Apostila Bioquímica 2008

FACULDADE ESTÁCIO DE SÁ DE CAMPO GRANDE-MS

BIOQUÍMICA – PRÁTICA

PROFESSOR Dr. JOAQUIM CORSINOAPOIO TÉCNICO – Rafael e Euler

Campo Grande – MS 2008INTRODUÇÃO

A – Objetivos Gerais das Aulas Práticas de Bioquímica

As aulas práticas de Bioquímica tem como objetivo criar condições para que os estudantes sejam capazes,

ao final do curso, de:

1. Manipular os equipamentos freqüentemente utilizados em laboratório de bioquímica.

2. Conhecer por meio de reações efetuadas no laboratório, as propriedades químicas das

substâncias que compõem os organismos vivos.

3. Interpretar resultados experimentais.

B – Normas do Laboratório de Bioquímica

1. Espectrofotômetro, centrifuga, banho-maria ou quaisquer outros aparelhos, somente deverão

ser manuseados pelos alunos após instruções, a fim de se evitar danos irreparáveis.

2. Em dias e hora pré-determinados, os alunos terão à sua disposição professores e técnicos

encarregados de orienta-los na execução e interpretação dos referidos trabalhos.

3. Após o uso de um bico de gás, ou de água, não deixa-los aberto, tomando o cuidado de fechar

as torneiras completamente.

4. Não lançar nas pias quaisquer materiais, com exceção de água, para evitar a corrosão dos

encanamentos.

C – Prevenção de Acidentes

1. Trabalhar sempre protegido por avental.

2. Não fumar dentro do laboratório.

3. Ao acender o bico de gás, ter o cuidado de não abrir a torneira de gás, antes que tenha a mão o

palito de fósforo acesso.

4. Não operar com substâncias inflamáveis (álcool, éter) nas proximidades de uma chama. Usar

banho de água ou areia.

5. Os reagentes tóxicos ou corrosivos, álcali ou ácidos fortes (quando concentrados), não deverão

ser pipetados com a boca.

TRABALHO PRÁTICO

IDENTIFICAÇÃO DE AMINOÁCIDOS

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

No final desse trabalho prático, o estudante deverá saber:

1. Executar testes qualitativos em tubos de ensaio para reconhecimento de aminoácidos.2. O significado de seguintes reações particulares.

Reação xantoprotéica Reação de Sakaguchi Reação de aminoácidos que contém enxofre.

1. Reações Gerais dos Aminoácidos a.Formação de sais com ácidos e bases devido à natureza de íon dipolar dos aminoácidos

O conhecimento das propriedades ácido-básicas dos aminoácidos, é extremamente importante para o entendimento de muitas propriedades das proteínas. Além disso, separar, identificar e quantificar os diferentes aminoácidos, que são passos necessários para a determinação da composição e seqüência aminoácidos das proteínas, é baseada no comportamento característicos de cada um destes monômeros.

Os aminoácidos são cristalizados a partir de soluções aquosas neutras em sua forma totalmente ionizada como íons dipolares ou zwitterions. Embora tais íons dipolares sejam eletricamente neutros e não se movam em um campo elétrico, eles possuem cargas opostas nos seus dois pólos. Quando um aminoácido neutro é dissolvido em água, ele pode se comportar como um ácido (doador de prótons) ou como uma base (aceptor de prótons).

OH- OH-

R-CH(+NH3)-COOH R-CH(+NH3) COO- R-CH(NH2)-COO-

H+ H+

[ A-]Sabendo-se que: pH = pK1 + log -------- onde HA é um ácido qualquer [ HA]

Podemos, por uma curva de titulação, calcular os diferentes pK, s de um determinado aminoácido bem como o seu ponto isoelétrico, a partir da relação:

PK, 1 + pK,

2

pI = ----------------------2

Dessa maneira, podemos, a partir dos valores de pK e pI identificar qualquer dos 20 aminoácidos protéicos.

Procedimento experimental

Suspender uma pitada de tirosina em 1 mL de água Acrescentar uma gota de indicador de cor (vermelho cresol), observar que a tirosina não se

dissolve. Adicionar, gota a gota, NaOH 2N e acompanhar a dissolução da tirosina precipitada. Adicionar, gota a gota, HCl 10% e notar a formação de precipitado. Prosseguir a adição de

HCl até dissolução da tirosina. Escrever as reações envolvidas nos diversos passos da experiência, usando a estrutura da

tirosina e explicar cada etapa do processo.

TIROSINA OBSERVAÇÃO: O vermelho de cresol apresenta os seguintes pontos de viragem: pH 0,0 – 2,5 – rosa; pH 2,5 – 6,5 – amarelo; pH acima de 7,0 - roxo

pK, s da tirosina: pK1 = 2,20; pK2 = 9,11; pK3 = 10,07

Responda:

Qual é o pI da tirosina? Se em lugar da tirosina tivesse sido empregada a glicina, os mesmos resultados seriam

observados? Por que?

b. Reação com Ninhidrina

A ninhidrina (hidrato de triceto-hidrindeno) é um composto heterocíclico que forma um derivado corado, após reagir com aminas, com os amingrupos dos aminoácidos livres ou de terminações de proteínas e peptídeos. A ninhidrina oxida o aminoácido, produzindo CO2 , NH3 , e um derivado aldeídico com um átomo de carbono a menos e, conseqüentemente, reduzindo. Posteriormente, a ninhidrina oxidada e reduzida reage com a amônia liberada formando um complexo violeta ou púrpura. Exceto o derivado da prolina, que é amarelo.

As reações podem ser equacionadas da seguinte maneira:

Como a intensidade da coloração do complexo formado é proporcional à concentração de aminoácidos ou peptídeos pequenos, esta reação é freqüentemente utilizada para determinação quantitativa de aminoácidos em solução.

HO CH2 C COO-

NH3+

H

H+ + 3 H2O +

O

O

HO

HO

O

O

N

O-

O

NH3

+ CR

H

O

CO2

O

OH

H

O

+ C

H

R COOH

NH2

O

OH

OH

O

Ninidrina

Ninidrina

Complexo


Tubo Amostra/Concentração Volume - mL Ninhidrina 0,1% - (gotas)

1 Água 1,0 52 Glicina 0,5 mM 1,0 53 Prolina 0,5 mM 1,0 54 Leucina 0,5 mM 1,0 55 Aspartame 0,19%* 1,0 56 Solução protéica 1,0 5

* Aspartame (L-aspartil-fenilalanina metil éste ), adoçante 200 vezes mais potente do que o açúcar. Dissolver o conteúdo de um envelope em 20 mL de água destilada.

Após a adição da ninhidrina, aquecê-los em banho-maria a 100º C por 3 minutos. Compare os resultados com o branco (tubo 1). Anote os resultados e explique-os.

2. Reações específicas de identificação de aminoácidos

a. Aminoácidos com grupos guanidina: Reação de Sakaguchi

Os aminoácidos com grupo guanidina [ ] desenvolvem em meio alcalino Um complexo verde com o a – naftol ( ) que, em presença de

hipoclorito de sódio (NaClO) passa a avermelhado. Identifique o (s) aminoácidos (s) contendo o grupo guanidina.


Tubos Amostra/Concentração

Volume mL

NaOH 2,5 N gotas

α – Naftol gotas

NaClO - 0,5% mL

1 Água 1,0 3 3 12 Arginina 0,5 mM 1,0 3 3 13 Glicina 0,5 mM 1,0 3 3 14 Triptofano 0,5 mM 1,0 3 3 15 Solução Protéica 1,0 3 3 1

Misturar e observar a cor, que desaparece após alguns minutos, usando o tubo 1 como controle. Anote os resultados e explique-os.

b. Reação xantoprotéica

H2N C NH R

NH2

OH

Específica para aminoácidos que apresentam anel aromático. O precipitado branco que se forma é devido à ação do HNO3 (ácido mineral forte), e o desenvolvimento da cor amarela ocorre por formação de nitrocompostos (anel aromático + NO2 ). Relacione os aminoácidos aromáticos e suas respectivas estruturas.


*** OBSERVAÇÃO: Para que se garanta a segurança, os experimentos a seguir deverão ser efetuados na capela.

Tubos Amostra/Concentração Volume - mL HNO3 - mL1 Água 2 12 Glicina 0,5 mM 2 13 Triptofano 0,5 mM 2 14 Tirosina 0,5 mM 2 15 Solução Protéica 2 1

Anote os resultados e explique-os.

c. Reação para aminoácidos contendo enxofre

Aminoácidos que contém enxofre, em meio alcalino e, à quente, liberam o enxofre que aparece na forma de sulfeto de sódio (Na2S). Este reage com acetato de chumbo (CH3COO)2

Pb, formando o PbS, que escurece a reação:

Cite os aminoácidos que contém enxofre, com suas respectivas fórmulas estruturais.


Tubos Amostras Volume - mL NaOH 2 N mL

100º C (CH3COO)2Pb mL

1 Água 2 1 0,52 Cisteína 2 1 0,53 Glicina 2 1 0,54 Solução Protéica 2 1 0,5

Anote os resultados obtidos e explique-os.

CH3COONa+PbS(CH2COO)2Pb+Na2S

R C NH2

H

COOH

+Na2SNaOH+R S R C NH2

H

COOH

Aminoácido com enxofre

Sulfeto de sódio Aminoácido sem

enxofre

Sulfeto de sódio

Acetado de chumbo

Sufeto de chumbo

Acetado de sódio

CARACTERIZAÇÃO DE PROTEÍNAS

I – INTRODUÇÃO

As proteínas, que são macromoléculas de peso molecular definido, são eletrólitos cujo comportamento se ajusta aos mesmos princípios físicos de eletrólitos de massa molecular menor. A natureza química dos radicais R (cadeias laterais) dos aminoácidos que compõe a estrutura primária das proteínas determina a sua estrutura secundária e/ou terciária.

O comportamento físico-químico das proteínas está relacionado a vários fatores. A solubilidade por exemplo, depende pH, força iônica do meio, constante dielétrica do solvente e temperatura. Em geral as proteínas são menos solúveis no ponto isoelétrico. Neste pH as proteínas não apresentam carga efetiva (as cargas positivas são iguais às negativas) e portanto não atuam como forças eletrostáticas entre as outras moléculas presentes no meio. De ambos os lados do pH isoelétrico todas as moléculas terão carga efetiva positiva ou negativa. Nestes casos,pelo fato das moléculas de proteínas se repelirem, haverá menor tendência para agregação e precipitação.

II – OBJETIVOS ESPECÍFICOS

No final deste trabalho prático o aluno estará familiarizado com as propriedades físico-químicas das proteínas, bem como as técnicas e reações de identificação das mesmas.

III – REAÇÃO DO BIURETO 3.1 – Fundamento

A reação do biureto ocorre com substâncias que contenham grupos e grupos nitrogenados. Sendo assim, essa reação é positiva para todas as proteínas e peptídeos graças às suas ligações peptídicas. Estas moléculas, quando tratadas com uma solução diluída de sulfato de cobre, em meio alcalino, dão coloração púrpura característica, devido à formação do complexo de coordenação entre o átomo de cobre e 4 átomos de nitrogênio.

Biureto - (complexo de coordenação entre peptídeos e cobre II, de cor púrpura)

C O

NH

Cu

HN NHCHR

CO

HN

HC R

C O

NH

3.2 – Procedimento

Montar uma bateria com:

Tubos Amostra CuSO4 a 0,5% mL NaOH a 10% mL1 Água, 2 mL 0,5 0,52 Clara de ovo(a), 2 mL 0,5 0,53 Gema de ovo(b), 2 mL 0,5 0,54 Leite(c), 2 mL 0,5 0,55 Extrato de Soja(d), 2 mL 0,5 0,5

Soluções preparadas por: a) homogeneização de 1 clara de ovo com 50 mL de água; b) homogeneização de 1 gema de ovo com 50 mL de água; c) homogeneização de 50 g (5 colheres médias) de leite em pó com 100 mL de água; d) homogeneização de 10 g de farinha de soja de semente de soja em 100 mL de água

destilada.

Observar que em alguns tubos haverá formação de uma coloração violeta, característica de reação positiva, enquanto que no tubo contendo apenas água e os reagentes verificar-se-á uma cor azul escura característica do cobre em meio alcalino (formação de Cu (OH)2 e de óxidos de Cu).

IV – REAÇÕES DE PRECIPITAÇÃO DE PROTEÍNAS

4.1 – Reações de Precipitação de Proteínas com Desnaturação

4.1.1 – Termocoagulação – Coagulação pelo calor

As proteínas são termolábeis, quando submetidas à ação do calor desnaturam irreversivelmente.

Procedimento Colocar em tubos de ensaio soluções contendo proteínas (ovo, soro, etc); Aquecer, e observar a coagulação.

4.1.2 – Coagulação com ácidos minerais – Reação de Heller

Fundamento

Os ácidos minerais fortes desnaturam as proteínas, transformando-as em metaproteínas, insolúveis. A reação de Heller (reação de proteínas com HNO3 concentrado) é freqüentemente utilizada para a pesquisa de albumina na urina e permite a dosagem semi-quantitativa. Esta reação é sensível a concentração da ordem 1:30.000.

Procedimento Experimental

***OBSERVAÇÃO: Para que se garanta a segurança, o experimento a seguir deverá ser efetuado na capela, pelo professor, de maneira demonstrativa.

Colocar um tubo de ensaio: 2 mL de solução protéica Juntar cuidadosamente e vagarosamente, pelas paredes do tubo, 2 mL de HNO3

concentrado, sem misturar. Observar no limite de separação das duas camadas um anel branco (proteína e meta-proteína).

4.1.3 – Precipitação com Sais de Metais Pesados

Alguns sais de metais pesados precipitam as proteínas, por exemplo: HgCl2, AgNO3

CuSO4, FeCl3, (CH2COO)2Pb (acetato de chumbo), etc. Outros somente precipitam proteínas em meio ácidos. Por exemplo: Na2WO4 (tungstato de sódio).

Procedimento A

Tubo Solução Protéica - mL

CuSO4 0,5% FeCl3 1% (CH2COO)2 Pb 1%

1 22 2 *gotas3 2 *gotas4 2 *gotas

* Adicionar gotas das soluções de metais pesados à solução protéica, até observar a formação de precipitado.

Procedimento B

Colocar em um tubo de ensaio: 2 mL de solução protéica; 1 mL de solução de Na2WO4 10% Agitar. Notar que não ocorre precipitação; Então Juntar: 0,5 mL de H2SO4 10%. Forma-se imediatamente um precipitado.

Esta reação é utilizada em análises clínicas para desproteinização de sangue (método de Follin – Wu), quando os métodos de dosagens de Glicose, Uréia, Creatinina, assim o exigem.

Interprete os resultados observados.

4.1.4 – Precipitação com Solventes Orgânicos

Colocar em tubo de ensaio: 2 mL de solução protéica; 1 mL de etanol.

Notar a formação de um anel branco na separação das camadas.

4.1.5 – Precipitação por reagentes alcalóides

Os reagentes alcalóides (ácido pícrico, cítrico, tânico, etc...), agem pelo seu âniom e reagem com as proteínas formando sais (proteinados) insolúveis. Esta reação só é possível se a proteína apresentar carga positiva, portanto, no lado ácido do seu pI. Quando adicionamos base, re-dissolve o precipitado formado.

Reação de Esbach


Colocar em tubo de ensaio: 2 mL de solução protéica; 1 mL do reativo de esbach (ácido pícrico – 1,0g / ácido cítrico – 2,0g em 100 mL de H2O).

Forma-se um precipitado amarelo. Juntar: 1 mL de NaOH 10%. Observar a dissolução do precipitado. Explicar.

ENZIMAS I

Objetivos Específicos

Ao final deste trabalho prático o estudante deverá saber: Manipular experimentalmente soluções de enzimas; Identificar experimentalmente as propriedades de termolabilidade e especificidade; Manipular reações catalisadas por enzimas com a finalidade de determinar

semiquantitativamente a influência da concentração de enzima, temperatura e do pH na atividade enzimática.


1. Atividade da Catalase

Enzima presente em quase todas as células animais.

a. Em um tubo de ensaio colocar: 10 gotas de sangue 5 mL de água destilada – homogeneizar 1 mL de H2O2 3% (10 volumes) – agitar

b. Note a formação de espuma abundante. Procure uma explicação para o fato. Esquematize a reação ocorrida.

2. Atividade da Peroxidase

A peroxidase é uma enzima encontrada em todas as plantas superiores, sendo rara em tecidos animais. As exceções são leucócitos, hemácias, fígado e rins.

a. Colocar em dois tubos de ensaio:

Tubos Reativo Kastle-Meyer Água - mL Sangue diluído - mL

H2O2 3% gotas

1 1,0 - 5,0 32 1,0 5,0 - 3

b. Note o aparecimento imediato de cor rosa, que se intensifica, lentamente, no tubo que contém sangue.

OBS.: O reativo de Kastle-Meuer é uma solução alcalina de fenolftaleína reduza (AH2), que oxida diidroxifenóis na presença de H2O2, formando a quinona correspondente. Não sendo oxidada pelo peróxido de hidrogênio (H2O2), nem pelo oxigênio molecular (O2). O sangue contém peroxidase, que transfere dois átomos de hidrogênio do substrato (AH2) para H2O2, que é convertido em H2O, oxidando assim a fenolftaleína, que adquire coloração rósea, em meio alcalino.

AH2 + H2O2 ® 2H2O + A+

Fenolftaleína reduzida Fenolftaleína oxidada

IDENTIFICAÇÃO DE CARBOIDRATOS

Introdução

Os carboidratos podem ser identificados por meio de várias reações. Algumas dessas reações envolvem a formação de complexos corados, e a especificidade da identificação depende da estrutura dos carboidratos. Assim, há reações gerais e outras para estruturas mais específicas, como aquelas, para aldoses, cetoses, mono e dissacarídeos redutores, etc.


No final deste trabalho prático, o estudante deverá saber:

Executar testes qualitativos para reconhecimento de carboidratos Significado dos seguintes testes: Molisch, Barfoed, Seliwanoff e Benedict.

1. Reação de Molich

Os carboidratos e algumas substâncias, que se transformam em furfural ou seus derivados na presença de H2SO4, reagem com alta naftol, formando compostos de condensação, de cor violeta, e de estrutura incerta. Abaixo estão representadas as reações de formação de furfural e de hidroximetilfurfural, respectivamente a partir de uma pentose e de uma hexose.


Preparar os seguintes 8 tubos de reação:

Tubos Amostra Volume mL Alfa-naftol 5% em etanol gotas

1 Água 1,0 32 Glicose 0,1 M 1,0 33 Frutose 0,1 M 1,0 34 Sacarose 0,1 M 1,0 35 Amido 0,1% 1,0 36 Maltose 0,1% 1,0 37 Aspartame 0,2%” (*) 1,0 38 Ciclamato/sacarina 1,0 3

+ H2SO4

O CO

HC5H10O5

+ H2SO4

O CO

HHOH2C

C6H12O6 a-

a-Composto violeta

Composto violeta

furfural

hidroximetilfurfural

Pela parede do tubo inclinado, adicionar lentamente, sem agitar, 2 mL de h2SO4 concentrado (CUIDADO CORROSIVO!!!). Anotar os resultados, usando o tubo 1 (branco, controle) como referência.( *) Aspartame = L – aspartil-L –fenilalanina – metil – éster.

O teste de Molisch serve para identificar carboidratos. Estes, pela ação desidratante do ácido sulfúrico, transformam-se em furfural no caso de pentoses, ou hidroximetilfurfural no caso de hexose. Estes, por sua vez, reagem com os fenóis (timol, natol), dando origem a um composto de cor roxa. A coloração verde que às vezes se forma, deve ser desprezada. Para o bom êxito desta reação é necessário que o tubo esteja seco, e que haja a menor agitação possível.

2. Reação de Barfoed

Através desta reação se distingue um mono de um dissacarídeo, pela velocidade com que se forma Cu2O, a partir da reação entre acetato cúprico e o carboidrato. Oreativo de Barfoed oxida os monossacarídeos ( a mono-ácidos ) mais rapidamente que os dissacarídeos permitindo, portanto, a diferenciação entre ambos ( mon e dissacarídeos ).

Cu +2 (aq) + CH 3COO - (aq) + carboidrato ® Cu 2O (prec.) + CH3COO - (aq) + carboidrato oxidado

3. Reação de Seliwanoff

Na presença de HCl, as cetoses, mais rapidamente do que as aldoses, formam derivados de furfural que se condensam com o reagente de Seliwanoff, que contém resorcinol (1,3 – bezenodiol), produzindo compostos avermelhados. A reação exige aquecimento em banho fervente, e é positiva também para sacarose que, nas condições do teste, é hidrolisada em glicose e frutose. Mesmo a glicose pode dar reação positiva, se o aquecimento for prolongado, porque na presença de HCl, ocorre a sua transformação em frutose. A concentração do HCl na reação não deve ultrapassar 12 % (aproximadamente 4 N).

A reação que ocorre é a seguinte:

Procedimento experimentalPreparar 5 tubos de ensaio:

Tubos Amostra Volume mL Seliwanoff (Resorcinol 0,05 % em HCl 2 N)

1 Água 1 1,52 Frutose 0,1 M 1 1,53 Glicose 0,1 M 1 1,54 Sacarose 0,1 M 1 1,55 Pentose 0,1 M 1 1,5

Após misturar o conteúdo dos tubos, colocar em banho de água fervente, e acompanhar o desenvolvimento da cor a cada 2 ou 3 minutos, até no máximo 15 minutos.

Cetose + resorcinolAquecimento

HClO C

O

HComposto violeta

furfural

Quando notar o aparecimento da cor vermelha acompanhada ou não de precipitado de cor marrom avermelhado, retirar o tubo do banho. Para dissolver o precipitado eventualmente formado, acrescente algumas gotas de etanol absoluto, agitando o tubo. Anotar os resultados obtidos, lembrando-se sempre de usar o tubo 1 (controle) como referência.

4. Reação de Benedict

Utilizada para identificação de carboidratos redutores. Íons de metais como, cobre, prata, ferro, mercúrio, etc, são reduzidos por grupos aldeídos ou cetônicos livres de vários carboidratos. Colocando-se hidróxido de cobre II, Cu (OH)2, de cor azul, em meio alcalino, forma-se uma suspensão que, sob aquecimento, se precipita como óxido de cobre II, CuO de cor preta. Mas se compostos redutores forem acrescentados à suspensão, o Cu (OH)2 é reduzido a Cu2O, que se precipita e cuja cor se situa entre o amarelo e o vermelho. As reações abaixo mostram o que ocorre o Cu (OH)2 na presença e na ausência de agentes redutores, em meio alcalino e a quente.

Ausência de composto redutor:

Meio alcalino Cu(OH)2 CuO + H2O (azul) Aquecimento (preto)

Presença de composto redutor:

Meio Alcalino Cu (OH)2 Cu2O + H2O (azul) Aquecimento (amarelo/vermelho)

Como não é prático utilizar uma suspensão de Cu2+, e também para evitar que o CuO (preto) mascare o resultado da reação, acrescenta-se ao meio da reação um composto orgânico solubilizador que, em meio alcalino adequado, reage com os íons metálicos, formando um complexo iônico solúvel. Este complexo se dissocia em grau suficiente para que haja, nomeio da reação, íons metálicos disponíveis para se reduzirem. No caso do reagente de Felihling, emprega-se CuSO4 à 2%, solubilizado por tartarato de Na+ e de K+ 10%, dissolvido em NaOH 2 M; no caso de reagente de Benedict (qualitativo), emprega-se CuSO4 2% solubilizado por citrato de Na+ 20%, dissolvidos em Na2CO3 2 M.

Os testes de carboidratos redutores são positivos para compostos com grupamento – OH glicosídico livre, mas negativos para polímeros de cadeias longas. Assim, amido não dá reação positiva, a não ser após a sua hidrólise, e a reação é tanto mais positiva quanto maior a extensão da hidrólise.

Até alguns anos atrás, o teste de substâncias redutoras, sobretudo na urina, era empregado no diagnóstico de pacientes diabéticos, ou suspeito de sê-lo, de modo rotineiro. Atualmente, há testes mais sensíveis para dosagem rápida de glicose, baseadas em ensaio enzimático (glicofita/glicose-oxidase) e que são muitos mais práticos, por não exigirem a disponibilidade dos reagentes mencionados.


Identificação de substâncias redutores com reagentes de Benedict (qualitativo)

Preparar 9 tubos de ensaio:

´Tubo Amostra Volume mL Reagente de Benedict Resultado1 Água 1,0 1,02 Glicose 0,1 M 1,0 1,03 Frutose 0,1 M 1,0 1,04 Sacarose 0,1 M 1,0 1,05 Amido 0,1% 1,0 1,06 Maltose 0,1 M 1,0 1,07 Aspartame 0,2% 1,0 1,08 Ciclamato/Sacarina 1,0 1,09 Urina humana 1,0 1,0

Aquecer todos os tubos em banho de água fervente , durante 5 minutos. Anotar os resultados obtidos (se positivo, numa escala de 1 a 4 cruzes, + a ++++), comparando com o tubo 1 (controle). Explique os resultados.

IDENTIFICAÇÃO DE POLISSACARÍDEOS


No final deste trabalho prático o estudante deverá saber:

1. Extrair grãos de amido de batata2. Preparar soluções de amido3. Reconhecer a presença de amido pelo teste de iodo – Lugol4. Realizar a hidrólise química do amido5. Determinar a progressão de hidrólise pelos testes de iodo e Benedict6. Reconhecer os produtos de hidrólise parcial e total de amido7. Extrair e caracterizar o glicogênio hepático8. significado das reações e operações realizadas

I. Extração e identificação do amido

O amido não pode ser detectado pelos testes de redução, porque dispõe de um número muito reduzido de resíduos de glicose livre, para determinação da atividade redutora. Na estrutura do amido, a cadeia linear é constituída por resíduos de glicose ligados entre si por ligações a (1,4), enquanto na cadeia ramificada ocorrem ligações a(1,4) e a (1,6). A cadeia linear (amilose) é solúvel e a cadeia ramificada (amilopectina), insolúvel. O amido da batata é constituído por 98% de amilose e 2% de amilopectina.

Na presença de iodo, o amido forma um complexo de cor azulada, de composição incerta. Esse complexo se desfaz sob aquecimento, perdendo a cor azul, mas é refeito quando é resfriado. A celulose, também um polímero de glicose, mas constituído de ligações b (1,4) não reage com iodo, enquanto o glicogênio, à semelhança do amido, reage formando um complexo de cor avermelhada. Também, à semelhanç do amido, o glicogênio é formado por ligações de tipo a (1,4) e a(1,6).

Procedimento experimentalA. Extração do amido

1. Raspar integralmente uma batata, com uma lâmina de vidro, transferindo as raspas para um béquer de 250 mL

2. Adicionar aproximadamente 50 mL de água destilada e agitar com bastão de vidro3. Filtrar em gaze, recolhendo o filtrado em um béquer de 500 mL. Espremer a gaze4. Extrair novamente o amido da raspa com 50 mL de água, filtrando em gaze e recolhendo o

filtrado no béquer de 500 mL5. Deixar o amido se depositar no béquer aproximadamente 20 minutos6. Descartar, cuidadosamente, o líquido sobrenadante.

B. Preparação da solução de amido

1. Colocar aproximadamente 25 mL de (amido) completo para 50 mL (água quente)2. Adicionar aproximadamente 50 mL de água destilada fria ao deposito de amido, obtido em

A.63. Adicionar esta última suspensão à água em ebulição, lentamente, sob constante agitação4. Continuar o aquecimento até que se forme uma solução opalescente em banho-maria,

fervente5. Utilizar esta solução para as experiências subsequentes

C. Detecção do amido – reação com Lugol

Tubos Amostras Quantidades mL

Lugol (iodo 5% em KI 10%) gotas

Resultado

1 Água 1,0 22 Amido obtido em B 1,0 23 Maltose 0,1% 1,0 24 Celulose 1,0 25 Glicose 0,1 M 1,0 26 Sacarose 0,1 M 1,0 2

Aquecer em banho de água fervente, durante 1 a 2 minutos, os tubos que dissolveram cor com Lugol. Observar. Resfriar. Observar novamente. Anotar os resultados, usando sempre o tubo 1 (controle) como referência.

D. Hidrolise ácida do amidoA estrutura polimérica do amido pode ser desfeita por hidrólise das suas ligações

glicosídicas. Fisiologicamente, o amido é hidrolisado enzimaticamente pela amilase salivar e pela amilase pancreática. Quimicamente, obtém-se resultado semelhante empregando-se HCl concentrado, à quente.

Durante a hidrólise do amido são formados compostos intermediários, de cadeias de glicose de tamanhos variáveis, e no final do processo obtém-se uma mistura de glicose e maltose.

Procedimento experimental:Transferir 25 mL de amido para um elenmyer e adicionar 1 mL de HCl concentrado,

aquecer em banho maria fervente por 30 minutos. Sendo que deve retirar, logo que adiciona o HCl, 1 mL da solução e transferir 0,5 mL

para um tubo e 0,5 mL para outro tubo de ensaio. Adicionar em um dos tubos 3 gotas de lugol, observar a coloração, e no outro adicionar 1 mL do reativo de Benedict e aquecer em banho maria fervente, observar a coloração.Repetir o processo em intervalos de 5 a 5 minutos.

Amido amido solúvel + maltose

Eritrodextrina + maltose

Acrodextrina + maltose

Maltose

Glicose

EXTRAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE LIPÍDEOS

I. Extração de lipídeos de semente se soja

Procedimento experimentala. Extração Em copo de 100 mL pesar 10 g de soja moída e seca Adicionar 25 mL de álcool Agitar por 5 minutos Filtrar através de papel de filtro, para um béquer Lavar o resíduo com 10 mL de álcool por duas vezes Evaporar o filtrado em banho de areia, com agitação constante até diminuição total do álcool Observar o resíduo amarelo e oleoso. Esse óleo será utilizado como material para as provas

seguintes.

b. Caracterização1. Solubilidade

Em uma bateria de 9 tubos de ensaio numerados, colocar 3 gotas de óleo vegetal em cada um e adicionar 3 mL de:

1º- Água2º- HCl a 4%3º- Na2CO3 a 2%4º- NaOH a 10%5º- Etanol6º- Éter Sulfúrico7º- Clorofórmio8º- Benzeno9º- Acetona

Agitar vigorosamente e verificar:

a) Insolubilidade no 1º e 2º tubosb) Emulsão estável nº 3 e 4c) Solubilidade parcial no tubo nº 5 que se torna total pelo aquecimentod) Solubilidade total no demais tubos.

Juntar mais 20 gotas de óleo nos tubos contendo:

Éter Clorofórmio Benzeno AcetonaObservar a grande solubilidade do óleo nesses solventes.

I – DOSAGEM DE GLICOSE

Vários métodos foram propostos para a determinação de glicose. No início, era utilizado o seu poder redutor, várias técnicas neste sentido foram desenvolvidas. Os oxidantes mais empregados foram os íons cobre e os íons ferricianeto; ambos, em meio alcalino. Naturalmente, estes métodos sofrem interferências de outros agentes redutores, presentes na amostra, o que determina a falta de especificidade para a análise em questão.

Outros métodos, aonde a glicose reage diretamente com certas substâncias orgânicas, foram desenvolvidos. Destas substâncias, a ortotoluidina é a mais utilizada.

Posteriormente, os métodos enzimáticos foram surgindo e colocados em prática. Como exemplo, podemos citar o método de glicose-oxidase e o método da hexoquinase.

1 – MÉTODO DA ORTOTOLUIDINA

A glicose reage especificamente com a ortotoluidina, a quente e em presença de ácido acético glacial, produzindo uma mistura, em equilíbrio, uma glicosilamina e a correspondente base de Schiff. A intensidade da cor é medida, fotometricamente.

AMOSTRASoro, plasma, urina, líquor e outras. O soro deve ser colhido em jejum e livre de

hemólise.

REATIVOSA – Reativo cromogênico

Num frasco de 2.000 mL, colocar 1 g de tiouréia, acrescentar 940 mL de ácido acético glacial e 60 mL de ortotoluidina. Misturar até completa dissolução e guardar em frasco escuro. A temperatura ambiente, é estável por 12 meses e, em geladeira, por 24 meses.

B – Solução padrão de glicose

Pesar, exatamente, 1 g de glicose e dissolver em 800 mL de água destilada. Adicionar 1 g de ácido benzóico e diluir com água destilada até completar 1.000 mL. Estável por um ano, quando conservada em geladeira.

Procedimento

a. Tomar 3 tubos, e proceder como a seguir:Branco Amostra Padrão

Água destilada 0,05mL - -Soro - 0,05 mL -

Padrão - - 0,05 mLReativo cromogênico 2,5 mL 2,5 mL 2,5 mL

Misturar e colocar os tubos, em banho fervente, durante 10 minutos. Esfriar em água corrente por 2 a 3 minutos e ler as absorvâncias, em 630 nm.

CÁLCULO

Glicose (mg/dL) + Absorvância da amostra / Absorvância do padrão x 100

NOTAS

a. A urina e o líquor podem seguir a metodologia direta para o soro ou plasma.b. A hemoglobina até 350 mg/dl e a bilirrubina até 20 mg/dl não interferem no método sem desproteinização. Quantidades maiores dão erros positivos.

c. A lactose e a galactose, presentes em casos de gravidez e durante a lactação ou em casos raros de galactosemia infantil, podem reagir com a ortotoluidina, manose também.d. É importante o uso de ortotoluidina, a mais incolor possível. A adição de tiouréia como antioxidante confere ao reativo uma cor ligeiramente amarelada. A absorbância desta solução frente a um branco de ácido acético não deve ser superior a 0,015e. É recomendaável não desproteinizar com ácido perclórico. O resfriamento, em água muita fria, pode provocar turvação.f. A reação segue a lei de Beer até 1.500 mg/dl. Quando os valores forem maiores que 300 mg/dl, diluir a solução final com reativo de cor, efetuar novamente as leituras e calcular, multiplicando o resultado final pelo fator de diluição, até 1.500 mg/dl.g. Somente os métodos do ortotoluidina e da hexoquinase fornecem resultados exatos para a glicose urinária, em concentrações inferiores a 0,2 g/dl.

VALORES DE REFERÊNCIA

Soro e plasma – 70 a 110 mg/dLSangue total – 60 a 100 mg/dLLíquor – 40 a 70 mg/dLUrina – até 30 mg/dL ou até 0,25 g/24 horas.

2 – GLICOSE ENZIMÁTICA

Finalidade

Sistema enzimático para a determinação de Glicose no sangue, líquor e líquidos ascíticos, pleural e senovial em método cinético. Somente para uso diagnóstico in vitro.

Princípio

A glicose oxidase catalisa a oxidação da Glicose de acordo com a seguinte reação:

GODGlicose + O2 + H2O Ácido Glucônico + H2O2

H2O2 formado reage com 4-aminoantipirina e fenol, sob ação catalisadora da peroxidase, através de uma reação oxidativa formando um antipirilquinonimina vermelha cuja intensidade de cor é proporcional à concentração da glicose na amostra.

POD 2H2O2 + 4 – Aminoantipirina + fenol Antipirilquinonimina + 4H2O

REAGENTES

Enzimas – conservar entre 2 – 8 ºCTampão – Conservar entre 2 – 8 ºC. Tampão fosfato – pH 7,4Padrão – 100 mg/dl – Estável entre 15 – 25 ºC. Após o manuseio armazenar, bem vedado, entre 2 – 8 ºC, para evitar evaporação.

INFLUÊNCIAS PRÉ-ANALÍTICAS

Ácido ascórbico em concentrações acima de 100 mg/L interferem na reação diminuindo os resultados.

Nas 24 horas que sucedem à ingestão aguda de álcool, ocorre significativa redução na glicemia. As reduções podem também ser significativas nos indivíduos submetidos a jejum prolongado ou em obesos tratados com dieta com baixo valor calórico.

AMOSTRA

A amostra de sangue deve ser obtida após jejum de no mínimo 8 horas ou de acordo com recomendação médica.

Usar plasma ou soro tomando as precauções a seguir. Realizar a colheita do sangue utilizando um anticoagulante contendo um inibidor da glicólise. As amostras de sangue não contendo um antiglicolítico, devem ser centrifugadas imediatamente após a colheita e o plasma ou soro, separados das células ou coágulo. O mesmo procedimento deve ser realizado na colheita de líquor e líquidos ascítico, pleural e senovial.

Nas amostras com antiglicolítico, a concentração da glicose permanece estável por até 24 horas. No plasma, soro e outros líquidos separados das células, a glicose permanece estável por 3 dias entre 2 – 8 ºC, quando não ocorre contaminação bacteriana.

INTERFERÊNCIAS

Bilirrubina até 16 mg/dL, Hemoglobina até 160 mg/dL e Triglicérides até 750 mg/dL não produzem interferências significativas.

PROCEDIMENTOTomar 3 tubos de ensaio e proceder como a seguir:

Branco Teste PadrãoAmostra - 0,02 mL -Padrão - - 0,02 mL

Reagente de cor 2,0 mL 2,0 mL 2,0 mL

Misturar vigorosamente e colocar em banho-maria a 37 ºC durante 15 minutos. Determinar as absorvâncias do teste e padrão em 505 nm. A cor é estável por 60 minutos.

CÁLCULOS

Glicose (mg/dL) = Absorvância do teste x 100 / Absorvância do padrão

LINEARIDADE

A reação é linear até 400 mg/dl. Diluir a amostra com NaCl mol/L (0,85%), dosar novamente e multiplicar o resultado obtido pelo fator de diluição.

VALORES DE REFERÊNCIA

Plasma: 70 a 110 mg/dLLíquor: 2/3 da glicemia – em amostras colhidas simultaneamente.

SIGNIFICADO CLÍNICO

Valores elevados ocorrem nos vários tipos de diabetes primárias, nos estados de intolerância à glicose e nas diabetes secundárias a várias doenças (hipertiroidismo, hiperpituitarismo, hipoadrenocorticismo, etc).

Valores diminuídos ocorrem nas hipoglicemias que podem ser devidas a várias causas. Quando a ocorrência de sintomas de hipoglicemia é relacionada à alimentação, duas formas de hipoglicemia podem ser definidas: hipoglicemia do jejum e pós-prandial.

Causas mais comuns de hipoglicemia do jejum: hiperinsulinismo, tumores extrapancreáticos, síndrome auto-imune (formação espontânea de anticorpos para receptores da insulina), insuficiência supra-renal e/ou hipofisária, doença hepática grave e alcoolismo.

A hipoglicemia pós-prandial é classificada em hipoglicemia alimentar, hipoglicemia do diabético tipo II e do paciente com intolerância à glicose.

A redução da concentração de glicose nos líquidos corporais encontra-se relacionada a processos inflamatórios ou infecciosos. A concentração de glicose no líquor representa um dos parâmetros para a distinção entre meningite bacteriana e virótica.

OBSERVAÇÕES

A limpeza e secagem adequadas do material utilizado são fatores fundamentais para a estabilidade dos reagentes e obtenção de resultados corretos

A água utilizada na limpeza do material deve ser de boa qualidade A urina contém numerosas substâncias, principalmente o ácido úrico, que interferem nos

métodos utilizando a reação GOD-POD levando a resultados falsamente diminuídos.

COLESTEROL

Principio O colesterol no soro é quantificado através das seguintes reações enzimáticas:

1. ésteres de colesterol col. esterase colesterol livres mais ácidos graxos

2. colesterol livre + O2 col. esterase colesterona + H2O2

3. 2 H2O2 + 4 aminoantipirina + p-hidroxibenzoato peroxidase 4 - antipirilquinonimina + 4 H2O

AmostraSoro ou plasma isentos de hemólise (anticoagulante - heparina). Jejum de 12 a 16 h. Amostra quando refrigerada de 2 a 8ºC se conserva por 7 dias, se mantida a 10ºC conserva-se por 3 meses.O uso de anticoagulantes como: citrato, EDTA e Oxalato, provocam resultados ligeiramente diminuídos.

ProcedimentoIdentificar três tubos com B (branco), T (teste) e P (padrao)

B T PReagente de cor 2,0 mL 2,0 mL 2,0 mLSolução padrão - - 20 mLAmostra - 20 mL -

Misturar por agitação e incubar por 10 minutos em banho Maria a 37ºC. retirar do banho Maria e efetuar as leituras das absorvancias de P e T em espectrofotômetro em 510 nm zerando o aparelho com o branco.

Calculo absorvancia do teste Colesterol (mg/dL) = ---------------------------- x 200 absorvancia do padrao

Valores de referencia

Em termos estatísticos, na população brasileira, em ambos os sexos, os níveis de colesterol situam-se na faixa de 150 – 240 mg/dL.

Colesterol (mg/dL)Desejável < 200Risco moderado 200 – 239Alto risco (DCI) > 240

TRIGLICERIDES

Principio Os triglicérides são determinados de acordo com as seguintes reações:

Triglicéride lípase da lipoproteína glicerol + acido graxo

Glicerol + ATP glicerolquinase Mg+2 glicerol - 3 - fosfato + ADP

Glicerol - 3 - fosfato + O2 glicerol-3-fosfato dihidroxiacetona + H2O2 oxidase2 H2O2 + 4 aminoantipirina + ESPAS peroxidase quinoneimina + 4 H2O

AmostraA amostra deve ser obtida após jejum de 12 a 14 h. Soro. O analito e estável por 2 - 8ºC.

O armazenamento prolongado da amostra não e recomendado porque varias substancias podem ser hidrolisadas liberando glicerol, levando a obtenção de resultados falsamente elevados.

ProcedimentoTomar três tubos de ensaio e proceder como a seguir

Branco Teste PadrãoAmostra - 0,01 mL -Padrão - - 0,01 mLReagente de cor 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL

Misturar e incubar por 10 minutos em banho Maria a 37ºC. O nível da água do banho deve ser superior ao nível dos reagentes nos tubos de ensaio. Efetuar as leituras das absorvancias do padrão e do teste em espectrofotômetro em 540 nm.

Calculo absorvancia do teste Triglicérides (mg/dL) = ---------------------------- x 200 absorvancia do padrao


TriglicéridesDesejável < 200Limiar alto 200 – 400Elevado 400 – 1000Muito elevado > 1000

LDL - COLESTEROL

Fundamento

As lipoproteínas de baixa densidade (LDL ou b-lipoproteínas) separam do soro, pecipitando-as seletivamente pela adição de polímeros de alto peso molecular. Após centrifugar, no sobrenadante fica o resto de lipoproteínas (HDL e VDL); o colesterol ligado às mesmas determina-se utilizando o sistema enzimático Colesterol oxidase/peroxidase com colorimetria segundo Trinder (Fenol/4-AF).

Pela diferença obtida entre o colesterol total e o determinado no sobrenadante, obtém se o colesterol ligado as LDL.

AmostraSoro

a) Coleta: o paciente deve estar em jejum (de 12 a 16 h) b) Aditivos: não são necessários c) Substâncias interferentes conhecidas: os soros hipertrigliceridemicos (com quilomicrons)

produzem sobrenadantes turvos; a bilirrubina interfere nos níveis maiores de 50 mg/L

Procedimento

Em um tubo de Kahn, colocar:

Amostra 200 mL Reagente precipitante 100 mLHomogeneizar agitando (sem inverter) durante 20 segundos e deixar 15 minutos no banho Maria a 20-25ºC. Centrifugar 15 minutos a 3000 rpm. Separar rapidamente o sobrenadante. Vide limitações do procedimento. Utilizar o sobrenadante como amostra para o ensaio colorimetrico.Em três tubos de fotocolorimetros marcados B (branco), P (padrão) e D (desconhecido), colocar:

B P DSobrenadante - - 100 mLPadrão - 20 mL -Reagente de trabalho

2 mL 2 mL 2 mL

Misturar e incubar 5 minutos a 37ºC quando seja utilizado o reagente de trabalho de Colestat enzimático AA/liquida ou 15 minutos a 37ºC quando seja utilizado aquele de Colestat enzimático. Tirar do banho Maria e esfriar. Ler em espectofotometro a 505 nm.

Calculo do resultado

LDL colesterol (g/l) = colesterol total (*) – (D x f)

f = 0,624 P(*) valor obtido com Colestat enzimático ou Colestat enzimático AA liquida.

Valores esperados

Risco baixo ou nenhum (pessoas normais): menores de 140 mg/dLRisco moderado (pessoas com probabilidade de contrair ECC): entre 140 e 190 mg/dLRisco elevado (pessoas suspeitas de ter ECC): acima de 190 mg/dL

HDL COLESTEROL

Principio Lipoproteínas de baixa densidade (LDL) e muita baixa densidade (VLDL), são

precipitadas seletivamente por polietilenoglicol tamponado. No sobrenadante, resta apenas a fração de alta densidade HDL. O teor de colesterol da fração HDL e determinado pelo sistema enzimático colesterol 250 Dolis/colesterol enzimático liquido Dolis.

AmostraSoro. Estável por 4 dias, sob refrigeração de 2-8ºC. Após a precipitação, o sobrenadante, permanece estável por 15 dias se mantido a - 20ºC. o paciente deve estar em jejum obrigatório de 12 h.

ProcedimentoIdentificar três tubos com B (branco), T (teste) e P (padrao)

B T PReagente de cor 2,0 mL 2,0 mL 2,0 mLSolução padrão - - 50 mLSobrenadante - 50 mL -

Misturar por agitação e incubar por 10 minutos em banho Maria a 37ºC. retirar do banho Maria e efetuar as leituras das absorvancias de P e T em espectrofotômetro em 510 nm, zerando o aparelho com o branco.

Calculo Absorvancia do teste Colesterol HDL (mg/dL) = ---------------------------- x 50 x 2 Absorvancia do padrao

Valores de referenciadesejável risco moderado Alto risco

Col. LDL(mg/dl) < 130 130 - 159 > 160Col. HDL fem (mg/dl) > 65 45 - 65 < 45Col. HDL masc (mg/dl) > 55 35 – 55 < 35

ÁCIDO ÚRICO

Principio

O ácido úrico e determinado de acordo com as seguintes reacões:

Ácido úrico + O2 + H2O uricase alantoina + CO2 +H2O2

2 H2O2 + DHBS + 4 – aminoantipirina peroxidase antipirilquinonimina + 4 H2O

AmostraUsar soro, úrina e líquidos (aminiotico e sinovial). O analto e estável por 3 dias entre 2 –

8ºC e por 6 meses a –10ºC.

ProcedimentoTomar três tubos de ensaio e proceder como a seguir :

Branco Teste PadrãoAmostra - 0,02 mL -Padrão - - 0,02 mLReagente de trabalho 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL

Misturar e incubar por 10 minutos em banho Maria a 37ºC. O nível da água do banho deve ser superior ao nível dos reagentes nos tubos de ensaio. Efetuar as leituras das absorvancias de padrão e do teste em espectrofotômetro em 520 nm.

Calculo absorvancia do teste Ácido úrico (mg/dL) = ---------------------------- x 6 absorvancia do padrao


Acido úrico (mg/dl)Soro: homens 2,5 a 7,0 Soro: mulheres 1,5 a 6,0Urina 250 a 750 por 24 h

PROTEINAS TOTAIS - PP

Fundamento As ligações peptídicas das proteínas (-HN-CO-) reagem com íons cúpricos em meio

alcalino (reagente do biureto), formando um complexo de coloração violeta, cuja absorbância medida em 545 nm e diretamente proporcional a concentração de proteína na amostra. Amostra

Soro ou plasma (heparinizados). O analito e estável por 8 dias entre 2-8ºC.

ProcedimentoPipetar em tubos de ensaio identificados:Tubos Branco Teste PadrãoÁgua destilada 20 mL - -Amostra - 20 mL -Padrão - - 20 mLBiureto 1000 mL 1000 mL 1000 mL

Agitar bem e deixar os tubos durante 10 minutos a temperatura ambiente. Ler absorbância do padrão e do teste, zerando o aparelho com o branco em 545 nm.

Calculo

O calculo pode ser efetuado através do Fator de Calibração.

CpFc = ------- Ap

Ct = Fc x At, onde:

Cp = concentração do padrãoCt = concentração do testeAp = absorbância do padrãoAt = absorbância do teste


Proteínas totaisSoro 6,0 a 8,0 g/dL Plasma 6,8 a 8,3 g/dL

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Apostila Bioquímica 2008