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By Maria Valentini (CRS4) watch full video of this presentation here:http://www.youtube.com/watch?v=RS59xkohGKg
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Applicazione in campo biomedico del modelling di
proteine.
Maria Valen*ni
1 Giugno 2011
Biologia in una slide...
Biologia in una slide...
DNA
Biologia in una slide...
DNA
Biologia in una slide...
DNA RNA
Biologia in una slide...
DNA RNA
Biologia in una slide...
DNA RNA PROTEINE
Proteine
Peptide Bond
Proteine
Le proteine sono polimeri di residui aminoacidici.
20 aminoacidi in natura.
La funzione biologica e’ legata alla struttura tridimensionale!
✓proteine come biofarmaci
✓proteine della famiglia delle citokine per scopi terapeu7ci
✓PEGhilazione di proteine per aumentarne la biodisponibilita’
Proteine in biomedicina
Biofarmaci
Come e’ il farmaco ideale ?
•Altamente specifico ed affine, buona solubilita’, stabile e sicuro (effetti collaterali minimi)
•di produzione economica, facile da formulare, di semplice assunzione e con il giusto profilo farmacocinetico.
Grazie agli studi gene7ci sappiamo che molte mala?e sono provocate dal mulfunzionamento o dalla assenza di specifiche proteine.
Dal punto di vista farmacologico, le proteine hanno il grande vantaggio di essere naturalmente adaDe ad essere metabolizzate nel corpo umano
Biofarmaci
Biofarmaci
Biofarmaci: sostanze biologiche o loro deriva7 molto simili alla molecola naturale, prodoDe aDraverso processi biotecnologici.
Biofarmaci
Biofarmaci: sostanze biologiche o loro deriva7 molto simili alla molecola naturale, prodoDe aDraverso processi biotecnologici.
Il primo biofarmaco approvato per uso terapeu*co e’ stata l’insulina umana prodo>a a>raverso tecniche di DNA ricombinante
Biofarmaci
Biofarmaci: sostanze biologiche o loro deriva7 molto simili alla molecola naturale, prodoDe aDraverso processi biotecnologici.
Il primo biofarmaco approvato per uso terapeu*co e’ stata l’insulina umana prodo>a a>raverso tecniche di DNA ricombinante
L’uso della tecnologia del DNA ricombinante perme>e la preparazione di buone quan*ta’ di proteina e riduce la possibilita’ di reazioni avverse: malaGa di Creutzfeld-‐Jakob, Hepa*te B o HIV, che possono essere causate da impurita’ presen* nelle proteine estra>e in natura.
Proteine come Biofarmaci
An7corpi monoclonali: OKT3, an*corpo monoclonale an*rige>o, impiegato nei trapian* d’organo e nelle
malaGe autoimmuni. Immunotossine, an*corpi monoclinali u*lizza* nelle terapie contro il cancro.
Citokine : Interferone alfa, biofarmaco u*lizzato nella cura di epa** virali e nel cancro. Interferone beta, usato nel tra>amento della sclerosi mul*pla e di altre malaGe
autoimmuni.Eritropoi*na, sostanza che controlla lo sviluppo delle cellule nel sangue, usata nelle
anemie.Granulocyte Colony s*mula*ng Factor, incrementa la formazione di granuloci* neutrofili
(specifici globuli bianchi) nel midollo osseo importan* per le difese immunitarie. Somministrato quando, a seguito di una chemioterapia, il numero di granuloci* neutrofili rischia di raggiungere valori troppo bassi, aumentando il rischio di infezione.
Ormoni :Insulina u*lizzata nella cura del diabete.GH, è l’ormone della crescita u*lizzato per curare le forme di nanismo.
Citokine
Le citokine sono proteine regolatrici della comunicazione intercellulare nel sistema immunitario.Sono secrete in risposta a microbi, an*geni e/o s*moli ambientali. Agiscono come modulatori, soppressori o enhancer di risposte specifiche del sistema immunitario
Stru>ura molto semplice (4-‐alpha helix bundle) ma svolgono mol* ruoli diversi in pathways importan* ....
Poly(ethylene glycol) (PEG) e’ un polimero inorganico idrofilo neutro usato per migliorare le proprieta’ farmauce*che dei biofarmaci.
I farmaci PEGhila* presentano mol* vantaggi una migiore stabilita’ e solubilita’ in acqua, maggiore resistenza alla inaGvazione proteoli*ca ,bassa tossicita’,migliore profilo faramcocine*co, minore immunogeni*cita’ e minore clearence renale.
PEGhilazione
Il caso del G-CSF e dell’MTgase.
Il caso del G-CSF e dell’MTgase.
BIOKER produce proteine per scopi terapeu*ci che sono so>oposte a PEGylazione per aumentarne la biodisponibilità ed emivita nel corpo umano.
Il caso del G-CSF e dell’MTgase.
BIOKER produce proteine per scopi terapeu*ci che sono so>oposte a PEGylazione per aumentarne la biodisponibilità ed emivita nel corpo umano.
G-‐CSF ha una emivita corta in vivo, per superare questo problema si modifica legandola in modo covalente ad una molecola di polyethylene glycol (PEG).
Il caso del G-CSF e dell’MTgase.
BIOKER produce proteine per scopi terapeu*ci che sono so>oposte a PEGylazione per aumentarne la biodisponibilità ed emivita nel corpo umano.
G-‐CSF ha una emivita corta in vivo, per superare questo problema si modifica legandola in modo covalente ad una molecola di polyethylene glycol (PEG).
Il processo di PEGylazione prevede l’uso di un enzima, la transglutamminasi ba>erica MTGase, in modo che la molecola di PEG si leghi chimicamente a specifici residui di glutammina della proteina.
Il caso del G-CSF e dell’MTgase.
BIOKER produce proteine per scopi terapeu*ci che sono so>oposte a PEGylazione per aumentarne la biodisponibilità ed emivita nel corpo umano.
G-‐CSF ha una emivita corta in vivo, per superare questo problema si modifica legandola in modo covalente ad una molecola di polyethylene glycol (PEG).
Il processo di PEGylazione prevede l’uso di un enzima, la transglutamminasi ba>erica MTGase, in modo che la molecola di PEG si leghi chimicamente a specifici residui di glutammina della proteina.
Per la approvazione da parte degli en* competen* e’ richiesta la riproducibilita’ e la predicibilita’ della aGvita’ del farmaco; per questo e’ necessario predire a priori potenziali si* di peghilazione ed in modo par*colare essere capaci di disegnare proteine con un unico sito di peghilazione .
Metodi computazionali
Metodi computazionali
Predizione di si* specifici di peghilazione nel G-‐CSF:
• metodi computazionali per lo studio della struDura di proteine
Metodi computazionali
Predizione di si* specifici di peghilazione nel G-‐CSF:
• metodi computazionali per lo studio della struDura di proteine allinemen*, patches idrofobici, Solvent Accessible Surface
Metodi computazionali
Predizione di si* specifici di peghilazione nel G-‐CSF:
• metodi computazionali per lo studio della struDura di proteine allinemen*, patches idrofobici, Solvent Accessible Surface
• metodi computazionali per lo studio della dinamica:
Metodi computazionali
Predizione di si* specifici di peghilazione nel G-‐CSF:
• metodi computazionali per lo studio della struDura di proteine allinemen*, patches idrofobici, Solvent Accessible Surface
• metodi computazionali per lo studio della dinamica: Dinamica Molecolare, Normal Modes Analysis
Metodi computazionali
Predizione di si* specifici di peghilazione nel G-‐CSF:
• metodi computazionali per lo studio della struDura di proteine allinemen*, patches idrofobici, Solvent Accessible Surface
• metodi computazionali per lo studio della dinamica: Dinamica Molecolare, Normal Modes Analysis
• metodi computazionali per lo studio delle interazioni con altre proteine:
Metodi computazionali
Predizione di si* specifici di peghilazione nel G-‐CSF:
• metodi computazionali per lo studio della struDura di proteine allinemen*, patches idrofobici, Solvent Accessible Surface
• metodi computazionali per lo studio della dinamica: Dinamica Molecolare, Normal Modes Analysis
• metodi computazionali per lo studio delle interazioni con altre proteine: Docking Proteina-‐Proteina
Metodi computazionali
Predizione di si* specifici di peghilazione nel G-‐CSF:
• metodi computazionali per lo studio della struDura di proteine allinemen*, patches idrofobici, Solvent Accessible Surface
• metodi computazionali per lo studio della dinamica: Dinamica Molecolare, Normal Modes Analysis
• metodi computazionali per lo studio delle interazioni con altre proteine: Docking Proteina-‐Proteina
Metodi computazionali
Predizione di si* specifici di peghilazione nel G-‐CSF:
Confronto con da* sperimentali
• metodi computazionali per lo studio della struDura di proteine allinemen*, patches idrofobici, Solvent Accessible Surface
• metodi computazionali per lo studio della dinamica: Dinamica Molecolare, Normal Modes Analysis
• metodi computazionali per lo studio delle interazioni con altre proteine: Docking Proteina-‐Proteina
Metodi computazionali
Predizione di si* specifici di peghilazione nel G-‐CSF:
Confronto con da* sperimentali
“Site-‐directed enzyma*c PEGyla*on of the human granulocyte colony-‐s*mula*ng factor.”C. Maullu, D. Raimondo, F. Caboi, A. GiorgeG, M. Sergi, M. Valen*ni, G. Tonon and A. TramontanoFEBS J. 276, 6741–6750 (2009)
Scale e tempi della modellazione
Molecular Dynamics (atoms)
Macro-homogeneous Fluid-Dynamics
(volume of fluids )
Coarse-grained Modelling
(blobs)
Time
Distance
Quantum Mechanics (electrons) femtoseconds
picoseconds
nanoseconds
microseconds
seconds
minutes
hours
1A 1nm 1µm 1mm meters
Normal mode
analysis
G-CSF struttura secondaria
G-CSF: sequenza e struttura secondaria
17 Glutammine (Q)
G-CSF: sequenza e struttura secondaria
17 Glutammine (Q)
8 buried SAS < 25%
G-CSF: sequenza e struttura secondaria
17 Glutammine (Q)
8 buried SAS < 25%
5 not in alpha helix
G-CSF: sequenza e struttura secondaria
17 Glutammine (Q)
8 buried SAS < 25%
5 not in alpha helix
G-CSF: sequenza e struttura secondaria
17 Glutammine (Q)
8 buried SAS < 25%
5 not in alpha helix
G-CSF: sequenza e struttura secondaria
17 Glutammine (Q)
8 buried SAS < 25%
5 not in alpha helix
G-CSF: sequenza e struttura secondaria
17 Glutammine (Q)
8 buried SAS < 25%
5 not in alpha helix
G-CSF: sequenza e struttura secondaria
17 Glutammine (Q)
8 buried SAS < 25%
5 not in alpha helix
G-CSF: sequenza e struttura secondaria
G-CSF: struttura 3D
Protein Data Bank (PDB): struttura 2D9Q (X-ray)
Dinamica Molecolare setup
Analyze data and print results
Set particle positions
Assign particle velocities
Calculate force on each particle
Move particles by time step
Reached preset nos. of time step?
Save current positions and velocities
no
yes Il tempo totale di simulazione si divide in time -steps.
Vengono aggiunta acqua e ioni per simulare le condizioni all’interno del corpo umano.
G-CSF DInamica Molecolare (MD)
G-CSF: risultati MD
MTgase
Struttura X-rays (PDB code 1IU4).
ha una struttura a disco con una tasca
contenente la triade catalitica (CYS64,
HIS274, ASP255).
G-CSF + MTgase
Transglutamination site (GLN134)
Active site (CYS64,ASP255,HIS274)
Protein-Protein Docking
1 Search Algorithms: esplora tu>o lo spazio delle configurazioni delle due proteine, generando mol*ssime configurazioni (decoys).
2 Scoring Func7on: per classificare ognuna delle stru>ure (decoys) generate. E’ basata su principi primi ma con*ene anche termini empirici.
E’ un problema computazionalmente molto pesante! Per assicurare un buon sampling di tu>o lo spazio delle mutue posizioni bisonga generare un grande numero di stru>ure (100K).
Risultati docking
Il decoy con score minimo non è come ci aspeDavamo!!!Cosa ci dice questo risultato?
Con il sopware Rose>aDock, in parallelo sul cluster di calcolo ad alta prestazioni del CRS4, sono stait genera* 100K decoys per ognuno dei quali le posizioni delle due proteine sono scelte in maniera random.
Protein-Protein Docking
L’ interpretazione dei risulta* del Docking e’ un problema sta*s*co: bisogna tenere in considerazione sia il miglior score che la distribuzione spaziale dei decoys con miglior scores.
Più spesso una conformazione viene trovata più probabile è in realta!
Cluster analysis dei 200 decoys con score migliore (RMSD cut-‐off=2.5Ǻ)
Protein-Protein Docking
L’ interpretazione dei risulta* del Docking e’ un problema sta*s*co: bisogna tenere in considerazione sia il miglior score che la distribuzione spaziale dei decoys con miglior scores.
Più spesso una conformazione viene trovata più probabile è in realta!
Cluster analysis dei 200 decoys con score migliore (RMSD cut-‐off=2.5Ǻ)
Protein-Protein Docking
L’ interpretazione dei risulta* del Docking e’ un problema sta*s*co: bisogna tenere in considerazione sia il miglior score che la distribuzione spaziale dei decoys con miglior scores.
Più spesso una conformazione viene trovata più probabile è in realta!
Non è presente alcun cluster significa*vo per numerosità!
Cluster analysis dei 200 decoys con score migliore (RMSD cut-‐off=2.5Ǻ)
Calcolo dei normal modes del MTgase tramite sopware Betagm (gaussian network model, MicheleG et al.,Proteins 2004)
MTgase: Normal Modes Analysis
La stru>ura cristallografica del MTgase presenta una conformazione piu>osto chiusa della tasca contenente il sito catali*co.
Normal Mode Analysis (NMA) evidenzia i mo* oscillatori della proteina su scale di tempo molto lunghe.
Calcolo dei normal modes del MTgase tramite sopware Betagm (gaussian network model, MicheleG et al.,Proteins 2004)
MTgase: Normal Modes Analysis
La stru>ura cristallografica del MTgase presenta una conformazione piu>osto chiusa della tasca contenente il sito catali*co.
Normal Mode Analysis (NMA) evidenzia i mo* oscillatori della proteina su scale di tempo molto lunghe.
E’ stata scelta una configurazione con la tasca del sito catali*co piu’ aperta: “MTGase open”
MTgase: “struttura aperta”
MTgase open :risultati docking
Nel caso di docking “open” è stato generato un cluster di 158 configurazioni che mostrano una interazione specifica dell’MTgase con la GLN134, indicando che tale glutammina è un sito di transglutamminazione del G-‐CSF.
Esperimenti Mutagenesi
E’ stato studiato computazionalmente anche il Mut4, dimostrando che la P132 rende rigida la Q131!
Inoltre...
Nell’ambito della collaborazione con BIOKER sono state studiate anche altre 2 proteine delle citokine :IFNb ed IFNa
scopo dello studio era migliorarne la solubilita’ per evitare aggregazioni che rendono difficile il delivery di queste proteine.
Abbiamo studiato la dinamica dei patches idrofobici, suggerendo possibili mutazioni per o>enere patches idrofobici piu’ piccoli e sparsi sulla superficie proteica, salvaguardando la funzionalita’ della proteina.
Conclusioni
Conclusioni
Studi computazionali fanno parte della pipeline di sviluppo di biofarmaci.
Conclusioni
Studi computazionali fanno parte della pipeline di sviluppo di biofarmaci.
Proteine sono en*ta’dinamiche, nel loro studio non si puo’ prescindere dalla capacita’ di riconformazione
Conclusioni
Studi computazionali fanno parte della pipeline di sviluppo di biofarmaci.
Proteine sono en*ta’dinamiche, nel loro studio non si puo’ prescindere dalla capacita’ di riconformazione
I tempi di studio delle dinamiche di proteine sono oramai brevi e quindi perfe>amente integrabili nella fase di proge>azione e studio di farmaci.
Conclusioni
Studi computazionali fanno parte della pipeline di sviluppo di biofarmaci.
Proteine sono en*ta’dinamiche, nel loro studio non si puo’ prescindere dalla capacita’ di riconformazione
I tempi di studio delle dinamiche di proteine sono oramai brevi e quindi perfe>amente integrabili nella fase di proge>azione e studio di farmaci.
Il dialogo tra sperimentali e computazionali perme>e risparmio di tempo e denaro ed una comprensione piu’ approfondita del problema.
Ringraziamenti
Bioker SRL :Carlo Maullu, Francesca Caboi, Sergio Mauri, Rodolfo Schrepfer, Giancarlo Tonon.
CRS4 : gruppo di bioinforma*ca , gruppo AGCT Ilenia, Ma>eo
sistemis* ed High Performance Compu*ng group.
CNR -‐IRGB (ex INN) : con cui lavoro ora per l’analisi di da* genomici (spero che prima o poi troviamo un target di interesse per il modelling !)