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Apoptose/chimiorésistance
des cellules d’ostéosarcome
Les ostéosarcomes
• Tumeurs primitives osseuses- Ostéoblastes malins
• Localisées principalement dans les os longs
• Surviennent majoritairement dans la
deuxième décennie (moyenne à 16 ans),
2ème pic d’apparition après 65 ans
• Tumeurs hétérogènes constituées
d’un os pathologique, associées à
des lésions ostéolytiques
• Tumeurs résistantes :
70% des patients survivent sans évènement à 5 ans
•Associées à des métastases
Les ostéosarcomes: étiologie
Altérations des gènes contrôlant le cycle cellulaire
• p53
• pRB
• c-myc
• p16
Altérations de l’expression des gènes impliqués dans la
différenciation ostéoblastique
• Runx2
• Ostérix
• Signalisation induite par WNT
• Perte du contrôle du cycle cellulaire
• Déstabilisation du génome
Altérations de la
différenciation
Les ostéosarcomes : traitements
Protocole OS2006 : étude clinique de phase III
Chirurgie conservatrice
Chimiothérapie préopératoire et postopératoire (suivant l’âge)
Bisphosphonate : zolédronate
Anti métabolites
Méthotrexate
Agents intercalants
Transcription Réplication
doxorubicine, cisplatine
Agents Alkylants
Ifosfamide Etoposide (VP-16)
Inhibiteur TopoII
Les ostéosarcomes: résistance aux traitements
↑ Export des agents
cytotoxiques
transporteurs ABC
↑ Réparation de l’ADN
Altération de l’apoptose
Inactivation des agents cytotoxiques
agents cytotoxiques
↓ Import des agents cytotoxiques
Perturbation des points de contrôle du
cycle cellulaire
diminution de la réponse apoptotique
Bcl-2, Bax, survivine
Chk1
GST
NER, TLS
Signalisation WNT et développement des ostéosarcomes
b-catenin
b-catenin
APC
GSK3
AXIN
WIF-1
-Expression de LRP5 dans des tumeurs humaines corrèle
avec la présence de métastases et une survie réduite des
patients (Hoang et coll., Int J Cancer, 2004)
-L’inhibition de LRP5 par un dominant négatif (DN)
diminue la croissance tumorale et les métastases dans un
modèle de tumeurs chez la souris
(Guo et coll., Clin Orthop Relat Res, 2008)
-WIF-1 est inhibé par des modifications épigénétiques (Kansara et coll., J Clin Invest, 2010)
-Altérations fréquentes du gène Apc qui corrèle avec un
mauvais pronostic (Entz-Werlé et coll., Neoplasia, 2007)
-Les souris Apc1638N/+Twist-null/+ développent des
tumeurs de type ostéosarcome (Entz-Werlé et coll., Trans Onc, 2010)
Altérations de la b-caténine dans les ostéosarcomes ?
-Accumulation de la b-caténine dans le cytoplasme
ou dans les noyaux (Haydon et coll., Int J Cancer, 2002)
-Accumulation de la b-caténine à la membrane
-Inactivation de la voie Wnt (Cai et coll., J Pathol, 2009)
Signalisation Wnt et réponse à la chimiothérapie ????????
Activation de la voie Wnt/b-caténine/TCF dans des lignées
de cellules humaines dérivées d’ostéosarcome
Activité transcriptionnelle
des facteurs TCF
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Cellules
d’ostéosarcome
Cellules
ostéoblastiques WRE WRE WRE WRE WRE LUCIFERASE
Plasmide TOPFlash
Matrice
extracellulaire
Récepteur
Enzymes
Facteurs
de croissance Assemblage
Clivage
Intégrines
signalisation
-Prolifération
-Différenciation
-Adhésion/migration
-Dépôt de la matrice
Le syndécan-2
SYNDÉCAN-2
E F Y A
Activité
catalytique
de PKCd
PKCδ
APOPTOSE
E F Y A
JNK
JNK-P
Syndécan-2 et apoptose
Le SYNDECAN-2 module la
signalisation cellulaire pour
induire ou favoriser l’APOPTOSE ERK
PI3K
NFkB
Modrowski et coll., Bone, 2005
Orosco, A. et coll., J Cell Biochem, 2006.
Villena, J., et coll., Apoptosis, 2006.
K7M2 K7M2+SYND2
Syndécan-2 = suppresseur de tumeur
Cellules K7M2 sont dérivées d’un ostéosarcome spontané chez la souris BalB/c
Le syndécan-2 module la
réponse aux agents de
chimiothérapie
Apoptose
+Syndécan-2
Doxorubicine
siRNA Syndécan-2
Doxorubicine
Défaut de syndécan-2 dans les ostéosarcomes
Orosco et coll., Cancer Research, 2007
Cellules
Ostéoblastiques MG63 U2OS SaOS2 OHS4
Exp
res
sio
n R
ela
tive d
u
Syn
deca
n-2
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
*
PCR
Exp
res
sio
n
du
Syn
decan
-2
1
2
3
4
Tissus
Osseux sains
Tissus
Tumoraux
*
Immunohistochimie
* Indique P <0,05
Les facteurs TCF répriment l’expression de syndécan-2
Sites de liaison TCF/LEF
ChIP
5’UTR LUC
Activité promoteur syndécan-2
R L
U
ARNm syndécan-2
0
0,5
1
1,5
2
2,5
Ctl
*
siTCF
DD
CT
0
1
2
3
*
TCF Ctl
* Indique P <0,05
TCF
FZD
β-caténine
WNT
LRP5/6
Expression du Syndecan-2
Wnt/β-caténine/TCF réprime le syndécan-2
RLU
0
1
2
3
*
Activité Promoteur Syndécan-2
β-caténine
contrôle
*
Wnt3a * Indique P <0,05
Signalisation Wnt/β-caténine/TCF et chimiorésistance des ostéosarcomes
Sélection de cellules résistantes
Traitement 24h
Doxorubicine 50ng/mL
semaine 1
semaine 2
semaine 3
semaine 4
Traitement
Traitement
Traitement
Lignées cellulaires d’ostéosarcome
Viabilité
ng/ml doxorubicine 0
20
40
60
80
100
120
0 50 100 150 200
U2OS
U2OS Résistantes
U2OS
U2OS + Syndécan-2
U2OS résistantes
U2OS résistantes + Syndécan-2
Doxorubicine (ng/ml)
20
40
60
80
100
0 10 25 50 75
Via
bili
té
(% d
e c
ellu
les
con
trô
le)
La surexpression de syndécan-2 rétablit la sensibilité à la doxorubicine
La doxorubicine n’induit pas le syndécan-2 dans les cellules résistantes
8012 13301
12174 13549
Cellules
U2OS
Cellules
U2OS
résistantes
ARNm du Syndécan-2
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
Doxorubicine - + - + (50ng/ml)
U2OS
U2OS
Résistantes *
ΔΔ
CT
Expression du syndécan-2 dans des tumeurs humaines
avant Chimiothérapie après Chimiothérapie
FoxO3a module l’induction de syndécan-2 par la
Doxorubicine
* Indique P <0,05
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0 *
ΔΔ
CT
ARNm du syndécan-2
FoxO3a
Vecteur vide
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5 * *
0.0
ΔΔ
CT
ARNm du syndécan-2
Contrôle
Doxorubicine
Doxorubicine + siFOXO3a
ATCA Site de liaison pour FoxO3a muté
AACA Site de liaison pour FoxO3a
Région 5’ du syndécan-2
p-3.62-LUC
5’UTR LUC
Région 5’ du syndécan-2
p-3.62-LUC
5’UTR LUC
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
AACA ATCA *
*
R L
U
Activité de p-3,62-LUC
FoxO3a module l’induction de syndécan-2 par la
doxorubicine de façon indirecte
* Indique P <0,05
FoxO3a interagit avec β-caténine sous stress oxydatif
Essers et Coll, Science, 2005
Doxorubicine/FoxO3a interagit avec WNT/β-caténine/TCF
* Indique P< 0,05
0
20
40
60
80
100
% I
np
ut
Liaison de TCF4
au promoteur du syndécan-2
Doxorubicine - +
*
0.2
0.6
1.0
1.4
1.8
ΔΔ
CT
Expression du syndécan-2
Doxo
FoxO*
Wnt
b-cat
TCF
Doxorubicine - + + TCF - + - b-Cat* - - +
bcat TCF
Doxorubicine Wnt
Transcription du syndécan-2
bcat TCF
Doxorubicine Wnt
Transcription du syndécan-2
Cellules sensibles Cellules résistantes
Syndécan-2
Résumé
Syndécan-2 FoxO
TCF
FZD
β-caténine
WNT
LRP5/6
Expression du Syndecan-
2/ Réponse à la
doxorubicine?
DKK1
sFRP-1
PKF115-584
Effets des inhibiteurs Wnt sur la réponse à la doxorubicine
Effets des inhibiteurs de Wnt sur l’activité de la doxorubicine
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5 *
*
U2OS U2OS résistantes
*
R L
U
(ce
llu
les
tra
ité
es
/ c
ell
ule
s
no
n-t
rait
ée
s)
0.0
Activité transcriptionelle des
facteurs FoxO
β-caténine est nécessaire à l’action de la Doxorubicine
FoxO3a β-caténine
Contrôle
Doxorubicine
Doxorubicine
+
sFRP1/ Dkk1
Doxorubicine
+
PKF 115-584
* Indique P <0,05
L’inhibition de l’activité TCF réduit la
viabilité cellulaire in vitro
Doxorubicine - + - + - + - +
Viabilité cellulaire (% des contrôles)
Cellules
sensibles
0
20
40
60
80
100
120
a a
b
Cellules
résistantes
+ PKF115 - - + + - - + +
b
b
H&E/Safran
Injection des
cellules
J-0 J-21
Doxorubicine
2 mg/Kg IV
J-28
Doxorubicine
2 mg/Kg IV
PBS
PKF 115-584
0,5mg/kg IP
Modèle d’ostéosarcomes in vivo
Sacrifice
J-35
K7M2
Vo
lum
e T
um
ora
l (
mm
3)
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
p= 0.0012
p= 0.028
p= 0.07
L’inhibition de l’activité transcriptionnelle TCF augmente
l’effet de la doxorubicine in vivo
Sans
cellules K7M2
K7M2
Doxorubicine K7M2
Doxorubicine +
PKF 115-584
*
*
Conclusions
-Activation de la signalisation Wnt/b-caténine/TCF
Freine la réponse aux agents de chimiothérapie
-La b-caténine est impliquée dans l’inhibition et l’induction de la réponse cellulaire
Inhibition ciblée de l’activité des facteurs TCF = Nouvelle stratégie thérapeutique dans l’ostéosarcome ?
D’après Khosla, 2008
β-caténine : molécule clé du système Wnt
CSM
Ostéoprogéniteur
Pré-ostéoblaste
Ostéoblaste
Ostéocyte
Apoptose
Survie
Renouvellement
Engagement
Prolifération
+
+
+ +
+
+
+ -
Multifonctions de la signalisation Wnt/β-caténine dans
les cellules souches embryonnaires dépend de:
1- expression des effecteurs Wnt
2- recrutement de co-facteurs par la β-caténine
Différenciation
Minéralisation
de la matrice
b-caténine
Activités transcriptionnelles et épigénétiques de la b-caténine
Développement de petites molécules ciblant
spécifiquement une activité de la b-caténine
b-caténine
TCF
p300 CBP
Phénotype
Cellules Souche
Initiation
de la Différenciation
IQ-1
Renouvellement des
cellules souches
ICG-001
Apoptose
des cellules cancéreuses
PKF-115-584