Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetéseaz Európai Unió új társadalmi kihívásainaka Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni EgyetemenAzonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

APOPTÓZIS ÚTVONALAK

Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetéseaz Európai Unió új társadalmi kihívásainaka Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni EgyetemenAzonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Berki Tímea és Boldizsár FerencJelátvitel

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

„A természetes sejthalál”• Az „apoptosis” kifejezést a görögök a fák leveleinek,

a virágszirmok hullásának megnevezésére használják

• Professzor James Cormack, az Aberdeeni egyetem görög tanszékének vezetője javasolta ezt a kifejezést a programozott sejthalál folyamatára 1972-ben

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Az apoptózis szerepe• Apoptózis, általánosságban előnyt jelent egy

szervezet életében: megfelelő válasz egy olyan jelre, amely egy adott sejt –az egész a szervezet számára szükséges és előnyös– pusztulását eredményezi

• Naponta 50 - 70 ezer milliárd (billió, 1012) sejt pusztul el naponta apoptózissal egy átlagos felnőtt emberben

• A programozott sejthalál a genomban kódolt folyamat

• Apoptózishoz nem szükséges új transzkripció vagy transzláció, amely azt jelzi, hogy a sejthalálhoz szükséges molekuláris komponensek a sejtben jelen vannak, csak megfelelő aktivációra várnak.

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Mikor előnyös a szervezet számára? • Az egyedfejlődés, embriogenezis, metamorfózis és

szöveti atrófia során, amikor a szervek-szövetek formálása történik

• A szervezet össz-sejtszámának szabályozása során • A szervezet védelme, a nem kívánt vagy veszélyes

sejtek eltávolítása: tumorsejtek, vírussal fertőzött sejtek, valamint az immunválasz során felszaporodott effektor limfociták eltávolítása

• Az immunrendszer érése során szükséges az autoreaktív vagy felesleges limfociták eltávolítása

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

A sejthalál morfológiai lépései • A sejtmag kondenzálódása és

feldarabolódása • A citoplazma kondenzálódása és

fragmentálódása membránnal határolt apoptotikus testekké

• A kromoszómák feldarabolódása nukleoszómákra (nukleoszóma létra)

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Apoptózist elindító jelekExtracelluláris: • Hormonok, pl. a tiroxin, amely az ebihal farkának apoptózisát

eredményezi • Túlélési szignálok hiánya, pl. hiányzó növekedési faktorok• Sejt-sejt kontaktus szomszédos sejtekkel• Toxinok, nitrogén-oxidok, citokinek• Megnövekedett intracelluláris kálcium → calpain termelés

(kálcium-kötő proteáz)Intracelluláris: • Ionizáló sugárzás, hő, tápanyag-megvonás • Vírus fertőzés • Oxidatív sérülés szabadgyököktől és hypoxia miatt • Glükokortikoidok

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Az apoptózis mechanizmusa: kaszpázok• Egy kaszpáz nevű proteáz fehérje család (emberben

kb. 10) jelenléte szükséges a programozott sejthalálhoz

• Kaszpázok: caspase - cys containing-asp specific protease

• Endoproteázok, aktív Cys (C) kötőhellyel, amelyek az Aszparagin (asp) N-terminális végénél hasítanak

• Ezek a proteázok inaktív állapotban vannak a sejtben és limitált proteolízissel aktiválódnak

• A kaszpázok kaszkádot alkotnak• Inaktív formában pro-kaszpázokként termelődnek

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Iniciátor kaszpázok• Az iniciátor kaszpáz aggregálódik, a kritikus

koncentrációt elérve aktiválódik• Az iniciátor kaszpáz prodoménje CARD

domént (pl. a kaszpáz-2 és -9) vagy death domént (DED) (kaszpáz-8 és -10) tartalmaz, amely lehetővé teszi az aktivációjukat szabályozó molekulákkal való interakciót

• Az aktiválódott iniciátor kaszpáz aktiválja az effektor kaszpázokat

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

A kaszpáz kaszkád aktivátorai • Granzyme B: szerin proteáz (citotoxikus T-

limfociták és NK sejtek termelik), amely aktiválja a kaszpáz-3-at és -7-et

• Halál receptorok: Fas, TRAIL receptorok és TNF receptorok, amelyek a kaszpáz-8-at és -10-et aktiválják

• Apoptoszóma: citokróm-c és a Bcl-2 fehérjecsalád szabályozza, a kaszpáz-9-et aktiválja

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

A fő apoptózis útvonalak összefoglalása

Halál ligandok(FasL, TRAIL, TNF)

Stimulus(Citokin hiány, vírusfertőzés,

DNS-károsodás, irradiáció, sejtes stressz)

Pro-Kaszpáz-8

FADD

Kaszpáz-9

Cytc

Apaf-1

Smac

FLIP

AktívKaszpáz-8

EffektorKaszpázok

Bax Bak

BH3 onlymolekulák

Anti-apoptotikusBcl-2 család tagjai

Halál receptorok(FasL, TRAIL, TNF)

Mitokondrium

Apoptoszóma

DISC

IAPs

Apoptózis

INTRINSZIKEXTRINSZIK

XIAPcIAP-1cIAP-2

Survivin

Kináz

Foszfatáz

Enzim

Ciklin, pro-apoptotikus

Túlélést serkentő

GTP-áz

GAP/GEF

Kaszpáz

Transzkripciós faktor

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Intracelluláris (intrinszik) apoptózis útvonal• A mitokondrium központi szerepe: csatornák

kinyílása, ezeket aspecifikus belső membrán permeábilitási tranzíciós pórusnak hívjuk

• A belső membrán sérülése az elektrokémiai potenciál összeomlását eredményezi

• Citokróm-c, Smac/DIABLO, Omi/HtrA2, AIF és endonukleáz-G áramlik ki a membránok közti térbe, ahol a citoplazmatikus Apaf-1 (apoptotic protease activating factor-1) fehérjéhez kötődnek

• Az Apaf-1 aktiválja az iniciátor kaszpáz-9-et a citoplazmában

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Mitokondriális apoptózis útvonal

Cytc

Bcl-2Bcl-2

Bcl-2Bad

BaxBax

Bcl-2Bax

Kaszpáz-9

Cytc Apaf-1 Apoptoszóma

Mitokondrium

BadP

PP

Bad

Kaszpáz kaszkád

Apoptotikus jel

PT Pórus

PP

P

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Permeábilitási tranzíciós pórus • Külső membrán protein (porin, a voltage-gated anion

channel - VDAC) és • Belső membrán fehérje (adenine nucleotide

translocator – ant) alkotja• Ezen a csatornán át bármely, MW 1500-nál kisebb

molekula szabadon kiáramlik   • Ez a protongrádiens összeomlását okozza, amely

szétkapcsolja az oxidációt és foszforilációt a mitokondriumban

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Apoptoszóma

Apaf-1Apaf-1

Apaf

-11 Apaf-1

Apaf-1

Apaf-1

Apaf-1

CytcCytc

Cytc

Cytc

CytcCytc

Cytc

Apoptoszóma kialakulása Pro-kaszpáz-9 toborzása

Kaszpáz aktiváció

Pro-kaszpáz -9

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Bcl-család

Anti-apoptotikusBH4 BH3 BH1 BH2

BH4 BH3 BH1 BH2 TM Bcl-2, Bcl-XL

BH3 BH1 BH2 TM Bax, Bak

BH4 BH3 BH1 BH2 TM Diva

BH4 BH3 TM Bcl-Xs

BH3 TM Bik, Bim

BH3 Bad, Bid, Egl-1

Pro-apoptotikus

Mcl1, CED9A1, Bfl-1

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Mi okozza a változásokat a mitokondriumban? • Besugárzás vagy másodlagos messengerek, pl. ceramid

hatására az oxidatív foszforiláció és az elektron transzport összeomlása

• A sejt redox potenciáljában beállt változások és reaktív oxigén termékek (reactive oxygen speciesek - ROS) képződése 

• Sugárzás vagy ROS okozta DNS sérülés p53 fehérje expressziót indukál, ez a sejtosztódás gátlásához vagy apoptózishoz vezet megakadályozva a sérült sejt tumorsejtté alakulását. A p53 így tumor szuppresszor gén; a vizsgált humán tumorok kb. 50%-ában mutáció következtében inaktiválódik. A p53 mutációja kb. 14 különböző gén expresszióját indukálhatja. Ezen gének termékeit a sejt többnyire az oxidatív stressz vagy az arra történő válasznál használja. A sejtek oxidatív sérülése p53 apoptózist okoz.

• Jelátviteli folyamatok miatt emelkedett intracelluláris kálcium ion koncentráció

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Apoptózis útvonalak aktivált T-sejtekben

T-sejt alcsoport Útvonal

Bulk aktivált T sejtek Fas/FasL

Th1 Fas/FasL

Th2 Granzyme B

Th17 Fas/FasL?

Tc1 Fas/FasL/Granzyme B

Tc2 ?

Treg, gdT sejtek, NK, NKT ?

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011Extracelluláris (extrinszik) apoptózis útvonal: halál receptorok• Aktiváció után pár nappal az aktivált immunsejtek

Fas-t (CD95) kezdenek el expresszálni, amely eltávolításukat célozza

• Stressz hatására bizonyos sejtek Fas és Fas-ligand (CD95L) expressziója egyaránt megindul, a sejtek önmagukat pusztítják el

• A legtöbb sejt expresszál Fas-t ; ligandja azonban főként az aktivált T-sejteken jelenik meg

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

A halál-receptorok szerepe: FasFAS receptor (más néven Apo-1 vagy CD95):• FADD (Fas-asszociált halál-domén) a CD95 aggregált

citoplazmatikus doménjéhez kötődik (az un. halál-doménhez)

• majd az inaktív kaszpáz-8 és 10 toborzását végzi → death-inducing signaling complex (DISC)

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

TNF receptor közvetítette apoptózis I.

FADD TRADD

FasL TNF-a

Fas/CD95

TNFR-1 TNFR2

TNF-a

ASK1RIP Kaszpáz-8,-10

Daxx

RAIDDTRAF2

RIPFADD

ASK1

DAPK c-IAP1/2 TRAF2

Kaszpáz-8,-10

FADDTRADD

APO-3L/TWEAK APO-2L/TRAIL

DR4/5

Kaszpáz-8,-10

DR3APO-3

FADDTRAF2

RIPKaszpáz-8,-10

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

TNF receptor közvetítette apoptózis II.

TRADD FADDFADD TRADD

FasL TNF-a APO-3L/TWEAK APO-2L/TRAIL

Fas/CD95

TNFR-1 TNFR2 DR3APO-3

DR4/5

TNF-a

FADDASK1

DAPKRAIDDTRAF2

RIP TRAF2RIP

NIK

Kaszpáz-8,-10 Kaszpáz-8,-10

Daxx

FADD

Kaszpáz-6Kaszpáz-9

Kaszpáz-7

MKK7

IKK

Lamin A Actin Gas2Fodrin Rock-1 ICAD

CAD

Acinus PARP

Cytc

NF-kB

Sejt zsugorodásMembrán kitüremkedés

DNSfragmentáció

Kromatinkondenzáció

DNS repair

FLIPs

Kaszpáz független sejthalál

Bcl-2

tBid

Bid

Apaf-1

Kaszpáz-3

FLIP

lkBNF-kB

ASK1

TRAF2

Apoptózis

Bcl-2

HtrA2

Smac

xIAPs

UBUBRIP

JNK

c-IAP1/2

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

TNFR jelátvitelTNF-R1 a legtöbb szövetben expresszálódik →

szolubilis és membrán kötött TNF TNF-R2 csak immunsejtekben expresszálódik →

kizárólag membrán kötött TNFHatások:• IKK → IkB → NFkB → A sejt túlélésében és

osztódásában, illetve gyulladásban szerepet játszó és anti-apoptotikus fehérjék transzkripciója

• MKK7 → JNK → AP-1→ Sejt differenciáció, proliferáció, pro-apoptotikus

• Kaszpáz-8 → Kaszpáz-3 → Apoptózis indukció• Kaszpáz-8 → Bid → Apoptózis indukció

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Apoptózis szabályozása• Apoptózis inhibitorok: Bcl-2 és Bcl-X• Hidrofób farokrészükkel a mitokondrium, a sejtmag vagy

az endoplazmatikus retikulum külső felszínéhez kötődnek • Bcl-2 kötődik az Apaf-1-hez is, és így gátolja az iniciátor

kaszpáz-9 aktivációját• A Bcl-2 overexpressziója a sejt tumoros átalakulását

okozza. Bizonyos vírusok IAP-k (inhibitors of apoptosis) termelődését indítják el

• Bcl-xL gátolja a Bax, Bak, Bid és cardiolipin által kialakított szuper-molekuláris lyukak kialakulását

• A család más tagjai, mint a Bax és Bad a mitokondriumhoz kötődve serkenti az apoptózist citokróm-c felszabadulást okozva

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011BID – híd az extracelluláris és mitokondriális apoptózis útvonalak között• Az aktivált kaszpáz-8 a citoszolikus Bid fehérje amino

terminális részének hasítását okozza, a keletkező t-Bid transzlokálódik a mitokondriumba az apoptózis során

• Bid (BH3 interacting domain death agonist) pro-apoptotikus tagja a Bcl-2 fehérjecsaládnak

• Bid kapcsolódik a Bax-hoz, amely ennek hatására a külső mitokondriális membránba ágyazódik

• A Bax ezen kívül kapcsolódik a mitokondriális voltage-dependens anion csatornához (VDAC) és indukálja annak kinyílását

• Az anti-apoptotikus Bcl-2 fehérjék gátolhatják az apoptózist a BID szequesztrálásával, amely csökkent Bax aktivációhoz vezet

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Effektor molekulák1. Kaszpáz aktiváció → DNS endonukleáz aktiváció →

DNS károsítás2. Kaszpáz-3 bontja a gelsolint → bontja az aktin

filamentumokat → membrán változásokhoz vezet3. Apoptózis alatt a normál állapotban a sejtek amúgy

a sejtmembrán belső felszínén található foszfatidilszerin molekulái kikerülnek a sejtmembrán külső felszínére → ezt felismerik és kötik a fagocita sejtek receptorai

4. Kaszpáz-3 aktiválja a p21-aktivált kináz-2-t (PAK-2) → amely apopotikus testek képződéséhez vezet

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Membrán lipid transzport „scramblázokkal”• A scramblázok tagjai a flippáz nevű transzmembrán

lipid transzporter családnak, amelyek a negatív töltésű foszfolipideket átemelik a belső membrán felszínéről a külsőre és fordítva

• Foszfatidilszerin (PS) transzlokálódik a külső membránba, amely fagocita szignál a makrofágoknak az apoptotikus sejtek eltakarítására

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

PS jelölés Annexin-V-el

Annexin V

Normál sejt

Citoplazmamembrán

Foszfatidilszerin

Apoptózis

Apoptotikus sejt

Annexin V kötődésCa2+ Ca2+ Ca2+

Ca2+

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Efferocitózis• Az efferocitózis hatására az elpusztult sejtek

felvételre kerülnek, mielőtt a membrán integritásuk sérülne, így a sejt tartalma nem jut ki a környező szövetekbe

• Ez megakadályozza, hogy a szövetekbe toxikus enzimek, oxidánsok és más intracelluláris komponensek, pl. proteázok és kaszpázok kijussanak

• Makrofágok, dendritikus sejtek, fibroblasztok és epitél sejtek végzik

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Sejtfelszíni jelenségek is gátolhatnak apoptózist • Túlélési faktorok kötődése (mint növekedési faktorok)

a sejt felszíni receptorokhoz leállíthatják a apoptózis útvonalakat a sejtben

• Ezek PI-3-kináz (foszfoinozitol-3-kináz) kapcsoltak a G- fehérje ras (p21) molekulán keresztül → PI-3,4-P2 és PI-3,4,5-P3 termelődik, amely aktiválja az Akt-ot, egy Ser/Thr protein kinázt → ez foszforilálja a pro-apoptotikus Bad fehérjét, amely így inaktiválódik

• Az aktív Akt prokaszpázt foszforilál → nem tud a citokróm-c-hez kapcsolódni, így gátolva az apoptózist.