o
fenoacutetipo eritrocitaacuterio permite a seleccedilatildeo de concentrados de hemaacutecias com o mesmo fenoacutetipo
o que previne reaccedilotildees transfusionais hemoliacuteticas assim como nova aloimunizaccedilatildeo
Indiviacuteduos que apresentam as hemaacutecias sensibilizadas ldquoin vivordquo por anticorpos anti-
eritrocitaacuterios como ocorre na anemia hemoliacutetica autoimune (AHAI) teratildeo o teste direto da
antiglobulina (TDA) positivo dificultando a realizaccedilatildeo da fenotipagem O TDA positivo
provoca resultados falsos positivos especialmente quando satildeo utilizados para a fenotipagem
soros comerciais da classe IgG que exigem a fase de antiglobulina humana ou teste indireto
da antiglobulina (TIA) para leitura Em 1982 Edwards Moulds e Judd propuseram a
utilizaccedilatildeo da teacutecnica da cloroquina para dissociar os complexos de antiacutegeno-anticorpo
preservando a membrana eritrocitaacuteria e permitindo a fenotipagem Atualmente eacute a teacutecnica
mais utilizada nos centros brasileiros A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA foi primeiramente
descrita por Louie Jieng e Zeroulis em 1986 poreacutem eacute pouco utilizada por natildeo haver os
reagentes prontos comercialmente no mercado brasileiro O presente estudo avaliou a teacutecnica
da glicina-aacutecida-EDTA com reagentes preparados ldquoin houserdquo em paralelo agrave teacutecnica da
cloroquina que eacute atualmente a teacutecnica aplicada no Hemocentro de Ribeiratildeo Preto Para isso
amostras de hemaacutecias de doadores (n=50) com fenoacutetipo conhecido foram sensibilizadas com
anticorpos humanos de especificidade conhecida e ambas as teacutecnicas foram aplicadas Foi
verificado ainda o efeito da teacutecnica sobre a expressatildeo dos antiacutegenos eritrocitaacuterios (Fya Fy
b
Jka Jk
b S e s) atraveacutes da fenotipagem das amostras que tiveram o TDA negativado A
viabiliadade dos anticorpos presentes no eluato recuperado apoacutes tratamento com a glicina-
aacutecidaEDTA tambeacutem foi testada A glicina-aacutecidaEDTA foi efetiva em negativar o TDA em
33 amostras (66) comparaacutevel com a cloroquina que negativou 28 amostras (56) O eluato
apresentou-se viaacutevel no tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA e natildeo foi constatada destruiccedilatildeo
dos antiacutegenos eritrocitaacuterios apoacutes o tratamento Concluiacutemos que a teacutecnica da glicina-
aacutecidaEDTA pode ser utilizada como uma opccedilatildeo no tratamento de hemaacutecias com TDA
positivo com a vantagem de seu tempo de execuccedilatildeo ser inferior ao da cloroquina (2minutos x
30 a 120 minutos) o que lhe torna uacutetil em situaccedilotildees de maior urgecircncia Quando ambas as
teacutecnicas satildeo utilizadas em hemaacutecias diferentes de uma mesma amostra a efetividade estaacute
significativamente aumentada (plt005)
Palavras chave Glicina-aacutecidaEDTA Teste direto da antiglobulina AHAI fenotipagem
ABSTRACT
The pre-transfusion tests are the group of immunohematology techniques applied in the
receptor and donor samples in order to provide a unit of red blood cells compatible and safe
for transfusion In addition to the obligatory ABO and Rh phenotyping in the pre-transfusion
tests the determination of the antigenic profile of other red cells antigens of clinical
importance improves transfusion safety especially for patients previously alloimmunized or
candidates for chronic transfusion For such patients knowing the phenotype allows the
selection of red blood cell concentrates with the same phenotype which prevents hemolytic
transfusion reactions as well as new alloimmunization Individuals who have antibody-coated
red blood cells sensitized in vivo such as in autoimmune hemolytic anemia (AHAI) will
have a direct antiglobulin test (DAT) positive making it difficult to perform phenotyping
Positive DAT causes false positive results especially when commercially available IgG
serums which require the human antiglobulin phase or indirect antiglobulin test (IAT) for
reading are used for phenotyping In 1982 Edwards Molds and Judd proposed the use of the
chloroquine technique to dissociate antigen-antibody complexes by preserving the erythrocyte
membrane and allowing phenotyping It is currently the most used technique in Brazilian
centers The EDTAglycine-acid technique was first described by Louie Jieng and Zeroulis in
1986 but it is little used because commercially available reagents are not available in the
Brazilian market The present study evaluated the EDTAglycine-acid technique with reagents
prepared in house in parallel to the chloroquine technique which is currently the technique
applied at the Hemocentro de Ribeiratildeo Preto For this donor red cells samples (n = 50) with
known phenotype were sensitized with human antibodies of known specificity and both
techniques were applied The effect of the technique on the expression of erythrocyte antigens
(Fya Fy
b Jk
a Jk
b S and s) was also verified by the phenotyping of the samples that had
negative DAT The viability of the antibodies present in the recovered eluate after treatment
with EDTAglycine-acid A was also tested EDTAglycine-acid was effective in negatively
affecting DAT in 33 samples (66) comparable to chloroquine that negatived 28 samples
(56) The eluate was viable in treatment with EDTAglycine-acid and no destruction of
erythrocyte antigens after treatment We conclude that the EDTA glycine-acid technique can
be used as an option in the treatment of red cells with TDA positive with the advantage that
its execution time is inferior to that of chloroquine (2 minutes x 30 to 120 minutes) which
makes it useful in emergency situations When both techniques are used in different
erythrocytes of the same sample the effectiveness is significantly increased (p lt005)
Key words EDTAglycine-acid direct antiglobulin test AIHA phenotyping
1 INTRODUCcedilAtildeO
A transfusatildeo de hemaacutecias eacute um recurso terapecircutico muito importante e eficaz e tem se
mostrado como um grande aliado no tratamento de diversas patologias auxiliando na
melhoria da sobrevida e qualidade de vida de diversos pacientes quando indicada de forma
correta Eacute provavelmente a modalidade de terapia mais utilizada no mundo sendo
considerada a forma mais antiga de terapia celular A transfusatildeo de hemaacutecias em pacientes
com anemia grave ou sangramento agudo reestabelece o niacutevel de hemoglobina moleacutecula
responsaacutevel pelo transporte de oxigecircnio para os tecidos melhorando a isquemia tecidual
(BARJAS-CASTRO 2013 ZAGO 2014)
A transfusatildeo de componentes celulares como o concentrado de hemaacutecias deve ser
bem avaliada quanto aos riscos e benefiacutecios Os testes preacute-transfusionais satildeo parte obrigatoacuteria
do processo transfusional e tecircm como funccedilatildeo assegurar que o melhor hemocomponente seja
selecionado para o paciente reduzindo assim a chance de transfusotildees incompatiacuteveis e reaccedilotildees
transfusionais (BARJAS-CASTRO 2013)
11TESTES PREacute-TRANSFUSIONAIS
Os testes preacute-transfusionais tecircm a finalidade de evitar a ocorrecircncia de reaccedilotildees
hemoliacuteticas no receptor decorrentes da transfusatildeo de hemaacutecias incompatiacuteveis do doador
(DOWNES e SHULMAN 2011) Tem como propoacutesito selecionar hemaacutecias que apoacutes
transfusatildeo deveratildeo ter sobrevida normal ou mais proacutexima do normal (MELO 2007)
Os testes preacute-transfusionais que consistem no conjunto de teacutecnicas
imunohematoloacutegicas aplicadas agraves amostras do receptor e doador devem ser realizados antes
de toda transfusatildeo A aplicaccedilatildeo desses testes tem como finalidade fornecer uma unidade de
hemaacutecias compatiacutevel e elevar a seguranccedila da transfusatildeo Os testes preacute-transfusionais aliados
a utilizaccedilatildeo de novas tecnologias tem historicamente evitado reaccedilotildees transfusionais
hemoliacuteticas garantindo a seguranccedila transfusional em cerca de 95 dos pacientes que recebem
transfusatildeo Eacute imprescindiacutevel poreacutem a execuccedilatildeo correta das teacutecnicas envolvidas nos testes preacute-
transfusionais e ainda garantir a identificaccedilatildeo correta do receptor e das amostras de sangue e
das unidades de hemaacutecias (CASTILHO 2000 MELO 2007 BARJAS-CASTRO 2013)
2
Todos os testes que compotildeem a rotina preacute-transfusional usam meacutetodos soroloacutegicos
que envolvem a reaccedilatildeo antiacutegeno x anticorpo Ao testar a presenccedila de um antiacutegeno na
superfiacutecie da hemaacutecia eacute necessaacuterio dispor de um soro com especificidade conhecida para
aquele antiacutegeno Por outro lado testar a presenccedila de um determinado anticorpo no soro ou no
plasma exige o uso de hemaacutecias com perfil antigecircnico conhecido Os testes preacute-transfusionais
incluem tipagem ABO (direta e reversa) tipagem Rh pesquisa de anticorpos irregulares no
sangue do receptor retipagem ABO e Rh do hemocomponente e prova de compatibilidade
entre as hemaacutecias do doador e soro ou plasma do receptor em caso de transfusatildeo de hemaacutecias
ou hemocomponentes que contenham mais de 2 mL de volume eritrocitaacuterio como o
concentrado de granuloacutecitos (BRASIL 2016 GANZELLA 2014 SANTOS 2014)
Aleacutem dos testes regularmente realizados a determinaccedilatildeo do fenoacutetipo para outros
antiacutegenos eritrocitaacuterios do doador e do receptor pode ser indicada A fenotipagem eritrocitaacuteria
determina o perfil antigecircnico para outros antiacutegenos de importacircncia cliacutenica aleacutem do sistema
ABO e do antiacutegeno RhD Ela pode auxiliar a confirmaccedilatildeo de uma especificidade de anticorpo
encontrada no soro do paciente uma vez que espera-se que a sua hemaacutecia natildeo expresse o
antiacutegeno correspondente e simultaneamente eacute utilizada para selecionar um concentrado de
hemaacutecias negativo para o respectivo antiacutegeno evitando reaccedilotildees hemoliacuteticas transfusionais A
fenotipagem de candidatos a transfusotildees crocircnicas tambeacutem eacute recomendada pois esse grupo de
pacientes deve se beneficiar com a transfusatildeo profilaacutetica de unidades de hemaacutecias com
mesmo fenoacutetipo evitando assim a aloimunizaccedilatildeo assim como reaccedilotildees hemoliacuteticas provocadas
por anticorpos previamente existentes e em baixo tiacutetulo natildeo identificados pela triagem de
anticorpos (CASTILHO JUNIOR e REID 2015 DOWNES e SHULMAN 2011)
111 TIPAGEM ABORh
O sistema ABO (ISBT001) foi o primeiro sistema de grupo sanguiacuteneo a ser
descoberto Ele foi descrito em 1900 por Karl Landsteiner e eacute considerado o sistema de maior
importacircncia na praacutetica transfusional Ele eacute composto por quatro antiacutegenos A1 (ABO1) B
(ABO2) AB (ABO3) e A1 (ABO4) e eacute caracterizado pela presenccedila dos anticorpos naturais
ou seja anticorpos que surgem sem a exposiccedilatildeo preacutevia aos antiacutegenos atraveacutes de transfusatildeo ou
gestaccedilatildeo Os anticorpos ABO satildeo predominantemente da classe IgM satildeo capazes de fixar o
complemento e de provocar hemoacutelise grave intravascular caso ocorra transfusatildeo ABO
incompatiacutevel Por apresentar essa caracteriacutestica peculiar a tipagem do sistema ABO eacute
composta de duas etapas a prova direta e a prova reversa Na prova direta eacute realizada a
pesquisa dos antiacutegenos na superfiacutecie das hemaacutecias que satildeo testadas com soros comerciais
3
Anti-A e Anti-B A prova reversa por sua vez pesquisa a presenccedila de anticorpos ABO ao
testar o soro ou plasma do pacientedoador com hemaacutecias A1 e B Ambas as provas satildeo
obrigatoacuterias e devem ser concordantes para interpretaccedilatildeo do fenoacutetipo ABO (COOLING
2011 SANTOS 2014)
O sistema Rh (ISBT004) eacute o maior e mais complexo sistema de grupos sanguiacuteneos
compreendendo atualmente 54 antiacutegenos (ISBT 2016) Satildeo cinco os principais antiacutegenos do
sistema Rh D (RH1) C (RH2) E (RH3) c (RH4) e e (RH5) Esses antiacutegenos possuem alta
capacidade imunogecircnica e seus respectivos anticorpos estatildeo envolvidos na doenccedila hemoliacutetica
perinatal e em reaccedilotildees transfusionais hemoliacuteticas Os autoanticorpos quentes como ocorre na
anemia hemoliacutetica quente satildeo representados em grande parte por anticorpos contra antiacutegenos
puacuteblicos do sistema Rh (CASTILHO 2007 CHOU e WESTHOFF 2011 BARJAS-
CASTRO 2013) A tipagem RhD pesquisa o antiacutegeno D na membrana eritrocitaacuteria ao testar a
hemaacutecia com antissoros comerciais Atualmente a maior parte dos soros Anti-D
comercializados satildeo monoclonais
112 ANTICORPOS ANTI-ERITROCITAacuteRIOS
Anticorpos satildeo proteiacutenas presentes no plasma tambeacutem denominadas imunoglobulinas
Satildeo produzidas pelo sistema imune em resposta a um determinado antiacutegeno Podem ser
classificadas de acordo com suas caracteriacutesticas e propriedades em cinco classes de
imunoglobulinas IgG IgM IgA IgE e IgD (BARJAS-CASTRO 2013)
A ligaccedilatildeo entre o antiacutegeno e o anticorpo envolvem ligaccedilotildees natildeo covalentes que satildeo
reversiacuteveis Vaacuterios tipos de interaccedilotildees natildeo covalentes podem contribuir para a ligaccedilatildeo do
antiacutegeno pelo anticorpo incluindo forccedilas eletrostaacuteticas pontes de hidrogecircnio forccedilas de Van
der Walls e interaccedilotildees hidrofoacutebicas (ABBAS LICHTMAN e PILLAI 2008)
As interaccedilotildees antiacutegeno-anticorpo satildeo constituiacutedas por ligaccedilotildees dinacircmicas que sofrem
interferecircncia de alteraccedilotildees fiacutesico-quiacutemicas no meio como mudanccedilas na temperatura na forccedila
eletrostaacutetica na concentraccedilatildeo do antiacutegeno e do anticorpo e no pH O melhor pH para a reaccedilatildeo
eacute em torno de 70 no entanto raros anticorpos podem exigir acidificaccedilatildeo do meio para serem
identificados (SANTOS 2014)
Em imunohematologia satildeo pesquisados os anticorpos que reconhecem os antiacutegenos
eritrocitaacuterios de grupo sanguiacuteneo ldquoin vivordquo esses anticorpos dependendo de seu significado
cliacutenico satildeo capazes de reconhecer seus respectivos antiacutegenos sobre a hemaacutecia podendo levar
a sua destruiccedilatildeo por dois mecanismos fagocitose por macroacutefagos no sistema
4
reticuloendotelial ou por ativaccedilatildeo do sistema complemento com a formaccedilatildeo do complexo de
ataque a membrana e hemoacutelise intravascular As duas classes de anticorpos de maior
importacircncia em imunohematologia satildeo as imunoglobulinas IgG e a IgM (SANTOS 2014)
Devido a sua estrutura pentameacuterica os anticorpos da classe IgM se ligam aos
antiacutegenos localizados na superfiacutecie da membrana de hemaacutecias proacuteximas e promovem
aglutinaccedilatildeo das mesmas em meio salino ldquoin vitrordquo Anticorpos da classe IgG por sua vez
satildeo denominados ldquonatildeo aglutinantesrdquo ou ldquoincompletosrdquo pois sua estrutura de monocircmero eacute
pequena o que desfavorece a aglutinaccedilatildeo direta uma vez que uma mesma moleacutecula de IgG
natildeo alcanccedila antiacutegenos alvos em duas hemaacutecias proacuteximas Os anticorpos IgM aleacutem de terem
um tamanho maior apresentam 750 vezes maior eficiecircncia de aglutinaccedilatildeo que os anticorpos
IgG permitindo maior facilidade nas ligaccedilotildees entre as hemaacutecias (CARRUCIO e WISE 2012
GREEN e KLOSTERMANN 2012)
Nos testes ldquoin vitrordquo satildeo simulados reaccedilotildees que poderiam ocorrer ldquoin vivordquo causando
reaccedilotildees indesejaacuteveis A fase de sensibilizaccedilatildeo em que o anticorpo se liga ao antiacutegeno
correspondente natildeo eacute identificada macroscopicamente poreacutem uma vez que o anticorpo
aproxima as hemaacutecias e vence a forccedila eletrostaacutetica que naturalmente as repele chamada de
potencial zeta ocorre a aglutinaccedilatildeo Dependendo das caracteriacutesticas do anticorpo e de sua
capacidade de fixar complemento pode ocorrer tambeacutem a hemoacutelise (SANTOS 2014)
113 PESQUISA E IDENTIFICACcedilAtildeO DE ANTICORPOS IRREGULARES
A pesquisa de anticorpos irregulares eacute teste obrigatoacuterio nos testes preacute-transfusionais e
tem a finalidade de detectar anticorpos ldquoin vitrordquo que possam causar reaccedilatildeo ldquoin vivordquo
Dependendo da populaccedilatildeo estudada (pacientes x doadores) e ainda da sensibilidade do
teste a frequecircncia de anticorpos irregulares pode variar de 03 a 38 A imunizaccedilatildeo pode
ocorrer por transfusatildeo gestaccedilatildeo transplante ou injeccedilatildeo de material imunogecircnico (WALKER
2011)
Os anticorpos irregulares podem ser classificados como aloanticorpos que satildeo
voltados contra antiacutegenos ausentes na hemaacutecia autoacuteloga ou como autoanticorpos os quais
reconhecem antiacutegenos eritrocitaacuterios proacuteprios Os autoanticorpos antieritrocitaacuterios surgem em
decorrecircncia da desregulaccedilatildeo da autotoleracircncia imune relacionada agrave condiccedilotildees diversas como
doenccedilas hematoloacutegicas doenccedilas inflamatoacuterias autoimunes neoplasias infecccedilotildees e uso de
medicaccedilotildees A presenccedila do autoanticorpo associado a um quadro de anemia hemoliacutetica
caracteriza a anemia hemoliacutetica autoimune (AHAI) seja ela primaacuteria ou secundaacuteria agrave outra
5
patologia Ateacute 12 a 40 dos pacientes com autoanticorpos quentes podem apresentar
aloanticorpos de significado cliacutenico mascarados pelos autoanticorpos (SHIREY et al 2002)
Eacute importante detectar a presenccedila de anticorpos no plasmasoro de um receptor de
transfusatildeo para garantir que seja transfundido sangue compatiacutevel Quando a pesquisa de
anticorpo irregular resultar positiva para um ou mais anticorpos de relevacircncia clinica eacute
necessaacuterio confirmar a ausecircncia do respectivo antiacutegeno na hemaacutecia do receptor assim como
selecionar para transfusatildeo concentrados de hemaacutecias tambeacutem negativos para aqueles
antiacutegenos evitando assim reaccedilotildees transfusionais (WALKER 2011)
A detecccedilatildeo de um anticorpo irregular eacute inicialmente realizada pela triagem de
anticorpos na qual o soroplasma do receptor eacute testado com 2 a 3 hemaacutecias do tipo ldquoOrdquo O
conjunto de fenoacutetipos dessas hemaacutecias deve contemplar os antiacutegenos de maior importacircncia
cliacutenica Como os anticorpos irregulares de maior interesse cliacutenico satildeo na maior parte das
vezes imunes portanto da classe IgG eacute obrigatoacuteria a fase de antiglobulina (AGH) do teste
ou teste indireto da antiglobulina (TIA) uma vez que esses anticorpos satildeo incompletos
(CASTILHO JUNIOR e REID 2015) O teste de triagem estando positivo deve-se fazer a
identificaccedilatildeo da especificidade do anticorpo utilizando um painel com maior nuacutemero de
hemaacutecias fenotipadas
114 PROVA DE COMPATIBILIDADE
A prova de compatibilidade eacute um teste obrigatoacuterio em caso de transfusatildeo de
componentes eritrocitaacuterios Tambeacutem chamada de prova de compatibilidade maior deve ser
realizada antes da administraccedilatildeo de sangue total ou concentrado de hemaacutecias utilizando-se
hemaacutecias obtidas do tubo coletor da bolsa a ser transfundida e o soro ou plasma do receptor
(BRASIL 2016)
Eacute definido como o procedimento para excluir a incompatibilidade entre o doador e o
receptor Tem o objetivo de detectar anticorpos que podem natildeo ter sido encontrados na
pesquisa de anticorpos devido a ausecircncia ou pouca expressatildeo de antiacutegenos no painel de
hemaacutecias aleacutem da possibilidade de terem ocorrido erros teacutecnicos ou notacionais durante a
realizaccedilatildeo da pesquisa (MELO 2007)
6
115 FENOTIPAGEM PARA OUTROS SISTEMAS
Aleacutem da pesquisa de ABORh que eacute realizado rotineiramente a fenotipagem para
outros sistemas tambeacutem denominado ldquofenotipagem estendidardquo determina a presenccedila ou
ausecircncia de antiacutegenos considerados de importacircncia cliacutenica A fenotipagem natildeo eacute obrigatoacuteria
nos testes preacute-transfusionais poreacutem a legislaccedilatildeo atual recomenda a realizaccedilatildeo da fenotipagem
eritrocitaacuteria dos antiacutegenos C (RH2) E (RH3) c (RH4) e (RH5) K (KELL1) Fya (FY1) Fy
b
(FY2) Jka
(JK1) Jkb (JK2) S (MNS3) e s (MNS4) para pacientes aloimunizados e pacientes
com indicaccedilatildeo de transfusatildeo crocircnica (BRASIL 2016)
A seleccedilatildeo de concentrados de hemaacutecias com o mesmo fenoacutetipo do receptor para
transfusatildeo pode evitar reaccedilotildees transfusionais hemoliacuteticas no paciente previamente
aloimunizado tambeacutem previne a sensibilizaccedilatildeo por outros antiacutegenos o que normalmente
torna as transfusotildees seguintes ainda mais complicadas A fenotipagem do paciente tambeacutem
auxilia na identificaccedilatildeo dos anticorpos pois espera-se que nas hemaacutecias do paciente o
antiacutegeno seja negativo para o anticorpo encontrado servindo de guia para teste de exclusatildeo de
anticorpos (SANTOS 2014 WALKER 2011)
A incidecircncia de aloanticorpos aumenta com o nuacutemero de transfusotildees no entanto a
implantaccedilatildeo de rotina de fenotipagem com transfusatildeo profilaacutetica de hemaacutecias com fenoacutetipo
compatiacutevel para pacientes candidatos agrave politransfusatildeo como os portadores de doenccedila
falciforme talassemia anemia aplaacutestica doenccedilas linfo e mieloproliferativas renais crocircnicos e
anemias refrataacuterias pode contribuir para o baixo iacutendice de sensibilizaccedilatildeo nessas populaccedilotildees
(FLUIT KUNST e DRENTHE-SCHONK 1999 MARTINS et al 2008 e VICHINSKY et
al 2001) Outro grupo de pacientes que se beneficia com a transfusatildeo de mesmo fenoacutetipo satildeo
os pacientes com AHAI uma vez que o autoanticorpo pode mascarar a presenccedila de um
aloanticorpo de significado cliacutenico em ateacute 40 dos casos Mesmo com as teacutecnicas utilizadas
ldquoin vitrordquo para remover a interferecircncia do autoanticorpo no soro um aloanticorpo pode natildeo
ser identificado e dessa forma transfundir o mesmo fenoacutetipo do paciente evitaria reaccedilatildeo
hemoliacutetica pelos anticorpos voltados contra antiacutegenos de maior importacircncia cliacutenica e de
frequecircncia intermediaacuteria Aleacutem disso os pacientes com AHAI satildeo fortes respondedores e a
transfusatildeo profilaacutetica do mesmo fenoacutetipo previne a aloimunizaccedilatildeo (SHIREY et al 2002)
Aleacutem de fenotipar o receptor eacute importante tambeacutem que os bancos de sangue tenham
rotinas de fenotipagem de doadores para atender as necessidade dos pacientes aloimunizados
ou em esquema de transfusatildeo crocircnica (PINTO BRAGA e SANTOS 2011)
7
Rotineiramente eacute inviaacutevel estabelecer o fenoacutetipo eritrocitaacuterio completo de um
indiviacuteduo pela grande diversidade de sistemas sanguiacuteneos descritos Ate junho de 2015 jaacute
haviam sido classificados 308 antiacutegenos atribuiacutedos a 36 sistemas definidos pela Sociedade
Internacional de Transfusatildeo de Sangue (ISBT) (CASTILHO JUNIOR e REID 2015)
Portanto o paciente eacute normalmente fenotipado para os antiacutegenos de maior importacircncia
clinica
Alguns fatores podem limitar a realizaccedilatildeo da fenotipagem eritrocitaacuteria Um dos fatores
eacute a transfusatildeo alogecircnica realizada haacute menos de 90 dias Neste caso podem ocorrer resultados
falso positivos para determinados antiacutegenos devido agrave presenccedila de hemaacutecias do doador
(LAINE et al 2000)
Outro fator eacute a presenccedila de anticorpo sensibilizando a hemaacutecia do paciente e
provocando positividade do teste direto da antiglobulina humana (TDA) Os soros
normalmente utilizados para fenotipagem especialmente para os antiacutegenos Fya
(FY1) Fyb
(FY2) Jka
(JK1) Jkb
(JK2) S (MNS3) e s (MNS4) necessitam da fase de antiglobulina
humana (AGH) para que ocorra aglutinacatildeo Amostras que apresentam o TDA positivo
aglutinam apoacutes reaccedilatildeo com a AGH natildeo pela real presenccedila do antiacutegeno em sua superfiacutecie mas
pela interaccedilatildeo da AGH com o anticorpo que estaacute sensibilizando o eritroacutecito A interferecircncia
do TDA positivo pode ser anulada atraveacutes de algumas teacutecnicas capazes de dissociar o
anticorpo como por exemplo o tratamento da hemaacutecia sensibilizada com cloroquina ou com
glicina-aacutecida-EDTA (BRANCH e PETZ 1999 SHIREY et al 2002 e LEGER 2011)
12 METODOLOGIAS APLICADOS Agrave ROTINA IMUNO-HEMATOLOacuteGICA
Todos os testes que compotildeem a rotina preacute-transfusional usam meacutetodos soroloacutegicos
que envolvem a reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo e tem como objetivo determinar o perfil antigecircnico
eritrocitaacuterio do receptor e do doador assim como identificar em seu soro a presenccedila de
anticorpos contra antiacutegenos eritrocitaacuterios que possam comprometer a sobrevida das hemaacutecias
transfundidas Para testar o antiacutegeno na superfiacutecie da hemaacutecia eacute necessaacuterio dispor de um
antissoro com especificidade conhecida para aquele antiacutegeno Por outro lado para testar a
presenccedila de um determinado anticorpo no soro ou plasma do receptor eacute necessaacuterio o uso de
hemaacutecias com perfil antigecircnico conhecido (SANTOS 2014)
Diversas metodologias satildeo aplicadas nos laboratoacuterios de imunohematologia Cada
serviccedilo de hemoterapia faz a escolha do meacutetodo que seraacute aplicado de acordo com o perfil do
laboratoacuterio com o volume de exames diaacuterios e tambeacutem com o custo envolvido Todas essas
8
teacutecnicas tecircm como objetivo comum demonstrar a reaccedilatildeo entre antiacutegeno e anticorpo no
entanto elas se baseiam em diferentes princiacutepios Muitas metodologias satildeo atualmente
aplicadas agrave imunohematologia entre elas o sistema de fase soacutelida a tecnologia de hemaacutecias
magnetizadas a biologia molecular e ateacute mesmo a citometria de fluxo no entanto os meacutetodos
mais tradicionais satildeo aqueles baseados no princiacutepio de hemaglutinaccedilatildeo
121 MEacuteTODOS DE FASE FLUacuteIDA
Os meacutetodos de fase fluiacuteda satildeo testes baseados na hemaglutinaccedilatildeo e incluem o teste em
tubo e o teste em microplacas Uma suspensatildeo de hemaacutecias eacute adicionada ao plasma ou soro
em seguida eacute realizada a centrifugaccedilatildeo e por fim eacute feita a leitura do resultado que eacute
considerado positivo se for observado algum grau de aglutinaccedilatildeo ou hemoacutelise A intensidade
de aglutinaccedilatildeo eacute graduada de acordo com o tamanho dos agregados desprendidos da
superfiacutecie apoacutes agitaccedilatildeo delicada do tubo ou microplaca Os meacutetodos de hemaglutinaccedilatildeo satildeo
aplicados a todos os testes preacute-transfusionais Como os anticorpos ABO satildeo aglutininas frias
a tipagem eacute realizada em temperatura ambiente (22degC) no entanto ao investigar a presenccedila
de anticorpos irregulares que como jaacute mencionado eacute na maioria das vezes anticorpos
incompletos da classe IgG eacute essencial que a reaccedilatildeo seja incubada a 37degC As reaccedilotildees satildeo
facilitadas com a utilizaccedilatildeo de potencializadores e da antiglobulina humana (WALKER e
HARMENING 2012 AABB 2011)
Nos meacutetodos de fase fluiacuteda nos quais a AGH eacute empregada a fase de lavagem eacute
fundamental Apoacutes a incubaccedilatildeo do soro com as hemaacutecias deve ser realizada a lavagem da
reaccedilatildeo para remover o excesso de anticorpos natildeo ligados agraves hemaacutecias jaacute que os anticorpos
livres podem bloquear a AGH quando ela eacute adicionada e levar a resultados falso negativos
(AABB 2011)
Os testes de hemaglutinaccedilatildeo satildeo os mais tradicionais entre os meacutetodos ainda hoje
aplicados agrave rotina de bancos de sangue A vantagem desses meacutetodos eacute o baixo custo quando
comparado agraves teacutecnicas mais modernas mas apresentam tambeacutem desvantagens A teacutecnica em
tubo por exemplo natildeo permite automaccedilatildeo eacute trabalhosa e exige matildeo-de-obra bastante treinada
na execuccedilatildeo das diversas etapas do teste e mesmo assim pode haver subjetividade na
interpretaccedilatildeo dos resultados aleacutem de resultados falso-negativos (DOWNES 2011 ZANTEK
et al 2012)
9
122 COLUNAS DE GEL
A teacutecnica em gel iniciada na deacutecada de 90 representou uma grande revoluccedilatildeo na
rotina laboratorial tornando-se muito popular Aleacutem de ser sensiacutevel a teacutecnica dispensa a fase
de lavagem antes da adiccedilatildeo da AGH assim como a agitaccedilatildeo do teste para leitura reduzindo o
nuacutemero de resultados falsos negativos decorrentes dessas duas etapas e o tempo para
execuccedilatildeo dos testes (LAPIERRE et al 1989 NOVARETTI et al 2000 NOVARETTI et
al 2004) Os reagentes satildeo comercializados na forma de cartotildees plaacutesticos contendo
microtubos preenchidos por gel composto por microesferas de acrilamida-dextran Nesta
metodologia tambeacutem baseada na hemaglutinaccedilatildeo a suspensatildeo de hemaacutecias e o soro satildeo
depositados em uma cacircmara acima da coluna de gel e em seguida procede-se com a
centrifugaccedilatildeo dos cartotildees As microesferas atuam como uma malha que permite a passagem
em direccedilatildeo ao fundo do microtubo apenas das hemaacutecias natildeo aglutinadas enquanto as
hemaacutecias aglutinadas ficam retidas na parte superior da coluna ou ao longo dela (GREEN e
KLOSTERMANN 2012) Portanto quanto maior a agregaccedilatildeo mais hemaacutecias ficam retidas
no topo da coluna Dependendo do tipo de teste a ser realizado pode ser utilizado gel neutro
ou gel especiacutefico impregnado pelo anticorpo desejado e o gel contendo antiglobulina humana
que satildeo utilizados para os testes diretos e indiretos da antiglobulina (LAPIERRE et al 1989)
A coluna de gel ainda permite a visualizaccedilatildeo clara de duas populaccedilotildees distintas de hemaacutecias
como em pacientes receacutem transfundidos
123 BIOLOGIA MOLECULAR
A biologia molecular ou genotipagem estaacute sendo cada vez mais aplicada aos grupos
sanguiacuteneos pois fornece resultados seguros e precisos especialmente nos casos em que natildeo eacute
possiacutevel a realizaccedilatildeo da fenotipagem como em pacientes receacutem-transfundidos e pacientes
com TDA positivo Na genotipagem eacute possiacutevel determinar atraveacutes do DNA do paciente
extraiacutedo de seus leucoacutecitos de sangue perifeacuterico o fenoacutetipo eritrocitaacuterio deduzido sem
qualquer interferecircncia do anticorpo que sensibiliza a hemaacutecia ou de hemaacutecias alogecircnicas
transfundidas Sua realizaccedilatildeo no entanto exige o treinamento de equipe especializada e capaz
de interpretar os resultados em conjunto com os achados soroloacutegicos (JUNIOR e OLIVATO
2007)
Apesar de ser uma ferramenta de grande importacircncia hoje na imuno-hematologia
ainda estaacute restrito aos grandes centros de hemoterapia no Brasil poucos serviccedilos puacuteblicos de
sauacutede dispotildeem desse recurso e utilizam teacutecnicas de genotipagem de grupos sanguiacuteneos para
atendimento a seus pacientes Esta abordagem poreacutem vem sendo introduzida em algumas
10
instituiccedilotildees de reconhecida competecircncia na hemoterapia mas sua disponibilizaccedilatildeo deve
tornar-se mais generalizada atraveacutes da formaccedilatildeo de centros de referecircncia para atendimento
das diversas unidades de hemoterapia (MARTINS et al 2009) Dessa forma muitas decisotildees
transfusionais especialmente em urgecircncias ainda devem ser tomadas sem o resultado da
genotipagem eritrocitaacuteria
13 TESTE DA ANTIGLOBULINA
Coombs Mourant e Race descreveram em 1945 uma teacutecnica com utilizando soro de
coelho contendo antiglobulina humana (AGH) que posteriormente foi chamada de ldquosoro de
Coombsrdquo O meacutetodo foi desenvolvido inicialmente para ampliar o efeito de aglutininas fracas
do sistema Rh anticorpos ldquoincompletosrdquo que normalmente natildeo apresentavam aglutinaccedilatildeo
visiacutevel O teste foi concebido como um instrumento de investigaccedilatildeo de doenccedila hemoliacutetica do
receacutem-nascido e de reaccedilotildees transfusionais causadas por anticorpos Rh que estavam presentes
no soro dos paciente poreacutem que natildeo eram demonstraacuteveis pelas teacutecnicas ateacute entatildeo existentes
A maior parte dos anticorpos de significado cliacutenico assim como seus respectivos
antiacutegenos foram descritos apoacutes o surgimento do ldquosoro de Coombsrdquo em 1945 sendo assim o
teste da antiglobulina representa ateacute hoje a forma mais importante de aglutinaccedilatildeo artificial em
imunohematologia permitindo revelar a presenccedila de anticorpos na membrana da hemaacutecia A
antiglobulina humana eacute constituiacuteda por anticorpo especiacutefico contra a porccedilatildeo Fc de outro
anticorpo Quando um anticorpo ldquoincompletordquo sensibiliza a hemaacutecia normalmente natildeo
provoca aglutinaccedilatildeo visiacutevel Apoacutes a adiccedilatildeo da AGH ao meio esta reconhece e se liga agraves
porccedilotildees Fc dos anticorpos que sensibilizam a hemaacutecia formando assim uma malha e
provocando aglutinaccedilatildeo visiacutevel (BARJAS-CASTRO 2013)
Os reagentes de antiglobulina podem ser poliespeciacuteficos ou monoespeciacuteficos Os
poliespeciacuteficos satildeo uma mistura de anticorpos ant-IgG e anti-C3d (fraccedilatildeo C3d do
complemento) Os reagentes monoespecificos podem ser anti-IgG anti-IgM anti-IgA anti-
complemento podendo ser anti-C3d e anti-C3b
O teste da antiglobulina pode ser usado para detectar hemaacutecias sensibilizadas com
aloanticorpos IgG autoanticorpos IgG e componentes do complemento A sensibilizaccedilatildeo
pode ocorrer ldquoin vivordquo ou ldquoin vitrordquo O uso do AGH para detectar a sensibilizaccedilatildeo ldquoin vitrordquo
tem dois estaacutegios e eacute denominado teste indireto da antiglobulina A sensibilizaccedilatildeo ldquoin vivordquo eacute
detectada em procedimento de um uacutenico estagio chamado teste direto da antiglobulina (TDA)
11
Os testes direto e indireto satildeo ateacute hoje amplamente aplicados como princiacutepio de inuacutemeros
testes soroloacutegicos em imuno-hematologia (GREEN e KLOSTERMANN 2012)
131 TESTE DIRETO DA ANTIGLOBULINA
O teste direto da antiglobulina humana revela a presenccedila de anticorpo eou fraccedilatildeo do
complemento ligados agrave superfiacutecie das hemaacutecias As sensibilizaccedilatildeo das hemaacutecias ocorrida ldquoin
vivordquo natildeo eacute visualizada mas apoacutes a adiccedilatildeo da antiglobulina humana ocorre a aglutinaccedilatildeo que
eacute visualizada macroscopicamente (Figura 1)
Figura 1 - Princiacutepio da teacutecnica direta da antiglobulina Teste utilizado para demonstrar a sensibilizaccedilatildeo ldquoin
vivordquo das hemaacutecias O sangue total eacute coletado do paciente em tubo contendo anticoagulante EDTA Na teacutecnica
realizada em tubo uma suspensatildeo de hemaacutecias 5 em soluccedilatildeo de salina eacute preparada Uma gota dessa suspensatildeo
eacute lavada 3 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica para retirada de anticorpos que estatildeo livres no plasma Toda soluccedilatildeo eacute
retirada e adiciona-se o soro de Coombs (antiglobulina humana) O soro de Coombs reconhece os anticorpos que
estatildeo ligados agrave superfiacutecie das hemaacutecias fazendo com que ocorra aglutinaccedilatildeo visiacutevel macroscopicamente
Apesar de natildeo ser um teste preacute-transfusional obrigatoacuterio o TDA eacute um dos testes mais
importantes para investigar e classificar quadros hemoliacuteticos como de origem imune ou natildeo
imune O seu valor preditivo positivo em vigecircncia de anemia hemoliacutetica eacute de 83 poreacutem natildeo
havendo sinais de hemoacutelise seu valor preditivo eacute apenas 14 Eacute por esse motivo que a
interpretaccedilatildeo do TDA positivo deve levar em consideraccedilatildeo a histoacuteria cliacutenica e os resultados
dos outros exames laboratoriais A realizaccedilatildeo do TDA eacute obrigatoacuteria na investigaccedilatildeo
12
laboratorial de diversos quadros hemoliacuteticos entre eles a anemia hemoliacutetica autoimune
(AHAI) a reaccedilatildeo hemoliacutetica imune poacutes-transfusional a siacutendrome do linfoacutecito passageiro a
doenccedila hemoliacutetica perinatal e a hemoacutelise droga-dependente (LEGER 2011)
Resultados de TDA positivos foram tambeacutem observados em indiviacuteduos com niacuteveis
seacutericos elevados de IgG ou complemento sem evidecircncia de anemia hemoliacutetica imune como
em pacientes com doenccedila falciforme talassemia doenccedila renal crocircnica mieloma muacuteltiplo
doenccedilas autoimunes e siacutendrome da imunodeficiecircncia adquirida (SIDA) Aleacutem disso pequenas
quantidades de IgG (5 a 90 moleacuteculas por hemaacutecia) e complemento (5 a 40 moleacuteculas por
hemaacutecia) podem estar presentes nas hemaacutecias de indiviacuteduos saudaacuteveis sem associaccedilatildeo com
reduccedilatildeo na sobrevida das mesmas A positividade do TDA depende da populaccedilatildeo estudada e
pode variar de 01 entre doadores de sangue sem qualquer sinal cliacutenico de hemoacutelise ateacute
15 em pacientes hospitalizados (CASTILHO JUNIOR e REID 2015 LEGER 2011)
Indiviacuteduos que apresentam TDA positivo seja agraves custas de IgG eou complemento
com ou sem sinais cliacutenicos de hemoacutelise teratildeo a fenotipagem eritrocitaacuteria prejudicada A
fenotipagem de indiviacuteduos com TDA positivo especialmente quando utilizado o teste indireto
da antiglobulina pode acarretar resultados falsos positivos e levar a seleccedilatildeo de fenoacutetipo
incorreto para transfusatildeo
132 TESTE INDIRETO DA ANTIGLOBULINA
O teste indireto da antiglobulina (TIA) eacute utilizado para revelar a sensibilizaccedilatildeo ldquoin
vitrordquo das hemaacutecias e eacute aplicado a diversos testes soroloacutegicos em imunohematologia entre
eles a pesquisa de anticorpos identificaccedilatildeo de anticorpos testes de compatibilidade
fenotipagem eritrocitaacuteria e titulaccedilatildeo de anticorpos Na teacutecnica indireta a hemaacutecia que contecircm
o antiacutegeno eacute colocada em contato ldquoin vitrordquo com o anticorpo que se liga mas natildeo promove a
aglutinaccedilatildeo visiacutevel A adiccedilatildeo da AGH forma uma malha entre os anticorpos que sensibilizam
as hemaacutecias e provoca a aglutinaccedilatildeo macroscoacutepica (figura 2)
Caso a amostra de hemaacutecia estudada seja previamente sensibilizada resultados falsos
positivos podem ser obtidos no TIA jaacute que a AGH reagiraacute com a moleacutecula que sensibilizava
anteriormente a hemaacutecia mesmo se o anticorpo especiacutefico natildeo tiver se ligado ao antiacutegeno
correspondente
13
133 CONDICcedilOtildeES CLIacuteNICAS COM TDA POSITIVO
O TDA positivo deve ser interpretado cuidadosamente sempre em conjunto com o
quadro cliacutenico do paciente A positividade isolada do TDA natildeo significa hemoacutelise A
interpretaccedilatildeo do teste positivo requer o conhecimento do diagnoacutestico do paciente da presenccedila
de sinais e sintomas sugestivos de hemoacutelise assim como de seu histoacuterico transfusional
gestacional e de informaccedilotildees sobre o uso recente de medicaccedilotildees (LEGER 2011)
Figura 2 ndash Princiacutepio do teste indireto da antiglobulina O TIA pode ser utilizado na pesquisa de anticorpos de
especificidades desconhecidas livres no soroplasma como eacute o caso da pesquisa e identificaccedilatildeo de anticorpos
irregulares Ele eacute tambeacutem utilizado para determinar a presenccedila de antiacutegenos na membrana da hemaacutecia quando
satildeo empregados soros de especificidades conhecidas da classe IgG No primeiro caso o soroplasma contendo o
anticorpo desconhecido eacute colocado em contato com hemaacutecias cujo perfil antigecircnico eacute conhecido No segundo
caso utiliza-se soro de especificidade conhecida da classe IgG para determinar a presenccedila ou ausecircncia de um
antiacutegeno na membrana O anticorpo encontra o antiacutegeno correspondente e ocorre a ligaccedilatildeo do anticorpo agrave
hemaacutecia mas natildeo ocorre aglutinaccedilatildeo Apoacutes a adiccedilatildeo da AGH que se liga aos anticorpos formando uma malha
ocorre a aglutinaccedilatildeo visiacutevel
O TDA positivo eacute uma achado claacutessico de algumas condiccedilotildees cliacutenicas como a reaccedilatildeo
transfusional hemoliacutetica a doenccedila hemoliacutetica do feto e do receacutem-nascido (DHFRN) a anemia
hemoliacutetica induzida por drogas a siacutendrome do linfoacutecito passageiro e a anemia hemoliacutetica
autoimune (AHAI) Portanto o TDA positivo pode ser decorrente da sensibilizaccedilatildeo da
hemaacutecia autoacuteloga por um autoanticorpo ou por um aloanticorpo ligado agrave hemaacutecia alogecircnica
circulante A positividade do TDA pode ainda ocorrer de forma passiva em pacientes que
14
recebem imunoglobulinas humanas ou ainda pela transfusatildeo de plaquetas ABO natildeo idecircntico
(LEGER 2011 RALPH 2012 ZANTEK et al 2012)
Nas reaccedilotildees transfusionais hemoliacuteticas imunes o aloanticorpo do receptor sensibiliza
as hemaacutecias transfundidas do doador e reduz sua sobrevida ao removecirc-la precocemente da
circulaccedilatildeo pela fagocitose no sistema retiacuteculo-endotelial ou pela hemoacutelise intravascular As
reaccedilotildees podem ser agudas se ocorrem ateacute 24 horas ou tardias quando ocorrem apoacutes 24 horas
da transfusatildeo A gravidade das reaccedilotildees hemoliacuteticas pode variar de um simples rendimento
transfusional inadequado agrave quadros graves de hemoacutelise intravascular evoluindo ateacute mesmo
com choque vascular e oacutebito O TDA pode resultar negativo caso toda massa eritrocitaacuteria
transfundida tenha sido destruiacuteda (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
Na doenccedila hemoliacutetica do feto e do receacutem-nascido (DHFRN) anticorpos maternos da
classe IgG atravessam a barreira placentaacuteria e sensibilizam as hemaacutecias fetais que seratildeo
destruiacutedas precocemente levando agrave anemia fetal Apesar da incompatibilidade ABO feto-
materna ser a causa mais frequente de DHFRN raramente ela eacute responsaacutevel pela ocorrecircncia
de quadros graves Por outro lado anticorpos contra antiacutegenos do sistema Rh e Kell
especialmente Anti-D (Anti-RH1) Anti-c (Anti-RH4) e Anti-Kell (Anti-KELL1) satildeo
conhecidos por causar DHFRN severa Raramente outros anticorpos tambeacutem podem estar
implicados na DHFRN como os anticorpos contra antiacutegenos do sistema Kidd Duffy MNS e
Diego (ZANTEK et al 2012)
A hemoacutelise droga-dependente eacute causada pela produccedilatildeo de um anticorpo voltado contra
a droga ligada agrave membrana eritrocitaacuteria ou ainda contra o complexo droga-membrana A
classe de medicaccedilotildees mais comumente envolvida eacute a dos antimicrobianos betalactacircmicos
(penicilinas e cefalosporinas) mas outras classes como quimioteraacutepicos e anti-inflamatoacuterios
tambeacutem satildeo descritos (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
Apoacutes transplante de ceacutelulas progenitoras hematopoieacuteticas em que o doador possui
anticorpos contra antiacutegenos eritrocitaacuterios do receptor o linfoacutecito de memoacuteria do doador pode
resistir ao esquema imunossupressor utilizado e continuar a produccedilatildeo de anticorpos que
reconhecem a hemaacutecia incompatiacutevel do receptor ainda circulante O quadro cliacutenico pode
variar de um simples TDA positivo sem outros sinais ou sintomas ateacute um quadro hemoliacutetico
grave e abrupto (LEGER 2011)
15
134 ANEMIA HEMOLIacuteTICA AUTOIMUNE
A anemia hemoliacutetica autoimune eacute caracterizada pela destruiccedilatildeo precoce das hemaacutecias
autoacutelogas por autoanticorpos que sensibilizam as hemaacutecias e levam agrave fagocitose pelos
macroacutefagos no sistema reticulo-endotelial ou hemoacutelise intravascular O diagnoacutestico da AHAI
baseia-se na presenccedila de hemoacutelise cliacutenica associada agrave evidecircncia de fator imune representado
pelo TDA positivo As classes de anticorpos envolvidas em quadros de AHAI satildeo IgG IgM e
raramente IgA (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012) Satildeo raros os casos de AHAI com TDA
negativo que podem estar relacionados a um autoanticorpo de baixa avidez de densidade
inferior agrave detecccedilatildeo do meacutetodo ou ainda de classe de imunoglobulina natildeo avaliada pelo
meacutetodo utilizado para o teste (GARRATY 2005)
A AHAI pode ser classificada em dois grupos principais de acordo com a melhor
temperatura de reaccedilatildeo do autoanticorpo As anemias hemoliacuteticas causadas por anticorpos
quentes que reagem melhor a 37oC e geralmente IgG representam 80 dos casos de AHAI
Nas AHAI por anticorpo quente o TDA pode ser positivo para IgG mais complemento (67)
somente IgG (20) ou somente por complemento (13) As anemias causadas por
anticorpos frios geralmente da classe IgM e que reagem melhor em temperatura ambiente ou
a 4oC representam aproximadamente 20 dos casos de AHAI Por exibirem amplitude
teacutermica esses anticorpos ligam-se agraves hemaacutecias ao atingirem a circulaccedilatildeo nas extremidades do
corpo fixam o complemento e desprendem-se da hemaacutecia apoacutes retornar para partes mais
quentes Por esse motivo em AHAI por anticorpos frios o TDA eacute positivo apenas agraves custas
de C3 e normalmente o IgM natildeo eacute detectado (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
A presenccedila do autoanticorpo IgG pode ser confirmada atraveacutes da eluiccedilatildeo do anticorpo
da hemaacutecia Tipicamente o eluato na AHAI por anticorpo quente reage com todas as ceacutelulas
testadas de um painel de hemaacutecias alogecircnicas do tipo ldquoOrdquo ou pode eventualmente exibir uma
especificidade conhecida como Anti-e (Anti-RH5) Nas AHAI a frio por sua vez espera-se
um eluato negativo (LEGER 2011)
Os autoanticorpos satildeo com frequecircncia encontrados livres no plasma e natildeo somente
ligados agraves hemaacutecias autoacutelogas Eles podem interferir em todas as fases dos testes preacute-
transfusionais nas quais o plasma eacute testado especialmente os autoanticorpos quentes que
acarretam resultados positivos em todos os testes levados agrave fase de antiglobulina humana
Esses anticorpos portanto positivam a pesquisa de anticorpos irregulares e mascaram a
presenccedila de aloanticorpos de significado cliacutenico Aproximadamente 60 dos pacientes que
apresentam AHAI a quente apresentam anticorpos que reagem em meio salino mas se forem
16
levados em conta meacutetodos mais sensiacuteveis como PEG enzima e estudo em gel a positividade
pode ser superior a 90 (LEGER 2011)
Aleacutem da eficaacutecia da transfusatildeo ser comprometida pela diminuiccedilatildeo da vida-meacutedia das
hemaacutecias a presenccedila do autoanticorpo dificulta a realizaccedilatildeo dos testes preacute-transfusionais e
compromete a seguranccedila transfusional Os autoanticorpos reagem normalmente como
panaglutininas pois satildeo normalmente voltados contra antiacutegenos puacuteblicos na maior parte das
vezes contra antiacutegenos do sistema Rh Por apresentarem essas caracteriacutesticas podem ainda
mascarar a presenccedila de aloanticorpos de significado clinico e levar a testes de compatibilidade
positivos exigindo uma avaliaccedilatildeo criteriosa da necessidade da transfusatildeo (BRANCH e PETZ
1999 JUNIOR e OLIVATO 2004)
Remover a interferecircncia do autoanticorpo para avaliar a presenccedila de aloanticorpos
mascarados nem sempre eacute possiacutevel mesmo utilizando teacutecnicas de autoadsorccedilatildeo ou
aloadsorccedilatildeo que aleacutem de tudo satildeo demoradas e exigem de 2 a 6 horas para conclusatildeo
(GARRATY e GEORGE 2002) Nesses casos a fenotipagem eritrocitaacuteria do paciente eacute de
extrema utilidade especialmente em situaccedilotildees de urgecircncia A definiccedilatildeo do fenoacutetipo do
paciente para os antiacutegenos de maior importacircncia cliacutenica pode auxiliar a seleccedilatildeo de unidades
de hemaacutecias com mesmo fenoacutetipo o que garante que eventuais aloanticorpos natildeo
identificados sejam respeitados e tambeacutem evita nova sensibilizaccedilatildeo (JUNIOR e OLIVATO
2004 SHIREY et al 2002)
135 TRATAMENTO DE HEMAacuteCIAS COM TDA POSITIVO
O TDA positivo impede a fenotipagem eritrocitaacutecia por meacutetodos que exigem a fase de
AGH uma vez que a aglutinaccedilatildeo ocorreraacute devido agrave interaccedilatildeo da AGH com o autoanticorpo
que sensibiliza a hemaacutecia do paciente levando a resultados falso positivos Em algumas
situaccedilotildees como na AHAI por anticorpo quente a fenotipagem eacute especialmente importante
pois o autoanticorpo interfere na triagem e identificaccedilatildeo de anticorpos assim como no teste de
compatibilidade e dificultam a detecccedilatildeo de aloanticorpos de significado cliacutenico que
obrigatoriamente devem ser respeitados Nessas situaccedilotildees a fenotipagem eritrocitaacuteria
determina o perfil antigecircnico do paciente e possibilita o fornecimento de unidades de
hemaacutecias com o mesmo fenoacutetipo para a transfusatildeo evitando a sensibilizaccedilatildeo para novos
antiacutegenos assim como reaccedilotildees hemoliacuteticas transfusionais No entanto eacute necessaacuterio aplicar
meacutetodos que natildeo sofram interferecircncia do TDA positivo ou seja meacutetodos que natildeo necessitem
da fase de AGH ou meacutetodos de bloqueio do anticorpo sem bloquear o antiacutegeno Uma opccedilatildeo eacute
a utilizaccedilatildeo de soros monoclonais IgM (salinos ou de meio proteico natildeo concentrado) mas
17
nem sempre esses reagentes estatildeo disponiacuteveis especialmente os reagentes monoclonais para
os antiacutegenos dos sistemas Duffy ( Fya Fy
b) Kidd ( Jk
a Jk
b) e MNS (S s) (JUNIOR e
OLIVATO 2004) Outra opccedilatildeo eacute a teacutecnica de bloqueio que pode ser utilizada para tratar
hemaacutecias para posterior fenotipagem em casos de TDA positivos com reatividade le2+
Em casos onde a positividade do TDA eacute maior que 2+ estaacute indicada a tratamento
quiacutemico para remoccedilatildeo da interferecircncia do autoanticorpo antes de realizar a fenotipagem Entre
as teacutecnicas utilizadas atualmente estatildeo o ZZAP a cloroquina e a glicina aacutecidaEDTA
1351 TEacuteCNICA DE BLOQUEIO
A teacutecnica de bloqueio se baseia na utilizaccedilatildeo de anti-IgG (Coombs monoespeciacutefico)
para tratar as hemaacutecias com TDA positivo O anticorpo anti-IgG se liga aos anticorpos que
estatildeo sensibilizando a hemaacutecias poreacutem sem o bloquear os antiacutegenos Os antiacutegenos que natildeo
estatildeo sensibilizados podem ser detectados atraveacutes dos antissoros especiacuteficos (SERERAT
VEIDT E DUTCHED 2000)
1352 TRATAMENTO DE HEMAacuteCIAS COM ZZAP
O Sulphydryl-Proteolytic Enzyme (ZZAP) que eacute uma mistura de ditiotreitol (DTT)
mais papaiacutena ativada com cisteiacutena eacute um reagente capaz de dissociar imunoglobulinas da
classe IgG ligadas a membrana dos eritroacutecitos enquanto trata enzimaticamente as hemaacutecias
O tratamento enzimaacutetico tambeacutem potencializa a ligaccedilatildeo do autoanticorpo ao antiacutegeno e
acelera o processo de autoadsorccedilatildeo O ZZAP pode desnaturar os antiacutegenos do sistema Duffy
MNS e Kell o que limita sua aplicaccedilatildeo para fins de fenotipagem (BRANCH e PETZ 1982)
1353 CLOROQUINA
Em 1982 Edwards Moulds e Judd propuseram a utilizaccedilatildeo da teacutecnica da cloroquina
que dissociava os complexos antiacutegeno-anticorpo e mantinha a membrana das hemaacutecias
iacutentegras Os derivados quinolecircicos jaacute haviam sido descritos anteriormente por Domokos e
Aszody em 1964 e Holtz Mantel e Buck em 1973 (apud Edwards Moulds e Judd 1982) pela
sua capacidade de separar imunocomplexos e inibir as reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo reduzindo
as cargas eleacutetricas das superfiacutecie das hemaacutecias A teacutecnica eacute uma das mais utilizadas nos
centros brasileiros para remover a interferecircncia do autoanticorpo e eacute tambeacutem a teacutecnica
atualmente adotada pelo laboratoacuterio de imunohematologia do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto
18
Edwards Moulds e Judd (1982) demonstraram que a teacutecnica da cloroquina para
dissociaccedilatildeo de anticorpos eacute uma teacutecnica simples efetiva e confiaacutevel para dissociar
imunoglobulina das hemaacutecias Desde que a membrana das hemaacutecias permaneccedila intacta natildeo
haacute perda da reatividade dos antiacutegenos e a sua maior aplicaccedilatildeo eacute a fenotipagem de hemaacutecias
com TDA positivo Os autores verificaram que em 83 das amostras sensibilizadas in vivo e
22 amostras (no total de 40) sensibilizadas ldquoin vitrordquo apresentaram TDA negativo e
puderam ser fenotipadas A teacutecnica poreacutem natildeo consegue remover os componentes do
complemento na maioria dos casos
Champagne e colaboradores (1999) testaram a teacutecnica da cloroquina para dissociar
antiacutegenos Bg comparando com a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA e verificaram vantagem em
relaccedilatildeo ao uso de um uacutenico reagente diminuindo a manipulaccedilatildeo e verificou que o mesmo natildeo
destroacutei antiacutegeno Kell
A cloroquina tambeacutem mostrou-se pouco efetivo em remover anticorpos do sistema
Duffy da superfiacutecie das hemaacutecias (EDWARDS MOUDS e JUDD 1982 ROZIERS e
SQUALI 1997)
1353 GLICINA-AacuteCIDAEDTA
A afinidade e a estabilidade entre a ligaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo eacute definida como a
resultante entre forccedilas atrativas e repulsivas entre ambos (CARUCIO e WISE 2012) e resulta
da somatoacuteria de forccedilas quiacutemicas dinacircmicas e fracas (natildeo covalentes) como pontes de
hidrogecircnio forcas eletrostaacuteticas forca de Van der Waals e pontes hidrofoacutebicas A estabilidade
dessa ligaccedilatildeo eacute facilmente abalada por alteraccedilotildees quiacutemicas e fiacutesicas no meio da reaccedilatildeo como
a alteraccedilatildeo do pH A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA se baseia na mudanccedila do pH para a
quebra da ligaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo (KOSANKE 2012)
A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA foi primeiramente descrita em 1986 por Louie Jieng
e Zeroulis que utilizaram 50 amostras de doadores sensibilizados ldquoin vitrordquo com anticorpos A
teacutecnica foi efetiva em 48 amostras permitindo o estudo do eluato assim como a fenotipagem
das hemaacutecias Os autores testaram tambeacutem a teacutecnica em 100 hemaacutecias TDA positivo que
puderam ser utilizadas para teacutecnicas de autoadsorccedilatildeo
Byrne (1991) descreveu a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA modificada e tambeacutem
verificou como uma opccedilatildeo para o tratamento de hemaacutecias com TDA positivo que deixava as
hemaacutecias intactas e o eluato viaacutevel para ser fenotipado
19
Roziers e Squali (1997) e Katharia e Chaudhary (2013) compararam a teacutecnica da
glicina-aacutecidaEDTA com as teacutecnicas da cloroquina e do aquecimento Verificaram maior
eficiecircncia da glicina-aacutecidaEDTA em relaccedilatildeo as outras duas teacutecnicas pois com uma mesma
quantidade de amostra produzia as hemaacutecias livres de anticorpo e tambeacutem o eluato Mostrou-
se ainda superior devido ao menor tempo exigido para sua realizaccedilatildeo o que favorece seu uso
em situaccedilotildees de urgecircncia e emergecircncia
As duas desvantagens da teacutecnica poreacutem eacute o fato de destruir os antiacutegenos do sistema
Kell e o fato de natildeo remover fraccedilotildees do complemento ligadas agrave hemaacutecia (PALLAS WILER e
McGEE 1991 ROZIERS e SQUALLI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012
e KATHARIA e CHAUNDHARY 2013)
20
2 OBJETIVOS
21 OBJETIVO GERAL
211 Avaliar a eficaacutecia da glicina-aacutecidaEDTA em remover os anticorpos ligados agraves
hemaacutecias sensibilizadas por anticorpos da classe IgG
22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
221 Preparaccedilatildeo dos reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
verificaccedilatildeo da estabilidade dos mesmos e avaliar custos
222 Testar a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA em amostras de hemaacutecias
sensibilizadas por anticorpos antieritrocitaacuterios humanos
223 Comparar a efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA com a teacutecnica da
cloroquina quanto a capacidade de remover a interferecircncia do anticorpo ligado
a hemaacutecia
224 Testar o eluato das amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA
225 Verificar se houve destruiccedilatildeo dos antiacutegenos eritrocitaacuterios apoacutes o tratamento
com glicina-aacutecidaEDTA e com cloroquina
226 Verificar se o tempo de execuccedilatildeo da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA descrito
nos textos de referecircncia eacute reprodutiacutevel
21
3 JUSTIFICATIVA
Algumas condiccedilotildees cliacutenicas podem levar ao depoacutesito ldquoin vivordquo de anticorpos eou
fraccedilotildees do complemento sobre as hemaacutecias Entre elas estatildeo as reaccedilotildees hemoliacuteticas poacutes-
transfusionais a doenccedila hemoliacutetica perinatal o uso de medicamentos e principalmente a
AHAI Na AHAI um anticorpo normalmente da classe IgG ou IgM reconhece antiacutegenos
proacuteprios na membrana eritrocitaacuteria e reduz a sobrevida da hemaacutecia levando a sua destruiccedilatildeo
pelos macroacutefagos no sistema reticulo-endotelial ou agrave ativaccedilatildeo do complexo de ataque agrave
membrana e agrave lise intravascular Os autoanticorpos satildeo voltados na maioria das vezes contra
antiacutegenos eritrocitaacuterios de alta frequecircncia populacional conhecidos como antiacutegenos puacuteblicos
e por este motivo reconhecem tanto hemaacutecias autoacutelogas quanto alogecircnicas
Devido agrave presenccedila do autoanticorpo livre no plasma e tambeacutem do anticorpo eou
complemento ligado agrave hemaacutecia o banco de sangue pode encontrar dificuldades em todas as
fases dos testes preacute-transfusionais do paciente com AHAI e deve utilizar teacutecnicas que
auxiliem na escolha do melhor hemocomponente melhorando a seguranccedila transfusional Essas
teacutecnicas visam remover a interferecircncia do autoanticorpo livre no soro e do autoanticorpo
ligado agrave hemaacutecia permitindo a detecccedilatildeo de aloanticorpos associados e a realizaccedilatildeo da
fenotipagem eritrocitaacuteria respectivamente
A finalizaccedilatildeo dos testes preacute-tranfusionais na presenccedila de autoanticorpo pode levar
algumas horas e nem sempre o paciente poderaacute aguardar Nesse contexto torna-se vantajosa a
aplicaccedilatildeo de teacutecnicas de raacutepida execuccedilatildeo
O presente estudo propotildee aplicar e avaliar a eficaacutecia da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
em remover os anticorpos ligados agrave hemaacutecia o que permite a fenotipagem eritrocitaacuteria
estendida e a seleccedilatildeo de concentrados de hemaacutecias com mesmo fenoacutetipo do paciente
Atualmente no Hemocentro de Ribeiratildeo Preto a teacutecnica utilizada para esse fim eacute o
tratamento das hemaacutecias com difosfato de cloroquina cujo tempo de execuccedilatildeo pode demorar
ateacute duas horas enquanto a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser realizada em apenas dois
minutos o que a tornaria opccedilatildeo de escolha especialmente em situaccedilotildees de urgecircncia Ao
contraacuterio da cloroquina a glicina-aacutecidaEDTA permite tambeacutem o estudo do eluato das
hemaacutecias tratadas
22
4 METODOL OGIA
41 AMOSTRAS DE DOADORES
Foram coletados 50 amostras de doadores de sangue que compareceram ao
Hemonuacutecleo de Araccedilatuba no periacuteodo de junho a agosto de 2016 Foram convidados a
participar da pesquisa doadores de repeticcedilatildeo do tipo sanguiacuteneo ldquoOrdquo RhD positivo
cadastrados no sistema de banco de sangue (SBS) do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto
Todos os doadores que concordaram em participar da pesquisa assinaram o termo de
consentimento livre e esclarecido (TCLE)
No momento da doaccedilatildeo foram coletados adicionalmente 5 mL de sangue total em
soluccedilatildeo anticoagulante EDTA (aacutecido dietilenoaminoaceacutetico) dispensando punccedilatildeo venosa
adicional para coleta da amostra O fluxograma 1 resume as etapas desenvolvidas no projeto
Fluxograma 1 - Fluxo da pesquisa utilizando as amostras de doadores
23
411 FENOTIPAGEM
Foram verificados se os doadores jaacute tinham fenotipagem para outros sistemas de
grupos sanguiacuteneos aleacutem do sistema ABORh que eacute realizado rotineiramente
A fenotipagem eritrocitaacuteria para outros sistemas ou fenotipagem estendida eacute realizada
para identificar a presenccedila ou ausecircncia de antiacutegenos considerados de importacircncia cliacutenica No
Hemonuacutecleo de Araccedilatuba uma parcela de doadores de repeticcedilatildeo satildeo fenotipados para os
antiacutegenos dos sistemas de grupo sanguiacuteneo Rh (antiacutegenos C c E e e) Kell (antiacutegeno K)
Duffy (antiacutegenos Fya e Fy
b) Kidd (antiacutegenos Jk
a e Jk
b) e sistema MNSs (antiacutegenos S e s)
A fenotipagem para o Rh e Kell eacute realizada por metodologia de microplaca utilizando
25 microL de hemaacutecia lavada e diluiacuteda a 5 em salina e 25 microL do antissoro comercial especiacutefico
A reaccedilatildeo eacute incubada 15 minutos a temperatura ambiente e centrifugadas para leitura Para os
antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s a metolodogia utilizado eacute gel contendo antiglobulina
humana (gel LissCoombs poliespeciacutefico) da marca BIO-RAD onde se utiliza suspensatildeo de
hemaacutecia em LISS (Soluccedilatildeo de baixa forccedila iocircnica) A suspensatildeo eacute preparada atraveacutes da
diluiccedilatildeo de 10 microL de hemaacutecia em 1000 microL de LISS Pipetado 50 microL dessa diluiccedilatildeo no gel e
adicionado 25 microL do antissoro especiacutefico Incuba-se em banho seco por 15 minutos a 37 deg
Celsius e eacute centrifugado em centriacutefuga especiacutefica Os antissoros utilizados eram das marcas
Fresenius e Lorne
Foi verificado a fenotipagem do doador no banco de dados do Hemocentro Os
registros dos fenoacutetipos dos doadores ficam armazenadas no sistema de banco de sangue
(SBS) Para doadores que natildeo tinham fenotipagem estendida preacutevia para antiacutegenos do sistema
Rh (C c E e e) e Kell (K) foi realizada a fenotipagem para esses antiacutegenos
O tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA e cloroquina para dissociar
anticorpos pode inativar enfraquecer ou destruir os antiacutegenos presentes nas hemaacutecias
alterando assim os resultados da fenotipagem Para verificar se houve destruiccedilatildeo dos
antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a e Jk
b S e s nas amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes
tratamento foram novamente fenotipadas ao final para os antiacutegenos que eram inicialmente
positivas
A repeticcedilatildeo da fenotipagem foi realizada nas amostras que apresentaram efetividade
no tratamento da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eou da cloroquina e a detecccedilatildeo do antiacutegeno
na amostra preacute-tratamento
24
412 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS HEMAacuteCIAS
As hemaacutecias foram sensibilizadas com antissoros policlonais humanos de amostras de
plasma fresco congelado de doadores com resultado de pesquisa de anticorpo irregular
positivos
A escolha do anticorpo para sensibilizar as hemaacutecias foi definida de acordo com o
fenoacutetipo do doador que deveria ser positivo para o respectivo antiacutegeno
Para a sensibilizaccedilatildeo um volume de antissoro (1 mL) e um volume (1 mL) de
hemaacutecias lavadas quatro vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica foram adicionadas a um tubo de 12 x
75 mm A mistura foi homogeneizada e incubada em banho maria (BM) a 37deg C por 60
minutos A seguir as hemaacutecias foram novamente lavadas 4 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica
para retirada dos anticorpos que natildeo se ligaram A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada
como controle negativo O teste da uacuteltima lavagem eacute importante para assegurar que os
anticorpos que poderatildeo ser detectados no eluato apoacutes o tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA
sejam aqueles que estavam ligados agraves hemaacutecias e natildeo aqueles livres no plasma O controle
negativo mostra que todo o anticorpo livre foi retirado (LEGER 2011)
Para o teste de presenccedila de anticorpo na soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foram incubadas
com hemaacutecias de triagem de anticorpos irregulares (ID-Diacell BIO-RAD) contendo os
antiacutegenos especiacuteficos Realizado a teacutecnica em gel LissCoombs com anti-IgG+C3d Incubado
no tempo de 15 minutos a temperatura de 37deg C e centrifugado 10 minutos em centriacutefuga
proacutepria
As 50 amostras de doadores foram sensibilizadas com os anticorpos policlonais
humanos
Apoacutes sensibilizadas rdquoin vitrordquo e lavadas as hemaacutecias foram diluiacutedas em soluccedilatildeo de
baixa forccedila iocircnica (LISS) na quantidade de 10 microL de hemaacutecia para 1000 microL de soluccedilatildeo A
suspensatildeo foi pipetada (50 microL) em coluna-gel-teste LissCoombs (BIO-RAD) que contecircm
antiglobulina poliespeciacutefico (IgG+C3d) e centrifugada em baixa rotaccedilatildeo conforme orientaccedilatildeo
do fabricante durante 10 minutos
As amostras deveriam apresentar aglutinaccedilatildeo com reatividade 3 a 4+ no TDA As
amostras que apresentaram reaccedilatildeo menor que 3+ foram novamente sensibilizadas com nova
aliacutequota do antissoro
25
413 TRATAMENTO DAS AMOSTRAS
As amostras sensibilizadas apresentando o TDA positivo 3 ou 4+ foram divididas em
duas aliacutequotas e submetidas a duas teacutecnicas diferentes com o objetivo de dissociar o anticorpo
ligado Uma aliacutequota da amostra foi tratada com soluccedilatildeo de difosfato de cloroquina enquanto
a outra aliacutequota foi tratada com glicina-aacutecidaEDTA
42 PREPARO DA GLICINA AacuteCIDA-EDTA
A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA utiliza 3 soluccedilotildees diferentes a glicina aacutecida o
EDTA e o tampatildeo TRIS
Os reagentes foram preparados utilizando os sais para anaacutelise (PA) de EDTA
(Na2EDTA2H2O) TRIS (C4H11NO3) Glicina (H2NCH2CO2H) NaCl e a soluccedilatildeo de aacutecido
cloriacutedrico (HCl) 12 N todos reagentes da marca SYNTH (quadro 1)
Para o preparo do tampatildeo glicina-acida eacute necessaacuterio o ajuste do pH para 15 Para esse
ajuste utiliza-se aacutecido cloriacutedrico (HCl) concentrado O pH foi medido com fitas reativas de pH
com escala de 1 a 14 da marca MERCK Posteriormente a soluccedilatildeo foi enviada ao laboratoacuterio
de controle de qualidade do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto e o pH medido no peagacircmetro O
tampatildeo glicina-aacutecida foi armazenado a 4deg e o tampatildeo tris e o EDTA em temperatura ambiente
controlada (20 a 24deg Celsius)
Apoacutes o preparo e durante a realizaccedilatildeo dos testes foram feitas inspeccedilotildees visuais para
verificaccedilatildeo de turvaccedilatildeo do meio e presenccedila de precipitados
Reagente Material Quantidade Preparo e
Conservaccedilatildeo
EDTA
EDTA
(Na2EDTA2H2O)
5 gramas Mistura ateacute
dissoluccedilatildeo do sal e
conserva em
temperatura ambiente Aacutegua Destilada 50 Ml
Tris
TRIS (C4H11NO3) 121 gramas Conservar em
temperatura ambiente NaCl 525g
Aacutegua destilada 100ml
Gliacutecina-aacutecida
Glicina
(H2NCH2CO2H) 15 gramas
Conservar a 4oC NaCl 116gramas
Aacutegua Destilada 200ml
HCL 12N Ajutar o pH para 15
Quadro 1 - Preparo dos Reagentes da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
Fonte - Manual teacutecnico AABB 2011
26
O tampatildeo glicina-aacutecida e o tampatildeo TRIS satildeo estaacuteveis por 7 meses O reagente EDTA
precipitou mesmo estando em temperatura em ambiente controlado Houve necessidade de
preparo de novo reagente
421 TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
1 Em um tubo de ensaio 12x75 mm eacute adicionado 08 mL da soluccedilatildeo de glicina-aacutecida A
esta soluccedilatildeo adiciona-se 02 mL de EDTA e mistura
2 Adiciona-se 02 mL de hemaacutecias sensibilizadas (lavada 4 vezes) A mistura eacute
homogeneizada e incubada por exatamente 2 minutos
3 A seguir 01 mL de tampatildeo TRIS eacute adicionado agrave mistura que eacute novamente
homogeneizada e centrifugada por 2 minutos a 3400 rpm O pH deve estar entre 7 a 75
4 Apoacutes centrifugaccedilatildeo separa-se em outro tubo o sobrenadante (eluato) e as hemaacutecias
que permanecem satildeo lavadas 4 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica para retirada de todo o
reagente e anticorpos livres
43 PREPARO DA CLOROQUINA
A cloroquina eacute diluiacuteda em tampatildeo PBS na concentraccedilatildeo de 20 (Quadro 2) e
armazenado a 4deg Celsius sua validade apoacutes o preparo eacute de 1 mecircs
A teacutecnica da cloroquina jaacute estaacute padronizada para rotina do laboratoacuterio de
imunohematologia do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto e suas unidades
Reagente Reagentes Quantidade PreparoConservaccedilatildeo
Cloroquina
Difosfato de cloroquina
(C18H32ClN3O8P2)
20 gramas
Conservar a 4deg Celsius
Tampatildeo PBS 100ml
NaOH 01 N Acertar o pH para
51
Quadro 2 - Preparo da Cloroquina Fonte - Manual teacutecnico da AABB 2011
431 TEacuteCNICA DA CLOROQUINA
1 4 partes da soluccedilatildeo pronta eacute adicionada a uma parte de hemaacutecias lavadas 4 vezes com
soluccedilatildeo fisioloacutegica
2 A mistura eacute incubada em temperatura ambiente por ateacute duas horas
3 Centrifugar a 3400 rpm por 2 minutos
27
4 Remover o sobrenadante lavar as hemaacutecias novamente com soluccedilatildeo fisioloacutegica 4
vezes
44 VERIFICACcedilAtildeO DA EFETIVIDADE DOS TESTES
Apoacutes tratamento pelas duas teacutecnicas o TDA foi repetido em todas as amostras para
verificar se os tratamentos foram efetivos e houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo Para as
amostras tratadas pela teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA que permaneceram com TDA positivo
novo tratamento foi realizado
45 TESTE DO ELUATO
O eluato resultante das amostras tratadas com glicina-acidaEDTA foi testado com
hemaacutecias de triagem A soluccedilatildeo do eluato foi incubada com as hemaacutecias de triagem de
anticorpos (ID-Diacell BIO-RAD) pela teacutecnica em gel LissCoombs O teste foi incubado 15
minutos a 37deg Celsius e centrifugado por 10 minutos em centrifuga proacutepria para a teacutecnica em
gel Os eluatos que apresentaram resultados positivos foram testados em painel de 11
hemaacutecias (ID-Diapanel BIO-RAD) para a identificaccedilatildeo do anticorpo
46 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente que apresentou TDA positivo por IgG e pesquisa
de anticorpo irregular positivo com presenccedila de autoanticorpo com reatividade panaglutinina
A amostra foi tratada em paralelo pelas duas teacutecnicas descritas e foi enviada para o
Hemocentro para genotipagem eritrocitaacuteria que foi realizado por metodologia PCR em tempo
real no equipamento Real-time system PCR 7500 ( Applied Biosystems Califoacuternia EUA)
28
5 RESULTADOS
51 REAGENTES
Para aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA satildeo necessaacuterios 3 diferentes
reagentes que podem ser encontrados em forma de kit pronto para uso No entanto esses kits
natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil Os reagentes satildeo tampatildeo glicina-aacutecida o EDTA e o tampatildeo
Tris
Todos os reagentes foram preparados rdquoin houserdquo a partir dos sais e soluccedilotildees PA (puro
para anaacutelise) da marca SYNTH que foram adquiridos para a pesquisa O custo estimado para
cada teste foi aproximadamente R$ 020 reais
Apoacutes o preparo os reagentes poderiam ser armazenados em condiccedilotildees adequadas pelo
periacuteodo de 1 ano (AABB 2011) Ao final do preparo e durante o periacuteodo de armazenamento
de fevereiro a setembro de 2016 foi realizada inspeccedilatildeo visual para verificar a presenccedila de
precipitados ou turvaccedilatildeo A soluccedilatildeo de glicina e o tampatildeo TRIS mostraram-se estaacuteveis ateacute o
final do periacuteodo Por sua vez o reagente EDTA precipitou mesmo estando armazenado em
temperatura ambiente controlada e foi necessaacuterio novo preparo
52 AMOSTRAS DE DOADORES
521 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS AMOSTRAS
Apoacutes incubaccedilatildeo da hemaacutecia com o antissoro a mesma foi lavada 4 vezes para retirada
dos anticorpos livres A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada Caso houvesse positividade na
soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem a etapa era repetida (figura 3) Das 50 amostras sensibilizadas a
uacuteltima lavagem foi positiva somente em 3 delas Nas 3 amostras o anticorpo utilizado para
sensibilizaccedilatildeo foi o anti-K Apoacutes repetido nova etapa de lavagem os resultados se
apresentaram negativos
Em todas as amostras sensibilizadas ldquoin vitrordquo o TDA foi testado e verificado a
intensidade do teste Entre as 50 amostras 47 alcanccedilaram TDA com intensidade 3-4+ apoacutes a
primeira sensibilizaccedilatildeo enquanto 3 amostras necessitaram uma segunda incubaccedilatildeo com
anticorpo (figura 4)
A escolha dos anticorpos para sensibilizar as hemaacutecias foi feita de acordo com o
fenoacutetipo do doador e foram utilizados sete diferentes especificidades de anticorpos policlonais
humanos conforme mostra o graacutefico1
29
Figura 3 - Soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada com hemaacutecia de triagem de
anticorpos em gel LissCoombs (BIO-RAD) A finalidade eacute verificar a presenccedila de anticorpos livres na
suspensatildeo que possam interferir na pesquisa do eluato As soluccedilotildees de lavagem das amostras na figura a tiveram
resultados negativos Na figura b duas amostras a 47 e 50 apresentaram resultado positivo Nova etapa de
lavagem foi realizada e o resultado final foi negativo
522 TRATAMENTO DAS HEMAacuteCIAS
Apoacutes a sensibilizaccedilatildeo e obtenccedilatildeo de resultados de TDA com intensidade de 3 a 4+
cada uma das amostras foi dividida em duas aliacutequotas e tratada separadamente pelas teacutecnicas
de glicinaaacutecida-EDTA e cloroquina
As teacutecnicas foram consideradas efetivas quando obteve-se a completa dissociaccedilatildeo do
anticorpo verificada atraveacutes do TDA negativo na amostra poacutes tratamento conforme figuras 5
e 6 Dentre as amostras tratadas com cloroquina 2850 tiveram o TDA negativado A glicina-
aacutecidaEDTA negativou o TDA em 33 das 50 amostras tratadas Apenas 17 amostras tratadas
com glicina-aacutecidaEDTA permaneceram com o TDA positivo e foram submetidas a um novo
tratamento
30
Figura 4 - TDA das amostras apoacutes sensibilizaccedilatildeo com anticorpos policlonais humanos Amostras na
figura a com intensidades de 3-4+ Na figura b amostras 4 e 7 com intensidade menor que 3+ e portanto foram
novamente sensibilizadas com nova aliacutequota de soro Anti-D e anti-S Apoacutes a segunda sensibilizaccedilatildeo
apresentaram reatividade 4 e 3+ respectivamente Os anticorpos utilizados para sensibilizaccedilatildeo foram D S c E
C e K
523 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS TEacuteCNICAS
No tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA houve dissociaccedilatildeo completa do anticorpo
em 33 amostras (66) das 50 amostras testadas enquanto que com a cloroquina foram 28
amostras (56) (tabela 1)
31
Graacutefico 1- Nuacutemero de amostras sesnsibilizadas por especificidade de anticorpo Entre as 50 amostras 12
foram sensibilizadas com anti-D 10 com anti-C 9 com anti-E 8 com anti-c 7 com anti-S 3 com anti-K e 1
com anti-Dia As especificidades dos anticorpos foram definidas de acordo o fenoacutetipo do doador
Figura 5 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com cloroquina Nas amostras onde houve
a dissociaccedilatildeo do anticorpo ( 2 21 a 23 26 39 a 42 45 46 e 49) a hemaacutecia se deposita no fundo no microtubo
apoacutes a centrifugaccedilatildeo (TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (1 3 24 25 43 44 47
48 e 50) o anticorpo ligado agraves hemaacutecias eacute alvo da AGH presente no gel (TDA positivo)
Anti-D 12
Anti-C 10
Anti-E 9
Anti-c 8
Anti-S 7
Anti-K 3 Anti-Dia 1
32
Figura 6 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA Nas amostras
onde houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo (4 6 7 12 a 15 17 34 35 37 e 38) a hemaacutecia se deposita no fundo no
microtubo apoacutes a centrifugaccedilatildeo ( TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (5 16 18
19 20 33 e 36 ) o AGH presente no gel se liga ao anticorpo ligado agraves hemaacutecias que ficam retidas no gel (TDA
positivo)
Tabela 1-Resultado geral do tratamento das hemaacutecias com glicina e cloroquina
Teacutecnica utilizada TDA negativo TDA positivo Total
Glicina-aacutecidaEDTA 33 17 50
Cloroquina 28 22 50
A glicina-aacutecidaEDTA conseguiu negativar mais amostras sensibilizadas com Anti-D
e anti-K que a cloroquina Para as hemaacutecias sensibilizadas com anti-E Anti-S e Anti-Dia
ambas as teacutecnicas dissociaram o anticorpo em 100 das amostras Os resultados detalhados
por especificidade do anticorpo apoacutes o primeiro tratamento com glicina-aacutecidaEDTA e com
cloroquina estatildeo na tabela 2
Para as amostras que permaneceram positivas (17 amostras) apoacutes o tratamento com a
glicina-aacutecidaEDTA foi realizado um novo tratamento Houve dissociaccedilatildeo do anticorpo em 3
amostras (18) apoacutes a segunda tentativa Nas demais 14 (82) amostras tratadas pela
segunda vez 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise
33
Tabela 2 - Resultados do TDA apoacutes tratamento das hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo
sensibilizado
ANTICORPOS
SENSIBILIZADOS
1ordm TRATAMENTO COM
GLICINA
TRATAMENTO COM
CLOROQUINA
TOTAL TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
Anti-D 8 4 0 12 12
Anti-C 6 4 10 0 10
Anti-E 9 0 9 0 9
Anti-c 0 8 1 7 8
Anti-S 7 0 7 0 7
Anti-K 2 1 0 3 3
Anti-Dia 1 0 1 0 1
TOTAL 33 17 28 22 50
A hemoacutelise foi verificada durante o procedimento de lavagem final das hemaacutecias com
soluccedilatildeo fisioloacutegica para a retirada dos reagentes As soluccedilotildees de lavagem ficaram
avermelhadas e as hemaacutecias com coloraccedilatildeo escura As amostras foram descartadas Dentre as
6 amostras que ainda puderam ser testadas para o TDA trecircs amostras negativaram sendo 1
sensibilizada com anti-D e 2 com anti-C (tabela 3)
Tabela 3 - Resultado apoacutes o segundo tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA
Tratamento com
glicina-aacutecidaEDTA
TDA Negativo TDA Positvo Hemoacutelise Total
Segundo tratamento 3 3 11 17
524 TESTAGEM DO ELUATO
Apoacutes o tratamento com a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA a soluccedilatildeo do eluato foi
testada para verificar a viabilidade dos anticorpos que foram dissociados ou eluiacutedos Dentre
as 50 amostras 41 apresentaram eluato positivo As nove amostras cujos eluatos foram
negativos haviam sido sensibilizadas com as seguintes especificidades de anticorpos anti-E 6
amostras (67) anti-S 2 amostras (40) e anti-D 1 amostra (8) (tabela 4) O eluato de
todas as amostras sensibilizadas com os anticorpos anti-C anti-c Anti-K e Anti-Dia foram
positivos Os eluatos positivos na triagem de anticorpos foram testados com paineacuteis de
identificaccedilatildeo para confirmar a especificidade e a viabilidade dos anticorpos (figuras 7 e 8)
34
525 EFEITO DA ELUICcedilAtildeO SOBRE OS ANTIacuteGENOS ERITROCITAacuteRIOS
Para verificar o efeito do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA e com a cloroquina
sobre a expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s foi realizada a fenotipagem das
amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes tratamento com ambas as teacutecnicas Foi avaliado
se o tratamento destruiu os antiacutegenos expressos antes do tratamento
Tabela 4- Resultado do Eluato das amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA
Anticorpos Eluato positvo Eluato negativo Total
Anti-D 11 1 12
Anti-C 10 0 10
Anti-E 3 6 9
Anti-c 8 0 8
Anti-S 5 2 7
Anti-K 3 0 3
Anti-Dia 1 0 1
Total 41 9 50
Figura 7 ndash Painel do eluato da amostra 21 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-C que foi
recuperado no eluato
Figura 8 ndash Painel do eluato da amostra 47 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-K que foi
recuperado no eluato
35
Dentre as 50 amostras 26 eram previamente fenotipadas para os antiacutegenos Fya Fy
b
Jka Jk
b S e s Dentre elas 20 alcanccedilaram TDA negativo apoacutes tratamento com a glicina-
aacutecidaEDTA e 20 negativaram apoacutes tratamento com cloroquina (tabela 5) Apoacutes ambas as
teacutecnicas os antiacutegenos originalmente expressos permaneceram positivos comprovando que natildeo
houve destruiccedilatildeo dos mesmos
Tabela 5 ndash Verificaccedilatildeo da interferecircncia do tratamento da hemaacutecias com cloroquina e glicina-
aacuteicdaEDTA sobre os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
AMOSTRAS
COM
FENOTIPAGEM
PREacuteVIA
TRATADAS COM
CLOROQUINA
TRATADAS COM
GLICINA
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
26
20
20
20
20
As amostras 24 47 e 50 eram positivas para o antiacutegeno K A cloroquina natildeo dissociou
o anticorpo em nenhuma das 3 amostras enquanto a glicina-aacutecidaEDTA foi efetiva nas
amostras 24 e 50 Foi testada a expressatildeo do antiacutegeno K nas amostras 24 e 50 apoacutes o
tratamento utilizando meacutetodo indireto em gel contendo AGH Apesar de natildeo ter sido avaliado
a intensidade de reaccedilatildeo de expressatildeo dos antiacutegenos podemos verificar na figura 9 que nas
duas amostras em que a teacutecnica foi efetiva e dissociou o anticorpo a expressatildeo do antiacutegeno K
continua presente mas a reatividade observada pode ser considerada 1+ sugerindo que houve
diminuiccedilatildeo da expressatildeo do antiacutegeno quando comparado com a expressatildeo observada em
hemaacutecia natildeo tratada
Os resultados individuais de cada amostra em ambas as teacutecnicas encontram-se
resumidas na tabela 6
526 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente onde foi constatada a presenccedila de autoanticorpo
a quente da classe IgG pelo TDA monoespeciacutefico (figura 10)O autoanticorpo tambeacutem
interferia na pesquisa e identificaccedilatildeo de anticorpos irregulares pois apresentava caracteriacutestica
de panaglutinina As hemaacutecias da paciente sensibilizadas ldquoin vivordquo foram tratadas com
cloroquina e com glicina-aacutecidaEDTA
36
Figura 9 ndash Fenotipagem das amostras 24 e 50 para antiacutegeno K apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
O teste positivo indica a presenccedila do antiacutegeno poreacutem a reatividade fraca (1+) sugere que houve enfraquecimento
de sua expressatildeo A direita a expressatildeo forte (4+) do antiacutegeno Kell em hemaacutecia controle natildeo tratada utilizada
como controle positivo
A cloroquina natildeo foi efetiva na retirada do anticorpo ligado as hemaacutecias ao contraacuterio
do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA que dissociou o anticorpo (figura 11)
A hemaacutecia tratada com glicina foi fenotipada para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
(figura 12) A fenotipagem para o sistema Rh (C c E e e) e Kell foi realizada em gel
especiacutefico monoclonal sem interferecircncia do TDA positivo (controle da reaccedilatildeo negativo)
O eluato resultante do tratamento com glicina-aacutecidaEDTA foi testada em gel com
hemaacutecias de painel de identificaccedilatildeo de anticorpos e apresentou resultado positivo com todas
as ceacutelulas (figura 13 e 14)
A amostra foi enviada para genotipagem e o resultado da genotipagem confirmou o
resultado da fenotipagem apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
527 TEMPO DE EXECUCcedilAtildeO DA TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
O tempo de reaccedilatildeo da glicina-aacutecidaEDTA eacute de 2 minutos Todas as amostras foram
tratadas obedecendo ao tempo descrito na literatura demonstrando que o mesmo eacute
reprodutiacutevel
37
Tabela 6- Resultados individuais por amostra
Amostra Especificidade
dos anticorpos
Intensidade do
TDA apoacutes
sensibilizaccedilatildeo
Tratamento
efetivo com
cloroquina
Tratamento
efetivo com
glicina
Eluato
poacutes
glicina
1 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 2 Dia 3+ Sim Sim 3+ 3 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 4 D 4+ Natildeo Sim 4+ 5 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 6 E 3+ Sim Sim Negativo 7 S 4+ Sim Sim 3+ 8 E 3+ Sim Sim 1+ 9 E 3+ Sim Sim 2+
10 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 11 D 4+ Natildeo Sim 4+ 12 D 4+ Natildeo Sim 4+ 13 S 3+ Sim Sim 3+ 14 S 3+ Sim Sim 3+ 15 D 3+ Natildeo Sim 3+ 16 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 17 E 3+ Sim Sim (+) 18 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 19 D 4+ Natildeo Natildeo 3+ 20 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 21 C 3+ Sim Sim 4+ 22 C 3+ Sim Sim 4+ 23 C 3+ Sim Sim 4+ 24 K 4+ Natildeo Sim 4+ 25 D 3+ Natildeo Natildeo Negativo 26 E 4+ Sim Sim Negativo 27 S 3+ Sim Sim 3+ 28 C 3+ Sim Natildeo 4+ 29 C 3+ Sim Sim 4+ 30 C 3+ Sim Sim 4+ 31 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 32 E 3+ Sim Sim Negativo 33 C 3+ Sim Natildeo 4+ 34 S 3+ Sim Sim Negativo 35 S 3+ Sim Sim Negativo 36 C 4+ Sim Natildeo 4+ 37 c 4+ Natildeo Natildeo 4+ 38 D 4+ Natildeo Sim 4+ 39 S 3+ Sim Sim 3+ 40 c 4+ Sim Natildeo 2+ 41 C 4+ Sim Natildeo 4+ 42 E 3+ Sim Sim Negativo 43 D 3+ Natildeo Sim 2+ 44 D 3+ Natildeo Sim 2+ 45 E 3+ Sim Sim Negativo 46 C 3+ Sim Sim 4+ 47 K 4+ Natildeo Natildeo 4+ 48 D 3+ Natildeo Sim 2+ 49 E 3+ Sim Sim Negativo 50 K 4+ Natildeo Sim 4+
TOTAL 50 28 33 41
38
Figura 10 ndash TDA monoespeciacutefico da amostra de paciente Hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo da classe
IgG
oacute Figura 11 ndash TDA apoacutes o tratamento com glicina-aacutecidaEDTA (esquerda) e cloroquina (direita) A glicina
negativou completamente o TDA enquanto a hemaacutecia tratada com cloroquina persistiu positiva (1+)
39
Figura 12 ndash Fenotipagem da amostra tratada com glicina-aacutecidaEDTA Fy(a+b+) Jk(a-b+) S+s+
Figura 13 ndash Painel em gel (LissAGH) do eluato apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de
intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
Figura 14 ndash ndash Painel ezimaacutetico (hemaacutecias tratadas com bromelina) do eluato em gel neutro apoacutes
tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
40
528 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Quanto a efetividade das teacutecnicas em negativar o TDA foi verificado que a glicina-
aacutecidaEDTA foi efetiva em 66 das amostras testadas no primeiro tratamento (3350
amostras) enquanto a cloroquina conseguiu negativar 56 (2850) Esses resultados natildeo
apresentam diferenccedila significativa (pgt005) demostrando que a teacutecnica da glicina-
aacutecidaEDTA natildeo eacute superior mas eacute tatildeo efetiva quanto a da cloroquina
Quando aliamos os resultados de ambas as teacutecnicas verificamos que em 76 (3850)
das amostras o TDA foi negativado Esse dado indica que ainda que uma teacutecnica natildeo seja
eficaz na remoccedilatildeo do anticorpo eacute uma boa alternativa tentar a segunda teacutecnica jaacute que a falha
em remover o anticorpo utilizando uma delas natildeo prevecirc necessariamente a falha com a outra
Quando se utiliza o teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla (graacutefico 2) para comparar a utilizaccedilatildeo das
duas teacutecnicas com o resultado de cada uma isolada (somente a cloroquina ou somente a
glicina) verificamos que os resultados apresentam diferenccedila significativa (plt005) (quadro 3)
TRATAMENTO EFETIVO COM TOTAL PORCENTAGEM
Glicina ou cloroquina 38 76
Glicina e cloroquina 23 46
Glicina apenas 10 20
Cloroquina apenas 5 10
Nenhuma das teacutecnicas 12 24
Quadro 3 - Resultados comparativos entre as teacutecnicas utilizadas
41
Graacutefico 2 - Teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla entre as teacutecnicas aplicadas A- Glicina e Cloroquina B-Cloroquina C-
Glicina ( plt005)
42
6 DISCUSSAtildeO
Os reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA podem ser adquiridos em
forma de kit comercial prontos para uso poreacutem natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil A preparaccedilatildeo
dos reagentes ldquoin houserdquo a partir de sais comerciais adquiridos se mostrou viaacutevel Os
reagentes glicina e o tampatildeo Tris armazenados de forma correta se mantiveram estaacuteveis por
um periacuteodo de 7 meses Somente o reagente EDTA precipitou mesmo armazenado em
condiccedilotildees adequadas sugerindo que o mesmo deve ser preparado em menor quantidade e
armazenado em aliacutequotas A soluccedilatildeo de cloroquina tambeacutem pode ser preparada ldquoin houserdquo e
pode ser armazenado por um mecircs A legislaccedilatildeo brasileira autoriza a utilizaccedilatildeo de reagentes
preparados a partir de sais comerciais como a cloroquina e a glicina-aacutecidaEDTA desde que
os sais tenham autorizaccedilatildeo da vigilacircncia sanitaacuteria para a comercializaccedilatildeo (BRASIL 2001)
A comparaccedilatildeo quanto a efetividade em dissociar anticorpos em amostras com TDA
positivos entre a teacutecnica da glicina e a teacutecnica da cloroquina mostrou que natildeo haacute diferenccedila
estatiacutestica entre elas e que ambas satildeo igualmente eficientes Se utilizadas conjuntamente haacute
maior possibilidade de elucidaccedilatildeo dos casos
Uma vantagem da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eacute que ela permite numa mesma
amostra eluir o anticorpo ligado aacute hemaacutecia assim como fenotipar a hemaacutecia tratada Devido a
sua dupla utilidade a teacutecnica eacute vantajosa principalmente em pacientes em que pouco volume
de amostra pode ser coletado como em casos de crianccedilas e receacutem-nascidos
A fenotipagem poacutes tratamento se mostrou viaacutevel jaacute que os antiacutegenos de maior
importacircncia natildeo sofreram alteraccedilotildees Nas 20 amostras que foram fenotipadas antes e apoacutes
tratamento para verificar a influecircncia dos reagentes na expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a
Jkb S e s natildeo houve destruiccedilatildeo dos mesmos por nenhuma das duas teacutecnicas
Para as amostras positivas para o antiacutegeno Kell (350) e sensibilizadas com o
respectivo anticorpo a teacutecnica da glicina foi efetiva em negativar o TDA em apenas duas
delas mas apoacutes o tratamento foi verificada uma fraca reatividade da reaccedilatildeo antiacutegeno-
anticorpo sugerindo que houve um enfraquecimento da expressatildeo do antiacutegeno conforme
esperado e descrito na literatura (BYRNE 1991 PALLAS WILER E MCGEE 1991
ROZIERS e SQUALI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012 e KATHARIA e
CHAUDHARY 2013) A accedilatildeo da glicina sobre o antigeno Kell natildeo representa impedimento
para seu uso uma vez que na impossibilidade de testar o antiacutegeno Kell o banco de sangue
consegue facilmente atender a solicitaccedilatildeo de transfusatildeo com unidades de hemaacutecias Kell
43
negativas jaacute que eacute um antiacutegeno de baixa prevalecircncia na populaccedilatildeo variando de 15 na
populaccedilatildeo africana a 9 nos europeus (DANIELS 2011)
A soluccedilatildeo resultante da dissociaccedilatildeo do anticorpo pela teacutecnica da glicina pode ainda ser
utilizada como eluato podendo substituir a teacutecnica de eluiccedilatildeo com reagentes comercias (kits
de eluiccedilatildeo aacutecida) que tem alto custo aproximadamente entre R$2000 a R$2500 por teste
Em 41 amostras (82) houve a dissociaccedilatildeo e recuperaccedilatildeo do anticorpo que estava
sensibilizando as hemaacutecias Em 9 amostras (18) os anticorpos foram eluiacutedos poreacutem
apresentaram reaccedilatildeo negativa quando testadas com hemaacutecias de triagem entre eles o anti-E
(6) anti-S (2) e Anti-D (1) Eacute possiacutevel que a correccedilatildeo pH do meio (WALKER 2011) natildeo
tenha sido adequada o que pode ter desfavorecido a reatividade do anticorpo
Para as amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA nas quais natildeo houve dissociaccedilatildeo do
anticorpo pelo primeiro tratamento (1750) o segundo tratamento natildeo se mostrou eficaz jaacute
que 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise O tempo de
armazenagem natildeo parece ter influenciado jaacute que todas as amostras foram testadas dentro de
48 horas apoacutes a coleta Outros fatores que natildeo foram verificados podem ter levado a
hemoacutelise Apesar da literatura (LOUIE JIENG e ZEROULIS 1986 e BYRNE 1991)
recomendar um segundo tratamento ele eacute pouco eficaz tendo negativado apenas 3 das 17
amostras testadas
A amostra de paciente que apresentou sensibilizaccedilatildeo ldquoin vivordquo mostrou melhor
efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA sobre a da cloroquina possibilitando
fenotipagem para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s que natildeo foram destruiacutedos apoacutes o
tratamento comprovado atraveacutes da genotipagem
A presenccedila de autoanticorpo a quente com presenccedila de hemoacutelise (AHAI) ou natildeo pode
mascarar a presenccedila de aloanticorpo interferindo na rotina soroloacutegica da fenotipagem que eacute
uma importante ferramenta para auxiliar na seleccedilatildeo de hemaacutecias para transfusatildeo (SHIREY et
al 2002) Esses pacientes frequentemente possuem aloanticorpos associados ao
autoanticorpo e a prevalecircncia de aloimunizaccedilatildeo entre eles varia entre 12 a 40 (LEGER e
GARRATY 1999 BRANCH e PETZ 1999) o que dificulta ainda mais a escolha do melhor
componente a ser transfundido aleacutem de aumentar a possibilidade reaccedilotildees hemoliacuteticas imunes
poacutes-transfusionais
Nesses casos as teacutecnicas de dissociaccedilatildeo de anticorpos satildeo importantes para tratar
amostras de pacientes e a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser usada como uma opccedilatildeo
pois se mostrou eficaz na dissociaccedilatildeo anticorpo ligado agraves hemaacutecias deixando livre a
superfiacutecie das mesmas permitindo a fenotipagem por antisoros IgG Paralelamente os
44
anticorpos eluiacutedos tambeacutem puderam ser estudados O mesmo natildeo ocorre com a cloroquina
que permite apenas a fenotipagem e tampouco com os kits de eluiccedilatildeo aacutecida disponiacuteveis no
mercado nacional que satildeo destinados a realizaccedilatildeo do eluato mas destroem as hemaacutecias
O tempo de tratamento na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA tambeacutem eacute uma vantagem
pois foi possiacutevel reproduzir no tempo determinado de 2 minutos enquanto a cloroquina
demora ateacute duas horas
Ainda que a aplicaccedilatildeo das teacutecnicas por biologia molecular estejam cada vez mais
presentes na rotina imuno-hematoloacutegica e possibilitam estabelecer o fenoacutetipo deduzido do
genoacutetipo elas natildeo estatildeo disponiacuteveis na maioria dos centros e sua realizaccedilatildeo exige algumas
horas A resoluccedilatildeo imediata do problema transfusional necessita dos resultados soroloacutegicos
pois com frequecircncia natildeo eacute possiacutevel aguardar o resultado do teste molecular Dessa forma
apesar da crescente importacircncia da genotipagem eritrocitaacuteria teacutecnicas soroloacutegicas aplicadas
corretamente e no momento propiacutecio satildeo de grande utilidade para resolver problemas imuno-
hematoloacutegicos como ocorre com a fenotipagem em pacientes com TDA positivo
45
7 CONCLUSAtildeO
A teacutecnica da glicina aacutecidaEDTA mostrou-se efetiva em remover os anticorpos que
sensibilizavam as hemaacutecias e pode ser utilizada com seguranccedila antes da fenotipagem
eritrocitaacuteria Por ser uma teacutecnica de raacutepida execuccedilatildeo eacute uma alternativa aplicaacutevel
principalmente em casos urgentes de pacientes que apresentam autoanticorpos
46
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50
9 ANEXOS
51
FUNDACcedilAtildeO HEMOCENTRO DE RIBEIRAtildeO PRETO
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE)
Tiacutetulo da pesquisa Aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina aacutecida-EDTA e avaliaccedilatildeo da
eficaacutecia no tratamento de hemaacutecias com teste direto da antiglobulina positivo
Pesquisadora responsaacutevel Ceacutelia Kazue Abiko
Orientador Prof Dimas Tadeu Covas
Co-orientadora Dra Flaacutevia Leite Souza Santos
Objetivo da pesquisa Vocecirc estaacute sendo convidado a participar de uma pesquisa que tem
como objetivo padronizar uma nova teacutecnica para auxiliar na tipagem sanguiacutenea de pacientes
A tipagem sanguiacutenea pode sofrer interferecircncia da presenccedila de anticorpos ligados aos gloacutebulos
vermelhos do sangue Nessas situaccedilotildees eacute difiacutecil selecionar o melhor sangue para o paciente e
eacute preciso a utilizaccedilatildeo de teacutecnicas adicionais para remover essas interferecircncias
Esta pesquisa tem como objetivo estudar outra teacutecnica para remover esses anticorpos e
comparaacute-la com a teacutecnica atualmente utilizada Para isso precisamos de amostras de pacientes
e doadores voluntaacuterios
Se vocecirc eacute um doador eacute necessaacuterio que vocecirc autorize a coleta de 5 ml (1 tubo) a mais
de seu sangue
Se vocecirc eacute um paciente natildeo haveraacute necessidade de nova amostra pois utilizaremos as
amostras jaacute coletadas para os testes preacute-transfusionais e os resultados encontrados nesta
pesquisa natildeo iratildeo interferir na escolha da (s) bolsa (s) de sangue que vocecirc possa vir a receber
Se vocecirc concordar em participar leia com atenccedilatildeo o texto abaixo e assine as duas vias
rubricando todas as paacuteginas deste termo de consentimento Uma via original assinada e
rubricada por vocecirc e pela pesquisadora ficaraacute com vocecirc
As suas informaccedilotildees seratildeo mantidas em sigilo pela pesquisadora e natildeo haveraacute
armazenamento de material para pesquisas posteriores Os seus dados seratildeo usados apenas
neste estudo e quando o trabalho for publicado seu nome e qualquer outra informaccedilatildeo que
possam identificaacute-lo natildeo seratildeo revelados
Eacute pouco provaacutevel que o que noacutes aprendermos com este estudo tenha um benefiacutecio
direto para vocecirc assim como natildeo poderemos dar nada em troca pela sua participaccedilatildeo na
pesquisa
Nosso objetivo com esta pesquisa eacute que os resultados poderatildeo ser uacuteteis para o
tratamento de pacientes no futuro Os riscos da participaccedilatildeo satildeo miacutenimos Se vocecirc eacute um
doador de sangue a amostra seraacute coletada no momento da doaccedilatildeo natildeo exigindo punccedilatildeo
venosa adicional
52
Eacute seu direito ter acesso aos resultados dos testes da pesquisa Esses resultados natildeo
seratildeo fornecidos automaticamente a vocecirc mas caso vocecirc se interesse em saber o resultado ou
tiver alguma duacutevida sobre a sua participaccedilatildeo neste estudo deveraacute entrar em contato com Ceacutelia
Kazue Abiko pelo telefone (18) 99718-3551
Vocecirc tem total liberdade de optar por natildeo participar da pesquisa Caso aceite
participar poderaacute desistir a qualquer momento ou retirar seu consentimento mesmo apoacutes ter
coletado o sangue Para cancelar sua participaccedilatildeo basta avisar a pesquisadora e os seus dados
seratildeo retirados do projeto
Qualquer duacutevida eacutetica sobre a pesquisa poderaacute entrar em contato com o Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa do Hospital das Cliacutenicas e da Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto
(CAMPUS UNIVERSITAacuteRIO bairro Monte Alegre CEP 14048-900 Ribeiratildeo Preto-SP
Telefone (16) 3602-2228 FAX (16) 3633-1144 e-mail cephcrpuspbr)
Consentimento de participaccedilatildeo
A Consentimento do participante
Li as informaccedilotildees acima sobre o estudo e recebi explicaccedilotildees sobre a participaccedilatildeo no estudo
Portanto dou o meu consentimento para participar do estudo
___________________________________________________________________________
Nome completo
___________________________________________________________________________
Assinatura
___________
Data
__________________________________________________________________________________
Nome completo da pesquisadora
___________________________________________________________________________
Assinatura
_____________
Data
LISTA DE FLUXOGRAMAS
Fluxograma 1 - Fluxograma da pesquisa utilizando as amostras de
doadorespaacutegina 22
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ABO
AHAI
Bg
c
C
C
C3
C3b
C3d
D
DHFRN
DNA
DTT
E
e
EDTA
Fc
Fya
Fyb
HCl
IgA
IgD
IgE
IgM
Mm
NaCl
PA
PAI
PBS
PCR
PEG
pH
Rh
rpm
S
s
SIDA
SBS
TCLE
TDA
TIA
TRIS
ZZAP
microL
Sistema Sanguiacuteneo ABO
Anemia Hemoliacutetica Autoimune
Antiacutegeno Bg
Antiacutegeno c
Celsius
Antiacutegeno C
Complemento
Fraccedilatildeo do complemento
Fraccedilatildeo do complemento
Antiacutegeno D
Doenccedila Hemoliacutetica do Feto e do Receacutem-nascido
Aacutecido desoxirribonucleico
Dithiothreitol
Antiacutegeno E
Antiacutegeno e
Aacutecido Etileno Diamino Tetraceacutetico
Porccedilatildeo do anticorpo
Antiacutegeno Duffy a
Antiacutegeno Duffy b
Aacutecido cloriacutedrico
Imunoglobulina A
Imunoglobulina D
Imunoglobulina E
Imunoglobulina M
Miliacutemetros
Cloreto de soacutedio
Puro para anaacutelise
Pesquisa de anticorpos irregulares
Tampatildeo fosfato salino
Reaccedilao em cadeia de polimerase
Polietilenoglicol
Potencial hidrogeniocircnico
Sistema sanguiacuteneo Rh
Rotaccedilotildees por minuto
Antiacutegeno S
Antiacutegeno s
Siacutendrome da Imunodeficiecircncia adquirida
Sistema de banco de sangue
Termo de consentimento livre e esclarecido
Teste direto da antiglobulina
Teste indireto da antiglobulina
Hidrometil aminometano
Sulphydryl-Proteolytic Enzyme
Microlitros
RESUMO
Os testes preacute-transfusionais satildeo o conjunto de teacutecnicas imuno-hematoloacutegicas aplicadas nas
amostras do receptor e do doador com a finalidade de fornecer uma unidade de hemaacutecias
compatiacutevel e segura para a transfusatildeo Aleacutem da fenotipagem ABO e Rh obrigatoacuteria nos testes
preacute-transfusionais a determinaccedilatildeo do perfil antigecircnico de outros antiacutegenos eritrocitaacuterios de
importacircncia cliacutenica melhora a seguranccedila transfusional especialmente para pacientes
previamente aloimunizados ou candidatos agrave transfusatildeo crocircnica Para tais pacientes conhecer o
fenoacutetipo eritrocitaacuterio permite a seleccedilatildeo de concentrados de hemaacutecias com o mesmo fenoacutetipo
o que previne reaccedilotildees transfusionais hemoliacuteticas assim como nova aloimunizaccedilatildeo
Indiviacuteduos que apresentam as hemaacutecias sensibilizadas ldquoin vivordquo por anticorpos anti-
eritrocitaacuterios como ocorre na anemia hemoliacutetica autoimune (AHAI) teratildeo o teste direto da
antiglobulina (TDA) positivo dificultando a realizaccedilatildeo da fenotipagem O TDA positivo
provoca resultados falsos positivos especialmente quando satildeo utilizados para a fenotipagem
soros comerciais da classe IgG que exigem a fase de antiglobulina humana ou teste indireto
da antiglobulina (TIA) para leitura Em 1982 Edwards Moulds e Judd propuseram a
utilizaccedilatildeo da teacutecnica da cloroquina para dissociar os complexos de antiacutegeno-anticorpo
preservando a membrana eritrocitaacuteria e permitindo a fenotipagem Atualmente eacute a teacutecnica
mais utilizada nos centros brasileiros A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA foi primeiramente
descrita por Louie Jieng e Zeroulis em 1986 poreacutem eacute pouco utilizada por natildeo haver os
reagentes prontos comercialmente no mercado brasileiro O presente estudo avaliou a teacutecnica
da glicina-aacutecida-EDTA com reagentes preparados ldquoin houserdquo em paralelo agrave teacutecnica da
cloroquina que eacute atualmente a teacutecnica aplicada no Hemocentro de Ribeiratildeo Preto Para isso
amostras de hemaacutecias de doadores (n=50) com fenoacutetipo conhecido foram sensibilizadas com
anticorpos humanos de especificidade conhecida e ambas as teacutecnicas foram aplicadas Foi
verificado ainda o efeito da teacutecnica sobre a expressatildeo dos antiacutegenos eritrocitaacuterios (Fya Fy
b
Jka Jk
b S e s) atraveacutes da fenotipagem das amostras que tiveram o TDA negativado A
viabiliadade dos anticorpos presentes no eluato recuperado apoacutes tratamento com a glicina-
aacutecidaEDTA tambeacutem foi testada A glicina-aacutecidaEDTA foi efetiva em negativar o TDA em
33 amostras (66) comparaacutevel com a cloroquina que negativou 28 amostras (56) O eluato
apresentou-se viaacutevel no tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA e natildeo foi constatada destruiccedilatildeo
dos antiacutegenos eritrocitaacuterios apoacutes o tratamento Concluiacutemos que a teacutecnica da glicina-
aacutecidaEDTA pode ser utilizada como uma opccedilatildeo no tratamento de hemaacutecias com TDA
positivo com a vantagem de seu tempo de execuccedilatildeo ser inferior ao da cloroquina (2minutos x
30 a 120 minutos) o que lhe torna uacutetil em situaccedilotildees de maior urgecircncia Quando ambas as
teacutecnicas satildeo utilizadas em hemaacutecias diferentes de uma mesma amostra a efetividade estaacute
significativamente aumentada (plt005)
Palavras chave Glicina-aacutecidaEDTA Teste direto da antiglobulina AHAI fenotipagem
ABSTRACT
The pre-transfusion tests are the group of immunohematology techniques applied in the
receptor and donor samples in order to provide a unit of red blood cells compatible and safe
for transfusion In addition to the obligatory ABO and Rh phenotyping in the pre-transfusion
tests the determination of the antigenic profile of other red cells antigens of clinical
importance improves transfusion safety especially for patients previously alloimmunized or
candidates for chronic transfusion For such patients knowing the phenotype allows the
selection of red blood cell concentrates with the same phenotype which prevents hemolytic
transfusion reactions as well as new alloimmunization Individuals who have antibody-coated
red blood cells sensitized in vivo such as in autoimmune hemolytic anemia (AHAI) will
have a direct antiglobulin test (DAT) positive making it difficult to perform phenotyping
Positive DAT causes false positive results especially when commercially available IgG
serums which require the human antiglobulin phase or indirect antiglobulin test (IAT) for
reading are used for phenotyping In 1982 Edwards Molds and Judd proposed the use of the
chloroquine technique to dissociate antigen-antibody complexes by preserving the erythrocyte
membrane and allowing phenotyping It is currently the most used technique in Brazilian
centers The EDTAglycine-acid technique was first described by Louie Jieng and Zeroulis in
1986 but it is little used because commercially available reagents are not available in the
Brazilian market The present study evaluated the EDTAglycine-acid technique with reagents
prepared in house in parallel to the chloroquine technique which is currently the technique
applied at the Hemocentro de Ribeiratildeo Preto For this donor red cells samples (n = 50) with
known phenotype were sensitized with human antibodies of known specificity and both
techniques were applied The effect of the technique on the expression of erythrocyte antigens
(Fya Fy
b Jk
a Jk
b S and s) was also verified by the phenotyping of the samples that had
negative DAT The viability of the antibodies present in the recovered eluate after treatment
with EDTAglycine-acid A was also tested EDTAglycine-acid was effective in negatively
affecting DAT in 33 samples (66) comparable to chloroquine that negatived 28 samples
(56) The eluate was viable in treatment with EDTAglycine-acid and no destruction of
erythrocyte antigens after treatment We conclude that the EDTA glycine-acid technique can
be used as an option in the treatment of red cells with TDA positive with the advantage that
its execution time is inferior to that of chloroquine (2 minutes x 30 to 120 minutes) which
makes it useful in emergency situations When both techniques are used in different
erythrocytes of the same sample the effectiveness is significantly increased (p lt005)
Key words EDTAglycine-acid direct antiglobulin test AIHA phenotyping
1 INTRODUCcedilAtildeO
A transfusatildeo de hemaacutecias eacute um recurso terapecircutico muito importante e eficaz e tem se
mostrado como um grande aliado no tratamento de diversas patologias auxiliando na
melhoria da sobrevida e qualidade de vida de diversos pacientes quando indicada de forma
correta Eacute provavelmente a modalidade de terapia mais utilizada no mundo sendo
considerada a forma mais antiga de terapia celular A transfusatildeo de hemaacutecias em pacientes
com anemia grave ou sangramento agudo reestabelece o niacutevel de hemoglobina moleacutecula
responsaacutevel pelo transporte de oxigecircnio para os tecidos melhorando a isquemia tecidual
(BARJAS-CASTRO 2013 ZAGO 2014)
A transfusatildeo de componentes celulares como o concentrado de hemaacutecias deve ser
bem avaliada quanto aos riscos e benefiacutecios Os testes preacute-transfusionais satildeo parte obrigatoacuteria
do processo transfusional e tecircm como funccedilatildeo assegurar que o melhor hemocomponente seja
selecionado para o paciente reduzindo assim a chance de transfusotildees incompatiacuteveis e reaccedilotildees
transfusionais (BARJAS-CASTRO 2013)
11TESTES PREacute-TRANSFUSIONAIS
Os testes preacute-transfusionais tecircm a finalidade de evitar a ocorrecircncia de reaccedilotildees
hemoliacuteticas no receptor decorrentes da transfusatildeo de hemaacutecias incompatiacuteveis do doador
(DOWNES e SHULMAN 2011) Tem como propoacutesito selecionar hemaacutecias que apoacutes
transfusatildeo deveratildeo ter sobrevida normal ou mais proacutexima do normal (MELO 2007)
Os testes preacute-transfusionais que consistem no conjunto de teacutecnicas
imunohematoloacutegicas aplicadas agraves amostras do receptor e doador devem ser realizados antes
de toda transfusatildeo A aplicaccedilatildeo desses testes tem como finalidade fornecer uma unidade de
hemaacutecias compatiacutevel e elevar a seguranccedila da transfusatildeo Os testes preacute-transfusionais aliados
a utilizaccedilatildeo de novas tecnologias tem historicamente evitado reaccedilotildees transfusionais
hemoliacuteticas garantindo a seguranccedila transfusional em cerca de 95 dos pacientes que recebem
transfusatildeo Eacute imprescindiacutevel poreacutem a execuccedilatildeo correta das teacutecnicas envolvidas nos testes preacute-
transfusionais e ainda garantir a identificaccedilatildeo correta do receptor e das amostras de sangue e
das unidades de hemaacutecias (CASTILHO 2000 MELO 2007 BARJAS-CASTRO 2013)
2
Todos os testes que compotildeem a rotina preacute-transfusional usam meacutetodos soroloacutegicos
que envolvem a reaccedilatildeo antiacutegeno x anticorpo Ao testar a presenccedila de um antiacutegeno na
superfiacutecie da hemaacutecia eacute necessaacuterio dispor de um soro com especificidade conhecida para
aquele antiacutegeno Por outro lado testar a presenccedila de um determinado anticorpo no soro ou no
plasma exige o uso de hemaacutecias com perfil antigecircnico conhecido Os testes preacute-transfusionais
incluem tipagem ABO (direta e reversa) tipagem Rh pesquisa de anticorpos irregulares no
sangue do receptor retipagem ABO e Rh do hemocomponente e prova de compatibilidade
entre as hemaacutecias do doador e soro ou plasma do receptor em caso de transfusatildeo de hemaacutecias
ou hemocomponentes que contenham mais de 2 mL de volume eritrocitaacuterio como o
concentrado de granuloacutecitos (BRASIL 2016 GANZELLA 2014 SANTOS 2014)
Aleacutem dos testes regularmente realizados a determinaccedilatildeo do fenoacutetipo para outros
antiacutegenos eritrocitaacuterios do doador e do receptor pode ser indicada A fenotipagem eritrocitaacuteria
determina o perfil antigecircnico para outros antiacutegenos de importacircncia cliacutenica aleacutem do sistema
ABO e do antiacutegeno RhD Ela pode auxiliar a confirmaccedilatildeo de uma especificidade de anticorpo
encontrada no soro do paciente uma vez que espera-se que a sua hemaacutecia natildeo expresse o
antiacutegeno correspondente e simultaneamente eacute utilizada para selecionar um concentrado de
hemaacutecias negativo para o respectivo antiacutegeno evitando reaccedilotildees hemoliacuteticas transfusionais A
fenotipagem de candidatos a transfusotildees crocircnicas tambeacutem eacute recomendada pois esse grupo de
pacientes deve se beneficiar com a transfusatildeo profilaacutetica de unidades de hemaacutecias com
mesmo fenoacutetipo evitando assim a aloimunizaccedilatildeo assim como reaccedilotildees hemoliacuteticas provocadas
por anticorpos previamente existentes e em baixo tiacutetulo natildeo identificados pela triagem de
anticorpos (CASTILHO JUNIOR e REID 2015 DOWNES e SHULMAN 2011)
111 TIPAGEM ABORh
O sistema ABO (ISBT001) foi o primeiro sistema de grupo sanguiacuteneo a ser
descoberto Ele foi descrito em 1900 por Karl Landsteiner e eacute considerado o sistema de maior
importacircncia na praacutetica transfusional Ele eacute composto por quatro antiacutegenos A1 (ABO1) B
(ABO2) AB (ABO3) e A1 (ABO4) e eacute caracterizado pela presenccedila dos anticorpos naturais
ou seja anticorpos que surgem sem a exposiccedilatildeo preacutevia aos antiacutegenos atraveacutes de transfusatildeo ou
gestaccedilatildeo Os anticorpos ABO satildeo predominantemente da classe IgM satildeo capazes de fixar o
complemento e de provocar hemoacutelise grave intravascular caso ocorra transfusatildeo ABO
incompatiacutevel Por apresentar essa caracteriacutestica peculiar a tipagem do sistema ABO eacute
composta de duas etapas a prova direta e a prova reversa Na prova direta eacute realizada a
pesquisa dos antiacutegenos na superfiacutecie das hemaacutecias que satildeo testadas com soros comerciais
3
Anti-A e Anti-B A prova reversa por sua vez pesquisa a presenccedila de anticorpos ABO ao
testar o soro ou plasma do pacientedoador com hemaacutecias A1 e B Ambas as provas satildeo
obrigatoacuterias e devem ser concordantes para interpretaccedilatildeo do fenoacutetipo ABO (COOLING
2011 SANTOS 2014)
O sistema Rh (ISBT004) eacute o maior e mais complexo sistema de grupos sanguiacuteneos
compreendendo atualmente 54 antiacutegenos (ISBT 2016) Satildeo cinco os principais antiacutegenos do
sistema Rh D (RH1) C (RH2) E (RH3) c (RH4) e e (RH5) Esses antiacutegenos possuem alta
capacidade imunogecircnica e seus respectivos anticorpos estatildeo envolvidos na doenccedila hemoliacutetica
perinatal e em reaccedilotildees transfusionais hemoliacuteticas Os autoanticorpos quentes como ocorre na
anemia hemoliacutetica quente satildeo representados em grande parte por anticorpos contra antiacutegenos
puacuteblicos do sistema Rh (CASTILHO 2007 CHOU e WESTHOFF 2011 BARJAS-
CASTRO 2013) A tipagem RhD pesquisa o antiacutegeno D na membrana eritrocitaacuteria ao testar a
hemaacutecia com antissoros comerciais Atualmente a maior parte dos soros Anti-D
comercializados satildeo monoclonais
112 ANTICORPOS ANTI-ERITROCITAacuteRIOS
Anticorpos satildeo proteiacutenas presentes no plasma tambeacutem denominadas imunoglobulinas
Satildeo produzidas pelo sistema imune em resposta a um determinado antiacutegeno Podem ser
classificadas de acordo com suas caracteriacutesticas e propriedades em cinco classes de
imunoglobulinas IgG IgM IgA IgE e IgD (BARJAS-CASTRO 2013)
A ligaccedilatildeo entre o antiacutegeno e o anticorpo envolvem ligaccedilotildees natildeo covalentes que satildeo
reversiacuteveis Vaacuterios tipos de interaccedilotildees natildeo covalentes podem contribuir para a ligaccedilatildeo do
antiacutegeno pelo anticorpo incluindo forccedilas eletrostaacuteticas pontes de hidrogecircnio forccedilas de Van
der Walls e interaccedilotildees hidrofoacutebicas (ABBAS LICHTMAN e PILLAI 2008)
As interaccedilotildees antiacutegeno-anticorpo satildeo constituiacutedas por ligaccedilotildees dinacircmicas que sofrem
interferecircncia de alteraccedilotildees fiacutesico-quiacutemicas no meio como mudanccedilas na temperatura na forccedila
eletrostaacutetica na concentraccedilatildeo do antiacutegeno e do anticorpo e no pH O melhor pH para a reaccedilatildeo
eacute em torno de 70 no entanto raros anticorpos podem exigir acidificaccedilatildeo do meio para serem
identificados (SANTOS 2014)
Em imunohematologia satildeo pesquisados os anticorpos que reconhecem os antiacutegenos
eritrocitaacuterios de grupo sanguiacuteneo ldquoin vivordquo esses anticorpos dependendo de seu significado
cliacutenico satildeo capazes de reconhecer seus respectivos antiacutegenos sobre a hemaacutecia podendo levar
a sua destruiccedilatildeo por dois mecanismos fagocitose por macroacutefagos no sistema
4
reticuloendotelial ou por ativaccedilatildeo do sistema complemento com a formaccedilatildeo do complexo de
ataque a membrana e hemoacutelise intravascular As duas classes de anticorpos de maior
importacircncia em imunohematologia satildeo as imunoglobulinas IgG e a IgM (SANTOS 2014)
Devido a sua estrutura pentameacuterica os anticorpos da classe IgM se ligam aos
antiacutegenos localizados na superfiacutecie da membrana de hemaacutecias proacuteximas e promovem
aglutinaccedilatildeo das mesmas em meio salino ldquoin vitrordquo Anticorpos da classe IgG por sua vez
satildeo denominados ldquonatildeo aglutinantesrdquo ou ldquoincompletosrdquo pois sua estrutura de monocircmero eacute
pequena o que desfavorece a aglutinaccedilatildeo direta uma vez que uma mesma moleacutecula de IgG
natildeo alcanccedila antiacutegenos alvos em duas hemaacutecias proacuteximas Os anticorpos IgM aleacutem de terem
um tamanho maior apresentam 750 vezes maior eficiecircncia de aglutinaccedilatildeo que os anticorpos
IgG permitindo maior facilidade nas ligaccedilotildees entre as hemaacutecias (CARRUCIO e WISE 2012
GREEN e KLOSTERMANN 2012)
Nos testes ldquoin vitrordquo satildeo simulados reaccedilotildees que poderiam ocorrer ldquoin vivordquo causando
reaccedilotildees indesejaacuteveis A fase de sensibilizaccedilatildeo em que o anticorpo se liga ao antiacutegeno
correspondente natildeo eacute identificada macroscopicamente poreacutem uma vez que o anticorpo
aproxima as hemaacutecias e vence a forccedila eletrostaacutetica que naturalmente as repele chamada de
potencial zeta ocorre a aglutinaccedilatildeo Dependendo das caracteriacutesticas do anticorpo e de sua
capacidade de fixar complemento pode ocorrer tambeacutem a hemoacutelise (SANTOS 2014)
113 PESQUISA E IDENTIFICACcedilAtildeO DE ANTICORPOS IRREGULARES
A pesquisa de anticorpos irregulares eacute teste obrigatoacuterio nos testes preacute-transfusionais e
tem a finalidade de detectar anticorpos ldquoin vitrordquo que possam causar reaccedilatildeo ldquoin vivordquo
Dependendo da populaccedilatildeo estudada (pacientes x doadores) e ainda da sensibilidade do
teste a frequecircncia de anticorpos irregulares pode variar de 03 a 38 A imunizaccedilatildeo pode
ocorrer por transfusatildeo gestaccedilatildeo transplante ou injeccedilatildeo de material imunogecircnico (WALKER
2011)
Os anticorpos irregulares podem ser classificados como aloanticorpos que satildeo
voltados contra antiacutegenos ausentes na hemaacutecia autoacuteloga ou como autoanticorpos os quais
reconhecem antiacutegenos eritrocitaacuterios proacuteprios Os autoanticorpos antieritrocitaacuterios surgem em
decorrecircncia da desregulaccedilatildeo da autotoleracircncia imune relacionada agrave condiccedilotildees diversas como
doenccedilas hematoloacutegicas doenccedilas inflamatoacuterias autoimunes neoplasias infecccedilotildees e uso de
medicaccedilotildees A presenccedila do autoanticorpo associado a um quadro de anemia hemoliacutetica
caracteriza a anemia hemoliacutetica autoimune (AHAI) seja ela primaacuteria ou secundaacuteria agrave outra
5
patologia Ateacute 12 a 40 dos pacientes com autoanticorpos quentes podem apresentar
aloanticorpos de significado cliacutenico mascarados pelos autoanticorpos (SHIREY et al 2002)
Eacute importante detectar a presenccedila de anticorpos no plasmasoro de um receptor de
transfusatildeo para garantir que seja transfundido sangue compatiacutevel Quando a pesquisa de
anticorpo irregular resultar positiva para um ou mais anticorpos de relevacircncia clinica eacute
necessaacuterio confirmar a ausecircncia do respectivo antiacutegeno na hemaacutecia do receptor assim como
selecionar para transfusatildeo concentrados de hemaacutecias tambeacutem negativos para aqueles
antiacutegenos evitando assim reaccedilotildees transfusionais (WALKER 2011)
A detecccedilatildeo de um anticorpo irregular eacute inicialmente realizada pela triagem de
anticorpos na qual o soroplasma do receptor eacute testado com 2 a 3 hemaacutecias do tipo ldquoOrdquo O
conjunto de fenoacutetipos dessas hemaacutecias deve contemplar os antiacutegenos de maior importacircncia
cliacutenica Como os anticorpos irregulares de maior interesse cliacutenico satildeo na maior parte das
vezes imunes portanto da classe IgG eacute obrigatoacuteria a fase de antiglobulina (AGH) do teste
ou teste indireto da antiglobulina (TIA) uma vez que esses anticorpos satildeo incompletos
(CASTILHO JUNIOR e REID 2015) O teste de triagem estando positivo deve-se fazer a
identificaccedilatildeo da especificidade do anticorpo utilizando um painel com maior nuacutemero de
hemaacutecias fenotipadas
114 PROVA DE COMPATIBILIDADE
A prova de compatibilidade eacute um teste obrigatoacuterio em caso de transfusatildeo de
componentes eritrocitaacuterios Tambeacutem chamada de prova de compatibilidade maior deve ser
realizada antes da administraccedilatildeo de sangue total ou concentrado de hemaacutecias utilizando-se
hemaacutecias obtidas do tubo coletor da bolsa a ser transfundida e o soro ou plasma do receptor
(BRASIL 2016)
Eacute definido como o procedimento para excluir a incompatibilidade entre o doador e o
receptor Tem o objetivo de detectar anticorpos que podem natildeo ter sido encontrados na
pesquisa de anticorpos devido a ausecircncia ou pouca expressatildeo de antiacutegenos no painel de
hemaacutecias aleacutem da possibilidade de terem ocorrido erros teacutecnicos ou notacionais durante a
realizaccedilatildeo da pesquisa (MELO 2007)
6
115 FENOTIPAGEM PARA OUTROS SISTEMAS
Aleacutem da pesquisa de ABORh que eacute realizado rotineiramente a fenotipagem para
outros sistemas tambeacutem denominado ldquofenotipagem estendidardquo determina a presenccedila ou
ausecircncia de antiacutegenos considerados de importacircncia cliacutenica A fenotipagem natildeo eacute obrigatoacuteria
nos testes preacute-transfusionais poreacutem a legislaccedilatildeo atual recomenda a realizaccedilatildeo da fenotipagem
eritrocitaacuteria dos antiacutegenos C (RH2) E (RH3) c (RH4) e (RH5) K (KELL1) Fya (FY1) Fy
b
(FY2) Jka
(JK1) Jkb (JK2) S (MNS3) e s (MNS4) para pacientes aloimunizados e pacientes
com indicaccedilatildeo de transfusatildeo crocircnica (BRASIL 2016)
A seleccedilatildeo de concentrados de hemaacutecias com o mesmo fenoacutetipo do receptor para
transfusatildeo pode evitar reaccedilotildees transfusionais hemoliacuteticas no paciente previamente
aloimunizado tambeacutem previne a sensibilizaccedilatildeo por outros antiacutegenos o que normalmente
torna as transfusotildees seguintes ainda mais complicadas A fenotipagem do paciente tambeacutem
auxilia na identificaccedilatildeo dos anticorpos pois espera-se que nas hemaacutecias do paciente o
antiacutegeno seja negativo para o anticorpo encontrado servindo de guia para teste de exclusatildeo de
anticorpos (SANTOS 2014 WALKER 2011)
A incidecircncia de aloanticorpos aumenta com o nuacutemero de transfusotildees no entanto a
implantaccedilatildeo de rotina de fenotipagem com transfusatildeo profilaacutetica de hemaacutecias com fenoacutetipo
compatiacutevel para pacientes candidatos agrave politransfusatildeo como os portadores de doenccedila
falciforme talassemia anemia aplaacutestica doenccedilas linfo e mieloproliferativas renais crocircnicos e
anemias refrataacuterias pode contribuir para o baixo iacutendice de sensibilizaccedilatildeo nessas populaccedilotildees
(FLUIT KUNST e DRENTHE-SCHONK 1999 MARTINS et al 2008 e VICHINSKY et
al 2001) Outro grupo de pacientes que se beneficia com a transfusatildeo de mesmo fenoacutetipo satildeo
os pacientes com AHAI uma vez que o autoanticorpo pode mascarar a presenccedila de um
aloanticorpo de significado cliacutenico em ateacute 40 dos casos Mesmo com as teacutecnicas utilizadas
ldquoin vitrordquo para remover a interferecircncia do autoanticorpo no soro um aloanticorpo pode natildeo
ser identificado e dessa forma transfundir o mesmo fenoacutetipo do paciente evitaria reaccedilatildeo
hemoliacutetica pelos anticorpos voltados contra antiacutegenos de maior importacircncia cliacutenica e de
frequecircncia intermediaacuteria Aleacutem disso os pacientes com AHAI satildeo fortes respondedores e a
transfusatildeo profilaacutetica do mesmo fenoacutetipo previne a aloimunizaccedilatildeo (SHIREY et al 2002)
Aleacutem de fenotipar o receptor eacute importante tambeacutem que os bancos de sangue tenham
rotinas de fenotipagem de doadores para atender as necessidade dos pacientes aloimunizados
ou em esquema de transfusatildeo crocircnica (PINTO BRAGA e SANTOS 2011)
7
Rotineiramente eacute inviaacutevel estabelecer o fenoacutetipo eritrocitaacuterio completo de um
indiviacuteduo pela grande diversidade de sistemas sanguiacuteneos descritos Ate junho de 2015 jaacute
haviam sido classificados 308 antiacutegenos atribuiacutedos a 36 sistemas definidos pela Sociedade
Internacional de Transfusatildeo de Sangue (ISBT) (CASTILHO JUNIOR e REID 2015)
Portanto o paciente eacute normalmente fenotipado para os antiacutegenos de maior importacircncia
clinica
Alguns fatores podem limitar a realizaccedilatildeo da fenotipagem eritrocitaacuteria Um dos fatores
eacute a transfusatildeo alogecircnica realizada haacute menos de 90 dias Neste caso podem ocorrer resultados
falso positivos para determinados antiacutegenos devido agrave presenccedila de hemaacutecias do doador
(LAINE et al 2000)
Outro fator eacute a presenccedila de anticorpo sensibilizando a hemaacutecia do paciente e
provocando positividade do teste direto da antiglobulina humana (TDA) Os soros
normalmente utilizados para fenotipagem especialmente para os antiacutegenos Fya
(FY1) Fyb
(FY2) Jka
(JK1) Jkb
(JK2) S (MNS3) e s (MNS4) necessitam da fase de antiglobulina
humana (AGH) para que ocorra aglutinacatildeo Amostras que apresentam o TDA positivo
aglutinam apoacutes reaccedilatildeo com a AGH natildeo pela real presenccedila do antiacutegeno em sua superfiacutecie mas
pela interaccedilatildeo da AGH com o anticorpo que estaacute sensibilizando o eritroacutecito A interferecircncia
do TDA positivo pode ser anulada atraveacutes de algumas teacutecnicas capazes de dissociar o
anticorpo como por exemplo o tratamento da hemaacutecia sensibilizada com cloroquina ou com
glicina-aacutecida-EDTA (BRANCH e PETZ 1999 SHIREY et al 2002 e LEGER 2011)
12 METODOLOGIAS APLICADOS Agrave ROTINA IMUNO-HEMATOLOacuteGICA
Todos os testes que compotildeem a rotina preacute-transfusional usam meacutetodos soroloacutegicos
que envolvem a reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo e tem como objetivo determinar o perfil antigecircnico
eritrocitaacuterio do receptor e do doador assim como identificar em seu soro a presenccedila de
anticorpos contra antiacutegenos eritrocitaacuterios que possam comprometer a sobrevida das hemaacutecias
transfundidas Para testar o antiacutegeno na superfiacutecie da hemaacutecia eacute necessaacuterio dispor de um
antissoro com especificidade conhecida para aquele antiacutegeno Por outro lado para testar a
presenccedila de um determinado anticorpo no soro ou plasma do receptor eacute necessaacuterio o uso de
hemaacutecias com perfil antigecircnico conhecido (SANTOS 2014)
Diversas metodologias satildeo aplicadas nos laboratoacuterios de imunohematologia Cada
serviccedilo de hemoterapia faz a escolha do meacutetodo que seraacute aplicado de acordo com o perfil do
laboratoacuterio com o volume de exames diaacuterios e tambeacutem com o custo envolvido Todas essas
8
teacutecnicas tecircm como objetivo comum demonstrar a reaccedilatildeo entre antiacutegeno e anticorpo no
entanto elas se baseiam em diferentes princiacutepios Muitas metodologias satildeo atualmente
aplicadas agrave imunohematologia entre elas o sistema de fase soacutelida a tecnologia de hemaacutecias
magnetizadas a biologia molecular e ateacute mesmo a citometria de fluxo no entanto os meacutetodos
mais tradicionais satildeo aqueles baseados no princiacutepio de hemaglutinaccedilatildeo
121 MEacuteTODOS DE FASE FLUacuteIDA
Os meacutetodos de fase fluiacuteda satildeo testes baseados na hemaglutinaccedilatildeo e incluem o teste em
tubo e o teste em microplacas Uma suspensatildeo de hemaacutecias eacute adicionada ao plasma ou soro
em seguida eacute realizada a centrifugaccedilatildeo e por fim eacute feita a leitura do resultado que eacute
considerado positivo se for observado algum grau de aglutinaccedilatildeo ou hemoacutelise A intensidade
de aglutinaccedilatildeo eacute graduada de acordo com o tamanho dos agregados desprendidos da
superfiacutecie apoacutes agitaccedilatildeo delicada do tubo ou microplaca Os meacutetodos de hemaglutinaccedilatildeo satildeo
aplicados a todos os testes preacute-transfusionais Como os anticorpos ABO satildeo aglutininas frias
a tipagem eacute realizada em temperatura ambiente (22degC) no entanto ao investigar a presenccedila
de anticorpos irregulares que como jaacute mencionado eacute na maioria das vezes anticorpos
incompletos da classe IgG eacute essencial que a reaccedilatildeo seja incubada a 37degC As reaccedilotildees satildeo
facilitadas com a utilizaccedilatildeo de potencializadores e da antiglobulina humana (WALKER e
HARMENING 2012 AABB 2011)
Nos meacutetodos de fase fluiacuteda nos quais a AGH eacute empregada a fase de lavagem eacute
fundamental Apoacutes a incubaccedilatildeo do soro com as hemaacutecias deve ser realizada a lavagem da
reaccedilatildeo para remover o excesso de anticorpos natildeo ligados agraves hemaacutecias jaacute que os anticorpos
livres podem bloquear a AGH quando ela eacute adicionada e levar a resultados falso negativos
(AABB 2011)
Os testes de hemaglutinaccedilatildeo satildeo os mais tradicionais entre os meacutetodos ainda hoje
aplicados agrave rotina de bancos de sangue A vantagem desses meacutetodos eacute o baixo custo quando
comparado agraves teacutecnicas mais modernas mas apresentam tambeacutem desvantagens A teacutecnica em
tubo por exemplo natildeo permite automaccedilatildeo eacute trabalhosa e exige matildeo-de-obra bastante treinada
na execuccedilatildeo das diversas etapas do teste e mesmo assim pode haver subjetividade na
interpretaccedilatildeo dos resultados aleacutem de resultados falso-negativos (DOWNES 2011 ZANTEK
et al 2012)
9
122 COLUNAS DE GEL
A teacutecnica em gel iniciada na deacutecada de 90 representou uma grande revoluccedilatildeo na
rotina laboratorial tornando-se muito popular Aleacutem de ser sensiacutevel a teacutecnica dispensa a fase
de lavagem antes da adiccedilatildeo da AGH assim como a agitaccedilatildeo do teste para leitura reduzindo o
nuacutemero de resultados falsos negativos decorrentes dessas duas etapas e o tempo para
execuccedilatildeo dos testes (LAPIERRE et al 1989 NOVARETTI et al 2000 NOVARETTI et
al 2004) Os reagentes satildeo comercializados na forma de cartotildees plaacutesticos contendo
microtubos preenchidos por gel composto por microesferas de acrilamida-dextran Nesta
metodologia tambeacutem baseada na hemaglutinaccedilatildeo a suspensatildeo de hemaacutecias e o soro satildeo
depositados em uma cacircmara acima da coluna de gel e em seguida procede-se com a
centrifugaccedilatildeo dos cartotildees As microesferas atuam como uma malha que permite a passagem
em direccedilatildeo ao fundo do microtubo apenas das hemaacutecias natildeo aglutinadas enquanto as
hemaacutecias aglutinadas ficam retidas na parte superior da coluna ou ao longo dela (GREEN e
KLOSTERMANN 2012) Portanto quanto maior a agregaccedilatildeo mais hemaacutecias ficam retidas
no topo da coluna Dependendo do tipo de teste a ser realizado pode ser utilizado gel neutro
ou gel especiacutefico impregnado pelo anticorpo desejado e o gel contendo antiglobulina humana
que satildeo utilizados para os testes diretos e indiretos da antiglobulina (LAPIERRE et al 1989)
A coluna de gel ainda permite a visualizaccedilatildeo clara de duas populaccedilotildees distintas de hemaacutecias
como em pacientes receacutem transfundidos
123 BIOLOGIA MOLECULAR
A biologia molecular ou genotipagem estaacute sendo cada vez mais aplicada aos grupos
sanguiacuteneos pois fornece resultados seguros e precisos especialmente nos casos em que natildeo eacute
possiacutevel a realizaccedilatildeo da fenotipagem como em pacientes receacutem-transfundidos e pacientes
com TDA positivo Na genotipagem eacute possiacutevel determinar atraveacutes do DNA do paciente
extraiacutedo de seus leucoacutecitos de sangue perifeacuterico o fenoacutetipo eritrocitaacuterio deduzido sem
qualquer interferecircncia do anticorpo que sensibiliza a hemaacutecia ou de hemaacutecias alogecircnicas
transfundidas Sua realizaccedilatildeo no entanto exige o treinamento de equipe especializada e capaz
de interpretar os resultados em conjunto com os achados soroloacutegicos (JUNIOR e OLIVATO
2007)
Apesar de ser uma ferramenta de grande importacircncia hoje na imuno-hematologia
ainda estaacute restrito aos grandes centros de hemoterapia no Brasil poucos serviccedilos puacuteblicos de
sauacutede dispotildeem desse recurso e utilizam teacutecnicas de genotipagem de grupos sanguiacuteneos para
atendimento a seus pacientes Esta abordagem poreacutem vem sendo introduzida em algumas
10
instituiccedilotildees de reconhecida competecircncia na hemoterapia mas sua disponibilizaccedilatildeo deve
tornar-se mais generalizada atraveacutes da formaccedilatildeo de centros de referecircncia para atendimento
das diversas unidades de hemoterapia (MARTINS et al 2009) Dessa forma muitas decisotildees
transfusionais especialmente em urgecircncias ainda devem ser tomadas sem o resultado da
genotipagem eritrocitaacuteria
13 TESTE DA ANTIGLOBULINA
Coombs Mourant e Race descreveram em 1945 uma teacutecnica com utilizando soro de
coelho contendo antiglobulina humana (AGH) que posteriormente foi chamada de ldquosoro de
Coombsrdquo O meacutetodo foi desenvolvido inicialmente para ampliar o efeito de aglutininas fracas
do sistema Rh anticorpos ldquoincompletosrdquo que normalmente natildeo apresentavam aglutinaccedilatildeo
visiacutevel O teste foi concebido como um instrumento de investigaccedilatildeo de doenccedila hemoliacutetica do
receacutem-nascido e de reaccedilotildees transfusionais causadas por anticorpos Rh que estavam presentes
no soro dos paciente poreacutem que natildeo eram demonstraacuteveis pelas teacutecnicas ateacute entatildeo existentes
A maior parte dos anticorpos de significado cliacutenico assim como seus respectivos
antiacutegenos foram descritos apoacutes o surgimento do ldquosoro de Coombsrdquo em 1945 sendo assim o
teste da antiglobulina representa ateacute hoje a forma mais importante de aglutinaccedilatildeo artificial em
imunohematologia permitindo revelar a presenccedila de anticorpos na membrana da hemaacutecia A
antiglobulina humana eacute constituiacuteda por anticorpo especiacutefico contra a porccedilatildeo Fc de outro
anticorpo Quando um anticorpo ldquoincompletordquo sensibiliza a hemaacutecia normalmente natildeo
provoca aglutinaccedilatildeo visiacutevel Apoacutes a adiccedilatildeo da AGH ao meio esta reconhece e se liga agraves
porccedilotildees Fc dos anticorpos que sensibilizam a hemaacutecia formando assim uma malha e
provocando aglutinaccedilatildeo visiacutevel (BARJAS-CASTRO 2013)
Os reagentes de antiglobulina podem ser poliespeciacuteficos ou monoespeciacuteficos Os
poliespeciacuteficos satildeo uma mistura de anticorpos ant-IgG e anti-C3d (fraccedilatildeo C3d do
complemento) Os reagentes monoespecificos podem ser anti-IgG anti-IgM anti-IgA anti-
complemento podendo ser anti-C3d e anti-C3b
O teste da antiglobulina pode ser usado para detectar hemaacutecias sensibilizadas com
aloanticorpos IgG autoanticorpos IgG e componentes do complemento A sensibilizaccedilatildeo
pode ocorrer ldquoin vivordquo ou ldquoin vitrordquo O uso do AGH para detectar a sensibilizaccedilatildeo ldquoin vitrordquo
tem dois estaacutegios e eacute denominado teste indireto da antiglobulina A sensibilizaccedilatildeo ldquoin vivordquo eacute
detectada em procedimento de um uacutenico estagio chamado teste direto da antiglobulina (TDA)
11
Os testes direto e indireto satildeo ateacute hoje amplamente aplicados como princiacutepio de inuacutemeros
testes soroloacutegicos em imuno-hematologia (GREEN e KLOSTERMANN 2012)
131 TESTE DIRETO DA ANTIGLOBULINA
O teste direto da antiglobulina humana revela a presenccedila de anticorpo eou fraccedilatildeo do
complemento ligados agrave superfiacutecie das hemaacutecias As sensibilizaccedilatildeo das hemaacutecias ocorrida ldquoin
vivordquo natildeo eacute visualizada mas apoacutes a adiccedilatildeo da antiglobulina humana ocorre a aglutinaccedilatildeo que
eacute visualizada macroscopicamente (Figura 1)
Figura 1 - Princiacutepio da teacutecnica direta da antiglobulina Teste utilizado para demonstrar a sensibilizaccedilatildeo ldquoin
vivordquo das hemaacutecias O sangue total eacute coletado do paciente em tubo contendo anticoagulante EDTA Na teacutecnica
realizada em tubo uma suspensatildeo de hemaacutecias 5 em soluccedilatildeo de salina eacute preparada Uma gota dessa suspensatildeo
eacute lavada 3 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica para retirada de anticorpos que estatildeo livres no plasma Toda soluccedilatildeo eacute
retirada e adiciona-se o soro de Coombs (antiglobulina humana) O soro de Coombs reconhece os anticorpos que
estatildeo ligados agrave superfiacutecie das hemaacutecias fazendo com que ocorra aglutinaccedilatildeo visiacutevel macroscopicamente
Apesar de natildeo ser um teste preacute-transfusional obrigatoacuterio o TDA eacute um dos testes mais
importantes para investigar e classificar quadros hemoliacuteticos como de origem imune ou natildeo
imune O seu valor preditivo positivo em vigecircncia de anemia hemoliacutetica eacute de 83 poreacutem natildeo
havendo sinais de hemoacutelise seu valor preditivo eacute apenas 14 Eacute por esse motivo que a
interpretaccedilatildeo do TDA positivo deve levar em consideraccedilatildeo a histoacuteria cliacutenica e os resultados
dos outros exames laboratoriais A realizaccedilatildeo do TDA eacute obrigatoacuteria na investigaccedilatildeo
12
laboratorial de diversos quadros hemoliacuteticos entre eles a anemia hemoliacutetica autoimune
(AHAI) a reaccedilatildeo hemoliacutetica imune poacutes-transfusional a siacutendrome do linfoacutecito passageiro a
doenccedila hemoliacutetica perinatal e a hemoacutelise droga-dependente (LEGER 2011)
Resultados de TDA positivos foram tambeacutem observados em indiviacuteduos com niacuteveis
seacutericos elevados de IgG ou complemento sem evidecircncia de anemia hemoliacutetica imune como
em pacientes com doenccedila falciforme talassemia doenccedila renal crocircnica mieloma muacuteltiplo
doenccedilas autoimunes e siacutendrome da imunodeficiecircncia adquirida (SIDA) Aleacutem disso pequenas
quantidades de IgG (5 a 90 moleacuteculas por hemaacutecia) e complemento (5 a 40 moleacuteculas por
hemaacutecia) podem estar presentes nas hemaacutecias de indiviacuteduos saudaacuteveis sem associaccedilatildeo com
reduccedilatildeo na sobrevida das mesmas A positividade do TDA depende da populaccedilatildeo estudada e
pode variar de 01 entre doadores de sangue sem qualquer sinal cliacutenico de hemoacutelise ateacute
15 em pacientes hospitalizados (CASTILHO JUNIOR e REID 2015 LEGER 2011)
Indiviacuteduos que apresentam TDA positivo seja agraves custas de IgG eou complemento
com ou sem sinais cliacutenicos de hemoacutelise teratildeo a fenotipagem eritrocitaacuteria prejudicada A
fenotipagem de indiviacuteduos com TDA positivo especialmente quando utilizado o teste indireto
da antiglobulina pode acarretar resultados falsos positivos e levar a seleccedilatildeo de fenoacutetipo
incorreto para transfusatildeo
132 TESTE INDIRETO DA ANTIGLOBULINA
O teste indireto da antiglobulina (TIA) eacute utilizado para revelar a sensibilizaccedilatildeo ldquoin
vitrordquo das hemaacutecias e eacute aplicado a diversos testes soroloacutegicos em imunohematologia entre
eles a pesquisa de anticorpos identificaccedilatildeo de anticorpos testes de compatibilidade
fenotipagem eritrocitaacuteria e titulaccedilatildeo de anticorpos Na teacutecnica indireta a hemaacutecia que contecircm
o antiacutegeno eacute colocada em contato ldquoin vitrordquo com o anticorpo que se liga mas natildeo promove a
aglutinaccedilatildeo visiacutevel A adiccedilatildeo da AGH forma uma malha entre os anticorpos que sensibilizam
as hemaacutecias e provoca a aglutinaccedilatildeo macroscoacutepica (figura 2)
Caso a amostra de hemaacutecia estudada seja previamente sensibilizada resultados falsos
positivos podem ser obtidos no TIA jaacute que a AGH reagiraacute com a moleacutecula que sensibilizava
anteriormente a hemaacutecia mesmo se o anticorpo especiacutefico natildeo tiver se ligado ao antiacutegeno
correspondente
13
133 CONDICcedilOtildeES CLIacuteNICAS COM TDA POSITIVO
O TDA positivo deve ser interpretado cuidadosamente sempre em conjunto com o
quadro cliacutenico do paciente A positividade isolada do TDA natildeo significa hemoacutelise A
interpretaccedilatildeo do teste positivo requer o conhecimento do diagnoacutestico do paciente da presenccedila
de sinais e sintomas sugestivos de hemoacutelise assim como de seu histoacuterico transfusional
gestacional e de informaccedilotildees sobre o uso recente de medicaccedilotildees (LEGER 2011)
Figura 2 ndash Princiacutepio do teste indireto da antiglobulina O TIA pode ser utilizado na pesquisa de anticorpos de
especificidades desconhecidas livres no soroplasma como eacute o caso da pesquisa e identificaccedilatildeo de anticorpos
irregulares Ele eacute tambeacutem utilizado para determinar a presenccedila de antiacutegenos na membrana da hemaacutecia quando
satildeo empregados soros de especificidades conhecidas da classe IgG No primeiro caso o soroplasma contendo o
anticorpo desconhecido eacute colocado em contato com hemaacutecias cujo perfil antigecircnico eacute conhecido No segundo
caso utiliza-se soro de especificidade conhecida da classe IgG para determinar a presenccedila ou ausecircncia de um
antiacutegeno na membrana O anticorpo encontra o antiacutegeno correspondente e ocorre a ligaccedilatildeo do anticorpo agrave
hemaacutecia mas natildeo ocorre aglutinaccedilatildeo Apoacutes a adiccedilatildeo da AGH que se liga aos anticorpos formando uma malha
ocorre a aglutinaccedilatildeo visiacutevel
O TDA positivo eacute uma achado claacutessico de algumas condiccedilotildees cliacutenicas como a reaccedilatildeo
transfusional hemoliacutetica a doenccedila hemoliacutetica do feto e do receacutem-nascido (DHFRN) a anemia
hemoliacutetica induzida por drogas a siacutendrome do linfoacutecito passageiro e a anemia hemoliacutetica
autoimune (AHAI) Portanto o TDA positivo pode ser decorrente da sensibilizaccedilatildeo da
hemaacutecia autoacuteloga por um autoanticorpo ou por um aloanticorpo ligado agrave hemaacutecia alogecircnica
circulante A positividade do TDA pode ainda ocorrer de forma passiva em pacientes que
14
recebem imunoglobulinas humanas ou ainda pela transfusatildeo de plaquetas ABO natildeo idecircntico
(LEGER 2011 RALPH 2012 ZANTEK et al 2012)
Nas reaccedilotildees transfusionais hemoliacuteticas imunes o aloanticorpo do receptor sensibiliza
as hemaacutecias transfundidas do doador e reduz sua sobrevida ao removecirc-la precocemente da
circulaccedilatildeo pela fagocitose no sistema retiacuteculo-endotelial ou pela hemoacutelise intravascular As
reaccedilotildees podem ser agudas se ocorrem ateacute 24 horas ou tardias quando ocorrem apoacutes 24 horas
da transfusatildeo A gravidade das reaccedilotildees hemoliacuteticas pode variar de um simples rendimento
transfusional inadequado agrave quadros graves de hemoacutelise intravascular evoluindo ateacute mesmo
com choque vascular e oacutebito O TDA pode resultar negativo caso toda massa eritrocitaacuteria
transfundida tenha sido destruiacuteda (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
Na doenccedila hemoliacutetica do feto e do receacutem-nascido (DHFRN) anticorpos maternos da
classe IgG atravessam a barreira placentaacuteria e sensibilizam as hemaacutecias fetais que seratildeo
destruiacutedas precocemente levando agrave anemia fetal Apesar da incompatibilidade ABO feto-
materna ser a causa mais frequente de DHFRN raramente ela eacute responsaacutevel pela ocorrecircncia
de quadros graves Por outro lado anticorpos contra antiacutegenos do sistema Rh e Kell
especialmente Anti-D (Anti-RH1) Anti-c (Anti-RH4) e Anti-Kell (Anti-KELL1) satildeo
conhecidos por causar DHFRN severa Raramente outros anticorpos tambeacutem podem estar
implicados na DHFRN como os anticorpos contra antiacutegenos do sistema Kidd Duffy MNS e
Diego (ZANTEK et al 2012)
A hemoacutelise droga-dependente eacute causada pela produccedilatildeo de um anticorpo voltado contra
a droga ligada agrave membrana eritrocitaacuteria ou ainda contra o complexo droga-membrana A
classe de medicaccedilotildees mais comumente envolvida eacute a dos antimicrobianos betalactacircmicos
(penicilinas e cefalosporinas) mas outras classes como quimioteraacutepicos e anti-inflamatoacuterios
tambeacutem satildeo descritos (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
Apoacutes transplante de ceacutelulas progenitoras hematopoieacuteticas em que o doador possui
anticorpos contra antiacutegenos eritrocitaacuterios do receptor o linfoacutecito de memoacuteria do doador pode
resistir ao esquema imunossupressor utilizado e continuar a produccedilatildeo de anticorpos que
reconhecem a hemaacutecia incompatiacutevel do receptor ainda circulante O quadro cliacutenico pode
variar de um simples TDA positivo sem outros sinais ou sintomas ateacute um quadro hemoliacutetico
grave e abrupto (LEGER 2011)
15
134 ANEMIA HEMOLIacuteTICA AUTOIMUNE
A anemia hemoliacutetica autoimune eacute caracterizada pela destruiccedilatildeo precoce das hemaacutecias
autoacutelogas por autoanticorpos que sensibilizam as hemaacutecias e levam agrave fagocitose pelos
macroacutefagos no sistema reticulo-endotelial ou hemoacutelise intravascular O diagnoacutestico da AHAI
baseia-se na presenccedila de hemoacutelise cliacutenica associada agrave evidecircncia de fator imune representado
pelo TDA positivo As classes de anticorpos envolvidas em quadros de AHAI satildeo IgG IgM e
raramente IgA (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012) Satildeo raros os casos de AHAI com TDA
negativo que podem estar relacionados a um autoanticorpo de baixa avidez de densidade
inferior agrave detecccedilatildeo do meacutetodo ou ainda de classe de imunoglobulina natildeo avaliada pelo
meacutetodo utilizado para o teste (GARRATY 2005)
A AHAI pode ser classificada em dois grupos principais de acordo com a melhor
temperatura de reaccedilatildeo do autoanticorpo As anemias hemoliacuteticas causadas por anticorpos
quentes que reagem melhor a 37oC e geralmente IgG representam 80 dos casos de AHAI
Nas AHAI por anticorpo quente o TDA pode ser positivo para IgG mais complemento (67)
somente IgG (20) ou somente por complemento (13) As anemias causadas por
anticorpos frios geralmente da classe IgM e que reagem melhor em temperatura ambiente ou
a 4oC representam aproximadamente 20 dos casos de AHAI Por exibirem amplitude
teacutermica esses anticorpos ligam-se agraves hemaacutecias ao atingirem a circulaccedilatildeo nas extremidades do
corpo fixam o complemento e desprendem-se da hemaacutecia apoacutes retornar para partes mais
quentes Por esse motivo em AHAI por anticorpos frios o TDA eacute positivo apenas agraves custas
de C3 e normalmente o IgM natildeo eacute detectado (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
A presenccedila do autoanticorpo IgG pode ser confirmada atraveacutes da eluiccedilatildeo do anticorpo
da hemaacutecia Tipicamente o eluato na AHAI por anticorpo quente reage com todas as ceacutelulas
testadas de um painel de hemaacutecias alogecircnicas do tipo ldquoOrdquo ou pode eventualmente exibir uma
especificidade conhecida como Anti-e (Anti-RH5) Nas AHAI a frio por sua vez espera-se
um eluato negativo (LEGER 2011)
Os autoanticorpos satildeo com frequecircncia encontrados livres no plasma e natildeo somente
ligados agraves hemaacutecias autoacutelogas Eles podem interferir em todas as fases dos testes preacute-
transfusionais nas quais o plasma eacute testado especialmente os autoanticorpos quentes que
acarretam resultados positivos em todos os testes levados agrave fase de antiglobulina humana
Esses anticorpos portanto positivam a pesquisa de anticorpos irregulares e mascaram a
presenccedila de aloanticorpos de significado cliacutenico Aproximadamente 60 dos pacientes que
apresentam AHAI a quente apresentam anticorpos que reagem em meio salino mas se forem
16
levados em conta meacutetodos mais sensiacuteveis como PEG enzima e estudo em gel a positividade
pode ser superior a 90 (LEGER 2011)
Aleacutem da eficaacutecia da transfusatildeo ser comprometida pela diminuiccedilatildeo da vida-meacutedia das
hemaacutecias a presenccedila do autoanticorpo dificulta a realizaccedilatildeo dos testes preacute-transfusionais e
compromete a seguranccedila transfusional Os autoanticorpos reagem normalmente como
panaglutininas pois satildeo normalmente voltados contra antiacutegenos puacuteblicos na maior parte das
vezes contra antiacutegenos do sistema Rh Por apresentarem essas caracteriacutesticas podem ainda
mascarar a presenccedila de aloanticorpos de significado clinico e levar a testes de compatibilidade
positivos exigindo uma avaliaccedilatildeo criteriosa da necessidade da transfusatildeo (BRANCH e PETZ
1999 JUNIOR e OLIVATO 2004)
Remover a interferecircncia do autoanticorpo para avaliar a presenccedila de aloanticorpos
mascarados nem sempre eacute possiacutevel mesmo utilizando teacutecnicas de autoadsorccedilatildeo ou
aloadsorccedilatildeo que aleacutem de tudo satildeo demoradas e exigem de 2 a 6 horas para conclusatildeo
(GARRATY e GEORGE 2002) Nesses casos a fenotipagem eritrocitaacuteria do paciente eacute de
extrema utilidade especialmente em situaccedilotildees de urgecircncia A definiccedilatildeo do fenoacutetipo do
paciente para os antiacutegenos de maior importacircncia cliacutenica pode auxiliar a seleccedilatildeo de unidades
de hemaacutecias com mesmo fenoacutetipo o que garante que eventuais aloanticorpos natildeo
identificados sejam respeitados e tambeacutem evita nova sensibilizaccedilatildeo (JUNIOR e OLIVATO
2004 SHIREY et al 2002)
135 TRATAMENTO DE HEMAacuteCIAS COM TDA POSITIVO
O TDA positivo impede a fenotipagem eritrocitaacutecia por meacutetodos que exigem a fase de
AGH uma vez que a aglutinaccedilatildeo ocorreraacute devido agrave interaccedilatildeo da AGH com o autoanticorpo
que sensibiliza a hemaacutecia do paciente levando a resultados falso positivos Em algumas
situaccedilotildees como na AHAI por anticorpo quente a fenotipagem eacute especialmente importante
pois o autoanticorpo interfere na triagem e identificaccedilatildeo de anticorpos assim como no teste de
compatibilidade e dificultam a detecccedilatildeo de aloanticorpos de significado cliacutenico que
obrigatoriamente devem ser respeitados Nessas situaccedilotildees a fenotipagem eritrocitaacuteria
determina o perfil antigecircnico do paciente e possibilita o fornecimento de unidades de
hemaacutecias com o mesmo fenoacutetipo para a transfusatildeo evitando a sensibilizaccedilatildeo para novos
antiacutegenos assim como reaccedilotildees hemoliacuteticas transfusionais No entanto eacute necessaacuterio aplicar
meacutetodos que natildeo sofram interferecircncia do TDA positivo ou seja meacutetodos que natildeo necessitem
da fase de AGH ou meacutetodos de bloqueio do anticorpo sem bloquear o antiacutegeno Uma opccedilatildeo eacute
a utilizaccedilatildeo de soros monoclonais IgM (salinos ou de meio proteico natildeo concentrado) mas
17
nem sempre esses reagentes estatildeo disponiacuteveis especialmente os reagentes monoclonais para
os antiacutegenos dos sistemas Duffy ( Fya Fy
b) Kidd ( Jk
a Jk
b) e MNS (S s) (JUNIOR e
OLIVATO 2004) Outra opccedilatildeo eacute a teacutecnica de bloqueio que pode ser utilizada para tratar
hemaacutecias para posterior fenotipagem em casos de TDA positivos com reatividade le2+
Em casos onde a positividade do TDA eacute maior que 2+ estaacute indicada a tratamento
quiacutemico para remoccedilatildeo da interferecircncia do autoanticorpo antes de realizar a fenotipagem Entre
as teacutecnicas utilizadas atualmente estatildeo o ZZAP a cloroquina e a glicina aacutecidaEDTA
1351 TEacuteCNICA DE BLOQUEIO
A teacutecnica de bloqueio se baseia na utilizaccedilatildeo de anti-IgG (Coombs monoespeciacutefico)
para tratar as hemaacutecias com TDA positivo O anticorpo anti-IgG se liga aos anticorpos que
estatildeo sensibilizando a hemaacutecias poreacutem sem o bloquear os antiacutegenos Os antiacutegenos que natildeo
estatildeo sensibilizados podem ser detectados atraveacutes dos antissoros especiacuteficos (SERERAT
VEIDT E DUTCHED 2000)
1352 TRATAMENTO DE HEMAacuteCIAS COM ZZAP
O Sulphydryl-Proteolytic Enzyme (ZZAP) que eacute uma mistura de ditiotreitol (DTT)
mais papaiacutena ativada com cisteiacutena eacute um reagente capaz de dissociar imunoglobulinas da
classe IgG ligadas a membrana dos eritroacutecitos enquanto trata enzimaticamente as hemaacutecias
O tratamento enzimaacutetico tambeacutem potencializa a ligaccedilatildeo do autoanticorpo ao antiacutegeno e
acelera o processo de autoadsorccedilatildeo O ZZAP pode desnaturar os antiacutegenos do sistema Duffy
MNS e Kell o que limita sua aplicaccedilatildeo para fins de fenotipagem (BRANCH e PETZ 1982)
1353 CLOROQUINA
Em 1982 Edwards Moulds e Judd propuseram a utilizaccedilatildeo da teacutecnica da cloroquina
que dissociava os complexos antiacutegeno-anticorpo e mantinha a membrana das hemaacutecias
iacutentegras Os derivados quinolecircicos jaacute haviam sido descritos anteriormente por Domokos e
Aszody em 1964 e Holtz Mantel e Buck em 1973 (apud Edwards Moulds e Judd 1982) pela
sua capacidade de separar imunocomplexos e inibir as reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo reduzindo
as cargas eleacutetricas das superfiacutecie das hemaacutecias A teacutecnica eacute uma das mais utilizadas nos
centros brasileiros para remover a interferecircncia do autoanticorpo e eacute tambeacutem a teacutecnica
atualmente adotada pelo laboratoacuterio de imunohematologia do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto
18
Edwards Moulds e Judd (1982) demonstraram que a teacutecnica da cloroquina para
dissociaccedilatildeo de anticorpos eacute uma teacutecnica simples efetiva e confiaacutevel para dissociar
imunoglobulina das hemaacutecias Desde que a membrana das hemaacutecias permaneccedila intacta natildeo
haacute perda da reatividade dos antiacutegenos e a sua maior aplicaccedilatildeo eacute a fenotipagem de hemaacutecias
com TDA positivo Os autores verificaram que em 83 das amostras sensibilizadas in vivo e
22 amostras (no total de 40) sensibilizadas ldquoin vitrordquo apresentaram TDA negativo e
puderam ser fenotipadas A teacutecnica poreacutem natildeo consegue remover os componentes do
complemento na maioria dos casos
Champagne e colaboradores (1999) testaram a teacutecnica da cloroquina para dissociar
antiacutegenos Bg comparando com a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA e verificaram vantagem em
relaccedilatildeo ao uso de um uacutenico reagente diminuindo a manipulaccedilatildeo e verificou que o mesmo natildeo
destroacutei antiacutegeno Kell
A cloroquina tambeacutem mostrou-se pouco efetivo em remover anticorpos do sistema
Duffy da superfiacutecie das hemaacutecias (EDWARDS MOUDS e JUDD 1982 ROZIERS e
SQUALI 1997)
1353 GLICINA-AacuteCIDAEDTA
A afinidade e a estabilidade entre a ligaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo eacute definida como a
resultante entre forccedilas atrativas e repulsivas entre ambos (CARUCIO e WISE 2012) e resulta
da somatoacuteria de forccedilas quiacutemicas dinacircmicas e fracas (natildeo covalentes) como pontes de
hidrogecircnio forcas eletrostaacuteticas forca de Van der Waals e pontes hidrofoacutebicas A estabilidade
dessa ligaccedilatildeo eacute facilmente abalada por alteraccedilotildees quiacutemicas e fiacutesicas no meio da reaccedilatildeo como
a alteraccedilatildeo do pH A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA se baseia na mudanccedila do pH para a
quebra da ligaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo (KOSANKE 2012)
A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA foi primeiramente descrita em 1986 por Louie Jieng
e Zeroulis que utilizaram 50 amostras de doadores sensibilizados ldquoin vitrordquo com anticorpos A
teacutecnica foi efetiva em 48 amostras permitindo o estudo do eluato assim como a fenotipagem
das hemaacutecias Os autores testaram tambeacutem a teacutecnica em 100 hemaacutecias TDA positivo que
puderam ser utilizadas para teacutecnicas de autoadsorccedilatildeo
Byrne (1991) descreveu a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA modificada e tambeacutem
verificou como uma opccedilatildeo para o tratamento de hemaacutecias com TDA positivo que deixava as
hemaacutecias intactas e o eluato viaacutevel para ser fenotipado
19
Roziers e Squali (1997) e Katharia e Chaudhary (2013) compararam a teacutecnica da
glicina-aacutecidaEDTA com as teacutecnicas da cloroquina e do aquecimento Verificaram maior
eficiecircncia da glicina-aacutecidaEDTA em relaccedilatildeo as outras duas teacutecnicas pois com uma mesma
quantidade de amostra produzia as hemaacutecias livres de anticorpo e tambeacutem o eluato Mostrou-
se ainda superior devido ao menor tempo exigido para sua realizaccedilatildeo o que favorece seu uso
em situaccedilotildees de urgecircncia e emergecircncia
As duas desvantagens da teacutecnica poreacutem eacute o fato de destruir os antiacutegenos do sistema
Kell e o fato de natildeo remover fraccedilotildees do complemento ligadas agrave hemaacutecia (PALLAS WILER e
McGEE 1991 ROZIERS e SQUALLI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012
e KATHARIA e CHAUNDHARY 2013)
20
2 OBJETIVOS
21 OBJETIVO GERAL
211 Avaliar a eficaacutecia da glicina-aacutecidaEDTA em remover os anticorpos ligados agraves
hemaacutecias sensibilizadas por anticorpos da classe IgG
22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
221 Preparaccedilatildeo dos reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
verificaccedilatildeo da estabilidade dos mesmos e avaliar custos
222 Testar a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA em amostras de hemaacutecias
sensibilizadas por anticorpos antieritrocitaacuterios humanos
223 Comparar a efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA com a teacutecnica da
cloroquina quanto a capacidade de remover a interferecircncia do anticorpo ligado
a hemaacutecia
224 Testar o eluato das amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA
225 Verificar se houve destruiccedilatildeo dos antiacutegenos eritrocitaacuterios apoacutes o tratamento
com glicina-aacutecidaEDTA e com cloroquina
226 Verificar se o tempo de execuccedilatildeo da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA descrito
nos textos de referecircncia eacute reprodutiacutevel
21
3 JUSTIFICATIVA
Algumas condiccedilotildees cliacutenicas podem levar ao depoacutesito ldquoin vivordquo de anticorpos eou
fraccedilotildees do complemento sobre as hemaacutecias Entre elas estatildeo as reaccedilotildees hemoliacuteticas poacutes-
transfusionais a doenccedila hemoliacutetica perinatal o uso de medicamentos e principalmente a
AHAI Na AHAI um anticorpo normalmente da classe IgG ou IgM reconhece antiacutegenos
proacuteprios na membrana eritrocitaacuteria e reduz a sobrevida da hemaacutecia levando a sua destruiccedilatildeo
pelos macroacutefagos no sistema reticulo-endotelial ou agrave ativaccedilatildeo do complexo de ataque agrave
membrana e agrave lise intravascular Os autoanticorpos satildeo voltados na maioria das vezes contra
antiacutegenos eritrocitaacuterios de alta frequecircncia populacional conhecidos como antiacutegenos puacuteblicos
e por este motivo reconhecem tanto hemaacutecias autoacutelogas quanto alogecircnicas
Devido agrave presenccedila do autoanticorpo livre no plasma e tambeacutem do anticorpo eou
complemento ligado agrave hemaacutecia o banco de sangue pode encontrar dificuldades em todas as
fases dos testes preacute-transfusionais do paciente com AHAI e deve utilizar teacutecnicas que
auxiliem na escolha do melhor hemocomponente melhorando a seguranccedila transfusional Essas
teacutecnicas visam remover a interferecircncia do autoanticorpo livre no soro e do autoanticorpo
ligado agrave hemaacutecia permitindo a detecccedilatildeo de aloanticorpos associados e a realizaccedilatildeo da
fenotipagem eritrocitaacuteria respectivamente
A finalizaccedilatildeo dos testes preacute-tranfusionais na presenccedila de autoanticorpo pode levar
algumas horas e nem sempre o paciente poderaacute aguardar Nesse contexto torna-se vantajosa a
aplicaccedilatildeo de teacutecnicas de raacutepida execuccedilatildeo
O presente estudo propotildee aplicar e avaliar a eficaacutecia da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
em remover os anticorpos ligados agrave hemaacutecia o que permite a fenotipagem eritrocitaacuteria
estendida e a seleccedilatildeo de concentrados de hemaacutecias com mesmo fenoacutetipo do paciente
Atualmente no Hemocentro de Ribeiratildeo Preto a teacutecnica utilizada para esse fim eacute o
tratamento das hemaacutecias com difosfato de cloroquina cujo tempo de execuccedilatildeo pode demorar
ateacute duas horas enquanto a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser realizada em apenas dois
minutos o que a tornaria opccedilatildeo de escolha especialmente em situaccedilotildees de urgecircncia Ao
contraacuterio da cloroquina a glicina-aacutecidaEDTA permite tambeacutem o estudo do eluato das
hemaacutecias tratadas
22
4 METODOL OGIA
41 AMOSTRAS DE DOADORES
Foram coletados 50 amostras de doadores de sangue que compareceram ao
Hemonuacutecleo de Araccedilatuba no periacuteodo de junho a agosto de 2016 Foram convidados a
participar da pesquisa doadores de repeticcedilatildeo do tipo sanguiacuteneo ldquoOrdquo RhD positivo
cadastrados no sistema de banco de sangue (SBS) do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto
Todos os doadores que concordaram em participar da pesquisa assinaram o termo de
consentimento livre e esclarecido (TCLE)
No momento da doaccedilatildeo foram coletados adicionalmente 5 mL de sangue total em
soluccedilatildeo anticoagulante EDTA (aacutecido dietilenoaminoaceacutetico) dispensando punccedilatildeo venosa
adicional para coleta da amostra O fluxograma 1 resume as etapas desenvolvidas no projeto
Fluxograma 1 - Fluxo da pesquisa utilizando as amostras de doadores
23
411 FENOTIPAGEM
Foram verificados se os doadores jaacute tinham fenotipagem para outros sistemas de
grupos sanguiacuteneos aleacutem do sistema ABORh que eacute realizado rotineiramente
A fenotipagem eritrocitaacuteria para outros sistemas ou fenotipagem estendida eacute realizada
para identificar a presenccedila ou ausecircncia de antiacutegenos considerados de importacircncia cliacutenica No
Hemonuacutecleo de Araccedilatuba uma parcela de doadores de repeticcedilatildeo satildeo fenotipados para os
antiacutegenos dos sistemas de grupo sanguiacuteneo Rh (antiacutegenos C c E e e) Kell (antiacutegeno K)
Duffy (antiacutegenos Fya e Fy
b) Kidd (antiacutegenos Jk
a e Jk
b) e sistema MNSs (antiacutegenos S e s)
A fenotipagem para o Rh e Kell eacute realizada por metodologia de microplaca utilizando
25 microL de hemaacutecia lavada e diluiacuteda a 5 em salina e 25 microL do antissoro comercial especiacutefico
A reaccedilatildeo eacute incubada 15 minutos a temperatura ambiente e centrifugadas para leitura Para os
antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s a metolodogia utilizado eacute gel contendo antiglobulina
humana (gel LissCoombs poliespeciacutefico) da marca BIO-RAD onde se utiliza suspensatildeo de
hemaacutecia em LISS (Soluccedilatildeo de baixa forccedila iocircnica) A suspensatildeo eacute preparada atraveacutes da
diluiccedilatildeo de 10 microL de hemaacutecia em 1000 microL de LISS Pipetado 50 microL dessa diluiccedilatildeo no gel e
adicionado 25 microL do antissoro especiacutefico Incuba-se em banho seco por 15 minutos a 37 deg
Celsius e eacute centrifugado em centriacutefuga especiacutefica Os antissoros utilizados eram das marcas
Fresenius e Lorne
Foi verificado a fenotipagem do doador no banco de dados do Hemocentro Os
registros dos fenoacutetipos dos doadores ficam armazenadas no sistema de banco de sangue
(SBS) Para doadores que natildeo tinham fenotipagem estendida preacutevia para antiacutegenos do sistema
Rh (C c E e e) e Kell (K) foi realizada a fenotipagem para esses antiacutegenos
O tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA e cloroquina para dissociar
anticorpos pode inativar enfraquecer ou destruir os antiacutegenos presentes nas hemaacutecias
alterando assim os resultados da fenotipagem Para verificar se houve destruiccedilatildeo dos
antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a e Jk
b S e s nas amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes
tratamento foram novamente fenotipadas ao final para os antiacutegenos que eram inicialmente
positivas
A repeticcedilatildeo da fenotipagem foi realizada nas amostras que apresentaram efetividade
no tratamento da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eou da cloroquina e a detecccedilatildeo do antiacutegeno
na amostra preacute-tratamento
24
412 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS HEMAacuteCIAS
As hemaacutecias foram sensibilizadas com antissoros policlonais humanos de amostras de
plasma fresco congelado de doadores com resultado de pesquisa de anticorpo irregular
positivos
A escolha do anticorpo para sensibilizar as hemaacutecias foi definida de acordo com o
fenoacutetipo do doador que deveria ser positivo para o respectivo antiacutegeno
Para a sensibilizaccedilatildeo um volume de antissoro (1 mL) e um volume (1 mL) de
hemaacutecias lavadas quatro vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica foram adicionadas a um tubo de 12 x
75 mm A mistura foi homogeneizada e incubada em banho maria (BM) a 37deg C por 60
minutos A seguir as hemaacutecias foram novamente lavadas 4 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica
para retirada dos anticorpos que natildeo se ligaram A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada
como controle negativo O teste da uacuteltima lavagem eacute importante para assegurar que os
anticorpos que poderatildeo ser detectados no eluato apoacutes o tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA
sejam aqueles que estavam ligados agraves hemaacutecias e natildeo aqueles livres no plasma O controle
negativo mostra que todo o anticorpo livre foi retirado (LEGER 2011)
Para o teste de presenccedila de anticorpo na soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foram incubadas
com hemaacutecias de triagem de anticorpos irregulares (ID-Diacell BIO-RAD) contendo os
antiacutegenos especiacuteficos Realizado a teacutecnica em gel LissCoombs com anti-IgG+C3d Incubado
no tempo de 15 minutos a temperatura de 37deg C e centrifugado 10 minutos em centriacutefuga
proacutepria
As 50 amostras de doadores foram sensibilizadas com os anticorpos policlonais
humanos
Apoacutes sensibilizadas rdquoin vitrordquo e lavadas as hemaacutecias foram diluiacutedas em soluccedilatildeo de
baixa forccedila iocircnica (LISS) na quantidade de 10 microL de hemaacutecia para 1000 microL de soluccedilatildeo A
suspensatildeo foi pipetada (50 microL) em coluna-gel-teste LissCoombs (BIO-RAD) que contecircm
antiglobulina poliespeciacutefico (IgG+C3d) e centrifugada em baixa rotaccedilatildeo conforme orientaccedilatildeo
do fabricante durante 10 minutos
As amostras deveriam apresentar aglutinaccedilatildeo com reatividade 3 a 4+ no TDA As
amostras que apresentaram reaccedilatildeo menor que 3+ foram novamente sensibilizadas com nova
aliacutequota do antissoro
25
413 TRATAMENTO DAS AMOSTRAS
As amostras sensibilizadas apresentando o TDA positivo 3 ou 4+ foram divididas em
duas aliacutequotas e submetidas a duas teacutecnicas diferentes com o objetivo de dissociar o anticorpo
ligado Uma aliacutequota da amostra foi tratada com soluccedilatildeo de difosfato de cloroquina enquanto
a outra aliacutequota foi tratada com glicina-aacutecidaEDTA
42 PREPARO DA GLICINA AacuteCIDA-EDTA
A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA utiliza 3 soluccedilotildees diferentes a glicina aacutecida o
EDTA e o tampatildeo TRIS
Os reagentes foram preparados utilizando os sais para anaacutelise (PA) de EDTA
(Na2EDTA2H2O) TRIS (C4H11NO3) Glicina (H2NCH2CO2H) NaCl e a soluccedilatildeo de aacutecido
cloriacutedrico (HCl) 12 N todos reagentes da marca SYNTH (quadro 1)
Para o preparo do tampatildeo glicina-acida eacute necessaacuterio o ajuste do pH para 15 Para esse
ajuste utiliza-se aacutecido cloriacutedrico (HCl) concentrado O pH foi medido com fitas reativas de pH
com escala de 1 a 14 da marca MERCK Posteriormente a soluccedilatildeo foi enviada ao laboratoacuterio
de controle de qualidade do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto e o pH medido no peagacircmetro O
tampatildeo glicina-aacutecida foi armazenado a 4deg e o tampatildeo tris e o EDTA em temperatura ambiente
controlada (20 a 24deg Celsius)
Apoacutes o preparo e durante a realizaccedilatildeo dos testes foram feitas inspeccedilotildees visuais para
verificaccedilatildeo de turvaccedilatildeo do meio e presenccedila de precipitados
Reagente Material Quantidade Preparo e
Conservaccedilatildeo
EDTA
EDTA
(Na2EDTA2H2O)
5 gramas Mistura ateacute
dissoluccedilatildeo do sal e
conserva em
temperatura ambiente Aacutegua Destilada 50 Ml
Tris
TRIS (C4H11NO3) 121 gramas Conservar em
temperatura ambiente NaCl 525g
Aacutegua destilada 100ml
Gliacutecina-aacutecida
Glicina
(H2NCH2CO2H) 15 gramas
Conservar a 4oC NaCl 116gramas
Aacutegua Destilada 200ml
HCL 12N Ajutar o pH para 15
Quadro 1 - Preparo dos Reagentes da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
Fonte - Manual teacutecnico AABB 2011
26
O tampatildeo glicina-aacutecida e o tampatildeo TRIS satildeo estaacuteveis por 7 meses O reagente EDTA
precipitou mesmo estando em temperatura em ambiente controlado Houve necessidade de
preparo de novo reagente
421 TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
1 Em um tubo de ensaio 12x75 mm eacute adicionado 08 mL da soluccedilatildeo de glicina-aacutecida A
esta soluccedilatildeo adiciona-se 02 mL de EDTA e mistura
2 Adiciona-se 02 mL de hemaacutecias sensibilizadas (lavada 4 vezes) A mistura eacute
homogeneizada e incubada por exatamente 2 minutos
3 A seguir 01 mL de tampatildeo TRIS eacute adicionado agrave mistura que eacute novamente
homogeneizada e centrifugada por 2 minutos a 3400 rpm O pH deve estar entre 7 a 75
4 Apoacutes centrifugaccedilatildeo separa-se em outro tubo o sobrenadante (eluato) e as hemaacutecias
que permanecem satildeo lavadas 4 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica para retirada de todo o
reagente e anticorpos livres
43 PREPARO DA CLOROQUINA
A cloroquina eacute diluiacuteda em tampatildeo PBS na concentraccedilatildeo de 20 (Quadro 2) e
armazenado a 4deg Celsius sua validade apoacutes o preparo eacute de 1 mecircs
A teacutecnica da cloroquina jaacute estaacute padronizada para rotina do laboratoacuterio de
imunohematologia do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto e suas unidades
Reagente Reagentes Quantidade PreparoConservaccedilatildeo
Cloroquina
Difosfato de cloroquina
(C18H32ClN3O8P2)
20 gramas
Conservar a 4deg Celsius
Tampatildeo PBS 100ml
NaOH 01 N Acertar o pH para
51
Quadro 2 - Preparo da Cloroquina Fonte - Manual teacutecnico da AABB 2011
431 TEacuteCNICA DA CLOROQUINA
1 4 partes da soluccedilatildeo pronta eacute adicionada a uma parte de hemaacutecias lavadas 4 vezes com
soluccedilatildeo fisioloacutegica
2 A mistura eacute incubada em temperatura ambiente por ateacute duas horas
3 Centrifugar a 3400 rpm por 2 minutos
27
4 Remover o sobrenadante lavar as hemaacutecias novamente com soluccedilatildeo fisioloacutegica 4
vezes
44 VERIFICACcedilAtildeO DA EFETIVIDADE DOS TESTES
Apoacutes tratamento pelas duas teacutecnicas o TDA foi repetido em todas as amostras para
verificar se os tratamentos foram efetivos e houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo Para as
amostras tratadas pela teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA que permaneceram com TDA positivo
novo tratamento foi realizado
45 TESTE DO ELUATO
O eluato resultante das amostras tratadas com glicina-acidaEDTA foi testado com
hemaacutecias de triagem A soluccedilatildeo do eluato foi incubada com as hemaacutecias de triagem de
anticorpos (ID-Diacell BIO-RAD) pela teacutecnica em gel LissCoombs O teste foi incubado 15
minutos a 37deg Celsius e centrifugado por 10 minutos em centrifuga proacutepria para a teacutecnica em
gel Os eluatos que apresentaram resultados positivos foram testados em painel de 11
hemaacutecias (ID-Diapanel BIO-RAD) para a identificaccedilatildeo do anticorpo
46 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente que apresentou TDA positivo por IgG e pesquisa
de anticorpo irregular positivo com presenccedila de autoanticorpo com reatividade panaglutinina
A amostra foi tratada em paralelo pelas duas teacutecnicas descritas e foi enviada para o
Hemocentro para genotipagem eritrocitaacuteria que foi realizado por metodologia PCR em tempo
real no equipamento Real-time system PCR 7500 ( Applied Biosystems Califoacuternia EUA)
28
5 RESULTADOS
51 REAGENTES
Para aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA satildeo necessaacuterios 3 diferentes
reagentes que podem ser encontrados em forma de kit pronto para uso No entanto esses kits
natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil Os reagentes satildeo tampatildeo glicina-aacutecida o EDTA e o tampatildeo
Tris
Todos os reagentes foram preparados rdquoin houserdquo a partir dos sais e soluccedilotildees PA (puro
para anaacutelise) da marca SYNTH que foram adquiridos para a pesquisa O custo estimado para
cada teste foi aproximadamente R$ 020 reais
Apoacutes o preparo os reagentes poderiam ser armazenados em condiccedilotildees adequadas pelo
periacuteodo de 1 ano (AABB 2011) Ao final do preparo e durante o periacuteodo de armazenamento
de fevereiro a setembro de 2016 foi realizada inspeccedilatildeo visual para verificar a presenccedila de
precipitados ou turvaccedilatildeo A soluccedilatildeo de glicina e o tampatildeo TRIS mostraram-se estaacuteveis ateacute o
final do periacuteodo Por sua vez o reagente EDTA precipitou mesmo estando armazenado em
temperatura ambiente controlada e foi necessaacuterio novo preparo
52 AMOSTRAS DE DOADORES
521 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS AMOSTRAS
Apoacutes incubaccedilatildeo da hemaacutecia com o antissoro a mesma foi lavada 4 vezes para retirada
dos anticorpos livres A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada Caso houvesse positividade na
soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem a etapa era repetida (figura 3) Das 50 amostras sensibilizadas a
uacuteltima lavagem foi positiva somente em 3 delas Nas 3 amostras o anticorpo utilizado para
sensibilizaccedilatildeo foi o anti-K Apoacutes repetido nova etapa de lavagem os resultados se
apresentaram negativos
Em todas as amostras sensibilizadas ldquoin vitrordquo o TDA foi testado e verificado a
intensidade do teste Entre as 50 amostras 47 alcanccedilaram TDA com intensidade 3-4+ apoacutes a
primeira sensibilizaccedilatildeo enquanto 3 amostras necessitaram uma segunda incubaccedilatildeo com
anticorpo (figura 4)
A escolha dos anticorpos para sensibilizar as hemaacutecias foi feita de acordo com o
fenoacutetipo do doador e foram utilizados sete diferentes especificidades de anticorpos policlonais
humanos conforme mostra o graacutefico1
29
Figura 3 - Soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada com hemaacutecia de triagem de
anticorpos em gel LissCoombs (BIO-RAD) A finalidade eacute verificar a presenccedila de anticorpos livres na
suspensatildeo que possam interferir na pesquisa do eluato As soluccedilotildees de lavagem das amostras na figura a tiveram
resultados negativos Na figura b duas amostras a 47 e 50 apresentaram resultado positivo Nova etapa de
lavagem foi realizada e o resultado final foi negativo
522 TRATAMENTO DAS HEMAacuteCIAS
Apoacutes a sensibilizaccedilatildeo e obtenccedilatildeo de resultados de TDA com intensidade de 3 a 4+
cada uma das amostras foi dividida em duas aliacutequotas e tratada separadamente pelas teacutecnicas
de glicinaaacutecida-EDTA e cloroquina
As teacutecnicas foram consideradas efetivas quando obteve-se a completa dissociaccedilatildeo do
anticorpo verificada atraveacutes do TDA negativo na amostra poacutes tratamento conforme figuras 5
e 6 Dentre as amostras tratadas com cloroquina 2850 tiveram o TDA negativado A glicina-
aacutecidaEDTA negativou o TDA em 33 das 50 amostras tratadas Apenas 17 amostras tratadas
com glicina-aacutecidaEDTA permaneceram com o TDA positivo e foram submetidas a um novo
tratamento
30
Figura 4 - TDA das amostras apoacutes sensibilizaccedilatildeo com anticorpos policlonais humanos Amostras na
figura a com intensidades de 3-4+ Na figura b amostras 4 e 7 com intensidade menor que 3+ e portanto foram
novamente sensibilizadas com nova aliacutequota de soro Anti-D e anti-S Apoacutes a segunda sensibilizaccedilatildeo
apresentaram reatividade 4 e 3+ respectivamente Os anticorpos utilizados para sensibilizaccedilatildeo foram D S c E
C e K
523 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS TEacuteCNICAS
No tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA houve dissociaccedilatildeo completa do anticorpo
em 33 amostras (66) das 50 amostras testadas enquanto que com a cloroquina foram 28
amostras (56) (tabela 1)
31
Graacutefico 1- Nuacutemero de amostras sesnsibilizadas por especificidade de anticorpo Entre as 50 amostras 12
foram sensibilizadas com anti-D 10 com anti-C 9 com anti-E 8 com anti-c 7 com anti-S 3 com anti-K e 1
com anti-Dia As especificidades dos anticorpos foram definidas de acordo o fenoacutetipo do doador
Figura 5 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com cloroquina Nas amostras onde houve
a dissociaccedilatildeo do anticorpo ( 2 21 a 23 26 39 a 42 45 46 e 49) a hemaacutecia se deposita no fundo no microtubo
apoacutes a centrifugaccedilatildeo (TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (1 3 24 25 43 44 47
48 e 50) o anticorpo ligado agraves hemaacutecias eacute alvo da AGH presente no gel (TDA positivo)
Anti-D 12
Anti-C 10
Anti-E 9
Anti-c 8
Anti-S 7
Anti-K 3 Anti-Dia 1
32
Figura 6 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA Nas amostras
onde houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo (4 6 7 12 a 15 17 34 35 37 e 38) a hemaacutecia se deposita no fundo no
microtubo apoacutes a centrifugaccedilatildeo ( TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (5 16 18
19 20 33 e 36 ) o AGH presente no gel se liga ao anticorpo ligado agraves hemaacutecias que ficam retidas no gel (TDA
positivo)
Tabela 1-Resultado geral do tratamento das hemaacutecias com glicina e cloroquina
Teacutecnica utilizada TDA negativo TDA positivo Total
Glicina-aacutecidaEDTA 33 17 50
Cloroquina 28 22 50
A glicina-aacutecidaEDTA conseguiu negativar mais amostras sensibilizadas com Anti-D
e anti-K que a cloroquina Para as hemaacutecias sensibilizadas com anti-E Anti-S e Anti-Dia
ambas as teacutecnicas dissociaram o anticorpo em 100 das amostras Os resultados detalhados
por especificidade do anticorpo apoacutes o primeiro tratamento com glicina-aacutecidaEDTA e com
cloroquina estatildeo na tabela 2
Para as amostras que permaneceram positivas (17 amostras) apoacutes o tratamento com a
glicina-aacutecidaEDTA foi realizado um novo tratamento Houve dissociaccedilatildeo do anticorpo em 3
amostras (18) apoacutes a segunda tentativa Nas demais 14 (82) amostras tratadas pela
segunda vez 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise
33
Tabela 2 - Resultados do TDA apoacutes tratamento das hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo
sensibilizado
ANTICORPOS
SENSIBILIZADOS
1ordm TRATAMENTO COM
GLICINA
TRATAMENTO COM
CLOROQUINA
TOTAL TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
Anti-D 8 4 0 12 12
Anti-C 6 4 10 0 10
Anti-E 9 0 9 0 9
Anti-c 0 8 1 7 8
Anti-S 7 0 7 0 7
Anti-K 2 1 0 3 3
Anti-Dia 1 0 1 0 1
TOTAL 33 17 28 22 50
A hemoacutelise foi verificada durante o procedimento de lavagem final das hemaacutecias com
soluccedilatildeo fisioloacutegica para a retirada dos reagentes As soluccedilotildees de lavagem ficaram
avermelhadas e as hemaacutecias com coloraccedilatildeo escura As amostras foram descartadas Dentre as
6 amostras que ainda puderam ser testadas para o TDA trecircs amostras negativaram sendo 1
sensibilizada com anti-D e 2 com anti-C (tabela 3)
Tabela 3 - Resultado apoacutes o segundo tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA
Tratamento com
glicina-aacutecidaEDTA
TDA Negativo TDA Positvo Hemoacutelise Total
Segundo tratamento 3 3 11 17
524 TESTAGEM DO ELUATO
Apoacutes o tratamento com a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA a soluccedilatildeo do eluato foi
testada para verificar a viabilidade dos anticorpos que foram dissociados ou eluiacutedos Dentre
as 50 amostras 41 apresentaram eluato positivo As nove amostras cujos eluatos foram
negativos haviam sido sensibilizadas com as seguintes especificidades de anticorpos anti-E 6
amostras (67) anti-S 2 amostras (40) e anti-D 1 amostra (8) (tabela 4) O eluato de
todas as amostras sensibilizadas com os anticorpos anti-C anti-c Anti-K e Anti-Dia foram
positivos Os eluatos positivos na triagem de anticorpos foram testados com paineacuteis de
identificaccedilatildeo para confirmar a especificidade e a viabilidade dos anticorpos (figuras 7 e 8)
34
525 EFEITO DA ELUICcedilAtildeO SOBRE OS ANTIacuteGENOS ERITROCITAacuteRIOS
Para verificar o efeito do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA e com a cloroquina
sobre a expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s foi realizada a fenotipagem das
amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes tratamento com ambas as teacutecnicas Foi avaliado
se o tratamento destruiu os antiacutegenos expressos antes do tratamento
Tabela 4- Resultado do Eluato das amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA
Anticorpos Eluato positvo Eluato negativo Total
Anti-D 11 1 12
Anti-C 10 0 10
Anti-E 3 6 9
Anti-c 8 0 8
Anti-S 5 2 7
Anti-K 3 0 3
Anti-Dia 1 0 1
Total 41 9 50
Figura 7 ndash Painel do eluato da amostra 21 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-C que foi
recuperado no eluato
Figura 8 ndash Painel do eluato da amostra 47 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-K que foi
recuperado no eluato
35
Dentre as 50 amostras 26 eram previamente fenotipadas para os antiacutegenos Fya Fy
b
Jka Jk
b S e s Dentre elas 20 alcanccedilaram TDA negativo apoacutes tratamento com a glicina-
aacutecidaEDTA e 20 negativaram apoacutes tratamento com cloroquina (tabela 5) Apoacutes ambas as
teacutecnicas os antiacutegenos originalmente expressos permaneceram positivos comprovando que natildeo
houve destruiccedilatildeo dos mesmos
Tabela 5 ndash Verificaccedilatildeo da interferecircncia do tratamento da hemaacutecias com cloroquina e glicina-
aacuteicdaEDTA sobre os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
AMOSTRAS
COM
FENOTIPAGEM
PREacuteVIA
TRATADAS COM
CLOROQUINA
TRATADAS COM
GLICINA
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
26
20
20
20
20
As amostras 24 47 e 50 eram positivas para o antiacutegeno K A cloroquina natildeo dissociou
o anticorpo em nenhuma das 3 amostras enquanto a glicina-aacutecidaEDTA foi efetiva nas
amostras 24 e 50 Foi testada a expressatildeo do antiacutegeno K nas amostras 24 e 50 apoacutes o
tratamento utilizando meacutetodo indireto em gel contendo AGH Apesar de natildeo ter sido avaliado
a intensidade de reaccedilatildeo de expressatildeo dos antiacutegenos podemos verificar na figura 9 que nas
duas amostras em que a teacutecnica foi efetiva e dissociou o anticorpo a expressatildeo do antiacutegeno K
continua presente mas a reatividade observada pode ser considerada 1+ sugerindo que houve
diminuiccedilatildeo da expressatildeo do antiacutegeno quando comparado com a expressatildeo observada em
hemaacutecia natildeo tratada
Os resultados individuais de cada amostra em ambas as teacutecnicas encontram-se
resumidas na tabela 6
526 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente onde foi constatada a presenccedila de autoanticorpo
a quente da classe IgG pelo TDA monoespeciacutefico (figura 10)O autoanticorpo tambeacutem
interferia na pesquisa e identificaccedilatildeo de anticorpos irregulares pois apresentava caracteriacutestica
de panaglutinina As hemaacutecias da paciente sensibilizadas ldquoin vivordquo foram tratadas com
cloroquina e com glicina-aacutecidaEDTA
36
Figura 9 ndash Fenotipagem das amostras 24 e 50 para antiacutegeno K apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
O teste positivo indica a presenccedila do antiacutegeno poreacutem a reatividade fraca (1+) sugere que houve enfraquecimento
de sua expressatildeo A direita a expressatildeo forte (4+) do antiacutegeno Kell em hemaacutecia controle natildeo tratada utilizada
como controle positivo
A cloroquina natildeo foi efetiva na retirada do anticorpo ligado as hemaacutecias ao contraacuterio
do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA que dissociou o anticorpo (figura 11)
A hemaacutecia tratada com glicina foi fenotipada para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
(figura 12) A fenotipagem para o sistema Rh (C c E e e) e Kell foi realizada em gel
especiacutefico monoclonal sem interferecircncia do TDA positivo (controle da reaccedilatildeo negativo)
O eluato resultante do tratamento com glicina-aacutecidaEDTA foi testada em gel com
hemaacutecias de painel de identificaccedilatildeo de anticorpos e apresentou resultado positivo com todas
as ceacutelulas (figura 13 e 14)
A amostra foi enviada para genotipagem e o resultado da genotipagem confirmou o
resultado da fenotipagem apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
527 TEMPO DE EXECUCcedilAtildeO DA TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
O tempo de reaccedilatildeo da glicina-aacutecidaEDTA eacute de 2 minutos Todas as amostras foram
tratadas obedecendo ao tempo descrito na literatura demonstrando que o mesmo eacute
reprodutiacutevel
37
Tabela 6- Resultados individuais por amostra
Amostra Especificidade
dos anticorpos
Intensidade do
TDA apoacutes
sensibilizaccedilatildeo
Tratamento
efetivo com
cloroquina
Tratamento
efetivo com
glicina
Eluato
poacutes
glicina
1 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 2 Dia 3+ Sim Sim 3+ 3 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 4 D 4+ Natildeo Sim 4+ 5 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 6 E 3+ Sim Sim Negativo 7 S 4+ Sim Sim 3+ 8 E 3+ Sim Sim 1+ 9 E 3+ Sim Sim 2+
10 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 11 D 4+ Natildeo Sim 4+ 12 D 4+ Natildeo Sim 4+ 13 S 3+ Sim Sim 3+ 14 S 3+ Sim Sim 3+ 15 D 3+ Natildeo Sim 3+ 16 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 17 E 3+ Sim Sim (+) 18 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 19 D 4+ Natildeo Natildeo 3+ 20 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 21 C 3+ Sim Sim 4+ 22 C 3+ Sim Sim 4+ 23 C 3+ Sim Sim 4+ 24 K 4+ Natildeo Sim 4+ 25 D 3+ Natildeo Natildeo Negativo 26 E 4+ Sim Sim Negativo 27 S 3+ Sim Sim 3+ 28 C 3+ Sim Natildeo 4+ 29 C 3+ Sim Sim 4+ 30 C 3+ Sim Sim 4+ 31 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 32 E 3+ Sim Sim Negativo 33 C 3+ Sim Natildeo 4+ 34 S 3+ Sim Sim Negativo 35 S 3+ Sim Sim Negativo 36 C 4+ Sim Natildeo 4+ 37 c 4+ Natildeo Natildeo 4+ 38 D 4+ Natildeo Sim 4+ 39 S 3+ Sim Sim 3+ 40 c 4+ Sim Natildeo 2+ 41 C 4+ Sim Natildeo 4+ 42 E 3+ Sim Sim Negativo 43 D 3+ Natildeo Sim 2+ 44 D 3+ Natildeo Sim 2+ 45 E 3+ Sim Sim Negativo 46 C 3+ Sim Sim 4+ 47 K 4+ Natildeo Natildeo 4+ 48 D 3+ Natildeo Sim 2+ 49 E 3+ Sim Sim Negativo 50 K 4+ Natildeo Sim 4+
TOTAL 50 28 33 41
38
Figura 10 ndash TDA monoespeciacutefico da amostra de paciente Hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo da classe
IgG
oacute Figura 11 ndash TDA apoacutes o tratamento com glicina-aacutecidaEDTA (esquerda) e cloroquina (direita) A glicina
negativou completamente o TDA enquanto a hemaacutecia tratada com cloroquina persistiu positiva (1+)
39
Figura 12 ndash Fenotipagem da amostra tratada com glicina-aacutecidaEDTA Fy(a+b+) Jk(a-b+) S+s+
Figura 13 ndash Painel em gel (LissAGH) do eluato apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de
intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
Figura 14 ndash ndash Painel ezimaacutetico (hemaacutecias tratadas com bromelina) do eluato em gel neutro apoacutes
tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
40
528 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Quanto a efetividade das teacutecnicas em negativar o TDA foi verificado que a glicina-
aacutecidaEDTA foi efetiva em 66 das amostras testadas no primeiro tratamento (3350
amostras) enquanto a cloroquina conseguiu negativar 56 (2850) Esses resultados natildeo
apresentam diferenccedila significativa (pgt005) demostrando que a teacutecnica da glicina-
aacutecidaEDTA natildeo eacute superior mas eacute tatildeo efetiva quanto a da cloroquina
Quando aliamos os resultados de ambas as teacutecnicas verificamos que em 76 (3850)
das amostras o TDA foi negativado Esse dado indica que ainda que uma teacutecnica natildeo seja
eficaz na remoccedilatildeo do anticorpo eacute uma boa alternativa tentar a segunda teacutecnica jaacute que a falha
em remover o anticorpo utilizando uma delas natildeo prevecirc necessariamente a falha com a outra
Quando se utiliza o teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla (graacutefico 2) para comparar a utilizaccedilatildeo das
duas teacutecnicas com o resultado de cada uma isolada (somente a cloroquina ou somente a
glicina) verificamos que os resultados apresentam diferenccedila significativa (plt005) (quadro 3)
TRATAMENTO EFETIVO COM TOTAL PORCENTAGEM
Glicina ou cloroquina 38 76
Glicina e cloroquina 23 46
Glicina apenas 10 20
Cloroquina apenas 5 10
Nenhuma das teacutecnicas 12 24
Quadro 3 - Resultados comparativos entre as teacutecnicas utilizadas
41
Graacutefico 2 - Teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla entre as teacutecnicas aplicadas A- Glicina e Cloroquina B-Cloroquina C-
Glicina ( plt005)
42
6 DISCUSSAtildeO
Os reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA podem ser adquiridos em
forma de kit comercial prontos para uso poreacutem natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil A preparaccedilatildeo
dos reagentes ldquoin houserdquo a partir de sais comerciais adquiridos se mostrou viaacutevel Os
reagentes glicina e o tampatildeo Tris armazenados de forma correta se mantiveram estaacuteveis por
um periacuteodo de 7 meses Somente o reagente EDTA precipitou mesmo armazenado em
condiccedilotildees adequadas sugerindo que o mesmo deve ser preparado em menor quantidade e
armazenado em aliacutequotas A soluccedilatildeo de cloroquina tambeacutem pode ser preparada ldquoin houserdquo e
pode ser armazenado por um mecircs A legislaccedilatildeo brasileira autoriza a utilizaccedilatildeo de reagentes
preparados a partir de sais comerciais como a cloroquina e a glicina-aacutecidaEDTA desde que
os sais tenham autorizaccedilatildeo da vigilacircncia sanitaacuteria para a comercializaccedilatildeo (BRASIL 2001)
A comparaccedilatildeo quanto a efetividade em dissociar anticorpos em amostras com TDA
positivos entre a teacutecnica da glicina e a teacutecnica da cloroquina mostrou que natildeo haacute diferenccedila
estatiacutestica entre elas e que ambas satildeo igualmente eficientes Se utilizadas conjuntamente haacute
maior possibilidade de elucidaccedilatildeo dos casos
Uma vantagem da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eacute que ela permite numa mesma
amostra eluir o anticorpo ligado aacute hemaacutecia assim como fenotipar a hemaacutecia tratada Devido a
sua dupla utilidade a teacutecnica eacute vantajosa principalmente em pacientes em que pouco volume
de amostra pode ser coletado como em casos de crianccedilas e receacutem-nascidos
A fenotipagem poacutes tratamento se mostrou viaacutevel jaacute que os antiacutegenos de maior
importacircncia natildeo sofreram alteraccedilotildees Nas 20 amostras que foram fenotipadas antes e apoacutes
tratamento para verificar a influecircncia dos reagentes na expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a
Jkb S e s natildeo houve destruiccedilatildeo dos mesmos por nenhuma das duas teacutecnicas
Para as amostras positivas para o antiacutegeno Kell (350) e sensibilizadas com o
respectivo anticorpo a teacutecnica da glicina foi efetiva em negativar o TDA em apenas duas
delas mas apoacutes o tratamento foi verificada uma fraca reatividade da reaccedilatildeo antiacutegeno-
anticorpo sugerindo que houve um enfraquecimento da expressatildeo do antiacutegeno conforme
esperado e descrito na literatura (BYRNE 1991 PALLAS WILER E MCGEE 1991
ROZIERS e SQUALI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012 e KATHARIA e
CHAUDHARY 2013) A accedilatildeo da glicina sobre o antigeno Kell natildeo representa impedimento
para seu uso uma vez que na impossibilidade de testar o antiacutegeno Kell o banco de sangue
consegue facilmente atender a solicitaccedilatildeo de transfusatildeo com unidades de hemaacutecias Kell
43
negativas jaacute que eacute um antiacutegeno de baixa prevalecircncia na populaccedilatildeo variando de 15 na
populaccedilatildeo africana a 9 nos europeus (DANIELS 2011)
A soluccedilatildeo resultante da dissociaccedilatildeo do anticorpo pela teacutecnica da glicina pode ainda ser
utilizada como eluato podendo substituir a teacutecnica de eluiccedilatildeo com reagentes comercias (kits
de eluiccedilatildeo aacutecida) que tem alto custo aproximadamente entre R$2000 a R$2500 por teste
Em 41 amostras (82) houve a dissociaccedilatildeo e recuperaccedilatildeo do anticorpo que estava
sensibilizando as hemaacutecias Em 9 amostras (18) os anticorpos foram eluiacutedos poreacutem
apresentaram reaccedilatildeo negativa quando testadas com hemaacutecias de triagem entre eles o anti-E
(6) anti-S (2) e Anti-D (1) Eacute possiacutevel que a correccedilatildeo pH do meio (WALKER 2011) natildeo
tenha sido adequada o que pode ter desfavorecido a reatividade do anticorpo
Para as amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA nas quais natildeo houve dissociaccedilatildeo do
anticorpo pelo primeiro tratamento (1750) o segundo tratamento natildeo se mostrou eficaz jaacute
que 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise O tempo de
armazenagem natildeo parece ter influenciado jaacute que todas as amostras foram testadas dentro de
48 horas apoacutes a coleta Outros fatores que natildeo foram verificados podem ter levado a
hemoacutelise Apesar da literatura (LOUIE JIENG e ZEROULIS 1986 e BYRNE 1991)
recomendar um segundo tratamento ele eacute pouco eficaz tendo negativado apenas 3 das 17
amostras testadas
A amostra de paciente que apresentou sensibilizaccedilatildeo ldquoin vivordquo mostrou melhor
efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA sobre a da cloroquina possibilitando
fenotipagem para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s que natildeo foram destruiacutedos apoacutes o
tratamento comprovado atraveacutes da genotipagem
A presenccedila de autoanticorpo a quente com presenccedila de hemoacutelise (AHAI) ou natildeo pode
mascarar a presenccedila de aloanticorpo interferindo na rotina soroloacutegica da fenotipagem que eacute
uma importante ferramenta para auxiliar na seleccedilatildeo de hemaacutecias para transfusatildeo (SHIREY et
al 2002) Esses pacientes frequentemente possuem aloanticorpos associados ao
autoanticorpo e a prevalecircncia de aloimunizaccedilatildeo entre eles varia entre 12 a 40 (LEGER e
GARRATY 1999 BRANCH e PETZ 1999) o que dificulta ainda mais a escolha do melhor
componente a ser transfundido aleacutem de aumentar a possibilidade reaccedilotildees hemoliacuteticas imunes
poacutes-transfusionais
Nesses casos as teacutecnicas de dissociaccedilatildeo de anticorpos satildeo importantes para tratar
amostras de pacientes e a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser usada como uma opccedilatildeo
pois se mostrou eficaz na dissociaccedilatildeo anticorpo ligado agraves hemaacutecias deixando livre a
superfiacutecie das mesmas permitindo a fenotipagem por antisoros IgG Paralelamente os
44
anticorpos eluiacutedos tambeacutem puderam ser estudados O mesmo natildeo ocorre com a cloroquina
que permite apenas a fenotipagem e tampouco com os kits de eluiccedilatildeo aacutecida disponiacuteveis no
mercado nacional que satildeo destinados a realizaccedilatildeo do eluato mas destroem as hemaacutecias
O tempo de tratamento na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA tambeacutem eacute uma vantagem
pois foi possiacutevel reproduzir no tempo determinado de 2 minutos enquanto a cloroquina
demora ateacute duas horas
Ainda que a aplicaccedilatildeo das teacutecnicas por biologia molecular estejam cada vez mais
presentes na rotina imuno-hematoloacutegica e possibilitam estabelecer o fenoacutetipo deduzido do
genoacutetipo elas natildeo estatildeo disponiacuteveis na maioria dos centros e sua realizaccedilatildeo exige algumas
horas A resoluccedilatildeo imediata do problema transfusional necessita dos resultados soroloacutegicos
pois com frequecircncia natildeo eacute possiacutevel aguardar o resultado do teste molecular Dessa forma
apesar da crescente importacircncia da genotipagem eritrocitaacuteria teacutecnicas soroloacutegicas aplicadas
corretamente e no momento propiacutecio satildeo de grande utilidade para resolver problemas imuno-
hematoloacutegicos como ocorre com a fenotipagem em pacientes com TDA positivo
45
7 CONCLUSAtildeO
A teacutecnica da glicina aacutecidaEDTA mostrou-se efetiva em remover os anticorpos que
sensibilizavam as hemaacutecias e pode ser utilizada com seguranccedila antes da fenotipagem
eritrocitaacuteria Por ser uma teacutecnica de raacutepida execuccedilatildeo eacute uma alternativa aplicaacutevel
principalmente em casos urgentes de pacientes que apresentam autoanticorpos
46
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9 ANEXOS
51
FUNDACcedilAtildeO HEMOCENTRO DE RIBEIRAtildeO PRETO
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE)
Tiacutetulo da pesquisa Aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina aacutecida-EDTA e avaliaccedilatildeo da
eficaacutecia no tratamento de hemaacutecias com teste direto da antiglobulina positivo
Pesquisadora responsaacutevel Ceacutelia Kazue Abiko
Orientador Prof Dimas Tadeu Covas
Co-orientadora Dra Flaacutevia Leite Souza Santos
Objetivo da pesquisa Vocecirc estaacute sendo convidado a participar de uma pesquisa que tem
como objetivo padronizar uma nova teacutecnica para auxiliar na tipagem sanguiacutenea de pacientes
A tipagem sanguiacutenea pode sofrer interferecircncia da presenccedila de anticorpos ligados aos gloacutebulos
vermelhos do sangue Nessas situaccedilotildees eacute difiacutecil selecionar o melhor sangue para o paciente e
eacute preciso a utilizaccedilatildeo de teacutecnicas adicionais para remover essas interferecircncias
Esta pesquisa tem como objetivo estudar outra teacutecnica para remover esses anticorpos e
comparaacute-la com a teacutecnica atualmente utilizada Para isso precisamos de amostras de pacientes
e doadores voluntaacuterios
Se vocecirc eacute um doador eacute necessaacuterio que vocecirc autorize a coleta de 5 ml (1 tubo) a mais
de seu sangue
Se vocecirc eacute um paciente natildeo haveraacute necessidade de nova amostra pois utilizaremos as
amostras jaacute coletadas para os testes preacute-transfusionais e os resultados encontrados nesta
pesquisa natildeo iratildeo interferir na escolha da (s) bolsa (s) de sangue que vocecirc possa vir a receber
Se vocecirc concordar em participar leia com atenccedilatildeo o texto abaixo e assine as duas vias
rubricando todas as paacuteginas deste termo de consentimento Uma via original assinada e
rubricada por vocecirc e pela pesquisadora ficaraacute com vocecirc
As suas informaccedilotildees seratildeo mantidas em sigilo pela pesquisadora e natildeo haveraacute
armazenamento de material para pesquisas posteriores Os seus dados seratildeo usados apenas
neste estudo e quando o trabalho for publicado seu nome e qualquer outra informaccedilatildeo que
possam identificaacute-lo natildeo seratildeo revelados
Eacute pouco provaacutevel que o que noacutes aprendermos com este estudo tenha um benefiacutecio
direto para vocecirc assim como natildeo poderemos dar nada em troca pela sua participaccedilatildeo na
pesquisa
Nosso objetivo com esta pesquisa eacute que os resultados poderatildeo ser uacuteteis para o
tratamento de pacientes no futuro Os riscos da participaccedilatildeo satildeo miacutenimos Se vocecirc eacute um
doador de sangue a amostra seraacute coletada no momento da doaccedilatildeo natildeo exigindo punccedilatildeo
venosa adicional
52
Eacute seu direito ter acesso aos resultados dos testes da pesquisa Esses resultados natildeo
seratildeo fornecidos automaticamente a vocecirc mas caso vocecirc se interesse em saber o resultado ou
tiver alguma duacutevida sobre a sua participaccedilatildeo neste estudo deveraacute entrar em contato com Ceacutelia
Kazue Abiko pelo telefone (18) 99718-3551
Vocecirc tem total liberdade de optar por natildeo participar da pesquisa Caso aceite
participar poderaacute desistir a qualquer momento ou retirar seu consentimento mesmo apoacutes ter
coletado o sangue Para cancelar sua participaccedilatildeo basta avisar a pesquisadora e os seus dados
seratildeo retirados do projeto
Qualquer duacutevida eacutetica sobre a pesquisa poderaacute entrar em contato com o Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa do Hospital das Cliacutenicas e da Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto
(CAMPUS UNIVERSITAacuteRIO bairro Monte Alegre CEP 14048-900 Ribeiratildeo Preto-SP
Telefone (16) 3602-2228 FAX (16) 3633-1144 e-mail cephcrpuspbr)
Consentimento de participaccedilatildeo
A Consentimento do participante
Li as informaccedilotildees acima sobre o estudo e recebi explicaccedilotildees sobre a participaccedilatildeo no estudo
Portanto dou o meu consentimento para participar do estudo
___________________________________________________________________________
Nome completo
___________________________________________________________________________
Assinatura
___________
Data
__________________________________________________________________________________
Nome completo da pesquisadora
___________________________________________________________________________
Assinatura
_____________
Data
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ABO
AHAI
Bg
c
C
C
C3
C3b
C3d
D
DHFRN
DNA
DTT
E
e
EDTA
Fc
Fya
Fyb
HCl
IgA
IgD
IgE
IgM
Mm
NaCl
PA
PAI
PBS
PCR
PEG
pH
Rh
rpm
S
s
SIDA
SBS
TCLE
TDA
TIA
TRIS
ZZAP
microL
Sistema Sanguiacuteneo ABO
Anemia Hemoliacutetica Autoimune
Antiacutegeno Bg
Antiacutegeno c
Celsius
Antiacutegeno C
Complemento
Fraccedilatildeo do complemento
Fraccedilatildeo do complemento
Antiacutegeno D
Doenccedila Hemoliacutetica do Feto e do Receacutem-nascido
Aacutecido desoxirribonucleico
Dithiothreitol
Antiacutegeno E
Antiacutegeno e
Aacutecido Etileno Diamino Tetraceacutetico
Porccedilatildeo do anticorpo
Antiacutegeno Duffy a
Antiacutegeno Duffy b
Aacutecido cloriacutedrico
Imunoglobulina A
Imunoglobulina D
Imunoglobulina E
Imunoglobulina M
Miliacutemetros
Cloreto de soacutedio
Puro para anaacutelise
Pesquisa de anticorpos irregulares
Tampatildeo fosfato salino
Reaccedilao em cadeia de polimerase
Polietilenoglicol
Potencial hidrogeniocircnico
Sistema sanguiacuteneo Rh
Rotaccedilotildees por minuto
Antiacutegeno S
Antiacutegeno s
Siacutendrome da Imunodeficiecircncia adquirida
Sistema de banco de sangue
Termo de consentimento livre e esclarecido
Teste direto da antiglobulina
Teste indireto da antiglobulina
Hidrometil aminometano
Sulphydryl-Proteolytic Enzyme
Microlitros
RESUMO
Os testes preacute-transfusionais satildeo o conjunto de teacutecnicas imuno-hematoloacutegicas aplicadas nas
amostras do receptor e do doador com a finalidade de fornecer uma unidade de hemaacutecias
compatiacutevel e segura para a transfusatildeo Aleacutem da fenotipagem ABO e Rh obrigatoacuteria nos testes
preacute-transfusionais a determinaccedilatildeo do perfil antigecircnico de outros antiacutegenos eritrocitaacuterios de
importacircncia cliacutenica melhora a seguranccedila transfusional especialmente para pacientes
previamente aloimunizados ou candidatos agrave transfusatildeo crocircnica Para tais pacientes conhecer o
fenoacutetipo eritrocitaacuterio permite a seleccedilatildeo de concentrados de hemaacutecias com o mesmo fenoacutetipo
o que previne reaccedilotildees transfusionais hemoliacuteticas assim como nova aloimunizaccedilatildeo
Indiviacuteduos que apresentam as hemaacutecias sensibilizadas ldquoin vivordquo por anticorpos anti-
eritrocitaacuterios como ocorre na anemia hemoliacutetica autoimune (AHAI) teratildeo o teste direto da
antiglobulina (TDA) positivo dificultando a realizaccedilatildeo da fenotipagem O TDA positivo
provoca resultados falsos positivos especialmente quando satildeo utilizados para a fenotipagem
soros comerciais da classe IgG que exigem a fase de antiglobulina humana ou teste indireto
da antiglobulina (TIA) para leitura Em 1982 Edwards Moulds e Judd propuseram a
utilizaccedilatildeo da teacutecnica da cloroquina para dissociar os complexos de antiacutegeno-anticorpo
preservando a membrana eritrocitaacuteria e permitindo a fenotipagem Atualmente eacute a teacutecnica
mais utilizada nos centros brasileiros A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA foi primeiramente
descrita por Louie Jieng e Zeroulis em 1986 poreacutem eacute pouco utilizada por natildeo haver os
reagentes prontos comercialmente no mercado brasileiro O presente estudo avaliou a teacutecnica
da glicina-aacutecida-EDTA com reagentes preparados ldquoin houserdquo em paralelo agrave teacutecnica da
cloroquina que eacute atualmente a teacutecnica aplicada no Hemocentro de Ribeiratildeo Preto Para isso
amostras de hemaacutecias de doadores (n=50) com fenoacutetipo conhecido foram sensibilizadas com
anticorpos humanos de especificidade conhecida e ambas as teacutecnicas foram aplicadas Foi
verificado ainda o efeito da teacutecnica sobre a expressatildeo dos antiacutegenos eritrocitaacuterios (Fya Fy
b
Jka Jk
b S e s) atraveacutes da fenotipagem das amostras que tiveram o TDA negativado A
viabiliadade dos anticorpos presentes no eluato recuperado apoacutes tratamento com a glicina-
aacutecidaEDTA tambeacutem foi testada A glicina-aacutecidaEDTA foi efetiva em negativar o TDA em
33 amostras (66) comparaacutevel com a cloroquina que negativou 28 amostras (56) O eluato
apresentou-se viaacutevel no tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA e natildeo foi constatada destruiccedilatildeo
dos antiacutegenos eritrocitaacuterios apoacutes o tratamento Concluiacutemos que a teacutecnica da glicina-
aacutecidaEDTA pode ser utilizada como uma opccedilatildeo no tratamento de hemaacutecias com TDA
positivo com a vantagem de seu tempo de execuccedilatildeo ser inferior ao da cloroquina (2minutos x
30 a 120 minutos) o que lhe torna uacutetil em situaccedilotildees de maior urgecircncia Quando ambas as
teacutecnicas satildeo utilizadas em hemaacutecias diferentes de uma mesma amostra a efetividade estaacute
significativamente aumentada (plt005)
Palavras chave Glicina-aacutecidaEDTA Teste direto da antiglobulina AHAI fenotipagem
ABSTRACT
The pre-transfusion tests are the group of immunohematology techniques applied in the
receptor and donor samples in order to provide a unit of red blood cells compatible and safe
for transfusion In addition to the obligatory ABO and Rh phenotyping in the pre-transfusion
tests the determination of the antigenic profile of other red cells antigens of clinical
importance improves transfusion safety especially for patients previously alloimmunized or
candidates for chronic transfusion For such patients knowing the phenotype allows the
selection of red blood cell concentrates with the same phenotype which prevents hemolytic
transfusion reactions as well as new alloimmunization Individuals who have antibody-coated
red blood cells sensitized in vivo such as in autoimmune hemolytic anemia (AHAI) will
have a direct antiglobulin test (DAT) positive making it difficult to perform phenotyping
Positive DAT causes false positive results especially when commercially available IgG
serums which require the human antiglobulin phase or indirect antiglobulin test (IAT) for
reading are used for phenotyping In 1982 Edwards Molds and Judd proposed the use of the
chloroquine technique to dissociate antigen-antibody complexes by preserving the erythrocyte
membrane and allowing phenotyping It is currently the most used technique in Brazilian
centers The EDTAglycine-acid technique was first described by Louie Jieng and Zeroulis in
1986 but it is little used because commercially available reagents are not available in the
Brazilian market The present study evaluated the EDTAglycine-acid technique with reagents
prepared in house in parallel to the chloroquine technique which is currently the technique
applied at the Hemocentro de Ribeiratildeo Preto For this donor red cells samples (n = 50) with
known phenotype were sensitized with human antibodies of known specificity and both
techniques were applied The effect of the technique on the expression of erythrocyte antigens
(Fya Fy
b Jk
a Jk
b S and s) was also verified by the phenotyping of the samples that had
negative DAT The viability of the antibodies present in the recovered eluate after treatment
with EDTAglycine-acid A was also tested EDTAglycine-acid was effective in negatively
affecting DAT in 33 samples (66) comparable to chloroquine that negatived 28 samples
(56) The eluate was viable in treatment with EDTAglycine-acid and no destruction of
erythrocyte antigens after treatment We conclude that the EDTA glycine-acid technique can
be used as an option in the treatment of red cells with TDA positive with the advantage that
its execution time is inferior to that of chloroquine (2 minutes x 30 to 120 minutes) which
makes it useful in emergency situations When both techniques are used in different
erythrocytes of the same sample the effectiveness is significantly increased (p lt005)
Key words EDTAglycine-acid direct antiglobulin test AIHA phenotyping
1 INTRODUCcedilAtildeO
A transfusatildeo de hemaacutecias eacute um recurso terapecircutico muito importante e eficaz e tem se
mostrado como um grande aliado no tratamento de diversas patologias auxiliando na
melhoria da sobrevida e qualidade de vida de diversos pacientes quando indicada de forma
correta Eacute provavelmente a modalidade de terapia mais utilizada no mundo sendo
considerada a forma mais antiga de terapia celular A transfusatildeo de hemaacutecias em pacientes
com anemia grave ou sangramento agudo reestabelece o niacutevel de hemoglobina moleacutecula
responsaacutevel pelo transporte de oxigecircnio para os tecidos melhorando a isquemia tecidual
(BARJAS-CASTRO 2013 ZAGO 2014)
A transfusatildeo de componentes celulares como o concentrado de hemaacutecias deve ser
bem avaliada quanto aos riscos e benefiacutecios Os testes preacute-transfusionais satildeo parte obrigatoacuteria
do processo transfusional e tecircm como funccedilatildeo assegurar que o melhor hemocomponente seja
selecionado para o paciente reduzindo assim a chance de transfusotildees incompatiacuteveis e reaccedilotildees
transfusionais (BARJAS-CASTRO 2013)
11TESTES PREacute-TRANSFUSIONAIS
Os testes preacute-transfusionais tecircm a finalidade de evitar a ocorrecircncia de reaccedilotildees
hemoliacuteticas no receptor decorrentes da transfusatildeo de hemaacutecias incompatiacuteveis do doador
(DOWNES e SHULMAN 2011) Tem como propoacutesito selecionar hemaacutecias que apoacutes
transfusatildeo deveratildeo ter sobrevida normal ou mais proacutexima do normal (MELO 2007)
Os testes preacute-transfusionais que consistem no conjunto de teacutecnicas
imunohematoloacutegicas aplicadas agraves amostras do receptor e doador devem ser realizados antes
de toda transfusatildeo A aplicaccedilatildeo desses testes tem como finalidade fornecer uma unidade de
hemaacutecias compatiacutevel e elevar a seguranccedila da transfusatildeo Os testes preacute-transfusionais aliados
a utilizaccedilatildeo de novas tecnologias tem historicamente evitado reaccedilotildees transfusionais
hemoliacuteticas garantindo a seguranccedila transfusional em cerca de 95 dos pacientes que recebem
transfusatildeo Eacute imprescindiacutevel poreacutem a execuccedilatildeo correta das teacutecnicas envolvidas nos testes preacute-
transfusionais e ainda garantir a identificaccedilatildeo correta do receptor e das amostras de sangue e
das unidades de hemaacutecias (CASTILHO 2000 MELO 2007 BARJAS-CASTRO 2013)
2
Todos os testes que compotildeem a rotina preacute-transfusional usam meacutetodos soroloacutegicos
que envolvem a reaccedilatildeo antiacutegeno x anticorpo Ao testar a presenccedila de um antiacutegeno na
superfiacutecie da hemaacutecia eacute necessaacuterio dispor de um soro com especificidade conhecida para
aquele antiacutegeno Por outro lado testar a presenccedila de um determinado anticorpo no soro ou no
plasma exige o uso de hemaacutecias com perfil antigecircnico conhecido Os testes preacute-transfusionais
incluem tipagem ABO (direta e reversa) tipagem Rh pesquisa de anticorpos irregulares no
sangue do receptor retipagem ABO e Rh do hemocomponente e prova de compatibilidade
entre as hemaacutecias do doador e soro ou plasma do receptor em caso de transfusatildeo de hemaacutecias
ou hemocomponentes que contenham mais de 2 mL de volume eritrocitaacuterio como o
concentrado de granuloacutecitos (BRASIL 2016 GANZELLA 2014 SANTOS 2014)
Aleacutem dos testes regularmente realizados a determinaccedilatildeo do fenoacutetipo para outros
antiacutegenos eritrocitaacuterios do doador e do receptor pode ser indicada A fenotipagem eritrocitaacuteria
determina o perfil antigecircnico para outros antiacutegenos de importacircncia cliacutenica aleacutem do sistema
ABO e do antiacutegeno RhD Ela pode auxiliar a confirmaccedilatildeo de uma especificidade de anticorpo
encontrada no soro do paciente uma vez que espera-se que a sua hemaacutecia natildeo expresse o
antiacutegeno correspondente e simultaneamente eacute utilizada para selecionar um concentrado de
hemaacutecias negativo para o respectivo antiacutegeno evitando reaccedilotildees hemoliacuteticas transfusionais A
fenotipagem de candidatos a transfusotildees crocircnicas tambeacutem eacute recomendada pois esse grupo de
pacientes deve se beneficiar com a transfusatildeo profilaacutetica de unidades de hemaacutecias com
mesmo fenoacutetipo evitando assim a aloimunizaccedilatildeo assim como reaccedilotildees hemoliacuteticas provocadas
por anticorpos previamente existentes e em baixo tiacutetulo natildeo identificados pela triagem de
anticorpos (CASTILHO JUNIOR e REID 2015 DOWNES e SHULMAN 2011)
111 TIPAGEM ABORh
O sistema ABO (ISBT001) foi o primeiro sistema de grupo sanguiacuteneo a ser
descoberto Ele foi descrito em 1900 por Karl Landsteiner e eacute considerado o sistema de maior
importacircncia na praacutetica transfusional Ele eacute composto por quatro antiacutegenos A1 (ABO1) B
(ABO2) AB (ABO3) e A1 (ABO4) e eacute caracterizado pela presenccedila dos anticorpos naturais
ou seja anticorpos que surgem sem a exposiccedilatildeo preacutevia aos antiacutegenos atraveacutes de transfusatildeo ou
gestaccedilatildeo Os anticorpos ABO satildeo predominantemente da classe IgM satildeo capazes de fixar o
complemento e de provocar hemoacutelise grave intravascular caso ocorra transfusatildeo ABO
incompatiacutevel Por apresentar essa caracteriacutestica peculiar a tipagem do sistema ABO eacute
composta de duas etapas a prova direta e a prova reversa Na prova direta eacute realizada a
pesquisa dos antiacutegenos na superfiacutecie das hemaacutecias que satildeo testadas com soros comerciais
3
Anti-A e Anti-B A prova reversa por sua vez pesquisa a presenccedila de anticorpos ABO ao
testar o soro ou plasma do pacientedoador com hemaacutecias A1 e B Ambas as provas satildeo
obrigatoacuterias e devem ser concordantes para interpretaccedilatildeo do fenoacutetipo ABO (COOLING
2011 SANTOS 2014)
O sistema Rh (ISBT004) eacute o maior e mais complexo sistema de grupos sanguiacuteneos
compreendendo atualmente 54 antiacutegenos (ISBT 2016) Satildeo cinco os principais antiacutegenos do
sistema Rh D (RH1) C (RH2) E (RH3) c (RH4) e e (RH5) Esses antiacutegenos possuem alta
capacidade imunogecircnica e seus respectivos anticorpos estatildeo envolvidos na doenccedila hemoliacutetica
perinatal e em reaccedilotildees transfusionais hemoliacuteticas Os autoanticorpos quentes como ocorre na
anemia hemoliacutetica quente satildeo representados em grande parte por anticorpos contra antiacutegenos
puacuteblicos do sistema Rh (CASTILHO 2007 CHOU e WESTHOFF 2011 BARJAS-
CASTRO 2013) A tipagem RhD pesquisa o antiacutegeno D na membrana eritrocitaacuteria ao testar a
hemaacutecia com antissoros comerciais Atualmente a maior parte dos soros Anti-D
comercializados satildeo monoclonais
112 ANTICORPOS ANTI-ERITROCITAacuteRIOS
Anticorpos satildeo proteiacutenas presentes no plasma tambeacutem denominadas imunoglobulinas
Satildeo produzidas pelo sistema imune em resposta a um determinado antiacutegeno Podem ser
classificadas de acordo com suas caracteriacutesticas e propriedades em cinco classes de
imunoglobulinas IgG IgM IgA IgE e IgD (BARJAS-CASTRO 2013)
A ligaccedilatildeo entre o antiacutegeno e o anticorpo envolvem ligaccedilotildees natildeo covalentes que satildeo
reversiacuteveis Vaacuterios tipos de interaccedilotildees natildeo covalentes podem contribuir para a ligaccedilatildeo do
antiacutegeno pelo anticorpo incluindo forccedilas eletrostaacuteticas pontes de hidrogecircnio forccedilas de Van
der Walls e interaccedilotildees hidrofoacutebicas (ABBAS LICHTMAN e PILLAI 2008)
As interaccedilotildees antiacutegeno-anticorpo satildeo constituiacutedas por ligaccedilotildees dinacircmicas que sofrem
interferecircncia de alteraccedilotildees fiacutesico-quiacutemicas no meio como mudanccedilas na temperatura na forccedila
eletrostaacutetica na concentraccedilatildeo do antiacutegeno e do anticorpo e no pH O melhor pH para a reaccedilatildeo
eacute em torno de 70 no entanto raros anticorpos podem exigir acidificaccedilatildeo do meio para serem
identificados (SANTOS 2014)
Em imunohematologia satildeo pesquisados os anticorpos que reconhecem os antiacutegenos
eritrocitaacuterios de grupo sanguiacuteneo ldquoin vivordquo esses anticorpos dependendo de seu significado
cliacutenico satildeo capazes de reconhecer seus respectivos antiacutegenos sobre a hemaacutecia podendo levar
a sua destruiccedilatildeo por dois mecanismos fagocitose por macroacutefagos no sistema
4
reticuloendotelial ou por ativaccedilatildeo do sistema complemento com a formaccedilatildeo do complexo de
ataque a membrana e hemoacutelise intravascular As duas classes de anticorpos de maior
importacircncia em imunohematologia satildeo as imunoglobulinas IgG e a IgM (SANTOS 2014)
Devido a sua estrutura pentameacuterica os anticorpos da classe IgM se ligam aos
antiacutegenos localizados na superfiacutecie da membrana de hemaacutecias proacuteximas e promovem
aglutinaccedilatildeo das mesmas em meio salino ldquoin vitrordquo Anticorpos da classe IgG por sua vez
satildeo denominados ldquonatildeo aglutinantesrdquo ou ldquoincompletosrdquo pois sua estrutura de monocircmero eacute
pequena o que desfavorece a aglutinaccedilatildeo direta uma vez que uma mesma moleacutecula de IgG
natildeo alcanccedila antiacutegenos alvos em duas hemaacutecias proacuteximas Os anticorpos IgM aleacutem de terem
um tamanho maior apresentam 750 vezes maior eficiecircncia de aglutinaccedilatildeo que os anticorpos
IgG permitindo maior facilidade nas ligaccedilotildees entre as hemaacutecias (CARRUCIO e WISE 2012
GREEN e KLOSTERMANN 2012)
Nos testes ldquoin vitrordquo satildeo simulados reaccedilotildees que poderiam ocorrer ldquoin vivordquo causando
reaccedilotildees indesejaacuteveis A fase de sensibilizaccedilatildeo em que o anticorpo se liga ao antiacutegeno
correspondente natildeo eacute identificada macroscopicamente poreacutem uma vez que o anticorpo
aproxima as hemaacutecias e vence a forccedila eletrostaacutetica que naturalmente as repele chamada de
potencial zeta ocorre a aglutinaccedilatildeo Dependendo das caracteriacutesticas do anticorpo e de sua
capacidade de fixar complemento pode ocorrer tambeacutem a hemoacutelise (SANTOS 2014)
113 PESQUISA E IDENTIFICACcedilAtildeO DE ANTICORPOS IRREGULARES
A pesquisa de anticorpos irregulares eacute teste obrigatoacuterio nos testes preacute-transfusionais e
tem a finalidade de detectar anticorpos ldquoin vitrordquo que possam causar reaccedilatildeo ldquoin vivordquo
Dependendo da populaccedilatildeo estudada (pacientes x doadores) e ainda da sensibilidade do
teste a frequecircncia de anticorpos irregulares pode variar de 03 a 38 A imunizaccedilatildeo pode
ocorrer por transfusatildeo gestaccedilatildeo transplante ou injeccedilatildeo de material imunogecircnico (WALKER
2011)
Os anticorpos irregulares podem ser classificados como aloanticorpos que satildeo
voltados contra antiacutegenos ausentes na hemaacutecia autoacuteloga ou como autoanticorpos os quais
reconhecem antiacutegenos eritrocitaacuterios proacuteprios Os autoanticorpos antieritrocitaacuterios surgem em
decorrecircncia da desregulaccedilatildeo da autotoleracircncia imune relacionada agrave condiccedilotildees diversas como
doenccedilas hematoloacutegicas doenccedilas inflamatoacuterias autoimunes neoplasias infecccedilotildees e uso de
medicaccedilotildees A presenccedila do autoanticorpo associado a um quadro de anemia hemoliacutetica
caracteriza a anemia hemoliacutetica autoimune (AHAI) seja ela primaacuteria ou secundaacuteria agrave outra
5
patologia Ateacute 12 a 40 dos pacientes com autoanticorpos quentes podem apresentar
aloanticorpos de significado cliacutenico mascarados pelos autoanticorpos (SHIREY et al 2002)
Eacute importante detectar a presenccedila de anticorpos no plasmasoro de um receptor de
transfusatildeo para garantir que seja transfundido sangue compatiacutevel Quando a pesquisa de
anticorpo irregular resultar positiva para um ou mais anticorpos de relevacircncia clinica eacute
necessaacuterio confirmar a ausecircncia do respectivo antiacutegeno na hemaacutecia do receptor assim como
selecionar para transfusatildeo concentrados de hemaacutecias tambeacutem negativos para aqueles
antiacutegenos evitando assim reaccedilotildees transfusionais (WALKER 2011)
A detecccedilatildeo de um anticorpo irregular eacute inicialmente realizada pela triagem de
anticorpos na qual o soroplasma do receptor eacute testado com 2 a 3 hemaacutecias do tipo ldquoOrdquo O
conjunto de fenoacutetipos dessas hemaacutecias deve contemplar os antiacutegenos de maior importacircncia
cliacutenica Como os anticorpos irregulares de maior interesse cliacutenico satildeo na maior parte das
vezes imunes portanto da classe IgG eacute obrigatoacuteria a fase de antiglobulina (AGH) do teste
ou teste indireto da antiglobulina (TIA) uma vez que esses anticorpos satildeo incompletos
(CASTILHO JUNIOR e REID 2015) O teste de triagem estando positivo deve-se fazer a
identificaccedilatildeo da especificidade do anticorpo utilizando um painel com maior nuacutemero de
hemaacutecias fenotipadas
114 PROVA DE COMPATIBILIDADE
A prova de compatibilidade eacute um teste obrigatoacuterio em caso de transfusatildeo de
componentes eritrocitaacuterios Tambeacutem chamada de prova de compatibilidade maior deve ser
realizada antes da administraccedilatildeo de sangue total ou concentrado de hemaacutecias utilizando-se
hemaacutecias obtidas do tubo coletor da bolsa a ser transfundida e o soro ou plasma do receptor
(BRASIL 2016)
Eacute definido como o procedimento para excluir a incompatibilidade entre o doador e o
receptor Tem o objetivo de detectar anticorpos que podem natildeo ter sido encontrados na
pesquisa de anticorpos devido a ausecircncia ou pouca expressatildeo de antiacutegenos no painel de
hemaacutecias aleacutem da possibilidade de terem ocorrido erros teacutecnicos ou notacionais durante a
realizaccedilatildeo da pesquisa (MELO 2007)
6
115 FENOTIPAGEM PARA OUTROS SISTEMAS
Aleacutem da pesquisa de ABORh que eacute realizado rotineiramente a fenotipagem para
outros sistemas tambeacutem denominado ldquofenotipagem estendidardquo determina a presenccedila ou
ausecircncia de antiacutegenos considerados de importacircncia cliacutenica A fenotipagem natildeo eacute obrigatoacuteria
nos testes preacute-transfusionais poreacutem a legislaccedilatildeo atual recomenda a realizaccedilatildeo da fenotipagem
eritrocitaacuteria dos antiacutegenos C (RH2) E (RH3) c (RH4) e (RH5) K (KELL1) Fya (FY1) Fy
b
(FY2) Jka
(JK1) Jkb (JK2) S (MNS3) e s (MNS4) para pacientes aloimunizados e pacientes
com indicaccedilatildeo de transfusatildeo crocircnica (BRASIL 2016)
A seleccedilatildeo de concentrados de hemaacutecias com o mesmo fenoacutetipo do receptor para
transfusatildeo pode evitar reaccedilotildees transfusionais hemoliacuteticas no paciente previamente
aloimunizado tambeacutem previne a sensibilizaccedilatildeo por outros antiacutegenos o que normalmente
torna as transfusotildees seguintes ainda mais complicadas A fenotipagem do paciente tambeacutem
auxilia na identificaccedilatildeo dos anticorpos pois espera-se que nas hemaacutecias do paciente o
antiacutegeno seja negativo para o anticorpo encontrado servindo de guia para teste de exclusatildeo de
anticorpos (SANTOS 2014 WALKER 2011)
A incidecircncia de aloanticorpos aumenta com o nuacutemero de transfusotildees no entanto a
implantaccedilatildeo de rotina de fenotipagem com transfusatildeo profilaacutetica de hemaacutecias com fenoacutetipo
compatiacutevel para pacientes candidatos agrave politransfusatildeo como os portadores de doenccedila
falciforme talassemia anemia aplaacutestica doenccedilas linfo e mieloproliferativas renais crocircnicos e
anemias refrataacuterias pode contribuir para o baixo iacutendice de sensibilizaccedilatildeo nessas populaccedilotildees
(FLUIT KUNST e DRENTHE-SCHONK 1999 MARTINS et al 2008 e VICHINSKY et
al 2001) Outro grupo de pacientes que se beneficia com a transfusatildeo de mesmo fenoacutetipo satildeo
os pacientes com AHAI uma vez que o autoanticorpo pode mascarar a presenccedila de um
aloanticorpo de significado cliacutenico em ateacute 40 dos casos Mesmo com as teacutecnicas utilizadas
ldquoin vitrordquo para remover a interferecircncia do autoanticorpo no soro um aloanticorpo pode natildeo
ser identificado e dessa forma transfundir o mesmo fenoacutetipo do paciente evitaria reaccedilatildeo
hemoliacutetica pelos anticorpos voltados contra antiacutegenos de maior importacircncia cliacutenica e de
frequecircncia intermediaacuteria Aleacutem disso os pacientes com AHAI satildeo fortes respondedores e a
transfusatildeo profilaacutetica do mesmo fenoacutetipo previne a aloimunizaccedilatildeo (SHIREY et al 2002)
Aleacutem de fenotipar o receptor eacute importante tambeacutem que os bancos de sangue tenham
rotinas de fenotipagem de doadores para atender as necessidade dos pacientes aloimunizados
ou em esquema de transfusatildeo crocircnica (PINTO BRAGA e SANTOS 2011)
7
Rotineiramente eacute inviaacutevel estabelecer o fenoacutetipo eritrocitaacuterio completo de um
indiviacuteduo pela grande diversidade de sistemas sanguiacuteneos descritos Ate junho de 2015 jaacute
haviam sido classificados 308 antiacutegenos atribuiacutedos a 36 sistemas definidos pela Sociedade
Internacional de Transfusatildeo de Sangue (ISBT) (CASTILHO JUNIOR e REID 2015)
Portanto o paciente eacute normalmente fenotipado para os antiacutegenos de maior importacircncia
clinica
Alguns fatores podem limitar a realizaccedilatildeo da fenotipagem eritrocitaacuteria Um dos fatores
eacute a transfusatildeo alogecircnica realizada haacute menos de 90 dias Neste caso podem ocorrer resultados
falso positivos para determinados antiacutegenos devido agrave presenccedila de hemaacutecias do doador
(LAINE et al 2000)
Outro fator eacute a presenccedila de anticorpo sensibilizando a hemaacutecia do paciente e
provocando positividade do teste direto da antiglobulina humana (TDA) Os soros
normalmente utilizados para fenotipagem especialmente para os antiacutegenos Fya
(FY1) Fyb
(FY2) Jka
(JK1) Jkb
(JK2) S (MNS3) e s (MNS4) necessitam da fase de antiglobulina
humana (AGH) para que ocorra aglutinacatildeo Amostras que apresentam o TDA positivo
aglutinam apoacutes reaccedilatildeo com a AGH natildeo pela real presenccedila do antiacutegeno em sua superfiacutecie mas
pela interaccedilatildeo da AGH com o anticorpo que estaacute sensibilizando o eritroacutecito A interferecircncia
do TDA positivo pode ser anulada atraveacutes de algumas teacutecnicas capazes de dissociar o
anticorpo como por exemplo o tratamento da hemaacutecia sensibilizada com cloroquina ou com
glicina-aacutecida-EDTA (BRANCH e PETZ 1999 SHIREY et al 2002 e LEGER 2011)
12 METODOLOGIAS APLICADOS Agrave ROTINA IMUNO-HEMATOLOacuteGICA
Todos os testes que compotildeem a rotina preacute-transfusional usam meacutetodos soroloacutegicos
que envolvem a reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo e tem como objetivo determinar o perfil antigecircnico
eritrocitaacuterio do receptor e do doador assim como identificar em seu soro a presenccedila de
anticorpos contra antiacutegenos eritrocitaacuterios que possam comprometer a sobrevida das hemaacutecias
transfundidas Para testar o antiacutegeno na superfiacutecie da hemaacutecia eacute necessaacuterio dispor de um
antissoro com especificidade conhecida para aquele antiacutegeno Por outro lado para testar a
presenccedila de um determinado anticorpo no soro ou plasma do receptor eacute necessaacuterio o uso de
hemaacutecias com perfil antigecircnico conhecido (SANTOS 2014)
Diversas metodologias satildeo aplicadas nos laboratoacuterios de imunohematologia Cada
serviccedilo de hemoterapia faz a escolha do meacutetodo que seraacute aplicado de acordo com o perfil do
laboratoacuterio com o volume de exames diaacuterios e tambeacutem com o custo envolvido Todas essas
8
teacutecnicas tecircm como objetivo comum demonstrar a reaccedilatildeo entre antiacutegeno e anticorpo no
entanto elas se baseiam em diferentes princiacutepios Muitas metodologias satildeo atualmente
aplicadas agrave imunohematologia entre elas o sistema de fase soacutelida a tecnologia de hemaacutecias
magnetizadas a biologia molecular e ateacute mesmo a citometria de fluxo no entanto os meacutetodos
mais tradicionais satildeo aqueles baseados no princiacutepio de hemaglutinaccedilatildeo
121 MEacuteTODOS DE FASE FLUacuteIDA
Os meacutetodos de fase fluiacuteda satildeo testes baseados na hemaglutinaccedilatildeo e incluem o teste em
tubo e o teste em microplacas Uma suspensatildeo de hemaacutecias eacute adicionada ao plasma ou soro
em seguida eacute realizada a centrifugaccedilatildeo e por fim eacute feita a leitura do resultado que eacute
considerado positivo se for observado algum grau de aglutinaccedilatildeo ou hemoacutelise A intensidade
de aglutinaccedilatildeo eacute graduada de acordo com o tamanho dos agregados desprendidos da
superfiacutecie apoacutes agitaccedilatildeo delicada do tubo ou microplaca Os meacutetodos de hemaglutinaccedilatildeo satildeo
aplicados a todos os testes preacute-transfusionais Como os anticorpos ABO satildeo aglutininas frias
a tipagem eacute realizada em temperatura ambiente (22degC) no entanto ao investigar a presenccedila
de anticorpos irregulares que como jaacute mencionado eacute na maioria das vezes anticorpos
incompletos da classe IgG eacute essencial que a reaccedilatildeo seja incubada a 37degC As reaccedilotildees satildeo
facilitadas com a utilizaccedilatildeo de potencializadores e da antiglobulina humana (WALKER e
HARMENING 2012 AABB 2011)
Nos meacutetodos de fase fluiacuteda nos quais a AGH eacute empregada a fase de lavagem eacute
fundamental Apoacutes a incubaccedilatildeo do soro com as hemaacutecias deve ser realizada a lavagem da
reaccedilatildeo para remover o excesso de anticorpos natildeo ligados agraves hemaacutecias jaacute que os anticorpos
livres podem bloquear a AGH quando ela eacute adicionada e levar a resultados falso negativos
(AABB 2011)
Os testes de hemaglutinaccedilatildeo satildeo os mais tradicionais entre os meacutetodos ainda hoje
aplicados agrave rotina de bancos de sangue A vantagem desses meacutetodos eacute o baixo custo quando
comparado agraves teacutecnicas mais modernas mas apresentam tambeacutem desvantagens A teacutecnica em
tubo por exemplo natildeo permite automaccedilatildeo eacute trabalhosa e exige matildeo-de-obra bastante treinada
na execuccedilatildeo das diversas etapas do teste e mesmo assim pode haver subjetividade na
interpretaccedilatildeo dos resultados aleacutem de resultados falso-negativos (DOWNES 2011 ZANTEK
et al 2012)
9
122 COLUNAS DE GEL
A teacutecnica em gel iniciada na deacutecada de 90 representou uma grande revoluccedilatildeo na
rotina laboratorial tornando-se muito popular Aleacutem de ser sensiacutevel a teacutecnica dispensa a fase
de lavagem antes da adiccedilatildeo da AGH assim como a agitaccedilatildeo do teste para leitura reduzindo o
nuacutemero de resultados falsos negativos decorrentes dessas duas etapas e o tempo para
execuccedilatildeo dos testes (LAPIERRE et al 1989 NOVARETTI et al 2000 NOVARETTI et
al 2004) Os reagentes satildeo comercializados na forma de cartotildees plaacutesticos contendo
microtubos preenchidos por gel composto por microesferas de acrilamida-dextran Nesta
metodologia tambeacutem baseada na hemaglutinaccedilatildeo a suspensatildeo de hemaacutecias e o soro satildeo
depositados em uma cacircmara acima da coluna de gel e em seguida procede-se com a
centrifugaccedilatildeo dos cartotildees As microesferas atuam como uma malha que permite a passagem
em direccedilatildeo ao fundo do microtubo apenas das hemaacutecias natildeo aglutinadas enquanto as
hemaacutecias aglutinadas ficam retidas na parte superior da coluna ou ao longo dela (GREEN e
KLOSTERMANN 2012) Portanto quanto maior a agregaccedilatildeo mais hemaacutecias ficam retidas
no topo da coluna Dependendo do tipo de teste a ser realizado pode ser utilizado gel neutro
ou gel especiacutefico impregnado pelo anticorpo desejado e o gel contendo antiglobulina humana
que satildeo utilizados para os testes diretos e indiretos da antiglobulina (LAPIERRE et al 1989)
A coluna de gel ainda permite a visualizaccedilatildeo clara de duas populaccedilotildees distintas de hemaacutecias
como em pacientes receacutem transfundidos
123 BIOLOGIA MOLECULAR
A biologia molecular ou genotipagem estaacute sendo cada vez mais aplicada aos grupos
sanguiacuteneos pois fornece resultados seguros e precisos especialmente nos casos em que natildeo eacute
possiacutevel a realizaccedilatildeo da fenotipagem como em pacientes receacutem-transfundidos e pacientes
com TDA positivo Na genotipagem eacute possiacutevel determinar atraveacutes do DNA do paciente
extraiacutedo de seus leucoacutecitos de sangue perifeacuterico o fenoacutetipo eritrocitaacuterio deduzido sem
qualquer interferecircncia do anticorpo que sensibiliza a hemaacutecia ou de hemaacutecias alogecircnicas
transfundidas Sua realizaccedilatildeo no entanto exige o treinamento de equipe especializada e capaz
de interpretar os resultados em conjunto com os achados soroloacutegicos (JUNIOR e OLIVATO
2007)
Apesar de ser uma ferramenta de grande importacircncia hoje na imuno-hematologia
ainda estaacute restrito aos grandes centros de hemoterapia no Brasil poucos serviccedilos puacuteblicos de
sauacutede dispotildeem desse recurso e utilizam teacutecnicas de genotipagem de grupos sanguiacuteneos para
atendimento a seus pacientes Esta abordagem poreacutem vem sendo introduzida em algumas
10
instituiccedilotildees de reconhecida competecircncia na hemoterapia mas sua disponibilizaccedilatildeo deve
tornar-se mais generalizada atraveacutes da formaccedilatildeo de centros de referecircncia para atendimento
das diversas unidades de hemoterapia (MARTINS et al 2009) Dessa forma muitas decisotildees
transfusionais especialmente em urgecircncias ainda devem ser tomadas sem o resultado da
genotipagem eritrocitaacuteria
13 TESTE DA ANTIGLOBULINA
Coombs Mourant e Race descreveram em 1945 uma teacutecnica com utilizando soro de
coelho contendo antiglobulina humana (AGH) que posteriormente foi chamada de ldquosoro de
Coombsrdquo O meacutetodo foi desenvolvido inicialmente para ampliar o efeito de aglutininas fracas
do sistema Rh anticorpos ldquoincompletosrdquo que normalmente natildeo apresentavam aglutinaccedilatildeo
visiacutevel O teste foi concebido como um instrumento de investigaccedilatildeo de doenccedila hemoliacutetica do
receacutem-nascido e de reaccedilotildees transfusionais causadas por anticorpos Rh que estavam presentes
no soro dos paciente poreacutem que natildeo eram demonstraacuteveis pelas teacutecnicas ateacute entatildeo existentes
A maior parte dos anticorpos de significado cliacutenico assim como seus respectivos
antiacutegenos foram descritos apoacutes o surgimento do ldquosoro de Coombsrdquo em 1945 sendo assim o
teste da antiglobulina representa ateacute hoje a forma mais importante de aglutinaccedilatildeo artificial em
imunohematologia permitindo revelar a presenccedila de anticorpos na membrana da hemaacutecia A
antiglobulina humana eacute constituiacuteda por anticorpo especiacutefico contra a porccedilatildeo Fc de outro
anticorpo Quando um anticorpo ldquoincompletordquo sensibiliza a hemaacutecia normalmente natildeo
provoca aglutinaccedilatildeo visiacutevel Apoacutes a adiccedilatildeo da AGH ao meio esta reconhece e se liga agraves
porccedilotildees Fc dos anticorpos que sensibilizam a hemaacutecia formando assim uma malha e
provocando aglutinaccedilatildeo visiacutevel (BARJAS-CASTRO 2013)
Os reagentes de antiglobulina podem ser poliespeciacuteficos ou monoespeciacuteficos Os
poliespeciacuteficos satildeo uma mistura de anticorpos ant-IgG e anti-C3d (fraccedilatildeo C3d do
complemento) Os reagentes monoespecificos podem ser anti-IgG anti-IgM anti-IgA anti-
complemento podendo ser anti-C3d e anti-C3b
O teste da antiglobulina pode ser usado para detectar hemaacutecias sensibilizadas com
aloanticorpos IgG autoanticorpos IgG e componentes do complemento A sensibilizaccedilatildeo
pode ocorrer ldquoin vivordquo ou ldquoin vitrordquo O uso do AGH para detectar a sensibilizaccedilatildeo ldquoin vitrordquo
tem dois estaacutegios e eacute denominado teste indireto da antiglobulina A sensibilizaccedilatildeo ldquoin vivordquo eacute
detectada em procedimento de um uacutenico estagio chamado teste direto da antiglobulina (TDA)
11
Os testes direto e indireto satildeo ateacute hoje amplamente aplicados como princiacutepio de inuacutemeros
testes soroloacutegicos em imuno-hematologia (GREEN e KLOSTERMANN 2012)
131 TESTE DIRETO DA ANTIGLOBULINA
O teste direto da antiglobulina humana revela a presenccedila de anticorpo eou fraccedilatildeo do
complemento ligados agrave superfiacutecie das hemaacutecias As sensibilizaccedilatildeo das hemaacutecias ocorrida ldquoin
vivordquo natildeo eacute visualizada mas apoacutes a adiccedilatildeo da antiglobulina humana ocorre a aglutinaccedilatildeo que
eacute visualizada macroscopicamente (Figura 1)
Figura 1 - Princiacutepio da teacutecnica direta da antiglobulina Teste utilizado para demonstrar a sensibilizaccedilatildeo ldquoin
vivordquo das hemaacutecias O sangue total eacute coletado do paciente em tubo contendo anticoagulante EDTA Na teacutecnica
realizada em tubo uma suspensatildeo de hemaacutecias 5 em soluccedilatildeo de salina eacute preparada Uma gota dessa suspensatildeo
eacute lavada 3 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica para retirada de anticorpos que estatildeo livres no plasma Toda soluccedilatildeo eacute
retirada e adiciona-se o soro de Coombs (antiglobulina humana) O soro de Coombs reconhece os anticorpos que
estatildeo ligados agrave superfiacutecie das hemaacutecias fazendo com que ocorra aglutinaccedilatildeo visiacutevel macroscopicamente
Apesar de natildeo ser um teste preacute-transfusional obrigatoacuterio o TDA eacute um dos testes mais
importantes para investigar e classificar quadros hemoliacuteticos como de origem imune ou natildeo
imune O seu valor preditivo positivo em vigecircncia de anemia hemoliacutetica eacute de 83 poreacutem natildeo
havendo sinais de hemoacutelise seu valor preditivo eacute apenas 14 Eacute por esse motivo que a
interpretaccedilatildeo do TDA positivo deve levar em consideraccedilatildeo a histoacuteria cliacutenica e os resultados
dos outros exames laboratoriais A realizaccedilatildeo do TDA eacute obrigatoacuteria na investigaccedilatildeo
12
laboratorial de diversos quadros hemoliacuteticos entre eles a anemia hemoliacutetica autoimune
(AHAI) a reaccedilatildeo hemoliacutetica imune poacutes-transfusional a siacutendrome do linfoacutecito passageiro a
doenccedila hemoliacutetica perinatal e a hemoacutelise droga-dependente (LEGER 2011)
Resultados de TDA positivos foram tambeacutem observados em indiviacuteduos com niacuteveis
seacutericos elevados de IgG ou complemento sem evidecircncia de anemia hemoliacutetica imune como
em pacientes com doenccedila falciforme talassemia doenccedila renal crocircnica mieloma muacuteltiplo
doenccedilas autoimunes e siacutendrome da imunodeficiecircncia adquirida (SIDA) Aleacutem disso pequenas
quantidades de IgG (5 a 90 moleacuteculas por hemaacutecia) e complemento (5 a 40 moleacuteculas por
hemaacutecia) podem estar presentes nas hemaacutecias de indiviacuteduos saudaacuteveis sem associaccedilatildeo com
reduccedilatildeo na sobrevida das mesmas A positividade do TDA depende da populaccedilatildeo estudada e
pode variar de 01 entre doadores de sangue sem qualquer sinal cliacutenico de hemoacutelise ateacute
15 em pacientes hospitalizados (CASTILHO JUNIOR e REID 2015 LEGER 2011)
Indiviacuteduos que apresentam TDA positivo seja agraves custas de IgG eou complemento
com ou sem sinais cliacutenicos de hemoacutelise teratildeo a fenotipagem eritrocitaacuteria prejudicada A
fenotipagem de indiviacuteduos com TDA positivo especialmente quando utilizado o teste indireto
da antiglobulina pode acarretar resultados falsos positivos e levar a seleccedilatildeo de fenoacutetipo
incorreto para transfusatildeo
132 TESTE INDIRETO DA ANTIGLOBULINA
O teste indireto da antiglobulina (TIA) eacute utilizado para revelar a sensibilizaccedilatildeo ldquoin
vitrordquo das hemaacutecias e eacute aplicado a diversos testes soroloacutegicos em imunohematologia entre
eles a pesquisa de anticorpos identificaccedilatildeo de anticorpos testes de compatibilidade
fenotipagem eritrocitaacuteria e titulaccedilatildeo de anticorpos Na teacutecnica indireta a hemaacutecia que contecircm
o antiacutegeno eacute colocada em contato ldquoin vitrordquo com o anticorpo que se liga mas natildeo promove a
aglutinaccedilatildeo visiacutevel A adiccedilatildeo da AGH forma uma malha entre os anticorpos que sensibilizam
as hemaacutecias e provoca a aglutinaccedilatildeo macroscoacutepica (figura 2)
Caso a amostra de hemaacutecia estudada seja previamente sensibilizada resultados falsos
positivos podem ser obtidos no TIA jaacute que a AGH reagiraacute com a moleacutecula que sensibilizava
anteriormente a hemaacutecia mesmo se o anticorpo especiacutefico natildeo tiver se ligado ao antiacutegeno
correspondente
13
133 CONDICcedilOtildeES CLIacuteNICAS COM TDA POSITIVO
O TDA positivo deve ser interpretado cuidadosamente sempre em conjunto com o
quadro cliacutenico do paciente A positividade isolada do TDA natildeo significa hemoacutelise A
interpretaccedilatildeo do teste positivo requer o conhecimento do diagnoacutestico do paciente da presenccedila
de sinais e sintomas sugestivos de hemoacutelise assim como de seu histoacuterico transfusional
gestacional e de informaccedilotildees sobre o uso recente de medicaccedilotildees (LEGER 2011)
Figura 2 ndash Princiacutepio do teste indireto da antiglobulina O TIA pode ser utilizado na pesquisa de anticorpos de
especificidades desconhecidas livres no soroplasma como eacute o caso da pesquisa e identificaccedilatildeo de anticorpos
irregulares Ele eacute tambeacutem utilizado para determinar a presenccedila de antiacutegenos na membrana da hemaacutecia quando
satildeo empregados soros de especificidades conhecidas da classe IgG No primeiro caso o soroplasma contendo o
anticorpo desconhecido eacute colocado em contato com hemaacutecias cujo perfil antigecircnico eacute conhecido No segundo
caso utiliza-se soro de especificidade conhecida da classe IgG para determinar a presenccedila ou ausecircncia de um
antiacutegeno na membrana O anticorpo encontra o antiacutegeno correspondente e ocorre a ligaccedilatildeo do anticorpo agrave
hemaacutecia mas natildeo ocorre aglutinaccedilatildeo Apoacutes a adiccedilatildeo da AGH que se liga aos anticorpos formando uma malha
ocorre a aglutinaccedilatildeo visiacutevel
O TDA positivo eacute uma achado claacutessico de algumas condiccedilotildees cliacutenicas como a reaccedilatildeo
transfusional hemoliacutetica a doenccedila hemoliacutetica do feto e do receacutem-nascido (DHFRN) a anemia
hemoliacutetica induzida por drogas a siacutendrome do linfoacutecito passageiro e a anemia hemoliacutetica
autoimune (AHAI) Portanto o TDA positivo pode ser decorrente da sensibilizaccedilatildeo da
hemaacutecia autoacuteloga por um autoanticorpo ou por um aloanticorpo ligado agrave hemaacutecia alogecircnica
circulante A positividade do TDA pode ainda ocorrer de forma passiva em pacientes que
14
recebem imunoglobulinas humanas ou ainda pela transfusatildeo de plaquetas ABO natildeo idecircntico
(LEGER 2011 RALPH 2012 ZANTEK et al 2012)
Nas reaccedilotildees transfusionais hemoliacuteticas imunes o aloanticorpo do receptor sensibiliza
as hemaacutecias transfundidas do doador e reduz sua sobrevida ao removecirc-la precocemente da
circulaccedilatildeo pela fagocitose no sistema retiacuteculo-endotelial ou pela hemoacutelise intravascular As
reaccedilotildees podem ser agudas se ocorrem ateacute 24 horas ou tardias quando ocorrem apoacutes 24 horas
da transfusatildeo A gravidade das reaccedilotildees hemoliacuteticas pode variar de um simples rendimento
transfusional inadequado agrave quadros graves de hemoacutelise intravascular evoluindo ateacute mesmo
com choque vascular e oacutebito O TDA pode resultar negativo caso toda massa eritrocitaacuteria
transfundida tenha sido destruiacuteda (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
Na doenccedila hemoliacutetica do feto e do receacutem-nascido (DHFRN) anticorpos maternos da
classe IgG atravessam a barreira placentaacuteria e sensibilizam as hemaacutecias fetais que seratildeo
destruiacutedas precocemente levando agrave anemia fetal Apesar da incompatibilidade ABO feto-
materna ser a causa mais frequente de DHFRN raramente ela eacute responsaacutevel pela ocorrecircncia
de quadros graves Por outro lado anticorpos contra antiacutegenos do sistema Rh e Kell
especialmente Anti-D (Anti-RH1) Anti-c (Anti-RH4) e Anti-Kell (Anti-KELL1) satildeo
conhecidos por causar DHFRN severa Raramente outros anticorpos tambeacutem podem estar
implicados na DHFRN como os anticorpos contra antiacutegenos do sistema Kidd Duffy MNS e
Diego (ZANTEK et al 2012)
A hemoacutelise droga-dependente eacute causada pela produccedilatildeo de um anticorpo voltado contra
a droga ligada agrave membrana eritrocitaacuteria ou ainda contra o complexo droga-membrana A
classe de medicaccedilotildees mais comumente envolvida eacute a dos antimicrobianos betalactacircmicos
(penicilinas e cefalosporinas) mas outras classes como quimioteraacutepicos e anti-inflamatoacuterios
tambeacutem satildeo descritos (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
Apoacutes transplante de ceacutelulas progenitoras hematopoieacuteticas em que o doador possui
anticorpos contra antiacutegenos eritrocitaacuterios do receptor o linfoacutecito de memoacuteria do doador pode
resistir ao esquema imunossupressor utilizado e continuar a produccedilatildeo de anticorpos que
reconhecem a hemaacutecia incompatiacutevel do receptor ainda circulante O quadro cliacutenico pode
variar de um simples TDA positivo sem outros sinais ou sintomas ateacute um quadro hemoliacutetico
grave e abrupto (LEGER 2011)
15
134 ANEMIA HEMOLIacuteTICA AUTOIMUNE
A anemia hemoliacutetica autoimune eacute caracterizada pela destruiccedilatildeo precoce das hemaacutecias
autoacutelogas por autoanticorpos que sensibilizam as hemaacutecias e levam agrave fagocitose pelos
macroacutefagos no sistema reticulo-endotelial ou hemoacutelise intravascular O diagnoacutestico da AHAI
baseia-se na presenccedila de hemoacutelise cliacutenica associada agrave evidecircncia de fator imune representado
pelo TDA positivo As classes de anticorpos envolvidas em quadros de AHAI satildeo IgG IgM e
raramente IgA (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012) Satildeo raros os casos de AHAI com TDA
negativo que podem estar relacionados a um autoanticorpo de baixa avidez de densidade
inferior agrave detecccedilatildeo do meacutetodo ou ainda de classe de imunoglobulina natildeo avaliada pelo
meacutetodo utilizado para o teste (GARRATY 2005)
A AHAI pode ser classificada em dois grupos principais de acordo com a melhor
temperatura de reaccedilatildeo do autoanticorpo As anemias hemoliacuteticas causadas por anticorpos
quentes que reagem melhor a 37oC e geralmente IgG representam 80 dos casos de AHAI
Nas AHAI por anticorpo quente o TDA pode ser positivo para IgG mais complemento (67)
somente IgG (20) ou somente por complemento (13) As anemias causadas por
anticorpos frios geralmente da classe IgM e que reagem melhor em temperatura ambiente ou
a 4oC representam aproximadamente 20 dos casos de AHAI Por exibirem amplitude
teacutermica esses anticorpos ligam-se agraves hemaacutecias ao atingirem a circulaccedilatildeo nas extremidades do
corpo fixam o complemento e desprendem-se da hemaacutecia apoacutes retornar para partes mais
quentes Por esse motivo em AHAI por anticorpos frios o TDA eacute positivo apenas agraves custas
de C3 e normalmente o IgM natildeo eacute detectado (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
A presenccedila do autoanticorpo IgG pode ser confirmada atraveacutes da eluiccedilatildeo do anticorpo
da hemaacutecia Tipicamente o eluato na AHAI por anticorpo quente reage com todas as ceacutelulas
testadas de um painel de hemaacutecias alogecircnicas do tipo ldquoOrdquo ou pode eventualmente exibir uma
especificidade conhecida como Anti-e (Anti-RH5) Nas AHAI a frio por sua vez espera-se
um eluato negativo (LEGER 2011)
Os autoanticorpos satildeo com frequecircncia encontrados livres no plasma e natildeo somente
ligados agraves hemaacutecias autoacutelogas Eles podem interferir em todas as fases dos testes preacute-
transfusionais nas quais o plasma eacute testado especialmente os autoanticorpos quentes que
acarretam resultados positivos em todos os testes levados agrave fase de antiglobulina humana
Esses anticorpos portanto positivam a pesquisa de anticorpos irregulares e mascaram a
presenccedila de aloanticorpos de significado cliacutenico Aproximadamente 60 dos pacientes que
apresentam AHAI a quente apresentam anticorpos que reagem em meio salino mas se forem
16
levados em conta meacutetodos mais sensiacuteveis como PEG enzima e estudo em gel a positividade
pode ser superior a 90 (LEGER 2011)
Aleacutem da eficaacutecia da transfusatildeo ser comprometida pela diminuiccedilatildeo da vida-meacutedia das
hemaacutecias a presenccedila do autoanticorpo dificulta a realizaccedilatildeo dos testes preacute-transfusionais e
compromete a seguranccedila transfusional Os autoanticorpos reagem normalmente como
panaglutininas pois satildeo normalmente voltados contra antiacutegenos puacuteblicos na maior parte das
vezes contra antiacutegenos do sistema Rh Por apresentarem essas caracteriacutesticas podem ainda
mascarar a presenccedila de aloanticorpos de significado clinico e levar a testes de compatibilidade
positivos exigindo uma avaliaccedilatildeo criteriosa da necessidade da transfusatildeo (BRANCH e PETZ
1999 JUNIOR e OLIVATO 2004)
Remover a interferecircncia do autoanticorpo para avaliar a presenccedila de aloanticorpos
mascarados nem sempre eacute possiacutevel mesmo utilizando teacutecnicas de autoadsorccedilatildeo ou
aloadsorccedilatildeo que aleacutem de tudo satildeo demoradas e exigem de 2 a 6 horas para conclusatildeo
(GARRATY e GEORGE 2002) Nesses casos a fenotipagem eritrocitaacuteria do paciente eacute de
extrema utilidade especialmente em situaccedilotildees de urgecircncia A definiccedilatildeo do fenoacutetipo do
paciente para os antiacutegenos de maior importacircncia cliacutenica pode auxiliar a seleccedilatildeo de unidades
de hemaacutecias com mesmo fenoacutetipo o que garante que eventuais aloanticorpos natildeo
identificados sejam respeitados e tambeacutem evita nova sensibilizaccedilatildeo (JUNIOR e OLIVATO
2004 SHIREY et al 2002)
135 TRATAMENTO DE HEMAacuteCIAS COM TDA POSITIVO
O TDA positivo impede a fenotipagem eritrocitaacutecia por meacutetodos que exigem a fase de
AGH uma vez que a aglutinaccedilatildeo ocorreraacute devido agrave interaccedilatildeo da AGH com o autoanticorpo
que sensibiliza a hemaacutecia do paciente levando a resultados falso positivos Em algumas
situaccedilotildees como na AHAI por anticorpo quente a fenotipagem eacute especialmente importante
pois o autoanticorpo interfere na triagem e identificaccedilatildeo de anticorpos assim como no teste de
compatibilidade e dificultam a detecccedilatildeo de aloanticorpos de significado cliacutenico que
obrigatoriamente devem ser respeitados Nessas situaccedilotildees a fenotipagem eritrocitaacuteria
determina o perfil antigecircnico do paciente e possibilita o fornecimento de unidades de
hemaacutecias com o mesmo fenoacutetipo para a transfusatildeo evitando a sensibilizaccedilatildeo para novos
antiacutegenos assim como reaccedilotildees hemoliacuteticas transfusionais No entanto eacute necessaacuterio aplicar
meacutetodos que natildeo sofram interferecircncia do TDA positivo ou seja meacutetodos que natildeo necessitem
da fase de AGH ou meacutetodos de bloqueio do anticorpo sem bloquear o antiacutegeno Uma opccedilatildeo eacute
a utilizaccedilatildeo de soros monoclonais IgM (salinos ou de meio proteico natildeo concentrado) mas
17
nem sempre esses reagentes estatildeo disponiacuteveis especialmente os reagentes monoclonais para
os antiacutegenos dos sistemas Duffy ( Fya Fy
b) Kidd ( Jk
a Jk
b) e MNS (S s) (JUNIOR e
OLIVATO 2004) Outra opccedilatildeo eacute a teacutecnica de bloqueio que pode ser utilizada para tratar
hemaacutecias para posterior fenotipagem em casos de TDA positivos com reatividade le2+
Em casos onde a positividade do TDA eacute maior que 2+ estaacute indicada a tratamento
quiacutemico para remoccedilatildeo da interferecircncia do autoanticorpo antes de realizar a fenotipagem Entre
as teacutecnicas utilizadas atualmente estatildeo o ZZAP a cloroquina e a glicina aacutecidaEDTA
1351 TEacuteCNICA DE BLOQUEIO
A teacutecnica de bloqueio se baseia na utilizaccedilatildeo de anti-IgG (Coombs monoespeciacutefico)
para tratar as hemaacutecias com TDA positivo O anticorpo anti-IgG se liga aos anticorpos que
estatildeo sensibilizando a hemaacutecias poreacutem sem o bloquear os antiacutegenos Os antiacutegenos que natildeo
estatildeo sensibilizados podem ser detectados atraveacutes dos antissoros especiacuteficos (SERERAT
VEIDT E DUTCHED 2000)
1352 TRATAMENTO DE HEMAacuteCIAS COM ZZAP
O Sulphydryl-Proteolytic Enzyme (ZZAP) que eacute uma mistura de ditiotreitol (DTT)
mais papaiacutena ativada com cisteiacutena eacute um reagente capaz de dissociar imunoglobulinas da
classe IgG ligadas a membrana dos eritroacutecitos enquanto trata enzimaticamente as hemaacutecias
O tratamento enzimaacutetico tambeacutem potencializa a ligaccedilatildeo do autoanticorpo ao antiacutegeno e
acelera o processo de autoadsorccedilatildeo O ZZAP pode desnaturar os antiacutegenos do sistema Duffy
MNS e Kell o que limita sua aplicaccedilatildeo para fins de fenotipagem (BRANCH e PETZ 1982)
1353 CLOROQUINA
Em 1982 Edwards Moulds e Judd propuseram a utilizaccedilatildeo da teacutecnica da cloroquina
que dissociava os complexos antiacutegeno-anticorpo e mantinha a membrana das hemaacutecias
iacutentegras Os derivados quinolecircicos jaacute haviam sido descritos anteriormente por Domokos e
Aszody em 1964 e Holtz Mantel e Buck em 1973 (apud Edwards Moulds e Judd 1982) pela
sua capacidade de separar imunocomplexos e inibir as reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo reduzindo
as cargas eleacutetricas das superfiacutecie das hemaacutecias A teacutecnica eacute uma das mais utilizadas nos
centros brasileiros para remover a interferecircncia do autoanticorpo e eacute tambeacutem a teacutecnica
atualmente adotada pelo laboratoacuterio de imunohematologia do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto
18
Edwards Moulds e Judd (1982) demonstraram que a teacutecnica da cloroquina para
dissociaccedilatildeo de anticorpos eacute uma teacutecnica simples efetiva e confiaacutevel para dissociar
imunoglobulina das hemaacutecias Desde que a membrana das hemaacutecias permaneccedila intacta natildeo
haacute perda da reatividade dos antiacutegenos e a sua maior aplicaccedilatildeo eacute a fenotipagem de hemaacutecias
com TDA positivo Os autores verificaram que em 83 das amostras sensibilizadas in vivo e
22 amostras (no total de 40) sensibilizadas ldquoin vitrordquo apresentaram TDA negativo e
puderam ser fenotipadas A teacutecnica poreacutem natildeo consegue remover os componentes do
complemento na maioria dos casos
Champagne e colaboradores (1999) testaram a teacutecnica da cloroquina para dissociar
antiacutegenos Bg comparando com a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA e verificaram vantagem em
relaccedilatildeo ao uso de um uacutenico reagente diminuindo a manipulaccedilatildeo e verificou que o mesmo natildeo
destroacutei antiacutegeno Kell
A cloroquina tambeacutem mostrou-se pouco efetivo em remover anticorpos do sistema
Duffy da superfiacutecie das hemaacutecias (EDWARDS MOUDS e JUDD 1982 ROZIERS e
SQUALI 1997)
1353 GLICINA-AacuteCIDAEDTA
A afinidade e a estabilidade entre a ligaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo eacute definida como a
resultante entre forccedilas atrativas e repulsivas entre ambos (CARUCIO e WISE 2012) e resulta
da somatoacuteria de forccedilas quiacutemicas dinacircmicas e fracas (natildeo covalentes) como pontes de
hidrogecircnio forcas eletrostaacuteticas forca de Van der Waals e pontes hidrofoacutebicas A estabilidade
dessa ligaccedilatildeo eacute facilmente abalada por alteraccedilotildees quiacutemicas e fiacutesicas no meio da reaccedilatildeo como
a alteraccedilatildeo do pH A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA se baseia na mudanccedila do pH para a
quebra da ligaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo (KOSANKE 2012)
A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA foi primeiramente descrita em 1986 por Louie Jieng
e Zeroulis que utilizaram 50 amostras de doadores sensibilizados ldquoin vitrordquo com anticorpos A
teacutecnica foi efetiva em 48 amostras permitindo o estudo do eluato assim como a fenotipagem
das hemaacutecias Os autores testaram tambeacutem a teacutecnica em 100 hemaacutecias TDA positivo que
puderam ser utilizadas para teacutecnicas de autoadsorccedilatildeo
Byrne (1991) descreveu a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA modificada e tambeacutem
verificou como uma opccedilatildeo para o tratamento de hemaacutecias com TDA positivo que deixava as
hemaacutecias intactas e o eluato viaacutevel para ser fenotipado
19
Roziers e Squali (1997) e Katharia e Chaudhary (2013) compararam a teacutecnica da
glicina-aacutecidaEDTA com as teacutecnicas da cloroquina e do aquecimento Verificaram maior
eficiecircncia da glicina-aacutecidaEDTA em relaccedilatildeo as outras duas teacutecnicas pois com uma mesma
quantidade de amostra produzia as hemaacutecias livres de anticorpo e tambeacutem o eluato Mostrou-
se ainda superior devido ao menor tempo exigido para sua realizaccedilatildeo o que favorece seu uso
em situaccedilotildees de urgecircncia e emergecircncia
As duas desvantagens da teacutecnica poreacutem eacute o fato de destruir os antiacutegenos do sistema
Kell e o fato de natildeo remover fraccedilotildees do complemento ligadas agrave hemaacutecia (PALLAS WILER e
McGEE 1991 ROZIERS e SQUALLI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012
e KATHARIA e CHAUNDHARY 2013)
20
2 OBJETIVOS
21 OBJETIVO GERAL
211 Avaliar a eficaacutecia da glicina-aacutecidaEDTA em remover os anticorpos ligados agraves
hemaacutecias sensibilizadas por anticorpos da classe IgG
22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
221 Preparaccedilatildeo dos reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
verificaccedilatildeo da estabilidade dos mesmos e avaliar custos
222 Testar a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA em amostras de hemaacutecias
sensibilizadas por anticorpos antieritrocitaacuterios humanos
223 Comparar a efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA com a teacutecnica da
cloroquina quanto a capacidade de remover a interferecircncia do anticorpo ligado
a hemaacutecia
224 Testar o eluato das amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA
225 Verificar se houve destruiccedilatildeo dos antiacutegenos eritrocitaacuterios apoacutes o tratamento
com glicina-aacutecidaEDTA e com cloroquina
226 Verificar se o tempo de execuccedilatildeo da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA descrito
nos textos de referecircncia eacute reprodutiacutevel
21
3 JUSTIFICATIVA
Algumas condiccedilotildees cliacutenicas podem levar ao depoacutesito ldquoin vivordquo de anticorpos eou
fraccedilotildees do complemento sobre as hemaacutecias Entre elas estatildeo as reaccedilotildees hemoliacuteticas poacutes-
transfusionais a doenccedila hemoliacutetica perinatal o uso de medicamentos e principalmente a
AHAI Na AHAI um anticorpo normalmente da classe IgG ou IgM reconhece antiacutegenos
proacuteprios na membrana eritrocitaacuteria e reduz a sobrevida da hemaacutecia levando a sua destruiccedilatildeo
pelos macroacutefagos no sistema reticulo-endotelial ou agrave ativaccedilatildeo do complexo de ataque agrave
membrana e agrave lise intravascular Os autoanticorpos satildeo voltados na maioria das vezes contra
antiacutegenos eritrocitaacuterios de alta frequecircncia populacional conhecidos como antiacutegenos puacuteblicos
e por este motivo reconhecem tanto hemaacutecias autoacutelogas quanto alogecircnicas
Devido agrave presenccedila do autoanticorpo livre no plasma e tambeacutem do anticorpo eou
complemento ligado agrave hemaacutecia o banco de sangue pode encontrar dificuldades em todas as
fases dos testes preacute-transfusionais do paciente com AHAI e deve utilizar teacutecnicas que
auxiliem na escolha do melhor hemocomponente melhorando a seguranccedila transfusional Essas
teacutecnicas visam remover a interferecircncia do autoanticorpo livre no soro e do autoanticorpo
ligado agrave hemaacutecia permitindo a detecccedilatildeo de aloanticorpos associados e a realizaccedilatildeo da
fenotipagem eritrocitaacuteria respectivamente
A finalizaccedilatildeo dos testes preacute-tranfusionais na presenccedila de autoanticorpo pode levar
algumas horas e nem sempre o paciente poderaacute aguardar Nesse contexto torna-se vantajosa a
aplicaccedilatildeo de teacutecnicas de raacutepida execuccedilatildeo
O presente estudo propotildee aplicar e avaliar a eficaacutecia da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
em remover os anticorpos ligados agrave hemaacutecia o que permite a fenotipagem eritrocitaacuteria
estendida e a seleccedilatildeo de concentrados de hemaacutecias com mesmo fenoacutetipo do paciente
Atualmente no Hemocentro de Ribeiratildeo Preto a teacutecnica utilizada para esse fim eacute o
tratamento das hemaacutecias com difosfato de cloroquina cujo tempo de execuccedilatildeo pode demorar
ateacute duas horas enquanto a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser realizada em apenas dois
minutos o que a tornaria opccedilatildeo de escolha especialmente em situaccedilotildees de urgecircncia Ao
contraacuterio da cloroquina a glicina-aacutecidaEDTA permite tambeacutem o estudo do eluato das
hemaacutecias tratadas
22
4 METODOL OGIA
41 AMOSTRAS DE DOADORES
Foram coletados 50 amostras de doadores de sangue que compareceram ao
Hemonuacutecleo de Araccedilatuba no periacuteodo de junho a agosto de 2016 Foram convidados a
participar da pesquisa doadores de repeticcedilatildeo do tipo sanguiacuteneo ldquoOrdquo RhD positivo
cadastrados no sistema de banco de sangue (SBS) do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto
Todos os doadores que concordaram em participar da pesquisa assinaram o termo de
consentimento livre e esclarecido (TCLE)
No momento da doaccedilatildeo foram coletados adicionalmente 5 mL de sangue total em
soluccedilatildeo anticoagulante EDTA (aacutecido dietilenoaminoaceacutetico) dispensando punccedilatildeo venosa
adicional para coleta da amostra O fluxograma 1 resume as etapas desenvolvidas no projeto
Fluxograma 1 - Fluxo da pesquisa utilizando as amostras de doadores
23
411 FENOTIPAGEM
Foram verificados se os doadores jaacute tinham fenotipagem para outros sistemas de
grupos sanguiacuteneos aleacutem do sistema ABORh que eacute realizado rotineiramente
A fenotipagem eritrocitaacuteria para outros sistemas ou fenotipagem estendida eacute realizada
para identificar a presenccedila ou ausecircncia de antiacutegenos considerados de importacircncia cliacutenica No
Hemonuacutecleo de Araccedilatuba uma parcela de doadores de repeticcedilatildeo satildeo fenotipados para os
antiacutegenos dos sistemas de grupo sanguiacuteneo Rh (antiacutegenos C c E e e) Kell (antiacutegeno K)
Duffy (antiacutegenos Fya e Fy
b) Kidd (antiacutegenos Jk
a e Jk
b) e sistema MNSs (antiacutegenos S e s)
A fenotipagem para o Rh e Kell eacute realizada por metodologia de microplaca utilizando
25 microL de hemaacutecia lavada e diluiacuteda a 5 em salina e 25 microL do antissoro comercial especiacutefico
A reaccedilatildeo eacute incubada 15 minutos a temperatura ambiente e centrifugadas para leitura Para os
antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s a metolodogia utilizado eacute gel contendo antiglobulina
humana (gel LissCoombs poliespeciacutefico) da marca BIO-RAD onde se utiliza suspensatildeo de
hemaacutecia em LISS (Soluccedilatildeo de baixa forccedila iocircnica) A suspensatildeo eacute preparada atraveacutes da
diluiccedilatildeo de 10 microL de hemaacutecia em 1000 microL de LISS Pipetado 50 microL dessa diluiccedilatildeo no gel e
adicionado 25 microL do antissoro especiacutefico Incuba-se em banho seco por 15 minutos a 37 deg
Celsius e eacute centrifugado em centriacutefuga especiacutefica Os antissoros utilizados eram das marcas
Fresenius e Lorne
Foi verificado a fenotipagem do doador no banco de dados do Hemocentro Os
registros dos fenoacutetipos dos doadores ficam armazenadas no sistema de banco de sangue
(SBS) Para doadores que natildeo tinham fenotipagem estendida preacutevia para antiacutegenos do sistema
Rh (C c E e e) e Kell (K) foi realizada a fenotipagem para esses antiacutegenos
O tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA e cloroquina para dissociar
anticorpos pode inativar enfraquecer ou destruir os antiacutegenos presentes nas hemaacutecias
alterando assim os resultados da fenotipagem Para verificar se houve destruiccedilatildeo dos
antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a e Jk
b S e s nas amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes
tratamento foram novamente fenotipadas ao final para os antiacutegenos que eram inicialmente
positivas
A repeticcedilatildeo da fenotipagem foi realizada nas amostras que apresentaram efetividade
no tratamento da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eou da cloroquina e a detecccedilatildeo do antiacutegeno
na amostra preacute-tratamento
24
412 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS HEMAacuteCIAS
As hemaacutecias foram sensibilizadas com antissoros policlonais humanos de amostras de
plasma fresco congelado de doadores com resultado de pesquisa de anticorpo irregular
positivos
A escolha do anticorpo para sensibilizar as hemaacutecias foi definida de acordo com o
fenoacutetipo do doador que deveria ser positivo para o respectivo antiacutegeno
Para a sensibilizaccedilatildeo um volume de antissoro (1 mL) e um volume (1 mL) de
hemaacutecias lavadas quatro vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica foram adicionadas a um tubo de 12 x
75 mm A mistura foi homogeneizada e incubada em banho maria (BM) a 37deg C por 60
minutos A seguir as hemaacutecias foram novamente lavadas 4 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica
para retirada dos anticorpos que natildeo se ligaram A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada
como controle negativo O teste da uacuteltima lavagem eacute importante para assegurar que os
anticorpos que poderatildeo ser detectados no eluato apoacutes o tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA
sejam aqueles que estavam ligados agraves hemaacutecias e natildeo aqueles livres no plasma O controle
negativo mostra que todo o anticorpo livre foi retirado (LEGER 2011)
Para o teste de presenccedila de anticorpo na soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foram incubadas
com hemaacutecias de triagem de anticorpos irregulares (ID-Diacell BIO-RAD) contendo os
antiacutegenos especiacuteficos Realizado a teacutecnica em gel LissCoombs com anti-IgG+C3d Incubado
no tempo de 15 minutos a temperatura de 37deg C e centrifugado 10 minutos em centriacutefuga
proacutepria
As 50 amostras de doadores foram sensibilizadas com os anticorpos policlonais
humanos
Apoacutes sensibilizadas rdquoin vitrordquo e lavadas as hemaacutecias foram diluiacutedas em soluccedilatildeo de
baixa forccedila iocircnica (LISS) na quantidade de 10 microL de hemaacutecia para 1000 microL de soluccedilatildeo A
suspensatildeo foi pipetada (50 microL) em coluna-gel-teste LissCoombs (BIO-RAD) que contecircm
antiglobulina poliespeciacutefico (IgG+C3d) e centrifugada em baixa rotaccedilatildeo conforme orientaccedilatildeo
do fabricante durante 10 minutos
As amostras deveriam apresentar aglutinaccedilatildeo com reatividade 3 a 4+ no TDA As
amostras que apresentaram reaccedilatildeo menor que 3+ foram novamente sensibilizadas com nova
aliacutequota do antissoro
25
413 TRATAMENTO DAS AMOSTRAS
As amostras sensibilizadas apresentando o TDA positivo 3 ou 4+ foram divididas em
duas aliacutequotas e submetidas a duas teacutecnicas diferentes com o objetivo de dissociar o anticorpo
ligado Uma aliacutequota da amostra foi tratada com soluccedilatildeo de difosfato de cloroquina enquanto
a outra aliacutequota foi tratada com glicina-aacutecidaEDTA
42 PREPARO DA GLICINA AacuteCIDA-EDTA
A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA utiliza 3 soluccedilotildees diferentes a glicina aacutecida o
EDTA e o tampatildeo TRIS
Os reagentes foram preparados utilizando os sais para anaacutelise (PA) de EDTA
(Na2EDTA2H2O) TRIS (C4H11NO3) Glicina (H2NCH2CO2H) NaCl e a soluccedilatildeo de aacutecido
cloriacutedrico (HCl) 12 N todos reagentes da marca SYNTH (quadro 1)
Para o preparo do tampatildeo glicina-acida eacute necessaacuterio o ajuste do pH para 15 Para esse
ajuste utiliza-se aacutecido cloriacutedrico (HCl) concentrado O pH foi medido com fitas reativas de pH
com escala de 1 a 14 da marca MERCK Posteriormente a soluccedilatildeo foi enviada ao laboratoacuterio
de controle de qualidade do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto e o pH medido no peagacircmetro O
tampatildeo glicina-aacutecida foi armazenado a 4deg e o tampatildeo tris e o EDTA em temperatura ambiente
controlada (20 a 24deg Celsius)
Apoacutes o preparo e durante a realizaccedilatildeo dos testes foram feitas inspeccedilotildees visuais para
verificaccedilatildeo de turvaccedilatildeo do meio e presenccedila de precipitados
Reagente Material Quantidade Preparo e
Conservaccedilatildeo
EDTA
EDTA
(Na2EDTA2H2O)
5 gramas Mistura ateacute
dissoluccedilatildeo do sal e
conserva em
temperatura ambiente Aacutegua Destilada 50 Ml
Tris
TRIS (C4H11NO3) 121 gramas Conservar em
temperatura ambiente NaCl 525g
Aacutegua destilada 100ml
Gliacutecina-aacutecida
Glicina
(H2NCH2CO2H) 15 gramas
Conservar a 4oC NaCl 116gramas
Aacutegua Destilada 200ml
HCL 12N Ajutar o pH para 15
Quadro 1 - Preparo dos Reagentes da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
Fonte - Manual teacutecnico AABB 2011
26
O tampatildeo glicina-aacutecida e o tampatildeo TRIS satildeo estaacuteveis por 7 meses O reagente EDTA
precipitou mesmo estando em temperatura em ambiente controlado Houve necessidade de
preparo de novo reagente
421 TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
1 Em um tubo de ensaio 12x75 mm eacute adicionado 08 mL da soluccedilatildeo de glicina-aacutecida A
esta soluccedilatildeo adiciona-se 02 mL de EDTA e mistura
2 Adiciona-se 02 mL de hemaacutecias sensibilizadas (lavada 4 vezes) A mistura eacute
homogeneizada e incubada por exatamente 2 minutos
3 A seguir 01 mL de tampatildeo TRIS eacute adicionado agrave mistura que eacute novamente
homogeneizada e centrifugada por 2 minutos a 3400 rpm O pH deve estar entre 7 a 75
4 Apoacutes centrifugaccedilatildeo separa-se em outro tubo o sobrenadante (eluato) e as hemaacutecias
que permanecem satildeo lavadas 4 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica para retirada de todo o
reagente e anticorpos livres
43 PREPARO DA CLOROQUINA
A cloroquina eacute diluiacuteda em tampatildeo PBS na concentraccedilatildeo de 20 (Quadro 2) e
armazenado a 4deg Celsius sua validade apoacutes o preparo eacute de 1 mecircs
A teacutecnica da cloroquina jaacute estaacute padronizada para rotina do laboratoacuterio de
imunohematologia do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto e suas unidades
Reagente Reagentes Quantidade PreparoConservaccedilatildeo
Cloroquina
Difosfato de cloroquina
(C18H32ClN3O8P2)
20 gramas
Conservar a 4deg Celsius
Tampatildeo PBS 100ml
NaOH 01 N Acertar o pH para
51
Quadro 2 - Preparo da Cloroquina Fonte - Manual teacutecnico da AABB 2011
431 TEacuteCNICA DA CLOROQUINA
1 4 partes da soluccedilatildeo pronta eacute adicionada a uma parte de hemaacutecias lavadas 4 vezes com
soluccedilatildeo fisioloacutegica
2 A mistura eacute incubada em temperatura ambiente por ateacute duas horas
3 Centrifugar a 3400 rpm por 2 minutos
27
4 Remover o sobrenadante lavar as hemaacutecias novamente com soluccedilatildeo fisioloacutegica 4
vezes
44 VERIFICACcedilAtildeO DA EFETIVIDADE DOS TESTES
Apoacutes tratamento pelas duas teacutecnicas o TDA foi repetido em todas as amostras para
verificar se os tratamentos foram efetivos e houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo Para as
amostras tratadas pela teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA que permaneceram com TDA positivo
novo tratamento foi realizado
45 TESTE DO ELUATO
O eluato resultante das amostras tratadas com glicina-acidaEDTA foi testado com
hemaacutecias de triagem A soluccedilatildeo do eluato foi incubada com as hemaacutecias de triagem de
anticorpos (ID-Diacell BIO-RAD) pela teacutecnica em gel LissCoombs O teste foi incubado 15
minutos a 37deg Celsius e centrifugado por 10 minutos em centrifuga proacutepria para a teacutecnica em
gel Os eluatos que apresentaram resultados positivos foram testados em painel de 11
hemaacutecias (ID-Diapanel BIO-RAD) para a identificaccedilatildeo do anticorpo
46 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente que apresentou TDA positivo por IgG e pesquisa
de anticorpo irregular positivo com presenccedila de autoanticorpo com reatividade panaglutinina
A amostra foi tratada em paralelo pelas duas teacutecnicas descritas e foi enviada para o
Hemocentro para genotipagem eritrocitaacuteria que foi realizado por metodologia PCR em tempo
real no equipamento Real-time system PCR 7500 ( Applied Biosystems Califoacuternia EUA)
28
5 RESULTADOS
51 REAGENTES
Para aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA satildeo necessaacuterios 3 diferentes
reagentes que podem ser encontrados em forma de kit pronto para uso No entanto esses kits
natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil Os reagentes satildeo tampatildeo glicina-aacutecida o EDTA e o tampatildeo
Tris
Todos os reagentes foram preparados rdquoin houserdquo a partir dos sais e soluccedilotildees PA (puro
para anaacutelise) da marca SYNTH que foram adquiridos para a pesquisa O custo estimado para
cada teste foi aproximadamente R$ 020 reais
Apoacutes o preparo os reagentes poderiam ser armazenados em condiccedilotildees adequadas pelo
periacuteodo de 1 ano (AABB 2011) Ao final do preparo e durante o periacuteodo de armazenamento
de fevereiro a setembro de 2016 foi realizada inspeccedilatildeo visual para verificar a presenccedila de
precipitados ou turvaccedilatildeo A soluccedilatildeo de glicina e o tampatildeo TRIS mostraram-se estaacuteveis ateacute o
final do periacuteodo Por sua vez o reagente EDTA precipitou mesmo estando armazenado em
temperatura ambiente controlada e foi necessaacuterio novo preparo
52 AMOSTRAS DE DOADORES
521 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS AMOSTRAS
Apoacutes incubaccedilatildeo da hemaacutecia com o antissoro a mesma foi lavada 4 vezes para retirada
dos anticorpos livres A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada Caso houvesse positividade na
soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem a etapa era repetida (figura 3) Das 50 amostras sensibilizadas a
uacuteltima lavagem foi positiva somente em 3 delas Nas 3 amostras o anticorpo utilizado para
sensibilizaccedilatildeo foi o anti-K Apoacutes repetido nova etapa de lavagem os resultados se
apresentaram negativos
Em todas as amostras sensibilizadas ldquoin vitrordquo o TDA foi testado e verificado a
intensidade do teste Entre as 50 amostras 47 alcanccedilaram TDA com intensidade 3-4+ apoacutes a
primeira sensibilizaccedilatildeo enquanto 3 amostras necessitaram uma segunda incubaccedilatildeo com
anticorpo (figura 4)
A escolha dos anticorpos para sensibilizar as hemaacutecias foi feita de acordo com o
fenoacutetipo do doador e foram utilizados sete diferentes especificidades de anticorpos policlonais
humanos conforme mostra o graacutefico1
29
Figura 3 - Soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada com hemaacutecia de triagem de
anticorpos em gel LissCoombs (BIO-RAD) A finalidade eacute verificar a presenccedila de anticorpos livres na
suspensatildeo que possam interferir na pesquisa do eluato As soluccedilotildees de lavagem das amostras na figura a tiveram
resultados negativos Na figura b duas amostras a 47 e 50 apresentaram resultado positivo Nova etapa de
lavagem foi realizada e o resultado final foi negativo
522 TRATAMENTO DAS HEMAacuteCIAS
Apoacutes a sensibilizaccedilatildeo e obtenccedilatildeo de resultados de TDA com intensidade de 3 a 4+
cada uma das amostras foi dividida em duas aliacutequotas e tratada separadamente pelas teacutecnicas
de glicinaaacutecida-EDTA e cloroquina
As teacutecnicas foram consideradas efetivas quando obteve-se a completa dissociaccedilatildeo do
anticorpo verificada atraveacutes do TDA negativo na amostra poacutes tratamento conforme figuras 5
e 6 Dentre as amostras tratadas com cloroquina 2850 tiveram o TDA negativado A glicina-
aacutecidaEDTA negativou o TDA em 33 das 50 amostras tratadas Apenas 17 amostras tratadas
com glicina-aacutecidaEDTA permaneceram com o TDA positivo e foram submetidas a um novo
tratamento
30
Figura 4 - TDA das amostras apoacutes sensibilizaccedilatildeo com anticorpos policlonais humanos Amostras na
figura a com intensidades de 3-4+ Na figura b amostras 4 e 7 com intensidade menor que 3+ e portanto foram
novamente sensibilizadas com nova aliacutequota de soro Anti-D e anti-S Apoacutes a segunda sensibilizaccedilatildeo
apresentaram reatividade 4 e 3+ respectivamente Os anticorpos utilizados para sensibilizaccedilatildeo foram D S c E
C e K
523 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS TEacuteCNICAS
No tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA houve dissociaccedilatildeo completa do anticorpo
em 33 amostras (66) das 50 amostras testadas enquanto que com a cloroquina foram 28
amostras (56) (tabela 1)
31
Graacutefico 1- Nuacutemero de amostras sesnsibilizadas por especificidade de anticorpo Entre as 50 amostras 12
foram sensibilizadas com anti-D 10 com anti-C 9 com anti-E 8 com anti-c 7 com anti-S 3 com anti-K e 1
com anti-Dia As especificidades dos anticorpos foram definidas de acordo o fenoacutetipo do doador
Figura 5 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com cloroquina Nas amostras onde houve
a dissociaccedilatildeo do anticorpo ( 2 21 a 23 26 39 a 42 45 46 e 49) a hemaacutecia se deposita no fundo no microtubo
apoacutes a centrifugaccedilatildeo (TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (1 3 24 25 43 44 47
48 e 50) o anticorpo ligado agraves hemaacutecias eacute alvo da AGH presente no gel (TDA positivo)
Anti-D 12
Anti-C 10
Anti-E 9
Anti-c 8
Anti-S 7
Anti-K 3 Anti-Dia 1
32
Figura 6 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA Nas amostras
onde houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo (4 6 7 12 a 15 17 34 35 37 e 38) a hemaacutecia se deposita no fundo no
microtubo apoacutes a centrifugaccedilatildeo ( TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (5 16 18
19 20 33 e 36 ) o AGH presente no gel se liga ao anticorpo ligado agraves hemaacutecias que ficam retidas no gel (TDA
positivo)
Tabela 1-Resultado geral do tratamento das hemaacutecias com glicina e cloroquina
Teacutecnica utilizada TDA negativo TDA positivo Total
Glicina-aacutecidaEDTA 33 17 50
Cloroquina 28 22 50
A glicina-aacutecidaEDTA conseguiu negativar mais amostras sensibilizadas com Anti-D
e anti-K que a cloroquina Para as hemaacutecias sensibilizadas com anti-E Anti-S e Anti-Dia
ambas as teacutecnicas dissociaram o anticorpo em 100 das amostras Os resultados detalhados
por especificidade do anticorpo apoacutes o primeiro tratamento com glicina-aacutecidaEDTA e com
cloroquina estatildeo na tabela 2
Para as amostras que permaneceram positivas (17 amostras) apoacutes o tratamento com a
glicina-aacutecidaEDTA foi realizado um novo tratamento Houve dissociaccedilatildeo do anticorpo em 3
amostras (18) apoacutes a segunda tentativa Nas demais 14 (82) amostras tratadas pela
segunda vez 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise
33
Tabela 2 - Resultados do TDA apoacutes tratamento das hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo
sensibilizado
ANTICORPOS
SENSIBILIZADOS
1ordm TRATAMENTO COM
GLICINA
TRATAMENTO COM
CLOROQUINA
TOTAL TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
Anti-D 8 4 0 12 12
Anti-C 6 4 10 0 10
Anti-E 9 0 9 0 9
Anti-c 0 8 1 7 8
Anti-S 7 0 7 0 7
Anti-K 2 1 0 3 3
Anti-Dia 1 0 1 0 1
TOTAL 33 17 28 22 50
A hemoacutelise foi verificada durante o procedimento de lavagem final das hemaacutecias com
soluccedilatildeo fisioloacutegica para a retirada dos reagentes As soluccedilotildees de lavagem ficaram
avermelhadas e as hemaacutecias com coloraccedilatildeo escura As amostras foram descartadas Dentre as
6 amostras que ainda puderam ser testadas para o TDA trecircs amostras negativaram sendo 1
sensibilizada com anti-D e 2 com anti-C (tabela 3)
Tabela 3 - Resultado apoacutes o segundo tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA
Tratamento com
glicina-aacutecidaEDTA
TDA Negativo TDA Positvo Hemoacutelise Total
Segundo tratamento 3 3 11 17
524 TESTAGEM DO ELUATO
Apoacutes o tratamento com a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA a soluccedilatildeo do eluato foi
testada para verificar a viabilidade dos anticorpos que foram dissociados ou eluiacutedos Dentre
as 50 amostras 41 apresentaram eluato positivo As nove amostras cujos eluatos foram
negativos haviam sido sensibilizadas com as seguintes especificidades de anticorpos anti-E 6
amostras (67) anti-S 2 amostras (40) e anti-D 1 amostra (8) (tabela 4) O eluato de
todas as amostras sensibilizadas com os anticorpos anti-C anti-c Anti-K e Anti-Dia foram
positivos Os eluatos positivos na triagem de anticorpos foram testados com paineacuteis de
identificaccedilatildeo para confirmar a especificidade e a viabilidade dos anticorpos (figuras 7 e 8)
34
525 EFEITO DA ELUICcedilAtildeO SOBRE OS ANTIacuteGENOS ERITROCITAacuteRIOS
Para verificar o efeito do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA e com a cloroquina
sobre a expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s foi realizada a fenotipagem das
amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes tratamento com ambas as teacutecnicas Foi avaliado
se o tratamento destruiu os antiacutegenos expressos antes do tratamento
Tabela 4- Resultado do Eluato das amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA
Anticorpos Eluato positvo Eluato negativo Total
Anti-D 11 1 12
Anti-C 10 0 10
Anti-E 3 6 9
Anti-c 8 0 8
Anti-S 5 2 7
Anti-K 3 0 3
Anti-Dia 1 0 1
Total 41 9 50
Figura 7 ndash Painel do eluato da amostra 21 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-C que foi
recuperado no eluato
Figura 8 ndash Painel do eluato da amostra 47 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-K que foi
recuperado no eluato
35
Dentre as 50 amostras 26 eram previamente fenotipadas para os antiacutegenos Fya Fy
b
Jka Jk
b S e s Dentre elas 20 alcanccedilaram TDA negativo apoacutes tratamento com a glicina-
aacutecidaEDTA e 20 negativaram apoacutes tratamento com cloroquina (tabela 5) Apoacutes ambas as
teacutecnicas os antiacutegenos originalmente expressos permaneceram positivos comprovando que natildeo
houve destruiccedilatildeo dos mesmos
Tabela 5 ndash Verificaccedilatildeo da interferecircncia do tratamento da hemaacutecias com cloroquina e glicina-
aacuteicdaEDTA sobre os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
AMOSTRAS
COM
FENOTIPAGEM
PREacuteVIA
TRATADAS COM
CLOROQUINA
TRATADAS COM
GLICINA
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
26
20
20
20
20
As amostras 24 47 e 50 eram positivas para o antiacutegeno K A cloroquina natildeo dissociou
o anticorpo em nenhuma das 3 amostras enquanto a glicina-aacutecidaEDTA foi efetiva nas
amostras 24 e 50 Foi testada a expressatildeo do antiacutegeno K nas amostras 24 e 50 apoacutes o
tratamento utilizando meacutetodo indireto em gel contendo AGH Apesar de natildeo ter sido avaliado
a intensidade de reaccedilatildeo de expressatildeo dos antiacutegenos podemos verificar na figura 9 que nas
duas amostras em que a teacutecnica foi efetiva e dissociou o anticorpo a expressatildeo do antiacutegeno K
continua presente mas a reatividade observada pode ser considerada 1+ sugerindo que houve
diminuiccedilatildeo da expressatildeo do antiacutegeno quando comparado com a expressatildeo observada em
hemaacutecia natildeo tratada
Os resultados individuais de cada amostra em ambas as teacutecnicas encontram-se
resumidas na tabela 6
526 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente onde foi constatada a presenccedila de autoanticorpo
a quente da classe IgG pelo TDA monoespeciacutefico (figura 10)O autoanticorpo tambeacutem
interferia na pesquisa e identificaccedilatildeo de anticorpos irregulares pois apresentava caracteriacutestica
de panaglutinina As hemaacutecias da paciente sensibilizadas ldquoin vivordquo foram tratadas com
cloroquina e com glicina-aacutecidaEDTA
36
Figura 9 ndash Fenotipagem das amostras 24 e 50 para antiacutegeno K apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
O teste positivo indica a presenccedila do antiacutegeno poreacutem a reatividade fraca (1+) sugere que houve enfraquecimento
de sua expressatildeo A direita a expressatildeo forte (4+) do antiacutegeno Kell em hemaacutecia controle natildeo tratada utilizada
como controle positivo
A cloroquina natildeo foi efetiva na retirada do anticorpo ligado as hemaacutecias ao contraacuterio
do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA que dissociou o anticorpo (figura 11)
A hemaacutecia tratada com glicina foi fenotipada para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
(figura 12) A fenotipagem para o sistema Rh (C c E e e) e Kell foi realizada em gel
especiacutefico monoclonal sem interferecircncia do TDA positivo (controle da reaccedilatildeo negativo)
O eluato resultante do tratamento com glicina-aacutecidaEDTA foi testada em gel com
hemaacutecias de painel de identificaccedilatildeo de anticorpos e apresentou resultado positivo com todas
as ceacutelulas (figura 13 e 14)
A amostra foi enviada para genotipagem e o resultado da genotipagem confirmou o
resultado da fenotipagem apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
527 TEMPO DE EXECUCcedilAtildeO DA TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
O tempo de reaccedilatildeo da glicina-aacutecidaEDTA eacute de 2 minutos Todas as amostras foram
tratadas obedecendo ao tempo descrito na literatura demonstrando que o mesmo eacute
reprodutiacutevel
37
Tabela 6- Resultados individuais por amostra
Amostra Especificidade
dos anticorpos
Intensidade do
TDA apoacutes
sensibilizaccedilatildeo
Tratamento
efetivo com
cloroquina
Tratamento
efetivo com
glicina
Eluato
poacutes
glicina
1 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 2 Dia 3+ Sim Sim 3+ 3 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 4 D 4+ Natildeo Sim 4+ 5 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 6 E 3+ Sim Sim Negativo 7 S 4+ Sim Sim 3+ 8 E 3+ Sim Sim 1+ 9 E 3+ Sim Sim 2+
10 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 11 D 4+ Natildeo Sim 4+ 12 D 4+ Natildeo Sim 4+ 13 S 3+ Sim Sim 3+ 14 S 3+ Sim Sim 3+ 15 D 3+ Natildeo Sim 3+ 16 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 17 E 3+ Sim Sim (+) 18 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 19 D 4+ Natildeo Natildeo 3+ 20 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 21 C 3+ Sim Sim 4+ 22 C 3+ Sim Sim 4+ 23 C 3+ Sim Sim 4+ 24 K 4+ Natildeo Sim 4+ 25 D 3+ Natildeo Natildeo Negativo 26 E 4+ Sim Sim Negativo 27 S 3+ Sim Sim 3+ 28 C 3+ Sim Natildeo 4+ 29 C 3+ Sim Sim 4+ 30 C 3+ Sim Sim 4+ 31 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 32 E 3+ Sim Sim Negativo 33 C 3+ Sim Natildeo 4+ 34 S 3+ Sim Sim Negativo 35 S 3+ Sim Sim Negativo 36 C 4+ Sim Natildeo 4+ 37 c 4+ Natildeo Natildeo 4+ 38 D 4+ Natildeo Sim 4+ 39 S 3+ Sim Sim 3+ 40 c 4+ Sim Natildeo 2+ 41 C 4+ Sim Natildeo 4+ 42 E 3+ Sim Sim Negativo 43 D 3+ Natildeo Sim 2+ 44 D 3+ Natildeo Sim 2+ 45 E 3+ Sim Sim Negativo 46 C 3+ Sim Sim 4+ 47 K 4+ Natildeo Natildeo 4+ 48 D 3+ Natildeo Sim 2+ 49 E 3+ Sim Sim Negativo 50 K 4+ Natildeo Sim 4+
TOTAL 50 28 33 41
38
Figura 10 ndash TDA monoespeciacutefico da amostra de paciente Hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo da classe
IgG
oacute Figura 11 ndash TDA apoacutes o tratamento com glicina-aacutecidaEDTA (esquerda) e cloroquina (direita) A glicina
negativou completamente o TDA enquanto a hemaacutecia tratada com cloroquina persistiu positiva (1+)
39
Figura 12 ndash Fenotipagem da amostra tratada com glicina-aacutecidaEDTA Fy(a+b+) Jk(a-b+) S+s+
Figura 13 ndash Painel em gel (LissAGH) do eluato apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de
intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
Figura 14 ndash ndash Painel ezimaacutetico (hemaacutecias tratadas com bromelina) do eluato em gel neutro apoacutes
tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
40
528 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Quanto a efetividade das teacutecnicas em negativar o TDA foi verificado que a glicina-
aacutecidaEDTA foi efetiva em 66 das amostras testadas no primeiro tratamento (3350
amostras) enquanto a cloroquina conseguiu negativar 56 (2850) Esses resultados natildeo
apresentam diferenccedila significativa (pgt005) demostrando que a teacutecnica da glicina-
aacutecidaEDTA natildeo eacute superior mas eacute tatildeo efetiva quanto a da cloroquina
Quando aliamos os resultados de ambas as teacutecnicas verificamos que em 76 (3850)
das amostras o TDA foi negativado Esse dado indica que ainda que uma teacutecnica natildeo seja
eficaz na remoccedilatildeo do anticorpo eacute uma boa alternativa tentar a segunda teacutecnica jaacute que a falha
em remover o anticorpo utilizando uma delas natildeo prevecirc necessariamente a falha com a outra
Quando se utiliza o teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla (graacutefico 2) para comparar a utilizaccedilatildeo das
duas teacutecnicas com o resultado de cada uma isolada (somente a cloroquina ou somente a
glicina) verificamos que os resultados apresentam diferenccedila significativa (plt005) (quadro 3)
TRATAMENTO EFETIVO COM TOTAL PORCENTAGEM
Glicina ou cloroquina 38 76
Glicina e cloroquina 23 46
Glicina apenas 10 20
Cloroquina apenas 5 10
Nenhuma das teacutecnicas 12 24
Quadro 3 - Resultados comparativos entre as teacutecnicas utilizadas
41
Graacutefico 2 - Teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla entre as teacutecnicas aplicadas A- Glicina e Cloroquina B-Cloroquina C-
Glicina ( plt005)
42
6 DISCUSSAtildeO
Os reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA podem ser adquiridos em
forma de kit comercial prontos para uso poreacutem natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil A preparaccedilatildeo
dos reagentes ldquoin houserdquo a partir de sais comerciais adquiridos se mostrou viaacutevel Os
reagentes glicina e o tampatildeo Tris armazenados de forma correta se mantiveram estaacuteveis por
um periacuteodo de 7 meses Somente o reagente EDTA precipitou mesmo armazenado em
condiccedilotildees adequadas sugerindo que o mesmo deve ser preparado em menor quantidade e
armazenado em aliacutequotas A soluccedilatildeo de cloroquina tambeacutem pode ser preparada ldquoin houserdquo e
pode ser armazenado por um mecircs A legislaccedilatildeo brasileira autoriza a utilizaccedilatildeo de reagentes
preparados a partir de sais comerciais como a cloroquina e a glicina-aacutecidaEDTA desde que
os sais tenham autorizaccedilatildeo da vigilacircncia sanitaacuteria para a comercializaccedilatildeo (BRASIL 2001)
A comparaccedilatildeo quanto a efetividade em dissociar anticorpos em amostras com TDA
positivos entre a teacutecnica da glicina e a teacutecnica da cloroquina mostrou que natildeo haacute diferenccedila
estatiacutestica entre elas e que ambas satildeo igualmente eficientes Se utilizadas conjuntamente haacute
maior possibilidade de elucidaccedilatildeo dos casos
Uma vantagem da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eacute que ela permite numa mesma
amostra eluir o anticorpo ligado aacute hemaacutecia assim como fenotipar a hemaacutecia tratada Devido a
sua dupla utilidade a teacutecnica eacute vantajosa principalmente em pacientes em que pouco volume
de amostra pode ser coletado como em casos de crianccedilas e receacutem-nascidos
A fenotipagem poacutes tratamento se mostrou viaacutevel jaacute que os antiacutegenos de maior
importacircncia natildeo sofreram alteraccedilotildees Nas 20 amostras que foram fenotipadas antes e apoacutes
tratamento para verificar a influecircncia dos reagentes na expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a
Jkb S e s natildeo houve destruiccedilatildeo dos mesmos por nenhuma das duas teacutecnicas
Para as amostras positivas para o antiacutegeno Kell (350) e sensibilizadas com o
respectivo anticorpo a teacutecnica da glicina foi efetiva em negativar o TDA em apenas duas
delas mas apoacutes o tratamento foi verificada uma fraca reatividade da reaccedilatildeo antiacutegeno-
anticorpo sugerindo que houve um enfraquecimento da expressatildeo do antiacutegeno conforme
esperado e descrito na literatura (BYRNE 1991 PALLAS WILER E MCGEE 1991
ROZIERS e SQUALI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012 e KATHARIA e
CHAUDHARY 2013) A accedilatildeo da glicina sobre o antigeno Kell natildeo representa impedimento
para seu uso uma vez que na impossibilidade de testar o antiacutegeno Kell o banco de sangue
consegue facilmente atender a solicitaccedilatildeo de transfusatildeo com unidades de hemaacutecias Kell
43
negativas jaacute que eacute um antiacutegeno de baixa prevalecircncia na populaccedilatildeo variando de 15 na
populaccedilatildeo africana a 9 nos europeus (DANIELS 2011)
A soluccedilatildeo resultante da dissociaccedilatildeo do anticorpo pela teacutecnica da glicina pode ainda ser
utilizada como eluato podendo substituir a teacutecnica de eluiccedilatildeo com reagentes comercias (kits
de eluiccedilatildeo aacutecida) que tem alto custo aproximadamente entre R$2000 a R$2500 por teste
Em 41 amostras (82) houve a dissociaccedilatildeo e recuperaccedilatildeo do anticorpo que estava
sensibilizando as hemaacutecias Em 9 amostras (18) os anticorpos foram eluiacutedos poreacutem
apresentaram reaccedilatildeo negativa quando testadas com hemaacutecias de triagem entre eles o anti-E
(6) anti-S (2) e Anti-D (1) Eacute possiacutevel que a correccedilatildeo pH do meio (WALKER 2011) natildeo
tenha sido adequada o que pode ter desfavorecido a reatividade do anticorpo
Para as amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA nas quais natildeo houve dissociaccedilatildeo do
anticorpo pelo primeiro tratamento (1750) o segundo tratamento natildeo se mostrou eficaz jaacute
que 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise O tempo de
armazenagem natildeo parece ter influenciado jaacute que todas as amostras foram testadas dentro de
48 horas apoacutes a coleta Outros fatores que natildeo foram verificados podem ter levado a
hemoacutelise Apesar da literatura (LOUIE JIENG e ZEROULIS 1986 e BYRNE 1991)
recomendar um segundo tratamento ele eacute pouco eficaz tendo negativado apenas 3 das 17
amostras testadas
A amostra de paciente que apresentou sensibilizaccedilatildeo ldquoin vivordquo mostrou melhor
efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA sobre a da cloroquina possibilitando
fenotipagem para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s que natildeo foram destruiacutedos apoacutes o
tratamento comprovado atraveacutes da genotipagem
A presenccedila de autoanticorpo a quente com presenccedila de hemoacutelise (AHAI) ou natildeo pode
mascarar a presenccedila de aloanticorpo interferindo na rotina soroloacutegica da fenotipagem que eacute
uma importante ferramenta para auxiliar na seleccedilatildeo de hemaacutecias para transfusatildeo (SHIREY et
al 2002) Esses pacientes frequentemente possuem aloanticorpos associados ao
autoanticorpo e a prevalecircncia de aloimunizaccedilatildeo entre eles varia entre 12 a 40 (LEGER e
GARRATY 1999 BRANCH e PETZ 1999) o que dificulta ainda mais a escolha do melhor
componente a ser transfundido aleacutem de aumentar a possibilidade reaccedilotildees hemoliacuteticas imunes
poacutes-transfusionais
Nesses casos as teacutecnicas de dissociaccedilatildeo de anticorpos satildeo importantes para tratar
amostras de pacientes e a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser usada como uma opccedilatildeo
pois se mostrou eficaz na dissociaccedilatildeo anticorpo ligado agraves hemaacutecias deixando livre a
superfiacutecie das mesmas permitindo a fenotipagem por antisoros IgG Paralelamente os
44
anticorpos eluiacutedos tambeacutem puderam ser estudados O mesmo natildeo ocorre com a cloroquina
que permite apenas a fenotipagem e tampouco com os kits de eluiccedilatildeo aacutecida disponiacuteveis no
mercado nacional que satildeo destinados a realizaccedilatildeo do eluato mas destroem as hemaacutecias
O tempo de tratamento na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA tambeacutem eacute uma vantagem
pois foi possiacutevel reproduzir no tempo determinado de 2 minutos enquanto a cloroquina
demora ateacute duas horas
Ainda que a aplicaccedilatildeo das teacutecnicas por biologia molecular estejam cada vez mais
presentes na rotina imuno-hematoloacutegica e possibilitam estabelecer o fenoacutetipo deduzido do
genoacutetipo elas natildeo estatildeo disponiacuteveis na maioria dos centros e sua realizaccedilatildeo exige algumas
horas A resoluccedilatildeo imediata do problema transfusional necessita dos resultados soroloacutegicos
pois com frequecircncia natildeo eacute possiacutevel aguardar o resultado do teste molecular Dessa forma
apesar da crescente importacircncia da genotipagem eritrocitaacuteria teacutecnicas soroloacutegicas aplicadas
corretamente e no momento propiacutecio satildeo de grande utilidade para resolver problemas imuno-
hematoloacutegicos como ocorre com a fenotipagem em pacientes com TDA positivo
45
7 CONCLUSAtildeO
A teacutecnica da glicina aacutecidaEDTA mostrou-se efetiva em remover os anticorpos que
sensibilizavam as hemaacutecias e pode ser utilizada com seguranccedila antes da fenotipagem
eritrocitaacuteria Por ser uma teacutecnica de raacutepida execuccedilatildeo eacute uma alternativa aplicaacutevel
principalmente em casos urgentes de pacientes que apresentam autoanticorpos
46
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Medicina Transfusional 2ordf ed Satildeo Paulo Atheneu 2014
50
9 ANEXOS
51
FUNDACcedilAtildeO HEMOCENTRO DE RIBEIRAtildeO PRETO
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE)
Tiacutetulo da pesquisa Aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina aacutecida-EDTA e avaliaccedilatildeo da
eficaacutecia no tratamento de hemaacutecias com teste direto da antiglobulina positivo
Pesquisadora responsaacutevel Ceacutelia Kazue Abiko
Orientador Prof Dimas Tadeu Covas
Co-orientadora Dra Flaacutevia Leite Souza Santos
Objetivo da pesquisa Vocecirc estaacute sendo convidado a participar de uma pesquisa que tem
como objetivo padronizar uma nova teacutecnica para auxiliar na tipagem sanguiacutenea de pacientes
A tipagem sanguiacutenea pode sofrer interferecircncia da presenccedila de anticorpos ligados aos gloacutebulos
vermelhos do sangue Nessas situaccedilotildees eacute difiacutecil selecionar o melhor sangue para o paciente e
eacute preciso a utilizaccedilatildeo de teacutecnicas adicionais para remover essas interferecircncias
Esta pesquisa tem como objetivo estudar outra teacutecnica para remover esses anticorpos e
comparaacute-la com a teacutecnica atualmente utilizada Para isso precisamos de amostras de pacientes
e doadores voluntaacuterios
Se vocecirc eacute um doador eacute necessaacuterio que vocecirc autorize a coleta de 5 ml (1 tubo) a mais
de seu sangue
Se vocecirc eacute um paciente natildeo haveraacute necessidade de nova amostra pois utilizaremos as
amostras jaacute coletadas para os testes preacute-transfusionais e os resultados encontrados nesta
pesquisa natildeo iratildeo interferir na escolha da (s) bolsa (s) de sangue que vocecirc possa vir a receber
Se vocecirc concordar em participar leia com atenccedilatildeo o texto abaixo e assine as duas vias
rubricando todas as paacuteginas deste termo de consentimento Uma via original assinada e
rubricada por vocecirc e pela pesquisadora ficaraacute com vocecirc
As suas informaccedilotildees seratildeo mantidas em sigilo pela pesquisadora e natildeo haveraacute
armazenamento de material para pesquisas posteriores Os seus dados seratildeo usados apenas
neste estudo e quando o trabalho for publicado seu nome e qualquer outra informaccedilatildeo que
possam identificaacute-lo natildeo seratildeo revelados
Eacute pouco provaacutevel que o que noacutes aprendermos com este estudo tenha um benefiacutecio
direto para vocecirc assim como natildeo poderemos dar nada em troca pela sua participaccedilatildeo na
pesquisa
Nosso objetivo com esta pesquisa eacute que os resultados poderatildeo ser uacuteteis para o
tratamento de pacientes no futuro Os riscos da participaccedilatildeo satildeo miacutenimos Se vocecirc eacute um
doador de sangue a amostra seraacute coletada no momento da doaccedilatildeo natildeo exigindo punccedilatildeo
venosa adicional
52
Eacute seu direito ter acesso aos resultados dos testes da pesquisa Esses resultados natildeo
seratildeo fornecidos automaticamente a vocecirc mas caso vocecirc se interesse em saber o resultado ou
tiver alguma duacutevida sobre a sua participaccedilatildeo neste estudo deveraacute entrar em contato com Ceacutelia
Kazue Abiko pelo telefone (18) 99718-3551
Vocecirc tem total liberdade de optar por natildeo participar da pesquisa Caso aceite
participar poderaacute desistir a qualquer momento ou retirar seu consentimento mesmo apoacutes ter
coletado o sangue Para cancelar sua participaccedilatildeo basta avisar a pesquisadora e os seus dados
seratildeo retirados do projeto
Qualquer duacutevida eacutetica sobre a pesquisa poderaacute entrar em contato com o Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa do Hospital das Cliacutenicas e da Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto
(CAMPUS UNIVERSITAacuteRIO bairro Monte Alegre CEP 14048-900 Ribeiratildeo Preto-SP
Telefone (16) 3602-2228 FAX (16) 3633-1144 e-mail cephcrpuspbr)
Consentimento de participaccedilatildeo
A Consentimento do participante
Li as informaccedilotildees acima sobre o estudo e recebi explicaccedilotildees sobre a participaccedilatildeo no estudo
Portanto dou o meu consentimento para participar do estudo
___________________________________________________________________________
Nome completo
___________________________________________________________________________
Assinatura
___________
Data
__________________________________________________________________________________
Nome completo da pesquisadora
___________________________________________________________________________
Assinatura
_____________
Data
RESUMO
Os testes preacute-transfusionais satildeo o conjunto de teacutecnicas imuno-hematoloacutegicas aplicadas nas
amostras do receptor e do doador com a finalidade de fornecer uma unidade de hemaacutecias
compatiacutevel e segura para a transfusatildeo Aleacutem da fenotipagem ABO e Rh obrigatoacuteria nos testes
preacute-transfusionais a determinaccedilatildeo do perfil antigecircnico de outros antiacutegenos eritrocitaacuterios de
importacircncia cliacutenica melhora a seguranccedila transfusional especialmente para pacientes
previamente aloimunizados ou candidatos agrave transfusatildeo crocircnica Para tais pacientes conhecer o
fenoacutetipo eritrocitaacuterio permite a seleccedilatildeo de concentrados de hemaacutecias com o mesmo fenoacutetipo
o que previne reaccedilotildees transfusionais hemoliacuteticas assim como nova aloimunizaccedilatildeo
Indiviacuteduos que apresentam as hemaacutecias sensibilizadas ldquoin vivordquo por anticorpos anti-
eritrocitaacuterios como ocorre na anemia hemoliacutetica autoimune (AHAI) teratildeo o teste direto da
antiglobulina (TDA) positivo dificultando a realizaccedilatildeo da fenotipagem O TDA positivo
provoca resultados falsos positivos especialmente quando satildeo utilizados para a fenotipagem
soros comerciais da classe IgG que exigem a fase de antiglobulina humana ou teste indireto
da antiglobulina (TIA) para leitura Em 1982 Edwards Moulds e Judd propuseram a
utilizaccedilatildeo da teacutecnica da cloroquina para dissociar os complexos de antiacutegeno-anticorpo
preservando a membrana eritrocitaacuteria e permitindo a fenotipagem Atualmente eacute a teacutecnica
mais utilizada nos centros brasileiros A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA foi primeiramente
descrita por Louie Jieng e Zeroulis em 1986 poreacutem eacute pouco utilizada por natildeo haver os
reagentes prontos comercialmente no mercado brasileiro O presente estudo avaliou a teacutecnica
da glicina-aacutecida-EDTA com reagentes preparados ldquoin houserdquo em paralelo agrave teacutecnica da
cloroquina que eacute atualmente a teacutecnica aplicada no Hemocentro de Ribeiratildeo Preto Para isso
amostras de hemaacutecias de doadores (n=50) com fenoacutetipo conhecido foram sensibilizadas com
anticorpos humanos de especificidade conhecida e ambas as teacutecnicas foram aplicadas Foi
verificado ainda o efeito da teacutecnica sobre a expressatildeo dos antiacutegenos eritrocitaacuterios (Fya Fy
b
Jka Jk
b S e s) atraveacutes da fenotipagem das amostras que tiveram o TDA negativado A
viabiliadade dos anticorpos presentes no eluato recuperado apoacutes tratamento com a glicina-
aacutecidaEDTA tambeacutem foi testada A glicina-aacutecidaEDTA foi efetiva em negativar o TDA em
33 amostras (66) comparaacutevel com a cloroquina que negativou 28 amostras (56) O eluato
apresentou-se viaacutevel no tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA e natildeo foi constatada destruiccedilatildeo
dos antiacutegenos eritrocitaacuterios apoacutes o tratamento Concluiacutemos que a teacutecnica da glicina-
aacutecidaEDTA pode ser utilizada como uma opccedilatildeo no tratamento de hemaacutecias com TDA
positivo com a vantagem de seu tempo de execuccedilatildeo ser inferior ao da cloroquina (2minutos x
30 a 120 minutos) o que lhe torna uacutetil em situaccedilotildees de maior urgecircncia Quando ambas as
teacutecnicas satildeo utilizadas em hemaacutecias diferentes de uma mesma amostra a efetividade estaacute
significativamente aumentada (plt005)
Palavras chave Glicina-aacutecidaEDTA Teste direto da antiglobulina AHAI fenotipagem
ABSTRACT
The pre-transfusion tests are the group of immunohematology techniques applied in the
receptor and donor samples in order to provide a unit of red blood cells compatible and safe
for transfusion In addition to the obligatory ABO and Rh phenotyping in the pre-transfusion
tests the determination of the antigenic profile of other red cells antigens of clinical
importance improves transfusion safety especially for patients previously alloimmunized or
candidates for chronic transfusion For such patients knowing the phenotype allows the
selection of red blood cell concentrates with the same phenotype which prevents hemolytic
transfusion reactions as well as new alloimmunization Individuals who have antibody-coated
red blood cells sensitized in vivo such as in autoimmune hemolytic anemia (AHAI) will
have a direct antiglobulin test (DAT) positive making it difficult to perform phenotyping
Positive DAT causes false positive results especially when commercially available IgG
serums which require the human antiglobulin phase or indirect antiglobulin test (IAT) for
reading are used for phenotyping In 1982 Edwards Molds and Judd proposed the use of the
chloroquine technique to dissociate antigen-antibody complexes by preserving the erythrocyte
membrane and allowing phenotyping It is currently the most used technique in Brazilian
centers The EDTAglycine-acid technique was first described by Louie Jieng and Zeroulis in
1986 but it is little used because commercially available reagents are not available in the
Brazilian market The present study evaluated the EDTAglycine-acid technique with reagents
prepared in house in parallel to the chloroquine technique which is currently the technique
applied at the Hemocentro de Ribeiratildeo Preto For this donor red cells samples (n = 50) with
known phenotype were sensitized with human antibodies of known specificity and both
techniques were applied The effect of the technique on the expression of erythrocyte antigens
(Fya Fy
b Jk
a Jk
b S and s) was also verified by the phenotyping of the samples that had
negative DAT The viability of the antibodies present in the recovered eluate after treatment
with EDTAglycine-acid A was also tested EDTAglycine-acid was effective in negatively
affecting DAT in 33 samples (66) comparable to chloroquine that negatived 28 samples
(56) The eluate was viable in treatment with EDTAglycine-acid and no destruction of
erythrocyte antigens after treatment We conclude that the EDTA glycine-acid technique can
be used as an option in the treatment of red cells with TDA positive with the advantage that
its execution time is inferior to that of chloroquine (2 minutes x 30 to 120 minutes) which
makes it useful in emergency situations When both techniques are used in different
erythrocytes of the same sample the effectiveness is significantly increased (p lt005)
Key words EDTAglycine-acid direct antiglobulin test AIHA phenotyping
1 INTRODUCcedilAtildeO
A transfusatildeo de hemaacutecias eacute um recurso terapecircutico muito importante e eficaz e tem se
mostrado como um grande aliado no tratamento de diversas patologias auxiliando na
melhoria da sobrevida e qualidade de vida de diversos pacientes quando indicada de forma
correta Eacute provavelmente a modalidade de terapia mais utilizada no mundo sendo
considerada a forma mais antiga de terapia celular A transfusatildeo de hemaacutecias em pacientes
com anemia grave ou sangramento agudo reestabelece o niacutevel de hemoglobina moleacutecula
responsaacutevel pelo transporte de oxigecircnio para os tecidos melhorando a isquemia tecidual
(BARJAS-CASTRO 2013 ZAGO 2014)
A transfusatildeo de componentes celulares como o concentrado de hemaacutecias deve ser
bem avaliada quanto aos riscos e benefiacutecios Os testes preacute-transfusionais satildeo parte obrigatoacuteria
do processo transfusional e tecircm como funccedilatildeo assegurar que o melhor hemocomponente seja
selecionado para o paciente reduzindo assim a chance de transfusotildees incompatiacuteveis e reaccedilotildees
transfusionais (BARJAS-CASTRO 2013)
11TESTES PREacute-TRANSFUSIONAIS
Os testes preacute-transfusionais tecircm a finalidade de evitar a ocorrecircncia de reaccedilotildees
hemoliacuteticas no receptor decorrentes da transfusatildeo de hemaacutecias incompatiacuteveis do doador
(DOWNES e SHULMAN 2011) Tem como propoacutesito selecionar hemaacutecias que apoacutes
transfusatildeo deveratildeo ter sobrevida normal ou mais proacutexima do normal (MELO 2007)
Os testes preacute-transfusionais que consistem no conjunto de teacutecnicas
imunohematoloacutegicas aplicadas agraves amostras do receptor e doador devem ser realizados antes
de toda transfusatildeo A aplicaccedilatildeo desses testes tem como finalidade fornecer uma unidade de
hemaacutecias compatiacutevel e elevar a seguranccedila da transfusatildeo Os testes preacute-transfusionais aliados
a utilizaccedilatildeo de novas tecnologias tem historicamente evitado reaccedilotildees transfusionais
hemoliacuteticas garantindo a seguranccedila transfusional em cerca de 95 dos pacientes que recebem
transfusatildeo Eacute imprescindiacutevel poreacutem a execuccedilatildeo correta das teacutecnicas envolvidas nos testes preacute-
transfusionais e ainda garantir a identificaccedilatildeo correta do receptor e das amostras de sangue e
das unidades de hemaacutecias (CASTILHO 2000 MELO 2007 BARJAS-CASTRO 2013)
2
Todos os testes que compotildeem a rotina preacute-transfusional usam meacutetodos soroloacutegicos
que envolvem a reaccedilatildeo antiacutegeno x anticorpo Ao testar a presenccedila de um antiacutegeno na
superfiacutecie da hemaacutecia eacute necessaacuterio dispor de um soro com especificidade conhecida para
aquele antiacutegeno Por outro lado testar a presenccedila de um determinado anticorpo no soro ou no
plasma exige o uso de hemaacutecias com perfil antigecircnico conhecido Os testes preacute-transfusionais
incluem tipagem ABO (direta e reversa) tipagem Rh pesquisa de anticorpos irregulares no
sangue do receptor retipagem ABO e Rh do hemocomponente e prova de compatibilidade
entre as hemaacutecias do doador e soro ou plasma do receptor em caso de transfusatildeo de hemaacutecias
ou hemocomponentes que contenham mais de 2 mL de volume eritrocitaacuterio como o
concentrado de granuloacutecitos (BRASIL 2016 GANZELLA 2014 SANTOS 2014)
Aleacutem dos testes regularmente realizados a determinaccedilatildeo do fenoacutetipo para outros
antiacutegenos eritrocitaacuterios do doador e do receptor pode ser indicada A fenotipagem eritrocitaacuteria
determina o perfil antigecircnico para outros antiacutegenos de importacircncia cliacutenica aleacutem do sistema
ABO e do antiacutegeno RhD Ela pode auxiliar a confirmaccedilatildeo de uma especificidade de anticorpo
encontrada no soro do paciente uma vez que espera-se que a sua hemaacutecia natildeo expresse o
antiacutegeno correspondente e simultaneamente eacute utilizada para selecionar um concentrado de
hemaacutecias negativo para o respectivo antiacutegeno evitando reaccedilotildees hemoliacuteticas transfusionais A
fenotipagem de candidatos a transfusotildees crocircnicas tambeacutem eacute recomendada pois esse grupo de
pacientes deve se beneficiar com a transfusatildeo profilaacutetica de unidades de hemaacutecias com
mesmo fenoacutetipo evitando assim a aloimunizaccedilatildeo assim como reaccedilotildees hemoliacuteticas provocadas
por anticorpos previamente existentes e em baixo tiacutetulo natildeo identificados pela triagem de
anticorpos (CASTILHO JUNIOR e REID 2015 DOWNES e SHULMAN 2011)
111 TIPAGEM ABORh
O sistema ABO (ISBT001) foi o primeiro sistema de grupo sanguiacuteneo a ser
descoberto Ele foi descrito em 1900 por Karl Landsteiner e eacute considerado o sistema de maior
importacircncia na praacutetica transfusional Ele eacute composto por quatro antiacutegenos A1 (ABO1) B
(ABO2) AB (ABO3) e A1 (ABO4) e eacute caracterizado pela presenccedila dos anticorpos naturais
ou seja anticorpos que surgem sem a exposiccedilatildeo preacutevia aos antiacutegenos atraveacutes de transfusatildeo ou
gestaccedilatildeo Os anticorpos ABO satildeo predominantemente da classe IgM satildeo capazes de fixar o
complemento e de provocar hemoacutelise grave intravascular caso ocorra transfusatildeo ABO
incompatiacutevel Por apresentar essa caracteriacutestica peculiar a tipagem do sistema ABO eacute
composta de duas etapas a prova direta e a prova reversa Na prova direta eacute realizada a
pesquisa dos antiacutegenos na superfiacutecie das hemaacutecias que satildeo testadas com soros comerciais
3
Anti-A e Anti-B A prova reversa por sua vez pesquisa a presenccedila de anticorpos ABO ao
testar o soro ou plasma do pacientedoador com hemaacutecias A1 e B Ambas as provas satildeo
obrigatoacuterias e devem ser concordantes para interpretaccedilatildeo do fenoacutetipo ABO (COOLING
2011 SANTOS 2014)
O sistema Rh (ISBT004) eacute o maior e mais complexo sistema de grupos sanguiacuteneos
compreendendo atualmente 54 antiacutegenos (ISBT 2016) Satildeo cinco os principais antiacutegenos do
sistema Rh D (RH1) C (RH2) E (RH3) c (RH4) e e (RH5) Esses antiacutegenos possuem alta
capacidade imunogecircnica e seus respectivos anticorpos estatildeo envolvidos na doenccedila hemoliacutetica
perinatal e em reaccedilotildees transfusionais hemoliacuteticas Os autoanticorpos quentes como ocorre na
anemia hemoliacutetica quente satildeo representados em grande parte por anticorpos contra antiacutegenos
puacuteblicos do sistema Rh (CASTILHO 2007 CHOU e WESTHOFF 2011 BARJAS-
CASTRO 2013) A tipagem RhD pesquisa o antiacutegeno D na membrana eritrocitaacuteria ao testar a
hemaacutecia com antissoros comerciais Atualmente a maior parte dos soros Anti-D
comercializados satildeo monoclonais
112 ANTICORPOS ANTI-ERITROCITAacuteRIOS
Anticorpos satildeo proteiacutenas presentes no plasma tambeacutem denominadas imunoglobulinas
Satildeo produzidas pelo sistema imune em resposta a um determinado antiacutegeno Podem ser
classificadas de acordo com suas caracteriacutesticas e propriedades em cinco classes de
imunoglobulinas IgG IgM IgA IgE e IgD (BARJAS-CASTRO 2013)
A ligaccedilatildeo entre o antiacutegeno e o anticorpo envolvem ligaccedilotildees natildeo covalentes que satildeo
reversiacuteveis Vaacuterios tipos de interaccedilotildees natildeo covalentes podem contribuir para a ligaccedilatildeo do
antiacutegeno pelo anticorpo incluindo forccedilas eletrostaacuteticas pontes de hidrogecircnio forccedilas de Van
der Walls e interaccedilotildees hidrofoacutebicas (ABBAS LICHTMAN e PILLAI 2008)
As interaccedilotildees antiacutegeno-anticorpo satildeo constituiacutedas por ligaccedilotildees dinacircmicas que sofrem
interferecircncia de alteraccedilotildees fiacutesico-quiacutemicas no meio como mudanccedilas na temperatura na forccedila
eletrostaacutetica na concentraccedilatildeo do antiacutegeno e do anticorpo e no pH O melhor pH para a reaccedilatildeo
eacute em torno de 70 no entanto raros anticorpos podem exigir acidificaccedilatildeo do meio para serem
identificados (SANTOS 2014)
Em imunohematologia satildeo pesquisados os anticorpos que reconhecem os antiacutegenos
eritrocitaacuterios de grupo sanguiacuteneo ldquoin vivordquo esses anticorpos dependendo de seu significado
cliacutenico satildeo capazes de reconhecer seus respectivos antiacutegenos sobre a hemaacutecia podendo levar
a sua destruiccedilatildeo por dois mecanismos fagocitose por macroacutefagos no sistema
4
reticuloendotelial ou por ativaccedilatildeo do sistema complemento com a formaccedilatildeo do complexo de
ataque a membrana e hemoacutelise intravascular As duas classes de anticorpos de maior
importacircncia em imunohematologia satildeo as imunoglobulinas IgG e a IgM (SANTOS 2014)
Devido a sua estrutura pentameacuterica os anticorpos da classe IgM se ligam aos
antiacutegenos localizados na superfiacutecie da membrana de hemaacutecias proacuteximas e promovem
aglutinaccedilatildeo das mesmas em meio salino ldquoin vitrordquo Anticorpos da classe IgG por sua vez
satildeo denominados ldquonatildeo aglutinantesrdquo ou ldquoincompletosrdquo pois sua estrutura de monocircmero eacute
pequena o que desfavorece a aglutinaccedilatildeo direta uma vez que uma mesma moleacutecula de IgG
natildeo alcanccedila antiacutegenos alvos em duas hemaacutecias proacuteximas Os anticorpos IgM aleacutem de terem
um tamanho maior apresentam 750 vezes maior eficiecircncia de aglutinaccedilatildeo que os anticorpos
IgG permitindo maior facilidade nas ligaccedilotildees entre as hemaacutecias (CARRUCIO e WISE 2012
GREEN e KLOSTERMANN 2012)
Nos testes ldquoin vitrordquo satildeo simulados reaccedilotildees que poderiam ocorrer ldquoin vivordquo causando
reaccedilotildees indesejaacuteveis A fase de sensibilizaccedilatildeo em que o anticorpo se liga ao antiacutegeno
correspondente natildeo eacute identificada macroscopicamente poreacutem uma vez que o anticorpo
aproxima as hemaacutecias e vence a forccedila eletrostaacutetica que naturalmente as repele chamada de
potencial zeta ocorre a aglutinaccedilatildeo Dependendo das caracteriacutesticas do anticorpo e de sua
capacidade de fixar complemento pode ocorrer tambeacutem a hemoacutelise (SANTOS 2014)
113 PESQUISA E IDENTIFICACcedilAtildeO DE ANTICORPOS IRREGULARES
A pesquisa de anticorpos irregulares eacute teste obrigatoacuterio nos testes preacute-transfusionais e
tem a finalidade de detectar anticorpos ldquoin vitrordquo que possam causar reaccedilatildeo ldquoin vivordquo
Dependendo da populaccedilatildeo estudada (pacientes x doadores) e ainda da sensibilidade do
teste a frequecircncia de anticorpos irregulares pode variar de 03 a 38 A imunizaccedilatildeo pode
ocorrer por transfusatildeo gestaccedilatildeo transplante ou injeccedilatildeo de material imunogecircnico (WALKER
2011)
Os anticorpos irregulares podem ser classificados como aloanticorpos que satildeo
voltados contra antiacutegenos ausentes na hemaacutecia autoacuteloga ou como autoanticorpos os quais
reconhecem antiacutegenos eritrocitaacuterios proacuteprios Os autoanticorpos antieritrocitaacuterios surgem em
decorrecircncia da desregulaccedilatildeo da autotoleracircncia imune relacionada agrave condiccedilotildees diversas como
doenccedilas hematoloacutegicas doenccedilas inflamatoacuterias autoimunes neoplasias infecccedilotildees e uso de
medicaccedilotildees A presenccedila do autoanticorpo associado a um quadro de anemia hemoliacutetica
caracteriza a anemia hemoliacutetica autoimune (AHAI) seja ela primaacuteria ou secundaacuteria agrave outra
5
patologia Ateacute 12 a 40 dos pacientes com autoanticorpos quentes podem apresentar
aloanticorpos de significado cliacutenico mascarados pelos autoanticorpos (SHIREY et al 2002)
Eacute importante detectar a presenccedila de anticorpos no plasmasoro de um receptor de
transfusatildeo para garantir que seja transfundido sangue compatiacutevel Quando a pesquisa de
anticorpo irregular resultar positiva para um ou mais anticorpos de relevacircncia clinica eacute
necessaacuterio confirmar a ausecircncia do respectivo antiacutegeno na hemaacutecia do receptor assim como
selecionar para transfusatildeo concentrados de hemaacutecias tambeacutem negativos para aqueles
antiacutegenos evitando assim reaccedilotildees transfusionais (WALKER 2011)
A detecccedilatildeo de um anticorpo irregular eacute inicialmente realizada pela triagem de
anticorpos na qual o soroplasma do receptor eacute testado com 2 a 3 hemaacutecias do tipo ldquoOrdquo O
conjunto de fenoacutetipos dessas hemaacutecias deve contemplar os antiacutegenos de maior importacircncia
cliacutenica Como os anticorpos irregulares de maior interesse cliacutenico satildeo na maior parte das
vezes imunes portanto da classe IgG eacute obrigatoacuteria a fase de antiglobulina (AGH) do teste
ou teste indireto da antiglobulina (TIA) uma vez que esses anticorpos satildeo incompletos
(CASTILHO JUNIOR e REID 2015) O teste de triagem estando positivo deve-se fazer a
identificaccedilatildeo da especificidade do anticorpo utilizando um painel com maior nuacutemero de
hemaacutecias fenotipadas
114 PROVA DE COMPATIBILIDADE
A prova de compatibilidade eacute um teste obrigatoacuterio em caso de transfusatildeo de
componentes eritrocitaacuterios Tambeacutem chamada de prova de compatibilidade maior deve ser
realizada antes da administraccedilatildeo de sangue total ou concentrado de hemaacutecias utilizando-se
hemaacutecias obtidas do tubo coletor da bolsa a ser transfundida e o soro ou plasma do receptor
(BRASIL 2016)
Eacute definido como o procedimento para excluir a incompatibilidade entre o doador e o
receptor Tem o objetivo de detectar anticorpos que podem natildeo ter sido encontrados na
pesquisa de anticorpos devido a ausecircncia ou pouca expressatildeo de antiacutegenos no painel de
hemaacutecias aleacutem da possibilidade de terem ocorrido erros teacutecnicos ou notacionais durante a
realizaccedilatildeo da pesquisa (MELO 2007)
6
115 FENOTIPAGEM PARA OUTROS SISTEMAS
Aleacutem da pesquisa de ABORh que eacute realizado rotineiramente a fenotipagem para
outros sistemas tambeacutem denominado ldquofenotipagem estendidardquo determina a presenccedila ou
ausecircncia de antiacutegenos considerados de importacircncia cliacutenica A fenotipagem natildeo eacute obrigatoacuteria
nos testes preacute-transfusionais poreacutem a legislaccedilatildeo atual recomenda a realizaccedilatildeo da fenotipagem
eritrocitaacuteria dos antiacutegenos C (RH2) E (RH3) c (RH4) e (RH5) K (KELL1) Fya (FY1) Fy
b
(FY2) Jka
(JK1) Jkb (JK2) S (MNS3) e s (MNS4) para pacientes aloimunizados e pacientes
com indicaccedilatildeo de transfusatildeo crocircnica (BRASIL 2016)
A seleccedilatildeo de concentrados de hemaacutecias com o mesmo fenoacutetipo do receptor para
transfusatildeo pode evitar reaccedilotildees transfusionais hemoliacuteticas no paciente previamente
aloimunizado tambeacutem previne a sensibilizaccedilatildeo por outros antiacutegenos o que normalmente
torna as transfusotildees seguintes ainda mais complicadas A fenotipagem do paciente tambeacutem
auxilia na identificaccedilatildeo dos anticorpos pois espera-se que nas hemaacutecias do paciente o
antiacutegeno seja negativo para o anticorpo encontrado servindo de guia para teste de exclusatildeo de
anticorpos (SANTOS 2014 WALKER 2011)
A incidecircncia de aloanticorpos aumenta com o nuacutemero de transfusotildees no entanto a
implantaccedilatildeo de rotina de fenotipagem com transfusatildeo profilaacutetica de hemaacutecias com fenoacutetipo
compatiacutevel para pacientes candidatos agrave politransfusatildeo como os portadores de doenccedila
falciforme talassemia anemia aplaacutestica doenccedilas linfo e mieloproliferativas renais crocircnicos e
anemias refrataacuterias pode contribuir para o baixo iacutendice de sensibilizaccedilatildeo nessas populaccedilotildees
(FLUIT KUNST e DRENTHE-SCHONK 1999 MARTINS et al 2008 e VICHINSKY et
al 2001) Outro grupo de pacientes que se beneficia com a transfusatildeo de mesmo fenoacutetipo satildeo
os pacientes com AHAI uma vez que o autoanticorpo pode mascarar a presenccedila de um
aloanticorpo de significado cliacutenico em ateacute 40 dos casos Mesmo com as teacutecnicas utilizadas
ldquoin vitrordquo para remover a interferecircncia do autoanticorpo no soro um aloanticorpo pode natildeo
ser identificado e dessa forma transfundir o mesmo fenoacutetipo do paciente evitaria reaccedilatildeo
hemoliacutetica pelos anticorpos voltados contra antiacutegenos de maior importacircncia cliacutenica e de
frequecircncia intermediaacuteria Aleacutem disso os pacientes com AHAI satildeo fortes respondedores e a
transfusatildeo profilaacutetica do mesmo fenoacutetipo previne a aloimunizaccedilatildeo (SHIREY et al 2002)
Aleacutem de fenotipar o receptor eacute importante tambeacutem que os bancos de sangue tenham
rotinas de fenotipagem de doadores para atender as necessidade dos pacientes aloimunizados
ou em esquema de transfusatildeo crocircnica (PINTO BRAGA e SANTOS 2011)
7
Rotineiramente eacute inviaacutevel estabelecer o fenoacutetipo eritrocitaacuterio completo de um
indiviacuteduo pela grande diversidade de sistemas sanguiacuteneos descritos Ate junho de 2015 jaacute
haviam sido classificados 308 antiacutegenos atribuiacutedos a 36 sistemas definidos pela Sociedade
Internacional de Transfusatildeo de Sangue (ISBT) (CASTILHO JUNIOR e REID 2015)
Portanto o paciente eacute normalmente fenotipado para os antiacutegenos de maior importacircncia
clinica
Alguns fatores podem limitar a realizaccedilatildeo da fenotipagem eritrocitaacuteria Um dos fatores
eacute a transfusatildeo alogecircnica realizada haacute menos de 90 dias Neste caso podem ocorrer resultados
falso positivos para determinados antiacutegenos devido agrave presenccedila de hemaacutecias do doador
(LAINE et al 2000)
Outro fator eacute a presenccedila de anticorpo sensibilizando a hemaacutecia do paciente e
provocando positividade do teste direto da antiglobulina humana (TDA) Os soros
normalmente utilizados para fenotipagem especialmente para os antiacutegenos Fya
(FY1) Fyb
(FY2) Jka
(JK1) Jkb
(JK2) S (MNS3) e s (MNS4) necessitam da fase de antiglobulina
humana (AGH) para que ocorra aglutinacatildeo Amostras que apresentam o TDA positivo
aglutinam apoacutes reaccedilatildeo com a AGH natildeo pela real presenccedila do antiacutegeno em sua superfiacutecie mas
pela interaccedilatildeo da AGH com o anticorpo que estaacute sensibilizando o eritroacutecito A interferecircncia
do TDA positivo pode ser anulada atraveacutes de algumas teacutecnicas capazes de dissociar o
anticorpo como por exemplo o tratamento da hemaacutecia sensibilizada com cloroquina ou com
glicina-aacutecida-EDTA (BRANCH e PETZ 1999 SHIREY et al 2002 e LEGER 2011)
12 METODOLOGIAS APLICADOS Agrave ROTINA IMUNO-HEMATOLOacuteGICA
Todos os testes que compotildeem a rotina preacute-transfusional usam meacutetodos soroloacutegicos
que envolvem a reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo e tem como objetivo determinar o perfil antigecircnico
eritrocitaacuterio do receptor e do doador assim como identificar em seu soro a presenccedila de
anticorpos contra antiacutegenos eritrocitaacuterios que possam comprometer a sobrevida das hemaacutecias
transfundidas Para testar o antiacutegeno na superfiacutecie da hemaacutecia eacute necessaacuterio dispor de um
antissoro com especificidade conhecida para aquele antiacutegeno Por outro lado para testar a
presenccedila de um determinado anticorpo no soro ou plasma do receptor eacute necessaacuterio o uso de
hemaacutecias com perfil antigecircnico conhecido (SANTOS 2014)
Diversas metodologias satildeo aplicadas nos laboratoacuterios de imunohematologia Cada
serviccedilo de hemoterapia faz a escolha do meacutetodo que seraacute aplicado de acordo com o perfil do
laboratoacuterio com o volume de exames diaacuterios e tambeacutem com o custo envolvido Todas essas
8
teacutecnicas tecircm como objetivo comum demonstrar a reaccedilatildeo entre antiacutegeno e anticorpo no
entanto elas se baseiam em diferentes princiacutepios Muitas metodologias satildeo atualmente
aplicadas agrave imunohematologia entre elas o sistema de fase soacutelida a tecnologia de hemaacutecias
magnetizadas a biologia molecular e ateacute mesmo a citometria de fluxo no entanto os meacutetodos
mais tradicionais satildeo aqueles baseados no princiacutepio de hemaglutinaccedilatildeo
121 MEacuteTODOS DE FASE FLUacuteIDA
Os meacutetodos de fase fluiacuteda satildeo testes baseados na hemaglutinaccedilatildeo e incluem o teste em
tubo e o teste em microplacas Uma suspensatildeo de hemaacutecias eacute adicionada ao plasma ou soro
em seguida eacute realizada a centrifugaccedilatildeo e por fim eacute feita a leitura do resultado que eacute
considerado positivo se for observado algum grau de aglutinaccedilatildeo ou hemoacutelise A intensidade
de aglutinaccedilatildeo eacute graduada de acordo com o tamanho dos agregados desprendidos da
superfiacutecie apoacutes agitaccedilatildeo delicada do tubo ou microplaca Os meacutetodos de hemaglutinaccedilatildeo satildeo
aplicados a todos os testes preacute-transfusionais Como os anticorpos ABO satildeo aglutininas frias
a tipagem eacute realizada em temperatura ambiente (22degC) no entanto ao investigar a presenccedila
de anticorpos irregulares que como jaacute mencionado eacute na maioria das vezes anticorpos
incompletos da classe IgG eacute essencial que a reaccedilatildeo seja incubada a 37degC As reaccedilotildees satildeo
facilitadas com a utilizaccedilatildeo de potencializadores e da antiglobulina humana (WALKER e
HARMENING 2012 AABB 2011)
Nos meacutetodos de fase fluiacuteda nos quais a AGH eacute empregada a fase de lavagem eacute
fundamental Apoacutes a incubaccedilatildeo do soro com as hemaacutecias deve ser realizada a lavagem da
reaccedilatildeo para remover o excesso de anticorpos natildeo ligados agraves hemaacutecias jaacute que os anticorpos
livres podem bloquear a AGH quando ela eacute adicionada e levar a resultados falso negativos
(AABB 2011)
Os testes de hemaglutinaccedilatildeo satildeo os mais tradicionais entre os meacutetodos ainda hoje
aplicados agrave rotina de bancos de sangue A vantagem desses meacutetodos eacute o baixo custo quando
comparado agraves teacutecnicas mais modernas mas apresentam tambeacutem desvantagens A teacutecnica em
tubo por exemplo natildeo permite automaccedilatildeo eacute trabalhosa e exige matildeo-de-obra bastante treinada
na execuccedilatildeo das diversas etapas do teste e mesmo assim pode haver subjetividade na
interpretaccedilatildeo dos resultados aleacutem de resultados falso-negativos (DOWNES 2011 ZANTEK
et al 2012)
9
122 COLUNAS DE GEL
A teacutecnica em gel iniciada na deacutecada de 90 representou uma grande revoluccedilatildeo na
rotina laboratorial tornando-se muito popular Aleacutem de ser sensiacutevel a teacutecnica dispensa a fase
de lavagem antes da adiccedilatildeo da AGH assim como a agitaccedilatildeo do teste para leitura reduzindo o
nuacutemero de resultados falsos negativos decorrentes dessas duas etapas e o tempo para
execuccedilatildeo dos testes (LAPIERRE et al 1989 NOVARETTI et al 2000 NOVARETTI et
al 2004) Os reagentes satildeo comercializados na forma de cartotildees plaacutesticos contendo
microtubos preenchidos por gel composto por microesferas de acrilamida-dextran Nesta
metodologia tambeacutem baseada na hemaglutinaccedilatildeo a suspensatildeo de hemaacutecias e o soro satildeo
depositados em uma cacircmara acima da coluna de gel e em seguida procede-se com a
centrifugaccedilatildeo dos cartotildees As microesferas atuam como uma malha que permite a passagem
em direccedilatildeo ao fundo do microtubo apenas das hemaacutecias natildeo aglutinadas enquanto as
hemaacutecias aglutinadas ficam retidas na parte superior da coluna ou ao longo dela (GREEN e
KLOSTERMANN 2012) Portanto quanto maior a agregaccedilatildeo mais hemaacutecias ficam retidas
no topo da coluna Dependendo do tipo de teste a ser realizado pode ser utilizado gel neutro
ou gel especiacutefico impregnado pelo anticorpo desejado e o gel contendo antiglobulina humana
que satildeo utilizados para os testes diretos e indiretos da antiglobulina (LAPIERRE et al 1989)
A coluna de gel ainda permite a visualizaccedilatildeo clara de duas populaccedilotildees distintas de hemaacutecias
como em pacientes receacutem transfundidos
123 BIOLOGIA MOLECULAR
A biologia molecular ou genotipagem estaacute sendo cada vez mais aplicada aos grupos
sanguiacuteneos pois fornece resultados seguros e precisos especialmente nos casos em que natildeo eacute
possiacutevel a realizaccedilatildeo da fenotipagem como em pacientes receacutem-transfundidos e pacientes
com TDA positivo Na genotipagem eacute possiacutevel determinar atraveacutes do DNA do paciente
extraiacutedo de seus leucoacutecitos de sangue perifeacuterico o fenoacutetipo eritrocitaacuterio deduzido sem
qualquer interferecircncia do anticorpo que sensibiliza a hemaacutecia ou de hemaacutecias alogecircnicas
transfundidas Sua realizaccedilatildeo no entanto exige o treinamento de equipe especializada e capaz
de interpretar os resultados em conjunto com os achados soroloacutegicos (JUNIOR e OLIVATO
2007)
Apesar de ser uma ferramenta de grande importacircncia hoje na imuno-hematologia
ainda estaacute restrito aos grandes centros de hemoterapia no Brasil poucos serviccedilos puacuteblicos de
sauacutede dispotildeem desse recurso e utilizam teacutecnicas de genotipagem de grupos sanguiacuteneos para
atendimento a seus pacientes Esta abordagem poreacutem vem sendo introduzida em algumas
10
instituiccedilotildees de reconhecida competecircncia na hemoterapia mas sua disponibilizaccedilatildeo deve
tornar-se mais generalizada atraveacutes da formaccedilatildeo de centros de referecircncia para atendimento
das diversas unidades de hemoterapia (MARTINS et al 2009) Dessa forma muitas decisotildees
transfusionais especialmente em urgecircncias ainda devem ser tomadas sem o resultado da
genotipagem eritrocitaacuteria
13 TESTE DA ANTIGLOBULINA
Coombs Mourant e Race descreveram em 1945 uma teacutecnica com utilizando soro de
coelho contendo antiglobulina humana (AGH) que posteriormente foi chamada de ldquosoro de
Coombsrdquo O meacutetodo foi desenvolvido inicialmente para ampliar o efeito de aglutininas fracas
do sistema Rh anticorpos ldquoincompletosrdquo que normalmente natildeo apresentavam aglutinaccedilatildeo
visiacutevel O teste foi concebido como um instrumento de investigaccedilatildeo de doenccedila hemoliacutetica do
receacutem-nascido e de reaccedilotildees transfusionais causadas por anticorpos Rh que estavam presentes
no soro dos paciente poreacutem que natildeo eram demonstraacuteveis pelas teacutecnicas ateacute entatildeo existentes
A maior parte dos anticorpos de significado cliacutenico assim como seus respectivos
antiacutegenos foram descritos apoacutes o surgimento do ldquosoro de Coombsrdquo em 1945 sendo assim o
teste da antiglobulina representa ateacute hoje a forma mais importante de aglutinaccedilatildeo artificial em
imunohematologia permitindo revelar a presenccedila de anticorpos na membrana da hemaacutecia A
antiglobulina humana eacute constituiacuteda por anticorpo especiacutefico contra a porccedilatildeo Fc de outro
anticorpo Quando um anticorpo ldquoincompletordquo sensibiliza a hemaacutecia normalmente natildeo
provoca aglutinaccedilatildeo visiacutevel Apoacutes a adiccedilatildeo da AGH ao meio esta reconhece e se liga agraves
porccedilotildees Fc dos anticorpos que sensibilizam a hemaacutecia formando assim uma malha e
provocando aglutinaccedilatildeo visiacutevel (BARJAS-CASTRO 2013)
Os reagentes de antiglobulina podem ser poliespeciacuteficos ou monoespeciacuteficos Os
poliespeciacuteficos satildeo uma mistura de anticorpos ant-IgG e anti-C3d (fraccedilatildeo C3d do
complemento) Os reagentes monoespecificos podem ser anti-IgG anti-IgM anti-IgA anti-
complemento podendo ser anti-C3d e anti-C3b
O teste da antiglobulina pode ser usado para detectar hemaacutecias sensibilizadas com
aloanticorpos IgG autoanticorpos IgG e componentes do complemento A sensibilizaccedilatildeo
pode ocorrer ldquoin vivordquo ou ldquoin vitrordquo O uso do AGH para detectar a sensibilizaccedilatildeo ldquoin vitrordquo
tem dois estaacutegios e eacute denominado teste indireto da antiglobulina A sensibilizaccedilatildeo ldquoin vivordquo eacute
detectada em procedimento de um uacutenico estagio chamado teste direto da antiglobulina (TDA)
11
Os testes direto e indireto satildeo ateacute hoje amplamente aplicados como princiacutepio de inuacutemeros
testes soroloacutegicos em imuno-hematologia (GREEN e KLOSTERMANN 2012)
131 TESTE DIRETO DA ANTIGLOBULINA
O teste direto da antiglobulina humana revela a presenccedila de anticorpo eou fraccedilatildeo do
complemento ligados agrave superfiacutecie das hemaacutecias As sensibilizaccedilatildeo das hemaacutecias ocorrida ldquoin
vivordquo natildeo eacute visualizada mas apoacutes a adiccedilatildeo da antiglobulina humana ocorre a aglutinaccedilatildeo que
eacute visualizada macroscopicamente (Figura 1)
Figura 1 - Princiacutepio da teacutecnica direta da antiglobulina Teste utilizado para demonstrar a sensibilizaccedilatildeo ldquoin
vivordquo das hemaacutecias O sangue total eacute coletado do paciente em tubo contendo anticoagulante EDTA Na teacutecnica
realizada em tubo uma suspensatildeo de hemaacutecias 5 em soluccedilatildeo de salina eacute preparada Uma gota dessa suspensatildeo
eacute lavada 3 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica para retirada de anticorpos que estatildeo livres no plasma Toda soluccedilatildeo eacute
retirada e adiciona-se o soro de Coombs (antiglobulina humana) O soro de Coombs reconhece os anticorpos que
estatildeo ligados agrave superfiacutecie das hemaacutecias fazendo com que ocorra aglutinaccedilatildeo visiacutevel macroscopicamente
Apesar de natildeo ser um teste preacute-transfusional obrigatoacuterio o TDA eacute um dos testes mais
importantes para investigar e classificar quadros hemoliacuteticos como de origem imune ou natildeo
imune O seu valor preditivo positivo em vigecircncia de anemia hemoliacutetica eacute de 83 poreacutem natildeo
havendo sinais de hemoacutelise seu valor preditivo eacute apenas 14 Eacute por esse motivo que a
interpretaccedilatildeo do TDA positivo deve levar em consideraccedilatildeo a histoacuteria cliacutenica e os resultados
dos outros exames laboratoriais A realizaccedilatildeo do TDA eacute obrigatoacuteria na investigaccedilatildeo
12
laboratorial de diversos quadros hemoliacuteticos entre eles a anemia hemoliacutetica autoimune
(AHAI) a reaccedilatildeo hemoliacutetica imune poacutes-transfusional a siacutendrome do linfoacutecito passageiro a
doenccedila hemoliacutetica perinatal e a hemoacutelise droga-dependente (LEGER 2011)
Resultados de TDA positivos foram tambeacutem observados em indiviacuteduos com niacuteveis
seacutericos elevados de IgG ou complemento sem evidecircncia de anemia hemoliacutetica imune como
em pacientes com doenccedila falciforme talassemia doenccedila renal crocircnica mieloma muacuteltiplo
doenccedilas autoimunes e siacutendrome da imunodeficiecircncia adquirida (SIDA) Aleacutem disso pequenas
quantidades de IgG (5 a 90 moleacuteculas por hemaacutecia) e complemento (5 a 40 moleacuteculas por
hemaacutecia) podem estar presentes nas hemaacutecias de indiviacuteduos saudaacuteveis sem associaccedilatildeo com
reduccedilatildeo na sobrevida das mesmas A positividade do TDA depende da populaccedilatildeo estudada e
pode variar de 01 entre doadores de sangue sem qualquer sinal cliacutenico de hemoacutelise ateacute
15 em pacientes hospitalizados (CASTILHO JUNIOR e REID 2015 LEGER 2011)
Indiviacuteduos que apresentam TDA positivo seja agraves custas de IgG eou complemento
com ou sem sinais cliacutenicos de hemoacutelise teratildeo a fenotipagem eritrocitaacuteria prejudicada A
fenotipagem de indiviacuteduos com TDA positivo especialmente quando utilizado o teste indireto
da antiglobulina pode acarretar resultados falsos positivos e levar a seleccedilatildeo de fenoacutetipo
incorreto para transfusatildeo
132 TESTE INDIRETO DA ANTIGLOBULINA
O teste indireto da antiglobulina (TIA) eacute utilizado para revelar a sensibilizaccedilatildeo ldquoin
vitrordquo das hemaacutecias e eacute aplicado a diversos testes soroloacutegicos em imunohematologia entre
eles a pesquisa de anticorpos identificaccedilatildeo de anticorpos testes de compatibilidade
fenotipagem eritrocitaacuteria e titulaccedilatildeo de anticorpos Na teacutecnica indireta a hemaacutecia que contecircm
o antiacutegeno eacute colocada em contato ldquoin vitrordquo com o anticorpo que se liga mas natildeo promove a
aglutinaccedilatildeo visiacutevel A adiccedilatildeo da AGH forma uma malha entre os anticorpos que sensibilizam
as hemaacutecias e provoca a aglutinaccedilatildeo macroscoacutepica (figura 2)
Caso a amostra de hemaacutecia estudada seja previamente sensibilizada resultados falsos
positivos podem ser obtidos no TIA jaacute que a AGH reagiraacute com a moleacutecula que sensibilizava
anteriormente a hemaacutecia mesmo se o anticorpo especiacutefico natildeo tiver se ligado ao antiacutegeno
correspondente
13
133 CONDICcedilOtildeES CLIacuteNICAS COM TDA POSITIVO
O TDA positivo deve ser interpretado cuidadosamente sempre em conjunto com o
quadro cliacutenico do paciente A positividade isolada do TDA natildeo significa hemoacutelise A
interpretaccedilatildeo do teste positivo requer o conhecimento do diagnoacutestico do paciente da presenccedila
de sinais e sintomas sugestivos de hemoacutelise assim como de seu histoacuterico transfusional
gestacional e de informaccedilotildees sobre o uso recente de medicaccedilotildees (LEGER 2011)
Figura 2 ndash Princiacutepio do teste indireto da antiglobulina O TIA pode ser utilizado na pesquisa de anticorpos de
especificidades desconhecidas livres no soroplasma como eacute o caso da pesquisa e identificaccedilatildeo de anticorpos
irregulares Ele eacute tambeacutem utilizado para determinar a presenccedila de antiacutegenos na membrana da hemaacutecia quando
satildeo empregados soros de especificidades conhecidas da classe IgG No primeiro caso o soroplasma contendo o
anticorpo desconhecido eacute colocado em contato com hemaacutecias cujo perfil antigecircnico eacute conhecido No segundo
caso utiliza-se soro de especificidade conhecida da classe IgG para determinar a presenccedila ou ausecircncia de um
antiacutegeno na membrana O anticorpo encontra o antiacutegeno correspondente e ocorre a ligaccedilatildeo do anticorpo agrave
hemaacutecia mas natildeo ocorre aglutinaccedilatildeo Apoacutes a adiccedilatildeo da AGH que se liga aos anticorpos formando uma malha
ocorre a aglutinaccedilatildeo visiacutevel
O TDA positivo eacute uma achado claacutessico de algumas condiccedilotildees cliacutenicas como a reaccedilatildeo
transfusional hemoliacutetica a doenccedila hemoliacutetica do feto e do receacutem-nascido (DHFRN) a anemia
hemoliacutetica induzida por drogas a siacutendrome do linfoacutecito passageiro e a anemia hemoliacutetica
autoimune (AHAI) Portanto o TDA positivo pode ser decorrente da sensibilizaccedilatildeo da
hemaacutecia autoacuteloga por um autoanticorpo ou por um aloanticorpo ligado agrave hemaacutecia alogecircnica
circulante A positividade do TDA pode ainda ocorrer de forma passiva em pacientes que
14
recebem imunoglobulinas humanas ou ainda pela transfusatildeo de plaquetas ABO natildeo idecircntico
(LEGER 2011 RALPH 2012 ZANTEK et al 2012)
Nas reaccedilotildees transfusionais hemoliacuteticas imunes o aloanticorpo do receptor sensibiliza
as hemaacutecias transfundidas do doador e reduz sua sobrevida ao removecirc-la precocemente da
circulaccedilatildeo pela fagocitose no sistema retiacuteculo-endotelial ou pela hemoacutelise intravascular As
reaccedilotildees podem ser agudas se ocorrem ateacute 24 horas ou tardias quando ocorrem apoacutes 24 horas
da transfusatildeo A gravidade das reaccedilotildees hemoliacuteticas pode variar de um simples rendimento
transfusional inadequado agrave quadros graves de hemoacutelise intravascular evoluindo ateacute mesmo
com choque vascular e oacutebito O TDA pode resultar negativo caso toda massa eritrocitaacuteria
transfundida tenha sido destruiacuteda (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
Na doenccedila hemoliacutetica do feto e do receacutem-nascido (DHFRN) anticorpos maternos da
classe IgG atravessam a barreira placentaacuteria e sensibilizam as hemaacutecias fetais que seratildeo
destruiacutedas precocemente levando agrave anemia fetal Apesar da incompatibilidade ABO feto-
materna ser a causa mais frequente de DHFRN raramente ela eacute responsaacutevel pela ocorrecircncia
de quadros graves Por outro lado anticorpos contra antiacutegenos do sistema Rh e Kell
especialmente Anti-D (Anti-RH1) Anti-c (Anti-RH4) e Anti-Kell (Anti-KELL1) satildeo
conhecidos por causar DHFRN severa Raramente outros anticorpos tambeacutem podem estar
implicados na DHFRN como os anticorpos contra antiacutegenos do sistema Kidd Duffy MNS e
Diego (ZANTEK et al 2012)
A hemoacutelise droga-dependente eacute causada pela produccedilatildeo de um anticorpo voltado contra
a droga ligada agrave membrana eritrocitaacuteria ou ainda contra o complexo droga-membrana A
classe de medicaccedilotildees mais comumente envolvida eacute a dos antimicrobianos betalactacircmicos
(penicilinas e cefalosporinas) mas outras classes como quimioteraacutepicos e anti-inflamatoacuterios
tambeacutem satildeo descritos (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
Apoacutes transplante de ceacutelulas progenitoras hematopoieacuteticas em que o doador possui
anticorpos contra antiacutegenos eritrocitaacuterios do receptor o linfoacutecito de memoacuteria do doador pode
resistir ao esquema imunossupressor utilizado e continuar a produccedilatildeo de anticorpos que
reconhecem a hemaacutecia incompatiacutevel do receptor ainda circulante O quadro cliacutenico pode
variar de um simples TDA positivo sem outros sinais ou sintomas ateacute um quadro hemoliacutetico
grave e abrupto (LEGER 2011)
15
134 ANEMIA HEMOLIacuteTICA AUTOIMUNE
A anemia hemoliacutetica autoimune eacute caracterizada pela destruiccedilatildeo precoce das hemaacutecias
autoacutelogas por autoanticorpos que sensibilizam as hemaacutecias e levam agrave fagocitose pelos
macroacutefagos no sistema reticulo-endotelial ou hemoacutelise intravascular O diagnoacutestico da AHAI
baseia-se na presenccedila de hemoacutelise cliacutenica associada agrave evidecircncia de fator imune representado
pelo TDA positivo As classes de anticorpos envolvidas em quadros de AHAI satildeo IgG IgM e
raramente IgA (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012) Satildeo raros os casos de AHAI com TDA
negativo que podem estar relacionados a um autoanticorpo de baixa avidez de densidade
inferior agrave detecccedilatildeo do meacutetodo ou ainda de classe de imunoglobulina natildeo avaliada pelo
meacutetodo utilizado para o teste (GARRATY 2005)
A AHAI pode ser classificada em dois grupos principais de acordo com a melhor
temperatura de reaccedilatildeo do autoanticorpo As anemias hemoliacuteticas causadas por anticorpos
quentes que reagem melhor a 37oC e geralmente IgG representam 80 dos casos de AHAI
Nas AHAI por anticorpo quente o TDA pode ser positivo para IgG mais complemento (67)
somente IgG (20) ou somente por complemento (13) As anemias causadas por
anticorpos frios geralmente da classe IgM e que reagem melhor em temperatura ambiente ou
a 4oC representam aproximadamente 20 dos casos de AHAI Por exibirem amplitude
teacutermica esses anticorpos ligam-se agraves hemaacutecias ao atingirem a circulaccedilatildeo nas extremidades do
corpo fixam o complemento e desprendem-se da hemaacutecia apoacutes retornar para partes mais
quentes Por esse motivo em AHAI por anticorpos frios o TDA eacute positivo apenas agraves custas
de C3 e normalmente o IgM natildeo eacute detectado (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
A presenccedila do autoanticorpo IgG pode ser confirmada atraveacutes da eluiccedilatildeo do anticorpo
da hemaacutecia Tipicamente o eluato na AHAI por anticorpo quente reage com todas as ceacutelulas
testadas de um painel de hemaacutecias alogecircnicas do tipo ldquoOrdquo ou pode eventualmente exibir uma
especificidade conhecida como Anti-e (Anti-RH5) Nas AHAI a frio por sua vez espera-se
um eluato negativo (LEGER 2011)
Os autoanticorpos satildeo com frequecircncia encontrados livres no plasma e natildeo somente
ligados agraves hemaacutecias autoacutelogas Eles podem interferir em todas as fases dos testes preacute-
transfusionais nas quais o plasma eacute testado especialmente os autoanticorpos quentes que
acarretam resultados positivos em todos os testes levados agrave fase de antiglobulina humana
Esses anticorpos portanto positivam a pesquisa de anticorpos irregulares e mascaram a
presenccedila de aloanticorpos de significado cliacutenico Aproximadamente 60 dos pacientes que
apresentam AHAI a quente apresentam anticorpos que reagem em meio salino mas se forem
16
levados em conta meacutetodos mais sensiacuteveis como PEG enzima e estudo em gel a positividade
pode ser superior a 90 (LEGER 2011)
Aleacutem da eficaacutecia da transfusatildeo ser comprometida pela diminuiccedilatildeo da vida-meacutedia das
hemaacutecias a presenccedila do autoanticorpo dificulta a realizaccedilatildeo dos testes preacute-transfusionais e
compromete a seguranccedila transfusional Os autoanticorpos reagem normalmente como
panaglutininas pois satildeo normalmente voltados contra antiacutegenos puacuteblicos na maior parte das
vezes contra antiacutegenos do sistema Rh Por apresentarem essas caracteriacutesticas podem ainda
mascarar a presenccedila de aloanticorpos de significado clinico e levar a testes de compatibilidade
positivos exigindo uma avaliaccedilatildeo criteriosa da necessidade da transfusatildeo (BRANCH e PETZ
1999 JUNIOR e OLIVATO 2004)
Remover a interferecircncia do autoanticorpo para avaliar a presenccedila de aloanticorpos
mascarados nem sempre eacute possiacutevel mesmo utilizando teacutecnicas de autoadsorccedilatildeo ou
aloadsorccedilatildeo que aleacutem de tudo satildeo demoradas e exigem de 2 a 6 horas para conclusatildeo
(GARRATY e GEORGE 2002) Nesses casos a fenotipagem eritrocitaacuteria do paciente eacute de
extrema utilidade especialmente em situaccedilotildees de urgecircncia A definiccedilatildeo do fenoacutetipo do
paciente para os antiacutegenos de maior importacircncia cliacutenica pode auxiliar a seleccedilatildeo de unidades
de hemaacutecias com mesmo fenoacutetipo o que garante que eventuais aloanticorpos natildeo
identificados sejam respeitados e tambeacutem evita nova sensibilizaccedilatildeo (JUNIOR e OLIVATO
2004 SHIREY et al 2002)
135 TRATAMENTO DE HEMAacuteCIAS COM TDA POSITIVO
O TDA positivo impede a fenotipagem eritrocitaacutecia por meacutetodos que exigem a fase de
AGH uma vez que a aglutinaccedilatildeo ocorreraacute devido agrave interaccedilatildeo da AGH com o autoanticorpo
que sensibiliza a hemaacutecia do paciente levando a resultados falso positivos Em algumas
situaccedilotildees como na AHAI por anticorpo quente a fenotipagem eacute especialmente importante
pois o autoanticorpo interfere na triagem e identificaccedilatildeo de anticorpos assim como no teste de
compatibilidade e dificultam a detecccedilatildeo de aloanticorpos de significado cliacutenico que
obrigatoriamente devem ser respeitados Nessas situaccedilotildees a fenotipagem eritrocitaacuteria
determina o perfil antigecircnico do paciente e possibilita o fornecimento de unidades de
hemaacutecias com o mesmo fenoacutetipo para a transfusatildeo evitando a sensibilizaccedilatildeo para novos
antiacutegenos assim como reaccedilotildees hemoliacuteticas transfusionais No entanto eacute necessaacuterio aplicar
meacutetodos que natildeo sofram interferecircncia do TDA positivo ou seja meacutetodos que natildeo necessitem
da fase de AGH ou meacutetodos de bloqueio do anticorpo sem bloquear o antiacutegeno Uma opccedilatildeo eacute
a utilizaccedilatildeo de soros monoclonais IgM (salinos ou de meio proteico natildeo concentrado) mas
17
nem sempre esses reagentes estatildeo disponiacuteveis especialmente os reagentes monoclonais para
os antiacutegenos dos sistemas Duffy ( Fya Fy
b) Kidd ( Jk
a Jk
b) e MNS (S s) (JUNIOR e
OLIVATO 2004) Outra opccedilatildeo eacute a teacutecnica de bloqueio que pode ser utilizada para tratar
hemaacutecias para posterior fenotipagem em casos de TDA positivos com reatividade le2+
Em casos onde a positividade do TDA eacute maior que 2+ estaacute indicada a tratamento
quiacutemico para remoccedilatildeo da interferecircncia do autoanticorpo antes de realizar a fenotipagem Entre
as teacutecnicas utilizadas atualmente estatildeo o ZZAP a cloroquina e a glicina aacutecidaEDTA
1351 TEacuteCNICA DE BLOQUEIO
A teacutecnica de bloqueio se baseia na utilizaccedilatildeo de anti-IgG (Coombs monoespeciacutefico)
para tratar as hemaacutecias com TDA positivo O anticorpo anti-IgG se liga aos anticorpos que
estatildeo sensibilizando a hemaacutecias poreacutem sem o bloquear os antiacutegenos Os antiacutegenos que natildeo
estatildeo sensibilizados podem ser detectados atraveacutes dos antissoros especiacuteficos (SERERAT
VEIDT E DUTCHED 2000)
1352 TRATAMENTO DE HEMAacuteCIAS COM ZZAP
O Sulphydryl-Proteolytic Enzyme (ZZAP) que eacute uma mistura de ditiotreitol (DTT)
mais papaiacutena ativada com cisteiacutena eacute um reagente capaz de dissociar imunoglobulinas da
classe IgG ligadas a membrana dos eritroacutecitos enquanto trata enzimaticamente as hemaacutecias
O tratamento enzimaacutetico tambeacutem potencializa a ligaccedilatildeo do autoanticorpo ao antiacutegeno e
acelera o processo de autoadsorccedilatildeo O ZZAP pode desnaturar os antiacutegenos do sistema Duffy
MNS e Kell o que limita sua aplicaccedilatildeo para fins de fenotipagem (BRANCH e PETZ 1982)
1353 CLOROQUINA
Em 1982 Edwards Moulds e Judd propuseram a utilizaccedilatildeo da teacutecnica da cloroquina
que dissociava os complexos antiacutegeno-anticorpo e mantinha a membrana das hemaacutecias
iacutentegras Os derivados quinolecircicos jaacute haviam sido descritos anteriormente por Domokos e
Aszody em 1964 e Holtz Mantel e Buck em 1973 (apud Edwards Moulds e Judd 1982) pela
sua capacidade de separar imunocomplexos e inibir as reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo reduzindo
as cargas eleacutetricas das superfiacutecie das hemaacutecias A teacutecnica eacute uma das mais utilizadas nos
centros brasileiros para remover a interferecircncia do autoanticorpo e eacute tambeacutem a teacutecnica
atualmente adotada pelo laboratoacuterio de imunohematologia do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto
18
Edwards Moulds e Judd (1982) demonstraram que a teacutecnica da cloroquina para
dissociaccedilatildeo de anticorpos eacute uma teacutecnica simples efetiva e confiaacutevel para dissociar
imunoglobulina das hemaacutecias Desde que a membrana das hemaacutecias permaneccedila intacta natildeo
haacute perda da reatividade dos antiacutegenos e a sua maior aplicaccedilatildeo eacute a fenotipagem de hemaacutecias
com TDA positivo Os autores verificaram que em 83 das amostras sensibilizadas in vivo e
22 amostras (no total de 40) sensibilizadas ldquoin vitrordquo apresentaram TDA negativo e
puderam ser fenotipadas A teacutecnica poreacutem natildeo consegue remover os componentes do
complemento na maioria dos casos
Champagne e colaboradores (1999) testaram a teacutecnica da cloroquina para dissociar
antiacutegenos Bg comparando com a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA e verificaram vantagem em
relaccedilatildeo ao uso de um uacutenico reagente diminuindo a manipulaccedilatildeo e verificou que o mesmo natildeo
destroacutei antiacutegeno Kell
A cloroquina tambeacutem mostrou-se pouco efetivo em remover anticorpos do sistema
Duffy da superfiacutecie das hemaacutecias (EDWARDS MOUDS e JUDD 1982 ROZIERS e
SQUALI 1997)
1353 GLICINA-AacuteCIDAEDTA
A afinidade e a estabilidade entre a ligaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo eacute definida como a
resultante entre forccedilas atrativas e repulsivas entre ambos (CARUCIO e WISE 2012) e resulta
da somatoacuteria de forccedilas quiacutemicas dinacircmicas e fracas (natildeo covalentes) como pontes de
hidrogecircnio forcas eletrostaacuteticas forca de Van der Waals e pontes hidrofoacutebicas A estabilidade
dessa ligaccedilatildeo eacute facilmente abalada por alteraccedilotildees quiacutemicas e fiacutesicas no meio da reaccedilatildeo como
a alteraccedilatildeo do pH A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA se baseia na mudanccedila do pH para a
quebra da ligaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo (KOSANKE 2012)
A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA foi primeiramente descrita em 1986 por Louie Jieng
e Zeroulis que utilizaram 50 amostras de doadores sensibilizados ldquoin vitrordquo com anticorpos A
teacutecnica foi efetiva em 48 amostras permitindo o estudo do eluato assim como a fenotipagem
das hemaacutecias Os autores testaram tambeacutem a teacutecnica em 100 hemaacutecias TDA positivo que
puderam ser utilizadas para teacutecnicas de autoadsorccedilatildeo
Byrne (1991) descreveu a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA modificada e tambeacutem
verificou como uma opccedilatildeo para o tratamento de hemaacutecias com TDA positivo que deixava as
hemaacutecias intactas e o eluato viaacutevel para ser fenotipado
19
Roziers e Squali (1997) e Katharia e Chaudhary (2013) compararam a teacutecnica da
glicina-aacutecidaEDTA com as teacutecnicas da cloroquina e do aquecimento Verificaram maior
eficiecircncia da glicina-aacutecidaEDTA em relaccedilatildeo as outras duas teacutecnicas pois com uma mesma
quantidade de amostra produzia as hemaacutecias livres de anticorpo e tambeacutem o eluato Mostrou-
se ainda superior devido ao menor tempo exigido para sua realizaccedilatildeo o que favorece seu uso
em situaccedilotildees de urgecircncia e emergecircncia
As duas desvantagens da teacutecnica poreacutem eacute o fato de destruir os antiacutegenos do sistema
Kell e o fato de natildeo remover fraccedilotildees do complemento ligadas agrave hemaacutecia (PALLAS WILER e
McGEE 1991 ROZIERS e SQUALLI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012
e KATHARIA e CHAUNDHARY 2013)
20
2 OBJETIVOS
21 OBJETIVO GERAL
211 Avaliar a eficaacutecia da glicina-aacutecidaEDTA em remover os anticorpos ligados agraves
hemaacutecias sensibilizadas por anticorpos da classe IgG
22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
221 Preparaccedilatildeo dos reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
verificaccedilatildeo da estabilidade dos mesmos e avaliar custos
222 Testar a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA em amostras de hemaacutecias
sensibilizadas por anticorpos antieritrocitaacuterios humanos
223 Comparar a efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA com a teacutecnica da
cloroquina quanto a capacidade de remover a interferecircncia do anticorpo ligado
a hemaacutecia
224 Testar o eluato das amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA
225 Verificar se houve destruiccedilatildeo dos antiacutegenos eritrocitaacuterios apoacutes o tratamento
com glicina-aacutecidaEDTA e com cloroquina
226 Verificar se o tempo de execuccedilatildeo da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA descrito
nos textos de referecircncia eacute reprodutiacutevel
21
3 JUSTIFICATIVA
Algumas condiccedilotildees cliacutenicas podem levar ao depoacutesito ldquoin vivordquo de anticorpos eou
fraccedilotildees do complemento sobre as hemaacutecias Entre elas estatildeo as reaccedilotildees hemoliacuteticas poacutes-
transfusionais a doenccedila hemoliacutetica perinatal o uso de medicamentos e principalmente a
AHAI Na AHAI um anticorpo normalmente da classe IgG ou IgM reconhece antiacutegenos
proacuteprios na membrana eritrocitaacuteria e reduz a sobrevida da hemaacutecia levando a sua destruiccedilatildeo
pelos macroacutefagos no sistema reticulo-endotelial ou agrave ativaccedilatildeo do complexo de ataque agrave
membrana e agrave lise intravascular Os autoanticorpos satildeo voltados na maioria das vezes contra
antiacutegenos eritrocitaacuterios de alta frequecircncia populacional conhecidos como antiacutegenos puacuteblicos
e por este motivo reconhecem tanto hemaacutecias autoacutelogas quanto alogecircnicas
Devido agrave presenccedila do autoanticorpo livre no plasma e tambeacutem do anticorpo eou
complemento ligado agrave hemaacutecia o banco de sangue pode encontrar dificuldades em todas as
fases dos testes preacute-transfusionais do paciente com AHAI e deve utilizar teacutecnicas que
auxiliem na escolha do melhor hemocomponente melhorando a seguranccedila transfusional Essas
teacutecnicas visam remover a interferecircncia do autoanticorpo livre no soro e do autoanticorpo
ligado agrave hemaacutecia permitindo a detecccedilatildeo de aloanticorpos associados e a realizaccedilatildeo da
fenotipagem eritrocitaacuteria respectivamente
A finalizaccedilatildeo dos testes preacute-tranfusionais na presenccedila de autoanticorpo pode levar
algumas horas e nem sempre o paciente poderaacute aguardar Nesse contexto torna-se vantajosa a
aplicaccedilatildeo de teacutecnicas de raacutepida execuccedilatildeo
O presente estudo propotildee aplicar e avaliar a eficaacutecia da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
em remover os anticorpos ligados agrave hemaacutecia o que permite a fenotipagem eritrocitaacuteria
estendida e a seleccedilatildeo de concentrados de hemaacutecias com mesmo fenoacutetipo do paciente
Atualmente no Hemocentro de Ribeiratildeo Preto a teacutecnica utilizada para esse fim eacute o
tratamento das hemaacutecias com difosfato de cloroquina cujo tempo de execuccedilatildeo pode demorar
ateacute duas horas enquanto a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser realizada em apenas dois
minutos o que a tornaria opccedilatildeo de escolha especialmente em situaccedilotildees de urgecircncia Ao
contraacuterio da cloroquina a glicina-aacutecidaEDTA permite tambeacutem o estudo do eluato das
hemaacutecias tratadas
22
4 METODOL OGIA
41 AMOSTRAS DE DOADORES
Foram coletados 50 amostras de doadores de sangue que compareceram ao
Hemonuacutecleo de Araccedilatuba no periacuteodo de junho a agosto de 2016 Foram convidados a
participar da pesquisa doadores de repeticcedilatildeo do tipo sanguiacuteneo ldquoOrdquo RhD positivo
cadastrados no sistema de banco de sangue (SBS) do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto
Todos os doadores que concordaram em participar da pesquisa assinaram o termo de
consentimento livre e esclarecido (TCLE)
No momento da doaccedilatildeo foram coletados adicionalmente 5 mL de sangue total em
soluccedilatildeo anticoagulante EDTA (aacutecido dietilenoaminoaceacutetico) dispensando punccedilatildeo venosa
adicional para coleta da amostra O fluxograma 1 resume as etapas desenvolvidas no projeto
Fluxograma 1 - Fluxo da pesquisa utilizando as amostras de doadores
23
411 FENOTIPAGEM
Foram verificados se os doadores jaacute tinham fenotipagem para outros sistemas de
grupos sanguiacuteneos aleacutem do sistema ABORh que eacute realizado rotineiramente
A fenotipagem eritrocitaacuteria para outros sistemas ou fenotipagem estendida eacute realizada
para identificar a presenccedila ou ausecircncia de antiacutegenos considerados de importacircncia cliacutenica No
Hemonuacutecleo de Araccedilatuba uma parcela de doadores de repeticcedilatildeo satildeo fenotipados para os
antiacutegenos dos sistemas de grupo sanguiacuteneo Rh (antiacutegenos C c E e e) Kell (antiacutegeno K)
Duffy (antiacutegenos Fya e Fy
b) Kidd (antiacutegenos Jk
a e Jk
b) e sistema MNSs (antiacutegenos S e s)
A fenotipagem para o Rh e Kell eacute realizada por metodologia de microplaca utilizando
25 microL de hemaacutecia lavada e diluiacuteda a 5 em salina e 25 microL do antissoro comercial especiacutefico
A reaccedilatildeo eacute incubada 15 minutos a temperatura ambiente e centrifugadas para leitura Para os
antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s a metolodogia utilizado eacute gel contendo antiglobulina
humana (gel LissCoombs poliespeciacutefico) da marca BIO-RAD onde se utiliza suspensatildeo de
hemaacutecia em LISS (Soluccedilatildeo de baixa forccedila iocircnica) A suspensatildeo eacute preparada atraveacutes da
diluiccedilatildeo de 10 microL de hemaacutecia em 1000 microL de LISS Pipetado 50 microL dessa diluiccedilatildeo no gel e
adicionado 25 microL do antissoro especiacutefico Incuba-se em banho seco por 15 minutos a 37 deg
Celsius e eacute centrifugado em centriacutefuga especiacutefica Os antissoros utilizados eram das marcas
Fresenius e Lorne
Foi verificado a fenotipagem do doador no banco de dados do Hemocentro Os
registros dos fenoacutetipos dos doadores ficam armazenadas no sistema de banco de sangue
(SBS) Para doadores que natildeo tinham fenotipagem estendida preacutevia para antiacutegenos do sistema
Rh (C c E e e) e Kell (K) foi realizada a fenotipagem para esses antiacutegenos
O tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA e cloroquina para dissociar
anticorpos pode inativar enfraquecer ou destruir os antiacutegenos presentes nas hemaacutecias
alterando assim os resultados da fenotipagem Para verificar se houve destruiccedilatildeo dos
antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a e Jk
b S e s nas amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes
tratamento foram novamente fenotipadas ao final para os antiacutegenos que eram inicialmente
positivas
A repeticcedilatildeo da fenotipagem foi realizada nas amostras que apresentaram efetividade
no tratamento da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eou da cloroquina e a detecccedilatildeo do antiacutegeno
na amostra preacute-tratamento
24
412 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS HEMAacuteCIAS
As hemaacutecias foram sensibilizadas com antissoros policlonais humanos de amostras de
plasma fresco congelado de doadores com resultado de pesquisa de anticorpo irregular
positivos
A escolha do anticorpo para sensibilizar as hemaacutecias foi definida de acordo com o
fenoacutetipo do doador que deveria ser positivo para o respectivo antiacutegeno
Para a sensibilizaccedilatildeo um volume de antissoro (1 mL) e um volume (1 mL) de
hemaacutecias lavadas quatro vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica foram adicionadas a um tubo de 12 x
75 mm A mistura foi homogeneizada e incubada em banho maria (BM) a 37deg C por 60
minutos A seguir as hemaacutecias foram novamente lavadas 4 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica
para retirada dos anticorpos que natildeo se ligaram A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada
como controle negativo O teste da uacuteltima lavagem eacute importante para assegurar que os
anticorpos que poderatildeo ser detectados no eluato apoacutes o tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA
sejam aqueles que estavam ligados agraves hemaacutecias e natildeo aqueles livres no plasma O controle
negativo mostra que todo o anticorpo livre foi retirado (LEGER 2011)
Para o teste de presenccedila de anticorpo na soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foram incubadas
com hemaacutecias de triagem de anticorpos irregulares (ID-Diacell BIO-RAD) contendo os
antiacutegenos especiacuteficos Realizado a teacutecnica em gel LissCoombs com anti-IgG+C3d Incubado
no tempo de 15 minutos a temperatura de 37deg C e centrifugado 10 minutos em centriacutefuga
proacutepria
As 50 amostras de doadores foram sensibilizadas com os anticorpos policlonais
humanos
Apoacutes sensibilizadas rdquoin vitrordquo e lavadas as hemaacutecias foram diluiacutedas em soluccedilatildeo de
baixa forccedila iocircnica (LISS) na quantidade de 10 microL de hemaacutecia para 1000 microL de soluccedilatildeo A
suspensatildeo foi pipetada (50 microL) em coluna-gel-teste LissCoombs (BIO-RAD) que contecircm
antiglobulina poliespeciacutefico (IgG+C3d) e centrifugada em baixa rotaccedilatildeo conforme orientaccedilatildeo
do fabricante durante 10 minutos
As amostras deveriam apresentar aglutinaccedilatildeo com reatividade 3 a 4+ no TDA As
amostras que apresentaram reaccedilatildeo menor que 3+ foram novamente sensibilizadas com nova
aliacutequota do antissoro
25
413 TRATAMENTO DAS AMOSTRAS
As amostras sensibilizadas apresentando o TDA positivo 3 ou 4+ foram divididas em
duas aliacutequotas e submetidas a duas teacutecnicas diferentes com o objetivo de dissociar o anticorpo
ligado Uma aliacutequota da amostra foi tratada com soluccedilatildeo de difosfato de cloroquina enquanto
a outra aliacutequota foi tratada com glicina-aacutecidaEDTA
42 PREPARO DA GLICINA AacuteCIDA-EDTA
A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA utiliza 3 soluccedilotildees diferentes a glicina aacutecida o
EDTA e o tampatildeo TRIS
Os reagentes foram preparados utilizando os sais para anaacutelise (PA) de EDTA
(Na2EDTA2H2O) TRIS (C4H11NO3) Glicina (H2NCH2CO2H) NaCl e a soluccedilatildeo de aacutecido
cloriacutedrico (HCl) 12 N todos reagentes da marca SYNTH (quadro 1)
Para o preparo do tampatildeo glicina-acida eacute necessaacuterio o ajuste do pH para 15 Para esse
ajuste utiliza-se aacutecido cloriacutedrico (HCl) concentrado O pH foi medido com fitas reativas de pH
com escala de 1 a 14 da marca MERCK Posteriormente a soluccedilatildeo foi enviada ao laboratoacuterio
de controle de qualidade do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto e o pH medido no peagacircmetro O
tampatildeo glicina-aacutecida foi armazenado a 4deg e o tampatildeo tris e o EDTA em temperatura ambiente
controlada (20 a 24deg Celsius)
Apoacutes o preparo e durante a realizaccedilatildeo dos testes foram feitas inspeccedilotildees visuais para
verificaccedilatildeo de turvaccedilatildeo do meio e presenccedila de precipitados
Reagente Material Quantidade Preparo e
Conservaccedilatildeo
EDTA
EDTA
(Na2EDTA2H2O)
5 gramas Mistura ateacute
dissoluccedilatildeo do sal e
conserva em
temperatura ambiente Aacutegua Destilada 50 Ml
Tris
TRIS (C4H11NO3) 121 gramas Conservar em
temperatura ambiente NaCl 525g
Aacutegua destilada 100ml
Gliacutecina-aacutecida
Glicina
(H2NCH2CO2H) 15 gramas
Conservar a 4oC NaCl 116gramas
Aacutegua Destilada 200ml
HCL 12N Ajutar o pH para 15
Quadro 1 - Preparo dos Reagentes da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
Fonte - Manual teacutecnico AABB 2011
26
O tampatildeo glicina-aacutecida e o tampatildeo TRIS satildeo estaacuteveis por 7 meses O reagente EDTA
precipitou mesmo estando em temperatura em ambiente controlado Houve necessidade de
preparo de novo reagente
421 TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
1 Em um tubo de ensaio 12x75 mm eacute adicionado 08 mL da soluccedilatildeo de glicina-aacutecida A
esta soluccedilatildeo adiciona-se 02 mL de EDTA e mistura
2 Adiciona-se 02 mL de hemaacutecias sensibilizadas (lavada 4 vezes) A mistura eacute
homogeneizada e incubada por exatamente 2 minutos
3 A seguir 01 mL de tampatildeo TRIS eacute adicionado agrave mistura que eacute novamente
homogeneizada e centrifugada por 2 minutos a 3400 rpm O pH deve estar entre 7 a 75
4 Apoacutes centrifugaccedilatildeo separa-se em outro tubo o sobrenadante (eluato) e as hemaacutecias
que permanecem satildeo lavadas 4 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica para retirada de todo o
reagente e anticorpos livres
43 PREPARO DA CLOROQUINA
A cloroquina eacute diluiacuteda em tampatildeo PBS na concentraccedilatildeo de 20 (Quadro 2) e
armazenado a 4deg Celsius sua validade apoacutes o preparo eacute de 1 mecircs
A teacutecnica da cloroquina jaacute estaacute padronizada para rotina do laboratoacuterio de
imunohematologia do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto e suas unidades
Reagente Reagentes Quantidade PreparoConservaccedilatildeo
Cloroquina
Difosfato de cloroquina
(C18H32ClN3O8P2)
20 gramas
Conservar a 4deg Celsius
Tampatildeo PBS 100ml
NaOH 01 N Acertar o pH para
51
Quadro 2 - Preparo da Cloroquina Fonte - Manual teacutecnico da AABB 2011
431 TEacuteCNICA DA CLOROQUINA
1 4 partes da soluccedilatildeo pronta eacute adicionada a uma parte de hemaacutecias lavadas 4 vezes com
soluccedilatildeo fisioloacutegica
2 A mistura eacute incubada em temperatura ambiente por ateacute duas horas
3 Centrifugar a 3400 rpm por 2 minutos
27
4 Remover o sobrenadante lavar as hemaacutecias novamente com soluccedilatildeo fisioloacutegica 4
vezes
44 VERIFICACcedilAtildeO DA EFETIVIDADE DOS TESTES
Apoacutes tratamento pelas duas teacutecnicas o TDA foi repetido em todas as amostras para
verificar se os tratamentos foram efetivos e houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo Para as
amostras tratadas pela teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA que permaneceram com TDA positivo
novo tratamento foi realizado
45 TESTE DO ELUATO
O eluato resultante das amostras tratadas com glicina-acidaEDTA foi testado com
hemaacutecias de triagem A soluccedilatildeo do eluato foi incubada com as hemaacutecias de triagem de
anticorpos (ID-Diacell BIO-RAD) pela teacutecnica em gel LissCoombs O teste foi incubado 15
minutos a 37deg Celsius e centrifugado por 10 minutos em centrifuga proacutepria para a teacutecnica em
gel Os eluatos que apresentaram resultados positivos foram testados em painel de 11
hemaacutecias (ID-Diapanel BIO-RAD) para a identificaccedilatildeo do anticorpo
46 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente que apresentou TDA positivo por IgG e pesquisa
de anticorpo irregular positivo com presenccedila de autoanticorpo com reatividade panaglutinina
A amostra foi tratada em paralelo pelas duas teacutecnicas descritas e foi enviada para o
Hemocentro para genotipagem eritrocitaacuteria que foi realizado por metodologia PCR em tempo
real no equipamento Real-time system PCR 7500 ( Applied Biosystems Califoacuternia EUA)
28
5 RESULTADOS
51 REAGENTES
Para aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA satildeo necessaacuterios 3 diferentes
reagentes que podem ser encontrados em forma de kit pronto para uso No entanto esses kits
natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil Os reagentes satildeo tampatildeo glicina-aacutecida o EDTA e o tampatildeo
Tris
Todos os reagentes foram preparados rdquoin houserdquo a partir dos sais e soluccedilotildees PA (puro
para anaacutelise) da marca SYNTH que foram adquiridos para a pesquisa O custo estimado para
cada teste foi aproximadamente R$ 020 reais
Apoacutes o preparo os reagentes poderiam ser armazenados em condiccedilotildees adequadas pelo
periacuteodo de 1 ano (AABB 2011) Ao final do preparo e durante o periacuteodo de armazenamento
de fevereiro a setembro de 2016 foi realizada inspeccedilatildeo visual para verificar a presenccedila de
precipitados ou turvaccedilatildeo A soluccedilatildeo de glicina e o tampatildeo TRIS mostraram-se estaacuteveis ateacute o
final do periacuteodo Por sua vez o reagente EDTA precipitou mesmo estando armazenado em
temperatura ambiente controlada e foi necessaacuterio novo preparo
52 AMOSTRAS DE DOADORES
521 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS AMOSTRAS
Apoacutes incubaccedilatildeo da hemaacutecia com o antissoro a mesma foi lavada 4 vezes para retirada
dos anticorpos livres A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada Caso houvesse positividade na
soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem a etapa era repetida (figura 3) Das 50 amostras sensibilizadas a
uacuteltima lavagem foi positiva somente em 3 delas Nas 3 amostras o anticorpo utilizado para
sensibilizaccedilatildeo foi o anti-K Apoacutes repetido nova etapa de lavagem os resultados se
apresentaram negativos
Em todas as amostras sensibilizadas ldquoin vitrordquo o TDA foi testado e verificado a
intensidade do teste Entre as 50 amostras 47 alcanccedilaram TDA com intensidade 3-4+ apoacutes a
primeira sensibilizaccedilatildeo enquanto 3 amostras necessitaram uma segunda incubaccedilatildeo com
anticorpo (figura 4)
A escolha dos anticorpos para sensibilizar as hemaacutecias foi feita de acordo com o
fenoacutetipo do doador e foram utilizados sete diferentes especificidades de anticorpos policlonais
humanos conforme mostra o graacutefico1
29
Figura 3 - Soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada com hemaacutecia de triagem de
anticorpos em gel LissCoombs (BIO-RAD) A finalidade eacute verificar a presenccedila de anticorpos livres na
suspensatildeo que possam interferir na pesquisa do eluato As soluccedilotildees de lavagem das amostras na figura a tiveram
resultados negativos Na figura b duas amostras a 47 e 50 apresentaram resultado positivo Nova etapa de
lavagem foi realizada e o resultado final foi negativo
522 TRATAMENTO DAS HEMAacuteCIAS
Apoacutes a sensibilizaccedilatildeo e obtenccedilatildeo de resultados de TDA com intensidade de 3 a 4+
cada uma das amostras foi dividida em duas aliacutequotas e tratada separadamente pelas teacutecnicas
de glicinaaacutecida-EDTA e cloroquina
As teacutecnicas foram consideradas efetivas quando obteve-se a completa dissociaccedilatildeo do
anticorpo verificada atraveacutes do TDA negativo na amostra poacutes tratamento conforme figuras 5
e 6 Dentre as amostras tratadas com cloroquina 2850 tiveram o TDA negativado A glicina-
aacutecidaEDTA negativou o TDA em 33 das 50 amostras tratadas Apenas 17 amostras tratadas
com glicina-aacutecidaEDTA permaneceram com o TDA positivo e foram submetidas a um novo
tratamento
30
Figura 4 - TDA das amostras apoacutes sensibilizaccedilatildeo com anticorpos policlonais humanos Amostras na
figura a com intensidades de 3-4+ Na figura b amostras 4 e 7 com intensidade menor que 3+ e portanto foram
novamente sensibilizadas com nova aliacutequota de soro Anti-D e anti-S Apoacutes a segunda sensibilizaccedilatildeo
apresentaram reatividade 4 e 3+ respectivamente Os anticorpos utilizados para sensibilizaccedilatildeo foram D S c E
C e K
523 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS TEacuteCNICAS
No tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA houve dissociaccedilatildeo completa do anticorpo
em 33 amostras (66) das 50 amostras testadas enquanto que com a cloroquina foram 28
amostras (56) (tabela 1)
31
Graacutefico 1- Nuacutemero de amostras sesnsibilizadas por especificidade de anticorpo Entre as 50 amostras 12
foram sensibilizadas com anti-D 10 com anti-C 9 com anti-E 8 com anti-c 7 com anti-S 3 com anti-K e 1
com anti-Dia As especificidades dos anticorpos foram definidas de acordo o fenoacutetipo do doador
Figura 5 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com cloroquina Nas amostras onde houve
a dissociaccedilatildeo do anticorpo ( 2 21 a 23 26 39 a 42 45 46 e 49) a hemaacutecia se deposita no fundo no microtubo
apoacutes a centrifugaccedilatildeo (TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (1 3 24 25 43 44 47
48 e 50) o anticorpo ligado agraves hemaacutecias eacute alvo da AGH presente no gel (TDA positivo)
Anti-D 12
Anti-C 10
Anti-E 9
Anti-c 8
Anti-S 7
Anti-K 3 Anti-Dia 1
32
Figura 6 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA Nas amostras
onde houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo (4 6 7 12 a 15 17 34 35 37 e 38) a hemaacutecia se deposita no fundo no
microtubo apoacutes a centrifugaccedilatildeo ( TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (5 16 18
19 20 33 e 36 ) o AGH presente no gel se liga ao anticorpo ligado agraves hemaacutecias que ficam retidas no gel (TDA
positivo)
Tabela 1-Resultado geral do tratamento das hemaacutecias com glicina e cloroquina
Teacutecnica utilizada TDA negativo TDA positivo Total
Glicina-aacutecidaEDTA 33 17 50
Cloroquina 28 22 50
A glicina-aacutecidaEDTA conseguiu negativar mais amostras sensibilizadas com Anti-D
e anti-K que a cloroquina Para as hemaacutecias sensibilizadas com anti-E Anti-S e Anti-Dia
ambas as teacutecnicas dissociaram o anticorpo em 100 das amostras Os resultados detalhados
por especificidade do anticorpo apoacutes o primeiro tratamento com glicina-aacutecidaEDTA e com
cloroquina estatildeo na tabela 2
Para as amostras que permaneceram positivas (17 amostras) apoacutes o tratamento com a
glicina-aacutecidaEDTA foi realizado um novo tratamento Houve dissociaccedilatildeo do anticorpo em 3
amostras (18) apoacutes a segunda tentativa Nas demais 14 (82) amostras tratadas pela
segunda vez 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise
33
Tabela 2 - Resultados do TDA apoacutes tratamento das hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo
sensibilizado
ANTICORPOS
SENSIBILIZADOS
1ordm TRATAMENTO COM
GLICINA
TRATAMENTO COM
CLOROQUINA
TOTAL TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
Anti-D 8 4 0 12 12
Anti-C 6 4 10 0 10
Anti-E 9 0 9 0 9
Anti-c 0 8 1 7 8
Anti-S 7 0 7 0 7
Anti-K 2 1 0 3 3
Anti-Dia 1 0 1 0 1
TOTAL 33 17 28 22 50
A hemoacutelise foi verificada durante o procedimento de lavagem final das hemaacutecias com
soluccedilatildeo fisioloacutegica para a retirada dos reagentes As soluccedilotildees de lavagem ficaram
avermelhadas e as hemaacutecias com coloraccedilatildeo escura As amostras foram descartadas Dentre as
6 amostras que ainda puderam ser testadas para o TDA trecircs amostras negativaram sendo 1
sensibilizada com anti-D e 2 com anti-C (tabela 3)
Tabela 3 - Resultado apoacutes o segundo tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA
Tratamento com
glicina-aacutecidaEDTA
TDA Negativo TDA Positvo Hemoacutelise Total
Segundo tratamento 3 3 11 17
524 TESTAGEM DO ELUATO
Apoacutes o tratamento com a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA a soluccedilatildeo do eluato foi
testada para verificar a viabilidade dos anticorpos que foram dissociados ou eluiacutedos Dentre
as 50 amostras 41 apresentaram eluato positivo As nove amostras cujos eluatos foram
negativos haviam sido sensibilizadas com as seguintes especificidades de anticorpos anti-E 6
amostras (67) anti-S 2 amostras (40) e anti-D 1 amostra (8) (tabela 4) O eluato de
todas as amostras sensibilizadas com os anticorpos anti-C anti-c Anti-K e Anti-Dia foram
positivos Os eluatos positivos na triagem de anticorpos foram testados com paineacuteis de
identificaccedilatildeo para confirmar a especificidade e a viabilidade dos anticorpos (figuras 7 e 8)
34
525 EFEITO DA ELUICcedilAtildeO SOBRE OS ANTIacuteGENOS ERITROCITAacuteRIOS
Para verificar o efeito do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA e com a cloroquina
sobre a expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s foi realizada a fenotipagem das
amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes tratamento com ambas as teacutecnicas Foi avaliado
se o tratamento destruiu os antiacutegenos expressos antes do tratamento
Tabela 4- Resultado do Eluato das amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA
Anticorpos Eluato positvo Eluato negativo Total
Anti-D 11 1 12
Anti-C 10 0 10
Anti-E 3 6 9
Anti-c 8 0 8
Anti-S 5 2 7
Anti-K 3 0 3
Anti-Dia 1 0 1
Total 41 9 50
Figura 7 ndash Painel do eluato da amostra 21 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-C que foi
recuperado no eluato
Figura 8 ndash Painel do eluato da amostra 47 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-K que foi
recuperado no eluato
35
Dentre as 50 amostras 26 eram previamente fenotipadas para os antiacutegenos Fya Fy
b
Jka Jk
b S e s Dentre elas 20 alcanccedilaram TDA negativo apoacutes tratamento com a glicina-
aacutecidaEDTA e 20 negativaram apoacutes tratamento com cloroquina (tabela 5) Apoacutes ambas as
teacutecnicas os antiacutegenos originalmente expressos permaneceram positivos comprovando que natildeo
houve destruiccedilatildeo dos mesmos
Tabela 5 ndash Verificaccedilatildeo da interferecircncia do tratamento da hemaacutecias com cloroquina e glicina-
aacuteicdaEDTA sobre os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
AMOSTRAS
COM
FENOTIPAGEM
PREacuteVIA
TRATADAS COM
CLOROQUINA
TRATADAS COM
GLICINA
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
26
20
20
20
20
As amostras 24 47 e 50 eram positivas para o antiacutegeno K A cloroquina natildeo dissociou
o anticorpo em nenhuma das 3 amostras enquanto a glicina-aacutecidaEDTA foi efetiva nas
amostras 24 e 50 Foi testada a expressatildeo do antiacutegeno K nas amostras 24 e 50 apoacutes o
tratamento utilizando meacutetodo indireto em gel contendo AGH Apesar de natildeo ter sido avaliado
a intensidade de reaccedilatildeo de expressatildeo dos antiacutegenos podemos verificar na figura 9 que nas
duas amostras em que a teacutecnica foi efetiva e dissociou o anticorpo a expressatildeo do antiacutegeno K
continua presente mas a reatividade observada pode ser considerada 1+ sugerindo que houve
diminuiccedilatildeo da expressatildeo do antiacutegeno quando comparado com a expressatildeo observada em
hemaacutecia natildeo tratada
Os resultados individuais de cada amostra em ambas as teacutecnicas encontram-se
resumidas na tabela 6
526 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente onde foi constatada a presenccedila de autoanticorpo
a quente da classe IgG pelo TDA monoespeciacutefico (figura 10)O autoanticorpo tambeacutem
interferia na pesquisa e identificaccedilatildeo de anticorpos irregulares pois apresentava caracteriacutestica
de panaglutinina As hemaacutecias da paciente sensibilizadas ldquoin vivordquo foram tratadas com
cloroquina e com glicina-aacutecidaEDTA
36
Figura 9 ndash Fenotipagem das amostras 24 e 50 para antiacutegeno K apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
O teste positivo indica a presenccedila do antiacutegeno poreacutem a reatividade fraca (1+) sugere que houve enfraquecimento
de sua expressatildeo A direita a expressatildeo forte (4+) do antiacutegeno Kell em hemaacutecia controle natildeo tratada utilizada
como controle positivo
A cloroquina natildeo foi efetiva na retirada do anticorpo ligado as hemaacutecias ao contraacuterio
do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA que dissociou o anticorpo (figura 11)
A hemaacutecia tratada com glicina foi fenotipada para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
(figura 12) A fenotipagem para o sistema Rh (C c E e e) e Kell foi realizada em gel
especiacutefico monoclonal sem interferecircncia do TDA positivo (controle da reaccedilatildeo negativo)
O eluato resultante do tratamento com glicina-aacutecidaEDTA foi testada em gel com
hemaacutecias de painel de identificaccedilatildeo de anticorpos e apresentou resultado positivo com todas
as ceacutelulas (figura 13 e 14)
A amostra foi enviada para genotipagem e o resultado da genotipagem confirmou o
resultado da fenotipagem apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
527 TEMPO DE EXECUCcedilAtildeO DA TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
O tempo de reaccedilatildeo da glicina-aacutecidaEDTA eacute de 2 minutos Todas as amostras foram
tratadas obedecendo ao tempo descrito na literatura demonstrando que o mesmo eacute
reprodutiacutevel
37
Tabela 6- Resultados individuais por amostra
Amostra Especificidade
dos anticorpos
Intensidade do
TDA apoacutes
sensibilizaccedilatildeo
Tratamento
efetivo com
cloroquina
Tratamento
efetivo com
glicina
Eluato
poacutes
glicina
1 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 2 Dia 3+ Sim Sim 3+ 3 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 4 D 4+ Natildeo Sim 4+ 5 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 6 E 3+ Sim Sim Negativo 7 S 4+ Sim Sim 3+ 8 E 3+ Sim Sim 1+ 9 E 3+ Sim Sim 2+
10 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 11 D 4+ Natildeo Sim 4+ 12 D 4+ Natildeo Sim 4+ 13 S 3+ Sim Sim 3+ 14 S 3+ Sim Sim 3+ 15 D 3+ Natildeo Sim 3+ 16 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 17 E 3+ Sim Sim (+) 18 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 19 D 4+ Natildeo Natildeo 3+ 20 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 21 C 3+ Sim Sim 4+ 22 C 3+ Sim Sim 4+ 23 C 3+ Sim Sim 4+ 24 K 4+ Natildeo Sim 4+ 25 D 3+ Natildeo Natildeo Negativo 26 E 4+ Sim Sim Negativo 27 S 3+ Sim Sim 3+ 28 C 3+ Sim Natildeo 4+ 29 C 3+ Sim Sim 4+ 30 C 3+ Sim Sim 4+ 31 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 32 E 3+ Sim Sim Negativo 33 C 3+ Sim Natildeo 4+ 34 S 3+ Sim Sim Negativo 35 S 3+ Sim Sim Negativo 36 C 4+ Sim Natildeo 4+ 37 c 4+ Natildeo Natildeo 4+ 38 D 4+ Natildeo Sim 4+ 39 S 3+ Sim Sim 3+ 40 c 4+ Sim Natildeo 2+ 41 C 4+ Sim Natildeo 4+ 42 E 3+ Sim Sim Negativo 43 D 3+ Natildeo Sim 2+ 44 D 3+ Natildeo Sim 2+ 45 E 3+ Sim Sim Negativo 46 C 3+ Sim Sim 4+ 47 K 4+ Natildeo Natildeo 4+ 48 D 3+ Natildeo Sim 2+ 49 E 3+ Sim Sim Negativo 50 K 4+ Natildeo Sim 4+
TOTAL 50 28 33 41
38
Figura 10 ndash TDA monoespeciacutefico da amostra de paciente Hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo da classe
IgG
oacute Figura 11 ndash TDA apoacutes o tratamento com glicina-aacutecidaEDTA (esquerda) e cloroquina (direita) A glicina
negativou completamente o TDA enquanto a hemaacutecia tratada com cloroquina persistiu positiva (1+)
39
Figura 12 ndash Fenotipagem da amostra tratada com glicina-aacutecidaEDTA Fy(a+b+) Jk(a-b+) S+s+
Figura 13 ndash Painel em gel (LissAGH) do eluato apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de
intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
Figura 14 ndash ndash Painel ezimaacutetico (hemaacutecias tratadas com bromelina) do eluato em gel neutro apoacutes
tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
40
528 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Quanto a efetividade das teacutecnicas em negativar o TDA foi verificado que a glicina-
aacutecidaEDTA foi efetiva em 66 das amostras testadas no primeiro tratamento (3350
amostras) enquanto a cloroquina conseguiu negativar 56 (2850) Esses resultados natildeo
apresentam diferenccedila significativa (pgt005) demostrando que a teacutecnica da glicina-
aacutecidaEDTA natildeo eacute superior mas eacute tatildeo efetiva quanto a da cloroquina
Quando aliamos os resultados de ambas as teacutecnicas verificamos que em 76 (3850)
das amostras o TDA foi negativado Esse dado indica que ainda que uma teacutecnica natildeo seja
eficaz na remoccedilatildeo do anticorpo eacute uma boa alternativa tentar a segunda teacutecnica jaacute que a falha
em remover o anticorpo utilizando uma delas natildeo prevecirc necessariamente a falha com a outra
Quando se utiliza o teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla (graacutefico 2) para comparar a utilizaccedilatildeo das
duas teacutecnicas com o resultado de cada uma isolada (somente a cloroquina ou somente a
glicina) verificamos que os resultados apresentam diferenccedila significativa (plt005) (quadro 3)
TRATAMENTO EFETIVO COM TOTAL PORCENTAGEM
Glicina ou cloroquina 38 76
Glicina e cloroquina 23 46
Glicina apenas 10 20
Cloroquina apenas 5 10
Nenhuma das teacutecnicas 12 24
Quadro 3 - Resultados comparativos entre as teacutecnicas utilizadas
41
Graacutefico 2 - Teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla entre as teacutecnicas aplicadas A- Glicina e Cloroquina B-Cloroquina C-
Glicina ( plt005)
42
6 DISCUSSAtildeO
Os reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA podem ser adquiridos em
forma de kit comercial prontos para uso poreacutem natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil A preparaccedilatildeo
dos reagentes ldquoin houserdquo a partir de sais comerciais adquiridos se mostrou viaacutevel Os
reagentes glicina e o tampatildeo Tris armazenados de forma correta se mantiveram estaacuteveis por
um periacuteodo de 7 meses Somente o reagente EDTA precipitou mesmo armazenado em
condiccedilotildees adequadas sugerindo que o mesmo deve ser preparado em menor quantidade e
armazenado em aliacutequotas A soluccedilatildeo de cloroquina tambeacutem pode ser preparada ldquoin houserdquo e
pode ser armazenado por um mecircs A legislaccedilatildeo brasileira autoriza a utilizaccedilatildeo de reagentes
preparados a partir de sais comerciais como a cloroquina e a glicina-aacutecidaEDTA desde que
os sais tenham autorizaccedilatildeo da vigilacircncia sanitaacuteria para a comercializaccedilatildeo (BRASIL 2001)
A comparaccedilatildeo quanto a efetividade em dissociar anticorpos em amostras com TDA
positivos entre a teacutecnica da glicina e a teacutecnica da cloroquina mostrou que natildeo haacute diferenccedila
estatiacutestica entre elas e que ambas satildeo igualmente eficientes Se utilizadas conjuntamente haacute
maior possibilidade de elucidaccedilatildeo dos casos
Uma vantagem da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eacute que ela permite numa mesma
amostra eluir o anticorpo ligado aacute hemaacutecia assim como fenotipar a hemaacutecia tratada Devido a
sua dupla utilidade a teacutecnica eacute vantajosa principalmente em pacientes em que pouco volume
de amostra pode ser coletado como em casos de crianccedilas e receacutem-nascidos
A fenotipagem poacutes tratamento se mostrou viaacutevel jaacute que os antiacutegenos de maior
importacircncia natildeo sofreram alteraccedilotildees Nas 20 amostras que foram fenotipadas antes e apoacutes
tratamento para verificar a influecircncia dos reagentes na expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a
Jkb S e s natildeo houve destruiccedilatildeo dos mesmos por nenhuma das duas teacutecnicas
Para as amostras positivas para o antiacutegeno Kell (350) e sensibilizadas com o
respectivo anticorpo a teacutecnica da glicina foi efetiva em negativar o TDA em apenas duas
delas mas apoacutes o tratamento foi verificada uma fraca reatividade da reaccedilatildeo antiacutegeno-
anticorpo sugerindo que houve um enfraquecimento da expressatildeo do antiacutegeno conforme
esperado e descrito na literatura (BYRNE 1991 PALLAS WILER E MCGEE 1991
ROZIERS e SQUALI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012 e KATHARIA e
CHAUDHARY 2013) A accedilatildeo da glicina sobre o antigeno Kell natildeo representa impedimento
para seu uso uma vez que na impossibilidade de testar o antiacutegeno Kell o banco de sangue
consegue facilmente atender a solicitaccedilatildeo de transfusatildeo com unidades de hemaacutecias Kell
43
negativas jaacute que eacute um antiacutegeno de baixa prevalecircncia na populaccedilatildeo variando de 15 na
populaccedilatildeo africana a 9 nos europeus (DANIELS 2011)
A soluccedilatildeo resultante da dissociaccedilatildeo do anticorpo pela teacutecnica da glicina pode ainda ser
utilizada como eluato podendo substituir a teacutecnica de eluiccedilatildeo com reagentes comercias (kits
de eluiccedilatildeo aacutecida) que tem alto custo aproximadamente entre R$2000 a R$2500 por teste
Em 41 amostras (82) houve a dissociaccedilatildeo e recuperaccedilatildeo do anticorpo que estava
sensibilizando as hemaacutecias Em 9 amostras (18) os anticorpos foram eluiacutedos poreacutem
apresentaram reaccedilatildeo negativa quando testadas com hemaacutecias de triagem entre eles o anti-E
(6) anti-S (2) e Anti-D (1) Eacute possiacutevel que a correccedilatildeo pH do meio (WALKER 2011) natildeo
tenha sido adequada o que pode ter desfavorecido a reatividade do anticorpo
Para as amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA nas quais natildeo houve dissociaccedilatildeo do
anticorpo pelo primeiro tratamento (1750) o segundo tratamento natildeo se mostrou eficaz jaacute
que 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise O tempo de
armazenagem natildeo parece ter influenciado jaacute que todas as amostras foram testadas dentro de
48 horas apoacutes a coleta Outros fatores que natildeo foram verificados podem ter levado a
hemoacutelise Apesar da literatura (LOUIE JIENG e ZEROULIS 1986 e BYRNE 1991)
recomendar um segundo tratamento ele eacute pouco eficaz tendo negativado apenas 3 das 17
amostras testadas
A amostra de paciente que apresentou sensibilizaccedilatildeo ldquoin vivordquo mostrou melhor
efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA sobre a da cloroquina possibilitando
fenotipagem para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s que natildeo foram destruiacutedos apoacutes o
tratamento comprovado atraveacutes da genotipagem
A presenccedila de autoanticorpo a quente com presenccedila de hemoacutelise (AHAI) ou natildeo pode
mascarar a presenccedila de aloanticorpo interferindo na rotina soroloacutegica da fenotipagem que eacute
uma importante ferramenta para auxiliar na seleccedilatildeo de hemaacutecias para transfusatildeo (SHIREY et
al 2002) Esses pacientes frequentemente possuem aloanticorpos associados ao
autoanticorpo e a prevalecircncia de aloimunizaccedilatildeo entre eles varia entre 12 a 40 (LEGER e
GARRATY 1999 BRANCH e PETZ 1999) o que dificulta ainda mais a escolha do melhor
componente a ser transfundido aleacutem de aumentar a possibilidade reaccedilotildees hemoliacuteticas imunes
poacutes-transfusionais
Nesses casos as teacutecnicas de dissociaccedilatildeo de anticorpos satildeo importantes para tratar
amostras de pacientes e a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser usada como uma opccedilatildeo
pois se mostrou eficaz na dissociaccedilatildeo anticorpo ligado agraves hemaacutecias deixando livre a
superfiacutecie das mesmas permitindo a fenotipagem por antisoros IgG Paralelamente os
44
anticorpos eluiacutedos tambeacutem puderam ser estudados O mesmo natildeo ocorre com a cloroquina
que permite apenas a fenotipagem e tampouco com os kits de eluiccedilatildeo aacutecida disponiacuteveis no
mercado nacional que satildeo destinados a realizaccedilatildeo do eluato mas destroem as hemaacutecias
O tempo de tratamento na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA tambeacutem eacute uma vantagem
pois foi possiacutevel reproduzir no tempo determinado de 2 minutos enquanto a cloroquina
demora ateacute duas horas
Ainda que a aplicaccedilatildeo das teacutecnicas por biologia molecular estejam cada vez mais
presentes na rotina imuno-hematoloacutegica e possibilitam estabelecer o fenoacutetipo deduzido do
genoacutetipo elas natildeo estatildeo disponiacuteveis na maioria dos centros e sua realizaccedilatildeo exige algumas
horas A resoluccedilatildeo imediata do problema transfusional necessita dos resultados soroloacutegicos
pois com frequecircncia natildeo eacute possiacutevel aguardar o resultado do teste molecular Dessa forma
apesar da crescente importacircncia da genotipagem eritrocitaacuteria teacutecnicas soroloacutegicas aplicadas
corretamente e no momento propiacutecio satildeo de grande utilidade para resolver problemas imuno-
hematoloacutegicos como ocorre com a fenotipagem em pacientes com TDA positivo
45
7 CONCLUSAtildeO
A teacutecnica da glicina aacutecidaEDTA mostrou-se efetiva em remover os anticorpos que
sensibilizavam as hemaacutecias e pode ser utilizada com seguranccedila antes da fenotipagem
eritrocitaacuteria Por ser uma teacutecnica de raacutepida execuccedilatildeo eacute uma alternativa aplicaacutevel
principalmente em casos urgentes de pacientes que apresentam autoanticorpos
46
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SERERAT T S VEIDT D e DUTCHED A A quick and simple method for plenotyping
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SHIREY R S et al Prophylactic antigen-matched donor blood for patients with warm
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ZAGO M A Apresentaccedilatildeo In Covas D T Ubialli E M A De Santis G C Manual de
Medicina Transfusional 2ordf ed Satildeo Paulo Atheneu 2014
50
9 ANEXOS
51
FUNDACcedilAtildeO HEMOCENTRO DE RIBEIRAtildeO PRETO
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE)
Tiacutetulo da pesquisa Aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina aacutecida-EDTA e avaliaccedilatildeo da
eficaacutecia no tratamento de hemaacutecias com teste direto da antiglobulina positivo
Pesquisadora responsaacutevel Ceacutelia Kazue Abiko
Orientador Prof Dimas Tadeu Covas
Co-orientadora Dra Flaacutevia Leite Souza Santos
Objetivo da pesquisa Vocecirc estaacute sendo convidado a participar de uma pesquisa que tem
como objetivo padronizar uma nova teacutecnica para auxiliar na tipagem sanguiacutenea de pacientes
A tipagem sanguiacutenea pode sofrer interferecircncia da presenccedila de anticorpos ligados aos gloacutebulos
vermelhos do sangue Nessas situaccedilotildees eacute difiacutecil selecionar o melhor sangue para o paciente e
eacute preciso a utilizaccedilatildeo de teacutecnicas adicionais para remover essas interferecircncias
Esta pesquisa tem como objetivo estudar outra teacutecnica para remover esses anticorpos e
comparaacute-la com a teacutecnica atualmente utilizada Para isso precisamos de amostras de pacientes
e doadores voluntaacuterios
Se vocecirc eacute um doador eacute necessaacuterio que vocecirc autorize a coleta de 5 ml (1 tubo) a mais
de seu sangue
Se vocecirc eacute um paciente natildeo haveraacute necessidade de nova amostra pois utilizaremos as
amostras jaacute coletadas para os testes preacute-transfusionais e os resultados encontrados nesta
pesquisa natildeo iratildeo interferir na escolha da (s) bolsa (s) de sangue que vocecirc possa vir a receber
Se vocecirc concordar em participar leia com atenccedilatildeo o texto abaixo e assine as duas vias
rubricando todas as paacuteginas deste termo de consentimento Uma via original assinada e
rubricada por vocecirc e pela pesquisadora ficaraacute com vocecirc
As suas informaccedilotildees seratildeo mantidas em sigilo pela pesquisadora e natildeo haveraacute
armazenamento de material para pesquisas posteriores Os seus dados seratildeo usados apenas
neste estudo e quando o trabalho for publicado seu nome e qualquer outra informaccedilatildeo que
possam identificaacute-lo natildeo seratildeo revelados
Eacute pouco provaacutevel que o que noacutes aprendermos com este estudo tenha um benefiacutecio
direto para vocecirc assim como natildeo poderemos dar nada em troca pela sua participaccedilatildeo na
pesquisa
Nosso objetivo com esta pesquisa eacute que os resultados poderatildeo ser uacuteteis para o
tratamento de pacientes no futuro Os riscos da participaccedilatildeo satildeo miacutenimos Se vocecirc eacute um
doador de sangue a amostra seraacute coletada no momento da doaccedilatildeo natildeo exigindo punccedilatildeo
venosa adicional
52
Eacute seu direito ter acesso aos resultados dos testes da pesquisa Esses resultados natildeo
seratildeo fornecidos automaticamente a vocecirc mas caso vocecirc se interesse em saber o resultado ou
tiver alguma duacutevida sobre a sua participaccedilatildeo neste estudo deveraacute entrar em contato com Ceacutelia
Kazue Abiko pelo telefone (18) 99718-3551
Vocecirc tem total liberdade de optar por natildeo participar da pesquisa Caso aceite
participar poderaacute desistir a qualquer momento ou retirar seu consentimento mesmo apoacutes ter
coletado o sangue Para cancelar sua participaccedilatildeo basta avisar a pesquisadora e os seus dados
seratildeo retirados do projeto
Qualquer duacutevida eacutetica sobre a pesquisa poderaacute entrar em contato com o Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa do Hospital das Cliacutenicas e da Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto
(CAMPUS UNIVERSITAacuteRIO bairro Monte Alegre CEP 14048-900 Ribeiratildeo Preto-SP
Telefone (16) 3602-2228 FAX (16) 3633-1144 e-mail cephcrpuspbr)
Consentimento de participaccedilatildeo
A Consentimento do participante
Li as informaccedilotildees acima sobre o estudo e recebi explicaccedilotildees sobre a participaccedilatildeo no estudo
Portanto dou o meu consentimento para participar do estudo
___________________________________________________________________________
Nome completo
___________________________________________________________________________
Assinatura
___________
Data
__________________________________________________________________________________
Nome completo da pesquisadora
___________________________________________________________________________
Assinatura
_____________
Data
ABSTRACT
The pre-transfusion tests are the group of immunohematology techniques applied in the
receptor and donor samples in order to provide a unit of red blood cells compatible and safe
for transfusion In addition to the obligatory ABO and Rh phenotyping in the pre-transfusion
tests the determination of the antigenic profile of other red cells antigens of clinical
importance improves transfusion safety especially for patients previously alloimmunized or
candidates for chronic transfusion For such patients knowing the phenotype allows the
selection of red blood cell concentrates with the same phenotype which prevents hemolytic
transfusion reactions as well as new alloimmunization Individuals who have antibody-coated
red blood cells sensitized in vivo such as in autoimmune hemolytic anemia (AHAI) will
have a direct antiglobulin test (DAT) positive making it difficult to perform phenotyping
Positive DAT causes false positive results especially when commercially available IgG
serums which require the human antiglobulin phase or indirect antiglobulin test (IAT) for
reading are used for phenotyping In 1982 Edwards Molds and Judd proposed the use of the
chloroquine technique to dissociate antigen-antibody complexes by preserving the erythrocyte
membrane and allowing phenotyping It is currently the most used technique in Brazilian
centers The EDTAglycine-acid technique was first described by Louie Jieng and Zeroulis in
1986 but it is little used because commercially available reagents are not available in the
Brazilian market The present study evaluated the EDTAglycine-acid technique with reagents
prepared in house in parallel to the chloroquine technique which is currently the technique
applied at the Hemocentro de Ribeiratildeo Preto For this donor red cells samples (n = 50) with
known phenotype were sensitized with human antibodies of known specificity and both
techniques were applied The effect of the technique on the expression of erythrocyte antigens
(Fya Fy
b Jk
a Jk
b S and s) was also verified by the phenotyping of the samples that had
negative DAT The viability of the antibodies present in the recovered eluate after treatment
with EDTAglycine-acid A was also tested EDTAglycine-acid was effective in negatively
affecting DAT in 33 samples (66) comparable to chloroquine that negatived 28 samples
(56) The eluate was viable in treatment with EDTAglycine-acid and no destruction of
erythrocyte antigens after treatment We conclude that the EDTA glycine-acid technique can
be used as an option in the treatment of red cells with TDA positive with the advantage that
its execution time is inferior to that of chloroquine (2 minutes x 30 to 120 minutes) which
makes it useful in emergency situations When both techniques are used in different
erythrocytes of the same sample the effectiveness is significantly increased (p lt005)
Key words EDTAglycine-acid direct antiglobulin test AIHA phenotyping
1 INTRODUCcedilAtildeO
A transfusatildeo de hemaacutecias eacute um recurso terapecircutico muito importante e eficaz e tem se
mostrado como um grande aliado no tratamento de diversas patologias auxiliando na
melhoria da sobrevida e qualidade de vida de diversos pacientes quando indicada de forma
correta Eacute provavelmente a modalidade de terapia mais utilizada no mundo sendo
considerada a forma mais antiga de terapia celular A transfusatildeo de hemaacutecias em pacientes
com anemia grave ou sangramento agudo reestabelece o niacutevel de hemoglobina moleacutecula
responsaacutevel pelo transporte de oxigecircnio para os tecidos melhorando a isquemia tecidual
(BARJAS-CASTRO 2013 ZAGO 2014)
A transfusatildeo de componentes celulares como o concentrado de hemaacutecias deve ser
bem avaliada quanto aos riscos e benefiacutecios Os testes preacute-transfusionais satildeo parte obrigatoacuteria
do processo transfusional e tecircm como funccedilatildeo assegurar que o melhor hemocomponente seja
selecionado para o paciente reduzindo assim a chance de transfusotildees incompatiacuteveis e reaccedilotildees
transfusionais (BARJAS-CASTRO 2013)
11TESTES PREacute-TRANSFUSIONAIS
Os testes preacute-transfusionais tecircm a finalidade de evitar a ocorrecircncia de reaccedilotildees
hemoliacuteticas no receptor decorrentes da transfusatildeo de hemaacutecias incompatiacuteveis do doador
(DOWNES e SHULMAN 2011) Tem como propoacutesito selecionar hemaacutecias que apoacutes
transfusatildeo deveratildeo ter sobrevida normal ou mais proacutexima do normal (MELO 2007)
Os testes preacute-transfusionais que consistem no conjunto de teacutecnicas
imunohematoloacutegicas aplicadas agraves amostras do receptor e doador devem ser realizados antes
de toda transfusatildeo A aplicaccedilatildeo desses testes tem como finalidade fornecer uma unidade de
hemaacutecias compatiacutevel e elevar a seguranccedila da transfusatildeo Os testes preacute-transfusionais aliados
a utilizaccedilatildeo de novas tecnologias tem historicamente evitado reaccedilotildees transfusionais
hemoliacuteticas garantindo a seguranccedila transfusional em cerca de 95 dos pacientes que recebem
transfusatildeo Eacute imprescindiacutevel poreacutem a execuccedilatildeo correta das teacutecnicas envolvidas nos testes preacute-
transfusionais e ainda garantir a identificaccedilatildeo correta do receptor e das amostras de sangue e
das unidades de hemaacutecias (CASTILHO 2000 MELO 2007 BARJAS-CASTRO 2013)
2
Todos os testes que compotildeem a rotina preacute-transfusional usam meacutetodos soroloacutegicos
que envolvem a reaccedilatildeo antiacutegeno x anticorpo Ao testar a presenccedila de um antiacutegeno na
superfiacutecie da hemaacutecia eacute necessaacuterio dispor de um soro com especificidade conhecida para
aquele antiacutegeno Por outro lado testar a presenccedila de um determinado anticorpo no soro ou no
plasma exige o uso de hemaacutecias com perfil antigecircnico conhecido Os testes preacute-transfusionais
incluem tipagem ABO (direta e reversa) tipagem Rh pesquisa de anticorpos irregulares no
sangue do receptor retipagem ABO e Rh do hemocomponente e prova de compatibilidade
entre as hemaacutecias do doador e soro ou plasma do receptor em caso de transfusatildeo de hemaacutecias
ou hemocomponentes que contenham mais de 2 mL de volume eritrocitaacuterio como o
concentrado de granuloacutecitos (BRASIL 2016 GANZELLA 2014 SANTOS 2014)
Aleacutem dos testes regularmente realizados a determinaccedilatildeo do fenoacutetipo para outros
antiacutegenos eritrocitaacuterios do doador e do receptor pode ser indicada A fenotipagem eritrocitaacuteria
determina o perfil antigecircnico para outros antiacutegenos de importacircncia cliacutenica aleacutem do sistema
ABO e do antiacutegeno RhD Ela pode auxiliar a confirmaccedilatildeo de uma especificidade de anticorpo
encontrada no soro do paciente uma vez que espera-se que a sua hemaacutecia natildeo expresse o
antiacutegeno correspondente e simultaneamente eacute utilizada para selecionar um concentrado de
hemaacutecias negativo para o respectivo antiacutegeno evitando reaccedilotildees hemoliacuteticas transfusionais A
fenotipagem de candidatos a transfusotildees crocircnicas tambeacutem eacute recomendada pois esse grupo de
pacientes deve se beneficiar com a transfusatildeo profilaacutetica de unidades de hemaacutecias com
mesmo fenoacutetipo evitando assim a aloimunizaccedilatildeo assim como reaccedilotildees hemoliacuteticas provocadas
por anticorpos previamente existentes e em baixo tiacutetulo natildeo identificados pela triagem de
anticorpos (CASTILHO JUNIOR e REID 2015 DOWNES e SHULMAN 2011)
111 TIPAGEM ABORh
O sistema ABO (ISBT001) foi o primeiro sistema de grupo sanguiacuteneo a ser
descoberto Ele foi descrito em 1900 por Karl Landsteiner e eacute considerado o sistema de maior
importacircncia na praacutetica transfusional Ele eacute composto por quatro antiacutegenos A1 (ABO1) B
(ABO2) AB (ABO3) e A1 (ABO4) e eacute caracterizado pela presenccedila dos anticorpos naturais
ou seja anticorpos que surgem sem a exposiccedilatildeo preacutevia aos antiacutegenos atraveacutes de transfusatildeo ou
gestaccedilatildeo Os anticorpos ABO satildeo predominantemente da classe IgM satildeo capazes de fixar o
complemento e de provocar hemoacutelise grave intravascular caso ocorra transfusatildeo ABO
incompatiacutevel Por apresentar essa caracteriacutestica peculiar a tipagem do sistema ABO eacute
composta de duas etapas a prova direta e a prova reversa Na prova direta eacute realizada a
pesquisa dos antiacutegenos na superfiacutecie das hemaacutecias que satildeo testadas com soros comerciais
3
Anti-A e Anti-B A prova reversa por sua vez pesquisa a presenccedila de anticorpos ABO ao
testar o soro ou plasma do pacientedoador com hemaacutecias A1 e B Ambas as provas satildeo
obrigatoacuterias e devem ser concordantes para interpretaccedilatildeo do fenoacutetipo ABO (COOLING
2011 SANTOS 2014)
O sistema Rh (ISBT004) eacute o maior e mais complexo sistema de grupos sanguiacuteneos
compreendendo atualmente 54 antiacutegenos (ISBT 2016) Satildeo cinco os principais antiacutegenos do
sistema Rh D (RH1) C (RH2) E (RH3) c (RH4) e e (RH5) Esses antiacutegenos possuem alta
capacidade imunogecircnica e seus respectivos anticorpos estatildeo envolvidos na doenccedila hemoliacutetica
perinatal e em reaccedilotildees transfusionais hemoliacuteticas Os autoanticorpos quentes como ocorre na
anemia hemoliacutetica quente satildeo representados em grande parte por anticorpos contra antiacutegenos
puacuteblicos do sistema Rh (CASTILHO 2007 CHOU e WESTHOFF 2011 BARJAS-
CASTRO 2013) A tipagem RhD pesquisa o antiacutegeno D na membrana eritrocitaacuteria ao testar a
hemaacutecia com antissoros comerciais Atualmente a maior parte dos soros Anti-D
comercializados satildeo monoclonais
112 ANTICORPOS ANTI-ERITROCITAacuteRIOS
Anticorpos satildeo proteiacutenas presentes no plasma tambeacutem denominadas imunoglobulinas
Satildeo produzidas pelo sistema imune em resposta a um determinado antiacutegeno Podem ser
classificadas de acordo com suas caracteriacutesticas e propriedades em cinco classes de
imunoglobulinas IgG IgM IgA IgE e IgD (BARJAS-CASTRO 2013)
A ligaccedilatildeo entre o antiacutegeno e o anticorpo envolvem ligaccedilotildees natildeo covalentes que satildeo
reversiacuteveis Vaacuterios tipos de interaccedilotildees natildeo covalentes podem contribuir para a ligaccedilatildeo do
antiacutegeno pelo anticorpo incluindo forccedilas eletrostaacuteticas pontes de hidrogecircnio forccedilas de Van
der Walls e interaccedilotildees hidrofoacutebicas (ABBAS LICHTMAN e PILLAI 2008)
As interaccedilotildees antiacutegeno-anticorpo satildeo constituiacutedas por ligaccedilotildees dinacircmicas que sofrem
interferecircncia de alteraccedilotildees fiacutesico-quiacutemicas no meio como mudanccedilas na temperatura na forccedila
eletrostaacutetica na concentraccedilatildeo do antiacutegeno e do anticorpo e no pH O melhor pH para a reaccedilatildeo
eacute em torno de 70 no entanto raros anticorpos podem exigir acidificaccedilatildeo do meio para serem
identificados (SANTOS 2014)
Em imunohematologia satildeo pesquisados os anticorpos que reconhecem os antiacutegenos
eritrocitaacuterios de grupo sanguiacuteneo ldquoin vivordquo esses anticorpos dependendo de seu significado
cliacutenico satildeo capazes de reconhecer seus respectivos antiacutegenos sobre a hemaacutecia podendo levar
a sua destruiccedilatildeo por dois mecanismos fagocitose por macroacutefagos no sistema
4
reticuloendotelial ou por ativaccedilatildeo do sistema complemento com a formaccedilatildeo do complexo de
ataque a membrana e hemoacutelise intravascular As duas classes de anticorpos de maior
importacircncia em imunohematologia satildeo as imunoglobulinas IgG e a IgM (SANTOS 2014)
Devido a sua estrutura pentameacuterica os anticorpos da classe IgM se ligam aos
antiacutegenos localizados na superfiacutecie da membrana de hemaacutecias proacuteximas e promovem
aglutinaccedilatildeo das mesmas em meio salino ldquoin vitrordquo Anticorpos da classe IgG por sua vez
satildeo denominados ldquonatildeo aglutinantesrdquo ou ldquoincompletosrdquo pois sua estrutura de monocircmero eacute
pequena o que desfavorece a aglutinaccedilatildeo direta uma vez que uma mesma moleacutecula de IgG
natildeo alcanccedila antiacutegenos alvos em duas hemaacutecias proacuteximas Os anticorpos IgM aleacutem de terem
um tamanho maior apresentam 750 vezes maior eficiecircncia de aglutinaccedilatildeo que os anticorpos
IgG permitindo maior facilidade nas ligaccedilotildees entre as hemaacutecias (CARRUCIO e WISE 2012
GREEN e KLOSTERMANN 2012)
Nos testes ldquoin vitrordquo satildeo simulados reaccedilotildees que poderiam ocorrer ldquoin vivordquo causando
reaccedilotildees indesejaacuteveis A fase de sensibilizaccedilatildeo em que o anticorpo se liga ao antiacutegeno
correspondente natildeo eacute identificada macroscopicamente poreacutem uma vez que o anticorpo
aproxima as hemaacutecias e vence a forccedila eletrostaacutetica que naturalmente as repele chamada de
potencial zeta ocorre a aglutinaccedilatildeo Dependendo das caracteriacutesticas do anticorpo e de sua
capacidade de fixar complemento pode ocorrer tambeacutem a hemoacutelise (SANTOS 2014)
113 PESQUISA E IDENTIFICACcedilAtildeO DE ANTICORPOS IRREGULARES
A pesquisa de anticorpos irregulares eacute teste obrigatoacuterio nos testes preacute-transfusionais e
tem a finalidade de detectar anticorpos ldquoin vitrordquo que possam causar reaccedilatildeo ldquoin vivordquo
Dependendo da populaccedilatildeo estudada (pacientes x doadores) e ainda da sensibilidade do
teste a frequecircncia de anticorpos irregulares pode variar de 03 a 38 A imunizaccedilatildeo pode
ocorrer por transfusatildeo gestaccedilatildeo transplante ou injeccedilatildeo de material imunogecircnico (WALKER
2011)
Os anticorpos irregulares podem ser classificados como aloanticorpos que satildeo
voltados contra antiacutegenos ausentes na hemaacutecia autoacuteloga ou como autoanticorpos os quais
reconhecem antiacutegenos eritrocitaacuterios proacuteprios Os autoanticorpos antieritrocitaacuterios surgem em
decorrecircncia da desregulaccedilatildeo da autotoleracircncia imune relacionada agrave condiccedilotildees diversas como
doenccedilas hematoloacutegicas doenccedilas inflamatoacuterias autoimunes neoplasias infecccedilotildees e uso de
medicaccedilotildees A presenccedila do autoanticorpo associado a um quadro de anemia hemoliacutetica
caracteriza a anemia hemoliacutetica autoimune (AHAI) seja ela primaacuteria ou secundaacuteria agrave outra
5
patologia Ateacute 12 a 40 dos pacientes com autoanticorpos quentes podem apresentar
aloanticorpos de significado cliacutenico mascarados pelos autoanticorpos (SHIREY et al 2002)
Eacute importante detectar a presenccedila de anticorpos no plasmasoro de um receptor de
transfusatildeo para garantir que seja transfundido sangue compatiacutevel Quando a pesquisa de
anticorpo irregular resultar positiva para um ou mais anticorpos de relevacircncia clinica eacute
necessaacuterio confirmar a ausecircncia do respectivo antiacutegeno na hemaacutecia do receptor assim como
selecionar para transfusatildeo concentrados de hemaacutecias tambeacutem negativos para aqueles
antiacutegenos evitando assim reaccedilotildees transfusionais (WALKER 2011)
A detecccedilatildeo de um anticorpo irregular eacute inicialmente realizada pela triagem de
anticorpos na qual o soroplasma do receptor eacute testado com 2 a 3 hemaacutecias do tipo ldquoOrdquo O
conjunto de fenoacutetipos dessas hemaacutecias deve contemplar os antiacutegenos de maior importacircncia
cliacutenica Como os anticorpos irregulares de maior interesse cliacutenico satildeo na maior parte das
vezes imunes portanto da classe IgG eacute obrigatoacuteria a fase de antiglobulina (AGH) do teste
ou teste indireto da antiglobulina (TIA) uma vez que esses anticorpos satildeo incompletos
(CASTILHO JUNIOR e REID 2015) O teste de triagem estando positivo deve-se fazer a
identificaccedilatildeo da especificidade do anticorpo utilizando um painel com maior nuacutemero de
hemaacutecias fenotipadas
114 PROVA DE COMPATIBILIDADE
A prova de compatibilidade eacute um teste obrigatoacuterio em caso de transfusatildeo de
componentes eritrocitaacuterios Tambeacutem chamada de prova de compatibilidade maior deve ser
realizada antes da administraccedilatildeo de sangue total ou concentrado de hemaacutecias utilizando-se
hemaacutecias obtidas do tubo coletor da bolsa a ser transfundida e o soro ou plasma do receptor
(BRASIL 2016)
Eacute definido como o procedimento para excluir a incompatibilidade entre o doador e o
receptor Tem o objetivo de detectar anticorpos que podem natildeo ter sido encontrados na
pesquisa de anticorpos devido a ausecircncia ou pouca expressatildeo de antiacutegenos no painel de
hemaacutecias aleacutem da possibilidade de terem ocorrido erros teacutecnicos ou notacionais durante a
realizaccedilatildeo da pesquisa (MELO 2007)
6
115 FENOTIPAGEM PARA OUTROS SISTEMAS
Aleacutem da pesquisa de ABORh que eacute realizado rotineiramente a fenotipagem para
outros sistemas tambeacutem denominado ldquofenotipagem estendidardquo determina a presenccedila ou
ausecircncia de antiacutegenos considerados de importacircncia cliacutenica A fenotipagem natildeo eacute obrigatoacuteria
nos testes preacute-transfusionais poreacutem a legislaccedilatildeo atual recomenda a realizaccedilatildeo da fenotipagem
eritrocitaacuteria dos antiacutegenos C (RH2) E (RH3) c (RH4) e (RH5) K (KELL1) Fya (FY1) Fy
b
(FY2) Jka
(JK1) Jkb (JK2) S (MNS3) e s (MNS4) para pacientes aloimunizados e pacientes
com indicaccedilatildeo de transfusatildeo crocircnica (BRASIL 2016)
A seleccedilatildeo de concentrados de hemaacutecias com o mesmo fenoacutetipo do receptor para
transfusatildeo pode evitar reaccedilotildees transfusionais hemoliacuteticas no paciente previamente
aloimunizado tambeacutem previne a sensibilizaccedilatildeo por outros antiacutegenos o que normalmente
torna as transfusotildees seguintes ainda mais complicadas A fenotipagem do paciente tambeacutem
auxilia na identificaccedilatildeo dos anticorpos pois espera-se que nas hemaacutecias do paciente o
antiacutegeno seja negativo para o anticorpo encontrado servindo de guia para teste de exclusatildeo de
anticorpos (SANTOS 2014 WALKER 2011)
A incidecircncia de aloanticorpos aumenta com o nuacutemero de transfusotildees no entanto a
implantaccedilatildeo de rotina de fenotipagem com transfusatildeo profilaacutetica de hemaacutecias com fenoacutetipo
compatiacutevel para pacientes candidatos agrave politransfusatildeo como os portadores de doenccedila
falciforme talassemia anemia aplaacutestica doenccedilas linfo e mieloproliferativas renais crocircnicos e
anemias refrataacuterias pode contribuir para o baixo iacutendice de sensibilizaccedilatildeo nessas populaccedilotildees
(FLUIT KUNST e DRENTHE-SCHONK 1999 MARTINS et al 2008 e VICHINSKY et
al 2001) Outro grupo de pacientes que se beneficia com a transfusatildeo de mesmo fenoacutetipo satildeo
os pacientes com AHAI uma vez que o autoanticorpo pode mascarar a presenccedila de um
aloanticorpo de significado cliacutenico em ateacute 40 dos casos Mesmo com as teacutecnicas utilizadas
ldquoin vitrordquo para remover a interferecircncia do autoanticorpo no soro um aloanticorpo pode natildeo
ser identificado e dessa forma transfundir o mesmo fenoacutetipo do paciente evitaria reaccedilatildeo
hemoliacutetica pelos anticorpos voltados contra antiacutegenos de maior importacircncia cliacutenica e de
frequecircncia intermediaacuteria Aleacutem disso os pacientes com AHAI satildeo fortes respondedores e a
transfusatildeo profilaacutetica do mesmo fenoacutetipo previne a aloimunizaccedilatildeo (SHIREY et al 2002)
Aleacutem de fenotipar o receptor eacute importante tambeacutem que os bancos de sangue tenham
rotinas de fenotipagem de doadores para atender as necessidade dos pacientes aloimunizados
ou em esquema de transfusatildeo crocircnica (PINTO BRAGA e SANTOS 2011)
7
Rotineiramente eacute inviaacutevel estabelecer o fenoacutetipo eritrocitaacuterio completo de um
indiviacuteduo pela grande diversidade de sistemas sanguiacuteneos descritos Ate junho de 2015 jaacute
haviam sido classificados 308 antiacutegenos atribuiacutedos a 36 sistemas definidos pela Sociedade
Internacional de Transfusatildeo de Sangue (ISBT) (CASTILHO JUNIOR e REID 2015)
Portanto o paciente eacute normalmente fenotipado para os antiacutegenos de maior importacircncia
clinica
Alguns fatores podem limitar a realizaccedilatildeo da fenotipagem eritrocitaacuteria Um dos fatores
eacute a transfusatildeo alogecircnica realizada haacute menos de 90 dias Neste caso podem ocorrer resultados
falso positivos para determinados antiacutegenos devido agrave presenccedila de hemaacutecias do doador
(LAINE et al 2000)
Outro fator eacute a presenccedila de anticorpo sensibilizando a hemaacutecia do paciente e
provocando positividade do teste direto da antiglobulina humana (TDA) Os soros
normalmente utilizados para fenotipagem especialmente para os antiacutegenos Fya
(FY1) Fyb
(FY2) Jka
(JK1) Jkb
(JK2) S (MNS3) e s (MNS4) necessitam da fase de antiglobulina
humana (AGH) para que ocorra aglutinacatildeo Amostras que apresentam o TDA positivo
aglutinam apoacutes reaccedilatildeo com a AGH natildeo pela real presenccedila do antiacutegeno em sua superfiacutecie mas
pela interaccedilatildeo da AGH com o anticorpo que estaacute sensibilizando o eritroacutecito A interferecircncia
do TDA positivo pode ser anulada atraveacutes de algumas teacutecnicas capazes de dissociar o
anticorpo como por exemplo o tratamento da hemaacutecia sensibilizada com cloroquina ou com
glicina-aacutecida-EDTA (BRANCH e PETZ 1999 SHIREY et al 2002 e LEGER 2011)
12 METODOLOGIAS APLICADOS Agrave ROTINA IMUNO-HEMATOLOacuteGICA
Todos os testes que compotildeem a rotina preacute-transfusional usam meacutetodos soroloacutegicos
que envolvem a reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo e tem como objetivo determinar o perfil antigecircnico
eritrocitaacuterio do receptor e do doador assim como identificar em seu soro a presenccedila de
anticorpos contra antiacutegenos eritrocitaacuterios que possam comprometer a sobrevida das hemaacutecias
transfundidas Para testar o antiacutegeno na superfiacutecie da hemaacutecia eacute necessaacuterio dispor de um
antissoro com especificidade conhecida para aquele antiacutegeno Por outro lado para testar a
presenccedila de um determinado anticorpo no soro ou plasma do receptor eacute necessaacuterio o uso de
hemaacutecias com perfil antigecircnico conhecido (SANTOS 2014)
Diversas metodologias satildeo aplicadas nos laboratoacuterios de imunohematologia Cada
serviccedilo de hemoterapia faz a escolha do meacutetodo que seraacute aplicado de acordo com o perfil do
laboratoacuterio com o volume de exames diaacuterios e tambeacutem com o custo envolvido Todas essas
8
teacutecnicas tecircm como objetivo comum demonstrar a reaccedilatildeo entre antiacutegeno e anticorpo no
entanto elas se baseiam em diferentes princiacutepios Muitas metodologias satildeo atualmente
aplicadas agrave imunohematologia entre elas o sistema de fase soacutelida a tecnologia de hemaacutecias
magnetizadas a biologia molecular e ateacute mesmo a citometria de fluxo no entanto os meacutetodos
mais tradicionais satildeo aqueles baseados no princiacutepio de hemaglutinaccedilatildeo
121 MEacuteTODOS DE FASE FLUacuteIDA
Os meacutetodos de fase fluiacuteda satildeo testes baseados na hemaglutinaccedilatildeo e incluem o teste em
tubo e o teste em microplacas Uma suspensatildeo de hemaacutecias eacute adicionada ao plasma ou soro
em seguida eacute realizada a centrifugaccedilatildeo e por fim eacute feita a leitura do resultado que eacute
considerado positivo se for observado algum grau de aglutinaccedilatildeo ou hemoacutelise A intensidade
de aglutinaccedilatildeo eacute graduada de acordo com o tamanho dos agregados desprendidos da
superfiacutecie apoacutes agitaccedilatildeo delicada do tubo ou microplaca Os meacutetodos de hemaglutinaccedilatildeo satildeo
aplicados a todos os testes preacute-transfusionais Como os anticorpos ABO satildeo aglutininas frias
a tipagem eacute realizada em temperatura ambiente (22degC) no entanto ao investigar a presenccedila
de anticorpos irregulares que como jaacute mencionado eacute na maioria das vezes anticorpos
incompletos da classe IgG eacute essencial que a reaccedilatildeo seja incubada a 37degC As reaccedilotildees satildeo
facilitadas com a utilizaccedilatildeo de potencializadores e da antiglobulina humana (WALKER e
HARMENING 2012 AABB 2011)
Nos meacutetodos de fase fluiacuteda nos quais a AGH eacute empregada a fase de lavagem eacute
fundamental Apoacutes a incubaccedilatildeo do soro com as hemaacutecias deve ser realizada a lavagem da
reaccedilatildeo para remover o excesso de anticorpos natildeo ligados agraves hemaacutecias jaacute que os anticorpos
livres podem bloquear a AGH quando ela eacute adicionada e levar a resultados falso negativos
(AABB 2011)
Os testes de hemaglutinaccedilatildeo satildeo os mais tradicionais entre os meacutetodos ainda hoje
aplicados agrave rotina de bancos de sangue A vantagem desses meacutetodos eacute o baixo custo quando
comparado agraves teacutecnicas mais modernas mas apresentam tambeacutem desvantagens A teacutecnica em
tubo por exemplo natildeo permite automaccedilatildeo eacute trabalhosa e exige matildeo-de-obra bastante treinada
na execuccedilatildeo das diversas etapas do teste e mesmo assim pode haver subjetividade na
interpretaccedilatildeo dos resultados aleacutem de resultados falso-negativos (DOWNES 2011 ZANTEK
et al 2012)
9
122 COLUNAS DE GEL
A teacutecnica em gel iniciada na deacutecada de 90 representou uma grande revoluccedilatildeo na
rotina laboratorial tornando-se muito popular Aleacutem de ser sensiacutevel a teacutecnica dispensa a fase
de lavagem antes da adiccedilatildeo da AGH assim como a agitaccedilatildeo do teste para leitura reduzindo o
nuacutemero de resultados falsos negativos decorrentes dessas duas etapas e o tempo para
execuccedilatildeo dos testes (LAPIERRE et al 1989 NOVARETTI et al 2000 NOVARETTI et
al 2004) Os reagentes satildeo comercializados na forma de cartotildees plaacutesticos contendo
microtubos preenchidos por gel composto por microesferas de acrilamida-dextran Nesta
metodologia tambeacutem baseada na hemaglutinaccedilatildeo a suspensatildeo de hemaacutecias e o soro satildeo
depositados em uma cacircmara acima da coluna de gel e em seguida procede-se com a
centrifugaccedilatildeo dos cartotildees As microesferas atuam como uma malha que permite a passagem
em direccedilatildeo ao fundo do microtubo apenas das hemaacutecias natildeo aglutinadas enquanto as
hemaacutecias aglutinadas ficam retidas na parte superior da coluna ou ao longo dela (GREEN e
KLOSTERMANN 2012) Portanto quanto maior a agregaccedilatildeo mais hemaacutecias ficam retidas
no topo da coluna Dependendo do tipo de teste a ser realizado pode ser utilizado gel neutro
ou gel especiacutefico impregnado pelo anticorpo desejado e o gel contendo antiglobulina humana
que satildeo utilizados para os testes diretos e indiretos da antiglobulina (LAPIERRE et al 1989)
A coluna de gel ainda permite a visualizaccedilatildeo clara de duas populaccedilotildees distintas de hemaacutecias
como em pacientes receacutem transfundidos
123 BIOLOGIA MOLECULAR
A biologia molecular ou genotipagem estaacute sendo cada vez mais aplicada aos grupos
sanguiacuteneos pois fornece resultados seguros e precisos especialmente nos casos em que natildeo eacute
possiacutevel a realizaccedilatildeo da fenotipagem como em pacientes receacutem-transfundidos e pacientes
com TDA positivo Na genotipagem eacute possiacutevel determinar atraveacutes do DNA do paciente
extraiacutedo de seus leucoacutecitos de sangue perifeacuterico o fenoacutetipo eritrocitaacuterio deduzido sem
qualquer interferecircncia do anticorpo que sensibiliza a hemaacutecia ou de hemaacutecias alogecircnicas
transfundidas Sua realizaccedilatildeo no entanto exige o treinamento de equipe especializada e capaz
de interpretar os resultados em conjunto com os achados soroloacutegicos (JUNIOR e OLIVATO
2007)
Apesar de ser uma ferramenta de grande importacircncia hoje na imuno-hematologia
ainda estaacute restrito aos grandes centros de hemoterapia no Brasil poucos serviccedilos puacuteblicos de
sauacutede dispotildeem desse recurso e utilizam teacutecnicas de genotipagem de grupos sanguiacuteneos para
atendimento a seus pacientes Esta abordagem poreacutem vem sendo introduzida em algumas
10
instituiccedilotildees de reconhecida competecircncia na hemoterapia mas sua disponibilizaccedilatildeo deve
tornar-se mais generalizada atraveacutes da formaccedilatildeo de centros de referecircncia para atendimento
das diversas unidades de hemoterapia (MARTINS et al 2009) Dessa forma muitas decisotildees
transfusionais especialmente em urgecircncias ainda devem ser tomadas sem o resultado da
genotipagem eritrocitaacuteria
13 TESTE DA ANTIGLOBULINA
Coombs Mourant e Race descreveram em 1945 uma teacutecnica com utilizando soro de
coelho contendo antiglobulina humana (AGH) que posteriormente foi chamada de ldquosoro de
Coombsrdquo O meacutetodo foi desenvolvido inicialmente para ampliar o efeito de aglutininas fracas
do sistema Rh anticorpos ldquoincompletosrdquo que normalmente natildeo apresentavam aglutinaccedilatildeo
visiacutevel O teste foi concebido como um instrumento de investigaccedilatildeo de doenccedila hemoliacutetica do
receacutem-nascido e de reaccedilotildees transfusionais causadas por anticorpos Rh que estavam presentes
no soro dos paciente poreacutem que natildeo eram demonstraacuteveis pelas teacutecnicas ateacute entatildeo existentes
A maior parte dos anticorpos de significado cliacutenico assim como seus respectivos
antiacutegenos foram descritos apoacutes o surgimento do ldquosoro de Coombsrdquo em 1945 sendo assim o
teste da antiglobulina representa ateacute hoje a forma mais importante de aglutinaccedilatildeo artificial em
imunohematologia permitindo revelar a presenccedila de anticorpos na membrana da hemaacutecia A
antiglobulina humana eacute constituiacuteda por anticorpo especiacutefico contra a porccedilatildeo Fc de outro
anticorpo Quando um anticorpo ldquoincompletordquo sensibiliza a hemaacutecia normalmente natildeo
provoca aglutinaccedilatildeo visiacutevel Apoacutes a adiccedilatildeo da AGH ao meio esta reconhece e se liga agraves
porccedilotildees Fc dos anticorpos que sensibilizam a hemaacutecia formando assim uma malha e
provocando aglutinaccedilatildeo visiacutevel (BARJAS-CASTRO 2013)
Os reagentes de antiglobulina podem ser poliespeciacuteficos ou monoespeciacuteficos Os
poliespeciacuteficos satildeo uma mistura de anticorpos ant-IgG e anti-C3d (fraccedilatildeo C3d do
complemento) Os reagentes monoespecificos podem ser anti-IgG anti-IgM anti-IgA anti-
complemento podendo ser anti-C3d e anti-C3b
O teste da antiglobulina pode ser usado para detectar hemaacutecias sensibilizadas com
aloanticorpos IgG autoanticorpos IgG e componentes do complemento A sensibilizaccedilatildeo
pode ocorrer ldquoin vivordquo ou ldquoin vitrordquo O uso do AGH para detectar a sensibilizaccedilatildeo ldquoin vitrordquo
tem dois estaacutegios e eacute denominado teste indireto da antiglobulina A sensibilizaccedilatildeo ldquoin vivordquo eacute
detectada em procedimento de um uacutenico estagio chamado teste direto da antiglobulina (TDA)
11
Os testes direto e indireto satildeo ateacute hoje amplamente aplicados como princiacutepio de inuacutemeros
testes soroloacutegicos em imuno-hematologia (GREEN e KLOSTERMANN 2012)
131 TESTE DIRETO DA ANTIGLOBULINA
O teste direto da antiglobulina humana revela a presenccedila de anticorpo eou fraccedilatildeo do
complemento ligados agrave superfiacutecie das hemaacutecias As sensibilizaccedilatildeo das hemaacutecias ocorrida ldquoin
vivordquo natildeo eacute visualizada mas apoacutes a adiccedilatildeo da antiglobulina humana ocorre a aglutinaccedilatildeo que
eacute visualizada macroscopicamente (Figura 1)
Figura 1 - Princiacutepio da teacutecnica direta da antiglobulina Teste utilizado para demonstrar a sensibilizaccedilatildeo ldquoin
vivordquo das hemaacutecias O sangue total eacute coletado do paciente em tubo contendo anticoagulante EDTA Na teacutecnica
realizada em tubo uma suspensatildeo de hemaacutecias 5 em soluccedilatildeo de salina eacute preparada Uma gota dessa suspensatildeo
eacute lavada 3 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica para retirada de anticorpos que estatildeo livres no plasma Toda soluccedilatildeo eacute
retirada e adiciona-se o soro de Coombs (antiglobulina humana) O soro de Coombs reconhece os anticorpos que
estatildeo ligados agrave superfiacutecie das hemaacutecias fazendo com que ocorra aglutinaccedilatildeo visiacutevel macroscopicamente
Apesar de natildeo ser um teste preacute-transfusional obrigatoacuterio o TDA eacute um dos testes mais
importantes para investigar e classificar quadros hemoliacuteticos como de origem imune ou natildeo
imune O seu valor preditivo positivo em vigecircncia de anemia hemoliacutetica eacute de 83 poreacutem natildeo
havendo sinais de hemoacutelise seu valor preditivo eacute apenas 14 Eacute por esse motivo que a
interpretaccedilatildeo do TDA positivo deve levar em consideraccedilatildeo a histoacuteria cliacutenica e os resultados
dos outros exames laboratoriais A realizaccedilatildeo do TDA eacute obrigatoacuteria na investigaccedilatildeo
12
laboratorial de diversos quadros hemoliacuteticos entre eles a anemia hemoliacutetica autoimune
(AHAI) a reaccedilatildeo hemoliacutetica imune poacutes-transfusional a siacutendrome do linfoacutecito passageiro a
doenccedila hemoliacutetica perinatal e a hemoacutelise droga-dependente (LEGER 2011)
Resultados de TDA positivos foram tambeacutem observados em indiviacuteduos com niacuteveis
seacutericos elevados de IgG ou complemento sem evidecircncia de anemia hemoliacutetica imune como
em pacientes com doenccedila falciforme talassemia doenccedila renal crocircnica mieloma muacuteltiplo
doenccedilas autoimunes e siacutendrome da imunodeficiecircncia adquirida (SIDA) Aleacutem disso pequenas
quantidades de IgG (5 a 90 moleacuteculas por hemaacutecia) e complemento (5 a 40 moleacuteculas por
hemaacutecia) podem estar presentes nas hemaacutecias de indiviacuteduos saudaacuteveis sem associaccedilatildeo com
reduccedilatildeo na sobrevida das mesmas A positividade do TDA depende da populaccedilatildeo estudada e
pode variar de 01 entre doadores de sangue sem qualquer sinal cliacutenico de hemoacutelise ateacute
15 em pacientes hospitalizados (CASTILHO JUNIOR e REID 2015 LEGER 2011)
Indiviacuteduos que apresentam TDA positivo seja agraves custas de IgG eou complemento
com ou sem sinais cliacutenicos de hemoacutelise teratildeo a fenotipagem eritrocitaacuteria prejudicada A
fenotipagem de indiviacuteduos com TDA positivo especialmente quando utilizado o teste indireto
da antiglobulina pode acarretar resultados falsos positivos e levar a seleccedilatildeo de fenoacutetipo
incorreto para transfusatildeo
132 TESTE INDIRETO DA ANTIGLOBULINA
O teste indireto da antiglobulina (TIA) eacute utilizado para revelar a sensibilizaccedilatildeo ldquoin
vitrordquo das hemaacutecias e eacute aplicado a diversos testes soroloacutegicos em imunohematologia entre
eles a pesquisa de anticorpos identificaccedilatildeo de anticorpos testes de compatibilidade
fenotipagem eritrocitaacuteria e titulaccedilatildeo de anticorpos Na teacutecnica indireta a hemaacutecia que contecircm
o antiacutegeno eacute colocada em contato ldquoin vitrordquo com o anticorpo que se liga mas natildeo promove a
aglutinaccedilatildeo visiacutevel A adiccedilatildeo da AGH forma uma malha entre os anticorpos que sensibilizam
as hemaacutecias e provoca a aglutinaccedilatildeo macroscoacutepica (figura 2)
Caso a amostra de hemaacutecia estudada seja previamente sensibilizada resultados falsos
positivos podem ser obtidos no TIA jaacute que a AGH reagiraacute com a moleacutecula que sensibilizava
anteriormente a hemaacutecia mesmo se o anticorpo especiacutefico natildeo tiver se ligado ao antiacutegeno
correspondente
13
133 CONDICcedilOtildeES CLIacuteNICAS COM TDA POSITIVO
O TDA positivo deve ser interpretado cuidadosamente sempre em conjunto com o
quadro cliacutenico do paciente A positividade isolada do TDA natildeo significa hemoacutelise A
interpretaccedilatildeo do teste positivo requer o conhecimento do diagnoacutestico do paciente da presenccedila
de sinais e sintomas sugestivos de hemoacutelise assim como de seu histoacuterico transfusional
gestacional e de informaccedilotildees sobre o uso recente de medicaccedilotildees (LEGER 2011)
Figura 2 ndash Princiacutepio do teste indireto da antiglobulina O TIA pode ser utilizado na pesquisa de anticorpos de
especificidades desconhecidas livres no soroplasma como eacute o caso da pesquisa e identificaccedilatildeo de anticorpos
irregulares Ele eacute tambeacutem utilizado para determinar a presenccedila de antiacutegenos na membrana da hemaacutecia quando
satildeo empregados soros de especificidades conhecidas da classe IgG No primeiro caso o soroplasma contendo o
anticorpo desconhecido eacute colocado em contato com hemaacutecias cujo perfil antigecircnico eacute conhecido No segundo
caso utiliza-se soro de especificidade conhecida da classe IgG para determinar a presenccedila ou ausecircncia de um
antiacutegeno na membrana O anticorpo encontra o antiacutegeno correspondente e ocorre a ligaccedilatildeo do anticorpo agrave
hemaacutecia mas natildeo ocorre aglutinaccedilatildeo Apoacutes a adiccedilatildeo da AGH que se liga aos anticorpos formando uma malha
ocorre a aglutinaccedilatildeo visiacutevel
O TDA positivo eacute uma achado claacutessico de algumas condiccedilotildees cliacutenicas como a reaccedilatildeo
transfusional hemoliacutetica a doenccedila hemoliacutetica do feto e do receacutem-nascido (DHFRN) a anemia
hemoliacutetica induzida por drogas a siacutendrome do linfoacutecito passageiro e a anemia hemoliacutetica
autoimune (AHAI) Portanto o TDA positivo pode ser decorrente da sensibilizaccedilatildeo da
hemaacutecia autoacuteloga por um autoanticorpo ou por um aloanticorpo ligado agrave hemaacutecia alogecircnica
circulante A positividade do TDA pode ainda ocorrer de forma passiva em pacientes que
14
recebem imunoglobulinas humanas ou ainda pela transfusatildeo de plaquetas ABO natildeo idecircntico
(LEGER 2011 RALPH 2012 ZANTEK et al 2012)
Nas reaccedilotildees transfusionais hemoliacuteticas imunes o aloanticorpo do receptor sensibiliza
as hemaacutecias transfundidas do doador e reduz sua sobrevida ao removecirc-la precocemente da
circulaccedilatildeo pela fagocitose no sistema retiacuteculo-endotelial ou pela hemoacutelise intravascular As
reaccedilotildees podem ser agudas se ocorrem ateacute 24 horas ou tardias quando ocorrem apoacutes 24 horas
da transfusatildeo A gravidade das reaccedilotildees hemoliacuteticas pode variar de um simples rendimento
transfusional inadequado agrave quadros graves de hemoacutelise intravascular evoluindo ateacute mesmo
com choque vascular e oacutebito O TDA pode resultar negativo caso toda massa eritrocitaacuteria
transfundida tenha sido destruiacuteda (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
Na doenccedila hemoliacutetica do feto e do receacutem-nascido (DHFRN) anticorpos maternos da
classe IgG atravessam a barreira placentaacuteria e sensibilizam as hemaacutecias fetais que seratildeo
destruiacutedas precocemente levando agrave anemia fetal Apesar da incompatibilidade ABO feto-
materna ser a causa mais frequente de DHFRN raramente ela eacute responsaacutevel pela ocorrecircncia
de quadros graves Por outro lado anticorpos contra antiacutegenos do sistema Rh e Kell
especialmente Anti-D (Anti-RH1) Anti-c (Anti-RH4) e Anti-Kell (Anti-KELL1) satildeo
conhecidos por causar DHFRN severa Raramente outros anticorpos tambeacutem podem estar
implicados na DHFRN como os anticorpos contra antiacutegenos do sistema Kidd Duffy MNS e
Diego (ZANTEK et al 2012)
A hemoacutelise droga-dependente eacute causada pela produccedilatildeo de um anticorpo voltado contra
a droga ligada agrave membrana eritrocitaacuteria ou ainda contra o complexo droga-membrana A
classe de medicaccedilotildees mais comumente envolvida eacute a dos antimicrobianos betalactacircmicos
(penicilinas e cefalosporinas) mas outras classes como quimioteraacutepicos e anti-inflamatoacuterios
tambeacutem satildeo descritos (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
Apoacutes transplante de ceacutelulas progenitoras hematopoieacuteticas em que o doador possui
anticorpos contra antiacutegenos eritrocitaacuterios do receptor o linfoacutecito de memoacuteria do doador pode
resistir ao esquema imunossupressor utilizado e continuar a produccedilatildeo de anticorpos que
reconhecem a hemaacutecia incompatiacutevel do receptor ainda circulante O quadro cliacutenico pode
variar de um simples TDA positivo sem outros sinais ou sintomas ateacute um quadro hemoliacutetico
grave e abrupto (LEGER 2011)
15
134 ANEMIA HEMOLIacuteTICA AUTOIMUNE
A anemia hemoliacutetica autoimune eacute caracterizada pela destruiccedilatildeo precoce das hemaacutecias
autoacutelogas por autoanticorpos que sensibilizam as hemaacutecias e levam agrave fagocitose pelos
macroacutefagos no sistema reticulo-endotelial ou hemoacutelise intravascular O diagnoacutestico da AHAI
baseia-se na presenccedila de hemoacutelise cliacutenica associada agrave evidecircncia de fator imune representado
pelo TDA positivo As classes de anticorpos envolvidas em quadros de AHAI satildeo IgG IgM e
raramente IgA (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012) Satildeo raros os casos de AHAI com TDA
negativo que podem estar relacionados a um autoanticorpo de baixa avidez de densidade
inferior agrave detecccedilatildeo do meacutetodo ou ainda de classe de imunoglobulina natildeo avaliada pelo
meacutetodo utilizado para o teste (GARRATY 2005)
A AHAI pode ser classificada em dois grupos principais de acordo com a melhor
temperatura de reaccedilatildeo do autoanticorpo As anemias hemoliacuteticas causadas por anticorpos
quentes que reagem melhor a 37oC e geralmente IgG representam 80 dos casos de AHAI
Nas AHAI por anticorpo quente o TDA pode ser positivo para IgG mais complemento (67)
somente IgG (20) ou somente por complemento (13) As anemias causadas por
anticorpos frios geralmente da classe IgM e que reagem melhor em temperatura ambiente ou
a 4oC representam aproximadamente 20 dos casos de AHAI Por exibirem amplitude
teacutermica esses anticorpos ligam-se agraves hemaacutecias ao atingirem a circulaccedilatildeo nas extremidades do
corpo fixam o complemento e desprendem-se da hemaacutecia apoacutes retornar para partes mais
quentes Por esse motivo em AHAI por anticorpos frios o TDA eacute positivo apenas agraves custas
de C3 e normalmente o IgM natildeo eacute detectado (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
A presenccedila do autoanticorpo IgG pode ser confirmada atraveacutes da eluiccedilatildeo do anticorpo
da hemaacutecia Tipicamente o eluato na AHAI por anticorpo quente reage com todas as ceacutelulas
testadas de um painel de hemaacutecias alogecircnicas do tipo ldquoOrdquo ou pode eventualmente exibir uma
especificidade conhecida como Anti-e (Anti-RH5) Nas AHAI a frio por sua vez espera-se
um eluato negativo (LEGER 2011)
Os autoanticorpos satildeo com frequecircncia encontrados livres no plasma e natildeo somente
ligados agraves hemaacutecias autoacutelogas Eles podem interferir em todas as fases dos testes preacute-
transfusionais nas quais o plasma eacute testado especialmente os autoanticorpos quentes que
acarretam resultados positivos em todos os testes levados agrave fase de antiglobulina humana
Esses anticorpos portanto positivam a pesquisa de anticorpos irregulares e mascaram a
presenccedila de aloanticorpos de significado cliacutenico Aproximadamente 60 dos pacientes que
apresentam AHAI a quente apresentam anticorpos que reagem em meio salino mas se forem
16
levados em conta meacutetodos mais sensiacuteveis como PEG enzima e estudo em gel a positividade
pode ser superior a 90 (LEGER 2011)
Aleacutem da eficaacutecia da transfusatildeo ser comprometida pela diminuiccedilatildeo da vida-meacutedia das
hemaacutecias a presenccedila do autoanticorpo dificulta a realizaccedilatildeo dos testes preacute-transfusionais e
compromete a seguranccedila transfusional Os autoanticorpos reagem normalmente como
panaglutininas pois satildeo normalmente voltados contra antiacutegenos puacuteblicos na maior parte das
vezes contra antiacutegenos do sistema Rh Por apresentarem essas caracteriacutesticas podem ainda
mascarar a presenccedila de aloanticorpos de significado clinico e levar a testes de compatibilidade
positivos exigindo uma avaliaccedilatildeo criteriosa da necessidade da transfusatildeo (BRANCH e PETZ
1999 JUNIOR e OLIVATO 2004)
Remover a interferecircncia do autoanticorpo para avaliar a presenccedila de aloanticorpos
mascarados nem sempre eacute possiacutevel mesmo utilizando teacutecnicas de autoadsorccedilatildeo ou
aloadsorccedilatildeo que aleacutem de tudo satildeo demoradas e exigem de 2 a 6 horas para conclusatildeo
(GARRATY e GEORGE 2002) Nesses casos a fenotipagem eritrocitaacuteria do paciente eacute de
extrema utilidade especialmente em situaccedilotildees de urgecircncia A definiccedilatildeo do fenoacutetipo do
paciente para os antiacutegenos de maior importacircncia cliacutenica pode auxiliar a seleccedilatildeo de unidades
de hemaacutecias com mesmo fenoacutetipo o que garante que eventuais aloanticorpos natildeo
identificados sejam respeitados e tambeacutem evita nova sensibilizaccedilatildeo (JUNIOR e OLIVATO
2004 SHIREY et al 2002)
135 TRATAMENTO DE HEMAacuteCIAS COM TDA POSITIVO
O TDA positivo impede a fenotipagem eritrocitaacutecia por meacutetodos que exigem a fase de
AGH uma vez que a aglutinaccedilatildeo ocorreraacute devido agrave interaccedilatildeo da AGH com o autoanticorpo
que sensibiliza a hemaacutecia do paciente levando a resultados falso positivos Em algumas
situaccedilotildees como na AHAI por anticorpo quente a fenotipagem eacute especialmente importante
pois o autoanticorpo interfere na triagem e identificaccedilatildeo de anticorpos assim como no teste de
compatibilidade e dificultam a detecccedilatildeo de aloanticorpos de significado cliacutenico que
obrigatoriamente devem ser respeitados Nessas situaccedilotildees a fenotipagem eritrocitaacuteria
determina o perfil antigecircnico do paciente e possibilita o fornecimento de unidades de
hemaacutecias com o mesmo fenoacutetipo para a transfusatildeo evitando a sensibilizaccedilatildeo para novos
antiacutegenos assim como reaccedilotildees hemoliacuteticas transfusionais No entanto eacute necessaacuterio aplicar
meacutetodos que natildeo sofram interferecircncia do TDA positivo ou seja meacutetodos que natildeo necessitem
da fase de AGH ou meacutetodos de bloqueio do anticorpo sem bloquear o antiacutegeno Uma opccedilatildeo eacute
a utilizaccedilatildeo de soros monoclonais IgM (salinos ou de meio proteico natildeo concentrado) mas
17
nem sempre esses reagentes estatildeo disponiacuteveis especialmente os reagentes monoclonais para
os antiacutegenos dos sistemas Duffy ( Fya Fy
b) Kidd ( Jk
a Jk
b) e MNS (S s) (JUNIOR e
OLIVATO 2004) Outra opccedilatildeo eacute a teacutecnica de bloqueio que pode ser utilizada para tratar
hemaacutecias para posterior fenotipagem em casos de TDA positivos com reatividade le2+
Em casos onde a positividade do TDA eacute maior que 2+ estaacute indicada a tratamento
quiacutemico para remoccedilatildeo da interferecircncia do autoanticorpo antes de realizar a fenotipagem Entre
as teacutecnicas utilizadas atualmente estatildeo o ZZAP a cloroquina e a glicina aacutecidaEDTA
1351 TEacuteCNICA DE BLOQUEIO
A teacutecnica de bloqueio se baseia na utilizaccedilatildeo de anti-IgG (Coombs monoespeciacutefico)
para tratar as hemaacutecias com TDA positivo O anticorpo anti-IgG se liga aos anticorpos que
estatildeo sensibilizando a hemaacutecias poreacutem sem o bloquear os antiacutegenos Os antiacutegenos que natildeo
estatildeo sensibilizados podem ser detectados atraveacutes dos antissoros especiacuteficos (SERERAT
VEIDT E DUTCHED 2000)
1352 TRATAMENTO DE HEMAacuteCIAS COM ZZAP
O Sulphydryl-Proteolytic Enzyme (ZZAP) que eacute uma mistura de ditiotreitol (DTT)
mais papaiacutena ativada com cisteiacutena eacute um reagente capaz de dissociar imunoglobulinas da
classe IgG ligadas a membrana dos eritroacutecitos enquanto trata enzimaticamente as hemaacutecias
O tratamento enzimaacutetico tambeacutem potencializa a ligaccedilatildeo do autoanticorpo ao antiacutegeno e
acelera o processo de autoadsorccedilatildeo O ZZAP pode desnaturar os antiacutegenos do sistema Duffy
MNS e Kell o que limita sua aplicaccedilatildeo para fins de fenotipagem (BRANCH e PETZ 1982)
1353 CLOROQUINA
Em 1982 Edwards Moulds e Judd propuseram a utilizaccedilatildeo da teacutecnica da cloroquina
que dissociava os complexos antiacutegeno-anticorpo e mantinha a membrana das hemaacutecias
iacutentegras Os derivados quinolecircicos jaacute haviam sido descritos anteriormente por Domokos e
Aszody em 1964 e Holtz Mantel e Buck em 1973 (apud Edwards Moulds e Judd 1982) pela
sua capacidade de separar imunocomplexos e inibir as reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo reduzindo
as cargas eleacutetricas das superfiacutecie das hemaacutecias A teacutecnica eacute uma das mais utilizadas nos
centros brasileiros para remover a interferecircncia do autoanticorpo e eacute tambeacutem a teacutecnica
atualmente adotada pelo laboratoacuterio de imunohematologia do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto
18
Edwards Moulds e Judd (1982) demonstraram que a teacutecnica da cloroquina para
dissociaccedilatildeo de anticorpos eacute uma teacutecnica simples efetiva e confiaacutevel para dissociar
imunoglobulina das hemaacutecias Desde que a membrana das hemaacutecias permaneccedila intacta natildeo
haacute perda da reatividade dos antiacutegenos e a sua maior aplicaccedilatildeo eacute a fenotipagem de hemaacutecias
com TDA positivo Os autores verificaram que em 83 das amostras sensibilizadas in vivo e
22 amostras (no total de 40) sensibilizadas ldquoin vitrordquo apresentaram TDA negativo e
puderam ser fenotipadas A teacutecnica poreacutem natildeo consegue remover os componentes do
complemento na maioria dos casos
Champagne e colaboradores (1999) testaram a teacutecnica da cloroquina para dissociar
antiacutegenos Bg comparando com a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA e verificaram vantagem em
relaccedilatildeo ao uso de um uacutenico reagente diminuindo a manipulaccedilatildeo e verificou que o mesmo natildeo
destroacutei antiacutegeno Kell
A cloroquina tambeacutem mostrou-se pouco efetivo em remover anticorpos do sistema
Duffy da superfiacutecie das hemaacutecias (EDWARDS MOUDS e JUDD 1982 ROZIERS e
SQUALI 1997)
1353 GLICINA-AacuteCIDAEDTA
A afinidade e a estabilidade entre a ligaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo eacute definida como a
resultante entre forccedilas atrativas e repulsivas entre ambos (CARUCIO e WISE 2012) e resulta
da somatoacuteria de forccedilas quiacutemicas dinacircmicas e fracas (natildeo covalentes) como pontes de
hidrogecircnio forcas eletrostaacuteticas forca de Van der Waals e pontes hidrofoacutebicas A estabilidade
dessa ligaccedilatildeo eacute facilmente abalada por alteraccedilotildees quiacutemicas e fiacutesicas no meio da reaccedilatildeo como
a alteraccedilatildeo do pH A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA se baseia na mudanccedila do pH para a
quebra da ligaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo (KOSANKE 2012)
A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA foi primeiramente descrita em 1986 por Louie Jieng
e Zeroulis que utilizaram 50 amostras de doadores sensibilizados ldquoin vitrordquo com anticorpos A
teacutecnica foi efetiva em 48 amostras permitindo o estudo do eluato assim como a fenotipagem
das hemaacutecias Os autores testaram tambeacutem a teacutecnica em 100 hemaacutecias TDA positivo que
puderam ser utilizadas para teacutecnicas de autoadsorccedilatildeo
Byrne (1991) descreveu a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA modificada e tambeacutem
verificou como uma opccedilatildeo para o tratamento de hemaacutecias com TDA positivo que deixava as
hemaacutecias intactas e o eluato viaacutevel para ser fenotipado
19
Roziers e Squali (1997) e Katharia e Chaudhary (2013) compararam a teacutecnica da
glicina-aacutecidaEDTA com as teacutecnicas da cloroquina e do aquecimento Verificaram maior
eficiecircncia da glicina-aacutecidaEDTA em relaccedilatildeo as outras duas teacutecnicas pois com uma mesma
quantidade de amostra produzia as hemaacutecias livres de anticorpo e tambeacutem o eluato Mostrou-
se ainda superior devido ao menor tempo exigido para sua realizaccedilatildeo o que favorece seu uso
em situaccedilotildees de urgecircncia e emergecircncia
As duas desvantagens da teacutecnica poreacutem eacute o fato de destruir os antiacutegenos do sistema
Kell e o fato de natildeo remover fraccedilotildees do complemento ligadas agrave hemaacutecia (PALLAS WILER e
McGEE 1991 ROZIERS e SQUALLI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012
e KATHARIA e CHAUNDHARY 2013)
20
2 OBJETIVOS
21 OBJETIVO GERAL
211 Avaliar a eficaacutecia da glicina-aacutecidaEDTA em remover os anticorpos ligados agraves
hemaacutecias sensibilizadas por anticorpos da classe IgG
22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
221 Preparaccedilatildeo dos reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
verificaccedilatildeo da estabilidade dos mesmos e avaliar custos
222 Testar a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA em amostras de hemaacutecias
sensibilizadas por anticorpos antieritrocitaacuterios humanos
223 Comparar a efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA com a teacutecnica da
cloroquina quanto a capacidade de remover a interferecircncia do anticorpo ligado
a hemaacutecia
224 Testar o eluato das amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA
225 Verificar se houve destruiccedilatildeo dos antiacutegenos eritrocitaacuterios apoacutes o tratamento
com glicina-aacutecidaEDTA e com cloroquina
226 Verificar se o tempo de execuccedilatildeo da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA descrito
nos textos de referecircncia eacute reprodutiacutevel
21
3 JUSTIFICATIVA
Algumas condiccedilotildees cliacutenicas podem levar ao depoacutesito ldquoin vivordquo de anticorpos eou
fraccedilotildees do complemento sobre as hemaacutecias Entre elas estatildeo as reaccedilotildees hemoliacuteticas poacutes-
transfusionais a doenccedila hemoliacutetica perinatal o uso de medicamentos e principalmente a
AHAI Na AHAI um anticorpo normalmente da classe IgG ou IgM reconhece antiacutegenos
proacuteprios na membrana eritrocitaacuteria e reduz a sobrevida da hemaacutecia levando a sua destruiccedilatildeo
pelos macroacutefagos no sistema reticulo-endotelial ou agrave ativaccedilatildeo do complexo de ataque agrave
membrana e agrave lise intravascular Os autoanticorpos satildeo voltados na maioria das vezes contra
antiacutegenos eritrocitaacuterios de alta frequecircncia populacional conhecidos como antiacutegenos puacuteblicos
e por este motivo reconhecem tanto hemaacutecias autoacutelogas quanto alogecircnicas
Devido agrave presenccedila do autoanticorpo livre no plasma e tambeacutem do anticorpo eou
complemento ligado agrave hemaacutecia o banco de sangue pode encontrar dificuldades em todas as
fases dos testes preacute-transfusionais do paciente com AHAI e deve utilizar teacutecnicas que
auxiliem na escolha do melhor hemocomponente melhorando a seguranccedila transfusional Essas
teacutecnicas visam remover a interferecircncia do autoanticorpo livre no soro e do autoanticorpo
ligado agrave hemaacutecia permitindo a detecccedilatildeo de aloanticorpos associados e a realizaccedilatildeo da
fenotipagem eritrocitaacuteria respectivamente
A finalizaccedilatildeo dos testes preacute-tranfusionais na presenccedila de autoanticorpo pode levar
algumas horas e nem sempre o paciente poderaacute aguardar Nesse contexto torna-se vantajosa a
aplicaccedilatildeo de teacutecnicas de raacutepida execuccedilatildeo
O presente estudo propotildee aplicar e avaliar a eficaacutecia da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
em remover os anticorpos ligados agrave hemaacutecia o que permite a fenotipagem eritrocitaacuteria
estendida e a seleccedilatildeo de concentrados de hemaacutecias com mesmo fenoacutetipo do paciente
Atualmente no Hemocentro de Ribeiratildeo Preto a teacutecnica utilizada para esse fim eacute o
tratamento das hemaacutecias com difosfato de cloroquina cujo tempo de execuccedilatildeo pode demorar
ateacute duas horas enquanto a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser realizada em apenas dois
minutos o que a tornaria opccedilatildeo de escolha especialmente em situaccedilotildees de urgecircncia Ao
contraacuterio da cloroquina a glicina-aacutecidaEDTA permite tambeacutem o estudo do eluato das
hemaacutecias tratadas
22
4 METODOL OGIA
41 AMOSTRAS DE DOADORES
Foram coletados 50 amostras de doadores de sangue que compareceram ao
Hemonuacutecleo de Araccedilatuba no periacuteodo de junho a agosto de 2016 Foram convidados a
participar da pesquisa doadores de repeticcedilatildeo do tipo sanguiacuteneo ldquoOrdquo RhD positivo
cadastrados no sistema de banco de sangue (SBS) do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto
Todos os doadores que concordaram em participar da pesquisa assinaram o termo de
consentimento livre e esclarecido (TCLE)
No momento da doaccedilatildeo foram coletados adicionalmente 5 mL de sangue total em
soluccedilatildeo anticoagulante EDTA (aacutecido dietilenoaminoaceacutetico) dispensando punccedilatildeo venosa
adicional para coleta da amostra O fluxograma 1 resume as etapas desenvolvidas no projeto
Fluxograma 1 - Fluxo da pesquisa utilizando as amostras de doadores
23
411 FENOTIPAGEM
Foram verificados se os doadores jaacute tinham fenotipagem para outros sistemas de
grupos sanguiacuteneos aleacutem do sistema ABORh que eacute realizado rotineiramente
A fenotipagem eritrocitaacuteria para outros sistemas ou fenotipagem estendida eacute realizada
para identificar a presenccedila ou ausecircncia de antiacutegenos considerados de importacircncia cliacutenica No
Hemonuacutecleo de Araccedilatuba uma parcela de doadores de repeticcedilatildeo satildeo fenotipados para os
antiacutegenos dos sistemas de grupo sanguiacuteneo Rh (antiacutegenos C c E e e) Kell (antiacutegeno K)
Duffy (antiacutegenos Fya e Fy
b) Kidd (antiacutegenos Jk
a e Jk
b) e sistema MNSs (antiacutegenos S e s)
A fenotipagem para o Rh e Kell eacute realizada por metodologia de microplaca utilizando
25 microL de hemaacutecia lavada e diluiacuteda a 5 em salina e 25 microL do antissoro comercial especiacutefico
A reaccedilatildeo eacute incubada 15 minutos a temperatura ambiente e centrifugadas para leitura Para os
antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s a metolodogia utilizado eacute gel contendo antiglobulina
humana (gel LissCoombs poliespeciacutefico) da marca BIO-RAD onde se utiliza suspensatildeo de
hemaacutecia em LISS (Soluccedilatildeo de baixa forccedila iocircnica) A suspensatildeo eacute preparada atraveacutes da
diluiccedilatildeo de 10 microL de hemaacutecia em 1000 microL de LISS Pipetado 50 microL dessa diluiccedilatildeo no gel e
adicionado 25 microL do antissoro especiacutefico Incuba-se em banho seco por 15 minutos a 37 deg
Celsius e eacute centrifugado em centriacutefuga especiacutefica Os antissoros utilizados eram das marcas
Fresenius e Lorne
Foi verificado a fenotipagem do doador no banco de dados do Hemocentro Os
registros dos fenoacutetipos dos doadores ficam armazenadas no sistema de banco de sangue
(SBS) Para doadores que natildeo tinham fenotipagem estendida preacutevia para antiacutegenos do sistema
Rh (C c E e e) e Kell (K) foi realizada a fenotipagem para esses antiacutegenos
O tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA e cloroquina para dissociar
anticorpos pode inativar enfraquecer ou destruir os antiacutegenos presentes nas hemaacutecias
alterando assim os resultados da fenotipagem Para verificar se houve destruiccedilatildeo dos
antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a e Jk
b S e s nas amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes
tratamento foram novamente fenotipadas ao final para os antiacutegenos que eram inicialmente
positivas
A repeticcedilatildeo da fenotipagem foi realizada nas amostras que apresentaram efetividade
no tratamento da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eou da cloroquina e a detecccedilatildeo do antiacutegeno
na amostra preacute-tratamento
24
412 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS HEMAacuteCIAS
As hemaacutecias foram sensibilizadas com antissoros policlonais humanos de amostras de
plasma fresco congelado de doadores com resultado de pesquisa de anticorpo irregular
positivos
A escolha do anticorpo para sensibilizar as hemaacutecias foi definida de acordo com o
fenoacutetipo do doador que deveria ser positivo para o respectivo antiacutegeno
Para a sensibilizaccedilatildeo um volume de antissoro (1 mL) e um volume (1 mL) de
hemaacutecias lavadas quatro vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica foram adicionadas a um tubo de 12 x
75 mm A mistura foi homogeneizada e incubada em banho maria (BM) a 37deg C por 60
minutos A seguir as hemaacutecias foram novamente lavadas 4 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica
para retirada dos anticorpos que natildeo se ligaram A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada
como controle negativo O teste da uacuteltima lavagem eacute importante para assegurar que os
anticorpos que poderatildeo ser detectados no eluato apoacutes o tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA
sejam aqueles que estavam ligados agraves hemaacutecias e natildeo aqueles livres no plasma O controle
negativo mostra que todo o anticorpo livre foi retirado (LEGER 2011)
Para o teste de presenccedila de anticorpo na soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foram incubadas
com hemaacutecias de triagem de anticorpos irregulares (ID-Diacell BIO-RAD) contendo os
antiacutegenos especiacuteficos Realizado a teacutecnica em gel LissCoombs com anti-IgG+C3d Incubado
no tempo de 15 minutos a temperatura de 37deg C e centrifugado 10 minutos em centriacutefuga
proacutepria
As 50 amostras de doadores foram sensibilizadas com os anticorpos policlonais
humanos
Apoacutes sensibilizadas rdquoin vitrordquo e lavadas as hemaacutecias foram diluiacutedas em soluccedilatildeo de
baixa forccedila iocircnica (LISS) na quantidade de 10 microL de hemaacutecia para 1000 microL de soluccedilatildeo A
suspensatildeo foi pipetada (50 microL) em coluna-gel-teste LissCoombs (BIO-RAD) que contecircm
antiglobulina poliespeciacutefico (IgG+C3d) e centrifugada em baixa rotaccedilatildeo conforme orientaccedilatildeo
do fabricante durante 10 minutos
As amostras deveriam apresentar aglutinaccedilatildeo com reatividade 3 a 4+ no TDA As
amostras que apresentaram reaccedilatildeo menor que 3+ foram novamente sensibilizadas com nova
aliacutequota do antissoro
25
413 TRATAMENTO DAS AMOSTRAS
As amostras sensibilizadas apresentando o TDA positivo 3 ou 4+ foram divididas em
duas aliacutequotas e submetidas a duas teacutecnicas diferentes com o objetivo de dissociar o anticorpo
ligado Uma aliacutequota da amostra foi tratada com soluccedilatildeo de difosfato de cloroquina enquanto
a outra aliacutequota foi tratada com glicina-aacutecidaEDTA
42 PREPARO DA GLICINA AacuteCIDA-EDTA
A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA utiliza 3 soluccedilotildees diferentes a glicina aacutecida o
EDTA e o tampatildeo TRIS
Os reagentes foram preparados utilizando os sais para anaacutelise (PA) de EDTA
(Na2EDTA2H2O) TRIS (C4H11NO3) Glicina (H2NCH2CO2H) NaCl e a soluccedilatildeo de aacutecido
cloriacutedrico (HCl) 12 N todos reagentes da marca SYNTH (quadro 1)
Para o preparo do tampatildeo glicina-acida eacute necessaacuterio o ajuste do pH para 15 Para esse
ajuste utiliza-se aacutecido cloriacutedrico (HCl) concentrado O pH foi medido com fitas reativas de pH
com escala de 1 a 14 da marca MERCK Posteriormente a soluccedilatildeo foi enviada ao laboratoacuterio
de controle de qualidade do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto e o pH medido no peagacircmetro O
tampatildeo glicina-aacutecida foi armazenado a 4deg e o tampatildeo tris e o EDTA em temperatura ambiente
controlada (20 a 24deg Celsius)
Apoacutes o preparo e durante a realizaccedilatildeo dos testes foram feitas inspeccedilotildees visuais para
verificaccedilatildeo de turvaccedilatildeo do meio e presenccedila de precipitados
Reagente Material Quantidade Preparo e
Conservaccedilatildeo
EDTA
EDTA
(Na2EDTA2H2O)
5 gramas Mistura ateacute
dissoluccedilatildeo do sal e
conserva em
temperatura ambiente Aacutegua Destilada 50 Ml
Tris
TRIS (C4H11NO3) 121 gramas Conservar em
temperatura ambiente NaCl 525g
Aacutegua destilada 100ml
Gliacutecina-aacutecida
Glicina
(H2NCH2CO2H) 15 gramas
Conservar a 4oC NaCl 116gramas
Aacutegua Destilada 200ml
HCL 12N Ajutar o pH para 15
Quadro 1 - Preparo dos Reagentes da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
Fonte - Manual teacutecnico AABB 2011
26
O tampatildeo glicina-aacutecida e o tampatildeo TRIS satildeo estaacuteveis por 7 meses O reagente EDTA
precipitou mesmo estando em temperatura em ambiente controlado Houve necessidade de
preparo de novo reagente
421 TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
1 Em um tubo de ensaio 12x75 mm eacute adicionado 08 mL da soluccedilatildeo de glicina-aacutecida A
esta soluccedilatildeo adiciona-se 02 mL de EDTA e mistura
2 Adiciona-se 02 mL de hemaacutecias sensibilizadas (lavada 4 vezes) A mistura eacute
homogeneizada e incubada por exatamente 2 minutos
3 A seguir 01 mL de tampatildeo TRIS eacute adicionado agrave mistura que eacute novamente
homogeneizada e centrifugada por 2 minutos a 3400 rpm O pH deve estar entre 7 a 75
4 Apoacutes centrifugaccedilatildeo separa-se em outro tubo o sobrenadante (eluato) e as hemaacutecias
que permanecem satildeo lavadas 4 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica para retirada de todo o
reagente e anticorpos livres
43 PREPARO DA CLOROQUINA
A cloroquina eacute diluiacuteda em tampatildeo PBS na concentraccedilatildeo de 20 (Quadro 2) e
armazenado a 4deg Celsius sua validade apoacutes o preparo eacute de 1 mecircs
A teacutecnica da cloroquina jaacute estaacute padronizada para rotina do laboratoacuterio de
imunohematologia do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto e suas unidades
Reagente Reagentes Quantidade PreparoConservaccedilatildeo
Cloroquina
Difosfato de cloroquina
(C18H32ClN3O8P2)
20 gramas
Conservar a 4deg Celsius
Tampatildeo PBS 100ml
NaOH 01 N Acertar o pH para
51
Quadro 2 - Preparo da Cloroquina Fonte - Manual teacutecnico da AABB 2011
431 TEacuteCNICA DA CLOROQUINA
1 4 partes da soluccedilatildeo pronta eacute adicionada a uma parte de hemaacutecias lavadas 4 vezes com
soluccedilatildeo fisioloacutegica
2 A mistura eacute incubada em temperatura ambiente por ateacute duas horas
3 Centrifugar a 3400 rpm por 2 minutos
27
4 Remover o sobrenadante lavar as hemaacutecias novamente com soluccedilatildeo fisioloacutegica 4
vezes
44 VERIFICACcedilAtildeO DA EFETIVIDADE DOS TESTES
Apoacutes tratamento pelas duas teacutecnicas o TDA foi repetido em todas as amostras para
verificar se os tratamentos foram efetivos e houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo Para as
amostras tratadas pela teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA que permaneceram com TDA positivo
novo tratamento foi realizado
45 TESTE DO ELUATO
O eluato resultante das amostras tratadas com glicina-acidaEDTA foi testado com
hemaacutecias de triagem A soluccedilatildeo do eluato foi incubada com as hemaacutecias de triagem de
anticorpos (ID-Diacell BIO-RAD) pela teacutecnica em gel LissCoombs O teste foi incubado 15
minutos a 37deg Celsius e centrifugado por 10 minutos em centrifuga proacutepria para a teacutecnica em
gel Os eluatos que apresentaram resultados positivos foram testados em painel de 11
hemaacutecias (ID-Diapanel BIO-RAD) para a identificaccedilatildeo do anticorpo
46 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente que apresentou TDA positivo por IgG e pesquisa
de anticorpo irregular positivo com presenccedila de autoanticorpo com reatividade panaglutinina
A amostra foi tratada em paralelo pelas duas teacutecnicas descritas e foi enviada para o
Hemocentro para genotipagem eritrocitaacuteria que foi realizado por metodologia PCR em tempo
real no equipamento Real-time system PCR 7500 ( Applied Biosystems Califoacuternia EUA)
28
5 RESULTADOS
51 REAGENTES
Para aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA satildeo necessaacuterios 3 diferentes
reagentes que podem ser encontrados em forma de kit pronto para uso No entanto esses kits
natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil Os reagentes satildeo tampatildeo glicina-aacutecida o EDTA e o tampatildeo
Tris
Todos os reagentes foram preparados rdquoin houserdquo a partir dos sais e soluccedilotildees PA (puro
para anaacutelise) da marca SYNTH que foram adquiridos para a pesquisa O custo estimado para
cada teste foi aproximadamente R$ 020 reais
Apoacutes o preparo os reagentes poderiam ser armazenados em condiccedilotildees adequadas pelo
periacuteodo de 1 ano (AABB 2011) Ao final do preparo e durante o periacuteodo de armazenamento
de fevereiro a setembro de 2016 foi realizada inspeccedilatildeo visual para verificar a presenccedila de
precipitados ou turvaccedilatildeo A soluccedilatildeo de glicina e o tampatildeo TRIS mostraram-se estaacuteveis ateacute o
final do periacuteodo Por sua vez o reagente EDTA precipitou mesmo estando armazenado em
temperatura ambiente controlada e foi necessaacuterio novo preparo
52 AMOSTRAS DE DOADORES
521 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS AMOSTRAS
Apoacutes incubaccedilatildeo da hemaacutecia com o antissoro a mesma foi lavada 4 vezes para retirada
dos anticorpos livres A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada Caso houvesse positividade na
soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem a etapa era repetida (figura 3) Das 50 amostras sensibilizadas a
uacuteltima lavagem foi positiva somente em 3 delas Nas 3 amostras o anticorpo utilizado para
sensibilizaccedilatildeo foi o anti-K Apoacutes repetido nova etapa de lavagem os resultados se
apresentaram negativos
Em todas as amostras sensibilizadas ldquoin vitrordquo o TDA foi testado e verificado a
intensidade do teste Entre as 50 amostras 47 alcanccedilaram TDA com intensidade 3-4+ apoacutes a
primeira sensibilizaccedilatildeo enquanto 3 amostras necessitaram uma segunda incubaccedilatildeo com
anticorpo (figura 4)
A escolha dos anticorpos para sensibilizar as hemaacutecias foi feita de acordo com o
fenoacutetipo do doador e foram utilizados sete diferentes especificidades de anticorpos policlonais
humanos conforme mostra o graacutefico1
29
Figura 3 - Soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada com hemaacutecia de triagem de
anticorpos em gel LissCoombs (BIO-RAD) A finalidade eacute verificar a presenccedila de anticorpos livres na
suspensatildeo que possam interferir na pesquisa do eluato As soluccedilotildees de lavagem das amostras na figura a tiveram
resultados negativos Na figura b duas amostras a 47 e 50 apresentaram resultado positivo Nova etapa de
lavagem foi realizada e o resultado final foi negativo
522 TRATAMENTO DAS HEMAacuteCIAS
Apoacutes a sensibilizaccedilatildeo e obtenccedilatildeo de resultados de TDA com intensidade de 3 a 4+
cada uma das amostras foi dividida em duas aliacutequotas e tratada separadamente pelas teacutecnicas
de glicinaaacutecida-EDTA e cloroquina
As teacutecnicas foram consideradas efetivas quando obteve-se a completa dissociaccedilatildeo do
anticorpo verificada atraveacutes do TDA negativo na amostra poacutes tratamento conforme figuras 5
e 6 Dentre as amostras tratadas com cloroquina 2850 tiveram o TDA negativado A glicina-
aacutecidaEDTA negativou o TDA em 33 das 50 amostras tratadas Apenas 17 amostras tratadas
com glicina-aacutecidaEDTA permaneceram com o TDA positivo e foram submetidas a um novo
tratamento
30
Figura 4 - TDA das amostras apoacutes sensibilizaccedilatildeo com anticorpos policlonais humanos Amostras na
figura a com intensidades de 3-4+ Na figura b amostras 4 e 7 com intensidade menor que 3+ e portanto foram
novamente sensibilizadas com nova aliacutequota de soro Anti-D e anti-S Apoacutes a segunda sensibilizaccedilatildeo
apresentaram reatividade 4 e 3+ respectivamente Os anticorpos utilizados para sensibilizaccedilatildeo foram D S c E
C e K
523 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS TEacuteCNICAS
No tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA houve dissociaccedilatildeo completa do anticorpo
em 33 amostras (66) das 50 amostras testadas enquanto que com a cloroquina foram 28
amostras (56) (tabela 1)
31
Graacutefico 1- Nuacutemero de amostras sesnsibilizadas por especificidade de anticorpo Entre as 50 amostras 12
foram sensibilizadas com anti-D 10 com anti-C 9 com anti-E 8 com anti-c 7 com anti-S 3 com anti-K e 1
com anti-Dia As especificidades dos anticorpos foram definidas de acordo o fenoacutetipo do doador
Figura 5 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com cloroquina Nas amostras onde houve
a dissociaccedilatildeo do anticorpo ( 2 21 a 23 26 39 a 42 45 46 e 49) a hemaacutecia se deposita no fundo no microtubo
apoacutes a centrifugaccedilatildeo (TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (1 3 24 25 43 44 47
48 e 50) o anticorpo ligado agraves hemaacutecias eacute alvo da AGH presente no gel (TDA positivo)
Anti-D 12
Anti-C 10
Anti-E 9
Anti-c 8
Anti-S 7
Anti-K 3 Anti-Dia 1
32
Figura 6 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA Nas amostras
onde houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo (4 6 7 12 a 15 17 34 35 37 e 38) a hemaacutecia se deposita no fundo no
microtubo apoacutes a centrifugaccedilatildeo ( TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (5 16 18
19 20 33 e 36 ) o AGH presente no gel se liga ao anticorpo ligado agraves hemaacutecias que ficam retidas no gel (TDA
positivo)
Tabela 1-Resultado geral do tratamento das hemaacutecias com glicina e cloroquina
Teacutecnica utilizada TDA negativo TDA positivo Total
Glicina-aacutecidaEDTA 33 17 50
Cloroquina 28 22 50
A glicina-aacutecidaEDTA conseguiu negativar mais amostras sensibilizadas com Anti-D
e anti-K que a cloroquina Para as hemaacutecias sensibilizadas com anti-E Anti-S e Anti-Dia
ambas as teacutecnicas dissociaram o anticorpo em 100 das amostras Os resultados detalhados
por especificidade do anticorpo apoacutes o primeiro tratamento com glicina-aacutecidaEDTA e com
cloroquina estatildeo na tabela 2
Para as amostras que permaneceram positivas (17 amostras) apoacutes o tratamento com a
glicina-aacutecidaEDTA foi realizado um novo tratamento Houve dissociaccedilatildeo do anticorpo em 3
amostras (18) apoacutes a segunda tentativa Nas demais 14 (82) amostras tratadas pela
segunda vez 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise
33
Tabela 2 - Resultados do TDA apoacutes tratamento das hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo
sensibilizado
ANTICORPOS
SENSIBILIZADOS
1ordm TRATAMENTO COM
GLICINA
TRATAMENTO COM
CLOROQUINA
TOTAL TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
Anti-D 8 4 0 12 12
Anti-C 6 4 10 0 10
Anti-E 9 0 9 0 9
Anti-c 0 8 1 7 8
Anti-S 7 0 7 0 7
Anti-K 2 1 0 3 3
Anti-Dia 1 0 1 0 1
TOTAL 33 17 28 22 50
A hemoacutelise foi verificada durante o procedimento de lavagem final das hemaacutecias com
soluccedilatildeo fisioloacutegica para a retirada dos reagentes As soluccedilotildees de lavagem ficaram
avermelhadas e as hemaacutecias com coloraccedilatildeo escura As amostras foram descartadas Dentre as
6 amostras que ainda puderam ser testadas para o TDA trecircs amostras negativaram sendo 1
sensibilizada com anti-D e 2 com anti-C (tabela 3)
Tabela 3 - Resultado apoacutes o segundo tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA
Tratamento com
glicina-aacutecidaEDTA
TDA Negativo TDA Positvo Hemoacutelise Total
Segundo tratamento 3 3 11 17
524 TESTAGEM DO ELUATO
Apoacutes o tratamento com a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA a soluccedilatildeo do eluato foi
testada para verificar a viabilidade dos anticorpos que foram dissociados ou eluiacutedos Dentre
as 50 amostras 41 apresentaram eluato positivo As nove amostras cujos eluatos foram
negativos haviam sido sensibilizadas com as seguintes especificidades de anticorpos anti-E 6
amostras (67) anti-S 2 amostras (40) e anti-D 1 amostra (8) (tabela 4) O eluato de
todas as amostras sensibilizadas com os anticorpos anti-C anti-c Anti-K e Anti-Dia foram
positivos Os eluatos positivos na triagem de anticorpos foram testados com paineacuteis de
identificaccedilatildeo para confirmar a especificidade e a viabilidade dos anticorpos (figuras 7 e 8)
34
525 EFEITO DA ELUICcedilAtildeO SOBRE OS ANTIacuteGENOS ERITROCITAacuteRIOS
Para verificar o efeito do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA e com a cloroquina
sobre a expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s foi realizada a fenotipagem das
amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes tratamento com ambas as teacutecnicas Foi avaliado
se o tratamento destruiu os antiacutegenos expressos antes do tratamento
Tabela 4- Resultado do Eluato das amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA
Anticorpos Eluato positvo Eluato negativo Total
Anti-D 11 1 12
Anti-C 10 0 10
Anti-E 3 6 9
Anti-c 8 0 8
Anti-S 5 2 7
Anti-K 3 0 3
Anti-Dia 1 0 1
Total 41 9 50
Figura 7 ndash Painel do eluato da amostra 21 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-C que foi
recuperado no eluato
Figura 8 ndash Painel do eluato da amostra 47 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-K que foi
recuperado no eluato
35
Dentre as 50 amostras 26 eram previamente fenotipadas para os antiacutegenos Fya Fy
b
Jka Jk
b S e s Dentre elas 20 alcanccedilaram TDA negativo apoacutes tratamento com a glicina-
aacutecidaEDTA e 20 negativaram apoacutes tratamento com cloroquina (tabela 5) Apoacutes ambas as
teacutecnicas os antiacutegenos originalmente expressos permaneceram positivos comprovando que natildeo
houve destruiccedilatildeo dos mesmos
Tabela 5 ndash Verificaccedilatildeo da interferecircncia do tratamento da hemaacutecias com cloroquina e glicina-
aacuteicdaEDTA sobre os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
AMOSTRAS
COM
FENOTIPAGEM
PREacuteVIA
TRATADAS COM
CLOROQUINA
TRATADAS COM
GLICINA
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
26
20
20
20
20
As amostras 24 47 e 50 eram positivas para o antiacutegeno K A cloroquina natildeo dissociou
o anticorpo em nenhuma das 3 amostras enquanto a glicina-aacutecidaEDTA foi efetiva nas
amostras 24 e 50 Foi testada a expressatildeo do antiacutegeno K nas amostras 24 e 50 apoacutes o
tratamento utilizando meacutetodo indireto em gel contendo AGH Apesar de natildeo ter sido avaliado
a intensidade de reaccedilatildeo de expressatildeo dos antiacutegenos podemos verificar na figura 9 que nas
duas amostras em que a teacutecnica foi efetiva e dissociou o anticorpo a expressatildeo do antiacutegeno K
continua presente mas a reatividade observada pode ser considerada 1+ sugerindo que houve
diminuiccedilatildeo da expressatildeo do antiacutegeno quando comparado com a expressatildeo observada em
hemaacutecia natildeo tratada
Os resultados individuais de cada amostra em ambas as teacutecnicas encontram-se
resumidas na tabela 6
526 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente onde foi constatada a presenccedila de autoanticorpo
a quente da classe IgG pelo TDA monoespeciacutefico (figura 10)O autoanticorpo tambeacutem
interferia na pesquisa e identificaccedilatildeo de anticorpos irregulares pois apresentava caracteriacutestica
de panaglutinina As hemaacutecias da paciente sensibilizadas ldquoin vivordquo foram tratadas com
cloroquina e com glicina-aacutecidaEDTA
36
Figura 9 ndash Fenotipagem das amostras 24 e 50 para antiacutegeno K apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
O teste positivo indica a presenccedila do antiacutegeno poreacutem a reatividade fraca (1+) sugere que houve enfraquecimento
de sua expressatildeo A direita a expressatildeo forte (4+) do antiacutegeno Kell em hemaacutecia controle natildeo tratada utilizada
como controle positivo
A cloroquina natildeo foi efetiva na retirada do anticorpo ligado as hemaacutecias ao contraacuterio
do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA que dissociou o anticorpo (figura 11)
A hemaacutecia tratada com glicina foi fenotipada para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
(figura 12) A fenotipagem para o sistema Rh (C c E e e) e Kell foi realizada em gel
especiacutefico monoclonal sem interferecircncia do TDA positivo (controle da reaccedilatildeo negativo)
O eluato resultante do tratamento com glicina-aacutecidaEDTA foi testada em gel com
hemaacutecias de painel de identificaccedilatildeo de anticorpos e apresentou resultado positivo com todas
as ceacutelulas (figura 13 e 14)
A amostra foi enviada para genotipagem e o resultado da genotipagem confirmou o
resultado da fenotipagem apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
527 TEMPO DE EXECUCcedilAtildeO DA TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
O tempo de reaccedilatildeo da glicina-aacutecidaEDTA eacute de 2 minutos Todas as amostras foram
tratadas obedecendo ao tempo descrito na literatura demonstrando que o mesmo eacute
reprodutiacutevel
37
Tabela 6- Resultados individuais por amostra
Amostra Especificidade
dos anticorpos
Intensidade do
TDA apoacutes
sensibilizaccedilatildeo
Tratamento
efetivo com
cloroquina
Tratamento
efetivo com
glicina
Eluato
poacutes
glicina
1 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 2 Dia 3+ Sim Sim 3+ 3 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 4 D 4+ Natildeo Sim 4+ 5 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 6 E 3+ Sim Sim Negativo 7 S 4+ Sim Sim 3+ 8 E 3+ Sim Sim 1+ 9 E 3+ Sim Sim 2+
10 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 11 D 4+ Natildeo Sim 4+ 12 D 4+ Natildeo Sim 4+ 13 S 3+ Sim Sim 3+ 14 S 3+ Sim Sim 3+ 15 D 3+ Natildeo Sim 3+ 16 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 17 E 3+ Sim Sim (+) 18 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 19 D 4+ Natildeo Natildeo 3+ 20 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 21 C 3+ Sim Sim 4+ 22 C 3+ Sim Sim 4+ 23 C 3+ Sim Sim 4+ 24 K 4+ Natildeo Sim 4+ 25 D 3+ Natildeo Natildeo Negativo 26 E 4+ Sim Sim Negativo 27 S 3+ Sim Sim 3+ 28 C 3+ Sim Natildeo 4+ 29 C 3+ Sim Sim 4+ 30 C 3+ Sim Sim 4+ 31 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 32 E 3+ Sim Sim Negativo 33 C 3+ Sim Natildeo 4+ 34 S 3+ Sim Sim Negativo 35 S 3+ Sim Sim Negativo 36 C 4+ Sim Natildeo 4+ 37 c 4+ Natildeo Natildeo 4+ 38 D 4+ Natildeo Sim 4+ 39 S 3+ Sim Sim 3+ 40 c 4+ Sim Natildeo 2+ 41 C 4+ Sim Natildeo 4+ 42 E 3+ Sim Sim Negativo 43 D 3+ Natildeo Sim 2+ 44 D 3+ Natildeo Sim 2+ 45 E 3+ Sim Sim Negativo 46 C 3+ Sim Sim 4+ 47 K 4+ Natildeo Natildeo 4+ 48 D 3+ Natildeo Sim 2+ 49 E 3+ Sim Sim Negativo 50 K 4+ Natildeo Sim 4+
TOTAL 50 28 33 41
38
Figura 10 ndash TDA monoespeciacutefico da amostra de paciente Hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo da classe
IgG
oacute Figura 11 ndash TDA apoacutes o tratamento com glicina-aacutecidaEDTA (esquerda) e cloroquina (direita) A glicina
negativou completamente o TDA enquanto a hemaacutecia tratada com cloroquina persistiu positiva (1+)
39
Figura 12 ndash Fenotipagem da amostra tratada com glicina-aacutecidaEDTA Fy(a+b+) Jk(a-b+) S+s+
Figura 13 ndash Painel em gel (LissAGH) do eluato apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de
intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
Figura 14 ndash ndash Painel ezimaacutetico (hemaacutecias tratadas com bromelina) do eluato em gel neutro apoacutes
tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
40
528 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Quanto a efetividade das teacutecnicas em negativar o TDA foi verificado que a glicina-
aacutecidaEDTA foi efetiva em 66 das amostras testadas no primeiro tratamento (3350
amostras) enquanto a cloroquina conseguiu negativar 56 (2850) Esses resultados natildeo
apresentam diferenccedila significativa (pgt005) demostrando que a teacutecnica da glicina-
aacutecidaEDTA natildeo eacute superior mas eacute tatildeo efetiva quanto a da cloroquina
Quando aliamos os resultados de ambas as teacutecnicas verificamos que em 76 (3850)
das amostras o TDA foi negativado Esse dado indica que ainda que uma teacutecnica natildeo seja
eficaz na remoccedilatildeo do anticorpo eacute uma boa alternativa tentar a segunda teacutecnica jaacute que a falha
em remover o anticorpo utilizando uma delas natildeo prevecirc necessariamente a falha com a outra
Quando se utiliza o teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla (graacutefico 2) para comparar a utilizaccedilatildeo das
duas teacutecnicas com o resultado de cada uma isolada (somente a cloroquina ou somente a
glicina) verificamos que os resultados apresentam diferenccedila significativa (plt005) (quadro 3)
TRATAMENTO EFETIVO COM TOTAL PORCENTAGEM
Glicina ou cloroquina 38 76
Glicina e cloroquina 23 46
Glicina apenas 10 20
Cloroquina apenas 5 10
Nenhuma das teacutecnicas 12 24
Quadro 3 - Resultados comparativos entre as teacutecnicas utilizadas
41
Graacutefico 2 - Teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla entre as teacutecnicas aplicadas A- Glicina e Cloroquina B-Cloroquina C-
Glicina ( plt005)
42
6 DISCUSSAtildeO
Os reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA podem ser adquiridos em
forma de kit comercial prontos para uso poreacutem natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil A preparaccedilatildeo
dos reagentes ldquoin houserdquo a partir de sais comerciais adquiridos se mostrou viaacutevel Os
reagentes glicina e o tampatildeo Tris armazenados de forma correta se mantiveram estaacuteveis por
um periacuteodo de 7 meses Somente o reagente EDTA precipitou mesmo armazenado em
condiccedilotildees adequadas sugerindo que o mesmo deve ser preparado em menor quantidade e
armazenado em aliacutequotas A soluccedilatildeo de cloroquina tambeacutem pode ser preparada ldquoin houserdquo e
pode ser armazenado por um mecircs A legislaccedilatildeo brasileira autoriza a utilizaccedilatildeo de reagentes
preparados a partir de sais comerciais como a cloroquina e a glicina-aacutecidaEDTA desde que
os sais tenham autorizaccedilatildeo da vigilacircncia sanitaacuteria para a comercializaccedilatildeo (BRASIL 2001)
A comparaccedilatildeo quanto a efetividade em dissociar anticorpos em amostras com TDA
positivos entre a teacutecnica da glicina e a teacutecnica da cloroquina mostrou que natildeo haacute diferenccedila
estatiacutestica entre elas e que ambas satildeo igualmente eficientes Se utilizadas conjuntamente haacute
maior possibilidade de elucidaccedilatildeo dos casos
Uma vantagem da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eacute que ela permite numa mesma
amostra eluir o anticorpo ligado aacute hemaacutecia assim como fenotipar a hemaacutecia tratada Devido a
sua dupla utilidade a teacutecnica eacute vantajosa principalmente em pacientes em que pouco volume
de amostra pode ser coletado como em casos de crianccedilas e receacutem-nascidos
A fenotipagem poacutes tratamento se mostrou viaacutevel jaacute que os antiacutegenos de maior
importacircncia natildeo sofreram alteraccedilotildees Nas 20 amostras que foram fenotipadas antes e apoacutes
tratamento para verificar a influecircncia dos reagentes na expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a
Jkb S e s natildeo houve destruiccedilatildeo dos mesmos por nenhuma das duas teacutecnicas
Para as amostras positivas para o antiacutegeno Kell (350) e sensibilizadas com o
respectivo anticorpo a teacutecnica da glicina foi efetiva em negativar o TDA em apenas duas
delas mas apoacutes o tratamento foi verificada uma fraca reatividade da reaccedilatildeo antiacutegeno-
anticorpo sugerindo que houve um enfraquecimento da expressatildeo do antiacutegeno conforme
esperado e descrito na literatura (BYRNE 1991 PALLAS WILER E MCGEE 1991
ROZIERS e SQUALI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012 e KATHARIA e
CHAUDHARY 2013) A accedilatildeo da glicina sobre o antigeno Kell natildeo representa impedimento
para seu uso uma vez que na impossibilidade de testar o antiacutegeno Kell o banco de sangue
consegue facilmente atender a solicitaccedilatildeo de transfusatildeo com unidades de hemaacutecias Kell
43
negativas jaacute que eacute um antiacutegeno de baixa prevalecircncia na populaccedilatildeo variando de 15 na
populaccedilatildeo africana a 9 nos europeus (DANIELS 2011)
A soluccedilatildeo resultante da dissociaccedilatildeo do anticorpo pela teacutecnica da glicina pode ainda ser
utilizada como eluato podendo substituir a teacutecnica de eluiccedilatildeo com reagentes comercias (kits
de eluiccedilatildeo aacutecida) que tem alto custo aproximadamente entre R$2000 a R$2500 por teste
Em 41 amostras (82) houve a dissociaccedilatildeo e recuperaccedilatildeo do anticorpo que estava
sensibilizando as hemaacutecias Em 9 amostras (18) os anticorpos foram eluiacutedos poreacutem
apresentaram reaccedilatildeo negativa quando testadas com hemaacutecias de triagem entre eles o anti-E
(6) anti-S (2) e Anti-D (1) Eacute possiacutevel que a correccedilatildeo pH do meio (WALKER 2011) natildeo
tenha sido adequada o que pode ter desfavorecido a reatividade do anticorpo
Para as amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA nas quais natildeo houve dissociaccedilatildeo do
anticorpo pelo primeiro tratamento (1750) o segundo tratamento natildeo se mostrou eficaz jaacute
que 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise O tempo de
armazenagem natildeo parece ter influenciado jaacute que todas as amostras foram testadas dentro de
48 horas apoacutes a coleta Outros fatores que natildeo foram verificados podem ter levado a
hemoacutelise Apesar da literatura (LOUIE JIENG e ZEROULIS 1986 e BYRNE 1991)
recomendar um segundo tratamento ele eacute pouco eficaz tendo negativado apenas 3 das 17
amostras testadas
A amostra de paciente que apresentou sensibilizaccedilatildeo ldquoin vivordquo mostrou melhor
efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA sobre a da cloroquina possibilitando
fenotipagem para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s que natildeo foram destruiacutedos apoacutes o
tratamento comprovado atraveacutes da genotipagem
A presenccedila de autoanticorpo a quente com presenccedila de hemoacutelise (AHAI) ou natildeo pode
mascarar a presenccedila de aloanticorpo interferindo na rotina soroloacutegica da fenotipagem que eacute
uma importante ferramenta para auxiliar na seleccedilatildeo de hemaacutecias para transfusatildeo (SHIREY et
al 2002) Esses pacientes frequentemente possuem aloanticorpos associados ao
autoanticorpo e a prevalecircncia de aloimunizaccedilatildeo entre eles varia entre 12 a 40 (LEGER e
GARRATY 1999 BRANCH e PETZ 1999) o que dificulta ainda mais a escolha do melhor
componente a ser transfundido aleacutem de aumentar a possibilidade reaccedilotildees hemoliacuteticas imunes
poacutes-transfusionais
Nesses casos as teacutecnicas de dissociaccedilatildeo de anticorpos satildeo importantes para tratar
amostras de pacientes e a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser usada como uma opccedilatildeo
pois se mostrou eficaz na dissociaccedilatildeo anticorpo ligado agraves hemaacutecias deixando livre a
superfiacutecie das mesmas permitindo a fenotipagem por antisoros IgG Paralelamente os
44
anticorpos eluiacutedos tambeacutem puderam ser estudados O mesmo natildeo ocorre com a cloroquina
que permite apenas a fenotipagem e tampouco com os kits de eluiccedilatildeo aacutecida disponiacuteveis no
mercado nacional que satildeo destinados a realizaccedilatildeo do eluato mas destroem as hemaacutecias
O tempo de tratamento na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA tambeacutem eacute uma vantagem
pois foi possiacutevel reproduzir no tempo determinado de 2 minutos enquanto a cloroquina
demora ateacute duas horas
Ainda que a aplicaccedilatildeo das teacutecnicas por biologia molecular estejam cada vez mais
presentes na rotina imuno-hematoloacutegica e possibilitam estabelecer o fenoacutetipo deduzido do
genoacutetipo elas natildeo estatildeo disponiacuteveis na maioria dos centros e sua realizaccedilatildeo exige algumas
horas A resoluccedilatildeo imediata do problema transfusional necessita dos resultados soroloacutegicos
pois com frequecircncia natildeo eacute possiacutevel aguardar o resultado do teste molecular Dessa forma
apesar da crescente importacircncia da genotipagem eritrocitaacuteria teacutecnicas soroloacutegicas aplicadas
corretamente e no momento propiacutecio satildeo de grande utilidade para resolver problemas imuno-
hematoloacutegicos como ocorre com a fenotipagem em pacientes com TDA positivo
45
7 CONCLUSAtildeO
A teacutecnica da glicina aacutecidaEDTA mostrou-se efetiva em remover os anticorpos que
sensibilizavam as hemaacutecias e pode ser utilizada com seguranccedila antes da fenotipagem
eritrocitaacuteria Por ser uma teacutecnica de raacutepida execuccedilatildeo eacute uma alternativa aplicaacutevel
principalmente em casos urgentes de pacientes que apresentam autoanticorpos
46
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9 ANEXOS
51
FUNDACcedilAtildeO HEMOCENTRO DE RIBEIRAtildeO PRETO
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE)
Tiacutetulo da pesquisa Aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina aacutecida-EDTA e avaliaccedilatildeo da
eficaacutecia no tratamento de hemaacutecias com teste direto da antiglobulina positivo
Pesquisadora responsaacutevel Ceacutelia Kazue Abiko
Orientador Prof Dimas Tadeu Covas
Co-orientadora Dra Flaacutevia Leite Souza Santos
Objetivo da pesquisa Vocecirc estaacute sendo convidado a participar de uma pesquisa que tem
como objetivo padronizar uma nova teacutecnica para auxiliar na tipagem sanguiacutenea de pacientes
A tipagem sanguiacutenea pode sofrer interferecircncia da presenccedila de anticorpos ligados aos gloacutebulos
vermelhos do sangue Nessas situaccedilotildees eacute difiacutecil selecionar o melhor sangue para o paciente e
eacute preciso a utilizaccedilatildeo de teacutecnicas adicionais para remover essas interferecircncias
Esta pesquisa tem como objetivo estudar outra teacutecnica para remover esses anticorpos e
comparaacute-la com a teacutecnica atualmente utilizada Para isso precisamos de amostras de pacientes
e doadores voluntaacuterios
Se vocecirc eacute um doador eacute necessaacuterio que vocecirc autorize a coleta de 5 ml (1 tubo) a mais
de seu sangue
Se vocecirc eacute um paciente natildeo haveraacute necessidade de nova amostra pois utilizaremos as
amostras jaacute coletadas para os testes preacute-transfusionais e os resultados encontrados nesta
pesquisa natildeo iratildeo interferir na escolha da (s) bolsa (s) de sangue que vocecirc possa vir a receber
Se vocecirc concordar em participar leia com atenccedilatildeo o texto abaixo e assine as duas vias
rubricando todas as paacuteginas deste termo de consentimento Uma via original assinada e
rubricada por vocecirc e pela pesquisadora ficaraacute com vocecirc
As suas informaccedilotildees seratildeo mantidas em sigilo pela pesquisadora e natildeo haveraacute
armazenamento de material para pesquisas posteriores Os seus dados seratildeo usados apenas
neste estudo e quando o trabalho for publicado seu nome e qualquer outra informaccedilatildeo que
possam identificaacute-lo natildeo seratildeo revelados
Eacute pouco provaacutevel que o que noacutes aprendermos com este estudo tenha um benefiacutecio
direto para vocecirc assim como natildeo poderemos dar nada em troca pela sua participaccedilatildeo na
pesquisa
Nosso objetivo com esta pesquisa eacute que os resultados poderatildeo ser uacuteteis para o
tratamento de pacientes no futuro Os riscos da participaccedilatildeo satildeo miacutenimos Se vocecirc eacute um
doador de sangue a amostra seraacute coletada no momento da doaccedilatildeo natildeo exigindo punccedilatildeo
venosa adicional
52
Eacute seu direito ter acesso aos resultados dos testes da pesquisa Esses resultados natildeo
seratildeo fornecidos automaticamente a vocecirc mas caso vocecirc se interesse em saber o resultado ou
tiver alguma duacutevida sobre a sua participaccedilatildeo neste estudo deveraacute entrar em contato com Ceacutelia
Kazue Abiko pelo telefone (18) 99718-3551
Vocecirc tem total liberdade de optar por natildeo participar da pesquisa Caso aceite
participar poderaacute desistir a qualquer momento ou retirar seu consentimento mesmo apoacutes ter
coletado o sangue Para cancelar sua participaccedilatildeo basta avisar a pesquisadora e os seus dados
seratildeo retirados do projeto
Qualquer duacutevida eacutetica sobre a pesquisa poderaacute entrar em contato com o Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa do Hospital das Cliacutenicas e da Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto
(CAMPUS UNIVERSITAacuteRIO bairro Monte Alegre CEP 14048-900 Ribeiratildeo Preto-SP
Telefone (16) 3602-2228 FAX (16) 3633-1144 e-mail cephcrpuspbr)
Consentimento de participaccedilatildeo
A Consentimento do participante
Li as informaccedilotildees acima sobre o estudo e recebi explicaccedilotildees sobre a participaccedilatildeo no estudo
Portanto dou o meu consentimento para participar do estudo
___________________________________________________________________________
Nome completo
___________________________________________________________________________
Assinatura
___________
Data
__________________________________________________________________________________
Nome completo da pesquisadora
___________________________________________________________________________
Assinatura
_____________
Data
1 INTRODUCcedilAtildeO
A transfusatildeo de hemaacutecias eacute um recurso terapecircutico muito importante e eficaz e tem se
mostrado como um grande aliado no tratamento de diversas patologias auxiliando na
melhoria da sobrevida e qualidade de vida de diversos pacientes quando indicada de forma
correta Eacute provavelmente a modalidade de terapia mais utilizada no mundo sendo
considerada a forma mais antiga de terapia celular A transfusatildeo de hemaacutecias em pacientes
com anemia grave ou sangramento agudo reestabelece o niacutevel de hemoglobina moleacutecula
responsaacutevel pelo transporte de oxigecircnio para os tecidos melhorando a isquemia tecidual
(BARJAS-CASTRO 2013 ZAGO 2014)
A transfusatildeo de componentes celulares como o concentrado de hemaacutecias deve ser
bem avaliada quanto aos riscos e benefiacutecios Os testes preacute-transfusionais satildeo parte obrigatoacuteria
do processo transfusional e tecircm como funccedilatildeo assegurar que o melhor hemocomponente seja
selecionado para o paciente reduzindo assim a chance de transfusotildees incompatiacuteveis e reaccedilotildees
transfusionais (BARJAS-CASTRO 2013)
11TESTES PREacute-TRANSFUSIONAIS
Os testes preacute-transfusionais tecircm a finalidade de evitar a ocorrecircncia de reaccedilotildees
hemoliacuteticas no receptor decorrentes da transfusatildeo de hemaacutecias incompatiacuteveis do doador
(DOWNES e SHULMAN 2011) Tem como propoacutesito selecionar hemaacutecias que apoacutes
transfusatildeo deveratildeo ter sobrevida normal ou mais proacutexima do normal (MELO 2007)
Os testes preacute-transfusionais que consistem no conjunto de teacutecnicas
imunohematoloacutegicas aplicadas agraves amostras do receptor e doador devem ser realizados antes
de toda transfusatildeo A aplicaccedilatildeo desses testes tem como finalidade fornecer uma unidade de
hemaacutecias compatiacutevel e elevar a seguranccedila da transfusatildeo Os testes preacute-transfusionais aliados
a utilizaccedilatildeo de novas tecnologias tem historicamente evitado reaccedilotildees transfusionais
hemoliacuteticas garantindo a seguranccedila transfusional em cerca de 95 dos pacientes que recebem
transfusatildeo Eacute imprescindiacutevel poreacutem a execuccedilatildeo correta das teacutecnicas envolvidas nos testes preacute-
transfusionais e ainda garantir a identificaccedilatildeo correta do receptor e das amostras de sangue e
das unidades de hemaacutecias (CASTILHO 2000 MELO 2007 BARJAS-CASTRO 2013)
2
Todos os testes que compotildeem a rotina preacute-transfusional usam meacutetodos soroloacutegicos
que envolvem a reaccedilatildeo antiacutegeno x anticorpo Ao testar a presenccedila de um antiacutegeno na
superfiacutecie da hemaacutecia eacute necessaacuterio dispor de um soro com especificidade conhecida para
aquele antiacutegeno Por outro lado testar a presenccedila de um determinado anticorpo no soro ou no
plasma exige o uso de hemaacutecias com perfil antigecircnico conhecido Os testes preacute-transfusionais
incluem tipagem ABO (direta e reversa) tipagem Rh pesquisa de anticorpos irregulares no
sangue do receptor retipagem ABO e Rh do hemocomponente e prova de compatibilidade
entre as hemaacutecias do doador e soro ou plasma do receptor em caso de transfusatildeo de hemaacutecias
ou hemocomponentes que contenham mais de 2 mL de volume eritrocitaacuterio como o
concentrado de granuloacutecitos (BRASIL 2016 GANZELLA 2014 SANTOS 2014)
Aleacutem dos testes regularmente realizados a determinaccedilatildeo do fenoacutetipo para outros
antiacutegenos eritrocitaacuterios do doador e do receptor pode ser indicada A fenotipagem eritrocitaacuteria
determina o perfil antigecircnico para outros antiacutegenos de importacircncia cliacutenica aleacutem do sistema
ABO e do antiacutegeno RhD Ela pode auxiliar a confirmaccedilatildeo de uma especificidade de anticorpo
encontrada no soro do paciente uma vez que espera-se que a sua hemaacutecia natildeo expresse o
antiacutegeno correspondente e simultaneamente eacute utilizada para selecionar um concentrado de
hemaacutecias negativo para o respectivo antiacutegeno evitando reaccedilotildees hemoliacuteticas transfusionais A
fenotipagem de candidatos a transfusotildees crocircnicas tambeacutem eacute recomendada pois esse grupo de
pacientes deve se beneficiar com a transfusatildeo profilaacutetica de unidades de hemaacutecias com
mesmo fenoacutetipo evitando assim a aloimunizaccedilatildeo assim como reaccedilotildees hemoliacuteticas provocadas
por anticorpos previamente existentes e em baixo tiacutetulo natildeo identificados pela triagem de
anticorpos (CASTILHO JUNIOR e REID 2015 DOWNES e SHULMAN 2011)
111 TIPAGEM ABORh
O sistema ABO (ISBT001) foi o primeiro sistema de grupo sanguiacuteneo a ser
descoberto Ele foi descrito em 1900 por Karl Landsteiner e eacute considerado o sistema de maior
importacircncia na praacutetica transfusional Ele eacute composto por quatro antiacutegenos A1 (ABO1) B
(ABO2) AB (ABO3) e A1 (ABO4) e eacute caracterizado pela presenccedila dos anticorpos naturais
ou seja anticorpos que surgem sem a exposiccedilatildeo preacutevia aos antiacutegenos atraveacutes de transfusatildeo ou
gestaccedilatildeo Os anticorpos ABO satildeo predominantemente da classe IgM satildeo capazes de fixar o
complemento e de provocar hemoacutelise grave intravascular caso ocorra transfusatildeo ABO
incompatiacutevel Por apresentar essa caracteriacutestica peculiar a tipagem do sistema ABO eacute
composta de duas etapas a prova direta e a prova reversa Na prova direta eacute realizada a
pesquisa dos antiacutegenos na superfiacutecie das hemaacutecias que satildeo testadas com soros comerciais
3
Anti-A e Anti-B A prova reversa por sua vez pesquisa a presenccedila de anticorpos ABO ao
testar o soro ou plasma do pacientedoador com hemaacutecias A1 e B Ambas as provas satildeo
obrigatoacuterias e devem ser concordantes para interpretaccedilatildeo do fenoacutetipo ABO (COOLING
2011 SANTOS 2014)
O sistema Rh (ISBT004) eacute o maior e mais complexo sistema de grupos sanguiacuteneos
compreendendo atualmente 54 antiacutegenos (ISBT 2016) Satildeo cinco os principais antiacutegenos do
sistema Rh D (RH1) C (RH2) E (RH3) c (RH4) e e (RH5) Esses antiacutegenos possuem alta
capacidade imunogecircnica e seus respectivos anticorpos estatildeo envolvidos na doenccedila hemoliacutetica
perinatal e em reaccedilotildees transfusionais hemoliacuteticas Os autoanticorpos quentes como ocorre na
anemia hemoliacutetica quente satildeo representados em grande parte por anticorpos contra antiacutegenos
puacuteblicos do sistema Rh (CASTILHO 2007 CHOU e WESTHOFF 2011 BARJAS-
CASTRO 2013) A tipagem RhD pesquisa o antiacutegeno D na membrana eritrocitaacuteria ao testar a
hemaacutecia com antissoros comerciais Atualmente a maior parte dos soros Anti-D
comercializados satildeo monoclonais
112 ANTICORPOS ANTI-ERITROCITAacuteRIOS
Anticorpos satildeo proteiacutenas presentes no plasma tambeacutem denominadas imunoglobulinas
Satildeo produzidas pelo sistema imune em resposta a um determinado antiacutegeno Podem ser
classificadas de acordo com suas caracteriacutesticas e propriedades em cinco classes de
imunoglobulinas IgG IgM IgA IgE e IgD (BARJAS-CASTRO 2013)
A ligaccedilatildeo entre o antiacutegeno e o anticorpo envolvem ligaccedilotildees natildeo covalentes que satildeo
reversiacuteveis Vaacuterios tipos de interaccedilotildees natildeo covalentes podem contribuir para a ligaccedilatildeo do
antiacutegeno pelo anticorpo incluindo forccedilas eletrostaacuteticas pontes de hidrogecircnio forccedilas de Van
der Walls e interaccedilotildees hidrofoacutebicas (ABBAS LICHTMAN e PILLAI 2008)
As interaccedilotildees antiacutegeno-anticorpo satildeo constituiacutedas por ligaccedilotildees dinacircmicas que sofrem
interferecircncia de alteraccedilotildees fiacutesico-quiacutemicas no meio como mudanccedilas na temperatura na forccedila
eletrostaacutetica na concentraccedilatildeo do antiacutegeno e do anticorpo e no pH O melhor pH para a reaccedilatildeo
eacute em torno de 70 no entanto raros anticorpos podem exigir acidificaccedilatildeo do meio para serem
identificados (SANTOS 2014)
Em imunohematologia satildeo pesquisados os anticorpos que reconhecem os antiacutegenos
eritrocitaacuterios de grupo sanguiacuteneo ldquoin vivordquo esses anticorpos dependendo de seu significado
cliacutenico satildeo capazes de reconhecer seus respectivos antiacutegenos sobre a hemaacutecia podendo levar
a sua destruiccedilatildeo por dois mecanismos fagocitose por macroacutefagos no sistema
4
reticuloendotelial ou por ativaccedilatildeo do sistema complemento com a formaccedilatildeo do complexo de
ataque a membrana e hemoacutelise intravascular As duas classes de anticorpos de maior
importacircncia em imunohematologia satildeo as imunoglobulinas IgG e a IgM (SANTOS 2014)
Devido a sua estrutura pentameacuterica os anticorpos da classe IgM se ligam aos
antiacutegenos localizados na superfiacutecie da membrana de hemaacutecias proacuteximas e promovem
aglutinaccedilatildeo das mesmas em meio salino ldquoin vitrordquo Anticorpos da classe IgG por sua vez
satildeo denominados ldquonatildeo aglutinantesrdquo ou ldquoincompletosrdquo pois sua estrutura de monocircmero eacute
pequena o que desfavorece a aglutinaccedilatildeo direta uma vez que uma mesma moleacutecula de IgG
natildeo alcanccedila antiacutegenos alvos em duas hemaacutecias proacuteximas Os anticorpos IgM aleacutem de terem
um tamanho maior apresentam 750 vezes maior eficiecircncia de aglutinaccedilatildeo que os anticorpos
IgG permitindo maior facilidade nas ligaccedilotildees entre as hemaacutecias (CARRUCIO e WISE 2012
GREEN e KLOSTERMANN 2012)
Nos testes ldquoin vitrordquo satildeo simulados reaccedilotildees que poderiam ocorrer ldquoin vivordquo causando
reaccedilotildees indesejaacuteveis A fase de sensibilizaccedilatildeo em que o anticorpo se liga ao antiacutegeno
correspondente natildeo eacute identificada macroscopicamente poreacutem uma vez que o anticorpo
aproxima as hemaacutecias e vence a forccedila eletrostaacutetica que naturalmente as repele chamada de
potencial zeta ocorre a aglutinaccedilatildeo Dependendo das caracteriacutesticas do anticorpo e de sua
capacidade de fixar complemento pode ocorrer tambeacutem a hemoacutelise (SANTOS 2014)
113 PESQUISA E IDENTIFICACcedilAtildeO DE ANTICORPOS IRREGULARES
A pesquisa de anticorpos irregulares eacute teste obrigatoacuterio nos testes preacute-transfusionais e
tem a finalidade de detectar anticorpos ldquoin vitrordquo que possam causar reaccedilatildeo ldquoin vivordquo
Dependendo da populaccedilatildeo estudada (pacientes x doadores) e ainda da sensibilidade do
teste a frequecircncia de anticorpos irregulares pode variar de 03 a 38 A imunizaccedilatildeo pode
ocorrer por transfusatildeo gestaccedilatildeo transplante ou injeccedilatildeo de material imunogecircnico (WALKER
2011)
Os anticorpos irregulares podem ser classificados como aloanticorpos que satildeo
voltados contra antiacutegenos ausentes na hemaacutecia autoacuteloga ou como autoanticorpos os quais
reconhecem antiacutegenos eritrocitaacuterios proacuteprios Os autoanticorpos antieritrocitaacuterios surgem em
decorrecircncia da desregulaccedilatildeo da autotoleracircncia imune relacionada agrave condiccedilotildees diversas como
doenccedilas hematoloacutegicas doenccedilas inflamatoacuterias autoimunes neoplasias infecccedilotildees e uso de
medicaccedilotildees A presenccedila do autoanticorpo associado a um quadro de anemia hemoliacutetica
caracteriza a anemia hemoliacutetica autoimune (AHAI) seja ela primaacuteria ou secundaacuteria agrave outra
5
patologia Ateacute 12 a 40 dos pacientes com autoanticorpos quentes podem apresentar
aloanticorpos de significado cliacutenico mascarados pelos autoanticorpos (SHIREY et al 2002)
Eacute importante detectar a presenccedila de anticorpos no plasmasoro de um receptor de
transfusatildeo para garantir que seja transfundido sangue compatiacutevel Quando a pesquisa de
anticorpo irregular resultar positiva para um ou mais anticorpos de relevacircncia clinica eacute
necessaacuterio confirmar a ausecircncia do respectivo antiacutegeno na hemaacutecia do receptor assim como
selecionar para transfusatildeo concentrados de hemaacutecias tambeacutem negativos para aqueles
antiacutegenos evitando assim reaccedilotildees transfusionais (WALKER 2011)
A detecccedilatildeo de um anticorpo irregular eacute inicialmente realizada pela triagem de
anticorpos na qual o soroplasma do receptor eacute testado com 2 a 3 hemaacutecias do tipo ldquoOrdquo O
conjunto de fenoacutetipos dessas hemaacutecias deve contemplar os antiacutegenos de maior importacircncia
cliacutenica Como os anticorpos irregulares de maior interesse cliacutenico satildeo na maior parte das
vezes imunes portanto da classe IgG eacute obrigatoacuteria a fase de antiglobulina (AGH) do teste
ou teste indireto da antiglobulina (TIA) uma vez que esses anticorpos satildeo incompletos
(CASTILHO JUNIOR e REID 2015) O teste de triagem estando positivo deve-se fazer a
identificaccedilatildeo da especificidade do anticorpo utilizando um painel com maior nuacutemero de
hemaacutecias fenotipadas
114 PROVA DE COMPATIBILIDADE
A prova de compatibilidade eacute um teste obrigatoacuterio em caso de transfusatildeo de
componentes eritrocitaacuterios Tambeacutem chamada de prova de compatibilidade maior deve ser
realizada antes da administraccedilatildeo de sangue total ou concentrado de hemaacutecias utilizando-se
hemaacutecias obtidas do tubo coletor da bolsa a ser transfundida e o soro ou plasma do receptor
(BRASIL 2016)
Eacute definido como o procedimento para excluir a incompatibilidade entre o doador e o
receptor Tem o objetivo de detectar anticorpos que podem natildeo ter sido encontrados na
pesquisa de anticorpos devido a ausecircncia ou pouca expressatildeo de antiacutegenos no painel de
hemaacutecias aleacutem da possibilidade de terem ocorrido erros teacutecnicos ou notacionais durante a
realizaccedilatildeo da pesquisa (MELO 2007)
6
115 FENOTIPAGEM PARA OUTROS SISTEMAS
Aleacutem da pesquisa de ABORh que eacute realizado rotineiramente a fenotipagem para
outros sistemas tambeacutem denominado ldquofenotipagem estendidardquo determina a presenccedila ou
ausecircncia de antiacutegenos considerados de importacircncia cliacutenica A fenotipagem natildeo eacute obrigatoacuteria
nos testes preacute-transfusionais poreacutem a legislaccedilatildeo atual recomenda a realizaccedilatildeo da fenotipagem
eritrocitaacuteria dos antiacutegenos C (RH2) E (RH3) c (RH4) e (RH5) K (KELL1) Fya (FY1) Fy
b
(FY2) Jka
(JK1) Jkb (JK2) S (MNS3) e s (MNS4) para pacientes aloimunizados e pacientes
com indicaccedilatildeo de transfusatildeo crocircnica (BRASIL 2016)
A seleccedilatildeo de concentrados de hemaacutecias com o mesmo fenoacutetipo do receptor para
transfusatildeo pode evitar reaccedilotildees transfusionais hemoliacuteticas no paciente previamente
aloimunizado tambeacutem previne a sensibilizaccedilatildeo por outros antiacutegenos o que normalmente
torna as transfusotildees seguintes ainda mais complicadas A fenotipagem do paciente tambeacutem
auxilia na identificaccedilatildeo dos anticorpos pois espera-se que nas hemaacutecias do paciente o
antiacutegeno seja negativo para o anticorpo encontrado servindo de guia para teste de exclusatildeo de
anticorpos (SANTOS 2014 WALKER 2011)
A incidecircncia de aloanticorpos aumenta com o nuacutemero de transfusotildees no entanto a
implantaccedilatildeo de rotina de fenotipagem com transfusatildeo profilaacutetica de hemaacutecias com fenoacutetipo
compatiacutevel para pacientes candidatos agrave politransfusatildeo como os portadores de doenccedila
falciforme talassemia anemia aplaacutestica doenccedilas linfo e mieloproliferativas renais crocircnicos e
anemias refrataacuterias pode contribuir para o baixo iacutendice de sensibilizaccedilatildeo nessas populaccedilotildees
(FLUIT KUNST e DRENTHE-SCHONK 1999 MARTINS et al 2008 e VICHINSKY et
al 2001) Outro grupo de pacientes que se beneficia com a transfusatildeo de mesmo fenoacutetipo satildeo
os pacientes com AHAI uma vez que o autoanticorpo pode mascarar a presenccedila de um
aloanticorpo de significado cliacutenico em ateacute 40 dos casos Mesmo com as teacutecnicas utilizadas
ldquoin vitrordquo para remover a interferecircncia do autoanticorpo no soro um aloanticorpo pode natildeo
ser identificado e dessa forma transfundir o mesmo fenoacutetipo do paciente evitaria reaccedilatildeo
hemoliacutetica pelos anticorpos voltados contra antiacutegenos de maior importacircncia cliacutenica e de
frequecircncia intermediaacuteria Aleacutem disso os pacientes com AHAI satildeo fortes respondedores e a
transfusatildeo profilaacutetica do mesmo fenoacutetipo previne a aloimunizaccedilatildeo (SHIREY et al 2002)
Aleacutem de fenotipar o receptor eacute importante tambeacutem que os bancos de sangue tenham
rotinas de fenotipagem de doadores para atender as necessidade dos pacientes aloimunizados
ou em esquema de transfusatildeo crocircnica (PINTO BRAGA e SANTOS 2011)
7
Rotineiramente eacute inviaacutevel estabelecer o fenoacutetipo eritrocitaacuterio completo de um
indiviacuteduo pela grande diversidade de sistemas sanguiacuteneos descritos Ate junho de 2015 jaacute
haviam sido classificados 308 antiacutegenos atribuiacutedos a 36 sistemas definidos pela Sociedade
Internacional de Transfusatildeo de Sangue (ISBT) (CASTILHO JUNIOR e REID 2015)
Portanto o paciente eacute normalmente fenotipado para os antiacutegenos de maior importacircncia
clinica
Alguns fatores podem limitar a realizaccedilatildeo da fenotipagem eritrocitaacuteria Um dos fatores
eacute a transfusatildeo alogecircnica realizada haacute menos de 90 dias Neste caso podem ocorrer resultados
falso positivos para determinados antiacutegenos devido agrave presenccedila de hemaacutecias do doador
(LAINE et al 2000)
Outro fator eacute a presenccedila de anticorpo sensibilizando a hemaacutecia do paciente e
provocando positividade do teste direto da antiglobulina humana (TDA) Os soros
normalmente utilizados para fenotipagem especialmente para os antiacutegenos Fya
(FY1) Fyb
(FY2) Jka
(JK1) Jkb
(JK2) S (MNS3) e s (MNS4) necessitam da fase de antiglobulina
humana (AGH) para que ocorra aglutinacatildeo Amostras que apresentam o TDA positivo
aglutinam apoacutes reaccedilatildeo com a AGH natildeo pela real presenccedila do antiacutegeno em sua superfiacutecie mas
pela interaccedilatildeo da AGH com o anticorpo que estaacute sensibilizando o eritroacutecito A interferecircncia
do TDA positivo pode ser anulada atraveacutes de algumas teacutecnicas capazes de dissociar o
anticorpo como por exemplo o tratamento da hemaacutecia sensibilizada com cloroquina ou com
glicina-aacutecida-EDTA (BRANCH e PETZ 1999 SHIREY et al 2002 e LEGER 2011)
12 METODOLOGIAS APLICADOS Agrave ROTINA IMUNO-HEMATOLOacuteGICA
Todos os testes que compotildeem a rotina preacute-transfusional usam meacutetodos soroloacutegicos
que envolvem a reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo e tem como objetivo determinar o perfil antigecircnico
eritrocitaacuterio do receptor e do doador assim como identificar em seu soro a presenccedila de
anticorpos contra antiacutegenos eritrocitaacuterios que possam comprometer a sobrevida das hemaacutecias
transfundidas Para testar o antiacutegeno na superfiacutecie da hemaacutecia eacute necessaacuterio dispor de um
antissoro com especificidade conhecida para aquele antiacutegeno Por outro lado para testar a
presenccedila de um determinado anticorpo no soro ou plasma do receptor eacute necessaacuterio o uso de
hemaacutecias com perfil antigecircnico conhecido (SANTOS 2014)
Diversas metodologias satildeo aplicadas nos laboratoacuterios de imunohematologia Cada
serviccedilo de hemoterapia faz a escolha do meacutetodo que seraacute aplicado de acordo com o perfil do
laboratoacuterio com o volume de exames diaacuterios e tambeacutem com o custo envolvido Todas essas
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teacutecnicas tecircm como objetivo comum demonstrar a reaccedilatildeo entre antiacutegeno e anticorpo no
entanto elas se baseiam em diferentes princiacutepios Muitas metodologias satildeo atualmente
aplicadas agrave imunohematologia entre elas o sistema de fase soacutelida a tecnologia de hemaacutecias
magnetizadas a biologia molecular e ateacute mesmo a citometria de fluxo no entanto os meacutetodos
mais tradicionais satildeo aqueles baseados no princiacutepio de hemaglutinaccedilatildeo
121 MEacuteTODOS DE FASE FLUacuteIDA
Os meacutetodos de fase fluiacuteda satildeo testes baseados na hemaglutinaccedilatildeo e incluem o teste em
tubo e o teste em microplacas Uma suspensatildeo de hemaacutecias eacute adicionada ao plasma ou soro
em seguida eacute realizada a centrifugaccedilatildeo e por fim eacute feita a leitura do resultado que eacute
considerado positivo se for observado algum grau de aglutinaccedilatildeo ou hemoacutelise A intensidade
de aglutinaccedilatildeo eacute graduada de acordo com o tamanho dos agregados desprendidos da
superfiacutecie apoacutes agitaccedilatildeo delicada do tubo ou microplaca Os meacutetodos de hemaglutinaccedilatildeo satildeo
aplicados a todos os testes preacute-transfusionais Como os anticorpos ABO satildeo aglutininas frias
a tipagem eacute realizada em temperatura ambiente (22degC) no entanto ao investigar a presenccedila
de anticorpos irregulares que como jaacute mencionado eacute na maioria das vezes anticorpos
incompletos da classe IgG eacute essencial que a reaccedilatildeo seja incubada a 37degC As reaccedilotildees satildeo
facilitadas com a utilizaccedilatildeo de potencializadores e da antiglobulina humana (WALKER e
HARMENING 2012 AABB 2011)
Nos meacutetodos de fase fluiacuteda nos quais a AGH eacute empregada a fase de lavagem eacute
fundamental Apoacutes a incubaccedilatildeo do soro com as hemaacutecias deve ser realizada a lavagem da
reaccedilatildeo para remover o excesso de anticorpos natildeo ligados agraves hemaacutecias jaacute que os anticorpos
livres podem bloquear a AGH quando ela eacute adicionada e levar a resultados falso negativos
(AABB 2011)
Os testes de hemaglutinaccedilatildeo satildeo os mais tradicionais entre os meacutetodos ainda hoje
aplicados agrave rotina de bancos de sangue A vantagem desses meacutetodos eacute o baixo custo quando
comparado agraves teacutecnicas mais modernas mas apresentam tambeacutem desvantagens A teacutecnica em
tubo por exemplo natildeo permite automaccedilatildeo eacute trabalhosa e exige matildeo-de-obra bastante treinada
na execuccedilatildeo das diversas etapas do teste e mesmo assim pode haver subjetividade na
interpretaccedilatildeo dos resultados aleacutem de resultados falso-negativos (DOWNES 2011 ZANTEK
et al 2012)
9
122 COLUNAS DE GEL
A teacutecnica em gel iniciada na deacutecada de 90 representou uma grande revoluccedilatildeo na
rotina laboratorial tornando-se muito popular Aleacutem de ser sensiacutevel a teacutecnica dispensa a fase
de lavagem antes da adiccedilatildeo da AGH assim como a agitaccedilatildeo do teste para leitura reduzindo o
nuacutemero de resultados falsos negativos decorrentes dessas duas etapas e o tempo para
execuccedilatildeo dos testes (LAPIERRE et al 1989 NOVARETTI et al 2000 NOVARETTI et
al 2004) Os reagentes satildeo comercializados na forma de cartotildees plaacutesticos contendo
microtubos preenchidos por gel composto por microesferas de acrilamida-dextran Nesta
metodologia tambeacutem baseada na hemaglutinaccedilatildeo a suspensatildeo de hemaacutecias e o soro satildeo
depositados em uma cacircmara acima da coluna de gel e em seguida procede-se com a
centrifugaccedilatildeo dos cartotildees As microesferas atuam como uma malha que permite a passagem
em direccedilatildeo ao fundo do microtubo apenas das hemaacutecias natildeo aglutinadas enquanto as
hemaacutecias aglutinadas ficam retidas na parte superior da coluna ou ao longo dela (GREEN e
KLOSTERMANN 2012) Portanto quanto maior a agregaccedilatildeo mais hemaacutecias ficam retidas
no topo da coluna Dependendo do tipo de teste a ser realizado pode ser utilizado gel neutro
ou gel especiacutefico impregnado pelo anticorpo desejado e o gel contendo antiglobulina humana
que satildeo utilizados para os testes diretos e indiretos da antiglobulina (LAPIERRE et al 1989)
A coluna de gel ainda permite a visualizaccedilatildeo clara de duas populaccedilotildees distintas de hemaacutecias
como em pacientes receacutem transfundidos
123 BIOLOGIA MOLECULAR
A biologia molecular ou genotipagem estaacute sendo cada vez mais aplicada aos grupos
sanguiacuteneos pois fornece resultados seguros e precisos especialmente nos casos em que natildeo eacute
possiacutevel a realizaccedilatildeo da fenotipagem como em pacientes receacutem-transfundidos e pacientes
com TDA positivo Na genotipagem eacute possiacutevel determinar atraveacutes do DNA do paciente
extraiacutedo de seus leucoacutecitos de sangue perifeacuterico o fenoacutetipo eritrocitaacuterio deduzido sem
qualquer interferecircncia do anticorpo que sensibiliza a hemaacutecia ou de hemaacutecias alogecircnicas
transfundidas Sua realizaccedilatildeo no entanto exige o treinamento de equipe especializada e capaz
de interpretar os resultados em conjunto com os achados soroloacutegicos (JUNIOR e OLIVATO
2007)
Apesar de ser uma ferramenta de grande importacircncia hoje na imuno-hematologia
ainda estaacute restrito aos grandes centros de hemoterapia no Brasil poucos serviccedilos puacuteblicos de
sauacutede dispotildeem desse recurso e utilizam teacutecnicas de genotipagem de grupos sanguiacuteneos para
atendimento a seus pacientes Esta abordagem poreacutem vem sendo introduzida em algumas
10
instituiccedilotildees de reconhecida competecircncia na hemoterapia mas sua disponibilizaccedilatildeo deve
tornar-se mais generalizada atraveacutes da formaccedilatildeo de centros de referecircncia para atendimento
das diversas unidades de hemoterapia (MARTINS et al 2009) Dessa forma muitas decisotildees
transfusionais especialmente em urgecircncias ainda devem ser tomadas sem o resultado da
genotipagem eritrocitaacuteria
13 TESTE DA ANTIGLOBULINA
Coombs Mourant e Race descreveram em 1945 uma teacutecnica com utilizando soro de
coelho contendo antiglobulina humana (AGH) que posteriormente foi chamada de ldquosoro de
Coombsrdquo O meacutetodo foi desenvolvido inicialmente para ampliar o efeito de aglutininas fracas
do sistema Rh anticorpos ldquoincompletosrdquo que normalmente natildeo apresentavam aglutinaccedilatildeo
visiacutevel O teste foi concebido como um instrumento de investigaccedilatildeo de doenccedila hemoliacutetica do
receacutem-nascido e de reaccedilotildees transfusionais causadas por anticorpos Rh que estavam presentes
no soro dos paciente poreacutem que natildeo eram demonstraacuteveis pelas teacutecnicas ateacute entatildeo existentes
A maior parte dos anticorpos de significado cliacutenico assim como seus respectivos
antiacutegenos foram descritos apoacutes o surgimento do ldquosoro de Coombsrdquo em 1945 sendo assim o
teste da antiglobulina representa ateacute hoje a forma mais importante de aglutinaccedilatildeo artificial em
imunohematologia permitindo revelar a presenccedila de anticorpos na membrana da hemaacutecia A
antiglobulina humana eacute constituiacuteda por anticorpo especiacutefico contra a porccedilatildeo Fc de outro
anticorpo Quando um anticorpo ldquoincompletordquo sensibiliza a hemaacutecia normalmente natildeo
provoca aglutinaccedilatildeo visiacutevel Apoacutes a adiccedilatildeo da AGH ao meio esta reconhece e se liga agraves
porccedilotildees Fc dos anticorpos que sensibilizam a hemaacutecia formando assim uma malha e
provocando aglutinaccedilatildeo visiacutevel (BARJAS-CASTRO 2013)
Os reagentes de antiglobulina podem ser poliespeciacuteficos ou monoespeciacuteficos Os
poliespeciacuteficos satildeo uma mistura de anticorpos ant-IgG e anti-C3d (fraccedilatildeo C3d do
complemento) Os reagentes monoespecificos podem ser anti-IgG anti-IgM anti-IgA anti-
complemento podendo ser anti-C3d e anti-C3b
O teste da antiglobulina pode ser usado para detectar hemaacutecias sensibilizadas com
aloanticorpos IgG autoanticorpos IgG e componentes do complemento A sensibilizaccedilatildeo
pode ocorrer ldquoin vivordquo ou ldquoin vitrordquo O uso do AGH para detectar a sensibilizaccedilatildeo ldquoin vitrordquo
tem dois estaacutegios e eacute denominado teste indireto da antiglobulina A sensibilizaccedilatildeo ldquoin vivordquo eacute
detectada em procedimento de um uacutenico estagio chamado teste direto da antiglobulina (TDA)
11
Os testes direto e indireto satildeo ateacute hoje amplamente aplicados como princiacutepio de inuacutemeros
testes soroloacutegicos em imuno-hematologia (GREEN e KLOSTERMANN 2012)
131 TESTE DIRETO DA ANTIGLOBULINA
O teste direto da antiglobulina humana revela a presenccedila de anticorpo eou fraccedilatildeo do
complemento ligados agrave superfiacutecie das hemaacutecias As sensibilizaccedilatildeo das hemaacutecias ocorrida ldquoin
vivordquo natildeo eacute visualizada mas apoacutes a adiccedilatildeo da antiglobulina humana ocorre a aglutinaccedilatildeo que
eacute visualizada macroscopicamente (Figura 1)
Figura 1 - Princiacutepio da teacutecnica direta da antiglobulina Teste utilizado para demonstrar a sensibilizaccedilatildeo ldquoin
vivordquo das hemaacutecias O sangue total eacute coletado do paciente em tubo contendo anticoagulante EDTA Na teacutecnica
realizada em tubo uma suspensatildeo de hemaacutecias 5 em soluccedilatildeo de salina eacute preparada Uma gota dessa suspensatildeo
eacute lavada 3 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica para retirada de anticorpos que estatildeo livres no plasma Toda soluccedilatildeo eacute
retirada e adiciona-se o soro de Coombs (antiglobulina humana) O soro de Coombs reconhece os anticorpos que
estatildeo ligados agrave superfiacutecie das hemaacutecias fazendo com que ocorra aglutinaccedilatildeo visiacutevel macroscopicamente
Apesar de natildeo ser um teste preacute-transfusional obrigatoacuterio o TDA eacute um dos testes mais
importantes para investigar e classificar quadros hemoliacuteticos como de origem imune ou natildeo
imune O seu valor preditivo positivo em vigecircncia de anemia hemoliacutetica eacute de 83 poreacutem natildeo
havendo sinais de hemoacutelise seu valor preditivo eacute apenas 14 Eacute por esse motivo que a
interpretaccedilatildeo do TDA positivo deve levar em consideraccedilatildeo a histoacuteria cliacutenica e os resultados
dos outros exames laboratoriais A realizaccedilatildeo do TDA eacute obrigatoacuteria na investigaccedilatildeo
12
laboratorial de diversos quadros hemoliacuteticos entre eles a anemia hemoliacutetica autoimune
(AHAI) a reaccedilatildeo hemoliacutetica imune poacutes-transfusional a siacutendrome do linfoacutecito passageiro a
doenccedila hemoliacutetica perinatal e a hemoacutelise droga-dependente (LEGER 2011)
Resultados de TDA positivos foram tambeacutem observados em indiviacuteduos com niacuteveis
seacutericos elevados de IgG ou complemento sem evidecircncia de anemia hemoliacutetica imune como
em pacientes com doenccedila falciforme talassemia doenccedila renal crocircnica mieloma muacuteltiplo
doenccedilas autoimunes e siacutendrome da imunodeficiecircncia adquirida (SIDA) Aleacutem disso pequenas
quantidades de IgG (5 a 90 moleacuteculas por hemaacutecia) e complemento (5 a 40 moleacuteculas por
hemaacutecia) podem estar presentes nas hemaacutecias de indiviacuteduos saudaacuteveis sem associaccedilatildeo com
reduccedilatildeo na sobrevida das mesmas A positividade do TDA depende da populaccedilatildeo estudada e
pode variar de 01 entre doadores de sangue sem qualquer sinal cliacutenico de hemoacutelise ateacute
15 em pacientes hospitalizados (CASTILHO JUNIOR e REID 2015 LEGER 2011)
Indiviacuteduos que apresentam TDA positivo seja agraves custas de IgG eou complemento
com ou sem sinais cliacutenicos de hemoacutelise teratildeo a fenotipagem eritrocitaacuteria prejudicada A
fenotipagem de indiviacuteduos com TDA positivo especialmente quando utilizado o teste indireto
da antiglobulina pode acarretar resultados falsos positivos e levar a seleccedilatildeo de fenoacutetipo
incorreto para transfusatildeo
132 TESTE INDIRETO DA ANTIGLOBULINA
O teste indireto da antiglobulina (TIA) eacute utilizado para revelar a sensibilizaccedilatildeo ldquoin
vitrordquo das hemaacutecias e eacute aplicado a diversos testes soroloacutegicos em imunohematologia entre
eles a pesquisa de anticorpos identificaccedilatildeo de anticorpos testes de compatibilidade
fenotipagem eritrocitaacuteria e titulaccedilatildeo de anticorpos Na teacutecnica indireta a hemaacutecia que contecircm
o antiacutegeno eacute colocada em contato ldquoin vitrordquo com o anticorpo que se liga mas natildeo promove a
aglutinaccedilatildeo visiacutevel A adiccedilatildeo da AGH forma uma malha entre os anticorpos que sensibilizam
as hemaacutecias e provoca a aglutinaccedilatildeo macroscoacutepica (figura 2)
Caso a amostra de hemaacutecia estudada seja previamente sensibilizada resultados falsos
positivos podem ser obtidos no TIA jaacute que a AGH reagiraacute com a moleacutecula que sensibilizava
anteriormente a hemaacutecia mesmo se o anticorpo especiacutefico natildeo tiver se ligado ao antiacutegeno
correspondente
13
133 CONDICcedilOtildeES CLIacuteNICAS COM TDA POSITIVO
O TDA positivo deve ser interpretado cuidadosamente sempre em conjunto com o
quadro cliacutenico do paciente A positividade isolada do TDA natildeo significa hemoacutelise A
interpretaccedilatildeo do teste positivo requer o conhecimento do diagnoacutestico do paciente da presenccedila
de sinais e sintomas sugestivos de hemoacutelise assim como de seu histoacuterico transfusional
gestacional e de informaccedilotildees sobre o uso recente de medicaccedilotildees (LEGER 2011)
Figura 2 ndash Princiacutepio do teste indireto da antiglobulina O TIA pode ser utilizado na pesquisa de anticorpos de
especificidades desconhecidas livres no soroplasma como eacute o caso da pesquisa e identificaccedilatildeo de anticorpos
irregulares Ele eacute tambeacutem utilizado para determinar a presenccedila de antiacutegenos na membrana da hemaacutecia quando
satildeo empregados soros de especificidades conhecidas da classe IgG No primeiro caso o soroplasma contendo o
anticorpo desconhecido eacute colocado em contato com hemaacutecias cujo perfil antigecircnico eacute conhecido No segundo
caso utiliza-se soro de especificidade conhecida da classe IgG para determinar a presenccedila ou ausecircncia de um
antiacutegeno na membrana O anticorpo encontra o antiacutegeno correspondente e ocorre a ligaccedilatildeo do anticorpo agrave
hemaacutecia mas natildeo ocorre aglutinaccedilatildeo Apoacutes a adiccedilatildeo da AGH que se liga aos anticorpos formando uma malha
ocorre a aglutinaccedilatildeo visiacutevel
O TDA positivo eacute uma achado claacutessico de algumas condiccedilotildees cliacutenicas como a reaccedilatildeo
transfusional hemoliacutetica a doenccedila hemoliacutetica do feto e do receacutem-nascido (DHFRN) a anemia
hemoliacutetica induzida por drogas a siacutendrome do linfoacutecito passageiro e a anemia hemoliacutetica
autoimune (AHAI) Portanto o TDA positivo pode ser decorrente da sensibilizaccedilatildeo da
hemaacutecia autoacuteloga por um autoanticorpo ou por um aloanticorpo ligado agrave hemaacutecia alogecircnica
circulante A positividade do TDA pode ainda ocorrer de forma passiva em pacientes que
14
recebem imunoglobulinas humanas ou ainda pela transfusatildeo de plaquetas ABO natildeo idecircntico
(LEGER 2011 RALPH 2012 ZANTEK et al 2012)
Nas reaccedilotildees transfusionais hemoliacuteticas imunes o aloanticorpo do receptor sensibiliza
as hemaacutecias transfundidas do doador e reduz sua sobrevida ao removecirc-la precocemente da
circulaccedilatildeo pela fagocitose no sistema retiacuteculo-endotelial ou pela hemoacutelise intravascular As
reaccedilotildees podem ser agudas se ocorrem ateacute 24 horas ou tardias quando ocorrem apoacutes 24 horas
da transfusatildeo A gravidade das reaccedilotildees hemoliacuteticas pode variar de um simples rendimento
transfusional inadequado agrave quadros graves de hemoacutelise intravascular evoluindo ateacute mesmo
com choque vascular e oacutebito O TDA pode resultar negativo caso toda massa eritrocitaacuteria
transfundida tenha sido destruiacuteda (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
Na doenccedila hemoliacutetica do feto e do receacutem-nascido (DHFRN) anticorpos maternos da
classe IgG atravessam a barreira placentaacuteria e sensibilizam as hemaacutecias fetais que seratildeo
destruiacutedas precocemente levando agrave anemia fetal Apesar da incompatibilidade ABO feto-
materna ser a causa mais frequente de DHFRN raramente ela eacute responsaacutevel pela ocorrecircncia
de quadros graves Por outro lado anticorpos contra antiacutegenos do sistema Rh e Kell
especialmente Anti-D (Anti-RH1) Anti-c (Anti-RH4) e Anti-Kell (Anti-KELL1) satildeo
conhecidos por causar DHFRN severa Raramente outros anticorpos tambeacutem podem estar
implicados na DHFRN como os anticorpos contra antiacutegenos do sistema Kidd Duffy MNS e
Diego (ZANTEK et al 2012)
A hemoacutelise droga-dependente eacute causada pela produccedilatildeo de um anticorpo voltado contra
a droga ligada agrave membrana eritrocitaacuteria ou ainda contra o complexo droga-membrana A
classe de medicaccedilotildees mais comumente envolvida eacute a dos antimicrobianos betalactacircmicos
(penicilinas e cefalosporinas) mas outras classes como quimioteraacutepicos e anti-inflamatoacuterios
tambeacutem satildeo descritos (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
Apoacutes transplante de ceacutelulas progenitoras hematopoieacuteticas em que o doador possui
anticorpos contra antiacutegenos eritrocitaacuterios do receptor o linfoacutecito de memoacuteria do doador pode
resistir ao esquema imunossupressor utilizado e continuar a produccedilatildeo de anticorpos que
reconhecem a hemaacutecia incompatiacutevel do receptor ainda circulante O quadro cliacutenico pode
variar de um simples TDA positivo sem outros sinais ou sintomas ateacute um quadro hemoliacutetico
grave e abrupto (LEGER 2011)
15
134 ANEMIA HEMOLIacuteTICA AUTOIMUNE
A anemia hemoliacutetica autoimune eacute caracterizada pela destruiccedilatildeo precoce das hemaacutecias
autoacutelogas por autoanticorpos que sensibilizam as hemaacutecias e levam agrave fagocitose pelos
macroacutefagos no sistema reticulo-endotelial ou hemoacutelise intravascular O diagnoacutestico da AHAI
baseia-se na presenccedila de hemoacutelise cliacutenica associada agrave evidecircncia de fator imune representado
pelo TDA positivo As classes de anticorpos envolvidas em quadros de AHAI satildeo IgG IgM e
raramente IgA (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012) Satildeo raros os casos de AHAI com TDA
negativo que podem estar relacionados a um autoanticorpo de baixa avidez de densidade
inferior agrave detecccedilatildeo do meacutetodo ou ainda de classe de imunoglobulina natildeo avaliada pelo
meacutetodo utilizado para o teste (GARRATY 2005)
A AHAI pode ser classificada em dois grupos principais de acordo com a melhor
temperatura de reaccedilatildeo do autoanticorpo As anemias hemoliacuteticas causadas por anticorpos
quentes que reagem melhor a 37oC e geralmente IgG representam 80 dos casos de AHAI
Nas AHAI por anticorpo quente o TDA pode ser positivo para IgG mais complemento (67)
somente IgG (20) ou somente por complemento (13) As anemias causadas por
anticorpos frios geralmente da classe IgM e que reagem melhor em temperatura ambiente ou
a 4oC representam aproximadamente 20 dos casos de AHAI Por exibirem amplitude
teacutermica esses anticorpos ligam-se agraves hemaacutecias ao atingirem a circulaccedilatildeo nas extremidades do
corpo fixam o complemento e desprendem-se da hemaacutecia apoacutes retornar para partes mais
quentes Por esse motivo em AHAI por anticorpos frios o TDA eacute positivo apenas agraves custas
de C3 e normalmente o IgM natildeo eacute detectado (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
A presenccedila do autoanticorpo IgG pode ser confirmada atraveacutes da eluiccedilatildeo do anticorpo
da hemaacutecia Tipicamente o eluato na AHAI por anticorpo quente reage com todas as ceacutelulas
testadas de um painel de hemaacutecias alogecircnicas do tipo ldquoOrdquo ou pode eventualmente exibir uma
especificidade conhecida como Anti-e (Anti-RH5) Nas AHAI a frio por sua vez espera-se
um eluato negativo (LEGER 2011)
Os autoanticorpos satildeo com frequecircncia encontrados livres no plasma e natildeo somente
ligados agraves hemaacutecias autoacutelogas Eles podem interferir em todas as fases dos testes preacute-
transfusionais nas quais o plasma eacute testado especialmente os autoanticorpos quentes que
acarretam resultados positivos em todos os testes levados agrave fase de antiglobulina humana
Esses anticorpos portanto positivam a pesquisa de anticorpos irregulares e mascaram a
presenccedila de aloanticorpos de significado cliacutenico Aproximadamente 60 dos pacientes que
apresentam AHAI a quente apresentam anticorpos que reagem em meio salino mas se forem
16
levados em conta meacutetodos mais sensiacuteveis como PEG enzima e estudo em gel a positividade
pode ser superior a 90 (LEGER 2011)
Aleacutem da eficaacutecia da transfusatildeo ser comprometida pela diminuiccedilatildeo da vida-meacutedia das
hemaacutecias a presenccedila do autoanticorpo dificulta a realizaccedilatildeo dos testes preacute-transfusionais e
compromete a seguranccedila transfusional Os autoanticorpos reagem normalmente como
panaglutininas pois satildeo normalmente voltados contra antiacutegenos puacuteblicos na maior parte das
vezes contra antiacutegenos do sistema Rh Por apresentarem essas caracteriacutesticas podem ainda
mascarar a presenccedila de aloanticorpos de significado clinico e levar a testes de compatibilidade
positivos exigindo uma avaliaccedilatildeo criteriosa da necessidade da transfusatildeo (BRANCH e PETZ
1999 JUNIOR e OLIVATO 2004)
Remover a interferecircncia do autoanticorpo para avaliar a presenccedila de aloanticorpos
mascarados nem sempre eacute possiacutevel mesmo utilizando teacutecnicas de autoadsorccedilatildeo ou
aloadsorccedilatildeo que aleacutem de tudo satildeo demoradas e exigem de 2 a 6 horas para conclusatildeo
(GARRATY e GEORGE 2002) Nesses casos a fenotipagem eritrocitaacuteria do paciente eacute de
extrema utilidade especialmente em situaccedilotildees de urgecircncia A definiccedilatildeo do fenoacutetipo do
paciente para os antiacutegenos de maior importacircncia cliacutenica pode auxiliar a seleccedilatildeo de unidades
de hemaacutecias com mesmo fenoacutetipo o que garante que eventuais aloanticorpos natildeo
identificados sejam respeitados e tambeacutem evita nova sensibilizaccedilatildeo (JUNIOR e OLIVATO
2004 SHIREY et al 2002)
135 TRATAMENTO DE HEMAacuteCIAS COM TDA POSITIVO
O TDA positivo impede a fenotipagem eritrocitaacutecia por meacutetodos que exigem a fase de
AGH uma vez que a aglutinaccedilatildeo ocorreraacute devido agrave interaccedilatildeo da AGH com o autoanticorpo
que sensibiliza a hemaacutecia do paciente levando a resultados falso positivos Em algumas
situaccedilotildees como na AHAI por anticorpo quente a fenotipagem eacute especialmente importante
pois o autoanticorpo interfere na triagem e identificaccedilatildeo de anticorpos assim como no teste de
compatibilidade e dificultam a detecccedilatildeo de aloanticorpos de significado cliacutenico que
obrigatoriamente devem ser respeitados Nessas situaccedilotildees a fenotipagem eritrocitaacuteria
determina o perfil antigecircnico do paciente e possibilita o fornecimento de unidades de
hemaacutecias com o mesmo fenoacutetipo para a transfusatildeo evitando a sensibilizaccedilatildeo para novos
antiacutegenos assim como reaccedilotildees hemoliacuteticas transfusionais No entanto eacute necessaacuterio aplicar
meacutetodos que natildeo sofram interferecircncia do TDA positivo ou seja meacutetodos que natildeo necessitem
da fase de AGH ou meacutetodos de bloqueio do anticorpo sem bloquear o antiacutegeno Uma opccedilatildeo eacute
a utilizaccedilatildeo de soros monoclonais IgM (salinos ou de meio proteico natildeo concentrado) mas
17
nem sempre esses reagentes estatildeo disponiacuteveis especialmente os reagentes monoclonais para
os antiacutegenos dos sistemas Duffy ( Fya Fy
b) Kidd ( Jk
a Jk
b) e MNS (S s) (JUNIOR e
OLIVATO 2004) Outra opccedilatildeo eacute a teacutecnica de bloqueio que pode ser utilizada para tratar
hemaacutecias para posterior fenotipagem em casos de TDA positivos com reatividade le2+
Em casos onde a positividade do TDA eacute maior que 2+ estaacute indicada a tratamento
quiacutemico para remoccedilatildeo da interferecircncia do autoanticorpo antes de realizar a fenotipagem Entre
as teacutecnicas utilizadas atualmente estatildeo o ZZAP a cloroquina e a glicina aacutecidaEDTA
1351 TEacuteCNICA DE BLOQUEIO
A teacutecnica de bloqueio se baseia na utilizaccedilatildeo de anti-IgG (Coombs monoespeciacutefico)
para tratar as hemaacutecias com TDA positivo O anticorpo anti-IgG se liga aos anticorpos que
estatildeo sensibilizando a hemaacutecias poreacutem sem o bloquear os antiacutegenos Os antiacutegenos que natildeo
estatildeo sensibilizados podem ser detectados atraveacutes dos antissoros especiacuteficos (SERERAT
VEIDT E DUTCHED 2000)
1352 TRATAMENTO DE HEMAacuteCIAS COM ZZAP
O Sulphydryl-Proteolytic Enzyme (ZZAP) que eacute uma mistura de ditiotreitol (DTT)
mais papaiacutena ativada com cisteiacutena eacute um reagente capaz de dissociar imunoglobulinas da
classe IgG ligadas a membrana dos eritroacutecitos enquanto trata enzimaticamente as hemaacutecias
O tratamento enzimaacutetico tambeacutem potencializa a ligaccedilatildeo do autoanticorpo ao antiacutegeno e
acelera o processo de autoadsorccedilatildeo O ZZAP pode desnaturar os antiacutegenos do sistema Duffy
MNS e Kell o que limita sua aplicaccedilatildeo para fins de fenotipagem (BRANCH e PETZ 1982)
1353 CLOROQUINA
Em 1982 Edwards Moulds e Judd propuseram a utilizaccedilatildeo da teacutecnica da cloroquina
que dissociava os complexos antiacutegeno-anticorpo e mantinha a membrana das hemaacutecias
iacutentegras Os derivados quinolecircicos jaacute haviam sido descritos anteriormente por Domokos e
Aszody em 1964 e Holtz Mantel e Buck em 1973 (apud Edwards Moulds e Judd 1982) pela
sua capacidade de separar imunocomplexos e inibir as reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo reduzindo
as cargas eleacutetricas das superfiacutecie das hemaacutecias A teacutecnica eacute uma das mais utilizadas nos
centros brasileiros para remover a interferecircncia do autoanticorpo e eacute tambeacutem a teacutecnica
atualmente adotada pelo laboratoacuterio de imunohematologia do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto
18
Edwards Moulds e Judd (1982) demonstraram que a teacutecnica da cloroquina para
dissociaccedilatildeo de anticorpos eacute uma teacutecnica simples efetiva e confiaacutevel para dissociar
imunoglobulina das hemaacutecias Desde que a membrana das hemaacutecias permaneccedila intacta natildeo
haacute perda da reatividade dos antiacutegenos e a sua maior aplicaccedilatildeo eacute a fenotipagem de hemaacutecias
com TDA positivo Os autores verificaram que em 83 das amostras sensibilizadas in vivo e
22 amostras (no total de 40) sensibilizadas ldquoin vitrordquo apresentaram TDA negativo e
puderam ser fenotipadas A teacutecnica poreacutem natildeo consegue remover os componentes do
complemento na maioria dos casos
Champagne e colaboradores (1999) testaram a teacutecnica da cloroquina para dissociar
antiacutegenos Bg comparando com a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA e verificaram vantagem em
relaccedilatildeo ao uso de um uacutenico reagente diminuindo a manipulaccedilatildeo e verificou que o mesmo natildeo
destroacutei antiacutegeno Kell
A cloroquina tambeacutem mostrou-se pouco efetivo em remover anticorpos do sistema
Duffy da superfiacutecie das hemaacutecias (EDWARDS MOUDS e JUDD 1982 ROZIERS e
SQUALI 1997)
1353 GLICINA-AacuteCIDAEDTA
A afinidade e a estabilidade entre a ligaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo eacute definida como a
resultante entre forccedilas atrativas e repulsivas entre ambos (CARUCIO e WISE 2012) e resulta
da somatoacuteria de forccedilas quiacutemicas dinacircmicas e fracas (natildeo covalentes) como pontes de
hidrogecircnio forcas eletrostaacuteticas forca de Van der Waals e pontes hidrofoacutebicas A estabilidade
dessa ligaccedilatildeo eacute facilmente abalada por alteraccedilotildees quiacutemicas e fiacutesicas no meio da reaccedilatildeo como
a alteraccedilatildeo do pH A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA se baseia na mudanccedila do pH para a
quebra da ligaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo (KOSANKE 2012)
A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA foi primeiramente descrita em 1986 por Louie Jieng
e Zeroulis que utilizaram 50 amostras de doadores sensibilizados ldquoin vitrordquo com anticorpos A
teacutecnica foi efetiva em 48 amostras permitindo o estudo do eluato assim como a fenotipagem
das hemaacutecias Os autores testaram tambeacutem a teacutecnica em 100 hemaacutecias TDA positivo que
puderam ser utilizadas para teacutecnicas de autoadsorccedilatildeo
Byrne (1991) descreveu a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA modificada e tambeacutem
verificou como uma opccedilatildeo para o tratamento de hemaacutecias com TDA positivo que deixava as
hemaacutecias intactas e o eluato viaacutevel para ser fenotipado
19
Roziers e Squali (1997) e Katharia e Chaudhary (2013) compararam a teacutecnica da
glicina-aacutecidaEDTA com as teacutecnicas da cloroquina e do aquecimento Verificaram maior
eficiecircncia da glicina-aacutecidaEDTA em relaccedilatildeo as outras duas teacutecnicas pois com uma mesma
quantidade de amostra produzia as hemaacutecias livres de anticorpo e tambeacutem o eluato Mostrou-
se ainda superior devido ao menor tempo exigido para sua realizaccedilatildeo o que favorece seu uso
em situaccedilotildees de urgecircncia e emergecircncia
As duas desvantagens da teacutecnica poreacutem eacute o fato de destruir os antiacutegenos do sistema
Kell e o fato de natildeo remover fraccedilotildees do complemento ligadas agrave hemaacutecia (PALLAS WILER e
McGEE 1991 ROZIERS e SQUALLI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012
e KATHARIA e CHAUNDHARY 2013)
20
2 OBJETIVOS
21 OBJETIVO GERAL
211 Avaliar a eficaacutecia da glicina-aacutecidaEDTA em remover os anticorpos ligados agraves
hemaacutecias sensibilizadas por anticorpos da classe IgG
22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
221 Preparaccedilatildeo dos reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
verificaccedilatildeo da estabilidade dos mesmos e avaliar custos
222 Testar a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA em amostras de hemaacutecias
sensibilizadas por anticorpos antieritrocitaacuterios humanos
223 Comparar a efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA com a teacutecnica da
cloroquina quanto a capacidade de remover a interferecircncia do anticorpo ligado
a hemaacutecia
224 Testar o eluato das amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA
225 Verificar se houve destruiccedilatildeo dos antiacutegenos eritrocitaacuterios apoacutes o tratamento
com glicina-aacutecidaEDTA e com cloroquina
226 Verificar se o tempo de execuccedilatildeo da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA descrito
nos textos de referecircncia eacute reprodutiacutevel
21
3 JUSTIFICATIVA
Algumas condiccedilotildees cliacutenicas podem levar ao depoacutesito ldquoin vivordquo de anticorpos eou
fraccedilotildees do complemento sobre as hemaacutecias Entre elas estatildeo as reaccedilotildees hemoliacuteticas poacutes-
transfusionais a doenccedila hemoliacutetica perinatal o uso de medicamentos e principalmente a
AHAI Na AHAI um anticorpo normalmente da classe IgG ou IgM reconhece antiacutegenos
proacuteprios na membrana eritrocitaacuteria e reduz a sobrevida da hemaacutecia levando a sua destruiccedilatildeo
pelos macroacutefagos no sistema reticulo-endotelial ou agrave ativaccedilatildeo do complexo de ataque agrave
membrana e agrave lise intravascular Os autoanticorpos satildeo voltados na maioria das vezes contra
antiacutegenos eritrocitaacuterios de alta frequecircncia populacional conhecidos como antiacutegenos puacuteblicos
e por este motivo reconhecem tanto hemaacutecias autoacutelogas quanto alogecircnicas
Devido agrave presenccedila do autoanticorpo livre no plasma e tambeacutem do anticorpo eou
complemento ligado agrave hemaacutecia o banco de sangue pode encontrar dificuldades em todas as
fases dos testes preacute-transfusionais do paciente com AHAI e deve utilizar teacutecnicas que
auxiliem na escolha do melhor hemocomponente melhorando a seguranccedila transfusional Essas
teacutecnicas visam remover a interferecircncia do autoanticorpo livre no soro e do autoanticorpo
ligado agrave hemaacutecia permitindo a detecccedilatildeo de aloanticorpos associados e a realizaccedilatildeo da
fenotipagem eritrocitaacuteria respectivamente
A finalizaccedilatildeo dos testes preacute-tranfusionais na presenccedila de autoanticorpo pode levar
algumas horas e nem sempre o paciente poderaacute aguardar Nesse contexto torna-se vantajosa a
aplicaccedilatildeo de teacutecnicas de raacutepida execuccedilatildeo
O presente estudo propotildee aplicar e avaliar a eficaacutecia da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
em remover os anticorpos ligados agrave hemaacutecia o que permite a fenotipagem eritrocitaacuteria
estendida e a seleccedilatildeo de concentrados de hemaacutecias com mesmo fenoacutetipo do paciente
Atualmente no Hemocentro de Ribeiratildeo Preto a teacutecnica utilizada para esse fim eacute o
tratamento das hemaacutecias com difosfato de cloroquina cujo tempo de execuccedilatildeo pode demorar
ateacute duas horas enquanto a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser realizada em apenas dois
minutos o que a tornaria opccedilatildeo de escolha especialmente em situaccedilotildees de urgecircncia Ao
contraacuterio da cloroquina a glicina-aacutecidaEDTA permite tambeacutem o estudo do eluato das
hemaacutecias tratadas
22
4 METODOL OGIA
41 AMOSTRAS DE DOADORES
Foram coletados 50 amostras de doadores de sangue que compareceram ao
Hemonuacutecleo de Araccedilatuba no periacuteodo de junho a agosto de 2016 Foram convidados a
participar da pesquisa doadores de repeticcedilatildeo do tipo sanguiacuteneo ldquoOrdquo RhD positivo
cadastrados no sistema de banco de sangue (SBS) do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto
Todos os doadores que concordaram em participar da pesquisa assinaram o termo de
consentimento livre e esclarecido (TCLE)
No momento da doaccedilatildeo foram coletados adicionalmente 5 mL de sangue total em
soluccedilatildeo anticoagulante EDTA (aacutecido dietilenoaminoaceacutetico) dispensando punccedilatildeo venosa
adicional para coleta da amostra O fluxograma 1 resume as etapas desenvolvidas no projeto
Fluxograma 1 - Fluxo da pesquisa utilizando as amostras de doadores
23
411 FENOTIPAGEM
Foram verificados se os doadores jaacute tinham fenotipagem para outros sistemas de
grupos sanguiacuteneos aleacutem do sistema ABORh que eacute realizado rotineiramente
A fenotipagem eritrocitaacuteria para outros sistemas ou fenotipagem estendida eacute realizada
para identificar a presenccedila ou ausecircncia de antiacutegenos considerados de importacircncia cliacutenica No
Hemonuacutecleo de Araccedilatuba uma parcela de doadores de repeticcedilatildeo satildeo fenotipados para os
antiacutegenos dos sistemas de grupo sanguiacuteneo Rh (antiacutegenos C c E e e) Kell (antiacutegeno K)
Duffy (antiacutegenos Fya e Fy
b) Kidd (antiacutegenos Jk
a e Jk
b) e sistema MNSs (antiacutegenos S e s)
A fenotipagem para o Rh e Kell eacute realizada por metodologia de microplaca utilizando
25 microL de hemaacutecia lavada e diluiacuteda a 5 em salina e 25 microL do antissoro comercial especiacutefico
A reaccedilatildeo eacute incubada 15 minutos a temperatura ambiente e centrifugadas para leitura Para os
antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s a metolodogia utilizado eacute gel contendo antiglobulina
humana (gel LissCoombs poliespeciacutefico) da marca BIO-RAD onde se utiliza suspensatildeo de
hemaacutecia em LISS (Soluccedilatildeo de baixa forccedila iocircnica) A suspensatildeo eacute preparada atraveacutes da
diluiccedilatildeo de 10 microL de hemaacutecia em 1000 microL de LISS Pipetado 50 microL dessa diluiccedilatildeo no gel e
adicionado 25 microL do antissoro especiacutefico Incuba-se em banho seco por 15 minutos a 37 deg
Celsius e eacute centrifugado em centriacutefuga especiacutefica Os antissoros utilizados eram das marcas
Fresenius e Lorne
Foi verificado a fenotipagem do doador no banco de dados do Hemocentro Os
registros dos fenoacutetipos dos doadores ficam armazenadas no sistema de banco de sangue
(SBS) Para doadores que natildeo tinham fenotipagem estendida preacutevia para antiacutegenos do sistema
Rh (C c E e e) e Kell (K) foi realizada a fenotipagem para esses antiacutegenos
O tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA e cloroquina para dissociar
anticorpos pode inativar enfraquecer ou destruir os antiacutegenos presentes nas hemaacutecias
alterando assim os resultados da fenotipagem Para verificar se houve destruiccedilatildeo dos
antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a e Jk
b S e s nas amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes
tratamento foram novamente fenotipadas ao final para os antiacutegenos que eram inicialmente
positivas
A repeticcedilatildeo da fenotipagem foi realizada nas amostras que apresentaram efetividade
no tratamento da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eou da cloroquina e a detecccedilatildeo do antiacutegeno
na amostra preacute-tratamento
24
412 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS HEMAacuteCIAS
As hemaacutecias foram sensibilizadas com antissoros policlonais humanos de amostras de
plasma fresco congelado de doadores com resultado de pesquisa de anticorpo irregular
positivos
A escolha do anticorpo para sensibilizar as hemaacutecias foi definida de acordo com o
fenoacutetipo do doador que deveria ser positivo para o respectivo antiacutegeno
Para a sensibilizaccedilatildeo um volume de antissoro (1 mL) e um volume (1 mL) de
hemaacutecias lavadas quatro vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica foram adicionadas a um tubo de 12 x
75 mm A mistura foi homogeneizada e incubada em banho maria (BM) a 37deg C por 60
minutos A seguir as hemaacutecias foram novamente lavadas 4 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica
para retirada dos anticorpos que natildeo se ligaram A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada
como controle negativo O teste da uacuteltima lavagem eacute importante para assegurar que os
anticorpos que poderatildeo ser detectados no eluato apoacutes o tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA
sejam aqueles que estavam ligados agraves hemaacutecias e natildeo aqueles livres no plasma O controle
negativo mostra que todo o anticorpo livre foi retirado (LEGER 2011)
Para o teste de presenccedila de anticorpo na soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foram incubadas
com hemaacutecias de triagem de anticorpos irregulares (ID-Diacell BIO-RAD) contendo os
antiacutegenos especiacuteficos Realizado a teacutecnica em gel LissCoombs com anti-IgG+C3d Incubado
no tempo de 15 minutos a temperatura de 37deg C e centrifugado 10 minutos em centriacutefuga
proacutepria
As 50 amostras de doadores foram sensibilizadas com os anticorpos policlonais
humanos
Apoacutes sensibilizadas rdquoin vitrordquo e lavadas as hemaacutecias foram diluiacutedas em soluccedilatildeo de
baixa forccedila iocircnica (LISS) na quantidade de 10 microL de hemaacutecia para 1000 microL de soluccedilatildeo A
suspensatildeo foi pipetada (50 microL) em coluna-gel-teste LissCoombs (BIO-RAD) que contecircm
antiglobulina poliespeciacutefico (IgG+C3d) e centrifugada em baixa rotaccedilatildeo conforme orientaccedilatildeo
do fabricante durante 10 minutos
As amostras deveriam apresentar aglutinaccedilatildeo com reatividade 3 a 4+ no TDA As
amostras que apresentaram reaccedilatildeo menor que 3+ foram novamente sensibilizadas com nova
aliacutequota do antissoro
25
413 TRATAMENTO DAS AMOSTRAS
As amostras sensibilizadas apresentando o TDA positivo 3 ou 4+ foram divididas em
duas aliacutequotas e submetidas a duas teacutecnicas diferentes com o objetivo de dissociar o anticorpo
ligado Uma aliacutequota da amostra foi tratada com soluccedilatildeo de difosfato de cloroquina enquanto
a outra aliacutequota foi tratada com glicina-aacutecidaEDTA
42 PREPARO DA GLICINA AacuteCIDA-EDTA
A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA utiliza 3 soluccedilotildees diferentes a glicina aacutecida o
EDTA e o tampatildeo TRIS
Os reagentes foram preparados utilizando os sais para anaacutelise (PA) de EDTA
(Na2EDTA2H2O) TRIS (C4H11NO3) Glicina (H2NCH2CO2H) NaCl e a soluccedilatildeo de aacutecido
cloriacutedrico (HCl) 12 N todos reagentes da marca SYNTH (quadro 1)
Para o preparo do tampatildeo glicina-acida eacute necessaacuterio o ajuste do pH para 15 Para esse
ajuste utiliza-se aacutecido cloriacutedrico (HCl) concentrado O pH foi medido com fitas reativas de pH
com escala de 1 a 14 da marca MERCK Posteriormente a soluccedilatildeo foi enviada ao laboratoacuterio
de controle de qualidade do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto e o pH medido no peagacircmetro O
tampatildeo glicina-aacutecida foi armazenado a 4deg e o tampatildeo tris e o EDTA em temperatura ambiente
controlada (20 a 24deg Celsius)
Apoacutes o preparo e durante a realizaccedilatildeo dos testes foram feitas inspeccedilotildees visuais para
verificaccedilatildeo de turvaccedilatildeo do meio e presenccedila de precipitados
Reagente Material Quantidade Preparo e
Conservaccedilatildeo
EDTA
EDTA
(Na2EDTA2H2O)
5 gramas Mistura ateacute
dissoluccedilatildeo do sal e
conserva em
temperatura ambiente Aacutegua Destilada 50 Ml
Tris
TRIS (C4H11NO3) 121 gramas Conservar em
temperatura ambiente NaCl 525g
Aacutegua destilada 100ml
Gliacutecina-aacutecida
Glicina
(H2NCH2CO2H) 15 gramas
Conservar a 4oC NaCl 116gramas
Aacutegua Destilada 200ml
HCL 12N Ajutar o pH para 15
Quadro 1 - Preparo dos Reagentes da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
Fonte - Manual teacutecnico AABB 2011
26
O tampatildeo glicina-aacutecida e o tampatildeo TRIS satildeo estaacuteveis por 7 meses O reagente EDTA
precipitou mesmo estando em temperatura em ambiente controlado Houve necessidade de
preparo de novo reagente
421 TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
1 Em um tubo de ensaio 12x75 mm eacute adicionado 08 mL da soluccedilatildeo de glicina-aacutecida A
esta soluccedilatildeo adiciona-se 02 mL de EDTA e mistura
2 Adiciona-se 02 mL de hemaacutecias sensibilizadas (lavada 4 vezes) A mistura eacute
homogeneizada e incubada por exatamente 2 minutos
3 A seguir 01 mL de tampatildeo TRIS eacute adicionado agrave mistura que eacute novamente
homogeneizada e centrifugada por 2 minutos a 3400 rpm O pH deve estar entre 7 a 75
4 Apoacutes centrifugaccedilatildeo separa-se em outro tubo o sobrenadante (eluato) e as hemaacutecias
que permanecem satildeo lavadas 4 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica para retirada de todo o
reagente e anticorpos livres
43 PREPARO DA CLOROQUINA
A cloroquina eacute diluiacuteda em tampatildeo PBS na concentraccedilatildeo de 20 (Quadro 2) e
armazenado a 4deg Celsius sua validade apoacutes o preparo eacute de 1 mecircs
A teacutecnica da cloroquina jaacute estaacute padronizada para rotina do laboratoacuterio de
imunohematologia do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto e suas unidades
Reagente Reagentes Quantidade PreparoConservaccedilatildeo
Cloroquina
Difosfato de cloroquina
(C18H32ClN3O8P2)
20 gramas
Conservar a 4deg Celsius
Tampatildeo PBS 100ml
NaOH 01 N Acertar o pH para
51
Quadro 2 - Preparo da Cloroquina Fonte - Manual teacutecnico da AABB 2011
431 TEacuteCNICA DA CLOROQUINA
1 4 partes da soluccedilatildeo pronta eacute adicionada a uma parte de hemaacutecias lavadas 4 vezes com
soluccedilatildeo fisioloacutegica
2 A mistura eacute incubada em temperatura ambiente por ateacute duas horas
3 Centrifugar a 3400 rpm por 2 minutos
27
4 Remover o sobrenadante lavar as hemaacutecias novamente com soluccedilatildeo fisioloacutegica 4
vezes
44 VERIFICACcedilAtildeO DA EFETIVIDADE DOS TESTES
Apoacutes tratamento pelas duas teacutecnicas o TDA foi repetido em todas as amostras para
verificar se os tratamentos foram efetivos e houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo Para as
amostras tratadas pela teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA que permaneceram com TDA positivo
novo tratamento foi realizado
45 TESTE DO ELUATO
O eluato resultante das amostras tratadas com glicina-acidaEDTA foi testado com
hemaacutecias de triagem A soluccedilatildeo do eluato foi incubada com as hemaacutecias de triagem de
anticorpos (ID-Diacell BIO-RAD) pela teacutecnica em gel LissCoombs O teste foi incubado 15
minutos a 37deg Celsius e centrifugado por 10 minutos em centrifuga proacutepria para a teacutecnica em
gel Os eluatos que apresentaram resultados positivos foram testados em painel de 11
hemaacutecias (ID-Diapanel BIO-RAD) para a identificaccedilatildeo do anticorpo
46 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente que apresentou TDA positivo por IgG e pesquisa
de anticorpo irregular positivo com presenccedila de autoanticorpo com reatividade panaglutinina
A amostra foi tratada em paralelo pelas duas teacutecnicas descritas e foi enviada para o
Hemocentro para genotipagem eritrocitaacuteria que foi realizado por metodologia PCR em tempo
real no equipamento Real-time system PCR 7500 ( Applied Biosystems Califoacuternia EUA)
28
5 RESULTADOS
51 REAGENTES
Para aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA satildeo necessaacuterios 3 diferentes
reagentes que podem ser encontrados em forma de kit pronto para uso No entanto esses kits
natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil Os reagentes satildeo tampatildeo glicina-aacutecida o EDTA e o tampatildeo
Tris
Todos os reagentes foram preparados rdquoin houserdquo a partir dos sais e soluccedilotildees PA (puro
para anaacutelise) da marca SYNTH que foram adquiridos para a pesquisa O custo estimado para
cada teste foi aproximadamente R$ 020 reais
Apoacutes o preparo os reagentes poderiam ser armazenados em condiccedilotildees adequadas pelo
periacuteodo de 1 ano (AABB 2011) Ao final do preparo e durante o periacuteodo de armazenamento
de fevereiro a setembro de 2016 foi realizada inspeccedilatildeo visual para verificar a presenccedila de
precipitados ou turvaccedilatildeo A soluccedilatildeo de glicina e o tampatildeo TRIS mostraram-se estaacuteveis ateacute o
final do periacuteodo Por sua vez o reagente EDTA precipitou mesmo estando armazenado em
temperatura ambiente controlada e foi necessaacuterio novo preparo
52 AMOSTRAS DE DOADORES
521 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS AMOSTRAS
Apoacutes incubaccedilatildeo da hemaacutecia com o antissoro a mesma foi lavada 4 vezes para retirada
dos anticorpos livres A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada Caso houvesse positividade na
soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem a etapa era repetida (figura 3) Das 50 amostras sensibilizadas a
uacuteltima lavagem foi positiva somente em 3 delas Nas 3 amostras o anticorpo utilizado para
sensibilizaccedilatildeo foi o anti-K Apoacutes repetido nova etapa de lavagem os resultados se
apresentaram negativos
Em todas as amostras sensibilizadas ldquoin vitrordquo o TDA foi testado e verificado a
intensidade do teste Entre as 50 amostras 47 alcanccedilaram TDA com intensidade 3-4+ apoacutes a
primeira sensibilizaccedilatildeo enquanto 3 amostras necessitaram uma segunda incubaccedilatildeo com
anticorpo (figura 4)
A escolha dos anticorpos para sensibilizar as hemaacutecias foi feita de acordo com o
fenoacutetipo do doador e foram utilizados sete diferentes especificidades de anticorpos policlonais
humanos conforme mostra o graacutefico1
29
Figura 3 - Soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada com hemaacutecia de triagem de
anticorpos em gel LissCoombs (BIO-RAD) A finalidade eacute verificar a presenccedila de anticorpos livres na
suspensatildeo que possam interferir na pesquisa do eluato As soluccedilotildees de lavagem das amostras na figura a tiveram
resultados negativos Na figura b duas amostras a 47 e 50 apresentaram resultado positivo Nova etapa de
lavagem foi realizada e o resultado final foi negativo
522 TRATAMENTO DAS HEMAacuteCIAS
Apoacutes a sensibilizaccedilatildeo e obtenccedilatildeo de resultados de TDA com intensidade de 3 a 4+
cada uma das amostras foi dividida em duas aliacutequotas e tratada separadamente pelas teacutecnicas
de glicinaaacutecida-EDTA e cloroquina
As teacutecnicas foram consideradas efetivas quando obteve-se a completa dissociaccedilatildeo do
anticorpo verificada atraveacutes do TDA negativo na amostra poacutes tratamento conforme figuras 5
e 6 Dentre as amostras tratadas com cloroquina 2850 tiveram o TDA negativado A glicina-
aacutecidaEDTA negativou o TDA em 33 das 50 amostras tratadas Apenas 17 amostras tratadas
com glicina-aacutecidaEDTA permaneceram com o TDA positivo e foram submetidas a um novo
tratamento
30
Figura 4 - TDA das amostras apoacutes sensibilizaccedilatildeo com anticorpos policlonais humanos Amostras na
figura a com intensidades de 3-4+ Na figura b amostras 4 e 7 com intensidade menor que 3+ e portanto foram
novamente sensibilizadas com nova aliacutequota de soro Anti-D e anti-S Apoacutes a segunda sensibilizaccedilatildeo
apresentaram reatividade 4 e 3+ respectivamente Os anticorpos utilizados para sensibilizaccedilatildeo foram D S c E
C e K
523 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS TEacuteCNICAS
No tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA houve dissociaccedilatildeo completa do anticorpo
em 33 amostras (66) das 50 amostras testadas enquanto que com a cloroquina foram 28
amostras (56) (tabela 1)
31
Graacutefico 1- Nuacutemero de amostras sesnsibilizadas por especificidade de anticorpo Entre as 50 amostras 12
foram sensibilizadas com anti-D 10 com anti-C 9 com anti-E 8 com anti-c 7 com anti-S 3 com anti-K e 1
com anti-Dia As especificidades dos anticorpos foram definidas de acordo o fenoacutetipo do doador
Figura 5 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com cloroquina Nas amostras onde houve
a dissociaccedilatildeo do anticorpo ( 2 21 a 23 26 39 a 42 45 46 e 49) a hemaacutecia se deposita no fundo no microtubo
apoacutes a centrifugaccedilatildeo (TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (1 3 24 25 43 44 47
48 e 50) o anticorpo ligado agraves hemaacutecias eacute alvo da AGH presente no gel (TDA positivo)
Anti-D 12
Anti-C 10
Anti-E 9
Anti-c 8
Anti-S 7
Anti-K 3 Anti-Dia 1
32
Figura 6 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA Nas amostras
onde houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo (4 6 7 12 a 15 17 34 35 37 e 38) a hemaacutecia se deposita no fundo no
microtubo apoacutes a centrifugaccedilatildeo ( TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (5 16 18
19 20 33 e 36 ) o AGH presente no gel se liga ao anticorpo ligado agraves hemaacutecias que ficam retidas no gel (TDA
positivo)
Tabela 1-Resultado geral do tratamento das hemaacutecias com glicina e cloroquina
Teacutecnica utilizada TDA negativo TDA positivo Total
Glicina-aacutecidaEDTA 33 17 50
Cloroquina 28 22 50
A glicina-aacutecidaEDTA conseguiu negativar mais amostras sensibilizadas com Anti-D
e anti-K que a cloroquina Para as hemaacutecias sensibilizadas com anti-E Anti-S e Anti-Dia
ambas as teacutecnicas dissociaram o anticorpo em 100 das amostras Os resultados detalhados
por especificidade do anticorpo apoacutes o primeiro tratamento com glicina-aacutecidaEDTA e com
cloroquina estatildeo na tabela 2
Para as amostras que permaneceram positivas (17 amostras) apoacutes o tratamento com a
glicina-aacutecidaEDTA foi realizado um novo tratamento Houve dissociaccedilatildeo do anticorpo em 3
amostras (18) apoacutes a segunda tentativa Nas demais 14 (82) amostras tratadas pela
segunda vez 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise
33
Tabela 2 - Resultados do TDA apoacutes tratamento das hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo
sensibilizado
ANTICORPOS
SENSIBILIZADOS
1ordm TRATAMENTO COM
GLICINA
TRATAMENTO COM
CLOROQUINA
TOTAL TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
Anti-D 8 4 0 12 12
Anti-C 6 4 10 0 10
Anti-E 9 0 9 0 9
Anti-c 0 8 1 7 8
Anti-S 7 0 7 0 7
Anti-K 2 1 0 3 3
Anti-Dia 1 0 1 0 1
TOTAL 33 17 28 22 50
A hemoacutelise foi verificada durante o procedimento de lavagem final das hemaacutecias com
soluccedilatildeo fisioloacutegica para a retirada dos reagentes As soluccedilotildees de lavagem ficaram
avermelhadas e as hemaacutecias com coloraccedilatildeo escura As amostras foram descartadas Dentre as
6 amostras que ainda puderam ser testadas para o TDA trecircs amostras negativaram sendo 1
sensibilizada com anti-D e 2 com anti-C (tabela 3)
Tabela 3 - Resultado apoacutes o segundo tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA
Tratamento com
glicina-aacutecidaEDTA
TDA Negativo TDA Positvo Hemoacutelise Total
Segundo tratamento 3 3 11 17
524 TESTAGEM DO ELUATO
Apoacutes o tratamento com a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA a soluccedilatildeo do eluato foi
testada para verificar a viabilidade dos anticorpos que foram dissociados ou eluiacutedos Dentre
as 50 amostras 41 apresentaram eluato positivo As nove amostras cujos eluatos foram
negativos haviam sido sensibilizadas com as seguintes especificidades de anticorpos anti-E 6
amostras (67) anti-S 2 amostras (40) e anti-D 1 amostra (8) (tabela 4) O eluato de
todas as amostras sensibilizadas com os anticorpos anti-C anti-c Anti-K e Anti-Dia foram
positivos Os eluatos positivos na triagem de anticorpos foram testados com paineacuteis de
identificaccedilatildeo para confirmar a especificidade e a viabilidade dos anticorpos (figuras 7 e 8)
34
525 EFEITO DA ELUICcedilAtildeO SOBRE OS ANTIacuteGENOS ERITROCITAacuteRIOS
Para verificar o efeito do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA e com a cloroquina
sobre a expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s foi realizada a fenotipagem das
amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes tratamento com ambas as teacutecnicas Foi avaliado
se o tratamento destruiu os antiacutegenos expressos antes do tratamento
Tabela 4- Resultado do Eluato das amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA
Anticorpos Eluato positvo Eluato negativo Total
Anti-D 11 1 12
Anti-C 10 0 10
Anti-E 3 6 9
Anti-c 8 0 8
Anti-S 5 2 7
Anti-K 3 0 3
Anti-Dia 1 0 1
Total 41 9 50
Figura 7 ndash Painel do eluato da amostra 21 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-C que foi
recuperado no eluato
Figura 8 ndash Painel do eluato da amostra 47 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-K que foi
recuperado no eluato
35
Dentre as 50 amostras 26 eram previamente fenotipadas para os antiacutegenos Fya Fy
b
Jka Jk
b S e s Dentre elas 20 alcanccedilaram TDA negativo apoacutes tratamento com a glicina-
aacutecidaEDTA e 20 negativaram apoacutes tratamento com cloroquina (tabela 5) Apoacutes ambas as
teacutecnicas os antiacutegenos originalmente expressos permaneceram positivos comprovando que natildeo
houve destruiccedilatildeo dos mesmos
Tabela 5 ndash Verificaccedilatildeo da interferecircncia do tratamento da hemaacutecias com cloroquina e glicina-
aacuteicdaEDTA sobre os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
AMOSTRAS
COM
FENOTIPAGEM
PREacuteVIA
TRATADAS COM
CLOROQUINA
TRATADAS COM
GLICINA
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
26
20
20
20
20
As amostras 24 47 e 50 eram positivas para o antiacutegeno K A cloroquina natildeo dissociou
o anticorpo em nenhuma das 3 amostras enquanto a glicina-aacutecidaEDTA foi efetiva nas
amostras 24 e 50 Foi testada a expressatildeo do antiacutegeno K nas amostras 24 e 50 apoacutes o
tratamento utilizando meacutetodo indireto em gel contendo AGH Apesar de natildeo ter sido avaliado
a intensidade de reaccedilatildeo de expressatildeo dos antiacutegenos podemos verificar na figura 9 que nas
duas amostras em que a teacutecnica foi efetiva e dissociou o anticorpo a expressatildeo do antiacutegeno K
continua presente mas a reatividade observada pode ser considerada 1+ sugerindo que houve
diminuiccedilatildeo da expressatildeo do antiacutegeno quando comparado com a expressatildeo observada em
hemaacutecia natildeo tratada
Os resultados individuais de cada amostra em ambas as teacutecnicas encontram-se
resumidas na tabela 6
526 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente onde foi constatada a presenccedila de autoanticorpo
a quente da classe IgG pelo TDA monoespeciacutefico (figura 10)O autoanticorpo tambeacutem
interferia na pesquisa e identificaccedilatildeo de anticorpos irregulares pois apresentava caracteriacutestica
de panaglutinina As hemaacutecias da paciente sensibilizadas ldquoin vivordquo foram tratadas com
cloroquina e com glicina-aacutecidaEDTA
36
Figura 9 ndash Fenotipagem das amostras 24 e 50 para antiacutegeno K apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
O teste positivo indica a presenccedila do antiacutegeno poreacutem a reatividade fraca (1+) sugere que houve enfraquecimento
de sua expressatildeo A direita a expressatildeo forte (4+) do antiacutegeno Kell em hemaacutecia controle natildeo tratada utilizada
como controle positivo
A cloroquina natildeo foi efetiva na retirada do anticorpo ligado as hemaacutecias ao contraacuterio
do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA que dissociou o anticorpo (figura 11)
A hemaacutecia tratada com glicina foi fenotipada para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
(figura 12) A fenotipagem para o sistema Rh (C c E e e) e Kell foi realizada em gel
especiacutefico monoclonal sem interferecircncia do TDA positivo (controle da reaccedilatildeo negativo)
O eluato resultante do tratamento com glicina-aacutecidaEDTA foi testada em gel com
hemaacutecias de painel de identificaccedilatildeo de anticorpos e apresentou resultado positivo com todas
as ceacutelulas (figura 13 e 14)
A amostra foi enviada para genotipagem e o resultado da genotipagem confirmou o
resultado da fenotipagem apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
527 TEMPO DE EXECUCcedilAtildeO DA TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
O tempo de reaccedilatildeo da glicina-aacutecidaEDTA eacute de 2 minutos Todas as amostras foram
tratadas obedecendo ao tempo descrito na literatura demonstrando que o mesmo eacute
reprodutiacutevel
37
Tabela 6- Resultados individuais por amostra
Amostra Especificidade
dos anticorpos
Intensidade do
TDA apoacutes
sensibilizaccedilatildeo
Tratamento
efetivo com
cloroquina
Tratamento
efetivo com
glicina
Eluato
poacutes
glicina
1 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 2 Dia 3+ Sim Sim 3+ 3 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 4 D 4+ Natildeo Sim 4+ 5 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 6 E 3+ Sim Sim Negativo 7 S 4+ Sim Sim 3+ 8 E 3+ Sim Sim 1+ 9 E 3+ Sim Sim 2+
10 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 11 D 4+ Natildeo Sim 4+ 12 D 4+ Natildeo Sim 4+ 13 S 3+ Sim Sim 3+ 14 S 3+ Sim Sim 3+ 15 D 3+ Natildeo Sim 3+ 16 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 17 E 3+ Sim Sim (+) 18 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 19 D 4+ Natildeo Natildeo 3+ 20 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 21 C 3+ Sim Sim 4+ 22 C 3+ Sim Sim 4+ 23 C 3+ Sim Sim 4+ 24 K 4+ Natildeo Sim 4+ 25 D 3+ Natildeo Natildeo Negativo 26 E 4+ Sim Sim Negativo 27 S 3+ Sim Sim 3+ 28 C 3+ Sim Natildeo 4+ 29 C 3+ Sim Sim 4+ 30 C 3+ Sim Sim 4+ 31 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 32 E 3+ Sim Sim Negativo 33 C 3+ Sim Natildeo 4+ 34 S 3+ Sim Sim Negativo 35 S 3+ Sim Sim Negativo 36 C 4+ Sim Natildeo 4+ 37 c 4+ Natildeo Natildeo 4+ 38 D 4+ Natildeo Sim 4+ 39 S 3+ Sim Sim 3+ 40 c 4+ Sim Natildeo 2+ 41 C 4+ Sim Natildeo 4+ 42 E 3+ Sim Sim Negativo 43 D 3+ Natildeo Sim 2+ 44 D 3+ Natildeo Sim 2+ 45 E 3+ Sim Sim Negativo 46 C 3+ Sim Sim 4+ 47 K 4+ Natildeo Natildeo 4+ 48 D 3+ Natildeo Sim 2+ 49 E 3+ Sim Sim Negativo 50 K 4+ Natildeo Sim 4+
TOTAL 50 28 33 41
38
Figura 10 ndash TDA monoespeciacutefico da amostra de paciente Hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo da classe
IgG
oacute Figura 11 ndash TDA apoacutes o tratamento com glicina-aacutecidaEDTA (esquerda) e cloroquina (direita) A glicina
negativou completamente o TDA enquanto a hemaacutecia tratada com cloroquina persistiu positiva (1+)
39
Figura 12 ndash Fenotipagem da amostra tratada com glicina-aacutecidaEDTA Fy(a+b+) Jk(a-b+) S+s+
Figura 13 ndash Painel em gel (LissAGH) do eluato apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de
intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
Figura 14 ndash ndash Painel ezimaacutetico (hemaacutecias tratadas com bromelina) do eluato em gel neutro apoacutes
tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
40
528 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Quanto a efetividade das teacutecnicas em negativar o TDA foi verificado que a glicina-
aacutecidaEDTA foi efetiva em 66 das amostras testadas no primeiro tratamento (3350
amostras) enquanto a cloroquina conseguiu negativar 56 (2850) Esses resultados natildeo
apresentam diferenccedila significativa (pgt005) demostrando que a teacutecnica da glicina-
aacutecidaEDTA natildeo eacute superior mas eacute tatildeo efetiva quanto a da cloroquina
Quando aliamos os resultados de ambas as teacutecnicas verificamos que em 76 (3850)
das amostras o TDA foi negativado Esse dado indica que ainda que uma teacutecnica natildeo seja
eficaz na remoccedilatildeo do anticorpo eacute uma boa alternativa tentar a segunda teacutecnica jaacute que a falha
em remover o anticorpo utilizando uma delas natildeo prevecirc necessariamente a falha com a outra
Quando se utiliza o teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla (graacutefico 2) para comparar a utilizaccedilatildeo das
duas teacutecnicas com o resultado de cada uma isolada (somente a cloroquina ou somente a
glicina) verificamos que os resultados apresentam diferenccedila significativa (plt005) (quadro 3)
TRATAMENTO EFETIVO COM TOTAL PORCENTAGEM
Glicina ou cloroquina 38 76
Glicina e cloroquina 23 46
Glicina apenas 10 20
Cloroquina apenas 5 10
Nenhuma das teacutecnicas 12 24
Quadro 3 - Resultados comparativos entre as teacutecnicas utilizadas
41
Graacutefico 2 - Teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla entre as teacutecnicas aplicadas A- Glicina e Cloroquina B-Cloroquina C-
Glicina ( plt005)
42
6 DISCUSSAtildeO
Os reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA podem ser adquiridos em
forma de kit comercial prontos para uso poreacutem natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil A preparaccedilatildeo
dos reagentes ldquoin houserdquo a partir de sais comerciais adquiridos se mostrou viaacutevel Os
reagentes glicina e o tampatildeo Tris armazenados de forma correta se mantiveram estaacuteveis por
um periacuteodo de 7 meses Somente o reagente EDTA precipitou mesmo armazenado em
condiccedilotildees adequadas sugerindo que o mesmo deve ser preparado em menor quantidade e
armazenado em aliacutequotas A soluccedilatildeo de cloroquina tambeacutem pode ser preparada ldquoin houserdquo e
pode ser armazenado por um mecircs A legislaccedilatildeo brasileira autoriza a utilizaccedilatildeo de reagentes
preparados a partir de sais comerciais como a cloroquina e a glicina-aacutecidaEDTA desde que
os sais tenham autorizaccedilatildeo da vigilacircncia sanitaacuteria para a comercializaccedilatildeo (BRASIL 2001)
A comparaccedilatildeo quanto a efetividade em dissociar anticorpos em amostras com TDA
positivos entre a teacutecnica da glicina e a teacutecnica da cloroquina mostrou que natildeo haacute diferenccedila
estatiacutestica entre elas e que ambas satildeo igualmente eficientes Se utilizadas conjuntamente haacute
maior possibilidade de elucidaccedilatildeo dos casos
Uma vantagem da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eacute que ela permite numa mesma
amostra eluir o anticorpo ligado aacute hemaacutecia assim como fenotipar a hemaacutecia tratada Devido a
sua dupla utilidade a teacutecnica eacute vantajosa principalmente em pacientes em que pouco volume
de amostra pode ser coletado como em casos de crianccedilas e receacutem-nascidos
A fenotipagem poacutes tratamento se mostrou viaacutevel jaacute que os antiacutegenos de maior
importacircncia natildeo sofreram alteraccedilotildees Nas 20 amostras que foram fenotipadas antes e apoacutes
tratamento para verificar a influecircncia dos reagentes na expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a
Jkb S e s natildeo houve destruiccedilatildeo dos mesmos por nenhuma das duas teacutecnicas
Para as amostras positivas para o antiacutegeno Kell (350) e sensibilizadas com o
respectivo anticorpo a teacutecnica da glicina foi efetiva em negativar o TDA em apenas duas
delas mas apoacutes o tratamento foi verificada uma fraca reatividade da reaccedilatildeo antiacutegeno-
anticorpo sugerindo que houve um enfraquecimento da expressatildeo do antiacutegeno conforme
esperado e descrito na literatura (BYRNE 1991 PALLAS WILER E MCGEE 1991
ROZIERS e SQUALI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012 e KATHARIA e
CHAUDHARY 2013) A accedilatildeo da glicina sobre o antigeno Kell natildeo representa impedimento
para seu uso uma vez que na impossibilidade de testar o antiacutegeno Kell o banco de sangue
consegue facilmente atender a solicitaccedilatildeo de transfusatildeo com unidades de hemaacutecias Kell
43
negativas jaacute que eacute um antiacutegeno de baixa prevalecircncia na populaccedilatildeo variando de 15 na
populaccedilatildeo africana a 9 nos europeus (DANIELS 2011)
A soluccedilatildeo resultante da dissociaccedilatildeo do anticorpo pela teacutecnica da glicina pode ainda ser
utilizada como eluato podendo substituir a teacutecnica de eluiccedilatildeo com reagentes comercias (kits
de eluiccedilatildeo aacutecida) que tem alto custo aproximadamente entre R$2000 a R$2500 por teste
Em 41 amostras (82) houve a dissociaccedilatildeo e recuperaccedilatildeo do anticorpo que estava
sensibilizando as hemaacutecias Em 9 amostras (18) os anticorpos foram eluiacutedos poreacutem
apresentaram reaccedilatildeo negativa quando testadas com hemaacutecias de triagem entre eles o anti-E
(6) anti-S (2) e Anti-D (1) Eacute possiacutevel que a correccedilatildeo pH do meio (WALKER 2011) natildeo
tenha sido adequada o que pode ter desfavorecido a reatividade do anticorpo
Para as amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA nas quais natildeo houve dissociaccedilatildeo do
anticorpo pelo primeiro tratamento (1750) o segundo tratamento natildeo se mostrou eficaz jaacute
que 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise O tempo de
armazenagem natildeo parece ter influenciado jaacute que todas as amostras foram testadas dentro de
48 horas apoacutes a coleta Outros fatores que natildeo foram verificados podem ter levado a
hemoacutelise Apesar da literatura (LOUIE JIENG e ZEROULIS 1986 e BYRNE 1991)
recomendar um segundo tratamento ele eacute pouco eficaz tendo negativado apenas 3 das 17
amostras testadas
A amostra de paciente que apresentou sensibilizaccedilatildeo ldquoin vivordquo mostrou melhor
efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA sobre a da cloroquina possibilitando
fenotipagem para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s que natildeo foram destruiacutedos apoacutes o
tratamento comprovado atraveacutes da genotipagem
A presenccedila de autoanticorpo a quente com presenccedila de hemoacutelise (AHAI) ou natildeo pode
mascarar a presenccedila de aloanticorpo interferindo na rotina soroloacutegica da fenotipagem que eacute
uma importante ferramenta para auxiliar na seleccedilatildeo de hemaacutecias para transfusatildeo (SHIREY et
al 2002) Esses pacientes frequentemente possuem aloanticorpos associados ao
autoanticorpo e a prevalecircncia de aloimunizaccedilatildeo entre eles varia entre 12 a 40 (LEGER e
GARRATY 1999 BRANCH e PETZ 1999) o que dificulta ainda mais a escolha do melhor
componente a ser transfundido aleacutem de aumentar a possibilidade reaccedilotildees hemoliacuteticas imunes
poacutes-transfusionais
Nesses casos as teacutecnicas de dissociaccedilatildeo de anticorpos satildeo importantes para tratar
amostras de pacientes e a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser usada como uma opccedilatildeo
pois se mostrou eficaz na dissociaccedilatildeo anticorpo ligado agraves hemaacutecias deixando livre a
superfiacutecie das mesmas permitindo a fenotipagem por antisoros IgG Paralelamente os
44
anticorpos eluiacutedos tambeacutem puderam ser estudados O mesmo natildeo ocorre com a cloroquina
que permite apenas a fenotipagem e tampouco com os kits de eluiccedilatildeo aacutecida disponiacuteveis no
mercado nacional que satildeo destinados a realizaccedilatildeo do eluato mas destroem as hemaacutecias
O tempo de tratamento na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA tambeacutem eacute uma vantagem
pois foi possiacutevel reproduzir no tempo determinado de 2 minutos enquanto a cloroquina
demora ateacute duas horas
Ainda que a aplicaccedilatildeo das teacutecnicas por biologia molecular estejam cada vez mais
presentes na rotina imuno-hematoloacutegica e possibilitam estabelecer o fenoacutetipo deduzido do
genoacutetipo elas natildeo estatildeo disponiacuteveis na maioria dos centros e sua realizaccedilatildeo exige algumas
horas A resoluccedilatildeo imediata do problema transfusional necessita dos resultados soroloacutegicos
pois com frequecircncia natildeo eacute possiacutevel aguardar o resultado do teste molecular Dessa forma
apesar da crescente importacircncia da genotipagem eritrocitaacuteria teacutecnicas soroloacutegicas aplicadas
corretamente e no momento propiacutecio satildeo de grande utilidade para resolver problemas imuno-
hematoloacutegicos como ocorre com a fenotipagem em pacientes com TDA positivo
45
7 CONCLUSAtildeO
A teacutecnica da glicina aacutecidaEDTA mostrou-se efetiva em remover os anticorpos que
sensibilizavam as hemaacutecias e pode ser utilizada com seguranccedila antes da fenotipagem
eritrocitaacuteria Por ser uma teacutecnica de raacutepida execuccedilatildeo eacute uma alternativa aplicaacutevel
principalmente em casos urgentes de pacientes que apresentam autoanticorpos
46
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50
9 ANEXOS
51
FUNDACcedilAtildeO HEMOCENTRO DE RIBEIRAtildeO PRETO
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE)
Tiacutetulo da pesquisa Aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina aacutecida-EDTA e avaliaccedilatildeo da
eficaacutecia no tratamento de hemaacutecias com teste direto da antiglobulina positivo
Pesquisadora responsaacutevel Ceacutelia Kazue Abiko
Orientador Prof Dimas Tadeu Covas
Co-orientadora Dra Flaacutevia Leite Souza Santos
Objetivo da pesquisa Vocecirc estaacute sendo convidado a participar de uma pesquisa que tem
como objetivo padronizar uma nova teacutecnica para auxiliar na tipagem sanguiacutenea de pacientes
A tipagem sanguiacutenea pode sofrer interferecircncia da presenccedila de anticorpos ligados aos gloacutebulos
vermelhos do sangue Nessas situaccedilotildees eacute difiacutecil selecionar o melhor sangue para o paciente e
eacute preciso a utilizaccedilatildeo de teacutecnicas adicionais para remover essas interferecircncias
Esta pesquisa tem como objetivo estudar outra teacutecnica para remover esses anticorpos e
comparaacute-la com a teacutecnica atualmente utilizada Para isso precisamos de amostras de pacientes
e doadores voluntaacuterios
Se vocecirc eacute um doador eacute necessaacuterio que vocecirc autorize a coleta de 5 ml (1 tubo) a mais
de seu sangue
Se vocecirc eacute um paciente natildeo haveraacute necessidade de nova amostra pois utilizaremos as
amostras jaacute coletadas para os testes preacute-transfusionais e os resultados encontrados nesta
pesquisa natildeo iratildeo interferir na escolha da (s) bolsa (s) de sangue que vocecirc possa vir a receber
Se vocecirc concordar em participar leia com atenccedilatildeo o texto abaixo e assine as duas vias
rubricando todas as paacuteginas deste termo de consentimento Uma via original assinada e
rubricada por vocecirc e pela pesquisadora ficaraacute com vocecirc
As suas informaccedilotildees seratildeo mantidas em sigilo pela pesquisadora e natildeo haveraacute
armazenamento de material para pesquisas posteriores Os seus dados seratildeo usados apenas
neste estudo e quando o trabalho for publicado seu nome e qualquer outra informaccedilatildeo que
possam identificaacute-lo natildeo seratildeo revelados
Eacute pouco provaacutevel que o que noacutes aprendermos com este estudo tenha um benefiacutecio
direto para vocecirc assim como natildeo poderemos dar nada em troca pela sua participaccedilatildeo na
pesquisa
Nosso objetivo com esta pesquisa eacute que os resultados poderatildeo ser uacuteteis para o
tratamento de pacientes no futuro Os riscos da participaccedilatildeo satildeo miacutenimos Se vocecirc eacute um
doador de sangue a amostra seraacute coletada no momento da doaccedilatildeo natildeo exigindo punccedilatildeo
venosa adicional
52
Eacute seu direito ter acesso aos resultados dos testes da pesquisa Esses resultados natildeo
seratildeo fornecidos automaticamente a vocecirc mas caso vocecirc se interesse em saber o resultado ou
tiver alguma duacutevida sobre a sua participaccedilatildeo neste estudo deveraacute entrar em contato com Ceacutelia
Kazue Abiko pelo telefone (18) 99718-3551
Vocecirc tem total liberdade de optar por natildeo participar da pesquisa Caso aceite
participar poderaacute desistir a qualquer momento ou retirar seu consentimento mesmo apoacutes ter
coletado o sangue Para cancelar sua participaccedilatildeo basta avisar a pesquisadora e os seus dados
seratildeo retirados do projeto
Qualquer duacutevida eacutetica sobre a pesquisa poderaacute entrar em contato com o Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa do Hospital das Cliacutenicas e da Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto
(CAMPUS UNIVERSITAacuteRIO bairro Monte Alegre CEP 14048-900 Ribeiratildeo Preto-SP
Telefone (16) 3602-2228 FAX (16) 3633-1144 e-mail cephcrpuspbr)
Consentimento de participaccedilatildeo
A Consentimento do participante
Li as informaccedilotildees acima sobre o estudo e recebi explicaccedilotildees sobre a participaccedilatildeo no estudo
Portanto dou o meu consentimento para participar do estudo
___________________________________________________________________________
Nome completo
___________________________________________________________________________
Assinatura
___________
Data
__________________________________________________________________________________
Nome completo da pesquisadora
___________________________________________________________________________
Assinatura
_____________
Data
2
Todos os testes que compotildeem a rotina preacute-transfusional usam meacutetodos soroloacutegicos
que envolvem a reaccedilatildeo antiacutegeno x anticorpo Ao testar a presenccedila de um antiacutegeno na
superfiacutecie da hemaacutecia eacute necessaacuterio dispor de um soro com especificidade conhecida para
aquele antiacutegeno Por outro lado testar a presenccedila de um determinado anticorpo no soro ou no
plasma exige o uso de hemaacutecias com perfil antigecircnico conhecido Os testes preacute-transfusionais
incluem tipagem ABO (direta e reversa) tipagem Rh pesquisa de anticorpos irregulares no
sangue do receptor retipagem ABO e Rh do hemocomponente e prova de compatibilidade
entre as hemaacutecias do doador e soro ou plasma do receptor em caso de transfusatildeo de hemaacutecias
ou hemocomponentes que contenham mais de 2 mL de volume eritrocitaacuterio como o
concentrado de granuloacutecitos (BRASIL 2016 GANZELLA 2014 SANTOS 2014)
Aleacutem dos testes regularmente realizados a determinaccedilatildeo do fenoacutetipo para outros
antiacutegenos eritrocitaacuterios do doador e do receptor pode ser indicada A fenotipagem eritrocitaacuteria
determina o perfil antigecircnico para outros antiacutegenos de importacircncia cliacutenica aleacutem do sistema
ABO e do antiacutegeno RhD Ela pode auxiliar a confirmaccedilatildeo de uma especificidade de anticorpo
encontrada no soro do paciente uma vez que espera-se que a sua hemaacutecia natildeo expresse o
antiacutegeno correspondente e simultaneamente eacute utilizada para selecionar um concentrado de
hemaacutecias negativo para o respectivo antiacutegeno evitando reaccedilotildees hemoliacuteticas transfusionais A
fenotipagem de candidatos a transfusotildees crocircnicas tambeacutem eacute recomendada pois esse grupo de
pacientes deve se beneficiar com a transfusatildeo profilaacutetica de unidades de hemaacutecias com
mesmo fenoacutetipo evitando assim a aloimunizaccedilatildeo assim como reaccedilotildees hemoliacuteticas provocadas
por anticorpos previamente existentes e em baixo tiacutetulo natildeo identificados pela triagem de
anticorpos (CASTILHO JUNIOR e REID 2015 DOWNES e SHULMAN 2011)
111 TIPAGEM ABORh
O sistema ABO (ISBT001) foi o primeiro sistema de grupo sanguiacuteneo a ser
descoberto Ele foi descrito em 1900 por Karl Landsteiner e eacute considerado o sistema de maior
importacircncia na praacutetica transfusional Ele eacute composto por quatro antiacutegenos A1 (ABO1) B
(ABO2) AB (ABO3) e A1 (ABO4) e eacute caracterizado pela presenccedila dos anticorpos naturais
ou seja anticorpos que surgem sem a exposiccedilatildeo preacutevia aos antiacutegenos atraveacutes de transfusatildeo ou
gestaccedilatildeo Os anticorpos ABO satildeo predominantemente da classe IgM satildeo capazes de fixar o
complemento e de provocar hemoacutelise grave intravascular caso ocorra transfusatildeo ABO
incompatiacutevel Por apresentar essa caracteriacutestica peculiar a tipagem do sistema ABO eacute
composta de duas etapas a prova direta e a prova reversa Na prova direta eacute realizada a
pesquisa dos antiacutegenos na superfiacutecie das hemaacutecias que satildeo testadas com soros comerciais
3
Anti-A e Anti-B A prova reversa por sua vez pesquisa a presenccedila de anticorpos ABO ao
testar o soro ou plasma do pacientedoador com hemaacutecias A1 e B Ambas as provas satildeo
obrigatoacuterias e devem ser concordantes para interpretaccedilatildeo do fenoacutetipo ABO (COOLING
2011 SANTOS 2014)
O sistema Rh (ISBT004) eacute o maior e mais complexo sistema de grupos sanguiacuteneos
compreendendo atualmente 54 antiacutegenos (ISBT 2016) Satildeo cinco os principais antiacutegenos do
sistema Rh D (RH1) C (RH2) E (RH3) c (RH4) e e (RH5) Esses antiacutegenos possuem alta
capacidade imunogecircnica e seus respectivos anticorpos estatildeo envolvidos na doenccedila hemoliacutetica
perinatal e em reaccedilotildees transfusionais hemoliacuteticas Os autoanticorpos quentes como ocorre na
anemia hemoliacutetica quente satildeo representados em grande parte por anticorpos contra antiacutegenos
puacuteblicos do sistema Rh (CASTILHO 2007 CHOU e WESTHOFF 2011 BARJAS-
CASTRO 2013) A tipagem RhD pesquisa o antiacutegeno D na membrana eritrocitaacuteria ao testar a
hemaacutecia com antissoros comerciais Atualmente a maior parte dos soros Anti-D
comercializados satildeo monoclonais
112 ANTICORPOS ANTI-ERITROCITAacuteRIOS
Anticorpos satildeo proteiacutenas presentes no plasma tambeacutem denominadas imunoglobulinas
Satildeo produzidas pelo sistema imune em resposta a um determinado antiacutegeno Podem ser
classificadas de acordo com suas caracteriacutesticas e propriedades em cinco classes de
imunoglobulinas IgG IgM IgA IgE e IgD (BARJAS-CASTRO 2013)
A ligaccedilatildeo entre o antiacutegeno e o anticorpo envolvem ligaccedilotildees natildeo covalentes que satildeo
reversiacuteveis Vaacuterios tipos de interaccedilotildees natildeo covalentes podem contribuir para a ligaccedilatildeo do
antiacutegeno pelo anticorpo incluindo forccedilas eletrostaacuteticas pontes de hidrogecircnio forccedilas de Van
der Walls e interaccedilotildees hidrofoacutebicas (ABBAS LICHTMAN e PILLAI 2008)
As interaccedilotildees antiacutegeno-anticorpo satildeo constituiacutedas por ligaccedilotildees dinacircmicas que sofrem
interferecircncia de alteraccedilotildees fiacutesico-quiacutemicas no meio como mudanccedilas na temperatura na forccedila
eletrostaacutetica na concentraccedilatildeo do antiacutegeno e do anticorpo e no pH O melhor pH para a reaccedilatildeo
eacute em torno de 70 no entanto raros anticorpos podem exigir acidificaccedilatildeo do meio para serem
identificados (SANTOS 2014)
Em imunohematologia satildeo pesquisados os anticorpos que reconhecem os antiacutegenos
eritrocitaacuterios de grupo sanguiacuteneo ldquoin vivordquo esses anticorpos dependendo de seu significado
cliacutenico satildeo capazes de reconhecer seus respectivos antiacutegenos sobre a hemaacutecia podendo levar
a sua destruiccedilatildeo por dois mecanismos fagocitose por macroacutefagos no sistema
4
reticuloendotelial ou por ativaccedilatildeo do sistema complemento com a formaccedilatildeo do complexo de
ataque a membrana e hemoacutelise intravascular As duas classes de anticorpos de maior
importacircncia em imunohematologia satildeo as imunoglobulinas IgG e a IgM (SANTOS 2014)
Devido a sua estrutura pentameacuterica os anticorpos da classe IgM se ligam aos
antiacutegenos localizados na superfiacutecie da membrana de hemaacutecias proacuteximas e promovem
aglutinaccedilatildeo das mesmas em meio salino ldquoin vitrordquo Anticorpos da classe IgG por sua vez
satildeo denominados ldquonatildeo aglutinantesrdquo ou ldquoincompletosrdquo pois sua estrutura de monocircmero eacute
pequena o que desfavorece a aglutinaccedilatildeo direta uma vez que uma mesma moleacutecula de IgG
natildeo alcanccedila antiacutegenos alvos em duas hemaacutecias proacuteximas Os anticorpos IgM aleacutem de terem
um tamanho maior apresentam 750 vezes maior eficiecircncia de aglutinaccedilatildeo que os anticorpos
IgG permitindo maior facilidade nas ligaccedilotildees entre as hemaacutecias (CARRUCIO e WISE 2012
GREEN e KLOSTERMANN 2012)
Nos testes ldquoin vitrordquo satildeo simulados reaccedilotildees que poderiam ocorrer ldquoin vivordquo causando
reaccedilotildees indesejaacuteveis A fase de sensibilizaccedilatildeo em que o anticorpo se liga ao antiacutegeno
correspondente natildeo eacute identificada macroscopicamente poreacutem uma vez que o anticorpo
aproxima as hemaacutecias e vence a forccedila eletrostaacutetica que naturalmente as repele chamada de
potencial zeta ocorre a aglutinaccedilatildeo Dependendo das caracteriacutesticas do anticorpo e de sua
capacidade de fixar complemento pode ocorrer tambeacutem a hemoacutelise (SANTOS 2014)
113 PESQUISA E IDENTIFICACcedilAtildeO DE ANTICORPOS IRREGULARES
A pesquisa de anticorpos irregulares eacute teste obrigatoacuterio nos testes preacute-transfusionais e
tem a finalidade de detectar anticorpos ldquoin vitrordquo que possam causar reaccedilatildeo ldquoin vivordquo
Dependendo da populaccedilatildeo estudada (pacientes x doadores) e ainda da sensibilidade do
teste a frequecircncia de anticorpos irregulares pode variar de 03 a 38 A imunizaccedilatildeo pode
ocorrer por transfusatildeo gestaccedilatildeo transplante ou injeccedilatildeo de material imunogecircnico (WALKER
2011)
Os anticorpos irregulares podem ser classificados como aloanticorpos que satildeo
voltados contra antiacutegenos ausentes na hemaacutecia autoacuteloga ou como autoanticorpos os quais
reconhecem antiacutegenos eritrocitaacuterios proacuteprios Os autoanticorpos antieritrocitaacuterios surgem em
decorrecircncia da desregulaccedilatildeo da autotoleracircncia imune relacionada agrave condiccedilotildees diversas como
doenccedilas hematoloacutegicas doenccedilas inflamatoacuterias autoimunes neoplasias infecccedilotildees e uso de
medicaccedilotildees A presenccedila do autoanticorpo associado a um quadro de anemia hemoliacutetica
caracteriza a anemia hemoliacutetica autoimune (AHAI) seja ela primaacuteria ou secundaacuteria agrave outra
5
patologia Ateacute 12 a 40 dos pacientes com autoanticorpos quentes podem apresentar
aloanticorpos de significado cliacutenico mascarados pelos autoanticorpos (SHIREY et al 2002)
Eacute importante detectar a presenccedila de anticorpos no plasmasoro de um receptor de
transfusatildeo para garantir que seja transfundido sangue compatiacutevel Quando a pesquisa de
anticorpo irregular resultar positiva para um ou mais anticorpos de relevacircncia clinica eacute
necessaacuterio confirmar a ausecircncia do respectivo antiacutegeno na hemaacutecia do receptor assim como
selecionar para transfusatildeo concentrados de hemaacutecias tambeacutem negativos para aqueles
antiacutegenos evitando assim reaccedilotildees transfusionais (WALKER 2011)
A detecccedilatildeo de um anticorpo irregular eacute inicialmente realizada pela triagem de
anticorpos na qual o soroplasma do receptor eacute testado com 2 a 3 hemaacutecias do tipo ldquoOrdquo O
conjunto de fenoacutetipos dessas hemaacutecias deve contemplar os antiacutegenos de maior importacircncia
cliacutenica Como os anticorpos irregulares de maior interesse cliacutenico satildeo na maior parte das
vezes imunes portanto da classe IgG eacute obrigatoacuteria a fase de antiglobulina (AGH) do teste
ou teste indireto da antiglobulina (TIA) uma vez que esses anticorpos satildeo incompletos
(CASTILHO JUNIOR e REID 2015) O teste de triagem estando positivo deve-se fazer a
identificaccedilatildeo da especificidade do anticorpo utilizando um painel com maior nuacutemero de
hemaacutecias fenotipadas
114 PROVA DE COMPATIBILIDADE
A prova de compatibilidade eacute um teste obrigatoacuterio em caso de transfusatildeo de
componentes eritrocitaacuterios Tambeacutem chamada de prova de compatibilidade maior deve ser
realizada antes da administraccedilatildeo de sangue total ou concentrado de hemaacutecias utilizando-se
hemaacutecias obtidas do tubo coletor da bolsa a ser transfundida e o soro ou plasma do receptor
(BRASIL 2016)
Eacute definido como o procedimento para excluir a incompatibilidade entre o doador e o
receptor Tem o objetivo de detectar anticorpos que podem natildeo ter sido encontrados na
pesquisa de anticorpos devido a ausecircncia ou pouca expressatildeo de antiacutegenos no painel de
hemaacutecias aleacutem da possibilidade de terem ocorrido erros teacutecnicos ou notacionais durante a
realizaccedilatildeo da pesquisa (MELO 2007)
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115 FENOTIPAGEM PARA OUTROS SISTEMAS
Aleacutem da pesquisa de ABORh que eacute realizado rotineiramente a fenotipagem para
outros sistemas tambeacutem denominado ldquofenotipagem estendidardquo determina a presenccedila ou
ausecircncia de antiacutegenos considerados de importacircncia cliacutenica A fenotipagem natildeo eacute obrigatoacuteria
nos testes preacute-transfusionais poreacutem a legislaccedilatildeo atual recomenda a realizaccedilatildeo da fenotipagem
eritrocitaacuteria dos antiacutegenos C (RH2) E (RH3) c (RH4) e (RH5) K (KELL1) Fya (FY1) Fy
b
(FY2) Jka
(JK1) Jkb (JK2) S (MNS3) e s (MNS4) para pacientes aloimunizados e pacientes
com indicaccedilatildeo de transfusatildeo crocircnica (BRASIL 2016)
A seleccedilatildeo de concentrados de hemaacutecias com o mesmo fenoacutetipo do receptor para
transfusatildeo pode evitar reaccedilotildees transfusionais hemoliacuteticas no paciente previamente
aloimunizado tambeacutem previne a sensibilizaccedilatildeo por outros antiacutegenos o que normalmente
torna as transfusotildees seguintes ainda mais complicadas A fenotipagem do paciente tambeacutem
auxilia na identificaccedilatildeo dos anticorpos pois espera-se que nas hemaacutecias do paciente o
antiacutegeno seja negativo para o anticorpo encontrado servindo de guia para teste de exclusatildeo de
anticorpos (SANTOS 2014 WALKER 2011)
A incidecircncia de aloanticorpos aumenta com o nuacutemero de transfusotildees no entanto a
implantaccedilatildeo de rotina de fenotipagem com transfusatildeo profilaacutetica de hemaacutecias com fenoacutetipo
compatiacutevel para pacientes candidatos agrave politransfusatildeo como os portadores de doenccedila
falciforme talassemia anemia aplaacutestica doenccedilas linfo e mieloproliferativas renais crocircnicos e
anemias refrataacuterias pode contribuir para o baixo iacutendice de sensibilizaccedilatildeo nessas populaccedilotildees
(FLUIT KUNST e DRENTHE-SCHONK 1999 MARTINS et al 2008 e VICHINSKY et
al 2001) Outro grupo de pacientes que se beneficia com a transfusatildeo de mesmo fenoacutetipo satildeo
os pacientes com AHAI uma vez que o autoanticorpo pode mascarar a presenccedila de um
aloanticorpo de significado cliacutenico em ateacute 40 dos casos Mesmo com as teacutecnicas utilizadas
ldquoin vitrordquo para remover a interferecircncia do autoanticorpo no soro um aloanticorpo pode natildeo
ser identificado e dessa forma transfundir o mesmo fenoacutetipo do paciente evitaria reaccedilatildeo
hemoliacutetica pelos anticorpos voltados contra antiacutegenos de maior importacircncia cliacutenica e de
frequecircncia intermediaacuteria Aleacutem disso os pacientes com AHAI satildeo fortes respondedores e a
transfusatildeo profilaacutetica do mesmo fenoacutetipo previne a aloimunizaccedilatildeo (SHIREY et al 2002)
Aleacutem de fenotipar o receptor eacute importante tambeacutem que os bancos de sangue tenham
rotinas de fenotipagem de doadores para atender as necessidade dos pacientes aloimunizados
ou em esquema de transfusatildeo crocircnica (PINTO BRAGA e SANTOS 2011)
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Rotineiramente eacute inviaacutevel estabelecer o fenoacutetipo eritrocitaacuterio completo de um
indiviacuteduo pela grande diversidade de sistemas sanguiacuteneos descritos Ate junho de 2015 jaacute
haviam sido classificados 308 antiacutegenos atribuiacutedos a 36 sistemas definidos pela Sociedade
Internacional de Transfusatildeo de Sangue (ISBT) (CASTILHO JUNIOR e REID 2015)
Portanto o paciente eacute normalmente fenotipado para os antiacutegenos de maior importacircncia
clinica
Alguns fatores podem limitar a realizaccedilatildeo da fenotipagem eritrocitaacuteria Um dos fatores
eacute a transfusatildeo alogecircnica realizada haacute menos de 90 dias Neste caso podem ocorrer resultados
falso positivos para determinados antiacutegenos devido agrave presenccedila de hemaacutecias do doador
(LAINE et al 2000)
Outro fator eacute a presenccedila de anticorpo sensibilizando a hemaacutecia do paciente e
provocando positividade do teste direto da antiglobulina humana (TDA) Os soros
normalmente utilizados para fenotipagem especialmente para os antiacutegenos Fya
(FY1) Fyb
(FY2) Jka
(JK1) Jkb
(JK2) S (MNS3) e s (MNS4) necessitam da fase de antiglobulina
humana (AGH) para que ocorra aglutinacatildeo Amostras que apresentam o TDA positivo
aglutinam apoacutes reaccedilatildeo com a AGH natildeo pela real presenccedila do antiacutegeno em sua superfiacutecie mas
pela interaccedilatildeo da AGH com o anticorpo que estaacute sensibilizando o eritroacutecito A interferecircncia
do TDA positivo pode ser anulada atraveacutes de algumas teacutecnicas capazes de dissociar o
anticorpo como por exemplo o tratamento da hemaacutecia sensibilizada com cloroquina ou com
glicina-aacutecida-EDTA (BRANCH e PETZ 1999 SHIREY et al 2002 e LEGER 2011)
12 METODOLOGIAS APLICADOS Agrave ROTINA IMUNO-HEMATOLOacuteGICA
Todos os testes que compotildeem a rotina preacute-transfusional usam meacutetodos soroloacutegicos
que envolvem a reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo e tem como objetivo determinar o perfil antigecircnico
eritrocitaacuterio do receptor e do doador assim como identificar em seu soro a presenccedila de
anticorpos contra antiacutegenos eritrocitaacuterios que possam comprometer a sobrevida das hemaacutecias
transfundidas Para testar o antiacutegeno na superfiacutecie da hemaacutecia eacute necessaacuterio dispor de um
antissoro com especificidade conhecida para aquele antiacutegeno Por outro lado para testar a
presenccedila de um determinado anticorpo no soro ou plasma do receptor eacute necessaacuterio o uso de
hemaacutecias com perfil antigecircnico conhecido (SANTOS 2014)
Diversas metodologias satildeo aplicadas nos laboratoacuterios de imunohematologia Cada
serviccedilo de hemoterapia faz a escolha do meacutetodo que seraacute aplicado de acordo com o perfil do
laboratoacuterio com o volume de exames diaacuterios e tambeacutem com o custo envolvido Todas essas
8
teacutecnicas tecircm como objetivo comum demonstrar a reaccedilatildeo entre antiacutegeno e anticorpo no
entanto elas se baseiam em diferentes princiacutepios Muitas metodologias satildeo atualmente
aplicadas agrave imunohematologia entre elas o sistema de fase soacutelida a tecnologia de hemaacutecias
magnetizadas a biologia molecular e ateacute mesmo a citometria de fluxo no entanto os meacutetodos
mais tradicionais satildeo aqueles baseados no princiacutepio de hemaglutinaccedilatildeo
121 MEacuteTODOS DE FASE FLUacuteIDA
Os meacutetodos de fase fluiacuteda satildeo testes baseados na hemaglutinaccedilatildeo e incluem o teste em
tubo e o teste em microplacas Uma suspensatildeo de hemaacutecias eacute adicionada ao plasma ou soro
em seguida eacute realizada a centrifugaccedilatildeo e por fim eacute feita a leitura do resultado que eacute
considerado positivo se for observado algum grau de aglutinaccedilatildeo ou hemoacutelise A intensidade
de aglutinaccedilatildeo eacute graduada de acordo com o tamanho dos agregados desprendidos da
superfiacutecie apoacutes agitaccedilatildeo delicada do tubo ou microplaca Os meacutetodos de hemaglutinaccedilatildeo satildeo
aplicados a todos os testes preacute-transfusionais Como os anticorpos ABO satildeo aglutininas frias
a tipagem eacute realizada em temperatura ambiente (22degC) no entanto ao investigar a presenccedila
de anticorpos irregulares que como jaacute mencionado eacute na maioria das vezes anticorpos
incompletos da classe IgG eacute essencial que a reaccedilatildeo seja incubada a 37degC As reaccedilotildees satildeo
facilitadas com a utilizaccedilatildeo de potencializadores e da antiglobulina humana (WALKER e
HARMENING 2012 AABB 2011)
Nos meacutetodos de fase fluiacuteda nos quais a AGH eacute empregada a fase de lavagem eacute
fundamental Apoacutes a incubaccedilatildeo do soro com as hemaacutecias deve ser realizada a lavagem da
reaccedilatildeo para remover o excesso de anticorpos natildeo ligados agraves hemaacutecias jaacute que os anticorpos
livres podem bloquear a AGH quando ela eacute adicionada e levar a resultados falso negativos
(AABB 2011)
Os testes de hemaglutinaccedilatildeo satildeo os mais tradicionais entre os meacutetodos ainda hoje
aplicados agrave rotina de bancos de sangue A vantagem desses meacutetodos eacute o baixo custo quando
comparado agraves teacutecnicas mais modernas mas apresentam tambeacutem desvantagens A teacutecnica em
tubo por exemplo natildeo permite automaccedilatildeo eacute trabalhosa e exige matildeo-de-obra bastante treinada
na execuccedilatildeo das diversas etapas do teste e mesmo assim pode haver subjetividade na
interpretaccedilatildeo dos resultados aleacutem de resultados falso-negativos (DOWNES 2011 ZANTEK
et al 2012)
9
122 COLUNAS DE GEL
A teacutecnica em gel iniciada na deacutecada de 90 representou uma grande revoluccedilatildeo na
rotina laboratorial tornando-se muito popular Aleacutem de ser sensiacutevel a teacutecnica dispensa a fase
de lavagem antes da adiccedilatildeo da AGH assim como a agitaccedilatildeo do teste para leitura reduzindo o
nuacutemero de resultados falsos negativos decorrentes dessas duas etapas e o tempo para
execuccedilatildeo dos testes (LAPIERRE et al 1989 NOVARETTI et al 2000 NOVARETTI et
al 2004) Os reagentes satildeo comercializados na forma de cartotildees plaacutesticos contendo
microtubos preenchidos por gel composto por microesferas de acrilamida-dextran Nesta
metodologia tambeacutem baseada na hemaglutinaccedilatildeo a suspensatildeo de hemaacutecias e o soro satildeo
depositados em uma cacircmara acima da coluna de gel e em seguida procede-se com a
centrifugaccedilatildeo dos cartotildees As microesferas atuam como uma malha que permite a passagem
em direccedilatildeo ao fundo do microtubo apenas das hemaacutecias natildeo aglutinadas enquanto as
hemaacutecias aglutinadas ficam retidas na parte superior da coluna ou ao longo dela (GREEN e
KLOSTERMANN 2012) Portanto quanto maior a agregaccedilatildeo mais hemaacutecias ficam retidas
no topo da coluna Dependendo do tipo de teste a ser realizado pode ser utilizado gel neutro
ou gel especiacutefico impregnado pelo anticorpo desejado e o gel contendo antiglobulina humana
que satildeo utilizados para os testes diretos e indiretos da antiglobulina (LAPIERRE et al 1989)
A coluna de gel ainda permite a visualizaccedilatildeo clara de duas populaccedilotildees distintas de hemaacutecias
como em pacientes receacutem transfundidos
123 BIOLOGIA MOLECULAR
A biologia molecular ou genotipagem estaacute sendo cada vez mais aplicada aos grupos
sanguiacuteneos pois fornece resultados seguros e precisos especialmente nos casos em que natildeo eacute
possiacutevel a realizaccedilatildeo da fenotipagem como em pacientes receacutem-transfundidos e pacientes
com TDA positivo Na genotipagem eacute possiacutevel determinar atraveacutes do DNA do paciente
extraiacutedo de seus leucoacutecitos de sangue perifeacuterico o fenoacutetipo eritrocitaacuterio deduzido sem
qualquer interferecircncia do anticorpo que sensibiliza a hemaacutecia ou de hemaacutecias alogecircnicas
transfundidas Sua realizaccedilatildeo no entanto exige o treinamento de equipe especializada e capaz
de interpretar os resultados em conjunto com os achados soroloacutegicos (JUNIOR e OLIVATO
2007)
Apesar de ser uma ferramenta de grande importacircncia hoje na imuno-hematologia
ainda estaacute restrito aos grandes centros de hemoterapia no Brasil poucos serviccedilos puacuteblicos de
sauacutede dispotildeem desse recurso e utilizam teacutecnicas de genotipagem de grupos sanguiacuteneos para
atendimento a seus pacientes Esta abordagem poreacutem vem sendo introduzida em algumas
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instituiccedilotildees de reconhecida competecircncia na hemoterapia mas sua disponibilizaccedilatildeo deve
tornar-se mais generalizada atraveacutes da formaccedilatildeo de centros de referecircncia para atendimento
das diversas unidades de hemoterapia (MARTINS et al 2009) Dessa forma muitas decisotildees
transfusionais especialmente em urgecircncias ainda devem ser tomadas sem o resultado da
genotipagem eritrocitaacuteria
13 TESTE DA ANTIGLOBULINA
Coombs Mourant e Race descreveram em 1945 uma teacutecnica com utilizando soro de
coelho contendo antiglobulina humana (AGH) que posteriormente foi chamada de ldquosoro de
Coombsrdquo O meacutetodo foi desenvolvido inicialmente para ampliar o efeito de aglutininas fracas
do sistema Rh anticorpos ldquoincompletosrdquo que normalmente natildeo apresentavam aglutinaccedilatildeo
visiacutevel O teste foi concebido como um instrumento de investigaccedilatildeo de doenccedila hemoliacutetica do
receacutem-nascido e de reaccedilotildees transfusionais causadas por anticorpos Rh que estavam presentes
no soro dos paciente poreacutem que natildeo eram demonstraacuteveis pelas teacutecnicas ateacute entatildeo existentes
A maior parte dos anticorpos de significado cliacutenico assim como seus respectivos
antiacutegenos foram descritos apoacutes o surgimento do ldquosoro de Coombsrdquo em 1945 sendo assim o
teste da antiglobulina representa ateacute hoje a forma mais importante de aglutinaccedilatildeo artificial em
imunohematologia permitindo revelar a presenccedila de anticorpos na membrana da hemaacutecia A
antiglobulina humana eacute constituiacuteda por anticorpo especiacutefico contra a porccedilatildeo Fc de outro
anticorpo Quando um anticorpo ldquoincompletordquo sensibiliza a hemaacutecia normalmente natildeo
provoca aglutinaccedilatildeo visiacutevel Apoacutes a adiccedilatildeo da AGH ao meio esta reconhece e se liga agraves
porccedilotildees Fc dos anticorpos que sensibilizam a hemaacutecia formando assim uma malha e
provocando aglutinaccedilatildeo visiacutevel (BARJAS-CASTRO 2013)
Os reagentes de antiglobulina podem ser poliespeciacuteficos ou monoespeciacuteficos Os
poliespeciacuteficos satildeo uma mistura de anticorpos ant-IgG e anti-C3d (fraccedilatildeo C3d do
complemento) Os reagentes monoespecificos podem ser anti-IgG anti-IgM anti-IgA anti-
complemento podendo ser anti-C3d e anti-C3b
O teste da antiglobulina pode ser usado para detectar hemaacutecias sensibilizadas com
aloanticorpos IgG autoanticorpos IgG e componentes do complemento A sensibilizaccedilatildeo
pode ocorrer ldquoin vivordquo ou ldquoin vitrordquo O uso do AGH para detectar a sensibilizaccedilatildeo ldquoin vitrordquo
tem dois estaacutegios e eacute denominado teste indireto da antiglobulina A sensibilizaccedilatildeo ldquoin vivordquo eacute
detectada em procedimento de um uacutenico estagio chamado teste direto da antiglobulina (TDA)
11
Os testes direto e indireto satildeo ateacute hoje amplamente aplicados como princiacutepio de inuacutemeros
testes soroloacutegicos em imuno-hematologia (GREEN e KLOSTERMANN 2012)
131 TESTE DIRETO DA ANTIGLOBULINA
O teste direto da antiglobulina humana revela a presenccedila de anticorpo eou fraccedilatildeo do
complemento ligados agrave superfiacutecie das hemaacutecias As sensibilizaccedilatildeo das hemaacutecias ocorrida ldquoin
vivordquo natildeo eacute visualizada mas apoacutes a adiccedilatildeo da antiglobulina humana ocorre a aglutinaccedilatildeo que
eacute visualizada macroscopicamente (Figura 1)
Figura 1 - Princiacutepio da teacutecnica direta da antiglobulina Teste utilizado para demonstrar a sensibilizaccedilatildeo ldquoin
vivordquo das hemaacutecias O sangue total eacute coletado do paciente em tubo contendo anticoagulante EDTA Na teacutecnica
realizada em tubo uma suspensatildeo de hemaacutecias 5 em soluccedilatildeo de salina eacute preparada Uma gota dessa suspensatildeo
eacute lavada 3 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica para retirada de anticorpos que estatildeo livres no plasma Toda soluccedilatildeo eacute
retirada e adiciona-se o soro de Coombs (antiglobulina humana) O soro de Coombs reconhece os anticorpos que
estatildeo ligados agrave superfiacutecie das hemaacutecias fazendo com que ocorra aglutinaccedilatildeo visiacutevel macroscopicamente
Apesar de natildeo ser um teste preacute-transfusional obrigatoacuterio o TDA eacute um dos testes mais
importantes para investigar e classificar quadros hemoliacuteticos como de origem imune ou natildeo
imune O seu valor preditivo positivo em vigecircncia de anemia hemoliacutetica eacute de 83 poreacutem natildeo
havendo sinais de hemoacutelise seu valor preditivo eacute apenas 14 Eacute por esse motivo que a
interpretaccedilatildeo do TDA positivo deve levar em consideraccedilatildeo a histoacuteria cliacutenica e os resultados
dos outros exames laboratoriais A realizaccedilatildeo do TDA eacute obrigatoacuteria na investigaccedilatildeo
12
laboratorial de diversos quadros hemoliacuteticos entre eles a anemia hemoliacutetica autoimune
(AHAI) a reaccedilatildeo hemoliacutetica imune poacutes-transfusional a siacutendrome do linfoacutecito passageiro a
doenccedila hemoliacutetica perinatal e a hemoacutelise droga-dependente (LEGER 2011)
Resultados de TDA positivos foram tambeacutem observados em indiviacuteduos com niacuteveis
seacutericos elevados de IgG ou complemento sem evidecircncia de anemia hemoliacutetica imune como
em pacientes com doenccedila falciforme talassemia doenccedila renal crocircnica mieloma muacuteltiplo
doenccedilas autoimunes e siacutendrome da imunodeficiecircncia adquirida (SIDA) Aleacutem disso pequenas
quantidades de IgG (5 a 90 moleacuteculas por hemaacutecia) e complemento (5 a 40 moleacuteculas por
hemaacutecia) podem estar presentes nas hemaacutecias de indiviacuteduos saudaacuteveis sem associaccedilatildeo com
reduccedilatildeo na sobrevida das mesmas A positividade do TDA depende da populaccedilatildeo estudada e
pode variar de 01 entre doadores de sangue sem qualquer sinal cliacutenico de hemoacutelise ateacute
15 em pacientes hospitalizados (CASTILHO JUNIOR e REID 2015 LEGER 2011)
Indiviacuteduos que apresentam TDA positivo seja agraves custas de IgG eou complemento
com ou sem sinais cliacutenicos de hemoacutelise teratildeo a fenotipagem eritrocitaacuteria prejudicada A
fenotipagem de indiviacuteduos com TDA positivo especialmente quando utilizado o teste indireto
da antiglobulina pode acarretar resultados falsos positivos e levar a seleccedilatildeo de fenoacutetipo
incorreto para transfusatildeo
132 TESTE INDIRETO DA ANTIGLOBULINA
O teste indireto da antiglobulina (TIA) eacute utilizado para revelar a sensibilizaccedilatildeo ldquoin
vitrordquo das hemaacutecias e eacute aplicado a diversos testes soroloacutegicos em imunohematologia entre
eles a pesquisa de anticorpos identificaccedilatildeo de anticorpos testes de compatibilidade
fenotipagem eritrocitaacuteria e titulaccedilatildeo de anticorpos Na teacutecnica indireta a hemaacutecia que contecircm
o antiacutegeno eacute colocada em contato ldquoin vitrordquo com o anticorpo que se liga mas natildeo promove a
aglutinaccedilatildeo visiacutevel A adiccedilatildeo da AGH forma uma malha entre os anticorpos que sensibilizam
as hemaacutecias e provoca a aglutinaccedilatildeo macroscoacutepica (figura 2)
Caso a amostra de hemaacutecia estudada seja previamente sensibilizada resultados falsos
positivos podem ser obtidos no TIA jaacute que a AGH reagiraacute com a moleacutecula que sensibilizava
anteriormente a hemaacutecia mesmo se o anticorpo especiacutefico natildeo tiver se ligado ao antiacutegeno
correspondente
13
133 CONDICcedilOtildeES CLIacuteNICAS COM TDA POSITIVO
O TDA positivo deve ser interpretado cuidadosamente sempre em conjunto com o
quadro cliacutenico do paciente A positividade isolada do TDA natildeo significa hemoacutelise A
interpretaccedilatildeo do teste positivo requer o conhecimento do diagnoacutestico do paciente da presenccedila
de sinais e sintomas sugestivos de hemoacutelise assim como de seu histoacuterico transfusional
gestacional e de informaccedilotildees sobre o uso recente de medicaccedilotildees (LEGER 2011)
Figura 2 ndash Princiacutepio do teste indireto da antiglobulina O TIA pode ser utilizado na pesquisa de anticorpos de
especificidades desconhecidas livres no soroplasma como eacute o caso da pesquisa e identificaccedilatildeo de anticorpos
irregulares Ele eacute tambeacutem utilizado para determinar a presenccedila de antiacutegenos na membrana da hemaacutecia quando
satildeo empregados soros de especificidades conhecidas da classe IgG No primeiro caso o soroplasma contendo o
anticorpo desconhecido eacute colocado em contato com hemaacutecias cujo perfil antigecircnico eacute conhecido No segundo
caso utiliza-se soro de especificidade conhecida da classe IgG para determinar a presenccedila ou ausecircncia de um
antiacutegeno na membrana O anticorpo encontra o antiacutegeno correspondente e ocorre a ligaccedilatildeo do anticorpo agrave
hemaacutecia mas natildeo ocorre aglutinaccedilatildeo Apoacutes a adiccedilatildeo da AGH que se liga aos anticorpos formando uma malha
ocorre a aglutinaccedilatildeo visiacutevel
O TDA positivo eacute uma achado claacutessico de algumas condiccedilotildees cliacutenicas como a reaccedilatildeo
transfusional hemoliacutetica a doenccedila hemoliacutetica do feto e do receacutem-nascido (DHFRN) a anemia
hemoliacutetica induzida por drogas a siacutendrome do linfoacutecito passageiro e a anemia hemoliacutetica
autoimune (AHAI) Portanto o TDA positivo pode ser decorrente da sensibilizaccedilatildeo da
hemaacutecia autoacuteloga por um autoanticorpo ou por um aloanticorpo ligado agrave hemaacutecia alogecircnica
circulante A positividade do TDA pode ainda ocorrer de forma passiva em pacientes que
14
recebem imunoglobulinas humanas ou ainda pela transfusatildeo de plaquetas ABO natildeo idecircntico
(LEGER 2011 RALPH 2012 ZANTEK et al 2012)
Nas reaccedilotildees transfusionais hemoliacuteticas imunes o aloanticorpo do receptor sensibiliza
as hemaacutecias transfundidas do doador e reduz sua sobrevida ao removecirc-la precocemente da
circulaccedilatildeo pela fagocitose no sistema retiacuteculo-endotelial ou pela hemoacutelise intravascular As
reaccedilotildees podem ser agudas se ocorrem ateacute 24 horas ou tardias quando ocorrem apoacutes 24 horas
da transfusatildeo A gravidade das reaccedilotildees hemoliacuteticas pode variar de um simples rendimento
transfusional inadequado agrave quadros graves de hemoacutelise intravascular evoluindo ateacute mesmo
com choque vascular e oacutebito O TDA pode resultar negativo caso toda massa eritrocitaacuteria
transfundida tenha sido destruiacuteda (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
Na doenccedila hemoliacutetica do feto e do receacutem-nascido (DHFRN) anticorpos maternos da
classe IgG atravessam a barreira placentaacuteria e sensibilizam as hemaacutecias fetais que seratildeo
destruiacutedas precocemente levando agrave anemia fetal Apesar da incompatibilidade ABO feto-
materna ser a causa mais frequente de DHFRN raramente ela eacute responsaacutevel pela ocorrecircncia
de quadros graves Por outro lado anticorpos contra antiacutegenos do sistema Rh e Kell
especialmente Anti-D (Anti-RH1) Anti-c (Anti-RH4) e Anti-Kell (Anti-KELL1) satildeo
conhecidos por causar DHFRN severa Raramente outros anticorpos tambeacutem podem estar
implicados na DHFRN como os anticorpos contra antiacutegenos do sistema Kidd Duffy MNS e
Diego (ZANTEK et al 2012)
A hemoacutelise droga-dependente eacute causada pela produccedilatildeo de um anticorpo voltado contra
a droga ligada agrave membrana eritrocitaacuteria ou ainda contra o complexo droga-membrana A
classe de medicaccedilotildees mais comumente envolvida eacute a dos antimicrobianos betalactacircmicos
(penicilinas e cefalosporinas) mas outras classes como quimioteraacutepicos e anti-inflamatoacuterios
tambeacutem satildeo descritos (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
Apoacutes transplante de ceacutelulas progenitoras hematopoieacuteticas em que o doador possui
anticorpos contra antiacutegenos eritrocitaacuterios do receptor o linfoacutecito de memoacuteria do doador pode
resistir ao esquema imunossupressor utilizado e continuar a produccedilatildeo de anticorpos que
reconhecem a hemaacutecia incompatiacutevel do receptor ainda circulante O quadro cliacutenico pode
variar de um simples TDA positivo sem outros sinais ou sintomas ateacute um quadro hemoliacutetico
grave e abrupto (LEGER 2011)
15
134 ANEMIA HEMOLIacuteTICA AUTOIMUNE
A anemia hemoliacutetica autoimune eacute caracterizada pela destruiccedilatildeo precoce das hemaacutecias
autoacutelogas por autoanticorpos que sensibilizam as hemaacutecias e levam agrave fagocitose pelos
macroacutefagos no sistema reticulo-endotelial ou hemoacutelise intravascular O diagnoacutestico da AHAI
baseia-se na presenccedila de hemoacutelise cliacutenica associada agrave evidecircncia de fator imune representado
pelo TDA positivo As classes de anticorpos envolvidas em quadros de AHAI satildeo IgG IgM e
raramente IgA (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012) Satildeo raros os casos de AHAI com TDA
negativo que podem estar relacionados a um autoanticorpo de baixa avidez de densidade
inferior agrave detecccedilatildeo do meacutetodo ou ainda de classe de imunoglobulina natildeo avaliada pelo
meacutetodo utilizado para o teste (GARRATY 2005)
A AHAI pode ser classificada em dois grupos principais de acordo com a melhor
temperatura de reaccedilatildeo do autoanticorpo As anemias hemoliacuteticas causadas por anticorpos
quentes que reagem melhor a 37oC e geralmente IgG representam 80 dos casos de AHAI
Nas AHAI por anticorpo quente o TDA pode ser positivo para IgG mais complemento (67)
somente IgG (20) ou somente por complemento (13) As anemias causadas por
anticorpos frios geralmente da classe IgM e que reagem melhor em temperatura ambiente ou
a 4oC representam aproximadamente 20 dos casos de AHAI Por exibirem amplitude
teacutermica esses anticorpos ligam-se agraves hemaacutecias ao atingirem a circulaccedilatildeo nas extremidades do
corpo fixam o complemento e desprendem-se da hemaacutecia apoacutes retornar para partes mais
quentes Por esse motivo em AHAI por anticorpos frios o TDA eacute positivo apenas agraves custas
de C3 e normalmente o IgM natildeo eacute detectado (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
A presenccedila do autoanticorpo IgG pode ser confirmada atraveacutes da eluiccedilatildeo do anticorpo
da hemaacutecia Tipicamente o eluato na AHAI por anticorpo quente reage com todas as ceacutelulas
testadas de um painel de hemaacutecias alogecircnicas do tipo ldquoOrdquo ou pode eventualmente exibir uma
especificidade conhecida como Anti-e (Anti-RH5) Nas AHAI a frio por sua vez espera-se
um eluato negativo (LEGER 2011)
Os autoanticorpos satildeo com frequecircncia encontrados livres no plasma e natildeo somente
ligados agraves hemaacutecias autoacutelogas Eles podem interferir em todas as fases dos testes preacute-
transfusionais nas quais o plasma eacute testado especialmente os autoanticorpos quentes que
acarretam resultados positivos em todos os testes levados agrave fase de antiglobulina humana
Esses anticorpos portanto positivam a pesquisa de anticorpos irregulares e mascaram a
presenccedila de aloanticorpos de significado cliacutenico Aproximadamente 60 dos pacientes que
apresentam AHAI a quente apresentam anticorpos que reagem em meio salino mas se forem
16
levados em conta meacutetodos mais sensiacuteveis como PEG enzima e estudo em gel a positividade
pode ser superior a 90 (LEGER 2011)
Aleacutem da eficaacutecia da transfusatildeo ser comprometida pela diminuiccedilatildeo da vida-meacutedia das
hemaacutecias a presenccedila do autoanticorpo dificulta a realizaccedilatildeo dos testes preacute-transfusionais e
compromete a seguranccedila transfusional Os autoanticorpos reagem normalmente como
panaglutininas pois satildeo normalmente voltados contra antiacutegenos puacuteblicos na maior parte das
vezes contra antiacutegenos do sistema Rh Por apresentarem essas caracteriacutesticas podem ainda
mascarar a presenccedila de aloanticorpos de significado clinico e levar a testes de compatibilidade
positivos exigindo uma avaliaccedilatildeo criteriosa da necessidade da transfusatildeo (BRANCH e PETZ
1999 JUNIOR e OLIVATO 2004)
Remover a interferecircncia do autoanticorpo para avaliar a presenccedila de aloanticorpos
mascarados nem sempre eacute possiacutevel mesmo utilizando teacutecnicas de autoadsorccedilatildeo ou
aloadsorccedilatildeo que aleacutem de tudo satildeo demoradas e exigem de 2 a 6 horas para conclusatildeo
(GARRATY e GEORGE 2002) Nesses casos a fenotipagem eritrocitaacuteria do paciente eacute de
extrema utilidade especialmente em situaccedilotildees de urgecircncia A definiccedilatildeo do fenoacutetipo do
paciente para os antiacutegenos de maior importacircncia cliacutenica pode auxiliar a seleccedilatildeo de unidades
de hemaacutecias com mesmo fenoacutetipo o que garante que eventuais aloanticorpos natildeo
identificados sejam respeitados e tambeacutem evita nova sensibilizaccedilatildeo (JUNIOR e OLIVATO
2004 SHIREY et al 2002)
135 TRATAMENTO DE HEMAacuteCIAS COM TDA POSITIVO
O TDA positivo impede a fenotipagem eritrocitaacutecia por meacutetodos que exigem a fase de
AGH uma vez que a aglutinaccedilatildeo ocorreraacute devido agrave interaccedilatildeo da AGH com o autoanticorpo
que sensibiliza a hemaacutecia do paciente levando a resultados falso positivos Em algumas
situaccedilotildees como na AHAI por anticorpo quente a fenotipagem eacute especialmente importante
pois o autoanticorpo interfere na triagem e identificaccedilatildeo de anticorpos assim como no teste de
compatibilidade e dificultam a detecccedilatildeo de aloanticorpos de significado cliacutenico que
obrigatoriamente devem ser respeitados Nessas situaccedilotildees a fenotipagem eritrocitaacuteria
determina o perfil antigecircnico do paciente e possibilita o fornecimento de unidades de
hemaacutecias com o mesmo fenoacutetipo para a transfusatildeo evitando a sensibilizaccedilatildeo para novos
antiacutegenos assim como reaccedilotildees hemoliacuteticas transfusionais No entanto eacute necessaacuterio aplicar
meacutetodos que natildeo sofram interferecircncia do TDA positivo ou seja meacutetodos que natildeo necessitem
da fase de AGH ou meacutetodos de bloqueio do anticorpo sem bloquear o antiacutegeno Uma opccedilatildeo eacute
a utilizaccedilatildeo de soros monoclonais IgM (salinos ou de meio proteico natildeo concentrado) mas
17
nem sempre esses reagentes estatildeo disponiacuteveis especialmente os reagentes monoclonais para
os antiacutegenos dos sistemas Duffy ( Fya Fy
b) Kidd ( Jk
a Jk
b) e MNS (S s) (JUNIOR e
OLIVATO 2004) Outra opccedilatildeo eacute a teacutecnica de bloqueio que pode ser utilizada para tratar
hemaacutecias para posterior fenotipagem em casos de TDA positivos com reatividade le2+
Em casos onde a positividade do TDA eacute maior que 2+ estaacute indicada a tratamento
quiacutemico para remoccedilatildeo da interferecircncia do autoanticorpo antes de realizar a fenotipagem Entre
as teacutecnicas utilizadas atualmente estatildeo o ZZAP a cloroquina e a glicina aacutecidaEDTA
1351 TEacuteCNICA DE BLOQUEIO
A teacutecnica de bloqueio se baseia na utilizaccedilatildeo de anti-IgG (Coombs monoespeciacutefico)
para tratar as hemaacutecias com TDA positivo O anticorpo anti-IgG se liga aos anticorpos que
estatildeo sensibilizando a hemaacutecias poreacutem sem o bloquear os antiacutegenos Os antiacutegenos que natildeo
estatildeo sensibilizados podem ser detectados atraveacutes dos antissoros especiacuteficos (SERERAT
VEIDT E DUTCHED 2000)
1352 TRATAMENTO DE HEMAacuteCIAS COM ZZAP
O Sulphydryl-Proteolytic Enzyme (ZZAP) que eacute uma mistura de ditiotreitol (DTT)
mais papaiacutena ativada com cisteiacutena eacute um reagente capaz de dissociar imunoglobulinas da
classe IgG ligadas a membrana dos eritroacutecitos enquanto trata enzimaticamente as hemaacutecias
O tratamento enzimaacutetico tambeacutem potencializa a ligaccedilatildeo do autoanticorpo ao antiacutegeno e
acelera o processo de autoadsorccedilatildeo O ZZAP pode desnaturar os antiacutegenos do sistema Duffy
MNS e Kell o que limita sua aplicaccedilatildeo para fins de fenotipagem (BRANCH e PETZ 1982)
1353 CLOROQUINA
Em 1982 Edwards Moulds e Judd propuseram a utilizaccedilatildeo da teacutecnica da cloroquina
que dissociava os complexos antiacutegeno-anticorpo e mantinha a membrana das hemaacutecias
iacutentegras Os derivados quinolecircicos jaacute haviam sido descritos anteriormente por Domokos e
Aszody em 1964 e Holtz Mantel e Buck em 1973 (apud Edwards Moulds e Judd 1982) pela
sua capacidade de separar imunocomplexos e inibir as reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo reduzindo
as cargas eleacutetricas das superfiacutecie das hemaacutecias A teacutecnica eacute uma das mais utilizadas nos
centros brasileiros para remover a interferecircncia do autoanticorpo e eacute tambeacutem a teacutecnica
atualmente adotada pelo laboratoacuterio de imunohematologia do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto
18
Edwards Moulds e Judd (1982) demonstraram que a teacutecnica da cloroquina para
dissociaccedilatildeo de anticorpos eacute uma teacutecnica simples efetiva e confiaacutevel para dissociar
imunoglobulina das hemaacutecias Desde que a membrana das hemaacutecias permaneccedila intacta natildeo
haacute perda da reatividade dos antiacutegenos e a sua maior aplicaccedilatildeo eacute a fenotipagem de hemaacutecias
com TDA positivo Os autores verificaram que em 83 das amostras sensibilizadas in vivo e
22 amostras (no total de 40) sensibilizadas ldquoin vitrordquo apresentaram TDA negativo e
puderam ser fenotipadas A teacutecnica poreacutem natildeo consegue remover os componentes do
complemento na maioria dos casos
Champagne e colaboradores (1999) testaram a teacutecnica da cloroquina para dissociar
antiacutegenos Bg comparando com a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA e verificaram vantagem em
relaccedilatildeo ao uso de um uacutenico reagente diminuindo a manipulaccedilatildeo e verificou que o mesmo natildeo
destroacutei antiacutegeno Kell
A cloroquina tambeacutem mostrou-se pouco efetivo em remover anticorpos do sistema
Duffy da superfiacutecie das hemaacutecias (EDWARDS MOUDS e JUDD 1982 ROZIERS e
SQUALI 1997)
1353 GLICINA-AacuteCIDAEDTA
A afinidade e a estabilidade entre a ligaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo eacute definida como a
resultante entre forccedilas atrativas e repulsivas entre ambos (CARUCIO e WISE 2012) e resulta
da somatoacuteria de forccedilas quiacutemicas dinacircmicas e fracas (natildeo covalentes) como pontes de
hidrogecircnio forcas eletrostaacuteticas forca de Van der Waals e pontes hidrofoacutebicas A estabilidade
dessa ligaccedilatildeo eacute facilmente abalada por alteraccedilotildees quiacutemicas e fiacutesicas no meio da reaccedilatildeo como
a alteraccedilatildeo do pH A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA se baseia na mudanccedila do pH para a
quebra da ligaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo (KOSANKE 2012)
A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA foi primeiramente descrita em 1986 por Louie Jieng
e Zeroulis que utilizaram 50 amostras de doadores sensibilizados ldquoin vitrordquo com anticorpos A
teacutecnica foi efetiva em 48 amostras permitindo o estudo do eluato assim como a fenotipagem
das hemaacutecias Os autores testaram tambeacutem a teacutecnica em 100 hemaacutecias TDA positivo que
puderam ser utilizadas para teacutecnicas de autoadsorccedilatildeo
Byrne (1991) descreveu a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA modificada e tambeacutem
verificou como uma opccedilatildeo para o tratamento de hemaacutecias com TDA positivo que deixava as
hemaacutecias intactas e o eluato viaacutevel para ser fenotipado
19
Roziers e Squali (1997) e Katharia e Chaudhary (2013) compararam a teacutecnica da
glicina-aacutecidaEDTA com as teacutecnicas da cloroquina e do aquecimento Verificaram maior
eficiecircncia da glicina-aacutecidaEDTA em relaccedilatildeo as outras duas teacutecnicas pois com uma mesma
quantidade de amostra produzia as hemaacutecias livres de anticorpo e tambeacutem o eluato Mostrou-
se ainda superior devido ao menor tempo exigido para sua realizaccedilatildeo o que favorece seu uso
em situaccedilotildees de urgecircncia e emergecircncia
As duas desvantagens da teacutecnica poreacutem eacute o fato de destruir os antiacutegenos do sistema
Kell e o fato de natildeo remover fraccedilotildees do complemento ligadas agrave hemaacutecia (PALLAS WILER e
McGEE 1991 ROZIERS e SQUALLI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012
e KATHARIA e CHAUNDHARY 2013)
20
2 OBJETIVOS
21 OBJETIVO GERAL
211 Avaliar a eficaacutecia da glicina-aacutecidaEDTA em remover os anticorpos ligados agraves
hemaacutecias sensibilizadas por anticorpos da classe IgG
22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
221 Preparaccedilatildeo dos reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
verificaccedilatildeo da estabilidade dos mesmos e avaliar custos
222 Testar a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA em amostras de hemaacutecias
sensibilizadas por anticorpos antieritrocitaacuterios humanos
223 Comparar a efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA com a teacutecnica da
cloroquina quanto a capacidade de remover a interferecircncia do anticorpo ligado
a hemaacutecia
224 Testar o eluato das amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA
225 Verificar se houve destruiccedilatildeo dos antiacutegenos eritrocitaacuterios apoacutes o tratamento
com glicina-aacutecidaEDTA e com cloroquina
226 Verificar se o tempo de execuccedilatildeo da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA descrito
nos textos de referecircncia eacute reprodutiacutevel
21
3 JUSTIFICATIVA
Algumas condiccedilotildees cliacutenicas podem levar ao depoacutesito ldquoin vivordquo de anticorpos eou
fraccedilotildees do complemento sobre as hemaacutecias Entre elas estatildeo as reaccedilotildees hemoliacuteticas poacutes-
transfusionais a doenccedila hemoliacutetica perinatal o uso de medicamentos e principalmente a
AHAI Na AHAI um anticorpo normalmente da classe IgG ou IgM reconhece antiacutegenos
proacuteprios na membrana eritrocitaacuteria e reduz a sobrevida da hemaacutecia levando a sua destruiccedilatildeo
pelos macroacutefagos no sistema reticulo-endotelial ou agrave ativaccedilatildeo do complexo de ataque agrave
membrana e agrave lise intravascular Os autoanticorpos satildeo voltados na maioria das vezes contra
antiacutegenos eritrocitaacuterios de alta frequecircncia populacional conhecidos como antiacutegenos puacuteblicos
e por este motivo reconhecem tanto hemaacutecias autoacutelogas quanto alogecircnicas
Devido agrave presenccedila do autoanticorpo livre no plasma e tambeacutem do anticorpo eou
complemento ligado agrave hemaacutecia o banco de sangue pode encontrar dificuldades em todas as
fases dos testes preacute-transfusionais do paciente com AHAI e deve utilizar teacutecnicas que
auxiliem na escolha do melhor hemocomponente melhorando a seguranccedila transfusional Essas
teacutecnicas visam remover a interferecircncia do autoanticorpo livre no soro e do autoanticorpo
ligado agrave hemaacutecia permitindo a detecccedilatildeo de aloanticorpos associados e a realizaccedilatildeo da
fenotipagem eritrocitaacuteria respectivamente
A finalizaccedilatildeo dos testes preacute-tranfusionais na presenccedila de autoanticorpo pode levar
algumas horas e nem sempre o paciente poderaacute aguardar Nesse contexto torna-se vantajosa a
aplicaccedilatildeo de teacutecnicas de raacutepida execuccedilatildeo
O presente estudo propotildee aplicar e avaliar a eficaacutecia da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
em remover os anticorpos ligados agrave hemaacutecia o que permite a fenotipagem eritrocitaacuteria
estendida e a seleccedilatildeo de concentrados de hemaacutecias com mesmo fenoacutetipo do paciente
Atualmente no Hemocentro de Ribeiratildeo Preto a teacutecnica utilizada para esse fim eacute o
tratamento das hemaacutecias com difosfato de cloroquina cujo tempo de execuccedilatildeo pode demorar
ateacute duas horas enquanto a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser realizada em apenas dois
minutos o que a tornaria opccedilatildeo de escolha especialmente em situaccedilotildees de urgecircncia Ao
contraacuterio da cloroquina a glicina-aacutecidaEDTA permite tambeacutem o estudo do eluato das
hemaacutecias tratadas
22
4 METODOL OGIA
41 AMOSTRAS DE DOADORES
Foram coletados 50 amostras de doadores de sangue que compareceram ao
Hemonuacutecleo de Araccedilatuba no periacuteodo de junho a agosto de 2016 Foram convidados a
participar da pesquisa doadores de repeticcedilatildeo do tipo sanguiacuteneo ldquoOrdquo RhD positivo
cadastrados no sistema de banco de sangue (SBS) do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto
Todos os doadores que concordaram em participar da pesquisa assinaram o termo de
consentimento livre e esclarecido (TCLE)
No momento da doaccedilatildeo foram coletados adicionalmente 5 mL de sangue total em
soluccedilatildeo anticoagulante EDTA (aacutecido dietilenoaminoaceacutetico) dispensando punccedilatildeo venosa
adicional para coleta da amostra O fluxograma 1 resume as etapas desenvolvidas no projeto
Fluxograma 1 - Fluxo da pesquisa utilizando as amostras de doadores
23
411 FENOTIPAGEM
Foram verificados se os doadores jaacute tinham fenotipagem para outros sistemas de
grupos sanguiacuteneos aleacutem do sistema ABORh que eacute realizado rotineiramente
A fenotipagem eritrocitaacuteria para outros sistemas ou fenotipagem estendida eacute realizada
para identificar a presenccedila ou ausecircncia de antiacutegenos considerados de importacircncia cliacutenica No
Hemonuacutecleo de Araccedilatuba uma parcela de doadores de repeticcedilatildeo satildeo fenotipados para os
antiacutegenos dos sistemas de grupo sanguiacuteneo Rh (antiacutegenos C c E e e) Kell (antiacutegeno K)
Duffy (antiacutegenos Fya e Fy
b) Kidd (antiacutegenos Jk
a e Jk
b) e sistema MNSs (antiacutegenos S e s)
A fenotipagem para o Rh e Kell eacute realizada por metodologia de microplaca utilizando
25 microL de hemaacutecia lavada e diluiacuteda a 5 em salina e 25 microL do antissoro comercial especiacutefico
A reaccedilatildeo eacute incubada 15 minutos a temperatura ambiente e centrifugadas para leitura Para os
antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s a metolodogia utilizado eacute gel contendo antiglobulina
humana (gel LissCoombs poliespeciacutefico) da marca BIO-RAD onde se utiliza suspensatildeo de
hemaacutecia em LISS (Soluccedilatildeo de baixa forccedila iocircnica) A suspensatildeo eacute preparada atraveacutes da
diluiccedilatildeo de 10 microL de hemaacutecia em 1000 microL de LISS Pipetado 50 microL dessa diluiccedilatildeo no gel e
adicionado 25 microL do antissoro especiacutefico Incuba-se em banho seco por 15 minutos a 37 deg
Celsius e eacute centrifugado em centriacutefuga especiacutefica Os antissoros utilizados eram das marcas
Fresenius e Lorne
Foi verificado a fenotipagem do doador no banco de dados do Hemocentro Os
registros dos fenoacutetipos dos doadores ficam armazenadas no sistema de banco de sangue
(SBS) Para doadores que natildeo tinham fenotipagem estendida preacutevia para antiacutegenos do sistema
Rh (C c E e e) e Kell (K) foi realizada a fenotipagem para esses antiacutegenos
O tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA e cloroquina para dissociar
anticorpos pode inativar enfraquecer ou destruir os antiacutegenos presentes nas hemaacutecias
alterando assim os resultados da fenotipagem Para verificar se houve destruiccedilatildeo dos
antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a e Jk
b S e s nas amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes
tratamento foram novamente fenotipadas ao final para os antiacutegenos que eram inicialmente
positivas
A repeticcedilatildeo da fenotipagem foi realizada nas amostras que apresentaram efetividade
no tratamento da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eou da cloroquina e a detecccedilatildeo do antiacutegeno
na amostra preacute-tratamento
24
412 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS HEMAacuteCIAS
As hemaacutecias foram sensibilizadas com antissoros policlonais humanos de amostras de
plasma fresco congelado de doadores com resultado de pesquisa de anticorpo irregular
positivos
A escolha do anticorpo para sensibilizar as hemaacutecias foi definida de acordo com o
fenoacutetipo do doador que deveria ser positivo para o respectivo antiacutegeno
Para a sensibilizaccedilatildeo um volume de antissoro (1 mL) e um volume (1 mL) de
hemaacutecias lavadas quatro vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica foram adicionadas a um tubo de 12 x
75 mm A mistura foi homogeneizada e incubada em banho maria (BM) a 37deg C por 60
minutos A seguir as hemaacutecias foram novamente lavadas 4 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica
para retirada dos anticorpos que natildeo se ligaram A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada
como controle negativo O teste da uacuteltima lavagem eacute importante para assegurar que os
anticorpos que poderatildeo ser detectados no eluato apoacutes o tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA
sejam aqueles que estavam ligados agraves hemaacutecias e natildeo aqueles livres no plasma O controle
negativo mostra que todo o anticorpo livre foi retirado (LEGER 2011)
Para o teste de presenccedila de anticorpo na soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foram incubadas
com hemaacutecias de triagem de anticorpos irregulares (ID-Diacell BIO-RAD) contendo os
antiacutegenos especiacuteficos Realizado a teacutecnica em gel LissCoombs com anti-IgG+C3d Incubado
no tempo de 15 minutos a temperatura de 37deg C e centrifugado 10 minutos em centriacutefuga
proacutepria
As 50 amostras de doadores foram sensibilizadas com os anticorpos policlonais
humanos
Apoacutes sensibilizadas rdquoin vitrordquo e lavadas as hemaacutecias foram diluiacutedas em soluccedilatildeo de
baixa forccedila iocircnica (LISS) na quantidade de 10 microL de hemaacutecia para 1000 microL de soluccedilatildeo A
suspensatildeo foi pipetada (50 microL) em coluna-gel-teste LissCoombs (BIO-RAD) que contecircm
antiglobulina poliespeciacutefico (IgG+C3d) e centrifugada em baixa rotaccedilatildeo conforme orientaccedilatildeo
do fabricante durante 10 minutos
As amostras deveriam apresentar aglutinaccedilatildeo com reatividade 3 a 4+ no TDA As
amostras que apresentaram reaccedilatildeo menor que 3+ foram novamente sensibilizadas com nova
aliacutequota do antissoro
25
413 TRATAMENTO DAS AMOSTRAS
As amostras sensibilizadas apresentando o TDA positivo 3 ou 4+ foram divididas em
duas aliacutequotas e submetidas a duas teacutecnicas diferentes com o objetivo de dissociar o anticorpo
ligado Uma aliacutequota da amostra foi tratada com soluccedilatildeo de difosfato de cloroquina enquanto
a outra aliacutequota foi tratada com glicina-aacutecidaEDTA
42 PREPARO DA GLICINA AacuteCIDA-EDTA
A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA utiliza 3 soluccedilotildees diferentes a glicina aacutecida o
EDTA e o tampatildeo TRIS
Os reagentes foram preparados utilizando os sais para anaacutelise (PA) de EDTA
(Na2EDTA2H2O) TRIS (C4H11NO3) Glicina (H2NCH2CO2H) NaCl e a soluccedilatildeo de aacutecido
cloriacutedrico (HCl) 12 N todos reagentes da marca SYNTH (quadro 1)
Para o preparo do tampatildeo glicina-acida eacute necessaacuterio o ajuste do pH para 15 Para esse
ajuste utiliza-se aacutecido cloriacutedrico (HCl) concentrado O pH foi medido com fitas reativas de pH
com escala de 1 a 14 da marca MERCK Posteriormente a soluccedilatildeo foi enviada ao laboratoacuterio
de controle de qualidade do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto e o pH medido no peagacircmetro O
tampatildeo glicina-aacutecida foi armazenado a 4deg e o tampatildeo tris e o EDTA em temperatura ambiente
controlada (20 a 24deg Celsius)
Apoacutes o preparo e durante a realizaccedilatildeo dos testes foram feitas inspeccedilotildees visuais para
verificaccedilatildeo de turvaccedilatildeo do meio e presenccedila de precipitados
Reagente Material Quantidade Preparo e
Conservaccedilatildeo
EDTA
EDTA
(Na2EDTA2H2O)
5 gramas Mistura ateacute
dissoluccedilatildeo do sal e
conserva em
temperatura ambiente Aacutegua Destilada 50 Ml
Tris
TRIS (C4H11NO3) 121 gramas Conservar em
temperatura ambiente NaCl 525g
Aacutegua destilada 100ml
Gliacutecina-aacutecida
Glicina
(H2NCH2CO2H) 15 gramas
Conservar a 4oC NaCl 116gramas
Aacutegua Destilada 200ml
HCL 12N Ajutar o pH para 15
Quadro 1 - Preparo dos Reagentes da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
Fonte - Manual teacutecnico AABB 2011
26
O tampatildeo glicina-aacutecida e o tampatildeo TRIS satildeo estaacuteveis por 7 meses O reagente EDTA
precipitou mesmo estando em temperatura em ambiente controlado Houve necessidade de
preparo de novo reagente
421 TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
1 Em um tubo de ensaio 12x75 mm eacute adicionado 08 mL da soluccedilatildeo de glicina-aacutecida A
esta soluccedilatildeo adiciona-se 02 mL de EDTA e mistura
2 Adiciona-se 02 mL de hemaacutecias sensibilizadas (lavada 4 vezes) A mistura eacute
homogeneizada e incubada por exatamente 2 minutos
3 A seguir 01 mL de tampatildeo TRIS eacute adicionado agrave mistura que eacute novamente
homogeneizada e centrifugada por 2 minutos a 3400 rpm O pH deve estar entre 7 a 75
4 Apoacutes centrifugaccedilatildeo separa-se em outro tubo o sobrenadante (eluato) e as hemaacutecias
que permanecem satildeo lavadas 4 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica para retirada de todo o
reagente e anticorpos livres
43 PREPARO DA CLOROQUINA
A cloroquina eacute diluiacuteda em tampatildeo PBS na concentraccedilatildeo de 20 (Quadro 2) e
armazenado a 4deg Celsius sua validade apoacutes o preparo eacute de 1 mecircs
A teacutecnica da cloroquina jaacute estaacute padronizada para rotina do laboratoacuterio de
imunohematologia do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto e suas unidades
Reagente Reagentes Quantidade PreparoConservaccedilatildeo
Cloroquina
Difosfato de cloroquina
(C18H32ClN3O8P2)
20 gramas
Conservar a 4deg Celsius
Tampatildeo PBS 100ml
NaOH 01 N Acertar o pH para
51
Quadro 2 - Preparo da Cloroquina Fonte - Manual teacutecnico da AABB 2011
431 TEacuteCNICA DA CLOROQUINA
1 4 partes da soluccedilatildeo pronta eacute adicionada a uma parte de hemaacutecias lavadas 4 vezes com
soluccedilatildeo fisioloacutegica
2 A mistura eacute incubada em temperatura ambiente por ateacute duas horas
3 Centrifugar a 3400 rpm por 2 minutos
27
4 Remover o sobrenadante lavar as hemaacutecias novamente com soluccedilatildeo fisioloacutegica 4
vezes
44 VERIFICACcedilAtildeO DA EFETIVIDADE DOS TESTES
Apoacutes tratamento pelas duas teacutecnicas o TDA foi repetido em todas as amostras para
verificar se os tratamentos foram efetivos e houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo Para as
amostras tratadas pela teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA que permaneceram com TDA positivo
novo tratamento foi realizado
45 TESTE DO ELUATO
O eluato resultante das amostras tratadas com glicina-acidaEDTA foi testado com
hemaacutecias de triagem A soluccedilatildeo do eluato foi incubada com as hemaacutecias de triagem de
anticorpos (ID-Diacell BIO-RAD) pela teacutecnica em gel LissCoombs O teste foi incubado 15
minutos a 37deg Celsius e centrifugado por 10 minutos em centrifuga proacutepria para a teacutecnica em
gel Os eluatos que apresentaram resultados positivos foram testados em painel de 11
hemaacutecias (ID-Diapanel BIO-RAD) para a identificaccedilatildeo do anticorpo
46 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente que apresentou TDA positivo por IgG e pesquisa
de anticorpo irregular positivo com presenccedila de autoanticorpo com reatividade panaglutinina
A amostra foi tratada em paralelo pelas duas teacutecnicas descritas e foi enviada para o
Hemocentro para genotipagem eritrocitaacuteria que foi realizado por metodologia PCR em tempo
real no equipamento Real-time system PCR 7500 ( Applied Biosystems Califoacuternia EUA)
28
5 RESULTADOS
51 REAGENTES
Para aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA satildeo necessaacuterios 3 diferentes
reagentes que podem ser encontrados em forma de kit pronto para uso No entanto esses kits
natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil Os reagentes satildeo tampatildeo glicina-aacutecida o EDTA e o tampatildeo
Tris
Todos os reagentes foram preparados rdquoin houserdquo a partir dos sais e soluccedilotildees PA (puro
para anaacutelise) da marca SYNTH que foram adquiridos para a pesquisa O custo estimado para
cada teste foi aproximadamente R$ 020 reais
Apoacutes o preparo os reagentes poderiam ser armazenados em condiccedilotildees adequadas pelo
periacuteodo de 1 ano (AABB 2011) Ao final do preparo e durante o periacuteodo de armazenamento
de fevereiro a setembro de 2016 foi realizada inspeccedilatildeo visual para verificar a presenccedila de
precipitados ou turvaccedilatildeo A soluccedilatildeo de glicina e o tampatildeo TRIS mostraram-se estaacuteveis ateacute o
final do periacuteodo Por sua vez o reagente EDTA precipitou mesmo estando armazenado em
temperatura ambiente controlada e foi necessaacuterio novo preparo
52 AMOSTRAS DE DOADORES
521 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS AMOSTRAS
Apoacutes incubaccedilatildeo da hemaacutecia com o antissoro a mesma foi lavada 4 vezes para retirada
dos anticorpos livres A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada Caso houvesse positividade na
soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem a etapa era repetida (figura 3) Das 50 amostras sensibilizadas a
uacuteltima lavagem foi positiva somente em 3 delas Nas 3 amostras o anticorpo utilizado para
sensibilizaccedilatildeo foi o anti-K Apoacutes repetido nova etapa de lavagem os resultados se
apresentaram negativos
Em todas as amostras sensibilizadas ldquoin vitrordquo o TDA foi testado e verificado a
intensidade do teste Entre as 50 amostras 47 alcanccedilaram TDA com intensidade 3-4+ apoacutes a
primeira sensibilizaccedilatildeo enquanto 3 amostras necessitaram uma segunda incubaccedilatildeo com
anticorpo (figura 4)
A escolha dos anticorpos para sensibilizar as hemaacutecias foi feita de acordo com o
fenoacutetipo do doador e foram utilizados sete diferentes especificidades de anticorpos policlonais
humanos conforme mostra o graacutefico1
29
Figura 3 - Soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada com hemaacutecia de triagem de
anticorpos em gel LissCoombs (BIO-RAD) A finalidade eacute verificar a presenccedila de anticorpos livres na
suspensatildeo que possam interferir na pesquisa do eluato As soluccedilotildees de lavagem das amostras na figura a tiveram
resultados negativos Na figura b duas amostras a 47 e 50 apresentaram resultado positivo Nova etapa de
lavagem foi realizada e o resultado final foi negativo
522 TRATAMENTO DAS HEMAacuteCIAS
Apoacutes a sensibilizaccedilatildeo e obtenccedilatildeo de resultados de TDA com intensidade de 3 a 4+
cada uma das amostras foi dividida em duas aliacutequotas e tratada separadamente pelas teacutecnicas
de glicinaaacutecida-EDTA e cloroquina
As teacutecnicas foram consideradas efetivas quando obteve-se a completa dissociaccedilatildeo do
anticorpo verificada atraveacutes do TDA negativo na amostra poacutes tratamento conforme figuras 5
e 6 Dentre as amostras tratadas com cloroquina 2850 tiveram o TDA negativado A glicina-
aacutecidaEDTA negativou o TDA em 33 das 50 amostras tratadas Apenas 17 amostras tratadas
com glicina-aacutecidaEDTA permaneceram com o TDA positivo e foram submetidas a um novo
tratamento
30
Figura 4 - TDA das amostras apoacutes sensibilizaccedilatildeo com anticorpos policlonais humanos Amostras na
figura a com intensidades de 3-4+ Na figura b amostras 4 e 7 com intensidade menor que 3+ e portanto foram
novamente sensibilizadas com nova aliacutequota de soro Anti-D e anti-S Apoacutes a segunda sensibilizaccedilatildeo
apresentaram reatividade 4 e 3+ respectivamente Os anticorpos utilizados para sensibilizaccedilatildeo foram D S c E
C e K
523 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS TEacuteCNICAS
No tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA houve dissociaccedilatildeo completa do anticorpo
em 33 amostras (66) das 50 amostras testadas enquanto que com a cloroquina foram 28
amostras (56) (tabela 1)
31
Graacutefico 1- Nuacutemero de amostras sesnsibilizadas por especificidade de anticorpo Entre as 50 amostras 12
foram sensibilizadas com anti-D 10 com anti-C 9 com anti-E 8 com anti-c 7 com anti-S 3 com anti-K e 1
com anti-Dia As especificidades dos anticorpos foram definidas de acordo o fenoacutetipo do doador
Figura 5 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com cloroquina Nas amostras onde houve
a dissociaccedilatildeo do anticorpo ( 2 21 a 23 26 39 a 42 45 46 e 49) a hemaacutecia se deposita no fundo no microtubo
apoacutes a centrifugaccedilatildeo (TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (1 3 24 25 43 44 47
48 e 50) o anticorpo ligado agraves hemaacutecias eacute alvo da AGH presente no gel (TDA positivo)
Anti-D 12
Anti-C 10
Anti-E 9
Anti-c 8
Anti-S 7
Anti-K 3 Anti-Dia 1
32
Figura 6 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA Nas amostras
onde houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo (4 6 7 12 a 15 17 34 35 37 e 38) a hemaacutecia se deposita no fundo no
microtubo apoacutes a centrifugaccedilatildeo ( TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (5 16 18
19 20 33 e 36 ) o AGH presente no gel se liga ao anticorpo ligado agraves hemaacutecias que ficam retidas no gel (TDA
positivo)
Tabela 1-Resultado geral do tratamento das hemaacutecias com glicina e cloroquina
Teacutecnica utilizada TDA negativo TDA positivo Total
Glicina-aacutecidaEDTA 33 17 50
Cloroquina 28 22 50
A glicina-aacutecidaEDTA conseguiu negativar mais amostras sensibilizadas com Anti-D
e anti-K que a cloroquina Para as hemaacutecias sensibilizadas com anti-E Anti-S e Anti-Dia
ambas as teacutecnicas dissociaram o anticorpo em 100 das amostras Os resultados detalhados
por especificidade do anticorpo apoacutes o primeiro tratamento com glicina-aacutecidaEDTA e com
cloroquina estatildeo na tabela 2
Para as amostras que permaneceram positivas (17 amostras) apoacutes o tratamento com a
glicina-aacutecidaEDTA foi realizado um novo tratamento Houve dissociaccedilatildeo do anticorpo em 3
amostras (18) apoacutes a segunda tentativa Nas demais 14 (82) amostras tratadas pela
segunda vez 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise
33
Tabela 2 - Resultados do TDA apoacutes tratamento das hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo
sensibilizado
ANTICORPOS
SENSIBILIZADOS
1ordm TRATAMENTO COM
GLICINA
TRATAMENTO COM
CLOROQUINA
TOTAL TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
Anti-D 8 4 0 12 12
Anti-C 6 4 10 0 10
Anti-E 9 0 9 0 9
Anti-c 0 8 1 7 8
Anti-S 7 0 7 0 7
Anti-K 2 1 0 3 3
Anti-Dia 1 0 1 0 1
TOTAL 33 17 28 22 50
A hemoacutelise foi verificada durante o procedimento de lavagem final das hemaacutecias com
soluccedilatildeo fisioloacutegica para a retirada dos reagentes As soluccedilotildees de lavagem ficaram
avermelhadas e as hemaacutecias com coloraccedilatildeo escura As amostras foram descartadas Dentre as
6 amostras que ainda puderam ser testadas para o TDA trecircs amostras negativaram sendo 1
sensibilizada com anti-D e 2 com anti-C (tabela 3)
Tabela 3 - Resultado apoacutes o segundo tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA
Tratamento com
glicina-aacutecidaEDTA
TDA Negativo TDA Positvo Hemoacutelise Total
Segundo tratamento 3 3 11 17
524 TESTAGEM DO ELUATO
Apoacutes o tratamento com a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA a soluccedilatildeo do eluato foi
testada para verificar a viabilidade dos anticorpos que foram dissociados ou eluiacutedos Dentre
as 50 amostras 41 apresentaram eluato positivo As nove amostras cujos eluatos foram
negativos haviam sido sensibilizadas com as seguintes especificidades de anticorpos anti-E 6
amostras (67) anti-S 2 amostras (40) e anti-D 1 amostra (8) (tabela 4) O eluato de
todas as amostras sensibilizadas com os anticorpos anti-C anti-c Anti-K e Anti-Dia foram
positivos Os eluatos positivos na triagem de anticorpos foram testados com paineacuteis de
identificaccedilatildeo para confirmar a especificidade e a viabilidade dos anticorpos (figuras 7 e 8)
34
525 EFEITO DA ELUICcedilAtildeO SOBRE OS ANTIacuteGENOS ERITROCITAacuteRIOS
Para verificar o efeito do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA e com a cloroquina
sobre a expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s foi realizada a fenotipagem das
amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes tratamento com ambas as teacutecnicas Foi avaliado
se o tratamento destruiu os antiacutegenos expressos antes do tratamento
Tabela 4- Resultado do Eluato das amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA
Anticorpos Eluato positvo Eluato negativo Total
Anti-D 11 1 12
Anti-C 10 0 10
Anti-E 3 6 9
Anti-c 8 0 8
Anti-S 5 2 7
Anti-K 3 0 3
Anti-Dia 1 0 1
Total 41 9 50
Figura 7 ndash Painel do eluato da amostra 21 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-C que foi
recuperado no eluato
Figura 8 ndash Painel do eluato da amostra 47 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-K que foi
recuperado no eluato
35
Dentre as 50 amostras 26 eram previamente fenotipadas para os antiacutegenos Fya Fy
b
Jka Jk
b S e s Dentre elas 20 alcanccedilaram TDA negativo apoacutes tratamento com a glicina-
aacutecidaEDTA e 20 negativaram apoacutes tratamento com cloroquina (tabela 5) Apoacutes ambas as
teacutecnicas os antiacutegenos originalmente expressos permaneceram positivos comprovando que natildeo
houve destruiccedilatildeo dos mesmos
Tabela 5 ndash Verificaccedilatildeo da interferecircncia do tratamento da hemaacutecias com cloroquina e glicina-
aacuteicdaEDTA sobre os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
AMOSTRAS
COM
FENOTIPAGEM
PREacuteVIA
TRATADAS COM
CLOROQUINA
TRATADAS COM
GLICINA
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
26
20
20
20
20
As amostras 24 47 e 50 eram positivas para o antiacutegeno K A cloroquina natildeo dissociou
o anticorpo em nenhuma das 3 amostras enquanto a glicina-aacutecidaEDTA foi efetiva nas
amostras 24 e 50 Foi testada a expressatildeo do antiacutegeno K nas amostras 24 e 50 apoacutes o
tratamento utilizando meacutetodo indireto em gel contendo AGH Apesar de natildeo ter sido avaliado
a intensidade de reaccedilatildeo de expressatildeo dos antiacutegenos podemos verificar na figura 9 que nas
duas amostras em que a teacutecnica foi efetiva e dissociou o anticorpo a expressatildeo do antiacutegeno K
continua presente mas a reatividade observada pode ser considerada 1+ sugerindo que houve
diminuiccedilatildeo da expressatildeo do antiacutegeno quando comparado com a expressatildeo observada em
hemaacutecia natildeo tratada
Os resultados individuais de cada amostra em ambas as teacutecnicas encontram-se
resumidas na tabela 6
526 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente onde foi constatada a presenccedila de autoanticorpo
a quente da classe IgG pelo TDA monoespeciacutefico (figura 10)O autoanticorpo tambeacutem
interferia na pesquisa e identificaccedilatildeo de anticorpos irregulares pois apresentava caracteriacutestica
de panaglutinina As hemaacutecias da paciente sensibilizadas ldquoin vivordquo foram tratadas com
cloroquina e com glicina-aacutecidaEDTA
36
Figura 9 ndash Fenotipagem das amostras 24 e 50 para antiacutegeno K apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
O teste positivo indica a presenccedila do antiacutegeno poreacutem a reatividade fraca (1+) sugere que houve enfraquecimento
de sua expressatildeo A direita a expressatildeo forte (4+) do antiacutegeno Kell em hemaacutecia controle natildeo tratada utilizada
como controle positivo
A cloroquina natildeo foi efetiva na retirada do anticorpo ligado as hemaacutecias ao contraacuterio
do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA que dissociou o anticorpo (figura 11)
A hemaacutecia tratada com glicina foi fenotipada para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
(figura 12) A fenotipagem para o sistema Rh (C c E e e) e Kell foi realizada em gel
especiacutefico monoclonal sem interferecircncia do TDA positivo (controle da reaccedilatildeo negativo)
O eluato resultante do tratamento com glicina-aacutecidaEDTA foi testada em gel com
hemaacutecias de painel de identificaccedilatildeo de anticorpos e apresentou resultado positivo com todas
as ceacutelulas (figura 13 e 14)
A amostra foi enviada para genotipagem e o resultado da genotipagem confirmou o
resultado da fenotipagem apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
527 TEMPO DE EXECUCcedilAtildeO DA TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
O tempo de reaccedilatildeo da glicina-aacutecidaEDTA eacute de 2 minutos Todas as amostras foram
tratadas obedecendo ao tempo descrito na literatura demonstrando que o mesmo eacute
reprodutiacutevel
37
Tabela 6- Resultados individuais por amostra
Amostra Especificidade
dos anticorpos
Intensidade do
TDA apoacutes
sensibilizaccedilatildeo
Tratamento
efetivo com
cloroquina
Tratamento
efetivo com
glicina
Eluato
poacutes
glicina
1 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 2 Dia 3+ Sim Sim 3+ 3 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 4 D 4+ Natildeo Sim 4+ 5 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 6 E 3+ Sim Sim Negativo 7 S 4+ Sim Sim 3+ 8 E 3+ Sim Sim 1+ 9 E 3+ Sim Sim 2+
10 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 11 D 4+ Natildeo Sim 4+ 12 D 4+ Natildeo Sim 4+ 13 S 3+ Sim Sim 3+ 14 S 3+ Sim Sim 3+ 15 D 3+ Natildeo Sim 3+ 16 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 17 E 3+ Sim Sim (+) 18 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 19 D 4+ Natildeo Natildeo 3+ 20 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 21 C 3+ Sim Sim 4+ 22 C 3+ Sim Sim 4+ 23 C 3+ Sim Sim 4+ 24 K 4+ Natildeo Sim 4+ 25 D 3+ Natildeo Natildeo Negativo 26 E 4+ Sim Sim Negativo 27 S 3+ Sim Sim 3+ 28 C 3+ Sim Natildeo 4+ 29 C 3+ Sim Sim 4+ 30 C 3+ Sim Sim 4+ 31 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 32 E 3+ Sim Sim Negativo 33 C 3+ Sim Natildeo 4+ 34 S 3+ Sim Sim Negativo 35 S 3+ Sim Sim Negativo 36 C 4+ Sim Natildeo 4+ 37 c 4+ Natildeo Natildeo 4+ 38 D 4+ Natildeo Sim 4+ 39 S 3+ Sim Sim 3+ 40 c 4+ Sim Natildeo 2+ 41 C 4+ Sim Natildeo 4+ 42 E 3+ Sim Sim Negativo 43 D 3+ Natildeo Sim 2+ 44 D 3+ Natildeo Sim 2+ 45 E 3+ Sim Sim Negativo 46 C 3+ Sim Sim 4+ 47 K 4+ Natildeo Natildeo 4+ 48 D 3+ Natildeo Sim 2+ 49 E 3+ Sim Sim Negativo 50 K 4+ Natildeo Sim 4+
TOTAL 50 28 33 41
38
Figura 10 ndash TDA monoespeciacutefico da amostra de paciente Hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo da classe
IgG
oacute Figura 11 ndash TDA apoacutes o tratamento com glicina-aacutecidaEDTA (esquerda) e cloroquina (direita) A glicina
negativou completamente o TDA enquanto a hemaacutecia tratada com cloroquina persistiu positiva (1+)
39
Figura 12 ndash Fenotipagem da amostra tratada com glicina-aacutecidaEDTA Fy(a+b+) Jk(a-b+) S+s+
Figura 13 ndash Painel em gel (LissAGH) do eluato apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de
intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
Figura 14 ndash ndash Painel ezimaacutetico (hemaacutecias tratadas com bromelina) do eluato em gel neutro apoacutes
tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
40
528 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Quanto a efetividade das teacutecnicas em negativar o TDA foi verificado que a glicina-
aacutecidaEDTA foi efetiva em 66 das amostras testadas no primeiro tratamento (3350
amostras) enquanto a cloroquina conseguiu negativar 56 (2850) Esses resultados natildeo
apresentam diferenccedila significativa (pgt005) demostrando que a teacutecnica da glicina-
aacutecidaEDTA natildeo eacute superior mas eacute tatildeo efetiva quanto a da cloroquina
Quando aliamos os resultados de ambas as teacutecnicas verificamos que em 76 (3850)
das amostras o TDA foi negativado Esse dado indica que ainda que uma teacutecnica natildeo seja
eficaz na remoccedilatildeo do anticorpo eacute uma boa alternativa tentar a segunda teacutecnica jaacute que a falha
em remover o anticorpo utilizando uma delas natildeo prevecirc necessariamente a falha com a outra
Quando se utiliza o teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla (graacutefico 2) para comparar a utilizaccedilatildeo das
duas teacutecnicas com o resultado de cada uma isolada (somente a cloroquina ou somente a
glicina) verificamos que os resultados apresentam diferenccedila significativa (plt005) (quadro 3)
TRATAMENTO EFETIVO COM TOTAL PORCENTAGEM
Glicina ou cloroquina 38 76
Glicina e cloroquina 23 46
Glicina apenas 10 20
Cloroquina apenas 5 10
Nenhuma das teacutecnicas 12 24
Quadro 3 - Resultados comparativos entre as teacutecnicas utilizadas
41
Graacutefico 2 - Teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla entre as teacutecnicas aplicadas A- Glicina e Cloroquina B-Cloroquina C-
Glicina ( plt005)
42
6 DISCUSSAtildeO
Os reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA podem ser adquiridos em
forma de kit comercial prontos para uso poreacutem natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil A preparaccedilatildeo
dos reagentes ldquoin houserdquo a partir de sais comerciais adquiridos se mostrou viaacutevel Os
reagentes glicina e o tampatildeo Tris armazenados de forma correta se mantiveram estaacuteveis por
um periacuteodo de 7 meses Somente o reagente EDTA precipitou mesmo armazenado em
condiccedilotildees adequadas sugerindo que o mesmo deve ser preparado em menor quantidade e
armazenado em aliacutequotas A soluccedilatildeo de cloroquina tambeacutem pode ser preparada ldquoin houserdquo e
pode ser armazenado por um mecircs A legislaccedilatildeo brasileira autoriza a utilizaccedilatildeo de reagentes
preparados a partir de sais comerciais como a cloroquina e a glicina-aacutecidaEDTA desde que
os sais tenham autorizaccedilatildeo da vigilacircncia sanitaacuteria para a comercializaccedilatildeo (BRASIL 2001)
A comparaccedilatildeo quanto a efetividade em dissociar anticorpos em amostras com TDA
positivos entre a teacutecnica da glicina e a teacutecnica da cloroquina mostrou que natildeo haacute diferenccedila
estatiacutestica entre elas e que ambas satildeo igualmente eficientes Se utilizadas conjuntamente haacute
maior possibilidade de elucidaccedilatildeo dos casos
Uma vantagem da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eacute que ela permite numa mesma
amostra eluir o anticorpo ligado aacute hemaacutecia assim como fenotipar a hemaacutecia tratada Devido a
sua dupla utilidade a teacutecnica eacute vantajosa principalmente em pacientes em que pouco volume
de amostra pode ser coletado como em casos de crianccedilas e receacutem-nascidos
A fenotipagem poacutes tratamento se mostrou viaacutevel jaacute que os antiacutegenos de maior
importacircncia natildeo sofreram alteraccedilotildees Nas 20 amostras que foram fenotipadas antes e apoacutes
tratamento para verificar a influecircncia dos reagentes na expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a
Jkb S e s natildeo houve destruiccedilatildeo dos mesmos por nenhuma das duas teacutecnicas
Para as amostras positivas para o antiacutegeno Kell (350) e sensibilizadas com o
respectivo anticorpo a teacutecnica da glicina foi efetiva em negativar o TDA em apenas duas
delas mas apoacutes o tratamento foi verificada uma fraca reatividade da reaccedilatildeo antiacutegeno-
anticorpo sugerindo que houve um enfraquecimento da expressatildeo do antiacutegeno conforme
esperado e descrito na literatura (BYRNE 1991 PALLAS WILER E MCGEE 1991
ROZIERS e SQUALI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012 e KATHARIA e
CHAUDHARY 2013) A accedilatildeo da glicina sobre o antigeno Kell natildeo representa impedimento
para seu uso uma vez que na impossibilidade de testar o antiacutegeno Kell o banco de sangue
consegue facilmente atender a solicitaccedilatildeo de transfusatildeo com unidades de hemaacutecias Kell
43
negativas jaacute que eacute um antiacutegeno de baixa prevalecircncia na populaccedilatildeo variando de 15 na
populaccedilatildeo africana a 9 nos europeus (DANIELS 2011)
A soluccedilatildeo resultante da dissociaccedilatildeo do anticorpo pela teacutecnica da glicina pode ainda ser
utilizada como eluato podendo substituir a teacutecnica de eluiccedilatildeo com reagentes comercias (kits
de eluiccedilatildeo aacutecida) que tem alto custo aproximadamente entre R$2000 a R$2500 por teste
Em 41 amostras (82) houve a dissociaccedilatildeo e recuperaccedilatildeo do anticorpo que estava
sensibilizando as hemaacutecias Em 9 amostras (18) os anticorpos foram eluiacutedos poreacutem
apresentaram reaccedilatildeo negativa quando testadas com hemaacutecias de triagem entre eles o anti-E
(6) anti-S (2) e Anti-D (1) Eacute possiacutevel que a correccedilatildeo pH do meio (WALKER 2011) natildeo
tenha sido adequada o que pode ter desfavorecido a reatividade do anticorpo
Para as amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA nas quais natildeo houve dissociaccedilatildeo do
anticorpo pelo primeiro tratamento (1750) o segundo tratamento natildeo se mostrou eficaz jaacute
que 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise O tempo de
armazenagem natildeo parece ter influenciado jaacute que todas as amostras foram testadas dentro de
48 horas apoacutes a coleta Outros fatores que natildeo foram verificados podem ter levado a
hemoacutelise Apesar da literatura (LOUIE JIENG e ZEROULIS 1986 e BYRNE 1991)
recomendar um segundo tratamento ele eacute pouco eficaz tendo negativado apenas 3 das 17
amostras testadas
A amostra de paciente que apresentou sensibilizaccedilatildeo ldquoin vivordquo mostrou melhor
efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA sobre a da cloroquina possibilitando
fenotipagem para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s que natildeo foram destruiacutedos apoacutes o
tratamento comprovado atraveacutes da genotipagem
A presenccedila de autoanticorpo a quente com presenccedila de hemoacutelise (AHAI) ou natildeo pode
mascarar a presenccedila de aloanticorpo interferindo na rotina soroloacutegica da fenotipagem que eacute
uma importante ferramenta para auxiliar na seleccedilatildeo de hemaacutecias para transfusatildeo (SHIREY et
al 2002) Esses pacientes frequentemente possuem aloanticorpos associados ao
autoanticorpo e a prevalecircncia de aloimunizaccedilatildeo entre eles varia entre 12 a 40 (LEGER e
GARRATY 1999 BRANCH e PETZ 1999) o que dificulta ainda mais a escolha do melhor
componente a ser transfundido aleacutem de aumentar a possibilidade reaccedilotildees hemoliacuteticas imunes
poacutes-transfusionais
Nesses casos as teacutecnicas de dissociaccedilatildeo de anticorpos satildeo importantes para tratar
amostras de pacientes e a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser usada como uma opccedilatildeo
pois se mostrou eficaz na dissociaccedilatildeo anticorpo ligado agraves hemaacutecias deixando livre a
superfiacutecie das mesmas permitindo a fenotipagem por antisoros IgG Paralelamente os
44
anticorpos eluiacutedos tambeacutem puderam ser estudados O mesmo natildeo ocorre com a cloroquina
que permite apenas a fenotipagem e tampouco com os kits de eluiccedilatildeo aacutecida disponiacuteveis no
mercado nacional que satildeo destinados a realizaccedilatildeo do eluato mas destroem as hemaacutecias
O tempo de tratamento na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA tambeacutem eacute uma vantagem
pois foi possiacutevel reproduzir no tempo determinado de 2 minutos enquanto a cloroquina
demora ateacute duas horas
Ainda que a aplicaccedilatildeo das teacutecnicas por biologia molecular estejam cada vez mais
presentes na rotina imuno-hematoloacutegica e possibilitam estabelecer o fenoacutetipo deduzido do
genoacutetipo elas natildeo estatildeo disponiacuteveis na maioria dos centros e sua realizaccedilatildeo exige algumas
horas A resoluccedilatildeo imediata do problema transfusional necessita dos resultados soroloacutegicos
pois com frequecircncia natildeo eacute possiacutevel aguardar o resultado do teste molecular Dessa forma
apesar da crescente importacircncia da genotipagem eritrocitaacuteria teacutecnicas soroloacutegicas aplicadas
corretamente e no momento propiacutecio satildeo de grande utilidade para resolver problemas imuno-
hematoloacutegicos como ocorre com a fenotipagem em pacientes com TDA positivo
45
7 CONCLUSAtildeO
A teacutecnica da glicina aacutecidaEDTA mostrou-se efetiva em remover os anticorpos que
sensibilizavam as hemaacutecias e pode ser utilizada com seguranccedila antes da fenotipagem
eritrocitaacuteria Por ser uma teacutecnica de raacutepida execuccedilatildeo eacute uma alternativa aplicaacutevel
principalmente em casos urgentes de pacientes que apresentam autoanticorpos
46
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50
9 ANEXOS
51
FUNDACcedilAtildeO HEMOCENTRO DE RIBEIRAtildeO PRETO
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE)
Tiacutetulo da pesquisa Aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina aacutecida-EDTA e avaliaccedilatildeo da
eficaacutecia no tratamento de hemaacutecias com teste direto da antiglobulina positivo
Pesquisadora responsaacutevel Ceacutelia Kazue Abiko
Orientador Prof Dimas Tadeu Covas
Co-orientadora Dra Flaacutevia Leite Souza Santos
Objetivo da pesquisa Vocecirc estaacute sendo convidado a participar de uma pesquisa que tem
como objetivo padronizar uma nova teacutecnica para auxiliar na tipagem sanguiacutenea de pacientes
A tipagem sanguiacutenea pode sofrer interferecircncia da presenccedila de anticorpos ligados aos gloacutebulos
vermelhos do sangue Nessas situaccedilotildees eacute difiacutecil selecionar o melhor sangue para o paciente e
eacute preciso a utilizaccedilatildeo de teacutecnicas adicionais para remover essas interferecircncias
Esta pesquisa tem como objetivo estudar outra teacutecnica para remover esses anticorpos e
comparaacute-la com a teacutecnica atualmente utilizada Para isso precisamos de amostras de pacientes
e doadores voluntaacuterios
Se vocecirc eacute um doador eacute necessaacuterio que vocecirc autorize a coleta de 5 ml (1 tubo) a mais
de seu sangue
Se vocecirc eacute um paciente natildeo haveraacute necessidade de nova amostra pois utilizaremos as
amostras jaacute coletadas para os testes preacute-transfusionais e os resultados encontrados nesta
pesquisa natildeo iratildeo interferir na escolha da (s) bolsa (s) de sangue que vocecirc possa vir a receber
Se vocecirc concordar em participar leia com atenccedilatildeo o texto abaixo e assine as duas vias
rubricando todas as paacuteginas deste termo de consentimento Uma via original assinada e
rubricada por vocecirc e pela pesquisadora ficaraacute com vocecirc
As suas informaccedilotildees seratildeo mantidas em sigilo pela pesquisadora e natildeo haveraacute
armazenamento de material para pesquisas posteriores Os seus dados seratildeo usados apenas
neste estudo e quando o trabalho for publicado seu nome e qualquer outra informaccedilatildeo que
possam identificaacute-lo natildeo seratildeo revelados
Eacute pouco provaacutevel que o que noacutes aprendermos com este estudo tenha um benefiacutecio
direto para vocecirc assim como natildeo poderemos dar nada em troca pela sua participaccedilatildeo na
pesquisa
Nosso objetivo com esta pesquisa eacute que os resultados poderatildeo ser uacuteteis para o
tratamento de pacientes no futuro Os riscos da participaccedilatildeo satildeo miacutenimos Se vocecirc eacute um
doador de sangue a amostra seraacute coletada no momento da doaccedilatildeo natildeo exigindo punccedilatildeo
venosa adicional
52
Eacute seu direito ter acesso aos resultados dos testes da pesquisa Esses resultados natildeo
seratildeo fornecidos automaticamente a vocecirc mas caso vocecirc se interesse em saber o resultado ou
tiver alguma duacutevida sobre a sua participaccedilatildeo neste estudo deveraacute entrar em contato com Ceacutelia
Kazue Abiko pelo telefone (18) 99718-3551
Vocecirc tem total liberdade de optar por natildeo participar da pesquisa Caso aceite
participar poderaacute desistir a qualquer momento ou retirar seu consentimento mesmo apoacutes ter
coletado o sangue Para cancelar sua participaccedilatildeo basta avisar a pesquisadora e os seus dados
seratildeo retirados do projeto
Qualquer duacutevida eacutetica sobre a pesquisa poderaacute entrar em contato com o Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa do Hospital das Cliacutenicas e da Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto
(CAMPUS UNIVERSITAacuteRIO bairro Monte Alegre CEP 14048-900 Ribeiratildeo Preto-SP
Telefone (16) 3602-2228 FAX (16) 3633-1144 e-mail cephcrpuspbr)
Consentimento de participaccedilatildeo
A Consentimento do participante
Li as informaccedilotildees acima sobre o estudo e recebi explicaccedilotildees sobre a participaccedilatildeo no estudo
Portanto dou o meu consentimento para participar do estudo
___________________________________________________________________________
Nome completo
___________________________________________________________________________
Assinatura
___________
Data
__________________________________________________________________________________
Nome completo da pesquisadora
___________________________________________________________________________
Assinatura
_____________
Data
3
Anti-A e Anti-B A prova reversa por sua vez pesquisa a presenccedila de anticorpos ABO ao
testar o soro ou plasma do pacientedoador com hemaacutecias A1 e B Ambas as provas satildeo
obrigatoacuterias e devem ser concordantes para interpretaccedilatildeo do fenoacutetipo ABO (COOLING
2011 SANTOS 2014)
O sistema Rh (ISBT004) eacute o maior e mais complexo sistema de grupos sanguiacuteneos
compreendendo atualmente 54 antiacutegenos (ISBT 2016) Satildeo cinco os principais antiacutegenos do
sistema Rh D (RH1) C (RH2) E (RH3) c (RH4) e e (RH5) Esses antiacutegenos possuem alta
capacidade imunogecircnica e seus respectivos anticorpos estatildeo envolvidos na doenccedila hemoliacutetica
perinatal e em reaccedilotildees transfusionais hemoliacuteticas Os autoanticorpos quentes como ocorre na
anemia hemoliacutetica quente satildeo representados em grande parte por anticorpos contra antiacutegenos
puacuteblicos do sistema Rh (CASTILHO 2007 CHOU e WESTHOFF 2011 BARJAS-
CASTRO 2013) A tipagem RhD pesquisa o antiacutegeno D na membrana eritrocitaacuteria ao testar a
hemaacutecia com antissoros comerciais Atualmente a maior parte dos soros Anti-D
comercializados satildeo monoclonais
112 ANTICORPOS ANTI-ERITROCITAacuteRIOS
Anticorpos satildeo proteiacutenas presentes no plasma tambeacutem denominadas imunoglobulinas
Satildeo produzidas pelo sistema imune em resposta a um determinado antiacutegeno Podem ser
classificadas de acordo com suas caracteriacutesticas e propriedades em cinco classes de
imunoglobulinas IgG IgM IgA IgE e IgD (BARJAS-CASTRO 2013)
A ligaccedilatildeo entre o antiacutegeno e o anticorpo envolvem ligaccedilotildees natildeo covalentes que satildeo
reversiacuteveis Vaacuterios tipos de interaccedilotildees natildeo covalentes podem contribuir para a ligaccedilatildeo do
antiacutegeno pelo anticorpo incluindo forccedilas eletrostaacuteticas pontes de hidrogecircnio forccedilas de Van
der Walls e interaccedilotildees hidrofoacutebicas (ABBAS LICHTMAN e PILLAI 2008)
As interaccedilotildees antiacutegeno-anticorpo satildeo constituiacutedas por ligaccedilotildees dinacircmicas que sofrem
interferecircncia de alteraccedilotildees fiacutesico-quiacutemicas no meio como mudanccedilas na temperatura na forccedila
eletrostaacutetica na concentraccedilatildeo do antiacutegeno e do anticorpo e no pH O melhor pH para a reaccedilatildeo
eacute em torno de 70 no entanto raros anticorpos podem exigir acidificaccedilatildeo do meio para serem
identificados (SANTOS 2014)
Em imunohematologia satildeo pesquisados os anticorpos que reconhecem os antiacutegenos
eritrocitaacuterios de grupo sanguiacuteneo ldquoin vivordquo esses anticorpos dependendo de seu significado
cliacutenico satildeo capazes de reconhecer seus respectivos antiacutegenos sobre a hemaacutecia podendo levar
a sua destruiccedilatildeo por dois mecanismos fagocitose por macroacutefagos no sistema
4
reticuloendotelial ou por ativaccedilatildeo do sistema complemento com a formaccedilatildeo do complexo de
ataque a membrana e hemoacutelise intravascular As duas classes de anticorpos de maior
importacircncia em imunohematologia satildeo as imunoglobulinas IgG e a IgM (SANTOS 2014)
Devido a sua estrutura pentameacuterica os anticorpos da classe IgM se ligam aos
antiacutegenos localizados na superfiacutecie da membrana de hemaacutecias proacuteximas e promovem
aglutinaccedilatildeo das mesmas em meio salino ldquoin vitrordquo Anticorpos da classe IgG por sua vez
satildeo denominados ldquonatildeo aglutinantesrdquo ou ldquoincompletosrdquo pois sua estrutura de monocircmero eacute
pequena o que desfavorece a aglutinaccedilatildeo direta uma vez que uma mesma moleacutecula de IgG
natildeo alcanccedila antiacutegenos alvos em duas hemaacutecias proacuteximas Os anticorpos IgM aleacutem de terem
um tamanho maior apresentam 750 vezes maior eficiecircncia de aglutinaccedilatildeo que os anticorpos
IgG permitindo maior facilidade nas ligaccedilotildees entre as hemaacutecias (CARRUCIO e WISE 2012
GREEN e KLOSTERMANN 2012)
Nos testes ldquoin vitrordquo satildeo simulados reaccedilotildees que poderiam ocorrer ldquoin vivordquo causando
reaccedilotildees indesejaacuteveis A fase de sensibilizaccedilatildeo em que o anticorpo se liga ao antiacutegeno
correspondente natildeo eacute identificada macroscopicamente poreacutem uma vez que o anticorpo
aproxima as hemaacutecias e vence a forccedila eletrostaacutetica que naturalmente as repele chamada de
potencial zeta ocorre a aglutinaccedilatildeo Dependendo das caracteriacutesticas do anticorpo e de sua
capacidade de fixar complemento pode ocorrer tambeacutem a hemoacutelise (SANTOS 2014)
113 PESQUISA E IDENTIFICACcedilAtildeO DE ANTICORPOS IRREGULARES
A pesquisa de anticorpos irregulares eacute teste obrigatoacuterio nos testes preacute-transfusionais e
tem a finalidade de detectar anticorpos ldquoin vitrordquo que possam causar reaccedilatildeo ldquoin vivordquo
Dependendo da populaccedilatildeo estudada (pacientes x doadores) e ainda da sensibilidade do
teste a frequecircncia de anticorpos irregulares pode variar de 03 a 38 A imunizaccedilatildeo pode
ocorrer por transfusatildeo gestaccedilatildeo transplante ou injeccedilatildeo de material imunogecircnico (WALKER
2011)
Os anticorpos irregulares podem ser classificados como aloanticorpos que satildeo
voltados contra antiacutegenos ausentes na hemaacutecia autoacuteloga ou como autoanticorpos os quais
reconhecem antiacutegenos eritrocitaacuterios proacuteprios Os autoanticorpos antieritrocitaacuterios surgem em
decorrecircncia da desregulaccedilatildeo da autotoleracircncia imune relacionada agrave condiccedilotildees diversas como
doenccedilas hematoloacutegicas doenccedilas inflamatoacuterias autoimunes neoplasias infecccedilotildees e uso de
medicaccedilotildees A presenccedila do autoanticorpo associado a um quadro de anemia hemoliacutetica
caracteriza a anemia hemoliacutetica autoimune (AHAI) seja ela primaacuteria ou secundaacuteria agrave outra
5
patologia Ateacute 12 a 40 dos pacientes com autoanticorpos quentes podem apresentar
aloanticorpos de significado cliacutenico mascarados pelos autoanticorpos (SHIREY et al 2002)
Eacute importante detectar a presenccedila de anticorpos no plasmasoro de um receptor de
transfusatildeo para garantir que seja transfundido sangue compatiacutevel Quando a pesquisa de
anticorpo irregular resultar positiva para um ou mais anticorpos de relevacircncia clinica eacute
necessaacuterio confirmar a ausecircncia do respectivo antiacutegeno na hemaacutecia do receptor assim como
selecionar para transfusatildeo concentrados de hemaacutecias tambeacutem negativos para aqueles
antiacutegenos evitando assim reaccedilotildees transfusionais (WALKER 2011)
A detecccedilatildeo de um anticorpo irregular eacute inicialmente realizada pela triagem de
anticorpos na qual o soroplasma do receptor eacute testado com 2 a 3 hemaacutecias do tipo ldquoOrdquo O
conjunto de fenoacutetipos dessas hemaacutecias deve contemplar os antiacutegenos de maior importacircncia
cliacutenica Como os anticorpos irregulares de maior interesse cliacutenico satildeo na maior parte das
vezes imunes portanto da classe IgG eacute obrigatoacuteria a fase de antiglobulina (AGH) do teste
ou teste indireto da antiglobulina (TIA) uma vez que esses anticorpos satildeo incompletos
(CASTILHO JUNIOR e REID 2015) O teste de triagem estando positivo deve-se fazer a
identificaccedilatildeo da especificidade do anticorpo utilizando um painel com maior nuacutemero de
hemaacutecias fenotipadas
114 PROVA DE COMPATIBILIDADE
A prova de compatibilidade eacute um teste obrigatoacuterio em caso de transfusatildeo de
componentes eritrocitaacuterios Tambeacutem chamada de prova de compatibilidade maior deve ser
realizada antes da administraccedilatildeo de sangue total ou concentrado de hemaacutecias utilizando-se
hemaacutecias obtidas do tubo coletor da bolsa a ser transfundida e o soro ou plasma do receptor
(BRASIL 2016)
Eacute definido como o procedimento para excluir a incompatibilidade entre o doador e o
receptor Tem o objetivo de detectar anticorpos que podem natildeo ter sido encontrados na
pesquisa de anticorpos devido a ausecircncia ou pouca expressatildeo de antiacutegenos no painel de
hemaacutecias aleacutem da possibilidade de terem ocorrido erros teacutecnicos ou notacionais durante a
realizaccedilatildeo da pesquisa (MELO 2007)
6
115 FENOTIPAGEM PARA OUTROS SISTEMAS
Aleacutem da pesquisa de ABORh que eacute realizado rotineiramente a fenotipagem para
outros sistemas tambeacutem denominado ldquofenotipagem estendidardquo determina a presenccedila ou
ausecircncia de antiacutegenos considerados de importacircncia cliacutenica A fenotipagem natildeo eacute obrigatoacuteria
nos testes preacute-transfusionais poreacutem a legislaccedilatildeo atual recomenda a realizaccedilatildeo da fenotipagem
eritrocitaacuteria dos antiacutegenos C (RH2) E (RH3) c (RH4) e (RH5) K (KELL1) Fya (FY1) Fy
b
(FY2) Jka
(JK1) Jkb (JK2) S (MNS3) e s (MNS4) para pacientes aloimunizados e pacientes
com indicaccedilatildeo de transfusatildeo crocircnica (BRASIL 2016)
A seleccedilatildeo de concentrados de hemaacutecias com o mesmo fenoacutetipo do receptor para
transfusatildeo pode evitar reaccedilotildees transfusionais hemoliacuteticas no paciente previamente
aloimunizado tambeacutem previne a sensibilizaccedilatildeo por outros antiacutegenos o que normalmente
torna as transfusotildees seguintes ainda mais complicadas A fenotipagem do paciente tambeacutem
auxilia na identificaccedilatildeo dos anticorpos pois espera-se que nas hemaacutecias do paciente o
antiacutegeno seja negativo para o anticorpo encontrado servindo de guia para teste de exclusatildeo de
anticorpos (SANTOS 2014 WALKER 2011)
A incidecircncia de aloanticorpos aumenta com o nuacutemero de transfusotildees no entanto a
implantaccedilatildeo de rotina de fenotipagem com transfusatildeo profilaacutetica de hemaacutecias com fenoacutetipo
compatiacutevel para pacientes candidatos agrave politransfusatildeo como os portadores de doenccedila
falciforme talassemia anemia aplaacutestica doenccedilas linfo e mieloproliferativas renais crocircnicos e
anemias refrataacuterias pode contribuir para o baixo iacutendice de sensibilizaccedilatildeo nessas populaccedilotildees
(FLUIT KUNST e DRENTHE-SCHONK 1999 MARTINS et al 2008 e VICHINSKY et
al 2001) Outro grupo de pacientes que se beneficia com a transfusatildeo de mesmo fenoacutetipo satildeo
os pacientes com AHAI uma vez que o autoanticorpo pode mascarar a presenccedila de um
aloanticorpo de significado cliacutenico em ateacute 40 dos casos Mesmo com as teacutecnicas utilizadas
ldquoin vitrordquo para remover a interferecircncia do autoanticorpo no soro um aloanticorpo pode natildeo
ser identificado e dessa forma transfundir o mesmo fenoacutetipo do paciente evitaria reaccedilatildeo
hemoliacutetica pelos anticorpos voltados contra antiacutegenos de maior importacircncia cliacutenica e de
frequecircncia intermediaacuteria Aleacutem disso os pacientes com AHAI satildeo fortes respondedores e a
transfusatildeo profilaacutetica do mesmo fenoacutetipo previne a aloimunizaccedilatildeo (SHIREY et al 2002)
Aleacutem de fenotipar o receptor eacute importante tambeacutem que os bancos de sangue tenham
rotinas de fenotipagem de doadores para atender as necessidade dos pacientes aloimunizados
ou em esquema de transfusatildeo crocircnica (PINTO BRAGA e SANTOS 2011)
7
Rotineiramente eacute inviaacutevel estabelecer o fenoacutetipo eritrocitaacuterio completo de um
indiviacuteduo pela grande diversidade de sistemas sanguiacuteneos descritos Ate junho de 2015 jaacute
haviam sido classificados 308 antiacutegenos atribuiacutedos a 36 sistemas definidos pela Sociedade
Internacional de Transfusatildeo de Sangue (ISBT) (CASTILHO JUNIOR e REID 2015)
Portanto o paciente eacute normalmente fenotipado para os antiacutegenos de maior importacircncia
clinica
Alguns fatores podem limitar a realizaccedilatildeo da fenotipagem eritrocitaacuteria Um dos fatores
eacute a transfusatildeo alogecircnica realizada haacute menos de 90 dias Neste caso podem ocorrer resultados
falso positivos para determinados antiacutegenos devido agrave presenccedila de hemaacutecias do doador
(LAINE et al 2000)
Outro fator eacute a presenccedila de anticorpo sensibilizando a hemaacutecia do paciente e
provocando positividade do teste direto da antiglobulina humana (TDA) Os soros
normalmente utilizados para fenotipagem especialmente para os antiacutegenos Fya
(FY1) Fyb
(FY2) Jka
(JK1) Jkb
(JK2) S (MNS3) e s (MNS4) necessitam da fase de antiglobulina
humana (AGH) para que ocorra aglutinacatildeo Amostras que apresentam o TDA positivo
aglutinam apoacutes reaccedilatildeo com a AGH natildeo pela real presenccedila do antiacutegeno em sua superfiacutecie mas
pela interaccedilatildeo da AGH com o anticorpo que estaacute sensibilizando o eritroacutecito A interferecircncia
do TDA positivo pode ser anulada atraveacutes de algumas teacutecnicas capazes de dissociar o
anticorpo como por exemplo o tratamento da hemaacutecia sensibilizada com cloroquina ou com
glicina-aacutecida-EDTA (BRANCH e PETZ 1999 SHIREY et al 2002 e LEGER 2011)
12 METODOLOGIAS APLICADOS Agrave ROTINA IMUNO-HEMATOLOacuteGICA
Todos os testes que compotildeem a rotina preacute-transfusional usam meacutetodos soroloacutegicos
que envolvem a reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo e tem como objetivo determinar o perfil antigecircnico
eritrocitaacuterio do receptor e do doador assim como identificar em seu soro a presenccedila de
anticorpos contra antiacutegenos eritrocitaacuterios que possam comprometer a sobrevida das hemaacutecias
transfundidas Para testar o antiacutegeno na superfiacutecie da hemaacutecia eacute necessaacuterio dispor de um
antissoro com especificidade conhecida para aquele antiacutegeno Por outro lado para testar a
presenccedila de um determinado anticorpo no soro ou plasma do receptor eacute necessaacuterio o uso de
hemaacutecias com perfil antigecircnico conhecido (SANTOS 2014)
Diversas metodologias satildeo aplicadas nos laboratoacuterios de imunohematologia Cada
serviccedilo de hemoterapia faz a escolha do meacutetodo que seraacute aplicado de acordo com o perfil do
laboratoacuterio com o volume de exames diaacuterios e tambeacutem com o custo envolvido Todas essas
8
teacutecnicas tecircm como objetivo comum demonstrar a reaccedilatildeo entre antiacutegeno e anticorpo no
entanto elas se baseiam em diferentes princiacutepios Muitas metodologias satildeo atualmente
aplicadas agrave imunohematologia entre elas o sistema de fase soacutelida a tecnologia de hemaacutecias
magnetizadas a biologia molecular e ateacute mesmo a citometria de fluxo no entanto os meacutetodos
mais tradicionais satildeo aqueles baseados no princiacutepio de hemaglutinaccedilatildeo
121 MEacuteTODOS DE FASE FLUacuteIDA
Os meacutetodos de fase fluiacuteda satildeo testes baseados na hemaglutinaccedilatildeo e incluem o teste em
tubo e o teste em microplacas Uma suspensatildeo de hemaacutecias eacute adicionada ao plasma ou soro
em seguida eacute realizada a centrifugaccedilatildeo e por fim eacute feita a leitura do resultado que eacute
considerado positivo se for observado algum grau de aglutinaccedilatildeo ou hemoacutelise A intensidade
de aglutinaccedilatildeo eacute graduada de acordo com o tamanho dos agregados desprendidos da
superfiacutecie apoacutes agitaccedilatildeo delicada do tubo ou microplaca Os meacutetodos de hemaglutinaccedilatildeo satildeo
aplicados a todos os testes preacute-transfusionais Como os anticorpos ABO satildeo aglutininas frias
a tipagem eacute realizada em temperatura ambiente (22degC) no entanto ao investigar a presenccedila
de anticorpos irregulares que como jaacute mencionado eacute na maioria das vezes anticorpos
incompletos da classe IgG eacute essencial que a reaccedilatildeo seja incubada a 37degC As reaccedilotildees satildeo
facilitadas com a utilizaccedilatildeo de potencializadores e da antiglobulina humana (WALKER e
HARMENING 2012 AABB 2011)
Nos meacutetodos de fase fluiacuteda nos quais a AGH eacute empregada a fase de lavagem eacute
fundamental Apoacutes a incubaccedilatildeo do soro com as hemaacutecias deve ser realizada a lavagem da
reaccedilatildeo para remover o excesso de anticorpos natildeo ligados agraves hemaacutecias jaacute que os anticorpos
livres podem bloquear a AGH quando ela eacute adicionada e levar a resultados falso negativos
(AABB 2011)
Os testes de hemaglutinaccedilatildeo satildeo os mais tradicionais entre os meacutetodos ainda hoje
aplicados agrave rotina de bancos de sangue A vantagem desses meacutetodos eacute o baixo custo quando
comparado agraves teacutecnicas mais modernas mas apresentam tambeacutem desvantagens A teacutecnica em
tubo por exemplo natildeo permite automaccedilatildeo eacute trabalhosa e exige matildeo-de-obra bastante treinada
na execuccedilatildeo das diversas etapas do teste e mesmo assim pode haver subjetividade na
interpretaccedilatildeo dos resultados aleacutem de resultados falso-negativos (DOWNES 2011 ZANTEK
et al 2012)
9
122 COLUNAS DE GEL
A teacutecnica em gel iniciada na deacutecada de 90 representou uma grande revoluccedilatildeo na
rotina laboratorial tornando-se muito popular Aleacutem de ser sensiacutevel a teacutecnica dispensa a fase
de lavagem antes da adiccedilatildeo da AGH assim como a agitaccedilatildeo do teste para leitura reduzindo o
nuacutemero de resultados falsos negativos decorrentes dessas duas etapas e o tempo para
execuccedilatildeo dos testes (LAPIERRE et al 1989 NOVARETTI et al 2000 NOVARETTI et
al 2004) Os reagentes satildeo comercializados na forma de cartotildees plaacutesticos contendo
microtubos preenchidos por gel composto por microesferas de acrilamida-dextran Nesta
metodologia tambeacutem baseada na hemaglutinaccedilatildeo a suspensatildeo de hemaacutecias e o soro satildeo
depositados em uma cacircmara acima da coluna de gel e em seguida procede-se com a
centrifugaccedilatildeo dos cartotildees As microesferas atuam como uma malha que permite a passagem
em direccedilatildeo ao fundo do microtubo apenas das hemaacutecias natildeo aglutinadas enquanto as
hemaacutecias aglutinadas ficam retidas na parte superior da coluna ou ao longo dela (GREEN e
KLOSTERMANN 2012) Portanto quanto maior a agregaccedilatildeo mais hemaacutecias ficam retidas
no topo da coluna Dependendo do tipo de teste a ser realizado pode ser utilizado gel neutro
ou gel especiacutefico impregnado pelo anticorpo desejado e o gel contendo antiglobulina humana
que satildeo utilizados para os testes diretos e indiretos da antiglobulina (LAPIERRE et al 1989)
A coluna de gel ainda permite a visualizaccedilatildeo clara de duas populaccedilotildees distintas de hemaacutecias
como em pacientes receacutem transfundidos
123 BIOLOGIA MOLECULAR
A biologia molecular ou genotipagem estaacute sendo cada vez mais aplicada aos grupos
sanguiacuteneos pois fornece resultados seguros e precisos especialmente nos casos em que natildeo eacute
possiacutevel a realizaccedilatildeo da fenotipagem como em pacientes receacutem-transfundidos e pacientes
com TDA positivo Na genotipagem eacute possiacutevel determinar atraveacutes do DNA do paciente
extraiacutedo de seus leucoacutecitos de sangue perifeacuterico o fenoacutetipo eritrocitaacuterio deduzido sem
qualquer interferecircncia do anticorpo que sensibiliza a hemaacutecia ou de hemaacutecias alogecircnicas
transfundidas Sua realizaccedilatildeo no entanto exige o treinamento de equipe especializada e capaz
de interpretar os resultados em conjunto com os achados soroloacutegicos (JUNIOR e OLIVATO
2007)
Apesar de ser uma ferramenta de grande importacircncia hoje na imuno-hematologia
ainda estaacute restrito aos grandes centros de hemoterapia no Brasil poucos serviccedilos puacuteblicos de
sauacutede dispotildeem desse recurso e utilizam teacutecnicas de genotipagem de grupos sanguiacuteneos para
atendimento a seus pacientes Esta abordagem poreacutem vem sendo introduzida em algumas
10
instituiccedilotildees de reconhecida competecircncia na hemoterapia mas sua disponibilizaccedilatildeo deve
tornar-se mais generalizada atraveacutes da formaccedilatildeo de centros de referecircncia para atendimento
das diversas unidades de hemoterapia (MARTINS et al 2009) Dessa forma muitas decisotildees
transfusionais especialmente em urgecircncias ainda devem ser tomadas sem o resultado da
genotipagem eritrocitaacuteria
13 TESTE DA ANTIGLOBULINA
Coombs Mourant e Race descreveram em 1945 uma teacutecnica com utilizando soro de
coelho contendo antiglobulina humana (AGH) que posteriormente foi chamada de ldquosoro de
Coombsrdquo O meacutetodo foi desenvolvido inicialmente para ampliar o efeito de aglutininas fracas
do sistema Rh anticorpos ldquoincompletosrdquo que normalmente natildeo apresentavam aglutinaccedilatildeo
visiacutevel O teste foi concebido como um instrumento de investigaccedilatildeo de doenccedila hemoliacutetica do
receacutem-nascido e de reaccedilotildees transfusionais causadas por anticorpos Rh que estavam presentes
no soro dos paciente poreacutem que natildeo eram demonstraacuteveis pelas teacutecnicas ateacute entatildeo existentes
A maior parte dos anticorpos de significado cliacutenico assim como seus respectivos
antiacutegenos foram descritos apoacutes o surgimento do ldquosoro de Coombsrdquo em 1945 sendo assim o
teste da antiglobulina representa ateacute hoje a forma mais importante de aglutinaccedilatildeo artificial em
imunohematologia permitindo revelar a presenccedila de anticorpos na membrana da hemaacutecia A
antiglobulina humana eacute constituiacuteda por anticorpo especiacutefico contra a porccedilatildeo Fc de outro
anticorpo Quando um anticorpo ldquoincompletordquo sensibiliza a hemaacutecia normalmente natildeo
provoca aglutinaccedilatildeo visiacutevel Apoacutes a adiccedilatildeo da AGH ao meio esta reconhece e se liga agraves
porccedilotildees Fc dos anticorpos que sensibilizam a hemaacutecia formando assim uma malha e
provocando aglutinaccedilatildeo visiacutevel (BARJAS-CASTRO 2013)
Os reagentes de antiglobulina podem ser poliespeciacuteficos ou monoespeciacuteficos Os
poliespeciacuteficos satildeo uma mistura de anticorpos ant-IgG e anti-C3d (fraccedilatildeo C3d do
complemento) Os reagentes monoespecificos podem ser anti-IgG anti-IgM anti-IgA anti-
complemento podendo ser anti-C3d e anti-C3b
O teste da antiglobulina pode ser usado para detectar hemaacutecias sensibilizadas com
aloanticorpos IgG autoanticorpos IgG e componentes do complemento A sensibilizaccedilatildeo
pode ocorrer ldquoin vivordquo ou ldquoin vitrordquo O uso do AGH para detectar a sensibilizaccedilatildeo ldquoin vitrordquo
tem dois estaacutegios e eacute denominado teste indireto da antiglobulina A sensibilizaccedilatildeo ldquoin vivordquo eacute
detectada em procedimento de um uacutenico estagio chamado teste direto da antiglobulina (TDA)
11
Os testes direto e indireto satildeo ateacute hoje amplamente aplicados como princiacutepio de inuacutemeros
testes soroloacutegicos em imuno-hematologia (GREEN e KLOSTERMANN 2012)
131 TESTE DIRETO DA ANTIGLOBULINA
O teste direto da antiglobulina humana revela a presenccedila de anticorpo eou fraccedilatildeo do
complemento ligados agrave superfiacutecie das hemaacutecias As sensibilizaccedilatildeo das hemaacutecias ocorrida ldquoin
vivordquo natildeo eacute visualizada mas apoacutes a adiccedilatildeo da antiglobulina humana ocorre a aglutinaccedilatildeo que
eacute visualizada macroscopicamente (Figura 1)
Figura 1 - Princiacutepio da teacutecnica direta da antiglobulina Teste utilizado para demonstrar a sensibilizaccedilatildeo ldquoin
vivordquo das hemaacutecias O sangue total eacute coletado do paciente em tubo contendo anticoagulante EDTA Na teacutecnica
realizada em tubo uma suspensatildeo de hemaacutecias 5 em soluccedilatildeo de salina eacute preparada Uma gota dessa suspensatildeo
eacute lavada 3 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica para retirada de anticorpos que estatildeo livres no plasma Toda soluccedilatildeo eacute
retirada e adiciona-se o soro de Coombs (antiglobulina humana) O soro de Coombs reconhece os anticorpos que
estatildeo ligados agrave superfiacutecie das hemaacutecias fazendo com que ocorra aglutinaccedilatildeo visiacutevel macroscopicamente
Apesar de natildeo ser um teste preacute-transfusional obrigatoacuterio o TDA eacute um dos testes mais
importantes para investigar e classificar quadros hemoliacuteticos como de origem imune ou natildeo
imune O seu valor preditivo positivo em vigecircncia de anemia hemoliacutetica eacute de 83 poreacutem natildeo
havendo sinais de hemoacutelise seu valor preditivo eacute apenas 14 Eacute por esse motivo que a
interpretaccedilatildeo do TDA positivo deve levar em consideraccedilatildeo a histoacuteria cliacutenica e os resultados
dos outros exames laboratoriais A realizaccedilatildeo do TDA eacute obrigatoacuteria na investigaccedilatildeo
12
laboratorial de diversos quadros hemoliacuteticos entre eles a anemia hemoliacutetica autoimune
(AHAI) a reaccedilatildeo hemoliacutetica imune poacutes-transfusional a siacutendrome do linfoacutecito passageiro a
doenccedila hemoliacutetica perinatal e a hemoacutelise droga-dependente (LEGER 2011)
Resultados de TDA positivos foram tambeacutem observados em indiviacuteduos com niacuteveis
seacutericos elevados de IgG ou complemento sem evidecircncia de anemia hemoliacutetica imune como
em pacientes com doenccedila falciforme talassemia doenccedila renal crocircnica mieloma muacuteltiplo
doenccedilas autoimunes e siacutendrome da imunodeficiecircncia adquirida (SIDA) Aleacutem disso pequenas
quantidades de IgG (5 a 90 moleacuteculas por hemaacutecia) e complemento (5 a 40 moleacuteculas por
hemaacutecia) podem estar presentes nas hemaacutecias de indiviacuteduos saudaacuteveis sem associaccedilatildeo com
reduccedilatildeo na sobrevida das mesmas A positividade do TDA depende da populaccedilatildeo estudada e
pode variar de 01 entre doadores de sangue sem qualquer sinal cliacutenico de hemoacutelise ateacute
15 em pacientes hospitalizados (CASTILHO JUNIOR e REID 2015 LEGER 2011)
Indiviacuteduos que apresentam TDA positivo seja agraves custas de IgG eou complemento
com ou sem sinais cliacutenicos de hemoacutelise teratildeo a fenotipagem eritrocitaacuteria prejudicada A
fenotipagem de indiviacuteduos com TDA positivo especialmente quando utilizado o teste indireto
da antiglobulina pode acarretar resultados falsos positivos e levar a seleccedilatildeo de fenoacutetipo
incorreto para transfusatildeo
132 TESTE INDIRETO DA ANTIGLOBULINA
O teste indireto da antiglobulina (TIA) eacute utilizado para revelar a sensibilizaccedilatildeo ldquoin
vitrordquo das hemaacutecias e eacute aplicado a diversos testes soroloacutegicos em imunohematologia entre
eles a pesquisa de anticorpos identificaccedilatildeo de anticorpos testes de compatibilidade
fenotipagem eritrocitaacuteria e titulaccedilatildeo de anticorpos Na teacutecnica indireta a hemaacutecia que contecircm
o antiacutegeno eacute colocada em contato ldquoin vitrordquo com o anticorpo que se liga mas natildeo promove a
aglutinaccedilatildeo visiacutevel A adiccedilatildeo da AGH forma uma malha entre os anticorpos que sensibilizam
as hemaacutecias e provoca a aglutinaccedilatildeo macroscoacutepica (figura 2)
Caso a amostra de hemaacutecia estudada seja previamente sensibilizada resultados falsos
positivos podem ser obtidos no TIA jaacute que a AGH reagiraacute com a moleacutecula que sensibilizava
anteriormente a hemaacutecia mesmo se o anticorpo especiacutefico natildeo tiver se ligado ao antiacutegeno
correspondente
13
133 CONDICcedilOtildeES CLIacuteNICAS COM TDA POSITIVO
O TDA positivo deve ser interpretado cuidadosamente sempre em conjunto com o
quadro cliacutenico do paciente A positividade isolada do TDA natildeo significa hemoacutelise A
interpretaccedilatildeo do teste positivo requer o conhecimento do diagnoacutestico do paciente da presenccedila
de sinais e sintomas sugestivos de hemoacutelise assim como de seu histoacuterico transfusional
gestacional e de informaccedilotildees sobre o uso recente de medicaccedilotildees (LEGER 2011)
Figura 2 ndash Princiacutepio do teste indireto da antiglobulina O TIA pode ser utilizado na pesquisa de anticorpos de
especificidades desconhecidas livres no soroplasma como eacute o caso da pesquisa e identificaccedilatildeo de anticorpos
irregulares Ele eacute tambeacutem utilizado para determinar a presenccedila de antiacutegenos na membrana da hemaacutecia quando
satildeo empregados soros de especificidades conhecidas da classe IgG No primeiro caso o soroplasma contendo o
anticorpo desconhecido eacute colocado em contato com hemaacutecias cujo perfil antigecircnico eacute conhecido No segundo
caso utiliza-se soro de especificidade conhecida da classe IgG para determinar a presenccedila ou ausecircncia de um
antiacutegeno na membrana O anticorpo encontra o antiacutegeno correspondente e ocorre a ligaccedilatildeo do anticorpo agrave
hemaacutecia mas natildeo ocorre aglutinaccedilatildeo Apoacutes a adiccedilatildeo da AGH que se liga aos anticorpos formando uma malha
ocorre a aglutinaccedilatildeo visiacutevel
O TDA positivo eacute uma achado claacutessico de algumas condiccedilotildees cliacutenicas como a reaccedilatildeo
transfusional hemoliacutetica a doenccedila hemoliacutetica do feto e do receacutem-nascido (DHFRN) a anemia
hemoliacutetica induzida por drogas a siacutendrome do linfoacutecito passageiro e a anemia hemoliacutetica
autoimune (AHAI) Portanto o TDA positivo pode ser decorrente da sensibilizaccedilatildeo da
hemaacutecia autoacuteloga por um autoanticorpo ou por um aloanticorpo ligado agrave hemaacutecia alogecircnica
circulante A positividade do TDA pode ainda ocorrer de forma passiva em pacientes que
14
recebem imunoglobulinas humanas ou ainda pela transfusatildeo de plaquetas ABO natildeo idecircntico
(LEGER 2011 RALPH 2012 ZANTEK et al 2012)
Nas reaccedilotildees transfusionais hemoliacuteticas imunes o aloanticorpo do receptor sensibiliza
as hemaacutecias transfundidas do doador e reduz sua sobrevida ao removecirc-la precocemente da
circulaccedilatildeo pela fagocitose no sistema retiacuteculo-endotelial ou pela hemoacutelise intravascular As
reaccedilotildees podem ser agudas se ocorrem ateacute 24 horas ou tardias quando ocorrem apoacutes 24 horas
da transfusatildeo A gravidade das reaccedilotildees hemoliacuteticas pode variar de um simples rendimento
transfusional inadequado agrave quadros graves de hemoacutelise intravascular evoluindo ateacute mesmo
com choque vascular e oacutebito O TDA pode resultar negativo caso toda massa eritrocitaacuteria
transfundida tenha sido destruiacuteda (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
Na doenccedila hemoliacutetica do feto e do receacutem-nascido (DHFRN) anticorpos maternos da
classe IgG atravessam a barreira placentaacuteria e sensibilizam as hemaacutecias fetais que seratildeo
destruiacutedas precocemente levando agrave anemia fetal Apesar da incompatibilidade ABO feto-
materna ser a causa mais frequente de DHFRN raramente ela eacute responsaacutevel pela ocorrecircncia
de quadros graves Por outro lado anticorpos contra antiacutegenos do sistema Rh e Kell
especialmente Anti-D (Anti-RH1) Anti-c (Anti-RH4) e Anti-Kell (Anti-KELL1) satildeo
conhecidos por causar DHFRN severa Raramente outros anticorpos tambeacutem podem estar
implicados na DHFRN como os anticorpos contra antiacutegenos do sistema Kidd Duffy MNS e
Diego (ZANTEK et al 2012)
A hemoacutelise droga-dependente eacute causada pela produccedilatildeo de um anticorpo voltado contra
a droga ligada agrave membrana eritrocitaacuteria ou ainda contra o complexo droga-membrana A
classe de medicaccedilotildees mais comumente envolvida eacute a dos antimicrobianos betalactacircmicos
(penicilinas e cefalosporinas) mas outras classes como quimioteraacutepicos e anti-inflamatoacuterios
tambeacutem satildeo descritos (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
Apoacutes transplante de ceacutelulas progenitoras hematopoieacuteticas em que o doador possui
anticorpos contra antiacutegenos eritrocitaacuterios do receptor o linfoacutecito de memoacuteria do doador pode
resistir ao esquema imunossupressor utilizado e continuar a produccedilatildeo de anticorpos que
reconhecem a hemaacutecia incompatiacutevel do receptor ainda circulante O quadro cliacutenico pode
variar de um simples TDA positivo sem outros sinais ou sintomas ateacute um quadro hemoliacutetico
grave e abrupto (LEGER 2011)
15
134 ANEMIA HEMOLIacuteTICA AUTOIMUNE
A anemia hemoliacutetica autoimune eacute caracterizada pela destruiccedilatildeo precoce das hemaacutecias
autoacutelogas por autoanticorpos que sensibilizam as hemaacutecias e levam agrave fagocitose pelos
macroacutefagos no sistema reticulo-endotelial ou hemoacutelise intravascular O diagnoacutestico da AHAI
baseia-se na presenccedila de hemoacutelise cliacutenica associada agrave evidecircncia de fator imune representado
pelo TDA positivo As classes de anticorpos envolvidas em quadros de AHAI satildeo IgG IgM e
raramente IgA (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012) Satildeo raros os casos de AHAI com TDA
negativo que podem estar relacionados a um autoanticorpo de baixa avidez de densidade
inferior agrave detecccedilatildeo do meacutetodo ou ainda de classe de imunoglobulina natildeo avaliada pelo
meacutetodo utilizado para o teste (GARRATY 2005)
A AHAI pode ser classificada em dois grupos principais de acordo com a melhor
temperatura de reaccedilatildeo do autoanticorpo As anemias hemoliacuteticas causadas por anticorpos
quentes que reagem melhor a 37oC e geralmente IgG representam 80 dos casos de AHAI
Nas AHAI por anticorpo quente o TDA pode ser positivo para IgG mais complemento (67)
somente IgG (20) ou somente por complemento (13) As anemias causadas por
anticorpos frios geralmente da classe IgM e que reagem melhor em temperatura ambiente ou
a 4oC representam aproximadamente 20 dos casos de AHAI Por exibirem amplitude
teacutermica esses anticorpos ligam-se agraves hemaacutecias ao atingirem a circulaccedilatildeo nas extremidades do
corpo fixam o complemento e desprendem-se da hemaacutecia apoacutes retornar para partes mais
quentes Por esse motivo em AHAI por anticorpos frios o TDA eacute positivo apenas agraves custas
de C3 e normalmente o IgM natildeo eacute detectado (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
A presenccedila do autoanticorpo IgG pode ser confirmada atraveacutes da eluiccedilatildeo do anticorpo
da hemaacutecia Tipicamente o eluato na AHAI por anticorpo quente reage com todas as ceacutelulas
testadas de um painel de hemaacutecias alogecircnicas do tipo ldquoOrdquo ou pode eventualmente exibir uma
especificidade conhecida como Anti-e (Anti-RH5) Nas AHAI a frio por sua vez espera-se
um eluato negativo (LEGER 2011)
Os autoanticorpos satildeo com frequecircncia encontrados livres no plasma e natildeo somente
ligados agraves hemaacutecias autoacutelogas Eles podem interferir em todas as fases dos testes preacute-
transfusionais nas quais o plasma eacute testado especialmente os autoanticorpos quentes que
acarretam resultados positivos em todos os testes levados agrave fase de antiglobulina humana
Esses anticorpos portanto positivam a pesquisa de anticorpos irregulares e mascaram a
presenccedila de aloanticorpos de significado cliacutenico Aproximadamente 60 dos pacientes que
apresentam AHAI a quente apresentam anticorpos que reagem em meio salino mas se forem
16
levados em conta meacutetodos mais sensiacuteveis como PEG enzima e estudo em gel a positividade
pode ser superior a 90 (LEGER 2011)
Aleacutem da eficaacutecia da transfusatildeo ser comprometida pela diminuiccedilatildeo da vida-meacutedia das
hemaacutecias a presenccedila do autoanticorpo dificulta a realizaccedilatildeo dos testes preacute-transfusionais e
compromete a seguranccedila transfusional Os autoanticorpos reagem normalmente como
panaglutininas pois satildeo normalmente voltados contra antiacutegenos puacuteblicos na maior parte das
vezes contra antiacutegenos do sistema Rh Por apresentarem essas caracteriacutesticas podem ainda
mascarar a presenccedila de aloanticorpos de significado clinico e levar a testes de compatibilidade
positivos exigindo uma avaliaccedilatildeo criteriosa da necessidade da transfusatildeo (BRANCH e PETZ
1999 JUNIOR e OLIVATO 2004)
Remover a interferecircncia do autoanticorpo para avaliar a presenccedila de aloanticorpos
mascarados nem sempre eacute possiacutevel mesmo utilizando teacutecnicas de autoadsorccedilatildeo ou
aloadsorccedilatildeo que aleacutem de tudo satildeo demoradas e exigem de 2 a 6 horas para conclusatildeo
(GARRATY e GEORGE 2002) Nesses casos a fenotipagem eritrocitaacuteria do paciente eacute de
extrema utilidade especialmente em situaccedilotildees de urgecircncia A definiccedilatildeo do fenoacutetipo do
paciente para os antiacutegenos de maior importacircncia cliacutenica pode auxiliar a seleccedilatildeo de unidades
de hemaacutecias com mesmo fenoacutetipo o que garante que eventuais aloanticorpos natildeo
identificados sejam respeitados e tambeacutem evita nova sensibilizaccedilatildeo (JUNIOR e OLIVATO
2004 SHIREY et al 2002)
135 TRATAMENTO DE HEMAacuteCIAS COM TDA POSITIVO
O TDA positivo impede a fenotipagem eritrocitaacutecia por meacutetodos que exigem a fase de
AGH uma vez que a aglutinaccedilatildeo ocorreraacute devido agrave interaccedilatildeo da AGH com o autoanticorpo
que sensibiliza a hemaacutecia do paciente levando a resultados falso positivos Em algumas
situaccedilotildees como na AHAI por anticorpo quente a fenotipagem eacute especialmente importante
pois o autoanticorpo interfere na triagem e identificaccedilatildeo de anticorpos assim como no teste de
compatibilidade e dificultam a detecccedilatildeo de aloanticorpos de significado cliacutenico que
obrigatoriamente devem ser respeitados Nessas situaccedilotildees a fenotipagem eritrocitaacuteria
determina o perfil antigecircnico do paciente e possibilita o fornecimento de unidades de
hemaacutecias com o mesmo fenoacutetipo para a transfusatildeo evitando a sensibilizaccedilatildeo para novos
antiacutegenos assim como reaccedilotildees hemoliacuteticas transfusionais No entanto eacute necessaacuterio aplicar
meacutetodos que natildeo sofram interferecircncia do TDA positivo ou seja meacutetodos que natildeo necessitem
da fase de AGH ou meacutetodos de bloqueio do anticorpo sem bloquear o antiacutegeno Uma opccedilatildeo eacute
a utilizaccedilatildeo de soros monoclonais IgM (salinos ou de meio proteico natildeo concentrado) mas
17
nem sempre esses reagentes estatildeo disponiacuteveis especialmente os reagentes monoclonais para
os antiacutegenos dos sistemas Duffy ( Fya Fy
b) Kidd ( Jk
a Jk
b) e MNS (S s) (JUNIOR e
OLIVATO 2004) Outra opccedilatildeo eacute a teacutecnica de bloqueio que pode ser utilizada para tratar
hemaacutecias para posterior fenotipagem em casos de TDA positivos com reatividade le2+
Em casos onde a positividade do TDA eacute maior que 2+ estaacute indicada a tratamento
quiacutemico para remoccedilatildeo da interferecircncia do autoanticorpo antes de realizar a fenotipagem Entre
as teacutecnicas utilizadas atualmente estatildeo o ZZAP a cloroquina e a glicina aacutecidaEDTA
1351 TEacuteCNICA DE BLOQUEIO
A teacutecnica de bloqueio se baseia na utilizaccedilatildeo de anti-IgG (Coombs monoespeciacutefico)
para tratar as hemaacutecias com TDA positivo O anticorpo anti-IgG se liga aos anticorpos que
estatildeo sensibilizando a hemaacutecias poreacutem sem o bloquear os antiacutegenos Os antiacutegenos que natildeo
estatildeo sensibilizados podem ser detectados atraveacutes dos antissoros especiacuteficos (SERERAT
VEIDT E DUTCHED 2000)
1352 TRATAMENTO DE HEMAacuteCIAS COM ZZAP
O Sulphydryl-Proteolytic Enzyme (ZZAP) que eacute uma mistura de ditiotreitol (DTT)
mais papaiacutena ativada com cisteiacutena eacute um reagente capaz de dissociar imunoglobulinas da
classe IgG ligadas a membrana dos eritroacutecitos enquanto trata enzimaticamente as hemaacutecias
O tratamento enzimaacutetico tambeacutem potencializa a ligaccedilatildeo do autoanticorpo ao antiacutegeno e
acelera o processo de autoadsorccedilatildeo O ZZAP pode desnaturar os antiacutegenos do sistema Duffy
MNS e Kell o que limita sua aplicaccedilatildeo para fins de fenotipagem (BRANCH e PETZ 1982)
1353 CLOROQUINA
Em 1982 Edwards Moulds e Judd propuseram a utilizaccedilatildeo da teacutecnica da cloroquina
que dissociava os complexos antiacutegeno-anticorpo e mantinha a membrana das hemaacutecias
iacutentegras Os derivados quinolecircicos jaacute haviam sido descritos anteriormente por Domokos e
Aszody em 1964 e Holtz Mantel e Buck em 1973 (apud Edwards Moulds e Judd 1982) pela
sua capacidade de separar imunocomplexos e inibir as reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo reduzindo
as cargas eleacutetricas das superfiacutecie das hemaacutecias A teacutecnica eacute uma das mais utilizadas nos
centros brasileiros para remover a interferecircncia do autoanticorpo e eacute tambeacutem a teacutecnica
atualmente adotada pelo laboratoacuterio de imunohematologia do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto
18
Edwards Moulds e Judd (1982) demonstraram que a teacutecnica da cloroquina para
dissociaccedilatildeo de anticorpos eacute uma teacutecnica simples efetiva e confiaacutevel para dissociar
imunoglobulina das hemaacutecias Desde que a membrana das hemaacutecias permaneccedila intacta natildeo
haacute perda da reatividade dos antiacutegenos e a sua maior aplicaccedilatildeo eacute a fenotipagem de hemaacutecias
com TDA positivo Os autores verificaram que em 83 das amostras sensibilizadas in vivo e
22 amostras (no total de 40) sensibilizadas ldquoin vitrordquo apresentaram TDA negativo e
puderam ser fenotipadas A teacutecnica poreacutem natildeo consegue remover os componentes do
complemento na maioria dos casos
Champagne e colaboradores (1999) testaram a teacutecnica da cloroquina para dissociar
antiacutegenos Bg comparando com a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA e verificaram vantagem em
relaccedilatildeo ao uso de um uacutenico reagente diminuindo a manipulaccedilatildeo e verificou que o mesmo natildeo
destroacutei antiacutegeno Kell
A cloroquina tambeacutem mostrou-se pouco efetivo em remover anticorpos do sistema
Duffy da superfiacutecie das hemaacutecias (EDWARDS MOUDS e JUDD 1982 ROZIERS e
SQUALI 1997)
1353 GLICINA-AacuteCIDAEDTA
A afinidade e a estabilidade entre a ligaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo eacute definida como a
resultante entre forccedilas atrativas e repulsivas entre ambos (CARUCIO e WISE 2012) e resulta
da somatoacuteria de forccedilas quiacutemicas dinacircmicas e fracas (natildeo covalentes) como pontes de
hidrogecircnio forcas eletrostaacuteticas forca de Van der Waals e pontes hidrofoacutebicas A estabilidade
dessa ligaccedilatildeo eacute facilmente abalada por alteraccedilotildees quiacutemicas e fiacutesicas no meio da reaccedilatildeo como
a alteraccedilatildeo do pH A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA se baseia na mudanccedila do pH para a
quebra da ligaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo (KOSANKE 2012)
A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA foi primeiramente descrita em 1986 por Louie Jieng
e Zeroulis que utilizaram 50 amostras de doadores sensibilizados ldquoin vitrordquo com anticorpos A
teacutecnica foi efetiva em 48 amostras permitindo o estudo do eluato assim como a fenotipagem
das hemaacutecias Os autores testaram tambeacutem a teacutecnica em 100 hemaacutecias TDA positivo que
puderam ser utilizadas para teacutecnicas de autoadsorccedilatildeo
Byrne (1991) descreveu a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA modificada e tambeacutem
verificou como uma opccedilatildeo para o tratamento de hemaacutecias com TDA positivo que deixava as
hemaacutecias intactas e o eluato viaacutevel para ser fenotipado
19
Roziers e Squali (1997) e Katharia e Chaudhary (2013) compararam a teacutecnica da
glicina-aacutecidaEDTA com as teacutecnicas da cloroquina e do aquecimento Verificaram maior
eficiecircncia da glicina-aacutecidaEDTA em relaccedilatildeo as outras duas teacutecnicas pois com uma mesma
quantidade de amostra produzia as hemaacutecias livres de anticorpo e tambeacutem o eluato Mostrou-
se ainda superior devido ao menor tempo exigido para sua realizaccedilatildeo o que favorece seu uso
em situaccedilotildees de urgecircncia e emergecircncia
As duas desvantagens da teacutecnica poreacutem eacute o fato de destruir os antiacutegenos do sistema
Kell e o fato de natildeo remover fraccedilotildees do complemento ligadas agrave hemaacutecia (PALLAS WILER e
McGEE 1991 ROZIERS e SQUALLI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012
e KATHARIA e CHAUNDHARY 2013)
20
2 OBJETIVOS
21 OBJETIVO GERAL
211 Avaliar a eficaacutecia da glicina-aacutecidaEDTA em remover os anticorpos ligados agraves
hemaacutecias sensibilizadas por anticorpos da classe IgG
22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
221 Preparaccedilatildeo dos reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
verificaccedilatildeo da estabilidade dos mesmos e avaliar custos
222 Testar a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA em amostras de hemaacutecias
sensibilizadas por anticorpos antieritrocitaacuterios humanos
223 Comparar a efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA com a teacutecnica da
cloroquina quanto a capacidade de remover a interferecircncia do anticorpo ligado
a hemaacutecia
224 Testar o eluato das amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA
225 Verificar se houve destruiccedilatildeo dos antiacutegenos eritrocitaacuterios apoacutes o tratamento
com glicina-aacutecidaEDTA e com cloroquina
226 Verificar se o tempo de execuccedilatildeo da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA descrito
nos textos de referecircncia eacute reprodutiacutevel
21
3 JUSTIFICATIVA
Algumas condiccedilotildees cliacutenicas podem levar ao depoacutesito ldquoin vivordquo de anticorpos eou
fraccedilotildees do complemento sobre as hemaacutecias Entre elas estatildeo as reaccedilotildees hemoliacuteticas poacutes-
transfusionais a doenccedila hemoliacutetica perinatal o uso de medicamentos e principalmente a
AHAI Na AHAI um anticorpo normalmente da classe IgG ou IgM reconhece antiacutegenos
proacuteprios na membrana eritrocitaacuteria e reduz a sobrevida da hemaacutecia levando a sua destruiccedilatildeo
pelos macroacutefagos no sistema reticulo-endotelial ou agrave ativaccedilatildeo do complexo de ataque agrave
membrana e agrave lise intravascular Os autoanticorpos satildeo voltados na maioria das vezes contra
antiacutegenos eritrocitaacuterios de alta frequecircncia populacional conhecidos como antiacutegenos puacuteblicos
e por este motivo reconhecem tanto hemaacutecias autoacutelogas quanto alogecircnicas
Devido agrave presenccedila do autoanticorpo livre no plasma e tambeacutem do anticorpo eou
complemento ligado agrave hemaacutecia o banco de sangue pode encontrar dificuldades em todas as
fases dos testes preacute-transfusionais do paciente com AHAI e deve utilizar teacutecnicas que
auxiliem na escolha do melhor hemocomponente melhorando a seguranccedila transfusional Essas
teacutecnicas visam remover a interferecircncia do autoanticorpo livre no soro e do autoanticorpo
ligado agrave hemaacutecia permitindo a detecccedilatildeo de aloanticorpos associados e a realizaccedilatildeo da
fenotipagem eritrocitaacuteria respectivamente
A finalizaccedilatildeo dos testes preacute-tranfusionais na presenccedila de autoanticorpo pode levar
algumas horas e nem sempre o paciente poderaacute aguardar Nesse contexto torna-se vantajosa a
aplicaccedilatildeo de teacutecnicas de raacutepida execuccedilatildeo
O presente estudo propotildee aplicar e avaliar a eficaacutecia da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
em remover os anticorpos ligados agrave hemaacutecia o que permite a fenotipagem eritrocitaacuteria
estendida e a seleccedilatildeo de concentrados de hemaacutecias com mesmo fenoacutetipo do paciente
Atualmente no Hemocentro de Ribeiratildeo Preto a teacutecnica utilizada para esse fim eacute o
tratamento das hemaacutecias com difosfato de cloroquina cujo tempo de execuccedilatildeo pode demorar
ateacute duas horas enquanto a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser realizada em apenas dois
minutos o que a tornaria opccedilatildeo de escolha especialmente em situaccedilotildees de urgecircncia Ao
contraacuterio da cloroquina a glicina-aacutecidaEDTA permite tambeacutem o estudo do eluato das
hemaacutecias tratadas
22
4 METODOL OGIA
41 AMOSTRAS DE DOADORES
Foram coletados 50 amostras de doadores de sangue que compareceram ao
Hemonuacutecleo de Araccedilatuba no periacuteodo de junho a agosto de 2016 Foram convidados a
participar da pesquisa doadores de repeticcedilatildeo do tipo sanguiacuteneo ldquoOrdquo RhD positivo
cadastrados no sistema de banco de sangue (SBS) do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto
Todos os doadores que concordaram em participar da pesquisa assinaram o termo de
consentimento livre e esclarecido (TCLE)
No momento da doaccedilatildeo foram coletados adicionalmente 5 mL de sangue total em
soluccedilatildeo anticoagulante EDTA (aacutecido dietilenoaminoaceacutetico) dispensando punccedilatildeo venosa
adicional para coleta da amostra O fluxograma 1 resume as etapas desenvolvidas no projeto
Fluxograma 1 - Fluxo da pesquisa utilizando as amostras de doadores
23
411 FENOTIPAGEM
Foram verificados se os doadores jaacute tinham fenotipagem para outros sistemas de
grupos sanguiacuteneos aleacutem do sistema ABORh que eacute realizado rotineiramente
A fenotipagem eritrocitaacuteria para outros sistemas ou fenotipagem estendida eacute realizada
para identificar a presenccedila ou ausecircncia de antiacutegenos considerados de importacircncia cliacutenica No
Hemonuacutecleo de Araccedilatuba uma parcela de doadores de repeticcedilatildeo satildeo fenotipados para os
antiacutegenos dos sistemas de grupo sanguiacuteneo Rh (antiacutegenos C c E e e) Kell (antiacutegeno K)
Duffy (antiacutegenos Fya e Fy
b) Kidd (antiacutegenos Jk
a e Jk
b) e sistema MNSs (antiacutegenos S e s)
A fenotipagem para o Rh e Kell eacute realizada por metodologia de microplaca utilizando
25 microL de hemaacutecia lavada e diluiacuteda a 5 em salina e 25 microL do antissoro comercial especiacutefico
A reaccedilatildeo eacute incubada 15 minutos a temperatura ambiente e centrifugadas para leitura Para os
antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s a metolodogia utilizado eacute gel contendo antiglobulina
humana (gel LissCoombs poliespeciacutefico) da marca BIO-RAD onde se utiliza suspensatildeo de
hemaacutecia em LISS (Soluccedilatildeo de baixa forccedila iocircnica) A suspensatildeo eacute preparada atraveacutes da
diluiccedilatildeo de 10 microL de hemaacutecia em 1000 microL de LISS Pipetado 50 microL dessa diluiccedilatildeo no gel e
adicionado 25 microL do antissoro especiacutefico Incuba-se em banho seco por 15 minutos a 37 deg
Celsius e eacute centrifugado em centriacutefuga especiacutefica Os antissoros utilizados eram das marcas
Fresenius e Lorne
Foi verificado a fenotipagem do doador no banco de dados do Hemocentro Os
registros dos fenoacutetipos dos doadores ficam armazenadas no sistema de banco de sangue
(SBS) Para doadores que natildeo tinham fenotipagem estendida preacutevia para antiacutegenos do sistema
Rh (C c E e e) e Kell (K) foi realizada a fenotipagem para esses antiacutegenos
O tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA e cloroquina para dissociar
anticorpos pode inativar enfraquecer ou destruir os antiacutegenos presentes nas hemaacutecias
alterando assim os resultados da fenotipagem Para verificar se houve destruiccedilatildeo dos
antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a e Jk
b S e s nas amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes
tratamento foram novamente fenotipadas ao final para os antiacutegenos que eram inicialmente
positivas
A repeticcedilatildeo da fenotipagem foi realizada nas amostras que apresentaram efetividade
no tratamento da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eou da cloroquina e a detecccedilatildeo do antiacutegeno
na amostra preacute-tratamento
24
412 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS HEMAacuteCIAS
As hemaacutecias foram sensibilizadas com antissoros policlonais humanos de amostras de
plasma fresco congelado de doadores com resultado de pesquisa de anticorpo irregular
positivos
A escolha do anticorpo para sensibilizar as hemaacutecias foi definida de acordo com o
fenoacutetipo do doador que deveria ser positivo para o respectivo antiacutegeno
Para a sensibilizaccedilatildeo um volume de antissoro (1 mL) e um volume (1 mL) de
hemaacutecias lavadas quatro vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica foram adicionadas a um tubo de 12 x
75 mm A mistura foi homogeneizada e incubada em banho maria (BM) a 37deg C por 60
minutos A seguir as hemaacutecias foram novamente lavadas 4 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica
para retirada dos anticorpos que natildeo se ligaram A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada
como controle negativo O teste da uacuteltima lavagem eacute importante para assegurar que os
anticorpos que poderatildeo ser detectados no eluato apoacutes o tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA
sejam aqueles que estavam ligados agraves hemaacutecias e natildeo aqueles livres no plasma O controle
negativo mostra que todo o anticorpo livre foi retirado (LEGER 2011)
Para o teste de presenccedila de anticorpo na soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foram incubadas
com hemaacutecias de triagem de anticorpos irregulares (ID-Diacell BIO-RAD) contendo os
antiacutegenos especiacuteficos Realizado a teacutecnica em gel LissCoombs com anti-IgG+C3d Incubado
no tempo de 15 minutos a temperatura de 37deg C e centrifugado 10 minutos em centriacutefuga
proacutepria
As 50 amostras de doadores foram sensibilizadas com os anticorpos policlonais
humanos
Apoacutes sensibilizadas rdquoin vitrordquo e lavadas as hemaacutecias foram diluiacutedas em soluccedilatildeo de
baixa forccedila iocircnica (LISS) na quantidade de 10 microL de hemaacutecia para 1000 microL de soluccedilatildeo A
suspensatildeo foi pipetada (50 microL) em coluna-gel-teste LissCoombs (BIO-RAD) que contecircm
antiglobulina poliespeciacutefico (IgG+C3d) e centrifugada em baixa rotaccedilatildeo conforme orientaccedilatildeo
do fabricante durante 10 minutos
As amostras deveriam apresentar aglutinaccedilatildeo com reatividade 3 a 4+ no TDA As
amostras que apresentaram reaccedilatildeo menor que 3+ foram novamente sensibilizadas com nova
aliacutequota do antissoro
25
413 TRATAMENTO DAS AMOSTRAS
As amostras sensibilizadas apresentando o TDA positivo 3 ou 4+ foram divididas em
duas aliacutequotas e submetidas a duas teacutecnicas diferentes com o objetivo de dissociar o anticorpo
ligado Uma aliacutequota da amostra foi tratada com soluccedilatildeo de difosfato de cloroquina enquanto
a outra aliacutequota foi tratada com glicina-aacutecidaEDTA
42 PREPARO DA GLICINA AacuteCIDA-EDTA
A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA utiliza 3 soluccedilotildees diferentes a glicina aacutecida o
EDTA e o tampatildeo TRIS
Os reagentes foram preparados utilizando os sais para anaacutelise (PA) de EDTA
(Na2EDTA2H2O) TRIS (C4H11NO3) Glicina (H2NCH2CO2H) NaCl e a soluccedilatildeo de aacutecido
cloriacutedrico (HCl) 12 N todos reagentes da marca SYNTH (quadro 1)
Para o preparo do tampatildeo glicina-acida eacute necessaacuterio o ajuste do pH para 15 Para esse
ajuste utiliza-se aacutecido cloriacutedrico (HCl) concentrado O pH foi medido com fitas reativas de pH
com escala de 1 a 14 da marca MERCK Posteriormente a soluccedilatildeo foi enviada ao laboratoacuterio
de controle de qualidade do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto e o pH medido no peagacircmetro O
tampatildeo glicina-aacutecida foi armazenado a 4deg e o tampatildeo tris e o EDTA em temperatura ambiente
controlada (20 a 24deg Celsius)
Apoacutes o preparo e durante a realizaccedilatildeo dos testes foram feitas inspeccedilotildees visuais para
verificaccedilatildeo de turvaccedilatildeo do meio e presenccedila de precipitados
Reagente Material Quantidade Preparo e
Conservaccedilatildeo
EDTA
EDTA
(Na2EDTA2H2O)
5 gramas Mistura ateacute
dissoluccedilatildeo do sal e
conserva em
temperatura ambiente Aacutegua Destilada 50 Ml
Tris
TRIS (C4H11NO3) 121 gramas Conservar em
temperatura ambiente NaCl 525g
Aacutegua destilada 100ml
Gliacutecina-aacutecida
Glicina
(H2NCH2CO2H) 15 gramas
Conservar a 4oC NaCl 116gramas
Aacutegua Destilada 200ml
HCL 12N Ajutar o pH para 15
Quadro 1 - Preparo dos Reagentes da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
Fonte - Manual teacutecnico AABB 2011
26
O tampatildeo glicina-aacutecida e o tampatildeo TRIS satildeo estaacuteveis por 7 meses O reagente EDTA
precipitou mesmo estando em temperatura em ambiente controlado Houve necessidade de
preparo de novo reagente
421 TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
1 Em um tubo de ensaio 12x75 mm eacute adicionado 08 mL da soluccedilatildeo de glicina-aacutecida A
esta soluccedilatildeo adiciona-se 02 mL de EDTA e mistura
2 Adiciona-se 02 mL de hemaacutecias sensibilizadas (lavada 4 vezes) A mistura eacute
homogeneizada e incubada por exatamente 2 minutos
3 A seguir 01 mL de tampatildeo TRIS eacute adicionado agrave mistura que eacute novamente
homogeneizada e centrifugada por 2 minutos a 3400 rpm O pH deve estar entre 7 a 75
4 Apoacutes centrifugaccedilatildeo separa-se em outro tubo o sobrenadante (eluato) e as hemaacutecias
que permanecem satildeo lavadas 4 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica para retirada de todo o
reagente e anticorpos livres
43 PREPARO DA CLOROQUINA
A cloroquina eacute diluiacuteda em tampatildeo PBS na concentraccedilatildeo de 20 (Quadro 2) e
armazenado a 4deg Celsius sua validade apoacutes o preparo eacute de 1 mecircs
A teacutecnica da cloroquina jaacute estaacute padronizada para rotina do laboratoacuterio de
imunohematologia do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto e suas unidades
Reagente Reagentes Quantidade PreparoConservaccedilatildeo
Cloroquina
Difosfato de cloroquina
(C18H32ClN3O8P2)
20 gramas
Conservar a 4deg Celsius
Tampatildeo PBS 100ml
NaOH 01 N Acertar o pH para
51
Quadro 2 - Preparo da Cloroquina Fonte - Manual teacutecnico da AABB 2011
431 TEacuteCNICA DA CLOROQUINA
1 4 partes da soluccedilatildeo pronta eacute adicionada a uma parte de hemaacutecias lavadas 4 vezes com
soluccedilatildeo fisioloacutegica
2 A mistura eacute incubada em temperatura ambiente por ateacute duas horas
3 Centrifugar a 3400 rpm por 2 minutos
27
4 Remover o sobrenadante lavar as hemaacutecias novamente com soluccedilatildeo fisioloacutegica 4
vezes
44 VERIFICACcedilAtildeO DA EFETIVIDADE DOS TESTES
Apoacutes tratamento pelas duas teacutecnicas o TDA foi repetido em todas as amostras para
verificar se os tratamentos foram efetivos e houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo Para as
amostras tratadas pela teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA que permaneceram com TDA positivo
novo tratamento foi realizado
45 TESTE DO ELUATO
O eluato resultante das amostras tratadas com glicina-acidaEDTA foi testado com
hemaacutecias de triagem A soluccedilatildeo do eluato foi incubada com as hemaacutecias de triagem de
anticorpos (ID-Diacell BIO-RAD) pela teacutecnica em gel LissCoombs O teste foi incubado 15
minutos a 37deg Celsius e centrifugado por 10 minutos em centrifuga proacutepria para a teacutecnica em
gel Os eluatos que apresentaram resultados positivos foram testados em painel de 11
hemaacutecias (ID-Diapanel BIO-RAD) para a identificaccedilatildeo do anticorpo
46 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente que apresentou TDA positivo por IgG e pesquisa
de anticorpo irregular positivo com presenccedila de autoanticorpo com reatividade panaglutinina
A amostra foi tratada em paralelo pelas duas teacutecnicas descritas e foi enviada para o
Hemocentro para genotipagem eritrocitaacuteria que foi realizado por metodologia PCR em tempo
real no equipamento Real-time system PCR 7500 ( Applied Biosystems Califoacuternia EUA)
28
5 RESULTADOS
51 REAGENTES
Para aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA satildeo necessaacuterios 3 diferentes
reagentes que podem ser encontrados em forma de kit pronto para uso No entanto esses kits
natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil Os reagentes satildeo tampatildeo glicina-aacutecida o EDTA e o tampatildeo
Tris
Todos os reagentes foram preparados rdquoin houserdquo a partir dos sais e soluccedilotildees PA (puro
para anaacutelise) da marca SYNTH que foram adquiridos para a pesquisa O custo estimado para
cada teste foi aproximadamente R$ 020 reais
Apoacutes o preparo os reagentes poderiam ser armazenados em condiccedilotildees adequadas pelo
periacuteodo de 1 ano (AABB 2011) Ao final do preparo e durante o periacuteodo de armazenamento
de fevereiro a setembro de 2016 foi realizada inspeccedilatildeo visual para verificar a presenccedila de
precipitados ou turvaccedilatildeo A soluccedilatildeo de glicina e o tampatildeo TRIS mostraram-se estaacuteveis ateacute o
final do periacuteodo Por sua vez o reagente EDTA precipitou mesmo estando armazenado em
temperatura ambiente controlada e foi necessaacuterio novo preparo
52 AMOSTRAS DE DOADORES
521 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS AMOSTRAS
Apoacutes incubaccedilatildeo da hemaacutecia com o antissoro a mesma foi lavada 4 vezes para retirada
dos anticorpos livres A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada Caso houvesse positividade na
soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem a etapa era repetida (figura 3) Das 50 amostras sensibilizadas a
uacuteltima lavagem foi positiva somente em 3 delas Nas 3 amostras o anticorpo utilizado para
sensibilizaccedilatildeo foi o anti-K Apoacutes repetido nova etapa de lavagem os resultados se
apresentaram negativos
Em todas as amostras sensibilizadas ldquoin vitrordquo o TDA foi testado e verificado a
intensidade do teste Entre as 50 amostras 47 alcanccedilaram TDA com intensidade 3-4+ apoacutes a
primeira sensibilizaccedilatildeo enquanto 3 amostras necessitaram uma segunda incubaccedilatildeo com
anticorpo (figura 4)
A escolha dos anticorpos para sensibilizar as hemaacutecias foi feita de acordo com o
fenoacutetipo do doador e foram utilizados sete diferentes especificidades de anticorpos policlonais
humanos conforme mostra o graacutefico1
29
Figura 3 - Soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada com hemaacutecia de triagem de
anticorpos em gel LissCoombs (BIO-RAD) A finalidade eacute verificar a presenccedila de anticorpos livres na
suspensatildeo que possam interferir na pesquisa do eluato As soluccedilotildees de lavagem das amostras na figura a tiveram
resultados negativos Na figura b duas amostras a 47 e 50 apresentaram resultado positivo Nova etapa de
lavagem foi realizada e o resultado final foi negativo
522 TRATAMENTO DAS HEMAacuteCIAS
Apoacutes a sensibilizaccedilatildeo e obtenccedilatildeo de resultados de TDA com intensidade de 3 a 4+
cada uma das amostras foi dividida em duas aliacutequotas e tratada separadamente pelas teacutecnicas
de glicinaaacutecida-EDTA e cloroquina
As teacutecnicas foram consideradas efetivas quando obteve-se a completa dissociaccedilatildeo do
anticorpo verificada atraveacutes do TDA negativo na amostra poacutes tratamento conforme figuras 5
e 6 Dentre as amostras tratadas com cloroquina 2850 tiveram o TDA negativado A glicina-
aacutecidaEDTA negativou o TDA em 33 das 50 amostras tratadas Apenas 17 amostras tratadas
com glicina-aacutecidaEDTA permaneceram com o TDA positivo e foram submetidas a um novo
tratamento
30
Figura 4 - TDA das amostras apoacutes sensibilizaccedilatildeo com anticorpos policlonais humanos Amostras na
figura a com intensidades de 3-4+ Na figura b amostras 4 e 7 com intensidade menor que 3+ e portanto foram
novamente sensibilizadas com nova aliacutequota de soro Anti-D e anti-S Apoacutes a segunda sensibilizaccedilatildeo
apresentaram reatividade 4 e 3+ respectivamente Os anticorpos utilizados para sensibilizaccedilatildeo foram D S c E
C e K
523 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS TEacuteCNICAS
No tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA houve dissociaccedilatildeo completa do anticorpo
em 33 amostras (66) das 50 amostras testadas enquanto que com a cloroquina foram 28
amostras (56) (tabela 1)
31
Graacutefico 1- Nuacutemero de amostras sesnsibilizadas por especificidade de anticorpo Entre as 50 amostras 12
foram sensibilizadas com anti-D 10 com anti-C 9 com anti-E 8 com anti-c 7 com anti-S 3 com anti-K e 1
com anti-Dia As especificidades dos anticorpos foram definidas de acordo o fenoacutetipo do doador
Figura 5 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com cloroquina Nas amostras onde houve
a dissociaccedilatildeo do anticorpo ( 2 21 a 23 26 39 a 42 45 46 e 49) a hemaacutecia se deposita no fundo no microtubo
apoacutes a centrifugaccedilatildeo (TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (1 3 24 25 43 44 47
48 e 50) o anticorpo ligado agraves hemaacutecias eacute alvo da AGH presente no gel (TDA positivo)
Anti-D 12
Anti-C 10
Anti-E 9
Anti-c 8
Anti-S 7
Anti-K 3 Anti-Dia 1
32
Figura 6 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA Nas amostras
onde houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo (4 6 7 12 a 15 17 34 35 37 e 38) a hemaacutecia se deposita no fundo no
microtubo apoacutes a centrifugaccedilatildeo ( TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (5 16 18
19 20 33 e 36 ) o AGH presente no gel se liga ao anticorpo ligado agraves hemaacutecias que ficam retidas no gel (TDA
positivo)
Tabela 1-Resultado geral do tratamento das hemaacutecias com glicina e cloroquina
Teacutecnica utilizada TDA negativo TDA positivo Total
Glicina-aacutecidaEDTA 33 17 50
Cloroquina 28 22 50
A glicina-aacutecidaEDTA conseguiu negativar mais amostras sensibilizadas com Anti-D
e anti-K que a cloroquina Para as hemaacutecias sensibilizadas com anti-E Anti-S e Anti-Dia
ambas as teacutecnicas dissociaram o anticorpo em 100 das amostras Os resultados detalhados
por especificidade do anticorpo apoacutes o primeiro tratamento com glicina-aacutecidaEDTA e com
cloroquina estatildeo na tabela 2
Para as amostras que permaneceram positivas (17 amostras) apoacutes o tratamento com a
glicina-aacutecidaEDTA foi realizado um novo tratamento Houve dissociaccedilatildeo do anticorpo em 3
amostras (18) apoacutes a segunda tentativa Nas demais 14 (82) amostras tratadas pela
segunda vez 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise
33
Tabela 2 - Resultados do TDA apoacutes tratamento das hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo
sensibilizado
ANTICORPOS
SENSIBILIZADOS
1ordm TRATAMENTO COM
GLICINA
TRATAMENTO COM
CLOROQUINA
TOTAL TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
Anti-D 8 4 0 12 12
Anti-C 6 4 10 0 10
Anti-E 9 0 9 0 9
Anti-c 0 8 1 7 8
Anti-S 7 0 7 0 7
Anti-K 2 1 0 3 3
Anti-Dia 1 0 1 0 1
TOTAL 33 17 28 22 50
A hemoacutelise foi verificada durante o procedimento de lavagem final das hemaacutecias com
soluccedilatildeo fisioloacutegica para a retirada dos reagentes As soluccedilotildees de lavagem ficaram
avermelhadas e as hemaacutecias com coloraccedilatildeo escura As amostras foram descartadas Dentre as
6 amostras que ainda puderam ser testadas para o TDA trecircs amostras negativaram sendo 1
sensibilizada com anti-D e 2 com anti-C (tabela 3)
Tabela 3 - Resultado apoacutes o segundo tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA
Tratamento com
glicina-aacutecidaEDTA
TDA Negativo TDA Positvo Hemoacutelise Total
Segundo tratamento 3 3 11 17
524 TESTAGEM DO ELUATO
Apoacutes o tratamento com a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA a soluccedilatildeo do eluato foi
testada para verificar a viabilidade dos anticorpos que foram dissociados ou eluiacutedos Dentre
as 50 amostras 41 apresentaram eluato positivo As nove amostras cujos eluatos foram
negativos haviam sido sensibilizadas com as seguintes especificidades de anticorpos anti-E 6
amostras (67) anti-S 2 amostras (40) e anti-D 1 amostra (8) (tabela 4) O eluato de
todas as amostras sensibilizadas com os anticorpos anti-C anti-c Anti-K e Anti-Dia foram
positivos Os eluatos positivos na triagem de anticorpos foram testados com paineacuteis de
identificaccedilatildeo para confirmar a especificidade e a viabilidade dos anticorpos (figuras 7 e 8)
34
525 EFEITO DA ELUICcedilAtildeO SOBRE OS ANTIacuteGENOS ERITROCITAacuteRIOS
Para verificar o efeito do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA e com a cloroquina
sobre a expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s foi realizada a fenotipagem das
amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes tratamento com ambas as teacutecnicas Foi avaliado
se o tratamento destruiu os antiacutegenos expressos antes do tratamento
Tabela 4- Resultado do Eluato das amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA
Anticorpos Eluato positvo Eluato negativo Total
Anti-D 11 1 12
Anti-C 10 0 10
Anti-E 3 6 9
Anti-c 8 0 8
Anti-S 5 2 7
Anti-K 3 0 3
Anti-Dia 1 0 1
Total 41 9 50
Figura 7 ndash Painel do eluato da amostra 21 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-C que foi
recuperado no eluato
Figura 8 ndash Painel do eluato da amostra 47 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-K que foi
recuperado no eluato
35
Dentre as 50 amostras 26 eram previamente fenotipadas para os antiacutegenos Fya Fy
b
Jka Jk
b S e s Dentre elas 20 alcanccedilaram TDA negativo apoacutes tratamento com a glicina-
aacutecidaEDTA e 20 negativaram apoacutes tratamento com cloroquina (tabela 5) Apoacutes ambas as
teacutecnicas os antiacutegenos originalmente expressos permaneceram positivos comprovando que natildeo
houve destruiccedilatildeo dos mesmos
Tabela 5 ndash Verificaccedilatildeo da interferecircncia do tratamento da hemaacutecias com cloroquina e glicina-
aacuteicdaEDTA sobre os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
AMOSTRAS
COM
FENOTIPAGEM
PREacuteVIA
TRATADAS COM
CLOROQUINA
TRATADAS COM
GLICINA
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
26
20
20
20
20
As amostras 24 47 e 50 eram positivas para o antiacutegeno K A cloroquina natildeo dissociou
o anticorpo em nenhuma das 3 amostras enquanto a glicina-aacutecidaEDTA foi efetiva nas
amostras 24 e 50 Foi testada a expressatildeo do antiacutegeno K nas amostras 24 e 50 apoacutes o
tratamento utilizando meacutetodo indireto em gel contendo AGH Apesar de natildeo ter sido avaliado
a intensidade de reaccedilatildeo de expressatildeo dos antiacutegenos podemos verificar na figura 9 que nas
duas amostras em que a teacutecnica foi efetiva e dissociou o anticorpo a expressatildeo do antiacutegeno K
continua presente mas a reatividade observada pode ser considerada 1+ sugerindo que houve
diminuiccedilatildeo da expressatildeo do antiacutegeno quando comparado com a expressatildeo observada em
hemaacutecia natildeo tratada
Os resultados individuais de cada amostra em ambas as teacutecnicas encontram-se
resumidas na tabela 6
526 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente onde foi constatada a presenccedila de autoanticorpo
a quente da classe IgG pelo TDA monoespeciacutefico (figura 10)O autoanticorpo tambeacutem
interferia na pesquisa e identificaccedilatildeo de anticorpos irregulares pois apresentava caracteriacutestica
de panaglutinina As hemaacutecias da paciente sensibilizadas ldquoin vivordquo foram tratadas com
cloroquina e com glicina-aacutecidaEDTA
36
Figura 9 ndash Fenotipagem das amostras 24 e 50 para antiacutegeno K apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
O teste positivo indica a presenccedila do antiacutegeno poreacutem a reatividade fraca (1+) sugere que houve enfraquecimento
de sua expressatildeo A direita a expressatildeo forte (4+) do antiacutegeno Kell em hemaacutecia controle natildeo tratada utilizada
como controle positivo
A cloroquina natildeo foi efetiva na retirada do anticorpo ligado as hemaacutecias ao contraacuterio
do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA que dissociou o anticorpo (figura 11)
A hemaacutecia tratada com glicina foi fenotipada para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
(figura 12) A fenotipagem para o sistema Rh (C c E e e) e Kell foi realizada em gel
especiacutefico monoclonal sem interferecircncia do TDA positivo (controle da reaccedilatildeo negativo)
O eluato resultante do tratamento com glicina-aacutecidaEDTA foi testada em gel com
hemaacutecias de painel de identificaccedilatildeo de anticorpos e apresentou resultado positivo com todas
as ceacutelulas (figura 13 e 14)
A amostra foi enviada para genotipagem e o resultado da genotipagem confirmou o
resultado da fenotipagem apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
527 TEMPO DE EXECUCcedilAtildeO DA TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
O tempo de reaccedilatildeo da glicina-aacutecidaEDTA eacute de 2 minutos Todas as amostras foram
tratadas obedecendo ao tempo descrito na literatura demonstrando que o mesmo eacute
reprodutiacutevel
37
Tabela 6- Resultados individuais por amostra
Amostra Especificidade
dos anticorpos
Intensidade do
TDA apoacutes
sensibilizaccedilatildeo
Tratamento
efetivo com
cloroquina
Tratamento
efetivo com
glicina
Eluato
poacutes
glicina
1 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 2 Dia 3+ Sim Sim 3+ 3 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 4 D 4+ Natildeo Sim 4+ 5 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 6 E 3+ Sim Sim Negativo 7 S 4+ Sim Sim 3+ 8 E 3+ Sim Sim 1+ 9 E 3+ Sim Sim 2+
10 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 11 D 4+ Natildeo Sim 4+ 12 D 4+ Natildeo Sim 4+ 13 S 3+ Sim Sim 3+ 14 S 3+ Sim Sim 3+ 15 D 3+ Natildeo Sim 3+ 16 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 17 E 3+ Sim Sim (+) 18 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 19 D 4+ Natildeo Natildeo 3+ 20 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 21 C 3+ Sim Sim 4+ 22 C 3+ Sim Sim 4+ 23 C 3+ Sim Sim 4+ 24 K 4+ Natildeo Sim 4+ 25 D 3+ Natildeo Natildeo Negativo 26 E 4+ Sim Sim Negativo 27 S 3+ Sim Sim 3+ 28 C 3+ Sim Natildeo 4+ 29 C 3+ Sim Sim 4+ 30 C 3+ Sim Sim 4+ 31 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 32 E 3+ Sim Sim Negativo 33 C 3+ Sim Natildeo 4+ 34 S 3+ Sim Sim Negativo 35 S 3+ Sim Sim Negativo 36 C 4+ Sim Natildeo 4+ 37 c 4+ Natildeo Natildeo 4+ 38 D 4+ Natildeo Sim 4+ 39 S 3+ Sim Sim 3+ 40 c 4+ Sim Natildeo 2+ 41 C 4+ Sim Natildeo 4+ 42 E 3+ Sim Sim Negativo 43 D 3+ Natildeo Sim 2+ 44 D 3+ Natildeo Sim 2+ 45 E 3+ Sim Sim Negativo 46 C 3+ Sim Sim 4+ 47 K 4+ Natildeo Natildeo 4+ 48 D 3+ Natildeo Sim 2+ 49 E 3+ Sim Sim Negativo 50 K 4+ Natildeo Sim 4+
TOTAL 50 28 33 41
38
Figura 10 ndash TDA monoespeciacutefico da amostra de paciente Hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo da classe
IgG
oacute Figura 11 ndash TDA apoacutes o tratamento com glicina-aacutecidaEDTA (esquerda) e cloroquina (direita) A glicina
negativou completamente o TDA enquanto a hemaacutecia tratada com cloroquina persistiu positiva (1+)
39
Figura 12 ndash Fenotipagem da amostra tratada com glicina-aacutecidaEDTA Fy(a+b+) Jk(a-b+) S+s+
Figura 13 ndash Painel em gel (LissAGH) do eluato apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de
intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
Figura 14 ndash ndash Painel ezimaacutetico (hemaacutecias tratadas com bromelina) do eluato em gel neutro apoacutes
tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
40
528 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Quanto a efetividade das teacutecnicas em negativar o TDA foi verificado que a glicina-
aacutecidaEDTA foi efetiva em 66 das amostras testadas no primeiro tratamento (3350
amostras) enquanto a cloroquina conseguiu negativar 56 (2850) Esses resultados natildeo
apresentam diferenccedila significativa (pgt005) demostrando que a teacutecnica da glicina-
aacutecidaEDTA natildeo eacute superior mas eacute tatildeo efetiva quanto a da cloroquina
Quando aliamos os resultados de ambas as teacutecnicas verificamos que em 76 (3850)
das amostras o TDA foi negativado Esse dado indica que ainda que uma teacutecnica natildeo seja
eficaz na remoccedilatildeo do anticorpo eacute uma boa alternativa tentar a segunda teacutecnica jaacute que a falha
em remover o anticorpo utilizando uma delas natildeo prevecirc necessariamente a falha com a outra
Quando se utiliza o teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla (graacutefico 2) para comparar a utilizaccedilatildeo das
duas teacutecnicas com o resultado de cada uma isolada (somente a cloroquina ou somente a
glicina) verificamos que os resultados apresentam diferenccedila significativa (plt005) (quadro 3)
TRATAMENTO EFETIVO COM TOTAL PORCENTAGEM
Glicina ou cloroquina 38 76
Glicina e cloroquina 23 46
Glicina apenas 10 20
Cloroquina apenas 5 10
Nenhuma das teacutecnicas 12 24
Quadro 3 - Resultados comparativos entre as teacutecnicas utilizadas
41
Graacutefico 2 - Teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla entre as teacutecnicas aplicadas A- Glicina e Cloroquina B-Cloroquina C-
Glicina ( plt005)
42
6 DISCUSSAtildeO
Os reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA podem ser adquiridos em
forma de kit comercial prontos para uso poreacutem natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil A preparaccedilatildeo
dos reagentes ldquoin houserdquo a partir de sais comerciais adquiridos se mostrou viaacutevel Os
reagentes glicina e o tampatildeo Tris armazenados de forma correta se mantiveram estaacuteveis por
um periacuteodo de 7 meses Somente o reagente EDTA precipitou mesmo armazenado em
condiccedilotildees adequadas sugerindo que o mesmo deve ser preparado em menor quantidade e
armazenado em aliacutequotas A soluccedilatildeo de cloroquina tambeacutem pode ser preparada ldquoin houserdquo e
pode ser armazenado por um mecircs A legislaccedilatildeo brasileira autoriza a utilizaccedilatildeo de reagentes
preparados a partir de sais comerciais como a cloroquina e a glicina-aacutecidaEDTA desde que
os sais tenham autorizaccedilatildeo da vigilacircncia sanitaacuteria para a comercializaccedilatildeo (BRASIL 2001)
A comparaccedilatildeo quanto a efetividade em dissociar anticorpos em amostras com TDA
positivos entre a teacutecnica da glicina e a teacutecnica da cloroquina mostrou que natildeo haacute diferenccedila
estatiacutestica entre elas e que ambas satildeo igualmente eficientes Se utilizadas conjuntamente haacute
maior possibilidade de elucidaccedilatildeo dos casos
Uma vantagem da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eacute que ela permite numa mesma
amostra eluir o anticorpo ligado aacute hemaacutecia assim como fenotipar a hemaacutecia tratada Devido a
sua dupla utilidade a teacutecnica eacute vantajosa principalmente em pacientes em que pouco volume
de amostra pode ser coletado como em casos de crianccedilas e receacutem-nascidos
A fenotipagem poacutes tratamento se mostrou viaacutevel jaacute que os antiacutegenos de maior
importacircncia natildeo sofreram alteraccedilotildees Nas 20 amostras que foram fenotipadas antes e apoacutes
tratamento para verificar a influecircncia dos reagentes na expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a
Jkb S e s natildeo houve destruiccedilatildeo dos mesmos por nenhuma das duas teacutecnicas
Para as amostras positivas para o antiacutegeno Kell (350) e sensibilizadas com o
respectivo anticorpo a teacutecnica da glicina foi efetiva em negativar o TDA em apenas duas
delas mas apoacutes o tratamento foi verificada uma fraca reatividade da reaccedilatildeo antiacutegeno-
anticorpo sugerindo que houve um enfraquecimento da expressatildeo do antiacutegeno conforme
esperado e descrito na literatura (BYRNE 1991 PALLAS WILER E MCGEE 1991
ROZIERS e SQUALI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012 e KATHARIA e
CHAUDHARY 2013) A accedilatildeo da glicina sobre o antigeno Kell natildeo representa impedimento
para seu uso uma vez que na impossibilidade de testar o antiacutegeno Kell o banco de sangue
consegue facilmente atender a solicitaccedilatildeo de transfusatildeo com unidades de hemaacutecias Kell
43
negativas jaacute que eacute um antiacutegeno de baixa prevalecircncia na populaccedilatildeo variando de 15 na
populaccedilatildeo africana a 9 nos europeus (DANIELS 2011)
A soluccedilatildeo resultante da dissociaccedilatildeo do anticorpo pela teacutecnica da glicina pode ainda ser
utilizada como eluato podendo substituir a teacutecnica de eluiccedilatildeo com reagentes comercias (kits
de eluiccedilatildeo aacutecida) que tem alto custo aproximadamente entre R$2000 a R$2500 por teste
Em 41 amostras (82) houve a dissociaccedilatildeo e recuperaccedilatildeo do anticorpo que estava
sensibilizando as hemaacutecias Em 9 amostras (18) os anticorpos foram eluiacutedos poreacutem
apresentaram reaccedilatildeo negativa quando testadas com hemaacutecias de triagem entre eles o anti-E
(6) anti-S (2) e Anti-D (1) Eacute possiacutevel que a correccedilatildeo pH do meio (WALKER 2011) natildeo
tenha sido adequada o que pode ter desfavorecido a reatividade do anticorpo
Para as amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA nas quais natildeo houve dissociaccedilatildeo do
anticorpo pelo primeiro tratamento (1750) o segundo tratamento natildeo se mostrou eficaz jaacute
que 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise O tempo de
armazenagem natildeo parece ter influenciado jaacute que todas as amostras foram testadas dentro de
48 horas apoacutes a coleta Outros fatores que natildeo foram verificados podem ter levado a
hemoacutelise Apesar da literatura (LOUIE JIENG e ZEROULIS 1986 e BYRNE 1991)
recomendar um segundo tratamento ele eacute pouco eficaz tendo negativado apenas 3 das 17
amostras testadas
A amostra de paciente que apresentou sensibilizaccedilatildeo ldquoin vivordquo mostrou melhor
efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA sobre a da cloroquina possibilitando
fenotipagem para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s que natildeo foram destruiacutedos apoacutes o
tratamento comprovado atraveacutes da genotipagem
A presenccedila de autoanticorpo a quente com presenccedila de hemoacutelise (AHAI) ou natildeo pode
mascarar a presenccedila de aloanticorpo interferindo na rotina soroloacutegica da fenotipagem que eacute
uma importante ferramenta para auxiliar na seleccedilatildeo de hemaacutecias para transfusatildeo (SHIREY et
al 2002) Esses pacientes frequentemente possuem aloanticorpos associados ao
autoanticorpo e a prevalecircncia de aloimunizaccedilatildeo entre eles varia entre 12 a 40 (LEGER e
GARRATY 1999 BRANCH e PETZ 1999) o que dificulta ainda mais a escolha do melhor
componente a ser transfundido aleacutem de aumentar a possibilidade reaccedilotildees hemoliacuteticas imunes
poacutes-transfusionais
Nesses casos as teacutecnicas de dissociaccedilatildeo de anticorpos satildeo importantes para tratar
amostras de pacientes e a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser usada como uma opccedilatildeo
pois se mostrou eficaz na dissociaccedilatildeo anticorpo ligado agraves hemaacutecias deixando livre a
superfiacutecie das mesmas permitindo a fenotipagem por antisoros IgG Paralelamente os
44
anticorpos eluiacutedos tambeacutem puderam ser estudados O mesmo natildeo ocorre com a cloroquina
que permite apenas a fenotipagem e tampouco com os kits de eluiccedilatildeo aacutecida disponiacuteveis no
mercado nacional que satildeo destinados a realizaccedilatildeo do eluato mas destroem as hemaacutecias
O tempo de tratamento na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA tambeacutem eacute uma vantagem
pois foi possiacutevel reproduzir no tempo determinado de 2 minutos enquanto a cloroquina
demora ateacute duas horas
Ainda que a aplicaccedilatildeo das teacutecnicas por biologia molecular estejam cada vez mais
presentes na rotina imuno-hematoloacutegica e possibilitam estabelecer o fenoacutetipo deduzido do
genoacutetipo elas natildeo estatildeo disponiacuteveis na maioria dos centros e sua realizaccedilatildeo exige algumas
horas A resoluccedilatildeo imediata do problema transfusional necessita dos resultados soroloacutegicos
pois com frequecircncia natildeo eacute possiacutevel aguardar o resultado do teste molecular Dessa forma
apesar da crescente importacircncia da genotipagem eritrocitaacuteria teacutecnicas soroloacutegicas aplicadas
corretamente e no momento propiacutecio satildeo de grande utilidade para resolver problemas imuno-
hematoloacutegicos como ocorre com a fenotipagem em pacientes com TDA positivo
45
7 CONCLUSAtildeO
A teacutecnica da glicina aacutecidaEDTA mostrou-se efetiva em remover os anticorpos que
sensibilizavam as hemaacutecias e pode ser utilizada com seguranccedila antes da fenotipagem
eritrocitaacuteria Por ser uma teacutecnica de raacutepida execuccedilatildeo eacute uma alternativa aplicaacutevel
principalmente em casos urgentes de pacientes que apresentam autoanticorpos
46
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50
9 ANEXOS
51
FUNDACcedilAtildeO HEMOCENTRO DE RIBEIRAtildeO PRETO
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE)
Tiacutetulo da pesquisa Aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina aacutecida-EDTA e avaliaccedilatildeo da
eficaacutecia no tratamento de hemaacutecias com teste direto da antiglobulina positivo
Pesquisadora responsaacutevel Ceacutelia Kazue Abiko
Orientador Prof Dimas Tadeu Covas
Co-orientadora Dra Flaacutevia Leite Souza Santos
Objetivo da pesquisa Vocecirc estaacute sendo convidado a participar de uma pesquisa que tem
como objetivo padronizar uma nova teacutecnica para auxiliar na tipagem sanguiacutenea de pacientes
A tipagem sanguiacutenea pode sofrer interferecircncia da presenccedila de anticorpos ligados aos gloacutebulos
vermelhos do sangue Nessas situaccedilotildees eacute difiacutecil selecionar o melhor sangue para o paciente e
eacute preciso a utilizaccedilatildeo de teacutecnicas adicionais para remover essas interferecircncias
Esta pesquisa tem como objetivo estudar outra teacutecnica para remover esses anticorpos e
comparaacute-la com a teacutecnica atualmente utilizada Para isso precisamos de amostras de pacientes
e doadores voluntaacuterios
Se vocecirc eacute um doador eacute necessaacuterio que vocecirc autorize a coleta de 5 ml (1 tubo) a mais
de seu sangue
Se vocecirc eacute um paciente natildeo haveraacute necessidade de nova amostra pois utilizaremos as
amostras jaacute coletadas para os testes preacute-transfusionais e os resultados encontrados nesta
pesquisa natildeo iratildeo interferir na escolha da (s) bolsa (s) de sangue que vocecirc possa vir a receber
Se vocecirc concordar em participar leia com atenccedilatildeo o texto abaixo e assine as duas vias
rubricando todas as paacuteginas deste termo de consentimento Uma via original assinada e
rubricada por vocecirc e pela pesquisadora ficaraacute com vocecirc
As suas informaccedilotildees seratildeo mantidas em sigilo pela pesquisadora e natildeo haveraacute
armazenamento de material para pesquisas posteriores Os seus dados seratildeo usados apenas
neste estudo e quando o trabalho for publicado seu nome e qualquer outra informaccedilatildeo que
possam identificaacute-lo natildeo seratildeo revelados
Eacute pouco provaacutevel que o que noacutes aprendermos com este estudo tenha um benefiacutecio
direto para vocecirc assim como natildeo poderemos dar nada em troca pela sua participaccedilatildeo na
pesquisa
Nosso objetivo com esta pesquisa eacute que os resultados poderatildeo ser uacuteteis para o
tratamento de pacientes no futuro Os riscos da participaccedilatildeo satildeo miacutenimos Se vocecirc eacute um
doador de sangue a amostra seraacute coletada no momento da doaccedilatildeo natildeo exigindo punccedilatildeo
venosa adicional
52
Eacute seu direito ter acesso aos resultados dos testes da pesquisa Esses resultados natildeo
seratildeo fornecidos automaticamente a vocecirc mas caso vocecirc se interesse em saber o resultado ou
tiver alguma duacutevida sobre a sua participaccedilatildeo neste estudo deveraacute entrar em contato com Ceacutelia
Kazue Abiko pelo telefone (18) 99718-3551
Vocecirc tem total liberdade de optar por natildeo participar da pesquisa Caso aceite
participar poderaacute desistir a qualquer momento ou retirar seu consentimento mesmo apoacutes ter
coletado o sangue Para cancelar sua participaccedilatildeo basta avisar a pesquisadora e os seus dados
seratildeo retirados do projeto
Qualquer duacutevida eacutetica sobre a pesquisa poderaacute entrar em contato com o Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa do Hospital das Cliacutenicas e da Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto
(CAMPUS UNIVERSITAacuteRIO bairro Monte Alegre CEP 14048-900 Ribeiratildeo Preto-SP
Telefone (16) 3602-2228 FAX (16) 3633-1144 e-mail cephcrpuspbr)
Consentimento de participaccedilatildeo
A Consentimento do participante
Li as informaccedilotildees acima sobre o estudo e recebi explicaccedilotildees sobre a participaccedilatildeo no estudo
Portanto dou o meu consentimento para participar do estudo
___________________________________________________________________________
Nome completo
___________________________________________________________________________
Assinatura
___________
Data
__________________________________________________________________________________
Nome completo da pesquisadora
___________________________________________________________________________
Assinatura
_____________
Data
4
reticuloendotelial ou por ativaccedilatildeo do sistema complemento com a formaccedilatildeo do complexo de
ataque a membrana e hemoacutelise intravascular As duas classes de anticorpos de maior
importacircncia em imunohematologia satildeo as imunoglobulinas IgG e a IgM (SANTOS 2014)
Devido a sua estrutura pentameacuterica os anticorpos da classe IgM se ligam aos
antiacutegenos localizados na superfiacutecie da membrana de hemaacutecias proacuteximas e promovem
aglutinaccedilatildeo das mesmas em meio salino ldquoin vitrordquo Anticorpos da classe IgG por sua vez
satildeo denominados ldquonatildeo aglutinantesrdquo ou ldquoincompletosrdquo pois sua estrutura de monocircmero eacute
pequena o que desfavorece a aglutinaccedilatildeo direta uma vez que uma mesma moleacutecula de IgG
natildeo alcanccedila antiacutegenos alvos em duas hemaacutecias proacuteximas Os anticorpos IgM aleacutem de terem
um tamanho maior apresentam 750 vezes maior eficiecircncia de aglutinaccedilatildeo que os anticorpos
IgG permitindo maior facilidade nas ligaccedilotildees entre as hemaacutecias (CARRUCIO e WISE 2012
GREEN e KLOSTERMANN 2012)
Nos testes ldquoin vitrordquo satildeo simulados reaccedilotildees que poderiam ocorrer ldquoin vivordquo causando
reaccedilotildees indesejaacuteveis A fase de sensibilizaccedilatildeo em que o anticorpo se liga ao antiacutegeno
correspondente natildeo eacute identificada macroscopicamente poreacutem uma vez que o anticorpo
aproxima as hemaacutecias e vence a forccedila eletrostaacutetica que naturalmente as repele chamada de
potencial zeta ocorre a aglutinaccedilatildeo Dependendo das caracteriacutesticas do anticorpo e de sua
capacidade de fixar complemento pode ocorrer tambeacutem a hemoacutelise (SANTOS 2014)
113 PESQUISA E IDENTIFICACcedilAtildeO DE ANTICORPOS IRREGULARES
A pesquisa de anticorpos irregulares eacute teste obrigatoacuterio nos testes preacute-transfusionais e
tem a finalidade de detectar anticorpos ldquoin vitrordquo que possam causar reaccedilatildeo ldquoin vivordquo
Dependendo da populaccedilatildeo estudada (pacientes x doadores) e ainda da sensibilidade do
teste a frequecircncia de anticorpos irregulares pode variar de 03 a 38 A imunizaccedilatildeo pode
ocorrer por transfusatildeo gestaccedilatildeo transplante ou injeccedilatildeo de material imunogecircnico (WALKER
2011)
Os anticorpos irregulares podem ser classificados como aloanticorpos que satildeo
voltados contra antiacutegenos ausentes na hemaacutecia autoacuteloga ou como autoanticorpos os quais
reconhecem antiacutegenos eritrocitaacuterios proacuteprios Os autoanticorpos antieritrocitaacuterios surgem em
decorrecircncia da desregulaccedilatildeo da autotoleracircncia imune relacionada agrave condiccedilotildees diversas como
doenccedilas hematoloacutegicas doenccedilas inflamatoacuterias autoimunes neoplasias infecccedilotildees e uso de
medicaccedilotildees A presenccedila do autoanticorpo associado a um quadro de anemia hemoliacutetica
caracteriza a anemia hemoliacutetica autoimune (AHAI) seja ela primaacuteria ou secundaacuteria agrave outra
5
patologia Ateacute 12 a 40 dos pacientes com autoanticorpos quentes podem apresentar
aloanticorpos de significado cliacutenico mascarados pelos autoanticorpos (SHIREY et al 2002)
Eacute importante detectar a presenccedila de anticorpos no plasmasoro de um receptor de
transfusatildeo para garantir que seja transfundido sangue compatiacutevel Quando a pesquisa de
anticorpo irregular resultar positiva para um ou mais anticorpos de relevacircncia clinica eacute
necessaacuterio confirmar a ausecircncia do respectivo antiacutegeno na hemaacutecia do receptor assim como
selecionar para transfusatildeo concentrados de hemaacutecias tambeacutem negativos para aqueles
antiacutegenos evitando assim reaccedilotildees transfusionais (WALKER 2011)
A detecccedilatildeo de um anticorpo irregular eacute inicialmente realizada pela triagem de
anticorpos na qual o soroplasma do receptor eacute testado com 2 a 3 hemaacutecias do tipo ldquoOrdquo O
conjunto de fenoacutetipos dessas hemaacutecias deve contemplar os antiacutegenos de maior importacircncia
cliacutenica Como os anticorpos irregulares de maior interesse cliacutenico satildeo na maior parte das
vezes imunes portanto da classe IgG eacute obrigatoacuteria a fase de antiglobulina (AGH) do teste
ou teste indireto da antiglobulina (TIA) uma vez que esses anticorpos satildeo incompletos
(CASTILHO JUNIOR e REID 2015) O teste de triagem estando positivo deve-se fazer a
identificaccedilatildeo da especificidade do anticorpo utilizando um painel com maior nuacutemero de
hemaacutecias fenotipadas
114 PROVA DE COMPATIBILIDADE
A prova de compatibilidade eacute um teste obrigatoacuterio em caso de transfusatildeo de
componentes eritrocitaacuterios Tambeacutem chamada de prova de compatibilidade maior deve ser
realizada antes da administraccedilatildeo de sangue total ou concentrado de hemaacutecias utilizando-se
hemaacutecias obtidas do tubo coletor da bolsa a ser transfundida e o soro ou plasma do receptor
(BRASIL 2016)
Eacute definido como o procedimento para excluir a incompatibilidade entre o doador e o
receptor Tem o objetivo de detectar anticorpos que podem natildeo ter sido encontrados na
pesquisa de anticorpos devido a ausecircncia ou pouca expressatildeo de antiacutegenos no painel de
hemaacutecias aleacutem da possibilidade de terem ocorrido erros teacutecnicos ou notacionais durante a
realizaccedilatildeo da pesquisa (MELO 2007)
6
115 FENOTIPAGEM PARA OUTROS SISTEMAS
Aleacutem da pesquisa de ABORh que eacute realizado rotineiramente a fenotipagem para
outros sistemas tambeacutem denominado ldquofenotipagem estendidardquo determina a presenccedila ou
ausecircncia de antiacutegenos considerados de importacircncia cliacutenica A fenotipagem natildeo eacute obrigatoacuteria
nos testes preacute-transfusionais poreacutem a legislaccedilatildeo atual recomenda a realizaccedilatildeo da fenotipagem
eritrocitaacuteria dos antiacutegenos C (RH2) E (RH3) c (RH4) e (RH5) K (KELL1) Fya (FY1) Fy
b
(FY2) Jka
(JK1) Jkb (JK2) S (MNS3) e s (MNS4) para pacientes aloimunizados e pacientes
com indicaccedilatildeo de transfusatildeo crocircnica (BRASIL 2016)
A seleccedilatildeo de concentrados de hemaacutecias com o mesmo fenoacutetipo do receptor para
transfusatildeo pode evitar reaccedilotildees transfusionais hemoliacuteticas no paciente previamente
aloimunizado tambeacutem previne a sensibilizaccedilatildeo por outros antiacutegenos o que normalmente
torna as transfusotildees seguintes ainda mais complicadas A fenotipagem do paciente tambeacutem
auxilia na identificaccedilatildeo dos anticorpos pois espera-se que nas hemaacutecias do paciente o
antiacutegeno seja negativo para o anticorpo encontrado servindo de guia para teste de exclusatildeo de
anticorpos (SANTOS 2014 WALKER 2011)
A incidecircncia de aloanticorpos aumenta com o nuacutemero de transfusotildees no entanto a
implantaccedilatildeo de rotina de fenotipagem com transfusatildeo profilaacutetica de hemaacutecias com fenoacutetipo
compatiacutevel para pacientes candidatos agrave politransfusatildeo como os portadores de doenccedila
falciforme talassemia anemia aplaacutestica doenccedilas linfo e mieloproliferativas renais crocircnicos e
anemias refrataacuterias pode contribuir para o baixo iacutendice de sensibilizaccedilatildeo nessas populaccedilotildees
(FLUIT KUNST e DRENTHE-SCHONK 1999 MARTINS et al 2008 e VICHINSKY et
al 2001) Outro grupo de pacientes que se beneficia com a transfusatildeo de mesmo fenoacutetipo satildeo
os pacientes com AHAI uma vez que o autoanticorpo pode mascarar a presenccedila de um
aloanticorpo de significado cliacutenico em ateacute 40 dos casos Mesmo com as teacutecnicas utilizadas
ldquoin vitrordquo para remover a interferecircncia do autoanticorpo no soro um aloanticorpo pode natildeo
ser identificado e dessa forma transfundir o mesmo fenoacutetipo do paciente evitaria reaccedilatildeo
hemoliacutetica pelos anticorpos voltados contra antiacutegenos de maior importacircncia cliacutenica e de
frequecircncia intermediaacuteria Aleacutem disso os pacientes com AHAI satildeo fortes respondedores e a
transfusatildeo profilaacutetica do mesmo fenoacutetipo previne a aloimunizaccedilatildeo (SHIREY et al 2002)
Aleacutem de fenotipar o receptor eacute importante tambeacutem que os bancos de sangue tenham
rotinas de fenotipagem de doadores para atender as necessidade dos pacientes aloimunizados
ou em esquema de transfusatildeo crocircnica (PINTO BRAGA e SANTOS 2011)
7
Rotineiramente eacute inviaacutevel estabelecer o fenoacutetipo eritrocitaacuterio completo de um
indiviacuteduo pela grande diversidade de sistemas sanguiacuteneos descritos Ate junho de 2015 jaacute
haviam sido classificados 308 antiacutegenos atribuiacutedos a 36 sistemas definidos pela Sociedade
Internacional de Transfusatildeo de Sangue (ISBT) (CASTILHO JUNIOR e REID 2015)
Portanto o paciente eacute normalmente fenotipado para os antiacutegenos de maior importacircncia
clinica
Alguns fatores podem limitar a realizaccedilatildeo da fenotipagem eritrocitaacuteria Um dos fatores
eacute a transfusatildeo alogecircnica realizada haacute menos de 90 dias Neste caso podem ocorrer resultados
falso positivos para determinados antiacutegenos devido agrave presenccedila de hemaacutecias do doador
(LAINE et al 2000)
Outro fator eacute a presenccedila de anticorpo sensibilizando a hemaacutecia do paciente e
provocando positividade do teste direto da antiglobulina humana (TDA) Os soros
normalmente utilizados para fenotipagem especialmente para os antiacutegenos Fya
(FY1) Fyb
(FY2) Jka
(JK1) Jkb
(JK2) S (MNS3) e s (MNS4) necessitam da fase de antiglobulina
humana (AGH) para que ocorra aglutinacatildeo Amostras que apresentam o TDA positivo
aglutinam apoacutes reaccedilatildeo com a AGH natildeo pela real presenccedila do antiacutegeno em sua superfiacutecie mas
pela interaccedilatildeo da AGH com o anticorpo que estaacute sensibilizando o eritroacutecito A interferecircncia
do TDA positivo pode ser anulada atraveacutes de algumas teacutecnicas capazes de dissociar o
anticorpo como por exemplo o tratamento da hemaacutecia sensibilizada com cloroquina ou com
glicina-aacutecida-EDTA (BRANCH e PETZ 1999 SHIREY et al 2002 e LEGER 2011)
12 METODOLOGIAS APLICADOS Agrave ROTINA IMUNO-HEMATOLOacuteGICA
Todos os testes que compotildeem a rotina preacute-transfusional usam meacutetodos soroloacutegicos
que envolvem a reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo e tem como objetivo determinar o perfil antigecircnico
eritrocitaacuterio do receptor e do doador assim como identificar em seu soro a presenccedila de
anticorpos contra antiacutegenos eritrocitaacuterios que possam comprometer a sobrevida das hemaacutecias
transfundidas Para testar o antiacutegeno na superfiacutecie da hemaacutecia eacute necessaacuterio dispor de um
antissoro com especificidade conhecida para aquele antiacutegeno Por outro lado para testar a
presenccedila de um determinado anticorpo no soro ou plasma do receptor eacute necessaacuterio o uso de
hemaacutecias com perfil antigecircnico conhecido (SANTOS 2014)
Diversas metodologias satildeo aplicadas nos laboratoacuterios de imunohematologia Cada
serviccedilo de hemoterapia faz a escolha do meacutetodo que seraacute aplicado de acordo com o perfil do
laboratoacuterio com o volume de exames diaacuterios e tambeacutem com o custo envolvido Todas essas
8
teacutecnicas tecircm como objetivo comum demonstrar a reaccedilatildeo entre antiacutegeno e anticorpo no
entanto elas se baseiam em diferentes princiacutepios Muitas metodologias satildeo atualmente
aplicadas agrave imunohematologia entre elas o sistema de fase soacutelida a tecnologia de hemaacutecias
magnetizadas a biologia molecular e ateacute mesmo a citometria de fluxo no entanto os meacutetodos
mais tradicionais satildeo aqueles baseados no princiacutepio de hemaglutinaccedilatildeo
121 MEacuteTODOS DE FASE FLUacuteIDA
Os meacutetodos de fase fluiacuteda satildeo testes baseados na hemaglutinaccedilatildeo e incluem o teste em
tubo e o teste em microplacas Uma suspensatildeo de hemaacutecias eacute adicionada ao plasma ou soro
em seguida eacute realizada a centrifugaccedilatildeo e por fim eacute feita a leitura do resultado que eacute
considerado positivo se for observado algum grau de aglutinaccedilatildeo ou hemoacutelise A intensidade
de aglutinaccedilatildeo eacute graduada de acordo com o tamanho dos agregados desprendidos da
superfiacutecie apoacutes agitaccedilatildeo delicada do tubo ou microplaca Os meacutetodos de hemaglutinaccedilatildeo satildeo
aplicados a todos os testes preacute-transfusionais Como os anticorpos ABO satildeo aglutininas frias
a tipagem eacute realizada em temperatura ambiente (22degC) no entanto ao investigar a presenccedila
de anticorpos irregulares que como jaacute mencionado eacute na maioria das vezes anticorpos
incompletos da classe IgG eacute essencial que a reaccedilatildeo seja incubada a 37degC As reaccedilotildees satildeo
facilitadas com a utilizaccedilatildeo de potencializadores e da antiglobulina humana (WALKER e
HARMENING 2012 AABB 2011)
Nos meacutetodos de fase fluiacuteda nos quais a AGH eacute empregada a fase de lavagem eacute
fundamental Apoacutes a incubaccedilatildeo do soro com as hemaacutecias deve ser realizada a lavagem da
reaccedilatildeo para remover o excesso de anticorpos natildeo ligados agraves hemaacutecias jaacute que os anticorpos
livres podem bloquear a AGH quando ela eacute adicionada e levar a resultados falso negativos
(AABB 2011)
Os testes de hemaglutinaccedilatildeo satildeo os mais tradicionais entre os meacutetodos ainda hoje
aplicados agrave rotina de bancos de sangue A vantagem desses meacutetodos eacute o baixo custo quando
comparado agraves teacutecnicas mais modernas mas apresentam tambeacutem desvantagens A teacutecnica em
tubo por exemplo natildeo permite automaccedilatildeo eacute trabalhosa e exige matildeo-de-obra bastante treinada
na execuccedilatildeo das diversas etapas do teste e mesmo assim pode haver subjetividade na
interpretaccedilatildeo dos resultados aleacutem de resultados falso-negativos (DOWNES 2011 ZANTEK
et al 2012)
9
122 COLUNAS DE GEL
A teacutecnica em gel iniciada na deacutecada de 90 representou uma grande revoluccedilatildeo na
rotina laboratorial tornando-se muito popular Aleacutem de ser sensiacutevel a teacutecnica dispensa a fase
de lavagem antes da adiccedilatildeo da AGH assim como a agitaccedilatildeo do teste para leitura reduzindo o
nuacutemero de resultados falsos negativos decorrentes dessas duas etapas e o tempo para
execuccedilatildeo dos testes (LAPIERRE et al 1989 NOVARETTI et al 2000 NOVARETTI et
al 2004) Os reagentes satildeo comercializados na forma de cartotildees plaacutesticos contendo
microtubos preenchidos por gel composto por microesferas de acrilamida-dextran Nesta
metodologia tambeacutem baseada na hemaglutinaccedilatildeo a suspensatildeo de hemaacutecias e o soro satildeo
depositados em uma cacircmara acima da coluna de gel e em seguida procede-se com a
centrifugaccedilatildeo dos cartotildees As microesferas atuam como uma malha que permite a passagem
em direccedilatildeo ao fundo do microtubo apenas das hemaacutecias natildeo aglutinadas enquanto as
hemaacutecias aglutinadas ficam retidas na parte superior da coluna ou ao longo dela (GREEN e
KLOSTERMANN 2012) Portanto quanto maior a agregaccedilatildeo mais hemaacutecias ficam retidas
no topo da coluna Dependendo do tipo de teste a ser realizado pode ser utilizado gel neutro
ou gel especiacutefico impregnado pelo anticorpo desejado e o gel contendo antiglobulina humana
que satildeo utilizados para os testes diretos e indiretos da antiglobulina (LAPIERRE et al 1989)
A coluna de gel ainda permite a visualizaccedilatildeo clara de duas populaccedilotildees distintas de hemaacutecias
como em pacientes receacutem transfundidos
123 BIOLOGIA MOLECULAR
A biologia molecular ou genotipagem estaacute sendo cada vez mais aplicada aos grupos
sanguiacuteneos pois fornece resultados seguros e precisos especialmente nos casos em que natildeo eacute
possiacutevel a realizaccedilatildeo da fenotipagem como em pacientes receacutem-transfundidos e pacientes
com TDA positivo Na genotipagem eacute possiacutevel determinar atraveacutes do DNA do paciente
extraiacutedo de seus leucoacutecitos de sangue perifeacuterico o fenoacutetipo eritrocitaacuterio deduzido sem
qualquer interferecircncia do anticorpo que sensibiliza a hemaacutecia ou de hemaacutecias alogecircnicas
transfundidas Sua realizaccedilatildeo no entanto exige o treinamento de equipe especializada e capaz
de interpretar os resultados em conjunto com os achados soroloacutegicos (JUNIOR e OLIVATO
2007)
Apesar de ser uma ferramenta de grande importacircncia hoje na imuno-hematologia
ainda estaacute restrito aos grandes centros de hemoterapia no Brasil poucos serviccedilos puacuteblicos de
sauacutede dispotildeem desse recurso e utilizam teacutecnicas de genotipagem de grupos sanguiacuteneos para
atendimento a seus pacientes Esta abordagem poreacutem vem sendo introduzida em algumas
10
instituiccedilotildees de reconhecida competecircncia na hemoterapia mas sua disponibilizaccedilatildeo deve
tornar-se mais generalizada atraveacutes da formaccedilatildeo de centros de referecircncia para atendimento
das diversas unidades de hemoterapia (MARTINS et al 2009) Dessa forma muitas decisotildees
transfusionais especialmente em urgecircncias ainda devem ser tomadas sem o resultado da
genotipagem eritrocitaacuteria
13 TESTE DA ANTIGLOBULINA
Coombs Mourant e Race descreveram em 1945 uma teacutecnica com utilizando soro de
coelho contendo antiglobulina humana (AGH) que posteriormente foi chamada de ldquosoro de
Coombsrdquo O meacutetodo foi desenvolvido inicialmente para ampliar o efeito de aglutininas fracas
do sistema Rh anticorpos ldquoincompletosrdquo que normalmente natildeo apresentavam aglutinaccedilatildeo
visiacutevel O teste foi concebido como um instrumento de investigaccedilatildeo de doenccedila hemoliacutetica do
receacutem-nascido e de reaccedilotildees transfusionais causadas por anticorpos Rh que estavam presentes
no soro dos paciente poreacutem que natildeo eram demonstraacuteveis pelas teacutecnicas ateacute entatildeo existentes
A maior parte dos anticorpos de significado cliacutenico assim como seus respectivos
antiacutegenos foram descritos apoacutes o surgimento do ldquosoro de Coombsrdquo em 1945 sendo assim o
teste da antiglobulina representa ateacute hoje a forma mais importante de aglutinaccedilatildeo artificial em
imunohematologia permitindo revelar a presenccedila de anticorpos na membrana da hemaacutecia A
antiglobulina humana eacute constituiacuteda por anticorpo especiacutefico contra a porccedilatildeo Fc de outro
anticorpo Quando um anticorpo ldquoincompletordquo sensibiliza a hemaacutecia normalmente natildeo
provoca aglutinaccedilatildeo visiacutevel Apoacutes a adiccedilatildeo da AGH ao meio esta reconhece e se liga agraves
porccedilotildees Fc dos anticorpos que sensibilizam a hemaacutecia formando assim uma malha e
provocando aglutinaccedilatildeo visiacutevel (BARJAS-CASTRO 2013)
Os reagentes de antiglobulina podem ser poliespeciacuteficos ou monoespeciacuteficos Os
poliespeciacuteficos satildeo uma mistura de anticorpos ant-IgG e anti-C3d (fraccedilatildeo C3d do
complemento) Os reagentes monoespecificos podem ser anti-IgG anti-IgM anti-IgA anti-
complemento podendo ser anti-C3d e anti-C3b
O teste da antiglobulina pode ser usado para detectar hemaacutecias sensibilizadas com
aloanticorpos IgG autoanticorpos IgG e componentes do complemento A sensibilizaccedilatildeo
pode ocorrer ldquoin vivordquo ou ldquoin vitrordquo O uso do AGH para detectar a sensibilizaccedilatildeo ldquoin vitrordquo
tem dois estaacutegios e eacute denominado teste indireto da antiglobulina A sensibilizaccedilatildeo ldquoin vivordquo eacute
detectada em procedimento de um uacutenico estagio chamado teste direto da antiglobulina (TDA)
11
Os testes direto e indireto satildeo ateacute hoje amplamente aplicados como princiacutepio de inuacutemeros
testes soroloacutegicos em imuno-hematologia (GREEN e KLOSTERMANN 2012)
131 TESTE DIRETO DA ANTIGLOBULINA
O teste direto da antiglobulina humana revela a presenccedila de anticorpo eou fraccedilatildeo do
complemento ligados agrave superfiacutecie das hemaacutecias As sensibilizaccedilatildeo das hemaacutecias ocorrida ldquoin
vivordquo natildeo eacute visualizada mas apoacutes a adiccedilatildeo da antiglobulina humana ocorre a aglutinaccedilatildeo que
eacute visualizada macroscopicamente (Figura 1)
Figura 1 - Princiacutepio da teacutecnica direta da antiglobulina Teste utilizado para demonstrar a sensibilizaccedilatildeo ldquoin
vivordquo das hemaacutecias O sangue total eacute coletado do paciente em tubo contendo anticoagulante EDTA Na teacutecnica
realizada em tubo uma suspensatildeo de hemaacutecias 5 em soluccedilatildeo de salina eacute preparada Uma gota dessa suspensatildeo
eacute lavada 3 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica para retirada de anticorpos que estatildeo livres no plasma Toda soluccedilatildeo eacute
retirada e adiciona-se o soro de Coombs (antiglobulina humana) O soro de Coombs reconhece os anticorpos que
estatildeo ligados agrave superfiacutecie das hemaacutecias fazendo com que ocorra aglutinaccedilatildeo visiacutevel macroscopicamente
Apesar de natildeo ser um teste preacute-transfusional obrigatoacuterio o TDA eacute um dos testes mais
importantes para investigar e classificar quadros hemoliacuteticos como de origem imune ou natildeo
imune O seu valor preditivo positivo em vigecircncia de anemia hemoliacutetica eacute de 83 poreacutem natildeo
havendo sinais de hemoacutelise seu valor preditivo eacute apenas 14 Eacute por esse motivo que a
interpretaccedilatildeo do TDA positivo deve levar em consideraccedilatildeo a histoacuteria cliacutenica e os resultados
dos outros exames laboratoriais A realizaccedilatildeo do TDA eacute obrigatoacuteria na investigaccedilatildeo
12
laboratorial de diversos quadros hemoliacuteticos entre eles a anemia hemoliacutetica autoimune
(AHAI) a reaccedilatildeo hemoliacutetica imune poacutes-transfusional a siacutendrome do linfoacutecito passageiro a
doenccedila hemoliacutetica perinatal e a hemoacutelise droga-dependente (LEGER 2011)
Resultados de TDA positivos foram tambeacutem observados em indiviacuteduos com niacuteveis
seacutericos elevados de IgG ou complemento sem evidecircncia de anemia hemoliacutetica imune como
em pacientes com doenccedila falciforme talassemia doenccedila renal crocircnica mieloma muacuteltiplo
doenccedilas autoimunes e siacutendrome da imunodeficiecircncia adquirida (SIDA) Aleacutem disso pequenas
quantidades de IgG (5 a 90 moleacuteculas por hemaacutecia) e complemento (5 a 40 moleacuteculas por
hemaacutecia) podem estar presentes nas hemaacutecias de indiviacuteduos saudaacuteveis sem associaccedilatildeo com
reduccedilatildeo na sobrevida das mesmas A positividade do TDA depende da populaccedilatildeo estudada e
pode variar de 01 entre doadores de sangue sem qualquer sinal cliacutenico de hemoacutelise ateacute
15 em pacientes hospitalizados (CASTILHO JUNIOR e REID 2015 LEGER 2011)
Indiviacuteduos que apresentam TDA positivo seja agraves custas de IgG eou complemento
com ou sem sinais cliacutenicos de hemoacutelise teratildeo a fenotipagem eritrocitaacuteria prejudicada A
fenotipagem de indiviacuteduos com TDA positivo especialmente quando utilizado o teste indireto
da antiglobulina pode acarretar resultados falsos positivos e levar a seleccedilatildeo de fenoacutetipo
incorreto para transfusatildeo
132 TESTE INDIRETO DA ANTIGLOBULINA
O teste indireto da antiglobulina (TIA) eacute utilizado para revelar a sensibilizaccedilatildeo ldquoin
vitrordquo das hemaacutecias e eacute aplicado a diversos testes soroloacutegicos em imunohematologia entre
eles a pesquisa de anticorpos identificaccedilatildeo de anticorpos testes de compatibilidade
fenotipagem eritrocitaacuteria e titulaccedilatildeo de anticorpos Na teacutecnica indireta a hemaacutecia que contecircm
o antiacutegeno eacute colocada em contato ldquoin vitrordquo com o anticorpo que se liga mas natildeo promove a
aglutinaccedilatildeo visiacutevel A adiccedilatildeo da AGH forma uma malha entre os anticorpos que sensibilizam
as hemaacutecias e provoca a aglutinaccedilatildeo macroscoacutepica (figura 2)
Caso a amostra de hemaacutecia estudada seja previamente sensibilizada resultados falsos
positivos podem ser obtidos no TIA jaacute que a AGH reagiraacute com a moleacutecula que sensibilizava
anteriormente a hemaacutecia mesmo se o anticorpo especiacutefico natildeo tiver se ligado ao antiacutegeno
correspondente
13
133 CONDICcedilOtildeES CLIacuteNICAS COM TDA POSITIVO
O TDA positivo deve ser interpretado cuidadosamente sempre em conjunto com o
quadro cliacutenico do paciente A positividade isolada do TDA natildeo significa hemoacutelise A
interpretaccedilatildeo do teste positivo requer o conhecimento do diagnoacutestico do paciente da presenccedila
de sinais e sintomas sugestivos de hemoacutelise assim como de seu histoacuterico transfusional
gestacional e de informaccedilotildees sobre o uso recente de medicaccedilotildees (LEGER 2011)
Figura 2 ndash Princiacutepio do teste indireto da antiglobulina O TIA pode ser utilizado na pesquisa de anticorpos de
especificidades desconhecidas livres no soroplasma como eacute o caso da pesquisa e identificaccedilatildeo de anticorpos
irregulares Ele eacute tambeacutem utilizado para determinar a presenccedila de antiacutegenos na membrana da hemaacutecia quando
satildeo empregados soros de especificidades conhecidas da classe IgG No primeiro caso o soroplasma contendo o
anticorpo desconhecido eacute colocado em contato com hemaacutecias cujo perfil antigecircnico eacute conhecido No segundo
caso utiliza-se soro de especificidade conhecida da classe IgG para determinar a presenccedila ou ausecircncia de um
antiacutegeno na membrana O anticorpo encontra o antiacutegeno correspondente e ocorre a ligaccedilatildeo do anticorpo agrave
hemaacutecia mas natildeo ocorre aglutinaccedilatildeo Apoacutes a adiccedilatildeo da AGH que se liga aos anticorpos formando uma malha
ocorre a aglutinaccedilatildeo visiacutevel
O TDA positivo eacute uma achado claacutessico de algumas condiccedilotildees cliacutenicas como a reaccedilatildeo
transfusional hemoliacutetica a doenccedila hemoliacutetica do feto e do receacutem-nascido (DHFRN) a anemia
hemoliacutetica induzida por drogas a siacutendrome do linfoacutecito passageiro e a anemia hemoliacutetica
autoimune (AHAI) Portanto o TDA positivo pode ser decorrente da sensibilizaccedilatildeo da
hemaacutecia autoacuteloga por um autoanticorpo ou por um aloanticorpo ligado agrave hemaacutecia alogecircnica
circulante A positividade do TDA pode ainda ocorrer de forma passiva em pacientes que
14
recebem imunoglobulinas humanas ou ainda pela transfusatildeo de plaquetas ABO natildeo idecircntico
(LEGER 2011 RALPH 2012 ZANTEK et al 2012)
Nas reaccedilotildees transfusionais hemoliacuteticas imunes o aloanticorpo do receptor sensibiliza
as hemaacutecias transfundidas do doador e reduz sua sobrevida ao removecirc-la precocemente da
circulaccedilatildeo pela fagocitose no sistema retiacuteculo-endotelial ou pela hemoacutelise intravascular As
reaccedilotildees podem ser agudas se ocorrem ateacute 24 horas ou tardias quando ocorrem apoacutes 24 horas
da transfusatildeo A gravidade das reaccedilotildees hemoliacuteticas pode variar de um simples rendimento
transfusional inadequado agrave quadros graves de hemoacutelise intravascular evoluindo ateacute mesmo
com choque vascular e oacutebito O TDA pode resultar negativo caso toda massa eritrocitaacuteria
transfundida tenha sido destruiacuteda (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
Na doenccedila hemoliacutetica do feto e do receacutem-nascido (DHFRN) anticorpos maternos da
classe IgG atravessam a barreira placentaacuteria e sensibilizam as hemaacutecias fetais que seratildeo
destruiacutedas precocemente levando agrave anemia fetal Apesar da incompatibilidade ABO feto-
materna ser a causa mais frequente de DHFRN raramente ela eacute responsaacutevel pela ocorrecircncia
de quadros graves Por outro lado anticorpos contra antiacutegenos do sistema Rh e Kell
especialmente Anti-D (Anti-RH1) Anti-c (Anti-RH4) e Anti-Kell (Anti-KELL1) satildeo
conhecidos por causar DHFRN severa Raramente outros anticorpos tambeacutem podem estar
implicados na DHFRN como os anticorpos contra antiacutegenos do sistema Kidd Duffy MNS e
Diego (ZANTEK et al 2012)
A hemoacutelise droga-dependente eacute causada pela produccedilatildeo de um anticorpo voltado contra
a droga ligada agrave membrana eritrocitaacuteria ou ainda contra o complexo droga-membrana A
classe de medicaccedilotildees mais comumente envolvida eacute a dos antimicrobianos betalactacircmicos
(penicilinas e cefalosporinas) mas outras classes como quimioteraacutepicos e anti-inflamatoacuterios
tambeacutem satildeo descritos (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
Apoacutes transplante de ceacutelulas progenitoras hematopoieacuteticas em que o doador possui
anticorpos contra antiacutegenos eritrocitaacuterios do receptor o linfoacutecito de memoacuteria do doador pode
resistir ao esquema imunossupressor utilizado e continuar a produccedilatildeo de anticorpos que
reconhecem a hemaacutecia incompatiacutevel do receptor ainda circulante O quadro cliacutenico pode
variar de um simples TDA positivo sem outros sinais ou sintomas ateacute um quadro hemoliacutetico
grave e abrupto (LEGER 2011)
15
134 ANEMIA HEMOLIacuteTICA AUTOIMUNE
A anemia hemoliacutetica autoimune eacute caracterizada pela destruiccedilatildeo precoce das hemaacutecias
autoacutelogas por autoanticorpos que sensibilizam as hemaacutecias e levam agrave fagocitose pelos
macroacutefagos no sistema reticulo-endotelial ou hemoacutelise intravascular O diagnoacutestico da AHAI
baseia-se na presenccedila de hemoacutelise cliacutenica associada agrave evidecircncia de fator imune representado
pelo TDA positivo As classes de anticorpos envolvidas em quadros de AHAI satildeo IgG IgM e
raramente IgA (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012) Satildeo raros os casos de AHAI com TDA
negativo que podem estar relacionados a um autoanticorpo de baixa avidez de densidade
inferior agrave detecccedilatildeo do meacutetodo ou ainda de classe de imunoglobulina natildeo avaliada pelo
meacutetodo utilizado para o teste (GARRATY 2005)
A AHAI pode ser classificada em dois grupos principais de acordo com a melhor
temperatura de reaccedilatildeo do autoanticorpo As anemias hemoliacuteticas causadas por anticorpos
quentes que reagem melhor a 37oC e geralmente IgG representam 80 dos casos de AHAI
Nas AHAI por anticorpo quente o TDA pode ser positivo para IgG mais complemento (67)
somente IgG (20) ou somente por complemento (13) As anemias causadas por
anticorpos frios geralmente da classe IgM e que reagem melhor em temperatura ambiente ou
a 4oC representam aproximadamente 20 dos casos de AHAI Por exibirem amplitude
teacutermica esses anticorpos ligam-se agraves hemaacutecias ao atingirem a circulaccedilatildeo nas extremidades do
corpo fixam o complemento e desprendem-se da hemaacutecia apoacutes retornar para partes mais
quentes Por esse motivo em AHAI por anticorpos frios o TDA eacute positivo apenas agraves custas
de C3 e normalmente o IgM natildeo eacute detectado (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
A presenccedila do autoanticorpo IgG pode ser confirmada atraveacutes da eluiccedilatildeo do anticorpo
da hemaacutecia Tipicamente o eluato na AHAI por anticorpo quente reage com todas as ceacutelulas
testadas de um painel de hemaacutecias alogecircnicas do tipo ldquoOrdquo ou pode eventualmente exibir uma
especificidade conhecida como Anti-e (Anti-RH5) Nas AHAI a frio por sua vez espera-se
um eluato negativo (LEGER 2011)
Os autoanticorpos satildeo com frequecircncia encontrados livres no plasma e natildeo somente
ligados agraves hemaacutecias autoacutelogas Eles podem interferir em todas as fases dos testes preacute-
transfusionais nas quais o plasma eacute testado especialmente os autoanticorpos quentes que
acarretam resultados positivos em todos os testes levados agrave fase de antiglobulina humana
Esses anticorpos portanto positivam a pesquisa de anticorpos irregulares e mascaram a
presenccedila de aloanticorpos de significado cliacutenico Aproximadamente 60 dos pacientes que
apresentam AHAI a quente apresentam anticorpos que reagem em meio salino mas se forem
16
levados em conta meacutetodos mais sensiacuteveis como PEG enzima e estudo em gel a positividade
pode ser superior a 90 (LEGER 2011)
Aleacutem da eficaacutecia da transfusatildeo ser comprometida pela diminuiccedilatildeo da vida-meacutedia das
hemaacutecias a presenccedila do autoanticorpo dificulta a realizaccedilatildeo dos testes preacute-transfusionais e
compromete a seguranccedila transfusional Os autoanticorpos reagem normalmente como
panaglutininas pois satildeo normalmente voltados contra antiacutegenos puacuteblicos na maior parte das
vezes contra antiacutegenos do sistema Rh Por apresentarem essas caracteriacutesticas podem ainda
mascarar a presenccedila de aloanticorpos de significado clinico e levar a testes de compatibilidade
positivos exigindo uma avaliaccedilatildeo criteriosa da necessidade da transfusatildeo (BRANCH e PETZ
1999 JUNIOR e OLIVATO 2004)
Remover a interferecircncia do autoanticorpo para avaliar a presenccedila de aloanticorpos
mascarados nem sempre eacute possiacutevel mesmo utilizando teacutecnicas de autoadsorccedilatildeo ou
aloadsorccedilatildeo que aleacutem de tudo satildeo demoradas e exigem de 2 a 6 horas para conclusatildeo
(GARRATY e GEORGE 2002) Nesses casos a fenotipagem eritrocitaacuteria do paciente eacute de
extrema utilidade especialmente em situaccedilotildees de urgecircncia A definiccedilatildeo do fenoacutetipo do
paciente para os antiacutegenos de maior importacircncia cliacutenica pode auxiliar a seleccedilatildeo de unidades
de hemaacutecias com mesmo fenoacutetipo o que garante que eventuais aloanticorpos natildeo
identificados sejam respeitados e tambeacutem evita nova sensibilizaccedilatildeo (JUNIOR e OLIVATO
2004 SHIREY et al 2002)
135 TRATAMENTO DE HEMAacuteCIAS COM TDA POSITIVO
O TDA positivo impede a fenotipagem eritrocitaacutecia por meacutetodos que exigem a fase de
AGH uma vez que a aglutinaccedilatildeo ocorreraacute devido agrave interaccedilatildeo da AGH com o autoanticorpo
que sensibiliza a hemaacutecia do paciente levando a resultados falso positivos Em algumas
situaccedilotildees como na AHAI por anticorpo quente a fenotipagem eacute especialmente importante
pois o autoanticorpo interfere na triagem e identificaccedilatildeo de anticorpos assim como no teste de
compatibilidade e dificultam a detecccedilatildeo de aloanticorpos de significado cliacutenico que
obrigatoriamente devem ser respeitados Nessas situaccedilotildees a fenotipagem eritrocitaacuteria
determina o perfil antigecircnico do paciente e possibilita o fornecimento de unidades de
hemaacutecias com o mesmo fenoacutetipo para a transfusatildeo evitando a sensibilizaccedilatildeo para novos
antiacutegenos assim como reaccedilotildees hemoliacuteticas transfusionais No entanto eacute necessaacuterio aplicar
meacutetodos que natildeo sofram interferecircncia do TDA positivo ou seja meacutetodos que natildeo necessitem
da fase de AGH ou meacutetodos de bloqueio do anticorpo sem bloquear o antiacutegeno Uma opccedilatildeo eacute
a utilizaccedilatildeo de soros monoclonais IgM (salinos ou de meio proteico natildeo concentrado) mas
17
nem sempre esses reagentes estatildeo disponiacuteveis especialmente os reagentes monoclonais para
os antiacutegenos dos sistemas Duffy ( Fya Fy
b) Kidd ( Jk
a Jk
b) e MNS (S s) (JUNIOR e
OLIVATO 2004) Outra opccedilatildeo eacute a teacutecnica de bloqueio que pode ser utilizada para tratar
hemaacutecias para posterior fenotipagem em casos de TDA positivos com reatividade le2+
Em casos onde a positividade do TDA eacute maior que 2+ estaacute indicada a tratamento
quiacutemico para remoccedilatildeo da interferecircncia do autoanticorpo antes de realizar a fenotipagem Entre
as teacutecnicas utilizadas atualmente estatildeo o ZZAP a cloroquina e a glicina aacutecidaEDTA
1351 TEacuteCNICA DE BLOQUEIO
A teacutecnica de bloqueio se baseia na utilizaccedilatildeo de anti-IgG (Coombs monoespeciacutefico)
para tratar as hemaacutecias com TDA positivo O anticorpo anti-IgG se liga aos anticorpos que
estatildeo sensibilizando a hemaacutecias poreacutem sem o bloquear os antiacutegenos Os antiacutegenos que natildeo
estatildeo sensibilizados podem ser detectados atraveacutes dos antissoros especiacuteficos (SERERAT
VEIDT E DUTCHED 2000)
1352 TRATAMENTO DE HEMAacuteCIAS COM ZZAP
O Sulphydryl-Proteolytic Enzyme (ZZAP) que eacute uma mistura de ditiotreitol (DTT)
mais papaiacutena ativada com cisteiacutena eacute um reagente capaz de dissociar imunoglobulinas da
classe IgG ligadas a membrana dos eritroacutecitos enquanto trata enzimaticamente as hemaacutecias
O tratamento enzimaacutetico tambeacutem potencializa a ligaccedilatildeo do autoanticorpo ao antiacutegeno e
acelera o processo de autoadsorccedilatildeo O ZZAP pode desnaturar os antiacutegenos do sistema Duffy
MNS e Kell o que limita sua aplicaccedilatildeo para fins de fenotipagem (BRANCH e PETZ 1982)
1353 CLOROQUINA
Em 1982 Edwards Moulds e Judd propuseram a utilizaccedilatildeo da teacutecnica da cloroquina
que dissociava os complexos antiacutegeno-anticorpo e mantinha a membrana das hemaacutecias
iacutentegras Os derivados quinolecircicos jaacute haviam sido descritos anteriormente por Domokos e
Aszody em 1964 e Holtz Mantel e Buck em 1973 (apud Edwards Moulds e Judd 1982) pela
sua capacidade de separar imunocomplexos e inibir as reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo reduzindo
as cargas eleacutetricas das superfiacutecie das hemaacutecias A teacutecnica eacute uma das mais utilizadas nos
centros brasileiros para remover a interferecircncia do autoanticorpo e eacute tambeacutem a teacutecnica
atualmente adotada pelo laboratoacuterio de imunohematologia do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto
18
Edwards Moulds e Judd (1982) demonstraram que a teacutecnica da cloroquina para
dissociaccedilatildeo de anticorpos eacute uma teacutecnica simples efetiva e confiaacutevel para dissociar
imunoglobulina das hemaacutecias Desde que a membrana das hemaacutecias permaneccedila intacta natildeo
haacute perda da reatividade dos antiacutegenos e a sua maior aplicaccedilatildeo eacute a fenotipagem de hemaacutecias
com TDA positivo Os autores verificaram que em 83 das amostras sensibilizadas in vivo e
22 amostras (no total de 40) sensibilizadas ldquoin vitrordquo apresentaram TDA negativo e
puderam ser fenotipadas A teacutecnica poreacutem natildeo consegue remover os componentes do
complemento na maioria dos casos
Champagne e colaboradores (1999) testaram a teacutecnica da cloroquina para dissociar
antiacutegenos Bg comparando com a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA e verificaram vantagem em
relaccedilatildeo ao uso de um uacutenico reagente diminuindo a manipulaccedilatildeo e verificou que o mesmo natildeo
destroacutei antiacutegeno Kell
A cloroquina tambeacutem mostrou-se pouco efetivo em remover anticorpos do sistema
Duffy da superfiacutecie das hemaacutecias (EDWARDS MOUDS e JUDD 1982 ROZIERS e
SQUALI 1997)
1353 GLICINA-AacuteCIDAEDTA
A afinidade e a estabilidade entre a ligaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo eacute definida como a
resultante entre forccedilas atrativas e repulsivas entre ambos (CARUCIO e WISE 2012) e resulta
da somatoacuteria de forccedilas quiacutemicas dinacircmicas e fracas (natildeo covalentes) como pontes de
hidrogecircnio forcas eletrostaacuteticas forca de Van der Waals e pontes hidrofoacutebicas A estabilidade
dessa ligaccedilatildeo eacute facilmente abalada por alteraccedilotildees quiacutemicas e fiacutesicas no meio da reaccedilatildeo como
a alteraccedilatildeo do pH A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA se baseia na mudanccedila do pH para a
quebra da ligaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo (KOSANKE 2012)
A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA foi primeiramente descrita em 1986 por Louie Jieng
e Zeroulis que utilizaram 50 amostras de doadores sensibilizados ldquoin vitrordquo com anticorpos A
teacutecnica foi efetiva em 48 amostras permitindo o estudo do eluato assim como a fenotipagem
das hemaacutecias Os autores testaram tambeacutem a teacutecnica em 100 hemaacutecias TDA positivo que
puderam ser utilizadas para teacutecnicas de autoadsorccedilatildeo
Byrne (1991) descreveu a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA modificada e tambeacutem
verificou como uma opccedilatildeo para o tratamento de hemaacutecias com TDA positivo que deixava as
hemaacutecias intactas e o eluato viaacutevel para ser fenotipado
19
Roziers e Squali (1997) e Katharia e Chaudhary (2013) compararam a teacutecnica da
glicina-aacutecidaEDTA com as teacutecnicas da cloroquina e do aquecimento Verificaram maior
eficiecircncia da glicina-aacutecidaEDTA em relaccedilatildeo as outras duas teacutecnicas pois com uma mesma
quantidade de amostra produzia as hemaacutecias livres de anticorpo e tambeacutem o eluato Mostrou-
se ainda superior devido ao menor tempo exigido para sua realizaccedilatildeo o que favorece seu uso
em situaccedilotildees de urgecircncia e emergecircncia
As duas desvantagens da teacutecnica poreacutem eacute o fato de destruir os antiacutegenos do sistema
Kell e o fato de natildeo remover fraccedilotildees do complemento ligadas agrave hemaacutecia (PALLAS WILER e
McGEE 1991 ROZIERS e SQUALLI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012
e KATHARIA e CHAUNDHARY 2013)
20
2 OBJETIVOS
21 OBJETIVO GERAL
211 Avaliar a eficaacutecia da glicina-aacutecidaEDTA em remover os anticorpos ligados agraves
hemaacutecias sensibilizadas por anticorpos da classe IgG
22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
221 Preparaccedilatildeo dos reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
verificaccedilatildeo da estabilidade dos mesmos e avaliar custos
222 Testar a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA em amostras de hemaacutecias
sensibilizadas por anticorpos antieritrocitaacuterios humanos
223 Comparar a efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA com a teacutecnica da
cloroquina quanto a capacidade de remover a interferecircncia do anticorpo ligado
a hemaacutecia
224 Testar o eluato das amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA
225 Verificar se houve destruiccedilatildeo dos antiacutegenos eritrocitaacuterios apoacutes o tratamento
com glicina-aacutecidaEDTA e com cloroquina
226 Verificar se o tempo de execuccedilatildeo da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA descrito
nos textos de referecircncia eacute reprodutiacutevel
21
3 JUSTIFICATIVA
Algumas condiccedilotildees cliacutenicas podem levar ao depoacutesito ldquoin vivordquo de anticorpos eou
fraccedilotildees do complemento sobre as hemaacutecias Entre elas estatildeo as reaccedilotildees hemoliacuteticas poacutes-
transfusionais a doenccedila hemoliacutetica perinatal o uso de medicamentos e principalmente a
AHAI Na AHAI um anticorpo normalmente da classe IgG ou IgM reconhece antiacutegenos
proacuteprios na membrana eritrocitaacuteria e reduz a sobrevida da hemaacutecia levando a sua destruiccedilatildeo
pelos macroacutefagos no sistema reticulo-endotelial ou agrave ativaccedilatildeo do complexo de ataque agrave
membrana e agrave lise intravascular Os autoanticorpos satildeo voltados na maioria das vezes contra
antiacutegenos eritrocitaacuterios de alta frequecircncia populacional conhecidos como antiacutegenos puacuteblicos
e por este motivo reconhecem tanto hemaacutecias autoacutelogas quanto alogecircnicas
Devido agrave presenccedila do autoanticorpo livre no plasma e tambeacutem do anticorpo eou
complemento ligado agrave hemaacutecia o banco de sangue pode encontrar dificuldades em todas as
fases dos testes preacute-transfusionais do paciente com AHAI e deve utilizar teacutecnicas que
auxiliem na escolha do melhor hemocomponente melhorando a seguranccedila transfusional Essas
teacutecnicas visam remover a interferecircncia do autoanticorpo livre no soro e do autoanticorpo
ligado agrave hemaacutecia permitindo a detecccedilatildeo de aloanticorpos associados e a realizaccedilatildeo da
fenotipagem eritrocitaacuteria respectivamente
A finalizaccedilatildeo dos testes preacute-tranfusionais na presenccedila de autoanticorpo pode levar
algumas horas e nem sempre o paciente poderaacute aguardar Nesse contexto torna-se vantajosa a
aplicaccedilatildeo de teacutecnicas de raacutepida execuccedilatildeo
O presente estudo propotildee aplicar e avaliar a eficaacutecia da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
em remover os anticorpos ligados agrave hemaacutecia o que permite a fenotipagem eritrocitaacuteria
estendida e a seleccedilatildeo de concentrados de hemaacutecias com mesmo fenoacutetipo do paciente
Atualmente no Hemocentro de Ribeiratildeo Preto a teacutecnica utilizada para esse fim eacute o
tratamento das hemaacutecias com difosfato de cloroquina cujo tempo de execuccedilatildeo pode demorar
ateacute duas horas enquanto a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser realizada em apenas dois
minutos o que a tornaria opccedilatildeo de escolha especialmente em situaccedilotildees de urgecircncia Ao
contraacuterio da cloroquina a glicina-aacutecidaEDTA permite tambeacutem o estudo do eluato das
hemaacutecias tratadas
22
4 METODOL OGIA
41 AMOSTRAS DE DOADORES
Foram coletados 50 amostras de doadores de sangue que compareceram ao
Hemonuacutecleo de Araccedilatuba no periacuteodo de junho a agosto de 2016 Foram convidados a
participar da pesquisa doadores de repeticcedilatildeo do tipo sanguiacuteneo ldquoOrdquo RhD positivo
cadastrados no sistema de banco de sangue (SBS) do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto
Todos os doadores que concordaram em participar da pesquisa assinaram o termo de
consentimento livre e esclarecido (TCLE)
No momento da doaccedilatildeo foram coletados adicionalmente 5 mL de sangue total em
soluccedilatildeo anticoagulante EDTA (aacutecido dietilenoaminoaceacutetico) dispensando punccedilatildeo venosa
adicional para coleta da amostra O fluxograma 1 resume as etapas desenvolvidas no projeto
Fluxograma 1 - Fluxo da pesquisa utilizando as amostras de doadores
23
411 FENOTIPAGEM
Foram verificados se os doadores jaacute tinham fenotipagem para outros sistemas de
grupos sanguiacuteneos aleacutem do sistema ABORh que eacute realizado rotineiramente
A fenotipagem eritrocitaacuteria para outros sistemas ou fenotipagem estendida eacute realizada
para identificar a presenccedila ou ausecircncia de antiacutegenos considerados de importacircncia cliacutenica No
Hemonuacutecleo de Araccedilatuba uma parcela de doadores de repeticcedilatildeo satildeo fenotipados para os
antiacutegenos dos sistemas de grupo sanguiacuteneo Rh (antiacutegenos C c E e e) Kell (antiacutegeno K)
Duffy (antiacutegenos Fya e Fy
b) Kidd (antiacutegenos Jk
a e Jk
b) e sistema MNSs (antiacutegenos S e s)
A fenotipagem para o Rh e Kell eacute realizada por metodologia de microplaca utilizando
25 microL de hemaacutecia lavada e diluiacuteda a 5 em salina e 25 microL do antissoro comercial especiacutefico
A reaccedilatildeo eacute incubada 15 minutos a temperatura ambiente e centrifugadas para leitura Para os
antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s a metolodogia utilizado eacute gel contendo antiglobulina
humana (gel LissCoombs poliespeciacutefico) da marca BIO-RAD onde se utiliza suspensatildeo de
hemaacutecia em LISS (Soluccedilatildeo de baixa forccedila iocircnica) A suspensatildeo eacute preparada atraveacutes da
diluiccedilatildeo de 10 microL de hemaacutecia em 1000 microL de LISS Pipetado 50 microL dessa diluiccedilatildeo no gel e
adicionado 25 microL do antissoro especiacutefico Incuba-se em banho seco por 15 minutos a 37 deg
Celsius e eacute centrifugado em centriacutefuga especiacutefica Os antissoros utilizados eram das marcas
Fresenius e Lorne
Foi verificado a fenotipagem do doador no banco de dados do Hemocentro Os
registros dos fenoacutetipos dos doadores ficam armazenadas no sistema de banco de sangue
(SBS) Para doadores que natildeo tinham fenotipagem estendida preacutevia para antiacutegenos do sistema
Rh (C c E e e) e Kell (K) foi realizada a fenotipagem para esses antiacutegenos
O tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA e cloroquina para dissociar
anticorpos pode inativar enfraquecer ou destruir os antiacutegenos presentes nas hemaacutecias
alterando assim os resultados da fenotipagem Para verificar se houve destruiccedilatildeo dos
antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a e Jk
b S e s nas amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes
tratamento foram novamente fenotipadas ao final para os antiacutegenos que eram inicialmente
positivas
A repeticcedilatildeo da fenotipagem foi realizada nas amostras que apresentaram efetividade
no tratamento da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eou da cloroquina e a detecccedilatildeo do antiacutegeno
na amostra preacute-tratamento
24
412 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS HEMAacuteCIAS
As hemaacutecias foram sensibilizadas com antissoros policlonais humanos de amostras de
plasma fresco congelado de doadores com resultado de pesquisa de anticorpo irregular
positivos
A escolha do anticorpo para sensibilizar as hemaacutecias foi definida de acordo com o
fenoacutetipo do doador que deveria ser positivo para o respectivo antiacutegeno
Para a sensibilizaccedilatildeo um volume de antissoro (1 mL) e um volume (1 mL) de
hemaacutecias lavadas quatro vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica foram adicionadas a um tubo de 12 x
75 mm A mistura foi homogeneizada e incubada em banho maria (BM) a 37deg C por 60
minutos A seguir as hemaacutecias foram novamente lavadas 4 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica
para retirada dos anticorpos que natildeo se ligaram A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada
como controle negativo O teste da uacuteltima lavagem eacute importante para assegurar que os
anticorpos que poderatildeo ser detectados no eluato apoacutes o tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA
sejam aqueles que estavam ligados agraves hemaacutecias e natildeo aqueles livres no plasma O controle
negativo mostra que todo o anticorpo livre foi retirado (LEGER 2011)
Para o teste de presenccedila de anticorpo na soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foram incubadas
com hemaacutecias de triagem de anticorpos irregulares (ID-Diacell BIO-RAD) contendo os
antiacutegenos especiacuteficos Realizado a teacutecnica em gel LissCoombs com anti-IgG+C3d Incubado
no tempo de 15 minutos a temperatura de 37deg C e centrifugado 10 minutos em centriacutefuga
proacutepria
As 50 amostras de doadores foram sensibilizadas com os anticorpos policlonais
humanos
Apoacutes sensibilizadas rdquoin vitrordquo e lavadas as hemaacutecias foram diluiacutedas em soluccedilatildeo de
baixa forccedila iocircnica (LISS) na quantidade de 10 microL de hemaacutecia para 1000 microL de soluccedilatildeo A
suspensatildeo foi pipetada (50 microL) em coluna-gel-teste LissCoombs (BIO-RAD) que contecircm
antiglobulina poliespeciacutefico (IgG+C3d) e centrifugada em baixa rotaccedilatildeo conforme orientaccedilatildeo
do fabricante durante 10 minutos
As amostras deveriam apresentar aglutinaccedilatildeo com reatividade 3 a 4+ no TDA As
amostras que apresentaram reaccedilatildeo menor que 3+ foram novamente sensibilizadas com nova
aliacutequota do antissoro
25
413 TRATAMENTO DAS AMOSTRAS
As amostras sensibilizadas apresentando o TDA positivo 3 ou 4+ foram divididas em
duas aliacutequotas e submetidas a duas teacutecnicas diferentes com o objetivo de dissociar o anticorpo
ligado Uma aliacutequota da amostra foi tratada com soluccedilatildeo de difosfato de cloroquina enquanto
a outra aliacutequota foi tratada com glicina-aacutecidaEDTA
42 PREPARO DA GLICINA AacuteCIDA-EDTA
A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA utiliza 3 soluccedilotildees diferentes a glicina aacutecida o
EDTA e o tampatildeo TRIS
Os reagentes foram preparados utilizando os sais para anaacutelise (PA) de EDTA
(Na2EDTA2H2O) TRIS (C4H11NO3) Glicina (H2NCH2CO2H) NaCl e a soluccedilatildeo de aacutecido
cloriacutedrico (HCl) 12 N todos reagentes da marca SYNTH (quadro 1)
Para o preparo do tampatildeo glicina-acida eacute necessaacuterio o ajuste do pH para 15 Para esse
ajuste utiliza-se aacutecido cloriacutedrico (HCl) concentrado O pH foi medido com fitas reativas de pH
com escala de 1 a 14 da marca MERCK Posteriormente a soluccedilatildeo foi enviada ao laboratoacuterio
de controle de qualidade do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto e o pH medido no peagacircmetro O
tampatildeo glicina-aacutecida foi armazenado a 4deg e o tampatildeo tris e o EDTA em temperatura ambiente
controlada (20 a 24deg Celsius)
Apoacutes o preparo e durante a realizaccedilatildeo dos testes foram feitas inspeccedilotildees visuais para
verificaccedilatildeo de turvaccedilatildeo do meio e presenccedila de precipitados
Reagente Material Quantidade Preparo e
Conservaccedilatildeo
EDTA
EDTA
(Na2EDTA2H2O)
5 gramas Mistura ateacute
dissoluccedilatildeo do sal e
conserva em
temperatura ambiente Aacutegua Destilada 50 Ml
Tris
TRIS (C4H11NO3) 121 gramas Conservar em
temperatura ambiente NaCl 525g
Aacutegua destilada 100ml
Gliacutecina-aacutecida
Glicina
(H2NCH2CO2H) 15 gramas
Conservar a 4oC NaCl 116gramas
Aacutegua Destilada 200ml
HCL 12N Ajutar o pH para 15
Quadro 1 - Preparo dos Reagentes da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
Fonte - Manual teacutecnico AABB 2011
26
O tampatildeo glicina-aacutecida e o tampatildeo TRIS satildeo estaacuteveis por 7 meses O reagente EDTA
precipitou mesmo estando em temperatura em ambiente controlado Houve necessidade de
preparo de novo reagente
421 TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
1 Em um tubo de ensaio 12x75 mm eacute adicionado 08 mL da soluccedilatildeo de glicina-aacutecida A
esta soluccedilatildeo adiciona-se 02 mL de EDTA e mistura
2 Adiciona-se 02 mL de hemaacutecias sensibilizadas (lavada 4 vezes) A mistura eacute
homogeneizada e incubada por exatamente 2 minutos
3 A seguir 01 mL de tampatildeo TRIS eacute adicionado agrave mistura que eacute novamente
homogeneizada e centrifugada por 2 minutos a 3400 rpm O pH deve estar entre 7 a 75
4 Apoacutes centrifugaccedilatildeo separa-se em outro tubo o sobrenadante (eluato) e as hemaacutecias
que permanecem satildeo lavadas 4 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica para retirada de todo o
reagente e anticorpos livres
43 PREPARO DA CLOROQUINA
A cloroquina eacute diluiacuteda em tampatildeo PBS na concentraccedilatildeo de 20 (Quadro 2) e
armazenado a 4deg Celsius sua validade apoacutes o preparo eacute de 1 mecircs
A teacutecnica da cloroquina jaacute estaacute padronizada para rotina do laboratoacuterio de
imunohematologia do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto e suas unidades
Reagente Reagentes Quantidade PreparoConservaccedilatildeo
Cloroquina
Difosfato de cloroquina
(C18H32ClN3O8P2)
20 gramas
Conservar a 4deg Celsius
Tampatildeo PBS 100ml
NaOH 01 N Acertar o pH para
51
Quadro 2 - Preparo da Cloroquina Fonte - Manual teacutecnico da AABB 2011
431 TEacuteCNICA DA CLOROQUINA
1 4 partes da soluccedilatildeo pronta eacute adicionada a uma parte de hemaacutecias lavadas 4 vezes com
soluccedilatildeo fisioloacutegica
2 A mistura eacute incubada em temperatura ambiente por ateacute duas horas
3 Centrifugar a 3400 rpm por 2 minutos
27
4 Remover o sobrenadante lavar as hemaacutecias novamente com soluccedilatildeo fisioloacutegica 4
vezes
44 VERIFICACcedilAtildeO DA EFETIVIDADE DOS TESTES
Apoacutes tratamento pelas duas teacutecnicas o TDA foi repetido em todas as amostras para
verificar se os tratamentos foram efetivos e houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo Para as
amostras tratadas pela teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA que permaneceram com TDA positivo
novo tratamento foi realizado
45 TESTE DO ELUATO
O eluato resultante das amostras tratadas com glicina-acidaEDTA foi testado com
hemaacutecias de triagem A soluccedilatildeo do eluato foi incubada com as hemaacutecias de triagem de
anticorpos (ID-Diacell BIO-RAD) pela teacutecnica em gel LissCoombs O teste foi incubado 15
minutos a 37deg Celsius e centrifugado por 10 minutos em centrifuga proacutepria para a teacutecnica em
gel Os eluatos que apresentaram resultados positivos foram testados em painel de 11
hemaacutecias (ID-Diapanel BIO-RAD) para a identificaccedilatildeo do anticorpo
46 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente que apresentou TDA positivo por IgG e pesquisa
de anticorpo irregular positivo com presenccedila de autoanticorpo com reatividade panaglutinina
A amostra foi tratada em paralelo pelas duas teacutecnicas descritas e foi enviada para o
Hemocentro para genotipagem eritrocitaacuteria que foi realizado por metodologia PCR em tempo
real no equipamento Real-time system PCR 7500 ( Applied Biosystems Califoacuternia EUA)
28
5 RESULTADOS
51 REAGENTES
Para aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA satildeo necessaacuterios 3 diferentes
reagentes que podem ser encontrados em forma de kit pronto para uso No entanto esses kits
natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil Os reagentes satildeo tampatildeo glicina-aacutecida o EDTA e o tampatildeo
Tris
Todos os reagentes foram preparados rdquoin houserdquo a partir dos sais e soluccedilotildees PA (puro
para anaacutelise) da marca SYNTH que foram adquiridos para a pesquisa O custo estimado para
cada teste foi aproximadamente R$ 020 reais
Apoacutes o preparo os reagentes poderiam ser armazenados em condiccedilotildees adequadas pelo
periacuteodo de 1 ano (AABB 2011) Ao final do preparo e durante o periacuteodo de armazenamento
de fevereiro a setembro de 2016 foi realizada inspeccedilatildeo visual para verificar a presenccedila de
precipitados ou turvaccedilatildeo A soluccedilatildeo de glicina e o tampatildeo TRIS mostraram-se estaacuteveis ateacute o
final do periacuteodo Por sua vez o reagente EDTA precipitou mesmo estando armazenado em
temperatura ambiente controlada e foi necessaacuterio novo preparo
52 AMOSTRAS DE DOADORES
521 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS AMOSTRAS
Apoacutes incubaccedilatildeo da hemaacutecia com o antissoro a mesma foi lavada 4 vezes para retirada
dos anticorpos livres A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada Caso houvesse positividade na
soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem a etapa era repetida (figura 3) Das 50 amostras sensibilizadas a
uacuteltima lavagem foi positiva somente em 3 delas Nas 3 amostras o anticorpo utilizado para
sensibilizaccedilatildeo foi o anti-K Apoacutes repetido nova etapa de lavagem os resultados se
apresentaram negativos
Em todas as amostras sensibilizadas ldquoin vitrordquo o TDA foi testado e verificado a
intensidade do teste Entre as 50 amostras 47 alcanccedilaram TDA com intensidade 3-4+ apoacutes a
primeira sensibilizaccedilatildeo enquanto 3 amostras necessitaram uma segunda incubaccedilatildeo com
anticorpo (figura 4)
A escolha dos anticorpos para sensibilizar as hemaacutecias foi feita de acordo com o
fenoacutetipo do doador e foram utilizados sete diferentes especificidades de anticorpos policlonais
humanos conforme mostra o graacutefico1
29
Figura 3 - Soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada com hemaacutecia de triagem de
anticorpos em gel LissCoombs (BIO-RAD) A finalidade eacute verificar a presenccedila de anticorpos livres na
suspensatildeo que possam interferir na pesquisa do eluato As soluccedilotildees de lavagem das amostras na figura a tiveram
resultados negativos Na figura b duas amostras a 47 e 50 apresentaram resultado positivo Nova etapa de
lavagem foi realizada e o resultado final foi negativo
522 TRATAMENTO DAS HEMAacuteCIAS
Apoacutes a sensibilizaccedilatildeo e obtenccedilatildeo de resultados de TDA com intensidade de 3 a 4+
cada uma das amostras foi dividida em duas aliacutequotas e tratada separadamente pelas teacutecnicas
de glicinaaacutecida-EDTA e cloroquina
As teacutecnicas foram consideradas efetivas quando obteve-se a completa dissociaccedilatildeo do
anticorpo verificada atraveacutes do TDA negativo na amostra poacutes tratamento conforme figuras 5
e 6 Dentre as amostras tratadas com cloroquina 2850 tiveram o TDA negativado A glicina-
aacutecidaEDTA negativou o TDA em 33 das 50 amostras tratadas Apenas 17 amostras tratadas
com glicina-aacutecidaEDTA permaneceram com o TDA positivo e foram submetidas a um novo
tratamento
30
Figura 4 - TDA das amostras apoacutes sensibilizaccedilatildeo com anticorpos policlonais humanos Amostras na
figura a com intensidades de 3-4+ Na figura b amostras 4 e 7 com intensidade menor que 3+ e portanto foram
novamente sensibilizadas com nova aliacutequota de soro Anti-D e anti-S Apoacutes a segunda sensibilizaccedilatildeo
apresentaram reatividade 4 e 3+ respectivamente Os anticorpos utilizados para sensibilizaccedilatildeo foram D S c E
C e K
523 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS TEacuteCNICAS
No tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA houve dissociaccedilatildeo completa do anticorpo
em 33 amostras (66) das 50 amostras testadas enquanto que com a cloroquina foram 28
amostras (56) (tabela 1)
31
Graacutefico 1- Nuacutemero de amostras sesnsibilizadas por especificidade de anticorpo Entre as 50 amostras 12
foram sensibilizadas com anti-D 10 com anti-C 9 com anti-E 8 com anti-c 7 com anti-S 3 com anti-K e 1
com anti-Dia As especificidades dos anticorpos foram definidas de acordo o fenoacutetipo do doador
Figura 5 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com cloroquina Nas amostras onde houve
a dissociaccedilatildeo do anticorpo ( 2 21 a 23 26 39 a 42 45 46 e 49) a hemaacutecia se deposita no fundo no microtubo
apoacutes a centrifugaccedilatildeo (TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (1 3 24 25 43 44 47
48 e 50) o anticorpo ligado agraves hemaacutecias eacute alvo da AGH presente no gel (TDA positivo)
Anti-D 12
Anti-C 10
Anti-E 9
Anti-c 8
Anti-S 7
Anti-K 3 Anti-Dia 1
32
Figura 6 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA Nas amostras
onde houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo (4 6 7 12 a 15 17 34 35 37 e 38) a hemaacutecia se deposita no fundo no
microtubo apoacutes a centrifugaccedilatildeo ( TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (5 16 18
19 20 33 e 36 ) o AGH presente no gel se liga ao anticorpo ligado agraves hemaacutecias que ficam retidas no gel (TDA
positivo)
Tabela 1-Resultado geral do tratamento das hemaacutecias com glicina e cloroquina
Teacutecnica utilizada TDA negativo TDA positivo Total
Glicina-aacutecidaEDTA 33 17 50
Cloroquina 28 22 50
A glicina-aacutecidaEDTA conseguiu negativar mais amostras sensibilizadas com Anti-D
e anti-K que a cloroquina Para as hemaacutecias sensibilizadas com anti-E Anti-S e Anti-Dia
ambas as teacutecnicas dissociaram o anticorpo em 100 das amostras Os resultados detalhados
por especificidade do anticorpo apoacutes o primeiro tratamento com glicina-aacutecidaEDTA e com
cloroquina estatildeo na tabela 2
Para as amostras que permaneceram positivas (17 amostras) apoacutes o tratamento com a
glicina-aacutecidaEDTA foi realizado um novo tratamento Houve dissociaccedilatildeo do anticorpo em 3
amostras (18) apoacutes a segunda tentativa Nas demais 14 (82) amostras tratadas pela
segunda vez 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise
33
Tabela 2 - Resultados do TDA apoacutes tratamento das hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo
sensibilizado
ANTICORPOS
SENSIBILIZADOS
1ordm TRATAMENTO COM
GLICINA
TRATAMENTO COM
CLOROQUINA
TOTAL TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
Anti-D 8 4 0 12 12
Anti-C 6 4 10 0 10
Anti-E 9 0 9 0 9
Anti-c 0 8 1 7 8
Anti-S 7 0 7 0 7
Anti-K 2 1 0 3 3
Anti-Dia 1 0 1 0 1
TOTAL 33 17 28 22 50
A hemoacutelise foi verificada durante o procedimento de lavagem final das hemaacutecias com
soluccedilatildeo fisioloacutegica para a retirada dos reagentes As soluccedilotildees de lavagem ficaram
avermelhadas e as hemaacutecias com coloraccedilatildeo escura As amostras foram descartadas Dentre as
6 amostras que ainda puderam ser testadas para o TDA trecircs amostras negativaram sendo 1
sensibilizada com anti-D e 2 com anti-C (tabela 3)
Tabela 3 - Resultado apoacutes o segundo tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA
Tratamento com
glicina-aacutecidaEDTA
TDA Negativo TDA Positvo Hemoacutelise Total
Segundo tratamento 3 3 11 17
524 TESTAGEM DO ELUATO
Apoacutes o tratamento com a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA a soluccedilatildeo do eluato foi
testada para verificar a viabilidade dos anticorpos que foram dissociados ou eluiacutedos Dentre
as 50 amostras 41 apresentaram eluato positivo As nove amostras cujos eluatos foram
negativos haviam sido sensibilizadas com as seguintes especificidades de anticorpos anti-E 6
amostras (67) anti-S 2 amostras (40) e anti-D 1 amostra (8) (tabela 4) O eluato de
todas as amostras sensibilizadas com os anticorpos anti-C anti-c Anti-K e Anti-Dia foram
positivos Os eluatos positivos na triagem de anticorpos foram testados com paineacuteis de
identificaccedilatildeo para confirmar a especificidade e a viabilidade dos anticorpos (figuras 7 e 8)
34
525 EFEITO DA ELUICcedilAtildeO SOBRE OS ANTIacuteGENOS ERITROCITAacuteRIOS
Para verificar o efeito do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA e com a cloroquina
sobre a expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s foi realizada a fenotipagem das
amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes tratamento com ambas as teacutecnicas Foi avaliado
se o tratamento destruiu os antiacutegenos expressos antes do tratamento
Tabela 4- Resultado do Eluato das amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA
Anticorpos Eluato positvo Eluato negativo Total
Anti-D 11 1 12
Anti-C 10 0 10
Anti-E 3 6 9
Anti-c 8 0 8
Anti-S 5 2 7
Anti-K 3 0 3
Anti-Dia 1 0 1
Total 41 9 50
Figura 7 ndash Painel do eluato da amostra 21 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-C que foi
recuperado no eluato
Figura 8 ndash Painel do eluato da amostra 47 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-K que foi
recuperado no eluato
35
Dentre as 50 amostras 26 eram previamente fenotipadas para os antiacutegenos Fya Fy
b
Jka Jk
b S e s Dentre elas 20 alcanccedilaram TDA negativo apoacutes tratamento com a glicina-
aacutecidaEDTA e 20 negativaram apoacutes tratamento com cloroquina (tabela 5) Apoacutes ambas as
teacutecnicas os antiacutegenos originalmente expressos permaneceram positivos comprovando que natildeo
houve destruiccedilatildeo dos mesmos
Tabela 5 ndash Verificaccedilatildeo da interferecircncia do tratamento da hemaacutecias com cloroquina e glicina-
aacuteicdaEDTA sobre os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
AMOSTRAS
COM
FENOTIPAGEM
PREacuteVIA
TRATADAS COM
CLOROQUINA
TRATADAS COM
GLICINA
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
26
20
20
20
20
As amostras 24 47 e 50 eram positivas para o antiacutegeno K A cloroquina natildeo dissociou
o anticorpo em nenhuma das 3 amostras enquanto a glicina-aacutecidaEDTA foi efetiva nas
amostras 24 e 50 Foi testada a expressatildeo do antiacutegeno K nas amostras 24 e 50 apoacutes o
tratamento utilizando meacutetodo indireto em gel contendo AGH Apesar de natildeo ter sido avaliado
a intensidade de reaccedilatildeo de expressatildeo dos antiacutegenos podemos verificar na figura 9 que nas
duas amostras em que a teacutecnica foi efetiva e dissociou o anticorpo a expressatildeo do antiacutegeno K
continua presente mas a reatividade observada pode ser considerada 1+ sugerindo que houve
diminuiccedilatildeo da expressatildeo do antiacutegeno quando comparado com a expressatildeo observada em
hemaacutecia natildeo tratada
Os resultados individuais de cada amostra em ambas as teacutecnicas encontram-se
resumidas na tabela 6
526 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente onde foi constatada a presenccedila de autoanticorpo
a quente da classe IgG pelo TDA monoespeciacutefico (figura 10)O autoanticorpo tambeacutem
interferia na pesquisa e identificaccedilatildeo de anticorpos irregulares pois apresentava caracteriacutestica
de panaglutinina As hemaacutecias da paciente sensibilizadas ldquoin vivordquo foram tratadas com
cloroquina e com glicina-aacutecidaEDTA
36
Figura 9 ndash Fenotipagem das amostras 24 e 50 para antiacutegeno K apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
O teste positivo indica a presenccedila do antiacutegeno poreacutem a reatividade fraca (1+) sugere que houve enfraquecimento
de sua expressatildeo A direita a expressatildeo forte (4+) do antiacutegeno Kell em hemaacutecia controle natildeo tratada utilizada
como controle positivo
A cloroquina natildeo foi efetiva na retirada do anticorpo ligado as hemaacutecias ao contraacuterio
do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA que dissociou o anticorpo (figura 11)
A hemaacutecia tratada com glicina foi fenotipada para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
(figura 12) A fenotipagem para o sistema Rh (C c E e e) e Kell foi realizada em gel
especiacutefico monoclonal sem interferecircncia do TDA positivo (controle da reaccedilatildeo negativo)
O eluato resultante do tratamento com glicina-aacutecidaEDTA foi testada em gel com
hemaacutecias de painel de identificaccedilatildeo de anticorpos e apresentou resultado positivo com todas
as ceacutelulas (figura 13 e 14)
A amostra foi enviada para genotipagem e o resultado da genotipagem confirmou o
resultado da fenotipagem apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
527 TEMPO DE EXECUCcedilAtildeO DA TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
O tempo de reaccedilatildeo da glicina-aacutecidaEDTA eacute de 2 minutos Todas as amostras foram
tratadas obedecendo ao tempo descrito na literatura demonstrando que o mesmo eacute
reprodutiacutevel
37
Tabela 6- Resultados individuais por amostra
Amostra Especificidade
dos anticorpos
Intensidade do
TDA apoacutes
sensibilizaccedilatildeo
Tratamento
efetivo com
cloroquina
Tratamento
efetivo com
glicina
Eluato
poacutes
glicina
1 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 2 Dia 3+ Sim Sim 3+ 3 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 4 D 4+ Natildeo Sim 4+ 5 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 6 E 3+ Sim Sim Negativo 7 S 4+ Sim Sim 3+ 8 E 3+ Sim Sim 1+ 9 E 3+ Sim Sim 2+
10 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 11 D 4+ Natildeo Sim 4+ 12 D 4+ Natildeo Sim 4+ 13 S 3+ Sim Sim 3+ 14 S 3+ Sim Sim 3+ 15 D 3+ Natildeo Sim 3+ 16 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 17 E 3+ Sim Sim (+) 18 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 19 D 4+ Natildeo Natildeo 3+ 20 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 21 C 3+ Sim Sim 4+ 22 C 3+ Sim Sim 4+ 23 C 3+ Sim Sim 4+ 24 K 4+ Natildeo Sim 4+ 25 D 3+ Natildeo Natildeo Negativo 26 E 4+ Sim Sim Negativo 27 S 3+ Sim Sim 3+ 28 C 3+ Sim Natildeo 4+ 29 C 3+ Sim Sim 4+ 30 C 3+ Sim Sim 4+ 31 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 32 E 3+ Sim Sim Negativo 33 C 3+ Sim Natildeo 4+ 34 S 3+ Sim Sim Negativo 35 S 3+ Sim Sim Negativo 36 C 4+ Sim Natildeo 4+ 37 c 4+ Natildeo Natildeo 4+ 38 D 4+ Natildeo Sim 4+ 39 S 3+ Sim Sim 3+ 40 c 4+ Sim Natildeo 2+ 41 C 4+ Sim Natildeo 4+ 42 E 3+ Sim Sim Negativo 43 D 3+ Natildeo Sim 2+ 44 D 3+ Natildeo Sim 2+ 45 E 3+ Sim Sim Negativo 46 C 3+ Sim Sim 4+ 47 K 4+ Natildeo Natildeo 4+ 48 D 3+ Natildeo Sim 2+ 49 E 3+ Sim Sim Negativo 50 K 4+ Natildeo Sim 4+
TOTAL 50 28 33 41
38
Figura 10 ndash TDA monoespeciacutefico da amostra de paciente Hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo da classe
IgG
oacute Figura 11 ndash TDA apoacutes o tratamento com glicina-aacutecidaEDTA (esquerda) e cloroquina (direita) A glicina
negativou completamente o TDA enquanto a hemaacutecia tratada com cloroquina persistiu positiva (1+)
39
Figura 12 ndash Fenotipagem da amostra tratada com glicina-aacutecidaEDTA Fy(a+b+) Jk(a-b+) S+s+
Figura 13 ndash Painel em gel (LissAGH) do eluato apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de
intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
Figura 14 ndash ndash Painel ezimaacutetico (hemaacutecias tratadas com bromelina) do eluato em gel neutro apoacutes
tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
40
528 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Quanto a efetividade das teacutecnicas em negativar o TDA foi verificado que a glicina-
aacutecidaEDTA foi efetiva em 66 das amostras testadas no primeiro tratamento (3350
amostras) enquanto a cloroquina conseguiu negativar 56 (2850) Esses resultados natildeo
apresentam diferenccedila significativa (pgt005) demostrando que a teacutecnica da glicina-
aacutecidaEDTA natildeo eacute superior mas eacute tatildeo efetiva quanto a da cloroquina
Quando aliamos os resultados de ambas as teacutecnicas verificamos que em 76 (3850)
das amostras o TDA foi negativado Esse dado indica que ainda que uma teacutecnica natildeo seja
eficaz na remoccedilatildeo do anticorpo eacute uma boa alternativa tentar a segunda teacutecnica jaacute que a falha
em remover o anticorpo utilizando uma delas natildeo prevecirc necessariamente a falha com a outra
Quando se utiliza o teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla (graacutefico 2) para comparar a utilizaccedilatildeo das
duas teacutecnicas com o resultado de cada uma isolada (somente a cloroquina ou somente a
glicina) verificamos que os resultados apresentam diferenccedila significativa (plt005) (quadro 3)
TRATAMENTO EFETIVO COM TOTAL PORCENTAGEM
Glicina ou cloroquina 38 76
Glicina e cloroquina 23 46
Glicina apenas 10 20
Cloroquina apenas 5 10
Nenhuma das teacutecnicas 12 24
Quadro 3 - Resultados comparativos entre as teacutecnicas utilizadas
41
Graacutefico 2 - Teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla entre as teacutecnicas aplicadas A- Glicina e Cloroquina B-Cloroquina C-
Glicina ( plt005)
42
6 DISCUSSAtildeO
Os reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA podem ser adquiridos em
forma de kit comercial prontos para uso poreacutem natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil A preparaccedilatildeo
dos reagentes ldquoin houserdquo a partir de sais comerciais adquiridos se mostrou viaacutevel Os
reagentes glicina e o tampatildeo Tris armazenados de forma correta se mantiveram estaacuteveis por
um periacuteodo de 7 meses Somente o reagente EDTA precipitou mesmo armazenado em
condiccedilotildees adequadas sugerindo que o mesmo deve ser preparado em menor quantidade e
armazenado em aliacutequotas A soluccedilatildeo de cloroquina tambeacutem pode ser preparada ldquoin houserdquo e
pode ser armazenado por um mecircs A legislaccedilatildeo brasileira autoriza a utilizaccedilatildeo de reagentes
preparados a partir de sais comerciais como a cloroquina e a glicina-aacutecidaEDTA desde que
os sais tenham autorizaccedilatildeo da vigilacircncia sanitaacuteria para a comercializaccedilatildeo (BRASIL 2001)
A comparaccedilatildeo quanto a efetividade em dissociar anticorpos em amostras com TDA
positivos entre a teacutecnica da glicina e a teacutecnica da cloroquina mostrou que natildeo haacute diferenccedila
estatiacutestica entre elas e que ambas satildeo igualmente eficientes Se utilizadas conjuntamente haacute
maior possibilidade de elucidaccedilatildeo dos casos
Uma vantagem da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eacute que ela permite numa mesma
amostra eluir o anticorpo ligado aacute hemaacutecia assim como fenotipar a hemaacutecia tratada Devido a
sua dupla utilidade a teacutecnica eacute vantajosa principalmente em pacientes em que pouco volume
de amostra pode ser coletado como em casos de crianccedilas e receacutem-nascidos
A fenotipagem poacutes tratamento se mostrou viaacutevel jaacute que os antiacutegenos de maior
importacircncia natildeo sofreram alteraccedilotildees Nas 20 amostras que foram fenotipadas antes e apoacutes
tratamento para verificar a influecircncia dos reagentes na expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a
Jkb S e s natildeo houve destruiccedilatildeo dos mesmos por nenhuma das duas teacutecnicas
Para as amostras positivas para o antiacutegeno Kell (350) e sensibilizadas com o
respectivo anticorpo a teacutecnica da glicina foi efetiva em negativar o TDA em apenas duas
delas mas apoacutes o tratamento foi verificada uma fraca reatividade da reaccedilatildeo antiacutegeno-
anticorpo sugerindo que houve um enfraquecimento da expressatildeo do antiacutegeno conforme
esperado e descrito na literatura (BYRNE 1991 PALLAS WILER E MCGEE 1991
ROZIERS e SQUALI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012 e KATHARIA e
CHAUDHARY 2013) A accedilatildeo da glicina sobre o antigeno Kell natildeo representa impedimento
para seu uso uma vez que na impossibilidade de testar o antiacutegeno Kell o banco de sangue
consegue facilmente atender a solicitaccedilatildeo de transfusatildeo com unidades de hemaacutecias Kell
43
negativas jaacute que eacute um antiacutegeno de baixa prevalecircncia na populaccedilatildeo variando de 15 na
populaccedilatildeo africana a 9 nos europeus (DANIELS 2011)
A soluccedilatildeo resultante da dissociaccedilatildeo do anticorpo pela teacutecnica da glicina pode ainda ser
utilizada como eluato podendo substituir a teacutecnica de eluiccedilatildeo com reagentes comercias (kits
de eluiccedilatildeo aacutecida) que tem alto custo aproximadamente entre R$2000 a R$2500 por teste
Em 41 amostras (82) houve a dissociaccedilatildeo e recuperaccedilatildeo do anticorpo que estava
sensibilizando as hemaacutecias Em 9 amostras (18) os anticorpos foram eluiacutedos poreacutem
apresentaram reaccedilatildeo negativa quando testadas com hemaacutecias de triagem entre eles o anti-E
(6) anti-S (2) e Anti-D (1) Eacute possiacutevel que a correccedilatildeo pH do meio (WALKER 2011) natildeo
tenha sido adequada o que pode ter desfavorecido a reatividade do anticorpo
Para as amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA nas quais natildeo houve dissociaccedilatildeo do
anticorpo pelo primeiro tratamento (1750) o segundo tratamento natildeo se mostrou eficaz jaacute
que 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise O tempo de
armazenagem natildeo parece ter influenciado jaacute que todas as amostras foram testadas dentro de
48 horas apoacutes a coleta Outros fatores que natildeo foram verificados podem ter levado a
hemoacutelise Apesar da literatura (LOUIE JIENG e ZEROULIS 1986 e BYRNE 1991)
recomendar um segundo tratamento ele eacute pouco eficaz tendo negativado apenas 3 das 17
amostras testadas
A amostra de paciente que apresentou sensibilizaccedilatildeo ldquoin vivordquo mostrou melhor
efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA sobre a da cloroquina possibilitando
fenotipagem para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s que natildeo foram destruiacutedos apoacutes o
tratamento comprovado atraveacutes da genotipagem
A presenccedila de autoanticorpo a quente com presenccedila de hemoacutelise (AHAI) ou natildeo pode
mascarar a presenccedila de aloanticorpo interferindo na rotina soroloacutegica da fenotipagem que eacute
uma importante ferramenta para auxiliar na seleccedilatildeo de hemaacutecias para transfusatildeo (SHIREY et
al 2002) Esses pacientes frequentemente possuem aloanticorpos associados ao
autoanticorpo e a prevalecircncia de aloimunizaccedilatildeo entre eles varia entre 12 a 40 (LEGER e
GARRATY 1999 BRANCH e PETZ 1999) o que dificulta ainda mais a escolha do melhor
componente a ser transfundido aleacutem de aumentar a possibilidade reaccedilotildees hemoliacuteticas imunes
poacutes-transfusionais
Nesses casos as teacutecnicas de dissociaccedilatildeo de anticorpos satildeo importantes para tratar
amostras de pacientes e a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser usada como uma opccedilatildeo
pois se mostrou eficaz na dissociaccedilatildeo anticorpo ligado agraves hemaacutecias deixando livre a
superfiacutecie das mesmas permitindo a fenotipagem por antisoros IgG Paralelamente os
44
anticorpos eluiacutedos tambeacutem puderam ser estudados O mesmo natildeo ocorre com a cloroquina
que permite apenas a fenotipagem e tampouco com os kits de eluiccedilatildeo aacutecida disponiacuteveis no
mercado nacional que satildeo destinados a realizaccedilatildeo do eluato mas destroem as hemaacutecias
O tempo de tratamento na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA tambeacutem eacute uma vantagem
pois foi possiacutevel reproduzir no tempo determinado de 2 minutos enquanto a cloroquina
demora ateacute duas horas
Ainda que a aplicaccedilatildeo das teacutecnicas por biologia molecular estejam cada vez mais
presentes na rotina imuno-hematoloacutegica e possibilitam estabelecer o fenoacutetipo deduzido do
genoacutetipo elas natildeo estatildeo disponiacuteveis na maioria dos centros e sua realizaccedilatildeo exige algumas
horas A resoluccedilatildeo imediata do problema transfusional necessita dos resultados soroloacutegicos
pois com frequecircncia natildeo eacute possiacutevel aguardar o resultado do teste molecular Dessa forma
apesar da crescente importacircncia da genotipagem eritrocitaacuteria teacutecnicas soroloacutegicas aplicadas
corretamente e no momento propiacutecio satildeo de grande utilidade para resolver problemas imuno-
hematoloacutegicos como ocorre com a fenotipagem em pacientes com TDA positivo
45
7 CONCLUSAtildeO
A teacutecnica da glicina aacutecidaEDTA mostrou-se efetiva em remover os anticorpos que
sensibilizavam as hemaacutecias e pode ser utilizada com seguranccedila antes da fenotipagem
eritrocitaacuteria Por ser uma teacutecnica de raacutepida execuccedilatildeo eacute uma alternativa aplicaacutevel
principalmente em casos urgentes de pacientes que apresentam autoanticorpos
46
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50
9 ANEXOS
51
FUNDACcedilAtildeO HEMOCENTRO DE RIBEIRAtildeO PRETO
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE)
Tiacutetulo da pesquisa Aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina aacutecida-EDTA e avaliaccedilatildeo da
eficaacutecia no tratamento de hemaacutecias com teste direto da antiglobulina positivo
Pesquisadora responsaacutevel Ceacutelia Kazue Abiko
Orientador Prof Dimas Tadeu Covas
Co-orientadora Dra Flaacutevia Leite Souza Santos
Objetivo da pesquisa Vocecirc estaacute sendo convidado a participar de uma pesquisa que tem
como objetivo padronizar uma nova teacutecnica para auxiliar na tipagem sanguiacutenea de pacientes
A tipagem sanguiacutenea pode sofrer interferecircncia da presenccedila de anticorpos ligados aos gloacutebulos
vermelhos do sangue Nessas situaccedilotildees eacute difiacutecil selecionar o melhor sangue para o paciente e
eacute preciso a utilizaccedilatildeo de teacutecnicas adicionais para remover essas interferecircncias
Esta pesquisa tem como objetivo estudar outra teacutecnica para remover esses anticorpos e
comparaacute-la com a teacutecnica atualmente utilizada Para isso precisamos de amostras de pacientes
e doadores voluntaacuterios
Se vocecirc eacute um doador eacute necessaacuterio que vocecirc autorize a coleta de 5 ml (1 tubo) a mais
de seu sangue
Se vocecirc eacute um paciente natildeo haveraacute necessidade de nova amostra pois utilizaremos as
amostras jaacute coletadas para os testes preacute-transfusionais e os resultados encontrados nesta
pesquisa natildeo iratildeo interferir na escolha da (s) bolsa (s) de sangue que vocecirc possa vir a receber
Se vocecirc concordar em participar leia com atenccedilatildeo o texto abaixo e assine as duas vias
rubricando todas as paacuteginas deste termo de consentimento Uma via original assinada e
rubricada por vocecirc e pela pesquisadora ficaraacute com vocecirc
As suas informaccedilotildees seratildeo mantidas em sigilo pela pesquisadora e natildeo haveraacute
armazenamento de material para pesquisas posteriores Os seus dados seratildeo usados apenas
neste estudo e quando o trabalho for publicado seu nome e qualquer outra informaccedilatildeo que
possam identificaacute-lo natildeo seratildeo revelados
Eacute pouco provaacutevel que o que noacutes aprendermos com este estudo tenha um benefiacutecio
direto para vocecirc assim como natildeo poderemos dar nada em troca pela sua participaccedilatildeo na
pesquisa
Nosso objetivo com esta pesquisa eacute que os resultados poderatildeo ser uacuteteis para o
tratamento de pacientes no futuro Os riscos da participaccedilatildeo satildeo miacutenimos Se vocecirc eacute um
doador de sangue a amostra seraacute coletada no momento da doaccedilatildeo natildeo exigindo punccedilatildeo
venosa adicional
52
Eacute seu direito ter acesso aos resultados dos testes da pesquisa Esses resultados natildeo
seratildeo fornecidos automaticamente a vocecirc mas caso vocecirc se interesse em saber o resultado ou
tiver alguma duacutevida sobre a sua participaccedilatildeo neste estudo deveraacute entrar em contato com Ceacutelia
Kazue Abiko pelo telefone (18) 99718-3551
Vocecirc tem total liberdade de optar por natildeo participar da pesquisa Caso aceite
participar poderaacute desistir a qualquer momento ou retirar seu consentimento mesmo apoacutes ter
coletado o sangue Para cancelar sua participaccedilatildeo basta avisar a pesquisadora e os seus dados
seratildeo retirados do projeto
Qualquer duacutevida eacutetica sobre a pesquisa poderaacute entrar em contato com o Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa do Hospital das Cliacutenicas e da Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto
(CAMPUS UNIVERSITAacuteRIO bairro Monte Alegre CEP 14048-900 Ribeiratildeo Preto-SP
Telefone (16) 3602-2228 FAX (16) 3633-1144 e-mail cephcrpuspbr)
Consentimento de participaccedilatildeo
A Consentimento do participante
Li as informaccedilotildees acima sobre o estudo e recebi explicaccedilotildees sobre a participaccedilatildeo no estudo
Portanto dou o meu consentimento para participar do estudo
___________________________________________________________________________
Nome completo
___________________________________________________________________________
Assinatura
___________
Data
__________________________________________________________________________________
Nome completo da pesquisadora
___________________________________________________________________________
Assinatura
_____________
Data
5
patologia Ateacute 12 a 40 dos pacientes com autoanticorpos quentes podem apresentar
aloanticorpos de significado cliacutenico mascarados pelos autoanticorpos (SHIREY et al 2002)
Eacute importante detectar a presenccedila de anticorpos no plasmasoro de um receptor de
transfusatildeo para garantir que seja transfundido sangue compatiacutevel Quando a pesquisa de
anticorpo irregular resultar positiva para um ou mais anticorpos de relevacircncia clinica eacute
necessaacuterio confirmar a ausecircncia do respectivo antiacutegeno na hemaacutecia do receptor assim como
selecionar para transfusatildeo concentrados de hemaacutecias tambeacutem negativos para aqueles
antiacutegenos evitando assim reaccedilotildees transfusionais (WALKER 2011)
A detecccedilatildeo de um anticorpo irregular eacute inicialmente realizada pela triagem de
anticorpos na qual o soroplasma do receptor eacute testado com 2 a 3 hemaacutecias do tipo ldquoOrdquo O
conjunto de fenoacutetipos dessas hemaacutecias deve contemplar os antiacutegenos de maior importacircncia
cliacutenica Como os anticorpos irregulares de maior interesse cliacutenico satildeo na maior parte das
vezes imunes portanto da classe IgG eacute obrigatoacuteria a fase de antiglobulina (AGH) do teste
ou teste indireto da antiglobulina (TIA) uma vez que esses anticorpos satildeo incompletos
(CASTILHO JUNIOR e REID 2015) O teste de triagem estando positivo deve-se fazer a
identificaccedilatildeo da especificidade do anticorpo utilizando um painel com maior nuacutemero de
hemaacutecias fenotipadas
114 PROVA DE COMPATIBILIDADE
A prova de compatibilidade eacute um teste obrigatoacuterio em caso de transfusatildeo de
componentes eritrocitaacuterios Tambeacutem chamada de prova de compatibilidade maior deve ser
realizada antes da administraccedilatildeo de sangue total ou concentrado de hemaacutecias utilizando-se
hemaacutecias obtidas do tubo coletor da bolsa a ser transfundida e o soro ou plasma do receptor
(BRASIL 2016)
Eacute definido como o procedimento para excluir a incompatibilidade entre o doador e o
receptor Tem o objetivo de detectar anticorpos que podem natildeo ter sido encontrados na
pesquisa de anticorpos devido a ausecircncia ou pouca expressatildeo de antiacutegenos no painel de
hemaacutecias aleacutem da possibilidade de terem ocorrido erros teacutecnicos ou notacionais durante a
realizaccedilatildeo da pesquisa (MELO 2007)
6
115 FENOTIPAGEM PARA OUTROS SISTEMAS
Aleacutem da pesquisa de ABORh que eacute realizado rotineiramente a fenotipagem para
outros sistemas tambeacutem denominado ldquofenotipagem estendidardquo determina a presenccedila ou
ausecircncia de antiacutegenos considerados de importacircncia cliacutenica A fenotipagem natildeo eacute obrigatoacuteria
nos testes preacute-transfusionais poreacutem a legislaccedilatildeo atual recomenda a realizaccedilatildeo da fenotipagem
eritrocitaacuteria dos antiacutegenos C (RH2) E (RH3) c (RH4) e (RH5) K (KELL1) Fya (FY1) Fy
b
(FY2) Jka
(JK1) Jkb (JK2) S (MNS3) e s (MNS4) para pacientes aloimunizados e pacientes
com indicaccedilatildeo de transfusatildeo crocircnica (BRASIL 2016)
A seleccedilatildeo de concentrados de hemaacutecias com o mesmo fenoacutetipo do receptor para
transfusatildeo pode evitar reaccedilotildees transfusionais hemoliacuteticas no paciente previamente
aloimunizado tambeacutem previne a sensibilizaccedilatildeo por outros antiacutegenos o que normalmente
torna as transfusotildees seguintes ainda mais complicadas A fenotipagem do paciente tambeacutem
auxilia na identificaccedilatildeo dos anticorpos pois espera-se que nas hemaacutecias do paciente o
antiacutegeno seja negativo para o anticorpo encontrado servindo de guia para teste de exclusatildeo de
anticorpos (SANTOS 2014 WALKER 2011)
A incidecircncia de aloanticorpos aumenta com o nuacutemero de transfusotildees no entanto a
implantaccedilatildeo de rotina de fenotipagem com transfusatildeo profilaacutetica de hemaacutecias com fenoacutetipo
compatiacutevel para pacientes candidatos agrave politransfusatildeo como os portadores de doenccedila
falciforme talassemia anemia aplaacutestica doenccedilas linfo e mieloproliferativas renais crocircnicos e
anemias refrataacuterias pode contribuir para o baixo iacutendice de sensibilizaccedilatildeo nessas populaccedilotildees
(FLUIT KUNST e DRENTHE-SCHONK 1999 MARTINS et al 2008 e VICHINSKY et
al 2001) Outro grupo de pacientes que se beneficia com a transfusatildeo de mesmo fenoacutetipo satildeo
os pacientes com AHAI uma vez que o autoanticorpo pode mascarar a presenccedila de um
aloanticorpo de significado cliacutenico em ateacute 40 dos casos Mesmo com as teacutecnicas utilizadas
ldquoin vitrordquo para remover a interferecircncia do autoanticorpo no soro um aloanticorpo pode natildeo
ser identificado e dessa forma transfundir o mesmo fenoacutetipo do paciente evitaria reaccedilatildeo
hemoliacutetica pelos anticorpos voltados contra antiacutegenos de maior importacircncia cliacutenica e de
frequecircncia intermediaacuteria Aleacutem disso os pacientes com AHAI satildeo fortes respondedores e a
transfusatildeo profilaacutetica do mesmo fenoacutetipo previne a aloimunizaccedilatildeo (SHIREY et al 2002)
Aleacutem de fenotipar o receptor eacute importante tambeacutem que os bancos de sangue tenham
rotinas de fenotipagem de doadores para atender as necessidade dos pacientes aloimunizados
ou em esquema de transfusatildeo crocircnica (PINTO BRAGA e SANTOS 2011)
7
Rotineiramente eacute inviaacutevel estabelecer o fenoacutetipo eritrocitaacuterio completo de um
indiviacuteduo pela grande diversidade de sistemas sanguiacuteneos descritos Ate junho de 2015 jaacute
haviam sido classificados 308 antiacutegenos atribuiacutedos a 36 sistemas definidos pela Sociedade
Internacional de Transfusatildeo de Sangue (ISBT) (CASTILHO JUNIOR e REID 2015)
Portanto o paciente eacute normalmente fenotipado para os antiacutegenos de maior importacircncia
clinica
Alguns fatores podem limitar a realizaccedilatildeo da fenotipagem eritrocitaacuteria Um dos fatores
eacute a transfusatildeo alogecircnica realizada haacute menos de 90 dias Neste caso podem ocorrer resultados
falso positivos para determinados antiacutegenos devido agrave presenccedila de hemaacutecias do doador
(LAINE et al 2000)
Outro fator eacute a presenccedila de anticorpo sensibilizando a hemaacutecia do paciente e
provocando positividade do teste direto da antiglobulina humana (TDA) Os soros
normalmente utilizados para fenotipagem especialmente para os antiacutegenos Fya
(FY1) Fyb
(FY2) Jka
(JK1) Jkb
(JK2) S (MNS3) e s (MNS4) necessitam da fase de antiglobulina
humana (AGH) para que ocorra aglutinacatildeo Amostras que apresentam o TDA positivo
aglutinam apoacutes reaccedilatildeo com a AGH natildeo pela real presenccedila do antiacutegeno em sua superfiacutecie mas
pela interaccedilatildeo da AGH com o anticorpo que estaacute sensibilizando o eritroacutecito A interferecircncia
do TDA positivo pode ser anulada atraveacutes de algumas teacutecnicas capazes de dissociar o
anticorpo como por exemplo o tratamento da hemaacutecia sensibilizada com cloroquina ou com
glicina-aacutecida-EDTA (BRANCH e PETZ 1999 SHIREY et al 2002 e LEGER 2011)
12 METODOLOGIAS APLICADOS Agrave ROTINA IMUNO-HEMATOLOacuteGICA
Todos os testes que compotildeem a rotina preacute-transfusional usam meacutetodos soroloacutegicos
que envolvem a reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo e tem como objetivo determinar o perfil antigecircnico
eritrocitaacuterio do receptor e do doador assim como identificar em seu soro a presenccedila de
anticorpos contra antiacutegenos eritrocitaacuterios que possam comprometer a sobrevida das hemaacutecias
transfundidas Para testar o antiacutegeno na superfiacutecie da hemaacutecia eacute necessaacuterio dispor de um
antissoro com especificidade conhecida para aquele antiacutegeno Por outro lado para testar a
presenccedila de um determinado anticorpo no soro ou plasma do receptor eacute necessaacuterio o uso de
hemaacutecias com perfil antigecircnico conhecido (SANTOS 2014)
Diversas metodologias satildeo aplicadas nos laboratoacuterios de imunohematologia Cada
serviccedilo de hemoterapia faz a escolha do meacutetodo que seraacute aplicado de acordo com o perfil do
laboratoacuterio com o volume de exames diaacuterios e tambeacutem com o custo envolvido Todas essas
8
teacutecnicas tecircm como objetivo comum demonstrar a reaccedilatildeo entre antiacutegeno e anticorpo no
entanto elas se baseiam em diferentes princiacutepios Muitas metodologias satildeo atualmente
aplicadas agrave imunohematologia entre elas o sistema de fase soacutelida a tecnologia de hemaacutecias
magnetizadas a biologia molecular e ateacute mesmo a citometria de fluxo no entanto os meacutetodos
mais tradicionais satildeo aqueles baseados no princiacutepio de hemaglutinaccedilatildeo
121 MEacuteTODOS DE FASE FLUacuteIDA
Os meacutetodos de fase fluiacuteda satildeo testes baseados na hemaglutinaccedilatildeo e incluem o teste em
tubo e o teste em microplacas Uma suspensatildeo de hemaacutecias eacute adicionada ao plasma ou soro
em seguida eacute realizada a centrifugaccedilatildeo e por fim eacute feita a leitura do resultado que eacute
considerado positivo se for observado algum grau de aglutinaccedilatildeo ou hemoacutelise A intensidade
de aglutinaccedilatildeo eacute graduada de acordo com o tamanho dos agregados desprendidos da
superfiacutecie apoacutes agitaccedilatildeo delicada do tubo ou microplaca Os meacutetodos de hemaglutinaccedilatildeo satildeo
aplicados a todos os testes preacute-transfusionais Como os anticorpos ABO satildeo aglutininas frias
a tipagem eacute realizada em temperatura ambiente (22degC) no entanto ao investigar a presenccedila
de anticorpos irregulares que como jaacute mencionado eacute na maioria das vezes anticorpos
incompletos da classe IgG eacute essencial que a reaccedilatildeo seja incubada a 37degC As reaccedilotildees satildeo
facilitadas com a utilizaccedilatildeo de potencializadores e da antiglobulina humana (WALKER e
HARMENING 2012 AABB 2011)
Nos meacutetodos de fase fluiacuteda nos quais a AGH eacute empregada a fase de lavagem eacute
fundamental Apoacutes a incubaccedilatildeo do soro com as hemaacutecias deve ser realizada a lavagem da
reaccedilatildeo para remover o excesso de anticorpos natildeo ligados agraves hemaacutecias jaacute que os anticorpos
livres podem bloquear a AGH quando ela eacute adicionada e levar a resultados falso negativos
(AABB 2011)
Os testes de hemaglutinaccedilatildeo satildeo os mais tradicionais entre os meacutetodos ainda hoje
aplicados agrave rotina de bancos de sangue A vantagem desses meacutetodos eacute o baixo custo quando
comparado agraves teacutecnicas mais modernas mas apresentam tambeacutem desvantagens A teacutecnica em
tubo por exemplo natildeo permite automaccedilatildeo eacute trabalhosa e exige matildeo-de-obra bastante treinada
na execuccedilatildeo das diversas etapas do teste e mesmo assim pode haver subjetividade na
interpretaccedilatildeo dos resultados aleacutem de resultados falso-negativos (DOWNES 2011 ZANTEK
et al 2012)
9
122 COLUNAS DE GEL
A teacutecnica em gel iniciada na deacutecada de 90 representou uma grande revoluccedilatildeo na
rotina laboratorial tornando-se muito popular Aleacutem de ser sensiacutevel a teacutecnica dispensa a fase
de lavagem antes da adiccedilatildeo da AGH assim como a agitaccedilatildeo do teste para leitura reduzindo o
nuacutemero de resultados falsos negativos decorrentes dessas duas etapas e o tempo para
execuccedilatildeo dos testes (LAPIERRE et al 1989 NOVARETTI et al 2000 NOVARETTI et
al 2004) Os reagentes satildeo comercializados na forma de cartotildees plaacutesticos contendo
microtubos preenchidos por gel composto por microesferas de acrilamida-dextran Nesta
metodologia tambeacutem baseada na hemaglutinaccedilatildeo a suspensatildeo de hemaacutecias e o soro satildeo
depositados em uma cacircmara acima da coluna de gel e em seguida procede-se com a
centrifugaccedilatildeo dos cartotildees As microesferas atuam como uma malha que permite a passagem
em direccedilatildeo ao fundo do microtubo apenas das hemaacutecias natildeo aglutinadas enquanto as
hemaacutecias aglutinadas ficam retidas na parte superior da coluna ou ao longo dela (GREEN e
KLOSTERMANN 2012) Portanto quanto maior a agregaccedilatildeo mais hemaacutecias ficam retidas
no topo da coluna Dependendo do tipo de teste a ser realizado pode ser utilizado gel neutro
ou gel especiacutefico impregnado pelo anticorpo desejado e o gel contendo antiglobulina humana
que satildeo utilizados para os testes diretos e indiretos da antiglobulina (LAPIERRE et al 1989)
A coluna de gel ainda permite a visualizaccedilatildeo clara de duas populaccedilotildees distintas de hemaacutecias
como em pacientes receacutem transfundidos
123 BIOLOGIA MOLECULAR
A biologia molecular ou genotipagem estaacute sendo cada vez mais aplicada aos grupos
sanguiacuteneos pois fornece resultados seguros e precisos especialmente nos casos em que natildeo eacute
possiacutevel a realizaccedilatildeo da fenotipagem como em pacientes receacutem-transfundidos e pacientes
com TDA positivo Na genotipagem eacute possiacutevel determinar atraveacutes do DNA do paciente
extraiacutedo de seus leucoacutecitos de sangue perifeacuterico o fenoacutetipo eritrocitaacuterio deduzido sem
qualquer interferecircncia do anticorpo que sensibiliza a hemaacutecia ou de hemaacutecias alogecircnicas
transfundidas Sua realizaccedilatildeo no entanto exige o treinamento de equipe especializada e capaz
de interpretar os resultados em conjunto com os achados soroloacutegicos (JUNIOR e OLIVATO
2007)
Apesar de ser uma ferramenta de grande importacircncia hoje na imuno-hematologia
ainda estaacute restrito aos grandes centros de hemoterapia no Brasil poucos serviccedilos puacuteblicos de
sauacutede dispotildeem desse recurso e utilizam teacutecnicas de genotipagem de grupos sanguiacuteneos para
atendimento a seus pacientes Esta abordagem poreacutem vem sendo introduzida em algumas
10
instituiccedilotildees de reconhecida competecircncia na hemoterapia mas sua disponibilizaccedilatildeo deve
tornar-se mais generalizada atraveacutes da formaccedilatildeo de centros de referecircncia para atendimento
das diversas unidades de hemoterapia (MARTINS et al 2009) Dessa forma muitas decisotildees
transfusionais especialmente em urgecircncias ainda devem ser tomadas sem o resultado da
genotipagem eritrocitaacuteria
13 TESTE DA ANTIGLOBULINA
Coombs Mourant e Race descreveram em 1945 uma teacutecnica com utilizando soro de
coelho contendo antiglobulina humana (AGH) que posteriormente foi chamada de ldquosoro de
Coombsrdquo O meacutetodo foi desenvolvido inicialmente para ampliar o efeito de aglutininas fracas
do sistema Rh anticorpos ldquoincompletosrdquo que normalmente natildeo apresentavam aglutinaccedilatildeo
visiacutevel O teste foi concebido como um instrumento de investigaccedilatildeo de doenccedila hemoliacutetica do
receacutem-nascido e de reaccedilotildees transfusionais causadas por anticorpos Rh que estavam presentes
no soro dos paciente poreacutem que natildeo eram demonstraacuteveis pelas teacutecnicas ateacute entatildeo existentes
A maior parte dos anticorpos de significado cliacutenico assim como seus respectivos
antiacutegenos foram descritos apoacutes o surgimento do ldquosoro de Coombsrdquo em 1945 sendo assim o
teste da antiglobulina representa ateacute hoje a forma mais importante de aglutinaccedilatildeo artificial em
imunohematologia permitindo revelar a presenccedila de anticorpos na membrana da hemaacutecia A
antiglobulina humana eacute constituiacuteda por anticorpo especiacutefico contra a porccedilatildeo Fc de outro
anticorpo Quando um anticorpo ldquoincompletordquo sensibiliza a hemaacutecia normalmente natildeo
provoca aglutinaccedilatildeo visiacutevel Apoacutes a adiccedilatildeo da AGH ao meio esta reconhece e se liga agraves
porccedilotildees Fc dos anticorpos que sensibilizam a hemaacutecia formando assim uma malha e
provocando aglutinaccedilatildeo visiacutevel (BARJAS-CASTRO 2013)
Os reagentes de antiglobulina podem ser poliespeciacuteficos ou monoespeciacuteficos Os
poliespeciacuteficos satildeo uma mistura de anticorpos ant-IgG e anti-C3d (fraccedilatildeo C3d do
complemento) Os reagentes monoespecificos podem ser anti-IgG anti-IgM anti-IgA anti-
complemento podendo ser anti-C3d e anti-C3b
O teste da antiglobulina pode ser usado para detectar hemaacutecias sensibilizadas com
aloanticorpos IgG autoanticorpos IgG e componentes do complemento A sensibilizaccedilatildeo
pode ocorrer ldquoin vivordquo ou ldquoin vitrordquo O uso do AGH para detectar a sensibilizaccedilatildeo ldquoin vitrordquo
tem dois estaacutegios e eacute denominado teste indireto da antiglobulina A sensibilizaccedilatildeo ldquoin vivordquo eacute
detectada em procedimento de um uacutenico estagio chamado teste direto da antiglobulina (TDA)
11
Os testes direto e indireto satildeo ateacute hoje amplamente aplicados como princiacutepio de inuacutemeros
testes soroloacutegicos em imuno-hematologia (GREEN e KLOSTERMANN 2012)
131 TESTE DIRETO DA ANTIGLOBULINA
O teste direto da antiglobulina humana revela a presenccedila de anticorpo eou fraccedilatildeo do
complemento ligados agrave superfiacutecie das hemaacutecias As sensibilizaccedilatildeo das hemaacutecias ocorrida ldquoin
vivordquo natildeo eacute visualizada mas apoacutes a adiccedilatildeo da antiglobulina humana ocorre a aglutinaccedilatildeo que
eacute visualizada macroscopicamente (Figura 1)
Figura 1 - Princiacutepio da teacutecnica direta da antiglobulina Teste utilizado para demonstrar a sensibilizaccedilatildeo ldquoin
vivordquo das hemaacutecias O sangue total eacute coletado do paciente em tubo contendo anticoagulante EDTA Na teacutecnica
realizada em tubo uma suspensatildeo de hemaacutecias 5 em soluccedilatildeo de salina eacute preparada Uma gota dessa suspensatildeo
eacute lavada 3 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica para retirada de anticorpos que estatildeo livres no plasma Toda soluccedilatildeo eacute
retirada e adiciona-se o soro de Coombs (antiglobulina humana) O soro de Coombs reconhece os anticorpos que
estatildeo ligados agrave superfiacutecie das hemaacutecias fazendo com que ocorra aglutinaccedilatildeo visiacutevel macroscopicamente
Apesar de natildeo ser um teste preacute-transfusional obrigatoacuterio o TDA eacute um dos testes mais
importantes para investigar e classificar quadros hemoliacuteticos como de origem imune ou natildeo
imune O seu valor preditivo positivo em vigecircncia de anemia hemoliacutetica eacute de 83 poreacutem natildeo
havendo sinais de hemoacutelise seu valor preditivo eacute apenas 14 Eacute por esse motivo que a
interpretaccedilatildeo do TDA positivo deve levar em consideraccedilatildeo a histoacuteria cliacutenica e os resultados
dos outros exames laboratoriais A realizaccedilatildeo do TDA eacute obrigatoacuteria na investigaccedilatildeo
12
laboratorial de diversos quadros hemoliacuteticos entre eles a anemia hemoliacutetica autoimune
(AHAI) a reaccedilatildeo hemoliacutetica imune poacutes-transfusional a siacutendrome do linfoacutecito passageiro a
doenccedila hemoliacutetica perinatal e a hemoacutelise droga-dependente (LEGER 2011)
Resultados de TDA positivos foram tambeacutem observados em indiviacuteduos com niacuteveis
seacutericos elevados de IgG ou complemento sem evidecircncia de anemia hemoliacutetica imune como
em pacientes com doenccedila falciforme talassemia doenccedila renal crocircnica mieloma muacuteltiplo
doenccedilas autoimunes e siacutendrome da imunodeficiecircncia adquirida (SIDA) Aleacutem disso pequenas
quantidades de IgG (5 a 90 moleacuteculas por hemaacutecia) e complemento (5 a 40 moleacuteculas por
hemaacutecia) podem estar presentes nas hemaacutecias de indiviacuteduos saudaacuteveis sem associaccedilatildeo com
reduccedilatildeo na sobrevida das mesmas A positividade do TDA depende da populaccedilatildeo estudada e
pode variar de 01 entre doadores de sangue sem qualquer sinal cliacutenico de hemoacutelise ateacute
15 em pacientes hospitalizados (CASTILHO JUNIOR e REID 2015 LEGER 2011)
Indiviacuteduos que apresentam TDA positivo seja agraves custas de IgG eou complemento
com ou sem sinais cliacutenicos de hemoacutelise teratildeo a fenotipagem eritrocitaacuteria prejudicada A
fenotipagem de indiviacuteduos com TDA positivo especialmente quando utilizado o teste indireto
da antiglobulina pode acarretar resultados falsos positivos e levar a seleccedilatildeo de fenoacutetipo
incorreto para transfusatildeo
132 TESTE INDIRETO DA ANTIGLOBULINA
O teste indireto da antiglobulina (TIA) eacute utilizado para revelar a sensibilizaccedilatildeo ldquoin
vitrordquo das hemaacutecias e eacute aplicado a diversos testes soroloacutegicos em imunohematologia entre
eles a pesquisa de anticorpos identificaccedilatildeo de anticorpos testes de compatibilidade
fenotipagem eritrocitaacuteria e titulaccedilatildeo de anticorpos Na teacutecnica indireta a hemaacutecia que contecircm
o antiacutegeno eacute colocada em contato ldquoin vitrordquo com o anticorpo que se liga mas natildeo promove a
aglutinaccedilatildeo visiacutevel A adiccedilatildeo da AGH forma uma malha entre os anticorpos que sensibilizam
as hemaacutecias e provoca a aglutinaccedilatildeo macroscoacutepica (figura 2)
Caso a amostra de hemaacutecia estudada seja previamente sensibilizada resultados falsos
positivos podem ser obtidos no TIA jaacute que a AGH reagiraacute com a moleacutecula que sensibilizava
anteriormente a hemaacutecia mesmo se o anticorpo especiacutefico natildeo tiver se ligado ao antiacutegeno
correspondente
13
133 CONDICcedilOtildeES CLIacuteNICAS COM TDA POSITIVO
O TDA positivo deve ser interpretado cuidadosamente sempre em conjunto com o
quadro cliacutenico do paciente A positividade isolada do TDA natildeo significa hemoacutelise A
interpretaccedilatildeo do teste positivo requer o conhecimento do diagnoacutestico do paciente da presenccedila
de sinais e sintomas sugestivos de hemoacutelise assim como de seu histoacuterico transfusional
gestacional e de informaccedilotildees sobre o uso recente de medicaccedilotildees (LEGER 2011)
Figura 2 ndash Princiacutepio do teste indireto da antiglobulina O TIA pode ser utilizado na pesquisa de anticorpos de
especificidades desconhecidas livres no soroplasma como eacute o caso da pesquisa e identificaccedilatildeo de anticorpos
irregulares Ele eacute tambeacutem utilizado para determinar a presenccedila de antiacutegenos na membrana da hemaacutecia quando
satildeo empregados soros de especificidades conhecidas da classe IgG No primeiro caso o soroplasma contendo o
anticorpo desconhecido eacute colocado em contato com hemaacutecias cujo perfil antigecircnico eacute conhecido No segundo
caso utiliza-se soro de especificidade conhecida da classe IgG para determinar a presenccedila ou ausecircncia de um
antiacutegeno na membrana O anticorpo encontra o antiacutegeno correspondente e ocorre a ligaccedilatildeo do anticorpo agrave
hemaacutecia mas natildeo ocorre aglutinaccedilatildeo Apoacutes a adiccedilatildeo da AGH que se liga aos anticorpos formando uma malha
ocorre a aglutinaccedilatildeo visiacutevel
O TDA positivo eacute uma achado claacutessico de algumas condiccedilotildees cliacutenicas como a reaccedilatildeo
transfusional hemoliacutetica a doenccedila hemoliacutetica do feto e do receacutem-nascido (DHFRN) a anemia
hemoliacutetica induzida por drogas a siacutendrome do linfoacutecito passageiro e a anemia hemoliacutetica
autoimune (AHAI) Portanto o TDA positivo pode ser decorrente da sensibilizaccedilatildeo da
hemaacutecia autoacuteloga por um autoanticorpo ou por um aloanticorpo ligado agrave hemaacutecia alogecircnica
circulante A positividade do TDA pode ainda ocorrer de forma passiva em pacientes que
14
recebem imunoglobulinas humanas ou ainda pela transfusatildeo de plaquetas ABO natildeo idecircntico
(LEGER 2011 RALPH 2012 ZANTEK et al 2012)
Nas reaccedilotildees transfusionais hemoliacuteticas imunes o aloanticorpo do receptor sensibiliza
as hemaacutecias transfundidas do doador e reduz sua sobrevida ao removecirc-la precocemente da
circulaccedilatildeo pela fagocitose no sistema retiacuteculo-endotelial ou pela hemoacutelise intravascular As
reaccedilotildees podem ser agudas se ocorrem ateacute 24 horas ou tardias quando ocorrem apoacutes 24 horas
da transfusatildeo A gravidade das reaccedilotildees hemoliacuteticas pode variar de um simples rendimento
transfusional inadequado agrave quadros graves de hemoacutelise intravascular evoluindo ateacute mesmo
com choque vascular e oacutebito O TDA pode resultar negativo caso toda massa eritrocitaacuteria
transfundida tenha sido destruiacuteda (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
Na doenccedila hemoliacutetica do feto e do receacutem-nascido (DHFRN) anticorpos maternos da
classe IgG atravessam a barreira placentaacuteria e sensibilizam as hemaacutecias fetais que seratildeo
destruiacutedas precocemente levando agrave anemia fetal Apesar da incompatibilidade ABO feto-
materna ser a causa mais frequente de DHFRN raramente ela eacute responsaacutevel pela ocorrecircncia
de quadros graves Por outro lado anticorpos contra antiacutegenos do sistema Rh e Kell
especialmente Anti-D (Anti-RH1) Anti-c (Anti-RH4) e Anti-Kell (Anti-KELL1) satildeo
conhecidos por causar DHFRN severa Raramente outros anticorpos tambeacutem podem estar
implicados na DHFRN como os anticorpos contra antiacutegenos do sistema Kidd Duffy MNS e
Diego (ZANTEK et al 2012)
A hemoacutelise droga-dependente eacute causada pela produccedilatildeo de um anticorpo voltado contra
a droga ligada agrave membrana eritrocitaacuteria ou ainda contra o complexo droga-membrana A
classe de medicaccedilotildees mais comumente envolvida eacute a dos antimicrobianos betalactacircmicos
(penicilinas e cefalosporinas) mas outras classes como quimioteraacutepicos e anti-inflamatoacuterios
tambeacutem satildeo descritos (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
Apoacutes transplante de ceacutelulas progenitoras hematopoieacuteticas em que o doador possui
anticorpos contra antiacutegenos eritrocitaacuterios do receptor o linfoacutecito de memoacuteria do doador pode
resistir ao esquema imunossupressor utilizado e continuar a produccedilatildeo de anticorpos que
reconhecem a hemaacutecia incompatiacutevel do receptor ainda circulante O quadro cliacutenico pode
variar de um simples TDA positivo sem outros sinais ou sintomas ateacute um quadro hemoliacutetico
grave e abrupto (LEGER 2011)
15
134 ANEMIA HEMOLIacuteTICA AUTOIMUNE
A anemia hemoliacutetica autoimune eacute caracterizada pela destruiccedilatildeo precoce das hemaacutecias
autoacutelogas por autoanticorpos que sensibilizam as hemaacutecias e levam agrave fagocitose pelos
macroacutefagos no sistema reticulo-endotelial ou hemoacutelise intravascular O diagnoacutestico da AHAI
baseia-se na presenccedila de hemoacutelise cliacutenica associada agrave evidecircncia de fator imune representado
pelo TDA positivo As classes de anticorpos envolvidas em quadros de AHAI satildeo IgG IgM e
raramente IgA (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012) Satildeo raros os casos de AHAI com TDA
negativo que podem estar relacionados a um autoanticorpo de baixa avidez de densidade
inferior agrave detecccedilatildeo do meacutetodo ou ainda de classe de imunoglobulina natildeo avaliada pelo
meacutetodo utilizado para o teste (GARRATY 2005)
A AHAI pode ser classificada em dois grupos principais de acordo com a melhor
temperatura de reaccedilatildeo do autoanticorpo As anemias hemoliacuteticas causadas por anticorpos
quentes que reagem melhor a 37oC e geralmente IgG representam 80 dos casos de AHAI
Nas AHAI por anticorpo quente o TDA pode ser positivo para IgG mais complemento (67)
somente IgG (20) ou somente por complemento (13) As anemias causadas por
anticorpos frios geralmente da classe IgM e que reagem melhor em temperatura ambiente ou
a 4oC representam aproximadamente 20 dos casos de AHAI Por exibirem amplitude
teacutermica esses anticorpos ligam-se agraves hemaacutecias ao atingirem a circulaccedilatildeo nas extremidades do
corpo fixam o complemento e desprendem-se da hemaacutecia apoacutes retornar para partes mais
quentes Por esse motivo em AHAI por anticorpos frios o TDA eacute positivo apenas agraves custas
de C3 e normalmente o IgM natildeo eacute detectado (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
A presenccedila do autoanticorpo IgG pode ser confirmada atraveacutes da eluiccedilatildeo do anticorpo
da hemaacutecia Tipicamente o eluato na AHAI por anticorpo quente reage com todas as ceacutelulas
testadas de um painel de hemaacutecias alogecircnicas do tipo ldquoOrdquo ou pode eventualmente exibir uma
especificidade conhecida como Anti-e (Anti-RH5) Nas AHAI a frio por sua vez espera-se
um eluato negativo (LEGER 2011)
Os autoanticorpos satildeo com frequecircncia encontrados livres no plasma e natildeo somente
ligados agraves hemaacutecias autoacutelogas Eles podem interferir em todas as fases dos testes preacute-
transfusionais nas quais o plasma eacute testado especialmente os autoanticorpos quentes que
acarretam resultados positivos em todos os testes levados agrave fase de antiglobulina humana
Esses anticorpos portanto positivam a pesquisa de anticorpos irregulares e mascaram a
presenccedila de aloanticorpos de significado cliacutenico Aproximadamente 60 dos pacientes que
apresentam AHAI a quente apresentam anticorpos que reagem em meio salino mas se forem
16
levados em conta meacutetodos mais sensiacuteveis como PEG enzima e estudo em gel a positividade
pode ser superior a 90 (LEGER 2011)
Aleacutem da eficaacutecia da transfusatildeo ser comprometida pela diminuiccedilatildeo da vida-meacutedia das
hemaacutecias a presenccedila do autoanticorpo dificulta a realizaccedilatildeo dos testes preacute-transfusionais e
compromete a seguranccedila transfusional Os autoanticorpos reagem normalmente como
panaglutininas pois satildeo normalmente voltados contra antiacutegenos puacuteblicos na maior parte das
vezes contra antiacutegenos do sistema Rh Por apresentarem essas caracteriacutesticas podem ainda
mascarar a presenccedila de aloanticorpos de significado clinico e levar a testes de compatibilidade
positivos exigindo uma avaliaccedilatildeo criteriosa da necessidade da transfusatildeo (BRANCH e PETZ
1999 JUNIOR e OLIVATO 2004)
Remover a interferecircncia do autoanticorpo para avaliar a presenccedila de aloanticorpos
mascarados nem sempre eacute possiacutevel mesmo utilizando teacutecnicas de autoadsorccedilatildeo ou
aloadsorccedilatildeo que aleacutem de tudo satildeo demoradas e exigem de 2 a 6 horas para conclusatildeo
(GARRATY e GEORGE 2002) Nesses casos a fenotipagem eritrocitaacuteria do paciente eacute de
extrema utilidade especialmente em situaccedilotildees de urgecircncia A definiccedilatildeo do fenoacutetipo do
paciente para os antiacutegenos de maior importacircncia cliacutenica pode auxiliar a seleccedilatildeo de unidades
de hemaacutecias com mesmo fenoacutetipo o que garante que eventuais aloanticorpos natildeo
identificados sejam respeitados e tambeacutem evita nova sensibilizaccedilatildeo (JUNIOR e OLIVATO
2004 SHIREY et al 2002)
135 TRATAMENTO DE HEMAacuteCIAS COM TDA POSITIVO
O TDA positivo impede a fenotipagem eritrocitaacutecia por meacutetodos que exigem a fase de
AGH uma vez que a aglutinaccedilatildeo ocorreraacute devido agrave interaccedilatildeo da AGH com o autoanticorpo
que sensibiliza a hemaacutecia do paciente levando a resultados falso positivos Em algumas
situaccedilotildees como na AHAI por anticorpo quente a fenotipagem eacute especialmente importante
pois o autoanticorpo interfere na triagem e identificaccedilatildeo de anticorpos assim como no teste de
compatibilidade e dificultam a detecccedilatildeo de aloanticorpos de significado cliacutenico que
obrigatoriamente devem ser respeitados Nessas situaccedilotildees a fenotipagem eritrocitaacuteria
determina o perfil antigecircnico do paciente e possibilita o fornecimento de unidades de
hemaacutecias com o mesmo fenoacutetipo para a transfusatildeo evitando a sensibilizaccedilatildeo para novos
antiacutegenos assim como reaccedilotildees hemoliacuteticas transfusionais No entanto eacute necessaacuterio aplicar
meacutetodos que natildeo sofram interferecircncia do TDA positivo ou seja meacutetodos que natildeo necessitem
da fase de AGH ou meacutetodos de bloqueio do anticorpo sem bloquear o antiacutegeno Uma opccedilatildeo eacute
a utilizaccedilatildeo de soros monoclonais IgM (salinos ou de meio proteico natildeo concentrado) mas
17
nem sempre esses reagentes estatildeo disponiacuteveis especialmente os reagentes monoclonais para
os antiacutegenos dos sistemas Duffy ( Fya Fy
b) Kidd ( Jk
a Jk
b) e MNS (S s) (JUNIOR e
OLIVATO 2004) Outra opccedilatildeo eacute a teacutecnica de bloqueio que pode ser utilizada para tratar
hemaacutecias para posterior fenotipagem em casos de TDA positivos com reatividade le2+
Em casos onde a positividade do TDA eacute maior que 2+ estaacute indicada a tratamento
quiacutemico para remoccedilatildeo da interferecircncia do autoanticorpo antes de realizar a fenotipagem Entre
as teacutecnicas utilizadas atualmente estatildeo o ZZAP a cloroquina e a glicina aacutecidaEDTA
1351 TEacuteCNICA DE BLOQUEIO
A teacutecnica de bloqueio se baseia na utilizaccedilatildeo de anti-IgG (Coombs monoespeciacutefico)
para tratar as hemaacutecias com TDA positivo O anticorpo anti-IgG se liga aos anticorpos que
estatildeo sensibilizando a hemaacutecias poreacutem sem o bloquear os antiacutegenos Os antiacutegenos que natildeo
estatildeo sensibilizados podem ser detectados atraveacutes dos antissoros especiacuteficos (SERERAT
VEIDT E DUTCHED 2000)
1352 TRATAMENTO DE HEMAacuteCIAS COM ZZAP
O Sulphydryl-Proteolytic Enzyme (ZZAP) que eacute uma mistura de ditiotreitol (DTT)
mais papaiacutena ativada com cisteiacutena eacute um reagente capaz de dissociar imunoglobulinas da
classe IgG ligadas a membrana dos eritroacutecitos enquanto trata enzimaticamente as hemaacutecias
O tratamento enzimaacutetico tambeacutem potencializa a ligaccedilatildeo do autoanticorpo ao antiacutegeno e
acelera o processo de autoadsorccedilatildeo O ZZAP pode desnaturar os antiacutegenos do sistema Duffy
MNS e Kell o que limita sua aplicaccedilatildeo para fins de fenotipagem (BRANCH e PETZ 1982)
1353 CLOROQUINA
Em 1982 Edwards Moulds e Judd propuseram a utilizaccedilatildeo da teacutecnica da cloroquina
que dissociava os complexos antiacutegeno-anticorpo e mantinha a membrana das hemaacutecias
iacutentegras Os derivados quinolecircicos jaacute haviam sido descritos anteriormente por Domokos e
Aszody em 1964 e Holtz Mantel e Buck em 1973 (apud Edwards Moulds e Judd 1982) pela
sua capacidade de separar imunocomplexos e inibir as reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo reduzindo
as cargas eleacutetricas das superfiacutecie das hemaacutecias A teacutecnica eacute uma das mais utilizadas nos
centros brasileiros para remover a interferecircncia do autoanticorpo e eacute tambeacutem a teacutecnica
atualmente adotada pelo laboratoacuterio de imunohematologia do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto
18
Edwards Moulds e Judd (1982) demonstraram que a teacutecnica da cloroquina para
dissociaccedilatildeo de anticorpos eacute uma teacutecnica simples efetiva e confiaacutevel para dissociar
imunoglobulina das hemaacutecias Desde que a membrana das hemaacutecias permaneccedila intacta natildeo
haacute perda da reatividade dos antiacutegenos e a sua maior aplicaccedilatildeo eacute a fenotipagem de hemaacutecias
com TDA positivo Os autores verificaram que em 83 das amostras sensibilizadas in vivo e
22 amostras (no total de 40) sensibilizadas ldquoin vitrordquo apresentaram TDA negativo e
puderam ser fenotipadas A teacutecnica poreacutem natildeo consegue remover os componentes do
complemento na maioria dos casos
Champagne e colaboradores (1999) testaram a teacutecnica da cloroquina para dissociar
antiacutegenos Bg comparando com a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA e verificaram vantagem em
relaccedilatildeo ao uso de um uacutenico reagente diminuindo a manipulaccedilatildeo e verificou que o mesmo natildeo
destroacutei antiacutegeno Kell
A cloroquina tambeacutem mostrou-se pouco efetivo em remover anticorpos do sistema
Duffy da superfiacutecie das hemaacutecias (EDWARDS MOUDS e JUDD 1982 ROZIERS e
SQUALI 1997)
1353 GLICINA-AacuteCIDAEDTA
A afinidade e a estabilidade entre a ligaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo eacute definida como a
resultante entre forccedilas atrativas e repulsivas entre ambos (CARUCIO e WISE 2012) e resulta
da somatoacuteria de forccedilas quiacutemicas dinacircmicas e fracas (natildeo covalentes) como pontes de
hidrogecircnio forcas eletrostaacuteticas forca de Van der Waals e pontes hidrofoacutebicas A estabilidade
dessa ligaccedilatildeo eacute facilmente abalada por alteraccedilotildees quiacutemicas e fiacutesicas no meio da reaccedilatildeo como
a alteraccedilatildeo do pH A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA se baseia na mudanccedila do pH para a
quebra da ligaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo (KOSANKE 2012)
A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA foi primeiramente descrita em 1986 por Louie Jieng
e Zeroulis que utilizaram 50 amostras de doadores sensibilizados ldquoin vitrordquo com anticorpos A
teacutecnica foi efetiva em 48 amostras permitindo o estudo do eluato assim como a fenotipagem
das hemaacutecias Os autores testaram tambeacutem a teacutecnica em 100 hemaacutecias TDA positivo que
puderam ser utilizadas para teacutecnicas de autoadsorccedilatildeo
Byrne (1991) descreveu a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA modificada e tambeacutem
verificou como uma opccedilatildeo para o tratamento de hemaacutecias com TDA positivo que deixava as
hemaacutecias intactas e o eluato viaacutevel para ser fenotipado
19
Roziers e Squali (1997) e Katharia e Chaudhary (2013) compararam a teacutecnica da
glicina-aacutecidaEDTA com as teacutecnicas da cloroquina e do aquecimento Verificaram maior
eficiecircncia da glicina-aacutecidaEDTA em relaccedilatildeo as outras duas teacutecnicas pois com uma mesma
quantidade de amostra produzia as hemaacutecias livres de anticorpo e tambeacutem o eluato Mostrou-
se ainda superior devido ao menor tempo exigido para sua realizaccedilatildeo o que favorece seu uso
em situaccedilotildees de urgecircncia e emergecircncia
As duas desvantagens da teacutecnica poreacutem eacute o fato de destruir os antiacutegenos do sistema
Kell e o fato de natildeo remover fraccedilotildees do complemento ligadas agrave hemaacutecia (PALLAS WILER e
McGEE 1991 ROZIERS e SQUALLI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012
e KATHARIA e CHAUNDHARY 2013)
20
2 OBJETIVOS
21 OBJETIVO GERAL
211 Avaliar a eficaacutecia da glicina-aacutecidaEDTA em remover os anticorpos ligados agraves
hemaacutecias sensibilizadas por anticorpos da classe IgG
22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
221 Preparaccedilatildeo dos reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
verificaccedilatildeo da estabilidade dos mesmos e avaliar custos
222 Testar a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA em amostras de hemaacutecias
sensibilizadas por anticorpos antieritrocitaacuterios humanos
223 Comparar a efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA com a teacutecnica da
cloroquina quanto a capacidade de remover a interferecircncia do anticorpo ligado
a hemaacutecia
224 Testar o eluato das amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA
225 Verificar se houve destruiccedilatildeo dos antiacutegenos eritrocitaacuterios apoacutes o tratamento
com glicina-aacutecidaEDTA e com cloroquina
226 Verificar se o tempo de execuccedilatildeo da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA descrito
nos textos de referecircncia eacute reprodutiacutevel
21
3 JUSTIFICATIVA
Algumas condiccedilotildees cliacutenicas podem levar ao depoacutesito ldquoin vivordquo de anticorpos eou
fraccedilotildees do complemento sobre as hemaacutecias Entre elas estatildeo as reaccedilotildees hemoliacuteticas poacutes-
transfusionais a doenccedila hemoliacutetica perinatal o uso de medicamentos e principalmente a
AHAI Na AHAI um anticorpo normalmente da classe IgG ou IgM reconhece antiacutegenos
proacuteprios na membrana eritrocitaacuteria e reduz a sobrevida da hemaacutecia levando a sua destruiccedilatildeo
pelos macroacutefagos no sistema reticulo-endotelial ou agrave ativaccedilatildeo do complexo de ataque agrave
membrana e agrave lise intravascular Os autoanticorpos satildeo voltados na maioria das vezes contra
antiacutegenos eritrocitaacuterios de alta frequecircncia populacional conhecidos como antiacutegenos puacuteblicos
e por este motivo reconhecem tanto hemaacutecias autoacutelogas quanto alogecircnicas
Devido agrave presenccedila do autoanticorpo livre no plasma e tambeacutem do anticorpo eou
complemento ligado agrave hemaacutecia o banco de sangue pode encontrar dificuldades em todas as
fases dos testes preacute-transfusionais do paciente com AHAI e deve utilizar teacutecnicas que
auxiliem na escolha do melhor hemocomponente melhorando a seguranccedila transfusional Essas
teacutecnicas visam remover a interferecircncia do autoanticorpo livre no soro e do autoanticorpo
ligado agrave hemaacutecia permitindo a detecccedilatildeo de aloanticorpos associados e a realizaccedilatildeo da
fenotipagem eritrocitaacuteria respectivamente
A finalizaccedilatildeo dos testes preacute-tranfusionais na presenccedila de autoanticorpo pode levar
algumas horas e nem sempre o paciente poderaacute aguardar Nesse contexto torna-se vantajosa a
aplicaccedilatildeo de teacutecnicas de raacutepida execuccedilatildeo
O presente estudo propotildee aplicar e avaliar a eficaacutecia da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
em remover os anticorpos ligados agrave hemaacutecia o que permite a fenotipagem eritrocitaacuteria
estendida e a seleccedilatildeo de concentrados de hemaacutecias com mesmo fenoacutetipo do paciente
Atualmente no Hemocentro de Ribeiratildeo Preto a teacutecnica utilizada para esse fim eacute o
tratamento das hemaacutecias com difosfato de cloroquina cujo tempo de execuccedilatildeo pode demorar
ateacute duas horas enquanto a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser realizada em apenas dois
minutos o que a tornaria opccedilatildeo de escolha especialmente em situaccedilotildees de urgecircncia Ao
contraacuterio da cloroquina a glicina-aacutecidaEDTA permite tambeacutem o estudo do eluato das
hemaacutecias tratadas
22
4 METODOL OGIA
41 AMOSTRAS DE DOADORES
Foram coletados 50 amostras de doadores de sangue que compareceram ao
Hemonuacutecleo de Araccedilatuba no periacuteodo de junho a agosto de 2016 Foram convidados a
participar da pesquisa doadores de repeticcedilatildeo do tipo sanguiacuteneo ldquoOrdquo RhD positivo
cadastrados no sistema de banco de sangue (SBS) do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto
Todos os doadores que concordaram em participar da pesquisa assinaram o termo de
consentimento livre e esclarecido (TCLE)
No momento da doaccedilatildeo foram coletados adicionalmente 5 mL de sangue total em
soluccedilatildeo anticoagulante EDTA (aacutecido dietilenoaminoaceacutetico) dispensando punccedilatildeo venosa
adicional para coleta da amostra O fluxograma 1 resume as etapas desenvolvidas no projeto
Fluxograma 1 - Fluxo da pesquisa utilizando as amostras de doadores
23
411 FENOTIPAGEM
Foram verificados se os doadores jaacute tinham fenotipagem para outros sistemas de
grupos sanguiacuteneos aleacutem do sistema ABORh que eacute realizado rotineiramente
A fenotipagem eritrocitaacuteria para outros sistemas ou fenotipagem estendida eacute realizada
para identificar a presenccedila ou ausecircncia de antiacutegenos considerados de importacircncia cliacutenica No
Hemonuacutecleo de Araccedilatuba uma parcela de doadores de repeticcedilatildeo satildeo fenotipados para os
antiacutegenos dos sistemas de grupo sanguiacuteneo Rh (antiacutegenos C c E e e) Kell (antiacutegeno K)
Duffy (antiacutegenos Fya e Fy
b) Kidd (antiacutegenos Jk
a e Jk
b) e sistema MNSs (antiacutegenos S e s)
A fenotipagem para o Rh e Kell eacute realizada por metodologia de microplaca utilizando
25 microL de hemaacutecia lavada e diluiacuteda a 5 em salina e 25 microL do antissoro comercial especiacutefico
A reaccedilatildeo eacute incubada 15 minutos a temperatura ambiente e centrifugadas para leitura Para os
antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s a metolodogia utilizado eacute gel contendo antiglobulina
humana (gel LissCoombs poliespeciacutefico) da marca BIO-RAD onde se utiliza suspensatildeo de
hemaacutecia em LISS (Soluccedilatildeo de baixa forccedila iocircnica) A suspensatildeo eacute preparada atraveacutes da
diluiccedilatildeo de 10 microL de hemaacutecia em 1000 microL de LISS Pipetado 50 microL dessa diluiccedilatildeo no gel e
adicionado 25 microL do antissoro especiacutefico Incuba-se em banho seco por 15 minutos a 37 deg
Celsius e eacute centrifugado em centriacutefuga especiacutefica Os antissoros utilizados eram das marcas
Fresenius e Lorne
Foi verificado a fenotipagem do doador no banco de dados do Hemocentro Os
registros dos fenoacutetipos dos doadores ficam armazenadas no sistema de banco de sangue
(SBS) Para doadores que natildeo tinham fenotipagem estendida preacutevia para antiacutegenos do sistema
Rh (C c E e e) e Kell (K) foi realizada a fenotipagem para esses antiacutegenos
O tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA e cloroquina para dissociar
anticorpos pode inativar enfraquecer ou destruir os antiacutegenos presentes nas hemaacutecias
alterando assim os resultados da fenotipagem Para verificar se houve destruiccedilatildeo dos
antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a e Jk
b S e s nas amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes
tratamento foram novamente fenotipadas ao final para os antiacutegenos que eram inicialmente
positivas
A repeticcedilatildeo da fenotipagem foi realizada nas amostras que apresentaram efetividade
no tratamento da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eou da cloroquina e a detecccedilatildeo do antiacutegeno
na amostra preacute-tratamento
24
412 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS HEMAacuteCIAS
As hemaacutecias foram sensibilizadas com antissoros policlonais humanos de amostras de
plasma fresco congelado de doadores com resultado de pesquisa de anticorpo irregular
positivos
A escolha do anticorpo para sensibilizar as hemaacutecias foi definida de acordo com o
fenoacutetipo do doador que deveria ser positivo para o respectivo antiacutegeno
Para a sensibilizaccedilatildeo um volume de antissoro (1 mL) e um volume (1 mL) de
hemaacutecias lavadas quatro vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica foram adicionadas a um tubo de 12 x
75 mm A mistura foi homogeneizada e incubada em banho maria (BM) a 37deg C por 60
minutos A seguir as hemaacutecias foram novamente lavadas 4 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica
para retirada dos anticorpos que natildeo se ligaram A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada
como controle negativo O teste da uacuteltima lavagem eacute importante para assegurar que os
anticorpos que poderatildeo ser detectados no eluato apoacutes o tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA
sejam aqueles que estavam ligados agraves hemaacutecias e natildeo aqueles livres no plasma O controle
negativo mostra que todo o anticorpo livre foi retirado (LEGER 2011)
Para o teste de presenccedila de anticorpo na soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foram incubadas
com hemaacutecias de triagem de anticorpos irregulares (ID-Diacell BIO-RAD) contendo os
antiacutegenos especiacuteficos Realizado a teacutecnica em gel LissCoombs com anti-IgG+C3d Incubado
no tempo de 15 minutos a temperatura de 37deg C e centrifugado 10 minutos em centriacutefuga
proacutepria
As 50 amostras de doadores foram sensibilizadas com os anticorpos policlonais
humanos
Apoacutes sensibilizadas rdquoin vitrordquo e lavadas as hemaacutecias foram diluiacutedas em soluccedilatildeo de
baixa forccedila iocircnica (LISS) na quantidade de 10 microL de hemaacutecia para 1000 microL de soluccedilatildeo A
suspensatildeo foi pipetada (50 microL) em coluna-gel-teste LissCoombs (BIO-RAD) que contecircm
antiglobulina poliespeciacutefico (IgG+C3d) e centrifugada em baixa rotaccedilatildeo conforme orientaccedilatildeo
do fabricante durante 10 minutos
As amostras deveriam apresentar aglutinaccedilatildeo com reatividade 3 a 4+ no TDA As
amostras que apresentaram reaccedilatildeo menor que 3+ foram novamente sensibilizadas com nova
aliacutequota do antissoro
25
413 TRATAMENTO DAS AMOSTRAS
As amostras sensibilizadas apresentando o TDA positivo 3 ou 4+ foram divididas em
duas aliacutequotas e submetidas a duas teacutecnicas diferentes com o objetivo de dissociar o anticorpo
ligado Uma aliacutequota da amostra foi tratada com soluccedilatildeo de difosfato de cloroquina enquanto
a outra aliacutequota foi tratada com glicina-aacutecidaEDTA
42 PREPARO DA GLICINA AacuteCIDA-EDTA
A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA utiliza 3 soluccedilotildees diferentes a glicina aacutecida o
EDTA e o tampatildeo TRIS
Os reagentes foram preparados utilizando os sais para anaacutelise (PA) de EDTA
(Na2EDTA2H2O) TRIS (C4H11NO3) Glicina (H2NCH2CO2H) NaCl e a soluccedilatildeo de aacutecido
cloriacutedrico (HCl) 12 N todos reagentes da marca SYNTH (quadro 1)
Para o preparo do tampatildeo glicina-acida eacute necessaacuterio o ajuste do pH para 15 Para esse
ajuste utiliza-se aacutecido cloriacutedrico (HCl) concentrado O pH foi medido com fitas reativas de pH
com escala de 1 a 14 da marca MERCK Posteriormente a soluccedilatildeo foi enviada ao laboratoacuterio
de controle de qualidade do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto e o pH medido no peagacircmetro O
tampatildeo glicina-aacutecida foi armazenado a 4deg e o tampatildeo tris e o EDTA em temperatura ambiente
controlada (20 a 24deg Celsius)
Apoacutes o preparo e durante a realizaccedilatildeo dos testes foram feitas inspeccedilotildees visuais para
verificaccedilatildeo de turvaccedilatildeo do meio e presenccedila de precipitados
Reagente Material Quantidade Preparo e
Conservaccedilatildeo
EDTA
EDTA
(Na2EDTA2H2O)
5 gramas Mistura ateacute
dissoluccedilatildeo do sal e
conserva em
temperatura ambiente Aacutegua Destilada 50 Ml
Tris
TRIS (C4H11NO3) 121 gramas Conservar em
temperatura ambiente NaCl 525g
Aacutegua destilada 100ml
Gliacutecina-aacutecida
Glicina
(H2NCH2CO2H) 15 gramas
Conservar a 4oC NaCl 116gramas
Aacutegua Destilada 200ml
HCL 12N Ajutar o pH para 15
Quadro 1 - Preparo dos Reagentes da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
Fonte - Manual teacutecnico AABB 2011
26
O tampatildeo glicina-aacutecida e o tampatildeo TRIS satildeo estaacuteveis por 7 meses O reagente EDTA
precipitou mesmo estando em temperatura em ambiente controlado Houve necessidade de
preparo de novo reagente
421 TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
1 Em um tubo de ensaio 12x75 mm eacute adicionado 08 mL da soluccedilatildeo de glicina-aacutecida A
esta soluccedilatildeo adiciona-se 02 mL de EDTA e mistura
2 Adiciona-se 02 mL de hemaacutecias sensibilizadas (lavada 4 vezes) A mistura eacute
homogeneizada e incubada por exatamente 2 minutos
3 A seguir 01 mL de tampatildeo TRIS eacute adicionado agrave mistura que eacute novamente
homogeneizada e centrifugada por 2 minutos a 3400 rpm O pH deve estar entre 7 a 75
4 Apoacutes centrifugaccedilatildeo separa-se em outro tubo o sobrenadante (eluato) e as hemaacutecias
que permanecem satildeo lavadas 4 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica para retirada de todo o
reagente e anticorpos livres
43 PREPARO DA CLOROQUINA
A cloroquina eacute diluiacuteda em tampatildeo PBS na concentraccedilatildeo de 20 (Quadro 2) e
armazenado a 4deg Celsius sua validade apoacutes o preparo eacute de 1 mecircs
A teacutecnica da cloroquina jaacute estaacute padronizada para rotina do laboratoacuterio de
imunohematologia do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto e suas unidades
Reagente Reagentes Quantidade PreparoConservaccedilatildeo
Cloroquina
Difosfato de cloroquina
(C18H32ClN3O8P2)
20 gramas
Conservar a 4deg Celsius
Tampatildeo PBS 100ml
NaOH 01 N Acertar o pH para
51
Quadro 2 - Preparo da Cloroquina Fonte - Manual teacutecnico da AABB 2011
431 TEacuteCNICA DA CLOROQUINA
1 4 partes da soluccedilatildeo pronta eacute adicionada a uma parte de hemaacutecias lavadas 4 vezes com
soluccedilatildeo fisioloacutegica
2 A mistura eacute incubada em temperatura ambiente por ateacute duas horas
3 Centrifugar a 3400 rpm por 2 minutos
27
4 Remover o sobrenadante lavar as hemaacutecias novamente com soluccedilatildeo fisioloacutegica 4
vezes
44 VERIFICACcedilAtildeO DA EFETIVIDADE DOS TESTES
Apoacutes tratamento pelas duas teacutecnicas o TDA foi repetido em todas as amostras para
verificar se os tratamentos foram efetivos e houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo Para as
amostras tratadas pela teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA que permaneceram com TDA positivo
novo tratamento foi realizado
45 TESTE DO ELUATO
O eluato resultante das amostras tratadas com glicina-acidaEDTA foi testado com
hemaacutecias de triagem A soluccedilatildeo do eluato foi incubada com as hemaacutecias de triagem de
anticorpos (ID-Diacell BIO-RAD) pela teacutecnica em gel LissCoombs O teste foi incubado 15
minutos a 37deg Celsius e centrifugado por 10 minutos em centrifuga proacutepria para a teacutecnica em
gel Os eluatos que apresentaram resultados positivos foram testados em painel de 11
hemaacutecias (ID-Diapanel BIO-RAD) para a identificaccedilatildeo do anticorpo
46 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente que apresentou TDA positivo por IgG e pesquisa
de anticorpo irregular positivo com presenccedila de autoanticorpo com reatividade panaglutinina
A amostra foi tratada em paralelo pelas duas teacutecnicas descritas e foi enviada para o
Hemocentro para genotipagem eritrocitaacuteria que foi realizado por metodologia PCR em tempo
real no equipamento Real-time system PCR 7500 ( Applied Biosystems Califoacuternia EUA)
28
5 RESULTADOS
51 REAGENTES
Para aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA satildeo necessaacuterios 3 diferentes
reagentes que podem ser encontrados em forma de kit pronto para uso No entanto esses kits
natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil Os reagentes satildeo tampatildeo glicina-aacutecida o EDTA e o tampatildeo
Tris
Todos os reagentes foram preparados rdquoin houserdquo a partir dos sais e soluccedilotildees PA (puro
para anaacutelise) da marca SYNTH que foram adquiridos para a pesquisa O custo estimado para
cada teste foi aproximadamente R$ 020 reais
Apoacutes o preparo os reagentes poderiam ser armazenados em condiccedilotildees adequadas pelo
periacuteodo de 1 ano (AABB 2011) Ao final do preparo e durante o periacuteodo de armazenamento
de fevereiro a setembro de 2016 foi realizada inspeccedilatildeo visual para verificar a presenccedila de
precipitados ou turvaccedilatildeo A soluccedilatildeo de glicina e o tampatildeo TRIS mostraram-se estaacuteveis ateacute o
final do periacuteodo Por sua vez o reagente EDTA precipitou mesmo estando armazenado em
temperatura ambiente controlada e foi necessaacuterio novo preparo
52 AMOSTRAS DE DOADORES
521 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS AMOSTRAS
Apoacutes incubaccedilatildeo da hemaacutecia com o antissoro a mesma foi lavada 4 vezes para retirada
dos anticorpos livres A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada Caso houvesse positividade na
soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem a etapa era repetida (figura 3) Das 50 amostras sensibilizadas a
uacuteltima lavagem foi positiva somente em 3 delas Nas 3 amostras o anticorpo utilizado para
sensibilizaccedilatildeo foi o anti-K Apoacutes repetido nova etapa de lavagem os resultados se
apresentaram negativos
Em todas as amostras sensibilizadas ldquoin vitrordquo o TDA foi testado e verificado a
intensidade do teste Entre as 50 amostras 47 alcanccedilaram TDA com intensidade 3-4+ apoacutes a
primeira sensibilizaccedilatildeo enquanto 3 amostras necessitaram uma segunda incubaccedilatildeo com
anticorpo (figura 4)
A escolha dos anticorpos para sensibilizar as hemaacutecias foi feita de acordo com o
fenoacutetipo do doador e foram utilizados sete diferentes especificidades de anticorpos policlonais
humanos conforme mostra o graacutefico1
29
Figura 3 - Soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada com hemaacutecia de triagem de
anticorpos em gel LissCoombs (BIO-RAD) A finalidade eacute verificar a presenccedila de anticorpos livres na
suspensatildeo que possam interferir na pesquisa do eluato As soluccedilotildees de lavagem das amostras na figura a tiveram
resultados negativos Na figura b duas amostras a 47 e 50 apresentaram resultado positivo Nova etapa de
lavagem foi realizada e o resultado final foi negativo
522 TRATAMENTO DAS HEMAacuteCIAS
Apoacutes a sensibilizaccedilatildeo e obtenccedilatildeo de resultados de TDA com intensidade de 3 a 4+
cada uma das amostras foi dividida em duas aliacutequotas e tratada separadamente pelas teacutecnicas
de glicinaaacutecida-EDTA e cloroquina
As teacutecnicas foram consideradas efetivas quando obteve-se a completa dissociaccedilatildeo do
anticorpo verificada atraveacutes do TDA negativo na amostra poacutes tratamento conforme figuras 5
e 6 Dentre as amostras tratadas com cloroquina 2850 tiveram o TDA negativado A glicina-
aacutecidaEDTA negativou o TDA em 33 das 50 amostras tratadas Apenas 17 amostras tratadas
com glicina-aacutecidaEDTA permaneceram com o TDA positivo e foram submetidas a um novo
tratamento
30
Figura 4 - TDA das amostras apoacutes sensibilizaccedilatildeo com anticorpos policlonais humanos Amostras na
figura a com intensidades de 3-4+ Na figura b amostras 4 e 7 com intensidade menor que 3+ e portanto foram
novamente sensibilizadas com nova aliacutequota de soro Anti-D e anti-S Apoacutes a segunda sensibilizaccedilatildeo
apresentaram reatividade 4 e 3+ respectivamente Os anticorpos utilizados para sensibilizaccedilatildeo foram D S c E
C e K
523 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS TEacuteCNICAS
No tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA houve dissociaccedilatildeo completa do anticorpo
em 33 amostras (66) das 50 amostras testadas enquanto que com a cloroquina foram 28
amostras (56) (tabela 1)
31
Graacutefico 1- Nuacutemero de amostras sesnsibilizadas por especificidade de anticorpo Entre as 50 amostras 12
foram sensibilizadas com anti-D 10 com anti-C 9 com anti-E 8 com anti-c 7 com anti-S 3 com anti-K e 1
com anti-Dia As especificidades dos anticorpos foram definidas de acordo o fenoacutetipo do doador
Figura 5 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com cloroquina Nas amostras onde houve
a dissociaccedilatildeo do anticorpo ( 2 21 a 23 26 39 a 42 45 46 e 49) a hemaacutecia se deposita no fundo no microtubo
apoacutes a centrifugaccedilatildeo (TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (1 3 24 25 43 44 47
48 e 50) o anticorpo ligado agraves hemaacutecias eacute alvo da AGH presente no gel (TDA positivo)
Anti-D 12
Anti-C 10
Anti-E 9
Anti-c 8
Anti-S 7
Anti-K 3 Anti-Dia 1
32
Figura 6 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA Nas amostras
onde houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo (4 6 7 12 a 15 17 34 35 37 e 38) a hemaacutecia se deposita no fundo no
microtubo apoacutes a centrifugaccedilatildeo ( TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (5 16 18
19 20 33 e 36 ) o AGH presente no gel se liga ao anticorpo ligado agraves hemaacutecias que ficam retidas no gel (TDA
positivo)
Tabela 1-Resultado geral do tratamento das hemaacutecias com glicina e cloroquina
Teacutecnica utilizada TDA negativo TDA positivo Total
Glicina-aacutecidaEDTA 33 17 50
Cloroquina 28 22 50
A glicina-aacutecidaEDTA conseguiu negativar mais amostras sensibilizadas com Anti-D
e anti-K que a cloroquina Para as hemaacutecias sensibilizadas com anti-E Anti-S e Anti-Dia
ambas as teacutecnicas dissociaram o anticorpo em 100 das amostras Os resultados detalhados
por especificidade do anticorpo apoacutes o primeiro tratamento com glicina-aacutecidaEDTA e com
cloroquina estatildeo na tabela 2
Para as amostras que permaneceram positivas (17 amostras) apoacutes o tratamento com a
glicina-aacutecidaEDTA foi realizado um novo tratamento Houve dissociaccedilatildeo do anticorpo em 3
amostras (18) apoacutes a segunda tentativa Nas demais 14 (82) amostras tratadas pela
segunda vez 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise
33
Tabela 2 - Resultados do TDA apoacutes tratamento das hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo
sensibilizado
ANTICORPOS
SENSIBILIZADOS
1ordm TRATAMENTO COM
GLICINA
TRATAMENTO COM
CLOROQUINA
TOTAL TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
Anti-D 8 4 0 12 12
Anti-C 6 4 10 0 10
Anti-E 9 0 9 0 9
Anti-c 0 8 1 7 8
Anti-S 7 0 7 0 7
Anti-K 2 1 0 3 3
Anti-Dia 1 0 1 0 1
TOTAL 33 17 28 22 50
A hemoacutelise foi verificada durante o procedimento de lavagem final das hemaacutecias com
soluccedilatildeo fisioloacutegica para a retirada dos reagentes As soluccedilotildees de lavagem ficaram
avermelhadas e as hemaacutecias com coloraccedilatildeo escura As amostras foram descartadas Dentre as
6 amostras que ainda puderam ser testadas para o TDA trecircs amostras negativaram sendo 1
sensibilizada com anti-D e 2 com anti-C (tabela 3)
Tabela 3 - Resultado apoacutes o segundo tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA
Tratamento com
glicina-aacutecidaEDTA
TDA Negativo TDA Positvo Hemoacutelise Total
Segundo tratamento 3 3 11 17
524 TESTAGEM DO ELUATO
Apoacutes o tratamento com a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA a soluccedilatildeo do eluato foi
testada para verificar a viabilidade dos anticorpos que foram dissociados ou eluiacutedos Dentre
as 50 amostras 41 apresentaram eluato positivo As nove amostras cujos eluatos foram
negativos haviam sido sensibilizadas com as seguintes especificidades de anticorpos anti-E 6
amostras (67) anti-S 2 amostras (40) e anti-D 1 amostra (8) (tabela 4) O eluato de
todas as amostras sensibilizadas com os anticorpos anti-C anti-c Anti-K e Anti-Dia foram
positivos Os eluatos positivos na triagem de anticorpos foram testados com paineacuteis de
identificaccedilatildeo para confirmar a especificidade e a viabilidade dos anticorpos (figuras 7 e 8)
34
525 EFEITO DA ELUICcedilAtildeO SOBRE OS ANTIacuteGENOS ERITROCITAacuteRIOS
Para verificar o efeito do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA e com a cloroquina
sobre a expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s foi realizada a fenotipagem das
amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes tratamento com ambas as teacutecnicas Foi avaliado
se o tratamento destruiu os antiacutegenos expressos antes do tratamento
Tabela 4- Resultado do Eluato das amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA
Anticorpos Eluato positvo Eluato negativo Total
Anti-D 11 1 12
Anti-C 10 0 10
Anti-E 3 6 9
Anti-c 8 0 8
Anti-S 5 2 7
Anti-K 3 0 3
Anti-Dia 1 0 1
Total 41 9 50
Figura 7 ndash Painel do eluato da amostra 21 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-C que foi
recuperado no eluato
Figura 8 ndash Painel do eluato da amostra 47 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-K que foi
recuperado no eluato
35
Dentre as 50 amostras 26 eram previamente fenotipadas para os antiacutegenos Fya Fy
b
Jka Jk
b S e s Dentre elas 20 alcanccedilaram TDA negativo apoacutes tratamento com a glicina-
aacutecidaEDTA e 20 negativaram apoacutes tratamento com cloroquina (tabela 5) Apoacutes ambas as
teacutecnicas os antiacutegenos originalmente expressos permaneceram positivos comprovando que natildeo
houve destruiccedilatildeo dos mesmos
Tabela 5 ndash Verificaccedilatildeo da interferecircncia do tratamento da hemaacutecias com cloroquina e glicina-
aacuteicdaEDTA sobre os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
AMOSTRAS
COM
FENOTIPAGEM
PREacuteVIA
TRATADAS COM
CLOROQUINA
TRATADAS COM
GLICINA
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
26
20
20
20
20
As amostras 24 47 e 50 eram positivas para o antiacutegeno K A cloroquina natildeo dissociou
o anticorpo em nenhuma das 3 amostras enquanto a glicina-aacutecidaEDTA foi efetiva nas
amostras 24 e 50 Foi testada a expressatildeo do antiacutegeno K nas amostras 24 e 50 apoacutes o
tratamento utilizando meacutetodo indireto em gel contendo AGH Apesar de natildeo ter sido avaliado
a intensidade de reaccedilatildeo de expressatildeo dos antiacutegenos podemos verificar na figura 9 que nas
duas amostras em que a teacutecnica foi efetiva e dissociou o anticorpo a expressatildeo do antiacutegeno K
continua presente mas a reatividade observada pode ser considerada 1+ sugerindo que houve
diminuiccedilatildeo da expressatildeo do antiacutegeno quando comparado com a expressatildeo observada em
hemaacutecia natildeo tratada
Os resultados individuais de cada amostra em ambas as teacutecnicas encontram-se
resumidas na tabela 6
526 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente onde foi constatada a presenccedila de autoanticorpo
a quente da classe IgG pelo TDA monoespeciacutefico (figura 10)O autoanticorpo tambeacutem
interferia na pesquisa e identificaccedilatildeo de anticorpos irregulares pois apresentava caracteriacutestica
de panaglutinina As hemaacutecias da paciente sensibilizadas ldquoin vivordquo foram tratadas com
cloroquina e com glicina-aacutecidaEDTA
36
Figura 9 ndash Fenotipagem das amostras 24 e 50 para antiacutegeno K apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
O teste positivo indica a presenccedila do antiacutegeno poreacutem a reatividade fraca (1+) sugere que houve enfraquecimento
de sua expressatildeo A direita a expressatildeo forte (4+) do antiacutegeno Kell em hemaacutecia controle natildeo tratada utilizada
como controle positivo
A cloroquina natildeo foi efetiva na retirada do anticorpo ligado as hemaacutecias ao contraacuterio
do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA que dissociou o anticorpo (figura 11)
A hemaacutecia tratada com glicina foi fenotipada para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
(figura 12) A fenotipagem para o sistema Rh (C c E e e) e Kell foi realizada em gel
especiacutefico monoclonal sem interferecircncia do TDA positivo (controle da reaccedilatildeo negativo)
O eluato resultante do tratamento com glicina-aacutecidaEDTA foi testada em gel com
hemaacutecias de painel de identificaccedilatildeo de anticorpos e apresentou resultado positivo com todas
as ceacutelulas (figura 13 e 14)
A amostra foi enviada para genotipagem e o resultado da genotipagem confirmou o
resultado da fenotipagem apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
527 TEMPO DE EXECUCcedilAtildeO DA TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
O tempo de reaccedilatildeo da glicina-aacutecidaEDTA eacute de 2 minutos Todas as amostras foram
tratadas obedecendo ao tempo descrito na literatura demonstrando que o mesmo eacute
reprodutiacutevel
37
Tabela 6- Resultados individuais por amostra
Amostra Especificidade
dos anticorpos
Intensidade do
TDA apoacutes
sensibilizaccedilatildeo
Tratamento
efetivo com
cloroquina
Tratamento
efetivo com
glicina
Eluato
poacutes
glicina
1 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 2 Dia 3+ Sim Sim 3+ 3 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 4 D 4+ Natildeo Sim 4+ 5 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 6 E 3+ Sim Sim Negativo 7 S 4+ Sim Sim 3+ 8 E 3+ Sim Sim 1+ 9 E 3+ Sim Sim 2+
10 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 11 D 4+ Natildeo Sim 4+ 12 D 4+ Natildeo Sim 4+ 13 S 3+ Sim Sim 3+ 14 S 3+ Sim Sim 3+ 15 D 3+ Natildeo Sim 3+ 16 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 17 E 3+ Sim Sim (+) 18 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 19 D 4+ Natildeo Natildeo 3+ 20 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 21 C 3+ Sim Sim 4+ 22 C 3+ Sim Sim 4+ 23 C 3+ Sim Sim 4+ 24 K 4+ Natildeo Sim 4+ 25 D 3+ Natildeo Natildeo Negativo 26 E 4+ Sim Sim Negativo 27 S 3+ Sim Sim 3+ 28 C 3+ Sim Natildeo 4+ 29 C 3+ Sim Sim 4+ 30 C 3+ Sim Sim 4+ 31 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 32 E 3+ Sim Sim Negativo 33 C 3+ Sim Natildeo 4+ 34 S 3+ Sim Sim Negativo 35 S 3+ Sim Sim Negativo 36 C 4+ Sim Natildeo 4+ 37 c 4+ Natildeo Natildeo 4+ 38 D 4+ Natildeo Sim 4+ 39 S 3+ Sim Sim 3+ 40 c 4+ Sim Natildeo 2+ 41 C 4+ Sim Natildeo 4+ 42 E 3+ Sim Sim Negativo 43 D 3+ Natildeo Sim 2+ 44 D 3+ Natildeo Sim 2+ 45 E 3+ Sim Sim Negativo 46 C 3+ Sim Sim 4+ 47 K 4+ Natildeo Natildeo 4+ 48 D 3+ Natildeo Sim 2+ 49 E 3+ Sim Sim Negativo 50 K 4+ Natildeo Sim 4+
TOTAL 50 28 33 41
38
Figura 10 ndash TDA monoespeciacutefico da amostra de paciente Hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo da classe
IgG
oacute Figura 11 ndash TDA apoacutes o tratamento com glicina-aacutecidaEDTA (esquerda) e cloroquina (direita) A glicina
negativou completamente o TDA enquanto a hemaacutecia tratada com cloroquina persistiu positiva (1+)
39
Figura 12 ndash Fenotipagem da amostra tratada com glicina-aacutecidaEDTA Fy(a+b+) Jk(a-b+) S+s+
Figura 13 ndash Painel em gel (LissAGH) do eluato apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de
intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
Figura 14 ndash ndash Painel ezimaacutetico (hemaacutecias tratadas com bromelina) do eluato em gel neutro apoacutes
tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
40
528 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Quanto a efetividade das teacutecnicas em negativar o TDA foi verificado que a glicina-
aacutecidaEDTA foi efetiva em 66 das amostras testadas no primeiro tratamento (3350
amostras) enquanto a cloroquina conseguiu negativar 56 (2850) Esses resultados natildeo
apresentam diferenccedila significativa (pgt005) demostrando que a teacutecnica da glicina-
aacutecidaEDTA natildeo eacute superior mas eacute tatildeo efetiva quanto a da cloroquina
Quando aliamos os resultados de ambas as teacutecnicas verificamos que em 76 (3850)
das amostras o TDA foi negativado Esse dado indica que ainda que uma teacutecnica natildeo seja
eficaz na remoccedilatildeo do anticorpo eacute uma boa alternativa tentar a segunda teacutecnica jaacute que a falha
em remover o anticorpo utilizando uma delas natildeo prevecirc necessariamente a falha com a outra
Quando se utiliza o teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla (graacutefico 2) para comparar a utilizaccedilatildeo das
duas teacutecnicas com o resultado de cada uma isolada (somente a cloroquina ou somente a
glicina) verificamos que os resultados apresentam diferenccedila significativa (plt005) (quadro 3)
TRATAMENTO EFETIVO COM TOTAL PORCENTAGEM
Glicina ou cloroquina 38 76
Glicina e cloroquina 23 46
Glicina apenas 10 20
Cloroquina apenas 5 10
Nenhuma das teacutecnicas 12 24
Quadro 3 - Resultados comparativos entre as teacutecnicas utilizadas
41
Graacutefico 2 - Teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla entre as teacutecnicas aplicadas A- Glicina e Cloroquina B-Cloroquina C-
Glicina ( plt005)
42
6 DISCUSSAtildeO
Os reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA podem ser adquiridos em
forma de kit comercial prontos para uso poreacutem natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil A preparaccedilatildeo
dos reagentes ldquoin houserdquo a partir de sais comerciais adquiridos se mostrou viaacutevel Os
reagentes glicina e o tampatildeo Tris armazenados de forma correta se mantiveram estaacuteveis por
um periacuteodo de 7 meses Somente o reagente EDTA precipitou mesmo armazenado em
condiccedilotildees adequadas sugerindo que o mesmo deve ser preparado em menor quantidade e
armazenado em aliacutequotas A soluccedilatildeo de cloroquina tambeacutem pode ser preparada ldquoin houserdquo e
pode ser armazenado por um mecircs A legislaccedilatildeo brasileira autoriza a utilizaccedilatildeo de reagentes
preparados a partir de sais comerciais como a cloroquina e a glicina-aacutecidaEDTA desde que
os sais tenham autorizaccedilatildeo da vigilacircncia sanitaacuteria para a comercializaccedilatildeo (BRASIL 2001)
A comparaccedilatildeo quanto a efetividade em dissociar anticorpos em amostras com TDA
positivos entre a teacutecnica da glicina e a teacutecnica da cloroquina mostrou que natildeo haacute diferenccedila
estatiacutestica entre elas e que ambas satildeo igualmente eficientes Se utilizadas conjuntamente haacute
maior possibilidade de elucidaccedilatildeo dos casos
Uma vantagem da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eacute que ela permite numa mesma
amostra eluir o anticorpo ligado aacute hemaacutecia assim como fenotipar a hemaacutecia tratada Devido a
sua dupla utilidade a teacutecnica eacute vantajosa principalmente em pacientes em que pouco volume
de amostra pode ser coletado como em casos de crianccedilas e receacutem-nascidos
A fenotipagem poacutes tratamento se mostrou viaacutevel jaacute que os antiacutegenos de maior
importacircncia natildeo sofreram alteraccedilotildees Nas 20 amostras que foram fenotipadas antes e apoacutes
tratamento para verificar a influecircncia dos reagentes na expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a
Jkb S e s natildeo houve destruiccedilatildeo dos mesmos por nenhuma das duas teacutecnicas
Para as amostras positivas para o antiacutegeno Kell (350) e sensibilizadas com o
respectivo anticorpo a teacutecnica da glicina foi efetiva em negativar o TDA em apenas duas
delas mas apoacutes o tratamento foi verificada uma fraca reatividade da reaccedilatildeo antiacutegeno-
anticorpo sugerindo que houve um enfraquecimento da expressatildeo do antiacutegeno conforme
esperado e descrito na literatura (BYRNE 1991 PALLAS WILER E MCGEE 1991
ROZIERS e SQUALI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012 e KATHARIA e
CHAUDHARY 2013) A accedilatildeo da glicina sobre o antigeno Kell natildeo representa impedimento
para seu uso uma vez que na impossibilidade de testar o antiacutegeno Kell o banco de sangue
consegue facilmente atender a solicitaccedilatildeo de transfusatildeo com unidades de hemaacutecias Kell
43
negativas jaacute que eacute um antiacutegeno de baixa prevalecircncia na populaccedilatildeo variando de 15 na
populaccedilatildeo africana a 9 nos europeus (DANIELS 2011)
A soluccedilatildeo resultante da dissociaccedilatildeo do anticorpo pela teacutecnica da glicina pode ainda ser
utilizada como eluato podendo substituir a teacutecnica de eluiccedilatildeo com reagentes comercias (kits
de eluiccedilatildeo aacutecida) que tem alto custo aproximadamente entre R$2000 a R$2500 por teste
Em 41 amostras (82) houve a dissociaccedilatildeo e recuperaccedilatildeo do anticorpo que estava
sensibilizando as hemaacutecias Em 9 amostras (18) os anticorpos foram eluiacutedos poreacutem
apresentaram reaccedilatildeo negativa quando testadas com hemaacutecias de triagem entre eles o anti-E
(6) anti-S (2) e Anti-D (1) Eacute possiacutevel que a correccedilatildeo pH do meio (WALKER 2011) natildeo
tenha sido adequada o que pode ter desfavorecido a reatividade do anticorpo
Para as amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA nas quais natildeo houve dissociaccedilatildeo do
anticorpo pelo primeiro tratamento (1750) o segundo tratamento natildeo se mostrou eficaz jaacute
que 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise O tempo de
armazenagem natildeo parece ter influenciado jaacute que todas as amostras foram testadas dentro de
48 horas apoacutes a coleta Outros fatores que natildeo foram verificados podem ter levado a
hemoacutelise Apesar da literatura (LOUIE JIENG e ZEROULIS 1986 e BYRNE 1991)
recomendar um segundo tratamento ele eacute pouco eficaz tendo negativado apenas 3 das 17
amostras testadas
A amostra de paciente que apresentou sensibilizaccedilatildeo ldquoin vivordquo mostrou melhor
efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA sobre a da cloroquina possibilitando
fenotipagem para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s que natildeo foram destruiacutedos apoacutes o
tratamento comprovado atraveacutes da genotipagem
A presenccedila de autoanticorpo a quente com presenccedila de hemoacutelise (AHAI) ou natildeo pode
mascarar a presenccedila de aloanticorpo interferindo na rotina soroloacutegica da fenotipagem que eacute
uma importante ferramenta para auxiliar na seleccedilatildeo de hemaacutecias para transfusatildeo (SHIREY et
al 2002) Esses pacientes frequentemente possuem aloanticorpos associados ao
autoanticorpo e a prevalecircncia de aloimunizaccedilatildeo entre eles varia entre 12 a 40 (LEGER e
GARRATY 1999 BRANCH e PETZ 1999) o que dificulta ainda mais a escolha do melhor
componente a ser transfundido aleacutem de aumentar a possibilidade reaccedilotildees hemoliacuteticas imunes
poacutes-transfusionais
Nesses casos as teacutecnicas de dissociaccedilatildeo de anticorpos satildeo importantes para tratar
amostras de pacientes e a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser usada como uma opccedilatildeo
pois se mostrou eficaz na dissociaccedilatildeo anticorpo ligado agraves hemaacutecias deixando livre a
superfiacutecie das mesmas permitindo a fenotipagem por antisoros IgG Paralelamente os
44
anticorpos eluiacutedos tambeacutem puderam ser estudados O mesmo natildeo ocorre com a cloroquina
que permite apenas a fenotipagem e tampouco com os kits de eluiccedilatildeo aacutecida disponiacuteveis no
mercado nacional que satildeo destinados a realizaccedilatildeo do eluato mas destroem as hemaacutecias
O tempo de tratamento na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA tambeacutem eacute uma vantagem
pois foi possiacutevel reproduzir no tempo determinado de 2 minutos enquanto a cloroquina
demora ateacute duas horas
Ainda que a aplicaccedilatildeo das teacutecnicas por biologia molecular estejam cada vez mais
presentes na rotina imuno-hematoloacutegica e possibilitam estabelecer o fenoacutetipo deduzido do
genoacutetipo elas natildeo estatildeo disponiacuteveis na maioria dos centros e sua realizaccedilatildeo exige algumas
horas A resoluccedilatildeo imediata do problema transfusional necessita dos resultados soroloacutegicos
pois com frequecircncia natildeo eacute possiacutevel aguardar o resultado do teste molecular Dessa forma
apesar da crescente importacircncia da genotipagem eritrocitaacuteria teacutecnicas soroloacutegicas aplicadas
corretamente e no momento propiacutecio satildeo de grande utilidade para resolver problemas imuno-
hematoloacutegicos como ocorre com a fenotipagem em pacientes com TDA positivo
45
7 CONCLUSAtildeO
A teacutecnica da glicina aacutecidaEDTA mostrou-se efetiva em remover os anticorpos que
sensibilizavam as hemaacutecias e pode ser utilizada com seguranccedila antes da fenotipagem
eritrocitaacuteria Por ser uma teacutecnica de raacutepida execuccedilatildeo eacute uma alternativa aplicaacutevel
principalmente em casos urgentes de pacientes que apresentam autoanticorpos
46
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50
9 ANEXOS
51
FUNDACcedilAtildeO HEMOCENTRO DE RIBEIRAtildeO PRETO
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE)
Tiacutetulo da pesquisa Aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina aacutecida-EDTA e avaliaccedilatildeo da
eficaacutecia no tratamento de hemaacutecias com teste direto da antiglobulina positivo
Pesquisadora responsaacutevel Ceacutelia Kazue Abiko
Orientador Prof Dimas Tadeu Covas
Co-orientadora Dra Flaacutevia Leite Souza Santos
Objetivo da pesquisa Vocecirc estaacute sendo convidado a participar de uma pesquisa que tem
como objetivo padronizar uma nova teacutecnica para auxiliar na tipagem sanguiacutenea de pacientes
A tipagem sanguiacutenea pode sofrer interferecircncia da presenccedila de anticorpos ligados aos gloacutebulos
vermelhos do sangue Nessas situaccedilotildees eacute difiacutecil selecionar o melhor sangue para o paciente e
eacute preciso a utilizaccedilatildeo de teacutecnicas adicionais para remover essas interferecircncias
Esta pesquisa tem como objetivo estudar outra teacutecnica para remover esses anticorpos e
comparaacute-la com a teacutecnica atualmente utilizada Para isso precisamos de amostras de pacientes
e doadores voluntaacuterios
Se vocecirc eacute um doador eacute necessaacuterio que vocecirc autorize a coleta de 5 ml (1 tubo) a mais
de seu sangue
Se vocecirc eacute um paciente natildeo haveraacute necessidade de nova amostra pois utilizaremos as
amostras jaacute coletadas para os testes preacute-transfusionais e os resultados encontrados nesta
pesquisa natildeo iratildeo interferir na escolha da (s) bolsa (s) de sangue que vocecirc possa vir a receber
Se vocecirc concordar em participar leia com atenccedilatildeo o texto abaixo e assine as duas vias
rubricando todas as paacuteginas deste termo de consentimento Uma via original assinada e
rubricada por vocecirc e pela pesquisadora ficaraacute com vocecirc
As suas informaccedilotildees seratildeo mantidas em sigilo pela pesquisadora e natildeo haveraacute
armazenamento de material para pesquisas posteriores Os seus dados seratildeo usados apenas
neste estudo e quando o trabalho for publicado seu nome e qualquer outra informaccedilatildeo que
possam identificaacute-lo natildeo seratildeo revelados
Eacute pouco provaacutevel que o que noacutes aprendermos com este estudo tenha um benefiacutecio
direto para vocecirc assim como natildeo poderemos dar nada em troca pela sua participaccedilatildeo na
pesquisa
Nosso objetivo com esta pesquisa eacute que os resultados poderatildeo ser uacuteteis para o
tratamento de pacientes no futuro Os riscos da participaccedilatildeo satildeo miacutenimos Se vocecirc eacute um
doador de sangue a amostra seraacute coletada no momento da doaccedilatildeo natildeo exigindo punccedilatildeo
venosa adicional
52
Eacute seu direito ter acesso aos resultados dos testes da pesquisa Esses resultados natildeo
seratildeo fornecidos automaticamente a vocecirc mas caso vocecirc se interesse em saber o resultado ou
tiver alguma duacutevida sobre a sua participaccedilatildeo neste estudo deveraacute entrar em contato com Ceacutelia
Kazue Abiko pelo telefone (18) 99718-3551
Vocecirc tem total liberdade de optar por natildeo participar da pesquisa Caso aceite
participar poderaacute desistir a qualquer momento ou retirar seu consentimento mesmo apoacutes ter
coletado o sangue Para cancelar sua participaccedilatildeo basta avisar a pesquisadora e os seus dados
seratildeo retirados do projeto
Qualquer duacutevida eacutetica sobre a pesquisa poderaacute entrar em contato com o Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa do Hospital das Cliacutenicas e da Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto
(CAMPUS UNIVERSITAacuteRIO bairro Monte Alegre CEP 14048-900 Ribeiratildeo Preto-SP
Telefone (16) 3602-2228 FAX (16) 3633-1144 e-mail cephcrpuspbr)
Consentimento de participaccedilatildeo
A Consentimento do participante
Li as informaccedilotildees acima sobre o estudo e recebi explicaccedilotildees sobre a participaccedilatildeo no estudo
Portanto dou o meu consentimento para participar do estudo
___________________________________________________________________________
Nome completo
___________________________________________________________________________
Assinatura
___________
Data
__________________________________________________________________________________
Nome completo da pesquisadora
___________________________________________________________________________
Assinatura
_____________
Data
6
115 FENOTIPAGEM PARA OUTROS SISTEMAS
Aleacutem da pesquisa de ABORh que eacute realizado rotineiramente a fenotipagem para
outros sistemas tambeacutem denominado ldquofenotipagem estendidardquo determina a presenccedila ou
ausecircncia de antiacutegenos considerados de importacircncia cliacutenica A fenotipagem natildeo eacute obrigatoacuteria
nos testes preacute-transfusionais poreacutem a legislaccedilatildeo atual recomenda a realizaccedilatildeo da fenotipagem
eritrocitaacuteria dos antiacutegenos C (RH2) E (RH3) c (RH4) e (RH5) K (KELL1) Fya (FY1) Fy
b
(FY2) Jka
(JK1) Jkb (JK2) S (MNS3) e s (MNS4) para pacientes aloimunizados e pacientes
com indicaccedilatildeo de transfusatildeo crocircnica (BRASIL 2016)
A seleccedilatildeo de concentrados de hemaacutecias com o mesmo fenoacutetipo do receptor para
transfusatildeo pode evitar reaccedilotildees transfusionais hemoliacuteticas no paciente previamente
aloimunizado tambeacutem previne a sensibilizaccedilatildeo por outros antiacutegenos o que normalmente
torna as transfusotildees seguintes ainda mais complicadas A fenotipagem do paciente tambeacutem
auxilia na identificaccedilatildeo dos anticorpos pois espera-se que nas hemaacutecias do paciente o
antiacutegeno seja negativo para o anticorpo encontrado servindo de guia para teste de exclusatildeo de
anticorpos (SANTOS 2014 WALKER 2011)
A incidecircncia de aloanticorpos aumenta com o nuacutemero de transfusotildees no entanto a
implantaccedilatildeo de rotina de fenotipagem com transfusatildeo profilaacutetica de hemaacutecias com fenoacutetipo
compatiacutevel para pacientes candidatos agrave politransfusatildeo como os portadores de doenccedila
falciforme talassemia anemia aplaacutestica doenccedilas linfo e mieloproliferativas renais crocircnicos e
anemias refrataacuterias pode contribuir para o baixo iacutendice de sensibilizaccedilatildeo nessas populaccedilotildees
(FLUIT KUNST e DRENTHE-SCHONK 1999 MARTINS et al 2008 e VICHINSKY et
al 2001) Outro grupo de pacientes que se beneficia com a transfusatildeo de mesmo fenoacutetipo satildeo
os pacientes com AHAI uma vez que o autoanticorpo pode mascarar a presenccedila de um
aloanticorpo de significado cliacutenico em ateacute 40 dos casos Mesmo com as teacutecnicas utilizadas
ldquoin vitrordquo para remover a interferecircncia do autoanticorpo no soro um aloanticorpo pode natildeo
ser identificado e dessa forma transfundir o mesmo fenoacutetipo do paciente evitaria reaccedilatildeo
hemoliacutetica pelos anticorpos voltados contra antiacutegenos de maior importacircncia cliacutenica e de
frequecircncia intermediaacuteria Aleacutem disso os pacientes com AHAI satildeo fortes respondedores e a
transfusatildeo profilaacutetica do mesmo fenoacutetipo previne a aloimunizaccedilatildeo (SHIREY et al 2002)
Aleacutem de fenotipar o receptor eacute importante tambeacutem que os bancos de sangue tenham
rotinas de fenotipagem de doadores para atender as necessidade dos pacientes aloimunizados
ou em esquema de transfusatildeo crocircnica (PINTO BRAGA e SANTOS 2011)
7
Rotineiramente eacute inviaacutevel estabelecer o fenoacutetipo eritrocitaacuterio completo de um
indiviacuteduo pela grande diversidade de sistemas sanguiacuteneos descritos Ate junho de 2015 jaacute
haviam sido classificados 308 antiacutegenos atribuiacutedos a 36 sistemas definidos pela Sociedade
Internacional de Transfusatildeo de Sangue (ISBT) (CASTILHO JUNIOR e REID 2015)
Portanto o paciente eacute normalmente fenotipado para os antiacutegenos de maior importacircncia
clinica
Alguns fatores podem limitar a realizaccedilatildeo da fenotipagem eritrocitaacuteria Um dos fatores
eacute a transfusatildeo alogecircnica realizada haacute menos de 90 dias Neste caso podem ocorrer resultados
falso positivos para determinados antiacutegenos devido agrave presenccedila de hemaacutecias do doador
(LAINE et al 2000)
Outro fator eacute a presenccedila de anticorpo sensibilizando a hemaacutecia do paciente e
provocando positividade do teste direto da antiglobulina humana (TDA) Os soros
normalmente utilizados para fenotipagem especialmente para os antiacutegenos Fya
(FY1) Fyb
(FY2) Jka
(JK1) Jkb
(JK2) S (MNS3) e s (MNS4) necessitam da fase de antiglobulina
humana (AGH) para que ocorra aglutinacatildeo Amostras que apresentam o TDA positivo
aglutinam apoacutes reaccedilatildeo com a AGH natildeo pela real presenccedila do antiacutegeno em sua superfiacutecie mas
pela interaccedilatildeo da AGH com o anticorpo que estaacute sensibilizando o eritroacutecito A interferecircncia
do TDA positivo pode ser anulada atraveacutes de algumas teacutecnicas capazes de dissociar o
anticorpo como por exemplo o tratamento da hemaacutecia sensibilizada com cloroquina ou com
glicina-aacutecida-EDTA (BRANCH e PETZ 1999 SHIREY et al 2002 e LEGER 2011)
12 METODOLOGIAS APLICADOS Agrave ROTINA IMUNO-HEMATOLOacuteGICA
Todos os testes que compotildeem a rotina preacute-transfusional usam meacutetodos soroloacutegicos
que envolvem a reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo e tem como objetivo determinar o perfil antigecircnico
eritrocitaacuterio do receptor e do doador assim como identificar em seu soro a presenccedila de
anticorpos contra antiacutegenos eritrocitaacuterios que possam comprometer a sobrevida das hemaacutecias
transfundidas Para testar o antiacutegeno na superfiacutecie da hemaacutecia eacute necessaacuterio dispor de um
antissoro com especificidade conhecida para aquele antiacutegeno Por outro lado para testar a
presenccedila de um determinado anticorpo no soro ou plasma do receptor eacute necessaacuterio o uso de
hemaacutecias com perfil antigecircnico conhecido (SANTOS 2014)
Diversas metodologias satildeo aplicadas nos laboratoacuterios de imunohematologia Cada
serviccedilo de hemoterapia faz a escolha do meacutetodo que seraacute aplicado de acordo com o perfil do
laboratoacuterio com o volume de exames diaacuterios e tambeacutem com o custo envolvido Todas essas
8
teacutecnicas tecircm como objetivo comum demonstrar a reaccedilatildeo entre antiacutegeno e anticorpo no
entanto elas se baseiam em diferentes princiacutepios Muitas metodologias satildeo atualmente
aplicadas agrave imunohematologia entre elas o sistema de fase soacutelida a tecnologia de hemaacutecias
magnetizadas a biologia molecular e ateacute mesmo a citometria de fluxo no entanto os meacutetodos
mais tradicionais satildeo aqueles baseados no princiacutepio de hemaglutinaccedilatildeo
121 MEacuteTODOS DE FASE FLUacuteIDA
Os meacutetodos de fase fluiacuteda satildeo testes baseados na hemaglutinaccedilatildeo e incluem o teste em
tubo e o teste em microplacas Uma suspensatildeo de hemaacutecias eacute adicionada ao plasma ou soro
em seguida eacute realizada a centrifugaccedilatildeo e por fim eacute feita a leitura do resultado que eacute
considerado positivo se for observado algum grau de aglutinaccedilatildeo ou hemoacutelise A intensidade
de aglutinaccedilatildeo eacute graduada de acordo com o tamanho dos agregados desprendidos da
superfiacutecie apoacutes agitaccedilatildeo delicada do tubo ou microplaca Os meacutetodos de hemaglutinaccedilatildeo satildeo
aplicados a todos os testes preacute-transfusionais Como os anticorpos ABO satildeo aglutininas frias
a tipagem eacute realizada em temperatura ambiente (22degC) no entanto ao investigar a presenccedila
de anticorpos irregulares que como jaacute mencionado eacute na maioria das vezes anticorpos
incompletos da classe IgG eacute essencial que a reaccedilatildeo seja incubada a 37degC As reaccedilotildees satildeo
facilitadas com a utilizaccedilatildeo de potencializadores e da antiglobulina humana (WALKER e
HARMENING 2012 AABB 2011)
Nos meacutetodos de fase fluiacuteda nos quais a AGH eacute empregada a fase de lavagem eacute
fundamental Apoacutes a incubaccedilatildeo do soro com as hemaacutecias deve ser realizada a lavagem da
reaccedilatildeo para remover o excesso de anticorpos natildeo ligados agraves hemaacutecias jaacute que os anticorpos
livres podem bloquear a AGH quando ela eacute adicionada e levar a resultados falso negativos
(AABB 2011)
Os testes de hemaglutinaccedilatildeo satildeo os mais tradicionais entre os meacutetodos ainda hoje
aplicados agrave rotina de bancos de sangue A vantagem desses meacutetodos eacute o baixo custo quando
comparado agraves teacutecnicas mais modernas mas apresentam tambeacutem desvantagens A teacutecnica em
tubo por exemplo natildeo permite automaccedilatildeo eacute trabalhosa e exige matildeo-de-obra bastante treinada
na execuccedilatildeo das diversas etapas do teste e mesmo assim pode haver subjetividade na
interpretaccedilatildeo dos resultados aleacutem de resultados falso-negativos (DOWNES 2011 ZANTEK
et al 2012)
9
122 COLUNAS DE GEL
A teacutecnica em gel iniciada na deacutecada de 90 representou uma grande revoluccedilatildeo na
rotina laboratorial tornando-se muito popular Aleacutem de ser sensiacutevel a teacutecnica dispensa a fase
de lavagem antes da adiccedilatildeo da AGH assim como a agitaccedilatildeo do teste para leitura reduzindo o
nuacutemero de resultados falsos negativos decorrentes dessas duas etapas e o tempo para
execuccedilatildeo dos testes (LAPIERRE et al 1989 NOVARETTI et al 2000 NOVARETTI et
al 2004) Os reagentes satildeo comercializados na forma de cartotildees plaacutesticos contendo
microtubos preenchidos por gel composto por microesferas de acrilamida-dextran Nesta
metodologia tambeacutem baseada na hemaglutinaccedilatildeo a suspensatildeo de hemaacutecias e o soro satildeo
depositados em uma cacircmara acima da coluna de gel e em seguida procede-se com a
centrifugaccedilatildeo dos cartotildees As microesferas atuam como uma malha que permite a passagem
em direccedilatildeo ao fundo do microtubo apenas das hemaacutecias natildeo aglutinadas enquanto as
hemaacutecias aglutinadas ficam retidas na parte superior da coluna ou ao longo dela (GREEN e
KLOSTERMANN 2012) Portanto quanto maior a agregaccedilatildeo mais hemaacutecias ficam retidas
no topo da coluna Dependendo do tipo de teste a ser realizado pode ser utilizado gel neutro
ou gel especiacutefico impregnado pelo anticorpo desejado e o gel contendo antiglobulina humana
que satildeo utilizados para os testes diretos e indiretos da antiglobulina (LAPIERRE et al 1989)
A coluna de gel ainda permite a visualizaccedilatildeo clara de duas populaccedilotildees distintas de hemaacutecias
como em pacientes receacutem transfundidos
123 BIOLOGIA MOLECULAR
A biologia molecular ou genotipagem estaacute sendo cada vez mais aplicada aos grupos
sanguiacuteneos pois fornece resultados seguros e precisos especialmente nos casos em que natildeo eacute
possiacutevel a realizaccedilatildeo da fenotipagem como em pacientes receacutem-transfundidos e pacientes
com TDA positivo Na genotipagem eacute possiacutevel determinar atraveacutes do DNA do paciente
extraiacutedo de seus leucoacutecitos de sangue perifeacuterico o fenoacutetipo eritrocitaacuterio deduzido sem
qualquer interferecircncia do anticorpo que sensibiliza a hemaacutecia ou de hemaacutecias alogecircnicas
transfundidas Sua realizaccedilatildeo no entanto exige o treinamento de equipe especializada e capaz
de interpretar os resultados em conjunto com os achados soroloacutegicos (JUNIOR e OLIVATO
2007)
Apesar de ser uma ferramenta de grande importacircncia hoje na imuno-hematologia
ainda estaacute restrito aos grandes centros de hemoterapia no Brasil poucos serviccedilos puacuteblicos de
sauacutede dispotildeem desse recurso e utilizam teacutecnicas de genotipagem de grupos sanguiacuteneos para
atendimento a seus pacientes Esta abordagem poreacutem vem sendo introduzida em algumas
10
instituiccedilotildees de reconhecida competecircncia na hemoterapia mas sua disponibilizaccedilatildeo deve
tornar-se mais generalizada atraveacutes da formaccedilatildeo de centros de referecircncia para atendimento
das diversas unidades de hemoterapia (MARTINS et al 2009) Dessa forma muitas decisotildees
transfusionais especialmente em urgecircncias ainda devem ser tomadas sem o resultado da
genotipagem eritrocitaacuteria
13 TESTE DA ANTIGLOBULINA
Coombs Mourant e Race descreveram em 1945 uma teacutecnica com utilizando soro de
coelho contendo antiglobulina humana (AGH) que posteriormente foi chamada de ldquosoro de
Coombsrdquo O meacutetodo foi desenvolvido inicialmente para ampliar o efeito de aglutininas fracas
do sistema Rh anticorpos ldquoincompletosrdquo que normalmente natildeo apresentavam aglutinaccedilatildeo
visiacutevel O teste foi concebido como um instrumento de investigaccedilatildeo de doenccedila hemoliacutetica do
receacutem-nascido e de reaccedilotildees transfusionais causadas por anticorpos Rh que estavam presentes
no soro dos paciente poreacutem que natildeo eram demonstraacuteveis pelas teacutecnicas ateacute entatildeo existentes
A maior parte dos anticorpos de significado cliacutenico assim como seus respectivos
antiacutegenos foram descritos apoacutes o surgimento do ldquosoro de Coombsrdquo em 1945 sendo assim o
teste da antiglobulina representa ateacute hoje a forma mais importante de aglutinaccedilatildeo artificial em
imunohematologia permitindo revelar a presenccedila de anticorpos na membrana da hemaacutecia A
antiglobulina humana eacute constituiacuteda por anticorpo especiacutefico contra a porccedilatildeo Fc de outro
anticorpo Quando um anticorpo ldquoincompletordquo sensibiliza a hemaacutecia normalmente natildeo
provoca aglutinaccedilatildeo visiacutevel Apoacutes a adiccedilatildeo da AGH ao meio esta reconhece e se liga agraves
porccedilotildees Fc dos anticorpos que sensibilizam a hemaacutecia formando assim uma malha e
provocando aglutinaccedilatildeo visiacutevel (BARJAS-CASTRO 2013)
Os reagentes de antiglobulina podem ser poliespeciacuteficos ou monoespeciacuteficos Os
poliespeciacuteficos satildeo uma mistura de anticorpos ant-IgG e anti-C3d (fraccedilatildeo C3d do
complemento) Os reagentes monoespecificos podem ser anti-IgG anti-IgM anti-IgA anti-
complemento podendo ser anti-C3d e anti-C3b
O teste da antiglobulina pode ser usado para detectar hemaacutecias sensibilizadas com
aloanticorpos IgG autoanticorpos IgG e componentes do complemento A sensibilizaccedilatildeo
pode ocorrer ldquoin vivordquo ou ldquoin vitrordquo O uso do AGH para detectar a sensibilizaccedilatildeo ldquoin vitrordquo
tem dois estaacutegios e eacute denominado teste indireto da antiglobulina A sensibilizaccedilatildeo ldquoin vivordquo eacute
detectada em procedimento de um uacutenico estagio chamado teste direto da antiglobulina (TDA)
11
Os testes direto e indireto satildeo ateacute hoje amplamente aplicados como princiacutepio de inuacutemeros
testes soroloacutegicos em imuno-hematologia (GREEN e KLOSTERMANN 2012)
131 TESTE DIRETO DA ANTIGLOBULINA
O teste direto da antiglobulina humana revela a presenccedila de anticorpo eou fraccedilatildeo do
complemento ligados agrave superfiacutecie das hemaacutecias As sensibilizaccedilatildeo das hemaacutecias ocorrida ldquoin
vivordquo natildeo eacute visualizada mas apoacutes a adiccedilatildeo da antiglobulina humana ocorre a aglutinaccedilatildeo que
eacute visualizada macroscopicamente (Figura 1)
Figura 1 - Princiacutepio da teacutecnica direta da antiglobulina Teste utilizado para demonstrar a sensibilizaccedilatildeo ldquoin
vivordquo das hemaacutecias O sangue total eacute coletado do paciente em tubo contendo anticoagulante EDTA Na teacutecnica
realizada em tubo uma suspensatildeo de hemaacutecias 5 em soluccedilatildeo de salina eacute preparada Uma gota dessa suspensatildeo
eacute lavada 3 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica para retirada de anticorpos que estatildeo livres no plasma Toda soluccedilatildeo eacute
retirada e adiciona-se o soro de Coombs (antiglobulina humana) O soro de Coombs reconhece os anticorpos que
estatildeo ligados agrave superfiacutecie das hemaacutecias fazendo com que ocorra aglutinaccedilatildeo visiacutevel macroscopicamente
Apesar de natildeo ser um teste preacute-transfusional obrigatoacuterio o TDA eacute um dos testes mais
importantes para investigar e classificar quadros hemoliacuteticos como de origem imune ou natildeo
imune O seu valor preditivo positivo em vigecircncia de anemia hemoliacutetica eacute de 83 poreacutem natildeo
havendo sinais de hemoacutelise seu valor preditivo eacute apenas 14 Eacute por esse motivo que a
interpretaccedilatildeo do TDA positivo deve levar em consideraccedilatildeo a histoacuteria cliacutenica e os resultados
dos outros exames laboratoriais A realizaccedilatildeo do TDA eacute obrigatoacuteria na investigaccedilatildeo
12
laboratorial de diversos quadros hemoliacuteticos entre eles a anemia hemoliacutetica autoimune
(AHAI) a reaccedilatildeo hemoliacutetica imune poacutes-transfusional a siacutendrome do linfoacutecito passageiro a
doenccedila hemoliacutetica perinatal e a hemoacutelise droga-dependente (LEGER 2011)
Resultados de TDA positivos foram tambeacutem observados em indiviacuteduos com niacuteveis
seacutericos elevados de IgG ou complemento sem evidecircncia de anemia hemoliacutetica imune como
em pacientes com doenccedila falciforme talassemia doenccedila renal crocircnica mieloma muacuteltiplo
doenccedilas autoimunes e siacutendrome da imunodeficiecircncia adquirida (SIDA) Aleacutem disso pequenas
quantidades de IgG (5 a 90 moleacuteculas por hemaacutecia) e complemento (5 a 40 moleacuteculas por
hemaacutecia) podem estar presentes nas hemaacutecias de indiviacuteduos saudaacuteveis sem associaccedilatildeo com
reduccedilatildeo na sobrevida das mesmas A positividade do TDA depende da populaccedilatildeo estudada e
pode variar de 01 entre doadores de sangue sem qualquer sinal cliacutenico de hemoacutelise ateacute
15 em pacientes hospitalizados (CASTILHO JUNIOR e REID 2015 LEGER 2011)
Indiviacuteduos que apresentam TDA positivo seja agraves custas de IgG eou complemento
com ou sem sinais cliacutenicos de hemoacutelise teratildeo a fenotipagem eritrocitaacuteria prejudicada A
fenotipagem de indiviacuteduos com TDA positivo especialmente quando utilizado o teste indireto
da antiglobulina pode acarretar resultados falsos positivos e levar a seleccedilatildeo de fenoacutetipo
incorreto para transfusatildeo
132 TESTE INDIRETO DA ANTIGLOBULINA
O teste indireto da antiglobulina (TIA) eacute utilizado para revelar a sensibilizaccedilatildeo ldquoin
vitrordquo das hemaacutecias e eacute aplicado a diversos testes soroloacutegicos em imunohematologia entre
eles a pesquisa de anticorpos identificaccedilatildeo de anticorpos testes de compatibilidade
fenotipagem eritrocitaacuteria e titulaccedilatildeo de anticorpos Na teacutecnica indireta a hemaacutecia que contecircm
o antiacutegeno eacute colocada em contato ldquoin vitrordquo com o anticorpo que se liga mas natildeo promove a
aglutinaccedilatildeo visiacutevel A adiccedilatildeo da AGH forma uma malha entre os anticorpos que sensibilizam
as hemaacutecias e provoca a aglutinaccedilatildeo macroscoacutepica (figura 2)
Caso a amostra de hemaacutecia estudada seja previamente sensibilizada resultados falsos
positivos podem ser obtidos no TIA jaacute que a AGH reagiraacute com a moleacutecula que sensibilizava
anteriormente a hemaacutecia mesmo se o anticorpo especiacutefico natildeo tiver se ligado ao antiacutegeno
correspondente
13
133 CONDICcedilOtildeES CLIacuteNICAS COM TDA POSITIVO
O TDA positivo deve ser interpretado cuidadosamente sempre em conjunto com o
quadro cliacutenico do paciente A positividade isolada do TDA natildeo significa hemoacutelise A
interpretaccedilatildeo do teste positivo requer o conhecimento do diagnoacutestico do paciente da presenccedila
de sinais e sintomas sugestivos de hemoacutelise assim como de seu histoacuterico transfusional
gestacional e de informaccedilotildees sobre o uso recente de medicaccedilotildees (LEGER 2011)
Figura 2 ndash Princiacutepio do teste indireto da antiglobulina O TIA pode ser utilizado na pesquisa de anticorpos de
especificidades desconhecidas livres no soroplasma como eacute o caso da pesquisa e identificaccedilatildeo de anticorpos
irregulares Ele eacute tambeacutem utilizado para determinar a presenccedila de antiacutegenos na membrana da hemaacutecia quando
satildeo empregados soros de especificidades conhecidas da classe IgG No primeiro caso o soroplasma contendo o
anticorpo desconhecido eacute colocado em contato com hemaacutecias cujo perfil antigecircnico eacute conhecido No segundo
caso utiliza-se soro de especificidade conhecida da classe IgG para determinar a presenccedila ou ausecircncia de um
antiacutegeno na membrana O anticorpo encontra o antiacutegeno correspondente e ocorre a ligaccedilatildeo do anticorpo agrave
hemaacutecia mas natildeo ocorre aglutinaccedilatildeo Apoacutes a adiccedilatildeo da AGH que se liga aos anticorpos formando uma malha
ocorre a aglutinaccedilatildeo visiacutevel
O TDA positivo eacute uma achado claacutessico de algumas condiccedilotildees cliacutenicas como a reaccedilatildeo
transfusional hemoliacutetica a doenccedila hemoliacutetica do feto e do receacutem-nascido (DHFRN) a anemia
hemoliacutetica induzida por drogas a siacutendrome do linfoacutecito passageiro e a anemia hemoliacutetica
autoimune (AHAI) Portanto o TDA positivo pode ser decorrente da sensibilizaccedilatildeo da
hemaacutecia autoacuteloga por um autoanticorpo ou por um aloanticorpo ligado agrave hemaacutecia alogecircnica
circulante A positividade do TDA pode ainda ocorrer de forma passiva em pacientes que
14
recebem imunoglobulinas humanas ou ainda pela transfusatildeo de plaquetas ABO natildeo idecircntico
(LEGER 2011 RALPH 2012 ZANTEK et al 2012)
Nas reaccedilotildees transfusionais hemoliacuteticas imunes o aloanticorpo do receptor sensibiliza
as hemaacutecias transfundidas do doador e reduz sua sobrevida ao removecirc-la precocemente da
circulaccedilatildeo pela fagocitose no sistema retiacuteculo-endotelial ou pela hemoacutelise intravascular As
reaccedilotildees podem ser agudas se ocorrem ateacute 24 horas ou tardias quando ocorrem apoacutes 24 horas
da transfusatildeo A gravidade das reaccedilotildees hemoliacuteticas pode variar de um simples rendimento
transfusional inadequado agrave quadros graves de hemoacutelise intravascular evoluindo ateacute mesmo
com choque vascular e oacutebito O TDA pode resultar negativo caso toda massa eritrocitaacuteria
transfundida tenha sido destruiacuteda (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
Na doenccedila hemoliacutetica do feto e do receacutem-nascido (DHFRN) anticorpos maternos da
classe IgG atravessam a barreira placentaacuteria e sensibilizam as hemaacutecias fetais que seratildeo
destruiacutedas precocemente levando agrave anemia fetal Apesar da incompatibilidade ABO feto-
materna ser a causa mais frequente de DHFRN raramente ela eacute responsaacutevel pela ocorrecircncia
de quadros graves Por outro lado anticorpos contra antiacutegenos do sistema Rh e Kell
especialmente Anti-D (Anti-RH1) Anti-c (Anti-RH4) e Anti-Kell (Anti-KELL1) satildeo
conhecidos por causar DHFRN severa Raramente outros anticorpos tambeacutem podem estar
implicados na DHFRN como os anticorpos contra antiacutegenos do sistema Kidd Duffy MNS e
Diego (ZANTEK et al 2012)
A hemoacutelise droga-dependente eacute causada pela produccedilatildeo de um anticorpo voltado contra
a droga ligada agrave membrana eritrocitaacuteria ou ainda contra o complexo droga-membrana A
classe de medicaccedilotildees mais comumente envolvida eacute a dos antimicrobianos betalactacircmicos
(penicilinas e cefalosporinas) mas outras classes como quimioteraacutepicos e anti-inflamatoacuterios
tambeacutem satildeo descritos (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
Apoacutes transplante de ceacutelulas progenitoras hematopoieacuteticas em que o doador possui
anticorpos contra antiacutegenos eritrocitaacuterios do receptor o linfoacutecito de memoacuteria do doador pode
resistir ao esquema imunossupressor utilizado e continuar a produccedilatildeo de anticorpos que
reconhecem a hemaacutecia incompatiacutevel do receptor ainda circulante O quadro cliacutenico pode
variar de um simples TDA positivo sem outros sinais ou sintomas ateacute um quadro hemoliacutetico
grave e abrupto (LEGER 2011)
15
134 ANEMIA HEMOLIacuteTICA AUTOIMUNE
A anemia hemoliacutetica autoimune eacute caracterizada pela destruiccedilatildeo precoce das hemaacutecias
autoacutelogas por autoanticorpos que sensibilizam as hemaacutecias e levam agrave fagocitose pelos
macroacutefagos no sistema reticulo-endotelial ou hemoacutelise intravascular O diagnoacutestico da AHAI
baseia-se na presenccedila de hemoacutelise cliacutenica associada agrave evidecircncia de fator imune representado
pelo TDA positivo As classes de anticorpos envolvidas em quadros de AHAI satildeo IgG IgM e
raramente IgA (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012) Satildeo raros os casos de AHAI com TDA
negativo que podem estar relacionados a um autoanticorpo de baixa avidez de densidade
inferior agrave detecccedilatildeo do meacutetodo ou ainda de classe de imunoglobulina natildeo avaliada pelo
meacutetodo utilizado para o teste (GARRATY 2005)
A AHAI pode ser classificada em dois grupos principais de acordo com a melhor
temperatura de reaccedilatildeo do autoanticorpo As anemias hemoliacuteticas causadas por anticorpos
quentes que reagem melhor a 37oC e geralmente IgG representam 80 dos casos de AHAI
Nas AHAI por anticorpo quente o TDA pode ser positivo para IgG mais complemento (67)
somente IgG (20) ou somente por complemento (13) As anemias causadas por
anticorpos frios geralmente da classe IgM e que reagem melhor em temperatura ambiente ou
a 4oC representam aproximadamente 20 dos casos de AHAI Por exibirem amplitude
teacutermica esses anticorpos ligam-se agraves hemaacutecias ao atingirem a circulaccedilatildeo nas extremidades do
corpo fixam o complemento e desprendem-se da hemaacutecia apoacutes retornar para partes mais
quentes Por esse motivo em AHAI por anticorpos frios o TDA eacute positivo apenas agraves custas
de C3 e normalmente o IgM natildeo eacute detectado (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
A presenccedila do autoanticorpo IgG pode ser confirmada atraveacutes da eluiccedilatildeo do anticorpo
da hemaacutecia Tipicamente o eluato na AHAI por anticorpo quente reage com todas as ceacutelulas
testadas de um painel de hemaacutecias alogecircnicas do tipo ldquoOrdquo ou pode eventualmente exibir uma
especificidade conhecida como Anti-e (Anti-RH5) Nas AHAI a frio por sua vez espera-se
um eluato negativo (LEGER 2011)
Os autoanticorpos satildeo com frequecircncia encontrados livres no plasma e natildeo somente
ligados agraves hemaacutecias autoacutelogas Eles podem interferir em todas as fases dos testes preacute-
transfusionais nas quais o plasma eacute testado especialmente os autoanticorpos quentes que
acarretam resultados positivos em todos os testes levados agrave fase de antiglobulina humana
Esses anticorpos portanto positivam a pesquisa de anticorpos irregulares e mascaram a
presenccedila de aloanticorpos de significado cliacutenico Aproximadamente 60 dos pacientes que
apresentam AHAI a quente apresentam anticorpos que reagem em meio salino mas se forem
16
levados em conta meacutetodos mais sensiacuteveis como PEG enzima e estudo em gel a positividade
pode ser superior a 90 (LEGER 2011)
Aleacutem da eficaacutecia da transfusatildeo ser comprometida pela diminuiccedilatildeo da vida-meacutedia das
hemaacutecias a presenccedila do autoanticorpo dificulta a realizaccedilatildeo dos testes preacute-transfusionais e
compromete a seguranccedila transfusional Os autoanticorpos reagem normalmente como
panaglutininas pois satildeo normalmente voltados contra antiacutegenos puacuteblicos na maior parte das
vezes contra antiacutegenos do sistema Rh Por apresentarem essas caracteriacutesticas podem ainda
mascarar a presenccedila de aloanticorpos de significado clinico e levar a testes de compatibilidade
positivos exigindo uma avaliaccedilatildeo criteriosa da necessidade da transfusatildeo (BRANCH e PETZ
1999 JUNIOR e OLIVATO 2004)
Remover a interferecircncia do autoanticorpo para avaliar a presenccedila de aloanticorpos
mascarados nem sempre eacute possiacutevel mesmo utilizando teacutecnicas de autoadsorccedilatildeo ou
aloadsorccedilatildeo que aleacutem de tudo satildeo demoradas e exigem de 2 a 6 horas para conclusatildeo
(GARRATY e GEORGE 2002) Nesses casos a fenotipagem eritrocitaacuteria do paciente eacute de
extrema utilidade especialmente em situaccedilotildees de urgecircncia A definiccedilatildeo do fenoacutetipo do
paciente para os antiacutegenos de maior importacircncia cliacutenica pode auxiliar a seleccedilatildeo de unidades
de hemaacutecias com mesmo fenoacutetipo o que garante que eventuais aloanticorpos natildeo
identificados sejam respeitados e tambeacutem evita nova sensibilizaccedilatildeo (JUNIOR e OLIVATO
2004 SHIREY et al 2002)
135 TRATAMENTO DE HEMAacuteCIAS COM TDA POSITIVO
O TDA positivo impede a fenotipagem eritrocitaacutecia por meacutetodos que exigem a fase de
AGH uma vez que a aglutinaccedilatildeo ocorreraacute devido agrave interaccedilatildeo da AGH com o autoanticorpo
que sensibiliza a hemaacutecia do paciente levando a resultados falso positivos Em algumas
situaccedilotildees como na AHAI por anticorpo quente a fenotipagem eacute especialmente importante
pois o autoanticorpo interfere na triagem e identificaccedilatildeo de anticorpos assim como no teste de
compatibilidade e dificultam a detecccedilatildeo de aloanticorpos de significado cliacutenico que
obrigatoriamente devem ser respeitados Nessas situaccedilotildees a fenotipagem eritrocitaacuteria
determina o perfil antigecircnico do paciente e possibilita o fornecimento de unidades de
hemaacutecias com o mesmo fenoacutetipo para a transfusatildeo evitando a sensibilizaccedilatildeo para novos
antiacutegenos assim como reaccedilotildees hemoliacuteticas transfusionais No entanto eacute necessaacuterio aplicar
meacutetodos que natildeo sofram interferecircncia do TDA positivo ou seja meacutetodos que natildeo necessitem
da fase de AGH ou meacutetodos de bloqueio do anticorpo sem bloquear o antiacutegeno Uma opccedilatildeo eacute
a utilizaccedilatildeo de soros monoclonais IgM (salinos ou de meio proteico natildeo concentrado) mas
17
nem sempre esses reagentes estatildeo disponiacuteveis especialmente os reagentes monoclonais para
os antiacutegenos dos sistemas Duffy ( Fya Fy
b) Kidd ( Jk
a Jk
b) e MNS (S s) (JUNIOR e
OLIVATO 2004) Outra opccedilatildeo eacute a teacutecnica de bloqueio que pode ser utilizada para tratar
hemaacutecias para posterior fenotipagem em casos de TDA positivos com reatividade le2+
Em casos onde a positividade do TDA eacute maior que 2+ estaacute indicada a tratamento
quiacutemico para remoccedilatildeo da interferecircncia do autoanticorpo antes de realizar a fenotipagem Entre
as teacutecnicas utilizadas atualmente estatildeo o ZZAP a cloroquina e a glicina aacutecidaEDTA
1351 TEacuteCNICA DE BLOQUEIO
A teacutecnica de bloqueio se baseia na utilizaccedilatildeo de anti-IgG (Coombs monoespeciacutefico)
para tratar as hemaacutecias com TDA positivo O anticorpo anti-IgG se liga aos anticorpos que
estatildeo sensibilizando a hemaacutecias poreacutem sem o bloquear os antiacutegenos Os antiacutegenos que natildeo
estatildeo sensibilizados podem ser detectados atraveacutes dos antissoros especiacuteficos (SERERAT
VEIDT E DUTCHED 2000)
1352 TRATAMENTO DE HEMAacuteCIAS COM ZZAP
O Sulphydryl-Proteolytic Enzyme (ZZAP) que eacute uma mistura de ditiotreitol (DTT)
mais papaiacutena ativada com cisteiacutena eacute um reagente capaz de dissociar imunoglobulinas da
classe IgG ligadas a membrana dos eritroacutecitos enquanto trata enzimaticamente as hemaacutecias
O tratamento enzimaacutetico tambeacutem potencializa a ligaccedilatildeo do autoanticorpo ao antiacutegeno e
acelera o processo de autoadsorccedilatildeo O ZZAP pode desnaturar os antiacutegenos do sistema Duffy
MNS e Kell o que limita sua aplicaccedilatildeo para fins de fenotipagem (BRANCH e PETZ 1982)
1353 CLOROQUINA
Em 1982 Edwards Moulds e Judd propuseram a utilizaccedilatildeo da teacutecnica da cloroquina
que dissociava os complexos antiacutegeno-anticorpo e mantinha a membrana das hemaacutecias
iacutentegras Os derivados quinolecircicos jaacute haviam sido descritos anteriormente por Domokos e
Aszody em 1964 e Holtz Mantel e Buck em 1973 (apud Edwards Moulds e Judd 1982) pela
sua capacidade de separar imunocomplexos e inibir as reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo reduzindo
as cargas eleacutetricas das superfiacutecie das hemaacutecias A teacutecnica eacute uma das mais utilizadas nos
centros brasileiros para remover a interferecircncia do autoanticorpo e eacute tambeacutem a teacutecnica
atualmente adotada pelo laboratoacuterio de imunohematologia do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto
18
Edwards Moulds e Judd (1982) demonstraram que a teacutecnica da cloroquina para
dissociaccedilatildeo de anticorpos eacute uma teacutecnica simples efetiva e confiaacutevel para dissociar
imunoglobulina das hemaacutecias Desde que a membrana das hemaacutecias permaneccedila intacta natildeo
haacute perda da reatividade dos antiacutegenos e a sua maior aplicaccedilatildeo eacute a fenotipagem de hemaacutecias
com TDA positivo Os autores verificaram que em 83 das amostras sensibilizadas in vivo e
22 amostras (no total de 40) sensibilizadas ldquoin vitrordquo apresentaram TDA negativo e
puderam ser fenotipadas A teacutecnica poreacutem natildeo consegue remover os componentes do
complemento na maioria dos casos
Champagne e colaboradores (1999) testaram a teacutecnica da cloroquina para dissociar
antiacutegenos Bg comparando com a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA e verificaram vantagem em
relaccedilatildeo ao uso de um uacutenico reagente diminuindo a manipulaccedilatildeo e verificou que o mesmo natildeo
destroacutei antiacutegeno Kell
A cloroquina tambeacutem mostrou-se pouco efetivo em remover anticorpos do sistema
Duffy da superfiacutecie das hemaacutecias (EDWARDS MOUDS e JUDD 1982 ROZIERS e
SQUALI 1997)
1353 GLICINA-AacuteCIDAEDTA
A afinidade e a estabilidade entre a ligaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo eacute definida como a
resultante entre forccedilas atrativas e repulsivas entre ambos (CARUCIO e WISE 2012) e resulta
da somatoacuteria de forccedilas quiacutemicas dinacircmicas e fracas (natildeo covalentes) como pontes de
hidrogecircnio forcas eletrostaacuteticas forca de Van der Waals e pontes hidrofoacutebicas A estabilidade
dessa ligaccedilatildeo eacute facilmente abalada por alteraccedilotildees quiacutemicas e fiacutesicas no meio da reaccedilatildeo como
a alteraccedilatildeo do pH A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA se baseia na mudanccedila do pH para a
quebra da ligaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo (KOSANKE 2012)
A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA foi primeiramente descrita em 1986 por Louie Jieng
e Zeroulis que utilizaram 50 amostras de doadores sensibilizados ldquoin vitrordquo com anticorpos A
teacutecnica foi efetiva em 48 amostras permitindo o estudo do eluato assim como a fenotipagem
das hemaacutecias Os autores testaram tambeacutem a teacutecnica em 100 hemaacutecias TDA positivo que
puderam ser utilizadas para teacutecnicas de autoadsorccedilatildeo
Byrne (1991) descreveu a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA modificada e tambeacutem
verificou como uma opccedilatildeo para o tratamento de hemaacutecias com TDA positivo que deixava as
hemaacutecias intactas e o eluato viaacutevel para ser fenotipado
19
Roziers e Squali (1997) e Katharia e Chaudhary (2013) compararam a teacutecnica da
glicina-aacutecidaEDTA com as teacutecnicas da cloroquina e do aquecimento Verificaram maior
eficiecircncia da glicina-aacutecidaEDTA em relaccedilatildeo as outras duas teacutecnicas pois com uma mesma
quantidade de amostra produzia as hemaacutecias livres de anticorpo e tambeacutem o eluato Mostrou-
se ainda superior devido ao menor tempo exigido para sua realizaccedilatildeo o que favorece seu uso
em situaccedilotildees de urgecircncia e emergecircncia
As duas desvantagens da teacutecnica poreacutem eacute o fato de destruir os antiacutegenos do sistema
Kell e o fato de natildeo remover fraccedilotildees do complemento ligadas agrave hemaacutecia (PALLAS WILER e
McGEE 1991 ROZIERS e SQUALLI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012
e KATHARIA e CHAUNDHARY 2013)
20
2 OBJETIVOS
21 OBJETIVO GERAL
211 Avaliar a eficaacutecia da glicina-aacutecidaEDTA em remover os anticorpos ligados agraves
hemaacutecias sensibilizadas por anticorpos da classe IgG
22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
221 Preparaccedilatildeo dos reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
verificaccedilatildeo da estabilidade dos mesmos e avaliar custos
222 Testar a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA em amostras de hemaacutecias
sensibilizadas por anticorpos antieritrocitaacuterios humanos
223 Comparar a efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA com a teacutecnica da
cloroquina quanto a capacidade de remover a interferecircncia do anticorpo ligado
a hemaacutecia
224 Testar o eluato das amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA
225 Verificar se houve destruiccedilatildeo dos antiacutegenos eritrocitaacuterios apoacutes o tratamento
com glicina-aacutecidaEDTA e com cloroquina
226 Verificar se o tempo de execuccedilatildeo da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA descrito
nos textos de referecircncia eacute reprodutiacutevel
21
3 JUSTIFICATIVA
Algumas condiccedilotildees cliacutenicas podem levar ao depoacutesito ldquoin vivordquo de anticorpos eou
fraccedilotildees do complemento sobre as hemaacutecias Entre elas estatildeo as reaccedilotildees hemoliacuteticas poacutes-
transfusionais a doenccedila hemoliacutetica perinatal o uso de medicamentos e principalmente a
AHAI Na AHAI um anticorpo normalmente da classe IgG ou IgM reconhece antiacutegenos
proacuteprios na membrana eritrocitaacuteria e reduz a sobrevida da hemaacutecia levando a sua destruiccedilatildeo
pelos macroacutefagos no sistema reticulo-endotelial ou agrave ativaccedilatildeo do complexo de ataque agrave
membrana e agrave lise intravascular Os autoanticorpos satildeo voltados na maioria das vezes contra
antiacutegenos eritrocitaacuterios de alta frequecircncia populacional conhecidos como antiacutegenos puacuteblicos
e por este motivo reconhecem tanto hemaacutecias autoacutelogas quanto alogecircnicas
Devido agrave presenccedila do autoanticorpo livre no plasma e tambeacutem do anticorpo eou
complemento ligado agrave hemaacutecia o banco de sangue pode encontrar dificuldades em todas as
fases dos testes preacute-transfusionais do paciente com AHAI e deve utilizar teacutecnicas que
auxiliem na escolha do melhor hemocomponente melhorando a seguranccedila transfusional Essas
teacutecnicas visam remover a interferecircncia do autoanticorpo livre no soro e do autoanticorpo
ligado agrave hemaacutecia permitindo a detecccedilatildeo de aloanticorpos associados e a realizaccedilatildeo da
fenotipagem eritrocitaacuteria respectivamente
A finalizaccedilatildeo dos testes preacute-tranfusionais na presenccedila de autoanticorpo pode levar
algumas horas e nem sempre o paciente poderaacute aguardar Nesse contexto torna-se vantajosa a
aplicaccedilatildeo de teacutecnicas de raacutepida execuccedilatildeo
O presente estudo propotildee aplicar e avaliar a eficaacutecia da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
em remover os anticorpos ligados agrave hemaacutecia o que permite a fenotipagem eritrocitaacuteria
estendida e a seleccedilatildeo de concentrados de hemaacutecias com mesmo fenoacutetipo do paciente
Atualmente no Hemocentro de Ribeiratildeo Preto a teacutecnica utilizada para esse fim eacute o
tratamento das hemaacutecias com difosfato de cloroquina cujo tempo de execuccedilatildeo pode demorar
ateacute duas horas enquanto a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser realizada em apenas dois
minutos o que a tornaria opccedilatildeo de escolha especialmente em situaccedilotildees de urgecircncia Ao
contraacuterio da cloroquina a glicina-aacutecidaEDTA permite tambeacutem o estudo do eluato das
hemaacutecias tratadas
22
4 METODOL OGIA
41 AMOSTRAS DE DOADORES
Foram coletados 50 amostras de doadores de sangue que compareceram ao
Hemonuacutecleo de Araccedilatuba no periacuteodo de junho a agosto de 2016 Foram convidados a
participar da pesquisa doadores de repeticcedilatildeo do tipo sanguiacuteneo ldquoOrdquo RhD positivo
cadastrados no sistema de banco de sangue (SBS) do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto
Todos os doadores que concordaram em participar da pesquisa assinaram o termo de
consentimento livre e esclarecido (TCLE)
No momento da doaccedilatildeo foram coletados adicionalmente 5 mL de sangue total em
soluccedilatildeo anticoagulante EDTA (aacutecido dietilenoaminoaceacutetico) dispensando punccedilatildeo venosa
adicional para coleta da amostra O fluxograma 1 resume as etapas desenvolvidas no projeto
Fluxograma 1 - Fluxo da pesquisa utilizando as amostras de doadores
23
411 FENOTIPAGEM
Foram verificados se os doadores jaacute tinham fenotipagem para outros sistemas de
grupos sanguiacuteneos aleacutem do sistema ABORh que eacute realizado rotineiramente
A fenotipagem eritrocitaacuteria para outros sistemas ou fenotipagem estendida eacute realizada
para identificar a presenccedila ou ausecircncia de antiacutegenos considerados de importacircncia cliacutenica No
Hemonuacutecleo de Araccedilatuba uma parcela de doadores de repeticcedilatildeo satildeo fenotipados para os
antiacutegenos dos sistemas de grupo sanguiacuteneo Rh (antiacutegenos C c E e e) Kell (antiacutegeno K)
Duffy (antiacutegenos Fya e Fy
b) Kidd (antiacutegenos Jk
a e Jk
b) e sistema MNSs (antiacutegenos S e s)
A fenotipagem para o Rh e Kell eacute realizada por metodologia de microplaca utilizando
25 microL de hemaacutecia lavada e diluiacuteda a 5 em salina e 25 microL do antissoro comercial especiacutefico
A reaccedilatildeo eacute incubada 15 minutos a temperatura ambiente e centrifugadas para leitura Para os
antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s a metolodogia utilizado eacute gel contendo antiglobulina
humana (gel LissCoombs poliespeciacutefico) da marca BIO-RAD onde se utiliza suspensatildeo de
hemaacutecia em LISS (Soluccedilatildeo de baixa forccedila iocircnica) A suspensatildeo eacute preparada atraveacutes da
diluiccedilatildeo de 10 microL de hemaacutecia em 1000 microL de LISS Pipetado 50 microL dessa diluiccedilatildeo no gel e
adicionado 25 microL do antissoro especiacutefico Incuba-se em banho seco por 15 minutos a 37 deg
Celsius e eacute centrifugado em centriacutefuga especiacutefica Os antissoros utilizados eram das marcas
Fresenius e Lorne
Foi verificado a fenotipagem do doador no banco de dados do Hemocentro Os
registros dos fenoacutetipos dos doadores ficam armazenadas no sistema de banco de sangue
(SBS) Para doadores que natildeo tinham fenotipagem estendida preacutevia para antiacutegenos do sistema
Rh (C c E e e) e Kell (K) foi realizada a fenotipagem para esses antiacutegenos
O tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA e cloroquina para dissociar
anticorpos pode inativar enfraquecer ou destruir os antiacutegenos presentes nas hemaacutecias
alterando assim os resultados da fenotipagem Para verificar se houve destruiccedilatildeo dos
antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a e Jk
b S e s nas amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes
tratamento foram novamente fenotipadas ao final para os antiacutegenos que eram inicialmente
positivas
A repeticcedilatildeo da fenotipagem foi realizada nas amostras que apresentaram efetividade
no tratamento da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eou da cloroquina e a detecccedilatildeo do antiacutegeno
na amostra preacute-tratamento
24
412 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS HEMAacuteCIAS
As hemaacutecias foram sensibilizadas com antissoros policlonais humanos de amostras de
plasma fresco congelado de doadores com resultado de pesquisa de anticorpo irregular
positivos
A escolha do anticorpo para sensibilizar as hemaacutecias foi definida de acordo com o
fenoacutetipo do doador que deveria ser positivo para o respectivo antiacutegeno
Para a sensibilizaccedilatildeo um volume de antissoro (1 mL) e um volume (1 mL) de
hemaacutecias lavadas quatro vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica foram adicionadas a um tubo de 12 x
75 mm A mistura foi homogeneizada e incubada em banho maria (BM) a 37deg C por 60
minutos A seguir as hemaacutecias foram novamente lavadas 4 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica
para retirada dos anticorpos que natildeo se ligaram A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada
como controle negativo O teste da uacuteltima lavagem eacute importante para assegurar que os
anticorpos que poderatildeo ser detectados no eluato apoacutes o tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA
sejam aqueles que estavam ligados agraves hemaacutecias e natildeo aqueles livres no plasma O controle
negativo mostra que todo o anticorpo livre foi retirado (LEGER 2011)
Para o teste de presenccedila de anticorpo na soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foram incubadas
com hemaacutecias de triagem de anticorpos irregulares (ID-Diacell BIO-RAD) contendo os
antiacutegenos especiacuteficos Realizado a teacutecnica em gel LissCoombs com anti-IgG+C3d Incubado
no tempo de 15 minutos a temperatura de 37deg C e centrifugado 10 minutos em centriacutefuga
proacutepria
As 50 amostras de doadores foram sensibilizadas com os anticorpos policlonais
humanos
Apoacutes sensibilizadas rdquoin vitrordquo e lavadas as hemaacutecias foram diluiacutedas em soluccedilatildeo de
baixa forccedila iocircnica (LISS) na quantidade de 10 microL de hemaacutecia para 1000 microL de soluccedilatildeo A
suspensatildeo foi pipetada (50 microL) em coluna-gel-teste LissCoombs (BIO-RAD) que contecircm
antiglobulina poliespeciacutefico (IgG+C3d) e centrifugada em baixa rotaccedilatildeo conforme orientaccedilatildeo
do fabricante durante 10 minutos
As amostras deveriam apresentar aglutinaccedilatildeo com reatividade 3 a 4+ no TDA As
amostras que apresentaram reaccedilatildeo menor que 3+ foram novamente sensibilizadas com nova
aliacutequota do antissoro
25
413 TRATAMENTO DAS AMOSTRAS
As amostras sensibilizadas apresentando o TDA positivo 3 ou 4+ foram divididas em
duas aliacutequotas e submetidas a duas teacutecnicas diferentes com o objetivo de dissociar o anticorpo
ligado Uma aliacutequota da amostra foi tratada com soluccedilatildeo de difosfato de cloroquina enquanto
a outra aliacutequota foi tratada com glicina-aacutecidaEDTA
42 PREPARO DA GLICINA AacuteCIDA-EDTA
A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA utiliza 3 soluccedilotildees diferentes a glicina aacutecida o
EDTA e o tampatildeo TRIS
Os reagentes foram preparados utilizando os sais para anaacutelise (PA) de EDTA
(Na2EDTA2H2O) TRIS (C4H11NO3) Glicina (H2NCH2CO2H) NaCl e a soluccedilatildeo de aacutecido
cloriacutedrico (HCl) 12 N todos reagentes da marca SYNTH (quadro 1)
Para o preparo do tampatildeo glicina-acida eacute necessaacuterio o ajuste do pH para 15 Para esse
ajuste utiliza-se aacutecido cloriacutedrico (HCl) concentrado O pH foi medido com fitas reativas de pH
com escala de 1 a 14 da marca MERCK Posteriormente a soluccedilatildeo foi enviada ao laboratoacuterio
de controle de qualidade do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto e o pH medido no peagacircmetro O
tampatildeo glicina-aacutecida foi armazenado a 4deg e o tampatildeo tris e o EDTA em temperatura ambiente
controlada (20 a 24deg Celsius)
Apoacutes o preparo e durante a realizaccedilatildeo dos testes foram feitas inspeccedilotildees visuais para
verificaccedilatildeo de turvaccedilatildeo do meio e presenccedila de precipitados
Reagente Material Quantidade Preparo e
Conservaccedilatildeo
EDTA
EDTA
(Na2EDTA2H2O)
5 gramas Mistura ateacute
dissoluccedilatildeo do sal e
conserva em
temperatura ambiente Aacutegua Destilada 50 Ml
Tris
TRIS (C4H11NO3) 121 gramas Conservar em
temperatura ambiente NaCl 525g
Aacutegua destilada 100ml
Gliacutecina-aacutecida
Glicina
(H2NCH2CO2H) 15 gramas
Conservar a 4oC NaCl 116gramas
Aacutegua Destilada 200ml
HCL 12N Ajutar o pH para 15
Quadro 1 - Preparo dos Reagentes da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
Fonte - Manual teacutecnico AABB 2011
26
O tampatildeo glicina-aacutecida e o tampatildeo TRIS satildeo estaacuteveis por 7 meses O reagente EDTA
precipitou mesmo estando em temperatura em ambiente controlado Houve necessidade de
preparo de novo reagente
421 TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
1 Em um tubo de ensaio 12x75 mm eacute adicionado 08 mL da soluccedilatildeo de glicina-aacutecida A
esta soluccedilatildeo adiciona-se 02 mL de EDTA e mistura
2 Adiciona-se 02 mL de hemaacutecias sensibilizadas (lavada 4 vezes) A mistura eacute
homogeneizada e incubada por exatamente 2 minutos
3 A seguir 01 mL de tampatildeo TRIS eacute adicionado agrave mistura que eacute novamente
homogeneizada e centrifugada por 2 minutos a 3400 rpm O pH deve estar entre 7 a 75
4 Apoacutes centrifugaccedilatildeo separa-se em outro tubo o sobrenadante (eluato) e as hemaacutecias
que permanecem satildeo lavadas 4 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica para retirada de todo o
reagente e anticorpos livres
43 PREPARO DA CLOROQUINA
A cloroquina eacute diluiacuteda em tampatildeo PBS na concentraccedilatildeo de 20 (Quadro 2) e
armazenado a 4deg Celsius sua validade apoacutes o preparo eacute de 1 mecircs
A teacutecnica da cloroquina jaacute estaacute padronizada para rotina do laboratoacuterio de
imunohematologia do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto e suas unidades
Reagente Reagentes Quantidade PreparoConservaccedilatildeo
Cloroquina
Difosfato de cloroquina
(C18H32ClN3O8P2)
20 gramas
Conservar a 4deg Celsius
Tampatildeo PBS 100ml
NaOH 01 N Acertar o pH para
51
Quadro 2 - Preparo da Cloroquina Fonte - Manual teacutecnico da AABB 2011
431 TEacuteCNICA DA CLOROQUINA
1 4 partes da soluccedilatildeo pronta eacute adicionada a uma parte de hemaacutecias lavadas 4 vezes com
soluccedilatildeo fisioloacutegica
2 A mistura eacute incubada em temperatura ambiente por ateacute duas horas
3 Centrifugar a 3400 rpm por 2 minutos
27
4 Remover o sobrenadante lavar as hemaacutecias novamente com soluccedilatildeo fisioloacutegica 4
vezes
44 VERIFICACcedilAtildeO DA EFETIVIDADE DOS TESTES
Apoacutes tratamento pelas duas teacutecnicas o TDA foi repetido em todas as amostras para
verificar se os tratamentos foram efetivos e houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo Para as
amostras tratadas pela teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA que permaneceram com TDA positivo
novo tratamento foi realizado
45 TESTE DO ELUATO
O eluato resultante das amostras tratadas com glicina-acidaEDTA foi testado com
hemaacutecias de triagem A soluccedilatildeo do eluato foi incubada com as hemaacutecias de triagem de
anticorpos (ID-Diacell BIO-RAD) pela teacutecnica em gel LissCoombs O teste foi incubado 15
minutos a 37deg Celsius e centrifugado por 10 minutos em centrifuga proacutepria para a teacutecnica em
gel Os eluatos que apresentaram resultados positivos foram testados em painel de 11
hemaacutecias (ID-Diapanel BIO-RAD) para a identificaccedilatildeo do anticorpo
46 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente que apresentou TDA positivo por IgG e pesquisa
de anticorpo irregular positivo com presenccedila de autoanticorpo com reatividade panaglutinina
A amostra foi tratada em paralelo pelas duas teacutecnicas descritas e foi enviada para o
Hemocentro para genotipagem eritrocitaacuteria que foi realizado por metodologia PCR em tempo
real no equipamento Real-time system PCR 7500 ( Applied Biosystems Califoacuternia EUA)
28
5 RESULTADOS
51 REAGENTES
Para aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA satildeo necessaacuterios 3 diferentes
reagentes que podem ser encontrados em forma de kit pronto para uso No entanto esses kits
natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil Os reagentes satildeo tampatildeo glicina-aacutecida o EDTA e o tampatildeo
Tris
Todos os reagentes foram preparados rdquoin houserdquo a partir dos sais e soluccedilotildees PA (puro
para anaacutelise) da marca SYNTH que foram adquiridos para a pesquisa O custo estimado para
cada teste foi aproximadamente R$ 020 reais
Apoacutes o preparo os reagentes poderiam ser armazenados em condiccedilotildees adequadas pelo
periacuteodo de 1 ano (AABB 2011) Ao final do preparo e durante o periacuteodo de armazenamento
de fevereiro a setembro de 2016 foi realizada inspeccedilatildeo visual para verificar a presenccedila de
precipitados ou turvaccedilatildeo A soluccedilatildeo de glicina e o tampatildeo TRIS mostraram-se estaacuteveis ateacute o
final do periacuteodo Por sua vez o reagente EDTA precipitou mesmo estando armazenado em
temperatura ambiente controlada e foi necessaacuterio novo preparo
52 AMOSTRAS DE DOADORES
521 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS AMOSTRAS
Apoacutes incubaccedilatildeo da hemaacutecia com o antissoro a mesma foi lavada 4 vezes para retirada
dos anticorpos livres A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada Caso houvesse positividade na
soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem a etapa era repetida (figura 3) Das 50 amostras sensibilizadas a
uacuteltima lavagem foi positiva somente em 3 delas Nas 3 amostras o anticorpo utilizado para
sensibilizaccedilatildeo foi o anti-K Apoacutes repetido nova etapa de lavagem os resultados se
apresentaram negativos
Em todas as amostras sensibilizadas ldquoin vitrordquo o TDA foi testado e verificado a
intensidade do teste Entre as 50 amostras 47 alcanccedilaram TDA com intensidade 3-4+ apoacutes a
primeira sensibilizaccedilatildeo enquanto 3 amostras necessitaram uma segunda incubaccedilatildeo com
anticorpo (figura 4)
A escolha dos anticorpos para sensibilizar as hemaacutecias foi feita de acordo com o
fenoacutetipo do doador e foram utilizados sete diferentes especificidades de anticorpos policlonais
humanos conforme mostra o graacutefico1
29
Figura 3 - Soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada com hemaacutecia de triagem de
anticorpos em gel LissCoombs (BIO-RAD) A finalidade eacute verificar a presenccedila de anticorpos livres na
suspensatildeo que possam interferir na pesquisa do eluato As soluccedilotildees de lavagem das amostras na figura a tiveram
resultados negativos Na figura b duas amostras a 47 e 50 apresentaram resultado positivo Nova etapa de
lavagem foi realizada e o resultado final foi negativo
522 TRATAMENTO DAS HEMAacuteCIAS
Apoacutes a sensibilizaccedilatildeo e obtenccedilatildeo de resultados de TDA com intensidade de 3 a 4+
cada uma das amostras foi dividida em duas aliacutequotas e tratada separadamente pelas teacutecnicas
de glicinaaacutecida-EDTA e cloroquina
As teacutecnicas foram consideradas efetivas quando obteve-se a completa dissociaccedilatildeo do
anticorpo verificada atraveacutes do TDA negativo na amostra poacutes tratamento conforme figuras 5
e 6 Dentre as amostras tratadas com cloroquina 2850 tiveram o TDA negativado A glicina-
aacutecidaEDTA negativou o TDA em 33 das 50 amostras tratadas Apenas 17 amostras tratadas
com glicina-aacutecidaEDTA permaneceram com o TDA positivo e foram submetidas a um novo
tratamento
30
Figura 4 - TDA das amostras apoacutes sensibilizaccedilatildeo com anticorpos policlonais humanos Amostras na
figura a com intensidades de 3-4+ Na figura b amostras 4 e 7 com intensidade menor que 3+ e portanto foram
novamente sensibilizadas com nova aliacutequota de soro Anti-D e anti-S Apoacutes a segunda sensibilizaccedilatildeo
apresentaram reatividade 4 e 3+ respectivamente Os anticorpos utilizados para sensibilizaccedilatildeo foram D S c E
C e K
523 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS TEacuteCNICAS
No tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA houve dissociaccedilatildeo completa do anticorpo
em 33 amostras (66) das 50 amostras testadas enquanto que com a cloroquina foram 28
amostras (56) (tabela 1)
31
Graacutefico 1- Nuacutemero de amostras sesnsibilizadas por especificidade de anticorpo Entre as 50 amostras 12
foram sensibilizadas com anti-D 10 com anti-C 9 com anti-E 8 com anti-c 7 com anti-S 3 com anti-K e 1
com anti-Dia As especificidades dos anticorpos foram definidas de acordo o fenoacutetipo do doador
Figura 5 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com cloroquina Nas amostras onde houve
a dissociaccedilatildeo do anticorpo ( 2 21 a 23 26 39 a 42 45 46 e 49) a hemaacutecia se deposita no fundo no microtubo
apoacutes a centrifugaccedilatildeo (TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (1 3 24 25 43 44 47
48 e 50) o anticorpo ligado agraves hemaacutecias eacute alvo da AGH presente no gel (TDA positivo)
Anti-D 12
Anti-C 10
Anti-E 9
Anti-c 8
Anti-S 7
Anti-K 3 Anti-Dia 1
32
Figura 6 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA Nas amostras
onde houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo (4 6 7 12 a 15 17 34 35 37 e 38) a hemaacutecia se deposita no fundo no
microtubo apoacutes a centrifugaccedilatildeo ( TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (5 16 18
19 20 33 e 36 ) o AGH presente no gel se liga ao anticorpo ligado agraves hemaacutecias que ficam retidas no gel (TDA
positivo)
Tabela 1-Resultado geral do tratamento das hemaacutecias com glicina e cloroquina
Teacutecnica utilizada TDA negativo TDA positivo Total
Glicina-aacutecidaEDTA 33 17 50
Cloroquina 28 22 50
A glicina-aacutecidaEDTA conseguiu negativar mais amostras sensibilizadas com Anti-D
e anti-K que a cloroquina Para as hemaacutecias sensibilizadas com anti-E Anti-S e Anti-Dia
ambas as teacutecnicas dissociaram o anticorpo em 100 das amostras Os resultados detalhados
por especificidade do anticorpo apoacutes o primeiro tratamento com glicina-aacutecidaEDTA e com
cloroquina estatildeo na tabela 2
Para as amostras que permaneceram positivas (17 amostras) apoacutes o tratamento com a
glicina-aacutecidaEDTA foi realizado um novo tratamento Houve dissociaccedilatildeo do anticorpo em 3
amostras (18) apoacutes a segunda tentativa Nas demais 14 (82) amostras tratadas pela
segunda vez 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise
33
Tabela 2 - Resultados do TDA apoacutes tratamento das hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo
sensibilizado
ANTICORPOS
SENSIBILIZADOS
1ordm TRATAMENTO COM
GLICINA
TRATAMENTO COM
CLOROQUINA
TOTAL TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
Anti-D 8 4 0 12 12
Anti-C 6 4 10 0 10
Anti-E 9 0 9 0 9
Anti-c 0 8 1 7 8
Anti-S 7 0 7 0 7
Anti-K 2 1 0 3 3
Anti-Dia 1 0 1 0 1
TOTAL 33 17 28 22 50
A hemoacutelise foi verificada durante o procedimento de lavagem final das hemaacutecias com
soluccedilatildeo fisioloacutegica para a retirada dos reagentes As soluccedilotildees de lavagem ficaram
avermelhadas e as hemaacutecias com coloraccedilatildeo escura As amostras foram descartadas Dentre as
6 amostras que ainda puderam ser testadas para o TDA trecircs amostras negativaram sendo 1
sensibilizada com anti-D e 2 com anti-C (tabela 3)
Tabela 3 - Resultado apoacutes o segundo tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA
Tratamento com
glicina-aacutecidaEDTA
TDA Negativo TDA Positvo Hemoacutelise Total
Segundo tratamento 3 3 11 17
524 TESTAGEM DO ELUATO
Apoacutes o tratamento com a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA a soluccedilatildeo do eluato foi
testada para verificar a viabilidade dos anticorpos que foram dissociados ou eluiacutedos Dentre
as 50 amostras 41 apresentaram eluato positivo As nove amostras cujos eluatos foram
negativos haviam sido sensibilizadas com as seguintes especificidades de anticorpos anti-E 6
amostras (67) anti-S 2 amostras (40) e anti-D 1 amostra (8) (tabela 4) O eluato de
todas as amostras sensibilizadas com os anticorpos anti-C anti-c Anti-K e Anti-Dia foram
positivos Os eluatos positivos na triagem de anticorpos foram testados com paineacuteis de
identificaccedilatildeo para confirmar a especificidade e a viabilidade dos anticorpos (figuras 7 e 8)
34
525 EFEITO DA ELUICcedilAtildeO SOBRE OS ANTIacuteGENOS ERITROCITAacuteRIOS
Para verificar o efeito do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA e com a cloroquina
sobre a expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s foi realizada a fenotipagem das
amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes tratamento com ambas as teacutecnicas Foi avaliado
se o tratamento destruiu os antiacutegenos expressos antes do tratamento
Tabela 4- Resultado do Eluato das amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA
Anticorpos Eluato positvo Eluato negativo Total
Anti-D 11 1 12
Anti-C 10 0 10
Anti-E 3 6 9
Anti-c 8 0 8
Anti-S 5 2 7
Anti-K 3 0 3
Anti-Dia 1 0 1
Total 41 9 50
Figura 7 ndash Painel do eluato da amostra 21 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-C que foi
recuperado no eluato
Figura 8 ndash Painel do eluato da amostra 47 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-K que foi
recuperado no eluato
35
Dentre as 50 amostras 26 eram previamente fenotipadas para os antiacutegenos Fya Fy
b
Jka Jk
b S e s Dentre elas 20 alcanccedilaram TDA negativo apoacutes tratamento com a glicina-
aacutecidaEDTA e 20 negativaram apoacutes tratamento com cloroquina (tabela 5) Apoacutes ambas as
teacutecnicas os antiacutegenos originalmente expressos permaneceram positivos comprovando que natildeo
houve destruiccedilatildeo dos mesmos
Tabela 5 ndash Verificaccedilatildeo da interferecircncia do tratamento da hemaacutecias com cloroquina e glicina-
aacuteicdaEDTA sobre os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
AMOSTRAS
COM
FENOTIPAGEM
PREacuteVIA
TRATADAS COM
CLOROQUINA
TRATADAS COM
GLICINA
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
26
20
20
20
20
As amostras 24 47 e 50 eram positivas para o antiacutegeno K A cloroquina natildeo dissociou
o anticorpo em nenhuma das 3 amostras enquanto a glicina-aacutecidaEDTA foi efetiva nas
amostras 24 e 50 Foi testada a expressatildeo do antiacutegeno K nas amostras 24 e 50 apoacutes o
tratamento utilizando meacutetodo indireto em gel contendo AGH Apesar de natildeo ter sido avaliado
a intensidade de reaccedilatildeo de expressatildeo dos antiacutegenos podemos verificar na figura 9 que nas
duas amostras em que a teacutecnica foi efetiva e dissociou o anticorpo a expressatildeo do antiacutegeno K
continua presente mas a reatividade observada pode ser considerada 1+ sugerindo que houve
diminuiccedilatildeo da expressatildeo do antiacutegeno quando comparado com a expressatildeo observada em
hemaacutecia natildeo tratada
Os resultados individuais de cada amostra em ambas as teacutecnicas encontram-se
resumidas na tabela 6
526 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente onde foi constatada a presenccedila de autoanticorpo
a quente da classe IgG pelo TDA monoespeciacutefico (figura 10)O autoanticorpo tambeacutem
interferia na pesquisa e identificaccedilatildeo de anticorpos irregulares pois apresentava caracteriacutestica
de panaglutinina As hemaacutecias da paciente sensibilizadas ldquoin vivordquo foram tratadas com
cloroquina e com glicina-aacutecidaEDTA
36
Figura 9 ndash Fenotipagem das amostras 24 e 50 para antiacutegeno K apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
O teste positivo indica a presenccedila do antiacutegeno poreacutem a reatividade fraca (1+) sugere que houve enfraquecimento
de sua expressatildeo A direita a expressatildeo forte (4+) do antiacutegeno Kell em hemaacutecia controle natildeo tratada utilizada
como controle positivo
A cloroquina natildeo foi efetiva na retirada do anticorpo ligado as hemaacutecias ao contraacuterio
do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA que dissociou o anticorpo (figura 11)
A hemaacutecia tratada com glicina foi fenotipada para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
(figura 12) A fenotipagem para o sistema Rh (C c E e e) e Kell foi realizada em gel
especiacutefico monoclonal sem interferecircncia do TDA positivo (controle da reaccedilatildeo negativo)
O eluato resultante do tratamento com glicina-aacutecidaEDTA foi testada em gel com
hemaacutecias de painel de identificaccedilatildeo de anticorpos e apresentou resultado positivo com todas
as ceacutelulas (figura 13 e 14)
A amostra foi enviada para genotipagem e o resultado da genotipagem confirmou o
resultado da fenotipagem apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
527 TEMPO DE EXECUCcedilAtildeO DA TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
O tempo de reaccedilatildeo da glicina-aacutecidaEDTA eacute de 2 minutos Todas as amostras foram
tratadas obedecendo ao tempo descrito na literatura demonstrando que o mesmo eacute
reprodutiacutevel
37
Tabela 6- Resultados individuais por amostra
Amostra Especificidade
dos anticorpos
Intensidade do
TDA apoacutes
sensibilizaccedilatildeo
Tratamento
efetivo com
cloroquina
Tratamento
efetivo com
glicina
Eluato
poacutes
glicina
1 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 2 Dia 3+ Sim Sim 3+ 3 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 4 D 4+ Natildeo Sim 4+ 5 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 6 E 3+ Sim Sim Negativo 7 S 4+ Sim Sim 3+ 8 E 3+ Sim Sim 1+ 9 E 3+ Sim Sim 2+
10 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 11 D 4+ Natildeo Sim 4+ 12 D 4+ Natildeo Sim 4+ 13 S 3+ Sim Sim 3+ 14 S 3+ Sim Sim 3+ 15 D 3+ Natildeo Sim 3+ 16 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 17 E 3+ Sim Sim (+) 18 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 19 D 4+ Natildeo Natildeo 3+ 20 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 21 C 3+ Sim Sim 4+ 22 C 3+ Sim Sim 4+ 23 C 3+ Sim Sim 4+ 24 K 4+ Natildeo Sim 4+ 25 D 3+ Natildeo Natildeo Negativo 26 E 4+ Sim Sim Negativo 27 S 3+ Sim Sim 3+ 28 C 3+ Sim Natildeo 4+ 29 C 3+ Sim Sim 4+ 30 C 3+ Sim Sim 4+ 31 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 32 E 3+ Sim Sim Negativo 33 C 3+ Sim Natildeo 4+ 34 S 3+ Sim Sim Negativo 35 S 3+ Sim Sim Negativo 36 C 4+ Sim Natildeo 4+ 37 c 4+ Natildeo Natildeo 4+ 38 D 4+ Natildeo Sim 4+ 39 S 3+ Sim Sim 3+ 40 c 4+ Sim Natildeo 2+ 41 C 4+ Sim Natildeo 4+ 42 E 3+ Sim Sim Negativo 43 D 3+ Natildeo Sim 2+ 44 D 3+ Natildeo Sim 2+ 45 E 3+ Sim Sim Negativo 46 C 3+ Sim Sim 4+ 47 K 4+ Natildeo Natildeo 4+ 48 D 3+ Natildeo Sim 2+ 49 E 3+ Sim Sim Negativo 50 K 4+ Natildeo Sim 4+
TOTAL 50 28 33 41
38
Figura 10 ndash TDA monoespeciacutefico da amostra de paciente Hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo da classe
IgG
oacute Figura 11 ndash TDA apoacutes o tratamento com glicina-aacutecidaEDTA (esquerda) e cloroquina (direita) A glicina
negativou completamente o TDA enquanto a hemaacutecia tratada com cloroquina persistiu positiva (1+)
39
Figura 12 ndash Fenotipagem da amostra tratada com glicina-aacutecidaEDTA Fy(a+b+) Jk(a-b+) S+s+
Figura 13 ndash Painel em gel (LissAGH) do eluato apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de
intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
Figura 14 ndash ndash Painel ezimaacutetico (hemaacutecias tratadas com bromelina) do eluato em gel neutro apoacutes
tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
40
528 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Quanto a efetividade das teacutecnicas em negativar o TDA foi verificado que a glicina-
aacutecidaEDTA foi efetiva em 66 das amostras testadas no primeiro tratamento (3350
amostras) enquanto a cloroquina conseguiu negativar 56 (2850) Esses resultados natildeo
apresentam diferenccedila significativa (pgt005) demostrando que a teacutecnica da glicina-
aacutecidaEDTA natildeo eacute superior mas eacute tatildeo efetiva quanto a da cloroquina
Quando aliamos os resultados de ambas as teacutecnicas verificamos que em 76 (3850)
das amostras o TDA foi negativado Esse dado indica que ainda que uma teacutecnica natildeo seja
eficaz na remoccedilatildeo do anticorpo eacute uma boa alternativa tentar a segunda teacutecnica jaacute que a falha
em remover o anticorpo utilizando uma delas natildeo prevecirc necessariamente a falha com a outra
Quando se utiliza o teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla (graacutefico 2) para comparar a utilizaccedilatildeo das
duas teacutecnicas com o resultado de cada uma isolada (somente a cloroquina ou somente a
glicina) verificamos que os resultados apresentam diferenccedila significativa (plt005) (quadro 3)
TRATAMENTO EFETIVO COM TOTAL PORCENTAGEM
Glicina ou cloroquina 38 76
Glicina e cloroquina 23 46
Glicina apenas 10 20
Cloroquina apenas 5 10
Nenhuma das teacutecnicas 12 24
Quadro 3 - Resultados comparativos entre as teacutecnicas utilizadas
41
Graacutefico 2 - Teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla entre as teacutecnicas aplicadas A- Glicina e Cloroquina B-Cloroquina C-
Glicina ( plt005)
42
6 DISCUSSAtildeO
Os reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA podem ser adquiridos em
forma de kit comercial prontos para uso poreacutem natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil A preparaccedilatildeo
dos reagentes ldquoin houserdquo a partir de sais comerciais adquiridos se mostrou viaacutevel Os
reagentes glicina e o tampatildeo Tris armazenados de forma correta se mantiveram estaacuteveis por
um periacuteodo de 7 meses Somente o reagente EDTA precipitou mesmo armazenado em
condiccedilotildees adequadas sugerindo que o mesmo deve ser preparado em menor quantidade e
armazenado em aliacutequotas A soluccedilatildeo de cloroquina tambeacutem pode ser preparada ldquoin houserdquo e
pode ser armazenado por um mecircs A legislaccedilatildeo brasileira autoriza a utilizaccedilatildeo de reagentes
preparados a partir de sais comerciais como a cloroquina e a glicina-aacutecidaEDTA desde que
os sais tenham autorizaccedilatildeo da vigilacircncia sanitaacuteria para a comercializaccedilatildeo (BRASIL 2001)
A comparaccedilatildeo quanto a efetividade em dissociar anticorpos em amostras com TDA
positivos entre a teacutecnica da glicina e a teacutecnica da cloroquina mostrou que natildeo haacute diferenccedila
estatiacutestica entre elas e que ambas satildeo igualmente eficientes Se utilizadas conjuntamente haacute
maior possibilidade de elucidaccedilatildeo dos casos
Uma vantagem da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eacute que ela permite numa mesma
amostra eluir o anticorpo ligado aacute hemaacutecia assim como fenotipar a hemaacutecia tratada Devido a
sua dupla utilidade a teacutecnica eacute vantajosa principalmente em pacientes em que pouco volume
de amostra pode ser coletado como em casos de crianccedilas e receacutem-nascidos
A fenotipagem poacutes tratamento se mostrou viaacutevel jaacute que os antiacutegenos de maior
importacircncia natildeo sofreram alteraccedilotildees Nas 20 amostras que foram fenotipadas antes e apoacutes
tratamento para verificar a influecircncia dos reagentes na expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a
Jkb S e s natildeo houve destruiccedilatildeo dos mesmos por nenhuma das duas teacutecnicas
Para as amostras positivas para o antiacutegeno Kell (350) e sensibilizadas com o
respectivo anticorpo a teacutecnica da glicina foi efetiva em negativar o TDA em apenas duas
delas mas apoacutes o tratamento foi verificada uma fraca reatividade da reaccedilatildeo antiacutegeno-
anticorpo sugerindo que houve um enfraquecimento da expressatildeo do antiacutegeno conforme
esperado e descrito na literatura (BYRNE 1991 PALLAS WILER E MCGEE 1991
ROZIERS e SQUALI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012 e KATHARIA e
CHAUDHARY 2013) A accedilatildeo da glicina sobre o antigeno Kell natildeo representa impedimento
para seu uso uma vez que na impossibilidade de testar o antiacutegeno Kell o banco de sangue
consegue facilmente atender a solicitaccedilatildeo de transfusatildeo com unidades de hemaacutecias Kell
43
negativas jaacute que eacute um antiacutegeno de baixa prevalecircncia na populaccedilatildeo variando de 15 na
populaccedilatildeo africana a 9 nos europeus (DANIELS 2011)
A soluccedilatildeo resultante da dissociaccedilatildeo do anticorpo pela teacutecnica da glicina pode ainda ser
utilizada como eluato podendo substituir a teacutecnica de eluiccedilatildeo com reagentes comercias (kits
de eluiccedilatildeo aacutecida) que tem alto custo aproximadamente entre R$2000 a R$2500 por teste
Em 41 amostras (82) houve a dissociaccedilatildeo e recuperaccedilatildeo do anticorpo que estava
sensibilizando as hemaacutecias Em 9 amostras (18) os anticorpos foram eluiacutedos poreacutem
apresentaram reaccedilatildeo negativa quando testadas com hemaacutecias de triagem entre eles o anti-E
(6) anti-S (2) e Anti-D (1) Eacute possiacutevel que a correccedilatildeo pH do meio (WALKER 2011) natildeo
tenha sido adequada o que pode ter desfavorecido a reatividade do anticorpo
Para as amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA nas quais natildeo houve dissociaccedilatildeo do
anticorpo pelo primeiro tratamento (1750) o segundo tratamento natildeo se mostrou eficaz jaacute
que 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise O tempo de
armazenagem natildeo parece ter influenciado jaacute que todas as amostras foram testadas dentro de
48 horas apoacutes a coleta Outros fatores que natildeo foram verificados podem ter levado a
hemoacutelise Apesar da literatura (LOUIE JIENG e ZEROULIS 1986 e BYRNE 1991)
recomendar um segundo tratamento ele eacute pouco eficaz tendo negativado apenas 3 das 17
amostras testadas
A amostra de paciente que apresentou sensibilizaccedilatildeo ldquoin vivordquo mostrou melhor
efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA sobre a da cloroquina possibilitando
fenotipagem para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s que natildeo foram destruiacutedos apoacutes o
tratamento comprovado atraveacutes da genotipagem
A presenccedila de autoanticorpo a quente com presenccedila de hemoacutelise (AHAI) ou natildeo pode
mascarar a presenccedila de aloanticorpo interferindo na rotina soroloacutegica da fenotipagem que eacute
uma importante ferramenta para auxiliar na seleccedilatildeo de hemaacutecias para transfusatildeo (SHIREY et
al 2002) Esses pacientes frequentemente possuem aloanticorpos associados ao
autoanticorpo e a prevalecircncia de aloimunizaccedilatildeo entre eles varia entre 12 a 40 (LEGER e
GARRATY 1999 BRANCH e PETZ 1999) o que dificulta ainda mais a escolha do melhor
componente a ser transfundido aleacutem de aumentar a possibilidade reaccedilotildees hemoliacuteticas imunes
poacutes-transfusionais
Nesses casos as teacutecnicas de dissociaccedilatildeo de anticorpos satildeo importantes para tratar
amostras de pacientes e a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser usada como uma opccedilatildeo
pois se mostrou eficaz na dissociaccedilatildeo anticorpo ligado agraves hemaacutecias deixando livre a
superfiacutecie das mesmas permitindo a fenotipagem por antisoros IgG Paralelamente os
44
anticorpos eluiacutedos tambeacutem puderam ser estudados O mesmo natildeo ocorre com a cloroquina
que permite apenas a fenotipagem e tampouco com os kits de eluiccedilatildeo aacutecida disponiacuteveis no
mercado nacional que satildeo destinados a realizaccedilatildeo do eluato mas destroem as hemaacutecias
O tempo de tratamento na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA tambeacutem eacute uma vantagem
pois foi possiacutevel reproduzir no tempo determinado de 2 minutos enquanto a cloroquina
demora ateacute duas horas
Ainda que a aplicaccedilatildeo das teacutecnicas por biologia molecular estejam cada vez mais
presentes na rotina imuno-hematoloacutegica e possibilitam estabelecer o fenoacutetipo deduzido do
genoacutetipo elas natildeo estatildeo disponiacuteveis na maioria dos centros e sua realizaccedilatildeo exige algumas
horas A resoluccedilatildeo imediata do problema transfusional necessita dos resultados soroloacutegicos
pois com frequecircncia natildeo eacute possiacutevel aguardar o resultado do teste molecular Dessa forma
apesar da crescente importacircncia da genotipagem eritrocitaacuteria teacutecnicas soroloacutegicas aplicadas
corretamente e no momento propiacutecio satildeo de grande utilidade para resolver problemas imuno-
hematoloacutegicos como ocorre com a fenotipagem em pacientes com TDA positivo
45
7 CONCLUSAtildeO
A teacutecnica da glicina aacutecidaEDTA mostrou-se efetiva em remover os anticorpos que
sensibilizavam as hemaacutecias e pode ser utilizada com seguranccedila antes da fenotipagem
eritrocitaacuteria Por ser uma teacutecnica de raacutepida execuccedilatildeo eacute uma alternativa aplicaacutevel
principalmente em casos urgentes de pacientes que apresentam autoanticorpos
46
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50
9 ANEXOS
51
FUNDACcedilAtildeO HEMOCENTRO DE RIBEIRAtildeO PRETO
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE)
Tiacutetulo da pesquisa Aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina aacutecida-EDTA e avaliaccedilatildeo da
eficaacutecia no tratamento de hemaacutecias com teste direto da antiglobulina positivo
Pesquisadora responsaacutevel Ceacutelia Kazue Abiko
Orientador Prof Dimas Tadeu Covas
Co-orientadora Dra Flaacutevia Leite Souza Santos
Objetivo da pesquisa Vocecirc estaacute sendo convidado a participar de uma pesquisa que tem
como objetivo padronizar uma nova teacutecnica para auxiliar na tipagem sanguiacutenea de pacientes
A tipagem sanguiacutenea pode sofrer interferecircncia da presenccedila de anticorpos ligados aos gloacutebulos
vermelhos do sangue Nessas situaccedilotildees eacute difiacutecil selecionar o melhor sangue para o paciente e
eacute preciso a utilizaccedilatildeo de teacutecnicas adicionais para remover essas interferecircncias
Esta pesquisa tem como objetivo estudar outra teacutecnica para remover esses anticorpos e
comparaacute-la com a teacutecnica atualmente utilizada Para isso precisamos de amostras de pacientes
e doadores voluntaacuterios
Se vocecirc eacute um doador eacute necessaacuterio que vocecirc autorize a coleta de 5 ml (1 tubo) a mais
de seu sangue
Se vocecirc eacute um paciente natildeo haveraacute necessidade de nova amostra pois utilizaremos as
amostras jaacute coletadas para os testes preacute-transfusionais e os resultados encontrados nesta
pesquisa natildeo iratildeo interferir na escolha da (s) bolsa (s) de sangue que vocecirc possa vir a receber
Se vocecirc concordar em participar leia com atenccedilatildeo o texto abaixo e assine as duas vias
rubricando todas as paacuteginas deste termo de consentimento Uma via original assinada e
rubricada por vocecirc e pela pesquisadora ficaraacute com vocecirc
As suas informaccedilotildees seratildeo mantidas em sigilo pela pesquisadora e natildeo haveraacute
armazenamento de material para pesquisas posteriores Os seus dados seratildeo usados apenas
neste estudo e quando o trabalho for publicado seu nome e qualquer outra informaccedilatildeo que
possam identificaacute-lo natildeo seratildeo revelados
Eacute pouco provaacutevel que o que noacutes aprendermos com este estudo tenha um benefiacutecio
direto para vocecirc assim como natildeo poderemos dar nada em troca pela sua participaccedilatildeo na
pesquisa
Nosso objetivo com esta pesquisa eacute que os resultados poderatildeo ser uacuteteis para o
tratamento de pacientes no futuro Os riscos da participaccedilatildeo satildeo miacutenimos Se vocecirc eacute um
doador de sangue a amostra seraacute coletada no momento da doaccedilatildeo natildeo exigindo punccedilatildeo
venosa adicional
52
Eacute seu direito ter acesso aos resultados dos testes da pesquisa Esses resultados natildeo
seratildeo fornecidos automaticamente a vocecirc mas caso vocecirc se interesse em saber o resultado ou
tiver alguma duacutevida sobre a sua participaccedilatildeo neste estudo deveraacute entrar em contato com Ceacutelia
Kazue Abiko pelo telefone (18) 99718-3551
Vocecirc tem total liberdade de optar por natildeo participar da pesquisa Caso aceite
participar poderaacute desistir a qualquer momento ou retirar seu consentimento mesmo apoacutes ter
coletado o sangue Para cancelar sua participaccedilatildeo basta avisar a pesquisadora e os seus dados
seratildeo retirados do projeto
Qualquer duacutevida eacutetica sobre a pesquisa poderaacute entrar em contato com o Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa do Hospital das Cliacutenicas e da Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto
(CAMPUS UNIVERSITAacuteRIO bairro Monte Alegre CEP 14048-900 Ribeiratildeo Preto-SP
Telefone (16) 3602-2228 FAX (16) 3633-1144 e-mail cephcrpuspbr)
Consentimento de participaccedilatildeo
A Consentimento do participante
Li as informaccedilotildees acima sobre o estudo e recebi explicaccedilotildees sobre a participaccedilatildeo no estudo
Portanto dou o meu consentimento para participar do estudo
___________________________________________________________________________
Nome completo
___________________________________________________________________________
Assinatura
___________
Data
__________________________________________________________________________________
Nome completo da pesquisadora
___________________________________________________________________________
Assinatura
_____________
Data
7
Rotineiramente eacute inviaacutevel estabelecer o fenoacutetipo eritrocitaacuterio completo de um
indiviacuteduo pela grande diversidade de sistemas sanguiacuteneos descritos Ate junho de 2015 jaacute
haviam sido classificados 308 antiacutegenos atribuiacutedos a 36 sistemas definidos pela Sociedade
Internacional de Transfusatildeo de Sangue (ISBT) (CASTILHO JUNIOR e REID 2015)
Portanto o paciente eacute normalmente fenotipado para os antiacutegenos de maior importacircncia
clinica
Alguns fatores podem limitar a realizaccedilatildeo da fenotipagem eritrocitaacuteria Um dos fatores
eacute a transfusatildeo alogecircnica realizada haacute menos de 90 dias Neste caso podem ocorrer resultados
falso positivos para determinados antiacutegenos devido agrave presenccedila de hemaacutecias do doador
(LAINE et al 2000)
Outro fator eacute a presenccedila de anticorpo sensibilizando a hemaacutecia do paciente e
provocando positividade do teste direto da antiglobulina humana (TDA) Os soros
normalmente utilizados para fenotipagem especialmente para os antiacutegenos Fya
(FY1) Fyb
(FY2) Jka
(JK1) Jkb
(JK2) S (MNS3) e s (MNS4) necessitam da fase de antiglobulina
humana (AGH) para que ocorra aglutinacatildeo Amostras que apresentam o TDA positivo
aglutinam apoacutes reaccedilatildeo com a AGH natildeo pela real presenccedila do antiacutegeno em sua superfiacutecie mas
pela interaccedilatildeo da AGH com o anticorpo que estaacute sensibilizando o eritroacutecito A interferecircncia
do TDA positivo pode ser anulada atraveacutes de algumas teacutecnicas capazes de dissociar o
anticorpo como por exemplo o tratamento da hemaacutecia sensibilizada com cloroquina ou com
glicina-aacutecida-EDTA (BRANCH e PETZ 1999 SHIREY et al 2002 e LEGER 2011)
12 METODOLOGIAS APLICADOS Agrave ROTINA IMUNO-HEMATOLOacuteGICA
Todos os testes que compotildeem a rotina preacute-transfusional usam meacutetodos soroloacutegicos
que envolvem a reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo e tem como objetivo determinar o perfil antigecircnico
eritrocitaacuterio do receptor e do doador assim como identificar em seu soro a presenccedila de
anticorpos contra antiacutegenos eritrocitaacuterios que possam comprometer a sobrevida das hemaacutecias
transfundidas Para testar o antiacutegeno na superfiacutecie da hemaacutecia eacute necessaacuterio dispor de um
antissoro com especificidade conhecida para aquele antiacutegeno Por outro lado para testar a
presenccedila de um determinado anticorpo no soro ou plasma do receptor eacute necessaacuterio o uso de
hemaacutecias com perfil antigecircnico conhecido (SANTOS 2014)
Diversas metodologias satildeo aplicadas nos laboratoacuterios de imunohematologia Cada
serviccedilo de hemoterapia faz a escolha do meacutetodo que seraacute aplicado de acordo com o perfil do
laboratoacuterio com o volume de exames diaacuterios e tambeacutem com o custo envolvido Todas essas
8
teacutecnicas tecircm como objetivo comum demonstrar a reaccedilatildeo entre antiacutegeno e anticorpo no
entanto elas se baseiam em diferentes princiacutepios Muitas metodologias satildeo atualmente
aplicadas agrave imunohematologia entre elas o sistema de fase soacutelida a tecnologia de hemaacutecias
magnetizadas a biologia molecular e ateacute mesmo a citometria de fluxo no entanto os meacutetodos
mais tradicionais satildeo aqueles baseados no princiacutepio de hemaglutinaccedilatildeo
121 MEacuteTODOS DE FASE FLUacuteIDA
Os meacutetodos de fase fluiacuteda satildeo testes baseados na hemaglutinaccedilatildeo e incluem o teste em
tubo e o teste em microplacas Uma suspensatildeo de hemaacutecias eacute adicionada ao plasma ou soro
em seguida eacute realizada a centrifugaccedilatildeo e por fim eacute feita a leitura do resultado que eacute
considerado positivo se for observado algum grau de aglutinaccedilatildeo ou hemoacutelise A intensidade
de aglutinaccedilatildeo eacute graduada de acordo com o tamanho dos agregados desprendidos da
superfiacutecie apoacutes agitaccedilatildeo delicada do tubo ou microplaca Os meacutetodos de hemaglutinaccedilatildeo satildeo
aplicados a todos os testes preacute-transfusionais Como os anticorpos ABO satildeo aglutininas frias
a tipagem eacute realizada em temperatura ambiente (22degC) no entanto ao investigar a presenccedila
de anticorpos irregulares que como jaacute mencionado eacute na maioria das vezes anticorpos
incompletos da classe IgG eacute essencial que a reaccedilatildeo seja incubada a 37degC As reaccedilotildees satildeo
facilitadas com a utilizaccedilatildeo de potencializadores e da antiglobulina humana (WALKER e
HARMENING 2012 AABB 2011)
Nos meacutetodos de fase fluiacuteda nos quais a AGH eacute empregada a fase de lavagem eacute
fundamental Apoacutes a incubaccedilatildeo do soro com as hemaacutecias deve ser realizada a lavagem da
reaccedilatildeo para remover o excesso de anticorpos natildeo ligados agraves hemaacutecias jaacute que os anticorpos
livres podem bloquear a AGH quando ela eacute adicionada e levar a resultados falso negativos
(AABB 2011)
Os testes de hemaglutinaccedilatildeo satildeo os mais tradicionais entre os meacutetodos ainda hoje
aplicados agrave rotina de bancos de sangue A vantagem desses meacutetodos eacute o baixo custo quando
comparado agraves teacutecnicas mais modernas mas apresentam tambeacutem desvantagens A teacutecnica em
tubo por exemplo natildeo permite automaccedilatildeo eacute trabalhosa e exige matildeo-de-obra bastante treinada
na execuccedilatildeo das diversas etapas do teste e mesmo assim pode haver subjetividade na
interpretaccedilatildeo dos resultados aleacutem de resultados falso-negativos (DOWNES 2011 ZANTEK
et al 2012)
9
122 COLUNAS DE GEL
A teacutecnica em gel iniciada na deacutecada de 90 representou uma grande revoluccedilatildeo na
rotina laboratorial tornando-se muito popular Aleacutem de ser sensiacutevel a teacutecnica dispensa a fase
de lavagem antes da adiccedilatildeo da AGH assim como a agitaccedilatildeo do teste para leitura reduzindo o
nuacutemero de resultados falsos negativos decorrentes dessas duas etapas e o tempo para
execuccedilatildeo dos testes (LAPIERRE et al 1989 NOVARETTI et al 2000 NOVARETTI et
al 2004) Os reagentes satildeo comercializados na forma de cartotildees plaacutesticos contendo
microtubos preenchidos por gel composto por microesferas de acrilamida-dextran Nesta
metodologia tambeacutem baseada na hemaglutinaccedilatildeo a suspensatildeo de hemaacutecias e o soro satildeo
depositados em uma cacircmara acima da coluna de gel e em seguida procede-se com a
centrifugaccedilatildeo dos cartotildees As microesferas atuam como uma malha que permite a passagem
em direccedilatildeo ao fundo do microtubo apenas das hemaacutecias natildeo aglutinadas enquanto as
hemaacutecias aglutinadas ficam retidas na parte superior da coluna ou ao longo dela (GREEN e
KLOSTERMANN 2012) Portanto quanto maior a agregaccedilatildeo mais hemaacutecias ficam retidas
no topo da coluna Dependendo do tipo de teste a ser realizado pode ser utilizado gel neutro
ou gel especiacutefico impregnado pelo anticorpo desejado e o gel contendo antiglobulina humana
que satildeo utilizados para os testes diretos e indiretos da antiglobulina (LAPIERRE et al 1989)
A coluna de gel ainda permite a visualizaccedilatildeo clara de duas populaccedilotildees distintas de hemaacutecias
como em pacientes receacutem transfundidos
123 BIOLOGIA MOLECULAR
A biologia molecular ou genotipagem estaacute sendo cada vez mais aplicada aos grupos
sanguiacuteneos pois fornece resultados seguros e precisos especialmente nos casos em que natildeo eacute
possiacutevel a realizaccedilatildeo da fenotipagem como em pacientes receacutem-transfundidos e pacientes
com TDA positivo Na genotipagem eacute possiacutevel determinar atraveacutes do DNA do paciente
extraiacutedo de seus leucoacutecitos de sangue perifeacuterico o fenoacutetipo eritrocitaacuterio deduzido sem
qualquer interferecircncia do anticorpo que sensibiliza a hemaacutecia ou de hemaacutecias alogecircnicas
transfundidas Sua realizaccedilatildeo no entanto exige o treinamento de equipe especializada e capaz
de interpretar os resultados em conjunto com os achados soroloacutegicos (JUNIOR e OLIVATO
2007)
Apesar de ser uma ferramenta de grande importacircncia hoje na imuno-hematologia
ainda estaacute restrito aos grandes centros de hemoterapia no Brasil poucos serviccedilos puacuteblicos de
sauacutede dispotildeem desse recurso e utilizam teacutecnicas de genotipagem de grupos sanguiacuteneos para
atendimento a seus pacientes Esta abordagem poreacutem vem sendo introduzida em algumas
10
instituiccedilotildees de reconhecida competecircncia na hemoterapia mas sua disponibilizaccedilatildeo deve
tornar-se mais generalizada atraveacutes da formaccedilatildeo de centros de referecircncia para atendimento
das diversas unidades de hemoterapia (MARTINS et al 2009) Dessa forma muitas decisotildees
transfusionais especialmente em urgecircncias ainda devem ser tomadas sem o resultado da
genotipagem eritrocitaacuteria
13 TESTE DA ANTIGLOBULINA
Coombs Mourant e Race descreveram em 1945 uma teacutecnica com utilizando soro de
coelho contendo antiglobulina humana (AGH) que posteriormente foi chamada de ldquosoro de
Coombsrdquo O meacutetodo foi desenvolvido inicialmente para ampliar o efeito de aglutininas fracas
do sistema Rh anticorpos ldquoincompletosrdquo que normalmente natildeo apresentavam aglutinaccedilatildeo
visiacutevel O teste foi concebido como um instrumento de investigaccedilatildeo de doenccedila hemoliacutetica do
receacutem-nascido e de reaccedilotildees transfusionais causadas por anticorpos Rh que estavam presentes
no soro dos paciente poreacutem que natildeo eram demonstraacuteveis pelas teacutecnicas ateacute entatildeo existentes
A maior parte dos anticorpos de significado cliacutenico assim como seus respectivos
antiacutegenos foram descritos apoacutes o surgimento do ldquosoro de Coombsrdquo em 1945 sendo assim o
teste da antiglobulina representa ateacute hoje a forma mais importante de aglutinaccedilatildeo artificial em
imunohematologia permitindo revelar a presenccedila de anticorpos na membrana da hemaacutecia A
antiglobulina humana eacute constituiacuteda por anticorpo especiacutefico contra a porccedilatildeo Fc de outro
anticorpo Quando um anticorpo ldquoincompletordquo sensibiliza a hemaacutecia normalmente natildeo
provoca aglutinaccedilatildeo visiacutevel Apoacutes a adiccedilatildeo da AGH ao meio esta reconhece e se liga agraves
porccedilotildees Fc dos anticorpos que sensibilizam a hemaacutecia formando assim uma malha e
provocando aglutinaccedilatildeo visiacutevel (BARJAS-CASTRO 2013)
Os reagentes de antiglobulina podem ser poliespeciacuteficos ou monoespeciacuteficos Os
poliespeciacuteficos satildeo uma mistura de anticorpos ant-IgG e anti-C3d (fraccedilatildeo C3d do
complemento) Os reagentes monoespecificos podem ser anti-IgG anti-IgM anti-IgA anti-
complemento podendo ser anti-C3d e anti-C3b
O teste da antiglobulina pode ser usado para detectar hemaacutecias sensibilizadas com
aloanticorpos IgG autoanticorpos IgG e componentes do complemento A sensibilizaccedilatildeo
pode ocorrer ldquoin vivordquo ou ldquoin vitrordquo O uso do AGH para detectar a sensibilizaccedilatildeo ldquoin vitrordquo
tem dois estaacutegios e eacute denominado teste indireto da antiglobulina A sensibilizaccedilatildeo ldquoin vivordquo eacute
detectada em procedimento de um uacutenico estagio chamado teste direto da antiglobulina (TDA)
11
Os testes direto e indireto satildeo ateacute hoje amplamente aplicados como princiacutepio de inuacutemeros
testes soroloacutegicos em imuno-hematologia (GREEN e KLOSTERMANN 2012)
131 TESTE DIRETO DA ANTIGLOBULINA
O teste direto da antiglobulina humana revela a presenccedila de anticorpo eou fraccedilatildeo do
complemento ligados agrave superfiacutecie das hemaacutecias As sensibilizaccedilatildeo das hemaacutecias ocorrida ldquoin
vivordquo natildeo eacute visualizada mas apoacutes a adiccedilatildeo da antiglobulina humana ocorre a aglutinaccedilatildeo que
eacute visualizada macroscopicamente (Figura 1)
Figura 1 - Princiacutepio da teacutecnica direta da antiglobulina Teste utilizado para demonstrar a sensibilizaccedilatildeo ldquoin
vivordquo das hemaacutecias O sangue total eacute coletado do paciente em tubo contendo anticoagulante EDTA Na teacutecnica
realizada em tubo uma suspensatildeo de hemaacutecias 5 em soluccedilatildeo de salina eacute preparada Uma gota dessa suspensatildeo
eacute lavada 3 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica para retirada de anticorpos que estatildeo livres no plasma Toda soluccedilatildeo eacute
retirada e adiciona-se o soro de Coombs (antiglobulina humana) O soro de Coombs reconhece os anticorpos que
estatildeo ligados agrave superfiacutecie das hemaacutecias fazendo com que ocorra aglutinaccedilatildeo visiacutevel macroscopicamente
Apesar de natildeo ser um teste preacute-transfusional obrigatoacuterio o TDA eacute um dos testes mais
importantes para investigar e classificar quadros hemoliacuteticos como de origem imune ou natildeo
imune O seu valor preditivo positivo em vigecircncia de anemia hemoliacutetica eacute de 83 poreacutem natildeo
havendo sinais de hemoacutelise seu valor preditivo eacute apenas 14 Eacute por esse motivo que a
interpretaccedilatildeo do TDA positivo deve levar em consideraccedilatildeo a histoacuteria cliacutenica e os resultados
dos outros exames laboratoriais A realizaccedilatildeo do TDA eacute obrigatoacuteria na investigaccedilatildeo
12
laboratorial de diversos quadros hemoliacuteticos entre eles a anemia hemoliacutetica autoimune
(AHAI) a reaccedilatildeo hemoliacutetica imune poacutes-transfusional a siacutendrome do linfoacutecito passageiro a
doenccedila hemoliacutetica perinatal e a hemoacutelise droga-dependente (LEGER 2011)
Resultados de TDA positivos foram tambeacutem observados em indiviacuteduos com niacuteveis
seacutericos elevados de IgG ou complemento sem evidecircncia de anemia hemoliacutetica imune como
em pacientes com doenccedila falciforme talassemia doenccedila renal crocircnica mieloma muacuteltiplo
doenccedilas autoimunes e siacutendrome da imunodeficiecircncia adquirida (SIDA) Aleacutem disso pequenas
quantidades de IgG (5 a 90 moleacuteculas por hemaacutecia) e complemento (5 a 40 moleacuteculas por
hemaacutecia) podem estar presentes nas hemaacutecias de indiviacuteduos saudaacuteveis sem associaccedilatildeo com
reduccedilatildeo na sobrevida das mesmas A positividade do TDA depende da populaccedilatildeo estudada e
pode variar de 01 entre doadores de sangue sem qualquer sinal cliacutenico de hemoacutelise ateacute
15 em pacientes hospitalizados (CASTILHO JUNIOR e REID 2015 LEGER 2011)
Indiviacuteduos que apresentam TDA positivo seja agraves custas de IgG eou complemento
com ou sem sinais cliacutenicos de hemoacutelise teratildeo a fenotipagem eritrocitaacuteria prejudicada A
fenotipagem de indiviacuteduos com TDA positivo especialmente quando utilizado o teste indireto
da antiglobulina pode acarretar resultados falsos positivos e levar a seleccedilatildeo de fenoacutetipo
incorreto para transfusatildeo
132 TESTE INDIRETO DA ANTIGLOBULINA
O teste indireto da antiglobulina (TIA) eacute utilizado para revelar a sensibilizaccedilatildeo ldquoin
vitrordquo das hemaacutecias e eacute aplicado a diversos testes soroloacutegicos em imunohematologia entre
eles a pesquisa de anticorpos identificaccedilatildeo de anticorpos testes de compatibilidade
fenotipagem eritrocitaacuteria e titulaccedilatildeo de anticorpos Na teacutecnica indireta a hemaacutecia que contecircm
o antiacutegeno eacute colocada em contato ldquoin vitrordquo com o anticorpo que se liga mas natildeo promove a
aglutinaccedilatildeo visiacutevel A adiccedilatildeo da AGH forma uma malha entre os anticorpos que sensibilizam
as hemaacutecias e provoca a aglutinaccedilatildeo macroscoacutepica (figura 2)
Caso a amostra de hemaacutecia estudada seja previamente sensibilizada resultados falsos
positivos podem ser obtidos no TIA jaacute que a AGH reagiraacute com a moleacutecula que sensibilizava
anteriormente a hemaacutecia mesmo se o anticorpo especiacutefico natildeo tiver se ligado ao antiacutegeno
correspondente
13
133 CONDICcedilOtildeES CLIacuteNICAS COM TDA POSITIVO
O TDA positivo deve ser interpretado cuidadosamente sempre em conjunto com o
quadro cliacutenico do paciente A positividade isolada do TDA natildeo significa hemoacutelise A
interpretaccedilatildeo do teste positivo requer o conhecimento do diagnoacutestico do paciente da presenccedila
de sinais e sintomas sugestivos de hemoacutelise assim como de seu histoacuterico transfusional
gestacional e de informaccedilotildees sobre o uso recente de medicaccedilotildees (LEGER 2011)
Figura 2 ndash Princiacutepio do teste indireto da antiglobulina O TIA pode ser utilizado na pesquisa de anticorpos de
especificidades desconhecidas livres no soroplasma como eacute o caso da pesquisa e identificaccedilatildeo de anticorpos
irregulares Ele eacute tambeacutem utilizado para determinar a presenccedila de antiacutegenos na membrana da hemaacutecia quando
satildeo empregados soros de especificidades conhecidas da classe IgG No primeiro caso o soroplasma contendo o
anticorpo desconhecido eacute colocado em contato com hemaacutecias cujo perfil antigecircnico eacute conhecido No segundo
caso utiliza-se soro de especificidade conhecida da classe IgG para determinar a presenccedila ou ausecircncia de um
antiacutegeno na membrana O anticorpo encontra o antiacutegeno correspondente e ocorre a ligaccedilatildeo do anticorpo agrave
hemaacutecia mas natildeo ocorre aglutinaccedilatildeo Apoacutes a adiccedilatildeo da AGH que se liga aos anticorpos formando uma malha
ocorre a aglutinaccedilatildeo visiacutevel
O TDA positivo eacute uma achado claacutessico de algumas condiccedilotildees cliacutenicas como a reaccedilatildeo
transfusional hemoliacutetica a doenccedila hemoliacutetica do feto e do receacutem-nascido (DHFRN) a anemia
hemoliacutetica induzida por drogas a siacutendrome do linfoacutecito passageiro e a anemia hemoliacutetica
autoimune (AHAI) Portanto o TDA positivo pode ser decorrente da sensibilizaccedilatildeo da
hemaacutecia autoacuteloga por um autoanticorpo ou por um aloanticorpo ligado agrave hemaacutecia alogecircnica
circulante A positividade do TDA pode ainda ocorrer de forma passiva em pacientes que
14
recebem imunoglobulinas humanas ou ainda pela transfusatildeo de plaquetas ABO natildeo idecircntico
(LEGER 2011 RALPH 2012 ZANTEK et al 2012)
Nas reaccedilotildees transfusionais hemoliacuteticas imunes o aloanticorpo do receptor sensibiliza
as hemaacutecias transfundidas do doador e reduz sua sobrevida ao removecirc-la precocemente da
circulaccedilatildeo pela fagocitose no sistema retiacuteculo-endotelial ou pela hemoacutelise intravascular As
reaccedilotildees podem ser agudas se ocorrem ateacute 24 horas ou tardias quando ocorrem apoacutes 24 horas
da transfusatildeo A gravidade das reaccedilotildees hemoliacuteticas pode variar de um simples rendimento
transfusional inadequado agrave quadros graves de hemoacutelise intravascular evoluindo ateacute mesmo
com choque vascular e oacutebito O TDA pode resultar negativo caso toda massa eritrocitaacuteria
transfundida tenha sido destruiacuteda (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
Na doenccedila hemoliacutetica do feto e do receacutem-nascido (DHFRN) anticorpos maternos da
classe IgG atravessam a barreira placentaacuteria e sensibilizam as hemaacutecias fetais que seratildeo
destruiacutedas precocemente levando agrave anemia fetal Apesar da incompatibilidade ABO feto-
materna ser a causa mais frequente de DHFRN raramente ela eacute responsaacutevel pela ocorrecircncia
de quadros graves Por outro lado anticorpos contra antiacutegenos do sistema Rh e Kell
especialmente Anti-D (Anti-RH1) Anti-c (Anti-RH4) e Anti-Kell (Anti-KELL1) satildeo
conhecidos por causar DHFRN severa Raramente outros anticorpos tambeacutem podem estar
implicados na DHFRN como os anticorpos contra antiacutegenos do sistema Kidd Duffy MNS e
Diego (ZANTEK et al 2012)
A hemoacutelise droga-dependente eacute causada pela produccedilatildeo de um anticorpo voltado contra
a droga ligada agrave membrana eritrocitaacuteria ou ainda contra o complexo droga-membrana A
classe de medicaccedilotildees mais comumente envolvida eacute a dos antimicrobianos betalactacircmicos
(penicilinas e cefalosporinas) mas outras classes como quimioteraacutepicos e anti-inflamatoacuterios
tambeacutem satildeo descritos (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
Apoacutes transplante de ceacutelulas progenitoras hematopoieacuteticas em que o doador possui
anticorpos contra antiacutegenos eritrocitaacuterios do receptor o linfoacutecito de memoacuteria do doador pode
resistir ao esquema imunossupressor utilizado e continuar a produccedilatildeo de anticorpos que
reconhecem a hemaacutecia incompatiacutevel do receptor ainda circulante O quadro cliacutenico pode
variar de um simples TDA positivo sem outros sinais ou sintomas ateacute um quadro hemoliacutetico
grave e abrupto (LEGER 2011)
15
134 ANEMIA HEMOLIacuteTICA AUTOIMUNE
A anemia hemoliacutetica autoimune eacute caracterizada pela destruiccedilatildeo precoce das hemaacutecias
autoacutelogas por autoanticorpos que sensibilizam as hemaacutecias e levam agrave fagocitose pelos
macroacutefagos no sistema reticulo-endotelial ou hemoacutelise intravascular O diagnoacutestico da AHAI
baseia-se na presenccedila de hemoacutelise cliacutenica associada agrave evidecircncia de fator imune representado
pelo TDA positivo As classes de anticorpos envolvidas em quadros de AHAI satildeo IgG IgM e
raramente IgA (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012) Satildeo raros os casos de AHAI com TDA
negativo que podem estar relacionados a um autoanticorpo de baixa avidez de densidade
inferior agrave detecccedilatildeo do meacutetodo ou ainda de classe de imunoglobulina natildeo avaliada pelo
meacutetodo utilizado para o teste (GARRATY 2005)
A AHAI pode ser classificada em dois grupos principais de acordo com a melhor
temperatura de reaccedilatildeo do autoanticorpo As anemias hemoliacuteticas causadas por anticorpos
quentes que reagem melhor a 37oC e geralmente IgG representam 80 dos casos de AHAI
Nas AHAI por anticorpo quente o TDA pode ser positivo para IgG mais complemento (67)
somente IgG (20) ou somente por complemento (13) As anemias causadas por
anticorpos frios geralmente da classe IgM e que reagem melhor em temperatura ambiente ou
a 4oC representam aproximadamente 20 dos casos de AHAI Por exibirem amplitude
teacutermica esses anticorpos ligam-se agraves hemaacutecias ao atingirem a circulaccedilatildeo nas extremidades do
corpo fixam o complemento e desprendem-se da hemaacutecia apoacutes retornar para partes mais
quentes Por esse motivo em AHAI por anticorpos frios o TDA eacute positivo apenas agraves custas
de C3 e normalmente o IgM natildeo eacute detectado (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
A presenccedila do autoanticorpo IgG pode ser confirmada atraveacutes da eluiccedilatildeo do anticorpo
da hemaacutecia Tipicamente o eluato na AHAI por anticorpo quente reage com todas as ceacutelulas
testadas de um painel de hemaacutecias alogecircnicas do tipo ldquoOrdquo ou pode eventualmente exibir uma
especificidade conhecida como Anti-e (Anti-RH5) Nas AHAI a frio por sua vez espera-se
um eluato negativo (LEGER 2011)
Os autoanticorpos satildeo com frequecircncia encontrados livres no plasma e natildeo somente
ligados agraves hemaacutecias autoacutelogas Eles podem interferir em todas as fases dos testes preacute-
transfusionais nas quais o plasma eacute testado especialmente os autoanticorpos quentes que
acarretam resultados positivos em todos os testes levados agrave fase de antiglobulina humana
Esses anticorpos portanto positivam a pesquisa de anticorpos irregulares e mascaram a
presenccedila de aloanticorpos de significado cliacutenico Aproximadamente 60 dos pacientes que
apresentam AHAI a quente apresentam anticorpos que reagem em meio salino mas se forem
16
levados em conta meacutetodos mais sensiacuteveis como PEG enzima e estudo em gel a positividade
pode ser superior a 90 (LEGER 2011)
Aleacutem da eficaacutecia da transfusatildeo ser comprometida pela diminuiccedilatildeo da vida-meacutedia das
hemaacutecias a presenccedila do autoanticorpo dificulta a realizaccedilatildeo dos testes preacute-transfusionais e
compromete a seguranccedila transfusional Os autoanticorpos reagem normalmente como
panaglutininas pois satildeo normalmente voltados contra antiacutegenos puacuteblicos na maior parte das
vezes contra antiacutegenos do sistema Rh Por apresentarem essas caracteriacutesticas podem ainda
mascarar a presenccedila de aloanticorpos de significado clinico e levar a testes de compatibilidade
positivos exigindo uma avaliaccedilatildeo criteriosa da necessidade da transfusatildeo (BRANCH e PETZ
1999 JUNIOR e OLIVATO 2004)
Remover a interferecircncia do autoanticorpo para avaliar a presenccedila de aloanticorpos
mascarados nem sempre eacute possiacutevel mesmo utilizando teacutecnicas de autoadsorccedilatildeo ou
aloadsorccedilatildeo que aleacutem de tudo satildeo demoradas e exigem de 2 a 6 horas para conclusatildeo
(GARRATY e GEORGE 2002) Nesses casos a fenotipagem eritrocitaacuteria do paciente eacute de
extrema utilidade especialmente em situaccedilotildees de urgecircncia A definiccedilatildeo do fenoacutetipo do
paciente para os antiacutegenos de maior importacircncia cliacutenica pode auxiliar a seleccedilatildeo de unidades
de hemaacutecias com mesmo fenoacutetipo o que garante que eventuais aloanticorpos natildeo
identificados sejam respeitados e tambeacutem evita nova sensibilizaccedilatildeo (JUNIOR e OLIVATO
2004 SHIREY et al 2002)
135 TRATAMENTO DE HEMAacuteCIAS COM TDA POSITIVO
O TDA positivo impede a fenotipagem eritrocitaacutecia por meacutetodos que exigem a fase de
AGH uma vez que a aglutinaccedilatildeo ocorreraacute devido agrave interaccedilatildeo da AGH com o autoanticorpo
que sensibiliza a hemaacutecia do paciente levando a resultados falso positivos Em algumas
situaccedilotildees como na AHAI por anticorpo quente a fenotipagem eacute especialmente importante
pois o autoanticorpo interfere na triagem e identificaccedilatildeo de anticorpos assim como no teste de
compatibilidade e dificultam a detecccedilatildeo de aloanticorpos de significado cliacutenico que
obrigatoriamente devem ser respeitados Nessas situaccedilotildees a fenotipagem eritrocitaacuteria
determina o perfil antigecircnico do paciente e possibilita o fornecimento de unidades de
hemaacutecias com o mesmo fenoacutetipo para a transfusatildeo evitando a sensibilizaccedilatildeo para novos
antiacutegenos assim como reaccedilotildees hemoliacuteticas transfusionais No entanto eacute necessaacuterio aplicar
meacutetodos que natildeo sofram interferecircncia do TDA positivo ou seja meacutetodos que natildeo necessitem
da fase de AGH ou meacutetodos de bloqueio do anticorpo sem bloquear o antiacutegeno Uma opccedilatildeo eacute
a utilizaccedilatildeo de soros monoclonais IgM (salinos ou de meio proteico natildeo concentrado) mas
17
nem sempre esses reagentes estatildeo disponiacuteveis especialmente os reagentes monoclonais para
os antiacutegenos dos sistemas Duffy ( Fya Fy
b) Kidd ( Jk
a Jk
b) e MNS (S s) (JUNIOR e
OLIVATO 2004) Outra opccedilatildeo eacute a teacutecnica de bloqueio que pode ser utilizada para tratar
hemaacutecias para posterior fenotipagem em casos de TDA positivos com reatividade le2+
Em casos onde a positividade do TDA eacute maior que 2+ estaacute indicada a tratamento
quiacutemico para remoccedilatildeo da interferecircncia do autoanticorpo antes de realizar a fenotipagem Entre
as teacutecnicas utilizadas atualmente estatildeo o ZZAP a cloroquina e a glicina aacutecidaEDTA
1351 TEacuteCNICA DE BLOQUEIO
A teacutecnica de bloqueio se baseia na utilizaccedilatildeo de anti-IgG (Coombs monoespeciacutefico)
para tratar as hemaacutecias com TDA positivo O anticorpo anti-IgG se liga aos anticorpos que
estatildeo sensibilizando a hemaacutecias poreacutem sem o bloquear os antiacutegenos Os antiacutegenos que natildeo
estatildeo sensibilizados podem ser detectados atraveacutes dos antissoros especiacuteficos (SERERAT
VEIDT E DUTCHED 2000)
1352 TRATAMENTO DE HEMAacuteCIAS COM ZZAP
O Sulphydryl-Proteolytic Enzyme (ZZAP) que eacute uma mistura de ditiotreitol (DTT)
mais papaiacutena ativada com cisteiacutena eacute um reagente capaz de dissociar imunoglobulinas da
classe IgG ligadas a membrana dos eritroacutecitos enquanto trata enzimaticamente as hemaacutecias
O tratamento enzimaacutetico tambeacutem potencializa a ligaccedilatildeo do autoanticorpo ao antiacutegeno e
acelera o processo de autoadsorccedilatildeo O ZZAP pode desnaturar os antiacutegenos do sistema Duffy
MNS e Kell o que limita sua aplicaccedilatildeo para fins de fenotipagem (BRANCH e PETZ 1982)
1353 CLOROQUINA
Em 1982 Edwards Moulds e Judd propuseram a utilizaccedilatildeo da teacutecnica da cloroquina
que dissociava os complexos antiacutegeno-anticorpo e mantinha a membrana das hemaacutecias
iacutentegras Os derivados quinolecircicos jaacute haviam sido descritos anteriormente por Domokos e
Aszody em 1964 e Holtz Mantel e Buck em 1973 (apud Edwards Moulds e Judd 1982) pela
sua capacidade de separar imunocomplexos e inibir as reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo reduzindo
as cargas eleacutetricas das superfiacutecie das hemaacutecias A teacutecnica eacute uma das mais utilizadas nos
centros brasileiros para remover a interferecircncia do autoanticorpo e eacute tambeacutem a teacutecnica
atualmente adotada pelo laboratoacuterio de imunohematologia do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto
18
Edwards Moulds e Judd (1982) demonstraram que a teacutecnica da cloroquina para
dissociaccedilatildeo de anticorpos eacute uma teacutecnica simples efetiva e confiaacutevel para dissociar
imunoglobulina das hemaacutecias Desde que a membrana das hemaacutecias permaneccedila intacta natildeo
haacute perda da reatividade dos antiacutegenos e a sua maior aplicaccedilatildeo eacute a fenotipagem de hemaacutecias
com TDA positivo Os autores verificaram que em 83 das amostras sensibilizadas in vivo e
22 amostras (no total de 40) sensibilizadas ldquoin vitrordquo apresentaram TDA negativo e
puderam ser fenotipadas A teacutecnica poreacutem natildeo consegue remover os componentes do
complemento na maioria dos casos
Champagne e colaboradores (1999) testaram a teacutecnica da cloroquina para dissociar
antiacutegenos Bg comparando com a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA e verificaram vantagem em
relaccedilatildeo ao uso de um uacutenico reagente diminuindo a manipulaccedilatildeo e verificou que o mesmo natildeo
destroacutei antiacutegeno Kell
A cloroquina tambeacutem mostrou-se pouco efetivo em remover anticorpos do sistema
Duffy da superfiacutecie das hemaacutecias (EDWARDS MOUDS e JUDD 1982 ROZIERS e
SQUALI 1997)
1353 GLICINA-AacuteCIDAEDTA
A afinidade e a estabilidade entre a ligaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo eacute definida como a
resultante entre forccedilas atrativas e repulsivas entre ambos (CARUCIO e WISE 2012) e resulta
da somatoacuteria de forccedilas quiacutemicas dinacircmicas e fracas (natildeo covalentes) como pontes de
hidrogecircnio forcas eletrostaacuteticas forca de Van der Waals e pontes hidrofoacutebicas A estabilidade
dessa ligaccedilatildeo eacute facilmente abalada por alteraccedilotildees quiacutemicas e fiacutesicas no meio da reaccedilatildeo como
a alteraccedilatildeo do pH A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA se baseia na mudanccedila do pH para a
quebra da ligaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo (KOSANKE 2012)
A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA foi primeiramente descrita em 1986 por Louie Jieng
e Zeroulis que utilizaram 50 amostras de doadores sensibilizados ldquoin vitrordquo com anticorpos A
teacutecnica foi efetiva em 48 amostras permitindo o estudo do eluato assim como a fenotipagem
das hemaacutecias Os autores testaram tambeacutem a teacutecnica em 100 hemaacutecias TDA positivo que
puderam ser utilizadas para teacutecnicas de autoadsorccedilatildeo
Byrne (1991) descreveu a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA modificada e tambeacutem
verificou como uma opccedilatildeo para o tratamento de hemaacutecias com TDA positivo que deixava as
hemaacutecias intactas e o eluato viaacutevel para ser fenotipado
19
Roziers e Squali (1997) e Katharia e Chaudhary (2013) compararam a teacutecnica da
glicina-aacutecidaEDTA com as teacutecnicas da cloroquina e do aquecimento Verificaram maior
eficiecircncia da glicina-aacutecidaEDTA em relaccedilatildeo as outras duas teacutecnicas pois com uma mesma
quantidade de amostra produzia as hemaacutecias livres de anticorpo e tambeacutem o eluato Mostrou-
se ainda superior devido ao menor tempo exigido para sua realizaccedilatildeo o que favorece seu uso
em situaccedilotildees de urgecircncia e emergecircncia
As duas desvantagens da teacutecnica poreacutem eacute o fato de destruir os antiacutegenos do sistema
Kell e o fato de natildeo remover fraccedilotildees do complemento ligadas agrave hemaacutecia (PALLAS WILER e
McGEE 1991 ROZIERS e SQUALLI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012
e KATHARIA e CHAUNDHARY 2013)
20
2 OBJETIVOS
21 OBJETIVO GERAL
211 Avaliar a eficaacutecia da glicina-aacutecidaEDTA em remover os anticorpos ligados agraves
hemaacutecias sensibilizadas por anticorpos da classe IgG
22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
221 Preparaccedilatildeo dos reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
verificaccedilatildeo da estabilidade dos mesmos e avaliar custos
222 Testar a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA em amostras de hemaacutecias
sensibilizadas por anticorpos antieritrocitaacuterios humanos
223 Comparar a efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA com a teacutecnica da
cloroquina quanto a capacidade de remover a interferecircncia do anticorpo ligado
a hemaacutecia
224 Testar o eluato das amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA
225 Verificar se houve destruiccedilatildeo dos antiacutegenos eritrocitaacuterios apoacutes o tratamento
com glicina-aacutecidaEDTA e com cloroquina
226 Verificar se o tempo de execuccedilatildeo da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA descrito
nos textos de referecircncia eacute reprodutiacutevel
21
3 JUSTIFICATIVA
Algumas condiccedilotildees cliacutenicas podem levar ao depoacutesito ldquoin vivordquo de anticorpos eou
fraccedilotildees do complemento sobre as hemaacutecias Entre elas estatildeo as reaccedilotildees hemoliacuteticas poacutes-
transfusionais a doenccedila hemoliacutetica perinatal o uso de medicamentos e principalmente a
AHAI Na AHAI um anticorpo normalmente da classe IgG ou IgM reconhece antiacutegenos
proacuteprios na membrana eritrocitaacuteria e reduz a sobrevida da hemaacutecia levando a sua destruiccedilatildeo
pelos macroacutefagos no sistema reticulo-endotelial ou agrave ativaccedilatildeo do complexo de ataque agrave
membrana e agrave lise intravascular Os autoanticorpos satildeo voltados na maioria das vezes contra
antiacutegenos eritrocitaacuterios de alta frequecircncia populacional conhecidos como antiacutegenos puacuteblicos
e por este motivo reconhecem tanto hemaacutecias autoacutelogas quanto alogecircnicas
Devido agrave presenccedila do autoanticorpo livre no plasma e tambeacutem do anticorpo eou
complemento ligado agrave hemaacutecia o banco de sangue pode encontrar dificuldades em todas as
fases dos testes preacute-transfusionais do paciente com AHAI e deve utilizar teacutecnicas que
auxiliem na escolha do melhor hemocomponente melhorando a seguranccedila transfusional Essas
teacutecnicas visam remover a interferecircncia do autoanticorpo livre no soro e do autoanticorpo
ligado agrave hemaacutecia permitindo a detecccedilatildeo de aloanticorpos associados e a realizaccedilatildeo da
fenotipagem eritrocitaacuteria respectivamente
A finalizaccedilatildeo dos testes preacute-tranfusionais na presenccedila de autoanticorpo pode levar
algumas horas e nem sempre o paciente poderaacute aguardar Nesse contexto torna-se vantajosa a
aplicaccedilatildeo de teacutecnicas de raacutepida execuccedilatildeo
O presente estudo propotildee aplicar e avaliar a eficaacutecia da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
em remover os anticorpos ligados agrave hemaacutecia o que permite a fenotipagem eritrocitaacuteria
estendida e a seleccedilatildeo de concentrados de hemaacutecias com mesmo fenoacutetipo do paciente
Atualmente no Hemocentro de Ribeiratildeo Preto a teacutecnica utilizada para esse fim eacute o
tratamento das hemaacutecias com difosfato de cloroquina cujo tempo de execuccedilatildeo pode demorar
ateacute duas horas enquanto a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser realizada em apenas dois
minutos o que a tornaria opccedilatildeo de escolha especialmente em situaccedilotildees de urgecircncia Ao
contraacuterio da cloroquina a glicina-aacutecidaEDTA permite tambeacutem o estudo do eluato das
hemaacutecias tratadas
22
4 METODOL OGIA
41 AMOSTRAS DE DOADORES
Foram coletados 50 amostras de doadores de sangue que compareceram ao
Hemonuacutecleo de Araccedilatuba no periacuteodo de junho a agosto de 2016 Foram convidados a
participar da pesquisa doadores de repeticcedilatildeo do tipo sanguiacuteneo ldquoOrdquo RhD positivo
cadastrados no sistema de banco de sangue (SBS) do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto
Todos os doadores que concordaram em participar da pesquisa assinaram o termo de
consentimento livre e esclarecido (TCLE)
No momento da doaccedilatildeo foram coletados adicionalmente 5 mL de sangue total em
soluccedilatildeo anticoagulante EDTA (aacutecido dietilenoaminoaceacutetico) dispensando punccedilatildeo venosa
adicional para coleta da amostra O fluxograma 1 resume as etapas desenvolvidas no projeto
Fluxograma 1 - Fluxo da pesquisa utilizando as amostras de doadores
23
411 FENOTIPAGEM
Foram verificados se os doadores jaacute tinham fenotipagem para outros sistemas de
grupos sanguiacuteneos aleacutem do sistema ABORh que eacute realizado rotineiramente
A fenotipagem eritrocitaacuteria para outros sistemas ou fenotipagem estendida eacute realizada
para identificar a presenccedila ou ausecircncia de antiacutegenos considerados de importacircncia cliacutenica No
Hemonuacutecleo de Araccedilatuba uma parcela de doadores de repeticcedilatildeo satildeo fenotipados para os
antiacutegenos dos sistemas de grupo sanguiacuteneo Rh (antiacutegenos C c E e e) Kell (antiacutegeno K)
Duffy (antiacutegenos Fya e Fy
b) Kidd (antiacutegenos Jk
a e Jk
b) e sistema MNSs (antiacutegenos S e s)
A fenotipagem para o Rh e Kell eacute realizada por metodologia de microplaca utilizando
25 microL de hemaacutecia lavada e diluiacuteda a 5 em salina e 25 microL do antissoro comercial especiacutefico
A reaccedilatildeo eacute incubada 15 minutos a temperatura ambiente e centrifugadas para leitura Para os
antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s a metolodogia utilizado eacute gel contendo antiglobulina
humana (gel LissCoombs poliespeciacutefico) da marca BIO-RAD onde se utiliza suspensatildeo de
hemaacutecia em LISS (Soluccedilatildeo de baixa forccedila iocircnica) A suspensatildeo eacute preparada atraveacutes da
diluiccedilatildeo de 10 microL de hemaacutecia em 1000 microL de LISS Pipetado 50 microL dessa diluiccedilatildeo no gel e
adicionado 25 microL do antissoro especiacutefico Incuba-se em banho seco por 15 minutos a 37 deg
Celsius e eacute centrifugado em centriacutefuga especiacutefica Os antissoros utilizados eram das marcas
Fresenius e Lorne
Foi verificado a fenotipagem do doador no banco de dados do Hemocentro Os
registros dos fenoacutetipos dos doadores ficam armazenadas no sistema de banco de sangue
(SBS) Para doadores que natildeo tinham fenotipagem estendida preacutevia para antiacutegenos do sistema
Rh (C c E e e) e Kell (K) foi realizada a fenotipagem para esses antiacutegenos
O tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA e cloroquina para dissociar
anticorpos pode inativar enfraquecer ou destruir os antiacutegenos presentes nas hemaacutecias
alterando assim os resultados da fenotipagem Para verificar se houve destruiccedilatildeo dos
antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a e Jk
b S e s nas amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes
tratamento foram novamente fenotipadas ao final para os antiacutegenos que eram inicialmente
positivas
A repeticcedilatildeo da fenotipagem foi realizada nas amostras que apresentaram efetividade
no tratamento da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eou da cloroquina e a detecccedilatildeo do antiacutegeno
na amostra preacute-tratamento
24
412 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS HEMAacuteCIAS
As hemaacutecias foram sensibilizadas com antissoros policlonais humanos de amostras de
plasma fresco congelado de doadores com resultado de pesquisa de anticorpo irregular
positivos
A escolha do anticorpo para sensibilizar as hemaacutecias foi definida de acordo com o
fenoacutetipo do doador que deveria ser positivo para o respectivo antiacutegeno
Para a sensibilizaccedilatildeo um volume de antissoro (1 mL) e um volume (1 mL) de
hemaacutecias lavadas quatro vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica foram adicionadas a um tubo de 12 x
75 mm A mistura foi homogeneizada e incubada em banho maria (BM) a 37deg C por 60
minutos A seguir as hemaacutecias foram novamente lavadas 4 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica
para retirada dos anticorpos que natildeo se ligaram A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada
como controle negativo O teste da uacuteltima lavagem eacute importante para assegurar que os
anticorpos que poderatildeo ser detectados no eluato apoacutes o tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA
sejam aqueles que estavam ligados agraves hemaacutecias e natildeo aqueles livres no plasma O controle
negativo mostra que todo o anticorpo livre foi retirado (LEGER 2011)
Para o teste de presenccedila de anticorpo na soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foram incubadas
com hemaacutecias de triagem de anticorpos irregulares (ID-Diacell BIO-RAD) contendo os
antiacutegenos especiacuteficos Realizado a teacutecnica em gel LissCoombs com anti-IgG+C3d Incubado
no tempo de 15 minutos a temperatura de 37deg C e centrifugado 10 minutos em centriacutefuga
proacutepria
As 50 amostras de doadores foram sensibilizadas com os anticorpos policlonais
humanos
Apoacutes sensibilizadas rdquoin vitrordquo e lavadas as hemaacutecias foram diluiacutedas em soluccedilatildeo de
baixa forccedila iocircnica (LISS) na quantidade de 10 microL de hemaacutecia para 1000 microL de soluccedilatildeo A
suspensatildeo foi pipetada (50 microL) em coluna-gel-teste LissCoombs (BIO-RAD) que contecircm
antiglobulina poliespeciacutefico (IgG+C3d) e centrifugada em baixa rotaccedilatildeo conforme orientaccedilatildeo
do fabricante durante 10 minutos
As amostras deveriam apresentar aglutinaccedilatildeo com reatividade 3 a 4+ no TDA As
amostras que apresentaram reaccedilatildeo menor que 3+ foram novamente sensibilizadas com nova
aliacutequota do antissoro
25
413 TRATAMENTO DAS AMOSTRAS
As amostras sensibilizadas apresentando o TDA positivo 3 ou 4+ foram divididas em
duas aliacutequotas e submetidas a duas teacutecnicas diferentes com o objetivo de dissociar o anticorpo
ligado Uma aliacutequota da amostra foi tratada com soluccedilatildeo de difosfato de cloroquina enquanto
a outra aliacutequota foi tratada com glicina-aacutecidaEDTA
42 PREPARO DA GLICINA AacuteCIDA-EDTA
A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA utiliza 3 soluccedilotildees diferentes a glicina aacutecida o
EDTA e o tampatildeo TRIS
Os reagentes foram preparados utilizando os sais para anaacutelise (PA) de EDTA
(Na2EDTA2H2O) TRIS (C4H11NO3) Glicina (H2NCH2CO2H) NaCl e a soluccedilatildeo de aacutecido
cloriacutedrico (HCl) 12 N todos reagentes da marca SYNTH (quadro 1)
Para o preparo do tampatildeo glicina-acida eacute necessaacuterio o ajuste do pH para 15 Para esse
ajuste utiliza-se aacutecido cloriacutedrico (HCl) concentrado O pH foi medido com fitas reativas de pH
com escala de 1 a 14 da marca MERCK Posteriormente a soluccedilatildeo foi enviada ao laboratoacuterio
de controle de qualidade do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto e o pH medido no peagacircmetro O
tampatildeo glicina-aacutecida foi armazenado a 4deg e o tampatildeo tris e o EDTA em temperatura ambiente
controlada (20 a 24deg Celsius)
Apoacutes o preparo e durante a realizaccedilatildeo dos testes foram feitas inspeccedilotildees visuais para
verificaccedilatildeo de turvaccedilatildeo do meio e presenccedila de precipitados
Reagente Material Quantidade Preparo e
Conservaccedilatildeo
EDTA
EDTA
(Na2EDTA2H2O)
5 gramas Mistura ateacute
dissoluccedilatildeo do sal e
conserva em
temperatura ambiente Aacutegua Destilada 50 Ml
Tris
TRIS (C4H11NO3) 121 gramas Conservar em
temperatura ambiente NaCl 525g
Aacutegua destilada 100ml
Gliacutecina-aacutecida
Glicina
(H2NCH2CO2H) 15 gramas
Conservar a 4oC NaCl 116gramas
Aacutegua Destilada 200ml
HCL 12N Ajutar o pH para 15
Quadro 1 - Preparo dos Reagentes da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
Fonte - Manual teacutecnico AABB 2011
26
O tampatildeo glicina-aacutecida e o tampatildeo TRIS satildeo estaacuteveis por 7 meses O reagente EDTA
precipitou mesmo estando em temperatura em ambiente controlado Houve necessidade de
preparo de novo reagente
421 TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
1 Em um tubo de ensaio 12x75 mm eacute adicionado 08 mL da soluccedilatildeo de glicina-aacutecida A
esta soluccedilatildeo adiciona-se 02 mL de EDTA e mistura
2 Adiciona-se 02 mL de hemaacutecias sensibilizadas (lavada 4 vezes) A mistura eacute
homogeneizada e incubada por exatamente 2 minutos
3 A seguir 01 mL de tampatildeo TRIS eacute adicionado agrave mistura que eacute novamente
homogeneizada e centrifugada por 2 minutos a 3400 rpm O pH deve estar entre 7 a 75
4 Apoacutes centrifugaccedilatildeo separa-se em outro tubo o sobrenadante (eluato) e as hemaacutecias
que permanecem satildeo lavadas 4 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica para retirada de todo o
reagente e anticorpos livres
43 PREPARO DA CLOROQUINA
A cloroquina eacute diluiacuteda em tampatildeo PBS na concentraccedilatildeo de 20 (Quadro 2) e
armazenado a 4deg Celsius sua validade apoacutes o preparo eacute de 1 mecircs
A teacutecnica da cloroquina jaacute estaacute padronizada para rotina do laboratoacuterio de
imunohematologia do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto e suas unidades
Reagente Reagentes Quantidade PreparoConservaccedilatildeo
Cloroquina
Difosfato de cloroquina
(C18H32ClN3O8P2)
20 gramas
Conservar a 4deg Celsius
Tampatildeo PBS 100ml
NaOH 01 N Acertar o pH para
51
Quadro 2 - Preparo da Cloroquina Fonte - Manual teacutecnico da AABB 2011
431 TEacuteCNICA DA CLOROQUINA
1 4 partes da soluccedilatildeo pronta eacute adicionada a uma parte de hemaacutecias lavadas 4 vezes com
soluccedilatildeo fisioloacutegica
2 A mistura eacute incubada em temperatura ambiente por ateacute duas horas
3 Centrifugar a 3400 rpm por 2 minutos
27
4 Remover o sobrenadante lavar as hemaacutecias novamente com soluccedilatildeo fisioloacutegica 4
vezes
44 VERIFICACcedilAtildeO DA EFETIVIDADE DOS TESTES
Apoacutes tratamento pelas duas teacutecnicas o TDA foi repetido em todas as amostras para
verificar se os tratamentos foram efetivos e houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo Para as
amostras tratadas pela teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA que permaneceram com TDA positivo
novo tratamento foi realizado
45 TESTE DO ELUATO
O eluato resultante das amostras tratadas com glicina-acidaEDTA foi testado com
hemaacutecias de triagem A soluccedilatildeo do eluato foi incubada com as hemaacutecias de triagem de
anticorpos (ID-Diacell BIO-RAD) pela teacutecnica em gel LissCoombs O teste foi incubado 15
minutos a 37deg Celsius e centrifugado por 10 minutos em centrifuga proacutepria para a teacutecnica em
gel Os eluatos que apresentaram resultados positivos foram testados em painel de 11
hemaacutecias (ID-Diapanel BIO-RAD) para a identificaccedilatildeo do anticorpo
46 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente que apresentou TDA positivo por IgG e pesquisa
de anticorpo irregular positivo com presenccedila de autoanticorpo com reatividade panaglutinina
A amostra foi tratada em paralelo pelas duas teacutecnicas descritas e foi enviada para o
Hemocentro para genotipagem eritrocitaacuteria que foi realizado por metodologia PCR em tempo
real no equipamento Real-time system PCR 7500 ( Applied Biosystems Califoacuternia EUA)
28
5 RESULTADOS
51 REAGENTES
Para aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA satildeo necessaacuterios 3 diferentes
reagentes que podem ser encontrados em forma de kit pronto para uso No entanto esses kits
natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil Os reagentes satildeo tampatildeo glicina-aacutecida o EDTA e o tampatildeo
Tris
Todos os reagentes foram preparados rdquoin houserdquo a partir dos sais e soluccedilotildees PA (puro
para anaacutelise) da marca SYNTH que foram adquiridos para a pesquisa O custo estimado para
cada teste foi aproximadamente R$ 020 reais
Apoacutes o preparo os reagentes poderiam ser armazenados em condiccedilotildees adequadas pelo
periacuteodo de 1 ano (AABB 2011) Ao final do preparo e durante o periacuteodo de armazenamento
de fevereiro a setembro de 2016 foi realizada inspeccedilatildeo visual para verificar a presenccedila de
precipitados ou turvaccedilatildeo A soluccedilatildeo de glicina e o tampatildeo TRIS mostraram-se estaacuteveis ateacute o
final do periacuteodo Por sua vez o reagente EDTA precipitou mesmo estando armazenado em
temperatura ambiente controlada e foi necessaacuterio novo preparo
52 AMOSTRAS DE DOADORES
521 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS AMOSTRAS
Apoacutes incubaccedilatildeo da hemaacutecia com o antissoro a mesma foi lavada 4 vezes para retirada
dos anticorpos livres A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada Caso houvesse positividade na
soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem a etapa era repetida (figura 3) Das 50 amostras sensibilizadas a
uacuteltima lavagem foi positiva somente em 3 delas Nas 3 amostras o anticorpo utilizado para
sensibilizaccedilatildeo foi o anti-K Apoacutes repetido nova etapa de lavagem os resultados se
apresentaram negativos
Em todas as amostras sensibilizadas ldquoin vitrordquo o TDA foi testado e verificado a
intensidade do teste Entre as 50 amostras 47 alcanccedilaram TDA com intensidade 3-4+ apoacutes a
primeira sensibilizaccedilatildeo enquanto 3 amostras necessitaram uma segunda incubaccedilatildeo com
anticorpo (figura 4)
A escolha dos anticorpos para sensibilizar as hemaacutecias foi feita de acordo com o
fenoacutetipo do doador e foram utilizados sete diferentes especificidades de anticorpos policlonais
humanos conforme mostra o graacutefico1
29
Figura 3 - Soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada com hemaacutecia de triagem de
anticorpos em gel LissCoombs (BIO-RAD) A finalidade eacute verificar a presenccedila de anticorpos livres na
suspensatildeo que possam interferir na pesquisa do eluato As soluccedilotildees de lavagem das amostras na figura a tiveram
resultados negativos Na figura b duas amostras a 47 e 50 apresentaram resultado positivo Nova etapa de
lavagem foi realizada e o resultado final foi negativo
522 TRATAMENTO DAS HEMAacuteCIAS
Apoacutes a sensibilizaccedilatildeo e obtenccedilatildeo de resultados de TDA com intensidade de 3 a 4+
cada uma das amostras foi dividida em duas aliacutequotas e tratada separadamente pelas teacutecnicas
de glicinaaacutecida-EDTA e cloroquina
As teacutecnicas foram consideradas efetivas quando obteve-se a completa dissociaccedilatildeo do
anticorpo verificada atraveacutes do TDA negativo na amostra poacutes tratamento conforme figuras 5
e 6 Dentre as amostras tratadas com cloroquina 2850 tiveram o TDA negativado A glicina-
aacutecidaEDTA negativou o TDA em 33 das 50 amostras tratadas Apenas 17 amostras tratadas
com glicina-aacutecidaEDTA permaneceram com o TDA positivo e foram submetidas a um novo
tratamento
30
Figura 4 - TDA das amostras apoacutes sensibilizaccedilatildeo com anticorpos policlonais humanos Amostras na
figura a com intensidades de 3-4+ Na figura b amostras 4 e 7 com intensidade menor que 3+ e portanto foram
novamente sensibilizadas com nova aliacutequota de soro Anti-D e anti-S Apoacutes a segunda sensibilizaccedilatildeo
apresentaram reatividade 4 e 3+ respectivamente Os anticorpos utilizados para sensibilizaccedilatildeo foram D S c E
C e K
523 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS TEacuteCNICAS
No tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA houve dissociaccedilatildeo completa do anticorpo
em 33 amostras (66) das 50 amostras testadas enquanto que com a cloroquina foram 28
amostras (56) (tabela 1)
31
Graacutefico 1- Nuacutemero de amostras sesnsibilizadas por especificidade de anticorpo Entre as 50 amostras 12
foram sensibilizadas com anti-D 10 com anti-C 9 com anti-E 8 com anti-c 7 com anti-S 3 com anti-K e 1
com anti-Dia As especificidades dos anticorpos foram definidas de acordo o fenoacutetipo do doador
Figura 5 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com cloroquina Nas amostras onde houve
a dissociaccedilatildeo do anticorpo ( 2 21 a 23 26 39 a 42 45 46 e 49) a hemaacutecia se deposita no fundo no microtubo
apoacutes a centrifugaccedilatildeo (TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (1 3 24 25 43 44 47
48 e 50) o anticorpo ligado agraves hemaacutecias eacute alvo da AGH presente no gel (TDA positivo)
Anti-D 12
Anti-C 10
Anti-E 9
Anti-c 8
Anti-S 7
Anti-K 3 Anti-Dia 1
32
Figura 6 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA Nas amostras
onde houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo (4 6 7 12 a 15 17 34 35 37 e 38) a hemaacutecia se deposita no fundo no
microtubo apoacutes a centrifugaccedilatildeo ( TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (5 16 18
19 20 33 e 36 ) o AGH presente no gel se liga ao anticorpo ligado agraves hemaacutecias que ficam retidas no gel (TDA
positivo)
Tabela 1-Resultado geral do tratamento das hemaacutecias com glicina e cloroquina
Teacutecnica utilizada TDA negativo TDA positivo Total
Glicina-aacutecidaEDTA 33 17 50
Cloroquina 28 22 50
A glicina-aacutecidaEDTA conseguiu negativar mais amostras sensibilizadas com Anti-D
e anti-K que a cloroquina Para as hemaacutecias sensibilizadas com anti-E Anti-S e Anti-Dia
ambas as teacutecnicas dissociaram o anticorpo em 100 das amostras Os resultados detalhados
por especificidade do anticorpo apoacutes o primeiro tratamento com glicina-aacutecidaEDTA e com
cloroquina estatildeo na tabela 2
Para as amostras que permaneceram positivas (17 amostras) apoacutes o tratamento com a
glicina-aacutecidaEDTA foi realizado um novo tratamento Houve dissociaccedilatildeo do anticorpo em 3
amostras (18) apoacutes a segunda tentativa Nas demais 14 (82) amostras tratadas pela
segunda vez 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise
33
Tabela 2 - Resultados do TDA apoacutes tratamento das hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo
sensibilizado
ANTICORPOS
SENSIBILIZADOS
1ordm TRATAMENTO COM
GLICINA
TRATAMENTO COM
CLOROQUINA
TOTAL TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
Anti-D 8 4 0 12 12
Anti-C 6 4 10 0 10
Anti-E 9 0 9 0 9
Anti-c 0 8 1 7 8
Anti-S 7 0 7 0 7
Anti-K 2 1 0 3 3
Anti-Dia 1 0 1 0 1
TOTAL 33 17 28 22 50
A hemoacutelise foi verificada durante o procedimento de lavagem final das hemaacutecias com
soluccedilatildeo fisioloacutegica para a retirada dos reagentes As soluccedilotildees de lavagem ficaram
avermelhadas e as hemaacutecias com coloraccedilatildeo escura As amostras foram descartadas Dentre as
6 amostras que ainda puderam ser testadas para o TDA trecircs amostras negativaram sendo 1
sensibilizada com anti-D e 2 com anti-C (tabela 3)
Tabela 3 - Resultado apoacutes o segundo tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA
Tratamento com
glicina-aacutecidaEDTA
TDA Negativo TDA Positvo Hemoacutelise Total
Segundo tratamento 3 3 11 17
524 TESTAGEM DO ELUATO
Apoacutes o tratamento com a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA a soluccedilatildeo do eluato foi
testada para verificar a viabilidade dos anticorpos que foram dissociados ou eluiacutedos Dentre
as 50 amostras 41 apresentaram eluato positivo As nove amostras cujos eluatos foram
negativos haviam sido sensibilizadas com as seguintes especificidades de anticorpos anti-E 6
amostras (67) anti-S 2 amostras (40) e anti-D 1 amostra (8) (tabela 4) O eluato de
todas as amostras sensibilizadas com os anticorpos anti-C anti-c Anti-K e Anti-Dia foram
positivos Os eluatos positivos na triagem de anticorpos foram testados com paineacuteis de
identificaccedilatildeo para confirmar a especificidade e a viabilidade dos anticorpos (figuras 7 e 8)
34
525 EFEITO DA ELUICcedilAtildeO SOBRE OS ANTIacuteGENOS ERITROCITAacuteRIOS
Para verificar o efeito do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA e com a cloroquina
sobre a expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s foi realizada a fenotipagem das
amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes tratamento com ambas as teacutecnicas Foi avaliado
se o tratamento destruiu os antiacutegenos expressos antes do tratamento
Tabela 4- Resultado do Eluato das amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA
Anticorpos Eluato positvo Eluato negativo Total
Anti-D 11 1 12
Anti-C 10 0 10
Anti-E 3 6 9
Anti-c 8 0 8
Anti-S 5 2 7
Anti-K 3 0 3
Anti-Dia 1 0 1
Total 41 9 50
Figura 7 ndash Painel do eluato da amostra 21 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-C que foi
recuperado no eluato
Figura 8 ndash Painel do eluato da amostra 47 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-K que foi
recuperado no eluato
35
Dentre as 50 amostras 26 eram previamente fenotipadas para os antiacutegenos Fya Fy
b
Jka Jk
b S e s Dentre elas 20 alcanccedilaram TDA negativo apoacutes tratamento com a glicina-
aacutecidaEDTA e 20 negativaram apoacutes tratamento com cloroquina (tabela 5) Apoacutes ambas as
teacutecnicas os antiacutegenos originalmente expressos permaneceram positivos comprovando que natildeo
houve destruiccedilatildeo dos mesmos
Tabela 5 ndash Verificaccedilatildeo da interferecircncia do tratamento da hemaacutecias com cloroquina e glicina-
aacuteicdaEDTA sobre os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
AMOSTRAS
COM
FENOTIPAGEM
PREacuteVIA
TRATADAS COM
CLOROQUINA
TRATADAS COM
GLICINA
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
26
20
20
20
20
As amostras 24 47 e 50 eram positivas para o antiacutegeno K A cloroquina natildeo dissociou
o anticorpo em nenhuma das 3 amostras enquanto a glicina-aacutecidaEDTA foi efetiva nas
amostras 24 e 50 Foi testada a expressatildeo do antiacutegeno K nas amostras 24 e 50 apoacutes o
tratamento utilizando meacutetodo indireto em gel contendo AGH Apesar de natildeo ter sido avaliado
a intensidade de reaccedilatildeo de expressatildeo dos antiacutegenos podemos verificar na figura 9 que nas
duas amostras em que a teacutecnica foi efetiva e dissociou o anticorpo a expressatildeo do antiacutegeno K
continua presente mas a reatividade observada pode ser considerada 1+ sugerindo que houve
diminuiccedilatildeo da expressatildeo do antiacutegeno quando comparado com a expressatildeo observada em
hemaacutecia natildeo tratada
Os resultados individuais de cada amostra em ambas as teacutecnicas encontram-se
resumidas na tabela 6
526 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente onde foi constatada a presenccedila de autoanticorpo
a quente da classe IgG pelo TDA monoespeciacutefico (figura 10)O autoanticorpo tambeacutem
interferia na pesquisa e identificaccedilatildeo de anticorpos irregulares pois apresentava caracteriacutestica
de panaglutinina As hemaacutecias da paciente sensibilizadas ldquoin vivordquo foram tratadas com
cloroquina e com glicina-aacutecidaEDTA
36
Figura 9 ndash Fenotipagem das amostras 24 e 50 para antiacutegeno K apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
O teste positivo indica a presenccedila do antiacutegeno poreacutem a reatividade fraca (1+) sugere que houve enfraquecimento
de sua expressatildeo A direita a expressatildeo forte (4+) do antiacutegeno Kell em hemaacutecia controle natildeo tratada utilizada
como controle positivo
A cloroquina natildeo foi efetiva na retirada do anticorpo ligado as hemaacutecias ao contraacuterio
do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA que dissociou o anticorpo (figura 11)
A hemaacutecia tratada com glicina foi fenotipada para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
(figura 12) A fenotipagem para o sistema Rh (C c E e e) e Kell foi realizada em gel
especiacutefico monoclonal sem interferecircncia do TDA positivo (controle da reaccedilatildeo negativo)
O eluato resultante do tratamento com glicina-aacutecidaEDTA foi testada em gel com
hemaacutecias de painel de identificaccedilatildeo de anticorpos e apresentou resultado positivo com todas
as ceacutelulas (figura 13 e 14)
A amostra foi enviada para genotipagem e o resultado da genotipagem confirmou o
resultado da fenotipagem apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
527 TEMPO DE EXECUCcedilAtildeO DA TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
O tempo de reaccedilatildeo da glicina-aacutecidaEDTA eacute de 2 minutos Todas as amostras foram
tratadas obedecendo ao tempo descrito na literatura demonstrando que o mesmo eacute
reprodutiacutevel
37
Tabela 6- Resultados individuais por amostra
Amostra Especificidade
dos anticorpos
Intensidade do
TDA apoacutes
sensibilizaccedilatildeo
Tratamento
efetivo com
cloroquina
Tratamento
efetivo com
glicina
Eluato
poacutes
glicina
1 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 2 Dia 3+ Sim Sim 3+ 3 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 4 D 4+ Natildeo Sim 4+ 5 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 6 E 3+ Sim Sim Negativo 7 S 4+ Sim Sim 3+ 8 E 3+ Sim Sim 1+ 9 E 3+ Sim Sim 2+
10 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 11 D 4+ Natildeo Sim 4+ 12 D 4+ Natildeo Sim 4+ 13 S 3+ Sim Sim 3+ 14 S 3+ Sim Sim 3+ 15 D 3+ Natildeo Sim 3+ 16 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 17 E 3+ Sim Sim (+) 18 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 19 D 4+ Natildeo Natildeo 3+ 20 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 21 C 3+ Sim Sim 4+ 22 C 3+ Sim Sim 4+ 23 C 3+ Sim Sim 4+ 24 K 4+ Natildeo Sim 4+ 25 D 3+ Natildeo Natildeo Negativo 26 E 4+ Sim Sim Negativo 27 S 3+ Sim Sim 3+ 28 C 3+ Sim Natildeo 4+ 29 C 3+ Sim Sim 4+ 30 C 3+ Sim Sim 4+ 31 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 32 E 3+ Sim Sim Negativo 33 C 3+ Sim Natildeo 4+ 34 S 3+ Sim Sim Negativo 35 S 3+ Sim Sim Negativo 36 C 4+ Sim Natildeo 4+ 37 c 4+ Natildeo Natildeo 4+ 38 D 4+ Natildeo Sim 4+ 39 S 3+ Sim Sim 3+ 40 c 4+ Sim Natildeo 2+ 41 C 4+ Sim Natildeo 4+ 42 E 3+ Sim Sim Negativo 43 D 3+ Natildeo Sim 2+ 44 D 3+ Natildeo Sim 2+ 45 E 3+ Sim Sim Negativo 46 C 3+ Sim Sim 4+ 47 K 4+ Natildeo Natildeo 4+ 48 D 3+ Natildeo Sim 2+ 49 E 3+ Sim Sim Negativo 50 K 4+ Natildeo Sim 4+
TOTAL 50 28 33 41
38
Figura 10 ndash TDA monoespeciacutefico da amostra de paciente Hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo da classe
IgG
oacute Figura 11 ndash TDA apoacutes o tratamento com glicina-aacutecidaEDTA (esquerda) e cloroquina (direita) A glicina
negativou completamente o TDA enquanto a hemaacutecia tratada com cloroquina persistiu positiva (1+)
39
Figura 12 ndash Fenotipagem da amostra tratada com glicina-aacutecidaEDTA Fy(a+b+) Jk(a-b+) S+s+
Figura 13 ndash Painel em gel (LissAGH) do eluato apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de
intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
Figura 14 ndash ndash Painel ezimaacutetico (hemaacutecias tratadas com bromelina) do eluato em gel neutro apoacutes
tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
40
528 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Quanto a efetividade das teacutecnicas em negativar o TDA foi verificado que a glicina-
aacutecidaEDTA foi efetiva em 66 das amostras testadas no primeiro tratamento (3350
amostras) enquanto a cloroquina conseguiu negativar 56 (2850) Esses resultados natildeo
apresentam diferenccedila significativa (pgt005) demostrando que a teacutecnica da glicina-
aacutecidaEDTA natildeo eacute superior mas eacute tatildeo efetiva quanto a da cloroquina
Quando aliamos os resultados de ambas as teacutecnicas verificamos que em 76 (3850)
das amostras o TDA foi negativado Esse dado indica que ainda que uma teacutecnica natildeo seja
eficaz na remoccedilatildeo do anticorpo eacute uma boa alternativa tentar a segunda teacutecnica jaacute que a falha
em remover o anticorpo utilizando uma delas natildeo prevecirc necessariamente a falha com a outra
Quando se utiliza o teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla (graacutefico 2) para comparar a utilizaccedilatildeo das
duas teacutecnicas com o resultado de cada uma isolada (somente a cloroquina ou somente a
glicina) verificamos que os resultados apresentam diferenccedila significativa (plt005) (quadro 3)
TRATAMENTO EFETIVO COM TOTAL PORCENTAGEM
Glicina ou cloroquina 38 76
Glicina e cloroquina 23 46
Glicina apenas 10 20
Cloroquina apenas 5 10
Nenhuma das teacutecnicas 12 24
Quadro 3 - Resultados comparativos entre as teacutecnicas utilizadas
41
Graacutefico 2 - Teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla entre as teacutecnicas aplicadas A- Glicina e Cloroquina B-Cloroquina C-
Glicina ( plt005)
42
6 DISCUSSAtildeO
Os reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA podem ser adquiridos em
forma de kit comercial prontos para uso poreacutem natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil A preparaccedilatildeo
dos reagentes ldquoin houserdquo a partir de sais comerciais adquiridos se mostrou viaacutevel Os
reagentes glicina e o tampatildeo Tris armazenados de forma correta se mantiveram estaacuteveis por
um periacuteodo de 7 meses Somente o reagente EDTA precipitou mesmo armazenado em
condiccedilotildees adequadas sugerindo que o mesmo deve ser preparado em menor quantidade e
armazenado em aliacutequotas A soluccedilatildeo de cloroquina tambeacutem pode ser preparada ldquoin houserdquo e
pode ser armazenado por um mecircs A legislaccedilatildeo brasileira autoriza a utilizaccedilatildeo de reagentes
preparados a partir de sais comerciais como a cloroquina e a glicina-aacutecidaEDTA desde que
os sais tenham autorizaccedilatildeo da vigilacircncia sanitaacuteria para a comercializaccedilatildeo (BRASIL 2001)
A comparaccedilatildeo quanto a efetividade em dissociar anticorpos em amostras com TDA
positivos entre a teacutecnica da glicina e a teacutecnica da cloroquina mostrou que natildeo haacute diferenccedila
estatiacutestica entre elas e que ambas satildeo igualmente eficientes Se utilizadas conjuntamente haacute
maior possibilidade de elucidaccedilatildeo dos casos
Uma vantagem da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eacute que ela permite numa mesma
amostra eluir o anticorpo ligado aacute hemaacutecia assim como fenotipar a hemaacutecia tratada Devido a
sua dupla utilidade a teacutecnica eacute vantajosa principalmente em pacientes em que pouco volume
de amostra pode ser coletado como em casos de crianccedilas e receacutem-nascidos
A fenotipagem poacutes tratamento se mostrou viaacutevel jaacute que os antiacutegenos de maior
importacircncia natildeo sofreram alteraccedilotildees Nas 20 amostras que foram fenotipadas antes e apoacutes
tratamento para verificar a influecircncia dos reagentes na expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a
Jkb S e s natildeo houve destruiccedilatildeo dos mesmos por nenhuma das duas teacutecnicas
Para as amostras positivas para o antiacutegeno Kell (350) e sensibilizadas com o
respectivo anticorpo a teacutecnica da glicina foi efetiva em negativar o TDA em apenas duas
delas mas apoacutes o tratamento foi verificada uma fraca reatividade da reaccedilatildeo antiacutegeno-
anticorpo sugerindo que houve um enfraquecimento da expressatildeo do antiacutegeno conforme
esperado e descrito na literatura (BYRNE 1991 PALLAS WILER E MCGEE 1991
ROZIERS e SQUALI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012 e KATHARIA e
CHAUDHARY 2013) A accedilatildeo da glicina sobre o antigeno Kell natildeo representa impedimento
para seu uso uma vez que na impossibilidade de testar o antiacutegeno Kell o banco de sangue
consegue facilmente atender a solicitaccedilatildeo de transfusatildeo com unidades de hemaacutecias Kell
43
negativas jaacute que eacute um antiacutegeno de baixa prevalecircncia na populaccedilatildeo variando de 15 na
populaccedilatildeo africana a 9 nos europeus (DANIELS 2011)
A soluccedilatildeo resultante da dissociaccedilatildeo do anticorpo pela teacutecnica da glicina pode ainda ser
utilizada como eluato podendo substituir a teacutecnica de eluiccedilatildeo com reagentes comercias (kits
de eluiccedilatildeo aacutecida) que tem alto custo aproximadamente entre R$2000 a R$2500 por teste
Em 41 amostras (82) houve a dissociaccedilatildeo e recuperaccedilatildeo do anticorpo que estava
sensibilizando as hemaacutecias Em 9 amostras (18) os anticorpos foram eluiacutedos poreacutem
apresentaram reaccedilatildeo negativa quando testadas com hemaacutecias de triagem entre eles o anti-E
(6) anti-S (2) e Anti-D (1) Eacute possiacutevel que a correccedilatildeo pH do meio (WALKER 2011) natildeo
tenha sido adequada o que pode ter desfavorecido a reatividade do anticorpo
Para as amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA nas quais natildeo houve dissociaccedilatildeo do
anticorpo pelo primeiro tratamento (1750) o segundo tratamento natildeo se mostrou eficaz jaacute
que 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise O tempo de
armazenagem natildeo parece ter influenciado jaacute que todas as amostras foram testadas dentro de
48 horas apoacutes a coleta Outros fatores que natildeo foram verificados podem ter levado a
hemoacutelise Apesar da literatura (LOUIE JIENG e ZEROULIS 1986 e BYRNE 1991)
recomendar um segundo tratamento ele eacute pouco eficaz tendo negativado apenas 3 das 17
amostras testadas
A amostra de paciente que apresentou sensibilizaccedilatildeo ldquoin vivordquo mostrou melhor
efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA sobre a da cloroquina possibilitando
fenotipagem para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s que natildeo foram destruiacutedos apoacutes o
tratamento comprovado atraveacutes da genotipagem
A presenccedila de autoanticorpo a quente com presenccedila de hemoacutelise (AHAI) ou natildeo pode
mascarar a presenccedila de aloanticorpo interferindo na rotina soroloacutegica da fenotipagem que eacute
uma importante ferramenta para auxiliar na seleccedilatildeo de hemaacutecias para transfusatildeo (SHIREY et
al 2002) Esses pacientes frequentemente possuem aloanticorpos associados ao
autoanticorpo e a prevalecircncia de aloimunizaccedilatildeo entre eles varia entre 12 a 40 (LEGER e
GARRATY 1999 BRANCH e PETZ 1999) o que dificulta ainda mais a escolha do melhor
componente a ser transfundido aleacutem de aumentar a possibilidade reaccedilotildees hemoliacuteticas imunes
poacutes-transfusionais
Nesses casos as teacutecnicas de dissociaccedilatildeo de anticorpos satildeo importantes para tratar
amostras de pacientes e a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser usada como uma opccedilatildeo
pois se mostrou eficaz na dissociaccedilatildeo anticorpo ligado agraves hemaacutecias deixando livre a
superfiacutecie das mesmas permitindo a fenotipagem por antisoros IgG Paralelamente os
44
anticorpos eluiacutedos tambeacutem puderam ser estudados O mesmo natildeo ocorre com a cloroquina
que permite apenas a fenotipagem e tampouco com os kits de eluiccedilatildeo aacutecida disponiacuteveis no
mercado nacional que satildeo destinados a realizaccedilatildeo do eluato mas destroem as hemaacutecias
O tempo de tratamento na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA tambeacutem eacute uma vantagem
pois foi possiacutevel reproduzir no tempo determinado de 2 minutos enquanto a cloroquina
demora ateacute duas horas
Ainda que a aplicaccedilatildeo das teacutecnicas por biologia molecular estejam cada vez mais
presentes na rotina imuno-hematoloacutegica e possibilitam estabelecer o fenoacutetipo deduzido do
genoacutetipo elas natildeo estatildeo disponiacuteveis na maioria dos centros e sua realizaccedilatildeo exige algumas
horas A resoluccedilatildeo imediata do problema transfusional necessita dos resultados soroloacutegicos
pois com frequecircncia natildeo eacute possiacutevel aguardar o resultado do teste molecular Dessa forma
apesar da crescente importacircncia da genotipagem eritrocitaacuteria teacutecnicas soroloacutegicas aplicadas
corretamente e no momento propiacutecio satildeo de grande utilidade para resolver problemas imuno-
hematoloacutegicos como ocorre com a fenotipagem em pacientes com TDA positivo
45
7 CONCLUSAtildeO
A teacutecnica da glicina aacutecidaEDTA mostrou-se efetiva em remover os anticorpos que
sensibilizavam as hemaacutecias e pode ser utilizada com seguranccedila antes da fenotipagem
eritrocitaacuteria Por ser uma teacutecnica de raacutepida execuccedilatildeo eacute uma alternativa aplicaacutevel
principalmente em casos urgentes de pacientes que apresentam autoanticorpos
46
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50
9 ANEXOS
51
FUNDACcedilAtildeO HEMOCENTRO DE RIBEIRAtildeO PRETO
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE)
Tiacutetulo da pesquisa Aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina aacutecida-EDTA e avaliaccedilatildeo da
eficaacutecia no tratamento de hemaacutecias com teste direto da antiglobulina positivo
Pesquisadora responsaacutevel Ceacutelia Kazue Abiko
Orientador Prof Dimas Tadeu Covas
Co-orientadora Dra Flaacutevia Leite Souza Santos
Objetivo da pesquisa Vocecirc estaacute sendo convidado a participar de uma pesquisa que tem
como objetivo padronizar uma nova teacutecnica para auxiliar na tipagem sanguiacutenea de pacientes
A tipagem sanguiacutenea pode sofrer interferecircncia da presenccedila de anticorpos ligados aos gloacutebulos
vermelhos do sangue Nessas situaccedilotildees eacute difiacutecil selecionar o melhor sangue para o paciente e
eacute preciso a utilizaccedilatildeo de teacutecnicas adicionais para remover essas interferecircncias
Esta pesquisa tem como objetivo estudar outra teacutecnica para remover esses anticorpos e
comparaacute-la com a teacutecnica atualmente utilizada Para isso precisamos de amostras de pacientes
e doadores voluntaacuterios
Se vocecirc eacute um doador eacute necessaacuterio que vocecirc autorize a coleta de 5 ml (1 tubo) a mais
de seu sangue
Se vocecirc eacute um paciente natildeo haveraacute necessidade de nova amostra pois utilizaremos as
amostras jaacute coletadas para os testes preacute-transfusionais e os resultados encontrados nesta
pesquisa natildeo iratildeo interferir na escolha da (s) bolsa (s) de sangue que vocecirc possa vir a receber
Se vocecirc concordar em participar leia com atenccedilatildeo o texto abaixo e assine as duas vias
rubricando todas as paacuteginas deste termo de consentimento Uma via original assinada e
rubricada por vocecirc e pela pesquisadora ficaraacute com vocecirc
As suas informaccedilotildees seratildeo mantidas em sigilo pela pesquisadora e natildeo haveraacute
armazenamento de material para pesquisas posteriores Os seus dados seratildeo usados apenas
neste estudo e quando o trabalho for publicado seu nome e qualquer outra informaccedilatildeo que
possam identificaacute-lo natildeo seratildeo revelados
Eacute pouco provaacutevel que o que noacutes aprendermos com este estudo tenha um benefiacutecio
direto para vocecirc assim como natildeo poderemos dar nada em troca pela sua participaccedilatildeo na
pesquisa
Nosso objetivo com esta pesquisa eacute que os resultados poderatildeo ser uacuteteis para o
tratamento de pacientes no futuro Os riscos da participaccedilatildeo satildeo miacutenimos Se vocecirc eacute um
doador de sangue a amostra seraacute coletada no momento da doaccedilatildeo natildeo exigindo punccedilatildeo
venosa adicional
52
Eacute seu direito ter acesso aos resultados dos testes da pesquisa Esses resultados natildeo
seratildeo fornecidos automaticamente a vocecirc mas caso vocecirc se interesse em saber o resultado ou
tiver alguma duacutevida sobre a sua participaccedilatildeo neste estudo deveraacute entrar em contato com Ceacutelia
Kazue Abiko pelo telefone (18) 99718-3551
Vocecirc tem total liberdade de optar por natildeo participar da pesquisa Caso aceite
participar poderaacute desistir a qualquer momento ou retirar seu consentimento mesmo apoacutes ter
coletado o sangue Para cancelar sua participaccedilatildeo basta avisar a pesquisadora e os seus dados
seratildeo retirados do projeto
Qualquer duacutevida eacutetica sobre a pesquisa poderaacute entrar em contato com o Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa do Hospital das Cliacutenicas e da Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto
(CAMPUS UNIVERSITAacuteRIO bairro Monte Alegre CEP 14048-900 Ribeiratildeo Preto-SP
Telefone (16) 3602-2228 FAX (16) 3633-1144 e-mail cephcrpuspbr)
Consentimento de participaccedilatildeo
A Consentimento do participante
Li as informaccedilotildees acima sobre o estudo e recebi explicaccedilotildees sobre a participaccedilatildeo no estudo
Portanto dou o meu consentimento para participar do estudo
___________________________________________________________________________
Nome completo
___________________________________________________________________________
Assinatura
___________
Data
__________________________________________________________________________________
Nome completo da pesquisadora
___________________________________________________________________________
Assinatura
_____________
Data
8
teacutecnicas tecircm como objetivo comum demonstrar a reaccedilatildeo entre antiacutegeno e anticorpo no
entanto elas se baseiam em diferentes princiacutepios Muitas metodologias satildeo atualmente
aplicadas agrave imunohematologia entre elas o sistema de fase soacutelida a tecnologia de hemaacutecias
magnetizadas a biologia molecular e ateacute mesmo a citometria de fluxo no entanto os meacutetodos
mais tradicionais satildeo aqueles baseados no princiacutepio de hemaglutinaccedilatildeo
121 MEacuteTODOS DE FASE FLUacuteIDA
Os meacutetodos de fase fluiacuteda satildeo testes baseados na hemaglutinaccedilatildeo e incluem o teste em
tubo e o teste em microplacas Uma suspensatildeo de hemaacutecias eacute adicionada ao plasma ou soro
em seguida eacute realizada a centrifugaccedilatildeo e por fim eacute feita a leitura do resultado que eacute
considerado positivo se for observado algum grau de aglutinaccedilatildeo ou hemoacutelise A intensidade
de aglutinaccedilatildeo eacute graduada de acordo com o tamanho dos agregados desprendidos da
superfiacutecie apoacutes agitaccedilatildeo delicada do tubo ou microplaca Os meacutetodos de hemaglutinaccedilatildeo satildeo
aplicados a todos os testes preacute-transfusionais Como os anticorpos ABO satildeo aglutininas frias
a tipagem eacute realizada em temperatura ambiente (22degC) no entanto ao investigar a presenccedila
de anticorpos irregulares que como jaacute mencionado eacute na maioria das vezes anticorpos
incompletos da classe IgG eacute essencial que a reaccedilatildeo seja incubada a 37degC As reaccedilotildees satildeo
facilitadas com a utilizaccedilatildeo de potencializadores e da antiglobulina humana (WALKER e
HARMENING 2012 AABB 2011)
Nos meacutetodos de fase fluiacuteda nos quais a AGH eacute empregada a fase de lavagem eacute
fundamental Apoacutes a incubaccedilatildeo do soro com as hemaacutecias deve ser realizada a lavagem da
reaccedilatildeo para remover o excesso de anticorpos natildeo ligados agraves hemaacutecias jaacute que os anticorpos
livres podem bloquear a AGH quando ela eacute adicionada e levar a resultados falso negativos
(AABB 2011)
Os testes de hemaglutinaccedilatildeo satildeo os mais tradicionais entre os meacutetodos ainda hoje
aplicados agrave rotina de bancos de sangue A vantagem desses meacutetodos eacute o baixo custo quando
comparado agraves teacutecnicas mais modernas mas apresentam tambeacutem desvantagens A teacutecnica em
tubo por exemplo natildeo permite automaccedilatildeo eacute trabalhosa e exige matildeo-de-obra bastante treinada
na execuccedilatildeo das diversas etapas do teste e mesmo assim pode haver subjetividade na
interpretaccedilatildeo dos resultados aleacutem de resultados falso-negativos (DOWNES 2011 ZANTEK
et al 2012)
9
122 COLUNAS DE GEL
A teacutecnica em gel iniciada na deacutecada de 90 representou uma grande revoluccedilatildeo na
rotina laboratorial tornando-se muito popular Aleacutem de ser sensiacutevel a teacutecnica dispensa a fase
de lavagem antes da adiccedilatildeo da AGH assim como a agitaccedilatildeo do teste para leitura reduzindo o
nuacutemero de resultados falsos negativos decorrentes dessas duas etapas e o tempo para
execuccedilatildeo dos testes (LAPIERRE et al 1989 NOVARETTI et al 2000 NOVARETTI et
al 2004) Os reagentes satildeo comercializados na forma de cartotildees plaacutesticos contendo
microtubos preenchidos por gel composto por microesferas de acrilamida-dextran Nesta
metodologia tambeacutem baseada na hemaglutinaccedilatildeo a suspensatildeo de hemaacutecias e o soro satildeo
depositados em uma cacircmara acima da coluna de gel e em seguida procede-se com a
centrifugaccedilatildeo dos cartotildees As microesferas atuam como uma malha que permite a passagem
em direccedilatildeo ao fundo do microtubo apenas das hemaacutecias natildeo aglutinadas enquanto as
hemaacutecias aglutinadas ficam retidas na parte superior da coluna ou ao longo dela (GREEN e
KLOSTERMANN 2012) Portanto quanto maior a agregaccedilatildeo mais hemaacutecias ficam retidas
no topo da coluna Dependendo do tipo de teste a ser realizado pode ser utilizado gel neutro
ou gel especiacutefico impregnado pelo anticorpo desejado e o gel contendo antiglobulina humana
que satildeo utilizados para os testes diretos e indiretos da antiglobulina (LAPIERRE et al 1989)
A coluna de gel ainda permite a visualizaccedilatildeo clara de duas populaccedilotildees distintas de hemaacutecias
como em pacientes receacutem transfundidos
123 BIOLOGIA MOLECULAR
A biologia molecular ou genotipagem estaacute sendo cada vez mais aplicada aos grupos
sanguiacuteneos pois fornece resultados seguros e precisos especialmente nos casos em que natildeo eacute
possiacutevel a realizaccedilatildeo da fenotipagem como em pacientes receacutem-transfundidos e pacientes
com TDA positivo Na genotipagem eacute possiacutevel determinar atraveacutes do DNA do paciente
extraiacutedo de seus leucoacutecitos de sangue perifeacuterico o fenoacutetipo eritrocitaacuterio deduzido sem
qualquer interferecircncia do anticorpo que sensibiliza a hemaacutecia ou de hemaacutecias alogecircnicas
transfundidas Sua realizaccedilatildeo no entanto exige o treinamento de equipe especializada e capaz
de interpretar os resultados em conjunto com os achados soroloacutegicos (JUNIOR e OLIVATO
2007)
Apesar de ser uma ferramenta de grande importacircncia hoje na imuno-hematologia
ainda estaacute restrito aos grandes centros de hemoterapia no Brasil poucos serviccedilos puacuteblicos de
sauacutede dispotildeem desse recurso e utilizam teacutecnicas de genotipagem de grupos sanguiacuteneos para
atendimento a seus pacientes Esta abordagem poreacutem vem sendo introduzida em algumas
10
instituiccedilotildees de reconhecida competecircncia na hemoterapia mas sua disponibilizaccedilatildeo deve
tornar-se mais generalizada atraveacutes da formaccedilatildeo de centros de referecircncia para atendimento
das diversas unidades de hemoterapia (MARTINS et al 2009) Dessa forma muitas decisotildees
transfusionais especialmente em urgecircncias ainda devem ser tomadas sem o resultado da
genotipagem eritrocitaacuteria
13 TESTE DA ANTIGLOBULINA
Coombs Mourant e Race descreveram em 1945 uma teacutecnica com utilizando soro de
coelho contendo antiglobulina humana (AGH) que posteriormente foi chamada de ldquosoro de
Coombsrdquo O meacutetodo foi desenvolvido inicialmente para ampliar o efeito de aglutininas fracas
do sistema Rh anticorpos ldquoincompletosrdquo que normalmente natildeo apresentavam aglutinaccedilatildeo
visiacutevel O teste foi concebido como um instrumento de investigaccedilatildeo de doenccedila hemoliacutetica do
receacutem-nascido e de reaccedilotildees transfusionais causadas por anticorpos Rh que estavam presentes
no soro dos paciente poreacutem que natildeo eram demonstraacuteveis pelas teacutecnicas ateacute entatildeo existentes
A maior parte dos anticorpos de significado cliacutenico assim como seus respectivos
antiacutegenos foram descritos apoacutes o surgimento do ldquosoro de Coombsrdquo em 1945 sendo assim o
teste da antiglobulina representa ateacute hoje a forma mais importante de aglutinaccedilatildeo artificial em
imunohematologia permitindo revelar a presenccedila de anticorpos na membrana da hemaacutecia A
antiglobulina humana eacute constituiacuteda por anticorpo especiacutefico contra a porccedilatildeo Fc de outro
anticorpo Quando um anticorpo ldquoincompletordquo sensibiliza a hemaacutecia normalmente natildeo
provoca aglutinaccedilatildeo visiacutevel Apoacutes a adiccedilatildeo da AGH ao meio esta reconhece e se liga agraves
porccedilotildees Fc dos anticorpos que sensibilizam a hemaacutecia formando assim uma malha e
provocando aglutinaccedilatildeo visiacutevel (BARJAS-CASTRO 2013)
Os reagentes de antiglobulina podem ser poliespeciacuteficos ou monoespeciacuteficos Os
poliespeciacuteficos satildeo uma mistura de anticorpos ant-IgG e anti-C3d (fraccedilatildeo C3d do
complemento) Os reagentes monoespecificos podem ser anti-IgG anti-IgM anti-IgA anti-
complemento podendo ser anti-C3d e anti-C3b
O teste da antiglobulina pode ser usado para detectar hemaacutecias sensibilizadas com
aloanticorpos IgG autoanticorpos IgG e componentes do complemento A sensibilizaccedilatildeo
pode ocorrer ldquoin vivordquo ou ldquoin vitrordquo O uso do AGH para detectar a sensibilizaccedilatildeo ldquoin vitrordquo
tem dois estaacutegios e eacute denominado teste indireto da antiglobulina A sensibilizaccedilatildeo ldquoin vivordquo eacute
detectada em procedimento de um uacutenico estagio chamado teste direto da antiglobulina (TDA)
11
Os testes direto e indireto satildeo ateacute hoje amplamente aplicados como princiacutepio de inuacutemeros
testes soroloacutegicos em imuno-hematologia (GREEN e KLOSTERMANN 2012)
131 TESTE DIRETO DA ANTIGLOBULINA
O teste direto da antiglobulina humana revela a presenccedila de anticorpo eou fraccedilatildeo do
complemento ligados agrave superfiacutecie das hemaacutecias As sensibilizaccedilatildeo das hemaacutecias ocorrida ldquoin
vivordquo natildeo eacute visualizada mas apoacutes a adiccedilatildeo da antiglobulina humana ocorre a aglutinaccedilatildeo que
eacute visualizada macroscopicamente (Figura 1)
Figura 1 - Princiacutepio da teacutecnica direta da antiglobulina Teste utilizado para demonstrar a sensibilizaccedilatildeo ldquoin
vivordquo das hemaacutecias O sangue total eacute coletado do paciente em tubo contendo anticoagulante EDTA Na teacutecnica
realizada em tubo uma suspensatildeo de hemaacutecias 5 em soluccedilatildeo de salina eacute preparada Uma gota dessa suspensatildeo
eacute lavada 3 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica para retirada de anticorpos que estatildeo livres no plasma Toda soluccedilatildeo eacute
retirada e adiciona-se o soro de Coombs (antiglobulina humana) O soro de Coombs reconhece os anticorpos que
estatildeo ligados agrave superfiacutecie das hemaacutecias fazendo com que ocorra aglutinaccedilatildeo visiacutevel macroscopicamente
Apesar de natildeo ser um teste preacute-transfusional obrigatoacuterio o TDA eacute um dos testes mais
importantes para investigar e classificar quadros hemoliacuteticos como de origem imune ou natildeo
imune O seu valor preditivo positivo em vigecircncia de anemia hemoliacutetica eacute de 83 poreacutem natildeo
havendo sinais de hemoacutelise seu valor preditivo eacute apenas 14 Eacute por esse motivo que a
interpretaccedilatildeo do TDA positivo deve levar em consideraccedilatildeo a histoacuteria cliacutenica e os resultados
dos outros exames laboratoriais A realizaccedilatildeo do TDA eacute obrigatoacuteria na investigaccedilatildeo
12
laboratorial de diversos quadros hemoliacuteticos entre eles a anemia hemoliacutetica autoimune
(AHAI) a reaccedilatildeo hemoliacutetica imune poacutes-transfusional a siacutendrome do linfoacutecito passageiro a
doenccedila hemoliacutetica perinatal e a hemoacutelise droga-dependente (LEGER 2011)
Resultados de TDA positivos foram tambeacutem observados em indiviacuteduos com niacuteveis
seacutericos elevados de IgG ou complemento sem evidecircncia de anemia hemoliacutetica imune como
em pacientes com doenccedila falciforme talassemia doenccedila renal crocircnica mieloma muacuteltiplo
doenccedilas autoimunes e siacutendrome da imunodeficiecircncia adquirida (SIDA) Aleacutem disso pequenas
quantidades de IgG (5 a 90 moleacuteculas por hemaacutecia) e complemento (5 a 40 moleacuteculas por
hemaacutecia) podem estar presentes nas hemaacutecias de indiviacuteduos saudaacuteveis sem associaccedilatildeo com
reduccedilatildeo na sobrevida das mesmas A positividade do TDA depende da populaccedilatildeo estudada e
pode variar de 01 entre doadores de sangue sem qualquer sinal cliacutenico de hemoacutelise ateacute
15 em pacientes hospitalizados (CASTILHO JUNIOR e REID 2015 LEGER 2011)
Indiviacuteduos que apresentam TDA positivo seja agraves custas de IgG eou complemento
com ou sem sinais cliacutenicos de hemoacutelise teratildeo a fenotipagem eritrocitaacuteria prejudicada A
fenotipagem de indiviacuteduos com TDA positivo especialmente quando utilizado o teste indireto
da antiglobulina pode acarretar resultados falsos positivos e levar a seleccedilatildeo de fenoacutetipo
incorreto para transfusatildeo
132 TESTE INDIRETO DA ANTIGLOBULINA
O teste indireto da antiglobulina (TIA) eacute utilizado para revelar a sensibilizaccedilatildeo ldquoin
vitrordquo das hemaacutecias e eacute aplicado a diversos testes soroloacutegicos em imunohematologia entre
eles a pesquisa de anticorpos identificaccedilatildeo de anticorpos testes de compatibilidade
fenotipagem eritrocitaacuteria e titulaccedilatildeo de anticorpos Na teacutecnica indireta a hemaacutecia que contecircm
o antiacutegeno eacute colocada em contato ldquoin vitrordquo com o anticorpo que se liga mas natildeo promove a
aglutinaccedilatildeo visiacutevel A adiccedilatildeo da AGH forma uma malha entre os anticorpos que sensibilizam
as hemaacutecias e provoca a aglutinaccedilatildeo macroscoacutepica (figura 2)
Caso a amostra de hemaacutecia estudada seja previamente sensibilizada resultados falsos
positivos podem ser obtidos no TIA jaacute que a AGH reagiraacute com a moleacutecula que sensibilizava
anteriormente a hemaacutecia mesmo se o anticorpo especiacutefico natildeo tiver se ligado ao antiacutegeno
correspondente
13
133 CONDICcedilOtildeES CLIacuteNICAS COM TDA POSITIVO
O TDA positivo deve ser interpretado cuidadosamente sempre em conjunto com o
quadro cliacutenico do paciente A positividade isolada do TDA natildeo significa hemoacutelise A
interpretaccedilatildeo do teste positivo requer o conhecimento do diagnoacutestico do paciente da presenccedila
de sinais e sintomas sugestivos de hemoacutelise assim como de seu histoacuterico transfusional
gestacional e de informaccedilotildees sobre o uso recente de medicaccedilotildees (LEGER 2011)
Figura 2 ndash Princiacutepio do teste indireto da antiglobulina O TIA pode ser utilizado na pesquisa de anticorpos de
especificidades desconhecidas livres no soroplasma como eacute o caso da pesquisa e identificaccedilatildeo de anticorpos
irregulares Ele eacute tambeacutem utilizado para determinar a presenccedila de antiacutegenos na membrana da hemaacutecia quando
satildeo empregados soros de especificidades conhecidas da classe IgG No primeiro caso o soroplasma contendo o
anticorpo desconhecido eacute colocado em contato com hemaacutecias cujo perfil antigecircnico eacute conhecido No segundo
caso utiliza-se soro de especificidade conhecida da classe IgG para determinar a presenccedila ou ausecircncia de um
antiacutegeno na membrana O anticorpo encontra o antiacutegeno correspondente e ocorre a ligaccedilatildeo do anticorpo agrave
hemaacutecia mas natildeo ocorre aglutinaccedilatildeo Apoacutes a adiccedilatildeo da AGH que se liga aos anticorpos formando uma malha
ocorre a aglutinaccedilatildeo visiacutevel
O TDA positivo eacute uma achado claacutessico de algumas condiccedilotildees cliacutenicas como a reaccedilatildeo
transfusional hemoliacutetica a doenccedila hemoliacutetica do feto e do receacutem-nascido (DHFRN) a anemia
hemoliacutetica induzida por drogas a siacutendrome do linfoacutecito passageiro e a anemia hemoliacutetica
autoimune (AHAI) Portanto o TDA positivo pode ser decorrente da sensibilizaccedilatildeo da
hemaacutecia autoacuteloga por um autoanticorpo ou por um aloanticorpo ligado agrave hemaacutecia alogecircnica
circulante A positividade do TDA pode ainda ocorrer de forma passiva em pacientes que
14
recebem imunoglobulinas humanas ou ainda pela transfusatildeo de plaquetas ABO natildeo idecircntico
(LEGER 2011 RALPH 2012 ZANTEK et al 2012)
Nas reaccedilotildees transfusionais hemoliacuteticas imunes o aloanticorpo do receptor sensibiliza
as hemaacutecias transfundidas do doador e reduz sua sobrevida ao removecirc-la precocemente da
circulaccedilatildeo pela fagocitose no sistema retiacuteculo-endotelial ou pela hemoacutelise intravascular As
reaccedilotildees podem ser agudas se ocorrem ateacute 24 horas ou tardias quando ocorrem apoacutes 24 horas
da transfusatildeo A gravidade das reaccedilotildees hemoliacuteticas pode variar de um simples rendimento
transfusional inadequado agrave quadros graves de hemoacutelise intravascular evoluindo ateacute mesmo
com choque vascular e oacutebito O TDA pode resultar negativo caso toda massa eritrocitaacuteria
transfundida tenha sido destruiacuteda (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
Na doenccedila hemoliacutetica do feto e do receacutem-nascido (DHFRN) anticorpos maternos da
classe IgG atravessam a barreira placentaacuteria e sensibilizam as hemaacutecias fetais que seratildeo
destruiacutedas precocemente levando agrave anemia fetal Apesar da incompatibilidade ABO feto-
materna ser a causa mais frequente de DHFRN raramente ela eacute responsaacutevel pela ocorrecircncia
de quadros graves Por outro lado anticorpos contra antiacutegenos do sistema Rh e Kell
especialmente Anti-D (Anti-RH1) Anti-c (Anti-RH4) e Anti-Kell (Anti-KELL1) satildeo
conhecidos por causar DHFRN severa Raramente outros anticorpos tambeacutem podem estar
implicados na DHFRN como os anticorpos contra antiacutegenos do sistema Kidd Duffy MNS e
Diego (ZANTEK et al 2012)
A hemoacutelise droga-dependente eacute causada pela produccedilatildeo de um anticorpo voltado contra
a droga ligada agrave membrana eritrocitaacuteria ou ainda contra o complexo droga-membrana A
classe de medicaccedilotildees mais comumente envolvida eacute a dos antimicrobianos betalactacircmicos
(penicilinas e cefalosporinas) mas outras classes como quimioteraacutepicos e anti-inflamatoacuterios
tambeacutem satildeo descritos (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
Apoacutes transplante de ceacutelulas progenitoras hematopoieacuteticas em que o doador possui
anticorpos contra antiacutegenos eritrocitaacuterios do receptor o linfoacutecito de memoacuteria do doador pode
resistir ao esquema imunossupressor utilizado e continuar a produccedilatildeo de anticorpos que
reconhecem a hemaacutecia incompatiacutevel do receptor ainda circulante O quadro cliacutenico pode
variar de um simples TDA positivo sem outros sinais ou sintomas ateacute um quadro hemoliacutetico
grave e abrupto (LEGER 2011)
15
134 ANEMIA HEMOLIacuteTICA AUTOIMUNE
A anemia hemoliacutetica autoimune eacute caracterizada pela destruiccedilatildeo precoce das hemaacutecias
autoacutelogas por autoanticorpos que sensibilizam as hemaacutecias e levam agrave fagocitose pelos
macroacutefagos no sistema reticulo-endotelial ou hemoacutelise intravascular O diagnoacutestico da AHAI
baseia-se na presenccedila de hemoacutelise cliacutenica associada agrave evidecircncia de fator imune representado
pelo TDA positivo As classes de anticorpos envolvidas em quadros de AHAI satildeo IgG IgM e
raramente IgA (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012) Satildeo raros os casos de AHAI com TDA
negativo que podem estar relacionados a um autoanticorpo de baixa avidez de densidade
inferior agrave detecccedilatildeo do meacutetodo ou ainda de classe de imunoglobulina natildeo avaliada pelo
meacutetodo utilizado para o teste (GARRATY 2005)
A AHAI pode ser classificada em dois grupos principais de acordo com a melhor
temperatura de reaccedilatildeo do autoanticorpo As anemias hemoliacuteticas causadas por anticorpos
quentes que reagem melhor a 37oC e geralmente IgG representam 80 dos casos de AHAI
Nas AHAI por anticorpo quente o TDA pode ser positivo para IgG mais complemento (67)
somente IgG (20) ou somente por complemento (13) As anemias causadas por
anticorpos frios geralmente da classe IgM e que reagem melhor em temperatura ambiente ou
a 4oC representam aproximadamente 20 dos casos de AHAI Por exibirem amplitude
teacutermica esses anticorpos ligam-se agraves hemaacutecias ao atingirem a circulaccedilatildeo nas extremidades do
corpo fixam o complemento e desprendem-se da hemaacutecia apoacutes retornar para partes mais
quentes Por esse motivo em AHAI por anticorpos frios o TDA eacute positivo apenas agraves custas
de C3 e normalmente o IgM natildeo eacute detectado (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
A presenccedila do autoanticorpo IgG pode ser confirmada atraveacutes da eluiccedilatildeo do anticorpo
da hemaacutecia Tipicamente o eluato na AHAI por anticorpo quente reage com todas as ceacutelulas
testadas de um painel de hemaacutecias alogecircnicas do tipo ldquoOrdquo ou pode eventualmente exibir uma
especificidade conhecida como Anti-e (Anti-RH5) Nas AHAI a frio por sua vez espera-se
um eluato negativo (LEGER 2011)
Os autoanticorpos satildeo com frequecircncia encontrados livres no plasma e natildeo somente
ligados agraves hemaacutecias autoacutelogas Eles podem interferir em todas as fases dos testes preacute-
transfusionais nas quais o plasma eacute testado especialmente os autoanticorpos quentes que
acarretam resultados positivos em todos os testes levados agrave fase de antiglobulina humana
Esses anticorpos portanto positivam a pesquisa de anticorpos irregulares e mascaram a
presenccedila de aloanticorpos de significado cliacutenico Aproximadamente 60 dos pacientes que
apresentam AHAI a quente apresentam anticorpos que reagem em meio salino mas se forem
16
levados em conta meacutetodos mais sensiacuteveis como PEG enzima e estudo em gel a positividade
pode ser superior a 90 (LEGER 2011)
Aleacutem da eficaacutecia da transfusatildeo ser comprometida pela diminuiccedilatildeo da vida-meacutedia das
hemaacutecias a presenccedila do autoanticorpo dificulta a realizaccedilatildeo dos testes preacute-transfusionais e
compromete a seguranccedila transfusional Os autoanticorpos reagem normalmente como
panaglutininas pois satildeo normalmente voltados contra antiacutegenos puacuteblicos na maior parte das
vezes contra antiacutegenos do sistema Rh Por apresentarem essas caracteriacutesticas podem ainda
mascarar a presenccedila de aloanticorpos de significado clinico e levar a testes de compatibilidade
positivos exigindo uma avaliaccedilatildeo criteriosa da necessidade da transfusatildeo (BRANCH e PETZ
1999 JUNIOR e OLIVATO 2004)
Remover a interferecircncia do autoanticorpo para avaliar a presenccedila de aloanticorpos
mascarados nem sempre eacute possiacutevel mesmo utilizando teacutecnicas de autoadsorccedilatildeo ou
aloadsorccedilatildeo que aleacutem de tudo satildeo demoradas e exigem de 2 a 6 horas para conclusatildeo
(GARRATY e GEORGE 2002) Nesses casos a fenotipagem eritrocitaacuteria do paciente eacute de
extrema utilidade especialmente em situaccedilotildees de urgecircncia A definiccedilatildeo do fenoacutetipo do
paciente para os antiacutegenos de maior importacircncia cliacutenica pode auxiliar a seleccedilatildeo de unidades
de hemaacutecias com mesmo fenoacutetipo o que garante que eventuais aloanticorpos natildeo
identificados sejam respeitados e tambeacutem evita nova sensibilizaccedilatildeo (JUNIOR e OLIVATO
2004 SHIREY et al 2002)
135 TRATAMENTO DE HEMAacuteCIAS COM TDA POSITIVO
O TDA positivo impede a fenotipagem eritrocitaacutecia por meacutetodos que exigem a fase de
AGH uma vez que a aglutinaccedilatildeo ocorreraacute devido agrave interaccedilatildeo da AGH com o autoanticorpo
que sensibiliza a hemaacutecia do paciente levando a resultados falso positivos Em algumas
situaccedilotildees como na AHAI por anticorpo quente a fenotipagem eacute especialmente importante
pois o autoanticorpo interfere na triagem e identificaccedilatildeo de anticorpos assim como no teste de
compatibilidade e dificultam a detecccedilatildeo de aloanticorpos de significado cliacutenico que
obrigatoriamente devem ser respeitados Nessas situaccedilotildees a fenotipagem eritrocitaacuteria
determina o perfil antigecircnico do paciente e possibilita o fornecimento de unidades de
hemaacutecias com o mesmo fenoacutetipo para a transfusatildeo evitando a sensibilizaccedilatildeo para novos
antiacutegenos assim como reaccedilotildees hemoliacuteticas transfusionais No entanto eacute necessaacuterio aplicar
meacutetodos que natildeo sofram interferecircncia do TDA positivo ou seja meacutetodos que natildeo necessitem
da fase de AGH ou meacutetodos de bloqueio do anticorpo sem bloquear o antiacutegeno Uma opccedilatildeo eacute
a utilizaccedilatildeo de soros monoclonais IgM (salinos ou de meio proteico natildeo concentrado) mas
17
nem sempre esses reagentes estatildeo disponiacuteveis especialmente os reagentes monoclonais para
os antiacutegenos dos sistemas Duffy ( Fya Fy
b) Kidd ( Jk
a Jk
b) e MNS (S s) (JUNIOR e
OLIVATO 2004) Outra opccedilatildeo eacute a teacutecnica de bloqueio que pode ser utilizada para tratar
hemaacutecias para posterior fenotipagem em casos de TDA positivos com reatividade le2+
Em casos onde a positividade do TDA eacute maior que 2+ estaacute indicada a tratamento
quiacutemico para remoccedilatildeo da interferecircncia do autoanticorpo antes de realizar a fenotipagem Entre
as teacutecnicas utilizadas atualmente estatildeo o ZZAP a cloroquina e a glicina aacutecidaEDTA
1351 TEacuteCNICA DE BLOQUEIO
A teacutecnica de bloqueio se baseia na utilizaccedilatildeo de anti-IgG (Coombs monoespeciacutefico)
para tratar as hemaacutecias com TDA positivo O anticorpo anti-IgG se liga aos anticorpos que
estatildeo sensibilizando a hemaacutecias poreacutem sem o bloquear os antiacutegenos Os antiacutegenos que natildeo
estatildeo sensibilizados podem ser detectados atraveacutes dos antissoros especiacuteficos (SERERAT
VEIDT E DUTCHED 2000)
1352 TRATAMENTO DE HEMAacuteCIAS COM ZZAP
O Sulphydryl-Proteolytic Enzyme (ZZAP) que eacute uma mistura de ditiotreitol (DTT)
mais papaiacutena ativada com cisteiacutena eacute um reagente capaz de dissociar imunoglobulinas da
classe IgG ligadas a membrana dos eritroacutecitos enquanto trata enzimaticamente as hemaacutecias
O tratamento enzimaacutetico tambeacutem potencializa a ligaccedilatildeo do autoanticorpo ao antiacutegeno e
acelera o processo de autoadsorccedilatildeo O ZZAP pode desnaturar os antiacutegenos do sistema Duffy
MNS e Kell o que limita sua aplicaccedilatildeo para fins de fenotipagem (BRANCH e PETZ 1982)
1353 CLOROQUINA
Em 1982 Edwards Moulds e Judd propuseram a utilizaccedilatildeo da teacutecnica da cloroquina
que dissociava os complexos antiacutegeno-anticorpo e mantinha a membrana das hemaacutecias
iacutentegras Os derivados quinolecircicos jaacute haviam sido descritos anteriormente por Domokos e
Aszody em 1964 e Holtz Mantel e Buck em 1973 (apud Edwards Moulds e Judd 1982) pela
sua capacidade de separar imunocomplexos e inibir as reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo reduzindo
as cargas eleacutetricas das superfiacutecie das hemaacutecias A teacutecnica eacute uma das mais utilizadas nos
centros brasileiros para remover a interferecircncia do autoanticorpo e eacute tambeacutem a teacutecnica
atualmente adotada pelo laboratoacuterio de imunohematologia do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto
18
Edwards Moulds e Judd (1982) demonstraram que a teacutecnica da cloroquina para
dissociaccedilatildeo de anticorpos eacute uma teacutecnica simples efetiva e confiaacutevel para dissociar
imunoglobulina das hemaacutecias Desde que a membrana das hemaacutecias permaneccedila intacta natildeo
haacute perda da reatividade dos antiacutegenos e a sua maior aplicaccedilatildeo eacute a fenotipagem de hemaacutecias
com TDA positivo Os autores verificaram que em 83 das amostras sensibilizadas in vivo e
22 amostras (no total de 40) sensibilizadas ldquoin vitrordquo apresentaram TDA negativo e
puderam ser fenotipadas A teacutecnica poreacutem natildeo consegue remover os componentes do
complemento na maioria dos casos
Champagne e colaboradores (1999) testaram a teacutecnica da cloroquina para dissociar
antiacutegenos Bg comparando com a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA e verificaram vantagem em
relaccedilatildeo ao uso de um uacutenico reagente diminuindo a manipulaccedilatildeo e verificou que o mesmo natildeo
destroacutei antiacutegeno Kell
A cloroquina tambeacutem mostrou-se pouco efetivo em remover anticorpos do sistema
Duffy da superfiacutecie das hemaacutecias (EDWARDS MOUDS e JUDD 1982 ROZIERS e
SQUALI 1997)
1353 GLICINA-AacuteCIDAEDTA
A afinidade e a estabilidade entre a ligaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo eacute definida como a
resultante entre forccedilas atrativas e repulsivas entre ambos (CARUCIO e WISE 2012) e resulta
da somatoacuteria de forccedilas quiacutemicas dinacircmicas e fracas (natildeo covalentes) como pontes de
hidrogecircnio forcas eletrostaacuteticas forca de Van der Waals e pontes hidrofoacutebicas A estabilidade
dessa ligaccedilatildeo eacute facilmente abalada por alteraccedilotildees quiacutemicas e fiacutesicas no meio da reaccedilatildeo como
a alteraccedilatildeo do pH A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA se baseia na mudanccedila do pH para a
quebra da ligaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo (KOSANKE 2012)
A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA foi primeiramente descrita em 1986 por Louie Jieng
e Zeroulis que utilizaram 50 amostras de doadores sensibilizados ldquoin vitrordquo com anticorpos A
teacutecnica foi efetiva em 48 amostras permitindo o estudo do eluato assim como a fenotipagem
das hemaacutecias Os autores testaram tambeacutem a teacutecnica em 100 hemaacutecias TDA positivo que
puderam ser utilizadas para teacutecnicas de autoadsorccedilatildeo
Byrne (1991) descreveu a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA modificada e tambeacutem
verificou como uma opccedilatildeo para o tratamento de hemaacutecias com TDA positivo que deixava as
hemaacutecias intactas e o eluato viaacutevel para ser fenotipado
19
Roziers e Squali (1997) e Katharia e Chaudhary (2013) compararam a teacutecnica da
glicina-aacutecidaEDTA com as teacutecnicas da cloroquina e do aquecimento Verificaram maior
eficiecircncia da glicina-aacutecidaEDTA em relaccedilatildeo as outras duas teacutecnicas pois com uma mesma
quantidade de amostra produzia as hemaacutecias livres de anticorpo e tambeacutem o eluato Mostrou-
se ainda superior devido ao menor tempo exigido para sua realizaccedilatildeo o que favorece seu uso
em situaccedilotildees de urgecircncia e emergecircncia
As duas desvantagens da teacutecnica poreacutem eacute o fato de destruir os antiacutegenos do sistema
Kell e o fato de natildeo remover fraccedilotildees do complemento ligadas agrave hemaacutecia (PALLAS WILER e
McGEE 1991 ROZIERS e SQUALLI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012
e KATHARIA e CHAUNDHARY 2013)
20
2 OBJETIVOS
21 OBJETIVO GERAL
211 Avaliar a eficaacutecia da glicina-aacutecidaEDTA em remover os anticorpos ligados agraves
hemaacutecias sensibilizadas por anticorpos da classe IgG
22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
221 Preparaccedilatildeo dos reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
verificaccedilatildeo da estabilidade dos mesmos e avaliar custos
222 Testar a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA em amostras de hemaacutecias
sensibilizadas por anticorpos antieritrocitaacuterios humanos
223 Comparar a efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA com a teacutecnica da
cloroquina quanto a capacidade de remover a interferecircncia do anticorpo ligado
a hemaacutecia
224 Testar o eluato das amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA
225 Verificar se houve destruiccedilatildeo dos antiacutegenos eritrocitaacuterios apoacutes o tratamento
com glicina-aacutecidaEDTA e com cloroquina
226 Verificar se o tempo de execuccedilatildeo da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA descrito
nos textos de referecircncia eacute reprodutiacutevel
21
3 JUSTIFICATIVA
Algumas condiccedilotildees cliacutenicas podem levar ao depoacutesito ldquoin vivordquo de anticorpos eou
fraccedilotildees do complemento sobre as hemaacutecias Entre elas estatildeo as reaccedilotildees hemoliacuteticas poacutes-
transfusionais a doenccedila hemoliacutetica perinatal o uso de medicamentos e principalmente a
AHAI Na AHAI um anticorpo normalmente da classe IgG ou IgM reconhece antiacutegenos
proacuteprios na membrana eritrocitaacuteria e reduz a sobrevida da hemaacutecia levando a sua destruiccedilatildeo
pelos macroacutefagos no sistema reticulo-endotelial ou agrave ativaccedilatildeo do complexo de ataque agrave
membrana e agrave lise intravascular Os autoanticorpos satildeo voltados na maioria das vezes contra
antiacutegenos eritrocitaacuterios de alta frequecircncia populacional conhecidos como antiacutegenos puacuteblicos
e por este motivo reconhecem tanto hemaacutecias autoacutelogas quanto alogecircnicas
Devido agrave presenccedila do autoanticorpo livre no plasma e tambeacutem do anticorpo eou
complemento ligado agrave hemaacutecia o banco de sangue pode encontrar dificuldades em todas as
fases dos testes preacute-transfusionais do paciente com AHAI e deve utilizar teacutecnicas que
auxiliem na escolha do melhor hemocomponente melhorando a seguranccedila transfusional Essas
teacutecnicas visam remover a interferecircncia do autoanticorpo livre no soro e do autoanticorpo
ligado agrave hemaacutecia permitindo a detecccedilatildeo de aloanticorpos associados e a realizaccedilatildeo da
fenotipagem eritrocitaacuteria respectivamente
A finalizaccedilatildeo dos testes preacute-tranfusionais na presenccedila de autoanticorpo pode levar
algumas horas e nem sempre o paciente poderaacute aguardar Nesse contexto torna-se vantajosa a
aplicaccedilatildeo de teacutecnicas de raacutepida execuccedilatildeo
O presente estudo propotildee aplicar e avaliar a eficaacutecia da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
em remover os anticorpos ligados agrave hemaacutecia o que permite a fenotipagem eritrocitaacuteria
estendida e a seleccedilatildeo de concentrados de hemaacutecias com mesmo fenoacutetipo do paciente
Atualmente no Hemocentro de Ribeiratildeo Preto a teacutecnica utilizada para esse fim eacute o
tratamento das hemaacutecias com difosfato de cloroquina cujo tempo de execuccedilatildeo pode demorar
ateacute duas horas enquanto a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser realizada em apenas dois
minutos o que a tornaria opccedilatildeo de escolha especialmente em situaccedilotildees de urgecircncia Ao
contraacuterio da cloroquina a glicina-aacutecidaEDTA permite tambeacutem o estudo do eluato das
hemaacutecias tratadas
22
4 METODOL OGIA
41 AMOSTRAS DE DOADORES
Foram coletados 50 amostras de doadores de sangue que compareceram ao
Hemonuacutecleo de Araccedilatuba no periacuteodo de junho a agosto de 2016 Foram convidados a
participar da pesquisa doadores de repeticcedilatildeo do tipo sanguiacuteneo ldquoOrdquo RhD positivo
cadastrados no sistema de banco de sangue (SBS) do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto
Todos os doadores que concordaram em participar da pesquisa assinaram o termo de
consentimento livre e esclarecido (TCLE)
No momento da doaccedilatildeo foram coletados adicionalmente 5 mL de sangue total em
soluccedilatildeo anticoagulante EDTA (aacutecido dietilenoaminoaceacutetico) dispensando punccedilatildeo venosa
adicional para coleta da amostra O fluxograma 1 resume as etapas desenvolvidas no projeto
Fluxograma 1 - Fluxo da pesquisa utilizando as amostras de doadores
23
411 FENOTIPAGEM
Foram verificados se os doadores jaacute tinham fenotipagem para outros sistemas de
grupos sanguiacuteneos aleacutem do sistema ABORh que eacute realizado rotineiramente
A fenotipagem eritrocitaacuteria para outros sistemas ou fenotipagem estendida eacute realizada
para identificar a presenccedila ou ausecircncia de antiacutegenos considerados de importacircncia cliacutenica No
Hemonuacutecleo de Araccedilatuba uma parcela de doadores de repeticcedilatildeo satildeo fenotipados para os
antiacutegenos dos sistemas de grupo sanguiacuteneo Rh (antiacutegenos C c E e e) Kell (antiacutegeno K)
Duffy (antiacutegenos Fya e Fy
b) Kidd (antiacutegenos Jk
a e Jk
b) e sistema MNSs (antiacutegenos S e s)
A fenotipagem para o Rh e Kell eacute realizada por metodologia de microplaca utilizando
25 microL de hemaacutecia lavada e diluiacuteda a 5 em salina e 25 microL do antissoro comercial especiacutefico
A reaccedilatildeo eacute incubada 15 minutos a temperatura ambiente e centrifugadas para leitura Para os
antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s a metolodogia utilizado eacute gel contendo antiglobulina
humana (gel LissCoombs poliespeciacutefico) da marca BIO-RAD onde se utiliza suspensatildeo de
hemaacutecia em LISS (Soluccedilatildeo de baixa forccedila iocircnica) A suspensatildeo eacute preparada atraveacutes da
diluiccedilatildeo de 10 microL de hemaacutecia em 1000 microL de LISS Pipetado 50 microL dessa diluiccedilatildeo no gel e
adicionado 25 microL do antissoro especiacutefico Incuba-se em banho seco por 15 minutos a 37 deg
Celsius e eacute centrifugado em centriacutefuga especiacutefica Os antissoros utilizados eram das marcas
Fresenius e Lorne
Foi verificado a fenotipagem do doador no banco de dados do Hemocentro Os
registros dos fenoacutetipos dos doadores ficam armazenadas no sistema de banco de sangue
(SBS) Para doadores que natildeo tinham fenotipagem estendida preacutevia para antiacutegenos do sistema
Rh (C c E e e) e Kell (K) foi realizada a fenotipagem para esses antiacutegenos
O tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA e cloroquina para dissociar
anticorpos pode inativar enfraquecer ou destruir os antiacutegenos presentes nas hemaacutecias
alterando assim os resultados da fenotipagem Para verificar se houve destruiccedilatildeo dos
antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a e Jk
b S e s nas amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes
tratamento foram novamente fenotipadas ao final para os antiacutegenos que eram inicialmente
positivas
A repeticcedilatildeo da fenotipagem foi realizada nas amostras que apresentaram efetividade
no tratamento da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eou da cloroquina e a detecccedilatildeo do antiacutegeno
na amostra preacute-tratamento
24
412 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS HEMAacuteCIAS
As hemaacutecias foram sensibilizadas com antissoros policlonais humanos de amostras de
plasma fresco congelado de doadores com resultado de pesquisa de anticorpo irregular
positivos
A escolha do anticorpo para sensibilizar as hemaacutecias foi definida de acordo com o
fenoacutetipo do doador que deveria ser positivo para o respectivo antiacutegeno
Para a sensibilizaccedilatildeo um volume de antissoro (1 mL) e um volume (1 mL) de
hemaacutecias lavadas quatro vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica foram adicionadas a um tubo de 12 x
75 mm A mistura foi homogeneizada e incubada em banho maria (BM) a 37deg C por 60
minutos A seguir as hemaacutecias foram novamente lavadas 4 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica
para retirada dos anticorpos que natildeo se ligaram A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada
como controle negativo O teste da uacuteltima lavagem eacute importante para assegurar que os
anticorpos que poderatildeo ser detectados no eluato apoacutes o tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA
sejam aqueles que estavam ligados agraves hemaacutecias e natildeo aqueles livres no plasma O controle
negativo mostra que todo o anticorpo livre foi retirado (LEGER 2011)
Para o teste de presenccedila de anticorpo na soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foram incubadas
com hemaacutecias de triagem de anticorpos irregulares (ID-Diacell BIO-RAD) contendo os
antiacutegenos especiacuteficos Realizado a teacutecnica em gel LissCoombs com anti-IgG+C3d Incubado
no tempo de 15 minutos a temperatura de 37deg C e centrifugado 10 minutos em centriacutefuga
proacutepria
As 50 amostras de doadores foram sensibilizadas com os anticorpos policlonais
humanos
Apoacutes sensibilizadas rdquoin vitrordquo e lavadas as hemaacutecias foram diluiacutedas em soluccedilatildeo de
baixa forccedila iocircnica (LISS) na quantidade de 10 microL de hemaacutecia para 1000 microL de soluccedilatildeo A
suspensatildeo foi pipetada (50 microL) em coluna-gel-teste LissCoombs (BIO-RAD) que contecircm
antiglobulina poliespeciacutefico (IgG+C3d) e centrifugada em baixa rotaccedilatildeo conforme orientaccedilatildeo
do fabricante durante 10 minutos
As amostras deveriam apresentar aglutinaccedilatildeo com reatividade 3 a 4+ no TDA As
amostras que apresentaram reaccedilatildeo menor que 3+ foram novamente sensibilizadas com nova
aliacutequota do antissoro
25
413 TRATAMENTO DAS AMOSTRAS
As amostras sensibilizadas apresentando o TDA positivo 3 ou 4+ foram divididas em
duas aliacutequotas e submetidas a duas teacutecnicas diferentes com o objetivo de dissociar o anticorpo
ligado Uma aliacutequota da amostra foi tratada com soluccedilatildeo de difosfato de cloroquina enquanto
a outra aliacutequota foi tratada com glicina-aacutecidaEDTA
42 PREPARO DA GLICINA AacuteCIDA-EDTA
A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA utiliza 3 soluccedilotildees diferentes a glicina aacutecida o
EDTA e o tampatildeo TRIS
Os reagentes foram preparados utilizando os sais para anaacutelise (PA) de EDTA
(Na2EDTA2H2O) TRIS (C4H11NO3) Glicina (H2NCH2CO2H) NaCl e a soluccedilatildeo de aacutecido
cloriacutedrico (HCl) 12 N todos reagentes da marca SYNTH (quadro 1)
Para o preparo do tampatildeo glicina-acida eacute necessaacuterio o ajuste do pH para 15 Para esse
ajuste utiliza-se aacutecido cloriacutedrico (HCl) concentrado O pH foi medido com fitas reativas de pH
com escala de 1 a 14 da marca MERCK Posteriormente a soluccedilatildeo foi enviada ao laboratoacuterio
de controle de qualidade do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto e o pH medido no peagacircmetro O
tampatildeo glicina-aacutecida foi armazenado a 4deg e o tampatildeo tris e o EDTA em temperatura ambiente
controlada (20 a 24deg Celsius)
Apoacutes o preparo e durante a realizaccedilatildeo dos testes foram feitas inspeccedilotildees visuais para
verificaccedilatildeo de turvaccedilatildeo do meio e presenccedila de precipitados
Reagente Material Quantidade Preparo e
Conservaccedilatildeo
EDTA
EDTA
(Na2EDTA2H2O)
5 gramas Mistura ateacute
dissoluccedilatildeo do sal e
conserva em
temperatura ambiente Aacutegua Destilada 50 Ml
Tris
TRIS (C4H11NO3) 121 gramas Conservar em
temperatura ambiente NaCl 525g
Aacutegua destilada 100ml
Gliacutecina-aacutecida
Glicina
(H2NCH2CO2H) 15 gramas
Conservar a 4oC NaCl 116gramas
Aacutegua Destilada 200ml
HCL 12N Ajutar o pH para 15
Quadro 1 - Preparo dos Reagentes da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
Fonte - Manual teacutecnico AABB 2011
26
O tampatildeo glicina-aacutecida e o tampatildeo TRIS satildeo estaacuteveis por 7 meses O reagente EDTA
precipitou mesmo estando em temperatura em ambiente controlado Houve necessidade de
preparo de novo reagente
421 TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
1 Em um tubo de ensaio 12x75 mm eacute adicionado 08 mL da soluccedilatildeo de glicina-aacutecida A
esta soluccedilatildeo adiciona-se 02 mL de EDTA e mistura
2 Adiciona-se 02 mL de hemaacutecias sensibilizadas (lavada 4 vezes) A mistura eacute
homogeneizada e incubada por exatamente 2 minutos
3 A seguir 01 mL de tampatildeo TRIS eacute adicionado agrave mistura que eacute novamente
homogeneizada e centrifugada por 2 minutos a 3400 rpm O pH deve estar entre 7 a 75
4 Apoacutes centrifugaccedilatildeo separa-se em outro tubo o sobrenadante (eluato) e as hemaacutecias
que permanecem satildeo lavadas 4 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica para retirada de todo o
reagente e anticorpos livres
43 PREPARO DA CLOROQUINA
A cloroquina eacute diluiacuteda em tampatildeo PBS na concentraccedilatildeo de 20 (Quadro 2) e
armazenado a 4deg Celsius sua validade apoacutes o preparo eacute de 1 mecircs
A teacutecnica da cloroquina jaacute estaacute padronizada para rotina do laboratoacuterio de
imunohematologia do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto e suas unidades
Reagente Reagentes Quantidade PreparoConservaccedilatildeo
Cloroquina
Difosfato de cloroquina
(C18H32ClN3O8P2)
20 gramas
Conservar a 4deg Celsius
Tampatildeo PBS 100ml
NaOH 01 N Acertar o pH para
51
Quadro 2 - Preparo da Cloroquina Fonte - Manual teacutecnico da AABB 2011
431 TEacuteCNICA DA CLOROQUINA
1 4 partes da soluccedilatildeo pronta eacute adicionada a uma parte de hemaacutecias lavadas 4 vezes com
soluccedilatildeo fisioloacutegica
2 A mistura eacute incubada em temperatura ambiente por ateacute duas horas
3 Centrifugar a 3400 rpm por 2 minutos
27
4 Remover o sobrenadante lavar as hemaacutecias novamente com soluccedilatildeo fisioloacutegica 4
vezes
44 VERIFICACcedilAtildeO DA EFETIVIDADE DOS TESTES
Apoacutes tratamento pelas duas teacutecnicas o TDA foi repetido em todas as amostras para
verificar se os tratamentos foram efetivos e houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo Para as
amostras tratadas pela teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA que permaneceram com TDA positivo
novo tratamento foi realizado
45 TESTE DO ELUATO
O eluato resultante das amostras tratadas com glicina-acidaEDTA foi testado com
hemaacutecias de triagem A soluccedilatildeo do eluato foi incubada com as hemaacutecias de triagem de
anticorpos (ID-Diacell BIO-RAD) pela teacutecnica em gel LissCoombs O teste foi incubado 15
minutos a 37deg Celsius e centrifugado por 10 minutos em centrifuga proacutepria para a teacutecnica em
gel Os eluatos que apresentaram resultados positivos foram testados em painel de 11
hemaacutecias (ID-Diapanel BIO-RAD) para a identificaccedilatildeo do anticorpo
46 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente que apresentou TDA positivo por IgG e pesquisa
de anticorpo irregular positivo com presenccedila de autoanticorpo com reatividade panaglutinina
A amostra foi tratada em paralelo pelas duas teacutecnicas descritas e foi enviada para o
Hemocentro para genotipagem eritrocitaacuteria que foi realizado por metodologia PCR em tempo
real no equipamento Real-time system PCR 7500 ( Applied Biosystems Califoacuternia EUA)
28
5 RESULTADOS
51 REAGENTES
Para aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA satildeo necessaacuterios 3 diferentes
reagentes que podem ser encontrados em forma de kit pronto para uso No entanto esses kits
natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil Os reagentes satildeo tampatildeo glicina-aacutecida o EDTA e o tampatildeo
Tris
Todos os reagentes foram preparados rdquoin houserdquo a partir dos sais e soluccedilotildees PA (puro
para anaacutelise) da marca SYNTH que foram adquiridos para a pesquisa O custo estimado para
cada teste foi aproximadamente R$ 020 reais
Apoacutes o preparo os reagentes poderiam ser armazenados em condiccedilotildees adequadas pelo
periacuteodo de 1 ano (AABB 2011) Ao final do preparo e durante o periacuteodo de armazenamento
de fevereiro a setembro de 2016 foi realizada inspeccedilatildeo visual para verificar a presenccedila de
precipitados ou turvaccedilatildeo A soluccedilatildeo de glicina e o tampatildeo TRIS mostraram-se estaacuteveis ateacute o
final do periacuteodo Por sua vez o reagente EDTA precipitou mesmo estando armazenado em
temperatura ambiente controlada e foi necessaacuterio novo preparo
52 AMOSTRAS DE DOADORES
521 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS AMOSTRAS
Apoacutes incubaccedilatildeo da hemaacutecia com o antissoro a mesma foi lavada 4 vezes para retirada
dos anticorpos livres A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada Caso houvesse positividade na
soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem a etapa era repetida (figura 3) Das 50 amostras sensibilizadas a
uacuteltima lavagem foi positiva somente em 3 delas Nas 3 amostras o anticorpo utilizado para
sensibilizaccedilatildeo foi o anti-K Apoacutes repetido nova etapa de lavagem os resultados se
apresentaram negativos
Em todas as amostras sensibilizadas ldquoin vitrordquo o TDA foi testado e verificado a
intensidade do teste Entre as 50 amostras 47 alcanccedilaram TDA com intensidade 3-4+ apoacutes a
primeira sensibilizaccedilatildeo enquanto 3 amostras necessitaram uma segunda incubaccedilatildeo com
anticorpo (figura 4)
A escolha dos anticorpos para sensibilizar as hemaacutecias foi feita de acordo com o
fenoacutetipo do doador e foram utilizados sete diferentes especificidades de anticorpos policlonais
humanos conforme mostra o graacutefico1
29
Figura 3 - Soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada com hemaacutecia de triagem de
anticorpos em gel LissCoombs (BIO-RAD) A finalidade eacute verificar a presenccedila de anticorpos livres na
suspensatildeo que possam interferir na pesquisa do eluato As soluccedilotildees de lavagem das amostras na figura a tiveram
resultados negativos Na figura b duas amostras a 47 e 50 apresentaram resultado positivo Nova etapa de
lavagem foi realizada e o resultado final foi negativo
522 TRATAMENTO DAS HEMAacuteCIAS
Apoacutes a sensibilizaccedilatildeo e obtenccedilatildeo de resultados de TDA com intensidade de 3 a 4+
cada uma das amostras foi dividida em duas aliacutequotas e tratada separadamente pelas teacutecnicas
de glicinaaacutecida-EDTA e cloroquina
As teacutecnicas foram consideradas efetivas quando obteve-se a completa dissociaccedilatildeo do
anticorpo verificada atraveacutes do TDA negativo na amostra poacutes tratamento conforme figuras 5
e 6 Dentre as amostras tratadas com cloroquina 2850 tiveram o TDA negativado A glicina-
aacutecidaEDTA negativou o TDA em 33 das 50 amostras tratadas Apenas 17 amostras tratadas
com glicina-aacutecidaEDTA permaneceram com o TDA positivo e foram submetidas a um novo
tratamento
30
Figura 4 - TDA das amostras apoacutes sensibilizaccedilatildeo com anticorpos policlonais humanos Amostras na
figura a com intensidades de 3-4+ Na figura b amostras 4 e 7 com intensidade menor que 3+ e portanto foram
novamente sensibilizadas com nova aliacutequota de soro Anti-D e anti-S Apoacutes a segunda sensibilizaccedilatildeo
apresentaram reatividade 4 e 3+ respectivamente Os anticorpos utilizados para sensibilizaccedilatildeo foram D S c E
C e K
523 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS TEacuteCNICAS
No tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA houve dissociaccedilatildeo completa do anticorpo
em 33 amostras (66) das 50 amostras testadas enquanto que com a cloroquina foram 28
amostras (56) (tabela 1)
31
Graacutefico 1- Nuacutemero de amostras sesnsibilizadas por especificidade de anticorpo Entre as 50 amostras 12
foram sensibilizadas com anti-D 10 com anti-C 9 com anti-E 8 com anti-c 7 com anti-S 3 com anti-K e 1
com anti-Dia As especificidades dos anticorpos foram definidas de acordo o fenoacutetipo do doador
Figura 5 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com cloroquina Nas amostras onde houve
a dissociaccedilatildeo do anticorpo ( 2 21 a 23 26 39 a 42 45 46 e 49) a hemaacutecia se deposita no fundo no microtubo
apoacutes a centrifugaccedilatildeo (TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (1 3 24 25 43 44 47
48 e 50) o anticorpo ligado agraves hemaacutecias eacute alvo da AGH presente no gel (TDA positivo)
Anti-D 12
Anti-C 10
Anti-E 9
Anti-c 8
Anti-S 7
Anti-K 3 Anti-Dia 1
32
Figura 6 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA Nas amostras
onde houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo (4 6 7 12 a 15 17 34 35 37 e 38) a hemaacutecia se deposita no fundo no
microtubo apoacutes a centrifugaccedilatildeo ( TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (5 16 18
19 20 33 e 36 ) o AGH presente no gel se liga ao anticorpo ligado agraves hemaacutecias que ficam retidas no gel (TDA
positivo)
Tabela 1-Resultado geral do tratamento das hemaacutecias com glicina e cloroquina
Teacutecnica utilizada TDA negativo TDA positivo Total
Glicina-aacutecidaEDTA 33 17 50
Cloroquina 28 22 50
A glicina-aacutecidaEDTA conseguiu negativar mais amostras sensibilizadas com Anti-D
e anti-K que a cloroquina Para as hemaacutecias sensibilizadas com anti-E Anti-S e Anti-Dia
ambas as teacutecnicas dissociaram o anticorpo em 100 das amostras Os resultados detalhados
por especificidade do anticorpo apoacutes o primeiro tratamento com glicina-aacutecidaEDTA e com
cloroquina estatildeo na tabela 2
Para as amostras que permaneceram positivas (17 amostras) apoacutes o tratamento com a
glicina-aacutecidaEDTA foi realizado um novo tratamento Houve dissociaccedilatildeo do anticorpo em 3
amostras (18) apoacutes a segunda tentativa Nas demais 14 (82) amostras tratadas pela
segunda vez 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise
33
Tabela 2 - Resultados do TDA apoacutes tratamento das hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo
sensibilizado
ANTICORPOS
SENSIBILIZADOS
1ordm TRATAMENTO COM
GLICINA
TRATAMENTO COM
CLOROQUINA
TOTAL TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
Anti-D 8 4 0 12 12
Anti-C 6 4 10 0 10
Anti-E 9 0 9 0 9
Anti-c 0 8 1 7 8
Anti-S 7 0 7 0 7
Anti-K 2 1 0 3 3
Anti-Dia 1 0 1 0 1
TOTAL 33 17 28 22 50
A hemoacutelise foi verificada durante o procedimento de lavagem final das hemaacutecias com
soluccedilatildeo fisioloacutegica para a retirada dos reagentes As soluccedilotildees de lavagem ficaram
avermelhadas e as hemaacutecias com coloraccedilatildeo escura As amostras foram descartadas Dentre as
6 amostras que ainda puderam ser testadas para o TDA trecircs amostras negativaram sendo 1
sensibilizada com anti-D e 2 com anti-C (tabela 3)
Tabela 3 - Resultado apoacutes o segundo tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA
Tratamento com
glicina-aacutecidaEDTA
TDA Negativo TDA Positvo Hemoacutelise Total
Segundo tratamento 3 3 11 17
524 TESTAGEM DO ELUATO
Apoacutes o tratamento com a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA a soluccedilatildeo do eluato foi
testada para verificar a viabilidade dos anticorpos que foram dissociados ou eluiacutedos Dentre
as 50 amostras 41 apresentaram eluato positivo As nove amostras cujos eluatos foram
negativos haviam sido sensibilizadas com as seguintes especificidades de anticorpos anti-E 6
amostras (67) anti-S 2 amostras (40) e anti-D 1 amostra (8) (tabela 4) O eluato de
todas as amostras sensibilizadas com os anticorpos anti-C anti-c Anti-K e Anti-Dia foram
positivos Os eluatos positivos na triagem de anticorpos foram testados com paineacuteis de
identificaccedilatildeo para confirmar a especificidade e a viabilidade dos anticorpos (figuras 7 e 8)
34
525 EFEITO DA ELUICcedilAtildeO SOBRE OS ANTIacuteGENOS ERITROCITAacuteRIOS
Para verificar o efeito do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA e com a cloroquina
sobre a expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s foi realizada a fenotipagem das
amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes tratamento com ambas as teacutecnicas Foi avaliado
se o tratamento destruiu os antiacutegenos expressos antes do tratamento
Tabela 4- Resultado do Eluato das amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA
Anticorpos Eluato positvo Eluato negativo Total
Anti-D 11 1 12
Anti-C 10 0 10
Anti-E 3 6 9
Anti-c 8 0 8
Anti-S 5 2 7
Anti-K 3 0 3
Anti-Dia 1 0 1
Total 41 9 50
Figura 7 ndash Painel do eluato da amostra 21 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-C que foi
recuperado no eluato
Figura 8 ndash Painel do eluato da amostra 47 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-K que foi
recuperado no eluato
35
Dentre as 50 amostras 26 eram previamente fenotipadas para os antiacutegenos Fya Fy
b
Jka Jk
b S e s Dentre elas 20 alcanccedilaram TDA negativo apoacutes tratamento com a glicina-
aacutecidaEDTA e 20 negativaram apoacutes tratamento com cloroquina (tabela 5) Apoacutes ambas as
teacutecnicas os antiacutegenos originalmente expressos permaneceram positivos comprovando que natildeo
houve destruiccedilatildeo dos mesmos
Tabela 5 ndash Verificaccedilatildeo da interferecircncia do tratamento da hemaacutecias com cloroquina e glicina-
aacuteicdaEDTA sobre os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
AMOSTRAS
COM
FENOTIPAGEM
PREacuteVIA
TRATADAS COM
CLOROQUINA
TRATADAS COM
GLICINA
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
26
20
20
20
20
As amostras 24 47 e 50 eram positivas para o antiacutegeno K A cloroquina natildeo dissociou
o anticorpo em nenhuma das 3 amostras enquanto a glicina-aacutecidaEDTA foi efetiva nas
amostras 24 e 50 Foi testada a expressatildeo do antiacutegeno K nas amostras 24 e 50 apoacutes o
tratamento utilizando meacutetodo indireto em gel contendo AGH Apesar de natildeo ter sido avaliado
a intensidade de reaccedilatildeo de expressatildeo dos antiacutegenos podemos verificar na figura 9 que nas
duas amostras em que a teacutecnica foi efetiva e dissociou o anticorpo a expressatildeo do antiacutegeno K
continua presente mas a reatividade observada pode ser considerada 1+ sugerindo que houve
diminuiccedilatildeo da expressatildeo do antiacutegeno quando comparado com a expressatildeo observada em
hemaacutecia natildeo tratada
Os resultados individuais de cada amostra em ambas as teacutecnicas encontram-se
resumidas na tabela 6
526 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente onde foi constatada a presenccedila de autoanticorpo
a quente da classe IgG pelo TDA monoespeciacutefico (figura 10)O autoanticorpo tambeacutem
interferia na pesquisa e identificaccedilatildeo de anticorpos irregulares pois apresentava caracteriacutestica
de panaglutinina As hemaacutecias da paciente sensibilizadas ldquoin vivordquo foram tratadas com
cloroquina e com glicina-aacutecidaEDTA
36
Figura 9 ndash Fenotipagem das amostras 24 e 50 para antiacutegeno K apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
O teste positivo indica a presenccedila do antiacutegeno poreacutem a reatividade fraca (1+) sugere que houve enfraquecimento
de sua expressatildeo A direita a expressatildeo forte (4+) do antiacutegeno Kell em hemaacutecia controle natildeo tratada utilizada
como controle positivo
A cloroquina natildeo foi efetiva na retirada do anticorpo ligado as hemaacutecias ao contraacuterio
do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA que dissociou o anticorpo (figura 11)
A hemaacutecia tratada com glicina foi fenotipada para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
(figura 12) A fenotipagem para o sistema Rh (C c E e e) e Kell foi realizada em gel
especiacutefico monoclonal sem interferecircncia do TDA positivo (controle da reaccedilatildeo negativo)
O eluato resultante do tratamento com glicina-aacutecidaEDTA foi testada em gel com
hemaacutecias de painel de identificaccedilatildeo de anticorpos e apresentou resultado positivo com todas
as ceacutelulas (figura 13 e 14)
A amostra foi enviada para genotipagem e o resultado da genotipagem confirmou o
resultado da fenotipagem apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
527 TEMPO DE EXECUCcedilAtildeO DA TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
O tempo de reaccedilatildeo da glicina-aacutecidaEDTA eacute de 2 minutos Todas as amostras foram
tratadas obedecendo ao tempo descrito na literatura demonstrando que o mesmo eacute
reprodutiacutevel
37
Tabela 6- Resultados individuais por amostra
Amostra Especificidade
dos anticorpos
Intensidade do
TDA apoacutes
sensibilizaccedilatildeo
Tratamento
efetivo com
cloroquina
Tratamento
efetivo com
glicina
Eluato
poacutes
glicina
1 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 2 Dia 3+ Sim Sim 3+ 3 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 4 D 4+ Natildeo Sim 4+ 5 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 6 E 3+ Sim Sim Negativo 7 S 4+ Sim Sim 3+ 8 E 3+ Sim Sim 1+ 9 E 3+ Sim Sim 2+
10 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 11 D 4+ Natildeo Sim 4+ 12 D 4+ Natildeo Sim 4+ 13 S 3+ Sim Sim 3+ 14 S 3+ Sim Sim 3+ 15 D 3+ Natildeo Sim 3+ 16 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 17 E 3+ Sim Sim (+) 18 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 19 D 4+ Natildeo Natildeo 3+ 20 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 21 C 3+ Sim Sim 4+ 22 C 3+ Sim Sim 4+ 23 C 3+ Sim Sim 4+ 24 K 4+ Natildeo Sim 4+ 25 D 3+ Natildeo Natildeo Negativo 26 E 4+ Sim Sim Negativo 27 S 3+ Sim Sim 3+ 28 C 3+ Sim Natildeo 4+ 29 C 3+ Sim Sim 4+ 30 C 3+ Sim Sim 4+ 31 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 32 E 3+ Sim Sim Negativo 33 C 3+ Sim Natildeo 4+ 34 S 3+ Sim Sim Negativo 35 S 3+ Sim Sim Negativo 36 C 4+ Sim Natildeo 4+ 37 c 4+ Natildeo Natildeo 4+ 38 D 4+ Natildeo Sim 4+ 39 S 3+ Sim Sim 3+ 40 c 4+ Sim Natildeo 2+ 41 C 4+ Sim Natildeo 4+ 42 E 3+ Sim Sim Negativo 43 D 3+ Natildeo Sim 2+ 44 D 3+ Natildeo Sim 2+ 45 E 3+ Sim Sim Negativo 46 C 3+ Sim Sim 4+ 47 K 4+ Natildeo Natildeo 4+ 48 D 3+ Natildeo Sim 2+ 49 E 3+ Sim Sim Negativo 50 K 4+ Natildeo Sim 4+
TOTAL 50 28 33 41
38
Figura 10 ndash TDA monoespeciacutefico da amostra de paciente Hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo da classe
IgG
oacute Figura 11 ndash TDA apoacutes o tratamento com glicina-aacutecidaEDTA (esquerda) e cloroquina (direita) A glicina
negativou completamente o TDA enquanto a hemaacutecia tratada com cloroquina persistiu positiva (1+)
39
Figura 12 ndash Fenotipagem da amostra tratada com glicina-aacutecidaEDTA Fy(a+b+) Jk(a-b+) S+s+
Figura 13 ndash Painel em gel (LissAGH) do eluato apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de
intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
Figura 14 ndash ndash Painel ezimaacutetico (hemaacutecias tratadas com bromelina) do eluato em gel neutro apoacutes
tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
40
528 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Quanto a efetividade das teacutecnicas em negativar o TDA foi verificado que a glicina-
aacutecidaEDTA foi efetiva em 66 das amostras testadas no primeiro tratamento (3350
amostras) enquanto a cloroquina conseguiu negativar 56 (2850) Esses resultados natildeo
apresentam diferenccedila significativa (pgt005) demostrando que a teacutecnica da glicina-
aacutecidaEDTA natildeo eacute superior mas eacute tatildeo efetiva quanto a da cloroquina
Quando aliamos os resultados de ambas as teacutecnicas verificamos que em 76 (3850)
das amostras o TDA foi negativado Esse dado indica que ainda que uma teacutecnica natildeo seja
eficaz na remoccedilatildeo do anticorpo eacute uma boa alternativa tentar a segunda teacutecnica jaacute que a falha
em remover o anticorpo utilizando uma delas natildeo prevecirc necessariamente a falha com a outra
Quando se utiliza o teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla (graacutefico 2) para comparar a utilizaccedilatildeo das
duas teacutecnicas com o resultado de cada uma isolada (somente a cloroquina ou somente a
glicina) verificamos que os resultados apresentam diferenccedila significativa (plt005) (quadro 3)
TRATAMENTO EFETIVO COM TOTAL PORCENTAGEM
Glicina ou cloroquina 38 76
Glicina e cloroquina 23 46
Glicina apenas 10 20
Cloroquina apenas 5 10
Nenhuma das teacutecnicas 12 24
Quadro 3 - Resultados comparativos entre as teacutecnicas utilizadas
41
Graacutefico 2 - Teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla entre as teacutecnicas aplicadas A- Glicina e Cloroquina B-Cloroquina C-
Glicina ( plt005)
42
6 DISCUSSAtildeO
Os reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA podem ser adquiridos em
forma de kit comercial prontos para uso poreacutem natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil A preparaccedilatildeo
dos reagentes ldquoin houserdquo a partir de sais comerciais adquiridos se mostrou viaacutevel Os
reagentes glicina e o tampatildeo Tris armazenados de forma correta se mantiveram estaacuteveis por
um periacuteodo de 7 meses Somente o reagente EDTA precipitou mesmo armazenado em
condiccedilotildees adequadas sugerindo que o mesmo deve ser preparado em menor quantidade e
armazenado em aliacutequotas A soluccedilatildeo de cloroquina tambeacutem pode ser preparada ldquoin houserdquo e
pode ser armazenado por um mecircs A legislaccedilatildeo brasileira autoriza a utilizaccedilatildeo de reagentes
preparados a partir de sais comerciais como a cloroquina e a glicina-aacutecidaEDTA desde que
os sais tenham autorizaccedilatildeo da vigilacircncia sanitaacuteria para a comercializaccedilatildeo (BRASIL 2001)
A comparaccedilatildeo quanto a efetividade em dissociar anticorpos em amostras com TDA
positivos entre a teacutecnica da glicina e a teacutecnica da cloroquina mostrou que natildeo haacute diferenccedila
estatiacutestica entre elas e que ambas satildeo igualmente eficientes Se utilizadas conjuntamente haacute
maior possibilidade de elucidaccedilatildeo dos casos
Uma vantagem da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eacute que ela permite numa mesma
amostra eluir o anticorpo ligado aacute hemaacutecia assim como fenotipar a hemaacutecia tratada Devido a
sua dupla utilidade a teacutecnica eacute vantajosa principalmente em pacientes em que pouco volume
de amostra pode ser coletado como em casos de crianccedilas e receacutem-nascidos
A fenotipagem poacutes tratamento se mostrou viaacutevel jaacute que os antiacutegenos de maior
importacircncia natildeo sofreram alteraccedilotildees Nas 20 amostras que foram fenotipadas antes e apoacutes
tratamento para verificar a influecircncia dos reagentes na expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a
Jkb S e s natildeo houve destruiccedilatildeo dos mesmos por nenhuma das duas teacutecnicas
Para as amostras positivas para o antiacutegeno Kell (350) e sensibilizadas com o
respectivo anticorpo a teacutecnica da glicina foi efetiva em negativar o TDA em apenas duas
delas mas apoacutes o tratamento foi verificada uma fraca reatividade da reaccedilatildeo antiacutegeno-
anticorpo sugerindo que houve um enfraquecimento da expressatildeo do antiacutegeno conforme
esperado e descrito na literatura (BYRNE 1991 PALLAS WILER E MCGEE 1991
ROZIERS e SQUALI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012 e KATHARIA e
CHAUDHARY 2013) A accedilatildeo da glicina sobre o antigeno Kell natildeo representa impedimento
para seu uso uma vez que na impossibilidade de testar o antiacutegeno Kell o banco de sangue
consegue facilmente atender a solicitaccedilatildeo de transfusatildeo com unidades de hemaacutecias Kell
43
negativas jaacute que eacute um antiacutegeno de baixa prevalecircncia na populaccedilatildeo variando de 15 na
populaccedilatildeo africana a 9 nos europeus (DANIELS 2011)
A soluccedilatildeo resultante da dissociaccedilatildeo do anticorpo pela teacutecnica da glicina pode ainda ser
utilizada como eluato podendo substituir a teacutecnica de eluiccedilatildeo com reagentes comercias (kits
de eluiccedilatildeo aacutecida) que tem alto custo aproximadamente entre R$2000 a R$2500 por teste
Em 41 amostras (82) houve a dissociaccedilatildeo e recuperaccedilatildeo do anticorpo que estava
sensibilizando as hemaacutecias Em 9 amostras (18) os anticorpos foram eluiacutedos poreacutem
apresentaram reaccedilatildeo negativa quando testadas com hemaacutecias de triagem entre eles o anti-E
(6) anti-S (2) e Anti-D (1) Eacute possiacutevel que a correccedilatildeo pH do meio (WALKER 2011) natildeo
tenha sido adequada o que pode ter desfavorecido a reatividade do anticorpo
Para as amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA nas quais natildeo houve dissociaccedilatildeo do
anticorpo pelo primeiro tratamento (1750) o segundo tratamento natildeo se mostrou eficaz jaacute
que 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise O tempo de
armazenagem natildeo parece ter influenciado jaacute que todas as amostras foram testadas dentro de
48 horas apoacutes a coleta Outros fatores que natildeo foram verificados podem ter levado a
hemoacutelise Apesar da literatura (LOUIE JIENG e ZEROULIS 1986 e BYRNE 1991)
recomendar um segundo tratamento ele eacute pouco eficaz tendo negativado apenas 3 das 17
amostras testadas
A amostra de paciente que apresentou sensibilizaccedilatildeo ldquoin vivordquo mostrou melhor
efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA sobre a da cloroquina possibilitando
fenotipagem para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s que natildeo foram destruiacutedos apoacutes o
tratamento comprovado atraveacutes da genotipagem
A presenccedila de autoanticorpo a quente com presenccedila de hemoacutelise (AHAI) ou natildeo pode
mascarar a presenccedila de aloanticorpo interferindo na rotina soroloacutegica da fenotipagem que eacute
uma importante ferramenta para auxiliar na seleccedilatildeo de hemaacutecias para transfusatildeo (SHIREY et
al 2002) Esses pacientes frequentemente possuem aloanticorpos associados ao
autoanticorpo e a prevalecircncia de aloimunizaccedilatildeo entre eles varia entre 12 a 40 (LEGER e
GARRATY 1999 BRANCH e PETZ 1999) o que dificulta ainda mais a escolha do melhor
componente a ser transfundido aleacutem de aumentar a possibilidade reaccedilotildees hemoliacuteticas imunes
poacutes-transfusionais
Nesses casos as teacutecnicas de dissociaccedilatildeo de anticorpos satildeo importantes para tratar
amostras de pacientes e a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser usada como uma opccedilatildeo
pois se mostrou eficaz na dissociaccedilatildeo anticorpo ligado agraves hemaacutecias deixando livre a
superfiacutecie das mesmas permitindo a fenotipagem por antisoros IgG Paralelamente os
44
anticorpos eluiacutedos tambeacutem puderam ser estudados O mesmo natildeo ocorre com a cloroquina
que permite apenas a fenotipagem e tampouco com os kits de eluiccedilatildeo aacutecida disponiacuteveis no
mercado nacional que satildeo destinados a realizaccedilatildeo do eluato mas destroem as hemaacutecias
O tempo de tratamento na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA tambeacutem eacute uma vantagem
pois foi possiacutevel reproduzir no tempo determinado de 2 minutos enquanto a cloroquina
demora ateacute duas horas
Ainda que a aplicaccedilatildeo das teacutecnicas por biologia molecular estejam cada vez mais
presentes na rotina imuno-hematoloacutegica e possibilitam estabelecer o fenoacutetipo deduzido do
genoacutetipo elas natildeo estatildeo disponiacuteveis na maioria dos centros e sua realizaccedilatildeo exige algumas
horas A resoluccedilatildeo imediata do problema transfusional necessita dos resultados soroloacutegicos
pois com frequecircncia natildeo eacute possiacutevel aguardar o resultado do teste molecular Dessa forma
apesar da crescente importacircncia da genotipagem eritrocitaacuteria teacutecnicas soroloacutegicas aplicadas
corretamente e no momento propiacutecio satildeo de grande utilidade para resolver problemas imuno-
hematoloacutegicos como ocorre com a fenotipagem em pacientes com TDA positivo
45
7 CONCLUSAtildeO
A teacutecnica da glicina aacutecidaEDTA mostrou-se efetiva em remover os anticorpos que
sensibilizavam as hemaacutecias e pode ser utilizada com seguranccedila antes da fenotipagem
eritrocitaacuteria Por ser uma teacutecnica de raacutepida execuccedilatildeo eacute uma alternativa aplicaacutevel
principalmente em casos urgentes de pacientes que apresentam autoanticorpos
46
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50
9 ANEXOS
51
FUNDACcedilAtildeO HEMOCENTRO DE RIBEIRAtildeO PRETO
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE)
Tiacutetulo da pesquisa Aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina aacutecida-EDTA e avaliaccedilatildeo da
eficaacutecia no tratamento de hemaacutecias com teste direto da antiglobulina positivo
Pesquisadora responsaacutevel Ceacutelia Kazue Abiko
Orientador Prof Dimas Tadeu Covas
Co-orientadora Dra Flaacutevia Leite Souza Santos
Objetivo da pesquisa Vocecirc estaacute sendo convidado a participar de uma pesquisa que tem
como objetivo padronizar uma nova teacutecnica para auxiliar na tipagem sanguiacutenea de pacientes
A tipagem sanguiacutenea pode sofrer interferecircncia da presenccedila de anticorpos ligados aos gloacutebulos
vermelhos do sangue Nessas situaccedilotildees eacute difiacutecil selecionar o melhor sangue para o paciente e
eacute preciso a utilizaccedilatildeo de teacutecnicas adicionais para remover essas interferecircncias
Esta pesquisa tem como objetivo estudar outra teacutecnica para remover esses anticorpos e
comparaacute-la com a teacutecnica atualmente utilizada Para isso precisamos de amostras de pacientes
e doadores voluntaacuterios
Se vocecirc eacute um doador eacute necessaacuterio que vocecirc autorize a coleta de 5 ml (1 tubo) a mais
de seu sangue
Se vocecirc eacute um paciente natildeo haveraacute necessidade de nova amostra pois utilizaremos as
amostras jaacute coletadas para os testes preacute-transfusionais e os resultados encontrados nesta
pesquisa natildeo iratildeo interferir na escolha da (s) bolsa (s) de sangue que vocecirc possa vir a receber
Se vocecirc concordar em participar leia com atenccedilatildeo o texto abaixo e assine as duas vias
rubricando todas as paacuteginas deste termo de consentimento Uma via original assinada e
rubricada por vocecirc e pela pesquisadora ficaraacute com vocecirc
As suas informaccedilotildees seratildeo mantidas em sigilo pela pesquisadora e natildeo haveraacute
armazenamento de material para pesquisas posteriores Os seus dados seratildeo usados apenas
neste estudo e quando o trabalho for publicado seu nome e qualquer outra informaccedilatildeo que
possam identificaacute-lo natildeo seratildeo revelados
Eacute pouco provaacutevel que o que noacutes aprendermos com este estudo tenha um benefiacutecio
direto para vocecirc assim como natildeo poderemos dar nada em troca pela sua participaccedilatildeo na
pesquisa
Nosso objetivo com esta pesquisa eacute que os resultados poderatildeo ser uacuteteis para o
tratamento de pacientes no futuro Os riscos da participaccedilatildeo satildeo miacutenimos Se vocecirc eacute um
doador de sangue a amostra seraacute coletada no momento da doaccedilatildeo natildeo exigindo punccedilatildeo
venosa adicional
52
Eacute seu direito ter acesso aos resultados dos testes da pesquisa Esses resultados natildeo
seratildeo fornecidos automaticamente a vocecirc mas caso vocecirc se interesse em saber o resultado ou
tiver alguma duacutevida sobre a sua participaccedilatildeo neste estudo deveraacute entrar em contato com Ceacutelia
Kazue Abiko pelo telefone (18) 99718-3551
Vocecirc tem total liberdade de optar por natildeo participar da pesquisa Caso aceite
participar poderaacute desistir a qualquer momento ou retirar seu consentimento mesmo apoacutes ter
coletado o sangue Para cancelar sua participaccedilatildeo basta avisar a pesquisadora e os seus dados
seratildeo retirados do projeto
Qualquer duacutevida eacutetica sobre a pesquisa poderaacute entrar em contato com o Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa do Hospital das Cliacutenicas e da Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto
(CAMPUS UNIVERSITAacuteRIO bairro Monte Alegre CEP 14048-900 Ribeiratildeo Preto-SP
Telefone (16) 3602-2228 FAX (16) 3633-1144 e-mail cephcrpuspbr)
Consentimento de participaccedilatildeo
A Consentimento do participante
Li as informaccedilotildees acima sobre o estudo e recebi explicaccedilotildees sobre a participaccedilatildeo no estudo
Portanto dou o meu consentimento para participar do estudo
___________________________________________________________________________
Nome completo
___________________________________________________________________________
Assinatura
___________
Data
__________________________________________________________________________________
Nome completo da pesquisadora
___________________________________________________________________________
Assinatura
_____________
Data
9
122 COLUNAS DE GEL
A teacutecnica em gel iniciada na deacutecada de 90 representou uma grande revoluccedilatildeo na
rotina laboratorial tornando-se muito popular Aleacutem de ser sensiacutevel a teacutecnica dispensa a fase
de lavagem antes da adiccedilatildeo da AGH assim como a agitaccedilatildeo do teste para leitura reduzindo o
nuacutemero de resultados falsos negativos decorrentes dessas duas etapas e o tempo para
execuccedilatildeo dos testes (LAPIERRE et al 1989 NOVARETTI et al 2000 NOVARETTI et
al 2004) Os reagentes satildeo comercializados na forma de cartotildees plaacutesticos contendo
microtubos preenchidos por gel composto por microesferas de acrilamida-dextran Nesta
metodologia tambeacutem baseada na hemaglutinaccedilatildeo a suspensatildeo de hemaacutecias e o soro satildeo
depositados em uma cacircmara acima da coluna de gel e em seguida procede-se com a
centrifugaccedilatildeo dos cartotildees As microesferas atuam como uma malha que permite a passagem
em direccedilatildeo ao fundo do microtubo apenas das hemaacutecias natildeo aglutinadas enquanto as
hemaacutecias aglutinadas ficam retidas na parte superior da coluna ou ao longo dela (GREEN e
KLOSTERMANN 2012) Portanto quanto maior a agregaccedilatildeo mais hemaacutecias ficam retidas
no topo da coluna Dependendo do tipo de teste a ser realizado pode ser utilizado gel neutro
ou gel especiacutefico impregnado pelo anticorpo desejado e o gel contendo antiglobulina humana
que satildeo utilizados para os testes diretos e indiretos da antiglobulina (LAPIERRE et al 1989)
A coluna de gel ainda permite a visualizaccedilatildeo clara de duas populaccedilotildees distintas de hemaacutecias
como em pacientes receacutem transfundidos
123 BIOLOGIA MOLECULAR
A biologia molecular ou genotipagem estaacute sendo cada vez mais aplicada aos grupos
sanguiacuteneos pois fornece resultados seguros e precisos especialmente nos casos em que natildeo eacute
possiacutevel a realizaccedilatildeo da fenotipagem como em pacientes receacutem-transfundidos e pacientes
com TDA positivo Na genotipagem eacute possiacutevel determinar atraveacutes do DNA do paciente
extraiacutedo de seus leucoacutecitos de sangue perifeacuterico o fenoacutetipo eritrocitaacuterio deduzido sem
qualquer interferecircncia do anticorpo que sensibiliza a hemaacutecia ou de hemaacutecias alogecircnicas
transfundidas Sua realizaccedilatildeo no entanto exige o treinamento de equipe especializada e capaz
de interpretar os resultados em conjunto com os achados soroloacutegicos (JUNIOR e OLIVATO
2007)
Apesar de ser uma ferramenta de grande importacircncia hoje na imuno-hematologia
ainda estaacute restrito aos grandes centros de hemoterapia no Brasil poucos serviccedilos puacuteblicos de
sauacutede dispotildeem desse recurso e utilizam teacutecnicas de genotipagem de grupos sanguiacuteneos para
atendimento a seus pacientes Esta abordagem poreacutem vem sendo introduzida em algumas
10
instituiccedilotildees de reconhecida competecircncia na hemoterapia mas sua disponibilizaccedilatildeo deve
tornar-se mais generalizada atraveacutes da formaccedilatildeo de centros de referecircncia para atendimento
das diversas unidades de hemoterapia (MARTINS et al 2009) Dessa forma muitas decisotildees
transfusionais especialmente em urgecircncias ainda devem ser tomadas sem o resultado da
genotipagem eritrocitaacuteria
13 TESTE DA ANTIGLOBULINA
Coombs Mourant e Race descreveram em 1945 uma teacutecnica com utilizando soro de
coelho contendo antiglobulina humana (AGH) que posteriormente foi chamada de ldquosoro de
Coombsrdquo O meacutetodo foi desenvolvido inicialmente para ampliar o efeito de aglutininas fracas
do sistema Rh anticorpos ldquoincompletosrdquo que normalmente natildeo apresentavam aglutinaccedilatildeo
visiacutevel O teste foi concebido como um instrumento de investigaccedilatildeo de doenccedila hemoliacutetica do
receacutem-nascido e de reaccedilotildees transfusionais causadas por anticorpos Rh que estavam presentes
no soro dos paciente poreacutem que natildeo eram demonstraacuteveis pelas teacutecnicas ateacute entatildeo existentes
A maior parte dos anticorpos de significado cliacutenico assim como seus respectivos
antiacutegenos foram descritos apoacutes o surgimento do ldquosoro de Coombsrdquo em 1945 sendo assim o
teste da antiglobulina representa ateacute hoje a forma mais importante de aglutinaccedilatildeo artificial em
imunohematologia permitindo revelar a presenccedila de anticorpos na membrana da hemaacutecia A
antiglobulina humana eacute constituiacuteda por anticorpo especiacutefico contra a porccedilatildeo Fc de outro
anticorpo Quando um anticorpo ldquoincompletordquo sensibiliza a hemaacutecia normalmente natildeo
provoca aglutinaccedilatildeo visiacutevel Apoacutes a adiccedilatildeo da AGH ao meio esta reconhece e se liga agraves
porccedilotildees Fc dos anticorpos que sensibilizam a hemaacutecia formando assim uma malha e
provocando aglutinaccedilatildeo visiacutevel (BARJAS-CASTRO 2013)
Os reagentes de antiglobulina podem ser poliespeciacuteficos ou monoespeciacuteficos Os
poliespeciacuteficos satildeo uma mistura de anticorpos ant-IgG e anti-C3d (fraccedilatildeo C3d do
complemento) Os reagentes monoespecificos podem ser anti-IgG anti-IgM anti-IgA anti-
complemento podendo ser anti-C3d e anti-C3b
O teste da antiglobulina pode ser usado para detectar hemaacutecias sensibilizadas com
aloanticorpos IgG autoanticorpos IgG e componentes do complemento A sensibilizaccedilatildeo
pode ocorrer ldquoin vivordquo ou ldquoin vitrordquo O uso do AGH para detectar a sensibilizaccedilatildeo ldquoin vitrordquo
tem dois estaacutegios e eacute denominado teste indireto da antiglobulina A sensibilizaccedilatildeo ldquoin vivordquo eacute
detectada em procedimento de um uacutenico estagio chamado teste direto da antiglobulina (TDA)
11
Os testes direto e indireto satildeo ateacute hoje amplamente aplicados como princiacutepio de inuacutemeros
testes soroloacutegicos em imuno-hematologia (GREEN e KLOSTERMANN 2012)
131 TESTE DIRETO DA ANTIGLOBULINA
O teste direto da antiglobulina humana revela a presenccedila de anticorpo eou fraccedilatildeo do
complemento ligados agrave superfiacutecie das hemaacutecias As sensibilizaccedilatildeo das hemaacutecias ocorrida ldquoin
vivordquo natildeo eacute visualizada mas apoacutes a adiccedilatildeo da antiglobulina humana ocorre a aglutinaccedilatildeo que
eacute visualizada macroscopicamente (Figura 1)
Figura 1 - Princiacutepio da teacutecnica direta da antiglobulina Teste utilizado para demonstrar a sensibilizaccedilatildeo ldquoin
vivordquo das hemaacutecias O sangue total eacute coletado do paciente em tubo contendo anticoagulante EDTA Na teacutecnica
realizada em tubo uma suspensatildeo de hemaacutecias 5 em soluccedilatildeo de salina eacute preparada Uma gota dessa suspensatildeo
eacute lavada 3 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica para retirada de anticorpos que estatildeo livres no plasma Toda soluccedilatildeo eacute
retirada e adiciona-se o soro de Coombs (antiglobulina humana) O soro de Coombs reconhece os anticorpos que
estatildeo ligados agrave superfiacutecie das hemaacutecias fazendo com que ocorra aglutinaccedilatildeo visiacutevel macroscopicamente
Apesar de natildeo ser um teste preacute-transfusional obrigatoacuterio o TDA eacute um dos testes mais
importantes para investigar e classificar quadros hemoliacuteticos como de origem imune ou natildeo
imune O seu valor preditivo positivo em vigecircncia de anemia hemoliacutetica eacute de 83 poreacutem natildeo
havendo sinais de hemoacutelise seu valor preditivo eacute apenas 14 Eacute por esse motivo que a
interpretaccedilatildeo do TDA positivo deve levar em consideraccedilatildeo a histoacuteria cliacutenica e os resultados
dos outros exames laboratoriais A realizaccedilatildeo do TDA eacute obrigatoacuteria na investigaccedilatildeo
12
laboratorial de diversos quadros hemoliacuteticos entre eles a anemia hemoliacutetica autoimune
(AHAI) a reaccedilatildeo hemoliacutetica imune poacutes-transfusional a siacutendrome do linfoacutecito passageiro a
doenccedila hemoliacutetica perinatal e a hemoacutelise droga-dependente (LEGER 2011)
Resultados de TDA positivos foram tambeacutem observados em indiviacuteduos com niacuteveis
seacutericos elevados de IgG ou complemento sem evidecircncia de anemia hemoliacutetica imune como
em pacientes com doenccedila falciforme talassemia doenccedila renal crocircnica mieloma muacuteltiplo
doenccedilas autoimunes e siacutendrome da imunodeficiecircncia adquirida (SIDA) Aleacutem disso pequenas
quantidades de IgG (5 a 90 moleacuteculas por hemaacutecia) e complemento (5 a 40 moleacuteculas por
hemaacutecia) podem estar presentes nas hemaacutecias de indiviacuteduos saudaacuteveis sem associaccedilatildeo com
reduccedilatildeo na sobrevida das mesmas A positividade do TDA depende da populaccedilatildeo estudada e
pode variar de 01 entre doadores de sangue sem qualquer sinal cliacutenico de hemoacutelise ateacute
15 em pacientes hospitalizados (CASTILHO JUNIOR e REID 2015 LEGER 2011)
Indiviacuteduos que apresentam TDA positivo seja agraves custas de IgG eou complemento
com ou sem sinais cliacutenicos de hemoacutelise teratildeo a fenotipagem eritrocitaacuteria prejudicada A
fenotipagem de indiviacuteduos com TDA positivo especialmente quando utilizado o teste indireto
da antiglobulina pode acarretar resultados falsos positivos e levar a seleccedilatildeo de fenoacutetipo
incorreto para transfusatildeo
132 TESTE INDIRETO DA ANTIGLOBULINA
O teste indireto da antiglobulina (TIA) eacute utilizado para revelar a sensibilizaccedilatildeo ldquoin
vitrordquo das hemaacutecias e eacute aplicado a diversos testes soroloacutegicos em imunohematologia entre
eles a pesquisa de anticorpos identificaccedilatildeo de anticorpos testes de compatibilidade
fenotipagem eritrocitaacuteria e titulaccedilatildeo de anticorpos Na teacutecnica indireta a hemaacutecia que contecircm
o antiacutegeno eacute colocada em contato ldquoin vitrordquo com o anticorpo que se liga mas natildeo promove a
aglutinaccedilatildeo visiacutevel A adiccedilatildeo da AGH forma uma malha entre os anticorpos que sensibilizam
as hemaacutecias e provoca a aglutinaccedilatildeo macroscoacutepica (figura 2)
Caso a amostra de hemaacutecia estudada seja previamente sensibilizada resultados falsos
positivos podem ser obtidos no TIA jaacute que a AGH reagiraacute com a moleacutecula que sensibilizava
anteriormente a hemaacutecia mesmo se o anticorpo especiacutefico natildeo tiver se ligado ao antiacutegeno
correspondente
13
133 CONDICcedilOtildeES CLIacuteNICAS COM TDA POSITIVO
O TDA positivo deve ser interpretado cuidadosamente sempre em conjunto com o
quadro cliacutenico do paciente A positividade isolada do TDA natildeo significa hemoacutelise A
interpretaccedilatildeo do teste positivo requer o conhecimento do diagnoacutestico do paciente da presenccedila
de sinais e sintomas sugestivos de hemoacutelise assim como de seu histoacuterico transfusional
gestacional e de informaccedilotildees sobre o uso recente de medicaccedilotildees (LEGER 2011)
Figura 2 ndash Princiacutepio do teste indireto da antiglobulina O TIA pode ser utilizado na pesquisa de anticorpos de
especificidades desconhecidas livres no soroplasma como eacute o caso da pesquisa e identificaccedilatildeo de anticorpos
irregulares Ele eacute tambeacutem utilizado para determinar a presenccedila de antiacutegenos na membrana da hemaacutecia quando
satildeo empregados soros de especificidades conhecidas da classe IgG No primeiro caso o soroplasma contendo o
anticorpo desconhecido eacute colocado em contato com hemaacutecias cujo perfil antigecircnico eacute conhecido No segundo
caso utiliza-se soro de especificidade conhecida da classe IgG para determinar a presenccedila ou ausecircncia de um
antiacutegeno na membrana O anticorpo encontra o antiacutegeno correspondente e ocorre a ligaccedilatildeo do anticorpo agrave
hemaacutecia mas natildeo ocorre aglutinaccedilatildeo Apoacutes a adiccedilatildeo da AGH que se liga aos anticorpos formando uma malha
ocorre a aglutinaccedilatildeo visiacutevel
O TDA positivo eacute uma achado claacutessico de algumas condiccedilotildees cliacutenicas como a reaccedilatildeo
transfusional hemoliacutetica a doenccedila hemoliacutetica do feto e do receacutem-nascido (DHFRN) a anemia
hemoliacutetica induzida por drogas a siacutendrome do linfoacutecito passageiro e a anemia hemoliacutetica
autoimune (AHAI) Portanto o TDA positivo pode ser decorrente da sensibilizaccedilatildeo da
hemaacutecia autoacuteloga por um autoanticorpo ou por um aloanticorpo ligado agrave hemaacutecia alogecircnica
circulante A positividade do TDA pode ainda ocorrer de forma passiva em pacientes que
14
recebem imunoglobulinas humanas ou ainda pela transfusatildeo de plaquetas ABO natildeo idecircntico
(LEGER 2011 RALPH 2012 ZANTEK et al 2012)
Nas reaccedilotildees transfusionais hemoliacuteticas imunes o aloanticorpo do receptor sensibiliza
as hemaacutecias transfundidas do doador e reduz sua sobrevida ao removecirc-la precocemente da
circulaccedilatildeo pela fagocitose no sistema retiacuteculo-endotelial ou pela hemoacutelise intravascular As
reaccedilotildees podem ser agudas se ocorrem ateacute 24 horas ou tardias quando ocorrem apoacutes 24 horas
da transfusatildeo A gravidade das reaccedilotildees hemoliacuteticas pode variar de um simples rendimento
transfusional inadequado agrave quadros graves de hemoacutelise intravascular evoluindo ateacute mesmo
com choque vascular e oacutebito O TDA pode resultar negativo caso toda massa eritrocitaacuteria
transfundida tenha sido destruiacuteda (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
Na doenccedila hemoliacutetica do feto e do receacutem-nascido (DHFRN) anticorpos maternos da
classe IgG atravessam a barreira placentaacuteria e sensibilizam as hemaacutecias fetais que seratildeo
destruiacutedas precocemente levando agrave anemia fetal Apesar da incompatibilidade ABO feto-
materna ser a causa mais frequente de DHFRN raramente ela eacute responsaacutevel pela ocorrecircncia
de quadros graves Por outro lado anticorpos contra antiacutegenos do sistema Rh e Kell
especialmente Anti-D (Anti-RH1) Anti-c (Anti-RH4) e Anti-Kell (Anti-KELL1) satildeo
conhecidos por causar DHFRN severa Raramente outros anticorpos tambeacutem podem estar
implicados na DHFRN como os anticorpos contra antiacutegenos do sistema Kidd Duffy MNS e
Diego (ZANTEK et al 2012)
A hemoacutelise droga-dependente eacute causada pela produccedilatildeo de um anticorpo voltado contra
a droga ligada agrave membrana eritrocitaacuteria ou ainda contra o complexo droga-membrana A
classe de medicaccedilotildees mais comumente envolvida eacute a dos antimicrobianos betalactacircmicos
(penicilinas e cefalosporinas) mas outras classes como quimioteraacutepicos e anti-inflamatoacuterios
tambeacutem satildeo descritos (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
Apoacutes transplante de ceacutelulas progenitoras hematopoieacuteticas em que o doador possui
anticorpos contra antiacutegenos eritrocitaacuterios do receptor o linfoacutecito de memoacuteria do doador pode
resistir ao esquema imunossupressor utilizado e continuar a produccedilatildeo de anticorpos que
reconhecem a hemaacutecia incompatiacutevel do receptor ainda circulante O quadro cliacutenico pode
variar de um simples TDA positivo sem outros sinais ou sintomas ateacute um quadro hemoliacutetico
grave e abrupto (LEGER 2011)
15
134 ANEMIA HEMOLIacuteTICA AUTOIMUNE
A anemia hemoliacutetica autoimune eacute caracterizada pela destruiccedilatildeo precoce das hemaacutecias
autoacutelogas por autoanticorpos que sensibilizam as hemaacutecias e levam agrave fagocitose pelos
macroacutefagos no sistema reticulo-endotelial ou hemoacutelise intravascular O diagnoacutestico da AHAI
baseia-se na presenccedila de hemoacutelise cliacutenica associada agrave evidecircncia de fator imune representado
pelo TDA positivo As classes de anticorpos envolvidas em quadros de AHAI satildeo IgG IgM e
raramente IgA (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012) Satildeo raros os casos de AHAI com TDA
negativo que podem estar relacionados a um autoanticorpo de baixa avidez de densidade
inferior agrave detecccedilatildeo do meacutetodo ou ainda de classe de imunoglobulina natildeo avaliada pelo
meacutetodo utilizado para o teste (GARRATY 2005)
A AHAI pode ser classificada em dois grupos principais de acordo com a melhor
temperatura de reaccedilatildeo do autoanticorpo As anemias hemoliacuteticas causadas por anticorpos
quentes que reagem melhor a 37oC e geralmente IgG representam 80 dos casos de AHAI
Nas AHAI por anticorpo quente o TDA pode ser positivo para IgG mais complemento (67)
somente IgG (20) ou somente por complemento (13) As anemias causadas por
anticorpos frios geralmente da classe IgM e que reagem melhor em temperatura ambiente ou
a 4oC representam aproximadamente 20 dos casos de AHAI Por exibirem amplitude
teacutermica esses anticorpos ligam-se agraves hemaacutecias ao atingirem a circulaccedilatildeo nas extremidades do
corpo fixam o complemento e desprendem-se da hemaacutecia apoacutes retornar para partes mais
quentes Por esse motivo em AHAI por anticorpos frios o TDA eacute positivo apenas agraves custas
de C3 e normalmente o IgM natildeo eacute detectado (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
A presenccedila do autoanticorpo IgG pode ser confirmada atraveacutes da eluiccedilatildeo do anticorpo
da hemaacutecia Tipicamente o eluato na AHAI por anticorpo quente reage com todas as ceacutelulas
testadas de um painel de hemaacutecias alogecircnicas do tipo ldquoOrdquo ou pode eventualmente exibir uma
especificidade conhecida como Anti-e (Anti-RH5) Nas AHAI a frio por sua vez espera-se
um eluato negativo (LEGER 2011)
Os autoanticorpos satildeo com frequecircncia encontrados livres no plasma e natildeo somente
ligados agraves hemaacutecias autoacutelogas Eles podem interferir em todas as fases dos testes preacute-
transfusionais nas quais o plasma eacute testado especialmente os autoanticorpos quentes que
acarretam resultados positivos em todos os testes levados agrave fase de antiglobulina humana
Esses anticorpos portanto positivam a pesquisa de anticorpos irregulares e mascaram a
presenccedila de aloanticorpos de significado cliacutenico Aproximadamente 60 dos pacientes que
apresentam AHAI a quente apresentam anticorpos que reagem em meio salino mas se forem
16
levados em conta meacutetodos mais sensiacuteveis como PEG enzima e estudo em gel a positividade
pode ser superior a 90 (LEGER 2011)
Aleacutem da eficaacutecia da transfusatildeo ser comprometida pela diminuiccedilatildeo da vida-meacutedia das
hemaacutecias a presenccedila do autoanticorpo dificulta a realizaccedilatildeo dos testes preacute-transfusionais e
compromete a seguranccedila transfusional Os autoanticorpos reagem normalmente como
panaglutininas pois satildeo normalmente voltados contra antiacutegenos puacuteblicos na maior parte das
vezes contra antiacutegenos do sistema Rh Por apresentarem essas caracteriacutesticas podem ainda
mascarar a presenccedila de aloanticorpos de significado clinico e levar a testes de compatibilidade
positivos exigindo uma avaliaccedilatildeo criteriosa da necessidade da transfusatildeo (BRANCH e PETZ
1999 JUNIOR e OLIVATO 2004)
Remover a interferecircncia do autoanticorpo para avaliar a presenccedila de aloanticorpos
mascarados nem sempre eacute possiacutevel mesmo utilizando teacutecnicas de autoadsorccedilatildeo ou
aloadsorccedilatildeo que aleacutem de tudo satildeo demoradas e exigem de 2 a 6 horas para conclusatildeo
(GARRATY e GEORGE 2002) Nesses casos a fenotipagem eritrocitaacuteria do paciente eacute de
extrema utilidade especialmente em situaccedilotildees de urgecircncia A definiccedilatildeo do fenoacutetipo do
paciente para os antiacutegenos de maior importacircncia cliacutenica pode auxiliar a seleccedilatildeo de unidades
de hemaacutecias com mesmo fenoacutetipo o que garante que eventuais aloanticorpos natildeo
identificados sejam respeitados e tambeacutem evita nova sensibilizaccedilatildeo (JUNIOR e OLIVATO
2004 SHIREY et al 2002)
135 TRATAMENTO DE HEMAacuteCIAS COM TDA POSITIVO
O TDA positivo impede a fenotipagem eritrocitaacutecia por meacutetodos que exigem a fase de
AGH uma vez que a aglutinaccedilatildeo ocorreraacute devido agrave interaccedilatildeo da AGH com o autoanticorpo
que sensibiliza a hemaacutecia do paciente levando a resultados falso positivos Em algumas
situaccedilotildees como na AHAI por anticorpo quente a fenotipagem eacute especialmente importante
pois o autoanticorpo interfere na triagem e identificaccedilatildeo de anticorpos assim como no teste de
compatibilidade e dificultam a detecccedilatildeo de aloanticorpos de significado cliacutenico que
obrigatoriamente devem ser respeitados Nessas situaccedilotildees a fenotipagem eritrocitaacuteria
determina o perfil antigecircnico do paciente e possibilita o fornecimento de unidades de
hemaacutecias com o mesmo fenoacutetipo para a transfusatildeo evitando a sensibilizaccedilatildeo para novos
antiacutegenos assim como reaccedilotildees hemoliacuteticas transfusionais No entanto eacute necessaacuterio aplicar
meacutetodos que natildeo sofram interferecircncia do TDA positivo ou seja meacutetodos que natildeo necessitem
da fase de AGH ou meacutetodos de bloqueio do anticorpo sem bloquear o antiacutegeno Uma opccedilatildeo eacute
a utilizaccedilatildeo de soros monoclonais IgM (salinos ou de meio proteico natildeo concentrado) mas
17
nem sempre esses reagentes estatildeo disponiacuteveis especialmente os reagentes monoclonais para
os antiacutegenos dos sistemas Duffy ( Fya Fy
b) Kidd ( Jk
a Jk
b) e MNS (S s) (JUNIOR e
OLIVATO 2004) Outra opccedilatildeo eacute a teacutecnica de bloqueio que pode ser utilizada para tratar
hemaacutecias para posterior fenotipagem em casos de TDA positivos com reatividade le2+
Em casos onde a positividade do TDA eacute maior que 2+ estaacute indicada a tratamento
quiacutemico para remoccedilatildeo da interferecircncia do autoanticorpo antes de realizar a fenotipagem Entre
as teacutecnicas utilizadas atualmente estatildeo o ZZAP a cloroquina e a glicina aacutecidaEDTA
1351 TEacuteCNICA DE BLOQUEIO
A teacutecnica de bloqueio se baseia na utilizaccedilatildeo de anti-IgG (Coombs monoespeciacutefico)
para tratar as hemaacutecias com TDA positivo O anticorpo anti-IgG se liga aos anticorpos que
estatildeo sensibilizando a hemaacutecias poreacutem sem o bloquear os antiacutegenos Os antiacutegenos que natildeo
estatildeo sensibilizados podem ser detectados atraveacutes dos antissoros especiacuteficos (SERERAT
VEIDT E DUTCHED 2000)
1352 TRATAMENTO DE HEMAacuteCIAS COM ZZAP
O Sulphydryl-Proteolytic Enzyme (ZZAP) que eacute uma mistura de ditiotreitol (DTT)
mais papaiacutena ativada com cisteiacutena eacute um reagente capaz de dissociar imunoglobulinas da
classe IgG ligadas a membrana dos eritroacutecitos enquanto trata enzimaticamente as hemaacutecias
O tratamento enzimaacutetico tambeacutem potencializa a ligaccedilatildeo do autoanticorpo ao antiacutegeno e
acelera o processo de autoadsorccedilatildeo O ZZAP pode desnaturar os antiacutegenos do sistema Duffy
MNS e Kell o que limita sua aplicaccedilatildeo para fins de fenotipagem (BRANCH e PETZ 1982)
1353 CLOROQUINA
Em 1982 Edwards Moulds e Judd propuseram a utilizaccedilatildeo da teacutecnica da cloroquina
que dissociava os complexos antiacutegeno-anticorpo e mantinha a membrana das hemaacutecias
iacutentegras Os derivados quinolecircicos jaacute haviam sido descritos anteriormente por Domokos e
Aszody em 1964 e Holtz Mantel e Buck em 1973 (apud Edwards Moulds e Judd 1982) pela
sua capacidade de separar imunocomplexos e inibir as reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo reduzindo
as cargas eleacutetricas das superfiacutecie das hemaacutecias A teacutecnica eacute uma das mais utilizadas nos
centros brasileiros para remover a interferecircncia do autoanticorpo e eacute tambeacutem a teacutecnica
atualmente adotada pelo laboratoacuterio de imunohematologia do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto
18
Edwards Moulds e Judd (1982) demonstraram que a teacutecnica da cloroquina para
dissociaccedilatildeo de anticorpos eacute uma teacutecnica simples efetiva e confiaacutevel para dissociar
imunoglobulina das hemaacutecias Desde que a membrana das hemaacutecias permaneccedila intacta natildeo
haacute perda da reatividade dos antiacutegenos e a sua maior aplicaccedilatildeo eacute a fenotipagem de hemaacutecias
com TDA positivo Os autores verificaram que em 83 das amostras sensibilizadas in vivo e
22 amostras (no total de 40) sensibilizadas ldquoin vitrordquo apresentaram TDA negativo e
puderam ser fenotipadas A teacutecnica poreacutem natildeo consegue remover os componentes do
complemento na maioria dos casos
Champagne e colaboradores (1999) testaram a teacutecnica da cloroquina para dissociar
antiacutegenos Bg comparando com a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA e verificaram vantagem em
relaccedilatildeo ao uso de um uacutenico reagente diminuindo a manipulaccedilatildeo e verificou que o mesmo natildeo
destroacutei antiacutegeno Kell
A cloroquina tambeacutem mostrou-se pouco efetivo em remover anticorpos do sistema
Duffy da superfiacutecie das hemaacutecias (EDWARDS MOUDS e JUDD 1982 ROZIERS e
SQUALI 1997)
1353 GLICINA-AacuteCIDAEDTA
A afinidade e a estabilidade entre a ligaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo eacute definida como a
resultante entre forccedilas atrativas e repulsivas entre ambos (CARUCIO e WISE 2012) e resulta
da somatoacuteria de forccedilas quiacutemicas dinacircmicas e fracas (natildeo covalentes) como pontes de
hidrogecircnio forcas eletrostaacuteticas forca de Van der Waals e pontes hidrofoacutebicas A estabilidade
dessa ligaccedilatildeo eacute facilmente abalada por alteraccedilotildees quiacutemicas e fiacutesicas no meio da reaccedilatildeo como
a alteraccedilatildeo do pH A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA se baseia na mudanccedila do pH para a
quebra da ligaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo (KOSANKE 2012)
A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA foi primeiramente descrita em 1986 por Louie Jieng
e Zeroulis que utilizaram 50 amostras de doadores sensibilizados ldquoin vitrordquo com anticorpos A
teacutecnica foi efetiva em 48 amostras permitindo o estudo do eluato assim como a fenotipagem
das hemaacutecias Os autores testaram tambeacutem a teacutecnica em 100 hemaacutecias TDA positivo que
puderam ser utilizadas para teacutecnicas de autoadsorccedilatildeo
Byrne (1991) descreveu a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA modificada e tambeacutem
verificou como uma opccedilatildeo para o tratamento de hemaacutecias com TDA positivo que deixava as
hemaacutecias intactas e o eluato viaacutevel para ser fenotipado
19
Roziers e Squali (1997) e Katharia e Chaudhary (2013) compararam a teacutecnica da
glicina-aacutecidaEDTA com as teacutecnicas da cloroquina e do aquecimento Verificaram maior
eficiecircncia da glicina-aacutecidaEDTA em relaccedilatildeo as outras duas teacutecnicas pois com uma mesma
quantidade de amostra produzia as hemaacutecias livres de anticorpo e tambeacutem o eluato Mostrou-
se ainda superior devido ao menor tempo exigido para sua realizaccedilatildeo o que favorece seu uso
em situaccedilotildees de urgecircncia e emergecircncia
As duas desvantagens da teacutecnica poreacutem eacute o fato de destruir os antiacutegenos do sistema
Kell e o fato de natildeo remover fraccedilotildees do complemento ligadas agrave hemaacutecia (PALLAS WILER e
McGEE 1991 ROZIERS e SQUALLI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012
e KATHARIA e CHAUNDHARY 2013)
20
2 OBJETIVOS
21 OBJETIVO GERAL
211 Avaliar a eficaacutecia da glicina-aacutecidaEDTA em remover os anticorpos ligados agraves
hemaacutecias sensibilizadas por anticorpos da classe IgG
22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
221 Preparaccedilatildeo dos reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
verificaccedilatildeo da estabilidade dos mesmos e avaliar custos
222 Testar a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA em amostras de hemaacutecias
sensibilizadas por anticorpos antieritrocitaacuterios humanos
223 Comparar a efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA com a teacutecnica da
cloroquina quanto a capacidade de remover a interferecircncia do anticorpo ligado
a hemaacutecia
224 Testar o eluato das amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA
225 Verificar se houve destruiccedilatildeo dos antiacutegenos eritrocitaacuterios apoacutes o tratamento
com glicina-aacutecidaEDTA e com cloroquina
226 Verificar se o tempo de execuccedilatildeo da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA descrito
nos textos de referecircncia eacute reprodutiacutevel
21
3 JUSTIFICATIVA
Algumas condiccedilotildees cliacutenicas podem levar ao depoacutesito ldquoin vivordquo de anticorpos eou
fraccedilotildees do complemento sobre as hemaacutecias Entre elas estatildeo as reaccedilotildees hemoliacuteticas poacutes-
transfusionais a doenccedila hemoliacutetica perinatal o uso de medicamentos e principalmente a
AHAI Na AHAI um anticorpo normalmente da classe IgG ou IgM reconhece antiacutegenos
proacuteprios na membrana eritrocitaacuteria e reduz a sobrevida da hemaacutecia levando a sua destruiccedilatildeo
pelos macroacutefagos no sistema reticulo-endotelial ou agrave ativaccedilatildeo do complexo de ataque agrave
membrana e agrave lise intravascular Os autoanticorpos satildeo voltados na maioria das vezes contra
antiacutegenos eritrocitaacuterios de alta frequecircncia populacional conhecidos como antiacutegenos puacuteblicos
e por este motivo reconhecem tanto hemaacutecias autoacutelogas quanto alogecircnicas
Devido agrave presenccedila do autoanticorpo livre no plasma e tambeacutem do anticorpo eou
complemento ligado agrave hemaacutecia o banco de sangue pode encontrar dificuldades em todas as
fases dos testes preacute-transfusionais do paciente com AHAI e deve utilizar teacutecnicas que
auxiliem na escolha do melhor hemocomponente melhorando a seguranccedila transfusional Essas
teacutecnicas visam remover a interferecircncia do autoanticorpo livre no soro e do autoanticorpo
ligado agrave hemaacutecia permitindo a detecccedilatildeo de aloanticorpos associados e a realizaccedilatildeo da
fenotipagem eritrocitaacuteria respectivamente
A finalizaccedilatildeo dos testes preacute-tranfusionais na presenccedila de autoanticorpo pode levar
algumas horas e nem sempre o paciente poderaacute aguardar Nesse contexto torna-se vantajosa a
aplicaccedilatildeo de teacutecnicas de raacutepida execuccedilatildeo
O presente estudo propotildee aplicar e avaliar a eficaacutecia da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
em remover os anticorpos ligados agrave hemaacutecia o que permite a fenotipagem eritrocitaacuteria
estendida e a seleccedilatildeo de concentrados de hemaacutecias com mesmo fenoacutetipo do paciente
Atualmente no Hemocentro de Ribeiratildeo Preto a teacutecnica utilizada para esse fim eacute o
tratamento das hemaacutecias com difosfato de cloroquina cujo tempo de execuccedilatildeo pode demorar
ateacute duas horas enquanto a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser realizada em apenas dois
minutos o que a tornaria opccedilatildeo de escolha especialmente em situaccedilotildees de urgecircncia Ao
contraacuterio da cloroquina a glicina-aacutecidaEDTA permite tambeacutem o estudo do eluato das
hemaacutecias tratadas
22
4 METODOL OGIA
41 AMOSTRAS DE DOADORES
Foram coletados 50 amostras de doadores de sangue que compareceram ao
Hemonuacutecleo de Araccedilatuba no periacuteodo de junho a agosto de 2016 Foram convidados a
participar da pesquisa doadores de repeticcedilatildeo do tipo sanguiacuteneo ldquoOrdquo RhD positivo
cadastrados no sistema de banco de sangue (SBS) do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto
Todos os doadores que concordaram em participar da pesquisa assinaram o termo de
consentimento livre e esclarecido (TCLE)
No momento da doaccedilatildeo foram coletados adicionalmente 5 mL de sangue total em
soluccedilatildeo anticoagulante EDTA (aacutecido dietilenoaminoaceacutetico) dispensando punccedilatildeo venosa
adicional para coleta da amostra O fluxograma 1 resume as etapas desenvolvidas no projeto
Fluxograma 1 - Fluxo da pesquisa utilizando as amostras de doadores
23
411 FENOTIPAGEM
Foram verificados se os doadores jaacute tinham fenotipagem para outros sistemas de
grupos sanguiacuteneos aleacutem do sistema ABORh que eacute realizado rotineiramente
A fenotipagem eritrocitaacuteria para outros sistemas ou fenotipagem estendida eacute realizada
para identificar a presenccedila ou ausecircncia de antiacutegenos considerados de importacircncia cliacutenica No
Hemonuacutecleo de Araccedilatuba uma parcela de doadores de repeticcedilatildeo satildeo fenotipados para os
antiacutegenos dos sistemas de grupo sanguiacuteneo Rh (antiacutegenos C c E e e) Kell (antiacutegeno K)
Duffy (antiacutegenos Fya e Fy
b) Kidd (antiacutegenos Jk
a e Jk
b) e sistema MNSs (antiacutegenos S e s)
A fenotipagem para o Rh e Kell eacute realizada por metodologia de microplaca utilizando
25 microL de hemaacutecia lavada e diluiacuteda a 5 em salina e 25 microL do antissoro comercial especiacutefico
A reaccedilatildeo eacute incubada 15 minutos a temperatura ambiente e centrifugadas para leitura Para os
antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s a metolodogia utilizado eacute gel contendo antiglobulina
humana (gel LissCoombs poliespeciacutefico) da marca BIO-RAD onde se utiliza suspensatildeo de
hemaacutecia em LISS (Soluccedilatildeo de baixa forccedila iocircnica) A suspensatildeo eacute preparada atraveacutes da
diluiccedilatildeo de 10 microL de hemaacutecia em 1000 microL de LISS Pipetado 50 microL dessa diluiccedilatildeo no gel e
adicionado 25 microL do antissoro especiacutefico Incuba-se em banho seco por 15 minutos a 37 deg
Celsius e eacute centrifugado em centriacutefuga especiacutefica Os antissoros utilizados eram das marcas
Fresenius e Lorne
Foi verificado a fenotipagem do doador no banco de dados do Hemocentro Os
registros dos fenoacutetipos dos doadores ficam armazenadas no sistema de banco de sangue
(SBS) Para doadores que natildeo tinham fenotipagem estendida preacutevia para antiacutegenos do sistema
Rh (C c E e e) e Kell (K) foi realizada a fenotipagem para esses antiacutegenos
O tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA e cloroquina para dissociar
anticorpos pode inativar enfraquecer ou destruir os antiacutegenos presentes nas hemaacutecias
alterando assim os resultados da fenotipagem Para verificar se houve destruiccedilatildeo dos
antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a e Jk
b S e s nas amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes
tratamento foram novamente fenotipadas ao final para os antiacutegenos que eram inicialmente
positivas
A repeticcedilatildeo da fenotipagem foi realizada nas amostras que apresentaram efetividade
no tratamento da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eou da cloroquina e a detecccedilatildeo do antiacutegeno
na amostra preacute-tratamento
24
412 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS HEMAacuteCIAS
As hemaacutecias foram sensibilizadas com antissoros policlonais humanos de amostras de
plasma fresco congelado de doadores com resultado de pesquisa de anticorpo irregular
positivos
A escolha do anticorpo para sensibilizar as hemaacutecias foi definida de acordo com o
fenoacutetipo do doador que deveria ser positivo para o respectivo antiacutegeno
Para a sensibilizaccedilatildeo um volume de antissoro (1 mL) e um volume (1 mL) de
hemaacutecias lavadas quatro vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica foram adicionadas a um tubo de 12 x
75 mm A mistura foi homogeneizada e incubada em banho maria (BM) a 37deg C por 60
minutos A seguir as hemaacutecias foram novamente lavadas 4 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica
para retirada dos anticorpos que natildeo se ligaram A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada
como controle negativo O teste da uacuteltima lavagem eacute importante para assegurar que os
anticorpos que poderatildeo ser detectados no eluato apoacutes o tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA
sejam aqueles que estavam ligados agraves hemaacutecias e natildeo aqueles livres no plasma O controle
negativo mostra que todo o anticorpo livre foi retirado (LEGER 2011)
Para o teste de presenccedila de anticorpo na soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foram incubadas
com hemaacutecias de triagem de anticorpos irregulares (ID-Diacell BIO-RAD) contendo os
antiacutegenos especiacuteficos Realizado a teacutecnica em gel LissCoombs com anti-IgG+C3d Incubado
no tempo de 15 minutos a temperatura de 37deg C e centrifugado 10 minutos em centriacutefuga
proacutepria
As 50 amostras de doadores foram sensibilizadas com os anticorpos policlonais
humanos
Apoacutes sensibilizadas rdquoin vitrordquo e lavadas as hemaacutecias foram diluiacutedas em soluccedilatildeo de
baixa forccedila iocircnica (LISS) na quantidade de 10 microL de hemaacutecia para 1000 microL de soluccedilatildeo A
suspensatildeo foi pipetada (50 microL) em coluna-gel-teste LissCoombs (BIO-RAD) que contecircm
antiglobulina poliespeciacutefico (IgG+C3d) e centrifugada em baixa rotaccedilatildeo conforme orientaccedilatildeo
do fabricante durante 10 minutos
As amostras deveriam apresentar aglutinaccedilatildeo com reatividade 3 a 4+ no TDA As
amostras que apresentaram reaccedilatildeo menor que 3+ foram novamente sensibilizadas com nova
aliacutequota do antissoro
25
413 TRATAMENTO DAS AMOSTRAS
As amostras sensibilizadas apresentando o TDA positivo 3 ou 4+ foram divididas em
duas aliacutequotas e submetidas a duas teacutecnicas diferentes com o objetivo de dissociar o anticorpo
ligado Uma aliacutequota da amostra foi tratada com soluccedilatildeo de difosfato de cloroquina enquanto
a outra aliacutequota foi tratada com glicina-aacutecidaEDTA
42 PREPARO DA GLICINA AacuteCIDA-EDTA
A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA utiliza 3 soluccedilotildees diferentes a glicina aacutecida o
EDTA e o tampatildeo TRIS
Os reagentes foram preparados utilizando os sais para anaacutelise (PA) de EDTA
(Na2EDTA2H2O) TRIS (C4H11NO3) Glicina (H2NCH2CO2H) NaCl e a soluccedilatildeo de aacutecido
cloriacutedrico (HCl) 12 N todos reagentes da marca SYNTH (quadro 1)
Para o preparo do tampatildeo glicina-acida eacute necessaacuterio o ajuste do pH para 15 Para esse
ajuste utiliza-se aacutecido cloriacutedrico (HCl) concentrado O pH foi medido com fitas reativas de pH
com escala de 1 a 14 da marca MERCK Posteriormente a soluccedilatildeo foi enviada ao laboratoacuterio
de controle de qualidade do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto e o pH medido no peagacircmetro O
tampatildeo glicina-aacutecida foi armazenado a 4deg e o tampatildeo tris e o EDTA em temperatura ambiente
controlada (20 a 24deg Celsius)
Apoacutes o preparo e durante a realizaccedilatildeo dos testes foram feitas inspeccedilotildees visuais para
verificaccedilatildeo de turvaccedilatildeo do meio e presenccedila de precipitados
Reagente Material Quantidade Preparo e
Conservaccedilatildeo
EDTA
EDTA
(Na2EDTA2H2O)
5 gramas Mistura ateacute
dissoluccedilatildeo do sal e
conserva em
temperatura ambiente Aacutegua Destilada 50 Ml
Tris
TRIS (C4H11NO3) 121 gramas Conservar em
temperatura ambiente NaCl 525g
Aacutegua destilada 100ml
Gliacutecina-aacutecida
Glicina
(H2NCH2CO2H) 15 gramas
Conservar a 4oC NaCl 116gramas
Aacutegua Destilada 200ml
HCL 12N Ajutar o pH para 15
Quadro 1 - Preparo dos Reagentes da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
Fonte - Manual teacutecnico AABB 2011
26
O tampatildeo glicina-aacutecida e o tampatildeo TRIS satildeo estaacuteveis por 7 meses O reagente EDTA
precipitou mesmo estando em temperatura em ambiente controlado Houve necessidade de
preparo de novo reagente
421 TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
1 Em um tubo de ensaio 12x75 mm eacute adicionado 08 mL da soluccedilatildeo de glicina-aacutecida A
esta soluccedilatildeo adiciona-se 02 mL de EDTA e mistura
2 Adiciona-se 02 mL de hemaacutecias sensibilizadas (lavada 4 vezes) A mistura eacute
homogeneizada e incubada por exatamente 2 minutos
3 A seguir 01 mL de tampatildeo TRIS eacute adicionado agrave mistura que eacute novamente
homogeneizada e centrifugada por 2 minutos a 3400 rpm O pH deve estar entre 7 a 75
4 Apoacutes centrifugaccedilatildeo separa-se em outro tubo o sobrenadante (eluato) e as hemaacutecias
que permanecem satildeo lavadas 4 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica para retirada de todo o
reagente e anticorpos livres
43 PREPARO DA CLOROQUINA
A cloroquina eacute diluiacuteda em tampatildeo PBS na concentraccedilatildeo de 20 (Quadro 2) e
armazenado a 4deg Celsius sua validade apoacutes o preparo eacute de 1 mecircs
A teacutecnica da cloroquina jaacute estaacute padronizada para rotina do laboratoacuterio de
imunohematologia do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto e suas unidades
Reagente Reagentes Quantidade PreparoConservaccedilatildeo
Cloroquina
Difosfato de cloroquina
(C18H32ClN3O8P2)
20 gramas
Conservar a 4deg Celsius
Tampatildeo PBS 100ml
NaOH 01 N Acertar o pH para
51
Quadro 2 - Preparo da Cloroquina Fonte - Manual teacutecnico da AABB 2011
431 TEacuteCNICA DA CLOROQUINA
1 4 partes da soluccedilatildeo pronta eacute adicionada a uma parte de hemaacutecias lavadas 4 vezes com
soluccedilatildeo fisioloacutegica
2 A mistura eacute incubada em temperatura ambiente por ateacute duas horas
3 Centrifugar a 3400 rpm por 2 minutos
27
4 Remover o sobrenadante lavar as hemaacutecias novamente com soluccedilatildeo fisioloacutegica 4
vezes
44 VERIFICACcedilAtildeO DA EFETIVIDADE DOS TESTES
Apoacutes tratamento pelas duas teacutecnicas o TDA foi repetido em todas as amostras para
verificar se os tratamentos foram efetivos e houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo Para as
amostras tratadas pela teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA que permaneceram com TDA positivo
novo tratamento foi realizado
45 TESTE DO ELUATO
O eluato resultante das amostras tratadas com glicina-acidaEDTA foi testado com
hemaacutecias de triagem A soluccedilatildeo do eluato foi incubada com as hemaacutecias de triagem de
anticorpos (ID-Diacell BIO-RAD) pela teacutecnica em gel LissCoombs O teste foi incubado 15
minutos a 37deg Celsius e centrifugado por 10 minutos em centrifuga proacutepria para a teacutecnica em
gel Os eluatos que apresentaram resultados positivos foram testados em painel de 11
hemaacutecias (ID-Diapanel BIO-RAD) para a identificaccedilatildeo do anticorpo
46 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente que apresentou TDA positivo por IgG e pesquisa
de anticorpo irregular positivo com presenccedila de autoanticorpo com reatividade panaglutinina
A amostra foi tratada em paralelo pelas duas teacutecnicas descritas e foi enviada para o
Hemocentro para genotipagem eritrocitaacuteria que foi realizado por metodologia PCR em tempo
real no equipamento Real-time system PCR 7500 ( Applied Biosystems Califoacuternia EUA)
28
5 RESULTADOS
51 REAGENTES
Para aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA satildeo necessaacuterios 3 diferentes
reagentes que podem ser encontrados em forma de kit pronto para uso No entanto esses kits
natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil Os reagentes satildeo tampatildeo glicina-aacutecida o EDTA e o tampatildeo
Tris
Todos os reagentes foram preparados rdquoin houserdquo a partir dos sais e soluccedilotildees PA (puro
para anaacutelise) da marca SYNTH que foram adquiridos para a pesquisa O custo estimado para
cada teste foi aproximadamente R$ 020 reais
Apoacutes o preparo os reagentes poderiam ser armazenados em condiccedilotildees adequadas pelo
periacuteodo de 1 ano (AABB 2011) Ao final do preparo e durante o periacuteodo de armazenamento
de fevereiro a setembro de 2016 foi realizada inspeccedilatildeo visual para verificar a presenccedila de
precipitados ou turvaccedilatildeo A soluccedilatildeo de glicina e o tampatildeo TRIS mostraram-se estaacuteveis ateacute o
final do periacuteodo Por sua vez o reagente EDTA precipitou mesmo estando armazenado em
temperatura ambiente controlada e foi necessaacuterio novo preparo
52 AMOSTRAS DE DOADORES
521 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS AMOSTRAS
Apoacutes incubaccedilatildeo da hemaacutecia com o antissoro a mesma foi lavada 4 vezes para retirada
dos anticorpos livres A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada Caso houvesse positividade na
soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem a etapa era repetida (figura 3) Das 50 amostras sensibilizadas a
uacuteltima lavagem foi positiva somente em 3 delas Nas 3 amostras o anticorpo utilizado para
sensibilizaccedilatildeo foi o anti-K Apoacutes repetido nova etapa de lavagem os resultados se
apresentaram negativos
Em todas as amostras sensibilizadas ldquoin vitrordquo o TDA foi testado e verificado a
intensidade do teste Entre as 50 amostras 47 alcanccedilaram TDA com intensidade 3-4+ apoacutes a
primeira sensibilizaccedilatildeo enquanto 3 amostras necessitaram uma segunda incubaccedilatildeo com
anticorpo (figura 4)
A escolha dos anticorpos para sensibilizar as hemaacutecias foi feita de acordo com o
fenoacutetipo do doador e foram utilizados sete diferentes especificidades de anticorpos policlonais
humanos conforme mostra o graacutefico1
29
Figura 3 - Soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada com hemaacutecia de triagem de
anticorpos em gel LissCoombs (BIO-RAD) A finalidade eacute verificar a presenccedila de anticorpos livres na
suspensatildeo que possam interferir na pesquisa do eluato As soluccedilotildees de lavagem das amostras na figura a tiveram
resultados negativos Na figura b duas amostras a 47 e 50 apresentaram resultado positivo Nova etapa de
lavagem foi realizada e o resultado final foi negativo
522 TRATAMENTO DAS HEMAacuteCIAS
Apoacutes a sensibilizaccedilatildeo e obtenccedilatildeo de resultados de TDA com intensidade de 3 a 4+
cada uma das amostras foi dividida em duas aliacutequotas e tratada separadamente pelas teacutecnicas
de glicinaaacutecida-EDTA e cloroquina
As teacutecnicas foram consideradas efetivas quando obteve-se a completa dissociaccedilatildeo do
anticorpo verificada atraveacutes do TDA negativo na amostra poacutes tratamento conforme figuras 5
e 6 Dentre as amostras tratadas com cloroquina 2850 tiveram o TDA negativado A glicina-
aacutecidaEDTA negativou o TDA em 33 das 50 amostras tratadas Apenas 17 amostras tratadas
com glicina-aacutecidaEDTA permaneceram com o TDA positivo e foram submetidas a um novo
tratamento
30
Figura 4 - TDA das amostras apoacutes sensibilizaccedilatildeo com anticorpos policlonais humanos Amostras na
figura a com intensidades de 3-4+ Na figura b amostras 4 e 7 com intensidade menor que 3+ e portanto foram
novamente sensibilizadas com nova aliacutequota de soro Anti-D e anti-S Apoacutes a segunda sensibilizaccedilatildeo
apresentaram reatividade 4 e 3+ respectivamente Os anticorpos utilizados para sensibilizaccedilatildeo foram D S c E
C e K
523 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS TEacuteCNICAS
No tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA houve dissociaccedilatildeo completa do anticorpo
em 33 amostras (66) das 50 amostras testadas enquanto que com a cloroquina foram 28
amostras (56) (tabela 1)
31
Graacutefico 1- Nuacutemero de amostras sesnsibilizadas por especificidade de anticorpo Entre as 50 amostras 12
foram sensibilizadas com anti-D 10 com anti-C 9 com anti-E 8 com anti-c 7 com anti-S 3 com anti-K e 1
com anti-Dia As especificidades dos anticorpos foram definidas de acordo o fenoacutetipo do doador
Figura 5 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com cloroquina Nas amostras onde houve
a dissociaccedilatildeo do anticorpo ( 2 21 a 23 26 39 a 42 45 46 e 49) a hemaacutecia se deposita no fundo no microtubo
apoacutes a centrifugaccedilatildeo (TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (1 3 24 25 43 44 47
48 e 50) o anticorpo ligado agraves hemaacutecias eacute alvo da AGH presente no gel (TDA positivo)
Anti-D 12
Anti-C 10
Anti-E 9
Anti-c 8
Anti-S 7
Anti-K 3 Anti-Dia 1
32
Figura 6 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA Nas amostras
onde houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo (4 6 7 12 a 15 17 34 35 37 e 38) a hemaacutecia se deposita no fundo no
microtubo apoacutes a centrifugaccedilatildeo ( TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (5 16 18
19 20 33 e 36 ) o AGH presente no gel se liga ao anticorpo ligado agraves hemaacutecias que ficam retidas no gel (TDA
positivo)
Tabela 1-Resultado geral do tratamento das hemaacutecias com glicina e cloroquina
Teacutecnica utilizada TDA negativo TDA positivo Total
Glicina-aacutecidaEDTA 33 17 50
Cloroquina 28 22 50
A glicina-aacutecidaEDTA conseguiu negativar mais amostras sensibilizadas com Anti-D
e anti-K que a cloroquina Para as hemaacutecias sensibilizadas com anti-E Anti-S e Anti-Dia
ambas as teacutecnicas dissociaram o anticorpo em 100 das amostras Os resultados detalhados
por especificidade do anticorpo apoacutes o primeiro tratamento com glicina-aacutecidaEDTA e com
cloroquina estatildeo na tabela 2
Para as amostras que permaneceram positivas (17 amostras) apoacutes o tratamento com a
glicina-aacutecidaEDTA foi realizado um novo tratamento Houve dissociaccedilatildeo do anticorpo em 3
amostras (18) apoacutes a segunda tentativa Nas demais 14 (82) amostras tratadas pela
segunda vez 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise
33
Tabela 2 - Resultados do TDA apoacutes tratamento das hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo
sensibilizado
ANTICORPOS
SENSIBILIZADOS
1ordm TRATAMENTO COM
GLICINA
TRATAMENTO COM
CLOROQUINA
TOTAL TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
Anti-D 8 4 0 12 12
Anti-C 6 4 10 0 10
Anti-E 9 0 9 0 9
Anti-c 0 8 1 7 8
Anti-S 7 0 7 0 7
Anti-K 2 1 0 3 3
Anti-Dia 1 0 1 0 1
TOTAL 33 17 28 22 50
A hemoacutelise foi verificada durante o procedimento de lavagem final das hemaacutecias com
soluccedilatildeo fisioloacutegica para a retirada dos reagentes As soluccedilotildees de lavagem ficaram
avermelhadas e as hemaacutecias com coloraccedilatildeo escura As amostras foram descartadas Dentre as
6 amostras que ainda puderam ser testadas para o TDA trecircs amostras negativaram sendo 1
sensibilizada com anti-D e 2 com anti-C (tabela 3)
Tabela 3 - Resultado apoacutes o segundo tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA
Tratamento com
glicina-aacutecidaEDTA
TDA Negativo TDA Positvo Hemoacutelise Total
Segundo tratamento 3 3 11 17
524 TESTAGEM DO ELUATO
Apoacutes o tratamento com a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA a soluccedilatildeo do eluato foi
testada para verificar a viabilidade dos anticorpos que foram dissociados ou eluiacutedos Dentre
as 50 amostras 41 apresentaram eluato positivo As nove amostras cujos eluatos foram
negativos haviam sido sensibilizadas com as seguintes especificidades de anticorpos anti-E 6
amostras (67) anti-S 2 amostras (40) e anti-D 1 amostra (8) (tabela 4) O eluato de
todas as amostras sensibilizadas com os anticorpos anti-C anti-c Anti-K e Anti-Dia foram
positivos Os eluatos positivos na triagem de anticorpos foram testados com paineacuteis de
identificaccedilatildeo para confirmar a especificidade e a viabilidade dos anticorpos (figuras 7 e 8)
34
525 EFEITO DA ELUICcedilAtildeO SOBRE OS ANTIacuteGENOS ERITROCITAacuteRIOS
Para verificar o efeito do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA e com a cloroquina
sobre a expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s foi realizada a fenotipagem das
amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes tratamento com ambas as teacutecnicas Foi avaliado
se o tratamento destruiu os antiacutegenos expressos antes do tratamento
Tabela 4- Resultado do Eluato das amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA
Anticorpos Eluato positvo Eluato negativo Total
Anti-D 11 1 12
Anti-C 10 0 10
Anti-E 3 6 9
Anti-c 8 0 8
Anti-S 5 2 7
Anti-K 3 0 3
Anti-Dia 1 0 1
Total 41 9 50
Figura 7 ndash Painel do eluato da amostra 21 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-C que foi
recuperado no eluato
Figura 8 ndash Painel do eluato da amostra 47 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-K que foi
recuperado no eluato
35
Dentre as 50 amostras 26 eram previamente fenotipadas para os antiacutegenos Fya Fy
b
Jka Jk
b S e s Dentre elas 20 alcanccedilaram TDA negativo apoacutes tratamento com a glicina-
aacutecidaEDTA e 20 negativaram apoacutes tratamento com cloroquina (tabela 5) Apoacutes ambas as
teacutecnicas os antiacutegenos originalmente expressos permaneceram positivos comprovando que natildeo
houve destruiccedilatildeo dos mesmos
Tabela 5 ndash Verificaccedilatildeo da interferecircncia do tratamento da hemaacutecias com cloroquina e glicina-
aacuteicdaEDTA sobre os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
AMOSTRAS
COM
FENOTIPAGEM
PREacuteVIA
TRATADAS COM
CLOROQUINA
TRATADAS COM
GLICINA
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
26
20
20
20
20
As amostras 24 47 e 50 eram positivas para o antiacutegeno K A cloroquina natildeo dissociou
o anticorpo em nenhuma das 3 amostras enquanto a glicina-aacutecidaEDTA foi efetiva nas
amostras 24 e 50 Foi testada a expressatildeo do antiacutegeno K nas amostras 24 e 50 apoacutes o
tratamento utilizando meacutetodo indireto em gel contendo AGH Apesar de natildeo ter sido avaliado
a intensidade de reaccedilatildeo de expressatildeo dos antiacutegenos podemos verificar na figura 9 que nas
duas amostras em que a teacutecnica foi efetiva e dissociou o anticorpo a expressatildeo do antiacutegeno K
continua presente mas a reatividade observada pode ser considerada 1+ sugerindo que houve
diminuiccedilatildeo da expressatildeo do antiacutegeno quando comparado com a expressatildeo observada em
hemaacutecia natildeo tratada
Os resultados individuais de cada amostra em ambas as teacutecnicas encontram-se
resumidas na tabela 6
526 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente onde foi constatada a presenccedila de autoanticorpo
a quente da classe IgG pelo TDA monoespeciacutefico (figura 10)O autoanticorpo tambeacutem
interferia na pesquisa e identificaccedilatildeo de anticorpos irregulares pois apresentava caracteriacutestica
de panaglutinina As hemaacutecias da paciente sensibilizadas ldquoin vivordquo foram tratadas com
cloroquina e com glicina-aacutecidaEDTA
36
Figura 9 ndash Fenotipagem das amostras 24 e 50 para antiacutegeno K apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
O teste positivo indica a presenccedila do antiacutegeno poreacutem a reatividade fraca (1+) sugere que houve enfraquecimento
de sua expressatildeo A direita a expressatildeo forte (4+) do antiacutegeno Kell em hemaacutecia controle natildeo tratada utilizada
como controle positivo
A cloroquina natildeo foi efetiva na retirada do anticorpo ligado as hemaacutecias ao contraacuterio
do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA que dissociou o anticorpo (figura 11)
A hemaacutecia tratada com glicina foi fenotipada para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
(figura 12) A fenotipagem para o sistema Rh (C c E e e) e Kell foi realizada em gel
especiacutefico monoclonal sem interferecircncia do TDA positivo (controle da reaccedilatildeo negativo)
O eluato resultante do tratamento com glicina-aacutecidaEDTA foi testada em gel com
hemaacutecias de painel de identificaccedilatildeo de anticorpos e apresentou resultado positivo com todas
as ceacutelulas (figura 13 e 14)
A amostra foi enviada para genotipagem e o resultado da genotipagem confirmou o
resultado da fenotipagem apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
527 TEMPO DE EXECUCcedilAtildeO DA TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
O tempo de reaccedilatildeo da glicina-aacutecidaEDTA eacute de 2 minutos Todas as amostras foram
tratadas obedecendo ao tempo descrito na literatura demonstrando que o mesmo eacute
reprodutiacutevel
37
Tabela 6- Resultados individuais por amostra
Amostra Especificidade
dos anticorpos
Intensidade do
TDA apoacutes
sensibilizaccedilatildeo
Tratamento
efetivo com
cloroquina
Tratamento
efetivo com
glicina
Eluato
poacutes
glicina
1 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 2 Dia 3+ Sim Sim 3+ 3 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 4 D 4+ Natildeo Sim 4+ 5 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 6 E 3+ Sim Sim Negativo 7 S 4+ Sim Sim 3+ 8 E 3+ Sim Sim 1+ 9 E 3+ Sim Sim 2+
10 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 11 D 4+ Natildeo Sim 4+ 12 D 4+ Natildeo Sim 4+ 13 S 3+ Sim Sim 3+ 14 S 3+ Sim Sim 3+ 15 D 3+ Natildeo Sim 3+ 16 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 17 E 3+ Sim Sim (+) 18 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 19 D 4+ Natildeo Natildeo 3+ 20 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 21 C 3+ Sim Sim 4+ 22 C 3+ Sim Sim 4+ 23 C 3+ Sim Sim 4+ 24 K 4+ Natildeo Sim 4+ 25 D 3+ Natildeo Natildeo Negativo 26 E 4+ Sim Sim Negativo 27 S 3+ Sim Sim 3+ 28 C 3+ Sim Natildeo 4+ 29 C 3+ Sim Sim 4+ 30 C 3+ Sim Sim 4+ 31 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 32 E 3+ Sim Sim Negativo 33 C 3+ Sim Natildeo 4+ 34 S 3+ Sim Sim Negativo 35 S 3+ Sim Sim Negativo 36 C 4+ Sim Natildeo 4+ 37 c 4+ Natildeo Natildeo 4+ 38 D 4+ Natildeo Sim 4+ 39 S 3+ Sim Sim 3+ 40 c 4+ Sim Natildeo 2+ 41 C 4+ Sim Natildeo 4+ 42 E 3+ Sim Sim Negativo 43 D 3+ Natildeo Sim 2+ 44 D 3+ Natildeo Sim 2+ 45 E 3+ Sim Sim Negativo 46 C 3+ Sim Sim 4+ 47 K 4+ Natildeo Natildeo 4+ 48 D 3+ Natildeo Sim 2+ 49 E 3+ Sim Sim Negativo 50 K 4+ Natildeo Sim 4+
TOTAL 50 28 33 41
38
Figura 10 ndash TDA monoespeciacutefico da amostra de paciente Hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo da classe
IgG
oacute Figura 11 ndash TDA apoacutes o tratamento com glicina-aacutecidaEDTA (esquerda) e cloroquina (direita) A glicina
negativou completamente o TDA enquanto a hemaacutecia tratada com cloroquina persistiu positiva (1+)
39
Figura 12 ndash Fenotipagem da amostra tratada com glicina-aacutecidaEDTA Fy(a+b+) Jk(a-b+) S+s+
Figura 13 ndash Painel em gel (LissAGH) do eluato apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de
intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
Figura 14 ndash ndash Painel ezimaacutetico (hemaacutecias tratadas com bromelina) do eluato em gel neutro apoacutes
tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
40
528 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Quanto a efetividade das teacutecnicas em negativar o TDA foi verificado que a glicina-
aacutecidaEDTA foi efetiva em 66 das amostras testadas no primeiro tratamento (3350
amostras) enquanto a cloroquina conseguiu negativar 56 (2850) Esses resultados natildeo
apresentam diferenccedila significativa (pgt005) demostrando que a teacutecnica da glicina-
aacutecidaEDTA natildeo eacute superior mas eacute tatildeo efetiva quanto a da cloroquina
Quando aliamos os resultados de ambas as teacutecnicas verificamos que em 76 (3850)
das amostras o TDA foi negativado Esse dado indica que ainda que uma teacutecnica natildeo seja
eficaz na remoccedilatildeo do anticorpo eacute uma boa alternativa tentar a segunda teacutecnica jaacute que a falha
em remover o anticorpo utilizando uma delas natildeo prevecirc necessariamente a falha com a outra
Quando se utiliza o teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla (graacutefico 2) para comparar a utilizaccedilatildeo das
duas teacutecnicas com o resultado de cada uma isolada (somente a cloroquina ou somente a
glicina) verificamos que os resultados apresentam diferenccedila significativa (plt005) (quadro 3)
TRATAMENTO EFETIVO COM TOTAL PORCENTAGEM
Glicina ou cloroquina 38 76
Glicina e cloroquina 23 46
Glicina apenas 10 20
Cloroquina apenas 5 10
Nenhuma das teacutecnicas 12 24
Quadro 3 - Resultados comparativos entre as teacutecnicas utilizadas
41
Graacutefico 2 - Teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla entre as teacutecnicas aplicadas A- Glicina e Cloroquina B-Cloroquina C-
Glicina ( plt005)
42
6 DISCUSSAtildeO
Os reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA podem ser adquiridos em
forma de kit comercial prontos para uso poreacutem natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil A preparaccedilatildeo
dos reagentes ldquoin houserdquo a partir de sais comerciais adquiridos se mostrou viaacutevel Os
reagentes glicina e o tampatildeo Tris armazenados de forma correta se mantiveram estaacuteveis por
um periacuteodo de 7 meses Somente o reagente EDTA precipitou mesmo armazenado em
condiccedilotildees adequadas sugerindo que o mesmo deve ser preparado em menor quantidade e
armazenado em aliacutequotas A soluccedilatildeo de cloroquina tambeacutem pode ser preparada ldquoin houserdquo e
pode ser armazenado por um mecircs A legislaccedilatildeo brasileira autoriza a utilizaccedilatildeo de reagentes
preparados a partir de sais comerciais como a cloroquina e a glicina-aacutecidaEDTA desde que
os sais tenham autorizaccedilatildeo da vigilacircncia sanitaacuteria para a comercializaccedilatildeo (BRASIL 2001)
A comparaccedilatildeo quanto a efetividade em dissociar anticorpos em amostras com TDA
positivos entre a teacutecnica da glicina e a teacutecnica da cloroquina mostrou que natildeo haacute diferenccedila
estatiacutestica entre elas e que ambas satildeo igualmente eficientes Se utilizadas conjuntamente haacute
maior possibilidade de elucidaccedilatildeo dos casos
Uma vantagem da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eacute que ela permite numa mesma
amostra eluir o anticorpo ligado aacute hemaacutecia assim como fenotipar a hemaacutecia tratada Devido a
sua dupla utilidade a teacutecnica eacute vantajosa principalmente em pacientes em que pouco volume
de amostra pode ser coletado como em casos de crianccedilas e receacutem-nascidos
A fenotipagem poacutes tratamento se mostrou viaacutevel jaacute que os antiacutegenos de maior
importacircncia natildeo sofreram alteraccedilotildees Nas 20 amostras que foram fenotipadas antes e apoacutes
tratamento para verificar a influecircncia dos reagentes na expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a
Jkb S e s natildeo houve destruiccedilatildeo dos mesmos por nenhuma das duas teacutecnicas
Para as amostras positivas para o antiacutegeno Kell (350) e sensibilizadas com o
respectivo anticorpo a teacutecnica da glicina foi efetiva em negativar o TDA em apenas duas
delas mas apoacutes o tratamento foi verificada uma fraca reatividade da reaccedilatildeo antiacutegeno-
anticorpo sugerindo que houve um enfraquecimento da expressatildeo do antiacutegeno conforme
esperado e descrito na literatura (BYRNE 1991 PALLAS WILER E MCGEE 1991
ROZIERS e SQUALI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012 e KATHARIA e
CHAUDHARY 2013) A accedilatildeo da glicina sobre o antigeno Kell natildeo representa impedimento
para seu uso uma vez que na impossibilidade de testar o antiacutegeno Kell o banco de sangue
consegue facilmente atender a solicitaccedilatildeo de transfusatildeo com unidades de hemaacutecias Kell
43
negativas jaacute que eacute um antiacutegeno de baixa prevalecircncia na populaccedilatildeo variando de 15 na
populaccedilatildeo africana a 9 nos europeus (DANIELS 2011)
A soluccedilatildeo resultante da dissociaccedilatildeo do anticorpo pela teacutecnica da glicina pode ainda ser
utilizada como eluato podendo substituir a teacutecnica de eluiccedilatildeo com reagentes comercias (kits
de eluiccedilatildeo aacutecida) que tem alto custo aproximadamente entre R$2000 a R$2500 por teste
Em 41 amostras (82) houve a dissociaccedilatildeo e recuperaccedilatildeo do anticorpo que estava
sensibilizando as hemaacutecias Em 9 amostras (18) os anticorpos foram eluiacutedos poreacutem
apresentaram reaccedilatildeo negativa quando testadas com hemaacutecias de triagem entre eles o anti-E
(6) anti-S (2) e Anti-D (1) Eacute possiacutevel que a correccedilatildeo pH do meio (WALKER 2011) natildeo
tenha sido adequada o que pode ter desfavorecido a reatividade do anticorpo
Para as amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA nas quais natildeo houve dissociaccedilatildeo do
anticorpo pelo primeiro tratamento (1750) o segundo tratamento natildeo se mostrou eficaz jaacute
que 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise O tempo de
armazenagem natildeo parece ter influenciado jaacute que todas as amostras foram testadas dentro de
48 horas apoacutes a coleta Outros fatores que natildeo foram verificados podem ter levado a
hemoacutelise Apesar da literatura (LOUIE JIENG e ZEROULIS 1986 e BYRNE 1991)
recomendar um segundo tratamento ele eacute pouco eficaz tendo negativado apenas 3 das 17
amostras testadas
A amostra de paciente que apresentou sensibilizaccedilatildeo ldquoin vivordquo mostrou melhor
efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA sobre a da cloroquina possibilitando
fenotipagem para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s que natildeo foram destruiacutedos apoacutes o
tratamento comprovado atraveacutes da genotipagem
A presenccedila de autoanticorpo a quente com presenccedila de hemoacutelise (AHAI) ou natildeo pode
mascarar a presenccedila de aloanticorpo interferindo na rotina soroloacutegica da fenotipagem que eacute
uma importante ferramenta para auxiliar na seleccedilatildeo de hemaacutecias para transfusatildeo (SHIREY et
al 2002) Esses pacientes frequentemente possuem aloanticorpos associados ao
autoanticorpo e a prevalecircncia de aloimunizaccedilatildeo entre eles varia entre 12 a 40 (LEGER e
GARRATY 1999 BRANCH e PETZ 1999) o que dificulta ainda mais a escolha do melhor
componente a ser transfundido aleacutem de aumentar a possibilidade reaccedilotildees hemoliacuteticas imunes
poacutes-transfusionais
Nesses casos as teacutecnicas de dissociaccedilatildeo de anticorpos satildeo importantes para tratar
amostras de pacientes e a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser usada como uma opccedilatildeo
pois se mostrou eficaz na dissociaccedilatildeo anticorpo ligado agraves hemaacutecias deixando livre a
superfiacutecie das mesmas permitindo a fenotipagem por antisoros IgG Paralelamente os
44
anticorpos eluiacutedos tambeacutem puderam ser estudados O mesmo natildeo ocorre com a cloroquina
que permite apenas a fenotipagem e tampouco com os kits de eluiccedilatildeo aacutecida disponiacuteveis no
mercado nacional que satildeo destinados a realizaccedilatildeo do eluato mas destroem as hemaacutecias
O tempo de tratamento na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA tambeacutem eacute uma vantagem
pois foi possiacutevel reproduzir no tempo determinado de 2 minutos enquanto a cloroquina
demora ateacute duas horas
Ainda que a aplicaccedilatildeo das teacutecnicas por biologia molecular estejam cada vez mais
presentes na rotina imuno-hematoloacutegica e possibilitam estabelecer o fenoacutetipo deduzido do
genoacutetipo elas natildeo estatildeo disponiacuteveis na maioria dos centros e sua realizaccedilatildeo exige algumas
horas A resoluccedilatildeo imediata do problema transfusional necessita dos resultados soroloacutegicos
pois com frequecircncia natildeo eacute possiacutevel aguardar o resultado do teste molecular Dessa forma
apesar da crescente importacircncia da genotipagem eritrocitaacuteria teacutecnicas soroloacutegicas aplicadas
corretamente e no momento propiacutecio satildeo de grande utilidade para resolver problemas imuno-
hematoloacutegicos como ocorre com a fenotipagem em pacientes com TDA positivo
45
7 CONCLUSAtildeO
A teacutecnica da glicina aacutecidaEDTA mostrou-se efetiva em remover os anticorpos que
sensibilizavam as hemaacutecias e pode ser utilizada com seguranccedila antes da fenotipagem
eritrocitaacuteria Por ser uma teacutecnica de raacutepida execuccedilatildeo eacute uma alternativa aplicaacutevel
principalmente em casos urgentes de pacientes que apresentam autoanticorpos
46
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50
9 ANEXOS
51
FUNDACcedilAtildeO HEMOCENTRO DE RIBEIRAtildeO PRETO
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE)
Tiacutetulo da pesquisa Aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina aacutecida-EDTA e avaliaccedilatildeo da
eficaacutecia no tratamento de hemaacutecias com teste direto da antiglobulina positivo
Pesquisadora responsaacutevel Ceacutelia Kazue Abiko
Orientador Prof Dimas Tadeu Covas
Co-orientadora Dra Flaacutevia Leite Souza Santos
Objetivo da pesquisa Vocecirc estaacute sendo convidado a participar de uma pesquisa que tem
como objetivo padronizar uma nova teacutecnica para auxiliar na tipagem sanguiacutenea de pacientes
A tipagem sanguiacutenea pode sofrer interferecircncia da presenccedila de anticorpos ligados aos gloacutebulos
vermelhos do sangue Nessas situaccedilotildees eacute difiacutecil selecionar o melhor sangue para o paciente e
eacute preciso a utilizaccedilatildeo de teacutecnicas adicionais para remover essas interferecircncias
Esta pesquisa tem como objetivo estudar outra teacutecnica para remover esses anticorpos e
comparaacute-la com a teacutecnica atualmente utilizada Para isso precisamos de amostras de pacientes
e doadores voluntaacuterios
Se vocecirc eacute um doador eacute necessaacuterio que vocecirc autorize a coleta de 5 ml (1 tubo) a mais
de seu sangue
Se vocecirc eacute um paciente natildeo haveraacute necessidade de nova amostra pois utilizaremos as
amostras jaacute coletadas para os testes preacute-transfusionais e os resultados encontrados nesta
pesquisa natildeo iratildeo interferir na escolha da (s) bolsa (s) de sangue que vocecirc possa vir a receber
Se vocecirc concordar em participar leia com atenccedilatildeo o texto abaixo e assine as duas vias
rubricando todas as paacuteginas deste termo de consentimento Uma via original assinada e
rubricada por vocecirc e pela pesquisadora ficaraacute com vocecirc
As suas informaccedilotildees seratildeo mantidas em sigilo pela pesquisadora e natildeo haveraacute
armazenamento de material para pesquisas posteriores Os seus dados seratildeo usados apenas
neste estudo e quando o trabalho for publicado seu nome e qualquer outra informaccedilatildeo que
possam identificaacute-lo natildeo seratildeo revelados
Eacute pouco provaacutevel que o que noacutes aprendermos com este estudo tenha um benefiacutecio
direto para vocecirc assim como natildeo poderemos dar nada em troca pela sua participaccedilatildeo na
pesquisa
Nosso objetivo com esta pesquisa eacute que os resultados poderatildeo ser uacuteteis para o
tratamento de pacientes no futuro Os riscos da participaccedilatildeo satildeo miacutenimos Se vocecirc eacute um
doador de sangue a amostra seraacute coletada no momento da doaccedilatildeo natildeo exigindo punccedilatildeo
venosa adicional
52
Eacute seu direito ter acesso aos resultados dos testes da pesquisa Esses resultados natildeo
seratildeo fornecidos automaticamente a vocecirc mas caso vocecirc se interesse em saber o resultado ou
tiver alguma duacutevida sobre a sua participaccedilatildeo neste estudo deveraacute entrar em contato com Ceacutelia
Kazue Abiko pelo telefone (18) 99718-3551
Vocecirc tem total liberdade de optar por natildeo participar da pesquisa Caso aceite
participar poderaacute desistir a qualquer momento ou retirar seu consentimento mesmo apoacutes ter
coletado o sangue Para cancelar sua participaccedilatildeo basta avisar a pesquisadora e os seus dados
seratildeo retirados do projeto
Qualquer duacutevida eacutetica sobre a pesquisa poderaacute entrar em contato com o Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa do Hospital das Cliacutenicas e da Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto
(CAMPUS UNIVERSITAacuteRIO bairro Monte Alegre CEP 14048-900 Ribeiratildeo Preto-SP
Telefone (16) 3602-2228 FAX (16) 3633-1144 e-mail cephcrpuspbr)
Consentimento de participaccedilatildeo
A Consentimento do participante
Li as informaccedilotildees acima sobre o estudo e recebi explicaccedilotildees sobre a participaccedilatildeo no estudo
Portanto dou o meu consentimento para participar do estudo
___________________________________________________________________________
Nome completo
___________________________________________________________________________
Assinatura
___________
Data
__________________________________________________________________________________
Nome completo da pesquisadora
___________________________________________________________________________
Assinatura
_____________
Data
10
instituiccedilotildees de reconhecida competecircncia na hemoterapia mas sua disponibilizaccedilatildeo deve
tornar-se mais generalizada atraveacutes da formaccedilatildeo de centros de referecircncia para atendimento
das diversas unidades de hemoterapia (MARTINS et al 2009) Dessa forma muitas decisotildees
transfusionais especialmente em urgecircncias ainda devem ser tomadas sem o resultado da
genotipagem eritrocitaacuteria
13 TESTE DA ANTIGLOBULINA
Coombs Mourant e Race descreveram em 1945 uma teacutecnica com utilizando soro de
coelho contendo antiglobulina humana (AGH) que posteriormente foi chamada de ldquosoro de
Coombsrdquo O meacutetodo foi desenvolvido inicialmente para ampliar o efeito de aglutininas fracas
do sistema Rh anticorpos ldquoincompletosrdquo que normalmente natildeo apresentavam aglutinaccedilatildeo
visiacutevel O teste foi concebido como um instrumento de investigaccedilatildeo de doenccedila hemoliacutetica do
receacutem-nascido e de reaccedilotildees transfusionais causadas por anticorpos Rh que estavam presentes
no soro dos paciente poreacutem que natildeo eram demonstraacuteveis pelas teacutecnicas ateacute entatildeo existentes
A maior parte dos anticorpos de significado cliacutenico assim como seus respectivos
antiacutegenos foram descritos apoacutes o surgimento do ldquosoro de Coombsrdquo em 1945 sendo assim o
teste da antiglobulina representa ateacute hoje a forma mais importante de aglutinaccedilatildeo artificial em
imunohematologia permitindo revelar a presenccedila de anticorpos na membrana da hemaacutecia A
antiglobulina humana eacute constituiacuteda por anticorpo especiacutefico contra a porccedilatildeo Fc de outro
anticorpo Quando um anticorpo ldquoincompletordquo sensibiliza a hemaacutecia normalmente natildeo
provoca aglutinaccedilatildeo visiacutevel Apoacutes a adiccedilatildeo da AGH ao meio esta reconhece e se liga agraves
porccedilotildees Fc dos anticorpos que sensibilizam a hemaacutecia formando assim uma malha e
provocando aglutinaccedilatildeo visiacutevel (BARJAS-CASTRO 2013)
Os reagentes de antiglobulina podem ser poliespeciacuteficos ou monoespeciacuteficos Os
poliespeciacuteficos satildeo uma mistura de anticorpos ant-IgG e anti-C3d (fraccedilatildeo C3d do
complemento) Os reagentes monoespecificos podem ser anti-IgG anti-IgM anti-IgA anti-
complemento podendo ser anti-C3d e anti-C3b
O teste da antiglobulina pode ser usado para detectar hemaacutecias sensibilizadas com
aloanticorpos IgG autoanticorpos IgG e componentes do complemento A sensibilizaccedilatildeo
pode ocorrer ldquoin vivordquo ou ldquoin vitrordquo O uso do AGH para detectar a sensibilizaccedilatildeo ldquoin vitrordquo
tem dois estaacutegios e eacute denominado teste indireto da antiglobulina A sensibilizaccedilatildeo ldquoin vivordquo eacute
detectada em procedimento de um uacutenico estagio chamado teste direto da antiglobulina (TDA)
11
Os testes direto e indireto satildeo ateacute hoje amplamente aplicados como princiacutepio de inuacutemeros
testes soroloacutegicos em imuno-hematologia (GREEN e KLOSTERMANN 2012)
131 TESTE DIRETO DA ANTIGLOBULINA
O teste direto da antiglobulina humana revela a presenccedila de anticorpo eou fraccedilatildeo do
complemento ligados agrave superfiacutecie das hemaacutecias As sensibilizaccedilatildeo das hemaacutecias ocorrida ldquoin
vivordquo natildeo eacute visualizada mas apoacutes a adiccedilatildeo da antiglobulina humana ocorre a aglutinaccedilatildeo que
eacute visualizada macroscopicamente (Figura 1)
Figura 1 - Princiacutepio da teacutecnica direta da antiglobulina Teste utilizado para demonstrar a sensibilizaccedilatildeo ldquoin
vivordquo das hemaacutecias O sangue total eacute coletado do paciente em tubo contendo anticoagulante EDTA Na teacutecnica
realizada em tubo uma suspensatildeo de hemaacutecias 5 em soluccedilatildeo de salina eacute preparada Uma gota dessa suspensatildeo
eacute lavada 3 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica para retirada de anticorpos que estatildeo livres no plasma Toda soluccedilatildeo eacute
retirada e adiciona-se o soro de Coombs (antiglobulina humana) O soro de Coombs reconhece os anticorpos que
estatildeo ligados agrave superfiacutecie das hemaacutecias fazendo com que ocorra aglutinaccedilatildeo visiacutevel macroscopicamente
Apesar de natildeo ser um teste preacute-transfusional obrigatoacuterio o TDA eacute um dos testes mais
importantes para investigar e classificar quadros hemoliacuteticos como de origem imune ou natildeo
imune O seu valor preditivo positivo em vigecircncia de anemia hemoliacutetica eacute de 83 poreacutem natildeo
havendo sinais de hemoacutelise seu valor preditivo eacute apenas 14 Eacute por esse motivo que a
interpretaccedilatildeo do TDA positivo deve levar em consideraccedilatildeo a histoacuteria cliacutenica e os resultados
dos outros exames laboratoriais A realizaccedilatildeo do TDA eacute obrigatoacuteria na investigaccedilatildeo
12
laboratorial de diversos quadros hemoliacuteticos entre eles a anemia hemoliacutetica autoimune
(AHAI) a reaccedilatildeo hemoliacutetica imune poacutes-transfusional a siacutendrome do linfoacutecito passageiro a
doenccedila hemoliacutetica perinatal e a hemoacutelise droga-dependente (LEGER 2011)
Resultados de TDA positivos foram tambeacutem observados em indiviacuteduos com niacuteveis
seacutericos elevados de IgG ou complemento sem evidecircncia de anemia hemoliacutetica imune como
em pacientes com doenccedila falciforme talassemia doenccedila renal crocircnica mieloma muacuteltiplo
doenccedilas autoimunes e siacutendrome da imunodeficiecircncia adquirida (SIDA) Aleacutem disso pequenas
quantidades de IgG (5 a 90 moleacuteculas por hemaacutecia) e complemento (5 a 40 moleacuteculas por
hemaacutecia) podem estar presentes nas hemaacutecias de indiviacuteduos saudaacuteveis sem associaccedilatildeo com
reduccedilatildeo na sobrevida das mesmas A positividade do TDA depende da populaccedilatildeo estudada e
pode variar de 01 entre doadores de sangue sem qualquer sinal cliacutenico de hemoacutelise ateacute
15 em pacientes hospitalizados (CASTILHO JUNIOR e REID 2015 LEGER 2011)
Indiviacuteduos que apresentam TDA positivo seja agraves custas de IgG eou complemento
com ou sem sinais cliacutenicos de hemoacutelise teratildeo a fenotipagem eritrocitaacuteria prejudicada A
fenotipagem de indiviacuteduos com TDA positivo especialmente quando utilizado o teste indireto
da antiglobulina pode acarretar resultados falsos positivos e levar a seleccedilatildeo de fenoacutetipo
incorreto para transfusatildeo
132 TESTE INDIRETO DA ANTIGLOBULINA
O teste indireto da antiglobulina (TIA) eacute utilizado para revelar a sensibilizaccedilatildeo ldquoin
vitrordquo das hemaacutecias e eacute aplicado a diversos testes soroloacutegicos em imunohematologia entre
eles a pesquisa de anticorpos identificaccedilatildeo de anticorpos testes de compatibilidade
fenotipagem eritrocitaacuteria e titulaccedilatildeo de anticorpos Na teacutecnica indireta a hemaacutecia que contecircm
o antiacutegeno eacute colocada em contato ldquoin vitrordquo com o anticorpo que se liga mas natildeo promove a
aglutinaccedilatildeo visiacutevel A adiccedilatildeo da AGH forma uma malha entre os anticorpos que sensibilizam
as hemaacutecias e provoca a aglutinaccedilatildeo macroscoacutepica (figura 2)
Caso a amostra de hemaacutecia estudada seja previamente sensibilizada resultados falsos
positivos podem ser obtidos no TIA jaacute que a AGH reagiraacute com a moleacutecula que sensibilizava
anteriormente a hemaacutecia mesmo se o anticorpo especiacutefico natildeo tiver se ligado ao antiacutegeno
correspondente
13
133 CONDICcedilOtildeES CLIacuteNICAS COM TDA POSITIVO
O TDA positivo deve ser interpretado cuidadosamente sempre em conjunto com o
quadro cliacutenico do paciente A positividade isolada do TDA natildeo significa hemoacutelise A
interpretaccedilatildeo do teste positivo requer o conhecimento do diagnoacutestico do paciente da presenccedila
de sinais e sintomas sugestivos de hemoacutelise assim como de seu histoacuterico transfusional
gestacional e de informaccedilotildees sobre o uso recente de medicaccedilotildees (LEGER 2011)
Figura 2 ndash Princiacutepio do teste indireto da antiglobulina O TIA pode ser utilizado na pesquisa de anticorpos de
especificidades desconhecidas livres no soroplasma como eacute o caso da pesquisa e identificaccedilatildeo de anticorpos
irregulares Ele eacute tambeacutem utilizado para determinar a presenccedila de antiacutegenos na membrana da hemaacutecia quando
satildeo empregados soros de especificidades conhecidas da classe IgG No primeiro caso o soroplasma contendo o
anticorpo desconhecido eacute colocado em contato com hemaacutecias cujo perfil antigecircnico eacute conhecido No segundo
caso utiliza-se soro de especificidade conhecida da classe IgG para determinar a presenccedila ou ausecircncia de um
antiacutegeno na membrana O anticorpo encontra o antiacutegeno correspondente e ocorre a ligaccedilatildeo do anticorpo agrave
hemaacutecia mas natildeo ocorre aglutinaccedilatildeo Apoacutes a adiccedilatildeo da AGH que se liga aos anticorpos formando uma malha
ocorre a aglutinaccedilatildeo visiacutevel
O TDA positivo eacute uma achado claacutessico de algumas condiccedilotildees cliacutenicas como a reaccedilatildeo
transfusional hemoliacutetica a doenccedila hemoliacutetica do feto e do receacutem-nascido (DHFRN) a anemia
hemoliacutetica induzida por drogas a siacutendrome do linfoacutecito passageiro e a anemia hemoliacutetica
autoimune (AHAI) Portanto o TDA positivo pode ser decorrente da sensibilizaccedilatildeo da
hemaacutecia autoacuteloga por um autoanticorpo ou por um aloanticorpo ligado agrave hemaacutecia alogecircnica
circulante A positividade do TDA pode ainda ocorrer de forma passiva em pacientes que
14
recebem imunoglobulinas humanas ou ainda pela transfusatildeo de plaquetas ABO natildeo idecircntico
(LEGER 2011 RALPH 2012 ZANTEK et al 2012)
Nas reaccedilotildees transfusionais hemoliacuteticas imunes o aloanticorpo do receptor sensibiliza
as hemaacutecias transfundidas do doador e reduz sua sobrevida ao removecirc-la precocemente da
circulaccedilatildeo pela fagocitose no sistema retiacuteculo-endotelial ou pela hemoacutelise intravascular As
reaccedilotildees podem ser agudas se ocorrem ateacute 24 horas ou tardias quando ocorrem apoacutes 24 horas
da transfusatildeo A gravidade das reaccedilotildees hemoliacuteticas pode variar de um simples rendimento
transfusional inadequado agrave quadros graves de hemoacutelise intravascular evoluindo ateacute mesmo
com choque vascular e oacutebito O TDA pode resultar negativo caso toda massa eritrocitaacuteria
transfundida tenha sido destruiacuteda (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
Na doenccedila hemoliacutetica do feto e do receacutem-nascido (DHFRN) anticorpos maternos da
classe IgG atravessam a barreira placentaacuteria e sensibilizam as hemaacutecias fetais que seratildeo
destruiacutedas precocemente levando agrave anemia fetal Apesar da incompatibilidade ABO feto-
materna ser a causa mais frequente de DHFRN raramente ela eacute responsaacutevel pela ocorrecircncia
de quadros graves Por outro lado anticorpos contra antiacutegenos do sistema Rh e Kell
especialmente Anti-D (Anti-RH1) Anti-c (Anti-RH4) e Anti-Kell (Anti-KELL1) satildeo
conhecidos por causar DHFRN severa Raramente outros anticorpos tambeacutem podem estar
implicados na DHFRN como os anticorpos contra antiacutegenos do sistema Kidd Duffy MNS e
Diego (ZANTEK et al 2012)
A hemoacutelise droga-dependente eacute causada pela produccedilatildeo de um anticorpo voltado contra
a droga ligada agrave membrana eritrocitaacuteria ou ainda contra o complexo droga-membrana A
classe de medicaccedilotildees mais comumente envolvida eacute a dos antimicrobianos betalactacircmicos
(penicilinas e cefalosporinas) mas outras classes como quimioteraacutepicos e anti-inflamatoacuterios
tambeacutem satildeo descritos (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
Apoacutes transplante de ceacutelulas progenitoras hematopoieacuteticas em que o doador possui
anticorpos contra antiacutegenos eritrocitaacuterios do receptor o linfoacutecito de memoacuteria do doador pode
resistir ao esquema imunossupressor utilizado e continuar a produccedilatildeo de anticorpos que
reconhecem a hemaacutecia incompatiacutevel do receptor ainda circulante O quadro cliacutenico pode
variar de um simples TDA positivo sem outros sinais ou sintomas ateacute um quadro hemoliacutetico
grave e abrupto (LEGER 2011)
15
134 ANEMIA HEMOLIacuteTICA AUTOIMUNE
A anemia hemoliacutetica autoimune eacute caracterizada pela destruiccedilatildeo precoce das hemaacutecias
autoacutelogas por autoanticorpos que sensibilizam as hemaacutecias e levam agrave fagocitose pelos
macroacutefagos no sistema reticulo-endotelial ou hemoacutelise intravascular O diagnoacutestico da AHAI
baseia-se na presenccedila de hemoacutelise cliacutenica associada agrave evidecircncia de fator imune representado
pelo TDA positivo As classes de anticorpos envolvidas em quadros de AHAI satildeo IgG IgM e
raramente IgA (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012) Satildeo raros os casos de AHAI com TDA
negativo que podem estar relacionados a um autoanticorpo de baixa avidez de densidade
inferior agrave detecccedilatildeo do meacutetodo ou ainda de classe de imunoglobulina natildeo avaliada pelo
meacutetodo utilizado para o teste (GARRATY 2005)
A AHAI pode ser classificada em dois grupos principais de acordo com a melhor
temperatura de reaccedilatildeo do autoanticorpo As anemias hemoliacuteticas causadas por anticorpos
quentes que reagem melhor a 37oC e geralmente IgG representam 80 dos casos de AHAI
Nas AHAI por anticorpo quente o TDA pode ser positivo para IgG mais complemento (67)
somente IgG (20) ou somente por complemento (13) As anemias causadas por
anticorpos frios geralmente da classe IgM e que reagem melhor em temperatura ambiente ou
a 4oC representam aproximadamente 20 dos casos de AHAI Por exibirem amplitude
teacutermica esses anticorpos ligam-se agraves hemaacutecias ao atingirem a circulaccedilatildeo nas extremidades do
corpo fixam o complemento e desprendem-se da hemaacutecia apoacutes retornar para partes mais
quentes Por esse motivo em AHAI por anticorpos frios o TDA eacute positivo apenas agraves custas
de C3 e normalmente o IgM natildeo eacute detectado (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
A presenccedila do autoanticorpo IgG pode ser confirmada atraveacutes da eluiccedilatildeo do anticorpo
da hemaacutecia Tipicamente o eluato na AHAI por anticorpo quente reage com todas as ceacutelulas
testadas de um painel de hemaacutecias alogecircnicas do tipo ldquoOrdquo ou pode eventualmente exibir uma
especificidade conhecida como Anti-e (Anti-RH5) Nas AHAI a frio por sua vez espera-se
um eluato negativo (LEGER 2011)
Os autoanticorpos satildeo com frequecircncia encontrados livres no plasma e natildeo somente
ligados agraves hemaacutecias autoacutelogas Eles podem interferir em todas as fases dos testes preacute-
transfusionais nas quais o plasma eacute testado especialmente os autoanticorpos quentes que
acarretam resultados positivos em todos os testes levados agrave fase de antiglobulina humana
Esses anticorpos portanto positivam a pesquisa de anticorpos irregulares e mascaram a
presenccedila de aloanticorpos de significado cliacutenico Aproximadamente 60 dos pacientes que
apresentam AHAI a quente apresentam anticorpos que reagem em meio salino mas se forem
16
levados em conta meacutetodos mais sensiacuteveis como PEG enzima e estudo em gel a positividade
pode ser superior a 90 (LEGER 2011)
Aleacutem da eficaacutecia da transfusatildeo ser comprometida pela diminuiccedilatildeo da vida-meacutedia das
hemaacutecias a presenccedila do autoanticorpo dificulta a realizaccedilatildeo dos testes preacute-transfusionais e
compromete a seguranccedila transfusional Os autoanticorpos reagem normalmente como
panaglutininas pois satildeo normalmente voltados contra antiacutegenos puacuteblicos na maior parte das
vezes contra antiacutegenos do sistema Rh Por apresentarem essas caracteriacutesticas podem ainda
mascarar a presenccedila de aloanticorpos de significado clinico e levar a testes de compatibilidade
positivos exigindo uma avaliaccedilatildeo criteriosa da necessidade da transfusatildeo (BRANCH e PETZ
1999 JUNIOR e OLIVATO 2004)
Remover a interferecircncia do autoanticorpo para avaliar a presenccedila de aloanticorpos
mascarados nem sempre eacute possiacutevel mesmo utilizando teacutecnicas de autoadsorccedilatildeo ou
aloadsorccedilatildeo que aleacutem de tudo satildeo demoradas e exigem de 2 a 6 horas para conclusatildeo
(GARRATY e GEORGE 2002) Nesses casos a fenotipagem eritrocitaacuteria do paciente eacute de
extrema utilidade especialmente em situaccedilotildees de urgecircncia A definiccedilatildeo do fenoacutetipo do
paciente para os antiacutegenos de maior importacircncia cliacutenica pode auxiliar a seleccedilatildeo de unidades
de hemaacutecias com mesmo fenoacutetipo o que garante que eventuais aloanticorpos natildeo
identificados sejam respeitados e tambeacutem evita nova sensibilizaccedilatildeo (JUNIOR e OLIVATO
2004 SHIREY et al 2002)
135 TRATAMENTO DE HEMAacuteCIAS COM TDA POSITIVO
O TDA positivo impede a fenotipagem eritrocitaacutecia por meacutetodos que exigem a fase de
AGH uma vez que a aglutinaccedilatildeo ocorreraacute devido agrave interaccedilatildeo da AGH com o autoanticorpo
que sensibiliza a hemaacutecia do paciente levando a resultados falso positivos Em algumas
situaccedilotildees como na AHAI por anticorpo quente a fenotipagem eacute especialmente importante
pois o autoanticorpo interfere na triagem e identificaccedilatildeo de anticorpos assim como no teste de
compatibilidade e dificultam a detecccedilatildeo de aloanticorpos de significado cliacutenico que
obrigatoriamente devem ser respeitados Nessas situaccedilotildees a fenotipagem eritrocitaacuteria
determina o perfil antigecircnico do paciente e possibilita o fornecimento de unidades de
hemaacutecias com o mesmo fenoacutetipo para a transfusatildeo evitando a sensibilizaccedilatildeo para novos
antiacutegenos assim como reaccedilotildees hemoliacuteticas transfusionais No entanto eacute necessaacuterio aplicar
meacutetodos que natildeo sofram interferecircncia do TDA positivo ou seja meacutetodos que natildeo necessitem
da fase de AGH ou meacutetodos de bloqueio do anticorpo sem bloquear o antiacutegeno Uma opccedilatildeo eacute
a utilizaccedilatildeo de soros monoclonais IgM (salinos ou de meio proteico natildeo concentrado) mas
17
nem sempre esses reagentes estatildeo disponiacuteveis especialmente os reagentes monoclonais para
os antiacutegenos dos sistemas Duffy ( Fya Fy
b) Kidd ( Jk
a Jk
b) e MNS (S s) (JUNIOR e
OLIVATO 2004) Outra opccedilatildeo eacute a teacutecnica de bloqueio que pode ser utilizada para tratar
hemaacutecias para posterior fenotipagem em casos de TDA positivos com reatividade le2+
Em casos onde a positividade do TDA eacute maior que 2+ estaacute indicada a tratamento
quiacutemico para remoccedilatildeo da interferecircncia do autoanticorpo antes de realizar a fenotipagem Entre
as teacutecnicas utilizadas atualmente estatildeo o ZZAP a cloroquina e a glicina aacutecidaEDTA
1351 TEacuteCNICA DE BLOQUEIO
A teacutecnica de bloqueio se baseia na utilizaccedilatildeo de anti-IgG (Coombs monoespeciacutefico)
para tratar as hemaacutecias com TDA positivo O anticorpo anti-IgG se liga aos anticorpos que
estatildeo sensibilizando a hemaacutecias poreacutem sem o bloquear os antiacutegenos Os antiacutegenos que natildeo
estatildeo sensibilizados podem ser detectados atraveacutes dos antissoros especiacuteficos (SERERAT
VEIDT E DUTCHED 2000)
1352 TRATAMENTO DE HEMAacuteCIAS COM ZZAP
O Sulphydryl-Proteolytic Enzyme (ZZAP) que eacute uma mistura de ditiotreitol (DTT)
mais papaiacutena ativada com cisteiacutena eacute um reagente capaz de dissociar imunoglobulinas da
classe IgG ligadas a membrana dos eritroacutecitos enquanto trata enzimaticamente as hemaacutecias
O tratamento enzimaacutetico tambeacutem potencializa a ligaccedilatildeo do autoanticorpo ao antiacutegeno e
acelera o processo de autoadsorccedilatildeo O ZZAP pode desnaturar os antiacutegenos do sistema Duffy
MNS e Kell o que limita sua aplicaccedilatildeo para fins de fenotipagem (BRANCH e PETZ 1982)
1353 CLOROQUINA
Em 1982 Edwards Moulds e Judd propuseram a utilizaccedilatildeo da teacutecnica da cloroquina
que dissociava os complexos antiacutegeno-anticorpo e mantinha a membrana das hemaacutecias
iacutentegras Os derivados quinolecircicos jaacute haviam sido descritos anteriormente por Domokos e
Aszody em 1964 e Holtz Mantel e Buck em 1973 (apud Edwards Moulds e Judd 1982) pela
sua capacidade de separar imunocomplexos e inibir as reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo reduzindo
as cargas eleacutetricas das superfiacutecie das hemaacutecias A teacutecnica eacute uma das mais utilizadas nos
centros brasileiros para remover a interferecircncia do autoanticorpo e eacute tambeacutem a teacutecnica
atualmente adotada pelo laboratoacuterio de imunohematologia do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto
18
Edwards Moulds e Judd (1982) demonstraram que a teacutecnica da cloroquina para
dissociaccedilatildeo de anticorpos eacute uma teacutecnica simples efetiva e confiaacutevel para dissociar
imunoglobulina das hemaacutecias Desde que a membrana das hemaacutecias permaneccedila intacta natildeo
haacute perda da reatividade dos antiacutegenos e a sua maior aplicaccedilatildeo eacute a fenotipagem de hemaacutecias
com TDA positivo Os autores verificaram que em 83 das amostras sensibilizadas in vivo e
22 amostras (no total de 40) sensibilizadas ldquoin vitrordquo apresentaram TDA negativo e
puderam ser fenotipadas A teacutecnica poreacutem natildeo consegue remover os componentes do
complemento na maioria dos casos
Champagne e colaboradores (1999) testaram a teacutecnica da cloroquina para dissociar
antiacutegenos Bg comparando com a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA e verificaram vantagem em
relaccedilatildeo ao uso de um uacutenico reagente diminuindo a manipulaccedilatildeo e verificou que o mesmo natildeo
destroacutei antiacutegeno Kell
A cloroquina tambeacutem mostrou-se pouco efetivo em remover anticorpos do sistema
Duffy da superfiacutecie das hemaacutecias (EDWARDS MOUDS e JUDD 1982 ROZIERS e
SQUALI 1997)
1353 GLICINA-AacuteCIDAEDTA
A afinidade e a estabilidade entre a ligaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo eacute definida como a
resultante entre forccedilas atrativas e repulsivas entre ambos (CARUCIO e WISE 2012) e resulta
da somatoacuteria de forccedilas quiacutemicas dinacircmicas e fracas (natildeo covalentes) como pontes de
hidrogecircnio forcas eletrostaacuteticas forca de Van der Waals e pontes hidrofoacutebicas A estabilidade
dessa ligaccedilatildeo eacute facilmente abalada por alteraccedilotildees quiacutemicas e fiacutesicas no meio da reaccedilatildeo como
a alteraccedilatildeo do pH A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA se baseia na mudanccedila do pH para a
quebra da ligaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo (KOSANKE 2012)
A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA foi primeiramente descrita em 1986 por Louie Jieng
e Zeroulis que utilizaram 50 amostras de doadores sensibilizados ldquoin vitrordquo com anticorpos A
teacutecnica foi efetiva em 48 amostras permitindo o estudo do eluato assim como a fenotipagem
das hemaacutecias Os autores testaram tambeacutem a teacutecnica em 100 hemaacutecias TDA positivo que
puderam ser utilizadas para teacutecnicas de autoadsorccedilatildeo
Byrne (1991) descreveu a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA modificada e tambeacutem
verificou como uma opccedilatildeo para o tratamento de hemaacutecias com TDA positivo que deixava as
hemaacutecias intactas e o eluato viaacutevel para ser fenotipado
19
Roziers e Squali (1997) e Katharia e Chaudhary (2013) compararam a teacutecnica da
glicina-aacutecidaEDTA com as teacutecnicas da cloroquina e do aquecimento Verificaram maior
eficiecircncia da glicina-aacutecidaEDTA em relaccedilatildeo as outras duas teacutecnicas pois com uma mesma
quantidade de amostra produzia as hemaacutecias livres de anticorpo e tambeacutem o eluato Mostrou-
se ainda superior devido ao menor tempo exigido para sua realizaccedilatildeo o que favorece seu uso
em situaccedilotildees de urgecircncia e emergecircncia
As duas desvantagens da teacutecnica poreacutem eacute o fato de destruir os antiacutegenos do sistema
Kell e o fato de natildeo remover fraccedilotildees do complemento ligadas agrave hemaacutecia (PALLAS WILER e
McGEE 1991 ROZIERS e SQUALLI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012
e KATHARIA e CHAUNDHARY 2013)
20
2 OBJETIVOS
21 OBJETIVO GERAL
211 Avaliar a eficaacutecia da glicina-aacutecidaEDTA em remover os anticorpos ligados agraves
hemaacutecias sensibilizadas por anticorpos da classe IgG
22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
221 Preparaccedilatildeo dos reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
verificaccedilatildeo da estabilidade dos mesmos e avaliar custos
222 Testar a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA em amostras de hemaacutecias
sensibilizadas por anticorpos antieritrocitaacuterios humanos
223 Comparar a efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA com a teacutecnica da
cloroquina quanto a capacidade de remover a interferecircncia do anticorpo ligado
a hemaacutecia
224 Testar o eluato das amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA
225 Verificar se houve destruiccedilatildeo dos antiacutegenos eritrocitaacuterios apoacutes o tratamento
com glicina-aacutecidaEDTA e com cloroquina
226 Verificar se o tempo de execuccedilatildeo da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA descrito
nos textos de referecircncia eacute reprodutiacutevel
21
3 JUSTIFICATIVA
Algumas condiccedilotildees cliacutenicas podem levar ao depoacutesito ldquoin vivordquo de anticorpos eou
fraccedilotildees do complemento sobre as hemaacutecias Entre elas estatildeo as reaccedilotildees hemoliacuteticas poacutes-
transfusionais a doenccedila hemoliacutetica perinatal o uso de medicamentos e principalmente a
AHAI Na AHAI um anticorpo normalmente da classe IgG ou IgM reconhece antiacutegenos
proacuteprios na membrana eritrocitaacuteria e reduz a sobrevida da hemaacutecia levando a sua destruiccedilatildeo
pelos macroacutefagos no sistema reticulo-endotelial ou agrave ativaccedilatildeo do complexo de ataque agrave
membrana e agrave lise intravascular Os autoanticorpos satildeo voltados na maioria das vezes contra
antiacutegenos eritrocitaacuterios de alta frequecircncia populacional conhecidos como antiacutegenos puacuteblicos
e por este motivo reconhecem tanto hemaacutecias autoacutelogas quanto alogecircnicas
Devido agrave presenccedila do autoanticorpo livre no plasma e tambeacutem do anticorpo eou
complemento ligado agrave hemaacutecia o banco de sangue pode encontrar dificuldades em todas as
fases dos testes preacute-transfusionais do paciente com AHAI e deve utilizar teacutecnicas que
auxiliem na escolha do melhor hemocomponente melhorando a seguranccedila transfusional Essas
teacutecnicas visam remover a interferecircncia do autoanticorpo livre no soro e do autoanticorpo
ligado agrave hemaacutecia permitindo a detecccedilatildeo de aloanticorpos associados e a realizaccedilatildeo da
fenotipagem eritrocitaacuteria respectivamente
A finalizaccedilatildeo dos testes preacute-tranfusionais na presenccedila de autoanticorpo pode levar
algumas horas e nem sempre o paciente poderaacute aguardar Nesse contexto torna-se vantajosa a
aplicaccedilatildeo de teacutecnicas de raacutepida execuccedilatildeo
O presente estudo propotildee aplicar e avaliar a eficaacutecia da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
em remover os anticorpos ligados agrave hemaacutecia o que permite a fenotipagem eritrocitaacuteria
estendida e a seleccedilatildeo de concentrados de hemaacutecias com mesmo fenoacutetipo do paciente
Atualmente no Hemocentro de Ribeiratildeo Preto a teacutecnica utilizada para esse fim eacute o
tratamento das hemaacutecias com difosfato de cloroquina cujo tempo de execuccedilatildeo pode demorar
ateacute duas horas enquanto a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser realizada em apenas dois
minutos o que a tornaria opccedilatildeo de escolha especialmente em situaccedilotildees de urgecircncia Ao
contraacuterio da cloroquina a glicina-aacutecidaEDTA permite tambeacutem o estudo do eluato das
hemaacutecias tratadas
22
4 METODOL OGIA
41 AMOSTRAS DE DOADORES
Foram coletados 50 amostras de doadores de sangue que compareceram ao
Hemonuacutecleo de Araccedilatuba no periacuteodo de junho a agosto de 2016 Foram convidados a
participar da pesquisa doadores de repeticcedilatildeo do tipo sanguiacuteneo ldquoOrdquo RhD positivo
cadastrados no sistema de banco de sangue (SBS) do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto
Todos os doadores que concordaram em participar da pesquisa assinaram o termo de
consentimento livre e esclarecido (TCLE)
No momento da doaccedilatildeo foram coletados adicionalmente 5 mL de sangue total em
soluccedilatildeo anticoagulante EDTA (aacutecido dietilenoaminoaceacutetico) dispensando punccedilatildeo venosa
adicional para coleta da amostra O fluxograma 1 resume as etapas desenvolvidas no projeto
Fluxograma 1 - Fluxo da pesquisa utilizando as amostras de doadores
23
411 FENOTIPAGEM
Foram verificados se os doadores jaacute tinham fenotipagem para outros sistemas de
grupos sanguiacuteneos aleacutem do sistema ABORh que eacute realizado rotineiramente
A fenotipagem eritrocitaacuteria para outros sistemas ou fenotipagem estendida eacute realizada
para identificar a presenccedila ou ausecircncia de antiacutegenos considerados de importacircncia cliacutenica No
Hemonuacutecleo de Araccedilatuba uma parcela de doadores de repeticcedilatildeo satildeo fenotipados para os
antiacutegenos dos sistemas de grupo sanguiacuteneo Rh (antiacutegenos C c E e e) Kell (antiacutegeno K)
Duffy (antiacutegenos Fya e Fy
b) Kidd (antiacutegenos Jk
a e Jk
b) e sistema MNSs (antiacutegenos S e s)
A fenotipagem para o Rh e Kell eacute realizada por metodologia de microplaca utilizando
25 microL de hemaacutecia lavada e diluiacuteda a 5 em salina e 25 microL do antissoro comercial especiacutefico
A reaccedilatildeo eacute incubada 15 minutos a temperatura ambiente e centrifugadas para leitura Para os
antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s a metolodogia utilizado eacute gel contendo antiglobulina
humana (gel LissCoombs poliespeciacutefico) da marca BIO-RAD onde se utiliza suspensatildeo de
hemaacutecia em LISS (Soluccedilatildeo de baixa forccedila iocircnica) A suspensatildeo eacute preparada atraveacutes da
diluiccedilatildeo de 10 microL de hemaacutecia em 1000 microL de LISS Pipetado 50 microL dessa diluiccedilatildeo no gel e
adicionado 25 microL do antissoro especiacutefico Incuba-se em banho seco por 15 minutos a 37 deg
Celsius e eacute centrifugado em centriacutefuga especiacutefica Os antissoros utilizados eram das marcas
Fresenius e Lorne
Foi verificado a fenotipagem do doador no banco de dados do Hemocentro Os
registros dos fenoacutetipos dos doadores ficam armazenadas no sistema de banco de sangue
(SBS) Para doadores que natildeo tinham fenotipagem estendida preacutevia para antiacutegenos do sistema
Rh (C c E e e) e Kell (K) foi realizada a fenotipagem para esses antiacutegenos
O tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA e cloroquina para dissociar
anticorpos pode inativar enfraquecer ou destruir os antiacutegenos presentes nas hemaacutecias
alterando assim os resultados da fenotipagem Para verificar se houve destruiccedilatildeo dos
antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a e Jk
b S e s nas amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes
tratamento foram novamente fenotipadas ao final para os antiacutegenos que eram inicialmente
positivas
A repeticcedilatildeo da fenotipagem foi realizada nas amostras que apresentaram efetividade
no tratamento da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eou da cloroquina e a detecccedilatildeo do antiacutegeno
na amostra preacute-tratamento
24
412 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS HEMAacuteCIAS
As hemaacutecias foram sensibilizadas com antissoros policlonais humanos de amostras de
plasma fresco congelado de doadores com resultado de pesquisa de anticorpo irregular
positivos
A escolha do anticorpo para sensibilizar as hemaacutecias foi definida de acordo com o
fenoacutetipo do doador que deveria ser positivo para o respectivo antiacutegeno
Para a sensibilizaccedilatildeo um volume de antissoro (1 mL) e um volume (1 mL) de
hemaacutecias lavadas quatro vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica foram adicionadas a um tubo de 12 x
75 mm A mistura foi homogeneizada e incubada em banho maria (BM) a 37deg C por 60
minutos A seguir as hemaacutecias foram novamente lavadas 4 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica
para retirada dos anticorpos que natildeo se ligaram A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada
como controle negativo O teste da uacuteltima lavagem eacute importante para assegurar que os
anticorpos que poderatildeo ser detectados no eluato apoacutes o tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA
sejam aqueles que estavam ligados agraves hemaacutecias e natildeo aqueles livres no plasma O controle
negativo mostra que todo o anticorpo livre foi retirado (LEGER 2011)
Para o teste de presenccedila de anticorpo na soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foram incubadas
com hemaacutecias de triagem de anticorpos irregulares (ID-Diacell BIO-RAD) contendo os
antiacutegenos especiacuteficos Realizado a teacutecnica em gel LissCoombs com anti-IgG+C3d Incubado
no tempo de 15 minutos a temperatura de 37deg C e centrifugado 10 minutos em centriacutefuga
proacutepria
As 50 amostras de doadores foram sensibilizadas com os anticorpos policlonais
humanos
Apoacutes sensibilizadas rdquoin vitrordquo e lavadas as hemaacutecias foram diluiacutedas em soluccedilatildeo de
baixa forccedila iocircnica (LISS) na quantidade de 10 microL de hemaacutecia para 1000 microL de soluccedilatildeo A
suspensatildeo foi pipetada (50 microL) em coluna-gel-teste LissCoombs (BIO-RAD) que contecircm
antiglobulina poliespeciacutefico (IgG+C3d) e centrifugada em baixa rotaccedilatildeo conforme orientaccedilatildeo
do fabricante durante 10 minutos
As amostras deveriam apresentar aglutinaccedilatildeo com reatividade 3 a 4+ no TDA As
amostras que apresentaram reaccedilatildeo menor que 3+ foram novamente sensibilizadas com nova
aliacutequota do antissoro
25
413 TRATAMENTO DAS AMOSTRAS
As amostras sensibilizadas apresentando o TDA positivo 3 ou 4+ foram divididas em
duas aliacutequotas e submetidas a duas teacutecnicas diferentes com o objetivo de dissociar o anticorpo
ligado Uma aliacutequota da amostra foi tratada com soluccedilatildeo de difosfato de cloroquina enquanto
a outra aliacutequota foi tratada com glicina-aacutecidaEDTA
42 PREPARO DA GLICINA AacuteCIDA-EDTA
A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA utiliza 3 soluccedilotildees diferentes a glicina aacutecida o
EDTA e o tampatildeo TRIS
Os reagentes foram preparados utilizando os sais para anaacutelise (PA) de EDTA
(Na2EDTA2H2O) TRIS (C4H11NO3) Glicina (H2NCH2CO2H) NaCl e a soluccedilatildeo de aacutecido
cloriacutedrico (HCl) 12 N todos reagentes da marca SYNTH (quadro 1)
Para o preparo do tampatildeo glicina-acida eacute necessaacuterio o ajuste do pH para 15 Para esse
ajuste utiliza-se aacutecido cloriacutedrico (HCl) concentrado O pH foi medido com fitas reativas de pH
com escala de 1 a 14 da marca MERCK Posteriormente a soluccedilatildeo foi enviada ao laboratoacuterio
de controle de qualidade do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto e o pH medido no peagacircmetro O
tampatildeo glicina-aacutecida foi armazenado a 4deg e o tampatildeo tris e o EDTA em temperatura ambiente
controlada (20 a 24deg Celsius)
Apoacutes o preparo e durante a realizaccedilatildeo dos testes foram feitas inspeccedilotildees visuais para
verificaccedilatildeo de turvaccedilatildeo do meio e presenccedila de precipitados
Reagente Material Quantidade Preparo e
Conservaccedilatildeo
EDTA
EDTA
(Na2EDTA2H2O)
5 gramas Mistura ateacute
dissoluccedilatildeo do sal e
conserva em
temperatura ambiente Aacutegua Destilada 50 Ml
Tris
TRIS (C4H11NO3) 121 gramas Conservar em
temperatura ambiente NaCl 525g
Aacutegua destilada 100ml
Gliacutecina-aacutecida
Glicina
(H2NCH2CO2H) 15 gramas
Conservar a 4oC NaCl 116gramas
Aacutegua Destilada 200ml
HCL 12N Ajutar o pH para 15
Quadro 1 - Preparo dos Reagentes da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
Fonte - Manual teacutecnico AABB 2011
26
O tampatildeo glicina-aacutecida e o tampatildeo TRIS satildeo estaacuteveis por 7 meses O reagente EDTA
precipitou mesmo estando em temperatura em ambiente controlado Houve necessidade de
preparo de novo reagente
421 TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
1 Em um tubo de ensaio 12x75 mm eacute adicionado 08 mL da soluccedilatildeo de glicina-aacutecida A
esta soluccedilatildeo adiciona-se 02 mL de EDTA e mistura
2 Adiciona-se 02 mL de hemaacutecias sensibilizadas (lavada 4 vezes) A mistura eacute
homogeneizada e incubada por exatamente 2 minutos
3 A seguir 01 mL de tampatildeo TRIS eacute adicionado agrave mistura que eacute novamente
homogeneizada e centrifugada por 2 minutos a 3400 rpm O pH deve estar entre 7 a 75
4 Apoacutes centrifugaccedilatildeo separa-se em outro tubo o sobrenadante (eluato) e as hemaacutecias
que permanecem satildeo lavadas 4 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica para retirada de todo o
reagente e anticorpos livres
43 PREPARO DA CLOROQUINA
A cloroquina eacute diluiacuteda em tampatildeo PBS na concentraccedilatildeo de 20 (Quadro 2) e
armazenado a 4deg Celsius sua validade apoacutes o preparo eacute de 1 mecircs
A teacutecnica da cloroquina jaacute estaacute padronizada para rotina do laboratoacuterio de
imunohematologia do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto e suas unidades
Reagente Reagentes Quantidade PreparoConservaccedilatildeo
Cloroquina
Difosfato de cloroquina
(C18H32ClN3O8P2)
20 gramas
Conservar a 4deg Celsius
Tampatildeo PBS 100ml
NaOH 01 N Acertar o pH para
51
Quadro 2 - Preparo da Cloroquina Fonte - Manual teacutecnico da AABB 2011
431 TEacuteCNICA DA CLOROQUINA
1 4 partes da soluccedilatildeo pronta eacute adicionada a uma parte de hemaacutecias lavadas 4 vezes com
soluccedilatildeo fisioloacutegica
2 A mistura eacute incubada em temperatura ambiente por ateacute duas horas
3 Centrifugar a 3400 rpm por 2 minutos
27
4 Remover o sobrenadante lavar as hemaacutecias novamente com soluccedilatildeo fisioloacutegica 4
vezes
44 VERIFICACcedilAtildeO DA EFETIVIDADE DOS TESTES
Apoacutes tratamento pelas duas teacutecnicas o TDA foi repetido em todas as amostras para
verificar se os tratamentos foram efetivos e houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo Para as
amostras tratadas pela teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA que permaneceram com TDA positivo
novo tratamento foi realizado
45 TESTE DO ELUATO
O eluato resultante das amostras tratadas com glicina-acidaEDTA foi testado com
hemaacutecias de triagem A soluccedilatildeo do eluato foi incubada com as hemaacutecias de triagem de
anticorpos (ID-Diacell BIO-RAD) pela teacutecnica em gel LissCoombs O teste foi incubado 15
minutos a 37deg Celsius e centrifugado por 10 minutos em centrifuga proacutepria para a teacutecnica em
gel Os eluatos que apresentaram resultados positivos foram testados em painel de 11
hemaacutecias (ID-Diapanel BIO-RAD) para a identificaccedilatildeo do anticorpo
46 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente que apresentou TDA positivo por IgG e pesquisa
de anticorpo irregular positivo com presenccedila de autoanticorpo com reatividade panaglutinina
A amostra foi tratada em paralelo pelas duas teacutecnicas descritas e foi enviada para o
Hemocentro para genotipagem eritrocitaacuteria que foi realizado por metodologia PCR em tempo
real no equipamento Real-time system PCR 7500 ( Applied Biosystems Califoacuternia EUA)
28
5 RESULTADOS
51 REAGENTES
Para aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA satildeo necessaacuterios 3 diferentes
reagentes que podem ser encontrados em forma de kit pronto para uso No entanto esses kits
natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil Os reagentes satildeo tampatildeo glicina-aacutecida o EDTA e o tampatildeo
Tris
Todos os reagentes foram preparados rdquoin houserdquo a partir dos sais e soluccedilotildees PA (puro
para anaacutelise) da marca SYNTH que foram adquiridos para a pesquisa O custo estimado para
cada teste foi aproximadamente R$ 020 reais
Apoacutes o preparo os reagentes poderiam ser armazenados em condiccedilotildees adequadas pelo
periacuteodo de 1 ano (AABB 2011) Ao final do preparo e durante o periacuteodo de armazenamento
de fevereiro a setembro de 2016 foi realizada inspeccedilatildeo visual para verificar a presenccedila de
precipitados ou turvaccedilatildeo A soluccedilatildeo de glicina e o tampatildeo TRIS mostraram-se estaacuteveis ateacute o
final do periacuteodo Por sua vez o reagente EDTA precipitou mesmo estando armazenado em
temperatura ambiente controlada e foi necessaacuterio novo preparo
52 AMOSTRAS DE DOADORES
521 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS AMOSTRAS
Apoacutes incubaccedilatildeo da hemaacutecia com o antissoro a mesma foi lavada 4 vezes para retirada
dos anticorpos livres A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada Caso houvesse positividade na
soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem a etapa era repetida (figura 3) Das 50 amostras sensibilizadas a
uacuteltima lavagem foi positiva somente em 3 delas Nas 3 amostras o anticorpo utilizado para
sensibilizaccedilatildeo foi o anti-K Apoacutes repetido nova etapa de lavagem os resultados se
apresentaram negativos
Em todas as amostras sensibilizadas ldquoin vitrordquo o TDA foi testado e verificado a
intensidade do teste Entre as 50 amostras 47 alcanccedilaram TDA com intensidade 3-4+ apoacutes a
primeira sensibilizaccedilatildeo enquanto 3 amostras necessitaram uma segunda incubaccedilatildeo com
anticorpo (figura 4)
A escolha dos anticorpos para sensibilizar as hemaacutecias foi feita de acordo com o
fenoacutetipo do doador e foram utilizados sete diferentes especificidades de anticorpos policlonais
humanos conforme mostra o graacutefico1
29
Figura 3 - Soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada com hemaacutecia de triagem de
anticorpos em gel LissCoombs (BIO-RAD) A finalidade eacute verificar a presenccedila de anticorpos livres na
suspensatildeo que possam interferir na pesquisa do eluato As soluccedilotildees de lavagem das amostras na figura a tiveram
resultados negativos Na figura b duas amostras a 47 e 50 apresentaram resultado positivo Nova etapa de
lavagem foi realizada e o resultado final foi negativo
522 TRATAMENTO DAS HEMAacuteCIAS
Apoacutes a sensibilizaccedilatildeo e obtenccedilatildeo de resultados de TDA com intensidade de 3 a 4+
cada uma das amostras foi dividida em duas aliacutequotas e tratada separadamente pelas teacutecnicas
de glicinaaacutecida-EDTA e cloroquina
As teacutecnicas foram consideradas efetivas quando obteve-se a completa dissociaccedilatildeo do
anticorpo verificada atraveacutes do TDA negativo na amostra poacutes tratamento conforme figuras 5
e 6 Dentre as amostras tratadas com cloroquina 2850 tiveram o TDA negativado A glicina-
aacutecidaEDTA negativou o TDA em 33 das 50 amostras tratadas Apenas 17 amostras tratadas
com glicina-aacutecidaEDTA permaneceram com o TDA positivo e foram submetidas a um novo
tratamento
30
Figura 4 - TDA das amostras apoacutes sensibilizaccedilatildeo com anticorpos policlonais humanos Amostras na
figura a com intensidades de 3-4+ Na figura b amostras 4 e 7 com intensidade menor que 3+ e portanto foram
novamente sensibilizadas com nova aliacutequota de soro Anti-D e anti-S Apoacutes a segunda sensibilizaccedilatildeo
apresentaram reatividade 4 e 3+ respectivamente Os anticorpos utilizados para sensibilizaccedilatildeo foram D S c E
C e K
523 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS TEacuteCNICAS
No tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA houve dissociaccedilatildeo completa do anticorpo
em 33 amostras (66) das 50 amostras testadas enquanto que com a cloroquina foram 28
amostras (56) (tabela 1)
31
Graacutefico 1- Nuacutemero de amostras sesnsibilizadas por especificidade de anticorpo Entre as 50 amostras 12
foram sensibilizadas com anti-D 10 com anti-C 9 com anti-E 8 com anti-c 7 com anti-S 3 com anti-K e 1
com anti-Dia As especificidades dos anticorpos foram definidas de acordo o fenoacutetipo do doador
Figura 5 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com cloroquina Nas amostras onde houve
a dissociaccedilatildeo do anticorpo ( 2 21 a 23 26 39 a 42 45 46 e 49) a hemaacutecia se deposita no fundo no microtubo
apoacutes a centrifugaccedilatildeo (TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (1 3 24 25 43 44 47
48 e 50) o anticorpo ligado agraves hemaacutecias eacute alvo da AGH presente no gel (TDA positivo)
Anti-D 12
Anti-C 10
Anti-E 9
Anti-c 8
Anti-S 7
Anti-K 3 Anti-Dia 1
32
Figura 6 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA Nas amostras
onde houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo (4 6 7 12 a 15 17 34 35 37 e 38) a hemaacutecia se deposita no fundo no
microtubo apoacutes a centrifugaccedilatildeo ( TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (5 16 18
19 20 33 e 36 ) o AGH presente no gel se liga ao anticorpo ligado agraves hemaacutecias que ficam retidas no gel (TDA
positivo)
Tabela 1-Resultado geral do tratamento das hemaacutecias com glicina e cloroquina
Teacutecnica utilizada TDA negativo TDA positivo Total
Glicina-aacutecidaEDTA 33 17 50
Cloroquina 28 22 50
A glicina-aacutecidaEDTA conseguiu negativar mais amostras sensibilizadas com Anti-D
e anti-K que a cloroquina Para as hemaacutecias sensibilizadas com anti-E Anti-S e Anti-Dia
ambas as teacutecnicas dissociaram o anticorpo em 100 das amostras Os resultados detalhados
por especificidade do anticorpo apoacutes o primeiro tratamento com glicina-aacutecidaEDTA e com
cloroquina estatildeo na tabela 2
Para as amostras que permaneceram positivas (17 amostras) apoacutes o tratamento com a
glicina-aacutecidaEDTA foi realizado um novo tratamento Houve dissociaccedilatildeo do anticorpo em 3
amostras (18) apoacutes a segunda tentativa Nas demais 14 (82) amostras tratadas pela
segunda vez 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise
33
Tabela 2 - Resultados do TDA apoacutes tratamento das hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo
sensibilizado
ANTICORPOS
SENSIBILIZADOS
1ordm TRATAMENTO COM
GLICINA
TRATAMENTO COM
CLOROQUINA
TOTAL TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
Anti-D 8 4 0 12 12
Anti-C 6 4 10 0 10
Anti-E 9 0 9 0 9
Anti-c 0 8 1 7 8
Anti-S 7 0 7 0 7
Anti-K 2 1 0 3 3
Anti-Dia 1 0 1 0 1
TOTAL 33 17 28 22 50
A hemoacutelise foi verificada durante o procedimento de lavagem final das hemaacutecias com
soluccedilatildeo fisioloacutegica para a retirada dos reagentes As soluccedilotildees de lavagem ficaram
avermelhadas e as hemaacutecias com coloraccedilatildeo escura As amostras foram descartadas Dentre as
6 amostras que ainda puderam ser testadas para o TDA trecircs amostras negativaram sendo 1
sensibilizada com anti-D e 2 com anti-C (tabela 3)
Tabela 3 - Resultado apoacutes o segundo tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA
Tratamento com
glicina-aacutecidaEDTA
TDA Negativo TDA Positvo Hemoacutelise Total
Segundo tratamento 3 3 11 17
524 TESTAGEM DO ELUATO
Apoacutes o tratamento com a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA a soluccedilatildeo do eluato foi
testada para verificar a viabilidade dos anticorpos que foram dissociados ou eluiacutedos Dentre
as 50 amostras 41 apresentaram eluato positivo As nove amostras cujos eluatos foram
negativos haviam sido sensibilizadas com as seguintes especificidades de anticorpos anti-E 6
amostras (67) anti-S 2 amostras (40) e anti-D 1 amostra (8) (tabela 4) O eluato de
todas as amostras sensibilizadas com os anticorpos anti-C anti-c Anti-K e Anti-Dia foram
positivos Os eluatos positivos na triagem de anticorpos foram testados com paineacuteis de
identificaccedilatildeo para confirmar a especificidade e a viabilidade dos anticorpos (figuras 7 e 8)
34
525 EFEITO DA ELUICcedilAtildeO SOBRE OS ANTIacuteGENOS ERITROCITAacuteRIOS
Para verificar o efeito do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA e com a cloroquina
sobre a expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s foi realizada a fenotipagem das
amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes tratamento com ambas as teacutecnicas Foi avaliado
se o tratamento destruiu os antiacutegenos expressos antes do tratamento
Tabela 4- Resultado do Eluato das amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA
Anticorpos Eluato positvo Eluato negativo Total
Anti-D 11 1 12
Anti-C 10 0 10
Anti-E 3 6 9
Anti-c 8 0 8
Anti-S 5 2 7
Anti-K 3 0 3
Anti-Dia 1 0 1
Total 41 9 50
Figura 7 ndash Painel do eluato da amostra 21 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-C que foi
recuperado no eluato
Figura 8 ndash Painel do eluato da amostra 47 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-K que foi
recuperado no eluato
35
Dentre as 50 amostras 26 eram previamente fenotipadas para os antiacutegenos Fya Fy
b
Jka Jk
b S e s Dentre elas 20 alcanccedilaram TDA negativo apoacutes tratamento com a glicina-
aacutecidaEDTA e 20 negativaram apoacutes tratamento com cloroquina (tabela 5) Apoacutes ambas as
teacutecnicas os antiacutegenos originalmente expressos permaneceram positivos comprovando que natildeo
houve destruiccedilatildeo dos mesmos
Tabela 5 ndash Verificaccedilatildeo da interferecircncia do tratamento da hemaacutecias com cloroquina e glicina-
aacuteicdaEDTA sobre os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
AMOSTRAS
COM
FENOTIPAGEM
PREacuteVIA
TRATADAS COM
CLOROQUINA
TRATADAS COM
GLICINA
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
26
20
20
20
20
As amostras 24 47 e 50 eram positivas para o antiacutegeno K A cloroquina natildeo dissociou
o anticorpo em nenhuma das 3 amostras enquanto a glicina-aacutecidaEDTA foi efetiva nas
amostras 24 e 50 Foi testada a expressatildeo do antiacutegeno K nas amostras 24 e 50 apoacutes o
tratamento utilizando meacutetodo indireto em gel contendo AGH Apesar de natildeo ter sido avaliado
a intensidade de reaccedilatildeo de expressatildeo dos antiacutegenos podemos verificar na figura 9 que nas
duas amostras em que a teacutecnica foi efetiva e dissociou o anticorpo a expressatildeo do antiacutegeno K
continua presente mas a reatividade observada pode ser considerada 1+ sugerindo que houve
diminuiccedilatildeo da expressatildeo do antiacutegeno quando comparado com a expressatildeo observada em
hemaacutecia natildeo tratada
Os resultados individuais de cada amostra em ambas as teacutecnicas encontram-se
resumidas na tabela 6
526 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente onde foi constatada a presenccedila de autoanticorpo
a quente da classe IgG pelo TDA monoespeciacutefico (figura 10)O autoanticorpo tambeacutem
interferia na pesquisa e identificaccedilatildeo de anticorpos irregulares pois apresentava caracteriacutestica
de panaglutinina As hemaacutecias da paciente sensibilizadas ldquoin vivordquo foram tratadas com
cloroquina e com glicina-aacutecidaEDTA
36
Figura 9 ndash Fenotipagem das amostras 24 e 50 para antiacutegeno K apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
O teste positivo indica a presenccedila do antiacutegeno poreacutem a reatividade fraca (1+) sugere que houve enfraquecimento
de sua expressatildeo A direita a expressatildeo forte (4+) do antiacutegeno Kell em hemaacutecia controle natildeo tratada utilizada
como controle positivo
A cloroquina natildeo foi efetiva na retirada do anticorpo ligado as hemaacutecias ao contraacuterio
do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA que dissociou o anticorpo (figura 11)
A hemaacutecia tratada com glicina foi fenotipada para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
(figura 12) A fenotipagem para o sistema Rh (C c E e e) e Kell foi realizada em gel
especiacutefico monoclonal sem interferecircncia do TDA positivo (controle da reaccedilatildeo negativo)
O eluato resultante do tratamento com glicina-aacutecidaEDTA foi testada em gel com
hemaacutecias de painel de identificaccedilatildeo de anticorpos e apresentou resultado positivo com todas
as ceacutelulas (figura 13 e 14)
A amostra foi enviada para genotipagem e o resultado da genotipagem confirmou o
resultado da fenotipagem apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
527 TEMPO DE EXECUCcedilAtildeO DA TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
O tempo de reaccedilatildeo da glicina-aacutecidaEDTA eacute de 2 minutos Todas as amostras foram
tratadas obedecendo ao tempo descrito na literatura demonstrando que o mesmo eacute
reprodutiacutevel
37
Tabela 6- Resultados individuais por amostra
Amostra Especificidade
dos anticorpos
Intensidade do
TDA apoacutes
sensibilizaccedilatildeo
Tratamento
efetivo com
cloroquina
Tratamento
efetivo com
glicina
Eluato
poacutes
glicina
1 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 2 Dia 3+ Sim Sim 3+ 3 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 4 D 4+ Natildeo Sim 4+ 5 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 6 E 3+ Sim Sim Negativo 7 S 4+ Sim Sim 3+ 8 E 3+ Sim Sim 1+ 9 E 3+ Sim Sim 2+
10 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 11 D 4+ Natildeo Sim 4+ 12 D 4+ Natildeo Sim 4+ 13 S 3+ Sim Sim 3+ 14 S 3+ Sim Sim 3+ 15 D 3+ Natildeo Sim 3+ 16 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 17 E 3+ Sim Sim (+) 18 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 19 D 4+ Natildeo Natildeo 3+ 20 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 21 C 3+ Sim Sim 4+ 22 C 3+ Sim Sim 4+ 23 C 3+ Sim Sim 4+ 24 K 4+ Natildeo Sim 4+ 25 D 3+ Natildeo Natildeo Negativo 26 E 4+ Sim Sim Negativo 27 S 3+ Sim Sim 3+ 28 C 3+ Sim Natildeo 4+ 29 C 3+ Sim Sim 4+ 30 C 3+ Sim Sim 4+ 31 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 32 E 3+ Sim Sim Negativo 33 C 3+ Sim Natildeo 4+ 34 S 3+ Sim Sim Negativo 35 S 3+ Sim Sim Negativo 36 C 4+ Sim Natildeo 4+ 37 c 4+ Natildeo Natildeo 4+ 38 D 4+ Natildeo Sim 4+ 39 S 3+ Sim Sim 3+ 40 c 4+ Sim Natildeo 2+ 41 C 4+ Sim Natildeo 4+ 42 E 3+ Sim Sim Negativo 43 D 3+ Natildeo Sim 2+ 44 D 3+ Natildeo Sim 2+ 45 E 3+ Sim Sim Negativo 46 C 3+ Sim Sim 4+ 47 K 4+ Natildeo Natildeo 4+ 48 D 3+ Natildeo Sim 2+ 49 E 3+ Sim Sim Negativo 50 K 4+ Natildeo Sim 4+
TOTAL 50 28 33 41
38
Figura 10 ndash TDA monoespeciacutefico da amostra de paciente Hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo da classe
IgG
oacute Figura 11 ndash TDA apoacutes o tratamento com glicina-aacutecidaEDTA (esquerda) e cloroquina (direita) A glicina
negativou completamente o TDA enquanto a hemaacutecia tratada com cloroquina persistiu positiva (1+)
39
Figura 12 ndash Fenotipagem da amostra tratada com glicina-aacutecidaEDTA Fy(a+b+) Jk(a-b+) S+s+
Figura 13 ndash Painel em gel (LissAGH) do eluato apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de
intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
Figura 14 ndash ndash Painel ezimaacutetico (hemaacutecias tratadas com bromelina) do eluato em gel neutro apoacutes
tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
40
528 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Quanto a efetividade das teacutecnicas em negativar o TDA foi verificado que a glicina-
aacutecidaEDTA foi efetiva em 66 das amostras testadas no primeiro tratamento (3350
amostras) enquanto a cloroquina conseguiu negativar 56 (2850) Esses resultados natildeo
apresentam diferenccedila significativa (pgt005) demostrando que a teacutecnica da glicina-
aacutecidaEDTA natildeo eacute superior mas eacute tatildeo efetiva quanto a da cloroquina
Quando aliamos os resultados de ambas as teacutecnicas verificamos que em 76 (3850)
das amostras o TDA foi negativado Esse dado indica que ainda que uma teacutecnica natildeo seja
eficaz na remoccedilatildeo do anticorpo eacute uma boa alternativa tentar a segunda teacutecnica jaacute que a falha
em remover o anticorpo utilizando uma delas natildeo prevecirc necessariamente a falha com a outra
Quando se utiliza o teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla (graacutefico 2) para comparar a utilizaccedilatildeo das
duas teacutecnicas com o resultado de cada uma isolada (somente a cloroquina ou somente a
glicina) verificamos que os resultados apresentam diferenccedila significativa (plt005) (quadro 3)
TRATAMENTO EFETIVO COM TOTAL PORCENTAGEM
Glicina ou cloroquina 38 76
Glicina e cloroquina 23 46
Glicina apenas 10 20
Cloroquina apenas 5 10
Nenhuma das teacutecnicas 12 24
Quadro 3 - Resultados comparativos entre as teacutecnicas utilizadas
41
Graacutefico 2 - Teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla entre as teacutecnicas aplicadas A- Glicina e Cloroquina B-Cloroquina C-
Glicina ( plt005)
42
6 DISCUSSAtildeO
Os reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA podem ser adquiridos em
forma de kit comercial prontos para uso poreacutem natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil A preparaccedilatildeo
dos reagentes ldquoin houserdquo a partir de sais comerciais adquiridos se mostrou viaacutevel Os
reagentes glicina e o tampatildeo Tris armazenados de forma correta se mantiveram estaacuteveis por
um periacuteodo de 7 meses Somente o reagente EDTA precipitou mesmo armazenado em
condiccedilotildees adequadas sugerindo que o mesmo deve ser preparado em menor quantidade e
armazenado em aliacutequotas A soluccedilatildeo de cloroquina tambeacutem pode ser preparada ldquoin houserdquo e
pode ser armazenado por um mecircs A legislaccedilatildeo brasileira autoriza a utilizaccedilatildeo de reagentes
preparados a partir de sais comerciais como a cloroquina e a glicina-aacutecidaEDTA desde que
os sais tenham autorizaccedilatildeo da vigilacircncia sanitaacuteria para a comercializaccedilatildeo (BRASIL 2001)
A comparaccedilatildeo quanto a efetividade em dissociar anticorpos em amostras com TDA
positivos entre a teacutecnica da glicina e a teacutecnica da cloroquina mostrou que natildeo haacute diferenccedila
estatiacutestica entre elas e que ambas satildeo igualmente eficientes Se utilizadas conjuntamente haacute
maior possibilidade de elucidaccedilatildeo dos casos
Uma vantagem da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eacute que ela permite numa mesma
amostra eluir o anticorpo ligado aacute hemaacutecia assim como fenotipar a hemaacutecia tratada Devido a
sua dupla utilidade a teacutecnica eacute vantajosa principalmente em pacientes em que pouco volume
de amostra pode ser coletado como em casos de crianccedilas e receacutem-nascidos
A fenotipagem poacutes tratamento se mostrou viaacutevel jaacute que os antiacutegenos de maior
importacircncia natildeo sofreram alteraccedilotildees Nas 20 amostras que foram fenotipadas antes e apoacutes
tratamento para verificar a influecircncia dos reagentes na expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a
Jkb S e s natildeo houve destruiccedilatildeo dos mesmos por nenhuma das duas teacutecnicas
Para as amostras positivas para o antiacutegeno Kell (350) e sensibilizadas com o
respectivo anticorpo a teacutecnica da glicina foi efetiva em negativar o TDA em apenas duas
delas mas apoacutes o tratamento foi verificada uma fraca reatividade da reaccedilatildeo antiacutegeno-
anticorpo sugerindo que houve um enfraquecimento da expressatildeo do antiacutegeno conforme
esperado e descrito na literatura (BYRNE 1991 PALLAS WILER E MCGEE 1991
ROZIERS e SQUALI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012 e KATHARIA e
CHAUDHARY 2013) A accedilatildeo da glicina sobre o antigeno Kell natildeo representa impedimento
para seu uso uma vez que na impossibilidade de testar o antiacutegeno Kell o banco de sangue
consegue facilmente atender a solicitaccedilatildeo de transfusatildeo com unidades de hemaacutecias Kell
43
negativas jaacute que eacute um antiacutegeno de baixa prevalecircncia na populaccedilatildeo variando de 15 na
populaccedilatildeo africana a 9 nos europeus (DANIELS 2011)
A soluccedilatildeo resultante da dissociaccedilatildeo do anticorpo pela teacutecnica da glicina pode ainda ser
utilizada como eluato podendo substituir a teacutecnica de eluiccedilatildeo com reagentes comercias (kits
de eluiccedilatildeo aacutecida) que tem alto custo aproximadamente entre R$2000 a R$2500 por teste
Em 41 amostras (82) houve a dissociaccedilatildeo e recuperaccedilatildeo do anticorpo que estava
sensibilizando as hemaacutecias Em 9 amostras (18) os anticorpos foram eluiacutedos poreacutem
apresentaram reaccedilatildeo negativa quando testadas com hemaacutecias de triagem entre eles o anti-E
(6) anti-S (2) e Anti-D (1) Eacute possiacutevel que a correccedilatildeo pH do meio (WALKER 2011) natildeo
tenha sido adequada o que pode ter desfavorecido a reatividade do anticorpo
Para as amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA nas quais natildeo houve dissociaccedilatildeo do
anticorpo pelo primeiro tratamento (1750) o segundo tratamento natildeo se mostrou eficaz jaacute
que 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise O tempo de
armazenagem natildeo parece ter influenciado jaacute que todas as amostras foram testadas dentro de
48 horas apoacutes a coleta Outros fatores que natildeo foram verificados podem ter levado a
hemoacutelise Apesar da literatura (LOUIE JIENG e ZEROULIS 1986 e BYRNE 1991)
recomendar um segundo tratamento ele eacute pouco eficaz tendo negativado apenas 3 das 17
amostras testadas
A amostra de paciente que apresentou sensibilizaccedilatildeo ldquoin vivordquo mostrou melhor
efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA sobre a da cloroquina possibilitando
fenotipagem para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s que natildeo foram destruiacutedos apoacutes o
tratamento comprovado atraveacutes da genotipagem
A presenccedila de autoanticorpo a quente com presenccedila de hemoacutelise (AHAI) ou natildeo pode
mascarar a presenccedila de aloanticorpo interferindo na rotina soroloacutegica da fenotipagem que eacute
uma importante ferramenta para auxiliar na seleccedilatildeo de hemaacutecias para transfusatildeo (SHIREY et
al 2002) Esses pacientes frequentemente possuem aloanticorpos associados ao
autoanticorpo e a prevalecircncia de aloimunizaccedilatildeo entre eles varia entre 12 a 40 (LEGER e
GARRATY 1999 BRANCH e PETZ 1999) o que dificulta ainda mais a escolha do melhor
componente a ser transfundido aleacutem de aumentar a possibilidade reaccedilotildees hemoliacuteticas imunes
poacutes-transfusionais
Nesses casos as teacutecnicas de dissociaccedilatildeo de anticorpos satildeo importantes para tratar
amostras de pacientes e a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser usada como uma opccedilatildeo
pois se mostrou eficaz na dissociaccedilatildeo anticorpo ligado agraves hemaacutecias deixando livre a
superfiacutecie das mesmas permitindo a fenotipagem por antisoros IgG Paralelamente os
44
anticorpos eluiacutedos tambeacutem puderam ser estudados O mesmo natildeo ocorre com a cloroquina
que permite apenas a fenotipagem e tampouco com os kits de eluiccedilatildeo aacutecida disponiacuteveis no
mercado nacional que satildeo destinados a realizaccedilatildeo do eluato mas destroem as hemaacutecias
O tempo de tratamento na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA tambeacutem eacute uma vantagem
pois foi possiacutevel reproduzir no tempo determinado de 2 minutos enquanto a cloroquina
demora ateacute duas horas
Ainda que a aplicaccedilatildeo das teacutecnicas por biologia molecular estejam cada vez mais
presentes na rotina imuno-hematoloacutegica e possibilitam estabelecer o fenoacutetipo deduzido do
genoacutetipo elas natildeo estatildeo disponiacuteveis na maioria dos centros e sua realizaccedilatildeo exige algumas
horas A resoluccedilatildeo imediata do problema transfusional necessita dos resultados soroloacutegicos
pois com frequecircncia natildeo eacute possiacutevel aguardar o resultado do teste molecular Dessa forma
apesar da crescente importacircncia da genotipagem eritrocitaacuteria teacutecnicas soroloacutegicas aplicadas
corretamente e no momento propiacutecio satildeo de grande utilidade para resolver problemas imuno-
hematoloacutegicos como ocorre com a fenotipagem em pacientes com TDA positivo
45
7 CONCLUSAtildeO
A teacutecnica da glicina aacutecidaEDTA mostrou-se efetiva em remover os anticorpos que
sensibilizavam as hemaacutecias e pode ser utilizada com seguranccedila antes da fenotipagem
eritrocitaacuteria Por ser uma teacutecnica de raacutepida execuccedilatildeo eacute uma alternativa aplicaacutevel
principalmente em casos urgentes de pacientes que apresentam autoanticorpos
46
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50
9 ANEXOS
51
FUNDACcedilAtildeO HEMOCENTRO DE RIBEIRAtildeO PRETO
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE)
Tiacutetulo da pesquisa Aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina aacutecida-EDTA e avaliaccedilatildeo da
eficaacutecia no tratamento de hemaacutecias com teste direto da antiglobulina positivo
Pesquisadora responsaacutevel Ceacutelia Kazue Abiko
Orientador Prof Dimas Tadeu Covas
Co-orientadora Dra Flaacutevia Leite Souza Santos
Objetivo da pesquisa Vocecirc estaacute sendo convidado a participar de uma pesquisa que tem
como objetivo padronizar uma nova teacutecnica para auxiliar na tipagem sanguiacutenea de pacientes
A tipagem sanguiacutenea pode sofrer interferecircncia da presenccedila de anticorpos ligados aos gloacutebulos
vermelhos do sangue Nessas situaccedilotildees eacute difiacutecil selecionar o melhor sangue para o paciente e
eacute preciso a utilizaccedilatildeo de teacutecnicas adicionais para remover essas interferecircncias
Esta pesquisa tem como objetivo estudar outra teacutecnica para remover esses anticorpos e
comparaacute-la com a teacutecnica atualmente utilizada Para isso precisamos de amostras de pacientes
e doadores voluntaacuterios
Se vocecirc eacute um doador eacute necessaacuterio que vocecirc autorize a coleta de 5 ml (1 tubo) a mais
de seu sangue
Se vocecirc eacute um paciente natildeo haveraacute necessidade de nova amostra pois utilizaremos as
amostras jaacute coletadas para os testes preacute-transfusionais e os resultados encontrados nesta
pesquisa natildeo iratildeo interferir na escolha da (s) bolsa (s) de sangue que vocecirc possa vir a receber
Se vocecirc concordar em participar leia com atenccedilatildeo o texto abaixo e assine as duas vias
rubricando todas as paacuteginas deste termo de consentimento Uma via original assinada e
rubricada por vocecirc e pela pesquisadora ficaraacute com vocecirc
As suas informaccedilotildees seratildeo mantidas em sigilo pela pesquisadora e natildeo haveraacute
armazenamento de material para pesquisas posteriores Os seus dados seratildeo usados apenas
neste estudo e quando o trabalho for publicado seu nome e qualquer outra informaccedilatildeo que
possam identificaacute-lo natildeo seratildeo revelados
Eacute pouco provaacutevel que o que noacutes aprendermos com este estudo tenha um benefiacutecio
direto para vocecirc assim como natildeo poderemos dar nada em troca pela sua participaccedilatildeo na
pesquisa
Nosso objetivo com esta pesquisa eacute que os resultados poderatildeo ser uacuteteis para o
tratamento de pacientes no futuro Os riscos da participaccedilatildeo satildeo miacutenimos Se vocecirc eacute um
doador de sangue a amostra seraacute coletada no momento da doaccedilatildeo natildeo exigindo punccedilatildeo
venosa adicional
52
Eacute seu direito ter acesso aos resultados dos testes da pesquisa Esses resultados natildeo
seratildeo fornecidos automaticamente a vocecirc mas caso vocecirc se interesse em saber o resultado ou
tiver alguma duacutevida sobre a sua participaccedilatildeo neste estudo deveraacute entrar em contato com Ceacutelia
Kazue Abiko pelo telefone (18) 99718-3551
Vocecirc tem total liberdade de optar por natildeo participar da pesquisa Caso aceite
participar poderaacute desistir a qualquer momento ou retirar seu consentimento mesmo apoacutes ter
coletado o sangue Para cancelar sua participaccedilatildeo basta avisar a pesquisadora e os seus dados
seratildeo retirados do projeto
Qualquer duacutevida eacutetica sobre a pesquisa poderaacute entrar em contato com o Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa do Hospital das Cliacutenicas e da Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto
(CAMPUS UNIVERSITAacuteRIO bairro Monte Alegre CEP 14048-900 Ribeiratildeo Preto-SP
Telefone (16) 3602-2228 FAX (16) 3633-1144 e-mail cephcrpuspbr)
Consentimento de participaccedilatildeo
A Consentimento do participante
Li as informaccedilotildees acima sobre o estudo e recebi explicaccedilotildees sobre a participaccedilatildeo no estudo
Portanto dou o meu consentimento para participar do estudo
___________________________________________________________________________
Nome completo
___________________________________________________________________________
Assinatura
___________
Data
__________________________________________________________________________________
Nome completo da pesquisadora
___________________________________________________________________________
Assinatura
_____________
Data
11
Os testes direto e indireto satildeo ateacute hoje amplamente aplicados como princiacutepio de inuacutemeros
testes soroloacutegicos em imuno-hematologia (GREEN e KLOSTERMANN 2012)
131 TESTE DIRETO DA ANTIGLOBULINA
O teste direto da antiglobulina humana revela a presenccedila de anticorpo eou fraccedilatildeo do
complemento ligados agrave superfiacutecie das hemaacutecias As sensibilizaccedilatildeo das hemaacutecias ocorrida ldquoin
vivordquo natildeo eacute visualizada mas apoacutes a adiccedilatildeo da antiglobulina humana ocorre a aglutinaccedilatildeo que
eacute visualizada macroscopicamente (Figura 1)
Figura 1 - Princiacutepio da teacutecnica direta da antiglobulina Teste utilizado para demonstrar a sensibilizaccedilatildeo ldquoin
vivordquo das hemaacutecias O sangue total eacute coletado do paciente em tubo contendo anticoagulante EDTA Na teacutecnica
realizada em tubo uma suspensatildeo de hemaacutecias 5 em soluccedilatildeo de salina eacute preparada Uma gota dessa suspensatildeo
eacute lavada 3 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica para retirada de anticorpos que estatildeo livres no plasma Toda soluccedilatildeo eacute
retirada e adiciona-se o soro de Coombs (antiglobulina humana) O soro de Coombs reconhece os anticorpos que
estatildeo ligados agrave superfiacutecie das hemaacutecias fazendo com que ocorra aglutinaccedilatildeo visiacutevel macroscopicamente
Apesar de natildeo ser um teste preacute-transfusional obrigatoacuterio o TDA eacute um dos testes mais
importantes para investigar e classificar quadros hemoliacuteticos como de origem imune ou natildeo
imune O seu valor preditivo positivo em vigecircncia de anemia hemoliacutetica eacute de 83 poreacutem natildeo
havendo sinais de hemoacutelise seu valor preditivo eacute apenas 14 Eacute por esse motivo que a
interpretaccedilatildeo do TDA positivo deve levar em consideraccedilatildeo a histoacuteria cliacutenica e os resultados
dos outros exames laboratoriais A realizaccedilatildeo do TDA eacute obrigatoacuteria na investigaccedilatildeo
12
laboratorial de diversos quadros hemoliacuteticos entre eles a anemia hemoliacutetica autoimune
(AHAI) a reaccedilatildeo hemoliacutetica imune poacutes-transfusional a siacutendrome do linfoacutecito passageiro a
doenccedila hemoliacutetica perinatal e a hemoacutelise droga-dependente (LEGER 2011)
Resultados de TDA positivos foram tambeacutem observados em indiviacuteduos com niacuteveis
seacutericos elevados de IgG ou complemento sem evidecircncia de anemia hemoliacutetica imune como
em pacientes com doenccedila falciforme talassemia doenccedila renal crocircnica mieloma muacuteltiplo
doenccedilas autoimunes e siacutendrome da imunodeficiecircncia adquirida (SIDA) Aleacutem disso pequenas
quantidades de IgG (5 a 90 moleacuteculas por hemaacutecia) e complemento (5 a 40 moleacuteculas por
hemaacutecia) podem estar presentes nas hemaacutecias de indiviacuteduos saudaacuteveis sem associaccedilatildeo com
reduccedilatildeo na sobrevida das mesmas A positividade do TDA depende da populaccedilatildeo estudada e
pode variar de 01 entre doadores de sangue sem qualquer sinal cliacutenico de hemoacutelise ateacute
15 em pacientes hospitalizados (CASTILHO JUNIOR e REID 2015 LEGER 2011)
Indiviacuteduos que apresentam TDA positivo seja agraves custas de IgG eou complemento
com ou sem sinais cliacutenicos de hemoacutelise teratildeo a fenotipagem eritrocitaacuteria prejudicada A
fenotipagem de indiviacuteduos com TDA positivo especialmente quando utilizado o teste indireto
da antiglobulina pode acarretar resultados falsos positivos e levar a seleccedilatildeo de fenoacutetipo
incorreto para transfusatildeo
132 TESTE INDIRETO DA ANTIGLOBULINA
O teste indireto da antiglobulina (TIA) eacute utilizado para revelar a sensibilizaccedilatildeo ldquoin
vitrordquo das hemaacutecias e eacute aplicado a diversos testes soroloacutegicos em imunohematologia entre
eles a pesquisa de anticorpos identificaccedilatildeo de anticorpos testes de compatibilidade
fenotipagem eritrocitaacuteria e titulaccedilatildeo de anticorpos Na teacutecnica indireta a hemaacutecia que contecircm
o antiacutegeno eacute colocada em contato ldquoin vitrordquo com o anticorpo que se liga mas natildeo promove a
aglutinaccedilatildeo visiacutevel A adiccedilatildeo da AGH forma uma malha entre os anticorpos que sensibilizam
as hemaacutecias e provoca a aglutinaccedilatildeo macroscoacutepica (figura 2)
Caso a amostra de hemaacutecia estudada seja previamente sensibilizada resultados falsos
positivos podem ser obtidos no TIA jaacute que a AGH reagiraacute com a moleacutecula que sensibilizava
anteriormente a hemaacutecia mesmo se o anticorpo especiacutefico natildeo tiver se ligado ao antiacutegeno
correspondente
13
133 CONDICcedilOtildeES CLIacuteNICAS COM TDA POSITIVO
O TDA positivo deve ser interpretado cuidadosamente sempre em conjunto com o
quadro cliacutenico do paciente A positividade isolada do TDA natildeo significa hemoacutelise A
interpretaccedilatildeo do teste positivo requer o conhecimento do diagnoacutestico do paciente da presenccedila
de sinais e sintomas sugestivos de hemoacutelise assim como de seu histoacuterico transfusional
gestacional e de informaccedilotildees sobre o uso recente de medicaccedilotildees (LEGER 2011)
Figura 2 ndash Princiacutepio do teste indireto da antiglobulina O TIA pode ser utilizado na pesquisa de anticorpos de
especificidades desconhecidas livres no soroplasma como eacute o caso da pesquisa e identificaccedilatildeo de anticorpos
irregulares Ele eacute tambeacutem utilizado para determinar a presenccedila de antiacutegenos na membrana da hemaacutecia quando
satildeo empregados soros de especificidades conhecidas da classe IgG No primeiro caso o soroplasma contendo o
anticorpo desconhecido eacute colocado em contato com hemaacutecias cujo perfil antigecircnico eacute conhecido No segundo
caso utiliza-se soro de especificidade conhecida da classe IgG para determinar a presenccedila ou ausecircncia de um
antiacutegeno na membrana O anticorpo encontra o antiacutegeno correspondente e ocorre a ligaccedilatildeo do anticorpo agrave
hemaacutecia mas natildeo ocorre aglutinaccedilatildeo Apoacutes a adiccedilatildeo da AGH que se liga aos anticorpos formando uma malha
ocorre a aglutinaccedilatildeo visiacutevel
O TDA positivo eacute uma achado claacutessico de algumas condiccedilotildees cliacutenicas como a reaccedilatildeo
transfusional hemoliacutetica a doenccedila hemoliacutetica do feto e do receacutem-nascido (DHFRN) a anemia
hemoliacutetica induzida por drogas a siacutendrome do linfoacutecito passageiro e a anemia hemoliacutetica
autoimune (AHAI) Portanto o TDA positivo pode ser decorrente da sensibilizaccedilatildeo da
hemaacutecia autoacuteloga por um autoanticorpo ou por um aloanticorpo ligado agrave hemaacutecia alogecircnica
circulante A positividade do TDA pode ainda ocorrer de forma passiva em pacientes que
14
recebem imunoglobulinas humanas ou ainda pela transfusatildeo de plaquetas ABO natildeo idecircntico
(LEGER 2011 RALPH 2012 ZANTEK et al 2012)
Nas reaccedilotildees transfusionais hemoliacuteticas imunes o aloanticorpo do receptor sensibiliza
as hemaacutecias transfundidas do doador e reduz sua sobrevida ao removecirc-la precocemente da
circulaccedilatildeo pela fagocitose no sistema retiacuteculo-endotelial ou pela hemoacutelise intravascular As
reaccedilotildees podem ser agudas se ocorrem ateacute 24 horas ou tardias quando ocorrem apoacutes 24 horas
da transfusatildeo A gravidade das reaccedilotildees hemoliacuteticas pode variar de um simples rendimento
transfusional inadequado agrave quadros graves de hemoacutelise intravascular evoluindo ateacute mesmo
com choque vascular e oacutebito O TDA pode resultar negativo caso toda massa eritrocitaacuteria
transfundida tenha sido destruiacuteda (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
Na doenccedila hemoliacutetica do feto e do receacutem-nascido (DHFRN) anticorpos maternos da
classe IgG atravessam a barreira placentaacuteria e sensibilizam as hemaacutecias fetais que seratildeo
destruiacutedas precocemente levando agrave anemia fetal Apesar da incompatibilidade ABO feto-
materna ser a causa mais frequente de DHFRN raramente ela eacute responsaacutevel pela ocorrecircncia
de quadros graves Por outro lado anticorpos contra antiacutegenos do sistema Rh e Kell
especialmente Anti-D (Anti-RH1) Anti-c (Anti-RH4) e Anti-Kell (Anti-KELL1) satildeo
conhecidos por causar DHFRN severa Raramente outros anticorpos tambeacutem podem estar
implicados na DHFRN como os anticorpos contra antiacutegenos do sistema Kidd Duffy MNS e
Diego (ZANTEK et al 2012)
A hemoacutelise droga-dependente eacute causada pela produccedilatildeo de um anticorpo voltado contra
a droga ligada agrave membrana eritrocitaacuteria ou ainda contra o complexo droga-membrana A
classe de medicaccedilotildees mais comumente envolvida eacute a dos antimicrobianos betalactacircmicos
(penicilinas e cefalosporinas) mas outras classes como quimioteraacutepicos e anti-inflamatoacuterios
tambeacutem satildeo descritos (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
Apoacutes transplante de ceacutelulas progenitoras hematopoieacuteticas em que o doador possui
anticorpos contra antiacutegenos eritrocitaacuterios do receptor o linfoacutecito de memoacuteria do doador pode
resistir ao esquema imunossupressor utilizado e continuar a produccedilatildeo de anticorpos que
reconhecem a hemaacutecia incompatiacutevel do receptor ainda circulante O quadro cliacutenico pode
variar de um simples TDA positivo sem outros sinais ou sintomas ateacute um quadro hemoliacutetico
grave e abrupto (LEGER 2011)
15
134 ANEMIA HEMOLIacuteTICA AUTOIMUNE
A anemia hemoliacutetica autoimune eacute caracterizada pela destruiccedilatildeo precoce das hemaacutecias
autoacutelogas por autoanticorpos que sensibilizam as hemaacutecias e levam agrave fagocitose pelos
macroacutefagos no sistema reticulo-endotelial ou hemoacutelise intravascular O diagnoacutestico da AHAI
baseia-se na presenccedila de hemoacutelise cliacutenica associada agrave evidecircncia de fator imune representado
pelo TDA positivo As classes de anticorpos envolvidas em quadros de AHAI satildeo IgG IgM e
raramente IgA (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012) Satildeo raros os casos de AHAI com TDA
negativo que podem estar relacionados a um autoanticorpo de baixa avidez de densidade
inferior agrave detecccedilatildeo do meacutetodo ou ainda de classe de imunoglobulina natildeo avaliada pelo
meacutetodo utilizado para o teste (GARRATY 2005)
A AHAI pode ser classificada em dois grupos principais de acordo com a melhor
temperatura de reaccedilatildeo do autoanticorpo As anemias hemoliacuteticas causadas por anticorpos
quentes que reagem melhor a 37oC e geralmente IgG representam 80 dos casos de AHAI
Nas AHAI por anticorpo quente o TDA pode ser positivo para IgG mais complemento (67)
somente IgG (20) ou somente por complemento (13) As anemias causadas por
anticorpos frios geralmente da classe IgM e que reagem melhor em temperatura ambiente ou
a 4oC representam aproximadamente 20 dos casos de AHAI Por exibirem amplitude
teacutermica esses anticorpos ligam-se agraves hemaacutecias ao atingirem a circulaccedilatildeo nas extremidades do
corpo fixam o complemento e desprendem-se da hemaacutecia apoacutes retornar para partes mais
quentes Por esse motivo em AHAI por anticorpos frios o TDA eacute positivo apenas agraves custas
de C3 e normalmente o IgM natildeo eacute detectado (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
A presenccedila do autoanticorpo IgG pode ser confirmada atraveacutes da eluiccedilatildeo do anticorpo
da hemaacutecia Tipicamente o eluato na AHAI por anticorpo quente reage com todas as ceacutelulas
testadas de um painel de hemaacutecias alogecircnicas do tipo ldquoOrdquo ou pode eventualmente exibir uma
especificidade conhecida como Anti-e (Anti-RH5) Nas AHAI a frio por sua vez espera-se
um eluato negativo (LEGER 2011)
Os autoanticorpos satildeo com frequecircncia encontrados livres no plasma e natildeo somente
ligados agraves hemaacutecias autoacutelogas Eles podem interferir em todas as fases dos testes preacute-
transfusionais nas quais o plasma eacute testado especialmente os autoanticorpos quentes que
acarretam resultados positivos em todos os testes levados agrave fase de antiglobulina humana
Esses anticorpos portanto positivam a pesquisa de anticorpos irregulares e mascaram a
presenccedila de aloanticorpos de significado cliacutenico Aproximadamente 60 dos pacientes que
apresentam AHAI a quente apresentam anticorpos que reagem em meio salino mas se forem
16
levados em conta meacutetodos mais sensiacuteveis como PEG enzima e estudo em gel a positividade
pode ser superior a 90 (LEGER 2011)
Aleacutem da eficaacutecia da transfusatildeo ser comprometida pela diminuiccedilatildeo da vida-meacutedia das
hemaacutecias a presenccedila do autoanticorpo dificulta a realizaccedilatildeo dos testes preacute-transfusionais e
compromete a seguranccedila transfusional Os autoanticorpos reagem normalmente como
panaglutininas pois satildeo normalmente voltados contra antiacutegenos puacuteblicos na maior parte das
vezes contra antiacutegenos do sistema Rh Por apresentarem essas caracteriacutesticas podem ainda
mascarar a presenccedila de aloanticorpos de significado clinico e levar a testes de compatibilidade
positivos exigindo uma avaliaccedilatildeo criteriosa da necessidade da transfusatildeo (BRANCH e PETZ
1999 JUNIOR e OLIVATO 2004)
Remover a interferecircncia do autoanticorpo para avaliar a presenccedila de aloanticorpos
mascarados nem sempre eacute possiacutevel mesmo utilizando teacutecnicas de autoadsorccedilatildeo ou
aloadsorccedilatildeo que aleacutem de tudo satildeo demoradas e exigem de 2 a 6 horas para conclusatildeo
(GARRATY e GEORGE 2002) Nesses casos a fenotipagem eritrocitaacuteria do paciente eacute de
extrema utilidade especialmente em situaccedilotildees de urgecircncia A definiccedilatildeo do fenoacutetipo do
paciente para os antiacutegenos de maior importacircncia cliacutenica pode auxiliar a seleccedilatildeo de unidades
de hemaacutecias com mesmo fenoacutetipo o que garante que eventuais aloanticorpos natildeo
identificados sejam respeitados e tambeacutem evita nova sensibilizaccedilatildeo (JUNIOR e OLIVATO
2004 SHIREY et al 2002)
135 TRATAMENTO DE HEMAacuteCIAS COM TDA POSITIVO
O TDA positivo impede a fenotipagem eritrocitaacutecia por meacutetodos que exigem a fase de
AGH uma vez que a aglutinaccedilatildeo ocorreraacute devido agrave interaccedilatildeo da AGH com o autoanticorpo
que sensibiliza a hemaacutecia do paciente levando a resultados falso positivos Em algumas
situaccedilotildees como na AHAI por anticorpo quente a fenotipagem eacute especialmente importante
pois o autoanticorpo interfere na triagem e identificaccedilatildeo de anticorpos assim como no teste de
compatibilidade e dificultam a detecccedilatildeo de aloanticorpos de significado cliacutenico que
obrigatoriamente devem ser respeitados Nessas situaccedilotildees a fenotipagem eritrocitaacuteria
determina o perfil antigecircnico do paciente e possibilita o fornecimento de unidades de
hemaacutecias com o mesmo fenoacutetipo para a transfusatildeo evitando a sensibilizaccedilatildeo para novos
antiacutegenos assim como reaccedilotildees hemoliacuteticas transfusionais No entanto eacute necessaacuterio aplicar
meacutetodos que natildeo sofram interferecircncia do TDA positivo ou seja meacutetodos que natildeo necessitem
da fase de AGH ou meacutetodos de bloqueio do anticorpo sem bloquear o antiacutegeno Uma opccedilatildeo eacute
a utilizaccedilatildeo de soros monoclonais IgM (salinos ou de meio proteico natildeo concentrado) mas
17
nem sempre esses reagentes estatildeo disponiacuteveis especialmente os reagentes monoclonais para
os antiacutegenos dos sistemas Duffy ( Fya Fy
b) Kidd ( Jk
a Jk
b) e MNS (S s) (JUNIOR e
OLIVATO 2004) Outra opccedilatildeo eacute a teacutecnica de bloqueio que pode ser utilizada para tratar
hemaacutecias para posterior fenotipagem em casos de TDA positivos com reatividade le2+
Em casos onde a positividade do TDA eacute maior que 2+ estaacute indicada a tratamento
quiacutemico para remoccedilatildeo da interferecircncia do autoanticorpo antes de realizar a fenotipagem Entre
as teacutecnicas utilizadas atualmente estatildeo o ZZAP a cloroquina e a glicina aacutecidaEDTA
1351 TEacuteCNICA DE BLOQUEIO
A teacutecnica de bloqueio se baseia na utilizaccedilatildeo de anti-IgG (Coombs monoespeciacutefico)
para tratar as hemaacutecias com TDA positivo O anticorpo anti-IgG se liga aos anticorpos que
estatildeo sensibilizando a hemaacutecias poreacutem sem o bloquear os antiacutegenos Os antiacutegenos que natildeo
estatildeo sensibilizados podem ser detectados atraveacutes dos antissoros especiacuteficos (SERERAT
VEIDT E DUTCHED 2000)
1352 TRATAMENTO DE HEMAacuteCIAS COM ZZAP
O Sulphydryl-Proteolytic Enzyme (ZZAP) que eacute uma mistura de ditiotreitol (DTT)
mais papaiacutena ativada com cisteiacutena eacute um reagente capaz de dissociar imunoglobulinas da
classe IgG ligadas a membrana dos eritroacutecitos enquanto trata enzimaticamente as hemaacutecias
O tratamento enzimaacutetico tambeacutem potencializa a ligaccedilatildeo do autoanticorpo ao antiacutegeno e
acelera o processo de autoadsorccedilatildeo O ZZAP pode desnaturar os antiacutegenos do sistema Duffy
MNS e Kell o que limita sua aplicaccedilatildeo para fins de fenotipagem (BRANCH e PETZ 1982)
1353 CLOROQUINA
Em 1982 Edwards Moulds e Judd propuseram a utilizaccedilatildeo da teacutecnica da cloroquina
que dissociava os complexos antiacutegeno-anticorpo e mantinha a membrana das hemaacutecias
iacutentegras Os derivados quinolecircicos jaacute haviam sido descritos anteriormente por Domokos e
Aszody em 1964 e Holtz Mantel e Buck em 1973 (apud Edwards Moulds e Judd 1982) pela
sua capacidade de separar imunocomplexos e inibir as reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo reduzindo
as cargas eleacutetricas das superfiacutecie das hemaacutecias A teacutecnica eacute uma das mais utilizadas nos
centros brasileiros para remover a interferecircncia do autoanticorpo e eacute tambeacutem a teacutecnica
atualmente adotada pelo laboratoacuterio de imunohematologia do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto
18
Edwards Moulds e Judd (1982) demonstraram que a teacutecnica da cloroquina para
dissociaccedilatildeo de anticorpos eacute uma teacutecnica simples efetiva e confiaacutevel para dissociar
imunoglobulina das hemaacutecias Desde que a membrana das hemaacutecias permaneccedila intacta natildeo
haacute perda da reatividade dos antiacutegenos e a sua maior aplicaccedilatildeo eacute a fenotipagem de hemaacutecias
com TDA positivo Os autores verificaram que em 83 das amostras sensibilizadas in vivo e
22 amostras (no total de 40) sensibilizadas ldquoin vitrordquo apresentaram TDA negativo e
puderam ser fenotipadas A teacutecnica poreacutem natildeo consegue remover os componentes do
complemento na maioria dos casos
Champagne e colaboradores (1999) testaram a teacutecnica da cloroquina para dissociar
antiacutegenos Bg comparando com a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA e verificaram vantagem em
relaccedilatildeo ao uso de um uacutenico reagente diminuindo a manipulaccedilatildeo e verificou que o mesmo natildeo
destroacutei antiacutegeno Kell
A cloroquina tambeacutem mostrou-se pouco efetivo em remover anticorpos do sistema
Duffy da superfiacutecie das hemaacutecias (EDWARDS MOUDS e JUDD 1982 ROZIERS e
SQUALI 1997)
1353 GLICINA-AacuteCIDAEDTA
A afinidade e a estabilidade entre a ligaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo eacute definida como a
resultante entre forccedilas atrativas e repulsivas entre ambos (CARUCIO e WISE 2012) e resulta
da somatoacuteria de forccedilas quiacutemicas dinacircmicas e fracas (natildeo covalentes) como pontes de
hidrogecircnio forcas eletrostaacuteticas forca de Van der Waals e pontes hidrofoacutebicas A estabilidade
dessa ligaccedilatildeo eacute facilmente abalada por alteraccedilotildees quiacutemicas e fiacutesicas no meio da reaccedilatildeo como
a alteraccedilatildeo do pH A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA se baseia na mudanccedila do pH para a
quebra da ligaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo (KOSANKE 2012)
A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA foi primeiramente descrita em 1986 por Louie Jieng
e Zeroulis que utilizaram 50 amostras de doadores sensibilizados ldquoin vitrordquo com anticorpos A
teacutecnica foi efetiva em 48 amostras permitindo o estudo do eluato assim como a fenotipagem
das hemaacutecias Os autores testaram tambeacutem a teacutecnica em 100 hemaacutecias TDA positivo que
puderam ser utilizadas para teacutecnicas de autoadsorccedilatildeo
Byrne (1991) descreveu a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA modificada e tambeacutem
verificou como uma opccedilatildeo para o tratamento de hemaacutecias com TDA positivo que deixava as
hemaacutecias intactas e o eluato viaacutevel para ser fenotipado
19
Roziers e Squali (1997) e Katharia e Chaudhary (2013) compararam a teacutecnica da
glicina-aacutecidaEDTA com as teacutecnicas da cloroquina e do aquecimento Verificaram maior
eficiecircncia da glicina-aacutecidaEDTA em relaccedilatildeo as outras duas teacutecnicas pois com uma mesma
quantidade de amostra produzia as hemaacutecias livres de anticorpo e tambeacutem o eluato Mostrou-
se ainda superior devido ao menor tempo exigido para sua realizaccedilatildeo o que favorece seu uso
em situaccedilotildees de urgecircncia e emergecircncia
As duas desvantagens da teacutecnica poreacutem eacute o fato de destruir os antiacutegenos do sistema
Kell e o fato de natildeo remover fraccedilotildees do complemento ligadas agrave hemaacutecia (PALLAS WILER e
McGEE 1991 ROZIERS e SQUALLI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012
e KATHARIA e CHAUNDHARY 2013)
20
2 OBJETIVOS
21 OBJETIVO GERAL
211 Avaliar a eficaacutecia da glicina-aacutecidaEDTA em remover os anticorpos ligados agraves
hemaacutecias sensibilizadas por anticorpos da classe IgG
22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
221 Preparaccedilatildeo dos reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
verificaccedilatildeo da estabilidade dos mesmos e avaliar custos
222 Testar a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA em amostras de hemaacutecias
sensibilizadas por anticorpos antieritrocitaacuterios humanos
223 Comparar a efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA com a teacutecnica da
cloroquina quanto a capacidade de remover a interferecircncia do anticorpo ligado
a hemaacutecia
224 Testar o eluato das amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA
225 Verificar se houve destruiccedilatildeo dos antiacutegenos eritrocitaacuterios apoacutes o tratamento
com glicina-aacutecidaEDTA e com cloroquina
226 Verificar se o tempo de execuccedilatildeo da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA descrito
nos textos de referecircncia eacute reprodutiacutevel
21
3 JUSTIFICATIVA
Algumas condiccedilotildees cliacutenicas podem levar ao depoacutesito ldquoin vivordquo de anticorpos eou
fraccedilotildees do complemento sobre as hemaacutecias Entre elas estatildeo as reaccedilotildees hemoliacuteticas poacutes-
transfusionais a doenccedila hemoliacutetica perinatal o uso de medicamentos e principalmente a
AHAI Na AHAI um anticorpo normalmente da classe IgG ou IgM reconhece antiacutegenos
proacuteprios na membrana eritrocitaacuteria e reduz a sobrevida da hemaacutecia levando a sua destruiccedilatildeo
pelos macroacutefagos no sistema reticulo-endotelial ou agrave ativaccedilatildeo do complexo de ataque agrave
membrana e agrave lise intravascular Os autoanticorpos satildeo voltados na maioria das vezes contra
antiacutegenos eritrocitaacuterios de alta frequecircncia populacional conhecidos como antiacutegenos puacuteblicos
e por este motivo reconhecem tanto hemaacutecias autoacutelogas quanto alogecircnicas
Devido agrave presenccedila do autoanticorpo livre no plasma e tambeacutem do anticorpo eou
complemento ligado agrave hemaacutecia o banco de sangue pode encontrar dificuldades em todas as
fases dos testes preacute-transfusionais do paciente com AHAI e deve utilizar teacutecnicas que
auxiliem na escolha do melhor hemocomponente melhorando a seguranccedila transfusional Essas
teacutecnicas visam remover a interferecircncia do autoanticorpo livre no soro e do autoanticorpo
ligado agrave hemaacutecia permitindo a detecccedilatildeo de aloanticorpos associados e a realizaccedilatildeo da
fenotipagem eritrocitaacuteria respectivamente
A finalizaccedilatildeo dos testes preacute-tranfusionais na presenccedila de autoanticorpo pode levar
algumas horas e nem sempre o paciente poderaacute aguardar Nesse contexto torna-se vantajosa a
aplicaccedilatildeo de teacutecnicas de raacutepida execuccedilatildeo
O presente estudo propotildee aplicar e avaliar a eficaacutecia da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
em remover os anticorpos ligados agrave hemaacutecia o que permite a fenotipagem eritrocitaacuteria
estendida e a seleccedilatildeo de concentrados de hemaacutecias com mesmo fenoacutetipo do paciente
Atualmente no Hemocentro de Ribeiratildeo Preto a teacutecnica utilizada para esse fim eacute o
tratamento das hemaacutecias com difosfato de cloroquina cujo tempo de execuccedilatildeo pode demorar
ateacute duas horas enquanto a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser realizada em apenas dois
minutos o que a tornaria opccedilatildeo de escolha especialmente em situaccedilotildees de urgecircncia Ao
contraacuterio da cloroquina a glicina-aacutecidaEDTA permite tambeacutem o estudo do eluato das
hemaacutecias tratadas
22
4 METODOL OGIA
41 AMOSTRAS DE DOADORES
Foram coletados 50 amostras de doadores de sangue que compareceram ao
Hemonuacutecleo de Araccedilatuba no periacuteodo de junho a agosto de 2016 Foram convidados a
participar da pesquisa doadores de repeticcedilatildeo do tipo sanguiacuteneo ldquoOrdquo RhD positivo
cadastrados no sistema de banco de sangue (SBS) do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto
Todos os doadores que concordaram em participar da pesquisa assinaram o termo de
consentimento livre e esclarecido (TCLE)
No momento da doaccedilatildeo foram coletados adicionalmente 5 mL de sangue total em
soluccedilatildeo anticoagulante EDTA (aacutecido dietilenoaminoaceacutetico) dispensando punccedilatildeo venosa
adicional para coleta da amostra O fluxograma 1 resume as etapas desenvolvidas no projeto
Fluxograma 1 - Fluxo da pesquisa utilizando as amostras de doadores
23
411 FENOTIPAGEM
Foram verificados se os doadores jaacute tinham fenotipagem para outros sistemas de
grupos sanguiacuteneos aleacutem do sistema ABORh que eacute realizado rotineiramente
A fenotipagem eritrocitaacuteria para outros sistemas ou fenotipagem estendida eacute realizada
para identificar a presenccedila ou ausecircncia de antiacutegenos considerados de importacircncia cliacutenica No
Hemonuacutecleo de Araccedilatuba uma parcela de doadores de repeticcedilatildeo satildeo fenotipados para os
antiacutegenos dos sistemas de grupo sanguiacuteneo Rh (antiacutegenos C c E e e) Kell (antiacutegeno K)
Duffy (antiacutegenos Fya e Fy
b) Kidd (antiacutegenos Jk
a e Jk
b) e sistema MNSs (antiacutegenos S e s)
A fenotipagem para o Rh e Kell eacute realizada por metodologia de microplaca utilizando
25 microL de hemaacutecia lavada e diluiacuteda a 5 em salina e 25 microL do antissoro comercial especiacutefico
A reaccedilatildeo eacute incubada 15 minutos a temperatura ambiente e centrifugadas para leitura Para os
antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s a metolodogia utilizado eacute gel contendo antiglobulina
humana (gel LissCoombs poliespeciacutefico) da marca BIO-RAD onde se utiliza suspensatildeo de
hemaacutecia em LISS (Soluccedilatildeo de baixa forccedila iocircnica) A suspensatildeo eacute preparada atraveacutes da
diluiccedilatildeo de 10 microL de hemaacutecia em 1000 microL de LISS Pipetado 50 microL dessa diluiccedilatildeo no gel e
adicionado 25 microL do antissoro especiacutefico Incuba-se em banho seco por 15 minutos a 37 deg
Celsius e eacute centrifugado em centriacutefuga especiacutefica Os antissoros utilizados eram das marcas
Fresenius e Lorne
Foi verificado a fenotipagem do doador no banco de dados do Hemocentro Os
registros dos fenoacutetipos dos doadores ficam armazenadas no sistema de banco de sangue
(SBS) Para doadores que natildeo tinham fenotipagem estendida preacutevia para antiacutegenos do sistema
Rh (C c E e e) e Kell (K) foi realizada a fenotipagem para esses antiacutegenos
O tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA e cloroquina para dissociar
anticorpos pode inativar enfraquecer ou destruir os antiacutegenos presentes nas hemaacutecias
alterando assim os resultados da fenotipagem Para verificar se houve destruiccedilatildeo dos
antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a e Jk
b S e s nas amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes
tratamento foram novamente fenotipadas ao final para os antiacutegenos que eram inicialmente
positivas
A repeticcedilatildeo da fenotipagem foi realizada nas amostras que apresentaram efetividade
no tratamento da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eou da cloroquina e a detecccedilatildeo do antiacutegeno
na amostra preacute-tratamento
24
412 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS HEMAacuteCIAS
As hemaacutecias foram sensibilizadas com antissoros policlonais humanos de amostras de
plasma fresco congelado de doadores com resultado de pesquisa de anticorpo irregular
positivos
A escolha do anticorpo para sensibilizar as hemaacutecias foi definida de acordo com o
fenoacutetipo do doador que deveria ser positivo para o respectivo antiacutegeno
Para a sensibilizaccedilatildeo um volume de antissoro (1 mL) e um volume (1 mL) de
hemaacutecias lavadas quatro vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica foram adicionadas a um tubo de 12 x
75 mm A mistura foi homogeneizada e incubada em banho maria (BM) a 37deg C por 60
minutos A seguir as hemaacutecias foram novamente lavadas 4 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica
para retirada dos anticorpos que natildeo se ligaram A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada
como controle negativo O teste da uacuteltima lavagem eacute importante para assegurar que os
anticorpos que poderatildeo ser detectados no eluato apoacutes o tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA
sejam aqueles que estavam ligados agraves hemaacutecias e natildeo aqueles livres no plasma O controle
negativo mostra que todo o anticorpo livre foi retirado (LEGER 2011)
Para o teste de presenccedila de anticorpo na soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foram incubadas
com hemaacutecias de triagem de anticorpos irregulares (ID-Diacell BIO-RAD) contendo os
antiacutegenos especiacuteficos Realizado a teacutecnica em gel LissCoombs com anti-IgG+C3d Incubado
no tempo de 15 minutos a temperatura de 37deg C e centrifugado 10 minutos em centriacutefuga
proacutepria
As 50 amostras de doadores foram sensibilizadas com os anticorpos policlonais
humanos
Apoacutes sensibilizadas rdquoin vitrordquo e lavadas as hemaacutecias foram diluiacutedas em soluccedilatildeo de
baixa forccedila iocircnica (LISS) na quantidade de 10 microL de hemaacutecia para 1000 microL de soluccedilatildeo A
suspensatildeo foi pipetada (50 microL) em coluna-gel-teste LissCoombs (BIO-RAD) que contecircm
antiglobulina poliespeciacutefico (IgG+C3d) e centrifugada em baixa rotaccedilatildeo conforme orientaccedilatildeo
do fabricante durante 10 minutos
As amostras deveriam apresentar aglutinaccedilatildeo com reatividade 3 a 4+ no TDA As
amostras que apresentaram reaccedilatildeo menor que 3+ foram novamente sensibilizadas com nova
aliacutequota do antissoro
25
413 TRATAMENTO DAS AMOSTRAS
As amostras sensibilizadas apresentando o TDA positivo 3 ou 4+ foram divididas em
duas aliacutequotas e submetidas a duas teacutecnicas diferentes com o objetivo de dissociar o anticorpo
ligado Uma aliacutequota da amostra foi tratada com soluccedilatildeo de difosfato de cloroquina enquanto
a outra aliacutequota foi tratada com glicina-aacutecidaEDTA
42 PREPARO DA GLICINA AacuteCIDA-EDTA
A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA utiliza 3 soluccedilotildees diferentes a glicina aacutecida o
EDTA e o tampatildeo TRIS
Os reagentes foram preparados utilizando os sais para anaacutelise (PA) de EDTA
(Na2EDTA2H2O) TRIS (C4H11NO3) Glicina (H2NCH2CO2H) NaCl e a soluccedilatildeo de aacutecido
cloriacutedrico (HCl) 12 N todos reagentes da marca SYNTH (quadro 1)
Para o preparo do tampatildeo glicina-acida eacute necessaacuterio o ajuste do pH para 15 Para esse
ajuste utiliza-se aacutecido cloriacutedrico (HCl) concentrado O pH foi medido com fitas reativas de pH
com escala de 1 a 14 da marca MERCK Posteriormente a soluccedilatildeo foi enviada ao laboratoacuterio
de controle de qualidade do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto e o pH medido no peagacircmetro O
tampatildeo glicina-aacutecida foi armazenado a 4deg e o tampatildeo tris e o EDTA em temperatura ambiente
controlada (20 a 24deg Celsius)
Apoacutes o preparo e durante a realizaccedilatildeo dos testes foram feitas inspeccedilotildees visuais para
verificaccedilatildeo de turvaccedilatildeo do meio e presenccedila de precipitados
Reagente Material Quantidade Preparo e
Conservaccedilatildeo
EDTA
EDTA
(Na2EDTA2H2O)
5 gramas Mistura ateacute
dissoluccedilatildeo do sal e
conserva em
temperatura ambiente Aacutegua Destilada 50 Ml
Tris
TRIS (C4H11NO3) 121 gramas Conservar em
temperatura ambiente NaCl 525g
Aacutegua destilada 100ml
Gliacutecina-aacutecida
Glicina
(H2NCH2CO2H) 15 gramas
Conservar a 4oC NaCl 116gramas
Aacutegua Destilada 200ml
HCL 12N Ajutar o pH para 15
Quadro 1 - Preparo dos Reagentes da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
Fonte - Manual teacutecnico AABB 2011
26
O tampatildeo glicina-aacutecida e o tampatildeo TRIS satildeo estaacuteveis por 7 meses O reagente EDTA
precipitou mesmo estando em temperatura em ambiente controlado Houve necessidade de
preparo de novo reagente
421 TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
1 Em um tubo de ensaio 12x75 mm eacute adicionado 08 mL da soluccedilatildeo de glicina-aacutecida A
esta soluccedilatildeo adiciona-se 02 mL de EDTA e mistura
2 Adiciona-se 02 mL de hemaacutecias sensibilizadas (lavada 4 vezes) A mistura eacute
homogeneizada e incubada por exatamente 2 minutos
3 A seguir 01 mL de tampatildeo TRIS eacute adicionado agrave mistura que eacute novamente
homogeneizada e centrifugada por 2 minutos a 3400 rpm O pH deve estar entre 7 a 75
4 Apoacutes centrifugaccedilatildeo separa-se em outro tubo o sobrenadante (eluato) e as hemaacutecias
que permanecem satildeo lavadas 4 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica para retirada de todo o
reagente e anticorpos livres
43 PREPARO DA CLOROQUINA
A cloroquina eacute diluiacuteda em tampatildeo PBS na concentraccedilatildeo de 20 (Quadro 2) e
armazenado a 4deg Celsius sua validade apoacutes o preparo eacute de 1 mecircs
A teacutecnica da cloroquina jaacute estaacute padronizada para rotina do laboratoacuterio de
imunohematologia do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto e suas unidades
Reagente Reagentes Quantidade PreparoConservaccedilatildeo
Cloroquina
Difosfato de cloroquina
(C18H32ClN3O8P2)
20 gramas
Conservar a 4deg Celsius
Tampatildeo PBS 100ml
NaOH 01 N Acertar o pH para
51
Quadro 2 - Preparo da Cloroquina Fonte - Manual teacutecnico da AABB 2011
431 TEacuteCNICA DA CLOROQUINA
1 4 partes da soluccedilatildeo pronta eacute adicionada a uma parte de hemaacutecias lavadas 4 vezes com
soluccedilatildeo fisioloacutegica
2 A mistura eacute incubada em temperatura ambiente por ateacute duas horas
3 Centrifugar a 3400 rpm por 2 minutos
27
4 Remover o sobrenadante lavar as hemaacutecias novamente com soluccedilatildeo fisioloacutegica 4
vezes
44 VERIFICACcedilAtildeO DA EFETIVIDADE DOS TESTES
Apoacutes tratamento pelas duas teacutecnicas o TDA foi repetido em todas as amostras para
verificar se os tratamentos foram efetivos e houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo Para as
amostras tratadas pela teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA que permaneceram com TDA positivo
novo tratamento foi realizado
45 TESTE DO ELUATO
O eluato resultante das amostras tratadas com glicina-acidaEDTA foi testado com
hemaacutecias de triagem A soluccedilatildeo do eluato foi incubada com as hemaacutecias de triagem de
anticorpos (ID-Diacell BIO-RAD) pela teacutecnica em gel LissCoombs O teste foi incubado 15
minutos a 37deg Celsius e centrifugado por 10 minutos em centrifuga proacutepria para a teacutecnica em
gel Os eluatos que apresentaram resultados positivos foram testados em painel de 11
hemaacutecias (ID-Diapanel BIO-RAD) para a identificaccedilatildeo do anticorpo
46 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente que apresentou TDA positivo por IgG e pesquisa
de anticorpo irregular positivo com presenccedila de autoanticorpo com reatividade panaglutinina
A amostra foi tratada em paralelo pelas duas teacutecnicas descritas e foi enviada para o
Hemocentro para genotipagem eritrocitaacuteria que foi realizado por metodologia PCR em tempo
real no equipamento Real-time system PCR 7500 ( Applied Biosystems Califoacuternia EUA)
28
5 RESULTADOS
51 REAGENTES
Para aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA satildeo necessaacuterios 3 diferentes
reagentes que podem ser encontrados em forma de kit pronto para uso No entanto esses kits
natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil Os reagentes satildeo tampatildeo glicina-aacutecida o EDTA e o tampatildeo
Tris
Todos os reagentes foram preparados rdquoin houserdquo a partir dos sais e soluccedilotildees PA (puro
para anaacutelise) da marca SYNTH que foram adquiridos para a pesquisa O custo estimado para
cada teste foi aproximadamente R$ 020 reais
Apoacutes o preparo os reagentes poderiam ser armazenados em condiccedilotildees adequadas pelo
periacuteodo de 1 ano (AABB 2011) Ao final do preparo e durante o periacuteodo de armazenamento
de fevereiro a setembro de 2016 foi realizada inspeccedilatildeo visual para verificar a presenccedila de
precipitados ou turvaccedilatildeo A soluccedilatildeo de glicina e o tampatildeo TRIS mostraram-se estaacuteveis ateacute o
final do periacuteodo Por sua vez o reagente EDTA precipitou mesmo estando armazenado em
temperatura ambiente controlada e foi necessaacuterio novo preparo
52 AMOSTRAS DE DOADORES
521 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS AMOSTRAS
Apoacutes incubaccedilatildeo da hemaacutecia com o antissoro a mesma foi lavada 4 vezes para retirada
dos anticorpos livres A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada Caso houvesse positividade na
soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem a etapa era repetida (figura 3) Das 50 amostras sensibilizadas a
uacuteltima lavagem foi positiva somente em 3 delas Nas 3 amostras o anticorpo utilizado para
sensibilizaccedilatildeo foi o anti-K Apoacutes repetido nova etapa de lavagem os resultados se
apresentaram negativos
Em todas as amostras sensibilizadas ldquoin vitrordquo o TDA foi testado e verificado a
intensidade do teste Entre as 50 amostras 47 alcanccedilaram TDA com intensidade 3-4+ apoacutes a
primeira sensibilizaccedilatildeo enquanto 3 amostras necessitaram uma segunda incubaccedilatildeo com
anticorpo (figura 4)
A escolha dos anticorpos para sensibilizar as hemaacutecias foi feita de acordo com o
fenoacutetipo do doador e foram utilizados sete diferentes especificidades de anticorpos policlonais
humanos conforme mostra o graacutefico1
29
Figura 3 - Soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada com hemaacutecia de triagem de
anticorpos em gel LissCoombs (BIO-RAD) A finalidade eacute verificar a presenccedila de anticorpos livres na
suspensatildeo que possam interferir na pesquisa do eluato As soluccedilotildees de lavagem das amostras na figura a tiveram
resultados negativos Na figura b duas amostras a 47 e 50 apresentaram resultado positivo Nova etapa de
lavagem foi realizada e o resultado final foi negativo
522 TRATAMENTO DAS HEMAacuteCIAS
Apoacutes a sensibilizaccedilatildeo e obtenccedilatildeo de resultados de TDA com intensidade de 3 a 4+
cada uma das amostras foi dividida em duas aliacutequotas e tratada separadamente pelas teacutecnicas
de glicinaaacutecida-EDTA e cloroquina
As teacutecnicas foram consideradas efetivas quando obteve-se a completa dissociaccedilatildeo do
anticorpo verificada atraveacutes do TDA negativo na amostra poacutes tratamento conforme figuras 5
e 6 Dentre as amostras tratadas com cloroquina 2850 tiveram o TDA negativado A glicina-
aacutecidaEDTA negativou o TDA em 33 das 50 amostras tratadas Apenas 17 amostras tratadas
com glicina-aacutecidaEDTA permaneceram com o TDA positivo e foram submetidas a um novo
tratamento
30
Figura 4 - TDA das amostras apoacutes sensibilizaccedilatildeo com anticorpos policlonais humanos Amostras na
figura a com intensidades de 3-4+ Na figura b amostras 4 e 7 com intensidade menor que 3+ e portanto foram
novamente sensibilizadas com nova aliacutequota de soro Anti-D e anti-S Apoacutes a segunda sensibilizaccedilatildeo
apresentaram reatividade 4 e 3+ respectivamente Os anticorpos utilizados para sensibilizaccedilatildeo foram D S c E
C e K
523 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS TEacuteCNICAS
No tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA houve dissociaccedilatildeo completa do anticorpo
em 33 amostras (66) das 50 amostras testadas enquanto que com a cloroquina foram 28
amostras (56) (tabela 1)
31
Graacutefico 1- Nuacutemero de amostras sesnsibilizadas por especificidade de anticorpo Entre as 50 amostras 12
foram sensibilizadas com anti-D 10 com anti-C 9 com anti-E 8 com anti-c 7 com anti-S 3 com anti-K e 1
com anti-Dia As especificidades dos anticorpos foram definidas de acordo o fenoacutetipo do doador
Figura 5 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com cloroquina Nas amostras onde houve
a dissociaccedilatildeo do anticorpo ( 2 21 a 23 26 39 a 42 45 46 e 49) a hemaacutecia se deposita no fundo no microtubo
apoacutes a centrifugaccedilatildeo (TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (1 3 24 25 43 44 47
48 e 50) o anticorpo ligado agraves hemaacutecias eacute alvo da AGH presente no gel (TDA positivo)
Anti-D 12
Anti-C 10
Anti-E 9
Anti-c 8
Anti-S 7
Anti-K 3 Anti-Dia 1
32
Figura 6 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA Nas amostras
onde houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo (4 6 7 12 a 15 17 34 35 37 e 38) a hemaacutecia se deposita no fundo no
microtubo apoacutes a centrifugaccedilatildeo ( TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (5 16 18
19 20 33 e 36 ) o AGH presente no gel se liga ao anticorpo ligado agraves hemaacutecias que ficam retidas no gel (TDA
positivo)
Tabela 1-Resultado geral do tratamento das hemaacutecias com glicina e cloroquina
Teacutecnica utilizada TDA negativo TDA positivo Total
Glicina-aacutecidaEDTA 33 17 50
Cloroquina 28 22 50
A glicina-aacutecidaEDTA conseguiu negativar mais amostras sensibilizadas com Anti-D
e anti-K que a cloroquina Para as hemaacutecias sensibilizadas com anti-E Anti-S e Anti-Dia
ambas as teacutecnicas dissociaram o anticorpo em 100 das amostras Os resultados detalhados
por especificidade do anticorpo apoacutes o primeiro tratamento com glicina-aacutecidaEDTA e com
cloroquina estatildeo na tabela 2
Para as amostras que permaneceram positivas (17 amostras) apoacutes o tratamento com a
glicina-aacutecidaEDTA foi realizado um novo tratamento Houve dissociaccedilatildeo do anticorpo em 3
amostras (18) apoacutes a segunda tentativa Nas demais 14 (82) amostras tratadas pela
segunda vez 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise
33
Tabela 2 - Resultados do TDA apoacutes tratamento das hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo
sensibilizado
ANTICORPOS
SENSIBILIZADOS
1ordm TRATAMENTO COM
GLICINA
TRATAMENTO COM
CLOROQUINA
TOTAL TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
Anti-D 8 4 0 12 12
Anti-C 6 4 10 0 10
Anti-E 9 0 9 0 9
Anti-c 0 8 1 7 8
Anti-S 7 0 7 0 7
Anti-K 2 1 0 3 3
Anti-Dia 1 0 1 0 1
TOTAL 33 17 28 22 50
A hemoacutelise foi verificada durante o procedimento de lavagem final das hemaacutecias com
soluccedilatildeo fisioloacutegica para a retirada dos reagentes As soluccedilotildees de lavagem ficaram
avermelhadas e as hemaacutecias com coloraccedilatildeo escura As amostras foram descartadas Dentre as
6 amostras que ainda puderam ser testadas para o TDA trecircs amostras negativaram sendo 1
sensibilizada com anti-D e 2 com anti-C (tabela 3)
Tabela 3 - Resultado apoacutes o segundo tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA
Tratamento com
glicina-aacutecidaEDTA
TDA Negativo TDA Positvo Hemoacutelise Total
Segundo tratamento 3 3 11 17
524 TESTAGEM DO ELUATO
Apoacutes o tratamento com a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA a soluccedilatildeo do eluato foi
testada para verificar a viabilidade dos anticorpos que foram dissociados ou eluiacutedos Dentre
as 50 amostras 41 apresentaram eluato positivo As nove amostras cujos eluatos foram
negativos haviam sido sensibilizadas com as seguintes especificidades de anticorpos anti-E 6
amostras (67) anti-S 2 amostras (40) e anti-D 1 amostra (8) (tabela 4) O eluato de
todas as amostras sensibilizadas com os anticorpos anti-C anti-c Anti-K e Anti-Dia foram
positivos Os eluatos positivos na triagem de anticorpos foram testados com paineacuteis de
identificaccedilatildeo para confirmar a especificidade e a viabilidade dos anticorpos (figuras 7 e 8)
34
525 EFEITO DA ELUICcedilAtildeO SOBRE OS ANTIacuteGENOS ERITROCITAacuteRIOS
Para verificar o efeito do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA e com a cloroquina
sobre a expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s foi realizada a fenotipagem das
amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes tratamento com ambas as teacutecnicas Foi avaliado
se o tratamento destruiu os antiacutegenos expressos antes do tratamento
Tabela 4- Resultado do Eluato das amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA
Anticorpos Eluato positvo Eluato negativo Total
Anti-D 11 1 12
Anti-C 10 0 10
Anti-E 3 6 9
Anti-c 8 0 8
Anti-S 5 2 7
Anti-K 3 0 3
Anti-Dia 1 0 1
Total 41 9 50
Figura 7 ndash Painel do eluato da amostra 21 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-C que foi
recuperado no eluato
Figura 8 ndash Painel do eluato da amostra 47 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-K que foi
recuperado no eluato
35
Dentre as 50 amostras 26 eram previamente fenotipadas para os antiacutegenos Fya Fy
b
Jka Jk
b S e s Dentre elas 20 alcanccedilaram TDA negativo apoacutes tratamento com a glicina-
aacutecidaEDTA e 20 negativaram apoacutes tratamento com cloroquina (tabela 5) Apoacutes ambas as
teacutecnicas os antiacutegenos originalmente expressos permaneceram positivos comprovando que natildeo
houve destruiccedilatildeo dos mesmos
Tabela 5 ndash Verificaccedilatildeo da interferecircncia do tratamento da hemaacutecias com cloroquina e glicina-
aacuteicdaEDTA sobre os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
AMOSTRAS
COM
FENOTIPAGEM
PREacuteVIA
TRATADAS COM
CLOROQUINA
TRATADAS COM
GLICINA
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
26
20
20
20
20
As amostras 24 47 e 50 eram positivas para o antiacutegeno K A cloroquina natildeo dissociou
o anticorpo em nenhuma das 3 amostras enquanto a glicina-aacutecidaEDTA foi efetiva nas
amostras 24 e 50 Foi testada a expressatildeo do antiacutegeno K nas amostras 24 e 50 apoacutes o
tratamento utilizando meacutetodo indireto em gel contendo AGH Apesar de natildeo ter sido avaliado
a intensidade de reaccedilatildeo de expressatildeo dos antiacutegenos podemos verificar na figura 9 que nas
duas amostras em que a teacutecnica foi efetiva e dissociou o anticorpo a expressatildeo do antiacutegeno K
continua presente mas a reatividade observada pode ser considerada 1+ sugerindo que houve
diminuiccedilatildeo da expressatildeo do antiacutegeno quando comparado com a expressatildeo observada em
hemaacutecia natildeo tratada
Os resultados individuais de cada amostra em ambas as teacutecnicas encontram-se
resumidas na tabela 6
526 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente onde foi constatada a presenccedila de autoanticorpo
a quente da classe IgG pelo TDA monoespeciacutefico (figura 10)O autoanticorpo tambeacutem
interferia na pesquisa e identificaccedilatildeo de anticorpos irregulares pois apresentava caracteriacutestica
de panaglutinina As hemaacutecias da paciente sensibilizadas ldquoin vivordquo foram tratadas com
cloroquina e com glicina-aacutecidaEDTA
36
Figura 9 ndash Fenotipagem das amostras 24 e 50 para antiacutegeno K apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
O teste positivo indica a presenccedila do antiacutegeno poreacutem a reatividade fraca (1+) sugere que houve enfraquecimento
de sua expressatildeo A direita a expressatildeo forte (4+) do antiacutegeno Kell em hemaacutecia controle natildeo tratada utilizada
como controle positivo
A cloroquina natildeo foi efetiva na retirada do anticorpo ligado as hemaacutecias ao contraacuterio
do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA que dissociou o anticorpo (figura 11)
A hemaacutecia tratada com glicina foi fenotipada para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
(figura 12) A fenotipagem para o sistema Rh (C c E e e) e Kell foi realizada em gel
especiacutefico monoclonal sem interferecircncia do TDA positivo (controle da reaccedilatildeo negativo)
O eluato resultante do tratamento com glicina-aacutecidaEDTA foi testada em gel com
hemaacutecias de painel de identificaccedilatildeo de anticorpos e apresentou resultado positivo com todas
as ceacutelulas (figura 13 e 14)
A amostra foi enviada para genotipagem e o resultado da genotipagem confirmou o
resultado da fenotipagem apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
527 TEMPO DE EXECUCcedilAtildeO DA TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
O tempo de reaccedilatildeo da glicina-aacutecidaEDTA eacute de 2 minutos Todas as amostras foram
tratadas obedecendo ao tempo descrito na literatura demonstrando que o mesmo eacute
reprodutiacutevel
37
Tabela 6- Resultados individuais por amostra
Amostra Especificidade
dos anticorpos
Intensidade do
TDA apoacutes
sensibilizaccedilatildeo
Tratamento
efetivo com
cloroquina
Tratamento
efetivo com
glicina
Eluato
poacutes
glicina
1 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 2 Dia 3+ Sim Sim 3+ 3 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 4 D 4+ Natildeo Sim 4+ 5 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 6 E 3+ Sim Sim Negativo 7 S 4+ Sim Sim 3+ 8 E 3+ Sim Sim 1+ 9 E 3+ Sim Sim 2+
10 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 11 D 4+ Natildeo Sim 4+ 12 D 4+ Natildeo Sim 4+ 13 S 3+ Sim Sim 3+ 14 S 3+ Sim Sim 3+ 15 D 3+ Natildeo Sim 3+ 16 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 17 E 3+ Sim Sim (+) 18 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 19 D 4+ Natildeo Natildeo 3+ 20 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 21 C 3+ Sim Sim 4+ 22 C 3+ Sim Sim 4+ 23 C 3+ Sim Sim 4+ 24 K 4+ Natildeo Sim 4+ 25 D 3+ Natildeo Natildeo Negativo 26 E 4+ Sim Sim Negativo 27 S 3+ Sim Sim 3+ 28 C 3+ Sim Natildeo 4+ 29 C 3+ Sim Sim 4+ 30 C 3+ Sim Sim 4+ 31 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 32 E 3+ Sim Sim Negativo 33 C 3+ Sim Natildeo 4+ 34 S 3+ Sim Sim Negativo 35 S 3+ Sim Sim Negativo 36 C 4+ Sim Natildeo 4+ 37 c 4+ Natildeo Natildeo 4+ 38 D 4+ Natildeo Sim 4+ 39 S 3+ Sim Sim 3+ 40 c 4+ Sim Natildeo 2+ 41 C 4+ Sim Natildeo 4+ 42 E 3+ Sim Sim Negativo 43 D 3+ Natildeo Sim 2+ 44 D 3+ Natildeo Sim 2+ 45 E 3+ Sim Sim Negativo 46 C 3+ Sim Sim 4+ 47 K 4+ Natildeo Natildeo 4+ 48 D 3+ Natildeo Sim 2+ 49 E 3+ Sim Sim Negativo 50 K 4+ Natildeo Sim 4+
TOTAL 50 28 33 41
38
Figura 10 ndash TDA monoespeciacutefico da amostra de paciente Hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo da classe
IgG
oacute Figura 11 ndash TDA apoacutes o tratamento com glicina-aacutecidaEDTA (esquerda) e cloroquina (direita) A glicina
negativou completamente o TDA enquanto a hemaacutecia tratada com cloroquina persistiu positiva (1+)
39
Figura 12 ndash Fenotipagem da amostra tratada com glicina-aacutecidaEDTA Fy(a+b+) Jk(a-b+) S+s+
Figura 13 ndash Painel em gel (LissAGH) do eluato apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de
intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
Figura 14 ndash ndash Painel ezimaacutetico (hemaacutecias tratadas com bromelina) do eluato em gel neutro apoacutes
tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
40
528 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Quanto a efetividade das teacutecnicas em negativar o TDA foi verificado que a glicina-
aacutecidaEDTA foi efetiva em 66 das amostras testadas no primeiro tratamento (3350
amostras) enquanto a cloroquina conseguiu negativar 56 (2850) Esses resultados natildeo
apresentam diferenccedila significativa (pgt005) demostrando que a teacutecnica da glicina-
aacutecidaEDTA natildeo eacute superior mas eacute tatildeo efetiva quanto a da cloroquina
Quando aliamos os resultados de ambas as teacutecnicas verificamos que em 76 (3850)
das amostras o TDA foi negativado Esse dado indica que ainda que uma teacutecnica natildeo seja
eficaz na remoccedilatildeo do anticorpo eacute uma boa alternativa tentar a segunda teacutecnica jaacute que a falha
em remover o anticorpo utilizando uma delas natildeo prevecirc necessariamente a falha com a outra
Quando se utiliza o teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla (graacutefico 2) para comparar a utilizaccedilatildeo das
duas teacutecnicas com o resultado de cada uma isolada (somente a cloroquina ou somente a
glicina) verificamos que os resultados apresentam diferenccedila significativa (plt005) (quadro 3)
TRATAMENTO EFETIVO COM TOTAL PORCENTAGEM
Glicina ou cloroquina 38 76
Glicina e cloroquina 23 46
Glicina apenas 10 20
Cloroquina apenas 5 10
Nenhuma das teacutecnicas 12 24
Quadro 3 - Resultados comparativos entre as teacutecnicas utilizadas
41
Graacutefico 2 - Teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla entre as teacutecnicas aplicadas A- Glicina e Cloroquina B-Cloroquina C-
Glicina ( plt005)
42
6 DISCUSSAtildeO
Os reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA podem ser adquiridos em
forma de kit comercial prontos para uso poreacutem natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil A preparaccedilatildeo
dos reagentes ldquoin houserdquo a partir de sais comerciais adquiridos se mostrou viaacutevel Os
reagentes glicina e o tampatildeo Tris armazenados de forma correta se mantiveram estaacuteveis por
um periacuteodo de 7 meses Somente o reagente EDTA precipitou mesmo armazenado em
condiccedilotildees adequadas sugerindo que o mesmo deve ser preparado em menor quantidade e
armazenado em aliacutequotas A soluccedilatildeo de cloroquina tambeacutem pode ser preparada ldquoin houserdquo e
pode ser armazenado por um mecircs A legislaccedilatildeo brasileira autoriza a utilizaccedilatildeo de reagentes
preparados a partir de sais comerciais como a cloroquina e a glicina-aacutecidaEDTA desde que
os sais tenham autorizaccedilatildeo da vigilacircncia sanitaacuteria para a comercializaccedilatildeo (BRASIL 2001)
A comparaccedilatildeo quanto a efetividade em dissociar anticorpos em amostras com TDA
positivos entre a teacutecnica da glicina e a teacutecnica da cloroquina mostrou que natildeo haacute diferenccedila
estatiacutestica entre elas e que ambas satildeo igualmente eficientes Se utilizadas conjuntamente haacute
maior possibilidade de elucidaccedilatildeo dos casos
Uma vantagem da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eacute que ela permite numa mesma
amostra eluir o anticorpo ligado aacute hemaacutecia assim como fenotipar a hemaacutecia tratada Devido a
sua dupla utilidade a teacutecnica eacute vantajosa principalmente em pacientes em que pouco volume
de amostra pode ser coletado como em casos de crianccedilas e receacutem-nascidos
A fenotipagem poacutes tratamento se mostrou viaacutevel jaacute que os antiacutegenos de maior
importacircncia natildeo sofreram alteraccedilotildees Nas 20 amostras que foram fenotipadas antes e apoacutes
tratamento para verificar a influecircncia dos reagentes na expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a
Jkb S e s natildeo houve destruiccedilatildeo dos mesmos por nenhuma das duas teacutecnicas
Para as amostras positivas para o antiacutegeno Kell (350) e sensibilizadas com o
respectivo anticorpo a teacutecnica da glicina foi efetiva em negativar o TDA em apenas duas
delas mas apoacutes o tratamento foi verificada uma fraca reatividade da reaccedilatildeo antiacutegeno-
anticorpo sugerindo que houve um enfraquecimento da expressatildeo do antiacutegeno conforme
esperado e descrito na literatura (BYRNE 1991 PALLAS WILER E MCGEE 1991
ROZIERS e SQUALI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012 e KATHARIA e
CHAUDHARY 2013) A accedilatildeo da glicina sobre o antigeno Kell natildeo representa impedimento
para seu uso uma vez que na impossibilidade de testar o antiacutegeno Kell o banco de sangue
consegue facilmente atender a solicitaccedilatildeo de transfusatildeo com unidades de hemaacutecias Kell
43
negativas jaacute que eacute um antiacutegeno de baixa prevalecircncia na populaccedilatildeo variando de 15 na
populaccedilatildeo africana a 9 nos europeus (DANIELS 2011)
A soluccedilatildeo resultante da dissociaccedilatildeo do anticorpo pela teacutecnica da glicina pode ainda ser
utilizada como eluato podendo substituir a teacutecnica de eluiccedilatildeo com reagentes comercias (kits
de eluiccedilatildeo aacutecida) que tem alto custo aproximadamente entre R$2000 a R$2500 por teste
Em 41 amostras (82) houve a dissociaccedilatildeo e recuperaccedilatildeo do anticorpo que estava
sensibilizando as hemaacutecias Em 9 amostras (18) os anticorpos foram eluiacutedos poreacutem
apresentaram reaccedilatildeo negativa quando testadas com hemaacutecias de triagem entre eles o anti-E
(6) anti-S (2) e Anti-D (1) Eacute possiacutevel que a correccedilatildeo pH do meio (WALKER 2011) natildeo
tenha sido adequada o que pode ter desfavorecido a reatividade do anticorpo
Para as amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA nas quais natildeo houve dissociaccedilatildeo do
anticorpo pelo primeiro tratamento (1750) o segundo tratamento natildeo se mostrou eficaz jaacute
que 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise O tempo de
armazenagem natildeo parece ter influenciado jaacute que todas as amostras foram testadas dentro de
48 horas apoacutes a coleta Outros fatores que natildeo foram verificados podem ter levado a
hemoacutelise Apesar da literatura (LOUIE JIENG e ZEROULIS 1986 e BYRNE 1991)
recomendar um segundo tratamento ele eacute pouco eficaz tendo negativado apenas 3 das 17
amostras testadas
A amostra de paciente que apresentou sensibilizaccedilatildeo ldquoin vivordquo mostrou melhor
efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA sobre a da cloroquina possibilitando
fenotipagem para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s que natildeo foram destruiacutedos apoacutes o
tratamento comprovado atraveacutes da genotipagem
A presenccedila de autoanticorpo a quente com presenccedila de hemoacutelise (AHAI) ou natildeo pode
mascarar a presenccedila de aloanticorpo interferindo na rotina soroloacutegica da fenotipagem que eacute
uma importante ferramenta para auxiliar na seleccedilatildeo de hemaacutecias para transfusatildeo (SHIREY et
al 2002) Esses pacientes frequentemente possuem aloanticorpos associados ao
autoanticorpo e a prevalecircncia de aloimunizaccedilatildeo entre eles varia entre 12 a 40 (LEGER e
GARRATY 1999 BRANCH e PETZ 1999) o que dificulta ainda mais a escolha do melhor
componente a ser transfundido aleacutem de aumentar a possibilidade reaccedilotildees hemoliacuteticas imunes
poacutes-transfusionais
Nesses casos as teacutecnicas de dissociaccedilatildeo de anticorpos satildeo importantes para tratar
amostras de pacientes e a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser usada como uma opccedilatildeo
pois se mostrou eficaz na dissociaccedilatildeo anticorpo ligado agraves hemaacutecias deixando livre a
superfiacutecie das mesmas permitindo a fenotipagem por antisoros IgG Paralelamente os
44
anticorpos eluiacutedos tambeacutem puderam ser estudados O mesmo natildeo ocorre com a cloroquina
que permite apenas a fenotipagem e tampouco com os kits de eluiccedilatildeo aacutecida disponiacuteveis no
mercado nacional que satildeo destinados a realizaccedilatildeo do eluato mas destroem as hemaacutecias
O tempo de tratamento na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA tambeacutem eacute uma vantagem
pois foi possiacutevel reproduzir no tempo determinado de 2 minutos enquanto a cloroquina
demora ateacute duas horas
Ainda que a aplicaccedilatildeo das teacutecnicas por biologia molecular estejam cada vez mais
presentes na rotina imuno-hematoloacutegica e possibilitam estabelecer o fenoacutetipo deduzido do
genoacutetipo elas natildeo estatildeo disponiacuteveis na maioria dos centros e sua realizaccedilatildeo exige algumas
horas A resoluccedilatildeo imediata do problema transfusional necessita dos resultados soroloacutegicos
pois com frequecircncia natildeo eacute possiacutevel aguardar o resultado do teste molecular Dessa forma
apesar da crescente importacircncia da genotipagem eritrocitaacuteria teacutecnicas soroloacutegicas aplicadas
corretamente e no momento propiacutecio satildeo de grande utilidade para resolver problemas imuno-
hematoloacutegicos como ocorre com a fenotipagem em pacientes com TDA positivo
45
7 CONCLUSAtildeO
A teacutecnica da glicina aacutecidaEDTA mostrou-se efetiva em remover os anticorpos que
sensibilizavam as hemaacutecias e pode ser utilizada com seguranccedila antes da fenotipagem
eritrocitaacuteria Por ser uma teacutecnica de raacutepida execuccedilatildeo eacute uma alternativa aplicaacutevel
principalmente em casos urgentes de pacientes que apresentam autoanticorpos
46
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50
9 ANEXOS
51
FUNDACcedilAtildeO HEMOCENTRO DE RIBEIRAtildeO PRETO
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE)
Tiacutetulo da pesquisa Aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina aacutecida-EDTA e avaliaccedilatildeo da
eficaacutecia no tratamento de hemaacutecias com teste direto da antiglobulina positivo
Pesquisadora responsaacutevel Ceacutelia Kazue Abiko
Orientador Prof Dimas Tadeu Covas
Co-orientadora Dra Flaacutevia Leite Souza Santos
Objetivo da pesquisa Vocecirc estaacute sendo convidado a participar de uma pesquisa que tem
como objetivo padronizar uma nova teacutecnica para auxiliar na tipagem sanguiacutenea de pacientes
A tipagem sanguiacutenea pode sofrer interferecircncia da presenccedila de anticorpos ligados aos gloacutebulos
vermelhos do sangue Nessas situaccedilotildees eacute difiacutecil selecionar o melhor sangue para o paciente e
eacute preciso a utilizaccedilatildeo de teacutecnicas adicionais para remover essas interferecircncias
Esta pesquisa tem como objetivo estudar outra teacutecnica para remover esses anticorpos e
comparaacute-la com a teacutecnica atualmente utilizada Para isso precisamos de amostras de pacientes
e doadores voluntaacuterios
Se vocecirc eacute um doador eacute necessaacuterio que vocecirc autorize a coleta de 5 ml (1 tubo) a mais
de seu sangue
Se vocecirc eacute um paciente natildeo haveraacute necessidade de nova amostra pois utilizaremos as
amostras jaacute coletadas para os testes preacute-transfusionais e os resultados encontrados nesta
pesquisa natildeo iratildeo interferir na escolha da (s) bolsa (s) de sangue que vocecirc possa vir a receber
Se vocecirc concordar em participar leia com atenccedilatildeo o texto abaixo e assine as duas vias
rubricando todas as paacuteginas deste termo de consentimento Uma via original assinada e
rubricada por vocecirc e pela pesquisadora ficaraacute com vocecirc
As suas informaccedilotildees seratildeo mantidas em sigilo pela pesquisadora e natildeo haveraacute
armazenamento de material para pesquisas posteriores Os seus dados seratildeo usados apenas
neste estudo e quando o trabalho for publicado seu nome e qualquer outra informaccedilatildeo que
possam identificaacute-lo natildeo seratildeo revelados
Eacute pouco provaacutevel que o que noacutes aprendermos com este estudo tenha um benefiacutecio
direto para vocecirc assim como natildeo poderemos dar nada em troca pela sua participaccedilatildeo na
pesquisa
Nosso objetivo com esta pesquisa eacute que os resultados poderatildeo ser uacuteteis para o
tratamento de pacientes no futuro Os riscos da participaccedilatildeo satildeo miacutenimos Se vocecirc eacute um
doador de sangue a amostra seraacute coletada no momento da doaccedilatildeo natildeo exigindo punccedilatildeo
venosa adicional
52
Eacute seu direito ter acesso aos resultados dos testes da pesquisa Esses resultados natildeo
seratildeo fornecidos automaticamente a vocecirc mas caso vocecirc se interesse em saber o resultado ou
tiver alguma duacutevida sobre a sua participaccedilatildeo neste estudo deveraacute entrar em contato com Ceacutelia
Kazue Abiko pelo telefone (18) 99718-3551
Vocecirc tem total liberdade de optar por natildeo participar da pesquisa Caso aceite
participar poderaacute desistir a qualquer momento ou retirar seu consentimento mesmo apoacutes ter
coletado o sangue Para cancelar sua participaccedilatildeo basta avisar a pesquisadora e os seus dados
seratildeo retirados do projeto
Qualquer duacutevida eacutetica sobre a pesquisa poderaacute entrar em contato com o Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa do Hospital das Cliacutenicas e da Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto
(CAMPUS UNIVERSITAacuteRIO bairro Monte Alegre CEP 14048-900 Ribeiratildeo Preto-SP
Telefone (16) 3602-2228 FAX (16) 3633-1144 e-mail cephcrpuspbr)
Consentimento de participaccedilatildeo
A Consentimento do participante
Li as informaccedilotildees acima sobre o estudo e recebi explicaccedilotildees sobre a participaccedilatildeo no estudo
Portanto dou o meu consentimento para participar do estudo
___________________________________________________________________________
Nome completo
___________________________________________________________________________
Assinatura
___________
Data
__________________________________________________________________________________
Nome completo da pesquisadora
___________________________________________________________________________
Assinatura
_____________
Data
12
laboratorial de diversos quadros hemoliacuteticos entre eles a anemia hemoliacutetica autoimune
(AHAI) a reaccedilatildeo hemoliacutetica imune poacutes-transfusional a siacutendrome do linfoacutecito passageiro a
doenccedila hemoliacutetica perinatal e a hemoacutelise droga-dependente (LEGER 2011)
Resultados de TDA positivos foram tambeacutem observados em indiviacuteduos com niacuteveis
seacutericos elevados de IgG ou complemento sem evidecircncia de anemia hemoliacutetica imune como
em pacientes com doenccedila falciforme talassemia doenccedila renal crocircnica mieloma muacuteltiplo
doenccedilas autoimunes e siacutendrome da imunodeficiecircncia adquirida (SIDA) Aleacutem disso pequenas
quantidades de IgG (5 a 90 moleacuteculas por hemaacutecia) e complemento (5 a 40 moleacuteculas por
hemaacutecia) podem estar presentes nas hemaacutecias de indiviacuteduos saudaacuteveis sem associaccedilatildeo com
reduccedilatildeo na sobrevida das mesmas A positividade do TDA depende da populaccedilatildeo estudada e
pode variar de 01 entre doadores de sangue sem qualquer sinal cliacutenico de hemoacutelise ateacute
15 em pacientes hospitalizados (CASTILHO JUNIOR e REID 2015 LEGER 2011)
Indiviacuteduos que apresentam TDA positivo seja agraves custas de IgG eou complemento
com ou sem sinais cliacutenicos de hemoacutelise teratildeo a fenotipagem eritrocitaacuteria prejudicada A
fenotipagem de indiviacuteduos com TDA positivo especialmente quando utilizado o teste indireto
da antiglobulina pode acarretar resultados falsos positivos e levar a seleccedilatildeo de fenoacutetipo
incorreto para transfusatildeo
132 TESTE INDIRETO DA ANTIGLOBULINA
O teste indireto da antiglobulina (TIA) eacute utilizado para revelar a sensibilizaccedilatildeo ldquoin
vitrordquo das hemaacutecias e eacute aplicado a diversos testes soroloacutegicos em imunohematologia entre
eles a pesquisa de anticorpos identificaccedilatildeo de anticorpos testes de compatibilidade
fenotipagem eritrocitaacuteria e titulaccedilatildeo de anticorpos Na teacutecnica indireta a hemaacutecia que contecircm
o antiacutegeno eacute colocada em contato ldquoin vitrordquo com o anticorpo que se liga mas natildeo promove a
aglutinaccedilatildeo visiacutevel A adiccedilatildeo da AGH forma uma malha entre os anticorpos que sensibilizam
as hemaacutecias e provoca a aglutinaccedilatildeo macroscoacutepica (figura 2)
Caso a amostra de hemaacutecia estudada seja previamente sensibilizada resultados falsos
positivos podem ser obtidos no TIA jaacute que a AGH reagiraacute com a moleacutecula que sensibilizava
anteriormente a hemaacutecia mesmo se o anticorpo especiacutefico natildeo tiver se ligado ao antiacutegeno
correspondente
13
133 CONDICcedilOtildeES CLIacuteNICAS COM TDA POSITIVO
O TDA positivo deve ser interpretado cuidadosamente sempre em conjunto com o
quadro cliacutenico do paciente A positividade isolada do TDA natildeo significa hemoacutelise A
interpretaccedilatildeo do teste positivo requer o conhecimento do diagnoacutestico do paciente da presenccedila
de sinais e sintomas sugestivos de hemoacutelise assim como de seu histoacuterico transfusional
gestacional e de informaccedilotildees sobre o uso recente de medicaccedilotildees (LEGER 2011)
Figura 2 ndash Princiacutepio do teste indireto da antiglobulina O TIA pode ser utilizado na pesquisa de anticorpos de
especificidades desconhecidas livres no soroplasma como eacute o caso da pesquisa e identificaccedilatildeo de anticorpos
irregulares Ele eacute tambeacutem utilizado para determinar a presenccedila de antiacutegenos na membrana da hemaacutecia quando
satildeo empregados soros de especificidades conhecidas da classe IgG No primeiro caso o soroplasma contendo o
anticorpo desconhecido eacute colocado em contato com hemaacutecias cujo perfil antigecircnico eacute conhecido No segundo
caso utiliza-se soro de especificidade conhecida da classe IgG para determinar a presenccedila ou ausecircncia de um
antiacutegeno na membrana O anticorpo encontra o antiacutegeno correspondente e ocorre a ligaccedilatildeo do anticorpo agrave
hemaacutecia mas natildeo ocorre aglutinaccedilatildeo Apoacutes a adiccedilatildeo da AGH que se liga aos anticorpos formando uma malha
ocorre a aglutinaccedilatildeo visiacutevel
O TDA positivo eacute uma achado claacutessico de algumas condiccedilotildees cliacutenicas como a reaccedilatildeo
transfusional hemoliacutetica a doenccedila hemoliacutetica do feto e do receacutem-nascido (DHFRN) a anemia
hemoliacutetica induzida por drogas a siacutendrome do linfoacutecito passageiro e a anemia hemoliacutetica
autoimune (AHAI) Portanto o TDA positivo pode ser decorrente da sensibilizaccedilatildeo da
hemaacutecia autoacuteloga por um autoanticorpo ou por um aloanticorpo ligado agrave hemaacutecia alogecircnica
circulante A positividade do TDA pode ainda ocorrer de forma passiva em pacientes que
14
recebem imunoglobulinas humanas ou ainda pela transfusatildeo de plaquetas ABO natildeo idecircntico
(LEGER 2011 RALPH 2012 ZANTEK et al 2012)
Nas reaccedilotildees transfusionais hemoliacuteticas imunes o aloanticorpo do receptor sensibiliza
as hemaacutecias transfundidas do doador e reduz sua sobrevida ao removecirc-la precocemente da
circulaccedilatildeo pela fagocitose no sistema retiacuteculo-endotelial ou pela hemoacutelise intravascular As
reaccedilotildees podem ser agudas se ocorrem ateacute 24 horas ou tardias quando ocorrem apoacutes 24 horas
da transfusatildeo A gravidade das reaccedilotildees hemoliacuteticas pode variar de um simples rendimento
transfusional inadequado agrave quadros graves de hemoacutelise intravascular evoluindo ateacute mesmo
com choque vascular e oacutebito O TDA pode resultar negativo caso toda massa eritrocitaacuteria
transfundida tenha sido destruiacuteda (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
Na doenccedila hemoliacutetica do feto e do receacutem-nascido (DHFRN) anticorpos maternos da
classe IgG atravessam a barreira placentaacuteria e sensibilizam as hemaacutecias fetais que seratildeo
destruiacutedas precocemente levando agrave anemia fetal Apesar da incompatibilidade ABO feto-
materna ser a causa mais frequente de DHFRN raramente ela eacute responsaacutevel pela ocorrecircncia
de quadros graves Por outro lado anticorpos contra antiacutegenos do sistema Rh e Kell
especialmente Anti-D (Anti-RH1) Anti-c (Anti-RH4) e Anti-Kell (Anti-KELL1) satildeo
conhecidos por causar DHFRN severa Raramente outros anticorpos tambeacutem podem estar
implicados na DHFRN como os anticorpos contra antiacutegenos do sistema Kidd Duffy MNS e
Diego (ZANTEK et al 2012)
A hemoacutelise droga-dependente eacute causada pela produccedilatildeo de um anticorpo voltado contra
a droga ligada agrave membrana eritrocitaacuteria ou ainda contra o complexo droga-membrana A
classe de medicaccedilotildees mais comumente envolvida eacute a dos antimicrobianos betalactacircmicos
(penicilinas e cefalosporinas) mas outras classes como quimioteraacutepicos e anti-inflamatoacuterios
tambeacutem satildeo descritos (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
Apoacutes transplante de ceacutelulas progenitoras hematopoieacuteticas em que o doador possui
anticorpos contra antiacutegenos eritrocitaacuterios do receptor o linfoacutecito de memoacuteria do doador pode
resistir ao esquema imunossupressor utilizado e continuar a produccedilatildeo de anticorpos que
reconhecem a hemaacutecia incompatiacutevel do receptor ainda circulante O quadro cliacutenico pode
variar de um simples TDA positivo sem outros sinais ou sintomas ateacute um quadro hemoliacutetico
grave e abrupto (LEGER 2011)
15
134 ANEMIA HEMOLIacuteTICA AUTOIMUNE
A anemia hemoliacutetica autoimune eacute caracterizada pela destruiccedilatildeo precoce das hemaacutecias
autoacutelogas por autoanticorpos que sensibilizam as hemaacutecias e levam agrave fagocitose pelos
macroacutefagos no sistema reticulo-endotelial ou hemoacutelise intravascular O diagnoacutestico da AHAI
baseia-se na presenccedila de hemoacutelise cliacutenica associada agrave evidecircncia de fator imune representado
pelo TDA positivo As classes de anticorpos envolvidas em quadros de AHAI satildeo IgG IgM e
raramente IgA (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012) Satildeo raros os casos de AHAI com TDA
negativo que podem estar relacionados a um autoanticorpo de baixa avidez de densidade
inferior agrave detecccedilatildeo do meacutetodo ou ainda de classe de imunoglobulina natildeo avaliada pelo
meacutetodo utilizado para o teste (GARRATY 2005)
A AHAI pode ser classificada em dois grupos principais de acordo com a melhor
temperatura de reaccedilatildeo do autoanticorpo As anemias hemoliacuteticas causadas por anticorpos
quentes que reagem melhor a 37oC e geralmente IgG representam 80 dos casos de AHAI
Nas AHAI por anticorpo quente o TDA pode ser positivo para IgG mais complemento (67)
somente IgG (20) ou somente por complemento (13) As anemias causadas por
anticorpos frios geralmente da classe IgM e que reagem melhor em temperatura ambiente ou
a 4oC representam aproximadamente 20 dos casos de AHAI Por exibirem amplitude
teacutermica esses anticorpos ligam-se agraves hemaacutecias ao atingirem a circulaccedilatildeo nas extremidades do
corpo fixam o complemento e desprendem-se da hemaacutecia apoacutes retornar para partes mais
quentes Por esse motivo em AHAI por anticorpos frios o TDA eacute positivo apenas agraves custas
de C3 e normalmente o IgM natildeo eacute detectado (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
A presenccedila do autoanticorpo IgG pode ser confirmada atraveacutes da eluiccedilatildeo do anticorpo
da hemaacutecia Tipicamente o eluato na AHAI por anticorpo quente reage com todas as ceacutelulas
testadas de um painel de hemaacutecias alogecircnicas do tipo ldquoOrdquo ou pode eventualmente exibir uma
especificidade conhecida como Anti-e (Anti-RH5) Nas AHAI a frio por sua vez espera-se
um eluato negativo (LEGER 2011)
Os autoanticorpos satildeo com frequecircncia encontrados livres no plasma e natildeo somente
ligados agraves hemaacutecias autoacutelogas Eles podem interferir em todas as fases dos testes preacute-
transfusionais nas quais o plasma eacute testado especialmente os autoanticorpos quentes que
acarretam resultados positivos em todos os testes levados agrave fase de antiglobulina humana
Esses anticorpos portanto positivam a pesquisa de anticorpos irregulares e mascaram a
presenccedila de aloanticorpos de significado cliacutenico Aproximadamente 60 dos pacientes que
apresentam AHAI a quente apresentam anticorpos que reagem em meio salino mas se forem
16
levados em conta meacutetodos mais sensiacuteveis como PEG enzima e estudo em gel a positividade
pode ser superior a 90 (LEGER 2011)
Aleacutem da eficaacutecia da transfusatildeo ser comprometida pela diminuiccedilatildeo da vida-meacutedia das
hemaacutecias a presenccedila do autoanticorpo dificulta a realizaccedilatildeo dos testes preacute-transfusionais e
compromete a seguranccedila transfusional Os autoanticorpos reagem normalmente como
panaglutininas pois satildeo normalmente voltados contra antiacutegenos puacuteblicos na maior parte das
vezes contra antiacutegenos do sistema Rh Por apresentarem essas caracteriacutesticas podem ainda
mascarar a presenccedila de aloanticorpos de significado clinico e levar a testes de compatibilidade
positivos exigindo uma avaliaccedilatildeo criteriosa da necessidade da transfusatildeo (BRANCH e PETZ
1999 JUNIOR e OLIVATO 2004)
Remover a interferecircncia do autoanticorpo para avaliar a presenccedila de aloanticorpos
mascarados nem sempre eacute possiacutevel mesmo utilizando teacutecnicas de autoadsorccedilatildeo ou
aloadsorccedilatildeo que aleacutem de tudo satildeo demoradas e exigem de 2 a 6 horas para conclusatildeo
(GARRATY e GEORGE 2002) Nesses casos a fenotipagem eritrocitaacuteria do paciente eacute de
extrema utilidade especialmente em situaccedilotildees de urgecircncia A definiccedilatildeo do fenoacutetipo do
paciente para os antiacutegenos de maior importacircncia cliacutenica pode auxiliar a seleccedilatildeo de unidades
de hemaacutecias com mesmo fenoacutetipo o que garante que eventuais aloanticorpos natildeo
identificados sejam respeitados e tambeacutem evita nova sensibilizaccedilatildeo (JUNIOR e OLIVATO
2004 SHIREY et al 2002)
135 TRATAMENTO DE HEMAacuteCIAS COM TDA POSITIVO
O TDA positivo impede a fenotipagem eritrocitaacutecia por meacutetodos que exigem a fase de
AGH uma vez que a aglutinaccedilatildeo ocorreraacute devido agrave interaccedilatildeo da AGH com o autoanticorpo
que sensibiliza a hemaacutecia do paciente levando a resultados falso positivos Em algumas
situaccedilotildees como na AHAI por anticorpo quente a fenotipagem eacute especialmente importante
pois o autoanticorpo interfere na triagem e identificaccedilatildeo de anticorpos assim como no teste de
compatibilidade e dificultam a detecccedilatildeo de aloanticorpos de significado cliacutenico que
obrigatoriamente devem ser respeitados Nessas situaccedilotildees a fenotipagem eritrocitaacuteria
determina o perfil antigecircnico do paciente e possibilita o fornecimento de unidades de
hemaacutecias com o mesmo fenoacutetipo para a transfusatildeo evitando a sensibilizaccedilatildeo para novos
antiacutegenos assim como reaccedilotildees hemoliacuteticas transfusionais No entanto eacute necessaacuterio aplicar
meacutetodos que natildeo sofram interferecircncia do TDA positivo ou seja meacutetodos que natildeo necessitem
da fase de AGH ou meacutetodos de bloqueio do anticorpo sem bloquear o antiacutegeno Uma opccedilatildeo eacute
a utilizaccedilatildeo de soros monoclonais IgM (salinos ou de meio proteico natildeo concentrado) mas
17
nem sempre esses reagentes estatildeo disponiacuteveis especialmente os reagentes monoclonais para
os antiacutegenos dos sistemas Duffy ( Fya Fy
b) Kidd ( Jk
a Jk
b) e MNS (S s) (JUNIOR e
OLIVATO 2004) Outra opccedilatildeo eacute a teacutecnica de bloqueio que pode ser utilizada para tratar
hemaacutecias para posterior fenotipagem em casos de TDA positivos com reatividade le2+
Em casos onde a positividade do TDA eacute maior que 2+ estaacute indicada a tratamento
quiacutemico para remoccedilatildeo da interferecircncia do autoanticorpo antes de realizar a fenotipagem Entre
as teacutecnicas utilizadas atualmente estatildeo o ZZAP a cloroquina e a glicina aacutecidaEDTA
1351 TEacuteCNICA DE BLOQUEIO
A teacutecnica de bloqueio se baseia na utilizaccedilatildeo de anti-IgG (Coombs monoespeciacutefico)
para tratar as hemaacutecias com TDA positivo O anticorpo anti-IgG se liga aos anticorpos que
estatildeo sensibilizando a hemaacutecias poreacutem sem o bloquear os antiacutegenos Os antiacutegenos que natildeo
estatildeo sensibilizados podem ser detectados atraveacutes dos antissoros especiacuteficos (SERERAT
VEIDT E DUTCHED 2000)
1352 TRATAMENTO DE HEMAacuteCIAS COM ZZAP
O Sulphydryl-Proteolytic Enzyme (ZZAP) que eacute uma mistura de ditiotreitol (DTT)
mais papaiacutena ativada com cisteiacutena eacute um reagente capaz de dissociar imunoglobulinas da
classe IgG ligadas a membrana dos eritroacutecitos enquanto trata enzimaticamente as hemaacutecias
O tratamento enzimaacutetico tambeacutem potencializa a ligaccedilatildeo do autoanticorpo ao antiacutegeno e
acelera o processo de autoadsorccedilatildeo O ZZAP pode desnaturar os antiacutegenos do sistema Duffy
MNS e Kell o que limita sua aplicaccedilatildeo para fins de fenotipagem (BRANCH e PETZ 1982)
1353 CLOROQUINA
Em 1982 Edwards Moulds e Judd propuseram a utilizaccedilatildeo da teacutecnica da cloroquina
que dissociava os complexos antiacutegeno-anticorpo e mantinha a membrana das hemaacutecias
iacutentegras Os derivados quinolecircicos jaacute haviam sido descritos anteriormente por Domokos e
Aszody em 1964 e Holtz Mantel e Buck em 1973 (apud Edwards Moulds e Judd 1982) pela
sua capacidade de separar imunocomplexos e inibir as reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo reduzindo
as cargas eleacutetricas das superfiacutecie das hemaacutecias A teacutecnica eacute uma das mais utilizadas nos
centros brasileiros para remover a interferecircncia do autoanticorpo e eacute tambeacutem a teacutecnica
atualmente adotada pelo laboratoacuterio de imunohematologia do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto
18
Edwards Moulds e Judd (1982) demonstraram que a teacutecnica da cloroquina para
dissociaccedilatildeo de anticorpos eacute uma teacutecnica simples efetiva e confiaacutevel para dissociar
imunoglobulina das hemaacutecias Desde que a membrana das hemaacutecias permaneccedila intacta natildeo
haacute perda da reatividade dos antiacutegenos e a sua maior aplicaccedilatildeo eacute a fenotipagem de hemaacutecias
com TDA positivo Os autores verificaram que em 83 das amostras sensibilizadas in vivo e
22 amostras (no total de 40) sensibilizadas ldquoin vitrordquo apresentaram TDA negativo e
puderam ser fenotipadas A teacutecnica poreacutem natildeo consegue remover os componentes do
complemento na maioria dos casos
Champagne e colaboradores (1999) testaram a teacutecnica da cloroquina para dissociar
antiacutegenos Bg comparando com a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA e verificaram vantagem em
relaccedilatildeo ao uso de um uacutenico reagente diminuindo a manipulaccedilatildeo e verificou que o mesmo natildeo
destroacutei antiacutegeno Kell
A cloroquina tambeacutem mostrou-se pouco efetivo em remover anticorpos do sistema
Duffy da superfiacutecie das hemaacutecias (EDWARDS MOUDS e JUDD 1982 ROZIERS e
SQUALI 1997)
1353 GLICINA-AacuteCIDAEDTA
A afinidade e a estabilidade entre a ligaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo eacute definida como a
resultante entre forccedilas atrativas e repulsivas entre ambos (CARUCIO e WISE 2012) e resulta
da somatoacuteria de forccedilas quiacutemicas dinacircmicas e fracas (natildeo covalentes) como pontes de
hidrogecircnio forcas eletrostaacuteticas forca de Van der Waals e pontes hidrofoacutebicas A estabilidade
dessa ligaccedilatildeo eacute facilmente abalada por alteraccedilotildees quiacutemicas e fiacutesicas no meio da reaccedilatildeo como
a alteraccedilatildeo do pH A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA se baseia na mudanccedila do pH para a
quebra da ligaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo (KOSANKE 2012)
A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA foi primeiramente descrita em 1986 por Louie Jieng
e Zeroulis que utilizaram 50 amostras de doadores sensibilizados ldquoin vitrordquo com anticorpos A
teacutecnica foi efetiva em 48 amostras permitindo o estudo do eluato assim como a fenotipagem
das hemaacutecias Os autores testaram tambeacutem a teacutecnica em 100 hemaacutecias TDA positivo que
puderam ser utilizadas para teacutecnicas de autoadsorccedilatildeo
Byrne (1991) descreveu a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA modificada e tambeacutem
verificou como uma opccedilatildeo para o tratamento de hemaacutecias com TDA positivo que deixava as
hemaacutecias intactas e o eluato viaacutevel para ser fenotipado
19
Roziers e Squali (1997) e Katharia e Chaudhary (2013) compararam a teacutecnica da
glicina-aacutecidaEDTA com as teacutecnicas da cloroquina e do aquecimento Verificaram maior
eficiecircncia da glicina-aacutecidaEDTA em relaccedilatildeo as outras duas teacutecnicas pois com uma mesma
quantidade de amostra produzia as hemaacutecias livres de anticorpo e tambeacutem o eluato Mostrou-
se ainda superior devido ao menor tempo exigido para sua realizaccedilatildeo o que favorece seu uso
em situaccedilotildees de urgecircncia e emergecircncia
As duas desvantagens da teacutecnica poreacutem eacute o fato de destruir os antiacutegenos do sistema
Kell e o fato de natildeo remover fraccedilotildees do complemento ligadas agrave hemaacutecia (PALLAS WILER e
McGEE 1991 ROZIERS e SQUALLI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012
e KATHARIA e CHAUNDHARY 2013)
20
2 OBJETIVOS
21 OBJETIVO GERAL
211 Avaliar a eficaacutecia da glicina-aacutecidaEDTA em remover os anticorpos ligados agraves
hemaacutecias sensibilizadas por anticorpos da classe IgG
22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
221 Preparaccedilatildeo dos reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
verificaccedilatildeo da estabilidade dos mesmos e avaliar custos
222 Testar a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA em amostras de hemaacutecias
sensibilizadas por anticorpos antieritrocitaacuterios humanos
223 Comparar a efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA com a teacutecnica da
cloroquina quanto a capacidade de remover a interferecircncia do anticorpo ligado
a hemaacutecia
224 Testar o eluato das amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA
225 Verificar se houve destruiccedilatildeo dos antiacutegenos eritrocitaacuterios apoacutes o tratamento
com glicina-aacutecidaEDTA e com cloroquina
226 Verificar se o tempo de execuccedilatildeo da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA descrito
nos textos de referecircncia eacute reprodutiacutevel
21
3 JUSTIFICATIVA
Algumas condiccedilotildees cliacutenicas podem levar ao depoacutesito ldquoin vivordquo de anticorpos eou
fraccedilotildees do complemento sobre as hemaacutecias Entre elas estatildeo as reaccedilotildees hemoliacuteticas poacutes-
transfusionais a doenccedila hemoliacutetica perinatal o uso de medicamentos e principalmente a
AHAI Na AHAI um anticorpo normalmente da classe IgG ou IgM reconhece antiacutegenos
proacuteprios na membrana eritrocitaacuteria e reduz a sobrevida da hemaacutecia levando a sua destruiccedilatildeo
pelos macroacutefagos no sistema reticulo-endotelial ou agrave ativaccedilatildeo do complexo de ataque agrave
membrana e agrave lise intravascular Os autoanticorpos satildeo voltados na maioria das vezes contra
antiacutegenos eritrocitaacuterios de alta frequecircncia populacional conhecidos como antiacutegenos puacuteblicos
e por este motivo reconhecem tanto hemaacutecias autoacutelogas quanto alogecircnicas
Devido agrave presenccedila do autoanticorpo livre no plasma e tambeacutem do anticorpo eou
complemento ligado agrave hemaacutecia o banco de sangue pode encontrar dificuldades em todas as
fases dos testes preacute-transfusionais do paciente com AHAI e deve utilizar teacutecnicas que
auxiliem na escolha do melhor hemocomponente melhorando a seguranccedila transfusional Essas
teacutecnicas visam remover a interferecircncia do autoanticorpo livre no soro e do autoanticorpo
ligado agrave hemaacutecia permitindo a detecccedilatildeo de aloanticorpos associados e a realizaccedilatildeo da
fenotipagem eritrocitaacuteria respectivamente
A finalizaccedilatildeo dos testes preacute-tranfusionais na presenccedila de autoanticorpo pode levar
algumas horas e nem sempre o paciente poderaacute aguardar Nesse contexto torna-se vantajosa a
aplicaccedilatildeo de teacutecnicas de raacutepida execuccedilatildeo
O presente estudo propotildee aplicar e avaliar a eficaacutecia da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
em remover os anticorpos ligados agrave hemaacutecia o que permite a fenotipagem eritrocitaacuteria
estendida e a seleccedilatildeo de concentrados de hemaacutecias com mesmo fenoacutetipo do paciente
Atualmente no Hemocentro de Ribeiratildeo Preto a teacutecnica utilizada para esse fim eacute o
tratamento das hemaacutecias com difosfato de cloroquina cujo tempo de execuccedilatildeo pode demorar
ateacute duas horas enquanto a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser realizada em apenas dois
minutos o que a tornaria opccedilatildeo de escolha especialmente em situaccedilotildees de urgecircncia Ao
contraacuterio da cloroquina a glicina-aacutecidaEDTA permite tambeacutem o estudo do eluato das
hemaacutecias tratadas
22
4 METODOL OGIA
41 AMOSTRAS DE DOADORES
Foram coletados 50 amostras de doadores de sangue que compareceram ao
Hemonuacutecleo de Araccedilatuba no periacuteodo de junho a agosto de 2016 Foram convidados a
participar da pesquisa doadores de repeticcedilatildeo do tipo sanguiacuteneo ldquoOrdquo RhD positivo
cadastrados no sistema de banco de sangue (SBS) do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto
Todos os doadores que concordaram em participar da pesquisa assinaram o termo de
consentimento livre e esclarecido (TCLE)
No momento da doaccedilatildeo foram coletados adicionalmente 5 mL de sangue total em
soluccedilatildeo anticoagulante EDTA (aacutecido dietilenoaminoaceacutetico) dispensando punccedilatildeo venosa
adicional para coleta da amostra O fluxograma 1 resume as etapas desenvolvidas no projeto
Fluxograma 1 - Fluxo da pesquisa utilizando as amostras de doadores
23
411 FENOTIPAGEM
Foram verificados se os doadores jaacute tinham fenotipagem para outros sistemas de
grupos sanguiacuteneos aleacutem do sistema ABORh que eacute realizado rotineiramente
A fenotipagem eritrocitaacuteria para outros sistemas ou fenotipagem estendida eacute realizada
para identificar a presenccedila ou ausecircncia de antiacutegenos considerados de importacircncia cliacutenica No
Hemonuacutecleo de Araccedilatuba uma parcela de doadores de repeticcedilatildeo satildeo fenotipados para os
antiacutegenos dos sistemas de grupo sanguiacuteneo Rh (antiacutegenos C c E e e) Kell (antiacutegeno K)
Duffy (antiacutegenos Fya e Fy
b) Kidd (antiacutegenos Jk
a e Jk
b) e sistema MNSs (antiacutegenos S e s)
A fenotipagem para o Rh e Kell eacute realizada por metodologia de microplaca utilizando
25 microL de hemaacutecia lavada e diluiacuteda a 5 em salina e 25 microL do antissoro comercial especiacutefico
A reaccedilatildeo eacute incubada 15 minutos a temperatura ambiente e centrifugadas para leitura Para os
antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s a metolodogia utilizado eacute gel contendo antiglobulina
humana (gel LissCoombs poliespeciacutefico) da marca BIO-RAD onde se utiliza suspensatildeo de
hemaacutecia em LISS (Soluccedilatildeo de baixa forccedila iocircnica) A suspensatildeo eacute preparada atraveacutes da
diluiccedilatildeo de 10 microL de hemaacutecia em 1000 microL de LISS Pipetado 50 microL dessa diluiccedilatildeo no gel e
adicionado 25 microL do antissoro especiacutefico Incuba-se em banho seco por 15 minutos a 37 deg
Celsius e eacute centrifugado em centriacutefuga especiacutefica Os antissoros utilizados eram das marcas
Fresenius e Lorne
Foi verificado a fenotipagem do doador no banco de dados do Hemocentro Os
registros dos fenoacutetipos dos doadores ficam armazenadas no sistema de banco de sangue
(SBS) Para doadores que natildeo tinham fenotipagem estendida preacutevia para antiacutegenos do sistema
Rh (C c E e e) e Kell (K) foi realizada a fenotipagem para esses antiacutegenos
O tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA e cloroquina para dissociar
anticorpos pode inativar enfraquecer ou destruir os antiacutegenos presentes nas hemaacutecias
alterando assim os resultados da fenotipagem Para verificar se houve destruiccedilatildeo dos
antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a e Jk
b S e s nas amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes
tratamento foram novamente fenotipadas ao final para os antiacutegenos que eram inicialmente
positivas
A repeticcedilatildeo da fenotipagem foi realizada nas amostras que apresentaram efetividade
no tratamento da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eou da cloroquina e a detecccedilatildeo do antiacutegeno
na amostra preacute-tratamento
24
412 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS HEMAacuteCIAS
As hemaacutecias foram sensibilizadas com antissoros policlonais humanos de amostras de
plasma fresco congelado de doadores com resultado de pesquisa de anticorpo irregular
positivos
A escolha do anticorpo para sensibilizar as hemaacutecias foi definida de acordo com o
fenoacutetipo do doador que deveria ser positivo para o respectivo antiacutegeno
Para a sensibilizaccedilatildeo um volume de antissoro (1 mL) e um volume (1 mL) de
hemaacutecias lavadas quatro vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica foram adicionadas a um tubo de 12 x
75 mm A mistura foi homogeneizada e incubada em banho maria (BM) a 37deg C por 60
minutos A seguir as hemaacutecias foram novamente lavadas 4 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica
para retirada dos anticorpos que natildeo se ligaram A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada
como controle negativo O teste da uacuteltima lavagem eacute importante para assegurar que os
anticorpos que poderatildeo ser detectados no eluato apoacutes o tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA
sejam aqueles que estavam ligados agraves hemaacutecias e natildeo aqueles livres no plasma O controle
negativo mostra que todo o anticorpo livre foi retirado (LEGER 2011)
Para o teste de presenccedila de anticorpo na soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foram incubadas
com hemaacutecias de triagem de anticorpos irregulares (ID-Diacell BIO-RAD) contendo os
antiacutegenos especiacuteficos Realizado a teacutecnica em gel LissCoombs com anti-IgG+C3d Incubado
no tempo de 15 minutos a temperatura de 37deg C e centrifugado 10 minutos em centriacutefuga
proacutepria
As 50 amostras de doadores foram sensibilizadas com os anticorpos policlonais
humanos
Apoacutes sensibilizadas rdquoin vitrordquo e lavadas as hemaacutecias foram diluiacutedas em soluccedilatildeo de
baixa forccedila iocircnica (LISS) na quantidade de 10 microL de hemaacutecia para 1000 microL de soluccedilatildeo A
suspensatildeo foi pipetada (50 microL) em coluna-gel-teste LissCoombs (BIO-RAD) que contecircm
antiglobulina poliespeciacutefico (IgG+C3d) e centrifugada em baixa rotaccedilatildeo conforme orientaccedilatildeo
do fabricante durante 10 minutos
As amostras deveriam apresentar aglutinaccedilatildeo com reatividade 3 a 4+ no TDA As
amostras que apresentaram reaccedilatildeo menor que 3+ foram novamente sensibilizadas com nova
aliacutequota do antissoro
25
413 TRATAMENTO DAS AMOSTRAS
As amostras sensibilizadas apresentando o TDA positivo 3 ou 4+ foram divididas em
duas aliacutequotas e submetidas a duas teacutecnicas diferentes com o objetivo de dissociar o anticorpo
ligado Uma aliacutequota da amostra foi tratada com soluccedilatildeo de difosfato de cloroquina enquanto
a outra aliacutequota foi tratada com glicina-aacutecidaEDTA
42 PREPARO DA GLICINA AacuteCIDA-EDTA
A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA utiliza 3 soluccedilotildees diferentes a glicina aacutecida o
EDTA e o tampatildeo TRIS
Os reagentes foram preparados utilizando os sais para anaacutelise (PA) de EDTA
(Na2EDTA2H2O) TRIS (C4H11NO3) Glicina (H2NCH2CO2H) NaCl e a soluccedilatildeo de aacutecido
cloriacutedrico (HCl) 12 N todos reagentes da marca SYNTH (quadro 1)
Para o preparo do tampatildeo glicina-acida eacute necessaacuterio o ajuste do pH para 15 Para esse
ajuste utiliza-se aacutecido cloriacutedrico (HCl) concentrado O pH foi medido com fitas reativas de pH
com escala de 1 a 14 da marca MERCK Posteriormente a soluccedilatildeo foi enviada ao laboratoacuterio
de controle de qualidade do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto e o pH medido no peagacircmetro O
tampatildeo glicina-aacutecida foi armazenado a 4deg e o tampatildeo tris e o EDTA em temperatura ambiente
controlada (20 a 24deg Celsius)
Apoacutes o preparo e durante a realizaccedilatildeo dos testes foram feitas inspeccedilotildees visuais para
verificaccedilatildeo de turvaccedilatildeo do meio e presenccedila de precipitados
Reagente Material Quantidade Preparo e
Conservaccedilatildeo
EDTA
EDTA
(Na2EDTA2H2O)
5 gramas Mistura ateacute
dissoluccedilatildeo do sal e
conserva em
temperatura ambiente Aacutegua Destilada 50 Ml
Tris
TRIS (C4H11NO3) 121 gramas Conservar em
temperatura ambiente NaCl 525g
Aacutegua destilada 100ml
Gliacutecina-aacutecida
Glicina
(H2NCH2CO2H) 15 gramas
Conservar a 4oC NaCl 116gramas
Aacutegua Destilada 200ml
HCL 12N Ajutar o pH para 15
Quadro 1 - Preparo dos Reagentes da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
Fonte - Manual teacutecnico AABB 2011
26
O tampatildeo glicina-aacutecida e o tampatildeo TRIS satildeo estaacuteveis por 7 meses O reagente EDTA
precipitou mesmo estando em temperatura em ambiente controlado Houve necessidade de
preparo de novo reagente
421 TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
1 Em um tubo de ensaio 12x75 mm eacute adicionado 08 mL da soluccedilatildeo de glicina-aacutecida A
esta soluccedilatildeo adiciona-se 02 mL de EDTA e mistura
2 Adiciona-se 02 mL de hemaacutecias sensibilizadas (lavada 4 vezes) A mistura eacute
homogeneizada e incubada por exatamente 2 minutos
3 A seguir 01 mL de tampatildeo TRIS eacute adicionado agrave mistura que eacute novamente
homogeneizada e centrifugada por 2 minutos a 3400 rpm O pH deve estar entre 7 a 75
4 Apoacutes centrifugaccedilatildeo separa-se em outro tubo o sobrenadante (eluato) e as hemaacutecias
que permanecem satildeo lavadas 4 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica para retirada de todo o
reagente e anticorpos livres
43 PREPARO DA CLOROQUINA
A cloroquina eacute diluiacuteda em tampatildeo PBS na concentraccedilatildeo de 20 (Quadro 2) e
armazenado a 4deg Celsius sua validade apoacutes o preparo eacute de 1 mecircs
A teacutecnica da cloroquina jaacute estaacute padronizada para rotina do laboratoacuterio de
imunohematologia do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto e suas unidades
Reagente Reagentes Quantidade PreparoConservaccedilatildeo
Cloroquina
Difosfato de cloroquina
(C18H32ClN3O8P2)
20 gramas
Conservar a 4deg Celsius
Tampatildeo PBS 100ml
NaOH 01 N Acertar o pH para
51
Quadro 2 - Preparo da Cloroquina Fonte - Manual teacutecnico da AABB 2011
431 TEacuteCNICA DA CLOROQUINA
1 4 partes da soluccedilatildeo pronta eacute adicionada a uma parte de hemaacutecias lavadas 4 vezes com
soluccedilatildeo fisioloacutegica
2 A mistura eacute incubada em temperatura ambiente por ateacute duas horas
3 Centrifugar a 3400 rpm por 2 minutos
27
4 Remover o sobrenadante lavar as hemaacutecias novamente com soluccedilatildeo fisioloacutegica 4
vezes
44 VERIFICACcedilAtildeO DA EFETIVIDADE DOS TESTES
Apoacutes tratamento pelas duas teacutecnicas o TDA foi repetido em todas as amostras para
verificar se os tratamentos foram efetivos e houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo Para as
amostras tratadas pela teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA que permaneceram com TDA positivo
novo tratamento foi realizado
45 TESTE DO ELUATO
O eluato resultante das amostras tratadas com glicina-acidaEDTA foi testado com
hemaacutecias de triagem A soluccedilatildeo do eluato foi incubada com as hemaacutecias de triagem de
anticorpos (ID-Diacell BIO-RAD) pela teacutecnica em gel LissCoombs O teste foi incubado 15
minutos a 37deg Celsius e centrifugado por 10 minutos em centrifuga proacutepria para a teacutecnica em
gel Os eluatos que apresentaram resultados positivos foram testados em painel de 11
hemaacutecias (ID-Diapanel BIO-RAD) para a identificaccedilatildeo do anticorpo
46 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente que apresentou TDA positivo por IgG e pesquisa
de anticorpo irregular positivo com presenccedila de autoanticorpo com reatividade panaglutinina
A amostra foi tratada em paralelo pelas duas teacutecnicas descritas e foi enviada para o
Hemocentro para genotipagem eritrocitaacuteria que foi realizado por metodologia PCR em tempo
real no equipamento Real-time system PCR 7500 ( Applied Biosystems Califoacuternia EUA)
28
5 RESULTADOS
51 REAGENTES
Para aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA satildeo necessaacuterios 3 diferentes
reagentes que podem ser encontrados em forma de kit pronto para uso No entanto esses kits
natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil Os reagentes satildeo tampatildeo glicina-aacutecida o EDTA e o tampatildeo
Tris
Todos os reagentes foram preparados rdquoin houserdquo a partir dos sais e soluccedilotildees PA (puro
para anaacutelise) da marca SYNTH que foram adquiridos para a pesquisa O custo estimado para
cada teste foi aproximadamente R$ 020 reais
Apoacutes o preparo os reagentes poderiam ser armazenados em condiccedilotildees adequadas pelo
periacuteodo de 1 ano (AABB 2011) Ao final do preparo e durante o periacuteodo de armazenamento
de fevereiro a setembro de 2016 foi realizada inspeccedilatildeo visual para verificar a presenccedila de
precipitados ou turvaccedilatildeo A soluccedilatildeo de glicina e o tampatildeo TRIS mostraram-se estaacuteveis ateacute o
final do periacuteodo Por sua vez o reagente EDTA precipitou mesmo estando armazenado em
temperatura ambiente controlada e foi necessaacuterio novo preparo
52 AMOSTRAS DE DOADORES
521 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS AMOSTRAS
Apoacutes incubaccedilatildeo da hemaacutecia com o antissoro a mesma foi lavada 4 vezes para retirada
dos anticorpos livres A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada Caso houvesse positividade na
soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem a etapa era repetida (figura 3) Das 50 amostras sensibilizadas a
uacuteltima lavagem foi positiva somente em 3 delas Nas 3 amostras o anticorpo utilizado para
sensibilizaccedilatildeo foi o anti-K Apoacutes repetido nova etapa de lavagem os resultados se
apresentaram negativos
Em todas as amostras sensibilizadas ldquoin vitrordquo o TDA foi testado e verificado a
intensidade do teste Entre as 50 amostras 47 alcanccedilaram TDA com intensidade 3-4+ apoacutes a
primeira sensibilizaccedilatildeo enquanto 3 amostras necessitaram uma segunda incubaccedilatildeo com
anticorpo (figura 4)
A escolha dos anticorpos para sensibilizar as hemaacutecias foi feita de acordo com o
fenoacutetipo do doador e foram utilizados sete diferentes especificidades de anticorpos policlonais
humanos conforme mostra o graacutefico1
29
Figura 3 - Soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada com hemaacutecia de triagem de
anticorpos em gel LissCoombs (BIO-RAD) A finalidade eacute verificar a presenccedila de anticorpos livres na
suspensatildeo que possam interferir na pesquisa do eluato As soluccedilotildees de lavagem das amostras na figura a tiveram
resultados negativos Na figura b duas amostras a 47 e 50 apresentaram resultado positivo Nova etapa de
lavagem foi realizada e o resultado final foi negativo
522 TRATAMENTO DAS HEMAacuteCIAS
Apoacutes a sensibilizaccedilatildeo e obtenccedilatildeo de resultados de TDA com intensidade de 3 a 4+
cada uma das amostras foi dividida em duas aliacutequotas e tratada separadamente pelas teacutecnicas
de glicinaaacutecida-EDTA e cloroquina
As teacutecnicas foram consideradas efetivas quando obteve-se a completa dissociaccedilatildeo do
anticorpo verificada atraveacutes do TDA negativo na amostra poacutes tratamento conforme figuras 5
e 6 Dentre as amostras tratadas com cloroquina 2850 tiveram o TDA negativado A glicina-
aacutecidaEDTA negativou o TDA em 33 das 50 amostras tratadas Apenas 17 amostras tratadas
com glicina-aacutecidaEDTA permaneceram com o TDA positivo e foram submetidas a um novo
tratamento
30
Figura 4 - TDA das amostras apoacutes sensibilizaccedilatildeo com anticorpos policlonais humanos Amostras na
figura a com intensidades de 3-4+ Na figura b amostras 4 e 7 com intensidade menor que 3+ e portanto foram
novamente sensibilizadas com nova aliacutequota de soro Anti-D e anti-S Apoacutes a segunda sensibilizaccedilatildeo
apresentaram reatividade 4 e 3+ respectivamente Os anticorpos utilizados para sensibilizaccedilatildeo foram D S c E
C e K
523 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS TEacuteCNICAS
No tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA houve dissociaccedilatildeo completa do anticorpo
em 33 amostras (66) das 50 amostras testadas enquanto que com a cloroquina foram 28
amostras (56) (tabela 1)
31
Graacutefico 1- Nuacutemero de amostras sesnsibilizadas por especificidade de anticorpo Entre as 50 amostras 12
foram sensibilizadas com anti-D 10 com anti-C 9 com anti-E 8 com anti-c 7 com anti-S 3 com anti-K e 1
com anti-Dia As especificidades dos anticorpos foram definidas de acordo o fenoacutetipo do doador
Figura 5 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com cloroquina Nas amostras onde houve
a dissociaccedilatildeo do anticorpo ( 2 21 a 23 26 39 a 42 45 46 e 49) a hemaacutecia se deposita no fundo no microtubo
apoacutes a centrifugaccedilatildeo (TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (1 3 24 25 43 44 47
48 e 50) o anticorpo ligado agraves hemaacutecias eacute alvo da AGH presente no gel (TDA positivo)
Anti-D 12
Anti-C 10
Anti-E 9
Anti-c 8
Anti-S 7
Anti-K 3 Anti-Dia 1
32
Figura 6 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA Nas amostras
onde houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo (4 6 7 12 a 15 17 34 35 37 e 38) a hemaacutecia se deposita no fundo no
microtubo apoacutes a centrifugaccedilatildeo ( TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (5 16 18
19 20 33 e 36 ) o AGH presente no gel se liga ao anticorpo ligado agraves hemaacutecias que ficam retidas no gel (TDA
positivo)
Tabela 1-Resultado geral do tratamento das hemaacutecias com glicina e cloroquina
Teacutecnica utilizada TDA negativo TDA positivo Total
Glicina-aacutecidaEDTA 33 17 50
Cloroquina 28 22 50
A glicina-aacutecidaEDTA conseguiu negativar mais amostras sensibilizadas com Anti-D
e anti-K que a cloroquina Para as hemaacutecias sensibilizadas com anti-E Anti-S e Anti-Dia
ambas as teacutecnicas dissociaram o anticorpo em 100 das amostras Os resultados detalhados
por especificidade do anticorpo apoacutes o primeiro tratamento com glicina-aacutecidaEDTA e com
cloroquina estatildeo na tabela 2
Para as amostras que permaneceram positivas (17 amostras) apoacutes o tratamento com a
glicina-aacutecidaEDTA foi realizado um novo tratamento Houve dissociaccedilatildeo do anticorpo em 3
amostras (18) apoacutes a segunda tentativa Nas demais 14 (82) amostras tratadas pela
segunda vez 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise
33
Tabela 2 - Resultados do TDA apoacutes tratamento das hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo
sensibilizado
ANTICORPOS
SENSIBILIZADOS
1ordm TRATAMENTO COM
GLICINA
TRATAMENTO COM
CLOROQUINA
TOTAL TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
Anti-D 8 4 0 12 12
Anti-C 6 4 10 0 10
Anti-E 9 0 9 0 9
Anti-c 0 8 1 7 8
Anti-S 7 0 7 0 7
Anti-K 2 1 0 3 3
Anti-Dia 1 0 1 0 1
TOTAL 33 17 28 22 50
A hemoacutelise foi verificada durante o procedimento de lavagem final das hemaacutecias com
soluccedilatildeo fisioloacutegica para a retirada dos reagentes As soluccedilotildees de lavagem ficaram
avermelhadas e as hemaacutecias com coloraccedilatildeo escura As amostras foram descartadas Dentre as
6 amostras que ainda puderam ser testadas para o TDA trecircs amostras negativaram sendo 1
sensibilizada com anti-D e 2 com anti-C (tabela 3)
Tabela 3 - Resultado apoacutes o segundo tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA
Tratamento com
glicina-aacutecidaEDTA
TDA Negativo TDA Positvo Hemoacutelise Total
Segundo tratamento 3 3 11 17
524 TESTAGEM DO ELUATO
Apoacutes o tratamento com a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA a soluccedilatildeo do eluato foi
testada para verificar a viabilidade dos anticorpos que foram dissociados ou eluiacutedos Dentre
as 50 amostras 41 apresentaram eluato positivo As nove amostras cujos eluatos foram
negativos haviam sido sensibilizadas com as seguintes especificidades de anticorpos anti-E 6
amostras (67) anti-S 2 amostras (40) e anti-D 1 amostra (8) (tabela 4) O eluato de
todas as amostras sensibilizadas com os anticorpos anti-C anti-c Anti-K e Anti-Dia foram
positivos Os eluatos positivos na triagem de anticorpos foram testados com paineacuteis de
identificaccedilatildeo para confirmar a especificidade e a viabilidade dos anticorpos (figuras 7 e 8)
34
525 EFEITO DA ELUICcedilAtildeO SOBRE OS ANTIacuteGENOS ERITROCITAacuteRIOS
Para verificar o efeito do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA e com a cloroquina
sobre a expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s foi realizada a fenotipagem das
amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes tratamento com ambas as teacutecnicas Foi avaliado
se o tratamento destruiu os antiacutegenos expressos antes do tratamento
Tabela 4- Resultado do Eluato das amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA
Anticorpos Eluato positvo Eluato negativo Total
Anti-D 11 1 12
Anti-C 10 0 10
Anti-E 3 6 9
Anti-c 8 0 8
Anti-S 5 2 7
Anti-K 3 0 3
Anti-Dia 1 0 1
Total 41 9 50
Figura 7 ndash Painel do eluato da amostra 21 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-C que foi
recuperado no eluato
Figura 8 ndash Painel do eluato da amostra 47 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-K que foi
recuperado no eluato
35
Dentre as 50 amostras 26 eram previamente fenotipadas para os antiacutegenos Fya Fy
b
Jka Jk
b S e s Dentre elas 20 alcanccedilaram TDA negativo apoacutes tratamento com a glicina-
aacutecidaEDTA e 20 negativaram apoacutes tratamento com cloroquina (tabela 5) Apoacutes ambas as
teacutecnicas os antiacutegenos originalmente expressos permaneceram positivos comprovando que natildeo
houve destruiccedilatildeo dos mesmos
Tabela 5 ndash Verificaccedilatildeo da interferecircncia do tratamento da hemaacutecias com cloroquina e glicina-
aacuteicdaEDTA sobre os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
AMOSTRAS
COM
FENOTIPAGEM
PREacuteVIA
TRATADAS COM
CLOROQUINA
TRATADAS COM
GLICINA
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
26
20
20
20
20
As amostras 24 47 e 50 eram positivas para o antiacutegeno K A cloroquina natildeo dissociou
o anticorpo em nenhuma das 3 amostras enquanto a glicina-aacutecidaEDTA foi efetiva nas
amostras 24 e 50 Foi testada a expressatildeo do antiacutegeno K nas amostras 24 e 50 apoacutes o
tratamento utilizando meacutetodo indireto em gel contendo AGH Apesar de natildeo ter sido avaliado
a intensidade de reaccedilatildeo de expressatildeo dos antiacutegenos podemos verificar na figura 9 que nas
duas amostras em que a teacutecnica foi efetiva e dissociou o anticorpo a expressatildeo do antiacutegeno K
continua presente mas a reatividade observada pode ser considerada 1+ sugerindo que houve
diminuiccedilatildeo da expressatildeo do antiacutegeno quando comparado com a expressatildeo observada em
hemaacutecia natildeo tratada
Os resultados individuais de cada amostra em ambas as teacutecnicas encontram-se
resumidas na tabela 6
526 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente onde foi constatada a presenccedila de autoanticorpo
a quente da classe IgG pelo TDA monoespeciacutefico (figura 10)O autoanticorpo tambeacutem
interferia na pesquisa e identificaccedilatildeo de anticorpos irregulares pois apresentava caracteriacutestica
de panaglutinina As hemaacutecias da paciente sensibilizadas ldquoin vivordquo foram tratadas com
cloroquina e com glicina-aacutecidaEDTA
36
Figura 9 ndash Fenotipagem das amostras 24 e 50 para antiacutegeno K apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
O teste positivo indica a presenccedila do antiacutegeno poreacutem a reatividade fraca (1+) sugere que houve enfraquecimento
de sua expressatildeo A direita a expressatildeo forte (4+) do antiacutegeno Kell em hemaacutecia controle natildeo tratada utilizada
como controle positivo
A cloroquina natildeo foi efetiva na retirada do anticorpo ligado as hemaacutecias ao contraacuterio
do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA que dissociou o anticorpo (figura 11)
A hemaacutecia tratada com glicina foi fenotipada para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
(figura 12) A fenotipagem para o sistema Rh (C c E e e) e Kell foi realizada em gel
especiacutefico monoclonal sem interferecircncia do TDA positivo (controle da reaccedilatildeo negativo)
O eluato resultante do tratamento com glicina-aacutecidaEDTA foi testada em gel com
hemaacutecias de painel de identificaccedilatildeo de anticorpos e apresentou resultado positivo com todas
as ceacutelulas (figura 13 e 14)
A amostra foi enviada para genotipagem e o resultado da genotipagem confirmou o
resultado da fenotipagem apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
527 TEMPO DE EXECUCcedilAtildeO DA TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
O tempo de reaccedilatildeo da glicina-aacutecidaEDTA eacute de 2 minutos Todas as amostras foram
tratadas obedecendo ao tempo descrito na literatura demonstrando que o mesmo eacute
reprodutiacutevel
37
Tabela 6- Resultados individuais por amostra
Amostra Especificidade
dos anticorpos
Intensidade do
TDA apoacutes
sensibilizaccedilatildeo
Tratamento
efetivo com
cloroquina
Tratamento
efetivo com
glicina
Eluato
poacutes
glicina
1 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 2 Dia 3+ Sim Sim 3+ 3 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 4 D 4+ Natildeo Sim 4+ 5 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 6 E 3+ Sim Sim Negativo 7 S 4+ Sim Sim 3+ 8 E 3+ Sim Sim 1+ 9 E 3+ Sim Sim 2+
10 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 11 D 4+ Natildeo Sim 4+ 12 D 4+ Natildeo Sim 4+ 13 S 3+ Sim Sim 3+ 14 S 3+ Sim Sim 3+ 15 D 3+ Natildeo Sim 3+ 16 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 17 E 3+ Sim Sim (+) 18 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 19 D 4+ Natildeo Natildeo 3+ 20 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 21 C 3+ Sim Sim 4+ 22 C 3+ Sim Sim 4+ 23 C 3+ Sim Sim 4+ 24 K 4+ Natildeo Sim 4+ 25 D 3+ Natildeo Natildeo Negativo 26 E 4+ Sim Sim Negativo 27 S 3+ Sim Sim 3+ 28 C 3+ Sim Natildeo 4+ 29 C 3+ Sim Sim 4+ 30 C 3+ Sim Sim 4+ 31 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 32 E 3+ Sim Sim Negativo 33 C 3+ Sim Natildeo 4+ 34 S 3+ Sim Sim Negativo 35 S 3+ Sim Sim Negativo 36 C 4+ Sim Natildeo 4+ 37 c 4+ Natildeo Natildeo 4+ 38 D 4+ Natildeo Sim 4+ 39 S 3+ Sim Sim 3+ 40 c 4+ Sim Natildeo 2+ 41 C 4+ Sim Natildeo 4+ 42 E 3+ Sim Sim Negativo 43 D 3+ Natildeo Sim 2+ 44 D 3+ Natildeo Sim 2+ 45 E 3+ Sim Sim Negativo 46 C 3+ Sim Sim 4+ 47 K 4+ Natildeo Natildeo 4+ 48 D 3+ Natildeo Sim 2+ 49 E 3+ Sim Sim Negativo 50 K 4+ Natildeo Sim 4+
TOTAL 50 28 33 41
38
Figura 10 ndash TDA monoespeciacutefico da amostra de paciente Hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo da classe
IgG
oacute Figura 11 ndash TDA apoacutes o tratamento com glicina-aacutecidaEDTA (esquerda) e cloroquina (direita) A glicina
negativou completamente o TDA enquanto a hemaacutecia tratada com cloroquina persistiu positiva (1+)
39
Figura 12 ndash Fenotipagem da amostra tratada com glicina-aacutecidaEDTA Fy(a+b+) Jk(a-b+) S+s+
Figura 13 ndash Painel em gel (LissAGH) do eluato apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de
intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
Figura 14 ndash ndash Painel ezimaacutetico (hemaacutecias tratadas com bromelina) do eluato em gel neutro apoacutes
tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
40
528 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Quanto a efetividade das teacutecnicas em negativar o TDA foi verificado que a glicina-
aacutecidaEDTA foi efetiva em 66 das amostras testadas no primeiro tratamento (3350
amostras) enquanto a cloroquina conseguiu negativar 56 (2850) Esses resultados natildeo
apresentam diferenccedila significativa (pgt005) demostrando que a teacutecnica da glicina-
aacutecidaEDTA natildeo eacute superior mas eacute tatildeo efetiva quanto a da cloroquina
Quando aliamos os resultados de ambas as teacutecnicas verificamos que em 76 (3850)
das amostras o TDA foi negativado Esse dado indica que ainda que uma teacutecnica natildeo seja
eficaz na remoccedilatildeo do anticorpo eacute uma boa alternativa tentar a segunda teacutecnica jaacute que a falha
em remover o anticorpo utilizando uma delas natildeo prevecirc necessariamente a falha com a outra
Quando se utiliza o teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla (graacutefico 2) para comparar a utilizaccedilatildeo das
duas teacutecnicas com o resultado de cada uma isolada (somente a cloroquina ou somente a
glicina) verificamos que os resultados apresentam diferenccedila significativa (plt005) (quadro 3)
TRATAMENTO EFETIVO COM TOTAL PORCENTAGEM
Glicina ou cloroquina 38 76
Glicina e cloroquina 23 46
Glicina apenas 10 20
Cloroquina apenas 5 10
Nenhuma das teacutecnicas 12 24
Quadro 3 - Resultados comparativos entre as teacutecnicas utilizadas
41
Graacutefico 2 - Teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla entre as teacutecnicas aplicadas A- Glicina e Cloroquina B-Cloroquina C-
Glicina ( plt005)
42
6 DISCUSSAtildeO
Os reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA podem ser adquiridos em
forma de kit comercial prontos para uso poreacutem natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil A preparaccedilatildeo
dos reagentes ldquoin houserdquo a partir de sais comerciais adquiridos se mostrou viaacutevel Os
reagentes glicina e o tampatildeo Tris armazenados de forma correta se mantiveram estaacuteveis por
um periacuteodo de 7 meses Somente o reagente EDTA precipitou mesmo armazenado em
condiccedilotildees adequadas sugerindo que o mesmo deve ser preparado em menor quantidade e
armazenado em aliacutequotas A soluccedilatildeo de cloroquina tambeacutem pode ser preparada ldquoin houserdquo e
pode ser armazenado por um mecircs A legislaccedilatildeo brasileira autoriza a utilizaccedilatildeo de reagentes
preparados a partir de sais comerciais como a cloroquina e a glicina-aacutecidaEDTA desde que
os sais tenham autorizaccedilatildeo da vigilacircncia sanitaacuteria para a comercializaccedilatildeo (BRASIL 2001)
A comparaccedilatildeo quanto a efetividade em dissociar anticorpos em amostras com TDA
positivos entre a teacutecnica da glicina e a teacutecnica da cloroquina mostrou que natildeo haacute diferenccedila
estatiacutestica entre elas e que ambas satildeo igualmente eficientes Se utilizadas conjuntamente haacute
maior possibilidade de elucidaccedilatildeo dos casos
Uma vantagem da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eacute que ela permite numa mesma
amostra eluir o anticorpo ligado aacute hemaacutecia assim como fenotipar a hemaacutecia tratada Devido a
sua dupla utilidade a teacutecnica eacute vantajosa principalmente em pacientes em que pouco volume
de amostra pode ser coletado como em casos de crianccedilas e receacutem-nascidos
A fenotipagem poacutes tratamento se mostrou viaacutevel jaacute que os antiacutegenos de maior
importacircncia natildeo sofreram alteraccedilotildees Nas 20 amostras que foram fenotipadas antes e apoacutes
tratamento para verificar a influecircncia dos reagentes na expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a
Jkb S e s natildeo houve destruiccedilatildeo dos mesmos por nenhuma das duas teacutecnicas
Para as amostras positivas para o antiacutegeno Kell (350) e sensibilizadas com o
respectivo anticorpo a teacutecnica da glicina foi efetiva em negativar o TDA em apenas duas
delas mas apoacutes o tratamento foi verificada uma fraca reatividade da reaccedilatildeo antiacutegeno-
anticorpo sugerindo que houve um enfraquecimento da expressatildeo do antiacutegeno conforme
esperado e descrito na literatura (BYRNE 1991 PALLAS WILER E MCGEE 1991
ROZIERS e SQUALI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012 e KATHARIA e
CHAUDHARY 2013) A accedilatildeo da glicina sobre o antigeno Kell natildeo representa impedimento
para seu uso uma vez que na impossibilidade de testar o antiacutegeno Kell o banco de sangue
consegue facilmente atender a solicitaccedilatildeo de transfusatildeo com unidades de hemaacutecias Kell
43
negativas jaacute que eacute um antiacutegeno de baixa prevalecircncia na populaccedilatildeo variando de 15 na
populaccedilatildeo africana a 9 nos europeus (DANIELS 2011)
A soluccedilatildeo resultante da dissociaccedilatildeo do anticorpo pela teacutecnica da glicina pode ainda ser
utilizada como eluato podendo substituir a teacutecnica de eluiccedilatildeo com reagentes comercias (kits
de eluiccedilatildeo aacutecida) que tem alto custo aproximadamente entre R$2000 a R$2500 por teste
Em 41 amostras (82) houve a dissociaccedilatildeo e recuperaccedilatildeo do anticorpo que estava
sensibilizando as hemaacutecias Em 9 amostras (18) os anticorpos foram eluiacutedos poreacutem
apresentaram reaccedilatildeo negativa quando testadas com hemaacutecias de triagem entre eles o anti-E
(6) anti-S (2) e Anti-D (1) Eacute possiacutevel que a correccedilatildeo pH do meio (WALKER 2011) natildeo
tenha sido adequada o que pode ter desfavorecido a reatividade do anticorpo
Para as amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA nas quais natildeo houve dissociaccedilatildeo do
anticorpo pelo primeiro tratamento (1750) o segundo tratamento natildeo se mostrou eficaz jaacute
que 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise O tempo de
armazenagem natildeo parece ter influenciado jaacute que todas as amostras foram testadas dentro de
48 horas apoacutes a coleta Outros fatores que natildeo foram verificados podem ter levado a
hemoacutelise Apesar da literatura (LOUIE JIENG e ZEROULIS 1986 e BYRNE 1991)
recomendar um segundo tratamento ele eacute pouco eficaz tendo negativado apenas 3 das 17
amostras testadas
A amostra de paciente que apresentou sensibilizaccedilatildeo ldquoin vivordquo mostrou melhor
efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA sobre a da cloroquina possibilitando
fenotipagem para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s que natildeo foram destruiacutedos apoacutes o
tratamento comprovado atraveacutes da genotipagem
A presenccedila de autoanticorpo a quente com presenccedila de hemoacutelise (AHAI) ou natildeo pode
mascarar a presenccedila de aloanticorpo interferindo na rotina soroloacutegica da fenotipagem que eacute
uma importante ferramenta para auxiliar na seleccedilatildeo de hemaacutecias para transfusatildeo (SHIREY et
al 2002) Esses pacientes frequentemente possuem aloanticorpos associados ao
autoanticorpo e a prevalecircncia de aloimunizaccedilatildeo entre eles varia entre 12 a 40 (LEGER e
GARRATY 1999 BRANCH e PETZ 1999) o que dificulta ainda mais a escolha do melhor
componente a ser transfundido aleacutem de aumentar a possibilidade reaccedilotildees hemoliacuteticas imunes
poacutes-transfusionais
Nesses casos as teacutecnicas de dissociaccedilatildeo de anticorpos satildeo importantes para tratar
amostras de pacientes e a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser usada como uma opccedilatildeo
pois se mostrou eficaz na dissociaccedilatildeo anticorpo ligado agraves hemaacutecias deixando livre a
superfiacutecie das mesmas permitindo a fenotipagem por antisoros IgG Paralelamente os
44
anticorpos eluiacutedos tambeacutem puderam ser estudados O mesmo natildeo ocorre com a cloroquina
que permite apenas a fenotipagem e tampouco com os kits de eluiccedilatildeo aacutecida disponiacuteveis no
mercado nacional que satildeo destinados a realizaccedilatildeo do eluato mas destroem as hemaacutecias
O tempo de tratamento na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA tambeacutem eacute uma vantagem
pois foi possiacutevel reproduzir no tempo determinado de 2 minutos enquanto a cloroquina
demora ateacute duas horas
Ainda que a aplicaccedilatildeo das teacutecnicas por biologia molecular estejam cada vez mais
presentes na rotina imuno-hematoloacutegica e possibilitam estabelecer o fenoacutetipo deduzido do
genoacutetipo elas natildeo estatildeo disponiacuteveis na maioria dos centros e sua realizaccedilatildeo exige algumas
horas A resoluccedilatildeo imediata do problema transfusional necessita dos resultados soroloacutegicos
pois com frequecircncia natildeo eacute possiacutevel aguardar o resultado do teste molecular Dessa forma
apesar da crescente importacircncia da genotipagem eritrocitaacuteria teacutecnicas soroloacutegicas aplicadas
corretamente e no momento propiacutecio satildeo de grande utilidade para resolver problemas imuno-
hematoloacutegicos como ocorre com a fenotipagem em pacientes com TDA positivo
45
7 CONCLUSAtildeO
A teacutecnica da glicina aacutecidaEDTA mostrou-se efetiva em remover os anticorpos que
sensibilizavam as hemaacutecias e pode ser utilizada com seguranccedila antes da fenotipagem
eritrocitaacuteria Por ser uma teacutecnica de raacutepida execuccedilatildeo eacute uma alternativa aplicaacutevel
principalmente em casos urgentes de pacientes que apresentam autoanticorpos
46
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50
9 ANEXOS
51
FUNDACcedilAtildeO HEMOCENTRO DE RIBEIRAtildeO PRETO
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE)
Tiacutetulo da pesquisa Aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina aacutecida-EDTA e avaliaccedilatildeo da
eficaacutecia no tratamento de hemaacutecias com teste direto da antiglobulina positivo
Pesquisadora responsaacutevel Ceacutelia Kazue Abiko
Orientador Prof Dimas Tadeu Covas
Co-orientadora Dra Flaacutevia Leite Souza Santos
Objetivo da pesquisa Vocecirc estaacute sendo convidado a participar de uma pesquisa que tem
como objetivo padronizar uma nova teacutecnica para auxiliar na tipagem sanguiacutenea de pacientes
A tipagem sanguiacutenea pode sofrer interferecircncia da presenccedila de anticorpos ligados aos gloacutebulos
vermelhos do sangue Nessas situaccedilotildees eacute difiacutecil selecionar o melhor sangue para o paciente e
eacute preciso a utilizaccedilatildeo de teacutecnicas adicionais para remover essas interferecircncias
Esta pesquisa tem como objetivo estudar outra teacutecnica para remover esses anticorpos e
comparaacute-la com a teacutecnica atualmente utilizada Para isso precisamos de amostras de pacientes
e doadores voluntaacuterios
Se vocecirc eacute um doador eacute necessaacuterio que vocecirc autorize a coleta de 5 ml (1 tubo) a mais
de seu sangue
Se vocecirc eacute um paciente natildeo haveraacute necessidade de nova amostra pois utilizaremos as
amostras jaacute coletadas para os testes preacute-transfusionais e os resultados encontrados nesta
pesquisa natildeo iratildeo interferir na escolha da (s) bolsa (s) de sangue que vocecirc possa vir a receber
Se vocecirc concordar em participar leia com atenccedilatildeo o texto abaixo e assine as duas vias
rubricando todas as paacuteginas deste termo de consentimento Uma via original assinada e
rubricada por vocecirc e pela pesquisadora ficaraacute com vocecirc
As suas informaccedilotildees seratildeo mantidas em sigilo pela pesquisadora e natildeo haveraacute
armazenamento de material para pesquisas posteriores Os seus dados seratildeo usados apenas
neste estudo e quando o trabalho for publicado seu nome e qualquer outra informaccedilatildeo que
possam identificaacute-lo natildeo seratildeo revelados
Eacute pouco provaacutevel que o que noacutes aprendermos com este estudo tenha um benefiacutecio
direto para vocecirc assim como natildeo poderemos dar nada em troca pela sua participaccedilatildeo na
pesquisa
Nosso objetivo com esta pesquisa eacute que os resultados poderatildeo ser uacuteteis para o
tratamento de pacientes no futuro Os riscos da participaccedilatildeo satildeo miacutenimos Se vocecirc eacute um
doador de sangue a amostra seraacute coletada no momento da doaccedilatildeo natildeo exigindo punccedilatildeo
venosa adicional
52
Eacute seu direito ter acesso aos resultados dos testes da pesquisa Esses resultados natildeo
seratildeo fornecidos automaticamente a vocecirc mas caso vocecirc se interesse em saber o resultado ou
tiver alguma duacutevida sobre a sua participaccedilatildeo neste estudo deveraacute entrar em contato com Ceacutelia
Kazue Abiko pelo telefone (18) 99718-3551
Vocecirc tem total liberdade de optar por natildeo participar da pesquisa Caso aceite
participar poderaacute desistir a qualquer momento ou retirar seu consentimento mesmo apoacutes ter
coletado o sangue Para cancelar sua participaccedilatildeo basta avisar a pesquisadora e os seus dados
seratildeo retirados do projeto
Qualquer duacutevida eacutetica sobre a pesquisa poderaacute entrar em contato com o Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa do Hospital das Cliacutenicas e da Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto
(CAMPUS UNIVERSITAacuteRIO bairro Monte Alegre CEP 14048-900 Ribeiratildeo Preto-SP
Telefone (16) 3602-2228 FAX (16) 3633-1144 e-mail cephcrpuspbr)
Consentimento de participaccedilatildeo
A Consentimento do participante
Li as informaccedilotildees acima sobre o estudo e recebi explicaccedilotildees sobre a participaccedilatildeo no estudo
Portanto dou o meu consentimento para participar do estudo
___________________________________________________________________________
Nome completo
___________________________________________________________________________
Assinatura
___________
Data
__________________________________________________________________________________
Nome completo da pesquisadora
___________________________________________________________________________
Assinatura
_____________
Data
13
133 CONDICcedilOtildeES CLIacuteNICAS COM TDA POSITIVO
O TDA positivo deve ser interpretado cuidadosamente sempre em conjunto com o
quadro cliacutenico do paciente A positividade isolada do TDA natildeo significa hemoacutelise A
interpretaccedilatildeo do teste positivo requer o conhecimento do diagnoacutestico do paciente da presenccedila
de sinais e sintomas sugestivos de hemoacutelise assim como de seu histoacuterico transfusional
gestacional e de informaccedilotildees sobre o uso recente de medicaccedilotildees (LEGER 2011)
Figura 2 ndash Princiacutepio do teste indireto da antiglobulina O TIA pode ser utilizado na pesquisa de anticorpos de
especificidades desconhecidas livres no soroplasma como eacute o caso da pesquisa e identificaccedilatildeo de anticorpos
irregulares Ele eacute tambeacutem utilizado para determinar a presenccedila de antiacutegenos na membrana da hemaacutecia quando
satildeo empregados soros de especificidades conhecidas da classe IgG No primeiro caso o soroplasma contendo o
anticorpo desconhecido eacute colocado em contato com hemaacutecias cujo perfil antigecircnico eacute conhecido No segundo
caso utiliza-se soro de especificidade conhecida da classe IgG para determinar a presenccedila ou ausecircncia de um
antiacutegeno na membrana O anticorpo encontra o antiacutegeno correspondente e ocorre a ligaccedilatildeo do anticorpo agrave
hemaacutecia mas natildeo ocorre aglutinaccedilatildeo Apoacutes a adiccedilatildeo da AGH que se liga aos anticorpos formando uma malha
ocorre a aglutinaccedilatildeo visiacutevel
O TDA positivo eacute uma achado claacutessico de algumas condiccedilotildees cliacutenicas como a reaccedilatildeo
transfusional hemoliacutetica a doenccedila hemoliacutetica do feto e do receacutem-nascido (DHFRN) a anemia
hemoliacutetica induzida por drogas a siacutendrome do linfoacutecito passageiro e a anemia hemoliacutetica
autoimune (AHAI) Portanto o TDA positivo pode ser decorrente da sensibilizaccedilatildeo da
hemaacutecia autoacuteloga por um autoanticorpo ou por um aloanticorpo ligado agrave hemaacutecia alogecircnica
circulante A positividade do TDA pode ainda ocorrer de forma passiva em pacientes que
14
recebem imunoglobulinas humanas ou ainda pela transfusatildeo de plaquetas ABO natildeo idecircntico
(LEGER 2011 RALPH 2012 ZANTEK et al 2012)
Nas reaccedilotildees transfusionais hemoliacuteticas imunes o aloanticorpo do receptor sensibiliza
as hemaacutecias transfundidas do doador e reduz sua sobrevida ao removecirc-la precocemente da
circulaccedilatildeo pela fagocitose no sistema retiacuteculo-endotelial ou pela hemoacutelise intravascular As
reaccedilotildees podem ser agudas se ocorrem ateacute 24 horas ou tardias quando ocorrem apoacutes 24 horas
da transfusatildeo A gravidade das reaccedilotildees hemoliacuteticas pode variar de um simples rendimento
transfusional inadequado agrave quadros graves de hemoacutelise intravascular evoluindo ateacute mesmo
com choque vascular e oacutebito O TDA pode resultar negativo caso toda massa eritrocitaacuteria
transfundida tenha sido destruiacuteda (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
Na doenccedila hemoliacutetica do feto e do receacutem-nascido (DHFRN) anticorpos maternos da
classe IgG atravessam a barreira placentaacuteria e sensibilizam as hemaacutecias fetais que seratildeo
destruiacutedas precocemente levando agrave anemia fetal Apesar da incompatibilidade ABO feto-
materna ser a causa mais frequente de DHFRN raramente ela eacute responsaacutevel pela ocorrecircncia
de quadros graves Por outro lado anticorpos contra antiacutegenos do sistema Rh e Kell
especialmente Anti-D (Anti-RH1) Anti-c (Anti-RH4) e Anti-Kell (Anti-KELL1) satildeo
conhecidos por causar DHFRN severa Raramente outros anticorpos tambeacutem podem estar
implicados na DHFRN como os anticorpos contra antiacutegenos do sistema Kidd Duffy MNS e
Diego (ZANTEK et al 2012)
A hemoacutelise droga-dependente eacute causada pela produccedilatildeo de um anticorpo voltado contra
a droga ligada agrave membrana eritrocitaacuteria ou ainda contra o complexo droga-membrana A
classe de medicaccedilotildees mais comumente envolvida eacute a dos antimicrobianos betalactacircmicos
(penicilinas e cefalosporinas) mas outras classes como quimioteraacutepicos e anti-inflamatoacuterios
tambeacutem satildeo descritos (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
Apoacutes transplante de ceacutelulas progenitoras hematopoieacuteticas em que o doador possui
anticorpos contra antiacutegenos eritrocitaacuterios do receptor o linfoacutecito de memoacuteria do doador pode
resistir ao esquema imunossupressor utilizado e continuar a produccedilatildeo de anticorpos que
reconhecem a hemaacutecia incompatiacutevel do receptor ainda circulante O quadro cliacutenico pode
variar de um simples TDA positivo sem outros sinais ou sintomas ateacute um quadro hemoliacutetico
grave e abrupto (LEGER 2011)
15
134 ANEMIA HEMOLIacuteTICA AUTOIMUNE
A anemia hemoliacutetica autoimune eacute caracterizada pela destruiccedilatildeo precoce das hemaacutecias
autoacutelogas por autoanticorpos que sensibilizam as hemaacutecias e levam agrave fagocitose pelos
macroacutefagos no sistema reticulo-endotelial ou hemoacutelise intravascular O diagnoacutestico da AHAI
baseia-se na presenccedila de hemoacutelise cliacutenica associada agrave evidecircncia de fator imune representado
pelo TDA positivo As classes de anticorpos envolvidas em quadros de AHAI satildeo IgG IgM e
raramente IgA (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012) Satildeo raros os casos de AHAI com TDA
negativo que podem estar relacionados a um autoanticorpo de baixa avidez de densidade
inferior agrave detecccedilatildeo do meacutetodo ou ainda de classe de imunoglobulina natildeo avaliada pelo
meacutetodo utilizado para o teste (GARRATY 2005)
A AHAI pode ser classificada em dois grupos principais de acordo com a melhor
temperatura de reaccedilatildeo do autoanticorpo As anemias hemoliacuteticas causadas por anticorpos
quentes que reagem melhor a 37oC e geralmente IgG representam 80 dos casos de AHAI
Nas AHAI por anticorpo quente o TDA pode ser positivo para IgG mais complemento (67)
somente IgG (20) ou somente por complemento (13) As anemias causadas por
anticorpos frios geralmente da classe IgM e que reagem melhor em temperatura ambiente ou
a 4oC representam aproximadamente 20 dos casos de AHAI Por exibirem amplitude
teacutermica esses anticorpos ligam-se agraves hemaacutecias ao atingirem a circulaccedilatildeo nas extremidades do
corpo fixam o complemento e desprendem-se da hemaacutecia apoacutes retornar para partes mais
quentes Por esse motivo em AHAI por anticorpos frios o TDA eacute positivo apenas agraves custas
de C3 e normalmente o IgM natildeo eacute detectado (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
A presenccedila do autoanticorpo IgG pode ser confirmada atraveacutes da eluiccedilatildeo do anticorpo
da hemaacutecia Tipicamente o eluato na AHAI por anticorpo quente reage com todas as ceacutelulas
testadas de um painel de hemaacutecias alogecircnicas do tipo ldquoOrdquo ou pode eventualmente exibir uma
especificidade conhecida como Anti-e (Anti-RH5) Nas AHAI a frio por sua vez espera-se
um eluato negativo (LEGER 2011)
Os autoanticorpos satildeo com frequecircncia encontrados livres no plasma e natildeo somente
ligados agraves hemaacutecias autoacutelogas Eles podem interferir em todas as fases dos testes preacute-
transfusionais nas quais o plasma eacute testado especialmente os autoanticorpos quentes que
acarretam resultados positivos em todos os testes levados agrave fase de antiglobulina humana
Esses anticorpos portanto positivam a pesquisa de anticorpos irregulares e mascaram a
presenccedila de aloanticorpos de significado cliacutenico Aproximadamente 60 dos pacientes que
apresentam AHAI a quente apresentam anticorpos que reagem em meio salino mas se forem
16
levados em conta meacutetodos mais sensiacuteveis como PEG enzima e estudo em gel a positividade
pode ser superior a 90 (LEGER 2011)
Aleacutem da eficaacutecia da transfusatildeo ser comprometida pela diminuiccedilatildeo da vida-meacutedia das
hemaacutecias a presenccedila do autoanticorpo dificulta a realizaccedilatildeo dos testes preacute-transfusionais e
compromete a seguranccedila transfusional Os autoanticorpos reagem normalmente como
panaglutininas pois satildeo normalmente voltados contra antiacutegenos puacuteblicos na maior parte das
vezes contra antiacutegenos do sistema Rh Por apresentarem essas caracteriacutesticas podem ainda
mascarar a presenccedila de aloanticorpos de significado clinico e levar a testes de compatibilidade
positivos exigindo uma avaliaccedilatildeo criteriosa da necessidade da transfusatildeo (BRANCH e PETZ
1999 JUNIOR e OLIVATO 2004)
Remover a interferecircncia do autoanticorpo para avaliar a presenccedila de aloanticorpos
mascarados nem sempre eacute possiacutevel mesmo utilizando teacutecnicas de autoadsorccedilatildeo ou
aloadsorccedilatildeo que aleacutem de tudo satildeo demoradas e exigem de 2 a 6 horas para conclusatildeo
(GARRATY e GEORGE 2002) Nesses casos a fenotipagem eritrocitaacuteria do paciente eacute de
extrema utilidade especialmente em situaccedilotildees de urgecircncia A definiccedilatildeo do fenoacutetipo do
paciente para os antiacutegenos de maior importacircncia cliacutenica pode auxiliar a seleccedilatildeo de unidades
de hemaacutecias com mesmo fenoacutetipo o que garante que eventuais aloanticorpos natildeo
identificados sejam respeitados e tambeacutem evita nova sensibilizaccedilatildeo (JUNIOR e OLIVATO
2004 SHIREY et al 2002)
135 TRATAMENTO DE HEMAacuteCIAS COM TDA POSITIVO
O TDA positivo impede a fenotipagem eritrocitaacutecia por meacutetodos que exigem a fase de
AGH uma vez que a aglutinaccedilatildeo ocorreraacute devido agrave interaccedilatildeo da AGH com o autoanticorpo
que sensibiliza a hemaacutecia do paciente levando a resultados falso positivos Em algumas
situaccedilotildees como na AHAI por anticorpo quente a fenotipagem eacute especialmente importante
pois o autoanticorpo interfere na triagem e identificaccedilatildeo de anticorpos assim como no teste de
compatibilidade e dificultam a detecccedilatildeo de aloanticorpos de significado cliacutenico que
obrigatoriamente devem ser respeitados Nessas situaccedilotildees a fenotipagem eritrocitaacuteria
determina o perfil antigecircnico do paciente e possibilita o fornecimento de unidades de
hemaacutecias com o mesmo fenoacutetipo para a transfusatildeo evitando a sensibilizaccedilatildeo para novos
antiacutegenos assim como reaccedilotildees hemoliacuteticas transfusionais No entanto eacute necessaacuterio aplicar
meacutetodos que natildeo sofram interferecircncia do TDA positivo ou seja meacutetodos que natildeo necessitem
da fase de AGH ou meacutetodos de bloqueio do anticorpo sem bloquear o antiacutegeno Uma opccedilatildeo eacute
a utilizaccedilatildeo de soros monoclonais IgM (salinos ou de meio proteico natildeo concentrado) mas
17
nem sempre esses reagentes estatildeo disponiacuteveis especialmente os reagentes monoclonais para
os antiacutegenos dos sistemas Duffy ( Fya Fy
b) Kidd ( Jk
a Jk
b) e MNS (S s) (JUNIOR e
OLIVATO 2004) Outra opccedilatildeo eacute a teacutecnica de bloqueio que pode ser utilizada para tratar
hemaacutecias para posterior fenotipagem em casos de TDA positivos com reatividade le2+
Em casos onde a positividade do TDA eacute maior que 2+ estaacute indicada a tratamento
quiacutemico para remoccedilatildeo da interferecircncia do autoanticorpo antes de realizar a fenotipagem Entre
as teacutecnicas utilizadas atualmente estatildeo o ZZAP a cloroquina e a glicina aacutecidaEDTA
1351 TEacuteCNICA DE BLOQUEIO
A teacutecnica de bloqueio se baseia na utilizaccedilatildeo de anti-IgG (Coombs monoespeciacutefico)
para tratar as hemaacutecias com TDA positivo O anticorpo anti-IgG se liga aos anticorpos que
estatildeo sensibilizando a hemaacutecias poreacutem sem o bloquear os antiacutegenos Os antiacutegenos que natildeo
estatildeo sensibilizados podem ser detectados atraveacutes dos antissoros especiacuteficos (SERERAT
VEIDT E DUTCHED 2000)
1352 TRATAMENTO DE HEMAacuteCIAS COM ZZAP
O Sulphydryl-Proteolytic Enzyme (ZZAP) que eacute uma mistura de ditiotreitol (DTT)
mais papaiacutena ativada com cisteiacutena eacute um reagente capaz de dissociar imunoglobulinas da
classe IgG ligadas a membrana dos eritroacutecitos enquanto trata enzimaticamente as hemaacutecias
O tratamento enzimaacutetico tambeacutem potencializa a ligaccedilatildeo do autoanticorpo ao antiacutegeno e
acelera o processo de autoadsorccedilatildeo O ZZAP pode desnaturar os antiacutegenos do sistema Duffy
MNS e Kell o que limita sua aplicaccedilatildeo para fins de fenotipagem (BRANCH e PETZ 1982)
1353 CLOROQUINA
Em 1982 Edwards Moulds e Judd propuseram a utilizaccedilatildeo da teacutecnica da cloroquina
que dissociava os complexos antiacutegeno-anticorpo e mantinha a membrana das hemaacutecias
iacutentegras Os derivados quinolecircicos jaacute haviam sido descritos anteriormente por Domokos e
Aszody em 1964 e Holtz Mantel e Buck em 1973 (apud Edwards Moulds e Judd 1982) pela
sua capacidade de separar imunocomplexos e inibir as reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo reduzindo
as cargas eleacutetricas das superfiacutecie das hemaacutecias A teacutecnica eacute uma das mais utilizadas nos
centros brasileiros para remover a interferecircncia do autoanticorpo e eacute tambeacutem a teacutecnica
atualmente adotada pelo laboratoacuterio de imunohematologia do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto
18
Edwards Moulds e Judd (1982) demonstraram que a teacutecnica da cloroquina para
dissociaccedilatildeo de anticorpos eacute uma teacutecnica simples efetiva e confiaacutevel para dissociar
imunoglobulina das hemaacutecias Desde que a membrana das hemaacutecias permaneccedila intacta natildeo
haacute perda da reatividade dos antiacutegenos e a sua maior aplicaccedilatildeo eacute a fenotipagem de hemaacutecias
com TDA positivo Os autores verificaram que em 83 das amostras sensibilizadas in vivo e
22 amostras (no total de 40) sensibilizadas ldquoin vitrordquo apresentaram TDA negativo e
puderam ser fenotipadas A teacutecnica poreacutem natildeo consegue remover os componentes do
complemento na maioria dos casos
Champagne e colaboradores (1999) testaram a teacutecnica da cloroquina para dissociar
antiacutegenos Bg comparando com a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA e verificaram vantagem em
relaccedilatildeo ao uso de um uacutenico reagente diminuindo a manipulaccedilatildeo e verificou que o mesmo natildeo
destroacutei antiacutegeno Kell
A cloroquina tambeacutem mostrou-se pouco efetivo em remover anticorpos do sistema
Duffy da superfiacutecie das hemaacutecias (EDWARDS MOUDS e JUDD 1982 ROZIERS e
SQUALI 1997)
1353 GLICINA-AacuteCIDAEDTA
A afinidade e a estabilidade entre a ligaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo eacute definida como a
resultante entre forccedilas atrativas e repulsivas entre ambos (CARUCIO e WISE 2012) e resulta
da somatoacuteria de forccedilas quiacutemicas dinacircmicas e fracas (natildeo covalentes) como pontes de
hidrogecircnio forcas eletrostaacuteticas forca de Van der Waals e pontes hidrofoacutebicas A estabilidade
dessa ligaccedilatildeo eacute facilmente abalada por alteraccedilotildees quiacutemicas e fiacutesicas no meio da reaccedilatildeo como
a alteraccedilatildeo do pH A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA se baseia na mudanccedila do pH para a
quebra da ligaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo (KOSANKE 2012)
A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA foi primeiramente descrita em 1986 por Louie Jieng
e Zeroulis que utilizaram 50 amostras de doadores sensibilizados ldquoin vitrordquo com anticorpos A
teacutecnica foi efetiva em 48 amostras permitindo o estudo do eluato assim como a fenotipagem
das hemaacutecias Os autores testaram tambeacutem a teacutecnica em 100 hemaacutecias TDA positivo que
puderam ser utilizadas para teacutecnicas de autoadsorccedilatildeo
Byrne (1991) descreveu a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA modificada e tambeacutem
verificou como uma opccedilatildeo para o tratamento de hemaacutecias com TDA positivo que deixava as
hemaacutecias intactas e o eluato viaacutevel para ser fenotipado
19
Roziers e Squali (1997) e Katharia e Chaudhary (2013) compararam a teacutecnica da
glicina-aacutecidaEDTA com as teacutecnicas da cloroquina e do aquecimento Verificaram maior
eficiecircncia da glicina-aacutecidaEDTA em relaccedilatildeo as outras duas teacutecnicas pois com uma mesma
quantidade de amostra produzia as hemaacutecias livres de anticorpo e tambeacutem o eluato Mostrou-
se ainda superior devido ao menor tempo exigido para sua realizaccedilatildeo o que favorece seu uso
em situaccedilotildees de urgecircncia e emergecircncia
As duas desvantagens da teacutecnica poreacutem eacute o fato de destruir os antiacutegenos do sistema
Kell e o fato de natildeo remover fraccedilotildees do complemento ligadas agrave hemaacutecia (PALLAS WILER e
McGEE 1991 ROZIERS e SQUALLI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012
e KATHARIA e CHAUNDHARY 2013)
20
2 OBJETIVOS
21 OBJETIVO GERAL
211 Avaliar a eficaacutecia da glicina-aacutecidaEDTA em remover os anticorpos ligados agraves
hemaacutecias sensibilizadas por anticorpos da classe IgG
22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
221 Preparaccedilatildeo dos reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
verificaccedilatildeo da estabilidade dos mesmos e avaliar custos
222 Testar a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA em amostras de hemaacutecias
sensibilizadas por anticorpos antieritrocitaacuterios humanos
223 Comparar a efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA com a teacutecnica da
cloroquina quanto a capacidade de remover a interferecircncia do anticorpo ligado
a hemaacutecia
224 Testar o eluato das amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA
225 Verificar se houve destruiccedilatildeo dos antiacutegenos eritrocitaacuterios apoacutes o tratamento
com glicina-aacutecidaEDTA e com cloroquina
226 Verificar se o tempo de execuccedilatildeo da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA descrito
nos textos de referecircncia eacute reprodutiacutevel
21
3 JUSTIFICATIVA
Algumas condiccedilotildees cliacutenicas podem levar ao depoacutesito ldquoin vivordquo de anticorpos eou
fraccedilotildees do complemento sobre as hemaacutecias Entre elas estatildeo as reaccedilotildees hemoliacuteticas poacutes-
transfusionais a doenccedila hemoliacutetica perinatal o uso de medicamentos e principalmente a
AHAI Na AHAI um anticorpo normalmente da classe IgG ou IgM reconhece antiacutegenos
proacuteprios na membrana eritrocitaacuteria e reduz a sobrevida da hemaacutecia levando a sua destruiccedilatildeo
pelos macroacutefagos no sistema reticulo-endotelial ou agrave ativaccedilatildeo do complexo de ataque agrave
membrana e agrave lise intravascular Os autoanticorpos satildeo voltados na maioria das vezes contra
antiacutegenos eritrocitaacuterios de alta frequecircncia populacional conhecidos como antiacutegenos puacuteblicos
e por este motivo reconhecem tanto hemaacutecias autoacutelogas quanto alogecircnicas
Devido agrave presenccedila do autoanticorpo livre no plasma e tambeacutem do anticorpo eou
complemento ligado agrave hemaacutecia o banco de sangue pode encontrar dificuldades em todas as
fases dos testes preacute-transfusionais do paciente com AHAI e deve utilizar teacutecnicas que
auxiliem na escolha do melhor hemocomponente melhorando a seguranccedila transfusional Essas
teacutecnicas visam remover a interferecircncia do autoanticorpo livre no soro e do autoanticorpo
ligado agrave hemaacutecia permitindo a detecccedilatildeo de aloanticorpos associados e a realizaccedilatildeo da
fenotipagem eritrocitaacuteria respectivamente
A finalizaccedilatildeo dos testes preacute-tranfusionais na presenccedila de autoanticorpo pode levar
algumas horas e nem sempre o paciente poderaacute aguardar Nesse contexto torna-se vantajosa a
aplicaccedilatildeo de teacutecnicas de raacutepida execuccedilatildeo
O presente estudo propotildee aplicar e avaliar a eficaacutecia da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
em remover os anticorpos ligados agrave hemaacutecia o que permite a fenotipagem eritrocitaacuteria
estendida e a seleccedilatildeo de concentrados de hemaacutecias com mesmo fenoacutetipo do paciente
Atualmente no Hemocentro de Ribeiratildeo Preto a teacutecnica utilizada para esse fim eacute o
tratamento das hemaacutecias com difosfato de cloroquina cujo tempo de execuccedilatildeo pode demorar
ateacute duas horas enquanto a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser realizada em apenas dois
minutos o que a tornaria opccedilatildeo de escolha especialmente em situaccedilotildees de urgecircncia Ao
contraacuterio da cloroquina a glicina-aacutecidaEDTA permite tambeacutem o estudo do eluato das
hemaacutecias tratadas
22
4 METODOL OGIA
41 AMOSTRAS DE DOADORES
Foram coletados 50 amostras de doadores de sangue que compareceram ao
Hemonuacutecleo de Araccedilatuba no periacuteodo de junho a agosto de 2016 Foram convidados a
participar da pesquisa doadores de repeticcedilatildeo do tipo sanguiacuteneo ldquoOrdquo RhD positivo
cadastrados no sistema de banco de sangue (SBS) do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto
Todos os doadores que concordaram em participar da pesquisa assinaram o termo de
consentimento livre e esclarecido (TCLE)
No momento da doaccedilatildeo foram coletados adicionalmente 5 mL de sangue total em
soluccedilatildeo anticoagulante EDTA (aacutecido dietilenoaminoaceacutetico) dispensando punccedilatildeo venosa
adicional para coleta da amostra O fluxograma 1 resume as etapas desenvolvidas no projeto
Fluxograma 1 - Fluxo da pesquisa utilizando as amostras de doadores
23
411 FENOTIPAGEM
Foram verificados se os doadores jaacute tinham fenotipagem para outros sistemas de
grupos sanguiacuteneos aleacutem do sistema ABORh que eacute realizado rotineiramente
A fenotipagem eritrocitaacuteria para outros sistemas ou fenotipagem estendida eacute realizada
para identificar a presenccedila ou ausecircncia de antiacutegenos considerados de importacircncia cliacutenica No
Hemonuacutecleo de Araccedilatuba uma parcela de doadores de repeticcedilatildeo satildeo fenotipados para os
antiacutegenos dos sistemas de grupo sanguiacuteneo Rh (antiacutegenos C c E e e) Kell (antiacutegeno K)
Duffy (antiacutegenos Fya e Fy
b) Kidd (antiacutegenos Jk
a e Jk
b) e sistema MNSs (antiacutegenos S e s)
A fenotipagem para o Rh e Kell eacute realizada por metodologia de microplaca utilizando
25 microL de hemaacutecia lavada e diluiacuteda a 5 em salina e 25 microL do antissoro comercial especiacutefico
A reaccedilatildeo eacute incubada 15 minutos a temperatura ambiente e centrifugadas para leitura Para os
antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s a metolodogia utilizado eacute gel contendo antiglobulina
humana (gel LissCoombs poliespeciacutefico) da marca BIO-RAD onde se utiliza suspensatildeo de
hemaacutecia em LISS (Soluccedilatildeo de baixa forccedila iocircnica) A suspensatildeo eacute preparada atraveacutes da
diluiccedilatildeo de 10 microL de hemaacutecia em 1000 microL de LISS Pipetado 50 microL dessa diluiccedilatildeo no gel e
adicionado 25 microL do antissoro especiacutefico Incuba-se em banho seco por 15 minutos a 37 deg
Celsius e eacute centrifugado em centriacutefuga especiacutefica Os antissoros utilizados eram das marcas
Fresenius e Lorne
Foi verificado a fenotipagem do doador no banco de dados do Hemocentro Os
registros dos fenoacutetipos dos doadores ficam armazenadas no sistema de banco de sangue
(SBS) Para doadores que natildeo tinham fenotipagem estendida preacutevia para antiacutegenos do sistema
Rh (C c E e e) e Kell (K) foi realizada a fenotipagem para esses antiacutegenos
O tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA e cloroquina para dissociar
anticorpos pode inativar enfraquecer ou destruir os antiacutegenos presentes nas hemaacutecias
alterando assim os resultados da fenotipagem Para verificar se houve destruiccedilatildeo dos
antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a e Jk
b S e s nas amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes
tratamento foram novamente fenotipadas ao final para os antiacutegenos que eram inicialmente
positivas
A repeticcedilatildeo da fenotipagem foi realizada nas amostras que apresentaram efetividade
no tratamento da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eou da cloroquina e a detecccedilatildeo do antiacutegeno
na amostra preacute-tratamento
24
412 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS HEMAacuteCIAS
As hemaacutecias foram sensibilizadas com antissoros policlonais humanos de amostras de
plasma fresco congelado de doadores com resultado de pesquisa de anticorpo irregular
positivos
A escolha do anticorpo para sensibilizar as hemaacutecias foi definida de acordo com o
fenoacutetipo do doador que deveria ser positivo para o respectivo antiacutegeno
Para a sensibilizaccedilatildeo um volume de antissoro (1 mL) e um volume (1 mL) de
hemaacutecias lavadas quatro vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica foram adicionadas a um tubo de 12 x
75 mm A mistura foi homogeneizada e incubada em banho maria (BM) a 37deg C por 60
minutos A seguir as hemaacutecias foram novamente lavadas 4 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica
para retirada dos anticorpos que natildeo se ligaram A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada
como controle negativo O teste da uacuteltima lavagem eacute importante para assegurar que os
anticorpos que poderatildeo ser detectados no eluato apoacutes o tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA
sejam aqueles que estavam ligados agraves hemaacutecias e natildeo aqueles livres no plasma O controle
negativo mostra que todo o anticorpo livre foi retirado (LEGER 2011)
Para o teste de presenccedila de anticorpo na soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foram incubadas
com hemaacutecias de triagem de anticorpos irregulares (ID-Diacell BIO-RAD) contendo os
antiacutegenos especiacuteficos Realizado a teacutecnica em gel LissCoombs com anti-IgG+C3d Incubado
no tempo de 15 minutos a temperatura de 37deg C e centrifugado 10 minutos em centriacutefuga
proacutepria
As 50 amostras de doadores foram sensibilizadas com os anticorpos policlonais
humanos
Apoacutes sensibilizadas rdquoin vitrordquo e lavadas as hemaacutecias foram diluiacutedas em soluccedilatildeo de
baixa forccedila iocircnica (LISS) na quantidade de 10 microL de hemaacutecia para 1000 microL de soluccedilatildeo A
suspensatildeo foi pipetada (50 microL) em coluna-gel-teste LissCoombs (BIO-RAD) que contecircm
antiglobulina poliespeciacutefico (IgG+C3d) e centrifugada em baixa rotaccedilatildeo conforme orientaccedilatildeo
do fabricante durante 10 minutos
As amostras deveriam apresentar aglutinaccedilatildeo com reatividade 3 a 4+ no TDA As
amostras que apresentaram reaccedilatildeo menor que 3+ foram novamente sensibilizadas com nova
aliacutequota do antissoro
25
413 TRATAMENTO DAS AMOSTRAS
As amostras sensibilizadas apresentando o TDA positivo 3 ou 4+ foram divididas em
duas aliacutequotas e submetidas a duas teacutecnicas diferentes com o objetivo de dissociar o anticorpo
ligado Uma aliacutequota da amostra foi tratada com soluccedilatildeo de difosfato de cloroquina enquanto
a outra aliacutequota foi tratada com glicina-aacutecidaEDTA
42 PREPARO DA GLICINA AacuteCIDA-EDTA
A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA utiliza 3 soluccedilotildees diferentes a glicina aacutecida o
EDTA e o tampatildeo TRIS
Os reagentes foram preparados utilizando os sais para anaacutelise (PA) de EDTA
(Na2EDTA2H2O) TRIS (C4H11NO3) Glicina (H2NCH2CO2H) NaCl e a soluccedilatildeo de aacutecido
cloriacutedrico (HCl) 12 N todos reagentes da marca SYNTH (quadro 1)
Para o preparo do tampatildeo glicina-acida eacute necessaacuterio o ajuste do pH para 15 Para esse
ajuste utiliza-se aacutecido cloriacutedrico (HCl) concentrado O pH foi medido com fitas reativas de pH
com escala de 1 a 14 da marca MERCK Posteriormente a soluccedilatildeo foi enviada ao laboratoacuterio
de controle de qualidade do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto e o pH medido no peagacircmetro O
tampatildeo glicina-aacutecida foi armazenado a 4deg e o tampatildeo tris e o EDTA em temperatura ambiente
controlada (20 a 24deg Celsius)
Apoacutes o preparo e durante a realizaccedilatildeo dos testes foram feitas inspeccedilotildees visuais para
verificaccedilatildeo de turvaccedilatildeo do meio e presenccedila de precipitados
Reagente Material Quantidade Preparo e
Conservaccedilatildeo
EDTA
EDTA
(Na2EDTA2H2O)
5 gramas Mistura ateacute
dissoluccedilatildeo do sal e
conserva em
temperatura ambiente Aacutegua Destilada 50 Ml
Tris
TRIS (C4H11NO3) 121 gramas Conservar em
temperatura ambiente NaCl 525g
Aacutegua destilada 100ml
Gliacutecina-aacutecida
Glicina
(H2NCH2CO2H) 15 gramas
Conservar a 4oC NaCl 116gramas
Aacutegua Destilada 200ml
HCL 12N Ajutar o pH para 15
Quadro 1 - Preparo dos Reagentes da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
Fonte - Manual teacutecnico AABB 2011
26
O tampatildeo glicina-aacutecida e o tampatildeo TRIS satildeo estaacuteveis por 7 meses O reagente EDTA
precipitou mesmo estando em temperatura em ambiente controlado Houve necessidade de
preparo de novo reagente
421 TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
1 Em um tubo de ensaio 12x75 mm eacute adicionado 08 mL da soluccedilatildeo de glicina-aacutecida A
esta soluccedilatildeo adiciona-se 02 mL de EDTA e mistura
2 Adiciona-se 02 mL de hemaacutecias sensibilizadas (lavada 4 vezes) A mistura eacute
homogeneizada e incubada por exatamente 2 minutos
3 A seguir 01 mL de tampatildeo TRIS eacute adicionado agrave mistura que eacute novamente
homogeneizada e centrifugada por 2 minutos a 3400 rpm O pH deve estar entre 7 a 75
4 Apoacutes centrifugaccedilatildeo separa-se em outro tubo o sobrenadante (eluato) e as hemaacutecias
que permanecem satildeo lavadas 4 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica para retirada de todo o
reagente e anticorpos livres
43 PREPARO DA CLOROQUINA
A cloroquina eacute diluiacuteda em tampatildeo PBS na concentraccedilatildeo de 20 (Quadro 2) e
armazenado a 4deg Celsius sua validade apoacutes o preparo eacute de 1 mecircs
A teacutecnica da cloroquina jaacute estaacute padronizada para rotina do laboratoacuterio de
imunohematologia do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto e suas unidades
Reagente Reagentes Quantidade PreparoConservaccedilatildeo
Cloroquina
Difosfato de cloroquina
(C18H32ClN3O8P2)
20 gramas
Conservar a 4deg Celsius
Tampatildeo PBS 100ml
NaOH 01 N Acertar o pH para
51
Quadro 2 - Preparo da Cloroquina Fonte - Manual teacutecnico da AABB 2011
431 TEacuteCNICA DA CLOROQUINA
1 4 partes da soluccedilatildeo pronta eacute adicionada a uma parte de hemaacutecias lavadas 4 vezes com
soluccedilatildeo fisioloacutegica
2 A mistura eacute incubada em temperatura ambiente por ateacute duas horas
3 Centrifugar a 3400 rpm por 2 minutos
27
4 Remover o sobrenadante lavar as hemaacutecias novamente com soluccedilatildeo fisioloacutegica 4
vezes
44 VERIFICACcedilAtildeO DA EFETIVIDADE DOS TESTES
Apoacutes tratamento pelas duas teacutecnicas o TDA foi repetido em todas as amostras para
verificar se os tratamentos foram efetivos e houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo Para as
amostras tratadas pela teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA que permaneceram com TDA positivo
novo tratamento foi realizado
45 TESTE DO ELUATO
O eluato resultante das amostras tratadas com glicina-acidaEDTA foi testado com
hemaacutecias de triagem A soluccedilatildeo do eluato foi incubada com as hemaacutecias de triagem de
anticorpos (ID-Diacell BIO-RAD) pela teacutecnica em gel LissCoombs O teste foi incubado 15
minutos a 37deg Celsius e centrifugado por 10 minutos em centrifuga proacutepria para a teacutecnica em
gel Os eluatos que apresentaram resultados positivos foram testados em painel de 11
hemaacutecias (ID-Diapanel BIO-RAD) para a identificaccedilatildeo do anticorpo
46 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente que apresentou TDA positivo por IgG e pesquisa
de anticorpo irregular positivo com presenccedila de autoanticorpo com reatividade panaglutinina
A amostra foi tratada em paralelo pelas duas teacutecnicas descritas e foi enviada para o
Hemocentro para genotipagem eritrocitaacuteria que foi realizado por metodologia PCR em tempo
real no equipamento Real-time system PCR 7500 ( Applied Biosystems Califoacuternia EUA)
28
5 RESULTADOS
51 REAGENTES
Para aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA satildeo necessaacuterios 3 diferentes
reagentes que podem ser encontrados em forma de kit pronto para uso No entanto esses kits
natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil Os reagentes satildeo tampatildeo glicina-aacutecida o EDTA e o tampatildeo
Tris
Todos os reagentes foram preparados rdquoin houserdquo a partir dos sais e soluccedilotildees PA (puro
para anaacutelise) da marca SYNTH que foram adquiridos para a pesquisa O custo estimado para
cada teste foi aproximadamente R$ 020 reais
Apoacutes o preparo os reagentes poderiam ser armazenados em condiccedilotildees adequadas pelo
periacuteodo de 1 ano (AABB 2011) Ao final do preparo e durante o periacuteodo de armazenamento
de fevereiro a setembro de 2016 foi realizada inspeccedilatildeo visual para verificar a presenccedila de
precipitados ou turvaccedilatildeo A soluccedilatildeo de glicina e o tampatildeo TRIS mostraram-se estaacuteveis ateacute o
final do periacuteodo Por sua vez o reagente EDTA precipitou mesmo estando armazenado em
temperatura ambiente controlada e foi necessaacuterio novo preparo
52 AMOSTRAS DE DOADORES
521 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS AMOSTRAS
Apoacutes incubaccedilatildeo da hemaacutecia com o antissoro a mesma foi lavada 4 vezes para retirada
dos anticorpos livres A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada Caso houvesse positividade na
soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem a etapa era repetida (figura 3) Das 50 amostras sensibilizadas a
uacuteltima lavagem foi positiva somente em 3 delas Nas 3 amostras o anticorpo utilizado para
sensibilizaccedilatildeo foi o anti-K Apoacutes repetido nova etapa de lavagem os resultados se
apresentaram negativos
Em todas as amostras sensibilizadas ldquoin vitrordquo o TDA foi testado e verificado a
intensidade do teste Entre as 50 amostras 47 alcanccedilaram TDA com intensidade 3-4+ apoacutes a
primeira sensibilizaccedilatildeo enquanto 3 amostras necessitaram uma segunda incubaccedilatildeo com
anticorpo (figura 4)
A escolha dos anticorpos para sensibilizar as hemaacutecias foi feita de acordo com o
fenoacutetipo do doador e foram utilizados sete diferentes especificidades de anticorpos policlonais
humanos conforme mostra o graacutefico1
29
Figura 3 - Soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada com hemaacutecia de triagem de
anticorpos em gel LissCoombs (BIO-RAD) A finalidade eacute verificar a presenccedila de anticorpos livres na
suspensatildeo que possam interferir na pesquisa do eluato As soluccedilotildees de lavagem das amostras na figura a tiveram
resultados negativos Na figura b duas amostras a 47 e 50 apresentaram resultado positivo Nova etapa de
lavagem foi realizada e o resultado final foi negativo
522 TRATAMENTO DAS HEMAacuteCIAS
Apoacutes a sensibilizaccedilatildeo e obtenccedilatildeo de resultados de TDA com intensidade de 3 a 4+
cada uma das amostras foi dividida em duas aliacutequotas e tratada separadamente pelas teacutecnicas
de glicinaaacutecida-EDTA e cloroquina
As teacutecnicas foram consideradas efetivas quando obteve-se a completa dissociaccedilatildeo do
anticorpo verificada atraveacutes do TDA negativo na amostra poacutes tratamento conforme figuras 5
e 6 Dentre as amostras tratadas com cloroquina 2850 tiveram o TDA negativado A glicina-
aacutecidaEDTA negativou o TDA em 33 das 50 amostras tratadas Apenas 17 amostras tratadas
com glicina-aacutecidaEDTA permaneceram com o TDA positivo e foram submetidas a um novo
tratamento
30
Figura 4 - TDA das amostras apoacutes sensibilizaccedilatildeo com anticorpos policlonais humanos Amostras na
figura a com intensidades de 3-4+ Na figura b amostras 4 e 7 com intensidade menor que 3+ e portanto foram
novamente sensibilizadas com nova aliacutequota de soro Anti-D e anti-S Apoacutes a segunda sensibilizaccedilatildeo
apresentaram reatividade 4 e 3+ respectivamente Os anticorpos utilizados para sensibilizaccedilatildeo foram D S c E
C e K
523 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS TEacuteCNICAS
No tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA houve dissociaccedilatildeo completa do anticorpo
em 33 amostras (66) das 50 amostras testadas enquanto que com a cloroquina foram 28
amostras (56) (tabela 1)
31
Graacutefico 1- Nuacutemero de amostras sesnsibilizadas por especificidade de anticorpo Entre as 50 amostras 12
foram sensibilizadas com anti-D 10 com anti-C 9 com anti-E 8 com anti-c 7 com anti-S 3 com anti-K e 1
com anti-Dia As especificidades dos anticorpos foram definidas de acordo o fenoacutetipo do doador
Figura 5 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com cloroquina Nas amostras onde houve
a dissociaccedilatildeo do anticorpo ( 2 21 a 23 26 39 a 42 45 46 e 49) a hemaacutecia se deposita no fundo no microtubo
apoacutes a centrifugaccedilatildeo (TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (1 3 24 25 43 44 47
48 e 50) o anticorpo ligado agraves hemaacutecias eacute alvo da AGH presente no gel (TDA positivo)
Anti-D 12
Anti-C 10
Anti-E 9
Anti-c 8
Anti-S 7
Anti-K 3 Anti-Dia 1
32
Figura 6 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA Nas amostras
onde houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo (4 6 7 12 a 15 17 34 35 37 e 38) a hemaacutecia se deposita no fundo no
microtubo apoacutes a centrifugaccedilatildeo ( TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (5 16 18
19 20 33 e 36 ) o AGH presente no gel se liga ao anticorpo ligado agraves hemaacutecias que ficam retidas no gel (TDA
positivo)
Tabela 1-Resultado geral do tratamento das hemaacutecias com glicina e cloroquina
Teacutecnica utilizada TDA negativo TDA positivo Total
Glicina-aacutecidaEDTA 33 17 50
Cloroquina 28 22 50
A glicina-aacutecidaEDTA conseguiu negativar mais amostras sensibilizadas com Anti-D
e anti-K que a cloroquina Para as hemaacutecias sensibilizadas com anti-E Anti-S e Anti-Dia
ambas as teacutecnicas dissociaram o anticorpo em 100 das amostras Os resultados detalhados
por especificidade do anticorpo apoacutes o primeiro tratamento com glicina-aacutecidaEDTA e com
cloroquina estatildeo na tabela 2
Para as amostras que permaneceram positivas (17 amostras) apoacutes o tratamento com a
glicina-aacutecidaEDTA foi realizado um novo tratamento Houve dissociaccedilatildeo do anticorpo em 3
amostras (18) apoacutes a segunda tentativa Nas demais 14 (82) amostras tratadas pela
segunda vez 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise
33
Tabela 2 - Resultados do TDA apoacutes tratamento das hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo
sensibilizado
ANTICORPOS
SENSIBILIZADOS
1ordm TRATAMENTO COM
GLICINA
TRATAMENTO COM
CLOROQUINA
TOTAL TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
Anti-D 8 4 0 12 12
Anti-C 6 4 10 0 10
Anti-E 9 0 9 0 9
Anti-c 0 8 1 7 8
Anti-S 7 0 7 0 7
Anti-K 2 1 0 3 3
Anti-Dia 1 0 1 0 1
TOTAL 33 17 28 22 50
A hemoacutelise foi verificada durante o procedimento de lavagem final das hemaacutecias com
soluccedilatildeo fisioloacutegica para a retirada dos reagentes As soluccedilotildees de lavagem ficaram
avermelhadas e as hemaacutecias com coloraccedilatildeo escura As amostras foram descartadas Dentre as
6 amostras que ainda puderam ser testadas para o TDA trecircs amostras negativaram sendo 1
sensibilizada com anti-D e 2 com anti-C (tabela 3)
Tabela 3 - Resultado apoacutes o segundo tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA
Tratamento com
glicina-aacutecidaEDTA
TDA Negativo TDA Positvo Hemoacutelise Total
Segundo tratamento 3 3 11 17
524 TESTAGEM DO ELUATO
Apoacutes o tratamento com a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA a soluccedilatildeo do eluato foi
testada para verificar a viabilidade dos anticorpos que foram dissociados ou eluiacutedos Dentre
as 50 amostras 41 apresentaram eluato positivo As nove amostras cujos eluatos foram
negativos haviam sido sensibilizadas com as seguintes especificidades de anticorpos anti-E 6
amostras (67) anti-S 2 amostras (40) e anti-D 1 amostra (8) (tabela 4) O eluato de
todas as amostras sensibilizadas com os anticorpos anti-C anti-c Anti-K e Anti-Dia foram
positivos Os eluatos positivos na triagem de anticorpos foram testados com paineacuteis de
identificaccedilatildeo para confirmar a especificidade e a viabilidade dos anticorpos (figuras 7 e 8)
34
525 EFEITO DA ELUICcedilAtildeO SOBRE OS ANTIacuteGENOS ERITROCITAacuteRIOS
Para verificar o efeito do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA e com a cloroquina
sobre a expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s foi realizada a fenotipagem das
amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes tratamento com ambas as teacutecnicas Foi avaliado
se o tratamento destruiu os antiacutegenos expressos antes do tratamento
Tabela 4- Resultado do Eluato das amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA
Anticorpos Eluato positvo Eluato negativo Total
Anti-D 11 1 12
Anti-C 10 0 10
Anti-E 3 6 9
Anti-c 8 0 8
Anti-S 5 2 7
Anti-K 3 0 3
Anti-Dia 1 0 1
Total 41 9 50
Figura 7 ndash Painel do eluato da amostra 21 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-C que foi
recuperado no eluato
Figura 8 ndash Painel do eluato da amostra 47 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-K que foi
recuperado no eluato
35
Dentre as 50 amostras 26 eram previamente fenotipadas para os antiacutegenos Fya Fy
b
Jka Jk
b S e s Dentre elas 20 alcanccedilaram TDA negativo apoacutes tratamento com a glicina-
aacutecidaEDTA e 20 negativaram apoacutes tratamento com cloroquina (tabela 5) Apoacutes ambas as
teacutecnicas os antiacutegenos originalmente expressos permaneceram positivos comprovando que natildeo
houve destruiccedilatildeo dos mesmos
Tabela 5 ndash Verificaccedilatildeo da interferecircncia do tratamento da hemaacutecias com cloroquina e glicina-
aacuteicdaEDTA sobre os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
AMOSTRAS
COM
FENOTIPAGEM
PREacuteVIA
TRATADAS COM
CLOROQUINA
TRATADAS COM
GLICINA
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
26
20
20
20
20
As amostras 24 47 e 50 eram positivas para o antiacutegeno K A cloroquina natildeo dissociou
o anticorpo em nenhuma das 3 amostras enquanto a glicina-aacutecidaEDTA foi efetiva nas
amostras 24 e 50 Foi testada a expressatildeo do antiacutegeno K nas amostras 24 e 50 apoacutes o
tratamento utilizando meacutetodo indireto em gel contendo AGH Apesar de natildeo ter sido avaliado
a intensidade de reaccedilatildeo de expressatildeo dos antiacutegenos podemos verificar na figura 9 que nas
duas amostras em que a teacutecnica foi efetiva e dissociou o anticorpo a expressatildeo do antiacutegeno K
continua presente mas a reatividade observada pode ser considerada 1+ sugerindo que houve
diminuiccedilatildeo da expressatildeo do antiacutegeno quando comparado com a expressatildeo observada em
hemaacutecia natildeo tratada
Os resultados individuais de cada amostra em ambas as teacutecnicas encontram-se
resumidas na tabela 6
526 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente onde foi constatada a presenccedila de autoanticorpo
a quente da classe IgG pelo TDA monoespeciacutefico (figura 10)O autoanticorpo tambeacutem
interferia na pesquisa e identificaccedilatildeo de anticorpos irregulares pois apresentava caracteriacutestica
de panaglutinina As hemaacutecias da paciente sensibilizadas ldquoin vivordquo foram tratadas com
cloroquina e com glicina-aacutecidaEDTA
36
Figura 9 ndash Fenotipagem das amostras 24 e 50 para antiacutegeno K apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
O teste positivo indica a presenccedila do antiacutegeno poreacutem a reatividade fraca (1+) sugere que houve enfraquecimento
de sua expressatildeo A direita a expressatildeo forte (4+) do antiacutegeno Kell em hemaacutecia controle natildeo tratada utilizada
como controle positivo
A cloroquina natildeo foi efetiva na retirada do anticorpo ligado as hemaacutecias ao contraacuterio
do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA que dissociou o anticorpo (figura 11)
A hemaacutecia tratada com glicina foi fenotipada para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
(figura 12) A fenotipagem para o sistema Rh (C c E e e) e Kell foi realizada em gel
especiacutefico monoclonal sem interferecircncia do TDA positivo (controle da reaccedilatildeo negativo)
O eluato resultante do tratamento com glicina-aacutecidaEDTA foi testada em gel com
hemaacutecias de painel de identificaccedilatildeo de anticorpos e apresentou resultado positivo com todas
as ceacutelulas (figura 13 e 14)
A amostra foi enviada para genotipagem e o resultado da genotipagem confirmou o
resultado da fenotipagem apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
527 TEMPO DE EXECUCcedilAtildeO DA TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
O tempo de reaccedilatildeo da glicina-aacutecidaEDTA eacute de 2 minutos Todas as amostras foram
tratadas obedecendo ao tempo descrito na literatura demonstrando que o mesmo eacute
reprodutiacutevel
37
Tabela 6- Resultados individuais por amostra
Amostra Especificidade
dos anticorpos
Intensidade do
TDA apoacutes
sensibilizaccedilatildeo
Tratamento
efetivo com
cloroquina
Tratamento
efetivo com
glicina
Eluato
poacutes
glicina
1 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 2 Dia 3+ Sim Sim 3+ 3 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 4 D 4+ Natildeo Sim 4+ 5 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 6 E 3+ Sim Sim Negativo 7 S 4+ Sim Sim 3+ 8 E 3+ Sim Sim 1+ 9 E 3+ Sim Sim 2+
10 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 11 D 4+ Natildeo Sim 4+ 12 D 4+ Natildeo Sim 4+ 13 S 3+ Sim Sim 3+ 14 S 3+ Sim Sim 3+ 15 D 3+ Natildeo Sim 3+ 16 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 17 E 3+ Sim Sim (+) 18 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 19 D 4+ Natildeo Natildeo 3+ 20 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 21 C 3+ Sim Sim 4+ 22 C 3+ Sim Sim 4+ 23 C 3+ Sim Sim 4+ 24 K 4+ Natildeo Sim 4+ 25 D 3+ Natildeo Natildeo Negativo 26 E 4+ Sim Sim Negativo 27 S 3+ Sim Sim 3+ 28 C 3+ Sim Natildeo 4+ 29 C 3+ Sim Sim 4+ 30 C 3+ Sim Sim 4+ 31 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 32 E 3+ Sim Sim Negativo 33 C 3+ Sim Natildeo 4+ 34 S 3+ Sim Sim Negativo 35 S 3+ Sim Sim Negativo 36 C 4+ Sim Natildeo 4+ 37 c 4+ Natildeo Natildeo 4+ 38 D 4+ Natildeo Sim 4+ 39 S 3+ Sim Sim 3+ 40 c 4+ Sim Natildeo 2+ 41 C 4+ Sim Natildeo 4+ 42 E 3+ Sim Sim Negativo 43 D 3+ Natildeo Sim 2+ 44 D 3+ Natildeo Sim 2+ 45 E 3+ Sim Sim Negativo 46 C 3+ Sim Sim 4+ 47 K 4+ Natildeo Natildeo 4+ 48 D 3+ Natildeo Sim 2+ 49 E 3+ Sim Sim Negativo 50 K 4+ Natildeo Sim 4+
TOTAL 50 28 33 41
38
Figura 10 ndash TDA monoespeciacutefico da amostra de paciente Hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo da classe
IgG
oacute Figura 11 ndash TDA apoacutes o tratamento com glicina-aacutecidaEDTA (esquerda) e cloroquina (direita) A glicina
negativou completamente o TDA enquanto a hemaacutecia tratada com cloroquina persistiu positiva (1+)
39
Figura 12 ndash Fenotipagem da amostra tratada com glicina-aacutecidaEDTA Fy(a+b+) Jk(a-b+) S+s+
Figura 13 ndash Painel em gel (LissAGH) do eluato apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de
intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
Figura 14 ndash ndash Painel ezimaacutetico (hemaacutecias tratadas com bromelina) do eluato em gel neutro apoacutes
tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
40
528 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Quanto a efetividade das teacutecnicas em negativar o TDA foi verificado que a glicina-
aacutecidaEDTA foi efetiva em 66 das amostras testadas no primeiro tratamento (3350
amostras) enquanto a cloroquina conseguiu negativar 56 (2850) Esses resultados natildeo
apresentam diferenccedila significativa (pgt005) demostrando que a teacutecnica da glicina-
aacutecidaEDTA natildeo eacute superior mas eacute tatildeo efetiva quanto a da cloroquina
Quando aliamos os resultados de ambas as teacutecnicas verificamos que em 76 (3850)
das amostras o TDA foi negativado Esse dado indica que ainda que uma teacutecnica natildeo seja
eficaz na remoccedilatildeo do anticorpo eacute uma boa alternativa tentar a segunda teacutecnica jaacute que a falha
em remover o anticorpo utilizando uma delas natildeo prevecirc necessariamente a falha com a outra
Quando se utiliza o teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla (graacutefico 2) para comparar a utilizaccedilatildeo das
duas teacutecnicas com o resultado de cada uma isolada (somente a cloroquina ou somente a
glicina) verificamos que os resultados apresentam diferenccedila significativa (plt005) (quadro 3)
TRATAMENTO EFETIVO COM TOTAL PORCENTAGEM
Glicina ou cloroquina 38 76
Glicina e cloroquina 23 46
Glicina apenas 10 20
Cloroquina apenas 5 10
Nenhuma das teacutecnicas 12 24
Quadro 3 - Resultados comparativos entre as teacutecnicas utilizadas
41
Graacutefico 2 - Teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla entre as teacutecnicas aplicadas A- Glicina e Cloroquina B-Cloroquina C-
Glicina ( plt005)
42
6 DISCUSSAtildeO
Os reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA podem ser adquiridos em
forma de kit comercial prontos para uso poreacutem natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil A preparaccedilatildeo
dos reagentes ldquoin houserdquo a partir de sais comerciais adquiridos se mostrou viaacutevel Os
reagentes glicina e o tampatildeo Tris armazenados de forma correta se mantiveram estaacuteveis por
um periacuteodo de 7 meses Somente o reagente EDTA precipitou mesmo armazenado em
condiccedilotildees adequadas sugerindo que o mesmo deve ser preparado em menor quantidade e
armazenado em aliacutequotas A soluccedilatildeo de cloroquina tambeacutem pode ser preparada ldquoin houserdquo e
pode ser armazenado por um mecircs A legislaccedilatildeo brasileira autoriza a utilizaccedilatildeo de reagentes
preparados a partir de sais comerciais como a cloroquina e a glicina-aacutecidaEDTA desde que
os sais tenham autorizaccedilatildeo da vigilacircncia sanitaacuteria para a comercializaccedilatildeo (BRASIL 2001)
A comparaccedilatildeo quanto a efetividade em dissociar anticorpos em amostras com TDA
positivos entre a teacutecnica da glicina e a teacutecnica da cloroquina mostrou que natildeo haacute diferenccedila
estatiacutestica entre elas e que ambas satildeo igualmente eficientes Se utilizadas conjuntamente haacute
maior possibilidade de elucidaccedilatildeo dos casos
Uma vantagem da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eacute que ela permite numa mesma
amostra eluir o anticorpo ligado aacute hemaacutecia assim como fenotipar a hemaacutecia tratada Devido a
sua dupla utilidade a teacutecnica eacute vantajosa principalmente em pacientes em que pouco volume
de amostra pode ser coletado como em casos de crianccedilas e receacutem-nascidos
A fenotipagem poacutes tratamento se mostrou viaacutevel jaacute que os antiacutegenos de maior
importacircncia natildeo sofreram alteraccedilotildees Nas 20 amostras que foram fenotipadas antes e apoacutes
tratamento para verificar a influecircncia dos reagentes na expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a
Jkb S e s natildeo houve destruiccedilatildeo dos mesmos por nenhuma das duas teacutecnicas
Para as amostras positivas para o antiacutegeno Kell (350) e sensibilizadas com o
respectivo anticorpo a teacutecnica da glicina foi efetiva em negativar o TDA em apenas duas
delas mas apoacutes o tratamento foi verificada uma fraca reatividade da reaccedilatildeo antiacutegeno-
anticorpo sugerindo que houve um enfraquecimento da expressatildeo do antiacutegeno conforme
esperado e descrito na literatura (BYRNE 1991 PALLAS WILER E MCGEE 1991
ROZIERS e SQUALI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012 e KATHARIA e
CHAUDHARY 2013) A accedilatildeo da glicina sobre o antigeno Kell natildeo representa impedimento
para seu uso uma vez que na impossibilidade de testar o antiacutegeno Kell o banco de sangue
consegue facilmente atender a solicitaccedilatildeo de transfusatildeo com unidades de hemaacutecias Kell
43
negativas jaacute que eacute um antiacutegeno de baixa prevalecircncia na populaccedilatildeo variando de 15 na
populaccedilatildeo africana a 9 nos europeus (DANIELS 2011)
A soluccedilatildeo resultante da dissociaccedilatildeo do anticorpo pela teacutecnica da glicina pode ainda ser
utilizada como eluato podendo substituir a teacutecnica de eluiccedilatildeo com reagentes comercias (kits
de eluiccedilatildeo aacutecida) que tem alto custo aproximadamente entre R$2000 a R$2500 por teste
Em 41 amostras (82) houve a dissociaccedilatildeo e recuperaccedilatildeo do anticorpo que estava
sensibilizando as hemaacutecias Em 9 amostras (18) os anticorpos foram eluiacutedos poreacutem
apresentaram reaccedilatildeo negativa quando testadas com hemaacutecias de triagem entre eles o anti-E
(6) anti-S (2) e Anti-D (1) Eacute possiacutevel que a correccedilatildeo pH do meio (WALKER 2011) natildeo
tenha sido adequada o que pode ter desfavorecido a reatividade do anticorpo
Para as amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA nas quais natildeo houve dissociaccedilatildeo do
anticorpo pelo primeiro tratamento (1750) o segundo tratamento natildeo se mostrou eficaz jaacute
que 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise O tempo de
armazenagem natildeo parece ter influenciado jaacute que todas as amostras foram testadas dentro de
48 horas apoacutes a coleta Outros fatores que natildeo foram verificados podem ter levado a
hemoacutelise Apesar da literatura (LOUIE JIENG e ZEROULIS 1986 e BYRNE 1991)
recomendar um segundo tratamento ele eacute pouco eficaz tendo negativado apenas 3 das 17
amostras testadas
A amostra de paciente que apresentou sensibilizaccedilatildeo ldquoin vivordquo mostrou melhor
efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA sobre a da cloroquina possibilitando
fenotipagem para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s que natildeo foram destruiacutedos apoacutes o
tratamento comprovado atraveacutes da genotipagem
A presenccedila de autoanticorpo a quente com presenccedila de hemoacutelise (AHAI) ou natildeo pode
mascarar a presenccedila de aloanticorpo interferindo na rotina soroloacutegica da fenotipagem que eacute
uma importante ferramenta para auxiliar na seleccedilatildeo de hemaacutecias para transfusatildeo (SHIREY et
al 2002) Esses pacientes frequentemente possuem aloanticorpos associados ao
autoanticorpo e a prevalecircncia de aloimunizaccedilatildeo entre eles varia entre 12 a 40 (LEGER e
GARRATY 1999 BRANCH e PETZ 1999) o que dificulta ainda mais a escolha do melhor
componente a ser transfundido aleacutem de aumentar a possibilidade reaccedilotildees hemoliacuteticas imunes
poacutes-transfusionais
Nesses casos as teacutecnicas de dissociaccedilatildeo de anticorpos satildeo importantes para tratar
amostras de pacientes e a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser usada como uma opccedilatildeo
pois se mostrou eficaz na dissociaccedilatildeo anticorpo ligado agraves hemaacutecias deixando livre a
superfiacutecie das mesmas permitindo a fenotipagem por antisoros IgG Paralelamente os
44
anticorpos eluiacutedos tambeacutem puderam ser estudados O mesmo natildeo ocorre com a cloroquina
que permite apenas a fenotipagem e tampouco com os kits de eluiccedilatildeo aacutecida disponiacuteveis no
mercado nacional que satildeo destinados a realizaccedilatildeo do eluato mas destroem as hemaacutecias
O tempo de tratamento na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA tambeacutem eacute uma vantagem
pois foi possiacutevel reproduzir no tempo determinado de 2 minutos enquanto a cloroquina
demora ateacute duas horas
Ainda que a aplicaccedilatildeo das teacutecnicas por biologia molecular estejam cada vez mais
presentes na rotina imuno-hematoloacutegica e possibilitam estabelecer o fenoacutetipo deduzido do
genoacutetipo elas natildeo estatildeo disponiacuteveis na maioria dos centros e sua realizaccedilatildeo exige algumas
horas A resoluccedilatildeo imediata do problema transfusional necessita dos resultados soroloacutegicos
pois com frequecircncia natildeo eacute possiacutevel aguardar o resultado do teste molecular Dessa forma
apesar da crescente importacircncia da genotipagem eritrocitaacuteria teacutecnicas soroloacutegicas aplicadas
corretamente e no momento propiacutecio satildeo de grande utilidade para resolver problemas imuno-
hematoloacutegicos como ocorre com a fenotipagem em pacientes com TDA positivo
45
7 CONCLUSAtildeO
A teacutecnica da glicina aacutecidaEDTA mostrou-se efetiva em remover os anticorpos que
sensibilizavam as hemaacutecias e pode ser utilizada com seguranccedila antes da fenotipagem
eritrocitaacuteria Por ser uma teacutecnica de raacutepida execuccedilatildeo eacute uma alternativa aplicaacutevel
principalmente em casos urgentes de pacientes que apresentam autoanticorpos
46
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50
9 ANEXOS
51
FUNDACcedilAtildeO HEMOCENTRO DE RIBEIRAtildeO PRETO
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE)
Tiacutetulo da pesquisa Aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina aacutecida-EDTA e avaliaccedilatildeo da
eficaacutecia no tratamento de hemaacutecias com teste direto da antiglobulina positivo
Pesquisadora responsaacutevel Ceacutelia Kazue Abiko
Orientador Prof Dimas Tadeu Covas
Co-orientadora Dra Flaacutevia Leite Souza Santos
Objetivo da pesquisa Vocecirc estaacute sendo convidado a participar de uma pesquisa que tem
como objetivo padronizar uma nova teacutecnica para auxiliar na tipagem sanguiacutenea de pacientes
A tipagem sanguiacutenea pode sofrer interferecircncia da presenccedila de anticorpos ligados aos gloacutebulos
vermelhos do sangue Nessas situaccedilotildees eacute difiacutecil selecionar o melhor sangue para o paciente e
eacute preciso a utilizaccedilatildeo de teacutecnicas adicionais para remover essas interferecircncias
Esta pesquisa tem como objetivo estudar outra teacutecnica para remover esses anticorpos e
comparaacute-la com a teacutecnica atualmente utilizada Para isso precisamos de amostras de pacientes
e doadores voluntaacuterios
Se vocecirc eacute um doador eacute necessaacuterio que vocecirc autorize a coleta de 5 ml (1 tubo) a mais
de seu sangue
Se vocecirc eacute um paciente natildeo haveraacute necessidade de nova amostra pois utilizaremos as
amostras jaacute coletadas para os testes preacute-transfusionais e os resultados encontrados nesta
pesquisa natildeo iratildeo interferir na escolha da (s) bolsa (s) de sangue que vocecirc possa vir a receber
Se vocecirc concordar em participar leia com atenccedilatildeo o texto abaixo e assine as duas vias
rubricando todas as paacuteginas deste termo de consentimento Uma via original assinada e
rubricada por vocecirc e pela pesquisadora ficaraacute com vocecirc
As suas informaccedilotildees seratildeo mantidas em sigilo pela pesquisadora e natildeo haveraacute
armazenamento de material para pesquisas posteriores Os seus dados seratildeo usados apenas
neste estudo e quando o trabalho for publicado seu nome e qualquer outra informaccedilatildeo que
possam identificaacute-lo natildeo seratildeo revelados
Eacute pouco provaacutevel que o que noacutes aprendermos com este estudo tenha um benefiacutecio
direto para vocecirc assim como natildeo poderemos dar nada em troca pela sua participaccedilatildeo na
pesquisa
Nosso objetivo com esta pesquisa eacute que os resultados poderatildeo ser uacuteteis para o
tratamento de pacientes no futuro Os riscos da participaccedilatildeo satildeo miacutenimos Se vocecirc eacute um
doador de sangue a amostra seraacute coletada no momento da doaccedilatildeo natildeo exigindo punccedilatildeo
venosa adicional
52
Eacute seu direito ter acesso aos resultados dos testes da pesquisa Esses resultados natildeo
seratildeo fornecidos automaticamente a vocecirc mas caso vocecirc se interesse em saber o resultado ou
tiver alguma duacutevida sobre a sua participaccedilatildeo neste estudo deveraacute entrar em contato com Ceacutelia
Kazue Abiko pelo telefone (18) 99718-3551
Vocecirc tem total liberdade de optar por natildeo participar da pesquisa Caso aceite
participar poderaacute desistir a qualquer momento ou retirar seu consentimento mesmo apoacutes ter
coletado o sangue Para cancelar sua participaccedilatildeo basta avisar a pesquisadora e os seus dados
seratildeo retirados do projeto
Qualquer duacutevida eacutetica sobre a pesquisa poderaacute entrar em contato com o Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa do Hospital das Cliacutenicas e da Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto
(CAMPUS UNIVERSITAacuteRIO bairro Monte Alegre CEP 14048-900 Ribeiratildeo Preto-SP
Telefone (16) 3602-2228 FAX (16) 3633-1144 e-mail cephcrpuspbr)
Consentimento de participaccedilatildeo
A Consentimento do participante
Li as informaccedilotildees acima sobre o estudo e recebi explicaccedilotildees sobre a participaccedilatildeo no estudo
Portanto dou o meu consentimento para participar do estudo
___________________________________________________________________________
Nome completo
___________________________________________________________________________
Assinatura
___________
Data
__________________________________________________________________________________
Nome completo da pesquisadora
___________________________________________________________________________
Assinatura
_____________
Data
14
recebem imunoglobulinas humanas ou ainda pela transfusatildeo de plaquetas ABO natildeo idecircntico
(LEGER 2011 RALPH 2012 ZANTEK et al 2012)
Nas reaccedilotildees transfusionais hemoliacuteticas imunes o aloanticorpo do receptor sensibiliza
as hemaacutecias transfundidas do doador e reduz sua sobrevida ao removecirc-la precocemente da
circulaccedilatildeo pela fagocitose no sistema retiacuteculo-endotelial ou pela hemoacutelise intravascular As
reaccedilotildees podem ser agudas se ocorrem ateacute 24 horas ou tardias quando ocorrem apoacutes 24 horas
da transfusatildeo A gravidade das reaccedilotildees hemoliacuteticas pode variar de um simples rendimento
transfusional inadequado agrave quadros graves de hemoacutelise intravascular evoluindo ateacute mesmo
com choque vascular e oacutebito O TDA pode resultar negativo caso toda massa eritrocitaacuteria
transfundida tenha sido destruiacuteda (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
Na doenccedila hemoliacutetica do feto e do receacutem-nascido (DHFRN) anticorpos maternos da
classe IgG atravessam a barreira placentaacuteria e sensibilizam as hemaacutecias fetais que seratildeo
destruiacutedas precocemente levando agrave anemia fetal Apesar da incompatibilidade ABO feto-
materna ser a causa mais frequente de DHFRN raramente ela eacute responsaacutevel pela ocorrecircncia
de quadros graves Por outro lado anticorpos contra antiacutegenos do sistema Rh e Kell
especialmente Anti-D (Anti-RH1) Anti-c (Anti-RH4) e Anti-Kell (Anti-KELL1) satildeo
conhecidos por causar DHFRN severa Raramente outros anticorpos tambeacutem podem estar
implicados na DHFRN como os anticorpos contra antiacutegenos do sistema Kidd Duffy MNS e
Diego (ZANTEK et al 2012)
A hemoacutelise droga-dependente eacute causada pela produccedilatildeo de um anticorpo voltado contra
a droga ligada agrave membrana eritrocitaacuteria ou ainda contra o complexo droga-membrana A
classe de medicaccedilotildees mais comumente envolvida eacute a dos antimicrobianos betalactacircmicos
(penicilinas e cefalosporinas) mas outras classes como quimioteraacutepicos e anti-inflamatoacuterios
tambeacutem satildeo descritos (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
Apoacutes transplante de ceacutelulas progenitoras hematopoieacuteticas em que o doador possui
anticorpos contra antiacutegenos eritrocitaacuterios do receptor o linfoacutecito de memoacuteria do doador pode
resistir ao esquema imunossupressor utilizado e continuar a produccedilatildeo de anticorpos que
reconhecem a hemaacutecia incompatiacutevel do receptor ainda circulante O quadro cliacutenico pode
variar de um simples TDA positivo sem outros sinais ou sintomas ateacute um quadro hemoliacutetico
grave e abrupto (LEGER 2011)
15
134 ANEMIA HEMOLIacuteTICA AUTOIMUNE
A anemia hemoliacutetica autoimune eacute caracterizada pela destruiccedilatildeo precoce das hemaacutecias
autoacutelogas por autoanticorpos que sensibilizam as hemaacutecias e levam agrave fagocitose pelos
macroacutefagos no sistema reticulo-endotelial ou hemoacutelise intravascular O diagnoacutestico da AHAI
baseia-se na presenccedila de hemoacutelise cliacutenica associada agrave evidecircncia de fator imune representado
pelo TDA positivo As classes de anticorpos envolvidas em quadros de AHAI satildeo IgG IgM e
raramente IgA (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012) Satildeo raros os casos de AHAI com TDA
negativo que podem estar relacionados a um autoanticorpo de baixa avidez de densidade
inferior agrave detecccedilatildeo do meacutetodo ou ainda de classe de imunoglobulina natildeo avaliada pelo
meacutetodo utilizado para o teste (GARRATY 2005)
A AHAI pode ser classificada em dois grupos principais de acordo com a melhor
temperatura de reaccedilatildeo do autoanticorpo As anemias hemoliacuteticas causadas por anticorpos
quentes que reagem melhor a 37oC e geralmente IgG representam 80 dos casos de AHAI
Nas AHAI por anticorpo quente o TDA pode ser positivo para IgG mais complemento (67)
somente IgG (20) ou somente por complemento (13) As anemias causadas por
anticorpos frios geralmente da classe IgM e que reagem melhor em temperatura ambiente ou
a 4oC representam aproximadamente 20 dos casos de AHAI Por exibirem amplitude
teacutermica esses anticorpos ligam-se agraves hemaacutecias ao atingirem a circulaccedilatildeo nas extremidades do
corpo fixam o complemento e desprendem-se da hemaacutecia apoacutes retornar para partes mais
quentes Por esse motivo em AHAI por anticorpos frios o TDA eacute positivo apenas agraves custas
de C3 e normalmente o IgM natildeo eacute detectado (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
A presenccedila do autoanticorpo IgG pode ser confirmada atraveacutes da eluiccedilatildeo do anticorpo
da hemaacutecia Tipicamente o eluato na AHAI por anticorpo quente reage com todas as ceacutelulas
testadas de um painel de hemaacutecias alogecircnicas do tipo ldquoOrdquo ou pode eventualmente exibir uma
especificidade conhecida como Anti-e (Anti-RH5) Nas AHAI a frio por sua vez espera-se
um eluato negativo (LEGER 2011)
Os autoanticorpos satildeo com frequecircncia encontrados livres no plasma e natildeo somente
ligados agraves hemaacutecias autoacutelogas Eles podem interferir em todas as fases dos testes preacute-
transfusionais nas quais o plasma eacute testado especialmente os autoanticorpos quentes que
acarretam resultados positivos em todos os testes levados agrave fase de antiglobulina humana
Esses anticorpos portanto positivam a pesquisa de anticorpos irregulares e mascaram a
presenccedila de aloanticorpos de significado cliacutenico Aproximadamente 60 dos pacientes que
apresentam AHAI a quente apresentam anticorpos que reagem em meio salino mas se forem
16
levados em conta meacutetodos mais sensiacuteveis como PEG enzima e estudo em gel a positividade
pode ser superior a 90 (LEGER 2011)
Aleacutem da eficaacutecia da transfusatildeo ser comprometida pela diminuiccedilatildeo da vida-meacutedia das
hemaacutecias a presenccedila do autoanticorpo dificulta a realizaccedilatildeo dos testes preacute-transfusionais e
compromete a seguranccedila transfusional Os autoanticorpos reagem normalmente como
panaglutininas pois satildeo normalmente voltados contra antiacutegenos puacuteblicos na maior parte das
vezes contra antiacutegenos do sistema Rh Por apresentarem essas caracteriacutesticas podem ainda
mascarar a presenccedila de aloanticorpos de significado clinico e levar a testes de compatibilidade
positivos exigindo uma avaliaccedilatildeo criteriosa da necessidade da transfusatildeo (BRANCH e PETZ
1999 JUNIOR e OLIVATO 2004)
Remover a interferecircncia do autoanticorpo para avaliar a presenccedila de aloanticorpos
mascarados nem sempre eacute possiacutevel mesmo utilizando teacutecnicas de autoadsorccedilatildeo ou
aloadsorccedilatildeo que aleacutem de tudo satildeo demoradas e exigem de 2 a 6 horas para conclusatildeo
(GARRATY e GEORGE 2002) Nesses casos a fenotipagem eritrocitaacuteria do paciente eacute de
extrema utilidade especialmente em situaccedilotildees de urgecircncia A definiccedilatildeo do fenoacutetipo do
paciente para os antiacutegenos de maior importacircncia cliacutenica pode auxiliar a seleccedilatildeo de unidades
de hemaacutecias com mesmo fenoacutetipo o que garante que eventuais aloanticorpos natildeo
identificados sejam respeitados e tambeacutem evita nova sensibilizaccedilatildeo (JUNIOR e OLIVATO
2004 SHIREY et al 2002)
135 TRATAMENTO DE HEMAacuteCIAS COM TDA POSITIVO
O TDA positivo impede a fenotipagem eritrocitaacutecia por meacutetodos que exigem a fase de
AGH uma vez que a aglutinaccedilatildeo ocorreraacute devido agrave interaccedilatildeo da AGH com o autoanticorpo
que sensibiliza a hemaacutecia do paciente levando a resultados falso positivos Em algumas
situaccedilotildees como na AHAI por anticorpo quente a fenotipagem eacute especialmente importante
pois o autoanticorpo interfere na triagem e identificaccedilatildeo de anticorpos assim como no teste de
compatibilidade e dificultam a detecccedilatildeo de aloanticorpos de significado cliacutenico que
obrigatoriamente devem ser respeitados Nessas situaccedilotildees a fenotipagem eritrocitaacuteria
determina o perfil antigecircnico do paciente e possibilita o fornecimento de unidades de
hemaacutecias com o mesmo fenoacutetipo para a transfusatildeo evitando a sensibilizaccedilatildeo para novos
antiacutegenos assim como reaccedilotildees hemoliacuteticas transfusionais No entanto eacute necessaacuterio aplicar
meacutetodos que natildeo sofram interferecircncia do TDA positivo ou seja meacutetodos que natildeo necessitem
da fase de AGH ou meacutetodos de bloqueio do anticorpo sem bloquear o antiacutegeno Uma opccedilatildeo eacute
a utilizaccedilatildeo de soros monoclonais IgM (salinos ou de meio proteico natildeo concentrado) mas
17
nem sempre esses reagentes estatildeo disponiacuteveis especialmente os reagentes monoclonais para
os antiacutegenos dos sistemas Duffy ( Fya Fy
b) Kidd ( Jk
a Jk
b) e MNS (S s) (JUNIOR e
OLIVATO 2004) Outra opccedilatildeo eacute a teacutecnica de bloqueio que pode ser utilizada para tratar
hemaacutecias para posterior fenotipagem em casos de TDA positivos com reatividade le2+
Em casos onde a positividade do TDA eacute maior que 2+ estaacute indicada a tratamento
quiacutemico para remoccedilatildeo da interferecircncia do autoanticorpo antes de realizar a fenotipagem Entre
as teacutecnicas utilizadas atualmente estatildeo o ZZAP a cloroquina e a glicina aacutecidaEDTA
1351 TEacuteCNICA DE BLOQUEIO
A teacutecnica de bloqueio se baseia na utilizaccedilatildeo de anti-IgG (Coombs monoespeciacutefico)
para tratar as hemaacutecias com TDA positivo O anticorpo anti-IgG se liga aos anticorpos que
estatildeo sensibilizando a hemaacutecias poreacutem sem o bloquear os antiacutegenos Os antiacutegenos que natildeo
estatildeo sensibilizados podem ser detectados atraveacutes dos antissoros especiacuteficos (SERERAT
VEIDT E DUTCHED 2000)
1352 TRATAMENTO DE HEMAacuteCIAS COM ZZAP
O Sulphydryl-Proteolytic Enzyme (ZZAP) que eacute uma mistura de ditiotreitol (DTT)
mais papaiacutena ativada com cisteiacutena eacute um reagente capaz de dissociar imunoglobulinas da
classe IgG ligadas a membrana dos eritroacutecitos enquanto trata enzimaticamente as hemaacutecias
O tratamento enzimaacutetico tambeacutem potencializa a ligaccedilatildeo do autoanticorpo ao antiacutegeno e
acelera o processo de autoadsorccedilatildeo O ZZAP pode desnaturar os antiacutegenos do sistema Duffy
MNS e Kell o que limita sua aplicaccedilatildeo para fins de fenotipagem (BRANCH e PETZ 1982)
1353 CLOROQUINA
Em 1982 Edwards Moulds e Judd propuseram a utilizaccedilatildeo da teacutecnica da cloroquina
que dissociava os complexos antiacutegeno-anticorpo e mantinha a membrana das hemaacutecias
iacutentegras Os derivados quinolecircicos jaacute haviam sido descritos anteriormente por Domokos e
Aszody em 1964 e Holtz Mantel e Buck em 1973 (apud Edwards Moulds e Judd 1982) pela
sua capacidade de separar imunocomplexos e inibir as reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo reduzindo
as cargas eleacutetricas das superfiacutecie das hemaacutecias A teacutecnica eacute uma das mais utilizadas nos
centros brasileiros para remover a interferecircncia do autoanticorpo e eacute tambeacutem a teacutecnica
atualmente adotada pelo laboratoacuterio de imunohematologia do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto
18
Edwards Moulds e Judd (1982) demonstraram que a teacutecnica da cloroquina para
dissociaccedilatildeo de anticorpos eacute uma teacutecnica simples efetiva e confiaacutevel para dissociar
imunoglobulina das hemaacutecias Desde que a membrana das hemaacutecias permaneccedila intacta natildeo
haacute perda da reatividade dos antiacutegenos e a sua maior aplicaccedilatildeo eacute a fenotipagem de hemaacutecias
com TDA positivo Os autores verificaram que em 83 das amostras sensibilizadas in vivo e
22 amostras (no total de 40) sensibilizadas ldquoin vitrordquo apresentaram TDA negativo e
puderam ser fenotipadas A teacutecnica poreacutem natildeo consegue remover os componentes do
complemento na maioria dos casos
Champagne e colaboradores (1999) testaram a teacutecnica da cloroquina para dissociar
antiacutegenos Bg comparando com a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA e verificaram vantagem em
relaccedilatildeo ao uso de um uacutenico reagente diminuindo a manipulaccedilatildeo e verificou que o mesmo natildeo
destroacutei antiacutegeno Kell
A cloroquina tambeacutem mostrou-se pouco efetivo em remover anticorpos do sistema
Duffy da superfiacutecie das hemaacutecias (EDWARDS MOUDS e JUDD 1982 ROZIERS e
SQUALI 1997)
1353 GLICINA-AacuteCIDAEDTA
A afinidade e a estabilidade entre a ligaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo eacute definida como a
resultante entre forccedilas atrativas e repulsivas entre ambos (CARUCIO e WISE 2012) e resulta
da somatoacuteria de forccedilas quiacutemicas dinacircmicas e fracas (natildeo covalentes) como pontes de
hidrogecircnio forcas eletrostaacuteticas forca de Van der Waals e pontes hidrofoacutebicas A estabilidade
dessa ligaccedilatildeo eacute facilmente abalada por alteraccedilotildees quiacutemicas e fiacutesicas no meio da reaccedilatildeo como
a alteraccedilatildeo do pH A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA se baseia na mudanccedila do pH para a
quebra da ligaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo (KOSANKE 2012)
A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA foi primeiramente descrita em 1986 por Louie Jieng
e Zeroulis que utilizaram 50 amostras de doadores sensibilizados ldquoin vitrordquo com anticorpos A
teacutecnica foi efetiva em 48 amostras permitindo o estudo do eluato assim como a fenotipagem
das hemaacutecias Os autores testaram tambeacutem a teacutecnica em 100 hemaacutecias TDA positivo que
puderam ser utilizadas para teacutecnicas de autoadsorccedilatildeo
Byrne (1991) descreveu a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA modificada e tambeacutem
verificou como uma opccedilatildeo para o tratamento de hemaacutecias com TDA positivo que deixava as
hemaacutecias intactas e o eluato viaacutevel para ser fenotipado
19
Roziers e Squali (1997) e Katharia e Chaudhary (2013) compararam a teacutecnica da
glicina-aacutecidaEDTA com as teacutecnicas da cloroquina e do aquecimento Verificaram maior
eficiecircncia da glicina-aacutecidaEDTA em relaccedilatildeo as outras duas teacutecnicas pois com uma mesma
quantidade de amostra produzia as hemaacutecias livres de anticorpo e tambeacutem o eluato Mostrou-
se ainda superior devido ao menor tempo exigido para sua realizaccedilatildeo o que favorece seu uso
em situaccedilotildees de urgecircncia e emergecircncia
As duas desvantagens da teacutecnica poreacutem eacute o fato de destruir os antiacutegenos do sistema
Kell e o fato de natildeo remover fraccedilotildees do complemento ligadas agrave hemaacutecia (PALLAS WILER e
McGEE 1991 ROZIERS e SQUALLI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012
e KATHARIA e CHAUNDHARY 2013)
20
2 OBJETIVOS
21 OBJETIVO GERAL
211 Avaliar a eficaacutecia da glicina-aacutecidaEDTA em remover os anticorpos ligados agraves
hemaacutecias sensibilizadas por anticorpos da classe IgG
22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
221 Preparaccedilatildeo dos reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
verificaccedilatildeo da estabilidade dos mesmos e avaliar custos
222 Testar a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA em amostras de hemaacutecias
sensibilizadas por anticorpos antieritrocitaacuterios humanos
223 Comparar a efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA com a teacutecnica da
cloroquina quanto a capacidade de remover a interferecircncia do anticorpo ligado
a hemaacutecia
224 Testar o eluato das amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA
225 Verificar se houve destruiccedilatildeo dos antiacutegenos eritrocitaacuterios apoacutes o tratamento
com glicina-aacutecidaEDTA e com cloroquina
226 Verificar se o tempo de execuccedilatildeo da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA descrito
nos textos de referecircncia eacute reprodutiacutevel
21
3 JUSTIFICATIVA
Algumas condiccedilotildees cliacutenicas podem levar ao depoacutesito ldquoin vivordquo de anticorpos eou
fraccedilotildees do complemento sobre as hemaacutecias Entre elas estatildeo as reaccedilotildees hemoliacuteticas poacutes-
transfusionais a doenccedila hemoliacutetica perinatal o uso de medicamentos e principalmente a
AHAI Na AHAI um anticorpo normalmente da classe IgG ou IgM reconhece antiacutegenos
proacuteprios na membrana eritrocitaacuteria e reduz a sobrevida da hemaacutecia levando a sua destruiccedilatildeo
pelos macroacutefagos no sistema reticulo-endotelial ou agrave ativaccedilatildeo do complexo de ataque agrave
membrana e agrave lise intravascular Os autoanticorpos satildeo voltados na maioria das vezes contra
antiacutegenos eritrocitaacuterios de alta frequecircncia populacional conhecidos como antiacutegenos puacuteblicos
e por este motivo reconhecem tanto hemaacutecias autoacutelogas quanto alogecircnicas
Devido agrave presenccedila do autoanticorpo livre no plasma e tambeacutem do anticorpo eou
complemento ligado agrave hemaacutecia o banco de sangue pode encontrar dificuldades em todas as
fases dos testes preacute-transfusionais do paciente com AHAI e deve utilizar teacutecnicas que
auxiliem na escolha do melhor hemocomponente melhorando a seguranccedila transfusional Essas
teacutecnicas visam remover a interferecircncia do autoanticorpo livre no soro e do autoanticorpo
ligado agrave hemaacutecia permitindo a detecccedilatildeo de aloanticorpos associados e a realizaccedilatildeo da
fenotipagem eritrocitaacuteria respectivamente
A finalizaccedilatildeo dos testes preacute-tranfusionais na presenccedila de autoanticorpo pode levar
algumas horas e nem sempre o paciente poderaacute aguardar Nesse contexto torna-se vantajosa a
aplicaccedilatildeo de teacutecnicas de raacutepida execuccedilatildeo
O presente estudo propotildee aplicar e avaliar a eficaacutecia da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
em remover os anticorpos ligados agrave hemaacutecia o que permite a fenotipagem eritrocitaacuteria
estendida e a seleccedilatildeo de concentrados de hemaacutecias com mesmo fenoacutetipo do paciente
Atualmente no Hemocentro de Ribeiratildeo Preto a teacutecnica utilizada para esse fim eacute o
tratamento das hemaacutecias com difosfato de cloroquina cujo tempo de execuccedilatildeo pode demorar
ateacute duas horas enquanto a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser realizada em apenas dois
minutos o que a tornaria opccedilatildeo de escolha especialmente em situaccedilotildees de urgecircncia Ao
contraacuterio da cloroquina a glicina-aacutecidaEDTA permite tambeacutem o estudo do eluato das
hemaacutecias tratadas
22
4 METODOL OGIA
41 AMOSTRAS DE DOADORES
Foram coletados 50 amostras de doadores de sangue que compareceram ao
Hemonuacutecleo de Araccedilatuba no periacuteodo de junho a agosto de 2016 Foram convidados a
participar da pesquisa doadores de repeticcedilatildeo do tipo sanguiacuteneo ldquoOrdquo RhD positivo
cadastrados no sistema de banco de sangue (SBS) do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto
Todos os doadores que concordaram em participar da pesquisa assinaram o termo de
consentimento livre e esclarecido (TCLE)
No momento da doaccedilatildeo foram coletados adicionalmente 5 mL de sangue total em
soluccedilatildeo anticoagulante EDTA (aacutecido dietilenoaminoaceacutetico) dispensando punccedilatildeo venosa
adicional para coleta da amostra O fluxograma 1 resume as etapas desenvolvidas no projeto
Fluxograma 1 - Fluxo da pesquisa utilizando as amostras de doadores
23
411 FENOTIPAGEM
Foram verificados se os doadores jaacute tinham fenotipagem para outros sistemas de
grupos sanguiacuteneos aleacutem do sistema ABORh que eacute realizado rotineiramente
A fenotipagem eritrocitaacuteria para outros sistemas ou fenotipagem estendida eacute realizada
para identificar a presenccedila ou ausecircncia de antiacutegenos considerados de importacircncia cliacutenica No
Hemonuacutecleo de Araccedilatuba uma parcela de doadores de repeticcedilatildeo satildeo fenotipados para os
antiacutegenos dos sistemas de grupo sanguiacuteneo Rh (antiacutegenos C c E e e) Kell (antiacutegeno K)
Duffy (antiacutegenos Fya e Fy
b) Kidd (antiacutegenos Jk
a e Jk
b) e sistema MNSs (antiacutegenos S e s)
A fenotipagem para o Rh e Kell eacute realizada por metodologia de microplaca utilizando
25 microL de hemaacutecia lavada e diluiacuteda a 5 em salina e 25 microL do antissoro comercial especiacutefico
A reaccedilatildeo eacute incubada 15 minutos a temperatura ambiente e centrifugadas para leitura Para os
antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s a metolodogia utilizado eacute gel contendo antiglobulina
humana (gel LissCoombs poliespeciacutefico) da marca BIO-RAD onde se utiliza suspensatildeo de
hemaacutecia em LISS (Soluccedilatildeo de baixa forccedila iocircnica) A suspensatildeo eacute preparada atraveacutes da
diluiccedilatildeo de 10 microL de hemaacutecia em 1000 microL de LISS Pipetado 50 microL dessa diluiccedilatildeo no gel e
adicionado 25 microL do antissoro especiacutefico Incuba-se em banho seco por 15 minutos a 37 deg
Celsius e eacute centrifugado em centriacutefuga especiacutefica Os antissoros utilizados eram das marcas
Fresenius e Lorne
Foi verificado a fenotipagem do doador no banco de dados do Hemocentro Os
registros dos fenoacutetipos dos doadores ficam armazenadas no sistema de banco de sangue
(SBS) Para doadores que natildeo tinham fenotipagem estendida preacutevia para antiacutegenos do sistema
Rh (C c E e e) e Kell (K) foi realizada a fenotipagem para esses antiacutegenos
O tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA e cloroquina para dissociar
anticorpos pode inativar enfraquecer ou destruir os antiacutegenos presentes nas hemaacutecias
alterando assim os resultados da fenotipagem Para verificar se houve destruiccedilatildeo dos
antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a e Jk
b S e s nas amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes
tratamento foram novamente fenotipadas ao final para os antiacutegenos que eram inicialmente
positivas
A repeticcedilatildeo da fenotipagem foi realizada nas amostras que apresentaram efetividade
no tratamento da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eou da cloroquina e a detecccedilatildeo do antiacutegeno
na amostra preacute-tratamento
24
412 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS HEMAacuteCIAS
As hemaacutecias foram sensibilizadas com antissoros policlonais humanos de amostras de
plasma fresco congelado de doadores com resultado de pesquisa de anticorpo irregular
positivos
A escolha do anticorpo para sensibilizar as hemaacutecias foi definida de acordo com o
fenoacutetipo do doador que deveria ser positivo para o respectivo antiacutegeno
Para a sensibilizaccedilatildeo um volume de antissoro (1 mL) e um volume (1 mL) de
hemaacutecias lavadas quatro vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica foram adicionadas a um tubo de 12 x
75 mm A mistura foi homogeneizada e incubada em banho maria (BM) a 37deg C por 60
minutos A seguir as hemaacutecias foram novamente lavadas 4 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica
para retirada dos anticorpos que natildeo se ligaram A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada
como controle negativo O teste da uacuteltima lavagem eacute importante para assegurar que os
anticorpos que poderatildeo ser detectados no eluato apoacutes o tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA
sejam aqueles que estavam ligados agraves hemaacutecias e natildeo aqueles livres no plasma O controle
negativo mostra que todo o anticorpo livre foi retirado (LEGER 2011)
Para o teste de presenccedila de anticorpo na soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foram incubadas
com hemaacutecias de triagem de anticorpos irregulares (ID-Diacell BIO-RAD) contendo os
antiacutegenos especiacuteficos Realizado a teacutecnica em gel LissCoombs com anti-IgG+C3d Incubado
no tempo de 15 minutos a temperatura de 37deg C e centrifugado 10 minutos em centriacutefuga
proacutepria
As 50 amostras de doadores foram sensibilizadas com os anticorpos policlonais
humanos
Apoacutes sensibilizadas rdquoin vitrordquo e lavadas as hemaacutecias foram diluiacutedas em soluccedilatildeo de
baixa forccedila iocircnica (LISS) na quantidade de 10 microL de hemaacutecia para 1000 microL de soluccedilatildeo A
suspensatildeo foi pipetada (50 microL) em coluna-gel-teste LissCoombs (BIO-RAD) que contecircm
antiglobulina poliespeciacutefico (IgG+C3d) e centrifugada em baixa rotaccedilatildeo conforme orientaccedilatildeo
do fabricante durante 10 minutos
As amostras deveriam apresentar aglutinaccedilatildeo com reatividade 3 a 4+ no TDA As
amostras que apresentaram reaccedilatildeo menor que 3+ foram novamente sensibilizadas com nova
aliacutequota do antissoro
25
413 TRATAMENTO DAS AMOSTRAS
As amostras sensibilizadas apresentando o TDA positivo 3 ou 4+ foram divididas em
duas aliacutequotas e submetidas a duas teacutecnicas diferentes com o objetivo de dissociar o anticorpo
ligado Uma aliacutequota da amostra foi tratada com soluccedilatildeo de difosfato de cloroquina enquanto
a outra aliacutequota foi tratada com glicina-aacutecidaEDTA
42 PREPARO DA GLICINA AacuteCIDA-EDTA
A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA utiliza 3 soluccedilotildees diferentes a glicina aacutecida o
EDTA e o tampatildeo TRIS
Os reagentes foram preparados utilizando os sais para anaacutelise (PA) de EDTA
(Na2EDTA2H2O) TRIS (C4H11NO3) Glicina (H2NCH2CO2H) NaCl e a soluccedilatildeo de aacutecido
cloriacutedrico (HCl) 12 N todos reagentes da marca SYNTH (quadro 1)
Para o preparo do tampatildeo glicina-acida eacute necessaacuterio o ajuste do pH para 15 Para esse
ajuste utiliza-se aacutecido cloriacutedrico (HCl) concentrado O pH foi medido com fitas reativas de pH
com escala de 1 a 14 da marca MERCK Posteriormente a soluccedilatildeo foi enviada ao laboratoacuterio
de controle de qualidade do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto e o pH medido no peagacircmetro O
tampatildeo glicina-aacutecida foi armazenado a 4deg e o tampatildeo tris e o EDTA em temperatura ambiente
controlada (20 a 24deg Celsius)
Apoacutes o preparo e durante a realizaccedilatildeo dos testes foram feitas inspeccedilotildees visuais para
verificaccedilatildeo de turvaccedilatildeo do meio e presenccedila de precipitados
Reagente Material Quantidade Preparo e
Conservaccedilatildeo
EDTA
EDTA
(Na2EDTA2H2O)
5 gramas Mistura ateacute
dissoluccedilatildeo do sal e
conserva em
temperatura ambiente Aacutegua Destilada 50 Ml
Tris
TRIS (C4H11NO3) 121 gramas Conservar em
temperatura ambiente NaCl 525g
Aacutegua destilada 100ml
Gliacutecina-aacutecida
Glicina
(H2NCH2CO2H) 15 gramas
Conservar a 4oC NaCl 116gramas
Aacutegua Destilada 200ml
HCL 12N Ajutar o pH para 15
Quadro 1 - Preparo dos Reagentes da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
Fonte - Manual teacutecnico AABB 2011
26
O tampatildeo glicina-aacutecida e o tampatildeo TRIS satildeo estaacuteveis por 7 meses O reagente EDTA
precipitou mesmo estando em temperatura em ambiente controlado Houve necessidade de
preparo de novo reagente
421 TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
1 Em um tubo de ensaio 12x75 mm eacute adicionado 08 mL da soluccedilatildeo de glicina-aacutecida A
esta soluccedilatildeo adiciona-se 02 mL de EDTA e mistura
2 Adiciona-se 02 mL de hemaacutecias sensibilizadas (lavada 4 vezes) A mistura eacute
homogeneizada e incubada por exatamente 2 minutos
3 A seguir 01 mL de tampatildeo TRIS eacute adicionado agrave mistura que eacute novamente
homogeneizada e centrifugada por 2 minutos a 3400 rpm O pH deve estar entre 7 a 75
4 Apoacutes centrifugaccedilatildeo separa-se em outro tubo o sobrenadante (eluato) e as hemaacutecias
que permanecem satildeo lavadas 4 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica para retirada de todo o
reagente e anticorpos livres
43 PREPARO DA CLOROQUINA
A cloroquina eacute diluiacuteda em tampatildeo PBS na concentraccedilatildeo de 20 (Quadro 2) e
armazenado a 4deg Celsius sua validade apoacutes o preparo eacute de 1 mecircs
A teacutecnica da cloroquina jaacute estaacute padronizada para rotina do laboratoacuterio de
imunohematologia do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto e suas unidades
Reagente Reagentes Quantidade PreparoConservaccedilatildeo
Cloroquina
Difosfato de cloroquina
(C18H32ClN3O8P2)
20 gramas
Conservar a 4deg Celsius
Tampatildeo PBS 100ml
NaOH 01 N Acertar o pH para
51
Quadro 2 - Preparo da Cloroquina Fonte - Manual teacutecnico da AABB 2011
431 TEacuteCNICA DA CLOROQUINA
1 4 partes da soluccedilatildeo pronta eacute adicionada a uma parte de hemaacutecias lavadas 4 vezes com
soluccedilatildeo fisioloacutegica
2 A mistura eacute incubada em temperatura ambiente por ateacute duas horas
3 Centrifugar a 3400 rpm por 2 minutos
27
4 Remover o sobrenadante lavar as hemaacutecias novamente com soluccedilatildeo fisioloacutegica 4
vezes
44 VERIFICACcedilAtildeO DA EFETIVIDADE DOS TESTES
Apoacutes tratamento pelas duas teacutecnicas o TDA foi repetido em todas as amostras para
verificar se os tratamentos foram efetivos e houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo Para as
amostras tratadas pela teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA que permaneceram com TDA positivo
novo tratamento foi realizado
45 TESTE DO ELUATO
O eluato resultante das amostras tratadas com glicina-acidaEDTA foi testado com
hemaacutecias de triagem A soluccedilatildeo do eluato foi incubada com as hemaacutecias de triagem de
anticorpos (ID-Diacell BIO-RAD) pela teacutecnica em gel LissCoombs O teste foi incubado 15
minutos a 37deg Celsius e centrifugado por 10 minutos em centrifuga proacutepria para a teacutecnica em
gel Os eluatos que apresentaram resultados positivos foram testados em painel de 11
hemaacutecias (ID-Diapanel BIO-RAD) para a identificaccedilatildeo do anticorpo
46 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente que apresentou TDA positivo por IgG e pesquisa
de anticorpo irregular positivo com presenccedila de autoanticorpo com reatividade panaglutinina
A amostra foi tratada em paralelo pelas duas teacutecnicas descritas e foi enviada para o
Hemocentro para genotipagem eritrocitaacuteria que foi realizado por metodologia PCR em tempo
real no equipamento Real-time system PCR 7500 ( Applied Biosystems Califoacuternia EUA)
28
5 RESULTADOS
51 REAGENTES
Para aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA satildeo necessaacuterios 3 diferentes
reagentes que podem ser encontrados em forma de kit pronto para uso No entanto esses kits
natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil Os reagentes satildeo tampatildeo glicina-aacutecida o EDTA e o tampatildeo
Tris
Todos os reagentes foram preparados rdquoin houserdquo a partir dos sais e soluccedilotildees PA (puro
para anaacutelise) da marca SYNTH que foram adquiridos para a pesquisa O custo estimado para
cada teste foi aproximadamente R$ 020 reais
Apoacutes o preparo os reagentes poderiam ser armazenados em condiccedilotildees adequadas pelo
periacuteodo de 1 ano (AABB 2011) Ao final do preparo e durante o periacuteodo de armazenamento
de fevereiro a setembro de 2016 foi realizada inspeccedilatildeo visual para verificar a presenccedila de
precipitados ou turvaccedilatildeo A soluccedilatildeo de glicina e o tampatildeo TRIS mostraram-se estaacuteveis ateacute o
final do periacuteodo Por sua vez o reagente EDTA precipitou mesmo estando armazenado em
temperatura ambiente controlada e foi necessaacuterio novo preparo
52 AMOSTRAS DE DOADORES
521 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS AMOSTRAS
Apoacutes incubaccedilatildeo da hemaacutecia com o antissoro a mesma foi lavada 4 vezes para retirada
dos anticorpos livres A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada Caso houvesse positividade na
soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem a etapa era repetida (figura 3) Das 50 amostras sensibilizadas a
uacuteltima lavagem foi positiva somente em 3 delas Nas 3 amostras o anticorpo utilizado para
sensibilizaccedilatildeo foi o anti-K Apoacutes repetido nova etapa de lavagem os resultados se
apresentaram negativos
Em todas as amostras sensibilizadas ldquoin vitrordquo o TDA foi testado e verificado a
intensidade do teste Entre as 50 amostras 47 alcanccedilaram TDA com intensidade 3-4+ apoacutes a
primeira sensibilizaccedilatildeo enquanto 3 amostras necessitaram uma segunda incubaccedilatildeo com
anticorpo (figura 4)
A escolha dos anticorpos para sensibilizar as hemaacutecias foi feita de acordo com o
fenoacutetipo do doador e foram utilizados sete diferentes especificidades de anticorpos policlonais
humanos conforme mostra o graacutefico1
29
Figura 3 - Soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada com hemaacutecia de triagem de
anticorpos em gel LissCoombs (BIO-RAD) A finalidade eacute verificar a presenccedila de anticorpos livres na
suspensatildeo que possam interferir na pesquisa do eluato As soluccedilotildees de lavagem das amostras na figura a tiveram
resultados negativos Na figura b duas amostras a 47 e 50 apresentaram resultado positivo Nova etapa de
lavagem foi realizada e o resultado final foi negativo
522 TRATAMENTO DAS HEMAacuteCIAS
Apoacutes a sensibilizaccedilatildeo e obtenccedilatildeo de resultados de TDA com intensidade de 3 a 4+
cada uma das amostras foi dividida em duas aliacutequotas e tratada separadamente pelas teacutecnicas
de glicinaaacutecida-EDTA e cloroquina
As teacutecnicas foram consideradas efetivas quando obteve-se a completa dissociaccedilatildeo do
anticorpo verificada atraveacutes do TDA negativo na amostra poacutes tratamento conforme figuras 5
e 6 Dentre as amostras tratadas com cloroquina 2850 tiveram o TDA negativado A glicina-
aacutecidaEDTA negativou o TDA em 33 das 50 amostras tratadas Apenas 17 amostras tratadas
com glicina-aacutecidaEDTA permaneceram com o TDA positivo e foram submetidas a um novo
tratamento
30
Figura 4 - TDA das amostras apoacutes sensibilizaccedilatildeo com anticorpos policlonais humanos Amostras na
figura a com intensidades de 3-4+ Na figura b amostras 4 e 7 com intensidade menor que 3+ e portanto foram
novamente sensibilizadas com nova aliacutequota de soro Anti-D e anti-S Apoacutes a segunda sensibilizaccedilatildeo
apresentaram reatividade 4 e 3+ respectivamente Os anticorpos utilizados para sensibilizaccedilatildeo foram D S c E
C e K
523 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS TEacuteCNICAS
No tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA houve dissociaccedilatildeo completa do anticorpo
em 33 amostras (66) das 50 amostras testadas enquanto que com a cloroquina foram 28
amostras (56) (tabela 1)
31
Graacutefico 1- Nuacutemero de amostras sesnsibilizadas por especificidade de anticorpo Entre as 50 amostras 12
foram sensibilizadas com anti-D 10 com anti-C 9 com anti-E 8 com anti-c 7 com anti-S 3 com anti-K e 1
com anti-Dia As especificidades dos anticorpos foram definidas de acordo o fenoacutetipo do doador
Figura 5 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com cloroquina Nas amostras onde houve
a dissociaccedilatildeo do anticorpo ( 2 21 a 23 26 39 a 42 45 46 e 49) a hemaacutecia se deposita no fundo no microtubo
apoacutes a centrifugaccedilatildeo (TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (1 3 24 25 43 44 47
48 e 50) o anticorpo ligado agraves hemaacutecias eacute alvo da AGH presente no gel (TDA positivo)
Anti-D 12
Anti-C 10
Anti-E 9
Anti-c 8
Anti-S 7
Anti-K 3 Anti-Dia 1
32
Figura 6 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA Nas amostras
onde houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo (4 6 7 12 a 15 17 34 35 37 e 38) a hemaacutecia se deposita no fundo no
microtubo apoacutes a centrifugaccedilatildeo ( TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (5 16 18
19 20 33 e 36 ) o AGH presente no gel se liga ao anticorpo ligado agraves hemaacutecias que ficam retidas no gel (TDA
positivo)
Tabela 1-Resultado geral do tratamento das hemaacutecias com glicina e cloroquina
Teacutecnica utilizada TDA negativo TDA positivo Total
Glicina-aacutecidaEDTA 33 17 50
Cloroquina 28 22 50
A glicina-aacutecidaEDTA conseguiu negativar mais amostras sensibilizadas com Anti-D
e anti-K que a cloroquina Para as hemaacutecias sensibilizadas com anti-E Anti-S e Anti-Dia
ambas as teacutecnicas dissociaram o anticorpo em 100 das amostras Os resultados detalhados
por especificidade do anticorpo apoacutes o primeiro tratamento com glicina-aacutecidaEDTA e com
cloroquina estatildeo na tabela 2
Para as amostras que permaneceram positivas (17 amostras) apoacutes o tratamento com a
glicina-aacutecidaEDTA foi realizado um novo tratamento Houve dissociaccedilatildeo do anticorpo em 3
amostras (18) apoacutes a segunda tentativa Nas demais 14 (82) amostras tratadas pela
segunda vez 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise
33
Tabela 2 - Resultados do TDA apoacutes tratamento das hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo
sensibilizado
ANTICORPOS
SENSIBILIZADOS
1ordm TRATAMENTO COM
GLICINA
TRATAMENTO COM
CLOROQUINA
TOTAL TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
Anti-D 8 4 0 12 12
Anti-C 6 4 10 0 10
Anti-E 9 0 9 0 9
Anti-c 0 8 1 7 8
Anti-S 7 0 7 0 7
Anti-K 2 1 0 3 3
Anti-Dia 1 0 1 0 1
TOTAL 33 17 28 22 50
A hemoacutelise foi verificada durante o procedimento de lavagem final das hemaacutecias com
soluccedilatildeo fisioloacutegica para a retirada dos reagentes As soluccedilotildees de lavagem ficaram
avermelhadas e as hemaacutecias com coloraccedilatildeo escura As amostras foram descartadas Dentre as
6 amostras que ainda puderam ser testadas para o TDA trecircs amostras negativaram sendo 1
sensibilizada com anti-D e 2 com anti-C (tabela 3)
Tabela 3 - Resultado apoacutes o segundo tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA
Tratamento com
glicina-aacutecidaEDTA
TDA Negativo TDA Positvo Hemoacutelise Total
Segundo tratamento 3 3 11 17
524 TESTAGEM DO ELUATO
Apoacutes o tratamento com a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA a soluccedilatildeo do eluato foi
testada para verificar a viabilidade dos anticorpos que foram dissociados ou eluiacutedos Dentre
as 50 amostras 41 apresentaram eluato positivo As nove amostras cujos eluatos foram
negativos haviam sido sensibilizadas com as seguintes especificidades de anticorpos anti-E 6
amostras (67) anti-S 2 amostras (40) e anti-D 1 amostra (8) (tabela 4) O eluato de
todas as amostras sensibilizadas com os anticorpos anti-C anti-c Anti-K e Anti-Dia foram
positivos Os eluatos positivos na triagem de anticorpos foram testados com paineacuteis de
identificaccedilatildeo para confirmar a especificidade e a viabilidade dos anticorpos (figuras 7 e 8)
34
525 EFEITO DA ELUICcedilAtildeO SOBRE OS ANTIacuteGENOS ERITROCITAacuteRIOS
Para verificar o efeito do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA e com a cloroquina
sobre a expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s foi realizada a fenotipagem das
amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes tratamento com ambas as teacutecnicas Foi avaliado
se o tratamento destruiu os antiacutegenos expressos antes do tratamento
Tabela 4- Resultado do Eluato das amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA
Anticorpos Eluato positvo Eluato negativo Total
Anti-D 11 1 12
Anti-C 10 0 10
Anti-E 3 6 9
Anti-c 8 0 8
Anti-S 5 2 7
Anti-K 3 0 3
Anti-Dia 1 0 1
Total 41 9 50
Figura 7 ndash Painel do eluato da amostra 21 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-C que foi
recuperado no eluato
Figura 8 ndash Painel do eluato da amostra 47 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-K que foi
recuperado no eluato
35
Dentre as 50 amostras 26 eram previamente fenotipadas para os antiacutegenos Fya Fy
b
Jka Jk
b S e s Dentre elas 20 alcanccedilaram TDA negativo apoacutes tratamento com a glicina-
aacutecidaEDTA e 20 negativaram apoacutes tratamento com cloroquina (tabela 5) Apoacutes ambas as
teacutecnicas os antiacutegenos originalmente expressos permaneceram positivos comprovando que natildeo
houve destruiccedilatildeo dos mesmos
Tabela 5 ndash Verificaccedilatildeo da interferecircncia do tratamento da hemaacutecias com cloroquina e glicina-
aacuteicdaEDTA sobre os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
AMOSTRAS
COM
FENOTIPAGEM
PREacuteVIA
TRATADAS COM
CLOROQUINA
TRATADAS COM
GLICINA
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
26
20
20
20
20
As amostras 24 47 e 50 eram positivas para o antiacutegeno K A cloroquina natildeo dissociou
o anticorpo em nenhuma das 3 amostras enquanto a glicina-aacutecidaEDTA foi efetiva nas
amostras 24 e 50 Foi testada a expressatildeo do antiacutegeno K nas amostras 24 e 50 apoacutes o
tratamento utilizando meacutetodo indireto em gel contendo AGH Apesar de natildeo ter sido avaliado
a intensidade de reaccedilatildeo de expressatildeo dos antiacutegenos podemos verificar na figura 9 que nas
duas amostras em que a teacutecnica foi efetiva e dissociou o anticorpo a expressatildeo do antiacutegeno K
continua presente mas a reatividade observada pode ser considerada 1+ sugerindo que houve
diminuiccedilatildeo da expressatildeo do antiacutegeno quando comparado com a expressatildeo observada em
hemaacutecia natildeo tratada
Os resultados individuais de cada amostra em ambas as teacutecnicas encontram-se
resumidas na tabela 6
526 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente onde foi constatada a presenccedila de autoanticorpo
a quente da classe IgG pelo TDA monoespeciacutefico (figura 10)O autoanticorpo tambeacutem
interferia na pesquisa e identificaccedilatildeo de anticorpos irregulares pois apresentava caracteriacutestica
de panaglutinina As hemaacutecias da paciente sensibilizadas ldquoin vivordquo foram tratadas com
cloroquina e com glicina-aacutecidaEDTA
36
Figura 9 ndash Fenotipagem das amostras 24 e 50 para antiacutegeno K apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
O teste positivo indica a presenccedila do antiacutegeno poreacutem a reatividade fraca (1+) sugere que houve enfraquecimento
de sua expressatildeo A direita a expressatildeo forte (4+) do antiacutegeno Kell em hemaacutecia controle natildeo tratada utilizada
como controle positivo
A cloroquina natildeo foi efetiva na retirada do anticorpo ligado as hemaacutecias ao contraacuterio
do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA que dissociou o anticorpo (figura 11)
A hemaacutecia tratada com glicina foi fenotipada para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
(figura 12) A fenotipagem para o sistema Rh (C c E e e) e Kell foi realizada em gel
especiacutefico monoclonal sem interferecircncia do TDA positivo (controle da reaccedilatildeo negativo)
O eluato resultante do tratamento com glicina-aacutecidaEDTA foi testada em gel com
hemaacutecias de painel de identificaccedilatildeo de anticorpos e apresentou resultado positivo com todas
as ceacutelulas (figura 13 e 14)
A amostra foi enviada para genotipagem e o resultado da genotipagem confirmou o
resultado da fenotipagem apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
527 TEMPO DE EXECUCcedilAtildeO DA TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
O tempo de reaccedilatildeo da glicina-aacutecidaEDTA eacute de 2 minutos Todas as amostras foram
tratadas obedecendo ao tempo descrito na literatura demonstrando que o mesmo eacute
reprodutiacutevel
37
Tabela 6- Resultados individuais por amostra
Amostra Especificidade
dos anticorpos
Intensidade do
TDA apoacutes
sensibilizaccedilatildeo
Tratamento
efetivo com
cloroquina
Tratamento
efetivo com
glicina
Eluato
poacutes
glicina
1 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 2 Dia 3+ Sim Sim 3+ 3 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 4 D 4+ Natildeo Sim 4+ 5 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 6 E 3+ Sim Sim Negativo 7 S 4+ Sim Sim 3+ 8 E 3+ Sim Sim 1+ 9 E 3+ Sim Sim 2+
10 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 11 D 4+ Natildeo Sim 4+ 12 D 4+ Natildeo Sim 4+ 13 S 3+ Sim Sim 3+ 14 S 3+ Sim Sim 3+ 15 D 3+ Natildeo Sim 3+ 16 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 17 E 3+ Sim Sim (+) 18 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 19 D 4+ Natildeo Natildeo 3+ 20 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 21 C 3+ Sim Sim 4+ 22 C 3+ Sim Sim 4+ 23 C 3+ Sim Sim 4+ 24 K 4+ Natildeo Sim 4+ 25 D 3+ Natildeo Natildeo Negativo 26 E 4+ Sim Sim Negativo 27 S 3+ Sim Sim 3+ 28 C 3+ Sim Natildeo 4+ 29 C 3+ Sim Sim 4+ 30 C 3+ Sim Sim 4+ 31 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 32 E 3+ Sim Sim Negativo 33 C 3+ Sim Natildeo 4+ 34 S 3+ Sim Sim Negativo 35 S 3+ Sim Sim Negativo 36 C 4+ Sim Natildeo 4+ 37 c 4+ Natildeo Natildeo 4+ 38 D 4+ Natildeo Sim 4+ 39 S 3+ Sim Sim 3+ 40 c 4+ Sim Natildeo 2+ 41 C 4+ Sim Natildeo 4+ 42 E 3+ Sim Sim Negativo 43 D 3+ Natildeo Sim 2+ 44 D 3+ Natildeo Sim 2+ 45 E 3+ Sim Sim Negativo 46 C 3+ Sim Sim 4+ 47 K 4+ Natildeo Natildeo 4+ 48 D 3+ Natildeo Sim 2+ 49 E 3+ Sim Sim Negativo 50 K 4+ Natildeo Sim 4+
TOTAL 50 28 33 41
38
Figura 10 ndash TDA monoespeciacutefico da amostra de paciente Hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo da classe
IgG
oacute Figura 11 ndash TDA apoacutes o tratamento com glicina-aacutecidaEDTA (esquerda) e cloroquina (direita) A glicina
negativou completamente o TDA enquanto a hemaacutecia tratada com cloroquina persistiu positiva (1+)
39
Figura 12 ndash Fenotipagem da amostra tratada com glicina-aacutecidaEDTA Fy(a+b+) Jk(a-b+) S+s+
Figura 13 ndash Painel em gel (LissAGH) do eluato apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de
intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
Figura 14 ndash ndash Painel ezimaacutetico (hemaacutecias tratadas com bromelina) do eluato em gel neutro apoacutes
tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
40
528 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Quanto a efetividade das teacutecnicas em negativar o TDA foi verificado que a glicina-
aacutecidaEDTA foi efetiva em 66 das amostras testadas no primeiro tratamento (3350
amostras) enquanto a cloroquina conseguiu negativar 56 (2850) Esses resultados natildeo
apresentam diferenccedila significativa (pgt005) demostrando que a teacutecnica da glicina-
aacutecidaEDTA natildeo eacute superior mas eacute tatildeo efetiva quanto a da cloroquina
Quando aliamos os resultados de ambas as teacutecnicas verificamos que em 76 (3850)
das amostras o TDA foi negativado Esse dado indica que ainda que uma teacutecnica natildeo seja
eficaz na remoccedilatildeo do anticorpo eacute uma boa alternativa tentar a segunda teacutecnica jaacute que a falha
em remover o anticorpo utilizando uma delas natildeo prevecirc necessariamente a falha com a outra
Quando se utiliza o teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla (graacutefico 2) para comparar a utilizaccedilatildeo das
duas teacutecnicas com o resultado de cada uma isolada (somente a cloroquina ou somente a
glicina) verificamos que os resultados apresentam diferenccedila significativa (plt005) (quadro 3)
TRATAMENTO EFETIVO COM TOTAL PORCENTAGEM
Glicina ou cloroquina 38 76
Glicina e cloroquina 23 46
Glicina apenas 10 20
Cloroquina apenas 5 10
Nenhuma das teacutecnicas 12 24
Quadro 3 - Resultados comparativos entre as teacutecnicas utilizadas
41
Graacutefico 2 - Teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla entre as teacutecnicas aplicadas A- Glicina e Cloroquina B-Cloroquina C-
Glicina ( plt005)
42
6 DISCUSSAtildeO
Os reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA podem ser adquiridos em
forma de kit comercial prontos para uso poreacutem natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil A preparaccedilatildeo
dos reagentes ldquoin houserdquo a partir de sais comerciais adquiridos se mostrou viaacutevel Os
reagentes glicina e o tampatildeo Tris armazenados de forma correta se mantiveram estaacuteveis por
um periacuteodo de 7 meses Somente o reagente EDTA precipitou mesmo armazenado em
condiccedilotildees adequadas sugerindo que o mesmo deve ser preparado em menor quantidade e
armazenado em aliacutequotas A soluccedilatildeo de cloroquina tambeacutem pode ser preparada ldquoin houserdquo e
pode ser armazenado por um mecircs A legislaccedilatildeo brasileira autoriza a utilizaccedilatildeo de reagentes
preparados a partir de sais comerciais como a cloroquina e a glicina-aacutecidaEDTA desde que
os sais tenham autorizaccedilatildeo da vigilacircncia sanitaacuteria para a comercializaccedilatildeo (BRASIL 2001)
A comparaccedilatildeo quanto a efetividade em dissociar anticorpos em amostras com TDA
positivos entre a teacutecnica da glicina e a teacutecnica da cloroquina mostrou que natildeo haacute diferenccedila
estatiacutestica entre elas e que ambas satildeo igualmente eficientes Se utilizadas conjuntamente haacute
maior possibilidade de elucidaccedilatildeo dos casos
Uma vantagem da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eacute que ela permite numa mesma
amostra eluir o anticorpo ligado aacute hemaacutecia assim como fenotipar a hemaacutecia tratada Devido a
sua dupla utilidade a teacutecnica eacute vantajosa principalmente em pacientes em que pouco volume
de amostra pode ser coletado como em casos de crianccedilas e receacutem-nascidos
A fenotipagem poacutes tratamento se mostrou viaacutevel jaacute que os antiacutegenos de maior
importacircncia natildeo sofreram alteraccedilotildees Nas 20 amostras que foram fenotipadas antes e apoacutes
tratamento para verificar a influecircncia dos reagentes na expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a
Jkb S e s natildeo houve destruiccedilatildeo dos mesmos por nenhuma das duas teacutecnicas
Para as amostras positivas para o antiacutegeno Kell (350) e sensibilizadas com o
respectivo anticorpo a teacutecnica da glicina foi efetiva em negativar o TDA em apenas duas
delas mas apoacutes o tratamento foi verificada uma fraca reatividade da reaccedilatildeo antiacutegeno-
anticorpo sugerindo que houve um enfraquecimento da expressatildeo do antiacutegeno conforme
esperado e descrito na literatura (BYRNE 1991 PALLAS WILER E MCGEE 1991
ROZIERS e SQUALI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012 e KATHARIA e
CHAUDHARY 2013) A accedilatildeo da glicina sobre o antigeno Kell natildeo representa impedimento
para seu uso uma vez que na impossibilidade de testar o antiacutegeno Kell o banco de sangue
consegue facilmente atender a solicitaccedilatildeo de transfusatildeo com unidades de hemaacutecias Kell
43
negativas jaacute que eacute um antiacutegeno de baixa prevalecircncia na populaccedilatildeo variando de 15 na
populaccedilatildeo africana a 9 nos europeus (DANIELS 2011)
A soluccedilatildeo resultante da dissociaccedilatildeo do anticorpo pela teacutecnica da glicina pode ainda ser
utilizada como eluato podendo substituir a teacutecnica de eluiccedilatildeo com reagentes comercias (kits
de eluiccedilatildeo aacutecida) que tem alto custo aproximadamente entre R$2000 a R$2500 por teste
Em 41 amostras (82) houve a dissociaccedilatildeo e recuperaccedilatildeo do anticorpo que estava
sensibilizando as hemaacutecias Em 9 amostras (18) os anticorpos foram eluiacutedos poreacutem
apresentaram reaccedilatildeo negativa quando testadas com hemaacutecias de triagem entre eles o anti-E
(6) anti-S (2) e Anti-D (1) Eacute possiacutevel que a correccedilatildeo pH do meio (WALKER 2011) natildeo
tenha sido adequada o que pode ter desfavorecido a reatividade do anticorpo
Para as amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA nas quais natildeo houve dissociaccedilatildeo do
anticorpo pelo primeiro tratamento (1750) o segundo tratamento natildeo se mostrou eficaz jaacute
que 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise O tempo de
armazenagem natildeo parece ter influenciado jaacute que todas as amostras foram testadas dentro de
48 horas apoacutes a coleta Outros fatores que natildeo foram verificados podem ter levado a
hemoacutelise Apesar da literatura (LOUIE JIENG e ZEROULIS 1986 e BYRNE 1991)
recomendar um segundo tratamento ele eacute pouco eficaz tendo negativado apenas 3 das 17
amostras testadas
A amostra de paciente que apresentou sensibilizaccedilatildeo ldquoin vivordquo mostrou melhor
efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA sobre a da cloroquina possibilitando
fenotipagem para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s que natildeo foram destruiacutedos apoacutes o
tratamento comprovado atraveacutes da genotipagem
A presenccedila de autoanticorpo a quente com presenccedila de hemoacutelise (AHAI) ou natildeo pode
mascarar a presenccedila de aloanticorpo interferindo na rotina soroloacutegica da fenotipagem que eacute
uma importante ferramenta para auxiliar na seleccedilatildeo de hemaacutecias para transfusatildeo (SHIREY et
al 2002) Esses pacientes frequentemente possuem aloanticorpos associados ao
autoanticorpo e a prevalecircncia de aloimunizaccedilatildeo entre eles varia entre 12 a 40 (LEGER e
GARRATY 1999 BRANCH e PETZ 1999) o que dificulta ainda mais a escolha do melhor
componente a ser transfundido aleacutem de aumentar a possibilidade reaccedilotildees hemoliacuteticas imunes
poacutes-transfusionais
Nesses casos as teacutecnicas de dissociaccedilatildeo de anticorpos satildeo importantes para tratar
amostras de pacientes e a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser usada como uma opccedilatildeo
pois se mostrou eficaz na dissociaccedilatildeo anticorpo ligado agraves hemaacutecias deixando livre a
superfiacutecie das mesmas permitindo a fenotipagem por antisoros IgG Paralelamente os
44
anticorpos eluiacutedos tambeacutem puderam ser estudados O mesmo natildeo ocorre com a cloroquina
que permite apenas a fenotipagem e tampouco com os kits de eluiccedilatildeo aacutecida disponiacuteveis no
mercado nacional que satildeo destinados a realizaccedilatildeo do eluato mas destroem as hemaacutecias
O tempo de tratamento na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA tambeacutem eacute uma vantagem
pois foi possiacutevel reproduzir no tempo determinado de 2 minutos enquanto a cloroquina
demora ateacute duas horas
Ainda que a aplicaccedilatildeo das teacutecnicas por biologia molecular estejam cada vez mais
presentes na rotina imuno-hematoloacutegica e possibilitam estabelecer o fenoacutetipo deduzido do
genoacutetipo elas natildeo estatildeo disponiacuteveis na maioria dos centros e sua realizaccedilatildeo exige algumas
horas A resoluccedilatildeo imediata do problema transfusional necessita dos resultados soroloacutegicos
pois com frequecircncia natildeo eacute possiacutevel aguardar o resultado do teste molecular Dessa forma
apesar da crescente importacircncia da genotipagem eritrocitaacuteria teacutecnicas soroloacutegicas aplicadas
corretamente e no momento propiacutecio satildeo de grande utilidade para resolver problemas imuno-
hematoloacutegicos como ocorre com a fenotipagem em pacientes com TDA positivo
45
7 CONCLUSAtildeO
A teacutecnica da glicina aacutecidaEDTA mostrou-se efetiva em remover os anticorpos que
sensibilizavam as hemaacutecias e pode ser utilizada com seguranccedila antes da fenotipagem
eritrocitaacuteria Por ser uma teacutecnica de raacutepida execuccedilatildeo eacute uma alternativa aplicaacutevel
principalmente em casos urgentes de pacientes que apresentam autoanticorpos
46
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50
9 ANEXOS
51
FUNDACcedilAtildeO HEMOCENTRO DE RIBEIRAtildeO PRETO
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE)
Tiacutetulo da pesquisa Aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina aacutecida-EDTA e avaliaccedilatildeo da
eficaacutecia no tratamento de hemaacutecias com teste direto da antiglobulina positivo
Pesquisadora responsaacutevel Ceacutelia Kazue Abiko
Orientador Prof Dimas Tadeu Covas
Co-orientadora Dra Flaacutevia Leite Souza Santos
Objetivo da pesquisa Vocecirc estaacute sendo convidado a participar de uma pesquisa que tem
como objetivo padronizar uma nova teacutecnica para auxiliar na tipagem sanguiacutenea de pacientes
A tipagem sanguiacutenea pode sofrer interferecircncia da presenccedila de anticorpos ligados aos gloacutebulos
vermelhos do sangue Nessas situaccedilotildees eacute difiacutecil selecionar o melhor sangue para o paciente e
eacute preciso a utilizaccedilatildeo de teacutecnicas adicionais para remover essas interferecircncias
Esta pesquisa tem como objetivo estudar outra teacutecnica para remover esses anticorpos e
comparaacute-la com a teacutecnica atualmente utilizada Para isso precisamos de amostras de pacientes
e doadores voluntaacuterios
Se vocecirc eacute um doador eacute necessaacuterio que vocecirc autorize a coleta de 5 ml (1 tubo) a mais
de seu sangue
Se vocecirc eacute um paciente natildeo haveraacute necessidade de nova amostra pois utilizaremos as
amostras jaacute coletadas para os testes preacute-transfusionais e os resultados encontrados nesta
pesquisa natildeo iratildeo interferir na escolha da (s) bolsa (s) de sangue que vocecirc possa vir a receber
Se vocecirc concordar em participar leia com atenccedilatildeo o texto abaixo e assine as duas vias
rubricando todas as paacuteginas deste termo de consentimento Uma via original assinada e
rubricada por vocecirc e pela pesquisadora ficaraacute com vocecirc
As suas informaccedilotildees seratildeo mantidas em sigilo pela pesquisadora e natildeo haveraacute
armazenamento de material para pesquisas posteriores Os seus dados seratildeo usados apenas
neste estudo e quando o trabalho for publicado seu nome e qualquer outra informaccedilatildeo que
possam identificaacute-lo natildeo seratildeo revelados
Eacute pouco provaacutevel que o que noacutes aprendermos com este estudo tenha um benefiacutecio
direto para vocecirc assim como natildeo poderemos dar nada em troca pela sua participaccedilatildeo na
pesquisa
Nosso objetivo com esta pesquisa eacute que os resultados poderatildeo ser uacuteteis para o
tratamento de pacientes no futuro Os riscos da participaccedilatildeo satildeo miacutenimos Se vocecirc eacute um
doador de sangue a amostra seraacute coletada no momento da doaccedilatildeo natildeo exigindo punccedilatildeo
venosa adicional
52
Eacute seu direito ter acesso aos resultados dos testes da pesquisa Esses resultados natildeo
seratildeo fornecidos automaticamente a vocecirc mas caso vocecirc se interesse em saber o resultado ou
tiver alguma duacutevida sobre a sua participaccedilatildeo neste estudo deveraacute entrar em contato com Ceacutelia
Kazue Abiko pelo telefone (18) 99718-3551
Vocecirc tem total liberdade de optar por natildeo participar da pesquisa Caso aceite
participar poderaacute desistir a qualquer momento ou retirar seu consentimento mesmo apoacutes ter
coletado o sangue Para cancelar sua participaccedilatildeo basta avisar a pesquisadora e os seus dados
seratildeo retirados do projeto
Qualquer duacutevida eacutetica sobre a pesquisa poderaacute entrar em contato com o Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa do Hospital das Cliacutenicas e da Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto
(CAMPUS UNIVERSITAacuteRIO bairro Monte Alegre CEP 14048-900 Ribeiratildeo Preto-SP
Telefone (16) 3602-2228 FAX (16) 3633-1144 e-mail cephcrpuspbr)
Consentimento de participaccedilatildeo
A Consentimento do participante
Li as informaccedilotildees acima sobre o estudo e recebi explicaccedilotildees sobre a participaccedilatildeo no estudo
Portanto dou o meu consentimento para participar do estudo
___________________________________________________________________________
Nome completo
___________________________________________________________________________
Assinatura
___________
Data
__________________________________________________________________________________
Nome completo da pesquisadora
___________________________________________________________________________
Assinatura
_____________
Data
15
134 ANEMIA HEMOLIacuteTICA AUTOIMUNE
A anemia hemoliacutetica autoimune eacute caracterizada pela destruiccedilatildeo precoce das hemaacutecias
autoacutelogas por autoanticorpos que sensibilizam as hemaacutecias e levam agrave fagocitose pelos
macroacutefagos no sistema reticulo-endotelial ou hemoacutelise intravascular O diagnoacutestico da AHAI
baseia-se na presenccedila de hemoacutelise cliacutenica associada agrave evidecircncia de fator imune representado
pelo TDA positivo As classes de anticorpos envolvidas em quadros de AHAI satildeo IgG IgM e
raramente IgA (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012) Satildeo raros os casos de AHAI com TDA
negativo que podem estar relacionados a um autoanticorpo de baixa avidez de densidade
inferior agrave detecccedilatildeo do meacutetodo ou ainda de classe de imunoglobulina natildeo avaliada pelo
meacutetodo utilizado para o teste (GARRATY 2005)
A AHAI pode ser classificada em dois grupos principais de acordo com a melhor
temperatura de reaccedilatildeo do autoanticorpo As anemias hemoliacuteticas causadas por anticorpos
quentes que reagem melhor a 37oC e geralmente IgG representam 80 dos casos de AHAI
Nas AHAI por anticorpo quente o TDA pode ser positivo para IgG mais complemento (67)
somente IgG (20) ou somente por complemento (13) As anemias causadas por
anticorpos frios geralmente da classe IgM e que reagem melhor em temperatura ambiente ou
a 4oC representam aproximadamente 20 dos casos de AHAI Por exibirem amplitude
teacutermica esses anticorpos ligam-se agraves hemaacutecias ao atingirem a circulaccedilatildeo nas extremidades do
corpo fixam o complemento e desprendem-se da hemaacutecia apoacutes retornar para partes mais
quentes Por esse motivo em AHAI por anticorpos frios o TDA eacute positivo apenas agraves custas
de C3 e normalmente o IgM natildeo eacute detectado (LEGER 2011 ZANTEK et al 2012)
A presenccedila do autoanticorpo IgG pode ser confirmada atraveacutes da eluiccedilatildeo do anticorpo
da hemaacutecia Tipicamente o eluato na AHAI por anticorpo quente reage com todas as ceacutelulas
testadas de um painel de hemaacutecias alogecircnicas do tipo ldquoOrdquo ou pode eventualmente exibir uma
especificidade conhecida como Anti-e (Anti-RH5) Nas AHAI a frio por sua vez espera-se
um eluato negativo (LEGER 2011)
Os autoanticorpos satildeo com frequecircncia encontrados livres no plasma e natildeo somente
ligados agraves hemaacutecias autoacutelogas Eles podem interferir em todas as fases dos testes preacute-
transfusionais nas quais o plasma eacute testado especialmente os autoanticorpos quentes que
acarretam resultados positivos em todos os testes levados agrave fase de antiglobulina humana
Esses anticorpos portanto positivam a pesquisa de anticorpos irregulares e mascaram a
presenccedila de aloanticorpos de significado cliacutenico Aproximadamente 60 dos pacientes que
apresentam AHAI a quente apresentam anticorpos que reagem em meio salino mas se forem
16
levados em conta meacutetodos mais sensiacuteveis como PEG enzima e estudo em gel a positividade
pode ser superior a 90 (LEGER 2011)
Aleacutem da eficaacutecia da transfusatildeo ser comprometida pela diminuiccedilatildeo da vida-meacutedia das
hemaacutecias a presenccedila do autoanticorpo dificulta a realizaccedilatildeo dos testes preacute-transfusionais e
compromete a seguranccedila transfusional Os autoanticorpos reagem normalmente como
panaglutininas pois satildeo normalmente voltados contra antiacutegenos puacuteblicos na maior parte das
vezes contra antiacutegenos do sistema Rh Por apresentarem essas caracteriacutesticas podem ainda
mascarar a presenccedila de aloanticorpos de significado clinico e levar a testes de compatibilidade
positivos exigindo uma avaliaccedilatildeo criteriosa da necessidade da transfusatildeo (BRANCH e PETZ
1999 JUNIOR e OLIVATO 2004)
Remover a interferecircncia do autoanticorpo para avaliar a presenccedila de aloanticorpos
mascarados nem sempre eacute possiacutevel mesmo utilizando teacutecnicas de autoadsorccedilatildeo ou
aloadsorccedilatildeo que aleacutem de tudo satildeo demoradas e exigem de 2 a 6 horas para conclusatildeo
(GARRATY e GEORGE 2002) Nesses casos a fenotipagem eritrocitaacuteria do paciente eacute de
extrema utilidade especialmente em situaccedilotildees de urgecircncia A definiccedilatildeo do fenoacutetipo do
paciente para os antiacutegenos de maior importacircncia cliacutenica pode auxiliar a seleccedilatildeo de unidades
de hemaacutecias com mesmo fenoacutetipo o que garante que eventuais aloanticorpos natildeo
identificados sejam respeitados e tambeacutem evita nova sensibilizaccedilatildeo (JUNIOR e OLIVATO
2004 SHIREY et al 2002)
135 TRATAMENTO DE HEMAacuteCIAS COM TDA POSITIVO
O TDA positivo impede a fenotipagem eritrocitaacutecia por meacutetodos que exigem a fase de
AGH uma vez que a aglutinaccedilatildeo ocorreraacute devido agrave interaccedilatildeo da AGH com o autoanticorpo
que sensibiliza a hemaacutecia do paciente levando a resultados falso positivos Em algumas
situaccedilotildees como na AHAI por anticorpo quente a fenotipagem eacute especialmente importante
pois o autoanticorpo interfere na triagem e identificaccedilatildeo de anticorpos assim como no teste de
compatibilidade e dificultam a detecccedilatildeo de aloanticorpos de significado cliacutenico que
obrigatoriamente devem ser respeitados Nessas situaccedilotildees a fenotipagem eritrocitaacuteria
determina o perfil antigecircnico do paciente e possibilita o fornecimento de unidades de
hemaacutecias com o mesmo fenoacutetipo para a transfusatildeo evitando a sensibilizaccedilatildeo para novos
antiacutegenos assim como reaccedilotildees hemoliacuteticas transfusionais No entanto eacute necessaacuterio aplicar
meacutetodos que natildeo sofram interferecircncia do TDA positivo ou seja meacutetodos que natildeo necessitem
da fase de AGH ou meacutetodos de bloqueio do anticorpo sem bloquear o antiacutegeno Uma opccedilatildeo eacute
a utilizaccedilatildeo de soros monoclonais IgM (salinos ou de meio proteico natildeo concentrado) mas
17
nem sempre esses reagentes estatildeo disponiacuteveis especialmente os reagentes monoclonais para
os antiacutegenos dos sistemas Duffy ( Fya Fy
b) Kidd ( Jk
a Jk
b) e MNS (S s) (JUNIOR e
OLIVATO 2004) Outra opccedilatildeo eacute a teacutecnica de bloqueio que pode ser utilizada para tratar
hemaacutecias para posterior fenotipagem em casos de TDA positivos com reatividade le2+
Em casos onde a positividade do TDA eacute maior que 2+ estaacute indicada a tratamento
quiacutemico para remoccedilatildeo da interferecircncia do autoanticorpo antes de realizar a fenotipagem Entre
as teacutecnicas utilizadas atualmente estatildeo o ZZAP a cloroquina e a glicina aacutecidaEDTA
1351 TEacuteCNICA DE BLOQUEIO
A teacutecnica de bloqueio se baseia na utilizaccedilatildeo de anti-IgG (Coombs monoespeciacutefico)
para tratar as hemaacutecias com TDA positivo O anticorpo anti-IgG se liga aos anticorpos que
estatildeo sensibilizando a hemaacutecias poreacutem sem o bloquear os antiacutegenos Os antiacutegenos que natildeo
estatildeo sensibilizados podem ser detectados atraveacutes dos antissoros especiacuteficos (SERERAT
VEIDT E DUTCHED 2000)
1352 TRATAMENTO DE HEMAacuteCIAS COM ZZAP
O Sulphydryl-Proteolytic Enzyme (ZZAP) que eacute uma mistura de ditiotreitol (DTT)
mais papaiacutena ativada com cisteiacutena eacute um reagente capaz de dissociar imunoglobulinas da
classe IgG ligadas a membrana dos eritroacutecitos enquanto trata enzimaticamente as hemaacutecias
O tratamento enzimaacutetico tambeacutem potencializa a ligaccedilatildeo do autoanticorpo ao antiacutegeno e
acelera o processo de autoadsorccedilatildeo O ZZAP pode desnaturar os antiacutegenos do sistema Duffy
MNS e Kell o que limita sua aplicaccedilatildeo para fins de fenotipagem (BRANCH e PETZ 1982)
1353 CLOROQUINA
Em 1982 Edwards Moulds e Judd propuseram a utilizaccedilatildeo da teacutecnica da cloroquina
que dissociava os complexos antiacutegeno-anticorpo e mantinha a membrana das hemaacutecias
iacutentegras Os derivados quinolecircicos jaacute haviam sido descritos anteriormente por Domokos e
Aszody em 1964 e Holtz Mantel e Buck em 1973 (apud Edwards Moulds e Judd 1982) pela
sua capacidade de separar imunocomplexos e inibir as reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo reduzindo
as cargas eleacutetricas das superfiacutecie das hemaacutecias A teacutecnica eacute uma das mais utilizadas nos
centros brasileiros para remover a interferecircncia do autoanticorpo e eacute tambeacutem a teacutecnica
atualmente adotada pelo laboratoacuterio de imunohematologia do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto
18
Edwards Moulds e Judd (1982) demonstraram que a teacutecnica da cloroquina para
dissociaccedilatildeo de anticorpos eacute uma teacutecnica simples efetiva e confiaacutevel para dissociar
imunoglobulina das hemaacutecias Desde que a membrana das hemaacutecias permaneccedila intacta natildeo
haacute perda da reatividade dos antiacutegenos e a sua maior aplicaccedilatildeo eacute a fenotipagem de hemaacutecias
com TDA positivo Os autores verificaram que em 83 das amostras sensibilizadas in vivo e
22 amostras (no total de 40) sensibilizadas ldquoin vitrordquo apresentaram TDA negativo e
puderam ser fenotipadas A teacutecnica poreacutem natildeo consegue remover os componentes do
complemento na maioria dos casos
Champagne e colaboradores (1999) testaram a teacutecnica da cloroquina para dissociar
antiacutegenos Bg comparando com a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA e verificaram vantagem em
relaccedilatildeo ao uso de um uacutenico reagente diminuindo a manipulaccedilatildeo e verificou que o mesmo natildeo
destroacutei antiacutegeno Kell
A cloroquina tambeacutem mostrou-se pouco efetivo em remover anticorpos do sistema
Duffy da superfiacutecie das hemaacutecias (EDWARDS MOUDS e JUDD 1982 ROZIERS e
SQUALI 1997)
1353 GLICINA-AacuteCIDAEDTA
A afinidade e a estabilidade entre a ligaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo eacute definida como a
resultante entre forccedilas atrativas e repulsivas entre ambos (CARUCIO e WISE 2012) e resulta
da somatoacuteria de forccedilas quiacutemicas dinacircmicas e fracas (natildeo covalentes) como pontes de
hidrogecircnio forcas eletrostaacuteticas forca de Van der Waals e pontes hidrofoacutebicas A estabilidade
dessa ligaccedilatildeo eacute facilmente abalada por alteraccedilotildees quiacutemicas e fiacutesicas no meio da reaccedilatildeo como
a alteraccedilatildeo do pH A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA se baseia na mudanccedila do pH para a
quebra da ligaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo (KOSANKE 2012)
A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA foi primeiramente descrita em 1986 por Louie Jieng
e Zeroulis que utilizaram 50 amostras de doadores sensibilizados ldquoin vitrordquo com anticorpos A
teacutecnica foi efetiva em 48 amostras permitindo o estudo do eluato assim como a fenotipagem
das hemaacutecias Os autores testaram tambeacutem a teacutecnica em 100 hemaacutecias TDA positivo que
puderam ser utilizadas para teacutecnicas de autoadsorccedilatildeo
Byrne (1991) descreveu a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA modificada e tambeacutem
verificou como uma opccedilatildeo para o tratamento de hemaacutecias com TDA positivo que deixava as
hemaacutecias intactas e o eluato viaacutevel para ser fenotipado
19
Roziers e Squali (1997) e Katharia e Chaudhary (2013) compararam a teacutecnica da
glicina-aacutecidaEDTA com as teacutecnicas da cloroquina e do aquecimento Verificaram maior
eficiecircncia da glicina-aacutecidaEDTA em relaccedilatildeo as outras duas teacutecnicas pois com uma mesma
quantidade de amostra produzia as hemaacutecias livres de anticorpo e tambeacutem o eluato Mostrou-
se ainda superior devido ao menor tempo exigido para sua realizaccedilatildeo o que favorece seu uso
em situaccedilotildees de urgecircncia e emergecircncia
As duas desvantagens da teacutecnica poreacutem eacute o fato de destruir os antiacutegenos do sistema
Kell e o fato de natildeo remover fraccedilotildees do complemento ligadas agrave hemaacutecia (PALLAS WILER e
McGEE 1991 ROZIERS e SQUALLI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012
e KATHARIA e CHAUNDHARY 2013)
20
2 OBJETIVOS
21 OBJETIVO GERAL
211 Avaliar a eficaacutecia da glicina-aacutecidaEDTA em remover os anticorpos ligados agraves
hemaacutecias sensibilizadas por anticorpos da classe IgG
22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
221 Preparaccedilatildeo dos reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
verificaccedilatildeo da estabilidade dos mesmos e avaliar custos
222 Testar a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA em amostras de hemaacutecias
sensibilizadas por anticorpos antieritrocitaacuterios humanos
223 Comparar a efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA com a teacutecnica da
cloroquina quanto a capacidade de remover a interferecircncia do anticorpo ligado
a hemaacutecia
224 Testar o eluato das amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA
225 Verificar se houve destruiccedilatildeo dos antiacutegenos eritrocitaacuterios apoacutes o tratamento
com glicina-aacutecidaEDTA e com cloroquina
226 Verificar se o tempo de execuccedilatildeo da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA descrito
nos textos de referecircncia eacute reprodutiacutevel
21
3 JUSTIFICATIVA
Algumas condiccedilotildees cliacutenicas podem levar ao depoacutesito ldquoin vivordquo de anticorpos eou
fraccedilotildees do complemento sobre as hemaacutecias Entre elas estatildeo as reaccedilotildees hemoliacuteticas poacutes-
transfusionais a doenccedila hemoliacutetica perinatal o uso de medicamentos e principalmente a
AHAI Na AHAI um anticorpo normalmente da classe IgG ou IgM reconhece antiacutegenos
proacuteprios na membrana eritrocitaacuteria e reduz a sobrevida da hemaacutecia levando a sua destruiccedilatildeo
pelos macroacutefagos no sistema reticulo-endotelial ou agrave ativaccedilatildeo do complexo de ataque agrave
membrana e agrave lise intravascular Os autoanticorpos satildeo voltados na maioria das vezes contra
antiacutegenos eritrocitaacuterios de alta frequecircncia populacional conhecidos como antiacutegenos puacuteblicos
e por este motivo reconhecem tanto hemaacutecias autoacutelogas quanto alogecircnicas
Devido agrave presenccedila do autoanticorpo livre no plasma e tambeacutem do anticorpo eou
complemento ligado agrave hemaacutecia o banco de sangue pode encontrar dificuldades em todas as
fases dos testes preacute-transfusionais do paciente com AHAI e deve utilizar teacutecnicas que
auxiliem na escolha do melhor hemocomponente melhorando a seguranccedila transfusional Essas
teacutecnicas visam remover a interferecircncia do autoanticorpo livre no soro e do autoanticorpo
ligado agrave hemaacutecia permitindo a detecccedilatildeo de aloanticorpos associados e a realizaccedilatildeo da
fenotipagem eritrocitaacuteria respectivamente
A finalizaccedilatildeo dos testes preacute-tranfusionais na presenccedila de autoanticorpo pode levar
algumas horas e nem sempre o paciente poderaacute aguardar Nesse contexto torna-se vantajosa a
aplicaccedilatildeo de teacutecnicas de raacutepida execuccedilatildeo
O presente estudo propotildee aplicar e avaliar a eficaacutecia da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
em remover os anticorpos ligados agrave hemaacutecia o que permite a fenotipagem eritrocitaacuteria
estendida e a seleccedilatildeo de concentrados de hemaacutecias com mesmo fenoacutetipo do paciente
Atualmente no Hemocentro de Ribeiratildeo Preto a teacutecnica utilizada para esse fim eacute o
tratamento das hemaacutecias com difosfato de cloroquina cujo tempo de execuccedilatildeo pode demorar
ateacute duas horas enquanto a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser realizada em apenas dois
minutos o que a tornaria opccedilatildeo de escolha especialmente em situaccedilotildees de urgecircncia Ao
contraacuterio da cloroquina a glicina-aacutecidaEDTA permite tambeacutem o estudo do eluato das
hemaacutecias tratadas
22
4 METODOL OGIA
41 AMOSTRAS DE DOADORES
Foram coletados 50 amostras de doadores de sangue que compareceram ao
Hemonuacutecleo de Araccedilatuba no periacuteodo de junho a agosto de 2016 Foram convidados a
participar da pesquisa doadores de repeticcedilatildeo do tipo sanguiacuteneo ldquoOrdquo RhD positivo
cadastrados no sistema de banco de sangue (SBS) do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto
Todos os doadores que concordaram em participar da pesquisa assinaram o termo de
consentimento livre e esclarecido (TCLE)
No momento da doaccedilatildeo foram coletados adicionalmente 5 mL de sangue total em
soluccedilatildeo anticoagulante EDTA (aacutecido dietilenoaminoaceacutetico) dispensando punccedilatildeo venosa
adicional para coleta da amostra O fluxograma 1 resume as etapas desenvolvidas no projeto
Fluxograma 1 - Fluxo da pesquisa utilizando as amostras de doadores
23
411 FENOTIPAGEM
Foram verificados se os doadores jaacute tinham fenotipagem para outros sistemas de
grupos sanguiacuteneos aleacutem do sistema ABORh que eacute realizado rotineiramente
A fenotipagem eritrocitaacuteria para outros sistemas ou fenotipagem estendida eacute realizada
para identificar a presenccedila ou ausecircncia de antiacutegenos considerados de importacircncia cliacutenica No
Hemonuacutecleo de Araccedilatuba uma parcela de doadores de repeticcedilatildeo satildeo fenotipados para os
antiacutegenos dos sistemas de grupo sanguiacuteneo Rh (antiacutegenos C c E e e) Kell (antiacutegeno K)
Duffy (antiacutegenos Fya e Fy
b) Kidd (antiacutegenos Jk
a e Jk
b) e sistema MNSs (antiacutegenos S e s)
A fenotipagem para o Rh e Kell eacute realizada por metodologia de microplaca utilizando
25 microL de hemaacutecia lavada e diluiacuteda a 5 em salina e 25 microL do antissoro comercial especiacutefico
A reaccedilatildeo eacute incubada 15 minutos a temperatura ambiente e centrifugadas para leitura Para os
antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s a metolodogia utilizado eacute gel contendo antiglobulina
humana (gel LissCoombs poliespeciacutefico) da marca BIO-RAD onde se utiliza suspensatildeo de
hemaacutecia em LISS (Soluccedilatildeo de baixa forccedila iocircnica) A suspensatildeo eacute preparada atraveacutes da
diluiccedilatildeo de 10 microL de hemaacutecia em 1000 microL de LISS Pipetado 50 microL dessa diluiccedilatildeo no gel e
adicionado 25 microL do antissoro especiacutefico Incuba-se em banho seco por 15 minutos a 37 deg
Celsius e eacute centrifugado em centriacutefuga especiacutefica Os antissoros utilizados eram das marcas
Fresenius e Lorne
Foi verificado a fenotipagem do doador no banco de dados do Hemocentro Os
registros dos fenoacutetipos dos doadores ficam armazenadas no sistema de banco de sangue
(SBS) Para doadores que natildeo tinham fenotipagem estendida preacutevia para antiacutegenos do sistema
Rh (C c E e e) e Kell (K) foi realizada a fenotipagem para esses antiacutegenos
O tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA e cloroquina para dissociar
anticorpos pode inativar enfraquecer ou destruir os antiacutegenos presentes nas hemaacutecias
alterando assim os resultados da fenotipagem Para verificar se houve destruiccedilatildeo dos
antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a e Jk
b S e s nas amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes
tratamento foram novamente fenotipadas ao final para os antiacutegenos que eram inicialmente
positivas
A repeticcedilatildeo da fenotipagem foi realizada nas amostras que apresentaram efetividade
no tratamento da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eou da cloroquina e a detecccedilatildeo do antiacutegeno
na amostra preacute-tratamento
24
412 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS HEMAacuteCIAS
As hemaacutecias foram sensibilizadas com antissoros policlonais humanos de amostras de
plasma fresco congelado de doadores com resultado de pesquisa de anticorpo irregular
positivos
A escolha do anticorpo para sensibilizar as hemaacutecias foi definida de acordo com o
fenoacutetipo do doador que deveria ser positivo para o respectivo antiacutegeno
Para a sensibilizaccedilatildeo um volume de antissoro (1 mL) e um volume (1 mL) de
hemaacutecias lavadas quatro vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica foram adicionadas a um tubo de 12 x
75 mm A mistura foi homogeneizada e incubada em banho maria (BM) a 37deg C por 60
minutos A seguir as hemaacutecias foram novamente lavadas 4 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica
para retirada dos anticorpos que natildeo se ligaram A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada
como controle negativo O teste da uacuteltima lavagem eacute importante para assegurar que os
anticorpos que poderatildeo ser detectados no eluato apoacutes o tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA
sejam aqueles que estavam ligados agraves hemaacutecias e natildeo aqueles livres no plasma O controle
negativo mostra que todo o anticorpo livre foi retirado (LEGER 2011)
Para o teste de presenccedila de anticorpo na soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foram incubadas
com hemaacutecias de triagem de anticorpos irregulares (ID-Diacell BIO-RAD) contendo os
antiacutegenos especiacuteficos Realizado a teacutecnica em gel LissCoombs com anti-IgG+C3d Incubado
no tempo de 15 minutos a temperatura de 37deg C e centrifugado 10 minutos em centriacutefuga
proacutepria
As 50 amostras de doadores foram sensibilizadas com os anticorpos policlonais
humanos
Apoacutes sensibilizadas rdquoin vitrordquo e lavadas as hemaacutecias foram diluiacutedas em soluccedilatildeo de
baixa forccedila iocircnica (LISS) na quantidade de 10 microL de hemaacutecia para 1000 microL de soluccedilatildeo A
suspensatildeo foi pipetada (50 microL) em coluna-gel-teste LissCoombs (BIO-RAD) que contecircm
antiglobulina poliespeciacutefico (IgG+C3d) e centrifugada em baixa rotaccedilatildeo conforme orientaccedilatildeo
do fabricante durante 10 minutos
As amostras deveriam apresentar aglutinaccedilatildeo com reatividade 3 a 4+ no TDA As
amostras que apresentaram reaccedilatildeo menor que 3+ foram novamente sensibilizadas com nova
aliacutequota do antissoro
25
413 TRATAMENTO DAS AMOSTRAS
As amostras sensibilizadas apresentando o TDA positivo 3 ou 4+ foram divididas em
duas aliacutequotas e submetidas a duas teacutecnicas diferentes com o objetivo de dissociar o anticorpo
ligado Uma aliacutequota da amostra foi tratada com soluccedilatildeo de difosfato de cloroquina enquanto
a outra aliacutequota foi tratada com glicina-aacutecidaEDTA
42 PREPARO DA GLICINA AacuteCIDA-EDTA
A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA utiliza 3 soluccedilotildees diferentes a glicina aacutecida o
EDTA e o tampatildeo TRIS
Os reagentes foram preparados utilizando os sais para anaacutelise (PA) de EDTA
(Na2EDTA2H2O) TRIS (C4H11NO3) Glicina (H2NCH2CO2H) NaCl e a soluccedilatildeo de aacutecido
cloriacutedrico (HCl) 12 N todos reagentes da marca SYNTH (quadro 1)
Para o preparo do tampatildeo glicina-acida eacute necessaacuterio o ajuste do pH para 15 Para esse
ajuste utiliza-se aacutecido cloriacutedrico (HCl) concentrado O pH foi medido com fitas reativas de pH
com escala de 1 a 14 da marca MERCK Posteriormente a soluccedilatildeo foi enviada ao laboratoacuterio
de controle de qualidade do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto e o pH medido no peagacircmetro O
tampatildeo glicina-aacutecida foi armazenado a 4deg e o tampatildeo tris e o EDTA em temperatura ambiente
controlada (20 a 24deg Celsius)
Apoacutes o preparo e durante a realizaccedilatildeo dos testes foram feitas inspeccedilotildees visuais para
verificaccedilatildeo de turvaccedilatildeo do meio e presenccedila de precipitados
Reagente Material Quantidade Preparo e
Conservaccedilatildeo
EDTA
EDTA
(Na2EDTA2H2O)
5 gramas Mistura ateacute
dissoluccedilatildeo do sal e
conserva em
temperatura ambiente Aacutegua Destilada 50 Ml
Tris
TRIS (C4H11NO3) 121 gramas Conservar em
temperatura ambiente NaCl 525g
Aacutegua destilada 100ml
Gliacutecina-aacutecida
Glicina
(H2NCH2CO2H) 15 gramas
Conservar a 4oC NaCl 116gramas
Aacutegua Destilada 200ml
HCL 12N Ajutar o pH para 15
Quadro 1 - Preparo dos Reagentes da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
Fonte - Manual teacutecnico AABB 2011
26
O tampatildeo glicina-aacutecida e o tampatildeo TRIS satildeo estaacuteveis por 7 meses O reagente EDTA
precipitou mesmo estando em temperatura em ambiente controlado Houve necessidade de
preparo de novo reagente
421 TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
1 Em um tubo de ensaio 12x75 mm eacute adicionado 08 mL da soluccedilatildeo de glicina-aacutecida A
esta soluccedilatildeo adiciona-se 02 mL de EDTA e mistura
2 Adiciona-se 02 mL de hemaacutecias sensibilizadas (lavada 4 vezes) A mistura eacute
homogeneizada e incubada por exatamente 2 minutos
3 A seguir 01 mL de tampatildeo TRIS eacute adicionado agrave mistura que eacute novamente
homogeneizada e centrifugada por 2 minutos a 3400 rpm O pH deve estar entre 7 a 75
4 Apoacutes centrifugaccedilatildeo separa-se em outro tubo o sobrenadante (eluato) e as hemaacutecias
que permanecem satildeo lavadas 4 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica para retirada de todo o
reagente e anticorpos livres
43 PREPARO DA CLOROQUINA
A cloroquina eacute diluiacuteda em tampatildeo PBS na concentraccedilatildeo de 20 (Quadro 2) e
armazenado a 4deg Celsius sua validade apoacutes o preparo eacute de 1 mecircs
A teacutecnica da cloroquina jaacute estaacute padronizada para rotina do laboratoacuterio de
imunohematologia do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto e suas unidades
Reagente Reagentes Quantidade PreparoConservaccedilatildeo
Cloroquina
Difosfato de cloroquina
(C18H32ClN3O8P2)
20 gramas
Conservar a 4deg Celsius
Tampatildeo PBS 100ml
NaOH 01 N Acertar o pH para
51
Quadro 2 - Preparo da Cloroquina Fonte - Manual teacutecnico da AABB 2011
431 TEacuteCNICA DA CLOROQUINA
1 4 partes da soluccedilatildeo pronta eacute adicionada a uma parte de hemaacutecias lavadas 4 vezes com
soluccedilatildeo fisioloacutegica
2 A mistura eacute incubada em temperatura ambiente por ateacute duas horas
3 Centrifugar a 3400 rpm por 2 minutos
27
4 Remover o sobrenadante lavar as hemaacutecias novamente com soluccedilatildeo fisioloacutegica 4
vezes
44 VERIFICACcedilAtildeO DA EFETIVIDADE DOS TESTES
Apoacutes tratamento pelas duas teacutecnicas o TDA foi repetido em todas as amostras para
verificar se os tratamentos foram efetivos e houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo Para as
amostras tratadas pela teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA que permaneceram com TDA positivo
novo tratamento foi realizado
45 TESTE DO ELUATO
O eluato resultante das amostras tratadas com glicina-acidaEDTA foi testado com
hemaacutecias de triagem A soluccedilatildeo do eluato foi incubada com as hemaacutecias de triagem de
anticorpos (ID-Diacell BIO-RAD) pela teacutecnica em gel LissCoombs O teste foi incubado 15
minutos a 37deg Celsius e centrifugado por 10 minutos em centrifuga proacutepria para a teacutecnica em
gel Os eluatos que apresentaram resultados positivos foram testados em painel de 11
hemaacutecias (ID-Diapanel BIO-RAD) para a identificaccedilatildeo do anticorpo
46 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente que apresentou TDA positivo por IgG e pesquisa
de anticorpo irregular positivo com presenccedila de autoanticorpo com reatividade panaglutinina
A amostra foi tratada em paralelo pelas duas teacutecnicas descritas e foi enviada para o
Hemocentro para genotipagem eritrocitaacuteria que foi realizado por metodologia PCR em tempo
real no equipamento Real-time system PCR 7500 ( Applied Biosystems Califoacuternia EUA)
28
5 RESULTADOS
51 REAGENTES
Para aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA satildeo necessaacuterios 3 diferentes
reagentes que podem ser encontrados em forma de kit pronto para uso No entanto esses kits
natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil Os reagentes satildeo tampatildeo glicina-aacutecida o EDTA e o tampatildeo
Tris
Todos os reagentes foram preparados rdquoin houserdquo a partir dos sais e soluccedilotildees PA (puro
para anaacutelise) da marca SYNTH que foram adquiridos para a pesquisa O custo estimado para
cada teste foi aproximadamente R$ 020 reais
Apoacutes o preparo os reagentes poderiam ser armazenados em condiccedilotildees adequadas pelo
periacuteodo de 1 ano (AABB 2011) Ao final do preparo e durante o periacuteodo de armazenamento
de fevereiro a setembro de 2016 foi realizada inspeccedilatildeo visual para verificar a presenccedila de
precipitados ou turvaccedilatildeo A soluccedilatildeo de glicina e o tampatildeo TRIS mostraram-se estaacuteveis ateacute o
final do periacuteodo Por sua vez o reagente EDTA precipitou mesmo estando armazenado em
temperatura ambiente controlada e foi necessaacuterio novo preparo
52 AMOSTRAS DE DOADORES
521 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS AMOSTRAS
Apoacutes incubaccedilatildeo da hemaacutecia com o antissoro a mesma foi lavada 4 vezes para retirada
dos anticorpos livres A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada Caso houvesse positividade na
soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem a etapa era repetida (figura 3) Das 50 amostras sensibilizadas a
uacuteltima lavagem foi positiva somente em 3 delas Nas 3 amostras o anticorpo utilizado para
sensibilizaccedilatildeo foi o anti-K Apoacutes repetido nova etapa de lavagem os resultados se
apresentaram negativos
Em todas as amostras sensibilizadas ldquoin vitrordquo o TDA foi testado e verificado a
intensidade do teste Entre as 50 amostras 47 alcanccedilaram TDA com intensidade 3-4+ apoacutes a
primeira sensibilizaccedilatildeo enquanto 3 amostras necessitaram uma segunda incubaccedilatildeo com
anticorpo (figura 4)
A escolha dos anticorpos para sensibilizar as hemaacutecias foi feita de acordo com o
fenoacutetipo do doador e foram utilizados sete diferentes especificidades de anticorpos policlonais
humanos conforme mostra o graacutefico1
29
Figura 3 - Soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada com hemaacutecia de triagem de
anticorpos em gel LissCoombs (BIO-RAD) A finalidade eacute verificar a presenccedila de anticorpos livres na
suspensatildeo que possam interferir na pesquisa do eluato As soluccedilotildees de lavagem das amostras na figura a tiveram
resultados negativos Na figura b duas amostras a 47 e 50 apresentaram resultado positivo Nova etapa de
lavagem foi realizada e o resultado final foi negativo
522 TRATAMENTO DAS HEMAacuteCIAS
Apoacutes a sensibilizaccedilatildeo e obtenccedilatildeo de resultados de TDA com intensidade de 3 a 4+
cada uma das amostras foi dividida em duas aliacutequotas e tratada separadamente pelas teacutecnicas
de glicinaaacutecida-EDTA e cloroquina
As teacutecnicas foram consideradas efetivas quando obteve-se a completa dissociaccedilatildeo do
anticorpo verificada atraveacutes do TDA negativo na amostra poacutes tratamento conforme figuras 5
e 6 Dentre as amostras tratadas com cloroquina 2850 tiveram o TDA negativado A glicina-
aacutecidaEDTA negativou o TDA em 33 das 50 amostras tratadas Apenas 17 amostras tratadas
com glicina-aacutecidaEDTA permaneceram com o TDA positivo e foram submetidas a um novo
tratamento
30
Figura 4 - TDA das amostras apoacutes sensibilizaccedilatildeo com anticorpos policlonais humanos Amostras na
figura a com intensidades de 3-4+ Na figura b amostras 4 e 7 com intensidade menor que 3+ e portanto foram
novamente sensibilizadas com nova aliacutequota de soro Anti-D e anti-S Apoacutes a segunda sensibilizaccedilatildeo
apresentaram reatividade 4 e 3+ respectivamente Os anticorpos utilizados para sensibilizaccedilatildeo foram D S c E
C e K
523 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS TEacuteCNICAS
No tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA houve dissociaccedilatildeo completa do anticorpo
em 33 amostras (66) das 50 amostras testadas enquanto que com a cloroquina foram 28
amostras (56) (tabela 1)
31
Graacutefico 1- Nuacutemero de amostras sesnsibilizadas por especificidade de anticorpo Entre as 50 amostras 12
foram sensibilizadas com anti-D 10 com anti-C 9 com anti-E 8 com anti-c 7 com anti-S 3 com anti-K e 1
com anti-Dia As especificidades dos anticorpos foram definidas de acordo o fenoacutetipo do doador
Figura 5 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com cloroquina Nas amostras onde houve
a dissociaccedilatildeo do anticorpo ( 2 21 a 23 26 39 a 42 45 46 e 49) a hemaacutecia se deposita no fundo no microtubo
apoacutes a centrifugaccedilatildeo (TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (1 3 24 25 43 44 47
48 e 50) o anticorpo ligado agraves hemaacutecias eacute alvo da AGH presente no gel (TDA positivo)
Anti-D 12
Anti-C 10
Anti-E 9
Anti-c 8
Anti-S 7
Anti-K 3 Anti-Dia 1
32
Figura 6 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA Nas amostras
onde houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo (4 6 7 12 a 15 17 34 35 37 e 38) a hemaacutecia se deposita no fundo no
microtubo apoacutes a centrifugaccedilatildeo ( TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (5 16 18
19 20 33 e 36 ) o AGH presente no gel se liga ao anticorpo ligado agraves hemaacutecias que ficam retidas no gel (TDA
positivo)
Tabela 1-Resultado geral do tratamento das hemaacutecias com glicina e cloroquina
Teacutecnica utilizada TDA negativo TDA positivo Total
Glicina-aacutecidaEDTA 33 17 50
Cloroquina 28 22 50
A glicina-aacutecidaEDTA conseguiu negativar mais amostras sensibilizadas com Anti-D
e anti-K que a cloroquina Para as hemaacutecias sensibilizadas com anti-E Anti-S e Anti-Dia
ambas as teacutecnicas dissociaram o anticorpo em 100 das amostras Os resultados detalhados
por especificidade do anticorpo apoacutes o primeiro tratamento com glicina-aacutecidaEDTA e com
cloroquina estatildeo na tabela 2
Para as amostras que permaneceram positivas (17 amostras) apoacutes o tratamento com a
glicina-aacutecidaEDTA foi realizado um novo tratamento Houve dissociaccedilatildeo do anticorpo em 3
amostras (18) apoacutes a segunda tentativa Nas demais 14 (82) amostras tratadas pela
segunda vez 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise
33
Tabela 2 - Resultados do TDA apoacutes tratamento das hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo
sensibilizado
ANTICORPOS
SENSIBILIZADOS
1ordm TRATAMENTO COM
GLICINA
TRATAMENTO COM
CLOROQUINA
TOTAL TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
Anti-D 8 4 0 12 12
Anti-C 6 4 10 0 10
Anti-E 9 0 9 0 9
Anti-c 0 8 1 7 8
Anti-S 7 0 7 0 7
Anti-K 2 1 0 3 3
Anti-Dia 1 0 1 0 1
TOTAL 33 17 28 22 50
A hemoacutelise foi verificada durante o procedimento de lavagem final das hemaacutecias com
soluccedilatildeo fisioloacutegica para a retirada dos reagentes As soluccedilotildees de lavagem ficaram
avermelhadas e as hemaacutecias com coloraccedilatildeo escura As amostras foram descartadas Dentre as
6 amostras que ainda puderam ser testadas para o TDA trecircs amostras negativaram sendo 1
sensibilizada com anti-D e 2 com anti-C (tabela 3)
Tabela 3 - Resultado apoacutes o segundo tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA
Tratamento com
glicina-aacutecidaEDTA
TDA Negativo TDA Positvo Hemoacutelise Total
Segundo tratamento 3 3 11 17
524 TESTAGEM DO ELUATO
Apoacutes o tratamento com a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA a soluccedilatildeo do eluato foi
testada para verificar a viabilidade dos anticorpos que foram dissociados ou eluiacutedos Dentre
as 50 amostras 41 apresentaram eluato positivo As nove amostras cujos eluatos foram
negativos haviam sido sensibilizadas com as seguintes especificidades de anticorpos anti-E 6
amostras (67) anti-S 2 amostras (40) e anti-D 1 amostra (8) (tabela 4) O eluato de
todas as amostras sensibilizadas com os anticorpos anti-C anti-c Anti-K e Anti-Dia foram
positivos Os eluatos positivos na triagem de anticorpos foram testados com paineacuteis de
identificaccedilatildeo para confirmar a especificidade e a viabilidade dos anticorpos (figuras 7 e 8)
34
525 EFEITO DA ELUICcedilAtildeO SOBRE OS ANTIacuteGENOS ERITROCITAacuteRIOS
Para verificar o efeito do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA e com a cloroquina
sobre a expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s foi realizada a fenotipagem das
amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes tratamento com ambas as teacutecnicas Foi avaliado
se o tratamento destruiu os antiacutegenos expressos antes do tratamento
Tabela 4- Resultado do Eluato das amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA
Anticorpos Eluato positvo Eluato negativo Total
Anti-D 11 1 12
Anti-C 10 0 10
Anti-E 3 6 9
Anti-c 8 0 8
Anti-S 5 2 7
Anti-K 3 0 3
Anti-Dia 1 0 1
Total 41 9 50
Figura 7 ndash Painel do eluato da amostra 21 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-C que foi
recuperado no eluato
Figura 8 ndash Painel do eluato da amostra 47 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-K que foi
recuperado no eluato
35
Dentre as 50 amostras 26 eram previamente fenotipadas para os antiacutegenos Fya Fy
b
Jka Jk
b S e s Dentre elas 20 alcanccedilaram TDA negativo apoacutes tratamento com a glicina-
aacutecidaEDTA e 20 negativaram apoacutes tratamento com cloroquina (tabela 5) Apoacutes ambas as
teacutecnicas os antiacutegenos originalmente expressos permaneceram positivos comprovando que natildeo
houve destruiccedilatildeo dos mesmos
Tabela 5 ndash Verificaccedilatildeo da interferecircncia do tratamento da hemaacutecias com cloroquina e glicina-
aacuteicdaEDTA sobre os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
AMOSTRAS
COM
FENOTIPAGEM
PREacuteVIA
TRATADAS COM
CLOROQUINA
TRATADAS COM
GLICINA
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
26
20
20
20
20
As amostras 24 47 e 50 eram positivas para o antiacutegeno K A cloroquina natildeo dissociou
o anticorpo em nenhuma das 3 amostras enquanto a glicina-aacutecidaEDTA foi efetiva nas
amostras 24 e 50 Foi testada a expressatildeo do antiacutegeno K nas amostras 24 e 50 apoacutes o
tratamento utilizando meacutetodo indireto em gel contendo AGH Apesar de natildeo ter sido avaliado
a intensidade de reaccedilatildeo de expressatildeo dos antiacutegenos podemos verificar na figura 9 que nas
duas amostras em que a teacutecnica foi efetiva e dissociou o anticorpo a expressatildeo do antiacutegeno K
continua presente mas a reatividade observada pode ser considerada 1+ sugerindo que houve
diminuiccedilatildeo da expressatildeo do antiacutegeno quando comparado com a expressatildeo observada em
hemaacutecia natildeo tratada
Os resultados individuais de cada amostra em ambas as teacutecnicas encontram-se
resumidas na tabela 6
526 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente onde foi constatada a presenccedila de autoanticorpo
a quente da classe IgG pelo TDA monoespeciacutefico (figura 10)O autoanticorpo tambeacutem
interferia na pesquisa e identificaccedilatildeo de anticorpos irregulares pois apresentava caracteriacutestica
de panaglutinina As hemaacutecias da paciente sensibilizadas ldquoin vivordquo foram tratadas com
cloroquina e com glicina-aacutecidaEDTA
36
Figura 9 ndash Fenotipagem das amostras 24 e 50 para antiacutegeno K apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
O teste positivo indica a presenccedila do antiacutegeno poreacutem a reatividade fraca (1+) sugere que houve enfraquecimento
de sua expressatildeo A direita a expressatildeo forte (4+) do antiacutegeno Kell em hemaacutecia controle natildeo tratada utilizada
como controle positivo
A cloroquina natildeo foi efetiva na retirada do anticorpo ligado as hemaacutecias ao contraacuterio
do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA que dissociou o anticorpo (figura 11)
A hemaacutecia tratada com glicina foi fenotipada para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
(figura 12) A fenotipagem para o sistema Rh (C c E e e) e Kell foi realizada em gel
especiacutefico monoclonal sem interferecircncia do TDA positivo (controle da reaccedilatildeo negativo)
O eluato resultante do tratamento com glicina-aacutecidaEDTA foi testada em gel com
hemaacutecias de painel de identificaccedilatildeo de anticorpos e apresentou resultado positivo com todas
as ceacutelulas (figura 13 e 14)
A amostra foi enviada para genotipagem e o resultado da genotipagem confirmou o
resultado da fenotipagem apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
527 TEMPO DE EXECUCcedilAtildeO DA TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
O tempo de reaccedilatildeo da glicina-aacutecidaEDTA eacute de 2 minutos Todas as amostras foram
tratadas obedecendo ao tempo descrito na literatura demonstrando que o mesmo eacute
reprodutiacutevel
37
Tabela 6- Resultados individuais por amostra
Amostra Especificidade
dos anticorpos
Intensidade do
TDA apoacutes
sensibilizaccedilatildeo
Tratamento
efetivo com
cloroquina
Tratamento
efetivo com
glicina
Eluato
poacutes
glicina
1 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 2 Dia 3+ Sim Sim 3+ 3 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 4 D 4+ Natildeo Sim 4+ 5 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 6 E 3+ Sim Sim Negativo 7 S 4+ Sim Sim 3+ 8 E 3+ Sim Sim 1+ 9 E 3+ Sim Sim 2+
10 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 11 D 4+ Natildeo Sim 4+ 12 D 4+ Natildeo Sim 4+ 13 S 3+ Sim Sim 3+ 14 S 3+ Sim Sim 3+ 15 D 3+ Natildeo Sim 3+ 16 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 17 E 3+ Sim Sim (+) 18 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 19 D 4+ Natildeo Natildeo 3+ 20 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 21 C 3+ Sim Sim 4+ 22 C 3+ Sim Sim 4+ 23 C 3+ Sim Sim 4+ 24 K 4+ Natildeo Sim 4+ 25 D 3+ Natildeo Natildeo Negativo 26 E 4+ Sim Sim Negativo 27 S 3+ Sim Sim 3+ 28 C 3+ Sim Natildeo 4+ 29 C 3+ Sim Sim 4+ 30 C 3+ Sim Sim 4+ 31 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 32 E 3+ Sim Sim Negativo 33 C 3+ Sim Natildeo 4+ 34 S 3+ Sim Sim Negativo 35 S 3+ Sim Sim Negativo 36 C 4+ Sim Natildeo 4+ 37 c 4+ Natildeo Natildeo 4+ 38 D 4+ Natildeo Sim 4+ 39 S 3+ Sim Sim 3+ 40 c 4+ Sim Natildeo 2+ 41 C 4+ Sim Natildeo 4+ 42 E 3+ Sim Sim Negativo 43 D 3+ Natildeo Sim 2+ 44 D 3+ Natildeo Sim 2+ 45 E 3+ Sim Sim Negativo 46 C 3+ Sim Sim 4+ 47 K 4+ Natildeo Natildeo 4+ 48 D 3+ Natildeo Sim 2+ 49 E 3+ Sim Sim Negativo 50 K 4+ Natildeo Sim 4+
TOTAL 50 28 33 41
38
Figura 10 ndash TDA monoespeciacutefico da amostra de paciente Hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo da classe
IgG
oacute Figura 11 ndash TDA apoacutes o tratamento com glicina-aacutecidaEDTA (esquerda) e cloroquina (direita) A glicina
negativou completamente o TDA enquanto a hemaacutecia tratada com cloroquina persistiu positiva (1+)
39
Figura 12 ndash Fenotipagem da amostra tratada com glicina-aacutecidaEDTA Fy(a+b+) Jk(a-b+) S+s+
Figura 13 ndash Painel em gel (LissAGH) do eluato apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de
intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
Figura 14 ndash ndash Painel ezimaacutetico (hemaacutecias tratadas com bromelina) do eluato em gel neutro apoacutes
tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
40
528 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Quanto a efetividade das teacutecnicas em negativar o TDA foi verificado que a glicina-
aacutecidaEDTA foi efetiva em 66 das amostras testadas no primeiro tratamento (3350
amostras) enquanto a cloroquina conseguiu negativar 56 (2850) Esses resultados natildeo
apresentam diferenccedila significativa (pgt005) demostrando que a teacutecnica da glicina-
aacutecidaEDTA natildeo eacute superior mas eacute tatildeo efetiva quanto a da cloroquina
Quando aliamos os resultados de ambas as teacutecnicas verificamos que em 76 (3850)
das amostras o TDA foi negativado Esse dado indica que ainda que uma teacutecnica natildeo seja
eficaz na remoccedilatildeo do anticorpo eacute uma boa alternativa tentar a segunda teacutecnica jaacute que a falha
em remover o anticorpo utilizando uma delas natildeo prevecirc necessariamente a falha com a outra
Quando se utiliza o teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla (graacutefico 2) para comparar a utilizaccedilatildeo das
duas teacutecnicas com o resultado de cada uma isolada (somente a cloroquina ou somente a
glicina) verificamos que os resultados apresentam diferenccedila significativa (plt005) (quadro 3)
TRATAMENTO EFETIVO COM TOTAL PORCENTAGEM
Glicina ou cloroquina 38 76
Glicina e cloroquina 23 46
Glicina apenas 10 20
Cloroquina apenas 5 10
Nenhuma das teacutecnicas 12 24
Quadro 3 - Resultados comparativos entre as teacutecnicas utilizadas
41
Graacutefico 2 - Teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla entre as teacutecnicas aplicadas A- Glicina e Cloroquina B-Cloroquina C-
Glicina ( plt005)
42
6 DISCUSSAtildeO
Os reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA podem ser adquiridos em
forma de kit comercial prontos para uso poreacutem natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil A preparaccedilatildeo
dos reagentes ldquoin houserdquo a partir de sais comerciais adquiridos se mostrou viaacutevel Os
reagentes glicina e o tampatildeo Tris armazenados de forma correta se mantiveram estaacuteveis por
um periacuteodo de 7 meses Somente o reagente EDTA precipitou mesmo armazenado em
condiccedilotildees adequadas sugerindo que o mesmo deve ser preparado em menor quantidade e
armazenado em aliacutequotas A soluccedilatildeo de cloroquina tambeacutem pode ser preparada ldquoin houserdquo e
pode ser armazenado por um mecircs A legislaccedilatildeo brasileira autoriza a utilizaccedilatildeo de reagentes
preparados a partir de sais comerciais como a cloroquina e a glicina-aacutecidaEDTA desde que
os sais tenham autorizaccedilatildeo da vigilacircncia sanitaacuteria para a comercializaccedilatildeo (BRASIL 2001)
A comparaccedilatildeo quanto a efetividade em dissociar anticorpos em amostras com TDA
positivos entre a teacutecnica da glicina e a teacutecnica da cloroquina mostrou que natildeo haacute diferenccedila
estatiacutestica entre elas e que ambas satildeo igualmente eficientes Se utilizadas conjuntamente haacute
maior possibilidade de elucidaccedilatildeo dos casos
Uma vantagem da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eacute que ela permite numa mesma
amostra eluir o anticorpo ligado aacute hemaacutecia assim como fenotipar a hemaacutecia tratada Devido a
sua dupla utilidade a teacutecnica eacute vantajosa principalmente em pacientes em que pouco volume
de amostra pode ser coletado como em casos de crianccedilas e receacutem-nascidos
A fenotipagem poacutes tratamento se mostrou viaacutevel jaacute que os antiacutegenos de maior
importacircncia natildeo sofreram alteraccedilotildees Nas 20 amostras que foram fenotipadas antes e apoacutes
tratamento para verificar a influecircncia dos reagentes na expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a
Jkb S e s natildeo houve destruiccedilatildeo dos mesmos por nenhuma das duas teacutecnicas
Para as amostras positivas para o antiacutegeno Kell (350) e sensibilizadas com o
respectivo anticorpo a teacutecnica da glicina foi efetiva em negativar o TDA em apenas duas
delas mas apoacutes o tratamento foi verificada uma fraca reatividade da reaccedilatildeo antiacutegeno-
anticorpo sugerindo que houve um enfraquecimento da expressatildeo do antiacutegeno conforme
esperado e descrito na literatura (BYRNE 1991 PALLAS WILER E MCGEE 1991
ROZIERS e SQUALI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012 e KATHARIA e
CHAUDHARY 2013) A accedilatildeo da glicina sobre o antigeno Kell natildeo representa impedimento
para seu uso uma vez que na impossibilidade de testar o antiacutegeno Kell o banco de sangue
consegue facilmente atender a solicitaccedilatildeo de transfusatildeo com unidades de hemaacutecias Kell
43
negativas jaacute que eacute um antiacutegeno de baixa prevalecircncia na populaccedilatildeo variando de 15 na
populaccedilatildeo africana a 9 nos europeus (DANIELS 2011)
A soluccedilatildeo resultante da dissociaccedilatildeo do anticorpo pela teacutecnica da glicina pode ainda ser
utilizada como eluato podendo substituir a teacutecnica de eluiccedilatildeo com reagentes comercias (kits
de eluiccedilatildeo aacutecida) que tem alto custo aproximadamente entre R$2000 a R$2500 por teste
Em 41 amostras (82) houve a dissociaccedilatildeo e recuperaccedilatildeo do anticorpo que estava
sensibilizando as hemaacutecias Em 9 amostras (18) os anticorpos foram eluiacutedos poreacutem
apresentaram reaccedilatildeo negativa quando testadas com hemaacutecias de triagem entre eles o anti-E
(6) anti-S (2) e Anti-D (1) Eacute possiacutevel que a correccedilatildeo pH do meio (WALKER 2011) natildeo
tenha sido adequada o que pode ter desfavorecido a reatividade do anticorpo
Para as amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA nas quais natildeo houve dissociaccedilatildeo do
anticorpo pelo primeiro tratamento (1750) o segundo tratamento natildeo se mostrou eficaz jaacute
que 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise O tempo de
armazenagem natildeo parece ter influenciado jaacute que todas as amostras foram testadas dentro de
48 horas apoacutes a coleta Outros fatores que natildeo foram verificados podem ter levado a
hemoacutelise Apesar da literatura (LOUIE JIENG e ZEROULIS 1986 e BYRNE 1991)
recomendar um segundo tratamento ele eacute pouco eficaz tendo negativado apenas 3 das 17
amostras testadas
A amostra de paciente que apresentou sensibilizaccedilatildeo ldquoin vivordquo mostrou melhor
efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA sobre a da cloroquina possibilitando
fenotipagem para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s que natildeo foram destruiacutedos apoacutes o
tratamento comprovado atraveacutes da genotipagem
A presenccedila de autoanticorpo a quente com presenccedila de hemoacutelise (AHAI) ou natildeo pode
mascarar a presenccedila de aloanticorpo interferindo na rotina soroloacutegica da fenotipagem que eacute
uma importante ferramenta para auxiliar na seleccedilatildeo de hemaacutecias para transfusatildeo (SHIREY et
al 2002) Esses pacientes frequentemente possuem aloanticorpos associados ao
autoanticorpo e a prevalecircncia de aloimunizaccedilatildeo entre eles varia entre 12 a 40 (LEGER e
GARRATY 1999 BRANCH e PETZ 1999) o que dificulta ainda mais a escolha do melhor
componente a ser transfundido aleacutem de aumentar a possibilidade reaccedilotildees hemoliacuteticas imunes
poacutes-transfusionais
Nesses casos as teacutecnicas de dissociaccedilatildeo de anticorpos satildeo importantes para tratar
amostras de pacientes e a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser usada como uma opccedilatildeo
pois se mostrou eficaz na dissociaccedilatildeo anticorpo ligado agraves hemaacutecias deixando livre a
superfiacutecie das mesmas permitindo a fenotipagem por antisoros IgG Paralelamente os
44
anticorpos eluiacutedos tambeacutem puderam ser estudados O mesmo natildeo ocorre com a cloroquina
que permite apenas a fenotipagem e tampouco com os kits de eluiccedilatildeo aacutecida disponiacuteveis no
mercado nacional que satildeo destinados a realizaccedilatildeo do eluato mas destroem as hemaacutecias
O tempo de tratamento na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA tambeacutem eacute uma vantagem
pois foi possiacutevel reproduzir no tempo determinado de 2 minutos enquanto a cloroquina
demora ateacute duas horas
Ainda que a aplicaccedilatildeo das teacutecnicas por biologia molecular estejam cada vez mais
presentes na rotina imuno-hematoloacutegica e possibilitam estabelecer o fenoacutetipo deduzido do
genoacutetipo elas natildeo estatildeo disponiacuteveis na maioria dos centros e sua realizaccedilatildeo exige algumas
horas A resoluccedilatildeo imediata do problema transfusional necessita dos resultados soroloacutegicos
pois com frequecircncia natildeo eacute possiacutevel aguardar o resultado do teste molecular Dessa forma
apesar da crescente importacircncia da genotipagem eritrocitaacuteria teacutecnicas soroloacutegicas aplicadas
corretamente e no momento propiacutecio satildeo de grande utilidade para resolver problemas imuno-
hematoloacutegicos como ocorre com a fenotipagem em pacientes com TDA positivo
45
7 CONCLUSAtildeO
A teacutecnica da glicina aacutecidaEDTA mostrou-se efetiva em remover os anticorpos que
sensibilizavam as hemaacutecias e pode ser utilizada com seguranccedila antes da fenotipagem
eritrocitaacuteria Por ser uma teacutecnica de raacutepida execuccedilatildeo eacute uma alternativa aplicaacutevel
principalmente em casos urgentes de pacientes que apresentam autoanticorpos
46
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50
9 ANEXOS
51
FUNDACcedilAtildeO HEMOCENTRO DE RIBEIRAtildeO PRETO
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE)
Tiacutetulo da pesquisa Aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina aacutecida-EDTA e avaliaccedilatildeo da
eficaacutecia no tratamento de hemaacutecias com teste direto da antiglobulina positivo
Pesquisadora responsaacutevel Ceacutelia Kazue Abiko
Orientador Prof Dimas Tadeu Covas
Co-orientadora Dra Flaacutevia Leite Souza Santos
Objetivo da pesquisa Vocecirc estaacute sendo convidado a participar de uma pesquisa que tem
como objetivo padronizar uma nova teacutecnica para auxiliar na tipagem sanguiacutenea de pacientes
A tipagem sanguiacutenea pode sofrer interferecircncia da presenccedila de anticorpos ligados aos gloacutebulos
vermelhos do sangue Nessas situaccedilotildees eacute difiacutecil selecionar o melhor sangue para o paciente e
eacute preciso a utilizaccedilatildeo de teacutecnicas adicionais para remover essas interferecircncias
Esta pesquisa tem como objetivo estudar outra teacutecnica para remover esses anticorpos e
comparaacute-la com a teacutecnica atualmente utilizada Para isso precisamos de amostras de pacientes
e doadores voluntaacuterios
Se vocecirc eacute um doador eacute necessaacuterio que vocecirc autorize a coleta de 5 ml (1 tubo) a mais
de seu sangue
Se vocecirc eacute um paciente natildeo haveraacute necessidade de nova amostra pois utilizaremos as
amostras jaacute coletadas para os testes preacute-transfusionais e os resultados encontrados nesta
pesquisa natildeo iratildeo interferir na escolha da (s) bolsa (s) de sangue que vocecirc possa vir a receber
Se vocecirc concordar em participar leia com atenccedilatildeo o texto abaixo e assine as duas vias
rubricando todas as paacuteginas deste termo de consentimento Uma via original assinada e
rubricada por vocecirc e pela pesquisadora ficaraacute com vocecirc
As suas informaccedilotildees seratildeo mantidas em sigilo pela pesquisadora e natildeo haveraacute
armazenamento de material para pesquisas posteriores Os seus dados seratildeo usados apenas
neste estudo e quando o trabalho for publicado seu nome e qualquer outra informaccedilatildeo que
possam identificaacute-lo natildeo seratildeo revelados
Eacute pouco provaacutevel que o que noacutes aprendermos com este estudo tenha um benefiacutecio
direto para vocecirc assim como natildeo poderemos dar nada em troca pela sua participaccedilatildeo na
pesquisa
Nosso objetivo com esta pesquisa eacute que os resultados poderatildeo ser uacuteteis para o
tratamento de pacientes no futuro Os riscos da participaccedilatildeo satildeo miacutenimos Se vocecirc eacute um
doador de sangue a amostra seraacute coletada no momento da doaccedilatildeo natildeo exigindo punccedilatildeo
venosa adicional
52
Eacute seu direito ter acesso aos resultados dos testes da pesquisa Esses resultados natildeo
seratildeo fornecidos automaticamente a vocecirc mas caso vocecirc se interesse em saber o resultado ou
tiver alguma duacutevida sobre a sua participaccedilatildeo neste estudo deveraacute entrar em contato com Ceacutelia
Kazue Abiko pelo telefone (18) 99718-3551
Vocecirc tem total liberdade de optar por natildeo participar da pesquisa Caso aceite
participar poderaacute desistir a qualquer momento ou retirar seu consentimento mesmo apoacutes ter
coletado o sangue Para cancelar sua participaccedilatildeo basta avisar a pesquisadora e os seus dados
seratildeo retirados do projeto
Qualquer duacutevida eacutetica sobre a pesquisa poderaacute entrar em contato com o Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa do Hospital das Cliacutenicas e da Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto
(CAMPUS UNIVERSITAacuteRIO bairro Monte Alegre CEP 14048-900 Ribeiratildeo Preto-SP
Telefone (16) 3602-2228 FAX (16) 3633-1144 e-mail cephcrpuspbr)
Consentimento de participaccedilatildeo
A Consentimento do participante
Li as informaccedilotildees acima sobre o estudo e recebi explicaccedilotildees sobre a participaccedilatildeo no estudo
Portanto dou o meu consentimento para participar do estudo
___________________________________________________________________________
Nome completo
___________________________________________________________________________
Assinatura
___________
Data
__________________________________________________________________________________
Nome completo da pesquisadora
___________________________________________________________________________
Assinatura
_____________
Data
16
levados em conta meacutetodos mais sensiacuteveis como PEG enzima e estudo em gel a positividade
pode ser superior a 90 (LEGER 2011)
Aleacutem da eficaacutecia da transfusatildeo ser comprometida pela diminuiccedilatildeo da vida-meacutedia das
hemaacutecias a presenccedila do autoanticorpo dificulta a realizaccedilatildeo dos testes preacute-transfusionais e
compromete a seguranccedila transfusional Os autoanticorpos reagem normalmente como
panaglutininas pois satildeo normalmente voltados contra antiacutegenos puacuteblicos na maior parte das
vezes contra antiacutegenos do sistema Rh Por apresentarem essas caracteriacutesticas podem ainda
mascarar a presenccedila de aloanticorpos de significado clinico e levar a testes de compatibilidade
positivos exigindo uma avaliaccedilatildeo criteriosa da necessidade da transfusatildeo (BRANCH e PETZ
1999 JUNIOR e OLIVATO 2004)
Remover a interferecircncia do autoanticorpo para avaliar a presenccedila de aloanticorpos
mascarados nem sempre eacute possiacutevel mesmo utilizando teacutecnicas de autoadsorccedilatildeo ou
aloadsorccedilatildeo que aleacutem de tudo satildeo demoradas e exigem de 2 a 6 horas para conclusatildeo
(GARRATY e GEORGE 2002) Nesses casos a fenotipagem eritrocitaacuteria do paciente eacute de
extrema utilidade especialmente em situaccedilotildees de urgecircncia A definiccedilatildeo do fenoacutetipo do
paciente para os antiacutegenos de maior importacircncia cliacutenica pode auxiliar a seleccedilatildeo de unidades
de hemaacutecias com mesmo fenoacutetipo o que garante que eventuais aloanticorpos natildeo
identificados sejam respeitados e tambeacutem evita nova sensibilizaccedilatildeo (JUNIOR e OLIVATO
2004 SHIREY et al 2002)
135 TRATAMENTO DE HEMAacuteCIAS COM TDA POSITIVO
O TDA positivo impede a fenotipagem eritrocitaacutecia por meacutetodos que exigem a fase de
AGH uma vez que a aglutinaccedilatildeo ocorreraacute devido agrave interaccedilatildeo da AGH com o autoanticorpo
que sensibiliza a hemaacutecia do paciente levando a resultados falso positivos Em algumas
situaccedilotildees como na AHAI por anticorpo quente a fenotipagem eacute especialmente importante
pois o autoanticorpo interfere na triagem e identificaccedilatildeo de anticorpos assim como no teste de
compatibilidade e dificultam a detecccedilatildeo de aloanticorpos de significado cliacutenico que
obrigatoriamente devem ser respeitados Nessas situaccedilotildees a fenotipagem eritrocitaacuteria
determina o perfil antigecircnico do paciente e possibilita o fornecimento de unidades de
hemaacutecias com o mesmo fenoacutetipo para a transfusatildeo evitando a sensibilizaccedilatildeo para novos
antiacutegenos assim como reaccedilotildees hemoliacuteticas transfusionais No entanto eacute necessaacuterio aplicar
meacutetodos que natildeo sofram interferecircncia do TDA positivo ou seja meacutetodos que natildeo necessitem
da fase de AGH ou meacutetodos de bloqueio do anticorpo sem bloquear o antiacutegeno Uma opccedilatildeo eacute
a utilizaccedilatildeo de soros monoclonais IgM (salinos ou de meio proteico natildeo concentrado) mas
17
nem sempre esses reagentes estatildeo disponiacuteveis especialmente os reagentes monoclonais para
os antiacutegenos dos sistemas Duffy ( Fya Fy
b) Kidd ( Jk
a Jk
b) e MNS (S s) (JUNIOR e
OLIVATO 2004) Outra opccedilatildeo eacute a teacutecnica de bloqueio que pode ser utilizada para tratar
hemaacutecias para posterior fenotipagem em casos de TDA positivos com reatividade le2+
Em casos onde a positividade do TDA eacute maior que 2+ estaacute indicada a tratamento
quiacutemico para remoccedilatildeo da interferecircncia do autoanticorpo antes de realizar a fenotipagem Entre
as teacutecnicas utilizadas atualmente estatildeo o ZZAP a cloroquina e a glicina aacutecidaEDTA
1351 TEacuteCNICA DE BLOQUEIO
A teacutecnica de bloqueio se baseia na utilizaccedilatildeo de anti-IgG (Coombs monoespeciacutefico)
para tratar as hemaacutecias com TDA positivo O anticorpo anti-IgG se liga aos anticorpos que
estatildeo sensibilizando a hemaacutecias poreacutem sem o bloquear os antiacutegenos Os antiacutegenos que natildeo
estatildeo sensibilizados podem ser detectados atraveacutes dos antissoros especiacuteficos (SERERAT
VEIDT E DUTCHED 2000)
1352 TRATAMENTO DE HEMAacuteCIAS COM ZZAP
O Sulphydryl-Proteolytic Enzyme (ZZAP) que eacute uma mistura de ditiotreitol (DTT)
mais papaiacutena ativada com cisteiacutena eacute um reagente capaz de dissociar imunoglobulinas da
classe IgG ligadas a membrana dos eritroacutecitos enquanto trata enzimaticamente as hemaacutecias
O tratamento enzimaacutetico tambeacutem potencializa a ligaccedilatildeo do autoanticorpo ao antiacutegeno e
acelera o processo de autoadsorccedilatildeo O ZZAP pode desnaturar os antiacutegenos do sistema Duffy
MNS e Kell o que limita sua aplicaccedilatildeo para fins de fenotipagem (BRANCH e PETZ 1982)
1353 CLOROQUINA
Em 1982 Edwards Moulds e Judd propuseram a utilizaccedilatildeo da teacutecnica da cloroquina
que dissociava os complexos antiacutegeno-anticorpo e mantinha a membrana das hemaacutecias
iacutentegras Os derivados quinolecircicos jaacute haviam sido descritos anteriormente por Domokos e
Aszody em 1964 e Holtz Mantel e Buck em 1973 (apud Edwards Moulds e Judd 1982) pela
sua capacidade de separar imunocomplexos e inibir as reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo reduzindo
as cargas eleacutetricas das superfiacutecie das hemaacutecias A teacutecnica eacute uma das mais utilizadas nos
centros brasileiros para remover a interferecircncia do autoanticorpo e eacute tambeacutem a teacutecnica
atualmente adotada pelo laboratoacuterio de imunohematologia do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto
18
Edwards Moulds e Judd (1982) demonstraram que a teacutecnica da cloroquina para
dissociaccedilatildeo de anticorpos eacute uma teacutecnica simples efetiva e confiaacutevel para dissociar
imunoglobulina das hemaacutecias Desde que a membrana das hemaacutecias permaneccedila intacta natildeo
haacute perda da reatividade dos antiacutegenos e a sua maior aplicaccedilatildeo eacute a fenotipagem de hemaacutecias
com TDA positivo Os autores verificaram que em 83 das amostras sensibilizadas in vivo e
22 amostras (no total de 40) sensibilizadas ldquoin vitrordquo apresentaram TDA negativo e
puderam ser fenotipadas A teacutecnica poreacutem natildeo consegue remover os componentes do
complemento na maioria dos casos
Champagne e colaboradores (1999) testaram a teacutecnica da cloroquina para dissociar
antiacutegenos Bg comparando com a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA e verificaram vantagem em
relaccedilatildeo ao uso de um uacutenico reagente diminuindo a manipulaccedilatildeo e verificou que o mesmo natildeo
destroacutei antiacutegeno Kell
A cloroquina tambeacutem mostrou-se pouco efetivo em remover anticorpos do sistema
Duffy da superfiacutecie das hemaacutecias (EDWARDS MOUDS e JUDD 1982 ROZIERS e
SQUALI 1997)
1353 GLICINA-AacuteCIDAEDTA
A afinidade e a estabilidade entre a ligaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo eacute definida como a
resultante entre forccedilas atrativas e repulsivas entre ambos (CARUCIO e WISE 2012) e resulta
da somatoacuteria de forccedilas quiacutemicas dinacircmicas e fracas (natildeo covalentes) como pontes de
hidrogecircnio forcas eletrostaacuteticas forca de Van der Waals e pontes hidrofoacutebicas A estabilidade
dessa ligaccedilatildeo eacute facilmente abalada por alteraccedilotildees quiacutemicas e fiacutesicas no meio da reaccedilatildeo como
a alteraccedilatildeo do pH A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA se baseia na mudanccedila do pH para a
quebra da ligaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo (KOSANKE 2012)
A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA foi primeiramente descrita em 1986 por Louie Jieng
e Zeroulis que utilizaram 50 amostras de doadores sensibilizados ldquoin vitrordquo com anticorpos A
teacutecnica foi efetiva em 48 amostras permitindo o estudo do eluato assim como a fenotipagem
das hemaacutecias Os autores testaram tambeacutem a teacutecnica em 100 hemaacutecias TDA positivo que
puderam ser utilizadas para teacutecnicas de autoadsorccedilatildeo
Byrne (1991) descreveu a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA modificada e tambeacutem
verificou como uma opccedilatildeo para o tratamento de hemaacutecias com TDA positivo que deixava as
hemaacutecias intactas e o eluato viaacutevel para ser fenotipado
19
Roziers e Squali (1997) e Katharia e Chaudhary (2013) compararam a teacutecnica da
glicina-aacutecidaEDTA com as teacutecnicas da cloroquina e do aquecimento Verificaram maior
eficiecircncia da glicina-aacutecidaEDTA em relaccedilatildeo as outras duas teacutecnicas pois com uma mesma
quantidade de amostra produzia as hemaacutecias livres de anticorpo e tambeacutem o eluato Mostrou-
se ainda superior devido ao menor tempo exigido para sua realizaccedilatildeo o que favorece seu uso
em situaccedilotildees de urgecircncia e emergecircncia
As duas desvantagens da teacutecnica poreacutem eacute o fato de destruir os antiacutegenos do sistema
Kell e o fato de natildeo remover fraccedilotildees do complemento ligadas agrave hemaacutecia (PALLAS WILER e
McGEE 1991 ROZIERS e SQUALLI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012
e KATHARIA e CHAUNDHARY 2013)
20
2 OBJETIVOS
21 OBJETIVO GERAL
211 Avaliar a eficaacutecia da glicina-aacutecidaEDTA em remover os anticorpos ligados agraves
hemaacutecias sensibilizadas por anticorpos da classe IgG
22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
221 Preparaccedilatildeo dos reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
verificaccedilatildeo da estabilidade dos mesmos e avaliar custos
222 Testar a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA em amostras de hemaacutecias
sensibilizadas por anticorpos antieritrocitaacuterios humanos
223 Comparar a efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA com a teacutecnica da
cloroquina quanto a capacidade de remover a interferecircncia do anticorpo ligado
a hemaacutecia
224 Testar o eluato das amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA
225 Verificar se houve destruiccedilatildeo dos antiacutegenos eritrocitaacuterios apoacutes o tratamento
com glicina-aacutecidaEDTA e com cloroquina
226 Verificar se o tempo de execuccedilatildeo da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA descrito
nos textos de referecircncia eacute reprodutiacutevel
21
3 JUSTIFICATIVA
Algumas condiccedilotildees cliacutenicas podem levar ao depoacutesito ldquoin vivordquo de anticorpos eou
fraccedilotildees do complemento sobre as hemaacutecias Entre elas estatildeo as reaccedilotildees hemoliacuteticas poacutes-
transfusionais a doenccedila hemoliacutetica perinatal o uso de medicamentos e principalmente a
AHAI Na AHAI um anticorpo normalmente da classe IgG ou IgM reconhece antiacutegenos
proacuteprios na membrana eritrocitaacuteria e reduz a sobrevida da hemaacutecia levando a sua destruiccedilatildeo
pelos macroacutefagos no sistema reticulo-endotelial ou agrave ativaccedilatildeo do complexo de ataque agrave
membrana e agrave lise intravascular Os autoanticorpos satildeo voltados na maioria das vezes contra
antiacutegenos eritrocitaacuterios de alta frequecircncia populacional conhecidos como antiacutegenos puacuteblicos
e por este motivo reconhecem tanto hemaacutecias autoacutelogas quanto alogecircnicas
Devido agrave presenccedila do autoanticorpo livre no plasma e tambeacutem do anticorpo eou
complemento ligado agrave hemaacutecia o banco de sangue pode encontrar dificuldades em todas as
fases dos testes preacute-transfusionais do paciente com AHAI e deve utilizar teacutecnicas que
auxiliem na escolha do melhor hemocomponente melhorando a seguranccedila transfusional Essas
teacutecnicas visam remover a interferecircncia do autoanticorpo livre no soro e do autoanticorpo
ligado agrave hemaacutecia permitindo a detecccedilatildeo de aloanticorpos associados e a realizaccedilatildeo da
fenotipagem eritrocitaacuteria respectivamente
A finalizaccedilatildeo dos testes preacute-tranfusionais na presenccedila de autoanticorpo pode levar
algumas horas e nem sempre o paciente poderaacute aguardar Nesse contexto torna-se vantajosa a
aplicaccedilatildeo de teacutecnicas de raacutepida execuccedilatildeo
O presente estudo propotildee aplicar e avaliar a eficaacutecia da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
em remover os anticorpos ligados agrave hemaacutecia o que permite a fenotipagem eritrocitaacuteria
estendida e a seleccedilatildeo de concentrados de hemaacutecias com mesmo fenoacutetipo do paciente
Atualmente no Hemocentro de Ribeiratildeo Preto a teacutecnica utilizada para esse fim eacute o
tratamento das hemaacutecias com difosfato de cloroquina cujo tempo de execuccedilatildeo pode demorar
ateacute duas horas enquanto a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser realizada em apenas dois
minutos o que a tornaria opccedilatildeo de escolha especialmente em situaccedilotildees de urgecircncia Ao
contraacuterio da cloroquina a glicina-aacutecidaEDTA permite tambeacutem o estudo do eluato das
hemaacutecias tratadas
22
4 METODOL OGIA
41 AMOSTRAS DE DOADORES
Foram coletados 50 amostras de doadores de sangue que compareceram ao
Hemonuacutecleo de Araccedilatuba no periacuteodo de junho a agosto de 2016 Foram convidados a
participar da pesquisa doadores de repeticcedilatildeo do tipo sanguiacuteneo ldquoOrdquo RhD positivo
cadastrados no sistema de banco de sangue (SBS) do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto
Todos os doadores que concordaram em participar da pesquisa assinaram o termo de
consentimento livre e esclarecido (TCLE)
No momento da doaccedilatildeo foram coletados adicionalmente 5 mL de sangue total em
soluccedilatildeo anticoagulante EDTA (aacutecido dietilenoaminoaceacutetico) dispensando punccedilatildeo venosa
adicional para coleta da amostra O fluxograma 1 resume as etapas desenvolvidas no projeto
Fluxograma 1 - Fluxo da pesquisa utilizando as amostras de doadores
23
411 FENOTIPAGEM
Foram verificados se os doadores jaacute tinham fenotipagem para outros sistemas de
grupos sanguiacuteneos aleacutem do sistema ABORh que eacute realizado rotineiramente
A fenotipagem eritrocitaacuteria para outros sistemas ou fenotipagem estendida eacute realizada
para identificar a presenccedila ou ausecircncia de antiacutegenos considerados de importacircncia cliacutenica No
Hemonuacutecleo de Araccedilatuba uma parcela de doadores de repeticcedilatildeo satildeo fenotipados para os
antiacutegenos dos sistemas de grupo sanguiacuteneo Rh (antiacutegenos C c E e e) Kell (antiacutegeno K)
Duffy (antiacutegenos Fya e Fy
b) Kidd (antiacutegenos Jk
a e Jk
b) e sistema MNSs (antiacutegenos S e s)
A fenotipagem para o Rh e Kell eacute realizada por metodologia de microplaca utilizando
25 microL de hemaacutecia lavada e diluiacuteda a 5 em salina e 25 microL do antissoro comercial especiacutefico
A reaccedilatildeo eacute incubada 15 minutos a temperatura ambiente e centrifugadas para leitura Para os
antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s a metolodogia utilizado eacute gel contendo antiglobulina
humana (gel LissCoombs poliespeciacutefico) da marca BIO-RAD onde se utiliza suspensatildeo de
hemaacutecia em LISS (Soluccedilatildeo de baixa forccedila iocircnica) A suspensatildeo eacute preparada atraveacutes da
diluiccedilatildeo de 10 microL de hemaacutecia em 1000 microL de LISS Pipetado 50 microL dessa diluiccedilatildeo no gel e
adicionado 25 microL do antissoro especiacutefico Incuba-se em banho seco por 15 minutos a 37 deg
Celsius e eacute centrifugado em centriacutefuga especiacutefica Os antissoros utilizados eram das marcas
Fresenius e Lorne
Foi verificado a fenotipagem do doador no banco de dados do Hemocentro Os
registros dos fenoacutetipos dos doadores ficam armazenadas no sistema de banco de sangue
(SBS) Para doadores que natildeo tinham fenotipagem estendida preacutevia para antiacutegenos do sistema
Rh (C c E e e) e Kell (K) foi realizada a fenotipagem para esses antiacutegenos
O tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA e cloroquina para dissociar
anticorpos pode inativar enfraquecer ou destruir os antiacutegenos presentes nas hemaacutecias
alterando assim os resultados da fenotipagem Para verificar se houve destruiccedilatildeo dos
antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a e Jk
b S e s nas amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes
tratamento foram novamente fenotipadas ao final para os antiacutegenos que eram inicialmente
positivas
A repeticcedilatildeo da fenotipagem foi realizada nas amostras que apresentaram efetividade
no tratamento da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eou da cloroquina e a detecccedilatildeo do antiacutegeno
na amostra preacute-tratamento
24
412 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS HEMAacuteCIAS
As hemaacutecias foram sensibilizadas com antissoros policlonais humanos de amostras de
plasma fresco congelado de doadores com resultado de pesquisa de anticorpo irregular
positivos
A escolha do anticorpo para sensibilizar as hemaacutecias foi definida de acordo com o
fenoacutetipo do doador que deveria ser positivo para o respectivo antiacutegeno
Para a sensibilizaccedilatildeo um volume de antissoro (1 mL) e um volume (1 mL) de
hemaacutecias lavadas quatro vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica foram adicionadas a um tubo de 12 x
75 mm A mistura foi homogeneizada e incubada em banho maria (BM) a 37deg C por 60
minutos A seguir as hemaacutecias foram novamente lavadas 4 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica
para retirada dos anticorpos que natildeo se ligaram A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada
como controle negativo O teste da uacuteltima lavagem eacute importante para assegurar que os
anticorpos que poderatildeo ser detectados no eluato apoacutes o tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA
sejam aqueles que estavam ligados agraves hemaacutecias e natildeo aqueles livres no plasma O controle
negativo mostra que todo o anticorpo livre foi retirado (LEGER 2011)
Para o teste de presenccedila de anticorpo na soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foram incubadas
com hemaacutecias de triagem de anticorpos irregulares (ID-Diacell BIO-RAD) contendo os
antiacutegenos especiacuteficos Realizado a teacutecnica em gel LissCoombs com anti-IgG+C3d Incubado
no tempo de 15 minutos a temperatura de 37deg C e centrifugado 10 minutos em centriacutefuga
proacutepria
As 50 amostras de doadores foram sensibilizadas com os anticorpos policlonais
humanos
Apoacutes sensibilizadas rdquoin vitrordquo e lavadas as hemaacutecias foram diluiacutedas em soluccedilatildeo de
baixa forccedila iocircnica (LISS) na quantidade de 10 microL de hemaacutecia para 1000 microL de soluccedilatildeo A
suspensatildeo foi pipetada (50 microL) em coluna-gel-teste LissCoombs (BIO-RAD) que contecircm
antiglobulina poliespeciacutefico (IgG+C3d) e centrifugada em baixa rotaccedilatildeo conforme orientaccedilatildeo
do fabricante durante 10 minutos
As amostras deveriam apresentar aglutinaccedilatildeo com reatividade 3 a 4+ no TDA As
amostras que apresentaram reaccedilatildeo menor que 3+ foram novamente sensibilizadas com nova
aliacutequota do antissoro
25
413 TRATAMENTO DAS AMOSTRAS
As amostras sensibilizadas apresentando o TDA positivo 3 ou 4+ foram divididas em
duas aliacutequotas e submetidas a duas teacutecnicas diferentes com o objetivo de dissociar o anticorpo
ligado Uma aliacutequota da amostra foi tratada com soluccedilatildeo de difosfato de cloroquina enquanto
a outra aliacutequota foi tratada com glicina-aacutecidaEDTA
42 PREPARO DA GLICINA AacuteCIDA-EDTA
A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA utiliza 3 soluccedilotildees diferentes a glicina aacutecida o
EDTA e o tampatildeo TRIS
Os reagentes foram preparados utilizando os sais para anaacutelise (PA) de EDTA
(Na2EDTA2H2O) TRIS (C4H11NO3) Glicina (H2NCH2CO2H) NaCl e a soluccedilatildeo de aacutecido
cloriacutedrico (HCl) 12 N todos reagentes da marca SYNTH (quadro 1)
Para o preparo do tampatildeo glicina-acida eacute necessaacuterio o ajuste do pH para 15 Para esse
ajuste utiliza-se aacutecido cloriacutedrico (HCl) concentrado O pH foi medido com fitas reativas de pH
com escala de 1 a 14 da marca MERCK Posteriormente a soluccedilatildeo foi enviada ao laboratoacuterio
de controle de qualidade do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto e o pH medido no peagacircmetro O
tampatildeo glicina-aacutecida foi armazenado a 4deg e o tampatildeo tris e o EDTA em temperatura ambiente
controlada (20 a 24deg Celsius)
Apoacutes o preparo e durante a realizaccedilatildeo dos testes foram feitas inspeccedilotildees visuais para
verificaccedilatildeo de turvaccedilatildeo do meio e presenccedila de precipitados
Reagente Material Quantidade Preparo e
Conservaccedilatildeo
EDTA
EDTA
(Na2EDTA2H2O)
5 gramas Mistura ateacute
dissoluccedilatildeo do sal e
conserva em
temperatura ambiente Aacutegua Destilada 50 Ml
Tris
TRIS (C4H11NO3) 121 gramas Conservar em
temperatura ambiente NaCl 525g
Aacutegua destilada 100ml
Gliacutecina-aacutecida
Glicina
(H2NCH2CO2H) 15 gramas
Conservar a 4oC NaCl 116gramas
Aacutegua Destilada 200ml
HCL 12N Ajutar o pH para 15
Quadro 1 - Preparo dos Reagentes da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
Fonte - Manual teacutecnico AABB 2011
26
O tampatildeo glicina-aacutecida e o tampatildeo TRIS satildeo estaacuteveis por 7 meses O reagente EDTA
precipitou mesmo estando em temperatura em ambiente controlado Houve necessidade de
preparo de novo reagente
421 TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
1 Em um tubo de ensaio 12x75 mm eacute adicionado 08 mL da soluccedilatildeo de glicina-aacutecida A
esta soluccedilatildeo adiciona-se 02 mL de EDTA e mistura
2 Adiciona-se 02 mL de hemaacutecias sensibilizadas (lavada 4 vezes) A mistura eacute
homogeneizada e incubada por exatamente 2 minutos
3 A seguir 01 mL de tampatildeo TRIS eacute adicionado agrave mistura que eacute novamente
homogeneizada e centrifugada por 2 minutos a 3400 rpm O pH deve estar entre 7 a 75
4 Apoacutes centrifugaccedilatildeo separa-se em outro tubo o sobrenadante (eluato) e as hemaacutecias
que permanecem satildeo lavadas 4 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica para retirada de todo o
reagente e anticorpos livres
43 PREPARO DA CLOROQUINA
A cloroquina eacute diluiacuteda em tampatildeo PBS na concentraccedilatildeo de 20 (Quadro 2) e
armazenado a 4deg Celsius sua validade apoacutes o preparo eacute de 1 mecircs
A teacutecnica da cloroquina jaacute estaacute padronizada para rotina do laboratoacuterio de
imunohematologia do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto e suas unidades
Reagente Reagentes Quantidade PreparoConservaccedilatildeo
Cloroquina
Difosfato de cloroquina
(C18H32ClN3O8P2)
20 gramas
Conservar a 4deg Celsius
Tampatildeo PBS 100ml
NaOH 01 N Acertar o pH para
51
Quadro 2 - Preparo da Cloroquina Fonte - Manual teacutecnico da AABB 2011
431 TEacuteCNICA DA CLOROQUINA
1 4 partes da soluccedilatildeo pronta eacute adicionada a uma parte de hemaacutecias lavadas 4 vezes com
soluccedilatildeo fisioloacutegica
2 A mistura eacute incubada em temperatura ambiente por ateacute duas horas
3 Centrifugar a 3400 rpm por 2 minutos
27
4 Remover o sobrenadante lavar as hemaacutecias novamente com soluccedilatildeo fisioloacutegica 4
vezes
44 VERIFICACcedilAtildeO DA EFETIVIDADE DOS TESTES
Apoacutes tratamento pelas duas teacutecnicas o TDA foi repetido em todas as amostras para
verificar se os tratamentos foram efetivos e houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo Para as
amostras tratadas pela teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA que permaneceram com TDA positivo
novo tratamento foi realizado
45 TESTE DO ELUATO
O eluato resultante das amostras tratadas com glicina-acidaEDTA foi testado com
hemaacutecias de triagem A soluccedilatildeo do eluato foi incubada com as hemaacutecias de triagem de
anticorpos (ID-Diacell BIO-RAD) pela teacutecnica em gel LissCoombs O teste foi incubado 15
minutos a 37deg Celsius e centrifugado por 10 minutos em centrifuga proacutepria para a teacutecnica em
gel Os eluatos que apresentaram resultados positivos foram testados em painel de 11
hemaacutecias (ID-Diapanel BIO-RAD) para a identificaccedilatildeo do anticorpo
46 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente que apresentou TDA positivo por IgG e pesquisa
de anticorpo irregular positivo com presenccedila de autoanticorpo com reatividade panaglutinina
A amostra foi tratada em paralelo pelas duas teacutecnicas descritas e foi enviada para o
Hemocentro para genotipagem eritrocitaacuteria que foi realizado por metodologia PCR em tempo
real no equipamento Real-time system PCR 7500 ( Applied Biosystems Califoacuternia EUA)
28
5 RESULTADOS
51 REAGENTES
Para aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA satildeo necessaacuterios 3 diferentes
reagentes que podem ser encontrados em forma de kit pronto para uso No entanto esses kits
natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil Os reagentes satildeo tampatildeo glicina-aacutecida o EDTA e o tampatildeo
Tris
Todos os reagentes foram preparados rdquoin houserdquo a partir dos sais e soluccedilotildees PA (puro
para anaacutelise) da marca SYNTH que foram adquiridos para a pesquisa O custo estimado para
cada teste foi aproximadamente R$ 020 reais
Apoacutes o preparo os reagentes poderiam ser armazenados em condiccedilotildees adequadas pelo
periacuteodo de 1 ano (AABB 2011) Ao final do preparo e durante o periacuteodo de armazenamento
de fevereiro a setembro de 2016 foi realizada inspeccedilatildeo visual para verificar a presenccedila de
precipitados ou turvaccedilatildeo A soluccedilatildeo de glicina e o tampatildeo TRIS mostraram-se estaacuteveis ateacute o
final do periacuteodo Por sua vez o reagente EDTA precipitou mesmo estando armazenado em
temperatura ambiente controlada e foi necessaacuterio novo preparo
52 AMOSTRAS DE DOADORES
521 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS AMOSTRAS
Apoacutes incubaccedilatildeo da hemaacutecia com o antissoro a mesma foi lavada 4 vezes para retirada
dos anticorpos livres A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada Caso houvesse positividade na
soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem a etapa era repetida (figura 3) Das 50 amostras sensibilizadas a
uacuteltima lavagem foi positiva somente em 3 delas Nas 3 amostras o anticorpo utilizado para
sensibilizaccedilatildeo foi o anti-K Apoacutes repetido nova etapa de lavagem os resultados se
apresentaram negativos
Em todas as amostras sensibilizadas ldquoin vitrordquo o TDA foi testado e verificado a
intensidade do teste Entre as 50 amostras 47 alcanccedilaram TDA com intensidade 3-4+ apoacutes a
primeira sensibilizaccedilatildeo enquanto 3 amostras necessitaram uma segunda incubaccedilatildeo com
anticorpo (figura 4)
A escolha dos anticorpos para sensibilizar as hemaacutecias foi feita de acordo com o
fenoacutetipo do doador e foram utilizados sete diferentes especificidades de anticorpos policlonais
humanos conforme mostra o graacutefico1
29
Figura 3 - Soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada com hemaacutecia de triagem de
anticorpos em gel LissCoombs (BIO-RAD) A finalidade eacute verificar a presenccedila de anticorpos livres na
suspensatildeo que possam interferir na pesquisa do eluato As soluccedilotildees de lavagem das amostras na figura a tiveram
resultados negativos Na figura b duas amostras a 47 e 50 apresentaram resultado positivo Nova etapa de
lavagem foi realizada e o resultado final foi negativo
522 TRATAMENTO DAS HEMAacuteCIAS
Apoacutes a sensibilizaccedilatildeo e obtenccedilatildeo de resultados de TDA com intensidade de 3 a 4+
cada uma das amostras foi dividida em duas aliacutequotas e tratada separadamente pelas teacutecnicas
de glicinaaacutecida-EDTA e cloroquina
As teacutecnicas foram consideradas efetivas quando obteve-se a completa dissociaccedilatildeo do
anticorpo verificada atraveacutes do TDA negativo na amostra poacutes tratamento conforme figuras 5
e 6 Dentre as amostras tratadas com cloroquina 2850 tiveram o TDA negativado A glicina-
aacutecidaEDTA negativou o TDA em 33 das 50 amostras tratadas Apenas 17 amostras tratadas
com glicina-aacutecidaEDTA permaneceram com o TDA positivo e foram submetidas a um novo
tratamento
30
Figura 4 - TDA das amostras apoacutes sensibilizaccedilatildeo com anticorpos policlonais humanos Amostras na
figura a com intensidades de 3-4+ Na figura b amostras 4 e 7 com intensidade menor que 3+ e portanto foram
novamente sensibilizadas com nova aliacutequota de soro Anti-D e anti-S Apoacutes a segunda sensibilizaccedilatildeo
apresentaram reatividade 4 e 3+ respectivamente Os anticorpos utilizados para sensibilizaccedilatildeo foram D S c E
C e K
523 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS TEacuteCNICAS
No tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA houve dissociaccedilatildeo completa do anticorpo
em 33 amostras (66) das 50 amostras testadas enquanto que com a cloroquina foram 28
amostras (56) (tabela 1)
31
Graacutefico 1- Nuacutemero de amostras sesnsibilizadas por especificidade de anticorpo Entre as 50 amostras 12
foram sensibilizadas com anti-D 10 com anti-C 9 com anti-E 8 com anti-c 7 com anti-S 3 com anti-K e 1
com anti-Dia As especificidades dos anticorpos foram definidas de acordo o fenoacutetipo do doador
Figura 5 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com cloroquina Nas amostras onde houve
a dissociaccedilatildeo do anticorpo ( 2 21 a 23 26 39 a 42 45 46 e 49) a hemaacutecia se deposita no fundo no microtubo
apoacutes a centrifugaccedilatildeo (TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (1 3 24 25 43 44 47
48 e 50) o anticorpo ligado agraves hemaacutecias eacute alvo da AGH presente no gel (TDA positivo)
Anti-D 12
Anti-C 10
Anti-E 9
Anti-c 8
Anti-S 7
Anti-K 3 Anti-Dia 1
32
Figura 6 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA Nas amostras
onde houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo (4 6 7 12 a 15 17 34 35 37 e 38) a hemaacutecia se deposita no fundo no
microtubo apoacutes a centrifugaccedilatildeo ( TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (5 16 18
19 20 33 e 36 ) o AGH presente no gel se liga ao anticorpo ligado agraves hemaacutecias que ficam retidas no gel (TDA
positivo)
Tabela 1-Resultado geral do tratamento das hemaacutecias com glicina e cloroquina
Teacutecnica utilizada TDA negativo TDA positivo Total
Glicina-aacutecidaEDTA 33 17 50
Cloroquina 28 22 50
A glicina-aacutecidaEDTA conseguiu negativar mais amostras sensibilizadas com Anti-D
e anti-K que a cloroquina Para as hemaacutecias sensibilizadas com anti-E Anti-S e Anti-Dia
ambas as teacutecnicas dissociaram o anticorpo em 100 das amostras Os resultados detalhados
por especificidade do anticorpo apoacutes o primeiro tratamento com glicina-aacutecidaEDTA e com
cloroquina estatildeo na tabela 2
Para as amostras que permaneceram positivas (17 amostras) apoacutes o tratamento com a
glicina-aacutecidaEDTA foi realizado um novo tratamento Houve dissociaccedilatildeo do anticorpo em 3
amostras (18) apoacutes a segunda tentativa Nas demais 14 (82) amostras tratadas pela
segunda vez 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise
33
Tabela 2 - Resultados do TDA apoacutes tratamento das hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo
sensibilizado
ANTICORPOS
SENSIBILIZADOS
1ordm TRATAMENTO COM
GLICINA
TRATAMENTO COM
CLOROQUINA
TOTAL TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
Anti-D 8 4 0 12 12
Anti-C 6 4 10 0 10
Anti-E 9 0 9 0 9
Anti-c 0 8 1 7 8
Anti-S 7 0 7 0 7
Anti-K 2 1 0 3 3
Anti-Dia 1 0 1 0 1
TOTAL 33 17 28 22 50
A hemoacutelise foi verificada durante o procedimento de lavagem final das hemaacutecias com
soluccedilatildeo fisioloacutegica para a retirada dos reagentes As soluccedilotildees de lavagem ficaram
avermelhadas e as hemaacutecias com coloraccedilatildeo escura As amostras foram descartadas Dentre as
6 amostras que ainda puderam ser testadas para o TDA trecircs amostras negativaram sendo 1
sensibilizada com anti-D e 2 com anti-C (tabela 3)
Tabela 3 - Resultado apoacutes o segundo tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA
Tratamento com
glicina-aacutecidaEDTA
TDA Negativo TDA Positvo Hemoacutelise Total
Segundo tratamento 3 3 11 17
524 TESTAGEM DO ELUATO
Apoacutes o tratamento com a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA a soluccedilatildeo do eluato foi
testada para verificar a viabilidade dos anticorpos que foram dissociados ou eluiacutedos Dentre
as 50 amostras 41 apresentaram eluato positivo As nove amostras cujos eluatos foram
negativos haviam sido sensibilizadas com as seguintes especificidades de anticorpos anti-E 6
amostras (67) anti-S 2 amostras (40) e anti-D 1 amostra (8) (tabela 4) O eluato de
todas as amostras sensibilizadas com os anticorpos anti-C anti-c Anti-K e Anti-Dia foram
positivos Os eluatos positivos na triagem de anticorpos foram testados com paineacuteis de
identificaccedilatildeo para confirmar a especificidade e a viabilidade dos anticorpos (figuras 7 e 8)
34
525 EFEITO DA ELUICcedilAtildeO SOBRE OS ANTIacuteGENOS ERITROCITAacuteRIOS
Para verificar o efeito do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA e com a cloroquina
sobre a expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s foi realizada a fenotipagem das
amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes tratamento com ambas as teacutecnicas Foi avaliado
se o tratamento destruiu os antiacutegenos expressos antes do tratamento
Tabela 4- Resultado do Eluato das amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA
Anticorpos Eluato positvo Eluato negativo Total
Anti-D 11 1 12
Anti-C 10 0 10
Anti-E 3 6 9
Anti-c 8 0 8
Anti-S 5 2 7
Anti-K 3 0 3
Anti-Dia 1 0 1
Total 41 9 50
Figura 7 ndash Painel do eluato da amostra 21 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-C que foi
recuperado no eluato
Figura 8 ndash Painel do eluato da amostra 47 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-K que foi
recuperado no eluato
35
Dentre as 50 amostras 26 eram previamente fenotipadas para os antiacutegenos Fya Fy
b
Jka Jk
b S e s Dentre elas 20 alcanccedilaram TDA negativo apoacutes tratamento com a glicina-
aacutecidaEDTA e 20 negativaram apoacutes tratamento com cloroquina (tabela 5) Apoacutes ambas as
teacutecnicas os antiacutegenos originalmente expressos permaneceram positivos comprovando que natildeo
houve destruiccedilatildeo dos mesmos
Tabela 5 ndash Verificaccedilatildeo da interferecircncia do tratamento da hemaacutecias com cloroquina e glicina-
aacuteicdaEDTA sobre os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
AMOSTRAS
COM
FENOTIPAGEM
PREacuteVIA
TRATADAS COM
CLOROQUINA
TRATADAS COM
GLICINA
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
26
20
20
20
20
As amostras 24 47 e 50 eram positivas para o antiacutegeno K A cloroquina natildeo dissociou
o anticorpo em nenhuma das 3 amostras enquanto a glicina-aacutecidaEDTA foi efetiva nas
amostras 24 e 50 Foi testada a expressatildeo do antiacutegeno K nas amostras 24 e 50 apoacutes o
tratamento utilizando meacutetodo indireto em gel contendo AGH Apesar de natildeo ter sido avaliado
a intensidade de reaccedilatildeo de expressatildeo dos antiacutegenos podemos verificar na figura 9 que nas
duas amostras em que a teacutecnica foi efetiva e dissociou o anticorpo a expressatildeo do antiacutegeno K
continua presente mas a reatividade observada pode ser considerada 1+ sugerindo que houve
diminuiccedilatildeo da expressatildeo do antiacutegeno quando comparado com a expressatildeo observada em
hemaacutecia natildeo tratada
Os resultados individuais de cada amostra em ambas as teacutecnicas encontram-se
resumidas na tabela 6
526 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente onde foi constatada a presenccedila de autoanticorpo
a quente da classe IgG pelo TDA monoespeciacutefico (figura 10)O autoanticorpo tambeacutem
interferia na pesquisa e identificaccedilatildeo de anticorpos irregulares pois apresentava caracteriacutestica
de panaglutinina As hemaacutecias da paciente sensibilizadas ldquoin vivordquo foram tratadas com
cloroquina e com glicina-aacutecidaEDTA
36
Figura 9 ndash Fenotipagem das amostras 24 e 50 para antiacutegeno K apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
O teste positivo indica a presenccedila do antiacutegeno poreacutem a reatividade fraca (1+) sugere que houve enfraquecimento
de sua expressatildeo A direita a expressatildeo forte (4+) do antiacutegeno Kell em hemaacutecia controle natildeo tratada utilizada
como controle positivo
A cloroquina natildeo foi efetiva na retirada do anticorpo ligado as hemaacutecias ao contraacuterio
do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA que dissociou o anticorpo (figura 11)
A hemaacutecia tratada com glicina foi fenotipada para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
(figura 12) A fenotipagem para o sistema Rh (C c E e e) e Kell foi realizada em gel
especiacutefico monoclonal sem interferecircncia do TDA positivo (controle da reaccedilatildeo negativo)
O eluato resultante do tratamento com glicina-aacutecidaEDTA foi testada em gel com
hemaacutecias de painel de identificaccedilatildeo de anticorpos e apresentou resultado positivo com todas
as ceacutelulas (figura 13 e 14)
A amostra foi enviada para genotipagem e o resultado da genotipagem confirmou o
resultado da fenotipagem apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
527 TEMPO DE EXECUCcedilAtildeO DA TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
O tempo de reaccedilatildeo da glicina-aacutecidaEDTA eacute de 2 minutos Todas as amostras foram
tratadas obedecendo ao tempo descrito na literatura demonstrando que o mesmo eacute
reprodutiacutevel
37
Tabela 6- Resultados individuais por amostra
Amostra Especificidade
dos anticorpos
Intensidade do
TDA apoacutes
sensibilizaccedilatildeo
Tratamento
efetivo com
cloroquina
Tratamento
efetivo com
glicina
Eluato
poacutes
glicina
1 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 2 Dia 3+ Sim Sim 3+ 3 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 4 D 4+ Natildeo Sim 4+ 5 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 6 E 3+ Sim Sim Negativo 7 S 4+ Sim Sim 3+ 8 E 3+ Sim Sim 1+ 9 E 3+ Sim Sim 2+
10 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 11 D 4+ Natildeo Sim 4+ 12 D 4+ Natildeo Sim 4+ 13 S 3+ Sim Sim 3+ 14 S 3+ Sim Sim 3+ 15 D 3+ Natildeo Sim 3+ 16 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 17 E 3+ Sim Sim (+) 18 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 19 D 4+ Natildeo Natildeo 3+ 20 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 21 C 3+ Sim Sim 4+ 22 C 3+ Sim Sim 4+ 23 C 3+ Sim Sim 4+ 24 K 4+ Natildeo Sim 4+ 25 D 3+ Natildeo Natildeo Negativo 26 E 4+ Sim Sim Negativo 27 S 3+ Sim Sim 3+ 28 C 3+ Sim Natildeo 4+ 29 C 3+ Sim Sim 4+ 30 C 3+ Sim Sim 4+ 31 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 32 E 3+ Sim Sim Negativo 33 C 3+ Sim Natildeo 4+ 34 S 3+ Sim Sim Negativo 35 S 3+ Sim Sim Negativo 36 C 4+ Sim Natildeo 4+ 37 c 4+ Natildeo Natildeo 4+ 38 D 4+ Natildeo Sim 4+ 39 S 3+ Sim Sim 3+ 40 c 4+ Sim Natildeo 2+ 41 C 4+ Sim Natildeo 4+ 42 E 3+ Sim Sim Negativo 43 D 3+ Natildeo Sim 2+ 44 D 3+ Natildeo Sim 2+ 45 E 3+ Sim Sim Negativo 46 C 3+ Sim Sim 4+ 47 K 4+ Natildeo Natildeo 4+ 48 D 3+ Natildeo Sim 2+ 49 E 3+ Sim Sim Negativo 50 K 4+ Natildeo Sim 4+
TOTAL 50 28 33 41
38
Figura 10 ndash TDA monoespeciacutefico da amostra de paciente Hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo da classe
IgG
oacute Figura 11 ndash TDA apoacutes o tratamento com glicina-aacutecidaEDTA (esquerda) e cloroquina (direita) A glicina
negativou completamente o TDA enquanto a hemaacutecia tratada com cloroquina persistiu positiva (1+)
39
Figura 12 ndash Fenotipagem da amostra tratada com glicina-aacutecidaEDTA Fy(a+b+) Jk(a-b+) S+s+
Figura 13 ndash Painel em gel (LissAGH) do eluato apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de
intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
Figura 14 ndash ndash Painel ezimaacutetico (hemaacutecias tratadas com bromelina) do eluato em gel neutro apoacutes
tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
40
528 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Quanto a efetividade das teacutecnicas em negativar o TDA foi verificado que a glicina-
aacutecidaEDTA foi efetiva em 66 das amostras testadas no primeiro tratamento (3350
amostras) enquanto a cloroquina conseguiu negativar 56 (2850) Esses resultados natildeo
apresentam diferenccedila significativa (pgt005) demostrando que a teacutecnica da glicina-
aacutecidaEDTA natildeo eacute superior mas eacute tatildeo efetiva quanto a da cloroquina
Quando aliamos os resultados de ambas as teacutecnicas verificamos que em 76 (3850)
das amostras o TDA foi negativado Esse dado indica que ainda que uma teacutecnica natildeo seja
eficaz na remoccedilatildeo do anticorpo eacute uma boa alternativa tentar a segunda teacutecnica jaacute que a falha
em remover o anticorpo utilizando uma delas natildeo prevecirc necessariamente a falha com a outra
Quando se utiliza o teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla (graacutefico 2) para comparar a utilizaccedilatildeo das
duas teacutecnicas com o resultado de cada uma isolada (somente a cloroquina ou somente a
glicina) verificamos que os resultados apresentam diferenccedila significativa (plt005) (quadro 3)
TRATAMENTO EFETIVO COM TOTAL PORCENTAGEM
Glicina ou cloroquina 38 76
Glicina e cloroquina 23 46
Glicina apenas 10 20
Cloroquina apenas 5 10
Nenhuma das teacutecnicas 12 24
Quadro 3 - Resultados comparativos entre as teacutecnicas utilizadas
41
Graacutefico 2 - Teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla entre as teacutecnicas aplicadas A- Glicina e Cloroquina B-Cloroquina C-
Glicina ( plt005)
42
6 DISCUSSAtildeO
Os reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA podem ser adquiridos em
forma de kit comercial prontos para uso poreacutem natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil A preparaccedilatildeo
dos reagentes ldquoin houserdquo a partir de sais comerciais adquiridos se mostrou viaacutevel Os
reagentes glicina e o tampatildeo Tris armazenados de forma correta se mantiveram estaacuteveis por
um periacuteodo de 7 meses Somente o reagente EDTA precipitou mesmo armazenado em
condiccedilotildees adequadas sugerindo que o mesmo deve ser preparado em menor quantidade e
armazenado em aliacutequotas A soluccedilatildeo de cloroquina tambeacutem pode ser preparada ldquoin houserdquo e
pode ser armazenado por um mecircs A legislaccedilatildeo brasileira autoriza a utilizaccedilatildeo de reagentes
preparados a partir de sais comerciais como a cloroquina e a glicina-aacutecidaEDTA desde que
os sais tenham autorizaccedilatildeo da vigilacircncia sanitaacuteria para a comercializaccedilatildeo (BRASIL 2001)
A comparaccedilatildeo quanto a efetividade em dissociar anticorpos em amostras com TDA
positivos entre a teacutecnica da glicina e a teacutecnica da cloroquina mostrou que natildeo haacute diferenccedila
estatiacutestica entre elas e que ambas satildeo igualmente eficientes Se utilizadas conjuntamente haacute
maior possibilidade de elucidaccedilatildeo dos casos
Uma vantagem da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eacute que ela permite numa mesma
amostra eluir o anticorpo ligado aacute hemaacutecia assim como fenotipar a hemaacutecia tratada Devido a
sua dupla utilidade a teacutecnica eacute vantajosa principalmente em pacientes em que pouco volume
de amostra pode ser coletado como em casos de crianccedilas e receacutem-nascidos
A fenotipagem poacutes tratamento se mostrou viaacutevel jaacute que os antiacutegenos de maior
importacircncia natildeo sofreram alteraccedilotildees Nas 20 amostras que foram fenotipadas antes e apoacutes
tratamento para verificar a influecircncia dos reagentes na expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a
Jkb S e s natildeo houve destruiccedilatildeo dos mesmos por nenhuma das duas teacutecnicas
Para as amostras positivas para o antiacutegeno Kell (350) e sensibilizadas com o
respectivo anticorpo a teacutecnica da glicina foi efetiva em negativar o TDA em apenas duas
delas mas apoacutes o tratamento foi verificada uma fraca reatividade da reaccedilatildeo antiacutegeno-
anticorpo sugerindo que houve um enfraquecimento da expressatildeo do antiacutegeno conforme
esperado e descrito na literatura (BYRNE 1991 PALLAS WILER E MCGEE 1991
ROZIERS e SQUALI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012 e KATHARIA e
CHAUDHARY 2013) A accedilatildeo da glicina sobre o antigeno Kell natildeo representa impedimento
para seu uso uma vez que na impossibilidade de testar o antiacutegeno Kell o banco de sangue
consegue facilmente atender a solicitaccedilatildeo de transfusatildeo com unidades de hemaacutecias Kell
43
negativas jaacute que eacute um antiacutegeno de baixa prevalecircncia na populaccedilatildeo variando de 15 na
populaccedilatildeo africana a 9 nos europeus (DANIELS 2011)
A soluccedilatildeo resultante da dissociaccedilatildeo do anticorpo pela teacutecnica da glicina pode ainda ser
utilizada como eluato podendo substituir a teacutecnica de eluiccedilatildeo com reagentes comercias (kits
de eluiccedilatildeo aacutecida) que tem alto custo aproximadamente entre R$2000 a R$2500 por teste
Em 41 amostras (82) houve a dissociaccedilatildeo e recuperaccedilatildeo do anticorpo que estava
sensibilizando as hemaacutecias Em 9 amostras (18) os anticorpos foram eluiacutedos poreacutem
apresentaram reaccedilatildeo negativa quando testadas com hemaacutecias de triagem entre eles o anti-E
(6) anti-S (2) e Anti-D (1) Eacute possiacutevel que a correccedilatildeo pH do meio (WALKER 2011) natildeo
tenha sido adequada o que pode ter desfavorecido a reatividade do anticorpo
Para as amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA nas quais natildeo houve dissociaccedilatildeo do
anticorpo pelo primeiro tratamento (1750) o segundo tratamento natildeo se mostrou eficaz jaacute
que 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise O tempo de
armazenagem natildeo parece ter influenciado jaacute que todas as amostras foram testadas dentro de
48 horas apoacutes a coleta Outros fatores que natildeo foram verificados podem ter levado a
hemoacutelise Apesar da literatura (LOUIE JIENG e ZEROULIS 1986 e BYRNE 1991)
recomendar um segundo tratamento ele eacute pouco eficaz tendo negativado apenas 3 das 17
amostras testadas
A amostra de paciente que apresentou sensibilizaccedilatildeo ldquoin vivordquo mostrou melhor
efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA sobre a da cloroquina possibilitando
fenotipagem para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s que natildeo foram destruiacutedos apoacutes o
tratamento comprovado atraveacutes da genotipagem
A presenccedila de autoanticorpo a quente com presenccedila de hemoacutelise (AHAI) ou natildeo pode
mascarar a presenccedila de aloanticorpo interferindo na rotina soroloacutegica da fenotipagem que eacute
uma importante ferramenta para auxiliar na seleccedilatildeo de hemaacutecias para transfusatildeo (SHIREY et
al 2002) Esses pacientes frequentemente possuem aloanticorpos associados ao
autoanticorpo e a prevalecircncia de aloimunizaccedilatildeo entre eles varia entre 12 a 40 (LEGER e
GARRATY 1999 BRANCH e PETZ 1999) o que dificulta ainda mais a escolha do melhor
componente a ser transfundido aleacutem de aumentar a possibilidade reaccedilotildees hemoliacuteticas imunes
poacutes-transfusionais
Nesses casos as teacutecnicas de dissociaccedilatildeo de anticorpos satildeo importantes para tratar
amostras de pacientes e a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser usada como uma opccedilatildeo
pois se mostrou eficaz na dissociaccedilatildeo anticorpo ligado agraves hemaacutecias deixando livre a
superfiacutecie das mesmas permitindo a fenotipagem por antisoros IgG Paralelamente os
44
anticorpos eluiacutedos tambeacutem puderam ser estudados O mesmo natildeo ocorre com a cloroquina
que permite apenas a fenotipagem e tampouco com os kits de eluiccedilatildeo aacutecida disponiacuteveis no
mercado nacional que satildeo destinados a realizaccedilatildeo do eluato mas destroem as hemaacutecias
O tempo de tratamento na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA tambeacutem eacute uma vantagem
pois foi possiacutevel reproduzir no tempo determinado de 2 minutos enquanto a cloroquina
demora ateacute duas horas
Ainda que a aplicaccedilatildeo das teacutecnicas por biologia molecular estejam cada vez mais
presentes na rotina imuno-hematoloacutegica e possibilitam estabelecer o fenoacutetipo deduzido do
genoacutetipo elas natildeo estatildeo disponiacuteveis na maioria dos centros e sua realizaccedilatildeo exige algumas
horas A resoluccedilatildeo imediata do problema transfusional necessita dos resultados soroloacutegicos
pois com frequecircncia natildeo eacute possiacutevel aguardar o resultado do teste molecular Dessa forma
apesar da crescente importacircncia da genotipagem eritrocitaacuteria teacutecnicas soroloacutegicas aplicadas
corretamente e no momento propiacutecio satildeo de grande utilidade para resolver problemas imuno-
hematoloacutegicos como ocorre com a fenotipagem em pacientes com TDA positivo
45
7 CONCLUSAtildeO
A teacutecnica da glicina aacutecidaEDTA mostrou-se efetiva em remover os anticorpos que
sensibilizavam as hemaacutecias e pode ser utilizada com seguranccedila antes da fenotipagem
eritrocitaacuteria Por ser uma teacutecnica de raacutepida execuccedilatildeo eacute uma alternativa aplicaacutevel
principalmente em casos urgentes de pacientes que apresentam autoanticorpos
46
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50
9 ANEXOS
51
FUNDACcedilAtildeO HEMOCENTRO DE RIBEIRAtildeO PRETO
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE)
Tiacutetulo da pesquisa Aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina aacutecida-EDTA e avaliaccedilatildeo da
eficaacutecia no tratamento de hemaacutecias com teste direto da antiglobulina positivo
Pesquisadora responsaacutevel Ceacutelia Kazue Abiko
Orientador Prof Dimas Tadeu Covas
Co-orientadora Dra Flaacutevia Leite Souza Santos
Objetivo da pesquisa Vocecirc estaacute sendo convidado a participar de uma pesquisa que tem
como objetivo padronizar uma nova teacutecnica para auxiliar na tipagem sanguiacutenea de pacientes
A tipagem sanguiacutenea pode sofrer interferecircncia da presenccedila de anticorpos ligados aos gloacutebulos
vermelhos do sangue Nessas situaccedilotildees eacute difiacutecil selecionar o melhor sangue para o paciente e
eacute preciso a utilizaccedilatildeo de teacutecnicas adicionais para remover essas interferecircncias
Esta pesquisa tem como objetivo estudar outra teacutecnica para remover esses anticorpos e
comparaacute-la com a teacutecnica atualmente utilizada Para isso precisamos de amostras de pacientes
e doadores voluntaacuterios
Se vocecirc eacute um doador eacute necessaacuterio que vocecirc autorize a coleta de 5 ml (1 tubo) a mais
de seu sangue
Se vocecirc eacute um paciente natildeo haveraacute necessidade de nova amostra pois utilizaremos as
amostras jaacute coletadas para os testes preacute-transfusionais e os resultados encontrados nesta
pesquisa natildeo iratildeo interferir na escolha da (s) bolsa (s) de sangue que vocecirc possa vir a receber
Se vocecirc concordar em participar leia com atenccedilatildeo o texto abaixo e assine as duas vias
rubricando todas as paacuteginas deste termo de consentimento Uma via original assinada e
rubricada por vocecirc e pela pesquisadora ficaraacute com vocecirc
As suas informaccedilotildees seratildeo mantidas em sigilo pela pesquisadora e natildeo haveraacute
armazenamento de material para pesquisas posteriores Os seus dados seratildeo usados apenas
neste estudo e quando o trabalho for publicado seu nome e qualquer outra informaccedilatildeo que
possam identificaacute-lo natildeo seratildeo revelados
Eacute pouco provaacutevel que o que noacutes aprendermos com este estudo tenha um benefiacutecio
direto para vocecirc assim como natildeo poderemos dar nada em troca pela sua participaccedilatildeo na
pesquisa
Nosso objetivo com esta pesquisa eacute que os resultados poderatildeo ser uacuteteis para o
tratamento de pacientes no futuro Os riscos da participaccedilatildeo satildeo miacutenimos Se vocecirc eacute um
doador de sangue a amostra seraacute coletada no momento da doaccedilatildeo natildeo exigindo punccedilatildeo
venosa adicional
52
Eacute seu direito ter acesso aos resultados dos testes da pesquisa Esses resultados natildeo
seratildeo fornecidos automaticamente a vocecirc mas caso vocecirc se interesse em saber o resultado ou
tiver alguma duacutevida sobre a sua participaccedilatildeo neste estudo deveraacute entrar em contato com Ceacutelia
Kazue Abiko pelo telefone (18) 99718-3551
Vocecirc tem total liberdade de optar por natildeo participar da pesquisa Caso aceite
participar poderaacute desistir a qualquer momento ou retirar seu consentimento mesmo apoacutes ter
coletado o sangue Para cancelar sua participaccedilatildeo basta avisar a pesquisadora e os seus dados
seratildeo retirados do projeto
Qualquer duacutevida eacutetica sobre a pesquisa poderaacute entrar em contato com o Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa do Hospital das Cliacutenicas e da Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto
(CAMPUS UNIVERSITAacuteRIO bairro Monte Alegre CEP 14048-900 Ribeiratildeo Preto-SP
Telefone (16) 3602-2228 FAX (16) 3633-1144 e-mail cephcrpuspbr)
Consentimento de participaccedilatildeo
A Consentimento do participante
Li as informaccedilotildees acima sobre o estudo e recebi explicaccedilotildees sobre a participaccedilatildeo no estudo
Portanto dou o meu consentimento para participar do estudo
___________________________________________________________________________
Nome completo
___________________________________________________________________________
Assinatura
___________
Data
__________________________________________________________________________________
Nome completo da pesquisadora
___________________________________________________________________________
Assinatura
_____________
Data
17
nem sempre esses reagentes estatildeo disponiacuteveis especialmente os reagentes monoclonais para
os antiacutegenos dos sistemas Duffy ( Fya Fy
b) Kidd ( Jk
a Jk
b) e MNS (S s) (JUNIOR e
OLIVATO 2004) Outra opccedilatildeo eacute a teacutecnica de bloqueio que pode ser utilizada para tratar
hemaacutecias para posterior fenotipagem em casos de TDA positivos com reatividade le2+
Em casos onde a positividade do TDA eacute maior que 2+ estaacute indicada a tratamento
quiacutemico para remoccedilatildeo da interferecircncia do autoanticorpo antes de realizar a fenotipagem Entre
as teacutecnicas utilizadas atualmente estatildeo o ZZAP a cloroquina e a glicina aacutecidaEDTA
1351 TEacuteCNICA DE BLOQUEIO
A teacutecnica de bloqueio se baseia na utilizaccedilatildeo de anti-IgG (Coombs monoespeciacutefico)
para tratar as hemaacutecias com TDA positivo O anticorpo anti-IgG se liga aos anticorpos que
estatildeo sensibilizando a hemaacutecias poreacutem sem o bloquear os antiacutegenos Os antiacutegenos que natildeo
estatildeo sensibilizados podem ser detectados atraveacutes dos antissoros especiacuteficos (SERERAT
VEIDT E DUTCHED 2000)
1352 TRATAMENTO DE HEMAacuteCIAS COM ZZAP
O Sulphydryl-Proteolytic Enzyme (ZZAP) que eacute uma mistura de ditiotreitol (DTT)
mais papaiacutena ativada com cisteiacutena eacute um reagente capaz de dissociar imunoglobulinas da
classe IgG ligadas a membrana dos eritroacutecitos enquanto trata enzimaticamente as hemaacutecias
O tratamento enzimaacutetico tambeacutem potencializa a ligaccedilatildeo do autoanticorpo ao antiacutegeno e
acelera o processo de autoadsorccedilatildeo O ZZAP pode desnaturar os antiacutegenos do sistema Duffy
MNS e Kell o que limita sua aplicaccedilatildeo para fins de fenotipagem (BRANCH e PETZ 1982)
1353 CLOROQUINA
Em 1982 Edwards Moulds e Judd propuseram a utilizaccedilatildeo da teacutecnica da cloroquina
que dissociava os complexos antiacutegeno-anticorpo e mantinha a membrana das hemaacutecias
iacutentegras Os derivados quinolecircicos jaacute haviam sido descritos anteriormente por Domokos e
Aszody em 1964 e Holtz Mantel e Buck em 1973 (apud Edwards Moulds e Judd 1982) pela
sua capacidade de separar imunocomplexos e inibir as reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo reduzindo
as cargas eleacutetricas das superfiacutecie das hemaacutecias A teacutecnica eacute uma das mais utilizadas nos
centros brasileiros para remover a interferecircncia do autoanticorpo e eacute tambeacutem a teacutecnica
atualmente adotada pelo laboratoacuterio de imunohematologia do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto
18
Edwards Moulds e Judd (1982) demonstraram que a teacutecnica da cloroquina para
dissociaccedilatildeo de anticorpos eacute uma teacutecnica simples efetiva e confiaacutevel para dissociar
imunoglobulina das hemaacutecias Desde que a membrana das hemaacutecias permaneccedila intacta natildeo
haacute perda da reatividade dos antiacutegenos e a sua maior aplicaccedilatildeo eacute a fenotipagem de hemaacutecias
com TDA positivo Os autores verificaram que em 83 das amostras sensibilizadas in vivo e
22 amostras (no total de 40) sensibilizadas ldquoin vitrordquo apresentaram TDA negativo e
puderam ser fenotipadas A teacutecnica poreacutem natildeo consegue remover os componentes do
complemento na maioria dos casos
Champagne e colaboradores (1999) testaram a teacutecnica da cloroquina para dissociar
antiacutegenos Bg comparando com a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA e verificaram vantagem em
relaccedilatildeo ao uso de um uacutenico reagente diminuindo a manipulaccedilatildeo e verificou que o mesmo natildeo
destroacutei antiacutegeno Kell
A cloroquina tambeacutem mostrou-se pouco efetivo em remover anticorpos do sistema
Duffy da superfiacutecie das hemaacutecias (EDWARDS MOUDS e JUDD 1982 ROZIERS e
SQUALI 1997)
1353 GLICINA-AacuteCIDAEDTA
A afinidade e a estabilidade entre a ligaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo eacute definida como a
resultante entre forccedilas atrativas e repulsivas entre ambos (CARUCIO e WISE 2012) e resulta
da somatoacuteria de forccedilas quiacutemicas dinacircmicas e fracas (natildeo covalentes) como pontes de
hidrogecircnio forcas eletrostaacuteticas forca de Van der Waals e pontes hidrofoacutebicas A estabilidade
dessa ligaccedilatildeo eacute facilmente abalada por alteraccedilotildees quiacutemicas e fiacutesicas no meio da reaccedilatildeo como
a alteraccedilatildeo do pH A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA se baseia na mudanccedila do pH para a
quebra da ligaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo (KOSANKE 2012)
A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA foi primeiramente descrita em 1986 por Louie Jieng
e Zeroulis que utilizaram 50 amostras de doadores sensibilizados ldquoin vitrordquo com anticorpos A
teacutecnica foi efetiva em 48 amostras permitindo o estudo do eluato assim como a fenotipagem
das hemaacutecias Os autores testaram tambeacutem a teacutecnica em 100 hemaacutecias TDA positivo que
puderam ser utilizadas para teacutecnicas de autoadsorccedilatildeo
Byrne (1991) descreveu a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA modificada e tambeacutem
verificou como uma opccedilatildeo para o tratamento de hemaacutecias com TDA positivo que deixava as
hemaacutecias intactas e o eluato viaacutevel para ser fenotipado
19
Roziers e Squali (1997) e Katharia e Chaudhary (2013) compararam a teacutecnica da
glicina-aacutecidaEDTA com as teacutecnicas da cloroquina e do aquecimento Verificaram maior
eficiecircncia da glicina-aacutecidaEDTA em relaccedilatildeo as outras duas teacutecnicas pois com uma mesma
quantidade de amostra produzia as hemaacutecias livres de anticorpo e tambeacutem o eluato Mostrou-
se ainda superior devido ao menor tempo exigido para sua realizaccedilatildeo o que favorece seu uso
em situaccedilotildees de urgecircncia e emergecircncia
As duas desvantagens da teacutecnica poreacutem eacute o fato de destruir os antiacutegenos do sistema
Kell e o fato de natildeo remover fraccedilotildees do complemento ligadas agrave hemaacutecia (PALLAS WILER e
McGEE 1991 ROZIERS e SQUALLI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012
e KATHARIA e CHAUNDHARY 2013)
20
2 OBJETIVOS
21 OBJETIVO GERAL
211 Avaliar a eficaacutecia da glicina-aacutecidaEDTA em remover os anticorpos ligados agraves
hemaacutecias sensibilizadas por anticorpos da classe IgG
22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
221 Preparaccedilatildeo dos reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
verificaccedilatildeo da estabilidade dos mesmos e avaliar custos
222 Testar a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA em amostras de hemaacutecias
sensibilizadas por anticorpos antieritrocitaacuterios humanos
223 Comparar a efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA com a teacutecnica da
cloroquina quanto a capacidade de remover a interferecircncia do anticorpo ligado
a hemaacutecia
224 Testar o eluato das amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA
225 Verificar se houve destruiccedilatildeo dos antiacutegenos eritrocitaacuterios apoacutes o tratamento
com glicina-aacutecidaEDTA e com cloroquina
226 Verificar se o tempo de execuccedilatildeo da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA descrito
nos textos de referecircncia eacute reprodutiacutevel
21
3 JUSTIFICATIVA
Algumas condiccedilotildees cliacutenicas podem levar ao depoacutesito ldquoin vivordquo de anticorpos eou
fraccedilotildees do complemento sobre as hemaacutecias Entre elas estatildeo as reaccedilotildees hemoliacuteticas poacutes-
transfusionais a doenccedila hemoliacutetica perinatal o uso de medicamentos e principalmente a
AHAI Na AHAI um anticorpo normalmente da classe IgG ou IgM reconhece antiacutegenos
proacuteprios na membrana eritrocitaacuteria e reduz a sobrevida da hemaacutecia levando a sua destruiccedilatildeo
pelos macroacutefagos no sistema reticulo-endotelial ou agrave ativaccedilatildeo do complexo de ataque agrave
membrana e agrave lise intravascular Os autoanticorpos satildeo voltados na maioria das vezes contra
antiacutegenos eritrocitaacuterios de alta frequecircncia populacional conhecidos como antiacutegenos puacuteblicos
e por este motivo reconhecem tanto hemaacutecias autoacutelogas quanto alogecircnicas
Devido agrave presenccedila do autoanticorpo livre no plasma e tambeacutem do anticorpo eou
complemento ligado agrave hemaacutecia o banco de sangue pode encontrar dificuldades em todas as
fases dos testes preacute-transfusionais do paciente com AHAI e deve utilizar teacutecnicas que
auxiliem na escolha do melhor hemocomponente melhorando a seguranccedila transfusional Essas
teacutecnicas visam remover a interferecircncia do autoanticorpo livre no soro e do autoanticorpo
ligado agrave hemaacutecia permitindo a detecccedilatildeo de aloanticorpos associados e a realizaccedilatildeo da
fenotipagem eritrocitaacuteria respectivamente
A finalizaccedilatildeo dos testes preacute-tranfusionais na presenccedila de autoanticorpo pode levar
algumas horas e nem sempre o paciente poderaacute aguardar Nesse contexto torna-se vantajosa a
aplicaccedilatildeo de teacutecnicas de raacutepida execuccedilatildeo
O presente estudo propotildee aplicar e avaliar a eficaacutecia da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
em remover os anticorpos ligados agrave hemaacutecia o que permite a fenotipagem eritrocitaacuteria
estendida e a seleccedilatildeo de concentrados de hemaacutecias com mesmo fenoacutetipo do paciente
Atualmente no Hemocentro de Ribeiratildeo Preto a teacutecnica utilizada para esse fim eacute o
tratamento das hemaacutecias com difosfato de cloroquina cujo tempo de execuccedilatildeo pode demorar
ateacute duas horas enquanto a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser realizada em apenas dois
minutos o que a tornaria opccedilatildeo de escolha especialmente em situaccedilotildees de urgecircncia Ao
contraacuterio da cloroquina a glicina-aacutecidaEDTA permite tambeacutem o estudo do eluato das
hemaacutecias tratadas
22
4 METODOL OGIA
41 AMOSTRAS DE DOADORES
Foram coletados 50 amostras de doadores de sangue que compareceram ao
Hemonuacutecleo de Araccedilatuba no periacuteodo de junho a agosto de 2016 Foram convidados a
participar da pesquisa doadores de repeticcedilatildeo do tipo sanguiacuteneo ldquoOrdquo RhD positivo
cadastrados no sistema de banco de sangue (SBS) do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto
Todos os doadores que concordaram em participar da pesquisa assinaram o termo de
consentimento livre e esclarecido (TCLE)
No momento da doaccedilatildeo foram coletados adicionalmente 5 mL de sangue total em
soluccedilatildeo anticoagulante EDTA (aacutecido dietilenoaminoaceacutetico) dispensando punccedilatildeo venosa
adicional para coleta da amostra O fluxograma 1 resume as etapas desenvolvidas no projeto
Fluxograma 1 - Fluxo da pesquisa utilizando as amostras de doadores
23
411 FENOTIPAGEM
Foram verificados se os doadores jaacute tinham fenotipagem para outros sistemas de
grupos sanguiacuteneos aleacutem do sistema ABORh que eacute realizado rotineiramente
A fenotipagem eritrocitaacuteria para outros sistemas ou fenotipagem estendida eacute realizada
para identificar a presenccedila ou ausecircncia de antiacutegenos considerados de importacircncia cliacutenica No
Hemonuacutecleo de Araccedilatuba uma parcela de doadores de repeticcedilatildeo satildeo fenotipados para os
antiacutegenos dos sistemas de grupo sanguiacuteneo Rh (antiacutegenos C c E e e) Kell (antiacutegeno K)
Duffy (antiacutegenos Fya e Fy
b) Kidd (antiacutegenos Jk
a e Jk
b) e sistema MNSs (antiacutegenos S e s)
A fenotipagem para o Rh e Kell eacute realizada por metodologia de microplaca utilizando
25 microL de hemaacutecia lavada e diluiacuteda a 5 em salina e 25 microL do antissoro comercial especiacutefico
A reaccedilatildeo eacute incubada 15 minutos a temperatura ambiente e centrifugadas para leitura Para os
antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s a metolodogia utilizado eacute gel contendo antiglobulina
humana (gel LissCoombs poliespeciacutefico) da marca BIO-RAD onde se utiliza suspensatildeo de
hemaacutecia em LISS (Soluccedilatildeo de baixa forccedila iocircnica) A suspensatildeo eacute preparada atraveacutes da
diluiccedilatildeo de 10 microL de hemaacutecia em 1000 microL de LISS Pipetado 50 microL dessa diluiccedilatildeo no gel e
adicionado 25 microL do antissoro especiacutefico Incuba-se em banho seco por 15 minutos a 37 deg
Celsius e eacute centrifugado em centriacutefuga especiacutefica Os antissoros utilizados eram das marcas
Fresenius e Lorne
Foi verificado a fenotipagem do doador no banco de dados do Hemocentro Os
registros dos fenoacutetipos dos doadores ficam armazenadas no sistema de banco de sangue
(SBS) Para doadores que natildeo tinham fenotipagem estendida preacutevia para antiacutegenos do sistema
Rh (C c E e e) e Kell (K) foi realizada a fenotipagem para esses antiacutegenos
O tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA e cloroquina para dissociar
anticorpos pode inativar enfraquecer ou destruir os antiacutegenos presentes nas hemaacutecias
alterando assim os resultados da fenotipagem Para verificar se houve destruiccedilatildeo dos
antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a e Jk
b S e s nas amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes
tratamento foram novamente fenotipadas ao final para os antiacutegenos que eram inicialmente
positivas
A repeticcedilatildeo da fenotipagem foi realizada nas amostras que apresentaram efetividade
no tratamento da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eou da cloroquina e a detecccedilatildeo do antiacutegeno
na amostra preacute-tratamento
24
412 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS HEMAacuteCIAS
As hemaacutecias foram sensibilizadas com antissoros policlonais humanos de amostras de
plasma fresco congelado de doadores com resultado de pesquisa de anticorpo irregular
positivos
A escolha do anticorpo para sensibilizar as hemaacutecias foi definida de acordo com o
fenoacutetipo do doador que deveria ser positivo para o respectivo antiacutegeno
Para a sensibilizaccedilatildeo um volume de antissoro (1 mL) e um volume (1 mL) de
hemaacutecias lavadas quatro vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica foram adicionadas a um tubo de 12 x
75 mm A mistura foi homogeneizada e incubada em banho maria (BM) a 37deg C por 60
minutos A seguir as hemaacutecias foram novamente lavadas 4 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica
para retirada dos anticorpos que natildeo se ligaram A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada
como controle negativo O teste da uacuteltima lavagem eacute importante para assegurar que os
anticorpos que poderatildeo ser detectados no eluato apoacutes o tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA
sejam aqueles que estavam ligados agraves hemaacutecias e natildeo aqueles livres no plasma O controle
negativo mostra que todo o anticorpo livre foi retirado (LEGER 2011)
Para o teste de presenccedila de anticorpo na soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foram incubadas
com hemaacutecias de triagem de anticorpos irregulares (ID-Diacell BIO-RAD) contendo os
antiacutegenos especiacuteficos Realizado a teacutecnica em gel LissCoombs com anti-IgG+C3d Incubado
no tempo de 15 minutos a temperatura de 37deg C e centrifugado 10 minutos em centriacutefuga
proacutepria
As 50 amostras de doadores foram sensibilizadas com os anticorpos policlonais
humanos
Apoacutes sensibilizadas rdquoin vitrordquo e lavadas as hemaacutecias foram diluiacutedas em soluccedilatildeo de
baixa forccedila iocircnica (LISS) na quantidade de 10 microL de hemaacutecia para 1000 microL de soluccedilatildeo A
suspensatildeo foi pipetada (50 microL) em coluna-gel-teste LissCoombs (BIO-RAD) que contecircm
antiglobulina poliespeciacutefico (IgG+C3d) e centrifugada em baixa rotaccedilatildeo conforme orientaccedilatildeo
do fabricante durante 10 minutos
As amostras deveriam apresentar aglutinaccedilatildeo com reatividade 3 a 4+ no TDA As
amostras que apresentaram reaccedilatildeo menor que 3+ foram novamente sensibilizadas com nova
aliacutequota do antissoro
25
413 TRATAMENTO DAS AMOSTRAS
As amostras sensibilizadas apresentando o TDA positivo 3 ou 4+ foram divididas em
duas aliacutequotas e submetidas a duas teacutecnicas diferentes com o objetivo de dissociar o anticorpo
ligado Uma aliacutequota da amostra foi tratada com soluccedilatildeo de difosfato de cloroquina enquanto
a outra aliacutequota foi tratada com glicina-aacutecidaEDTA
42 PREPARO DA GLICINA AacuteCIDA-EDTA
A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA utiliza 3 soluccedilotildees diferentes a glicina aacutecida o
EDTA e o tampatildeo TRIS
Os reagentes foram preparados utilizando os sais para anaacutelise (PA) de EDTA
(Na2EDTA2H2O) TRIS (C4H11NO3) Glicina (H2NCH2CO2H) NaCl e a soluccedilatildeo de aacutecido
cloriacutedrico (HCl) 12 N todos reagentes da marca SYNTH (quadro 1)
Para o preparo do tampatildeo glicina-acida eacute necessaacuterio o ajuste do pH para 15 Para esse
ajuste utiliza-se aacutecido cloriacutedrico (HCl) concentrado O pH foi medido com fitas reativas de pH
com escala de 1 a 14 da marca MERCK Posteriormente a soluccedilatildeo foi enviada ao laboratoacuterio
de controle de qualidade do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto e o pH medido no peagacircmetro O
tampatildeo glicina-aacutecida foi armazenado a 4deg e o tampatildeo tris e o EDTA em temperatura ambiente
controlada (20 a 24deg Celsius)
Apoacutes o preparo e durante a realizaccedilatildeo dos testes foram feitas inspeccedilotildees visuais para
verificaccedilatildeo de turvaccedilatildeo do meio e presenccedila de precipitados
Reagente Material Quantidade Preparo e
Conservaccedilatildeo
EDTA
EDTA
(Na2EDTA2H2O)
5 gramas Mistura ateacute
dissoluccedilatildeo do sal e
conserva em
temperatura ambiente Aacutegua Destilada 50 Ml
Tris
TRIS (C4H11NO3) 121 gramas Conservar em
temperatura ambiente NaCl 525g
Aacutegua destilada 100ml
Gliacutecina-aacutecida
Glicina
(H2NCH2CO2H) 15 gramas
Conservar a 4oC NaCl 116gramas
Aacutegua Destilada 200ml
HCL 12N Ajutar o pH para 15
Quadro 1 - Preparo dos Reagentes da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
Fonte - Manual teacutecnico AABB 2011
26
O tampatildeo glicina-aacutecida e o tampatildeo TRIS satildeo estaacuteveis por 7 meses O reagente EDTA
precipitou mesmo estando em temperatura em ambiente controlado Houve necessidade de
preparo de novo reagente
421 TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
1 Em um tubo de ensaio 12x75 mm eacute adicionado 08 mL da soluccedilatildeo de glicina-aacutecida A
esta soluccedilatildeo adiciona-se 02 mL de EDTA e mistura
2 Adiciona-se 02 mL de hemaacutecias sensibilizadas (lavada 4 vezes) A mistura eacute
homogeneizada e incubada por exatamente 2 minutos
3 A seguir 01 mL de tampatildeo TRIS eacute adicionado agrave mistura que eacute novamente
homogeneizada e centrifugada por 2 minutos a 3400 rpm O pH deve estar entre 7 a 75
4 Apoacutes centrifugaccedilatildeo separa-se em outro tubo o sobrenadante (eluato) e as hemaacutecias
que permanecem satildeo lavadas 4 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica para retirada de todo o
reagente e anticorpos livres
43 PREPARO DA CLOROQUINA
A cloroquina eacute diluiacuteda em tampatildeo PBS na concentraccedilatildeo de 20 (Quadro 2) e
armazenado a 4deg Celsius sua validade apoacutes o preparo eacute de 1 mecircs
A teacutecnica da cloroquina jaacute estaacute padronizada para rotina do laboratoacuterio de
imunohematologia do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto e suas unidades
Reagente Reagentes Quantidade PreparoConservaccedilatildeo
Cloroquina
Difosfato de cloroquina
(C18H32ClN3O8P2)
20 gramas
Conservar a 4deg Celsius
Tampatildeo PBS 100ml
NaOH 01 N Acertar o pH para
51
Quadro 2 - Preparo da Cloroquina Fonte - Manual teacutecnico da AABB 2011
431 TEacuteCNICA DA CLOROQUINA
1 4 partes da soluccedilatildeo pronta eacute adicionada a uma parte de hemaacutecias lavadas 4 vezes com
soluccedilatildeo fisioloacutegica
2 A mistura eacute incubada em temperatura ambiente por ateacute duas horas
3 Centrifugar a 3400 rpm por 2 minutos
27
4 Remover o sobrenadante lavar as hemaacutecias novamente com soluccedilatildeo fisioloacutegica 4
vezes
44 VERIFICACcedilAtildeO DA EFETIVIDADE DOS TESTES
Apoacutes tratamento pelas duas teacutecnicas o TDA foi repetido em todas as amostras para
verificar se os tratamentos foram efetivos e houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo Para as
amostras tratadas pela teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA que permaneceram com TDA positivo
novo tratamento foi realizado
45 TESTE DO ELUATO
O eluato resultante das amostras tratadas com glicina-acidaEDTA foi testado com
hemaacutecias de triagem A soluccedilatildeo do eluato foi incubada com as hemaacutecias de triagem de
anticorpos (ID-Diacell BIO-RAD) pela teacutecnica em gel LissCoombs O teste foi incubado 15
minutos a 37deg Celsius e centrifugado por 10 minutos em centrifuga proacutepria para a teacutecnica em
gel Os eluatos que apresentaram resultados positivos foram testados em painel de 11
hemaacutecias (ID-Diapanel BIO-RAD) para a identificaccedilatildeo do anticorpo
46 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente que apresentou TDA positivo por IgG e pesquisa
de anticorpo irregular positivo com presenccedila de autoanticorpo com reatividade panaglutinina
A amostra foi tratada em paralelo pelas duas teacutecnicas descritas e foi enviada para o
Hemocentro para genotipagem eritrocitaacuteria que foi realizado por metodologia PCR em tempo
real no equipamento Real-time system PCR 7500 ( Applied Biosystems Califoacuternia EUA)
28
5 RESULTADOS
51 REAGENTES
Para aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA satildeo necessaacuterios 3 diferentes
reagentes que podem ser encontrados em forma de kit pronto para uso No entanto esses kits
natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil Os reagentes satildeo tampatildeo glicina-aacutecida o EDTA e o tampatildeo
Tris
Todos os reagentes foram preparados rdquoin houserdquo a partir dos sais e soluccedilotildees PA (puro
para anaacutelise) da marca SYNTH que foram adquiridos para a pesquisa O custo estimado para
cada teste foi aproximadamente R$ 020 reais
Apoacutes o preparo os reagentes poderiam ser armazenados em condiccedilotildees adequadas pelo
periacuteodo de 1 ano (AABB 2011) Ao final do preparo e durante o periacuteodo de armazenamento
de fevereiro a setembro de 2016 foi realizada inspeccedilatildeo visual para verificar a presenccedila de
precipitados ou turvaccedilatildeo A soluccedilatildeo de glicina e o tampatildeo TRIS mostraram-se estaacuteveis ateacute o
final do periacuteodo Por sua vez o reagente EDTA precipitou mesmo estando armazenado em
temperatura ambiente controlada e foi necessaacuterio novo preparo
52 AMOSTRAS DE DOADORES
521 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS AMOSTRAS
Apoacutes incubaccedilatildeo da hemaacutecia com o antissoro a mesma foi lavada 4 vezes para retirada
dos anticorpos livres A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada Caso houvesse positividade na
soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem a etapa era repetida (figura 3) Das 50 amostras sensibilizadas a
uacuteltima lavagem foi positiva somente em 3 delas Nas 3 amostras o anticorpo utilizado para
sensibilizaccedilatildeo foi o anti-K Apoacutes repetido nova etapa de lavagem os resultados se
apresentaram negativos
Em todas as amostras sensibilizadas ldquoin vitrordquo o TDA foi testado e verificado a
intensidade do teste Entre as 50 amostras 47 alcanccedilaram TDA com intensidade 3-4+ apoacutes a
primeira sensibilizaccedilatildeo enquanto 3 amostras necessitaram uma segunda incubaccedilatildeo com
anticorpo (figura 4)
A escolha dos anticorpos para sensibilizar as hemaacutecias foi feita de acordo com o
fenoacutetipo do doador e foram utilizados sete diferentes especificidades de anticorpos policlonais
humanos conforme mostra o graacutefico1
29
Figura 3 - Soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada com hemaacutecia de triagem de
anticorpos em gel LissCoombs (BIO-RAD) A finalidade eacute verificar a presenccedila de anticorpos livres na
suspensatildeo que possam interferir na pesquisa do eluato As soluccedilotildees de lavagem das amostras na figura a tiveram
resultados negativos Na figura b duas amostras a 47 e 50 apresentaram resultado positivo Nova etapa de
lavagem foi realizada e o resultado final foi negativo
522 TRATAMENTO DAS HEMAacuteCIAS
Apoacutes a sensibilizaccedilatildeo e obtenccedilatildeo de resultados de TDA com intensidade de 3 a 4+
cada uma das amostras foi dividida em duas aliacutequotas e tratada separadamente pelas teacutecnicas
de glicinaaacutecida-EDTA e cloroquina
As teacutecnicas foram consideradas efetivas quando obteve-se a completa dissociaccedilatildeo do
anticorpo verificada atraveacutes do TDA negativo na amostra poacutes tratamento conforme figuras 5
e 6 Dentre as amostras tratadas com cloroquina 2850 tiveram o TDA negativado A glicina-
aacutecidaEDTA negativou o TDA em 33 das 50 amostras tratadas Apenas 17 amostras tratadas
com glicina-aacutecidaEDTA permaneceram com o TDA positivo e foram submetidas a um novo
tratamento
30
Figura 4 - TDA das amostras apoacutes sensibilizaccedilatildeo com anticorpos policlonais humanos Amostras na
figura a com intensidades de 3-4+ Na figura b amostras 4 e 7 com intensidade menor que 3+ e portanto foram
novamente sensibilizadas com nova aliacutequota de soro Anti-D e anti-S Apoacutes a segunda sensibilizaccedilatildeo
apresentaram reatividade 4 e 3+ respectivamente Os anticorpos utilizados para sensibilizaccedilatildeo foram D S c E
C e K
523 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS TEacuteCNICAS
No tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA houve dissociaccedilatildeo completa do anticorpo
em 33 amostras (66) das 50 amostras testadas enquanto que com a cloroquina foram 28
amostras (56) (tabela 1)
31
Graacutefico 1- Nuacutemero de amostras sesnsibilizadas por especificidade de anticorpo Entre as 50 amostras 12
foram sensibilizadas com anti-D 10 com anti-C 9 com anti-E 8 com anti-c 7 com anti-S 3 com anti-K e 1
com anti-Dia As especificidades dos anticorpos foram definidas de acordo o fenoacutetipo do doador
Figura 5 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com cloroquina Nas amostras onde houve
a dissociaccedilatildeo do anticorpo ( 2 21 a 23 26 39 a 42 45 46 e 49) a hemaacutecia se deposita no fundo no microtubo
apoacutes a centrifugaccedilatildeo (TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (1 3 24 25 43 44 47
48 e 50) o anticorpo ligado agraves hemaacutecias eacute alvo da AGH presente no gel (TDA positivo)
Anti-D 12
Anti-C 10
Anti-E 9
Anti-c 8
Anti-S 7
Anti-K 3 Anti-Dia 1
32
Figura 6 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA Nas amostras
onde houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo (4 6 7 12 a 15 17 34 35 37 e 38) a hemaacutecia se deposita no fundo no
microtubo apoacutes a centrifugaccedilatildeo ( TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (5 16 18
19 20 33 e 36 ) o AGH presente no gel se liga ao anticorpo ligado agraves hemaacutecias que ficam retidas no gel (TDA
positivo)
Tabela 1-Resultado geral do tratamento das hemaacutecias com glicina e cloroquina
Teacutecnica utilizada TDA negativo TDA positivo Total
Glicina-aacutecidaEDTA 33 17 50
Cloroquina 28 22 50
A glicina-aacutecidaEDTA conseguiu negativar mais amostras sensibilizadas com Anti-D
e anti-K que a cloroquina Para as hemaacutecias sensibilizadas com anti-E Anti-S e Anti-Dia
ambas as teacutecnicas dissociaram o anticorpo em 100 das amostras Os resultados detalhados
por especificidade do anticorpo apoacutes o primeiro tratamento com glicina-aacutecidaEDTA e com
cloroquina estatildeo na tabela 2
Para as amostras que permaneceram positivas (17 amostras) apoacutes o tratamento com a
glicina-aacutecidaEDTA foi realizado um novo tratamento Houve dissociaccedilatildeo do anticorpo em 3
amostras (18) apoacutes a segunda tentativa Nas demais 14 (82) amostras tratadas pela
segunda vez 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise
33
Tabela 2 - Resultados do TDA apoacutes tratamento das hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo
sensibilizado
ANTICORPOS
SENSIBILIZADOS
1ordm TRATAMENTO COM
GLICINA
TRATAMENTO COM
CLOROQUINA
TOTAL TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
Anti-D 8 4 0 12 12
Anti-C 6 4 10 0 10
Anti-E 9 0 9 0 9
Anti-c 0 8 1 7 8
Anti-S 7 0 7 0 7
Anti-K 2 1 0 3 3
Anti-Dia 1 0 1 0 1
TOTAL 33 17 28 22 50
A hemoacutelise foi verificada durante o procedimento de lavagem final das hemaacutecias com
soluccedilatildeo fisioloacutegica para a retirada dos reagentes As soluccedilotildees de lavagem ficaram
avermelhadas e as hemaacutecias com coloraccedilatildeo escura As amostras foram descartadas Dentre as
6 amostras que ainda puderam ser testadas para o TDA trecircs amostras negativaram sendo 1
sensibilizada com anti-D e 2 com anti-C (tabela 3)
Tabela 3 - Resultado apoacutes o segundo tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA
Tratamento com
glicina-aacutecidaEDTA
TDA Negativo TDA Positvo Hemoacutelise Total
Segundo tratamento 3 3 11 17
524 TESTAGEM DO ELUATO
Apoacutes o tratamento com a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA a soluccedilatildeo do eluato foi
testada para verificar a viabilidade dos anticorpos que foram dissociados ou eluiacutedos Dentre
as 50 amostras 41 apresentaram eluato positivo As nove amostras cujos eluatos foram
negativos haviam sido sensibilizadas com as seguintes especificidades de anticorpos anti-E 6
amostras (67) anti-S 2 amostras (40) e anti-D 1 amostra (8) (tabela 4) O eluato de
todas as amostras sensibilizadas com os anticorpos anti-C anti-c Anti-K e Anti-Dia foram
positivos Os eluatos positivos na triagem de anticorpos foram testados com paineacuteis de
identificaccedilatildeo para confirmar a especificidade e a viabilidade dos anticorpos (figuras 7 e 8)
34
525 EFEITO DA ELUICcedilAtildeO SOBRE OS ANTIacuteGENOS ERITROCITAacuteRIOS
Para verificar o efeito do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA e com a cloroquina
sobre a expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s foi realizada a fenotipagem das
amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes tratamento com ambas as teacutecnicas Foi avaliado
se o tratamento destruiu os antiacutegenos expressos antes do tratamento
Tabela 4- Resultado do Eluato das amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA
Anticorpos Eluato positvo Eluato negativo Total
Anti-D 11 1 12
Anti-C 10 0 10
Anti-E 3 6 9
Anti-c 8 0 8
Anti-S 5 2 7
Anti-K 3 0 3
Anti-Dia 1 0 1
Total 41 9 50
Figura 7 ndash Painel do eluato da amostra 21 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-C que foi
recuperado no eluato
Figura 8 ndash Painel do eluato da amostra 47 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-K que foi
recuperado no eluato
35
Dentre as 50 amostras 26 eram previamente fenotipadas para os antiacutegenos Fya Fy
b
Jka Jk
b S e s Dentre elas 20 alcanccedilaram TDA negativo apoacutes tratamento com a glicina-
aacutecidaEDTA e 20 negativaram apoacutes tratamento com cloroquina (tabela 5) Apoacutes ambas as
teacutecnicas os antiacutegenos originalmente expressos permaneceram positivos comprovando que natildeo
houve destruiccedilatildeo dos mesmos
Tabela 5 ndash Verificaccedilatildeo da interferecircncia do tratamento da hemaacutecias com cloroquina e glicina-
aacuteicdaEDTA sobre os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
AMOSTRAS
COM
FENOTIPAGEM
PREacuteVIA
TRATADAS COM
CLOROQUINA
TRATADAS COM
GLICINA
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
26
20
20
20
20
As amostras 24 47 e 50 eram positivas para o antiacutegeno K A cloroquina natildeo dissociou
o anticorpo em nenhuma das 3 amostras enquanto a glicina-aacutecidaEDTA foi efetiva nas
amostras 24 e 50 Foi testada a expressatildeo do antiacutegeno K nas amostras 24 e 50 apoacutes o
tratamento utilizando meacutetodo indireto em gel contendo AGH Apesar de natildeo ter sido avaliado
a intensidade de reaccedilatildeo de expressatildeo dos antiacutegenos podemos verificar na figura 9 que nas
duas amostras em que a teacutecnica foi efetiva e dissociou o anticorpo a expressatildeo do antiacutegeno K
continua presente mas a reatividade observada pode ser considerada 1+ sugerindo que houve
diminuiccedilatildeo da expressatildeo do antiacutegeno quando comparado com a expressatildeo observada em
hemaacutecia natildeo tratada
Os resultados individuais de cada amostra em ambas as teacutecnicas encontram-se
resumidas na tabela 6
526 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente onde foi constatada a presenccedila de autoanticorpo
a quente da classe IgG pelo TDA monoespeciacutefico (figura 10)O autoanticorpo tambeacutem
interferia na pesquisa e identificaccedilatildeo de anticorpos irregulares pois apresentava caracteriacutestica
de panaglutinina As hemaacutecias da paciente sensibilizadas ldquoin vivordquo foram tratadas com
cloroquina e com glicina-aacutecidaEDTA
36
Figura 9 ndash Fenotipagem das amostras 24 e 50 para antiacutegeno K apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
O teste positivo indica a presenccedila do antiacutegeno poreacutem a reatividade fraca (1+) sugere que houve enfraquecimento
de sua expressatildeo A direita a expressatildeo forte (4+) do antiacutegeno Kell em hemaacutecia controle natildeo tratada utilizada
como controle positivo
A cloroquina natildeo foi efetiva na retirada do anticorpo ligado as hemaacutecias ao contraacuterio
do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA que dissociou o anticorpo (figura 11)
A hemaacutecia tratada com glicina foi fenotipada para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
(figura 12) A fenotipagem para o sistema Rh (C c E e e) e Kell foi realizada em gel
especiacutefico monoclonal sem interferecircncia do TDA positivo (controle da reaccedilatildeo negativo)
O eluato resultante do tratamento com glicina-aacutecidaEDTA foi testada em gel com
hemaacutecias de painel de identificaccedilatildeo de anticorpos e apresentou resultado positivo com todas
as ceacutelulas (figura 13 e 14)
A amostra foi enviada para genotipagem e o resultado da genotipagem confirmou o
resultado da fenotipagem apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
527 TEMPO DE EXECUCcedilAtildeO DA TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
O tempo de reaccedilatildeo da glicina-aacutecidaEDTA eacute de 2 minutos Todas as amostras foram
tratadas obedecendo ao tempo descrito na literatura demonstrando que o mesmo eacute
reprodutiacutevel
37
Tabela 6- Resultados individuais por amostra
Amostra Especificidade
dos anticorpos
Intensidade do
TDA apoacutes
sensibilizaccedilatildeo
Tratamento
efetivo com
cloroquina
Tratamento
efetivo com
glicina
Eluato
poacutes
glicina
1 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 2 Dia 3+ Sim Sim 3+ 3 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 4 D 4+ Natildeo Sim 4+ 5 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 6 E 3+ Sim Sim Negativo 7 S 4+ Sim Sim 3+ 8 E 3+ Sim Sim 1+ 9 E 3+ Sim Sim 2+
10 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 11 D 4+ Natildeo Sim 4+ 12 D 4+ Natildeo Sim 4+ 13 S 3+ Sim Sim 3+ 14 S 3+ Sim Sim 3+ 15 D 3+ Natildeo Sim 3+ 16 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 17 E 3+ Sim Sim (+) 18 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 19 D 4+ Natildeo Natildeo 3+ 20 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 21 C 3+ Sim Sim 4+ 22 C 3+ Sim Sim 4+ 23 C 3+ Sim Sim 4+ 24 K 4+ Natildeo Sim 4+ 25 D 3+ Natildeo Natildeo Negativo 26 E 4+ Sim Sim Negativo 27 S 3+ Sim Sim 3+ 28 C 3+ Sim Natildeo 4+ 29 C 3+ Sim Sim 4+ 30 C 3+ Sim Sim 4+ 31 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 32 E 3+ Sim Sim Negativo 33 C 3+ Sim Natildeo 4+ 34 S 3+ Sim Sim Negativo 35 S 3+ Sim Sim Negativo 36 C 4+ Sim Natildeo 4+ 37 c 4+ Natildeo Natildeo 4+ 38 D 4+ Natildeo Sim 4+ 39 S 3+ Sim Sim 3+ 40 c 4+ Sim Natildeo 2+ 41 C 4+ Sim Natildeo 4+ 42 E 3+ Sim Sim Negativo 43 D 3+ Natildeo Sim 2+ 44 D 3+ Natildeo Sim 2+ 45 E 3+ Sim Sim Negativo 46 C 3+ Sim Sim 4+ 47 K 4+ Natildeo Natildeo 4+ 48 D 3+ Natildeo Sim 2+ 49 E 3+ Sim Sim Negativo 50 K 4+ Natildeo Sim 4+
TOTAL 50 28 33 41
38
Figura 10 ndash TDA monoespeciacutefico da amostra de paciente Hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo da classe
IgG
oacute Figura 11 ndash TDA apoacutes o tratamento com glicina-aacutecidaEDTA (esquerda) e cloroquina (direita) A glicina
negativou completamente o TDA enquanto a hemaacutecia tratada com cloroquina persistiu positiva (1+)
39
Figura 12 ndash Fenotipagem da amostra tratada com glicina-aacutecidaEDTA Fy(a+b+) Jk(a-b+) S+s+
Figura 13 ndash Painel em gel (LissAGH) do eluato apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de
intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
Figura 14 ndash ndash Painel ezimaacutetico (hemaacutecias tratadas com bromelina) do eluato em gel neutro apoacutes
tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
40
528 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Quanto a efetividade das teacutecnicas em negativar o TDA foi verificado que a glicina-
aacutecidaEDTA foi efetiva em 66 das amostras testadas no primeiro tratamento (3350
amostras) enquanto a cloroquina conseguiu negativar 56 (2850) Esses resultados natildeo
apresentam diferenccedila significativa (pgt005) demostrando que a teacutecnica da glicina-
aacutecidaEDTA natildeo eacute superior mas eacute tatildeo efetiva quanto a da cloroquina
Quando aliamos os resultados de ambas as teacutecnicas verificamos que em 76 (3850)
das amostras o TDA foi negativado Esse dado indica que ainda que uma teacutecnica natildeo seja
eficaz na remoccedilatildeo do anticorpo eacute uma boa alternativa tentar a segunda teacutecnica jaacute que a falha
em remover o anticorpo utilizando uma delas natildeo prevecirc necessariamente a falha com a outra
Quando se utiliza o teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla (graacutefico 2) para comparar a utilizaccedilatildeo das
duas teacutecnicas com o resultado de cada uma isolada (somente a cloroquina ou somente a
glicina) verificamos que os resultados apresentam diferenccedila significativa (plt005) (quadro 3)
TRATAMENTO EFETIVO COM TOTAL PORCENTAGEM
Glicina ou cloroquina 38 76
Glicina e cloroquina 23 46
Glicina apenas 10 20
Cloroquina apenas 5 10
Nenhuma das teacutecnicas 12 24
Quadro 3 - Resultados comparativos entre as teacutecnicas utilizadas
41
Graacutefico 2 - Teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla entre as teacutecnicas aplicadas A- Glicina e Cloroquina B-Cloroquina C-
Glicina ( plt005)
42
6 DISCUSSAtildeO
Os reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA podem ser adquiridos em
forma de kit comercial prontos para uso poreacutem natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil A preparaccedilatildeo
dos reagentes ldquoin houserdquo a partir de sais comerciais adquiridos se mostrou viaacutevel Os
reagentes glicina e o tampatildeo Tris armazenados de forma correta se mantiveram estaacuteveis por
um periacuteodo de 7 meses Somente o reagente EDTA precipitou mesmo armazenado em
condiccedilotildees adequadas sugerindo que o mesmo deve ser preparado em menor quantidade e
armazenado em aliacutequotas A soluccedilatildeo de cloroquina tambeacutem pode ser preparada ldquoin houserdquo e
pode ser armazenado por um mecircs A legislaccedilatildeo brasileira autoriza a utilizaccedilatildeo de reagentes
preparados a partir de sais comerciais como a cloroquina e a glicina-aacutecidaEDTA desde que
os sais tenham autorizaccedilatildeo da vigilacircncia sanitaacuteria para a comercializaccedilatildeo (BRASIL 2001)
A comparaccedilatildeo quanto a efetividade em dissociar anticorpos em amostras com TDA
positivos entre a teacutecnica da glicina e a teacutecnica da cloroquina mostrou que natildeo haacute diferenccedila
estatiacutestica entre elas e que ambas satildeo igualmente eficientes Se utilizadas conjuntamente haacute
maior possibilidade de elucidaccedilatildeo dos casos
Uma vantagem da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eacute que ela permite numa mesma
amostra eluir o anticorpo ligado aacute hemaacutecia assim como fenotipar a hemaacutecia tratada Devido a
sua dupla utilidade a teacutecnica eacute vantajosa principalmente em pacientes em que pouco volume
de amostra pode ser coletado como em casos de crianccedilas e receacutem-nascidos
A fenotipagem poacutes tratamento se mostrou viaacutevel jaacute que os antiacutegenos de maior
importacircncia natildeo sofreram alteraccedilotildees Nas 20 amostras que foram fenotipadas antes e apoacutes
tratamento para verificar a influecircncia dos reagentes na expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a
Jkb S e s natildeo houve destruiccedilatildeo dos mesmos por nenhuma das duas teacutecnicas
Para as amostras positivas para o antiacutegeno Kell (350) e sensibilizadas com o
respectivo anticorpo a teacutecnica da glicina foi efetiva em negativar o TDA em apenas duas
delas mas apoacutes o tratamento foi verificada uma fraca reatividade da reaccedilatildeo antiacutegeno-
anticorpo sugerindo que houve um enfraquecimento da expressatildeo do antiacutegeno conforme
esperado e descrito na literatura (BYRNE 1991 PALLAS WILER E MCGEE 1991
ROZIERS e SQUALI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012 e KATHARIA e
CHAUDHARY 2013) A accedilatildeo da glicina sobre o antigeno Kell natildeo representa impedimento
para seu uso uma vez que na impossibilidade de testar o antiacutegeno Kell o banco de sangue
consegue facilmente atender a solicitaccedilatildeo de transfusatildeo com unidades de hemaacutecias Kell
43
negativas jaacute que eacute um antiacutegeno de baixa prevalecircncia na populaccedilatildeo variando de 15 na
populaccedilatildeo africana a 9 nos europeus (DANIELS 2011)
A soluccedilatildeo resultante da dissociaccedilatildeo do anticorpo pela teacutecnica da glicina pode ainda ser
utilizada como eluato podendo substituir a teacutecnica de eluiccedilatildeo com reagentes comercias (kits
de eluiccedilatildeo aacutecida) que tem alto custo aproximadamente entre R$2000 a R$2500 por teste
Em 41 amostras (82) houve a dissociaccedilatildeo e recuperaccedilatildeo do anticorpo que estava
sensibilizando as hemaacutecias Em 9 amostras (18) os anticorpos foram eluiacutedos poreacutem
apresentaram reaccedilatildeo negativa quando testadas com hemaacutecias de triagem entre eles o anti-E
(6) anti-S (2) e Anti-D (1) Eacute possiacutevel que a correccedilatildeo pH do meio (WALKER 2011) natildeo
tenha sido adequada o que pode ter desfavorecido a reatividade do anticorpo
Para as amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA nas quais natildeo houve dissociaccedilatildeo do
anticorpo pelo primeiro tratamento (1750) o segundo tratamento natildeo se mostrou eficaz jaacute
que 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise O tempo de
armazenagem natildeo parece ter influenciado jaacute que todas as amostras foram testadas dentro de
48 horas apoacutes a coleta Outros fatores que natildeo foram verificados podem ter levado a
hemoacutelise Apesar da literatura (LOUIE JIENG e ZEROULIS 1986 e BYRNE 1991)
recomendar um segundo tratamento ele eacute pouco eficaz tendo negativado apenas 3 das 17
amostras testadas
A amostra de paciente que apresentou sensibilizaccedilatildeo ldquoin vivordquo mostrou melhor
efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA sobre a da cloroquina possibilitando
fenotipagem para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s que natildeo foram destruiacutedos apoacutes o
tratamento comprovado atraveacutes da genotipagem
A presenccedila de autoanticorpo a quente com presenccedila de hemoacutelise (AHAI) ou natildeo pode
mascarar a presenccedila de aloanticorpo interferindo na rotina soroloacutegica da fenotipagem que eacute
uma importante ferramenta para auxiliar na seleccedilatildeo de hemaacutecias para transfusatildeo (SHIREY et
al 2002) Esses pacientes frequentemente possuem aloanticorpos associados ao
autoanticorpo e a prevalecircncia de aloimunizaccedilatildeo entre eles varia entre 12 a 40 (LEGER e
GARRATY 1999 BRANCH e PETZ 1999) o que dificulta ainda mais a escolha do melhor
componente a ser transfundido aleacutem de aumentar a possibilidade reaccedilotildees hemoliacuteticas imunes
poacutes-transfusionais
Nesses casos as teacutecnicas de dissociaccedilatildeo de anticorpos satildeo importantes para tratar
amostras de pacientes e a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser usada como uma opccedilatildeo
pois se mostrou eficaz na dissociaccedilatildeo anticorpo ligado agraves hemaacutecias deixando livre a
superfiacutecie das mesmas permitindo a fenotipagem por antisoros IgG Paralelamente os
44
anticorpos eluiacutedos tambeacutem puderam ser estudados O mesmo natildeo ocorre com a cloroquina
que permite apenas a fenotipagem e tampouco com os kits de eluiccedilatildeo aacutecida disponiacuteveis no
mercado nacional que satildeo destinados a realizaccedilatildeo do eluato mas destroem as hemaacutecias
O tempo de tratamento na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA tambeacutem eacute uma vantagem
pois foi possiacutevel reproduzir no tempo determinado de 2 minutos enquanto a cloroquina
demora ateacute duas horas
Ainda que a aplicaccedilatildeo das teacutecnicas por biologia molecular estejam cada vez mais
presentes na rotina imuno-hematoloacutegica e possibilitam estabelecer o fenoacutetipo deduzido do
genoacutetipo elas natildeo estatildeo disponiacuteveis na maioria dos centros e sua realizaccedilatildeo exige algumas
horas A resoluccedilatildeo imediata do problema transfusional necessita dos resultados soroloacutegicos
pois com frequecircncia natildeo eacute possiacutevel aguardar o resultado do teste molecular Dessa forma
apesar da crescente importacircncia da genotipagem eritrocitaacuteria teacutecnicas soroloacutegicas aplicadas
corretamente e no momento propiacutecio satildeo de grande utilidade para resolver problemas imuno-
hematoloacutegicos como ocorre com a fenotipagem em pacientes com TDA positivo
45
7 CONCLUSAtildeO
A teacutecnica da glicina aacutecidaEDTA mostrou-se efetiva em remover os anticorpos que
sensibilizavam as hemaacutecias e pode ser utilizada com seguranccedila antes da fenotipagem
eritrocitaacuteria Por ser uma teacutecnica de raacutepida execuccedilatildeo eacute uma alternativa aplicaacutevel
principalmente em casos urgentes de pacientes que apresentam autoanticorpos
46
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50
9 ANEXOS
51
FUNDACcedilAtildeO HEMOCENTRO DE RIBEIRAtildeO PRETO
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE)
Tiacutetulo da pesquisa Aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina aacutecida-EDTA e avaliaccedilatildeo da
eficaacutecia no tratamento de hemaacutecias com teste direto da antiglobulina positivo
Pesquisadora responsaacutevel Ceacutelia Kazue Abiko
Orientador Prof Dimas Tadeu Covas
Co-orientadora Dra Flaacutevia Leite Souza Santos
Objetivo da pesquisa Vocecirc estaacute sendo convidado a participar de uma pesquisa que tem
como objetivo padronizar uma nova teacutecnica para auxiliar na tipagem sanguiacutenea de pacientes
A tipagem sanguiacutenea pode sofrer interferecircncia da presenccedila de anticorpos ligados aos gloacutebulos
vermelhos do sangue Nessas situaccedilotildees eacute difiacutecil selecionar o melhor sangue para o paciente e
eacute preciso a utilizaccedilatildeo de teacutecnicas adicionais para remover essas interferecircncias
Esta pesquisa tem como objetivo estudar outra teacutecnica para remover esses anticorpos e
comparaacute-la com a teacutecnica atualmente utilizada Para isso precisamos de amostras de pacientes
e doadores voluntaacuterios
Se vocecirc eacute um doador eacute necessaacuterio que vocecirc autorize a coleta de 5 ml (1 tubo) a mais
de seu sangue
Se vocecirc eacute um paciente natildeo haveraacute necessidade de nova amostra pois utilizaremos as
amostras jaacute coletadas para os testes preacute-transfusionais e os resultados encontrados nesta
pesquisa natildeo iratildeo interferir na escolha da (s) bolsa (s) de sangue que vocecirc possa vir a receber
Se vocecirc concordar em participar leia com atenccedilatildeo o texto abaixo e assine as duas vias
rubricando todas as paacuteginas deste termo de consentimento Uma via original assinada e
rubricada por vocecirc e pela pesquisadora ficaraacute com vocecirc
As suas informaccedilotildees seratildeo mantidas em sigilo pela pesquisadora e natildeo haveraacute
armazenamento de material para pesquisas posteriores Os seus dados seratildeo usados apenas
neste estudo e quando o trabalho for publicado seu nome e qualquer outra informaccedilatildeo que
possam identificaacute-lo natildeo seratildeo revelados
Eacute pouco provaacutevel que o que noacutes aprendermos com este estudo tenha um benefiacutecio
direto para vocecirc assim como natildeo poderemos dar nada em troca pela sua participaccedilatildeo na
pesquisa
Nosso objetivo com esta pesquisa eacute que os resultados poderatildeo ser uacuteteis para o
tratamento de pacientes no futuro Os riscos da participaccedilatildeo satildeo miacutenimos Se vocecirc eacute um
doador de sangue a amostra seraacute coletada no momento da doaccedilatildeo natildeo exigindo punccedilatildeo
venosa adicional
52
Eacute seu direito ter acesso aos resultados dos testes da pesquisa Esses resultados natildeo
seratildeo fornecidos automaticamente a vocecirc mas caso vocecirc se interesse em saber o resultado ou
tiver alguma duacutevida sobre a sua participaccedilatildeo neste estudo deveraacute entrar em contato com Ceacutelia
Kazue Abiko pelo telefone (18) 99718-3551
Vocecirc tem total liberdade de optar por natildeo participar da pesquisa Caso aceite
participar poderaacute desistir a qualquer momento ou retirar seu consentimento mesmo apoacutes ter
coletado o sangue Para cancelar sua participaccedilatildeo basta avisar a pesquisadora e os seus dados
seratildeo retirados do projeto
Qualquer duacutevida eacutetica sobre a pesquisa poderaacute entrar em contato com o Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa do Hospital das Cliacutenicas e da Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto
(CAMPUS UNIVERSITAacuteRIO bairro Monte Alegre CEP 14048-900 Ribeiratildeo Preto-SP
Telefone (16) 3602-2228 FAX (16) 3633-1144 e-mail cephcrpuspbr)
Consentimento de participaccedilatildeo
A Consentimento do participante
Li as informaccedilotildees acima sobre o estudo e recebi explicaccedilotildees sobre a participaccedilatildeo no estudo
Portanto dou o meu consentimento para participar do estudo
___________________________________________________________________________
Nome completo
___________________________________________________________________________
Assinatura
___________
Data
__________________________________________________________________________________
Nome completo da pesquisadora
___________________________________________________________________________
Assinatura
_____________
Data
18
Edwards Moulds e Judd (1982) demonstraram que a teacutecnica da cloroquina para
dissociaccedilatildeo de anticorpos eacute uma teacutecnica simples efetiva e confiaacutevel para dissociar
imunoglobulina das hemaacutecias Desde que a membrana das hemaacutecias permaneccedila intacta natildeo
haacute perda da reatividade dos antiacutegenos e a sua maior aplicaccedilatildeo eacute a fenotipagem de hemaacutecias
com TDA positivo Os autores verificaram que em 83 das amostras sensibilizadas in vivo e
22 amostras (no total de 40) sensibilizadas ldquoin vitrordquo apresentaram TDA negativo e
puderam ser fenotipadas A teacutecnica poreacutem natildeo consegue remover os componentes do
complemento na maioria dos casos
Champagne e colaboradores (1999) testaram a teacutecnica da cloroquina para dissociar
antiacutegenos Bg comparando com a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA e verificaram vantagem em
relaccedilatildeo ao uso de um uacutenico reagente diminuindo a manipulaccedilatildeo e verificou que o mesmo natildeo
destroacutei antiacutegeno Kell
A cloroquina tambeacutem mostrou-se pouco efetivo em remover anticorpos do sistema
Duffy da superfiacutecie das hemaacutecias (EDWARDS MOUDS e JUDD 1982 ROZIERS e
SQUALI 1997)
1353 GLICINA-AacuteCIDAEDTA
A afinidade e a estabilidade entre a ligaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo eacute definida como a
resultante entre forccedilas atrativas e repulsivas entre ambos (CARUCIO e WISE 2012) e resulta
da somatoacuteria de forccedilas quiacutemicas dinacircmicas e fracas (natildeo covalentes) como pontes de
hidrogecircnio forcas eletrostaacuteticas forca de Van der Waals e pontes hidrofoacutebicas A estabilidade
dessa ligaccedilatildeo eacute facilmente abalada por alteraccedilotildees quiacutemicas e fiacutesicas no meio da reaccedilatildeo como
a alteraccedilatildeo do pH A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA se baseia na mudanccedila do pH para a
quebra da ligaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo (KOSANKE 2012)
A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA foi primeiramente descrita em 1986 por Louie Jieng
e Zeroulis que utilizaram 50 amostras de doadores sensibilizados ldquoin vitrordquo com anticorpos A
teacutecnica foi efetiva em 48 amostras permitindo o estudo do eluato assim como a fenotipagem
das hemaacutecias Os autores testaram tambeacutem a teacutecnica em 100 hemaacutecias TDA positivo que
puderam ser utilizadas para teacutecnicas de autoadsorccedilatildeo
Byrne (1991) descreveu a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA modificada e tambeacutem
verificou como uma opccedilatildeo para o tratamento de hemaacutecias com TDA positivo que deixava as
hemaacutecias intactas e o eluato viaacutevel para ser fenotipado
19
Roziers e Squali (1997) e Katharia e Chaudhary (2013) compararam a teacutecnica da
glicina-aacutecidaEDTA com as teacutecnicas da cloroquina e do aquecimento Verificaram maior
eficiecircncia da glicina-aacutecidaEDTA em relaccedilatildeo as outras duas teacutecnicas pois com uma mesma
quantidade de amostra produzia as hemaacutecias livres de anticorpo e tambeacutem o eluato Mostrou-
se ainda superior devido ao menor tempo exigido para sua realizaccedilatildeo o que favorece seu uso
em situaccedilotildees de urgecircncia e emergecircncia
As duas desvantagens da teacutecnica poreacutem eacute o fato de destruir os antiacutegenos do sistema
Kell e o fato de natildeo remover fraccedilotildees do complemento ligadas agrave hemaacutecia (PALLAS WILER e
McGEE 1991 ROZIERS e SQUALLI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012
e KATHARIA e CHAUNDHARY 2013)
20
2 OBJETIVOS
21 OBJETIVO GERAL
211 Avaliar a eficaacutecia da glicina-aacutecidaEDTA em remover os anticorpos ligados agraves
hemaacutecias sensibilizadas por anticorpos da classe IgG
22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
221 Preparaccedilatildeo dos reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
verificaccedilatildeo da estabilidade dos mesmos e avaliar custos
222 Testar a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA em amostras de hemaacutecias
sensibilizadas por anticorpos antieritrocitaacuterios humanos
223 Comparar a efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA com a teacutecnica da
cloroquina quanto a capacidade de remover a interferecircncia do anticorpo ligado
a hemaacutecia
224 Testar o eluato das amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA
225 Verificar se houve destruiccedilatildeo dos antiacutegenos eritrocitaacuterios apoacutes o tratamento
com glicina-aacutecidaEDTA e com cloroquina
226 Verificar se o tempo de execuccedilatildeo da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA descrito
nos textos de referecircncia eacute reprodutiacutevel
21
3 JUSTIFICATIVA
Algumas condiccedilotildees cliacutenicas podem levar ao depoacutesito ldquoin vivordquo de anticorpos eou
fraccedilotildees do complemento sobre as hemaacutecias Entre elas estatildeo as reaccedilotildees hemoliacuteticas poacutes-
transfusionais a doenccedila hemoliacutetica perinatal o uso de medicamentos e principalmente a
AHAI Na AHAI um anticorpo normalmente da classe IgG ou IgM reconhece antiacutegenos
proacuteprios na membrana eritrocitaacuteria e reduz a sobrevida da hemaacutecia levando a sua destruiccedilatildeo
pelos macroacutefagos no sistema reticulo-endotelial ou agrave ativaccedilatildeo do complexo de ataque agrave
membrana e agrave lise intravascular Os autoanticorpos satildeo voltados na maioria das vezes contra
antiacutegenos eritrocitaacuterios de alta frequecircncia populacional conhecidos como antiacutegenos puacuteblicos
e por este motivo reconhecem tanto hemaacutecias autoacutelogas quanto alogecircnicas
Devido agrave presenccedila do autoanticorpo livre no plasma e tambeacutem do anticorpo eou
complemento ligado agrave hemaacutecia o banco de sangue pode encontrar dificuldades em todas as
fases dos testes preacute-transfusionais do paciente com AHAI e deve utilizar teacutecnicas que
auxiliem na escolha do melhor hemocomponente melhorando a seguranccedila transfusional Essas
teacutecnicas visam remover a interferecircncia do autoanticorpo livre no soro e do autoanticorpo
ligado agrave hemaacutecia permitindo a detecccedilatildeo de aloanticorpos associados e a realizaccedilatildeo da
fenotipagem eritrocitaacuteria respectivamente
A finalizaccedilatildeo dos testes preacute-tranfusionais na presenccedila de autoanticorpo pode levar
algumas horas e nem sempre o paciente poderaacute aguardar Nesse contexto torna-se vantajosa a
aplicaccedilatildeo de teacutecnicas de raacutepida execuccedilatildeo
O presente estudo propotildee aplicar e avaliar a eficaacutecia da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
em remover os anticorpos ligados agrave hemaacutecia o que permite a fenotipagem eritrocitaacuteria
estendida e a seleccedilatildeo de concentrados de hemaacutecias com mesmo fenoacutetipo do paciente
Atualmente no Hemocentro de Ribeiratildeo Preto a teacutecnica utilizada para esse fim eacute o
tratamento das hemaacutecias com difosfato de cloroquina cujo tempo de execuccedilatildeo pode demorar
ateacute duas horas enquanto a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser realizada em apenas dois
minutos o que a tornaria opccedilatildeo de escolha especialmente em situaccedilotildees de urgecircncia Ao
contraacuterio da cloroquina a glicina-aacutecidaEDTA permite tambeacutem o estudo do eluato das
hemaacutecias tratadas
22
4 METODOL OGIA
41 AMOSTRAS DE DOADORES
Foram coletados 50 amostras de doadores de sangue que compareceram ao
Hemonuacutecleo de Araccedilatuba no periacuteodo de junho a agosto de 2016 Foram convidados a
participar da pesquisa doadores de repeticcedilatildeo do tipo sanguiacuteneo ldquoOrdquo RhD positivo
cadastrados no sistema de banco de sangue (SBS) do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto
Todos os doadores que concordaram em participar da pesquisa assinaram o termo de
consentimento livre e esclarecido (TCLE)
No momento da doaccedilatildeo foram coletados adicionalmente 5 mL de sangue total em
soluccedilatildeo anticoagulante EDTA (aacutecido dietilenoaminoaceacutetico) dispensando punccedilatildeo venosa
adicional para coleta da amostra O fluxograma 1 resume as etapas desenvolvidas no projeto
Fluxograma 1 - Fluxo da pesquisa utilizando as amostras de doadores
23
411 FENOTIPAGEM
Foram verificados se os doadores jaacute tinham fenotipagem para outros sistemas de
grupos sanguiacuteneos aleacutem do sistema ABORh que eacute realizado rotineiramente
A fenotipagem eritrocitaacuteria para outros sistemas ou fenotipagem estendida eacute realizada
para identificar a presenccedila ou ausecircncia de antiacutegenos considerados de importacircncia cliacutenica No
Hemonuacutecleo de Araccedilatuba uma parcela de doadores de repeticcedilatildeo satildeo fenotipados para os
antiacutegenos dos sistemas de grupo sanguiacuteneo Rh (antiacutegenos C c E e e) Kell (antiacutegeno K)
Duffy (antiacutegenos Fya e Fy
b) Kidd (antiacutegenos Jk
a e Jk
b) e sistema MNSs (antiacutegenos S e s)
A fenotipagem para o Rh e Kell eacute realizada por metodologia de microplaca utilizando
25 microL de hemaacutecia lavada e diluiacuteda a 5 em salina e 25 microL do antissoro comercial especiacutefico
A reaccedilatildeo eacute incubada 15 minutos a temperatura ambiente e centrifugadas para leitura Para os
antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s a metolodogia utilizado eacute gel contendo antiglobulina
humana (gel LissCoombs poliespeciacutefico) da marca BIO-RAD onde se utiliza suspensatildeo de
hemaacutecia em LISS (Soluccedilatildeo de baixa forccedila iocircnica) A suspensatildeo eacute preparada atraveacutes da
diluiccedilatildeo de 10 microL de hemaacutecia em 1000 microL de LISS Pipetado 50 microL dessa diluiccedilatildeo no gel e
adicionado 25 microL do antissoro especiacutefico Incuba-se em banho seco por 15 minutos a 37 deg
Celsius e eacute centrifugado em centriacutefuga especiacutefica Os antissoros utilizados eram das marcas
Fresenius e Lorne
Foi verificado a fenotipagem do doador no banco de dados do Hemocentro Os
registros dos fenoacutetipos dos doadores ficam armazenadas no sistema de banco de sangue
(SBS) Para doadores que natildeo tinham fenotipagem estendida preacutevia para antiacutegenos do sistema
Rh (C c E e e) e Kell (K) foi realizada a fenotipagem para esses antiacutegenos
O tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA e cloroquina para dissociar
anticorpos pode inativar enfraquecer ou destruir os antiacutegenos presentes nas hemaacutecias
alterando assim os resultados da fenotipagem Para verificar se houve destruiccedilatildeo dos
antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a e Jk
b S e s nas amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes
tratamento foram novamente fenotipadas ao final para os antiacutegenos que eram inicialmente
positivas
A repeticcedilatildeo da fenotipagem foi realizada nas amostras que apresentaram efetividade
no tratamento da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eou da cloroquina e a detecccedilatildeo do antiacutegeno
na amostra preacute-tratamento
24
412 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS HEMAacuteCIAS
As hemaacutecias foram sensibilizadas com antissoros policlonais humanos de amostras de
plasma fresco congelado de doadores com resultado de pesquisa de anticorpo irregular
positivos
A escolha do anticorpo para sensibilizar as hemaacutecias foi definida de acordo com o
fenoacutetipo do doador que deveria ser positivo para o respectivo antiacutegeno
Para a sensibilizaccedilatildeo um volume de antissoro (1 mL) e um volume (1 mL) de
hemaacutecias lavadas quatro vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica foram adicionadas a um tubo de 12 x
75 mm A mistura foi homogeneizada e incubada em banho maria (BM) a 37deg C por 60
minutos A seguir as hemaacutecias foram novamente lavadas 4 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica
para retirada dos anticorpos que natildeo se ligaram A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada
como controle negativo O teste da uacuteltima lavagem eacute importante para assegurar que os
anticorpos que poderatildeo ser detectados no eluato apoacutes o tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA
sejam aqueles que estavam ligados agraves hemaacutecias e natildeo aqueles livres no plasma O controle
negativo mostra que todo o anticorpo livre foi retirado (LEGER 2011)
Para o teste de presenccedila de anticorpo na soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foram incubadas
com hemaacutecias de triagem de anticorpos irregulares (ID-Diacell BIO-RAD) contendo os
antiacutegenos especiacuteficos Realizado a teacutecnica em gel LissCoombs com anti-IgG+C3d Incubado
no tempo de 15 minutos a temperatura de 37deg C e centrifugado 10 minutos em centriacutefuga
proacutepria
As 50 amostras de doadores foram sensibilizadas com os anticorpos policlonais
humanos
Apoacutes sensibilizadas rdquoin vitrordquo e lavadas as hemaacutecias foram diluiacutedas em soluccedilatildeo de
baixa forccedila iocircnica (LISS) na quantidade de 10 microL de hemaacutecia para 1000 microL de soluccedilatildeo A
suspensatildeo foi pipetada (50 microL) em coluna-gel-teste LissCoombs (BIO-RAD) que contecircm
antiglobulina poliespeciacutefico (IgG+C3d) e centrifugada em baixa rotaccedilatildeo conforme orientaccedilatildeo
do fabricante durante 10 minutos
As amostras deveriam apresentar aglutinaccedilatildeo com reatividade 3 a 4+ no TDA As
amostras que apresentaram reaccedilatildeo menor que 3+ foram novamente sensibilizadas com nova
aliacutequota do antissoro
25
413 TRATAMENTO DAS AMOSTRAS
As amostras sensibilizadas apresentando o TDA positivo 3 ou 4+ foram divididas em
duas aliacutequotas e submetidas a duas teacutecnicas diferentes com o objetivo de dissociar o anticorpo
ligado Uma aliacutequota da amostra foi tratada com soluccedilatildeo de difosfato de cloroquina enquanto
a outra aliacutequota foi tratada com glicina-aacutecidaEDTA
42 PREPARO DA GLICINA AacuteCIDA-EDTA
A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA utiliza 3 soluccedilotildees diferentes a glicina aacutecida o
EDTA e o tampatildeo TRIS
Os reagentes foram preparados utilizando os sais para anaacutelise (PA) de EDTA
(Na2EDTA2H2O) TRIS (C4H11NO3) Glicina (H2NCH2CO2H) NaCl e a soluccedilatildeo de aacutecido
cloriacutedrico (HCl) 12 N todos reagentes da marca SYNTH (quadro 1)
Para o preparo do tampatildeo glicina-acida eacute necessaacuterio o ajuste do pH para 15 Para esse
ajuste utiliza-se aacutecido cloriacutedrico (HCl) concentrado O pH foi medido com fitas reativas de pH
com escala de 1 a 14 da marca MERCK Posteriormente a soluccedilatildeo foi enviada ao laboratoacuterio
de controle de qualidade do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto e o pH medido no peagacircmetro O
tampatildeo glicina-aacutecida foi armazenado a 4deg e o tampatildeo tris e o EDTA em temperatura ambiente
controlada (20 a 24deg Celsius)
Apoacutes o preparo e durante a realizaccedilatildeo dos testes foram feitas inspeccedilotildees visuais para
verificaccedilatildeo de turvaccedilatildeo do meio e presenccedila de precipitados
Reagente Material Quantidade Preparo e
Conservaccedilatildeo
EDTA
EDTA
(Na2EDTA2H2O)
5 gramas Mistura ateacute
dissoluccedilatildeo do sal e
conserva em
temperatura ambiente Aacutegua Destilada 50 Ml
Tris
TRIS (C4H11NO3) 121 gramas Conservar em
temperatura ambiente NaCl 525g
Aacutegua destilada 100ml
Gliacutecina-aacutecida
Glicina
(H2NCH2CO2H) 15 gramas
Conservar a 4oC NaCl 116gramas
Aacutegua Destilada 200ml
HCL 12N Ajutar o pH para 15
Quadro 1 - Preparo dos Reagentes da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
Fonte - Manual teacutecnico AABB 2011
26
O tampatildeo glicina-aacutecida e o tampatildeo TRIS satildeo estaacuteveis por 7 meses O reagente EDTA
precipitou mesmo estando em temperatura em ambiente controlado Houve necessidade de
preparo de novo reagente
421 TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
1 Em um tubo de ensaio 12x75 mm eacute adicionado 08 mL da soluccedilatildeo de glicina-aacutecida A
esta soluccedilatildeo adiciona-se 02 mL de EDTA e mistura
2 Adiciona-se 02 mL de hemaacutecias sensibilizadas (lavada 4 vezes) A mistura eacute
homogeneizada e incubada por exatamente 2 minutos
3 A seguir 01 mL de tampatildeo TRIS eacute adicionado agrave mistura que eacute novamente
homogeneizada e centrifugada por 2 minutos a 3400 rpm O pH deve estar entre 7 a 75
4 Apoacutes centrifugaccedilatildeo separa-se em outro tubo o sobrenadante (eluato) e as hemaacutecias
que permanecem satildeo lavadas 4 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica para retirada de todo o
reagente e anticorpos livres
43 PREPARO DA CLOROQUINA
A cloroquina eacute diluiacuteda em tampatildeo PBS na concentraccedilatildeo de 20 (Quadro 2) e
armazenado a 4deg Celsius sua validade apoacutes o preparo eacute de 1 mecircs
A teacutecnica da cloroquina jaacute estaacute padronizada para rotina do laboratoacuterio de
imunohematologia do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto e suas unidades
Reagente Reagentes Quantidade PreparoConservaccedilatildeo
Cloroquina
Difosfato de cloroquina
(C18H32ClN3O8P2)
20 gramas
Conservar a 4deg Celsius
Tampatildeo PBS 100ml
NaOH 01 N Acertar o pH para
51
Quadro 2 - Preparo da Cloroquina Fonte - Manual teacutecnico da AABB 2011
431 TEacuteCNICA DA CLOROQUINA
1 4 partes da soluccedilatildeo pronta eacute adicionada a uma parte de hemaacutecias lavadas 4 vezes com
soluccedilatildeo fisioloacutegica
2 A mistura eacute incubada em temperatura ambiente por ateacute duas horas
3 Centrifugar a 3400 rpm por 2 minutos
27
4 Remover o sobrenadante lavar as hemaacutecias novamente com soluccedilatildeo fisioloacutegica 4
vezes
44 VERIFICACcedilAtildeO DA EFETIVIDADE DOS TESTES
Apoacutes tratamento pelas duas teacutecnicas o TDA foi repetido em todas as amostras para
verificar se os tratamentos foram efetivos e houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo Para as
amostras tratadas pela teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA que permaneceram com TDA positivo
novo tratamento foi realizado
45 TESTE DO ELUATO
O eluato resultante das amostras tratadas com glicina-acidaEDTA foi testado com
hemaacutecias de triagem A soluccedilatildeo do eluato foi incubada com as hemaacutecias de triagem de
anticorpos (ID-Diacell BIO-RAD) pela teacutecnica em gel LissCoombs O teste foi incubado 15
minutos a 37deg Celsius e centrifugado por 10 minutos em centrifuga proacutepria para a teacutecnica em
gel Os eluatos que apresentaram resultados positivos foram testados em painel de 11
hemaacutecias (ID-Diapanel BIO-RAD) para a identificaccedilatildeo do anticorpo
46 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente que apresentou TDA positivo por IgG e pesquisa
de anticorpo irregular positivo com presenccedila de autoanticorpo com reatividade panaglutinina
A amostra foi tratada em paralelo pelas duas teacutecnicas descritas e foi enviada para o
Hemocentro para genotipagem eritrocitaacuteria que foi realizado por metodologia PCR em tempo
real no equipamento Real-time system PCR 7500 ( Applied Biosystems Califoacuternia EUA)
28
5 RESULTADOS
51 REAGENTES
Para aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA satildeo necessaacuterios 3 diferentes
reagentes que podem ser encontrados em forma de kit pronto para uso No entanto esses kits
natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil Os reagentes satildeo tampatildeo glicina-aacutecida o EDTA e o tampatildeo
Tris
Todos os reagentes foram preparados rdquoin houserdquo a partir dos sais e soluccedilotildees PA (puro
para anaacutelise) da marca SYNTH que foram adquiridos para a pesquisa O custo estimado para
cada teste foi aproximadamente R$ 020 reais
Apoacutes o preparo os reagentes poderiam ser armazenados em condiccedilotildees adequadas pelo
periacuteodo de 1 ano (AABB 2011) Ao final do preparo e durante o periacuteodo de armazenamento
de fevereiro a setembro de 2016 foi realizada inspeccedilatildeo visual para verificar a presenccedila de
precipitados ou turvaccedilatildeo A soluccedilatildeo de glicina e o tampatildeo TRIS mostraram-se estaacuteveis ateacute o
final do periacuteodo Por sua vez o reagente EDTA precipitou mesmo estando armazenado em
temperatura ambiente controlada e foi necessaacuterio novo preparo
52 AMOSTRAS DE DOADORES
521 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS AMOSTRAS
Apoacutes incubaccedilatildeo da hemaacutecia com o antissoro a mesma foi lavada 4 vezes para retirada
dos anticorpos livres A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada Caso houvesse positividade na
soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem a etapa era repetida (figura 3) Das 50 amostras sensibilizadas a
uacuteltima lavagem foi positiva somente em 3 delas Nas 3 amostras o anticorpo utilizado para
sensibilizaccedilatildeo foi o anti-K Apoacutes repetido nova etapa de lavagem os resultados se
apresentaram negativos
Em todas as amostras sensibilizadas ldquoin vitrordquo o TDA foi testado e verificado a
intensidade do teste Entre as 50 amostras 47 alcanccedilaram TDA com intensidade 3-4+ apoacutes a
primeira sensibilizaccedilatildeo enquanto 3 amostras necessitaram uma segunda incubaccedilatildeo com
anticorpo (figura 4)
A escolha dos anticorpos para sensibilizar as hemaacutecias foi feita de acordo com o
fenoacutetipo do doador e foram utilizados sete diferentes especificidades de anticorpos policlonais
humanos conforme mostra o graacutefico1
29
Figura 3 - Soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada com hemaacutecia de triagem de
anticorpos em gel LissCoombs (BIO-RAD) A finalidade eacute verificar a presenccedila de anticorpos livres na
suspensatildeo que possam interferir na pesquisa do eluato As soluccedilotildees de lavagem das amostras na figura a tiveram
resultados negativos Na figura b duas amostras a 47 e 50 apresentaram resultado positivo Nova etapa de
lavagem foi realizada e o resultado final foi negativo
522 TRATAMENTO DAS HEMAacuteCIAS
Apoacutes a sensibilizaccedilatildeo e obtenccedilatildeo de resultados de TDA com intensidade de 3 a 4+
cada uma das amostras foi dividida em duas aliacutequotas e tratada separadamente pelas teacutecnicas
de glicinaaacutecida-EDTA e cloroquina
As teacutecnicas foram consideradas efetivas quando obteve-se a completa dissociaccedilatildeo do
anticorpo verificada atraveacutes do TDA negativo na amostra poacutes tratamento conforme figuras 5
e 6 Dentre as amostras tratadas com cloroquina 2850 tiveram o TDA negativado A glicina-
aacutecidaEDTA negativou o TDA em 33 das 50 amostras tratadas Apenas 17 amostras tratadas
com glicina-aacutecidaEDTA permaneceram com o TDA positivo e foram submetidas a um novo
tratamento
30
Figura 4 - TDA das amostras apoacutes sensibilizaccedilatildeo com anticorpos policlonais humanos Amostras na
figura a com intensidades de 3-4+ Na figura b amostras 4 e 7 com intensidade menor que 3+ e portanto foram
novamente sensibilizadas com nova aliacutequota de soro Anti-D e anti-S Apoacutes a segunda sensibilizaccedilatildeo
apresentaram reatividade 4 e 3+ respectivamente Os anticorpos utilizados para sensibilizaccedilatildeo foram D S c E
C e K
523 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS TEacuteCNICAS
No tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA houve dissociaccedilatildeo completa do anticorpo
em 33 amostras (66) das 50 amostras testadas enquanto que com a cloroquina foram 28
amostras (56) (tabela 1)
31
Graacutefico 1- Nuacutemero de amostras sesnsibilizadas por especificidade de anticorpo Entre as 50 amostras 12
foram sensibilizadas com anti-D 10 com anti-C 9 com anti-E 8 com anti-c 7 com anti-S 3 com anti-K e 1
com anti-Dia As especificidades dos anticorpos foram definidas de acordo o fenoacutetipo do doador
Figura 5 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com cloroquina Nas amostras onde houve
a dissociaccedilatildeo do anticorpo ( 2 21 a 23 26 39 a 42 45 46 e 49) a hemaacutecia se deposita no fundo no microtubo
apoacutes a centrifugaccedilatildeo (TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (1 3 24 25 43 44 47
48 e 50) o anticorpo ligado agraves hemaacutecias eacute alvo da AGH presente no gel (TDA positivo)
Anti-D 12
Anti-C 10
Anti-E 9
Anti-c 8
Anti-S 7
Anti-K 3 Anti-Dia 1
32
Figura 6 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA Nas amostras
onde houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo (4 6 7 12 a 15 17 34 35 37 e 38) a hemaacutecia se deposita no fundo no
microtubo apoacutes a centrifugaccedilatildeo ( TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (5 16 18
19 20 33 e 36 ) o AGH presente no gel se liga ao anticorpo ligado agraves hemaacutecias que ficam retidas no gel (TDA
positivo)
Tabela 1-Resultado geral do tratamento das hemaacutecias com glicina e cloroquina
Teacutecnica utilizada TDA negativo TDA positivo Total
Glicina-aacutecidaEDTA 33 17 50
Cloroquina 28 22 50
A glicina-aacutecidaEDTA conseguiu negativar mais amostras sensibilizadas com Anti-D
e anti-K que a cloroquina Para as hemaacutecias sensibilizadas com anti-E Anti-S e Anti-Dia
ambas as teacutecnicas dissociaram o anticorpo em 100 das amostras Os resultados detalhados
por especificidade do anticorpo apoacutes o primeiro tratamento com glicina-aacutecidaEDTA e com
cloroquina estatildeo na tabela 2
Para as amostras que permaneceram positivas (17 amostras) apoacutes o tratamento com a
glicina-aacutecidaEDTA foi realizado um novo tratamento Houve dissociaccedilatildeo do anticorpo em 3
amostras (18) apoacutes a segunda tentativa Nas demais 14 (82) amostras tratadas pela
segunda vez 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise
33
Tabela 2 - Resultados do TDA apoacutes tratamento das hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo
sensibilizado
ANTICORPOS
SENSIBILIZADOS
1ordm TRATAMENTO COM
GLICINA
TRATAMENTO COM
CLOROQUINA
TOTAL TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
Anti-D 8 4 0 12 12
Anti-C 6 4 10 0 10
Anti-E 9 0 9 0 9
Anti-c 0 8 1 7 8
Anti-S 7 0 7 0 7
Anti-K 2 1 0 3 3
Anti-Dia 1 0 1 0 1
TOTAL 33 17 28 22 50
A hemoacutelise foi verificada durante o procedimento de lavagem final das hemaacutecias com
soluccedilatildeo fisioloacutegica para a retirada dos reagentes As soluccedilotildees de lavagem ficaram
avermelhadas e as hemaacutecias com coloraccedilatildeo escura As amostras foram descartadas Dentre as
6 amostras que ainda puderam ser testadas para o TDA trecircs amostras negativaram sendo 1
sensibilizada com anti-D e 2 com anti-C (tabela 3)
Tabela 3 - Resultado apoacutes o segundo tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA
Tratamento com
glicina-aacutecidaEDTA
TDA Negativo TDA Positvo Hemoacutelise Total
Segundo tratamento 3 3 11 17
524 TESTAGEM DO ELUATO
Apoacutes o tratamento com a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA a soluccedilatildeo do eluato foi
testada para verificar a viabilidade dos anticorpos que foram dissociados ou eluiacutedos Dentre
as 50 amostras 41 apresentaram eluato positivo As nove amostras cujos eluatos foram
negativos haviam sido sensibilizadas com as seguintes especificidades de anticorpos anti-E 6
amostras (67) anti-S 2 amostras (40) e anti-D 1 amostra (8) (tabela 4) O eluato de
todas as amostras sensibilizadas com os anticorpos anti-C anti-c Anti-K e Anti-Dia foram
positivos Os eluatos positivos na triagem de anticorpos foram testados com paineacuteis de
identificaccedilatildeo para confirmar a especificidade e a viabilidade dos anticorpos (figuras 7 e 8)
34
525 EFEITO DA ELUICcedilAtildeO SOBRE OS ANTIacuteGENOS ERITROCITAacuteRIOS
Para verificar o efeito do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA e com a cloroquina
sobre a expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s foi realizada a fenotipagem das
amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes tratamento com ambas as teacutecnicas Foi avaliado
se o tratamento destruiu os antiacutegenos expressos antes do tratamento
Tabela 4- Resultado do Eluato das amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA
Anticorpos Eluato positvo Eluato negativo Total
Anti-D 11 1 12
Anti-C 10 0 10
Anti-E 3 6 9
Anti-c 8 0 8
Anti-S 5 2 7
Anti-K 3 0 3
Anti-Dia 1 0 1
Total 41 9 50
Figura 7 ndash Painel do eluato da amostra 21 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-C que foi
recuperado no eluato
Figura 8 ndash Painel do eluato da amostra 47 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-K que foi
recuperado no eluato
35
Dentre as 50 amostras 26 eram previamente fenotipadas para os antiacutegenos Fya Fy
b
Jka Jk
b S e s Dentre elas 20 alcanccedilaram TDA negativo apoacutes tratamento com a glicina-
aacutecidaEDTA e 20 negativaram apoacutes tratamento com cloroquina (tabela 5) Apoacutes ambas as
teacutecnicas os antiacutegenos originalmente expressos permaneceram positivos comprovando que natildeo
houve destruiccedilatildeo dos mesmos
Tabela 5 ndash Verificaccedilatildeo da interferecircncia do tratamento da hemaacutecias com cloroquina e glicina-
aacuteicdaEDTA sobre os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
AMOSTRAS
COM
FENOTIPAGEM
PREacuteVIA
TRATADAS COM
CLOROQUINA
TRATADAS COM
GLICINA
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
26
20
20
20
20
As amostras 24 47 e 50 eram positivas para o antiacutegeno K A cloroquina natildeo dissociou
o anticorpo em nenhuma das 3 amostras enquanto a glicina-aacutecidaEDTA foi efetiva nas
amostras 24 e 50 Foi testada a expressatildeo do antiacutegeno K nas amostras 24 e 50 apoacutes o
tratamento utilizando meacutetodo indireto em gel contendo AGH Apesar de natildeo ter sido avaliado
a intensidade de reaccedilatildeo de expressatildeo dos antiacutegenos podemos verificar na figura 9 que nas
duas amostras em que a teacutecnica foi efetiva e dissociou o anticorpo a expressatildeo do antiacutegeno K
continua presente mas a reatividade observada pode ser considerada 1+ sugerindo que houve
diminuiccedilatildeo da expressatildeo do antiacutegeno quando comparado com a expressatildeo observada em
hemaacutecia natildeo tratada
Os resultados individuais de cada amostra em ambas as teacutecnicas encontram-se
resumidas na tabela 6
526 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente onde foi constatada a presenccedila de autoanticorpo
a quente da classe IgG pelo TDA monoespeciacutefico (figura 10)O autoanticorpo tambeacutem
interferia na pesquisa e identificaccedilatildeo de anticorpos irregulares pois apresentava caracteriacutestica
de panaglutinina As hemaacutecias da paciente sensibilizadas ldquoin vivordquo foram tratadas com
cloroquina e com glicina-aacutecidaEDTA
36
Figura 9 ndash Fenotipagem das amostras 24 e 50 para antiacutegeno K apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
O teste positivo indica a presenccedila do antiacutegeno poreacutem a reatividade fraca (1+) sugere que houve enfraquecimento
de sua expressatildeo A direita a expressatildeo forte (4+) do antiacutegeno Kell em hemaacutecia controle natildeo tratada utilizada
como controle positivo
A cloroquina natildeo foi efetiva na retirada do anticorpo ligado as hemaacutecias ao contraacuterio
do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA que dissociou o anticorpo (figura 11)
A hemaacutecia tratada com glicina foi fenotipada para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
(figura 12) A fenotipagem para o sistema Rh (C c E e e) e Kell foi realizada em gel
especiacutefico monoclonal sem interferecircncia do TDA positivo (controle da reaccedilatildeo negativo)
O eluato resultante do tratamento com glicina-aacutecidaEDTA foi testada em gel com
hemaacutecias de painel de identificaccedilatildeo de anticorpos e apresentou resultado positivo com todas
as ceacutelulas (figura 13 e 14)
A amostra foi enviada para genotipagem e o resultado da genotipagem confirmou o
resultado da fenotipagem apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
527 TEMPO DE EXECUCcedilAtildeO DA TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
O tempo de reaccedilatildeo da glicina-aacutecidaEDTA eacute de 2 minutos Todas as amostras foram
tratadas obedecendo ao tempo descrito na literatura demonstrando que o mesmo eacute
reprodutiacutevel
37
Tabela 6- Resultados individuais por amostra
Amostra Especificidade
dos anticorpos
Intensidade do
TDA apoacutes
sensibilizaccedilatildeo
Tratamento
efetivo com
cloroquina
Tratamento
efetivo com
glicina
Eluato
poacutes
glicina
1 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 2 Dia 3+ Sim Sim 3+ 3 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 4 D 4+ Natildeo Sim 4+ 5 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 6 E 3+ Sim Sim Negativo 7 S 4+ Sim Sim 3+ 8 E 3+ Sim Sim 1+ 9 E 3+ Sim Sim 2+
10 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 11 D 4+ Natildeo Sim 4+ 12 D 4+ Natildeo Sim 4+ 13 S 3+ Sim Sim 3+ 14 S 3+ Sim Sim 3+ 15 D 3+ Natildeo Sim 3+ 16 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 17 E 3+ Sim Sim (+) 18 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 19 D 4+ Natildeo Natildeo 3+ 20 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 21 C 3+ Sim Sim 4+ 22 C 3+ Sim Sim 4+ 23 C 3+ Sim Sim 4+ 24 K 4+ Natildeo Sim 4+ 25 D 3+ Natildeo Natildeo Negativo 26 E 4+ Sim Sim Negativo 27 S 3+ Sim Sim 3+ 28 C 3+ Sim Natildeo 4+ 29 C 3+ Sim Sim 4+ 30 C 3+ Sim Sim 4+ 31 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 32 E 3+ Sim Sim Negativo 33 C 3+ Sim Natildeo 4+ 34 S 3+ Sim Sim Negativo 35 S 3+ Sim Sim Negativo 36 C 4+ Sim Natildeo 4+ 37 c 4+ Natildeo Natildeo 4+ 38 D 4+ Natildeo Sim 4+ 39 S 3+ Sim Sim 3+ 40 c 4+ Sim Natildeo 2+ 41 C 4+ Sim Natildeo 4+ 42 E 3+ Sim Sim Negativo 43 D 3+ Natildeo Sim 2+ 44 D 3+ Natildeo Sim 2+ 45 E 3+ Sim Sim Negativo 46 C 3+ Sim Sim 4+ 47 K 4+ Natildeo Natildeo 4+ 48 D 3+ Natildeo Sim 2+ 49 E 3+ Sim Sim Negativo 50 K 4+ Natildeo Sim 4+
TOTAL 50 28 33 41
38
Figura 10 ndash TDA monoespeciacutefico da amostra de paciente Hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo da classe
IgG
oacute Figura 11 ndash TDA apoacutes o tratamento com glicina-aacutecidaEDTA (esquerda) e cloroquina (direita) A glicina
negativou completamente o TDA enquanto a hemaacutecia tratada com cloroquina persistiu positiva (1+)
39
Figura 12 ndash Fenotipagem da amostra tratada com glicina-aacutecidaEDTA Fy(a+b+) Jk(a-b+) S+s+
Figura 13 ndash Painel em gel (LissAGH) do eluato apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de
intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
Figura 14 ndash ndash Painel ezimaacutetico (hemaacutecias tratadas com bromelina) do eluato em gel neutro apoacutes
tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
40
528 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Quanto a efetividade das teacutecnicas em negativar o TDA foi verificado que a glicina-
aacutecidaEDTA foi efetiva em 66 das amostras testadas no primeiro tratamento (3350
amostras) enquanto a cloroquina conseguiu negativar 56 (2850) Esses resultados natildeo
apresentam diferenccedila significativa (pgt005) demostrando que a teacutecnica da glicina-
aacutecidaEDTA natildeo eacute superior mas eacute tatildeo efetiva quanto a da cloroquina
Quando aliamos os resultados de ambas as teacutecnicas verificamos que em 76 (3850)
das amostras o TDA foi negativado Esse dado indica que ainda que uma teacutecnica natildeo seja
eficaz na remoccedilatildeo do anticorpo eacute uma boa alternativa tentar a segunda teacutecnica jaacute que a falha
em remover o anticorpo utilizando uma delas natildeo prevecirc necessariamente a falha com a outra
Quando se utiliza o teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla (graacutefico 2) para comparar a utilizaccedilatildeo das
duas teacutecnicas com o resultado de cada uma isolada (somente a cloroquina ou somente a
glicina) verificamos que os resultados apresentam diferenccedila significativa (plt005) (quadro 3)
TRATAMENTO EFETIVO COM TOTAL PORCENTAGEM
Glicina ou cloroquina 38 76
Glicina e cloroquina 23 46
Glicina apenas 10 20
Cloroquina apenas 5 10
Nenhuma das teacutecnicas 12 24
Quadro 3 - Resultados comparativos entre as teacutecnicas utilizadas
41
Graacutefico 2 - Teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla entre as teacutecnicas aplicadas A- Glicina e Cloroquina B-Cloroquina C-
Glicina ( plt005)
42
6 DISCUSSAtildeO
Os reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA podem ser adquiridos em
forma de kit comercial prontos para uso poreacutem natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil A preparaccedilatildeo
dos reagentes ldquoin houserdquo a partir de sais comerciais adquiridos se mostrou viaacutevel Os
reagentes glicina e o tampatildeo Tris armazenados de forma correta se mantiveram estaacuteveis por
um periacuteodo de 7 meses Somente o reagente EDTA precipitou mesmo armazenado em
condiccedilotildees adequadas sugerindo que o mesmo deve ser preparado em menor quantidade e
armazenado em aliacutequotas A soluccedilatildeo de cloroquina tambeacutem pode ser preparada ldquoin houserdquo e
pode ser armazenado por um mecircs A legislaccedilatildeo brasileira autoriza a utilizaccedilatildeo de reagentes
preparados a partir de sais comerciais como a cloroquina e a glicina-aacutecidaEDTA desde que
os sais tenham autorizaccedilatildeo da vigilacircncia sanitaacuteria para a comercializaccedilatildeo (BRASIL 2001)
A comparaccedilatildeo quanto a efetividade em dissociar anticorpos em amostras com TDA
positivos entre a teacutecnica da glicina e a teacutecnica da cloroquina mostrou que natildeo haacute diferenccedila
estatiacutestica entre elas e que ambas satildeo igualmente eficientes Se utilizadas conjuntamente haacute
maior possibilidade de elucidaccedilatildeo dos casos
Uma vantagem da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eacute que ela permite numa mesma
amostra eluir o anticorpo ligado aacute hemaacutecia assim como fenotipar a hemaacutecia tratada Devido a
sua dupla utilidade a teacutecnica eacute vantajosa principalmente em pacientes em que pouco volume
de amostra pode ser coletado como em casos de crianccedilas e receacutem-nascidos
A fenotipagem poacutes tratamento se mostrou viaacutevel jaacute que os antiacutegenos de maior
importacircncia natildeo sofreram alteraccedilotildees Nas 20 amostras que foram fenotipadas antes e apoacutes
tratamento para verificar a influecircncia dos reagentes na expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a
Jkb S e s natildeo houve destruiccedilatildeo dos mesmos por nenhuma das duas teacutecnicas
Para as amostras positivas para o antiacutegeno Kell (350) e sensibilizadas com o
respectivo anticorpo a teacutecnica da glicina foi efetiva em negativar o TDA em apenas duas
delas mas apoacutes o tratamento foi verificada uma fraca reatividade da reaccedilatildeo antiacutegeno-
anticorpo sugerindo que houve um enfraquecimento da expressatildeo do antiacutegeno conforme
esperado e descrito na literatura (BYRNE 1991 PALLAS WILER E MCGEE 1991
ROZIERS e SQUALI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012 e KATHARIA e
CHAUDHARY 2013) A accedilatildeo da glicina sobre o antigeno Kell natildeo representa impedimento
para seu uso uma vez que na impossibilidade de testar o antiacutegeno Kell o banco de sangue
consegue facilmente atender a solicitaccedilatildeo de transfusatildeo com unidades de hemaacutecias Kell
43
negativas jaacute que eacute um antiacutegeno de baixa prevalecircncia na populaccedilatildeo variando de 15 na
populaccedilatildeo africana a 9 nos europeus (DANIELS 2011)
A soluccedilatildeo resultante da dissociaccedilatildeo do anticorpo pela teacutecnica da glicina pode ainda ser
utilizada como eluato podendo substituir a teacutecnica de eluiccedilatildeo com reagentes comercias (kits
de eluiccedilatildeo aacutecida) que tem alto custo aproximadamente entre R$2000 a R$2500 por teste
Em 41 amostras (82) houve a dissociaccedilatildeo e recuperaccedilatildeo do anticorpo que estava
sensibilizando as hemaacutecias Em 9 amostras (18) os anticorpos foram eluiacutedos poreacutem
apresentaram reaccedilatildeo negativa quando testadas com hemaacutecias de triagem entre eles o anti-E
(6) anti-S (2) e Anti-D (1) Eacute possiacutevel que a correccedilatildeo pH do meio (WALKER 2011) natildeo
tenha sido adequada o que pode ter desfavorecido a reatividade do anticorpo
Para as amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA nas quais natildeo houve dissociaccedilatildeo do
anticorpo pelo primeiro tratamento (1750) o segundo tratamento natildeo se mostrou eficaz jaacute
que 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise O tempo de
armazenagem natildeo parece ter influenciado jaacute que todas as amostras foram testadas dentro de
48 horas apoacutes a coleta Outros fatores que natildeo foram verificados podem ter levado a
hemoacutelise Apesar da literatura (LOUIE JIENG e ZEROULIS 1986 e BYRNE 1991)
recomendar um segundo tratamento ele eacute pouco eficaz tendo negativado apenas 3 das 17
amostras testadas
A amostra de paciente que apresentou sensibilizaccedilatildeo ldquoin vivordquo mostrou melhor
efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA sobre a da cloroquina possibilitando
fenotipagem para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s que natildeo foram destruiacutedos apoacutes o
tratamento comprovado atraveacutes da genotipagem
A presenccedila de autoanticorpo a quente com presenccedila de hemoacutelise (AHAI) ou natildeo pode
mascarar a presenccedila de aloanticorpo interferindo na rotina soroloacutegica da fenotipagem que eacute
uma importante ferramenta para auxiliar na seleccedilatildeo de hemaacutecias para transfusatildeo (SHIREY et
al 2002) Esses pacientes frequentemente possuem aloanticorpos associados ao
autoanticorpo e a prevalecircncia de aloimunizaccedilatildeo entre eles varia entre 12 a 40 (LEGER e
GARRATY 1999 BRANCH e PETZ 1999) o que dificulta ainda mais a escolha do melhor
componente a ser transfundido aleacutem de aumentar a possibilidade reaccedilotildees hemoliacuteticas imunes
poacutes-transfusionais
Nesses casos as teacutecnicas de dissociaccedilatildeo de anticorpos satildeo importantes para tratar
amostras de pacientes e a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser usada como uma opccedilatildeo
pois se mostrou eficaz na dissociaccedilatildeo anticorpo ligado agraves hemaacutecias deixando livre a
superfiacutecie das mesmas permitindo a fenotipagem por antisoros IgG Paralelamente os
44
anticorpos eluiacutedos tambeacutem puderam ser estudados O mesmo natildeo ocorre com a cloroquina
que permite apenas a fenotipagem e tampouco com os kits de eluiccedilatildeo aacutecida disponiacuteveis no
mercado nacional que satildeo destinados a realizaccedilatildeo do eluato mas destroem as hemaacutecias
O tempo de tratamento na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA tambeacutem eacute uma vantagem
pois foi possiacutevel reproduzir no tempo determinado de 2 minutos enquanto a cloroquina
demora ateacute duas horas
Ainda que a aplicaccedilatildeo das teacutecnicas por biologia molecular estejam cada vez mais
presentes na rotina imuno-hematoloacutegica e possibilitam estabelecer o fenoacutetipo deduzido do
genoacutetipo elas natildeo estatildeo disponiacuteveis na maioria dos centros e sua realizaccedilatildeo exige algumas
horas A resoluccedilatildeo imediata do problema transfusional necessita dos resultados soroloacutegicos
pois com frequecircncia natildeo eacute possiacutevel aguardar o resultado do teste molecular Dessa forma
apesar da crescente importacircncia da genotipagem eritrocitaacuteria teacutecnicas soroloacutegicas aplicadas
corretamente e no momento propiacutecio satildeo de grande utilidade para resolver problemas imuno-
hematoloacutegicos como ocorre com a fenotipagem em pacientes com TDA positivo
45
7 CONCLUSAtildeO
A teacutecnica da glicina aacutecidaEDTA mostrou-se efetiva em remover os anticorpos que
sensibilizavam as hemaacutecias e pode ser utilizada com seguranccedila antes da fenotipagem
eritrocitaacuteria Por ser uma teacutecnica de raacutepida execuccedilatildeo eacute uma alternativa aplicaacutevel
principalmente em casos urgentes de pacientes que apresentam autoanticorpos
46
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ZAGO M A Apresentaccedilatildeo In Covas D T Ubialli E M A De Santis G C Manual de
Medicina Transfusional 2ordf ed Satildeo Paulo Atheneu 2014
50
9 ANEXOS
51
FUNDACcedilAtildeO HEMOCENTRO DE RIBEIRAtildeO PRETO
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE)
Tiacutetulo da pesquisa Aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina aacutecida-EDTA e avaliaccedilatildeo da
eficaacutecia no tratamento de hemaacutecias com teste direto da antiglobulina positivo
Pesquisadora responsaacutevel Ceacutelia Kazue Abiko
Orientador Prof Dimas Tadeu Covas
Co-orientadora Dra Flaacutevia Leite Souza Santos
Objetivo da pesquisa Vocecirc estaacute sendo convidado a participar de uma pesquisa que tem
como objetivo padronizar uma nova teacutecnica para auxiliar na tipagem sanguiacutenea de pacientes
A tipagem sanguiacutenea pode sofrer interferecircncia da presenccedila de anticorpos ligados aos gloacutebulos
vermelhos do sangue Nessas situaccedilotildees eacute difiacutecil selecionar o melhor sangue para o paciente e
eacute preciso a utilizaccedilatildeo de teacutecnicas adicionais para remover essas interferecircncias
Esta pesquisa tem como objetivo estudar outra teacutecnica para remover esses anticorpos e
comparaacute-la com a teacutecnica atualmente utilizada Para isso precisamos de amostras de pacientes
e doadores voluntaacuterios
Se vocecirc eacute um doador eacute necessaacuterio que vocecirc autorize a coleta de 5 ml (1 tubo) a mais
de seu sangue
Se vocecirc eacute um paciente natildeo haveraacute necessidade de nova amostra pois utilizaremos as
amostras jaacute coletadas para os testes preacute-transfusionais e os resultados encontrados nesta
pesquisa natildeo iratildeo interferir na escolha da (s) bolsa (s) de sangue que vocecirc possa vir a receber
Se vocecirc concordar em participar leia com atenccedilatildeo o texto abaixo e assine as duas vias
rubricando todas as paacuteginas deste termo de consentimento Uma via original assinada e
rubricada por vocecirc e pela pesquisadora ficaraacute com vocecirc
As suas informaccedilotildees seratildeo mantidas em sigilo pela pesquisadora e natildeo haveraacute
armazenamento de material para pesquisas posteriores Os seus dados seratildeo usados apenas
neste estudo e quando o trabalho for publicado seu nome e qualquer outra informaccedilatildeo que
possam identificaacute-lo natildeo seratildeo revelados
Eacute pouco provaacutevel que o que noacutes aprendermos com este estudo tenha um benefiacutecio
direto para vocecirc assim como natildeo poderemos dar nada em troca pela sua participaccedilatildeo na
pesquisa
Nosso objetivo com esta pesquisa eacute que os resultados poderatildeo ser uacuteteis para o
tratamento de pacientes no futuro Os riscos da participaccedilatildeo satildeo miacutenimos Se vocecirc eacute um
doador de sangue a amostra seraacute coletada no momento da doaccedilatildeo natildeo exigindo punccedilatildeo
venosa adicional
52
Eacute seu direito ter acesso aos resultados dos testes da pesquisa Esses resultados natildeo
seratildeo fornecidos automaticamente a vocecirc mas caso vocecirc se interesse em saber o resultado ou
tiver alguma duacutevida sobre a sua participaccedilatildeo neste estudo deveraacute entrar em contato com Ceacutelia
Kazue Abiko pelo telefone (18) 99718-3551
Vocecirc tem total liberdade de optar por natildeo participar da pesquisa Caso aceite
participar poderaacute desistir a qualquer momento ou retirar seu consentimento mesmo apoacutes ter
coletado o sangue Para cancelar sua participaccedilatildeo basta avisar a pesquisadora e os seus dados
seratildeo retirados do projeto
Qualquer duacutevida eacutetica sobre a pesquisa poderaacute entrar em contato com o Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa do Hospital das Cliacutenicas e da Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto
(CAMPUS UNIVERSITAacuteRIO bairro Monte Alegre CEP 14048-900 Ribeiratildeo Preto-SP
Telefone (16) 3602-2228 FAX (16) 3633-1144 e-mail cephcrpuspbr)
Consentimento de participaccedilatildeo
A Consentimento do participante
Li as informaccedilotildees acima sobre o estudo e recebi explicaccedilotildees sobre a participaccedilatildeo no estudo
Portanto dou o meu consentimento para participar do estudo
___________________________________________________________________________
Nome completo
___________________________________________________________________________
Assinatura
___________
Data
__________________________________________________________________________________
Nome completo da pesquisadora
___________________________________________________________________________
Assinatura
_____________
Data
19
Roziers e Squali (1997) e Katharia e Chaudhary (2013) compararam a teacutecnica da
glicina-aacutecidaEDTA com as teacutecnicas da cloroquina e do aquecimento Verificaram maior
eficiecircncia da glicina-aacutecidaEDTA em relaccedilatildeo as outras duas teacutecnicas pois com uma mesma
quantidade de amostra produzia as hemaacutecias livres de anticorpo e tambeacutem o eluato Mostrou-
se ainda superior devido ao menor tempo exigido para sua realizaccedilatildeo o que favorece seu uso
em situaccedilotildees de urgecircncia e emergecircncia
As duas desvantagens da teacutecnica poreacutem eacute o fato de destruir os antiacutegenos do sistema
Kell e o fato de natildeo remover fraccedilotildees do complemento ligadas agrave hemaacutecia (PALLAS WILER e
McGEE 1991 ROZIERS e SQUALLI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012
e KATHARIA e CHAUNDHARY 2013)
20
2 OBJETIVOS
21 OBJETIVO GERAL
211 Avaliar a eficaacutecia da glicina-aacutecidaEDTA em remover os anticorpos ligados agraves
hemaacutecias sensibilizadas por anticorpos da classe IgG
22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
221 Preparaccedilatildeo dos reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
verificaccedilatildeo da estabilidade dos mesmos e avaliar custos
222 Testar a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA em amostras de hemaacutecias
sensibilizadas por anticorpos antieritrocitaacuterios humanos
223 Comparar a efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA com a teacutecnica da
cloroquina quanto a capacidade de remover a interferecircncia do anticorpo ligado
a hemaacutecia
224 Testar o eluato das amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA
225 Verificar se houve destruiccedilatildeo dos antiacutegenos eritrocitaacuterios apoacutes o tratamento
com glicina-aacutecidaEDTA e com cloroquina
226 Verificar se o tempo de execuccedilatildeo da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA descrito
nos textos de referecircncia eacute reprodutiacutevel
21
3 JUSTIFICATIVA
Algumas condiccedilotildees cliacutenicas podem levar ao depoacutesito ldquoin vivordquo de anticorpos eou
fraccedilotildees do complemento sobre as hemaacutecias Entre elas estatildeo as reaccedilotildees hemoliacuteticas poacutes-
transfusionais a doenccedila hemoliacutetica perinatal o uso de medicamentos e principalmente a
AHAI Na AHAI um anticorpo normalmente da classe IgG ou IgM reconhece antiacutegenos
proacuteprios na membrana eritrocitaacuteria e reduz a sobrevida da hemaacutecia levando a sua destruiccedilatildeo
pelos macroacutefagos no sistema reticulo-endotelial ou agrave ativaccedilatildeo do complexo de ataque agrave
membrana e agrave lise intravascular Os autoanticorpos satildeo voltados na maioria das vezes contra
antiacutegenos eritrocitaacuterios de alta frequecircncia populacional conhecidos como antiacutegenos puacuteblicos
e por este motivo reconhecem tanto hemaacutecias autoacutelogas quanto alogecircnicas
Devido agrave presenccedila do autoanticorpo livre no plasma e tambeacutem do anticorpo eou
complemento ligado agrave hemaacutecia o banco de sangue pode encontrar dificuldades em todas as
fases dos testes preacute-transfusionais do paciente com AHAI e deve utilizar teacutecnicas que
auxiliem na escolha do melhor hemocomponente melhorando a seguranccedila transfusional Essas
teacutecnicas visam remover a interferecircncia do autoanticorpo livre no soro e do autoanticorpo
ligado agrave hemaacutecia permitindo a detecccedilatildeo de aloanticorpos associados e a realizaccedilatildeo da
fenotipagem eritrocitaacuteria respectivamente
A finalizaccedilatildeo dos testes preacute-tranfusionais na presenccedila de autoanticorpo pode levar
algumas horas e nem sempre o paciente poderaacute aguardar Nesse contexto torna-se vantajosa a
aplicaccedilatildeo de teacutecnicas de raacutepida execuccedilatildeo
O presente estudo propotildee aplicar e avaliar a eficaacutecia da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
em remover os anticorpos ligados agrave hemaacutecia o que permite a fenotipagem eritrocitaacuteria
estendida e a seleccedilatildeo de concentrados de hemaacutecias com mesmo fenoacutetipo do paciente
Atualmente no Hemocentro de Ribeiratildeo Preto a teacutecnica utilizada para esse fim eacute o
tratamento das hemaacutecias com difosfato de cloroquina cujo tempo de execuccedilatildeo pode demorar
ateacute duas horas enquanto a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser realizada em apenas dois
minutos o que a tornaria opccedilatildeo de escolha especialmente em situaccedilotildees de urgecircncia Ao
contraacuterio da cloroquina a glicina-aacutecidaEDTA permite tambeacutem o estudo do eluato das
hemaacutecias tratadas
22
4 METODOL OGIA
41 AMOSTRAS DE DOADORES
Foram coletados 50 amostras de doadores de sangue que compareceram ao
Hemonuacutecleo de Araccedilatuba no periacuteodo de junho a agosto de 2016 Foram convidados a
participar da pesquisa doadores de repeticcedilatildeo do tipo sanguiacuteneo ldquoOrdquo RhD positivo
cadastrados no sistema de banco de sangue (SBS) do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto
Todos os doadores que concordaram em participar da pesquisa assinaram o termo de
consentimento livre e esclarecido (TCLE)
No momento da doaccedilatildeo foram coletados adicionalmente 5 mL de sangue total em
soluccedilatildeo anticoagulante EDTA (aacutecido dietilenoaminoaceacutetico) dispensando punccedilatildeo venosa
adicional para coleta da amostra O fluxograma 1 resume as etapas desenvolvidas no projeto
Fluxograma 1 - Fluxo da pesquisa utilizando as amostras de doadores
23
411 FENOTIPAGEM
Foram verificados se os doadores jaacute tinham fenotipagem para outros sistemas de
grupos sanguiacuteneos aleacutem do sistema ABORh que eacute realizado rotineiramente
A fenotipagem eritrocitaacuteria para outros sistemas ou fenotipagem estendida eacute realizada
para identificar a presenccedila ou ausecircncia de antiacutegenos considerados de importacircncia cliacutenica No
Hemonuacutecleo de Araccedilatuba uma parcela de doadores de repeticcedilatildeo satildeo fenotipados para os
antiacutegenos dos sistemas de grupo sanguiacuteneo Rh (antiacutegenos C c E e e) Kell (antiacutegeno K)
Duffy (antiacutegenos Fya e Fy
b) Kidd (antiacutegenos Jk
a e Jk
b) e sistema MNSs (antiacutegenos S e s)
A fenotipagem para o Rh e Kell eacute realizada por metodologia de microplaca utilizando
25 microL de hemaacutecia lavada e diluiacuteda a 5 em salina e 25 microL do antissoro comercial especiacutefico
A reaccedilatildeo eacute incubada 15 minutos a temperatura ambiente e centrifugadas para leitura Para os
antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s a metolodogia utilizado eacute gel contendo antiglobulina
humana (gel LissCoombs poliespeciacutefico) da marca BIO-RAD onde se utiliza suspensatildeo de
hemaacutecia em LISS (Soluccedilatildeo de baixa forccedila iocircnica) A suspensatildeo eacute preparada atraveacutes da
diluiccedilatildeo de 10 microL de hemaacutecia em 1000 microL de LISS Pipetado 50 microL dessa diluiccedilatildeo no gel e
adicionado 25 microL do antissoro especiacutefico Incuba-se em banho seco por 15 minutos a 37 deg
Celsius e eacute centrifugado em centriacutefuga especiacutefica Os antissoros utilizados eram das marcas
Fresenius e Lorne
Foi verificado a fenotipagem do doador no banco de dados do Hemocentro Os
registros dos fenoacutetipos dos doadores ficam armazenadas no sistema de banco de sangue
(SBS) Para doadores que natildeo tinham fenotipagem estendida preacutevia para antiacutegenos do sistema
Rh (C c E e e) e Kell (K) foi realizada a fenotipagem para esses antiacutegenos
O tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA e cloroquina para dissociar
anticorpos pode inativar enfraquecer ou destruir os antiacutegenos presentes nas hemaacutecias
alterando assim os resultados da fenotipagem Para verificar se houve destruiccedilatildeo dos
antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a e Jk
b S e s nas amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes
tratamento foram novamente fenotipadas ao final para os antiacutegenos que eram inicialmente
positivas
A repeticcedilatildeo da fenotipagem foi realizada nas amostras que apresentaram efetividade
no tratamento da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eou da cloroquina e a detecccedilatildeo do antiacutegeno
na amostra preacute-tratamento
24
412 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS HEMAacuteCIAS
As hemaacutecias foram sensibilizadas com antissoros policlonais humanos de amostras de
plasma fresco congelado de doadores com resultado de pesquisa de anticorpo irregular
positivos
A escolha do anticorpo para sensibilizar as hemaacutecias foi definida de acordo com o
fenoacutetipo do doador que deveria ser positivo para o respectivo antiacutegeno
Para a sensibilizaccedilatildeo um volume de antissoro (1 mL) e um volume (1 mL) de
hemaacutecias lavadas quatro vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica foram adicionadas a um tubo de 12 x
75 mm A mistura foi homogeneizada e incubada em banho maria (BM) a 37deg C por 60
minutos A seguir as hemaacutecias foram novamente lavadas 4 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica
para retirada dos anticorpos que natildeo se ligaram A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada
como controle negativo O teste da uacuteltima lavagem eacute importante para assegurar que os
anticorpos que poderatildeo ser detectados no eluato apoacutes o tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA
sejam aqueles que estavam ligados agraves hemaacutecias e natildeo aqueles livres no plasma O controle
negativo mostra que todo o anticorpo livre foi retirado (LEGER 2011)
Para o teste de presenccedila de anticorpo na soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foram incubadas
com hemaacutecias de triagem de anticorpos irregulares (ID-Diacell BIO-RAD) contendo os
antiacutegenos especiacuteficos Realizado a teacutecnica em gel LissCoombs com anti-IgG+C3d Incubado
no tempo de 15 minutos a temperatura de 37deg C e centrifugado 10 minutos em centriacutefuga
proacutepria
As 50 amostras de doadores foram sensibilizadas com os anticorpos policlonais
humanos
Apoacutes sensibilizadas rdquoin vitrordquo e lavadas as hemaacutecias foram diluiacutedas em soluccedilatildeo de
baixa forccedila iocircnica (LISS) na quantidade de 10 microL de hemaacutecia para 1000 microL de soluccedilatildeo A
suspensatildeo foi pipetada (50 microL) em coluna-gel-teste LissCoombs (BIO-RAD) que contecircm
antiglobulina poliespeciacutefico (IgG+C3d) e centrifugada em baixa rotaccedilatildeo conforme orientaccedilatildeo
do fabricante durante 10 minutos
As amostras deveriam apresentar aglutinaccedilatildeo com reatividade 3 a 4+ no TDA As
amostras que apresentaram reaccedilatildeo menor que 3+ foram novamente sensibilizadas com nova
aliacutequota do antissoro
25
413 TRATAMENTO DAS AMOSTRAS
As amostras sensibilizadas apresentando o TDA positivo 3 ou 4+ foram divididas em
duas aliacutequotas e submetidas a duas teacutecnicas diferentes com o objetivo de dissociar o anticorpo
ligado Uma aliacutequota da amostra foi tratada com soluccedilatildeo de difosfato de cloroquina enquanto
a outra aliacutequota foi tratada com glicina-aacutecidaEDTA
42 PREPARO DA GLICINA AacuteCIDA-EDTA
A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA utiliza 3 soluccedilotildees diferentes a glicina aacutecida o
EDTA e o tampatildeo TRIS
Os reagentes foram preparados utilizando os sais para anaacutelise (PA) de EDTA
(Na2EDTA2H2O) TRIS (C4H11NO3) Glicina (H2NCH2CO2H) NaCl e a soluccedilatildeo de aacutecido
cloriacutedrico (HCl) 12 N todos reagentes da marca SYNTH (quadro 1)
Para o preparo do tampatildeo glicina-acida eacute necessaacuterio o ajuste do pH para 15 Para esse
ajuste utiliza-se aacutecido cloriacutedrico (HCl) concentrado O pH foi medido com fitas reativas de pH
com escala de 1 a 14 da marca MERCK Posteriormente a soluccedilatildeo foi enviada ao laboratoacuterio
de controle de qualidade do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto e o pH medido no peagacircmetro O
tampatildeo glicina-aacutecida foi armazenado a 4deg e o tampatildeo tris e o EDTA em temperatura ambiente
controlada (20 a 24deg Celsius)
Apoacutes o preparo e durante a realizaccedilatildeo dos testes foram feitas inspeccedilotildees visuais para
verificaccedilatildeo de turvaccedilatildeo do meio e presenccedila de precipitados
Reagente Material Quantidade Preparo e
Conservaccedilatildeo
EDTA
EDTA
(Na2EDTA2H2O)
5 gramas Mistura ateacute
dissoluccedilatildeo do sal e
conserva em
temperatura ambiente Aacutegua Destilada 50 Ml
Tris
TRIS (C4H11NO3) 121 gramas Conservar em
temperatura ambiente NaCl 525g
Aacutegua destilada 100ml
Gliacutecina-aacutecida
Glicina
(H2NCH2CO2H) 15 gramas
Conservar a 4oC NaCl 116gramas
Aacutegua Destilada 200ml
HCL 12N Ajutar o pH para 15
Quadro 1 - Preparo dos Reagentes da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
Fonte - Manual teacutecnico AABB 2011
26
O tampatildeo glicina-aacutecida e o tampatildeo TRIS satildeo estaacuteveis por 7 meses O reagente EDTA
precipitou mesmo estando em temperatura em ambiente controlado Houve necessidade de
preparo de novo reagente
421 TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
1 Em um tubo de ensaio 12x75 mm eacute adicionado 08 mL da soluccedilatildeo de glicina-aacutecida A
esta soluccedilatildeo adiciona-se 02 mL de EDTA e mistura
2 Adiciona-se 02 mL de hemaacutecias sensibilizadas (lavada 4 vezes) A mistura eacute
homogeneizada e incubada por exatamente 2 minutos
3 A seguir 01 mL de tampatildeo TRIS eacute adicionado agrave mistura que eacute novamente
homogeneizada e centrifugada por 2 minutos a 3400 rpm O pH deve estar entre 7 a 75
4 Apoacutes centrifugaccedilatildeo separa-se em outro tubo o sobrenadante (eluato) e as hemaacutecias
que permanecem satildeo lavadas 4 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica para retirada de todo o
reagente e anticorpos livres
43 PREPARO DA CLOROQUINA
A cloroquina eacute diluiacuteda em tampatildeo PBS na concentraccedilatildeo de 20 (Quadro 2) e
armazenado a 4deg Celsius sua validade apoacutes o preparo eacute de 1 mecircs
A teacutecnica da cloroquina jaacute estaacute padronizada para rotina do laboratoacuterio de
imunohematologia do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto e suas unidades
Reagente Reagentes Quantidade PreparoConservaccedilatildeo
Cloroquina
Difosfato de cloroquina
(C18H32ClN3O8P2)
20 gramas
Conservar a 4deg Celsius
Tampatildeo PBS 100ml
NaOH 01 N Acertar o pH para
51
Quadro 2 - Preparo da Cloroquina Fonte - Manual teacutecnico da AABB 2011
431 TEacuteCNICA DA CLOROQUINA
1 4 partes da soluccedilatildeo pronta eacute adicionada a uma parte de hemaacutecias lavadas 4 vezes com
soluccedilatildeo fisioloacutegica
2 A mistura eacute incubada em temperatura ambiente por ateacute duas horas
3 Centrifugar a 3400 rpm por 2 minutos
27
4 Remover o sobrenadante lavar as hemaacutecias novamente com soluccedilatildeo fisioloacutegica 4
vezes
44 VERIFICACcedilAtildeO DA EFETIVIDADE DOS TESTES
Apoacutes tratamento pelas duas teacutecnicas o TDA foi repetido em todas as amostras para
verificar se os tratamentos foram efetivos e houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo Para as
amostras tratadas pela teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA que permaneceram com TDA positivo
novo tratamento foi realizado
45 TESTE DO ELUATO
O eluato resultante das amostras tratadas com glicina-acidaEDTA foi testado com
hemaacutecias de triagem A soluccedilatildeo do eluato foi incubada com as hemaacutecias de triagem de
anticorpos (ID-Diacell BIO-RAD) pela teacutecnica em gel LissCoombs O teste foi incubado 15
minutos a 37deg Celsius e centrifugado por 10 minutos em centrifuga proacutepria para a teacutecnica em
gel Os eluatos que apresentaram resultados positivos foram testados em painel de 11
hemaacutecias (ID-Diapanel BIO-RAD) para a identificaccedilatildeo do anticorpo
46 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente que apresentou TDA positivo por IgG e pesquisa
de anticorpo irregular positivo com presenccedila de autoanticorpo com reatividade panaglutinina
A amostra foi tratada em paralelo pelas duas teacutecnicas descritas e foi enviada para o
Hemocentro para genotipagem eritrocitaacuteria que foi realizado por metodologia PCR em tempo
real no equipamento Real-time system PCR 7500 ( Applied Biosystems Califoacuternia EUA)
28
5 RESULTADOS
51 REAGENTES
Para aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA satildeo necessaacuterios 3 diferentes
reagentes que podem ser encontrados em forma de kit pronto para uso No entanto esses kits
natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil Os reagentes satildeo tampatildeo glicina-aacutecida o EDTA e o tampatildeo
Tris
Todos os reagentes foram preparados rdquoin houserdquo a partir dos sais e soluccedilotildees PA (puro
para anaacutelise) da marca SYNTH que foram adquiridos para a pesquisa O custo estimado para
cada teste foi aproximadamente R$ 020 reais
Apoacutes o preparo os reagentes poderiam ser armazenados em condiccedilotildees adequadas pelo
periacuteodo de 1 ano (AABB 2011) Ao final do preparo e durante o periacuteodo de armazenamento
de fevereiro a setembro de 2016 foi realizada inspeccedilatildeo visual para verificar a presenccedila de
precipitados ou turvaccedilatildeo A soluccedilatildeo de glicina e o tampatildeo TRIS mostraram-se estaacuteveis ateacute o
final do periacuteodo Por sua vez o reagente EDTA precipitou mesmo estando armazenado em
temperatura ambiente controlada e foi necessaacuterio novo preparo
52 AMOSTRAS DE DOADORES
521 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS AMOSTRAS
Apoacutes incubaccedilatildeo da hemaacutecia com o antissoro a mesma foi lavada 4 vezes para retirada
dos anticorpos livres A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada Caso houvesse positividade na
soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem a etapa era repetida (figura 3) Das 50 amostras sensibilizadas a
uacuteltima lavagem foi positiva somente em 3 delas Nas 3 amostras o anticorpo utilizado para
sensibilizaccedilatildeo foi o anti-K Apoacutes repetido nova etapa de lavagem os resultados se
apresentaram negativos
Em todas as amostras sensibilizadas ldquoin vitrordquo o TDA foi testado e verificado a
intensidade do teste Entre as 50 amostras 47 alcanccedilaram TDA com intensidade 3-4+ apoacutes a
primeira sensibilizaccedilatildeo enquanto 3 amostras necessitaram uma segunda incubaccedilatildeo com
anticorpo (figura 4)
A escolha dos anticorpos para sensibilizar as hemaacutecias foi feita de acordo com o
fenoacutetipo do doador e foram utilizados sete diferentes especificidades de anticorpos policlonais
humanos conforme mostra o graacutefico1
29
Figura 3 - Soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada com hemaacutecia de triagem de
anticorpos em gel LissCoombs (BIO-RAD) A finalidade eacute verificar a presenccedila de anticorpos livres na
suspensatildeo que possam interferir na pesquisa do eluato As soluccedilotildees de lavagem das amostras na figura a tiveram
resultados negativos Na figura b duas amostras a 47 e 50 apresentaram resultado positivo Nova etapa de
lavagem foi realizada e o resultado final foi negativo
522 TRATAMENTO DAS HEMAacuteCIAS
Apoacutes a sensibilizaccedilatildeo e obtenccedilatildeo de resultados de TDA com intensidade de 3 a 4+
cada uma das amostras foi dividida em duas aliacutequotas e tratada separadamente pelas teacutecnicas
de glicinaaacutecida-EDTA e cloroquina
As teacutecnicas foram consideradas efetivas quando obteve-se a completa dissociaccedilatildeo do
anticorpo verificada atraveacutes do TDA negativo na amostra poacutes tratamento conforme figuras 5
e 6 Dentre as amostras tratadas com cloroquina 2850 tiveram o TDA negativado A glicina-
aacutecidaEDTA negativou o TDA em 33 das 50 amostras tratadas Apenas 17 amostras tratadas
com glicina-aacutecidaEDTA permaneceram com o TDA positivo e foram submetidas a um novo
tratamento
30
Figura 4 - TDA das amostras apoacutes sensibilizaccedilatildeo com anticorpos policlonais humanos Amostras na
figura a com intensidades de 3-4+ Na figura b amostras 4 e 7 com intensidade menor que 3+ e portanto foram
novamente sensibilizadas com nova aliacutequota de soro Anti-D e anti-S Apoacutes a segunda sensibilizaccedilatildeo
apresentaram reatividade 4 e 3+ respectivamente Os anticorpos utilizados para sensibilizaccedilatildeo foram D S c E
C e K
523 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS TEacuteCNICAS
No tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA houve dissociaccedilatildeo completa do anticorpo
em 33 amostras (66) das 50 amostras testadas enquanto que com a cloroquina foram 28
amostras (56) (tabela 1)
31
Graacutefico 1- Nuacutemero de amostras sesnsibilizadas por especificidade de anticorpo Entre as 50 amostras 12
foram sensibilizadas com anti-D 10 com anti-C 9 com anti-E 8 com anti-c 7 com anti-S 3 com anti-K e 1
com anti-Dia As especificidades dos anticorpos foram definidas de acordo o fenoacutetipo do doador
Figura 5 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com cloroquina Nas amostras onde houve
a dissociaccedilatildeo do anticorpo ( 2 21 a 23 26 39 a 42 45 46 e 49) a hemaacutecia se deposita no fundo no microtubo
apoacutes a centrifugaccedilatildeo (TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (1 3 24 25 43 44 47
48 e 50) o anticorpo ligado agraves hemaacutecias eacute alvo da AGH presente no gel (TDA positivo)
Anti-D 12
Anti-C 10
Anti-E 9
Anti-c 8
Anti-S 7
Anti-K 3 Anti-Dia 1
32
Figura 6 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA Nas amostras
onde houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo (4 6 7 12 a 15 17 34 35 37 e 38) a hemaacutecia se deposita no fundo no
microtubo apoacutes a centrifugaccedilatildeo ( TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (5 16 18
19 20 33 e 36 ) o AGH presente no gel se liga ao anticorpo ligado agraves hemaacutecias que ficam retidas no gel (TDA
positivo)
Tabela 1-Resultado geral do tratamento das hemaacutecias com glicina e cloroquina
Teacutecnica utilizada TDA negativo TDA positivo Total
Glicina-aacutecidaEDTA 33 17 50
Cloroquina 28 22 50
A glicina-aacutecidaEDTA conseguiu negativar mais amostras sensibilizadas com Anti-D
e anti-K que a cloroquina Para as hemaacutecias sensibilizadas com anti-E Anti-S e Anti-Dia
ambas as teacutecnicas dissociaram o anticorpo em 100 das amostras Os resultados detalhados
por especificidade do anticorpo apoacutes o primeiro tratamento com glicina-aacutecidaEDTA e com
cloroquina estatildeo na tabela 2
Para as amostras que permaneceram positivas (17 amostras) apoacutes o tratamento com a
glicina-aacutecidaEDTA foi realizado um novo tratamento Houve dissociaccedilatildeo do anticorpo em 3
amostras (18) apoacutes a segunda tentativa Nas demais 14 (82) amostras tratadas pela
segunda vez 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise
33
Tabela 2 - Resultados do TDA apoacutes tratamento das hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo
sensibilizado
ANTICORPOS
SENSIBILIZADOS
1ordm TRATAMENTO COM
GLICINA
TRATAMENTO COM
CLOROQUINA
TOTAL TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
Anti-D 8 4 0 12 12
Anti-C 6 4 10 0 10
Anti-E 9 0 9 0 9
Anti-c 0 8 1 7 8
Anti-S 7 0 7 0 7
Anti-K 2 1 0 3 3
Anti-Dia 1 0 1 0 1
TOTAL 33 17 28 22 50
A hemoacutelise foi verificada durante o procedimento de lavagem final das hemaacutecias com
soluccedilatildeo fisioloacutegica para a retirada dos reagentes As soluccedilotildees de lavagem ficaram
avermelhadas e as hemaacutecias com coloraccedilatildeo escura As amostras foram descartadas Dentre as
6 amostras que ainda puderam ser testadas para o TDA trecircs amostras negativaram sendo 1
sensibilizada com anti-D e 2 com anti-C (tabela 3)
Tabela 3 - Resultado apoacutes o segundo tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA
Tratamento com
glicina-aacutecidaEDTA
TDA Negativo TDA Positvo Hemoacutelise Total
Segundo tratamento 3 3 11 17
524 TESTAGEM DO ELUATO
Apoacutes o tratamento com a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA a soluccedilatildeo do eluato foi
testada para verificar a viabilidade dos anticorpos que foram dissociados ou eluiacutedos Dentre
as 50 amostras 41 apresentaram eluato positivo As nove amostras cujos eluatos foram
negativos haviam sido sensibilizadas com as seguintes especificidades de anticorpos anti-E 6
amostras (67) anti-S 2 amostras (40) e anti-D 1 amostra (8) (tabela 4) O eluato de
todas as amostras sensibilizadas com os anticorpos anti-C anti-c Anti-K e Anti-Dia foram
positivos Os eluatos positivos na triagem de anticorpos foram testados com paineacuteis de
identificaccedilatildeo para confirmar a especificidade e a viabilidade dos anticorpos (figuras 7 e 8)
34
525 EFEITO DA ELUICcedilAtildeO SOBRE OS ANTIacuteGENOS ERITROCITAacuteRIOS
Para verificar o efeito do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA e com a cloroquina
sobre a expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s foi realizada a fenotipagem das
amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes tratamento com ambas as teacutecnicas Foi avaliado
se o tratamento destruiu os antiacutegenos expressos antes do tratamento
Tabela 4- Resultado do Eluato das amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA
Anticorpos Eluato positvo Eluato negativo Total
Anti-D 11 1 12
Anti-C 10 0 10
Anti-E 3 6 9
Anti-c 8 0 8
Anti-S 5 2 7
Anti-K 3 0 3
Anti-Dia 1 0 1
Total 41 9 50
Figura 7 ndash Painel do eluato da amostra 21 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-C que foi
recuperado no eluato
Figura 8 ndash Painel do eluato da amostra 47 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-K que foi
recuperado no eluato
35
Dentre as 50 amostras 26 eram previamente fenotipadas para os antiacutegenos Fya Fy
b
Jka Jk
b S e s Dentre elas 20 alcanccedilaram TDA negativo apoacutes tratamento com a glicina-
aacutecidaEDTA e 20 negativaram apoacutes tratamento com cloroquina (tabela 5) Apoacutes ambas as
teacutecnicas os antiacutegenos originalmente expressos permaneceram positivos comprovando que natildeo
houve destruiccedilatildeo dos mesmos
Tabela 5 ndash Verificaccedilatildeo da interferecircncia do tratamento da hemaacutecias com cloroquina e glicina-
aacuteicdaEDTA sobre os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
AMOSTRAS
COM
FENOTIPAGEM
PREacuteVIA
TRATADAS COM
CLOROQUINA
TRATADAS COM
GLICINA
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
26
20
20
20
20
As amostras 24 47 e 50 eram positivas para o antiacutegeno K A cloroquina natildeo dissociou
o anticorpo em nenhuma das 3 amostras enquanto a glicina-aacutecidaEDTA foi efetiva nas
amostras 24 e 50 Foi testada a expressatildeo do antiacutegeno K nas amostras 24 e 50 apoacutes o
tratamento utilizando meacutetodo indireto em gel contendo AGH Apesar de natildeo ter sido avaliado
a intensidade de reaccedilatildeo de expressatildeo dos antiacutegenos podemos verificar na figura 9 que nas
duas amostras em que a teacutecnica foi efetiva e dissociou o anticorpo a expressatildeo do antiacutegeno K
continua presente mas a reatividade observada pode ser considerada 1+ sugerindo que houve
diminuiccedilatildeo da expressatildeo do antiacutegeno quando comparado com a expressatildeo observada em
hemaacutecia natildeo tratada
Os resultados individuais de cada amostra em ambas as teacutecnicas encontram-se
resumidas na tabela 6
526 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente onde foi constatada a presenccedila de autoanticorpo
a quente da classe IgG pelo TDA monoespeciacutefico (figura 10)O autoanticorpo tambeacutem
interferia na pesquisa e identificaccedilatildeo de anticorpos irregulares pois apresentava caracteriacutestica
de panaglutinina As hemaacutecias da paciente sensibilizadas ldquoin vivordquo foram tratadas com
cloroquina e com glicina-aacutecidaEDTA
36
Figura 9 ndash Fenotipagem das amostras 24 e 50 para antiacutegeno K apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
O teste positivo indica a presenccedila do antiacutegeno poreacutem a reatividade fraca (1+) sugere que houve enfraquecimento
de sua expressatildeo A direita a expressatildeo forte (4+) do antiacutegeno Kell em hemaacutecia controle natildeo tratada utilizada
como controle positivo
A cloroquina natildeo foi efetiva na retirada do anticorpo ligado as hemaacutecias ao contraacuterio
do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA que dissociou o anticorpo (figura 11)
A hemaacutecia tratada com glicina foi fenotipada para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
(figura 12) A fenotipagem para o sistema Rh (C c E e e) e Kell foi realizada em gel
especiacutefico monoclonal sem interferecircncia do TDA positivo (controle da reaccedilatildeo negativo)
O eluato resultante do tratamento com glicina-aacutecidaEDTA foi testada em gel com
hemaacutecias de painel de identificaccedilatildeo de anticorpos e apresentou resultado positivo com todas
as ceacutelulas (figura 13 e 14)
A amostra foi enviada para genotipagem e o resultado da genotipagem confirmou o
resultado da fenotipagem apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
527 TEMPO DE EXECUCcedilAtildeO DA TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
O tempo de reaccedilatildeo da glicina-aacutecidaEDTA eacute de 2 minutos Todas as amostras foram
tratadas obedecendo ao tempo descrito na literatura demonstrando que o mesmo eacute
reprodutiacutevel
37
Tabela 6- Resultados individuais por amostra
Amostra Especificidade
dos anticorpos
Intensidade do
TDA apoacutes
sensibilizaccedilatildeo
Tratamento
efetivo com
cloroquina
Tratamento
efetivo com
glicina
Eluato
poacutes
glicina
1 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 2 Dia 3+ Sim Sim 3+ 3 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 4 D 4+ Natildeo Sim 4+ 5 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 6 E 3+ Sim Sim Negativo 7 S 4+ Sim Sim 3+ 8 E 3+ Sim Sim 1+ 9 E 3+ Sim Sim 2+
10 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 11 D 4+ Natildeo Sim 4+ 12 D 4+ Natildeo Sim 4+ 13 S 3+ Sim Sim 3+ 14 S 3+ Sim Sim 3+ 15 D 3+ Natildeo Sim 3+ 16 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 17 E 3+ Sim Sim (+) 18 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 19 D 4+ Natildeo Natildeo 3+ 20 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 21 C 3+ Sim Sim 4+ 22 C 3+ Sim Sim 4+ 23 C 3+ Sim Sim 4+ 24 K 4+ Natildeo Sim 4+ 25 D 3+ Natildeo Natildeo Negativo 26 E 4+ Sim Sim Negativo 27 S 3+ Sim Sim 3+ 28 C 3+ Sim Natildeo 4+ 29 C 3+ Sim Sim 4+ 30 C 3+ Sim Sim 4+ 31 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 32 E 3+ Sim Sim Negativo 33 C 3+ Sim Natildeo 4+ 34 S 3+ Sim Sim Negativo 35 S 3+ Sim Sim Negativo 36 C 4+ Sim Natildeo 4+ 37 c 4+ Natildeo Natildeo 4+ 38 D 4+ Natildeo Sim 4+ 39 S 3+ Sim Sim 3+ 40 c 4+ Sim Natildeo 2+ 41 C 4+ Sim Natildeo 4+ 42 E 3+ Sim Sim Negativo 43 D 3+ Natildeo Sim 2+ 44 D 3+ Natildeo Sim 2+ 45 E 3+ Sim Sim Negativo 46 C 3+ Sim Sim 4+ 47 K 4+ Natildeo Natildeo 4+ 48 D 3+ Natildeo Sim 2+ 49 E 3+ Sim Sim Negativo 50 K 4+ Natildeo Sim 4+
TOTAL 50 28 33 41
38
Figura 10 ndash TDA monoespeciacutefico da amostra de paciente Hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo da classe
IgG
oacute Figura 11 ndash TDA apoacutes o tratamento com glicina-aacutecidaEDTA (esquerda) e cloroquina (direita) A glicina
negativou completamente o TDA enquanto a hemaacutecia tratada com cloroquina persistiu positiva (1+)
39
Figura 12 ndash Fenotipagem da amostra tratada com glicina-aacutecidaEDTA Fy(a+b+) Jk(a-b+) S+s+
Figura 13 ndash Painel em gel (LissAGH) do eluato apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de
intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
Figura 14 ndash ndash Painel ezimaacutetico (hemaacutecias tratadas com bromelina) do eluato em gel neutro apoacutes
tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
40
528 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Quanto a efetividade das teacutecnicas em negativar o TDA foi verificado que a glicina-
aacutecidaEDTA foi efetiva em 66 das amostras testadas no primeiro tratamento (3350
amostras) enquanto a cloroquina conseguiu negativar 56 (2850) Esses resultados natildeo
apresentam diferenccedila significativa (pgt005) demostrando que a teacutecnica da glicina-
aacutecidaEDTA natildeo eacute superior mas eacute tatildeo efetiva quanto a da cloroquina
Quando aliamos os resultados de ambas as teacutecnicas verificamos que em 76 (3850)
das amostras o TDA foi negativado Esse dado indica que ainda que uma teacutecnica natildeo seja
eficaz na remoccedilatildeo do anticorpo eacute uma boa alternativa tentar a segunda teacutecnica jaacute que a falha
em remover o anticorpo utilizando uma delas natildeo prevecirc necessariamente a falha com a outra
Quando se utiliza o teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla (graacutefico 2) para comparar a utilizaccedilatildeo das
duas teacutecnicas com o resultado de cada uma isolada (somente a cloroquina ou somente a
glicina) verificamos que os resultados apresentam diferenccedila significativa (plt005) (quadro 3)
TRATAMENTO EFETIVO COM TOTAL PORCENTAGEM
Glicina ou cloroquina 38 76
Glicina e cloroquina 23 46
Glicina apenas 10 20
Cloroquina apenas 5 10
Nenhuma das teacutecnicas 12 24
Quadro 3 - Resultados comparativos entre as teacutecnicas utilizadas
41
Graacutefico 2 - Teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla entre as teacutecnicas aplicadas A- Glicina e Cloroquina B-Cloroquina C-
Glicina ( plt005)
42
6 DISCUSSAtildeO
Os reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA podem ser adquiridos em
forma de kit comercial prontos para uso poreacutem natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil A preparaccedilatildeo
dos reagentes ldquoin houserdquo a partir de sais comerciais adquiridos se mostrou viaacutevel Os
reagentes glicina e o tampatildeo Tris armazenados de forma correta se mantiveram estaacuteveis por
um periacuteodo de 7 meses Somente o reagente EDTA precipitou mesmo armazenado em
condiccedilotildees adequadas sugerindo que o mesmo deve ser preparado em menor quantidade e
armazenado em aliacutequotas A soluccedilatildeo de cloroquina tambeacutem pode ser preparada ldquoin houserdquo e
pode ser armazenado por um mecircs A legislaccedilatildeo brasileira autoriza a utilizaccedilatildeo de reagentes
preparados a partir de sais comerciais como a cloroquina e a glicina-aacutecidaEDTA desde que
os sais tenham autorizaccedilatildeo da vigilacircncia sanitaacuteria para a comercializaccedilatildeo (BRASIL 2001)
A comparaccedilatildeo quanto a efetividade em dissociar anticorpos em amostras com TDA
positivos entre a teacutecnica da glicina e a teacutecnica da cloroquina mostrou que natildeo haacute diferenccedila
estatiacutestica entre elas e que ambas satildeo igualmente eficientes Se utilizadas conjuntamente haacute
maior possibilidade de elucidaccedilatildeo dos casos
Uma vantagem da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eacute que ela permite numa mesma
amostra eluir o anticorpo ligado aacute hemaacutecia assim como fenotipar a hemaacutecia tratada Devido a
sua dupla utilidade a teacutecnica eacute vantajosa principalmente em pacientes em que pouco volume
de amostra pode ser coletado como em casos de crianccedilas e receacutem-nascidos
A fenotipagem poacutes tratamento se mostrou viaacutevel jaacute que os antiacutegenos de maior
importacircncia natildeo sofreram alteraccedilotildees Nas 20 amostras que foram fenotipadas antes e apoacutes
tratamento para verificar a influecircncia dos reagentes na expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a
Jkb S e s natildeo houve destruiccedilatildeo dos mesmos por nenhuma das duas teacutecnicas
Para as amostras positivas para o antiacutegeno Kell (350) e sensibilizadas com o
respectivo anticorpo a teacutecnica da glicina foi efetiva em negativar o TDA em apenas duas
delas mas apoacutes o tratamento foi verificada uma fraca reatividade da reaccedilatildeo antiacutegeno-
anticorpo sugerindo que houve um enfraquecimento da expressatildeo do antiacutegeno conforme
esperado e descrito na literatura (BYRNE 1991 PALLAS WILER E MCGEE 1991
ROZIERS e SQUALI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012 e KATHARIA e
CHAUDHARY 2013) A accedilatildeo da glicina sobre o antigeno Kell natildeo representa impedimento
para seu uso uma vez que na impossibilidade de testar o antiacutegeno Kell o banco de sangue
consegue facilmente atender a solicitaccedilatildeo de transfusatildeo com unidades de hemaacutecias Kell
43
negativas jaacute que eacute um antiacutegeno de baixa prevalecircncia na populaccedilatildeo variando de 15 na
populaccedilatildeo africana a 9 nos europeus (DANIELS 2011)
A soluccedilatildeo resultante da dissociaccedilatildeo do anticorpo pela teacutecnica da glicina pode ainda ser
utilizada como eluato podendo substituir a teacutecnica de eluiccedilatildeo com reagentes comercias (kits
de eluiccedilatildeo aacutecida) que tem alto custo aproximadamente entre R$2000 a R$2500 por teste
Em 41 amostras (82) houve a dissociaccedilatildeo e recuperaccedilatildeo do anticorpo que estava
sensibilizando as hemaacutecias Em 9 amostras (18) os anticorpos foram eluiacutedos poreacutem
apresentaram reaccedilatildeo negativa quando testadas com hemaacutecias de triagem entre eles o anti-E
(6) anti-S (2) e Anti-D (1) Eacute possiacutevel que a correccedilatildeo pH do meio (WALKER 2011) natildeo
tenha sido adequada o que pode ter desfavorecido a reatividade do anticorpo
Para as amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA nas quais natildeo houve dissociaccedilatildeo do
anticorpo pelo primeiro tratamento (1750) o segundo tratamento natildeo se mostrou eficaz jaacute
que 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise O tempo de
armazenagem natildeo parece ter influenciado jaacute que todas as amostras foram testadas dentro de
48 horas apoacutes a coleta Outros fatores que natildeo foram verificados podem ter levado a
hemoacutelise Apesar da literatura (LOUIE JIENG e ZEROULIS 1986 e BYRNE 1991)
recomendar um segundo tratamento ele eacute pouco eficaz tendo negativado apenas 3 das 17
amostras testadas
A amostra de paciente que apresentou sensibilizaccedilatildeo ldquoin vivordquo mostrou melhor
efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA sobre a da cloroquina possibilitando
fenotipagem para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s que natildeo foram destruiacutedos apoacutes o
tratamento comprovado atraveacutes da genotipagem
A presenccedila de autoanticorpo a quente com presenccedila de hemoacutelise (AHAI) ou natildeo pode
mascarar a presenccedila de aloanticorpo interferindo na rotina soroloacutegica da fenotipagem que eacute
uma importante ferramenta para auxiliar na seleccedilatildeo de hemaacutecias para transfusatildeo (SHIREY et
al 2002) Esses pacientes frequentemente possuem aloanticorpos associados ao
autoanticorpo e a prevalecircncia de aloimunizaccedilatildeo entre eles varia entre 12 a 40 (LEGER e
GARRATY 1999 BRANCH e PETZ 1999) o que dificulta ainda mais a escolha do melhor
componente a ser transfundido aleacutem de aumentar a possibilidade reaccedilotildees hemoliacuteticas imunes
poacutes-transfusionais
Nesses casos as teacutecnicas de dissociaccedilatildeo de anticorpos satildeo importantes para tratar
amostras de pacientes e a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser usada como uma opccedilatildeo
pois se mostrou eficaz na dissociaccedilatildeo anticorpo ligado agraves hemaacutecias deixando livre a
superfiacutecie das mesmas permitindo a fenotipagem por antisoros IgG Paralelamente os
44
anticorpos eluiacutedos tambeacutem puderam ser estudados O mesmo natildeo ocorre com a cloroquina
que permite apenas a fenotipagem e tampouco com os kits de eluiccedilatildeo aacutecida disponiacuteveis no
mercado nacional que satildeo destinados a realizaccedilatildeo do eluato mas destroem as hemaacutecias
O tempo de tratamento na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA tambeacutem eacute uma vantagem
pois foi possiacutevel reproduzir no tempo determinado de 2 minutos enquanto a cloroquina
demora ateacute duas horas
Ainda que a aplicaccedilatildeo das teacutecnicas por biologia molecular estejam cada vez mais
presentes na rotina imuno-hematoloacutegica e possibilitam estabelecer o fenoacutetipo deduzido do
genoacutetipo elas natildeo estatildeo disponiacuteveis na maioria dos centros e sua realizaccedilatildeo exige algumas
horas A resoluccedilatildeo imediata do problema transfusional necessita dos resultados soroloacutegicos
pois com frequecircncia natildeo eacute possiacutevel aguardar o resultado do teste molecular Dessa forma
apesar da crescente importacircncia da genotipagem eritrocitaacuteria teacutecnicas soroloacutegicas aplicadas
corretamente e no momento propiacutecio satildeo de grande utilidade para resolver problemas imuno-
hematoloacutegicos como ocorre com a fenotipagem em pacientes com TDA positivo
45
7 CONCLUSAtildeO
A teacutecnica da glicina aacutecidaEDTA mostrou-se efetiva em remover os anticorpos que
sensibilizavam as hemaacutecias e pode ser utilizada com seguranccedila antes da fenotipagem
eritrocitaacuteria Por ser uma teacutecnica de raacutepida execuccedilatildeo eacute uma alternativa aplicaacutevel
principalmente em casos urgentes de pacientes que apresentam autoanticorpos
46
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50
9 ANEXOS
51
FUNDACcedilAtildeO HEMOCENTRO DE RIBEIRAtildeO PRETO
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE)
Tiacutetulo da pesquisa Aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina aacutecida-EDTA e avaliaccedilatildeo da
eficaacutecia no tratamento de hemaacutecias com teste direto da antiglobulina positivo
Pesquisadora responsaacutevel Ceacutelia Kazue Abiko
Orientador Prof Dimas Tadeu Covas
Co-orientadora Dra Flaacutevia Leite Souza Santos
Objetivo da pesquisa Vocecirc estaacute sendo convidado a participar de uma pesquisa que tem
como objetivo padronizar uma nova teacutecnica para auxiliar na tipagem sanguiacutenea de pacientes
A tipagem sanguiacutenea pode sofrer interferecircncia da presenccedila de anticorpos ligados aos gloacutebulos
vermelhos do sangue Nessas situaccedilotildees eacute difiacutecil selecionar o melhor sangue para o paciente e
eacute preciso a utilizaccedilatildeo de teacutecnicas adicionais para remover essas interferecircncias
Esta pesquisa tem como objetivo estudar outra teacutecnica para remover esses anticorpos e
comparaacute-la com a teacutecnica atualmente utilizada Para isso precisamos de amostras de pacientes
e doadores voluntaacuterios
Se vocecirc eacute um doador eacute necessaacuterio que vocecirc autorize a coleta de 5 ml (1 tubo) a mais
de seu sangue
Se vocecirc eacute um paciente natildeo haveraacute necessidade de nova amostra pois utilizaremos as
amostras jaacute coletadas para os testes preacute-transfusionais e os resultados encontrados nesta
pesquisa natildeo iratildeo interferir na escolha da (s) bolsa (s) de sangue que vocecirc possa vir a receber
Se vocecirc concordar em participar leia com atenccedilatildeo o texto abaixo e assine as duas vias
rubricando todas as paacuteginas deste termo de consentimento Uma via original assinada e
rubricada por vocecirc e pela pesquisadora ficaraacute com vocecirc
As suas informaccedilotildees seratildeo mantidas em sigilo pela pesquisadora e natildeo haveraacute
armazenamento de material para pesquisas posteriores Os seus dados seratildeo usados apenas
neste estudo e quando o trabalho for publicado seu nome e qualquer outra informaccedilatildeo que
possam identificaacute-lo natildeo seratildeo revelados
Eacute pouco provaacutevel que o que noacutes aprendermos com este estudo tenha um benefiacutecio
direto para vocecirc assim como natildeo poderemos dar nada em troca pela sua participaccedilatildeo na
pesquisa
Nosso objetivo com esta pesquisa eacute que os resultados poderatildeo ser uacuteteis para o
tratamento de pacientes no futuro Os riscos da participaccedilatildeo satildeo miacutenimos Se vocecirc eacute um
doador de sangue a amostra seraacute coletada no momento da doaccedilatildeo natildeo exigindo punccedilatildeo
venosa adicional
52
Eacute seu direito ter acesso aos resultados dos testes da pesquisa Esses resultados natildeo
seratildeo fornecidos automaticamente a vocecirc mas caso vocecirc se interesse em saber o resultado ou
tiver alguma duacutevida sobre a sua participaccedilatildeo neste estudo deveraacute entrar em contato com Ceacutelia
Kazue Abiko pelo telefone (18) 99718-3551
Vocecirc tem total liberdade de optar por natildeo participar da pesquisa Caso aceite
participar poderaacute desistir a qualquer momento ou retirar seu consentimento mesmo apoacutes ter
coletado o sangue Para cancelar sua participaccedilatildeo basta avisar a pesquisadora e os seus dados
seratildeo retirados do projeto
Qualquer duacutevida eacutetica sobre a pesquisa poderaacute entrar em contato com o Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa do Hospital das Cliacutenicas e da Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto
(CAMPUS UNIVERSITAacuteRIO bairro Monte Alegre CEP 14048-900 Ribeiratildeo Preto-SP
Telefone (16) 3602-2228 FAX (16) 3633-1144 e-mail cephcrpuspbr)
Consentimento de participaccedilatildeo
A Consentimento do participante
Li as informaccedilotildees acima sobre o estudo e recebi explicaccedilotildees sobre a participaccedilatildeo no estudo
Portanto dou o meu consentimento para participar do estudo
___________________________________________________________________________
Nome completo
___________________________________________________________________________
Assinatura
___________
Data
__________________________________________________________________________________
Nome completo da pesquisadora
___________________________________________________________________________
Assinatura
_____________
Data
20
2 OBJETIVOS
21 OBJETIVO GERAL
211 Avaliar a eficaacutecia da glicina-aacutecidaEDTA em remover os anticorpos ligados agraves
hemaacutecias sensibilizadas por anticorpos da classe IgG
22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
221 Preparaccedilatildeo dos reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
verificaccedilatildeo da estabilidade dos mesmos e avaliar custos
222 Testar a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA em amostras de hemaacutecias
sensibilizadas por anticorpos antieritrocitaacuterios humanos
223 Comparar a efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA com a teacutecnica da
cloroquina quanto a capacidade de remover a interferecircncia do anticorpo ligado
a hemaacutecia
224 Testar o eluato das amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA
225 Verificar se houve destruiccedilatildeo dos antiacutegenos eritrocitaacuterios apoacutes o tratamento
com glicina-aacutecidaEDTA e com cloroquina
226 Verificar se o tempo de execuccedilatildeo da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA descrito
nos textos de referecircncia eacute reprodutiacutevel
21
3 JUSTIFICATIVA
Algumas condiccedilotildees cliacutenicas podem levar ao depoacutesito ldquoin vivordquo de anticorpos eou
fraccedilotildees do complemento sobre as hemaacutecias Entre elas estatildeo as reaccedilotildees hemoliacuteticas poacutes-
transfusionais a doenccedila hemoliacutetica perinatal o uso de medicamentos e principalmente a
AHAI Na AHAI um anticorpo normalmente da classe IgG ou IgM reconhece antiacutegenos
proacuteprios na membrana eritrocitaacuteria e reduz a sobrevida da hemaacutecia levando a sua destruiccedilatildeo
pelos macroacutefagos no sistema reticulo-endotelial ou agrave ativaccedilatildeo do complexo de ataque agrave
membrana e agrave lise intravascular Os autoanticorpos satildeo voltados na maioria das vezes contra
antiacutegenos eritrocitaacuterios de alta frequecircncia populacional conhecidos como antiacutegenos puacuteblicos
e por este motivo reconhecem tanto hemaacutecias autoacutelogas quanto alogecircnicas
Devido agrave presenccedila do autoanticorpo livre no plasma e tambeacutem do anticorpo eou
complemento ligado agrave hemaacutecia o banco de sangue pode encontrar dificuldades em todas as
fases dos testes preacute-transfusionais do paciente com AHAI e deve utilizar teacutecnicas que
auxiliem na escolha do melhor hemocomponente melhorando a seguranccedila transfusional Essas
teacutecnicas visam remover a interferecircncia do autoanticorpo livre no soro e do autoanticorpo
ligado agrave hemaacutecia permitindo a detecccedilatildeo de aloanticorpos associados e a realizaccedilatildeo da
fenotipagem eritrocitaacuteria respectivamente
A finalizaccedilatildeo dos testes preacute-tranfusionais na presenccedila de autoanticorpo pode levar
algumas horas e nem sempre o paciente poderaacute aguardar Nesse contexto torna-se vantajosa a
aplicaccedilatildeo de teacutecnicas de raacutepida execuccedilatildeo
O presente estudo propotildee aplicar e avaliar a eficaacutecia da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
em remover os anticorpos ligados agrave hemaacutecia o que permite a fenotipagem eritrocitaacuteria
estendida e a seleccedilatildeo de concentrados de hemaacutecias com mesmo fenoacutetipo do paciente
Atualmente no Hemocentro de Ribeiratildeo Preto a teacutecnica utilizada para esse fim eacute o
tratamento das hemaacutecias com difosfato de cloroquina cujo tempo de execuccedilatildeo pode demorar
ateacute duas horas enquanto a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser realizada em apenas dois
minutos o que a tornaria opccedilatildeo de escolha especialmente em situaccedilotildees de urgecircncia Ao
contraacuterio da cloroquina a glicina-aacutecidaEDTA permite tambeacutem o estudo do eluato das
hemaacutecias tratadas
22
4 METODOL OGIA
41 AMOSTRAS DE DOADORES
Foram coletados 50 amostras de doadores de sangue que compareceram ao
Hemonuacutecleo de Araccedilatuba no periacuteodo de junho a agosto de 2016 Foram convidados a
participar da pesquisa doadores de repeticcedilatildeo do tipo sanguiacuteneo ldquoOrdquo RhD positivo
cadastrados no sistema de banco de sangue (SBS) do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto
Todos os doadores que concordaram em participar da pesquisa assinaram o termo de
consentimento livre e esclarecido (TCLE)
No momento da doaccedilatildeo foram coletados adicionalmente 5 mL de sangue total em
soluccedilatildeo anticoagulante EDTA (aacutecido dietilenoaminoaceacutetico) dispensando punccedilatildeo venosa
adicional para coleta da amostra O fluxograma 1 resume as etapas desenvolvidas no projeto
Fluxograma 1 - Fluxo da pesquisa utilizando as amostras de doadores
23
411 FENOTIPAGEM
Foram verificados se os doadores jaacute tinham fenotipagem para outros sistemas de
grupos sanguiacuteneos aleacutem do sistema ABORh que eacute realizado rotineiramente
A fenotipagem eritrocitaacuteria para outros sistemas ou fenotipagem estendida eacute realizada
para identificar a presenccedila ou ausecircncia de antiacutegenos considerados de importacircncia cliacutenica No
Hemonuacutecleo de Araccedilatuba uma parcela de doadores de repeticcedilatildeo satildeo fenotipados para os
antiacutegenos dos sistemas de grupo sanguiacuteneo Rh (antiacutegenos C c E e e) Kell (antiacutegeno K)
Duffy (antiacutegenos Fya e Fy
b) Kidd (antiacutegenos Jk
a e Jk
b) e sistema MNSs (antiacutegenos S e s)
A fenotipagem para o Rh e Kell eacute realizada por metodologia de microplaca utilizando
25 microL de hemaacutecia lavada e diluiacuteda a 5 em salina e 25 microL do antissoro comercial especiacutefico
A reaccedilatildeo eacute incubada 15 minutos a temperatura ambiente e centrifugadas para leitura Para os
antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s a metolodogia utilizado eacute gel contendo antiglobulina
humana (gel LissCoombs poliespeciacutefico) da marca BIO-RAD onde se utiliza suspensatildeo de
hemaacutecia em LISS (Soluccedilatildeo de baixa forccedila iocircnica) A suspensatildeo eacute preparada atraveacutes da
diluiccedilatildeo de 10 microL de hemaacutecia em 1000 microL de LISS Pipetado 50 microL dessa diluiccedilatildeo no gel e
adicionado 25 microL do antissoro especiacutefico Incuba-se em banho seco por 15 minutos a 37 deg
Celsius e eacute centrifugado em centriacutefuga especiacutefica Os antissoros utilizados eram das marcas
Fresenius e Lorne
Foi verificado a fenotipagem do doador no banco de dados do Hemocentro Os
registros dos fenoacutetipos dos doadores ficam armazenadas no sistema de banco de sangue
(SBS) Para doadores que natildeo tinham fenotipagem estendida preacutevia para antiacutegenos do sistema
Rh (C c E e e) e Kell (K) foi realizada a fenotipagem para esses antiacutegenos
O tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA e cloroquina para dissociar
anticorpos pode inativar enfraquecer ou destruir os antiacutegenos presentes nas hemaacutecias
alterando assim os resultados da fenotipagem Para verificar se houve destruiccedilatildeo dos
antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a e Jk
b S e s nas amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes
tratamento foram novamente fenotipadas ao final para os antiacutegenos que eram inicialmente
positivas
A repeticcedilatildeo da fenotipagem foi realizada nas amostras que apresentaram efetividade
no tratamento da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eou da cloroquina e a detecccedilatildeo do antiacutegeno
na amostra preacute-tratamento
24
412 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS HEMAacuteCIAS
As hemaacutecias foram sensibilizadas com antissoros policlonais humanos de amostras de
plasma fresco congelado de doadores com resultado de pesquisa de anticorpo irregular
positivos
A escolha do anticorpo para sensibilizar as hemaacutecias foi definida de acordo com o
fenoacutetipo do doador que deveria ser positivo para o respectivo antiacutegeno
Para a sensibilizaccedilatildeo um volume de antissoro (1 mL) e um volume (1 mL) de
hemaacutecias lavadas quatro vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica foram adicionadas a um tubo de 12 x
75 mm A mistura foi homogeneizada e incubada em banho maria (BM) a 37deg C por 60
minutos A seguir as hemaacutecias foram novamente lavadas 4 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica
para retirada dos anticorpos que natildeo se ligaram A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada
como controle negativo O teste da uacuteltima lavagem eacute importante para assegurar que os
anticorpos que poderatildeo ser detectados no eluato apoacutes o tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA
sejam aqueles que estavam ligados agraves hemaacutecias e natildeo aqueles livres no plasma O controle
negativo mostra que todo o anticorpo livre foi retirado (LEGER 2011)
Para o teste de presenccedila de anticorpo na soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foram incubadas
com hemaacutecias de triagem de anticorpos irregulares (ID-Diacell BIO-RAD) contendo os
antiacutegenos especiacuteficos Realizado a teacutecnica em gel LissCoombs com anti-IgG+C3d Incubado
no tempo de 15 minutos a temperatura de 37deg C e centrifugado 10 minutos em centriacutefuga
proacutepria
As 50 amostras de doadores foram sensibilizadas com os anticorpos policlonais
humanos
Apoacutes sensibilizadas rdquoin vitrordquo e lavadas as hemaacutecias foram diluiacutedas em soluccedilatildeo de
baixa forccedila iocircnica (LISS) na quantidade de 10 microL de hemaacutecia para 1000 microL de soluccedilatildeo A
suspensatildeo foi pipetada (50 microL) em coluna-gel-teste LissCoombs (BIO-RAD) que contecircm
antiglobulina poliespeciacutefico (IgG+C3d) e centrifugada em baixa rotaccedilatildeo conforme orientaccedilatildeo
do fabricante durante 10 minutos
As amostras deveriam apresentar aglutinaccedilatildeo com reatividade 3 a 4+ no TDA As
amostras que apresentaram reaccedilatildeo menor que 3+ foram novamente sensibilizadas com nova
aliacutequota do antissoro
25
413 TRATAMENTO DAS AMOSTRAS
As amostras sensibilizadas apresentando o TDA positivo 3 ou 4+ foram divididas em
duas aliacutequotas e submetidas a duas teacutecnicas diferentes com o objetivo de dissociar o anticorpo
ligado Uma aliacutequota da amostra foi tratada com soluccedilatildeo de difosfato de cloroquina enquanto
a outra aliacutequota foi tratada com glicina-aacutecidaEDTA
42 PREPARO DA GLICINA AacuteCIDA-EDTA
A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA utiliza 3 soluccedilotildees diferentes a glicina aacutecida o
EDTA e o tampatildeo TRIS
Os reagentes foram preparados utilizando os sais para anaacutelise (PA) de EDTA
(Na2EDTA2H2O) TRIS (C4H11NO3) Glicina (H2NCH2CO2H) NaCl e a soluccedilatildeo de aacutecido
cloriacutedrico (HCl) 12 N todos reagentes da marca SYNTH (quadro 1)
Para o preparo do tampatildeo glicina-acida eacute necessaacuterio o ajuste do pH para 15 Para esse
ajuste utiliza-se aacutecido cloriacutedrico (HCl) concentrado O pH foi medido com fitas reativas de pH
com escala de 1 a 14 da marca MERCK Posteriormente a soluccedilatildeo foi enviada ao laboratoacuterio
de controle de qualidade do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto e o pH medido no peagacircmetro O
tampatildeo glicina-aacutecida foi armazenado a 4deg e o tampatildeo tris e o EDTA em temperatura ambiente
controlada (20 a 24deg Celsius)
Apoacutes o preparo e durante a realizaccedilatildeo dos testes foram feitas inspeccedilotildees visuais para
verificaccedilatildeo de turvaccedilatildeo do meio e presenccedila de precipitados
Reagente Material Quantidade Preparo e
Conservaccedilatildeo
EDTA
EDTA
(Na2EDTA2H2O)
5 gramas Mistura ateacute
dissoluccedilatildeo do sal e
conserva em
temperatura ambiente Aacutegua Destilada 50 Ml
Tris
TRIS (C4H11NO3) 121 gramas Conservar em
temperatura ambiente NaCl 525g
Aacutegua destilada 100ml
Gliacutecina-aacutecida
Glicina
(H2NCH2CO2H) 15 gramas
Conservar a 4oC NaCl 116gramas
Aacutegua Destilada 200ml
HCL 12N Ajutar o pH para 15
Quadro 1 - Preparo dos Reagentes da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
Fonte - Manual teacutecnico AABB 2011
26
O tampatildeo glicina-aacutecida e o tampatildeo TRIS satildeo estaacuteveis por 7 meses O reagente EDTA
precipitou mesmo estando em temperatura em ambiente controlado Houve necessidade de
preparo de novo reagente
421 TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
1 Em um tubo de ensaio 12x75 mm eacute adicionado 08 mL da soluccedilatildeo de glicina-aacutecida A
esta soluccedilatildeo adiciona-se 02 mL de EDTA e mistura
2 Adiciona-se 02 mL de hemaacutecias sensibilizadas (lavada 4 vezes) A mistura eacute
homogeneizada e incubada por exatamente 2 minutos
3 A seguir 01 mL de tampatildeo TRIS eacute adicionado agrave mistura que eacute novamente
homogeneizada e centrifugada por 2 minutos a 3400 rpm O pH deve estar entre 7 a 75
4 Apoacutes centrifugaccedilatildeo separa-se em outro tubo o sobrenadante (eluato) e as hemaacutecias
que permanecem satildeo lavadas 4 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica para retirada de todo o
reagente e anticorpos livres
43 PREPARO DA CLOROQUINA
A cloroquina eacute diluiacuteda em tampatildeo PBS na concentraccedilatildeo de 20 (Quadro 2) e
armazenado a 4deg Celsius sua validade apoacutes o preparo eacute de 1 mecircs
A teacutecnica da cloroquina jaacute estaacute padronizada para rotina do laboratoacuterio de
imunohematologia do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto e suas unidades
Reagente Reagentes Quantidade PreparoConservaccedilatildeo
Cloroquina
Difosfato de cloroquina
(C18H32ClN3O8P2)
20 gramas
Conservar a 4deg Celsius
Tampatildeo PBS 100ml
NaOH 01 N Acertar o pH para
51
Quadro 2 - Preparo da Cloroquina Fonte - Manual teacutecnico da AABB 2011
431 TEacuteCNICA DA CLOROQUINA
1 4 partes da soluccedilatildeo pronta eacute adicionada a uma parte de hemaacutecias lavadas 4 vezes com
soluccedilatildeo fisioloacutegica
2 A mistura eacute incubada em temperatura ambiente por ateacute duas horas
3 Centrifugar a 3400 rpm por 2 minutos
27
4 Remover o sobrenadante lavar as hemaacutecias novamente com soluccedilatildeo fisioloacutegica 4
vezes
44 VERIFICACcedilAtildeO DA EFETIVIDADE DOS TESTES
Apoacutes tratamento pelas duas teacutecnicas o TDA foi repetido em todas as amostras para
verificar se os tratamentos foram efetivos e houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo Para as
amostras tratadas pela teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA que permaneceram com TDA positivo
novo tratamento foi realizado
45 TESTE DO ELUATO
O eluato resultante das amostras tratadas com glicina-acidaEDTA foi testado com
hemaacutecias de triagem A soluccedilatildeo do eluato foi incubada com as hemaacutecias de triagem de
anticorpos (ID-Diacell BIO-RAD) pela teacutecnica em gel LissCoombs O teste foi incubado 15
minutos a 37deg Celsius e centrifugado por 10 minutos em centrifuga proacutepria para a teacutecnica em
gel Os eluatos que apresentaram resultados positivos foram testados em painel de 11
hemaacutecias (ID-Diapanel BIO-RAD) para a identificaccedilatildeo do anticorpo
46 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente que apresentou TDA positivo por IgG e pesquisa
de anticorpo irregular positivo com presenccedila de autoanticorpo com reatividade panaglutinina
A amostra foi tratada em paralelo pelas duas teacutecnicas descritas e foi enviada para o
Hemocentro para genotipagem eritrocitaacuteria que foi realizado por metodologia PCR em tempo
real no equipamento Real-time system PCR 7500 ( Applied Biosystems Califoacuternia EUA)
28
5 RESULTADOS
51 REAGENTES
Para aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA satildeo necessaacuterios 3 diferentes
reagentes que podem ser encontrados em forma de kit pronto para uso No entanto esses kits
natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil Os reagentes satildeo tampatildeo glicina-aacutecida o EDTA e o tampatildeo
Tris
Todos os reagentes foram preparados rdquoin houserdquo a partir dos sais e soluccedilotildees PA (puro
para anaacutelise) da marca SYNTH que foram adquiridos para a pesquisa O custo estimado para
cada teste foi aproximadamente R$ 020 reais
Apoacutes o preparo os reagentes poderiam ser armazenados em condiccedilotildees adequadas pelo
periacuteodo de 1 ano (AABB 2011) Ao final do preparo e durante o periacuteodo de armazenamento
de fevereiro a setembro de 2016 foi realizada inspeccedilatildeo visual para verificar a presenccedila de
precipitados ou turvaccedilatildeo A soluccedilatildeo de glicina e o tampatildeo TRIS mostraram-se estaacuteveis ateacute o
final do periacuteodo Por sua vez o reagente EDTA precipitou mesmo estando armazenado em
temperatura ambiente controlada e foi necessaacuterio novo preparo
52 AMOSTRAS DE DOADORES
521 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS AMOSTRAS
Apoacutes incubaccedilatildeo da hemaacutecia com o antissoro a mesma foi lavada 4 vezes para retirada
dos anticorpos livres A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada Caso houvesse positividade na
soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem a etapa era repetida (figura 3) Das 50 amostras sensibilizadas a
uacuteltima lavagem foi positiva somente em 3 delas Nas 3 amostras o anticorpo utilizado para
sensibilizaccedilatildeo foi o anti-K Apoacutes repetido nova etapa de lavagem os resultados se
apresentaram negativos
Em todas as amostras sensibilizadas ldquoin vitrordquo o TDA foi testado e verificado a
intensidade do teste Entre as 50 amostras 47 alcanccedilaram TDA com intensidade 3-4+ apoacutes a
primeira sensibilizaccedilatildeo enquanto 3 amostras necessitaram uma segunda incubaccedilatildeo com
anticorpo (figura 4)
A escolha dos anticorpos para sensibilizar as hemaacutecias foi feita de acordo com o
fenoacutetipo do doador e foram utilizados sete diferentes especificidades de anticorpos policlonais
humanos conforme mostra o graacutefico1
29
Figura 3 - Soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada com hemaacutecia de triagem de
anticorpos em gel LissCoombs (BIO-RAD) A finalidade eacute verificar a presenccedila de anticorpos livres na
suspensatildeo que possam interferir na pesquisa do eluato As soluccedilotildees de lavagem das amostras na figura a tiveram
resultados negativos Na figura b duas amostras a 47 e 50 apresentaram resultado positivo Nova etapa de
lavagem foi realizada e o resultado final foi negativo
522 TRATAMENTO DAS HEMAacuteCIAS
Apoacutes a sensibilizaccedilatildeo e obtenccedilatildeo de resultados de TDA com intensidade de 3 a 4+
cada uma das amostras foi dividida em duas aliacutequotas e tratada separadamente pelas teacutecnicas
de glicinaaacutecida-EDTA e cloroquina
As teacutecnicas foram consideradas efetivas quando obteve-se a completa dissociaccedilatildeo do
anticorpo verificada atraveacutes do TDA negativo na amostra poacutes tratamento conforme figuras 5
e 6 Dentre as amostras tratadas com cloroquina 2850 tiveram o TDA negativado A glicina-
aacutecidaEDTA negativou o TDA em 33 das 50 amostras tratadas Apenas 17 amostras tratadas
com glicina-aacutecidaEDTA permaneceram com o TDA positivo e foram submetidas a um novo
tratamento
30
Figura 4 - TDA das amostras apoacutes sensibilizaccedilatildeo com anticorpos policlonais humanos Amostras na
figura a com intensidades de 3-4+ Na figura b amostras 4 e 7 com intensidade menor que 3+ e portanto foram
novamente sensibilizadas com nova aliacutequota de soro Anti-D e anti-S Apoacutes a segunda sensibilizaccedilatildeo
apresentaram reatividade 4 e 3+ respectivamente Os anticorpos utilizados para sensibilizaccedilatildeo foram D S c E
C e K
523 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS TEacuteCNICAS
No tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA houve dissociaccedilatildeo completa do anticorpo
em 33 amostras (66) das 50 amostras testadas enquanto que com a cloroquina foram 28
amostras (56) (tabela 1)
31
Graacutefico 1- Nuacutemero de amostras sesnsibilizadas por especificidade de anticorpo Entre as 50 amostras 12
foram sensibilizadas com anti-D 10 com anti-C 9 com anti-E 8 com anti-c 7 com anti-S 3 com anti-K e 1
com anti-Dia As especificidades dos anticorpos foram definidas de acordo o fenoacutetipo do doador
Figura 5 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com cloroquina Nas amostras onde houve
a dissociaccedilatildeo do anticorpo ( 2 21 a 23 26 39 a 42 45 46 e 49) a hemaacutecia se deposita no fundo no microtubo
apoacutes a centrifugaccedilatildeo (TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (1 3 24 25 43 44 47
48 e 50) o anticorpo ligado agraves hemaacutecias eacute alvo da AGH presente no gel (TDA positivo)
Anti-D 12
Anti-C 10
Anti-E 9
Anti-c 8
Anti-S 7
Anti-K 3 Anti-Dia 1
32
Figura 6 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA Nas amostras
onde houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo (4 6 7 12 a 15 17 34 35 37 e 38) a hemaacutecia se deposita no fundo no
microtubo apoacutes a centrifugaccedilatildeo ( TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (5 16 18
19 20 33 e 36 ) o AGH presente no gel se liga ao anticorpo ligado agraves hemaacutecias que ficam retidas no gel (TDA
positivo)
Tabela 1-Resultado geral do tratamento das hemaacutecias com glicina e cloroquina
Teacutecnica utilizada TDA negativo TDA positivo Total
Glicina-aacutecidaEDTA 33 17 50
Cloroquina 28 22 50
A glicina-aacutecidaEDTA conseguiu negativar mais amostras sensibilizadas com Anti-D
e anti-K que a cloroquina Para as hemaacutecias sensibilizadas com anti-E Anti-S e Anti-Dia
ambas as teacutecnicas dissociaram o anticorpo em 100 das amostras Os resultados detalhados
por especificidade do anticorpo apoacutes o primeiro tratamento com glicina-aacutecidaEDTA e com
cloroquina estatildeo na tabela 2
Para as amostras que permaneceram positivas (17 amostras) apoacutes o tratamento com a
glicina-aacutecidaEDTA foi realizado um novo tratamento Houve dissociaccedilatildeo do anticorpo em 3
amostras (18) apoacutes a segunda tentativa Nas demais 14 (82) amostras tratadas pela
segunda vez 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise
33
Tabela 2 - Resultados do TDA apoacutes tratamento das hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo
sensibilizado
ANTICORPOS
SENSIBILIZADOS
1ordm TRATAMENTO COM
GLICINA
TRATAMENTO COM
CLOROQUINA
TOTAL TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
Anti-D 8 4 0 12 12
Anti-C 6 4 10 0 10
Anti-E 9 0 9 0 9
Anti-c 0 8 1 7 8
Anti-S 7 0 7 0 7
Anti-K 2 1 0 3 3
Anti-Dia 1 0 1 0 1
TOTAL 33 17 28 22 50
A hemoacutelise foi verificada durante o procedimento de lavagem final das hemaacutecias com
soluccedilatildeo fisioloacutegica para a retirada dos reagentes As soluccedilotildees de lavagem ficaram
avermelhadas e as hemaacutecias com coloraccedilatildeo escura As amostras foram descartadas Dentre as
6 amostras que ainda puderam ser testadas para o TDA trecircs amostras negativaram sendo 1
sensibilizada com anti-D e 2 com anti-C (tabela 3)
Tabela 3 - Resultado apoacutes o segundo tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA
Tratamento com
glicina-aacutecidaEDTA
TDA Negativo TDA Positvo Hemoacutelise Total
Segundo tratamento 3 3 11 17
524 TESTAGEM DO ELUATO
Apoacutes o tratamento com a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA a soluccedilatildeo do eluato foi
testada para verificar a viabilidade dos anticorpos que foram dissociados ou eluiacutedos Dentre
as 50 amostras 41 apresentaram eluato positivo As nove amostras cujos eluatos foram
negativos haviam sido sensibilizadas com as seguintes especificidades de anticorpos anti-E 6
amostras (67) anti-S 2 amostras (40) e anti-D 1 amostra (8) (tabela 4) O eluato de
todas as amostras sensibilizadas com os anticorpos anti-C anti-c Anti-K e Anti-Dia foram
positivos Os eluatos positivos na triagem de anticorpos foram testados com paineacuteis de
identificaccedilatildeo para confirmar a especificidade e a viabilidade dos anticorpos (figuras 7 e 8)
34
525 EFEITO DA ELUICcedilAtildeO SOBRE OS ANTIacuteGENOS ERITROCITAacuteRIOS
Para verificar o efeito do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA e com a cloroquina
sobre a expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s foi realizada a fenotipagem das
amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes tratamento com ambas as teacutecnicas Foi avaliado
se o tratamento destruiu os antiacutegenos expressos antes do tratamento
Tabela 4- Resultado do Eluato das amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA
Anticorpos Eluato positvo Eluato negativo Total
Anti-D 11 1 12
Anti-C 10 0 10
Anti-E 3 6 9
Anti-c 8 0 8
Anti-S 5 2 7
Anti-K 3 0 3
Anti-Dia 1 0 1
Total 41 9 50
Figura 7 ndash Painel do eluato da amostra 21 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-C que foi
recuperado no eluato
Figura 8 ndash Painel do eluato da amostra 47 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-K que foi
recuperado no eluato
35
Dentre as 50 amostras 26 eram previamente fenotipadas para os antiacutegenos Fya Fy
b
Jka Jk
b S e s Dentre elas 20 alcanccedilaram TDA negativo apoacutes tratamento com a glicina-
aacutecidaEDTA e 20 negativaram apoacutes tratamento com cloroquina (tabela 5) Apoacutes ambas as
teacutecnicas os antiacutegenos originalmente expressos permaneceram positivos comprovando que natildeo
houve destruiccedilatildeo dos mesmos
Tabela 5 ndash Verificaccedilatildeo da interferecircncia do tratamento da hemaacutecias com cloroquina e glicina-
aacuteicdaEDTA sobre os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
AMOSTRAS
COM
FENOTIPAGEM
PREacuteVIA
TRATADAS COM
CLOROQUINA
TRATADAS COM
GLICINA
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
26
20
20
20
20
As amostras 24 47 e 50 eram positivas para o antiacutegeno K A cloroquina natildeo dissociou
o anticorpo em nenhuma das 3 amostras enquanto a glicina-aacutecidaEDTA foi efetiva nas
amostras 24 e 50 Foi testada a expressatildeo do antiacutegeno K nas amostras 24 e 50 apoacutes o
tratamento utilizando meacutetodo indireto em gel contendo AGH Apesar de natildeo ter sido avaliado
a intensidade de reaccedilatildeo de expressatildeo dos antiacutegenos podemos verificar na figura 9 que nas
duas amostras em que a teacutecnica foi efetiva e dissociou o anticorpo a expressatildeo do antiacutegeno K
continua presente mas a reatividade observada pode ser considerada 1+ sugerindo que houve
diminuiccedilatildeo da expressatildeo do antiacutegeno quando comparado com a expressatildeo observada em
hemaacutecia natildeo tratada
Os resultados individuais de cada amostra em ambas as teacutecnicas encontram-se
resumidas na tabela 6
526 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente onde foi constatada a presenccedila de autoanticorpo
a quente da classe IgG pelo TDA monoespeciacutefico (figura 10)O autoanticorpo tambeacutem
interferia na pesquisa e identificaccedilatildeo de anticorpos irregulares pois apresentava caracteriacutestica
de panaglutinina As hemaacutecias da paciente sensibilizadas ldquoin vivordquo foram tratadas com
cloroquina e com glicina-aacutecidaEDTA
36
Figura 9 ndash Fenotipagem das amostras 24 e 50 para antiacutegeno K apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
O teste positivo indica a presenccedila do antiacutegeno poreacutem a reatividade fraca (1+) sugere que houve enfraquecimento
de sua expressatildeo A direita a expressatildeo forte (4+) do antiacutegeno Kell em hemaacutecia controle natildeo tratada utilizada
como controle positivo
A cloroquina natildeo foi efetiva na retirada do anticorpo ligado as hemaacutecias ao contraacuterio
do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA que dissociou o anticorpo (figura 11)
A hemaacutecia tratada com glicina foi fenotipada para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
(figura 12) A fenotipagem para o sistema Rh (C c E e e) e Kell foi realizada em gel
especiacutefico monoclonal sem interferecircncia do TDA positivo (controle da reaccedilatildeo negativo)
O eluato resultante do tratamento com glicina-aacutecidaEDTA foi testada em gel com
hemaacutecias de painel de identificaccedilatildeo de anticorpos e apresentou resultado positivo com todas
as ceacutelulas (figura 13 e 14)
A amostra foi enviada para genotipagem e o resultado da genotipagem confirmou o
resultado da fenotipagem apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
527 TEMPO DE EXECUCcedilAtildeO DA TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
O tempo de reaccedilatildeo da glicina-aacutecidaEDTA eacute de 2 minutos Todas as amostras foram
tratadas obedecendo ao tempo descrito na literatura demonstrando que o mesmo eacute
reprodutiacutevel
37
Tabela 6- Resultados individuais por amostra
Amostra Especificidade
dos anticorpos
Intensidade do
TDA apoacutes
sensibilizaccedilatildeo
Tratamento
efetivo com
cloroquina
Tratamento
efetivo com
glicina
Eluato
poacutes
glicina
1 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 2 Dia 3+ Sim Sim 3+ 3 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 4 D 4+ Natildeo Sim 4+ 5 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 6 E 3+ Sim Sim Negativo 7 S 4+ Sim Sim 3+ 8 E 3+ Sim Sim 1+ 9 E 3+ Sim Sim 2+
10 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 11 D 4+ Natildeo Sim 4+ 12 D 4+ Natildeo Sim 4+ 13 S 3+ Sim Sim 3+ 14 S 3+ Sim Sim 3+ 15 D 3+ Natildeo Sim 3+ 16 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 17 E 3+ Sim Sim (+) 18 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 19 D 4+ Natildeo Natildeo 3+ 20 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 21 C 3+ Sim Sim 4+ 22 C 3+ Sim Sim 4+ 23 C 3+ Sim Sim 4+ 24 K 4+ Natildeo Sim 4+ 25 D 3+ Natildeo Natildeo Negativo 26 E 4+ Sim Sim Negativo 27 S 3+ Sim Sim 3+ 28 C 3+ Sim Natildeo 4+ 29 C 3+ Sim Sim 4+ 30 C 3+ Sim Sim 4+ 31 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 32 E 3+ Sim Sim Negativo 33 C 3+ Sim Natildeo 4+ 34 S 3+ Sim Sim Negativo 35 S 3+ Sim Sim Negativo 36 C 4+ Sim Natildeo 4+ 37 c 4+ Natildeo Natildeo 4+ 38 D 4+ Natildeo Sim 4+ 39 S 3+ Sim Sim 3+ 40 c 4+ Sim Natildeo 2+ 41 C 4+ Sim Natildeo 4+ 42 E 3+ Sim Sim Negativo 43 D 3+ Natildeo Sim 2+ 44 D 3+ Natildeo Sim 2+ 45 E 3+ Sim Sim Negativo 46 C 3+ Sim Sim 4+ 47 K 4+ Natildeo Natildeo 4+ 48 D 3+ Natildeo Sim 2+ 49 E 3+ Sim Sim Negativo 50 K 4+ Natildeo Sim 4+
TOTAL 50 28 33 41
38
Figura 10 ndash TDA monoespeciacutefico da amostra de paciente Hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo da classe
IgG
oacute Figura 11 ndash TDA apoacutes o tratamento com glicina-aacutecidaEDTA (esquerda) e cloroquina (direita) A glicina
negativou completamente o TDA enquanto a hemaacutecia tratada com cloroquina persistiu positiva (1+)
39
Figura 12 ndash Fenotipagem da amostra tratada com glicina-aacutecidaEDTA Fy(a+b+) Jk(a-b+) S+s+
Figura 13 ndash Painel em gel (LissAGH) do eluato apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de
intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
Figura 14 ndash ndash Painel ezimaacutetico (hemaacutecias tratadas com bromelina) do eluato em gel neutro apoacutes
tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
40
528 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Quanto a efetividade das teacutecnicas em negativar o TDA foi verificado que a glicina-
aacutecidaEDTA foi efetiva em 66 das amostras testadas no primeiro tratamento (3350
amostras) enquanto a cloroquina conseguiu negativar 56 (2850) Esses resultados natildeo
apresentam diferenccedila significativa (pgt005) demostrando que a teacutecnica da glicina-
aacutecidaEDTA natildeo eacute superior mas eacute tatildeo efetiva quanto a da cloroquina
Quando aliamos os resultados de ambas as teacutecnicas verificamos que em 76 (3850)
das amostras o TDA foi negativado Esse dado indica que ainda que uma teacutecnica natildeo seja
eficaz na remoccedilatildeo do anticorpo eacute uma boa alternativa tentar a segunda teacutecnica jaacute que a falha
em remover o anticorpo utilizando uma delas natildeo prevecirc necessariamente a falha com a outra
Quando se utiliza o teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla (graacutefico 2) para comparar a utilizaccedilatildeo das
duas teacutecnicas com o resultado de cada uma isolada (somente a cloroquina ou somente a
glicina) verificamos que os resultados apresentam diferenccedila significativa (plt005) (quadro 3)
TRATAMENTO EFETIVO COM TOTAL PORCENTAGEM
Glicina ou cloroquina 38 76
Glicina e cloroquina 23 46
Glicina apenas 10 20
Cloroquina apenas 5 10
Nenhuma das teacutecnicas 12 24
Quadro 3 - Resultados comparativos entre as teacutecnicas utilizadas
41
Graacutefico 2 - Teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla entre as teacutecnicas aplicadas A- Glicina e Cloroquina B-Cloroquina C-
Glicina ( plt005)
42
6 DISCUSSAtildeO
Os reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA podem ser adquiridos em
forma de kit comercial prontos para uso poreacutem natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil A preparaccedilatildeo
dos reagentes ldquoin houserdquo a partir de sais comerciais adquiridos se mostrou viaacutevel Os
reagentes glicina e o tampatildeo Tris armazenados de forma correta se mantiveram estaacuteveis por
um periacuteodo de 7 meses Somente o reagente EDTA precipitou mesmo armazenado em
condiccedilotildees adequadas sugerindo que o mesmo deve ser preparado em menor quantidade e
armazenado em aliacutequotas A soluccedilatildeo de cloroquina tambeacutem pode ser preparada ldquoin houserdquo e
pode ser armazenado por um mecircs A legislaccedilatildeo brasileira autoriza a utilizaccedilatildeo de reagentes
preparados a partir de sais comerciais como a cloroquina e a glicina-aacutecidaEDTA desde que
os sais tenham autorizaccedilatildeo da vigilacircncia sanitaacuteria para a comercializaccedilatildeo (BRASIL 2001)
A comparaccedilatildeo quanto a efetividade em dissociar anticorpos em amostras com TDA
positivos entre a teacutecnica da glicina e a teacutecnica da cloroquina mostrou que natildeo haacute diferenccedila
estatiacutestica entre elas e que ambas satildeo igualmente eficientes Se utilizadas conjuntamente haacute
maior possibilidade de elucidaccedilatildeo dos casos
Uma vantagem da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eacute que ela permite numa mesma
amostra eluir o anticorpo ligado aacute hemaacutecia assim como fenotipar a hemaacutecia tratada Devido a
sua dupla utilidade a teacutecnica eacute vantajosa principalmente em pacientes em que pouco volume
de amostra pode ser coletado como em casos de crianccedilas e receacutem-nascidos
A fenotipagem poacutes tratamento se mostrou viaacutevel jaacute que os antiacutegenos de maior
importacircncia natildeo sofreram alteraccedilotildees Nas 20 amostras que foram fenotipadas antes e apoacutes
tratamento para verificar a influecircncia dos reagentes na expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a
Jkb S e s natildeo houve destruiccedilatildeo dos mesmos por nenhuma das duas teacutecnicas
Para as amostras positivas para o antiacutegeno Kell (350) e sensibilizadas com o
respectivo anticorpo a teacutecnica da glicina foi efetiva em negativar o TDA em apenas duas
delas mas apoacutes o tratamento foi verificada uma fraca reatividade da reaccedilatildeo antiacutegeno-
anticorpo sugerindo que houve um enfraquecimento da expressatildeo do antiacutegeno conforme
esperado e descrito na literatura (BYRNE 1991 PALLAS WILER E MCGEE 1991
ROZIERS e SQUALI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012 e KATHARIA e
CHAUDHARY 2013) A accedilatildeo da glicina sobre o antigeno Kell natildeo representa impedimento
para seu uso uma vez que na impossibilidade de testar o antiacutegeno Kell o banco de sangue
consegue facilmente atender a solicitaccedilatildeo de transfusatildeo com unidades de hemaacutecias Kell
43
negativas jaacute que eacute um antiacutegeno de baixa prevalecircncia na populaccedilatildeo variando de 15 na
populaccedilatildeo africana a 9 nos europeus (DANIELS 2011)
A soluccedilatildeo resultante da dissociaccedilatildeo do anticorpo pela teacutecnica da glicina pode ainda ser
utilizada como eluato podendo substituir a teacutecnica de eluiccedilatildeo com reagentes comercias (kits
de eluiccedilatildeo aacutecida) que tem alto custo aproximadamente entre R$2000 a R$2500 por teste
Em 41 amostras (82) houve a dissociaccedilatildeo e recuperaccedilatildeo do anticorpo que estava
sensibilizando as hemaacutecias Em 9 amostras (18) os anticorpos foram eluiacutedos poreacutem
apresentaram reaccedilatildeo negativa quando testadas com hemaacutecias de triagem entre eles o anti-E
(6) anti-S (2) e Anti-D (1) Eacute possiacutevel que a correccedilatildeo pH do meio (WALKER 2011) natildeo
tenha sido adequada o que pode ter desfavorecido a reatividade do anticorpo
Para as amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA nas quais natildeo houve dissociaccedilatildeo do
anticorpo pelo primeiro tratamento (1750) o segundo tratamento natildeo se mostrou eficaz jaacute
que 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise O tempo de
armazenagem natildeo parece ter influenciado jaacute que todas as amostras foram testadas dentro de
48 horas apoacutes a coleta Outros fatores que natildeo foram verificados podem ter levado a
hemoacutelise Apesar da literatura (LOUIE JIENG e ZEROULIS 1986 e BYRNE 1991)
recomendar um segundo tratamento ele eacute pouco eficaz tendo negativado apenas 3 das 17
amostras testadas
A amostra de paciente que apresentou sensibilizaccedilatildeo ldquoin vivordquo mostrou melhor
efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA sobre a da cloroquina possibilitando
fenotipagem para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s que natildeo foram destruiacutedos apoacutes o
tratamento comprovado atraveacutes da genotipagem
A presenccedila de autoanticorpo a quente com presenccedila de hemoacutelise (AHAI) ou natildeo pode
mascarar a presenccedila de aloanticorpo interferindo na rotina soroloacutegica da fenotipagem que eacute
uma importante ferramenta para auxiliar na seleccedilatildeo de hemaacutecias para transfusatildeo (SHIREY et
al 2002) Esses pacientes frequentemente possuem aloanticorpos associados ao
autoanticorpo e a prevalecircncia de aloimunizaccedilatildeo entre eles varia entre 12 a 40 (LEGER e
GARRATY 1999 BRANCH e PETZ 1999) o que dificulta ainda mais a escolha do melhor
componente a ser transfundido aleacutem de aumentar a possibilidade reaccedilotildees hemoliacuteticas imunes
poacutes-transfusionais
Nesses casos as teacutecnicas de dissociaccedilatildeo de anticorpos satildeo importantes para tratar
amostras de pacientes e a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser usada como uma opccedilatildeo
pois se mostrou eficaz na dissociaccedilatildeo anticorpo ligado agraves hemaacutecias deixando livre a
superfiacutecie das mesmas permitindo a fenotipagem por antisoros IgG Paralelamente os
44
anticorpos eluiacutedos tambeacutem puderam ser estudados O mesmo natildeo ocorre com a cloroquina
que permite apenas a fenotipagem e tampouco com os kits de eluiccedilatildeo aacutecida disponiacuteveis no
mercado nacional que satildeo destinados a realizaccedilatildeo do eluato mas destroem as hemaacutecias
O tempo de tratamento na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA tambeacutem eacute uma vantagem
pois foi possiacutevel reproduzir no tempo determinado de 2 minutos enquanto a cloroquina
demora ateacute duas horas
Ainda que a aplicaccedilatildeo das teacutecnicas por biologia molecular estejam cada vez mais
presentes na rotina imuno-hematoloacutegica e possibilitam estabelecer o fenoacutetipo deduzido do
genoacutetipo elas natildeo estatildeo disponiacuteveis na maioria dos centros e sua realizaccedilatildeo exige algumas
horas A resoluccedilatildeo imediata do problema transfusional necessita dos resultados soroloacutegicos
pois com frequecircncia natildeo eacute possiacutevel aguardar o resultado do teste molecular Dessa forma
apesar da crescente importacircncia da genotipagem eritrocitaacuteria teacutecnicas soroloacutegicas aplicadas
corretamente e no momento propiacutecio satildeo de grande utilidade para resolver problemas imuno-
hematoloacutegicos como ocorre com a fenotipagem em pacientes com TDA positivo
45
7 CONCLUSAtildeO
A teacutecnica da glicina aacutecidaEDTA mostrou-se efetiva em remover os anticorpos que
sensibilizavam as hemaacutecias e pode ser utilizada com seguranccedila antes da fenotipagem
eritrocitaacuteria Por ser uma teacutecnica de raacutepida execuccedilatildeo eacute uma alternativa aplicaacutevel
principalmente em casos urgentes de pacientes que apresentam autoanticorpos
46
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50
9 ANEXOS
51
FUNDACcedilAtildeO HEMOCENTRO DE RIBEIRAtildeO PRETO
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE)
Tiacutetulo da pesquisa Aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina aacutecida-EDTA e avaliaccedilatildeo da
eficaacutecia no tratamento de hemaacutecias com teste direto da antiglobulina positivo
Pesquisadora responsaacutevel Ceacutelia Kazue Abiko
Orientador Prof Dimas Tadeu Covas
Co-orientadora Dra Flaacutevia Leite Souza Santos
Objetivo da pesquisa Vocecirc estaacute sendo convidado a participar de uma pesquisa que tem
como objetivo padronizar uma nova teacutecnica para auxiliar na tipagem sanguiacutenea de pacientes
A tipagem sanguiacutenea pode sofrer interferecircncia da presenccedila de anticorpos ligados aos gloacutebulos
vermelhos do sangue Nessas situaccedilotildees eacute difiacutecil selecionar o melhor sangue para o paciente e
eacute preciso a utilizaccedilatildeo de teacutecnicas adicionais para remover essas interferecircncias
Esta pesquisa tem como objetivo estudar outra teacutecnica para remover esses anticorpos e
comparaacute-la com a teacutecnica atualmente utilizada Para isso precisamos de amostras de pacientes
e doadores voluntaacuterios
Se vocecirc eacute um doador eacute necessaacuterio que vocecirc autorize a coleta de 5 ml (1 tubo) a mais
de seu sangue
Se vocecirc eacute um paciente natildeo haveraacute necessidade de nova amostra pois utilizaremos as
amostras jaacute coletadas para os testes preacute-transfusionais e os resultados encontrados nesta
pesquisa natildeo iratildeo interferir na escolha da (s) bolsa (s) de sangue que vocecirc possa vir a receber
Se vocecirc concordar em participar leia com atenccedilatildeo o texto abaixo e assine as duas vias
rubricando todas as paacuteginas deste termo de consentimento Uma via original assinada e
rubricada por vocecirc e pela pesquisadora ficaraacute com vocecirc
As suas informaccedilotildees seratildeo mantidas em sigilo pela pesquisadora e natildeo haveraacute
armazenamento de material para pesquisas posteriores Os seus dados seratildeo usados apenas
neste estudo e quando o trabalho for publicado seu nome e qualquer outra informaccedilatildeo que
possam identificaacute-lo natildeo seratildeo revelados
Eacute pouco provaacutevel que o que noacutes aprendermos com este estudo tenha um benefiacutecio
direto para vocecirc assim como natildeo poderemos dar nada em troca pela sua participaccedilatildeo na
pesquisa
Nosso objetivo com esta pesquisa eacute que os resultados poderatildeo ser uacuteteis para o
tratamento de pacientes no futuro Os riscos da participaccedilatildeo satildeo miacutenimos Se vocecirc eacute um
doador de sangue a amostra seraacute coletada no momento da doaccedilatildeo natildeo exigindo punccedilatildeo
venosa adicional
52
Eacute seu direito ter acesso aos resultados dos testes da pesquisa Esses resultados natildeo
seratildeo fornecidos automaticamente a vocecirc mas caso vocecirc se interesse em saber o resultado ou
tiver alguma duacutevida sobre a sua participaccedilatildeo neste estudo deveraacute entrar em contato com Ceacutelia
Kazue Abiko pelo telefone (18) 99718-3551
Vocecirc tem total liberdade de optar por natildeo participar da pesquisa Caso aceite
participar poderaacute desistir a qualquer momento ou retirar seu consentimento mesmo apoacutes ter
coletado o sangue Para cancelar sua participaccedilatildeo basta avisar a pesquisadora e os seus dados
seratildeo retirados do projeto
Qualquer duacutevida eacutetica sobre a pesquisa poderaacute entrar em contato com o Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa do Hospital das Cliacutenicas e da Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto
(CAMPUS UNIVERSITAacuteRIO bairro Monte Alegre CEP 14048-900 Ribeiratildeo Preto-SP
Telefone (16) 3602-2228 FAX (16) 3633-1144 e-mail cephcrpuspbr)
Consentimento de participaccedilatildeo
A Consentimento do participante
Li as informaccedilotildees acima sobre o estudo e recebi explicaccedilotildees sobre a participaccedilatildeo no estudo
Portanto dou o meu consentimento para participar do estudo
___________________________________________________________________________
Nome completo
___________________________________________________________________________
Assinatura
___________
Data
__________________________________________________________________________________
Nome completo da pesquisadora
___________________________________________________________________________
Assinatura
_____________
Data
21
3 JUSTIFICATIVA
Algumas condiccedilotildees cliacutenicas podem levar ao depoacutesito ldquoin vivordquo de anticorpos eou
fraccedilotildees do complemento sobre as hemaacutecias Entre elas estatildeo as reaccedilotildees hemoliacuteticas poacutes-
transfusionais a doenccedila hemoliacutetica perinatal o uso de medicamentos e principalmente a
AHAI Na AHAI um anticorpo normalmente da classe IgG ou IgM reconhece antiacutegenos
proacuteprios na membrana eritrocitaacuteria e reduz a sobrevida da hemaacutecia levando a sua destruiccedilatildeo
pelos macroacutefagos no sistema reticulo-endotelial ou agrave ativaccedilatildeo do complexo de ataque agrave
membrana e agrave lise intravascular Os autoanticorpos satildeo voltados na maioria das vezes contra
antiacutegenos eritrocitaacuterios de alta frequecircncia populacional conhecidos como antiacutegenos puacuteblicos
e por este motivo reconhecem tanto hemaacutecias autoacutelogas quanto alogecircnicas
Devido agrave presenccedila do autoanticorpo livre no plasma e tambeacutem do anticorpo eou
complemento ligado agrave hemaacutecia o banco de sangue pode encontrar dificuldades em todas as
fases dos testes preacute-transfusionais do paciente com AHAI e deve utilizar teacutecnicas que
auxiliem na escolha do melhor hemocomponente melhorando a seguranccedila transfusional Essas
teacutecnicas visam remover a interferecircncia do autoanticorpo livre no soro e do autoanticorpo
ligado agrave hemaacutecia permitindo a detecccedilatildeo de aloanticorpos associados e a realizaccedilatildeo da
fenotipagem eritrocitaacuteria respectivamente
A finalizaccedilatildeo dos testes preacute-tranfusionais na presenccedila de autoanticorpo pode levar
algumas horas e nem sempre o paciente poderaacute aguardar Nesse contexto torna-se vantajosa a
aplicaccedilatildeo de teacutecnicas de raacutepida execuccedilatildeo
O presente estudo propotildee aplicar e avaliar a eficaacutecia da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
em remover os anticorpos ligados agrave hemaacutecia o que permite a fenotipagem eritrocitaacuteria
estendida e a seleccedilatildeo de concentrados de hemaacutecias com mesmo fenoacutetipo do paciente
Atualmente no Hemocentro de Ribeiratildeo Preto a teacutecnica utilizada para esse fim eacute o
tratamento das hemaacutecias com difosfato de cloroquina cujo tempo de execuccedilatildeo pode demorar
ateacute duas horas enquanto a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser realizada em apenas dois
minutos o que a tornaria opccedilatildeo de escolha especialmente em situaccedilotildees de urgecircncia Ao
contraacuterio da cloroquina a glicina-aacutecidaEDTA permite tambeacutem o estudo do eluato das
hemaacutecias tratadas
22
4 METODOL OGIA
41 AMOSTRAS DE DOADORES
Foram coletados 50 amostras de doadores de sangue que compareceram ao
Hemonuacutecleo de Araccedilatuba no periacuteodo de junho a agosto de 2016 Foram convidados a
participar da pesquisa doadores de repeticcedilatildeo do tipo sanguiacuteneo ldquoOrdquo RhD positivo
cadastrados no sistema de banco de sangue (SBS) do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto
Todos os doadores que concordaram em participar da pesquisa assinaram o termo de
consentimento livre e esclarecido (TCLE)
No momento da doaccedilatildeo foram coletados adicionalmente 5 mL de sangue total em
soluccedilatildeo anticoagulante EDTA (aacutecido dietilenoaminoaceacutetico) dispensando punccedilatildeo venosa
adicional para coleta da amostra O fluxograma 1 resume as etapas desenvolvidas no projeto
Fluxograma 1 - Fluxo da pesquisa utilizando as amostras de doadores
23
411 FENOTIPAGEM
Foram verificados se os doadores jaacute tinham fenotipagem para outros sistemas de
grupos sanguiacuteneos aleacutem do sistema ABORh que eacute realizado rotineiramente
A fenotipagem eritrocitaacuteria para outros sistemas ou fenotipagem estendida eacute realizada
para identificar a presenccedila ou ausecircncia de antiacutegenos considerados de importacircncia cliacutenica No
Hemonuacutecleo de Araccedilatuba uma parcela de doadores de repeticcedilatildeo satildeo fenotipados para os
antiacutegenos dos sistemas de grupo sanguiacuteneo Rh (antiacutegenos C c E e e) Kell (antiacutegeno K)
Duffy (antiacutegenos Fya e Fy
b) Kidd (antiacutegenos Jk
a e Jk
b) e sistema MNSs (antiacutegenos S e s)
A fenotipagem para o Rh e Kell eacute realizada por metodologia de microplaca utilizando
25 microL de hemaacutecia lavada e diluiacuteda a 5 em salina e 25 microL do antissoro comercial especiacutefico
A reaccedilatildeo eacute incubada 15 minutos a temperatura ambiente e centrifugadas para leitura Para os
antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s a metolodogia utilizado eacute gel contendo antiglobulina
humana (gel LissCoombs poliespeciacutefico) da marca BIO-RAD onde se utiliza suspensatildeo de
hemaacutecia em LISS (Soluccedilatildeo de baixa forccedila iocircnica) A suspensatildeo eacute preparada atraveacutes da
diluiccedilatildeo de 10 microL de hemaacutecia em 1000 microL de LISS Pipetado 50 microL dessa diluiccedilatildeo no gel e
adicionado 25 microL do antissoro especiacutefico Incuba-se em banho seco por 15 minutos a 37 deg
Celsius e eacute centrifugado em centriacutefuga especiacutefica Os antissoros utilizados eram das marcas
Fresenius e Lorne
Foi verificado a fenotipagem do doador no banco de dados do Hemocentro Os
registros dos fenoacutetipos dos doadores ficam armazenadas no sistema de banco de sangue
(SBS) Para doadores que natildeo tinham fenotipagem estendida preacutevia para antiacutegenos do sistema
Rh (C c E e e) e Kell (K) foi realizada a fenotipagem para esses antiacutegenos
O tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA e cloroquina para dissociar
anticorpos pode inativar enfraquecer ou destruir os antiacutegenos presentes nas hemaacutecias
alterando assim os resultados da fenotipagem Para verificar se houve destruiccedilatildeo dos
antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a e Jk
b S e s nas amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes
tratamento foram novamente fenotipadas ao final para os antiacutegenos que eram inicialmente
positivas
A repeticcedilatildeo da fenotipagem foi realizada nas amostras que apresentaram efetividade
no tratamento da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eou da cloroquina e a detecccedilatildeo do antiacutegeno
na amostra preacute-tratamento
24
412 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS HEMAacuteCIAS
As hemaacutecias foram sensibilizadas com antissoros policlonais humanos de amostras de
plasma fresco congelado de doadores com resultado de pesquisa de anticorpo irregular
positivos
A escolha do anticorpo para sensibilizar as hemaacutecias foi definida de acordo com o
fenoacutetipo do doador que deveria ser positivo para o respectivo antiacutegeno
Para a sensibilizaccedilatildeo um volume de antissoro (1 mL) e um volume (1 mL) de
hemaacutecias lavadas quatro vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica foram adicionadas a um tubo de 12 x
75 mm A mistura foi homogeneizada e incubada em banho maria (BM) a 37deg C por 60
minutos A seguir as hemaacutecias foram novamente lavadas 4 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica
para retirada dos anticorpos que natildeo se ligaram A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada
como controle negativo O teste da uacuteltima lavagem eacute importante para assegurar que os
anticorpos que poderatildeo ser detectados no eluato apoacutes o tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA
sejam aqueles que estavam ligados agraves hemaacutecias e natildeo aqueles livres no plasma O controle
negativo mostra que todo o anticorpo livre foi retirado (LEGER 2011)
Para o teste de presenccedila de anticorpo na soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foram incubadas
com hemaacutecias de triagem de anticorpos irregulares (ID-Diacell BIO-RAD) contendo os
antiacutegenos especiacuteficos Realizado a teacutecnica em gel LissCoombs com anti-IgG+C3d Incubado
no tempo de 15 minutos a temperatura de 37deg C e centrifugado 10 minutos em centriacutefuga
proacutepria
As 50 amostras de doadores foram sensibilizadas com os anticorpos policlonais
humanos
Apoacutes sensibilizadas rdquoin vitrordquo e lavadas as hemaacutecias foram diluiacutedas em soluccedilatildeo de
baixa forccedila iocircnica (LISS) na quantidade de 10 microL de hemaacutecia para 1000 microL de soluccedilatildeo A
suspensatildeo foi pipetada (50 microL) em coluna-gel-teste LissCoombs (BIO-RAD) que contecircm
antiglobulina poliespeciacutefico (IgG+C3d) e centrifugada em baixa rotaccedilatildeo conforme orientaccedilatildeo
do fabricante durante 10 minutos
As amostras deveriam apresentar aglutinaccedilatildeo com reatividade 3 a 4+ no TDA As
amostras que apresentaram reaccedilatildeo menor que 3+ foram novamente sensibilizadas com nova
aliacutequota do antissoro
25
413 TRATAMENTO DAS AMOSTRAS
As amostras sensibilizadas apresentando o TDA positivo 3 ou 4+ foram divididas em
duas aliacutequotas e submetidas a duas teacutecnicas diferentes com o objetivo de dissociar o anticorpo
ligado Uma aliacutequota da amostra foi tratada com soluccedilatildeo de difosfato de cloroquina enquanto
a outra aliacutequota foi tratada com glicina-aacutecidaEDTA
42 PREPARO DA GLICINA AacuteCIDA-EDTA
A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA utiliza 3 soluccedilotildees diferentes a glicina aacutecida o
EDTA e o tampatildeo TRIS
Os reagentes foram preparados utilizando os sais para anaacutelise (PA) de EDTA
(Na2EDTA2H2O) TRIS (C4H11NO3) Glicina (H2NCH2CO2H) NaCl e a soluccedilatildeo de aacutecido
cloriacutedrico (HCl) 12 N todos reagentes da marca SYNTH (quadro 1)
Para o preparo do tampatildeo glicina-acida eacute necessaacuterio o ajuste do pH para 15 Para esse
ajuste utiliza-se aacutecido cloriacutedrico (HCl) concentrado O pH foi medido com fitas reativas de pH
com escala de 1 a 14 da marca MERCK Posteriormente a soluccedilatildeo foi enviada ao laboratoacuterio
de controle de qualidade do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto e o pH medido no peagacircmetro O
tampatildeo glicina-aacutecida foi armazenado a 4deg e o tampatildeo tris e o EDTA em temperatura ambiente
controlada (20 a 24deg Celsius)
Apoacutes o preparo e durante a realizaccedilatildeo dos testes foram feitas inspeccedilotildees visuais para
verificaccedilatildeo de turvaccedilatildeo do meio e presenccedila de precipitados
Reagente Material Quantidade Preparo e
Conservaccedilatildeo
EDTA
EDTA
(Na2EDTA2H2O)
5 gramas Mistura ateacute
dissoluccedilatildeo do sal e
conserva em
temperatura ambiente Aacutegua Destilada 50 Ml
Tris
TRIS (C4H11NO3) 121 gramas Conservar em
temperatura ambiente NaCl 525g
Aacutegua destilada 100ml
Gliacutecina-aacutecida
Glicina
(H2NCH2CO2H) 15 gramas
Conservar a 4oC NaCl 116gramas
Aacutegua Destilada 200ml
HCL 12N Ajutar o pH para 15
Quadro 1 - Preparo dos Reagentes da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
Fonte - Manual teacutecnico AABB 2011
26
O tampatildeo glicina-aacutecida e o tampatildeo TRIS satildeo estaacuteveis por 7 meses O reagente EDTA
precipitou mesmo estando em temperatura em ambiente controlado Houve necessidade de
preparo de novo reagente
421 TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
1 Em um tubo de ensaio 12x75 mm eacute adicionado 08 mL da soluccedilatildeo de glicina-aacutecida A
esta soluccedilatildeo adiciona-se 02 mL de EDTA e mistura
2 Adiciona-se 02 mL de hemaacutecias sensibilizadas (lavada 4 vezes) A mistura eacute
homogeneizada e incubada por exatamente 2 minutos
3 A seguir 01 mL de tampatildeo TRIS eacute adicionado agrave mistura que eacute novamente
homogeneizada e centrifugada por 2 minutos a 3400 rpm O pH deve estar entre 7 a 75
4 Apoacutes centrifugaccedilatildeo separa-se em outro tubo o sobrenadante (eluato) e as hemaacutecias
que permanecem satildeo lavadas 4 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica para retirada de todo o
reagente e anticorpos livres
43 PREPARO DA CLOROQUINA
A cloroquina eacute diluiacuteda em tampatildeo PBS na concentraccedilatildeo de 20 (Quadro 2) e
armazenado a 4deg Celsius sua validade apoacutes o preparo eacute de 1 mecircs
A teacutecnica da cloroquina jaacute estaacute padronizada para rotina do laboratoacuterio de
imunohematologia do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto e suas unidades
Reagente Reagentes Quantidade PreparoConservaccedilatildeo
Cloroquina
Difosfato de cloroquina
(C18H32ClN3O8P2)
20 gramas
Conservar a 4deg Celsius
Tampatildeo PBS 100ml
NaOH 01 N Acertar o pH para
51
Quadro 2 - Preparo da Cloroquina Fonte - Manual teacutecnico da AABB 2011
431 TEacuteCNICA DA CLOROQUINA
1 4 partes da soluccedilatildeo pronta eacute adicionada a uma parte de hemaacutecias lavadas 4 vezes com
soluccedilatildeo fisioloacutegica
2 A mistura eacute incubada em temperatura ambiente por ateacute duas horas
3 Centrifugar a 3400 rpm por 2 minutos
27
4 Remover o sobrenadante lavar as hemaacutecias novamente com soluccedilatildeo fisioloacutegica 4
vezes
44 VERIFICACcedilAtildeO DA EFETIVIDADE DOS TESTES
Apoacutes tratamento pelas duas teacutecnicas o TDA foi repetido em todas as amostras para
verificar se os tratamentos foram efetivos e houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo Para as
amostras tratadas pela teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA que permaneceram com TDA positivo
novo tratamento foi realizado
45 TESTE DO ELUATO
O eluato resultante das amostras tratadas com glicina-acidaEDTA foi testado com
hemaacutecias de triagem A soluccedilatildeo do eluato foi incubada com as hemaacutecias de triagem de
anticorpos (ID-Diacell BIO-RAD) pela teacutecnica em gel LissCoombs O teste foi incubado 15
minutos a 37deg Celsius e centrifugado por 10 minutos em centrifuga proacutepria para a teacutecnica em
gel Os eluatos que apresentaram resultados positivos foram testados em painel de 11
hemaacutecias (ID-Diapanel BIO-RAD) para a identificaccedilatildeo do anticorpo
46 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente que apresentou TDA positivo por IgG e pesquisa
de anticorpo irregular positivo com presenccedila de autoanticorpo com reatividade panaglutinina
A amostra foi tratada em paralelo pelas duas teacutecnicas descritas e foi enviada para o
Hemocentro para genotipagem eritrocitaacuteria que foi realizado por metodologia PCR em tempo
real no equipamento Real-time system PCR 7500 ( Applied Biosystems Califoacuternia EUA)
28
5 RESULTADOS
51 REAGENTES
Para aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA satildeo necessaacuterios 3 diferentes
reagentes que podem ser encontrados em forma de kit pronto para uso No entanto esses kits
natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil Os reagentes satildeo tampatildeo glicina-aacutecida o EDTA e o tampatildeo
Tris
Todos os reagentes foram preparados rdquoin houserdquo a partir dos sais e soluccedilotildees PA (puro
para anaacutelise) da marca SYNTH que foram adquiridos para a pesquisa O custo estimado para
cada teste foi aproximadamente R$ 020 reais
Apoacutes o preparo os reagentes poderiam ser armazenados em condiccedilotildees adequadas pelo
periacuteodo de 1 ano (AABB 2011) Ao final do preparo e durante o periacuteodo de armazenamento
de fevereiro a setembro de 2016 foi realizada inspeccedilatildeo visual para verificar a presenccedila de
precipitados ou turvaccedilatildeo A soluccedilatildeo de glicina e o tampatildeo TRIS mostraram-se estaacuteveis ateacute o
final do periacuteodo Por sua vez o reagente EDTA precipitou mesmo estando armazenado em
temperatura ambiente controlada e foi necessaacuterio novo preparo
52 AMOSTRAS DE DOADORES
521 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS AMOSTRAS
Apoacutes incubaccedilatildeo da hemaacutecia com o antissoro a mesma foi lavada 4 vezes para retirada
dos anticorpos livres A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada Caso houvesse positividade na
soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem a etapa era repetida (figura 3) Das 50 amostras sensibilizadas a
uacuteltima lavagem foi positiva somente em 3 delas Nas 3 amostras o anticorpo utilizado para
sensibilizaccedilatildeo foi o anti-K Apoacutes repetido nova etapa de lavagem os resultados se
apresentaram negativos
Em todas as amostras sensibilizadas ldquoin vitrordquo o TDA foi testado e verificado a
intensidade do teste Entre as 50 amostras 47 alcanccedilaram TDA com intensidade 3-4+ apoacutes a
primeira sensibilizaccedilatildeo enquanto 3 amostras necessitaram uma segunda incubaccedilatildeo com
anticorpo (figura 4)
A escolha dos anticorpos para sensibilizar as hemaacutecias foi feita de acordo com o
fenoacutetipo do doador e foram utilizados sete diferentes especificidades de anticorpos policlonais
humanos conforme mostra o graacutefico1
29
Figura 3 - Soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada com hemaacutecia de triagem de
anticorpos em gel LissCoombs (BIO-RAD) A finalidade eacute verificar a presenccedila de anticorpos livres na
suspensatildeo que possam interferir na pesquisa do eluato As soluccedilotildees de lavagem das amostras na figura a tiveram
resultados negativos Na figura b duas amostras a 47 e 50 apresentaram resultado positivo Nova etapa de
lavagem foi realizada e o resultado final foi negativo
522 TRATAMENTO DAS HEMAacuteCIAS
Apoacutes a sensibilizaccedilatildeo e obtenccedilatildeo de resultados de TDA com intensidade de 3 a 4+
cada uma das amostras foi dividida em duas aliacutequotas e tratada separadamente pelas teacutecnicas
de glicinaaacutecida-EDTA e cloroquina
As teacutecnicas foram consideradas efetivas quando obteve-se a completa dissociaccedilatildeo do
anticorpo verificada atraveacutes do TDA negativo na amostra poacutes tratamento conforme figuras 5
e 6 Dentre as amostras tratadas com cloroquina 2850 tiveram o TDA negativado A glicina-
aacutecidaEDTA negativou o TDA em 33 das 50 amostras tratadas Apenas 17 amostras tratadas
com glicina-aacutecidaEDTA permaneceram com o TDA positivo e foram submetidas a um novo
tratamento
30
Figura 4 - TDA das amostras apoacutes sensibilizaccedilatildeo com anticorpos policlonais humanos Amostras na
figura a com intensidades de 3-4+ Na figura b amostras 4 e 7 com intensidade menor que 3+ e portanto foram
novamente sensibilizadas com nova aliacutequota de soro Anti-D e anti-S Apoacutes a segunda sensibilizaccedilatildeo
apresentaram reatividade 4 e 3+ respectivamente Os anticorpos utilizados para sensibilizaccedilatildeo foram D S c E
C e K
523 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS TEacuteCNICAS
No tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA houve dissociaccedilatildeo completa do anticorpo
em 33 amostras (66) das 50 amostras testadas enquanto que com a cloroquina foram 28
amostras (56) (tabela 1)
31
Graacutefico 1- Nuacutemero de amostras sesnsibilizadas por especificidade de anticorpo Entre as 50 amostras 12
foram sensibilizadas com anti-D 10 com anti-C 9 com anti-E 8 com anti-c 7 com anti-S 3 com anti-K e 1
com anti-Dia As especificidades dos anticorpos foram definidas de acordo o fenoacutetipo do doador
Figura 5 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com cloroquina Nas amostras onde houve
a dissociaccedilatildeo do anticorpo ( 2 21 a 23 26 39 a 42 45 46 e 49) a hemaacutecia se deposita no fundo no microtubo
apoacutes a centrifugaccedilatildeo (TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (1 3 24 25 43 44 47
48 e 50) o anticorpo ligado agraves hemaacutecias eacute alvo da AGH presente no gel (TDA positivo)
Anti-D 12
Anti-C 10
Anti-E 9
Anti-c 8
Anti-S 7
Anti-K 3 Anti-Dia 1
32
Figura 6 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA Nas amostras
onde houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo (4 6 7 12 a 15 17 34 35 37 e 38) a hemaacutecia se deposita no fundo no
microtubo apoacutes a centrifugaccedilatildeo ( TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (5 16 18
19 20 33 e 36 ) o AGH presente no gel se liga ao anticorpo ligado agraves hemaacutecias que ficam retidas no gel (TDA
positivo)
Tabela 1-Resultado geral do tratamento das hemaacutecias com glicina e cloroquina
Teacutecnica utilizada TDA negativo TDA positivo Total
Glicina-aacutecidaEDTA 33 17 50
Cloroquina 28 22 50
A glicina-aacutecidaEDTA conseguiu negativar mais amostras sensibilizadas com Anti-D
e anti-K que a cloroquina Para as hemaacutecias sensibilizadas com anti-E Anti-S e Anti-Dia
ambas as teacutecnicas dissociaram o anticorpo em 100 das amostras Os resultados detalhados
por especificidade do anticorpo apoacutes o primeiro tratamento com glicina-aacutecidaEDTA e com
cloroquina estatildeo na tabela 2
Para as amostras que permaneceram positivas (17 amostras) apoacutes o tratamento com a
glicina-aacutecidaEDTA foi realizado um novo tratamento Houve dissociaccedilatildeo do anticorpo em 3
amostras (18) apoacutes a segunda tentativa Nas demais 14 (82) amostras tratadas pela
segunda vez 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise
33
Tabela 2 - Resultados do TDA apoacutes tratamento das hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo
sensibilizado
ANTICORPOS
SENSIBILIZADOS
1ordm TRATAMENTO COM
GLICINA
TRATAMENTO COM
CLOROQUINA
TOTAL TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
Anti-D 8 4 0 12 12
Anti-C 6 4 10 0 10
Anti-E 9 0 9 0 9
Anti-c 0 8 1 7 8
Anti-S 7 0 7 0 7
Anti-K 2 1 0 3 3
Anti-Dia 1 0 1 0 1
TOTAL 33 17 28 22 50
A hemoacutelise foi verificada durante o procedimento de lavagem final das hemaacutecias com
soluccedilatildeo fisioloacutegica para a retirada dos reagentes As soluccedilotildees de lavagem ficaram
avermelhadas e as hemaacutecias com coloraccedilatildeo escura As amostras foram descartadas Dentre as
6 amostras que ainda puderam ser testadas para o TDA trecircs amostras negativaram sendo 1
sensibilizada com anti-D e 2 com anti-C (tabela 3)
Tabela 3 - Resultado apoacutes o segundo tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA
Tratamento com
glicina-aacutecidaEDTA
TDA Negativo TDA Positvo Hemoacutelise Total
Segundo tratamento 3 3 11 17
524 TESTAGEM DO ELUATO
Apoacutes o tratamento com a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA a soluccedilatildeo do eluato foi
testada para verificar a viabilidade dos anticorpos que foram dissociados ou eluiacutedos Dentre
as 50 amostras 41 apresentaram eluato positivo As nove amostras cujos eluatos foram
negativos haviam sido sensibilizadas com as seguintes especificidades de anticorpos anti-E 6
amostras (67) anti-S 2 amostras (40) e anti-D 1 amostra (8) (tabela 4) O eluato de
todas as amostras sensibilizadas com os anticorpos anti-C anti-c Anti-K e Anti-Dia foram
positivos Os eluatos positivos na triagem de anticorpos foram testados com paineacuteis de
identificaccedilatildeo para confirmar a especificidade e a viabilidade dos anticorpos (figuras 7 e 8)
34
525 EFEITO DA ELUICcedilAtildeO SOBRE OS ANTIacuteGENOS ERITROCITAacuteRIOS
Para verificar o efeito do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA e com a cloroquina
sobre a expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s foi realizada a fenotipagem das
amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes tratamento com ambas as teacutecnicas Foi avaliado
se o tratamento destruiu os antiacutegenos expressos antes do tratamento
Tabela 4- Resultado do Eluato das amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA
Anticorpos Eluato positvo Eluato negativo Total
Anti-D 11 1 12
Anti-C 10 0 10
Anti-E 3 6 9
Anti-c 8 0 8
Anti-S 5 2 7
Anti-K 3 0 3
Anti-Dia 1 0 1
Total 41 9 50
Figura 7 ndash Painel do eluato da amostra 21 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-C que foi
recuperado no eluato
Figura 8 ndash Painel do eluato da amostra 47 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-K que foi
recuperado no eluato
35
Dentre as 50 amostras 26 eram previamente fenotipadas para os antiacutegenos Fya Fy
b
Jka Jk
b S e s Dentre elas 20 alcanccedilaram TDA negativo apoacutes tratamento com a glicina-
aacutecidaEDTA e 20 negativaram apoacutes tratamento com cloroquina (tabela 5) Apoacutes ambas as
teacutecnicas os antiacutegenos originalmente expressos permaneceram positivos comprovando que natildeo
houve destruiccedilatildeo dos mesmos
Tabela 5 ndash Verificaccedilatildeo da interferecircncia do tratamento da hemaacutecias com cloroquina e glicina-
aacuteicdaEDTA sobre os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
AMOSTRAS
COM
FENOTIPAGEM
PREacuteVIA
TRATADAS COM
CLOROQUINA
TRATADAS COM
GLICINA
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
26
20
20
20
20
As amostras 24 47 e 50 eram positivas para o antiacutegeno K A cloroquina natildeo dissociou
o anticorpo em nenhuma das 3 amostras enquanto a glicina-aacutecidaEDTA foi efetiva nas
amostras 24 e 50 Foi testada a expressatildeo do antiacutegeno K nas amostras 24 e 50 apoacutes o
tratamento utilizando meacutetodo indireto em gel contendo AGH Apesar de natildeo ter sido avaliado
a intensidade de reaccedilatildeo de expressatildeo dos antiacutegenos podemos verificar na figura 9 que nas
duas amostras em que a teacutecnica foi efetiva e dissociou o anticorpo a expressatildeo do antiacutegeno K
continua presente mas a reatividade observada pode ser considerada 1+ sugerindo que houve
diminuiccedilatildeo da expressatildeo do antiacutegeno quando comparado com a expressatildeo observada em
hemaacutecia natildeo tratada
Os resultados individuais de cada amostra em ambas as teacutecnicas encontram-se
resumidas na tabela 6
526 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente onde foi constatada a presenccedila de autoanticorpo
a quente da classe IgG pelo TDA monoespeciacutefico (figura 10)O autoanticorpo tambeacutem
interferia na pesquisa e identificaccedilatildeo de anticorpos irregulares pois apresentava caracteriacutestica
de panaglutinina As hemaacutecias da paciente sensibilizadas ldquoin vivordquo foram tratadas com
cloroquina e com glicina-aacutecidaEDTA
36
Figura 9 ndash Fenotipagem das amostras 24 e 50 para antiacutegeno K apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
O teste positivo indica a presenccedila do antiacutegeno poreacutem a reatividade fraca (1+) sugere que houve enfraquecimento
de sua expressatildeo A direita a expressatildeo forte (4+) do antiacutegeno Kell em hemaacutecia controle natildeo tratada utilizada
como controle positivo
A cloroquina natildeo foi efetiva na retirada do anticorpo ligado as hemaacutecias ao contraacuterio
do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA que dissociou o anticorpo (figura 11)
A hemaacutecia tratada com glicina foi fenotipada para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
(figura 12) A fenotipagem para o sistema Rh (C c E e e) e Kell foi realizada em gel
especiacutefico monoclonal sem interferecircncia do TDA positivo (controle da reaccedilatildeo negativo)
O eluato resultante do tratamento com glicina-aacutecidaEDTA foi testada em gel com
hemaacutecias de painel de identificaccedilatildeo de anticorpos e apresentou resultado positivo com todas
as ceacutelulas (figura 13 e 14)
A amostra foi enviada para genotipagem e o resultado da genotipagem confirmou o
resultado da fenotipagem apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
527 TEMPO DE EXECUCcedilAtildeO DA TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
O tempo de reaccedilatildeo da glicina-aacutecidaEDTA eacute de 2 minutos Todas as amostras foram
tratadas obedecendo ao tempo descrito na literatura demonstrando que o mesmo eacute
reprodutiacutevel
37
Tabela 6- Resultados individuais por amostra
Amostra Especificidade
dos anticorpos
Intensidade do
TDA apoacutes
sensibilizaccedilatildeo
Tratamento
efetivo com
cloroquina
Tratamento
efetivo com
glicina
Eluato
poacutes
glicina
1 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 2 Dia 3+ Sim Sim 3+ 3 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 4 D 4+ Natildeo Sim 4+ 5 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 6 E 3+ Sim Sim Negativo 7 S 4+ Sim Sim 3+ 8 E 3+ Sim Sim 1+ 9 E 3+ Sim Sim 2+
10 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 11 D 4+ Natildeo Sim 4+ 12 D 4+ Natildeo Sim 4+ 13 S 3+ Sim Sim 3+ 14 S 3+ Sim Sim 3+ 15 D 3+ Natildeo Sim 3+ 16 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 17 E 3+ Sim Sim (+) 18 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 19 D 4+ Natildeo Natildeo 3+ 20 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 21 C 3+ Sim Sim 4+ 22 C 3+ Sim Sim 4+ 23 C 3+ Sim Sim 4+ 24 K 4+ Natildeo Sim 4+ 25 D 3+ Natildeo Natildeo Negativo 26 E 4+ Sim Sim Negativo 27 S 3+ Sim Sim 3+ 28 C 3+ Sim Natildeo 4+ 29 C 3+ Sim Sim 4+ 30 C 3+ Sim Sim 4+ 31 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 32 E 3+ Sim Sim Negativo 33 C 3+ Sim Natildeo 4+ 34 S 3+ Sim Sim Negativo 35 S 3+ Sim Sim Negativo 36 C 4+ Sim Natildeo 4+ 37 c 4+ Natildeo Natildeo 4+ 38 D 4+ Natildeo Sim 4+ 39 S 3+ Sim Sim 3+ 40 c 4+ Sim Natildeo 2+ 41 C 4+ Sim Natildeo 4+ 42 E 3+ Sim Sim Negativo 43 D 3+ Natildeo Sim 2+ 44 D 3+ Natildeo Sim 2+ 45 E 3+ Sim Sim Negativo 46 C 3+ Sim Sim 4+ 47 K 4+ Natildeo Natildeo 4+ 48 D 3+ Natildeo Sim 2+ 49 E 3+ Sim Sim Negativo 50 K 4+ Natildeo Sim 4+
TOTAL 50 28 33 41
38
Figura 10 ndash TDA monoespeciacutefico da amostra de paciente Hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo da classe
IgG
oacute Figura 11 ndash TDA apoacutes o tratamento com glicina-aacutecidaEDTA (esquerda) e cloroquina (direita) A glicina
negativou completamente o TDA enquanto a hemaacutecia tratada com cloroquina persistiu positiva (1+)
39
Figura 12 ndash Fenotipagem da amostra tratada com glicina-aacutecidaEDTA Fy(a+b+) Jk(a-b+) S+s+
Figura 13 ndash Painel em gel (LissAGH) do eluato apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de
intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
Figura 14 ndash ndash Painel ezimaacutetico (hemaacutecias tratadas com bromelina) do eluato em gel neutro apoacutes
tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
40
528 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Quanto a efetividade das teacutecnicas em negativar o TDA foi verificado que a glicina-
aacutecidaEDTA foi efetiva em 66 das amostras testadas no primeiro tratamento (3350
amostras) enquanto a cloroquina conseguiu negativar 56 (2850) Esses resultados natildeo
apresentam diferenccedila significativa (pgt005) demostrando que a teacutecnica da glicina-
aacutecidaEDTA natildeo eacute superior mas eacute tatildeo efetiva quanto a da cloroquina
Quando aliamos os resultados de ambas as teacutecnicas verificamos que em 76 (3850)
das amostras o TDA foi negativado Esse dado indica que ainda que uma teacutecnica natildeo seja
eficaz na remoccedilatildeo do anticorpo eacute uma boa alternativa tentar a segunda teacutecnica jaacute que a falha
em remover o anticorpo utilizando uma delas natildeo prevecirc necessariamente a falha com a outra
Quando se utiliza o teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla (graacutefico 2) para comparar a utilizaccedilatildeo das
duas teacutecnicas com o resultado de cada uma isolada (somente a cloroquina ou somente a
glicina) verificamos que os resultados apresentam diferenccedila significativa (plt005) (quadro 3)
TRATAMENTO EFETIVO COM TOTAL PORCENTAGEM
Glicina ou cloroquina 38 76
Glicina e cloroquina 23 46
Glicina apenas 10 20
Cloroquina apenas 5 10
Nenhuma das teacutecnicas 12 24
Quadro 3 - Resultados comparativos entre as teacutecnicas utilizadas
41
Graacutefico 2 - Teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla entre as teacutecnicas aplicadas A- Glicina e Cloroquina B-Cloroquina C-
Glicina ( plt005)
42
6 DISCUSSAtildeO
Os reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA podem ser adquiridos em
forma de kit comercial prontos para uso poreacutem natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil A preparaccedilatildeo
dos reagentes ldquoin houserdquo a partir de sais comerciais adquiridos se mostrou viaacutevel Os
reagentes glicina e o tampatildeo Tris armazenados de forma correta se mantiveram estaacuteveis por
um periacuteodo de 7 meses Somente o reagente EDTA precipitou mesmo armazenado em
condiccedilotildees adequadas sugerindo que o mesmo deve ser preparado em menor quantidade e
armazenado em aliacutequotas A soluccedilatildeo de cloroquina tambeacutem pode ser preparada ldquoin houserdquo e
pode ser armazenado por um mecircs A legislaccedilatildeo brasileira autoriza a utilizaccedilatildeo de reagentes
preparados a partir de sais comerciais como a cloroquina e a glicina-aacutecidaEDTA desde que
os sais tenham autorizaccedilatildeo da vigilacircncia sanitaacuteria para a comercializaccedilatildeo (BRASIL 2001)
A comparaccedilatildeo quanto a efetividade em dissociar anticorpos em amostras com TDA
positivos entre a teacutecnica da glicina e a teacutecnica da cloroquina mostrou que natildeo haacute diferenccedila
estatiacutestica entre elas e que ambas satildeo igualmente eficientes Se utilizadas conjuntamente haacute
maior possibilidade de elucidaccedilatildeo dos casos
Uma vantagem da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eacute que ela permite numa mesma
amostra eluir o anticorpo ligado aacute hemaacutecia assim como fenotipar a hemaacutecia tratada Devido a
sua dupla utilidade a teacutecnica eacute vantajosa principalmente em pacientes em que pouco volume
de amostra pode ser coletado como em casos de crianccedilas e receacutem-nascidos
A fenotipagem poacutes tratamento se mostrou viaacutevel jaacute que os antiacutegenos de maior
importacircncia natildeo sofreram alteraccedilotildees Nas 20 amostras que foram fenotipadas antes e apoacutes
tratamento para verificar a influecircncia dos reagentes na expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a
Jkb S e s natildeo houve destruiccedilatildeo dos mesmos por nenhuma das duas teacutecnicas
Para as amostras positivas para o antiacutegeno Kell (350) e sensibilizadas com o
respectivo anticorpo a teacutecnica da glicina foi efetiva em negativar o TDA em apenas duas
delas mas apoacutes o tratamento foi verificada uma fraca reatividade da reaccedilatildeo antiacutegeno-
anticorpo sugerindo que houve um enfraquecimento da expressatildeo do antiacutegeno conforme
esperado e descrito na literatura (BYRNE 1991 PALLAS WILER E MCGEE 1991
ROZIERS e SQUALI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012 e KATHARIA e
CHAUDHARY 2013) A accedilatildeo da glicina sobre o antigeno Kell natildeo representa impedimento
para seu uso uma vez que na impossibilidade de testar o antiacutegeno Kell o banco de sangue
consegue facilmente atender a solicitaccedilatildeo de transfusatildeo com unidades de hemaacutecias Kell
43
negativas jaacute que eacute um antiacutegeno de baixa prevalecircncia na populaccedilatildeo variando de 15 na
populaccedilatildeo africana a 9 nos europeus (DANIELS 2011)
A soluccedilatildeo resultante da dissociaccedilatildeo do anticorpo pela teacutecnica da glicina pode ainda ser
utilizada como eluato podendo substituir a teacutecnica de eluiccedilatildeo com reagentes comercias (kits
de eluiccedilatildeo aacutecida) que tem alto custo aproximadamente entre R$2000 a R$2500 por teste
Em 41 amostras (82) houve a dissociaccedilatildeo e recuperaccedilatildeo do anticorpo que estava
sensibilizando as hemaacutecias Em 9 amostras (18) os anticorpos foram eluiacutedos poreacutem
apresentaram reaccedilatildeo negativa quando testadas com hemaacutecias de triagem entre eles o anti-E
(6) anti-S (2) e Anti-D (1) Eacute possiacutevel que a correccedilatildeo pH do meio (WALKER 2011) natildeo
tenha sido adequada o que pode ter desfavorecido a reatividade do anticorpo
Para as amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA nas quais natildeo houve dissociaccedilatildeo do
anticorpo pelo primeiro tratamento (1750) o segundo tratamento natildeo se mostrou eficaz jaacute
que 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise O tempo de
armazenagem natildeo parece ter influenciado jaacute que todas as amostras foram testadas dentro de
48 horas apoacutes a coleta Outros fatores que natildeo foram verificados podem ter levado a
hemoacutelise Apesar da literatura (LOUIE JIENG e ZEROULIS 1986 e BYRNE 1991)
recomendar um segundo tratamento ele eacute pouco eficaz tendo negativado apenas 3 das 17
amostras testadas
A amostra de paciente que apresentou sensibilizaccedilatildeo ldquoin vivordquo mostrou melhor
efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA sobre a da cloroquina possibilitando
fenotipagem para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s que natildeo foram destruiacutedos apoacutes o
tratamento comprovado atraveacutes da genotipagem
A presenccedila de autoanticorpo a quente com presenccedila de hemoacutelise (AHAI) ou natildeo pode
mascarar a presenccedila de aloanticorpo interferindo na rotina soroloacutegica da fenotipagem que eacute
uma importante ferramenta para auxiliar na seleccedilatildeo de hemaacutecias para transfusatildeo (SHIREY et
al 2002) Esses pacientes frequentemente possuem aloanticorpos associados ao
autoanticorpo e a prevalecircncia de aloimunizaccedilatildeo entre eles varia entre 12 a 40 (LEGER e
GARRATY 1999 BRANCH e PETZ 1999) o que dificulta ainda mais a escolha do melhor
componente a ser transfundido aleacutem de aumentar a possibilidade reaccedilotildees hemoliacuteticas imunes
poacutes-transfusionais
Nesses casos as teacutecnicas de dissociaccedilatildeo de anticorpos satildeo importantes para tratar
amostras de pacientes e a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser usada como uma opccedilatildeo
pois se mostrou eficaz na dissociaccedilatildeo anticorpo ligado agraves hemaacutecias deixando livre a
superfiacutecie das mesmas permitindo a fenotipagem por antisoros IgG Paralelamente os
44
anticorpos eluiacutedos tambeacutem puderam ser estudados O mesmo natildeo ocorre com a cloroquina
que permite apenas a fenotipagem e tampouco com os kits de eluiccedilatildeo aacutecida disponiacuteveis no
mercado nacional que satildeo destinados a realizaccedilatildeo do eluato mas destroem as hemaacutecias
O tempo de tratamento na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA tambeacutem eacute uma vantagem
pois foi possiacutevel reproduzir no tempo determinado de 2 minutos enquanto a cloroquina
demora ateacute duas horas
Ainda que a aplicaccedilatildeo das teacutecnicas por biologia molecular estejam cada vez mais
presentes na rotina imuno-hematoloacutegica e possibilitam estabelecer o fenoacutetipo deduzido do
genoacutetipo elas natildeo estatildeo disponiacuteveis na maioria dos centros e sua realizaccedilatildeo exige algumas
horas A resoluccedilatildeo imediata do problema transfusional necessita dos resultados soroloacutegicos
pois com frequecircncia natildeo eacute possiacutevel aguardar o resultado do teste molecular Dessa forma
apesar da crescente importacircncia da genotipagem eritrocitaacuteria teacutecnicas soroloacutegicas aplicadas
corretamente e no momento propiacutecio satildeo de grande utilidade para resolver problemas imuno-
hematoloacutegicos como ocorre com a fenotipagem em pacientes com TDA positivo
45
7 CONCLUSAtildeO
A teacutecnica da glicina aacutecidaEDTA mostrou-se efetiva em remover os anticorpos que
sensibilizavam as hemaacutecias e pode ser utilizada com seguranccedila antes da fenotipagem
eritrocitaacuteria Por ser uma teacutecnica de raacutepida execuccedilatildeo eacute uma alternativa aplicaacutevel
principalmente em casos urgentes de pacientes que apresentam autoanticorpos
46
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50
9 ANEXOS
51
FUNDACcedilAtildeO HEMOCENTRO DE RIBEIRAtildeO PRETO
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE)
Tiacutetulo da pesquisa Aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina aacutecida-EDTA e avaliaccedilatildeo da
eficaacutecia no tratamento de hemaacutecias com teste direto da antiglobulina positivo
Pesquisadora responsaacutevel Ceacutelia Kazue Abiko
Orientador Prof Dimas Tadeu Covas
Co-orientadora Dra Flaacutevia Leite Souza Santos
Objetivo da pesquisa Vocecirc estaacute sendo convidado a participar de uma pesquisa que tem
como objetivo padronizar uma nova teacutecnica para auxiliar na tipagem sanguiacutenea de pacientes
A tipagem sanguiacutenea pode sofrer interferecircncia da presenccedila de anticorpos ligados aos gloacutebulos
vermelhos do sangue Nessas situaccedilotildees eacute difiacutecil selecionar o melhor sangue para o paciente e
eacute preciso a utilizaccedilatildeo de teacutecnicas adicionais para remover essas interferecircncias
Esta pesquisa tem como objetivo estudar outra teacutecnica para remover esses anticorpos e
comparaacute-la com a teacutecnica atualmente utilizada Para isso precisamos de amostras de pacientes
e doadores voluntaacuterios
Se vocecirc eacute um doador eacute necessaacuterio que vocecirc autorize a coleta de 5 ml (1 tubo) a mais
de seu sangue
Se vocecirc eacute um paciente natildeo haveraacute necessidade de nova amostra pois utilizaremos as
amostras jaacute coletadas para os testes preacute-transfusionais e os resultados encontrados nesta
pesquisa natildeo iratildeo interferir na escolha da (s) bolsa (s) de sangue que vocecirc possa vir a receber
Se vocecirc concordar em participar leia com atenccedilatildeo o texto abaixo e assine as duas vias
rubricando todas as paacuteginas deste termo de consentimento Uma via original assinada e
rubricada por vocecirc e pela pesquisadora ficaraacute com vocecirc
As suas informaccedilotildees seratildeo mantidas em sigilo pela pesquisadora e natildeo haveraacute
armazenamento de material para pesquisas posteriores Os seus dados seratildeo usados apenas
neste estudo e quando o trabalho for publicado seu nome e qualquer outra informaccedilatildeo que
possam identificaacute-lo natildeo seratildeo revelados
Eacute pouco provaacutevel que o que noacutes aprendermos com este estudo tenha um benefiacutecio
direto para vocecirc assim como natildeo poderemos dar nada em troca pela sua participaccedilatildeo na
pesquisa
Nosso objetivo com esta pesquisa eacute que os resultados poderatildeo ser uacuteteis para o
tratamento de pacientes no futuro Os riscos da participaccedilatildeo satildeo miacutenimos Se vocecirc eacute um
doador de sangue a amostra seraacute coletada no momento da doaccedilatildeo natildeo exigindo punccedilatildeo
venosa adicional
52
Eacute seu direito ter acesso aos resultados dos testes da pesquisa Esses resultados natildeo
seratildeo fornecidos automaticamente a vocecirc mas caso vocecirc se interesse em saber o resultado ou
tiver alguma duacutevida sobre a sua participaccedilatildeo neste estudo deveraacute entrar em contato com Ceacutelia
Kazue Abiko pelo telefone (18) 99718-3551
Vocecirc tem total liberdade de optar por natildeo participar da pesquisa Caso aceite
participar poderaacute desistir a qualquer momento ou retirar seu consentimento mesmo apoacutes ter
coletado o sangue Para cancelar sua participaccedilatildeo basta avisar a pesquisadora e os seus dados
seratildeo retirados do projeto
Qualquer duacutevida eacutetica sobre a pesquisa poderaacute entrar em contato com o Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa do Hospital das Cliacutenicas e da Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto
(CAMPUS UNIVERSITAacuteRIO bairro Monte Alegre CEP 14048-900 Ribeiratildeo Preto-SP
Telefone (16) 3602-2228 FAX (16) 3633-1144 e-mail cephcrpuspbr)
Consentimento de participaccedilatildeo
A Consentimento do participante
Li as informaccedilotildees acima sobre o estudo e recebi explicaccedilotildees sobre a participaccedilatildeo no estudo
Portanto dou o meu consentimento para participar do estudo
___________________________________________________________________________
Nome completo
___________________________________________________________________________
Assinatura
___________
Data
__________________________________________________________________________________
Nome completo da pesquisadora
___________________________________________________________________________
Assinatura
_____________
Data
22
4 METODOL OGIA
41 AMOSTRAS DE DOADORES
Foram coletados 50 amostras de doadores de sangue que compareceram ao
Hemonuacutecleo de Araccedilatuba no periacuteodo de junho a agosto de 2016 Foram convidados a
participar da pesquisa doadores de repeticcedilatildeo do tipo sanguiacuteneo ldquoOrdquo RhD positivo
cadastrados no sistema de banco de sangue (SBS) do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto
Todos os doadores que concordaram em participar da pesquisa assinaram o termo de
consentimento livre e esclarecido (TCLE)
No momento da doaccedilatildeo foram coletados adicionalmente 5 mL de sangue total em
soluccedilatildeo anticoagulante EDTA (aacutecido dietilenoaminoaceacutetico) dispensando punccedilatildeo venosa
adicional para coleta da amostra O fluxograma 1 resume as etapas desenvolvidas no projeto
Fluxograma 1 - Fluxo da pesquisa utilizando as amostras de doadores
23
411 FENOTIPAGEM
Foram verificados se os doadores jaacute tinham fenotipagem para outros sistemas de
grupos sanguiacuteneos aleacutem do sistema ABORh que eacute realizado rotineiramente
A fenotipagem eritrocitaacuteria para outros sistemas ou fenotipagem estendida eacute realizada
para identificar a presenccedila ou ausecircncia de antiacutegenos considerados de importacircncia cliacutenica No
Hemonuacutecleo de Araccedilatuba uma parcela de doadores de repeticcedilatildeo satildeo fenotipados para os
antiacutegenos dos sistemas de grupo sanguiacuteneo Rh (antiacutegenos C c E e e) Kell (antiacutegeno K)
Duffy (antiacutegenos Fya e Fy
b) Kidd (antiacutegenos Jk
a e Jk
b) e sistema MNSs (antiacutegenos S e s)
A fenotipagem para o Rh e Kell eacute realizada por metodologia de microplaca utilizando
25 microL de hemaacutecia lavada e diluiacuteda a 5 em salina e 25 microL do antissoro comercial especiacutefico
A reaccedilatildeo eacute incubada 15 minutos a temperatura ambiente e centrifugadas para leitura Para os
antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s a metolodogia utilizado eacute gel contendo antiglobulina
humana (gel LissCoombs poliespeciacutefico) da marca BIO-RAD onde se utiliza suspensatildeo de
hemaacutecia em LISS (Soluccedilatildeo de baixa forccedila iocircnica) A suspensatildeo eacute preparada atraveacutes da
diluiccedilatildeo de 10 microL de hemaacutecia em 1000 microL de LISS Pipetado 50 microL dessa diluiccedilatildeo no gel e
adicionado 25 microL do antissoro especiacutefico Incuba-se em banho seco por 15 minutos a 37 deg
Celsius e eacute centrifugado em centriacutefuga especiacutefica Os antissoros utilizados eram das marcas
Fresenius e Lorne
Foi verificado a fenotipagem do doador no banco de dados do Hemocentro Os
registros dos fenoacutetipos dos doadores ficam armazenadas no sistema de banco de sangue
(SBS) Para doadores que natildeo tinham fenotipagem estendida preacutevia para antiacutegenos do sistema
Rh (C c E e e) e Kell (K) foi realizada a fenotipagem para esses antiacutegenos
O tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA e cloroquina para dissociar
anticorpos pode inativar enfraquecer ou destruir os antiacutegenos presentes nas hemaacutecias
alterando assim os resultados da fenotipagem Para verificar se houve destruiccedilatildeo dos
antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a e Jk
b S e s nas amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes
tratamento foram novamente fenotipadas ao final para os antiacutegenos que eram inicialmente
positivas
A repeticcedilatildeo da fenotipagem foi realizada nas amostras que apresentaram efetividade
no tratamento da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eou da cloroquina e a detecccedilatildeo do antiacutegeno
na amostra preacute-tratamento
24
412 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS HEMAacuteCIAS
As hemaacutecias foram sensibilizadas com antissoros policlonais humanos de amostras de
plasma fresco congelado de doadores com resultado de pesquisa de anticorpo irregular
positivos
A escolha do anticorpo para sensibilizar as hemaacutecias foi definida de acordo com o
fenoacutetipo do doador que deveria ser positivo para o respectivo antiacutegeno
Para a sensibilizaccedilatildeo um volume de antissoro (1 mL) e um volume (1 mL) de
hemaacutecias lavadas quatro vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica foram adicionadas a um tubo de 12 x
75 mm A mistura foi homogeneizada e incubada em banho maria (BM) a 37deg C por 60
minutos A seguir as hemaacutecias foram novamente lavadas 4 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica
para retirada dos anticorpos que natildeo se ligaram A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada
como controle negativo O teste da uacuteltima lavagem eacute importante para assegurar que os
anticorpos que poderatildeo ser detectados no eluato apoacutes o tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA
sejam aqueles que estavam ligados agraves hemaacutecias e natildeo aqueles livres no plasma O controle
negativo mostra que todo o anticorpo livre foi retirado (LEGER 2011)
Para o teste de presenccedila de anticorpo na soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foram incubadas
com hemaacutecias de triagem de anticorpos irregulares (ID-Diacell BIO-RAD) contendo os
antiacutegenos especiacuteficos Realizado a teacutecnica em gel LissCoombs com anti-IgG+C3d Incubado
no tempo de 15 minutos a temperatura de 37deg C e centrifugado 10 minutos em centriacutefuga
proacutepria
As 50 amostras de doadores foram sensibilizadas com os anticorpos policlonais
humanos
Apoacutes sensibilizadas rdquoin vitrordquo e lavadas as hemaacutecias foram diluiacutedas em soluccedilatildeo de
baixa forccedila iocircnica (LISS) na quantidade de 10 microL de hemaacutecia para 1000 microL de soluccedilatildeo A
suspensatildeo foi pipetada (50 microL) em coluna-gel-teste LissCoombs (BIO-RAD) que contecircm
antiglobulina poliespeciacutefico (IgG+C3d) e centrifugada em baixa rotaccedilatildeo conforme orientaccedilatildeo
do fabricante durante 10 minutos
As amostras deveriam apresentar aglutinaccedilatildeo com reatividade 3 a 4+ no TDA As
amostras que apresentaram reaccedilatildeo menor que 3+ foram novamente sensibilizadas com nova
aliacutequota do antissoro
25
413 TRATAMENTO DAS AMOSTRAS
As amostras sensibilizadas apresentando o TDA positivo 3 ou 4+ foram divididas em
duas aliacutequotas e submetidas a duas teacutecnicas diferentes com o objetivo de dissociar o anticorpo
ligado Uma aliacutequota da amostra foi tratada com soluccedilatildeo de difosfato de cloroquina enquanto
a outra aliacutequota foi tratada com glicina-aacutecidaEDTA
42 PREPARO DA GLICINA AacuteCIDA-EDTA
A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA utiliza 3 soluccedilotildees diferentes a glicina aacutecida o
EDTA e o tampatildeo TRIS
Os reagentes foram preparados utilizando os sais para anaacutelise (PA) de EDTA
(Na2EDTA2H2O) TRIS (C4H11NO3) Glicina (H2NCH2CO2H) NaCl e a soluccedilatildeo de aacutecido
cloriacutedrico (HCl) 12 N todos reagentes da marca SYNTH (quadro 1)
Para o preparo do tampatildeo glicina-acida eacute necessaacuterio o ajuste do pH para 15 Para esse
ajuste utiliza-se aacutecido cloriacutedrico (HCl) concentrado O pH foi medido com fitas reativas de pH
com escala de 1 a 14 da marca MERCK Posteriormente a soluccedilatildeo foi enviada ao laboratoacuterio
de controle de qualidade do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto e o pH medido no peagacircmetro O
tampatildeo glicina-aacutecida foi armazenado a 4deg e o tampatildeo tris e o EDTA em temperatura ambiente
controlada (20 a 24deg Celsius)
Apoacutes o preparo e durante a realizaccedilatildeo dos testes foram feitas inspeccedilotildees visuais para
verificaccedilatildeo de turvaccedilatildeo do meio e presenccedila de precipitados
Reagente Material Quantidade Preparo e
Conservaccedilatildeo
EDTA
EDTA
(Na2EDTA2H2O)
5 gramas Mistura ateacute
dissoluccedilatildeo do sal e
conserva em
temperatura ambiente Aacutegua Destilada 50 Ml
Tris
TRIS (C4H11NO3) 121 gramas Conservar em
temperatura ambiente NaCl 525g
Aacutegua destilada 100ml
Gliacutecina-aacutecida
Glicina
(H2NCH2CO2H) 15 gramas
Conservar a 4oC NaCl 116gramas
Aacutegua Destilada 200ml
HCL 12N Ajutar o pH para 15
Quadro 1 - Preparo dos Reagentes da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
Fonte - Manual teacutecnico AABB 2011
26
O tampatildeo glicina-aacutecida e o tampatildeo TRIS satildeo estaacuteveis por 7 meses O reagente EDTA
precipitou mesmo estando em temperatura em ambiente controlado Houve necessidade de
preparo de novo reagente
421 TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
1 Em um tubo de ensaio 12x75 mm eacute adicionado 08 mL da soluccedilatildeo de glicina-aacutecida A
esta soluccedilatildeo adiciona-se 02 mL de EDTA e mistura
2 Adiciona-se 02 mL de hemaacutecias sensibilizadas (lavada 4 vezes) A mistura eacute
homogeneizada e incubada por exatamente 2 minutos
3 A seguir 01 mL de tampatildeo TRIS eacute adicionado agrave mistura que eacute novamente
homogeneizada e centrifugada por 2 minutos a 3400 rpm O pH deve estar entre 7 a 75
4 Apoacutes centrifugaccedilatildeo separa-se em outro tubo o sobrenadante (eluato) e as hemaacutecias
que permanecem satildeo lavadas 4 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica para retirada de todo o
reagente e anticorpos livres
43 PREPARO DA CLOROQUINA
A cloroquina eacute diluiacuteda em tampatildeo PBS na concentraccedilatildeo de 20 (Quadro 2) e
armazenado a 4deg Celsius sua validade apoacutes o preparo eacute de 1 mecircs
A teacutecnica da cloroquina jaacute estaacute padronizada para rotina do laboratoacuterio de
imunohematologia do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto e suas unidades
Reagente Reagentes Quantidade PreparoConservaccedilatildeo
Cloroquina
Difosfato de cloroquina
(C18H32ClN3O8P2)
20 gramas
Conservar a 4deg Celsius
Tampatildeo PBS 100ml
NaOH 01 N Acertar o pH para
51
Quadro 2 - Preparo da Cloroquina Fonte - Manual teacutecnico da AABB 2011
431 TEacuteCNICA DA CLOROQUINA
1 4 partes da soluccedilatildeo pronta eacute adicionada a uma parte de hemaacutecias lavadas 4 vezes com
soluccedilatildeo fisioloacutegica
2 A mistura eacute incubada em temperatura ambiente por ateacute duas horas
3 Centrifugar a 3400 rpm por 2 minutos
27
4 Remover o sobrenadante lavar as hemaacutecias novamente com soluccedilatildeo fisioloacutegica 4
vezes
44 VERIFICACcedilAtildeO DA EFETIVIDADE DOS TESTES
Apoacutes tratamento pelas duas teacutecnicas o TDA foi repetido em todas as amostras para
verificar se os tratamentos foram efetivos e houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo Para as
amostras tratadas pela teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA que permaneceram com TDA positivo
novo tratamento foi realizado
45 TESTE DO ELUATO
O eluato resultante das amostras tratadas com glicina-acidaEDTA foi testado com
hemaacutecias de triagem A soluccedilatildeo do eluato foi incubada com as hemaacutecias de triagem de
anticorpos (ID-Diacell BIO-RAD) pela teacutecnica em gel LissCoombs O teste foi incubado 15
minutos a 37deg Celsius e centrifugado por 10 minutos em centrifuga proacutepria para a teacutecnica em
gel Os eluatos que apresentaram resultados positivos foram testados em painel de 11
hemaacutecias (ID-Diapanel BIO-RAD) para a identificaccedilatildeo do anticorpo
46 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente que apresentou TDA positivo por IgG e pesquisa
de anticorpo irregular positivo com presenccedila de autoanticorpo com reatividade panaglutinina
A amostra foi tratada em paralelo pelas duas teacutecnicas descritas e foi enviada para o
Hemocentro para genotipagem eritrocitaacuteria que foi realizado por metodologia PCR em tempo
real no equipamento Real-time system PCR 7500 ( Applied Biosystems Califoacuternia EUA)
28
5 RESULTADOS
51 REAGENTES
Para aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA satildeo necessaacuterios 3 diferentes
reagentes que podem ser encontrados em forma de kit pronto para uso No entanto esses kits
natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil Os reagentes satildeo tampatildeo glicina-aacutecida o EDTA e o tampatildeo
Tris
Todos os reagentes foram preparados rdquoin houserdquo a partir dos sais e soluccedilotildees PA (puro
para anaacutelise) da marca SYNTH que foram adquiridos para a pesquisa O custo estimado para
cada teste foi aproximadamente R$ 020 reais
Apoacutes o preparo os reagentes poderiam ser armazenados em condiccedilotildees adequadas pelo
periacuteodo de 1 ano (AABB 2011) Ao final do preparo e durante o periacuteodo de armazenamento
de fevereiro a setembro de 2016 foi realizada inspeccedilatildeo visual para verificar a presenccedila de
precipitados ou turvaccedilatildeo A soluccedilatildeo de glicina e o tampatildeo TRIS mostraram-se estaacuteveis ateacute o
final do periacuteodo Por sua vez o reagente EDTA precipitou mesmo estando armazenado em
temperatura ambiente controlada e foi necessaacuterio novo preparo
52 AMOSTRAS DE DOADORES
521 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS AMOSTRAS
Apoacutes incubaccedilatildeo da hemaacutecia com o antissoro a mesma foi lavada 4 vezes para retirada
dos anticorpos livres A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada Caso houvesse positividade na
soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem a etapa era repetida (figura 3) Das 50 amostras sensibilizadas a
uacuteltima lavagem foi positiva somente em 3 delas Nas 3 amostras o anticorpo utilizado para
sensibilizaccedilatildeo foi o anti-K Apoacutes repetido nova etapa de lavagem os resultados se
apresentaram negativos
Em todas as amostras sensibilizadas ldquoin vitrordquo o TDA foi testado e verificado a
intensidade do teste Entre as 50 amostras 47 alcanccedilaram TDA com intensidade 3-4+ apoacutes a
primeira sensibilizaccedilatildeo enquanto 3 amostras necessitaram uma segunda incubaccedilatildeo com
anticorpo (figura 4)
A escolha dos anticorpos para sensibilizar as hemaacutecias foi feita de acordo com o
fenoacutetipo do doador e foram utilizados sete diferentes especificidades de anticorpos policlonais
humanos conforme mostra o graacutefico1
29
Figura 3 - Soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada com hemaacutecia de triagem de
anticorpos em gel LissCoombs (BIO-RAD) A finalidade eacute verificar a presenccedila de anticorpos livres na
suspensatildeo que possam interferir na pesquisa do eluato As soluccedilotildees de lavagem das amostras na figura a tiveram
resultados negativos Na figura b duas amostras a 47 e 50 apresentaram resultado positivo Nova etapa de
lavagem foi realizada e o resultado final foi negativo
522 TRATAMENTO DAS HEMAacuteCIAS
Apoacutes a sensibilizaccedilatildeo e obtenccedilatildeo de resultados de TDA com intensidade de 3 a 4+
cada uma das amostras foi dividida em duas aliacutequotas e tratada separadamente pelas teacutecnicas
de glicinaaacutecida-EDTA e cloroquina
As teacutecnicas foram consideradas efetivas quando obteve-se a completa dissociaccedilatildeo do
anticorpo verificada atraveacutes do TDA negativo na amostra poacutes tratamento conforme figuras 5
e 6 Dentre as amostras tratadas com cloroquina 2850 tiveram o TDA negativado A glicina-
aacutecidaEDTA negativou o TDA em 33 das 50 amostras tratadas Apenas 17 amostras tratadas
com glicina-aacutecidaEDTA permaneceram com o TDA positivo e foram submetidas a um novo
tratamento
30
Figura 4 - TDA das amostras apoacutes sensibilizaccedilatildeo com anticorpos policlonais humanos Amostras na
figura a com intensidades de 3-4+ Na figura b amostras 4 e 7 com intensidade menor que 3+ e portanto foram
novamente sensibilizadas com nova aliacutequota de soro Anti-D e anti-S Apoacutes a segunda sensibilizaccedilatildeo
apresentaram reatividade 4 e 3+ respectivamente Os anticorpos utilizados para sensibilizaccedilatildeo foram D S c E
C e K
523 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS TEacuteCNICAS
No tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA houve dissociaccedilatildeo completa do anticorpo
em 33 amostras (66) das 50 amostras testadas enquanto que com a cloroquina foram 28
amostras (56) (tabela 1)
31
Graacutefico 1- Nuacutemero de amostras sesnsibilizadas por especificidade de anticorpo Entre as 50 amostras 12
foram sensibilizadas com anti-D 10 com anti-C 9 com anti-E 8 com anti-c 7 com anti-S 3 com anti-K e 1
com anti-Dia As especificidades dos anticorpos foram definidas de acordo o fenoacutetipo do doador
Figura 5 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com cloroquina Nas amostras onde houve
a dissociaccedilatildeo do anticorpo ( 2 21 a 23 26 39 a 42 45 46 e 49) a hemaacutecia se deposita no fundo no microtubo
apoacutes a centrifugaccedilatildeo (TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (1 3 24 25 43 44 47
48 e 50) o anticorpo ligado agraves hemaacutecias eacute alvo da AGH presente no gel (TDA positivo)
Anti-D 12
Anti-C 10
Anti-E 9
Anti-c 8
Anti-S 7
Anti-K 3 Anti-Dia 1
32
Figura 6 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA Nas amostras
onde houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo (4 6 7 12 a 15 17 34 35 37 e 38) a hemaacutecia se deposita no fundo no
microtubo apoacutes a centrifugaccedilatildeo ( TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (5 16 18
19 20 33 e 36 ) o AGH presente no gel se liga ao anticorpo ligado agraves hemaacutecias que ficam retidas no gel (TDA
positivo)
Tabela 1-Resultado geral do tratamento das hemaacutecias com glicina e cloroquina
Teacutecnica utilizada TDA negativo TDA positivo Total
Glicina-aacutecidaEDTA 33 17 50
Cloroquina 28 22 50
A glicina-aacutecidaEDTA conseguiu negativar mais amostras sensibilizadas com Anti-D
e anti-K que a cloroquina Para as hemaacutecias sensibilizadas com anti-E Anti-S e Anti-Dia
ambas as teacutecnicas dissociaram o anticorpo em 100 das amostras Os resultados detalhados
por especificidade do anticorpo apoacutes o primeiro tratamento com glicina-aacutecidaEDTA e com
cloroquina estatildeo na tabela 2
Para as amostras que permaneceram positivas (17 amostras) apoacutes o tratamento com a
glicina-aacutecidaEDTA foi realizado um novo tratamento Houve dissociaccedilatildeo do anticorpo em 3
amostras (18) apoacutes a segunda tentativa Nas demais 14 (82) amostras tratadas pela
segunda vez 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise
33
Tabela 2 - Resultados do TDA apoacutes tratamento das hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo
sensibilizado
ANTICORPOS
SENSIBILIZADOS
1ordm TRATAMENTO COM
GLICINA
TRATAMENTO COM
CLOROQUINA
TOTAL TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
Anti-D 8 4 0 12 12
Anti-C 6 4 10 0 10
Anti-E 9 0 9 0 9
Anti-c 0 8 1 7 8
Anti-S 7 0 7 0 7
Anti-K 2 1 0 3 3
Anti-Dia 1 0 1 0 1
TOTAL 33 17 28 22 50
A hemoacutelise foi verificada durante o procedimento de lavagem final das hemaacutecias com
soluccedilatildeo fisioloacutegica para a retirada dos reagentes As soluccedilotildees de lavagem ficaram
avermelhadas e as hemaacutecias com coloraccedilatildeo escura As amostras foram descartadas Dentre as
6 amostras que ainda puderam ser testadas para o TDA trecircs amostras negativaram sendo 1
sensibilizada com anti-D e 2 com anti-C (tabela 3)
Tabela 3 - Resultado apoacutes o segundo tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA
Tratamento com
glicina-aacutecidaEDTA
TDA Negativo TDA Positvo Hemoacutelise Total
Segundo tratamento 3 3 11 17
524 TESTAGEM DO ELUATO
Apoacutes o tratamento com a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA a soluccedilatildeo do eluato foi
testada para verificar a viabilidade dos anticorpos que foram dissociados ou eluiacutedos Dentre
as 50 amostras 41 apresentaram eluato positivo As nove amostras cujos eluatos foram
negativos haviam sido sensibilizadas com as seguintes especificidades de anticorpos anti-E 6
amostras (67) anti-S 2 amostras (40) e anti-D 1 amostra (8) (tabela 4) O eluato de
todas as amostras sensibilizadas com os anticorpos anti-C anti-c Anti-K e Anti-Dia foram
positivos Os eluatos positivos na triagem de anticorpos foram testados com paineacuteis de
identificaccedilatildeo para confirmar a especificidade e a viabilidade dos anticorpos (figuras 7 e 8)
34
525 EFEITO DA ELUICcedilAtildeO SOBRE OS ANTIacuteGENOS ERITROCITAacuteRIOS
Para verificar o efeito do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA e com a cloroquina
sobre a expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s foi realizada a fenotipagem das
amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes tratamento com ambas as teacutecnicas Foi avaliado
se o tratamento destruiu os antiacutegenos expressos antes do tratamento
Tabela 4- Resultado do Eluato das amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA
Anticorpos Eluato positvo Eluato negativo Total
Anti-D 11 1 12
Anti-C 10 0 10
Anti-E 3 6 9
Anti-c 8 0 8
Anti-S 5 2 7
Anti-K 3 0 3
Anti-Dia 1 0 1
Total 41 9 50
Figura 7 ndash Painel do eluato da amostra 21 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-C que foi
recuperado no eluato
Figura 8 ndash Painel do eluato da amostra 47 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-K que foi
recuperado no eluato
35
Dentre as 50 amostras 26 eram previamente fenotipadas para os antiacutegenos Fya Fy
b
Jka Jk
b S e s Dentre elas 20 alcanccedilaram TDA negativo apoacutes tratamento com a glicina-
aacutecidaEDTA e 20 negativaram apoacutes tratamento com cloroquina (tabela 5) Apoacutes ambas as
teacutecnicas os antiacutegenos originalmente expressos permaneceram positivos comprovando que natildeo
houve destruiccedilatildeo dos mesmos
Tabela 5 ndash Verificaccedilatildeo da interferecircncia do tratamento da hemaacutecias com cloroquina e glicina-
aacuteicdaEDTA sobre os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
AMOSTRAS
COM
FENOTIPAGEM
PREacuteVIA
TRATADAS COM
CLOROQUINA
TRATADAS COM
GLICINA
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
26
20
20
20
20
As amostras 24 47 e 50 eram positivas para o antiacutegeno K A cloroquina natildeo dissociou
o anticorpo em nenhuma das 3 amostras enquanto a glicina-aacutecidaEDTA foi efetiva nas
amostras 24 e 50 Foi testada a expressatildeo do antiacutegeno K nas amostras 24 e 50 apoacutes o
tratamento utilizando meacutetodo indireto em gel contendo AGH Apesar de natildeo ter sido avaliado
a intensidade de reaccedilatildeo de expressatildeo dos antiacutegenos podemos verificar na figura 9 que nas
duas amostras em que a teacutecnica foi efetiva e dissociou o anticorpo a expressatildeo do antiacutegeno K
continua presente mas a reatividade observada pode ser considerada 1+ sugerindo que houve
diminuiccedilatildeo da expressatildeo do antiacutegeno quando comparado com a expressatildeo observada em
hemaacutecia natildeo tratada
Os resultados individuais de cada amostra em ambas as teacutecnicas encontram-se
resumidas na tabela 6
526 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente onde foi constatada a presenccedila de autoanticorpo
a quente da classe IgG pelo TDA monoespeciacutefico (figura 10)O autoanticorpo tambeacutem
interferia na pesquisa e identificaccedilatildeo de anticorpos irregulares pois apresentava caracteriacutestica
de panaglutinina As hemaacutecias da paciente sensibilizadas ldquoin vivordquo foram tratadas com
cloroquina e com glicina-aacutecidaEDTA
36
Figura 9 ndash Fenotipagem das amostras 24 e 50 para antiacutegeno K apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
O teste positivo indica a presenccedila do antiacutegeno poreacutem a reatividade fraca (1+) sugere que houve enfraquecimento
de sua expressatildeo A direita a expressatildeo forte (4+) do antiacutegeno Kell em hemaacutecia controle natildeo tratada utilizada
como controle positivo
A cloroquina natildeo foi efetiva na retirada do anticorpo ligado as hemaacutecias ao contraacuterio
do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA que dissociou o anticorpo (figura 11)
A hemaacutecia tratada com glicina foi fenotipada para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
(figura 12) A fenotipagem para o sistema Rh (C c E e e) e Kell foi realizada em gel
especiacutefico monoclonal sem interferecircncia do TDA positivo (controle da reaccedilatildeo negativo)
O eluato resultante do tratamento com glicina-aacutecidaEDTA foi testada em gel com
hemaacutecias de painel de identificaccedilatildeo de anticorpos e apresentou resultado positivo com todas
as ceacutelulas (figura 13 e 14)
A amostra foi enviada para genotipagem e o resultado da genotipagem confirmou o
resultado da fenotipagem apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
527 TEMPO DE EXECUCcedilAtildeO DA TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
O tempo de reaccedilatildeo da glicina-aacutecidaEDTA eacute de 2 minutos Todas as amostras foram
tratadas obedecendo ao tempo descrito na literatura demonstrando que o mesmo eacute
reprodutiacutevel
37
Tabela 6- Resultados individuais por amostra
Amostra Especificidade
dos anticorpos
Intensidade do
TDA apoacutes
sensibilizaccedilatildeo
Tratamento
efetivo com
cloroquina
Tratamento
efetivo com
glicina
Eluato
poacutes
glicina
1 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 2 Dia 3+ Sim Sim 3+ 3 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 4 D 4+ Natildeo Sim 4+ 5 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 6 E 3+ Sim Sim Negativo 7 S 4+ Sim Sim 3+ 8 E 3+ Sim Sim 1+ 9 E 3+ Sim Sim 2+
10 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 11 D 4+ Natildeo Sim 4+ 12 D 4+ Natildeo Sim 4+ 13 S 3+ Sim Sim 3+ 14 S 3+ Sim Sim 3+ 15 D 3+ Natildeo Sim 3+ 16 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 17 E 3+ Sim Sim (+) 18 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 19 D 4+ Natildeo Natildeo 3+ 20 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 21 C 3+ Sim Sim 4+ 22 C 3+ Sim Sim 4+ 23 C 3+ Sim Sim 4+ 24 K 4+ Natildeo Sim 4+ 25 D 3+ Natildeo Natildeo Negativo 26 E 4+ Sim Sim Negativo 27 S 3+ Sim Sim 3+ 28 C 3+ Sim Natildeo 4+ 29 C 3+ Sim Sim 4+ 30 C 3+ Sim Sim 4+ 31 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 32 E 3+ Sim Sim Negativo 33 C 3+ Sim Natildeo 4+ 34 S 3+ Sim Sim Negativo 35 S 3+ Sim Sim Negativo 36 C 4+ Sim Natildeo 4+ 37 c 4+ Natildeo Natildeo 4+ 38 D 4+ Natildeo Sim 4+ 39 S 3+ Sim Sim 3+ 40 c 4+ Sim Natildeo 2+ 41 C 4+ Sim Natildeo 4+ 42 E 3+ Sim Sim Negativo 43 D 3+ Natildeo Sim 2+ 44 D 3+ Natildeo Sim 2+ 45 E 3+ Sim Sim Negativo 46 C 3+ Sim Sim 4+ 47 K 4+ Natildeo Natildeo 4+ 48 D 3+ Natildeo Sim 2+ 49 E 3+ Sim Sim Negativo 50 K 4+ Natildeo Sim 4+
TOTAL 50 28 33 41
38
Figura 10 ndash TDA monoespeciacutefico da amostra de paciente Hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo da classe
IgG
oacute Figura 11 ndash TDA apoacutes o tratamento com glicina-aacutecidaEDTA (esquerda) e cloroquina (direita) A glicina
negativou completamente o TDA enquanto a hemaacutecia tratada com cloroquina persistiu positiva (1+)
39
Figura 12 ndash Fenotipagem da amostra tratada com glicina-aacutecidaEDTA Fy(a+b+) Jk(a-b+) S+s+
Figura 13 ndash Painel em gel (LissAGH) do eluato apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de
intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
Figura 14 ndash ndash Painel ezimaacutetico (hemaacutecias tratadas com bromelina) do eluato em gel neutro apoacutes
tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
40
528 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Quanto a efetividade das teacutecnicas em negativar o TDA foi verificado que a glicina-
aacutecidaEDTA foi efetiva em 66 das amostras testadas no primeiro tratamento (3350
amostras) enquanto a cloroquina conseguiu negativar 56 (2850) Esses resultados natildeo
apresentam diferenccedila significativa (pgt005) demostrando que a teacutecnica da glicina-
aacutecidaEDTA natildeo eacute superior mas eacute tatildeo efetiva quanto a da cloroquina
Quando aliamos os resultados de ambas as teacutecnicas verificamos que em 76 (3850)
das amostras o TDA foi negativado Esse dado indica que ainda que uma teacutecnica natildeo seja
eficaz na remoccedilatildeo do anticorpo eacute uma boa alternativa tentar a segunda teacutecnica jaacute que a falha
em remover o anticorpo utilizando uma delas natildeo prevecirc necessariamente a falha com a outra
Quando se utiliza o teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla (graacutefico 2) para comparar a utilizaccedilatildeo das
duas teacutecnicas com o resultado de cada uma isolada (somente a cloroquina ou somente a
glicina) verificamos que os resultados apresentam diferenccedila significativa (plt005) (quadro 3)
TRATAMENTO EFETIVO COM TOTAL PORCENTAGEM
Glicina ou cloroquina 38 76
Glicina e cloroquina 23 46
Glicina apenas 10 20
Cloroquina apenas 5 10
Nenhuma das teacutecnicas 12 24
Quadro 3 - Resultados comparativos entre as teacutecnicas utilizadas
41
Graacutefico 2 - Teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla entre as teacutecnicas aplicadas A- Glicina e Cloroquina B-Cloroquina C-
Glicina ( plt005)
42
6 DISCUSSAtildeO
Os reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA podem ser adquiridos em
forma de kit comercial prontos para uso poreacutem natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil A preparaccedilatildeo
dos reagentes ldquoin houserdquo a partir de sais comerciais adquiridos se mostrou viaacutevel Os
reagentes glicina e o tampatildeo Tris armazenados de forma correta se mantiveram estaacuteveis por
um periacuteodo de 7 meses Somente o reagente EDTA precipitou mesmo armazenado em
condiccedilotildees adequadas sugerindo que o mesmo deve ser preparado em menor quantidade e
armazenado em aliacutequotas A soluccedilatildeo de cloroquina tambeacutem pode ser preparada ldquoin houserdquo e
pode ser armazenado por um mecircs A legislaccedilatildeo brasileira autoriza a utilizaccedilatildeo de reagentes
preparados a partir de sais comerciais como a cloroquina e a glicina-aacutecidaEDTA desde que
os sais tenham autorizaccedilatildeo da vigilacircncia sanitaacuteria para a comercializaccedilatildeo (BRASIL 2001)
A comparaccedilatildeo quanto a efetividade em dissociar anticorpos em amostras com TDA
positivos entre a teacutecnica da glicina e a teacutecnica da cloroquina mostrou que natildeo haacute diferenccedila
estatiacutestica entre elas e que ambas satildeo igualmente eficientes Se utilizadas conjuntamente haacute
maior possibilidade de elucidaccedilatildeo dos casos
Uma vantagem da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eacute que ela permite numa mesma
amostra eluir o anticorpo ligado aacute hemaacutecia assim como fenotipar a hemaacutecia tratada Devido a
sua dupla utilidade a teacutecnica eacute vantajosa principalmente em pacientes em que pouco volume
de amostra pode ser coletado como em casos de crianccedilas e receacutem-nascidos
A fenotipagem poacutes tratamento se mostrou viaacutevel jaacute que os antiacutegenos de maior
importacircncia natildeo sofreram alteraccedilotildees Nas 20 amostras que foram fenotipadas antes e apoacutes
tratamento para verificar a influecircncia dos reagentes na expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a
Jkb S e s natildeo houve destruiccedilatildeo dos mesmos por nenhuma das duas teacutecnicas
Para as amostras positivas para o antiacutegeno Kell (350) e sensibilizadas com o
respectivo anticorpo a teacutecnica da glicina foi efetiva em negativar o TDA em apenas duas
delas mas apoacutes o tratamento foi verificada uma fraca reatividade da reaccedilatildeo antiacutegeno-
anticorpo sugerindo que houve um enfraquecimento da expressatildeo do antiacutegeno conforme
esperado e descrito na literatura (BYRNE 1991 PALLAS WILER E MCGEE 1991
ROZIERS e SQUALI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012 e KATHARIA e
CHAUDHARY 2013) A accedilatildeo da glicina sobre o antigeno Kell natildeo representa impedimento
para seu uso uma vez que na impossibilidade de testar o antiacutegeno Kell o banco de sangue
consegue facilmente atender a solicitaccedilatildeo de transfusatildeo com unidades de hemaacutecias Kell
43
negativas jaacute que eacute um antiacutegeno de baixa prevalecircncia na populaccedilatildeo variando de 15 na
populaccedilatildeo africana a 9 nos europeus (DANIELS 2011)
A soluccedilatildeo resultante da dissociaccedilatildeo do anticorpo pela teacutecnica da glicina pode ainda ser
utilizada como eluato podendo substituir a teacutecnica de eluiccedilatildeo com reagentes comercias (kits
de eluiccedilatildeo aacutecida) que tem alto custo aproximadamente entre R$2000 a R$2500 por teste
Em 41 amostras (82) houve a dissociaccedilatildeo e recuperaccedilatildeo do anticorpo que estava
sensibilizando as hemaacutecias Em 9 amostras (18) os anticorpos foram eluiacutedos poreacutem
apresentaram reaccedilatildeo negativa quando testadas com hemaacutecias de triagem entre eles o anti-E
(6) anti-S (2) e Anti-D (1) Eacute possiacutevel que a correccedilatildeo pH do meio (WALKER 2011) natildeo
tenha sido adequada o que pode ter desfavorecido a reatividade do anticorpo
Para as amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA nas quais natildeo houve dissociaccedilatildeo do
anticorpo pelo primeiro tratamento (1750) o segundo tratamento natildeo se mostrou eficaz jaacute
que 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise O tempo de
armazenagem natildeo parece ter influenciado jaacute que todas as amostras foram testadas dentro de
48 horas apoacutes a coleta Outros fatores que natildeo foram verificados podem ter levado a
hemoacutelise Apesar da literatura (LOUIE JIENG e ZEROULIS 1986 e BYRNE 1991)
recomendar um segundo tratamento ele eacute pouco eficaz tendo negativado apenas 3 das 17
amostras testadas
A amostra de paciente que apresentou sensibilizaccedilatildeo ldquoin vivordquo mostrou melhor
efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA sobre a da cloroquina possibilitando
fenotipagem para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s que natildeo foram destruiacutedos apoacutes o
tratamento comprovado atraveacutes da genotipagem
A presenccedila de autoanticorpo a quente com presenccedila de hemoacutelise (AHAI) ou natildeo pode
mascarar a presenccedila de aloanticorpo interferindo na rotina soroloacutegica da fenotipagem que eacute
uma importante ferramenta para auxiliar na seleccedilatildeo de hemaacutecias para transfusatildeo (SHIREY et
al 2002) Esses pacientes frequentemente possuem aloanticorpos associados ao
autoanticorpo e a prevalecircncia de aloimunizaccedilatildeo entre eles varia entre 12 a 40 (LEGER e
GARRATY 1999 BRANCH e PETZ 1999) o que dificulta ainda mais a escolha do melhor
componente a ser transfundido aleacutem de aumentar a possibilidade reaccedilotildees hemoliacuteticas imunes
poacutes-transfusionais
Nesses casos as teacutecnicas de dissociaccedilatildeo de anticorpos satildeo importantes para tratar
amostras de pacientes e a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser usada como uma opccedilatildeo
pois se mostrou eficaz na dissociaccedilatildeo anticorpo ligado agraves hemaacutecias deixando livre a
superfiacutecie das mesmas permitindo a fenotipagem por antisoros IgG Paralelamente os
44
anticorpos eluiacutedos tambeacutem puderam ser estudados O mesmo natildeo ocorre com a cloroquina
que permite apenas a fenotipagem e tampouco com os kits de eluiccedilatildeo aacutecida disponiacuteveis no
mercado nacional que satildeo destinados a realizaccedilatildeo do eluato mas destroem as hemaacutecias
O tempo de tratamento na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA tambeacutem eacute uma vantagem
pois foi possiacutevel reproduzir no tempo determinado de 2 minutos enquanto a cloroquina
demora ateacute duas horas
Ainda que a aplicaccedilatildeo das teacutecnicas por biologia molecular estejam cada vez mais
presentes na rotina imuno-hematoloacutegica e possibilitam estabelecer o fenoacutetipo deduzido do
genoacutetipo elas natildeo estatildeo disponiacuteveis na maioria dos centros e sua realizaccedilatildeo exige algumas
horas A resoluccedilatildeo imediata do problema transfusional necessita dos resultados soroloacutegicos
pois com frequecircncia natildeo eacute possiacutevel aguardar o resultado do teste molecular Dessa forma
apesar da crescente importacircncia da genotipagem eritrocitaacuteria teacutecnicas soroloacutegicas aplicadas
corretamente e no momento propiacutecio satildeo de grande utilidade para resolver problemas imuno-
hematoloacutegicos como ocorre com a fenotipagem em pacientes com TDA positivo
45
7 CONCLUSAtildeO
A teacutecnica da glicina aacutecidaEDTA mostrou-se efetiva em remover os anticorpos que
sensibilizavam as hemaacutecias e pode ser utilizada com seguranccedila antes da fenotipagem
eritrocitaacuteria Por ser uma teacutecnica de raacutepida execuccedilatildeo eacute uma alternativa aplicaacutevel
principalmente em casos urgentes de pacientes que apresentam autoanticorpos
46
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50
9 ANEXOS
51
FUNDACcedilAtildeO HEMOCENTRO DE RIBEIRAtildeO PRETO
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE)
Tiacutetulo da pesquisa Aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina aacutecida-EDTA e avaliaccedilatildeo da
eficaacutecia no tratamento de hemaacutecias com teste direto da antiglobulina positivo
Pesquisadora responsaacutevel Ceacutelia Kazue Abiko
Orientador Prof Dimas Tadeu Covas
Co-orientadora Dra Flaacutevia Leite Souza Santos
Objetivo da pesquisa Vocecirc estaacute sendo convidado a participar de uma pesquisa que tem
como objetivo padronizar uma nova teacutecnica para auxiliar na tipagem sanguiacutenea de pacientes
A tipagem sanguiacutenea pode sofrer interferecircncia da presenccedila de anticorpos ligados aos gloacutebulos
vermelhos do sangue Nessas situaccedilotildees eacute difiacutecil selecionar o melhor sangue para o paciente e
eacute preciso a utilizaccedilatildeo de teacutecnicas adicionais para remover essas interferecircncias
Esta pesquisa tem como objetivo estudar outra teacutecnica para remover esses anticorpos e
comparaacute-la com a teacutecnica atualmente utilizada Para isso precisamos de amostras de pacientes
e doadores voluntaacuterios
Se vocecirc eacute um doador eacute necessaacuterio que vocecirc autorize a coleta de 5 ml (1 tubo) a mais
de seu sangue
Se vocecirc eacute um paciente natildeo haveraacute necessidade de nova amostra pois utilizaremos as
amostras jaacute coletadas para os testes preacute-transfusionais e os resultados encontrados nesta
pesquisa natildeo iratildeo interferir na escolha da (s) bolsa (s) de sangue que vocecirc possa vir a receber
Se vocecirc concordar em participar leia com atenccedilatildeo o texto abaixo e assine as duas vias
rubricando todas as paacuteginas deste termo de consentimento Uma via original assinada e
rubricada por vocecirc e pela pesquisadora ficaraacute com vocecirc
As suas informaccedilotildees seratildeo mantidas em sigilo pela pesquisadora e natildeo haveraacute
armazenamento de material para pesquisas posteriores Os seus dados seratildeo usados apenas
neste estudo e quando o trabalho for publicado seu nome e qualquer outra informaccedilatildeo que
possam identificaacute-lo natildeo seratildeo revelados
Eacute pouco provaacutevel que o que noacutes aprendermos com este estudo tenha um benefiacutecio
direto para vocecirc assim como natildeo poderemos dar nada em troca pela sua participaccedilatildeo na
pesquisa
Nosso objetivo com esta pesquisa eacute que os resultados poderatildeo ser uacuteteis para o
tratamento de pacientes no futuro Os riscos da participaccedilatildeo satildeo miacutenimos Se vocecirc eacute um
doador de sangue a amostra seraacute coletada no momento da doaccedilatildeo natildeo exigindo punccedilatildeo
venosa adicional
52
Eacute seu direito ter acesso aos resultados dos testes da pesquisa Esses resultados natildeo
seratildeo fornecidos automaticamente a vocecirc mas caso vocecirc se interesse em saber o resultado ou
tiver alguma duacutevida sobre a sua participaccedilatildeo neste estudo deveraacute entrar em contato com Ceacutelia
Kazue Abiko pelo telefone (18) 99718-3551
Vocecirc tem total liberdade de optar por natildeo participar da pesquisa Caso aceite
participar poderaacute desistir a qualquer momento ou retirar seu consentimento mesmo apoacutes ter
coletado o sangue Para cancelar sua participaccedilatildeo basta avisar a pesquisadora e os seus dados
seratildeo retirados do projeto
Qualquer duacutevida eacutetica sobre a pesquisa poderaacute entrar em contato com o Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa do Hospital das Cliacutenicas e da Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto
(CAMPUS UNIVERSITAacuteRIO bairro Monte Alegre CEP 14048-900 Ribeiratildeo Preto-SP
Telefone (16) 3602-2228 FAX (16) 3633-1144 e-mail cephcrpuspbr)
Consentimento de participaccedilatildeo
A Consentimento do participante
Li as informaccedilotildees acima sobre o estudo e recebi explicaccedilotildees sobre a participaccedilatildeo no estudo
Portanto dou o meu consentimento para participar do estudo
___________________________________________________________________________
Nome completo
___________________________________________________________________________
Assinatura
___________
Data
__________________________________________________________________________________
Nome completo da pesquisadora
___________________________________________________________________________
Assinatura
_____________
Data
23
411 FENOTIPAGEM
Foram verificados se os doadores jaacute tinham fenotipagem para outros sistemas de
grupos sanguiacuteneos aleacutem do sistema ABORh que eacute realizado rotineiramente
A fenotipagem eritrocitaacuteria para outros sistemas ou fenotipagem estendida eacute realizada
para identificar a presenccedila ou ausecircncia de antiacutegenos considerados de importacircncia cliacutenica No
Hemonuacutecleo de Araccedilatuba uma parcela de doadores de repeticcedilatildeo satildeo fenotipados para os
antiacutegenos dos sistemas de grupo sanguiacuteneo Rh (antiacutegenos C c E e e) Kell (antiacutegeno K)
Duffy (antiacutegenos Fya e Fy
b) Kidd (antiacutegenos Jk
a e Jk
b) e sistema MNSs (antiacutegenos S e s)
A fenotipagem para o Rh e Kell eacute realizada por metodologia de microplaca utilizando
25 microL de hemaacutecia lavada e diluiacuteda a 5 em salina e 25 microL do antissoro comercial especiacutefico
A reaccedilatildeo eacute incubada 15 minutos a temperatura ambiente e centrifugadas para leitura Para os
antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s a metolodogia utilizado eacute gel contendo antiglobulina
humana (gel LissCoombs poliespeciacutefico) da marca BIO-RAD onde se utiliza suspensatildeo de
hemaacutecia em LISS (Soluccedilatildeo de baixa forccedila iocircnica) A suspensatildeo eacute preparada atraveacutes da
diluiccedilatildeo de 10 microL de hemaacutecia em 1000 microL de LISS Pipetado 50 microL dessa diluiccedilatildeo no gel e
adicionado 25 microL do antissoro especiacutefico Incuba-se em banho seco por 15 minutos a 37 deg
Celsius e eacute centrifugado em centriacutefuga especiacutefica Os antissoros utilizados eram das marcas
Fresenius e Lorne
Foi verificado a fenotipagem do doador no banco de dados do Hemocentro Os
registros dos fenoacutetipos dos doadores ficam armazenadas no sistema de banco de sangue
(SBS) Para doadores que natildeo tinham fenotipagem estendida preacutevia para antiacutegenos do sistema
Rh (C c E e e) e Kell (K) foi realizada a fenotipagem para esses antiacutegenos
O tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA e cloroquina para dissociar
anticorpos pode inativar enfraquecer ou destruir os antiacutegenos presentes nas hemaacutecias
alterando assim os resultados da fenotipagem Para verificar se houve destruiccedilatildeo dos
antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a e Jk
b S e s nas amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes
tratamento foram novamente fenotipadas ao final para os antiacutegenos que eram inicialmente
positivas
A repeticcedilatildeo da fenotipagem foi realizada nas amostras que apresentaram efetividade
no tratamento da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eou da cloroquina e a detecccedilatildeo do antiacutegeno
na amostra preacute-tratamento
24
412 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS HEMAacuteCIAS
As hemaacutecias foram sensibilizadas com antissoros policlonais humanos de amostras de
plasma fresco congelado de doadores com resultado de pesquisa de anticorpo irregular
positivos
A escolha do anticorpo para sensibilizar as hemaacutecias foi definida de acordo com o
fenoacutetipo do doador que deveria ser positivo para o respectivo antiacutegeno
Para a sensibilizaccedilatildeo um volume de antissoro (1 mL) e um volume (1 mL) de
hemaacutecias lavadas quatro vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica foram adicionadas a um tubo de 12 x
75 mm A mistura foi homogeneizada e incubada em banho maria (BM) a 37deg C por 60
minutos A seguir as hemaacutecias foram novamente lavadas 4 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica
para retirada dos anticorpos que natildeo se ligaram A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada
como controle negativo O teste da uacuteltima lavagem eacute importante para assegurar que os
anticorpos que poderatildeo ser detectados no eluato apoacutes o tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA
sejam aqueles que estavam ligados agraves hemaacutecias e natildeo aqueles livres no plasma O controle
negativo mostra que todo o anticorpo livre foi retirado (LEGER 2011)
Para o teste de presenccedila de anticorpo na soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foram incubadas
com hemaacutecias de triagem de anticorpos irregulares (ID-Diacell BIO-RAD) contendo os
antiacutegenos especiacuteficos Realizado a teacutecnica em gel LissCoombs com anti-IgG+C3d Incubado
no tempo de 15 minutos a temperatura de 37deg C e centrifugado 10 minutos em centriacutefuga
proacutepria
As 50 amostras de doadores foram sensibilizadas com os anticorpos policlonais
humanos
Apoacutes sensibilizadas rdquoin vitrordquo e lavadas as hemaacutecias foram diluiacutedas em soluccedilatildeo de
baixa forccedila iocircnica (LISS) na quantidade de 10 microL de hemaacutecia para 1000 microL de soluccedilatildeo A
suspensatildeo foi pipetada (50 microL) em coluna-gel-teste LissCoombs (BIO-RAD) que contecircm
antiglobulina poliespeciacutefico (IgG+C3d) e centrifugada em baixa rotaccedilatildeo conforme orientaccedilatildeo
do fabricante durante 10 minutos
As amostras deveriam apresentar aglutinaccedilatildeo com reatividade 3 a 4+ no TDA As
amostras que apresentaram reaccedilatildeo menor que 3+ foram novamente sensibilizadas com nova
aliacutequota do antissoro
25
413 TRATAMENTO DAS AMOSTRAS
As amostras sensibilizadas apresentando o TDA positivo 3 ou 4+ foram divididas em
duas aliacutequotas e submetidas a duas teacutecnicas diferentes com o objetivo de dissociar o anticorpo
ligado Uma aliacutequota da amostra foi tratada com soluccedilatildeo de difosfato de cloroquina enquanto
a outra aliacutequota foi tratada com glicina-aacutecidaEDTA
42 PREPARO DA GLICINA AacuteCIDA-EDTA
A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA utiliza 3 soluccedilotildees diferentes a glicina aacutecida o
EDTA e o tampatildeo TRIS
Os reagentes foram preparados utilizando os sais para anaacutelise (PA) de EDTA
(Na2EDTA2H2O) TRIS (C4H11NO3) Glicina (H2NCH2CO2H) NaCl e a soluccedilatildeo de aacutecido
cloriacutedrico (HCl) 12 N todos reagentes da marca SYNTH (quadro 1)
Para o preparo do tampatildeo glicina-acida eacute necessaacuterio o ajuste do pH para 15 Para esse
ajuste utiliza-se aacutecido cloriacutedrico (HCl) concentrado O pH foi medido com fitas reativas de pH
com escala de 1 a 14 da marca MERCK Posteriormente a soluccedilatildeo foi enviada ao laboratoacuterio
de controle de qualidade do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto e o pH medido no peagacircmetro O
tampatildeo glicina-aacutecida foi armazenado a 4deg e o tampatildeo tris e o EDTA em temperatura ambiente
controlada (20 a 24deg Celsius)
Apoacutes o preparo e durante a realizaccedilatildeo dos testes foram feitas inspeccedilotildees visuais para
verificaccedilatildeo de turvaccedilatildeo do meio e presenccedila de precipitados
Reagente Material Quantidade Preparo e
Conservaccedilatildeo
EDTA
EDTA
(Na2EDTA2H2O)
5 gramas Mistura ateacute
dissoluccedilatildeo do sal e
conserva em
temperatura ambiente Aacutegua Destilada 50 Ml
Tris
TRIS (C4H11NO3) 121 gramas Conservar em
temperatura ambiente NaCl 525g
Aacutegua destilada 100ml
Gliacutecina-aacutecida
Glicina
(H2NCH2CO2H) 15 gramas
Conservar a 4oC NaCl 116gramas
Aacutegua Destilada 200ml
HCL 12N Ajutar o pH para 15
Quadro 1 - Preparo dos Reagentes da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
Fonte - Manual teacutecnico AABB 2011
26
O tampatildeo glicina-aacutecida e o tampatildeo TRIS satildeo estaacuteveis por 7 meses O reagente EDTA
precipitou mesmo estando em temperatura em ambiente controlado Houve necessidade de
preparo de novo reagente
421 TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
1 Em um tubo de ensaio 12x75 mm eacute adicionado 08 mL da soluccedilatildeo de glicina-aacutecida A
esta soluccedilatildeo adiciona-se 02 mL de EDTA e mistura
2 Adiciona-se 02 mL de hemaacutecias sensibilizadas (lavada 4 vezes) A mistura eacute
homogeneizada e incubada por exatamente 2 minutos
3 A seguir 01 mL de tampatildeo TRIS eacute adicionado agrave mistura que eacute novamente
homogeneizada e centrifugada por 2 minutos a 3400 rpm O pH deve estar entre 7 a 75
4 Apoacutes centrifugaccedilatildeo separa-se em outro tubo o sobrenadante (eluato) e as hemaacutecias
que permanecem satildeo lavadas 4 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica para retirada de todo o
reagente e anticorpos livres
43 PREPARO DA CLOROQUINA
A cloroquina eacute diluiacuteda em tampatildeo PBS na concentraccedilatildeo de 20 (Quadro 2) e
armazenado a 4deg Celsius sua validade apoacutes o preparo eacute de 1 mecircs
A teacutecnica da cloroquina jaacute estaacute padronizada para rotina do laboratoacuterio de
imunohematologia do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto e suas unidades
Reagente Reagentes Quantidade PreparoConservaccedilatildeo
Cloroquina
Difosfato de cloroquina
(C18H32ClN3O8P2)
20 gramas
Conservar a 4deg Celsius
Tampatildeo PBS 100ml
NaOH 01 N Acertar o pH para
51
Quadro 2 - Preparo da Cloroquina Fonte - Manual teacutecnico da AABB 2011
431 TEacuteCNICA DA CLOROQUINA
1 4 partes da soluccedilatildeo pronta eacute adicionada a uma parte de hemaacutecias lavadas 4 vezes com
soluccedilatildeo fisioloacutegica
2 A mistura eacute incubada em temperatura ambiente por ateacute duas horas
3 Centrifugar a 3400 rpm por 2 minutos
27
4 Remover o sobrenadante lavar as hemaacutecias novamente com soluccedilatildeo fisioloacutegica 4
vezes
44 VERIFICACcedilAtildeO DA EFETIVIDADE DOS TESTES
Apoacutes tratamento pelas duas teacutecnicas o TDA foi repetido em todas as amostras para
verificar se os tratamentos foram efetivos e houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo Para as
amostras tratadas pela teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA que permaneceram com TDA positivo
novo tratamento foi realizado
45 TESTE DO ELUATO
O eluato resultante das amostras tratadas com glicina-acidaEDTA foi testado com
hemaacutecias de triagem A soluccedilatildeo do eluato foi incubada com as hemaacutecias de triagem de
anticorpos (ID-Diacell BIO-RAD) pela teacutecnica em gel LissCoombs O teste foi incubado 15
minutos a 37deg Celsius e centrifugado por 10 minutos em centrifuga proacutepria para a teacutecnica em
gel Os eluatos que apresentaram resultados positivos foram testados em painel de 11
hemaacutecias (ID-Diapanel BIO-RAD) para a identificaccedilatildeo do anticorpo
46 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente que apresentou TDA positivo por IgG e pesquisa
de anticorpo irregular positivo com presenccedila de autoanticorpo com reatividade panaglutinina
A amostra foi tratada em paralelo pelas duas teacutecnicas descritas e foi enviada para o
Hemocentro para genotipagem eritrocitaacuteria que foi realizado por metodologia PCR em tempo
real no equipamento Real-time system PCR 7500 ( Applied Biosystems Califoacuternia EUA)
28
5 RESULTADOS
51 REAGENTES
Para aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA satildeo necessaacuterios 3 diferentes
reagentes que podem ser encontrados em forma de kit pronto para uso No entanto esses kits
natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil Os reagentes satildeo tampatildeo glicina-aacutecida o EDTA e o tampatildeo
Tris
Todos os reagentes foram preparados rdquoin houserdquo a partir dos sais e soluccedilotildees PA (puro
para anaacutelise) da marca SYNTH que foram adquiridos para a pesquisa O custo estimado para
cada teste foi aproximadamente R$ 020 reais
Apoacutes o preparo os reagentes poderiam ser armazenados em condiccedilotildees adequadas pelo
periacuteodo de 1 ano (AABB 2011) Ao final do preparo e durante o periacuteodo de armazenamento
de fevereiro a setembro de 2016 foi realizada inspeccedilatildeo visual para verificar a presenccedila de
precipitados ou turvaccedilatildeo A soluccedilatildeo de glicina e o tampatildeo TRIS mostraram-se estaacuteveis ateacute o
final do periacuteodo Por sua vez o reagente EDTA precipitou mesmo estando armazenado em
temperatura ambiente controlada e foi necessaacuterio novo preparo
52 AMOSTRAS DE DOADORES
521 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS AMOSTRAS
Apoacutes incubaccedilatildeo da hemaacutecia com o antissoro a mesma foi lavada 4 vezes para retirada
dos anticorpos livres A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada Caso houvesse positividade na
soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem a etapa era repetida (figura 3) Das 50 amostras sensibilizadas a
uacuteltima lavagem foi positiva somente em 3 delas Nas 3 amostras o anticorpo utilizado para
sensibilizaccedilatildeo foi o anti-K Apoacutes repetido nova etapa de lavagem os resultados se
apresentaram negativos
Em todas as amostras sensibilizadas ldquoin vitrordquo o TDA foi testado e verificado a
intensidade do teste Entre as 50 amostras 47 alcanccedilaram TDA com intensidade 3-4+ apoacutes a
primeira sensibilizaccedilatildeo enquanto 3 amostras necessitaram uma segunda incubaccedilatildeo com
anticorpo (figura 4)
A escolha dos anticorpos para sensibilizar as hemaacutecias foi feita de acordo com o
fenoacutetipo do doador e foram utilizados sete diferentes especificidades de anticorpos policlonais
humanos conforme mostra o graacutefico1
29
Figura 3 - Soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada com hemaacutecia de triagem de
anticorpos em gel LissCoombs (BIO-RAD) A finalidade eacute verificar a presenccedila de anticorpos livres na
suspensatildeo que possam interferir na pesquisa do eluato As soluccedilotildees de lavagem das amostras na figura a tiveram
resultados negativos Na figura b duas amostras a 47 e 50 apresentaram resultado positivo Nova etapa de
lavagem foi realizada e o resultado final foi negativo
522 TRATAMENTO DAS HEMAacuteCIAS
Apoacutes a sensibilizaccedilatildeo e obtenccedilatildeo de resultados de TDA com intensidade de 3 a 4+
cada uma das amostras foi dividida em duas aliacutequotas e tratada separadamente pelas teacutecnicas
de glicinaaacutecida-EDTA e cloroquina
As teacutecnicas foram consideradas efetivas quando obteve-se a completa dissociaccedilatildeo do
anticorpo verificada atraveacutes do TDA negativo na amostra poacutes tratamento conforme figuras 5
e 6 Dentre as amostras tratadas com cloroquina 2850 tiveram o TDA negativado A glicina-
aacutecidaEDTA negativou o TDA em 33 das 50 amostras tratadas Apenas 17 amostras tratadas
com glicina-aacutecidaEDTA permaneceram com o TDA positivo e foram submetidas a um novo
tratamento
30
Figura 4 - TDA das amostras apoacutes sensibilizaccedilatildeo com anticorpos policlonais humanos Amostras na
figura a com intensidades de 3-4+ Na figura b amostras 4 e 7 com intensidade menor que 3+ e portanto foram
novamente sensibilizadas com nova aliacutequota de soro Anti-D e anti-S Apoacutes a segunda sensibilizaccedilatildeo
apresentaram reatividade 4 e 3+ respectivamente Os anticorpos utilizados para sensibilizaccedilatildeo foram D S c E
C e K
523 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS TEacuteCNICAS
No tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA houve dissociaccedilatildeo completa do anticorpo
em 33 amostras (66) das 50 amostras testadas enquanto que com a cloroquina foram 28
amostras (56) (tabela 1)
31
Graacutefico 1- Nuacutemero de amostras sesnsibilizadas por especificidade de anticorpo Entre as 50 amostras 12
foram sensibilizadas com anti-D 10 com anti-C 9 com anti-E 8 com anti-c 7 com anti-S 3 com anti-K e 1
com anti-Dia As especificidades dos anticorpos foram definidas de acordo o fenoacutetipo do doador
Figura 5 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com cloroquina Nas amostras onde houve
a dissociaccedilatildeo do anticorpo ( 2 21 a 23 26 39 a 42 45 46 e 49) a hemaacutecia se deposita no fundo no microtubo
apoacutes a centrifugaccedilatildeo (TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (1 3 24 25 43 44 47
48 e 50) o anticorpo ligado agraves hemaacutecias eacute alvo da AGH presente no gel (TDA positivo)
Anti-D 12
Anti-C 10
Anti-E 9
Anti-c 8
Anti-S 7
Anti-K 3 Anti-Dia 1
32
Figura 6 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA Nas amostras
onde houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo (4 6 7 12 a 15 17 34 35 37 e 38) a hemaacutecia se deposita no fundo no
microtubo apoacutes a centrifugaccedilatildeo ( TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (5 16 18
19 20 33 e 36 ) o AGH presente no gel se liga ao anticorpo ligado agraves hemaacutecias que ficam retidas no gel (TDA
positivo)
Tabela 1-Resultado geral do tratamento das hemaacutecias com glicina e cloroquina
Teacutecnica utilizada TDA negativo TDA positivo Total
Glicina-aacutecidaEDTA 33 17 50
Cloroquina 28 22 50
A glicina-aacutecidaEDTA conseguiu negativar mais amostras sensibilizadas com Anti-D
e anti-K que a cloroquina Para as hemaacutecias sensibilizadas com anti-E Anti-S e Anti-Dia
ambas as teacutecnicas dissociaram o anticorpo em 100 das amostras Os resultados detalhados
por especificidade do anticorpo apoacutes o primeiro tratamento com glicina-aacutecidaEDTA e com
cloroquina estatildeo na tabela 2
Para as amostras que permaneceram positivas (17 amostras) apoacutes o tratamento com a
glicina-aacutecidaEDTA foi realizado um novo tratamento Houve dissociaccedilatildeo do anticorpo em 3
amostras (18) apoacutes a segunda tentativa Nas demais 14 (82) amostras tratadas pela
segunda vez 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise
33
Tabela 2 - Resultados do TDA apoacutes tratamento das hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo
sensibilizado
ANTICORPOS
SENSIBILIZADOS
1ordm TRATAMENTO COM
GLICINA
TRATAMENTO COM
CLOROQUINA
TOTAL TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
Anti-D 8 4 0 12 12
Anti-C 6 4 10 0 10
Anti-E 9 0 9 0 9
Anti-c 0 8 1 7 8
Anti-S 7 0 7 0 7
Anti-K 2 1 0 3 3
Anti-Dia 1 0 1 0 1
TOTAL 33 17 28 22 50
A hemoacutelise foi verificada durante o procedimento de lavagem final das hemaacutecias com
soluccedilatildeo fisioloacutegica para a retirada dos reagentes As soluccedilotildees de lavagem ficaram
avermelhadas e as hemaacutecias com coloraccedilatildeo escura As amostras foram descartadas Dentre as
6 amostras que ainda puderam ser testadas para o TDA trecircs amostras negativaram sendo 1
sensibilizada com anti-D e 2 com anti-C (tabela 3)
Tabela 3 - Resultado apoacutes o segundo tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA
Tratamento com
glicina-aacutecidaEDTA
TDA Negativo TDA Positvo Hemoacutelise Total
Segundo tratamento 3 3 11 17
524 TESTAGEM DO ELUATO
Apoacutes o tratamento com a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA a soluccedilatildeo do eluato foi
testada para verificar a viabilidade dos anticorpos que foram dissociados ou eluiacutedos Dentre
as 50 amostras 41 apresentaram eluato positivo As nove amostras cujos eluatos foram
negativos haviam sido sensibilizadas com as seguintes especificidades de anticorpos anti-E 6
amostras (67) anti-S 2 amostras (40) e anti-D 1 amostra (8) (tabela 4) O eluato de
todas as amostras sensibilizadas com os anticorpos anti-C anti-c Anti-K e Anti-Dia foram
positivos Os eluatos positivos na triagem de anticorpos foram testados com paineacuteis de
identificaccedilatildeo para confirmar a especificidade e a viabilidade dos anticorpos (figuras 7 e 8)
34
525 EFEITO DA ELUICcedilAtildeO SOBRE OS ANTIacuteGENOS ERITROCITAacuteRIOS
Para verificar o efeito do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA e com a cloroquina
sobre a expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s foi realizada a fenotipagem das
amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes tratamento com ambas as teacutecnicas Foi avaliado
se o tratamento destruiu os antiacutegenos expressos antes do tratamento
Tabela 4- Resultado do Eluato das amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA
Anticorpos Eluato positvo Eluato negativo Total
Anti-D 11 1 12
Anti-C 10 0 10
Anti-E 3 6 9
Anti-c 8 0 8
Anti-S 5 2 7
Anti-K 3 0 3
Anti-Dia 1 0 1
Total 41 9 50
Figura 7 ndash Painel do eluato da amostra 21 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-C que foi
recuperado no eluato
Figura 8 ndash Painel do eluato da amostra 47 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-K que foi
recuperado no eluato
35
Dentre as 50 amostras 26 eram previamente fenotipadas para os antiacutegenos Fya Fy
b
Jka Jk
b S e s Dentre elas 20 alcanccedilaram TDA negativo apoacutes tratamento com a glicina-
aacutecidaEDTA e 20 negativaram apoacutes tratamento com cloroquina (tabela 5) Apoacutes ambas as
teacutecnicas os antiacutegenos originalmente expressos permaneceram positivos comprovando que natildeo
houve destruiccedilatildeo dos mesmos
Tabela 5 ndash Verificaccedilatildeo da interferecircncia do tratamento da hemaacutecias com cloroquina e glicina-
aacuteicdaEDTA sobre os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
AMOSTRAS
COM
FENOTIPAGEM
PREacuteVIA
TRATADAS COM
CLOROQUINA
TRATADAS COM
GLICINA
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
26
20
20
20
20
As amostras 24 47 e 50 eram positivas para o antiacutegeno K A cloroquina natildeo dissociou
o anticorpo em nenhuma das 3 amostras enquanto a glicina-aacutecidaEDTA foi efetiva nas
amostras 24 e 50 Foi testada a expressatildeo do antiacutegeno K nas amostras 24 e 50 apoacutes o
tratamento utilizando meacutetodo indireto em gel contendo AGH Apesar de natildeo ter sido avaliado
a intensidade de reaccedilatildeo de expressatildeo dos antiacutegenos podemos verificar na figura 9 que nas
duas amostras em que a teacutecnica foi efetiva e dissociou o anticorpo a expressatildeo do antiacutegeno K
continua presente mas a reatividade observada pode ser considerada 1+ sugerindo que houve
diminuiccedilatildeo da expressatildeo do antiacutegeno quando comparado com a expressatildeo observada em
hemaacutecia natildeo tratada
Os resultados individuais de cada amostra em ambas as teacutecnicas encontram-se
resumidas na tabela 6
526 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente onde foi constatada a presenccedila de autoanticorpo
a quente da classe IgG pelo TDA monoespeciacutefico (figura 10)O autoanticorpo tambeacutem
interferia na pesquisa e identificaccedilatildeo de anticorpos irregulares pois apresentava caracteriacutestica
de panaglutinina As hemaacutecias da paciente sensibilizadas ldquoin vivordquo foram tratadas com
cloroquina e com glicina-aacutecidaEDTA
36
Figura 9 ndash Fenotipagem das amostras 24 e 50 para antiacutegeno K apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
O teste positivo indica a presenccedila do antiacutegeno poreacutem a reatividade fraca (1+) sugere que houve enfraquecimento
de sua expressatildeo A direita a expressatildeo forte (4+) do antiacutegeno Kell em hemaacutecia controle natildeo tratada utilizada
como controle positivo
A cloroquina natildeo foi efetiva na retirada do anticorpo ligado as hemaacutecias ao contraacuterio
do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA que dissociou o anticorpo (figura 11)
A hemaacutecia tratada com glicina foi fenotipada para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
(figura 12) A fenotipagem para o sistema Rh (C c E e e) e Kell foi realizada em gel
especiacutefico monoclonal sem interferecircncia do TDA positivo (controle da reaccedilatildeo negativo)
O eluato resultante do tratamento com glicina-aacutecidaEDTA foi testada em gel com
hemaacutecias de painel de identificaccedilatildeo de anticorpos e apresentou resultado positivo com todas
as ceacutelulas (figura 13 e 14)
A amostra foi enviada para genotipagem e o resultado da genotipagem confirmou o
resultado da fenotipagem apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
527 TEMPO DE EXECUCcedilAtildeO DA TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
O tempo de reaccedilatildeo da glicina-aacutecidaEDTA eacute de 2 minutos Todas as amostras foram
tratadas obedecendo ao tempo descrito na literatura demonstrando que o mesmo eacute
reprodutiacutevel
37
Tabela 6- Resultados individuais por amostra
Amostra Especificidade
dos anticorpos
Intensidade do
TDA apoacutes
sensibilizaccedilatildeo
Tratamento
efetivo com
cloroquina
Tratamento
efetivo com
glicina
Eluato
poacutes
glicina
1 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 2 Dia 3+ Sim Sim 3+ 3 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 4 D 4+ Natildeo Sim 4+ 5 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 6 E 3+ Sim Sim Negativo 7 S 4+ Sim Sim 3+ 8 E 3+ Sim Sim 1+ 9 E 3+ Sim Sim 2+
10 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 11 D 4+ Natildeo Sim 4+ 12 D 4+ Natildeo Sim 4+ 13 S 3+ Sim Sim 3+ 14 S 3+ Sim Sim 3+ 15 D 3+ Natildeo Sim 3+ 16 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 17 E 3+ Sim Sim (+) 18 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 19 D 4+ Natildeo Natildeo 3+ 20 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 21 C 3+ Sim Sim 4+ 22 C 3+ Sim Sim 4+ 23 C 3+ Sim Sim 4+ 24 K 4+ Natildeo Sim 4+ 25 D 3+ Natildeo Natildeo Negativo 26 E 4+ Sim Sim Negativo 27 S 3+ Sim Sim 3+ 28 C 3+ Sim Natildeo 4+ 29 C 3+ Sim Sim 4+ 30 C 3+ Sim Sim 4+ 31 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 32 E 3+ Sim Sim Negativo 33 C 3+ Sim Natildeo 4+ 34 S 3+ Sim Sim Negativo 35 S 3+ Sim Sim Negativo 36 C 4+ Sim Natildeo 4+ 37 c 4+ Natildeo Natildeo 4+ 38 D 4+ Natildeo Sim 4+ 39 S 3+ Sim Sim 3+ 40 c 4+ Sim Natildeo 2+ 41 C 4+ Sim Natildeo 4+ 42 E 3+ Sim Sim Negativo 43 D 3+ Natildeo Sim 2+ 44 D 3+ Natildeo Sim 2+ 45 E 3+ Sim Sim Negativo 46 C 3+ Sim Sim 4+ 47 K 4+ Natildeo Natildeo 4+ 48 D 3+ Natildeo Sim 2+ 49 E 3+ Sim Sim Negativo 50 K 4+ Natildeo Sim 4+
TOTAL 50 28 33 41
38
Figura 10 ndash TDA monoespeciacutefico da amostra de paciente Hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo da classe
IgG
oacute Figura 11 ndash TDA apoacutes o tratamento com glicina-aacutecidaEDTA (esquerda) e cloroquina (direita) A glicina
negativou completamente o TDA enquanto a hemaacutecia tratada com cloroquina persistiu positiva (1+)
39
Figura 12 ndash Fenotipagem da amostra tratada com glicina-aacutecidaEDTA Fy(a+b+) Jk(a-b+) S+s+
Figura 13 ndash Painel em gel (LissAGH) do eluato apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de
intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
Figura 14 ndash ndash Painel ezimaacutetico (hemaacutecias tratadas com bromelina) do eluato em gel neutro apoacutes
tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
40
528 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Quanto a efetividade das teacutecnicas em negativar o TDA foi verificado que a glicina-
aacutecidaEDTA foi efetiva em 66 das amostras testadas no primeiro tratamento (3350
amostras) enquanto a cloroquina conseguiu negativar 56 (2850) Esses resultados natildeo
apresentam diferenccedila significativa (pgt005) demostrando que a teacutecnica da glicina-
aacutecidaEDTA natildeo eacute superior mas eacute tatildeo efetiva quanto a da cloroquina
Quando aliamos os resultados de ambas as teacutecnicas verificamos que em 76 (3850)
das amostras o TDA foi negativado Esse dado indica que ainda que uma teacutecnica natildeo seja
eficaz na remoccedilatildeo do anticorpo eacute uma boa alternativa tentar a segunda teacutecnica jaacute que a falha
em remover o anticorpo utilizando uma delas natildeo prevecirc necessariamente a falha com a outra
Quando se utiliza o teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla (graacutefico 2) para comparar a utilizaccedilatildeo das
duas teacutecnicas com o resultado de cada uma isolada (somente a cloroquina ou somente a
glicina) verificamos que os resultados apresentam diferenccedila significativa (plt005) (quadro 3)
TRATAMENTO EFETIVO COM TOTAL PORCENTAGEM
Glicina ou cloroquina 38 76
Glicina e cloroquina 23 46
Glicina apenas 10 20
Cloroquina apenas 5 10
Nenhuma das teacutecnicas 12 24
Quadro 3 - Resultados comparativos entre as teacutecnicas utilizadas
41
Graacutefico 2 - Teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla entre as teacutecnicas aplicadas A- Glicina e Cloroquina B-Cloroquina C-
Glicina ( plt005)
42
6 DISCUSSAtildeO
Os reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA podem ser adquiridos em
forma de kit comercial prontos para uso poreacutem natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil A preparaccedilatildeo
dos reagentes ldquoin houserdquo a partir de sais comerciais adquiridos se mostrou viaacutevel Os
reagentes glicina e o tampatildeo Tris armazenados de forma correta se mantiveram estaacuteveis por
um periacuteodo de 7 meses Somente o reagente EDTA precipitou mesmo armazenado em
condiccedilotildees adequadas sugerindo que o mesmo deve ser preparado em menor quantidade e
armazenado em aliacutequotas A soluccedilatildeo de cloroquina tambeacutem pode ser preparada ldquoin houserdquo e
pode ser armazenado por um mecircs A legislaccedilatildeo brasileira autoriza a utilizaccedilatildeo de reagentes
preparados a partir de sais comerciais como a cloroquina e a glicina-aacutecidaEDTA desde que
os sais tenham autorizaccedilatildeo da vigilacircncia sanitaacuteria para a comercializaccedilatildeo (BRASIL 2001)
A comparaccedilatildeo quanto a efetividade em dissociar anticorpos em amostras com TDA
positivos entre a teacutecnica da glicina e a teacutecnica da cloroquina mostrou que natildeo haacute diferenccedila
estatiacutestica entre elas e que ambas satildeo igualmente eficientes Se utilizadas conjuntamente haacute
maior possibilidade de elucidaccedilatildeo dos casos
Uma vantagem da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eacute que ela permite numa mesma
amostra eluir o anticorpo ligado aacute hemaacutecia assim como fenotipar a hemaacutecia tratada Devido a
sua dupla utilidade a teacutecnica eacute vantajosa principalmente em pacientes em que pouco volume
de amostra pode ser coletado como em casos de crianccedilas e receacutem-nascidos
A fenotipagem poacutes tratamento se mostrou viaacutevel jaacute que os antiacutegenos de maior
importacircncia natildeo sofreram alteraccedilotildees Nas 20 amostras que foram fenotipadas antes e apoacutes
tratamento para verificar a influecircncia dos reagentes na expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a
Jkb S e s natildeo houve destruiccedilatildeo dos mesmos por nenhuma das duas teacutecnicas
Para as amostras positivas para o antiacutegeno Kell (350) e sensibilizadas com o
respectivo anticorpo a teacutecnica da glicina foi efetiva em negativar o TDA em apenas duas
delas mas apoacutes o tratamento foi verificada uma fraca reatividade da reaccedilatildeo antiacutegeno-
anticorpo sugerindo que houve um enfraquecimento da expressatildeo do antiacutegeno conforme
esperado e descrito na literatura (BYRNE 1991 PALLAS WILER E MCGEE 1991
ROZIERS e SQUALI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012 e KATHARIA e
CHAUDHARY 2013) A accedilatildeo da glicina sobre o antigeno Kell natildeo representa impedimento
para seu uso uma vez que na impossibilidade de testar o antiacutegeno Kell o banco de sangue
consegue facilmente atender a solicitaccedilatildeo de transfusatildeo com unidades de hemaacutecias Kell
43
negativas jaacute que eacute um antiacutegeno de baixa prevalecircncia na populaccedilatildeo variando de 15 na
populaccedilatildeo africana a 9 nos europeus (DANIELS 2011)
A soluccedilatildeo resultante da dissociaccedilatildeo do anticorpo pela teacutecnica da glicina pode ainda ser
utilizada como eluato podendo substituir a teacutecnica de eluiccedilatildeo com reagentes comercias (kits
de eluiccedilatildeo aacutecida) que tem alto custo aproximadamente entre R$2000 a R$2500 por teste
Em 41 amostras (82) houve a dissociaccedilatildeo e recuperaccedilatildeo do anticorpo que estava
sensibilizando as hemaacutecias Em 9 amostras (18) os anticorpos foram eluiacutedos poreacutem
apresentaram reaccedilatildeo negativa quando testadas com hemaacutecias de triagem entre eles o anti-E
(6) anti-S (2) e Anti-D (1) Eacute possiacutevel que a correccedilatildeo pH do meio (WALKER 2011) natildeo
tenha sido adequada o que pode ter desfavorecido a reatividade do anticorpo
Para as amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA nas quais natildeo houve dissociaccedilatildeo do
anticorpo pelo primeiro tratamento (1750) o segundo tratamento natildeo se mostrou eficaz jaacute
que 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise O tempo de
armazenagem natildeo parece ter influenciado jaacute que todas as amostras foram testadas dentro de
48 horas apoacutes a coleta Outros fatores que natildeo foram verificados podem ter levado a
hemoacutelise Apesar da literatura (LOUIE JIENG e ZEROULIS 1986 e BYRNE 1991)
recomendar um segundo tratamento ele eacute pouco eficaz tendo negativado apenas 3 das 17
amostras testadas
A amostra de paciente que apresentou sensibilizaccedilatildeo ldquoin vivordquo mostrou melhor
efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA sobre a da cloroquina possibilitando
fenotipagem para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s que natildeo foram destruiacutedos apoacutes o
tratamento comprovado atraveacutes da genotipagem
A presenccedila de autoanticorpo a quente com presenccedila de hemoacutelise (AHAI) ou natildeo pode
mascarar a presenccedila de aloanticorpo interferindo na rotina soroloacutegica da fenotipagem que eacute
uma importante ferramenta para auxiliar na seleccedilatildeo de hemaacutecias para transfusatildeo (SHIREY et
al 2002) Esses pacientes frequentemente possuem aloanticorpos associados ao
autoanticorpo e a prevalecircncia de aloimunizaccedilatildeo entre eles varia entre 12 a 40 (LEGER e
GARRATY 1999 BRANCH e PETZ 1999) o que dificulta ainda mais a escolha do melhor
componente a ser transfundido aleacutem de aumentar a possibilidade reaccedilotildees hemoliacuteticas imunes
poacutes-transfusionais
Nesses casos as teacutecnicas de dissociaccedilatildeo de anticorpos satildeo importantes para tratar
amostras de pacientes e a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser usada como uma opccedilatildeo
pois se mostrou eficaz na dissociaccedilatildeo anticorpo ligado agraves hemaacutecias deixando livre a
superfiacutecie das mesmas permitindo a fenotipagem por antisoros IgG Paralelamente os
44
anticorpos eluiacutedos tambeacutem puderam ser estudados O mesmo natildeo ocorre com a cloroquina
que permite apenas a fenotipagem e tampouco com os kits de eluiccedilatildeo aacutecida disponiacuteveis no
mercado nacional que satildeo destinados a realizaccedilatildeo do eluato mas destroem as hemaacutecias
O tempo de tratamento na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA tambeacutem eacute uma vantagem
pois foi possiacutevel reproduzir no tempo determinado de 2 minutos enquanto a cloroquina
demora ateacute duas horas
Ainda que a aplicaccedilatildeo das teacutecnicas por biologia molecular estejam cada vez mais
presentes na rotina imuno-hematoloacutegica e possibilitam estabelecer o fenoacutetipo deduzido do
genoacutetipo elas natildeo estatildeo disponiacuteveis na maioria dos centros e sua realizaccedilatildeo exige algumas
horas A resoluccedilatildeo imediata do problema transfusional necessita dos resultados soroloacutegicos
pois com frequecircncia natildeo eacute possiacutevel aguardar o resultado do teste molecular Dessa forma
apesar da crescente importacircncia da genotipagem eritrocitaacuteria teacutecnicas soroloacutegicas aplicadas
corretamente e no momento propiacutecio satildeo de grande utilidade para resolver problemas imuno-
hematoloacutegicos como ocorre com a fenotipagem em pacientes com TDA positivo
45
7 CONCLUSAtildeO
A teacutecnica da glicina aacutecidaEDTA mostrou-se efetiva em remover os anticorpos que
sensibilizavam as hemaacutecias e pode ser utilizada com seguranccedila antes da fenotipagem
eritrocitaacuteria Por ser uma teacutecnica de raacutepida execuccedilatildeo eacute uma alternativa aplicaacutevel
principalmente em casos urgentes de pacientes que apresentam autoanticorpos
46
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SHIREY R S et al Prophylactic antigen-matched donor blood for patients with warm
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VICHINSKY E P et al Prospective RBC phenotype matching in a stroke-prevention trial in
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ZAGO M A Apresentaccedilatildeo In Covas D T Ubialli E M A De Santis G C Manual de
Medicina Transfusional 2ordf ed Satildeo Paulo Atheneu 2014
50
9 ANEXOS
51
FUNDACcedilAtildeO HEMOCENTRO DE RIBEIRAtildeO PRETO
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE)
Tiacutetulo da pesquisa Aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina aacutecida-EDTA e avaliaccedilatildeo da
eficaacutecia no tratamento de hemaacutecias com teste direto da antiglobulina positivo
Pesquisadora responsaacutevel Ceacutelia Kazue Abiko
Orientador Prof Dimas Tadeu Covas
Co-orientadora Dra Flaacutevia Leite Souza Santos
Objetivo da pesquisa Vocecirc estaacute sendo convidado a participar de uma pesquisa que tem
como objetivo padronizar uma nova teacutecnica para auxiliar na tipagem sanguiacutenea de pacientes
A tipagem sanguiacutenea pode sofrer interferecircncia da presenccedila de anticorpos ligados aos gloacutebulos
vermelhos do sangue Nessas situaccedilotildees eacute difiacutecil selecionar o melhor sangue para o paciente e
eacute preciso a utilizaccedilatildeo de teacutecnicas adicionais para remover essas interferecircncias
Esta pesquisa tem como objetivo estudar outra teacutecnica para remover esses anticorpos e
comparaacute-la com a teacutecnica atualmente utilizada Para isso precisamos de amostras de pacientes
e doadores voluntaacuterios
Se vocecirc eacute um doador eacute necessaacuterio que vocecirc autorize a coleta de 5 ml (1 tubo) a mais
de seu sangue
Se vocecirc eacute um paciente natildeo haveraacute necessidade de nova amostra pois utilizaremos as
amostras jaacute coletadas para os testes preacute-transfusionais e os resultados encontrados nesta
pesquisa natildeo iratildeo interferir na escolha da (s) bolsa (s) de sangue que vocecirc possa vir a receber
Se vocecirc concordar em participar leia com atenccedilatildeo o texto abaixo e assine as duas vias
rubricando todas as paacuteginas deste termo de consentimento Uma via original assinada e
rubricada por vocecirc e pela pesquisadora ficaraacute com vocecirc
As suas informaccedilotildees seratildeo mantidas em sigilo pela pesquisadora e natildeo haveraacute
armazenamento de material para pesquisas posteriores Os seus dados seratildeo usados apenas
neste estudo e quando o trabalho for publicado seu nome e qualquer outra informaccedilatildeo que
possam identificaacute-lo natildeo seratildeo revelados
Eacute pouco provaacutevel que o que noacutes aprendermos com este estudo tenha um benefiacutecio
direto para vocecirc assim como natildeo poderemos dar nada em troca pela sua participaccedilatildeo na
pesquisa
Nosso objetivo com esta pesquisa eacute que os resultados poderatildeo ser uacuteteis para o
tratamento de pacientes no futuro Os riscos da participaccedilatildeo satildeo miacutenimos Se vocecirc eacute um
doador de sangue a amostra seraacute coletada no momento da doaccedilatildeo natildeo exigindo punccedilatildeo
venosa adicional
52
Eacute seu direito ter acesso aos resultados dos testes da pesquisa Esses resultados natildeo
seratildeo fornecidos automaticamente a vocecirc mas caso vocecirc se interesse em saber o resultado ou
tiver alguma duacutevida sobre a sua participaccedilatildeo neste estudo deveraacute entrar em contato com Ceacutelia
Kazue Abiko pelo telefone (18) 99718-3551
Vocecirc tem total liberdade de optar por natildeo participar da pesquisa Caso aceite
participar poderaacute desistir a qualquer momento ou retirar seu consentimento mesmo apoacutes ter
coletado o sangue Para cancelar sua participaccedilatildeo basta avisar a pesquisadora e os seus dados
seratildeo retirados do projeto
Qualquer duacutevida eacutetica sobre a pesquisa poderaacute entrar em contato com o Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa do Hospital das Cliacutenicas e da Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto
(CAMPUS UNIVERSITAacuteRIO bairro Monte Alegre CEP 14048-900 Ribeiratildeo Preto-SP
Telefone (16) 3602-2228 FAX (16) 3633-1144 e-mail cephcrpuspbr)
Consentimento de participaccedilatildeo
A Consentimento do participante
Li as informaccedilotildees acima sobre o estudo e recebi explicaccedilotildees sobre a participaccedilatildeo no estudo
Portanto dou o meu consentimento para participar do estudo
___________________________________________________________________________
Nome completo
___________________________________________________________________________
Assinatura
___________
Data
__________________________________________________________________________________
Nome completo da pesquisadora
___________________________________________________________________________
Assinatura
_____________
Data
24
412 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS HEMAacuteCIAS
As hemaacutecias foram sensibilizadas com antissoros policlonais humanos de amostras de
plasma fresco congelado de doadores com resultado de pesquisa de anticorpo irregular
positivos
A escolha do anticorpo para sensibilizar as hemaacutecias foi definida de acordo com o
fenoacutetipo do doador que deveria ser positivo para o respectivo antiacutegeno
Para a sensibilizaccedilatildeo um volume de antissoro (1 mL) e um volume (1 mL) de
hemaacutecias lavadas quatro vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica foram adicionadas a um tubo de 12 x
75 mm A mistura foi homogeneizada e incubada em banho maria (BM) a 37deg C por 60
minutos A seguir as hemaacutecias foram novamente lavadas 4 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica
para retirada dos anticorpos que natildeo se ligaram A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada
como controle negativo O teste da uacuteltima lavagem eacute importante para assegurar que os
anticorpos que poderatildeo ser detectados no eluato apoacutes o tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA
sejam aqueles que estavam ligados agraves hemaacutecias e natildeo aqueles livres no plasma O controle
negativo mostra que todo o anticorpo livre foi retirado (LEGER 2011)
Para o teste de presenccedila de anticorpo na soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foram incubadas
com hemaacutecias de triagem de anticorpos irregulares (ID-Diacell BIO-RAD) contendo os
antiacutegenos especiacuteficos Realizado a teacutecnica em gel LissCoombs com anti-IgG+C3d Incubado
no tempo de 15 minutos a temperatura de 37deg C e centrifugado 10 minutos em centriacutefuga
proacutepria
As 50 amostras de doadores foram sensibilizadas com os anticorpos policlonais
humanos
Apoacutes sensibilizadas rdquoin vitrordquo e lavadas as hemaacutecias foram diluiacutedas em soluccedilatildeo de
baixa forccedila iocircnica (LISS) na quantidade de 10 microL de hemaacutecia para 1000 microL de soluccedilatildeo A
suspensatildeo foi pipetada (50 microL) em coluna-gel-teste LissCoombs (BIO-RAD) que contecircm
antiglobulina poliespeciacutefico (IgG+C3d) e centrifugada em baixa rotaccedilatildeo conforme orientaccedilatildeo
do fabricante durante 10 minutos
As amostras deveriam apresentar aglutinaccedilatildeo com reatividade 3 a 4+ no TDA As
amostras que apresentaram reaccedilatildeo menor que 3+ foram novamente sensibilizadas com nova
aliacutequota do antissoro
25
413 TRATAMENTO DAS AMOSTRAS
As amostras sensibilizadas apresentando o TDA positivo 3 ou 4+ foram divididas em
duas aliacutequotas e submetidas a duas teacutecnicas diferentes com o objetivo de dissociar o anticorpo
ligado Uma aliacutequota da amostra foi tratada com soluccedilatildeo de difosfato de cloroquina enquanto
a outra aliacutequota foi tratada com glicina-aacutecidaEDTA
42 PREPARO DA GLICINA AacuteCIDA-EDTA
A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA utiliza 3 soluccedilotildees diferentes a glicina aacutecida o
EDTA e o tampatildeo TRIS
Os reagentes foram preparados utilizando os sais para anaacutelise (PA) de EDTA
(Na2EDTA2H2O) TRIS (C4H11NO3) Glicina (H2NCH2CO2H) NaCl e a soluccedilatildeo de aacutecido
cloriacutedrico (HCl) 12 N todos reagentes da marca SYNTH (quadro 1)
Para o preparo do tampatildeo glicina-acida eacute necessaacuterio o ajuste do pH para 15 Para esse
ajuste utiliza-se aacutecido cloriacutedrico (HCl) concentrado O pH foi medido com fitas reativas de pH
com escala de 1 a 14 da marca MERCK Posteriormente a soluccedilatildeo foi enviada ao laboratoacuterio
de controle de qualidade do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto e o pH medido no peagacircmetro O
tampatildeo glicina-aacutecida foi armazenado a 4deg e o tampatildeo tris e o EDTA em temperatura ambiente
controlada (20 a 24deg Celsius)
Apoacutes o preparo e durante a realizaccedilatildeo dos testes foram feitas inspeccedilotildees visuais para
verificaccedilatildeo de turvaccedilatildeo do meio e presenccedila de precipitados
Reagente Material Quantidade Preparo e
Conservaccedilatildeo
EDTA
EDTA
(Na2EDTA2H2O)
5 gramas Mistura ateacute
dissoluccedilatildeo do sal e
conserva em
temperatura ambiente Aacutegua Destilada 50 Ml
Tris
TRIS (C4H11NO3) 121 gramas Conservar em
temperatura ambiente NaCl 525g
Aacutegua destilada 100ml
Gliacutecina-aacutecida
Glicina
(H2NCH2CO2H) 15 gramas
Conservar a 4oC NaCl 116gramas
Aacutegua Destilada 200ml
HCL 12N Ajutar o pH para 15
Quadro 1 - Preparo dos Reagentes da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
Fonte - Manual teacutecnico AABB 2011
26
O tampatildeo glicina-aacutecida e o tampatildeo TRIS satildeo estaacuteveis por 7 meses O reagente EDTA
precipitou mesmo estando em temperatura em ambiente controlado Houve necessidade de
preparo de novo reagente
421 TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
1 Em um tubo de ensaio 12x75 mm eacute adicionado 08 mL da soluccedilatildeo de glicina-aacutecida A
esta soluccedilatildeo adiciona-se 02 mL de EDTA e mistura
2 Adiciona-se 02 mL de hemaacutecias sensibilizadas (lavada 4 vezes) A mistura eacute
homogeneizada e incubada por exatamente 2 minutos
3 A seguir 01 mL de tampatildeo TRIS eacute adicionado agrave mistura que eacute novamente
homogeneizada e centrifugada por 2 minutos a 3400 rpm O pH deve estar entre 7 a 75
4 Apoacutes centrifugaccedilatildeo separa-se em outro tubo o sobrenadante (eluato) e as hemaacutecias
que permanecem satildeo lavadas 4 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica para retirada de todo o
reagente e anticorpos livres
43 PREPARO DA CLOROQUINA
A cloroquina eacute diluiacuteda em tampatildeo PBS na concentraccedilatildeo de 20 (Quadro 2) e
armazenado a 4deg Celsius sua validade apoacutes o preparo eacute de 1 mecircs
A teacutecnica da cloroquina jaacute estaacute padronizada para rotina do laboratoacuterio de
imunohematologia do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto e suas unidades
Reagente Reagentes Quantidade PreparoConservaccedilatildeo
Cloroquina
Difosfato de cloroquina
(C18H32ClN3O8P2)
20 gramas
Conservar a 4deg Celsius
Tampatildeo PBS 100ml
NaOH 01 N Acertar o pH para
51
Quadro 2 - Preparo da Cloroquina Fonte - Manual teacutecnico da AABB 2011
431 TEacuteCNICA DA CLOROQUINA
1 4 partes da soluccedilatildeo pronta eacute adicionada a uma parte de hemaacutecias lavadas 4 vezes com
soluccedilatildeo fisioloacutegica
2 A mistura eacute incubada em temperatura ambiente por ateacute duas horas
3 Centrifugar a 3400 rpm por 2 minutos
27
4 Remover o sobrenadante lavar as hemaacutecias novamente com soluccedilatildeo fisioloacutegica 4
vezes
44 VERIFICACcedilAtildeO DA EFETIVIDADE DOS TESTES
Apoacutes tratamento pelas duas teacutecnicas o TDA foi repetido em todas as amostras para
verificar se os tratamentos foram efetivos e houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo Para as
amostras tratadas pela teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA que permaneceram com TDA positivo
novo tratamento foi realizado
45 TESTE DO ELUATO
O eluato resultante das amostras tratadas com glicina-acidaEDTA foi testado com
hemaacutecias de triagem A soluccedilatildeo do eluato foi incubada com as hemaacutecias de triagem de
anticorpos (ID-Diacell BIO-RAD) pela teacutecnica em gel LissCoombs O teste foi incubado 15
minutos a 37deg Celsius e centrifugado por 10 minutos em centrifuga proacutepria para a teacutecnica em
gel Os eluatos que apresentaram resultados positivos foram testados em painel de 11
hemaacutecias (ID-Diapanel BIO-RAD) para a identificaccedilatildeo do anticorpo
46 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente que apresentou TDA positivo por IgG e pesquisa
de anticorpo irregular positivo com presenccedila de autoanticorpo com reatividade panaglutinina
A amostra foi tratada em paralelo pelas duas teacutecnicas descritas e foi enviada para o
Hemocentro para genotipagem eritrocitaacuteria que foi realizado por metodologia PCR em tempo
real no equipamento Real-time system PCR 7500 ( Applied Biosystems Califoacuternia EUA)
28
5 RESULTADOS
51 REAGENTES
Para aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA satildeo necessaacuterios 3 diferentes
reagentes que podem ser encontrados em forma de kit pronto para uso No entanto esses kits
natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil Os reagentes satildeo tampatildeo glicina-aacutecida o EDTA e o tampatildeo
Tris
Todos os reagentes foram preparados rdquoin houserdquo a partir dos sais e soluccedilotildees PA (puro
para anaacutelise) da marca SYNTH que foram adquiridos para a pesquisa O custo estimado para
cada teste foi aproximadamente R$ 020 reais
Apoacutes o preparo os reagentes poderiam ser armazenados em condiccedilotildees adequadas pelo
periacuteodo de 1 ano (AABB 2011) Ao final do preparo e durante o periacuteodo de armazenamento
de fevereiro a setembro de 2016 foi realizada inspeccedilatildeo visual para verificar a presenccedila de
precipitados ou turvaccedilatildeo A soluccedilatildeo de glicina e o tampatildeo TRIS mostraram-se estaacuteveis ateacute o
final do periacuteodo Por sua vez o reagente EDTA precipitou mesmo estando armazenado em
temperatura ambiente controlada e foi necessaacuterio novo preparo
52 AMOSTRAS DE DOADORES
521 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS AMOSTRAS
Apoacutes incubaccedilatildeo da hemaacutecia com o antissoro a mesma foi lavada 4 vezes para retirada
dos anticorpos livres A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada Caso houvesse positividade na
soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem a etapa era repetida (figura 3) Das 50 amostras sensibilizadas a
uacuteltima lavagem foi positiva somente em 3 delas Nas 3 amostras o anticorpo utilizado para
sensibilizaccedilatildeo foi o anti-K Apoacutes repetido nova etapa de lavagem os resultados se
apresentaram negativos
Em todas as amostras sensibilizadas ldquoin vitrordquo o TDA foi testado e verificado a
intensidade do teste Entre as 50 amostras 47 alcanccedilaram TDA com intensidade 3-4+ apoacutes a
primeira sensibilizaccedilatildeo enquanto 3 amostras necessitaram uma segunda incubaccedilatildeo com
anticorpo (figura 4)
A escolha dos anticorpos para sensibilizar as hemaacutecias foi feita de acordo com o
fenoacutetipo do doador e foram utilizados sete diferentes especificidades de anticorpos policlonais
humanos conforme mostra o graacutefico1
29
Figura 3 - Soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada com hemaacutecia de triagem de
anticorpos em gel LissCoombs (BIO-RAD) A finalidade eacute verificar a presenccedila de anticorpos livres na
suspensatildeo que possam interferir na pesquisa do eluato As soluccedilotildees de lavagem das amostras na figura a tiveram
resultados negativos Na figura b duas amostras a 47 e 50 apresentaram resultado positivo Nova etapa de
lavagem foi realizada e o resultado final foi negativo
522 TRATAMENTO DAS HEMAacuteCIAS
Apoacutes a sensibilizaccedilatildeo e obtenccedilatildeo de resultados de TDA com intensidade de 3 a 4+
cada uma das amostras foi dividida em duas aliacutequotas e tratada separadamente pelas teacutecnicas
de glicinaaacutecida-EDTA e cloroquina
As teacutecnicas foram consideradas efetivas quando obteve-se a completa dissociaccedilatildeo do
anticorpo verificada atraveacutes do TDA negativo na amostra poacutes tratamento conforme figuras 5
e 6 Dentre as amostras tratadas com cloroquina 2850 tiveram o TDA negativado A glicina-
aacutecidaEDTA negativou o TDA em 33 das 50 amostras tratadas Apenas 17 amostras tratadas
com glicina-aacutecidaEDTA permaneceram com o TDA positivo e foram submetidas a um novo
tratamento
30
Figura 4 - TDA das amostras apoacutes sensibilizaccedilatildeo com anticorpos policlonais humanos Amostras na
figura a com intensidades de 3-4+ Na figura b amostras 4 e 7 com intensidade menor que 3+ e portanto foram
novamente sensibilizadas com nova aliacutequota de soro Anti-D e anti-S Apoacutes a segunda sensibilizaccedilatildeo
apresentaram reatividade 4 e 3+ respectivamente Os anticorpos utilizados para sensibilizaccedilatildeo foram D S c E
C e K
523 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS TEacuteCNICAS
No tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA houve dissociaccedilatildeo completa do anticorpo
em 33 amostras (66) das 50 amostras testadas enquanto que com a cloroquina foram 28
amostras (56) (tabela 1)
31
Graacutefico 1- Nuacutemero de amostras sesnsibilizadas por especificidade de anticorpo Entre as 50 amostras 12
foram sensibilizadas com anti-D 10 com anti-C 9 com anti-E 8 com anti-c 7 com anti-S 3 com anti-K e 1
com anti-Dia As especificidades dos anticorpos foram definidas de acordo o fenoacutetipo do doador
Figura 5 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com cloroquina Nas amostras onde houve
a dissociaccedilatildeo do anticorpo ( 2 21 a 23 26 39 a 42 45 46 e 49) a hemaacutecia se deposita no fundo no microtubo
apoacutes a centrifugaccedilatildeo (TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (1 3 24 25 43 44 47
48 e 50) o anticorpo ligado agraves hemaacutecias eacute alvo da AGH presente no gel (TDA positivo)
Anti-D 12
Anti-C 10
Anti-E 9
Anti-c 8
Anti-S 7
Anti-K 3 Anti-Dia 1
32
Figura 6 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA Nas amostras
onde houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo (4 6 7 12 a 15 17 34 35 37 e 38) a hemaacutecia se deposita no fundo no
microtubo apoacutes a centrifugaccedilatildeo ( TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (5 16 18
19 20 33 e 36 ) o AGH presente no gel se liga ao anticorpo ligado agraves hemaacutecias que ficam retidas no gel (TDA
positivo)
Tabela 1-Resultado geral do tratamento das hemaacutecias com glicina e cloroquina
Teacutecnica utilizada TDA negativo TDA positivo Total
Glicina-aacutecidaEDTA 33 17 50
Cloroquina 28 22 50
A glicina-aacutecidaEDTA conseguiu negativar mais amostras sensibilizadas com Anti-D
e anti-K que a cloroquina Para as hemaacutecias sensibilizadas com anti-E Anti-S e Anti-Dia
ambas as teacutecnicas dissociaram o anticorpo em 100 das amostras Os resultados detalhados
por especificidade do anticorpo apoacutes o primeiro tratamento com glicina-aacutecidaEDTA e com
cloroquina estatildeo na tabela 2
Para as amostras que permaneceram positivas (17 amostras) apoacutes o tratamento com a
glicina-aacutecidaEDTA foi realizado um novo tratamento Houve dissociaccedilatildeo do anticorpo em 3
amostras (18) apoacutes a segunda tentativa Nas demais 14 (82) amostras tratadas pela
segunda vez 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise
33
Tabela 2 - Resultados do TDA apoacutes tratamento das hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo
sensibilizado
ANTICORPOS
SENSIBILIZADOS
1ordm TRATAMENTO COM
GLICINA
TRATAMENTO COM
CLOROQUINA
TOTAL TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
Anti-D 8 4 0 12 12
Anti-C 6 4 10 0 10
Anti-E 9 0 9 0 9
Anti-c 0 8 1 7 8
Anti-S 7 0 7 0 7
Anti-K 2 1 0 3 3
Anti-Dia 1 0 1 0 1
TOTAL 33 17 28 22 50
A hemoacutelise foi verificada durante o procedimento de lavagem final das hemaacutecias com
soluccedilatildeo fisioloacutegica para a retirada dos reagentes As soluccedilotildees de lavagem ficaram
avermelhadas e as hemaacutecias com coloraccedilatildeo escura As amostras foram descartadas Dentre as
6 amostras que ainda puderam ser testadas para o TDA trecircs amostras negativaram sendo 1
sensibilizada com anti-D e 2 com anti-C (tabela 3)
Tabela 3 - Resultado apoacutes o segundo tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA
Tratamento com
glicina-aacutecidaEDTA
TDA Negativo TDA Positvo Hemoacutelise Total
Segundo tratamento 3 3 11 17
524 TESTAGEM DO ELUATO
Apoacutes o tratamento com a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA a soluccedilatildeo do eluato foi
testada para verificar a viabilidade dos anticorpos que foram dissociados ou eluiacutedos Dentre
as 50 amostras 41 apresentaram eluato positivo As nove amostras cujos eluatos foram
negativos haviam sido sensibilizadas com as seguintes especificidades de anticorpos anti-E 6
amostras (67) anti-S 2 amostras (40) e anti-D 1 amostra (8) (tabela 4) O eluato de
todas as amostras sensibilizadas com os anticorpos anti-C anti-c Anti-K e Anti-Dia foram
positivos Os eluatos positivos na triagem de anticorpos foram testados com paineacuteis de
identificaccedilatildeo para confirmar a especificidade e a viabilidade dos anticorpos (figuras 7 e 8)
34
525 EFEITO DA ELUICcedilAtildeO SOBRE OS ANTIacuteGENOS ERITROCITAacuteRIOS
Para verificar o efeito do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA e com a cloroquina
sobre a expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s foi realizada a fenotipagem das
amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes tratamento com ambas as teacutecnicas Foi avaliado
se o tratamento destruiu os antiacutegenos expressos antes do tratamento
Tabela 4- Resultado do Eluato das amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA
Anticorpos Eluato positvo Eluato negativo Total
Anti-D 11 1 12
Anti-C 10 0 10
Anti-E 3 6 9
Anti-c 8 0 8
Anti-S 5 2 7
Anti-K 3 0 3
Anti-Dia 1 0 1
Total 41 9 50
Figura 7 ndash Painel do eluato da amostra 21 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-C que foi
recuperado no eluato
Figura 8 ndash Painel do eluato da amostra 47 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-K que foi
recuperado no eluato
35
Dentre as 50 amostras 26 eram previamente fenotipadas para os antiacutegenos Fya Fy
b
Jka Jk
b S e s Dentre elas 20 alcanccedilaram TDA negativo apoacutes tratamento com a glicina-
aacutecidaEDTA e 20 negativaram apoacutes tratamento com cloroquina (tabela 5) Apoacutes ambas as
teacutecnicas os antiacutegenos originalmente expressos permaneceram positivos comprovando que natildeo
houve destruiccedilatildeo dos mesmos
Tabela 5 ndash Verificaccedilatildeo da interferecircncia do tratamento da hemaacutecias com cloroquina e glicina-
aacuteicdaEDTA sobre os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
AMOSTRAS
COM
FENOTIPAGEM
PREacuteVIA
TRATADAS COM
CLOROQUINA
TRATADAS COM
GLICINA
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
26
20
20
20
20
As amostras 24 47 e 50 eram positivas para o antiacutegeno K A cloroquina natildeo dissociou
o anticorpo em nenhuma das 3 amostras enquanto a glicina-aacutecidaEDTA foi efetiva nas
amostras 24 e 50 Foi testada a expressatildeo do antiacutegeno K nas amostras 24 e 50 apoacutes o
tratamento utilizando meacutetodo indireto em gel contendo AGH Apesar de natildeo ter sido avaliado
a intensidade de reaccedilatildeo de expressatildeo dos antiacutegenos podemos verificar na figura 9 que nas
duas amostras em que a teacutecnica foi efetiva e dissociou o anticorpo a expressatildeo do antiacutegeno K
continua presente mas a reatividade observada pode ser considerada 1+ sugerindo que houve
diminuiccedilatildeo da expressatildeo do antiacutegeno quando comparado com a expressatildeo observada em
hemaacutecia natildeo tratada
Os resultados individuais de cada amostra em ambas as teacutecnicas encontram-se
resumidas na tabela 6
526 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente onde foi constatada a presenccedila de autoanticorpo
a quente da classe IgG pelo TDA monoespeciacutefico (figura 10)O autoanticorpo tambeacutem
interferia na pesquisa e identificaccedilatildeo de anticorpos irregulares pois apresentava caracteriacutestica
de panaglutinina As hemaacutecias da paciente sensibilizadas ldquoin vivordquo foram tratadas com
cloroquina e com glicina-aacutecidaEDTA
36
Figura 9 ndash Fenotipagem das amostras 24 e 50 para antiacutegeno K apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
O teste positivo indica a presenccedila do antiacutegeno poreacutem a reatividade fraca (1+) sugere que houve enfraquecimento
de sua expressatildeo A direita a expressatildeo forte (4+) do antiacutegeno Kell em hemaacutecia controle natildeo tratada utilizada
como controle positivo
A cloroquina natildeo foi efetiva na retirada do anticorpo ligado as hemaacutecias ao contraacuterio
do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA que dissociou o anticorpo (figura 11)
A hemaacutecia tratada com glicina foi fenotipada para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
(figura 12) A fenotipagem para o sistema Rh (C c E e e) e Kell foi realizada em gel
especiacutefico monoclonal sem interferecircncia do TDA positivo (controle da reaccedilatildeo negativo)
O eluato resultante do tratamento com glicina-aacutecidaEDTA foi testada em gel com
hemaacutecias de painel de identificaccedilatildeo de anticorpos e apresentou resultado positivo com todas
as ceacutelulas (figura 13 e 14)
A amostra foi enviada para genotipagem e o resultado da genotipagem confirmou o
resultado da fenotipagem apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
527 TEMPO DE EXECUCcedilAtildeO DA TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
O tempo de reaccedilatildeo da glicina-aacutecidaEDTA eacute de 2 minutos Todas as amostras foram
tratadas obedecendo ao tempo descrito na literatura demonstrando que o mesmo eacute
reprodutiacutevel
37
Tabela 6- Resultados individuais por amostra
Amostra Especificidade
dos anticorpos
Intensidade do
TDA apoacutes
sensibilizaccedilatildeo
Tratamento
efetivo com
cloroquina
Tratamento
efetivo com
glicina
Eluato
poacutes
glicina
1 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 2 Dia 3+ Sim Sim 3+ 3 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 4 D 4+ Natildeo Sim 4+ 5 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 6 E 3+ Sim Sim Negativo 7 S 4+ Sim Sim 3+ 8 E 3+ Sim Sim 1+ 9 E 3+ Sim Sim 2+
10 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 11 D 4+ Natildeo Sim 4+ 12 D 4+ Natildeo Sim 4+ 13 S 3+ Sim Sim 3+ 14 S 3+ Sim Sim 3+ 15 D 3+ Natildeo Sim 3+ 16 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 17 E 3+ Sim Sim (+) 18 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 19 D 4+ Natildeo Natildeo 3+ 20 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 21 C 3+ Sim Sim 4+ 22 C 3+ Sim Sim 4+ 23 C 3+ Sim Sim 4+ 24 K 4+ Natildeo Sim 4+ 25 D 3+ Natildeo Natildeo Negativo 26 E 4+ Sim Sim Negativo 27 S 3+ Sim Sim 3+ 28 C 3+ Sim Natildeo 4+ 29 C 3+ Sim Sim 4+ 30 C 3+ Sim Sim 4+ 31 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 32 E 3+ Sim Sim Negativo 33 C 3+ Sim Natildeo 4+ 34 S 3+ Sim Sim Negativo 35 S 3+ Sim Sim Negativo 36 C 4+ Sim Natildeo 4+ 37 c 4+ Natildeo Natildeo 4+ 38 D 4+ Natildeo Sim 4+ 39 S 3+ Sim Sim 3+ 40 c 4+ Sim Natildeo 2+ 41 C 4+ Sim Natildeo 4+ 42 E 3+ Sim Sim Negativo 43 D 3+ Natildeo Sim 2+ 44 D 3+ Natildeo Sim 2+ 45 E 3+ Sim Sim Negativo 46 C 3+ Sim Sim 4+ 47 K 4+ Natildeo Natildeo 4+ 48 D 3+ Natildeo Sim 2+ 49 E 3+ Sim Sim Negativo 50 K 4+ Natildeo Sim 4+
TOTAL 50 28 33 41
38
Figura 10 ndash TDA monoespeciacutefico da amostra de paciente Hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo da classe
IgG
oacute Figura 11 ndash TDA apoacutes o tratamento com glicina-aacutecidaEDTA (esquerda) e cloroquina (direita) A glicina
negativou completamente o TDA enquanto a hemaacutecia tratada com cloroquina persistiu positiva (1+)
39
Figura 12 ndash Fenotipagem da amostra tratada com glicina-aacutecidaEDTA Fy(a+b+) Jk(a-b+) S+s+
Figura 13 ndash Painel em gel (LissAGH) do eluato apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de
intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
Figura 14 ndash ndash Painel ezimaacutetico (hemaacutecias tratadas com bromelina) do eluato em gel neutro apoacutes
tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
40
528 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Quanto a efetividade das teacutecnicas em negativar o TDA foi verificado que a glicina-
aacutecidaEDTA foi efetiva em 66 das amostras testadas no primeiro tratamento (3350
amostras) enquanto a cloroquina conseguiu negativar 56 (2850) Esses resultados natildeo
apresentam diferenccedila significativa (pgt005) demostrando que a teacutecnica da glicina-
aacutecidaEDTA natildeo eacute superior mas eacute tatildeo efetiva quanto a da cloroquina
Quando aliamos os resultados de ambas as teacutecnicas verificamos que em 76 (3850)
das amostras o TDA foi negativado Esse dado indica que ainda que uma teacutecnica natildeo seja
eficaz na remoccedilatildeo do anticorpo eacute uma boa alternativa tentar a segunda teacutecnica jaacute que a falha
em remover o anticorpo utilizando uma delas natildeo prevecirc necessariamente a falha com a outra
Quando se utiliza o teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla (graacutefico 2) para comparar a utilizaccedilatildeo das
duas teacutecnicas com o resultado de cada uma isolada (somente a cloroquina ou somente a
glicina) verificamos que os resultados apresentam diferenccedila significativa (plt005) (quadro 3)
TRATAMENTO EFETIVO COM TOTAL PORCENTAGEM
Glicina ou cloroquina 38 76
Glicina e cloroquina 23 46
Glicina apenas 10 20
Cloroquina apenas 5 10
Nenhuma das teacutecnicas 12 24
Quadro 3 - Resultados comparativos entre as teacutecnicas utilizadas
41
Graacutefico 2 - Teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla entre as teacutecnicas aplicadas A- Glicina e Cloroquina B-Cloroquina C-
Glicina ( plt005)
42
6 DISCUSSAtildeO
Os reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA podem ser adquiridos em
forma de kit comercial prontos para uso poreacutem natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil A preparaccedilatildeo
dos reagentes ldquoin houserdquo a partir de sais comerciais adquiridos se mostrou viaacutevel Os
reagentes glicina e o tampatildeo Tris armazenados de forma correta se mantiveram estaacuteveis por
um periacuteodo de 7 meses Somente o reagente EDTA precipitou mesmo armazenado em
condiccedilotildees adequadas sugerindo que o mesmo deve ser preparado em menor quantidade e
armazenado em aliacutequotas A soluccedilatildeo de cloroquina tambeacutem pode ser preparada ldquoin houserdquo e
pode ser armazenado por um mecircs A legislaccedilatildeo brasileira autoriza a utilizaccedilatildeo de reagentes
preparados a partir de sais comerciais como a cloroquina e a glicina-aacutecidaEDTA desde que
os sais tenham autorizaccedilatildeo da vigilacircncia sanitaacuteria para a comercializaccedilatildeo (BRASIL 2001)
A comparaccedilatildeo quanto a efetividade em dissociar anticorpos em amostras com TDA
positivos entre a teacutecnica da glicina e a teacutecnica da cloroquina mostrou que natildeo haacute diferenccedila
estatiacutestica entre elas e que ambas satildeo igualmente eficientes Se utilizadas conjuntamente haacute
maior possibilidade de elucidaccedilatildeo dos casos
Uma vantagem da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eacute que ela permite numa mesma
amostra eluir o anticorpo ligado aacute hemaacutecia assim como fenotipar a hemaacutecia tratada Devido a
sua dupla utilidade a teacutecnica eacute vantajosa principalmente em pacientes em que pouco volume
de amostra pode ser coletado como em casos de crianccedilas e receacutem-nascidos
A fenotipagem poacutes tratamento se mostrou viaacutevel jaacute que os antiacutegenos de maior
importacircncia natildeo sofreram alteraccedilotildees Nas 20 amostras que foram fenotipadas antes e apoacutes
tratamento para verificar a influecircncia dos reagentes na expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a
Jkb S e s natildeo houve destruiccedilatildeo dos mesmos por nenhuma das duas teacutecnicas
Para as amostras positivas para o antiacutegeno Kell (350) e sensibilizadas com o
respectivo anticorpo a teacutecnica da glicina foi efetiva em negativar o TDA em apenas duas
delas mas apoacutes o tratamento foi verificada uma fraca reatividade da reaccedilatildeo antiacutegeno-
anticorpo sugerindo que houve um enfraquecimento da expressatildeo do antiacutegeno conforme
esperado e descrito na literatura (BYRNE 1991 PALLAS WILER E MCGEE 1991
ROZIERS e SQUALI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012 e KATHARIA e
CHAUDHARY 2013) A accedilatildeo da glicina sobre o antigeno Kell natildeo representa impedimento
para seu uso uma vez que na impossibilidade de testar o antiacutegeno Kell o banco de sangue
consegue facilmente atender a solicitaccedilatildeo de transfusatildeo com unidades de hemaacutecias Kell
43
negativas jaacute que eacute um antiacutegeno de baixa prevalecircncia na populaccedilatildeo variando de 15 na
populaccedilatildeo africana a 9 nos europeus (DANIELS 2011)
A soluccedilatildeo resultante da dissociaccedilatildeo do anticorpo pela teacutecnica da glicina pode ainda ser
utilizada como eluato podendo substituir a teacutecnica de eluiccedilatildeo com reagentes comercias (kits
de eluiccedilatildeo aacutecida) que tem alto custo aproximadamente entre R$2000 a R$2500 por teste
Em 41 amostras (82) houve a dissociaccedilatildeo e recuperaccedilatildeo do anticorpo que estava
sensibilizando as hemaacutecias Em 9 amostras (18) os anticorpos foram eluiacutedos poreacutem
apresentaram reaccedilatildeo negativa quando testadas com hemaacutecias de triagem entre eles o anti-E
(6) anti-S (2) e Anti-D (1) Eacute possiacutevel que a correccedilatildeo pH do meio (WALKER 2011) natildeo
tenha sido adequada o que pode ter desfavorecido a reatividade do anticorpo
Para as amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA nas quais natildeo houve dissociaccedilatildeo do
anticorpo pelo primeiro tratamento (1750) o segundo tratamento natildeo se mostrou eficaz jaacute
que 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise O tempo de
armazenagem natildeo parece ter influenciado jaacute que todas as amostras foram testadas dentro de
48 horas apoacutes a coleta Outros fatores que natildeo foram verificados podem ter levado a
hemoacutelise Apesar da literatura (LOUIE JIENG e ZEROULIS 1986 e BYRNE 1991)
recomendar um segundo tratamento ele eacute pouco eficaz tendo negativado apenas 3 das 17
amostras testadas
A amostra de paciente que apresentou sensibilizaccedilatildeo ldquoin vivordquo mostrou melhor
efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA sobre a da cloroquina possibilitando
fenotipagem para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s que natildeo foram destruiacutedos apoacutes o
tratamento comprovado atraveacutes da genotipagem
A presenccedila de autoanticorpo a quente com presenccedila de hemoacutelise (AHAI) ou natildeo pode
mascarar a presenccedila de aloanticorpo interferindo na rotina soroloacutegica da fenotipagem que eacute
uma importante ferramenta para auxiliar na seleccedilatildeo de hemaacutecias para transfusatildeo (SHIREY et
al 2002) Esses pacientes frequentemente possuem aloanticorpos associados ao
autoanticorpo e a prevalecircncia de aloimunizaccedilatildeo entre eles varia entre 12 a 40 (LEGER e
GARRATY 1999 BRANCH e PETZ 1999) o que dificulta ainda mais a escolha do melhor
componente a ser transfundido aleacutem de aumentar a possibilidade reaccedilotildees hemoliacuteticas imunes
poacutes-transfusionais
Nesses casos as teacutecnicas de dissociaccedilatildeo de anticorpos satildeo importantes para tratar
amostras de pacientes e a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser usada como uma opccedilatildeo
pois se mostrou eficaz na dissociaccedilatildeo anticorpo ligado agraves hemaacutecias deixando livre a
superfiacutecie das mesmas permitindo a fenotipagem por antisoros IgG Paralelamente os
44
anticorpos eluiacutedos tambeacutem puderam ser estudados O mesmo natildeo ocorre com a cloroquina
que permite apenas a fenotipagem e tampouco com os kits de eluiccedilatildeo aacutecida disponiacuteveis no
mercado nacional que satildeo destinados a realizaccedilatildeo do eluato mas destroem as hemaacutecias
O tempo de tratamento na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA tambeacutem eacute uma vantagem
pois foi possiacutevel reproduzir no tempo determinado de 2 minutos enquanto a cloroquina
demora ateacute duas horas
Ainda que a aplicaccedilatildeo das teacutecnicas por biologia molecular estejam cada vez mais
presentes na rotina imuno-hematoloacutegica e possibilitam estabelecer o fenoacutetipo deduzido do
genoacutetipo elas natildeo estatildeo disponiacuteveis na maioria dos centros e sua realizaccedilatildeo exige algumas
horas A resoluccedilatildeo imediata do problema transfusional necessita dos resultados soroloacutegicos
pois com frequecircncia natildeo eacute possiacutevel aguardar o resultado do teste molecular Dessa forma
apesar da crescente importacircncia da genotipagem eritrocitaacuteria teacutecnicas soroloacutegicas aplicadas
corretamente e no momento propiacutecio satildeo de grande utilidade para resolver problemas imuno-
hematoloacutegicos como ocorre com a fenotipagem em pacientes com TDA positivo
45
7 CONCLUSAtildeO
A teacutecnica da glicina aacutecidaEDTA mostrou-se efetiva em remover os anticorpos que
sensibilizavam as hemaacutecias e pode ser utilizada com seguranccedila antes da fenotipagem
eritrocitaacuteria Por ser uma teacutecnica de raacutepida execuccedilatildeo eacute uma alternativa aplicaacutevel
principalmente em casos urgentes de pacientes que apresentam autoanticorpos
46
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50
9 ANEXOS
51
FUNDACcedilAtildeO HEMOCENTRO DE RIBEIRAtildeO PRETO
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE)
Tiacutetulo da pesquisa Aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina aacutecida-EDTA e avaliaccedilatildeo da
eficaacutecia no tratamento de hemaacutecias com teste direto da antiglobulina positivo
Pesquisadora responsaacutevel Ceacutelia Kazue Abiko
Orientador Prof Dimas Tadeu Covas
Co-orientadora Dra Flaacutevia Leite Souza Santos
Objetivo da pesquisa Vocecirc estaacute sendo convidado a participar de uma pesquisa que tem
como objetivo padronizar uma nova teacutecnica para auxiliar na tipagem sanguiacutenea de pacientes
A tipagem sanguiacutenea pode sofrer interferecircncia da presenccedila de anticorpos ligados aos gloacutebulos
vermelhos do sangue Nessas situaccedilotildees eacute difiacutecil selecionar o melhor sangue para o paciente e
eacute preciso a utilizaccedilatildeo de teacutecnicas adicionais para remover essas interferecircncias
Esta pesquisa tem como objetivo estudar outra teacutecnica para remover esses anticorpos e
comparaacute-la com a teacutecnica atualmente utilizada Para isso precisamos de amostras de pacientes
e doadores voluntaacuterios
Se vocecirc eacute um doador eacute necessaacuterio que vocecirc autorize a coleta de 5 ml (1 tubo) a mais
de seu sangue
Se vocecirc eacute um paciente natildeo haveraacute necessidade de nova amostra pois utilizaremos as
amostras jaacute coletadas para os testes preacute-transfusionais e os resultados encontrados nesta
pesquisa natildeo iratildeo interferir na escolha da (s) bolsa (s) de sangue que vocecirc possa vir a receber
Se vocecirc concordar em participar leia com atenccedilatildeo o texto abaixo e assine as duas vias
rubricando todas as paacuteginas deste termo de consentimento Uma via original assinada e
rubricada por vocecirc e pela pesquisadora ficaraacute com vocecirc
As suas informaccedilotildees seratildeo mantidas em sigilo pela pesquisadora e natildeo haveraacute
armazenamento de material para pesquisas posteriores Os seus dados seratildeo usados apenas
neste estudo e quando o trabalho for publicado seu nome e qualquer outra informaccedilatildeo que
possam identificaacute-lo natildeo seratildeo revelados
Eacute pouco provaacutevel que o que noacutes aprendermos com este estudo tenha um benefiacutecio
direto para vocecirc assim como natildeo poderemos dar nada em troca pela sua participaccedilatildeo na
pesquisa
Nosso objetivo com esta pesquisa eacute que os resultados poderatildeo ser uacuteteis para o
tratamento de pacientes no futuro Os riscos da participaccedilatildeo satildeo miacutenimos Se vocecirc eacute um
doador de sangue a amostra seraacute coletada no momento da doaccedilatildeo natildeo exigindo punccedilatildeo
venosa adicional
52
Eacute seu direito ter acesso aos resultados dos testes da pesquisa Esses resultados natildeo
seratildeo fornecidos automaticamente a vocecirc mas caso vocecirc se interesse em saber o resultado ou
tiver alguma duacutevida sobre a sua participaccedilatildeo neste estudo deveraacute entrar em contato com Ceacutelia
Kazue Abiko pelo telefone (18) 99718-3551
Vocecirc tem total liberdade de optar por natildeo participar da pesquisa Caso aceite
participar poderaacute desistir a qualquer momento ou retirar seu consentimento mesmo apoacutes ter
coletado o sangue Para cancelar sua participaccedilatildeo basta avisar a pesquisadora e os seus dados
seratildeo retirados do projeto
Qualquer duacutevida eacutetica sobre a pesquisa poderaacute entrar em contato com o Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa do Hospital das Cliacutenicas e da Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto
(CAMPUS UNIVERSITAacuteRIO bairro Monte Alegre CEP 14048-900 Ribeiratildeo Preto-SP
Telefone (16) 3602-2228 FAX (16) 3633-1144 e-mail cephcrpuspbr)
Consentimento de participaccedilatildeo
A Consentimento do participante
Li as informaccedilotildees acima sobre o estudo e recebi explicaccedilotildees sobre a participaccedilatildeo no estudo
Portanto dou o meu consentimento para participar do estudo
___________________________________________________________________________
Nome completo
___________________________________________________________________________
Assinatura
___________
Data
__________________________________________________________________________________
Nome completo da pesquisadora
___________________________________________________________________________
Assinatura
_____________
Data
25
413 TRATAMENTO DAS AMOSTRAS
As amostras sensibilizadas apresentando o TDA positivo 3 ou 4+ foram divididas em
duas aliacutequotas e submetidas a duas teacutecnicas diferentes com o objetivo de dissociar o anticorpo
ligado Uma aliacutequota da amostra foi tratada com soluccedilatildeo de difosfato de cloroquina enquanto
a outra aliacutequota foi tratada com glicina-aacutecidaEDTA
42 PREPARO DA GLICINA AacuteCIDA-EDTA
A teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA utiliza 3 soluccedilotildees diferentes a glicina aacutecida o
EDTA e o tampatildeo TRIS
Os reagentes foram preparados utilizando os sais para anaacutelise (PA) de EDTA
(Na2EDTA2H2O) TRIS (C4H11NO3) Glicina (H2NCH2CO2H) NaCl e a soluccedilatildeo de aacutecido
cloriacutedrico (HCl) 12 N todos reagentes da marca SYNTH (quadro 1)
Para o preparo do tampatildeo glicina-acida eacute necessaacuterio o ajuste do pH para 15 Para esse
ajuste utiliza-se aacutecido cloriacutedrico (HCl) concentrado O pH foi medido com fitas reativas de pH
com escala de 1 a 14 da marca MERCK Posteriormente a soluccedilatildeo foi enviada ao laboratoacuterio
de controle de qualidade do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto e o pH medido no peagacircmetro O
tampatildeo glicina-aacutecida foi armazenado a 4deg e o tampatildeo tris e o EDTA em temperatura ambiente
controlada (20 a 24deg Celsius)
Apoacutes o preparo e durante a realizaccedilatildeo dos testes foram feitas inspeccedilotildees visuais para
verificaccedilatildeo de turvaccedilatildeo do meio e presenccedila de precipitados
Reagente Material Quantidade Preparo e
Conservaccedilatildeo
EDTA
EDTA
(Na2EDTA2H2O)
5 gramas Mistura ateacute
dissoluccedilatildeo do sal e
conserva em
temperatura ambiente Aacutegua Destilada 50 Ml
Tris
TRIS (C4H11NO3) 121 gramas Conservar em
temperatura ambiente NaCl 525g
Aacutegua destilada 100ml
Gliacutecina-aacutecida
Glicina
(H2NCH2CO2H) 15 gramas
Conservar a 4oC NaCl 116gramas
Aacutegua Destilada 200ml
HCL 12N Ajutar o pH para 15
Quadro 1 - Preparo dos Reagentes da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA
Fonte - Manual teacutecnico AABB 2011
26
O tampatildeo glicina-aacutecida e o tampatildeo TRIS satildeo estaacuteveis por 7 meses O reagente EDTA
precipitou mesmo estando em temperatura em ambiente controlado Houve necessidade de
preparo de novo reagente
421 TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
1 Em um tubo de ensaio 12x75 mm eacute adicionado 08 mL da soluccedilatildeo de glicina-aacutecida A
esta soluccedilatildeo adiciona-se 02 mL de EDTA e mistura
2 Adiciona-se 02 mL de hemaacutecias sensibilizadas (lavada 4 vezes) A mistura eacute
homogeneizada e incubada por exatamente 2 minutos
3 A seguir 01 mL de tampatildeo TRIS eacute adicionado agrave mistura que eacute novamente
homogeneizada e centrifugada por 2 minutos a 3400 rpm O pH deve estar entre 7 a 75
4 Apoacutes centrifugaccedilatildeo separa-se em outro tubo o sobrenadante (eluato) e as hemaacutecias
que permanecem satildeo lavadas 4 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica para retirada de todo o
reagente e anticorpos livres
43 PREPARO DA CLOROQUINA
A cloroquina eacute diluiacuteda em tampatildeo PBS na concentraccedilatildeo de 20 (Quadro 2) e
armazenado a 4deg Celsius sua validade apoacutes o preparo eacute de 1 mecircs
A teacutecnica da cloroquina jaacute estaacute padronizada para rotina do laboratoacuterio de
imunohematologia do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto e suas unidades
Reagente Reagentes Quantidade PreparoConservaccedilatildeo
Cloroquina
Difosfato de cloroquina
(C18H32ClN3O8P2)
20 gramas
Conservar a 4deg Celsius
Tampatildeo PBS 100ml
NaOH 01 N Acertar o pH para
51
Quadro 2 - Preparo da Cloroquina Fonte - Manual teacutecnico da AABB 2011
431 TEacuteCNICA DA CLOROQUINA
1 4 partes da soluccedilatildeo pronta eacute adicionada a uma parte de hemaacutecias lavadas 4 vezes com
soluccedilatildeo fisioloacutegica
2 A mistura eacute incubada em temperatura ambiente por ateacute duas horas
3 Centrifugar a 3400 rpm por 2 minutos
27
4 Remover o sobrenadante lavar as hemaacutecias novamente com soluccedilatildeo fisioloacutegica 4
vezes
44 VERIFICACcedilAtildeO DA EFETIVIDADE DOS TESTES
Apoacutes tratamento pelas duas teacutecnicas o TDA foi repetido em todas as amostras para
verificar se os tratamentos foram efetivos e houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo Para as
amostras tratadas pela teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA que permaneceram com TDA positivo
novo tratamento foi realizado
45 TESTE DO ELUATO
O eluato resultante das amostras tratadas com glicina-acidaEDTA foi testado com
hemaacutecias de triagem A soluccedilatildeo do eluato foi incubada com as hemaacutecias de triagem de
anticorpos (ID-Diacell BIO-RAD) pela teacutecnica em gel LissCoombs O teste foi incubado 15
minutos a 37deg Celsius e centrifugado por 10 minutos em centrifuga proacutepria para a teacutecnica em
gel Os eluatos que apresentaram resultados positivos foram testados em painel de 11
hemaacutecias (ID-Diapanel BIO-RAD) para a identificaccedilatildeo do anticorpo
46 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente que apresentou TDA positivo por IgG e pesquisa
de anticorpo irregular positivo com presenccedila de autoanticorpo com reatividade panaglutinina
A amostra foi tratada em paralelo pelas duas teacutecnicas descritas e foi enviada para o
Hemocentro para genotipagem eritrocitaacuteria que foi realizado por metodologia PCR em tempo
real no equipamento Real-time system PCR 7500 ( Applied Biosystems Califoacuternia EUA)
28
5 RESULTADOS
51 REAGENTES
Para aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA satildeo necessaacuterios 3 diferentes
reagentes que podem ser encontrados em forma de kit pronto para uso No entanto esses kits
natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil Os reagentes satildeo tampatildeo glicina-aacutecida o EDTA e o tampatildeo
Tris
Todos os reagentes foram preparados rdquoin houserdquo a partir dos sais e soluccedilotildees PA (puro
para anaacutelise) da marca SYNTH que foram adquiridos para a pesquisa O custo estimado para
cada teste foi aproximadamente R$ 020 reais
Apoacutes o preparo os reagentes poderiam ser armazenados em condiccedilotildees adequadas pelo
periacuteodo de 1 ano (AABB 2011) Ao final do preparo e durante o periacuteodo de armazenamento
de fevereiro a setembro de 2016 foi realizada inspeccedilatildeo visual para verificar a presenccedila de
precipitados ou turvaccedilatildeo A soluccedilatildeo de glicina e o tampatildeo TRIS mostraram-se estaacuteveis ateacute o
final do periacuteodo Por sua vez o reagente EDTA precipitou mesmo estando armazenado em
temperatura ambiente controlada e foi necessaacuterio novo preparo
52 AMOSTRAS DE DOADORES
521 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS AMOSTRAS
Apoacutes incubaccedilatildeo da hemaacutecia com o antissoro a mesma foi lavada 4 vezes para retirada
dos anticorpos livres A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada Caso houvesse positividade na
soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem a etapa era repetida (figura 3) Das 50 amostras sensibilizadas a
uacuteltima lavagem foi positiva somente em 3 delas Nas 3 amostras o anticorpo utilizado para
sensibilizaccedilatildeo foi o anti-K Apoacutes repetido nova etapa de lavagem os resultados se
apresentaram negativos
Em todas as amostras sensibilizadas ldquoin vitrordquo o TDA foi testado e verificado a
intensidade do teste Entre as 50 amostras 47 alcanccedilaram TDA com intensidade 3-4+ apoacutes a
primeira sensibilizaccedilatildeo enquanto 3 amostras necessitaram uma segunda incubaccedilatildeo com
anticorpo (figura 4)
A escolha dos anticorpos para sensibilizar as hemaacutecias foi feita de acordo com o
fenoacutetipo do doador e foram utilizados sete diferentes especificidades de anticorpos policlonais
humanos conforme mostra o graacutefico1
29
Figura 3 - Soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada com hemaacutecia de triagem de
anticorpos em gel LissCoombs (BIO-RAD) A finalidade eacute verificar a presenccedila de anticorpos livres na
suspensatildeo que possam interferir na pesquisa do eluato As soluccedilotildees de lavagem das amostras na figura a tiveram
resultados negativos Na figura b duas amostras a 47 e 50 apresentaram resultado positivo Nova etapa de
lavagem foi realizada e o resultado final foi negativo
522 TRATAMENTO DAS HEMAacuteCIAS
Apoacutes a sensibilizaccedilatildeo e obtenccedilatildeo de resultados de TDA com intensidade de 3 a 4+
cada uma das amostras foi dividida em duas aliacutequotas e tratada separadamente pelas teacutecnicas
de glicinaaacutecida-EDTA e cloroquina
As teacutecnicas foram consideradas efetivas quando obteve-se a completa dissociaccedilatildeo do
anticorpo verificada atraveacutes do TDA negativo na amostra poacutes tratamento conforme figuras 5
e 6 Dentre as amostras tratadas com cloroquina 2850 tiveram o TDA negativado A glicina-
aacutecidaEDTA negativou o TDA em 33 das 50 amostras tratadas Apenas 17 amostras tratadas
com glicina-aacutecidaEDTA permaneceram com o TDA positivo e foram submetidas a um novo
tratamento
30
Figura 4 - TDA das amostras apoacutes sensibilizaccedilatildeo com anticorpos policlonais humanos Amostras na
figura a com intensidades de 3-4+ Na figura b amostras 4 e 7 com intensidade menor que 3+ e portanto foram
novamente sensibilizadas com nova aliacutequota de soro Anti-D e anti-S Apoacutes a segunda sensibilizaccedilatildeo
apresentaram reatividade 4 e 3+ respectivamente Os anticorpos utilizados para sensibilizaccedilatildeo foram D S c E
C e K
523 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS TEacuteCNICAS
No tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA houve dissociaccedilatildeo completa do anticorpo
em 33 amostras (66) das 50 amostras testadas enquanto que com a cloroquina foram 28
amostras (56) (tabela 1)
31
Graacutefico 1- Nuacutemero de amostras sesnsibilizadas por especificidade de anticorpo Entre as 50 amostras 12
foram sensibilizadas com anti-D 10 com anti-C 9 com anti-E 8 com anti-c 7 com anti-S 3 com anti-K e 1
com anti-Dia As especificidades dos anticorpos foram definidas de acordo o fenoacutetipo do doador
Figura 5 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com cloroquina Nas amostras onde houve
a dissociaccedilatildeo do anticorpo ( 2 21 a 23 26 39 a 42 45 46 e 49) a hemaacutecia se deposita no fundo no microtubo
apoacutes a centrifugaccedilatildeo (TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (1 3 24 25 43 44 47
48 e 50) o anticorpo ligado agraves hemaacutecias eacute alvo da AGH presente no gel (TDA positivo)
Anti-D 12
Anti-C 10
Anti-E 9
Anti-c 8
Anti-S 7
Anti-K 3 Anti-Dia 1
32
Figura 6 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA Nas amostras
onde houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo (4 6 7 12 a 15 17 34 35 37 e 38) a hemaacutecia se deposita no fundo no
microtubo apoacutes a centrifugaccedilatildeo ( TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (5 16 18
19 20 33 e 36 ) o AGH presente no gel se liga ao anticorpo ligado agraves hemaacutecias que ficam retidas no gel (TDA
positivo)
Tabela 1-Resultado geral do tratamento das hemaacutecias com glicina e cloroquina
Teacutecnica utilizada TDA negativo TDA positivo Total
Glicina-aacutecidaEDTA 33 17 50
Cloroquina 28 22 50
A glicina-aacutecidaEDTA conseguiu negativar mais amostras sensibilizadas com Anti-D
e anti-K que a cloroquina Para as hemaacutecias sensibilizadas com anti-E Anti-S e Anti-Dia
ambas as teacutecnicas dissociaram o anticorpo em 100 das amostras Os resultados detalhados
por especificidade do anticorpo apoacutes o primeiro tratamento com glicina-aacutecidaEDTA e com
cloroquina estatildeo na tabela 2
Para as amostras que permaneceram positivas (17 amostras) apoacutes o tratamento com a
glicina-aacutecidaEDTA foi realizado um novo tratamento Houve dissociaccedilatildeo do anticorpo em 3
amostras (18) apoacutes a segunda tentativa Nas demais 14 (82) amostras tratadas pela
segunda vez 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise
33
Tabela 2 - Resultados do TDA apoacutes tratamento das hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo
sensibilizado
ANTICORPOS
SENSIBILIZADOS
1ordm TRATAMENTO COM
GLICINA
TRATAMENTO COM
CLOROQUINA
TOTAL TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
Anti-D 8 4 0 12 12
Anti-C 6 4 10 0 10
Anti-E 9 0 9 0 9
Anti-c 0 8 1 7 8
Anti-S 7 0 7 0 7
Anti-K 2 1 0 3 3
Anti-Dia 1 0 1 0 1
TOTAL 33 17 28 22 50
A hemoacutelise foi verificada durante o procedimento de lavagem final das hemaacutecias com
soluccedilatildeo fisioloacutegica para a retirada dos reagentes As soluccedilotildees de lavagem ficaram
avermelhadas e as hemaacutecias com coloraccedilatildeo escura As amostras foram descartadas Dentre as
6 amostras que ainda puderam ser testadas para o TDA trecircs amostras negativaram sendo 1
sensibilizada com anti-D e 2 com anti-C (tabela 3)
Tabela 3 - Resultado apoacutes o segundo tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA
Tratamento com
glicina-aacutecidaEDTA
TDA Negativo TDA Positvo Hemoacutelise Total
Segundo tratamento 3 3 11 17
524 TESTAGEM DO ELUATO
Apoacutes o tratamento com a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA a soluccedilatildeo do eluato foi
testada para verificar a viabilidade dos anticorpos que foram dissociados ou eluiacutedos Dentre
as 50 amostras 41 apresentaram eluato positivo As nove amostras cujos eluatos foram
negativos haviam sido sensibilizadas com as seguintes especificidades de anticorpos anti-E 6
amostras (67) anti-S 2 amostras (40) e anti-D 1 amostra (8) (tabela 4) O eluato de
todas as amostras sensibilizadas com os anticorpos anti-C anti-c Anti-K e Anti-Dia foram
positivos Os eluatos positivos na triagem de anticorpos foram testados com paineacuteis de
identificaccedilatildeo para confirmar a especificidade e a viabilidade dos anticorpos (figuras 7 e 8)
34
525 EFEITO DA ELUICcedilAtildeO SOBRE OS ANTIacuteGENOS ERITROCITAacuteRIOS
Para verificar o efeito do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA e com a cloroquina
sobre a expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s foi realizada a fenotipagem das
amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes tratamento com ambas as teacutecnicas Foi avaliado
se o tratamento destruiu os antiacutegenos expressos antes do tratamento
Tabela 4- Resultado do Eluato das amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA
Anticorpos Eluato positvo Eluato negativo Total
Anti-D 11 1 12
Anti-C 10 0 10
Anti-E 3 6 9
Anti-c 8 0 8
Anti-S 5 2 7
Anti-K 3 0 3
Anti-Dia 1 0 1
Total 41 9 50
Figura 7 ndash Painel do eluato da amostra 21 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-C que foi
recuperado no eluato
Figura 8 ndash Painel do eluato da amostra 47 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-K que foi
recuperado no eluato
35
Dentre as 50 amostras 26 eram previamente fenotipadas para os antiacutegenos Fya Fy
b
Jka Jk
b S e s Dentre elas 20 alcanccedilaram TDA negativo apoacutes tratamento com a glicina-
aacutecidaEDTA e 20 negativaram apoacutes tratamento com cloroquina (tabela 5) Apoacutes ambas as
teacutecnicas os antiacutegenos originalmente expressos permaneceram positivos comprovando que natildeo
houve destruiccedilatildeo dos mesmos
Tabela 5 ndash Verificaccedilatildeo da interferecircncia do tratamento da hemaacutecias com cloroquina e glicina-
aacuteicdaEDTA sobre os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
AMOSTRAS
COM
FENOTIPAGEM
PREacuteVIA
TRATADAS COM
CLOROQUINA
TRATADAS COM
GLICINA
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
26
20
20
20
20
As amostras 24 47 e 50 eram positivas para o antiacutegeno K A cloroquina natildeo dissociou
o anticorpo em nenhuma das 3 amostras enquanto a glicina-aacutecidaEDTA foi efetiva nas
amostras 24 e 50 Foi testada a expressatildeo do antiacutegeno K nas amostras 24 e 50 apoacutes o
tratamento utilizando meacutetodo indireto em gel contendo AGH Apesar de natildeo ter sido avaliado
a intensidade de reaccedilatildeo de expressatildeo dos antiacutegenos podemos verificar na figura 9 que nas
duas amostras em que a teacutecnica foi efetiva e dissociou o anticorpo a expressatildeo do antiacutegeno K
continua presente mas a reatividade observada pode ser considerada 1+ sugerindo que houve
diminuiccedilatildeo da expressatildeo do antiacutegeno quando comparado com a expressatildeo observada em
hemaacutecia natildeo tratada
Os resultados individuais de cada amostra em ambas as teacutecnicas encontram-se
resumidas na tabela 6
526 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente onde foi constatada a presenccedila de autoanticorpo
a quente da classe IgG pelo TDA monoespeciacutefico (figura 10)O autoanticorpo tambeacutem
interferia na pesquisa e identificaccedilatildeo de anticorpos irregulares pois apresentava caracteriacutestica
de panaglutinina As hemaacutecias da paciente sensibilizadas ldquoin vivordquo foram tratadas com
cloroquina e com glicina-aacutecidaEDTA
36
Figura 9 ndash Fenotipagem das amostras 24 e 50 para antiacutegeno K apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
O teste positivo indica a presenccedila do antiacutegeno poreacutem a reatividade fraca (1+) sugere que houve enfraquecimento
de sua expressatildeo A direita a expressatildeo forte (4+) do antiacutegeno Kell em hemaacutecia controle natildeo tratada utilizada
como controle positivo
A cloroquina natildeo foi efetiva na retirada do anticorpo ligado as hemaacutecias ao contraacuterio
do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA que dissociou o anticorpo (figura 11)
A hemaacutecia tratada com glicina foi fenotipada para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
(figura 12) A fenotipagem para o sistema Rh (C c E e e) e Kell foi realizada em gel
especiacutefico monoclonal sem interferecircncia do TDA positivo (controle da reaccedilatildeo negativo)
O eluato resultante do tratamento com glicina-aacutecidaEDTA foi testada em gel com
hemaacutecias de painel de identificaccedilatildeo de anticorpos e apresentou resultado positivo com todas
as ceacutelulas (figura 13 e 14)
A amostra foi enviada para genotipagem e o resultado da genotipagem confirmou o
resultado da fenotipagem apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
527 TEMPO DE EXECUCcedilAtildeO DA TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
O tempo de reaccedilatildeo da glicina-aacutecidaEDTA eacute de 2 minutos Todas as amostras foram
tratadas obedecendo ao tempo descrito na literatura demonstrando que o mesmo eacute
reprodutiacutevel
37
Tabela 6- Resultados individuais por amostra
Amostra Especificidade
dos anticorpos
Intensidade do
TDA apoacutes
sensibilizaccedilatildeo
Tratamento
efetivo com
cloroquina
Tratamento
efetivo com
glicina
Eluato
poacutes
glicina
1 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 2 Dia 3+ Sim Sim 3+ 3 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 4 D 4+ Natildeo Sim 4+ 5 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 6 E 3+ Sim Sim Negativo 7 S 4+ Sim Sim 3+ 8 E 3+ Sim Sim 1+ 9 E 3+ Sim Sim 2+
10 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 11 D 4+ Natildeo Sim 4+ 12 D 4+ Natildeo Sim 4+ 13 S 3+ Sim Sim 3+ 14 S 3+ Sim Sim 3+ 15 D 3+ Natildeo Sim 3+ 16 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 17 E 3+ Sim Sim (+) 18 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 19 D 4+ Natildeo Natildeo 3+ 20 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 21 C 3+ Sim Sim 4+ 22 C 3+ Sim Sim 4+ 23 C 3+ Sim Sim 4+ 24 K 4+ Natildeo Sim 4+ 25 D 3+ Natildeo Natildeo Negativo 26 E 4+ Sim Sim Negativo 27 S 3+ Sim Sim 3+ 28 C 3+ Sim Natildeo 4+ 29 C 3+ Sim Sim 4+ 30 C 3+ Sim Sim 4+ 31 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 32 E 3+ Sim Sim Negativo 33 C 3+ Sim Natildeo 4+ 34 S 3+ Sim Sim Negativo 35 S 3+ Sim Sim Negativo 36 C 4+ Sim Natildeo 4+ 37 c 4+ Natildeo Natildeo 4+ 38 D 4+ Natildeo Sim 4+ 39 S 3+ Sim Sim 3+ 40 c 4+ Sim Natildeo 2+ 41 C 4+ Sim Natildeo 4+ 42 E 3+ Sim Sim Negativo 43 D 3+ Natildeo Sim 2+ 44 D 3+ Natildeo Sim 2+ 45 E 3+ Sim Sim Negativo 46 C 3+ Sim Sim 4+ 47 K 4+ Natildeo Natildeo 4+ 48 D 3+ Natildeo Sim 2+ 49 E 3+ Sim Sim Negativo 50 K 4+ Natildeo Sim 4+
TOTAL 50 28 33 41
38
Figura 10 ndash TDA monoespeciacutefico da amostra de paciente Hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo da classe
IgG
oacute Figura 11 ndash TDA apoacutes o tratamento com glicina-aacutecidaEDTA (esquerda) e cloroquina (direita) A glicina
negativou completamente o TDA enquanto a hemaacutecia tratada com cloroquina persistiu positiva (1+)
39
Figura 12 ndash Fenotipagem da amostra tratada com glicina-aacutecidaEDTA Fy(a+b+) Jk(a-b+) S+s+
Figura 13 ndash Painel em gel (LissAGH) do eluato apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de
intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
Figura 14 ndash ndash Painel ezimaacutetico (hemaacutecias tratadas com bromelina) do eluato em gel neutro apoacutes
tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
40
528 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Quanto a efetividade das teacutecnicas em negativar o TDA foi verificado que a glicina-
aacutecidaEDTA foi efetiva em 66 das amostras testadas no primeiro tratamento (3350
amostras) enquanto a cloroquina conseguiu negativar 56 (2850) Esses resultados natildeo
apresentam diferenccedila significativa (pgt005) demostrando que a teacutecnica da glicina-
aacutecidaEDTA natildeo eacute superior mas eacute tatildeo efetiva quanto a da cloroquina
Quando aliamos os resultados de ambas as teacutecnicas verificamos que em 76 (3850)
das amostras o TDA foi negativado Esse dado indica que ainda que uma teacutecnica natildeo seja
eficaz na remoccedilatildeo do anticorpo eacute uma boa alternativa tentar a segunda teacutecnica jaacute que a falha
em remover o anticorpo utilizando uma delas natildeo prevecirc necessariamente a falha com a outra
Quando se utiliza o teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla (graacutefico 2) para comparar a utilizaccedilatildeo das
duas teacutecnicas com o resultado de cada uma isolada (somente a cloroquina ou somente a
glicina) verificamos que os resultados apresentam diferenccedila significativa (plt005) (quadro 3)
TRATAMENTO EFETIVO COM TOTAL PORCENTAGEM
Glicina ou cloroquina 38 76
Glicina e cloroquina 23 46
Glicina apenas 10 20
Cloroquina apenas 5 10
Nenhuma das teacutecnicas 12 24
Quadro 3 - Resultados comparativos entre as teacutecnicas utilizadas
41
Graacutefico 2 - Teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla entre as teacutecnicas aplicadas A- Glicina e Cloroquina B-Cloroquina C-
Glicina ( plt005)
42
6 DISCUSSAtildeO
Os reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA podem ser adquiridos em
forma de kit comercial prontos para uso poreacutem natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil A preparaccedilatildeo
dos reagentes ldquoin houserdquo a partir de sais comerciais adquiridos se mostrou viaacutevel Os
reagentes glicina e o tampatildeo Tris armazenados de forma correta se mantiveram estaacuteveis por
um periacuteodo de 7 meses Somente o reagente EDTA precipitou mesmo armazenado em
condiccedilotildees adequadas sugerindo que o mesmo deve ser preparado em menor quantidade e
armazenado em aliacutequotas A soluccedilatildeo de cloroquina tambeacutem pode ser preparada ldquoin houserdquo e
pode ser armazenado por um mecircs A legislaccedilatildeo brasileira autoriza a utilizaccedilatildeo de reagentes
preparados a partir de sais comerciais como a cloroquina e a glicina-aacutecidaEDTA desde que
os sais tenham autorizaccedilatildeo da vigilacircncia sanitaacuteria para a comercializaccedilatildeo (BRASIL 2001)
A comparaccedilatildeo quanto a efetividade em dissociar anticorpos em amostras com TDA
positivos entre a teacutecnica da glicina e a teacutecnica da cloroquina mostrou que natildeo haacute diferenccedila
estatiacutestica entre elas e que ambas satildeo igualmente eficientes Se utilizadas conjuntamente haacute
maior possibilidade de elucidaccedilatildeo dos casos
Uma vantagem da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eacute que ela permite numa mesma
amostra eluir o anticorpo ligado aacute hemaacutecia assim como fenotipar a hemaacutecia tratada Devido a
sua dupla utilidade a teacutecnica eacute vantajosa principalmente em pacientes em que pouco volume
de amostra pode ser coletado como em casos de crianccedilas e receacutem-nascidos
A fenotipagem poacutes tratamento se mostrou viaacutevel jaacute que os antiacutegenos de maior
importacircncia natildeo sofreram alteraccedilotildees Nas 20 amostras que foram fenotipadas antes e apoacutes
tratamento para verificar a influecircncia dos reagentes na expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a
Jkb S e s natildeo houve destruiccedilatildeo dos mesmos por nenhuma das duas teacutecnicas
Para as amostras positivas para o antiacutegeno Kell (350) e sensibilizadas com o
respectivo anticorpo a teacutecnica da glicina foi efetiva em negativar o TDA em apenas duas
delas mas apoacutes o tratamento foi verificada uma fraca reatividade da reaccedilatildeo antiacutegeno-
anticorpo sugerindo que houve um enfraquecimento da expressatildeo do antiacutegeno conforme
esperado e descrito na literatura (BYRNE 1991 PALLAS WILER E MCGEE 1991
ROZIERS e SQUALI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012 e KATHARIA e
CHAUDHARY 2013) A accedilatildeo da glicina sobre o antigeno Kell natildeo representa impedimento
para seu uso uma vez que na impossibilidade de testar o antiacutegeno Kell o banco de sangue
consegue facilmente atender a solicitaccedilatildeo de transfusatildeo com unidades de hemaacutecias Kell
43
negativas jaacute que eacute um antiacutegeno de baixa prevalecircncia na populaccedilatildeo variando de 15 na
populaccedilatildeo africana a 9 nos europeus (DANIELS 2011)
A soluccedilatildeo resultante da dissociaccedilatildeo do anticorpo pela teacutecnica da glicina pode ainda ser
utilizada como eluato podendo substituir a teacutecnica de eluiccedilatildeo com reagentes comercias (kits
de eluiccedilatildeo aacutecida) que tem alto custo aproximadamente entre R$2000 a R$2500 por teste
Em 41 amostras (82) houve a dissociaccedilatildeo e recuperaccedilatildeo do anticorpo que estava
sensibilizando as hemaacutecias Em 9 amostras (18) os anticorpos foram eluiacutedos poreacutem
apresentaram reaccedilatildeo negativa quando testadas com hemaacutecias de triagem entre eles o anti-E
(6) anti-S (2) e Anti-D (1) Eacute possiacutevel que a correccedilatildeo pH do meio (WALKER 2011) natildeo
tenha sido adequada o que pode ter desfavorecido a reatividade do anticorpo
Para as amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA nas quais natildeo houve dissociaccedilatildeo do
anticorpo pelo primeiro tratamento (1750) o segundo tratamento natildeo se mostrou eficaz jaacute
que 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise O tempo de
armazenagem natildeo parece ter influenciado jaacute que todas as amostras foram testadas dentro de
48 horas apoacutes a coleta Outros fatores que natildeo foram verificados podem ter levado a
hemoacutelise Apesar da literatura (LOUIE JIENG e ZEROULIS 1986 e BYRNE 1991)
recomendar um segundo tratamento ele eacute pouco eficaz tendo negativado apenas 3 das 17
amostras testadas
A amostra de paciente que apresentou sensibilizaccedilatildeo ldquoin vivordquo mostrou melhor
efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA sobre a da cloroquina possibilitando
fenotipagem para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s que natildeo foram destruiacutedos apoacutes o
tratamento comprovado atraveacutes da genotipagem
A presenccedila de autoanticorpo a quente com presenccedila de hemoacutelise (AHAI) ou natildeo pode
mascarar a presenccedila de aloanticorpo interferindo na rotina soroloacutegica da fenotipagem que eacute
uma importante ferramenta para auxiliar na seleccedilatildeo de hemaacutecias para transfusatildeo (SHIREY et
al 2002) Esses pacientes frequentemente possuem aloanticorpos associados ao
autoanticorpo e a prevalecircncia de aloimunizaccedilatildeo entre eles varia entre 12 a 40 (LEGER e
GARRATY 1999 BRANCH e PETZ 1999) o que dificulta ainda mais a escolha do melhor
componente a ser transfundido aleacutem de aumentar a possibilidade reaccedilotildees hemoliacuteticas imunes
poacutes-transfusionais
Nesses casos as teacutecnicas de dissociaccedilatildeo de anticorpos satildeo importantes para tratar
amostras de pacientes e a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser usada como uma opccedilatildeo
pois se mostrou eficaz na dissociaccedilatildeo anticorpo ligado agraves hemaacutecias deixando livre a
superfiacutecie das mesmas permitindo a fenotipagem por antisoros IgG Paralelamente os
44
anticorpos eluiacutedos tambeacutem puderam ser estudados O mesmo natildeo ocorre com a cloroquina
que permite apenas a fenotipagem e tampouco com os kits de eluiccedilatildeo aacutecida disponiacuteveis no
mercado nacional que satildeo destinados a realizaccedilatildeo do eluato mas destroem as hemaacutecias
O tempo de tratamento na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA tambeacutem eacute uma vantagem
pois foi possiacutevel reproduzir no tempo determinado de 2 minutos enquanto a cloroquina
demora ateacute duas horas
Ainda que a aplicaccedilatildeo das teacutecnicas por biologia molecular estejam cada vez mais
presentes na rotina imuno-hematoloacutegica e possibilitam estabelecer o fenoacutetipo deduzido do
genoacutetipo elas natildeo estatildeo disponiacuteveis na maioria dos centros e sua realizaccedilatildeo exige algumas
horas A resoluccedilatildeo imediata do problema transfusional necessita dos resultados soroloacutegicos
pois com frequecircncia natildeo eacute possiacutevel aguardar o resultado do teste molecular Dessa forma
apesar da crescente importacircncia da genotipagem eritrocitaacuteria teacutecnicas soroloacutegicas aplicadas
corretamente e no momento propiacutecio satildeo de grande utilidade para resolver problemas imuno-
hematoloacutegicos como ocorre com a fenotipagem em pacientes com TDA positivo
45
7 CONCLUSAtildeO
A teacutecnica da glicina aacutecidaEDTA mostrou-se efetiva em remover os anticorpos que
sensibilizavam as hemaacutecias e pode ser utilizada com seguranccedila antes da fenotipagem
eritrocitaacuteria Por ser uma teacutecnica de raacutepida execuccedilatildeo eacute uma alternativa aplicaacutevel
principalmente em casos urgentes de pacientes que apresentam autoanticorpos
46
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50
9 ANEXOS
51
FUNDACcedilAtildeO HEMOCENTRO DE RIBEIRAtildeO PRETO
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE)
Tiacutetulo da pesquisa Aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina aacutecida-EDTA e avaliaccedilatildeo da
eficaacutecia no tratamento de hemaacutecias com teste direto da antiglobulina positivo
Pesquisadora responsaacutevel Ceacutelia Kazue Abiko
Orientador Prof Dimas Tadeu Covas
Co-orientadora Dra Flaacutevia Leite Souza Santos
Objetivo da pesquisa Vocecirc estaacute sendo convidado a participar de uma pesquisa que tem
como objetivo padronizar uma nova teacutecnica para auxiliar na tipagem sanguiacutenea de pacientes
A tipagem sanguiacutenea pode sofrer interferecircncia da presenccedila de anticorpos ligados aos gloacutebulos
vermelhos do sangue Nessas situaccedilotildees eacute difiacutecil selecionar o melhor sangue para o paciente e
eacute preciso a utilizaccedilatildeo de teacutecnicas adicionais para remover essas interferecircncias
Esta pesquisa tem como objetivo estudar outra teacutecnica para remover esses anticorpos e
comparaacute-la com a teacutecnica atualmente utilizada Para isso precisamos de amostras de pacientes
e doadores voluntaacuterios
Se vocecirc eacute um doador eacute necessaacuterio que vocecirc autorize a coleta de 5 ml (1 tubo) a mais
de seu sangue
Se vocecirc eacute um paciente natildeo haveraacute necessidade de nova amostra pois utilizaremos as
amostras jaacute coletadas para os testes preacute-transfusionais e os resultados encontrados nesta
pesquisa natildeo iratildeo interferir na escolha da (s) bolsa (s) de sangue que vocecirc possa vir a receber
Se vocecirc concordar em participar leia com atenccedilatildeo o texto abaixo e assine as duas vias
rubricando todas as paacuteginas deste termo de consentimento Uma via original assinada e
rubricada por vocecirc e pela pesquisadora ficaraacute com vocecirc
As suas informaccedilotildees seratildeo mantidas em sigilo pela pesquisadora e natildeo haveraacute
armazenamento de material para pesquisas posteriores Os seus dados seratildeo usados apenas
neste estudo e quando o trabalho for publicado seu nome e qualquer outra informaccedilatildeo que
possam identificaacute-lo natildeo seratildeo revelados
Eacute pouco provaacutevel que o que noacutes aprendermos com este estudo tenha um benefiacutecio
direto para vocecirc assim como natildeo poderemos dar nada em troca pela sua participaccedilatildeo na
pesquisa
Nosso objetivo com esta pesquisa eacute que os resultados poderatildeo ser uacuteteis para o
tratamento de pacientes no futuro Os riscos da participaccedilatildeo satildeo miacutenimos Se vocecirc eacute um
doador de sangue a amostra seraacute coletada no momento da doaccedilatildeo natildeo exigindo punccedilatildeo
venosa adicional
52
Eacute seu direito ter acesso aos resultados dos testes da pesquisa Esses resultados natildeo
seratildeo fornecidos automaticamente a vocecirc mas caso vocecirc se interesse em saber o resultado ou
tiver alguma duacutevida sobre a sua participaccedilatildeo neste estudo deveraacute entrar em contato com Ceacutelia
Kazue Abiko pelo telefone (18) 99718-3551
Vocecirc tem total liberdade de optar por natildeo participar da pesquisa Caso aceite
participar poderaacute desistir a qualquer momento ou retirar seu consentimento mesmo apoacutes ter
coletado o sangue Para cancelar sua participaccedilatildeo basta avisar a pesquisadora e os seus dados
seratildeo retirados do projeto
Qualquer duacutevida eacutetica sobre a pesquisa poderaacute entrar em contato com o Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa do Hospital das Cliacutenicas e da Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto
(CAMPUS UNIVERSITAacuteRIO bairro Monte Alegre CEP 14048-900 Ribeiratildeo Preto-SP
Telefone (16) 3602-2228 FAX (16) 3633-1144 e-mail cephcrpuspbr)
Consentimento de participaccedilatildeo
A Consentimento do participante
Li as informaccedilotildees acima sobre o estudo e recebi explicaccedilotildees sobre a participaccedilatildeo no estudo
Portanto dou o meu consentimento para participar do estudo
___________________________________________________________________________
Nome completo
___________________________________________________________________________
Assinatura
___________
Data
__________________________________________________________________________________
Nome completo da pesquisadora
___________________________________________________________________________
Assinatura
_____________
Data
26
O tampatildeo glicina-aacutecida e o tampatildeo TRIS satildeo estaacuteveis por 7 meses O reagente EDTA
precipitou mesmo estando em temperatura em ambiente controlado Houve necessidade de
preparo de novo reagente
421 TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
1 Em um tubo de ensaio 12x75 mm eacute adicionado 08 mL da soluccedilatildeo de glicina-aacutecida A
esta soluccedilatildeo adiciona-se 02 mL de EDTA e mistura
2 Adiciona-se 02 mL de hemaacutecias sensibilizadas (lavada 4 vezes) A mistura eacute
homogeneizada e incubada por exatamente 2 minutos
3 A seguir 01 mL de tampatildeo TRIS eacute adicionado agrave mistura que eacute novamente
homogeneizada e centrifugada por 2 minutos a 3400 rpm O pH deve estar entre 7 a 75
4 Apoacutes centrifugaccedilatildeo separa-se em outro tubo o sobrenadante (eluato) e as hemaacutecias
que permanecem satildeo lavadas 4 vezes com soluccedilatildeo fisioloacutegica para retirada de todo o
reagente e anticorpos livres
43 PREPARO DA CLOROQUINA
A cloroquina eacute diluiacuteda em tampatildeo PBS na concentraccedilatildeo de 20 (Quadro 2) e
armazenado a 4deg Celsius sua validade apoacutes o preparo eacute de 1 mecircs
A teacutecnica da cloroquina jaacute estaacute padronizada para rotina do laboratoacuterio de
imunohematologia do Hemocentro de Ribeiratildeo Preto e suas unidades
Reagente Reagentes Quantidade PreparoConservaccedilatildeo
Cloroquina
Difosfato de cloroquina
(C18H32ClN3O8P2)
20 gramas
Conservar a 4deg Celsius
Tampatildeo PBS 100ml
NaOH 01 N Acertar o pH para
51
Quadro 2 - Preparo da Cloroquina Fonte - Manual teacutecnico da AABB 2011
431 TEacuteCNICA DA CLOROQUINA
1 4 partes da soluccedilatildeo pronta eacute adicionada a uma parte de hemaacutecias lavadas 4 vezes com
soluccedilatildeo fisioloacutegica
2 A mistura eacute incubada em temperatura ambiente por ateacute duas horas
3 Centrifugar a 3400 rpm por 2 minutos
27
4 Remover o sobrenadante lavar as hemaacutecias novamente com soluccedilatildeo fisioloacutegica 4
vezes
44 VERIFICACcedilAtildeO DA EFETIVIDADE DOS TESTES
Apoacutes tratamento pelas duas teacutecnicas o TDA foi repetido em todas as amostras para
verificar se os tratamentos foram efetivos e houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo Para as
amostras tratadas pela teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA que permaneceram com TDA positivo
novo tratamento foi realizado
45 TESTE DO ELUATO
O eluato resultante das amostras tratadas com glicina-acidaEDTA foi testado com
hemaacutecias de triagem A soluccedilatildeo do eluato foi incubada com as hemaacutecias de triagem de
anticorpos (ID-Diacell BIO-RAD) pela teacutecnica em gel LissCoombs O teste foi incubado 15
minutos a 37deg Celsius e centrifugado por 10 minutos em centrifuga proacutepria para a teacutecnica em
gel Os eluatos que apresentaram resultados positivos foram testados em painel de 11
hemaacutecias (ID-Diapanel BIO-RAD) para a identificaccedilatildeo do anticorpo
46 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente que apresentou TDA positivo por IgG e pesquisa
de anticorpo irregular positivo com presenccedila de autoanticorpo com reatividade panaglutinina
A amostra foi tratada em paralelo pelas duas teacutecnicas descritas e foi enviada para o
Hemocentro para genotipagem eritrocitaacuteria que foi realizado por metodologia PCR em tempo
real no equipamento Real-time system PCR 7500 ( Applied Biosystems Califoacuternia EUA)
28
5 RESULTADOS
51 REAGENTES
Para aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA satildeo necessaacuterios 3 diferentes
reagentes que podem ser encontrados em forma de kit pronto para uso No entanto esses kits
natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil Os reagentes satildeo tampatildeo glicina-aacutecida o EDTA e o tampatildeo
Tris
Todos os reagentes foram preparados rdquoin houserdquo a partir dos sais e soluccedilotildees PA (puro
para anaacutelise) da marca SYNTH que foram adquiridos para a pesquisa O custo estimado para
cada teste foi aproximadamente R$ 020 reais
Apoacutes o preparo os reagentes poderiam ser armazenados em condiccedilotildees adequadas pelo
periacuteodo de 1 ano (AABB 2011) Ao final do preparo e durante o periacuteodo de armazenamento
de fevereiro a setembro de 2016 foi realizada inspeccedilatildeo visual para verificar a presenccedila de
precipitados ou turvaccedilatildeo A soluccedilatildeo de glicina e o tampatildeo TRIS mostraram-se estaacuteveis ateacute o
final do periacuteodo Por sua vez o reagente EDTA precipitou mesmo estando armazenado em
temperatura ambiente controlada e foi necessaacuterio novo preparo
52 AMOSTRAS DE DOADORES
521 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS AMOSTRAS
Apoacutes incubaccedilatildeo da hemaacutecia com o antissoro a mesma foi lavada 4 vezes para retirada
dos anticorpos livres A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada Caso houvesse positividade na
soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem a etapa era repetida (figura 3) Das 50 amostras sensibilizadas a
uacuteltima lavagem foi positiva somente em 3 delas Nas 3 amostras o anticorpo utilizado para
sensibilizaccedilatildeo foi o anti-K Apoacutes repetido nova etapa de lavagem os resultados se
apresentaram negativos
Em todas as amostras sensibilizadas ldquoin vitrordquo o TDA foi testado e verificado a
intensidade do teste Entre as 50 amostras 47 alcanccedilaram TDA com intensidade 3-4+ apoacutes a
primeira sensibilizaccedilatildeo enquanto 3 amostras necessitaram uma segunda incubaccedilatildeo com
anticorpo (figura 4)
A escolha dos anticorpos para sensibilizar as hemaacutecias foi feita de acordo com o
fenoacutetipo do doador e foram utilizados sete diferentes especificidades de anticorpos policlonais
humanos conforme mostra o graacutefico1
29
Figura 3 - Soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada com hemaacutecia de triagem de
anticorpos em gel LissCoombs (BIO-RAD) A finalidade eacute verificar a presenccedila de anticorpos livres na
suspensatildeo que possam interferir na pesquisa do eluato As soluccedilotildees de lavagem das amostras na figura a tiveram
resultados negativos Na figura b duas amostras a 47 e 50 apresentaram resultado positivo Nova etapa de
lavagem foi realizada e o resultado final foi negativo
522 TRATAMENTO DAS HEMAacuteCIAS
Apoacutes a sensibilizaccedilatildeo e obtenccedilatildeo de resultados de TDA com intensidade de 3 a 4+
cada uma das amostras foi dividida em duas aliacutequotas e tratada separadamente pelas teacutecnicas
de glicinaaacutecida-EDTA e cloroquina
As teacutecnicas foram consideradas efetivas quando obteve-se a completa dissociaccedilatildeo do
anticorpo verificada atraveacutes do TDA negativo na amostra poacutes tratamento conforme figuras 5
e 6 Dentre as amostras tratadas com cloroquina 2850 tiveram o TDA negativado A glicina-
aacutecidaEDTA negativou o TDA em 33 das 50 amostras tratadas Apenas 17 amostras tratadas
com glicina-aacutecidaEDTA permaneceram com o TDA positivo e foram submetidas a um novo
tratamento
30
Figura 4 - TDA das amostras apoacutes sensibilizaccedilatildeo com anticorpos policlonais humanos Amostras na
figura a com intensidades de 3-4+ Na figura b amostras 4 e 7 com intensidade menor que 3+ e portanto foram
novamente sensibilizadas com nova aliacutequota de soro Anti-D e anti-S Apoacutes a segunda sensibilizaccedilatildeo
apresentaram reatividade 4 e 3+ respectivamente Os anticorpos utilizados para sensibilizaccedilatildeo foram D S c E
C e K
523 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS TEacuteCNICAS
No tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA houve dissociaccedilatildeo completa do anticorpo
em 33 amostras (66) das 50 amostras testadas enquanto que com a cloroquina foram 28
amostras (56) (tabela 1)
31
Graacutefico 1- Nuacutemero de amostras sesnsibilizadas por especificidade de anticorpo Entre as 50 amostras 12
foram sensibilizadas com anti-D 10 com anti-C 9 com anti-E 8 com anti-c 7 com anti-S 3 com anti-K e 1
com anti-Dia As especificidades dos anticorpos foram definidas de acordo o fenoacutetipo do doador
Figura 5 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com cloroquina Nas amostras onde houve
a dissociaccedilatildeo do anticorpo ( 2 21 a 23 26 39 a 42 45 46 e 49) a hemaacutecia se deposita no fundo no microtubo
apoacutes a centrifugaccedilatildeo (TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (1 3 24 25 43 44 47
48 e 50) o anticorpo ligado agraves hemaacutecias eacute alvo da AGH presente no gel (TDA positivo)
Anti-D 12
Anti-C 10
Anti-E 9
Anti-c 8
Anti-S 7
Anti-K 3 Anti-Dia 1
32
Figura 6 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA Nas amostras
onde houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo (4 6 7 12 a 15 17 34 35 37 e 38) a hemaacutecia se deposita no fundo no
microtubo apoacutes a centrifugaccedilatildeo ( TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (5 16 18
19 20 33 e 36 ) o AGH presente no gel se liga ao anticorpo ligado agraves hemaacutecias que ficam retidas no gel (TDA
positivo)
Tabela 1-Resultado geral do tratamento das hemaacutecias com glicina e cloroquina
Teacutecnica utilizada TDA negativo TDA positivo Total
Glicina-aacutecidaEDTA 33 17 50
Cloroquina 28 22 50
A glicina-aacutecidaEDTA conseguiu negativar mais amostras sensibilizadas com Anti-D
e anti-K que a cloroquina Para as hemaacutecias sensibilizadas com anti-E Anti-S e Anti-Dia
ambas as teacutecnicas dissociaram o anticorpo em 100 das amostras Os resultados detalhados
por especificidade do anticorpo apoacutes o primeiro tratamento com glicina-aacutecidaEDTA e com
cloroquina estatildeo na tabela 2
Para as amostras que permaneceram positivas (17 amostras) apoacutes o tratamento com a
glicina-aacutecidaEDTA foi realizado um novo tratamento Houve dissociaccedilatildeo do anticorpo em 3
amostras (18) apoacutes a segunda tentativa Nas demais 14 (82) amostras tratadas pela
segunda vez 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise
33
Tabela 2 - Resultados do TDA apoacutes tratamento das hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo
sensibilizado
ANTICORPOS
SENSIBILIZADOS
1ordm TRATAMENTO COM
GLICINA
TRATAMENTO COM
CLOROQUINA
TOTAL TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
Anti-D 8 4 0 12 12
Anti-C 6 4 10 0 10
Anti-E 9 0 9 0 9
Anti-c 0 8 1 7 8
Anti-S 7 0 7 0 7
Anti-K 2 1 0 3 3
Anti-Dia 1 0 1 0 1
TOTAL 33 17 28 22 50
A hemoacutelise foi verificada durante o procedimento de lavagem final das hemaacutecias com
soluccedilatildeo fisioloacutegica para a retirada dos reagentes As soluccedilotildees de lavagem ficaram
avermelhadas e as hemaacutecias com coloraccedilatildeo escura As amostras foram descartadas Dentre as
6 amostras que ainda puderam ser testadas para o TDA trecircs amostras negativaram sendo 1
sensibilizada com anti-D e 2 com anti-C (tabela 3)
Tabela 3 - Resultado apoacutes o segundo tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA
Tratamento com
glicina-aacutecidaEDTA
TDA Negativo TDA Positvo Hemoacutelise Total
Segundo tratamento 3 3 11 17
524 TESTAGEM DO ELUATO
Apoacutes o tratamento com a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA a soluccedilatildeo do eluato foi
testada para verificar a viabilidade dos anticorpos que foram dissociados ou eluiacutedos Dentre
as 50 amostras 41 apresentaram eluato positivo As nove amostras cujos eluatos foram
negativos haviam sido sensibilizadas com as seguintes especificidades de anticorpos anti-E 6
amostras (67) anti-S 2 amostras (40) e anti-D 1 amostra (8) (tabela 4) O eluato de
todas as amostras sensibilizadas com os anticorpos anti-C anti-c Anti-K e Anti-Dia foram
positivos Os eluatos positivos na triagem de anticorpos foram testados com paineacuteis de
identificaccedilatildeo para confirmar a especificidade e a viabilidade dos anticorpos (figuras 7 e 8)
34
525 EFEITO DA ELUICcedilAtildeO SOBRE OS ANTIacuteGENOS ERITROCITAacuteRIOS
Para verificar o efeito do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA e com a cloroquina
sobre a expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s foi realizada a fenotipagem das
amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes tratamento com ambas as teacutecnicas Foi avaliado
se o tratamento destruiu os antiacutegenos expressos antes do tratamento
Tabela 4- Resultado do Eluato das amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA
Anticorpos Eluato positvo Eluato negativo Total
Anti-D 11 1 12
Anti-C 10 0 10
Anti-E 3 6 9
Anti-c 8 0 8
Anti-S 5 2 7
Anti-K 3 0 3
Anti-Dia 1 0 1
Total 41 9 50
Figura 7 ndash Painel do eluato da amostra 21 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-C que foi
recuperado no eluato
Figura 8 ndash Painel do eluato da amostra 47 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-K que foi
recuperado no eluato
35
Dentre as 50 amostras 26 eram previamente fenotipadas para os antiacutegenos Fya Fy
b
Jka Jk
b S e s Dentre elas 20 alcanccedilaram TDA negativo apoacutes tratamento com a glicina-
aacutecidaEDTA e 20 negativaram apoacutes tratamento com cloroquina (tabela 5) Apoacutes ambas as
teacutecnicas os antiacutegenos originalmente expressos permaneceram positivos comprovando que natildeo
houve destruiccedilatildeo dos mesmos
Tabela 5 ndash Verificaccedilatildeo da interferecircncia do tratamento da hemaacutecias com cloroquina e glicina-
aacuteicdaEDTA sobre os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
AMOSTRAS
COM
FENOTIPAGEM
PREacuteVIA
TRATADAS COM
CLOROQUINA
TRATADAS COM
GLICINA
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
26
20
20
20
20
As amostras 24 47 e 50 eram positivas para o antiacutegeno K A cloroquina natildeo dissociou
o anticorpo em nenhuma das 3 amostras enquanto a glicina-aacutecidaEDTA foi efetiva nas
amostras 24 e 50 Foi testada a expressatildeo do antiacutegeno K nas amostras 24 e 50 apoacutes o
tratamento utilizando meacutetodo indireto em gel contendo AGH Apesar de natildeo ter sido avaliado
a intensidade de reaccedilatildeo de expressatildeo dos antiacutegenos podemos verificar na figura 9 que nas
duas amostras em que a teacutecnica foi efetiva e dissociou o anticorpo a expressatildeo do antiacutegeno K
continua presente mas a reatividade observada pode ser considerada 1+ sugerindo que houve
diminuiccedilatildeo da expressatildeo do antiacutegeno quando comparado com a expressatildeo observada em
hemaacutecia natildeo tratada
Os resultados individuais de cada amostra em ambas as teacutecnicas encontram-se
resumidas na tabela 6
526 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente onde foi constatada a presenccedila de autoanticorpo
a quente da classe IgG pelo TDA monoespeciacutefico (figura 10)O autoanticorpo tambeacutem
interferia na pesquisa e identificaccedilatildeo de anticorpos irregulares pois apresentava caracteriacutestica
de panaglutinina As hemaacutecias da paciente sensibilizadas ldquoin vivordquo foram tratadas com
cloroquina e com glicina-aacutecidaEDTA
36
Figura 9 ndash Fenotipagem das amostras 24 e 50 para antiacutegeno K apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
O teste positivo indica a presenccedila do antiacutegeno poreacutem a reatividade fraca (1+) sugere que houve enfraquecimento
de sua expressatildeo A direita a expressatildeo forte (4+) do antiacutegeno Kell em hemaacutecia controle natildeo tratada utilizada
como controle positivo
A cloroquina natildeo foi efetiva na retirada do anticorpo ligado as hemaacutecias ao contraacuterio
do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA que dissociou o anticorpo (figura 11)
A hemaacutecia tratada com glicina foi fenotipada para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
(figura 12) A fenotipagem para o sistema Rh (C c E e e) e Kell foi realizada em gel
especiacutefico monoclonal sem interferecircncia do TDA positivo (controle da reaccedilatildeo negativo)
O eluato resultante do tratamento com glicina-aacutecidaEDTA foi testada em gel com
hemaacutecias de painel de identificaccedilatildeo de anticorpos e apresentou resultado positivo com todas
as ceacutelulas (figura 13 e 14)
A amostra foi enviada para genotipagem e o resultado da genotipagem confirmou o
resultado da fenotipagem apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
527 TEMPO DE EXECUCcedilAtildeO DA TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
O tempo de reaccedilatildeo da glicina-aacutecidaEDTA eacute de 2 minutos Todas as amostras foram
tratadas obedecendo ao tempo descrito na literatura demonstrando que o mesmo eacute
reprodutiacutevel
37
Tabela 6- Resultados individuais por amostra
Amostra Especificidade
dos anticorpos
Intensidade do
TDA apoacutes
sensibilizaccedilatildeo
Tratamento
efetivo com
cloroquina
Tratamento
efetivo com
glicina
Eluato
poacutes
glicina
1 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 2 Dia 3+ Sim Sim 3+ 3 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 4 D 4+ Natildeo Sim 4+ 5 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 6 E 3+ Sim Sim Negativo 7 S 4+ Sim Sim 3+ 8 E 3+ Sim Sim 1+ 9 E 3+ Sim Sim 2+
10 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 11 D 4+ Natildeo Sim 4+ 12 D 4+ Natildeo Sim 4+ 13 S 3+ Sim Sim 3+ 14 S 3+ Sim Sim 3+ 15 D 3+ Natildeo Sim 3+ 16 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 17 E 3+ Sim Sim (+) 18 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 19 D 4+ Natildeo Natildeo 3+ 20 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 21 C 3+ Sim Sim 4+ 22 C 3+ Sim Sim 4+ 23 C 3+ Sim Sim 4+ 24 K 4+ Natildeo Sim 4+ 25 D 3+ Natildeo Natildeo Negativo 26 E 4+ Sim Sim Negativo 27 S 3+ Sim Sim 3+ 28 C 3+ Sim Natildeo 4+ 29 C 3+ Sim Sim 4+ 30 C 3+ Sim Sim 4+ 31 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 32 E 3+ Sim Sim Negativo 33 C 3+ Sim Natildeo 4+ 34 S 3+ Sim Sim Negativo 35 S 3+ Sim Sim Negativo 36 C 4+ Sim Natildeo 4+ 37 c 4+ Natildeo Natildeo 4+ 38 D 4+ Natildeo Sim 4+ 39 S 3+ Sim Sim 3+ 40 c 4+ Sim Natildeo 2+ 41 C 4+ Sim Natildeo 4+ 42 E 3+ Sim Sim Negativo 43 D 3+ Natildeo Sim 2+ 44 D 3+ Natildeo Sim 2+ 45 E 3+ Sim Sim Negativo 46 C 3+ Sim Sim 4+ 47 K 4+ Natildeo Natildeo 4+ 48 D 3+ Natildeo Sim 2+ 49 E 3+ Sim Sim Negativo 50 K 4+ Natildeo Sim 4+
TOTAL 50 28 33 41
38
Figura 10 ndash TDA monoespeciacutefico da amostra de paciente Hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo da classe
IgG
oacute Figura 11 ndash TDA apoacutes o tratamento com glicina-aacutecidaEDTA (esquerda) e cloroquina (direita) A glicina
negativou completamente o TDA enquanto a hemaacutecia tratada com cloroquina persistiu positiva (1+)
39
Figura 12 ndash Fenotipagem da amostra tratada com glicina-aacutecidaEDTA Fy(a+b+) Jk(a-b+) S+s+
Figura 13 ndash Painel em gel (LissAGH) do eluato apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de
intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
Figura 14 ndash ndash Painel ezimaacutetico (hemaacutecias tratadas com bromelina) do eluato em gel neutro apoacutes
tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
40
528 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Quanto a efetividade das teacutecnicas em negativar o TDA foi verificado que a glicina-
aacutecidaEDTA foi efetiva em 66 das amostras testadas no primeiro tratamento (3350
amostras) enquanto a cloroquina conseguiu negativar 56 (2850) Esses resultados natildeo
apresentam diferenccedila significativa (pgt005) demostrando que a teacutecnica da glicina-
aacutecidaEDTA natildeo eacute superior mas eacute tatildeo efetiva quanto a da cloroquina
Quando aliamos os resultados de ambas as teacutecnicas verificamos que em 76 (3850)
das amostras o TDA foi negativado Esse dado indica que ainda que uma teacutecnica natildeo seja
eficaz na remoccedilatildeo do anticorpo eacute uma boa alternativa tentar a segunda teacutecnica jaacute que a falha
em remover o anticorpo utilizando uma delas natildeo prevecirc necessariamente a falha com a outra
Quando se utiliza o teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla (graacutefico 2) para comparar a utilizaccedilatildeo das
duas teacutecnicas com o resultado de cada uma isolada (somente a cloroquina ou somente a
glicina) verificamos que os resultados apresentam diferenccedila significativa (plt005) (quadro 3)
TRATAMENTO EFETIVO COM TOTAL PORCENTAGEM
Glicina ou cloroquina 38 76
Glicina e cloroquina 23 46
Glicina apenas 10 20
Cloroquina apenas 5 10
Nenhuma das teacutecnicas 12 24
Quadro 3 - Resultados comparativos entre as teacutecnicas utilizadas
41
Graacutefico 2 - Teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla entre as teacutecnicas aplicadas A- Glicina e Cloroquina B-Cloroquina C-
Glicina ( plt005)
42
6 DISCUSSAtildeO
Os reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA podem ser adquiridos em
forma de kit comercial prontos para uso poreacutem natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil A preparaccedilatildeo
dos reagentes ldquoin houserdquo a partir de sais comerciais adquiridos se mostrou viaacutevel Os
reagentes glicina e o tampatildeo Tris armazenados de forma correta se mantiveram estaacuteveis por
um periacuteodo de 7 meses Somente o reagente EDTA precipitou mesmo armazenado em
condiccedilotildees adequadas sugerindo que o mesmo deve ser preparado em menor quantidade e
armazenado em aliacutequotas A soluccedilatildeo de cloroquina tambeacutem pode ser preparada ldquoin houserdquo e
pode ser armazenado por um mecircs A legislaccedilatildeo brasileira autoriza a utilizaccedilatildeo de reagentes
preparados a partir de sais comerciais como a cloroquina e a glicina-aacutecidaEDTA desde que
os sais tenham autorizaccedilatildeo da vigilacircncia sanitaacuteria para a comercializaccedilatildeo (BRASIL 2001)
A comparaccedilatildeo quanto a efetividade em dissociar anticorpos em amostras com TDA
positivos entre a teacutecnica da glicina e a teacutecnica da cloroquina mostrou que natildeo haacute diferenccedila
estatiacutestica entre elas e que ambas satildeo igualmente eficientes Se utilizadas conjuntamente haacute
maior possibilidade de elucidaccedilatildeo dos casos
Uma vantagem da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eacute que ela permite numa mesma
amostra eluir o anticorpo ligado aacute hemaacutecia assim como fenotipar a hemaacutecia tratada Devido a
sua dupla utilidade a teacutecnica eacute vantajosa principalmente em pacientes em que pouco volume
de amostra pode ser coletado como em casos de crianccedilas e receacutem-nascidos
A fenotipagem poacutes tratamento se mostrou viaacutevel jaacute que os antiacutegenos de maior
importacircncia natildeo sofreram alteraccedilotildees Nas 20 amostras que foram fenotipadas antes e apoacutes
tratamento para verificar a influecircncia dos reagentes na expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a
Jkb S e s natildeo houve destruiccedilatildeo dos mesmos por nenhuma das duas teacutecnicas
Para as amostras positivas para o antiacutegeno Kell (350) e sensibilizadas com o
respectivo anticorpo a teacutecnica da glicina foi efetiva em negativar o TDA em apenas duas
delas mas apoacutes o tratamento foi verificada uma fraca reatividade da reaccedilatildeo antiacutegeno-
anticorpo sugerindo que houve um enfraquecimento da expressatildeo do antiacutegeno conforme
esperado e descrito na literatura (BYRNE 1991 PALLAS WILER E MCGEE 1991
ROZIERS e SQUALI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012 e KATHARIA e
CHAUDHARY 2013) A accedilatildeo da glicina sobre o antigeno Kell natildeo representa impedimento
para seu uso uma vez que na impossibilidade de testar o antiacutegeno Kell o banco de sangue
consegue facilmente atender a solicitaccedilatildeo de transfusatildeo com unidades de hemaacutecias Kell
43
negativas jaacute que eacute um antiacutegeno de baixa prevalecircncia na populaccedilatildeo variando de 15 na
populaccedilatildeo africana a 9 nos europeus (DANIELS 2011)
A soluccedilatildeo resultante da dissociaccedilatildeo do anticorpo pela teacutecnica da glicina pode ainda ser
utilizada como eluato podendo substituir a teacutecnica de eluiccedilatildeo com reagentes comercias (kits
de eluiccedilatildeo aacutecida) que tem alto custo aproximadamente entre R$2000 a R$2500 por teste
Em 41 amostras (82) houve a dissociaccedilatildeo e recuperaccedilatildeo do anticorpo que estava
sensibilizando as hemaacutecias Em 9 amostras (18) os anticorpos foram eluiacutedos poreacutem
apresentaram reaccedilatildeo negativa quando testadas com hemaacutecias de triagem entre eles o anti-E
(6) anti-S (2) e Anti-D (1) Eacute possiacutevel que a correccedilatildeo pH do meio (WALKER 2011) natildeo
tenha sido adequada o que pode ter desfavorecido a reatividade do anticorpo
Para as amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA nas quais natildeo houve dissociaccedilatildeo do
anticorpo pelo primeiro tratamento (1750) o segundo tratamento natildeo se mostrou eficaz jaacute
que 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise O tempo de
armazenagem natildeo parece ter influenciado jaacute que todas as amostras foram testadas dentro de
48 horas apoacutes a coleta Outros fatores que natildeo foram verificados podem ter levado a
hemoacutelise Apesar da literatura (LOUIE JIENG e ZEROULIS 1986 e BYRNE 1991)
recomendar um segundo tratamento ele eacute pouco eficaz tendo negativado apenas 3 das 17
amostras testadas
A amostra de paciente que apresentou sensibilizaccedilatildeo ldquoin vivordquo mostrou melhor
efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA sobre a da cloroquina possibilitando
fenotipagem para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s que natildeo foram destruiacutedos apoacutes o
tratamento comprovado atraveacutes da genotipagem
A presenccedila de autoanticorpo a quente com presenccedila de hemoacutelise (AHAI) ou natildeo pode
mascarar a presenccedila de aloanticorpo interferindo na rotina soroloacutegica da fenotipagem que eacute
uma importante ferramenta para auxiliar na seleccedilatildeo de hemaacutecias para transfusatildeo (SHIREY et
al 2002) Esses pacientes frequentemente possuem aloanticorpos associados ao
autoanticorpo e a prevalecircncia de aloimunizaccedilatildeo entre eles varia entre 12 a 40 (LEGER e
GARRATY 1999 BRANCH e PETZ 1999) o que dificulta ainda mais a escolha do melhor
componente a ser transfundido aleacutem de aumentar a possibilidade reaccedilotildees hemoliacuteticas imunes
poacutes-transfusionais
Nesses casos as teacutecnicas de dissociaccedilatildeo de anticorpos satildeo importantes para tratar
amostras de pacientes e a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser usada como uma opccedilatildeo
pois se mostrou eficaz na dissociaccedilatildeo anticorpo ligado agraves hemaacutecias deixando livre a
superfiacutecie das mesmas permitindo a fenotipagem por antisoros IgG Paralelamente os
44
anticorpos eluiacutedos tambeacutem puderam ser estudados O mesmo natildeo ocorre com a cloroquina
que permite apenas a fenotipagem e tampouco com os kits de eluiccedilatildeo aacutecida disponiacuteveis no
mercado nacional que satildeo destinados a realizaccedilatildeo do eluato mas destroem as hemaacutecias
O tempo de tratamento na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA tambeacutem eacute uma vantagem
pois foi possiacutevel reproduzir no tempo determinado de 2 minutos enquanto a cloroquina
demora ateacute duas horas
Ainda que a aplicaccedilatildeo das teacutecnicas por biologia molecular estejam cada vez mais
presentes na rotina imuno-hematoloacutegica e possibilitam estabelecer o fenoacutetipo deduzido do
genoacutetipo elas natildeo estatildeo disponiacuteveis na maioria dos centros e sua realizaccedilatildeo exige algumas
horas A resoluccedilatildeo imediata do problema transfusional necessita dos resultados soroloacutegicos
pois com frequecircncia natildeo eacute possiacutevel aguardar o resultado do teste molecular Dessa forma
apesar da crescente importacircncia da genotipagem eritrocitaacuteria teacutecnicas soroloacutegicas aplicadas
corretamente e no momento propiacutecio satildeo de grande utilidade para resolver problemas imuno-
hematoloacutegicos como ocorre com a fenotipagem em pacientes com TDA positivo
45
7 CONCLUSAtildeO
A teacutecnica da glicina aacutecidaEDTA mostrou-se efetiva em remover os anticorpos que
sensibilizavam as hemaacutecias e pode ser utilizada com seguranccedila antes da fenotipagem
eritrocitaacuteria Por ser uma teacutecnica de raacutepida execuccedilatildeo eacute uma alternativa aplicaacutevel
principalmente em casos urgentes de pacientes que apresentam autoanticorpos
46
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50
9 ANEXOS
51
FUNDACcedilAtildeO HEMOCENTRO DE RIBEIRAtildeO PRETO
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE)
Tiacutetulo da pesquisa Aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina aacutecida-EDTA e avaliaccedilatildeo da
eficaacutecia no tratamento de hemaacutecias com teste direto da antiglobulina positivo
Pesquisadora responsaacutevel Ceacutelia Kazue Abiko
Orientador Prof Dimas Tadeu Covas
Co-orientadora Dra Flaacutevia Leite Souza Santos
Objetivo da pesquisa Vocecirc estaacute sendo convidado a participar de uma pesquisa que tem
como objetivo padronizar uma nova teacutecnica para auxiliar na tipagem sanguiacutenea de pacientes
A tipagem sanguiacutenea pode sofrer interferecircncia da presenccedila de anticorpos ligados aos gloacutebulos
vermelhos do sangue Nessas situaccedilotildees eacute difiacutecil selecionar o melhor sangue para o paciente e
eacute preciso a utilizaccedilatildeo de teacutecnicas adicionais para remover essas interferecircncias
Esta pesquisa tem como objetivo estudar outra teacutecnica para remover esses anticorpos e
comparaacute-la com a teacutecnica atualmente utilizada Para isso precisamos de amostras de pacientes
e doadores voluntaacuterios
Se vocecirc eacute um doador eacute necessaacuterio que vocecirc autorize a coleta de 5 ml (1 tubo) a mais
de seu sangue
Se vocecirc eacute um paciente natildeo haveraacute necessidade de nova amostra pois utilizaremos as
amostras jaacute coletadas para os testes preacute-transfusionais e os resultados encontrados nesta
pesquisa natildeo iratildeo interferir na escolha da (s) bolsa (s) de sangue que vocecirc possa vir a receber
Se vocecirc concordar em participar leia com atenccedilatildeo o texto abaixo e assine as duas vias
rubricando todas as paacuteginas deste termo de consentimento Uma via original assinada e
rubricada por vocecirc e pela pesquisadora ficaraacute com vocecirc
As suas informaccedilotildees seratildeo mantidas em sigilo pela pesquisadora e natildeo haveraacute
armazenamento de material para pesquisas posteriores Os seus dados seratildeo usados apenas
neste estudo e quando o trabalho for publicado seu nome e qualquer outra informaccedilatildeo que
possam identificaacute-lo natildeo seratildeo revelados
Eacute pouco provaacutevel que o que noacutes aprendermos com este estudo tenha um benefiacutecio
direto para vocecirc assim como natildeo poderemos dar nada em troca pela sua participaccedilatildeo na
pesquisa
Nosso objetivo com esta pesquisa eacute que os resultados poderatildeo ser uacuteteis para o
tratamento de pacientes no futuro Os riscos da participaccedilatildeo satildeo miacutenimos Se vocecirc eacute um
doador de sangue a amostra seraacute coletada no momento da doaccedilatildeo natildeo exigindo punccedilatildeo
venosa adicional
52
Eacute seu direito ter acesso aos resultados dos testes da pesquisa Esses resultados natildeo
seratildeo fornecidos automaticamente a vocecirc mas caso vocecirc se interesse em saber o resultado ou
tiver alguma duacutevida sobre a sua participaccedilatildeo neste estudo deveraacute entrar em contato com Ceacutelia
Kazue Abiko pelo telefone (18) 99718-3551
Vocecirc tem total liberdade de optar por natildeo participar da pesquisa Caso aceite
participar poderaacute desistir a qualquer momento ou retirar seu consentimento mesmo apoacutes ter
coletado o sangue Para cancelar sua participaccedilatildeo basta avisar a pesquisadora e os seus dados
seratildeo retirados do projeto
Qualquer duacutevida eacutetica sobre a pesquisa poderaacute entrar em contato com o Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa do Hospital das Cliacutenicas e da Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto
(CAMPUS UNIVERSITAacuteRIO bairro Monte Alegre CEP 14048-900 Ribeiratildeo Preto-SP
Telefone (16) 3602-2228 FAX (16) 3633-1144 e-mail cephcrpuspbr)
Consentimento de participaccedilatildeo
A Consentimento do participante
Li as informaccedilotildees acima sobre o estudo e recebi explicaccedilotildees sobre a participaccedilatildeo no estudo
Portanto dou o meu consentimento para participar do estudo
___________________________________________________________________________
Nome completo
___________________________________________________________________________
Assinatura
___________
Data
__________________________________________________________________________________
Nome completo da pesquisadora
___________________________________________________________________________
Assinatura
_____________
Data
27
4 Remover o sobrenadante lavar as hemaacutecias novamente com soluccedilatildeo fisioloacutegica 4
vezes
44 VERIFICACcedilAtildeO DA EFETIVIDADE DOS TESTES
Apoacutes tratamento pelas duas teacutecnicas o TDA foi repetido em todas as amostras para
verificar se os tratamentos foram efetivos e houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo Para as
amostras tratadas pela teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA que permaneceram com TDA positivo
novo tratamento foi realizado
45 TESTE DO ELUATO
O eluato resultante das amostras tratadas com glicina-acidaEDTA foi testado com
hemaacutecias de triagem A soluccedilatildeo do eluato foi incubada com as hemaacutecias de triagem de
anticorpos (ID-Diacell BIO-RAD) pela teacutecnica em gel LissCoombs O teste foi incubado 15
minutos a 37deg Celsius e centrifugado por 10 minutos em centrifuga proacutepria para a teacutecnica em
gel Os eluatos que apresentaram resultados positivos foram testados em painel de 11
hemaacutecias (ID-Diapanel BIO-RAD) para a identificaccedilatildeo do anticorpo
46 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente que apresentou TDA positivo por IgG e pesquisa
de anticorpo irregular positivo com presenccedila de autoanticorpo com reatividade panaglutinina
A amostra foi tratada em paralelo pelas duas teacutecnicas descritas e foi enviada para o
Hemocentro para genotipagem eritrocitaacuteria que foi realizado por metodologia PCR em tempo
real no equipamento Real-time system PCR 7500 ( Applied Biosystems Califoacuternia EUA)
28
5 RESULTADOS
51 REAGENTES
Para aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA satildeo necessaacuterios 3 diferentes
reagentes que podem ser encontrados em forma de kit pronto para uso No entanto esses kits
natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil Os reagentes satildeo tampatildeo glicina-aacutecida o EDTA e o tampatildeo
Tris
Todos os reagentes foram preparados rdquoin houserdquo a partir dos sais e soluccedilotildees PA (puro
para anaacutelise) da marca SYNTH que foram adquiridos para a pesquisa O custo estimado para
cada teste foi aproximadamente R$ 020 reais
Apoacutes o preparo os reagentes poderiam ser armazenados em condiccedilotildees adequadas pelo
periacuteodo de 1 ano (AABB 2011) Ao final do preparo e durante o periacuteodo de armazenamento
de fevereiro a setembro de 2016 foi realizada inspeccedilatildeo visual para verificar a presenccedila de
precipitados ou turvaccedilatildeo A soluccedilatildeo de glicina e o tampatildeo TRIS mostraram-se estaacuteveis ateacute o
final do periacuteodo Por sua vez o reagente EDTA precipitou mesmo estando armazenado em
temperatura ambiente controlada e foi necessaacuterio novo preparo
52 AMOSTRAS DE DOADORES
521 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS AMOSTRAS
Apoacutes incubaccedilatildeo da hemaacutecia com o antissoro a mesma foi lavada 4 vezes para retirada
dos anticorpos livres A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada Caso houvesse positividade na
soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem a etapa era repetida (figura 3) Das 50 amostras sensibilizadas a
uacuteltima lavagem foi positiva somente em 3 delas Nas 3 amostras o anticorpo utilizado para
sensibilizaccedilatildeo foi o anti-K Apoacutes repetido nova etapa de lavagem os resultados se
apresentaram negativos
Em todas as amostras sensibilizadas ldquoin vitrordquo o TDA foi testado e verificado a
intensidade do teste Entre as 50 amostras 47 alcanccedilaram TDA com intensidade 3-4+ apoacutes a
primeira sensibilizaccedilatildeo enquanto 3 amostras necessitaram uma segunda incubaccedilatildeo com
anticorpo (figura 4)
A escolha dos anticorpos para sensibilizar as hemaacutecias foi feita de acordo com o
fenoacutetipo do doador e foram utilizados sete diferentes especificidades de anticorpos policlonais
humanos conforme mostra o graacutefico1
29
Figura 3 - Soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada com hemaacutecia de triagem de
anticorpos em gel LissCoombs (BIO-RAD) A finalidade eacute verificar a presenccedila de anticorpos livres na
suspensatildeo que possam interferir na pesquisa do eluato As soluccedilotildees de lavagem das amostras na figura a tiveram
resultados negativos Na figura b duas amostras a 47 e 50 apresentaram resultado positivo Nova etapa de
lavagem foi realizada e o resultado final foi negativo
522 TRATAMENTO DAS HEMAacuteCIAS
Apoacutes a sensibilizaccedilatildeo e obtenccedilatildeo de resultados de TDA com intensidade de 3 a 4+
cada uma das amostras foi dividida em duas aliacutequotas e tratada separadamente pelas teacutecnicas
de glicinaaacutecida-EDTA e cloroquina
As teacutecnicas foram consideradas efetivas quando obteve-se a completa dissociaccedilatildeo do
anticorpo verificada atraveacutes do TDA negativo na amostra poacutes tratamento conforme figuras 5
e 6 Dentre as amostras tratadas com cloroquina 2850 tiveram o TDA negativado A glicina-
aacutecidaEDTA negativou o TDA em 33 das 50 amostras tratadas Apenas 17 amostras tratadas
com glicina-aacutecidaEDTA permaneceram com o TDA positivo e foram submetidas a um novo
tratamento
30
Figura 4 - TDA das amostras apoacutes sensibilizaccedilatildeo com anticorpos policlonais humanos Amostras na
figura a com intensidades de 3-4+ Na figura b amostras 4 e 7 com intensidade menor que 3+ e portanto foram
novamente sensibilizadas com nova aliacutequota de soro Anti-D e anti-S Apoacutes a segunda sensibilizaccedilatildeo
apresentaram reatividade 4 e 3+ respectivamente Os anticorpos utilizados para sensibilizaccedilatildeo foram D S c E
C e K
523 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS TEacuteCNICAS
No tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA houve dissociaccedilatildeo completa do anticorpo
em 33 amostras (66) das 50 amostras testadas enquanto que com a cloroquina foram 28
amostras (56) (tabela 1)
31
Graacutefico 1- Nuacutemero de amostras sesnsibilizadas por especificidade de anticorpo Entre as 50 amostras 12
foram sensibilizadas com anti-D 10 com anti-C 9 com anti-E 8 com anti-c 7 com anti-S 3 com anti-K e 1
com anti-Dia As especificidades dos anticorpos foram definidas de acordo o fenoacutetipo do doador
Figura 5 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com cloroquina Nas amostras onde houve
a dissociaccedilatildeo do anticorpo ( 2 21 a 23 26 39 a 42 45 46 e 49) a hemaacutecia se deposita no fundo no microtubo
apoacutes a centrifugaccedilatildeo (TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (1 3 24 25 43 44 47
48 e 50) o anticorpo ligado agraves hemaacutecias eacute alvo da AGH presente no gel (TDA positivo)
Anti-D 12
Anti-C 10
Anti-E 9
Anti-c 8
Anti-S 7
Anti-K 3 Anti-Dia 1
32
Figura 6 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA Nas amostras
onde houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo (4 6 7 12 a 15 17 34 35 37 e 38) a hemaacutecia se deposita no fundo no
microtubo apoacutes a centrifugaccedilatildeo ( TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (5 16 18
19 20 33 e 36 ) o AGH presente no gel se liga ao anticorpo ligado agraves hemaacutecias que ficam retidas no gel (TDA
positivo)
Tabela 1-Resultado geral do tratamento das hemaacutecias com glicina e cloroquina
Teacutecnica utilizada TDA negativo TDA positivo Total
Glicina-aacutecidaEDTA 33 17 50
Cloroquina 28 22 50
A glicina-aacutecidaEDTA conseguiu negativar mais amostras sensibilizadas com Anti-D
e anti-K que a cloroquina Para as hemaacutecias sensibilizadas com anti-E Anti-S e Anti-Dia
ambas as teacutecnicas dissociaram o anticorpo em 100 das amostras Os resultados detalhados
por especificidade do anticorpo apoacutes o primeiro tratamento com glicina-aacutecidaEDTA e com
cloroquina estatildeo na tabela 2
Para as amostras que permaneceram positivas (17 amostras) apoacutes o tratamento com a
glicina-aacutecidaEDTA foi realizado um novo tratamento Houve dissociaccedilatildeo do anticorpo em 3
amostras (18) apoacutes a segunda tentativa Nas demais 14 (82) amostras tratadas pela
segunda vez 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise
33
Tabela 2 - Resultados do TDA apoacutes tratamento das hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo
sensibilizado
ANTICORPOS
SENSIBILIZADOS
1ordm TRATAMENTO COM
GLICINA
TRATAMENTO COM
CLOROQUINA
TOTAL TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
Anti-D 8 4 0 12 12
Anti-C 6 4 10 0 10
Anti-E 9 0 9 0 9
Anti-c 0 8 1 7 8
Anti-S 7 0 7 0 7
Anti-K 2 1 0 3 3
Anti-Dia 1 0 1 0 1
TOTAL 33 17 28 22 50
A hemoacutelise foi verificada durante o procedimento de lavagem final das hemaacutecias com
soluccedilatildeo fisioloacutegica para a retirada dos reagentes As soluccedilotildees de lavagem ficaram
avermelhadas e as hemaacutecias com coloraccedilatildeo escura As amostras foram descartadas Dentre as
6 amostras que ainda puderam ser testadas para o TDA trecircs amostras negativaram sendo 1
sensibilizada com anti-D e 2 com anti-C (tabela 3)
Tabela 3 - Resultado apoacutes o segundo tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA
Tratamento com
glicina-aacutecidaEDTA
TDA Negativo TDA Positvo Hemoacutelise Total
Segundo tratamento 3 3 11 17
524 TESTAGEM DO ELUATO
Apoacutes o tratamento com a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA a soluccedilatildeo do eluato foi
testada para verificar a viabilidade dos anticorpos que foram dissociados ou eluiacutedos Dentre
as 50 amostras 41 apresentaram eluato positivo As nove amostras cujos eluatos foram
negativos haviam sido sensibilizadas com as seguintes especificidades de anticorpos anti-E 6
amostras (67) anti-S 2 amostras (40) e anti-D 1 amostra (8) (tabela 4) O eluato de
todas as amostras sensibilizadas com os anticorpos anti-C anti-c Anti-K e Anti-Dia foram
positivos Os eluatos positivos na triagem de anticorpos foram testados com paineacuteis de
identificaccedilatildeo para confirmar a especificidade e a viabilidade dos anticorpos (figuras 7 e 8)
34
525 EFEITO DA ELUICcedilAtildeO SOBRE OS ANTIacuteGENOS ERITROCITAacuteRIOS
Para verificar o efeito do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA e com a cloroquina
sobre a expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s foi realizada a fenotipagem das
amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes tratamento com ambas as teacutecnicas Foi avaliado
se o tratamento destruiu os antiacutegenos expressos antes do tratamento
Tabela 4- Resultado do Eluato das amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA
Anticorpos Eluato positvo Eluato negativo Total
Anti-D 11 1 12
Anti-C 10 0 10
Anti-E 3 6 9
Anti-c 8 0 8
Anti-S 5 2 7
Anti-K 3 0 3
Anti-Dia 1 0 1
Total 41 9 50
Figura 7 ndash Painel do eluato da amostra 21 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-C que foi
recuperado no eluato
Figura 8 ndash Painel do eluato da amostra 47 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-K que foi
recuperado no eluato
35
Dentre as 50 amostras 26 eram previamente fenotipadas para os antiacutegenos Fya Fy
b
Jka Jk
b S e s Dentre elas 20 alcanccedilaram TDA negativo apoacutes tratamento com a glicina-
aacutecidaEDTA e 20 negativaram apoacutes tratamento com cloroquina (tabela 5) Apoacutes ambas as
teacutecnicas os antiacutegenos originalmente expressos permaneceram positivos comprovando que natildeo
houve destruiccedilatildeo dos mesmos
Tabela 5 ndash Verificaccedilatildeo da interferecircncia do tratamento da hemaacutecias com cloroquina e glicina-
aacuteicdaEDTA sobre os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
AMOSTRAS
COM
FENOTIPAGEM
PREacuteVIA
TRATADAS COM
CLOROQUINA
TRATADAS COM
GLICINA
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
26
20
20
20
20
As amostras 24 47 e 50 eram positivas para o antiacutegeno K A cloroquina natildeo dissociou
o anticorpo em nenhuma das 3 amostras enquanto a glicina-aacutecidaEDTA foi efetiva nas
amostras 24 e 50 Foi testada a expressatildeo do antiacutegeno K nas amostras 24 e 50 apoacutes o
tratamento utilizando meacutetodo indireto em gel contendo AGH Apesar de natildeo ter sido avaliado
a intensidade de reaccedilatildeo de expressatildeo dos antiacutegenos podemos verificar na figura 9 que nas
duas amostras em que a teacutecnica foi efetiva e dissociou o anticorpo a expressatildeo do antiacutegeno K
continua presente mas a reatividade observada pode ser considerada 1+ sugerindo que houve
diminuiccedilatildeo da expressatildeo do antiacutegeno quando comparado com a expressatildeo observada em
hemaacutecia natildeo tratada
Os resultados individuais de cada amostra em ambas as teacutecnicas encontram-se
resumidas na tabela 6
526 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente onde foi constatada a presenccedila de autoanticorpo
a quente da classe IgG pelo TDA monoespeciacutefico (figura 10)O autoanticorpo tambeacutem
interferia na pesquisa e identificaccedilatildeo de anticorpos irregulares pois apresentava caracteriacutestica
de panaglutinina As hemaacutecias da paciente sensibilizadas ldquoin vivordquo foram tratadas com
cloroquina e com glicina-aacutecidaEDTA
36
Figura 9 ndash Fenotipagem das amostras 24 e 50 para antiacutegeno K apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
O teste positivo indica a presenccedila do antiacutegeno poreacutem a reatividade fraca (1+) sugere que houve enfraquecimento
de sua expressatildeo A direita a expressatildeo forte (4+) do antiacutegeno Kell em hemaacutecia controle natildeo tratada utilizada
como controle positivo
A cloroquina natildeo foi efetiva na retirada do anticorpo ligado as hemaacutecias ao contraacuterio
do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA que dissociou o anticorpo (figura 11)
A hemaacutecia tratada com glicina foi fenotipada para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
(figura 12) A fenotipagem para o sistema Rh (C c E e e) e Kell foi realizada em gel
especiacutefico monoclonal sem interferecircncia do TDA positivo (controle da reaccedilatildeo negativo)
O eluato resultante do tratamento com glicina-aacutecidaEDTA foi testada em gel com
hemaacutecias de painel de identificaccedilatildeo de anticorpos e apresentou resultado positivo com todas
as ceacutelulas (figura 13 e 14)
A amostra foi enviada para genotipagem e o resultado da genotipagem confirmou o
resultado da fenotipagem apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
527 TEMPO DE EXECUCcedilAtildeO DA TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
O tempo de reaccedilatildeo da glicina-aacutecidaEDTA eacute de 2 minutos Todas as amostras foram
tratadas obedecendo ao tempo descrito na literatura demonstrando que o mesmo eacute
reprodutiacutevel
37
Tabela 6- Resultados individuais por amostra
Amostra Especificidade
dos anticorpos
Intensidade do
TDA apoacutes
sensibilizaccedilatildeo
Tratamento
efetivo com
cloroquina
Tratamento
efetivo com
glicina
Eluato
poacutes
glicina
1 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 2 Dia 3+ Sim Sim 3+ 3 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 4 D 4+ Natildeo Sim 4+ 5 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 6 E 3+ Sim Sim Negativo 7 S 4+ Sim Sim 3+ 8 E 3+ Sim Sim 1+ 9 E 3+ Sim Sim 2+
10 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 11 D 4+ Natildeo Sim 4+ 12 D 4+ Natildeo Sim 4+ 13 S 3+ Sim Sim 3+ 14 S 3+ Sim Sim 3+ 15 D 3+ Natildeo Sim 3+ 16 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 17 E 3+ Sim Sim (+) 18 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 19 D 4+ Natildeo Natildeo 3+ 20 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 21 C 3+ Sim Sim 4+ 22 C 3+ Sim Sim 4+ 23 C 3+ Sim Sim 4+ 24 K 4+ Natildeo Sim 4+ 25 D 3+ Natildeo Natildeo Negativo 26 E 4+ Sim Sim Negativo 27 S 3+ Sim Sim 3+ 28 C 3+ Sim Natildeo 4+ 29 C 3+ Sim Sim 4+ 30 C 3+ Sim Sim 4+ 31 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 32 E 3+ Sim Sim Negativo 33 C 3+ Sim Natildeo 4+ 34 S 3+ Sim Sim Negativo 35 S 3+ Sim Sim Negativo 36 C 4+ Sim Natildeo 4+ 37 c 4+ Natildeo Natildeo 4+ 38 D 4+ Natildeo Sim 4+ 39 S 3+ Sim Sim 3+ 40 c 4+ Sim Natildeo 2+ 41 C 4+ Sim Natildeo 4+ 42 E 3+ Sim Sim Negativo 43 D 3+ Natildeo Sim 2+ 44 D 3+ Natildeo Sim 2+ 45 E 3+ Sim Sim Negativo 46 C 3+ Sim Sim 4+ 47 K 4+ Natildeo Natildeo 4+ 48 D 3+ Natildeo Sim 2+ 49 E 3+ Sim Sim Negativo 50 K 4+ Natildeo Sim 4+
TOTAL 50 28 33 41
38
Figura 10 ndash TDA monoespeciacutefico da amostra de paciente Hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo da classe
IgG
oacute Figura 11 ndash TDA apoacutes o tratamento com glicina-aacutecidaEDTA (esquerda) e cloroquina (direita) A glicina
negativou completamente o TDA enquanto a hemaacutecia tratada com cloroquina persistiu positiva (1+)
39
Figura 12 ndash Fenotipagem da amostra tratada com glicina-aacutecidaEDTA Fy(a+b+) Jk(a-b+) S+s+
Figura 13 ndash Painel em gel (LissAGH) do eluato apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de
intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
Figura 14 ndash ndash Painel ezimaacutetico (hemaacutecias tratadas com bromelina) do eluato em gel neutro apoacutes
tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
40
528 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Quanto a efetividade das teacutecnicas em negativar o TDA foi verificado que a glicina-
aacutecidaEDTA foi efetiva em 66 das amostras testadas no primeiro tratamento (3350
amostras) enquanto a cloroquina conseguiu negativar 56 (2850) Esses resultados natildeo
apresentam diferenccedila significativa (pgt005) demostrando que a teacutecnica da glicina-
aacutecidaEDTA natildeo eacute superior mas eacute tatildeo efetiva quanto a da cloroquina
Quando aliamos os resultados de ambas as teacutecnicas verificamos que em 76 (3850)
das amostras o TDA foi negativado Esse dado indica que ainda que uma teacutecnica natildeo seja
eficaz na remoccedilatildeo do anticorpo eacute uma boa alternativa tentar a segunda teacutecnica jaacute que a falha
em remover o anticorpo utilizando uma delas natildeo prevecirc necessariamente a falha com a outra
Quando se utiliza o teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla (graacutefico 2) para comparar a utilizaccedilatildeo das
duas teacutecnicas com o resultado de cada uma isolada (somente a cloroquina ou somente a
glicina) verificamos que os resultados apresentam diferenccedila significativa (plt005) (quadro 3)
TRATAMENTO EFETIVO COM TOTAL PORCENTAGEM
Glicina ou cloroquina 38 76
Glicina e cloroquina 23 46
Glicina apenas 10 20
Cloroquina apenas 5 10
Nenhuma das teacutecnicas 12 24
Quadro 3 - Resultados comparativos entre as teacutecnicas utilizadas
41
Graacutefico 2 - Teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla entre as teacutecnicas aplicadas A- Glicina e Cloroquina B-Cloroquina C-
Glicina ( plt005)
42
6 DISCUSSAtildeO
Os reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA podem ser adquiridos em
forma de kit comercial prontos para uso poreacutem natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil A preparaccedilatildeo
dos reagentes ldquoin houserdquo a partir de sais comerciais adquiridos se mostrou viaacutevel Os
reagentes glicina e o tampatildeo Tris armazenados de forma correta se mantiveram estaacuteveis por
um periacuteodo de 7 meses Somente o reagente EDTA precipitou mesmo armazenado em
condiccedilotildees adequadas sugerindo que o mesmo deve ser preparado em menor quantidade e
armazenado em aliacutequotas A soluccedilatildeo de cloroquina tambeacutem pode ser preparada ldquoin houserdquo e
pode ser armazenado por um mecircs A legislaccedilatildeo brasileira autoriza a utilizaccedilatildeo de reagentes
preparados a partir de sais comerciais como a cloroquina e a glicina-aacutecidaEDTA desde que
os sais tenham autorizaccedilatildeo da vigilacircncia sanitaacuteria para a comercializaccedilatildeo (BRASIL 2001)
A comparaccedilatildeo quanto a efetividade em dissociar anticorpos em amostras com TDA
positivos entre a teacutecnica da glicina e a teacutecnica da cloroquina mostrou que natildeo haacute diferenccedila
estatiacutestica entre elas e que ambas satildeo igualmente eficientes Se utilizadas conjuntamente haacute
maior possibilidade de elucidaccedilatildeo dos casos
Uma vantagem da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eacute que ela permite numa mesma
amostra eluir o anticorpo ligado aacute hemaacutecia assim como fenotipar a hemaacutecia tratada Devido a
sua dupla utilidade a teacutecnica eacute vantajosa principalmente em pacientes em que pouco volume
de amostra pode ser coletado como em casos de crianccedilas e receacutem-nascidos
A fenotipagem poacutes tratamento se mostrou viaacutevel jaacute que os antiacutegenos de maior
importacircncia natildeo sofreram alteraccedilotildees Nas 20 amostras que foram fenotipadas antes e apoacutes
tratamento para verificar a influecircncia dos reagentes na expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a
Jkb S e s natildeo houve destruiccedilatildeo dos mesmos por nenhuma das duas teacutecnicas
Para as amostras positivas para o antiacutegeno Kell (350) e sensibilizadas com o
respectivo anticorpo a teacutecnica da glicina foi efetiva em negativar o TDA em apenas duas
delas mas apoacutes o tratamento foi verificada uma fraca reatividade da reaccedilatildeo antiacutegeno-
anticorpo sugerindo que houve um enfraquecimento da expressatildeo do antiacutegeno conforme
esperado e descrito na literatura (BYRNE 1991 PALLAS WILER E MCGEE 1991
ROZIERS e SQUALI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012 e KATHARIA e
CHAUDHARY 2013) A accedilatildeo da glicina sobre o antigeno Kell natildeo representa impedimento
para seu uso uma vez que na impossibilidade de testar o antiacutegeno Kell o banco de sangue
consegue facilmente atender a solicitaccedilatildeo de transfusatildeo com unidades de hemaacutecias Kell
43
negativas jaacute que eacute um antiacutegeno de baixa prevalecircncia na populaccedilatildeo variando de 15 na
populaccedilatildeo africana a 9 nos europeus (DANIELS 2011)
A soluccedilatildeo resultante da dissociaccedilatildeo do anticorpo pela teacutecnica da glicina pode ainda ser
utilizada como eluato podendo substituir a teacutecnica de eluiccedilatildeo com reagentes comercias (kits
de eluiccedilatildeo aacutecida) que tem alto custo aproximadamente entre R$2000 a R$2500 por teste
Em 41 amostras (82) houve a dissociaccedilatildeo e recuperaccedilatildeo do anticorpo que estava
sensibilizando as hemaacutecias Em 9 amostras (18) os anticorpos foram eluiacutedos poreacutem
apresentaram reaccedilatildeo negativa quando testadas com hemaacutecias de triagem entre eles o anti-E
(6) anti-S (2) e Anti-D (1) Eacute possiacutevel que a correccedilatildeo pH do meio (WALKER 2011) natildeo
tenha sido adequada o que pode ter desfavorecido a reatividade do anticorpo
Para as amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA nas quais natildeo houve dissociaccedilatildeo do
anticorpo pelo primeiro tratamento (1750) o segundo tratamento natildeo se mostrou eficaz jaacute
que 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise O tempo de
armazenagem natildeo parece ter influenciado jaacute que todas as amostras foram testadas dentro de
48 horas apoacutes a coleta Outros fatores que natildeo foram verificados podem ter levado a
hemoacutelise Apesar da literatura (LOUIE JIENG e ZEROULIS 1986 e BYRNE 1991)
recomendar um segundo tratamento ele eacute pouco eficaz tendo negativado apenas 3 das 17
amostras testadas
A amostra de paciente que apresentou sensibilizaccedilatildeo ldquoin vivordquo mostrou melhor
efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA sobre a da cloroquina possibilitando
fenotipagem para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s que natildeo foram destruiacutedos apoacutes o
tratamento comprovado atraveacutes da genotipagem
A presenccedila de autoanticorpo a quente com presenccedila de hemoacutelise (AHAI) ou natildeo pode
mascarar a presenccedila de aloanticorpo interferindo na rotina soroloacutegica da fenotipagem que eacute
uma importante ferramenta para auxiliar na seleccedilatildeo de hemaacutecias para transfusatildeo (SHIREY et
al 2002) Esses pacientes frequentemente possuem aloanticorpos associados ao
autoanticorpo e a prevalecircncia de aloimunizaccedilatildeo entre eles varia entre 12 a 40 (LEGER e
GARRATY 1999 BRANCH e PETZ 1999) o que dificulta ainda mais a escolha do melhor
componente a ser transfundido aleacutem de aumentar a possibilidade reaccedilotildees hemoliacuteticas imunes
poacutes-transfusionais
Nesses casos as teacutecnicas de dissociaccedilatildeo de anticorpos satildeo importantes para tratar
amostras de pacientes e a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser usada como uma opccedilatildeo
pois se mostrou eficaz na dissociaccedilatildeo anticorpo ligado agraves hemaacutecias deixando livre a
superfiacutecie das mesmas permitindo a fenotipagem por antisoros IgG Paralelamente os
44
anticorpos eluiacutedos tambeacutem puderam ser estudados O mesmo natildeo ocorre com a cloroquina
que permite apenas a fenotipagem e tampouco com os kits de eluiccedilatildeo aacutecida disponiacuteveis no
mercado nacional que satildeo destinados a realizaccedilatildeo do eluato mas destroem as hemaacutecias
O tempo de tratamento na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA tambeacutem eacute uma vantagem
pois foi possiacutevel reproduzir no tempo determinado de 2 minutos enquanto a cloroquina
demora ateacute duas horas
Ainda que a aplicaccedilatildeo das teacutecnicas por biologia molecular estejam cada vez mais
presentes na rotina imuno-hematoloacutegica e possibilitam estabelecer o fenoacutetipo deduzido do
genoacutetipo elas natildeo estatildeo disponiacuteveis na maioria dos centros e sua realizaccedilatildeo exige algumas
horas A resoluccedilatildeo imediata do problema transfusional necessita dos resultados soroloacutegicos
pois com frequecircncia natildeo eacute possiacutevel aguardar o resultado do teste molecular Dessa forma
apesar da crescente importacircncia da genotipagem eritrocitaacuteria teacutecnicas soroloacutegicas aplicadas
corretamente e no momento propiacutecio satildeo de grande utilidade para resolver problemas imuno-
hematoloacutegicos como ocorre com a fenotipagem em pacientes com TDA positivo
45
7 CONCLUSAtildeO
A teacutecnica da glicina aacutecidaEDTA mostrou-se efetiva em remover os anticorpos que
sensibilizavam as hemaacutecias e pode ser utilizada com seguranccedila antes da fenotipagem
eritrocitaacuteria Por ser uma teacutecnica de raacutepida execuccedilatildeo eacute uma alternativa aplicaacutevel
principalmente em casos urgentes de pacientes que apresentam autoanticorpos
46
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50
9 ANEXOS
51
FUNDACcedilAtildeO HEMOCENTRO DE RIBEIRAtildeO PRETO
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE)
Tiacutetulo da pesquisa Aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina aacutecida-EDTA e avaliaccedilatildeo da
eficaacutecia no tratamento de hemaacutecias com teste direto da antiglobulina positivo
Pesquisadora responsaacutevel Ceacutelia Kazue Abiko
Orientador Prof Dimas Tadeu Covas
Co-orientadora Dra Flaacutevia Leite Souza Santos
Objetivo da pesquisa Vocecirc estaacute sendo convidado a participar de uma pesquisa que tem
como objetivo padronizar uma nova teacutecnica para auxiliar na tipagem sanguiacutenea de pacientes
A tipagem sanguiacutenea pode sofrer interferecircncia da presenccedila de anticorpos ligados aos gloacutebulos
vermelhos do sangue Nessas situaccedilotildees eacute difiacutecil selecionar o melhor sangue para o paciente e
eacute preciso a utilizaccedilatildeo de teacutecnicas adicionais para remover essas interferecircncias
Esta pesquisa tem como objetivo estudar outra teacutecnica para remover esses anticorpos e
comparaacute-la com a teacutecnica atualmente utilizada Para isso precisamos de amostras de pacientes
e doadores voluntaacuterios
Se vocecirc eacute um doador eacute necessaacuterio que vocecirc autorize a coleta de 5 ml (1 tubo) a mais
de seu sangue
Se vocecirc eacute um paciente natildeo haveraacute necessidade de nova amostra pois utilizaremos as
amostras jaacute coletadas para os testes preacute-transfusionais e os resultados encontrados nesta
pesquisa natildeo iratildeo interferir na escolha da (s) bolsa (s) de sangue que vocecirc possa vir a receber
Se vocecirc concordar em participar leia com atenccedilatildeo o texto abaixo e assine as duas vias
rubricando todas as paacuteginas deste termo de consentimento Uma via original assinada e
rubricada por vocecirc e pela pesquisadora ficaraacute com vocecirc
As suas informaccedilotildees seratildeo mantidas em sigilo pela pesquisadora e natildeo haveraacute
armazenamento de material para pesquisas posteriores Os seus dados seratildeo usados apenas
neste estudo e quando o trabalho for publicado seu nome e qualquer outra informaccedilatildeo que
possam identificaacute-lo natildeo seratildeo revelados
Eacute pouco provaacutevel que o que noacutes aprendermos com este estudo tenha um benefiacutecio
direto para vocecirc assim como natildeo poderemos dar nada em troca pela sua participaccedilatildeo na
pesquisa
Nosso objetivo com esta pesquisa eacute que os resultados poderatildeo ser uacuteteis para o
tratamento de pacientes no futuro Os riscos da participaccedilatildeo satildeo miacutenimos Se vocecirc eacute um
doador de sangue a amostra seraacute coletada no momento da doaccedilatildeo natildeo exigindo punccedilatildeo
venosa adicional
52
Eacute seu direito ter acesso aos resultados dos testes da pesquisa Esses resultados natildeo
seratildeo fornecidos automaticamente a vocecirc mas caso vocecirc se interesse em saber o resultado ou
tiver alguma duacutevida sobre a sua participaccedilatildeo neste estudo deveraacute entrar em contato com Ceacutelia
Kazue Abiko pelo telefone (18) 99718-3551
Vocecirc tem total liberdade de optar por natildeo participar da pesquisa Caso aceite
participar poderaacute desistir a qualquer momento ou retirar seu consentimento mesmo apoacutes ter
coletado o sangue Para cancelar sua participaccedilatildeo basta avisar a pesquisadora e os seus dados
seratildeo retirados do projeto
Qualquer duacutevida eacutetica sobre a pesquisa poderaacute entrar em contato com o Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa do Hospital das Cliacutenicas e da Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto
(CAMPUS UNIVERSITAacuteRIO bairro Monte Alegre CEP 14048-900 Ribeiratildeo Preto-SP
Telefone (16) 3602-2228 FAX (16) 3633-1144 e-mail cephcrpuspbr)
Consentimento de participaccedilatildeo
A Consentimento do participante
Li as informaccedilotildees acima sobre o estudo e recebi explicaccedilotildees sobre a participaccedilatildeo no estudo
Portanto dou o meu consentimento para participar do estudo
___________________________________________________________________________
Nome completo
___________________________________________________________________________
Assinatura
___________
Data
__________________________________________________________________________________
Nome completo da pesquisadora
___________________________________________________________________________
Assinatura
_____________
Data
28
5 RESULTADOS
51 REAGENTES
Para aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA satildeo necessaacuterios 3 diferentes
reagentes que podem ser encontrados em forma de kit pronto para uso No entanto esses kits
natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil Os reagentes satildeo tampatildeo glicina-aacutecida o EDTA e o tampatildeo
Tris
Todos os reagentes foram preparados rdquoin houserdquo a partir dos sais e soluccedilotildees PA (puro
para anaacutelise) da marca SYNTH que foram adquiridos para a pesquisa O custo estimado para
cada teste foi aproximadamente R$ 020 reais
Apoacutes o preparo os reagentes poderiam ser armazenados em condiccedilotildees adequadas pelo
periacuteodo de 1 ano (AABB 2011) Ao final do preparo e durante o periacuteodo de armazenamento
de fevereiro a setembro de 2016 foi realizada inspeccedilatildeo visual para verificar a presenccedila de
precipitados ou turvaccedilatildeo A soluccedilatildeo de glicina e o tampatildeo TRIS mostraram-se estaacuteveis ateacute o
final do periacuteodo Por sua vez o reagente EDTA precipitou mesmo estando armazenado em
temperatura ambiente controlada e foi necessaacuterio novo preparo
52 AMOSTRAS DE DOADORES
521 SENSIBILIZACcedilAtildeO DAS AMOSTRAS
Apoacutes incubaccedilatildeo da hemaacutecia com o antissoro a mesma foi lavada 4 vezes para retirada
dos anticorpos livres A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada Caso houvesse positividade na
soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem a etapa era repetida (figura 3) Das 50 amostras sensibilizadas a
uacuteltima lavagem foi positiva somente em 3 delas Nas 3 amostras o anticorpo utilizado para
sensibilizaccedilatildeo foi o anti-K Apoacutes repetido nova etapa de lavagem os resultados se
apresentaram negativos
Em todas as amostras sensibilizadas ldquoin vitrordquo o TDA foi testado e verificado a
intensidade do teste Entre as 50 amostras 47 alcanccedilaram TDA com intensidade 3-4+ apoacutes a
primeira sensibilizaccedilatildeo enquanto 3 amostras necessitaram uma segunda incubaccedilatildeo com
anticorpo (figura 4)
A escolha dos anticorpos para sensibilizar as hemaacutecias foi feita de acordo com o
fenoacutetipo do doador e foram utilizados sete diferentes especificidades de anticorpos policlonais
humanos conforme mostra o graacutefico1
29
Figura 3 - Soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada com hemaacutecia de triagem de
anticorpos em gel LissCoombs (BIO-RAD) A finalidade eacute verificar a presenccedila de anticorpos livres na
suspensatildeo que possam interferir na pesquisa do eluato As soluccedilotildees de lavagem das amostras na figura a tiveram
resultados negativos Na figura b duas amostras a 47 e 50 apresentaram resultado positivo Nova etapa de
lavagem foi realizada e o resultado final foi negativo
522 TRATAMENTO DAS HEMAacuteCIAS
Apoacutes a sensibilizaccedilatildeo e obtenccedilatildeo de resultados de TDA com intensidade de 3 a 4+
cada uma das amostras foi dividida em duas aliacutequotas e tratada separadamente pelas teacutecnicas
de glicinaaacutecida-EDTA e cloroquina
As teacutecnicas foram consideradas efetivas quando obteve-se a completa dissociaccedilatildeo do
anticorpo verificada atraveacutes do TDA negativo na amostra poacutes tratamento conforme figuras 5
e 6 Dentre as amostras tratadas com cloroquina 2850 tiveram o TDA negativado A glicina-
aacutecidaEDTA negativou o TDA em 33 das 50 amostras tratadas Apenas 17 amostras tratadas
com glicina-aacutecidaEDTA permaneceram com o TDA positivo e foram submetidas a um novo
tratamento
30
Figura 4 - TDA das amostras apoacutes sensibilizaccedilatildeo com anticorpos policlonais humanos Amostras na
figura a com intensidades de 3-4+ Na figura b amostras 4 e 7 com intensidade menor que 3+ e portanto foram
novamente sensibilizadas com nova aliacutequota de soro Anti-D e anti-S Apoacutes a segunda sensibilizaccedilatildeo
apresentaram reatividade 4 e 3+ respectivamente Os anticorpos utilizados para sensibilizaccedilatildeo foram D S c E
C e K
523 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS TEacuteCNICAS
No tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA houve dissociaccedilatildeo completa do anticorpo
em 33 amostras (66) das 50 amostras testadas enquanto que com a cloroquina foram 28
amostras (56) (tabela 1)
31
Graacutefico 1- Nuacutemero de amostras sesnsibilizadas por especificidade de anticorpo Entre as 50 amostras 12
foram sensibilizadas com anti-D 10 com anti-C 9 com anti-E 8 com anti-c 7 com anti-S 3 com anti-K e 1
com anti-Dia As especificidades dos anticorpos foram definidas de acordo o fenoacutetipo do doador
Figura 5 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com cloroquina Nas amostras onde houve
a dissociaccedilatildeo do anticorpo ( 2 21 a 23 26 39 a 42 45 46 e 49) a hemaacutecia se deposita no fundo no microtubo
apoacutes a centrifugaccedilatildeo (TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (1 3 24 25 43 44 47
48 e 50) o anticorpo ligado agraves hemaacutecias eacute alvo da AGH presente no gel (TDA positivo)
Anti-D 12
Anti-C 10
Anti-E 9
Anti-c 8
Anti-S 7
Anti-K 3 Anti-Dia 1
32
Figura 6 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA Nas amostras
onde houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo (4 6 7 12 a 15 17 34 35 37 e 38) a hemaacutecia se deposita no fundo no
microtubo apoacutes a centrifugaccedilatildeo ( TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (5 16 18
19 20 33 e 36 ) o AGH presente no gel se liga ao anticorpo ligado agraves hemaacutecias que ficam retidas no gel (TDA
positivo)
Tabela 1-Resultado geral do tratamento das hemaacutecias com glicina e cloroquina
Teacutecnica utilizada TDA negativo TDA positivo Total
Glicina-aacutecidaEDTA 33 17 50
Cloroquina 28 22 50
A glicina-aacutecidaEDTA conseguiu negativar mais amostras sensibilizadas com Anti-D
e anti-K que a cloroquina Para as hemaacutecias sensibilizadas com anti-E Anti-S e Anti-Dia
ambas as teacutecnicas dissociaram o anticorpo em 100 das amostras Os resultados detalhados
por especificidade do anticorpo apoacutes o primeiro tratamento com glicina-aacutecidaEDTA e com
cloroquina estatildeo na tabela 2
Para as amostras que permaneceram positivas (17 amostras) apoacutes o tratamento com a
glicina-aacutecidaEDTA foi realizado um novo tratamento Houve dissociaccedilatildeo do anticorpo em 3
amostras (18) apoacutes a segunda tentativa Nas demais 14 (82) amostras tratadas pela
segunda vez 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise
33
Tabela 2 - Resultados do TDA apoacutes tratamento das hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo
sensibilizado
ANTICORPOS
SENSIBILIZADOS
1ordm TRATAMENTO COM
GLICINA
TRATAMENTO COM
CLOROQUINA
TOTAL TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
Anti-D 8 4 0 12 12
Anti-C 6 4 10 0 10
Anti-E 9 0 9 0 9
Anti-c 0 8 1 7 8
Anti-S 7 0 7 0 7
Anti-K 2 1 0 3 3
Anti-Dia 1 0 1 0 1
TOTAL 33 17 28 22 50
A hemoacutelise foi verificada durante o procedimento de lavagem final das hemaacutecias com
soluccedilatildeo fisioloacutegica para a retirada dos reagentes As soluccedilotildees de lavagem ficaram
avermelhadas e as hemaacutecias com coloraccedilatildeo escura As amostras foram descartadas Dentre as
6 amostras que ainda puderam ser testadas para o TDA trecircs amostras negativaram sendo 1
sensibilizada com anti-D e 2 com anti-C (tabela 3)
Tabela 3 - Resultado apoacutes o segundo tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA
Tratamento com
glicina-aacutecidaEDTA
TDA Negativo TDA Positvo Hemoacutelise Total
Segundo tratamento 3 3 11 17
524 TESTAGEM DO ELUATO
Apoacutes o tratamento com a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA a soluccedilatildeo do eluato foi
testada para verificar a viabilidade dos anticorpos que foram dissociados ou eluiacutedos Dentre
as 50 amostras 41 apresentaram eluato positivo As nove amostras cujos eluatos foram
negativos haviam sido sensibilizadas com as seguintes especificidades de anticorpos anti-E 6
amostras (67) anti-S 2 amostras (40) e anti-D 1 amostra (8) (tabela 4) O eluato de
todas as amostras sensibilizadas com os anticorpos anti-C anti-c Anti-K e Anti-Dia foram
positivos Os eluatos positivos na triagem de anticorpos foram testados com paineacuteis de
identificaccedilatildeo para confirmar a especificidade e a viabilidade dos anticorpos (figuras 7 e 8)
34
525 EFEITO DA ELUICcedilAtildeO SOBRE OS ANTIacuteGENOS ERITROCITAacuteRIOS
Para verificar o efeito do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA e com a cloroquina
sobre a expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s foi realizada a fenotipagem das
amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes tratamento com ambas as teacutecnicas Foi avaliado
se o tratamento destruiu os antiacutegenos expressos antes do tratamento
Tabela 4- Resultado do Eluato das amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA
Anticorpos Eluato positvo Eluato negativo Total
Anti-D 11 1 12
Anti-C 10 0 10
Anti-E 3 6 9
Anti-c 8 0 8
Anti-S 5 2 7
Anti-K 3 0 3
Anti-Dia 1 0 1
Total 41 9 50
Figura 7 ndash Painel do eluato da amostra 21 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-C que foi
recuperado no eluato
Figura 8 ndash Painel do eluato da amostra 47 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-K que foi
recuperado no eluato
35
Dentre as 50 amostras 26 eram previamente fenotipadas para os antiacutegenos Fya Fy
b
Jka Jk
b S e s Dentre elas 20 alcanccedilaram TDA negativo apoacutes tratamento com a glicina-
aacutecidaEDTA e 20 negativaram apoacutes tratamento com cloroquina (tabela 5) Apoacutes ambas as
teacutecnicas os antiacutegenos originalmente expressos permaneceram positivos comprovando que natildeo
houve destruiccedilatildeo dos mesmos
Tabela 5 ndash Verificaccedilatildeo da interferecircncia do tratamento da hemaacutecias com cloroquina e glicina-
aacuteicdaEDTA sobre os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
AMOSTRAS
COM
FENOTIPAGEM
PREacuteVIA
TRATADAS COM
CLOROQUINA
TRATADAS COM
GLICINA
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
26
20
20
20
20
As amostras 24 47 e 50 eram positivas para o antiacutegeno K A cloroquina natildeo dissociou
o anticorpo em nenhuma das 3 amostras enquanto a glicina-aacutecidaEDTA foi efetiva nas
amostras 24 e 50 Foi testada a expressatildeo do antiacutegeno K nas amostras 24 e 50 apoacutes o
tratamento utilizando meacutetodo indireto em gel contendo AGH Apesar de natildeo ter sido avaliado
a intensidade de reaccedilatildeo de expressatildeo dos antiacutegenos podemos verificar na figura 9 que nas
duas amostras em que a teacutecnica foi efetiva e dissociou o anticorpo a expressatildeo do antiacutegeno K
continua presente mas a reatividade observada pode ser considerada 1+ sugerindo que houve
diminuiccedilatildeo da expressatildeo do antiacutegeno quando comparado com a expressatildeo observada em
hemaacutecia natildeo tratada
Os resultados individuais de cada amostra em ambas as teacutecnicas encontram-se
resumidas na tabela 6
526 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente onde foi constatada a presenccedila de autoanticorpo
a quente da classe IgG pelo TDA monoespeciacutefico (figura 10)O autoanticorpo tambeacutem
interferia na pesquisa e identificaccedilatildeo de anticorpos irregulares pois apresentava caracteriacutestica
de panaglutinina As hemaacutecias da paciente sensibilizadas ldquoin vivordquo foram tratadas com
cloroquina e com glicina-aacutecidaEDTA
36
Figura 9 ndash Fenotipagem das amostras 24 e 50 para antiacutegeno K apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
O teste positivo indica a presenccedila do antiacutegeno poreacutem a reatividade fraca (1+) sugere que houve enfraquecimento
de sua expressatildeo A direita a expressatildeo forte (4+) do antiacutegeno Kell em hemaacutecia controle natildeo tratada utilizada
como controle positivo
A cloroquina natildeo foi efetiva na retirada do anticorpo ligado as hemaacutecias ao contraacuterio
do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA que dissociou o anticorpo (figura 11)
A hemaacutecia tratada com glicina foi fenotipada para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
(figura 12) A fenotipagem para o sistema Rh (C c E e e) e Kell foi realizada em gel
especiacutefico monoclonal sem interferecircncia do TDA positivo (controle da reaccedilatildeo negativo)
O eluato resultante do tratamento com glicina-aacutecidaEDTA foi testada em gel com
hemaacutecias de painel de identificaccedilatildeo de anticorpos e apresentou resultado positivo com todas
as ceacutelulas (figura 13 e 14)
A amostra foi enviada para genotipagem e o resultado da genotipagem confirmou o
resultado da fenotipagem apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
527 TEMPO DE EXECUCcedilAtildeO DA TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
O tempo de reaccedilatildeo da glicina-aacutecidaEDTA eacute de 2 minutos Todas as amostras foram
tratadas obedecendo ao tempo descrito na literatura demonstrando que o mesmo eacute
reprodutiacutevel
37
Tabela 6- Resultados individuais por amostra
Amostra Especificidade
dos anticorpos
Intensidade do
TDA apoacutes
sensibilizaccedilatildeo
Tratamento
efetivo com
cloroquina
Tratamento
efetivo com
glicina
Eluato
poacutes
glicina
1 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 2 Dia 3+ Sim Sim 3+ 3 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 4 D 4+ Natildeo Sim 4+ 5 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 6 E 3+ Sim Sim Negativo 7 S 4+ Sim Sim 3+ 8 E 3+ Sim Sim 1+ 9 E 3+ Sim Sim 2+
10 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 11 D 4+ Natildeo Sim 4+ 12 D 4+ Natildeo Sim 4+ 13 S 3+ Sim Sim 3+ 14 S 3+ Sim Sim 3+ 15 D 3+ Natildeo Sim 3+ 16 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 17 E 3+ Sim Sim (+) 18 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 19 D 4+ Natildeo Natildeo 3+ 20 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 21 C 3+ Sim Sim 4+ 22 C 3+ Sim Sim 4+ 23 C 3+ Sim Sim 4+ 24 K 4+ Natildeo Sim 4+ 25 D 3+ Natildeo Natildeo Negativo 26 E 4+ Sim Sim Negativo 27 S 3+ Sim Sim 3+ 28 C 3+ Sim Natildeo 4+ 29 C 3+ Sim Sim 4+ 30 C 3+ Sim Sim 4+ 31 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 32 E 3+ Sim Sim Negativo 33 C 3+ Sim Natildeo 4+ 34 S 3+ Sim Sim Negativo 35 S 3+ Sim Sim Negativo 36 C 4+ Sim Natildeo 4+ 37 c 4+ Natildeo Natildeo 4+ 38 D 4+ Natildeo Sim 4+ 39 S 3+ Sim Sim 3+ 40 c 4+ Sim Natildeo 2+ 41 C 4+ Sim Natildeo 4+ 42 E 3+ Sim Sim Negativo 43 D 3+ Natildeo Sim 2+ 44 D 3+ Natildeo Sim 2+ 45 E 3+ Sim Sim Negativo 46 C 3+ Sim Sim 4+ 47 K 4+ Natildeo Natildeo 4+ 48 D 3+ Natildeo Sim 2+ 49 E 3+ Sim Sim Negativo 50 K 4+ Natildeo Sim 4+
TOTAL 50 28 33 41
38
Figura 10 ndash TDA monoespeciacutefico da amostra de paciente Hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo da classe
IgG
oacute Figura 11 ndash TDA apoacutes o tratamento com glicina-aacutecidaEDTA (esquerda) e cloroquina (direita) A glicina
negativou completamente o TDA enquanto a hemaacutecia tratada com cloroquina persistiu positiva (1+)
39
Figura 12 ndash Fenotipagem da amostra tratada com glicina-aacutecidaEDTA Fy(a+b+) Jk(a-b+) S+s+
Figura 13 ndash Painel em gel (LissAGH) do eluato apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de
intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
Figura 14 ndash ndash Painel ezimaacutetico (hemaacutecias tratadas com bromelina) do eluato em gel neutro apoacutes
tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
40
528 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Quanto a efetividade das teacutecnicas em negativar o TDA foi verificado que a glicina-
aacutecidaEDTA foi efetiva em 66 das amostras testadas no primeiro tratamento (3350
amostras) enquanto a cloroquina conseguiu negativar 56 (2850) Esses resultados natildeo
apresentam diferenccedila significativa (pgt005) demostrando que a teacutecnica da glicina-
aacutecidaEDTA natildeo eacute superior mas eacute tatildeo efetiva quanto a da cloroquina
Quando aliamos os resultados de ambas as teacutecnicas verificamos que em 76 (3850)
das amostras o TDA foi negativado Esse dado indica que ainda que uma teacutecnica natildeo seja
eficaz na remoccedilatildeo do anticorpo eacute uma boa alternativa tentar a segunda teacutecnica jaacute que a falha
em remover o anticorpo utilizando uma delas natildeo prevecirc necessariamente a falha com a outra
Quando se utiliza o teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla (graacutefico 2) para comparar a utilizaccedilatildeo das
duas teacutecnicas com o resultado de cada uma isolada (somente a cloroquina ou somente a
glicina) verificamos que os resultados apresentam diferenccedila significativa (plt005) (quadro 3)
TRATAMENTO EFETIVO COM TOTAL PORCENTAGEM
Glicina ou cloroquina 38 76
Glicina e cloroquina 23 46
Glicina apenas 10 20
Cloroquina apenas 5 10
Nenhuma das teacutecnicas 12 24
Quadro 3 - Resultados comparativos entre as teacutecnicas utilizadas
41
Graacutefico 2 - Teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla entre as teacutecnicas aplicadas A- Glicina e Cloroquina B-Cloroquina C-
Glicina ( plt005)
42
6 DISCUSSAtildeO
Os reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA podem ser adquiridos em
forma de kit comercial prontos para uso poreacutem natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil A preparaccedilatildeo
dos reagentes ldquoin houserdquo a partir de sais comerciais adquiridos se mostrou viaacutevel Os
reagentes glicina e o tampatildeo Tris armazenados de forma correta se mantiveram estaacuteveis por
um periacuteodo de 7 meses Somente o reagente EDTA precipitou mesmo armazenado em
condiccedilotildees adequadas sugerindo que o mesmo deve ser preparado em menor quantidade e
armazenado em aliacutequotas A soluccedilatildeo de cloroquina tambeacutem pode ser preparada ldquoin houserdquo e
pode ser armazenado por um mecircs A legislaccedilatildeo brasileira autoriza a utilizaccedilatildeo de reagentes
preparados a partir de sais comerciais como a cloroquina e a glicina-aacutecidaEDTA desde que
os sais tenham autorizaccedilatildeo da vigilacircncia sanitaacuteria para a comercializaccedilatildeo (BRASIL 2001)
A comparaccedilatildeo quanto a efetividade em dissociar anticorpos em amostras com TDA
positivos entre a teacutecnica da glicina e a teacutecnica da cloroquina mostrou que natildeo haacute diferenccedila
estatiacutestica entre elas e que ambas satildeo igualmente eficientes Se utilizadas conjuntamente haacute
maior possibilidade de elucidaccedilatildeo dos casos
Uma vantagem da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eacute que ela permite numa mesma
amostra eluir o anticorpo ligado aacute hemaacutecia assim como fenotipar a hemaacutecia tratada Devido a
sua dupla utilidade a teacutecnica eacute vantajosa principalmente em pacientes em que pouco volume
de amostra pode ser coletado como em casos de crianccedilas e receacutem-nascidos
A fenotipagem poacutes tratamento se mostrou viaacutevel jaacute que os antiacutegenos de maior
importacircncia natildeo sofreram alteraccedilotildees Nas 20 amostras que foram fenotipadas antes e apoacutes
tratamento para verificar a influecircncia dos reagentes na expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a
Jkb S e s natildeo houve destruiccedilatildeo dos mesmos por nenhuma das duas teacutecnicas
Para as amostras positivas para o antiacutegeno Kell (350) e sensibilizadas com o
respectivo anticorpo a teacutecnica da glicina foi efetiva em negativar o TDA em apenas duas
delas mas apoacutes o tratamento foi verificada uma fraca reatividade da reaccedilatildeo antiacutegeno-
anticorpo sugerindo que houve um enfraquecimento da expressatildeo do antiacutegeno conforme
esperado e descrito na literatura (BYRNE 1991 PALLAS WILER E MCGEE 1991
ROZIERS e SQUALI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012 e KATHARIA e
CHAUDHARY 2013) A accedilatildeo da glicina sobre o antigeno Kell natildeo representa impedimento
para seu uso uma vez que na impossibilidade de testar o antiacutegeno Kell o banco de sangue
consegue facilmente atender a solicitaccedilatildeo de transfusatildeo com unidades de hemaacutecias Kell
43
negativas jaacute que eacute um antiacutegeno de baixa prevalecircncia na populaccedilatildeo variando de 15 na
populaccedilatildeo africana a 9 nos europeus (DANIELS 2011)
A soluccedilatildeo resultante da dissociaccedilatildeo do anticorpo pela teacutecnica da glicina pode ainda ser
utilizada como eluato podendo substituir a teacutecnica de eluiccedilatildeo com reagentes comercias (kits
de eluiccedilatildeo aacutecida) que tem alto custo aproximadamente entre R$2000 a R$2500 por teste
Em 41 amostras (82) houve a dissociaccedilatildeo e recuperaccedilatildeo do anticorpo que estava
sensibilizando as hemaacutecias Em 9 amostras (18) os anticorpos foram eluiacutedos poreacutem
apresentaram reaccedilatildeo negativa quando testadas com hemaacutecias de triagem entre eles o anti-E
(6) anti-S (2) e Anti-D (1) Eacute possiacutevel que a correccedilatildeo pH do meio (WALKER 2011) natildeo
tenha sido adequada o que pode ter desfavorecido a reatividade do anticorpo
Para as amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA nas quais natildeo houve dissociaccedilatildeo do
anticorpo pelo primeiro tratamento (1750) o segundo tratamento natildeo se mostrou eficaz jaacute
que 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise O tempo de
armazenagem natildeo parece ter influenciado jaacute que todas as amostras foram testadas dentro de
48 horas apoacutes a coleta Outros fatores que natildeo foram verificados podem ter levado a
hemoacutelise Apesar da literatura (LOUIE JIENG e ZEROULIS 1986 e BYRNE 1991)
recomendar um segundo tratamento ele eacute pouco eficaz tendo negativado apenas 3 das 17
amostras testadas
A amostra de paciente que apresentou sensibilizaccedilatildeo ldquoin vivordquo mostrou melhor
efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA sobre a da cloroquina possibilitando
fenotipagem para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s que natildeo foram destruiacutedos apoacutes o
tratamento comprovado atraveacutes da genotipagem
A presenccedila de autoanticorpo a quente com presenccedila de hemoacutelise (AHAI) ou natildeo pode
mascarar a presenccedila de aloanticorpo interferindo na rotina soroloacutegica da fenotipagem que eacute
uma importante ferramenta para auxiliar na seleccedilatildeo de hemaacutecias para transfusatildeo (SHIREY et
al 2002) Esses pacientes frequentemente possuem aloanticorpos associados ao
autoanticorpo e a prevalecircncia de aloimunizaccedilatildeo entre eles varia entre 12 a 40 (LEGER e
GARRATY 1999 BRANCH e PETZ 1999) o que dificulta ainda mais a escolha do melhor
componente a ser transfundido aleacutem de aumentar a possibilidade reaccedilotildees hemoliacuteticas imunes
poacutes-transfusionais
Nesses casos as teacutecnicas de dissociaccedilatildeo de anticorpos satildeo importantes para tratar
amostras de pacientes e a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser usada como uma opccedilatildeo
pois se mostrou eficaz na dissociaccedilatildeo anticorpo ligado agraves hemaacutecias deixando livre a
superfiacutecie das mesmas permitindo a fenotipagem por antisoros IgG Paralelamente os
44
anticorpos eluiacutedos tambeacutem puderam ser estudados O mesmo natildeo ocorre com a cloroquina
que permite apenas a fenotipagem e tampouco com os kits de eluiccedilatildeo aacutecida disponiacuteveis no
mercado nacional que satildeo destinados a realizaccedilatildeo do eluato mas destroem as hemaacutecias
O tempo de tratamento na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA tambeacutem eacute uma vantagem
pois foi possiacutevel reproduzir no tempo determinado de 2 minutos enquanto a cloroquina
demora ateacute duas horas
Ainda que a aplicaccedilatildeo das teacutecnicas por biologia molecular estejam cada vez mais
presentes na rotina imuno-hematoloacutegica e possibilitam estabelecer o fenoacutetipo deduzido do
genoacutetipo elas natildeo estatildeo disponiacuteveis na maioria dos centros e sua realizaccedilatildeo exige algumas
horas A resoluccedilatildeo imediata do problema transfusional necessita dos resultados soroloacutegicos
pois com frequecircncia natildeo eacute possiacutevel aguardar o resultado do teste molecular Dessa forma
apesar da crescente importacircncia da genotipagem eritrocitaacuteria teacutecnicas soroloacutegicas aplicadas
corretamente e no momento propiacutecio satildeo de grande utilidade para resolver problemas imuno-
hematoloacutegicos como ocorre com a fenotipagem em pacientes com TDA positivo
45
7 CONCLUSAtildeO
A teacutecnica da glicina aacutecidaEDTA mostrou-se efetiva em remover os anticorpos que
sensibilizavam as hemaacutecias e pode ser utilizada com seguranccedila antes da fenotipagem
eritrocitaacuteria Por ser uma teacutecnica de raacutepida execuccedilatildeo eacute uma alternativa aplicaacutevel
principalmente em casos urgentes de pacientes que apresentam autoanticorpos
46
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50
9 ANEXOS
51
FUNDACcedilAtildeO HEMOCENTRO DE RIBEIRAtildeO PRETO
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE)
Tiacutetulo da pesquisa Aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina aacutecida-EDTA e avaliaccedilatildeo da
eficaacutecia no tratamento de hemaacutecias com teste direto da antiglobulina positivo
Pesquisadora responsaacutevel Ceacutelia Kazue Abiko
Orientador Prof Dimas Tadeu Covas
Co-orientadora Dra Flaacutevia Leite Souza Santos
Objetivo da pesquisa Vocecirc estaacute sendo convidado a participar de uma pesquisa que tem
como objetivo padronizar uma nova teacutecnica para auxiliar na tipagem sanguiacutenea de pacientes
A tipagem sanguiacutenea pode sofrer interferecircncia da presenccedila de anticorpos ligados aos gloacutebulos
vermelhos do sangue Nessas situaccedilotildees eacute difiacutecil selecionar o melhor sangue para o paciente e
eacute preciso a utilizaccedilatildeo de teacutecnicas adicionais para remover essas interferecircncias
Esta pesquisa tem como objetivo estudar outra teacutecnica para remover esses anticorpos e
comparaacute-la com a teacutecnica atualmente utilizada Para isso precisamos de amostras de pacientes
e doadores voluntaacuterios
Se vocecirc eacute um doador eacute necessaacuterio que vocecirc autorize a coleta de 5 ml (1 tubo) a mais
de seu sangue
Se vocecirc eacute um paciente natildeo haveraacute necessidade de nova amostra pois utilizaremos as
amostras jaacute coletadas para os testes preacute-transfusionais e os resultados encontrados nesta
pesquisa natildeo iratildeo interferir na escolha da (s) bolsa (s) de sangue que vocecirc possa vir a receber
Se vocecirc concordar em participar leia com atenccedilatildeo o texto abaixo e assine as duas vias
rubricando todas as paacuteginas deste termo de consentimento Uma via original assinada e
rubricada por vocecirc e pela pesquisadora ficaraacute com vocecirc
As suas informaccedilotildees seratildeo mantidas em sigilo pela pesquisadora e natildeo haveraacute
armazenamento de material para pesquisas posteriores Os seus dados seratildeo usados apenas
neste estudo e quando o trabalho for publicado seu nome e qualquer outra informaccedilatildeo que
possam identificaacute-lo natildeo seratildeo revelados
Eacute pouco provaacutevel que o que noacutes aprendermos com este estudo tenha um benefiacutecio
direto para vocecirc assim como natildeo poderemos dar nada em troca pela sua participaccedilatildeo na
pesquisa
Nosso objetivo com esta pesquisa eacute que os resultados poderatildeo ser uacuteteis para o
tratamento de pacientes no futuro Os riscos da participaccedilatildeo satildeo miacutenimos Se vocecirc eacute um
doador de sangue a amostra seraacute coletada no momento da doaccedilatildeo natildeo exigindo punccedilatildeo
venosa adicional
52
Eacute seu direito ter acesso aos resultados dos testes da pesquisa Esses resultados natildeo
seratildeo fornecidos automaticamente a vocecirc mas caso vocecirc se interesse em saber o resultado ou
tiver alguma duacutevida sobre a sua participaccedilatildeo neste estudo deveraacute entrar em contato com Ceacutelia
Kazue Abiko pelo telefone (18) 99718-3551
Vocecirc tem total liberdade de optar por natildeo participar da pesquisa Caso aceite
participar poderaacute desistir a qualquer momento ou retirar seu consentimento mesmo apoacutes ter
coletado o sangue Para cancelar sua participaccedilatildeo basta avisar a pesquisadora e os seus dados
seratildeo retirados do projeto
Qualquer duacutevida eacutetica sobre a pesquisa poderaacute entrar em contato com o Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa do Hospital das Cliacutenicas e da Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto
(CAMPUS UNIVERSITAacuteRIO bairro Monte Alegre CEP 14048-900 Ribeiratildeo Preto-SP
Telefone (16) 3602-2228 FAX (16) 3633-1144 e-mail cephcrpuspbr)
Consentimento de participaccedilatildeo
A Consentimento do participante
Li as informaccedilotildees acima sobre o estudo e recebi explicaccedilotildees sobre a participaccedilatildeo no estudo
Portanto dou o meu consentimento para participar do estudo
___________________________________________________________________________
Nome completo
___________________________________________________________________________
Assinatura
___________
Data
__________________________________________________________________________________
Nome completo da pesquisadora
___________________________________________________________________________
Assinatura
_____________
Data
29
Figura 3 - Soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem A soluccedilatildeo da uacuteltima lavagem foi testada com hemaacutecia de triagem de
anticorpos em gel LissCoombs (BIO-RAD) A finalidade eacute verificar a presenccedila de anticorpos livres na
suspensatildeo que possam interferir na pesquisa do eluato As soluccedilotildees de lavagem das amostras na figura a tiveram
resultados negativos Na figura b duas amostras a 47 e 50 apresentaram resultado positivo Nova etapa de
lavagem foi realizada e o resultado final foi negativo
522 TRATAMENTO DAS HEMAacuteCIAS
Apoacutes a sensibilizaccedilatildeo e obtenccedilatildeo de resultados de TDA com intensidade de 3 a 4+
cada uma das amostras foi dividida em duas aliacutequotas e tratada separadamente pelas teacutecnicas
de glicinaaacutecida-EDTA e cloroquina
As teacutecnicas foram consideradas efetivas quando obteve-se a completa dissociaccedilatildeo do
anticorpo verificada atraveacutes do TDA negativo na amostra poacutes tratamento conforme figuras 5
e 6 Dentre as amostras tratadas com cloroquina 2850 tiveram o TDA negativado A glicina-
aacutecidaEDTA negativou o TDA em 33 das 50 amostras tratadas Apenas 17 amostras tratadas
com glicina-aacutecidaEDTA permaneceram com o TDA positivo e foram submetidas a um novo
tratamento
30
Figura 4 - TDA das amostras apoacutes sensibilizaccedilatildeo com anticorpos policlonais humanos Amostras na
figura a com intensidades de 3-4+ Na figura b amostras 4 e 7 com intensidade menor que 3+ e portanto foram
novamente sensibilizadas com nova aliacutequota de soro Anti-D e anti-S Apoacutes a segunda sensibilizaccedilatildeo
apresentaram reatividade 4 e 3+ respectivamente Os anticorpos utilizados para sensibilizaccedilatildeo foram D S c E
C e K
523 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS TEacuteCNICAS
No tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA houve dissociaccedilatildeo completa do anticorpo
em 33 amostras (66) das 50 amostras testadas enquanto que com a cloroquina foram 28
amostras (56) (tabela 1)
31
Graacutefico 1- Nuacutemero de amostras sesnsibilizadas por especificidade de anticorpo Entre as 50 amostras 12
foram sensibilizadas com anti-D 10 com anti-C 9 com anti-E 8 com anti-c 7 com anti-S 3 com anti-K e 1
com anti-Dia As especificidades dos anticorpos foram definidas de acordo o fenoacutetipo do doador
Figura 5 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com cloroquina Nas amostras onde houve
a dissociaccedilatildeo do anticorpo ( 2 21 a 23 26 39 a 42 45 46 e 49) a hemaacutecia se deposita no fundo no microtubo
apoacutes a centrifugaccedilatildeo (TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (1 3 24 25 43 44 47
48 e 50) o anticorpo ligado agraves hemaacutecias eacute alvo da AGH presente no gel (TDA positivo)
Anti-D 12
Anti-C 10
Anti-E 9
Anti-c 8
Anti-S 7
Anti-K 3 Anti-Dia 1
32
Figura 6 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA Nas amostras
onde houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo (4 6 7 12 a 15 17 34 35 37 e 38) a hemaacutecia se deposita no fundo no
microtubo apoacutes a centrifugaccedilatildeo ( TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (5 16 18
19 20 33 e 36 ) o AGH presente no gel se liga ao anticorpo ligado agraves hemaacutecias que ficam retidas no gel (TDA
positivo)
Tabela 1-Resultado geral do tratamento das hemaacutecias com glicina e cloroquina
Teacutecnica utilizada TDA negativo TDA positivo Total
Glicina-aacutecidaEDTA 33 17 50
Cloroquina 28 22 50
A glicina-aacutecidaEDTA conseguiu negativar mais amostras sensibilizadas com Anti-D
e anti-K que a cloroquina Para as hemaacutecias sensibilizadas com anti-E Anti-S e Anti-Dia
ambas as teacutecnicas dissociaram o anticorpo em 100 das amostras Os resultados detalhados
por especificidade do anticorpo apoacutes o primeiro tratamento com glicina-aacutecidaEDTA e com
cloroquina estatildeo na tabela 2
Para as amostras que permaneceram positivas (17 amostras) apoacutes o tratamento com a
glicina-aacutecidaEDTA foi realizado um novo tratamento Houve dissociaccedilatildeo do anticorpo em 3
amostras (18) apoacutes a segunda tentativa Nas demais 14 (82) amostras tratadas pela
segunda vez 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise
33
Tabela 2 - Resultados do TDA apoacutes tratamento das hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo
sensibilizado
ANTICORPOS
SENSIBILIZADOS
1ordm TRATAMENTO COM
GLICINA
TRATAMENTO COM
CLOROQUINA
TOTAL TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
Anti-D 8 4 0 12 12
Anti-C 6 4 10 0 10
Anti-E 9 0 9 0 9
Anti-c 0 8 1 7 8
Anti-S 7 0 7 0 7
Anti-K 2 1 0 3 3
Anti-Dia 1 0 1 0 1
TOTAL 33 17 28 22 50
A hemoacutelise foi verificada durante o procedimento de lavagem final das hemaacutecias com
soluccedilatildeo fisioloacutegica para a retirada dos reagentes As soluccedilotildees de lavagem ficaram
avermelhadas e as hemaacutecias com coloraccedilatildeo escura As amostras foram descartadas Dentre as
6 amostras que ainda puderam ser testadas para o TDA trecircs amostras negativaram sendo 1
sensibilizada com anti-D e 2 com anti-C (tabela 3)
Tabela 3 - Resultado apoacutes o segundo tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA
Tratamento com
glicina-aacutecidaEDTA
TDA Negativo TDA Positvo Hemoacutelise Total
Segundo tratamento 3 3 11 17
524 TESTAGEM DO ELUATO
Apoacutes o tratamento com a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA a soluccedilatildeo do eluato foi
testada para verificar a viabilidade dos anticorpos que foram dissociados ou eluiacutedos Dentre
as 50 amostras 41 apresentaram eluato positivo As nove amostras cujos eluatos foram
negativos haviam sido sensibilizadas com as seguintes especificidades de anticorpos anti-E 6
amostras (67) anti-S 2 amostras (40) e anti-D 1 amostra (8) (tabela 4) O eluato de
todas as amostras sensibilizadas com os anticorpos anti-C anti-c Anti-K e Anti-Dia foram
positivos Os eluatos positivos na triagem de anticorpos foram testados com paineacuteis de
identificaccedilatildeo para confirmar a especificidade e a viabilidade dos anticorpos (figuras 7 e 8)
34
525 EFEITO DA ELUICcedilAtildeO SOBRE OS ANTIacuteGENOS ERITROCITAacuteRIOS
Para verificar o efeito do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA e com a cloroquina
sobre a expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s foi realizada a fenotipagem das
amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes tratamento com ambas as teacutecnicas Foi avaliado
se o tratamento destruiu os antiacutegenos expressos antes do tratamento
Tabela 4- Resultado do Eluato das amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA
Anticorpos Eluato positvo Eluato negativo Total
Anti-D 11 1 12
Anti-C 10 0 10
Anti-E 3 6 9
Anti-c 8 0 8
Anti-S 5 2 7
Anti-K 3 0 3
Anti-Dia 1 0 1
Total 41 9 50
Figura 7 ndash Painel do eluato da amostra 21 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-C que foi
recuperado no eluato
Figura 8 ndash Painel do eluato da amostra 47 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-K que foi
recuperado no eluato
35
Dentre as 50 amostras 26 eram previamente fenotipadas para os antiacutegenos Fya Fy
b
Jka Jk
b S e s Dentre elas 20 alcanccedilaram TDA negativo apoacutes tratamento com a glicina-
aacutecidaEDTA e 20 negativaram apoacutes tratamento com cloroquina (tabela 5) Apoacutes ambas as
teacutecnicas os antiacutegenos originalmente expressos permaneceram positivos comprovando que natildeo
houve destruiccedilatildeo dos mesmos
Tabela 5 ndash Verificaccedilatildeo da interferecircncia do tratamento da hemaacutecias com cloroquina e glicina-
aacuteicdaEDTA sobre os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
AMOSTRAS
COM
FENOTIPAGEM
PREacuteVIA
TRATADAS COM
CLOROQUINA
TRATADAS COM
GLICINA
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
26
20
20
20
20
As amostras 24 47 e 50 eram positivas para o antiacutegeno K A cloroquina natildeo dissociou
o anticorpo em nenhuma das 3 amostras enquanto a glicina-aacutecidaEDTA foi efetiva nas
amostras 24 e 50 Foi testada a expressatildeo do antiacutegeno K nas amostras 24 e 50 apoacutes o
tratamento utilizando meacutetodo indireto em gel contendo AGH Apesar de natildeo ter sido avaliado
a intensidade de reaccedilatildeo de expressatildeo dos antiacutegenos podemos verificar na figura 9 que nas
duas amostras em que a teacutecnica foi efetiva e dissociou o anticorpo a expressatildeo do antiacutegeno K
continua presente mas a reatividade observada pode ser considerada 1+ sugerindo que houve
diminuiccedilatildeo da expressatildeo do antiacutegeno quando comparado com a expressatildeo observada em
hemaacutecia natildeo tratada
Os resultados individuais de cada amostra em ambas as teacutecnicas encontram-se
resumidas na tabela 6
526 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente onde foi constatada a presenccedila de autoanticorpo
a quente da classe IgG pelo TDA monoespeciacutefico (figura 10)O autoanticorpo tambeacutem
interferia na pesquisa e identificaccedilatildeo de anticorpos irregulares pois apresentava caracteriacutestica
de panaglutinina As hemaacutecias da paciente sensibilizadas ldquoin vivordquo foram tratadas com
cloroquina e com glicina-aacutecidaEDTA
36
Figura 9 ndash Fenotipagem das amostras 24 e 50 para antiacutegeno K apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
O teste positivo indica a presenccedila do antiacutegeno poreacutem a reatividade fraca (1+) sugere que houve enfraquecimento
de sua expressatildeo A direita a expressatildeo forte (4+) do antiacutegeno Kell em hemaacutecia controle natildeo tratada utilizada
como controle positivo
A cloroquina natildeo foi efetiva na retirada do anticorpo ligado as hemaacutecias ao contraacuterio
do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA que dissociou o anticorpo (figura 11)
A hemaacutecia tratada com glicina foi fenotipada para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
(figura 12) A fenotipagem para o sistema Rh (C c E e e) e Kell foi realizada em gel
especiacutefico monoclonal sem interferecircncia do TDA positivo (controle da reaccedilatildeo negativo)
O eluato resultante do tratamento com glicina-aacutecidaEDTA foi testada em gel com
hemaacutecias de painel de identificaccedilatildeo de anticorpos e apresentou resultado positivo com todas
as ceacutelulas (figura 13 e 14)
A amostra foi enviada para genotipagem e o resultado da genotipagem confirmou o
resultado da fenotipagem apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
527 TEMPO DE EXECUCcedilAtildeO DA TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
O tempo de reaccedilatildeo da glicina-aacutecidaEDTA eacute de 2 minutos Todas as amostras foram
tratadas obedecendo ao tempo descrito na literatura demonstrando que o mesmo eacute
reprodutiacutevel
37
Tabela 6- Resultados individuais por amostra
Amostra Especificidade
dos anticorpos
Intensidade do
TDA apoacutes
sensibilizaccedilatildeo
Tratamento
efetivo com
cloroquina
Tratamento
efetivo com
glicina
Eluato
poacutes
glicina
1 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 2 Dia 3+ Sim Sim 3+ 3 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 4 D 4+ Natildeo Sim 4+ 5 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 6 E 3+ Sim Sim Negativo 7 S 4+ Sim Sim 3+ 8 E 3+ Sim Sim 1+ 9 E 3+ Sim Sim 2+
10 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 11 D 4+ Natildeo Sim 4+ 12 D 4+ Natildeo Sim 4+ 13 S 3+ Sim Sim 3+ 14 S 3+ Sim Sim 3+ 15 D 3+ Natildeo Sim 3+ 16 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 17 E 3+ Sim Sim (+) 18 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 19 D 4+ Natildeo Natildeo 3+ 20 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 21 C 3+ Sim Sim 4+ 22 C 3+ Sim Sim 4+ 23 C 3+ Sim Sim 4+ 24 K 4+ Natildeo Sim 4+ 25 D 3+ Natildeo Natildeo Negativo 26 E 4+ Sim Sim Negativo 27 S 3+ Sim Sim 3+ 28 C 3+ Sim Natildeo 4+ 29 C 3+ Sim Sim 4+ 30 C 3+ Sim Sim 4+ 31 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 32 E 3+ Sim Sim Negativo 33 C 3+ Sim Natildeo 4+ 34 S 3+ Sim Sim Negativo 35 S 3+ Sim Sim Negativo 36 C 4+ Sim Natildeo 4+ 37 c 4+ Natildeo Natildeo 4+ 38 D 4+ Natildeo Sim 4+ 39 S 3+ Sim Sim 3+ 40 c 4+ Sim Natildeo 2+ 41 C 4+ Sim Natildeo 4+ 42 E 3+ Sim Sim Negativo 43 D 3+ Natildeo Sim 2+ 44 D 3+ Natildeo Sim 2+ 45 E 3+ Sim Sim Negativo 46 C 3+ Sim Sim 4+ 47 K 4+ Natildeo Natildeo 4+ 48 D 3+ Natildeo Sim 2+ 49 E 3+ Sim Sim Negativo 50 K 4+ Natildeo Sim 4+
TOTAL 50 28 33 41
38
Figura 10 ndash TDA monoespeciacutefico da amostra de paciente Hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo da classe
IgG
oacute Figura 11 ndash TDA apoacutes o tratamento com glicina-aacutecidaEDTA (esquerda) e cloroquina (direita) A glicina
negativou completamente o TDA enquanto a hemaacutecia tratada com cloroquina persistiu positiva (1+)
39
Figura 12 ndash Fenotipagem da amostra tratada com glicina-aacutecidaEDTA Fy(a+b+) Jk(a-b+) S+s+
Figura 13 ndash Painel em gel (LissAGH) do eluato apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de
intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
Figura 14 ndash ndash Painel ezimaacutetico (hemaacutecias tratadas com bromelina) do eluato em gel neutro apoacutes
tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
40
528 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Quanto a efetividade das teacutecnicas em negativar o TDA foi verificado que a glicina-
aacutecidaEDTA foi efetiva em 66 das amostras testadas no primeiro tratamento (3350
amostras) enquanto a cloroquina conseguiu negativar 56 (2850) Esses resultados natildeo
apresentam diferenccedila significativa (pgt005) demostrando que a teacutecnica da glicina-
aacutecidaEDTA natildeo eacute superior mas eacute tatildeo efetiva quanto a da cloroquina
Quando aliamos os resultados de ambas as teacutecnicas verificamos que em 76 (3850)
das amostras o TDA foi negativado Esse dado indica que ainda que uma teacutecnica natildeo seja
eficaz na remoccedilatildeo do anticorpo eacute uma boa alternativa tentar a segunda teacutecnica jaacute que a falha
em remover o anticorpo utilizando uma delas natildeo prevecirc necessariamente a falha com a outra
Quando se utiliza o teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla (graacutefico 2) para comparar a utilizaccedilatildeo das
duas teacutecnicas com o resultado de cada uma isolada (somente a cloroquina ou somente a
glicina) verificamos que os resultados apresentam diferenccedila significativa (plt005) (quadro 3)
TRATAMENTO EFETIVO COM TOTAL PORCENTAGEM
Glicina ou cloroquina 38 76
Glicina e cloroquina 23 46
Glicina apenas 10 20
Cloroquina apenas 5 10
Nenhuma das teacutecnicas 12 24
Quadro 3 - Resultados comparativos entre as teacutecnicas utilizadas
41
Graacutefico 2 - Teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla entre as teacutecnicas aplicadas A- Glicina e Cloroquina B-Cloroquina C-
Glicina ( plt005)
42
6 DISCUSSAtildeO
Os reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA podem ser adquiridos em
forma de kit comercial prontos para uso poreacutem natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil A preparaccedilatildeo
dos reagentes ldquoin houserdquo a partir de sais comerciais adquiridos se mostrou viaacutevel Os
reagentes glicina e o tampatildeo Tris armazenados de forma correta se mantiveram estaacuteveis por
um periacuteodo de 7 meses Somente o reagente EDTA precipitou mesmo armazenado em
condiccedilotildees adequadas sugerindo que o mesmo deve ser preparado em menor quantidade e
armazenado em aliacutequotas A soluccedilatildeo de cloroquina tambeacutem pode ser preparada ldquoin houserdquo e
pode ser armazenado por um mecircs A legislaccedilatildeo brasileira autoriza a utilizaccedilatildeo de reagentes
preparados a partir de sais comerciais como a cloroquina e a glicina-aacutecidaEDTA desde que
os sais tenham autorizaccedilatildeo da vigilacircncia sanitaacuteria para a comercializaccedilatildeo (BRASIL 2001)
A comparaccedilatildeo quanto a efetividade em dissociar anticorpos em amostras com TDA
positivos entre a teacutecnica da glicina e a teacutecnica da cloroquina mostrou que natildeo haacute diferenccedila
estatiacutestica entre elas e que ambas satildeo igualmente eficientes Se utilizadas conjuntamente haacute
maior possibilidade de elucidaccedilatildeo dos casos
Uma vantagem da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eacute que ela permite numa mesma
amostra eluir o anticorpo ligado aacute hemaacutecia assim como fenotipar a hemaacutecia tratada Devido a
sua dupla utilidade a teacutecnica eacute vantajosa principalmente em pacientes em que pouco volume
de amostra pode ser coletado como em casos de crianccedilas e receacutem-nascidos
A fenotipagem poacutes tratamento se mostrou viaacutevel jaacute que os antiacutegenos de maior
importacircncia natildeo sofreram alteraccedilotildees Nas 20 amostras que foram fenotipadas antes e apoacutes
tratamento para verificar a influecircncia dos reagentes na expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a
Jkb S e s natildeo houve destruiccedilatildeo dos mesmos por nenhuma das duas teacutecnicas
Para as amostras positivas para o antiacutegeno Kell (350) e sensibilizadas com o
respectivo anticorpo a teacutecnica da glicina foi efetiva em negativar o TDA em apenas duas
delas mas apoacutes o tratamento foi verificada uma fraca reatividade da reaccedilatildeo antiacutegeno-
anticorpo sugerindo que houve um enfraquecimento da expressatildeo do antiacutegeno conforme
esperado e descrito na literatura (BYRNE 1991 PALLAS WILER E MCGEE 1991
ROZIERS e SQUALI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012 e KATHARIA e
CHAUDHARY 2013) A accedilatildeo da glicina sobre o antigeno Kell natildeo representa impedimento
para seu uso uma vez que na impossibilidade de testar o antiacutegeno Kell o banco de sangue
consegue facilmente atender a solicitaccedilatildeo de transfusatildeo com unidades de hemaacutecias Kell
43
negativas jaacute que eacute um antiacutegeno de baixa prevalecircncia na populaccedilatildeo variando de 15 na
populaccedilatildeo africana a 9 nos europeus (DANIELS 2011)
A soluccedilatildeo resultante da dissociaccedilatildeo do anticorpo pela teacutecnica da glicina pode ainda ser
utilizada como eluato podendo substituir a teacutecnica de eluiccedilatildeo com reagentes comercias (kits
de eluiccedilatildeo aacutecida) que tem alto custo aproximadamente entre R$2000 a R$2500 por teste
Em 41 amostras (82) houve a dissociaccedilatildeo e recuperaccedilatildeo do anticorpo que estava
sensibilizando as hemaacutecias Em 9 amostras (18) os anticorpos foram eluiacutedos poreacutem
apresentaram reaccedilatildeo negativa quando testadas com hemaacutecias de triagem entre eles o anti-E
(6) anti-S (2) e Anti-D (1) Eacute possiacutevel que a correccedilatildeo pH do meio (WALKER 2011) natildeo
tenha sido adequada o que pode ter desfavorecido a reatividade do anticorpo
Para as amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA nas quais natildeo houve dissociaccedilatildeo do
anticorpo pelo primeiro tratamento (1750) o segundo tratamento natildeo se mostrou eficaz jaacute
que 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise O tempo de
armazenagem natildeo parece ter influenciado jaacute que todas as amostras foram testadas dentro de
48 horas apoacutes a coleta Outros fatores que natildeo foram verificados podem ter levado a
hemoacutelise Apesar da literatura (LOUIE JIENG e ZEROULIS 1986 e BYRNE 1991)
recomendar um segundo tratamento ele eacute pouco eficaz tendo negativado apenas 3 das 17
amostras testadas
A amostra de paciente que apresentou sensibilizaccedilatildeo ldquoin vivordquo mostrou melhor
efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA sobre a da cloroquina possibilitando
fenotipagem para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s que natildeo foram destruiacutedos apoacutes o
tratamento comprovado atraveacutes da genotipagem
A presenccedila de autoanticorpo a quente com presenccedila de hemoacutelise (AHAI) ou natildeo pode
mascarar a presenccedila de aloanticorpo interferindo na rotina soroloacutegica da fenotipagem que eacute
uma importante ferramenta para auxiliar na seleccedilatildeo de hemaacutecias para transfusatildeo (SHIREY et
al 2002) Esses pacientes frequentemente possuem aloanticorpos associados ao
autoanticorpo e a prevalecircncia de aloimunizaccedilatildeo entre eles varia entre 12 a 40 (LEGER e
GARRATY 1999 BRANCH e PETZ 1999) o que dificulta ainda mais a escolha do melhor
componente a ser transfundido aleacutem de aumentar a possibilidade reaccedilotildees hemoliacuteticas imunes
poacutes-transfusionais
Nesses casos as teacutecnicas de dissociaccedilatildeo de anticorpos satildeo importantes para tratar
amostras de pacientes e a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser usada como uma opccedilatildeo
pois se mostrou eficaz na dissociaccedilatildeo anticorpo ligado agraves hemaacutecias deixando livre a
superfiacutecie das mesmas permitindo a fenotipagem por antisoros IgG Paralelamente os
44
anticorpos eluiacutedos tambeacutem puderam ser estudados O mesmo natildeo ocorre com a cloroquina
que permite apenas a fenotipagem e tampouco com os kits de eluiccedilatildeo aacutecida disponiacuteveis no
mercado nacional que satildeo destinados a realizaccedilatildeo do eluato mas destroem as hemaacutecias
O tempo de tratamento na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA tambeacutem eacute uma vantagem
pois foi possiacutevel reproduzir no tempo determinado de 2 minutos enquanto a cloroquina
demora ateacute duas horas
Ainda que a aplicaccedilatildeo das teacutecnicas por biologia molecular estejam cada vez mais
presentes na rotina imuno-hematoloacutegica e possibilitam estabelecer o fenoacutetipo deduzido do
genoacutetipo elas natildeo estatildeo disponiacuteveis na maioria dos centros e sua realizaccedilatildeo exige algumas
horas A resoluccedilatildeo imediata do problema transfusional necessita dos resultados soroloacutegicos
pois com frequecircncia natildeo eacute possiacutevel aguardar o resultado do teste molecular Dessa forma
apesar da crescente importacircncia da genotipagem eritrocitaacuteria teacutecnicas soroloacutegicas aplicadas
corretamente e no momento propiacutecio satildeo de grande utilidade para resolver problemas imuno-
hematoloacutegicos como ocorre com a fenotipagem em pacientes com TDA positivo
45
7 CONCLUSAtildeO
A teacutecnica da glicina aacutecidaEDTA mostrou-se efetiva em remover os anticorpos que
sensibilizavam as hemaacutecias e pode ser utilizada com seguranccedila antes da fenotipagem
eritrocitaacuteria Por ser uma teacutecnica de raacutepida execuccedilatildeo eacute uma alternativa aplicaacutevel
principalmente em casos urgentes de pacientes que apresentam autoanticorpos
46
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50
9 ANEXOS
51
FUNDACcedilAtildeO HEMOCENTRO DE RIBEIRAtildeO PRETO
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE)
Tiacutetulo da pesquisa Aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina aacutecida-EDTA e avaliaccedilatildeo da
eficaacutecia no tratamento de hemaacutecias com teste direto da antiglobulina positivo
Pesquisadora responsaacutevel Ceacutelia Kazue Abiko
Orientador Prof Dimas Tadeu Covas
Co-orientadora Dra Flaacutevia Leite Souza Santos
Objetivo da pesquisa Vocecirc estaacute sendo convidado a participar de uma pesquisa que tem
como objetivo padronizar uma nova teacutecnica para auxiliar na tipagem sanguiacutenea de pacientes
A tipagem sanguiacutenea pode sofrer interferecircncia da presenccedila de anticorpos ligados aos gloacutebulos
vermelhos do sangue Nessas situaccedilotildees eacute difiacutecil selecionar o melhor sangue para o paciente e
eacute preciso a utilizaccedilatildeo de teacutecnicas adicionais para remover essas interferecircncias
Esta pesquisa tem como objetivo estudar outra teacutecnica para remover esses anticorpos e
comparaacute-la com a teacutecnica atualmente utilizada Para isso precisamos de amostras de pacientes
e doadores voluntaacuterios
Se vocecirc eacute um doador eacute necessaacuterio que vocecirc autorize a coleta de 5 ml (1 tubo) a mais
de seu sangue
Se vocecirc eacute um paciente natildeo haveraacute necessidade de nova amostra pois utilizaremos as
amostras jaacute coletadas para os testes preacute-transfusionais e os resultados encontrados nesta
pesquisa natildeo iratildeo interferir na escolha da (s) bolsa (s) de sangue que vocecirc possa vir a receber
Se vocecirc concordar em participar leia com atenccedilatildeo o texto abaixo e assine as duas vias
rubricando todas as paacuteginas deste termo de consentimento Uma via original assinada e
rubricada por vocecirc e pela pesquisadora ficaraacute com vocecirc
As suas informaccedilotildees seratildeo mantidas em sigilo pela pesquisadora e natildeo haveraacute
armazenamento de material para pesquisas posteriores Os seus dados seratildeo usados apenas
neste estudo e quando o trabalho for publicado seu nome e qualquer outra informaccedilatildeo que
possam identificaacute-lo natildeo seratildeo revelados
Eacute pouco provaacutevel que o que noacutes aprendermos com este estudo tenha um benefiacutecio
direto para vocecirc assim como natildeo poderemos dar nada em troca pela sua participaccedilatildeo na
pesquisa
Nosso objetivo com esta pesquisa eacute que os resultados poderatildeo ser uacuteteis para o
tratamento de pacientes no futuro Os riscos da participaccedilatildeo satildeo miacutenimos Se vocecirc eacute um
doador de sangue a amostra seraacute coletada no momento da doaccedilatildeo natildeo exigindo punccedilatildeo
venosa adicional
52
Eacute seu direito ter acesso aos resultados dos testes da pesquisa Esses resultados natildeo
seratildeo fornecidos automaticamente a vocecirc mas caso vocecirc se interesse em saber o resultado ou
tiver alguma duacutevida sobre a sua participaccedilatildeo neste estudo deveraacute entrar em contato com Ceacutelia
Kazue Abiko pelo telefone (18) 99718-3551
Vocecirc tem total liberdade de optar por natildeo participar da pesquisa Caso aceite
participar poderaacute desistir a qualquer momento ou retirar seu consentimento mesmo apoacutes ter
coletado o sangue Para cancelar sua participaccedilatildeo basta avisar a pesquisadora e os seus dados
seratildeo retirados do projeto
Qualquer duacutevida eacutetica sobre a pesquisa poderaacute entrar em contato com o Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa do Hospital das Cliacutenicas e da Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto
(CAMPUS UNIVERSITAacuteRIO bairro Monte Alegre CEP 14048-900 Ribeiratildeo Preto-SP
Telefone (16) 3602-2228 FAX (16) 3633-1144 e-mail cephcrpuspbr)
Consentimento de participaccedilatildeo
A Consentimento do participante
Li as informaccedilotildees acima sobre o estudo e recebi explicaccedilotildees sobre a participaccedilatildeo no estudo
Portanto dou o meu consentimento para participar do estudo
___________________________________________________________________________
Nome completo
___________________________________________________________________________
Assinatura
___________
Data
__________________________________________________________________________________
Nome completo da pesquisadora
___________________________________________________________________________
Assinatura
_____________
Data
30
Figura 4 - TDA das amostras apoacutes sensibilizaccedilatildeo com anticorpos policlonais humanos Amostras na
figura a com intensidades de 3-4+ Na figura b amostras 4 e 7 com intensidade menor que 3+ e portanto foram
novamente sensibilizadas com nova aliacutequota de soro Anti-D e anti-S Apoacutes a segunda sensibilizaccedilatildeo
apresentaram reatividade 4 e 3+ respectivamente Os anticorpos utilizados para sensibilizaccedilatildeo foram D S c E
C e K
523 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS TEacuteCNICAS
No tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA houve dissociaccedilatildeo completa do anticorpo
em 33 amostras (66) das 50 amostras testadas enquanto que com a cloroquina foram 28
amostras (56) (tabela 1)
31
Graacutefico 1- Nuacutemero de amostras sesnsibilizadas por especificidade de anticorpo Entre as 50 amostras 12
foram sensibilizadas com anti-D 10 com anti-C 9 com anti-E 8 com anti-c 7 com anti-S 3 com anti-K e 1
com anti-Dia As especificidades dos anticorpos foram definidas de acordo o fenoacutetipo do doador
Figura 5 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com cloroquina Nas amostras onde houve
a dissociaccedilatildeo do anticorpo ( 2 21 a 23 26 39 a 42 45 46 e 49) a hemaacutecia se deposita no fundo no microtubo
apoacutes a centrifugaccedilatildeo (TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (1 3 24 25 43 44 47
48 e 50) o anticorpo ligado agraves hemaacutecias eacute alvo da AGH presente no gel (TDA positivo)
Anti-D 12
Anti-C 10
Anti-E 9
Anti-c 8
Anti-S 7
Anti-K 3 Anti-Dia 1
32
Figura 6 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA Nas amostras
onde houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo (4 6 7 12 a 15 17 34 35 37 e 38) a hemaacutecia se deposita no fundo no
microtubo apoacutes a centrifugaccedilatildeo ( TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (5 16 18
19 20 33 e 36 ) o AGH presente no gel se liga ao anticorpo ligado agraves hemaacutecias que ficam retidas no gel (TDA
positivo)
Tabela 1-Resultado geral do tratamento das hemaacutecias com glicina e cloroquina
Teacutecnica utilizada TDA negativo TDA positivo Total
Glicina-aacutecidaEDTA 33 17 50
Cloroquina 28 22 50
A glicina-aacutecidaEDTA conseguiu negativar mais amostras sensibilizadas com Anti-D
e anti-K que a cloroquina Para as hemaacutecias sensibilizadas com anti-E Anti-S e Anti-Dia
ambas as teacutecnicas dissociaram o anticorpo em 100 das amostras Os resultados detalhados
por especificidade do anticorpo apoacutes o primeiro tratamento com glicina-aacutecidaEDTA e com
cloroquina estatildeo na tabela 2
Para as amostras que permaneceram positivas (17 amostras) apoacutes o tratamento com a
glicina-aacutecidaEDTA foi realizado um novo tratamento Houve dissociaccedilatildeo do anticorpo em 3
amostras (18) apoacutes a segunda tentativa Nas demais 14 (82) amostras tratadas pela
segunda vez 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise
33
Tabela 2 - Resultados do TDA apoacutes tratamento das hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo
sensibilizado
ANTICORPOS
SENSIBILIZADOS
1ordm TRATAMENTO COM
GLICINA
TRATAMENTO COM
CLOROQUINA
TOTAL TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
Anti-D 8 4 0 12 12
Anti-C 6 4 10 0 10
Anti-E 9 0 9 0 9
Anti-c 0 8 1 7 8
Anti-S 7 0 7 0 7
Anti-K 2 1 0 3 3
Anti-Dia 1 0 1 0 1
TOTAL 33 17 28 22 50
A hemoacutelise foi verificada durante o procedimento de lavagem final das hemaacutecias com
soluccedilatildeo fisioloacutegica para a retirada dos reagentes As soluccedilotildees de lavagem ficaram
avermelhadas e as hemaacutecias com coloraccedilatildeo escura As amostras foram descartadas Dentre as
6 amostras que ainda puderam ser testadas para o TDA trecircs amostras negativaram sendo 1
sensibilizada com anti-D e 2 com anti-C (tabela 3)
Tabela 3 - Resultado apoacutes o segundo tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA
Tratamento com
glicina-aacutecidaEDTA
TDA Negativo TDA Positvo Hemoacutelise Total
Segundo tratamento 3 3 11 17
524 TESTAGEM DO ELUATO
Apoacutes o tratamento com a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA a soluccedilatildeo do eluato foi
testada para verificar a viabilidade dos anticorpos que foram dissociados ou eluiacutedos Dentre
as 50 amostras 41 apresentaram eluato positivo As nove amostras cujos eluatos foram
negativos haviam sido sensibilizadas com as seguintes especificidades de anticorpos anti-E 6
amostras (67) anti-S 2 amostras (40) e anti-D 1 amostra (8) (tabela 4) O eluato de
todas as amostras sensibilizadas com os anticorpos anti-C anti-c Anti-K e Anti-Dia foram
positivos Os eluatos positivos na triagem de anticorpos foram testados com paineacuteis de
identificaccedilatildeo para confirmar a especificidade e a viabilidade dos anticorpos (figuras 7 e 8)
34
525 EFEITO DA ELUICcedilAtildeO SOBRE OS ANTIacuteGENOS ERITROCITAacuteRIOS
Para verificar o efeito do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA e com a cloroquina
sobre a expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s foi realizada a fenotipagem das
amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes tratamento com ambas as teacutecnicas Foi avaliado
se o tratamento destruiu os antiacutegenos expressos antes do tratamento
Tabela 4- Resultado do Eluato das amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA
Anticorpos Eluato positvo Eluato negativo Total
Anti-D 11 1 12
Anti-C 10 0 10
Anti-E 3 6 9
Anti-c 8 0 8
Anti-S 5 2 7
Anti-K 3 0 3
Anti-Dia 1 0 1
Total 41 9 50
Figura 7 ndash Painel do eluato da amostra 21 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-C que foi
recuperado no eluato
Figura 8 ndash Painel do eluato da amostra 47 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-K que foi
recuperado no eluato
35
Dentre as 50 amostras 26 eram previamente fenotipadas para os antiacutegenos Fya Fy
b
Jka Jk
b S e s Dentre elas 20 alcanccedilaram TDA negativo apoacutes tratamento com a glicina-
aacutecidaEDTA e 20 negativaram apoacutes tratamento com cloroquina (tabela 5) Apoacutes ambas as
teacutecnicas os antiacutegenos originalmente expressos permaneceram positivos comprovando que natildeo
houve destruiccedilatildeo dos mesmos
Tabela 5 ndash Verificaccedilatildeo da interferecircncia do tratamento da hemaacutecias com cloroquina e glicina-
aacuteicdaEDTA sobre os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
AMOSTRAS
COM
FENOTIPAGEM
PREacuteVIA
TRATADAS COM
CLOROQUINA
TRATADAS COM
GLICINA
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
26
20
20
20
20
As amostras 24 47 e 50 eram positivas para o antiacutegeno K A cloroquina natildeo dissociou
o anticorpo em nenhuma das 3 amostras enquanto a glicina-aacutecidaEDTA foi efetiva nas
amostras 24 e 50 Foi testada a expressatildeo do antiacutegeno K nas amostras 24 e 50 apoacutes o
tratamento utilizando meacutetodo indireto em gel contendo AGH Apesar de natildeo ter sido avaliado
a intensidade de reaccedilatildeo de expressatildeo dos antiacutegenos podemos verificar na figura 9 que nas
duas amostras em que a teacutecnica foi efetiva e dissociou o anticorpo a expressatildeo do antiacutegeno K
continua presente mas a reatividade observada pode ser considerada 1+ sugerindo que houve
diminuiccedilatildeo da expressatildeo do antiacutegeno quando comparado com a expressatildeo observada em
hemaacutecia natildeo tratada
Os resultados individuais de cada amostra em ambas as teacutecnicas encontram-se
resumidas na tabela 6
526 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente onde foi constatada a presenccedila de autoanticorpo
a quente da classe IgG pelo TDA monoespeciacutefico (figura 10)O autoanticorpo tambeacutem
interferia na pesquisa e identificaccedilatildeo de anticorpos irregulares pois apresentava caracteriacutestica
de panaglutinina As hemaacutecias da paciente sensibilizadas ldquoin vivordquo foram tratadas com
cloroquina e com glicina-aacutecidaEDTA
36
Figura 9 ndash Fenotipagem das amostras 24 e 50 para antiacutegeno K apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
O teste positivo indica a presenccedila do antiacutegeno poreacutem a reatividade fraca (1+) sugere que houve enfraquecimento
de sua expressatildeo A direita a expressatildeo forte (4+) do antiacutegeno Kell em hemaacutecia controle natildeo tratada utilizada
como controle positivo
A cloroquina natildeo foi efetiva na retirada do anticorpo ligado as hemaacutecias ao contraacuterio
do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA que dissociou o anticorpo (figura 11)
A hemaacutecia tratada com glicina foi fenotipada para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
(figura 12) A fenotipagem para o sistema Rh (C c E e e) e Kell foi realizada em gel
especiacutefico monoclonal sem interferecircncia do TDA positivo (controle da reaccedilatildeo negativo)
O eluato resultante do tratamento com glicina-aacutecidaEDTA foi testada em gel com
hemaacutecias de painel de identificaccedilatildeo de anticorpos e apresentou resultado positivo com todas
as ceacutelulas (figura 13 e 14)
A amostra foi enviada para genotipagem e o resultado da genotipagem confirmou o
resultado da fenotipagem apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
527 TEMPO DE EXECUCcedilAtildeO DA TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
O tempo de reaccedilatildeo da glicina-aacutecidaEDTA eacute de 2 minutos Todas as amostras foram
tratadas obedecendo ao tempo descrito na literatura demonstrando que o mesmo eacute
reprodutiacutevel
37
Tabela 6- Resultados individuais por amostra
Amostra Especificidade
dos anticorpos
Intensidade do
TDA apoacutes
sensibilizaccedilatildeo
Tratamento
efetivo com
cloroquina
Tratamento
efetivo com
glicina
Eluato
poacutes
glicina
1 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 2 Dia 3+ Sim Sim 3+ 3 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 4 D 4+ Natildeo Sim 4+ 5 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 6 E 3+ Sim Sim Negativo 7 S 4+ Sim Sim 3+ 8 E 3+ Sim Sim 1+ 9 E 3+ Sim Sim 2+
10 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 11 D 4+ Natildeo Sim 4+ 12 D 4+ Natildeo Sim 4+ 13 S 3+ Sim Sim 3+ 14 S 3+ Sim Sim 3+ 15 D 3+ Natildeo Sim 3+ 16 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 17 E 3+ Sim Sim (+) 18 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 19 D 4+ Natildeo Natildeo 3+ 20 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 21 C 3+ Sim Sim 4+ 22 C 3+ Sim Sim 4+ 23 C 3+ Sim Sim 4+ 24 K 4+ Natildeo Sim 4+ 25 D 3+ Natildeo Natildeo Negativo 26 E 4+ Sim Sim Negativo 27 S 3+ Sim Sim 3+ 28 C 3+ Sim Natildeo 4+ 29 C 3+ Sim Sim 4+ 30 C 3+ Sim Sim 4+ 31 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 32 E 3+ Sim Sim Negativo 33 C 3+ Sim Natildeo 4+ 34 S 3+ Sim Sim Negativo 35 S 3+ Sim Sim Negativo 36 C 4+ Sim Natildeo 4+ 37 c 4+ Natildeo Natildeo 4+ 38 D 4+ Natildeo Sim 4+ 39 S 3+ Sim Sim 3+ 40 c 4+ Sim Natildeo 2+ 41 C 4+ Sim Natildeo 4+ 42 E 3+ Sim Sim Negativo 43 D 3+ Natildeo Sim 2+ 44 D 3+ Natildeo Sim 2+ 45 E 3+ Sim Sim Negativo 46 C 3+ Sim Sim 4+ 47 K 4+ Natildeo Natildeo 4+ 48 D 3+ Natildeo Sim 2+ 49 E 3+ Sim Sim Negativo 50 K 4+ Natildeo Sim 4+
TOTAL 50 28 33 41
38
Figura 10 ndash TDA monoespeciacutefico da amostra de paciente Hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo da classe
IgG
oacute Figura 11 ndash TDA apoacutes o tratamento com glicina-aacutecidaEDTA (esquerda) e cloroquina (direita) A glicina
negativou completamente o TDA enquanto a hemaacutecia tratada com cloroquina persistiu positiva (1+)
39
Figura 12 ndash Fenotipagem da amostra tratada com glicina-aacutecidaEDTA Fy(a+b+) Jk(a-b+) S+s+
Figura 13 ndash Painel em gel (LissAGH) do eluato apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de
intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
Figura 14 ndash ndash Painel ezimaacutetico (hemaacutecias tratadas com bromelina) do eluato em gel neutro apoacutes
tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
40
528 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Quanto a efetividade das teacutecnicas em negativar o TDA foi verificado que a glicina-
aacutecidaEDTA foi efetiva em 66 das amostras testadas no primeiro tratamento (3350
amostras) enquanto a cloroquina conseguiu negativar 56 (2850) Esses resultados natildeo
apresentam diferenccedila significativa (pgt005) demostrando que a teacutecnica da glicina-
aacutecidaEDTA natildeo eacute superior mas eacute tatildeo efetiva quanto a da cloroquina
Quando aliamos os resultados de ambas as teacutecnicas verificamos que em 76 (3850)
das amostras o TDA foi negativado Esse dado indica que ainda que uma teacutecnica natildeo seja
eficaz na remoccedilatildeo do anticorpo eacute uma boa alternativa tentar a segunda teacutecnica jaacute que a falha
em remover o anticorpo utilizando uma delas natildeo prevecirc necessariamente a falha com a outra
Quando se utiliza o teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla (graacutefico 2) para comparar a utilizaccedilatildeo das
duas teacutecnicas com o resultado de cada uma isolada (somente a cloroquina ou somente a
glicina) verificamos que os resultados apresentam diferenccedila significativa (plt005) (quadro 3)
TRATAMENTO EFETIVO COM TOTAL PORCENTAGEM
Glicina ou cloroquina 38 76
Glicina e cloroquina 23 46
Glicina apenas 10 20
Cloroquina apenas 5 10
Nenhuma das teacutecnicas 12 24
Quadro 3 - Resultados comparativos entre as teacutecnicas utilizadas
41
Graacutefico 2 - Teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla entre as teacutecnicas aplicadas A- Glicina e Cloroquina B-Cloroquina C-
Glicina ( plt005)
42
6 DISCUSSAtildeO
Os reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA podem ser adquiridos em
forma de kit comercial prontos para uso poreacutem natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil A preparaccedilatildeo
dos reagentes ldquoin houserdquo a partir de sais comerciais adquiridos se mostrou viaacutevel Os
reagentes glicina e o tampatildeo Tris armazenados de forma correta se mantiveram estaacuteveis por
um periacuteodo de 7 meses Somente o reagente EDTA precipitou mesmo armazenado em
condiccedilotildees adequadas sugerindo que o mesmo deve ser preparado em menor quantidade e
armazenado em aliacutequotas A soluccedilatildeo de cloroquina tambeacutem pode ser preparada ldquoin houserdquo e
pode ser armazenado por um mecircs A legislaccedilatildeo brasileira autoriza a utilizaccedilatildeo de reagentes
preparados a partir de sais comerciais como a cloroquina e a glicina-aacutecidaEDTA desde que
os sais tenham autorizaccedilatildeo da vigilacircncia sanitaacuteria para a comercializaccedilatildeo (BRASIL 2001)
A comparaccedilatildeo quanto a efetividade em dissociar anticorpos em amostras com TDA
positivos entre a teacutecnica da glicina e a teacutecnica da cloroquina mostrou que natildeo haacute diferenccedila
estatiacutestica entre elas e que ambas satildeo igualmente eficientes Se utilizadas conjuntamente haacute
maior possibilidade de elucidaccedilatildeo dos casos
Uma vantagem da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eacute que ela permite numa mesma
amostra eluir o anticorpo ligado aacute hemaacutecia assim como fenotipar a hemaacutecia tratada Devido a
sua dupla utilidade a teacutecnica eacute vantajosa principalmente em pacientes em que pouco volume
de amostra pode ser coletado como em casos de crianccedilas e receacutem-nascidos
A fenotipagem poacutes tratamento se mostrou viaacutevel jaacute que os antiacutegenos de maior
importacircncia natildeo sofreram alteraccedilotildees Nas 20 amostras que foram fenotipadas antes e apoacutes
tratamento para verificar a influecircncia dos reagentes na expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a
Jkb S e s natildeo houve destruiccedilatildeo dos mesmos por nenhuma das duas teacutecnicas
Para as amostras positivas para o antiacutegeno Kell (350) e sensibilizadas com o
respectivo anticorpo a teacutecnica da glicina foi efetiva em negativar o TDA em apenas duas
delas mas apoacutes o tratamento foi verificada uma fraca reatividade da reaccedilatildeo antiacutegeno-
anticorpo sugerindo que houve um enfraquecimento da expressatildeo do antiacutegeno conforme
esperado e descrito na literatura (BYRNE 1991 PALLAS WILER E MCGEE 1991
ROZIERS e SQUALI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012 e KATHARIA e
CHAUDHARY 2013) A accedilatildeo da glicina sobre o antigeno Kell natildeo representa impedimento
para seu uso uma vez que na impossibilidade de testar o antiacutegeno Kell o banco de sangue
consegue facilmente atender a solicitaccedilatildeo de transfusatildeo com unidades de hemaacutecias Kell
43
negativas jaacute que eacute um antiacutegeno de baixa prevalecircncia na populaccedilatildeo variando de 15 na
populaccedilatildeo africana a 9 nos europeus (DANIELS 2011)
A soluccedilatildeo resultante da dissociaccedilatildeo do anticorpo pela teacutecnica da glicina pode ainda ser
utilizada como eluato podendo substituir a teacutecnica de eluiccedilatildeo com reagentes comercias (kits
de eluiccedilatildeo aacutecida) que tem alto custo aproximadamente entre R$2000 a R$2500 por teste
Em 41 amostras (82) houve a dissociaccedilatildeo e recuperaccedilatildeo do anticorpo que estava
sensibilizando as hemaacutecias Em 9 amostras (18) os anticorpos foram eluiacutedos poreacutem
apresentaram reaccedilatildeo negativa quando testadas com hemaacutecias de triagem entre eles o anti-E
(6) anti-S (2) e Anti-D (1) Eacute possiacutevel que a correccedilatildeo pH do meio (WALKER 2011) natildeo
tenha sido adequada o que pode ter desfavorecido a reatividade do anticorpo
Para as amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA nas quais natildeo houve dissociaccedilatildeo do
anticorpo pelo primeiro tratamento (1750) o segundo tratamento natildeo se mostrou eficaz jaacute
que 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise O tempo de
armazenagem natildeo parece ter influenciado jaacute que todas as amostras foram testadas dentro de
48 horas apoacutes a coleta Outros fatores que natildeo foram verificados podem ter levado a
hemoacutelise Apesar da literatura (LOUIE JIENG e ZEROULIS 1986 e BYRNE 1991)
recomendar um segundo tratamento ele eacute pouco eficaz tendo negativado apenas 3 das 17
amostras testadas
A amostra de paciente que apresentou sensibilizaccedilatildeo ldquoin vivordquo mostrou melhor
efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA sobre a da cloroquina possibilitando
fenotipagem para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s que natildeo foram destruiacutedos apoacutes o
tratamento comprovado atraveacutes da genotipagem
A presenccedila de autoanticorpo a quente com presenccedila de hemoacutelise (AHAI) ou natildeo pode
mascarar a presenccedila de aloanticorpo interferindo na rotina soroloacutegica da fenotipagem que eacute
uma importante ferramenta para auxiliar na seleccedilatildeo de hemaacutecias para transfusatildeo (SHIREY et
al 2002) Esses pacientes frequentemente possuem aloanticorpos associados ao
autoanticorpo e a prevalecircncia de aloimunizaccedilatildeo entre eles varia entre 12 a 40 (LEGER e
GARRATY 1999 BRANCH e PETZ 1999) o que dificulta ainda mais a escolha do melhor
componente a ser transfundido aleacutem de aumentar a possibilidade reaccedilotildees hemoliacuteticas imunes
poacutes-transfusionais
Nesses casos as teacutecnicas de dissociaccedilatildeo de anticorpos satildeo importantes para tratar
amostras de pacientes e a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser usada como uma opccedilatildeo
pois se mostrou eficaz na dissociaccedilatildeo anticorpo ligado agraves hemaacutecias deixando livre a
superfiacutecie das mesmas permitindo a fenotipagem por antisoros IgG Paralelamente os
44
anticorpos eluiacutedos tambeacutem puderam ser estudados O mesmo natildeo ocorre com a cloroquina
que permite apenas a fenotipagem e tampouco com os kits de eluiccedilatildeo aacutecida disponiacuteveis no
mercado nacional que satildeo destinados a realizaccedilatildeo do eluato mas destroem as hemaacutecias
O tempo de tratamento na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA tambeacutem eacute uma vantagem
pois foi possiacutevel reproduzir no tempo determinado de 2 minutos enquanto a cloroquina
demora ateacute duas horas
Ainda que a aplicaccedilatildeo das teacutecnicas por biologia molecular estejam cada vez mais
presentes na rotina imuno-hematoloacutegica e possibilitam estabelecer o fenoacutetipo deduzido do
genoacutetipo elas natildeo estatildeo disponiacuteveis na maioria dos centros e sua realizaccedilatildeo exige algumas
horas A resoluccedilatildeo imediata do problema transfusional necessita dos resultados soroloacutegicos
pois com frequecircncia natildeo eacute possiacutevel aguardar o resultado do teste molecular Dessa forma
apesar da crescente importacircncia da genotipagem eritrocitaacuteria teacutecnicas soroloacutegicas aplicadas
corretamente e no momento propiacutecio satildeo de grande utilidade para resolver problemas imuno-
hematoloacutegicos como ocorre com a fenotipagem em pacientes com TDA positivo
45
7 CONCLUSAtildeO
A teacutecnica da glicina aacutecidaEDTA mostrou-se efetiva em remover os anticorpos que
sensibilizavam as hemaacutecias e pode ser utilizada com seguranccedila antes da fenotipagem
eritrocitaacuteria Por ser uma teacutecnica de raacutepida execuccedilatildeo eacute uma alternativa aplicaacutevel
principalmente em casos urgentes de pacientes que apresentam autoanticorpos
46
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hemolysis American Journal of Hematology Test of the month 2012
ZAGO M A Apresentaccedilatildeo In Covas D T Ubialli E M A De Santis G C Manual de
Medicina Transfusional 2ordf ed Satildeo Paulo Atheneu 2014
50
9 ANEXOS
51
FUNDACcedilAtildeO HEMOCENTRO DE RIBEIRAtildeO PRETO
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE)
Tiacutetulo da pesquisa Aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina aacutecida-EDTA e avaliaccedilatildeo da
eficaacutecia no tratamento de hemaacutecias com teste direto da antiglobulina positivo
Pesquisadora responsaacutevel Ceacutelia Kazue Abiko
Orientador Prof Dimas Tadeu Covas
Co-orientadora Dra Flaacutevia Leite Souza Santos
Objetivo da pesquisa Vocecirc estaacute sendo convidado a participar de uma pesquisa que tem
como objetivo padronizar uma nova teacutecnica para auxiliar na tipagem sanguiacutenea de pacientes
A tipagem sanguiacutenea pode sofrer interferecircncia da presenccedila de anticorpos ligados aos gloacutebulos
vermelhos do sangue Nessas situaccedilotildees eacute difiacutecil selecionar o melhor sangue para o paciente e
eacute preciso a utilizaccedilatildeo de teacutecnicas adicionais para remover essas interferecircncias
Esta pesquisa tem como objetivo estudar outra teacutecnica para remover esses anticorpos e
comparaacute-la com a teacutecnica atualmente utilizada Para isso precisamos de amostras de pacientes
e doadores voluntaacuterios
Se vocecirc eacute um doador eacute necessaacuterio que vocecirc autorize a coleta de 5 ml (1 tubo) a mais
de seu sangue
Se vocecirc eacute um paciente natildeo haveraacute necessidade de nova amostra pois utilizaremos as
amostras jaacute coletadas para os testes preacute-transfusionais e os resultados encontrados nesta
pesquisa natildeo iratildeo interferir na escolha da (s) bolsa (s) de sangue que vocecirc possa vir a receber
Se vocecirc concordar em participar leia com atenccedilatildeo o texto abaixo e assine as duas vias
rubricando todas as paacuteginas deste termo de consentimento Uma via original assinada e
rubricada por vocecirc e pela pesquisadora ficaraacute com vocecirc
As suas informaccedilotildees seratildeo mantidas em sigilo pela pesquisadora e natildeo haveraacute
armazenamento de material para pesquisas posteriores Os seus dados seratildeo usados apenas
neste estudo e quando o trabalho for publicado seu nome e qualquer outra informaccedilatildeo que
possam identificaacute-lo natildeo seratildeo revelados
Eacute pouco provaacutevel que o que noacutes aprendermos com este estudo tenha um benefiacutecio
direto para vocecirc assim como natildeo poderemos dar nada em troca pela sua participaccedilatildeo na
pesquisa
Nosso objetivo com esta pesquisa eacute que os resultados poderatildeo ser uacuteteis para o
tratamento de pacientes no futuro Os riscos da participaccedilatildeo satildeo miacutenimos Se vocecirc eacute um
doador de sangue a amostra seraacute coletada no momento da doaccedilatildeo natildeo exigindo punccedilatildeo
venosa adicional
52
Eacute seu direito ter acesso aos resultados dos testes da pesquisa Esses resultados natildeo
seratildeo fornecidos automaticamente a vocecirc mas caso vocecirc se interesse em saber o resultado ou
tiver alguma duacutevida sobre a sua participaccedilatildeo neste estudo deveraacute entrar em contato com Ceacutelia
Kazue Abiko pelo telefone (18) 99718-3551
Vocecirc tem total liberdade de optar por natildeo participar da pesquisa Caso aceite
participar poderaacute desistir a qualquer momento ou retirar seu consentimento mesmo apoacutes ter
coletado o sangue Para cancelar sua participaccedilatildeo basta avisar a pesquisadora e os seus dados
seratildeo retirados do projeto
Qualquer duacutevida eacutetica sobre a pesquisa poderaacute entrar em contato com o Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa do Hospital das Cliacutenicas e da Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto
(CAMPUS UNIVERSITAacuteRIO bairro Monte Alegre CEP 14048-900 Ribeiratildeo Preto-SP
Telefone (16) 3602-2228 FAX (16) 3633-1144 e-mail cephcrpuspbr)
Consentimento de participaccedilatildeo
A Consentimento do participante
Li as informaccedilotildees acima sobre o estudo e recebi explicaccedilotildees sobre a participaccedilatildeo no estudo
Portanto dou o meu consentimento para participar do estudo
___________________________________________________________________________
Nome completo
___________________________________________________________________________
Assinatura
___________
Data
__________________________________________________________________________________
Nome completo da pesquisadora
___________________________________________________________________________
Assinatura
_____________
Data
31
Graacutefico 1- Nuacutemero de amostras sesnsibilizadas por especificidade de anticorpo Entre as 50 amostras 12
foram sensibilizadas com anti-D 10 com anti-C 9 com anti-E 8 com anti-c 7 com anti-S 3 com anti-K e 1
com anti-Dia As especificidades dos anticorpos foram definidas de acordo o fenoacutetipo do doador
Figura 5 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com cloroquina Nas amostras onde houve
a dissociaccedilatildeo do anticorpo ( 2 21 a 23 26 39 a 42 45 46 e 49) a hemaacutecia se deposita no fundo no microtubo
apoacutes a centrifugaccedilatildeo (TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (1 3 24 25 43 44 47
48 e 50) o anticorpo ligado agraves hemaacutecias eacute alvo da AGH presente no gel (TDA positivo)
Anti-D 12
Anti-C 10
Anti-E 9
Anti-c 8
Anti-S 7
Anti-K 3 Anti-Dia 1
32
Figura 6 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA Nas amostras
onde houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo (4 6 7 12 a 15 17 34 35 37 e 38) a hemaacutecia se deposita no fundo no
microtubo apoacutes a centrifugaccedilatildeo ( TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (5 16 18
19 20 33 e 36 ) o AGH presente no gel se liga ao anticorpo ligado agraves hemaacutecias que ficam retidas no gel (TDA
positivo)
Tabela 1-Resultado geral do tratamento das hemaacutecias com glicina e cloroquina
Teacutecnica utilizada TDA negativo TDA positivo Total
Glicina-aacutecidaEDTA 33 17 50
Cloroquina 28 22 50
A glicina-aacutecidaEDTA conseguiu negativar mais amostras sensibilizadas com Anti-D
e anti-K que a cloroquina Para as hemaacutecias sensibilizadas com anti-E Anti-S e Anti-Dia
ambas as teacutecnicas dissociaram o anticorpo em 100 das amostras Os resultados detalhados
por especificidade do anticorpo apoacutes o primeiro tratamento com glicina-aacutecidaEDTA e com
cloroquina estatildeo na tabela 2
Para as amostras que permaneceram positivas (17 amostras) apoacutes o tratamento com a
glicina-aacutecidaEDTA foi realizado um novo tratamento Houve dissociaccedilatildeo do anticorpo em 3
amostras (18) apoacutes a segunda tentativa Nas demais 14 (82) amostras tratadas pela
segunda vez 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise
33
Tabela 2 - Resultados do TDA apoacutes tratamento das hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo
sensibilizado
ANTICORPOS
SENSIBILIZADOS
1ordm TRATAMENTO COM
GLICINA
TRATAMENTO COM
CLOROQUINA
TOTAL TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
Anti-D 8 4 0 12 12
Anti-C 6 4 10 0 10
Anti-E 9 0 9 0 9
Anti-c 0 8 1 7 8
Anti-S 7 0 7 0 7
Anti-K 2 1 0 3 3
Anti-Dia 1 0 1 0 1
TOTAL 33 17 28 22 50
A hemoacutelise foi verificada durante o procedimento de lavagem final das hemaacutecias com
soluccedilatildeo fisioloacutegica para a retirada dos reagentes As soluccedilotildees de lavagem ficaram
avermelhadas e as hemaacutecias com coloraccedilatildeo escura As amostras foram descartadas Dentre as
6 amostras que ainda puderam ser testadas para o TDA trecircs amostras negativaram sendo 1
sensibilizada com anti-D e 2 com anti-C (tabela 3)
Tabela 3 - Resultado apoacutes o segundo tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA
Tratamento com
glicina-aacutecidaEDTA
TDA Negativo TDA Positvo Hemoacutelise Total
Segundo tratamento 3 3 11 17
524 TESTAGEM DO ELUATO
Apoacutes o tratamento com a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA a soluccedilatildeo do eluato foi
testada para verificar a viabilidade dos anticorpos que foram dissociados ou eluiacutedos Dentre
as 50 amostras 41 apresentaram eluato positivo As nove amostras cujos eluatos foram
negativos haviam sido sensibilizadas com as seguintes especificidades de anticorpos anti-E 6
amostras (67) anti-S 2 amostras (40) e anti-D 1 amostra (8) (tabela 4) O eluato de
todas as amostras sensibilizadas com os anticorpos anti-C anti-c Anti-K e Anti-Dia foram
positivos Os eluatos positivos na triagem de anticorpos foram testados com paineacuteis de
identificaccedilatildeo para confirmar a especificidade e a viabilidade dos anticorpos (figuras 7 e 8)
34
525 EFEITO DA ELUICcedilAtildeO SOBRE OS ANTIacuteGENOS ERITROCITAacuteRIOS
Para verificar o efeito do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA e com a cloroquina
sobre a expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s foi realizada a fenotipagem das
amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes tratamento com ambas as teacutecnicas Foi avaliado
se o tratamento destruiu os antiacutegenos expressos antes do tratamento
Tabela 4- Resultado do Eluato das amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA
Anticorpos Eluato positvo Eluato negativo Total
Anti-D 11 1 12
Anti-C 10 0 10
Anti-E 3 6 9
Anti-c 8 0 8
Anti-S 5 2 7
Anti-K 3 0 3
Anti-Dia 1 0 1
Total 41 9 50
Figura 7 ndash Painel do eluato da amostra 21 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-C que foi
recuperado no eluato
Figura 8 ndash Painel do eluato da amostra 47 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-K que foi
recuperado no eluato
35
Dentre as 50 amostras 26 eram previamente fenotipadas para os antiacutegenos Fya Fy
b
Jka Jk
b S e s Dentre elas 20 alcanccedilaram TDA negativo apoacutes tratamento com a glicina-
aacutecidaEDTA e 20 negativaram apoacutes tratamento com cloroquina (tabela 5) Apoacutes ambas as
teacutecnicas os antiacutegenos originalmente expressos permaneceram positivos comprovando que natildeo
houve destruiccedilatildeo dos mesmos
Tabela 5 ndash Verificaccedilatildeo da interferecircncia do tratamento da hemaacutecias com cloroquina e glicina-
aacuteicdaEDTA sobre os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
AMOSTRAS
COM
FENOTIPAGEM
PREacuteVIA
TRATADAS COM
CLOROQUINA
TRATADAS COM
GLICINA
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
26
20
20
20
20
As amostras 24 47 e 50 eram positivas para o antiacutegeno K A cloroquina natildeo dissociou
o anticorpo em nenhuma das 3 amostras enquanto a glicina-aacutecidaEDTA foi efetiva nas
amostras 24 e 50 Foi testada a expressatildeo do antiacutegeno K nas amostras 24 e 50 apoacutes o
tratamento utilizando meacutetodo indireto em gel contendo AGH Apesar de natildeo ter sido avaliado
a intensidade de reaccedilatildeo de expressatildeo dos antiacutegenos podemos verificar na figura 9 que nas
duas amostras em que a teacutecnica foi efetiva e dissociou o anticorpo a expressatildeo do antiacutegeno K
continua presente mas a reatividade observada pode ser considerada 1+ sugerindo que houve
diminuiccedilatildeo da expressatildeo do antiacutegeno quando comparado com a expressatildeo observada em
hemaacutecia natildeo tratada
Os resultados individuais de cada amostra em ambas as teacutecnicas encontram-se
resumidas na tabela 6
526 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente onde foi constatada a presenccedila de autoanticorpo
a quente da classe IgG pelo TDA monoespeciacutefico (figura 10)O autoanticorpo tambeacutem
interferia na pesquisa e identificaccedilatildeo de anticorpos irregulares pois apresentava caracteriacutestica
de panaglutinina As hemaacutecias da paciente sensibilizadas ldquoin vivordquo foram tratadas com
cloroquina e com glicina-aacutecidaEDTA
36
Figura 9 ndash Fenotipagem das amostras 24 e 50 para antiacutegeno K apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
O teste positivo indica a presenccedila do antiacutegeno poreacutem a reatividade fraca (1+) sugere que houve enfraquecimento
de sua expressatildeo A direita a expressatildeo forte (4+) do antiacutegeno Kell em hemaacutecia controle natildeo tratada utilizada
como controle positivo
A cloroquina natildeo foi efetiva na retirada do anticorpo ligado as hemaacutecias ao contraacuterio
do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA que dissociou o anticorpo (figura 11)
A hemaacutecia tratada com glicina foi fenotipada para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
(figura 12) A fenotipagem para o sistema Rh (C c E e e) e Kell foi realizada em gel
especiacutefico monoclonal sem interferecircncia do TDA positivo (controle da reaccedilatildeo negativo)
O eluato resultante do tratamento com glicina-aacutecidaEDTA foi testada em gel com
hemaacutecias de painel de identificaccedilatildeo de anticorpos e apresentou resultado positivo com todas
as ceacutelulas (figura 13 e 14)
A amostra foi enviada para genotipagem e o resultado da genotipagem confirmou o
resultado da fenotipagem apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
527 TEMPO DE EXECUCcedilAtildeO DA TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
O tempo de reaccedilatildeo da glicina-aacutecidaEDTA eacute de 2 minutos Todas as amostras foram
tratadas obedecendo ao tempo descrito na literatura demonstrando que o mesmo eacute
reprodutiacutevel
37
Tabela 6- Resultados individuais por amostra
Amostra Especificidade
dos anticorpos
Intensidade do
TDA apoacutes
sensibilizaccedilatildeo
Tratamento
efetivo com
cloroquina
Tratamento
efetivo com
glicina
Eluato
poacutes
glicina
1 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 2 Dia 3+ Sim Sim 3+ 3 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 4 D 4+ Natildeo Sim 4+ 5 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 6 E 3+ Sim Sim Negativo 7 S 4+ Sim Sim 3+ 8 E 3+ Sim Sim 1+ 9 E 3+ Sim Sim 2+
10 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 11 D 4+ Natildeo Sim 4+ 12 D 4+ Natildeo Sim 4+ 13 S 3+ Sim Sim 3+ 14 S 3+ Sim Sim 3+ 15 D 3+ Natildeo Sim 3+ 16 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 17 E 3+ Sim Sim (+) 18 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 19 D 4+ Natildeo Natildeo 3+ 20 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 21 C 3+ Sim Sim 4+ 22 C 3+ Sim Sim 4+ 23 C 3+ Sim Sim 4+ 24 K 4+ Natildeo Sim 4+ 25 D 3+ Natildeo Natildeo Negativo 26 E 4+ Sim Sim Negativo 27 S 3+ Sim Sim 3+ 28 C 3+ Sim Natildeo 4+ 29 C 3+ Sim Sim 4+ 30 C 3+ Sim Sim 4+ 31 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 32 E 3+ Sim Sim Negativo 33 C 3+ Sim Natildeo 4+ 34 S 3+ Sim Sim Negativo 35 S 3+ Sim Sim Negativo 36 C 4+ Sim Natildeo 4+ 37 c 4+ Natildeo Natildeo 4+ 38 D 4+ Natildeo Sim 4+ 39 S 3+ Sim Sim 3+ 40 c 4+ Sim Natildeo 2+ 41 C 4+ Sim Natildeo 4+ 42 E 3+ Sim Sim Negativo 43 D 3+ Natildeo Sim 2+ 44 D 3+ Natildeo Sim 2+ 45 E 3+ Sim Sim Negativo 46 C 3+ Sim Sim 4+ 47 K 4+ Natildeo Natildeo 4+ 48 D 3+ Natildeo Sim 2+ 49 E 3+ Sim Sim Negativo 50 K 4+ Natildeo Sim 4+
TOTAL 50 28 33 41
38
Figura 10 ndash TDA monoespeciacutefico da amostra de paciente Hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo da classe
IgG
oacute Figura 11 ndash TDA apoacutes o tratamento com glicina-aacutecidaEDTA (esquerda) e cloroquina (direita) A glicina
negativou completamente o TDA enquanto a hemaacutecia tratada com cloroquina persistiu positiva (1+)
39
Figura 12 ndash Fenotipagem da amostra tratada com glicina-aacutecidaEDTA Fy(a+b+) Jk(a-b+) S+s+
Figura 13 ndash Painel em gel (LissAGH) do eluato apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de
intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
Figura 14 ndash ndash Painel ezimaacutetico (hemaacutecias tratadas com bromelina) do eluato em gel neutro apoacutes
tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
40
528 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Quanto a efetividade das teacutecnicas em negativar o TDA foi verificado que a glicina-
aacutecidaEDTA foi efetiva em 66 das amostras testadas no primeiro tratamento (3350
amostras) enquanto a cloroquina conseguiu negativar 56 (2850) Esses resultados natildeo
apresentam diferenccedila significativa (pgt005) demostrando que a teacutecnica da glicina-
aacutecidaEDTA natildeo eacute superior mas eacute tatildeo efetiva quanto a da cloroquina
Quando aliamos os resultados de ambas as teacutecnicas verificamos que em 76 (3850)
das amostras o TDA foi negativado Esse dado indica que ainda que uma teacutecnica natildeo seja
eficaz na remoccedilatildeo do anticorpo eacute uma boa alternativa tentar a segunda teacutecnica jaacute que a falha
em remover o anticorpo utilizando uma delas natildeo prevecirc necessariamente a falha com a outra
Quando se utiliza o teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla (graacutefico 2) para comparar a utilizaccedilatildeo das
duas teacutecnicas com o resultado de cada uma isolada (somente a cloroquina ou somente a
glicina) verificamos que os resultados apresentam diferenccedila significativa (plt005) (quadro 3)
TRATAMENTO EFETIVO COM TOTAL PORCENTAGEM
Glicina ou cloroquina 38 76
Glicina e cloroquina 23 46
Glicina apenas 10 20
Cloroquina apenas 5 10
Nenhuma das teacutecnicas 12 24
Quadro 3 - Resultados comparativos entre as teacutecnicas utilizadas
41
Graacutefico 2 - Teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla entre as teacutecnicas aplicadas A- Glicina e Cloroquina B-Cloroquina C-
Glicina ( plt005)
42
6 DISCUSSAtildeO
Os reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA podem ser adquiridos em
forma de kit comercial prontos para uso poreacutem natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil A preparaccedilatildeo
dos reagentes ldquoin houserdquo a partir de sais comerciais adquiridos se mostrou viaacutevel Os
reagentes glicina e o tampatildeo Tris armazenados de forma correta se mantiveram estaacuteveis por
um periacuteodo de 7 meses Somente o reagente EDTA precipitou mesmo armazenado em
condiccedilotildees adequadas sugerindo que o mesmo deve ser preparado em menor quantidade e
armazenado em aliacutequotas A soluccedilatildeo de cloroquina tambeacutem pode ser preparada ldquoin houserdquo e
pode ser armazenado por um mecircs A legislaccedilatildeo brasileira autoriza a utilizaccedilatildeo de reagentes
preparados a partir de sais comerciais como a cloroquina e a glicina-aacutecidaEDTA desde que
os sais tenham autorizaccedilatildeo da vigilacircncia sanitaacuteria para a comercializaccedilatildeo (BRASIL 2001)
A comparaccedilatildeo quanto a efetividade em dissociar anticorpos em amostras com TDA
positivos entre a teacutecnica da glicina e a teacutecnica da cloroquina mostrou que natildeo haacute diferenccedila
estatiacutestica entre elas e que ambas satildeo igualmente eficientes Se utilizadas conjuntamente haacute
maior possibilidade de elucidaccedilatildeo dos casos
Uma vantagem da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eacute que ela permite numa mesma
amostra eluir o anticorpo ligado aacute hemaacutecia assim como fenotipar a hemaacutecia tratada Devido a
sua dupla utilidade a teacutecnica eacute vantajosa principalmente em pacientes em que pouco volume
de amostra pode ser coletado como em casos de crianccedilas e receacutem-nascidos
A fenotipagem poacutes tratamento se mostrou viaacutevel jaacute que os antiacutegenos de maior
importacircncia natildeo sofreram alteraccedilotildees Nas 20 amostras que foram fenotipadas antes e apoacutes
tratamento para verificar a influecircncia dos reagentes na expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a
Jkb S e s natildeo houve destruiccedilatildeo dos mesmos por nenhuma das duas teacutecnicas
Para as amostras positivas para o antiacutegeno Kell (350) e sensibilizadas com o
respectivo anticorpo a teacutecnica da glicina foi efetiva em negativar o TDA em apenas duas
delas mas apoacutes o tratamento foi verificada uma fraca reatividade da reaccedilatildeo antiacutegeno-
anticorpo sugerindo que houve um enfraquecimento da expressatildeo do antiacutegeno conforme
esperado e descrito na literatura (BYRNE 1991 PALLAS WILER E MCGEE 1991
ROZIERS e SQUALI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012 e KATHARIA e
CHAUDHARY 2013) A accedilatildeo da glicina sobre o antigeno Kell natildeo representa impedimento
para seu uso uma vez que na impossibilidade de testar o antiacutegeno Kell o banco de sangue
consegue facilmente atender a solicitaccedilatildeo de transfusatildeo com unidades de hemaacutecias Kell
43
negativas jaacute que eacute um antiacutegeno de baixa prevalecircncia na populaccedilatildeo variando de 15 na
populaccedilatildeo africana a 9 nos europeus (DANIELS 2011)
A soluccedilatildeo resultante da dissociaccedilatildeo do anticorpo pela teacutecnica da glicina pode ainda ser
utilizada como eluato podendo substituir a teacutecnica de eluiccedilatildeo com reagentes comercias (kits
de eluiccedilatildeo aacutecida) que tem alto custo aproximadamente entre R$2000 a R$2500 por teste
Em 41 amostras (82) houve a dissociaccedilatildeo e recuperaccedilatildeo do anticorpo que estava
sensibilizando as hemaacutecias Em 9 amostras (18) os anticorpos foram eluiacutedos poreacutem
apresentaram reaccedilatildeo negativa quando testadas com hemaacutecias de triagem entre eles o anti-E
(6) anti-S (2) e Anti-D (1) Eacute possiacutevel que a correccedilatildeo pH do meio (WALKER 2011) natildeo
tenha sido adequada o que pode ter desfavorecido a reatividade do anticorpo
Para as amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA nas quais natildeo houve dissociaccedilatildeo do
anticorpo pelo primeiro tratamento (1750) o segundo tratamento natildeo se mostrou eficaz jaacute
que 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise O tempo de
armazenagem natildeo parece ter influenciado jaacute que todas as amostras foram testadas dentro de
48 horas apoacutes a coleta Outros fatores que natildeo foram verificados podem ter levado a
hemoacutelise Apesar da literatura (LOUIE JIENG e ZEROULIS 1986 e BYRNE 1991)
recomendar um segundo tratamento ele eacute pouco eficaz tendo negativado apenas 3 das 17
amostras testadas
A amostra de paciente que apresentou sensibilizaccedilatildeo ldquoin vivordquo mostrou melhor
efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA sobre a da cloroquina possibilitando
fenotipagem para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s que natildeo foram destruiacutedos apoacutes o
tratamento comprovado atraveacutes da genotipagem
A presenccedila de autoanticorpo a quente com presenccedila de hemoacutelise (AHAI) ou natildeo pode
mascarar a presenccedila de aloanticorpo interferindo na rotina soroloacutegica da fenotipagem que eacute
uma importante ferramenta para auxiliar na seleccedilatildeo de hemaacutecias para transfusatildeo (SHIREY et
al 2002) Esses pacientes frequentemente possuem aloanticorpos associados ao
autoanticorpo e a prevalecircncia de aloimunizaccedilatildeo entre eles varia entre 12 a 40 (LEGER e
GARRATY 1999 BRANCH e PETZ 1999) o que dificulta ainda mais a escolha do melhor
componente a ser transfundido aleacutem de aumentar a possibilidade reaccedilotildees hemoliacuteticas imunes
poacutes-transfusionais
Nesses casos as teacutecnicas de dissociaccedilatildeo de anticorpos satildeo importantes para tratar
amostras de pacientes e a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser usada como uma opccedilatildeo
pois se mostrou eficaz na dissociaccedilatildeo anticorpo ligado agraves hemaacutecias deixando livre a
superfiacutecie das mesmas permitindo a fenotipagem por antisoros IgG Paralelamente os
44
anticorpos eluiacutedos tambeacutem puderam ser estudados O mesmo natildeo ocorre com a cloroquina
que permite apenas a fenotipagem e tampouco com os kits de eluiccedilatildeo aacutecida disponiacuteveis no
mercado nacional que satildeo destinados a realizaccedilatildeo do eluato mas destroem as hemaacutecias
O tempo de tratamento na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA tambeacutem eacute uma vantagem
pois foi possiacutevel reproduzir no tempo determinado de 2 minutos enquanto a cloroquina
demora ateacute duas horas
Ainda que a aplicaccedilatildeo das teacutecnicas por biologia molecular estejam cada vez mais
presentes na rotina imuno-hematoloacutegica e possibilitam estabelecer o fenoacutetipo deduzido do
genoacutetipo elas natildeo estatildeo disponiacuteveis na maioria dos centros e sua realizaccedilatildeo exige algumas
horas A resoluccedilatildeo imediata do problema transfusional necessita dos resultados soroloacutegicos
pois com frequecircncia natildeo eacute possiacutevel aguardar o resultado do teste molecular Dessa forma
apesar da crescente importacircncia da genotipagem eritrocitaacuteria teacutecnicas soroloacutegicas aplicadas
corretamente e no momento propiacutecio satildeo de grande utilidade para resolver problemas imuno-
hematoloacutegicos como ocorre com a fenotipagem em pacientes com TDA positivo
45
7 CONCLUSAtildeO
A teacutecnica da glicina aacutecidaEDTA mostrou-se efetiva em remover os anticorpos que
sensibilizavam as hemaacutecias e pode ser utilizada com seguranccedila antes da fenotipagem
eritrocitaacuteria Por ser uma teacutecnica de raacutepida execuccedilatildeo eacute uma alternativa aplicaacutevel
principalmente em casos urgentes de pacientes que apresentam autoanticorpos
46
8 REFEREcircNCIA BIBLIOGRAacuteFICA
ABBAS A LICHTMAN A H e PILLAI S Imunologia Celular e Molecular 6ordf ed Rio
de Janeiro Elsevier 2008 p 75-96
BARJAS-CASTRO M L Imuno-Hematologia do Doador e do Receptor In Teacutecnico em
Hemoterapia livro textoMinisteacuterio da Sauacutede Brasiacutelia 2013 p 143-170
BRANCH D R PETZ L D A new reagent (ZZAP) having multiple applications in
immunohematology American Journal of Clinical Pathology Baltimore v 78 n 2 p
161-167 aug 1982
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50
9 ANEXOS
51
FUNDACcedilAtildeO HEMOCENTRO DE RIBEIRAtildeO PRETO
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE)
Tiacutetulo da pesquisa Aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina aacutecida-EDTA e avaliaccedilatildeo da
eficaacutecia no tratamento de hemaacutecias com teste direto da antiglobulina positivo
Pesquisadora responsaacutevel Ceacutelia Kazue Abiko
Orientador Prof Dimas Tadeu Covas
Co-orientadora Dra Flaacutevia Leite Souza Santos
Objetivo da pesquisa Vocecirc estaacute sendo convidado a participar de uma pesquisa que tem
como objetivo padronizar uma nova teacutecnica para auxiliar na tipagem sanguiacutenea de pacientes
A tipagem sanguiacutenea pode sofrer interferecircncia da presenccedila de anticorpos ligados aos gloacutebulos
vermelhos do sangue Nessas situaccedilotildees eacute difiacutecil selecionar o melhor sangue para o paciente e
eacute preciso a utilizaccedilatildeo de teacutecnicas adicionais para remover essas interferecircncias
Esta pesquisa tem como objetivo estudar outra teacutecnica para remover esses anticorpos e
comparaacute-la com a teacutecnica atualmente utilizada Para isso precisamos de amostras de pacientes
e doadores voluntaacuterios
Se vocecirc eacute um doador eacute necessaacuterio que vocecirc autorize a coleta de 5 ml (1 tubo) a mais
de seu sangue
Se vocecirc eacute um paciente natildeo haveraacute necessidade de nova amostra pois utilizaremos as
amostras jaacute coletadas para os testes preacute-transfusionais e os resultados encontrados nesta
pesquisa natildeo iratildeo interferir na escolha da (s) bolsa (s) de sangue que vocecirc possa vir a receber
Se vocecirc concordar em participar leia com atenccedilatildeo o texto abaixo e assine as duas vias
rubricando todas as paacuteginas deste termo de consentimento Uma via original assinada e
rubricada por vocecirc e pela pesquisadora ficaraacute com vocecirc
As suas informaccedilotildees seratildeo mantidas em sigilo pela pesquisadora e natildeo haveraacute
armazenamento de material para pesquisas posteriores Os seus dados seratildeo usados apenas
neste estudo e quando o trabalho for publicado seu nome e qualquer outra informaccedilatildeo que
possam identificaacute-lo natildeo seratildeo revelados
Eacute pouco provaacutevel que o que noacutes aprendermos com este estudo tenha um benefiacutecio
direto para vocecirc assim como natildeo poderemos dar nada em troca pela sua participaccedilatildeo na
pesquisa
Nosso objetivo com esta pesquisa eacute que os resultados poderatildeo ser uacuteteis para o
tratamento de pacientes no futuro Os riscos da participaccedilatildeo satildeo miacutenimos Se vocecirc eacute um
doador de sangue a amostra seraacute coletada no momento da doaccedilatildeo natildeo exigindo punccedilatildeo
venosa adicional
52
Eacute seu direito ter acesso aos resultados dos testes da pesquisa Esses resultados natildeo
seratildeo fornecidos automaticamente a vocecirc mas caso vocecirc se interesse em saber o resultado ou
tiver alguma duacutevida sobre a sua participaccedilatildeo neste estudo deveraacute entrar em contato com Ceacutelia
Kazue Abiko pelo telefone (18) 99718-3551
Vocecirc tem total liberdade de optar por natildeo participar da pesquisa Caso aceite
participar poderaacute desistir a qualquer momento ou retirar seu consentimento mesmo apoacutes ter
coletado o sangue Para cancelar sua participaccedilatildeo basta avisar a pesquisadora e os seus dados
seratildeo retirados do projeto
Qualquer duacutevida eacutetica sobre a pesquisa poderaacute entrar em contato com o Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa do Hospital das Cliacutenicas e da Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto
(CAMPUS UNIVERSITAacuteRIO bairro Monte Alegre CEP 14048-900 Ribeiratildeo Preto-SP
Telefone (16) 3602-2228 FAX (16) 3633-1144 e-mail cephcrpuspbr)
Consentimento de participaccedilatildeo
A Consentimento do participante
Li as informaccedilotildees acima sobre o estudo e recebi explicaccedilotildees sobre a participaccedilatildeo no estudo
Portanto dou o meu consentimento para participar do estudo
___________________________________________________________________________
Nome completo
___________________________________________________________________________
Assinatura
___________
Data
__________________________________________________________________________________
Nome completo da pesquisadora
___________________________________________________________________________
Assinatura
_____________
Data
32
Figura 6 ndash Resultados do TDA apoacutes o tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA Nas amostras
onde houve a dissociaccedilatildeo do anticorpo (4 6 7 12 a 15 17 34 35 37 e 38) a hemaacutecia se deposita no fundo no
microtubo apoacutes a centrifugaccedilatildeo ( TDA negativo) As amostras em que a dissociaccedilatildeo natildeo foi efetiva (5 16 18
19 20 33 e 36 ) o AGH presente no gel se liga ao anticorpo ligado agraves hemaacutecias que ficam retidas no gel (TDA
positivo)
Tabela 1-Resultado geral do tratamento das hemaacutecias com glicina e cloroquina
Teacutecnica utilizada TDA negativo TDA positivo Total
Glicina-aacutecidaEDTA 33 17 50
Cloroquina 28 22 50
A glicina-aacutecidaEDTA conseguiu negativar mais amostras sensibilizadas com Anti-D
e anti-K que a cloroquina Para as hemaacutecias sensibilizadas com anti-E Anti-S e Anti-Dia
ambas as teacutecnicas dissociaram o anticorpo em 100 das amostras Os resultados detalhados
por especificidade do anticorpo apoacutes o primeiro tratamento com glicina-aacutecidaEDTA e com
cloroquina estatildeo na tabela 2
Para as amostras que permaneceram positivas (17 amostras) apoacutes o tratamento com a
glicina-aacutecidaEDTA foi realizado um novo tratamento Houve dissociaccedilatildeo do anticorpo em 3
amostras (18) apoacutes a segunda tentativa Nas demais 14 (82) amostras tratadas pela
segunda vez 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise
33
Tabela 2 - Resultados do TDA apoacutes tratamento das hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo
sensibilizado
ANTICORPOS
SENSIBILIZADOS
1ordm TRATAMENTO COM
GLICINA
TRATAMENTO COM
CLOROQUINA
TOTAL TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
Anti-D 8 4 0 12 12
Anti-C 6 4 10 0 10
Anti-E 9 0 9 0 9
Anti-c 0 8 1 7 8
Anti-S 7 0 7 0 7
Anti-K 2 1 0 3 3
Anti-Dia 1 0 1 0 1
TOTAL 33 17 28 22 50
A hemoacutelise foi verificada durante o procedimento de lavagem final das hemaacutecias com
soluccedilatildeo fisioloacutegica para a retirada dos reagentes As soluccedilotildees de lavagem ficaram
avermelhadas e as hemaacutecias com coloraccedilatildeo escura As amostras foram descartadas Dentre as
6 amostras que ainda puderam ser testadas para o TDA trecircs amostras negativaram sendo 1
sensibilizada com anti-D e 2 com anti-C (tabela 3)
Tabela 3 - Resultado apoacutes o segundo tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA
Tratamento com
glicina-aacutecidaEDTA
TDA Negativo TDA Positvo Hemoacutelise Total
Segundo tratamento 3 3 11 17
524 TESTAGEM DO ELUATO
Apoacutes o tratamento com a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA a soluccedilatildeo do eluato foi
testada para verificar a viabilidade dos anticorpos que foram dissociados ou eluiacutedos Dentre
as 50 amostras 41 apresentaram eluato positivo As nove amostras cujos eluatos foram
negativos haviam sido sensibilizadas com as seguintes especificidades de anticorpos anti-E 6
amostras (67) anti-S 2 amostras (40) e anti-D 1 amostra (8) (tabela 4) O eluato de
todas as amostras sensibilizadas com os anticorpos anti-C anti-c Anti-K e Anti-Dia foram
positivos Os eluatos positivos na triagem de anticorpos foram testados com paineacuteis de
identificaccedilatildeo para confirmar a especificidade e a viabilidade dos anticorpos (figuras 7 e 8)
34
525 EFEITO DA ELUICcedilAtildeO SOBRE OS ANTIacuteGENOS ERITROCITAacuteRIOS
Para verificar o efeito do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA e com a cloroquina
sobre a expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s foi realizada a fenotipagem das
amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes tratamento com ambas as teacutecnicas Foi avaliado
se o tratamento destruiu os antiacutegenos expressos antes do tratamento
Tabela 4- Resultado do Eluato das amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA
Anticorpos Eluato positvo Eluato negativo Total
Anti-D 11 1 12
Anti-C 10 0 10
Anti-E 3 6 9
Anti-c 8 0 8
Anti-S 5 2 7
Anti-K 3 0 3
Anti-Dia 1 0 1
Total 41 9 50
Figura 7 ndash Painel do eluato da amostra 21 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-C que foi
recuperado no eluato
Figura 8 ndash Painel do eluato da amostra 47 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-K que foi
recuperado no eluato
35
Dentre as 50 amostras 26 eram previamente fenotipadas para os antiacutegenos Fya Fy
b
Jka Jk
b S e s Dentre elas 20 alcanccedilaram TDA negativo apoacutes tratamento com a glicina-
aacutecidaEDTA e 20 negativaram apoacutes tratamento com cloroquina (tabela 5) Apoacutes ambas as
teacutecnicas os antiacutegenos originalmente expressos permaneceram positivos comprovando que natildeo
houve destruiccedilatildeo dos mesmos
Tabela 5 ndash Verificaccedilatildeo da interferecircncia do tratamento da hemaacutecias com cloroquina e glicina-
aacuteicdaEDTA sobre os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
AMOSTRAS
COM
FENOTIPAGEM
PREacuteVIA
TRATADAS COM
CLOROQUINA
TRATADAS COM
GLICINA
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
26
20
20
20
20
As amostras 24 47 e 50 eram positivas para o antiacutegeno K A cloroquina natildeo dissociou
o anticorpo em nenhuma das 3 amostras enquanto a glicina-aacutecidaEDTA foi efetiva nas
amostras 24 e 50 Foi testada a expressatildeo do antiacutegeno K nas amostras 24 e 50 apoacutes o
tratamento utilizando meacutetodo indireto em gel contendo AGH Apesar de natildeo ter sido avaliado
a intensidade de reaccedilatildeo de expressatildeo dos antiacutegenos podemos verificar na figura 9 que nas
duas amostras em que a teacutecnica foi efetiva e dissociou o anticorpo a expressatildeo do antiacutegeno K
continua presente mas a reatividade observada pode ser considerada 1+ sugerindo que houve
diminuiccedilatildeo da expressatildeo do antiacutegeno quando comparado com a expressatildeo observada em
hemaacutecia natildeo tratada
Os resultados individuais de cada amostra em ambas as teacutecnicas encontram-se
resumidas na tabela 6
526 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente onde foi constatada a presenccedila de autoanticorpo
a quente da classe IgG pelo TDA monoespeciacutefico (figura 10)O autoanticorpo tambeacutem
interferia na pesquisa e identificaccedilatildeo de anticorpos irregulares pois apresentava caracteriacutestica
de panaglutinina As hemaacutecias da paciente sensibilizadas ldquoin vivordquo foram tratadas com
cloroquina e com glicina-aacutecidaEDTA
36
Figura 9 ndash Fenotipagem das amostras 24 e 50 para antiacutegeno K apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
O teste positivo indica a presenccedila do antiacutegeno poreacutem a reatividade fraca (1+) sugere que houve enfraquecimento
de sua expressatildeo A direita a expressatildeo forte (4+) do antiacutegeno Kell em hemaacutecia controle natildeo tratada utilizada
como controle positivo
A cloroquina natildeo foi efetiva na retirada do anticorpo ligado as hemaacutecias ao contraacuterio
do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA que dissociou o anticorpo (figura 11)
A hemaacutecia tratada com glicina foi fenotipada para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
(figura 12) A fenotipagem para o sistema Rh (C c E e e) e Kell foi realizada em gel
especiacutefico monoclonal sem interferecircncia do TDA positivo (controle da reaccedilatildeo negativo)
O eluato resultante do tratamento com glicina-aacutecidaEDTA foi testada em gel com
hemaacutecias de painel de identificaccedilatildeo de anticorpos e apresentou resultado positivo com todas
as ceacutelulas (figura 13 e 14)
A amostra foi enviada para genotipagem e o resultado da genotipagem confirmou o
resultado da fenotipagem apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
527 TEMPO DE EXECUCcedilAtildeO DA TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
O tempo de reaccedilatildeo da glicina-aacutecidaEDTA eacute de 2 minutos Todas as amostras foram
tratadas obedecendo ao tempo descrito na literatura demonstrando que o mesmo eacute
reprodutiacutevel
37
Tabela 6- Resultados individuais por amostra
Amostra Especificidade
dos anticorpos
Intensidade do
TDA apoacutes
sensibilizaccedilatildeo
Tratamento
efetivo com
cloroquina
Tratamento
efetivo com
glicina
Eluato
poacutes
glicina
1 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 2 Dia 3+ Sim Sim 3+ 3 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 4 D 4+ Natildeo Sim 4+ 5 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 6 E 3+ Sim Sim Negativo 7 S 4+ Sim Sim 3+ 8 E 3+ Sim Sim 1+ 9 E 3+ Sim Sim 2+
10 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 11 D 4+ Natildeo Sim 4+ 12 D 4+ Natildeo Sim 4+ 13 S 3+ Sim Sim 3+ 14 S 3+ Sim Sim 3+ 15 D 3+ Natildeo Sim 3+ 16 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 17 E 3+ Sim Sim (+) 18 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 19 D 4+ Natildeo Natildeo 3+ 20 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 21 C 3+ Sim Sim 4+ 22 C 3+ Sim Sim 4+ 23 C 3+ Sim Sim 4+ 24 K 4+ Natildeo Sim 4+ 25 D 3+ Natildeo Natildeo Negativo 26 E 4+ Sim Sim Negativo 27 S 3+ Sim Sim 3+ 28 C 3+ Sim Natildeo 4+ 29 C 3+ Sim Sim 4+ 30 C 3+ Sim Sim 4+ 31 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 32 E 3+ Sim Sim Negativo 33 C 3+ Sim Natildeo 4+ 34 S 3+ Sim Sim Negativo 35 S 3+ Sim Sim Negativo 36 C 4+ Sim Natildeo 4+ 37 c 4+ Natildeo Natildeo 4+ 38 D 4+ Natildeo Sim 4+ 39 S 3+ Sim Sim 3+ 40 c 4+ Sim Natildeo 2+ 41 C 4+ Sim Natildeo 4+ 42 E 3+ Sim Sim Negativo 43 D 3+ Natildeo Sim 2+ 44 D 3+ Natildeo Sim 2+ 45 E 3+ Sim Sim Negativo 46 C 3+ Sim Sim 4+ 47 K 4+ Natildeo Natildeo 4+ 48 D 3+ Natildeo Sim 2+ 49 E 3+ Sim Sim Negativo 50 K 4+ Natildeo Sim 4+
TOTAL 50 28 33 41
38
Figura 10 ndash TDA monoespeciacutefico da amostra de paciente Hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo da classe
IgG
oacute Figura 11 ndash TDA apoacutes o tratamento com glicina-aacutecidaEDTA (esquerda) e cloroquina (direita) A glicina
negativou completamente o TDA enquanto a hemaacutecia tratada com cloroquina persistiu positiva (1+)
39
Figura 12 ndash Fenotipagem da amostra tratada com glicina-aacutecidaEDTA Fy(a+b+) Jk(a-b+) S+s+
Figura 13 ndash Painel em gel (LissAGH) do eluato apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de
intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
Figura 14 ndash ndash Painel ezimaacutetico (hemaacutecias tratadas com bromelina) do eluato em gel neutro apoacutes
tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
40
528 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Quanto a efetividade das teacutecnicas em negativar o TDA foi verificado que a glicina-
aacutecidaEDTA foi efetiva em 66 das amostras testadas no primeiro tratamento (3350
amostras) enquanto a cloroquina conseguiu negativar 56 (2850) Esses resultados natildeo
apresentam diferenccedila significativa (pgt005) demostrando que a teacutecnica da glicina-
aacutecidaEDTA natildeo eacute superior mas eacute tatildeo efetiva quanto a da cloroquina
Quando aliamos os resultados de ambas as teacutecnicas verificamos que em 76 (3850)
das amostras o TDA foi negativado Esse dado indica que ainda que uma teacutecnica natildeo seja
eficaz na remoccedilatildeo do anticorpo eacute uma boa alternativa tentar a segunda teacutecnica jaacute que a falha
em remover o anticorpo utilizando uma delas natildeo prevecirc necessariamente a falha com a outra
Quando se utiliza o teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla (graacutefico 2) para comparar a utilizaccedilatildeo das
duas teacutecnicas com o resultado de cada uma isolada (somente a cloroquina ou somente a
glicina) verificamos que os resultados apresentam diferenccedila significativa (plt005) (quadro 3)
TRATAMENTO EFETIVO COM TOTAL PORCENTAGEM
Glicina ou cloroquina 38 76
Glicina e cloroquina 23 46
Glicina apenas 10 20
Cloroquina apenas 5 10
Nenhuma das teacutecnicas 12 24
Quadro 3 - Resultados comparativos entre as teacutecnicas utilizadas
41
Graacutefico 2 - Teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla entre as teacutecnicas aplicadas A- Glicina e Cloroquina B-Cloroquina C-
Glicina ( plt005)
42
6 DISCUSSAtildeO
Os reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA podem ser adquiridos em
forma de kit comercial prontos para uso poreacutem natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil A preparaccedilatildeo
dos reagentes ldquoin houserdquo a partir de sais comerciais adquiridos se mostrou viaacutevel Os
reagentes glicina e o tampatildeo Tris armazenados de forma correta se mantiveram estaacuteveis por
um periacuteodo de 7 meses Somente o reagente EDTA precipitou mesmo armazenado em
condiccedilotildees adequadas sugerindo que o mesmo deve ser preparado em menor quantidade e
armazenado em aliacutequotas A soluccedilatildeo de cloroquina tambeacutem pode ser preparada ldquoin houserdquo e
pode ser armazenado por um mecircs A legislaccedilatildeo brasileira autoriza a utilizaccedilatildeo de reagentes
preparados a partir de sais comerciais como a cloroquina e a glicina-aacutecidaEDTA desde que
os sais tenham autorizaccedilatildeo da vigilacircncia sanitaacuteria para a comercializaccedilatildeo (BRASIL 2001)
A comparaccedilatildeo quanto a efetividade em dissociar anticorpos em amostras com TDA
positivos entre a teacutecnica da glicina e a teacutecnica da cloroquina mostrou que natildeo haacute diferenccedila
estatiacutestica entre elas e que ambas satildeo igualmente eficientes Se utilizadas conjuntamente haacute
maior possibilidade de elucidaccedilatildeo dos casos
Uma vantagem da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eacute que ela permite numa mesma
amostra eluir o anticorpo ligado aacute hemaacutecia assim como fenotipar a hemaacutecia tratada Devido a
sua dupla utilidade a teacutecnica eacute vantajosa principalmente em pacientes em que pouco volume
de amostra pode ser coletado como em casos de crianccedilas e receacutem-nascidos
A fenotipagem poacutes tratamento se mostrou viaacutevel jaacute que os antiacutegenos de maior
importacircncia natildeo sofreram alteraccedilotildees Nas 20 amostras que foram fenotipadas antes e apoacutes
tratamento para verificar a influecircncia dos reagentes na expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a
Jkb S e s natildeo houve destruiccedilatildeo dos mesmos por nenhuma das duas teacutecnicas
Para as amostras positivas para o antiacutegeno Kell (350) e sensibilizadas com o
respectivo anticorpo a teacutecnica da glicina foi efetiva em negativar o TDA em apenas duas
delas mas apoacutes o tratamento foi verificada uma fraca reatividade da reaccedilatildeo antiacutegeno-
anticorpo sugerindo que houve um enfraquecimento da expressatildeo do antiacutegeno conforme
esperado e descrito na literatura (BYRNE 1991 PALLAS WILER E MCGEE 1991
ROZIERS e SQUALI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012 e KATHARIA e
CHAUDHARY 2013) A accedilatildeo da glicina sobre o antigeno Kell natildeo representa impedimento
para seu uso uma vez que na impossibilidade de testar o antiacutegeno Kell o banco de sangue
consegue facilmente atender a solicitaccedilatildeo de transfusatildeo com unidades de hemaacutecias Kell
43
negativas jaacute que eacute um antiacutegeno de baixa prevalecircncia na populaccedilatildeo variando de 15 na
populaccedilatildeo africana a 9 nos europeus (DANIELS 2011)
A soluccedilatildeo resultante da dissociaccedilatildeo do anticorpo pela teacutecnica da glicina pode ainda ser
utilizada como eluato podendo substituir a teacutecnica de eluiccedilatildeo com reagentes comercias (kits
de eluiccedilatildeo aacutecida) que tem alto custo aproximadamente entre R$2000 a R$2500 por teste
Em 41 amostras (82) houve a dissociaccedilatildeo e recuperaccedilatildeo do anticorpo que estava
sensibilizando as hemaacutecias Em 9 amostras (18) os anticorpos foram eluiacutedos poreacutem
apresentaram reaccedilatildeo negativa quando testadas com hemaacutecias de triagem entre eles o anti-E
(6) anti-S (2) e Anti-D (1) Eacute possiacutevel que a correccedilatildeo pH do meio (WALKER 2011) natildeo
tenha sido adequada o que pode ter desfavorecido a reatividade do anticorpo
Para as amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA nas quais natildeo houve dissociaccedilatildeo do
anticorpo pelo primeiro tratamento (1750) o segundo tratamento natildeo se mostrou eficaz jaacute
que 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise O tempo de
armazenagem natildeo parece ter influenciado jaacute que todas as amostras foram testadas dentro de
48 horas apoacutes a coleta Outros fatores que natildeo foram verificados podem ter levado a
hemoacutelise Apesar da literatura (LOUIE JIENG e ZEROULIS 1986 e BYRNE 1991)
recomendar um segundo tratamento ele eacute pouco eficaz tendo negativado apenas 3 das 17
amostras testadas
A amostra de paciente que apresentou sensibilizaccedilatildeo ldquoin vivordquo mostrou melhor
efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA sobre a da cloroquina possibilitando
fenotipagem para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s que natildeo foram destruiacutedos apoacutes o
tratamento comprovado atraveacutes da genotipagem
A presenccedila de autoanticorpo a quente com presenccedila de hemoacutelise (AHAI) ou natildeo pode
mascarar a presenccedila de aloanticorpo interferindo na rotina soroloacutegica da fenotipagem que eacute
uma importante ferramenta para auxiliar na seleccedilatildeo de hemaacutecias para transfusatildeo (SHIREY et
al 2002) Esses pacientes frequentemente possuem aloanticorpos associados ao
autoanticorpo e a prevalecircncia de aloimunizaccedilatildeo entre eles varia entre 12 a 40 (LEGER e
GARRATY 1999 BRANCH e PETZ 1999) o que dificulta ainda mais a escolha do melhor
componente a ser transfundido aleacutem de aumentar a possibilidade reaccedilotildees hemoliacuteticas imunes
poacutes-transfusionais
Nesses casos as teacutecnicas de dissociaccedilatildeo de anticorpos satildeo importantes para tratar
amostras de pacientes e a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser usada como uma opccedilatildeo
pois se mostrou eficaz na dissociaccedilatildeo anticorpo ligado agraves hemaacutecias deixando livre a
superfiacutecie das mesmas permitindo a fenotipagem por antisoros IgG Paralelamente os
44
anticorpos eluiacutedos tambeacutem puderam ser estudados O mesmo natildeo ocorre com a cloroquina
que permite apenas a fenotipagem e tampouco com os kits de eluiccedilatildeo aacutecida disponiacuteveis no
mercado nacional que satildeo destinados a realizaccedilatildeo do eluato mas destroem as hemaacutecias
O tempo de tratamento na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA tambeacutem eacute uma vantagem
pois foi possiacutevel reproduzir no tempo determinado de 2 minutos enquanto a cloroquina
demora ateacute duas horas
Ainda que a aplicaccedilatildeo das teacutecnicas por biologia molecular estejam cada vez mais
presentes na rotina imuno-hematoloacutegica e possibilitam estabelecer o fenoacutetipo deduzido do
genoacutetipo elas natildeo estatildeo disponiacuteveis na maioria dos centros e sua realizaccedilatildeo exige algumas
horas A resoluccedilatildeo imediata do problema transfusional necessita dos resultados soroloacutegicos
pois com frequecircncia natildeo eacute possiacutevel aguardar o resultado do teste molecular Dessa forma
apesar da crescente importacircncia da genotipagem eritrocitaacuteria teacutecnicas soroloacutegicas aplicadas
corretamente e no momento propiacutecio satildeo de grande utilidade para resolver problemas imuno-
hematoloacutegicos como ocorre com a fenotipagem em pacientes com TDA positivo
45
7 CONCLUSAtildeO
A teacutecnica da glicina aacutecidaEDTA mostrou-se efetiva em remover os anticorpos que
sensibilizavam as hemaacutecias e pode ser utilizada com seguranccedila antes da fenotipagem
eritrocitaacuteria Por ser uma teacutecnica de raacutepida execuccedilatildeo eacute uma alternativa aplicaacutevel
principalmente em casos urgentes de pacientes que apresentam autoanticorpos
46
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50
9 ANEXOS
51
FUNDACcedilAtildeO HEMOCENTRO DE RIBEIRAtildeO PRETO
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE)
Tiacutetulo da pesquisa Aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina aacutecida-EDTA e avaliaccedilatildeo da
eficaacutecia no tratamento de hemaacutecias com teste direto da antiglobulina positivo
Pesquisadora responsaacutevel Ceacutelia Kazue Abiko
Orientador Prof Dimas Tadeu Covas
Co-orientadora Dra Flaacutevia Leite Souza Santos
Objetivo da pesquisa Vocecirc estaacute sendo convidado a participar de uma pesquisa que tem
como objetivo padronizar uma nova teacutecnica para auxiliar na tipagem sanguiacutenea de pacientes
A tipagem sanguiacutenea pode sofrer interferecircncia da presenccedila de anticorpos ligados aos gloacutebulos
vermelhos do sangue Nessas situaccedilotildees eacute difiacutecil selecionar o melhor sangue para o paciente e
eacute preciso a utilizaccedilatildeo de teacutecnicas adicionais para remover essas interferecircncias
Esta pesquisa tem como objetivo estudar outra teacutecnica para remover esses anticorpos e
comparaacute-la com a teacutecnica atualmente utilizada Para isso precisamos de amostras de pacientes
e doadores voluntaacuterios
Se vocecirc eacute um doador eacute necessaacuterio que vocecirc autorize a coleta de 5 ml (1 tubo) a mais
de seu sangue
Se vocecirc eacute um paciente natildeo haveraacute necessidade de nova amostra pois utilizaremos as
amostras jaacute coletadas para os testes preacute-transfusionais e os resultados encontrados nesta
pesquisa natildeo iratildeo interferir na escolha da (s) bolsa (s) de sangue que vocecirc possa vir a receber
Se vocecirc concordar em participar leia com atenccedilatildeo o texto abaixo e assine as duas vias
rubricando todas as paacuteginas deste termo de consentimento Uma via original assinada e
rubricada por vocecirc e pela pesquisadora ficaraacute com vocecirc
As suas informaccedilotildees seratildeo mantidas em sigilo pela pesquisadora e natildeo haveraacute
armazenamento de material para pesquisas posteriores Os seus dados seratildeo usados apenas
neste estudo e quando o trabalho for publicado seu nome e qualquer outra informaccedilatildeo que
possam identificaacute-lo natildeo seratildeo revelados
Eacute pouco provaacutevel que o que noacutes aprendermos com este estudo tenha um benefiacutecio
direto para vocecirc assim como natildeo poderemos dar nada em troca pela sua participaccedilatildeo na
pesquisa
Nosso objetivo com esta pesquisa eacute que os resultados poderatildeo ser uacuteteis para o
tratamento de pacientes no futuro Os riscos da participaccedilatildeo satildeo miacutenimos Se vocecirc eacute um
doador de sangue a amostra seraacute coletada no momento da doaccedilatildeo natildeo exigindo punccedilatildeo
venosa adicional
52
Eacute seu direito ter acesso aos resultados dos testes da pesquisa Esses resultados natildeo
seratildeo fornecidos automaticamente a vocecirc mas caso vocecirc se interesse em saber o resultado ou
tiver alguma duacutevida sobre a sua participaccedilatildeo neste estudo deveraacute entrar em contato com Ceacutelia
Kazue Abiko pelo telefone (18) 99718-3551
Vocecirc tem total liberdade de optar por natildeo participar da pesquisa Caso aceite
participar poderaacute desistir a qualquer momento ou retirar seu consentimento mesmo apoacutes ter
coletado o sangue Para cancelar sua participaccedilatildeo basta avisar a pesquisadora e os seus dados
seratildeo retirados do projeto
Qualquer duacutevida eacutetica sobre a pesquisa poderaacute entrar em contato com o Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa do Hospital das Cliacutenicas e da Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto
(CAMPUS UNIVERSITAacuteRIO bairro Monte Alegre CEP 14048-900 Ribeiratildeo Preto-SP
Telefone (16) 3602-2228 FAX (16) 3633-1144 e-mail cephcrpuspbr)
Consentimento de participaccedilatildeo
A Consentimento do participante
Li as informaccedilotildees acima sobre o estudo e recebi explicaccedilotildees sobre a participaccedilatildeo no estudo
Portanto dou o meu consentimento para participar do estudo
___________________________________________________________________________
Nome completo
___________________________________________________________________________
Assinatura
___________
Data
__________________________________________________________________________________
Nome completo da pesquisadora
___________________________________________________________________________
Assinatura
_____________
Data
33
Tabela 2 - Resultados do TDA apoacutes tratamento das hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo
sensibilizado
ANTICORPOS
SENSIBILIZADOS
1ordm TRATAMENTO COM
GLICINA
TRATAMENTO COM
CLOROQUINA
TOTAL TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
TDA
NEGATIVO
TDA
POSITIVO
Anti-D 8 4 0 12 12
Anti-C 6 4 10 0 10
Anti-E 9 0 9 0 9
Anti-c 0 8 1 7 8
Anti-S 7 0 7 0 7
Anti-K 2 1 0 3 3
Anti-Dia 1 0 1 0 1
TOTAL 33 17 28 22 50
A hemoacutelise foi verificada durante o procedimento de lavagem final das hemaacutecias com
soluccedilatildeo fisioloacutegica para a retirada dos reagentes As soluccedilotildees de lavagem ficaram
avermelhadas e as hemaacutecias com coloraccedilatildeo escura As amostras foram descartadas Dentre as
6 amostras que ainda puderam ser testadas para o TDA trecircs amostras negativaram sendo 1
sensibilizada com anti-D e 2 com anti-C (tabela 3)
Tabela 3 - Resultado apoacutes o segundo tratamento das hemaacutecias com glicina-aacutecidaEDTA
Tratamento com
glicina-aacutecidaEDTA
TDA Negativo TDA Positvo Hemoacutelise Total
Segundo tratamento 3 3 11 17
524 TESTAGEM DO ELUATO
Apoacutes o tratamento com a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA a soluccedilatildeo do eluato foi
testada para verificar a viabilidade dos anticorpos que foram dissociados ou eluiacutedos Dentre
as 50 amostras 41 apresentaram eluato positivo As nove amostras cujos eluatos foram
negativos haviam sido sensibilizadas com as seguintes especificidades de anticorpos anti-E 6
amostras (67) anti-S 2 amostras (40) e anti-D 1 amostra (8) (tabela 4) O eluato de
todas as amostras sensibilizadas com os anticorpos anti-C anti-c Anti-K e Anti-Dia foram
positivos Os eluatos positivos na triagem de anticorpos foram testados com paineacuteis de
identificaccedilatildeo para confirmar a especificidade e a viabilidade dos anticorpos (figuras 7 e 8)
34
525 EFEITO DA ELUICcedilAtildeO SOBRE OS ANTIacuteGENOS ERITROCITAacuteRIOS
Para verificar o efeito do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA e com a cloroquina
sobre a expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s foi realizada a fenotipagem das
amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes tratamento com ambas as teacutecnicas Foi avaliado
se o tratamento destruiu os antiacutegenos expressos antes do tratamento
Tabela 4- Resultado do Eluato das amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA
Anticorpos Eluato positvo Eluato negativo Total
Anti-D 11 1 12
Anti-C 10 0 10
Anti-E 3 6 9
Anti-c 8 0 8
Anti-S 5 2 7
Anti-K 3 0 3
Anti-Dia 1 0 1
Total 41 9 50
Figura 7 ndash Painel do eluato da amostra 21 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-C que foi
recuperado no eluato
Figura 8 ndash Painel do eluato da amostra 47 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-K que foi
recuperado no eluato
35
Dentre as 50 amostras 26 eram previamente fenotipadas para os antiacutegenos Fya Fy
b
Jka Jk
b S e s Dentre elas 20 alcanccedilaram TDA negativo apoacutes tratamento com a glicina-
aacutecidaEDTA e 20 negativaram apoacutes tratamento com cloroquina (tabela 5) Apoacutes ambas as
teacutecnicas os antiacutegenos originalmente expressos permaneceram positivos comprovando que natildeo
houve destruiccedilatildeo dos mesmos
Tabela 5 ndash Verificaccedilatildeo da interferecircncia do tratamento da hemaacutecias com cloroquina e glicina-
aacuteicdaEDTA sobre os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
AMOSTRAS
COM
FENOTIPAGEM
PREacuteVIA
TRATADAS COM
CLOROQUINA
TRATADAS COM
GLICINA
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
26
20
20
20
20
As amostras 24 47 e 50 eram positivas para o antiacutegeno K A cloroquina natildeo dissociou
o anticorpo em nenhuma das 3 amostras enquanto a glicina-aacutecidaEDTA foi efetiva nas
amostras 24 e 50 Foi testada a expressatildeo do antiacutegeno K nas amostras 24 e 50 apoacutes o
tratamento utilizando meacutetodo indireto em gel contendo AGH Apesar de natildeo ter sido avaliado
a intensidade de reaccedilatildeo de expressatildeo dos antiacutegenos podemos verificar na figura 9 que nas
duas amostras em que a teacutecnica foi efetiva e dissociou o anticorpo a expressatildeo do antiacutegeno K
continua presente mas a reatividade observada pode ser considerada 1+ sugerindo que houve
diminuiccedilatildeo da expressatildeo do antiacutegeno quando comparado com a expressatildeo observada em
hemaacutecia natildeo tratada
Os resultados individuais de cada amostra em ambas as teacutecnicas encontram-se
resumidas na tabela 6
526 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente onde foi constatada a presenccedila de autoanticorpo
a quente da classe IgG pelo TDA monoespeciacutefico (figura 10)O autoanticorpo tambeacutem
interferia na pesquisa e identificaccedilatildeo de anticorpos irregulares pois apresentava caracteriacutestica
de panaglutinina As hemaacutecias da paciente sensibilizadas ldquoin vivordquo foram tratadas com
cloroquina e com glicina-aacutecidaEDTA
36
Figura 9 ndash Fenotipagem das amostras 24 e 50 para antiacutegeno K apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
O teste positivo indica a presenccedila do antiacutegeno poreacutem a reatividade fraca (1+) sugere que houve enfraquecimento
de sua expressatildeo A direita a expressatildeo forte (4+) do antiacutegeno Kell em hemaacutecia controle natildeo tratada utilizada
como controle positivo
A cloroquina natildeo foi efetiva na retirada do anticorpo ligado as hemaacutecias ao contraacuterio
do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA que dissociou o anticorpo (figura 11)
A hemaacutecia tratada com glicina foi fenotipada para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
(figura 12) A fenotipagem para o sistema Rh (C c E e e) e Kell foi realizada em gel
especiacutefico monoclonal sem interferecircncia do TDA positivo (controle da reaccedilatildeo negativo)
O eluato resultante do tratamento com glicina-aacutecidaEDTA foi testada em gel com
hemaacutecias de painel de identificaccedilatildeo de anticorpos e apresentou resultado positivo com todas
as ceacutelulas (figura 13 e 14)
A amostra foi enviada para genotipagem e o resultado da genotipagem confirmou o
resultado da fenotipagem apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
527 TEMPO DE EXECUCcedilAtildeO DA TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
O tempo de reaccedilatildeo da glicina-aacutecidaEDTA eacute de 2 minutos Todas as amostras foram
tratadas obedecendo ao tempo descrito na literatura demonstrando que o mesmo eacute
reprodutiacutevel
37
Tabela 6- Resultados individuais por amostra
Amostra Especificidade
dos anticorpos
Intensidade do
TDA apoacutes
sensibilizaccedilatildeo
Tratamento
efetivo com
cloroquina
Tratamento
efetivo com
glicina
Eluato
poacutes
glicina
1 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 2 Dia 3+ Sim Sim 3+ 3 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 4 D 4+ Natildeo Sim 4+ 5 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 6 E 3+ Sim Sim Negativo 7 S 4+ Sim Sim 3+ 8 E 3+ Sim Sim 1+ 9 E 3+ Sim Sim 2+
10 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 11 D 4+ Natildeo Sim 4+ 12 D 4+ Natildeo Sim 4+ 13 S 3+ Sim Sim 3+ 14 S 3+ Sim Sim 3+ 15 D 3+ Natildeo Sim 3+ 16 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 17 E 3+ Sim Sim (+) 18 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 19 D 4+ Natildeo Natildeo 3+ 20 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 21 C 3+ Sim Sim 4+ 22 C 3+ Sim Sim 4+ 23 C 3+ Sim Sim 4+ 24 K 4+ Natildeo Sim 4+ 25 D 3+ Natildeo Natildeo Negativo 26 E 4+ Sim Sim Negativo 27 S 3+ Sim Sim 3+ 28 C 3+ Sim Natildeo 4+ 29 C 3+ Sim Sim 4+ 30 C 3+ Sim Sim 4+ 31 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 32 E 3+ Sim Sim Negativo 33 C 3+ Sim Natildeo 4+ 34 S 3+ Sim Sim Negativo 35 S 3+ Sim Sim Negativo 36 C 4+ Sim Natildeo 4+ 37 c 4+ Natildeo Natildeo 4+ 38 D 4+ Natildeo Sim 4+ 39 S 3+ Sim Sim 3+ 40 c 4+ Sim Natildeo 2+ 41 C 4+ Sim Natildeo 4+ 42 E 3+ Sim Sim Negativo 43 D 3+ Natildeo Sim 2+ 44 D 3+ Natildeo Sim 2+ 45 E 3+ Sim Sim Negativo 46 C 3+ Sim Sim 4+ 47 K 4+ Natildeo Natildeo 4+ 48 D 3+ Natildeo Sim 2+ 49 E 3+ Sim Sim Negativo 50 K 4+ Natildeo Sim 4+
TOTAL 50 28 33 41
38
Figura 10 ndash TDA monoespeciacutefico da amostra de paciente Hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo da classe
IgG
oacute Figura 11 ndash TDA apoacutes o tratamento com glicina-aacutecidaEDTA (esquerda) e cloroquina (direita) A glicina
negativou completamente o TDA enquanto a hemaacutecia tratada com cloroquina persistiu positiva (1+)
39
Figura 12 ndash Fenotipagem da amostra tratada com glicina-aacutecidaEDTA Fy(a+b+) Jk(a-b+) S+s+
Figura 13 ndash Painel em gel (LissAGH) do eluato apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de
intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
Figura 14 ndash ndash Painel ezimaacutetico (hemaacutecias tratadas com bromelina) do eluato em gel neutro apoacutes
tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
40
528 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Quanto a efetividade das teacutecnicas em negativar o TDA foi verificado que a glicina-
aacutecidaEDTA foi efetiva em 66 das amostras testadas no primeiro tratamento (3350
amostras) enquanto a cloroquina conseguiu negativar 56 (2850) Esses resultados natildeo
apresentam diferenccedila significativa (pgt005) demostrando que a teacutecnica da glicina-
aacutecidaEDTA natildeo eacute superior mas eacute tatildeo efetiva quanto a da cloroquina
Quando aliamos os resultados de ambas as teacutecnicas verificamos que em 76 (3850)
das amostras o TDA foi negativado Esse dado indica que ainda que uma teacutecnica natildeo seja
eficaz na remoccedilatildeo do anticorpo eacute uma boa alternativa tentar a segunda teacutecnica jaacute que a falha
em remover o anticorpo utilizando uma delas natildeo prevecirc necessariamente a falha com a outra
Quando se utiliza o teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla (graacutefico 2) para comparar a utilizaccedilatildeo das
duas teacutecnicas com o resultado de cada uma isolada (somente a cloroquina ou somente a
glicina) verificamos que os resultados apresentam diferenccedila significativa (plt005) (quadro 3)
TRATAMENTO EFETIVO COM TOTAL PORCENTAGEM
Glicina ou cloroquina 38 76
Glicina e cloroquina 23 46
Glicina apenas 10 20
Cloroquina apenas 5 10
Nenhuma das teacutecnicas 12 24
Quadro 3 - Resultados comparativos entre as teacutecnicas utilizadas
41
Graacutefico 2 - Teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla entre as teacutecnicas aplicadas A- Glicina e Cloroquina B-Cloroquina C-
Glicina ( plt005)
42
6 DISCUSSAtildeO
Os reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA podem ser adquiridos em
forma de kit comercial prontos para uso poreacutem natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil A preparaccedilatildeo
dos reagentes ldquoin houserdquo a partir de sais comerciais adquiridos se mostrou viaacutevel Os
reagentes glicina e o tampatildeo Tris armazenados de forma correta se mantiveram estaacuteveis por
um periacuteodo de 7 meses Somente o reagente EDTA precipitou mesmo armazenado em
condiccedilotildees adequadas sugerindo que o mesmo deve ser preparado em menor quantidade e
armazenado em aliacutequotas A soluccedilatildeo de cloroquina tambeacutem pode ser preparada ldquoin houserdquo e
pode ser armazenado por um mecircs A legislaccedilatildeo brasileira autoriza a utilizaccedilatildeo de reagentes
preparados a partir de sais comerciais como a cloroquina e a glicina-aacutecidaEDTA desde que
os sais tenham autorizaccedilatildeo da vigilacircncia sanitaacuteria para a comercializaccedilatildeo (BRASIL 2001)
A comparaccedilatildeo quanto a efetividade em dissociar anticorpos em amostras com TDA
positivos entre a teacutecnica da glicina e a teacutecnica da cloroquina mostrou que natildeo haacute diferenccedila
estatiacutestica entre elas e que ambas satildeo igualmente eficientes Se utilizadas conjuntamente haacute
maior possibilidade de elucidaccedilatildeo dos casos
Uma vantagem da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eacute que ela permite numa mesma
amostra eluir o anticorpo ligado aacute hemaacutecia assim como fenotipar a hemaacutecia tratada Devido a
sua dupla utilidade a teacutecnica eacute vantajosa principalmente em pacientes em que pouco volume
de amostra pode ser coletado como em casos de crianccedilas e receacutem-nascidos
A fenotipagem poacutes tratamento se mostrou viaacutevel jaacute que os antiacutegenos de maior
importacircncia natildeo sofreram alteraccedilotildees Nas 20 amostras que foram fenotipadas antes e apoacutes
tratamento para verificar a influecircncia dos reagentes na expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a
Jkb S e s natildeo houve destruiccedilatildeo dos mesmos por nenhuma das duas teacutecnicas
Para as amostras positivas para o antiacutegeno Kell (350) e sensibilizadas com o
respectivo anticorpo a teacutecnica da glicina foi efetiva em negativar o TDA em apenas duas
delas mas apoacutes o tratamento foi verificada uma fraca reatividade da reaccedilatildeo antiacutegeno-
anticorpo sugerindo que houve um enfraquecimento da expressatildeo do antiacutegeno conforme
esperado e descrito na literatura (BYRNE 1991 PALLAS WILER E MCGEE 1991
ROZIERS e SQUALI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012 e KATHARIA e
CHAUDHARY 2013) A accedilatildeo da glicina sobre o antigeno Kell natildeo representa impedimento
para seu uso uma vez que na impossibilidade de testar o antiacutegeno Kell o banco de sangue
consegue facilmente atender a solicitaccedilatildeo de transfusatildeo com unidades de hemaacutecias Kell
43
negativas jaacute que eacute um antiacutegeno de baixa prevalecircncia na populaccedilatildeo variando de 15 na
populaccedilatildeo africana a 9 nos europeus (DANIELS 2011)
A soluccedilatildeo resultante da dissociaccedilatildeo do anticorpo pela teacutecnica da glicina pode ainda ser
utilizada como eluato podendo substituir a teacutecnica de eluiccedilatildeo com reagentes comercias (kits
de eluiccedilatildeo aacutecida) que tem alto custo aproximadamente entre R$2000 a R$2500 por teste
Em 41 amostras (82) houve a dissociaccedilatildeo e recuperaccedilatildeo do anticorpo que estava
sensibilizando as hemaacutecias Em 9 amostras (18) os anticorpos foram eluiacutedos poreacutem
apresentaram reaccedilatildeo negativa quando testadas com hemaacutecias de triagem entre eles o anti-E
(6) anti-S (2) e Anti-D (1) Eacute possiacutevel que a correccedilatildeo pH do meio (WALKER 2011) natildeo
tenha sido adequada o que pode ter desfavorecido a reatividade do anticorpo
Para as amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA nas quais natildeo houve dissociaccedilatildeo do
anticorpo pelo primeiro tratamento (1750) o segundo tratamento natildeo se mostrou eficaz jaacute
que 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise O tempo de
armazenagem natildeo parece ter influenciado jaacute que todas as amostras foram testadas dentro de
48 horas apoacutes a coleta Outros fatores que natildeo foram verificados podem ter levado a
hemoacutelise Apesar da literatura (LOUIE JIENG e ZEROULIS 1986 e BYRNE 1991)
recomendar um segundo tratamento ele eacute pouco eficaz tendo negativado apenas 3 das 17
amostras testadas
A amostra de paciente que apresentou sensibilizaccedilatildeo ldquoin vivordquo mostrou melhor
efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA sobre a da cloroquina possibilitando
fenotipagem para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s que natildeo foram destruiacutedos apoacutes o
tratamento comprovado atraveacutes da genotipagem
A presenccedila de autoanticorpo a quente com presenccedila de hemoacutelise (AHAI) ou natildeo pode
mascarar a presenccedila de aloanticorpo interferindo na rotina soroloacutegica da fenotipagem que eacute
uma importante ferramenta para auxiliar na seleccedilatildeo de hemaacutecias para transfusatildeo (SHIREY et
al 2002) Esses pacientes frequentemente possuem aloanticorpos associados ao
autoanticorpo e a prevalecircncia de aloimunizaccedilatildeo entre eles varia entre 12 a 40 (LEGER e
GARRATY 1999 BRANCH e PETZ 1999) o que dificulta ainda mais a escolha do melhor
componente a ser transfundido aleacutem de aumentar a possibilidade reaccedilotildees hemoliacuteticas imunes
poacutes-transfusionais
Nesses casos as teacutecnicas de dissociaccedilatildeo de anticorpos satildeo importantes para tratar
amostras de pacientes e a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser usada como uma opccedilatildeo
pois se mostrou eficaz na dissociaccedilatildeo anticorpo ligado agraves hemaacutecias deixando livre a
superfiacutecie das mesmas permitindo a fenotipagem por antisoros IgG Paralelamente os
44
anticorpos eluiacutedos tambeacutem puderam ser estudados O mesmo natildeo ocorre com a cloroquina
que permite apenas a fenotipagem e tampouco com os kits de eluiccedilatildeo aacutecida disponiacuteveis no
mercado nacional que satildeo destinados a realizaccedilatildeo do eluato mas destroem as hemaacutecias
O tempo de tratamento na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA tambeacutem eacute uma vantagem
pois foi possiacutevel reproduzir no tempo determinado de 2 minutos enquanto a cloroquina
demora ateacute duas horas
Ainda que a aplicaccedilatildeo das teacutecnicas por biologia molecular estejam cada vez mais
presentes na rotina imuno-hematoloacutegica e possibilitam estabelecer o fenoacutetipo deduzido do
genoacutetipo elas natildeo estatildeo disponiacuteveis na maioria dos centros e sua realizaccedilatildeo exige algumas
horas A resoluccedilatildeo imediata do problema transfusional necessita dos resultados soroloacutegicos
pois com frequecircncia natildeo eacute possiacutevel aguardar o resultado do teste molecular Dessa forma
apesar da crescente importacircncia da genotipagem eritrocitaacuteria teacutecnicas soroloacutegicas aplicadas
corretamente e no momento propiacutecio satildeo de grande utilidade para resolver problemas imuno-
hematoloacutegicos como ocorre com a fenotipagem em pacientes com TDA positivo
45
7 CONCLUSAtildeO
A teacutecnica da glicina aacutecidaEDTA mostrou-se efetiva em remover os anticorpos que
sensibilizavam as hemaacutecias e pode ser utilizada com seguranccedila antes da fenotipagem
eritrocitaacuteria Por ser uma teacutecnica de raacutepida execuccedilatildeo eacute uma alternativa aplicaacutevel
principalmente em casos urgentes de pacientes que apresentam autoanticorpos
46
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50
9 ANEXOS
51
FUNDACcedilAtildeO HEMOCENTRO DE RIBEIRAtildeO PRETO
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE)
Tiacutetulo da pesquisa Aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina aacutecida-EDTA e avaliaccedilatildeo da
eficaacutecia no tratamento de hemaacutecias com teste direto da antiglobulina positivo
Pesquisadora responsaacutevel Ceacutelia Kazue Abiko
Orientador Prof Dimas Tadeu Covas
Co-orientadora Dra Flaacutevia Leite Souza Santos
Objetivo da pesquisa Vocecirc estaacute sendo convidado a participar de uma pesquisa que tem
como objetivo padronizar uma nova teacutecnica para auxiliar na tipagem sanguiacutenea de pacientes
A tipagem sanguiacutenea pode sofrer interferecircncia da presenccedila de anticorpos ligados aos gloacutebulos
vermelhos do sangue Nessas situaccedilotildees eacute difiacutecil selecionar o melhor sangue para o paciente e
eacute preciso a utilizaccedilatildeo de teacutecnicas adicionais para remover essas interferecircncias
Esta pesquisa tem como objetivo estudar outra teacutecnica para remover esses anticorpos e
comparaacute-la com a teacutecnica atualmente utilizada Para isso precisamos de amostras de pacientes
e doadores voluntaacuterios
Se vocecirc eacute um doador eacute necessaacuterio que vocecirc autorize a coleta de 5 ml (1 tubo) a mais
de seu sangue
Se vocecirc eacute um paciente natildeo haveraacute necessidade de nova amostra pois utilizaremos as
amostras jaacute coletadas para os testes preacute-transfusionais e os resultados encontrados nesta
pesquisa natildeo iratildeo interferir na escolha da (s) bolsa (s) de sangue que vocecirc possa vir a receber
Se vocecirc concordar em participar leia com atenccedilatildeo o texto abaixo e assine as duas vias
rubricando todas as paacuteginas deste termo de consentimento Uma via original assinada e
rubricada por vocecirc e pela pesquisadora ficaraacute com vocecirc
As suas informaccedilotildees seratildeo mantidas em sigilo pela pesquisadora e natildeo haveraacute
armazenamento de material para pesquisas posteriores Os seus dados seratildeo usados apenas
neste estudo e quando o trabalho for publicado seu nome e qualquer outra informaccedilatildeo que
possam identificaacute-lo natildeo seratildeo revelados
Eacute pouco provaacutevel que o que noacutes aprendermos com este estudo tenha um benefiacutecio
direto para vocecirc assim como natildeo poderemos dar nada em troca pela sua participaccedilatildeo na
pesquisa
Nosso objetivo com esta pesquisa eacute que os resultados poderatildeo ser uacuteteis para o
tratamento de pacientes no futuro Os riscos da participaccedilatildeo satildeo miacutenimos Se vocecirc eacute um
doador de sangue a amostra seraacute coletada no momento da doaccedilatildeo natildeo exigindo punccedilatildeo
venosa adicional
52
Eacute seu direito ter acesso aos resultados dos testes da pesquisa Esses resultados natildeo
seratildeo fornecidos automaticamente a vocecirc mas caso vocecirc se interesse em saber o resultado ou
tiver alguma duacutevida sobre a sua participaccedilatildeo neste estudo deveraacute entrar em contato com Ceacutelia
Kazue Abiko pelo telefone (18) 99718-3551
Vocecirc tem total liberdade de optar por natildeo participar da pesquisa Caso aceite
participar poderaacute desistir a qualquer momento ou retirar seu consentimento mesmo apoacutes ter
coletado o sangue Para cancelar sua participaccedilatildeo basta avisar a pesquisadora e os seus dados
seratildeo retirados do projeto
Qualquer duacutevida eacutetica sobre a pesquisa poderaacute entrar em contato com o Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa do Hospital das Cliacutenicas e da Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto
(CAMPUS UNIVERSITAacuteRIO bairro Monte Alegre CEP 14048-900 Ribeiratildeo Preto-SP
Telefone (16) 3602-2228 FAX (16) 3633-1144 e-mail cephcrpuspbr)
Consentimento de participaccedilatildeo
A Consentimento do participante
Li as informaccedilotildees acima sobre o estudo e recebi explicaccedilotildees sobre a participaccedilatildeo no estudo
Portanto dou o meu consentimento para participar do estudo
___________________________________________________________________________
Nome completo
___________________________________________________________________________
Assinatura
___________
Data
__________________________________________________________________________________
Nome completo da pesquisadora
___________________________________________________________________________
Assinatura
_____________
Data
34
525 EFEITO DA ELUICcedilAtildeO SOBRE OS ANTIacuteGENOS ERITROCITAacuteRIOS
Para verificar o efeito do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA e com a cloroquina
sobre a expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s foi realizada a fenotipagem das
amostras que tiveram o TDA negativado apoacutes tratamento com ambas as teacutecnicas Foi avaliado
se o tratamento destruiu os antiacutegenos expressos antes do tratamento
Tabela 4- Resultado do Eluato das amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA
Anticorpos Eluato positvo Eluato negativo Total
Anti-D 11 1 12
Anti-C 10 0 10
Anti-E 3 6 9
Anti-c 8 0 8
Anti-S 5 2 7
Anti-K 3 0 3
Anti-Dia 1 0 1
Total 41 9 50
Figura 7 ndash Painel do eluato da amostra 21 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-C que foi
recuperado no eluato
Figura 8 ndash Painel do eluato da amostra 47 A amostra foi sensibilizada com anticorpo anti-K que foi
recuperado no eluato
35
Dentre as 50 amostras 26 eram previamente fenotipadas para os antiacutegenos Fya Fy
b
Jka Jk
b S e s Dentre elas 20 alcanccedilaram TDA negativo apoacutes tratamento com a glicina-
aacutecidaEDTA e 20 negativaram apoacutes tratamento com cloroquina (tabela 5) Apoacutes ambas as
teacutecnicas os antiacutegenos originalmente expressos permaneceram positivos comprovando que natildeo
houve destruiccedilatildeo dos mesmos
Tabela 5 ndash Verificaccedilatildeo da interferecircncia do tratamento da hemaacutecias com cloroquina e glicina-
aacuteicdaEDTA sobre os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
AMOSTRAS
COM
FENOTIPAGEM
PREacuteVIA
TRATADAS COM
CLOROQUINA
TRATADAS COM
GLICINA
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
26
20
20
20
20
As amostras 24 47 e 50 eram positivas para o antiacutegeno K A cloroquina natildeo dissociou
o anticorpo em nenhuma das 3 amostras enquanto a glicina-aacutecidaEDTA foi efetiva nas
amostras 24 e 50 Foi testada a expressatildeo do antiacutegeno K nas amostras 24 e 50 apoacutes o
tratamento utilizando meacutetodo indireto em gel contendo AGH Apesar de natildeo ter sido avaliado
a intensidade de reaccedilatildeo de expressatildeo dos antiacutegenos podemos verificar na figura 9 que nas
duas amostras em que a teacutecnica foi efetiva e dissociou o anticorpo a expressatildeo do antiacutegeno K
continua presente mas a reatividade observada pode ser considerada 1+ sugerindo que houve
diminuiccedilatildeo da expressatildeo do antiacutegeno quando comparado com a expressatildeo observada em
hemaacutecia natildeo tratada
Os resultados individuais de cada amostra em ambas as teacutecnicas encontram-se
resumidas na tabela 6
526 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente onde foi constatada a presenccedila de autoanticorpo
a quente da classe IgG pelo TDA monoespeciacutefico (figura 10)O autoanticorpo tambeacutem
interferia na pesquisa e identificaccedilatildeo de anticorpos irregulares pois apresentava caracteriacutestica
de panaglutinina As hemaacutecias da paciente sensibilizadas ldquoin vivordquo foram tratadas com
cloroquina e com glicina-aacutecidaEDTA
36
Figura 9 ndash Fenotipagem das amostras 24 e 50 para antiacutegeno K apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
O teste positivo indica a presenccedila do antiacutegeno poreacutem a reatividade fraca (1+) sugere que houve enfraquecimento
de sua expressatildeo A direita a expressatildeo forte (4+) do antiacutegeno Kell em hemaacutecia controle natildeo tratada utilizada
como controle positivo
A cloroquina natildeo foi efetiva na retirada do anticorpo ligado as hemaacutecias ao contraacuterio
do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA que dissociou o anticorpo (figura 11)
A hemaacutecia tratada com glicina foi fenotipada para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
(figura 12) A fenotipagem para o sistema Rh (C c E e e) e Kell foi realizada em gel
especiacutefico monoclonal sem interferecircncia do TDA positivo (controle da reaccedilatildeo negativo)
O eluato resultante do tratamento com glicina-aacutecidaEDTA foi testada em gel com
hemaacutecias de painel de identificaccedilatildeo de anticorpos e apresentou resultado positivo com todas
as ceacutelulas (figura 13 e 14)
A amostra foi enviada para genotipagem e o resultado da genotipagem confirmou o
resultado da fenotipagem apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
527 TEMPO DE EXECUCcedilAtildeO DA TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
O tempo de reaccedilatildeo da glicina-aacutecidaEDTA eacute de 2 minutos Todas as amostras foram
tratadas obedecendo ao tempo descrito na literatura demonstrando que o mesmo eacute
reprodutiacutevel
37
Tabela 6- Resultados individuais por amostra
Amostra Especificidade
dos anticorpos
Intensidade do
TDA apoacutes
sensibilizaccedilatildeo
Tratamento
efetivo com
cloroquina
Tratamento
efetivo com
glicina
Eluato
poacutes
glicina
1 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 2 Dia 3+ Sim Sim 3+ 3 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 4 D 4+ Natildeo Sim 4+ 5 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 6 E 3+ Sim Sim Negativo 7 S 4+ Sim Sim 3+ 8 E 3+ Sim Sim 1+ 9 E 3+ Sim Sim 2+
10 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 11 D 4+ Natildeo Sim 4+ 12 D 4+ Natildeo Sim 4+ 13 S 3+ Sim Sim 3+ 14 S 3+ Sim Sim 3+ 15 D 3+ Natildeo Sim 3+ 16 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 17 E 3+ Sim Sim (+) 18 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 19 D 4+ Natildeo Natildeo 3+ 20 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 21 C 3+ Sim Sim 4+ 22 C 3+ Sim Sim 4+ 23 C 3+ Sim Sim 4+ 24 K 4+ Natildeo Sim 4+ 25 D 3+ Natildeo Natildeo Negativo 26 E 4+ Sim Sim Negativo 27 S 3+ Sim Sim 3+ 28 C 3+ Sim Natildeo 4+ 29 C 3+ Sim Sim 4+ 30 C 3+ Sim Sim 4+ 31 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 32 E 3+ Sim Sim Negativo 33 C 3+ Sim Natildeo 4+ 34 S 3+ Sim Sim Negativo 35 S 3+ Sim Sim Negativo 36 C 4+ Sim Natildeo 4+ 37 c 4+ Natildeo Natildeo 4+ 38 D 4+ Natildeo Sim 4+ 39 S 3+ Sim Sim 3+ 40 c 4+ Sim Natildeo 2+ 41 C 4+ Sim Natildeo 4+ 42 E 3+ Sim Sim Negativo 43 D 3+ Natildeo Sim 2+ 44 D 3+ Natildeo Sim 2+ 45 E 3+ Sim Sim Negativo 46 C 3+ Sim Sim 4+ 47 K 4+ Natildeo Natildeo 4+ 48 D 3+ Natildeo Sim 2+ 49 E 3+ Sim Sim Negativo 50 K 4+ Natildeo Sim 4+
TOTAL 50 28 33 41
38
Figura 10 ndash TDA monoespeciacutefico da amostra de paciente Hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo da classe
IgG
oacute Figura 11 ndash TDA apoacutes o tratamento com glicina-aacutecidaEDTA (esquerda) e cloroquina (direita) A glicina
negativou completamente o TDA enquanto a hemaacutecia tratada com cloroquina persistiu positiva (1+)
39
Figura 12 ndash Fenotipagem da amostra tratada com glicina-aacutecidaEDTA Fy(a+b+) Jk(a-b+) S+s+
Figura 13 ndash Painel em gel (LissAGH) do eluato apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de
intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
Figura 14 ndash ndash Painel ezimaacutetico (hemaacutecias tratadas com bromelina) do eluato em gel neutro apoacutes
tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
40
528 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Quanto a efetividade das teacutecnicas em negativar o TDA foi verificado que a glicina-
aacutecidaEDTA foi efetiva em 66 das amostras testadas no primeiro tratamento (3350
amostras) enquanto a cloroquina conseguiu negativar 56 (2850) Esses resultados natildeo
apresentam diferenccedila significativa (pgt005) demostrando que a teacutecnica da glicina-
aacutecidaEDTA natildeo eacute superior mas eacute tatildeo efetiva quanto a da cloroquina
Quando aliamos os resultados de ambas as teacutecnicas verificamos que em 76 (3850)
das amostras o TDA foi negativado Esse dado indica que ainda que uma teacutecnica natildeo seja
eficaz na remoccedilatildeo do anticorpo eacute uma boa alternativa tentar a segunda teacutecnica jaacute que a falha
em remover o anticorpo utilizando uma delas natildeo prevecirc necessariamente a falha com a outra
Quando se utiliza o teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla (graacutefico 2) para comparar a utilizaccedilatildeo das
duas teacutecnicas com o resultado de cada uma isolada (somente a cloroquina ou somente a
glicina) verificamos que os resultados apresentam diferenccedila significativa (plt005) (quadro 3)
TRATAMENTO EFETIVO COM TOTAL PORCENTAGEM
Glicina ou cloroquina 38 76
Glicina e cloroquina 23 46
Glicina apenas 10 20
Cloroquina apenas 5 10
Nenhuma das teacutecnicas 12 24
Quadro 3 - Resultados comparativos entre as teacutecnicas utilizadas
41
Graacutefico 2 - Teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla entre as teacutecnicas aplicadas A- Glicina e Cloroquina B-Cloroquina C-
Glicina ( plt005)
42
6 DISCUSSAtildeO
Os reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA podem ser adquiridos em
forma de kit comercial prontos para uso poreacutem natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil A preparaccedilatildeo
dos reagentes ldquoin houserdquo a partir de sais comerciais adquiridos se mostrou viaacutevel Os
reagentes glicina e o tampatildeo Tris armazenados de forma correta se mantiveram estaacuteveis por
um periacuteodo de 7 meses Somente o reagente EDTA precipitou mesmo armazenado em
condiccedilotildees adequadas sugerindo que o mesmo deve ser preparado em menor quantidade e
armazenado em aliacutequotas A soluccedilatildeo de cloroquina tambeacutem pode ser preparada ldquoin houserdquo e
pode ser armazenado por um mecircs A legislaccedilatildeo brasileira autoriza a utilizaccedilatildeo de reagentes
preparados a partir de sais comerciais como a cloroquina e a glicina-aacutecidaEDTA desde que
os sais tenham autorizaccedilatildeo da vigilacircncia sanitaacuteria para a comercializaccedilatildeo (BRASIL 2001)
A comparaccedilatildeo quanto a efetividade em dissociar anticorpos em amostras com TDA
positivos entre a teacutecnica da glicina e a teacutecnica da cloroquina mostrou que natildeo haacute diferenccedila
estatiacutestica entre elas e que ambas satildeo igualmente eficientes Se utilizadas conjuntamente haacute
maior possibilidade de elucidaccedilatildeo dos casos
Uma vantagem da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eacute que ela permite numa mesma
amostra eluir o anticorpo ligado aacute hemaacutecia assim como fenotipar a hemaacutecia tratada Devido a
sua dupla utilidade a teacutecnica eacute vantajosa principalmente em pacientes em que pouco volume
de amostra pode ser coletado como em casos de crianccedilas e receacutem-nascidos
A fenotipagem poacutes tratamento se mostrou viaacutevel jaacute que os antiacutegenos de maior
importacircncia natildeo sofreram alteraccedilotildees Nas 20 amostras que foram fenotipadas antes e apoacutes
tratamento para verificar a influecircncia dos reagentes na expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a
Jkb S e s natildeo houve destruiccedilatildeo dos mesmos por nenhuma das duas teacutecnicas
Para as amostras positivas para o antiacutegeno Kell (350) e sensibilizadas com o
respectivo anticorpo a teacutecnica da glicina foi efetiva em negativar o TDA em apenas duas
delas mas apoacutes o tratamento foi verificada uma fraca reatividade da reaccedilatildeo antiacutegeno-
anticorpo sugerindo que houve um enfraquecimento da expressatildeo do antiacutegeno conforme
esperado e descrito na literatura (BYRNE 1991 PALLAS WILER E MCGEE 1991
ROZIERS e SQUALI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012 e KATHARIA e
CHAUDHARY 2013) A accedilatildeo da glicina sobre o antigeno Kell natildeo representa impedimento
para seu uso uma vez que na impossibilidade de testar o antiacutegeno Kell o banco de sangue
consegue facilmente atender a solicitaccedilatildeo de transfusatildeo com unidades de hemaacutecias Kell
43
negativas jaacute que eacute um antiacutegeno de baixa prevalecircncia na populaccedilatildeo variando de 15 na
populaccedilatildeo africana a 9 nos europeus (DANIELS 2011)
A soluccedilatildeo resultante da dissociaccedilatildeo do anticorpo pela teacutecnica da glicina pode ainda ser
utilizada como eluato podendo substituir a teacutecnica de eluiccedilatildeo com reagentes comercias (kits
de eluiccedilatildeo aacutecida) que tem alto custo aproximadamente entre R$2000 a R$2500 por teste
Em 41 amostras (82) houve a dissociaccedilatildeo e recuperaccedilatildeo do anticorpo que estava
sensibilizando as hemaacutecias Em 9 amostras (18) os anticorpos foram eluiacutedos poreacutem
apresentaram reaccedilatildeo negativa quando testadas com hemaacutecias de triagem entre eles o anti-E
(6) anti-S (2) e Anti-D (1) Eacute possiacutevel que a correccedilatildeo pH do meio (WALKER 2011) natildeo
tenha sido adequada o que pode ter desfavorecido a reatividade do anticorpo
Para as amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA nas quais natildeo houve dissociaccedilatildeo do
anticorpo pelo primeiro tratamento (1750) o segundo tratamento natildeo se mostrou eficaz jaacute
que 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise O tempo de
armazenagem natildeo parece ter influenciado jaacute que todas as amostras foram testadas dentro de
48 horas apoacutes a coleta Outros fatores que natildeo foram verificados podem ter levado a
hemoacutelise Apesar da literatura (LOUIE JIENG e ZEROULIS 1986 e BYRNE 1991)
recomendar um segundo tratamento ele eacute pouco eficaz tendo negativado apenas 3 das 17
amostras testadas
A amostra de paciente que apresentou sensibilizaccedilatildeo ldquoin vivordquo mostrou melhor
efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA sobre a da cloroquina possibilitando
fenotipagem para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s que natildeo foram destruiacutedos apoacutes o
tratamento comprovado atraveacutes da genotipagem
A presenccedila de autoanticorpo a quente com presenccedila de hemoacutelise (AHAI) ou natildeo pode
mascarar a presenccedila de aloanticorpo interferindo na rotina soroloacutegica da fenotipagem que eacute
uma importante ferramenta para auxiliar na seleccedilatildeo de hemaacutecias para transfusatildeo (SHIREY et
al 2002) Esses pacientes frequentemente possuem aloanticorpos associados ao
autoanticorpo e a prevalecircncia de aloimunizaccedilatildeo entre eles varia entre 12 a 40 (LEGER e
GARRATY 1999 BRANCH e PETZ 1999) o que dificulta ainda mais a escolha do melhor
componente a ser transfundido aleacutem de aumentar a possibilidade reaccedilotildees hemoliacuteticas imunes
poacutes-transfusionais
Nesses casos as teacutecnicas de dissociaccedilatildeo de anticorpos satildeo importantes para tratar
amostras de pacientes e a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser usada como uma opccedilatildeo
pois se mostrou eficaz na dissociaccedilatildeo anticorpo ligado agraves hemaacutecias deixando livre a
superfiacutecie das mesmas permitindo a fenotipagem por antisoros IgG Paralelamente os
44
anticorpos eluiacutedos tambeacutem puderam ser estudados O mesmo natildeo ocorre com a cloroquina
que permite apenas a fenotipagem e tampouco com os kits de eluiccedilatildeo aacutecida disponiacuteveis no
mercado nacional que satildeo destinados a realizaccedilatildeo do eluato mas destroem as hemaacutecias
O tempo de tratamento na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA tambeacutem eacute uma vantagem
pois foi possiacutevel reproduzir no tempo determinado de 2 minutos enquanto a cloroquina
demora ateacute duas horas
Ainda que a aplicaccedilatildeo das teacutecnicas por biologia molecular estejam cada vez mais
presentes na rotina imuno-hematoloacutegica e possibilitam estabelecer o fenoacutetipo deduzido do
genoacutetipo elas natildeo estatildeo disponiacuteveis na maioria dos centros e sua realizaccedilatildeo exige algumas
horas A resoluccedilatildeo imediata do problema transfusional necessita dos resultados soroloacutegicos
pois com frequecircncia natildeo eacute possiacutevel aguardar o resultado do teste molecular Dessa forma
apesar da crescente importacircncia da genotipagem eritrocitaacuteria teacutecnicas soroloacutegicas aplicadas
corretamente e no momento propiacutecio satildeo de grande utilidade para resolver problemas imuno-
hematoloacutegicos como ocorre com a fenotipagem em pacientes com TDA positivo
45
7 CONCLUSAtildeO
A teacutecnica da glicina aacutecidaEDTA mostrou-se efetiva em remover os anticorpos que
sensibilizavam as hemaacutecias e pode ser utilizada com seguranccedila antes da fenotipagem
eritrocitaacuteria Por ser uma teacutecnica de raacutepida execuccedilatildeo eacute uma alternativa aplicaacutevel
principalmente em casos urgentes de pacientes que apresentam autoanticorpos
46
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50
9 ANEXOS
51
FUNDACcedilAtildeO HEMOCENTRO DE RIBEIRAtildeO PRETO
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE)
Tiacutetulo da pesquisa Aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina aacutecida-EDTA e avaliaccedilatildeo da
eficaacutecia no tratamento de hemaacutecias com teste direto da antiglobulina positivo
Pesquisadora responsaacutevel Ceacutelia Kazue Abiko
Orientador Prof Dimas Tadeu Covas
Co-orientadora Dra Flaacutevia Leite Souza Santos
Objetivo da pesquisa Vocecirc estaacute sendo convidado a participar de uma pesquisa que tem
como objetivo padronizar uma nova teacutecnica para auxiliar na tipagem sanguiacutenea de pacientes
A tipagem sanguiacutenea pode sofrer interferecircncia da presenccedila de anticorpos ligados aos gloacutebulos
vermelhos do sangue Nessas situaccedilotildees eacute difiacutecil selecionar o melhor sangue para o paciente e
eacute preciso a utilizaccedilatildeo de teacutecnicas adicionais para remover essas interferecircncias
Esta pesquisa tem como objetivo estudar outra teacutecnica para remover esses anticorpos e
comparaacute-la com a teacutecnica atualmente utilizada Para isso precisamos de amostras de pacientes
e doadores voluntaacuterios
Se vocecirc eacute um doador eacute necessaacuterio que vocecirc autorize a coleta de 5 ml (1 tubo) a mais
de seu sangue
Se vocecirc eacute um paciente natildeo haveraacute necessidade de nova amostra pois utilizaremos as
amostras jaacute coletadas para os testes preacute-transfusionais e os resultados encontrados nesta
pesquisa natildeo iratildeo interferir na escolha da (s) bolsa (s) de sangue que vocecirc possa vir a receber
Se vocecirc concordar em participar leia com atenccedilatildeo o texto abaixo e assine as duas vias
rubricando todas as paacuteginas deste termo de consentimento Uma via original assinada e
rubricada por vocecirc e pela pesquisadora ficaraacute com vocecirc
As suas informaccedilotildees seratildeo mantidas em sigilo pela pesquisadora e natildeo haveraacute
armazenamento de material para pesquisas posteriores Os seus dados seratildeo usados apenas
neste estudo e quando o trabalho for publicado seu nome e qualquer outra informaccedilatildeo que
possam identificaacute-lo natildeo seratildeo revelados
Eacute pouco provaacutevel que o que noacutes aprendermos com este estudo tenha um benefiacutecio
direto para vocecirc assim como natildeo poderemos dar nada em troca pela sua participaccedilatildeo na
pesquisa
Nosso objetivo com esta pesquisa eacute que os resultados poderatildeo ser uacuteteis para o
tratamento de pacientes no futuro Os riscos da participaccedilatildeo satildeo miacutenimos Se vocecirc eacute um
doador de sangue a amostra seraacute coletada no momento da doaccedilatildeo natildeo exigindo punccedilatildeo
venosa adicional
52
Eacute seu direito ter acesso aos resultados dos testes da pesquisa Esses resultados natildeo
seratildeo fornecidos automaticamente a vocecirc mas caso vocecirc se interesse em saber o resultado ou
tiver alguma duacutevida sobre a sua participaccedilatildeo neste estudo deveraacute entrar em contato com Ceacutelia
Kazue Abiko pelo telefone (18) 99718-3551
Vocecirc tem total liberdade de optar por natildeo participar da pesquisa Caso aceite
participar poderaacute desistir a qualquer momento ou retirar seu consentimento mesmo apoacutes ter
coletado o sangue Para cancelar sua participaccedilatildeo basta avisar a pesquisadora e os seus dados
seratildeo retirados do projeto
Qualquer duacutevida eacutetica sobre a pesquisa poderaacute entrar em contato com o Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa do Hospital das Cliacutenicas e da Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto
(CAMPUS UNIVERSITAacuteRIO bairro Monte Alegre CEP 14048-900 Ribeiratildeo Preto-SP
Telefone (16) 3602-2228 FAX (16) 3633-1144 e-mail cephcrpuspbr)
Consentimento de participaccedilatildeo
A Consentimento do participante
Li as informaccedilotildees acima sobre o estudo e recebi explicaccedilotildees sobre a participaccedilatildeo no estudo
Portanto dou o meu consentimento para participar do estudo
___________________________________________________________________________
Nome completo
___________________________________________________________________________
Assinatura
___________
Data
__________________________________________________________________________________
Nome completo da pesquisadora
___________________________________________________________________________
Assinatura
_____________
Data
35
Dentre as 50 amostras 26 eram previamente fenotipadas para os antiacutegenos Fya Fy
b
Jka Jk
b S e s Dentre elas 20 alcanccedilaram TDA negativo apoacutes tratamento com a glicina-
aacutecidaEDTA e 20 negativaram apoacutes tratamento com cloroquina (tabela 5) Apoacutes ambas as
teacutecnicas os antiacutegenos originalmente expressos permaneceram positivos comprovando que natildeo
houve destruiccedilatildeo dos mesmos
Tabela 5 ndash Verificaccedilatildeo da interferecircncia do tratamento da hemaacutecias com cloroquina e glicina-
aacuteicdaEDTA sobre os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
AMOSTRAS
COM
FENOTIPAGEM
PREacuteVIA
TRATADAS COM
CLOROQUINA
TRATADAS COM
GLICINA
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
Tratamento
efetivo
Amostras
concordantes com
a fenotipagem
preacutevia
26
20
20
20
20
As amostras 24 47 e 50 eram positivas para o antiacutegeno K A cloroquina natildeo dissociou
o anticorpo em nenhuma das 3 amostras enquanto a glicina-aacutecidaEDTA foi efetiva nas
amostras 24 e 50 Foi testada a expressatildeo do antiacutegeno K nas amostras 24 e 50 apoacutes o
tratamento utilizando meacutetodo indireto em gel contendo AGH Apesar de natildeo ter sido avaliado
a intensidade de reaccedilatildeo de expressatildeo dos antiacutegenos podemos verificar na figura 9 que nas
duas amostras em que a teacutecnica foi efetiva e dissociou o anticorpo a expressatildeo do antiacutegeno K
continua presente mas a reatividade observada pode ser considerada 1+ sugerindo que houve
diminuiccedilatildeo da expressatildeo do antiacutegeno quando comparado com a expressatildeo observada em
hemaacutecia natildeo tratada
Os resultados individuais de cada amostra em ambas as teacutecnicas encontram-se
resumidas na tabela 6
526 AMOSTRA DE PACIENTE
Foi incluiacuteda uma amostra de paciente onde foi constatada a presenccedila de autoanticorpo
a quente da classe IgG pelo TDA monoespeciacutefico (figura 10)O autoanticorpo tambeacutem
interferia na pesquisa e identificaccedilatildeo de anticorpos irregulares pois apresentava caracteriacutestica
de panaglutinina As hemaacutecias da paciente sensibilizadas ldquoin vivordquo foram tratadas com
cloroquina e com glicina-aacutecidaEDTA
36
Figura 9 ndash Fenotipagem das amostras 24 e 50 para antiacutegeno K apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
O teste positivo indica a presenccedila do antiacutegeno poreacutem a reatividade fraca (1+) sugere que houve enfraquecimento
de sua expressatildeo A direita a expressatildeo forte (4+) do antiacutegeno Kell em hemaacutecia controle natildeo tratada utilizada
como controle positivo
A cloroquina natildeo foi efetiva na retirada do anticorpo ligado as hemaacutecias ao contraacuterio
do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA que dissociou o anticorpo (figura 11)
A hemaacutecia tratada com glicina foi fenotipada para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
(figura 12) A fenotipagem para o sistema Rh (C c E e e) e Kell foi realizada em gel
especiacutefico monoclonal sem interferecircncia do TDA positivo (controle da reaccedilatildeo negativo)
O eluato resultante do tratamento com glicina-aacutecidaEDTA foi testada em gel com
hemaacutecias de painel de identificaccedilatildeo de anticorpos e apresentou resultado positivo com todas
as ceacutelulas (figura 13 e 14)
A amostra foi enviada para genotipagem e o resultado da genotipagem confirmou o
resultado da fenotipagem apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
527 TEMPO DE EXECUCcedilAtildeO DA TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
O tempo de reaccedilatildeo da glicina-aacutecidaEDTA eacute de 2 minutos Todas as amostras foram
tratadas obedecendo ao tempo descrito na literatura demonstrando que o mesmo eacute
reprodutiacutevel
37
Tabela 6- Resultados individuais por amostra
Amostra Especificidade
dos anticorpos
Intensidade do
TDA apoacutes
sensibilizaccedilatildeo
Tratamento
efetivo com
cloroquina
Tratamento
efetivo com
glicina
Eluato
poacutes
glicina
1 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 2 Dia 3+ Sim Sim 3+ 3 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 4 D 4+ Natildeo Sim 4+ 5 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 6 E 3+ Sim Sim Negativo 7 S 4+ Sim Sim 3+ 8 E 3+ Sim Sim 1+ 9 E 3+ Sim Sim 2+
10 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 11 D 4+ Natildeo Sim 4+ 12 D 4+ Natildeo Sim 4+ 13 S 3+ Sim Sim 3+ 14 S 3+ Sim Sim 3+ 15 D 3+ Natildeo Sim 3+ 16 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 17 E 3+ Sim Sim (+) 18 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 19 D 4+ Natildeo Natildeo 3+ 20 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 21 C 3+ Sim Sim 4+ 22 C 3+ Sim Sim 4+ 23 C 3+ Sim Sim 4+ 24 K 4+ Natildeo Sim 4+ 25 D 3+ Natildeo Natildeo Negativo 26 E 4+ Sim Sim Negativo 27 S 3+ Sim Sim 3+ 28 C 3+ Sim Natildeo 4+ 29 C 3+ Sim Sim 4+ 30 C 3+ Sim Sim 4+ 31 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 32 E 3+ Sim Sim Negativo 33 C 3+ Sim Natildeo 4+ 34 S 3+ Sim Sim Negativo 35 S 3+ Sim Sim Negativo 36 C 4+ Sim Natildeo 4+ 37 c 4+ Natildeo Natildeo 4+ 38 D 4+ Natildeo Sim 4+ 39 S 3+ Sim Sim 3+ 40 c 4+ Sim Natildeo 2+ 41 C 4+ Sim Natildeo 4+ 42 E 3+ Sim Sim Negativo 43 D 3+ Natildeo Sim 2+ 44 D 3+ Natildeo Sim 2+ 45 E 3+ Sim Sim Negativo 46 C 3+ Sim Sim 4+ 47 K 4+ Natildeo Natildeo 4+ 48 D 3+ Natildeo Sim 2+ 49 E 3+ Sim Sim Negativo 50 K 4+ Natildeo Sim 4+
TOTAL 50 28 33 41
38
Figura 10 ndash TDA monoespeciacutefico da amostra de paciente Hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo da classe
IgG
oacute Figura 11 ndash TDA apoacutes o tratamento com glicina-aacutecidaEDTA (esquerda) e cloroquina (direita) A glicina
negativou completamente o TDA enquanto a hemaacutecia tratada com cloroquina persistiu positiva (1+)
39
Figura 12 ndash Fenotipagem da amostra tratada com glicina-aacutecidaEDTA Fy(a+b+) Jk(a-b+) S+s+
Figura 13 ndash Painel em gel (LissAGH) do eluato apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de
intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
Figura 14 ndash ndash Painel ezimaacutetico (hemaacutecias tratadas com bromelina) do eluato em gel neutro apoacutes
tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
40
528 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Quanto a efetividade das teacutecnicas em negativar o TDA foi verificado que a glicina-
aacutecidaEDTA foi efetiva em 66 das amostras testadas no primeiro tratamento (3350
amostras) enquanto a cloroquina conseguiu negativar 56 (2850) Esses resultados natildeo
apresentam diferenccedila significativa (pgt005) demostrando que a teacutecnica da glicina-
aacutecidaEDTA natildeo eacute superior mas eacute tatildeo efetiva quanto a da cloroquina
Quando aliamos os resultados de ambas as teacutecnicas verificamos que em 76 (3850)
das amostras o TDA foi negativado Esse dado indica que ainda que uma teacutecnica natildeo seja
eficaz na remoccedilatildeo do anticorpo eacute uma boa alternativa tentar a segunda teacutecnica jaacute que a falha
em remover o anticorpo utilizando uma delas natildeo prevecirc necessariamente a falha com a outra
Quando se utiliza o teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla (graacutefico 2) para comparar a utilizaccedilatildeo das
duas teacutecnicas com o resultado de cada uma isolada (somente a cloroquina ou somente a
glicina) verificamos que os resultados apresentam diferenccedila significativa (plt005) (quadro 3)
TRATAMENTO EFETIVO COM TOTAL PORCENTAGEM
Glicina ou cloroquina 38 76
Glicina e cloroquina 23 46
Glicina apenas 10 20
Cloroquina apenas 5 10
Nenhuma das teacutecnicas 12 24
Quadro 3 - Resultados comparativos entre as teacutecnicas utilizadas
41
Graacutefico 2 - Teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla entre as teacutecnicas aplicadas A- Glicina e Cloroquina B-Cloroquina C-
Glicina ( plt005)
42
6 DISCUSSAtildeO
Os reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA podem ser adquiridos em
forma de kit comercial prontos para uso poreacutem natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil A preparaccedilatildeo
dos reagentes ldquoin houserdquo a partir de sais comerciais adquiridos se mostrou viaacutevel Os
reagentes glicina e o tampatildeo Tris armazenados de forma correta se mantiveram estaacuteveis por
um periacuteodo de 7 meses Somente o reagente EDTA precipitou mesmo armazenado em
condiccedilotildees adequadas sugerindo que o mesmo deve ser preparado em menor quantidade e
armazenado em aliacutequotas A soluccedilatildeo de cloroquina tambeacutem pode ser preparada ldquoin houserdquo e
pode ser armazenado por um mecircs A legislaccedilatildeo brasileira autoriza a utilizaccedilatildeo de reagentes
preparados a partir de sais comerciais como a cloroquina e a glicina-aacutecidaEDTA desde que
os sais tenham autorizaccedilatildeo da vigilacircncia sanitaacuteria para a comercializaccedilatildeo (BRASIL 2001)
A comparaccedilatildeo quanto a efetividade em dissociar anticorpos em amostras com TDA
positivos entre a teacutecnica da glicina e a teacutecnica da cloroquina mostrou que natildeo haacute diferenccedila
estatiacutestica entre elas e que ambas satildeo igualmente eficientes Se utilizadas conjuntamente haacute
maior possibilidade de elucidaccedilatildeo dos casos
Uma vantagem da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eacute que ela permite numa mesma
amostra eluir o anticorpo ligado aacute hemaacutecia assim como fenotipar a hemaacutecia tratada Devido a
sua dupla utilidade a teacutecnica eacute vantajosa principalmente em pacientes em que pouco volume
de amostra pode ser coletado como em casos de crianccedilas e receacutem-nascidos
A fenotipagem poacutes tratamento se mostrou viaacutevel jaacute que os antiacutegenos de maior
importacircncia natildeo sofreram alteraccedilotildees Nas 20 amostras que foram fenotipadas antes e apoacutes
tratamento para verificar a influecircncia dos reagentes na expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a
Jkb S e s natildeo houve destruiccedilatildeo dos mesmos por nenhuma das duas teacutecnicas
Para as amostras positivas para o antiacutegeno Kell (350) e sensibilizadas com o
respectivo anticorpo a teacutecnica da glicina foi efetiva em negativar o TDA em apenas duas
delas mas apoacutes o tratamento foi verificada uma fraca reatividade da reaccedilatildeo antiacutegeno-
anticorpo sugerindo que houve um enfraquecimento da expressatildeo do antiacutegeno conforme
esperado e descrito na literatura (BYRNE 1991 PALLAS WILER E MCGEE 1991
ROZIERS e SQUALI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012 e KATHARIA e
CHAUDHARY 2013) A accedilatildeo da glicina sobre o antigeno Kell natildeo representa impedimento
para seu uso uma vez que na impossibilidade de testar o antiacutegeno Kell o banco de sangue
consegue facilmente atender a solicitaccedilatildeo de transfusatildeo com unidades de hemaacutecias Kell
43
negativas jaacute que eacute um antiacutegeno de baixa prevalecircncia na populaccedilatildeo variando de 15 na
populaccedilatildeo africana a 9 nos europeus (DANIELS 2011)
A soluccedilatildeo resultante da dissociaccedilatildeo do anticorpo pela teacutecnica da glicina pode ainda ser
utilizada como eluato podendo substituir a teacutecnica de eluiccedilatildeo com reagentes comercias (kits
de eluiccedilatildeo aacutecida) que tem alto custo aproximadamente entre R$2000 a R$2500 por teste
Em 41 amostras (82) houve a dissociaccedilatildeo e recuperaccedilatildeo do anticorpo que estava
sensibilizando as hemaacutecias Em 9 amostras (18) os anticorpos foram eluiacutedos poreacutem
apresentaram reaccedilatildeo negativa quando testadas com hemaacutecias de triagem entre eles o anti-E
(6) anti-S (2) e Anti-D (1) Eacute possiacutevel que a correccedilatildeo pH do meio (WALKER 2011) natildeo
tenha sido adequada o que pode ter desfavorecido a reatividade do anticorpo
Para as amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA nas quais natildeo houve dissociaccedilatildeo do
anticorpo pelo primeiro tratamento (1750) o segundo tratamento natildeo se mostrou eficaz jaacute
que 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise O tempo de
armazenagem natildeo parece ter influenciado jaacute que todas as amostras foram testadas dentro de
48 horas apoacutes a coleta Outros fatores que natildeo foram verificados podem ter levado a
hemoacutelise Apesar da literatura (LOUIE JIENG e ZEROULIS 1986 e BYRNE 1991)
recomendar um segundo tratamento ele eacute pouco eficaz tendo negativado apenas 3 das 17
amostras testadas
A amostra de paciente que apresentou sensibilizaccedilatildeo ldquoin vivordquo mostrou melhor
efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA sobre a da cloroquina possibilitando
fenotipagem para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s que natildeo foram destruiacutedos apoacutes o
tratamento comprovado atraveacutes da genotipagem
A presenccedila de autoanticorpo a quente com presenccedila de hemoacutelise (AHAI) ou natildeo pode
mascarar a presenccedila de aloanticorpo interferindo na rotina soroloacutegica da fenotipagem que eacute
uma importante ferramenta para auxiliar na seleccedilatildeo de hemaacutecias para transfusatildeo (SHIREY et
al 2002) Esses pacientes frequentemente possuem aloanticorpos associados ao
autoanticorpo e a prevalecircncia de aloimunizaccedilatildeo entre eles varia entre 12 a 40 (LEGER e
GARRATY 1999 BRANCH e PETZ 1999) o que dificulta ainda mais a escolha do melhor
componente a ser transfundido aleacutem de aumentar a possibilidade reaccedilotildees hemoliacuteticas imunes
poacutes-transfusionais
Nesses casos as teacutecnicas de dissociaccedilatildeo de anticorpos satildeo importantes para tratar
amostras de pacientes e a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser usada como uma opccedilatildeo
pois se mostrou eficaz na dissociaccedilatildeo anticorpo ligado agraves hemaacutecias deixando livre a
superfiacutecie das mesmas permitindo a fenotipagem por antisoros IgG Paralelamente os
44
anticorpos eluiacutedos tambeacutem puderam ser estudados O mesmo natildeo ocorre com a cloroquina
que permite apenas a fenotipagem e tampouco com os kits de eluiccedilatildeo aacutecida disponiacuteveis no
mercado nacional que satildeo destinados a realizaccedilatildeo do eluato mas destroem as hemaacutecias
O tempo de tratamento na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA tambeacutem eacute uma vantagem
pois foi possiacutevel reproduzir no tempo determinado de 2 minutos enquanto a cloroquina
demora ateacute duas horas
Ainda que a aplicaccedilatildeo das teacutecnicas por biologia molecular estejam cada vez mais
presentes na rotina imuno-hematoloacutegica e possibilitam estabelecer o fenoacutetipo deduzido do
genoacutetipo elas natildeo estatildeo disponiacuteveis na maioria dos centros e sua realizaccedilatildeo exige algumas
horas A resoluccedilatildeo imediata do problema transfusional necessita dos resultados soroloacutegicos
pois com frequecircncia natildeo eacute possiacutevel aguardar o resultado do teste molecular Dessa forma
apesar da crescente importacircncia da genotipagem eritrocitaacuteria teacutecnicas soroloacutegicas aplicadas
corretamente e no momento propiacutecio satildeo de grande utilidade para resolver problemas imuno-
hematoloacutegicos como ocorre com a fenotipagem em pacientes com TDA positivo
45
7 CONCLUSAtildeO
A teacutecnica da glicina aacutecidaEDTA mostrou-se efetiva em remover os anticorpos que
sensibilizavam as hemaacutecias e pode ser utilizada com seguranccedila antes da fenotipagem
eritrocitaacuteria Por ser uma teacutecnica de raacutepida execuccedilatildeo eacute uma alternativa aplicaacutevel
principalmente em casos urgentes de pacientes que apresentam autoanticorpos
46
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50
9 ANEXOS
51
FUNDACcedilAtildeO HEMOCENTRO DE RIBEIRAtildeO PRETO
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE)
Tiacutetulo da pesquisa Aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina aacutecida-EDTA e avaliaccedilatildeo da
eficaacutecia no tratamento de hemaacutecias com teste direto da antiglobulina positivo
Pesquisadora responsaacutevel Ceacutelia Kazue Abiko
Orientador Prof Dimas Tadeu Covas
Co-orientadora Dra Flaacutevia Leite Souza Santos
Objetivo da pesquisa Vocecirc estaacute sendo convidado a participar de uma pesquisa que tem
como objetivo padronizar uma nova teacutecnica para auxiliar na tipagem sanguiacutenea de pacientes
A tipagem sanguiacutenea pode sofrer interferecircncia da presenccedila de anticorpos ligados aos gloacutebulos
vermelhos do sangue Nessas situaccedilotildees eacute difiacutecil selecionar o melhor sangue para o paciente e
eacute preciso a utilizaccedilatildeo de teacutecnicas adicionais para remover essas interferecircncias
Esta pesquisa tem como objetivo estudar outra teacutecnica para remover esses anticorpos e
comparaacute-la com a teacutecnica atualmente utilizada Para isso precisamos de amostras de pacientes
e doadores voluntaacuterios
Se vocecirc eacute um doador eacute necessaacuterio que vocecirc autorize a coleta de 5 ml (1 tubo) a mais
de seu sangue
Se vocecirc eacute um paciente natildeo haveraacute necessidade de nova amostra pois utilizaremos as
amostras jaacute coletadas para os testes preacute-transfusionais e os resultados encontrados nesta
pesquisa natildeo iratildeo interferir na escolha da (s) bolsa (s) de sangue que vocecirc possa vir a receber
Se vocecirc concordar em participar leia com atenccedilatildeo o texto abaixo e assine as duas vias
rubricando todas as paacuteginas deste termo de consentimento Uma via original assinada e
rubricada por vocecirc e pela pesquisadora ficaraacute com vocecirc
As suas informaccedilotildees seratildeo mantidas em sigilo pela pesquisadora e natildeo haveraacute
armazenamento de material para pesquisas posteriores Os seus dados seratildeo usados apenas
neste estudo e quando o trabalho for publicado seu nome e qualquer outra informaccedilatildeo que
possam identificaacute-lo natildeo seratildeo revelados
Eacute pouco provaacutevel que o que noacutes aprendermos com este estudo tenha um benefiacutecio
direto para vocecirc assim como natildeo poderemos dar nada em troca pela sua participaccedilatildeo na
pesquisa
Nosso objetivo com esta pesquisa eacute que os resultados poderatildeo ser uacuteteis para o
tratamento de pacientes no futuro Os riscos da participaccedilatildeo satildeo miacutenimos Se vocecirc eacute um
doador de sangue a amostra seraacute coletada no momento da doaccedilatildeo natildeo exigindo punccedilatildeo
venosa adicional
52
Eacute seu direito ter acesso aos resultados dos testes da pesquisa Esses resultados natildeo
seratildeo fornecidos automaticamente a vocecirc mas caso vocecirc se interesse em saber o resultado ou
tiver alguma duacutevida sobre a sua participaccedilatildeo neste estudo deveraacute entrar em contato com Ceacutelia
Kazue Abiko pelo telefone (18) 99718-3551
Vocecirc tem total liberdade de optar por natildeo participar da pesquisa Caso aceite
participar poderaacute desistir a qualquer momento ou retirar seu consentimento mesmo apoacutes ter
coletado o sangue Para cancelar sua participaccedilatildeo basta avisar a pesquisadora e os seus dados
seratildeo retirados do projeto
Qualquer duacutevida eacutetica sobre a pesquisa poderaacute entrar em contato com o Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa do Hospital das Cliacutenicas e da Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto
(CAMPUS UNIVERSITAacuteRIO bairro Monte Alegre CEP 14048-900 Ribeiratildeo Preto-SP
Telefone (16) 3602-2228 FAX (16) 3633-1144 e-mail cephcrpuspbr)
Consentimento de participaccedilatildeo
A Consentimento do participante
Li as informaccedilotildees acima sobre o estudo e recebi explicaccedilotildees sobre a participaccedilatildeo no estudo
Portanto dou o meu consentimento para participar do estudo
___________________________________________________________________________
Nome completo
___________________________________________________________________________
Assinatura
___________
Data
__________________________________________________________________________________
Nome completo da pesquisadora
___________________________________________________________________________
Assinatura
_____________
Data
36
Figura 9 ndash Fenotipagem das amostras 24 e 50 para antiacutegeno K apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
O teste positivo indica a presenccedila do antiacutegeno poreacutem a reatividade fraca (1+) sugere que houve enfraquecimento
de sua expressatildeo A direita a expressatildeo forte (4+) do antiacutegeno Kell em hemaacutecia controle natildeo tratada utilizada
como controle positivo
A cloroquina natildeo foi efetiva na retirada do anticorpo ligado as hemaacutecias ao contraacuterio
do tratamento com a glicina-aacutecidaEDTA que dissociou o anticorpo (figura 11)
A hemaacutecia tratada com glicina foi fenotipada para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s
(figura 12) A fenotipagem para o sistema Rh (C c E e e) e Kell foi realizada em gel
especiacutefico monoclonal sem interferecircncia do TDA positivo (controle da reaccedilatildeo negativo)
O eluato resultante do tratamento com glicina-aacutecidaEDTA foi testada em gel com
hemaacutecias de painel de identificaccedilatildeo de anticorpos e apresentou resultado positivo com todas
as ceacutelulas (figura 13 e 14)
A amostra foi enviada para genotipagem e o resultado da genotipagem confirmou o
resultado da fenotipagem apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA
527 TEMPO DE EXECUCcedilAtildeO DA TEacuteCNICA DA GLICINA-AacuteCIDAEDTA
O tempo de reaccedilatildeo da glicina-aacutecidaEDTA eacute de 2 minutos Todas as amostras foram
tratadas obedecendo ao tempo descrito na literatura demonstrando que o mesmo eacute
reprodutiacutevel
37
Tabela 6- Resultados individuais por amostra
Amostra Especificidade
dos anticorpos
Intensidade do
TDA apoacutes
sensibilizaccedilatildeo
Tratamento
efetivo com
cloroquina
Tratamento
efetivo com
glicina
Eluato
poacutes
glicina
1 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 2 Dia 3+ Sim Sim 3+ 3 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 4 D 4+ Natildeo Sim 4+ 5 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 6 E 3+ Sim Sim Negativo 7 S 4+ Sim Sim 3+ 8 E 3+ Sim Sim 1+ 9 E 3+ Sim Sim 2+
10 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 11 D 4+ Natildeo Sim 4+ 12 D 4+ Natildeo Sim 4+ 13 S 3+ Sim Sim 3+ 14 S 3+ Sim Sim 3+ 15 D 3+ Natildeo Sim 3+ 16 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 17 E 3+ Sim Sim (+) 18 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 19 D 4+ Natildeo Natildeo 3+ 20 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 21 C 3+ Sim Sim 4+ 22 C 3+ Sim Sim 4+ 23 C 3+ Sim Sim 4+ 24 K 4+ Natildeo Sim 4+ 25 D 3+ Natildeo Natildeo Negativo 26 E 4+ Sim Sim Negativo 27 S 3+ Sim Sim 3+ 28 C 3+ Sim Natildeo 4+ 29 C 3+ Sim Sim 4+ 30 C 3+ Sim Sim 4+ 31 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 32 E 3+ Sim Sim Negativo 33 C 3+ Sim Natildeo 4+ 34 S 3+ Sim Sim Negativo 35 S 3+ Sim Sim Negativo 36 C 4+ Sim Natildeo 4+ 37 c 4+ Natildeo Natildeo 4+ 38 D 4+ Natildeo Sim 4+ 39 S 3+ Sim Sim 3+ 40 c 4+ Sim Natildeo 2+ 41 C 4+ Sim Natildeo 4+ 42 E 3+ Sim Sim Negativo 43 D 3+ Natildeo Sim 2+ 44 D 3+ Natildeo Sim 2+ 45 E 3+ Sim Sim Negativo 46 C 3+ Sim Sim 4+ 47 K 4+ Natildeo Natildeo 4+ 48 D 3+ Natildeo Sim 2+ 49 E 3+ Sim Sim Negativo 50 K 4+ Natildeo Sim 4+
TOTAL 50 28 33 41
38
Figura 10 ndash TDA monoespeciacutefico da amostra de paciente Hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo da classe
IgG
oacute Figura 11 ndash TDA apoacutes o tratamento com glicina-aacutecidaEDTA (esquerda) e cloroquina (direita) A glicina
negativou completamente o TDA enquanto a hemaacutecia tratada com cloroquina persistiu positiva (1+)
39
Figura 12 ndash Fenotipagem da amostra tratada com glicina-aacutecidaEDTA Fy(a+b+) Jk(a-b+) S+s+
Figura 13 ndash Painel em gel (LissAGH) do eluato apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de
intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
Figura 14 ndash ndash Painel ezimaacutetico (hemaacutecias tratadas com bromelina) do eluato em gel neutro apoacutes
tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
40
528 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Quanto a efetividade das teacutecnicas em negativar o TDA foi verificado que a glicina-
aacutecidaEDTA foi efetiva em 66 das amostras testadas no primeiro tratamento (3350
amostras) enquanto a cloroquina conseguiu negativar 56 (2850) Esses resultados natildeo
apresentam diferenccedila significativa (pgt005) demostrando que a teacutecnica da glicina-
aacutecidaEDTA natildeo eacute superior mas eacute tatildeo efetiva quanto a da cloroquina
Quando aliamos os resultados de ambas as teacutecnicas verificamos que em 76 (3850)
das amostras o TDA foi negativado Esse dado indica que ainda que uma teacutecnica natildeo seja
eficaz na remoccedilatildeo do anticorpo eacute uma boa alternativa tentar a segunda teacutecnica jaacute que a falha
em remover o anticorpo utilizando uma delas natildeo prevecirc necessariamente a falha com a outra
Quando se utiliza o teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla (graacutefico 2) para comparar a utilizaccedilatildeo das
duas teacutecnicas com o resultado de cada uma isolada (somente a cloroquina ou somente a
glicina) verificamos que os resultados apresentam diferenccedila significativa (plt005) (quadro 3)
TRATAMENTO EFETIVO COM TOTAL PORCENTAGEM
Glicina ou cloroquina 38 76
Glicina e cloroquina 23 46
Glicina apenas 10 20
Cloroquina apenas 5 10
Nenhuma das teacutecnicas 12 24
Quadro 3 - Resultados comparativos entre as teacutecnicas utilizadas
41
Graacutefico 2 - Teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla entre as teacutecnicas aplicadas A- Glicina e Cloroquina B-Cloroquina C-
Glicina ( plt005)
42
6 DISCUSSAtildeO
Os reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA podem ser adquiridos em
forma de kit comercial prontos para uso poreacutem natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil A preparaccedilatildeo
dos reagentes ldquoin houserdquo a partir de sais comerciais adquiridos se mostrou viaacutevel Os
reagentes glicina e o tampatildeo Tris armazenados de forma correta se mantiveram estaacuteveis por
um periacuteodo de 7 meses Somente o reagente EDTA precipitou mesmo armazenado em
condiccedilotildees adequadas sugerindo que o mesmo deve ser preparado em menor quantidade e
armazenado em aliacutequotas A soluccedilatildeo de cloroquina tambeacutem pode ser preparada ldquoin houserdquo e
pode ser armazenado por um mecircs A legislaccedilatildeo brasileira autoriza a utilizaccedilatildeo de reagentes
preparados a partir de sais comerciais como a cloroquina e a glicina-aacutecidaEDTA desde que
os sais tenham autorizaccedilatildeo da vigilacircncia sanitaacuteria para a comercializaccedilatildeo (BRASIL 2001)
A comparaccedilatildeo quanto a efetividade em dissociar anticorpos em amostras com TDA
positivos entre a teacutecnica da glicina e a teacutecnica da cloroquina mostrou que natildeo haacute diferenccedila
estatiacutestica entre elas e que ambas satildeo igualmente eficientes Se utilizadas conjuntamente haacute
maior possibilidade de elucidaccedilatildeo dos casos
Uma vantagem da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eacute que ela permite numa mesma
amostra eluir o anticorpo ligado aacute hemaacutecia assim como fenotipar a hemaacutecia tratada Devido a
sua dupla utilidade a teacutecnica eacute vantajosa principalmente em pacientes em que pouco volume
de amostra pode ser coletado como em casos de crianccedilas e receacutem-nascidos
A fenotipagem poacutes tratamento se mostrou viaacutevel jaacute que os antiacutegenos de maior
importacircncia natildeo sofreram alteraccedilotildees Nas 20 amostras que foram fenotipadas antes e apoacutes
tratamento para verificar a influecircncia dos reagentes na expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a
Jkb S e s natildeo houve destruiccedilatildeo dos mesmos por nenhuma das duas teacutecnicas
Para as amostras positivas para o antiacutegeno Kell (350) e sensibilizadas com o
respectivo anticorpo a teacutecnica da glicina foi efetiva em negativar o TDA em apenas duas
delas mas apoacutes o tratamento foi verificada uma fraca reatividade da reaccedilatildeo antiacutegeno-
anticorpo sugerindo que houve um enfraquecimento da expressatildeo do antiacutegeno conforme
esperado e descrito na literatura (BYRNE 1991 PALLAS WILER E MCGEE 1991
ROZIERS e SQUALI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012 e KATHARIA e
CHAUDHARY 2013) A accedilatildeo da glicina sobre o antigeno Kell natildeo representa impedimento
para seu uso uma vez que na impossibilidade de testar o antiacutegeno Kell o banco de sangue
consegue facilmente atender a solicitaccedilatildeo de transfusatildeo com unidades de hemaacutecias Kell
43
negativas jaacute que eacute um antiacutegeno de baixa prevalecircncia na populaccedilatildeo variando de 15 na
populaccedilatildeo africana a 9 nos europeus (DANIELS 2011)
A soluccedilatildeo resultante da dissociaccedilatildeo do anticorpo pela teacutecnica da glicina pode ainda ser
utilizada como eluato podendo substituir a teacutecnica de eluiccedilatildeo com reagentes comercias (kits
de eluiccedilatildeo aacutecida) que tem alto custo aproximadamente entre R$2000 a R$2500 por teste
Em 41 amostras (82) houve a dissociaccedilatildeo e recuperaccedilatildeo do anticorpo que estava
sensibilizando as hemaacutecias Em 9 amostras (18) os anticorpos foram eluiacutedos poreacutem
apresentaram reaccedilatildeo negativa quando testadas com hemaacutecias de triagem entre eles o anti-E
(6) anti-S (2) e Anti-D (1) Eacute possiacutevel que a correccedilatildeo pH do meio (WALKER 2011) natildeo
tenha sido adequada o que pode ter desfavorecido a reatividade do anticorpo
Para as amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA nas quais natildeo houve dissociaccedilatildeo do
anticorpo pelo primeiro tratamento (1750) o segundo tratamento natildeo se mostrou eficaz jaacute
que 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise O tempo de
armazenagem natildeo parece ter influenciado jaacute que todas as amostras foram testadas dentro de
48 horas apoacutes a coleta Outros fatores que natildeo foram verificados podem ter levado a
hemoacutelise Apesar da literatura (LOUIE JIENG e ZEROULIS 1986 e BYRNE 1991)
recomendar um segundo tratamento ele eacute pouco eficaz tendo negativado apenas 3 das 17
amostras testadas
A amostra de paciente que apresentou sensibilizaccedilatildeo ldquoin vivordquo mostrou melhor
efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA sobre a da cloroquina possibilitando
fenotipagem para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s que natildeo foram destruiacutedos apoacutes o
tratamento comprovado atraveacutes da genotipagem
A presenccedila de autoanticorpo a quente com presenccedila de hemoacutelise (AHAI) ou natildeo pode
mascarar a presenccedila de aloanticorpo interferindo na rotina soroloacutegica da fenotipagem que eacute
uma importante ferramenta para auxiliar na seleccedilatildeo de hemaacutecias para transfusatildeo (SHIREY et
al 2002) Esses pacientes frequentemente possuem aloanticorpos associados ao
autoanticorpo e a prevalecircncia de aloimunizaccedilatildeo entre eles varia entre 12 a 40 (LEGER e
GARRATY 1999 BRANCH e PETZ 1999) o que dificulta ainda mais a escolha do melhor
componente a ser transfundido aleacutem de aumentar a possibilidade reaccedilotildees hemoliacuteticas imunes
poacutes-transfusionais
Nesses casos as teacutecnicas de dissociaccedilatildeo de anticorpos satildeo importantes para tratar
amostras de pacientes e a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser usada como uma opccedilatildeo
pois se mostrou eficaz na dissociaccedilatildeo anticorpo ligado agraves hemaacutecias deixando livre a
superfiacutecie das mesmas permitindo a fenotipagem por antisoros IgG Paralelamente os
44
anticorpos eluiacutedos tambeacutem puderam ser estudados O mesmo natildeo ocorre com a cloroquina
que permite apenas a fenotipagem e tampouco com os kits de eluiccedilatildeo aacutecida disponiacuteveis no
mercado nacional que satildeo destinados a realizaccedilatildeo do eluato mas destroem as hemaacutecias
O tempo de tratamento na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA tambeacutem eacute uma vantagem
pois foi possiacutevel reproduzir no tempo determinado de 2 minutos enquanto a cloroquina
demora ateacute duas horas
Ainda que a aplicaccedilatildeo das teacutecnicas por biologia molecular estejam cada vez mais
presentes na rotina imuno-hematoloacutegica e possibilitam estabelecer o fenoacutetipo deduzido do
genoacutetipo elas natildeo estatildeo disponiacuteveis na maioria dos centros e sua realizaccedilatildeo exige algumas
horas A resoluccedilatildeo imediata do problema transfusional necessita dos resultados soroloacutegicos
pois com frequecircncia natildeo eacute possiacutevel aguardar o resultado do teste molecular Dessa forma
apesar da crescente importacircncia da genotipagem eritrocitaacuteria teacutecnicas soroloacutegicas aplicadas
corretamente e no momento propiacutecio satildeo de grande utilidade para resolver problemas imuno-
hematoloacutegicos como ocorre com a fenotipagem em pacientes com TDA positivo
45
7 CONCLUSAtildeO
A teacutecnica da glicina aacutecidaEDTA mostrou-se efetiva em remover os anticorpos que
sensibilizavam as hemaacutecias e pode ser utilizada com seguranccedila antes da fenotipagem
eritrocitaacuteria Por ser uma teacutecnica de raacutepida execuccedilatildeo eacute uma alternativa aplicaacutevel
principalmente em casos urgentes de pacientes que apresentam autoanticorpos
46
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50
9 ANEXOS
51
FUNDACcedilAtildeO HEMOCENTRO DE RIBEIRAtildeO PRETO
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE)
Tiacutetulo da pesquisa Aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina aacutecida-EDTA e avaliaccedilatildeo da
eficaacutecia no tratamento de hemaacutecias com teste direto da antiglobulina positivo
Pesquisadora responsaacutevel Ceacutelia Kazue Abiko
Orientador Prof Dimas Tadeu Covas
Co-orientadora Dra Flaacutevia Leite Souza Santos
Objetivo da pesquisa Vocecirc estaacute sendo convidado a participar de uma pesquisa que tem
como objetivo padronizar uma nova teacutecnica para auxiliar na tipagem sanguiacutenea de pacientes
A tipagem sanguiacutenea pode sofrer interferecircncia da presenccedila de anticorpos ligados aos gloacutebulos
vermelhos do sangue Nessas situaccedilotildees eacute difiacutecil selecionar o melhor sangue para o paciente e
eacute preciso a utilizaccedilatildeo de teacutecnicas adicionais para remover essas interferecircncias
Esta pesquisa tem como objetivo estudar outra teacutecnica para remover esses anticorpos e
comparaacute-la com a teacutecnica atualmente utilizada Para isso precisamos de amostras de pacientes
e doadores voluntaacuterios
Se vocecirc eacute um doador eacute necessaacuterio que vocecirc autorize a coleta de 5 ml (1 tubo) a mais
de seu sangue
Se vocecirc eacute um paciente natildeo haveraacute necessidade de nova amostra pois utilizaremos as
amostras jaacute coletadas para os testes preacute-transfusionais e os resultados encontrados nesta
pesquisa natildeo iratildeo interferir na escolha da (s) bolsa (s) de sangue que vocecirc possa vir a receber
Se vocecirc concordar em participar leia com atenccedilatildeo o texto abaixo e assine as duas vias
rubricando todas as paacuteginas deste termo de consentimento Uma via original assinada e
rubricada por vocecirc e pela pesquisadora ficaraacute com vocecirc
As suas informaccedilotildees seratildeo mantidas em sigilo pela pesquisadora e natildeo haveraacute
armazenamento de material para pesquisas posteriores Os seus dados seratildeo usados apenas
neste estudo e quando o trabalho for publicado seu nome e qualquer outra informaccedilatildeo que
possam identificaacute-lo natildeo seratildeo revelados
Eacute pouco provaacutevel que o que noacutes aprendermos com este estudo tenha um benefiacutecio
direto para vocecirc assim como natildeo poderemos dar nada em troca pela sua participaccedilatildeo na
pesquisa
Nosso objetivo com esta pesquisa eacute que os resultados poderatildeo ser uacuteteis para o
tratamento de pacientes no futuro Os riscos da participaccedilatildeo satildeo miacutenimos Se vocecirc eacute um
doador de sangue a amostra seraacute coletada no momento da doaccedilatildeo natildeo exigindo punccedilatildeo
venosa adicional
52
Eacute seu direito ter acesso aos resultados dos testes da pesquisa Esses resultados natildeo
seratildeo fornecidos automaticamente a vocecirc mas caso vocecirc se interesse em saber o resultado ou
tiver alguma duacutevida sobre a sua participaccedilatildeo neste estudo deveraacute entrar em contato com Ceacutelia
Kazue Abiko pelo telefone (18) 99718-3551
Vocecirc tem total liberdade de optar por natildeo participar da pesquisa Caso aceite
participar poderaacute desistir a qualquer momento ou retirar seu consentimento mesmo apoacutes ter
coletado o sangue Para cancelar sua participaccedilatildeo basta avisar a pesquisadora e os seus dados
seratildeo retirados do projeto
Qualquer duacutevida eacutetica sobre a pesquisa poderaacute entrar em contato com o Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa do Hospital das Cliacutenicas e da Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto
(CAMPUS UNIVERSITAacuteRIO bairro Monte Alegre CEP 14048-900 Ribeiratildeo Preto-SP
Telefone (16) 3602-2228 FAX (16) 3633-1144 e-mail cephcrpuspbr)
Consentimento de participaccedilatildeo
A Consentimento do participante
Li as informaccedilotildees acima sobre o estudo e recebi explicaccedilotildees sobre a participaccedilatildeo no estudo
Portanto dou o meu consentimento para participar do estudo
___________________________________________________________________________
Nome completo
___________________________________________________________________________
Assinatura
___________
Data
__________________________________________________________________________________
Nome completo da pesquisadora
___________________________________________________________________________
Assinatura
_____________
Data
37
Tabela 6- Resultados individuais por amostra
Amostra Especificidade
dos anticorpos
Intensidade do
TDA apoacutes
sensibilizaccedilatildeo
Tratamento
efetivo com
cloroquina
Tratamento
efetivo com
glicina
Eluato
poacutes
glicina
1 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 2 Dia 3+ Sim Sim 3+ 3 D 4+ Natildeo Natildeo 4+ 4 D 4+ Natildeo Sim 4+ 5 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 6 E 3+ Sim Sim Negativo 7 S 4+ Sim Sim 3+ 8 E 3+ Sim Sim 1+ 9 E 3+ Sim Sim 2+
10 c 3+ Natildeo Natildeo 3+ 11 D 4+ Natildeo Sim 4+ 12 D 4+ Natildeo Sim 4+ 13 S 3+ Sim Sim 3+ 14 S 3+ Sim Sim 3+ 15 D 3+ Natildeo Sim 3+ 16 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 17 E 3+ Sim Sim (+) 18 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 19 D 4+ Natildeo Natildeo 3+ 20 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 21 C 3+ Sim Sim 4+ 22 C 3+ Sim Sim 4+ 23 C 3+ Sim Sim 4+ 24 K 4+ Natildeo Sim 4+ 25 D 3+ Natildeo Natildeo Negativo 26 E 4+ Sim Sim Negativo 27 S 3+ Sim Sim 3+ 28 C 3+ Sim Natildeo 4+ 29 C 3+ Sim Sim 4+ 30 C 3+ Sim Sim 4+ 31 c 3+ Natildeo Natildeo 2+ 32 E 3+ Sim Sim Negativo 33 C 3+ Sim Natildeo 4+ 34 S 3+ Sim Sim Negativo 35 S 3+ Sim Sim Negativo 36 C 4+ Sim Natildeo 4+ 37 c 4+ Natildeo Natildeo 4+ 38 D 4+ Natildeo Sim 4+ 39 S 3+ Sim Sim 3+ 40 c 4+ Sim Natildeo 2+ 41 C 4+ Sim Natildeo 4+ 42 E 3+ Sim Sim Negativo 43 D 3+ Natildeo Sim 2+ 44 D 3+ Natildeo Sim 2+ 45 E 3+ Sim Sim Negativo 46 C 3+ Sim Sim 4+ 47 K 4+ Natildeo Natildeo 4+ 48 D 3+ Natildeo Sim 2+ 49 E 3+ Sim Sim Negativo 50 K 4+ Natildeo Sim 4+
TOTAL 50 28 33 41
38
Figura 10 ndash TDA monoespeciacutefico da amostra de paciente Hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo da classe
IgG
oacute Figura 11 ndash TDA apoacutes o tratamento com glicina-aacutecidaEDTA (esquerda) e cloroquina (direita) A glicina
negativou completamente o TDA enquanto a hemaacutecia tratada com cloroquina persistiu positiva (1+)
39
Figura 12 ndash Fenotipagem da amostra tratada com glicina-aacutecidaEDTA Fy(a+b+) Jk(a-b+) S+s+
Figura 13 ndash Painel em gel (LissAGH) do eluato apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de
intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
Figura 14 ndash ndash Painel ezimaacutetico (hemaacutecias tratadas com bromelina) do eluato em gel neutro apoacutes
tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
40
528 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Quanto a efetividade das teacutecnicas em negativar o TDA foi verificado que a glicina-
aacutecidaEDTA foi efetiva em 66 das amostras testadas no primeiro tratamento (3350
amostras) enquanto a cloroquina conseguiu negativar 56 (2850) Esses resultados natildeo
apresentam diferenccedila significativa (pgt005) demostrando que a teacutecnica da glicina-
aacutecidaEDTA natildeo eacute superior mas eacute tatildeo efetiva quanto a da cloroquina
Quando aliamos os resultados de ambas as teacutecnicas verificamos que em 76 (3850)
das amostras o TDA foi negativado Esse dado indica que ainda que uma teacutecnica natildeo seja
eficaz na remoccedilatildeo do anticorpo eacute uma boa alternativa tentar a segunda teacutecnica jaacute que a falha
em remover o anticorpo utilizando uma delas natildeo prevecirc necessariamente a falha com a outra
Quando se utiliza o teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla (graacutefico 2) para comparar a utilizaccedilatildeo das
duas teacutecnicas com o resultado de cada uma isolada (somente a cloroquina ou somente a
glicina) verificamos que os resultados apresentam diferenccedila significativa (plt005) (quadro 3)
TRATAMENTO EFETIVO COM TOTAL PORCENTAGEM
Glicina ou cloroquina 38 76
Glicina e cloroquina 23 46
Glicina apenas 10 20
Cloroquina apenas 5 10
Nenhuma das teacutecnicas 12 24
Quadro 3 - Resultados comparativos entre as teacutecnicas utilizadas
41
Graacutefico 2 - Teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla entre as teacutecnicas aplicadas A- Glicina e Cloroquina B-Cloroquina C-
Glicina ( plt005)
42
6 DISCUSSAtildeO
Os reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA podem ser adquiridos em
forma de kit comercial prontos para uso poreacutem natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil A preparaccedilatildeo
dos reagentes ldquoin houserdquo a partir de sais comerciais adquiridos se mostrou viaacutevel Os
reagentes glicina e o tampatildeo Tris armazenados de forma correta se mantiveram estaacuteveis por
um periacuteodo de 7 meses Somente o reagente EDTA precipitou mesmo armazenado em
condiccedilotildees adequadas sugerindo que o mesmo deve ser preparado em menor quantidade e
armazenado em aliacutequotas A soluccedilatildeo de cloroquina tambeacutem pode ser preparada ldquoin houserdquo e
pode ser armazenado por um mecircs A legislaccedilatildeo brasileira autoriza a utilizaccedilatildeo de reagentes
preparados a partir de sais comerciais como a cloroquina e a glicina-aacutecidaEDTA desde que
os sais tenham autorizaccedilatildeo da vigilacircncia sanitaacuteria para a comercializaccedilatildeo (BRASIL 2001)
A comparaccedilatildeo quanto a efetividade em dissociar anticorpos em amostras com TDA
positivos entre a teacutecnica da glicina e a teacutecnica da cloroquina mostrou que natildeo haacute diferenccedila
estatiacutestica entre elas e que ambas satildeo igualmente eficientes Se utilizadas conjuntamente haacute
maior possibilidade de elucidaccedilatildeo dos casos
Uma vantagem da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eacute que ela permite numa mesma
amostra eluir o anticorpo ligado aacute hemaacutecia assim como fenotipar a hemaacutecia tratada Devido a
sua dupla utilidade a teacutecnica eacute vantajosa principalmente em pacientes em que pouco volume
de amostra pode ser coletado como em casos de crianccedilas e receacutem-nascidos
A fenotipagem poacutes tratamento se mostrou viaacutevel jaacute que os antiacutegenos de maior
importacircncia natildeo sofreram alteraccedilotildees Nas 20 amostras que foram fenotipadas antes e apoacutes
tratamento para verificar a influecircncia dos reagentes na expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a
Jkb S e s natildeo houve destruiccedilatildeo dos mesmos por nenhuma das duas teacutecnicas
Para as amostras positivas para o antiacutegeno Kell (350) e sensibilizadas com o
respectivo anticorpo a teacutecnica da glicina foi efetiva em negativar o TDA em apenas duas
delas mas apoacutes o tratamento foi verificada uma fraca reatividade da reaccedilatildeo antiacutegeno-
anticorpo sugerindo que houve um enfraquecimento da expressatildeo do antiacutegeno conforme
esperado e descrito na literatura (BYRNE 1991 PALLAS WILER E MCGEE 1991
ROZIERS e SQUALI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012 e KATHARIA e
CHAUDHARY 2013) A accedilatildeo da glicina sobre o antigeno Kell natildeo representa impedimento
para seu uso uma vez que na impossibilidade de testar o antiacutegeno Kell o banco de sangue
consegue facilmente atender a solicitaccedilatildeo de transfusatildeo com unidades de hemaacutecias Kell
43
negativas jaacute que eacute um antiacutegeno de baixa prevalecircncia na populaccedilatildeo variando de 15 na
populaccedilatildeo africana a 9 nos europeus (DANIELS 2011)
A soluccedilatildeo resultante da dissociaccedilatildeo do anticorpo pela teacutecnica da glicina pode ainda ser
utilizada como eluato podendo substituir a teacutecnica de eluiccedilatildeo com reagentes comercias (kits
de eluiccedilatildeo aacutecida) que tem alto custo aproximadamente entre R$2000 a R$2500 por teste
Em 41 amostras (82) houve a dissociaccedilatildeo e recuperaccedilatildeo do anticorpo que estava
sensibilizando as hemaacutecias Em 9 amostras (18) os anticorpos foram eluiacutedos poreacutem
apresentaram reaccedilatildeo negativa quando testadas com hemaacutecias de triagem entre eles o anti-E
(6) anti-S (2) e Anti-D (1) Eacute possiacutevel que a correccedilatildeo pH do meio (WALKER 2011) natildeo
tenha sido adequada o que pode ter desfavorecido a reatividade do anticorpo
Para as amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA nas quais natildeo houve dissociaccedilatildeo do
anticorpo pelo primeiro tratamento (1750) o segundo tratamento natildeo se mostrou eficaz jaacute
que 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise O tempo de
armazenagem natildeo parece ter influenciado jaacute que todas as amostras foram testadas dentro de
48 horas apoacutes a coleta Outros fatores que natildeo foram verificados podem ter levado a
hemoacutelise Apesar da literatura (LOUIE JIENG e ZEROULIS 1986 e BYRNE 1991)
recomendar um segundo tratamento ele eacute pouco eficaz tendo negativado apenas 3 das 17
amostras testadas
A amostra de paciente que apresentou sensibilizaccedilatildeo ldquoin vivordquo mostrou melhor
efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA sobre a da cloroquina possibilitando
fenotipagem para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s que natildeo foram destruiacutedos apoacutes o
tratamento comprovado atraveacutes da genotipagem
A presenccedila de autoanticorpo a quente com presenccedila de hemoacutelise (AHAI) ou natildeo pode
mascarar a presenccedila de aloanticorpo interferindo na rotina soroloacutegica da fenotipagem que eacute
uma importante ferramenta para auxiliar na seleccedilatildeo de hemaacutecias para transfusatildeo (SHIREY et
al 2002) Esses pacientes frequentemente possuem aloanticorpos associados ao
autoanticorpo e a prevalecircncia de aloimunizaccedilatildeo entre eles varia entre 12 a 40 (LEGER e
GARRATY 1999 BRANCH e PETZ 1999) o que dificulta ainda mais a escolha do melhor
componente a ser transfundido aleacutem de aumentar a possibilidade reaccedilotildees hemoliacuteticas imunes
poacutes-transfusionais
Nesses casos as teacutecnicas de dissociaccedilatildeo de anticorpos satildeo importantes para tratar
amostras de pacientes e a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser usada como uma opccedilatildeo
pois se mostrou eficaz na dissociaccedilatildeo anticorpo ligado agraves hemaacutecias deixando livre a
superfiacutecie das mesmas permitindo a fenotipagem por antisoros IgG Paralelamente os
44
anticorpos eluiacutedos tambeacutem puderam ser estudados O mesmo natildeo ocorre com a cloroquina
que permite apenas a fenotipagem e tampouco com os kits de eluiccedilatildeo aacutecida disponiacuteveis no
mercado nacional que satildeo destinados a realizaccedilatildeo do eluato mas destroem as hemaacutecias
O tempo de tratamento na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA tambeacutem eacute uma vantagem
pois foi possiacutevel reproduzir no tempo determinado de 2 minutos enquanto a cloroquina
demora ateacute duas horas
Ainda que a aplicaccedilatildeo das teacutecnicas por biologia molecular estejam cada vez mais
presentes na rotina imuno-hematoloacutegica e possibilitam estabelecer o fenoacutetipo deduzido do
genoacutetipo elas natildeo estatildeo disponiacuteveis na maioria dos centros e sua realizaccedilatildeo exige algumas
horas A resoluccedilatildeo imediata do problema transfusional necessita dos resultados soroloacutegicos
pois com frequecircncia natildeo eacute possiacutevel aguardar o resultado do teste molecular Dessa forma
apesar da crescente importacircncia da genotipagem eritrocitaacuteria teacutecnicas soroloacutegicas aplicadas
corretamente e no momento propiacutecio satildeo de grande utilidade para resolver problemas imuno-
hematoloacutegicos como ocorre com a fenotipagem em pacientes com TDA positivo
45
7 CONCLUSAtildeO
A teacutecnica da glicina aacutecidaEDTA mostrou-se efetiva em remover os anticorpos que
sensibilizavam as hemaacutecias e pode ser utilizada com seguranccedila antes da fenotipagem
eritrocitaacuteria Por ser uma teacutecnica de raacutepida execuccedilatildeo eacute uma alternativa aplicaacutevel
principalmente em casos urgentes de pacientes que apresentam autoanticorpos
46
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50
9 ANEXOS
51
FUNDACcedilAtildeO HEMOCENTRO DE RIBEIRAtildeO PRETO
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE)
Tiacutetulo da pesquisa Aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina aacutecida-EDTA e avaliaccedilatildeo da
eficaacutecia no tratamento de hemaacutecias com teste direto da antiglobulina positivo
Pesquisadora responsaacutevel Ceacutelia Kazue Abiko
Orientador Prof Dimas Tadeu Covas
Co-orientadora Dra Flaacutevia Leite Souza Santos
Objetivo da pesquisa Vocecirc estaacute sendo convidado a participar de uma pesquisa que tem
como objetivo padronizar uma nova teacutecnica para auxiliar na tipagem sanguiacutenea de pacientes
A tipagem sanguiacutenea pode sofrer interferecircncia da presenccedila de anticorpos ligados aos gloacutebulos
vermelhos do sangue Nessas situaccedilotildees eacute difiacutecil selecionar o melhor sangue para o paciente e
eacute preciso a utilizaccedilatildeo de teacutecnicas adicionais para remover essas interferecircncias
Esta pesquisa tem como objetivo estudar outra teacutecnica para remover esses anticorpos e
comparaacute-la com a teacutecnica atualmente utilizada Para isso precisamos de amostras de pacientes
e doadores voluntaacuterios
Se vocecirc eacute um doador eacute necessaacuterio que vocecirc autorize a coleta de 5 ml (1 tubo) a mais
de seu sangue
Se vocecirc eacute um paciente natildeo haveraacute necessidade de nova amostra pois utilizaremos as
amostras jaacute coletadas para os testes preacute-transfusionais e os resultados encontrados nesta
pesquisa natildeo iratildeo interferir na escolha da (s) bolsa (s) de sangue que vocecirc possa vir a receber
Se vocecirc concordar em participar leia com atenccedilatildeo o texto abaixo e assine as duas vias
rubricando todas as paacuteginas deste termo de consentimento Uma via original assinada e
rubricada por vocecirc e pela pesquisadora ficaraacute com vocecirc
As suas informaccedilotildees seratildeo mantidas em sigilo pela pesquisadora e natildeo haveraacute
armazenamento de material para pesquisas posteriores Os seus dados seratildeo usados apenas
neste estudo e quando o trabalho for publicado seu nome e qualquer outra informaccedilatildeo que
possam identificaacute-lo natildeo seratildeo revelados
Eacute pouco provaacutevel que o que noacutes aprendermos com este estudo tenha um benefiacutecio
direto para vocecirc assim como natildeo poderemos dar nada em troca pela sua participaccedilatildeo na
pesquisa
Nosso objetivo com esta pesquisa eacute que os resultados poderatildeo ser uacuteteis para o
tratamento de pacientes no futuro Os riscos da participaccedilatildeo satildeo miacutenimos Se vocecirc eacute um
doador de sangue a amostra seraacute coletada no momento da doaccedilatildeo natildeo exigindo punccedilatildeo
venosa adicional
52
Eacute seu direito ter acesso aos resultados dos testes da pesquisa Esses resultados natildeo
seratildeo fornecidos automaticamente a vocecirc mas caso vocecirc se interesse em saber o resultado ou
tiver alguma duacutevida sobre a sua participaccedilatildeo neste estudo deveraacute entrar em contato com Ceacutelia
Kazue Abiko pelo telefone (18) 99718-3551
Vocecirc tem total liberdade de optar por natildeo participar da pesquisa Caso aceite
participar poderaacute desistir a qualquer momento ou retirar seu consentimento mesmo apoacutes ter
coletado o sangue Para cancelar sua participaccedilatildeo basta avisar a pesquisadora e os seus dados
seratildeo retirados do projeto
Qualquer duacutevida eacutetica sobre a pesquisa poderaacute entrar em contato com o Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa do Hospital das Cliacutenicas e da Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto
(CAMPUS UNIVERSITAacuteRIO bairro Monte Alegre CEP 14048-900 Ribeiratildeo Preto-SP
Telefone (16) 3602-2228 FAX (16) 3633-1144 e-mail cephcrpuspbr)
Consentimento de participaccedilatildeo
A Consentimento do participante
Li as informaccedilotildees acima sobre o estudo e recebi explicaccedilotildees sobre a participaccedilatildeo no estudo
Portanto dou o meu consentimento para participar do estudo
___________________________________________________________________________
Nome completo
___________________________________________________________________________
Assinatura
___________
Data
__________________________________________________________________________________
Nome completo da pesquisadora
___________________________________________________________________________
Assinatura
_____________
Data
38
Figura 10 ndash TDA monoespeciacutefico da amostra de paciente Hemaacutecias sensibilizadas por anticorpo da classe
IgG
oacute Figura 11 ndash TDA apoacutes o tratamento com glicina-aacutecidaEDTA (esquerda) e cloroquina (direita) A glicina
negativou completamente o TDA enquanto a hemaacutecia tratada com cloroquina persistiu positiva (1+)
39
Figura 12 ndash Fenotipagem da amostra tratada com glicina-aacutecidaEDTA Fy(a+b+) Jk(a-b+) S+s+
Figura 13 ndash Painel em gel (LissAGH) do eluato apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de
intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
Figura 14 ndash ndash Painel ezimaacutetico (hemaacutecias tratadas com bromelina) do eluato em gel neutro apoacutes
tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
40
528 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Quanto a efetividade das teacutecnicas em negativar o TDA foi verificado que a glicina-
aacutecidaEDTA foi efetiva em 66 das amostras testadas no primeiro tratamento (3350
amostras) enquanto a cloroquina conseguiu negativar 56 (2850) Esses resultados natildeo
apresentam diferenccedila significativa (pgt005) demostrando que a teacutecnica da glicina-
aacutecidaEDTA natildeo eacute superior mas eacute tatildeo efetiva quanto a da cloroquina
Quando aliamos os resultados de ambas as teacutecnicas verificamos que em 76 (3850)
das amostras o TDA foi negativado Esse dado indica que ainda que uma teacutecnica natildeo seja
eficaz na remoccedilatildeo do anticorpo eacute uma boa alternativa tentar a segunda teacutecnica jaacute que a falha
em remover o anticorpo utilizando uma delas natildeo prevecirc necessariamente a falha com a outra
Quando se utiliza o teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla (graacutefico 2) para comparar a utilizaccedilatildeo das
duas teacutecnicas com o resultado de cada uma isolada (somente a cloroquina ou somente a
glicina) verificamos que os resultados apresentam diferenccedila significativa (plt005) (quadro 3)
TRATAMENTO EFETIVO COM TOTAL PORCENTAGEM
Glicina ou cloroquina 38 76
Glicina e cloroquina 23 46
Glicina apenas 10 20
Cloroquina apenas 5 10
Nenhuma das teacutecnicas 12 24
Quadro 3 - Resultados comparativos entre as teacutecnicas utilizadas
41
Graacutefico 2 - Teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla entre as teacutecnicas aplicadas A- Glicina e Cloroquina B-Cloroquina C-
Glicina ( plt005)
42
6 DISCUSSAtildeO
Os reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA podem ser adquiridos em
forma de kit comercial prontos para uso poreacutem natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil A preparaccedilatildeo
dos reagentes ldquoin houserdquo a partir de sais comerciais adquiridos se mostrou viaacutevel Os
reagentes glicina e o tampatildeo Tris armazenados de forma correta se mantiveram estaacuteveis por
um periacuteodo de 7 meses Somente o reagente EDTA precipitou mesmo armazenado em
condiccedilotildees adequadas sugerindo que o mesmo deve ser preparado em menor quantidade e
armazenado em aliacutequotas A soluccedilatildeo de cloroquina tambeacutem pode ser preparada ldquoin houserdquo e
pode ser armazenado por um mecircs A legislaccedilatildeo brasileira autoriza a utilizaccedilatildeo de reagentes
preparados a partir de sais comerciais como a cloroquina e a glicina-aacutecidaEDTA desde que
os sais tenham autorizaccedilatildeo da vigilacircncia sanitaacuteria para a comercializaccedilatildeo (BRASIL 2001)
A comparaccedilatildeo quanto a efetividade em dissociar anticorpos em amostras com TDA
positivos entre a teacutecnica da glicina e a teacutecnica da cloroquina mostrou que natildeo haacute diferenccedila
estatiacutestica entre elas e que ambas satildeo igualmente eficientes Se utilizadas conjuntamente haacute
maior possibilidade de elucidaccedilatildeo dos casos
Uma vantagem da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eacute que ela permite numa mesma
amostra eluir o anticorpo ligado aacute hemaacutecia assim como fenotipar a hemaacutecia tratada Devido a
sua dupla utilidade a teacutecnica eacute vantajosa principalmente em pacientes em que pouco volume
de amostra pode ser coletado como em casos de crianccedilas e receacutem-nascidos
A fenotipagem poacutes tratamento se mostrou viaacutevel jaacute que os antiacutegenos de maior
importacircncia natildeo sofreram alteraccedilotildees Nas 20 amostras que foram fenotipadas antes e apoacutes
tratamento para verificar a influecircncia dos reagentes na expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a
Jkb S e s natildeo houve destruiccedilatildeo dos mesmos por nenhuma das duas teacutecnicas
Para as amostras positivas para o antiacutegeno Kell (350) e sensibilizadas com o
respectivo anticorpo a teacutecnica da glicina foi efetiva em negativar o TDA em apenas duas
delas mas apoacutes o tratamento foi verificada uma fraca reatividade da reaccedilatildeo antiacutegeno-
anticorpo sugerindo que houve um enfraquecimento da expressatildeo do antiacutegeno conforme
esperado e descrito na literatura (BYRNE 1991 PALLAS WILER E MCGEE 1991
ROZIERS e SQUALI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012 e KATHARIA e
CHAUDHARY 2013) A accedilatildeo da glicina sobre o antigeno Kell natildeo representa impedimento
para seu uso uma vez que na impossibilidade de testar o antiacutegeno Kell o banco de sangue
consegue facilmente atender a solicitaccedilatildeo de transfusatildeo com unidades de hemaacutecias Kell
43
negativas jaacute que eacute um antiacutegeno de baixa prevalecircncia na populaccedilatildeo variando de 15 na
populaccedilatildeo africana a 9 nos europeus (DANIELS 2011)
A soluccedilatildeo resultante da dissociaccedilatildeo do anticorpo pela teacutecnica da glicina pode ainda ser
utilizada como eluato podendo substituir a teacutecnica de eluiccedilatildeo com reagentes comercias (kits
de eluiccedilatildeo aacutecida) que tem alto custo aproximadamente entre R$2000 a R$2500 por teste
Em 41 amostras (82) houve a dissociaccedilatildeo e recuperaccedilatildeo do anticorpo que estava
sensibilizando as hemaacutecias Em 9 amostras (18) os anticorpos foram eluiacutedos poreacutem
apresentaram reaccedilatildeo negativa quando testadas com hemaacutecias de triagem entre eles o anti-E
(6) anti-S (2) e Anti-D (1) Eacute possiacutevel que a correccedilatildeo pH do meio (WALKER 2011) natildeo
tenha sido adequada o que pode ter desfavorecido a reatividade do anticorpo
Para as amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA nas quais natildeo houve dissociaccedilatildeo do
anticorpo pelo primeiro tratamento (1750) o segundo tratamento natildeo se mostrou eficaz jaacute
que 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise O tempo de
armazenagem natildeo parece ter influenciado jaacute que todas as amostras foram testadas dentro de
48 horas apoacutes a coleta Outros fatores que natildeo foram verificados podem ter levado a
hemoacutelise Apesar da literatura (LOUIE JIENG e ZEROULIS 1986 e BYRNE 1991)
recomendar um segundo tratamento ele eacute pouco eficaz tendo negativado apenas 3 das 17
amostras testadas
A amostra de paciente que apresentou sensibilizaccedilatildeo ldquoin vivordquo mostrou melhor
efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA sobre a da cloroquina possibilitando
fenotipagem para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s que natildeo foram destruiacutedos apoacutes o
tratamento comprovado atraveacutes da genotipagem
A presenccedila de autoanticorpo a quente com presenccedila de hemoacutelise (AHAI) ou natildeo pode
mascarar a presenccedila de aloanticorpo interferindo na rotina soroloacutegica da fenotipagem que eacute
uma importante ferramenta para auxiliar na seleccedilatildeo de hemaacutecias para transfusatildeo (SHIREY et
al 2002) Esses pacientes frequentemente possuem aloanticorpos associados ao
autoanticorpo e a prevalecircncia de aloimunizaccedilatildeo entre eles varia entre 12 a 40 (LEGER e
GARRATY 1999 BRANCH e PETZ 1999) o que dificulta ainda mais a escolha do melhor
componente a ser transfundido aleacutem de aumentar a possibilidade reaccedilotildees hemoliacuteticas imunes
poacutes-transfusionais
Nesses casos as teacutecnicas de dissociaccedilatildeo de anticorpos satildeo importantes para tratar
amostras de pacientes e a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser usada como uma opccedilatildeo
pois se mostrou eficaz na dissociaccedilatildeo anticorpo ligado agraves hemaacutecias deixando livre a
superfiacutecie das mesmas permitindo a fenotipagem por antisoros IgG Paralelamente os
44
anticorpos eluiacutedos tambeacutem puderam ser estudados O mesmo natildeo ocorre com a cloroquina
que permite apenas a fenotipagem e tampouco com os kits de eluiccedilatildeo aacutecida disponiacuteveis no
mercado nacional que satildeo destinados a realizaccedilatildeo do eluato mas destroem as hemaacutecias
O tempo de tratamento na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA tambeacutem eacute uma vantagem
pois foi possiacutevel reproduzir no tempo determinado de 2 minutos enquanto a cloroquina
demora ateacute duas horas
Ainda que a aplicaccedilatildeo das teacutecnicas por biologia molecular estejam cada vez mais
presentes na rotina imuno-hematoloacutegica e possibilitam estabelecer o fenoacutetipo deduzido do
genoacutetipo elas natildeo estatildeo disponiacuteveis na maioria dos centros e sua realizaccedilatildeo exige algumas
horas A resoluccedilatildeo imediata do problema transfusional necessita dos resultados soroloacutegicos
pois com frequecircncia natildeo eacute possiacutevel aguardar o resultado do teste molecular Dessa forma
apesar da crescente importacircncia da genotipagem eritrocitaacuteria teacutecnicas soroloacutegicas aplicadas
corretamente e no momento propiacutecio satildeo de grande utilidade para resolver problemas imuno-
hematoloacutegicos como ocorre com a fenotipagem em pacientes com TDA positivo
45
7 CONCLUSAtildeO
A teacutecnica da glicina aacutecidaEDTA mostrou-se efetiva em remover os anticorpos que
sensibilizavam as hemaacutecias e pode ser utilizada com seguranccedila antes da fenotipagem
eritrocitaacuteria Por ser uma teacutecnica de raacutepida execuccedilatildeo eacute uma alternativa aplicaacutevel
principalmente em casos urgentes de pacientes que apresentam autoanticorpos
46
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hemolysis American Journal of Hematology Test of the month 2012
ZAGO M A Apresentaccedilatildeo In Covas D T Ubialli E M A De Santis G C Manual de
Medicina Transfusional 2ordf ed Satildeo Paulo Atheneu 2014
50
9 ANEXOS
51
FUNDACcedilAtildeO HEMOCENTRO DE RIBEIRAtildeO PRETO
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE)
Tiacutetulo da pesquisa Aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina aacutecida-EDTA e avaliaccedilatildeo da
eficaacutecia no tratamento de hemaacutecias com teste direto da antiglobulina positivo
Pesquisadora responsaacutevel Ceacutelia Kazue Abiko
Orientador Prof Dimas Tadeu Covas
Co-orientadora Dra Flaacutevia Leite Souza Santos
Objetivo da pesquisa Vocecirc estaacute sendo convidado a participar de uma pesquisa que tem
como objetivo padronizar uma nova teacutecnica para auxiliar na tipagem sanguiacutenea de pacientes
A tipagem sanguiacutenea pode sofrer interferecircncia da presenccedila de anticorpos ligados aos gloacutebulos
vermelhos do sangue Nessas situaccedilotildees eacute difiacutecil selecionar o melhor sangue para o paciente e
eacute preciso a utilizaccedilatildeo de teacutecnicas adicionais para remover essas interferecircncias
Esta pesquisa tem como objetivo estudar outra teacutecnica para remover esses anticorpos e
comparaacute-la com a teacutecnica atualmente utilizada Para isso precisamos de amostras de pacientes
e doadores voluntaacuterios
Se vocecirc eacute um doador eacute necessaacuterio que vocecirc autorize a coleta de 5 ml (1 tubo) a mais
de seu sangue
Se vocecirc eacute um paciente natildeo haveraacute necessidade de nova amostra pois utilizaremos as
amostras jaacute coletadas para os testes preacute-transfusionais e os resultados encontrados nesta
pesquisa natildeo iratildeo interferir na escolha da (s) bolsa (s) de sangue que vocecirc possa vir a receber
Se vocecirc concordar em participar leia com atenccedilatildeo o texto abaixo e assine as duas vias
rubricando todas as paacuteginas deste termo de consentimento Uma via original assinada e
rubricada por vocecirc e pela pesquisadora ficaraacute com vocecirc
As suas informaccedilotildees seratildeo mantidas em sigilo pela pesquisadora e natildeo haveraacute
armazenamento de material para pesquisas posteriores Os seus dados seratildeo usados apenas
neste estudo e quando o trabalho for publicado seu nome e qualquer outra informaccedilatildeo que
possam identificaacute-lo natildeo seratildeo revelados
Eacute pouco provaacutevel que o que noacutes aprendermos com este estudo tenha um benefiacutecio
direto para vocecirc assim como natildeo poderemos dar nada em troca pela sua participaccedilatildeo na
pesquisa
Nosso objetivo com esta pesquisa eacute que os resultados poderatildeo ser uacuteteis para o
tratamento de pacientes no futuro Os riscos da participaccedilatildeo satildeo miacutenimos Se vocecirc eacute um
doador de sangue a amostra seraacute coletada no momento da doaccedilatildeo natildeo exigindo punccedilatildeo
venosa adicional
52
Eacute seu direito ter acesso aos resultados dos testes da pesquisa Esses resultados natildeo
seratildeo fornecidos automaticamente a vocecirc mas caso vocecirc se interesse em saber o resultado ou
tiver alguma duacutevida sobre a sua participaccedilatildeo neste estudo deveraacute entrar em contato com Ceacutelia
Kazue Abiko pelo telefone (18) 99718-3551
Vocecirc tem total liberdade de optar por natildeo participar da pesquisa Caso aceite
participar poderaacute desistir a qualquer momento ou retirar seu consentimento mesmo apoacutes ter
coletado o sangue Para cancelar sua participaccedilatildeo basta avisar a pesquisadora e os seus dados
seratildeo retirados do projeto
Qualquer duacutevida eacutetica sobre a pesquisa poderaacute entrar em contato com o Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa do Hospital das Cliacutenicas e da Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto
(CAMPUS UNIVERSITAacuteRIO bairro Monte Alegre CEP 14048-900 Ribeiratildeo Preto-SP
Telefone (16) 3602-2228 FAX (16) 3633-1144 e-mail cephcrpuspbr)
Consentimento de participaccedilatildeo
A Consentimento do participante
Li as informaccedilotildees acima sobre o estudo e recebi explicaccedilotildees sobre a participaccedilatildeo no estudo
Portanto dou o meu consentimento para participar do estudo
___________________________________________________________________________
Nome completo
___________________________________________________________________________
Assinatura
___________
Data
__________________________________________________________________________________
Nome completo da pesquisadora
___________________________________________________________________________
Assinatura
_____________
Data
39
Figura 12 ndash Fenotipagem da amostra tratada com glicina-aacutecidaEDTA Fy(a+b+) Jk(a-b+) S+s+
Figura 13 ndash Painel em gel (LissAGH) do eluato apoacutes tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de
intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
Figura 14 ndash ndash Painel ezimaacutetico (hemaacutecias tratadas com bromelina) do eluato em gel neutro apoacutes
tratamento com glicina-aacutecidaEDTA Reatividade de intensidade 4+ em todas as ceacutelulas
40
528 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Quanto a efetividade das teacutecnicas em negativar o TDA foi verificado que a glicina-
aacutecidaEDTA foi efetiva em 66 das amostras testadas no primeiro tratamento (3350
amostras) enquanto a cloroquina conseguiu negativar 56 (2850) Esses resultados natildeo
apresentam diferenccedila significativa (pgt005) demostrando que a teacutecnica da glicina-
aacutecidaEDTA natildeo eacute superior mas eacute tatildeo efetiva quanto a da cloroquina
Quando aliamos os resultados de ambas as teacutecnicas verificamos que em 76 (3850)
das amostras o TDA foi negativado Esse dado indica que ainda que uma teacutecnica natildeo seja
eficaz na remoccedilatildeo do anticorpo eacute uma boa alternativa tentar a segunda teacutecnica jaacute que a falha
em remover o anticorpo utilizando uma delas natildeo prevecirc necessariamente a falha com a outra
Quando se utiliza o teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla (graacutefico 2) para comparar a utilizaccedilatildeo das
duas teacutecnicas com o resultado de cada uma isolada (somente a cloroquina ou somente a
glicina) verificamos que os resultados apresentam diferenccedila significativa (plt005) (quadro 3)
TRATAMENTO EFETIVO COM TOTAL PORCENTAGEM
Glicina ou cloroquina 38 76
Glicina e cloroquina 23 46
Glicina apenas 10 20
Cloroquina apenas 5 10
Nenhuma das teacutecnicas 12 24
Quadro 3 - Resultados comparativos entre as teacutecnicas utilizadas
41
Graacutefico 2 - Teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla entre as teacutecnicas aplicadas A- Glicina e Cloroquina B-Cloroquina C-
Glicina ( plt005)
42
6 DISCUSSAtildeO
Os reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA podem ser adquiridos em
forma de kit comercial prontos para uso poreacutem natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil A preparaccedilatildeo
dos reagentes ldquoin houserdquo a partir de sais comerciais adquiridos se mostrou viaacutevel Os
reagentes glicina e o tampatildeo Tris armazenados de forma correta se mantiveram estaacuteveis por
um periacuteodo de 7 meses Somente o reagente EDTA precipitou mesmo armazenado em
condiccedilotildees adequadas sugerindo que o mesmo deve ser preparado em menor quantidade e
armazenado em aliacutequotas A soluccedilatildeo de cloroquina tambeacutem pode ser preparada ldquoin houserdquo e
pode ser armazenado por um mecircs A legislaccedilatildeo brasileira autoriza a utilizaccedilatildeo de reagentes
preparados a partir de sais comerciais como a cloroquina e a glicina-aacutecidaEDTA desde que
os sais tenham autorizaccedilatildeo da vigilacircncia sanitaacuteria para a comercializaccedilatildeo (BRASIL 2001)
A comparaccedilatildeo quanto a efetividade em dissociar anticorpos em amostras com TDA
positivos entre a teacutecnica da glicina e a teacutecnica da cloroquina mostrou que natildeo haacute diferenccedila
estatiacutestica entre elas e que ambas satildeo igualmente eficientes Se utilizadas conjuntamente haacute
maior possibilidade de elucidaccedilatildeo dos casos
Uma vantagem da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eacute que ela permite numa mesma
amostra eluir o anticorpo ligado aacute hemaacutecia assim como fenotipar a hemaacutecia tratada Devido a
sua dupla utilidade a teacutecnica eacute vantajosa principalmente em pacientes em que pouco volume
de amostra pode ser coletado como em casos de crianccedilas e receacutem-nascidos
A fenotipagem poacutes tratamento se mostrou viaacutevel jaacute que os antiacutegenos de maior
importacircncia natildeo sofreram alteraccedilotildees Nas 20 amostras que foram fenotipadas antes e apoacutes
tratamento para verificar a influecircncia dos reagentes na expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a
Jkb S e s natildeo houve destruiccedilatildeo dos mesmos por nenhuma das duas teacutecnicas
Para as amostras positivas para o antiacutegeno Kell (350) e sensibilizadas com o
respectivo anticorpo a teacutecnica da glicina foi efetiva em negativar o TDA em apenas duas
delas mas apoacutes o tratamento foi verificada uma fraca reatividade da reaccedilatildeo antiacutegeno-
anticorpo sugerindo que houve um enfraquecimento da expressatildeo do antiacutegeno conforme
esperado e descrito na literatura (BYRNE 1991 PALLAS WILER E MCGEE 1991
ROZIERS e SQUALI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012 e KATHARIA e
CHAUDHARY 2013) A accedilatildeo da glicina sobre o antigeno Kell natildeo representa impedimento
para seu uso uma vez que na impossibilidade de testar o antiacutegeno Kell o banco de sangue
consegue facilmente atender a solicitaccedilatildeo de transfusatildeo com unidades de hemaacutecias Kell
43
negativas jaacute que eacute um antiacutegeno de baixa prevalecircncia na populaccedilatildeo variando de 15 na
populaccedilatildeo africana a 9 nos europeus (DANIELS 2011)
A soluccedilatildeo resultante da dissociaccedilatildeo do anticorpo pela teacutecnica da glicina pode ainda ser
utilizada como eluato podendo substituir a teacutecnica de eluiccedilatildeo com reagentes comercias (kits
de eluiccedilatildeo aacutecida) que tem alto custo aproximadamente entre R$2000 a R$2500 por teste
Em 41 amostras (82) houve a dissociaccedilatildeo e recuperaccedilatildeo do anticorpo que estava
sensibilizando as hemaacutecias Em 9 amostras (18) os anticorpos foram eluiacutedos poreacutem
apresentaram reaccedilatildeo negativa quando testadas com hemaacutecias de triagem entre eles o anti-E
(6) anti-S (2) e Anti-D (1) Eacute possiacutevel que a correccedilatildeo pH do meio (WALKER 2011) natildeo
tenha sido adequada o que pode ter desfavorecido a reatividade do anticorpo
Para as amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA nas quais natildeo houve dissociaccedilatildeo do
anticorpo pelo primeiro tratamento (1750) o segundo tratamento natildeo se mostrou eficaz jaacute
que 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise O tempo de
armazenagem natildeo parece ter influenciado jaacute que todas as amostras foram testadas dentro de
48 horas apoacutes a coleta Outros fatores que natildeo foram verificados podem ter levado a
hemoacutelise Apesar da literatura (LOUIE JIENG e ZEROULIS 1986 e BYRNE 1991)
recomendar um segundo tratamento ele eacute pouco eficaz tendo negativado apenas 3 das 17
amostras testadas
A amostra de paciente que apresentou sensibilizaccedilatildeo ldquoin vivordquo mostrou melhor
efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA sobre a da cloroquina possibilitando
fenotipagem para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s que natildeo foram destruiacutedos apoacutes o
tratamento comprovado atraveacutes da genotipagem
A presenccedila de autoanticorpo a quente com presenccedila de hemoacutelise (AHAI) ou natildeo pode
mascarar a presenccedila de aloanticorpo interferindo na rotina soroloacutegica da fenotipagem que eacute
uma importante ferramenta para auxiliar na seleccedilatildeo de hemaacutecias para transfusatildeo (SHIREY et
al 2002) Esses pacientes frequentemente possuem aloanticorpos associados ao
autoanticorpo e a prevalecircncia de aloimunizaccedilatildeo entre eles varia entre 12 a 40 (LEGER e
GARRATY 1999 BRANCH e PETZ 1999) o que dificulta ainda mais a escolha do melhor
componente a ser transfundido aleacutem de aumentar a possibilidade reaccedilotildees hemoliacuteticas imunes
poacutes-transfusionais
Nesses casos as teacutecnicas de dissociaccedilatildeo de anticorpos satildeo importantes para tratar
amostras de pacientes e a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser usada como uma opccedilatildeo
pois se mostrou eficaz na dissociaccedilatildeo anticorpo ligado agraves hemaacutecias deixando livre a
superfiacutecie das mesmas permitindo a fenotipagem por antisoros IgG Paralelamente os
44
anticorpos eluiacutedos tambeacutem puderam ser estudados O mesmo natildeo ocorre com a cloroquina
que permite apenas a fenotipagem e tampouco com os kits de eluiccedilatildeo aacutecida disponiacuteveis no
mercado nacional que satildeo destinados a realizaccedilatildeo do eluato mas destroem as hemaacutecias
O tempo de tratamento na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA tambeacutem eacute uma vantagem
pois foi possiacutevel reproduzir no tempo determinado de 2 minutos enquanto a cloroquina
demora ateacute duas horas
Ainda que a aplicaccedilatildeo das teacutecnicas por biologia molecular estejam cada vez mais
presentes na rotina imuno-hematoloacutegica e possibilitam estabelecer o fenoacutetipo deduzido do
genoacutetipo elas natildeo estatildeo disponiacuteveis na maioria dos centros e sua realizaccedilatildeo exige algumas
horas A resoluccedilatildeo imediata do problema transfusional necessita dos resultados soroloacutegicos
pois com frequecircncia natildeo eacute possiacutevel aguardar o resultado do teste molecular Dessa forma
apesar da crescente importacircncia da genotipagem eritrocitaacuteria teacutecnicas soroloacutegicas aplicadas
corretamente e no momento propiacutecio satildeo de grande utilidade para resolver problemas imuno-
hematoloacutegicos como ocorre com a fenotipagem em pacientes com TDA positivo
45
7 CONCLUSAtildeO
A teacutecnica da glicina aacutecidaEDTA mostrou-se efetiva em remover os anticorpos que
sensibilizavam as hemaacutecias e pode ser utilizada com seguranccedila antes da fenotipagem
eritrocitaacuteria Por ser uma teacutecnica de raacutepida execuccedilatildeo eacute uma alternativa aplicaacutevel
principalmente em casos urgentes de pacientes que apresentam autoanticorpos
46
8 REFEREcircNCIA BIBLIOGRAacuteFICA
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9 ANEXOS
51
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Tiacutetulo da pesquisa Aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina aacutecida-EDTA e avaliaccedilatildeo da
eficaacutecia no tratamento de hemaacutecias com teste direto da antiglobulina positivo
Pesquisadora responsaacutevel Ceacutelia Kazue Abiko
Orientador Prof Dimas Tadeu Covas
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Objetivo da pesquisa Vocecirc estaacute sendo convidado a participar de uma pesquisa que tem
como objetivo padronizar uma nova teacutecnica para auxiliar na tipagem sanguiacutenea de pacientes
A tipagem sanguiacutenea pode sofrer interferecircncia da presenccedila de anticorpos ligados aos gloacutebulos
vermelhos do sangue Nessas situaccedilotildees eacute difiacutecil selecionar o melhor sangue para o paciente e
eacute preciso a utilizaccedilatildeo de teacutecnicas adicionais para remover essas interferecircncias
Esta pesquisa tem como objetivo estudar outra teacutecnica para remover esses anticorpos e
comparaacute-la com a teacutecnica atualmente utilizada Para isso precisamos de amostras de pacientes
e doadores voluntaacuterios
Se vocecirc eacute um doador eacute necessaacuterio que vocecirc autorize a coleta de 5 ml (1 tubo) a mais
de seu sangue
Se vocecirc eacute um paciente natildeo haveraacute necessidade de nova amostra pois utilizaremos as
amostras jaacute coletadas para os testes preacute-transfusionais e os resultados encontrados nesta
pesquisa natildeo iratildeo interferir na escolha da (s) bolsa (s) de sangue que vocecirc possa vir a receber
Se vocecirc concordar em participar leia com atenccedilatildeo o texto abaixo e assine as duas vias
rubricando todas as paacuteginas deste termo de consentimento Uma via original assinada e
rubricada por vocecirc e pela pesquisadora ficaraacute com vocecirc
As suas informaccedilotildees seratildeo mantidas em sigilo pela pesquisadora e natildeo haveraacute
armazenamento de material para pesquisas posteriores Os seus dados seratildeo usados apenas
neste estudo e quando o trabalho for publicado seu nome e qualquer outra informaccedilatildeo que
possam identificaacute-lo natildeo seratildeo revelados
Eacute pouco provaacutevel que o que noacutes aprendermos com este estudo tenha um benefiacutecio
direto para vocecirc assim como natildeo poderemos dar nada em troca pela sua participaccedilatildeo na
pesquisa
Nosso objetivo com esta pesquisa eacute que os resultados poderatildeo ser uacuteteis para o
tratamento de pacientes no futuro Os riscos da participaccedilatildeo satildeo miacutenimos Se vocecirc eacute um
doador de sangue a amostra seraacute coletada no momento da doaccedilatildeo natildeo exigindo punccedilatildeo
venosa adicional
52
Eacute seu direito ter acesso aos resultados dos testes da pesquisa Esses resultados natildeo
seratildeo fornecidos automaticamente a vocecirc mas caso vocecirc se interesse em saber o resultado ou
tiver alguma duacutevida sobre a sua participaccedilatildeo neste estudo deveraacute entrar em contato com Ceacutelia
Kazue Abiko pelo telefone (18) 99718-3551
Vocecirc tem total liberdade de optar por natildeo participar da pesquisa Caso aceite
participar poderaacute desistir a qualquer momento ou retirar seu consentimento mesmo apoacutes ter
coletado o sangue Para cancelar sua participaccedilatildeo basta avisar a pesquisadora e os seus dados
seratildeo retirados do projeto
Qualquer duacutevida eacutetica sobre a pesquisa poderaacute entrar em contato com o Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa do Hospital das Cliacutenicas e da Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto
(CAMPUS UNIVERSITAacuteRIO bairro Monte Alegre CEP 14048-900 Ribeiratildeo Preto-SP
Telefone (16) 3602-2228 FAX (16) 3633-1144 e-mail cephcrpuspbr)
Consentimento de participaccedilatildeo
A Consentimento do participante
Li as informaccedilotildees acima sobre o estudo e recebi explicaccedilotildees sobre a participaccedilatildeo no estudo
Portanto dou o meu consentimento para participar do estudo
___________________________________________________________________________
Nome completo
___________________________________________________________________________
Assinatura
___________
Data
__________________________________________________________________________________
Nome completo da pesquisadora
___________________________________________________________________________
Assinatura
_____________
Data
40
528 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Quanto a efetividade das teacutecnicas em negativar o TDA foi verificado que a glicina-
aacutecidaEDTA foi efetiva em 66 das amostras testadas no primeiro tratamento (3350
amostras) enquanto a cloroquina conseguiu negativar 56 (2850) Esses resultados natildeo
apresentam diferenccedila significativa (pgt005) demostrando que a teacutecnica da glicina-
aacutecidaEDTA natildeo eacute superior mas eacute tatildeo efetiva quanto a da cloroquina
Quando aliamos os resultados de ambas as teacutecnicas verificamos que em 76 (3850)
das amostras o TDA foi negativado Esse dado indica que ainda que uma teacutecnica natildeo seja
eficaz na remoccedilatildeo do anticorpo eacute uma boa alternativa tentar a segunda teacutecnica jaacute que a falha
em remover o anticorpo utilizando uma delas natildeo prevecirc necessariamente a falha com a outra
Quando se utiliza o teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla (graacutefico 2) para comparar a utilizaccedilatildeo das
duas teacutecnicas com o resultado de cada uma isolada (somente a cloroquina ou somente a
glicina) verificamos que os resultados apresentam diferenccedila significativa (plt005) (quadro 3)
TRATAMENTO EFETIVO COM TOTAL PORCENTAGEM
Glicina ou cloroquina 38 76
Glicina e cloroquina 23 46
Glicina apenas 10 20
Cloroquina apenas 5 10
Nenhuma das teacutecnicas 12 24
Quadro 3 - Resultados comparativos entre as teacutecnicas utilizadas
41
Graacutefico 2 - Teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla entre as teacutecnicas aplicadas A- Glicina e Cloroquina B-Cloroquina C-
Glicina ( plt005)
42
6 DISCUSSAtildeO
Os reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA podem ser adquiridos em
forma de kit comercial prontos para uso poreacutem natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil A preparaccedilatildeo
dos reagentes ldquoin houserdquo a partir de sais comerciais adquiridos se mostrou viaacutevel Os
reagentes glicina e o tampatildeo Tris armazenados de forma correta se mantiveram estaacuteveis por
um periacuteodo de 7 meses Somente o reagente EDTA precipitou mesmo armazenado em
condiccedilotildees adequadas sugerindo que o mesmo deve ser preparado em menor quantidade e
armazenado em aliacutequotas A soluccedilatildeo de cloroquina tambeacutem pode ser preparada ldquoin houserdquo e
pode ser armazenado por um mecircs A legislaccedilatildeo brasileira autoriza a utilizaccedilatildeo de reagentes
preparados a partir de sais comerciais como a cloroquina e a glicina-aacutecidaEDTA desde que
os sais tenham autorizaccedilatildeo da vigilacircncia sanitaacuteria para a comercializaccedilatildeo (BRASIL 2001)
A comparaccedilatildeo quanto a efetividade em dissociar anticorpos em amostras com TDA
positivos entre a teacutecnica da glicina e a teacutecnica da cloroquina mostrou que natildeo haacute diferenccedila
estatiacutestica entre elas e que ambas satildeo igualmente eficientes Se utilizadas conjuntamente haacute
maior possibilidade de elucidaccedilatildeo dos casos
Uma vantagem da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eacute que ela permite numa mesma
amostra eluir o anticorpo ligado aacute hemaacutecia assim como fenotipar a hemaacutecia tratada Devido a
sua dupla utilidade a teacutecnica eacute vantajosa principalmente em pacientes em que pouco volume
de amostra pode ser coletado como em casos de crianccedilas e receacutem-nascidos
A fenotipagem poacutes tratamento se mostrou viaacutevel jaacute que os antiacutegenos de maior
importacircncia natildeo sofreram alteraccedilotildees Nas 20 amostras que foram fenotipadas antes e apoacutes
tratamento para verificar a influecircncia dos reagentes na expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a
Jkb S e s natildeo houve destruiccedilatildeo dos mesmos por nenhuma das duas teacutecnicas
Para as amostras positivas para o antiacutegeno Kell (350) e sensibilizadas com o
respectivo anticorpo a teacutecnica da glicina foi efetiva em negativar o TDA em apenas duas
delas mas apoacutes o tratamento foi verificada uma fraca reatividade da reaccedilatildeo antiacutegeno-
anticorpo sugerindo que houve um enfraquecimento da expressatildeo do antiacutegeno conforme
esperado e descrito na literatura (BYRNE 1991 PALLAS WILER E MCGEE 1991
ROZIERS e SQUALI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012 e KATHARIA e
CHAUDHARY 2013) A accedilatildeo da glicina sobre o antigeno Kell natildeo representa impedimento
para seu uso uma vez que na impossibilidade de testar o antiacutegeno Kell o banco de sangue
consegue facilmente atender a solicitaccedilatildeo de transfusatildeo com unidades de hemaacutecias Kell
43
negativas jaacute que eacute um antiacutegeno de baixa prevalecircncia na populaccedilatildeo variando de 15 na
populaccedilatildeo africana a 9 nos europeus (DANIELS 2011)
A soluccedilatildeo resultante da dissociaccedilatildeo do anticorpo pela teacutecnica da glicina pode ainda ser
utilizada como eluato podendo substituir a teacutecnica de eluiccedilatildeo com reagentes comercias (kits
de eluiccedilatildeo aacutecida) que tem alto custo aproximadamente entre R$2000 a R$2500 por teste
Em 41 amostras (82) houve a dissociaccedilatildeo e recuperaccedilatildeo do anticorpo que estava
sensibilizando as hemaacutecias Em 9 amostras (18) os anticorpos foram eluiacutedos poreacutem
apresentaram reaccedilatildeo negativa quando testadas com hemaacutecias de triagem entre eles o anti-E
(6) anti-S (2) e Anti-D (1) Eacute possiacutevel que a correccedilatildeo pH do meio (WALKER 2011) natildeo
tenha sido adequada o que pode ter desfavorecido a reatividade do anticorpo
Para as amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA nas quais natildeo houve dissociaccedilatildeo do
anticorpo pelo primeiro tratamento (1750) o segundo tratamento natildeo se mostrou eficaz jaacute
que 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise O tempo de
armazenagem natildeo parece ter influenciado jaacute que todas as amostras foram testadas dentro de
48 horas apoacutes a coleta Outros fatores que natildeo foram verificados podem ter levado a
hemoacutelise Apesar da literatura (LOUIE JIENG e ZEROULIS 1986 e BYRNE 1991)
recomendar um segundo tratamento ele eacute pouco eficaz tendo negativado apenas 3 das 17
amostras testadas
A amostra de paciente que apresentou sensibilizaccedilatildeo ldquoin vivordquo mostrou melhor
efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA sobre a da cloroquina possibilitando
fenotipagem para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s que natildeo foram destruiacutedos apoacutes o
tratamento comprovado atraveacutes da genotipagem
A presenccedila de autoanticorpo a quente com presenccedila de hemoacutelise (AHAI) ou natildeo pode
mascarar a presenccedila de aloanticorpo interferindo na rotina soroloacutegica da fenotipagem que eacute
uma importante ferramenta para auxiliar na seleccedilatildeo de hemaacutecias para transfusatildeo (SHIREY et
al 2002) Esses pacientes frequentemente possuem aloanticorpos associados ao
autoanticorpo e a prevalecircncia de aloimunizaccedilatildeo entre eles varia entre 12 a 40 (LEGER e
GARRATY 1999 BRANCH e PETZ 1999) o que dificulta ainda mais a escolha do melhor
componente a ser transfundido aleacutem de aumentar a possibilidade reaccedilotildees hemoliacuteticas imunes
poacutes-transfusionais
Nesses casos as teacutecnicas de dissociaccedilatildeo de anticorpos satildeo importantes para tratar
amostras de pacientes e a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser usada como uma opccedilatildeo
pois se mostrou eficaz na dissociaccedilatildeo anticorpo ligado agraves hemaacutecias deixando livre a
superfiacutecie das mesmas permitindo a fenotipagem por antisoros IgG Paralelamente os
44
anticorpos eluiacutedos tambeacutem puderam ser estudados O mesmo natildeo ocorre com a cloroquina
que permite apenas a fenotipagem e tampouco com os kits de eluiccedilatildeo aacutecida disponiacuteveis no
mercado nacional que satildeo destinados a realizaccedilatildeo do eluato mas destroem as hemaacutecias
O tempo de tratamento na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA tambeacutem eacute uma vantagem
pois foi possiacutevel reproduzir no tempo determinado de 2 minutos enquanto a cloroquina
demora ateacute duas horas
Ainda que a aplicaccedilatildeo das teacutecnicas por biologia molecular estejam cada vez mais
presentes na rotina imuno-hematoloacutegica e possibilitam estabelecer o fenoacutetipo deduzido do
genoacutetipo elas natildeo estatildeo disponiacuteveis na maioria dos centros e sua realizaccedilatildeo exige algumas
horas A resoluccedilatildeo imediata do problema transfusional necessita dos resultados soroloacutegicos
pois com frequecircncia natildeo eacute possiacutevel aguardar o resultado do teste molecular Dessa forma
apesar da crescente importacircncia da genotipagem eritrocitaacuteria teacutecnicas soroloacutegicas aplicadas
corretamente e no momento propiacutecio satildeo de grande utilidade para resolver problemas imuno-
hematoloacutegicos como ocorre com a fenotipagem em pacientes com TDA positivo
45
7 CONCLUSAtildeO
A teacutecnica da glicina aacutecidaEDTA mostrou-se efetiva em remover os anticorpos que
sensibilizavam as hemaacutecias e pode ser utilizada com seguranccedila antes da fenotipagem
eritrocitaacuteria Por ser uma teacutecnica de raacutepida execuccedilatildeo eacute uma alternativa aplicaacutevel
principalmente em casos urgentes de pacientes que apresentam autoanticorpos
46
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aplicaccedilatildeo do sangue seus componentes e derivados estabelece o ordenamento institucional
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50
9 ANEXOS
51
FUNDACcedilAtildeO HEMOCENTRO DE RIBEIRAtildeO PRETO
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE)
Tiacutetulo da pesquisa Aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina aacutecida-EDTA e avaliaccedilatildeo da
eficaacutecia no tratamento de hemaacutecias com teste direto da antiglobulina positivo
Pesquisadora responsaacutevel Ceacutelia Kazue Abiko
Orientador Prof Dimas Tadeu Covas
Co-orientadora Dra Flaacutevia Leite Souza Santos
Objetivo da pesquisa Vocecirc estaacute sendo convidado a participar de uma pesquisa que tem
como objetivo padronizar uma nova teacutecnica para auxiliar na tipagem sanguiacutenea de pacientes
A tipagem sanguiacutenea pode sofrer interferecircncia da presenccedila de anticorpos ligados aos gloacutebulos
vermelhos do sangue Nessas situaccedilotildees eacute difiacutecil selecionar o melhor sangue para o paciente e
eacute preciso a utilizaccedilatildeo de teacutecnicas adicionais para remover essas interferecircncias
Esta pesquisa tem como objetivo estudar outra teacutecnica para remover esses anticorpos e
comparaacute-la com a teacutecnica atualmente utilizada Para isso precisamos de amostras de pacientes
e doadores voluntaacuterios
Se vocecirc eacute um doador eacute necessaacuterio que vocecirc autorize a coleta de 5 ml (1 tubo) a mais
de seu sangue
Se vocecirc eacute um paciente natildeo haveraacute necessidade de nova amostra pois utilizaremos as
amostras jaacute coletadas para os testes preacute-transfusionais e os resultados encontrados nesta
pesquisa natildeo iratildeo interferir na escolha da (s) bolsa (s) de sangue que vocecirc possa vir a receber
Se vocecirc concordar em participar leia com atenccedilatildeo o texto abaixo e assine as duas vias
rubricando todas as paacuteginas deste termo de consentimento Uma via original assinada e
rubricada por vocecirc e pela pesquisadora ficaraacute com vocecirc
As suas informaccedilotildees seratildeo mantidas em sigilo pela pesquisadora e natildeo haveraacute
armazenamento de material para pesquisas posteriores Os seus dados seratildeo usados apenas
neste estudo e quando o trabalho for publicado seu nome e qualquer outra informaccedilatildeo que
possam identificaacute-lo natildeo seratildeo revelados
Eacute pouco provaacutevel que o que noacutes aprendermos com este estudo tenha um benefiacutecio
direto para vocecirc assim como natildeo poderemos dar nada em troca pela sua participaccedilatildeo na
pesquisa
Nosso objetivo com esta pesquisa eacute que os resultados poderatildeo ser uacuteteis para o
tratamento de pacientes no futuro Os riscos da participaccedilatildeo satildeo miacutenimos Se vocecirc eacute um
doador de sangue a amostra seraacute coletada no momento da doaccedilatildeo natildeo exigindo punccedilatildeo
venosa adicional
52
Eacute seu direito ter acesso aos resultados dos testes da pesquisa Esses resultados natildeo
seratildeo fornecidos automaticamente a vocecirc mas caso vocecirc se interesse em saber o resultado ou
tiver alguma duacutevida sobre a sua participaccedilatildeo neste estudo deveraacute entrar em contato com Ceacutelia
Kazue Abiko pelo telefone (18) 99718-3551
Vocecirc tem total liberdade de optar por natildeo participar da pesquisa Caso aceite
participar poderaacute desistir a qualquer momento ou retirar seu consentimento mesmo apoacutes ter
coletado o sangue Para cancelar sua participaccedilatildeo basta avisar a pesquisadora e os seus dados
seratildeo retirados do projeto
Qualquer duacutevida eacutetica sobre a pesquisa poderaacute entrar em contato com o Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa do Hospital das Cliacutenicas e da Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto
(CAMPUS UNIVERSITAacuteRIO bairro Monte Alegre CEP 14048-900 Ribeiratildeo Preto-SP
Telefone (16) 3602-2228 FAX (16) 3633-1144 e-mail cephcrpuspbr)
Consentimento de participaccedilatildeo
A Consentimento do participante
Li as informaccedilotildees acima sobre o estudo e recebi explicaccedilotildees sobre a participaccedilatildeo no estudo
Portanto dou o meu consentimento para participar do estudo
___________________________________________________________________________
Nome completo
___________________________________________________________________________
Assinatura
___________
Data
__________________________________________________________________________________
Nome completo da pesquisadora
___________________________________________________________________________
Assinatura
_____________
Data
41
Graacutefico 2 - Teste de correlaccedilatildeo muacuteltipla entre as teacutecnicas aplicadas A- Glicina e Cloroquina B-Cloroquina C-
Glicina ( plt005)
42
6 DISCUSSAtildeO
Os reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA podem ser adquiridos em
forma de kit comercial prontos para uso poreacutem natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil A preparaccedilatildeo
dos reagentes ldquoin houserdquo a partir de sais comerciais adquiridos se mostrou viaacutevel Os
reagentes glicina e o tampatildeo Tris armazenados de forma correta se mantiveram estaacuteveis por
um periacuteodo de 7 meses Somente o reagente EDTA precipitou mesmo armazenado em
condiccedilotildees adequadas sugerindo que o mesmo deve ser preparado em menor quantidade e
armazenado em aliacutequotas A soluccedilatildeo de cloroquina tambeacutem pode ser preparada ldquoin houserdquo e
pode ser armazenado por um mecircs A legislaccedilatildeo brasileira autoriza a utilizaccedilatildeo de reagentes
preparados a partir de sais comerciais como a cloroquina e a glicina-aacutecidaEDTA desde que
os sais tenham autorizaccedilatildeo da vigilacircncia sanitaacuteria para a comercializaccedilatildeo (BRASIL 2001)
A comparaccedilatildeo quanto a efetividade em dissociar anticorpos em amostras com TDA
positivos entre a teacutecnica da glicina e a teacutecnica da cloroquina mostrou que natildeo haacute diferenccedila
estatiacutestica entre elas e que ambas satildeo igualmente eficientes Se utilizadas conjuntamente haacute
maior possibilidade de elucidaccedilatildeo dos casos
Uma vantagem da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eacute que ela permite numa mesma
amostra eluir o anticorpo ligado aacute hemaacutecia assim como fenotipar a hemaacutecia tratada Devido a
sua dupla utilidade a teacutecnica eacute vantajosa principalmente em pacientes em que pouco volume
de amostra pode ser coletado como em casos de crianccedilas e receacutem-nascidos
A fenotipagem poacutes tratamento se mostrou viaacutevel jaacute que os antiacutegenos de maior
importacircncia natildeo sofreram alteraccedilotildees Nas 20 amostras que foram fenotipadas antes e apoacutes
tratamento para verificar a influecircncia dos reagentes na expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a
Jkb S e s natildeo houve destruiccedilatildeo dos mesmos por nenhuma das duas teacutecnicas
Para as amostras positivas para o antiacutegeno Kell (350) e sensibilizadas com o
respectivo anticorpo a teacutecnica da glicina foi efetiva em negativar o TDA em apenas duas
delas mas apoacutes o tratamento foi verificada uma fraca reatividade da reaccedilatildeo antiacutegeno-
anticorpo sugerindo que houve um enfraquecimento da expressatildeo do antiacutegeno conforme
esperado e descrito na literatura (BYRNE 1991 PALLAS WILER E MCGEE 1991
ROZIERS e SQUALI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012 e KATHARIA e
CHAUDHARY 2013) A accedilatildeo da glicina sobre o antigeno Kell natildeo representa impedimento
para seu uso uma vez que na impossibilidade de testar o antiacutegeno Kell o banco de sangue
consegue facilmente atender a solicitaccedilatildeo de transfusatildeo com unidades de hemaacutecias Kell
43
negativas jaacute que eacute um antiacutegeno de baixa prevalecircncia na populaccedilatildeo variando de 15 na
populaccedilatildeo africana a 9 nos europeus (DANIELS 2011)
A soluccedilatildeo resultante da dissociaccedilatildeo do anticorpo pela teacutecnica da glicina pode ainda ser
utilizada como eluato podendo substituir a teacutecnica de eluiccedilatildeo com reagentes comercias (kits
de eluiccedilatildeo aacutecida) que tem alto custo aproximadamente entre R$2000 a R$2500 por teste
Em 41 amostras (82) houve a dissociaccedilatildeo e recuperaccedilatildeo do anticorpo que estava
sensibilizando as hemaacutecias Em 9 amostras (18) os anticorpos foram eluiacutedos poreacutem
apresentaram reaccedilatildeo negativa quando testadas com hemaacutecias de triagem entre eles o anti-E
(6) anti-S (2) e Anti-D (1) Eacute possiacutevel que a correccedilatildeo pH do meio (WALKER 2011) natildeo
tenha sido adequada o que pode ter desfavorecido a reatividade do anticorpo
Para as amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA nas quais natildeo houve dissociaccedilatildeo do
anticorpo pelo primeiro tratamento (1750) o segundo tratamento natildeo se mostrou eficaz jaacute
que 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise O tempo de
armazenagem natildeo parece ter influenciado jaacute que todas as amostras foram testadas dentro de
48 horas apoacutes a coleta Outros fatores que natildeo foram verificados podem ter levado a
hemoacutelise Apesar da literatura (LOUIE JIENG e ZEROULIS 1986 e BYRNE 1991)
recomendar um segundo tratamento ele eacute pouco eficaz tendo negativado apenas 3 das 17
amostras testadas
A amostra de paciente que apresentou sensibilizaccedilatildeo ldquoin vivordquo mostrou melhor
efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA sobre a da cloroquina possibilitando
fenotipagem para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s que natildeo foram destruiacutedos apoacutes o
tratamento comprovado atraveacutes da genotipagem
A presenccedila de autoanticorpo a quente com presenccedila de hemoacutelise (AHAI) ou natildeo pode
mascarar a presenccedila de aloanticorpo interferindo na rotina soroloacutegica da fenotipagem que eacute
uma importante ferramenta para auxiliar na seleccedilatildeo de hemaacutecias para transfusatildeo (SHIREY et
al 2002) Esses pacientes frequentemente possuem aloanticorpos associados ao
autoanticorpo e a prevalecircncia de aloimunizaccedilatildeo entre eles varia entre 12 a 40 (LEGER e
GARRATY 1999 BRANCH e PETZ 1999) o que dificulta ainda mais a escolha do melhor
componente a ser transfundido aleacutem de aumentar a possibilidade reaccedilotildees hemoliacuteticas imunes
poacutes-transfusionais
Nesses casos as teacutecnicas de dissociaccedilatildeo de anticorpos satildeo importantes para tratar
amostras de pacientes e a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser usada como uma opccedilatildeo
pois se mostrou eficaz na dissociaccedilatildeo anticorpo ligado agraves hemaacutecias deixando livre a
superfiacutecie das mesmas permitindo a fenotipagem por antisoros IgG Paralelamente os
44
anticorpos eluiacutedos tambeacutem puderam ser estudados O mesmo natildeo ocorre com a cloroquina
que permite apenas a fenotipagem e tampouco com os kits de eluiccedilatildeo aacutecida disponiacuteveis no
mercado nacional que satildeo destinados a realizaccedilatildeo do eluato mas destroem as hemaacutecias
O tempo de tratamento na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA tambeacutem eacute uma vantagem
pois foi possiacutevel reproduzir no tempo determinado de 2 minutos enquanto a cloroquina
demora ateacute duas horas
Ainda que a aplicaccedilatildeo das teacutecnicas por biologia molecular estejam cada vez mais
presentes na rotina imuno-hematoloacutegica e possibilitam estabelecer o fenoacutetipo deduzido do
genoacutetipo elas natildeo estatildeo disponiacuteveis na maioria dos centros e sua realizaccedilatildeo exige algumas
horas A resoluccedilatildeo imediata do problema transfusional necessita dos resultados soroloacutegicos
pois com frequecircncia natildeo eacute possiacutevel aguardar o resultado do teste molecular Dessa forma
apesar da crescente importacircncia da genotipagem eritrocitaacuteria teacutecnicas soroloacutegicas aplicadas
corretamente e no momento propiacutecio satildeo de grande utilidade para resolver problemas imuno-
hematoloacutegicos como ocorre com a fenotipagem em pacientes com TDA positivo
45
7 CONCLUSAtildeO
A teacutecnica da glicina aacutecidaEDTA mostrou-se efetiva em remover os anticorpos que
sensibilizavam as hemaacutecias e pode ser utilizada com seguranccedila antes da fenotipagem
eritrocitaacuteria Por ser uma teacutecnica de raacutepida execuccedilatildeo eacute uma alternativa aplicaacutevel
principalmente em casos urgentes de pacientes que apresentam autoanticorpos
46
8 REFEREcircNCIA BIBLIOGRAacuteFICA
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aplicaccedilatildeo do sangue seus componentes e derivados estabelece o ordenamento institucional
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50
9 ANEXOS
51
FUNDACcedilAtildeO HEMOCENTRO DE RIBEIRAtildeO PRETO
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE)
Tiacutetulo da pesquisa Aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina aacutecida-EDTA e avaliaccedilatildeo da
eficaacutecia no tratamento de hemaacutecias com teste direto da antiglobulina positivo
Pesquisadora responsaacutevel Ceacutelia Kazue Abiko
Orientador Prof Dimas Tadeu Covas
Co-orientadora Dra Flaacutevia Leite Souza Santos
Objetivo da pesquisa Vocecirc estaacute sendo convidado a participar de uma pesquisa que tem
como objetivo padronizar uma nova teacutecnica para auxiliar na tipagem sanguiacutenea de pacientes
A tipagem sanguiacutenea pode sofrer interferecircncia da presenccedila de anticorpos ligados aos gloacutebulos
vermelhos do sangue Nessas situaccedilotildees eacute difiacutecil selecionar o melhor sangue para o paciente e
eacute preciso a utilizaccedilatildeo de teacutecnicas adicionais para remover essas interferecircncias
Esta pesquisa tem como objetivo estudar outra teacutecnica para remover esses anticorpos e
comparaacute-la com a teacutecnica atualmente utilizada Para isso precisamos de amostras de pacientes
e doadores voluntaacuterios
Se vocecirc eacute um doador eacute necessaacuterio que vocecirc autorize a coleta de 5 ml (1 tubo) a mais
de seu sangue
Se vocecirc eacute um paciente natildeo haveraacute necessidade de nova amostra pois utilizaremos as
amostras jaacute coletadas para os testes preacute-transfusionais e os resultados encontrados nesta
pesquisa natildeo iratildeo interferir na escolha da (s) bolsa (s) de sangue que vocecirc possa vir a receber
Se vocecirc concordar em participar leia com atenccedilatildeo o texto abaixo e assine as duas vias
rubricando todas as paacuteginas deste termo de consentimento Uma via original assinada e
rubricada por vocecirc e pela pesquisadora ficaraacute com vocecirc
As suas informaccedilotildees seratildeo mantidas em sigilo pela pesquisadora e natildeo haveraacute
armazenamento de material para pesquisas posteriores Os seus dados seratildeo usados apenas
neste estudo e quando o trabalho for publicado seu nome e qualquer outra informaccedilatildeo que
possam identificaacute-lo natildeo seratildeo revelados
Eacute pouco provaacutevel que o que noacutes aprendermos com este estudo tenha um benefiacutecio
direto para vocecirc assim como natildeo poderemos dar nada em troca pela sua participaccedilatildeo na
pesquisa
Nosso objetivo com esta pesquisa eacute que os resultados poderatildeo ser uacuteteis para o
tratamento de pacientes no futuro Os riscos da participaccedilatildeo satildeo miacutenimos Se vocecirc eacute um
doador de sangue a amostra seraacute coletada no momento da doaccedilatildeo natildeo exigindo punccedilatildeo
venosa adicional
52
Eacute seu direito ter acesso aos resultados dos testes da pesquisa Esses resultados natildeo
seratildeo fornecidos automaticamente a vocecirc mas caso vocecirc se interesse em saber o resultado ou
tiver alguma duacutevida sobre a sua participaccedilatildeo neste estudo deveraacute entrar em contato com Ceacutelia
Kazue Abiko pelo telefone (18) 99718-3551
Vocecirc tem total liberdade de optar por natildeo participar da pesquisa Caso aceite
participar poderaacute desistir a qualquer momento ou retirar seu consentimento mesmo apoacutes ter
coletado o sangue Para cancelar sua participaccedilatildeo basta avisar a pesquisadora e os seus dados
seratildeo retirados do projeto
Qualquer duacutevida eacutetica sobre a pesquisa poderaacute entrar em contato com o Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa do Hospital das Cliacutenicas e da Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto
(CAMPUS UNIVERSITAacuteRIO bairro Monte Alegre CEP 14048-900 Ribeiratildeo Preto-SP
Telefone (16) 3602-2228 FAX (16) 3633-1144 e-mail cephcrpuspbr)
Consentimento de participaccedilatildeo
A Consentimento do participante
Li as informaccedilotildees acima sobre o estudo e recebi explicaccedilotildees sobre a participaccedilatildeo no estudo
Portanto dou o meu consentimento para participar do estudo
___________________________________________________________________________
Nome completo
___________________________________________________________________________
Assinatura
___________
Data
__________________________________________________________________________________
Nome completo da pesquisadora
___________________________________________________________________________
Assinatura
_____________
Data
42
6 DISCUSSAtildeO
Os reagentes utilizados na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA podem ser adquiridos em
forma de kit comercial prontos para uso poreacutem natildeo estatildeo disponiacuteveis no Brasil A preparaccedilatildeo
dos reagentes ldquoin houserdquo a partir de sais comerciais adquiridos se mostrou viaacutevel Os
reagentes glicina e o tampatildeo Tris armazenados de forma correta se mantiveram estaacuteveis por
um periacuteodo de 7 meses Somente o reagente EDTA precipitou mesmo armazenado em
condiccedilotildees adequadas sugerindo que o mesmo deve ser preparado em menor quantidade e
armazenado em aliacutequotas A soluccedilatildeo de cloroquina tambeacutem pode ser preparada ldquoin houserdquo e
pode ser armazenado por um mecircs A legislaccedilatildeo brasileira autoriza a utilizaccedilatildeo de reagentes
preparados a partir de sais comerciais como a cloroquina e a glicina-aacutecidaEDTA desde que
os sais tenham autorizaccedilatildeo da vigilacircncia sanitaacuteria para a comercializaccedilatildeo (BRASIL 2001)
A comparaccedilatildeo quanto a efetividade em dissociar anticorpos em amostras com TDA
positivos entre a teacutecnica da glicina e a teacutecnica da cloroquina mostrou que natildeo haacute diferenccedila
estatiacutestica entre elas e que ambas satildeo igualmente eficientes Se utilizadas conjuntamente haacute
maior possibilidade de elucidaccedilatildeo dos casos
Uma vantagem da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA eacute que ela permite numa mesma
amostra eluir o anticorpo ligado aacute hemaacutecia assim como fenotipar a hemaacutecia tratada Devido a
sua dupla utilidade a teacutecnica eacute vantajosa principalmente em pacientes em que pouco volume
de amostra pode ser coletado como em casos de crianccedilas e receacutem-nascidos
A fenotipagem poacutes tratamento se mostrou viaacutevel jaacute que os antiacutegenos de maior
importacircncia natildeo sofreram alteraccedilotildees Nas 20 amostras que foram fenotipadas antes e apoacutes
tratamento para verificar a influecircncia dos reagentes na expressatildeo dos antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a
Jkb S e s natildeo houve destruiccedilatildeo dos mesmos por nenhuma das duas teacutecnicas
Para as amostras positivas para o antiacutegeno Kell (350) e sensibilizadas com o
respectivo anticorpo a teacutecnica da glicina foi efetiva em negativar o TDA em apenas duas
delas mas apoacutes o tratamento foi verificada uma fraca reatividade da reaccedilatildeo antiacutegeno-
anticorpo sugerindo que houve um enfraquecimento da expressatildeo do antiacutegeno conforme
esperado e descrito na literatura (BYRNE 1991 PALLAS WILER E MCGEE 1991
ROZIERS e SQUALI 1997 CHAMPAGNE et al 1999 KOSANKE 2012 e KATHARIA e
CHAUDHARY 2013) A accedilatildeo da glicina sobre o antigeno Kell natildeo representa impedimento
para seu uso uma vez que na impossibilidade de testar o antiacutegeno Kell o banco de sangue
consegue facilmente atender a solicitaccedilatildeo de transfusatildeo com unidades de hemaacutecias Kell
43
negativas jaacute que eacute um antiacutegeno de baixa prevalecircncia na populaccedilatildeo variando de 15 na
populaccedilatildeo africana a 9 nos europeus (DANIELS 2011)
A soluccedilatildeo resultante da dissociaccedilatildeo do anticorpo pela teacutecnica da glicina pode ainda ser
utilizada como eluato podendo substituir a teacutecnica de eluiccedilatildeo com reagentes comercias (kits
de eluiccedilatildeo aacutecida) que tem alto custo aproximadamente entre R$2000 a R$2500 por teste
Em 41 amostras (82) houve a dissociaccedilatildeo e recuperaccedilatildeo do anticorpo que estava
sensibilizando as hemaacutecias Em 9 amostras (18) os anticorpos foram eluiacutedos poreacutem
apresentaram reaccedilatildeo negativa quando testadas com hemaacutecias de triagem entre eles o anti-E
(6) anti-S (2) e Anti-D (1) Eacute possiacutevel que a correccedilatildeo pH do meio (WALKER 2011) natildeo
tenha sido adequada o que pode ter desfavorecido a reatividade do anticorpo
Para as amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA nas quais natildeo houve dissociaccedilatildeo do
anticorpo pelo primeiro tratamento (1750) o segundo tratamento natildeo se mostrou eficaz jaacute
que 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise O tempo de
armazenagem natildeo parece ter influenciado jaacute que todas as amostras foram testadas dentro de
48 horas apoacutes a coleta Outros fatores que natildeo foram verificados podem ter levado a
hemoacutelise Apesar da literatura (LOUIE JIENG e ZEROULIS 1986 e BYRNE 1991)
recomendar um segundo tratamento ele eacute pouco eficaz tendo negativado apenas 3 das 17
amostras testadas
A amostra de paciente que apresentou sensibilizaccedilatildeo ldquoin vivordquo mostrou melhor
efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA sobre a da cloroquina possibilitando
fenotipagem para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s que natildeo foram destruiacutedos apoacutes o
tratamento comprovado atraveacutes da genotipagem
A presenccedila de autoanticorpo a quente com presenccedila de hemoacutelise (AHAI) ou natildeo pode
mascarar a presenccedila de aloanticorpo interferindo na rotina soroloacutegica da fenotipagem que eacute
uma importante ferramenta para auxiliar na seleccedilatildeo de hemaacutecias para transfusatildeo (SHIREY et
al 2002) Esses pacientes frequentemente possuem aloanticorpos associados ao
autoanticorpo e a prevalecircncia de aloimunizaccedilatildeo entre eles varia entre 12 a 40 (LEGER e
GARRATY 1999 BRANCH e PETZ 1999) o que dificulta ainda mais a escolha do melhor
componente a ser transfundido aleacutem de aumentar a possibilidade reaccedilotildees hemoliacuteticas imunes
poacutes-transfusionais
Nesses casos as teacutecnicas de dissociaccedilatildeo de anticorpos satildeo importantes para tratar
amostras de pacientes e a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser usada como uma opccedilatildeo
pois se mostrou eficaz na dissociaccedilatildeo anticorpo ligado agraves hemaacutecias deixando livre a
superfiacutecie das mesmas permitindo a fenotipagem por antisoros IgG Paralelamente os
44
anticorpos eluiacutedos tambeacutem puderam ser estudados O mesmo natildeo ocorre com a cloroquina
que permite apenas a fenotipagem e tampouco com os kits de eluiccedilatildeo aacutecida disponiacuteveis no
mercado nacional que satildeo destinados a realizaccedilatildeo do eluato mas destroem as hemaacutecias
O tempo de tratamento na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA tambeacutem eacute uma vantagem
pois foi possiacutevel reproduzir no tempo determinado de 2 minutos enquanto a cloroquina
demora ateacute duas horas
Ainda que a aplicaccedilatildeo das teacutecnicas por biologia molecular estejam cada vez mais
presentes na rotina imuno-hematoloacutegica e possibilitam estabelecer o fenoacutetipo deduzido do
genoacutetipo elas natildeo estatildeo disponiacuteveis na maioria dos centros e sua realizaccedilatildeo exige algumas
horas A resoluccedilatildeo imediata do problema transfusional necessita dos resultados soroloacutegicos
pois com frequecircncia natildeo eacute possiacutevel aguardar o resultado do teste molecular Dessa forma
apesar da crescente importacircncia da genotipagem eritrocitaacuteria teacutecnicas soroloacutegicas aplicadas
corretamente e no momento propiacutecio satildeo de grande utilidade para resolver problemas imuno-
hematoloacutegicos como ocorre com a fenotipagem em pacientes com TDA positivo
45
7 CONCLUSAtildeO
A teacutecnica da glicina aacutecidaEDTA mostrou-se efetiva em remover os anticorpos que
sensibilizavam as hemaacutecias e pode ser utilizada com seguranccedila antes da fenotipagem
eritrocitaacuteria Por ser uma teacutecnica de raacutepida execuccedilatildeo eacute uma alternativa aplicaacutevel
principalmente em casos urgentes de pacientes que apresentam autoanticorpos
46
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50
9 ANEXOS
51
FUNDACcedilAtildeO HEMOCENTRO DE RIBEIRAtildeO PRETO
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE)
Tiacutetulo da pesquisa Aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina aacutecida-EDTA e avaliaccedilatildeo da
eficaacutecia no tratamento de hemaacutecias com teste direto da antiglobulina positivo
Pesquisadora responsaacutevel Ceacutelia Kazue Abiko
Orientador Prof Dimas Tadeu Covas
Co-orientadora Dra Flaacutevia Leite Souza Santos
Objetivo da pesquisa Vocecirc estaacute sendo convidado a participar de uma pesquisa que tem
como objetivo padronizar uma nova teacutecnica para auxiliar na tipagem sanguiacutenea de pacientes
A tipagem sanguiacutenea pode sofrer interferecircncia da presenccedila de anticorpos ligados aos gloacutebulos
vermelhos do sangue Nessas situaccedilotildees eacute difiacutecil selecionar o melhor sangue para o paciente e
eacute preciso a utilizaccedilatildeo de teacutecnicas adicionais para remover essas interferecircncias
Esta pesquisa tem como objetivo estudar outra teacutecnica para remover esses anticorpos e
comparaacute-la com a teacutecnica atualmente utilizada Para isso precisamos de amostras de pacientes
e doadores voluntaacuterios
Se vocecirc eacute um doador eacute necessaacuterio que vocecirc autorize a coleta de 5 ml (1 tubo) a mais
de seu sangue
Se vocecirc eacute um paciente natildeo haveraacute necessidade de nova amostra pois utilizaremos as
amostras jaacute coletadas para os testes preacute-transfusionais e os resultados encontrados nesta
pesquisa natildeo iratildeo interferir na escolha da (s) bolsa (s) de sangue que vocecirc possa vir a receber
Se vocecirc concordar em participar leia com atenccedilatildeo o texto abaixo e assine as duas vias
rubricando todas as paacuteginas deste termo de consentimento Uma via original assinada e
rubricada por vocecirc e pela pesquisadora ficaraacute com vocecirc
As suas informaccedilotildees seratildeo mantidas em sigilo pela pesquisadora e natildeo haveraacute
armazenamento de material para pesquisas posteriores Os seus dados seratildeo usados apenas
neste estudo e quando o trabalho for publicado seu nome e qualquer outra informaccedilatildeo que
possam identificaacute-lo natildeo seratildeo revelados
Eacute pouco provaacutevel que o que noacutes aprendermos com este estudo tenha um benefiacutecio
direto para vocecirc assim como natildeo poderemos dar nada em troca pela sua participaccedilatildeo na
pesquisa
Nosso objetivo com esta pesquisa eacute que os resultados poderatildeo ser uacuteteis para o
tratamento de pacientes no futuro Os riscos da participaccedilatildeo satildeo miacutenimos Se vocecirc eacute um
doador de sangue a amostra seraacute coletada no momento da doaccedilatildeo natildeo exigindo punccedilatildeo
venosa adicional
52
Eacute seu direito ter acesso aos resultados dos testes da pesquisa Esses resultados natildeo
seratildeo fornecidos automaticamente a vocecirc mas caso vocecirc se interesse em saber o resultado ou
tiver alguma duacutevida sobre a sua participaccedilatildeo neste estudo deveraacute entrar em contato com Ceacutelia
Kazue Abiko pelo telefone (18) 99718-3551
Vocecirc tem total liberdade de optar por natildeo participar da pesquisa Caso aceite
participar poderaacute desistir a qualquer momento ou retirar seu consentimento mesmo apoacutes ter
coletado o sangue Para cancelar sua participaccedilatildeo basta avisar a pesquisadora e os seus dados
seratildeo retirados do projeto
Qualquer duacutevida eacutetica sobre a pesquisa poderaacute entrar em contato com o Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa do Hospital das Cliacutenicas e da Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto
(CAMPUS UNIVERSITAacuteRIO bairro Monte Alegre CEP 14048-900 Ribeiratildeo Preto-SP
Telefone (16) 3602-2228 FAX (16) 3633-1144 e-mail cephcrpuspbr)
Consentimento de participaccedilatildeo
A Consentimento do participante
Li as informaccedilotildees acima sobre o estudo e recebi explicaccedilotildees sobre a participaccedilatildeo no estudo
Portanto dou o meu consentimento para participar do estudo
___________________________________________________________________________
Nome completo
___________________________________________________________________________
Assinatura
___________
Data
__________________________________________________________________________________
Nome completo da pesquisadora
___________________________________________________________________________
Assinatura
_____________
Data
43
negativas jaacute que eacute um antiacutegeno de baixa prevalecircncia na populaccedilatildeo variando de 15 na
populaccedilatildeo africana a 9 nos europeus (DANIELS 2011)
A soluccedilatildeo resultante da dissociaccedilatildeo do anticorpo pela teacutecnica da glicina pode ainda ser
utilizada como eluato podendo substituir a teacutecnica de eluiccedilatildeo com reagentes comercias (kits
de eluiccedilatildeo aacutecida) que tem alto custo aproximadamente entre R$2000 a R$2500 por teste
Em 41 amostras (82) houve a dissociaccedilatildeo e recuperaccedilatildeo do anticorpo que estava
sensibilizando as hemaacutecias Em 9 amostras (18) os anticorpos foram eluiacutedos poreacutem
apresentaram reaccedilatildeo negativa quando testadas com hemaacutecias de triagem entre eles o anti-E
(6) anti-S (2) e Anti-D (1) Eacute possiacutevel que a correccedilatildeo pH do meio (WALKER 2011) natildeo
tenha sido adequada o que pode ter desfavorecido a reatividade do anticorpo
Para as amostras tratadas com glicina-aacutecidaEDTA nas quais natildeo houve dissociaccedilatildeo do
anticorpo pelo primeiro tratamento (1750) o segundo tratamento natildeo se mostrou eficaz jaacute
que 3 (18) permaneceram positivas e 11 (65) sofreram hemoacutelise O tempo de
armazenagem natildeo parece ter influenciado jaacute que todas as amostras foram testadas dentro de
48 horas apoacutes a coleta Outros fatores que natildeo foram verificados podem ter levado a
hemoacutelise Apesar da literatura (LOUIE JIENG e ZEROULIS 1986 e BYRNE 1991)
recomendar um segundo tratamento ele eacute pouco eficaz tendo negativado apenas 3 das 17
amostras testadas
A amostra de paciente que apresentou sensibilizaccedilatildeo ldquoin vivordquo mostrou melhor
efetividade da teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA sobre a da cloroquina possibilitando
fenotipagem para os antiacutegenos Fya Fy
b Jk
a Jk
b S e s que natildeo foram destruiacutedos apoacutes o
tratamento comprovado atraveacutes da genotipagem
A presenccedila de autoanticorpo a quente com presenccedila de hemoacutelise (AHAI) ou natildeo pode
mascarar a presenccedila de aloanticorpo interferindo na rotina soroloacutegica da fenotipagem que eacute
uma importante ferramenta para auxiliar na seleccedilatildeo de hemaacutecias para transfusatildeo (SHIREY et
al 2002) Esses pacientes frequentemente possuem aloanticorpos associados ao
autoanticorpo e a prevalecircncia de aloimunizaccedilatildeo entre eles varia entre 12 a 40 (LEGER e
GARRATY 1999 BRANCH e PETZ 1999) o que dificulta ainda mais a escolha do melhor
componente a ser transfundido aleacutem de aumentar a possibilidade reaccedilotildees hemoliacuteticas imunes
poacutes-transfusionais
Nesses casos as teacutecnicas de dissociaccedilatildeo de anticorpos satildeo importantes para tratar
amostras de pacientes e a teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA pode ser usada como uma opccedilatildeo
pois se mostrou eficaz na dissociaccedilatildeo anticorpo ligado agraves hemaacutecias deixando livre a
superfiacutecie das mesmas permitindo a fenotipagem por antisoros IgG Paralelamente os
44
anticorpos eluiacutedos tambeacutem puderam ser estudados O mesmo natildeo ocorre com a cloroquina
que permite apenas a fenotipagem e tampouco com os kits de eluiccedilatildeo aacutecida disponiacuteveis no
mercado nacional que satildeo destinados a realizaccedilatildeo do eluato mas destroem as hemaacutecias
O tempo de tratamento na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA tambeacutem eacute uma vantagem
pois foi possiacutevel reproduzir no tempo determinado de 2 minutos enquanto a cloroquina
demora ateacute duas horas
Ainda que a aplicaccedilatildeo das teacutecnicas por biologia molecular estejam cada vez mais
presentes na rotina imuno-hematoloacutegica e possibilitam estabelecer o fenoacutetipo deduzido do
genoacutetipo elas natildeo estatildeo disponiacuteveis na maioria dos centros e sua realizaccedilatildeo exige algumas
horas A resoluccedilatildeo imediata do problema transfusional necessita dos resultados soroloacutegicos
pois com frequecircncia natildeo eacute possiacutevel aguardar o resultado do teste molecular Dessa forma
apesar da crescente importacircncia da genotipagem eritrocitaacuteria teacutecnicas soroloacutegicas aplicadas
corretamente e no momento propiacutecio satildeo de grande utilidade para resolver problemas imuno-
hematoloacutegicos como ocorre com a fenotipagem em pacientes com TDA positivo
45
7 CONCLUSAtildeO
A teacutecnica da glicina aacutecidaEDTA mostrou-se efetiva em remover os anticorpos que
sensibilizavam as hemaacutecias e pode ser utilizada com seguranccedila antes da fenotipagem
eritrocitaacuteria Por ser uma teacutecnica de raacutepida execuccedilatildeo eacute uma alternativa aplicaacutevel
principalmente em casos urgentes de pacientes que apresentam autoanticorpos
46
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autoantibodies an algorithm for transfusion management Transfusion v 42 2002 p 1435-
1441
VICHINSKY E P et al Prospective RBC phenotype matching in a stroke-prevention trial in
sicke cell anemia a multicenter transfusional trial Transfusion v 41 September 2001
p1086-1092
WALKER P S Identification of Antibodies to Red Cell Antigens Techinical manual
AABB 17th ed Bethesda American Association of Blood Banks 2011p 463-496
WALKER P S e HARMENING D M Other technologies and Automation In Harmening
D M Modern Blood Banking amp Transfusion Practices 6ordf ed Philadelphia F A Davis
Company 2012 p 273-287
ZANTEK N D et al The direct antiglobulin test A critical step in the evaluation of
hemolysis American Journal of Hematology Test of the month 2012
ZAGO M A Apresentaccedilatildeo In Covas D T Ubialli E M A De Santis G C Manual de
Medicina Transfusional 2ordf ed Satildeo Paulo Atheneu 2014
50
9 ANEXOS
51
FUNDACcedilAtildeO HEMOCENTRO DE RIBEIRAtildeO PRETO
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE)
Tiacutetulo da pesquisa Aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina aacutecida-EDTA e avaliaccedilatildeo da
eficaacutecia no tratamento de hemaacutecias com teste direto da antiglobulina positivo
Pesquisadora responsaacutevel Ceacutelia Kazue Abiko
Orientador Prof Dimas Tadeu Covas
Co-orientadora Dra Flaacutevia Leite Souza Santos
Objetivo da pesquisa Vocecirc estaacute sendo convidado a participar de uma pesquisa que tem
como objetivo padronizar uma nova teacutecnica para auxiliar na tipagem sanguiacutenea de pacientes
A tipagem sanguiacutenea pode sofrer interferecircncia da presenccedila de anticorpos ligados aos gloacutebulos
vermelhos do sangue Nessas situaccedilotildees eacute difiacutecil selecionar o melhor sangue para o paciente e
eacute preciso a utilizaccedilatildeo de teacutecnicas adicionais para remover essas interferecircncias
Esta pesquisa tem como objetivo estudar outra teacutecnica para remover esses anticorpos e
comparaacute-la com a teacutecnica atualmente utilizada Para isso precisamos de amostras de pacientes
e doadores voluntaacuterios
Se vocecirc eacute um doador eacute necessaacuterio que vocecirc autorize a coleta de 5 ml (1 tubo) a mais
de seu sangue
Se vocecirc eacute um paciente natildeo haveraacute necessidade de nova amostra pois utilizaremos as
amostras jaacute coletadas para os testes preacute-transfusionais e os resultados encontrados nesta
pesquisa natildeo iratildeo interferir na escolha da (s) bolsa (s) de sangue que vocecirc possa vir a receber
Se vocecirc concordar em participar leia com atenccedilatildeo o texto abaixo e assine as duas vias
rubricando todas as paacuteginas deste termo de consentimento Uma via original assinada e
rubricada por vocecirc e pela pesquisadora ficaraacute com vocecirc
As suas informaccedilotildees seratildeo mantidas em sigilo pela pesquisadora e natildeo haveraacute
armazenamento de material para pesquisas posteriores Os seus dados seratildeo usados apenas
neste estudo e quando o trabalho for publicado seu nome e qualquer outra informaccedilatildeo que
possam identificaacute-lo natildeo seratildeo revelados
Eacute pouco provaacutevel que o que noacutes aprendermos com este estudo tenha um benefiacutecio
direto para vocecirc assim como natildeo poderemos dar nada em troca pela sua participaccedilatildeo na
pesquisa
Nosso objetivo com esta pesquisa eacute que os resultados poderatildeo ser uacuteteis para o
tratamento de pacientes no futuro Os riscos da participaccedilatildeo satildeo miacutenimos Se vocecirc eacute um
doador de sangue a amostra seraacute coletada no momento da doaccedilatildeo natildeo exigindo punccedilatildeo
venosa adicional
52
Eacute seu direito ter acesso aos resultados dos testes da pesquisa Esses resultados natildeo
seratildeo fornecidos automaticamente a vocecirc mas caso vocecirc se interesse em saber o resultado ou
tiver alguma duacutevida sobre a sua participaccedilatildeo neste estudo deveraacute entrar em contato com Ceacutelia
Kazue Abiko pelo telefone (18) 99718-3551
Vocecirc tem total liberdade de optar por natildeo participar da pesquisa Caso aceite
participar poderaacute desistir a qualquer momento ou retirar seu consentimento mesmo apoacutes ter
coletado o sangue Para cancelar sua participaccedilatildeo basta avisar a pesquisadora e os seus dados
seratildeo retirados do projeto
Qualquer duacutevida eacutetica sobre a pesquisa poderaacute entrar em contato com o Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa do Hospital das Cliacutenicas e da Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto
(CAMPUS UNIVERSITAacuteRIO bairro Monte Alegre CEP 14048-900 Ribeiratildeo Preto-SP
Telefone (16) 3602-2228 FAX (16) 3633-1144 e-mail cephcrpuspbr)
Consentimento de participaccedilatildeo
A Consentimento do participante
Li as informaccedilotildees acima sobre o estudo e recebi explicaccedilotildees sobre a participaccedilatildeo no estudo
Portanto dou o meu consentimento para participar do estudo
___________________________________________________________________________
Nome completo
___________________________________________________________________________
Assinatura
___________
Data
__________________________________________________________________________________
Nome completo da pesquisadora
___________________________________________________________________________
Assinatura
_____________
Data
44
anticorpos eluiacutedos tambeacutem puderam ser estudados O mesmo natildeo ocorre com a cloroquina
que permite apenas a fenotipagem e tampouco com os kits de eluiccedilatildeo aacutecida disponiacuteveis no
mercado nacional que satildeo destinados a realizaccedilatildeo do eluato mas destroem as hemaacutecias
O tempo de tratamento na teacutecnica da glicina-aacutecidaEDTA tambeacutem eacute uma vantagem
pois foi possiacutevel reproduzir no tempo determinado de 2 minutos enquanto a cloroquina
demora ateacute duas horas
Ainda que a aplicaccedilatildeo das teacutecnicas por biologia molecular estejam cada vez mais
presentes na rotina imuno-hematoloacutegica e possibilitam estabelecer o fenoacutetipo deduzido do
genoacutetipo elas natildeo estatildeo disponiacuteveis na maioria dos centros e sua realizaccedilatildeo exige algumas
horas A resoluccedilatildeo imediata do problema transfusional necessita dos resultados soroloacutegicos
pois com frequecircncia natildeo eacute possiacutevel aguardar o resultado do teste molecular Dessa forma
apesar da crescente importacircncia da genotipagem eritrocitaacuteria teacutecnicas soroloacutegicas aplicadas
corretamente e no momento propiacutecio satildeo de grande utilidade para resolver problemas imuno-
hematoloacutegicos como ocorre com a fenotipagem em pacientes com TDA positivo
45
7 CONCLUSAtildeO
A teacutecnica da glicina aacutecidaEDTA mostrou-se efetiva em remover os anticorpos que
sensibilizavam as hemaacutecias e pode ser utilizada com seguranccedila antes da fenotipagem
eritrocitaacuteria Por ser uma teacutecnica de raacutepida execuccedilatildeo eacute uma alternativa aplicaacutevel
principalmente em casos urgentes de pacientes que apresentam autoanticorpos
46
8 REFEREcircNCIA BIBLIOGRAacuteFICA
ABBAS A LICHTMAN A H e PILLAI S Imunologia Celular e Molecular 6ordf ed Rio
de Janeiro Elsevier 2008 p 75-96
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art 199 da Constituiccedilatildeo Federal relativo agrave coleta processamento estocagem distribuiccedilatildeo e
aplicaccedilatildeo do sangue seus componentes e derivados estabelece o ordenamento institucional
indispensaacutevel agrave execuccedilatildeo adequada dessas atividades e daacute outras providecircncias Diaacuterio Oficial
da Uniatildeo Brasiacutelia 22 de mar 2001 Seccedilatildeo 1 p 1
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eacute preciso a utilizaccedilatildeo de teacutecnicas adicionais para remover essas interferecircncias
Esta pesquisa tem como objetivo estudar outra teacutecnica para remover esses anticorpos e
comparaacute-la com a teacutecnica atualmente utilizada Para isso precisamos de amostras de pacientes
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de seu sangue
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amostras jaacute coletadas para os testes preacute-transfusionais e os resultados encontrados nesta
pesquisa natildeo iratildeo interferir na escolha da (s) bolsa (s) de sangue que vocecirc possa vir a receber
Se vocecirc concordar em participar leia com atenccedilatildeo o texto abaixo e assine as duas vias
rubricando todas as paacuteginas deste termo de consentimento Uma via original assinada e
rubricada por vocecirc e pela pesquisadora ficaraacute com vocecirc
As suas informaccedilotildees seratildeo mantidas em sigilo pela pesquisadora e natildeo haveraacute
armazenamento de material para pesquisas posteriores Os seus dados seratildeo usados apenas
neste estudo e quando o trabalho for publicado seu nome e qualquer outra informaccedilatildeo que
possam identificaacute-lo natildeo seratildeo revelados
Eacute pouco provaacutevel que o que noacutes aprendermos com este estudo tenha um benefiacutecio
direto para vocecirc assim como natildeo poderemos dar nada em troca pela sua participaccedilatildeo na
pesquisa
Nosso objetivo com esta pesquisa eacute que os resultados poderatildeo ser uacuteteis para o
tratamento de pacientes no futuro Os riscos da participaccedilatildeo satildeo miacutenimos Se vocecirc eacute um
doador de sangue a amostra seraacute coletada no momento da doaccedilatildeo natildeo exigindo punccedilatildeo
venosa adicional
52
Eacute seu direito ter acesso aos resultados dos testes da pesquisa Esses resultados natildeo
seratildeo fornecidos automaticamente a vocecirc mas caso vocecirc se interesse em saber o resultado ou
tiver alguma duacutevida sobre a sua participaccedilatildeo neste estudo deveraacute entrar em contato com Ceacutelia
Kazue Abiko pelo telefone (18) 99718-3551
Vocecirc tem total liberdade de optar por natildeo participar da pesquisa Caso aceite
participar poderaacute desistir a qualquer momento ou retirar seu consentimento mesmo apoacutes ter
coletado o sangue Para cancelar sua participaccedilatildeo basta avisar a pesquisadora e os seus dados
seratildeo retirados do projeto
Qualquer duacutevida eacutetica sobre a pesquisa poderaacute entrar em contato com o Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa do Hospital das Cliacutenicas e da Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto
(CAMPUS UNIVERSITAacuteRIO bairro Monte Alegre CEP 14048-900 Ribeiratildeo Preto-SP
Telefone (16) 3602-2228 FAX (16) 3633-1144 e-mail cephcrpuspbr)
Consentimento de participaccedilatildeo
A Consentimento do participante
Li as informaccedilotildees acima sobre o estudo e recebi explicaccedilotildees sobre a participaccedilatildeo no estudo
Portanto dou o meu consentimento para participar do estudo
___________________________________________________________________________
Nome completo
___________________________________________________________________________
Assinatura
___________
Data
__________________________________________________________________________________
Nome completo da pesquisadora
___________________________________________________________________________
Assinatura
_____________
Data
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7 CONCLUSAtildeO
A teacutecnica da glicina aacutecidaEDTA mostrou-se efetiva em remover os anticorpos que
sensibilizavam as hemaacutecias e pode ser utilizada com seguranccedila antes da fenotipagem
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aplicaccedilatildeo do sangue seus componentes e derivados estabelece o ordenamento institucional
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Techinical manual AABB 16th ed Bethesda American Association of Blood Banks 2011
p 497-522
LEGER R M e GARRATY G Evaluation of methods for detecting alloantibodies
underlying warm autoantibodies Transfusion v 39 1999 p 11-16
LOUIE J E JIENG A F e ZEROULIS C G Preparation of intact antibody-free red
blood RBCs in autoimmune hemolytic anemia (abstract) Transfusion 26 p550 1986
MARTINS P R J et al Frequumlecircncia de anticorpos irregulares em politransfundidos no
Hemocentro Regional de Uberaba-MG de 1997 a 2005 Revista Brasileira de Hematologia
e Hemoterapia 2008 30(4)272-276
MARTINS L M et al Uso da genotipagem de grupos sanguiacuteneos na elucidaccedilatildeo de casos
inconclusivos na fenotipagem eritrocitaacuteria de pacientes atendidos na Fundaccedilatildeo Hemominas
Revista Brasileira de Hematologia e Hemoterapia 2009 31(4) p 252-259
MELO L Testes de Compatibilidade Sanguiacutenea In Bordin J O Juacutenior D M L e Dimas
T C Hemoterapia Fundamentos e Praacutetica 2ordf ed Satildeo Paulo Atheneu 2007 p 171-176
NOVARETTI MCZ et al Comparison of tube and gel techniques for antibody
identification Immunohematology v 16 2000 p138ndash141
NOVARETTI M C Z et al Comparison of Conventional Tube Test Technique and Gel
Microcolumn Assay for Direct Antiglobulin Test A Large Study Journal of Clinical
Laboratory Analysis v18 2004 p 255ndash258
PALLAS C WILER M e McGEE B Comparison of glycine acid-EDTA to chloroquine
diphosphate for IgG removal Transfusion (abstract) v 31 1991 27S
PINTO P C A BRAGA J A P SANTOS A M N Fatores de risco para aloimunizaccedilatildeo
em pacientes com anemia falciforme Revista da Associaccedilatildeo Meacutedica Brasileira 2011
57(6) p 668-673
RALPH E B GREEN e KLOSTERMANN D A The Antiglobulin Test In Harmening
D M Modern Blood Banking amp Transfusion Practices 6ordf ed Philadelphia F A Davis
Company 2012 p 101-118
ROBACK JD et al Technique Manual AABB 17ordf ed Bethesda MD American
Association of Blood Banks 2011
49
ROZIERS N B SQUALLI S Removing IgG antibodies from intact red cells comparison
of acid and EDTA heat and chloroquine elution methods Transfusion v 37 1997 p 497-
501
SANTOS F L S Testes preacute-transfusionais In Covas D T Ubialli E M A De Santis G
C Manual de Medicina Transfusional 2ordf ed Satildeo Paulo Atheneu 2014 p 47-62
SERERAT T S VEIDT D e DUTCHED A A quick and simple method for plenotyping
IgG-sensitized red blood cells Imunohematology v 16 2000 p 154-156
SHIREY R S et al Prophylactic antigen-matched donor blood for patients with warm
autoantibodies an algorithm for transfusion management Transfusion v 42 2002 p 1435-
1441
VICHINSKY E P et al Prospective RBC phenotype matching in a stroke-prevention trial in
sicke cell anemia a multicenter transfusional trial Transfusion v 41 September 2001
p1086-1092
WALKER P S Identification of Antibodies to Red Cell Antigens Techinical manual
AABB 17th ed Bethesda American Association of Blood Banks 2011p 463-496
WALKER P S e HARMENING D M Other technologies and Automation In Harmening
D M Modern Blood Banking amp Transfusion Practices 6ordf ed Philadelphia F A Davis
Company 2012 p 273-287
ZANTEK N D et al The direct antiglobulin test A critical step in the evaluation of
hemolysis American Journal of Hematology Test of the month 2012
ZAGO M A Apresentaccedilatildeo In Covas D T Ubialli E M A De Santis G C Manual de
Medicina Transfusional 2ordf ed Satildeo Paulo Atheneu 2014
50
9 ANEXOS
51
FUNDACcedilAtildeO HEMOCENTRO DE RIBEIRAtildeO PRETO
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE)
Tiacutetulo da pesquisa Aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina aacutecida-EDTA e avaliaccedilatildeo da
eficaacutecia no tratamento de hemaacutecias com teste direto da antiglobulina positivo
Pesquisadora responsaacutevel Ceacutelia Kazue Abiko
Orientador Prof Dimas Tadeu Covas
Co-orientadora Dra Flaacutevia Leite Souza Santos
Objetivo da pesquisa Vocecirc estaacute sendo convidado a participar de uma pesquisa que tem
como objetivo padronizar uma nova teacutecnica para auxiliar na tipagem sanguiacutenea de pacientes
A tipagem sanguiacutenea pode sofrer interferecircncia da presenccedila de anticorpos ligados aos gloacutebulos
vermelhos do sangue Nessas situaccedilotildees eacute difiacutecil selecionar o melhor sangue para o paciente e
eacute preciso a utilizaccedilatildeo de teacutecnicas adicionais para remover essas interferecircncias
Esta pesquisa tem como objetivo estudar outra teacutecnica para remover esses anticorpos e
comparaacute-la com a teacutecnica atualmente utilizada Para isso precisamos de amostras de pacientes
e doadores voluntaacuterios
Se vocecirc eacute um doador eacute necessaacuterio que vocecirc autorize a coleta de 5 ml (1 tubo) a mais
de seu sangue
Se vocecirc eacute um paciente natildeo haveraacute necessidade de nova amostra pois utilizaremos as
amostras jaacute coletadas para os testes preacute-transfusionais e os resultados encontrados nesta
pesquisa natildeo iratildeo interferir na escolha da (s) bolsa (s) de sangue que vocecirc possa vir a receber
Se vocecirc concordar em participar leia com atenccedilatildeo o texto abaixo e assine as duas vias
rubricando todas as paacuteginas deste termo de consentimento Uma via original assinada e
rubricada por vocecirc e pela pesquisadora ficaraacute com vocecirc
As suas informaccedilotildees seratildeo mantidas em sigilo pela pesquisadora e natildeo haveraacute
armazenamento de material para pesquisas posteriores Os seus dados seratildeo usados apenas
neste estudo e quando o trabalho for publicado seu nome e qualquer outra informaccedilatildeo que
possam identificaacute-lo natildeo seratildeo revelados
Eacute pouco provaacutevel que o que noacutes aprendermos com este estudo tenha um benefiacutecio
direto para vocecirc assim como natildeo poderemos dar nada em troca pela sua participaccedilatildeo na
pesquisa
Nosso objetivo com esta pesquisa eacute que os resultados poderatildeo ser uacuteteis para o
tratamento de pacientes no futuro Os riscos da participaccedilatildeo satildeo miacutenimos Se vocecirc eacute um
doador de sangue a amostra seraacute coletada no momento da doaccedilatildeo natildeo exigindo punccedilatildeo
venosa adicional
52
Eacute seu direito ter acesso aos resultados dos testes da pesquisa Esses resultados natildeo
seratildeo fornecidos automaticamente a vocecirc mas caso vocecirc se interesse em saber o resultado ou
tiver alguma duacutevida sobre a sua participaccedilatildeo neste estudo deveraacute entrar em contato com Ceacutelia
Kazue Abiko pelo telefone (18) 99718-3551
Vocecirc tem total liberdade de optar por natildeo participar da pesquisa Caso aceite
participar poderaacute desistir a qualquer momento ou retirar seu consentimento mesmo apoacutes ter
coletado o sangue Para cancelar sua participaccedilatildeo basta avisar a pesquisadora e os seus dados
seratildeo retirados do projeto
Qualquer duacutevida eacutetica sobre a pesquisa poderaacute entrar em contato com o Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa do Hospital das Cliacutenicas e da Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto
(CAMPUS UNIVERSITAacuteRIO bairro Monte Alegre CEP 14048-900 Ribeiratildeo Preto-SP
Telefone (16) 3602-2228 FAX (16) 3633-1144 e-mail cephcrpuspbr)
Consentimento de participaccedilatildeo
A Consentimento do participante
Li as informaccedilotildees acima sobre o estudo e recebi explicaccedilotildees sobre a participaccedilatildeo no estudo
Portanto dou o meu consentimento para participar do estudo
___________________________________________________________________________
Nome completo
___________________________________________________________________________
Assinatura
___________
Data
__________________________________________________________________________________
Nome completo da pesquisadora
___________________________________________________________________________
Assinatura
_____________
Data
46
8 REFEREcircNCIA BIBLIOGRAacuteFICA
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50
9 ANEXOS
51
FUNDACcedilAtildeO HEMOCENTRO DE RIBEIRAtildeO PRETO
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE)
Tiacutetulo da pesquisa Aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina aacutecida-EDTA e avaliaccedilatildeo da
eficaacutecia no tratamento de hemaacutecias com teste direto da antiglobulina positivo
Pesquisadora responsaacutevel Ceacutelia Kazue Abiko
Orientador Prof Dimas Tadeu Covas
Co-orientadora Dra Flaacutevia Leite Souza Santos
Objetivo da pesquisa Vocecirc estaacute sendo convidado a participar de uma pesquisa que tem
como objetivo padronizar uma nova teacutecnica para auxiliar na tipagem sanguiacutenea de pacientes
A tipagem sanguiacutenea pode sofrer interferecircncia da presenccedila de anticorpos ligados aos gloacutebulos
vermelhos do sangue Nessas situaccedilotildees eacute difiacutecil selecionar o melhor sangue para o paciente e
eacute preciso a utilizaccedilatildeo de teacutecnicas adicionais para remover essas interferecircncias
Esta pesquisa tem como objetivo estudar outra teacutecnica para remover esses anticorpos e
comparaacute-la com a teacutecnica atualmente utilizada Para isso precisamos de amostras de pacientes
e doadores voluntaacuterios
Se vocecirc eacute um doador eacute necessaacuterio que vocecirc autorize a coleta de 5 ml (1 tubo) a mais
de seu sangue
Se vocecirc eacute um paciente natildeo haveraacute necessidade de nova amostra pois utilizaremos as
amostras jaacute coletadas para os testes preacute-transfusionais e os resultados encontrados nesta
pesquisa natildeo iratildeo interferir na escolha da (s) bolsa (s) de sangue que vocecirc possa vir a receber
Se vocecirc concordar em participar leia com atenccedilatildeo o texto abaixo e assine as duas vias
rubricando todas as paacuteginas deste termo de consentimento Uma via original assinada e
rubricada por vocecirc e pela pesquisadora ficaraacute com vocecirc
As suas informaccedilotildees seratildeo mantidas em sigilo pela pesquisadora e natildeo haveraacute
armazenamento de material para pesquisas posteriores Os seus dados seratildeo usados apenas
neste estudo e quando o trabalho for publicado seu nome e qualquer outra informaccedilatildeo que
possam identificaacute-lo natildeo seratildeo revelados
Eacute pouco provaacutevel que o que noacutes aprendermos com este estudo tenha um benefiacutecio
direto para vocecirc assim como natildeo poderemos dar nada em troca pela sua participaccedilatildeo na
pesquisa
Nosso objetivo com esta pesquisa eacute que os resultados poderatildeo ser uacuteteis para o
tratamento de pacientes no futuro Os riscos da participaccedilatildeo satildeo miacutenimos Se vocecirc eacute um
doador de sangue a amostra seraacute coletada no momento da doaccedilatildeo natildeo exigindo punccedilatildeo
venosa adicional
52
Eacute seu direito ter acesso aos resultados dos testes da pesquisa Esses resultados natildeo
seratildeo fornecidos automaticamente a vocecirc mas caso vocecirc se interesse em saber o resultado ou
tiver alguma duacutevida sobre a sua participaccedilatildeo neste estudo deveraacute entrar em contato com Ceacutelia
Kazue Abiko pelo telefone (18) 99718-3551
Vocecirc tem total liberdade de optar por natildeo participar da pesquisa Caso aceite
participar poderaacute desistir a qualquer momento ou retirar seu consentimento mesmo apoacutes ter
coletado o sangue Para cancelar sua participaccedilatildeo basta avisar a pesquisadora e os seus dados
seratildeo retirados do projeto
Qualquer duacutevida eacutetica sobre a pesquisa poderaacute entrar em contato com o Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa do Hospital das Cliacutenicas e da Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto
(CAMPUS UNIVERSITAacuteRIO bairro Monte Alegre CEP 14048-900 Ribeiratildeo Preto-SP
Telefone (16) 3602-2228 FAX (16) 3633-1144 e-mail cephcrpuspbr)
Consentimento de participaccedilatildeo
A Consentimento do participante
Li as informaccedilotildees acima sobre o estudo e recebi explicaccedilotildees sobre a participaccedilatildeo no estudo
Portanto dou o meu consentimento para participar do estudo
___________________________________________________________________________
Nome completo
___________________________________________________________________________
Assinatura
___________
Data
__________________________________________________________________________________
Nome completo da pesquisadora
___________________________________________________________________________
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_____________
Data
47
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underlying warm autoantibodies Transfusion v 39 1999 p 11-16
LOUIE J E JIENG A F e ZEROULIS C G Preparation of intact antibody-free red
blood RBCs in autoimmune hemolytic anemia (abstract) Transfusion 26 p550 1986
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NOVARETTI M C Z et al Comparison of Conventional Tube Test Technique and Gel
Microcolumn Assay for Direct Antiglobulin Test A Large Study Journal of Clinical
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diphosphate for IgG removal Transfusion (abstract) v 31 1991 27S
PINTO P C A BRAGA J A P SANTOS A M N Fatores de risco para aloimunizaccedilatildeo
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57(6) p 668-673
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D M Modern Blood Banking amp Transfusion Practices 6ordf ed Philadelphia F A Davis
Company 2012 p 101-118
ROBACK JD et al Technique Manual AABB 17ordf ed Bethesda MD American
Association of Blood Banks 2011
49
ROZIERS N B SQUALLI S Removing IgG antibodies from intact red cells comparison
of acid and EDTA heat and chloroquine elution methods Transfusion v 37 1997 p 497-
501
SANTOS F L S Testes preacute-transfusionais In Covas D T Ubialli E M A De Santis G
C Manual de Medicina Transfusional 2ordf ed Satildeo Paulo Atheneu 2014 p 47-62
SERERAT T S VEIDT D e DUTCHED A A quick and simple method for plenotyping
IgG-sensitized red blood cells Imunohematology v 16 2000 p 154-156
SHIREY R S et al Prophylactic antigen-matched donor blood for patients with warm
autoantibodies an algorithm for transfusion management Transfusion v 42 2002 p 1435-
1441
VICHINSKY E P et al Prospective RBC phenotype matching in a stroke-prevention trial in
sicke cell anemia a multicenter transfusional trial Transfusion v 41 September 2001
p1086-1092
WALKER P S Identification of Antibodies to Red Cell Antigens Techinical manual
AABB 17th ed Bethesda American Association of Blood Banks 2011p 463-496
WALKER P S e HARMENING D M Other technologies and Automation In Harmening
D M Modern Blood Banking amp Transfusion Practices 6ordf ed Philadelphia F A Davis
Company 2012 p 273-287
ZANTEK N D et al The direct antiglobulin test A critical step in the evaluation of
hemolysis American Journal of Hematology Test of the month 2012
ZAGO M A Apresentaccedilatildeo In Covas D T Ubialli E M A De Santis G C Manual de
Medicina Transfusional 2ordf ed Satildeo Paulo Atheneu 2014
50
9 ANEXOS
51
FUNDACcedilAtildeO HEMOCENTRO DE RIBEIRAtildeO PRETO
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE)
Tiacutetulo da pesquisa Aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina aacutecida-EDTA e avaliaccedilatildeo da
eficaacutecia no tratamento de hemaacutecias com teste direto da antiglobulina positivo
Pesquisadora responsaacutevel Ceacutelia Kazue Abiko
Orientador Prof Dimas Tadeu Covas
Co-orientadora Dra Flaacutevia Leite Souza Santos
Objetivo da pesquisa Vocecirc estaacute sendo convidado a participar de uma pesquisa que tem
como objetivo padronizar uma nova teacutecnica para auxiliar na tipagem sanguiacutenea de pacientes
A tipagem sanguiacutenea pode sofrer interferecircncia da presenccedila de anticorpos ligados aos gloacutebulos
vermelhos do sangue Nessas situaccedilotildees eacute difiacutecil selecionar o melhor sangue para o paciente e
eacute preciso a utilizaccedilatildeo de teacutecnicas adicionais para remover essas interferecircncias
Esta pesquisa tem como objetivo estudar outra teacutecnica para remover esses anticorpos e
comparaacute-la com a teacutecnica atualmente utilizada Para isso precisamos de amostras de pacientes
e doadores voluntaacuterios
Se vocecirc eacute um doador eacute necessaacuterio que vocecirc autorize a coleta de 5 ml (1 tubo) a mais
de seu sangue
Se vocecirc eacute um paciente natildeo haveraacute necessidade de nova amostra pois utilizaremos as
amostras jaacute coletadas para os testes preacute-transfusionais e os resultados encontrados nesta
pesquisa natildeo iratildeo interferir na escolha da (s) bolsa (s) de sangue que vocecirc possa vir a receber
Se vocecirc concordar em participar leia com atenccedilatildeo o texto abaixo e assine as duas vias
rubricando todas as paacuteginas deste termo de consentimento Uma via original assinada e
rubricada por vocecirc e pela pesquisadora ficaraacute com vocecirc
As suas informaccedilotildees seratildeo mantidas em sigilo pela pesquisadora e natildeo haveraacute
armazenamento de material para pesquisas posteriores Os seus dados seratildeo usados apenas
neste estudo e quando o trabalho for publicado seu nome e qualquer outra informaccedilatildeo que
possam identificaacute-lo natildeo seratildeo revelados
Eacute pouco provaacutevel que o que noacutes aprendermos com este estudo tenha um benefiacutecio
direto para vocecirc assim como natildeo poderemos dar nada em troca pela sua participaccedilatildeo na
pesquisa
Nosso objetivo com esta pesquisa eacute que os resultados poderatildeo ser uacuteteis para o
tratamento de pacientes no futuro Os riscos da participaccedilatildeo satildeo miacutenimos Se vocecirc eacute um
doador de sangue a amostra seraacute coletada no momento da doaccedilatildeo natildeo exigindo punccedilatildeo
venosa adicional
52
Eacute seu direito ter acesso aos resultados dos testes da pesquisa Esses resultados natildeo
seratildeo fornecidos automaticamente a vocecirc mas caso vocecirc se interesse em saber o resultado ou
tiver alguma duacutevida sobre a sua participaccedilatildeo neste estudo deveraacute entrar em contato com Ceacutelia
Kazue Abiko pelo telefone (18) 99718-3551
Vocecirc tem total liberdade de optar por natildeo participar da pesquisa Caso aceite
participar poderaacute desistir a qualquer momento ou retirar seu consentimento mesmo apoacutes ter
coletado o sangue Para cancelar sua participaccedilatildeo basta avisar a pesquisadora e os seus dados
seratildeo retirados do projeto
Qualquer duacutevida eacutetica sobre a pesquisa poderaacute entrar em contato com o Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa do Hospital das Cliacutenicas e da Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto
(CAMPUS UNIVERSITAacuteRIO bairro Monte Alegre CEP 14048-900 Ribeiratildeo Preto-SP
Telefone (16) 3602-2228 FAX (16) 3633-1144 e-mail cephcrpuspbr)
Consentimento de participaccedilatildeo
A Consentimento do participante
Li as informaccedilotildees acima sobre o estudo e recebi explicaccedilotildees sobre a participaccedilatildeo no estudo
Portanto dou o meu consentimento para participar do estudo
___________________________________________________________________________
Nome completo
___________________________________________________________________________
Assinatura
___________
Data
__________________________________________________________________________________
Nome completo da pesquisadora
___________________________________________________________________________
Assinatura
_____________
Data
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LAPIERRE Y et al The gel test a new way to detect red cell antigen-antiboy reactions
Transfusion v 30 n 2 1990 p 109-113
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LEGER R M e GARRATY G Evaluation of methods for detecting alloantibodies
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LOUIE J E JIENG A F e ZEROULIS C G Preparation of intact antibody-free red
blood RBCs in autoimmune hemolytic anemia (abstract) Transfusion 26 p550 1986
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Hemocentro Regional de Uberaba-MG de 1997 a 2005 Revista Brasileira de Hematologia
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MARTINS L M et al Uso da genotipagem de grupos sanguiacuteneos na elucidaccedilatildeo de casos
inconclusivos na fenotipagem eritrocitaacuteria de pacientes atendidos na Fundaccedilatildeo Hemominas
Revista Brasileira de Hematologia e Hemoterapia 2009 31(4) p 252-259
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Laboratory Analysis v18 2004 p 255ndash258
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RALPH E B GREEN e KLOSTERMANN D A The Antiglobulin Test In Harmening
D M Modern Blood Banking amp Transfusion Practices 6ordf ed Philadelphia F A Davis
Company 2012 p 101-118
ROBACK JD et al Technique Manual AABB 17ordf ed Bethesda MD American
Association of Blood Banks 2011
49
ROZIERS N B SQUALLI S Removing IgG antibodies from intact red cells comparison
of acid and EDTA heat and chloroquine elution methods Transfusion v 37 1997 p 497-
501
SANTOS F L S Testes preacute-transfusionais In Covas D T Ubialli E M A De Santis G
C Manual de Medicina Transfusional 2ordf ed Satildeo Paulo Atheneu 2014 p 47-62
SERERAT T S VEIDT D e DUTCHED A A quick and simple method for plenotyping
IgG-sensitized red blood cells Imunohematology v 16 2000 p 154-156
SHIREY R S et al Prophylactic antigen-matched donor blood for patients with warm
autoantibodies an algorithm for transfusion management Transfusion v 42 2002 p 1435-
1441
VICHINSKY E P et al Prospective RBC phenotype matching in a stroke-prevention trial in
sicke cell anemia a multicenter transfusional trial Transfusion v 41 September 2001
p1086-1092
WALKER P S Identification of Antibodies to Red Cell Antigens Techinical manual
AABB 17th ed Bethesda American Association of Blood Banks 2011p 463-496
WALKER P S e HARMENING D M Other technologies and Automation In Harmening
D M Modern Blood Banking amp Transfusion Practices 6ordf ed Philadelphia F A Davis
Company 2012 p 273-287
ZANTEK N D et al The direct antiglobulin test A critical step in the evaluation of
hemolysis American Journal of Hematology Test of the month 2012
ZAGO M A Apresentaccedilatildeo In Covas D T Ubialli E M A De Santis G C Manual de
Medicina Transfusional 2ordf ed Satildeo Paulo Atheneu 2014
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9 ANEXOS
51
FUNDACcedilAtildeO HEMOCENTRO DE RIBEIRAtildeO PRETO
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE)
Tiacutetulo da pesquisa Aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina aacutecida-EDTA e avaliaccedilatildeo da
eficaacutecia no tratamento de hemaacutecias com teste direto da antiglobulina positivo
Pesquisadora responsaacutevel Ceacutelia Kazue Abiko
Orientador Prof Dimas Tadeu Covas
Co-orientadora Dra Flaacutevia Leite Souza Santos
Objetivo da pesquisa Vocecirc estaacute sendo convidado a participar de uma pesquisa que tem
como objetivo padronizar uma nova teacutecnica para auxiliar na tipagem sanguiacutenea de pacientes
A tipagem sanguiacutenea pode sofrer interferecircncia da presenccedila de anticorpos ligados aos gloacutebulos
vermelhos do sangue Nessas situaccedilotildees eacute difiacutecil selecionar o melhor sangue para o paciente e
eacute preciso a utilizaccedilatildeo de teacutecnicas adicionais para remover essas interferecircncias
Esta pesquisa tem como objetivo estudar outra teacutecnica para remover esses anticorpos e
comparaacute-la com a teacutecnica atualmente utilizada Para isso precisamos de amostras de pacientes
e doadores voluntaacuterios
Se vocecirc eacute um doador eacute necessaacuterio que vocecirc autorize a coleta de 5 ml (1 tubo) a mais
de seu sangue
Se vocecirc eacute um paciente natildeo haveraacute necessidade de nova amostra pois utilizaremos as
amostras jaacute coletadas para os testes preacute-transfusionais e os resultados encontrados nesta
pesquisa natildeo iratildeo interferir na escolha da (s) bolsa (s) de sangue que vocecirc possa vir a receber
Se vocecirc concordar em participar leia com atenccedilatildeo o texto abaixo e assine as duas vias
rubricando todas as paacuteginas deste termo de consentimento Uma via original assinada e
rubricada por vocecirc e pela pesquisadora ficaraacute com vocecirc
As suas informaccedilotildees seratildeo mantidas em sigilo pela pesquisadora e natildeo haveraacute
armazenamento de material para pesquisas posteriores Os seus dados seratildeo usados apenas
neste estudo e quando o trabalho for publicado seu nome e qualquer outra informaccedilatildeo que
possam identificaacute-lo natildeo seratildeo revelados
Eacute pouco provaacutevel que o que noacutes aprendermos com este estudo tenha um benefiacutecio
direto para vocecirc assim como natildeo poderemos dar nada em troca pela sua participaccedilatildeo na
pesquisa
Nosso objetivo com esta pesquisa eacute que os resultados poderatildeo ser uacuteteis para o
tratamento de pacientes no futuro Os riscos da participaccedilatildeo satildeo miacutenimos Se vocecirc eacute um
doador de sangue a amostra seraacute coletada no momento da doaccedilatildeo natildeo exigindo punccedilatildeo
venosa adicional
52
Eacute seu direito ter acesso aos resultados dos testes da pesquisa Esses resultados natildeo
seratildeo fornecidos automaticamente a vocecirc mas caso vocecirc se interesse em saber o resultado ou
tiver alguma duacutevida sobre a sua participaccedilatildeo neste estudo deveraacute entrar em contato com Ceacutelia
Kazue Abiko pelo telefone (18) 99718-3551
Vocecirc tem total liberdade de optar por natildeo participar da pesquisa Caso aceite
participar poderaacute desistir a qualquer momento ou retirar seu consentimento mesmo apoacutes ter
coletado o sangue Para cancelar sua participaccedilatildeo basta avisar a pesquisadora e os seus dados
seratildeo retirados do projeto
Qualquer duacutevida eacutetica sobre a pesquisa poderaacute entrar em contato com o Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa do Hospital das Cliacutenicas e da Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto
(CAMPUS UNIVERSITAacuteRIO bairro Monte Alegre CEP 14048-900 Ribeiratildeo Preto-SP
Telefone (16) 3602-2228 FAX (16) 3633-1144 e-mail cephcrpuspbr)
Consentimento de participaccedilatildeo
A Consentimento do participante
Li as informaccedilotildees acima sobre o estudo e recebi explicaccedilotildees sobre a participaccedilatildeo no estudo
Portanto dou o meu consentimento para participar do estudo
___________________________________________________________________________
Nome completo
___________________________________________________________________________
Assinatura
___________
Data
__________________________________________________________________________________
Nome completo da pesquisadora
___________________________________________________________________________
Assinatura
_____________
Data
49
ROZIERS N B SQUALLI S Removing IgG antibodies from intact red cells comparison
of acid and EDTA heat and chloroquine elution methods Transfusion v 37 1997 p 497-
501
SANTOS F L S Testes preacute-transfusionais In Covas D T Ubialli E M A De Santis G
C Manual de Medicina Transfusional 2ordf ed Satildeo Paulo Atheneu 2014 p 47-62
SERERAT T S VEIDT D e DUTCHED A A quick and simple method for plenotyping
IgG-sensitized red blood cells Imunohematology v 16 2000 p 154-156
SHIREY R S et al Prophylactic antigen-matched donor blood for patients with warm
autoantibodies an algorithm for transfusion management Transfusion v 42 2002 p 1435-
1441
VICHINSKY E P et al Prospective RBC phenotype matching in a stroke-prevention trial in
sicke cell anemia a multicenter transfusional trial Transfusion v 41 September 2001
p1086-1092
WALKER P S Identification of Antibodies to Red Cell Antigens Techinical manual
AABB 17th ed Bethesda American Association of Blood Banks 2011p 463-496
WALKER P S e HARMENING D M Other technologies and Automation In Harmening
D M Modern Blood Banking amp Transfusion Practices 6ordf ed Philadelphia F A Davis
Company 2012 p 273-287
ZANTEK N D et al The direct antiglobulin test A critical step in the evaluation of
hemolysis American Journal of Hematology Test of the month 2012
ZAGO M A Apresentaccedilatildeo In Covas D T Ubialli E M A De Santis G C Manual de
Medicina Transfusional 2ordf ed Satildeo Paulo Atheneu 2014
50
9 ANEXOS
51
FUNDACcedilAtildeO HEMOCENTRO DE RIBEIRAtildeO PRETO
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE)
Tiacutetulo da pesquisa Aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina aacutecida-EDTA e avaliaccedilatildeo da
eficaacutecia no tratamento de hemaacutecias com teste direto da antiglobulina positivo
Pesquisadora responsaacutevel Ceacutelia Kazue Abiko
Orientador Prof Dimas Tadeu Covas
Co-orientadora Dra Flaacutevia Leite Souza Santos
Objetivo da pesquisa Vocecirc estaacute sendo convidado a participar de uma pesquisa que tem
como objetivo padronizar uma nova teacutecnica para auxiliar na tipagem sanguiacutenea de pacientes
A tipagem sanguiacutenea pode sofrer interferecircncia da presenccedila de anticorpos ligados aos gloacutebulos
vermelhos do sangue Nessas situaccedilotildees eacute difiacutecil selecionar o melhor sangue para o paciente e
eacute preciso a utilizaccedilatildeo de teacutecnicas adicionais para remover essas interferecircncias
Esta pesquisa tem como objetivo estudar outra teacutecnica para remover esses anticorpos e
comparaacute-la com a teacutecnica atualmente utilizada Para isso precisamos de amostras de pacientes
e doadores voluntaacuterios
Se vocecirc eacute um doador eacute necessaacuterio que vocecirc autorize a coleta de 5 ml (1 tubo) a mais
de seu sangue
Se vocecirc eacute um paciente natildeo haveraacute necessidade de nova amostra pois utilizaremos as
amostras jaacute coletadas para os testes preacute-transfusionais e os resultados encontrados nesta
pesquisa natildeo iratildeo interferir na escolha da (s) bolsa (s) de sangue que vocecirc possa vir a receber
Se vocecirc concordar em participar leia com atenccedilatildeo o texto abaixo e assine as duas vias
rubricando todas as paacuteginas deste termo de consentimento Uma via original assinada e
rubricada por vocecirc e pela pesquisadora ficaraacute com vocecirc
As suas informaccedilotildees seratildeo mantidas em sigilo pela pesquisadora e natildeo haveraacute
armazenamento de material para pesquisas posteriores Os seus dados seratildeo usados apenas
neste estudo e quando o trabalho for publicado seu nome e qualquer outra informaccedilatildeo que
possam identificaacute-lo natildeo seratildeo revelados
Eacute pouco provaacutevel que o que noacutes aprendermos com este estudo tenha um benefiacutecio
direto para vocecirc assim como natildeo poderemos dar nada em troca pela sua participaccedilatildeo na
pesquisa
Nosso objetivo com esta pesquisa eacute que os resultados poderatildeo ser uacuteteis para o
tratamento de pacientes no futuro Os riscos da participaccedilatildeo satildeo miacutenimos Se vocecirc eacute um
doador de sangue a amostra seraacute coletada no momento da doaccedilatildeo natildeo exigindo punccedilatildeo
venosa adicional
52
Eacute seu direito ter acesso aos resultados dos testes da pesquisa Esses resultados natildeo
seratildeo fornecidos automaticamente a vocecirc mas caso vocecirc se interesse em saber o resultado ou
tiver alguma duacutevida sobre a sua participaccedilatildeo neste estudo deveraacute entrar em contato com Ceacutelia
Kazue Abiko pelo telefone (18) 99718-3551
Vocecirc tem total liberdade de optar por natildeo participar da pesquisa Caso aceite
participar poderaacute desistir a qualquer momento ou retirar seu consentimento mesmo apoacutes ter
coletado o sangue Para cancelar sua participaccedilatildeo basta avisar a pesquisadora e os seus dados
seratildeo retirados do projeto
Qualquer duacutevida eacutetica sobre a pesquisa poderaacute entrar em contato com o Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa do Hospital das Cliacutenicas e da Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto
(CAMPUS UNIVERSITAacuteRIO bairro Monte Alegre CEP 14048-900 Ribeiratildeo Preto-SP
Telefone (16) 3602-2228 FAX (16) 3633-1144 e-mail cephcrpuspbr)
Consentimento de participaccedilatildeo
A Consentimento do participante
Li as informaccedilotildees acima sobre o estudo e recebi explicaccedilotildees sobre a participaccedilatildeo no estudo
Portanto dou o meu consentimento para participar do estudo
___________________________________________________________________________
Nome completo
___________________________________________________________________________
Assinatura
___________
Data
__________________________________________________________________________________
Nome completo da pesquisadora
___________________________________________________________________________
Assinatura
_____________
Data
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9 ANEXOS
51
FUNDACcedilAtildeO HEMOCENTRO DE RIBEIRAtildeO PRETO
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE)
Tiacutetulo da pesquisa Aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina aacutecida-EDTA e avaliaccedilatildeo da
eficaacutecia no tratamento de hemaacutecias com teste direto da antiglobulina positivo
Pesquisadora responsaacutevel Ceacutelia Kazue Abiko
Orientador Prof Dimas Tadeu Covas
Co-orientadora Dra Flaacutevia Leite Souza Santos
Objetivo da pesquisa Vocecirc estaacute sendo convidado a participar de uma pesquisa que tem
como objetivo padronizar uma nova teacutecnica para auxiliar na tipagem sanguiacutenea de pacientes
A tipagem sanguiacutenea pode sofrer interferecircncia da presenccedila de anticorpos ligados aos gloacutebulos
vermelhos do sangue Nessas situaccedilotildees eacute difiacutecil selecionar o melhor sangue para o paciente e
eacute preciso a utilizaccedilatildeo de teacutecnicas adicionais para remover essas interferecircncias
Esta pesquisa tem como objetivo estudar outra teacutecnica para remover esses anticorpos e
comparaacute-la com a teacutecnica atualmente utilizada Para isso precisamos de amostras de pacientes
e doadores voluntaacuterios
Se vocecirc eacute um doador eacute necessaacuterio que vocecirc autorize a coleta de 5 ml (1 tubo) a mais
de seu sangue
Se vocecirc eacute um paciente natildeo haveraacute necessidade de nova amostra pois utilizaremos as
amostras jaacute coletadas para os testes preacute-transfusionais e os resultados encontrados nesta
pesquisa natildeo iratildeo interferir na escolha da (s) bolsa (s) de sangue que vocecirc possa vir a receber
Se vocecirc concordar em participar leia com atenccedilatildeo o texto abaixo e assine as duas vias
rubricando todas as paacuteginas deste termo de consentimento Uma via original assinada e
rubricada por vocecirc e pela pesquisadora ficaraacute com vocecirc
As suas informaccedilotildees seratildeo mantidas em sigilo pela pesquisadora e natildeo haveraacute
armazenamento de material para pesquisas posteriores Os seus dados seratildeo usados apenas
neste estudo e quando o trabalho for publicado seu nome e qualquer outra informaccedilatildeo que
possam identificaacute-lo natildeo seratildeo revelados
Eacute pouco provaacutevel que o que noacutes aprendermos com este estudo tenha um benefiacutecio
direto para vocecirc assim como natildeo poderemos dar nada em troca pela sua participaccedilatildeo na
pesquisa
Nosso objetivo com esta pesquisa eacute que os resultados poderatildeo ser uacuteteis para o
tratamento de pacientes no futuro Os riscos da participaccedilatildeo satildeo miacutenimos Se vocecirc eacute um
doador de sangue a amostra seraacute coletada no momento da doaccedilatildeo natildeo exigindo punccedilatildeo
venosa adicional
52
Eacute seu direito ter acesso aos resultados dos testes da pesquisa Esses resultados natildeo
seratildeo fornecidos automaticamente a vocecirc mas caso vocecirc se interesse em saber o resultado ou
tiver alguma duacutevida sobre a sua participaccedilatildeo neste estudo deveraacute entrar em contato com Ceacutelia
Kazue Abiko pelo telefone (18) 99718-3551
Vocecirc tem total liberdade de optar por natildeo participar da pesquisa Caso aceite
participar poderaacute desistir a qualquer momento ou retirar seu consentimento mesmo apoacutes ter
coletado o sangue Para cancelar sua participaccedilatildeo basta avisar a pesquisadora e os seus dados
seratildeo retirados do projeto
Qualquer duacutevida eacutetica sobre a pesquisa poderaacute entrar em contato com o Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa do Hospital das Cliacutenicas e da Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto
(CAMPUS UNIVERSITAacuteRIO bairro Monte Alegre CEP 14048-900 Ribeiratildeo Preto-SP
Telefone (16) 3602-2228 FAX (16) 3633-1144 e-mail cephcrpuspbr)
Consentimento de participaccedilatildeo
A Consentimento do participante
Li as informaccedilotildees acima sobre o estudo e recebi explicaccedilotildees sobre a participaccedilatildeo no estudo
Portanto dou o meu consentimento para participar do estudo
___________________________________________________________________________
Nome completo
___________________________________________________________________________
Assinatura
___________
Data
__________________________________________________________________________________
Nome completo da pesquisadora
___________________________________________________________________________
Assinatura
_____________
Data
51
FUNDACcedilAtildeO HEMOCENTRO DE RIBEIRAtildeO PRETO
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE)
Tiacutetulo da pesquisa Aplicaccedilatildeo da teacutecnica da glicina aacutecida-EDTA e avaliaccedilatildeo da
eficaacutecia no tratamento de hemaacutecias com teste direto da antiglobulina positivo
Pesquisadora responsaacutevel Ceacutelia Kazue Abiko
Orientador Prof Dimas Tadeu Covas
Co-orientadora Dra Flaacutevia Leite Souza Santos
Objetivo da pesquisa Vocecirc estaacute sendo convidado a participar de uma pesquisa que tem
como objetivo padronizar uma nova teacutecnica para auxiliar na tipagem sanguiacutenea de pacientes
A tipagem sanguiacutenea pode sofrer interferecircncia da presenccedila de anticorpos ligados aos gloacutebulos
vermelhos do sangue Nessas situaccedilotildees eacute difiacutecil selecionar o melhor sangue para o paciente e
eacute preciso a utilizaccedilatildeo de teacutecnicas adicionais para remover essas interferecircncias
Esta pesquisa tem como objetivo estudar outra teacutecnica para remover esses anticorpos e
comparaacute-la com a teacutecnica atualmente utilizada Para isso precisamos de amostras de pacientes
e doadores voluntaacuterios
Se vocecirc eacute um doador eacute necessaacuterio que vocecirc autorize a coleta de 5 ml (1 tubo) a mais
de seu sangue
Se vocecirc eacute um paciente natildeo haveraacute necessidade de nova amostra pois utilizaremos as
amostras jaacute coletadas para os testes preacute-transfusionais e os resultados encontrados nesta
pesquisa natildeo iratildeo interferir na escolha da (s) bolsa (s) de sangue que vocecirc possa vir a receber
Se vocecirc concordar em participar leia com atenccedilatildeo o texto abaixo e assine as duas vias
rubricando todas as paacuteginas deste termo de consentimento Uma via original assinada e
rubricada por vocecirc e pela pesquisadora ficaraacute com vocecirc
As suas informaccedilotildees seratildeo mantidas em sigilo pela pesquisadora e natildeo haveraacute
armazenamento de material para pesquisas posteriores Os seus dados seratildeo usados apenas
neste estudo e quando o trabalho for publicado seu nome e qualquer outra informaccedilatildeo que
possam identificaacute-lo natildeo seratildeo revelados
Eacute pouco provaacutevel que o que noacutes aprendermos com este estudo tenha um benefiacutecio
direto para vocecirc assim como natildeo poderemos dar nada em troca pela sua participaccedilatildeo na
pesquisa
Nosso objetivo com esta pesquisa eacute que os resultados poderatildeo ser uacuteteis para o
tratamento de pacientes no futuro Os riscos da participaccedilatildeo satildeo miacutenimos Se vocecirc eacute um
doador de sangue a amostra seraacute coletada no momento da doaccedilatildeo natildeo exigindo punccedilatildeo
venosa adicional
52
Eacute seu direito ter acesso aos resultados dos testes da pesquisa Esses resultados natildeo
seratildeo fornecidos automaticamente a vocecirc mas caso vocecirc se interesse em saber o resultado ou
tiver alguma duacutevida sobre a sua participaccedilatildeo neste estudo deveraacute entrar em contato com Ceacutelia
Kazue Abiko pelo telefone (18) 99718-3551
Vocecirc tem total liberdade de optar por natildeo participar da pesquisa Caso aceite
participar poderaacute desistir a qualquer momento ou retirar seu consentimento mesmo apoacutes ter
coletado o sangue Para cancelar sua participaccedilatildeo basta avisar a pesquisadora e os seus dados
seratildeo retirados do projeto
Qualquer duacutevida eacutetica sobre a pesquisa poderaacute entrar em contato com o Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa do Hospital das Cliacutenicas e da Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto
(CAMPUS UNIVERSITAacuteRIO bairro Monte Alegre CEP 14048-900 Ribeiratildeo Preto-SP
Telefone (16) 3602-2228 FAX (16) 3633-1144 e-mail cephcrpuspbr)
Consentimento de participaccedilatildeo
A Consentimento do participante
Li as informaccedilotildees acima sobre o estudo e recebi explicaccedilotildees sobre a participaccedilatildeo no estudo
Portanto dou o meu consentimento para participar do estudo
___________________________________________________________________________
Nome completo
___________________________________________________________________________
Assinatura
___________
Data
__________________________________________________________________________________
Nome completo da pesquisadora
___________________________________________________________________________
Assinatura
_____________
Data
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Eacute seu direito ter acesso aos resultados dos testes da pesquisa Esses resultados natildeo
seratildeo fornecidos automaticamente a vocecirc mas caso vocecirc se interesse em saber o resultado ou
tiver alguma duacutevida sobre a sua participaccedilatildeo neste estudo deveraacute entrar em contato com Ceacutelia
Kazue Abiko pelo telefone (18) 99718-3551
Vocecirc tem total liberdade de optar por natildeo participar da pesquisa Caso aceite
participar poderaacute desistir a qualquer momento ou retirar seu consentimento mesmo apoacutes ter
coletado o sangue Para cancelar sua participaccedilatildeo basta avisar a pesquisadora e os seus dados
seratildeo retirados do projeto
Qualquer duacutevida eacutetica sobre a pesquisa poderaacute entrar em contato com o Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa do Hospital das Cliacutenicas e da Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto
(CAMPUS UNIVERSITAacuteRIO bairro Monte Alegre CEP 14048-900 Ribeiratildeo Preto-SP
Telefone (16) 3602-2228 FAX (16) 3633-1144 e-mail cephcrpuspbr)
Consentimento de participaccedilatildeo
A Consentimento do participante
Li as informaccedilotildees acima sobre o estudo e recebi explicaccedilotildees sobre a participaccedilatildeo no estudo
Portanto dou o meu consentimento para participar do estudo
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Nome completo
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Assinatura
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Data
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Nome completo da pesquisadora
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Assinatura
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Data