UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRIDFACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular I

QUITOSANTO, UN BIOPOLMERO CON APLICACIONES EN SISTEMAS DE LIBERACIN CONTROLADA DE FRMACOS.MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR

Ruth Expsito HarrisBajo la direccin de los doctores ngeles Mara Heras Caballero Niuris Acosta ContrerasMadrid, 2010 ISBN: 978-84-693-5983-9 Ruth Expsito Harris, 2010

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular I

QUITOSANO, UN BIOPOLMERO CON APLICACIONES EN SISTEMAS DE LIBERACIN CONTROLADA DE FRMACOS

MEMORIA DE TESIS DOCTORAL PRESENTADA POR:

Da. Ruth Expsito Harris

DIRECTORES DE TESIS: ngeles Mara Heras Caballero Niuris Acosta Contreras Madrid, 2009

Agradecimientos Durante estos aos he recibido el apoyo de muchas personas a las que quiero mostrar mi ms sincero agradecimiento. Agradezco a mis directoras de Tesis, las Dras. ngeles Heras y Niuris Acosta el apoyo y el nimo que me han brindado durante este tiempo y, sobre todo, el haberme dado la oportunidad de trabajar con ellas. A ngeles tengo que agradecerle el nimo que me ha dado da tras da para que todo el trabajo realizado durante estos aos tuviese su fruto en esta memoria de tesis. A Niuris, agradecerle el esfuerzo por ayudarme aun trabajando en otro centro. Expreso mi agradecimiento al Instituto de Estudios Biofuncionales y al Departamento de Fsico-Qumica II de la Facultad de Farmacia, en las personas que ocupan su direccin, el Dr. Jos Gonzlez y el Dr. Pedro Antonio Galera, respectivamente. Gracias tambin a la Dra. Begoa Elorza, investigadora principal de los proyectos MAT 200403982 y MAT2007-63757 del Ministerio de Ciencia e Innovacin, durante los aos que la Dra. ngeles Heras estuvo en comisin de servicios en el Ministerio de Sanidad y Consumo. El agradecimiento ms grande de todos va dirigido a mi familia, sobre todo a Sergio, a David y a mi madre, porque esta Tesis es una realidad gracias a ellos, a su apoyo incondicional, desde el principio. Mencin especial para Sergio, por su ayuda y su paciencia y por estar ah en los momentos buenos y malos. Gracias tambin a los que estn lejos y a los que ya no estn, sobre todo a Paquita, porque s que le hubiese gustado estar aqu y ver mi Tesis terminada. He tenido la suerte de conocer a gente maravillosa en el Instituto de Estudios Biofuncionales. Gracias a mis nias, Marian, Carol, Ana y Alba, que han estado conmigo desde el principio de esta andadura y con quienes he compartido tantos momentos. A las que llegaron despus, Inma, Susana y Elena, por sus consejos, su ayuda en estos ltimos meses y su amistad. Y por supuesto, a Bea, Inma y Gemma, por ayudarme en mis inicios. No me olvido de Ins, probablemente a quien le debo que el tema de mi tesis sea el que es y quien me ayud y apoy durante los primeros aos. Al resto de compaeros del Instituto y del CAI de RMN, gracias por los consejos, las risas y todos los buenos momentos.

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He disfrutado de una estancia en la Universidad de Nottingham. Quiero mostrar mi agradecimiento a las Prof. Lisbeth Illum y Snow Stolnik el haberme dado la oportunidad de realizar parte del trabajo experimental de la Tesis en su grupo de investigacin. Gracias a mis compaeros all, a Driton y Emilia, por dedicar su tiempo a ensearme y ayudarme en el laboratorio. Gracias a la Red Alfa II 0259 de la Unin Europea disfrut del curso Biopolymers in materials and life sciences en la Universidad de Potsdam (Alemania), una de las mejores experiencias que he vivido. En la Universidad Complutense tambin debo mostrar mi agradecimiento a Eugenio y Alfonso, del CAI de Microscopa y a Fernando, del CAI de Rayos X. Quiero agradecer a la empresa Vegal Farmacutica S.L., con la que el Instituto de Estudios Biofuncionales mantuvo un contrato artculo 83, el financiar esta tesis durante el primer ao. Esta tesis se ha realizado con la financiacin de dos contratos asociados a los proyectos MAT 2004-03982 y MAT 2007-63757 del Ministerio de Ciencia e Innovacin.

Muchas gracias a todos, de corazn.

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FRUTO DE ESTA TESIS HAN SIDO: Publicaciones: I. Paos, R. Harris, N. Acosta, B. Miralles, A. Heras Study of the amount of chitosan bound to alginate in polyelectrolyte complexes. Advances in Quitin Science, Vol IX (2006). Eds. A. Domard, E. Guibal, K. M. Vrum. Pags 637644. R. Harris, I. Paos, N. Acosta, A. Heras. Preparation and characterization of chitosan microspheres for controlled release of tramadol. Journal of Controlled Release (2008), 132 (3), e76-e77. Inmaculada Aranaz, Marian Mengbar, Ruth Harris, Ins Paos, Beatriz Miralles, Niuris Acosta, Gemma Galed, ngeles Heras. Functional characterization of chitin and chitosan. Current Chemical Biology (2009), 3, 203-230. B. Miralles, M. Mengbar, R. Harris and A. Heras. Suitability of a colorimetric method for the selective determination of chitosan in dietary supplements. Food Chemistry. Aceptado Julio de 2009. Ref: FOODCHEM-D-09-01275R1. Inmaculada Aranaz, Ruth Harris and Angeles Heras. Chitosan Amphiphilic Derivatives. Chemistry and Applications. Current Organic Chemistry. Aceptado 2009. R. Harris, E. Lecumberri, I. Mateos-Aparicio, M. Mengbar, A. Heras. Chitosan nanoparticles and microspheres for the encapsulation of natural antioxidants and their application in cosmetics. Carbohydrate Polymers (En revisin: CARBPOL-D-09-00950). R. Harris, N. Acosta, A. Heras. Novel chitosan hydrochloride - genipin microspheres for controlled release of tramadol hydrochloride. Journal of Microencapsulation (Enviado: TMNC-2009-0197). E. Lecumberri, R. Harris, A. Heras. Chitosan microspheres crosslinked with genipin for controlled release of drugs. En elaboracin para enviar a la revista Marine Drugs. R. Harris, I. Paos, N. Acosta, A. Heras. New chitosan films for controlled release of ciprofloxacin hydrochloride. En elaboracin para enviar a la revista Drug Delivery.

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D. Vllasaliu, R. Harris, L. Casettari, A. Heras, L. Illum, S. Stolnik. Tight junction modulation of chitosan solution and chitosan nanoparticles. En elaboracin para enviar a la revista Journal of Controlled Release. Contribuciones a congresos internacionales: I. Paos, R. Harris, I. Aranaz, G. Galed, N. Acosta, A. Heras. Chitosan films for the controlled release of ciprofloxacin HCl. IV Congreso Internacional de Biomateriales, BIOMAT, La Habana, Cuba, 2006. (Pster). I. Paos, R. Harris, B. Miralles, N. Acosta, A. Heras. Study of amount of chitosan bound to alginate in polyelectrolyte complexes. 10th International Conference on Chitin and Chitosan. 7th International Conference of the European Chitin Society. Montpellier, Francia, 2006. (Pster). I. Paos, R. Harris, B. Miralles, N. Acosta, A. Heras. Chitosan films for controlled release of ciprofloxacin. IV Simposio Iberoamericano de quitina, SIAQ. Natal, Brasil, 2007. (Pster). I. Paos, R. Harris, N. Acosta, A. Heras. Sustained release chitosan microspheres prepared by a w/o/w emulsion-spray drying method. 34rd Controlled Release Society Meeting. Long Beach, California, EE.UU., 2007. (Pster). R. Harris, I. Paos, N. Acosta, A. Heras. Preparation and characterization of chitosan microspheres for controlled release of tramadol. 10th European Symposium of Controlled Drug Delivery. Noordwijk aan Zee (Holanda), 2008. (Pster). R. Harris, I. Paos, N. Acosta, A. Heras. Chitosan-genipin microspheres prepared by spray-drying: characterization. World Meeting in Pharmaceutics, Biopharmaceutics and Pharmaceutical Technology. Barcelona, 2008. (Pster). R. Harris, N. Acosta, E. Lecumberri, A. Heras. Novel chitosan hydrochloridegenipin microspheres for controlled release of tramadol hydrochloride. Controlled Release Society. Copenhague (Dinamarca), 2009. (Pster). E. Lecumberri, R. Harris, A. Heras. Chitosan microspheres crosslinked with genipin for controlled release of drugs. European Quitin Society. Venecia (Italia), 2009. (Pster). R. Harris, E. Lecumberri, I. Mateos-Aparicio, M. Mengbar, S.Iglesias, A. Heras. Chitosan nanoparticles and microspheres for the encapsulation of natural antioxidants and their application in cosmetics.11th Internacional Conference on Chitin and Chitosan. Taipei (Taiwan), 2009. (Pster). 4

A. Heras, R. Harris, E. Lecumberri, I. Mateos-Aparicio, M. Mengbar. Chitosan and co-passengers. Functional applications. 11th Internacional Conference on Chitin and Chitosan. Taipei (Taiwan), 2009. Keynote lecture. A. Heras, R. Harris, E. Lecumberri, I. Mateos-Aparicio, M. Mengbar. Quitosano, biopolmero creador de sinergias. V Iberoamerican chitin symposium. Chile, 2010. Plenary conference. Congresos nacionales: R. Harris Pelculas de quitosano para la liberacin controlada de frmacos. II Jornadas Complutenses y I Congreso Nacional de Investigacin para alumnos de pregrado en Ciencias de la Salud. Facultad de Farmacia, Madrid, Espaa, 2007. Comunicacin oral. Estancias en centros extranjeros Estancia de cuatro meses en la Universidad de Nottingham (Reino Unido). Drug delivery and tissue engineering department. Febrero-Mayo 2008. Actividades de transferencia de tecnologa: Integrante del equipo promotor de la empresa de base tecnolgica (EBT) InFiQuS. Fecha: 2009 Informes a empresas: 1. Matrices de liberacin controlada a base de quitosano: aplicaciones a la claritromicina y a la venlafaxina. Vegal Farmacutica S.L. Marzo 2007. 2. Matrices de liberacin controlada a base de quitosano: aplicaciones a la claritromicina y a la venlafaxina. Vegal Farmacutica S.L. Junio 2007. 3. Matrices de liberacin controlada a base de quitosano y genipina. Laboratorios ROVI S.A. Junio 2008.

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Abreviaturas ANOVA: CS: DRX: EE: FFLM: FT-IR: FD: GD: Gnp: HBSS: HCS: LD 50: anlisis de la varianza de una va quitosano difraccin de rayos X eficiencia de encapsulacin formas farmacuticas de liberacin modificada espectroscopa de infrarrojos por transformada de Fourier dextrano marcado con isotiocianato de fluorescena (del ingls FITC-Dextran) grado de desacetilacin genipina solucin salina equilibrada de Hank (del ingls Hanks balanced salt solution) hidrocloruro de quitosano dosis letal para el 50% de un conjunto de animales de prueba (del ingls lethal dosis) test de citotoxicidad en el que se determina la liberacin de lactato deshidrogenasa de las clulas ensayo de citotoxicidad en el que se utiliza una sal del tetrazolio (3-(4,5dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H- tetrazolio) tampn fosfato salino (del ingles phosphate buffered saline) rendimiento de atomizacin desviacin estndar (del ingls standard deviation) microscopa electrnica de barrido (del ingls scanning electron microscopy) fluido gstrico simulado (del ingls simulated gastric fluid) fluido intestinal simulado (del ingls simulated intestinal fluid) tripolifosfato sdico ultravioleta ultravioleta-visible

LDH

MTS

PBS RA: SD: SEM: SGF: SIF: TPP: UV: UV-Vis:

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ndice ndice I. 1 2 3 4 5 INTRODUCCIN .................................................................................................... 15 Sistemas de liberacin modificada ............................................................................. 17 Polmeros utilizados en sistemas de liberacin de frmacos...................................... 18 Quitosano: Caractersticas, propiedades y aplicaciones ............................................. 19 Microesferas y nanopartculas de quitosano .............................................................. 22 Pelculas de quitosano ................................................................................................ 25 5.1 6 7 8 9 Hinchamiento de las pelculas de quitosano ....................................................... 26

El quitosano como promotor de la absorcin de frmacos ........................................ 28 Cultivos celulares como modelo epitelial .................................................................. 32 Agentes entrecruzantes ............................................................................................... 34 Frmacos empleados .................................................................................................. 38

10 Modelos matemticos ................................................................................................. 42 II. 1 2 3 4 5 MATERIALES Y MTODOS ............................................................................ 49 Materiales ................................................................................................................... 51 Obtencin de microesferas de hidrocloruro de quitosano .......................................... 52 Obtencin de pelculas de quitosano .......................................................................... 53 Obtencin de nanopartculas de hidrocloruro de quitosano ....................................... 54 Caracterizacin ........................................................................................................... 54 5.1 Estudios de morfologa ....................................................................................... 54 5.2 Determinacin de la caraga elctrica superficial de microesferas y nanopartculas ................................................................................................................ 55 5.3 Estudios de interaccin frmaco-polmero ......................................................... 56 5.3.1 Difraccin de rayos X ..................................................................................... 56 5.3.2 Espectroscopia de infrarrojo............................................................................ 56 5.4 Reaccin de entrecruzamiento del hidrocloruro de quitosano y la genipina ...... 57 9

ndice 5.5 5.6 5.7 6 Determinacin del grado de entrecruzamiento con genipina .............................. 57 Estudios de hinchamiento de las pelculas de quitosano .................................... 58 Determinacin de la cantidad de quitosano unido a las nanopartculas.............. 58

Estudios de liberacin in vitro.................................................................................... 59 6.1 6.2 6.3 Microesferas de claritromicina ........................................................................... 59 Microesferas de hidrocloruro de tramadol .......................................................... 60 Pelculas de quitosano con hidrocloruro de ciprofloxacino ................................ 61

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Cultivos celulares ....................................................................................................... 61 7.1 7.2 7.3 7.4 7.5 Clulas Calu-3..................................................................................................... 61 Ensayo de toxicidad MTS ................................................................................... 62 Ensayo de liberacin de LDH ............................................................................. 63 Determinacin de la resistencia transepitelial..................................................... 63 Ensayos de permeabilidad celular ....................................................................... 64 RESULTADOS Y DISCUSIN .......................................................................... 69 Microesferas de hidrocloruro de quitosano con claritromicina obtenidas por

III. 1

atomizacin........................................................................................................................ 71 1.1 Microesferas de hidrocloruro de quitosano con claritromicina entrecruzadas con tripolifosfato sdico ................................................................................................ 71 1.1.1 Obtencin de las microesferas......................................................................... 71 1.1.2 Estudios de morfologa.................................................................................... 74 1.1.3 Determinacin de la carga superficial de las microesferas ............................. 75 1.1.4 Interaccin frmaco-polmero ......................................................................... 77 1.1.5 Estudios de liberacin in vitro......................................................................... 78 1.2 Microesferas de hidrocloruro de quitosano con claritromicina entrecruzadas con genipina ................................................................................................................... 90 1.2.1 Obtencin de las microesferas......................................................................... 90 1.2.2 Estudios de morfologa.................................................................................... 90 1.2.3 Determinacin de la carga superficial de las microesferas ............................. 91 1.2.4 Interaccin frmaco-polmero ......................................................................... 91 1.2.5 Estudios de liberacin in vitro......................................................................... 92 1.3 Conclusiones parciales del captulo .................................................................... 95 2 Microesferas de hidrocloruro de quitosano con hidrocloruro de tramadol obtenidas

por atomizacin ................................................................................................................. 97 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 Reaccin de entrecruzamiento del hidrocloruro de quitosano y la genipina ...... 97 Determinacin del grado de entrecruzamiento ................................................. 101 Obtencin de las microesferas .......................................................................... 103 Estudios de morfologa ..................................................................................... 104 Determinacin de la carga superficial de las microesferas ............................... 105 10

ndice 2.6 2.7 2.8 3 Interaccin frmaco-polmero ........................................................................... 106 Estudios de liberacin in vitro .......................................................................... 108 Conclusiones parciales del captulo .................................................................. 117

Pelculas de quitosano con hidrocloruro de ciprofloxacino ..................................... 119 3.1 Obtencin de las pelculas ................................................................................ 119 3.2 Estudios de morfologa ..................................................................................... 120 3.3 Grado de hinchamiento de las pelculas ........................................................... 121 3.4 Estudios de interaccin frmaco-polmero ....................................................... 124 3.4.1 Difraccin de rayos X ................................................................................... 124 3.4.2 Espectroscopa de infrarrojo.......................................................................... 128 3.5 Ensayos de liberacin in vitro ........................................................................... 131 3.6 Conclusiones parciales del captulo .................................................................. 136

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Estudio del efecto del quitosano sobre las uniones estrechas de clulas Calu-3...... 139 4.1 Obtencin y caracterizacin de nanopartculas de hidrocloruro de quitosano . 140 4.2 Estudios de citotoxicidad .................................................................................. 142 4.2.1 Ensayo de MTS ............................................................................................. 142 4.2.2 Ensayo LDH .................................................................................................. 144 4.3 Estudio de la resistencia transepitelial .............................................................. 146 4.4 Ensayos de permeabilidad celular ..................................................................... 150 4.5 Conclusiones parciales del captulo .................................................................. 151

IV. CONCLUSIONES .................................................................................................... 153 V. BIBLIOGRAFA........................................................................................................ 157

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Objetivos OBJETIVOS Siguiendo la lnea de investigacin del grupo Investigaciones en el Sistema QuitinaQuitosano y dentro del rea de sistemas de liberacin controlada de frmacos basados en quitosano, en esta Tesis se ha dado un paso ms en el conocimiento del quitosano y las potenciales aplicaciones de este biopolmero en el campo de la tecnologa farmacutica. As, el objetivo general de esta Tesis ha sido, por una parte obtener microesferas, pelculas y nanopartculas de quitosano para la encapsulacin de frmacos y, por otra parte, estudiar la citotoxicidad del quitosano y su capacidad como promotor de absorcin de macromolculas en monocapas de clulas Calu-3. Este objetivo general podra desglosarse en los siguientes objetivos especficos: Obtencin, caracterizacin y estudio de la liberacin in vitro de microesferas de hidrocloruro de quitosano como sistemas de liberacin controlada de claritromicina e hidrocloruro de tramadol para administracin oral. Obtencin, caracterizacin y estudio de la liberacin in vitro de pelculas de quitosano como sistemas de liberacin controlada de hidrocloruro de ciprofloxacino para uso tpico. Estudio del efecto del quitosano, en solucin o en nanopartculas sobre una lnea celular de epitelio respiratorio: citotoxicidad, apertura de uniones estrechas y permeabilidad celular de macromolculas.

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Introduccin

I. INTRODUCCIN

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Introduccin

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Sistemas de liberacin modificada

En las ltimas dcadas, el desarrollo de nuevas formas farmacuticas de liberacin modificada (FFLM), tambin llamadas de liberacin controlada, ha suscitado gran inters en la industria farmacutica. Se trata de dispositivos que aportan mejores pautas posolgicas, mejor perfil farmacocintico e incluso reduccin de efectos adversos. De acuerdo con la Real Farmacopea Espaola [1], las FFLM son aqullas en las que la velocidad y el lugar de liberacin de la sustancia o sustancias activas es diferente del de la forma farmacutica de liberacin convencional, administrada por la misma va. En ellas se introducen modificaciones en la formulacin o en el proceso de produccin con el fin de alterar la velocidad, el tiempo o el lugar de liberacin del frmaco [2]. De esta forma se pueden alcanzar los niveles teraputicos del frmaco en el lugar de accin y mantenerlos a lo largo del tiempo. Como consecuencia, las FFLM presentan numerosas ventajas con respecto a las formas farmacuticas convencionales [3]: Disminucin de la frecuencia de administracin del medicamento, mejorando de esta forma el cumplimiento del tratamiento por parte del paciente. Reduccin de los efectos secundarios relacionados con dosis elevadas. Disminucin de la fluctuacin de niveles plasmticos. Efecto teraputico ms uniforme. Sin embargo, tambin existen algunos inconvenientes, entre los que hay que destacar [3]: Coste elevado. Correlaciones in vitro/in vivo difciles de predecir. Posible sobredosificacin por liberacin inmediata e incontrolada de la dosis. Dificultad en el ajuste de la dosificacin. Dependencia del tiempo de trnsito intestinal en las formas de administracin oral. Riesgo de acumulacin del frmaco y necesidad de ajuste de pautas posolgicas.

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Introduccin En la Tabla I.1 se resumen los principales tipos de liberacin modificada [4, 5]:Tabla I.1. Caractersticas y ejemplos de los diferentes tipos de liberacin modificada.

Tipo de liberacin Prolongada o controlada

Caractersticas principales

Ejemplos

Diseadas para garantizar Comprimidos o parches una liberacin ms lenta del lipdicos, hidroflicos o de frmaco. polmeros insolubles. Retrasan la liberacin del principio activo. No prolongan el efecto teraputico. Sistemas de cubierta entrica o formas farmacuticas gastrorresistentes.

Retardada

Pulstil

Modificadas para garantizar una liberacin secuencial Sistemas que pretenden del frmaco. hacer coincidir la liberacin Normalmente presentan dos del frmaco con ciclos fases: una inmediata y otra circadianos hormonales. al cabo de un tiempo. Liberan el principio activo cuando la forma farmacutica alcanza su lugar de accin. Sistemas bioadhesivos.

De control espacial

Los sistemas de liberacin modificada tambin se pueden clasificar en funcin del mecanismo por el cual se libera el principio activo. La liberacin puede ocurrir por difusin, disolucin, presin osmtica, fuerza mecnica, hinchamiento, erosin o activacin [2]. 2 Polmeros utilizados en sistemas de liberacin de frmacos

Actualmente, en la elaboracin de sistemas de liberacin controlada, se utilizan un gran nmero de polmeros. Existen dos grandes grupos de polmeros: Polmeros naturales, como el colgeno, la albmina o el quitosano. Polmeros sintticos, entre los que se distinguen: o Polmeros biodegradables, como los cidos polilctico y poligliclico. o Polmeros no biodegradables, como los cidos poliacrlicos.

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Introduccin Tanto los materiales empleados en el desarrollo de los sistemas de liberacin as como sus productos de degradacin han de ser biocompatibles. La liberacin del frmaco desde una matriz polimrica puede deberse a tres tipos de mecanismos: liberacin desde la superficie de las partculas, difusin a travs de la matriz hinchada y liberacin debido a la erosin del polmero. En la mayora de los casos, la liberacin se debe a ms de uno de estos mecanismos [6]. En el caso de la liberacin desde la superficie, el frmaco atrapado en la capa superficial de las partculas se disuelve instantneamente al entrar en contacto con el medio. Esto provoca el llamado efecto estallido, del ingls burst effect, que puede evitarse

utilizando agentes entrecruzantes o lavando las partculas con solventes apropiados, lo cual puede conducir a una baja eficiencia de encapsulacin. La liberacin por difusin implica tres etapas. En la primera, el agua penetra en el sistema, lo que hace que la matriz se hinche; en la segunda, el polmero cristalino se convierte en una matriz hidratada; y en la tercera, se produce una difusin del frmaco a travs de dicha matriz hidratada. La velocidad global del proceso vendr determinada por la velocidad de cada etapa. Ajustando experimentalmente las variables adecuadas se puede conseguir la velocidad de liberacin del frmaco idnea. Este tipo de liberacin es tpico en hidrogeles. En el caso de polmeros biodegradables, el principio activo puede liberarse por erosin de la matriz en la que est encapsulado. 3 Quitosano: Caractersticas, propiedades y aplicaciones

El quitosano es un polmero natural que se obtiene a partir de la quitina, uno de los biopolmeros ms abundantes en la naturaleza. La quitina forma parte de la estructura de soporte de numerosos organismos vivos, tales como artrpodos (crustceos e insectos), moluscos y hongos. Se trata adems de un subproducto importante de varias industrias como la pesquera y la cervecera. La quitina y el quitosano son biopolmeros que en los ltimos aos han encontrado gran cantidad de aplicaciones, especialmente en la industria alimentaria y en la biotecnolgica [7]. La quitina est formada por unidades de 2-acetamido-2-deoxy--D-glucosa unidas por enlaces -(14). La obtencin de quitosano a partir de quitina se realiza por desacetilacin de la misma, dejando libre el grupo amino del carbono 2, si bien este 19

Introduccin proceso nunca llega al 100% [8]. Es por ello que el quitosano es un copolmero de 2acetamido-2-deoxy--D-glucosa y 2-amino-2-deoxy--D-glucosa (Figura I.1).

(a)

(b)

Figura I.1. Estructura de la quitina (a) y del quitosano (b).

La fuente y el mtodo de obtencin determinan la composicin de las cadenas de quitosano y su tamao. Por este motivo, el grado de desacetilacin y el peso molecular promedio son dos parmetros de obligado conocimiento para la caracterizacin de este polmero. Las principales propiedades fsico-qumicas del quitosano que determinan sus propiedades funcionales son su grado de desacetilacin y su peso molecular promedio, aunque la cristalinidad, el contenido de agua, cenizas y protenas tambin son caractersticas fsico-qumicas a considerar para la aplicacin de un quitosano especfico. El porcentaje de grupos amino que quedan libres en la molcula de quitosano es lo que se denomina grado de desacetilacin y est estrechamente vinculado con su solubilidad. Como consecuencia de la hidrlisis del grupo N-acetilo, aumenta la capacidad hidroflica del quitosano y pasa a ser soluble en soluciones cidas diludas (actico, 20

Introduccin frmico, clorhdrico, entre otros) ya que el pKa del gupo amino del quitosano es de 6,5 [9]. La protonacin de los grupos amino del quitosano en medio cido le confiere un carcter altamente reactivo. El quitosano es un polmero formado por unidades repetidas de D-glucosamina, por lo que la longitud de la cadena y, por tanto, su peso molecular, es una caracterstica importante de la molcula. Algunas de las propiedades funcionales del quitosano son: biodegradabilidad, biocompatibilidad, mucoadhesin, capacidad filmognica, hemosttico, promotor de absorcin, actividad antimicrobiana, anticolesterolmica y antioxidante [10]. Estas propiedades funcionales han promovido su utilizacin en varios campos distintos como son agricultura, industria y medicina. En agricultura, el quitosano se ha descrito como antivirus en plantas y como aditivo en fertilizantes. As mismo se ha investigado como agente quelante de metales en agricultura e industria y como agente filmognico en cosmtica [11]. Tambin ha sido utilizado en la industria papelera, en la textil y en el tratamiento de aguas residuales [12]. En la industria alimentaria se puede utilizar como ingrediente funcional y como fibra alimentaria. Adems, tiene la capacidad de unirse a grasas, por lo que se utiliza como agente hipocolesterolmico en productos dietticos [10]. Ha sido altamente utilizado en el campo de la biomedicina debido a su actividad inmunoestimuladora, propiedades anticoagulates, accin antibacteriana y antifngica [13] y por su accin como promotor de la cicatrizacin de heridas [14]. Debido a su carcter catinico y a sus propiedades gelificantes y filmognicas, el quitosano ha sido estudiado en la industria farmacutica por su potencial en el desarrollo de sistemas de liberacin de frmacos [15, 16]. En este sentido, hay que destacar que el hidrocloruro de quitosano fue aprobado por las autoridades e incluido en la cuarta edicin de la Farmacopea Europea (2002) [17]. Constituye un vehculo para la encapsulacin del frmaco, protegindolo y liberndolo de forma controlada, adems de promover su absorcin a travs del epitelio. As mismo, el quitosano presenta propiedades necesarias para su uso en dicha industria, como son su biodegradabilidad, biocompatibilidad y no toxicidad. La toxicidad del quitosano por va oral es baja; se ha descrito una LD50 (dosis letal para el 50% de un conjunto de animales de prueba) de 16g/Kg en ratas [18]. El grado de desacetilacin y el peso molecular promedio del quitosano son dos caractersticas fsico-qumicas

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Introduccin fundamentales, ya que afectan a las propiedades de las formulaciones farmacuticas basadas en este polmero [10]. En los ltimos aos, el estudio del quitosano se ha centrado sobre todo en mejorar la liberacin y la absorcin de las llamadas biomolculas teraputicas, como son los frmacos proteicos [19]. Existen resultados contradictorios sobre la mayor eficiencia del quitosano en solucin, en polvo o en forma de nanopartculas en la liberacin in vivo. En general, se ha visto que la eficiencia de la absorcin de macromolculas en mucosas utilizando nanopartculas de quitosano como vehculo de encapsulacin es inferior a la obtenida con formulaciones de quitosano en solucin o en polvo [20]. 4 Microesferas y nanopartculas de quitosano

El uso de sistemas micro y nanoparticulados para la encapsulacin de frmacos permite el transporte de stos al lugar de accin teraputica, el incremento de su vida media y su liberacin controlada en el tiempo. Adems, al ser partculas pequeas, presentan una relacin superficie-volumen alta [21]. La liberacin de un principio activo a partir de sistemas particulados a base de quitosano depende de la densidad de la matriz polimrica. As, mediante la variacin de la concentracin y del peso molecular del polmero e incorporando copolmeros y agentes entrecruzantes se pueden obtener sistemas de encapsulacin con los perfiles de liberacin adecuados en cada caso. Las microesferas son sistemas homogneos en los que el frmaco est disperso en una matriz polimrica, a diferencia de las microcpsulas, en las que el principio activo se encuentra rodeado por una capa de polmero. Las microesferas de quitosano constituyen uno de los sistemas de liberacin controlada de frmacos ms estudiados, tanto para su administracin parenteral como por va oral. Adems de controlar la liberacin de principios activos, mejoran la biodisponibilidad de sustancias degradables como las protenas y promueven la absorcin de frmacos hidrosolubles a travs de las membranas epiteliales.

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Introduccin Existen varios mtodos para la obtencin de microesferas, como son [22]: Gelificacin ionotrpica Precipitacin Atomizacin o spray-drying Coacervacin simple Coacervacin compleja Entrecruzamiento qumico Entrecruzamiento trmico Emulsin La atomizacin o spray-drying es un proceso de evaporacin de solvente que se ha empleado extensamente en la industria farmacutica para producir polvos secos, grnulos y aglomerados a partir de soluciones y suspensiones. Esta tcnica se puede utilizar tanto para frmacos resistentes al calor como para frmacos sensibles, para frmacos solubles o insolubles en agua y para polmeros hidroflicos o hidrofbicos [23]. Se trata de un proceso de una sola etapa que se puede escalar fcilmente, es de bajo coste, produce partculas de pequeo tamao y permite reformular las partculas en forma de suspensiones, cpsulas o comprimidos [24]. Las microesferas obtenidas tienen un tamao de una micra a varias decenas de micras y son adecuadas para su administracin por las vas oral, nasal o parenteral [25-28]. Los parmetros del proceso de atomizacin, como son el tipo de aguja, la velocidad de la bomba y el flujo de air comprimido, permiten modular el tamao de partcula. Las nanopartculas han suscitado un gran inters en los ltimos aos como sistemas de liberacin de frmacos, sobre todo para vas de administracin alternativas a la oral, como aquellas que requieren inyeccin o deposicin en superficies mucosas como la nasal. Las nanopartculas se definen como aquellas partculas cuyo tamao es inferior a 1m [29]. Ohya et al. (1994) [30] presentaron los primeros resultados de nanopartculas de quitosano para aplicaciones en liberacin de frmacos. Obtuvieron nanopartculas cargadas con 5-fluoroacilo por emulsin (w/o) y entrecruzadas con glutaraldehido. Este

23

Introduccin agente entrecuzante es txico, por lo que no es adecuado para la encapsulacin de frmacos. Posteriormente, Calvo et al. (1997) [31] describieron la preparacin de nanopartculas de quitosano por gelificacin ionotrpica del quitosano y el tripolifosfato sdico (de ahora en adelante TPP), nanopartculas biodegradables y biocompatibles preparadas por un proceso ms suave, sin altas temperaturas ni solventes orgnicos. Las nanopartculas de quitosano y TPP presentan una serie de interesantes caractersticas que las hacen ser vehculos prometedores para la liberacin de macromolculas, tales como protenas y ADN. Algunas de estas propiedades son: su obtencin por un proceso suave, su tamao ajustable dependiendo de los parmetros de obtencin y la modulacin de su carga positiva y su capacidad de asociacin a pptidos, protenas, oligonucletidos y plsmidos [16, 32]. La gelificacin inica entre el quitosano y el TPP ha sido utilizada en diversos estudios. Por ejemplo, Urrusuno et al. (1999) [33] estudiaron el efecto de nanopartculas de quitosano y TPP cargadas con insulina sobre la absorcin de insulina en conejos. Observaron que las nanopartculas liberaron el frmaco en su forma activa y que promovieron su absorcin. Tambin se ha estudiado en ratones el efecto sobre los niveles de inmunoglobulina G en suero e inmunoglobulina A en mucosa de formulaciones preparadas por este mtodo con el toxoide del ttanos, propiciando su aumento tras la administracin nasal [34]. Pan et al. (2002) [35] estudiaron la capacidad de nanopartculas de quitosano-TPP para promover la absorcin intestinal y la biodisponibilidad farmacolgica de insulina tras su administracin oral. Las nanopartculas as formadas mejoraron la absorcin de insulina en relacin con una solucin de quitosano. El tamao de las nanopartculas es uno de los factores que ms afectan y determinan la internalizacin de las mismas en mucosas y tejidos epiteliales y su transporte dentro de las clulas. La carga superficial de las nanopartculas determina sus propiedades mucoadhesivas y se ha descrito en la bibliografa que la habilidad de las nanopartculas para escapar a la accin de los endolisosomas y liberar el principio activo depende as mismo de dicha carga superficial [32]. Ambas caractersticas pueden ser controladas variando ciertas condiciones y variables del proceso de obtencin, como la concentracin de quitosano, la proporcin quitosano: TPP y el pH de la solucin. La

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Introduccin proporcin de quitosano:TPP es, adems, la responsable de la formacin de las nanopartculas [36]. 5 Pelculas de quitosano

El carcter filmognico del quitosano dio lugar a una de las primeras aplicaciones investigadas de este polmero natural. Es posible formar pelculas de quitosano con buenas propiedades fsicas y mecnicas a partir de sus disoluciones en cidos diluidos [37], tales como frmico, actico o propinico [38]. Las propiedades filmognicas del quitosano se deben a la formacin de enlaces de hidrgeno intermoleculares entre los grupos amino e hidroxilo de sus cadenas. A pH cido estos enlaces de hidrgeno se disocian debido a la protonacin de los grupos amino y se produce un rpido hinchamiento de la pelcula. Muzzarelli plante por primera vez en 1974 dos metodologas generales de trabajo para obtener pelculas de quitosano; la primera es mediante la evaporacin del cido empleado en la solucin de quitosano (mtodo de evaporacin de solvente), y la segunda se basa en la preparacin directa de quitosano a partir de la pelcula quitinosa de la jibia (molusco cefalpodo). Este ltimo mtodo [39] no result eficiente, pues las propiedades mecnicas de las pelculas obtenidas no fueron las idneas, por lo cual no es utilizado en la actualidad. Las posibles aplicaciones de las pelculas de quitosano se extienden a la medicina, la industria fotogrfica, la alimentacin y la cosmtica [40, 41]. En el campo de la farmacia, las pelculas de quitosano se han empleado para el recubrimiento de comprimidos [42] y como sistemas de liberacin controlada de frmacos [43]. El uso de pelculas de quitosano para el tratamiento de heridas cutneas presenta un gran inters puesto que se puede administrar el frmaco de forma localizada y sostenida en el sitio de accin. Se trata de un sistema ventajoso con respecto al uso de cremas, ya que stas deben ser aplicadas continuamente y son eliminadas con facilidad. Se ha descrito en la bibliografa el uso de pelculas de quitosano para el vendaje de heridas cutneas y pelculas con minociclina para el tratamiento de quemaduras en ratas [44]. Las pelculas de quitosano resultan efectivas porque protegen la herida, absorben el exudado, tienen accin antibacteriana [45, 46]y favorecen la cicatrizacin de heridas al estimular la proliferacin de fibroblastos [47, 48]. Por otro lado, tambin se han realizado estudios de citotoxicidad del quitosano en clulas cutneas como 25

Introduccin queratinocitos y fibroblastos, estudios importantes para este tipo de aplicacin, y se ha comprobado que no presenta citotoxicidad in vitro [49]. El carcter hemosttico del quitosano ha promovido su utilizacin en parches y vendajes hemostticos [50]. Prueba de ellos es la comercializacin de varios productos de este tipo a base de quitosano por parte de la empresa HemCon Medical Technologies INC (Oregon, EEUU). 5.1 Hinchamiento de las pelculas de quitosano

La hidratacin de los polmeros es uno de los factores que influyen en la liberacin de principios activos a travs de matrices polimricas. La hidrofilicidad en los polmeros est dada por el grado de hinchamiento, el cual se calcula a partir de la relacin entre el volumen de gel hinchado y el volumen de gel seco. Durante el proceso de hinchamiento se produce la incorporacin del lquido en el interior de la matriz, producto de la diferencia de potencial qumico del disolvente dentro y fuera de ella, provocando una dilatacin de la misma. Al proceso de dilatacin se opone una fuerza elstica-retrctil, la cual se opone a la penetracin del solvente [51]. El equilibrio de hinchamiento se alcanza cuando se igualan la fuerza de hinchamiento y la fuerza elstica-retrctil. En los hidrogeles inicos, la presencia de grupos cargados confiere caractersticas nicas al hinchamiento. Dichas caractersticas dependen del pH y la fuerza inica del medio. Peppas y Khare [52] determinaron como factores clave que afectan el hinchamiento: Grado de ionizacin. Equilibrio de ionizacin. Naturaleza de los contraiones. El modelo ms comn para estudiar la difusin es el propuesto en las leyes de Fick. En la primera ley se define que, en estado de equilibrio, el flujo del penetrante es proporcional al gradiente de concentracin [51]: J = - D (dc/dx) (I.1)

donde J representa el nmero de molculas de sustancia por segundo y por unidad de superficie perpendicular a la direccin de flujo, D es el coeficiente de difusin, y dc/dx es el gradiente de concentracin. 26

Introduccin Existen otros modelos de cinticas que describen el comportamiento del hinchamiento en los polmeros. Un ejemplo de los mismos es el planteado por Schott [53], donde se estudia la cintica de hinchamiento en pelculas de gelatina y celulosa. El autor llega a una ecuacin emprica que ajusta los valores obtenidos para todo el proceso de hinchamiento. Dicha ecuacin es:

t W

A Bt

(I.2)

donde W representa el hinchamiento a un tiempo t, A es la ordenada en el origen y B es el inverso del hinchamiento mximo. El hinchamiento se calcula por la ecuacin [54]:W M M0 M0

(I.3)

donde M es el peso de la pelcula a un tiempo t y M0 es el peso de la pelcula antes del proceso de hinchamiento. Para tiempos grandes Bt >>A, la pendiente B se define como el inverso del hinchamiento mximo

1 W

, mientras que para tiempos cortos Bt se puede despreciar y

en este caso A es el recproco de la velocidad inicial de hinchamiento A

1 dW dt

.0

A diferencia del comportamiento Fickiano, en que el hinchamiento est controlado por la difusin, en el modelo de Schott el hinchamiento esta controlado por la relajacin de las cadenas. Al representar los valores de

t en funcin de t, Schott demostr que el proceso de W

hinchamiento de estos materiales responda a una cintica de segundo orden respecto al hinchamiento remanente, representada por la siguiente ecuacin:

dW dt

K W

W

2

(I.4)

donde W es el hinchamiento a tiempo infinito, W el hinchamiento a tiempo t y K la constante del sistema. El proceso completo de transporte en una matriz polimrica depende principalmente de dos factores, los cuales estn gobernados por una amplia variedad de elementos relacionados con la composicin y las condiciones 27

Introduccin experimentales. Uno de ellos es la movilidad segmental de las cadenas polimricas y el otro est relacionado con la estructura y morfologa del polmero. En cuanto al primer factor, el movimiento difusivo depende de la movilidad relativa de las molculas del penetrante y de los segmentos de la cadena polimrica, su tamao, concentracin, la interaccin de los componentes, la temperatura y otros factores que afectan la movilidad segmental del polmero[51]. La estructura de la red polimrica es un parmetro determinante cuando se describe el transporte a travs de las pelculas, ya que la magnitud del espacio entre las cadenas polimricas va a determinar cmo se produce dicho transporte. 6 El quitosano como promotor de la absorcin de frmacos

El uso de promotores de absorcin de frmacos en las formulaciones farmacuticas est siendo objeto de estudio actualmente para mejorar la liberacin de frmacos a travs de las mucosas. Los promotores empleados suelen ser polmeros multifuncionales con propiedades mucoadhesivas, capaces de abrir transitoriamente las uniones intercelulares en el epitelio, que no muestren toxicidad y que no se absorban, siendo el quitosano uno de los polmeros ms estudiados [55]. Illum et al. (1994) [27] estudiaron el efecto de una solucin de quitosano de alto peso molecular sobre el transporte de insulina a travs de la mucosa nasal en ratas y ovejas. Sus resultados fueron prometedores y desde entonces se han realizado muchos estudios sobre el potencial del quitosano para mejorar la absorcin de frmacos peptdicos a travs de las mucosas. Por otro lado tambin se ha estudiado la administracin nasal de antgenos en soluciones de quitosano y quitosano en polvo y se ha visto que promueven la respuesta inmune del organismo. Illum et al. (2001) [56] evaluaron en humanos una vacuna nasal de la gripe basada en una solucin de quitosano. Ms del 70% de los voluntarios presentaron niveles protectores tras la administracin intranasal. El efecto positivo del quitosano sobre la liberacin de frmacos a travs de los epitelios se debe a una combinacin entre sus propiedades mucoadhesivas y su capacidad para abrir las uniones estrechas (del ingls tight junctions) entre clulas epiteliales, facilitando as el transporte de frmacos, sobre todo frmacos macromoleculares, a travs del epitelio.

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Introduccin Mucoadhesin La mucoadhesin aumenta el tiempo de permanencia y el contacto entre la membrana y la formulacin, lo cual permite una liberacin del principio activo de forma sostenida en el tiempo, reduciendo as la necesidad de varias dosis. Se ha descrito en la bibliografa que la administracin de principios activos combinados con el quitosano prolonga el tiempo de contacto entre el frmaco y la superficie de absorcin de las mucosas en general [57]. Las propiedades mucoadhesivas del quitosano se deben a la interaccin entre sus grupos amino protonados y la capa de mucus. ste est compuesto por una glicoprotena, la mucina, que tiene cargas negativas debido a la presencia de residuos de cido silico. La unin depende de la cantidad de cido silico presente en la mucina y del grado de desacetilacin del quitosano o grupos amino libres. He et al. (1998) [58] estudiaron la mucoadhesin de microesferas de quitosano en epitelio intestinal de rata y vieron que sta aument con el nmero de grupos amino libres debido a los monmeros de glucosamina del quitosano. EL pH tambin influye en las propiedades mucoadhesivas del quitosano ya que a pH cido el quitosano se encuentra cargado positivamente (pKa 6,5). Tambin se ha descrito que los quitosanos con cadenas polimricas ms largas penetran ms en la capa de mucina, por lo que un alto peso molecular del quitosano tambin puede favorecer la mucoadhesin [59, 60]. En definitiva, un quitosano de peso molecular alto y grado de desacetilacin alto favorece la mucoadhesin. Apertura de uniones estrechas entre clulas epiteliales Los epitelios actan como barreras que separan al organismo del medio externo, de forma que incluso el movimiento de iones a travs del epitelio est retringido, dando lugar a diferencias de potencial elctrico. Las molculas pueden atravesar el epitelio de varias formas: Por transporte pasivo o difusin, que se produce a favor de gradiente de concentracin o gradiente de carga elctrica y que, por lo tanto, no supone un gasto de energa para las clulas. La difusin pasiva puede producirse a travs de la membrana celular (transporte transcelular) o entre clulas adyacentes (transporte paracelular).

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Introduccin Por transporte activo, mecanismo que permite a la clula transportar sustancias a travs de su membrana desde regiones menos concentradas a otras ms concentradas. Es un proceso que requiere energa. Las molculas lipoflicas atraviesan fcilmente la membrana celular por difusin pasiva. Sin embargo, las molculas hidroflicas no pueden atravesar la membrana hidrofbica, por lo que tienen que atravesar el epitelio por la va paracelular. Esta va est restringida por la presencia de las uniones estrechas, estructuras multiproteicas dinmicas y complejas que constituyen una barrera semipermeable, que restringe la difusin dependiendo de la carga y el tamao del soluto. En el epitelio, las uniones estrechas se encuentran en la membrana plasmtica en clulas adyacentes (Figura I.2) y forman una estructura continua que rodea a las clulas completamente. Las uniones estrechas del epitelio forman una barrera funcional y morfolgica entre las superficies apical y basolateral de las clulas y regulan la difusin a travs de la va paracelular[61].Transporte paracelular

Zona apical

Unin estrecha Transporte paracelular

Membrana apical

Complejo de protenas de unin estrecha

Membrana basolateral

Espacio paracelular Membrana celular

Zona basal

Figura I.2. Representacin esquemtica de las uniones estrechas entre clulas epiteliales y el transporte paracelular.

La unin estrecha est formada por un grupo de protenas transmembrana y citoslicas que no slo interactan entre ellas, sino tambin con la membrana celular y el citoesqueleto de actina, de modo que forman un sistema que une a los componentes de las uniones estrechas con el citoesqueleto. Existen varios tipos de protenas distintas dentro del grupo que forma parte de las uniones estrechas[61]:

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Introduccin La ocludina es una de las protenas integrales de membrana que forma parte de las uniones estrechas. Por un lado proporciona la integridad estructural de la unin y por otro regula su funcin de barrera. Hay estudios que asocian las ocludinas a la regulacin de la difusin de pequeos marcadores hidroflicos, por lo que estn implicadas en la regulacin de la dinmica de las uniones. Las claudinas son las principales responsables del ensamblaje de las bandas formadas por las uniones estrechas y de la formacin de rutas selectivas de difusin paracelular de iones, ya que diferentes protenas de la familia de las claudinas permiten el paso de distintos tipos de iones. Se conocen tres protenas citoslicas, ZO-1, ZO-2 y ZO-3 (del latn Znula occludens, que significa unin estrecha), denominadas protenas asociadas a uniones estrechas, que interactan entre ellas y ponen en contacto la unin estrecha con el citoesqueleto. Adems se ha descrito que regulan la funcin de la unin estrecha junto con la ocludina. El estado de fosforilacin de estas protenas reguladoras se ha asociado con diferencias en la permeabilidad en modelos in vitro. Las mismas rutas de sealizacin cuyo efecto final es la fosforilacin de dichas protenas pueden tambin afectar al citoesqueleto de actina, asociado a la membrana plasmtica por un grupo de filamentos de actina situado debajo de la unin estrecha y por un anillo de filamentos a nivel de la unin de adhesin que tambin contiene miosina II. La disrupcin del citoesqueleto est asociada con la apertura de las uniones estrechas y, por tanto, al aumento de la permeabilidad paracelular [62]. Smith et al. (2005) [63] describieron que la habilidad del quitosano en solucin y en forma de nanopartculas para modular las uniones estrechas se puede explicar por las posibles interacciones del quitosano con receptores especficos de la superficie celular que conlleva la activacin de la transduccin de seales dependiente de la protena kinasa C (PKC). La activacin de la PKC adems induce la prdida de asociacin de las protenas de las uniones estrechas, la ZO-1 y la ocludina, en la membrana plasmtica y, por tanto, la prdida de las uniones estrechas. Ranaldi et al. (2002) [64] tambin demostraron que el tratamiento con quitosano alteraba la distribucin de F-actina en clulas Caco-2.

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Introduccin 7 Cultivos celulares como modelo epitelial

Los estudios con cultivos de clulas epiteliales permiten una fcil evaluacin de las propiedades de las uniones entre clulas y constituyen un mtodo muy utilizado en experimentos de transporte de principios activos a travs de monocapas celulares. Para llevar a cabo este tipo de experimentos, las clulas epiteliales se suelen sembrar en soportes permeables (transwells) (Figura I.3), que estn constitudos por una membrana y una cmara basal y otra apical. Sobre estos soportes, las clulas sembradas forman monocapas.Compartimento apical

Monocapa de clulas

Compartimento basolateral

Filtro microporoso

Figura I.3. Esquema de una monocapa celular en un soporte permeable.

Se realizan dos tipos de estudios en relacin con las uniones estrechas: la medida de corrientes elctricas y el estudio del flujo de compuestos marcados a travs de las monocapas. Como se ha comentado en el apartado anterior, las uniones estrechas limitan la difusin paracelular de molculas hidroflicas de forma selectiva, por carga y tamao. Cuando el movimiento de iones a travs de la monocapa est restringido debido al correcto funcionamiento de la unin estrecha, existe un gradiente de potencial elctrico a ambos lados de la misma. Por ello, la integridad y la madurez de las uniones estrechas se suele determinar midiendo la resistencia elctrica transepitelial (TEER), que es inversamente proporcional a la permeabilidad, empleando para ello un voltmetro cuyos electrodos pueden aplicarse directamente sobre los soportes permeables. Este estudio se realiza en medio de cultivo, por lo que refleja principalmente la permeabilidad al sodio. Las medidas de TEER se suelen realizar para hacer un seguimiento del crecimiento celular tras la siembra, ya que su valor aumenta a medida que se va formando la monocapa de clulas. As mismo, se realizan medidas de TEER durante los 32

Introduccin experimentos de permeabilidad de sustancias problema para observar cualquier cambio en la integridad de la monocapa. Los experimentos de permeabilidad paracelular se llevan a cabo con compuestos marcados con fluorescencia como dextranos, o bien con protenas que se pueden cuantificar con ensayos enzimticos. De esta forma es posible cuantificar la cantidad de compuesto que pasa de la parte apical a la basal en un perodo de tiempo concreto. Se pueden emplear marcadores de distintos pesos moleculares para evaluar la eficiencia de un determinado promotor de permeabilidad celular. Existen distintas lneas de clulas epiteliales que se utilizan como modelos para experimentos de permeabilidad y de evaluacin de la apertura de uniones estrechas. Clulas Calu-3 Los modelos celulares in vitro son muy utilizados con el fin de estudiar la deposicin y absorcin de frmacos tras su administracin por la va respiratoria, aunque existen otros mtodos como son estudios con modelos de perfusin en pulmn aislado y anlisis frmaco-cinticos in vivo. La lnea celular Calu-3 procede de adenocarcinoma de pulmn humano y se utiliza como modelo del epitelio de las vas respiratorias [65]. El lumen y el tejido submucoso de los conductos respiratorios constituyen el lugar de accin de una gran cantidad de frmacos, pero tambin constituye una barrera frente a la absorcin de dichos frmacos. Por tanto, el epitelio respiratorio es una membrana clave a estudiar, tanto por ser una barrera para el transporte de frmacos, como por ser un lugar donde los frmacos pueden ejercer su toxicidad. El epitelio vara entre un epitelio pseudo-estratificado en columnas, con tres tipos principales de clulas (ciliadas, basales y secretoras) interconectadas por uniones estrechas en los bronquios proximales, hasta un epitelio progresivamente ms cuboidal, no cicliado y localizado en los bronquiolos distales [65]. Una caracterstica importante del epitelio respiratorio es su diferenciacin en capas de clulas interconectadas por uniones estrechas intercelulares, que limitan el transporte paracelular de solutos, por lo que afecta a la absorcin y el metabolismo de frmacos. Otras caractersticas propias de este epitelio incluyen la produccin de mucus, la presencia de cilios apicales y la expresin de transportadores y sistemas metablicos. Se ha demostrado en varios estudios que algunas de estas caractersticas estn presentes en las clulas Calu-3, lo que sugiere la utilidad de esta lnea celular como modelo del epitelio respiratorio [66, 67].

33

Introduccin Las condiciones de cultivo tienen un efecto importante sobre la diferenciacin de las clulas epiteliales respiratorias y deben ser optimizadas para cada modelo celular individualmente. Se han descrito tanto cultivos sumergidos como cultivos con una interfase aire-lquido para clulas Calu-3 [68, 69]. La formacin de cilios est influenciada por el mtodo de incubacin, siendo ms cortos y gruesos en cultivos sumergidos[70]. Uno de los primeros trabajos sobre transporte de frmacos en clulas Calu-3 fue realizado por Cavet et al. (1997) [71]. Estudiaron el transporte de ciprofloxacino a travs de monocapas constituidas por estas clulas y observaron que el antibitico era transportado principalmente por va transcelular por difusin pasiva. Este resultado concidi con los resultados de estudios frmaco-cinticos en humanos. 8 Agentes entrecruzantes

Los sistemas de liberacin a base polmeros biodegradables necesitan ser entrecruzados para modular sus propiedades y mantener la estabilidad de la matriz y as cumplir el objetivo de liberar el frmaco a lo largo del tiempo deseado. El quitosano, como se ha comentado, se disuelve en condiciones cidas, lo que limita su aplicacin como sistema de liberacin. El entrecruzamiento puede reducir la solubilidad del quitosano en solventes acuosos, aumentar su resistencia a la degradacin qumica o biolgica y ayudar a controlar la liberacin de principios activos desde la matriz formada. El glutaraldehido es un agente entrecruzante muy utilizado, pero su capacidad de transformacin en especies reactivas txicas ha promovido la bsqueda de otros agentes y procedimientos de entrecruzamiento ms seguros, como son el tripolifosfato sdico y la genipina [72]. Tripolifosfato sdico El tripolifosfato sdico (TPP) es un agente entrecruzante no txico (reconocido como GRAS por la FDA) que es capaz de formar geles al unirse con el quitosano por interaccin inica. Desde que Bodmeier et al. (1989) [73] describiesen la preparacin de complejos quitosano/TPP, la formacin de complejos entre estas molculas con cargas opuestas para obtener formulaciones que controlan la liberacin de frmacos ha ganado inters puesto que se trata de un proceso muy simple. Concretamente, la formulacin de micro 34

Introduccin y nanopartculas por interaccin inica entre el quitosano y el tripolifosfato sdico es muy comn porque implica la mezcla de dos fases acuosas a temperatura ambiente sin el uso de solventes orgnicos. La reaccin que se produce entre el quitosano y el TPP ha sido descrita en la bibliografa [74, 75]. El TPP (Na5P3O10) disuelto en agua se disocia en iones tripolifosfricos y en OH y la solucin resultante tiene pH 9. Los pKa del TPP son: pK1=1, pK2=2, pK3=2,79, pK4=6,47 y pK5=9,24 [76]. Los aniones procedentes del TPP (P3O105-, HP3O104- y H2P3O103-) coexisten en solucin acuosa en funcin del pH. Dependiendo del valor de ste, predominarn unos u otros y de ello depender el tipo de interaccin que ocurra entre el TPP y el quitosano. Cuando el TPP se disuelve en agua, con pH 9, se disocia en iones P3O105- y, ste a su vez en HP3O104- y en iones OH-. Al aadir la solucin de este agente entrecruzante (pH 9) a una solucin de quitosano (pH cido), los iones P3O105- y HP3O104- compiten con los OH- por reaccionar con los grupos NH3+ del quitosano por entrecruzamiento inico, en el caso de los iones tripolifosfricos o por desprotonacin, en el caso de los OH- (Figura I.4). A pH 9 de la disolucin de TPP, por tanto, habr grupos amino neutralizados por los grupos hidroxilo y grupos amino entrecruzados inicamente. Sin embargo, si el pH del TPP es ajustado a un pH cido, slo existirn iones tripolifosfricos. El tipo de iones tripolifosfricos y su proporcin vendrn dados por el pH de la solucin. En este caso, el complejo quitosano-TPP se forma exclusivamente por entrecruzamiento inico entre los grupos NH3+ y los aniones de TPP.

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Introduccin

a) neutralizacin de los grupos amino

b) entrecruzamiento inico Figura I.4. Esquema de la reaccin entre el quitosano en solucin cida y los iones de TPP: Aneutralizacn de los grupos amino, B- entrecruzamiento inico[75].

Genipina La genipina (Figura I.5) es un compuesto de origen natural que se obtiene a partir del genipsido procedente del fruto de Genipa americana y Gardenia jasminoides. Estos frutos tienen propiedades antiinflamatorias, diurticas, colerticas y hemostticas[77]. Una propiedad destacable de la genipina es su capacidad de reaccionar espontneamente con aminas primarias, dando lugar a pigmentos azules. Se ha descrito su reaccin con materiales que contienen grupos amino, como el quitosano y algunos pptidos y protenas, dando lugar a estructuras entrecruzadas qumicamente. Dicha propiedad permite su utilizacin como agente entrecruzante en sistemas de liberacin de frmacos. 36

Introduccin Se ha comprobado que la genipina presenta una toxicidad 5000-10000 veces ms baja con respecto al glutaraldehido[78].O OCH 3

O OH CH2OHFigura I.5. Estructura qumica de la genipina.

Durante la reaccin de entrecruzamiento entre la genipina y el quitosano se producen dos reacciones separadas. La primera reaccin consiste en un ataque nucleoflico por parte de los grupos amino del quitosano sobre el carbono 3 de la genipina, que da lugar a la formacin de un compuesto heterocclico de la genipina unida al residuo de glucosamina en el quitosano. La segunda reaccin, ms lenta, consiste en una sustitucin nucleoflica del grupo ester de la genipina, liberando metanol y formndose un enlace amida con el quitosano. En la Figura I.6 se muestra un esquema del entrecruzamiento del quitosano con genipina. Simultneamente, se puede producir una polimerizacin entre molculas de genipina que ya estn unidas a los grupos amino del quitosano, lo cual puede dar lugar al entrecruzamiento del quitosano a travs de copolmeros de genipina [77].CH2 OH O H H H O OH H H OH O H O NH CH2 OH H OH H H NH2

N H H O H H O H O CH2 OH NH2 H HO H H H HO H HOH2 C

OH CH2 OH

Figura I.6. Esquema del entrecruzamiento del quitosano con la genipina.

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Introduccin La genipina ha sido utilizada en la obtencin de diversos sistemas de liberacin de frmacos tales como microcpsulas e hidrogeles. Mi et al. prepararon complejos

polielectrolitos con la membrana formada por alginato y quitosano y el interior de la cpsula compuesto por quitosano entrecruzado con genipina [79], as como cpsulas de quitosano entrecruzadas simultneamente por entrecruzamiento inico con TPP y qumico con genipina[80]. Barck & Butler (2005) emplearon distintos polmeros polianinicos, entre ellos el alginato, para formar complejos polielectrolitos con quitosano y entrecruzados con genipina[81]. Por otro lado, microcpsulas de alginatoquitosano con el interior compuesto de alginato y la membrana de quitosano con genipina fueron preparadas por Chen et al. (2006) para la encapsulacin de clulas vivas y otras aplicaciones en liberacin [82]. Hidrogeles de quitosano entrecruzados con genipina han sido preparados y caracterizados en diversos trabajos [83, 84]. Slo se han descrito en la biliografa algunos estudios sobre la preparacin, caracterizacin y liberacin in vitro de frmacos a partir de microesferas de quitosano entrecruzadas con genipina. Mi et al. (2001) prepararon microesferas de quitosano por un mtodo de dispersin agua en aceite, utilizando genipina como agente entrecruzante[85]. Yuan et al. (2007) obtuvieron microesferas de quitosano, albmina bovina y genipina[86]. 9 Frmacos empleados

Claritromicina La claritromicina es un antibitico perteneciente al grupo de los macrlidos, que ejerce su accin antibacteriana por interferir en la sntesis de protenas de las bacterias sensibles ligndose a la subunidad ribosomal 50S. Se trata de una sustancia bsica de carcter cristalino, de color blanco. Su masa molecular es 747 g/mol. En la Figura I.7 se presenta la estructura molecular de la claritromicina.

38

Introduccin

Figura I.7. Estructura molecular de Claritromicina.

La claritromicina es bactericida para Helicobacter pylori, presente en la mucosa gstrica de la mayora de los pacientes con lcera duodenal o gastritis. La infeccin por Helicobacter pylori se considera uno de los principales factores patognicos responsables de la lcera gstrica. La terapia con antibiticos presenta ciertos inconvenientes, como la necesidad de una dosis frecuente para mantener la concentracin de frmaco en plasma al nivel teraputico, el bajo cumplimiento por parte del paciente, infecciones causadas por microorganismos resistentes y efectos secundarios en el tracto gastrointestinal [87]. La ineficacia descrita en el tratamiento de la infeccin por H. pylori puede ser debida a la baja estabilidad de los antibiticos en el medio cido del estmago, a la baja absorcin a travs de la capa de mucus, o a la administracin de una dosis sub-teraputica[60]. La liberacin especfica de claritromicina en el estmago a travs de un sistema de encapsulacin basado en quitosano podra ser un tratamiento adecuado frente a H.pylori. El quitosano se hincha en medio cido, es un sistema adecuado para la liberacin controlada de frmacos, presenta propiedades anticidas, disminuye la

irritacin en el estmago causada por la administracin de frmacos[60] y ejerce actividad antibacteriana debido a la unin de los grupos catinicos del quitosano a las molculas aninicas de la superficie externa de la membrana bacteriana [88]. Adems, como se ha explicado anteriormente, es bioadhesivo y acta sobre las uniones estrechas entre clulas epiteliales, por lo que aumenta el tiempo de residencia en el tejido y promueve la absorcin del frmaco a travs de las mucosas. Por otro lado, la

39

Introduccin microencapsulacin de claritromicina en una matriz polimrica la protegera frente a la degradacin a pH cido. La claritromicina es soluble a pH cido y su solubilidad disminuye al aumentar el pH, por lo que es ms soluble y se absorbe mejor en el estmago que en el intestino. Se han descrito en la bibliografa otros estudios de encapsulacin de claritromicina. Majithiya y Murthy (2005) [60]obtuvieron microesferas de quitosano con claritromicina por emulsificacin y entrecruzamiento con glutaraldehido. Zgoulli et al. (1999) [24] prepararon microesferas cargadas con eritromicina y claritromicina por atomizacin para enmascarar su sabor, aumentar la biodisponibilidad de estos antibiticos y mejorar su estabilidad. Hidrocloruro de tramadol El hidrocloruro de tramadol (Figura I.8) es un opiceo sinttico del grupo de los aminociclohexanoles (clorhidrato de () cis-2- [(dimetillamino)metil]-1-(3-metoxifenil) ciclohexanol) con accin analgsica a nivel central. El tramadol es un anlogo sinttico de la codena, con una menor afinidad que sta hacia los receptores opiceos. Su vida media es de 5,5 horas, y la dosis adecuada suele ser de 50-100mg cada 4-6 horas. La frmula emprica es C16H25NO2 y su masa molecular 263g/mol.

Figura I.8. Estructura molecular del hidrocloruro de tramadol.

El tramadol es un analgsico opiceo con un mecanismo dual de accin. Es una mezcla racmica de los ismeros trans, observndose importantes diferencias desde el punto de vista bioqumico, farmacolgico y metablico entre ambos enantimeros. El tramadol tiene un potencial mucho menor que otros opiceos para inducir depresin respiratoria y dependencia, pero ambos efectos adversos pueden tener lugar. Para disminuir la frecuencia de administracin, sera deseable administrarlo a travs de una forma farmacutica de accin retardada.

40

Introduccin Hidrocloruro de ciprofloxacino El hidrocloruro de ciprofloxacino (Figura I.9) es un antibitico del grupo de las fluoroquinolonas. Se utiliza en casos de pneumona, infecciones cutneas y es uno de los antibiticos ms utlizados en oftalmologa [89]. Su peso molecular es de 331,35g/mol. Es activo frente a un amplio espectro de bacterias Gram-negativas aerobias, incluyendo patgenos entricos, Pseudomonas y Serratia marcescens, aunque ya han empezado a aparecer cepas resistentes. Igualmente es activo frente a bacterias Gram-positivas, aunque tambin se han detectado resistencias en algunas cepas de Staphyloccocus aureus y Pneumococos. No es activo frente a microorganismos anaerobios. Se utiliza ocasionalmente, en combinacin con otros antibacterianos, en el tratamiento de las infecciones por micobacterias. Los efectos antibacterianos del hidrocloruro de ciprofloxacino se deben a la inhibicin de la topoisomerasa IV y la DNA-girasa bacterianas. Estas topoisomerasas alteran el DNA introduciendo pliegues superhelicoidales en el DNA de doble cadena, facilitando el desenrollado de las cadenas. La DNA-girasa tiene dos subunidades codificadas por el gen gyrA, y actuan rompiendo las cadenas del cromosoma bacteriano y luego pegndolas una vez que se ha formado la superhlice. Las quinolonas inhiben estas subunidades impidiendo la replicacin y la transcripcin del DNA bacteriano. Las clulas humanas y de los mamferos contienen una topoisomerasa que acta de una forma parecida a la DNA-girasa bacteriana, pero esta enzima no es afectada por las concentraciones bactericidas del hidrocloruro de ciprofloxacino. Este principio activo puede producir efectos secundarios cuando se administra por va oral, como dolor abdominal, nauseas, dolor de cabeza, entre otros. Una forma alternativa de administracin, como la va tpica podra minimizar estos efectos secundarios [90].

NH N HO F O O N

Figura I.9. Estructura molecular del hidrocloruro de ciprofloxacino

41

Introduccin 10 Modelos matemticos

Los estudios de disolucin/liberacin in vitro constituyen un eslabn importante dentro de la cadena del desarrollo de un nuevo medicamento. Bajo ciertas condiciones puede servir para aportar criterios de biodisponibilidad y bioequivalencia. Un objetivo fundamental a la hora de desarrollar nuevos sistemas de liberacin controlada, es poder predecir los niveles plasmticos que alcanzar el frmaco una vez administrado. De esa forma, el desarrollo de los procesos de obtencin de nuevos medicamentos puede ser acelerado, de modo que stos pueden ponerse en el mercado con mayor brevedad y a menor precio. Por este motivo se han desarrollado numerosos modelos matemticos que permiten predecir las cinticas de disolucin- liberacin de los principios activos incluidos en los sistemas de liberacin controlada, y por tanto su biodisponibilidad in vivo. Estos modelos permiten interpretar los resultados cuantitativos de un ensayo de liberacin in vitro a travs de una ecuacin que relaciona varios parmetros [91]. Para comparar diferentes perfiles de liberacin se pueden emplear mtodos matemticos (mtodos modelo dependiente) y mtodos estadsticos (mtodos modelo independiente), que incluyen el anlisis de la varianza, de una o dos vas (ANOVA). Los modelos matemticos facilitan el anlisis cuantitativo de los resultados obtenidos en los ensayos de liberacin/disolucin, y describen los resultados de liberacin en funcin de alguna de las caractersticas o variables de la formulacin empleada [91]. Cintica de orden cero Las formas farmacuticas que presentan esta cintica liberan la misma cantidad de frmaco por unidad de tiempo. Es el mecanismo de liberacin ideal cuando se quiere conseguir una accin farmacolgica prolongada. La liberacin del frmaco desde formas farmacuticas que no se disgregan y que liberan el principio activo lentamente (asumiendo que el rea no cambia y que no se alcanzan condiciones de equilibrio), puede ser representada por la siguiente ecuacin: W0-Wt = Kt (I.5)

donde W0 es la cantidad inicial de frmaco en la forma farmacutica, Wt es la cantidad de frmaco presente en la misma a tiempo t y K la constante de proporcionalidad.

42

Introduccin Si esta ecuacin se divide entre W0 y se simplifica, se obtiene: ft = K 0 t (I.6)

donde ft

1 (Wt / W0 ) y f t representa la fraccin de frmaco liberado a tiempo t y K0

la constante de liberacin aparente o constante de orden cero. De esta forma, una grfica de la fraccin de frmaco liberado en funcin del tiempo ser lineal si se cumplen las condiciones anteriores. Otra forma de expresar este modelo se refleja en la siguiente ecuacin: Qt = Q0 + K0t (I.7)

donde Qt es la cantidad de frmaco liberado a tiempo t, Q0 es la cantidad inicial de frmaco en solucin, que generalmente es cero y K0 es la constante de velocidad en la cintica de orden cero. Cintica de primer orden La aplicacin de este modelo al estudio de la liberacin de frmacos fue propuesto por primera vez por Gibaldi y Feldman en 1967 [92]. La cintica de orden uno presenta la siguiente ecuacin de velocidad: Qt = Q0 e -K1t ln Qt= -K1t+ ln Q0 o en logaritmos decimales: log Qt = -(K1t/2,303) +log Q0 (I.10) (I.8) (I.9)

donde Qt es la cantidad de frmaco liberado a tiempo t, Q0 es la cantidad inicial de frmaco en la solucin y K1 es la constante de primer orden. De esta forma, la representacin del logaritmo de la cantidad de frmaco disuelto frente al tiempo transcurrido da lugar a una recta en los procesos con cintica de primer orden. Las formas farmacuticas que siguen este perfil de disolucin suelen ser matrices porosas que contienen principios activos hidrosolubles. Modelo de Higuchi Higuchi (1963) desarroll varios modelos tericos para estudiar la liberacin de

frmacos solubles y poco solubles incorporados en matrices slidas o semi-slidas[93]. 43

Introduccin Este modelo describe la liberacin del frmaco como un proceso de difusin a travs de la matriz de polmero, siempre y cuando se mantengan las condiciones sumidero (del ingls sink conditions), es decir, que se garantice la solubilidad del frmaco en todo momento durante la liberacin. Esta difusin est basada en la ley de Fick, que depende de la raz cuadrada del tiempo. Generalmente se emplea lo que se conoce como ecuacin simplificada de Higuchi: Q = KH t1/2 (I.11)

donde Q es la cantidad de frmaco liberado y KH es la constante de disolucin de Higuchi. Modelo de Hixson- Crowell o de la raz cbica Hixson and Crowell (1931) [94], partiendo de la base de que el rea regular de la partcula es proporcional a la raz cbica de su volumen propusieron la siguiente ecuacin para describir este modelo: W01/3- Wt1/3= Kst (I.12)

donde W0 es la cantidad inicial de frmaco en la forma farmacutica, Wt es la cantidad de frmaco que queda en la forma farmacutica a tiempo t y Ks es una constante que incorpora la relacin superficie-volumen. Dividiendo la ecuacin anterior entre W01/3 y simplificando: (1 f t) 1/3 = 1- K t donde f t (I.13)

1 (Wt / W0 ) y representa la fraccin de frmaco disuelto a tiempo t y K es la

constante de liberacin. La grfica de la raz cbica de la fraccin de frmaco no liberada en funcin del tiempo ser lineal si la forma farmacutica disminuye de tamao proporcionalmente en el tiempo. Cuando se utiliza este modelo, se asume que la velocidad de liberacin est condicionada por la velocidad de disolucin de las partculas de frmaco y no por la difusin que pueda ocurrir a travs de la matriz polimrica. Modelo de Korsmeyer-Peppas Korsmeyer et al. (1983) [95] desarrollaron un modelo semiemprico sencillo que relaciona la liberacin de frmaco con el tiempo a travs de una ecuacin exponencial. Estos autores plantearon que, en ocasiones, el mecanismo de difusin se desva de la 44

Introduccin difusin Fickiana, siguiendo un comportamiento anmalo o no Fickiano. Es un modelo especialmente til cuando se desconoce el mecanismo de liberacin o cuando sta ocurre por ms de un mecanismo. Mt/M= Ktn (I.14) (I.15)

Log Mt/M= Log K+ n Log t

donde Mt es cantidad de frmaco liberado a tiempo t, M es la cantidad de frmaco que se liberara a tiempo infinito (por tanto, Mt/M es la fraccin de frmaco liberado a tiempo t), K es la constante del sistema y n es el exponente difusional. La representacin del Log Mt/M en funcin del Log t dar lugar a una lnea recta si el sistema se ajusta a este modelo. Segn los valores que tome n se pueden definir distintos mecanismos de transporte [96]. En la Tabla I.2 se muestran los posibles mecanismos que se pueden observar en la liberacin controlada de un principio activo utilizando una pelcula polimrica como sistema regulador. Cuando n = 0,5 se trata de una difusin Fickiana y la constante k puede expresarse como:

k

4

Di2

1/ 2

(I.16)

donde Di es el coeficiente de difusin del frmaco desde el polmero y el espesor de la matriz de polmero. Valores de n > 0,5 se asocian a un mecanismo de difusin anmalo (no Fickiano). En particular, cuando n = 1, se trata de la cintica de orden cero, que Peppas considera un caso lmite de transporte no Fickiano, denominndolo Transporte Caso II. En este caso, el transporte del soluto se realiza a velocidad constante debido a que el frente de hinchamiento del polmero avanza de forma constante. Este tipo de transporte est controlado por la relajacin de las cadenas del polmero. Cuando n < 0,5 < 1, el proceso est dominado por procesos de difusin y relajacin de las cadenas polimricas. Valores de n > 1 aparecen usualmente cuando los tiempos de liberacin son muy elevados y a este tipo de transporte lo denominan Transporte Supercaso II. Por ltimo, valores de n < 0,5 se asocian a la presencia de poros en la matriz polimrica y a la consiguiente difusin simultnea a travs de la matriz hinchada y a travs de los poros llenos de medio de disolucin. 45

IntroduccinTabla I.2. Resumen de los mecanismos de transporte de solutos dependiendo del exponente difusional n.

Exponente de liberacin (n) 0,5 0,5 n 1 n>1 1

Mecanismo de transporte del frmaco Difusin Fickiana Transporte anmalo Transporte Caso II Transporte Supercaso II

En la Tabla I.3 se muestran los valores del exponente difusional (n) para matrices de liberacin con diferentes geometras y mecanismos de liberacin.Tabla I.3. Valores del exponente difusional en el modelo emprico de Korsmeyer-Peppas para sistemas de distinta geometra.

Geometra de la matriz Lmina Cilindro Esfera

Sistema controlado por difusin (Caso I) n = 0,5 n = 0,45 n = 0,43

Sistema controlado por hinchamiento (Caso II) n=1 n = 0,89 n = 0,85

Cuando el hidrogel est inicialmente hinchado y contiene un frmaco soluble, las ecuaciones que se utilizan en la cintica de liberacin son las mostradas en la Tabla I.4, las cuales dependen de la geometra del hidrogel [97].Tabla I.4. Soluciones aproximadas para la liberacin difusional de frmacos a partir de matrices polimricas [97].

Geometra Pelculas r = espesor Cilindros r = radio Esferas r = radio

Estados inicialesMt MMt M 4

Estados finales1/ 2

4Dt r2

Dt r21/ 2

Mt M

1

8

2

exp 2

Dt

r

2

Dt r2

Mt M

1

4 exp 2 2.405

2.405 Dt r22

2

Mt M

Dt 6 2 r

1/ 2

3

Dt r2

Mt M

1

6

exp 2

Dt

r

2

46

Introduccin Modelo de Baker- Lonsdale Este modelo fue desarrollado por Baker and Lonsdale (1974) [98] a partir del modelo de Higuchi. Describe la liberacin de frmaco desde una matriz esfrica y viene dado por la siguiente expresin:

ft

3 1 2

Mt 1 M

2/3

Mt M

kt (I.17)

donde Mt es la cantidad de frmaco liberada a tiempo t, M es la cantidad de frmaco que se liberara a tiempo infinito (por tanto, Mt/M es la fraccin de frmaco liberado a tiempo t) y k la constante de liberacin y pendiente de la recta. Esta ecuacin se ha empleado para la linealizacin de perfiles de liberacin de microcpsulas y microesferas[99].

47

Materiales y Mtodos

II. MATERIALES Y MTODOS

49

Materiales y Mtodos

1

Materiales

En este trabajo se han empleado los siguientes reactivos: Polmeros Hidrocloruro de quitosano (HCS) (Protasan UP Cl 113 y 213), suministrado por Novamatrix (Noruega), de 150 y 400 kDa de peso molecular respectivamente y un grado de desacetilacin del 86% en ambos casos. Quitosano (CS), suministrado por Primex (Islandia), con un peso molecular de 644kDa y un grado de desacetilacin del 90%. Principios activos Claritromicina, suministrada por el Laboratorio Farmacutico Vegal Farmacutica S.L. (Madrid, Espaa). Hidrocloruro de tramadol, suministrado por el Laboratorio Farmacutico Vegal Farmacutica S.L. (Madrid, Espaa). Hidrocloruro de ciprofloxacino, suministrado por Elfar Drag S.L. (Madrid, Espaa) Agentes entrecruzantes Tripolifosfato sdico (TPP), suministrado por Sigma- Aldrich (Espaa) Genipina, suministrada por Challenge Bioproducts Co., Ltd (Taiwan). Clulas y reactivos para los ensayos celulares Las clulas Calu-3 y el medio de cultivo EMEM (Eagle's Minimal Essential Medium) se obtuvieron de la ATCC (del ingls American Type Culture Collection) LGC Promochem. La solucin salina equilibrada de Hank (HBSS), el surfactante Triton-X 100 y el kit para el ensayo LDH (lactato deshidrogenasa), comercialmente conocido como TOX7, fueron suministrados por Sigma Chemical Company (Poole, UK). El reactivo para MTS (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2Htetrazolio),

comercialmente conocido como CellTiter 96 AQueous One Solution Assay, fue suministrado por Promega (USA).

51

Materiales y Mtodos 2 Obtencin de microesferas de hidrocloruro de quitosano

Se prepararon soluciones de hidrocloruro de quitosano en agua destilada en diferentes concentraciones segn el caso (0,1-1% p/v). A continuacin se aadi el frmaco correspondiente, un 30% p/p para las microesferas de tramadol y un 50% p/p para las de claritromicina. Las soluciones resultantes se atomizaron en un Bchi Mini Spray- Dryer B- 290 (Bchi Labortechnik AG, Flawil, Suiza), representado en la Figura II.1. Se utilizaron las siguientes condiciones: flujo de aire 473 NL h-1, flujo de pulverizacin 32 m3 h-1 y temperatura de entrada (inlet) 160C. Las microesferas resultantes se recogieron del colector y fueron almacenadas en un desecador Pyrex (Afora S.A., Barcelona, Espaa) a temperatura ambiente. En el proceso de atomizacin, el lquido llega a la aguja gracias a la bomba peristltica y la fuerza del aire comprimido lo separa en gotas, que pasan a una cmara donde es evaporado el solvente. El solvente de las gotas es retirado debido a la energa calorfica producida por el atomizador. Se obtiene una eficiencia ptima de atomizacin cuando existe un equilibrio entre la energa de entrada y la cantidad de energa necesaria, que depende de la muestra que se atomice. Puesto que el punto de ebullicin del agua es 100C, la temperatura de entrada del atomizador debe ser mayor. Se ha descrito en la bibliografa que la temperatura de entrada ptima para la preparacin de microesferas a partir de soluciones de quitosano es de 160C. A temperaturas inferiores o velocidades de flujo altas, el solvente de las gotculas no se evapora completamente [25-28]. En el caso de las microesferas entrecruzadas, antes del proceso de atomizacin, se aadi adems el agente entrecruzante correspondiente. Para las microesferas con claritromicina se emple TPP o genipina. Se utilizaron dos concentraciones de TPP (0,1 y 0,2% p/v) en una proporcin de volumen 10:3 y a valores de pH 4 y 9. La genipina se aadi en una concentracin de 0,5 (0,02% p/v) y 1mM (0,04% p/v). Las soluciones de hidrocloruro de quitosano 0,5 y 1% (p/v) entrecruzadas con TPP a pH 9 no se pudieron atomizar puesto que se formaron agregados al aadir el TPP. Las microesferas con hidrocloruro de tramadol fueron sometidas a un entrecruzamiento con varias concentraciones de genipina (2-20mM), para lo cual se aadi la solucin de genipina y se someti la mezcla resultante a dos tiempos de entrecruzamiento (5 y 15 horas) a 50C.

52

Materiales y Mtodos

Figura II.1. Atomizador Bchi Mini Spray- Dryer B- 290.

El rendimiento de atomizacin (RA) se calcul a partir de la cantidad total de slidos iniciales en la solucin. Para determinar la eficiencia de encapsulacin (EE) de las microesferas de tramadol y claritromicina obtenidas por atomizacin, se tomaron 5mg de microesferas y se disolvieron en 20mL de HCl 0,1N durante 24 horas. De ah se tom una alcuota que se centrifug a 20000rpm (Mikro 12-24, Hettich Zentrifugen, Andreas Hettich GmbH & Co KG, Tuttlingen, Alemania) y se determin la cantidad de frmaco presente por espectrofotometra UV-VIS (GBC UV-VIS 920) en el caso del tramadol, y por cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC) en el caso de la claritromicina. Todas las medidas se realizaron por triplicado. 3 Obtencin de pelculas de quitosano

Las pelculas de quitosano cargadas con hidrocloruro de ciprofloxacino se obtuvieron por el mtodo de evaporacin del solvente. Se disolvi el quitosano al 3% (p/v) en cido actico 1% (v/v) y se aadi el frmaco en un 30% (p/p) respecto al polmero. Se verti una cantidad determinada de la solucin en una placa Petri modelo y se dej secar a 37C durante 48 horas. El entrecruzamiento entre el quitosano y el agente entrecruzante se llev a cabo por inmersin de las pelculas en soluciones acuosas de TPP (100mL) a 4C a diferentes concentraciones (0, 1, 2,5 y 5% p/v) y tiempos de entrecruzamiento (0, 0,5, 1 y 4 horas). Finalmente se extrajo la pelcula de la solucin de TPP y se sec en estufa a 37C, durante 24 horas. La EE del hidrocloruro de ciprofloxacino se determin midiendo por espectrofotometra UV-VIS la cantidad de frmaco que qued en las soluciones de TPP tras la reaccin de entrecruzamiento. La EE se calcul utilizando la siguiente expresin. 53

Materiales y Mtodos EE (%) = [(Q total Q) / Q total] 100 (II.1)

donde Qtotal es la cantidad tericamente encapsulada de frmaco y Q la cantidad de frmaco detectada en la solucin de TPP tras el entrecruzamiento. 4 Obtencin de nanopartculas de hidrocloruro de quitosano

Las nanopartculas se prepararon por gelificacin ionotrpica del TPP y el hidrocloruro de quitosano con modificaciones del mtodo propuesto por Fernandez-Urrusuno et al. [33]. Inicialmente se determin la concentracin adecuada de hidrocloruro de quitosano y TPP para la formacin de las nanopartculas. Para ello, se gotearon 1,8mL de una solucin de TPP 0,084% (p/v) sobre soluciones de 4mL de hidrocloruro de quitosano de diferentes concentraciones (0,05-0,2% p/v) en agua destilada, con agitacin. Las suspensiones resultantes se caracterizaron visualmente como solucin transparente, suspensin opalescente (nanopartculas) o agregados. La formacin de nanopartculas se confirm por Dynamic Light Scattering (DLS), con un detector Viscotek. Se determin el pH de la solucin de TPP que dio lugar a nanopartculas de menor tamao, utilizando soluciones de TPP a tres valores de pH distintos (9; 5,5 y 4). Para aislar las nanopartculas del posible quitosano libre se centrifugaron las suspensiones a 13000 rpm durante 1 hora y se resuspendieron las nanopartculas en HBSS (pH 6) para los estudios en cultivos celulares. 5 5.1 Caracterizacin Estudios de morfologa

Las imgenes de microscopa electrnica de barrido (SEM) presentadas en esta memoria se obtuvieron en el Centro de Microscopa de la Universidad Complutense de Madrid. Las muestras de microesferas, se adhirieron con una cinta de doble haz adhesivo sobre los portamuestras cilndricos. Para observar los cortes transversales de las pelculas de quitosano, se obtuvieron fragmentos de las mismas mediante criofractura con nitrgeno lquido y se montaron sobre los portamuestras.

54

Materiales y Mtodos Las muestras se metalizaron con Au/Pd utilizando un evaporador a vaco (Balzers SDC 004 Sputter coater, Oerlikon Corporate Pfffikon, Switzerland) a una presin de vaco de 0,1mbar y a 25mA, durante 3 minutos. Se emple un microscopio JEOL JSM-6400 (JEOL, Tokyo, Japan), el cual trabaj a un voltaje de aceleracin de electrones de 5kV. 5.2 Determinacin de la caraga elctrica superficial de microesferas y

nanopartculas El potencial zeta de las microesferas se determin por espectroscopia de correlacin fotnica empleando un Malvern Zetasizer Nanoseries Nano ZS (Malvern Instruments, Herrenberg, Alemania). Las muestras se prepararon de la siguiente forma: se suspendieron 25mg de microesferas en 2,5mL de etanol, se tom 0,5mL de la suspensin y se diluy hasta 50mL con una solucin de KCl 10-3M. La medida del potencial zeta se realiz utilizando cubetas desechables DTS 1060 (Malvern Instruments, Herrenberg, Alemania), con un voltaje efectivo de 150V, a 25C. El potencial zeta de las nanopartculas y de la solucin de hidrocloruro de quitosano utilizada para obtenerlas se determin en un Zetasizer 2000 (Malvern instruments). Los datos de movilidad electrofortica (UE) fueron automticamente traducidos a valores de potencial zeta, utilizando la ecuacin de Henry [100].

UE

2 3

f(

a)

(II.2) la viscosidad y f( .a) la funcin

donde es la constante dielctrica, el potencial zeta, de Henry.

La unidad de , distancia de Debye, es la recproca de la distancia, y generalmente se toma-1

como el grosor de la doble capa elctrica