APLIKASI MARKA MOLEKULER DALAM PENGEMBANGAN …peripi.org/wp-content/uploads/2019/02/makalah-61-halaman-552-565-OK.pdftomat terhadap layu bakteri diketahui dikontrol oleh beberapa

552

Prosiding Seminar Nasional PERIPI 2017 Bogor, 3 Oktober 2017

Aplikasi Marka Molekuler dalam Pengembangan Galur Tomat Dataran Tinggi Tahan Layu Bakteri dan Virus Gemini Halaman 552-565

APLIKASI MARKA MOLEKULER DALAM PENGEMBANGAN GALUR TOMAT DATARAN TINGGI TAHAN LAYU BAKTERI DAN VIRUS GEMINI

Hari Perdanaputra1, Boy Valenza Damiri2, Rahman Awaludin1, Asteria Pitasari1, Sandi Arya Rumintang2, Masrukhin3, Nugraheni Vita Rachma1, Muryanto2,

Ramadhani Safitri3, dan Asep Harpenas4*

1Departemen Breeding A, Divisi R&D, PT East West Seed Indonesia (PT EWINDO) 2Departemen Lab. Biotechnology, Divisi R&D, PT East West Seed Indonesia

(PT EWINDO) 3Departemen Lab. Phytopathology, Divisi R&D, PT East West Seed Indonesia

(PT EWINDO) 4Divisi R&D, PT East West Seed Indonesia (PT EWINDO) *Penulis untuk korespondensi: [email protected]

ABSTRAK

Gen-gen ketahanan terhadap layu bakteri dan virus Gemini dapat diperoleh dari tomat liar yang umumnya memiliki karakter agronomi yang kurang diminati konsumen. Metode MABC (Marker-Assisted Backcrossing) dapat mempercepat proses seleksi tanaman target yang memiliki karakter tertentu menggunakan marka molekuler. Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan galur tomat dataran tinggi tahan layu bakteri dan virus Gemini. Penelitian dilakukan di Kebun Percobaan Cisarua PT EWINDO dari tahun 2014 hingga 2016 menggunakan dua nomor aksesi, yaitu EWINDO#68 (tetua recurrent) dan EWINDO#24 (tetua donor). Marka molekuler yang digunakan merupakan marka SNP untuk gen ketahanan layu bakteri (Bw-12), gen ketahanan virus Gemini (Ty-2, Ty-3, dan Ty-5), serta marka lainnya. Amplifikasi sekuens DNA menggunakan mesin PCR dan analisis marka molekuler menggunakan metode HRM (High Resolution Melting) yang dapat mendeteksi perbedaan satu basa nitrogen pada sekuens DNA berdasarkan suhu denaturasinya. Field screening dilakukan untuk mengetahui tingkat ketahanan tanaman terhadap penyakit. Tingkat serangan penyakit dinilai berdasarkan dua metode, yaitu tingkat kejadian penyakit untuk layu bakteri serta tingkat keparahan penyakit untuk virus Gemini. Deteksi keberadaan gen ketahanan sudah dapat dilakukan pada 30 hari setelah semai. Populasi BC1 yang lolos seleksi sebanyak 3% untuk selanjutnya disilangkan ke tetua recurrent-nya menjadi BC2. Populasi BC2 yang lolos seleksi sebanyak 42% untuk selanjutnya disilangkan ke tetua recurrent-nya menjadi BC3. Populasi BC3 yang lolos seleksi sebanyak 26% untuk selanjutnya dimurnikan sampai generasi ke-4 menghasilkan 16 galur yang memiliki ketahanan layu bakteri (skor ketahanan 100%) dan virus Gemini (skor ketahanan 100%).

Kata kunci: Gen, MABC, SNP, Solanum lycopersicum

PENDAHULUAN

Tomat (Solanum lycopersicum Mill.) merupakan salah satu sayuran penting yang ditanam dan dikonsumsi secara luas di dunia (Prakasha et. al., 2016). Penyakit utama tomat di Indonesia adalah layu bakteri dan virus gemini. Salah

553

Aplikasi Marka Molekuler dalam Pengembangan Galur Tomat Dataran Tinggi Tahan

Layu Bakteri dan Virus Gemini Halaman 552-565


satu cara untuk mengurangi masalah tersebut adalah dengan menggunakan varietas yang tahan terhadap penyakit layu bakteri dan gemini virus.

Ralstonia solanacearum merupakan bakteri penyebab penyakit layu bakteri. Menurut Mansfield et al. (2012), bakteri ini menjadi bakteri patogen nomor dua paling merugikan setelah Pseudomonas syringe. Secara umum R. solanacearum yang menyerang tanaman solanaceae adalah R. solanacearum ras I. Ketahanan tomat terhadap layu bakteri diketahui dikontrol oleh beberapa QTL (Quantitative Trait Loci). QTL di kromosom 6 memainkan peranan penting dalam mengatur ketahanan dan lokus pada kromosom 6 yang spesifik terhadap strain tertentu ditemukan dari Hawaii 7996 (Wang et. al., 2000). Bwr-12 mempunyai pengaruh yang besar dan ini adalah kontributor utama terhadap kestabilan ketahanan pada “Hawaii 7996” (Wang et. al., 2012).

Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) merupakan jenis geminivirus (famili Geminiviridae, genus Begomovirus) yang menyerang tomat (Czosnek & Laterrot, 1997). TYLCV ditransmisikan oleh kutu putih (Bemisia tabaci). Virus ini menyebabkan kehilangan hasil yang serius pada produksi tomat (S. lycopersicum L.) di banyak Negara tropis dan subtropis di dunia (Ji et al., 2007a; Cohen & Lapidot, 2007; Yang et al., 2014). Tomat budidaya rentan terhadap infeksi TYLCV, sehingga upaya pemuliaan diarahkan ke pemindahan gen-gen ketahanan dari kerabat tomat liar. Spesies-spesies tanaman yang sudah di demonstrasikan tahan termasuk S. pimpinellifolium, S. peruvianum, S. chilense, S. habrochaites, and S. cheesmaniae (Pico et al., 1996; Scott, 2007; Vidavski, 2007; Ji et al., 2007b; Yang et al., 2014). Sejauh ini, sebanyak lima lokus ketahanan sudah dipetakan, sebagai contoh: gen-gen dominan termasuk Ty-1, Ty-2, Ty-3, Ty-4, dan gen resesif ty-5 (Zamir et al., 1994; Hanson et al., 2000; Ji et al., 2007a, 2009b; Anbinder et al., 2009, Yanget al., 2014). Ty-1 dan Ty-3 berasal dari S. chilense serta dipetakan letaknya dekat pada kromosom 6 (Ji et al., 2007c; Yanget al., 2014). Ty-2 berasal dari S. habrochaites f. glabratum aksesi “B6013” (Kallo dan Banerjee, 1990; Ji et. al., 2009a; Yanget. al., 2014) dan sebelumnya dipetakan di lengan panjang kromosom 11 dekat marka TG36 (84 cM) serta TG393 (103 cM) (Hanson et al., 2000; Yang et al., 2014). Piramiding Ty-2 dan Ty-3 secara bersama menghasilkan tingkat ketahanan yang lebih tinggi daripada Ty-3 sendirian (Meji’a et al., 2010; Yang et al., 2014). Gen ty-5 sepertinya berasal dari aksesi S. peruvianum kompleks (Anbinderet al., 2009; Yang et al., 2014) serta dipetakan pada kromosom 4 (Anbinderet al., 2009; Hutton et al., 2012; Yanget al., 2014).

Gen-gen ketahanan terhadap layu bakteri dan virus Gemini dapat diperoleh dari tomat liar yang umumnya memiliki karakter agronomi yang kurang diminati konsumen. MABC (marker-assisted backcrossing) merupakan proses penggunaan marka molekuler untuk menyeleksi lokus target, mengurangi panjang segmen donor yang mengandung lokus target dan atau mempercepat pemulihan genom tetua recurrent selama silang balik. MABC unggul terhadap silang balik secara konvesional dalam hal presisi dan efisiensi (Hasanet. al., 2014).

Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan galur tomat dataran tinggi yang tahan terhadap penyamkit layu bakteri dan virus Gemini melalui pemanfaatan marka molekuler dalam melakukan seleksi genotipe.

554



BAHAN DAN METODE

Penelitian dilakukan di Kebun Percobaan Cisarua PT EWINDO di ketinggian 1,100 mdpl dari tahun 2014 hingga 2016 enggunakan tomat dataran tinggi (Solanum lycopersicum). Persilangan tetua awal dilakukan pada tahun 2014. Selanjutnya dilakukan pembentukan BC1F1, BC2F1, dan BC3F1 di tahun 2015. Seleksi genotip dengan menggunakan marka molekuler dilakukan pada saat tanaman berumur 14 Hari Setelah Semai (HSS), sedangkan seleksi fenotip dilakukan sampai fase generatifdi stadia BC1F1, BC2F1, BC3F1, dan BC3F2. Selama proses penggaluran akan dilakukan field screening untuk memvalidasi tingkat ketahanan terhadap penyakit layu bakteri dan virus gemini di lapangan.

Material Tanaman Material tanaman yang digunakan pada penelitian ini adalah tanaman

tomat EWINDO dengan nomor kode EWINDO#24 (tetua donor) serta EWINDO#68 (tetua recurrent). Selain kedua nomor tersebut, penelitian ini juga menggunakanmaterial lain dengan nomor kode EWINDO#24’ sebagai tetua donor.EWINDO#24’adalah material tomat EWINDO#24 yang toleran terhadap pecah buah. BC1F1 dilakukan ke tetua donor EWINDO#24’ yang bertujuan untuk mendapatkan gen toleransi terhadap pecah buah.Sedangkan BC2F1 dan BC3F1 dilakukan ke tetua recurrent EWINDO#68. Proses penggalurandilakukan sampai mendapatkan galur yang seragam baik secara genotip maupun fenotip. Skema proses pemuliaan tersebut dijabarkan pada Gambar 1.

Gambar 1. Skema proses pemuliaan dengan metode MABC

Deteksi Marka Molekuler Marka SNP merupakan marka co-dominan yang dapat mendeteksi genotip

homozigot dominan, homozigot resesif, maupun heterozigot melalui perbedaan satu basa. Marka molekuler SNP pada penelitian ini didesain secara khusus sehingga dapat mendeteksi keberadaan gen target, yakni gen ketahanan layu bakteri (Bw-12), gen ketahanan virus gemini (Ty-2, Ty-3, dan ty-5), serta marka lainnya.

555




Ekstraksi DNA dilakukan dari sampel daun muda atau kuncup muda yang masih segar dengan menggunakan larutan ekstraksi CTAB 1% NaCl 0.7 M kemudian ekstrak DNA dikeringkan pada suhu 60°C. Ekstrak DNA dilarutkan dengan larutan TE (Tris-EDTA) kemudian dilakukan PCR untuk mengamplifikasi fragmen (sekuens yang mengandung SNP target) menggunakan mesin Thermal Cycler (G-Storm) dengan 50x siklus (suhu denaturasi 95 °C 15 detik, suhu penempelan 60 °C 30 detik, dan suhu elongasi 72 °C 10 detik).

Amplikon fragmen DNA dianalisis menggunakan mesin HRM (High Resolution Melting, Idaho Technology) yang dapat mendeteksi pendaran flourescence ketika DNA terdenaturasi bersamaan dengan kenaikan suhu mesin HRM. Perbedaan satu basa nukleotida (SNP) akan memberikan grafik berbeda ketika fragmen DNA terdenaturasi sehingga hasil analisis HRM memberikan informasi mengenai sampel yang memiliki SNP target. Skoring marka molekuler dilakukan berdasarkan grafik acuan HRM pada Gambar 2.

Gambar 2. Grafik acuan deteksi keberadaan marka molekuler (SNP target) untuk gen ketahanan virus Gemini; BB(Bw-12, homozigot), Bb (Bw-12, heterozigot), bb (non-Bw-12), R2R2(Ty-2, homozigot), R2r2(Ty-2, heterozigot), r2r2(non-Ty-2), R3R3(Ty-3, homozigot), R3r3(Ty-3, heterozigot), r3r3(non-Ty-3), R5R5(ty-5,

homozigot), R5r5(ty-5, heterozigot), dan r5r5(non-ty-5)

556



Pengujian Ketahanan Penyakit Pengujian ketahananterhadap penyakit layu bakteri dan virus gemini

dilakukan dengan menggunakan metode field screening. Metode pengujian ini dilakukan langsung dilapangan yang endemik penyakit layu bakteri dan virus gemini. Tingkat serangan penyakit dinilai berdasarkan dua metode, yaitu tingkat kejadian penyakit untuk layu bakteri (terinfeksi dan tidak terinfeksi) serta tingkat keparahan penyakit untuk virus gemini. Tanaman dikategorikan menjadi tahan (R, tingkat kejadian penyakit <10%), agak tahan (MR, tingkat kejadian penyakit 10%–20%), agak rentan (MS, tingkat kejadian penyakit >20%–30%), rentan (S, tingkat kejadian penyakit >30%–70%) and sangat rentan (HS, tingkat kejadian penyakit >70%) (Dutta, 2012). Sementara itu skala infeksi virus gemini dijabarkan pada Tabel 1.

Tingkat kejadian penyakit untuk layu bakteri dihitung dengan rumus:

Tingkat kejadian penyakit =

Tingkat keparahan penyakit untuk virus gemini dihitung dengan rumus:

Tingkat keparahan penyakit =

Tabel 1. Skala gejala infeksi Gemini virus pada tomat

Skala Reaksi Deskripsi Gambar

0 Sehat Tidak bergejala

1 Sangat Sedikit

Bergejala

Sangat sedikit menguning, gejala mosaic pada pucuk dan daun muda, tidak ada daun

yang keriting

2 Sedikit Bergejala

Sedikit menguning, gejala mosaic dan keriting pada pucuk dan daun muda

3 Sedang Menguning dan keriting pada pucuk dan daun muda serta

daun berbentuk mangkuk

4 Parah Tanaman kerdil, pertumbuhan terhenti

HASIL

Karakterisasi tanaman tetua donor dan tetua recurrent dilakukan secara fenotip maupun genotip. Karakterisasi fenotip dilakukan secara visual menggunakan panduan UPOV. Sementara karakterisasi genotip dilakukan dengan

557




bantuan marka molekuler. Karakteristik tanaman tetua donor serta tetua recurrent dijelaskan pada Tabel 2 dan Gambar 3.

Tabel 2. Karakteristik tanaman tetua donor dan tetua recurrent

No. Karakter EWINDO#24 EWINDO#68

1 Warna hipokotil Hijau Ungu 2 Tipe tumbuh Determinate Determinate 3 Bentuk buah Cordate Oblong 4 Warna hijau pundak buah Tidak ada Ada 5 Warna buah matang Merah Merah 6 Bobot buah (g) 89 121 7 Panjang buah (mm) 58 65 8 Diameter buah (mm) 52 58 8 Pecah buah rentan rentan 9 Tahan layu bakteri (Bw-12) Rentan (bb) Tahan (BB) 10 Tahan virus gemini (Ty-2) Tahan (R2R2) Rentan (r2r2) 11 Tahan virus gemini (Ty-3) Tahan (R3R3) Rentan (r3r3) 12 Tahan virus gemini (ty-5) Rentan (r5r5) Tahan (R5R5)

EWINDO#24 EWINDO#68

Gambar 3. Fenotip buah tomat tetua donor (EWINDO#24) dan tetua recurrent (EWINDO#68)

Seleksi menggunakan marka molekuler dilakukan pada stadia BC1F1, BC2F1, BC3F1, dan BC3F2. Pada stadia BC1F1, terdapat 334 tanaman terseleksi dari total 10028 tanaman yang dimarka atau sekitar 3% (Tabel 3). Selanjutnya tanaman terseleksi di silangkan dengan tetua recurrent-nya untuk mendapatkan populasi BC2F1.

Pada stadia BC2F1, terdapat 2259 tanaman terseleksi dari total 5352 tanaman yang dimarka atau sekitar 42% (Tabel 4). Selanjutnya tanaman terseleksi di silangkan dengan tetua recurrent-nya untuk mendapatkan populasi BC3F1.

Pada stadia BC3F1, terdapat 1229 tanaman terseleksi dari total 4784 tanaman yang dimarka atau sekitar 26% (Tabel 5). Beberapa grafik HRM gen ketahanan Ty ditunjukkan pada Gambar 4. Selanjutnya tanaman terseleksi akan dicampur untuk mendapatkan populasi F2.

Pada stadia F2, terdapat 534 tanaman terseleksi dari total 8924 tanaman yang dimarka atau sekitar 6% (Tabel 6). Selanjutnya tanaman terseleksi di galurkan sampai ke generasi ke-4.

558



Tabel 3. Hasil skoring marka molekuler pada populasi BC1F1

No. Ty-2 Ty-3 ty-5 Total Tanaman Keterangan 1 R2R2 R3R3 R5r5 334 3% Terseleksi 2 R2R2 R3R3 r5r5 295 3% 3 R2R2 R3r3 R5r5 668 7% 4 R2R2 R3r3 r5r5 570 6% 5 R2R2 r3r3 R5r5 411 4% 6 R2R2 r3r3 r5r5 295 3% 7 R2r2 R3R3 R5r5 499 5% 8 R2r2 R3R3 r5r5 417 4% 9 R2r2 R3r3 R5r5 1334 13% 10 R2r2 R3r3 r5r5 1101 11% 11 R2r2 r3r3 R5r5 674 7% 12 R2r2 r3r3 r5r5 557 6% 13 r2r2 R3R3 R5r5 164 2% 14 r2r2 R3R3 r5r5 151 2% 15 r2r2 R3r3 R5r5 437 4% 16 r2r2 R3r3 r5r5 379 4% 17 r2r2 r3r3 R5r5 264 3% 18 r2r2 r3r3 r5r5 187 2% 19 Unknown 1291 13%

Total 10028

Tabel 4. Hasil skorsing marka molekuler pada populasi BC2F1

No. Ty-2 Ty-3 ty-5 Total Keterangan

1 R2r2 R3r3 R5R5 2259 42% Terseleksi 2 R2r2 R3r3 R5r5 2565 48% 3 Unknown 528 10%

Total 5352

Tabel 5. Hasil skoring marka molekuler pada populasi BC3F1

No. Ty-2 Ty-3 ty-5 Total Keterangan

1 R2r2 R3r3 R5R5 1229 26% Terseleksi 2 R2r2 r3r3 R5R5 1306 27% 3 r2r2 R3r3 R5R5 894 19% 4 r2r2 r3r3 R5R5 1050 22% 5 Unknown 528 10%

Total 5352

Tabel 6. Hasil skoring marka molekuler pada populasi F2

No Ty-2 Ty-3 ty-5 Total Keterangan 1 R2R2 R3R3 R5R5 534 6% Terseleksi 2 R2R2 R3r3 R5R5 1048 12% 3 R2R2 r3r3 R5R5 604 7% 4 R2r2 R3R3 R5R5 999 11% 5 R2r2 R3r3 R5R5 2033 23% 6 R2r2 r3r3 R5R5 1154 13% 7 r2r2 R3R3 R5R5 463 5% 8 r2r2 R3r3 R5R5 920 10% 9 r2r2 r3r3 R5R5 506 6% 10 Unknown 663 7%

Total 8924

559




A

B

C

Gambar 4. Beberapa hasil analisis HRM pada populasi BC3F1 A. Grafik berwarna biru menunjukkan keberadaan gen Ty-2 heterozigot yang dimiliki oleh sampel. B. Grafik berwarna abu menunjukkan keberadaan gen Ty-3 heterozigot yang dimiliki

oleh sampel. C. Semua sampel terdeteksi memiliki gen ty-5 Pada stadia F4, terdapat 16 galur tanaman terseleksi dari total 77 galur

yang ditanam atau sekitar 21%. Karakteristik galur tanaman terseleksi dijelaskan pada Tabel 7 dan Gambar 5.

560



Tabel 7. Karakteristik galur tanaman terseleksi pada stadia F4

No. W

arn

a h

ipokotil

Tip

e t

um

buh

Bentu

k b

uah

Warn

a h

ijau

pundak b

uah

Warn

a b

uah

mata

ng

Bobot

buah (

gr)

Panja

ng b

uah

(mm

)

Dia

mete

r

buah (

mm

)

Peca

h b

uah Tingkat

ketahanan layu bakteri

Tingkat ketahanan virus gemini

% Bw-12 % Ty-2 Ty-3 ty-5

1 Ungu Det Cordate ada Merah 77.5 53.3 50.1 Rentan 100 RR 100 R2R2 R3R3 R5R5 2 Ungu Det Oblong ada Merah 81.9 56.2 52.1 Rentan 100 RR 100 R2R2 R3R3 R5R5 3 Hijau Det Cordate ada Merah 90.5 58.4 53.6 Medium 100 RR 100 R2R2 R3R3 R5R5 4 Ungu Det Obovate tidak Merah 73.9 55.0 46.5 Rentan 100 RR 100 R2R2 R3R3 R5R5 5 Ungu Det Obovate tidak Merah 68.3 55.1 46.1 Rentan 100 RR 100 R2R2 R3R3 R5R5 6 Hijau Det Obovate tidak Merah 62.1 54.1 44.5 Rentan 100 RR 100 R2R2 R3R3 R5R5 7 Hijau Det Cordate tidak Merah 85.7 60.7 51.1 Medium 100 RR 100 R2R2 R3R3 R5R5 8 Ungu Det Eliptic tidak Merah 114.5 72.2 52.9 Rentan 100 RR 100 R2R2 R3R3 R5R5 9 Ungu Det Oblong tidak Merah 111.5 68.7 53.8 Rentan 100 RR 100 R2R2 R3R3 R5R5

10 Ungu Det Oblong tidak Merah 89.7 65.7 48.9 Rentan 100 RR 100 R2R2 R3R3 R5R5 11 Ungu Det Oblong tidak Merah 82.4 62.1 48.3 Toleran 100 RR 100 R2R2 R3R3 R5R5 12 Ungu Det Oblong tidak Merah 140.0 74.8 57.2 Rentan 100 RR 100 R2R2 R3R3 R5R5 13 Ungu Det Oblong tidak Merah 124.1 69.4 55.5 Rentan 100 RR 100 R2R2 R3R3 R5R5 14 Ungu Det Oblong ada Merah 69.7 57.2 46.0 Toleran 100 RR 100 R2R2 R3R3 R5R5 15 Ungu Det Obovate ada Merah 75.3 60.2 46.2 Toleran 100 RR 100 R2R2 R3R3 R5R5 16 Ungu Det Oblong tidak Merah 94.8 62.2 51.5 Medium 100 RR 100 R2R2 R3R3 R5R5

Sumber: UPOV 2013

561




EWINDO#149 (No. 1)

EWINDO#158 (No. 9)

EWINDO#150 (No. 2)

EWINDO#159 (No. 10)

EWINDO#152 (No. 3)

EWINDO#160 (No. 11)

EWINDO#153 (No. 4)

EWINDO#161 (No. 12)

EWINDO#154 (No. 5)

EWINDO#162 (No. 13)

562



EWINDO#155 (No. 6)

EWINDO#163 (No. 14)

ff EWINDO#156 (No. 7)

EWINDO#164 (No. 15)

EWINDO#157 (No. 8)

EWINDO#165 (No. 16)

SC BW

SC GV

Gambar 5. Fenotip buah galur tomat terseleksi pada stadia F4 serta standar SC BW dan standar SC GV

PEMBAHASAN

Tetua recurrent sudah memiliki gen ketahanan terhadap layu bakteri (Bw-12) serta virus gemini (ty-5) akan tetapi masih belum memiliki gen ketahanan terhadap virus gemini yang lain (Ty-2 dan Ty-3). Sementara itu, tetua donor memiliki gen ketahanan terhadap virus gemini (Ty-2 dan Ty-3) akan tetapi masih belum memiliki gen ketahanan terhadap layu bakteri (Bw-12) serta virus gemini lain (ty-5) (Tabel 2) (Gambar 3). Kedua tetua tersebut memiliki karakter yang saling melengkapi sehingga sesuai untuk dijadikan sebagai material MABC.

Pada populasi BC1F1 (Tabel 3) terdapat 334 (3%) tanaman terseleksi yang memiliki gen Ty-2 (R2R2), Ty-3 (R3R3), serta ty-5 (R5r5). Hasil ini tidak berbeda jauh dengan ekspektasi awal pada perhitungan sebagai berikut: 25%

563




(Ty-2) x 25% (Ty-3) x 50% (ty-5) = 3%. Populasi BC2F2 (Tabel 4), terdapat 2259 (42%) tanaman terseleksi yang memiliki gen Ty-2 (R2r2), Ty-3 (R3r3), serta ty-5 (R5R5). Hasil ini tidak berbeda jauh dengan ekspektasi awal pada perhitungan sebagai berikut 100% (Ty-2) x 100% (Ty-3) x 50% (ty-5) = 50%. Populasi BC3F1 (Tabel 5), terdapat 1229 (26%) tanaman terseleksi yang memiliki gen Ty-2 (R2r2), Ty-3 (R3r3), serta ty-5 (R5R5). Hasil ini tidak berbeda jauh dengan ekspektasi awal pada perhitungan sebagai berikut 50% (Ty-2) x 50% (Ty-3) x 100% (ty-5) = 25%. Penggunaan marka molekuler SNP dan instrumen HRM pada populasi BC3F1 sebagai alat untuk mendeteksi keberadaan SNP target dapat diaplikasikan untuk mempercepat dan mempermudah proses seleksi genotip. Hasil analisis HRM menunjukkan grafik hasil yang bersifat valid jika grafik sesuai dengan grafik acuan yang dibuat sebelumnya menggunakan sampel kontrol dan tahapan-tahapan optimasi untuk setiap trait (gen) dan marka molekuler. Sebagai contoh, grafik hasil analisis HRM untuk seleksi individu sampel yang memiliki gen Ty-2 pada BC3 (Gambar 4A), sampel-sampel yang dianalisis terbagi menjadi dua kelompok (grafik berwarna jingga dan biru). Kelompok berwarna jingga memiliki satu puncak grafik di rentang suhu 62-64 °C (sesuai grafik acuan). Hal tersebut menunjukkan bahwa sampel-sampel tersebut memiliki genotip yang bersifat homozigot (resesif/suseptibel), sedangkan kelompok berwarna biru memiliki dua puncak grafik di rentang suhu 62-64 °C dan 71-73 °C (sesuai grafik acuan). Hasil ini menunjukkan bahwa sampel-sampel yang berwarna biru memiliki genotip yang bersifat heterozigot (resisten Ty-2). Berdasarkan hasil tersebut maka seleksi dilakukan pada sampel-sampel yang memiliki grafik berwarna biru. Populasi BC3F2 (Tabel 6), terdapat (6%) tanaman BC3F1 terseleksi memiliki gen Ty-2 (R2r2), Ty-3 (R3r3), serta ty-5 (R5R5). Hasil ini tidak berbeda jauh dengan ekspektasi awal pada perhitungan sebagai berikut 25% (Ty-2) x 25% (Ty-3) x 100% (ty-5) = 6%.

Pada populasi F4 terdapat 16 galur terseleksi yang memiliki gen Ty-2 (R2R2), Ty-3 (R3R3), serta ty-5 (R5R5). Pada Tabel 7, 16 galur memiliki tingkat ketahanan layu bakteri dan virus gemini yang tinggi yaitu sebesar 100%. Pengamatan fenotip 16 galur menunjukkan galur EWINDO#161 dan EWINDO#162 memiliki kesamaan paling tinggi dengan tetua recurrent. Galur EWINDO#160, EWINDO#163, dan EWINDO#164 memiliki toleransi terhadap pecah buah tetapi bobot buah masih lebih kecil dari tetua recurrent.

Populasi BC1 yang lolos seleksi sebanyak 3% untuk selanjutnya disilangkan ke tetua recurrent-nya menjadi BC2. Populasi BC2 yang lolos seleksi sebanyak 42% untuk selanjutnya disilangkan ke tetua recurrent-nya menjadi BC3. Populasi BC3 yang lolos seleksi sebanyak 26% untuk selanjutnya dimurnikan sampai generasi ke-4 menghasilkan 16 galur yang memiliki ketahanan layu bakteri (skor ketahanan 100%) dan virus gemini (skor ketahanan 100%). Penggunaan marka molekuler dapat mempercepat proses seleksi tanaman yang memiliki gen ketahanan terhadap layu bakteri dan virus gemini.

UCAPAN TERIMA KASIH

Penulis ingin berterima kasih kepada PT East West Seed Indonesia yang telah mendanai penelitian ini. Selain itu, penulis juga berterima kasih kepada tim A Breeding, tim Lab Bioteknologi, tim Lab. Phytopathology, tim Farm, serta tim

564



Genetic Resources PT East West Seed Indonesia yang telah membantu pelaksanaan penelitian ini.

DAFTAR PUSTAKA

Anbinder, I., M. Reuveni, R. Azari, I. Paran, S. Nahon, H. Shlomo, L. Chen, M. Lapidot, I. Levin. 2009. Molecular dissection oftomato leaf curl virus resistance in tomato line TY172 derived from Solanum peruvianum. Theor Appl Genet. 119:519–530.

Cohen, S., M. Lapidot. 2007. Appearance and expansion of TYLCV: a historical point of view. In Czosnek H. (Ed.).Tomato Yellow Leaf Curl Virus Disease. Springer, the Netherlands.

Czosneck,H., H. Laterrot. 1997. A worldwide survey of tomato yellow leaf curl viruses. Arch virol. 142:1391-1406.

Dutta, P., B. Rahman. 2012. Varietal screening of tomato against bacterial wilt disease under subtropical humid climate of Tripura. International Journal of Farm Sciences. 2(2):40-43.

Hanson, P.M., D. Bernacchi, S. Green, S.D. Tanksley, V. Muniyappa, A.S. Padmaja, H. Chen, G. Kuo, D. Fang, J. Chen. 2000. Mapping a wild tomato introgression associated with tomato yellow leaf curl virus resistance in a cultivated tomato line. J Am Soc Hort Sci. 15:15–20.

Hasan, M.M., M.Y. Rafii, M.R. Ismail, M. Mahmood, H.A. Rahim, M.A. Alam, S. Ashkani, M.A. Malek, Ma. Latif. 2014. Marker-assisted backcrossing: a useful method for rice improvement. Biotechnology & Biotechnological Equipment. 29(2):237-254.

Hutton, S.F., J.W. Scott, D.J. Schuster. 2012. Recessive resistance to tomato yellow leaf curl virus from the tomato cultivarTyking is located in the same region as Ty-5 on chromosome 4. HortScience. 47(3):324–327.

Ji, Y., D.J. Schuster, J.W. Scott. 2007a. Ty-3, a begomovirus resistance locus near the tomato yellow leaf curl virus resistance locus Ty-1 on chromosome 6 of tomato. Mol Breed. 20:271–284.

Ji, Y., J.W. Scott, P. Hanson, E. Graham, D.P. Maxwell. 2007b. Sources of resistance, inheritance, and location of genetic loci conferring resistance to members of the tomato infecting begomoviruses. P. 343–362. In Czosnek H. (Ed.). Tomato yellow leaf curl virus disease: management, molecular biology, breeding for resistance. Kluwer, Dordrecht.

Ji, Y., M.S. Salus, B. van Betteray, J. Smeets, K.S. Jensen, C.T. Martin, L. Mejıá, J.W. Scott, M.J. Havey, D.P. Maxwell. 2007c. Co-dominant SCAR markers for detection of the Ty-3 and Ty-3a loci from Solanum chilense at 25 cM of chromosome 6 of tomato. Rep Tomato Genet Coop. 57:25–28.

Ji, Y., J.W. Scott, D.J. Schuster. 2009a. Toward fine mapping of the tomato yellow leaf curl virus resistance gene Ty-2 on chromosome 11 of tomato. HortScience. 44(3):614–618

Ji, Y., J.W. Scott, D.J. Schuster, D.P. Maxwell. 2009b. Molecular mapping of Ty-4, a new tomato yellow leaf curl virus resistance locus on chromosome 3 of tomato. J Am Soc Hort Sci. 134:281–288.

Kalloo, G., M.K. Banerjee. 1990. Transfer of tomato leaf curl virus resistance from Lycopersicon hirsutum f. glabratum to L. esculentum. Plant Breed. 105:156–159.

565




Mejıá, L., R.E. Teni, B.E. Garcıá, A.C. Fulladolsa, L. Meńdez, S. Melgar, D.P. Maxwell. 2010. Preliminary observations on theeffectiveness of five introgressions for resistance to begomoviruses in tomatoes. TGC Report. 60:41–53.

Pico, B., M.J. Diez, F. Nuez. 1996. Viral diseases causing the greatest economic losses to the tomato crop 2. The tomato yellow leaf curl virus-a review. Sci Hort. 67:151–196.

Prakasha, A., S. Umesha, S. Raghava, S.Marahel. 2016. Discrimination of Ralstonia solanacearum isolates by genetic signatures produced by single-strand conformation polymorphism and low-stringency single specific primer PCR analysis. Afr J Microbiol Res. 10(30):1128-1139.

Scott, J.W. 2007. Breeding for resistance to viral pathogens. P. 447–474. In Razdan M.K., Mattoo A.K. (Eds.). Genetic improvement of solanaceous crops. Science Publisher Inc,Enfield, NH.

UPOV. 2013. Guidelines for The Conduct of Tests for Distinctness, Uniformity and Stability. International Union for The Protection of New Varieties of Plants. Geneva.

Vidavski, F.S. 2007. Exploitation of resistance genes found in wild tomato species to produce resistant cultivars; pile up of resistant genes. P. 363-372. In Czosnek H. (Ed.). Tomato yellow leaf curl virus disease: management, molecular biology, breeding for resistance. Kluwer, Dordrecht.

Wang, J.F., J. Olivier, P. Thoquet, B. Mangin, L. Sauviac, Grimsley, N. Hidayati. 2000. Resistance of tomato line Hawaii7996 to Ralstonia solanacearum Pss4 in Taiwan is controlled mainly by a major strain-specific locus. Mol. Plant-Microbe Interact. 13:6-13.

Wang, J.F., F.I. Ho, H.T.H. Truong, S.M. Huang, C.H. Balatero, V. Dittapongpitch, N. Hidayati. 2012. Identification of major QTLs associated with stable resistance of tomato cultivar ‘Hawaii 7996’ to Ralstonia solanacearum. Euphytica. 190:241–252.

Yang, X., M. Caro, S.F. Hutton, J.W. Scott, Y. Guo, X. Wang, M.H. Rashid, D. Szinay, H. de Jong, R.G.F. Visser, Y. Bai, Y. Du. 2014. Fine mapping of the tomato yellow leaf curl virus resistance gene Ty-2 on chromosome 11 of tomato. Mol Breeding. 34:749–760.

Zamir, D., I. Eksteinmichelson, Y. Zakay, N. Navot, M. Zeidan, M. Sarfatti, Y. Eshed, E. Harel, T. Pleban, H. Vanoss, N. Kedar, H.D. Rabinowitch, H. Czosnek. 1994. Mapping and introgression of a tomato yellow leaf curl virus tolerance gene, Ty-1. Theor Appl Genet. 88:141–146.

Documents

APLIKASI MARKA MOLEKULER DALAM PENGEMBANGAN …peripi.org/wp-content/uploads/2019/02/makalah-61-halaman-552-565-OK.pdftomat terhadap layu bakteri diketahui dikontrol oleh beberapa